CN110672854A - 一种用于血清学诊断IgA肾病的分子探针 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于血清学诊断IgA肾病的分子探针。本发明构建了能与IgA结合的CD89重组蛋白片段，并将这种CD89分子探针用于体外识别和结合病人血浆样品中的IgA，以达到定量检测IgA的目的。相比于在IgA肾病发病机制中可能扮演重要角色的总IgA1水平以及半乳糖缺失的Gd‑IgA1水平，这种运用CD89分子探针的检测方法可以更好的区分IgA肾病患者和健康对照，并且在IgA肾病患者和健康对照之间的重叠率也更小。发现运用CD89分子探针的检测方法重复性好。本发明将对IgA肾病的早期诊断以及治疗提供有效的帮助。

Description

一种用于血清学诊断IgA肾病的分子探针

技术领域

本发明涉及一种运用分子探针检测血液中致病性生物标志物的水平，以协助诊断IgA肾病。

背景技术

肾脏是重要的排泄水分和身体代谢产物的器官。在中国有超过一亿的人患有慢性肾病，并且肾脏病中自身免疫性疾病占了很大比例。由免疫球蛋白IgA沉积引起的IgA肾病(IgAnephropathy,IgAN)是目前全球最常见的原发性肾小球疾病。根据来自于中国，韩国及日本临床数据，在亚洲人群中IgA肾病约占所有肾小球疾病的30-40％。而在北欧和美国人群统计中IgA肾病约占所有肾小球疾病的25-30％。其中超过30％的患者在发病10-20年后进展至终末期肾脏病(End-Stage Renal Disease,ESRD)，使得IgA肾病成为引起青壮年尿毒症最常见的病因之一。

目前关于IgA肾病的发病机制，普遍认为是与粘膜免疫相关的诱发因素有关。例如当呼吸道或消化道感染时，人体在对抗病原体的过程中，粘膜免疫系统被激活。在这个过程中B淋巴细胞起到主要作用。B淋巴细胞在激活后，进而通过T淋巴细胞依赖以及T淋巴细胞非依赖途径，继续分化及转变成产生和分泌IgA抗体的浆细胞(浆细胞是B淋巴细胞的一种)。之后通过淋巴细胞转运，分泌IgA的浆细胞最终停留在粘膜组织的下表层(例如呼吸道粘膜及肠粘膜间质)。而大量分泌的IgA会通过受体介导转运到粘膜外腔隙(外分泌)，从而针对性的对抗呼吸道及肠腔内的病原微生物。但是，在淋巴细胞转运路径中，一些分泌IgA的浆细胞会病理性“归巢”到其他组织区域。而其分泌的IgA亚型IgA1继而逃逸粘膜免疫中的抗体外分泌过程，并异常出现在血循环中。通过研究IgA的分子类型与肾脏沉积的关系，目前众多实验室发现在IgA肾病中IgA1分子存在其铰链区-O糖半乳糖缺失(galactose-deficient IgA1,Gd-IgA1)的现象。这种糖基化缺陷IgA1分子在血液中容易自发性聚集并产生多聚循环免疫复合物。也有研究发现在血液循环中还同时存在针对Gd-IgA1的抗糖抗体，比如IgG，并共同参与IgG-IgA1循环免疫复合物的形成。最终这种包含IgA的循环免疫复合物在肾小球系膜区局部沉积，进而激活补体系统和诱发炎症反应，导致肾组织损伤。

同时，大量的研究表明，生理情况下人体内存在具有选择性清除强免疫源性的IgA的细胞机制。例如在血液循环中当IgA与病原微生物或其他分子结合物形成复合物后表现出强免疫源性，继而引发多种类型的吞噬细胞有选择性的将其清除。这个过程是通过吞噬细胞表面的CD89介导的。作为IgA的受体，CD89可以选择性的结合复合物型IgA，而对正常单体IgA分子只有较弱的物理亲和力。CD89是一种跨膜糖蛋白。其胞外区的蛋白结构具有结合IgA的Fc段的功能，并表现出对多聚型IgA的选择性。同时病理性的IgA清除障碍也被认为是IgA肾病的诱发因素之一。

IgA肾病的目前诊断的金标准仍然是肾脏病理组织活检。免疫病理检查显示以IgA为主的免疫球蛋白在肾小球系膜区沉积，并伴有不同程度的组织病理损伤。然而有创肾活检有一定的风险，许多病人因为存在肾穿刺相对禁忌症(如出血风险高的条件限制)，或者由于病人所在的地区或国家医院不具有肾穿刺病理诊断的条件，而导致病人无法获得明确诊断和针对性的治疗。因此临床上亟需开发有助于IgA肾病诊断或病情判断的无创性生物标志物，比如血液中的异常IgA1分子，包括其特殊病理类型的复合物多聚体。

2019年发表的KDIGO国际肾小球肾炎共识指出，尽管有关生物学标志物研究非常多，但是目前缺乏能够有效用于临床的生物学标志物。以下是潜在有希望应用于临床的血清生物学标志物：

(1)半乳糖缺陷IgA1分子(Gd-IgA1)：Gd-IgA1被认为可能是IgA肾病发病的始动因素。一些研究发现半乳糖缺陷的IgA1水平在病人中显著升高。例如，Moldoveanu et al.在153例的单中心研究中发现Gd-IgA在美国人中有很好的诊断价值：以正常人Gd-IgA1的90％上限水平为界值(即特异性90％情况下)，其敏感性为76.5％。然而这一结果并未在其他研究中得到普遍证实。如表1所示在其他研究中显示包括日本人及中国人中其敏感性仅为41-57％,受试者工作曲线(ROC曲线)分析区别健康对照和IgA肾病患者的敏感性和特异性分别为41％-49％,89％-91％。北大医院肾内科通过超过1000例IgA肾病病人的测定，发现Gd-IgA1的诊断的敏感性和特异性仅分别为50.5％和89.5％。而且，Gd-IgA1水平在患者和正常人之间存在很大的重叠，显示其临床价值的局限性。此外，该检测还有一个重要技术缺陷，那就是目前采用的凝集素方法来测定Gd-IgA1的操作表现不稳定，尤其在不同批次的凝集素试剂在测定时存在明显差异，这严重制约了该方法的临床的广泛应用。目前测定Gd-IgA1的方法并未得到KDIGO的推荐。

(2)KM-55：2015年日本学者制备了针对糖肽的单克隆抗体KM-55用于测定Gd-IgA1水平，结果显示与凝集素HAA测定具有很好的一致性，并且克服了HAA测定的不稳定性。但是以此为方法测定Gd-IgA1相比于传统的凝集素HAA方法，患者和健康对照之间的Gd-IgA1水平的重合部分仍然很大，并没有优于传统凝集素方法。这种用KM-55直接检测Gd-IgA1的方法存在的问题包括其检测的糖型过于单一，而无法覆盖IgA糖型的多样性。这也提示Gd-IgA1的临床应用前景具有相当的局限性。

(3)抗糖抗体：2009年美国实验室的Suzuki et al发现针对Gd-IgA1的内源性抗糖抗体(在这里Gd-IgA1作为抗原与其内源产生的抗糖抗体结合)，并认为该抗糖抗体是IgA肾病的致病性抗体。从而建议内源性抗糖抗体有可能成为IgA肾病特异性诊断标志物。该组学者在2014年的一项研究中检测了针对Gd-IgA1特异性的IgG型抗糖抗体，其作为诊断指标的敏感性为89％，特异性为92％。然而到目前为止这个结论还缺乏其他实验室的独立验证。发明人在中国人群中开展的研究显示在IgA肾病和正常人血清中均发现抗糖抗体。尽管病人抗糖抗体平均水平高于正常对照，但如果以正常人90％上限为阈值，只有不足50％的中国IgA肾病患者抗糖抗体水平升高(表1)。因此抗糖抗体作为IgA肾病诊断的临床价值仍然非常有限。

(4)IgA/补体C3比值：早期有日本学者提出采用血IgA或IgA/C3比值来进行IgA肾病诊断，这些研究如表1所示其对于疾病诊断的敏感性和特异性均低，临床价值有限。

因此正如最新KDIGO国际肾小球肾炎共识会所总结的，到目前为止仍缺乏可用于临床的IgA肾病血清学诊断方法。

表1 IgA肾病诊断标志物研究比较

发明内容

本发明的目的是提供一种用于辅助诊断IgA肾病的新型生物标志物。

本发明首先保护功能蛋白在制备用于辅助诊断IgA肾病的产品中的应用；

所述功能蛋白为如下(a1)或(a2)：

(a1)CD89蛋白胞外区；

(a2)具有CD89蛋白胞外区的融合蛋白。

本发明还保护所述功能蛋白和IgA抗体在制备用于辅助诊断IgA肾病的产品中的应用。

所述IgA抗体具体可为HRP标记的IgA抗体。

本发明还保护用于辅助诊断IgA肾病的酶联免疫试剂盒，含有包被有所述功能蛋白的酶标板。

所述试剂盒还包括HRP标记的IgA抗体。

所述试剂盒中还含有如下中的至少一种：IgA标准品、洗涤液、显色底物和终止液。

所述IgA标准品为商品化的人IgA1，具体可为Abcam公司生产的货号为ab91020的人IgA1。

所述洗涤液为含有0.1％(体积百分含量)Tween-20的PBST溶液。

所述显色底物为过氧化物酶底物TMB。

所述终止液为1M硫酸溶液。

所述试剂盒还包括记载有诊断方法的可读性载体；

所述诊断方法如下：取待测患者血浆和健康对照血浆，采用以上任一所述的试剂盒进行ELISA检测，根据检测结果判断待测患者是否患有IgA肾病；

所述ELISA检测及结果判断方法包括如下步骤：(1)取包被有所述功能蛋白的酶标板，加入待测血浆进行孵育；(2)完成步骤(1)后，采用洗涤液洗板(共洗三次，每次一分钟)后加入HRP标记的IgA抗体进行孵育；(3)完成步骤(2)后，进行显色、终止和读值；(4)采用不同浓度的IgA标准品进行步骤(1)-(3)进行操作，制作标准曲线；(5)根据步骤(4)制作的标准曲线，计算得到待测血浆中可与所述功能蛋白结合的IgA水平；(6)比较待测患者与健康对照血浆中可与所述功能蛋白结合的IgA水平；如果待测患者血浆中所述IgA蛋白水平大于健康对照血浆中所述IgA水平的第90个百分位点，待测患者或疑似患有IgA肾病。

所述健康对照血浆为未患有IgA肾病的健康人离体血浆。

所述步骤(1)中，所述待测血浆采用1％BSA/PBST缓冲液进行1：1000倍稀释后加至所述酶标板中，37℃孵育3h。

所述步骤(2)中，所述IgA抗体采用1％BSA/PBST缓冲液进行1：1000倍稀释后加至所述酶标板中，37℃孵育1h。

所述步骤(3)中，在450/570nm双波长读数。

所述步骤(4)中，所述标准曲线为Logistic四参数拟合标准曲线。

以上任一所述包被有所述功能蛋白的酶标板的制备方法如下：(A)取ELISA板，用pH＝9.6的重碳酸盐缓冲液将所述功能蛋白稀释至2.5μg/ml浓度后，每孔加入50μl，4℃包被过夜；(B)完成步骤(A)后，每孔加入100μl封闭液(1％BSA/PBST)，37℃封闭1h。完成所述步骤(A)和步骤(B)后，均采用洗涤液洗板三次，每次1分钟。

本发明还保护以上所述功能蛋白和记载有以上任一所述诊断方法的可读性载体在制备用于辅助诊断IgA肾病的产品中的应用。

本发明还保护用于辅助诊断IgA肾病的系统，包括以上任一所述的试剂盒和酶标仪。

以上任一所述CD89蛋白胞外区为如下(1)或(2)：

(1)序列表的序列2自N端第22-227位所示的蛋白质；

(2)将(2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质。

以上任一所述具有所述CD89蛋白胞外区的融合蛋白为在CD89蛋白胞外区的N末端和/或C末端融合标签蛋白得到的。标签蛋白与CD89蛋白胞外区可以直接融合连接，也可以通连接肽融合连接。所示标签蛋白具体可为3×Flag标签。所述具有所述CD89蛋白胞外区的融合蛋白具体可如如序列表的序列2所示。

本发明还保护可与所述功能蛋白结合的IgA作为标志物在制备用于辅助诊断IgA肾病的产品中的应用。

本发明的实施例中通过实验证明，血液中可与所述功能蛋白结合的IgA为IgA复合物。

本发明特别定义可与CD89(又名Fc fragment ofIgAreceptor/FCAR或FcαRI)结合的IgA分子，并以此作为一种新型生物标志物来进行相关的血清学检测。本发明的发明人构建了能与IgA分子结合的CD89重组蛋白片段，并将这种CD89分子探针用于体外识别和结合病人血浆样品中的IgA，以达到定量检测IgA的目的。相比于在IgA肾病发病机制中可能扮演重要角色的总IgA1水平以及半乳糖缺失的Gd-IgA1水平，这种运用CD89分子探针的检测方法可以更好的区分IgA肾病患者和健康对照，并且在IgA肾病患者和健康对照之间的重叠率也更小。在进行了三组独立人群验证之后，发现运用CD89分子探针的检测方法重复性好。本发明将对IgA肾病的早期诊断以及治疗提供有效的帮助。

附图说明

图1为重组CD89蛋白可以结合循环中的IgA分子。

图2为检测方法原理示意图。

图3为三种检测方法比较。

图4为三种检测方法ROC曲线。

图5为标准品非还原的考马斯亮蓝染色及标准曲线。

图6为重组CD89-flag结合IgA复合物。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、重组CD89蛋白的制备

一、重组表达载体的构建

采用序列表的序列1所示的DNA分子替代pcDNA3载体(Invitrogen^TM)的BamHI和XhoI位点间的片段，得到重组表达载体pcDNA-CD89-Flag(已经测序验证)。

序列表的序列1中，自5’端第7-69位编码信息肽，第70-687CD89蛋白膜外区，第688-753位编码3×Flag标签。序列表的序列1编码序列2所示的蛋白质。序列表的序列2中，自N端第1-21为信息肽，第22-227位为CD89蛋白膜外区，第228-249位为3×Flag标签。

二、重组CD89蛋白的表达纯化

在运用重组表达载体pcDNA-CD89-Flag稳定转染HEK293细胞(ATCC)之后，筛选可以持续分泌CD89的细胞克隆，运用特异性连接有抗flag标签抗体琼脂糖凝胶从细胞培养上清中提纯重组蛋白CD89，具体实验步骤如下：

1.准备质粒：取10μl重组表达载体pcDNA-CD89-Flag(5μg)，与100μl Opti-MEM(Thermofisher,31985062)和5μl Lipofectamine 2000(Thermofisher,11668019)混合，室温放置10分钟，得到转染复合物。

2.转染：将培养HEK293细胞的六孔板中细胞培养液换成预先在37℃放置的Opti-MEM(Thermofisher,31985062)，1ml/孔，将步骤1中混匀的得到转染复合物缓慢滴入六孔板中，在37℃/5％CO₂细胞孵箱放置4小时后，将细胞培养液换成DMEM(Cellgro,10017CVR)，10％胎牛血清(10％FBS)(Gibco,10099141)继续培养。

3.选择性筛选：待细胞全部长满培养皿后，按照不同比例进行传代细胞，24小时之后，将细胞培养液换成DMEM培养基，10％FBS，1mg/ml G418选择性抗生素(Solarbio,G8160)，继续培养，等待成功转染CD89质粒的细胞克隆生长。

4.挑选细胞克隆：培养11天后，选择性抗生素选择继续生长的细胞克隆，培养皿中已经有细胞克隆生成，将每个细胞克隆团转移至96孔培养板中，培养基同上，也加入1mg/mlG418选择性抗生素筛选。

5.检测表达：培养7天之后，运用Dot-blot的方法(使用的抗Flag标签抗体Anti-Flag-M2购自Sigma)检测细胞克隆分泌CD89的情况，选取分泌量最大的细胞克隆进行扩大培养，运用无血清DMEM培养基进行培养，培养7天后收取细胞上清，进行纯化CD89。

6.提纯CD89：收取的细胞上清3500g/30min离心去除细胞碎片等杂质，得到的上清加入500μl抗flag标签抗体琼脂糖凝胶(sigma,A2220)，4度混匀3小时，运用10mM TBS清洗3次；

7.提纯CD89：运用100μg/ml 3×flag短肽(sigma,F4799)进行竞争性洗脱，得到纯化的CD89蛋白，考马斯亮蓝染色以及运用抗Flag标签抗体(同上)进行鉴定，运用Nanodrop检测蛋白浓度，4℃冰箱保存。

实施例2、可与重组CD89结合的IgA免疫复合物在辅助诊断肾病中的应用

一、重组蛋白CD89具有作为IgA分子配体的功能

1.按照实施例1的步骤1-6进行操作。

2.CD89-血浆免疫共沉淀：结合CD89的flag标签的琼脂糖凝胶分别与一个IgA肾病患者或健康对照来源的血浆混合，血浆稀释比例为1：20(体积比)，4℃混匀2小时，10mM TBS洗3次，IgA肾病患者血浆来源于北大医院肾内科已经签署知情同意的肾活检诊断为IgA肾病的患者，健康对照血浆来源于签署知情同意的健康献血者。

3.洗脱：运用100μg/ml 3×flag短肽(sigma,F4799)与结合过血浆以及CD89蛋白的琼脂糖凝胶进行竞争性洗脱，收集洗脱后的含有CD89-IgA复合物的蛋白溶液，每50μl加入10μl还原性SDS蛋白上样缓冲液，100℃加热10min变性还原，冷却至室温瞬时离心后准备上样。

4.制胶：将配好的10％分离胶液快速灌入玻璃板，以去离子水压平界面。待分离胶凝固彻底后(约20min)，倾倒出覆盖的水，滤纸吸干，再灌入配好的4％浓缩胶，快速插入与玻璃板配套的梳子。

5.上样：固定胶板至电泳仪拔掉梳子，每孔加入20ul/30ul样品，每个胶板各加入4ul的蛋白marker。

6.电泳跑胶：检查电泳仪内外槽电泳液的量，连接电源，设置恒压80V通过浓缩胶，120V通过分离胶。

7.考马斯亮蓝染色：将加入30μl样品的胶放入考马斯亮蓝染液中，室温摇床上摇晃1h，脱色液脱色，观察脱色后条带并拍照保存(见图1a)。

8.转膜：将上样量为20μl的胶板中凝胶取下来准备转膜。滤纸以及提前甲醇激活的PVDF膜及凝胶按照顺序摆放。由正极到负极顺序依次为：滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸。注意赶走气泡以防转膜不彻底。转膜条件：恒流300mmA，90分钟。

9.封闭：用0.1％TBST冲洗转膜后的PVDF膜，在5％的脱脂奶粉中室温封闭60分钟；

10.HRP标记的抗Flag标签抗体(abcam,ab49763)5％脱脂乳1：5000稀释，biotin标记抗IgA1抗体(Southern biotech,9130-08)5％脱脂乳1：2000稀释，室温孵育PVDF膜1h，0.1％TBST洗三次每次10min。

11.HRP标记的extravidin二抗5％脱脂乳1：2000稀释，0.1％TBST洗三次每次10min。

12.化学发光：化学发光液A液(鲁米诺发光液)和B液(H₂O₂)1：1混合，混匀后加在PVDF膜上，至GE Image Quant LAS4000化学发光成像分析仪中连续曝光拍照120s，每次间隔10s，保存照片。

采用抗Flag标签抗体和抗IgA1抗体孵育后的拍照结果如图1b和图1c所示。其中，+代表加了血浆，-代表未添加血浆的对照组。

结果显示，与对照组相比，CD89可以结合血浆中的IgA分子，证明重组蛋白CD89具有作为IgA分子配体的功能。

二、重组蛋白CD89结合IgA免疫复合物

1.包板：取ELISA板，用pH＝9.6的重碳酸盐缓冲液将实施例1制备的重组CD89蛋白和山羊抗人IgA-Fab段抗体(Jackson ImmunoResearch)均稀释至10μg/ml浓度后，每孔加入50μl，4℃包被8小时，得到CD89包被板和抗IgA抗体包被板，0.1％PBST洗3次每次1分钟。

2.封闭：向步骤1制备的CD89包被板中加入1％BSA/PBST，100μl/孔，37℃封闭1h，0.1％PBST洗3次每次1分钟。

3.上样：一名IgA肾病患者血浆样本运用PBS按照1：1000稀释，50μl每孔，4度孵育过夜；

4.收集样品上清：4度过夜后，收集两种蛋白包被板中的样本上清备用，超滤浓缩至100μl，PBS缓冲液洗3次每次1分钟；

5.收集复合物：准备非还原/还原SDS上样缓冲液，共100μl，分别洗脱两种蛋白包被板中与包被蛋白结合的复合物，保持体积为100μl；

6.制胶：将配好的8％分离胶液快速灌入玻璃板，以去离子水压平界面。待分离胶凝固彻底后(约20min)，倾倒出覆盖的水，滤纸吸干，再灌入配好的4％浓缩胶，快速插入与玻璃板配套的梳子。

7.上样：固定胶板至电泳仪拔掉梳子，每孔加入30μl样品，每个胶板各加入4μl的蛋白marker。

8.电泳跑胶：检查电泳仪内外槽电泳液的量，连接电源，设置恒压80V通过浓缩胶，120V通过分离胶。

9.转膜：将胶板中凝胶取下来准备转膜。滤纸以及提前甲醇激活的PVDF膜及凝胶按照顺序摆放。由正极到负极顺序依次为：滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸。注意赶走气泡以防转膜不彻底。转膜条件：恒流300mmA，100分钟。

9.封闭：用0.1％TBST冲洗转膜后的PVDF膜，在5％的脱脂奶粉中室温封闭60分钟；

10.HRP标记的抗Flag标签抗体(abcam,ab49763)5％脱脂乳1：5000稀释，biotin标记抗IgA1抗体(Southern biotech,9130-08)5％脱脂乳1：2000稀释，室温孵育PVDF膜1h，0.1％TBST洗三次每次10min。

11.HRP标记的extravidin二抗5％脱脂乳1：2000稀释，0.1％TBST洗三次每次10min。

12.化学发光：化学发光液A液(鲁米诺发光液)和B液(H₂O₂)1：1混合，混匀后加在PVDF膜上，至GE Image Quant LAS4000化学发光成像分析仪中连续曝光拍照120s，每次间隔10s，保存照片。

结果如图6所示。图6中，sub.表示加样后4度孵育过夜后结合在ELISA板上包板蛋白结合的复合物；#表示ELISA板由重组蛋白CD89包被；*表示ELISA板由山羊抗人IgA-Fab段包被；还原条件表示样品中加入还原性SDS上样缓冲液，非还原条件表示样品中加入非还原性SDS上样缓冲液。结果显示，非还原条件下重组蛋白CD89结合的是血浆中IgA免疫复合物(Western blot结果中箭头所指蛋白条带位置大于300kDa)，不是单体IgA。

三、利用重组CD89作为分子探针检测病人血浆样品中IgA免疫复合物的水平

检测原理如图2所示。

1.包板：取ELISA板，用pH＝9.6的重碳酸盐缓冲液将实施例1制备的重组CD89蛋白稀释至2.5μg/ml浓度后，每孔加入50μl，4℃包被过夜，得到CD89包被板，0.1％PBST洗3次每次1分钟。

2.封闭：向步骤1制备的CD89包被板中加入1％BSA/PBST，100μl/孔，37℃封闭1h，0.1％PBST洗3次每次1分钟。

3.加样：50μl待测血浆样本(血浆样本采用1％BSA/PBST缓冲液进行1：1000倍稀释)，37℃孵育3h，0.1％PBST洗3次每次1分钟。

4.加抗体：完成步骤3后，每孔加入50μl HRP标记的抗IgA的抗体(abcam,ab7383)，1％BSA/PBST缓冲液进行1：1000倍稀释，37℃孵育1h。

5.TMB显色：过氧化物酶底物TMB显色液1：1比例现配现用，避光，洗板时避光在摇床将A B液混匀，每孔50ul显色液，室温避光显色30min。

6.终止读数：1M浓硫酸终止读数。酶标仪450/570nm双波长读数，采用商品化IgA蛋白(Abcam,ab91020)进行倍比稀释作为标准品，Logistic四参数拟合标准曲线计算对应水平浓度。商品化IgA蛋白(Abcam,ab91020)经过非还原的考马斯亮蓝染色验证，既有单体IgA，也有复合物IgA(图5)。

商品化IgA蛋白稀释浓度及各浓度对应的检测结果度数见表2。表2中，浓度数值为总IgA蛋白浓度(包括单体IgA和复合物IgA)。

表2

μg/ml	OD值
		500	1.923
250	1.744
		125	1.4605
62.5	0.9455
		31.25	0.538
15.625	0.2905
		7.8125	0.1565
0	0

Logistic四参数拟合标准曲线如图5所示。

标准曲线方程：y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D；其中，A＝2.07884，B＝-1.08659，C＝1854.70355，D＝0.00030。标准曲线方程r^2＝0.99994。

将待测样本经过上述步骤检测得到的OD度数代入标准曲线方程中的y值，计算x值，用以评价病人血浆样品中CD89结合的IgA水平。经过前面实验证明，血液中与CD89结合的IgA以IgA复合物形式存在，因此，本方法评价的CD89结合的IgA水平可以认为是CD89结合的IgA复合物水平。

四、方法比较

分别采取步骤三的方法、IgA1检测方法和Gd-IgA1检测方法对28名肾病患者和42名健康人的循环(血浆样本来源于EDTA抗凝血浆，采血离心后分离血浆冻于-80℃冰箱)中IgA1水平，Gd-IgA1水平以及CD89结合的IgA水平进行检测。

IgA肾病患者血浆来源于北大医院肾内科已经签署知情同意的肾活检诊断为IgA肾病的患者，健康对照血浆来源于签署知情同意的健康献血者。

IgA1检测方法见参考文献：Moldoveanu Z,Wyatt R J,JY Lee,et al.Patientswith IgA nephropathy have increased serum galactose-deficient IgA1levels[J].Kidney International,2007,11(11):1148-1154.

Gd-IgA1检测方法见参考文献：Suzuki H,Moldoveanu Z,Hall S,et al.IgA1-secreting cell lines from patients with IgA nephropathy produce aberrantlyglycosylated IgA1[J].Journal ofClinical Investigation,2008,118(2):629-639.

三种方法的检测结果如图3所示。ROC曲线分析结果如图4所示。IgA肾病患者和健康对照之间三种生物指标重合百分比如表3所示。三种生物指标诊断效能的敏感度，特异度，阳性预测值，阴性预测值统计结果如表4所示。

结果显示，对于CD89检测的IgA水平以及IgA1水平和Gd-IgA1水平，IgA肾病患者都要高于健康对照，并且达到统计学差异。同时三种生物标志物的水平在健康对照和IgA肾病患者之间都存在重叠部分。以正常人生物标记物水平第90个百分位点为截断值，CD89检测IgA水平在患者和健康对照之间的重叠率是25％，远远小于IgA1水平的46.43％以及Gd-IgA1水平的42.86％，运用CD89检测IgA的ROC曲线下面积达到0.918，大于IgA1水平以及Gd-IgA1水平计算的ROC曲线下面积并且达到统计学差异(P＝0.0119，P＝0.0405)，诊断敏感度为75％，特异度为90.5％，阳性预测值为84％，阴性预测值为84.44，均优于单纯检测IgA1水平以及Gd-IgA1水平的传统方法。

表3 IgA肾病患者和健康对照之间三种生物指标重合百分比

表4三种生物指标诊断效能的敏感度，特异度，阳性预测值，阴性预测值

序列表

<110> 北京大学第一医院

西北大学

<120> 一种用于血清学诊断 IgA肾病的分子探针

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agcacgatgg accccaaaca gaccaccctc ctgtgtcttg tgctctgtct gggccagagg 60

attcaggcac aggaagggga ctttcccatg cctttcatat ctgccaaatc gagtcctgtg 120

attcccttgg atggatctgt gaaaatccag tgccaggcca ttcgtgaagc ttacctgacc 180

cagctgatga tcataaaaaa ctccacgtac cgagagatag gcagaagact gaagttttgg 240

aatgagactg atcctgagtt cgtcattgac cacatggacg caaacaaggc agggcgctat 300

cagtgccaat ataggatagg gcactacaga ttccggtaca gtgacaccct ggagctggta 360

gtgacaggct tgtatggcaa acccttcctc tctgcagatc ggggtctggt gttgatgcca 420

ggagagaata tttccctcac gtgcagctca gcacacatcc catttgatag attttcactg 480

gccaaggagg gagaactttc tctgccacag caccaaagtg gggaacaccc ggccaacttc 540

tctttgggtc ctgtggacct caatgtctca gggatctaca ggtgctacgg ttggtacaac 600

aggagcccct acctgtggtc cttccccagt aatgccttgg agcttgtggt cacagactcc 660

atccaccaag attacacgac gcagaacgac tacaaggacc acgacggtga ctacaaggac 720

cacgacatcg actacaagga cgacgacgac aagtga 756

<210> 2

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Asp Pro Lys Gln Thr Thr Leu Leu Cys Leu Val Leu Cys Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ile Gln Ala Gln Glu Gly Asp Phe Pro Met Pro Phe Ile Ser

20 25 30

Ala Lys Ser Ser Pro Val Ile Pro Leu Asp Gly Ser Val Lys Ile Gln

35 40 45

Cys Gln Ala Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Thr Gln Leu Met Ile Ile Lys

50 55 60

Asn Ser Thr Tyr Arg Glu Ile Gly Arg Arg Leu Lys Phe Trp Asn Glu

65 70 75 80

Thr Asp Pro Glu Phe Val Ile Asp His Met Asp Ala Asn Lys Ala Gly

85 90 95

Arg Tyr Gln Cys Gln Tyr Arg Ile Gly His Tyr Arg Phe Arg Tyr Ser

100 105 110

Asp Thr Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Leu Tyr Gly Lys Pro Phe Leu

115 120 125

Ser Ala Asp Arg Gly Leu Val Leu Met Pro Gly Glu Asn Ile Ser Leu

130 135 140

Thr Cys Ser Ser Ala His Ile Pro Phe Asp Arg Phe Ser Leu Ala Lys

145 150 155 160

Glu Gly Glu Leu Ser Leu Pro Gln His Gln Ser Gly Glu His Pro Ala

165 170 175

Asn Phe Ser Leu Gly Pro Val Asp Leu Asn Val Ser Gly Ile Tyr Arg

180 185 190

Cys Tyr Gly Trp Tyr Asn Arg Ser Pro Tyr Leu Trp Ser Phe Pro Ser

195 200 205

Asn Ala Leu Glu Leu Val Val Thr Asp Ser Ile His Gln Asp Tyr Thr

210 215 220

Thr Gln Asn Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp

225 230 235 240

Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

245

Claims (10)

1.功能蛋白在制备用于辅助诊断IgA肾病的产品中的应用；

所述功能蛋白为如下(a1)或(a2)：

(a1)CD89蛋白胞外区；

(a2)具有CD89蛋白胞外区的融合蛋白。

2.权利要求1中所述的功能蛋白和IgA抗体在制备用于辅助诊断IgA肾病的产品中的应用。

3.用于辅助诊断IgA肾病的酶联免疫试剂盒，含有包被有权利要求1中所述功能蛋白的酶标板。

4.如权利要求3所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括HRP标记的IgA抗体。

5.如权利要求3或4所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有如下中的至少一种：IgA标准品、洗涤液、显色底物和终止液。

6.如权利要求3至5任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括记载有诊断方法的可读性载体；

所述诊断方法如下：取待测患者血浆和健康对照血浆，采用以上任一所述的试剂盒进行ELISA检测，根据检测结果判断待测患者是否患有IgA肾病；

所述ELISA检测及结果判断包括如下步骤：(1)取包被有权利要求1中所述功能蛋白的酶标板，加入待测血浆进行孵育；(2)完成步骤(1)后，采用洗涤液洗板后加入HRP标记的IgA抗体进行孵育；(3)完成步骤(2)后，进行显色、终止和读值；(4)采用不同浓度的IgA标准品进行步骤(1)-(3)进行操作，制作标准曲线；(5)根据步骤(4)制作的标准曲线，计算得到待测血浆中可与权利要求1中所述功能蛋白结合的IgA水平；(6)比较待测患者与健康对照血浆中可与权利要求1中所述功能蛋白结合的IgA水平；如果待测患者血浆中所述IgA水平大于健康对照血浆中所述IgA水平的第90个百分位点，待测患者或疑似患有IgA肾病。

7.权利要求1中所述的功能蛋白和记载有权利要求6中所述诊断方法的可读性载体在制备用于辅助诊断IgA肾病的产品中的应用。

8.用于辅助诊断IgA肾病的系统，包括权利要求3至5任一所述的试剂盒和酶标仪。

9.如权利要求1至8任一所述应用或试剂盒或系统，其特征在于：

所述CD89蛋白胞外区为如下(1)或(2)：

(1)序列表的序列2自N端第22-227位所示的蛋白质；

(2)将(2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质。

10.可与权利要求1中所述功能蛋白结合的IgA作为标志物在制备用于辅助诊断IgA肾病的产品中的应用。

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