CN113755443A - 自身免疫性脑炎抗体瞬转与稳转检测方法及其应用 - Google Patents

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CN113755443A CN202010505708.8A CN202010505708A CN113755443A CN 113755443 A CN113755443 A CN 113755443A CN 202010505708 A CN202010505708 A CN 202010505708A CN 113755443 A CN113755443 A CN 113755443A
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Abstract

本发明提供了自身免疫性脑炎抗体瞬转与稳转检测方法及其应用。具体地，本发明提供了一种表达突变型NMDAR的重组细胞，所述重组细胞表达外源的突变型NMDAR和荧光蛋白的融合蛋白，且转染成活率高。本发明的重组细胞可用于检测自身免疫性脑炎相关的抗体，包括NMDAR、AMPAR1、AMPAR2、LGI1、Caspr2、GABABR。本发明还提供了基于本发明的重组的转染细胞系，利用转染细胞系通过间接免疫荧光法来检测抗自身免疫性脑炎方法。本发明的方法具有高敏感性和特异性，可以精确检测致病抗体种类，以便帮助患者实施针对性免疫治疗，恢复健康。

Description

自身免疫性脑炎抗体瞬转与稳转检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及医学领域，具体地涉及自身免疫性脑炎抗体瞬转与稳转检测方法及其应用。
背景技术
自身免疫性脑炎(Autoimmune encephalitis,AE)是近10余年来新进被认识的一类中枢神经系统自身免疫性疾病，其特点是患者体内存在抗神经元表面蛋白、离子通道和受体的自身抗体，这些自身抗体被认为具有致病性，可以成为疾病诊断的标志物。AE患者常表现出精神行为异常、癫痫发作、记忆障碍、认知异常、运动异常、自主神经功能紊乱、意识下降等严重的临床症状，但早期的免疫治疗可取得很好的疗效与疾病转归。一般而言，常见的介导AE的特异性自身抗体有NMDAR、AMPAR1、AMPAR2、LGI1、Caspr2、GABABR六种，并且不同抗体介导的AE患者与伴发肿瘤及预后均有较大差异。因此，及时准确检测相关自身抗体对AE早期诊治具有极其重要的意义。
2005年，在4例年轻女性卵巢畸胎瘤患者中首次发现了记忆缺失、精神症状、意识水平下降及通气不足的一组症状[1]。很快在这些患者以及其他几例类似神经系统症状的患者中检测出一种N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)的特异性抗体。此后，陆续报道的病例中有很多是儿童或青年男性患者，可伴或不伴肿瘤。此病被命名为抗NMDAR脑炎(Anti-NMDAR encephalitis)。
研究表明，自身免疫性脑炎抗体是造成自身免疫性脑炎的病因之一，然而，本领域尚缺乏敏感性和特异性均高的AE自身抗体的检测方法。
虽然尝试开发基于AE自身抗体-NMDAR之间的相互作用来进行检测的方法，但是重组表达和纯化的NMDAR构象与天然状态下的NMDAR构象存在差异，导致灵敏度和特异性较差。
另一种检测方法是基于活细胞分析(Cell-based Assay,CBA)，一种代表性的方法是间接免疫荧光法。在该方法中，一般通过重组转染细胞系表达NMDAR亚基(NR1和NR2A)，然后通过间接免疫荧光法来检测抗NMDAR抗体，具有一定的敏感性。然而，该方法还存在缺点，例如NMDAR亚基(NR1和NR2A)会导致细胞大量死亡，导致测量不够准确，且重复性差。
因此，本领域迫切需要开发新的高敏感性和高特异性AE自身抗体的检测方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高敏感性和高特异性的AE自身抗体的检测方法。
本发明的另一目的是提供了一种基于本发明的重组的转染细胞系，利用转染细胞系通过间接免疫荧光法来检测抗自身免疫性脑炎方法。
在本发明的第一方面，提供了一种制备重组细胞的方法，所述方法包括步骤：
(a)提供待转染的细胞以及用于转染的第一质粒和第二质粒；其中，所述的细胞为待转染的细胞为肾细胞，
所述的第一质粒含有第一表达盒，所述第一表达盒用于表达式I所示的融合蛋白P0，
Z1-Z2 (I)
式中，
Z1为突变型NMDAR亚基NR1，所述突变型NMDAR亚基NR1的序列如SEQ ID No:2所示；
Z2为GFP蛋白元件；
所述的第二质粒含有第二表达盒，所述的第二表达盒用于表达NMDAR亚基NR2A；
(b)将所述的第一质粒和第二质粒转入所述的待转染的细胞，从而获得所述的重组细胞C0，其中所述的重组细胞C0表达重组的NMDAR蛋白。
(c)检测步骤(b)所获得的重组细胞的存活情况。
在另一优选例中，所述的重组的NMDAR蛋白由式I所示的融合蛋白P0和NMDAR亚基NR2A构成。
在另一优选例中，所述的第一质粒和第二质粒为同一质粒或不同的质粒。
在另一优选例中，所述方法还包括：
在另一优选例中，所述的待转染的细胞为人肾细胞。
在另一优选例中，所述的待转染的细胞为HEK-293细胞。
在本发明的第二方面，提供了一种重组细胞(即重组细胞C0)，所述的重组细胞是用第一方面所述的方法制备的。
在另一优选例中，所述的重组细胞表达NMDAR突变蛋白，所述NMDAR突变蛋白由NR1亚基和NR2A亚基构成，其中，NR1亚基为突变型亚基，且NR1亚基的第815位氨基酸由野生型的甘氨酸突变为精氨酸。(注：其中所述815位氨基酸位于NMDAR跨膜区M4段)。
在另一优选例中，所述的NR1亚基以式I所示的融合蛋白形式存在。
在另一优选例中，所述的重组细胞表达NMDAR突变蛋白，并且所述的NMDAR突变蛋白以膜蛋白形式存在于重组细胞的细胞膜上。
在另一优选例中，所述的突变型NMDAR突变蛋白以跨膜蛋白形式存在于所述重组细胞的细胞膜上。
在另一优选例中，所述重组细胞在转染后12-24小时，细胞存活率≥50％，较佳地为50％-85％，更佳地60％-75％。
在另一优选例中，所述的转染指用所述的第一质粒和第二质粒进行转染。
在本发明的第三方面，提供一种本发明第二方面所述的重组细胞或用于制备所述的重组细胞的转染试剂的用途，它被用于制备检测自身免疫性脑炎的检测试剂或试剂盒。
在另一优选例中，所述的试剂盒含有：(Y0)本发明第二方面所述的重组细胞C0,或用于制备所述重组细胞C0的转染试剂。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括一使用说明书，所述使用说明书描述了检测样本中是否存在抗NMDAR蛋白的抗体的使用方法。
在另一优选例中，所述的试剂盒，还含有选自下组的额外试剂：
(Y1)用于表达AMPAR1蛋白的重组细胞C1,或用于制备所述重组细胞C1的转染试剂；
(Y2)用于表达AMPAR2蛋白的重组细胞C2，或用于制备所述重组细胞C2的转染试剂；
(Y3)用于表达LGI1蛋白的重组细胞C3，或用于制备所述重组细胞C3的转染试剂；
(Y4)用于表达Caspr2蛋白的重组细胞C4，或用于制备所述重组细胞C4的转染试剂；
(Y5)用于表达GABABR蛋白的重组细胞C5，或用于制备所述重组细胞C5的转染试剂；
(Y6)所述Y1～Y5的任意组合。
在另一优选例中，所述的重组细胞C0、C1、C2、C3、C4和C5为同一细胞或不同的细胞。
在另一优选例中，所述的试剂，所述重组细胞C1表达AMPAR1蛋白与GFP绿色荧光蛋白的融合蛋白P1；
所述重组细胞C2表达AMPAR2蛋白与GFP绿色荧光蛋白的融合蛋白P2；
所述重组细胞C3表达LGI1蛋白与GFP绿色荧光蛋白的融合蛋白P3；
所述重组细胞C4表达Caspr2蛋白与GFP绿色荧光蛋白的融合蛋白P4；
所述重组细胞C5表达GABABR蛋白与GFP绿色荧光蛋白的融合蛋白P5。
在本发明的第四方面，提供了一种检测试剂盒，所述的试剂盒含有：
(a)本发明第二方面所述的重组细胞C0,或用于制备所述重组细胞C0的转染试剂；
(b)针对抗NMDAR蛋白的抗体的二抗。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有选自下组的额外试剂：
(Y1)用于表达AMPAR1蛋白的重组细胞C1,或用于制备所述重组细胞C1的转染试剂；
(Y2)用于表达AMPAR2蛋白的重组细胞C2，或用于制备所述重组细胞C2的转染试剂；
(Y3)用于表达LGI1蛋白的重组细胞C3，或用于制备所述重组细胞C3的转染试剂；
(Y4)用于表达Caspr2蛋白的重组细胞C4，或用于制备所述重组细胞C4的转染试剂；
(Y5)用于表达GABABR蛋白的重组细胞C5，或用于制备所述重组细胞C5的转染试剂；
(Y6)所述Y1～Y5的任意组合。
在本发明的第五方面，提供了一种检测样本中是否存在抗NMDAR蛋白的抗体的方法，包括步骤：
(a)提供本发明第二方面所述的重组细胞，即重组细胞C0；
(b)将所述的重组细胞C0与待测样本混合，从而获得第一混合物，从而重组细胞C0与抗NMDAR蛋白的抗体发生结合，从而形成“重组细胞C0-抗NMDAR蛋白的抗体”第一复合物；
(c)对所述第一混合物进行洗涤，获得经洗涤的“重组细胞C0-抗NMDAR蛋白的抗体”第一复合物；
(d)将经洗涤的“重组细胞C0-抗NMDAR蛋白的抗体”第一复合物与二抗进行混合，从而形成“重组细胞C0-抗NMDAR蛋白的抗体－二抗”第二复合物；和
(e)检测“重组细胞C0-抗NMDAR蛋白的抗体－二抗”第二复合物的存在与否和/或数量，从而获得抗NMDAR蛋白的抗体的检测结果。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。
在另一优选例中，所述的方法是体外方法。
在另一优选例中，在步骤(e)中，包括检测荧光和/或生色团。
在另一优选例中，所述的二抗是具有可检测标记(detectable label)的二抗。
在另一优选例中，所述的可检测标记包括显色酶。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了转染表达野生型NMDAR及突变型NMDAR的HEK293细胞。其中图A为转染野生型GRIN1质粒+GRIN2A质粒；图B：转染pCDNA3.1-GRIN1-815R-GFP质粒+GRIN2A质粒。
图2显示了转染表达野生型NMDAR及突变型NMDAR的HEK293细胞死亡率。其中，N1/2A组：转染野生型GRIN1质粒+GRIN2A质粒；N1-815R组：转染pCDNA3.1-GRIN1-815R-GFP质粒(用于表达式I所示的融合蛋白)+GRIN2A质粒；n＝5，P<0.05。
图3显示了pCDNA3.1-GRIN1-815R-GFP质粒的结构。
图4显示了pCDNA3.1-GRIN2A质粒的结构。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种高特异性和高灵敏度的用于检测抗NMDAR蛋白的抗体的方法。本发明方法采用表达具有特定结构的式I所示的融合蛋白P0的重组细胞。实验表明，用本发明特定转染试剂所制备的本发明的重组细胞，不仅可高效表达含NMDAR的融合蛋白P0，而且可以出乎意料地降低在非神经细胞中表达外源NMDAR所导致的细胞毒性(如转染毒性)和细胞死亡，从而使得基于重组细胞进行的免疫荧光法可以更特异性、更灵敏度和更准确地检测抗NMDAR蛋白的抗体。此外，本发明的重组细胞还可进一步与其他自身免疫性脑炎特异性抗体(如AMPAR1、AMPAR2、LGI1、Caspr2、GABABR抗体)的检测试剂和方法联用，从而更全面地更准确地提供自身免疫性脑炎抗体的检测结果。在此基础上完成了本发明。
在一优选例中，本发明提供了一种通过重组转染细胞系表达自身免疫性脑炎特异性抗体(NMDAR、AMPAR1、AMPAR2、LGI1、Caspr2、GABABR抗体)，然后通过间接免疫荧光法来检测抗AE特异性抗体，从而精确检测AE。
优选地，本发明提供一种将编码SEQ ID No:2所示的NMDAR的亚基的cDNA,转染细胞，获得重组细胞。然后通过间接免疫荧光法来检测抗NMDAR抗体的方法来检测自身免疫性脑炎。
术语
如本文所用，“本发明的方法”、“本发明的检测方法”、“本发明的转染然细胞系检测方法”可以互换使用，均是指用转染的细胞系通过间接荧光免疫法检测自身免疫性脑炎的方法。
NMDAR
NMDAR，是N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)，是一种离子型谷氨酸受体，是一种常见的AE特异性自身抗原。抗NMDAR型AE临床多表现为认知障碍、语言障碍、癫痫发作、运动障碍、异动症或肌强直/异常姿势、自主神经功能障碍或中枢性通气不足等。
野生型的人GRIN1序列如SEQ ID No:1所示：
atgagcaccatgcgcctgctgacgctcgccctgctgttctcctgctccgtcgcccgtgccgcgtgcgaccccaagatcgtcaacattggcgcggtgctgagcacgcggaagcacgagcagatgttccgcgaggccgtgaaccaggccaacaagcggcacggctcctggaagattcagctcaatgccacctccgtcacgcacaagcccaacgccatccagatggctctgtcggtgtgcgaggacctcatctccagccaggtctacgccatcctagttagccatccacctacccccaacgaccacttcactcccacccctgtctcctacacagccggcttctaccgcatacccgtgctggggctgaccacccgcatgtccatctactcggacaagagcatccacctgagcttcctgcgcaccgtgccgccctactcccaccagtccagcgtgtggtttgagatgatgcgtgtctacagctggaaccacatcatcctgctggtcagcgacgaccacgagggccgggcggctcagaaacgcctggagacgctgctggaggagcgtgagtccaaggcagagaaggtgctgcagtttgacccagggaccaagaacgtgacggccctgctgatggaggcgaaagagctggaggcccgggtcatcatcctttctgccagcgaggacgatgctgccactgtataccgcgcagccgcgatgctgaacatgacgggctccgggtacgtgtggctggtcggcgagcgcgagatctcggggaacgccctgcgctacgccccagacggcatcctcgggctgcagctcatcaacggcaagaacgagtcggcccacatcagcgacgccgtgggcgtggtggcccaggccgtgcacgagctcctcgagaaggagaacatcaccgacccgccgcggggctgcgtgggcaacaccaacatctggaagaccgggccgctcttcaagagagtgctgatgtcttccaagtatgcggatggggtgactggtcgcgtggagttcaatgaggatggggaccggaagttcgccaactacagcatcatgaacctgcagaaccgcaagctggtgcaagtgggcatctacaatggcacccacgtcatccctaatgacaggaagatcatctggccaggcggagagacagagaagcctcgagggtaccagatgtccaccagactgaagattgtgacgatccaccaggagcccttcgtgtacgtcaagcccacgctgagtgatgggacatgcaaggaggagttcacagtcaacggcgacccagtcaagaaggtgatctgcaccgggcccaacgacacgtcgccgggcagcccccgccacacggtgcctcagtgttgctacggcttttgcatcgacctgctcatcaagctggcacggaccatgaacttcacctacgaggtgcacctggtggcagatggcaagttcggcacacaggagcgggtgaacaacagcaacaagaaggagtggaatgggatgatgggcgagctgctcagcgggcaggcagacatgatcgtggcgccgctaaccataaacaacgagcgcgcgcagtacatcgagttttccaagcccttcaagtaccagggcctgactattctggtcaagaaggagattccccggagcacgctggactcgttcatgcagccgttccagagcacactgtggctgctggtggggctgtcggtgcacgtggtggccgtgatgctgtacctgctggaccgcttcagccccttcggccggttcaaggtgaacagcgaggaggaggaggaggacgcactgaccctgtcctcggccatgtggttctcctggggcgtcctgctcaactccggcatcggggaaggcgcccccagaagcttctcagcgcgcatcctgggcatggtgtgggccggctttgccatgatcatcgtggcctcctacaccgccaacctggcggccttcctggtgctggaccggccggaggagcgcatcacgggcatcaacgaccctcggctgaggaacccctcggacaagtttatctacgccacggtgaagcagagctccgtggatatctacttccggcgccaggtggagctgagcaccatgtaccggcatatggagaagcacaactacgagagtgcggcggaggccatccaggccgtgagagacaacaagctgcatgccttcatctgggactcggcggtgctggagttcgaggcctcgcagaagtgcgacctggtgacgactggagagctgtttttccgctcgggcttcggcataggcatgcgcaaagacagcccctggaagcagaacgtctccctgtccatcctcaagtcccacgagaatggcttcatggaagacctggacaagacgtgggttcggtatcaggaatgtgactcgcgcagcaacgcccctgcgacccttacttttgagaacatggccggggtcttcatgctggtagctgggggcatcgtggccgggatcttcctgattttcatcgagattgcctacaagcggcacaaggatgctcgccggaagcagatgcagctggcctttgccgccgttaacgtgtggcggaagaacctgcaggatagaaagagtggtagagcagagcctgaccctaaaaagaaagccacatttagggctatcacctccaccctggcttccagcttcaagaggcgtaggtcctccaaagacacgcagtaccatcccactgatatcacgggcccgctcaacctctcagatccctcggtcagcaccgtggtgtga(SEQ ID NO：1)。
在本发明中，突变型的GRIN1的基因序列如SEQ ID NO.：2所示：
atgagcaccatgcgcctgctgacgctcgccctgctgttctcctgctccgtcgcccgtgccgcgtgcgaccccaagatcgtcaacattggcgcggtgctgagcacgcggaagcacgagcagatgttccgcgaggccgtgaaccaggccaacaagcggcacggctcctggaagattcagctcaatgccacctccgtcacgcacaagcccaacgccatccagatggctctgtcggtgtgcgaggacctcatctccagccaggtctacgccatcctagttagccatccacctacccccaacgaccacttcactcccacccctgtctcctacacagccggcttctaccgcatacccgtgctggggctgaccacccgcatgtccatctactcggacaagagcatccacctgagcttcctgcgcaccgtgccgccctactcccaccagtccagcgtgtggtttgagatgatgcgtgtctacagctggaaccacatcatcctgctggtcagcgacgaccacgagggccgggcggctcagaaacgcctggagacgctgctggaggagcgtgagtccaaggcagagaaggtgctgcagtttgacccagggaccaagaacgtgacggccctgctgatggaggcgaaagagctggaggcccgggtcatcatcctttctgccagcgaggacgatgctgccactgtataccgcgcagccgcgatgctgaacatgacgggctccgggtacgtgtggctggtcggcgagcgcgagatctcggggaacgccctgcgctacgccccagacggcatcctcgggctgcagctcatcaacggcaagaacgagtcggcccacatcagcgacgccgtgggcgtggtggcccaggccgtgcacgagctcctcgagaaggagaacatcaccgacccgccgcggggctgcgtgggcaacaccaacatctggaagaccgggccgctcttcaagagagtgctgatgtcttccaagtatgcggatggggtgactggtcgcgtggagttcaatgaggatggggaccggaagttcgccaactacagcatcatgaacctgcagaaccgcaagctggtgcaagtgggcatctacaatggcacccacgtcatccctaatgacaggaagatcatctggccaggcggagagacagagaagcctcgagggtaccagatgtccaccagactgaagattgtgacgatccaccaggagcccttcgtgtacgtcaagcccacgctgagtgatgggacatgcaaggaggagttcacagtcaacggcgacccagtcaagaaggtgatctgcaccgggcccaacgacacgtcgccgggcagcccccgccacacggtgcctcagtgttgctacggcttttgcatcgacctgctcatcaagctggcacggaccatgaacttcacctacgaggtgcacctggtggcagatggcaagttcggcacacaggagcgggtgaacaacagcaacaagaaggagtggaatgggatgatgggcgagctgctcagcgggcaggcagacatgatcgtggcgccgctaaccataaacaacgagcgcgcgcagtacatcgagttttccaagcccttcaagtaccagggcctgactattctggtcaagaaggagattccccggagcacgctggactcgttcatgcagccgttccagagcacactgtggctgctggtggggctgtcggtgcacgtggtggccgtgatgctgtacctgctggaccgcttcagccccttcggccggttcaaggtgaacagcgaggaggaggaggaggacgcactgaccctgtcctcggccatgtggttctcctggggcgtcctgctcaactccggcatcggggaaggcgcccccagaagcttctcagcgcgcatcctgggcatggtgtgggccggctttgccatgatcatcgtggcctcctacaccgccaacctggcggccttcctggtgctggaccggccggaggagcgcatcacgggcatcaacgaccctcggctgaggaacccctcggacaagtttatctacgccacggtgaagcagagctccgtggatatctacttccggcgccaggtggagctgagcaccatgtaccggcatatggagaagcacaactacgagagtgcggcggaggccatccaggccgtgagagacaacaagctgcatgccttcatctgggactcggcggtgctggagttcgaggcctcgcagaagtgcgacctggtgacgactggagagctgtttttccgctcgggcttcggcataggcatgcgcaaagacagcccctggaagcagaacgtctccctgtccatcctcaagtcccacgagaatggcttcatggaagacctggacaagacgtgggttcggtatcaggaatgtgactcgcgcagcaacgcccctgcgacccttacttttgagaacatggcccgggtcttcatgctggtagctgggggcatcgtggccgggatcttcctgattttcatcgagattgcctacaagcggcacaaggatgctcgccggaagcagatgcagctggcctttgccgccgttaacgtgtggcggaagaacctgcaggatagaaagagtggtagagcagagcctgaccctaaaaagaaagccacatttagggctatcacctccaccctggcttccagcttcaagaggcgtaggtcctccaaagacacgcagtaccatcccactgatatcacgggcccgctcaacctctcagatccctcggtcagcaccgtggtgtga(SEQ ID NO.：2)
AMPAR
AMPAR是α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙受体，是一种离子型谷氨酸受体，是一种AE特异性自身抗原。AMPAR1、AMPAR2是不同组成方式的AMPAR，抗AMPAR型AE好发于女性,可有典型的边缘性脑炎表现,包括亚急性意识障碍、抑郁、易激惹、近记忆缺失和颞叶内侧功能障碍性癫痫发作等。
LGI1
LGI1是富亮氨酸胶质瘤失活1蛋白(leucin-rich glioma-inactivated1protein)，是一种常见的AE特异性自身抗原。抗LGI1型AE临床多表现为多种形式的癫痫发作、典型的面-臂肌张力障碍样发作、顽固性低钠血症、自主神经功能异常等。头颅MRI提示颞叶受累明显。
Caspr2
Caspr2是接触蛋白相关蛋白-2(contactin associated protein-like 2)，是一种AE特异性自身抗体。抗Caspr2型AE临床可表现为边缘系统脑炎、Morvan综合征和神经性肌强直等。
GABABR
GABABR是Y-氨基丁酸B型受体(gamma aminobutyricacid receptor type B)，属于C族G蛋白偶联受体。是一种常见的AE特异性自身抗原。抗GABABR型AE，癫痫发作常常作为首发及疾病过程中的突出症状，大部分患者在病程中出现以精神行为异常、记忆障碍、癫痫发作为特征的边缘系统脑炎。
质粒
质粒是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体(或拟核)以外的DNA分子，存在于细胞质中(但酵母除外，酵母的2μm质粒存在于细胞核中)，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，是闭合环状的双链DNA分子。质粒不是细菌生长繁殖所必需的物质，可自行丢失或人工处理而消除，如高温、紫外线等。质粒携带的遗传信息能赋予宿主菌某些生物学性状，有利于细菌在特定的环境条件下生存。
与细菌基因组相同，质粒也属于环形双链DNA，因此常在用于DNA重组技术中的载体。载体是指把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进受体细胞中去进行增殖和表达的工具。将某种目标基因片段重组到质粒中，构成重组基因或重组体。然后将这种重组体经微生物学的转化技术，转入受体细胞(如大肠杆菌)中，使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达，从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。
可用于本发明的作为目的转染基因载体的质粒，可用常规方法构建或基于现有的质粒进行改造。例如，可采用市售的质粒进行改造：NMDAR基因载体质粒：野生型GRIN1质粒(货号：P6908，公司：淼灵质粒平台)+GRIN2A质粒(货号：P8212，公司：淼灵质粒平台)。
本发明的一种优选的含有815位基因突变的NMDAR基因载体质粒为pCDNA3.1-GRIN1-815R-GFP质粒+GRIN2A质粒(货号：P8212，公司：淼灵质粒平台)，其中，将购买来的人源野生型pcDNA 3.1-GRIN1质粒(货号：P6908，公司：淼灵质粒平台)通过基因编辑引入核苷酸突变，使编码蛋白的第815位氨基酸由甘氨酸突变为精氨酸，并再在质粒上接入GFP标签(融合表达绿色荧光蛋白)，以获得质粒pCDNA3.1-GRIN1-815R-GFP。
pCDNA3.1-GRIN1-815R-GFP的结构如图3所示，其一些基本信息如下：
基因名称：GRIN1
物种：人
基因大小：2769bp
基因信息：XM_005266071.3
编辑信息：815位氨基酸由甘氨酸突变为精氨酸
TAG：GFP(羧基末端)
克隆位点(5')：BamHI
克隆位点(3')：EcoRI
载体名称：pCDNA3.1
载体类型：哺乳动物表达
载体大小：5417bp
真核抗性：新霉素、G418
原核抗性：氨苄青霉素
克隆菌株：DH5α
生长温度：37℃。
pCDNA3.1-GRIN2A的结构如图4所示，其一些基本信息如下：
基因名称：GRIN2A
物种：人
基因大小：3846bp
基因信息：NM_001134408.2
编辑信息：无
TAG：无
克隆位点(5')：BamHI
克隆位点(3')：EcoRI
载体名称：pCDNA3.1
载体类型：哺乳动物表达
载体大小：5417bp
真核抗性：新霉素、G418
原核抗性：氨苄青霉素
克隆菌株：DH5α
生长温度：37℃
本发明检测方法
本发明提供一种自身免疫性脑炎的检测方法，包括步骤：
(a)提供待转染的细胞(如HEK-293细胞)和含目的基因的质粒(即第一质粒和第二质粒)；
(b)配制含有所述质粒的转染体系，将所述待转染的细胞(如HEK-293细胞)加入96孔板中，用所述转染体系转染，培育时间t0后换液,从而得到转染后的细胞系；
(c)将转染后的细胞依次与待测样本、二抗共孵育，得到转染细胞-样本抗体-二抗的混合物，其中所述二抗是显色酶标记的可结合于待测样本抗体的特异性二抗。
在另一优选例中，所述HEK-293细胞从液氮中取出，复苏后传代培养。
在另一优选例中，所述传代培养待细胞密度长至70％左右时进行。
在另一优选例中，所述传代培养接种在6块96孔板上进行。
在另一优选例中，所述96孔板密度为3-5万个细胞/孔。
在另一优选例中，所述传代培养在37℃细胞培养箱中过夜。
在另一优选例中，所述转染体系为含有质粒、DMEM培液、PEI试剂的混合物；
其中所述转染体系含有DMEM培液5-15μL,较佳地7-12μL，更佳地10μL；
含有质粒0.01-1μg,0.05-2μg，更佳地0.1μg；
含有PET试剂0.03-3μL,0.1-1μL，0.3μL；
在另一优选例中，所述t0为5-10小时，较佳地6-9小时，更佳地8小时。
在另一优选例中，所述显色酶为红色荧光蛋白酶。。
在另一优选例中，所述二抗为抗人IgG二抗。
本发明的优点包括：
(a)本发明的稳定转染细胞的方法可以作为AE中自身抗体检测的细胞基质，且具有操作更加简单、稳定性更好的特点，值得推广。
(b)本发明首次意外地发现，使815位氨基酸由甘氨酸突变为精氨酸得到的突变蛋白，可显著减少用编码NMDA受体亚基的cDNA转染时对待转染细胞(如HEK293细胞)造成的细胞毒性，使得转染后细胞的死亡率显著下降(相对下降幅度约30％)，从而有助于提高检测效率和准确性。
(c)本发明方法可以在抗NMDAR阳性的基础上，配合其他检测试剂，可进一步成功检测出抗AMPAR脑炎、抗LGI1脑炎、抗Caspr2脑炎、抗GABABR脑炎的特异性自身抗体。因此，本发明方法的检测效率高，且可以明确诊断出致病病因，从而制定针对病因有效的治疗方案，帮助病人快速恢复健康。
(d)本发明的方法具有高敏感性和高特异性，可以精确检测致病抗体种类，帮助病患对症下药，恢复健康。
(e)本发明的检测方法中使用的转染细胞系可以是瞬时转染的细胞系也可以是稳定转染的细胞系，两者都具有转染成活率高、检测结果精确的特点。
(f)本发明的检测方法具有重复性高、效率高的特点。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如,Sambrook等著.分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
通用方法
活细胞转染方法
该分用于制备可用于人血清和(或)脑脊液抗NMDAR抗体检测的活细胞转染体系，包括以下步骤：
(1)从液氮中取出HEK-293细胞(来自中国科学院细胞库)，复苏、传代培养；
(2)传代、种板：待细胞密度长至70％左右时进行传代，种6块96孔板(种板密度：3-5万个细胞/孔)；至于37℃细胞培养箱培养，过夜；
(3)转染：
1)转染体系的配制：每孔：10μL DMEM培液(货号：12660012公司：GIBCO)+0.1μg质粒+0.3μL PEI试剂；
2)6块96孔板分别转染含目的基因的质粒：pCDNA3.1-GRIN1-815R-GFP(融合表达绿色荧光蛋白)和pCDNA3.1-GRIN2A；
(4)8小时后换液；
(5)待细胞转染效率达40％以上时可用于检测。
实施例1基于瞬时转染细胞的AE中自身抗体检测方法的建立
1.1分组转染HEK293细胞：
(1)N1/2A组：野生型GRIN1质粒(货号：P6908，公司：淼灵质粒平台)+GRIN2A质粒(货号：P8212，公司：淼灵质粒平台)。
(2)N1-815R/2A组：pCDNA3.1-GRIN1-815R-GFP质粒+GRIN2A质粒(货号：P8212，公司：淼灵质粒平台)。其中，将购买的人源野生型pcDNA 3.1-GRIN1质粒(货号：P6908，公司：淼灵质粒平台)，进行基因编辑，引入核苷酸突变，使815位氨基酸由甘氨酸突变为精氨酸，再在质粒上接入GFP标签(融合表达绿色荧光蛋白)，以获得质粒pCDNA3.1-GRIN1-815R-GFP。
(3)空白对照；
35毫米细胞培养孔4微克总DNA用于转染细胞。在用NR构建物转染的细胞中，使用等量的NR(各2ng)。细胞在37℃的3％CO2中培养24小时，在PBS中洗涤，在37℃的新鲜培养基中培养24小时，在5％的条件下再培养24小时。
1.2细胞死亡的测量
用细胞刮刀将细胞从培养皿中取出，用贝克曼(Beckman)台式离心机在4℃条件下以1000g的速度离心。用100～1PBS和100/d台盼蓝(0.4％)重悬细胞。细胞浓度为200-300个/0.1mm3。
活细胞数量在血球计数板中以盲法计数。每个条件下活细胞(即，台盼蓝除外细胞)的数量除以转染对照孔中活细胞的数量,获得细胞死亡百分比，计算公式如下：
细胞死亡百分比(％)＝(1-(每个条件下活细胞数量/转染对照孔中活细胞的数量))×100％。
1.3 NMDA受体亚基cDNA转染HEK293细胞后的细胞毒性
用通过编码NMDA受体亚基的cDNA转染HEK293细胞，观察对细胞造成的细胞毒性。
1.4结果
如图1所示，在N1-815R/2A组(转染pCDNA3.1-GRIN1-815R-GFP质粒+GRIN2A质粒)，大多数细胞存活良好(图1B)，而N1/2A组(野生型GRIN1质粒+GRIN2A质粒)细胞死亡较多(图1A)。
如图2所示，N1-815R/2A组的细胞死亡率为53.58±8.75％；而N1/2A组的细胞死亡率为：38.00±9.70％。
上述结果表明，GRIN1-815R即使815位氨基酸由甘氨酸突变为精氨酸得编码方式可显著减少编码NMDA受体亚基的cDNA转染对HEK293细胞造成的细胞毒性，使得转染后细胞的死亡率相对下降幅度约为29％((53.58-38.00)/53.58＝29.1％)。
实施例2：基于瞬时转染细胞的AE中自身抗体检测方法的建立
本实施例的目的：建立一个高效可靠的基于瞬时转染的HEK293细胞的间接免疫荧光法进行AE中常见自身抗体检测的系统。方法如下：
利用已有的商业化cDNA文库获取常见6种自身抗体(NMDAR、AMPAR1、AMPAR2、LGI1、Caspr2、GABABR)对应的目的基因。将NMDAR(GluN1蛋白)第815位氨基酸由甘氨酸突变为精氨酸,LGI1融合表达Caspr2跨膜区，其他自身抗体蛋白的基因保持不变。然后编辑这些自身抗体的cDNA，使得它们融合表达绿色荧光蛋白的基因片段(分组转染)。
将HEK293接种于96孔板中，通过PEI法对HEK293细胞进行分组转染，使HEK293细胞分别表达上述6种改造后的自身抗原。
96孔板每孔可进行1份标本的检测，检测时，将转染后的HEK293细胞依次与待测标本及荧光素标记抗人IgG二抗孵育。
结果判读时，绿色荧光标记自身抗原在细胞膜表面表达，红色荧光为荧光素标记抗人IgG二抗产生，用于标记自身抗体，若红色荧光与绿色荧光重合，则该份标本定义为抗体检测阳性，滴度判读时，将血清和脑脊液以固定倍数稀释，根据红色荧光强度判定滴度水平为+、++、+++、++++。
选择102份标本进行抗NMDAR抗体检测，并与欧蒙公司抗谷氨酸受体抗体检测试剂盒进行对比。对于筛选出的抗NMDAR脑炎阳性标本，再用同样的免疫荧光法进行抗AMPAR脑炎、抗LGI1脑炎、抗Caspr2脑炎、抗GABABR脑炎抗体检测方。
结果：
GluN1第815位氨基酸突变后所获得的突变型NMDAR亚基pCDNA3.1-GRIN1-815R，可以减少NMDAR对HEK293细胞毒性。
将编码自身抗原与绿色荧光蛋白融合蛋白基因转入HEK293细胞中，可见绿色荧光蛋白在HEK293细胞胞浆和细胞膜上表达。
根据红绿荧光共定位和红色荧光强度可以判读检测结果和抗体滴度。计算出抗NMDAR抗体检测灵敏度为92.9％，特异度为87.5％。
本方法可以在抗NMDAR阳性的基础上再成功检测出抗AMPAR脑炎、抗LGI1脑炎、抗Caspr2脑炎、抗GABABR脑炎的特异性自身抗体。这表明本发明的检测方法检测效率高，且可以清晰诊断出致病病因，从而对症下药，针对真正致病原因设计有效治疗方案，帮助病人快速恢复健康。
实施例3：基于稳定转染细胞的AE中自身抗体检测方法的探索
本实施例的目的：生产稳定转染细胞作为AE中自身抗体检测的细胞基质。
方法：
通过将PiggyBac转座系统中的两个反向重复序列构建至四环素诱导表达系统所需序列的两侧，得到进行四环素诱导表达的PiggyBac转座系统的工具质粒。将LGI1(融合表达绿色荧光蛋白)基因克隆至所得到的工具质粒中，转染细胞后依次加入0μg/ml、1μg/ml、2μg/ml多西环素验证四环素诱导表达系统。并利用不同浓度的嘌呤霉素和G418对HEK293进行筛选，确定6-8d内能使所有细胞死亡的最低浓度为筛选浓度。用嘌呤霉素和G418筛选2周，将细胞转移至96孔板进行单克隆的生产，得到的单克隆依次扩大培养，并加入多西环素验证克隆的正确性。选择10例利用瞬时转染细胞测得抗LGI1抗体阳性、2例阴性的标本，用已经稳定形成的稳定转染细胞进行抗LGI1抗体的检测，并对比结果。
结果
成功构建进行四环素诱导表达的PiggyBac转座系统的工具质粒，并将LGI1(融合表达绿色荧光蛋白)基因克隆至所得到的工具质粒中，转染细胞后依次加入0μg/ml、1μg/ml、2μg/ml多西环素，绿色荧光蛋白的表达量逐渐增加。确定确定6～8d内能使所有细胞死亡的最低抗生素浓度分别为嘌呤霉素0.9μg/ml，G418 600μg/ml。共得到9株稳定转染细胞。稳定转染细胞能检测出10例标本中的抗LGI1抗体，且结果与利用瞬时转染细胞检测结果符合。
上述结果表明，稳定转染细胞可以作为AE中自身抗体检测的细胞基质，且具有操作更加简单、稳定性更好的特点。
实施例4：抗GABABR脑炎患者中抗KCTD16抗体的检测
本实施例的目的：检测抗GABABR脑炎患者中的抗KCTD16抗体，并探索抗KCTD16抗体与合并肿瘤的相关性及抗体识别的抗原区域。
方法：
收集2015.8-2019.12期间由复旦大学附属华山医院诊治并随访的28例抗GABABR脑炎患者的临床资料。利用基于固定细胞法的间接免疫荧光法和免疫印迹法检测抗KCTD8、12、16抗体。并通过HEK293细胞转染表达KCTD12和KCTD16结构域替换蛋白，确定抗体识别的抗原结构域。
结果
共检出9例患者抗KCTD16抗体阳性，阳性率为32.1％。9例抗KCTD16抗体阳性患者中，8例(88.9％)患者合并肿瘤，其中4例患者有小细胞肺癌，3例患者高度怀疑有肿瘤，但病理不明，1例患者有贲门癌，1例患者经14个月随访未发现肿瘤，19例抗KCTD16阴性患者中，6例(31.6％)患者有肿瘤，其中4例患者有小细胞肺癌，2例患者有胸腺瘤，13例患者平均经15个月随访未发现肿瘤(P＝0.013)。所有患者抗KCTD16抗体均能识别两个或三个结构域，而并不存在选择性。
由此可见，抗KCTD16抗体可以存在于抗GABABR脑炎患者中，且与肿瘤合并相关。抗KCTD16抗体并无特定识别的抗原结构域，提示我们需要进一步研究此抗体的产生机制。
讨论
NMDAR(N-methyl-D-aspartate receptor)是中枢神经系统内一类重要的兴奋性氨基酸(excitatory amino acid,EAA)受体，属于离子型的谷氨酸受体。NMDAR在调节神经元的存活、参与突触信号传导及可塑性的形成等方面发挥重要作用。
NMDAR的过度激活可导致兴奋性中毒表现，可能为癫痫、痴呆、脑卒中的潜在发病机制；反之则可出现精神分裂症样症状。
NMDAR包括联接甘氨酸的NR1及联接谷氨酸的NR2(A、B、C、D)亚基(subunit)。由于NR1在脑内的分别更为广泛，更符合抗NMDAR脑炎临床损害的部位，实验研究也表明NR1为该疾病的致病亚基。
在抗NMDAR脑炎患者的血清与脑脊液(CSF)中有抗NR1亚基细胞外位点的自身抗体。抗NMDAR脑炎患者的IgG可识别GluN1亚基的细胞外N端结构域，而N端结构域可调节NMDAR离子通道功能，包裹通道的开放频率、失活率和变构调节等。因此，抗NMDAR脑炎临床可表现为精神症状、癫发作、意识障碍、口手运动障碍及自主神经功能障碍等。
目前可通过大鼠脑片海马组织、表面标记海马神经元的培养细胞或NR1/NR2转染人胚胎肾细胞(HEK)检测血清或脑脊液中是否存在抗NMDAR抗体。
本发明首次提供了具有高活力的用于检测抗NMDAR抗体的重组细胞，并提供了基于活细胞分析(Cell-based Assay,CBA)的间接免疫荧光法。本发明方法是一种简单有效的检测方法，通过重组转染细胞系表达NMDAR亚基(NR1和NR2A)检测抗NMDAR抗体，具有很高的敏感性和特异性。
本发明的研究表明，本发明的方法和检测试剂具有高敏感性和特异性，可以精确检测致病抗体种类，有助于疾病诊断和治疗。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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atgagcacca tgcgcctgct gacgctcgcc ctgctgttct cctgctccgt cgcccgtgcc 60
gcgtgcgacc ccaagatcgt caacattggc gcggtgctga gcacgcggaa gcacgagcag 120
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ctttctgcca gcgaggacga tgctgccact gtataccgcg cagccgcgat gctgaacatg 720
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atcagcgacg ccgtgggcgt ggtggcccag gccgtgcacg agctcctcga gaaggagaac 900
atcaccgacc cgccgcgggg ctgcgtgggc aacaccaaca tctggaagac cgggccgctc 960
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aatgaggatg gggaccggaa gttcgccaac tacagcatca tgaacctgca gaaccgcaag 1080
ctggtgcaag tgggcatcta caatggcacc cacgtcatcc ctaatgacag gaagatcatc 1140
tggccaggcg gagagacaga gaagcctcga gggtaccaga tgtccaccag actgaagatt 1200
gtgacgatcc accaggagcc cttcgtgtac gtcaagccca cgctgagtga tgggacatgc 1260
aaggaggagt tcacagtcaa cggcgaccca gtcaagaagg tgatctgcac cgggcccaac 1320
gacacgtcgc cgggcagccc ccgccacacg gtgcctcagt gttgctacgg cttttgcatc 1380
gacctgctca tcaagctggc acggaccatg aacttcacct acgaggtgca cctggtggca 1440
gatggcaagt tcggcacaca ggagcgggtg aacaacagca acaagaagga gtggaatggg 1500
atgatgggcg agctgctcag cgggcaggca gacatgatcg tggcgccgct aaccataaac 1560
aacgagcgcg cgcagtacat cgagttttcc aagcccttca agtaccaggg cctgactatt 1620
ctggtcaaga aggagattcc ccggagcacg ctggactcgt tcatgcagcc gttccagagc 1680
acactgtggc tgctggtggg gctgtcggtg cacgtggtgg ccgtgatgct gtacctgctg 1740
gaccgcttca gccccttcgg ccggttcaag gtgaacagcg aggaggagga ggaggacgca 1800
ctgaccctgt cctcggccat gtggttctcc tggggcgtcc tgctcaactc cggcatcggg 1860
gaaggcgccc ccagaagctt ctcagcgcgc atcctgggca tggtgtgggc cggctttgcc 1920
atgatcatcg tggcctccta caccgccaac ctggcggcct tcctggtgct ggaccggccg 1980
gaggagcgca tcacgggcat caacgaccct cggctgagga acccctcgga caagtttatc 2040
tacgccacgg tgaagcagag ctccgtggat atctacttcc ggcgccaggt ggagctgagc 2100
accatgtacc ggcatatgga gaagcacaac tacgagagtg cggcggaggc catccaggcc 2160
gtgagagaca acaagctgca tgccttcatc tgggactcgg cggtgctgga gttcgaggcc 2220
tcgcagaagt gcgacctggt gacgactgga gagctgtttt tccgctcggg cttcggcata 2280
ggcatgcgca aagacagccc ctggaagcag aacgtctccc tgtccatcct caagtcccac 2340
gagaatggct tcatggaaga cctggacaag acgtgggttc ggtatcagga atgtgactcg 2400
cgcagcaacg cccctgcgac ccttactttt gagaacatgg ccggggtctt catgctggta 2460
gctgggggca tcgtggccgg gatcttcctg attttcatcg agattgccta caagcggcac 2520
aaggatgctc gccggaagca gatgcagctg gcctttgccg ccgttaacgt gtggcggaag 2580
aacctgcagg atagaaagag tggtagagca gagcctgacc ctaaaaagaa agccacattt 2640
agggctatca cctccaccct ggcttccagc ttcaagaggc gtaggtcctc caaagacacg 2700
cagtaccatc ccactgatat cacgggcccg ctcaacctct cagatccctc ggtcagcacc 2760
gtggtgtga 2769
<210> 2
<211> 2769
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
atgagcacca tgcgcctgct gacgctcgcc ctgctgttct cctgctccgt cgcccgtgcc 60
gcgtgcgacc ccaagatcgt caacattggc gcggtgctga gcacgcggaa gcacgagcag 120
atgttccgcg aggccgtgaa ccaggccaac aagcggcacg gctcctggaa gattcagctc 180
aatgccacct ccgtcacgca caagcccaac gccatccaga tggctctgtc ggtgtgcgag 240
gacctcatct ccagccaggt ctacgccatc ctagttagcc atccacctac ccccaacgac 300
cacttcactc ccacccctgt ctcctacaca gccggcttct accgcatacc cgtgctgggg 360
ctgaccaccc gcatgtccat ctactcggac aagagcatcc acctgagctt cctgcgcacc 420
gtgccgccct actcccacca gtccagcgtg tggtttgaga tgatgcgtgt ctacagctgg 480
aaccacatca tcctgctggt cagcgacgac cacgagggcc gggcggctca gaaacgcctg 540
gagacgctgc tggaggagcg tgagtccaag gcagagaagg tgctgcagtt tgacccaggg 600
accaagaacg tgacggccct gctgatggag gcgaaagagc tggaggcccg ggtcatcatc 660
ctttctgcca gcgaggacga tgctgccact gtataccgcg cagccgcgat gctgaacatg 720
acgggctccg ggtacgtgtg gctggtcggc gagcgcgaga tctcggggaa cgccctgcgc 780
tacgccccag acggcatcct cgggctgcag ctcatcaacg gcaagaacga gtcggcccac 840
atcagcgacg ccgtgggcgt ggtggcccag gccgtgcacg agctcctcga gaaggagaac 900
atcaccgacc cgccgcgggg ctgcgtgggc aacaccaaca tctggaagac cgggccgctc 960
ttcaagagag tgctgatgtc ttccaagtat gcggatgggg tgactggtcg cgtggagttc 1020
aatgaggatg gggaccggaa gttcgccaac tacagcatca tgaacctgca gaaccgcaag 1080
ctggtgcaag tgggcatcta caatggcacc cacgtcatcc ctaatgacag gaagatcatc 1140
tggccaggcg gagagacaga gaagcctcga gggtaccaga tgtccaccag actgaagatt 1200
gtgacgatcc accaggagcc cttcgtgtac gtcaagccca cgctgagtga tgggacatgc 1260
aaggaggagt tcacagtcaa cggcgaccca gtcaagaagg tgatctgcac cgggcccaac 1320
gacacgtcgc cgggcagccc ccgccacacg gtgcctcagt gttgctacgg cttttgcatc 1380
gacctgctca tcaagctggc acggaccatg aacttcacct acgaggtgca cctggtggca 1440
gatggcaagt tcggcacaca ggagcgggtg aacaacagca acaagaagga gtggaatggg 1500
atgatgggcg agctgctcag cgggcaggca gacatgatcg tggcgccgct aaccataaac 1560
aacgagcgcg cgcagtacat cgagttttcc aagcccttca agtaccaggg cctgactatt 1620
ctggtcaaga aggagattcc ccggagcacg ctggactcgt tcatgcagcc gttccagagc 1680
acactgtggc tgctggtggg gctgtcggtg cacgtggtgg ccgtgatgct gtacctgctg 1740
gaccgcttca gccccttcgg ccggttcaag gtgaacagcg aggaggagga ggaggacgca 1800
ctgaccctgt cctcggccat gtggttctcc tggggcgtcc tgctcaactc cggcatcggg 1860
gaaggcgccc ccagaagctt ctcagcgcgc atcctgggca tggtgtgggc cggctttgcc 1920
atgatcatcg tggcctccta caccgccaac ctggcggcct tcctggtgct ggaccggccg 1980
gaggagcgca tcacgggcat caacgaccct cggctgagga acccctcgga caagtttatc 2040
tacgccacgg tgaagcagag ctccgtggat atctacttcc ggcgccaggt ggagctgagc 2100
accatgtacc ggcatatgga gaagcacaac tacgagagtg cggcggaggc catccaggcc 2160
gtgagagaca acaagctgca tgccttcatc tgggactcgg cggtgctgga gttcgaggcc 2220
tcgcagaagt gcgacctggt gacgactgga gagctgtttt tccgctcggg cttcggcata 2280
ggcatgcgca aagacagccc ctggaagcag aacgtctccc tgtccatcct caagtcccac 2340
gagaatggct tcatggaaga cctggacaag acgtgggttc ggtatcagga atgtgactcg 2400
cgcagcaacg cccctgcgac ccttactttt gagaacatgg cccgggtctt catgctggta 2460
gctgggggca tcgtggccgg gatcttcctg attttcatcg agattgccta caagcggcac 2520
aaggatgctc gccggaagca gatgcagctg gcctttgccg ccgttaacgt gtggcggaag 2580
aacctgcagg atagaaagag tggtagagca gagcctgacc ctaaaaagaa agccacattt 2640
agggctatca cctccaccct ggcttccagc ttcaagaggc gtaggtcctc caaagacacg 2700
cagtaccatc ccactgatat cacgggcccg ctcaacctct cagatccctc ggtcagcacc 2760
gtggtgtga 2769

Claims (10)

1.一种制备重组细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(a)提供待转染的细胞以及用于转染的第一质粒和第二质粒；其中，所述的细胞为待转染的细胞为肾细胞，
所述的第一质粒含有第一表达盒，所述第一表达盒用于表达式I所示的融合蛋白P0，
Z1-Z2 (I)
式中，
Z1为突变型NMDAR亚基NR1，所述突变型NMDAR亚基NR1的序列如SEQ ID No:2所示；
Z2为GFP蛋白元件；
所述的第二质粒含有第二表达盒，所述的第二表达盒用于表达NMDAR亚基NR2A；
(b)将所述的第一质粒和第二质粒转入所述的待转染的细胞，从而获得所述的重组细胞C0，其中所述的重组细胞C0表达重组的NMDAR蛋白；
(c)检测步骤(b)所获得的重组细胞的存活情况。
2.一种重组细胞，其特征在于，所述的重组细胞是用权利要求1所述的方法制备的。
3.如权利要求2所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞表达NMDAR突变蛋白，所述NMDAR突变蛋白由NR1亚基和NR2A亚基构成，其中，NR1亚基为突变型亚基，且NR1亚基的第815位氨基酸由野生型的甘氨酸突变为精氨酸。
4.如权利要求2所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞在转染后12-24小时，细胞存活率≥50％，较佳地为50％-85％，更佳地60％-75％。
5.一种权利要求2所述的重组细胞或用于制备所述的重组细胞的转染试剂的用途，其特征在于，用于制备检测自身免疫性脑炎的检测试剂或试剂盒。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还含有选自下组的额外试剂：
(Y1)用于表达AMPAR1蛋白的重组细胞C1,或用于制备所述重组细胞C1的转染试剂；
(Y2)用于表达AMPAR2蛋白的重组细胞C2，或用于制备所述重组细胞C2的转染试剂；
(Y3)用于表达LGI1蛋白的重组细胞C3，或用于制备所述重组细胞C3的转染试剂；
(Y4)用于表达Caspr2蛋白的重组细胞C4，或用于制备所述重组细胞C4的转染试剂；
(Y5)用于表达GABABR蛋白的重组细胞C5，或用于制备所述重组细胞C5的转染试剂；
(Y6)所述Y1～Y5的任意组合。
7.如权利要求6所述的试剂，其特征在于，所述重组细胞C1表达AMPAR1蛋白与GFP绿色荧光蛋白的融合蛋白P1；
所述重组细胞C2表达AMPAR2蛋白与GFP绿色荧光蛋白的融合蛋白P2；
所述重组细胞C3表达LGI1蛋白与GFP绿色荧光蛋白的融合蛋白P3；
所述重组细胞C4表达Caspr2蛋白与GFP绿色荧光蛋白的融合蛋白P4；
所述重组细胞C5表达GABABR蛋白与GFP绿色荧光蛋白的融合蛋白P5。
8.一种检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有：
(a)权利要求2所述的重组细胞,或用于制备所述重组细胞的转染试剂；
(b)针对抗NMDAR蛋白的抗体的二抗。
9.一种检测样本中是否存在抗NMDAR蛋白的抗体的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供权利要求2所述的重组细胞，即重组细胞C0；
(b)将所述的重组细胞C0与待测样本混合，从而获得第一混合物，从而重组细胞C0与抗NMDAR蛋白的抗体发生结合，从而形成“重组细胞C0-抗NMDAR蛋白的抗体”第一复合物；
(c)对所述第一混合物进行洗涤，获得经洗涤的“重组细胞C0-抗NMDAR蛋白的抗体”第一复合物；
(d)将经洗涤的“重组细胞C0-抗NMDAR蛋白的抗体”第一复合物与二抗进行混合，从而形成“重组细胞C0-抗NMDAR蛋白的抗体－二抗”第二复合物；和
(e)检测“重组细胞C0-抗NMDAR蛋白的抗体－二抗”第二复合物的存在与否和/或数量，从而获得抗NMDAR蛋白的抗体的检测结果。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤(e)中，包括检测荧光和/或生色团。
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