JP6986054B2 - バイオセンサーを有するヒト細胞モデル - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１３年９月５日に出願されたＡｎｇｅｌａ Ｈｕａｎｇによる先行米国仮
特許出願第６１／８７３，９５０号明細書、Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌ
ｓ ｗｉｔｈ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓに対する優先権及びその利益を主張する。この先行
出願の全開示は参照によって本明細書に援用される。

本発明は、活性薬剤スクリーニング、電気インパルスのモニタリング用の、及びシグナ
ル伝達をモニタするための方法及び組成物の分野に関する。本発明は、例えば代表性のあ
る宿主細胞の標的領域における特異的な生物活性を検出するための組成物を提供する。方
法は、再プログラム化されたヒト細胞を、例えば細胞におけるイオン環境の変化又は電位
ポテンシャルの検出に特異的な標的化されたセンサーコンストラクトで形質転換すること
を含む。

細胞の電位ポテンシャル及び内部イオン環境に対する変化の検出は、細胞の生物活性の
モニタリングにおいて有用であり得る。例えば、多くの細胞は、Ｇタンパク質受容体への
リガンドの結合に応答して内部カルシウムイオン（Ｃａ^２＋）濃度の著しい変化を被る。
別の態様において、特定の細胞は、例えばシナプスにおける神経伝達物質との接触に応答
して、膜の電位ポテンシャルの大きい変化を被る。かかる細胞変化は細胞の重要な機能に
関与し、細胞の健康、機能、又は発生プロセスの指標となり得る。

遺伝的にコードされたカルシウムインジケーター（ＧＥＣＩ）は、細胞のＣａ^２＋濃度
の全般的なモニタリングを可能にするために開発された。例えばＬｏｏｇｅｒ（米国特許
出願公開第２０１２／００３４６９１号明細書）を参照されたく、ここではカルモジュリ
ンペプチド配列が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーターを有するコンストラクトと
組み合わされる。Ｃａ^２＋結合に応答したカルモジュリンペプチドのコンホメーション変
化によってＧＦＰ蛍光の効率が変化し、発光プロファイル及び強度の変化がもたらされる
。ＧＥＣＩで形質転換された細胞は、概して、例えばシグナル伝達リガンド又は阻害薬に
応答した内部Ｃａ^２＋濃度の変化に関してモニタすることができる。Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋ
（米国特許出願公開第２００９／００３５７８８号明細書）もまた参照されたく、ここで
はＦＲＥＴドナー及びアクセプターがトロポニンペプチド配列によって分けられ、Ｃａ^２
＋の結合時に蛍光変化がもたらされる。しかしながら、かかるＧＥＣＩはそのシグナル分
解能が限られており、多細胞／３Ｄ構造を貫通する能力、及び利用可能な該当の細胞型の
範囲が限られている。典型的には、従来技術のシステムは、細胞単層からの二次元の顕微
鏡的シグナル検出を対象とする。

多くの場合、シグナル伝達研究は、実際の目的の細胞を代表するものではない細胞型で
行われる。例えば、研究者はシグナル伝達剤及び有望な治療薬をげっ歯類又は不死化細胞
株においてインビトロで研究するよう制限され得るが、これは多くの場合にヒト細胞又は
臨床患者で再現されない結果をもたらす。例えば、研究者は初代細胞株に癌遺伝子を導入
することにより、例えば選択の細胞型に分化させて、研究用の宿主細胞を作製し得る。し
かしながら、この過程の経過後には、細胞は、生物活性剤との接触に通常どおり応答する
ものとして頼ることができない。Ｗｅｉｓｓ（米国特許第７，１０１，７０９号明細書）
は多能性マウス神経幹細胞の調製方法を開示している。細胞を分化させて、いくらか免疫
特権があるＣＮＳ部位に移植し得る。この場合もまた、細胞は多くの研究にとって代表性
がなく、シグナル検出は免疫化学的手段に限られている。

上記の観点から、目的とする生きている動物系に存在する細胞及び組織を代表するモデ
ル細胞システムが必要とされている。それが特定の細胞内部位に標的化し得るセンサーペ
プチドコンストラクトを有するならば望ましい。代表性のある細胞のモック組織において
インビトロで三次元シグナル検出が可能なシステムが利用可能であったならば、利益が実
現し得る。本発明は、これらの特徴及び以下を考察することで明らかになるであろう他の
特徴を提供する。

本バイオセンサーは相補的な特徴を組み合わせることにより、シグナル伝達に関連する
細胞内変化をインビボで検出する。本バイオセンサーは、種々のコンテクストで有用性が
見出される。例えば、ヒトｉＰＳＣ由来の細胞型におけるバイオセンサーは、特定の病態
を発現する細胞の２Ｄ又は３Ｄ細胞モデルをイメージングするよう機能し得る。かかるモ
デルは、化学的効果、生物学的効果、治療効果、及び毒性効果に関する候補薬物化合物の
スクリーニング及び評価において有用であり得る。

合成の及び遺伝的にコードされたバイオセンサーは、ヒト細胞におけるカルシウム（Ｃ
ａ^２＋）濃度のレポーターとして機能し得る。バイオセンサーは、細胞内コンパートメン
ト、例えば、核、細胞質、原形質、特定の膜表面などを標的化する構造を有し得る。バイ
オセンサーは、任意選択で、ヒト細胞コンパートメントにおける細胞電位変化のレポータ
ーとして機能し得る。例えば、電位センサーは、ナトリウム（Ｎａ^＋）及びカリウム（Ｋ
^＋）濃度の差又は変化に起因する膜ポテンシャルの変動を評価及びレポートすることがで
きる。

バイオセンサーは、細胞型特異的様式で機能するように構成し得る。例えば、バイオセ
ンサーは、特定の細胞型、例えば、ドーパミン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニュー
ロン、アストロサイト、心筋細胞、不死化ヒト癌細胞株、ＨＳＣ、ＮＰＣ、一般にヒト細
胞及び／又はＭＳＣに特異的なプロモーター配列を含むように遺伝子修飾することができ
る。

一実施形態において、バイオセンサーは電位センサーである。電位センサーには、例え
ば、膜貫通ドメインと電位感受性ドメインとレポータードメインとを含むペプチドコンス
トラクトが含まれ得る。例えば、電位センサーコンストラクトは、ヒト細胞の膜にインテ
グレートするように適合された膜貫通ドメインと、Ｈ^＋、Ｎａ^＋及び／又はＫ^＋濃度に感
受性を示す電位感知ドメインと、蛍光レポータードメインとを含み得る。蛍光レポーター
は５００ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲の波長で蛍光を発するように適合され得る。バイオセン
サーは、局所電位ポテンシャルに応答して（例えば、電位感知ドメインの）コンホメーシ
ョンを変化させることにより、蛍光レポータードメインによる蛍光発光特性の変化をもた
らすように適合され得る。多くの実施形態において、膜貫通ドメインと電位感知ドメイン
とは異なるドメインである（例えば、異なる非相同配列を有するか、又は異なる親ペプチ
ドに由来する）。

電位センサーシステムの特定の実施形態において、電位センサーペプチドは、

と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一の配列を含む電
位感知ドメインを含む。好ましい実施形態において、電位センサーペプチド配列は、Ｉ１
２３、Ｒ２２０、Ｒ２２６、Ｒ２２９、Ｒ２３５及び／又はＲ２３８残基を保持する。よ
り好ましい実施形態では、電位センサードメインペプチドであって、配列が少なくともＲ
２３５及びＩ１２３を保持する。

電位センサーシステムの一部の実施形態では、蛍光レポータードメインペプチドは、

と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一の配列を含む蛍
光ドメインを含む。

特定の実施形態において、電位センサーペプチドコンストラクトは、配列番号１及び配
列番号２の各々と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一
のペプチド配列を含む。

別の本発明の態様は、本明細書に記載される電位センサーのいずれかをコードする核酸
コンストラクトを含む。さらに、核酸コンストラクトは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）タ
グ、ミトコンドリア局在化タグ、及び繊毛タグからなる群から選択されるタグ配列を含み
得る。さらに、核酸コンストラクトは、ペプチド配列：

と少なくとも８０％の同一性を含むＮＬＳタグを含み得る。

本願の発明の寄与には、本明細書に記載される電位センサーを含むヒト細胞が含まれる
。好ましい実施形態において、ヒト細胞はｉＰＳＣ由来細胞である。例えば、細胞は、線
維芽細胞又は血球細胞を多能性状態又は不死状態に誘導することによって得られ得る。多
くの場合、細胞はヒト患者由来の細胞型に由来する。

本発明のバイオセンサーはカルシウムセンサーを含む。例えば、カルシウムセンサーペ
プチドコンストラクトは、カルシウム結合ドメインとＥＦハンドトロポニン様結合ドメイ
ンと蛍光レポータードメインとを含み得る。多くの場合に蛍光レポーターは５００ｎｍ〜
７５０ｎｍの範囲の波長で発光するように適合される。蛍光レポータードメインは、例え
ばＥＦハンドトロポニン様ドメインのコンホメーション変化に応答して蛍光発光特性を変
化させるように適合され得る。

カルシウムセンサーペプチドコンストラクトは、カルモジュリンペプチド配列を含むカ
ルシウム結合ドメインを含み得る。例えば、カルシウムセンサーペプチドコンストラクト
は、

と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一のカルシウム結
合ドメインを含み得る。

カルシウムセンサーペプチドコンストラクトは、

と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一のＥＦハンド結
合ドメインを含み得る。

カルシウムセンサーペプチドコンストラクトは、

と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一の蛍光レポータ
ードメインを含み得る。

カルシウムセンサーペプチドコンストラクトは、配列番号４及び配列番号５の各々と少
なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一のペプチド配列を含
み得る。

本明細書に記載される別の本発明の態様は、本明細書に記載される任意のカルシウムセ
ンサーをコードする核酸コンストラクトを含む。さらに、核酸コンストラクトはタグ配列
を含み得る。例えば、タグ配列は、ＮＬＳタグ、脂質膜タグ、ＥＲタグ、ゴルジタグ、エ
ンドソームタグ、及び／又は繊毛タグなどの標的化配列を含み得る。

本願の発明の寄与には、本明細書に記載される任意のカルシウムセンサーを含むヒト細
胞が含まれる。好ましい実施形態において、ヒト細胞はｉＰＳＣ由来細胞である。例えば
、細胞は線維芽細胞又は血球細胞に由来し得る。

本発明は、細胞の再プログラム化及びモニタリング方法を含む。例えば、線維芽細胞の
再プログラム化方法には、Ｅボックスプロモーターを有するヒト時計遺伝子及びヒトＢｍ
ａｌ１／２／３／４遺伝子を含む１つ以上のコンストラクトによる線維芽細胞の形質転換
、線維芽細胞の概日リズムの同期、線維芽細胞の転写調節制御の修飾（それにより線維芽
細胞を誘導性多能性幹細胞に変換する）、及び誘導性ニューロン（ｉＮ）、グリア細胞（
アストロサイトを含む、ｉＧ）、誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、又は誘導性神経前駆
細胞（ｉＮＰＣ）への幹細胞の再プログラム化が含まれ得る。ヒト細胞型の概日リズムを
使用した再プログラム化方法の多くにおいて、形質転換コンストラクトは、本明細書に記
載される電位センサー又は本明細書に記載されるカルシウムセンサーをコードする核酸を
含む。

本方法は、例えば、線維芽細胞の系統に好適な特定の転写因子を提供することにより転
写制御を修飾するステップを含み得る。転写因子には、ヒト細胞型の概日リズムを使用し
て再プログラム化するための概日調節エレメント（Ｅボックスプロモーター、人工Ｅボッ
クス様プロモーター配列タグ、概日リズム周期を変更し又は同期させる化学剤、又は合成
転写エンハンサーエレメント）を含むように修飾された線維芽細胞の細胞系統に特異的な
因子が含まれ得る。

細胞組成物は、ｉＮ細胞とｉＧ細胞との共培養によってインビトロで足場上に３Ｄモデ
ルを作製することをさらに含み得る。また、ヒト癌細胞株及び癌幹細胞を、標準的な培養
ハードウェア及び条件を用いて３Ｄスフェロイド方式で培養することができる。本発明の
バイオセンサーコンストラクトを使用して、得られた組織をイメージングし、細胞電位ポ
テンシャル及び／又はカルシウムレベルの変化を例えばリアルタイムでモニタすることが
できる。

本明細書に記載されるカルシウム及び電位バイオセンサーと同様の論理を用いてヘム結
合及びＡＴＰ結合バイオセンサーを設計することができる。両方のバイオセンサーとも、
それぞれヘム分子又はＡＴＰに結合する特異的ドメインを伴い遺伝的にコードされる。こ
れらのバイオセンサーは、ドメイン結合に起因するコンホメーション変化に起因して強度
が変わる蛍光レポーター（６００ｎｍ〜７００ｎｍ範囲）に結合される。単一の蛍光又は
インテンシオメトリック（ｉｎｔｅｎｓｉｏｍｅｔｒｉｃ）レポーターの代替例では、バ
イオセンサードメインを様々な波長の一対のＦＲＥＴ蛍光レポーターに結合させてＦＲＥ
Ｔセンサーとなるようにし得る。

本発明の方法は、細胞のカルシウム又は電位ポテンシャルに影響を及ぼす薬剤をスクリ
ーニングするための組成物及び技法を含む。例えば、活性薬剤のスクリーニング方法は、
電位センサー又はカルシウムセンサーをコードする核酸で１つ以上の細胞を形質転換する
ステップと、細胞において電位センサー又はカルシウムセンサーを発現させるステップと
、細胞を候補活性薬剤と接触させるステップと、薬剤に応答した電位センサー又はカルシ
ウムセンサーの蛍光（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）の変化を検出するステップとを含み得る
。典型的な薬剤としては、例えば小分子化学ライブラリのメンバーを挙げることができる
。例えば、薬剤は、ＧＰＣＲ、膜チャネル、受容体、及び／又は関連するシグナル伝達経
路との相互作用によってもたらされる活性に関して考察され得る。

さらに、本方法は、低い、中程度の、及び／又は高いスループットのアッセイフォーマ
ットによる生細胞のイメージングにおいて有用であることが想定される。例えば、本発明
のバイオセンサーコンストラクトを形質転換され、且つそれを発現する、３Ｄアレイ中の
細胞を、例えば顕微鏡イメージングシステムを使用してリアルタイムで観察することがで
きる。任意選択で、表面培養又は浮遊培養下のバイオセンサー細胞を、共焦点イメージン
グ、ＦＡＣＳソーター、ＣＣＤビデオイメージングなどを使用してモニタすることができ
る。

３Ｄヒト癌細胞モデルは、ライブラリスクリーニングハイスループットスクリーニング
（ＨＴＳ）方法を使用した薬物候補に対する腫瘍応答の改良された予測手段として用いら
れている。かかる研究に用いられる細胞は不死化癌細胞株に限られない。スクリーニング
には癌幹細胞、初代組織細胞、及び３Ｄプリント組織型を使用することができる。

定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定の装置又は生物学的システムに限定されず
、それらは当然ながら異なってもよいことが理解されるべきである。また、本明細書で使
用される用語は特定の実施形態を説明するために過ぎず、限定することを意図するもので
はないことも理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されると
き、文脈上特に明確に指示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数
の指示対象を含む。従って、例えば、「表面（ａ ｓｕｒｆａｃｅ）」に対する言及は２
つ以上の表面の組み合わせを含み；「細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）」に対する言及は細菌の
混合物を含むなどする。

特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が関係す
る技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本発明の試験の実施には、
本明細書に記載されるものと同様の又は等価な任意の方法及び材料を使用し得るが、好ま
しい材料及び方法が本明細書に記載される。本発明を記載及び特許請求するにあたり、下
記に示す定義に従い以下の用語を用いる。

ｉＰＳＣは誘導性多能性幹細胞を指す；ｉＮは誘導性ニューロンを指す；ｉＧは誘導性
グリア細胞（アストロサイトを含む）を指す；及びｉＮＰＣは誘導性神経前駆細胞。

近赤外は約６００ｎｍ〜約１４００ｎｍの範囲の光波長を指す。

用語「保存変異体」は、保存された機能をもたらす所与の配列の修飾を含む。例えば、
核酸の文脈では、遺伝子コードの縮重のため、「サイレント置換」（即ち、コードされた
ポリペプチドに変化をもたらさない核酸配列における置換）は、アミノ酸をコードするあ
らゆる核酸配列の黙示的な特徴である。

同様に、ペプチド配列の文脈における保存変異体も機能を保持すると予想され得る。例
えば、Ｇｕｏ，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ｒａｎｄｏｍ Ａｍｉｎ
ｏ Ａｃｉｄ Ｃｈａｎｇｅ”，（ＰＮＡＳ １０１：９２０５−１０；２００４）は、
「タンパク質の構造がその機能的有用性とどのように関係付けられるのかに関する詳細な
知識がなくとも．．．」当業者がペプチドの修飾に成功し得ることを実証している。Ｇｕ
ｏは、僅か２５％のランダム突然変異が実質的な活性喪失を引き起こすことを見出してい
る。Ｇｕｏは、当業者がどのように活性部位の位置、αヘリックス、βシート、疎水性相
互作用、ターン及びループ、保存部位などを考慮すれば、例えば重要な位置での置換回避
によるか又は保存的アミノ酸置換を用いて活性の喪失を知的に回避し得るかを広範に考察
している。さらに、Ｇｕｏは、彼の「データベースが、タンパク質機能に対する突然変異
の効果を予測するための価値のあるリソースであり得る．．．」ことを述べている。既知
の構造への置換は予測可能であり、構造情報を有するものを持っている。従って、アミノ
酸配列中の１個又は数個のアミノ酸が別の極めて類似した特性のアミノ酸で置換される保
存的アミノ酸置換はまた、開示されるコンストラクトに極めて類似していると容易に特定
され、機能を保持しているものと予想される。当業者は、コード配列中の単一のアミノ酸
又は僅かな割合のアミノ酸（典型的には５％未満、より典型的には４％、２％又は１％未
満）を変化させ、付加し又は欠失させる個々の置換、欠失、又は付加が、改変によってア
ミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、又は化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換が
もたらされる「保存的に修飾された変異」であることを認識するであろう。従って、本発
明の列挙されるポリペプチド配列の「保存的変異」には、ポリペプチド配列の中の僅かな
割合、典型的には５％未満、より典型的には２％又は１％未満のアミノ酸の、同じ保存的
置換群の保存的に選択されたアミノ酸による置換が含まれる。

ＴｅｍｐｏＣａｌ（商標）をヒト細胞に組み込み、且つヒスタミン（２０μＭ）、カルバコール（２０μＭ）、及びイオノマイシン（２０μＭ）で刺激したグラフを示し、平均応答は対照と比べて９〜１２倍である。ヒスタミン：細胞内カルシウムの増加を刺激する既知の物質。カルバコール：既知の緑内障治療用薬剤；抗アポトーシス剤、ａＣＨＲアゴニスト、及びＴＮＦ−α阻害薬。イオノマイシン：研究において細胞内カルシウムレベルを上昇させるために使用されるイオノフォア。 ＴｅｍｐｏＭｉｔｏ（商標）含有細胞をヒスタミン（２０μＭ）、及びカルボキシアミドトリアゾール（２０μＭ）で刺激したグラフを示す。ヒスタミン：細胞内カルシウムの増加を刺激する既知の物質。カルボキシアミノイミダゾール（ＣＡＩ）：経口活性薬剤、非電位作動型カルシウムチャネル遮断薬。 ＴｅｍｐｏＶｏｌ（商標）組込み細胞が、ｐＨ３、０．１Ｍ ＣａＣｌ_２、ＥＤＴＡ、及びＣａ^２＋Ｍｇ^２＋不含溶液に応答することを示す。 単一の２．５ｍＭ ＣａＣｌ_２刺激によるＴｅｍｐｏＣａｌ（商標）、ＴｅｍｐｏＭｉｔｏ（商標）、及びＴｅｍｐｏＶｏｌ（商標）細胞応答を示す。 ＴｅｍｐｏＶｏｌ（商標）：ｐＨ３、１．０ｍＭ ＣａＣｌ_２、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２、及び１０ｍＭ ＥＤＴＡに対する細胞応答を示す。 Ｕ２−ＯＳヒト骨芽細胞腫細胞を使用したＴｅｍｐｏＭｉｔｏ（商標）応答を示す。 ＴｅｍｐｏのｉＰＳ由来ヒト神経前駆細胞を示す。免疫組織化学はバイオマーカービメンチン抗体を用いる。ヒトビメンチンは中間径フィラメントタイプであり、中枢神経系の神経前駆細胞／幹細胞によって発現される。 光透過顕微鏡視野におけるＴｅｍｐｏのｉＰＳ由来ヒト神経前駆細胞を示す。 ＴｅｍｐｏのｉＰＳ由来ヒト神経前駆細胞で発現するＴｅｍｐｏＣａｌ（商標）バイオセンサーを示す。 光透過像におけるＴｅｍｐｏのｉＰＳ由来ヒトアストロサイト細胞を示す。 ＴｅｍｐｏのｉＰＳ由来ヒトアストロサイト細胞を示す。免疫組織化学はバイオマーカーＧＦＡＰ抗体を用いる。ＧＦＰ（グリアフィラメントタンパク質）はクラスＩＩＩ中間径フィラメントであり、中枢神経系の発生の間にアストロサイトを他のグリア細胞と区別する細胞特異的マーカーである。 ＴｅｍｐｏのｉＰＳ由来ヒトアストロサイト細胞で発現するＴｅｍｐｏＣａｌ（商標）バイオセンサーを示す。 ＴｅｍｐｏのｉＰＳ由来ヒトアストロサイト細胞で発現するＴｅｍｐｏＭｉｔｏ（商標）バイオセンサーを示す。 ＴｅｍｐｏのｉＰＳ由来ヒト神経前駆細胞で発現するＴｅｍｐｏＭｉｔｏ（商標）バイオセンサーを示す。 Ｔｅｍｐｏの専売神経上皮細胞で発現するＴｅｍｐｏＣａｌ（商標）バイオセンサーを示す。 Ｔｅｍｐｏの専売神経上皮細胞で発現するＴｅｍｐｏＭｉｔｏ（商標）バイオセンサーを示す。 ＴｅｍｐｏのｉＰＳ由来ヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞を示す。免疫組織化学はバイオマーカーＯ４抗体を用いた。 Ｔ３ホルモン（７０ｎｇ／ｍｌ）で誘導した６日後のＴｅｍｐｏのｉＰＳ由来ヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞を示す。免疫組織化学はバイオマーカーミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）抗体を用いる。 Ｔｅｍｐｏの専売神経上皮細胞で発現するＴｅｍｐｏＶｏｌ（商標）バイオセンサーを示す。 ＴｅｍｐｏのｉＰＳ由来ヒトドーパミン作動性ニューロンを示す。免疫組織化学はバイオマーカーチミンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）抗体を用いる。 Ｌｉｐｉｄｕｒｅをコーティングした９６ウェルＵ字型プレートを使用して３Ｄスフェロイドモデルとして試験したＴｅｍｐｏの不死化神経上皮細胞を示す。図示されるスフェロイドの直径＝２５０μｍ。

本発明は、バイオセンサーコンストラクト、コンストラクトを受け取るのに有用な細胞
を調製するための再プログラム化方法、及び例えば生細胞における活性薬剤又はシグナル
の存在を検出するための、バイオセンサーを用いたアッセイ方法を含む。

バイオセンサーは、概して、特定の細胞内部位における電位又はイオンを感知し、且つ
パラメータの変化に相関する個別的なシグナルを提供するように協働する様々な相補的ド
メイン構造を含む。特に有用な実施形態において、バイオセンサーは、特定の種（例えば
ヒト）、目的の細胞型を代表する細胞、又は目的の病態を発現する細胞で発現する。バイ
オセンサーを発現する細胞は条件又は薬剤に曝露され、細胞応答を示すシグナルに関して
モニタされ得る。

バイオセンサー概要
本発明のバイオセンサーは、概して、例えば位置決め、感知、及びレポートを提供する
ことに特化した構成要素を含むように操作される。センサー核酸コンストラクトの発現に
おいて、ペプチド産物は細胞内に、例えば、シャペロン又は移行配列、疎水性親和性、又
はリガンド／受容体相互作用によって位置決めされ得る。感知ドメインは、典型的には、
変化した細胞内条件又はシグナルイオン若しくは分子の結合に応答してコンホメーション
を変化させる。レポートドメインは、典型的には、関連する感知ドメインのコンホメーシ
ョン変化に応答して変化する検出可能シグナルを呈する。

バイオセンサーの細胞内位置は、任意選択で、標的化ドメイン又は「タグ」によって制
御することができる。バイオセンサーによっては、細胞内位置は一般化され、又は受動的
に決定される。例えば、センサーは概して核及び／又は細胞質全体に分散してもよい。他
の場合には、バイオセンサーシグナルの機能又は特異性が、特定の細胞内膜又は細胞小器
官における局在化に依存してもよい。バイオセンサータグの例としては、膜と相互作用す
るように仕向けられた疎水性ペプチド、細胞質中に分散するように仕向けられたイオン性
ペプチド、バイオセンサーを特定のコンパートメントに仕向けるシャペロン配列、及び／
又は受容体に仕向けられるリガンドが挙げられる。細胞内シグナル伝達の研究及び薬剤ス
クリーニングアッセイにおいて有用なタグとしては、例えば、ＮＬＳタグ、脂質膜タグ、
小胞体（ＥＲ）タグ、ゴルジタグ、エンドソームタグ、繊毛タグなどを挙げることができ
る。

バイオセンサーの感知ドメインは、変化した物理的状態、リガンドの結合、又はイオン
環境の変化に応答してコンホメーションが変化する。このコンホメーション変化によって
、例えば、関連するレポータードメインのコンホメーション変化が起こり、又はレポータ
ードメインの位置が変わり、それによりシグナルが増強され又は減弱し得る。感知ドメイ
ンは、ペプチドの結合、核酸の結合、プロテアーゼとの相互作用、ホスファターゼとの相
互作用、ｐＨの変化、イオン強度の変化、電位ポテンシャルの変化などに応答してコンホ
メーションが変化し得る。

バイオセンサーのレポータードメインは、当該技術分野において公知の任意の適切なタ
イプのものであってよい。しかしながら、好ましい実施形態では、レポーターは１つ以上
のペプチドドメインを含み、例えばそのためレポーターはインビボ系で容易に用いること
ができる。典型的にはペプチドレポータードメインは、特定のインテロゲーティング励起
光波長に応答して特定の蛍光発光を提供する。センサードメインコンホメーション変化の
文脈ではＦＲＥＴ戦略が有効であってもよく、例えばここではバイオセンサーコンストラ
クトが対になったドナー／アクセプターペプチドペアを含む。特定の実施形態において、
レポータードメインは赤色乃至近赤外スペクトルの発光を提供するように適合され、それ
によって例えば細胞層又は組織層を通じた三次元でのシグナルの通過及び検出を可能にす
る。例えば、比較的透過性のあるレポーター発光シグナルは、５００ｎｍ〜１４００ｎｍ
、５５０ｎｍ〜９００ｎｍ、６００ｎｍ〜８５０ｎｍ、６５０ｎｍ〜８００ｎｍ、又は約
７００ｎｍの範囲であり得る。例示的実施形態において、レポータードメインは、トリプ
トファン、チロシン、フェニルアラニンなど、ドメインのそれらの内因性蛍光に寄与する
蛍光増強性のアミノ酸を含む。任意選択で、レポータードメインは、所望の長波長発光を
提供するように天然で翻訳後修飾される領域を含み得る。例えば、赤色領域で発光するド
メインは、４−（ｐ−ヒドロキシベンジリデン）−イミダゾリジン−５−オン構造に修飾
される内部セリン−チロシン−グリシン配列がフルオロフォアの由来である修飾緑色蛍光
タンパク質であり得る。

バイオセンサーコンストラクトは、例えば上述のドメインタイプの２つ、３つ、又は４
つを種々の機能構成のいずれでも含むことができる。例えば、任意の順序のセンサードメ
イン及びレポータードメインがバイオセンサーを構成し得る。多くの場合に、本発明のバ
イオセンサーは少なくとも３つのドメイン、例えば、標的化ドメインとセンサードメイン
とレポートドメインとを含む。これらの３つのドメインは任意の順序であってよく、しか
し典型的には標的化ドメインがコンストラクトの一方の端部にあり、センサーが中央にあ
って、レポーターが第２の端部にある。特定の構成では、バイオセンサーコンストラクト
は以下の順序（Ｃ末端／Ｎ末端又はＮ末端／Ｃ末端）：センサー／レポーター；標的化／
センサー／レポーター；標的化／レポーター／センサー；標的化／レポーター１／センサ
ー／レポーター２（例えば、ＦＲＥＴ）；レポーター１／センサー／レポーター２；セン
サー／レポーター１／レポーター２；及び標的化／センサー／レポーター１／レポーター
２であってもよい。

典型的には、ドメインは、共通に翻訳される単一線状ペプチドコンストラクトにおいて
一体に連結されている。任意選択で、コンストラクトは、別のドメインと同じペプチド鎖
にない１つ以上のドメインを含み得る。例えば、別個のドメインが、非共有結合性相互作
用、例えば、疎水性相互作用、キレート化、リガンド／受容体相互作用、抗体／抗原相互
作用などで会合し得る。

ある場合には、単一のドメインが２つ以上の機能を有し得る。例えば、センサードメイ
ンが、標的化ドメインとして機能する構造も有し得る。一実施形態において、ドメインは
、センサー（例えばリガンド応答性イオンチャネル）及び膜特異的標的化ドメインの両方
として働く一連の膜貫通ドメインを有し得る。別の態様において、センサードメインはま
た、例えば別個のレポータードメインとのＦＲＥＴペアのドナー又はクエンチャーメンバ
ーとして働くレポーター機能も含み得る。

電位感知バイオセンサー
本発明の電位センサーは、上記に記載する態様の多くを含み、このセンサードメインは
電位ポテンシャルの変化に応答する。例えば、電位センサーは、局所環境における静電的
影響、例えば、それが結合している膜にわたる電位差に感受性を有し得る。任意選択で、
電位センサーは局所イオン環境に感受性を有する。生細胞において、電位ポテンシャルは
通常、Ｈ^＋、Ｃａ^２＋、Ｋ^＋及び／又はＮａ^＋の絶対濃度、又は膜にわたるこれらのイオ
ンの濃度差に関係する。従って、電位センサードメインは、典型的には、静電力、Ｈ^＋、
Ｃａ^２＋、Ｋ^＋及び／又はＮａ^＋濃度に感受性を有するドメインを含む。かかるセンサー
は、筋細胞、心臓細胞、及び神経細胞などの比較的電気活性の高い細胞に関連して特に有
用である。

重要なことには、かかる電位センサーは、特異的に細胞内部位におけるイオン／電位状
態を標的化し及びレポートするように構成され得る。例えば、コンストラクトは、コンス
トラクトを細胞内コンパートメント又は表面、例えば、核、筋形質（ｓａｃｒｏｐｌａｓ
ｍａ）、細胞膜、神経軸索、繊毛、又はシナプスなどに仕向ける標的化ドメインを含み得
る。従って、概して細胞でシグナル伝達をモニタすることができるのみならず、細胞成分
レベルでより特異的な電位差効果を可視化することができる。

本発明の典型的な電位感受性バイオセンサーは、膜貫通ドメインと電位感知ドメインと
レポータードメインとを含む。場合によっては、膜貫通ドメインが標的化ドメイン及び／
又は電位感知ドメインとして働き得る。一実施形態では、電位センサーは膜貫通／センサ
ー／レポーターの順序でドメインを有する。好ましい実施形態において、レポーターは、
例えば赤色乃至近赤外領域で発光する蛍光ペプチドである。

好ましい電位バイオセンサーコンストラクトは、イオンチャネル膜貫通ペプチドとイオ
ンチャネル電位感知ペプチドドメインと蛍光ペプチドとの組み合わせを含む。例示的実施
形態において、電位センサーは、修飾された膜貫通ペプチドと、修飾された電位と、赤色
発光を提供するように修飾された蛍光タンパク質とを含む。コンストラクトのドメインは
、典型的には修飾された進化的突然変異生成としてバイオインフォマティクス／データベ
ース配列の組み合わせから構成される。

特定の電位感知ドメインにおいて、配列は

を含む。配列の保存的変異は、実質的な有用機能を保持するものと予想される。本電位セ
ンサードメインは、配列番号１と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、
９８％、又は９９％同一の配列を含むペプチドを含む。機能は、保存的置換であって且つ
配列が以下のアミノ酸残基：Ｉ１２３、Ｒ２２０、Ｒ２２６、Ｒ２２９、Ｒ２３５、又は
Ｒ２３８の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つ全てを保持する場合、最
良に保存されるものと予想される。多くの実施形態において、Ｒ２３５及びＩ１２３の保
存が、最適な電位センサー機能の保持に特に有用であり得る。

電位センサーペプチドの特定のレポータードメインにおいて、配列は

を含む。配列の保存的変異は、実質的な有用機能を保持するものと予想される。本蛍光レ
ポーターセンサードメインは、配列番号２と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％
、９５％、９８％、又は９９％同一の配列を含むペプチドを含む。

本発明の好ましい電位感知バイオセンサーは、配列番号１の電位センサーと配列番号２
の蛍光レポーターとの両方、及び／又は上記で考察したとおりのそれらの保存変異体を含
む。

カルシウムイオン感知バイオセンサー
本発明のカルシウムセンサーコンストラクトは、一般にバイオセンサーに関して上記に
記載する態様の多くを含むが、センサードメインはカルシウムイオンレベルの変化に応答
性を有する。例えば、カルシウムセンサーは、典型的には特定の親和性でＣａ^２＋を結合
し、局所Ｃａ^２＋濃度に応じてコンホメーションをある程度変化させる。Ｃａ^２＋は、細
胞型に依存して、且つ誘導されたシグナルの影響に応じて劇的に変わり得る。例えば、Ｃ
ａ^２＋は、筋細胞、神経細胞、Ｇタンパク質制御シグナルに応答する細胞、アポトーシス
を受ける細胞などをモニタするための情報を提供し得る。生細胞では、Ｃａ^２＋レベルは
多くの場合に細胞内部位によって変わる。本カルシウムセンサーは、センサーを膜の任意
の細胞内コンパートメント、例えば、液胞、核、細胞質、シナプス、小胞体などに仕向け
る標的化ドメインを含み得る。

カルシウムセンサードメインは、典型的には１つ以上のカルシウム結合タンパク質の一
部に相同なペプチドである。例えば、カルシウム結合ドメインは、カルモジュリン、カレ
クシチン、パルブアルブミン、Ｓ１００タンパク質、カルシニューリンなどに見られる進
化配列と同様の配列を有し得る。センサーの役割としては、カルシウム濃度の変化に伴い
ペプチド又はペプチド断片がコンホメーションを変化させることで十分である。コンホメ
ーションの変化によってレポーター基の位置が変わり、典型的には発光プロファイル又は
強度が変化する。現代のタンパク質工学技術を用いて、レポーターの転位置を引き起こす
エンハンスメント（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）を、例えば誘導された接触又はレポーター
それ自体の誘導されたコンホメーション変化によって増強し又は抑えるように操作するこ
とができる。

好ましいカルシウムバイオセンサーコンストラクトは、カルモジュリン及びトロポニン
モチーフを含むカルシウム結合ドメイン（即ち、ＥＦハンドドメイン）と蛍光ペプチドと
のタンデムアレイの組み合わせを含む。例示的実施形態において、カルシウムセンサーは
、カルモジュリン、トロポニンからの修飾されたカルシウム結合ドメインと、赤色発光を
提供するように修飾された蛍光タンパク質とを含む。コンストラクトのドメインは、典型
的には、修飾された進化的突然変異生成としてバイオインフォマティクス／データベース
配列の組み合わせから構成される。

特定のカルシウム結合ドメインにおいて、配列は、

を含む。配列の保存的変異は、実質的な有用機能を保持するものと予想される。本カルシ
ウム結合ドメインは、配列番号４と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％
、９８％、又は９９％同一の配列を含むペプチドを含む。

カルシウムセンサーペプチドの特定のＥＦハンドドメインにおいて、配列は、

を含む。配列の保存的変異は、実質的な有用機能を保持するものと予想される。本ＥＦハ
ンドドメインは、配列番号５と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９
８％、又は９９％同一の配列を含むペプチドを含む。

カルシウムセンサーペプチドの特定のレポータードメインにおいて、配列は、

を含む。配列の保存的変異は、実質的な有用機能を保持するものと予想される。本蛍光レ
ポーターセンサードメインは、配列番号６と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％
、９５％、９８％、又は９９％同一の配列を含むペプチドを含む。

本発明の好ましいカルシウム感知バイオセンサーは、配列番号４、５、６、及び７で同
定されるドメインの１つ、２つ、３つ又はそれ以上、及び／又は上記で考察したとおりの
それらの保存変異体を含む。

ヒト細胞におけるバイオセンサーコンストラクト
本明細書に記載されるバイオセンサーは、細胞に組み込むことで、細胞内の電位及びイ
オン状態をモニタすることができる。例えば、バイオセンサーペプチドドメインをコード
する核酸コンストラクトを、当該技術分野において公知のとおり、真核細胞に形質転換し
又はトランスフェクトし、例えば適切なプロモーターを使用して発現させることができる
。細胞は好ましくはヒトであり、例えばヒトシグナル伝達及び病状の研究向けに、信頼で
きる宿主細胞モデルの利益が提供される。細胞は好ましくは、幹細胞又は目的の特定の細
胞型に分化した細胞である。

核酸コンストラクトは、本明細書に記載される任意のバイオセンサーをコードし得る。
例えば、コンストラクトは、電位センサードメイン、カルシウムセンサードメイン、標的
化ドメイン、及び／又はレポータードメインの組み合わせをコードし得る。一実施形態に
おいて、核酸コンストラクトは、機能性バイオセンサーを提供するドメインの組み合わせ
を含むペプチド鎖の発現を仕向ける一過性発現ベクター構成要素を含む。例えば、核酸は
、カルシウム結合ドメインとトロポニンドメインとレポータードメインとの組み合わせを
含む単一のペプチド鎖を発現し得る。別の例において、核酸コンストラクトは、少なくと
も膜貫通ドメインと電位感知ドメインとレポータードメインとの組み合わせを含むペプチ
ドをコードし得る。

核酸発現コンストラクトの他の実施形態では、発現ベクターは、配列番号１、２、３、
４、５、６、及び／又は７のいずれかのペプチドをコードする配列を含む。電位バイオセ
ンサーとして機能する特定の実施形態において、ベクターは、配列番号１及び２のペプチ
ドをコードする核酸配列の組み合わせを、例えば、膜貫通ドメイン、例えばＧタンパク質
ドメイン又はイオンチャネルドメインをコードする配列と共に含み得る。かかるコンスト
ラクトは、配列番号１及び／又は配列番号２の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％
、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一の機能性ペプチド配列をコードし得る。好ま
しい実施形態において、コンストラクトは、少なくともＩ１２３、Ｒ２２０、Ｒ２２６、
Ｒ２２９、Ｒ２３５、及び／又はＲ２３８のアミノ酸を保持する配列番号１の相同体をコ
ードする。多くの実施形態において、Ｒ２３５及びＩ１２３の保存が、最適な電位センサ
ー機能の保持に特に有用であり得る。カルシウム感知バイオセンサーとして機能する他の
実施形態では、ベクターは、配列番号４、５、６、及び／又は７のペプチドをコードする
核酸配列の組み合わせを含み得る。かかるコンストラクトは、配列番号４、配列番号５、
配列番号６、及び／又は配列番号７の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％
、９５％、９８％、又は９９％同一の機能性ペプチド配列をコードし得る。

上記の発現ベクターの有用な核酸コンストラクトは、標的化タグ、例えば、ＮＬＳタグ
、脂質膜タグ、ＥＲタグ、ゴルジタグ、エンドソームタグ、ミトコンドリアタグ、及び／
又は繊毛タグなどをコードするさらなる配列を含み得る。例えば、標的化タグは、配列番
号３のペプチドタグ配列をコードする配列と少なくとも９０％同一の配列を含み得る。

本発明は、本明細書で考察されるバイオセンサーを含む細胞を含む。例えば、バイオセ
ンサーペプチドをコードする核酸コンストラクトが選択の真核細胞に形質導入又はトラン
スフェクトされ得る。好ましい実施形態において、細胞は哺乳動物、最も好ましくはヒト
に由来する。多くの実施形態において、細胞は不死化幹細胞、又は幹細胞から完全に若し
くは部分的に分化した細胞である。

本バイオセンサーとの関連において、細胞は初めにヒト患者試料から得られてもよい。
かかる細胞の利点は、それらが当該の患者にとっての活性薬剤及び条件変化に対する極め
て代表性の高い応答を提供し得ることである。従って、かかる細胞モデルは、当該の患者
にとっての候補治療薬の作用様式又は有効性に関する情報を提供する可能性が高い。例え
ば、かかる細胞モデルは、自己免疫疾患、神経系疾患、癌、糖尿病、又は遺伝的欠陥によ
る病態などの特定の病状を有する患者に個別に合わせたテーラーメイド治療を特定する助
けとなり得る。

或いは、モデルは、遺伝子工学技術によって導入される目的の特定の非内因性遺伝子を
有する細胞を用いてもよい。例えば、目的の遺伝子は、目的の受容体分子、Ｇタンパク質
共役受容体、又はイオンチャネルをコードし得る。典型的には、宿主細胞は、研究におけ
る目的の細胞型の代表性が最も高い細胞である。かかるモデル細胞は、例えばシグナル伝
達のモニタリング又は目的の遺伝子の調節に活性を有する候補薬剤のスクリーニングにお
いて、より代表性の高い結果を提供するのに有用であり得る。

細胞モデルは、生きている動物に由来する細胞の初代培養物から入手可能な誘導性細胞
から得られてもよい。例えば、線維芽細胞又は循環血液からの未分化細胞を誘導して多能
性細胞を提供することができる。細胞の状態を幹細胞、前駆細胞、又は成熟細胞に仕向け
ることにおいて後成的プロセスが中心的な役割を果たし得ることは注目に値する。Ｌｉｓ
ｔｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ ４７１（７３３６）：６８−７３，２０１１）において、種々の
異なる多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の誘導能を有する異常なエピゲノミックなプログラム化
が見出された。女性の肺線維芽細胞、脂肪細胞、及び包皮線維芽細胞が、ＯＣＴ４、ＳＯ
Ｘ２、ＫＬＦ４、及びＭＹＣ遺伝子を使用して誘導多能性状態に再プログラム化された。
ｉＰＳＣは、ＤＮＡメチル化パターンを含む多くの特徴が胚性幹細胞と類似していること
が見出された。かかる概念を用いることにより、例えば以下に記載するさらなる概日同期
化技法と組み合わせて、細胞を再プログラム化することができる。

不死化遺伝子の作用による誘導に加え、細胞シグナル伝達は、分化を左右する後成的プ
ロセスに影響を及ぼすことが見出された。Ｂａｙｌｉｎ（例えば、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８（１０）：１０３３−８，２０１０）の研究において、いく
つかのシグナル伝達経路が胚性幹細胞の誘導及び維持並びにそれらの分化に重要であると
示唆された。例えば、成長因子のシグナル伝達経路は細胞分化の後成的調節において役割
を果たし得る。これらの成長因子には、例えば、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細
胞成長因子（ＦＧＦ）、及び骨形成タンパク質が含まれる。誘導及び分化に重要な別の因
子は、Ｗｎｔシグナル伝達経路であり得る。

細胞同期に対する概日リズムの影響を、多能性（ｐｌｕｏｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ）細
胞の誘導に用いることができる。例えば、ヒト時計遺伝子及びヒトＢｍａｌ１／２／３／
４遺伝子並びにそれらのＥボックスプロモーターを使用して細胞を誘導性多能性幹細胞に
再プログラム化することができる。一態様において、かかる再プログラム化によって線維
芽細胞ｉＰＳＣを作成し、さらに、所望に応じて誘導性ニューロン（ｉＮ）、グリア細胞
、又は誘導性神経前駆細胞（ｉＮＰＣ）を提供するように仕向けることができる。各細胞
型の再プログラム化因子は、典型的には細胞系統に特異的な転写調節因子である。各因子
は、概日調節エレメント（Ｅボックスプロモーター又は人工Ｅボックス様プロモーター配
列タグなど）によって制御されるように修飾され得る。かかるプロモーター配列は各転写
調節因子に付加することができ、ひいてはヒト時計及びＢｍａｌ遺伝子によって調節され
る新規転写制御エレメントを形成し得る。

本明細書に記載されるバイオセンサーシステムを補完するため、誘導細胞を併せて「組
織」構造において、例えば三次元で培養することができる。このようにして目的の細胞間
接触を、例えば近赤外レポーターシグナルの形態で利用可能な透過イメージングを使用し
て研究することができる。例えば、ｉＮ及びｉＧの共培養を調製してニューロン構造の３
Ｄモデルを作成することができる。この構造は、例えば共焦点顕微鏡観察用に、例えばレ
ポーターシグナルに対して不透過性でない材料を使用した適切に構造化された足場を例え
ば使用して、さらに制御することができる。

モデル細胞におけるバイオセンサーを使用したスクリーニング及びアッセイ方法
例えば目的のモデル細胞となるように操作されたバイオセンサーコンストラクトは、目
的とする生命科学研究及び臨床病理学試験に関連性のあるアッセイ及びスクリーニング結
果を、より高い予測性をもって提供することができる。即ち、特定の表現型に分化した適
切な細胞型における標的化された本バイオセンサーは、例えば従来技術の異種型モデルと
比べ、モデル化された生物における通常の応答を予測する可能性がより高いモデルを提供
することができる。

モデルシステムの調製における最初のステップは、目的の細胞型及び検出するシグナル
を同定することであり得る。例えば、特定の神経学的病状を調べるため、例えばｉＰＳ細
胞から分化したモデル細胞において、電位センサーを細胞膜に標的化することを選択し得
る。或いは、モデルＣＭＬ細胞に誘導された造血芽細胞及びカルシウム感知バイオセンサ
ーコンストラクトからのシグナル伝達を使用して血液細胞癌を調べることを決定し得る。
典型的には、バイオセンサーコンストラクトは、例えばＣＭＶ構成的プロモーター又は細
胞型特異的プロモーターを使用して、細胞において一過性に発現させる。

モデルシステムが樹立されると、単一細胞において、又は細胞のアレイにわたり、バイ
オセンサーをモニタすることができる。例えば、細胞をシグナル伝達剤に曝露して、細胞
型が当該の薬剤、例えばサイトカイン又は候補小分子生物活性剤に応答するかどうかを確
かめることができる。任意選択で、細胞を目的のペプチド（例えば、腫瘍関連抗原又は癌
遺伝子）の第２の発現コンストラクトとコトランスフェクトし、シグナル伝達経路におけ
る外部遺伝子の任意の影響をモニタすることができる。

他の実施形態では、細胞は、低い、中程度の、又は高いスループットのアッセイフォー
マットに補完的なアレイに分離することができる。例えば、細胞を推定候補薬剤のライブ
ラリメンバーに別個に曝露するため、９６ウェルプレート、マイクロウェルアレイ、又は
ＦＡＣＳソーターに分注することができる。かかるアレイは標準的な蛍光検出機器を使用
してレビューすることができる。任意選択で、アレイは、デジタルＣＣＤベースのカメラ
によって写真でレビューすることができる。さらなる特徴付けのため、例えば陽性又は陰
性基準と比較したときのシグナルの変化をフラッギングすることができる。

以下の例は例示のために提供され、特許請求される本発明を限定するために提供される
ものではない。本明細書に開示される発明概念には、細胞内条件に感受性を有する特定の
バイオセンサー、そのバイオセンサーを発現する細胞、及び細胞をモニタして、例えば外
部から加えられた薬剤の活性に関連する細胞内変化を検出する方法が含まれる。

実施例１−電位センサーコンストラクト
細胞内環境で使用される電位センサーが提供される。この電位センサーは、相互作用す
る構造的特徴の組み合わせを特徴とするペプチドコンストラクトである。発現したペプチ
ドコンストラクトは、膜貫通ドメインと電位感知ドメインと蛍光レポーターとを含む。膜
貫通はセンサーを選択の細胞の脂質膜にアンカリングし得る。電位感知ドメインは、例え
ば、周囲のイオン環境の変化又はアンカー膜にわたる電位ポテンシャルに感受性を有する
極性基又はイオン基を含み得る。蛍光レポーターは、例えばコンストラクトの他のドメイ
ンのコンホメーション変化に感受性を有するように適合された蛍光ペプチド配列である。

膜貫通ドメインは、典型的には、膜の脂質と相互作用してコンストラクトをアンカリン
グする疎水性アミノ酸残基を含む。さらに、膜貫通ドメインは、併せてイオンチャネル又
は電位開口型チャネルを含む複数の膜貫通構造を提供し得る。

例示的実施形態の電位感知ドメインは、以下のペプチド配列を含む。

電位感知配列の注目すべき構造的特徴としては、低複雑度領域（アミノ酸６３〜７５）
、膜貫通ドメイン（アミノ酸１０９〜１３１）、及びイオン輸送（アミノ酸１４９〜２４
５）が挙げられる。コンホメーション応答作用に特に重要な残基としては、Ｉ１２３、Ｒ
２２０、Ｒ２２６、Ｒ２２９、Ｒ２３５、Ｒ２３８；特に残基Ｒ２３５及びＩ１２３が挙
げられる。

このコンストラクトにおいては、近赤外長波長特性フルオロフォア赤色強度が、残基Ｒ
２３５及びＩ１２３の任意の変化に特に感受性を有するはずである。感知ドメイン及び膜
貫通ドメインの（例えば、特に膜アンカー環境における）コンホメーション変化は、フル
オロフォアドメイン発光の強度（ΔＦ）及びスペクトル輪郭の測定可能な実質的変化をも
たらす。

以下は、有用な蛍光赤色レポータードメイン配列のサンプルである。

実施例２−カルシウムセンサーコンストラクト
例示的カルシウムセンサーコンストラクトの構造的特徴は、カルモジュリン結合ドメイ
ンとトロポニンドメインと蛍光レポータードメインとの相補的な組み合わせを含む。コン
ストラクトは、コンストラクトを特定の細胞内部位又は環境に標的化する１つ以上のタグ
配列をさらに含み得る。カルモジュリン様結合ドメイン及びトロポニン様ドメインを含む
ＥＦハンドドメインと、蛍光レポータードメインとのタンデムアレイの相補的な組み合わ
せ。蛍光レポーターは、例えばコンストラクトの他のドメインのコンホメーション変化に
感受性を有するように適合された蛍光ペプチド配列である。

カルシウムセンサー構成要素は以下のとおり相互作用する。ＥＦハンドドメインに対す
るカルシウム結合がペプチドコンストラクトのコンホメーション変化及び表面疎水性変化
を生じさせる。次に変化したカルシウム結合ドメインが蛍光レポータードメインと異なる
形で相互作用し、フルオロフォア（ΔＦ）発光の強度の実質的且つ測定可能な変化を引き
起こす。

例示的実施形態のカルシウム感知ドメインは、以下のペプチド配列を含む。

赤色蛍光指示薬は、以下の近赤外レポータードメイン配列を含み得る。

実施例３−標的化タグ
多くの場合、電位センサー又はカルシウムセンサーを特定の細胞内膜又はコンパートメ
ントに仕向けることが有利である。本発明のバイオセンサーは、細胞標的に親和性を有す
るように適合されたペプチドセグメントを含み得る。

バイオセンサーを所望の細胞内部位に標的化させるのに有用な例示的ペプチド配列とし
ては、例えば：
−ＮＬＳタグ（タンパク質配列）：

−ＥＲタグ：

−エンドソームタグ：

−繊毛タグ：

−ヒトエンドソーム配列タグ

−配列番号１６ ヒトシナプシンタグ：

−配列番号１７ ヒトシナプス小胞タグ：

−ＴｅｍｐｏＥｎｄｏタンパク質配列；エンドソームタグを有するＴｅｍｐｏＶｏｌ

が挙げられる。タグは（ほとんどの場合）各センサー−レポーターコンストラクトのＮ末
端側である。

実施例４−細胞の再プログラム化方法
ヒト線維芽細胞は、多能性状態に再プログラム化することができる。次にかかる細胞を
ある程度まで分化させてバイオセンサー発現用の細胞型特異的モデルシステムを提供する
ことができる。

線維芽細胞は、転写調節制御修飾と組み合わせた概日リズム（細胞同期）の誘導による
方法を用いて、約１０日の間に誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に再プログラム化される
。例えば、関連するＥボックスプロモーターを例えば使用して、ヒト時計遺伝子及びヒト
Ｂｍａｌ１／２／３／４遺伝子を用いることができる。

各再プログラム化因子は、典型的には細胞系統に特異的な転写調節因子であり、各因子
が概日調節エレメント（Ｅボックスプロモーター又は人工Ｅボックス様プロモーター配列
タグ）によって制御されるように修飾される。プロモーター配列は各転写調節因子に付加
され、ひいてはヒト時計及びＢｍａｌ遺伝子によって調節される新規転写エレメント及び
制御を形成する。

線維芽細胞は、ｉＰＳＣと同様の手法を用いて、但しそれらの系統に好適な特定の転写
因子によって、誘導性ニューロン（ｉＮ）、グリア細胞（アストロサイトを含む、ｉＧ）
、及び誘導性神経前駆細胞（ｉＮＰＣ）に再プログラム化することができる。

ｉＮ及びｉＧの共培養を実施することにより、専売のインビトロ足場を使用して、３Ｄ
モデルが作成される。

実施例５−再プログラム化された細胞のスクリーニング方法
本明細書に記載されるセンサーを再プログラム化細胞に導入し、それにより例えば細胞
内のシグナル伝達部分の相互作用をモニタすることができる。さらに、再プログラム化細
胞を候補薬剤分子に曝露して、薬剤が細胞内カルシウムレベル及び／又は細胞の電位ポテ
ンシャルに及ぼす効果をモニタすることができる。

バイオセンサーをコードする核酸は、例えば標準的な電気穿孔技法を用いて、選択の発
現用細胞に一過性に（４８時間）形質導入することができる。目的の遺伝子（ＧＰＣＲ、
チャネル、受容体等）を発現させるため、細胞に対してさらなる遺伝子修飾を実施するこ
とができる。かかる細胞は、シグナル伝達相互作用及び生物活性剤を調べるための代表性
のあるモデルとして働き得る。

一つの選択肢では、細胞は初めに患者試料から直接得られる。再プログラム化及びバイ
オセンサーの導入後、かかる細胞は、患者の応答を反映する可能性がより高いモデルシス
テム及びアッセイ結果を提供し得る。患者由来細胞の文脈では、例えば、患者線維芽細胞
を多能性にし、例えば病態の標的細胞を反映するのに望ましい程度まで分化させ得る。目
的の病態に応じて、バイオセンサーは、目的の部位に標的化され、関連する電位又はカル
シウムレベルを検出し、且つ使用する検出システムに適切なシグナルを提供するように適
合される。

別の選択肢では、目的の外部（例えば、非内因性）遺伝子が、調べようとする細胞に導
入される。例えば、受容体分子、ＧＰＣＲ、又はチャネルなどの目的の遺伝子をヒトｃＤ
ＮＡライブラリから分子クローニングした後、その遺伝子を細胞にトランスフェクトする
ことができる。バイオセンサーもまた細胞に導入され、細胞機能アッセイが実施される。
このようにして、その遺伝子のコードされたペプチドを、関連性のある細胞のユニークな
環境で調べることができる。かかるモデル細胞（例えば、異常な受容体を発現する再プロ
グラム化ヒト細胞）は、他のインビトロアッセイと比べて関連する生きている動物の結果
を反映する可能性が高いバイオセンサーシグナルを提供し得る。

以下は、典型的な実験計画である。目的の細胞がマルチウェルフォーマット（１２、２
４、４８、９６、３８４、又は１５３８ウェルフォーマット）に播種される。標準的なト
ランスフェクション手順を用いてセンサー発現コンストラクトが導入される。トランスフ
ェクションの３６〜４８時間後、センサーの発現レベルを正しく評価した後に細胞機能ア
ッセイが開始される。各実験の刺激はアッセイする受容体又はチャネルの性質及び適用さ
れる関連性のある表現型／疾患条件は何かに依存する。目的の薬剤（例えば、特定の分子
又はリガンド）が分かっている場合、それは、細胞に適用される液体溶液中に溶解される
。

薬剤の適用前にベースラインを確立し得る。典型的には励起波長は約４５０〜５７０ｎ
ｍに設定される。発光波長は典型的には約５００〜７００ｎｍの範囲である。蛍光は、露
光時間約５００ｍｓで約３秒毎にサンプリングされる。実際の蛍光応答から減算され、開
始蛍光値に対して正規化される、ベースライン蛍光レベル（例えば、２０データ点）を減
算することによりΔＦ／Ｆが計算される。細胞又は組織の目的の領域毎に、ＩｍａｇｅＪ
、Ｍａｔｌａｂ又は製造者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｔｅｃａｎ、Ｂｉｏ
Ｔｅｋ等）のソフトウェアアルゴリズムによって開発された任意の専売ソフトウェアにお
けるスクリプトを使用して、蛍光変化率が計算される。

実施例６−ヒト細胞モデルを使用したスクリーニング及び発見
本明細書に記載されるバイオセンサー及びモデル細胞システムは、どのようなフォーマ
ット及びコンテクストにおいても細胞間相互作用、シグナル伝達、及び細胞内応答のモニ
タリングに使用し得ることが想定される。例えば、以下の有用性が実現され得る。

１）ヒトｉＰＳＣ由来のものを細胞型に用いてヒト疾患モデルの２Ｄ又は３Ｄ細胞モデ
ルを作成することができ、及びバイオセンサーを使用して化学的、生物学的、薬物様、及
び毒性化合物をスクリーニングし、それにより例えば候補薬物化合物を同定及び評価する
ことができる。

２）合成され且つ遺伝的にコードされたバイオセンサーをヒト細胞におけるＣａ^２＋濃
度のレポーターとして機能するように調製し、例えば、核、細胞質、細胞膜などの細胞内
コンパートメントにおけるイベントを分析することができる。

３）合成され且つ遺伝的にコードされたバイオセンサーを、例えば、核、細胞質、又は
細胞膜などのコンパートメントにおいて、ヒト細胞の細胞電位変化のレポーターとして機
能させることができる。電位センサーは、ナトリウム（Ｎａ^＋）及びカリウム（Ｋ^＋）濃
度の変化に起因する膜ポテンシャルの変動を評価及びレポートし得る。

４）バイオセンサーは細胞型特異的様式で使用することができる。例えば、本明細書の
開示に基づき、細胞型、例えば、ドーパミン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロ
ン、アストロサイト、心筋細胞、ＨＳＣ、ＮＰＣ、ＭＳＣ、癌細胞、癌幹細胞などに対す
る特異的プロモーター配列が含まれるようにバイオセンサーを遺伝的に修飾することがで
きる。ヒト及び哺乳類細胞型は、一般に特に重要で興味深い。

５）長波長範囲（例えば、５００ｎｍ〜７５０ｎｍ範囲）でシグナルを伝達するバイオ
センサーを使用して、生物学的試料の三次元での相互作用を検出することができる。

６）以下の配列（間もなく示す予定）と少なくとも７０％の同一性で配列同一性を有す
るバイオセンサーを使用すること。

７）好都合に線維芽細胞又は血液に由来するヒト細胞モデルを使用して患者又は細胞型
に特異的な情報を提供すること。

８）血液又は線維芽細胞生検からのパーキンソン病患者由来誘導性多能性細胞（ｉＰＳ
Ｃ）を再プログラム化すると神経前駆細胞（ＮＰＣ）になる。この細胞に、電気穿孔又は
化学的トランスフェクション方法（標準）を使用して適切なバイオセンサーが導入される
。細胞をマルチウェルプレート（２４、４８、９５、又は１５００ウェルプレート）にプ
レーティングする。標準的なローディング方法によって化合物を細胞に適用する。蛍光励
起が実験の開始となる。刺激溶液に洗浄溶液が続く。測定が取られ、蛍光（ΔＦ）及び比
（ΔＦ／Ｆ）の変化が計算され、時間（ミリ秒乃至秒の時間フレーム）に対してプロット
される。或いは、単一のインテンシオメトリックレポーターを使用した計算には、ベース
ライン応答の標準化及び化学的又は生物学的化合物に応答した蛍光強度の変化の計算が必
要となり得る。

９）罹患患者及び非罹患者から、血液又は線維芽細胞生検からのレット症候群患者由来
誘導性多能性細胞（ｉＰＳＣ）が初代ニューロン、アストロサイト及びニューロンアスト
ロサイト共培養物に誘導される。この細胞に、電気穿孔又は化学的トランスフェクション
方法（標準）を使用してバイオセンサーが導入される。細胞がマルチウェルプレート（２
４、４８、９５、又は１５００ウェルプレート）にプレーティングされる。標準的なロー
ディング方法によって化合物が細胞に適用される。蛍光励起が実験の開始となる。刺激溶
液に洗浄溶液が続く。測定が取られ、蛍光（ΔＦ）及び比（ΔＦ／Ｆ）の変化が計算され
、時間（ミリ秒乃至秒の時間フレーム）に対してプロットされる。或いは、単一のインテ
ンシオメトリックレポーターを使用した計算には、ベースライン応答の標準化及び化学的
又は生物学的化合物に応答した蛍光強度の変化の計算が必要となり得る。

１０）自身の化合物（具体的には、生物学的製剤及び合成ペプチド）のライブラリの新
規スクリーニング方法を探している初期乃至中期段階のバイオ製薬会社は、新規スクリー
ニング方法を必要とする。前駆細胞（ＮＰＣ、ＭＳＣ、ＨＳＣ）が作成され、その細胞に
電位バイオセンサーが導入される。次に、細胞がマルチウェルプレート（２４、４８、９
５、又は１５００ウェルプレート）にプレーティングされる。標準的なローディング方法
によって化合物が細胞に適用される。蛍光励起が実験の開始となる。刺激溶液に洗浄溶液
が続く。測定が取られ、蛍光（ΔＦ）及び比（ΔＦ／Ｆ）の変化が計算され、時間（ミリ
秒乃至秒の時間フレーム）に対してプロットされる。或いは、単一のインテンシオメトリ
ックレポーターを使用した計算には、ベースライン応答の標準化及び化学的又は生物学的
化合物に応答した蛍光強度の変化の計算が必要となり得る。

１１）ある会社が、生理学的に関連性のある細胞環境における候補化合物の効果を、例
えば２Ｄ又は３Ｄモデルでヒト初代／由来／誘導細胞型及び共培養物を使用して評価する
新規毒性学的技法を採りたいと考える。機器には、マルチプレート蛍光リーダー（例：Ｔ
ＥＣＡＮのＭ１０００Ｐｒｏ）又はハイコンテンツ細胞イメージャ（ＧＥのＩＮ Ｃｅｌ
ｌ ６０００）が含まれ得る。

１２）ある会社が、候補化合物に最も適切な遺伝子型を決定するため（臨床第１／２／
３相試験及び評価のため）、患者由来細胞集団に対して薬物候補をスクリーニングしたい
と考える（個人化した薬剤効能）。会社は二組のカスタムサービス−初めに前駆細胞型（
ＮＰＣ、ＨＰＣ、又はＭＳＣ）を作製してスクリーニング用バイオセンサーを導入し；第
二に特異的細胞型（ニューロン、グリア、心筋細胞、肝臓等）を作製してスクリーニング
用バイオセンサーを導入するサービスの提供を受け得る。

実施例７−２Ｄ対３Ｄヒト細胞モデル
従来、２Ｄの細胞培養モデルは単層として実施される。３Ｄでのヒト細胞の培養には、
コーティング（例えば、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）コーティング又はＮｕｎｃ（登録
商標））及び時に、Ｕ字型、Ｖ字型、又はＦ字型ディッシュ底を有する特殊な細胞培養デ
ィッシュが必要である。近年、ヒト癌及び幹細胞分野における数多くの研究が３Ｄ培養の
重要性を指摘している。３Ｄ培養により、癌細胞は腫瘍をスフェロイドとして形成するこ
とが可能になる（図２１を参照のこと。学術文献の多くが、３Ｄスフェロイドは薬物化合
物に対する癌細胞応答の予測性が高いことを示唆している。従って、３Ｄスフェロイドモ
デルを使用することで、化学的化合物（薬物ライブラリにおける化学的化合物としても知
られる）に対する腫瘍応答を予測する新規の改良されたモデルが提供される。

実施例８−ＡＴＰバイオセンサー
ＡＴＰ感知は、特にミトコンドリアにおいて、細胞機能に重要である。哺乳類細胞に関
して、ＡＴＰ測定値は代謝機能を示し、これはヒト突然変異又は多型に起因する病状、シ
グナル伝達経路の破壊、又はミトコンドリア機能不全に起因する機能不全の指標となり得
る。従って、細胞レポーターとしてのＡＴＰバイオセンサーの開発には決定的な重要性が
ある。ＴｅｍｐｏのＡＴＰバイオセンサーは、ＡＴＰを感知してそれに結合するドメイン
と、６０５ｎｍ〜６３５ｎｍ（励起／発光）範囲の蛍光レポーターであるドメインとを含
む。

ＡＴＰ結合バイオセンサー、ＴｅｍｐｏＡＴＰ：

実施例９−ヘムバイオセンサー
ヘム感知は、特にミトコンドリア機能の研究、並びに癌／腫瘍低酸素研究において、細
胞機能に重要である（参考文献が必要？）。哺乳類細胞に関して、細胞代謝速度は酸素消
費量によって測定され、代謝機能を示す。細胞モデルにおける機能不全及び異常は、細胞
の疾患表現型（ヒト突然変異又は多型に起因する）、シグナル伝達経路の破壊、又はミト
コンドリア機能不全に起因し得る。従って、細胞レポーターとしてのヘムバイオセンサー
の開発には決定的な重要性がある。Ｔｅｍｐｏヘムバイオセンサーは、ヘム（アミノ酸残
基１〜２０５）を感知してそれに結合するドメインと、６０５ｎｍ〜６３５ｎｍ（励起／
発光）範囲の蛍光レポーターであるドメインとを含む。

酸素−ヘム結合バイオセンサー、ＴｅｍｐｏＨＥＭＥ

本明細書に記載される例及び実施形態は例示目的に過ぎず、それらを踏まえた様々な改
良又は変更が当業者に示唆され得るとともに、本願の趣旨及び範囲並びに添付の特許請求
の範囲に含まれるものとされることが理解される。

前述の発明は、明確さ及び理解のためいくらか詳細に記載されているが、当業者には、
本開示を読むことにより、本発明の真の範囲から逸脱することなく形式及び詳細の様々な
変更を行い得ることが明らかであろう。例えば、上記に記載される技術及び装置は全て、
様々な組み合わせで使用することができる。本願に引用される全ての刊行物、特許、特許
出願、及び／又は他の文献は、個々の各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献が
あらゆる目的から参照によって援用されることを個々に示された場合と同程度にあらゆる
目的から全体として参照により援用される。

Claims (9)

1. ヒト細胞の膜に組み込まれるのに適した膜貫通ドメイン；
   以下の配列番号１を含む、Ｎａ^＋、Ｈ^＋又はＫ^＋濃度に感受性を有する電位感知ドメイン及び
   蛍光レポーターが５００ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲の波長で蛍光を発するように適合され、以下の配列番号２を含む、蛍光レポータードメインを含み、
   前記蛍光レポータードメインが、前記電位感知ドメインの立体配座変化に応答して蛍光発光特性を変化させるように適合されている、電位センサーペプチドコンストラクト。
   

   

   
   
   
   

   
2. 請求項１に記載の電位センサーをコードする核酸コンストラクト。
3. ＮＬＳタグ及び繊毛タグからなる群から選択されるタグ配列をさらに含む、請求項２に記載の核酸コンストラクト。
4. 請求項２又は３に記載の核酸コンストラクトで形質変換された細胞。
5. ヒト細胞である請求項４に記載の細胞。
6. 前記ヒト細胞が幹細胞である請求項５の細胞。
7. 前記ヒト細胞がｉＰＳＣ由来細胞であるか、線維芽細胞又は血球細胞に由来する請求項５に記載の細胞。
8. 請求項２又は３に記載の核酸コンストラクトを含むベクター。
9. 蛍光レポーターが、６００ｎｍ〜８５０ｎｍの範囲（励起／発光）の波長である請求項１の電位センサーペプチドコンストラクト。
   

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