CN114585729A - 功能性神经调节类组装体 - Google Patents

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Abstract

人中缝核类器官或球状体(hRNS)在体外生成，其可以至少部分由人多能干(hPS)细胞生成。此类球状体模拟所述人中缝核并包含与所述人中缝核相关的特定细胞组(例如血清素能神经元)，而且可与皮质球状体(hCS)组装以形成功能性人神经调节回路。

Description

功能性神经调节类组装体
交叉引用
本专利申请案主张于2019年9月10日提交的编号为62/898,430的美国临时专利申请案的优先权，此专利中的内容全文并入本文以用于所有目的。
背景技术
哺乳动物神经调节系统由从脑干、脑桥核或基底前脑投射的离散神经元组组成，这些神经元可微调大脑功能，并与各种神经精神病症相关联。血清素、去甲肾上腺素、乙酰胆碱、多巴胺等神经调节剂可在多个时间尺度上对这些细胞起作用，相应范围从神经元和突触功能的短期调整到长期回路适应。在大脑早期发育过程中，神经调节剂通过调节细胞分裂、分化、迁移、突触发生、突触传递和树突修剪来积极参与神经系统的组装。最早到达发育中的大脑皮层的其中一种神经调节性神经支配通过源自位于脑干中线的中缝核的血清素能神经元实现。
尽管在人脑中血清素(5HT)系统仅由约50万个神经元组成，但它几乎支配着中枢神经系统的每个区域。血清素通过至少十四种不同的G蛋白偶联受体起作用，据证实，人大脑皮层中的这些受体与其他哺乳动物和灵长类动物中的相应受体有所不同。根据亚型，这些受体可发挥抑制性或兴奋性调节神经元活动的作用。
早在受孕后5周(最迟到受孕后15周)，人中枢神经系统中便会产生血清素能神经元，且中缝核中已包含定型排列的血清素神经元。重要的是，长期以来，血清素能神经传递功能障碍与重度抑郁症(MDD)相关，而许多用于MDD的药剂(例如选择性血清素再摄取抑制剂(SSRI))都是通过调节此通路来发挥作用的。SSRI是治疗MDD的一线药物。然而，很大一部分患者仍对SSRI耐药，目前尚不清楚血清素能神经元的改变是否以及如何导致这些患者对SSRI耐药。此外，血清素信号传导与多种其他神经精神病症相关联，例如精神分裂症、情感障碍、焦虑症和孤独症谱系障碍。
区域特异性脑类器官或脑球状体目前不包含神经调节系统，且目前也无人类平台来用人类患者衍生细胞研究、操纵或探究神经调节通路。
发明内容
本发明提供了用于体外生成人中缝核类器官或球状体(hRNS)的组合物和方法，其可以至少部分由人多能干(hPS)细胞生成。此类球状体模拟所述人中缝核并包含与所述人中缝核相关的特定细胞组，例如血清素能神经元、GABA能神经元等。
所述hRNS可与包含人皮质神经元(例如谷氨酸能神经元)的人大脑皮质球状体(hCS)进行功能性整合，以提供皮质-中缝核类组装体(hCS-hRNS)。人血清素能神经元在所述hRNS和hCS的神经元之间形成双向投射，以生成神经调节类组装体。所述类组装体由功能性整合的细胞(包括神经元)组成，所述细胞以生理上相关的方式相互作用，例如在神经元类别之间形成突触，以提供生理上相关的功能性神经回路。使用病毒追踪和实时成像的组合，本发明提供了有关体外生成的人皮质-中缝核神经回路形成的证据，其提供了皮质-中缝核通路建立和功能障碍的有用建模。
在一些实施例中，提供了类组装体，其中可对所述细胞中的一种或更多种进行基因修饰，以提供额外的筛选功能。例如，可对皮质神经元和血清素能神经元中的一种或两种进行基因修饰，以表达荧光钙指示剂，所述指示剂是本领域已知并使用的指示剂。可对皮质神经元和血清素能神经元中的一种或两种进行基因修饰，以表达光活化视蛋白。在一些实施例中，类组装体包含表达视蛋白的血清素能神经元以及表达荧光钙指示剂的皮质(例如谷氨酰胺能)神经元，其中所述神经元之间的功能关系通过使用光活化所述血清素能神经元，并观察皮质神经元的钙指示剂反应来证明。现有5HT谱系特异性病毒工具，例如基于AAV的FEV微型启动子驱动报告基因，并且据证实，所述病毒工具可如下用于专门探测和研究hRNS和hCS-hRNS中的5HT谱系细胞。
所述hRNS球状体和hCS-hRNS类组装体为以下各项的分析提供了独特的机会：所述中缝核与所述皮质(反之亦然)之间的血清素能神经回路的发育和功能；以及皮质神经回路的血清素能调节。此外，这些球状体或大脑区域特异性类器官和类组装体提供了用以研究神经或精神病症对这些大脑区域中的神经回路的影响的模型。特别相关的是与血清素功能障碍有关的神经或精神病症，例如MDD、精神分裂症和其他精神病、情感障碍(例如抑郁、双相障碍或焦虑症)和孤独症谱系障碍(ASD)。
此外，这些球状体和类组装体可用于建立SSRI功能筛选平台，例如，模拟SSRI和非典型抗精神病药物对所述血清素能系统的不同药理调节；分析血清素综合征等血清素能相关病症；分析子宫内SSRI对皮质发育的影响；等等。例如，在其中用钙指示剂(gCamp6或Fluo-4)或电压指示剂监测皮质神经元活动和/或用电极、光遗传学等调节血清素能神经元活动的神经调节类组装体系统中，所述系统可用于对候选药剂(例如5-HT受体(例如抗精神病药物)调节剂或5-HT转运蛋白(SSRI)调节剂)文库进行高通量测定，以测试其相较于已知活性的药物的相对生理效应(即，钙振幅、钙尖峰频率、神经元膜电压变化等)。本发明提供的模型还允许诸如通过使用来自不同人类参与者的多个类组装体来测试遗传背景的影响，所述类组装体任选地包含影响目的受体或转运蛋白功能的基因变体。由所述突触后神经元表达的5HT受体的所述组成随神经元亚型和发育年龄而变化，决定了此系统中刺激和药理学应用的效果，使得神经调节反应发生改变，例如抑制或兴奋延长，强直、自适应、簇状放电模式。与一种或更多种已知对照药剂的比较可用于确定所需反应。
另外，此系统还具有提供使用源自患者的hiPS细胞的机会的优势。这可使筛选方法能够阐明hRNS-hCS类组装体中SSRI抗性的机制，所述类组装体源于患有神经或精神病症(例如重度抑郁症(MDD))、对SSRI耐药或不耐药的患者。此外，可组合对照和患者细胞(例如对照-hCS与患者-hRNS)生成类组装体，以剖析细胞自主贡献。此平台还可用于研究与5-HT系统失调相关联的孤独症谱系障碍的遗传形式，例如16p11.2微缺失或重复以及FEV基因中罕见的致病突变。
本发明还提供了用于确定候选药剂在所述类组装体内神经回路中的活性的方法，所述方法包含使所述候选药剂与所述类组装体接触。存在于所述类组装体中的所述细胞任选地包含至少一个等位基因，所述等位基因编码与神经或精神病症相关或可能相关的突变，并确定所述药剂对形态学、遗传或功能参数的影响，所述参数包括但不限于神经元数量、神经元功能、基因表达谱、细胞死亡、单细胞基因表达(RNA-seq)、具有药理学筛选功能的钙成像、膜片钳记录、突触发生调节等。
在阅读标的方法和组合物的详细信息(详见下文)后，本发明的这些目标、优点和特征以及其他目标、优点和特征对所属领域的技术人员来说是显而易见的。
附图说明
结合附图阅读以下详细说明，可获得对本发明最全面的理解。需要强调的是，根据惯例，附图的各个特征未按比例绘制。相反，为了清楚起见，可任意扩大或缩小各个特征的尺寸。附图中包括以下图示：
图1A-1G.(A)展示了hRNS-hCS组装体的示意图(B)展示了用于衍生人中缝核样球状体(hRNS)的配方的示意图。(C)在人皮质球状体(hCS)与hRNS内发育中的后脑中表达的基因的RT-qPCR分析。不同的hiPSC系用不同的颜色表示。(D)展示了后脑祖细胞和(E)5-HT神经谱系细胞的免疫细胞化学法(ICC)的代表性图像。(F)在不同体外阶段和hiPSC系条件下通过HPLC测量hRNS中的5-HT神经递质水平。(G)体外分化后第100天时hCS中不同5-HT受体(HTR)的RT-qPCR分析。HTR亚型用颜色表示。
图2A-2C(A)来自13,708个hRNS细胞的单细胞转录组数据的UMAP投射，这些细胞收获自体外分化后第79天至第82天的3个hiPSC系衍生的9个球状体。(B)展示了hRNS中不同神经元群体的聚类标志物表达。(C)展示了具有尾部和喙部特性(上图)的单独子聚类的FEV+子聚类分析以及每个聚类中前10个差异表达基因的热图(下图)。
图3A-3C.(A)hCS和AAV-Syn1::mCherry标记的hRNS的组装体(左图)。具有用mCherry标记的hRNS细胞的hCS-hRNS类组装体的3D重建(右图)。(B)展示了hRNS-hCS类组装体中标记的NKX6-1+后脑祖细胞和TPH2+5-HT表达细胞的代表性ICC图像。(C)AAV-Syn1::mCherry标记的hCS与AAV-Syn1::eYFP标记的hRNS的组装体(左图)。展示了双向投射的双重感染hRNS-hCS的实时成像(右图)。插图展示了出现常见于前脑-投射5-HT+神经元过程中的纺锤样静脉曲张的轴突形态。
图4A-4C.(A)展示了解离的hRNS细胞上5HT谱系特异性FEV报告基因Ple67的表征的示意图(左图)、代表性免疫细胞化学图像(中图)和共定位量化情况(右图)。(B)用AAV-SYN1::mCherry标记的hCS与用AAV-Ple67iCRE和AAV-EF1α-DIO-eYFP标记的hRNS的组装体(左图)。展示了朝向hCS的5HT谱系细胞投射的受感染hRNS-hCS的实时成像(右图)。(C)用AAV-Syn1::GCaMP7s标记的hCS与用AAV-Ple67iCRE和AAV-EF1α-DIO-ChRmine-Kv2.1-mScarlet标记的hRNS的组装体(左图)和hCS神经元中由625nm光刺激hRNS中的5-HT谱系FEV+细胞引起的光诱发钙瞬态痕迹的示例(右图)。
结合附图阅读以下详细说明，可获得对本发明最全面的理解。
具体实施方式
在描述本发明的组合物和方法之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定组合物和方法，因为在实际实施中一定会存在差异。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，而无意限制本发明构思，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。
在提供数值范围的情况下，应当理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值都明确地公开。除非上下文另有明确规定，否则每个中间值应低至下限单位的十分之一。本发明涵盖了在所述范围内的任何所述值或介入值与在所述范围内的任何其他所述值或介入值之间的每个较小范围。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在所述范围内或排除在所述范围外，并且本发明也涵盖一个限值、无限值或两个限值包括在所述较小范围内的各范围，同时需遵守所述范围内任何特别排除的限值的要求。在所述范围包括一个或两个限值的条件下，排除了那些所包括限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明内。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料也可用于本发明的实施或测试中，但下文描述了一些潜在和首选的方法和材料。本文提及的所有出版物均以引用方式并入本文，以公开和描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。应当理解，当存在矛盾时，本发明内容应取代所引用出版物中的任何公开内容。
必须注意的是，如本文和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一”、“一个”和“所述/该”包括复数指代对象，除非上下文另有明确说明。因此，举例而言，“重编程因子多肽”的指代对象包括多个此类多肽，而“所述诱导性多能干细胞”的指代对象包括一种或更多种诱导性多能干细胞及所属领域技术人员已知的等效物，等等。
本文所讨论的出版物仅供在本专利的申请日之前披露。本文中无任何内容可以解释为承认由于之前的发明使得本发明无权早于此类出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要单独确认。
定义
“多能性”和多能干细胞意指此类细胞能够分化为生物体内所有类型的细胞。术语“诱导性多能干细胞”涵盖可长时间培养，同时保持分化为生物体内所有类型的细胞的能力的多能细胞(例如胚胎干(ES)细胞)，也涵盖由分化的体细胞衍生的多能细胞(不同于ES细胞)，即，潜力更窄、更明确，且在无实验操纵的情况下无法在生物体内产生所有类型的细胞的细胞。hiPS细胞具有人ES样形态，以扁平菌落形式生长，具有较大的核质比、明确的边界和明显的细胞核。此外，hiPS细胞表达本领域普通技术人员已知的若干种多能性标志物，包括但不限于碱性磷酸酶、SSEA3、SSEA4、Sox2、Oct3/4、Nanog、TRA160、TRA181、TDGF 1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26a1、TERT和zfp42。此外，所述hiPS细胞能够形成畸胎瘤。此外，它们能够在活生物体内形成或促成外胚层、中胚层或内胚层组织。
本文中使用的“重编程因子”是指作用于细胞以改变转录，从而将细胞重编程为多潜能性或多能性细胞的生物活性因子中的一种或更多种，即混合物。重编程因子可以单独或以重编程因子的单一组合物(即，预混组合物)形式提供给所述细胞，例如，来自具有心脏病家族史或目的基因构成的个体的细胞，例如成纤维细胞、脂肪细胞等。所述因子可以相同的摩尔比或以不同的摩尔比提供。所述因子可以在培养本发明的细胞的过程中提供一次或多次。在一些实施例中，所述重编程因子是转录因子，包括但不限于Oct3/4；Sox2；Klf4；c-Myc；Nanog；以及Lin-28。
体细胞与如上定义的重编程因子(其组合和数量足以将所述细胞重编程为多能性细胞)接触。重编程因子可以单独或以重编程因子的单一组合物(即，预混组合物)形式提供给所述体细胞。在一些实施例中，所述重编程因子作为载体上的多个编码序列提供。如本领域所公知，所述体细胞可以是成纤维细胞、脂肪细胞、基质细胞等。体细胞或hiPS细胞可从细胞库、正常供体、患有目的神经或精神疾病的个体等中获得。
进行多能性诱导后，根据任何适宜的方法在诸如辐照过的饲养细胞和市售培养基上培养hiPS细胞。通过用蛋白酶(例如分散酶)消化，优选地以足以从所述饲养层中分离出完整的多能干细胞集落的浓度和时间消化，可将所述hiPS细胞从饲养层中解离出来。所述球状体还可通过使用各种方法(包括板中离心等)解离成单细胞悬液和聚集体，由在无饲养层条件下生长的hiPS细胞生成。
可以出于多种目的将基因引入所述体细胞或由其衍生的所述hiPS细胞，例如，置换具有丧失功能的突变的基因、提供标志基因等。或者，引入表达反义mRNA、siRNA或核酶等的载体，从而阻断非预期基因的表达。其他基因治疗方法是引入耐药基因，使正常祖细胞具有优势并受到选择压力，例如多重耐药基因(MDR)或抗凋亡基因，例如BCL-2。如上所述，本领域已知的各种技术可用于将核酸引入所述靶细胞，例如，电穿孔、钙沉淀DNA、融合、转染、脂质体转染、感染等。引入DNA的特定方式对于本发明的实践无关紧要。
疾病相关或引起疾病的基因型可通过靶向基因操纵(CRISPR/Cas9等)在健康hiPS细胞中生成，或者hiPS细胞可源于携带疾病相关基因型或被诊断患有疾病的个体患者。此外，可在所述模型系统内研究组成不太明确或无遗传组成的神经和神经肌肉疾病。此方法的独特优势是，编辑后的hiPS细胞系与其相应的未编辑hiPS细胞系具有相同的遗传背景。这减少了与遗传背景中的系间差异相关的变异性。具有强大的遗传组成或由遗传或基因组改变直接引起的神经发育和神经精神病症以及神经疾病的情况可用本发明的系统建模。
本文所述的方法和组合物与大脑区域特异性球状体相关。大脑区域特异性球状体是类似于人脑特定区域的细胞的三维(3D)聚集体，且含有通常与该大脑区域相关的功能性神经元。这些球状体能够在悬浮培养物中保持较长时间而不粘附于表面(例如培养皿表面)，例如2周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间。功能性神经元意指神经元能够与其他神经元一起在同一球状体或另外的球状体中形成功能性突触。可使用钙成像来揭示功能性突触的形成，具体如示例中更为详细的描述所示。例如，本文所述的人中缝核球状体包含中缝核神经元，例如血清素能神经元。
本文所述的方法和组合物还与包含一个以上(例如两个或三个或更多个)的这些大脑区域特异性球状体的类组装体相关。本文所述的类组装体类似于所述大脑的多个区域，且含有一个球状体(代表一个区域)的神经元与另一球状体(代表另一区域)的神经元之间的功能性神经回路。例如，所述皮质-中缝核类组装体类似于所述人脑的所述皮质和中缝核，且含有在所述中缝核球状体与皮质球状体之间投射的神经元(例如血清素能神经元)，其中这些神经元能够与所述皮质球状体的人皮质神经元(例如谷氨酸能神经元)形成功能性突触，并调节所述皮质球状体中神经回路的活动。与所述球状体类似，这些类组装体也能够长时间保持而不粘附于表面。
中缝核。所述人中缝核是位于所述脑干内的神经元簇。大部分起源于所述中缝核的所述神经元是血清素能神经元，其投射至所述人中枢神经系统的多个位置，包括所述前脑的所述皮质、腹侧纹状体、海马体和杏仁核。所述中缝核还接收来自所述大脑皮层和其他大脑区域的连接信息。通过与这些区域和其他神经调节系统的相互作用，血清素会影响广泛的功能，例如奖励评估、冲动、伤害厌恶和焦虑状态。这些系统的损伤与多种神经精神病症有关，下文对其中一些提供了更为详细的描述。
血清素能神经元是产生神经递质血清素的神经元，也称为5-羟色胺或5-HT。这些神经元的存在可通过诸如血清素、参与所述血清素通路的酶(例如色氨酸5-羟化酶2(TPH2))和/或成熟血清素神经元的标志物(例如囊泡单胺转运蛋白2(VMAT2)和血清素再摄取转运蛋白(SERT))的表达来检测。血清素通过至少十四种不同的G蛋白偶联受体起作用，这些受体根据其亚型，可发挥兴奋性或抑制性神经元活动的作用。
本发明提供了包含血清素能神经元的体外球状体结构(也称为区域特异性类器官)和由此衍生的类组装体。血清素能神经元的存在可通过确定表达上述标志物的神经元的存在以及这些神经元产生的血清素的存在来加以验证。hRNS可以包含至少1％(占总细胞群体的百分比)的通过这些标志物界定的血清素能神经元，至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％或更多的血清素能神经元。
将hRNS与hCS融合以生成类组装体时，所述结构为皮质回路的血清素能(5-HT)调节提供了模型。血清素能神经元和皮层神经元的所述功能整合可通过双向轴突投射的存在来加以验证，通过所述投射，hCS衍生神经元的轴突投射至hRNS，hRNS衍生神经元的轴突投射至hCS。hRNS-hCS中的双向轴突投射可通过以下方式实现可视化：在组装前用神经元特异性病毒报告基因(例如适用于hCS的AAV-DJ-hSyn1::mCherrry和适用于hRNS的AAV-DJ-hSyn1::eYFP)标记hRNS和hCS，并通过长期共聚焦成像监测投射的出现。这些投射的子集有望建立突触连接。值得注意的是，除突触连接外，一些血清素能神经元在无紧密贴靠的突触后位点的情况下以弥散方式释放5-HT，使得所述释放位点远端的细胞可以与所述释放的5-HT结合(称为“容积传递”)。因此，对hCS的血清素能连接性的真实测量也可能涉及非连接神经递质传递。
回路整合的功能测定可以包括，例如，确定神经元类别之间的信号传递；并且可以包括确定神经调节系统对细胞分裂、分化、迁移、突触发生和树突修剪调节的影响。例如，在光遗传学系统中，血清素能神经元的光刺激可揭示功能性整合的皮层神经元中的反应模式，例如，响应于光刺激的钙活动增加、瞬时或在整个刺激后期间响应于光刺激的钙活动降低；等等。有多种反应可指示hRNS-hCS中的功能连接性和SSRI反应性(如上所述)。例如，可确定刺激后的钙反应，其中每个组装体的活化神经元数量可以是10个或更多、100个或更多、103个或更多。可使用具有优化成像装置的双光子(2P)系统捕获更多数量的事件。
大脑皮层。成人大脑皮层含有两大类神经元：谷氨酸能皮质神经元(也称为锥体细胞)和GABA能中间神经元。
谷氨酸能神经元。成熟的大脑皮层内含异质谷氨酸能神经元群体，可组成高度复杂的组织学架构。所谓的兴奋性神经元通常根据其胞体所在的层、基因表达的特定组合、树突形态、电生理学特性等进行分类。GABA能中间神经元是神经系统的抑制性神经元，它在神经回路和活动中起着至关重要的作用。它们因释放神经递质γ-氨基丁酸(GABA)而得名。中间神经元是特殊类型的神经元，其主要作用是调节神经网络中其他神经元的活动。皮质中间神经元因其在大脑皮质中的定位而得名。
疾病相关性。血清素能神经回路功能障碍与各种神经和精神病症有关，包括精神分裂症、情感障碍和孤独症谱系障碍(ASD)。本文所述的系统为研究这些回路在这些病症中的作用提供了独特机会，且允许筛选潜在疗法。
情感障碍是一组精神病症，也称为心境障碍，其包括抑郁、双相障碍和焦虑症。血清素活性的改变与各种心境障碍有关，选择性血清素再摄取抑制剂(SSRI)经常用作情感障碍(例如重度抑郁症(MDD))的治疗方案。血清素在情感障碍中的潜在作用尚不完全清楚，因此本文所述的系统为进一步研究其在这些病症中的作用、筛选潜在的新SSRI以及模拟SSRI与血清素能神经元之间的相互作用提供了机会。极高水平的血清素可引起称之为血清素综合征的疾病，具有毒性和潜在致命效应，也可使用本文所述的系统作进一步研究。
精神分裂症。精神分裂症是一种影响个体行为的慢性、严重的精神障碍。精神分裂症的根本原因仍不清楚，但该病症与中枢神经系统中的血清素和多巴胺信号传导异常有关。本文所述的系统为进一步研究血清素在精神分裂症中的作用以及开发潜在的治疗方法提供了机会。
孤独症谱系障碍(ASD)是一种发育障碍，影响沟通和行为并与之相关联。尽管仍不完全清楚血清素系统对ASD病理生理学的促成作用，但全血血清素升高是在ASD中发现的第一个生物标志物，并且存在于超过25％的受影响儿童中(Muller等人，“孤独症谱系障碍中的血清素系统：从生物标志物到动物模型”，神经科学，321：24-41(2016))。本文所述的系统为研究血清素在ASD中的作用提供了机会。
钙传感器。神经活动引起细胞内游离钙的快速变化，所述游离钙可用于追踪神经元群体的活动。用于此目的的本领域认可的传感器包括在钙浓度变化存在的情况下发出荧光的荧光蛋白。可通过在合适的表达载体(例如病毒载体)上包括编码序列来将这些蛋白引入细胞(例如hiPS细胞)，以对通过本文所述的方法产生的神经元进行遗传修饰。尽管也有多种其他传感器可供使用，但GCaMP是广泛使用的蛋白钙传感器，由荧光蛋白组成，例如GFP、钙结合蛋白钙调蛋白(CaM)以及与CaM相互作用的M13肽。有许多不同的蛋白可供使用，包括，例如，以下出版物中所述的蛋白：Zhao等人，(2011)科学，333：1888-1891；Mank等人，(2008)自然：方法，5(9)：805-11；Akerboom等人，(2012)神经科学杂志，32(40)：13819-40；Chen等人，(2013)自然，499(7458)：295-300；等等；第8,629,256、9,518,980、9,488,642和9,945,844号美国专利。
光遗传学整合了光学和基因工程来测量和操纵神经元。致动器是用于光活化蛋白控制的基因编码工具；例如，视蛋白和光开关。视蛋白是吸收特定波长的光的光门控离子通道或泵。视蛋白可靶向特定神经元子集并在其中表达，从而通过打开和关闭光源对这些神经元进行精确的时空控制。通道视紫红质通常通过直接刺激离子通道，使神经元在暴露于光时快速去极化。莱茵衣藻通道视紫红质-1(ChR1)由蓝光激发，并在受刺激时允许非特异性阳离子流入所述细胞。来自其他物种的ChR的示例包括：CsChR(来自Chloromonassubdivisa)、CoChR(来自Chloromonas oogama)和SdChR(来自Scherffelia dubia)。现已创造出合成变体，例如ChR2(H134R)、C1V1(t/t)、ChIEF；CheTA、VChR1、Chrimson、ChrimsonR、Chronos、PsChR2、CoChR、CsChR、CheRiff等。或者，现已创造出并发现了抑制神经元的ChR变体，例如GtACR1和GtACR2(来自隐芽植物蓝隐藻)以及变体如iChloC、SwiChRca、Phobos、Aurora。嗜盐菌视紫红质(称为NpHR，来自法老嗜盐碱单胞菌)用黄光触发时会使得所述细胞超极化，变体包括Halo、eNpHR、eNpHR2.0、eNpHR3.0、Jaws。来自苏打盐红菌的古细菌视紫红质-3(Arch)也用于抑制神经元。
本文中使用的术语“治疗”等通常是指获得期望的药理学和/或生理学作用。预防作用是指对疾病或其症状的完全或部分预防，治疗作用是指对疾病和/或疾病导致的不良反应实现部分或完全稳定或治愈。本文中使用的“治疗”涵盖了哺乳动物，特别是人体疾病的任何治疗，包括：(a)防止受试者患上疾病或出现症状，其中所述受试者可能易患上该疾病或出现该症状但尚未确诊；(b)抑制该疾病症状，即阻止其发展；或(c)缓解该疾病症状，即，使疾病或症状消退。
术语“个人”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，指的是需要诊断、治疗或疗法治疗的任何哺乳动物受试者，尤其是人类。
产生球状体和类组装体的方法
本发明提供了用于获取并使用球状体(也称为大脑区域特异性类器官)和类组装体的体外细胞培养物的方法，其中所述球状体和类组装体由人多能干细胞产生。采用多步骤流程生成人中缝核球状体(hRNS)。各种分化的球状体结构(例如hRNS和hCS)由神经祖细胞球状体分化而来。在一些实施例中，所述人多能干细胞是诱导性人多能干(hiPS)细胞。在一些实施例中，所述hiPS细胞衍生自从未受影响的个体中获得的体细胞。在其他实施例中，所述hiPS细胞衍生自从个体中获得的体细胞，其包含至少一个编码与疾病相关的突变的等位基因，所述疾病包括但不限于上述神经或精神病症。
人神经祖细胞球状体。所述神经祖细胞球状体可由多能干细胞分化而来，包括但不限于人诱导性多能干细胞、hiPS细胞。最初，hiPS细胞可从任何适宜的来源获取，或者可使用本领域认可的方法由体细胞生成。从饲养层中解离出所述hiPS细胞，将其解离成单个细胞并使其在悬浮培养物中生长，优选地在解离为完整集落时进行。在某些实施例中，所述培养物是不含饲养层的培养物，例如在玻连蛋白包被容器上生长时。所述培养物可以进一步不含非人源组分，即不含异源动物成分。所述hiPS细胞可以置于任何适合于hiPS细胞生长和扩增的培养基中培养。例如，所述培养基可以是Essential 8培养基。悬浮生长任选地包括在所述培养基中加入有效剂量的选择性Rho相关激酶(ROCK)抑制剂，用于培养初始阶段，持续至多约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约36小时、约48小时(参见，例如，Watanabe等人，(2007)自然：生物技术，25：681 686)。用于此类目的的抑制剂包括但不限于Y-27632；Thiazovivin(细胞研究，2013，23(10)：1187-200；Fasudil(HA-1077)HCl(临床研究杂志，2014，124(9)：3757-66)；GSK429286A(美国国家科学院院刊，2014，111(12)：E1140-8)；RKI-1447；AT13148；等等。在特定实施例中，使用ROCK抑制剂Y-27632。
然后将悬浮培养的hiPS细胞向神经命运诱导。此培养物可以是不含饲养层的培养物。对于神经诱导，将有效剂量的BMP抑制剂和TGFβ通路抑制剂加入所述培养基(例如Essential 8培养基)中，持续至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天，且至多约10天、至多约9天、至多约8天、至多约7天、至多约6天、至多约5天。此类抑制剂也被称为SMAD通路抑制剂。例如，可加入浓度至少约为0.1μM、至少约为1μM、至少约为5μM、至少约为10μM、至少约为50μM、至多约为100μM的有效剂量的多索吗啡(DM)，其可抑制骨形态生成蛋白(BMP)I型受体(ALK2、ALK3和ALK6)。其他有用的BMP抑制剂包括但不限于A 83-01；DMH-1；K 02288；ML 347；SB 505124；等等。SB-431542是TGFβ抑制剂，可在其浓度至少约为0.1μM、至少约为1μM、至少约为5μM、至少约为10μM、至少约为50μM、至多约为100μM的条件下以有效剂量加入，其可抑制TGFβ信号传导但对BMP信号传导无影响。其他有用的TGFβ抑制剂包括但不限于LDN-193189(临床研究杂志，2015，125(2)：796-808)；Galunisertib(LY2157299)(癌症研究，2014，74(21)：5963-77)；LY2109761(毒理学，2014，326C：9-17)；SB525334(细胞信号，2014，26(12)：3027-35)；SD-208；EW-7197；Kartogenin；DMH1；LDN-212854；ML347；LDN-193189HCl(美国国家研究院院刊，2013，110(52)：E5039-48)；SB505124；吡非尼酮(组织化学与细胞生物学，2014，10.1007/s00418-014-1223-0)；RepSox；K02288；橙皮素；GW788388；LY364947；等等。可以每天更换含有所述TGFβ抑制剂和BMP抑制剂的所述培养基。
所述培养基中可以包括有效剂量的GSK-3抑制剂。例如，可加入浓度为约0.5μM至约50μM、约1μM至约25μM、约1μM至约10μM、约1μM至约5μM、约1μM至约3μM的有效剂量的CHIR99021，或者CHIR99021的浓度可以是约1.5μM。其他有用的GSK-3抑制剂包括但不限于CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080 6-BIO、Dibromocantharelline、Hymenialdesine、靛玉红、Meridianin、Alsterpaullone、Cazpaullone、Kenpaullone等。所述GSK-3抑制剂可以与BMP抑制剂和TGFβ抑制剂同时加入所述培养基中，也可以在所述BMP抑制剂和TGFβ抑制剂加入约1、2或3天后再加入所述培养基中。例如，可以在用所述BMP抑制剂和TGFβ抑制剂培养1至2天后(例如1天后)，用GSK-3抑制剂补充所述培养基。
所述方法可以包含在包含所述BMP抑制剂、TGFβ抑制剂和GSK-3抑制剂的所述培养基中培养至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天，且至多约10天、至多约9天、至多约8天、至多约7天、至多约6天、至多约5天。例如，所述神经诱导步骤可以包含在包含BMP抑制剂和转化生长因子β(TGFβ)抑制剂的培养基中培养1至2天，例如1天，用GSK-3抑制剂补充所述培养基，并在包含所述BMP抑制剂、TGFβ抑制剂和GSK-3抑制剂的培养基中培养4至10天，例如7天。可以每天更换含有所述TGFβ抑制剂、BMP抑制剂和GSK-3抑制剂的所述培养基。
在所述培养基中培养期间，可以降低所述BMP抑制剂浓度。例如，在包含所述BMP抑制剂、TGFβ抑制剂和GSK-3抑制剂的所述培养基中培养可包含(1)在包含所述BMP抑制剂、TGFβ抑制剂和GSK-3抑制剂的培养基中培养2至5天，其中所述TGFβ抑制剂以约5μM至约20μM、约5μM至约15μM、约8μM至约12μM或约10μM的浓度存在；随后(2)在包含所述BMP抑制剂、TGFβ抑制剂和GSK-3抑制剂的培养基中培养2至5天，其中所述TGFβ抑制剂以约1μM至约5μM、约2μM至约4μM或约2.5μM的浓度存在。
人中缝核球状体。置于悬浮培养物中约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天后，将所述漂浮的神经祖细胞球状体移至神经培养基中，以分化所述神经祖细胞。示例性神经培养基是包含神经基础培养基、无维生素A的B-27补充剂和GlutaMAX补充剂的培养基。用GSK-3抑制剂、音猬因子通路激动剂和FGF4补充所述神经培养基。
GSK-3抑制剂可以如上所述。在某些实施例中，用诸如浓度为约0.5μM至约50μM、约1μM至约25μM、约1μM至约10μM、约1μM至约5μM、约1μM至约3μM，或者可以用浓度约为1.5μM的CHIR99021补充所述神经培养基。
合适的音猬因子通路激动剂包括平滑激动剂(SAG，CAS 364590-63-6)，其通过与Smo七螺旋结构域相互作用来调节所述Smo与其下游效应子的偶联(KD＝59nM)。可以在所述神经培养基中提供浓度为约10nM至约1μM、约50nM至约0.5μM、约75nM至约0.25μM或者浓度约为100nM的SAG。
在某些实施例中，用诸如浓度为约1ng/ml至约100ng/ml、约5ng/ml至约50ng/ml、约5ng/ml至约15ng/ml或约10ng/ml的FGF4补充所述神经培养基。所述FGF4可以与所述GSK-3抑制剂和音猬因子通路激动剂同时加入所述神经培养基中，或者可以在所述BMP抑制剂和TGFβ抑制剂加入至少约2天、至少约3天，且至多约10天、至多约7天、至多约6天或至多约5天后加入所述神经培养基中。例如，可以在含有所述GSK-3抑制剂和音猬因子通路激动剂的所述神经培养基中培养1至5天后(例如3天后)，用FGF4补充所述神经培养基。
使所述神经球状体分化为hRNS的步骤可以包含在包含所述GSK-3抑制剂和音猬因子通路激动剂的所述神经培养基中培养至少约2天、至少约3天，且至多约10天、至多约7天、至多约6天或至多约5天。例如，使所述神经球状体分化为hRNS的步骤可以包含在包含所述GSK-3抑制剂和音猬因子通路激动剂的神经培养基中培养2至5天(例如3天)，用FGF4补充所述神经培养基，并在包含所述GSK-3抑制剂、音猬因子激动剂和FGF4的神经培养基中培养至少1周、至少2周、至少3周、至多约5周、至多约4周或1至3周。可以每天更换含有所述GSK-3抑制剂、音猬因子激动剂和FGF4的所述培养基。
如示例所证实，例如在将悬浮培养的hiPS细胞向神经命运诱导后至少2周，组合使用GSK-3抑制剂、音猬因子通路激动剂和FGF4可形成具有高水平标志物(指示所述人中缝核)的hRNS。例如，所述hRNS可以具有驱动尾部中脑/后脑发育的高水平转录因子，例如NKX6-1、NKX2-2、OLIG2、GATA2、GATA3、LMX1B、FOXA2、EN1，但前脑标志物水平较低，例如FOXG1。用于确定转录因子表达水平的方法包括如示例中进一步描述的RT-qPCR。在一些实施例中，本文所揭示的方法进一步包含确定hRNS是否表达驱动尾部中脑/后脑发育的转录因子。使用标准统计检验计算时，与非中缝核球状体(例如皮质球状体(hCS))中的基因表达相比，具有高或低水平转录因子的hRNS可以具有明显更高或更低水平的基因表达。
为了促进神经祖细胞向神经元的分化，在将所述神经球状体转移至所述神经培养基后约1周、约2周、约3周、约4周，更换所述神经培养基，以用有效剂量的BDNF和NT3替换所述GSK-3抑制剂、音猬因子通路激动剂。可提供各自浓度为至少约0.5ng/ml、至少约1ng/ml、至少约5ng/ml、至少约10ng/ml、至多约500ng/ml、至多约250ng/ml、至多约100ng/ml、至多约20ng/ml或约10ng/ml的所述生长因子。
通常可以用有效剂量的以下促进神经元活动的药剂中的一种或更多种任选地补充此阶段的所述神经培养基：浓度为约1至25mM、约2至10mM且可以为约2.5mM的γ分泌酶抑制剂，例如DAPT；浓度为约10至500nM、约50至250nM且可以为约200nM的L-抗坏血酸；浓度为约10至500nM、约50至150nM且可以为约100nM的cAMP；以及浓度为约1μM至100μM、约5μM至约50μM、5μM至25μM或者可以为约10μM的二十二碳六烯酸(DHA)。在一些实施例中，所述神经培养基包含有效剂量的BDNF、NT3、γ分泌酶抑制剂、L-抗坏血酸、cAMP和DHA。
为了促进神经祖细胞向神经元的分化，所述神经球状体可以在包含上文所列因子的神经培养基中培养至少约1周、至少约2周、至少约3周、至多约6周、至多约5周、至多约4周、约1至约3周或约2周。所述神经培养基可以进一步包含FGF4，持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至多约10天、至多约8天、至多约6天、约2至约10天或约5天。
例如，所述促进神经祖细胞向神经元分化的步骤可以包含：(4)在神经培养基中培养悬浮培养物中的所述神经球状体2至10天，所述培养基包含FGF4以及选自由以下各项组成的群组的化合物中的至少一种：脑源性神经营养因子(BDNF)、NT-3、L-抗坏血酸2-磷酸三钠盐(AA)、N6、2'-O-二丁酰腺苷3',5'-环单磷酸钠盐(cAMP)、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA)和DAPT；以及(5)在神经培养基中培养悬浮培养物中的所述神经球状体至少1周，所述培养基包含所述至少一种化合物，无FGF4存在。
在将所述神经球状体转移至所述神经培养基后约1周、2周、4周、约5周、约6周、约7周，可在较长时间内保持所述球状体处于神经培养基中，例如1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长时间。在一些实施例中，在3个月或更长时间内保持所述球状体。可以保持所述球状体处于无生长因子存在的神经培养基中。
所述hRNS包含功能性血清素能神经元。如上所述，大部分起源于所述人中缝核的神经元是血清素能神经元，其投射至所述人中枢神经系统的多个位置，包括人皮质区域。所述血清素能神经元的存在可通过诸如使用免疫组化等方法确定血清素、参与所述血清素通路的酶(例如色氨酸5-羟化酶2(TPH2))和/或成熟血清素神经元的标志物(例如囊泡单胺转运蛋白2(VMAT2)和血清素再摄取转运蛋白(SERT))的表达来检测。所述神经元的所述功能可通过监测神经元活动来确定，例如对Ca2+活动进行成像。
人皮质球状体。hCS可以通过前文描述的方法生成，例如以下出版物中所述的方法：Pasca等人，(2015)自然：方法，12(7)：671-678，标题为“3D培养中来自人多能干细胞的功能性皮质神经元和星形胶质细胞”，该出版物中的内容以引用方式并入本文。
例如，如上所述，培养悬浮培养的hiPS细胞，以提供神经祖细胞球状体。置于悬浮培养物中约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天后，将所述漂浮的神经祖细胞球状体移至神经培养基中，以分化所述神经祖细胞。用有效剂量的FGF2和EGF补充所述培养基。可提供各自浓度为至少约0.5ng/ml、至少约1ng/ml、至少约5ng/ml、至少约10ng/ml、至少约20ng/ml、至多约500ng/ml、至多约250ng/ml、至多约100ng/ml的所述生长因子。
为了促进神经祖细胞向包含谷氨酸能神经元的hCS的分化，在FGF2/EGF暴露后约1周、约2周、约3周、约4周，更换所述神经培养基，以用有效剂量的BDNF和NT3替换所述FGF2和EGF。可提供各自浓度为至少约0.5ng/ml、至少约1ng/ml、至少约5ng/ml、至少约10ng/ml、至少约20ng/ml、至多约500ng/ml、至多约250ng/ml、至多约100ng/ml的所述生长因子。所述皮质球状体包含功能性谷氨酸能神经元。
类组装体。所述hRNS可与单独培养的人皮质球状体(hCS)进行功能性整合，以形成包括谷氨酸能神经元和血清素能神经元的皮质-中缝核类组装体(hCS-hRNS)。由此得到的hCS-hRNS含有位于所述皮质与中缝核之间的神经回路，并对这些回路进行功能整合。例如，所述功能性整合的细胞以生理上相关的方式相互作用，例如形成突触、传递信号、形成多细胞结构等。
在允许细胞融合的条件下，在神经培养基中将所述皮质球状体与所述人中缝核球状体共培养。允许细胞融合的条件可以包括使所述hRNS和hCS紧靠进行培养，例如彼此直接接触。
培养约30天、约60天、约90天后(适用于hRNS)；培养约30天、约60天、约90天后(适用于hCS)，可以用球状体进行组装。可以将所述hRNS和hCS球状体共培养2天、3天、5天、8天、10天、14天、18天、21天或更长时间。可以在神经培养基中进行组装。据证实，由此得到的皮质-中缝核类组装体含有功能性神经回路，其中所述类组装体包含皮质与中缝核球状体之间的双向投射，并且所述中缝核球状体的所述血清素能神经元能够调节皮质神经回路的活动。用于确认所述神经元的所述功能的方法是本领域已知的方法，并且包括光遗传学方法和神经元中钙活动成像，例如示例中描述的方法。在一些实施例中，所述方法可以包含确认所述皮质-中缝核类组装体中的神经元的功能。
筛选测定
本文还公开了涉及确定候选药剂对所述球状体(例如hRNS)、类组装体(例如hCS-hRNS)或由其衍生的细胞的影响的筛选测定。候选药剂可以是小分子或遗传因子。所述筛选测定可以涉及使所述候选药剂与所述球状体、类组装体或由其衍生的细胞接触，并确定所述候选药剂对所述球状体、类组装体或细胞的参数的影响，其中此类参数包括形态、基因或功能变化。
例如，筛选测定可以涉及确定候选药剂(例如SSRI抑制剂)对球状体或类组装体内神经回路功能的影响。如本文所述，据证实，hCS-hRNS类组装体包含在hCS-hRNS之间双向投射的神经元，且hRNS的所述血清素能神经元能够调节皮层神经回路的功能，如病毒标记和钙成像与光刺激的组合所揭示。因此，所述筛选测定可以涉及确定候选药剂能否改变血清素能神经元调节所述hCS中所述皮质神经回路的功能的能力。
另外，如本文所述，各种疾病和病症与血清素能功能障碍有关。因此，在所述球状体或类组装体包含至少一个与神经或精神病症、精神分裂症、情感障碍(例如，MDD、双相障碍或焦虑症)和孤独症谱系障碍(ASD)相关的等位基因的情况下，可能尤其适用本文所述的测定。能够诸如使包含这些病症相关等位基因的球状体或类组装体中神经回路(例如皮质神经回路)的功能恢复的候选药剂在所述病症的治疗中可能具有治疗效用。
此外，本文所述的类组装体可用于剖析这些病症中的细胞自主贡献。例如，可生成类组装体，其中一个球状体(例如hRNS或hCS)源于患有本文所述的病症的患者，而另一球状体源于未受影响的个体，即未患有同种病症的受试者。例如，在由第一和第二人多能干细胞生成类组装体的方法中，所述第一或第二人多能干细胞可包含至少一个与神经或精神病症相关的等位基因。
神经活动引起细胞内游离钙的快速变化。因此，利用这一点的钙成像测定可用于确定神经元回路的功能。这可能涉及修饰神经元以含有基因编码的钙指示蛋白，使得所述蛋白包括荧光团传感器GCaMP并对这些细胞进行成像。GCaMP包含循环排列的绿色荧光蛋白、钙结合蛋白钙调蛋白(CaM)以及与CaM相互作用的M13肽，其中所述GFP的亮度在钙结合后有所增加。有关钙成像测定的进一步详情请见以下出版物：Chen等人，(2013)自然，499(7458)：295-300。其他钙成像测定包括Fura-2钙成像、Fluo-4钙成像和Cal-590钙成像。
例如，可以修饰所述神经元以表达GCamP6f。这可与响应于外部刺激而活化某些神经元的方法相结合，例如响应于光而活化神经元的光遗传学方法。例如，为了测试神经回路中涉及的两种神经元之间的功能，可修饰“第一”神经元以表达光遗传学致动器(例如ChrimsonR)，并且可修饰“第二”神经元以表达钙指示剂(例如GCamP6f)和用于监测钙释放的成像。如果所述第一神经元与所述第二神经元进行功能性连接(突触连接)，则所述第一神经元的光遗传学活化将影响细胞内钙水平以及所述第二神经元的可见读数。
如上所述，血清素可引起各种不同的反应，这可能取决于血清素所作用的受体。因此，确定血清素能神经元调节皮质神经回路的能力的方法可以包含用光遗传学致动器(例如ChrimsonR)标记所述hRNS的细胞，用钙指示剂标记所述hCS的细胞，刺激所述hRNS-hCS类组装体中所述hRNS的细胞，并确定所述类组装体内所述hCS的细胞中钙活动是增加还是减少。此类增加或减少可以是瞬时的，也可以在整个刺激后期间发生。如本文中的示例所述，此类方法用于确认所述hRNS-hCS类组装体中皮质神经回路的血清素能调节。为了确定候选药剂对此血清素能调节的影响，此光遗传学方法可在候选药剂存在和不存在的情况下进行，并比较两种条件下的结果。
另外受人关注的是单细胞水平下的分析方法，例如如上所述：实时成像(包括共聚焦或光片显微镜检查)、单细胞基因表达或单细胞RNA测序、钙成像、免疫细胞化学、膜片钳、流式细胞术等。可测量各种参数，以确定药物或治疗对所述球状体、类组装体或由其衍生的细胞的影响。例如，构成所述球状体或类组装体的细胞的单细胞RNA测序可用于表征这些细胞的特性，并且可用于旨在确定候选药剂是否影响细胞命运的测定中。
参数是细胞的可量化组分，尤其是可以在高通量系统中准确测量的组分。参数还可以是任何细胞组分或细胞产物，包括细胞表面决定因素、受体、蛋白或其构象或翻译后修饰、脂质、碳水化合物、有机或无机分子、核酸(例如，mRNA、DNA等)或源自此类细胞组分的部分或其组合。虽然大多数参数会提供定量读数，但在一些情况下，半定量或定性结果是可接受的。读数可以包括单个确定的值，也可以包括平均值、中值或方差等。相应值预计会发生变化，并且采用标准统计方法和用于提供单个值的常用统计方法来获取测试参数组中各参数的值范围。
目的参数包括细胞质、细胞表面或分泌的生物分子、生物聚合物的检测，例如多肽、多糖、多核苷酸、脂质等。细胞表面和分泌的分子是优选的参数类型，因为它们介导细胞通讯和细胞效应子反应，并且可以更轻易地进行测定。在一实施例中，参数包括特异性表位。经常使用特异性单克隆抗体或受体探针鉴定表位。在一些情况下，包含所述表位的所述分子实体来自两种或更多种物质，并且包含确定的结构；示例包括与异二聚体整联蛋白相关的用组合方法确定的表位。参数可以是特异性修饰的蛋白或寡糖的检测。参数可以由特异性单克隆抗体或配体或受体结合决定簇来定义。
目的候选药剂是涵盖许多化学类别的生物活性剂，主要是有机分子，其可以包括有机金属分子、无机分子、基因序列等。本发明的重要方面是评价候选药物、选择具有优选生物反应功能的治疗性抗体和基于蛋白的治疗手段。候选药剂包含与蛋白进行结构相互作用(尤其是氢键结合)所必需的官能团，且通常包括至少一个氨基、羰基、羟基或羧基，经常包括至少两个官能化学基团。所述候选药剂通常包含被一个或更多个上述官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳族或多芳族结构。候选药剂还可以源自于包括肽、多核苷酸、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或其组合的生物分子。
其还包括药理活性药物、遗传活性分子等。目的化合物包括化疗剂、抗炎剂、激素或激素拮抗剂、离子通道修饰剂和神经活性剂。适用于本发明的药物制剂的示例是以下出版物中描述的药物制剂：“治疗学的药理学基础”，Goodman和Gilman，McGraw-Hill，纽约州纽约市，(1996)，第九版，以下章节：作用于突触和神经效应器连接部位的药物；心血管药物；维生素，皮肤科；以及毒理学，所有内容均以引用方式并入本文。
与本文所述的组合物和方法结合使用的重要的候选药剂类别是选择性血清素再摄取抑制剂(SSRI)。SSRI是一类药物，通常用作治疗重度抑郁症(MDD)和焦虑症的抗抑郁药。SSRI通常通过限制血清素再吸收来增加细胞外血清素水平，从而发挥作用。已知的SSRI的示例包括西酞普兰、依他普仑、氟西汀、氟伏沙明、帕罗西汀、舍曲林、达泊西汀。除研究这些已知SSRI的作用外，本文所述的系统还可用作筛选测定的一部分，以发现新的SSRI。
受试化合物包括上述所有类型的分子，并且可以进一步包含未知含量的样本。受人关注的是源自天然来源(例如植物)的天然存在的化合物的复杂混合物。虽然许多样本包含化合物溶液，但也可以测定可溶于合适溶剂中的固体样本。目的样本包括环境样本，例如地下水、海水、采矿废弃物等；生物学样本，例如用作物、组织样本等制备的裂解物；制造样本，例如药品制备过程中的时间进程；以及为分析制备的化合物文库；等等。目的样本包括正在评估潜在治疗价值的化合物，即候选药物。
术语样本还包括已向其中加入额外组分的上述流体，例如影响离子强度、pH、总蛋白浓度等的组分。此外，可对所述样本进行处理，以实现至少部分分级分离或浓缩。如果注意减少所述化合物的降解，则可以将生物学样本储存在氮气下、将其冷冻储存或其组合等。所用样本的体积足以进行可测量的检测，通常约0.1至1ml的生物学样本便已足够。
化合物(包括候选药剂)可从各种来源处获得，包括合成或天然化合物文库。例如，许多手段可用于各种有机化合物(包括生物分子)的随机和定向合成，包括随机寡核苷酸和寡肽的表达。或者，可获得或轻易产生呈细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库。此外，天然或合成产生的文库和化合物可通过常规化学、物理和生化手段轻易地加以修饰，且可用于产生组合文库。已知药剂可以进行直接或随机的化学修饰(例如，酰化、烷化、酯化、酰胺化等)，以生成结构类似物。
本文中使用的术语“遗传因子”是指多核苷酸及其类似物，其中在本发明的筛选测定中通过向细胞中加入所述遗传因子来测试所述遗传因子。所述遗传因子的引入使得所述细胞的总遗传组成发生改变。遗传因子(例如DNA)可使得细胞基因组发生实验引入的变化，通常通过将所述序列整合到染色体中进行，例如使用CRISPR介导的基因组工程(参见，例如，Shmakov等人，(2017)自然综述：微生物学，15：169)。基因变化也可以是瞬时变化，其中所述外源序列未整合，而是作为附加体保持。遗传因子(例如反义寡核苷酸)还可通过干扰mRNA的转录或翻译，在不改变细胞基因型的情况下影响蛋白的表达。遗传因子的作用是使所述细胞中一种或更多种基因产物的表达增加或减少。
编码多肽的表达载体的引入可用于在缺乏所述序列的细胞中表达所述编码产物，或过表达所述产物。可使用各种组成型或受外部调节的启动子，其中在后一种情形中，可开启或关闭基因转录。这些编码序列可以包括全长cDNA或基因组克隆、由其衍生的片段或将天然存在的序列与其他编码序列的功能或结构域组合的嵌合体。或者，所述引入的序列可以编码反义序列；为反义寡核苷酸；RNAi，编码显性负突变，或天然序列的显性或组成性活性突变；改变的调节序列等。所述表达载体可以是病毒载体，例如腺相关病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒、甲病毒、黄病毒、弹状病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、痘病毒和小核糖核酸病毒载体。
可通过本领域已知的方法化学合成反义和RNAi寡核苷酸。利用其本身的磷酸二酯结构对优选寡核苷酸进行化学修饰，以便增加其细胞内稳定性和结合亲和力。文献中已记载了许多这样的修饰，其改变骨架、糖或杂环碱基的化学性质。骨架化学法中有用的变化是硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，其中两个非桥连氧都被硫、亚磷酰胺、烷基磷酸三酯和硼酸磷酸酯取代。非手性磷酸酯衍生物包括3'-O'-5'-S-硫代磷酸酯、3'-S-5'-O-硫代磷酸酯、3'-CH2-5'-O-膦酸酯和3'-NH-5'-O-磷酰胺。肽核酸用肽键替代整个核糖磷酸二酯骨架。糖修饰也用于增强稳定性和亲和力，例如吗啉代寡核苷酸类似物。
用不同浓度的药剂并行进行多项测定，以获得对各种浓度的不同反应。如本领域所公知，确定药剂的有效浓度通常使用由1:10或其他对数比例的稀释液得到的浓度范围。如有必要，可以使用第二系列稀释液进一步细化浓度。通常，这些浓度中的其中一种用作阴性对照，即零浓度或低于所述药剂的检测水平，或处于或低于不会发生可检测的表型变化的药剂浓度。
除上述功能参数外，还可利用各种方法来量化选定参数的存在。为了测量存在的分子的量，适宜的方法是用可检测的部分标记分子，所述部分可以是荧光的、发光的、放射性的、具有酶活性的等，尤其是以高亲和力与所述参数特异性结合的分子，荧光部分可随时用于标记几乎任何生物分子、结构或细胞类型。免疫荧光部分不仅可与特异性蛋白结合，还可与特异性构象、裂解产物或磷酸化等位点修饰结合。可对单独的肽和蛋白进行工程改造以发出荧光，例如通过将其表达为细胞内的绿色荧光蛋白嵌合体实现(有关综述，请参见Jones等人，(1999)生物技术动向，17(12)：477-81)。因此，可对抗体进行基因修饰，以提供荧光染料作为其结构的一部分
根据选择的标记，可以使用荧光标记以外的方法、免疫测定技术(例如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸光度测定(ELISA)、均质酶免疫测定)以及相关的非酶技术测量参数。这些技术利用特异性抗体作为报告分子，由于其对附着于单个分子靶标的高度特异性，因此尤为有用。第4,568,649号美国专利描述了配体检测系统，所述系统采用了闪烁计数。这些技术对于蛋白或修饰的蛋白参数或表位或碳水化合物决定簇而言尤为有用。可使用荧光或其他标记的报告分子获得蛋白和其他细胞决定体的细胞读数。基于细胞的ELISA或相关的非酶或基于荧光的方法能够测量细胞表面参数和分泌参数。Capture ELISA和相关的非酶方法通常采用两种特异性抗体或报告分子，可用于测量溶液中的参数。流式细胞术方法可用于测量细胞表面和细胞内参数，以及形状变化和粒度，并且可用于分析用作抗体或探针连接试剂的磁珠。此类测定的读数可以是与单独的荧光抗体检测细胞表面分子或细胞因子相关的荧光平均值，或者是平均荧光强度、中值荧光强度、荧光强度的变化或这些值之间的某种关系。
本领域使用单细胞多参数和多细胞多参数多重测定，其中鉴定了输入细胞类型，并通过定量成像以及荧光和共聚焦显微镜检查读取参数，详情请参见共聚焦显微镜检查法和方案(分子生物学方法第122卷)。Paddock，编辑，Humana Press，1998。这些方法请见1999年11月23日发布的第5,989,833号美国专利。
可将测定结果输入数据处理器中，以提供数据集。算法用于比较和分析在不同条件下获得的数据。通过确定多个参数的变化来读取因素和药剂的影响。所述数据将包括来自用所述药剂进行的测定组合的结果，并且还可以包括对照状态、模拟状态以及来自使用其他药剂或在其他条件下进行的其他测定组合的结果中的一种或更多种。为了快速轻松地进行比较，所述结果可以在图表中直观地呈现，并且可包括数字、图表、颜色表示等。
所述数据集是由通过以下方式获得的值编制而成：在不同细胞(例如基因修饰细胞、在影响神经元功能的特定因素或药剂存在的情况下培养的细胞)存在和不存在的情况下测量参数，将目的药剂的存在情况与至少一种其他状态进行比较，通常是对照状态，其可以包括无药剂或含有不同药剂的状态。所述参数包括功能状态，例如响应于刺激的突触形成和钙离子，其水平在所述因素存在的情况下会有所不同。理想的是，相对于标准(通常是“对照值或状态”)将所述结果归一化，以提供归一化的数据集。从测试条件中获得的值可通过以下方式实现归一化：从所述实测值中减去未受刺激的对照值，将校正的实测值除以校正的刺激对照值。还可使用其他归一化方法；并且可以使用实测值的对数或其他导数或实测值与刺激值或其他对照值的比率。在对照条件下，相对于相同细胞类型的对照数据将数据归一化，但数据集可以包含来自一种、两种或多种细胞类型和测定条件的归一化数据。
所述数据集可包含在不同测定组合下获得的参数组的水平值。编制了为足够数量的替代测定组合提供值以允许比较值的汇编。
数据库可基于实验组进行汇编，例如，数据库可含有从一组测定组合中获得的数据，具有多种不同的环境变化，其中每项变化可以是一系列相关的化合物，也可以是代表不同类别的分子的化合物。
数学系统可用于比较数据集，并定量测量它们之间的相似性和差异性。例如，可通过使用统计分析(相关系数等)以量化相关性的模式识别算法或聚类方法(例如分层或k均值聚类等)来分析所述数据集。可修改这些方法(通过加权、采用分类策略等)，以优化数据集区分不同功能效应的能力。例如，在分析数据集时，可向各个参数或多或少地赋予权重，以增强分析的判别能力。评估改变分配给每个参数的权重的效果，并使用迭代过程来优化通路或细胞功能区分。
从受试化合物中获得的数据集与参考数据集的比较通过使用合适的推导方案、AI系统、统计比较等来完成。优选地，将所述数据集与参考数据的数据库进行比较。与涉及已知通路刺激或抑制剂的参考数据的相似性可提供对由受试刺激或药剂靶向或改变的细胞通路的初始指示。
可汇编参考数据库。这些数据库可以包括来自套组的参考数据，所述套组包括靶向特定通路的已知药剂或药剂组合，同时包括来自在环境条件下处理的细胞的分析的参考数据，其中删除或专门改变了单个或多个环境条件或参数。参考数据还可以基于含有细胞的套组生成，所述细胞具有选择性靶向或调节特定细胞通路的遗传构建体。通过这种方式，开发可揭示各个通路对复杂反应的贡献的数据库。
模式搜索算法在分类中的有效性可涉及参数数量和测定组合的优化。所揭示的用于选择参数的技术提供了得到生理相关输出的计算要求。此外，这些使用细胞活动和疾病相关生物信息预过滤数据集(或潜在数据集)的技术提高了从数据库检索返回的输出与预测药剂机制和体内药剂效果相关的可能性。
为了开发用于生物活性药物化合物或其他干预措施选择及分类的专家系统，采用以下程序。对于每种参考和测试模式，通常会生成数据矩阵，其中所述数据矩阵中的每个点对应于参数的读数，其中每个参数的数据可以来自于重复测定，例如相同类型的多个独立细胞。如前所述，数据点可以是定量的、半定量的或定性的，这取决于所述参数的性质。
读数可以是与测量相关的平均值、平均数、中值、方差或其他统计学或数学导出的值。通过直接比较相应的参考读出，可以进一步细化参数读数信息。在相同条件下针对各项参数获得的绝对值将显示出活生物体所固有的变异性，还可以反映出个体细胞变异性以及个体之间固有的变异性。
分类规则是基于从多次重复实验中获得的训练数据集(即数据矩阵)构建的。选择分类规则，以便正确识别重复参考模式并成功区分不同的参考模式。分类规则学习算法可以包括决策树方法、统计方法、朴素贝叶斯算法等。
知识数据库将具有足够的复杂性，以便有效识别新的受试数据并分类。用于生成一组充分涵盖的分类模式的若干种方法以及用于区分它们的足够强大的数学/统计方法可以实现这一点。
来自用已知与特定靶标或通路相互作用的特异性药物处理的细胞的数据提供了一组更为详细的分类读数。基于使用过表达技术和反义技术进行基因修饰的细胞生成的数据允许测试单个基因对表型的影响。
优选知识数据库含有来自优化细胞、环境和参数组的参考数据。对于复杂的环境，知识数据库还可以包括反映环境微小变化的数据，例如其中一种或更多种目的因子或细胞类型被排除在外或包括在内或定量改变的环境，例如浓度或暴露时间等
对于在实践本发明时有用的一般技术的进一步阐述，从业者可参考细胞生物学、组织培养、胚胎学和神经生物学方面的标准教科书和综述。对于组织培养和胚胎干细胞，读者不妨参考畸胎癌和胚胎干细胞：一种实践方法(E.J.Robertson，编辑，IRL Press Ltd.，1987)；小鼠发育技术指南(P.M.Wasserman等人编辑，Academic Press，1993)；胚胎干细胞体外分化(M.V.Wiles，酶学方法，225：900，1993)；胚胎干细胞的特性和用途：应用于人类生物学和基因治疗的前景(P.D.Rathjen等人，生殖、生育力和发育，10：31，1998)。
分子学和细胞生物化学的一般检查方法可参阅以下标准教材：分子克隆：实验室手册，第3版(Sambrook等人，Harbor Laboratory Press 2001)；精编分子生物学实验指南，第4版(编辑：Ausubel等人，John Wiley&Sons 1999)；蛋白质方法(Bollag等人，JohnWiley&Sons 1996)；用于基因治疗的非病毒载体(编辑：Wagner等人，Academic Press1999)；病毒载体(编辑：Kaplift和Loewy，Academic Press 1995)；免疫学方法手册(编辑：I.Lefkovits，Academic Press 1997)；细胞与组织培养：生物技术实验室程序(Doyle和Griffiths，John Wiley&Sons 1998)。本发明中提及的用于基因操纵的试剂、克隆载体和试剂盒可从商业供货商处获得，例如，BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich和Clontech。
本说明书中引用的每份出版物均出于所有目的通过引用方式全文并入本文中。
提出以下示例是为了向本领域普通技术人员完整地公开并叙述构建及使用本发明的方法，并且无意限制发明人所认为其发明的范围，也无意表示以下实验是全部或唯一进行的实验。已经努力确保所使用数字(例如数量、温度等)的准确性，但是应该考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份数，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，压力指大气压或接近大气压。
实验
本发明描述了使用人多能干细胞(hPSC)研究功能性神经调节系统，以生成三维(3D)类组装体的新方法，所述类组装体含有与模拟中缝核的类器官偶联的前脑类器官，并且能够发送血清素能投射。我们首先生成了hPSC衍生的中缝核球状体(hRNS)，其中包括功能性血清素能神经元以及中缝核的其他常驻细胞类型。人大脑皮质球状体(hCS)(包括各种皮质层的锥体谷氨酸能神经元)与hRNS组装得到hRNS-hCS类组装体，其中存在位于皮质与中缝核之间的双向投射。我们将单细胞RNA测序、病毒标记和钙成像与光刺激相结合，展示了皮质回路血清素能调节的体外人类细胞模型，该模型可用作了解这些回路组装的平台，其对MDD、孤独症谱系障碍和精神分裂症等病症进行了建模，并进行了药物筛选以鉴定出靶向这种神经调节通路的更好药物。
示例1
方法
人中缝核球状体(hRNS)的生成。将人多能干细胞(hPSC)置于补充有青霉素和链霉素(1:100，Gibco，15140122)的Essential 8培养基(Life Technologies，A1517001)中包被有重组人玻连蛋白(VTN-N，Life Technologies，A14700)的六孔板上。为了生成hRNS，将hiPSC与Accutase(Innovate Cell Technologies，AT-104)在37℃下一起孵育7分钟并解离成单细胞。在补充有ROCK抑制剂Y-27632(10μM，Selleckchem，S1049)的Essential 8培养基中，向每个AggreWell 800(STEMCELL Technologies，34815)孔中加入约300万个单细胞，以100g的离心力离心3分钟以捕获微孔中的细胞，并置于37℃和5％CO2条件下孵育。24小时后，我们通过(用P1000吸头的切端)稳定地上下移取孔中的培养基，并将其转移至补充有多索吗啡(2.5μM，Sigma-Aldrich，P5499)和SB-431542(10μM，Tocris，1614)的Essential 6培养基(Life Technologies，A1516401)内的超低附着力塑料培养皿(Corning，3262)中，从而从每个微孔中收集球状体。从第2天至第8天，每天更换培养基并补充多索吗啡、SB-431542(第2天至第5天：10μM，第5天至第8天：2.5μM)和GSK-3抑制剂CHIR 99021(1.5μM)。
第6天，将神经球状体转移至含有Neurobasal A(Life Technologies，10888)、无维生素A的B-27补充剂(Life Technologies，12587)、GlutaMax(1:100，LifeTechnologies，35050)以及青霉素和链霉素的神经培养基中。从第5天至第15天，每天更换神经培养基并补充CHIR 99021(1.5μM)和平滑激动剂SAG(100nM)。从第8天至第20天，还用成纤维细胞生长因子4(FGF4，10ng/mL)补充神经培养基。
为了促进分化，从第16天至第30天，每隔一天更换一次神经培养基，并补充BDNF(10ng/mL)、NT-3(10ng/mL)、IGF-1(10ng/mL)、cAMP(100nM)、L-抗坏血酸(200μM)和二十二碳六烯酸(DHA，10μM)。展示了不同配方的示意图如图1A所示。为了表征hRNS中的细胞多样性，我们根据供应商的建议在第42天对解离的hRNS进行了单细胞转录组学操作(10x基因组学，120262)。为了量化hRNS中的血清素释放，在不同时间点快速冷冻2-3个完整hRNS/个时间点/个hiPS细胞系并作相应处理，以便进行高效液相层析(HPLC)。对于血清素解笼锁实验，使用NPEC笼锁血清素(Tocris，3991)，使其最终浓度为50μM。Leica SP8共聚焦显微镜的FRAP模块用于使用UV光(405nm)实现谷氨酸盐解笼锁。
皮质-中缝核类组装体(hCS-hRNS)的生成。(图1A)为了生成皮质-中缝皮质-中缝核类组装体(hCS-hRNS)，分别生成hCS和hRNS，然后通过将其彼此紧靠放置在培养箱内1.5ml微量离心管中3天进行组装。用于组装的神经培养基含有neurobasal-A、无维生素A的B-27补充剂、GlutaMax(1:100)、青霉素和链霉素(1:100)。在第2天，小心更换培养基。在第3天，使用切割的P1000移液器吸头将类组装体置于上述神经培养基内的24孔超低附着力培养板中。此后，每3-4天更换一次培养基。用前述方法13,14生成hCS。在第45天至第60天之间进行组装。对于一些实验，在组装前七至十天用AAV-DJ1-hSyn1::YFP对hCS或hRNS进行病毒标记。对于光遗传学光刺激实验，用AAV1-hSyn1::ChrimsonR-tdTomato病毒标记hRNS，并与上述表达EF1a-GCaMP6的hCS组装在一起。
示例2
功能性hRNS的生成
为了详细说明类似于中缝核的球状体(类器官)，聚集在微孔中的hPSC首先通过对神经外胚层的双重SMAD抑制实现模式化，然后暴露于CHIR、SHH激动剂SAG和FGF4(图1B)中。在模式化后第15天，通过RT-qPCR和免疫细胞化学法进行的基因和蛋白表达分析显示，驱动尾部中脑/后脑发育的转录因子上调(NKX6-1、NKX2-2、OLIG2、GATA2、GATA3、LMX1B、FOXA2、EN1；图1C、D)，前脑标志物FOXG1下调(图1C)。
第52天的免疫细胞化学显示存在血清素能神经元，其通过5-羟色胺(血清素，5-HT)以及血清素合成通路中的主要酶中的其中一种——色氨酸5-羟化酶2(TPH2)表征。成熟血清素能神经元的核心分子表型包括囊泡单胺转运蛋白2(VMAT2)，它将5-HT包装入突触小泡和血清素再摄取转运蛋白SERT，并回收细胞外5-HT15。第52天的免疫细胞化学揭示了hRNS中SERT和VMAT2均呈阳性的细胞(图1E)。接下来，我们使用HPLC来测量hRNS中的5-HT释放。在三个不同的时间点和细胞系中，我们一致地测量了hRNS中的5-HT，范围为20-175ng/mL/mg蛋白，而对于hCS，我们在任何时间点均未检测到5-HT，表明hRNS模式化对中缝核的特异性(图1F)。接下来，研究了hCS中十一种5HT促代谢型受体(HTR)的基因表达谱。我们观察到兴奋性Go/Gs/G11偶联(粉红色，HTR2a，HTR6，HTR2c)和抑制性Gi/Go偶联(绿色，HTR1b，1d)的组合在第100天时于hCS中表达(图1G)。
为了探究hRNS中细胞类型的多样性，我们在第79-82天进行了hRNS的单细胞转录组学操作。hRNS细胞的无监督聚类揭示了大量表达5HT谱系标志物中典型标志物的后脑谱系神经元(“5HT神经元”)以及其他神经元亚型(“GABA能神经元”、“谷氨酸能神经元”)(图2A-B)。对5-HT聚类进行的更为仔细的检查揭示了尾部和喙部亚群(图2C)
示例3
hCS-hRNS的组装
为了模拟皮质-中缝核回路的发育和功能，在第45天至第60天使用AAV-DJ1-hSYN1::mCherry对hRNS进行病毒标记，并在7-8天后使其与hCS组装，从而得到hRNS-hCS类组装体。组装后16天(融合后的天数；daf)的完整hRNS-hCS的实时成像展示了广泛投射至hCS中的hRNS衍生的mCherry+细胞(图3A)。免疫细胞化学还展示了投射至hCS中的TPH2+细胞(图3B)。为了评估hRNS-hCS中投射的方向性，我们分别用AAV-DJ1-hSYN1::eYFP和AAV-DJ1-hSYN1::mCherry对hRNS和hCS进行病毒标记，然后组装它们。组装后50天的完整hrNS-hCS的实时成像揭示了hRNS与hCS之间的双向投射。中缝核中的前脑投射血清素能细胞显示出不同的轴突形态，沿着细轴突具有较大的椭圆形静脉曲张[4]。在hCS中沿hRNS衍生的eYFP+投射的轴突观察到类似结构，而在沿hCS衍生的mCherry+投射的轴突中未观察到类似结构(图3C)。
示例4
hCS-hRNS中神经调节连接性的功能探测
为了标记hRNS中的5HT谱系神经元以进行功能研究，我们使用了在FEV微型启动子Ple67(AAV-Ple67::emGFP)下驱动emGFP表达的病毒报告基因。我们使用5-HT和TPH2对感染Ple67::emGFP的解离hRNS细胞的免疫染色来表征其特异性(图4A)；该实验表明80-90％的emGFP+为5HT+或TPH2+，表明具有高特异性。接下来，我们使用了该报告基因的iCRE依赖性版本(AAV-DJ-Ple67iCRE)，并用AAV-EF1α-DIO-eYFP共感染hRNS，以诱导重组，同时驱动5-HT谱系细胞中的eYFP表达。然后，我们将共感染的hRNS与感染了AAV-hSYN1::mCherry的hCS组装在一起。所得到的hCS-hRNS展示了5-HT谱系细胞从hRNS到hCS的广泛eYFP+投射(图4B)。为了对hCS-hRNS中hCS的血清素能输入进行功能性探测，我们使用了相同的iCRE依赖性Ple67报告基因在hRNS(AAV-Ple67iCRE和AAV-EF1α-DIO-ChRmine-Kv2.1)的5-HT谱系细胞中表达ChRmine-KV2.1(其是胞体靶向红移视蛋白)，并将其与用基因编码钙指示剂(AAV-hSYN1-GCamP7s)标记的hCS组装在一起。如刺激锁定的钙反应所示，通过625nm波长的高频光刺激对5-HT谱系细胞进行光刺激可靠地诱发了hCS神经元的反应(图4C)。
引文
Nadim,F.和Bucher,D.神经元和突触的神经调节。神经生物学新见.0，48–56(2014).Bucher,D.和Marder,E.快照：神经调节。细胞155，482-482.e1(2013).Vitalis,T.和Parnavelas,J.G.血清素在早期皮质发育中的作用。发展神经科学。25，245–256(2003).Hornung,J.-P.人中缝核和血清素能系统。化学神经解剖学杂志.26，331–343(2003).Jacobs,B.L.和Azmitia,E.C.大脑血清素系统的结构和功能。生理学评论.72,165–229(1992).Hodge,R.D.等人。人与小鼠皮质之间具有不同特征的保守细胞类型。bioRxiv384826(2018).doi:10.1101/384826
Figure BDA0003609894260000271
E.等人。孕早期人类延髓脊髓单胺能神经元的神经化学分化。发育期大脑研究。75，1–12(1993)。Takahash等人。使用抗血清素血清通过免疫组化测定人胎儿脑干中含有血清素的细胞体的分布。大脑发育.8，355–365(1986).Adell,A.重新审视中缝和血清素在神经精神疾病中的作用。普通生理学杂志.145，257–259(2015).Sodhi,M.S.K.和Sanders-Bush,E.血清素和大脑发育.国际神经生物学综观59,111–174(Academic Press，2004)。Bonnin,A.等人.胎儿前脑血清素的短暂胎盘来源。自然472，347–350(2011).Whitaker-Azmitia,P.M.血清素和大脑发育：在人类发育性疾病中的作用。脑研究通报.56，479–485(2001).
Figure BDA0003609894260000272
A.M.等人.3D培养中来自人多能干细胞的功能性皮质神经元和星形胶质细胞。自然：方法12，671–678(2015).Birey,F.等人.功能性整合的人前脑球状体的组装。自然545，54–59(2017).Okaty,B.W.,Commons,K.G.和Dymecki,S.M.拥抱5-HT神经元系统的多样性。自然综述：神经科学.1(2019).doi:10.1038/s41583-019-0151-3.Celada,P.,Puig,M.V.和Artigas,F.皮质神经元和网络的血清素调节。综合神经科学前沿.7，(2013).Frank,C.血清素综合征的识别和治疗。加拿大家庭医生54，988–992(2008).Walsh,J.J.等人.伏隔核中的5-HT释放可挽救小鼠孤独症模型中的社会缺陷。自然560,589(2018).Doan,R.N.等人.孤独症谱系障碍中的隐性基因破坏。自然：遗传学.1(2019).doi:10.1038/s41588-019-0433-8。

Claims (48)

1.一种用于在体外产生人中缝核样球状体或类器官(hRNS)的方法，所述方法包含：
(a)将3D悬浮培养物中的人多能干细胞向神经命运诱导，以生成神经球状体；
(b)使所述神经球状体分化为hRNS；以及
(c)保持所述hRNS处于神经培养基中，使所述hRNS包含血清素能神经元。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述人多能干细胞是诱导性人多能干细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中将悬浮培养物中的所述人多能干细胞向所述神经命运诱导包含在培养基中培养，所述培养基包含骨形态生成蛋白(BMP)抑制剂和转化生长因子β(TGFβ)抑制剂，并且其中所述方法包含用GSK-3抑制剂补充所述培养基。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述BMP抑制剂是多索吗啡，所述TGFβ抑制剂是SB-431542。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中所述GSK-3抑制剂是CHIR99021。
6.根据权利要求3所述的方法，其中在包含所述BMP抑制剂和TGFβ抑制剂的所述培养基中培养2至10天。
7.根据权利要求6所述的方法，其中在1至2天后用GSK-3抑制剂补充所述培养基，使所述培养基包含所述BMP抑制剂、TGFβ抑制剂和GSK-3抑制剂，任选地，其中在包含所述BMP抑制剂、TGFβ抑制剂和GSK-3抑制剂的所述培养基中培养4至8天。
8.根据权利要求7所述的方法，其中在包含所述BMP抑制剂、TGFβ抑制剂和GSK-3抑制剂的所述培养基中培养包含：
(1)在包含所述BMP抑制剂、TGFβ抑制剂和GSK-3抑制剂的培养基中培养2至5天，其中所述TGFβ抑制剂以5μM至20μM的浓度存在；随后
(2)在包含所述BMP抑制剂、TGFβ抑制剂和GSK-3抑制剂的培养基中培养2至5天，其中所述TGFβ抑制剂以1μM至5μM的浓度存在。
9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中的所述悬浮培养物不含饲养层。
10.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中使所述神经球状体分化为所述hRNS包含在神经培养基中培养悬浮培养物中的所述神经球状体，所述培养基包含GSK-3抑制剂和音猬因子通路激动剂，并且其中所述方法包含用FGF4补充所述神经培养基。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述GSK-3抑制剂是CHIR99021。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述音猬因子(SHH)通路激动剂是平滑激动剂(SAG)。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述神经球状体在包含所述GSK-3抑制剂和SHH通路激动剂的神经培养基中培养1至3周，并且其中在2至10天后用FGF4补充所述神经培养基。
14.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)进一步包含用选自由以下各项组成的群组的化合物中的至少一种补充所述神经培养基：脑源性神经营养因子(BDNF)、NT3、L-抗坏血酸2-磷酸三钠盐(AA)、N6、2'-O-二丁酰腺苷3',5'-环单磷酸钠盐(cAMP)、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA)和DAPT，
任选地，其中在1至3周后用所述至少一种化合物补充所述神经培养基。
15.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中使所述神经球状体分化为所述hRNS包含：
(1)在神经培养基中培养悬浮培养物中的所述神经球状体2至10天，所述培养基包含GSK-3抑制剂和音猬因子通路激动剂；
(2)用FGF4补充所述神经培养基；以及
(3)在神经培养基中培养悬浮培养物中的所述神经球状体1至3周，所述培养基包含GSK-3抑制剂、音猬因子通路激动剂和FGF4。
16.根据权利要求15所述的方法，其进一步包含以下步骤(3)：
(4)在神经培养基中培养悬浮培养物中的所述神经球状体2至10天，所述培养基包含FGF4以及选自由以下各项组成的群组的化合物中的至少一种：脑源性神经营养因子(BDNF)、NT3、L-抗坏血酸2-磷酸三钠盐(AA)、N6、2'-O-二丁酰腺苷3',5'-环单磷酸钠盐(cAMP)、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA)和DAPT；以及
(5)在神经培养基中培养悬浮培养物中的所述神经球状体至少1周，所述培养基包含所述至少一种化合物，无FGF4存在。
17.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中的保持所述hRNS是在无生长因子存在的神经培养基中进行的。
18.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中的保持所述hRNS至少持续1周。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述hRNS的细胞包含至少一种与神经或精神病症相关的等位基因。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述神经或精神病症选自由以下各项组成的群组：精神分裂症、情感障碍和孤独症谱系障碍(ASD)，任选地，其中所述情感障碍是重度抑郁症、双相障碍或焦虑症。
21.一种包含人血清素能神经元的人中缝核球状体(hRNS)，其中所述hRNS能够在悬浮培养物中保持至少1个月而不粘附于表面。
22.一种通过根据权利要求1所述的方法获得的人中缝核球状体(hRNS)。
23.一种用于在体外产生皮质-中缝核类组装体(hCS-hRNS)的方法，所述方法包含：
(i)(a)将悬浮培养物中的第一人多能干细胞向神经命运诱导，以提供第一神经球状体；
(b)使所述第一神经球状体分化为人中缝核球状体(hRNS)，
(ii)(a)将第二悬浮培养物中的人多能干细胞向神经命运诱导，以衍生第二神经球状体；
(b)使所述第二神经球状体分化为皮质球状体(hCS)；以及
(iii)在允许细胞融合的条件下于神经培养基中培养所述hRNS和hCS，使得皮质-中缝类组装体包含在所述hRNS与hCS之间投射的人血清素能神经元，以及来自投射入hRNS的所述hCS的神经元。
24.根据权利要求23所述的方法，其中人神经元在所述hRNS和hCS之间形成双向投射。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一和/或第二人多能干细胞是诱导性人多能干细胞。
26.根据权利要求23所述的方法，其中步骤(a)中将悬浮培养物中的所述第一人多能干细胞向所述神经命运诱导包含在培养基中培养，所述培养基包含骨形态生成蛋白(BMP)抑制剂和转化生长因子β(TGFβ)抑制剂，并且其中所述方法包含用GSK-3抑制剂补充所述培养基。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述BMP抑制剂是多索吗啡，所述TGFβ抑制剂是SB-431542。
28.根据权利要求23-26所述的方法，其中所述GSK-3抑制剂是CHIR99021。
29.根据权利要求23所述的方法，其中在包含所述BMP抑制剂和TGFβ抑制剂的所述培养基中培养2至10天。
30.根据权利要求29所述的方法，其中在1至2天后用GSK-3抑制剂补充所述培养基，使所述培养基包含所述BMP抑制剂、TGFβ抑制剂和GSK-3抑制剂，任选地，其中在包含所述BMP抑制剂、TGFβ抑制剂和GSK-3抑制剂的所述培养基中培养4至8天。
31.根据权利要求30所述的方法，其中在包含所述BMP抑制剂、TGFβ抑制剂和GSK-3抑制剂的所述培养基中培养包含：
(1)在包含所述BMP抑制剂、TGFβ抑制剂和GSK-3抑制剂的培养基中培养2至5天，其中所述TGFβ抑制剂以5μM至20μM的浓度存在；随后
(2)在包含所述BMP抑制剂、TGFβ抑制剂和GSK-3抑制剂的培养基中培养2至5天，其中所述TGFβ抑制剂以1μM至5μM的浓度存在。
32.根据权利要求23所述的方法，其中步骤(i)(b)中使所述第一神经球状体分化为所述hRNS包含在神经培养基中培养悬浮培养物中的所述神经球状体，所述培养基包含GSK-3抑制剂和SHH通路激动剂，并且其中所述方法包含用FGF4补充所述神经培养基。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述GSK-3抑制剂是CHIR99021。
34.根据权利要求32-33所述的方法，其中所述SHH通路激动剂是平滑激动剂(SAG)。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述神经球状体在包含所述GSK-3抑制剂和音猬因子通路激动剂的神经培养基中培养1至3周，并且其中在2至10天后用FGF4补充所述神经培养基。
36.根据权利要求23所述的方法，其中步骤(i)(b)进一步包含用选自由以下各项组成的群组的化合物中的至少一种补充所述神经培养基：脑源性神经营养因子(BDNF)、NT-3、L-抗坏血酸2-磷酸三钠盐(AA)、N6、2'-O-二丁酰腺苷3',5'-环单磷酸钠盐(cAMP)、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA)和DAPT，
任选地，其中在1至3周后用所述至少一种化合物补充所述神经培养基。
37.根据权利要求23所述的方法，其中步骤(i)(b)中使所述第一神经球状体分化为所述hRNS包含：
(1)在神经培养基中培养悬浮培养物中的所述神经球状体2至10天，所述培养基包含GSK-3抑制剂和音猬因子通路激动剂；
(2)用FGF4补充所述神经培养基；以及
(3)在神经培养基中培养悬浮培养物中的所述神经球状体1至3周，所述培养基包含GSK-3抑制剂、音猬因子通路激动剂和FGF4。
38.根据权利要求37所述的方法，其进一步包含以下步骤(3)：
(4)在神经培养基中培养悬浮培养物中的所述神经球状体2至10天，所述培养基包含FGF4以及选自由以下各项组成的群组的化合物中的至少一种：脑源性神经营养因子(BDNF)、NT3、L-抗坏血酸2-磷酸三钠盐(AA)、N6、2'-O-二丁酰腺苷3',5'-环单磷酸钠盐(cAMP)、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA)和DAPT；以及
(5)在神经培养基中培养悬浮培养物中的所述神经球状体至少1周，所述培养基包含所述至少一种化合物，无FGF4存在。
39.根据权利要求23所述的方法，其中步骤(iii)包含在允许细胞融合的条件下培养所述hRNS和hCS至少3天。
40.根据权利要求23所述的方法，其中步骤(iii)包含以彼此直接物理接触的方式培养所述hRNS和hCS。
41.根据权利要求23所述的方法，其中步骤(i)(a)或步骤(ii)(a)中的所述悬浮培养物为不含饲养层的培养条件。
42.根据权利要求23所述的方法，其中所述皮质-中缝核类组装体的细胞包含至少一种/起与神经或精神病症相关的等位基因或遗传事件。
43.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一或第二人多能干细胞包含至少一种/起与神经或精神病症相关的等位基因或遗传事件。
44.根据权利要求42-43所述的方法，其中所述神经或精神病症选自由以下各项组成的群组：精神分裂症、情感障碍和孤独症谱系障碍(ASD)，任选地，其中所述情感障碍是重度抑郁症、双相障碍或焦虑症。
45.一种包含与皮质球状体(hCS)融合的中缝核球状体(hRNS)的皮质-中缝核类组装体(hCS-hRNS)，其中所述hCS-hRNS包含在所述hRNS与hCS之间投射并形成人神经调节回路的人血清素能神经元，并且其中所述hCS-hRNS能够在悬浮培养物中保持至少4周而不粘附于表面。
46.一种通过根据权利要求23-44中任一项所述的方法产生的皮质-中缝核类组装体。
47.一种确定候选药剂对皮质神经回路上的血清素能调节的影响的方法，所述方法包含：使所述候选药剂与根据权利要求45-46所述的皮质-中缝核类组装体(hCS-hRNS)接触；并确定所述候选药剂对血清素能神经元调节皮质神经回路功能的能力的影响，
任选地，其中所述hCS-hRNS的细胞包含至少一种/起与神经或精神病症相关的等位基因或遗传事件，进一步任选地，其中所述神经或精神病症选自由以下各项组成的群组：精神分裂症、情感障碍和孤独症谱系障碍(ASD)。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述候选药剂是选择性血清素再摄取抑制剂(SSRI)。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL2029861B1 (en) * 2021-11-23 2023-06-15 Neurodrug Res B V A method for generating a human cortical spheroid from self-renewing stem cells capable of differentiation

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110145179A1 (en) * 2009-12-10 2011-06-16 Knowmtech, Llc Framework for the organization of neural assemblies
US20160152950A1 (en) * 2013-03-01 2016-06-02 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods of Maintaining, Expanding and Differentiating Neuronal Subtype Specific Progenitors
WO2018234491A1 (en) * 2017-06-22 2018-12-27 Hi-Stem Ggmbh Im Deutschen Krebsforschungszentrum Dkfz NOVEL METHODS FOR THE GENERATION AND USE OF HUMAN INDUCED NEURONAL NEURAL STEM CELLS

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10125365B2 (en) * 2014-02-05 2018-11-13 Yeda Research And Development Co. Ltd. Micro-RNAs and compositions comprising same for the treatment and diagnosis of serotonin-, adrenalin-, noradrenalin-, glutamate-, and corticotropin-releasing hormone- associated medical conditions
US10626368B2 (en) * 2015-04-14 2020-04-21 Kyoto University Method for inducing cerebral cortex neurons

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110145179A1 (en) * 2009-12-10 2011-06-16 Knowmtech, Llc Framework for the organization of neural assemblies
US20160152950A1 (en) * 2013-03-01 2016-06-02 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods of Maintaining, Expanding and Differentiating Neuronal Subtype Specific Progenitors
US20180119098A1 (en) * 2013-03-01 2018-05-03 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods of maintaining, expanding, and differentiating neuronal subtype specific progenitors
WO2018234491A1 (en) * 2017-06-22 2018-12-27 Hi-Stem Ggmbh Im Deutschen Krebsforschungszentrum Dkfz NOVEL METHODS FOR THE GENERATION AND USE OF HUMAN INDUCED NEURONAL NEURAL STEM CELLS

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LU, J.ET AL.: "Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells", NAT BIOTECHNOL, vol. 34, no. 1, 31 January 2016 (2016-01-31), pages 89 - 94, XP055474042, DOI: 10.1038/nbt.3435 *

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