CN104099357A - 检测蛋白质稳定性的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供结构如5’-A+B+C+D+E-3’所示的遗传构建物,其中A表示启动子;B表示由目标蛋白和第一标记蛋白构成的融合蛋白的编码序列;C表示连接肽的编码序列;D表示第二标记蛋白的编码序列;和E表示终止子。本发明还提供结构如B1+C1+D1所示的多肽,其中B1表示由目标蛋白和第一标记蛋白构成的融合蛋白;C1表示连接肽;和D1表示第二标记蛋白的编码序列。本发明还提供包含所述遗传构建物的载体,包含所述遗传构建物或载体的哺乳动物细胞,由所述细胞构成的文库以及检测蛋白质稳定性的方法和应用。本发明方法对蛋白质稳定性的检测不仅灵敏度和特异性高,而且操作简便。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质检测领域。具体地说,本发明涉及检测蛋白质稳定性的方法及其应用。
背景技术
蛋白质水平的动态变化是细胞保持活力和进行生命活动的基本特征和必要前提。在任何时间点,细胞内特定蛋白质的水平取决于其合成与降解过程之间的动态平衡。蛋白质的合成主要在核糖体上进行,目前对蛋白质合成的及其调节的过程都了解得相对清楚。
人类对蛋白质降解过程的研究始于上世纪八十年代,近年来已经发展成为现代生物学的一个非常重要的研究领域。这是因为所有的蛋白都必须被适时的降解,细胞的基本生命过程例如细胞周期的进行才得以成为可能。无数证据表明,许多受到损伤的或者折叠错误的蛋白也都必须降解掉,否则正常的细胞功能就会受到影响,从而导致如癌症、神经退行性疾病等(C.Raiborg和H.Stenmark,2009;Christian Hirsch等,2009;Steven Bergink和Stefan Jentsch,2009)。
因为很多疾病的病理过程都与蛋白质降解途径的不正常有关(Salvatore Oddo,2008;Jeffrey H Kordower,2008;Jianjun Wang,2008),许多肿瘤细胞与病毒也是利用泛素蛋白酶体系统扰乱蛋白质的降解,从而达到肿瘤细胞的扩散或对宿主细胞的入侵(Daniela Hoeller和Ivan Dikic,2009)。目前许多影响蛋白质降解途径的药物已经或正在开发之中。已有的研究结果和临床试验的数据都显示这类药物对很多目前难以治愈的疾病都具有极高的潜在药用价值(Matthew D Petroski,2008;Grzegorz Nalepa,2006)。
因此,研究蛋白质稳定性的差异变化对于相应蛋白质受累疾病的预测、及发病、病因、治疗药物的筛选等均存在重要的提示作用,检测蛋白质稳定性的异常变化对于研究发病机制尤为重要。现在主要的方法是通过Cycloheximide时间梯度实验来检测蛋白质的稳定性。然而,这一方法不仅工作量大,而且对于研究蛋白质组学范围内的蛋白质差异变化无能为力。同时,该方法因实验的复 杂性而不适用于高通量药物筛选。
蛋白质芯片技术可以一次性检测多种蛋白质的稳定性,但由于抗体的可用性,使得其通量有限,同时也极大的限制了该技术的实用性。利用质谱技术可以实现大规模样品,蛋白质组学范围内的蛋白质稳定性变化的检测,但是质谱技术识别能力有限,对于低丰度蛋白稳定性的变化无法检测。
在细胞生物学与分子生物学领域中,荧光蛋白分子具有广泛的应用。荧光蛋白常常会被用做报告基因,标识目标蛋白的细胞定位,同时可以结合FACS技术,进行目标蛋白分子胞内丰度的相对定量。
因此,本领域急需能够实现广泛应用于全基因组范围内蛋白质稳定性的检测,并且易于应用于高通量小化合物筛选的新型检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于检测蛋白质稳定性的融合蛋白以及编码所述融合蛋白的遗传构建物、包含所述遗传构建物的载体、包含所述遗传构建物或载体的细胞,以及由所述细胞构成的文库和检测蛋白质稳定性的方法和应用。本发明方法对蛋白质稳定性的检测不仅灵敏度和特异性高,而且操作简便。
在第一方面,本发明提供一种遗传构建物,其结构如下式所示:
5’-A+B+C+D+E-3’,
其中,
A表示启动子;
B表示由目标蛋白和第一标记蛋白构成的融合蛋白的编码序列;
C表示连接肽的编码序列;
D表示第二标记蛋白的编码序列;和
E表示终止子;
其中,B和D可以互换。
在优选的实施方式中,所述启动子为CMV启动子。
在另一优选的实施方式中,B中5’-3’依次包含目标蛋白的编码序列和第一标记蛋白的编码序列。
在另一优选的实施方式中,所述连接肽选自:泛素、泛素截短体、泛素突变体及类泛素、2A短肽等;优选泛素;最优选K(R)饱和突变的泛素。
在优选的实施方式中,所述第一标记蛋白和第二标记蛋白是荧光蛋白。
在优选的实施方式中,所述荧光蛋白选自EGFP或RFP;优选第一标记蛋白是EGFP,第二标记蛋白是RFP。
在优选的实施方式中,所述EGFP是mEGFP,所述RFP是mRFP。
在优选的实施方式中,所述荧光蛋白C端或N端融合有一个或多个标签蛋白,例如Flag或myc。
在另一优选的实施方式中,所述目标蛋白的编码序列包括人类基因组文库human ORFeome V5.1中所有基因。
在第二方面,本发明提供一种多肽,其结构如下式所示:
B1+C1+D1,
其中,
B1表示由目标蛋白和第一标记蛋白构成的融合蛋白
C1表示连接肽;和
D1表示第二标记蛋白;
其中B1和D1可以互换。
在优选的实施方式中,所述多肽中各部分的顺序为目标蛋白、第一标记蛋白、连接肽和第二标记蛋白,或第二标记蛋白、连接肽、目标蛋白和第一标记蛋白。
在优选的实施方式中,所述多肽由权利要求1所述的遗传构建物编码。
在另一优选的实施方式中,所述连接肽选自:泛素、泛素突变体及类泛素、2A短肽等;优选泛素;最优选K(R)突变的泛素。
在另一优选的实施方式中,所述第一标记蛋白和第二标记蛋白是荧光蛋白。
在另一优选的实施方式中,所述荧光蛋白选自EGFP或RFP;优选第一标记蛋白是EGFP,第二标记蛋白是RFP。
在另一优选的实施方式中,所述EGFP是mEGFP,所述RFP是mRFP。
在另一优选的实施方式中,所述荧光蛋白C端或N端融合有一个或多个标签蛋白,例如Flag或myc。
在另一优选的实施方式中,所述目标蛋白包括人类细胞全基因组文库human ORFeome V5.1中的开放阅读框所编码的所有蛋白质。
在第三方面,本发明提供一种载体,其包含本发明第一方面所述的遗传构建物。
在优选的实施方式中,所述载体可以是逆转录病毒质粒、慢病毒质粒等可以整合到受体细胞基因组的质粒。
在第四方面,本发明提供一种细胞,其包含本发明第一方面所述的遗传构建物或本发明第三方面所述的载体。
在第五方面,本发明提供一种细胞文库,其由本发明第四方面所述的细胞构成。
在优选的实施方式中,所述的细胞是哺乳动物细胞;
在另一优选的实施方式中,所述的哺乳动物细胞是灵长类细胞或人细胞;优选地,所述哺乳动物细胞是人细胞。
在另一优选的实施方式中,所述哺乳动物细胞包括但不限于:293细胞、293T细胞、293FT细胞、Hela细胞、NIH3T3细胞、癌细胞、干细胞等。
在第六方面,本发明提供一种检测一个或多个目标蛋白质稳定性的方法,包括以下步骤:
(1)构建本发明第五方面所述的细胞文库;
(2)在所述特定条件下和对照条件下培养(1)所得的细胞文库;
(3)测定所述特定条件下和对照条件下培养的细胞文库中第一标记蛋白与第二标记蛋白之比;和
(4)通过比较所述特定条件下和对照条件下培养的细胞系中第一标记蛋白与第二标记蛋白之比得出目标蛋白质稳定性是否变化的结论;或:
采用流式细胞仪技术按照第一标记蛋白与第二标记蛋白之比将细胞分成n个区间(n大于等于2),并通过DNA芯片技术检测每一区间中目标基因的各自表达量计算出目标基因在各个区间中的分布情况,并将所述特定条件下和对照条件下培养的细胞系中目标基因分布情况进行对比,得出目标基因所编码的蛋白质 稳定性是否变化的结论。
在优选的实施方式中,所述特定条件可以是添加刺激与扰动,例如化学刺激,如药物等;也可以是基因过表达,基因敲除或RNA干扰;可以是病毒感染、稳转、质粒瞬转,也可以是对照条件本身。
在优选的实施方式中,所述特定条件是在接触待测化合物、应激、辐射等条件;优选地,所述特定条件是接触待测化合物。
在优选的实施方式中,采用流式细胞仪技术检测第一标记蛋白与第二标记蛋白之比;即,检测荧光蛋白的荧光强度之比。
在优选的实施方式中,所述的区间数量为8个。
在优选的实施方式中,所述目标蛋白质是人类细胞全基因组文库human ORFeome V5.1中所有ORF所编码的蛋白质。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1a显示了双荧光质粒的结构示意图。
图1b显示了利用双荧光质粒系统检测蛋白质相对稳定性的原理。
图1c显示没有融合蛋白质ORF的mEGFP稳定性良好,与mRFP形成分子摩尔量稳定的1:1关系。
图1d显示双荧光质粒系统可以成功筛选出抗癌药物Bortezomib(硼替佐米)的底物蛋白质RGS4,阴性蛋白质未显示任何变化。且附有Western数据验证。
图2a显示利用双荧光细胞文库测定全基因组范围内蛋白质稳定性的试验流程图。
图2b显示利用双荧光细胞文库测定的全基因组范围内蛋白质相对稳定性的PSI数据分布图。
图2c、d显示随机挑选的基因PSI数据。
图3a显示抗癌药物Bortezomib的化学结构。
图3b显示双荧光全细胞文库经抗癌药物Bortezomib处理后整体变化。
图3c显示代表性数据。
图3d显示蛋白质相对稳定性变化值△PSI分布图。
图3e、f、g、h显示利用FACS与Western Blot技术对芯片结果的验证数据。
图4a显示利用生物信息学工具DAVID对稳定性变化剧烈的蛋白质进行GO(Biological Pathway)分析。
图4b显示对图4a结果中BP004亚族进行细节分析。
图4c显示对图4a结果中BP00179亚族进行细节分析。
图4d显示利用生物信息学工具STRING与可视化工具cytoscape对响应蛋白质进行蛋白质-蛋白质相互作用关系(PPI)分析。
图5显示对照双荧光细胞系散点图。
图6显示含有human ORFeome V5.1的双荧光细胞文库。
图7以TP53-mEGFPfu-mRFPf为例展示了融合多肽在刚被翻译出时的原始条带,以及被泛素化酶切割后形成的两条不同条带(TP53-mEGFP融合蛋白条带和mRFP条带)的western blot电泳结果。
图8显示利用生物信息学工具STITCH与可视化工具cytoscape对响应蛋白质进行小化合物-蛋白质相互作用关系(CPI)分析。
图9A、B显示为针对CZ-1或CZ-1/R细胞,BTZ与17-AAG的药物联用效果。
图9C、D显示为针对CZ-1或CZ-1/R细胞,BTZ与C75的药物联用效果。
图10A显示BTZ与C75药物联用效果CI计算。
图10B显示BTZ与17-AAG药物联用效果CI计算。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究,出乎意料地发现利用本发明的双荧光质粒系统能够方便而准确地实现全基因组范围内蛋白质稳定性的同时检测,极大提高了双荧光技术的实用性,进而应用于影响致病基因蛋白质稳定性的小化合物的高通量筛选以及寻找参与疾病发生的未知关键基因。在此基础上完成了本发明。
在本发明中,发明人设计了一种双荧光质粒系统对蛋白质降解速率进行相对定量。本技术的核心在于共表达一个荧光报告蛋白分子(mEGFP)相融合的特定靶标蛋白与一个对照荧光蛋白分子(mRFP),二者通过特殊的连接蛋白连接,在翻译完成之后,将被有效切割而分离。mRFP的表达水平充当了内参作用,mEGFP则被融合到靶标蛋白X的C端,成为靶标蛋白X胞内丰度的测量尺,通过 mEGFP/mRFP的比值发明人可以精确界定在单个细胞内特定蛋白X的稳定性。
同时,任何生物学事件(如删除或过表达调整特定蛋白X的E3连接酶)或者化学刺激(如药物处理)选择性改变融合蛋白X-mEGFP的稳定性时,都将会导致融合蛋白X-mEGFP丰度的变化,但是不会影响mRFP的丰度,进而导致mEGFP/mRFP比值的改变。
因此,本发明可以有效的克服以往技术的缺陷,必将广泛的应用于全基因组范围内蛋白质稳定性的测定,以及高通量的小化合物筛选。
本发明采用在同一启动子下共表达目标蛋白、第一标记蛋白、连接肽和第二标记蛋白构成的融合蛋白,通过切割连接肽,形成目标蛋白与第一标记蛋白的融合蛋白以及第二标记蛋白,进而通过与目标蛋白相融合的第一标记蛋白与第二标记蛋白之比表征目标蛋白的相对稳定性。
例如,在具体的实施方式中,本发明将荧光蛋白与目标基因或基因文库融合,利用荧光分子可以荧光定量的特性,根据荧光强度表征融合蛋白量,最终获得蛋白质稳定性的参数。结合human ORFeome文库基因,进而实现全基因组范围内所有蛋白质稳定性的同时检测。
利用该技术,可以高通量筛选影响致病基因蛋白质稳定性的小化合物。同时,结合human ORFemoe文库,可以实现全基因组范围内蛋白质稳定性的检测,进而可以在全基因组范围内筛选疾病状态与正常状态下发生稳定性异常变化的蛋白质,以寻找未知的参与疾病发生的关键基因,以解决现在仍无法全面了解的症结所在。
在优选的实施方式中,本发明首先如下所述构建双荧光表达质粒:
在同一启动子启动下共表达对照蛋白((Red fluorescent protein(RFP))与荧光报告蛋白(enhanced green fluorescent protein(EGFP))相融合的特定靶标蛋白,二者通过泛素连接,在翻译完成后,细胞内上百种去泛素化酶有效切割泛素而形成分离的RFP。RFP的表达水平充当内参,EGFP则被融合到靶标蛋白X的C端,成为靶标蛋白X胞内丰度的测量尺,通过EGFP/RFP的比值可以精确界定单个细胞内特定蛋白X的相对稳定性,并利用流式细胞术实现不同EGFP/RFP比值的细胞分选与检测。当进行高通量药物筛选时,只需将目标蛋白利用高效的同源重组技术Gateway反应重组到该双荧光表达载体上,然后构建细胞系,即可利用高通量技术进行筛选。当需要检测全基因组范围内蛋白质稳定性的异常 变化时,则利用同源重组技术Gateway反应将人类ORFemoe文库所有基因同源重组到双荧光表达质粒上,然后,通过超低的病毒滴度(MOI~0.05)感染细胞,维持一个细胞一个基因的频率构建整合有人类ORFemoe文库的细胞文库,利用该细胞文库,并结合FACS,与芯片技术就可以一次性实现全基因组范围内所有蛋白质稳定性的检测。
因此,本发明首先提供了一种遗传构建物,其结构如下式所示:
5’-A+B+C+D+E-3’,
其中,A表示启动子;B表示由目标蛋白和第一标记蛋白构成的融合蛋白的编码序列;C表示连接肽的编码序列;D表示第二标记蛋白的编码序列;和E表示终止子;其中B和D可以互换。
其中目标蛋白和第一标记蛋白编码序列的位置顺序可以互换。
鉴于本发明的教导和现有技术,本领域技术人员应理解,由于本发明是通过共表达目标蛋白、第一标记蛋白、连接肽和第二标记蛋白构成的融合蛋白,通过切割连接肽,形成目标蛋白与第一标记蛋白的融合蛋白以及第二标记蛋白,进而通过与目标蛋白相融合的第一标记蛋白与第二标记蛋白之比表征目标蛋白的相对稳定性。因此,上述遗传构建物中B和D可以互换而不影响功能或使用。
鉴于本发明的教导和现有技术,本领域技术人员还应理解,B中的目标蛋白和第一标记蛋白编码序列的位置顺序也可以互换而不影响使用或功能。
在优选的实施方式中,B中5’-3’依次包含目标蛋白的编码序列和第一标记蛋白的编码序列。
本领域普通技术人员鉴于本发明的教导和现有技术,应该明白,本发明可利用各种连接肽,只要所述连接肽能在胞内被切割,从而形成分离的两种标记蛋白。例如,在具体的实施方式中,所述连接肽选自:泛素(Ub)、泛素突变体及类泛素、2A短肽等;优选泛素;最优选K(R)突变的泛素。K(R)突变的泛素可以保证有效切割的同时自身不会成为泛素化位点,因而不会影响目标蛋白的降解特性。
本领域技术人员还应该理解,本发明可利用各种标记蛋白,只要能够精确表征所述标记蛋白的量。例如,在具体的实施方式中,所述第一标记蛋白和第二标记蛋白是荧光蛋白;优选地,所述荧光蛋白是EGFP或RFP;更优选地,第一标记蛋白是EGFP,第二标记蛋白是RFP。在更优选的实施方式中,所述EGFP是单体形EGFP(mEGFP),所述RFP是单体形式RFP(mRFP)。
在另一优选实施方式中,所述荧光蛋白C端或N端融合有一个或多个标签蛋白,例如Flag或myc。
在另一优选实施方式中,所述启动子为CMV启动子。
在另一优选实施方式中,所述目标蛋白的编码序列是人类基因组文库所有基因。
本发明还提供多肽,其结构如下式所示:
B1+C1+D1,
其中,
B1表示由目标蛋白和第一标记蛋白构成的融合蛋白
C1表示连接肽;和
D1表示第二标记蛋白;
其中B1和D1可以互换。
如上所述,本领域技术人员应该理解,本发明多肽中的B1和D1可以互换而不影响功能或使用。而本发明多肽中B1的目标蛋白和第一标记蛋白的位置顺序也可以互换而不影响使用或功能。
在优选的实施方式中,所述多肽由本发明的遗传构建物编码。
在优选的实施方式中,所述多肽的顺序为目标蛋白、第一标记蛋白、连接肽和第二标记蛋白,或第二标记蛋白、连接肽、目标蛋白和第一标记蛋白。
在本发明的遗传构建物的基础上,本发明还提供包含本发明遗传构建物的载体,包含所述遗传构建物或载体的哺乳动物细胞以及由所述哺乳动物细胞构成的哺乳动物细胞文库。
在具体的实施方式中,所述载体可以是逆转录病毒质粒、慢病毒质粒等可以整合到受体细胞基因组的质粒。所述哺乳动物细胞可以是灵长类细胞或人细胞;优选地,所述哺乳动物细胞是人细胞。在具体的实施方式中,所述哺乳动物细胞包括但不限于:293细胞,也可以是其他细胞,如293t,hela,3t3,癌细胞,干细胞等。
在本发明遗传构建物、载体、多肽、细胞以及细胞文库的基础上,本发明进一步提供一种检测特定条件下目标蛋白质稳定性变化的方法,所述方法包括以下步 骤:
(1)构建本发明的细胞文库;
(2)在所述特定条件下和对照条件下培养所得的细胞文库;
(3)测定所述特定条件下和对照条件下培养的细胞文库中第一标记蛋白与第二标记蛋白之比;和
(4)通过比较所述特定条件下和对照条件下培养的细胞系中第一标记蛋白与第二标记蛋白之比得出目标蛋白质稳定性是否变化的结论。
当获得细胞文库后,既可以添加刺激与扰动,例如化学刺激,如药物;也可以是基因过表达,或者是RNA干扰;可以是病毒稳转,亦可以是质粒瞬转。
在优选的实施方式中,所述特定条件是在接触待测化合物、应激、辐射等条件;优选地,所述特定条件是接触待测化合物。
在优选的实施方式中,采用DNA微阵列技术检测第一标记蛋白与第二标记蛋白之比,例如检测第一标记蛋白和第二标记蛋白的荧光强度之比。
在优选的实施方式中,所述目标蛋白质是人类细胞全基因组文库human ORFeome V5.1中所有的蛋白质。
在本发明中,涉及的全基因组范围内的基因,可以是human ORF version5.1版本,也可以是更高或是其他版本,也可以是其他物种的ORF文库版本。
本领域普通技术人员鉴于本发明的教导和现有技术应该理解,本发明可利用各种标记蛋白,只要能够精确表征所述标记蛋白的量。例如,本发明可利用各种荧光蛋白,包括但不限于mEGFP与mRFP或其突变体,也可以是其他荧光蛋白,只要两种荧光蛋白含有不同的激发光波长。
本发明的多肽中采用两种不同的荧光蛋白。优选的实施方式中,本发明的荧光蛋白是mEGFP与mRFP。
作为示例,本发明可利用SEQ ID NO:1、2、3或4所示的荧光蛋白(SEQ ID NO:1,atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgc agctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaag;SEQ ID NO:2,MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSK(A)LSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK;SEQ ID NO:3,atggcctcctccgaggacgtcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggcggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttccagtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctccaccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagatgaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgccgaggtcaagaccacctacatggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaagaccgacatcaagctggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgagcgcgccgagggccgccactccaccggcgcc;SEQ ID NO:4,MASSEDVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMYPEDGALKGEIKMRLKLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGA)。
本发明包括含有SEQ ID NO:2或4所示氨基酸序列的荧光蛋白,以及与SEQ ID NO:2或4具有相同功能的、它们的变异形式,或者其它荧光蛋白分子。表1列举了可能的荧光蛋白分子,包括但并不局限于以下蛋白:
表1
注:在表中,峰值激发波长为Ex,峰值发射波长为Em,摩尔消光系数为EC,量子产率为QY。将摩尔消光系数与量子产率的乘积除以EGFP的值得到计算的亮度值。
作为示例,荧光蛋白,例如mEGFP可以N端与目标蛋白的ORF融合,即采用结构形式:ORF-mEGFP-Ub-mRFP,也可以C端与目标蛋白的ORF融合,即采用结构形式:mEGFP-ORF-Ub-mRFP;同时,也可以采用,例如mRFP与目标蛋白的ORF融合的方式。
本发明中荧光分子C端融合有2个Flag标签,可以不融合,也可以1个Flag标签或者更多,还可以换成其他标签蛋白,如myc等。标签融合的位置也可以在荧光分子的N端。
实际上,在本发明公开的基础上,结合本领域已知的荧光蛋白的氨基酸组成及其结构,根据具体的实验要求与目的,本领域技术人员可对荧光蛋白分子的种类自主选择,对N端融合或C端融合自主选择。
本发明包括应用各种文库ORF融合双荧光蛋白来检测蛋白质稳定性的文库。本发明所采用的文库可以是商业化的ORF文库,也可以是本领域技术人员自己构建的文库。可以是human的ORF,也可以是其他物种的ORF。也可以是ORF中的部分功能结构域中。也可以是本领域技术人员自己设计的序列片段。
文库基因重组与扩增在大肠杆菌中进行,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。
一旦获得构建文库所需的文库基因序列,就可以构建融合有双荧光蛋白分子的基因文库。构建的方法可以是基因重组的方法,例如Gateway反应等,亦可以是其他重组反应。还可以是常规的重组DNA技术(Science,1984;224:1431),如传统酶切-连接酶链接的方法。
当获得了融合有双荧光蛋白分子的基因文库后,即可利用病毒包装的方法,构建整合有质粒基因的双荧光细胞文库,质粒可以是慢病毒质粒或者是其他可以整合基因组的质粒,构建双荧光细胞文库的细胞可以是293细胞,也可以是其他细胞,如293T细胞、Hela细胞、NIH3T3细胞、癌细胞、干细胞等。
构建的细胞文库用FASC进行分选,分选时基于mEGFP/mRFP的比值将文库分选为若干区间,区间数可以为6、7、8、9或更多,也可以将文库中部分mEGFP/mRFP比值的区间的细胞进行精细分选。区间数可以是4、5、6、7等或更多。
分选的细胞分别提取基因组,可采用常规的方法从细胞或组织提取基因组DNA,制备含基因组DNA的样品。然后以基因组DNA为模板,以质粒共同区段设计引物,对ORF进行PCR扩增,3’端引物添加T7启动子引物,进行PCR扩增的tag酶宜选择延伸能力强的酶,例如Ex-tag等。PCR产物进行体外RNA扩增,扩增产物用于芯片杂交。芯片可采用Algent双标芯片。芯片结果采用Bioconductor程序包limma中的Composite loess normalization进行归一化。
本发明提到的上述特征,或实施例提到的特征可以任意组合。本文所揭示的所有特征可以任何组合形式并用,说明书中所揭示的各个特征,可以任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除非有特别说明,所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的优点:
1.本发明极大提高检测蛋白质稳定性的实用性;
2.本发明方法的检测准确度高,操作便捷,省时;
3.本发明方法能高灵敏度和特异性地检测蛋白质稳定性的变化情况。
4.本发明方法荧光蛋白分子融合在目标蛋白的C段,可以有效地暴露蛋白质N端的信号序列,真实模拟蛋白质的降解动态;
5.本发明方法中荧光蛋白分子之间采用泛素Ub连接,细胞内大量的去泛素化酶保证Ub的高效切割,进而在蛋白质翻译水平上保证两个荧光分子1:1的 摩尔比例关系;
6.本发明方法中采用单体形式的荧光分子,可以有效的避免由于荧光分子聚集引起的蛋白质降解动态改变;
7.本发明方法中采用的荧光分子,具有快速的折叠速率,保证了及时、动态的跟踪蛋白质稳定性的变化。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例
材料与方法
CZ-1细胞和CZ-1/R细胞
CZ-1细胞是从多发性骨髓瘤细胞系(即,BTZ药物敏感细胞系);此细胞系在体外经小剂量间歇处理BTZ药物,多代培养,从而获得BTZ抗药性,标记为CZ-1/R(即,BTZ药物抗性细胞系)。
CZ-1细胞可以获自上海长征医院候健实验室(Hou J,Lin FY,Zhang B,Zhang LZ,Ding SQ,Establishment and biological characteristics of human multiple myeloma cell line CZ-1.Chinese Medical Journal[2004,117(1):115-119]),CZ-1/R细胞系由发明人实验室构建,可以获自发明人实验室(http://www.sibcb.ac.cn/PI.asp?id=129)。
293细胞
293细胞可以获自ATCC(马里兰州,美国)。
质粒构建
将设计的双荧光结构组装,用PCR反应进行扩增并加上限制性内切酶位点。mEGFP片段C端带上两个Flag标签,mRFP片段C端带上两个Flag标签,Ub蛋白K(R)饱和突变,命名为mEGFPfu-mRFPf,三片段拼接在一起后,经Hind III与XhoI1酶切位点插入载体pAG426GAL-ccdB-EGFP(Addgene),利用mEGFP-Ub-mRFP结构替换EGFP结构,得到质粒pAG426GAL-ccdB-mEGFPfu-mRFPf。
其中pAG426GAL-ccdB-mEGFPfu-mRFPf质粒构建所需的引物如下:
HindIII-(a)-mGFPN1(5-3):ACA aagctta atggtgagca agggcgagga(SEQ ID NO:5)
mGFPC1-FLAG2N1(3-5):tggacgagct gtacaag ggatctgactacaag(SEQ ID NO:6)
GWs3(5-3):gggtctgactacaaggacgatgacgataagggcggagactacaaggacgatgacgataagggctct(SEQ ID NO:7)
FLAG2C1-hUbN1(5-3):acgatgacgataagggctct atgcagatctttgtgaGg(SEQ ID NO:8)
GWS5(5-3):atgcagatctttgtgaGgaccctcactggcaGaaccatcacccttgaggtcgagcccagtgacaccattgagaatgtcaGagccaGaattcaagacaGgg(SEQ ID NO:9)
GWS6(5-3):gccaGaattcaagacaGggagggtatcccacctgaccagcagcgtctgatatttgccggcaGacagctggaggatggccgcactctctcagactacaac(SEQ ID NO:10)
hUbK6RN3-mRFPN1(3-5):cactctctcagactacaacatccagaGagagtccaccctgcacctggtgttgcgcctccgcggtggtatggcctcctccgaggacgt(SEQ ID NO:11)
GWS8(5-3):atggcctcct ccgaggacgt(SEQ ID NO:12)
GWS9(5-3):ccgc cactccaccg gcgcc ggAtctgactacaaggacgat(SEQ ID NO:13)
GWS10(5-3):acaaggacgatgacgataag TAG taactcgagtca(SEQ ID NO:14)
通过spe1与XhoI两个限制性内切酶对pAG426GAL-ccdB-mEGFPfu-mRFPf质粒双酶切,补平,将载体pCDH-CMV-MCS-EF1a-Puro(Addgene)用xba1单切,然后补平,再通过T4连接酶连接,经测序鉴定正确。得到质粒pCDH-CMV-ccdB-mEGFPfu-mRFPf。
人类基因文库的混合与扩增
利用Biomek FX自动化工作站,完成人类基因文库的混合,并检测滴度。采用原始文库的100倍的量来扩增。37℃培养18~24h后。刮取平板上的克隆,收集后充分混匀,进行质粒大量提取。
人类基因文库LR反应及鉴定
人类基因文库存在于含有attL序列的Entry克隆中,文库基因直接可以与发明人的目标载体pCDH-CMV-ccdB-mEGFPfu-mRFPf(含有attR序列)发生LR反应(技术细节与所有操作参照invitrogen公司GATEWAYTMCloning Technology技术),获得存在于pCDH-CMV-ORFs-mEGFPfu-mRFPf的人类基因文库。刮取克隆,收集后充分混匀,然后质粒大量抽提。
双荧光细胞文库的构建
293FT细胞系于含10%胎牛血清,10%NEAA和P/S抗生素的DMEM培养基中,37℃、5%CO2孵箱培养。293FT细胞转染pCDH-CMV-ORFs-mEGFPfu-mRFPf文库,辅助质粒采用慢病毒表达系统(LV100A-1,SBI),方法参照使用说明。
双荧光对照细胞系的构建
与hORFome文库中挑取pENTRY-RGS4,pENTRY-TP53,pENTRY-ARC,pENTRY-AXNA1,pENTRY-NFKBIB,pENTRY-CDC25A质粒,与目标载体pCDH-CMV-ccdB-mEGFPfu-mRFPf做gateway反应,分别得到目标质粒pCDH-CMV-RGS4-mEGFPfu-mRFPf,pCDH-CMV-P53-mEGFPfu-mRFPf,pCDH-CMV-ARC-mEGFPfu-mRFPf,pCDH-CMV-AXNA1-mEGFPfu-mRFPf,pCDH-CMV-NFKBIB-mEGFPfu-mRFPf,pCDH-CMV-CDC25A-mEGFPfu-mRFPf。采用慢病毒表达系统(LV100A-1,SBI)分别包装病毒,感染293FT细胞,FACS分选,分别得到pCDH-CMV-RGS4-mEGFPfu-mRFPf,pCDH-CMV-TP53-mEGFPfu-mRFPf,pCDH-CMV-ARC-mEGFPfu-mRFPf,pCDH-CMV-AXNA1-mEGFPfu-mRFPf,pCDH-CMV-NFKBIB-mEGFPfu-mRFPf,pCDH-CMV-CDC25A-mEGFPfu-mRFPf双荧光过表达细胞系。
pCDH-CMV-RGS4-mEGFPfu-mRFPf,pCDH-CMV-TP53-mEGFPfu-mRFPf,pCDH-CMV-ARC-mEGFPfu-mRFPf,pCDH-CMV-AXNA1-mEGFPfu-mRFPf,pCDH-CMV-NFKBIB-mEGFPfu-mRFPf,pCDH-CMV-CDC25A-mEGFPfu-mRFPf 双荧光过表达细胞系使用Bortezomib(1μM终浓度)处理6h,以DMSO为对照,FACS检验EGFP/RFP比值变化,然后裂解细胞,Western检验蛋白质丰度变化。
双荧光细胞文库的8区间分选
将含有Human ORFeome V5.1基因的双荧光细胞文库细胞消化,吹散为单细胞,用培养基重悬,然后经40μm滤器过滤,细胞分选采用BD公司FACSAriaII细胞分选系统。细胞分选时,首先选取高RFP信号的细胞群体,然后将选取的细胞按照mEGFP/mRFP的荧光比值分选为8个区间。
区间细胞基因组DNA提取与芯片杂交
各个区间的细胞分别用裂解液裂解,裂解液成分为10mM Tris-HCl(8.0),10mM EDTA,0.5%SDS,0.2mg/ml蛋白酶K和25μg/ml RNA酶A,55℃裂解16h,然后加入0.2M氯化钠。基因组DNA经过酚氯仿抽提,氯仿提纯,乙醇沉淀,然后溶解在10mM Tris-HCl(8.0)和0.1mM EDTA缓冲液中。为定量扩增整合在基因组上的ORF-mEGFPfu-mRFPf结构,以基因组DNA为模板,利用PCR进行扩增,PCR引物:
正向引物:CCTGGAGACGCCATCCACGCTG(SEQ ID NO:15)
反向引物:TAATACGACTCACTATAGGGAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATTAAGCT(S EQ ID NO:16)
反向引物中含有T7RNA聚合酶启动子位点。采用EX-Taq(Takara)酶扩增。然后以PCR产物为模板进行体外RNA扩增,体外RNA扩增采用T7MEGAscript(Ambion)试剂盒,扩增的RNAs使用RNeasy mini kit纯化,经纯化的RNA标记Cy3和Cy5(Cat#PA13105,GE healthcare Bioscience,Pittsburgh,PA,US),然后再用RNeasy mini kit(Cat#74106,QIAGEN,GmBH,Germany)纯化。具体细节参照使用说明。
芯片杂交
然后,根据用量进行芯片杂交(Cat#5188-5242,Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)in Hybridization Oven(Cat#G2545A,Agilent technologies,Santa Clara,CA,US),杂交17小时后,洗涤(Cat#121,Thermo Shandon,Waltham,MA,US)(Cat#5188-5327,Agilent technologies,Santa Clara,CA,US),固定、干燥(Cat#121, Thermo Shandon,Waltham,MA,US)with Gene Expression Wash Buffer Kit(Cat#5188-5327,Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)。所有操作参照使用说明。相同探针信号合并求平均数,对于每个ORF,八个区间的信号值的和被归一化为1,然后计算PSI与STDEV值。具体计算细节参照文献(Hsueh-Chi Sherry Yen等,2008,science).
寻找受Bortezomib处理后稳定性被影响的体内重要生物学通路和关键蛋白
为需找Bortezomib敏感蛋白,ORFs-mEGFPfu-mRFPf细胞文库分为两组:对照组加入DMSO;实验组加入Bortezomib(1μM终浓度),然后FACS进行8区间分选,检测Bortezomib处理对全基因组范围内蛋白质稳定性的影响。
利用系统生物学进行数据深度挖掘
GO注释分析
发明人计算每个ORF在DMSO与Bortezomib处理条件下,PSI的变化值。发明人以△PSI/PSI进行排序,然后取序列前15%基因进行GO富集分析,发明人以芯片上所有探针作为对照基因,GO富集分析采用DAVID在线软件(Glynn Dennis Jr,2003;Da Wei Huang,2009)。
信号通路富集分析
利用DAVID在线软件搜索了Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)and GO annotation,Biocarta pathway,BBID,PANTHER pathway等14个功能注释数据库,去寻找显著性改变的信号通路。
蛋白-蛋白相互作用网络
为了更好的理解Bortezomib加入后对细胞整体信号网络的影响,发明人挑取△PSI/PSI排序在前5%的基因进行蛋白质-蛋白质相互作用网络分析,发明人使用了在线工具STRING数据库(Snel B,2000)。
小化合物-蛋白质相互作用分析(CPI)
蛋白质与小化合物的相互作用网络对于理解分子与细胞的功能具有重要的意义。利用STITCH('search tool for interactions of chemicals')(Kuhn等.,2008) (2.0版)(http://stitch2.embl.de/)在线数据库,分析化合物-蛋白质相互作用网络。
MTT检测细胞活力
调整细胞悬液浓度,铺板使待测细胞调密度为1000-10000/孔,加入浓度梯度的药物Bortezomib、17-AAG(Selleck Chemicals)或C75(Cayman Chemical),每个浓度设置4-6个重复。孵育24-72小时。每孔加入20ul MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑)溶液,继续培养4h。每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm(570nm)处测量各孔的吸光值。
相互作用参数CI(Combination index)分析
药物BTZ与17-AAG或者C75的相互作用模式采用CompuSyn软件分析(http://www.combosyn.com/)。相互作用方程采用Chou-Talalay原则(T C Chou,P Talalay,Quantitative analysis of dose-effect relationships:the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors.Advances in Enzyme Regulation02/1984;22:27-55.),即当CI=1,>1,或<1时分别认为药物分别具有叠加,拮抗或协同作用。将CZ-1细胞于96孔板中每孔5000个细胞,分别添加相应浓度的BTZ,同时添加联用药物17-AAG或C75,24h后,使用MTT检测细胞活力。
实施例1.双荧光蛋白系统高效测定蛋白质相对稳定性
发明人设计构建了双荧光蛋白结构,其中mEGFP与目标蛋白的C端融合,中间linker蛋白为K(R)饱和突变的泛素,内参荧光蛋白为mRFP,三者组成mEGFPfu-mRFPf的结构,其中mEGFP参照序列SEQ ID NO:1,2,mRFP参照序列SEQ ID NO:3,4,UbK0参照序列为SEQ ID NO:17,18,其结构示意图如图1a所示,对目标蛋白质进行相对定量的原理如图1b所示,发明人将人工设计的重组双荧光蛋白结构构件在哺乳动物细胞表达质粒上,采用CMV启动子组成性表达。
发明人将没有融合任何外源基因的mEGFPfu-mRFPf构建入真核细胞表达载体中,通过慢病毒感染293FT细胞,成功构建融合有mEGFPfu-mRFPf稳转细胞系,通过FACS技术,发明人检测发现mEGFP-UBK0与mRFP具有相同稳定性,且都十分稳定。见图1c。其中低信号区的细胞为阴性对照细胞。
为了检测基因的相对稳定性,发明人通过gateway重组技术,将基因ARC, TP53,CDC25A与mEGFP-UBK0-mRFP结构的mEGFP的N端融合,通过慢病毒感染293FT细胞,成功构建融合有ARC-mEGFPfu-mRFPf,TP53-mEGFPfu-mRFPf,CDC25A-mEGFPfu-mRFPf的稳转细胞系,通过FACS技术,发明人发现不同基因具有不同的蛋白质稳定性。见图5。
为了验证双荧光蛋白系统被泛素化酶切割的情况,发明人以TP53-mEGFPfu-mRFPf载体表达蛋白为例进行了测试。该融合肽段在刚被翻译出时的原始条带,以及被泛素化酶切割后形成的两条较小的条带(分别为TP53-mEGFP融合蛋白条带和mRFP条带),通过western blot电泳均得到了验证,如图7所示。这表明本发明提供的融合多肽成功被泛素化酶进行了切割,且形成了预期的两段蛋白。
为了测试双荧光蛋白结构是否可以实时监测外源刺激扰动对蛋白质稳定性的影响,发明人构建AXNA1-mEGFPfu-mRFPf与RGS4-mEGFPfu-mRFPf细胞系,并检测细胞系对抗癌药物Bortezomib的反应,利用FACS技术与westernbloting检测,证明发明人的双荧光系统可以敏感且特异的检测到蛋白质稳定性的变化。见图1d。
实施例2.mEGFP-UBK0-mRFP双荧光蛋白系统检测全基因组范围内蛋白质稳定性
发明人以human ORFeome V5.1为目标基因文库,利用gateway同源重组技术,将接近15000个ORF的C端融合上mEGFP-UBK0-mRFP结构。利用融合有mEGFPfu-mRFPf结构的基因文库,采用慢病毒感染技术感染293细胞,构建整合有文库基因的双荧光细胞系。结果见图6。然后利用FACS技术,基于mEGFP/mRFP的比值,将文库分选为8各区间,提取各个区间细胞基因组,利用PCR产物为模板进行体外cRNA扩增,然后进行芯片杂交,利用Bioconductor程序包limma中的Composite loess normalization程序进行数据处理,计算每个基因的相对稳定性参数PSI(Protein Stability Index)。其流程图见图2a。蛋白质相对稳定性参数分布范围见图2b,代表性数据见图2c,d。图2d是图2c数据绘制的折线图,反应基因成单峰分布。
实施例3.利用双荧光细胞文库检测对抗癌药物bortezomib在蛋白质稳定性层面响应的候选基因
发明人利用含有human ORFeome V5.1基因文库的双荧光细胞文库,分别用 DMSO(对照处理)与Bortezomib(实验处理)处理文库细胞,然后利用图2a所示的流程,分别计算每个文库基因在DMSO与Bortezomib状态下的PSI值,然后求的△PSI=PSIBTZ-PSIDMSO,进而利用△PSI对所有基因排序,对显著基因进行生物信息学分析。图3a为抗癌药物Bortezomib的化学结构,图3c,d为代表性数据与底物响应蛋白,图4为生物信息学分析结果。
实施例4.ProTA数据的CPI分析指导理性药物联用
蛋白质与小化合物的相互作用网络对于理解分子与细胞的功能具有重要的意义。因此,发明人利用STITCH(search tool for interactions of chemicals)在线数据库,研究了BTZ效应蛋白显著性存在相互作用的小化合物,以其探讨Bortezomib药物细胞毒性与抗药性产生的细胞学机制。分别用DMSO(对照处理)与Bortezomib(实验处理)处理实施例2所得的文库细胞,然后利用图2a所示的流程,分别计算每个文库基因在DMSO与Bortezomib状态下的PSI值,然后求的△PSI=PSIBTZ-PSIDMSO,进而利用△PSI对所有基因排序,对前250个击中的基因进行CPI(化合物-蛋白质相互作用)分析。图8为CPI分析结果。CPI分析的结果显示,发明人特异的富集到小化合物adenosine diph(采用类似物17-AAG代替)与coenzyme A(采用FASN抑制剂C75)。
随后,发明人以CZ-1与CZ-1/R细胞系为验证细胞系,验证了BTZ与17-AAG或C75的药物联用效果,并计算了相互作用参数CI(Combination index),即,分析药物BTZ与17-AAG或者C75的相互作用模式,结果如图9和10所示。其中,图9显示MTT检测BTZ与17-AAG或C75的药物联用效果,结果显示:BTZ与17-AAG或C75的药物联用对BTZ敏感细胞系CZ-1与BTZ抗药性细胞系CZ-1/R都具有明显的杀伤效果。图10显示BTZ在5,10,15,20nM的浓度下与17-AAG具有协同作用,BTZ在所有测试浓度下与C75都具有协同作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种遗传构建物,其结构如下式所示:
5’-A+B+C+D+E-3’,
其中,
A表示启动子;
B表示由目标蛋白和第一标记蛋白构成的融合蛋白的编码序列;
C表示连接肽的编码序列;
D表示第二标记蛋白的编码序列;和
E表示终止子;
其中,B和D可以互换。
2.如权利要求1所述的遗传构建物,其特征在于,B中5’-3’依次包含目标蛋白的编码序列和第一标记蛋白的编码序列。
3.如权利要求1所述的遗传构建物,其特征在于,所述连接肽选自:泛素、泛素截短体、泛素突变体及类泛素、2A短肽等;优选泛素;最优选K(R)饱和突变的泛素。
4.如权利要求1所述的遗传构建物,其特征在于,所述第一标记蛋白和第二标记蛋白是荧光蛋白。
5.如权利要求1所述的遗传构建物,其特征在于,所述目标蛋白的编码序列包括人类基因组文库human ORFeome V5.1中所有基因。
6.一种多肽,其结构如下式所示:
B1+C1+D1,
其中,
B1表示由目标蛋白和第一标记蛋白构成的融合蛋白
C1表示连接肽;和
D1表示第二标记蛋白;
其中B1和D1可以互换。
7.一种载体,其包含权利要求1-5中任一项所述的遗传构建物。
8.一种细胞,其包含权利要求1-5中任一项所述的遗传构建物或权利要求7所述的载体。
9.一种细胞文库,其由权利要求8所述的细胞构成。
10.一种检测一个或多个目标蛋白质稳定性的方法,包括以下步骤:
(1)构建权利要求9所述的细胞文库;
(2)在所述特定条件下和对照条件下培养(1)所得的细胞文库;
(3)测定所述特定条件下和对照条件下培养的细胞文库中第一标记蛋白与第二标记蛋白之比;和
(4)通过比较所述特定条件下和对照条件下培养的细胞系中第一标记蛋白与第二标记蛋白之比得出目标蛋白质稳定性是否变化的结论;或:
采用流式细胞仪技术按照第一标记蛋白与第二标记蛋白之比将细胞分成n个区间(n大于等于2),并通过DNA芯片技术检测每一区间中目标基因的各自表达量计算出目标基因在各个区间中的分布情况,并将所述特定条件下和对照条件下培养的细胞系中目标基因分布情况进行对比,得出目标基因所编码的蛋白质稳定性是否变化的结论。
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