CN114957446B - 与nmdar脑炎患者中的自身抗体结合的nmdar突变体及其构建方法 - Google Patents
与nmdar脑炎患者中的自身抗体结合的nmdar突变体及其构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了与NMDAR脑炎患者中的自身抗体结合的NMDAR突变体及其构建方法，涉及生物医药技术领域。本发明所述NMDAR的突变体可与抗NMDAR脑炎患者中的自身抗体结合，从而为利用通用型CAR‑T疗法治疗抗NMDAR抗体脑炎提供了多种不同种类的抗原肽。本发明对于NMDAR的1α亚基进行突变，缺失胞内段3或跨膜段4，或胞内段3或与膜段4同时缺失，突变体与患者样本中的自身抗体结合不受影响；缺失胞内段5时，突变体与患者样本中的自身抗体结合信号减弱。其余不同段的多个氨基酸缺失均会影响患者样本中自身抗体的结合。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及与NMDAR脑炎患者中的自身抗体结合的NMDAR突变体及其构建方法。
背景技术
N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体是谷氨酸(Glu)门控的钙高通透离子通道，对突触传递和突触可塑性起到重要调节作用。2007年，Dalmau在一组表现为记忆障碍、精神障碍和通气不足的病人中发现针对N-甲基-D-天冬氨酸受体NR1亚单位的自身抗体，并首次命名了抗NMDAR抗体脑炎(Dalmau J,Tüzün E,Wu HY,et al.Paraneoplastic anti-N-methyl-Daspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.AnnNeurol,2007,61:25-36)。抗NMDAR抗体的致病机制是患者体内NMDAR抗体导致NMDAR表面密度和突触定位的选择性及可逆性下降，通过使NMDAR受体交联内化而导致受体功能丧失，进而引发神经系统疾病(Ethan G.Hughes,Xiaoyu Peng,Amy J.Gleichman,et al.Cellular andsynaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis[J].The JournalofNeuroscience,2010,30(17):5866-5875)。
抗NMDAR抗体脑炎是一种免疫机制介导的疾病，目前的主要治疗方法是免疫疗法，虽然约有85％的患者对免疫疗法有反应，但患者通常需要几个月或一年以上的时间才能康复。现有的针对NMDAR介导的疾病，如抑郁症、神经痛、精神分裂和阿尔兹海默等的治疗药物，主要是抑制剂、拮抗剂和变构调节剂，因其对中枢系统有副作用，所以尚未有广泛应用。虽然Mannara等人的研究结果表明SGE-301或类似的调节剂可作为抗NMDAR脑炎的补充疗法，但仍需进一步验证(Mannara F,RadosevicM,Planaguma J,et al.Allostericmodulation of NMDA receptors prevents the antibody effects of patients withanti-NMDAR encephalitis.BRAIN,2020,143(9):2709-2720)。2021年，Bo Zhang等人创新性地开发了基于自身抗原肽的可控、通用型嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)新技术，并将其应用于自身免疫病的治疗(Bo Zhang,Yan Wang,Ye shuang Yuan,et al.In vitroelimination of autoreactive B cells from rheumatoid arthritis patients byuniversal chimeric antigen receptor T cells.Ann Rheum Dis,2021,80(2):176-184)。
2008年，Dalmau的研究发现，NMDAR NR1亚基的25～388氨基酸是抗NMDAR抗体的主要识别表位，但是没有进行更多更细致表位的鉴定。而更多更细致的NMDAR抗原表位的鉴定，对利用Bo Zhang等人提出的新型自身免疫疾病的治疗方法(CAR-T)治疗抗NMDAR抗体脑炎具有重大意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供与NMDAR脑炎患者中的自身抗体结合的NMDAR突变体及其构建方法，从而确定更多更精细的抗原表位，为利用通用型CAR-T疗法治疗抗NMDAR抗体脑炎提供了多种不同种类的抗原肽。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了与NMDAR脑炎患者中的自身抗体结合的NMDAR突变体，所述NMDAR突变体包括：NMDAR1α亚基缺失胞外段1中不多于2个氨基酸、缺失跨膜段4、缺失胞内段3、缺失胞内段5中不多于5个连续氨基酸、缺失胞外段1与跨膜段2的连接处氨基酸和/或缺失跨膜段6与胞外段7的连接处氨基酸；
所述胞外段1位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的19-559位；
所述跨膜段4位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的603-624位；
所述胞内段3位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的581-602位；
所述胞内段5位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的625-630位；
所述胞外段1与跨膜段2的连接处氨基酸位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的559-560位；
所述跨膜段6与胞外段7的连接处氨基酸位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的647-648位。
优选的，所述NMDAR突变体包括：缺失胞内段3或跨膜段4，或胞内段3与跨膜段4同时缺失。
优选的，所述跨膜段2位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的560-580位；
所述跨膜段6位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的631-647位；
所述胞外段7位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的648-812位。
本发明还提供了构建上述的NMDAR突变体的引物对，包括针对胞外段1设计的引物19-559-F和19-559-R，针对跨膜段4设计的引物603-624-F和603-624-R，针对胞内段3设计的引物581-602-F和581-602-R，针对胞内段5设计的引物625-630-F和625-630-R，针对胞外段1与跨膜段2的连接处氨基酸设计的引物559-560-F和559-560-R，和针对跨膜段6与胞外段7的连接处氨基酸设计的引物647-648-F和647-648-R；
所述19-559-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述19-559-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述603-624-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述603-624-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述581-602-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述581-602-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述625-630-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述625-630-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述559-560-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述559-560-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
所述647-648-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述647-648-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
本发明还提供了扩增上述的NMDAR突变体的编码基因的方法，包括以下步骤：将编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸插入pCDNA3.1中，得模板质粒；将所述模板质粒和上述引物对混合进行PCR扩增。
优选的，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述PCR扩增的程序包括：98℃预变性2min；98℃变性15s，59℃退火15s，72℃延伸4min，30～35个循环；72℃再延伸5～10min。
有益效果：本发明提供了多种NMDAR的突变体，所述突变体可与抗NMDAR脑炎患者中的自身抗体结合，从而为利用通用型CAR-T疗法治疗抗NMDAR抗体脑炎提供了多种不同种类的抗原肽。如在本发明实施例中，对于NMDAR的1α亚基进行突变，缺失胞内段3(第581-602位)或跨膜段4(第603-624位)，或胞内段3或与跨膜段4同时缺失，突变体与患者样本中的自身抗体结合不受影响；缺失胞内段5(第625-630位)时，突变体与患者样本中的自身抗体结合信号减弱。其余不同段的多个氨基酸缺失均会影响患者样本中自身抗体的结合。
附图说明
图1为NMDAR 1α的氨基酸在细胞膜内外的分布。
具体实施方式
本发明提供了与NMDAR脑炎患者中的自身抗体结合的NMDAR突变体，所述NMDAR突变体包括：NMDAR1α亚基缺失胞外段1中不多于2个氨基酸、缺失跨膜段4、缺失胞内段3、缺失胞内段5中不多于5个连续氨基酸、缺失胞外段1与跨膜段2的连接处氨基酸和/或缺失跨膜段6与胞外段7的连接处氨基酸；
所述胞外段1位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的19-559位；
所述跨膜段4位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的603-624位；
所述胞内段3位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的581-602位；
所述胞内段5位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的625-630位；
所述胞外段1与跨膜段2的连接处氨基酸位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的559-560位；
所述跨膜段6与胞外段7的连接处氨基酸位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的647-648位。
本发明所述NMDAR的1α的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，且在细胞膜内外分布如图1所示，其中胞外段包括：胞外段1(第19-559位氨基酸)和胞外段7(第648-812位氨基酸)；跨膜段包括：跨膜段2(第560-580位)、跨膜段4(第603-624位)、跨膜段6(第631-647位)和跨膜段8(第813-833位)；胞内段包括：胞内段3(第581-602位)、胞内段5(第625-630位)和胞内段9(第834-938位)；连接处包括：胞外段1与跨膜段2的连接处氨基酸(559-560位氨基酸)以及跨膜段6与胞外段7的连接处(647-648位氨基酸)。
本发明所述突变体优选包括：缺失胞内段3或跨膜段4，或胞内段3与跨膜段4同时缺失。经实施例验证，对于NMDAR的1α亚基来说，缺失胞内段3或跨膜段4，或胞内段3或与跨膜段4同时缺失，突变体与患者样本中的自身抗体结合不受影响；缺失胞内段5时，突变体与患者样本中的自身抗体结合信号减弱；其余不同段的多个氨基酸缺失均会影响患者样本中自身抗体的结合。
本发明还提供了构建上述的NMDAR突变体的引物对，包括针对胞外段1设计的引物19-559-F和19-559-R，针对跨膜段4设计的引物603-624-F和603-624-R，针对胞内段3设计的引物581-602-F和581-602-R，针对胞内段5设计的引物625-630-F和625-630-R，针对胞外段1与跨膜段2的连接处氨基酸设计的引物559-560-F和559-560-R，和针对跨膜段6与胞外段7的连接处氨基酸设计的引物647-648-F和647-648-R；各引物的核苷酸序列如表1所示。本发明所述表1中除包含上述的NMDAR突变体的构建引物对，还包括了基于所述NMDAR的其他抗原表位设计的突变体构建引物对，在实施例中用以作为对比。
表1根据突变位点设计的引物
本发明还提供了扩增上述的NMDAR突变体的编码基因的方法，包括以下步骤：将编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸插入pCDNA3.1中，得模板质粒；将所述模板质粒和上述引物对混合进行PCR扩增。
本发明编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示。本发明对所述插入的方法并没有特殊限定，优选插入NheI和NotI两个酶切位点之间。
本发明以所述模板质粒和所述引物对混合构建PCR扩增体系，所述PCR扩增体系以50μl计，优选包括：模板50ng、引物F(0.2μM)2μl、引物R(0.2μM)2μl、Fast PfuDNAPolymerase(2.5units)1μl、5×Fast Pfubuffer 10μl、2.5mM dNTP 4μl、DMSO 1μl，余量的Nuclease-free Water；所述PCR扩增的程序包括：98℃预变性2min；98℃变性15s，59℃退火15s，72℃延伸4min，变性到延伸30～35个循环；72℃再延伸5～10min。
在本发明实施例中，除构建缺失243-249位氨基酸、缺失581-583位氨基酸、缺失657-659位氨基酸和缺失837-838位氨基酸的突变体时，以缺失了864-937位氨基酸的NMDAR1α序列为模板外，其余突变体在构建时，均以包含SEQ ID NO.1所示序列的模板质粒为模板。
本发明还提供了验证各突变体能否结合NMDAR脑炎患者中自身抗体的方法。将构建好的各突变体分别转染已培养好的293T细胞，36～48h后使用预冷的丙酮对已转染突变体的细胞进行固定，烘干备用；然后，以NMDAR脑炎患者的血清样本作为一抗孵育烘干的细胞爬片，以荧光标记的抗人IgG作为二抗继续孵育，通过荧光显微镜观察结果。
下面结合实施例对本发明提供的与NMDAR脑炎患者中的自身抗体结合的NMDAR突变体及其构建方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
NMDAR突变体的构建
1、通过人工合成的方法，将NMDAR的1α亚基DNA序列(SEQ ID NO.2)合成至pCDNA3.1上，插入酶切位点为NheI和NotI。
2、根据突变位点设计表1所示引物。
3、分别使用步骤2的引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
使用编号为1～33及38的引物对进行PCR扩增时，以NMDAR 1α亚基的DNA序列为模板时；
使用编号为34～37的引物对进行PCR扩增时，以缺失了864-937位氨基酸的NMDAR1α亚基的DNA序列为模板。
PCR扩增体系为：模板50ng、引物F(0.2μM)2μl、引物R(0.2μM)2μl、FastPfuDNAPolymerase(2.5units)1μl、5×Fast Pfu buffer 10μl、2.5mM dNTP 4μl、DMSO 1μl，最后用Nuclease-free Water将体系补足50μl；PCR扩增的程序包括：98℃预变性2min；98℃变性15s，59℃退火15s，72℃延伸4min，变性到延伸33个循环；72℃再延伸5～10min。
4、将步骤3得到的PCR产物进一步处理，转化，测序，测序正确的质粒大提后备用。
使用编号为4～11、19～32以及33～38的引物扩增得到的各PCR产物，分别用DMT酶于37℃处理1h，去除模板质粒，进行胶回收。将胶回收的产物使用T4 PolynucleotideKinase进行处理(按照NEB说明书进行操作)，处理后的产物加入T4连接酶室温连接2小时，然后将连接产物转化至感受态细胞(DMT Chemically Competent Cell)中；
使用编号为1～3、12～18的引物扩增得到的各PCR产物，分别使用DMT酶于37℃处理1h，去除模板质粒，然后将处理后的PCR产物转化至感受态细胞(DMT ChemicallyCompetent Cell)中；
将转化产物涂平板，于37℃培养箱中过夜培养；次日，挑取单克隆至卡那抗性的LB液体培养基，37℃摇床过夜培养，提质粒送金维智测序。测序正确的质粒大提保存。
实施例2
制备各突变体的细胞爬片
(1)293T细胞培养：DMEM高糖培养基与FBS按9:1比例配制成10％FBS-DMEM高糖培养基，待细胞铺满时按1:5～1:6传代至含有载玻片的10cm2培养皿，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中过夜培养；
(2)PEI转染：使用PEI转染试剂将实施例1提取得到的质粒转染至步骤(1)培养获得的细胞，36～48h准备固定；
(3)爬片的固定及烘干：用PBS将细胞爬片冲洗2次，然后置于预冷的丙酮中，固定5～10min，取出，于42℃烘干备用。
实施例3
取NMDAR脑炎患者血清10例，以NMDAR脑炎患者的血清样本作为一抗分别孵育烘干的各细胞爬片，以荧光标记的抗人IgG作为二抗继续孵育，通过免疫荧光法验证各突变体与阳性血清的结合能力，具体步骤如下：
(1)用PBS洗涤实施例2制备得到的各爬片；
(2)一抗孵育：将各NMDAR脑炎患者的血清使用PBST按照1:10的比例稀释后进行孵育，孵育时间40min；
(3)洗涤：使用PBST洗涤3次；
(4)二抗孵育：使用FITC标记的抗人IgG进行孵育(JACKSON二抗，使用PBST按照1:200稀释后使用)，孵育时间40min；
(5)洗涤：使用PBST洗涤3次；
(6)显微镜下观察结果，并记录各突变体与自身抗体的结合情况。
各突变体与自身抗体的结合情况如表2所示，表2中编号与表1中引物对及缺失位点相对应：(1)关于胞外段：当NMDAR 1α亚基缺失胞外段1(第19-559位氨基酸)或胞外段7(第648-812位氨基酸)时，患者的样本不与该缺失突变体结合产生阳性信号；
对胞外段1的序列分别缺失19-109位氨基酸、110-209位氨基酸、210-309位氨基酸、310-409位氨基酸、410-559位氨基酸，结果是突变体均不与患者血清结合产生阳性信号；更进一步的研究发现，当NMDAR 1α亚基缺失了19-28位氨基酸、296-299位氨基酸、296-301位氨基酸、296-303位氨基酸、296-305位氨基酸时，各突变体也均不与患者血清结合产生阳性信号；仅当NMDAR 1α亚基缺失了296-297位氨基酸时，与患者样本反应后才有少量的阳性信号。因此，对于胞外段1来说，缺失2个或2个以下氨基酸对阳性信号影响较小，当突变体为缺失4个及4个以上氨基酸的序列时，不与阳性样本结合产生信号。
(2)关于跨膜段：当NMDAR1α亚基分别缺失跨膜段2(第560-580位)、跨膜段4(第603-624位)、跨膜段6(第631-647位)、跨膜段8(第813-833位)时，发现只有缺失跨膜段4的突变体可与患者血清反应产生与对照一致的阳性信号，其余三个突变体均不产生阳性信号。
(3)关于胞内段：当NMDAR 1α亚基缺失胞内段3(第581-602位)、胞内段5(第625-630位)、胞内段9(第834-938位)时，胞内段9的缺失突变体不与患者样本产生阳性信号，缺失胞内段3的突变体可与患者样本反应产生与对照一致的阳性信号，缺失胞内段5的突变体也可与患者样本产生少量阳性信号；
对胞内段5进行细致的突变研究，发现分别缺失625-626位氨基酸、627-628位氨基酸、629-630位氨基酸、626-630位氨基酸、627-630位氨基酸、628-630位氨基酸时，各突变体均与患者血清产生与对照一致的阳性信号。对于胞内段5来说，当连续缺失5个及5个以下氨基酸时，各突变体与患者血清的反应不受影响，仅当胞内段5的6个氨基酸全部缺失或同时缺失第625位和第630位氨基酸，或将胞内段5全部突变为甘氨酸时，阳性信号才会减弱；
对胞内段9进行细致的突变研究，发现缺失864-938位氨基酸时，该突变体与患者血清的反应不受影响。
(4)分别缺失胞外段1与跨膜段2的连接处氨基酸(559-560位氨基酸)，跨膜段6与胞外段7的连接处(647-648位氨基酸)时，突变体与患者样本反应产生与对照一致的阳性信号，而缺失胞外段7与跨膜段8的连接处(812-813位氨基酸)时，突变体与患者样本反应仅产生少量的阳性信号。
(5)胞内段3(第581-602位)与跨膜段4(第603-624位)同时缺失，仍不影响对阳性样本中自身抗体的识别；但将胞内段3，跨膜段4和胞内段5同时缺失突变为精氨酸时，阳性信号数量有所减少。
表2各突变体与自身抗体的结合情况
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 陕西脉元生物科技有限公司
<120> 与NMDAR脑炎患者中的自身抗体结合的NMDAR突变体及其构建方法
<160> 75
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2817
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagcacca tgcgcctgct gacgctcgcc ctgctgttct cctgctccgt cgcccgtgcc 60
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gtgacgatcc accaggagcc cttcgtgtac gtcaagccca cgctgagtga tgggacatgc 1260
aaggaggagt tcacagtcaa cggcgaccca gtcaagaagg tgatctgcac cgggcccaac 1320
gacacgtcgc cgggcagccc ccgccacacg gtgcctcagt gttgctacgg cttttgcatc 1380
gacctgctca tcaagctggc acggaccatg aacttcacct acgaggtgca cctggtggca 1440
gatggcaagt tcggcacaca ggagcgggtg aacaacagca acaagaagga gtggaatggg 1500
atgatgggcg agctgctcag cgggcaggca gacatgatcg tggcgccgct aaccataaac 1560
aacgagcgcg cgcagtacat cgagttttcc aagcccttca agtaccaggg cctgactatt 1620
ctggtcaaga aggagattcc ccggagcacg ctggactcgt tcatgcagcc gttccagagc 1680
acactgtggc tgctggtggg gctgtcggtg cacgtggtgg ccgtgatgct gtacctgctg 1740
gaccgcttca gccccttcgg ccggttcaag gtgaacagcg aggaggagga ggaggacgca 1800
ctgaccctgt cctcggccat gtggttctcc tggggcgtcc tgctcaactc cggcatcggg 1860
gaaggcgccc ccagaagctt ctcagcgcgc atcctgggca tggtgtgggc cggctttgcc 1920
atgatcatcg tggcctccta caccgccaac ctggcggcct tcctggtgct ggaccggccg 1980
gaggagcgca tcacgggcat caacgaccct cggctgagga acccctcgga caagtttatc 2040
tacgccacgg tgaagcagag ctccgtggat atctacttcc ggcgccaggt ggagctgagc 2100
accatgtacc ggcatatgga gaagcacaac tacgagagtg cggcggaggc catccaggcc 2160
gtgagagaca acaagctgca tgccttcatc tgggactcgg cggtgctgga gttcgaggcc 2220
tcgcagaagt gcgacctggt gacgactgga gagctgtttt tccgctcggg cttcggcata 2280
ggcatgcgca aagacagccc ctggaagcag aacgtctccc tgtccatcct caagtcccac 2340
gagaatggct tcatggaaga cctggacaag acgtgggttc ggtatcagga atgtgactcg 2400
cgcagcaacg cccctgcgac ccttactttt gagaacatgg ccggggtctt catgctggta 2460
gctgggggca tcgtggccgg gatcttcctg attttcatcg agattgccta caagcggcac 2520
aaggatgctc gccggaagca gatgcagctg gcctttgccg ccgttaacgt gtggcggaag 2580
aacctgcagg atagaaagag tggtagagca gagcctgacc ctaaaaagaa agccacattt 2640
agggctatca cctccaccct ggcttccagc ttcaagaggc gtaggtcctc caaagacacg 2700
agcaccgggg gtggacgcgg cgctttgcaa aaccaaaaag acacagtgct gccgcgacgc 2760
gctattgaga gggaggaggg ccagctgcag ctgtgttccc gtcataggga gagctga 2817
<210> 2
<211> 938
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ser Thr Met Arg Leu Leu Thr Leu Ala Leu Leu Phe Ser Cys Ser
1 5 10 15
Val Ala Arg Ala Ala Cys Asp Pro Lys Ile Val Asn Ile Gly Ala Val
20 25 30
Leu Ser Thr Arg Lys His Glu Gln Met Phe Arg Glu Ala Val Asn Gln
35 40 45
Ala Asn Lys Arg His Gly Ser Trp Lys Ile Gln Leu Asn Ala Thr Ser
50 55 60
Val Thr His Lys Pro Asn Ala Ile Gln Met Ala Leu Ser Val Cys Glu
65 70 75 80
Asp Leu Ile Ser Ser Gln Val Tyr Ala Ile Leu Val Ser His Pro Pro
85 90 95
Thr Pro Asn Asp His Phe Thr Pro Thr Pro Val Ser Tyr Thr Ala Gly
100 105 110
Phe Tyr Arg Ile Pro Val Leu Gly Leu Thr Thr Arg Met Ser Ile Tyr
115 120 125
Ser Asp Lys Ser Ile His Leu Ser Phe Leu Arg Thr Val Pro Pro Tyr
130 135 140
Ser His Gln Ser Ser Val Trp Phe Glu Met Met Arg Val Tyr Ser Trp
145 150 155 160
Asn His Ile Ile Leu Leu Val Ser Asp Asp His Glu Gly Arg Ala Ala
165 170 175
Gln Lys Arg Leu Glu Thr Leu Leu Glu Glu Arg Glu Ser Lys Ala Glu
180 185 190
Lys Val Leu Gln Phe Asp Pro Gly Thr Lys Asn Val Thr Ala Leu Leu
195 200 205
Met Glu Ala Lys Glu Leu Glu Ala Arg Val Ile Ile Leu Ser Ala Ser
210 215 220
Glu Asp Asp Ala Ala Thr Val Tyr Arg Ala Ala Ala Met Leu Asn Met
225 230 235 240
Thr Gly Ser Gly Tyr Val Trp Leu Val Gly Glu Arg Glu Ile Ser Gly
245 250 255
Asn Ala Leu Arg Tyr Ala Pro Asp Gly Ile Leu Gly Leu Gln Leu Ile
260 265 270
Asn Gly Lys Asn Glu Ser Ala His Ile Ser Asp Ala Val Gly Val Val
275 280 285
Ala Gln Ala Val His Glu Leu Leu Glu Lys Glu Asn Ile Thr Asp Pro
290 295 300
Pro Arg Gly Cys Val Gly Asn Thr Asn Ile Trp Lys Thr Gly Pro Leu
305 310 315 320
Phe Lys Arg Val Leu Met Ser Ser Lys Tyr Ala Asp Gly Val Thr Gly
325 330 335
Arg Val Glu Phe Asn Glu Asp Gly Asp Arg Lys Phe Ala Asn Tyr Ser
340 345 350
Ile Met Asn Leu Gln Asn Arg Lys Leu Val Gln Val Gly Ile Tyr Asn
355 360 365
Gly Thr His Val Ile Pro Asn Asp Arg Lys Ile Ile Trp Pro Gly Gly
370 375 380
Glu Thr Glu Lys Pro Arg Gly Tyr Gln Met Ser Thr Arg Leu Lys Ile
385 390 395 400
Val Thr Ile His Gln Glu Pro Phe Val Tyr Val Lys Pro Thr Leu Ser
405 410 415
Asp Gly Thr Cys Lys Glu Glu Phe Thr Val Asn Gly Asp Pro Val Lys
420 425 430
Lys Val Ile Cys Thr Gly Pro Asn Asp Thr Ser Pro Gly Ser Pro Arg
435 440 445
His Thr Val Pro Gln Cys Cys Tyr Gly Phe Cys Ile Asp Leu Leu Ile
450 455 460
Lys Leu Ala Arg Thr Met Asn Phe Thr Tyr Glu Val His Leu Val Ala
465 470 475 480
Asp Gly Lys Phe Gly Thr Gln Glu Arg Val Asn Asn Ser Asn Lys Lys
485 490 495
Glu Trp Asn Gly Met Met Gly Glu Leu Leu Ser Gly Gln Ala Asp Met
500 505 510
Ile Val Ala Pro Leu Thr Ile Asn Asn Glu Arg Ala Gln Tyr Ile Glu
515 520 525
Phe Ser Lys Pro Phe Lys Tyr Gln Gly Leu Thr Ile Leu Val Lys Lys
530 535 540
Glu Ile Pro Arg Ser Thr Leu Asp Ser Phe Met Gln Pro Phe Gln Ser
545 550 555 560
Thr Leu Trp Leu Leu Val Gly Leu Ser Val His Val Val Ala Val Met
565 570 575
Leu Tyr Leu Leu Asp Arg Phe Ser Pro Phe Gly Arg Phe Lys Val Asn
580 585 590
Ser Glu Glu Glu Glu Glu Asp Ala Leu Thr Leu Ser Ser Ala Met Trp
595 600 605
Phe Ser Trp Gly Val Leu Leu Asn Ser Gly Ile Gly Glu Gly Ala Pro
610 615 620
Arg Ser Phe Ser Ala Arg Ile Leu Gly Met Val Trp Ala Gly Phe Ala
625 630 635 640
Met Ile Ile Val Ala Ser Tyr Thr Ala Asn Leu Ala Ala Phe Leu Val
645 650 655
Leu Asp Arg Pro Glu Glu Arg Ile Thr Gly Ile Asn Asp Pro Arg Leu
660 665 670
Arg Asn Pro Ser Asp Lys Phe Ile Tyr Ala Thr Val Lys Gln Ser Ser
675 680 685
Val Asp Ile Tyr Phe Arg Arg Gln Val Glu Leu Ser Thr Met Tyr Arg
690 695 700
His Met Glu Lys His Asn Tyr Glu Ser Ala Ala Glu Ala Ile Gln Ala
705 710 715 720
Val Arg Asp Asn Lys Leu His Ala Phe Ile Trp Asp Ser Ala Val Leu
725 730 735
Glu Phe Glu Ala Ser Gln Lys Cys Asp Leu Val Thr Thr Gly Glu Leu
740 745 750
Phe Phe Arg Ser Gly Phe Gly Ile Gly Met Arg Lys Asp Ser Pro Trp
755 760 765
Lys Gln Asn Val Ser Leu Ser Ile Leu Lys Ser His Glu Asn Gly Phe
770 775 780
Met Glu Asp Leu Asp Lys Thr Trp Val Arg Tyr Gln Glu Cys Asp Ser
785 790 795 800
Arg Ser Asn Ala Pro Ala Thr Leu Thr Phe Glu Asn Met Ala Gly Val
805 810 815
Phe Met Leu Val Ala Gly Gly Ile Val Ala Gly Ile Phe Leu Ile Phe
820 825 830
Ile Glu Ile Ala Tyr Lys Arg His Lys Asp Ala Arg Arg Lys Gln Met
835 840 845
Gln Leu Ala Phe Ala Ala Val Asn Val Trp Arg Lys Asn Leu Gln Asp
850 855 860
Arg Lys Ser Gly Arg Ala Glu Pro Asp Pro Lys Lys Lys Ala Thr Phe
865 870 875 880
Arg Ala Ile Thr Ser Thr Leu Ala Ser Ser Phe Lys Arg Arg Arg Ser
885 890 895
Ser Lys Asp Thr Ser Thr Gly Gly Gly Arg Gly Ala Leu Gln Asn Gln
900 905 910
Lys Asp Thr Val Leu Pro Arg Arg Ala Ile Glu Arg Glu Glu Gly Gln
915 920 925
Leu Gln Leu Cys Ser Arg His Arg Glu Ser
930 935
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcacactgt ggctgctggt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcgacggag caggagaaca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agaagcttct cagcgcgcat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtcagtgcg tcctcctcct 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgtcctcgg ccatgtggtt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagcaggtac agcatcacgg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atcctgggca tggtgtgggc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gggggcgcct tccccgatgc 20
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcagccgttc acactgtggc tgctggtggg 30
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaacggctgc atgaacgagt 20
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgtggcctcc gccaacctgg cggccttcct 30
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggaggccacg atgatcatgg 20
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tacttttgag gccggggtct tcatgctggt 30
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctcaaaagta agggtcgcag 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acagccggct tctaccgcat 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggcgacggag caggagaaca 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaggcgaaag agctggaggc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtaggagaca ggggtgggag 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggcaacacca acatctggaa 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
catcagcagg gccgtcacgt 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tacgtcaagc ccacgctgag 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cacgcagccc cgcggcgggt 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agcacactgt ggctgctggt 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cacgaagggc tcctggtgga 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ttctcagcgc gcatcctggg 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gggggcgcct tccccgatgc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gcgcgcatcc tgggcatggt 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gcttctgggg gcgccttccc 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
atcctgggca tggtgtgggc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tgagaagctt ctgggggcgc 20
<210> 33
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gcatcgggga aggcgccccc agaatcctgg gcatggtgtg ggc 43
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gggggcgcct tccccgatgc 20
<210> 35
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gcatcgggga aggcgccccc agaagcatcc tgggcatggt gtgggc 46
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gggggcgcct tccccgatgc 20
<210> 37
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cccaggccgt gcacgagctc cggggctgcg tgggcaacac 40
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cgcagccccg gagctcgtgc acggcctggg 30
<210> 39
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gcatcgggga aggcgccccc agaagcttca tcctgggcat ggtgtgggc 49
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gggggcgcct tccccgatgc 20
<210> 41
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
agcttctcag cgatcctggg catggtgtgg gc 32
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gggggcgcct tccccgatgc 20
<210> 43
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
aggcgccccc ggaatcctgg gcatggtgtg ggccggct 38
<210> 44
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
tgcccaggat tccgggggcg ccttccccga tgccggag 38
<210> 45
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gtacctgctg agaagcttct cagcgcgcat cctgg 35
<210> 46
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
agaagcttct cagcaggtac agcatcacgg ccacc 35
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
cgcatcctgg gcatggtgtg 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ccgtgatgct gtacctgctg 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
attggcgcgg tgctgagcac 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ggcgacggag caggagaaca 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
aaggagaaca tcaccgaccc 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gagctcgtgc acggcctggg 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
aacatcaccg acccgccgcg 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
accgacccgc cgcggggctg 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ccgccgcggg gctgcgtggg 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gaccgcttca gccccttcgg 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ctggaacggc tgcatgaacg 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
accgccaacc tggcggcctt 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
gcgcgctgag aagcttctgg 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
atggccgggg tcttcatgct 20
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
gtaggaggcc acgatgatca t 21
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gagattgcct acaagcggca 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
gttctcaaaa gtaagggtcg 20
<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
gattacaagg atgacgacga taag 24
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
gatgaaaatc aggaagatcc 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
ggcgagcgcg agatctcggg 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gcccgtcatg ttcagcatcg 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
agccccttcg gccggttcaa 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
cagcaggtac agcatcacgg 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
ccggaggagc gcatcacggg 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
caccaggaag gccgccaggt 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
cggcacaagg atgctcgccg 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
ggcaatctcg atgaaaatca 20
<210> 74
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
aacctctcag atccctcggt cagcaccgtg gtgtgagatt acaaggatga cgacga 56
<210> 75
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
gagcgggccc gtgatatcag tgggatggta ctgctgcagg ttcttccgcc aca 53
Claims (4)
1.与NMDAR脑炎患者中的自身抗体结合的NMDAR突变体，所述NMDAR的氨基酸序列如SEQID No.2所示，所述NMDAR突变体包括以下任意一种：
缺失胞外段1与跨膜段2的连接处氨基酸，所述连接处氨基酸位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的559~560位；
缺失跨膜段6与胞外段7的连接处氨基酸，所述连接处氨基酸位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的647~648位；
分别缺失胞内段5中的第625~626 位、627~628位、629~630位、626~630位、627~630位、628~630位，所述胞内段5位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的625~630 位；
同时缺失位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的603~624位的跨膜段4以及位于SEQ IDNO.2所示氨基酸序列的581~602位的胞内段3；
缺失胞内段1的第296-297位，所述胞内段1位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的19-559位；
缺失胞内段3，所述胞内段3位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的 581~602位；
缺失跨膜段4，位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的603~624位；
缺失位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的864~937位。
2.扩增权利要求1所述的NMDAR突变体的编码基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：将编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸插入pCDNA3.1中，得模板质粒；将所述模板质粒和引物对混合进行PCR扩增；
针对缺失胞外段1与跨膜段2的连接处氨基酸的突变体设计的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的559-560-F和SEQ ID NO.12所示的559-560-R；
针对缺失缺失跨膜段6与胞外段7的连接处氨基酸的突变体设计的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的647~648-F和SEQ ID NO.14所示的647~648-R；
针对缺失胞内段5中的第625~626 位的突变体设计的引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO.27所示的625-626-F和SEQ ID NO.28所示的625-626-R；
针对缺失胞内段5中的第627~628位的突变体设计的引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO.29所示的627-628-F和SEQ ID NO.30所示的627-628-R；
针对缺失胞内段5中的第629~630位的突变体设计的引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO.31所示的629-630-F和SEQ ID NO.32所示的629-630-R；
针对缺失胞内段5中的第626~630位的突变体设计的引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO.33所示的626-630-F和SEQ ID NO.34所示的626-630-R；
针对缺失胞内段5中的第627~630位的突变体设计的引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO.35所示的627-630-F和SEQ ID NO.36所示的627-630-R；
针对缺失胞内段5中的第628~630位的突变体设计的引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO.39所示的628-630-F和SEQ ID NO.40所示的628-630-R；
针对同时缺失位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的603~624位的跨膜段4以及位于SEQID NO.2所示氨基酸序列的581~602位的胞内段3的突变体设计的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示的581-624-F和SEQ ID NO.46所示的581-624-R；
针对缺失胞内段1的第296-297位的突变体设计的引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO.51所示的296-297-F和SEQ ID NO.52所示的296-297-R；
针对缺失胞内段3的突变体设计的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的581-602-F和SEQ ID NO.8所示的581-602-R；
针对缺失跨膜段4的突变体突变体设计的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的603-624-F和SEQ ID NO.6所示的603-624-R；
针对缺失位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的864~937位的突变体设计的引物包括配核苷酸序列如SEQ ID NO.74所示的864-937-F和SEQ ID NO.75所示的864-937-R。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序包括：98℃预变性2min；98℃变性15s，59℃退火15s，72℃延伸4min，30~35个循环；72℃再延伸5~10min。
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Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997042314A1 (en) * | 1996-05-08 | 1997-11-13 | Cedars-Sinai Medical Center | Nucleic acid encoding spinocerebellar ataxia-2 and products related thereto |
| CN103168240A (zh) * | 2010-05-11 | 2013-06-19 | 宾夕法尼亚大学理事会 | 诊断和治疗脑炎或癫痫的方法 |
| CN111320684A (zh) * | 2018-12-13 | 2020-06-23 | 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 | 人源N-甲基-D-天冬氨酸受体的GluN1/GluN2A四聚体的表达及其应用 |
| WO2021027250A1 (zh) * | 2019-08-12 | 2021-02-18 | 陕西脉元生物科技有限公司 | 人体液中抗nmdar自身抗体的检测材料、制备方法及应用 |
| CN113092779A (zh) * | 2021-03-29 | 2021-07-09 | 广州市妇女儿童医疗中心 | 抗nmdar自身抗体作为先天性巨结肠诊断标志物的应用 |
| CN113755443A (zh) * | 2020-06-05 | 2021-12-07 | 陈向军 | 自身免疫性脑炎抗体瞬转与稳转检测方法及其应用 |
| CN114008204A (zh) * | 2019-06-05 | 2022-02-01 | 德国神经退行性疾病中心 | 结合在神经自身免疫疾病中靶向中枢神经系统的自身抗体的嵌合自身抗体受体(caar) |
| CN114144427A (zh) * | 2019-07-16 | 2022-03-04 | 德国神经退行性疾病中心 | 用于检测和分离nmdar自身抗体的nmda受体构建体 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060029546A1 (en) * | 2004-08-06 | 2006-02-09 | Decode Genetics, Inc. | Materials and methods for identifying anti-schizophrenic agents |
-
2022
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Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997042314A1 (en) * | 1996-05-08 | 1997-11-13 | Cedars-Sinai Medical Center | Nucleic acid encoding spinocerebellar ataxia-2 and products related thereto |
| CN103168240A (zh) * | 2010-05-11 | 2013-06-19 | 宾夕法尼亚大学理事会 | 诊断和治疗脑炎或癫痫的方法 |
| CN111320684A (zh) * | 2018-12-13 | 2020-06-23 | 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 | 人源N-甲基-D-天冬氨酸受体的GluN1/GluN2A四聚体的表达及其应用 |
| CN114008204A (zh) * | 2019-06-05 | 2022-02-01 | 德国神经退行性疾病中心 | 结合在神经自身免疫疾病中靶向中枢神经系统的自身抗体的嵌合自身抗体受体(caar) |
| CN114144427A (zh) * | 2019-07-16 | 2022-03-04 | 德国神经退行性疾病中心 | 用于检测和分离nmdar自身抗体的nmda受体构建体 |
| WO2021027250A1 (zh) * | 2019-08-12 | 2021-02-18 | 陕西脉元生物科技有限公司 | 人体液中抗nmdar自身抗体的检测材料、制备方法及应用 |
| CN113755443A (zh) * | 2020-06-05 | 2021-12-07 | 陈向军 | 自身免疫性脑炎抗体瞬转与稳转检测方法及其应用 |
| CN113092779A (zh) * | 2021-03-29 | 2021-07-09 | 广州市妇女儿童医疗中心 | 抗nmdar自身抗体作为先天性巨结肠诊断标志物的应用 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| glutamate receptor ionotropic, NMDA 1 isoform GluN1-1a precursor [Homo sapiens];佚名;《NCBI》;第1-938位 * |
| NM_007327.4(GRIN1):c.1342del (p.Arg448fs) AND Intellectualdisability, autosomal dominant 8;佚名;《NCBI》;第1-2页 * |
| NM_007327.4(GRIN1):c.1782GGA[4] (p.Glu598del) ANDIntellectual disability, autosomal dominant 8;佚名;《NCBI》;第1-2页 * |
| NMDA受体NR2A亚单位C末端突变体在HEK293细胞的共表达研究;郑婵颖, 罗建红, 傅婷, 杨巍, 沈海清;浙江大学学报(医学版)(第06期);第20-24页 * |
| 佚名.NM_007327.4(GRIN1):c.1342del (p.Arg448fs) AND Intellectualdisability, autosomal dominant 8.《NCBI》.2018,第1-2页. * |
| 佚名.NM_007327.4(GRIN1):c.1782GGA[4] (p.Glu598del) ANDIntellectual disability, autosomal dominant 8.《NCBI》.2019,第1-2页. * |
| 抗NMDA受体脑炎临床研究;李佳佳;邓文静;王雪晶;王昭旖;滕军放;;中国实用神经疾病杂志(第23期);第26-28页 * |
| 抗N-甲基-D-天冬氨酸受体脑炎的研究进展;刘婷婷;王婷;杨琨;;转化医学电子杂志(第10期);第17-20页 * |
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