CN111093696A - 抗iii型纤连蛋白结构域的抗原结合区及其使用方法 - Google Patents

Abstract

III型纤连蛋白(FN3)结构域抗体、能够编码所述FN3结构域抗体或抗原结合片段的多核苷酸、表达FN3结构域抗体或抗原结合片段的细胞、以及相关载体和可检测标记的FN3结构域抗体或抗原结合片段可用于工程化靶向FN3结构域的嵌合抗原受体(CAR)。制备所述FN3结构域抗体、CAR和工程化免疫细胞的方法，以及使用所述工程化免疫细胞的方法适用于治疗包括癌症在内的疾病。

Description

抗III型纤连蛋白结构域的抗原结合区及其使用方法

序列表

本申请包含已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且据此全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2018年6月29日，命名为JBI5032WOPCTSL.txt，并且大小为88,120字节。

技术领域

本发明涉及特异性地结合III型纤连蛋白结构域(FN3结构域)的抗体以及制备和使用所述抗体的方法。

背景技术

基于纤粘蛋白的支架是能够进化以结合任何感兴趣的化合物的蛋白质家族。这些蛋白质通常使用来源于III型纤连蛋白(FN3)或FN3样结构域的支架，其以天然或工程化抗体(即多克隆抗体、单克隆抗体或单链抗体)的特性的方式发挥作用，并且另外具有结构优势。具体地，这些抗体模拟物的结构已被设计用于最佳的折叠、稳定性和溶解度，即使在通常导致抗体的结构和功能丧失的条件下也是如此。基于纤连蛋白的支架蛋白的示例是Centyrin^TM(Jacobs等人，Protein Engineering，Design，and Selection，25：107-117，2012；US2010/0216708)。

III型纤连蛋白(Fn3)结构域按从N末端到C末端的顺序包含β或β样链，A；环，AB；β或β样链，B；环，BC；β或β样链C；环CD；β或β样链D；环DE；β或β样链，E；环，EF；β或β样链F；环FG；以及β或β样链G。环AB、BC、CD、DE、EF和FG中的任一个或全部可参与靶结合。BC、DE和FG环在结构上和功能上与来自免疫球蛋白的互补决定区(CDR)类似。

考虑到小尺寸、不含二硫键、高稳定性和在原核宿主中表达的能力，FN3结构域已获得生物医药目的。FN3结构域可容易地缀合至药物/毒素，有效地渗透到组织中，并且易于格式化为多特异性结合剂和融合蛋白，包括嵌合抗原受体(CAR)。

尽管存在多功能性，但目前不存在特异性地结合FN3结构域以用于检测、测定或生物制药目的的抗体。

发明内容

本发明包括结合III型纤连蛋白(FN3)结构域的非随机化区的抗体和抗原结合片段。本文还描述了能够编码所提供的FN3结构域抗体和抗原结合片段的相关多核苷酸、表达所提供的抗体和抗原结合片段的细胞、以及相关载体和可检测标记的FN3结构域抗体和抗原结合片段。如通过在实施例3中所示的条件下通过ELISA测量的，抗体或其抗原结合片段不选择性地结合FN3结构域的随机化区。

此外，还描述了使用所提供的FN3结构域抗体和抗原结合片段的方法。所述FN3结构域抗体和抗原结合片段可用于检测包含FN3结构域的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞表面表达。在另一个实施方案中，所述FN3结构域抗体和抗原结合片段可用于激活表达包含FN3结构域的CAR的T细胞。在另一个实施方案中，所述FN3结构域抗体或抗原结合片段可用于生成包含所述抗原结合片段的CAR。

在一些实施方案中，本发明包含分离的抗体和抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段特异性地结合FN3结构域的非随机化区。这些FN3结构域抗体或其抗原结合片段可检测包含FN3结构域的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞表面表达。在一些实施方案中，FN3结构域抗体或抗原结合片段激活表达包含FN3结构域的CAR的T细胞。在一些实施方案中，FN3结构域抗体和抗原结合片段结合在环区中被修饰的FN3结构域。表1提供本文所述的FN3结构域特异性抗体的CDR序列。

表1：FN3结构域特异性抗体的CDR序列

(SEQ ID NO：)

在一些实施方案中，FN3抗体或其抗原结合片段包含含有表1所述氨基酸序列中的任一种的CDR1、CDR2和CDR3的重链以及含有表1所述氨基酸序列中的任一种的CDR1、CDR2和CDR3的轻链。本发明的FN3结构域抗体可包含SEQ ID NO：14的重链可变区序列，并且可包含SEQ ID NO：15的轻链可变区序列。在其它实施方案中，本发明的FN3结构域抗体可包含SEQID NO：74的重链可变区序列，并且可包含SEQ ID NO：75的轻链可变区序列。在其它实施方案中，本发明的FN3结构域抗体可包含SEQ ID NO：78的重链可变区序列，并且可包含SEQ IDNO：79的轻链可变区序列。

本文所述的FN3结构域抗体包括具有与IgG同种型中的任一种组合的CDR和可变结构域的所述特征的抗体，包括其中Fc序列已经被修饰以实现不同效应功能的修饰型式。

除所述FN3结构域抗体和抗原结合片段之外，还提供了能够编码FN3结构域抗体和抗原结合片段的多核苷酸序列。还提供了包含所述多核苷酸的载体，以及表达本文提供的FN3结构域抗体或抗原结合片段的细胞。还描述了能够表达所公开的载体的细胞。这些细胞可以是哺乳动物细胞(诸如293F细胞、CHO细胞)、昆虫细胞(诸如Sf9细胞)、酵母细胞、植物细胞或细菌细胞(诸如大肠杆菌(E.coli))。还提供了用于制备FN3结构域抗体或抗原结合片段的方法。

本发明还包括本发明的CAR，其包含分离的多肽，所述分离的多肽包含：

(a)胞外结构域，所述胞外结构域具有scFv，所述scFv特异性地结合FN3结构域的非随机化区；

(b)跨膜结构域；以及

(c)胞内信号结构域。

CAR还可包含使胞外结构域和跨膜结构域连接的铰链区。

在一些实施方案中，CAR分离的多肽包含：

(a)胞外结构域，所述胞外结构域包含本发明的FN3结构域，诸如具有与SEQ IDNO：68-73之一，优选地SEQ ID NO：68-73之一有至少90％同一性的氨基酸序列的FN3结构域；

(b)铰链区，所述铰链区具有与SEQ ID NO：24有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列；

(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域具有与SEQ ID NO：25有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列；以及

(d)胞内信号结构域，所述胞内信号结构域包含具有与SEQ ID NO：26有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有SEQ ID NO：26的共同刺激结构域以及具有与SEQ ID NO：27有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有SEQ ID NO：27的初级信号结构域。

本发明还包括编码本发明的CAR的分离的多核苷酸，其包含：

(a)胞外结构域，所述胞外结构域具有scFv，所述scFv特异性地结合FN3结构域的非随机化区；

(b)跨膜结构域；以及

(c)胞内信号结构域。

CAR还可包含使胞外结构域和跨膜结构域连接的铰链区。

在一些实施方案中，分离的多核苷酸编码CAR，所述CAR包含：

(a)胞外结构域，所述胞外结构域包含本发明的FN3结构域，诸如具有与SEQ IDNO：68-73之一，优选地SEQ ID NO：68-73之一有至少90％同一性的氨基酸序列的FN3结构域；

(b)铰链区，所述铰链区具有与SEQ ID NO：24有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列；

(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域具有与SEQ ID NO：25有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列；以及

(d)胞内信号结构域，所述胞内信号结构域包含具有与SEQ ID NO：26有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有SEQ ID NO：26的共同刺激结构域以及具有与SEQ ID NO：27有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有SEQ ID NO：27的初级信号结构域。

在另一个总的方面，本发明涉及本发明的CAR、包含编码本发明CAR的多核苷酸的载体、以及包含载体或编码本发明CAR的分离的多核苷酸的宿主细胞。本发明还涉及产生本发明CAR的方法，包括在产生CAR的条件下培养包含编码CAR的多核苷酸序列的宿主细胞，并且回收CAR。CAR可与宿主细胞或从宿主细胞分离的细胞膜相结合。

根据另一个总的方面，本发明涉及包含本发明CAR的工程化免疫细胞。优选地，工程化免疫细胞是T细胞受体敲除免疫细胞。优选地，工程化免疫细胞是HLA I/B2-微球蛋白敲除免疫细胞。任选地，HLA I/B2-微球蛋白敲除免疫细胞另外是缺乏宿主患者的同种异体免疫应答的HLA II敲除免疫细胞。工程化免疫细胞可包含具有特异性地结合不同于FN3结构域的靶标的胞外结构域的第二CAR。工程化免疫细胞也可对至少一种抗癌症化学疗法有抗性。

在另一个总的方面，本发明涉及包含本发明的工程化免疫细胞的药物组合物。

在另一个总的方面，本发明涉及在对其有需要的受治疗者中治疗B细胞相关病症的方法，包括向受治疗者施用治疗有效量的本发明的药物组合物。在一个优选的实施方案中，B细胞相关病症是多发性骨髓瘤。

在另一个总的方面，本发明涉及使本发明的免疫细胞工程化的方法，包括提供免疫细胞，并且将编码本发明CAR的多肽引入该细胞中。

在另一个总的方面，本发明涉及制备药物组合物的方法，包括使本发明的工程化免疫细胞与药学上可接受的载体组合，以获得药物组合物。

包括本发明所公开的FN3结构域抗体或其抗原结合片段的试剂盒在本发明的范围内。所述试剂盒可用于实施使用本文提供的FN3结构域抗体或抗原结合片段的方法或者本领域技术人员已知的其它方法。在一些实施方案中，所述试剂盒可包括本文所述的FN3结构域抗体或抗原结合片段以及用于检测生物样本中FN3结构域的存在的试剂，以及任选地在不使用时容纳FN3结构域抗体或片段的容器，FN3结构域抗体或片段的使用说明，附连至固体支撑体的FN3结构域抗体或片段，和/或FN3结构域抗体或片段的可检测标记形式。

附图说明

图1A-1C示出了对结合固定的FN3结构域或阴性对照蛋白的重组AS7B90和AS7B91的测试，以及每个与原始兔杂交瘤衍生的抗体CEN25-105-5的比较。图1A示出了不具有靶标特异性的tencon25的结合数据。图1B示出了A3的结合数据，其为针对人cMET特异性的FN3结构域。图1C示出了83v2-ABD的结合数据，其为具有白蛋白结合结构域的针对人EGFR特异性的FN3结构域。

图2A-2M示出了AS7B91能够检测在T细胞表面上表达的所有CARTyrins。

图3示出了使用标记的tencon 25检测在初级T细胞表面上的AS7B91 scFv CAR表达。

图4A-4C示出了响应于表达BCMA的靶细胞的AS7B91 scFv CAR-BCMA特异性FN3结构域脱粒。图4A示出了H929(BCMA高表达细胞)。图4B示出了ARH77(BCMA低表达细胞)。图4C示出了K562(BCMA阴性细胞)。将不同的FN3结构域在50nM的浓度下与AS7B91scFv CAR T细胞一起温育，洗涤，并且然后以1∶1的比率加入到靶细胞中。BAR-T变体1＝AS7B91 scFv L-HCAR；BAR-T变体2＝AS7B91 scFv H-L CAR。

图5示出了表达BCMA的靶细胞的AS7B91 scFv CAR-BCMA杀伤。H929，BCMA高表达细胞；ARH77，BCMA低表达细胞；K562，BCMA阴性细胞。将不同的FN3结构域在25nM的浓度下与AS7B91 scFv CAR T细胞一起温育，洗涤，并且然后以1∶1的比率加入到靶细胞中。BAR-T变体1＝AS7B91 scFv L-H CAR；BAR-T变体2＝AS7B91 scFv H-L CAR。

图6示出了标记的Tencon-25与T细胞上的AS7B16 scFv CAR构建体的结合。L2H，AS7B16轻链重链取向。H2L，AS7B16重链轻链取向。

图7示出了标记的EGFR 83v2与T细胞上的AS7B16 scFv CAR构建体的结合。L2H，AS7B16轻链重链取向。H2L，AS7B16重链轻链取向。

图8示出了标记的Tencon-25与T细胞上的AS7B82 scFv CAR构建体的结合。L2H，AS7B82轻链重链取向。H2L，AS7B16重链轻链取向。

图9示出了标记的EGFR 83v2与T细胞上的AS7B82 scFv CAR构建体的结合。L2H，AS7B16轻链重链取向。H2L，AS7B16重链轻链取向。

图10FcgR表达细胞系的生成。使用Lenti-Pac HIV表达包装系统包装编码人FcgR(CD16a、CD32和CD64)的纯化慢病毒表达质粒以转柒293T细胞。

图11A-11B：经由分选酶化学，以1∶5的比率(centyrin比肽)执行瓜氨酸化环状肽与Tencon25 centyrin的缀合。在Ni琼脂糖柱(GE)上手动纯化缀合物，以除去游离的分选酶和肽。纯化后，将缀合物在PBS中缓冲交换并浓缩。通过(a)质谱(LC-MS)和(b)尺寸排阻色谱法(superdex 75)对缀合物进行QC并无菌过滤。

图12：检测与centyrin-CCP1-肽缀合物结合的抗瓜氨酸化抗体。将表达FcgR的HEK293细胞与200ug/mL的人抗瓜氨酸化纤维蛋白原抗体或人IgG1同种型对照进行温育。通过流式细胞术评估结合。

图13：AS7B91 scFv CAR-T细胞介导的抗瓜氨酸化的mAb结合的FcR表达细胞的杀伤。

图14A-14C：评估多种自身免疫疾病中用于BAR-T平台扩展的潜在肽/抗体组合。针对a)重症肌无力(MG)，b)多发性硬化(MS)和c)系统性红斑狼疮(SLE)特异性的肽分别测试其结合抗AChR、抗MOG或抗dsDNA抗体的能力。图14A分别以外观顺序公开了SEQ ID NO：85-87。图14B分别以外观顺序公开了SEQ ID NO：88-90。图14C分别以外观顺序公开了SEQ IDNO：91-93。

具体实施方式

定义

背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、设备、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。

如本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括两个或更多个细胞的组合等等。

如本文所用，术语“约”在涉及可测量值诸如量、时距等时，意指涵盖与指定值至多±10％的变化，因为这类变化适合执行本发明所公开的方法。除非另外指明，否则说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、特性诸如分子量、反应条件等的所有数字在所有情况下均应理解为被术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则在下述说明书和所附权利要求书中列出的数值参数均为近似值，这些近似值可根据本发明寻求获得的期望特性而变化。在最低程度上且不试图将等同原则的应用限制到权利要求书的保护范围的前提下，至少应当根据所报告的数值的有效数位并通过应用惯常的四舍五入法来解释每一个数值参数。

尽管用以阐明本发明之宽范围的数值范围和参数是近似的，但在具体的实施例中提出的数值却是尽可能精确地报告的。然而，任何数值均固有地包含某些误差，所述误差必然会由存在于其各自测试测量法中的标准偏差产生。

“分离”意指生物组分(诸如核酸、肽或蛋白质)已经与组分天然存在的生物体的其它生物组分(即其它染色体和染色体外DNA和RNA以及蛋白质)基本上分离、分开得到或从其中纯化出来。因此，已经“分离的”核酸、肽和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。“分离的”核酸、肽和蛋白质可为组合物的一部分，并且如果这样的组合物不是核酸、肽或蛋白质自身环境的一部分，则仍然是分离的。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。如本文所用，“分离”的抗体或抗原结合片段旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体或抗原结合片段的抗体或抗原结合片段(例如，特异性地结合FN3结构域的分离的抗体基本上不含未特异性结合FN3结构域的抗体)。

如本文所用，术语“III型纤连蛋白结构域”或“FN3结构域”指在蛋白质中频繁出现的结构域，所述蛋白质包括纤连蛋白、腱生蛋白、细胞内细胞骨架蛋白、细胞因子受体和原核酶(Bork和Doolittle，PNAS USA 89：8990-8994，1992；Meinke等人，J Bacteriol 175：1910-1918，1993；Watanabe等人，J Biol Chem 265：15659-15665，1990)，或它们的衍生物。示例性FN3结构域是存在于人腱生蛋白C中的15个不同的FN3结构域、存在于人纤连蛋白(FN)中的15个不同的FN3结构域以及非天然合成的FN3结构域(例如US8278419中)。单个的FN3结构域用结构域编号和蛋白质名称来表示，例如腱生蛋白的第三FN3结构域(TN3)或纤连蛋白的第十FN3结构域(FN10)。

除非另有说明，否则“抗体”是指包括各种单体、聚合和嵌合形式的免疫球蛋白的所有同种型(IgG、IgA、IgE、IgM、IgD和IgY)。术语“抗体”具体地涵盖多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)和抗体样多肽，诸如嵌合抗体和人源化抗体。

“抗原结合片段”是可对特定抗原表现出结合亲和力的任何蛋白质性结构。抗原结合片段包括通过任何已知技术诸如酶切割、肽合成和重组技术提供的那些。一些抗原结合片段由完整抗体的保留亲本抗体分子的抗原结合特异性的部分组成。例如，抗原结合片段可包含已知结合特定抗原的抗体的至少一个可变区(重链可变区或轻链可变区)或者一个或多个CDR。合适的抗原结合片段的示例包括但不限于双体抗体和单链分子以及Fab、F(ab’)2、Fc、Fabc和Fv分子；单链(Sc)抗体；单个抗体轻链；单个抗体重链；抗体链或CDR与其它蛋白质之间的嵌合融合体；蛋白质支架；重链单体或二聚体；轻链单体或二聚体；由一条重链和一条轻链组成的二聚体；由VL、VH、CL和CH1域组成的单价片段；或如WO2007059782中所述的单价抗体；包含由铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；基本上由V.sub.H和C.sub.H1域组成的Fd片段；基本上由抗体的单臂的VL域和VH域组成的Fv片段；基本上由VH域组成的dAb片段(Ward等人，Nature 341，544-546(1989))，并且也被称为域抗体(Holt等人，Trends Biotechnol.，2003年11月，21(11)：484-90)；羊驼或纳米抗体(Revets等人，Expert Opin Biol Ther.，2005年1月，5(1)：111-24)；分离互补决定区(CDR)等。所有抗体同种型均可用于产生抗原结合片段。另外，抗原结合片段可包括非抗体蛋白质性框架，其可成功地以赋予感兴趣的给定抗原(诸如蛋白质支架)亲和力的取向并入多肽区段。抗原结合片段可重组产生或通过对完整抗体的酶切割或化学切割产生。短语“抗体或其抗原结合片段”可用于表示给定的抗原结合片段并入该短语中提及的抗体的一个或多个氨基酸区段。

术语“CDR”是指互补决定区(CDR)，其中三个构成轻链可变区(CDRL1、CDRL2和CDRL3)的结合特征，三个构成重链可变区(CDRH1、CDRH2和CDRH3)的结合特征。CDR有助于抗体分子的功能活性，并且由包含支架或框架区的氨基酸序列分开。确切定义的CDR边界和长度受限于不同的分类和编号系统。因此，可通过IMGT、Kabat、Chothia或任何其它边界定义来引用CDR。尽管边界不同，但这些系统中的每一个在可变序列内构成所谓的“高变区”的方面具有一定程度的重叠。因此，根据这些系统的CDR定义可在长度和相对于相邻框架区域的边界区域方面不同。参见例如Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，NIH出版物号91-3242(1991)；Chothia等人，“Canonical Structures Forthe Hypervariable Regions of Immunoglobulins”，J.Mol.Biol.196：901(1987)；以及MacCallum等人，“Antibody-Antigen Interactions：Contact Analysis and BindingSite Topography”，J.Mol.Biol.262：732(1996))；这些文献中的每一篇全文据此均以引用方式并入。

通常，CDR形成可被分类为规范结构的环状结构。术语“规范结构”是指抗原结合(CDR)环所采用的主链构象。从比较结构研究中，已发现六个抗原结合环中有五个仅具有受限的可用构象库。每个规范结构可由多肽主链的扭转角来表征。因此，抗体之间的对应环可具有非常相似的三维结构，尽管环的大部分区域具有高氨基酸序列可变性(Chothia等人，“Canonical Structures For the Hypervariable Regions of Immunoglobulins”，J.Mol.Biol.196：901(1987)；Chothia等人，“Conformations of ImmunoglobulinHypervariable Regions”，I 342：877(1989)；Martin和Thornton，“Structural Familiesin Loops of Homologous Proteins：Automatic Classification，Modelling andApplication to Antibodies”，J.Mol.Biol.263：800(1996)；这些文献中的每一篇全文均以引用方式并入)。此外，采用的环状结构与其周围的氨基酸序列之间存在关系。特定规范类的构象由环的长度以及位于环内以及保守框架内(即，环外部)关键位置的氨基酸残基确定。因此，可基于这些关键氨基酸残基是否存在来进行对特定规范类的分配。

当在抗体或抗体片段的上下文中使用时，“特异性结合”或“特异地结合”或其衍生术语表示经由由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的结构域结合感兴趣的蛋白质的一个或多个表位，而不优先结合含有混合分子群的样本中的其它分子。通常，抗体以如通过表面等离振子共振测定或细胞结合测定来测量的小于约1×10^-8M的K_d结合同源抗原。在一个优选的实施方案中，结合特异性使用生物层干涉测量法进行测量。短语诸如“[抗原]特异性”抗体意在表达所述抗体特异性地结合所述抗原。

同义地称为“核酸分子”、“核苷酸”或“核酸”的“多核苷酸”是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可为未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链的DNA、为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链的RNA以及为单链区和双链区的混合物的RNA、包含可为单链或更典型地为双链或者为单链区和双链区的混合物的DNA和RNA的杂合分子。此外，“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰的碱基的DNA或RNA，以及具有出于稳定性或其它原因而被修饰的主链的DNA或RNA。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和稀有碱基诸如肌苷。可对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括通常天然存在的多核苷酸的化学修饰、酶修饰或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”也包括相对短的核酸链，通常被称为寡核苷酸。

“载体”是复制子，诸如质粒、噬菌体、粘粒或病毒，其中可以可操作地插入另一核酸区段以引起该区段的复制或表达。

如本文所用，术语“宿主细胞”可为任何类型的细胞，例如，原代细胞、培养中的细胞或来自细胞系的细胞。在具体的实施方案中，术语“宿主细胞”是指用核酸分子转染的细胞和此类细胞的后代或潜在后代。此类细胞的后代可与用核酸分子转染的亲本细胞不同，例如，由于可在后代中发生的突变或环境影响或者由于核酸分子整合到宿主细胞基因组中。术语“表达”和“产生”在本文中同义使用，并且是指基因产物的生物合成。这些术语涵盖基因到RNA的转录。这些术语还涵盖RNA到一个或多个多肽的翻译，并且还涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。抗体或其抗原结合片段的表达或产生可在细胞的细胞质内，或者在胞外环境中诸如细胞培养物的生长培养基中。“基本上相同”的含义可根据使用该术语的上下文而不同。由于重链和轻链以及编码它们的基因之间可能存在的天然序列变异，预期在氨基酸序列或编码本文所述的抗体或抗原结合片段的基因内发现一定程度的变异，而对其独特的结合特性(例如，特异性和亲和力)产生的影响很小或无影响。此类预期部分归因于遗传密码的简并性以及保守氨基酸序列变异的成功进化，但这不会明显改变所编码蛋白质的性质。因此，在核酸序列的上下文中，“基本上相同”意指两个或更多个序列之间具有至少65％的同一性。优选地，该术语是指两个或更多个序列之间具有至少70％的同一性，更优选至少75％的同一性，更优选至少80％的同一性，更优选至少85％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少91％的同一性，更优选至少92％的同一性，更优选至少93％的同一性，更优选至少94％的同一性，更优选至少95％的同一性，更优选至少96％的同一性，更优选至少97％的同一性，更优选至少98％的同一性，以及更优选至少99％或更高的同一性。两个序列之间的百分比同一性是序列所共有的相同位置数目的函数(即，同源性％＝相同位置的数目/位置总数×100)，考虑到空位的数目和每个空位的长度，需要引入这些参数用于两个序列的最佳比对。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性可例如使用E.Meyers和W.Miller，Comput.Appl.Biosci 4，11-17(1988)的算法(该算法已经并入ALIGN程序(版本2.0)中)，使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12和空位罚分4来确定。此外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可使用Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48，444-453(1970)的算法来确定。

在蛋白质的氨基酸序列内可能发生的对蛋白质功能没有实质性影响的变异程度远低于核酸序列的变异程度，因为相同的简并性原则不适用于氨基酸序列。因此，在抗体或抗原结合片段的上下文中，“基本上相同”意指与所述抗体或抗原结合片段具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的抗体或抗原结合片段。其它实施方案包括具有框架、支架或其它非结合区的FN3结构域抗体或抗原结合片段，其不与本文所述的FN3结构域抗体和抗原结合片段具有显著的同一性，但确实并入一个或多个CDR或赋予与本文所述的此类序列有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的结合所需的其它序列。

如本文所用，术语“嵌合抗原受体”(CAR)是指至少包含特异性地结合抗原或靶标的胞外结构域、跨膜结构域以及胞内T细胞受体-活化信号结构域的重组多肽。CAR的胞外结构域与靶细胞表面上的靶抗原结合导致CAR聚簇并将激活刺激传送给含CAR细胞。CAR重定向免疫效应细胞的特异性，并且触发了增殖、细胞因子产生、能够以不依赖主要组织相容性(MHC)的方式介导表达靶抗原的细胞死亡的分子的吞噬作用和/或产生。

如本文所用，术语“胞外抗原结合结构域”、“胞外结构域”或“胞外配体结合结构域”是指位于细胞膜外侧并且能够结合抗原、靶标或配体的CAR的一部分。

如本文所用，术语“铰链区”是指连接CAR蛋白质的两个相邻结构域，例如胞外结构域和跨膜结构域的CAR的一部分。

如本文所用，术语“跨膜结构域”是指跨越细胞膜延伸并使CAR锚定于细胞膜的CAR的一部分。

如本文所用，术语“胞内T细胞受体-活化信号结构域”、“细胞质信号结构域”或“胞内信号结构域”是指位于细胞膜内侧并能够转导效应信号的CAR的一部分。

如本文所用，术语“刺激性分子”是指由T细胞表达的分子，提供以对T细胞信号转导途径的至少一些方面的刺激方式来调节T细胞受体(TCR)复合物的初步活化的初级细胞质信号序列。刺激性分子包含两类不同的细胞质信号序列——引发抗原依赖性初步活化的那些(称为“初级信号结构域”)，以及以抗原非依赖性方式起作用来提供第二共同刺激信号的那些(称为“共同刺激信号结构域”)。

如本文所用，术语“表达”是指基因产物的生物合成。该术语涵盖基因到RNA的转录。该术语还涵盖RNA到一个或多个多肽的翻译，并且还涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。表达的FN3结构域或CAR可处于宿主细胞的细胞质内，处于胞外环境诸如细胞培养物的生长培养基中，或锚定至细胞膜。

如本文所用，术语“免疫细胞”或“免疫效应细胞”是指参与免疫应答，例如促进免疫效应应答的细胞。免疫细胞的示例包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、肥大细胞、以及来源于骨髓的吞噬细胞。根据特定实施方案，工程化免疫细胞是T细胞，并且称为CAR-T细胞，因为它们被工程化成用于表达本发明的CAR。

如本文所用，术语“工程化免疫细胞”是指通过将DNA或RNA形式的额外遗传物质加入细胞的总遗传物质而被基因修饰的免疫细胞，也称为免疫效应细胞。根据本文的实施方案，工程化免疫细胞已经过基因修饰以表达根据本发明的靶向FN3结构域的CAR。

如本文所用，术语“载体”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、类脂、含脂质囊泡、微球体、脂质体包囊、或本领域公知的用于药物制剂的其他材料。应当理解，载体、赋形剂或稀释剂的特征将取决于具体应用的施用途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不干扰根据本发明的组合物的效果或根据本发明的组合物的生物活性的非毒性材料。

如本文所用，术语“受治疗者”是指动物，并且优选地指哺乳动物。根据特定实施方案，受治疗者是哺乳动物，包括非灵长类(例如骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、犬、大鼠、兔子、豚鼠或小鼠)或灵长类(例如猴、黑猩猩或人)。在特定实施方案中，受治疗者是人。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指在受治疗者中引起期望的生物学或药物学应答的活性成分或组分的量。治疗有效量可相对于指定目的根据经验以常规方式进行确定。

如本文所用，术语“治疗”和“处理”均旨在意指与癌症或自体免疫性疾病有关的至少一种可测量物理参数的改善或逆转，其不一定是受治疗者中可识别的，但能够在受治疗者中识别。术语“处理”和“治疗”也可指导致消退，预防发展，或至少延缓疾病、障碍或病症的发展。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指减轻、预防发展或发作，或缩短与疾病、障碍或病症(诸如肿瘤或更优选癌症)相关的一种或多种症状的持续时间。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指预防疾病、障碍或病症的复发。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指患有疾病、障碍或病症的受治疗者的存活提高。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指受治疗者中疾病、障碍或病症的消除。

FN3结构域文库

Tencon是由来自人腱生蛋白-C的十五个FN3结构域的共有序列设计的非天然存在的FN3结构域(Jacobs等人，Protein Engineering，Design，and Selection，25：107-117，2012；US2010/0216708)。Tencon的晶体结构示出六个表面暴露环，这些环连接七个β-链作为FN3结构域的特性，所述β-链称为A、B、C、D、E、F和G，并且所述环称为AB、BC、CD、DE、EF和FG环(Bork和Doolittle，PNAS USA 89：8990-8992，1992；US6673901)。这些环或每个环内所选择的残基可随机化，以便构建可用于选择出结合特定抗原的新型分子的FN3结构域的文库。因此，如本文所述，FN3结构域的“非随机化”区是指FN3结构域内在所有FN3结构域之间保守的区域。表2示出了Tencon(SEQ ID NO：33)中的每个环和β-链的位置和序列。

表2

FN3结构域	Tencon(SEQ ID NO：33)
		A链	1-12
AB环	13-16
		B链	17-21
BC环	22-28
		C链	29-37
CD环	38-43
		D链	44-50
DE环	51-54
		E链	55-59
EF环	60-64
		F链	65-74
FG环	75-81
		G链	82-89

根据Tencon序列设计的文库可因此在一个或多个环或链中具有随机化序列。例如，基于Tencon的文库可在AB环、BC环、CD环、DE、EF环和FG环中的一者或多者具有随机化序列。例如，Tencon BC环的长度为7个氨基酸，因此1、2、3、4、5、6或7个氨基酸可在BC环处多样化的基于Tencon序列的文库中随机化。Tencon CD环的长度为6个氨基酸，因此1、2、3、4、5或6个氨基酸可在CD环处多样化的基于Tencon序列的文库中随机化。Tencon EF环的长度为5个氨基酸，因此1、2、3、4或5个氨基酸可在EF环处多样化的基于Tencon序列的文库中随机化。Tencon FG环的长度为7个氨基酸，因此1、2、3、4、5、6或7个氨基酸可在FG环处多样化的基于Tencon序列的文库中随机化。Tencon文库中的环处的进一步多样性可通过环处残基的插入和/或缺失来实现。例如，BC、CD、EF和/或FG环可延伸1-22个氨基酸，或减少1-3个氨基酸。Tencon中的FG环的长度为7个氨基酸，而抗体重链中的相应环在4-28个残基的范围内。为了提供最大的多样性，FG环在序列以及长度方面可为多样化的以对应于4-28个残基的抗体CDR3长度范围。例如，FG环在长度方面可通过将环延伸额外的1、2、3、4或5个氨基酸进一步多样化。

根据Tencon序列设计的文库也可具有随机化可选表面，所述表面在FN3结构域的侧面上形成并且包含两条或更多条β链，以及至少一个环。一个这样的可选表面由Cβ-链和Fβ-链以及CD环和FG环中的氨基酸形成(C-CD-F-FG表面)。基于Tencon可选C-CD-F-FG表面的文库设计在US2013/0226834中有所描述。基于Tencon序列设计的文库还包括基于Tencon变体设计的文库，诸如在第11、17、46和/或86位残基位置处具有取代的Tencon变体(残基编号对应于SEQ ID NO：33)，并且所述变体显示出改善的热稳定性。示例性Tencon变体在US2011/0274623中有所描述，并且包括Tencon27(SEQ ID NO：34)，其与SEQ ID NO：33的Tencon相比具有取代E11R、L17A、N46V和E861。

可使用随机的或定义的氨基酸集合在所选残基位置处使Tencon文库和基于其他FN3序列的文库随机化。例如，可使用NNK密码子(其编码所有20种天然存在的氨基酸)产生具有随机取代的文库中的变体。在其他多样化方案中，DVK密码子可用于编码氨基酸Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly和Cys。另选地，NNS密码子可用于产生所有20种氨基酸残基，与此同时降低终止密码子的频率。可例如使用

技术(http：_//www_sloning_com)来合成在待多样化的位置具有偏向氨基酸分布的FN3结构域文库。这种技术使用预先制备的双链三体的文库，其用作对于成千上万的基因合成工艺而言为足够的通用构建模块。该三体文库代表对构建任何期望的DNA分子所必需的所有可能的序列组合。密码子命名根据熟知的IUB密码。

FN3结构域抗体和抗原结合片段

本文描述了特异性地结合FN3结构域的非随机化区的分离的单克隆抗体或抗原结合片段。抗体分子的一般结构包括抗原结合域，该结构域包含重链和轻链以及Fc结构域，并发挥多种功能(包括补体固定和结合抗体受体)。

所述FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段包括所有同种型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，以及四链免疫球蛋白结构的合成多聚体。所述抗体或抗原结合片段也包括通常存在于母鸡或火鸡血清和母鸡或火鸡蛋黄中的IgY同种型。

FN3结构域特异性抗体和抗原结合片段可通过重组方式来源于任何物种。例如，抗体或抗原结合片段可为小鼠、大鼠、山羊、马、猪、牛、鸡、兔、羊驼、驴、人或其嵌合型式。为适于施用于人，非人源抗体或抗原结合片段可在施用于人类患者时被基因或结构改变成抗原性较低。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是嵌合的。如本文所用，术语“嵌合”是指抗体或其抗原结合片段的至少一个可变域的至少某些部分来源于非人哺乳动物、啮齿动物或爬行动物的抗体氨基酸序列，而抗体或其抗原结合片段的其余部分来源于人。

在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。人源化抗体可为含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其它抗原结合亚序列)。在很大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的互补决定区(CDR)中的残基由具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的CDR中的残基替换。一般来讲，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个，并且一般是两个可变域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，并且所有或基本上所有的框架区是人免疫球蛋白序列的那些框架区。人源化抗体可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。

本文所述的抗体或抗原结合片段能够以多种形式存在，但将包含表1所示的抗体CDR中的一者或多者。

本文描述了特异性地结合FN3结构域的分离的抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段来源于兔子。虽然本文例示的FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段是来源于兔子的，但是所例示的抗体或抗原结合片段也可为嵌合的。

在一些实施方案中，提供了FN3结构域特异性抗体或其抗原结合片段，它们包含含有表1所述抗体中的任一抗体的CDR1、CDR2和CDR3的重链以及含有表1所述抗体中的任一抗体的CDR1、CDR2和CDR3的轻链。

在一些实施方案中，FN3结构域特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：1的重链CDR1、含有SEQ ID NO：4的重链CDR2、含有SEQ ID NO：7的重链CDR3、含有SEQ ID NO：9的轻链CDR1、含有SEQ ID NO：11的轻链CDR2、以及含有SEQ ID NO：13的轻链CDR3。该FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段可包含非兔框架序列。该FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段可结合FN3结构域的非随机化区，可检测包含FN3结构域的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞表面表达，并且可激活表达包含FN3结构域的CAR的T细胞。在一些实施方案中，FN3结构域特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO：14基本上相同或同一的可变重链区以及与SEQ ID NO：15基本上相同或同一的可变轻链。所述FN3结构域抗体或抗原结合片段可用于生成包含所述抗原结合片段的CAR。

在一些实施方案中，FN3结构域特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：2的重链CDR1、含有SEQ ID NO：5的重链CDR2、含有SEQ ID NO：8的重链CDR3、含有SEQ ID NO：10的轻链CDR1、含有SEQ ID NO：12的轻链CDR2、以及含有SEQ ID NO：13的轻链CDR3。该FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段可包含非兔框架序列。该FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段可结合FN3结构域的非随机化区，可检测包含FN3结构域的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞表面表达，并且可激活表达包含FN3结构域的CAR的T细胞。在一些实施方案中，FN3结构域特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO：14基本上相同或同一的可变重链区以及与SEQ ID NO：15基本上相同或同一的可变轻链。所述FN3结构域抗体或抗原结合片段可用于生成包含所述抗原结合片段的CAR。

在一些实施方案中，FN3结构域特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：2的重链CDR1、含有SEQ ID NO：5的重链CDR2、含有SEQ ID NO：8的重链CDR3、含有SEQ ID NO：10的轻链CDR1、含有SEQ ID NO：12的轻链CDR2、以及含有SEQ ID NO：13的轻链CDR3。该FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段可包含非兔框架序列。该FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段可结合FN3结构域的非随机化区，可检测包含FN3结构域的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞表面表达，并且可激活表达包含FN3结构域的CAR的T细胞。在一些实施方案中，FN3结构域特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO：14基本上相同或同一的可变重链区以及与SEQ ID NO：15基本上相同或同一的可变轻链。所述FN3结构域抗体或抗原结合片段可用于生成包含所述抗原结合片段的CAR。

在一些实施方案中，FN3结构域特异性抗体和抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ IDNO：44的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：46的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ IDNO：48的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：50的氨基酸序列的轻链CDR3。该FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段可包含非小鼠框架序列。该FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段可结合FN3结构域的非随机化区，可检测包含FN3结构域的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞表面表达，并且可激活表达包含FN3结构域的CAR的T细胞。在一些实施方案中，FN3结构域特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO：74基本上相同或同一的可变重链区以及与SEQ ID NO：75基本上相同或同一的可变轻链。所述FN3结构域抗体或抗原结合片段可用于生成包含所述抗原结合片段的CAR。

在一些实施方案中，FN3结构域特异性抗体和抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：36的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ IDNO：45的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ IDNO：49的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：50的氨基酸序列的轻链CDR3。该FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段可包含非小鼠框架序列。该FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段可结合FN3结构域的非随机化区，可检测包含FN3结构域的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞表面表达，并且可激活表达包含FN3结构域的CAR的T细胞。在一些实施方案中，FN3结构域特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO：74基本上相同或同一的可变重链区以及与SEQ ID NO：75基本上相同或同一的可变轻链。所述FN3结构域抗体或抗原结合片段可用于生成包含所述抗原结合片段的CAR。

在一些实施方案中，FN3结构域特异性抗体和抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ IDNO：44的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：46的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ IDNO：48的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：50的氨基酸序列的轻链CDR3。该FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段可包含非小鼠框架序列。该FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段可结合FN3结构域的非随机化区，可检测包含FN3结构域的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞表面表达，并且可激活表达包含FN3结构域的CAR的T细胞。在一些实施方案中，FN3结构域特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO：74基本上相同或同一的可变重链区以及与SEQ ID NO：75基本上相同或同一的可变轻链。所述FN3结构域抗体或抗原结合片段可用于生成包含所述抗原结合片段的CAR。

在一些实施方案中，FN3结构域特异性抗体和抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ IDNO：44的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：46的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ IDNO：48的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：50的氨基酸序列的轻链CDR3。该FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段可包含非小鼠框架序列。该FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段可结合FN3结构域的非随机化区，可检测包含FN3结构域的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞表面表达，并且可激活表达包含FN3结构域的CAR的T细胞。在一些实施方案中，FN3结构域特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO：78基本上相同或同一的可变重链区以及与SEQ ID NO：79基本上相同或同一的可变轻链。所述FN3结构域抗体或抗原结合片段可用于生成包含所述抗原结合片段的CAR。

在一些实施方案中，FN3结构域特异性抗体和抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：36的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ IDNO：45的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的轻链CDRl、具有SEQ IDNO：49的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：50的氨基酸序列的轻链CDR3。该FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段可包含非小鼠框架序列。该FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段可结合FN3结构域的非随机化区，可检测包含FN3结构域的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞表面表达，并且可激活表达包含FN3结构域的CAR的T细胞。在一些实施方案中，FN3结构域特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO：78基本上相同或同一的可变重链区以及与SEQ ID NO：79基本上相同或同一的可变轻链。所述FN3结构域抗体或抗原结合片段可用于生成包含所述抗原结合片段的CAR。

在一些实施方案中，FN3结构域特异性抗体和抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ IDNO：44的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：46的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ IDNO：48的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：50的氨基酸序列的轻链CDR3。该FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段可包含非小鼠框架序列。该FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段可结合FN3结构域的非随机化区，可检测包含FN3结构域的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞表面表达，并且可激活表达包含FN3结构域的CAR的T细胞。在一些实施方案中，FN3结构域特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO：78基本上相同或同一的可变重链区以及与SEQ ID NO：79基本上相同或同一的可变轻链。所述FN3结构域抗体或抗原结合片段可用于生成包含所述抗原结合片段的CAR。

本发明还公开了编码特异性地结合FN3结构域的抗体或抗原结合片段的分离的多核苷酸。能够编码本文提供的可变域区段的分离多核苷酸可包括在相同或不同的载体上以产生抗体或抗原结合片段。

编码重组抗原结合蛋白的多核苷酸也在本公开的范围内。在一些实施方案中，所述多核苷酸(及其编码的肽)包含前导序列。可采用本领域已知的任何前导序列。前导序列可包含但不限于限制性位点或翻译起始位点。

本文所述的FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段包括这样的变体：其具有保留所述FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段的生物特性(例如，结合亲和力或免疫效应活性)的单个或多个氨基酸置换、缺失或添加。这些变体可包括：(a)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸置换的变体，(b)其中一个或多个氨基酸添加到多肽或从多肽缺失的变体，(c)其中一个或多个氨基酸包括取代基的变体，以及(d)其中多肽与另一种肽或多肽(诸如融合配偶体、蛋白质标签或其它化学部分)融合的变体，其可赋予多肽有用的特性，诸如例如抗体的表位、多组氨酸序列、生物素部分等。本文所述的抗体或抗原结合片段可包括这样的变体：其中来自一个物种的氨基酸残基在保守位置或非保守位置处置换为另一物种中的对应残基。在其它实施方案中，非保守位置处的氨基酸残基被保守或非保守残基置换。得到这些变体的技术，包括基因技术(缺失、突变等)、化学技术和酶技术，是本领域普通技术人员已知的。

本文所述的FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段可包括若干抗体同种型，诸如，IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在一些实施方案中，抗体同种型为IgG。抗体或其抗原结合片段的特异性主要是由CDR的氨基酸序列和排列决定的。因此，一种同种型的CDR可转变为另一种同种型而不改变抗原特异性。或者，已经建立技术使杂交瘤从产生一种抗体同种型转换到产生另一种同种型(同种型转换)而不改变抗原特异性。因此，这类抗体同种型在所述抗体或抗原结合片段的范围内。

所述FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段的亲和力可通过本领域已知的多种方法诸如表面等离振子共振或基于ELISA的方法来确定。通过SPR测量亲和力的测定包括使用BIAcore 3000机器进行的测定，其中该测定在室温(例如在25℃或接近25℃)下进行，其中能够结合FN3结构域的抗体在BIAcore传感器芯片上被抗Fc抗体(例如山羊抗人IgG Fc特异性抗体，Jackson ImmunoResearch laboratories Prod#109-005-098)捕获至约75RU的水平，然后在40μl/min的流速下采集缔合和解离数据。

检测FN3结构域的方法

本文提供了用于通过使样本与本文所述的抗体或其抗原结合片段接触来检测生物样本中的FN3结构域的方法。如本文所述，样本可来源于尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片，包括细针抽吸组织)、组织学制备物等。在一些实施方案中，所述方法包括通过使样本与本文所述的FN3结构域特异性抗体或其抗原结合片段中的任一种接触来检测生物样本中的FN3结构域。

在一些实施方案中，样本可与本文所述的FN3结构域特异性抗体或抗原结合片段中的多于一种接触。例如，样本可与第一FN3结构域特异性抗体或其抗原结合片段接触，并且然后与第二FN3结构域特异性抗体或其抗原结合片段接触，其中第一抗体或抗原结合片段和第二抗体或抗原结合片段不是相同的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，第一抗体或其抗原结合片段在接触样本之前可附连至表面，诸如多孔板、芯片或类似的底物上。在其它实施方案中，第一抗体或其抗原结合片段在接触样本之前完全可不附连或连接至任何物体。

可对所述FN3结构域特异性抗体和抗原结合片段进行可检测地标记。在一些实施方案中，经由本文所述的方法，标记的抗体和抗原结合片段可有利于检测FN3结构域。许多这样的标记是本领域技术人员容易知晓的。例如，合适的标记包括但不应当认为其限于放射标记、荧光标记、表位标签、生物素、发色团标记、ECL标记或酶。更具体地，所述标记包括钌、¹¹¹In-DOTA、¹¹¹In-二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶、聚组氨酸(HIS标签)、吖啶染料、花青染料、荧光酮染料、噁嗪染料、菲啶染料、罗丹明染料、

染料等。

所述FN3结构域特异性抗体和抗原结合片段可用于多种测定中，以检测生物样本中的FN3结构域。一些合适的测定包括但不应当认为其限于蛋白质印迹分析、放射性免疫测定、表面等离振子共振、免疫荧光测定、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散、电化学发光(ECL)免疫测定、免疫组织化学、荧光激活细胞分选(FACS)或ELISA测定。

用于检测FN3结构域的试剂盒

本文提供了用于检测生物样本中的FN3结构域的试剂盒。这些试剂盒包括本文所述的FN3结构域抗体或其抗原结合片段中的一种或多种，以及试剂盒的使用说明。

所提供的FN3结构域抗体或抗原结合片段可为溶液；被冻干；附连到底物、载体或板；或被可检测地标记。

所述试剂盒还可包括用于实施本文所述方法的附加组分。举例来说，试剂盒可包括用于从受治疗者获得样本的装置、对照或参照样本(例如来自患有进展缓慢的癌症的受治疗者和/或不患癌症的受治疗者的样本)、一个或多个样本室和/或描述本发明方法的性能的说明材料、以及组织特异性对照或标准品。

用于确定FN3结构域的水平的装置还可包括例如在用于确定FN3结构域水平的测定中使用的缓冲液或其它试剂。说明书可为例如用于执行测定的印刷说明书和/或用于评估FN3结构域的表达水平的说明书。

所述试剂盒还可包括用于从受治疗者分离出样本的装置。这些装置可包括可用于从受治疗者中获得流体或组织的设备或试剂中的一项或多项。用于从受治疗者中获得样本的装置还可包括用于从血液样本中分离出血液组分诸如血清的装置。优选的是，将试剂盒设计成与人类受治疗者一起使用。

靶向FN3结构域的嵌合抗原受体(CAR)

在其他总的方面，本发明涉及包含FN3结构域特异性scFv的靶向FN3结构域的CAR。

在一个方面，本发明涉及CAR，其包含：

a.胞外结构域，所述胞外结构域具有scFv，所述scFv特异性地结合FN3结构域的非随机化区；

b.跨膜结构域；以及

c.胞内信号结构域。

在一些实施方案中，在新生CAR中，胞外结构域处在N末端的信号肽之后。本发明可使用任何合适的信号肽。信号肽可来源于天然的、合成的、半合成的或重组的来源。

根据本发明的实施方案，CAR的胞外结构域包含特异性地结合FN3结构域的非随机化区的scFv。根据本发明的实施方案的特异性地结合FN3结构域的任何scFv(包括但不限于本文所述的那些)可用于CAR的胞外结构域中。

根据本发明的实施方案，CAR还可包含使胞外结构域和跨膜结构域连接的铰链区。铰链区用于使胞外结构域远离工程化免疫细胞的表面移动以实现适当的细胞/细胞接触，从而结合靶标或抗原并且活化(Patel等人，Gene Therapy，1999；6：412-419)。任何合适的铰链区均可用于本发明的CAR。它可来源于天然的、合成的、半合成的或重组的来源。根据一些实施方案，CAR的铰链区是6x GS肽(SEQ ID NO：84)或其片段，或来自CD8蛋白质的铰链区，或它们的衍生物。在特定实施方案中，铰链区具有与SEQ ID NO：24有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列。

任何合适的跨膜结构域均可用于本发明的CAR。跨膜结构域可来源于天然的、合成的、半合成的或重组的来源。根据一些实施方案，跨膜结构域是来自诸如CD8、CD28、CD4、CD2、GMCSFR等分子的跨膜结构域。在特定实施方案中，跨膜结构域具有与SEQ ID NO：25有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列。

任何合适的胞内信号结构域均可用于本发明的CAR。在特定实施方案中，使用整个胞内信号结构域。在其他特定实施方案中，使用转导效应信号的信号结构域的截短部分。根据本发明的实施方案，胞内信号结构域产生的信号促进含CAR细胞(例如CAR-T细胞)的免疫效应功能，包括但不限于增殖、活化和/或分化。在特定实施方案中，该信号促进例如CAR-T细胞的溶细胞活性、辅助细胞活性和/或细胞因子分泌。在其他实施方案中，在本发明的CAR中不使用胞内信号结构域，并且包含特异性地结合本发明的FN3结构域的scFv的CAR与用于将该效应细胞靶向靶细胞的FN3结构域一起使用。

根据一些实施方案中，胞内信号结构域包含源于以下项的功能信号结构域：CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD16、CD22、CD27、CD28、CD30、CD79a、CD79b、CD134(也称为TNFRSF4或OX-40)、4-1BB(CD137)、CD278(也称为ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12、ITAM结构域或CD66d等。

根据特定实施方案，胞内信号结构域包含初级信号结构域以及一个或多个共同刺激信号结构域。

在一个实施方案中，胞内信号结构域包含具有源于人CD3ζ的功能信号结构域的初级胞内信号结构域。在特定实施方案中，初级胞内信号结构域具有与SEQ ID NO：27有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列。

根据一些实施方案，胞内信号结构域还包含源于人4-1BB的共同刺激胞内信号结构域。在特定实施方案中，共同刺激胞内信号结构域具有与SEQ ID NO：26有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明的CAR与表达CAR的宿主细胞结合。

在另一个实施方案中，本发明的CAR存在于表达CAR的宿主细胞的分离的细胞膜中。

在另一个实施方案中，将本发明的CAR从表达CAR的宿主细胞的其他组分中纯化或分离。

多核苷酸、载体和宿主细胞

在其他总的方面，本发明涉及编码本发明的FN3结构域抗体或CAR的分离的多核苷酸和载体，以及包含该载体的重组细胞。

鉴于本公开，编码本文所公开的任何各种蛋白质或多肽的核酸能够以化学方式或使用本领域内的其他方法进行合成。可选择密码子使用，以便改善改善细胞中的表达。此类密码子使用将取决于所选的细胞类型。特化的密码子使用模式已被开发成用于大肠杆菌(E.coli)及其他细菌，以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞。参见例如：Mayfield等人，PNAS USA.2003100(2)：438-42；Sinclair等人《蛋白表达与纯化杂志》2002(1)：96-105；Connell，Curr Opin Biotechnol.2001(5)：446-9；Makrides等人MicrobiolRev.199660(3)：512-38；and Sharp等人Yeast.1991 7(7)：657-78.

用于核酸操纵的一般技术在本领域技术人员的权限内，并且也描述于例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第1-3卷，Cold Spring HarborLaboratory Press，第2版，1989，或Ausubel等人编辑，1994，Current Protocols inMolecular Biology，第1卷，John Wiley&Sons，Inc.，New York，以及定期更新，以引用方式并入本文。编码蛋白质的DNA可操作地连接至源于哺乳动物、病毒或昆虫基因的合适的转录或翻译调控元件。此类调控元件包含转录启动子、控制转录的任选操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译的终止的序列。另外掺入通常由复制起点所赋予的宿主内复制能力，以及有助于识别转化体的选择基因。合适的调控元件是本领域中已知的。

本领域的技术人员将理解，可以改变蛋白质的编码序列而不改变蛋白质的氨基酸序列。因此，本领域的技术人员将理解，可变更编码本发明的FN3结构域抗体或CAR的核酸序列而不改变蛋白质的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明涉及包含编码本发明的FN3结构域抗体或CAR的分离的核酸的载体。根据本公开，可使用本领域内的技术人员已知的任何载体，诸如质粒、粘端质粒、噬菌体载体或病毒载体。在一个实施方案中，载体是包含编码本发明的FN3结构域或CAR的多核苷酸序列的表达载体，该多核苷酸序列可操作地连接至启动子序列，任选地一个或多个其他调控序列。

在另一个实施方案中，本发明涉及通过编码CAR的mRNA来瞬时表达本发明的CAR。在一个方面，将编码CAR的mRNA以瞬时转染形式引入免疫效应细胞中，其中非整合的转基因的表达被表达数小时、数天或数周的时段，其中该表达的时间段少于整合进基因组或包含在宿主细胞的稳定质粒复制子内情况下的基因表达的时间段。在一个方面，使用PCR产生的模板，通过体外转录产生mRNA。

在另一个总的方面，本发明涉及包含编码本发明的FN3结构域抗体或CAR的分离的核酸的宿主细胞。宿主细胞可以用本发明的核酸分子稳定或瞬时转染。

合适的宿主细胞包括原核生物、酵母、哺乳动物细胞、或细菌细胞。合适的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如大肠杆菌或芽孢杆菌属(Bacillus spp.)。优选地来自于酵母属(Saccharomyces)物种的酵母，诸如酿酒酵母(S.cerevisiae)也可用于产生多肽。各种哺乳动物或昆虫细胞培养物体系也可用于表达重组蛋白质。Luckow和Summers(Bio/Technology，6：47，1988)综述了用于在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒系统。在某些情况下，期望在脊椎动物细胞中产生蛋白质，诸如对于糖基化，在培养物(组织培养物)中增殖脊椎动物细胞已经成为常规方法。合适的哺乳动物宿主细胞系的示例包括内皮细胞、COS-7猴肾细胞、CV-1、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、人胚肾细胞、HeLa、293、293T和BHK细胞系。

本发明的宿主细胞可为工程化靶向FN3结构域的免疫细胞，其在下文有详细描述。

蛋白质产生

在另一个总的方面，本发明涉及产生本发明的FN3结构域抗体的方法，包括在产生本发明的FN3结构域抗体的条件下培养包含编码FN3结构域抗体的核酸的宿主细胞，以及从细胞或细胞培养物(例如从上清液)回收FN3结构域抗体。根据本公开，可以从细胞或细胞培养物收获表达的FN3结构域抗体并根据本领域已知的常规技术进行纯化。

在另一个总的方面，本发明涉及产生本发明的CAR的方法，包括在产生本发明的CAR的条件下培养包含编码CAR的核酸的宿主细胞，并且回收CAR。可以从细胞收获表达的CAR，并且根据本领域已知以及如本文所述的常规技术进行纯化。

用表达或克隆载体转化宿主细胞以用于蛋白质产生，并且在常规营养基中培养，该营养基被改良为适于例如诱导启动子、选择转化体或扩增编码所期望序列的基因。

可在多种培养基中培养用于产生本发明的蛋白质的宿主细胞。市售的培养基诸如Ham’s F10(Sigma)、极限必需培养基((MEM)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)，以及Dulbecco改良Eagle培养基((DMEM)，Sigma)适用于培养宿主细胞。此外，Ham等人，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes等人，Anal.Biochem.102：255(1980)；US4767704；US4657866；US4927762；US4560655；US5122469；WO90/03430；WO87/00195或USRE30985所述的任何培养基可用作宿主细胞的培养基。任何这些培养基可根据需要补充有激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCIN^TM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)，以及葡萄糖或等同形式的能量源。还可包括本领域的技术人员已知的适当浓度的任何其他需要的补充剂。培养条件，诸如温度、pH等是先前选择用于表达的宿主细胞所使用的那些，并且对于普通的技术人员是显而易见的。

本文所公开的蛋白质也可使用细胞翻译系统在体外产生。为此，编码蛋白质的核酸必须被修饰成允许体外转录产生mRNA并允许在所用的特定无细胞体系中无细胞翻译mRNA。示例性无真核细胞翻译系统包括例如无哺乳动物或酵母细胞翻译系统，并且示例性无原核细胞翻译系统包括例如无细菌细胞翻译系统。

本文所公开的蛋白质也可通过化学合成产生(例如Solid Phase PeptideSynthesis，第2版，1984，The Pierce Chemical Co.，Rockford，IL所述的方法)。蛋白质修饰也可通过化学合成产生。

本文所公开的蛋白质可通过蛋白质化学领域通常已知的蛋白质的分离/纯化方法进行纯化。非限制性示例包括提取、重结晶、盐析(例如用硫酸铵或硫酸钠)、离心、渗析、超滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、正相色谱法、反相色谱法、凝胶过滤、凝胶渗透色谱法、亲和色谱法、电泳、反流分布法或这些的任何组合。在纯化之后，可使蛋白质交换到不同的缓冲液中，并且/或者通过本领域已知任何多种方法，包括但不限于过滤和渗析对蛋白质进行浓缩。

经纯化的蛋白质优选地为至少85％的纯度，更优选地至少95％的纯度，并且最优选地至少98％的纯度。

工程化靶向FN3结构域的CAR-T细胞、其组合物和方法

在另一个总的方面，本发明涉及包含本发明的靶向FN3结构域的CAR的工程化靶向FN3结构域的免疫细胞，制备工程化免疫细胞的方法，包含工程化免疫细胞的组合物，以及使周工程化免疫细胞治疗疾病诸如多发性骨髓瘤的方法。

在一个总的方面，本发明涉及包含本发明的靶向FN3结构域的CAR的工程化免疫细胞。

根据一些实施方案，可例如通过以下方式制备异源性较小的免疫细胞：使表达T细胞受体(TCR)的一种或多种组分的至少一种基因失活，如WO 2013/176915中所述，其能够与使编码或调节HLA I/B2-微球蛋白(B2M)的蛋白质表达的基因失活相结合。因此，移植物抗宿主综合征以及移植物排斥的风险显著下降。缺乏功能TCR(称为“TCR敲除”或“TCR-KO”细胞)的T细胞能够被工程化成使得其不在它表面表达任何功能TCR；工程化成使得其不表达包含功能TCR的一个或多个亚基(例如，工程化成使得其不表达(或表现出减少的表达)TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、TCRε和/或TCRζ)；或工程化成使得其在它表面产生极少的功能TCR。另选地，T细胞可例如通过表达TCR的一种或多种亚基的突变或截短形式来表达明显削弱的TCR(即在宿主中不引发不良免疫反应的TCR)。缺乏功能TCR和/或B2M表达的经修饰T细胞可通过任何合适的方式获得，包括敲除或敲去TCR和/或B2M的一个或多个亚基。例如，T细胞可包括使用siRNA、shRNA、成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、类转录激活因子效应核酸酶(TALEN)、megaTAL、大范围核酸酶、或锌指内切核酸酶(ZFN)敲去TCR和/或B2M。

在特定实施方案中，包含本发明的靶向FN3结构域的CAR的免疫效应细胞是T细胞、NKT细胞或NK细胞，优选地人T细胞或人NK细胞，更优选地TCR敲除细胞，最优选地人TCR敲除细胞和/或HLA I/B2M敲除细胞。在其他实施方案中，包含本发明的靶向FN3结构域的CAR的免疫效应细胞是工程化T细胞系，诸如TALL-104 T细胞系(即表达CD8和CD3而非CD16的IL-2-依赖性人非限制性细胞毒性T细胞系)。

本发明的免疫效应细胞可为自体同源(即“自体”，例如同源)或非自体同源(即“非自体”，例如异源、同系、异种)。自体同源是指源于同一个体的任何物质，该物质稍后被重新引入该个体。非自体同源是指源于同一物种的不同个体的任何物质，该物质稍后被引入该个体。

在另一个总的方面，本发明涉及制备包含本发明的靶向FN3结构域的CAR的工程化靶向FN3结构域的免疫细胞的方法。编码CAR的载体可被直接转导到免疫细胞中。另选地，可将编码CAR的体外转录的RNA或合成RNA引入免疫细胞中。

根据特定实施方案，制备工程化靶向FN3结构域的免疫细胞的方法包括转染或转导分离自个体的免疫效应细胞，使得免疫效应细胞表达根据本发明实施方案的一种或多种CAR。制备用于免疫疗法的免疫细胞的方法描述于例如WO2014/130635、WO2013/176916和WO2013/176915，这些专利以引用方式并入本文。公开了可用于制备工程化免疫细胞的单个步骤，例如WO2014/039523、WO2014/184741、WO2014/191128、WO2014/184744和WO2014/184143，这些专利以引用方式并入本文。

在特定实施方案中，将免疫效应细胞诸如T细胞用本发明的CAR遗传修饰(例如用包含编码CAR的核酸的病毒载体转导)，并且然后活化并在体外扩增。在各种实施方案中，可使用如例如US6352694，US6534055，US6905680，US6692964，US5858358，US6887466，US6905681，US7144575，US7067318，US7172869，US7232566，US7175843，US5883223，US6905874，US6797514，US6867041，US2006/121005(它们以引用方式并入本文)所述的方法，在基因修饰以表达CAR之前或之后，使T细胞活化并扩增。T细胞可在体外或体内扩增。一般来讲，本发明的T细胞可通过接触其上附着有刺激CD3/TCR复合物相关的信号的试剂以及刺激T细胞表面的共同刺激分子的配体的表面来扩增。作为非限制性示例，如此处所述，可例如通过接触固定于表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段、或抗CD2抗体，或通过接触连有钙离子载体的蛋白激酶C活化剂(例如苔藓虫素)，或通过活化CAR自身来刺激T细胞群。为共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配基。例如，可在适于刺激T细胞增殖的条件下使T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。适于T细胞培养的条件包括例如适当的培养基(例如极限必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 5(Lonza))，其中可包含增殖和存活所需的因子，包括血清(例如胎牛或人血清)、白细胞因子诸如IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21、胰岛素、IFN-g、GM-CSF、TGFb和/或技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。在其他实施方案中，可使用诸如US6040177、US5827642和WO2012129514(它们以引用方式并入本文)中所述的那些的方法，采用饲养细胞以及适当的抗体和细胞因子使T细胞活化和刺激以进行增殖。

在一些实施方案中，本发明表达的CAR细胞还可包含具有特异性地结合相同靶标或不同靶标的胞外结构域的第二CAR。优选地，免疫细胞表达特异性地结合两种不同靶标的两种CAR，或者免疫细胞表达双特异性受体，诸如包含特异性地结合与感兴趣的疾病相关的两种不同靶标(即FN3结构域及另一种靶标)的两个FN3结构域的CAR。例如，另一个靶标也可与某种类型的癌症相关。更优选地，两种CAR还具有不同的胞内信号结构域，例如第一CAR具有共刺激性信号结构域而不具有初级信号结构域，并且第二CAR具有初级信号结构域而不具有共刺激性信号结构域，或者反之亦然。通过将共刺激性信号结构域(诸如来自4-1BB、CD28、CD27 ICOS或OX-40)定位到一种CAR上，并将初级信号结构域(来自诸如CD3ζ)定位到另一种CAR上，可以限制针对表达两种靶标的细胞的CAR活性，例如用于增强特异性。

在一些实施方案中，本发明的表达CAR的细胞还可包含抑制性CAR作为我调节安全开关来约束基于T细胞的疗法并避免肿瘤细胞毒性。例如，抑制性CAR可包括特异性地结合正常细胞而非靶癌细胞上所见的靶标的胞外结构域。抑制性CAR也包括具有抑制性受体信号结构域的胞内结构域，诸如包括但不限于PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、I类MHC、II类MHC、GAL9、腺苷和TGFRβ的抑制性分子的胞内结构域。表达靶向FN3结构域的CAR和抑制性CAR的细胞在遇到正常细胞时受到抑制，但在遇到不表达正常细胞靶标的肿瘤细胞时被激活。

在一些其他实施方案中，本发明的表达CAR的细胞还可包含提高表达CAR的细胞的活性的试剂。例如，该试剂能够抑制宿主细胞中抑制性分子的活性，诸如本文所述的那些。

根据特定实施方案，工程化免疫CAR表达细胞被进一步基因工程化成抗化学疗法。该抗化学疗法可允许工程化免疫细胞在药物存在下存活，同时选择性地靶向感兴趣的FN3结构域。

根据一些实施方案，通过使表达CAR的细胞遗传工程成表达至少一种药物抗性基因而使其具有药物抗性。本发明的药物抗性基因可编码抗代谢物、甲氨蝶呤、长春碱、顺铂、烷基化剂、蒽环类抗生素、细胞毒性抗生素、抗免疫亲和素、它们的类似物或衍生物等的抗性。已经鉴定出可用于赋予本发明的工程化免疫CAR表达细胞药物抗性的几种药物抗性基因。参见例如Takebe等人，Mol Ther.2001年1月；3(1)：88-96.；Sugimoto等人，J GeneMed.2003年5月；5(5)：366-76；Zielske等人，J Clin Invest.2003年11月；112(10)：1561-70；Nivens等人，Cancer Chemother Pharmacol.2004年2月；53(2)：107-15；Bardenheuer等人，Leukemia.2005年12月；19(12)：2281-8；Kushman等人，Carcinogenesis.2007年1月；28(1)：207-14。可在细胞中表达的药物抗性基因的示例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)的突变或修饰形式、肌苷-5’-单磷酸脱氢酶II(IMPDH2)的突变或修饰形式、多药物抗性蛋白1(MDR1)、钙调磷酸酶、甲基鸟嘌呤转移酶(MGMT)、微RNA-21、抗生素抗性基因ble和mcrA等。根据特定实施方案，可通过任何合适的方式，包括例如将至少一种载体所编码的转基因引入细胞中，使所述药物抗性基因在细胞中表达。

也可例如通过使负责细胞对药物的敏感性的基因失活而赋予对抗癌症化学疗法的抗性。可失活以赋予细胞药物抗性的基因的示例包括例如CD52、糖皮质素受体、CD3、人次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、人脱氧胞苷激酶(dCK)等。负责细胞对抗癌药物的敏感性的基因可通过任何合适的方式失活，包括敲除或敲去基因，例如使用siRNA、shRNA、CRISPR、TALEN、或ZFN。

在另一个总的方面，本发明涉及药物组合物，包含本发明的工程化靶向FN3结构域的免疫细胞和药学上可接受的载体。根据本公开，适用于CAR-T药物组合物的任何药学上可接受的载体均可用于本发明。

在另一个总的方面，本发明涉及在对其有需要的受治疗者中治疗癌症的方法，包括向受治疗者施用治疗有效量的本发明的药物组合物。

根据本发明的实施方案，治疗有效量的药物组合物在对其有需要的受治疗者中刺激免疫应答，优选地导致治疗疾病、障碍或病症；预防或减缓疾病、障碍或病症的发展；或者减轻或完全缓解与免疫疾病、障碍或病症相关联的症状。

根据特定实施方案，所治疗的疾病、障碍或病症是过度增殖疾病。根据其他特定实施方案，所治疗的疾病、障碍或病症是癌症或肿瘤，或恶性过度增殖疾病，优选选自以下的癌症：实体瘤、血液性癌症、膀胱癌、胆管癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食管癌、胃癌、胶质瘤、头癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、颈癌、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、肾癌、涎腺癌、胃部癌症、胸腺上皮癌、以及甲状腺癌。

根据特定实施方案，靶向FN3结构域的免疫细胞组合物的治疗有效量是足以在对其有需要的受治疗者中实现以下作用中的一者、两者、三者、四者、或更多者的治疗量：(i)减小或改善所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的严重性；(ii)减少所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的持续时间；(iii)预防所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状发展；(iv)引起所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状消退；(v)预防所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状发展或发作；(vi)预防所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状复发；(vii)减少患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的受治疗者的住院治疗；(viii)减少患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的受治疗者的住院时间；(ix)提高患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的受治疗者的存活；(xi)抑制或减少受治疗者中所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状；和/或(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。在特定实施方案中，治疗有效量是指足以实现以下效应中的一者、两者、三者、四者、或更多者的治疗量：(i)减小肿瘤体积；(ii)减少肿瘤细胞数；(iii)降低转移瘤数量；(iv)增大预期寿命；(v)降低肿瘤细胞增殖；(vi)降低肿瘤细胞存活；(vii)改善与癌症病症相关的生理症状；和/或(viii)防止肿瘤出现。

治疗有效量或剂量可根据各种因素，诸如欲被治疗的疾病、障碍、或病症、施用方式、目标部位、受治疗者的生理状态(包括例如年龄、体重、健康)而变化，不论受治疗者是人或动物、施用的其他药物，以及是否为预防性或治疗性治疗。最佳地滴定治疗剂量以优化安全性和功效。确切剂量可使用已知技术由本领域的技术人员确定。一般来讲，将靶向FN3结构域的免疫细胞以约10⁵至10⁸个细胞/kg体重的剂量施用。根据一些实施方案，细胞的总剂量可经由剂量分次施用给受治疗者，例如一次、两次、三次或更多次分开施用部分剂量。

根据特定实施方案，本文所述组合物被配制成适于施用于受治疗者的预期途径。例如，本文所述组合物可被配制成适于静脉内、皮下或肌内注射施用。

根据特定实施方案，用于治疗癌症的组合物可以与另一种治疗联合使用，包括但不限于化学疗法、淋巴细胞清除疗法、放射疗法、其他免疫-肿瘤药物、靶向疗法、癌症疫苗、或其他抗癌药物。

如本文所用，在将两种或更多种疗法施用于受治疗者的上下文中，术语“联合”是指使用多于一种疗法。术语“联合”的使用并不限制疗法施用于受治疗者的次序。例如，第一疗法(例如，本文所述的组合物)可在第二疗法施用于受治疗者之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以前)，与此同时，或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以后)施用。

在另一个总的方面，本发明涉及在对其有需要的受治疗者中重定向免疫细胞以使它们靶向杀伤FN3结构域结合细胞的方法，包括向受治疗者施用本发明的药物组合物。

在另一个总的方面，本发明涉及产生包含本发明的靶向FN3结构域的免疫细胞的药物组合物的方法，包括使靶向FN3结构域的免疫细胞与药学上可接受的载体组合，以获得药物组合物。

本发明还提供一些非限制性实施方案。

实施方案

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合III型纤连蛋白(FN3)结构域的非随机化区。

2.根据实施方案1所述的分离的抗体或抗原结合片段，包含：

a.具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的轻链CDR3；

b.具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链CD则、具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的轻链CDR3；

c.具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的轻链CDR3；

d.具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO：44的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：46的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：48的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：50的氨基酸序列的轻链CDR3；

e.具有SEQ ID NO：36的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO：45的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：49的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：50的氨基酸序列的轻链CDR3；

f.具有SEQ ID NO：37的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO：45的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：49的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：50的氨基酸序列的轻链CDR3；

g.具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：51的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO：54的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：56的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：58的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：60的氨基酸序列的轻链CDR3；

h.具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列的重链CD则、具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：57的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：59的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：61的氨基酸序列的轻链CDR3；或者

i.具有SEQ ID NO：40的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：53的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：57的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：59的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：61的氨基酸序列的轻链CDR3。

3.根据实施方案1所述的抗体或抗原结合片段，其中

a.所述抗体的可变重链包括SEQ ID NO：14的氨基酸序列，并且所述抗体的可变轻链包括SEQ ID NO：15的氨基酸序列；

b.所述抗体的可变重链包括SEQ ID NO：74的氨基酸序列，并且所述抗体的可变轻链包括SEQ ID NO：75的氨基酸序列；或者

c.所述抗体的可变重链包括SEQ ID NO：78的氨基酸序列，并且所述抗体的可变轻链包括SEQ ID NO：79的氨基酸序列。

4.根据实施方案1所述的抗体或抗原结合片段，其中

a.所述抗体的重链包括SEQ ID NO：18的氨基酸序列，并且所述抗体的轻链包括SEQ ID NO：19的氨基酸序列；

b.所述抗体的重链包括SEQ ID NO：20的氨基酸序列，并且所述抗体的轻链包括SEQ ID NO：21的氨基酸序列；

c.所述抗体的重链包括SEQ ID NO：62的氨基酸序列，并且所述抗体的轻链包括SEQ ID NO：63的氨基酸序列；或者

d.所述抗体的重链包括SEQ ID NO：64的氨基酸序列，并且所述抗体的轻链包括SEQ ID NO：65的氨基酸序列。

5.根据实施方案1至4中任一项所述的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段为Fab片段、Fab2片段或单链抗体。

6.根据实施方案1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段为IgG。

7.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码根据实施方案1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段。

8.一种载体，包含根据实施方案7所述的多核苷酸。

9.一种宿主细胞，包含根据实施方案7所述的分离的多核苷酸。

10.一种宿主细胞，包含根据实施方案8所述的载体。

11.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包含：

(a)胞外结构域，所述胞外结构域包含scFv，所述scFv特异性地结合FN3结构域的非随机化区；

(b)跨膜结构域；以及

(c)胞内信号结构域，

其中所述CAR还任选地包含使所述胞外结构域和所述跨膜结构域连接的铰链区。

12.根据实施方案11所述的分离的多核苷酸，其中所述CAR包含：

(a)胞外结构域，所述胞外结构域包含scFv，所述scFv具有与SEQ ID NO：68-73之一有至少90％同一性的氨基酸序列；

(b)铰链区，所述铰链区包含与SEQ ID NO：24有至少90％同一性的氨基酸序列；

(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO：25有至少90％同一性的氨基酸序列；以及

(d)胞内信号结构域，所述胞内信号结构域包含具有与SEQ ID NO：26有至少90％同一性的氨基酸序列的共同刺激结构域以及具有与SEQ ID NO：27有至少90％同一性的氨基酸序列的初级信号结构域。

13.根据实施方案12所述的分离的多核苷酸，其中：

(a)所述胞外结构域包含SEQ ID NO：68-73之一的氨基酸序列；

(b)所述铰链区包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列；

(c)所述跨膜结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列；并且

(d)所述胞内信号结构域包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列和SEQ ID NO：27的氨基酸序列。

14.一种载体，包含根据实施方案11-13中任一项所述的多核苷酸。

15.一种宿主细胞，包含根据实施方案11-13中任一项所述的多核苷酸。

16.一种宿主细胞，包含根据实施方案14所述的载体。

17.一种嵌合抗原受体(CAR)，包含：

(a)胞外结构域，所述胞外结构域包含scFv，所述scFv特异性地结合FN3结构域的非随机化区；

(b)跨膜结构域；以及

(c)胞内信号结构域，

其中所述CAR还任选地包含使所述胞外结构域和所述跨膜结构域连接的铰链区。

18.根据实施方案16所述的CAR，包含：

(a)胞外结构域，所述胞外结构域包含scFv，所述scFv具有与SEQ ID NO：68-73之一有至少90％同一性的氨基酸序列；

(b)铰链区，所述铰链区包含与SEQ ID NO：24有至少90％同一性的氨基酸序列；

(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO：25有至少90％同一性的氨基酸序列；以及

(d)胞内信号结构域，所述胞内信号结构域包含具有与SEQ ID NO：26有至少90％同一性的氨基酸序列的共同刺激结构域以及具有与SEQ ID NO：27有至少90％同一性的氨基酸序列的初级信号结构域。

19.根据实施方案17所述的CAR，其中：

(a)所述胞外结构域包含SEQ ID NO：68-73之一的氨基酸序列；

(b)所述铰链区包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列；

(c)所述跨膜结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列；并且

(d)所述胞内信号结构域包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列和SEQ ID NO：27的氨基酸序列。

实施例

提供了以下实施例以补充现有公开并提供对本文所述主题的更好理解。不应将这些实施例视为限制所描述的主题。而应当理解，本文所述的实施例和实施方案只是为了进行示意性的说明，根据其的各种变型或改变对于本领域技术人员将是显而易见的并且包括在本发明真实范围内，并可在不脱离本发明真实范围的情况下进行各种变型或改变。

实施例1：兔子的免疫以产生抗FN3结构域抗体

使用Tencon25抗原(SEQ ID NO：28)执行兔子单克隆抗体的生成。

动物：ID为E4831和E4832的3个月大新西兰白兔并执行免疫。

免疫方案：

使用每只兔子进行五次注射和两次测试出血的标准方案对兔子进行免疫。在每次注射时，将抗原等分试样解冻并与完全弗氏佐剂(CFA)(对于第一次注射)或用不完全弗氏佐剂(IFA)进行组合，用于随后的注射。注射途径为皮下注射(SC)。免疫详情总结于表3中：

表3：兔子免疫详情

ELISA效价检查：

针对Tencon25的血清效价以及反筛选抗原Tencon28(SEQ ID NO：29)和P114-83(SEQ ID NO：30)利用Epitomics，Inc.标准方案使用测试出血1和2进行评估。总之，两只兔子对免疫原均具有良好的免疫应答，并已达到脾切除的标准临界值(稀释度为1∶64K时O.D.＞0.3)。选择兔子E4832作为脾切除和单克隆融合的候选者。

脾切除术：

向兔子E4832施加IV升压，然后进行脾切除术

根据Epitomics的标准程序(表3)，递送脾脏并分离脾细胞。

表4：脾细胞分离的详情

融合：

2亿个淋巴细胞与1亿个融合伴侣细胞融合在一起，并分别铺在20X96孔板上(表4)。将板在标准条件下保存在组织培养箱中。

表5：融合信息

抗原ID	融合代码	融合日期	板的编号	融合效率(％)
					CEN-11	F1	2011/8/10	20	46
CEN-11	F2	2011/8/11	20	59

融合后2-3周检查细胞生长，并使用生长的孔数除以检查的孔总数计算融合效率。对于每次融合，检查最少两个板。

筛选过程总结如下：

预筛：板#5&#25；

主筛：剩余的38个板；

筛选方法：标准ELISA，涂覆有50ng的Tencon25/孔的板；

阳性对照：稀释度为1∶10K时E4832的出血2；

结果：O.D.大于0.5的158个克隆被认为是阳性，并进一步扩展至24孔板；

确认筛选：涂覆有50ng的Tencon25/孔或涂覆有50ng的Tencon28或P114-83的板。

结果：确认有151个克隆对Tencon25呈阳性。其中78个是Tencon25特异性的，因为它们是Tencon28阴性的。

实施例2：抗FN3结构域抗体的选择

生产：

评估克隆上清液与所有centyrin的结合并且不与阴性对照蛋白的结合。从该评估中，挑选一个克隆CEN-25-105-5进行生产。培养杂交瘤细胞，并且使其适应无血清培养基，并接种到1L整合烧瓶中。收获后，使用蛋白A树脂纯化抗体并进行QC。对于CEN-25-105-5，产量为20mg。

表6：CEN-25-105-5的CDR氨基酸序列

(SEQ ID NO：)

CEN-25-105-5的VH和VL示于下表7中。

表7：CEN-25-105-5的可变重链和可变轻链序列

将CEN-25-105-5的重链和轻链的可变区克隆到大鼠和小鼠IgGK表达载体中以用于表达和表征。CEN-25-105-5现在被称为AS7B91作为小鼠IgG2a kappa抗体，并且AS7B90被称为大鼠IgG1 kappa抗体。AS7B16和AS7B82也分别由小鼠和兔子V区产生。表8和9示出了CDR的序列以及AS7B16和AS7B82的V区的序列。所有抗体的重链和轻链序列在下表10中示出。

表8：AS7B16和AS7B82的CDR氨基酸序列

AS7B16

AS7B82

表9：AS7B16和AS7B82的可变重链和可变轻链序列

表10：AS7B91的重链和轻链序列

实施例3：与原始CEN-25-105-5兔抗体相比，重组AS7B90和AS7B91与FN3结构域的 结合

通过EUSA评估了分别为CEN-25-105-5的大鼠和小鼠嵌合体的AS7B90和AS7B91的上清液结合重组FN3结构域的能力。用针对人cMET(SEQ ID NO：31)特异性的FN3结构域A3，针对具有白蛋白结合结构域(SEQ ID NO：32)的人EGFR特异性的83v2-ABD，无特异性(SEQID NO：28)的tencon 25或阴性对照蛋白的剂量应答曲线涂覆三个板，它们全部在50mM PBS中为50μL/孔。将板在4℃下过夜温育。将上清液从板中倾倒，并且在室温下将200μL/孔超块加入块板中1小时。用TBS-T洗涤板3次。在超级块中以1μg/ml制备上清液和CEN25-105-5，并添加到板中。将板在室温下温育1小时。用TBS-T洗涤板3次。将二级抗体(HRP-山羊抗兔子、大鼠或小鼠)在超块中以1∶10,000制备并添加到板中。将板在室温下温育1小时。用TBS-T洗涤板3次。将50μL/孔POD试剂(根据Sigma-Aldrich制造商的说明书制备并在使用前在室温下在暗处温育至少30分钟)添加到板中。在温育3-5分钟后，保护其免受光照射，使用M5来读取发光。使用对数/对数变换，并且然后使用四参数曲线拟合，将结果在Prism中绘制(图1A-C)。如图1A-C所示，AS7B90和AS7B91均显示出对三个不同的FN3结构域的特异性，证实这些抗FN3结构域抗体的结合表位对于保守框架区是特异性的，而不是呈现FN3结构域特异性的可变环。应当指出的是，不存在与阴性对照抗体的非特异性结合。抗体AS7B91的小鼠版本似乎具有与原始兔杂交瘤抗体更相似的结合特性。

实施例4：用于检测在初级T细胞表面上表达的抗BCMA CARTyrins的测试AS7B91。

每孔100μl接种1×10⁶抗BCMA CARTyrin T细胞/ml。用PBS洗涤孔2次。将eFlour506可固化活性染料以1∶2000最终浓度加入到样本中以进行LIVE-DEAD样本染色，并允许其在4℃下温育30分钟。用FACS缓冲液淬灭染色反应，并且用FACS缓冲液洗涤样本两次。在室温下加入Fc块(33μl Fc/ml FACS)10分钟。加入100μl的初级AS7B91、FACS缓冲液或同种型对照，并在冰上温育20分钟。然后用FACS缓冲液洗涤样本一次。加入次级抗体并在冰上温育20分钟(抗小鼠IgG-AF647以1∶50使用，最终浓度为10μg/ml)。在二次抗体温育后，用FACS缓冲液洗涤孔一次，然后用PBS洗涤一次。洗涤后，将样本在室温下在2％PFA中固定10分钟。将样本洗涤并重悬于FACS缓冲液中。

如图2所示，重组AS7B91能够检测到主T细胞表面上的CARTyrins的表达，并因此可用作一般的CARTyrin检测试剂。在表达CARTyrin的T细胞的同质群体中，AS7B91抗体可用于定量细胞表面上的CARTyrins的数目。

实施例5：使用AS7B91激活表达CARTyrins的T细胞

由于CARTyrins连接至T细胞信号结构域，因此通过AS7B91抗体对这些CARTyrins的结合和簇合可导致这些信号结构域的活化和表达它们的T细胞的活化。为了测试这一点，将表达CARTyrins的初级T细胞与已知诱导激活的AS7B91或抗CD3抗体一起温育。简而言之，使用ECM 830方波电穿孔系统(BTX)，将12种不同的表达BCMA RNA的CARTyrin克隆电穿孔到来源于正常人血液的原代pan T细胞中(Normal Blood Donor Service-TSRI)。在采用或不采用10ug的靶向BCMA的CAR mRNA情况下，根据制造商规程，使5×10⁶个pan T细胞接受单电脉冲(500V，750us)。24小时后使用多克隆抗FN3结构域Ab评估CAR的表面表达。AS7B91或抗CD3抗体在可溶性抗CD28抗体(2ug/ml)的存在下以5μg/ml接种。刺激后第2天和第6天收获细胞和上清液。对细胞进行T细胞亚群标记(CD4、8)，激活标记(CD25、69、71、137，HLA-DR)和可染性染料染色。门控活细胞(FVD阴性)-＞双重排斥-＞CD4或CD8单阳性-＞分别评估激活标记表达的CD4和CD8。基于抗体共轭珠和单色对照设定LSR电压。基于荧光减一对照(FMO)和同种型对照来设定门极。

如表11中所见，AS7B91单克隆抗FN3结构域抗体能够在通过CD28的共刺激的存在下刺激CARTyrin+初级panT细胞(类似于抗CD3/CD28程序)。这种活化取决于CARTyrin表达，并且不像用CD3抗观察到的那样稳健或长。此外，与未刺激细胞相比，用AS7B91和抗CD28处理导致细胞数目增加11倍。总之，抗FN3结构域抗体可诱导表达CARTyrins的细胞的T细胞增殖和活化。

表11：使用抗centryin抗体AS7B91结合抗CD28共刺激激活表达CARTyrin的 pan T 细胞。与表达的未经刺激的对照细胞相比，pos＝阳性染色(在非刺激物中为neg)，hi＝高染 色水平，lo＝低染色水平(在非刺激物中为neg)，neg＝无染色。

实施例6：将AS7B91工程化成scFv嵌合抗原受体：

为了生成AS7B91，AS7B16和AS7B82抗体的CAR构建体，将可变区构建为scFv。对于AS7B91，scFv是以两种不同的取向生成的：HCv-LCv或LCv-HCv。

AS7B91 H-L scFv(SEQ ID NO：22)

AS7B91 L-H scFv(SEQ ID NO：23)

AS7B16 H-L scFv(SEQ ID NO：66)

AS7B16 L-H scFv(SEQ ID NO：82)

AS7B82 H-L scFv(SEQ ID NO：67)

AS7B82 L-H scFv(SEQ ID NO：83)

不同scFv序列的氨基酸序列通过铰链序列、TM结构域和信号结构域进行反向翻译和工程改造。将完成的构建体克隆到T7体外转录载体中，以使用可商购获得的mMESSAGE

T7 ULTRA转录试剂盒。CAR构建体的组分的氨基酸序列示于表12中：

表12：两种不同的AS7B91、AS7B16和AS7B82 CAR构建体的氨基酸序列(H-L取向和 L-H取向)。

实施例7：表达AS7B91、AS7B16和AS7B82 CAR的工程化免疫细胞的产生和分析

使用ECM 830方波电穿孔系统(BTX)，将mRNA电穿孔到源于正常人血液(正常献血服务——TSRI)的pan T细胞中。在具有或不具有10ug的AS7B91 CAR mRNA情况下，根据制造商规程，使5×10⁶个pan T细胞接受单电脉冲(500V，750us)。24小时后使用多克隆抗FN3结构域Ab评估CAR的表面表达。结果示于图3中。

测试了AS7B91 scFv CAR细胞的功能，以确定它们结合FN3结构域并响应于FN3结构域与靶细胞的结合而诱导T细胞杀伤的能力。这首先在使用BCMA特异性FN3结构域以及BCMA^hi(H929细胞)、BCMA^lo(D0HH-2细胞)BCMA^neg(EXPI293细胞)靶细胞的脱粒测定中确定，并且然后在杀伤测定中确定。

在脱粒试验(动员CD107a)中，将T细胞与1∶1或1∶10量的表达或不表达BCMA蛋白质的细胞一起在96孔板中温育。将共培养物在最终体积的OpTmizer“完全”培养基中在37C下保持4小时，所述培养基含有1∶1500 Golgi Stop(BD)和1∶1300抗CD107a APC(Biolegend)。在4h温育期之后，用可固定的活性染料(eFluor 780，来自eBioscience)和荧光染料缀合的抗CD8(PE缀合的，Biologend)对细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。通过确定CD8+细胞中CD107a染色的平均荧光强度信号(MFI)来确定脱粒活性。在mRNA转染后24h进行脱粒测定。如图4所示，在添加抗BCMA特异性FN3结构域后，表达AS7B91 scFv CAR的T细胞以抗BCMA和AS7B91特异性方式进行脱粒。这些数据表明，AS7B91 scFv CAR在结合靶标特异性FN3结构域并响应其发信号的能力方面是起作用的，其中靶标在其他细胞的表面上表达。

评估了响应于BCMA特异性FN3结构域以及CFSE标记的BCMA^hi(U-2932细胞)、BCMA^lo(D0HH-2细胞)BCMA^neg(EXPI293细胞)靶细胞的AS7B91 scFv CAR-T细胞杀伤。将CAR-T/模拟T细胞与BCMA特异性FN3结构域在37℃下预温育1小时，然后用BCMA靶细胞以在0至1的范围内的E∶T比率温育48小时。在实验结束时，将死细胞标记为CFSE-FL1，SYTOX-red-FL4。通过流式细胞计(FACSCalibur)分析细胞死亡的百分比，并用FlowJo v 10分析数据。如图5所示，在添加BCMA特异性FN3结构域时，表达AS7B91 scFv CAR的T细胞以抗BCMA FN3结构域和AS7B91 scFv CAR特异性方式杀伤了表达BCMA的靶细胞。这些数据表明，AS7B91 scFv CAR在结合靶标特异性FN3结构域并响应其发信号的能力方面是起作用的，其中靶标在其他细胞的表面上表达。

对于AS7B16和AS7B82，使用流式细胞术评估结合。简而言之，在电穿孔后二十四小时，将细胞在100x g下离心10分钟，并且在FACS染色缓冲液(BD Bioscience目录号554657)中洗涤两次。将细胞与最终浓度为50nM的APC标记的抗Tencon-25或AF647标记的抗EGFR83v2 FN3结构域在4℃下温育1小时。将标记的细胞在FACS染色缓冲液中洗涤两次，并重新悬浮于200uL的相同缓冲液中。使用BD LSRFortessa流式细胞计收集数据，并使用Flowjo软件进行分析。数据在图6至图9中示出。所有经过测试的CART、AS7B16、AS7B82和AS7B91均与受测试的FN3结构域、Tencon-T25和EGFR 83v2结合。CART的结合以如下方式发生：ASS7B91＞AS7B82＞AS7B16。

实施例8：由as7b91 scFV CAR-T介导的表达抗瓜氨酸化蛋白抗体的细胞的体外杀 伤，所述细胞与缀合至环状瓜氨酸化肽的FN3结构域预络合

自身免疫疾病的特征在于自身抗原的抗体(自动抗体)的产生失调。这些自动抗体可针对多种分子，包括但不限于蛋白质和核酸。就蛋白质而言，这些自动抗体通常识别翻译后修饰的抗原。下面示出了表达由AS7B91scFv CAR T细胞介导的细胞(“BAR-T”细胞)介导的抗瓜氨酸化蛋白抗体(ACPA)的细胞的体外杀伤，该细胞预与缀合至环状瓜氨酸化肽(CCP-1)的centyrin预络合。该发现表明，可以将自身抗原缀合至Tencon25 centyrin以与BAR-T细胞接合，从而靶向消除抗原特异性的、自动反应的B细胞。

FcgR表达细胞系的生成

使用Lenti-Pac HIV表达包装系统(GeneCopoeia)包装编码人FcgR(CD16a、CD32和CD64)的纯化慢病毒表达质粒以转染293T细胞。在转染后72小时，收获含lenti的上清液并用于转导HEK293细胞。用聚丙烯补充培养基(最终浓度为8ug/mL)。第二天，用补充有10％胎牛血清的RPMI Media 1640代替含聚凝胺的培养基。转导后72小时，收获细胞并为FcgR表达染色。然后基于FcgR表达(SH800S细胞Sorter-Sony Biotechnology)对细胞进行分选。培养高表达细胞并用作靶细胞用于将来的研究。

将瓜氨酸化环状肽缀合至Tencon25 centyrin

甘氨酸标记的(GGG-)瓜氨酸化环状肽-1(CCP-1-Cit)和精氨酸控制肽(CCP-1-Arg)得自Peptides International。将Sortase-v5标记的Tencon25(Tencon25_sort_v5)脱盐至TBS中并浓缩，然后进行缀合。经由分选酶化学将每种肽以1∶5的比率(FN3结构域比肽)缀合。在Ni琼脂糖柱(GE)上手动纯化缀合物，以除去游离的分选酶和肽。纯化后，将缀合物在PBS中缓冲交换并浓缩。通过(a)质谱(LC-MS)和(b)尺寸排阻色谱法(superdex 75)对缀合物进行QC并无菌过滤。

检测与centyrin-CCP1-肽缀合物结合的抗瓜氨酸化抗体

将表达FcgR的HEK293细胞与200ug/mL的人抗瓜氨酸化纤维蛋白原抗体(克隆1F11-Modiquest)或人IgG1同种型对照(Abcam)在冰温育30分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞2次，然后与centyrin-CCP1-Cit缀合物(576nM)在冰上温育1小时。用FACS缓冲液洗涤细胞2次，然后用PE标记的抗centyrin(AS7B91)抗体在冰上温育30分钟。通过流式细胞术(BDFACSCanto II)评估结合并用BD FACSDiva 6.1.3软件进行分析。

AS7B91 scFv CAR-T细胞介导的抗瓜氨酸化的mAb结合的FcR表达细胞的杀伤

将模拟电穿孔T细胞(模拟)或AS7B91 scFv CAR-T细胞(“BAR-T”)与centyrin缀合的CCP1(cit-CCP)预络合。用细胞Tracker Green(CTG)染料(ThermoFisher)标记表达CD16a或CD64的HEK293细胞，并与人IgG1同种型对照或抗除丝蛋白原抗体(抗CCP Ab)预络合。然后将BAR-T和HEK293细胞以1∶1或5∶1的比率接种～18小时。在实验结束时，用Zombie染料紫(Biolegend)对细胞进行染色。如通过流式细胞术(BD FACSCanto II)所评估的，死细胞被认为是CTG+/Zombie+细胞。使用BD FACSDiva 6.1.3和Graphpad Prism 5软件分析数据。观察到与抗瓜氨酸化抗体结合的靶细胞与预络合有centyrin-CCP-1-cit的BAR-T细胞一起温育时的细胞死亡比相对于用模拟T细胞或同种型对照抗体的温育的细胞死亡增加了2倍。

评估多种自身免疫疾病中用于BAR-T平台扩展的潜在肽/抗体组合

针对a)重症肌无力(MG)，b)多发性硬化(MS)和c)系统性红斑狼疮(SLE)特异性的肽分别测试其结合抗AChR、抗MOG或抗dsDNA抗体的能力。用10ug/mL所示肽包被三个高亲和力结合中性抗生物素蛋白板。将板用PBS-T洗涤3次，并在室温下用2X测定缓冲液A(eBioscience)封闭2小时。将板用PBS-T洗涤3次，并在室温下在1小时内添加100ug/mL的所示抗体。将板用PBS-T洗涤3次，并在室温下在1小时内添加适当的次级抗体。将板用PBS-T洗涤3次，并在添加终止溶液(ThermoFisher)之前在5-8分钟内添加TMB底物。使用SpectraMax340PC仪器读取吸光度，并使用Graphpad Prism 5软件分析数据。结合结果为每个疾病指示鉴定了一种潜在的前肽/抗体组合以用于进一步评估。

序列表简述

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US2010/0216708

US2013/0226834

US2011/0274623

US4767704

US4657866

US4927762

US4560655

US5122469

WO90/03430

WO87/00195

USRF30985

WO 2013/176915

WO2014/130635

WO2013/176916

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WO2014/039523

WO2014/184741

WO2014/191128

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US2006/121005

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WO2012129514

Claims (19)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合III型纤连蛋白(FN3)结构域的非随机化区。

2.根据权利要求1所述的分离的抗体或抗原结合片段，包含：

a.具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的轻链CDR3；

b.具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的轻链CDR3；

c.具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的轻链CDR3；

d.具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO：44的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：46的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：48的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：50的氨基酸序列的轻链CDR3；

e.具有SEQ ID NO：36的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO：45的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：49的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：50的氨基酸序列的轻链CDR3；

f.具有SEQ ID NO：37的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO：45的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：49的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：50的氨基酸序列的轻链CDR3；

g.具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：51的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO：54的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：56的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：58的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ IDNO：60的氨基酸序列的轻链CDR3；

h.具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：57的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：59的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：61的氨基酸序列的轻链CDR3；或者

i.具有SEQ ID NO：40的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：53的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：57的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：59的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO：61的氨基酸序列的轻链CDR3。

3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中

d.所述抗体的可变重链包括SEQ ID NO：14的氨基酸序列，并且所述抗体的可变轻链包括SEQ ID NO：15的氨基酸序列；

e.所述抗体的可变重链包括SEQ ID NO：74的氨基酸序列，并且所述抗体的可变轻链包括SEQ ID NO：75的氨基酸序列；或者

f.所述抗体的可变重链包括SEQ ID NO：78的氨基酸序列，并且所述抗体的可变轻链包括SEQ ID NO：79的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中

e.所述抗体的重链包括SEQ ID NO：18的氨基酸序列，并且所述抗体的轻链包括SEQ IDNO：19的氨基酸序列；

f.所述抗体的重链包括SEQ ID NO：20的氨基酸序列，并且所述抗体的轻链包括SEQ IDNO：21的氨基酸序列；

g.所述抗体的重链包括SEQ ID NO：62的氨基酸序列，并且所述抗体的轻链包括SEQ IDNO：63的氨基酸序列；或者

h.所述抗体的重链包括SEQ ID NO：64的氨基酸序列，并且所述抗体的轻链包括SEQ IDNO：65的氨基酸序列。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段为Fab片段、Fab2片段或单链抗体。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段为IgG。

7.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段。

8.一种载体，包含根据权利要求7所述的多核苷酸。

9.一种宿主细胞，包含根据权利要求7所述的分离的多核苷酸。

10.一种宿主细胞，包含根据权利要求8所述的载体。

11.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包含：

(a)胞外结构域，所述胞外结构域包含scFv，所述scFv特异性地结合FN3结构域的非随机化区；

(b)跨膜结构域；以及

(c)胞内信号结构域，

其中所述CAR还任选地包含使所述胞外结构域和所述跨膜结构域连接的铰链区。

12.根据权利要求11所述的分离的多核苷酸，其中所编码的CAR包含：

(a)胞外结构域，所述胞外结构域包含scFv，所述scFv具有与SEQ ID NO：68-73之一有至少90％同一性的氨基酸序列；

(b)铰链区，所述铰链区包含与SEQ ID NO：24有至少90％同一性的氨基酸序列；

(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO：25有至少90％同一性的氨基酸序列；以及

(d)胞内信号结构域，所述胞内信号结构域包含具有与SEQ ID NO：26有至少90％同一性的氨基酸序列的共同刺激结构域以及具有与SEQ ID NO：27有至少90％同一性的氨基酸序列的初级信号结构域。

13.根据权利要求12所述的分离的多核苷酸，其中所编码的CAR包含：

(a)胞外结构域，所述胞外结构域包含SEQ ID NO：68-73之一的氨基酸序列；

(b)铰链区，所述铰链区包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列；

(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列；以及

(d)胞内信号结构域，所述胞内信号结构域包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列和SEQ IDNO：27的氨基酸序列。

14.一种载体，包含根据权利要求11-13中任一项所述的多核苷酸。

15.一种宿主细胞，包含根据权利要求11-13中任一项所述的多核苷酸。

16.一种宿主细胞，包含根据权利要求14所述的载体。

17.一种嵌合抗原受体(CAR)，包含：

(a)胞外结构域，所述胞外结构域包含scFv，所述scFv特异性地结合FN3结构域的非随机化区；

(b)跨膜结构域；以及

(c)胞内信号结构域，

其中所述CAR还任选地包含使所述胞外结构域和所述跨膜结构域连接的铰链区。

18.根据权利要求17所述的CAR，包含：

(a)胞外结构域，所述胞外结构域包含scFv，所述scFv具有与SEQ ID NO：68-73之一有至少90％同一性的氨基酸序列；

(b)铰链区，所述铰链区包含与SEQ ID NO：24有至少90％同一性的氨基酸序列；

(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO：25有至少90％同一性的氨基酸序列；以及

(d)胞内信号结构域，所述胞内信号结构域包含具有与SEQ ID NO：26有至少90％同一性的氨基酸序列的共同刺激结构域以及具有与SEQ ID NO：27有至少90％同一性的氨基酸序列的初级信号结构域。

19.根据权利要求18所述的CAR，其中：

(a)所述胞外结构域包含SEQ ID NO：68-73之一的氨基酸序列；

(b)所述铰链区包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列；

(c)所述跨膜结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列；并且

(d)所述胞内信号结构域包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列和SEQ ID NO：27的氨基酸序列。

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