CN107531795B - Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其医药用途 - Google Patents

Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其医药用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种PCSK9抗体、其抗原结合片段及其医药用途。

Description

PCSK9抗体、其抗原结合片段及其医药用途
技术领域
本发明涉及一种PCSK9抗体，PCSK9的抗原结合片段，包含所述PCSK9抗体CDR区的嵌合抗体、人源化抗体，以及包含人PCSK9抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为降血脂药物的用途。
背景技术
高胆固醇血症是一种以血清胆固醇水平升高为主要特征的脂类代谢异常疾病，其主要表现为血清胆固醇水平升高，导致胆固醇在血管聚集，形成动脉粥样硬化。大量的临床及实验研究结果都证实，脂质代谢异常和冠心病的发生、发展有着密切的关系。因此，降低血液中的胆固醇浓度成为了目前治疗和预防动脉粥样硬化的一个主要手段。
随着我国国民生活水平的快速提高，血脂异常也成为了危害我国城乡居民的主要因素。据2012年统计数据，我国每年死亡人数中约有40％死于心血管疾病。目前，我国成人血脂异常患病率为18.6％，估计全国血脂异常现患人数1.6亿。不同类型的血脂异常现患率分别为：高胆固醇血症2.9％，高甘油三酯血症11.9％，低高密度脂蛋白血症7.4％；另有3.9％的人血胆固醇边缘升高。2012年卫生部疾病预防控制专家委员会慢性病防治分委会达成的“慢性病防治中国专家共识”中提到，我国有3300万高胆固醇血症患者，而从局部地区看，我国血脂异常发病率情况远比上述数据要严重。
目前，临床上调脂药物主要以他汀类为主。立普妥(Liptor)作为全世界应用最广泛的降胆固醇药物，也是医药史上最畅销药物，通过阻断肝脏生产胆固醇的酶作用，减少胆固醇的生产，从而增加肝脏从血液中摄取更多的胆固醇，进而减低血液中胆固醇浓度。但是立普妥也有其不足之处，首先从数据看，立普妥可以降低30％-40％的低密度脂蛋白,但仍然有很多病人依然无法到达有效的降低血脂(低密度脂蛋白浓度<50mg/dL)，其次病人对立普妥的响应率也有人种差异。这些种种原因，致使病人需要一个更为有效的降低血脂的药物。
家族性高胆固醇血症(Familial hypercholesterolemia,FM)是一种常染色体单基因显性遗传性疾病，其临床特征为血总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇(low densitylipoprotein-cholesterol,LDL-c)显著升高、睑黄瘤、角膜弓以及早发的心血管疾病。低密度脂蛋白受体(LDL receptor,LDLR)基因突变致其缺陷或缺乏，LDL-c不能顺利转运到肝脏清除，以致血中LDL-c水平升高。目前已明确3种基因与FM的发生有关，它们分别是LDLR基因、载脂蛋白B100基因和PCSK9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)基因。
前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是一种前蛋白转化酶，属于分泌的枯草杆菌酶家族的蛋白酶K亚族。该编码蛋白是作为可溶性酶原合成的，在内质网中经过自身催化分子内加工。实验结果显示，PCSK9促进LDL受体的降解从而增加血浆中LDL胆固醇含量，而LDL受体介导肝内的LDL胞吞过程，后者是从循环系统清除LDL的主要途径。研究发现，12.5％的高胆固醇血症(ADH)患者检测有PCSK9基因突变。PCSK9突变形式多样，根据突变对PCSK9调节LDL-C水平的不同影响可分为两类：功能缺失型和功能获得型。其中功能缺失型突变与低血胆固醇水平有关，有预防冠状动脉粥样硬化性心脏病发生的作用，非洲人群中低胆固醇的PCSK9突变率高于其他种族。PCSK9功能获得型突变体通过增加PCSK9的功能、降低LDLR的表达而升高血浆胆固醇水平，可以导致严重高胆固醇血症和早发冠状动脉粥样硬化性心脏病，目前发现的PCSK9功能获得型突变包括：D374Y、S127R、F216L、N157K、R306S等。其中，与PCSK9野生型相比，D374Y突变体细胞表面的LDLR减少了36％，S127R突变有相应减少了10％。
目前PCSK9作为一个极具潜力的，新的靶标已成为高胆固醇血症研究的热点，对于深入了解胆固醇代谢的机制和寻求新的治疗手段有重要意义。有多家跨国制药公司在研发针对PCSK9的单克隆抗体，它通过在血液中中和PCSK9，从而增加了肝脏表面LDL受体的浓度，进而达到降低血液中LDL浓度的目的。相关的专利有WO2011111007、WO2011072263、WO2013170367、WO2013169886、WO2013148284、WO2013091103、WO2013039958、WO2013039969、WO2013016648、WO2013008185、WO2012170607、WO2012168491、WO2012154999、WO2012109530、WO2012101251、WO2012088313、US8829165B2、US8030457B2、US8563698B2、US8859741B2、US8871913B2、US8871914B2、US8883983B2、WO2012058137和WO2012054438。
本发明提供有着更高亲和力、更高选择性、更高生物活性的PCSK9抗体。
发明内容
本发明提供一种特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或抗原结合片段，其包含可变区，所述可变区包含至少一个或多个选自以下的CDR区：
i)HCDR1，所述HCDR1为GYX1IH(SEQ ID NO:43)，其中X1是T、D或E；
ii)HCDR2，所述HCDR2为X2IX3PSX4TYTKFNQKFKD(SEQ ID NO:44)，其中X2是Y或E；X3是N、L、I或V；X4是S、G或A；
iii)HCDR3，所述HCDR3为AREX5IX6X7NYWFFDX8(SEQ ID NO:45)，其中X5是R或N；X6是Y或F；X7是S或F；X8是V或R；
iv)LCDR1，所述LCDR1为KASQNVYX1X2VX3(SEQ ID NO:46)，其中X1是T或W；X2是A或E；X3是A、D或V；
v)LCDR 2，所述LCDR2为X4X5X6NRYT(SEQ ID NO:47)，其中X4是S、E或Q；X5是A或M；X6是S或V；和
vi)LCDR3，所述LCDR3为QQX7SX8X9PX10T(SEQ ID NO:48)，其中X7是Y、F或L；X8是S或W；X9是Y、F、Q或S；X10是Y、D或E。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述PCSK9抗体或其抗原结合片段包含分别如SEQ ID NO:43、SEQID NO:44和SEQ ID NO:45所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或抗原结合片段，其中所述PCSK9抗体或其抗原结合片段包含分别如SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47和SEQ ID NO:48所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
上述的SEQ ID NO:43-48也可以进一步通过亲和力成熟的技术手段，对本发明的CDR区进行获得更高活性的氨基酸突变。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的HCDR1选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的氨基酸序列，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
HCDR2选自SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27的氨基酸序列，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
HCDR3选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的氨基酸序列，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的LCDR1选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34的氨基酸序列，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
LCDR2选自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37的氨基酸序列，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
LCDR3选自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41或SEQ ID NO:42的氨基酸序列，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述PCSK9抗体包含选自以下的六个CDR：
1)分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19所示的六个CDR；
2)分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19所示的六个CDR；
3)分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19所示的六个CDR；
4)分别如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19所示的六个CDR；
5)分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19所示的六个CDR；
6)分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19所示的六个CDR；
7)分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:35和SEQ ID NO:19所示的六个CDR；
8)分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:36和SEQ ID NO:19所示的六个CDR；
9)分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19所示的六个CDR；
10)分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19所示的六个CDR；
11)分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:38所示的六个CDR；
12)分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:39所示的六个CDR；
13)分别如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19所示的六个CDR；
14)分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19所示的六个CDR；
15)SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:19所示的六个CDR；
16)分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:40所示的六个CDR；
17)分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:41所示的六个CDR；
18)分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19所示的六个CDR；
19)分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19所示的六个CDR；
20)分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19所示的六个CDR；
21)分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19所示的六个CDR；
22)分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:42所示的六个CDR；和
23)分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19所示的六个CDR。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体或其片段。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体或其片段。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或其片段。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体重链包含重链可变区FR区序列来源于人种系重链，IGHV1-2*02和hjh6.1的组合序列或其突变序列；其包含人种系重链IGHV1-2*02的FR1、FR2、FR3区和hjh6.1的FR4区或其突变序列，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体重链序列为SEQ ID NO:10所示的序列的变体；所述变体优选在重链可变区有0-10的氨基酸变化。所述的氨基酸变化可以是用现有技术，为提高抗体如亲和性、半衰期等性能做的改进，如用亲和力成熟修改CDR区的氨基酸，或者用回复突变修改FR区的氨基酸。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体包含具有0-10个氨基酸的回复突变的重链FR区，其中所述回复突变优选为一个或多个选自R72A、T74K、V68A、M70L、M48V、G49A、R67K和R38K的氨基酸回复突变。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，所述PCSK9抗体包含VH，所述VH的氨基酸序列选自SEQ ID NO:12、SEQID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的氨基酸序列，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体轻链可变区上的轻链FR区序列来源于人种系轻链模板IGKV1-39*01和hjk4.1的组合序列或其突变序列；其包含人种系轻链IGKV1-39*01的FR1、FR2、FR3区和hjk4.1的FR4区或其突变序列，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含SEQ ID NO:11或其变体所示的轻链可变区；所述变体是指在SEQ ID NO:11的序列中有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化。所述的氨基酸变化可以是用现有技术，为提高抗体如亲和性、半衰期等性能做的改进，如用亲和力成熟修改CDR区的氨基酸，或者用回复突变修改FR区的氨基酸。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含具有0-10个氨基酸的回复突变的轻链FR区，其中所述回复突变优选为一个或多个选自Q3V、A43S和Y87F的氨基酸回复突变。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含
VL，所述VL的氨基酸序列选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70的氨基酸序列，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含选自以下的VH和VL：
1)SEQ ID NO:12的VH和SEQID NO:13的VL；
2)SEQ ID NO:49的VH和SEQID NO:13的VL；
3)SEQ ID NO:50的VH和SEQID NO:13的VL；
4)SEQ ID NO:51的VH和SEQID NO:13的VL；
5)SEQ ID NO:52的VH和SEQID NO:13的VL；
6)SEQ ID NO:53的VH和SEQID NO:13的VL；
7)SEQ ID NO:12的VH和SEQID NO:59的VL；
8)SEQ ID NO:12的VH和SEQID NO:60的VL；
9)SEQ ID NO:12的VH和SEQID NO:61的VL；
10)SEQ ID NO:12的VH和SEQID NO:62的VL；
11)SEQ ID NO:12的VH和SEQID NO:63的VL；
12)SEQ ID NO:12的VH和SEQID NO:64的VL；
13)SEQ ID NO:54的VH和SEQID NO:13的VL；
14)SEQ ID NO:55的VH和SEQID NO:13的VL；
15)SEQ ID NO:56的VH和SEQID NO:65的VL；
16)SEQ ID NO:12的VH和SEQID NO:66的VL；
17)SEQ ID NO:12的VH和SEQID NO:67的VL；
18)SEQ ID NO:57的VH和SEQID NO:13的VL；
19)SEQ ID NO:58的VH和SEQID NO:13的VL；
20)SEQ ID NO:12的VH和SEQID NO:68的VL；
21)SEQ ID NO:12的VH和SEQID NO:69的VL；
22)SEQ ID NO:12的VH和SEQID NO:70的VL；和
23)SEQ ID NO:56的VH和SEQID NO:13的VL。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述嵌合抗体或人源化抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4或使用氨基酸突变延长抗体在血清中的半衰期的IgG1、IgG2或IgG4变体的重链恒定区，更优选包含引入YTE突变的IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区；
所述嵌合抗体或人源化抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的恒定区，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述PCSK9抗体或其抗原结合片段包含：
1)SEQ ID NO:71的重链序列和SEQ ID NO:73的轻链序列；或
2)SEQ ID NO:75的重链序列和SEQ ID NO:73的轻链序列。
另一方面，本发明提供一种PCSK9抗体或其抗原结合片段，其包含一个或多个选自以下的CDR：如序列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的、或与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16具有至少95％序列同一性的序列所示的HCDR；和如序列SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19所示的、或与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19具有至少95％序列同一性的序列所示的LCDR。所述的95％序列同一性的序列可以来自CDR区的亲和力成熟而得，如本发明的SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的HCDR1，或SEQ ID NO:22至SEQ ID NO:27的HCDR2，或SEQ ID NO:28至SEQ ID NO:30的HCDR3；或SEQID NO:31至SEQ ID NO:34的LCDR1，或SEQ ID NO:35至SEQ ID NO:37的LCDR2，或SEQ IDNO:38至SEQ ID NO:42的LCDR3。本发明优选的HCDR包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24和SEQID NO:16，优选的LCDR包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19。
本发明进一步提供一种编码如上所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段的DNA分子。
本发明进一步提供一种含有如上所述的DNA分子的表达载体。
本发明进一步提供一种用如上所述的表达载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞，优选为真核细胞，更优选哺乳动物细胞。
本发明进一步提供一种制备PCSK9抗体的方法，所述方法包括在适于表达编码如前所述的PCSK9抗体的核酸的条件下培养如前所述的宿主细胞，和/或从所述宿主细胞回收所述PCSK9抗体。
本发明进一步提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的如上所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明进一步提供一种所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段、或如上所述的药物组合物，在制备用于治疗PCSK9介导的疾病或病症的药物中的用途，其中所述的疾病或病症优选为胆固醇相关疾病(其包括“血清胆固醇相关疾病”)；更优选为高胆固醇血症、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠状动脉心脏病、卒中、心血管疾病、阿尔茨海默病和一般性的异常脂血症；最优选高胆固醇血症、异常脂血症、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏病。
可以使用本发明的抗体诊断的示例性疾病包括胆固醇相关疾病(其包括“血清胆固醇相关疾病”)，其包括以下的任何一种或多种：高胆固醇血症、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠状动脉心脏病、卒中、心血管疾病、阿尔茨海默病和一般性的异常脂血症(其显示为例如提高的总血清胆固醇、提高的LDL、提高的甘油三酯、提高的极低密度脂蛋白(VLDL)和/或低的HDL)。
在一方面中，本发明提供治疗或预防个体中的高胆固醇血症和/或至少一种以下症状的方法：异常脂血症、动脉粥样硬化、心血管疾病(CVD)或冠状动脉心脏病，所述方法包括向所述个体施用有效量的PCSK9抗体。本发明还提供有效量的拮抗胞外或循环PCSK9的PCSK9抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防个体的高胆固醇血症和/或至少一种以下症状：异常脂血症、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏病。
本文所述的任何实施方案或其任何组合适用于本文所述的发明的任何和所有PCSK9抗体、方法和用途。
附图说明
图1:不同PCSK9抗体(h011-3058，h011-3065，h011-3133，h011-3147，h011-3191)浓度下HepG2细胞的LDL摄取变化。数据结果显示PCSK9抗体能够促进HepG2细胞摄取LDL。
图2:不同PCSK9抗体(h011-3050，h011-3095，h011-3181，h011-3187，h011-3190)浓度下HepG2细胞的LDL摄取变化。数据结果显示PCSK9抗体能够促进HepG2细胞摄取LDL。
图3:注射不同PCSK9抗体(h011-3133-WT，h011-3133-YTE，h011-3191，h011-3065)的小鼠血清中LDL-c浓度变化(*：p<0.05,vs IgG，**：p<0.01,vs IgG)。数据结果显示PCSK9抗体能够降低过表达人PCSK9的小鼠血清中LDL-c浓度。
图4:注射不同PCSK9抗体(h011-3058，h011-3191，h011-3147)的小鼠血清中LDL-c浓度变化(*：p<0.05,vs IgG，**：p<0.01,vs IgG)。数据结果显示PCSK9抗体能够降低过表达人PCSK9的小鼠血清中LDL-c浓度。
图5:注射不同PCSK9抗体(h011-3133-WT，h011-3133-YTE，h011-3191)的小鼠血清中相对IgG组的LDL-c浓度变化。数据结果显示相对IgG组，PCSK9抗体能够降低过表达人PCSK9的小鼠血清中LDL-c浓度。
图6:注射不同PCSK9抗体(h011-3058，h011-3191，h011-3147)的小鼠血清中相对IgG组的LDL-c浓度变化。数据结果显示相对IgG组，PCSK9抗体能够降低过表达人PCSK9的小鼠血清中LDL-c浓度。
具体实施方式
发明实施方案详述
本文描述或引用的技术和方法一般被很好的理解，并且通常为本领域技术人员使用常规方法所采用，如，例如在以下文献中所述的被广泛使用的方法：Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)第3版(2001)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.CURRENT PROTOCOLSINMOLECULAR BIOLOGY(分子生物学中的最新实验方法)(F.M.Ausubel等编辑，(2003))；系列METHOD SINENZYMOLOGY(Academic Press,Inc.):PCR2:A PRACTICAL APPROACH(PCR2:实用方法)(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995))，Harlow和Lane编辑(1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL(抗体，实验室手册)，和ANIMAL CELL CULTURE(动物细胞培养)(R.I.Freshney编辑(1987))；Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)(M.J.Gait编辑1984)；Methods in Molecular Biology(分子生物学中的方法)，HumanaPress；Cell Biology:A Laboratory Notebook(细胞生物学：实验室手册)(J.E.C ellis编辑1998)Academic Press；Animal Cell Culture(动物细胞培养)(R.I.Freshney)编辑，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(细胞和组织培养导言)(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell和Tissue Culture:Laboratory Procedures(细胞和组织培养：实验室方法)(A.Doyle，J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑，1993-8)J.Wiley和Sons；Handbook of Experimental Immunology(实验免疫学手册)(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(用于哺乳动物细胞的基因转移载体)(J.M.Miller和M.P.Calos编辑，1987)；PCR:The Polymerase ChainReaction(PCR:聚合酶链反应)，(Mullis等编辑，1994)；Current Protocols inImmunology(免疫学最新方法)(J.E.Coligan等编辑，1991)；Short Protocols inMolecular Biology(分子生物学中的小方法)(Wiley和Sons，1999)；Immunobiology(免疫生物学)(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；Antibodies(抗体)(P.Finch，1997)；Antibodies:APractical Approach(抗体：实用方法)(D.Catty编辑，IRL Press，1988-1989)；Monoclonal Antibodi es:A Practical Approach(单克隆抗体：实用方法)(P.Shepherd和C.Dean编辑，Oxford University Press，2000)；Using Antibodies:ALaboratory Manual(使用抗体：实验室手册)(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring HarborLaboratory Press,1999)；The Antibodies(抗体)(M.Zanetti和J.D.Capra编辑，HarwoodAcademic Publishers，1995)；以及Cancer:Principles和Practice of Oncology(癌症：肿瘤学的原理和实践)(V.T.DeVita等编辑，J.B.Lippincott Company，1993)。
定义
除非另外限定，本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属的技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同的含义。Singleton等，Dictionary ofMicrobiology(微生物学词典)和Molecular Biology(分子生物学)第2版，J.Wiley&Sons(New York，N.Y.1994)，以及March，Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanisms and Structure(高等有机化学反应，机制和结构)第4版，John Wiley&Sons(New York，N.Y.1992)，对于本申请中所用的许多术语，为本领域技术人员提供了一般指导。本文引用的所有文献(包括专利申请和出版物)通过引用完整地结合。
为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。在以下所述的任何定义与通过引用结合于本文中的任何文献冲突的情况中，以以下所述的定义为准。
除非另外说明，术语“前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin型9(Proproteinconvertase subtilisin/kexin type 9)(PCSK9)”、“PCSK9”或“NARC-1”当用于本文中时是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然PCSK9，除非另有说明。该术语涵盖“全长”未加工的PCSK9以及由细胞内加工产生的任何形式的PCSK9或其任何片段。该术语还包括天然存在的PCSK9的变体，例如，剪接变体或等位变体。
在本说明书和权利要求中，免疫球蛋白重链中残基的编号是如在Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)中的EU索引(EU index)的编号，上述文献通过引用结合于本文中。“如在Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(CDR)。(参见，例如，Kindt等KubyImmunology，6th ed.，W.H.Freeman and Co.91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。此外，可以使用来自与特定抗原结合的抗体的VH或VL结构域来分离结合所述抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等，Nature 352:624-628(1991)。
术语“高变区”或“HVR”当在本文中使用时，是指抗体可变结构域的每个区域，其序列高可变和/或形成结构上限定的环(“高变环”)。通常，天然四链抗体包含六个CDR；三个在VH(H1，H2，H3)中，三个在VL(L1，L2，L3)中。CDR通常包含来自高变环和/或“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列可变性和/或涉及抗原识别。示例性高变环发生在氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)，和96-101(H3)。(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。示例性CDR(LCDR1，LCDR2，LCDR3，HCDR1，HCDR2，和HCDR3)发生在氨基酸残基L1的24-34，L2的50-56，L3的89-97，H1的31-35B，H2的50-65，和H3的95-102。(Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1991))。除了VH中的CDR1，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是与抗原接触的残基。SDR包含在被称为缩短的(abbreviated)-CDR或a-CDR的CDR区域中。示例性a-CDR(a-LCDR1，a-LCDR2，a-LCDR3，a-HCDR1，a-HCDR12，和a-HCDR13)发生在氨基酸残基L1的31-34，L2的50-55，L3的89-96，H1的31-35B，H2的50-58，和H3的95-102。(见Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另外说明，可变结构域中的CDR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等(见上文)编号。
术语“抗PCSK9抗体”、“抗PCSK9”、“PCSK9抗体”或“结合PCSK9的抗体”在本文中可互换使用，是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合PCSK9抗体以致所述抗体可以用作靶向PCSK9中的诊断剂和/或治疗剂。
术语“抗体”在本文中以最广义使用，并且包括不同抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(如双特异性抗体)，和抗原结合片段，只要它们显示所需的抗原结合活性。
术语“全长抗体”、“完整的抗体”和“完整抗体”在本文被可交换地用于指结构与天然抗体结构基本相似或具有包含如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
本发明所述的抗原结合片段，选自Fab、Fab’-SH、Fv、scFv或(Fab’)2片段。
“抗原结合片段”不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分结合完整抗体结合的抗原。抗原结合片段的实例包括但不限于Fv，Fab，Fab′，Fab’-SH，F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗原结合片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有单一抗原结合位点，和残留的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab’)2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
“Fab”片段包括重链可变结构域和轻链可变结构域，并且还包括轻链的恒定结构域以及重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段因在重链CH1结构域的羧基末端增加了一些残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段不同。Fab’-SH是本文中对其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带一个游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab’)2抗原结合片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗原结合片段的其它化学偶联也是已知的。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在某些实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羰基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，其也被称为EU索引，如在Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，5th Ed.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991中所述。Fc区域是抗体的效应子功能所必需的。效应子功能包括启动补体依赖的细胞毒性(CDC)、启动吞噬作用和抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)并通过胞转作用转运抗体通过细胞屏障。此外，Fc区域对维持IgG类抗体的血清半衰期至关重要(Ward和Ghetie，Ther.Immunol.2:77-94(1995))。研究发现IgG抗体的血清半衰期由Fc和新生Fc受体(FcRn)的结合来介导。FcRn是由跨膜α链和可溶性β链(β2-微球蛋白)组成的异源二聚体。美国专利号6,165,745公开了一种通过将突变引入编码抗体的DNA片段生产生物半衰期减少的抗体的方法。该突变包括在Fc-绞链结构域的位置253、310、311、433或434处的氨基酸取代。美国专利号6,277,375B1公开了含有突变型IgG分子的组合物，该分子相对野生型IgG血清半衰期增加，其中该突变型IgG分子含有以下氨基酸取代：在252位苏氨酸取代亮氨酸，在254位苏氨酸取代丝氨酸，或在256位苏氨酸取代苯丙氨酸(M252Y、S254T和T256E)。也公开了在位置433、435或436处具有氨基酸取代的突变型IgG。美国专利号6,528,624公开了含有IgG Fc区域的一种抗体的变体，该变体在人IgG Fc区域的一个或多个氨基酸位置(位置270、322、326、327、329、331、333和334)具有氨基酸取代。PCT公开号WO 02/060919A2公开了修饰的IgG，该修饰的IgG包含的IgG恒定区相对于野生型IgG恒定区含有一个或多个氨基酸修饰，其中该修饰的IgG与含有野生型IgG恒定区的IgG相比增加了半衰期，并且其中一个或多个氨基酸修饰位于以下一个或多个位置：251、253、255、285-290、308-314、385-389、和428-435。具体地，本文所述“YTE”或“YET突变”指IgG1的Fc区的一个突变组合，用于促进Fc区与人FcRn的结合，延长抗体在人血清中的半衰期。YTE突变子包含三个“YTE突变子”的组合：M252Y、S254T和T256E，残基编号是根据EU编号系统，其也被称为EU索引，如在Kabat等(参考U.S.专利No.7,658,921所述)对IgG重链进行编号。相较于野生型抗体，YTE突变抗体大大延长了抗体在血清中的半衰期，如e.g.,Dall’Acqua et al,J.Biol.Chem.281:23514-24(2006)和U.S.专利号No.7,083,784。
“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗原结合片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域以紧密的，非共价缔合的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接从而使轻链和重链可以以类似于双链Fv种类的“二聚体”结构缔合。在这种构型中，每个可变结构域的三个CDRs相互作用从而限定在VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。总而言之，六个CDRs将抗原结合特异性赋予抗体。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个CDRs的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和性低于完整结合位点。
“单链Fv”或“scFv”抗原结合片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域以单多肽链存在。一般地，所述scFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，所述接头使scFv形成对于抗原结合需要的结构。关于scFv的综述参见例如Pluckthün于The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies(单克隆抗体药理学)，卷113，Rosenburg和Moore编辑，(Springer-Verlag，New York，1994)，pp.269-315中。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要选建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再要据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。在本发明一个优选的实施方案中，所述的PCSK9嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链Fc区。所述的PCSK9嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链Fc区，优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变(如YTE突变)后延长抗体在血清中的半衰期的IgG1、IgG2或IgG4变体。
“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于这样抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体是指包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。
“框架”或“F R”是指除高变区(CDR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1，FR2，FR3和FR4。因此，CDR和FR序列通常以以下顺序出现在VH(或VL)：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
“人共有框架”是指这样的框架，即在选择人免疫球蛋白VL或VH框架序列中，其代表最常出现的氨基酸残基。一般而言，对人免疫球蛋白VL或VH序列的选择是从可变结构域序列的亚型中选择。一般而言，该序列的亚型是如Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，1-3卷中的亚型。在一个实施方案中，对于VL，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型III。
用于本文目的的“接纳体人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或如下所定义的人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的接纳体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或其可以包含氨基酸序列的变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10以下，9以下，8以下，7以下，6以下，5以下，4以下，3以下，或2以下。在一些实施方案中，VL接纳体人框架的序列与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些。用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案描述于以下。
“亲和力成熟的”抗体指这样的抗体，在该抗体的一个或多个高变区(CDR)中具有一处或多处改变，导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有提高。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用并且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。
“分离的抗体”是这样的抗体，其已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗体纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等，J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
“分离的编码PCSK9抗体的核酸”是指一个或多个核酸分子，其编码抗体重和轻链(或其片段)，包括在单一载体或分开的载体中的这样的核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这样的核酸分子。
术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能的变体抗体(该变体抗体例如含有天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂的过程中出现，此类变体通常少量存在)外，构成群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位。相比于通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，单克隆抗体制剂中的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来产生抗体。例如，将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括但不限于杂交瘤法，重组DNA法，噬菌体展示法，和利用包含所有或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这样的方法和用于制备单克隆抗体的其他示例性方法描述于本文中。
“裸抗体”是指没有缀合异源部分(如细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”是指天然存在的具有变化的结构的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由两个相同的轻链和两个相同的重链组成，所述链通过二硫键结合。从N末端至C末端，每个重链具有可变区(VH)，其也被称为可变重结构域或重链可变结构域，其后是三个恒定结构域(CH1，CH2和CH3)。类似地，从N末端到C末端，每个轻链具有可变区(VL)，其也被称为可变轻结构域或轻链可变结构域，其后是恒定轻(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以被分配给被称为kappa(κ)和lambda(λ)的两个类型中的一个。
相对于参比多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将所述序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参比多肽序列中的氨基酸残基相同的百分数。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而，为此目的，％氨基酸序列同一性值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。ALIGN-2序列比较计算机程序的作者是Genentech，Inc，并且源代码已经随用户文档提交至美国版权局(Washington D.C.，20559)，其美国版权注册登记号为TXU510087。公众可通过Genentech，Inc.(Sou th San Francisco，California)得到ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当为在UNIX操作系统、包括数字UNIXV4.0D上使用而进行编译。ALIGN-2程序设定了所有序列比对参数并且不变。
在ALIGN-2应用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者这样说：给定氨基酸序列A具有或含有相对于、与或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算：
100乘以X/Y比值
其中X是用序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另外具体说明，在本文用的所有％氨基酸序列同一性的值都是用ALIGN-2计算机程序如前段所描述的那样得到的。
试剂例如药物制剂的“有效量”是指在需要的剂量和时间阶段有效获得所需的治疗或预防结果的量。
术语“高胆固醇血症”当用于本文中时是指其中胆固醇水平升高到理想水平以上的病症。在某些实施方案中，LDL-胆固醇水平升高到理想水平以上。在某些实施方案中，血清LDL-胆固醇水平升高到理想水平以上。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
术语“药物制剂”或“药物组合物”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
“药用载体”是指药物制剂中不同于活性成分的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“PCSK9活性”或PCSK9的“生物学活性”当用于本文中时包括PCSK9的任何生物学作用。在某些实施方案中，PCSK9活性包括PCSK9与底物或受体相互作用或结合的能力。在某些实施方案中，PCSK9的生物学活性是PCSK9与LDL-受体(LDLR)结合的能力。在某些实施方案中，PCSK9活性包括PCSK9降低或减少LDLR的利用度的能力。在某些实施方案中，PCSK9的生物学活性包括PCSK9提高受试者的LDL的量的能力。在某些实施方案中，PCSK9的生物学活性包括PCSK9降低受试者的可以用于与LDL结合的LDLR的量的能力。在某些实施方案中，PCSK9的生物学活性包括PCSK9降低可以用于与LDL结合的LDLR的量的能力。在某些实施方案中，PCSK9的生物学活性包括由PCSK9信号传导所致的任何生物学活性。
用于本文时，“治疗”指在尝试改变待治疗的个体的天然进程中的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的理想效果包括但不限于防止疾病发生或复发，缓和症状，消除疾病的任何直接或间接病理学后果，减少疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和症状缓解或改善的预后。在一些实施方案中，将本发明的抗体用于延缓疾病的发生或减缓疾病的进展。组合物和方法
在一方面中，本发明部分基于利用PCSK9抗体获得的实验结果。所得的结果指示利用PCSK9抗体阻断PCSK9的生物学活性防止LDLR减少。此外，结果证实施用PCSK9抗体降低受试者的总LDL-胆固醇水平。因此，如本文所述的本发明的PCSK9抗体提供重要的治疗和诊断剂，所述治疗和诊断剂用于靶向与PCSK9相关的病理学状况，例如胆固醇相关疾病。
在某些实施方案中，“胆固醇相关疾病”包括以下中的任一种或多种：高胆固醇血症、心脏病、代谢综合征(metabolic syndrome)、糖尿病、冠状动脉心脏病(coronary heartdisease)、卒中(stroke)、心血管疾病(cardiovascular diseases)、阿尔茨海默病(Alzheimers disease)和一般性的异常脂血症(dyslipidemia)(其显示为例如提高的总血清胆固醇、提高的LDL、提高的甘油三酯、提高的VLDL和/或低的HDL)。可以使用PCSK9抗体(单独地或与一种或多种其他药剂组合地)治疗的原发性和继发性异常脂血症的一些非限制性实例包括代谢综合征、糖尿病(diabetes mellitus)、家族性混合性高脂血症(familial combined hyperlipidemia)、家族性高甘油三酯血症(familialhypertriglyceridemia)、家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemias)，包括杂合性高胆固醇血症(heterozygous hypercholesterolemia)、纯合性高胆固醇血症(homozygous hypercholesterolemia)、家族性缺陷性载脂蛋白(familial defectiveapoplipoprotein)B-100；多基因性高胆固醇血症(polygenic hypercholesterolemia)；残粒移去障碍病(remnant removal disease)、肝脂肪酶缺失(hepatic lipasedeficiency)；继发于以下任何的异常脂血症：饮食不慎(dietary indiscretion)、甲状腺机能障碍(hypothyroidism)、药物(包括雌激素和孕酮疗法、β阻断剂和噻嗪类利尿剂(thiazide diuretics))；肾病综合征(nephrotic syndrome)、慢性肾衰竭(chronic renalfailure)、库欣综合征(Cushing’s syndrome)、原发性胆汁性肝硬变(primary biliarycirrhosis)、糖原沉积病(glycogen storage diseases)、肝细胞瘤(hepatoma)、胆汁淤积(cholestasis)、肢端肥大症(acromegaly)、胰岛素瘤(insulinoma)、单纯性生长素缺乏症(isolated growth hormone deficiency)和酒精所致高甘油三酯血症(alcohol-inducedhypertriglyceridemia)。本文所述的PCSK9抗体可以用于预防或治疗动脉粥样硬化疾病，如例如，冠状动脉心脏病、冠脉疾病、周围动脉疾病(peripheral arterial disease)、卒中(缺血性(ischaemic)和出血性(hemorrhagic))、心绞痛(angina pectoris)或脑血管疾病和急性冠脉综合征(acute coronary syndrome)、心肌梗死(myocardial infarction)。在某些实施方案中，本文所述的PCSK9抗体可以用于降低以下的风险：非致死性心脏病发作(nonfatal heart attacks)、致死性和非致死性卒中、某些类型的心脏手术、心力衰竭的住院治疗、患有心脏病的患者的胸痛、和/或心血管事件，其由于确定的心脏病导致，如在前的心脏病发作、在前的心脏手术、和/或有阻塞的动脉的证据的胸痛。在某些实施方案中，本文所述的PCSK9抗体和方法可以用于降低复发的心血管事件的风险。
示例性PCSK9抗体
在一方面中，本发明提供特异性结合PCSK9的分离的抗体。在某些实施方案中，PCSK9抗体调节PCSK9活性。
在某些实施方案中，PCSK9抗体是人源化的。在一个实施方案中，PCSK9抗体包含如在任意以上实施方案中的CDR，并且还包含接纳体人框架，例如，人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在另一方面中，PCSK9抗体包含重链可变结构域(VH)序列，所述序列与氨基酸序列SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列包含置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的PCSK9抗体保持结合PCSK9的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58中，总计1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDR外的区域(即，在FR中)。任选地，PCSK9抗体包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个特别的实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的CDR:(a)HCDR1，所述HCDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20或SEQ IDNO:21，(b)HCDR2，所述HCDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27，和(c)HCDR3，所述HCDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30。
在另一方面中，提供PCSK9抗体，其中所述抗体包含轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域(VL)与氨基酸序列SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列包含置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的PCSK9抗体保持结合PCSK9的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70中，总计1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换，插入或缺失发生在CDR外的区域(即，在FR中)。任选地，抗PCSK9抗体包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:69或SEQ ID NO:70中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个特别的实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的CDR:(a)LCDR1，所述LCDR1包含氨基酸序列SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34；(b)LCDR2，所述LCDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37；和(c)LCDR3，所述LCDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42。
在另一方面中，提供PCSK9抗体，其中所述抗体包含如在任何以上提供的实施方案中的VH，和如在任何以上提供的实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体包含分别在SEQID NO:12和SEQ ID NO:13中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗体分别包含分别在SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:59中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗体分别包含分别在SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:13中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:13中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:65中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:13中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在本发明的另一个方面中，根据任何以上实施方案的PCSK9抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，PCSK9抗体是抗原结合片段，例如，Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如，完整IgG1抗体或如本文所定义的其他抗体类别或同种型。
在另一方面中，根据任何以上实施方案的PCSK9抗体可以结合如在以下部分所述的任何特征(单独地或组合地):
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文提供的抗体具有的解离常数(Kd)≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10E-8M以下，例如10E-8M至10E-13M，例如，10E-9M至10E-13M)。
2.抗原结合片段
在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗原结合片段。抗原结合片段包括但不限于，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2，Fv，和scFv片段，以及以下描述的其他片段。对于特定抗原结合片段的综述，请参见Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)。对于scFv片段的综述，请参见，例如，Pluckthün，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体的药理学)，卷113，Rosenburg和Moore编辑，(Springer-Verlag，New York)，269-315页(1994)；还请参见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含拯救受体(salvagerec eptor)结合表位残基和具有提高的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
单一结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗原结合片段。在某些实施方案中，单一结构域抗体是人单一结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见，例如，美国专利号6,248,516B1)。
抗原结合片段可以通过不同技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。
3.嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体于例如美国专利第4,816,567号；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851-6855(1984)中描述。在一个实例中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或例如猴的非人类灵长类动物的可变区)及人类恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是种类或亚类已经自亲本抗体的种类或亚类发生变化的“种类转变”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非人类抗体经人源化以降低对人类的免疫原性，同时保持亲本非人类抗体的特异性及亲和力。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中CDRs，例如CDRs(或其部分)源自非人类抗体，且FRs(或其部分)是源自人类抗体序列。人源化抗体任选地也将包含人类恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基经来自非人类抗体(例如CDR残基所源自的抗体)的相应残基置换，例如以恢复或提高抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法于例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中评述，且进一步于例如Riechmann等人，Nature(自然)332:323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号和第7,087,409号；Kashmiri等人，Methods(方法)36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)Padlan，Mol.Immunol.(分子免疫学)28:489-498(1991)(描述“表面重整”)；Dall′Acqua等人，Methods 36:43-60(2005)(描述“FR重组(shuffling)”)；及Osbourn等人，Methods(方法)36:61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer(英国癌症杂志)，83:252-260(2000)(描述FR重组(shuffling)的“导向选择”方法)中描述。
可用于人源化的人类框架区包括，但不限于，使用“最佳拟合”法选择的框架区(参见例如Sims等人，J.Immunol.(免疫学杂志)151:2296(1993))；源自特定亚群的轻链或重链可变区的人类抗体共同序列的框架区(参见例如Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，151:2623(1993))；人类成熟(体细胞突变)框架区或人类生殖系框架区(参见例如Almagro及Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；及源自筛选FR文库的框架区(参见例如Baca等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)272:10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)271:22611-22618(1996))。
4.源自文库的抗体
可通过在组合文库中筛选具有所需活性的抗体来分离本发明抗体。举例来说，本领域中已知多种用于产生噬菌体展示文库并且在这些文库中筛选具有所需结合特征的抗体的方法。这些方法于例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)178:1-37(O’Brien等人编，人Press，Totowa，NJ，2001)中评述，并且进一步于例如McCafferty等人，Nature(自然)348:552-554；Clackso等人，Nature(自然)352:624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222:581-597(1992)；Marks及Bradbury，Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)248:161-175(Lo编，人Press，Totowa，NJ，2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)338(2):299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)340(5):1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；并且Lee等人，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)284(1-2):119-132(2004)中描述。
在某些噬菌体展示方法中，VH及VL基因库(repertoire)是通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆并且随机重组于噬菌体文库中，随后可如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.(免疫学年度综述)，12:433-455(1994)中所述在其中筛选抗原结合噬菌体。噬菌体通常呈现单链Fv(scFv)片段或Fab片段形式的抗原结合片段。来自免疫来源的文库无需构建杂交瘤即可提供免疫原的高亲和力抗体。或者，天然库可经克隆(例如自人)以在无任何免疫的情况下提供针对多种非自体抗原以及自体抗原的抗体单一来源，如Griffiths等人，EMBOJ，12:725-734(1993)所述。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V基因区段，并且使用含有随机序列的PCR引物来编码高变性CDR3区，并且实现体外重排来合成制得天然文库，如Hoogenboom及Winter，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开物包括例如：美国专利第5,750,373号，及美国专利公开第2005/0079574号、第2005/0119455号、第2005/0266000号、第2007/0117126号、第2007/0160598号、第2007/0237764号、第2007/0292936号和第2009/0002360号。从人抗体文库分离的抗体或抗原结合片段被视为本文的人抗体或人抗原结合片段。
5.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文中所提供抗体的氨基酸序列变体。举例来说，可能需要其来提高抗体的结合亲和力、延长抗体在血清中的半衰期和/或其他生物特性。可通过在编码抗体的核苷酸序列中引入适当修饰或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这些修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基缺失和/或插入其中和/或对其进行置换。可进行缺失、插入和置换的任何组合以获得最终构建体，其限制条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。
置换、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换性诱变的相关位点包括CDR和FR。保守性置换显示在表1中在“保守性置换”的标题下。更多实质性变化于表1中的“示例性置换”的标题下提供且如下文关于氨基酸侧链种类进一步描述。可将氨基酸置换引入相关抗体中并筛选具有所需活性，例如保持/提高的抗原结合、降低的免疫原性、或延长的半衰期的产物。
表1
Figure GDA0002722015820000231
可根据常见侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。
非保守性置换将需要将一种这些种类中的成员换成另一种类。
一种类型的置换变体涉及置换亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般而言，选择用于进一步研究的所得变体的某些生物学特性相对于亲本抗体改变(例如提高)(例如亲和力增加、半衰期延长或免疫原性降低)和/或将实质上保持亲本抗体的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，例如本文中所述的那些，方便地产生。简言之，一个或多个CDR残基被突变，且变异抗体呈现于噬菌体上，并针对特定生物活性(例如结合亲和力)对其进行筛选。
可在CDR中进行改变(例如置换)，例如以提高抗体亲和力。这些改变可于CDR“热点”也即由在体细胞成熟过程中经历高频率突变的密码子编码的残基中进行(参见例如Chowdhury，Methods Mol.Biol.(分子生物学方法)207:179-196(2008))；并且/或于SDRs(a-CDRs)，其中测试所得变异VH或VL的结合亲和力。通过构建并且自第二文库重新选择而获得的亲和力成熟已于例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)178:1-37(O’Brien等人编人Press，Totowa，NJ，(2001))中描述。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR(error-prone PCR)、链重组(shuffling)或寡核苷酸定向诱变)中任一种将多样性引入经选择以供成熟的可变基因中。随后产生第二文库。随后筛选该文库以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。另一引入多样性的方法涉及CDR定向方法，其中随机选择数个CDR残基(例如每次4-6个残基)。可例如使用丙氨酸扫描诱变或模型化特定地鉴别抗原结合中所涉及的CDR残基。特定地，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。
在某些实施方案中，置换、插入或缺失可在一个或多个CDR内进行，只要这些改变不实质上降低抗体结合抗原的能力即可。举例来说，可在CDR中进行不实质上降低结合亲和力的保守性改变(例如如本文中所提供的保守性置换)。这些改变可在CDR“热点”或SDR外部。在上文提供的变异VH及VL序列的某些实施方案中，各CDR未经改变，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。
Fc区域变体
在某些实施方案中，可在本文中所提供抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体，以便促进Fc区与人FcRn的结合，延长抗体在人血清中的半衰期。Fc区变体可包含在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
测定
本文中提供的抗PCSK9抗体可以对其物理/化学特性和/或生物活性，通过本领域中已知的不同测定来识别、筛选或表征。
1.结合测定和其他测定
在一方面中，测试本发明的抗PCSK9抗体的PCSK9结合活性，例如，通过已知方法如ELISA、蛋白印迹法等。
2.活性测定
在一方面中，提供用于鉴别具有生物学活性的PCSK9抗体的测定。PCSK9抗体的生物学活性可以包括，例如，阻断、拮抗、抑制、干扰、调节和/或降低PCSK9的一种或多种生物学活性。还提供在体内和/或体外具有这样的生物学活性的抗体。
在某些实施方案中，PCSK9抗体结合人PCSK9并阻断与LDLR的相互作用。在某些实施方案中，本发明提供分离的PCSK9抗体，其特异性地结合PCSK9，并且当在体外使用本文中公开的HepG2细胞中的LDLR减量调节测定测量时，拮抗PCSK9介导的对LDLR水平的作用。
可以使用本发明的抗体诊断的示例性疾病包括胆固醇相关疾病(其包括“血清胆固醇相关疾病”)，其包括以下的任何一种或多种：高胆固醇血症、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠状动脉心脏病、卒中、心血管疾病、阿尔茨海默病和一般性的异常脂血症(其显示为例如提高的总血清胆固醇、提高的LDL、提高的甘油三酯、提高的极低密度脂蛋白(VLDL)和/或低的HDL)。在一方面中，本发明提供治疗或预防个体中的高胆固醇血症和/或至少一种以下症状的方法：异常脂血症、动脉粥样硬化、心血管疾病(CVD)或冠状动脉心脏病，所述方法包括向所述个体施用有效量的PCSK9抗体。在某些实施方案中，本发明提供有效量的PCSK9抗体用于治疗或预防受试者中的高胆固醇血症和/或至少一种以下症状：异常脂血症、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏病。本发明还提供有效量的拮抗胞外或循环PCSK9的PCSK9抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防个体的高胆固醇血症和/或至少一种以下症状：异常脂血症、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏病。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。要理解，根据以上提供的一般性描述，可以实施多种其他实施方案。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1、PCSK9抗原及检测用蛋白的制备
将人PCSK9(以UniProt Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9(人PCSK9，Uniprot号：Q8MBP7)作为本发明PCSK9的模板，可选的在PCSK9蛋白基础上融合不同的标签如his标签或促进免疫的肽段如PADRE肽，分别克隆到pTT5载体上(Biovector，Cat#:102762)或pTargeT载体上(promega,A1410)，在293细胞瞬转表达或CHO-S稳定表达，用常规的方法进行纯化，获得编码本发明抗原及检测用蛋白。详细序列如SEQ ID NO:1-9所示，或其突变蛋白(如PCSK9D374Y突变,PCSK9-Y)用作用于抗人PCSK9杂交瘤单克隆抗体的制备和文库分选的抗原。
带His标签的PCSK9：PCSK9-His6，用于免疫原免疫小鼠或检测试剂
Figure GDA0002722015820000261
注释：划横线部分为信号肽，斜体部分为His6-tag(6组氨酸标签)。
带PADRE肽和His标签的PCSK9：PCSK9-PADRE-His6，作为免疫原，所含PADRE肽可以促进免疫；
Figure GDA0002722015820000262
Figure GDA0002722015820000271
注释：划横线部分为信号肽，双划线部分为接头，点划线部分为PADRE肽，斜体部分为His6-tag。
带TEV酶切位点的PCSK9与his标签融合蛋白：PCSK9-TEV-His6，可通过TEV酶切获得N-PCSK9(N端pCSK9结构域)，作为免疫原；
Figure GDA0002722015820000272
注释：划横线部分为信号肽，双划线部分为TEV酶切位点，斜体部分为His6-tag。
PCSK9-D374Y突变蛋白，带his标签：PCSK9-D374Y-His6，作为检测试剂；
Figure GDA0002722015820000273
Figure GDA0002722015820000281
注释：划横线部分为信号肽，斜体部分为His6-tag。
插入生物素接受肽BP15及his标签的PCSK9蛋白：PCSK9-BP15-His6，作为检测试剂，BP15肽位置在表达过程中能够进行生物素标记，免除体外生物素标记及可能导致的构象变化；
Figure GDA0002722015820000282
注释：划横线部分为信号肽，双划线部分为生物素接受肽，斜体部分为His6-tag。
插入生物素接受肽及his标签的PCSK9 D374Y突变体蛋白：PCSK9-D374Y-BP15-His6，检测蛋白；
Figure GDA0002722015820000291
注释：划横线部分为信号肽，双划线部分为生物素接受肽，斜体部分为His6-tag。
带Flag标签和His标签的pCSK9受体蛋白LDLR胞外域片段：LDLR-ECD-Flag-His6，检测试剂
Figure GDA0002722015820000292
Figure GDA0002722015820000301
注释：划横线部分为信号肽，双划线部分为Flag标签，斜体部分为His6-tag；
缩短形式的LDLR胞外域片段与hIgG1-Fc融合蛋白(具有与PCSK9结合活性)：LDLR-sECD–Fc(hIgG1)作为检测试剂；
Figure GDA0002722015820000302
注释：划横线部分为信号肽，双划线部分为缩短形式的具有与PCSK9结合活性的LDLR胞外域片段(LDLR-sECD)，斜体部分为hIgG1-Fc部分；
更加缩短形式的LDLR胞外域片段与hIgG1-Fc融合蛋白(具有与pCSK9结合活性)：LDLR-ssECD–Fc(hIgG1)作为检测试剂
Figure GDA0002722015820000303
注释：划横线部分为信号肽，双划线部分为更加缩短形式的具有与PCSK9结合活性的LDLR胞外域片段(LDLR-ssECD)，斜体部分为hIgG1-Fc部分；
实施例2、抗人PCSK9杂交瘤单克隆抗体的制备
抗人PCSK9单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用SJL白小鼠，雌性，6周龄(北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001)。饲养环境：SPF级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，12/12小时光/暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。将已适应环境的小鼠按两种方案免疫(A/B)，每组6-10只。免疫抗原为带His标签的人PCSK9-His6(SEQ ID NO:1)、PCSK9-PADRE-His6(SEQ ID NO:2)及N-PCSK9(SEQ ID NO:3)。
方案A用弗氏佐剂(sigma Lot Num：F5881/F5506)乳化：首免用弗氏完全佐剂(CFA)，其余加强免疫用弗氏不完全佐剂(IFA)。抗原与佐剂比例为1:1，100μg/只(首免)，50μg/只(加强免疫)。第0天腹膜内(IP)注射100μg/只的乳化后抗原，首免后每两周一次，共6-8周。
方案B用Titermax(sigma Lot Num：T2684)与Alum(Thremo Lot Num：77161)交叉免疫。抗原与佐剂(titermax)比例为1:1，抗原与佐剂(Alum)比例为3:1，10-20μg/只(首免)，5μg/只(加强免疫)。第0天腹膜内(IP)注射20/10μg/只的乳化后抗原，首免后每周一次，Titermax和Alum交替使用，共6-11周。免疫四周后，根据背部结块和腹部肿胀情况，选择背部或腹膜内注射抗原。
实施例3、文库构建
将免疫过后的小鼠脾脏，经滤网磨碎，PBS清洗之后，抽提RNA。再经反转录得到cDNA。抗体残基编号根据Kabat(Kabat等，Sequences of proteins of immunologicalinterest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，5th Ed.，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1991))进行。采用上游引物混合物和下游引物混合物分别扩增重轻链，引物设计参照(Brocks et al.2001)，重链上游引物加入sfiI酶切位点及保护碱基，下游引物加入linker的部分序列；轻链上游引物加入部分linker序列与重链下游引物形成互补，下游引物加入另一个sfiI酶切位点及保护碱基。扩增的VH和VL片段经凝胶回收后，进行over-lap PCR拼接成scFv，由VH-(G4S)3-VL组成。scFv再经sfiI酶切后，与sfiI酶切后的噬菌粒载体连接，电转化大肠杆菌SS320，文库库容约为1E9。
实施例4、筛选
大肠杆菌文库经辅助噬菌体(NEB,N0315S)包装成噬菌体颗粒后，采用液相法淘筛(panning)：噬菌体与生物素化PCSK9液相结合，再采用链霉亲和素磁珠分离。两轮淘筛后挑取单克隆包装出噬菌体，用于噬菌体ELISA测试。测试分为两部分，一部分是结合活性和阻断活性。结合活性：ELISA板上包被2ng/μl链霉亲和素，再孵育1ng/μl生物素化PCSK9(SEQID NO：5)，加入1:1封闭缓冲液(1×PBS+2％脱脂牛奶)稀释的噬菌体上清，最后用anti-M13HRP(GE,27-9421-01)检测；阻断活性：与结合活性类似，只是在孵育噬菌体上清的时候，加入50ng/μl终浓度的LDLR-Fc(SEQ ID NO：8)。将经结合活性测试得到的ELISA OD45值除以经阻断活性测试得到的ELISA OD45值，筛选得到值大于2.0的克隆，包括鼠源克隆mAb-011进行测序，以及进一步的筛选。
实施例5、嵌合抗体表达和鉴定
将筛选得到的克隆(包括mAb-011)构建到IgG1/κ嵌合抗体表达载体中，进行哺乳动物细胞瞬转表达。ProteinA亲和纯化后，针对PCSK9(野生型PCSK9，SEQ ID NO:5)和PCSK9-Y(突变型PCSK9，SEQ ID NO:6)进行结合活性(测试例1和测试例2)测试，计算其EC50；并针对野生型PCSK9和PCSK9-Y进行阻断活性(测试例3和测试例4)测试，计算其IC50。结合活性采用链霉亲和素包被平板，孵育生物素化PCSK9(或PCSK9-Y)，再孵育梯度稀释的嵌合抗体。阻断活性测试采用LDLR-Fc包被平板，封闭平板后，同时孵育梯度稀释的嵌合抗体和生物素化PCSK9(或者生物素化PCSK9-Y)，再孵育链霉亲和素HRP进行检测。筛选得到活性较好(见表2)的嵌合抗体ch-011，作为重点分子，进行后续的人源化。
表2嵌合抗体结合及阻断活性：
Figure GDA0002722015820000321
本发明筛选得到的PCSK9嵌合抗体ch-011与PCSK9/PCSK9-Y蛋白的结合测定结果显示：ch-011抗体对PCSK9/PCSK9-Y有较高的结合活性，ch-011抗体对PCSK9的结合活性更高。
本发明筛选得到的PCSK9嵌合抗体ch-011对LDLR和PCSK9/PCSK9-Y结合的阻断能力测定，结果显示ch-011抗体能有效阻断PCSK9/PCSK9-Y与LDLR之间的结合，ch-011抗体对野生型PCSK9的阻断活性更显著。
实施例6、mAb-011人源化及鉴定
根据嵌合抗体实验结果，我们选择鼠源克隆mAb-011进行人源化。人源化策略采用CDR移植策略，比对人源重轻链可变区种系基因数据库，选择与鼠源mAb-011序列同源最高的种系基因作为模板。鼠源抗体mAb-011的人源化轻链模板为IGKV1-39*01和hjk4.1，人源化重链模板为IGHV1-2*02和hjh6.1，人源化可变区序列如下：
>h011-1 VH(CDR graft)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYTIHWVRQAPGQGLEWMGYINPSSTYTKFNQKFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARERIYSNYWFFDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO：10
>h011-1 VL(CDR graft)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVYTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSYPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：11
CDR移植后，选择不同的回复突变进行组合(表3)。设计好的人源化序列进行全基因合成，重轻链相互组合进行哺乳动物表达(表4)。蛋白纯化后，进行与嵌合抗体相同的阻断活性鉴定(方法见测试例3和4，结果见表5)。随后挑选部分克隆蛋白采用表面等离子体共振(SPR)方法(Biacore X100，GE，方法见测试例5)测定解离常数：待测样品通过CM5芯片(GE)上的Amine-Coupling Anti-Fc pAb(GE)捕获，PCSK9(SEQ ID NO：1)或PCSK9-Y(SEQ IDNO：4)为流动相，工作缓冲液为1X HBS-EP+,pH 7.4，再生缓冲液为3M MgCl2，所得结果如表6。
表3、mAb-011的模板选择和回复突变设计
Figure GDA0002722015820000331
表4、重轻链相互组合表
h011_VL.1 h011_VL.1A h011_VL.1B
h011_VH.1 h011-1 h011-2 h011-3
h011_VH.1A h011-4 h011-5 h0117-6
h011_VH.1B h011-7 h011-8 h011-9
h011_VH.1C h011-10 h011-11 h011-12
h011_VH.1D h011-13 h011-14 h011-15
h011_VH.1E h011-16 h011-17 h011-18
h011_VH.1F h011-19 h011-20 h011-21
注：该表表示各种突变组合所得的序列。如h011-5表示，在人源化的抗体h011-5上的有重链h011_VH.1A、轻链h011_VL.1A两种突变。其它类推。
进行结合PCSK9或PCSK9-Y的ELISA方法检测(方法见测试例1和2)。并将结合ELISA检测的阳性孔细胞进行PCSK9或PCSK9-Y和LDLR结合的阻断ELISA检测(方法见测试例3和4)，最终确定轻重链组合为h011-VH.1和h011-VL.1B。人源化的h011-3轻重链可变区序列如下：
>h011-3 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYTIHWVRQAPGQGLEWMGYINPSSTYTKFNQKFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARERIYSNYWFFDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：12
>h011-3 VL
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVYTAVAWYQQKPGKSPKLLIYSASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYSSYPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：13
表5嵌合抗体和人源化抗体对PCSK9或PCSK9-Y和LDLR-FC结合的阻断活性
Figure GDA0002722015820000341
本发明筛选得到的PCSK9嵌合抗体、人源化抗体与野生型/突变型PCSK9蛋白的结合测定结果显示：h011-3和ch-011抗体对野生型/突变型PCSK9有较高的结合活性，h011-3和ch-011抗体对野生型PCSK9的结合活性更高。
表6：人源化后部分样品解离常数
Figure GDA0002722015820000342
注：ch011:mAb-011嵌合抗体
本发明筛选得到的PCSK9嵌合抗体、人源化抗体对野生型/突变型PCSK9的Biacore检测结果显示：h011-3和ch-011具有较低的平衡解离常数，具有较高的亲和力，h011-3和ch-011对野生型PCSK9的亲和力更高。
实施例7、h011-3亲和力成熟
鼠源mAb-011及其人源化后抗体h011-3对PCSK9-Y的亲和力比较低，我们决定以h011-3进行针对PCSK9-Y的亲和力成熟。亲和力成熟采用M13噬菌体展示技术。采用codon-based引物(在引物合成过程中，单个密码子都由野生型密码子和NNK组成)在每个CDR引入突变，每个CDR都构建一个单独的噬菌体展示文库。根据CDR的长短，调整每个CDR需要掺入的NNK比例和需要文库的库容大小(表7)。
表7文库库容及NNK掺入比例设计表
Lib CDR length NNK ratio Lib size
H1 5 50％ >2E7
H2 17 20％ >1E8
H3 12 30％ >1E8
L1 11 30％ >1E8
L2 7 50％ >2E7
L3 9 40％ >1E8
构建好的6个文库经包装成噬菌体后，进行淘筛：在液相与生物素化PCSK9-Y(SEQID NO：6)结合，链霉亲和素捕获，淘洗，洗脱，重新侵染大肠杆菌，进行下一个循环的淘筛。每一轮淘筛将生物素化PCSK9-Y浓度降低10倍。3-4轮淘筛之后，每个文库挑取单克隆进行测序验证。根据CDR区氨基酸残基富集程度，挑选部分克隆，构建全长Ig进行哺乳动物细胞表达；同时人工组合不同CDR的富集突变，也构建成全长Ig进行哺乳动物细胞表达(如表8-11所示)。
克隆蛋白经纯化后，进行结合pCSK9的ELISA方法检测(测试例1)，和结合pCSK9-Y的ELISA方法检测(测试例2)；并将结合ELISA检测的阳性孔细胞进行pCSK9-Y/LDLR结合的阻断ELISA检测(见测试例3)，和进行pCSK9/LDLR结合的阻断ELISA检测(见测试例4)。结果见表12-15。
结果显示，本发明得到的PCSK9抗体与PCSK9和PCSK9-Y有较高的结合活性；并且能有效阻断PCSK9/PCSK9-Y与LDLR之间的结合。
表8富集克隆及人工组合克隆的CDR序列
Figure GDA0002722015820000351
Figure GDA0002722015820000361
Figure GDA0002722015820000371
以上表8人工组合克隆的CDR序列可用表9进行定义总结：
表9本发明抗体CDR序列
克隆号 HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
h011-3 GYX<sup>1</sup>IH X<sup>2</sup>IX<sup>3</sup>PSX<sup>4</sup>TYTKFNQKFKD AREX<sup>5</sup>IX<sup>6</sup>X<sup>7</sup>NYWFFDX<sup>8</sup> KASQNVYX<sub>1</sub>X<sub>2</sub>VX<sub>3</sub> X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>X<sub>6</sub>NRYT QQX<sub>7</sub>SX<sub>8</sub>X<sub>9</sub>PX<sub>10</sub>T
SEQ ID NO 43 44 45 46 47 48
X1选自T、D或E；
X2选自Y或E；X3选自N、L、I或V；X4选自S、G或A；
X5选自R或N；X6选自Y或F；X7选自S或F；X8选自V或R；
X1选自T或W；X2选自A或E；X3选自A、D或V；
X4选自S、E或Q；X5选自A或M；X6选自S或V；
X7选自Y、F或L；X8选自S或W；X9选自Y、F、Q或S；X10选自Y、D或E。
挑选得到的人工组合的单克隆抗体的轻重链可变区序列如下表10所示：
表10单克隆抗体可变区序列组合
Figure GDA0002722015820000372
Figure GDA0002722015820000381
具体轻、重链可变区序列见表11：
Figure GDA0002722015820000382
Figure GDA0002722015820000391
实施例8、构建和表达抗人PCSK9人源化抗体IgG1及IgG1-YTE形式
设计引物PCR搭建各人源化抗体VH/VK基因片段，再与表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-FC/CL)片段)进行同源重组，构建抗体全长表达载体VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr。IgG1-YTE抗体形式可以通过IgG1抗体形式简单点突变获得。设计构建几种抗体形式，①h011-3133-WT：h011-3133-IgG1形式，即人源化序列组合h011-3133，结合来自人IgG1的重链恒定区，与来自人kappa链的轻链恒定区；②h011-3133-YTE：h011-3133-IgG1-YTE形式，即人源化序列组合h011-3133，结合突变的人IgG1(YTE突变)的重链恒定区，与来自人kappa链的轻链恒定区。突变的人IgG1也可以是别种形式的突变。
突变的抗体用BIAcore检测其亲和力(测试例6)，结果见表16。
h011-3133-IgG1
重链氨基酸序列：IgG1
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYEIHWVRQAPGQGLEWMGYINPSATYTKFNQKFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARERIYSNYWFFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：71
重链DNA序列：
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTCGCGATTCTTAAGGGTGTCCAGTGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCATCTGTGAAGGTGTCTTGTAAGGCCTCTGGCTATACCTTTACCGGCTACGAGATCCACTGGGTGCGGCAGGCACCCGGGCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTACATCAACCCCTCTGCTACCTACACCAAGTTTAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTGACCATGACCCGGGACACCTCTATCTCTACCGCCTACATGGAGCTGTCTCGGCTGCGGTCTGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCACGCGAACGGATCTACTCTAACTACTGGTTCTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCTTCTGCTTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO：72
h011-3133-kappa
轻链氨基酸序列：kappa轻链
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVYTAVAWYQQKPGKSPKLLIYSASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYSSYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：73
轻链DNA序列：
ATGGACATGCGCGTGCCCGCCCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCGCGATGCGACATCGTGATGACCCAGTCTCCCTCATCTCTGAGTGCCTCTGTTGGCGACCGGGTGACCATCACCTGCAAAGCCTCTCAGAACGTATACACAGCCGTGGCCTGGTATCAACAGAAGCCCGGCAAGTCCCCCAAGCTGCTGATTTACTCTGCCTCTAACCGGTACACCGGCGTGCCCTCTCGGTTCTCTGGCTCTGGTTCTGGCACCGACTTCACCCTGACTATCTCTTCTCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGTACTCTTCTTACCCCTACACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
SEQ ID NO：74
h011-3133-IgG1-YTE(轻链为h011-3133-kappa SEQ ID NO：73)
重链氨基酸序列：IgG1-YTE
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYEIHWVRQAPGQGLEWMGYINPSATYTKFNQKFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARERIYSNYWFFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：75
重链DNA序列：
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTCGCGATTCTTAAGGGTGTCCAGTGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCATCTGTGAAGGTGTCTTGTAAGGCCTCTGGCTATACCTTTACCGGCTACGAGATCCACTGGGTGCGGCAGGCACCCGGGCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTACATCAACCCCTCTGCTACCTACACCAAGTTTAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTGACCATGACCCGGGACACCTCTATCTCTACCGCCTACATGGAGCTGTCTCGGCTGCGGTCTGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCACGCGAACGGATCTACTCTAACTACTGGTTCTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCTTCTGCTTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCTACATCACCCGGGAGCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO：76
测试例1、PCSK9抗体结合PCSK9的ELISA实验
本发明PCSK9抗体与PCSK9(野生型PCSK9，SEQ ID NO:5)的结合力测试，通过抗体与固定在ELISA板上PCSK9的结合的量来检测。
用PBS稀释链霉亲和素(sigma，CAT#S4762)至2μg/ml，包被在96孔ELISA板上，4℃放置过夜。洗板后，用Tris缓冲液(含0.9mM氯化钙、0.05％Tween20和5％脱脂奶粉)在37℃封闭2小时。再洗板，加入内部生产的生物素标记的PCSK9(用含0.9mM氯化钙、0.05％Tween20和1％脱脂奶粉的Tris缓冲液稀释)100μl/孔，37℃孵育1小时。洗板，加入不同浓度稀释的PCSK9抗体样品，在37℃孵育1小时。再洗板，加入辣根过氧化物酶-羊抗人(H+L)抗体(jackson，CAT#109-035-088)，37℃孵育1小时。再洗板，加入四甲基联苯胺溶液显色。最后加入终止液，在酶标仪上测量OD450，并计算其EC50值。
本发明人源化抗体、亲和力成熟后抗体与PCSK9的结合力ELISA实验，结果见表12。
表12本发明PCSK9抗体与PCSK9的结合活性测试
Figure GDA0002722015820000431
Figure GDA0002722015820000441
结果显示，本发明PCSK9抗体与PCSK9有较高的结合活性。
测试例2、PCSK9抗体结合PCSK9-Y的ELISA实验
本发明PCSK9抗体与PCSK9-Y(突变型PCSK9，SEQ ID NO:6)的结合力测试，通过抗体与固定在ELISA板上PCSK9-Y的结合的量来检测。
用PBS稀释链霉亲和素(sigma，CAT#S4762)至2μg/ml，包被在96孔ELISA板上，4℃放置过夜。洗板，在37℃用Tris缓冲液(含0.9mM氯化钙、0.05％Tween20和5％脱脂奶粉)封闭2小时。洗板，加入内部生产的生物素标记的PCSK9-Y(用含0.9mM氯化钙、0.05％Tween 20和1％脱脂奶粉的Tris缓冲液稀释)100μl/孔，37℃孵育1小时。洗板，加入不同浓度稀释的PCSK9抗体样品，37℃孵育1小时。再洗板，加入辣根过氧化物酶-羊抗人(H+L)抗体(jackson，CAT#109-035-088)，37℃孵育1小时。再洗板，加入四甲基联苯胺溶液显色。最后加入终止液，在酶标仪上测量OD450，并计算其EC50值。
本发明人源化抗体、亲和力成熟后抗体与PCSK9-Y的结合力ELISA实验，结果见表13。
表13本发明PCSK9抗体与PCSK9-Y的结合活性测试
Figure GDA0002722015820000442
Figure GDA0002722015820000451
结果显示，本发明PCSK9抗体与PCSK9-Y有较高的结合活性。
测试例3、PCSK9抗体对LDLR-FC/PCSK9-Y结合的阻断
本发明PCSK9抗体对LDLR-FC和PCSK9-Y(突变型PCSK9，SEQ ID NO:6)结合的阻断能力测试，通过检测在抗体存在的条件下，PCSK9-Y与LDLR结合的量来确定。
用磷酸缓冲液稀释LDLR-FC(内部生产的，序列为SEQ ID NO:8)至2μg/ml，包被在96孔ELISA板上，4℃放置过夜。洗板，在37℃用Tris缓冲液(含0.9mM氯化钙、0.05％Tween20和5％脱脂奶粉)封闭2小时。洗板，加入生物素标记的突变型PCSK9(用含0.9mM氯化钙、0.05％Tween 20和1％脱脂奶粉的Tris缓冲液稀释至终浓度1μg/ml)和抗体样品(用含0.9mM氯化钙、0.05％Tween 20和1％脱脂奶粉的Tris缓冲液稀释)的混合液100μl/孔，37℃孵育1小时。洗板，加入辣根过氧化物酶-链霉亲和素(sigma，CAT#S2438)，37℃孵育1小时。再洗板，加入四甲基联苯胺溶液显色。最后加入终止液，在酶标仪上测量OD450，并计算其IC50值。
本发明人源化抗体、亲和力成熟后抗体对LDLR-FC/PCSK9-Y结合的阻断效果测试，结果见表14。
表14.本发明PCSK9抗体阻断PCSK9-Y与LDLR之间结合的效果测试
Figure GDA0002722015820000452
Figure GDA0002722015820000461
结果显示，本发明PCSK9抗体能有效阻断PCSK9-Y与LDLR之间的结合。
用上面所述方法，测试本发明PCSK9抗体对其它形式的LDLR-FC(内部生产的，序列见SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9)和PCSK9(SEQ ID NO:5)结合的阻断能力，实验证明本发明PCSK9抗体能有效阻断PCSK9与缩短形式的LDLR之间的结合。
测试例4、PCSK9抗体对LDLR-FC/PCSK9结合的阻断
本发明PCSK9抗体对LDLR-FC(内部生产的，序列为SEQ ID NO:8)和PCSK9(SEQ IDNO:5)结合的阻断能力测试，通过检测在抗体存在的条件下，PCSK9与LDLR结合的量来确定。
用磷酸缓冲液稀释LDLR-FC至5μg/ml，包被在96孔ELISA板上，4℃放置过夜。洗板后，在37℃用Tris缓冲液(含0.9mM氯化钙、0.05％Tween 20和5％脱脂奶粉)封闭2小时。洗板，加入生物素标记的PCSK9(用含0.9mM氯化钙、0.05％Tween 20和1％脱脂奶粉的Tris缓冲液稀释至终浓度2μg/ml)和抗体样品(用含0.9mM氯化钙、0.05％Tween 20和1％脱脂奶粉的Tris缓冲液稀释)的混合液100μl/孔，37℃孵育1小时。洗板，加入辣根过氧化物酶-链霉亲和素(sigma，CAT#S2438)，37℃孵育1小时。再洗板，加入四甲基联苯胺溶液显色。最后加入终止液，在酶标仪上测量OD450，并计算其IC50值。
本发明人源化抗体、亲和力成熟后抗体对LDLR-FC/PCSK9结合的阻断效果测试，结果见表15。
表15.本发明PCSK9抗体阻断PCSK9与LDLR之间结合的效果测试
克隆号 IC50(μg/ml)
h011-3050 0.598
h011-3058 0.542
h011-3065 0.730
h011-3070 0.629
h011-3073 0.604
h011-3093 0.706
h011-3095 0.582
h011-3111 1.224
h011-3118 1.042
h011-3120 0.911
h011-3121 0.662
h011-3133 0.495
h011-3147 0.567
h011-3174 1.671
h011-3181 0.857
h011-3187 0.666
h011-3190 0.837
h011-3191 0.740
h011-3192 0.698
h011-3193 0.621
h011-3194 0.628
h011-3195 2.252
h011-3 0.681
结果显示，本发明PCSK9抗体能有效阻断PCSK9与LDLR之间的结合。
用上面所述方法，测试本发明PCSK9抗体对其它形式的LDLR-FC(内部生产的，序列见SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9)和PCSK9(SEQ ID NO:5)结合的阻断能力，实验证明本发明PCSK9抗体能有效阻断PCSK9与缩短形式的LDLR之间的结合。
测试例5、PCSK9抗体对LDL uptake实验
HepG2细胞(中科院细胞库，#CAT，TCHu72)培养在DMEM培养基(Hyclone，#CATSH30243.01B)中(含10％胎牛血清，Gibco，#CAT 10099-141)。当细胞覆盖80-90％时，消化吹散后计数1.5*104cells/孔铺于96孔板。24小时后，更换培养基为DMEM，10％无脂蛋白血清(Millipore，CAT#LP4)。48小时后，用磷酸缓冲液洗2次，加入在4℃预孵育1小时的含PCSK9(SEQ ID NO:1，终浓度10μg/ml)和抗体样品(用培养基稀释至不同浓度)的混合物，以及终浓度10μg/ml的
Figure GDA0002722015820000481
(Invitrogen，CAT#L3483)，37℃孵育。6小时后，用磷酸缓冲液洗板2次。用酶标仪读取荧光值(EX485nm/EM535nm)，然后加入50μl/孔
Figure GDA0002722015820000482
细胞活性发光检测试剂(Promega,G7571)，读取化学发光值。LDL uptake结果如图1，图2所示，数据结果显示本发明PCSK9抗体能够促进HepG2细胞摄取LDL。
测试例6、BIAcore检测PCSK9抗体亲和力实验
按照人Fab捕获试剂盒(Cat.#28-9583-25，GE)说明书中所述的方法，将人Fab捕获分子共价偶联于CM5生物传感芯片(Cat.#BR-1000-12，GE)上，从而亲和捕获待测本发明PCSK9抗体，然后于芯片表面流经人PCSK9抗原(带His标签的PCSK9：PCSK9-His6，SEQ IDNO：1)，利用Biacore仪器实时检测反应信号，从而获得结合和解离曲线，通过拟合得到亲和力数值，见下表16。在实验中每个循环解离完成后，用人Fab捕获试剂盒(GE)里配置的再生溶液将生物芯片洗净再生。
表16抗PCSK9单克隆抗体的亲和力活性
Figure GDA0002722015820000483
本发明PCSK抗体与人PCSK9抗原有强亲和力。
用上面相似的方法，检测本发明PCSK9抗体与PCSK9-Y(SEQ ID NO：4)的亲和力，显示本发明PCSK9抗体与PCSK9-Y抗原有较强亲和力。
测试例7、PCSK9抗体体内降低LDL-c的药效实验
本实验构建过表达人PCSK9的小鼠模型,进行尾静脉注射PCSK9抗体，来评价本发明PCSK9抗体在过表达人PCSK9的小鼠体内降低LDL-c的作用。人IgG(从混合的正常人血清中，利用传统的亲和层析方法如ProteinA纯化获得的人免疫球蛋白)作为空白对照。
C57Bl/6小鼠(购自上海西普尔·必凯实验动物有限责任公司)实验室环境适应5天，通过尾静脉注射AAV-PCSK9病毒(北京本元正阳基因技术有限公司)，注射4×1011v.g.。注射病毒后第10天禁食过夜，眼眶取血，用HDL and LDL/VLDL CholesterolQuantification Kit(购自BioVision公司，货号#K613-100)检测LDL-c，根据LDL-c浓度随机分组，每组6只小鼠(n＝6)，进行尾静脉注射给药，内部生产的人IgG、PCSK9抗体给药剂量为10mg/kg(人IgG、PCSK9抗体用PBS配制，浓度为1mg/ml)。取血前禁食过夜，给药后第24、48、72小时眼眶取血，37℃放置1小时，3500rpm离心10分钟，取血清保存在-80℃。
最后一次取血清后，把冻存的血清在同一天检测。用HDL and LDL/VLDLCholesterol Quantification Kit检测血清中LDL-c浓度，按照试剂盒说明书操作。
结果讨论：
1、PCSK9抗体h011-3133组体内降低LDL-c的药效实验
注射AAV8-PCSK9病毒后第10天，血清中LDL-c浓度为平均53mg/dl。分组后给药，给药24小时后，与IgG组相比，PCSK9抗体h011-3133-WT、h011-3133-YTE、h011-3191、h011-3065组LDL-c浓度分别下降62％、40％、56％、56％，各给药组在10mg/kg剂量下均能够显著降低血清中LDL-c浓度。各给药组之间LDL-c浓度没有显著性差别。给药48小时后，与IgG组相比，h011-3133-WT组LDL-c浓度下降18％，与IgG组相比没有显著差别，其他各组与IgG组相当。给药72小时后，各给药组LDL-c浓度与IgG组相当。结果如图3、表17和图5所示。图3表示各样品给药后不同时间点血清中LDL-c的绝对值，图5则表示以IgG的值为对照作为100％，给药组的血清中LDL-c相比IgG同一时间点的百分含量。
图4中，正常小鼠血清LDL-c浓度约为6mg/dl。注射AAV8-PCSK9病毒后第34天，血清中LDL-c浓度为平均33mg/dl。分组后马上给药，给药24小时后，与IgG组相比，h011-3058、h011-3191、h011-3147组LDL-c浓度分别下降49％、40％、29％，h011-3058、h011-3191、h011-3147在10mg/kg剂量下能够显著降低血清中LDL-c浓度，各给药组之间LDL-c浓度没有显著性差别。给药48小时后，与IgG组相比，h011-3058、h011-3191、h011-3147组LDL-c浓度分别下降12％、11％、9％，与IgG组相比没有显著差别。给药72小时后，各给药组LDL-c浓度与IgG组相当。结果如图4、表18和图6所示。图4表示各样品给药后不同时间点血清中LDL-c的绝对值，图6则表示以IgG的值为对照作为100％，给药组的血清中LDL-c相比IgG同一时间点的百分含量。
综上，本次实验中，h011-3133-WT、h011-3133-YTE、h011-3191、h011-3065、h011-3058和h011-3147均能够降低过表达人PCSK9的小鼠血清中LDL-c浓度。
表17.各组小鼠血清中LDL-c浓度变化
Figure GDA0002722015820000491
Figure GDA0002722015820000501
表18.各组小鼠血清中LDL-c浓度变化
Figure GDA0002722015820000502
实施例8、竞争性实验
在竞争性ELISA实验中，我们将一种抗体包板过夜，之后同时加入生物素化的PCSK9-his和50倍于包板浓度的竞争抗体，包板抗体和溶液中的抗体将竞争性结合抗原，之后检测板上抗原的信号。结果显示，h011-3133-YTE和21B12(US8030457B2)自身能够竞争性结合抗原外，h011-3133-YTE和21B12之间无明显竞争结合，提示两者抗原表位的不同。
IR(％) h011-3133-YTE 21B12
h011-3133-YTE 96.17 -0.28
21B12 3.01 97.78
虽然为了清楚的理解，已经借助于附图和实例详细描述了上述发明，但是描述和实例不应当解释为限制本发明的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用完整地清楚结合。
序列表
<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司、上海恒瑞医药有限公司
<120> PCSK9抗体、其抗原结合片段及其医药用途
<130> 760087CPCT
<160> 76
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 698
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带His标签的pCSK9：pCSK9-His6，用于免疫原免疫小鼠或检测试剂
<400> 1
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50 55 60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100 105 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115 120 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130 135 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180 185 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195 200 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210 215 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245 250 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260 265 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275 280 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305 310 315 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325 330 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340 345 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355 360 365
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370 375 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385 390 395 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405 410 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420 425 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435 440 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450 455 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465 470 475 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485 490 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500 505 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515 520 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530 535 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545 550 555 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565 570 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580 585 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595 600 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610 615 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625 630 635 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645 650 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
660 665 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675 680 685
Gln Glu Leu Gln His His His His His His
690 695
<210> 2
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带PADRE肽和His标签的pCSK9：pCSK9-PADRE-His6，作为免疫原，所含PADR
E肽可以促进免疫
<400> 2
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50 55 60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100 105 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115 120 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130 135 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180 185 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195 200 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210 215 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245 250 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260 265 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275 280 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305 310 315 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325 330 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340 345 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355 360 365
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370 375 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385 390 395 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405 410 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420 425 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435 440 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450 455 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465 470 475 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485 490 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500 505 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515 520 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530 535 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545 550 555 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565 570 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580 585 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595 600 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610 615 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625 630 635 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645 650 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
660 665 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675 680 685
Gln Glu Leu Gln Gly Ser Gly Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu
690 695 700
Lys Ala Ala Ala His His His His His His
705 710
<210> 3
<211> 704
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带TEV酶切位点的
pCSK9与his标签融合蛋白：pCSK9-TEV-His6，可通过TEV酶切获得N-pCSK9（
N端pCSK9结构域），作为免疫原
<400> 3
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50 55 60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100 105 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115 120 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130 135 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180 185 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195 200 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210 215 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245 250 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260 265 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275 280 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305 310 315 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325 330 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340 345 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355 360 365
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370 375 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385 390 395 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405 410 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420 425 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435 440 445
His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg
450 455 460
Thr Val Trp Ser Ala His Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val
465 470 475 480
Ala Arg Cys Ala Pro Asp Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser
485 490 495
Arg Ser Gly Lys Arg Arg Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys
500 505 510
Leu Val Cys Arg Ala His Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala
515 520 525
Ile Ala Arg Cys Cys Leu Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr
530 535 540
Ala Pro Pro Ala Glu Ala Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln
545 550 555 560
Gln Gly His Val Leu Thr Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp
565 570 575
Leu Gly Thr His Lys Pro Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn
580 585 590
Gln Cys Val Gly His Arg Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His
595 600 605
Ala Pro Gly Leu Glu Cys Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro
610 615 620
Gln Glu Gln Val Thr Val Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly
625 630 635 640
Cys Ser Ala Leu Pro Gly Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val
645 650 655
Asp Asn Thr Cys Val Val Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser
660 665 670
Thr Ser Glu Gly Ala Val Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg
675 680 685
His Leu Ala Gln Ala Ser Gln Glu Leu Gln His His His His His His
690 695 700
<210> 4
<211> 698
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pCSK9-D374Y突变蛋白，带his标签：pCSK9-D374Y-His6，作为检测试剂
<400> 4
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50 55 60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100 105 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115 120 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130 135 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180 185 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195 200 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210 215 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245 250 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260 265 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275 280 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305 310 315 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325 330 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340 345 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355 360 365
Ile Gly Ala Ser Ser Tyr Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370 375 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385 390 395 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405 410 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420 425 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435 440 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450 455 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465 470 475 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485 490 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500 505 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515 520 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530 535 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545 550 555 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565 570 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580 585 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595 600 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610 615 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625 630 635 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645 650 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
660 665 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675 680 685
Gln Glu Leu Gln His His His His His His
690 695
<210> 5
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 插入生物素接受肽及his标签的pCSK9蛋白：pCSK9-BP15-His6，作为检测试
剂，BP15肽位置在表达过程中能够进行生物素标记，免除体外生物素标记及
可能导致的构建变化
<400> 5
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50 55 60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100 105 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115 120 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130 135 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180 185 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195 200 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210 215 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245 250 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260 265 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275 280 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305 310 315 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325 330 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340 345 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355 360 365
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370 375 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385 390 395 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405 410 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420 425 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435 440 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450 455 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465 470 475 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485 490 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500 505 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515 520 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530 535 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545 550 555 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565 570 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580 585 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595 600 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610 615 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625 630 635 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645 650 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
660 665 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675 680 685
Gln Glu Leu Gln Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe
690 695 700
Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His His His His His His
705 710 715
<210> 6
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 插入生物素接受肽及his标签的pCSK9
D374Y突变体蛋白：pCSK9-D374Y-BP15-His6，检测蛋白
<400> 6
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50 55 60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100 105 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115 120 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130 135 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180 185 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195 200 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210 215 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245 250 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260 265 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275 280 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305 310 315 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325 330 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340 345 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355 360 365
Ile Gly Ala Ser Ser Tyr Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370 375 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385 390 395 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405 410 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420 425 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435 440 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450 455 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465 470 475 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485 490 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500 505 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515 520 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530 535 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545 550 555 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565 570 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580 585 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595 600 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610 615 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625 630 635 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645 650 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
660 665 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675 680 685
Gln Glu Leu Gln Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe
690 695 700
Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His His His His His His
705 710 715
<210> 7
<211> 802
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带Flag标签和His标签的pCSK9受体蛋白LDLR胞外域片段：LDLR-ECD-Flag-H
is6，检测试剂
<400> 7
Met Gly Pro Trp Gly Trp Lys Leu Arg Trp Thr Val Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Asp Arg Cys Glu Arg Asn Glu Phe
20 25 30
Gln Cys Gln Asp Gly Lys Cys Ile Ser Tyr Lys Trp Val Cys Asp Gly
35 40 45
Ser Ala Glu Cys Gln Asp Gly Ser Asp Glu Ser Gln Glu Thr Cys Leu
50 55 60
Ser Val Thr Cys Lys Ser Gly Asp Phe Ser Cys Gly Gly Arg Val Asn
65 70 75 80
Arg Cys Ile Pro Gln Phe Trp Arg Cys Asp Gly Gln Val Asp Cys Asp
85 90 95
Asn Gly Ser Asp Glu Gln Gly Cys Pro Pro Lys Thr Cys Ser Gln Asp
100 105 110
Glu Phe Arg Cys His Asp Gly Lys Cys Ile Ser Arg Gln Phe Val Cys
115 120 125
Asp Ser Asp Arg Asp Cys Leu Asp Gly Ser Asp Glu Ala Ser Cys Pro
130 135 140
Val Leu Thr Cys Gly Pro Ala Ser Phe Gln Cys Asn Ser Ser Thr Cys
145 150 155 160
Ile Pro Gln Leu Trp Ala Cys Asp Asn Asp Pro Asp Cys Glu Asp Gly
165 170 175
Ser Asp Glu Trp Pro Gln Arg Cys Arg Gly Leu Tyr Val Phe Gln Gly
180 185 190
Asp Ser Ser Pro Cys Ser Ala Phe Glu Phe His Cys Leu Ser Gly Glu
195 200 205
Cys Ile His Ser Ser Trp Arg Cys Asp Gly Gly Pro Asp Cys Lys Asp
210 215 220
Lys Ser Asp Glu Glu Asn Cys Ala Val Ala Thr Cys Arg Pro Asp Glu
225 230 235 240
Phe Gln Cys Ser Asp Gly Asn Cys Ile His Gly Ser Arg Gln Cys Asp
245 250 255
Arg Glu Tyr Asp Cys Lys Asp Met Ser Asp Glu Val Gly Cys Val Asn
260 265 270
Val Thr Leu Cys Glu Gly Pro Asn Lys Phe Lys Cys His Ser Gly Glu
275 280 285
Cys Ile Thr Leu Asp Lys Val Cys Asn Met Ala Arg Asp Cys Arg Asp
290 295 300
Trp Ser Asp Glu Pro Ile Lys Glu Cys Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp
305 310 315 320
Asn Asn Gly Gly Cys Ser His Val Cys Asn Asp Leu Lys Ile Gly Tyr
325 330 335
Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys
340 345 350
Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Asp Pro Asp Thr Cys Ser Gln Leu Cys
355 360 365
Val Asn Leu Glu Gly Gly Tyr Lys Cys Gln Cys Glu Glu Gly Phe Gln
370 375 380
Leu Asp Pro His Thr Lys Ala Cys Lys Ala Val Gly Ser Ile Ala Tyr
385 390 395 400
Leu Phe Phe Thr Asn Arg His Glu Val Arg Lys Met Thr Leu Asp Arg
405 410 415
Ser Glu Tyr Thr Ser Leu Ile Pro Asn Leu Arg Asn Val Val Ala Leu
420 425 430
Asp Thr Glu Val Ala Ser Asn Arg Ile Tyr Trp Ser Asp Leu Ser Gln
435 440 445
Arg Met Ile Cys Ser Thr Gln Leu Asp Arg Ala His Gly Val Ser Ser
450 455 460
Tyr Asp Thr Val Ile Ser Arg Asp Ile Gln Ala Pro Asp Gly Leu Ala
465 470 475 480
Val Asp Trp Ile His Ser Asn Ile Tyr Trp Thr Asp Ser Val Leu Gly
485 490 495
Thr Val Ser Val Ala Asp Thr Lys Gly Val Lys Arg Lys Thr Leu Phe
500 505 510
Arg Glu Asn Gly Ser Lys Pro Arg Ala Ile Val Val Asp Pro Val His
515 520 525
Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Thr Pro Ala Lys Ile Lys Lys
530 535 540
Gly Gly Leu Asn Gly Val Asp Ile Tyr Ser Leu Val Thr Glu Asn Ile
545 550 555 560
Gln Trp Pro Asn Gly Ile Thr Leu Asp Leu Leu Ser Gly Arg Leu Tyr
565 570 575
Trp Val Asp Ser Lys Leu His Ser Ile Ser Ser Ile Asp Val Asn Gly
580 585 590
Gly Asn Arg Lys Thr Ile Leu Glu Asp Glu Lys Arg Leu Ala His Pro
595 600 605
Phe Ser Leu Ala Val Phe Glu Asp Lys Val Phe Trp Thr Asp Ile Ile
610 615 620
Asn Glu Ala Ile Phe Ser Ala Asn Arg Leu Thr Gly Ser Asp Val Asn
625 630 635 640
Leu Leu Ala Glu Asn Leu Leu Ser Pro Glu Asp Met Val Leu Phe His
645 650 655
Asn Leu Thr Gln Pro Arg Gly Val Asn Trp Cys Glu Arg Thr Thr Leu
660 665 670
Ser Asn Gly Gly Cys Gln Tyr Leu Cys Leu Pro Ala Pro Gln Ile Asn
675 680 685
Pro His Ser Pro Lys Phe Thr Cys Ala Cys Pro Asp Gly Met Leu Leu
690 695 700
Ala Arg Asp Met Arg Ser Cys Leu Thr Glu Ala Glu Ala Ala Val Ala
705 710 715 720
Thr Gln Glu Thr Ser Thr Val Arg Leu Lys Val Ser Ser Thr Ala Val
725 730 735
Arg Thr Gln His Thr Thr Thr Arg Pro Val Pro Asp Thr Ser Arg Leu
740 745 750
Pro Gly Ala Thr Pro Gly Leu Thr Thr Val Glu Ile Val Thr Met Ser
755 760 765
His Gln Ala Leu Gly Asp Val Ala Gly Arg Gly Asn Glu Lys Lys Pro
770 775 780
Ser Ser Val Arg Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys His His His His
785 790 795 800
His His
<210> 8
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缩短形式的LDLR胞外域片段与hIgG1-Fc融合蛋白（具有与pCSK9结合活性）
：LDLR-sECD -Fc（hIgG1）作为检测试剂
<400> 8
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Asn Gly Gly Cys Ser
20 25 30
His Val Cys Asn Asp Leu Lys Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp
35 40 45
Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys
50 55 60
Gln Asp Pro Asp Thr Cys Ser Gln Leu Cys Val Asn Leu Glu Gly Gly
65 70 75 80
Tyr Lys Cys Gln Cys Glu Glu Gly Phe Gln Leu Asp Pro His Thr Lys
85 90 95
Ala Cys Lys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
100 105 110
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
115 120 125
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
130 135 140
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
145 150 155 160
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
165 170 175
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
180 185 190
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
195 200 205
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
210 215 220
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
225 230 235 240
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
245 250 255
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
260 265 270
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
275 280 285
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
290 295 300
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
305 310 315 320
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 9
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 更加缩短形式的LDLR胞外域片段与hIgG1-Fc融合蛋白（具有与pCSK9结合活
性）：LDLR-ssECD -Fc（hIgG1）作为检测试剂
<400> 9
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Asn Gly Gly Cys Ser
20 25 30
His Val Cys Asn Asp Leu Lys Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp
35 40 45
Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu Asp Ile Asp Glu Pro
50 55 60
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
65 70 75 80
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
85 90 95
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
100 105 110
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
115 120 125
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
130 135 140
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
145 150 155 160
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
165 170 175
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
180 185 190
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
195 200 205
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
210 215 220
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
225 230 235 240
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
245 250 255
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
260 265 270
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
275 280 285
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
290
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h011-1 VH
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Thr Tyr Thr Lys Phe Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Ile Tyr Ser Asn Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h011-1 VL
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Tyr Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h011-3 VH
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Thr Tyr Thr Lys Phe Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Ile Tyr Ser Asn Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h011-3 VL
<400> 13
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Tyr Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 14
Gly Tyr Thr Ile His
1 5
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 15
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Thr Tyr Thr Lys Phe Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 16
Ala Arg Glu Arg Ile Tyr Ser Asn Tyr Trp Phe Phe Asp Val
1 5 10
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 17
Lys Ala Ser Gln Asn Val Tyr Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 18
Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 19
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR1-1
<400> 20
Gly Tyr Asp Ile His
1 5
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR1-2
<400> 21
Gly Tyr Glu Ile His
1 5
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR2-1
<400> 22
Glu Ile Leu Pro Ser Ser Thr Tyr Thr Lys Phe Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR2-2
<400> 23
Glu Ile Asn Pro Ser Gly Thr Tyr Thr Lys Phe Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR2-3
<400> 24
Tyr Ile Asn Pro Ser Ala Thr Tyr Thr Lys Phe Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR2-4
<400> 25
Glu Ile Ile Pro Ser Ser Thr Tyr Thr Lys Phe Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR2-5
<400> 26
Glu Ile Asn Pro Ser Ser Thr Tyr Thr Lys Phe Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR2-6
<400> 27
Tyr Ile Val Pro Ser Ser Thr Tyr Thr Lys Phe Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR3-1
<400> 28
Ala Arg Glu Asn Ile Tyr Phe Asn Tyr Trp Phe Phe Asp Arg
1 5 10
<210> 29
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR3-2
<400> 29
Ala Arg Glu Asn Ile Phe Ser Asn Tyr Trp Phe Phe Asp Arg
1 5 10
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR3-3
<400> 30
Ala Arg Glu Arg Ile Phe Ser Asn Tyr Trp Phe Phe Asp Val
1 5 10
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR1-1
<400> 31
Lys Ala Ser Gln Asn Val Tyr Trp Glu Val Asp
1 5 10
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR1-2
<400> 32
Lys Ala Ser Gln Asn Val Tyr Trp Glu Val Val
1 5 10
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR1-3
<400> 33
Lys Ala Ser Gln Asn Val Tyr Thr Glu Val Ala
1 5 10
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR1-4
<400> 34
Lys Ala Ser Gln Asn Val Tyr Thr Ala Val Asp
1 5 10
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR2-1
<400> 35
Glu Met Val Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR2-2
<400> 36
Glu Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR2-3
<400> 37
Gln Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3-1
<400> 38
Gln Gln Phe Ser Trp Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3-2
<400> 39
Gln Gln Leu Ser Ser Gln Pro Glu Thr
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3-3
<400> 40
Gln Gln Leu Ser Ser Tyr Pro Asp Thr
1 5
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3-4
<400> 41
Gln Gln Leu Ser Ser Ser Pro Glu Thr
1 5
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3-5
<400> 42
Gln Gln Leu Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是Thr, Asp或Glu
<400> 43
Gly Tyr Xaa Ile His
1 5
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是Tyr或Glu
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是Asn,Leu,Ile或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以是Ser,Gly或Ala
<400> 44
Xaa Ile Xaa Pro Ser Xaa Thr Tyr Thr Lys Phe Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 45
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是Arg或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以是Tyr或Phe
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是Ser或Phe
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa可以是Val或Arg
<400> 45
Ala Arg Glu Xaa Ile Xaa Xaa Asn Tyr Trp Phe Phe Asp Xaa
1 5 10
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可以是Thr或Trp
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa可以是Ala或Glu
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa可以是Ala,Asp或Val
<400> 46
Lys Ala Ser Gln Asn Val Tyr Xaa Xaa Val Xaa
1 5 10
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是Ser, Glu或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是Ala或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是Ser或Val
<400> 47
Xaa Xaa Xaa Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是Tyr,Phe或Leu
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是Ser或Trp
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以是Tyr,Phe,Gln或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可以是Tyr,Asp或Glu
<400> 48
Gln Gln Xaa Ser Xaa Xaa Pro Xaa Thr
1 5
<210> 49
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h011-3050-VH
<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Ser Ser Thr Tyr Thr Lys Phe Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Ile Tyr Ser Asn Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 50
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h011-3058-VH
<400> 50
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Gly Thr Tyr Thr Lys Phe Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Ile Tyr Ser Asn Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h011-3065-VH
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Thr Tyr Thr Lys Phe Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Ile Tyr Ser Asn Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 52
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h011-3070-VH
<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Thr Tyr Thr Lys Phe Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asn Ile Tyr Phe Asn Tyr Trp Phe Phe Asp Arg Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 53
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h011-3073-VH
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Thr Tyr Thr Lys Phe Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asn Ile Phe Ser Asn Tyr Trp Phe Phe Asp Arg Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 54
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h011-3133-VH
<400> 54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Glu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ala Thr Tyr Thr Lys Phe Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Ile Tyr Ser Asn Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 55
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h011-3147-VH
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Ile Pro Ser Ser Thr Tyr Thr Lys Phe Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Ile Tyr Ser Asn Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 121
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<213> 人工序列
<220>
<223> h011-3195-VH
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Thr Tyr Thr Lys Phe Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser Thr Tyr Thr Lys Phe Asn Gln Lys Phe
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100 105 110
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Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Val Pro Ser Ser Thr Tyr Thr Lys Phe Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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115 120
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<400> 59
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
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65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 107
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<213> 人工序列
<220>
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
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<220>
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<400> 65
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Tyr Thr Ala
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Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 70
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h011-3194-VL
<400> 70
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Tyr Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h011-3133-IgG1
<400> 71
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Glu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ala Thr Tyr Thr Lys Phe Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
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195 200 205
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 72
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtcgcgattc ttaagggtgt ccagtgccag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaggtg aagaagcccg gagcatctgt gaaggtgtct 120
tgtaaggcct ctggctatac ctttaccggc tacgagatcc actgggtgcg gcaggcaccc 180
gggcagggcc tggagtggat gggctacatc aacccctctg ctacctacac caagtttaac 240
cagaagttca aggaccgggt gaccatgacc cgggacacct ctatctctac cgcctacatg 300
gagctgtctc ggctgcggtc tgacgacacc gccgtgtact actgcgcacg cgaacggatc 360
tactctaact actggttctt cgacgtgtgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgtcttct 420
gcttcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 720
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1140
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413
<210> 73
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h011-3133-kappa
<400> 73
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Tyr Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 74
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h011-3133-kappa
<400> 74
atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctgc tgctgtggtt ccccggctcg 60
cgatgcgaca tcgtgatgac ccagtctccc tcatctctga gtgcctctgt tggcgaccgg 120
gtgaccatca cctgcaaagc ctctcagaac gtatacacag ccgtggcctg gtatcaacag 180
aagcccggca agtcccccaa gctgctgatt tactctgcct ctaaccggta caccggcgtg 240
ccctctcggt tctctggctc tggttctggc accgacttca ccctgactat ctcttctctg 300
cagcccgagg acttcgccac ctacttctgc cagcagtact cttcttaccc ctacaccttc 360
ggcggaggca ccaaggtgga gatcaagcgt acggtggctg caccatctgt cttcatcttc 420
ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480
ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540
tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600
ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660
cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgttg a 711
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<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h011-3133-IgG1-YTE
<400> 75
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
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Glu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ala Thr Tyr Thr Lys Phe Asn Gln Lys Phe
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Ile Tyr Ser Asn Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr
245 250 255
Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
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275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 76
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h011-3133-IgG1-YTE
<400> 76
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtcgcgattc ttaagggtgt ccagtgccag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaggtg aagaagcccg gagcatctgt gaaggtgtct 120
tgtaaggcct ctggctatac ctttaccggc tacgagatcc actgggtgcg gcaggcaccc 180
gggcagggcc tggagtggat gggctacatc aacccctctg ctacctacac caagtttaac 240
cagaagttca aggaccgggt gaccatgacc cgggacacct ctatctctac cgcctacatg 300
gagctgtctc ggctgcggtc tgacgacacc gccgtgtact actgcgcacg cgaacggatc 360
tactctaact actggttctt cgacgtgtgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgtcttct 420
gcttcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 720
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tctacatcac ccgggagcct 840
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1140
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413

Claims (23)

1.一种特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.如权利要求1所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体或其片段。
3.如权利要求1所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体或其片段。
4.如权利要求1所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或其片段。
5.如权利要求4所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体包含重链可变区FR区，所述重链可变区FR区的序列来源于人种系重链IGHV1-2*02和hjh6.1的组合序列；所述重链可变区FR区包含人种系重链IGHV1-2*02的FR1、FR2、FR3区和hjh6.1的FR4区。
6.如权利要求1所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，所述PCSK9抗体包含VH，所述VH的氨基酸序列为SEQ ID NO: 54的氨基酸序列。
7.如权利要求4所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体包含轻链可变区上的轻链FR区，所述轻链FR区的序列来源于人种系轻链模板IGKV1-39*01和hjk4.1的组合序列；所述轻链FR区包含人种系轻链IGKV1-39*01的FR1、FR2、FR3区和hjk4.1的FR4区。
8.如权利要求1所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含VL，所述VL的氨基酸序列为SEQ ID NO: 13的氨基酸序列。
9.如权利要求4所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含SEQ ID NO: 54的VH和SEQID NO: 13的VL。
10.如权利要求4所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中：
所述PCSK9抗体或其抗原结合片段进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区；
所述PCSK9抗体或其抗原结合片段进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。
11.根据权利要求10所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的PCSK9抗体包含人源IgG1、IgG2或IgG4或使用氨基酸突变延长抗体在血清中的半衰期的IgG1、IgG2或IgG4变体的重链恒定区。
12.根据权根据权利要求11所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的PCSK9抗体包含引入YTE突变的IgG1、IgG2或IgG4的重链恒定区。
13.如权利要求10所述的特异性结合PCSK9的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述PCSK9抗体或其抗原结合片段包含：
1) SEQ ID NO: 71的重链序列和SEQ ID NO: 73的轻链序列；或
2) SEQ ID NO: 75的重链序列和SEQ ID NO: 73的轻链序列。
14.一种编码根据权利要求1至13中任一项所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段的DNA分子。
15.一种含有根据权利要求14所述的DNA分子的表达载体。
16.一种用根据权利要求15所述的表达载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞。
17.如权利要求16所述的宿主细胞，其为哺乳动物细胞。
18.一种制备PCSK9抗体的方法，所述方法包括在适于表达编码权利要求1 至13中任一项所述的PCSK9抗体的核酸的条件下培养权利要求16或权利要求17的宿主细胞，和/或从所述宿主细胞回收所述PCSK9抗体。
19.一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1至13中任一项所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
20.如权利要求1至13中任一项所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段或如权利要求19所述的药物组合物在制备用于治疗PCSK9介导的疾病或病症的药物中的用途。
21.如权利要求20所述的用途，其中所述的疾病或病症为胆固醇相关疾病。
22.如权利要求20所述的用途，其中所述的疾病或病症为高胆固醇血症、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠状动脉心脏病、卒中、心血管疾病、阿尔茨海默病或一般性的异常脂血症。
23.如权利要求20所述的用途，其中所述的疾病或病症为高胆固醇血症、异常脂血症、动脉粥样硬化、CVD 或冠状动脉心脏病。
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