KR20150082503A - 혈소판 유래 성장 인자 b 특이적 항체, 및 그의 조성물 및 용도 - Google Patents

혈소판 유래 성장 인자 b 특이적 항체, 및 그의 조성물 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PDGF-B와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명은 추가로, 이러한 항체 및 이를 코딩하는 핵산을 수득하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로, PDGF-B 매개된 질환, 장애 또는 상태의 치료 및/또는 예방에 이들 항체를 사용하기 위한 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다.

Description

혈소판 유래 성장 인자 B 특이적 항체, 및 그의 조성물 및 용도 {PLATELET-DERIVED GROWTH FACTOR B SPECIFIC ANTIBODIES AND COMPOSITIONS AND USES THEREOF}
본 발명은 혈소판 유래 성장 인자 B (PDGF-B)와 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 전장 항체 및 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, PDGF-B에 대한 항체를 포함하는 조성물, 및 이러한 항체를 의약으로서 사용하는 방법에 관한 것이다. PDGF-B 항체는 PDGFRβ (PDGFRββ와 PDGFRαβ 동종-이량체성 및 이종-이량체성 수용체 둘 다의 각각)에 대한 PDGF-B 결합에 의해 매개되는 질환 및 장애를 치료하고 예방하는데 유용하다.
많은 만성 질환은 지속적이고 끊임없는 염증, 손상, 조직 재형성 및 섬유증을 특징으로 한다. 예를 들어, 당뇨병성 신병증, IgA 신병증 및 증식성 루푸스 신염을 포함하는 진행성 신장 질환의 코호트에서는, 이들이 조직학적으로, 혈관간 세포 확장 및 사구체뿐만 아니라 세관간질 섬유증을 특징으로 한다. 이와 관련하여, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 수용체-β의 리간드가 아마도 지금까지 가장 우수한 것으로 명확히 규명된 매개제이다.
PDGF는 중간엽 및 신경외배엽 기원의 세포에 대한 주요 분열촉진물질이다. PDGF 계열은 동종-이량체화 및 이종-이량체화에 의해 5가지 별개의 단백질, 즉 PDGF-AA, -AB, -BB, -CC 및 -DD를 형성하는 것으로 밝혀진 4가지 상이한 폴리펩티드 쇄, 즉 PDGF-A, B, C 및 D로 구성된다. PDGF는 동종-이량체 및 이종-이량체 (예를 들어, PDGFRαα, PDGFRαβ, PDGFRββ)를 형성하는, 2개의 구조상 관련된 티로신 키나제 수용체 PDGF-Rα 및 β를 활성화시킴으로써 그의 생물학적 활성을 발휘한다. PDGF-A는 PDGFRαα를 활성화시키는 반면, PDGF-B는 3가지 수용체 이량체, 즉 PDGF-Rαα, PDGF-Rαβ, PDGF-Rββ를 모두 활성화시킬 수 있다. PDGF-AB 및 PDGF-C는 PDGF-Rαα 및 PDGF-Rαβ를 활성화시키는 반면, PDGF-D는 PDGF-Rββ를 우선적으로 활성화시킨다 (문헌 [Trojanowska 2008, Rheumatology 47:v2-v4]에 의해 검토된 바와 같다).
PDGF는 아테롬성동맥경화증, 재발 협착증, 폐 고혈압, 망막 혈관 질환, 기관 섬유증 (예를 들어, 심장, 폐, 신장 및 신장), 류마티스 관절염, 골관절염, 종양발생, 및 전신 경화증 (SSc; 경피증)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 광범위한 인간 질환에 연루되어 왔다 (예를 들어, 문헌 [Trojanowska, 2008, Rheumatology 47:v2-v4]; [Andrae et al. 2008 Genes Dev. 22:1276-1312] 참조).
보다 구체적으로 언급하면, 4가지 PDGF 이소형 모두 뿐만 아니라 두 수용체 쇄는 신장에서 발현되고, 사구체 및/또는 간질 위치에서의 PDGF의 발현 증가가 광범위한 신장 질환에서 확인되었다. 또한, PDGF 수용체의 발현 증가는 실험적 및 인간 신장 질환에서 일어난다. PDGF-B와 PDGF-D 둘 다는 인간 신장 질환에 특히 중요한 것으로 여겨진다. 혈관간 세포는 시험관 내에서 PDGF-B를 생성하고, 각종 성장 인자는 자가분비 또는 측분비 PDGF-B-쇄 배출의 유도를 통하여 혈관간 증식을 유도한다 (Silver et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1056-1060; Floege et al., 1991, Clin. Exp. Immunol. 86:334-341). PDGF-B-쇄의 과발현은 혈관간 증식과 매트릭스 확장을 유도시키고 (문헌 [Floege et al., 1993, J. Clin. Invest. 92:2952-2962]; [Isaka et al., 1993, J. Clin. Invest. 92:2597-2601]) PDGF-B-쇄 또는 β-수용체 녹아웃(knock-out) 마우스는 혈관간을 발생시키지 못하였다 (Leveen et al., 1994, Genes Dev. 8:1875-1887; Soriano P., 1994, Genes Dev. 8:1888-1896).
항체, 압타머(aptamer), 가용성 PDGF 수용체 또는 PDGF β-수용체 티로신 키나제 차단제를 이용하여 PDGF-B를 특이적으로 억제하면, 수많은 상이한 전-임상 모델에서 혈관간증식성 변화가 저하되고, 장기간 신장 반흔형성이 방지되며 신장 기능이 개선된다 (Floege et al., 1999, Am. J. Pathol. 154:169-179; Gilbert et al., 2001, Kidney Int. 59:1324-1332; Nakamura et al., 2001, Kidney Int. 59:2134-2145; Ostendorf et al., 2001, J. Am. Soc. Nephrol. 12:909-918).
유사하게, 간 섬유증은 만성 간 손상 후에 흔히 관찰된다. 간 섬유조직의 성장에 있어서의 주요 현상은 간 성상 세포와 근육섬유모세포의 증식 및 이에 의한 콜라겐 생성이다. 사구체신염의 경우에 흔히 있는 일이지만, PDGF는 강력하게 분열촉진성이고 간 성상 세포와 근육섬유모세포 화학주성을 유발시킨다 (Czochra et al., 2006, J. Hepatol. 45:419-28). 인간의 경변성 간에서는, PDGF-BB 및 PDGFRβ 단백질 발현이 정상 간과 비교해서 현저하게 증강된다 (Ikura et al., 1997, J Gastroenterol. 32:496-501). 래트에서 담관 결찰 (BDL)에 의해 유도된 담즙정체성 간 손상 모델에서는, PDGF-B mRNA 발현과 PDGF-BB 단백질 생성이 담관 절편, 담도 상피 세포, 침윤성 대식세포 및 간 성상 세포에서 증가하는 것으로 관찰되었다 (Kinnman et al., 2000, Lab. Invest. 80: 697-707; Grappone et al., 1999, J. Hepatol. 31:100-109; Bonner, JC, 2004, Cytokine Growth Factor Rev. 15: 255-273). 보다 최근에는, PDGF-B/PDGF-Rβ 수용체 결합을 항체로 억제하면 간 섬유증의 발생이 저하되었는데 (문헌 [Ogawa et al., 2010, Hepatol. Res. 40:1128-1141]), 이는 간 섬유증에 있어서의 PDGF-B 신호 전달의 역할을 입증해준다.
PDGFRβ를 통한 PDGF-BB-유도된 신호 전달은 간 성상 세포 증식, 이동 및 근육섬유모세포로의 표현형 변화를 강력하게 증진시키고, 이어서 콜라겐 침착과 섬유조직의 성장을 증진시킨다 (Kinnman et al., 2001, Lab. Invest. 81:1709-1716; Kinnman et al., 2003, Lab. Invest. 83:163-173). 안티센스, 차단성 mAb, 우성-음성 가용성 PDGFRβ 또는 이마티닙(imatinib) [STI571, 글리벡(Gleevec®; Glivec®)] (PDGFR α와 β 둘 다를 포함한 티로신 키나제의 억제제)에 의해 PDGF-B의 효과를 억제하면, 래트의 BDL 유도된 간 섬유증 모델에서 간 히드록시프롤린 함량이 감소될 뿐만 아니라 PDGF-B, PDGFRβ, 및 콜라겐 유형 1의 mRNA 발현이 저하되었다 (Ogawa et al., 2010, Hepatol. Res. 40:1128-1141; Kinnman et al., 2000, Lab. Invest. 80: 697-707; Kinnman et al., 2001, Lab. Invest. 81:1709-1716; Kinnman et al., 2003, Lab. Invest. 83: 163-173; Borkham et al., 2004, Biochem. Biophys. Res. Commun. 321:413-423; Borkham et al., 2004, Lab. Invest. 84:766-777; Neef et al., 2006, J. Hepatol. 44:167-175).
전-임상 섬유증 모델, 특히 신장 및 간 모델에서 관찰된 데이터를 취합해 보면, PDGF-B/PDGFRβ 결합 및/또는 신호 전달을 억제하여 바람직하지 못한 세포외 매트릭스 침착을 제한하고 기관 기능을 보존함으로써 매개된 중요한 잠재적 치료 효과를 강조하고 있다.
요컨대, PDGF-B를 포함하는 PDGF-AB 및/또는 PDGF-BB 리간드와 PDGFRβ의 상호 작용을 통하여 이들 리간드 신호 전달에 의해 매개되는 섬유성 질환 및 장애는 인간의 사망률과 이환률에 심각한 타격을 가한다. 따라서, 이들 질환/장애를 치료하거나 완화시키기 위한 신규의 잠재적 치료제에 대한 필요성이 오랫동안 있어 왔고, 본 발명은 이러한 필요성을 충족시켜 준다.
본 발명은 PDGF-B와 특이적으로 결합하고 서열 6의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열의 VH 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 4의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열의 VL CDR1 (CDR-L1), CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함하는 단리된 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다.
한 측면에서, 상기 항체는 서열 6의 VH 아미노산 서열의 CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 4의 VL 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 측면에서, 항체는 서열 7의 CDR-H1 아미노산 서열, 서열 8의 CDR-H2 아미노산 서열, 및 서열 9의 CDR-H3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 10의 CDR-L1 아미노산 서열, 서열 11의 CDR-L2 아미노산 서열, 및 서열 12의 CDR-L3 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
또한 또 다른 측면에서, 항체는 서열 8의 CDR-H2 아미노산 서열, 및 서열 9의 CDR-H3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 10의 CDR-L1 아미노산 서열, 서열 11의 CDR-L2 아미노산 서열, 및 서열 12의 CDR-L3 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
또한 추가 측면에서, 항체는 MOR8457-GL-VH로서 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13303)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 VH 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH, 및 MOR8457-GL-VL로서 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13302)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
한 측면에서, 항체는 MOR8457-GL-VH로서 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13303)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 VH 아미노산 서열의 CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH, 및 MOR8457-GL-VL로서 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13302)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 VL 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 측면에서, 항체는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 측면에서, 항체는 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
또한 또 다른 측면에서, 항체는 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
추가 측면에서, 항체는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
또한 또 다른 측면에서, 항체는 서열 14의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
한 측면에서, 항체는 서열 5의 핵산 서열에 의해 코딩된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH, 및 서열 3의 핵산 서열에 의해 코딩된 VL CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 항체는 서열 5의 핵산 서열에 의해 코딩된 CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH, 및 서열 3의 핵산 서열에 의해 코딩된 VL CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함한다.
또한 또 다른 측면에서, 항체는 서열 5의 핵산 서열에 의해 코딩된 VH, 및 서열 3의 핵산 서열에 의해 코딩된 VL을 포함한다.
추가 측면에서, 항체는 서열 13의 핵산 서열에 의해 코딩된 중쇄, 및 서열 15의 핵산 서열에 의해 코딩된 경쇄를 포함한다.
또 다른 측면에서, 항체는 서열 44의 VH 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH, 및 서열 39의 VL 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
추가 측면에서, 항체는 서열 44의 VH 아미노산 서열의 CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH, 및 서열 39의 VL 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또한 또 다른 측면에서, 항체는 서열 7의 CDR-H1 아미노산 서열, 서열 8의 CDR-H2 아미노산 서열, 및 서열 9의 CDR-H3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 10의 CDR-L1 아미노산 서열, 서열 41의 CDR-L2 아미노산 서열, 및 서열 12의 CDR-L3 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 측면에서, 항체는 서열 8의 CDR-H2 아미노산 서열 및 서열 9의 CDR-H3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 10의 CDR-L1 아미노산 서열, 서열 41의 CDR-L2 아미노산 서열, 및 서열 12의 CDR-L3 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
한 측면에서, 항체는 서열 44의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
또한 또 다른 측면에서, 항체는 서열 46의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
한 측면에서, 항체는 서열 44의 VH 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 34의 VL 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
추가 측면에서, 항체는 서열 44의 VH 아미노산 서열의 CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 34의 VL 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 측면에서, 항체는 서열 7의 CDR-H1 아미노산 서열, 서열 8의 CDR-H2 아미노산 서열, 및 서열 9의 CDR-H3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 10의 CDR-L1 아미노산 서열, 서열 11의 CDR-L2 아미노산 서열, 및 서열 36의 CDR-L3 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
추가 측면에서, 항체는 서열 8의 CDR-H2 아미노산 서열 및 서열 9의 CDR-H3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 10의 CDR-L1 아미노산 서열, 서열 11의 CDR-L2 아미노산 서열, 및 서열 36의 CDR-L3 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
또한 또 다른 측면에서, 항체는 서열 44의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
추가 측면에서, 항체는 서열 46의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본 발명은 서열 6의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열의 VH 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 4의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열의 VL CDR1 (CDR-L1), CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산을 포함한다.
한 측면에서, 상기 핵산은 서열 6의 VH 아미노산 서열의 CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 4의 VL 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 코딩한다.
또 다른 측면에서, 핵산은 서열 7의 CDR-H1 아미노산 서열, 서열 8의 CDR-H2 아미노산 서열, 및 서열 9의 CDR-H3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 10의 CDR-L1 아미노산 서열, 서열 11의 CDR-L2 아미노산 서열, 및 서열 12의 CDR-L3 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 코딩한다.
또한 또 다른 측면에서, 핵산은 서열 8의 CDR-H2 아미노산 서열, 및 서열 9의 CDR-H3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 10의 CDR-L1 아미노산 서열, 서열 11의 CDR-L2 아미노산 서열, 및 서열 12의 CDR-L3 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 코딩한다.
또한 추가 측면에서, 핵산은 MOR8457-GL-VH로서 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13303)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 VH 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH, 및 MOR8457-GL-VL로서 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13302)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 코딩한다.
한 측면에서, 핵산은 MOR8457-GL-VH로서 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13303)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 VH 아미노산 서열의 CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH, 및 MOR8457-GL-VL로서 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13302)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 VL 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 코딩한다.
또 다른 측면에서, 핵산은 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 코딩한다.
또 다른 측면에서, 핵산은 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 코딩한다.
또한 또 다른 측면에서, 핵산은 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 코딩한다.
추가 측면에서, 핵산은 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 코딩한다.
또한 또 다른 측면에서, 핵산은 서열 14의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 코딩한다.
또 다른 측면에서, 핵산은 서열 44의 VH 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 39의 VL 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 코딩한다.
추가 측면에서, 핵산은 서열 44의 VH 아미노산 서열의 CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 39의 VL 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 코딩한다.
또한 또 다른 측면에서, 핵산은 서열 7의 CDR-H1 아미노산 서열, 서열 8의 CDR-H2 아미노산 서열, 및 서열 9의 CDR-H3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 10의 CDR-L1 아미노산 서열, 서열 41의 CDR-L2 아미노산 서열, 및 서열 12의 CDR-L3 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 코딩한다.
또 다른 측면에서, 핵산은 서열 8의 CDR-H2 아미노산 서열 및 서열 9의 CDR-H3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 10의 CDR-L1 아미노산 서열, 서열 41의 CDR-L2 아미노산 서열, 및 서열 12의 CDR-L3 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 코딩한다.
한 측면에서, 핵산은 서열 44의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 코딩한다.
또한 또 다른 측면에서, 핵산은 서열 46의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 코딩한다.
한 측면에서, 핵산은 서열 44의 VH 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 34의 VL 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 코딩한다.
추가 측면에서, 핵산은 서열 44의 VH 아미노산 서열의 CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 34의 VL 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 코딩한다.
또 다른 측면에서, 핵산은 서열 7의 CDR-H1 아미노산 서열, 서열 8의 CDR-H2 아미노산 서열, 및 서열 9의 CDR-H3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 10의 CDR-L1 아미노산 서열, 서열 11의 CDR-L2 아미노산 서열, 및 서열 36의 CDR-L3 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 코딩한다.
추가 측면에서, 핵산은 서열 8의 CDR-H2 아미노산 서열 및 서열 9의 CDR-H3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 10의 CDR-L1 아미노산 서열, 서열 11의 CDR-L2 아미노산 서열, 및 서열 36의 CDR-L3 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 코딩한다.
또한 또 다른 측면에서, 핵산은 서열 44의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 코딩한다.
추가 측면에서, 핵산은 서열 46의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 코딩한다.
한 측면에서, 핵산은 서열 5의 핵산 서열에 의해 코딩된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH, 및 서열 3의 핵산 서열에 의해 코딩된 VL CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 항체를 코딩한다.
또 다른 측면에서, 핵산은 서열 5의 핵산 서열에 의해 코딩된 CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH, 및 서열 3의 핵산 서열에 의해 코딩된 VL CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 항체를 코딩한다.
또한 또 다른 측면에서, 핵산은 서열 5의 핵산 서열에 의해 코딩된 VH, 및 서열 3의 핵산 서열에 의해 코딩된 VL을 포함하는 항체를 코딩한다.
추가 측면에서, 핵산은 서열 13의 핵산 서열에 의해 코딩된 중쇄, 및 서열 15의 핵산 서열에 의해 코딩된 경쇄를 포함하는 항체를 코딩한다.
본 발명은 PDGF-B와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는데, 이러한 핵산은 서열 3의 핵산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 상기 핵산은 서열 5의 핵산 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 핵산은 서열 13의 핵산 서열을 포함한다.
또한 또 다른 측면에서, 핵산은 서열 15의 핵산 서열을 포함한다.
추가 측면에서, 핵산은 서열 3의 핵산 서열 및 서열 5의 핵산 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 핵산은 서열 13의 핵산 서열 및 서열 15의 핵산 서열을 포함한다.
또한 또 다른 측면에서, 핵산은 ATCC 수탁 번호 PTA-13303을 갖는 MOR8457-GL-VH로서 기탁된 벡터의 삽입물의 핵산 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 핵산은 ATCC 수탁 번호 PTA-13302를 갖는 MOR8457-GL-VL로서 기탁된 벡터의 삽입물의 핵산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 핵산은 서열 45의 핵산 서열에 의해 코딩된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH, 및 서열 35의 핵산 서열에 의해 코딩된 VL CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 항체를 코딩한다.
또 다른 측면에서, 핵산은 서열 45의 핵산 서열에 의해 코딩된 CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH, 및 서열 35의 핵산 서열에 의해 코딩된 VL CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 항체를 코딩한다.
또한 또 다른 측면에서, 핵산은 서열 45의 핵산 서열에 의해 코딩된 VH, 및 서열 35의 핵산 서열에 의해 코딩된 VL을 포함하는 항체를 코딩한다.
추가 측면에서, 핵산은 서열 47의 핵산 서열에 의해 코딩된 중쇄, 및 서열 38의 핵산 서열에 의해 코딩된 경쇄를 포함하는 항체를 코딩한다.
한 측면에서, 핵산은 서열 45의 핵산 서열에 의해 코딩된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH, 및 서열 40의 핵산 서열에 의해 코딩된 VL CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 항체를 코딩한다.
또 다른 측면에서, 핵산은 서열 45의 핵산 서열에 의해 코딩된 CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH, 및 서열 40의 핵산 서열에 의해 코딩된 VL CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 항체를 코딩한다.
또한 또 다른 측면에서, 핵산은 서열 45의 핵산 서열에 의해 코딩된 VH, 및 서열 40의 핵산 서열에 의해 코딩된 VL을 포함하는 항체를 코딩한다.
추가 측면에서, 핵산은 서열 47의 핵산 서열에 의해 코딩된 중쇄, 및 서열 43의 핵산 서열에 의해 코딩된 경쇄를 포함하는 항체를 코딩한다.
추가 측면에서, 핵산은 서열 35의 핵산 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 핵산은 서열 40의 핵산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 핵산은 서열 45의 핵산 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 핵산은 서열 38의 핵산 서열을 포함한다.
또한 또 다른 측면에서, 핵산은 서열 43의 핵산 서열을 포함한다.
추가 측면에서, 핵산은 서열 47의 핵산 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 핵산은 서열 35 및 서열 45의 핵산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 핵산은 서열 40 및 서열 45의 핵산 서열을 포함한다.
추가 측면에서, 핵산은 서열 38 및 서열 47의 핵산 서열을 포함한다.
또한 또 다른 측면에서, 핵산은 서열 43 및 서열 47의 핵산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다.
또한 또 다른 측면에서, 숙주 세포는 박테리아 세포 또는 포유동물 세포이다.
본 발명은 PDGF-B와 특이적으로 결합하는 항체가 발현되는 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 이러한 항체를 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 생성 방법을 포함한다.
본 발명은 청구항 1의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는데, 여기서 VL은 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고 CDR 내에 있지 않은 아미노산 중에 1개 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 항체는 서열 6의 아미노산 서열을 포함하고 CDR 내에 있지 않은 아미노산 중에 1개 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 VH를 포함한다.
또한 또 다른 측면에서, 항체는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고 CDR 내에 있지 않은 아미노산 중에 1개 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 VL; 및 서열 6의 아미노산 서열을 포함하고 CDR 내에 있지 않은 아미노산 중에 1개 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 VH를 포함한다.
본 발명은 PDGF-B와 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는데, 이러한 항체는 본원에 개시된 항체와 동일한 에피토프와 결합하거나 또는 본원에 개시된 항체와 PDGF-B에 대한 PDGFRββ 상의 결합 부위에서 중복되고, 상기 항체는 AbyD3263이 아니다.
본 발명은 PDGF-B와 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는데, 이러한 항체는 PDGF-B와의 결합에 대해 PDGFRββ와 교차 경쟁하고, 추가로 상기 항체는 2 pM 내지 100 pM의 범위의 KD로 PDGF-B와 결합된다.
한 측면에서, 상기 항체는 PDGF-BB 상의 하나 이상의 에피토프와 결합하는데, 이러한 에피토프는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
서열 33의 아미노산 서열에 대해 잔기 Leu 38, Val 39 및 Trp 40, Asn 54, Arg 56, Glu 71, Arg 73, Ile 75, Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, Pro 82, Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86을 포함하는 에피토프; 및
서열 33의 아미노산 서열에 대해 잔기 Trp 40, Asn 54, Glu 71, Arg 73, Ile 75, Glu 76, Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, Pro 82, Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86을 포함하는 에피토프.
또 다른 측면에서, 항체는 파라토프(paratope)를 포함하는데, 이러한 파라토프는 서열 1의 서열에 대해 카바트(Kabat) 넘버링에 기초하여 아미노산 잔기 G28, S29, Y30, F31, D49, D50, F90, T91, H92, N93, S94; 및 서열 2의 서열에 대해 카바트 넘버링에 기초하여 아미노산 잔기 Y50, L57, Y59, Y60, D62, W102, Y103, G104, G105로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 파라토프는 서열 1의 서열에 대해 카바트 넘버링에 기초하여 아미노산 잔기 N65 및/또는 서열 2의 서열에 대해 카바트 넘버링에 기초하여 잔기 W47을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 약 2 pM 내지 69 pM의 범위의 KD로 PDGF-B와 특이적으로 결합하고, PDGF-B와의 결합에 대해 PDGFRβ와 교차 경쟁하며 PDGFRβ에 대한 PDGF-B 결합에 의해 매개되는 활성을 억제하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다.
한 측면에서, PDGFRβ에 대한 PDGF-B 결합에 의해 매개되는 활성은 상기 PDGFRβ의 인산화, 세포 증식의 유도, 세포 이동의 유도, 및 세포외 매트릭스의 침착 증가로 이루어진 군으로부터 선택된 한 가지 이상의 활성이다.
본 발명은 약 13 pM의 KD로 인간 PDGF-BB와 특이적으로 결합하고,
(a) PDGF-BB와의 결합에 대해 PDGFRββ와 교차 경쟁하고;
(b) (i) 서열 33의 아미노산 서열에 대해 잔기 Leu 38, Val 39 및 Trp 40, Asn 54, Arg 56, Glu 71, Arg 73, Ile 75, Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, Pro 82, Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86을 포함하는 에피토프; 및
(ii) 서열 33의 아미노산 서열에 대해 잔기 Trp 40, Asn 54, Glu 71, Arg 73, Ile 75, Glu 76, Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, Pro 82, Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86을 포함하는 에피토프 (상기 에피토프들은 PDGF-BB 상에 대략 190 Å 떨어져 있다)
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 에피토프와 결합하며;
(c) 서열 1의 서열에 대해 카바트 넘버링에 기초하여 아미노산 잔기 G28, S29, Y30, F31, D49, D50, F90, T91, H92, N93, S94; 및 서열 2의 서열에 대해 카바트 넘버링에 기초하여 아미노산 잔기 Y50, L57, Y59, Y60, D62, W102, Y103, G104, G105를 포함하는 파라토프를 포함하고;
(d) 상기 파라토프의 아미노산 잔기는 4 Å 이내에서, 다음과 같이 하나의 상기 에피토프의 아미노산 잔기와 접촉되며:
(i) 경쇄 가변 도메인의 경우, Trp 47은 PDGF-B의 Lys 82와 접촉하고, Leu 57은 PDGF-B의 Ile 77과 접촉하며, Tyr 59는 PDGF-B의 Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, 및 Pro 82와 접촉하고; Trp 102는 PDGF-B의 Leu 8, Val 39, Trp 40, Asn 54, Arg 56, Ile 75, 및 Phe 84와 접촉하며, Tyr 103은 PDGF-B의 Trp 40, Arg 73, Ile 75, 및 Phe 84와 접촉하고, Gly 104는 PDGF-B의 Arg 73 및 Phe 84와 접촉하며, Gly 105는 PDGF-B의 Phe 84와 접촉하고 (이러한 경쇄 가변 도메인 아미노산의 넘버링은 서열 1을 기준으로 하여 카바트 넘버링에 기초함);
(ii) 중쇄 가변 도메인의 경우, Gly 28은 PDGF-B의 Lys 86과 접촉하고, Ser 29는 PDGF-B의 Lys 85 및 Lys 86과 접촉하며, Tyr 30은 PDGF-B의 Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86과 접촉하고, Phe 31은 PDGF-B의 Gln 71, Arg 73, Phe 84 및 Lys 86과 접촉하며, Asp 49는 PDGF-B의 Arg 73과 접촉하고, Asp 50은 PDGF-B의 Lys 86과 접촉하며, Asn 65는 PDGF-B의 Lys 86과 접촉하고, Phe 90은 PDGF-B의 Pro 82, Ile 83, 및 Phe 84와 접촉하며, Thr 91은 PDGF-B의 Lys 81 및 Ile 83과 접촉하고, His 92는 PDGF-B의 Lys 81 및 Ile 83과 접촉하며, Asn 93은 PDGF-B의 Lys 81과 접촉하고, Ser 94는 PDGF-B의 Lys 81과 접촉하며 (이러한 중쇄 가변 도메인 아미노산의 넘버링은 서열 2를 기준으로 하여 카바트 넘버링에 기초함);
추가로 PDGF-B 접촉 잔기의 아미노산 잔기 넘버링은 서열 33의 아미노산 서열에 대한 것인
단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 포함한다.
본 발명은 세포외 매트릭스의 침착을 감소시킬 필요가 있는 대상체에서 세포외 매트릭스의 침착을 감소시키는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 상기 대상체에게 유효량의 제약 조성물을 투여함으로써, 이러한 대상체에서 세포외 매트릭스의 과도한 침착을 억제하는 것을 포함한다.
본 발명은 추가로, 세포외 매트릭스의 침착을 감소시킬 필요가 있는 대상체에서 이러한 세포외 매트릭스의 침착을 감소시키는데 사용하기 위한 의약을 제조하는데 있어서의, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 제약 조성물의 용도를 포함한다.
본 발명은 추가로, 세포외 매트릭스의 침착을 감소시킬 필요가 있는 대상체에서 이러한 세포외 매트릭스의 침착을 감소시키는데 사용하기 위한, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 PDGFRβ에 대한 PDGF-B 결합에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 상태의 예방 또는 치료 방법을 포함한다. 이러한 방법은 상기 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 추가로, PDGFRβ에 대한 PDGF-B 결합에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 상태를 예방 또는 치료하기 위한 의약을 제조하는데 있어서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 제약 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 추가로, PDGFRβ에 대한 PDGF-B 결합에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 상태를 예방 또는 치료하기 위한, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 제약 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 상기 질환, 장애 또는 상태는 아테롬성동맥경화증, 재발 협착증, 폐 고혈압, 망막 혈관 질환, 심장 섬유증, 폐 섬유증, 간 섬유증, 신장 섬유증, 전신 경화증, 류마티스 관절염, 골관절염, 및 종양발생으로 이루어진 군으로부터 선택된 한 가지 이상이다.
전술된 요약뿐만 아니라 다음의 발명의 상세한 설명은 첨부된 도면과 연계해서 판독한 경우에 보다 잘 이해될 것이다. 본 발명을 예시할 목적으로, 본 발명에 바람직한 도면 실시양태(들)가 제시되어 있다. 그러나, 본 발명이 도시된 바와 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
도면에서:
패널 a 내지 n을 포함하는 도 1은 IMGT 데이터베이스 중의 가장 근접한 4가지 각각의 배선 V 영역을 수반한 MOR-8457 중쇄 가변 영역 (도 1a) 및 경쇄 가변 영역 (도 1b)의 서열 정렬을 도시한 것이다. 동일한 잔기는 (.)로서 제시되고, 프레임워크 및 CDR1 및 CDR2가 표시되어 있다. 도 1c는 배선화를 수반하지 않은 MOR8457-VL의 아미노산 서열 (서열 1)을 나타내고, CDR에 밑줄이 그어져 있다. 도 1d는 배선화를 수반하지 않은 MOR8457-VH의 아미노산 서열 (서열 2)을 나타내고, CDR에 밑줄이 그어져 있다. 도 1e는 배선화 후 MOR8457-GL-VL의 아미노산 서열 (서열 4)을 나타내고, CDR에 밑줄이 그어져 있다. 도 1f는 배선화 후 MOR8457-GL-VH의 아미노산 서열 (서열 6)을 나타내고, CDR에 밑줄이 그어져 있다. 도 1g는 MOR8457-GL-LC 전장 경쇄의 아미노산 서열 (서열 16)을 나타내는데, VL 영역은 배선화되었다. 도 1h는 이펙터 널 삼중 돌연변이 (3m)를 포함하는 배선화 VH 영역 및 인간 IgG1을 포함하는 (여기서, 야생형 서열 "LLGL"은 "AAGA"로 돌연변이되었다) MOR8457-GL-hIgG1-3m-HC 전장 중쇄의 아미노산 서열 (서열 14)을 나타낸다. 류신이 알라닌으로 치환된 부위에 밑줄이 그어져 있다. 도 1i는 조작된 변이체 MOR8457-15-VL의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (서열 34)을 나타내는데, CDR에 밑줄이 그어져 있다. 도 1j는 조작된 변이체 MOR8457-15-VH 및 MOR8457-16-VH의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (서열 44)을 나타내는데, 그 CDR에 밑줄이 그어져 있다. 조작된 변이체 MOR8457-15와 MOR8457-16 둘 다는 동일한 중쇄 서열을 공유하고 있다. 도 1k는 조작된 변이체 MOR8457-16-VL의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (서열 39)을 나타내는데, 그 CDR에 밑줄이 그어져 있다. 도 1l은 MOR8457-15 전장 경쇄의 아미노산 서열 (서열 37)을 나타내는데, VL 영역은 개선된 생물물리학적 특성을 위해 조작되었다. 도 1m은 이펙터 널 삼중 돌연변이 (3m)를 포함하는 조작된 VH 영역 및 인간 IgG1을 포함하는 (이러한 VH 영역은 개선된 생물물리학적 특성을 위해 조작되었고, 불변 영역 야생형 서열 "LLGL"은 "AAGA"로 돌연변이되었다) MOR8457-15-HC 및 MOR8457-16-HC의 전장 중쇄의 아미노산 서열 (서열 46)을 나타낸다. 류신이 알라닌으로 치환된 부위에 밑줄이 그어져 있다. 도 1n은 MOR8457-16-LC 전장 경쇄의 아미노산 서열 (서열 42)을 나타내는데, VL 영역은 개선된 생물물리학적 특성을 위해 조작되었다.
패널 A 내지 K를 포함하는 도 2는 상이한 PDGF에 대한 MOR8457 항체의 결합 동역학을 나타내는 비아코어(Biacore) 센서그램을 도시한 것이다. 항-인간 (A-D, I-K) 또는 항-마우스 (E-H) IgG 항체를 CM5 센서 칩의 유동 세포에 고정화시켰다. 1 ㎍/mL의 MOR8457-IKR-hIgG1-3m (A-D), MOR8457-mIgG1 (E-H) 또는 MOR8457-GL-hIgG1-3m (I-K)을 10초 동안 각각의 항-인간 또는 항-마우스 표면 전반에 걸쳐 독립적으로 주사하면, 50 내지 100 RU의 안정한 항-PDGF 표면이 생성되었다. 이어서, PDGF 단백질의 상이한 농도, 즉 0.25, 0.5, 및 1 nM을 2분 동안 결합을 위해 100 ㎕/min의 유속으로 상기 항체 표면 상에 주사하였다. 복합체를 10분 동안 해리시켜 두었다. 10 mM 염화마그네슘을 30초 주사하여 상기 표면을 재생시키면, 이는 항-PDGF 항체 포획과 PDGF 결합 동역학의 또 다른 라운드를 위해 준비된 표면으로 되었다. 이들 3개 항체 각각은 인간 (A, E, I), 마우스 (B, F, J) 및 래트 (C, G, K) PDGF-BB와 단단히 결합되었다. MOR8457-IKR-hIgG1-3m (D) 및 MOR8457-mIgG1 (H)은 인간 PDGF-AB와 결합하였다. 도시된 각 센서그램은 3가지 독립적인 실험 중 대표적인 한 가지이다.
도 3은 인간 PDGF-BB가 이미 MOR8457-mIgG1과 결합된 경우에는, MOR8457-IKR-hIgG1-3m이 인간 PDGF-BB와 결합되지만, PDGFRβ-hIGg1은 그렇지 못하였다는 것을 예시해 주는 도면 및 센서그램을 도시한 것이다. MOR8457-mIgG1은 CM5 센서 칩 상으로 고정화된 항-마우스 IgG를 통하여 포획하였는데, 이로써 200 내지 400 RU의 안정한 표면이 생성되었다 (주사 1). 인간 PDGF-BB 1 nM을 6분 동안 주사하면 표면 포화에 도달하였는데 (주사 2), 그 후에 MOR8457-IKR-hIgG1-3m (주기 1, 주사-3, 흑색 라인), 또는 PDGFRβ-hIgG1 (주기 2, 주사 3, 회색 라인), 또는 완충제 (주기 3, 주사 3, 점선)를 주사하였다. 결합을 나타내지 않은 PDGFRβ-hIgG1 및 완충제 (주기 2 및 주기 3 라인은 주사 3 후에 RU 상의 증가를 나타내지 않는다)와는 달리, MOR8457-IKR-hIgG1-3m은 상기 칩 상에 미리-조립된 MOR8457-mIgG1/PDGF-BB 복합체와 결합하였는데 (주기 1 센서그램은 주사 3 후에 공명 상의 증가를 나타내었다), 이는 PDGF-BB 이량체가 2개의 MOR8457 분자와 결합하였고 하나의 MOR8457에 의한 PDGF-BB의 결합이 PDGFRββ 수용체 결합을 차단시키기에 충분하였다는 것을 입증해준다. 제시된 데이터는 2가지 독립적인 실험 중 하나의 대표적 실험으로부터의 것이다.
도 4는 PDGF-BB가 hPDGFRβ-hIgG1과 결합된 경우에 MOR8457-IKR-hIgG1-3m은 인간 PDGF-BB와 결합할 수 없었다는 것을 예시해 주는 다이어그램 및 센서그램을 도시한 것이다. PDGFRβ-hIgG1은 항-인간 IgG 항체를 통하여 CM5 센서 칩 상으로 포획하였다 (주사-1). 이어서, 인간 PDGF-BB를 6분 동안 1 nM의 농도로 주사하여 PDGFRβ-hIgG1 상의 결합 부위를 포화시켰고 (주사-2), 이어서 MOR8457-IKR-hIgG1-3m (주기 1, 주사-3, 흑색 라인), 또는 완충제 (주기 2, 주사-3, 회색 라인)를 주사하였다. MOR8457-IKR-hIgG1-3m은 미리-조립된 PDGFRβ-hIgG1/PDGF-BB 복합체와 결합하지 않았는데, 이는 MOR8457과 PDGFR이 PDGF-BB 상의 동일한 결합 부위를 놓고 경쟁한다는 것을 제안한다. 제시된 데이터는 2가지 독립적인 실험 중 하나의 대표적 실험으로부터의 것이다.
패널 A 및 B를 포함하는 도 5는 MOR8457이 용액 중에서 PDGFRβ-hIgG1에 대한 인간 PDGF-BB 결합을 차단시켰다는 것을 도시한 것이다. 도 5A는 용액 중에서의 경쟁 검정의 비아코어 설정을 예시하는 다이어그램을 도시한 것이다. MOR8457-mIgG1을 PBS에서 일련으로 희석시킨 다음, 이를 1 mM의 인간 PDGF-BB와 혼합하고, 2 내지 8℃ 하에 20시간 동안 인큐베이션하여 [각 괄호]로써 표기된 바와 같이 평형에 도달하게 하였다. 이어서, 각 MOR8457-mIgG1 및 PDGF-BB 희석 혼합물을 CM5 칩 상에 항-인간 IgG1에 의해 포획된 PDGFRβ-hIgG1의 표면 상으로 주사하였다. 도 5B는 MOR8457이 PDGFRβ-hIgG1에 대한 PDGF-BB의 결합을 억제하였다는 것을 입증해 주는 농도 반응 곡선을 나타낸 그래프를 도시한 것이다. 제시된 데이터는 2가지 독립적인 실험 중 하나의 대표적 실험으로부터의 것이다.
도 6은 PDGF-BB 이량체에 대한 MOR8457의 결합 방식을 예시하는 다이어그램을 도시한 것이다. 이 도면은 PDGF-BB 분자 상의 결합 에피토프 1 및 2가 대략 190 Å 떨어져 있어 단일 MOR8457 항체가 에피토프 1 및 2 둘 다와 동시에 결합할 수 없다는 것을 예시해준다. 따라서, 상기 모델은 본원의 다른 곳에서 관찰된 2:1 결합 화학량론이 너무 멀리 떨어져 있는 2개 에피토프의 기하학적 제약에 기인한다는 것을 입증해준다.
도 7은 하나의 PDGF-B 상의 하나의 결합 에피토프에 대한 하나의 MOR8457의 결합을 나타내는 모델의 다이어그램을 도시한 것이다. 이 다이어그램은 MOR8457의 VH 및 VL 도메인이 PDGF-B의 다음 아미노산 잔기와 결합 (즉, 4 Å 미만 떨어져 있는 잔기와 접촉)한다는 것을 추가로 도시한다: Leu 38, Val 39, Trp 40, Asn 54, Arg 56, Glu 71, Arg 73, Ile 75, Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, Pro 82, Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86.
패널 A 및 B를 포함하는 도 8은 MOR8457이 PDGF-BB 유도된 인간 혈관간 세포 증식을 강력하게 억제하였다는 것을 나타내는 2개의 그래프를 도시한 것이다. 도 8A는 MOR8457의 부재 하에 PDGF-BB 유도된 인간 혈관간 세포 증식의 농도 반응 곡선을 나타내는 그래프를 도시한 것이다. 일차 인간 혈관간 세포를 배양하고, 이를 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 혈청-무함유 MCM 배지를 이용하여 세포를 24시간 동안 성장-저지시켰다. 24시간 후, 상기 세포를 37℃ 하에 4시간 동안 일련으로 희석된 PDGF-BB로 자극하였다. BrdU 혼입 검정을 이용하여 마지막 16시간 동안 DNA 합성을 결정하였다. PDGF-BB는 2.3 ng/mL의 EC50으로 혈관간 세포 증식을 강력하게 유도시켰다. 도 8B는 도 8A에 제시된 바와 동일한 검정에서 MOR8457의 대표적 억제 곡선을 나타내는 그래프를 도시한 것이다. 즉, MOR8457-IKR-IgG1-3m을 100 nM에서 0.1 nM으로 반-로그 희석시킨 다음, 이를 혈청-무함유 MCM 배지에서 30분 동안 2.5 ng/ml의 PDGF-BB와 혼합한 후, 이 혼합물을 상기 세포에 가하였다. 증식 검정을 도 8A에 기재된 바와 같이 수행하였다. 3가지 독립적인 실험으로부터 결정된 평균 IC50은 13.4 ± 2.8 pM이었고, 최대 억제는 87.9 ± 5.7%였다.
패널 A 및 B를 포함하는 도 9는 MOR8457의 경쟁적 억제에 대한 쉴트(Schild) 분석을 나타내는 2개의 그래프를 도시한 것이다. 도 9A는 0.01, 0.1, 1 및 10 nM의 MOR8457-IKR-IgG1-3m의 부재 하 및 존재 하에 PDGF-BB의 농도 반응 곡선을 나타내는 그래프를 도시한 것이다. 항체를 PDGF-BB와 혼합하고, 25℃ 하에 2.5시간 동안 인큐베이션한 후, 이 혼합물을 세포에 가하였다. 세포 증식 검정을 도 8에 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 9A는 곡선이 증가 농도의 MOR8457-IKR-IgG1-3m에 따라 우측으로 이동하였고 억제 정도는 고 농도의 PDGF-BB 하에 극복할 수 있었다는 것을 나타내는데, 이는 상기 억제가 경쟁적이라는 것을 제안한다. 도 9B는 쉴트 회귀 분석을 나타내는 그래프를 도시한 것이다. 쉴트 분석을 문헌 (Arunklakshana & Schild, 1959, Br. J. Pharmacol. 65:48-58)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 항체의 부재 하 및 존재 하에 측정된 PDGF-BB의 EC50을 사용하여 용량 비 (DR)를 계산하였다. 일련의 로그 [B] 항체 농도에 대한 일련의 로그 (DR-1) 값을 그래프 상에 플롯하였다. 이 그래프로부터 추론된 pA2는 약 20 pM이었는데, 이는 비아코어에 의해 측정된 바와 같은 결합 친화도 (즉, 약 13 pM)와 일치한다. 이들 데이터는 MOR8457이 기능성 검정에서 강력하고도 경쟁적인 억제제라는 것을 나타낸다.
패널 A 및 B를 포함하는 도 10은 래트에서 OX-7 유도 후 9일째 항-Thy1.1 신염 신장 조직 샘플 상에서 혈관간 세포 증식에 대한 MOR8457-mIgG1의 효과를 입증해 주는 그래프를 도시한 것이다. 모노클로날 항체 OX-7 (1 mg/kg)을 정맥내 주사함으로써 숫컷 위스타르(Wistar) 래트에서 신염을 개시시켰다. MOR8457-mIgG1 (3, 10 및 30 mg/kg) 및 이소형 대조군 IgG (30 mg/kg)를 피하 주사하여, 질환 유도 후 1.5일째에 동물 (n=6)의 코호트를 분리시켰다. 8일째에, 모든 래트에게 50 mg/kg 브로모데옥시우리딘 (BrdU)을 복강내 주사하여 세포 주기의 DNA (S) 상의 세포를 표지시켰다. 9일째에 동물을 희생시키고 신장 조직 샘플을 수득하여 세포 증식에 대한 MOR8457-mIgG1의 효과 (도 10A), 및 혈관간 및 족세포 활성화에 대한 MOR8457-mIgG1의 효과 [알파-평활근 액틴 (α-SMA)에 대한 면역조직화학, 도 10B]를 평가하였다. 데이터는 MOR8457-mIgG1이 혈관간 세포 증식에 있어서 용량-의존적 감소를 유도시켰고 (도 10A) 알파-평활근 액틴 양성 염색을 저하시켰다는 것을 (도 10B) 나타낸다.
도 11은 pH 6.0에서 예측된 FAB 전하에 대항하여 플롯된 저염 및 pH 6.0에서 100 mg/ml 농도 하의 7개 항체의 점도를 나타내는 그래프를 도시한 것이다. 예측된 FAB 전하는 디스커버리 스튜디오(Discovery Studio) 3.5 pKa 예측기를 이용하여 계산한다. 항체 AAB-001, RK35, IMA-638, MOR8457 및 MOR8457-GL의 점도는 방법에 기재된 바와 같이 측정한다. MAb1 및 MAb2 점도 측정은 문헌 (Yadav 2012, 상기 참조)에 기재되어 있다.
도 12는 pH 6.0에서 예측된 Fab 쌍극자 모멘트 크기(Dipole Moment Magnitude)에 대항하여 플롯된 저염 및 pH 6.0에서 100 mg/ml 농도 하의 7개 항체의 점도를 나타낸 것이다. 예측된 FAB 전하는 디스커버리 스튜디오 3.5 pKa 예측기를 이용하여 계산한다. 이어서, 이들 전하를 이용하여 쌍극자 모멘트를 계산하였다. AAB-001, RK35, IMA-638, MOR8457 및 MOR8457-GL의 점도는 방법에 기재된 바와 같이 측정한다. MAb1 및 MAb2 점도 측정은 문헌 (Yadav 2012, 상기 참조)에 기재되어 있다.
도 13은 CDR 영역 내의 잔기의 순전하에 대항하여 플롯된 저염 및 pH 6.0에서 100 mg/ml 농도 하의 7개 항체의 점도를 나타내는 그래프를 도시한 것이다. 순전하는 양 하전된 잔기 +1, 음 하전된 잔기 -1, 및 His +1/2 전하를 제공함으로써 계산한다. AAB-001, RK35, IMA-638, MOR8457 및 MOR8457-GL의 점도는 방법에 기재된 바와 같이 측정한다. MAb1 및 MAb2 점도 측정은 문헌 (Yadav 2012, 상기 참조)에 기재되어 있다.
패널 A 내지 G를 포함하는 도 14는 (A) AAB-001 (B) RK35 (C) MAb2 (D) IMA-638 (E) MAb1 (F) MOR8457-GL (G) MOR8457의 CDR 영역을 강조하는 정전기 퍼텐셜 에너지 표면을 도시한 것이다. 표면 전하는 본 도면의 우측 하단에 있는 막대로써 도시된 바와 같이 양 하전된 패치에 대한 흑색부터 음 하전된 패치에 대한 백색까지의 스펙트럼으로서 나타낸다. 모든 분자는 각 CDR 영역이 좌측 중쇄 및 우측 경쇄와 (종이의 평면으로부터) 바깥쪽으로 향하도록 배향 제시된다.
도 15는 증가 농도의 함수로서 MOR8457 및 그의 조작된 변이체에 대한 점도 측정을 나타내는 그래프를 도시한 것이다. 모 MOR8457 항체는 실선으로서 제시된다. 배선화된 MOR8457-GL은 진한 사각형을 수반한 점선으로서 제시된다. 조작된 변이체 MOR8457-15는 진한 원형을 수반한 점선으로서 제시된다. 조작된 변이체 MOR8457-16은 진한 삼각형을 수반한 점선으로서 제시된다. 제시된 데이터는 MOR8457-16의 점도가 기타 3가지 MOR8457 항체와 비교해서 감소된다는 것을 입증해준다.
패널 A 및 B를 포함하는 도 16은 PDGF-BB 이량체와의 복합체 중의 (A) MOR8457-15 및 (B) MOR8457-16의 구조적 모델을 나타내는 다이어그램을 도시한 것이다. Fab는 회색 리본으로서 제시되고 PDGF-BB 이량체는 연회색 표면 표시이다. PDGF-BB와 직접적으로 접촉되는 잔기는 회색 스틱으로서 제시되고, 모 항체와 비교해서 돌연변이된 잔기는 흑색 스틱으로서 제시된다. 제시된 데이터는 조작된 MOR8457 변이체 둘 다의 경우에, 3가지 돌연변이 중 어느 것도 PDGF-BB 이량체와 상호 작용하지 않는다는 것을 입증해준다.
패널 A 및 B를 포함하는 도 17은 (A) MOR8457-GL 및 (B) MOR8457-16의 정전기 퍼텐셜 에너지 표면을 도시한 것이다. 이 도면에 제시된 전하 표면 스케일링은 도 14에 제시된 바와 동일하다. MOR8457-GL 중의 Asn에서 MOR8457-16 중의 Lys로 돌연변이되는 부위 L53이 화살표로 표시된다. 이 잔기는 경쇄 CDR 내의 큰 음 하전된 패치 (L53 부위 위의 백색 패치)에 바로 인접해 있고, 이들 데이터는 상기 잔기가 모 항체와 비교해서 점도 상의 감소에 대해 책임이 있다는 것을 제안한다.
도 18은 인산염 완충 식염수 중의 MOR8457-GL (사각형), MOR8457-15 (원형) 및 MOR8457-16 (삼각형)의 시차 주사 열량측정법 (DSC) 프로파일을 나타내는 그래프를 도시한 것이다.
패널 A 및 B를 포함하는 도 19는 MOR8457 및 그의 조작된 변이체 각각의 발현 및 정제 프로파일을 나타내는 그래프를 도시한 것이다. 패널 A는 각 항체에 대하여, 293 배양물에서의 일시적 발현 후 발현 수준 (mg/mL로서 백색 막대로 제시됨) 및 단백질 A 포획 후 정제 수율 (관심 피크 면적 %로서 회색 막대로 제시됨)을 나타내는 막대 그래프를 도시한 것이다. 패널 B는 단일 피크를 나타내는 단백질 A 용출 후 MOR8457-16에 대한 분석적 크기 배제 크로마토그래프를 나타내는 그래프를 도시한 것이다.
패널 A 내지 D를 포함하는 도 20은 상이한 PDGF 이소형에 대한 MOR8457-16의 결합 역할을 나타내는 비아코어 센서그램을 도시한 것이다. 항-인간 IgG 항체를 이용하여 MOR8457-16을 CM5 칩 상으로 포획하였다. 각 PDGF 이소형의 결합 동역학은 상이한 농도의 각 PDGF 이소형을 상기 포획된 MOR8457-16 표면 상에 유동시킴으로써 평가하였다. Hu-PDGF-BB (A) 및 Mu-PDGF-BB (C)의 농도는 0.25, 0.5, 및 1 nM였고, Hu-PDGF-AB (B) 및 래트-PDGF-BB (D)에 대한 농도는 0.5 및 1 nM였다. 각 센서그램은 2가지 독립적인 실험 중 대표적인 한 가지이다. 동역학 데이터를 이중 참조하였고, 비아코어 평가 소프트웨어 버전 4.1을 이용하여 피팅하였다. 본 도면에 제시된 작동 속도 및 이탈 속도, 및 결합 친화도가 표 8에 열거되어 있다.
패널 A 및 B를 포함하는 도 21은 혈관간 세포 증식 검정에서 MOR8457-16 (A) 및 MOR8457-GL (B)의 억제 곡선을 도시하는 그래프를 나타낸다. 2.5 ng/ml의 PDGF-BB를 이용하여 세포 증식을 자극하였다. 이 검정을 실시예 8에 기재된 바와 같이 수행하였다. MOR8457-16의 IC50은 14 pM인 반면, 모 MOR8457-GL의 IC50은 20 pM이었다.
본원에는 PDGF-B와 특이적으로 결합하고 PDGFRβ에 대한 PDGF-B의 결합을 억제하는 항체가 개시되어 있다. PDGF-B 항체의 제조 방법, 이들 항체를 포함하는 조성물, 및 이들 항체의 사용 방법이 제공된다. PDGF-B 항체는 PDGFRβ에 대한 PDGF-B 결합에 의해 유발되고/되거나 이와 연관된 질환, 장애 또는 상태의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 이러한 질환, 장애 또는 상태는 아테롬성동맥경화증, 풍선 손상-유도된 재발 협착증, 폐 고혈압, 기관 섬유증 (예를 들어, 심장, 폐, 신장 및 신장), 전신 경화증, 류마티스 관절염, 골관절염, 및 종양발생을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일반적 기술
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 연계해서 사용된 과학적 및 기술적 용어는 통상의 기술자에 의해 흔히 이해되는 의미를 가져야 한다. 추가로, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함해야 하고 복수 용어는 단수를 포함해야 한다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 연계해서 사용되고 이들의 기술에서 사용된 명칭은 널리 공지되어 있고 관련 기술분야에서 흔히 사용되는 것이다.
본 발명의 실시는 달리 표시되지 않는 한, 관련 기술분야의 기술 수준 내에 있는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌 (예컨대, [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press]; [Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)]; [Methods in Molecular Biology, Humana Press]; [Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press]; [Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987)]; [Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press]; [Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons]; [Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)]; [Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)]; [Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987)]; [PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)]; [Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)]; [Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)]; [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002)]; [Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998)]; [Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY (2003)]; [Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)]; [Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)]; [Antibodies (P. Finch, 1997)]; [Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; [Monoclonal Antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; [Using Antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; [The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)])에 상세히 설명되어 있다.
효소적 반응 및 정제 기술은 관련 기술분야에서 통상적으로 수행되는 바와 같거나 또는 본원에 기재된 바와 같이, 제조업자의 명세서에 따라서 수행한다. 본원에 기재된 분석 화학, 생화학, 면역학, 분자 생물학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 제약 화학과 연계해서 사용된 명칭, 및 이들 분야의 실험 과정 및 기술은 널리 공지되어 있고 관련 기술분야에서 흔히 사용되는 것이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 제약 제제, 제제화, 및 전달, 및 환자의 치료에 대한 표준 기술이 사용된다.
정의
달리 표시되지 않는 한, 다음 용어는 다음 의미를 갖는 것으로 이해해야 한다: 용어 "단리된 분자" (이 분자가, 예를 들어 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체인 경우)는 그의 유래 기원 또는 공급원을 통하여, (1) 그의 천연 상태로 그를 수반하는 자연적으로 연합된 성분과 연합되지 않거나, (2) 동일한 종으로부터의 다른 분자가 실질적으로 없거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 자연에 존재하지 않는 분자이다. 따라서, 화학적으로 합성되거나 또는 그것이 자연적으로 유래되는 세포와 상이한 세포성 시스템에서 발현되는 분자는 그의 자연적으로 연합된 성분으로부터 "단리될" 것이다. 특정 분자는 또한, 관련 기술분야에 널리 공지된 정제 기술을 이용하여 단리시킴으로써 자연적으로 연합된 성분이 실질적으로 없을 수 있다. 분자 순도 또는 동질성은 관련 기술분야에 널리 공지된 수많은 수단에 의해 검정할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 샘플의 순도는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 상기 폴리펩티드를 가시화하기 위한 겔의 염색 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 검정할 수 있다. 특정의 목적을 위해, HPLC 또는 정제를 위해 관련 기술분야에 널리 공지된 기타 수단을 이용함으로써 보다 고 해상도가 제공될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "실질적으로 순수한"은 목적 종이, 존재하는 우세 종이라는 것을 의미하고 (즉, 몰 기준으로 하여, 이것이 조성물 중의 다른 개개의 종 보다 더 풍부하다), 바람직하게 실질적으로 정제된 분획은 목적 종 (예를 들어, 항체 또는 수용체를 포함한 당단백질)이 존재하는 모든 거대분자 종의 약 50% 이상 (몰 기준으로 함)을 차지하는 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 이러한 조성물에 존재하는 모든 거대분자 종의 약 80% 초과, 보다 바람직하게 약 85%, 90%, 95%, 및 99% 초과를 차지할 것이다. 가장 바람직하게, 목적 종은 본질적으로 동질성이 되도록 정제되는데 (통상적인 검출 방법에 의해 조성물 내에 오염 종이 검출될 수 없다), 이러한 조성물은 본질적으로 단일 거대분자 종으로 이루어진다.
"항체"는 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역에 위치한, 하나 이상의 항원 인식 부위를 통하여 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등과 특이적으로 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 분자이다. 본원에 사용된 바와 같은, 상기 용어는 온전한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체뿐만 아니라 달리 명시되지 않는 한, 특이적 결합을 놓고 온전한 항체와 경쟁하는 그의 모든 항원 결합 부분, 항원 결합 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 이뮤노글로불린 분자의 다른 변형된 입체 배치를 포괄한다. 항원 결합 부분은, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, 도메인 항체 (dAb, 예를 들어 상어 및 낙타과 항체), 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한 단편, 단일 쇄 가변 단편 항체 (scFv), 맥시바디(maxibody), 미니바디(minibody), 인트라바디(intrabody), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), v-NAR 및 비스-scFv, 및 폴리펩티드에 대한 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 함유하는 폴리펩티드를 포함한다. 항체는 모든 부류의 항체, 예컨대 IgG, IgA, 또는 IgM (또는 그의 아부류)을 포함하고, 항체가 어느 특별한 부류일 필요는 없다. 그의 중쇄의 불변 영역의 항체 아미노산 서열에 따라서, 이뮤노글로불린은 상이한 부류로 배정될 수 있다. 5가지 주요 부류의 이뮤노글로불린, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있고, 이들 부류 중 몇 가지는 아부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가 분할될 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 영역은 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 각각 불리운다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원적 입체 배치는 널리 공지되어 있다.
본원에서 상호 교환적으로 사용된 바와 같은, 항체의 "항원 결합 부분" 또는 "항원 결합 단편" (또는 간단히 "항체 부분")은 항원 (예를 들어, PDGF)과 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원 결합 부분" 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지(hinge) 영역에서 디술피드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (문헌 [Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR), 디술피드-연결된 Fv (dsFv), 및 항-개체특이형 (항-Id) 항체 및 인트라바디를 포함한다. 더욱이, Fv 단편의 두 도메인 VL과 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되긴 하지만, 재조합 방법을 사용하여, 이들이 단일 단백질 쇄로서 만들어질 수 있도록 해주는 합성 링커에 의해 함께 연결될 수 있는데, 여기서는 VL 영역과 VH 영역이 짝을 지어 1가 분자 [단일 쇄 Fv (scFv)로서 공지됨]를 형성한다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al. Science 242:423-426 (1988)] 및 [Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)] 참조). 이러한 단일 쇄 항체 또한, 용어 항체의 "항원 결합 부분" 내에 포괄된다. 기타 형태의 단일 쇄 항체, 예컨대 디아바디 또한 포괄된다. 디아바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄 상에 발현되지만, 동일한 쇄 상에서 두 도메인 간에 짝을 짓기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 이들 도메인이 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 짝을 짓도록 해주고 2개의 항원 결합 부위를 창출시키는 2가의 이중-특이적 항체이다 (예를 들어, 문헌 [Holliger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]; [Poljak et al., 1994, Structure 2:1121-1123] 참조).
항체는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 토끼, 개, 고양이, 마우스 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 모든 포유동물, 또는 기타 동물, 예컨대 조류 (예를 들어, 치킨), 어류 (예를 들어, 상어), 및 낙타과 동물 (예를 들어, 라마)로부터 유래될 수 있다.
항체의 "가변 영역"은 단독으로 또는 조합하여, 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각, 초가변 영역으로서 공지되기도 한 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 이루어지고, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. 특히 CDR 영역 외부의 (즉, 프레임워크 영역 내의) 아미노산 잔기에 있어서의 치환을 수반하는, 대상 가변 영역의 변이체가 요망되는 경우에는, 이러한 대상 가변 영역과 동일한 표준 부류의 CDR1 및 CDR2 서열을 함유하는 다른 항체의 가변 영역을, 상기 대상 가변 영역과 비교함으로써 적당한 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환을 확인할 수 있다 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196(4): 901-917, 1987).
특정의 실시양태에서, CDR의 결정적 묘사 및 항체의 결합 부위를 포함하는 잔기의 확인은 이러한 항체의 구조를 해석하고/하거나 항체-리간드 복합체의 구조를 해석함으로써 달성된다. 특정의 실시양태에서, 이는 통상의 기술자에게 공지된 모든 광범위한 기술, 예컨대 X선 결정학에 의해 달성될 수 있다. 특정의 실시양태에서, 각종 분석 방법을 이용하여 CDR 영역을 확인하거나 또는 근사치를 낼 수 있다. 특정의 실시양태에서, 각종 분석 방법을 이용하여 CDR 영역을 확인하거나 또는 근사치를 낼 수 있다. 이러한 방법의 예는 카바트 정의, 코티아 정의, AbM 정의, 접촉 정의, 및 입체 형태적 정의를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
카바트 정의는 항체 중의 잔기를 넘버링하기 위한 표준이고 CDR 영역을 확인하기 위해 전형적으로 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Johnson & Wu, 2000, Nucleic Acids Res., 28: 214-8] 참조). 코티아 정의는 카바트 정의와 유사하지만, 코티아 정의는 특정의 구조적 루프 영역의 위치를 고려한다 (예를 들어, 문헌 [Chothia et al., 1986, J. Mol. Biol., 196: 901-17]; [Chothia et al., 1989, Nature, 342: 877-83] 참조). AbM 정의는 항체 구조를 모델로 하는 옥스포드 몰레큘라 그룹(Oxford Molecular Group)에 의해 생성된 컴퓨터 프로그램의 통합 도구를 이용한다 (예를 들어, 문헌 [Martin et al., 1989, Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272]; ["AbM™, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies," Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd.] 참조). AbM 정의는 지식 데이터베이스와 애초의 방법, 예컨대 문헌 (Samudrala et al., 1999, "Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach," in PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194-198)에 기재된 것과의 조합을 이용하여 1차 서열로부터 항체의 4차 구조를 모델로 한다. 접촉 정의는 입수 가능한 복합체 결정 구조의 분석에 기초하여다 (예를 들어, 문헌 [MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 5:732-45] 참조). 본원에서 CDR의 "입체 형태적 정의"로서 지칭된 또 다른 접근방식에서, 이러한 CDR의 위치는 항원 결합에 엔탈피 기여를 하는 잔기로서 확인될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166] 참조). 또한 기타 CDR 경계 정의가 상기 접근방식 중의 하나를 엄격하게 따를 수는 없지만, 그럼에도 불구하고 카바트 CDR의 적어도 일부와 중복될 것이지만, 이들은 특별한 잔기 또는 잔기 군이 항원 결합에 상당한 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견에 비추어 단축되거나 연장될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 특정 CDR은 관련 기술분야에 공지된 모든 접근방식 (접근방식의 조합을 포함함)에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 방법은 이들 접근방식 중 어느 것에 따라서 정의된 CDR을 활용할 수 있다. 둘 이상의 CDR을 함유하는 소정의 어떠한 실시양태에 대해서도, 이러한 CDR은 카바트, 코티아, 연장된, AbM, 접촉, 및/또는 입체 형태적 정의 중 어느 것에 따라서 정의될 수 있다.
항체 또는 이에 의해 특이적으로 결합된 항원을 기준으로 하여 본원에 사용된 바와 같은 "접촉 잔기"는 동족 항체/항원 상에 존재하는 아미노산 잔기의 중원자의 4 Å 이하 이내에 있는 하나 이상의 중원자 (즉, 수소가 아니다)를 포함하는 항체/항원 상에 존재하는 아미노산 잔기를 지칭한다.
관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 항체의 "불변 영역"은 단독으로 또는 조합하여, 항체 경쇄의 불변 영역 또는 항체 중쇄의 불변 영역을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적 항체 집단, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가, 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일한 집단으로부터 수득한 항체를 지칭한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 더욱이, 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대항하여 유도된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대항하여 유도된다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 형질을 표시하고, 특별한 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 추론되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용하고자 하는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256: 495]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 만들 수 있거나 또는 재조합 DNA 방법, 예컨대 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 방법에 의해 만들 수 있다. 모노클로날 항체는 또한, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554]에 기재된 기술을 이용하여 생성된 파지(phage) 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "인간화" 항체는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 쇄 또는 그의 단편 [예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 기타 항원 결합 하위서열]인 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 바람직하게, 인간화 항체는 수용자의 CDR로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로써 대체시킨 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 인간화 항체는 수용자 항체에서 발견되지 않거나 또는 수입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않지만, 항체 성능을 추가로 정련 및 최적화시키기 위해 포함되는 잔기를 포함할 수 있다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성되고/되거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체의 제조 기술 중 어느 것을 이용하여 제조한 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 이러한 인간 항체의 정의는 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특이적으로 배제한다.
용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 한 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열이 또 다른 종으로부터 유래되는 항체, 예컨대 가변 영역 서열이 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열이 인간 항체로부터 유래되는 항체를 지칭한다.
용어 "항원 (Ag)"은 이러한 Ag를 인식하는 항체 (Ab)를 생성하거나 또는 발현 라이브러리 (예를 들어, 특히 파지, 효모 또는 리보솜 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝하기 위하여 면역적격 척추동물의 면역을 위해 사용된 분자상 실체를 지칭한다. 본원에서, Ag는 보다 광범위하게 불리우고 일반적으로 Ab에 의해 특이적으로 인식되는 표적 분자를 포함하고자 하므로, Ab를 생성시키기 위한 면역 공정에 사용되거나 또는 Ab를 선별하기 위한 라이브러리 스크리닝에 사용된 분자의 단편 또는 모방체를 포함한다. 따라서, PDGF-B와 결합하는 본 발명의 항체의 경우에는, 포유동물 종으로부터의 전장 PDGF-B (예를 들어, 인간, 마우스 및 래트 PDGF-B) (그의 단량체와 이량체 둘 다 포함함) 뿐만 아니라 PDGF-B의 절단된 변이체 및 기타 변이체가 항원으로서 지칭된다.
일반적으로, 용어 "에피토프"는 항체와 특이적으로 결합되는 항원의 부위 또는 영역, 즉 항체와 물리적으로 접촉되는 부위 또는 영역을 지칭한다. 따라서, 용어 "에피토프"는 항체의 항원 결합 영역 중 하나 이상에서 이러한 항체에 의해 인식되고 결합될 수 있는 분자의 그 부분을 지칭한다. 전형적으로, 에피토프는 "항체 또는 그의 항원 결합 단편" (Ab)과 그의 상응하는 항원 간의 분자 상호 작용의 맥락에서 정의된다. 에피토프는 종종, 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 표면 집단으로 이루어지고 특이적 3차원 구조적 특징뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 지니고 있다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 단백질 에피토프일 수 있다. 단백질 에피토프는 선형이거나 입체 형태적일 수 있다. 선형 에피토프에서, 단백질과 상호 작용하는 분자 (예컨대, 항체) 간의 상호 작용 지점 모두는 이러한 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 존재한다. "비선형 에피토프" 또는 "입체 형태적 에피토프"는 이러한 에피토프에 대해 특이적인 항체와 결합하는 항원성 단백질 내의 비연속성 폴리펩티드 (또는 아미노산)를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항원성 에피토프"는 관련 기술분야에 널리 공지된 모든 방법, 예를 들어 통상적인 면역검정에 의해서 결정된 바와 같이, 항체와 특이적으로 결합될 수 있는 항원의 특정 부분으로서 정의된다. 항원 상의 목적하는 에피토프가 일단 결정되면, 예를 들어 본 명세서에 기재된 기술을 이용하여 상기 에피토프에 대한 항체를 생성시키는 것이 가능하다. 또 다른 한편으론, 디스커버리 과정 동안, 항체의 생성 및 특징 확인으로 인해, 목적하는 에피토프에 관한 정보를 밝혀낼 수 있다. 이러한 정보로부터, 동일한 에피토프에 대한 결합을 알아보기 위해 항체를 경쟁적으로 스크리닝하는 것이 가능하다. 이를 달성하기 위한 한 접근방식은 PDGF-B와의 결합에 대해 서로 경쟁하거나 교차 경쟁하는 항체, 예를 들어 항원과의 결합에 대해 경쟁하는 항체를 밝혀내기 위해 경쟁 및 교차 경쟁 연구를 수행하는 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "야생형 아미노산", "야생형 IgG", "야생형 항체" 또는 "야생형 mAb"는 특정의 집단 (예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 세포 등) 내에서 자연적으로 존재하는 아미노산 또는 핵산의 서열을 지칭한다.
본원의 다른 곳에 요약된 바와 같이, 항체 분자의 특정의 위치를 변경시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "위치"란 특정 단백질의 서열 내의 위치를 의미한다. 위치는 순차적으로 또는 정립된 포맷에 따라서 넘버링될 수 있는데, 예를 들어 EU 인덱스 및 카바트 인덱스를 사용하여 항체의 아미노산 잔기를 넘버링할 수 있다. 예를 들어, 위치 297은 인간 항체 IgG1 내에서의 위치이다. 상응하는 위치는 일반적으로 다른 모 서열과의 정렬을 통하여 상기 언급된 바와 같이 결정된다.
본원에 사용된 바와 같은 "잔기"란 단백질 내의 특정 위치 및 그의 관련 아미노산 실체를 의미한다. 예를 들어, 아스파라긴 297 (Asn297로서 지칭되기도 함, 또한 N297로서 지칭됨)은 인간 항체 IgG1 내의 잔기이다.
용어 "길항제 항체"는 표적과 결합하고 이러한 표적의 생물학적 효과를 방지 또는 저하시키는 항체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 용어는 이와 결합되는 표적, 예를 들어 PDGF-B가 생물학적 기능 (예를 들어, 그의 동족 수용체 PDGFR-αα, PDGFRαβ, 및 PDGFRββ와의 결합)을 수행하지 못하게 하는 항체를 의미할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "PDGF-B 길항제 항체"는 PDGF-B 생물학적 활성을 억제할 수 있거나 또는 PDGF-B를 포함하는 동종-이량체 또는 이종-이량체 (예를 들어, PDGF-AB 및 PDGF-BB)의 활성 및/또는 PDGF-B에 의해 매개되는 하류 현상(들) (이는 그의 동족 티로신 키나제 수용체와 결합하는 활성 및 신호 전달을 매개함으로써, 특히 세포 증식, 이동 및/또는 세포외 매트릭스 침착을 유발시키는 활성을 포함하지만, 그에 제한되지 않는다)을 억제할 수 있는 항체를 지칭한다. PDGF-B 길항제 항체는 PDGF-B 생물학적 활성 (이는 PDGF-B에 의해 매개되는 하류 현상, 예컨대 PDGF 수용체 결합 및 하류 신호 전달, 세포 증식 및 세포 이동의 유도를 포함한다)을 어느 정도 (상당한 정도 포함) 차단, 길항, 억제 또는 저하시키는 항체를 포괄한다. 본 발명의 목적상, 용어 "PDGF-B 길항제 항체" (용어 "길항제 PDGF-B 항체", "길항제 항-PDGF-B 항체", "항-PDGF-B 길항제 항체", "길항제 PDGF-BB 항체", "길항제 항-PDGF-BB 항체", "항-PDGF-BB 길항제 항체", "길항제 PDGF-AB 항체", "길항제 항-PDGF-AB 항체" 또는 "항-PDGF-AB 길항제 항체"와 상호 교환 가능하다)는 앞서 확인된 용어, 표제, 및 기능적 상태 및 특징 모두를 포괄함으로써, PDGF-B 자체, PDGF-B 생물학적 활성 (수용체와 결합할 수 있는 그의 능력, 및 세포 증식을 유도시킬 수 있는 그의 능력을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다), 또는 이러한 생물학적 활성에 따른 결과를 의미 있는 어떠한 정도로도 실질적으로 무효화시키거나, 감소시키거나 또는 중화시킨다는 것을 명쾌하게 이해해야할 것이다. 일부 실시양태에서, PDGF-B 항체는 PDGF-B와 결합하고 PDGFRβ에 대한 그의 결합을 방지한다. 일부 실시양태에서, 상기 길항제 활성은 세포 성장 검정을 통하여 명확히 규명되고/되거나 기재된다. 일부 실시양태에서, 길항제 능력은 IC50 또는 EC50 값으로 기재된다. PDGF-B 항체의 예가 본원에 제공되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "PDGFRβ"는 하나 이상의 PDGFRβ 폴리펩티드 쇄를 포함하는 수용체를 포괄한다. 즉, 본원에 사용된 바와 같은 PDGFRβ는 단일 PDGFRβ 폴리펩티드 쇄 뿐만 아니라 PDGFRββ 동종-이량체 및 PDGFRαβ 이종-이량체를 포함한다.
용어 "폴리펩티드", "올리고펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 모든 길이의 아미노산의 쇄를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 이 쇄는 선형 또는 분지될 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고/있거나 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어는 또한, 자연적으로 또는 간섭에 의해, 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 변형시킨 아미노산 쇄를 포괄한다. 또한 상기 정의 내에는, 예를 들어 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 비자연 아미노산 등을 포함함) 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 기타 변형물을 함유하는 폴리펩티드가 포함된다. 폴리펩티드는 단일 쇄로서 또는 연합 쇄로서 존재할 수 있는 것으로 이해된다.
관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 본원에서 상호 교환적으로 사용된 바와 같은 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 모든 길이의 뉴클레오티드 쇄를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 쇄 내로 혼입될 수 있는 모든 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 쇄의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후에, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 기타 유형의 변형물은, 예를 들어 "캡", 자연 발생 뉴클레오티드 중 하나 이상을 유사체로 치환한 것, 뉴클레오티드간 변형물, 예컨대 전하를 띠지 않은 연쇄 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등)를 수반한 변형물 및 하전된 연쇄 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)를 수반한 변형물, 펜던트 부분, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 변형물, 삽입제 (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)를 수반한 변형물, 킬레이트제 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 변형물, 알킬화제를 함유하는 변형물, 변형된 연쇄 (예를 들어, 알파 아노머성 핵산 등)를 수반한 변형물뿐만 아니라 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함한다. 추가로, 당에 통상적으로 존재하는 어떠한 히드록실 기도, 예를 들어 포스포네이트 기, 포스페이트 기에 의해 대체될 수 있거나, 표준 보호 기에 의해 보호될 수 있거나, 부가의 뉴클레오티드에 대한 부가의 연쇄를 제조하기 위해 활성화될 수 있거나, 또는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화될 수 있거나, 또는 1 내지 20개 탄소 원자의 유기 캡핑 기 부분 또는 아민으로 치환될 수 있다. 다른 히드록실이 또한 표준 보호 기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한, 관련 기술분야에 일반적으로 공지되어 있는 유사한 형태의 리보스 또는 데옥시리보스 당을 함유할 수 있는데, 이는 예를 들어, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, 알파- 또는 베타-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 크실로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 아시클릭 유사체 및 무염기성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 포함한다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연쇄를 또 다른 연결성 기로써 대체할 수 있다. 이들 또 다른 연결성 기는 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") (여기서, R 또는 R'는 각각 독립적으로, H이거나 또는 에테르 (-O-) 연쇄를 임의로 함유하는 치환되거나 치환되지 않은 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알킬이다)에 의해 대체되는 실시양태를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연쇄가 동일한 필요는 없다. 앞서의 설명은 본원에 지칭된 모든 폴리뉴클레오티드 (RNA 및 DNA 포함)에 적용된다.
본원에 사용된 바와 같은, 항체는 본원의 실시예 6 및 8에 개시된 방법에 의해 측정된 바와 같이 평형 해리 상수가 100 pM 이하, 바람직하게 약 69 pM 미만, 보다 바람직하게 약 50 pM 미만, 가장 바람직하게 약 30 pM 미만, 보다 바람직하게 약 20 pM 미만, 보다 더 바람직하게 약 15 pM 미만, 보다 더 바람직하게 약 10 pM 미만, 보다 더 바람직하게 약 4 pM 미만, 보다 바람직하게 약 2 pM 미만인 경우에, PDGF-B와 "상호 작용한다". 한 실시양태에서, 항체는 KD가 약 69 pM 내지 약 2 pM의 범위인 경우에 PDGF-B와 상호 작용한다. 한 실시양태에서, 항체는 약 10 pM의 KD로 PDGF-B와 상호 작용한다.
특정 에피토프와 "우선적으로 결합"하거나 또는 "특이적으로 결합"하는 (본원에서 상호 교환적으로 사용된다) 항체는 관련 기술분야에서 널리 이해되는 용어이고, 이러한 특이적 결합 또는 우선적 결합을 결정하는 방법 또한, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 특정 분자는 이것이 또 다른 세포 또는 물질과의 경우에서 보다 더 자주, 더 신속하게, 더 큰 지속성으로 및/또는 더 큰 친화도로 특정 세포 또는 물질과 반응하거나 연합되는 경우에 "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타내는 것으로 여겨진다. 특정 항체는 이것이 다른 물질과 결합하는 것 보다 더 큰 친화도, 결합 활성도로, 보다 신속하게 및/또는 더 큰 지속성으로 결합하는 경우에 특정 표적과 "특이적으로 결합"하거나 또는 "우선적으로 결합"된다. 예를 들어, PDGF-B 에피토프와 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는, 다른 PDGF-B 에피토프 또는 비-PDGF-B 에피토프와 결합하는 것 보다 더 큰 친화도, 결합 활성도로, 더 신속하게 및/또는 더 큰 지속성으로 상기 PDGF-B 에피토프와 결합하는 항체이다. 또한, 본 정의를 판독함으로써, 예를 들어 제1 표적과 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체 (또는 부분 또는 에피토프)가 제2 표적과 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"이 반드시 독점적 결합을 요구하지는 않는다 (이러한 독점적 결합을 포함할 수도 있지만). 일반적이긴 하지만, 반드시는 아니게, 결합에 대한 언급은 우선적 결합을 의미한다. "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 특이적 분자를 인식하고 이와 결합하지만, 샘플 중의 다른 분자는 실질적으로 인식하지 않거나 결합하지 않는 화합물, 예를 들어 단백질, 핵산, 항체 등을 포함한다. 예를 들어, 샘플 중의 동족 리간드 또는 결합 파트너 (예를 들어, 종양 항원과 결합하는 항-인간 종양 항원 항체)를 인식하고 이와 결합하지만, 샘플 중의 다른 분자는 실질적으로 인식하지 않거나 이와 결합하지 않는 항체 또는 펩티드 수용체는 그러한 동족 리간드 또는 결합 파트너와 특이적으로 결합한다. 따라서, 지정된 검정 조건 하에서, 명시된 결합 부분 (예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 또는 수용체 또는 그의 리간드 결합 부분)은 특별한 표적 분자와 우선적으로 결합하고, 시험 샘플에 존재하는 다른 성분과는 상당한 양으로 결합하지 않는다.
각종 검정 포맷을 사용하여 관심 분자와 특이적으로 결합하는 항체 또는 펩티드를 선별할 수 있다. 특정 항원 또는 수용체와 특이적으로 반응하는 항체, 또는 동족 리간드 또는 결합 파트너와 특이적으로 결합하는 그의 리간드 결합 부분을 확인하는데 사용될 수 있는 많은 검정 중에서 특히, 예를 들어 고체 상 ELISA 면역검정, 면역침전, 비아코어(BIAcore™) [GE 헬스케어 (GE Healthcare; 미국 뉴저지주 피스카타웨이)], 형광-활성화 세포 분류 (FACS), 옥테트(Octet™) [포르테바이오, 인크. (ForteBio, Inc.; 미국 캘리포니아주 멘로 파크)] 및 웨스턴 블롯(Western blot) 분석이 있다. 전형적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 배경 신호 또는 소음의 2배 이상, 보다 전형적으로 배경의 10배 초과일 것이며, 보다 더 구체적으로 언급하면, 평형 해리 상수 (KD)가 ≤ 1 μM, 바람직하게 ≤ 100 nM, 보다 바람직하게 ≤ 10 nM, 보다 더 바람직하게, ≤ 100 pM, 또한 더 바람직하게, ≤ 10 pM, 보다 더 바람직하게, ≤ 1 pM인 경우에, 특정 항체는 항원과 "특이적으로 결합"하는 것으로 여겨진다.
용어 "결합 친화도"는 두 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 단편과 항원 간의 비-공유적 상호 작용의 강도에 관한 측정기준으로서 본원에 사용된다. 용어 "결합 친화도"는 1가 상호 작용 (고유의 활성)을 언급하기 위해 사용된다.
1가 상호 작용을 통한 두 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 단편과 항원 간의 결합 친화도는 해리 상수 (KD)를 결정함으로써 정량화할 수 있다. 결국, KD는, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 (SPR) 방법 (비아코어)에 의해 복합체 형성 및 해리의 동역학을 측정함으로써 결정할 수 있다. 1가 복합체의 연합 및 해리에 상응하는 속도 상수는 각각 연합 속도 상수 k a (또는 k on ) 및 해리 속도 상수 k d (또는 k off )로서 지칭된다. KD는 방정식 KD = k d /k a 을 통한 k a 및 k d 에 관한 것이다.
상기 정의에 따라서, 상이한 분자 상호 작용과 연관된 결합 친화도, 예를 들어 소정의 항원에 대한 상이한 항체의 결합 친화도의 비교는 개개의 항체/항원 복합체에 대한 KD 값을 비교함으로써 비교할 수 있다. 항체 또는 기타 결합 파트너에 대한 KD 값은 관련 기술분야에 널리 정립된 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 KD를 결정하기 위한 한 가지 방법은, 전형적으로 바이오센서 시스템 (예컨대, 비아코어® 시스템)을 이용하여, 표면 플라스몬 공명을 사용하는 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, "실질적으로 순수한"은 50% 이상 순수한 (즉, 오염물질이 없다), 보다 바람직하게 90% 이상 순수한, 보다 바람직하게 95% 이상 순수한, 보다 더 바람직하게 98% 이상 순수한, 가장 바람직하게 99% 이상 순수한 물질을 지칭한다.
"숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드 삽입물의 혼입을 위해 벡터(들)에 대한 수용체일 수 있거나 또는 이러한 수용체였던 개개의 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 이러한 자손은 자연적, 우발적 또는 고의적 돌연변이로 인해 본래의 모 세포와 (형태학적 또는 게놈 DNA 보체 측면에서) 반드시 완벽하게 동일하지 않을 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)로 생체 내에서 형질감염된 세포를 포함한다.
관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 용어 "Fc 영역"은 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 이러한 "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 다양할 수도 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로, 위치 Cys226에서의 아미노산 잔기로부터 또는 Pro230으로부터 그의 카르복실-말단까지 연장되는 것으로 정의된다. Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스의 넘버링이다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). 이뮤노글로불린의 Fc 영역은 일반적으로, 2개의 불변 도메인, 즉 CH2 및 CH3을 포함한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, Fc 영역은 이량체 또는 단량체 형태로 존재할 수 있다.
관련 기술분야에 사용된 바와 같이, "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역과 결합하는 수용체를 언급한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 더욱이, 바람직한 FcR은 IgG 항체와 결합하는 것이고 (감마 수용체), FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 아부류의 수용체를 포함하는데, 이는 이들 수용체의 대립 유전자성 변이체, 및 교대로 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제성 수용체")를 포함하는데, 이는 그의 세포질성 도메인에 있어서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. FcR은 다음 문헌에서 검토된다 (Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34; 및 de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41). "FcR"은 또한, 모계 IgG를 태아에게 전이시키는 데에 책임이 있는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다 (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; 및 Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).
항체와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "경쟁하는"은 제1 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 결합과 충분히 유사한 방식으로 에피토프와 결합하여, 제1 항체와 그의 동족 에피토프와의 결합에 따른 결과가 제2 항체의 부재 하에서의 제1 항체의 결합과 비교해서, 제2 항체의 존재 하에서 검출 가능한 수준으로 감소되는 것을 의미한다. 제2 항체와 그의 에피토프와의 결합이 또한, 제1 항체의 존재 하에서 검출 가능한 수준으로 감소되는 또 다른 방식도 이에 해당될 수 있지만, 반드시 그렇지는 않다. 즉, 제2 항체가 제1 항체와 그의 각각의 에피토프와의 결합을 억제하지 않으면서, 제1 항체가 이러한 제2 항체와 그의 에피토프와의 결합을 억제할 수 있다. 그러나, 각 항체가 다른 항체와 그의 동족 에피토프 또는 리간드와의 결합을 검출 가능한 수준으로 억제하는 경우, 억제 정도가 동일한지, 보다 큰지 아니면 보다 적은지 간에, 이러한 항체는 그들의 각각의 에피토프(들)와의 결합에 대해 서로 "교차 경쟁"하는 것으로 여겨진다. 경쟁적 항체와 교차 경쟁적 항체 둘 다가 본 발명에 포괄된다. 이러한 경쟁 또는 교차 경쟁이 일어나는 기전 (예를 들어, 입체 장애, 입체 형태적 변화, 또는 공통의 에피토프 또는 그의 일부와의 결합)에 상관없이, 통상의 기술자는 본원에 제공된 교시에 근거하여, 이러한 경쟁적 및/또는 교차 경쟁적 항체가 포괄되고 본원에 개시된 방법에 유용할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 한 가지 이상의 이펙터 기능을 보유하고 있다. 예시되는 "이펙터 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성; 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능을 위해서는 일반적으로, Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 합해야만 하고, 이는 상기 항체 이펙터 기능을 평가하는 것으로 관련 기술분야에 공지된 각종 검정을 이용하여 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연계에서 발견된 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 1개 이상의 아미노산 변형을 통하여 천연 서열 Fc 영역과는 상이한 아미노산 서열을 포함하지만, 천연 서열 Fc 영역의 한 가지 이상의 이펙터 기능을 보유하고 있다. 바람직하게, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교해서 1개 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환을 갖고, 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과의 서열 동일률이 바람직하게 약 80% 이상, 가장 바람직하게 약 90% 이상, 보다 바람직하게 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상일 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, "처치"는 유리하거나 목적하는 임상 결과를 수득하기 위한 접근방식이다. 본 발명의 목적상, 유리하거나 목적하는 임상 결과는 다음 중 한 가지 이상을 포함하지만, 그에 제한되지 않는다: 생존율 개선 (사망률 저하), 질환에 대한 염증 반응의 감소, 조직 섬유증의 양 감소, 질환 병변의 외관 상의 개선, 병소에 대한 병리학적 병변의 제한, 질환으로부터의 손해 정도 감소, 질환의 지속 기간 감소, 및/또는 질환과 관련된 증상의 수, 정도 또는 지속 기간 감소. 상기 용어는 질환의 증상, 합병증 또는 생화학적 표시의 개시를 방지 또는 지연시키거나, 증상을 경감시키거나, 또는 질환, 상태 또는 장애의 추가 발생을 저지 또는 억제하기 위해 본 발명의 화합물 또는 작용제를 투여하는 것을 포함한다. 처치는 예방적일 수 있거나 (질환의 개시를 방지 또는 지연시키기 위해, 또는 그의 임상적 또는 준임상적 증상의 징후를 방지하기 위함) 또는 질환의 징후 후 증상의 치료적 억제 또는 경감일 수 있다.
"완화시키는" 것은 PDGF-B 항체를 투여하지 않은 것과 비교해서 한 가지 이상의 증상을 개선시키거나 약화시키는 것을 의미한다. "완화시키는" 것은 또한, 증상의 지속 기간을 단축시키거나 감소시키는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 "유효 투여량" 또는 "유효량"은 한 가지 이상의 유리하거나 목적하는 어떠한 결과에도 영향을 미치기에 충분한 양이다. 보다 구체적인 측면에서, 유효량은 질환 또는 감염의 증상을 방지, 경감 또는 완화시켜 주고/주거나 치료하고자 하는 대상체의 생존을 연장시켜 준다. 예방적으로 사용하는 경우, 유리하거나 목적하는 결과는 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 행동적 증상을 포함한 질환, 그의 합병증 및 질환의 발생 동안 제시되는 중간 병리학적 표현형에 따른 위험을 제거 또는 저하시키는 것, 그의 중증도를 약화시키는 것, 또는 그의 개시를 지연시키는 것을 포함한다. 치료적으로 사용하는 경우, 유리하거나 목적하는 결과는 PDGF-B 매개된 질환, 장애 또는 상태의 한 가지 이상의 증상을 저하시키고/시키거나, 이러한 질환을 치료하기 위해 요구되는 다른 의약의 용량을 감소시키고/시키거나, 또 다른 의약의 효과를 증강시키고/시키거나 환자의 질환 진행을 지연시키는 것과 같은 임상 결과를 포함한다. 유효 투여량은 1회 이상의 투여로 투여할 수 있다. 본 발명의 목적상, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효 투여량은 직접 또는 간접적으로 예방적 또는 치료적 처치를 달성하기에 충분한 양이다. 임상 맥락에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효 투여량은 또 다른 약물, 화합물 또는 제약 조성물과 연계해서 달성될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 따라서, "유효 투여량"은 한 가지 이상의 치료제를 투여하는 맥락에서 고려될 수 있고, 단일 작용제는 이것이 한 가지 이상의 다른 작용제와 연계해서 목적하는 결과를 달성할 수 있거나 달성하는 경우에, 유효량으로 제공되는 것으로 간주될 수 있다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물, 보다 바람직하게 인간이다. 포유동물는 또한, 농장 동물 (예를 들어, 암소, 돼지, 말, 닭 등), 스포츠 동물, 애완용 동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 이러한 개체는 PDGF-B의 수용체에 대한 PDGF-B 결합 및 이에 의해 매개되는 신호 전달에 의해 매개되거나 또는 이와 연관된 질환, 장애 또는 상태에 걸릴 위험이 있는 것으로 간주된다.
본원에 사용된 바와 같은, "벡터"는 숙주 세포에 하나 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있고, 바람직하게는 이들을 발현할 수 있는 구조물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스성 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 연합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜 내에 피막화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정의 진핵 세포, 예컨대 생산자 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, "발현 제어 서열"은 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 제어 서열은 프로모터, 예컨대 구성적 또는 유도성 프로모터, 또는 증강인자일 수 있다. 발현 제어 서열은 전사하고자 하는 핵산 서열과 작동적으로 연결된다.
본원에 사용된 바와 같은, "제약상 허용되는 담체" 또는 "제약상 허용되는 부형제"는 활성 성분과 조합되는 경우에, 이러한 성분이 생물학적 활성을 보존할 수 있도록 해주고 대상체의 면역계와 비-반응성인 모든 물질을 포함한다. 그의 예는 모든 표준 제약 담체, 예컨대 인산염 완충 식염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 및 각종 유형의 습윤제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여용으로 바람직한 희석제는 인산염 완충 식염수 (PBS) 또는 정상 (0.9%) 식염수이다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 제제화된다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990]; 및 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000] 참조).
본원에서 특정 값 또는 파라미터의 "약"에 대한 언급은 이러한 값 또는 파라미터 그 자체에 대한 실시양태를 포함한다 (기재한다). 예를 들어, "약 X"에 대한 기재는 "X"의 기재를 포함한다. 수치 범위는 이러한 범위를 규정하는 수를 포함한다.
본 발명의 넓은 범위를 제시하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 구체적 실시예에 제시된 수치는 가능한 한 정확하게 보고되어 있다. 그러나, 모든 수치는 본질적으로, 그 각각의 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로부터 필수적으로 발생하는 특정의 오차를 함유하고 있다. 더욱이, 본원에 개시된 모든 범위는 그에 포함된 모든 부분 범위를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, "1 내지 10"으로 언급된 범위는 1의 최소 값과 10의 최대 값 사이 (그 자체도 포함한다)의 모든 부분 범위를 포함하는 것으로 간주되어야 하는데; 즉, 1 또는 그 초과의 최소 값, 예를 들어 1 내지 6.1로 시작하여 10 또는 그 미만의 최대 값, 예를 들어 5.5 내지 10으로 끝나는 모든 부분 범위를 포함한다.
실시양태가 "포함하는"이란 언어와 함께 본원에 기재되는 모든 경우에, "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"과 관련하여 기재된 다른 유사한 실시양태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.
본 발명의 측면 또는 실시양태를 대체물의 마쿠쉬(Markush) 군 또는 기타 집단과 관련해서 기재하는 경우, 본 발명은 전체로서 열거된 전체 군 뿐만 아니라 이러한 군의 개별적 각 구성원 및 주요 군의 가능한 모든 아군 (또한, 상기 군 구성원 중 하나 이상이 존재하지 않는 주요 군)을 포괄한다. 본 발명은 또한, 청구된 본 발명의 군 구성원 중 어느 것의 하나 이상을 명시적으로 배제하는 것을 예상한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명의 속하는 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 분쟁이 생기는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 사용된 용어 "포함하다" 또는 그의 변형, 예컨대 "포함한다" 또는 "포함하는"은 명시된 정수 또는 정수의 군을 포함할 수 있지만 다른 정수나 정수의 군을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함해야 하고, 복수 용어는 단수를 포함해야 한다. 용어 "예를 들어" 다음의 예(들)는 소모적이거나 제한적인 것을 의미하지 않는다.
예시되는 방법 및 물질이 본원에 기재되긴 하지만, 본원에 기재된 바와 유사하거나 등가의 방법 및 물질이 또한, 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 이러한 물질, 방법 및 예는 단지 예시적이고, 제한적이지 않다.
PDGF -B 항체
본 발명은 단량체성 및/또는 이량체성 PDGF-B와 결합하는 항체에 관한 것이다. 이러한 항체는 바람직하게, PDGF-B와 특이적으로 결합하는데, 즉 PDGF-B와는 결합하지만, 다른 분자와는 검출 가능한 수준으로 결합하지 않거나 보다 낮은 친화도로 결합한다. 특히, 본 발명은 PDGF-B와 결합하고 그의 활성을 조정하는 항체에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 동족 PDGFRβ 수용체 (PDGFRαβ, PDGFRββ, 및 PDGFRβ-IgG1)에 대한 PDGF-B의 결합을 감소 또는 억제시킴으로써 수용체 신호 전달을 저하 또는 억제할 수 있는 능력을 지닐 수 있다. 본 발명은 또한, 이러한 항체를 포함하는 조성물뿐만 아니라 치료적 및 제약 용도를 포함한, 상기 항체에 대한 용도에 관한 것이다.
용어 "PDGF-B"란 적합한 어떠한 유기체로부터도 유래될 수 있는, 단량체성 또는 이량체성의 모든 자연 발생 형태의 PDGF-B를 의미한다. 상기 용어는 PDGF-B를 포함하는 모든 이량체, 즉 PDGF-AB 및 PDGF-BB를 포괄한다. 본원에 사용된 바와 같은, "PDGF-B"는 포유동물 PDGF-B, 예컨대 인간, 래트 또는 마우스뿐만 아니라 비-인간 영장류, 소, 양 또는 돼지의 PDGF-B를 지칭한다. 바람직하게, PDGF-B는 인간이다. 용어 "PDGF-B"는 또한, 상기 PDGF-B 분자의 단편, 변이체, 이소형, 및 기타 상동체를 포괄한다. 변이체 PDGF-B 분자는 일반적으로, 자연 발생 PDGF-B와 동일한 유형의 활성, 예컨대 PDGFRβ와 결합할 수 있는 능력, 이러한 수용체의 인산화를 유도시킬 수 있는 능력, 상기 수용체에 의한 신호 전달을 매개할 수 있는 능력, 세포 이동 또는 증식을 유도시킬 수 있는 능력, 및 세포외 매트릭스의 침착을 유도 또는 증가시킬 수 있는 능력을 갖는 것을 특징으로 할 것이다.
본 발명의 항체는 PDGF-B (즉, PDGF-B, PDGF-AB 및 PDGF-BB)와 특이적으로 결합하고, 이와 PDGFRβ, 예를 들어 PDGFRββ 및 PDGFRαβ의 상호 작용을 억제함으로써, PDGF-B 활성을 억제한다. 본원에서 상호 교환적으로 사용된 바와 같은 용어 "PDGF-B 매개된 활성", "PDGF-B 매개된 효과", "PDGF-B 활성", "PDGF-B 생물학적 활성" 또는 "PDGF-B 기능"은 PDGF-B와 동족 수용체와의 상호 작용에 의해 매개되는 모든 활성을 의미하는데, 이는 PDGFRβ에 대한 PDGF-B 결합, PDGFRβ의 인산화, 세포 이동 상의 증가, 세포 증식 상의 증가, 세포외 매트릭스 침착 상의 증가, 및 관련 기술분야에 공지되어 있거나 또는 나중에 밝혀질 PDGF-B의 다른 모든 활성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
따라서, 본 발명의 방법은 PDGF-B에 의해 매개되는 하류 현상을 포함한 PDGF-B 활성을 차단, 억제 또는 저하시키는 (상당히 저하시키는 것을 포함함) 본 발명의 항체를 이용한다. 본 발명의 PDGF-B 항체는 다음 특징들 중 한 가지 이상을 나타내야 한다: (a) PDGF-B와 특이적으로 결합하는 특징; (b) PDGF-B와 세포 표면 수용체와의 상호 작용 및 하류 신호 전달 현상을 차단시키는 특징; (c) PDGFRβ의 인산화를 차단시키는 특징; (d) 세포 증식의 PDGF-B 매개된 유도를 차단시키는 특징; (e) 세포 이동의 유도를 차단시키는 특징; 및 (f) 세포외 매트릭스의 PDGF-B 매개된 침착을 차단 또는 저하시키는 특징.
본 발명의 목적상, 상기 항체는 바람직하게, PDGF-B와 세포 표면 수용체, 예를 들어 PDGFRαβ 및 PDGFRββ의 상호 작용을 차단시키는 방식으로 PDGF-B와 반응한다.
본 발명에 유용한 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 키메라 항체, 이중-특이적 항체, 이종-접합성 항체, 단일 쇄 (ScFv), 그의 돌연변이체, 특정 항체 부분 (예를 들어, 도메인 항체)을 포함하는 융합 단백질, 인간화 항체, 및 요구된 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 이뮤노글로불린 분자의 다른 모든 변형된 입체 배치 (항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체, 및 공유적으로 변형된 항체 포함)를 포괄할 수 있다. 항체는 뮤린, 래트, 인간, 또는 다른 모든 기원 (키메라 또는 인간화 항체 포함)일 수 있다. 일부 실시양태에서, PDGF-B 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 또는 인간화 항체이다.
본 발명의 PDGF-B 항체는 관련 기술분야에 공지된 어떠한 방법에 의해서도 만들 수 있다. 인간 및 마우스 항체를 생성하기 위한 일반적 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있고/있거나 본원에 기재되어 있다.
PDGF-B 항체는 관련 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 확인하거나 명확히 규명할 수 있음으로써, PDGF-B 활성의 저하, 완화 또는 중화를 검출하고/하거나 측정한다. 일부 실시양태에서, PDGF-B 항체는 후보 작용제 (예를 들어, PDGFRββ 또는 PDGFRβ-IgG1)를 PDGF-B와 함께 인큐베이션하고, PDGF-B의 결합 및/또는 PDGF-B의 생물학적 활성의 부수적인 저하 또는 억제를 모니터링함으로써 확인한다. 결합 검정은, 예를 들어 정제된 PDGF-B 폴리펩티드(들)를 이용하여 수행하거나 또는 각종 수용체를 자연적으로 발현하는 세포 또는 PDGF-B 수용체를 발현하도록 형질감염시킨 세포를 이용하여 수행할 수 있다. 한 실시양태에서, 결합 검정은 PDGF-B 결합을 놓고 공지된 PDGF-B 항체와 경쟁할 수 있는 후보 항체의 능력을 평가하는 경쟁적 결합 검정이다. 이러한 검정은 ELISA 포맷을 포함한 각종 포맷으로 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, PDGF-B 항체는 후보 항체를 PDGF-B와 함께 인큐베이션하고, 결합을 모니터링함으로써 확인한다. 일부 실시양태에서, PDGF-B는 후보 항체 (예를 들어, 인간 항-PDGF-B 항체)를 PDGF-B와 함께 인큐베이션하고, PDGF-B에 대한 제2의 PDGF-B 항체 (예를 들어, 비-인간 불변 영역을 포함하는 PDGF-B 항체)의 결합을 모니터링하여 한 항체가 PDGF-B의 결합에 대해 제2의 항체와 경쟁하는 지를 평가함으로써 확인한다.
초기 확인 후, 후보 PDGF-B 항체의 활성을, 표적화된 생물학적 활성을 시험하는 것으로 공지된 생물학적 검정에 의해 추가로 확인 및 제련할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시험관내 세포 검정을 이용하여 후보 PDGF-B 항체를 추가로 명확히 규명한다. 예를 들어, 후보 항체를 PDGF-B와 함께 인큐베이션하고, 수용체의 세포외 도메인을 포함하는 가용성 PDGFRβ (예를 들어, PDGFRβ-IgG1) 또는 제2의 PDGF-B 항체를 가하며, 이러한 제2의 항체 또는 가용성 수용체에 의한 PDGF-B의 결합을 모니터링한다. 또 다른 한편으론, 생물학적 검정을 이용하여 후보물을 직접적으로 스크리닝할 수 있다. PDGF-B 항체를 확인하고 명확히 규명하기 위한 일부 방법은 본 실시예에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 PDGF-B 항체는 다음 특징들 중 한 가지 이상을 나타낸다: (a) PDGF-B와 특이적으로 결합하는 특징; (b) PDGF-B와 세포 표면 수용체의 상호 작용 및 하류 신호 전달 현상을 차단시키는 특징; (c) 세포 증식 또는 이동의 PDGF-B 매개된 유도를 차단시키는 특징; 및 (d) 세포외 매트릭스의 PDGF-B 매개된 침착을 차단 또는 저하시키는 특징. 바람직하게, 본 발명의 PDGF-B 항체는 이들 특색 중 2 가지 이상을 갖는다. 보다 바람직하게, 상기 항체는 이들 특색 중 3가지 이상을 갖는다. 보다 바람직하게, 상기 항체는 4가지 모든 특징을 갖는다.
PDGF-B 항체는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 명확히 규명할 수 있다. 예를 들어, 한 가지 방법은 항체와 결합하는 에피토프를 확인하는 것이거나 또는 "에피토프 맵핑" 방법이다. 단백질 상의 에피토프의 위치를 맵핑하고 명확히 규명하기 위해 관련 기술분야에 공지된 많은 방법이 있는데, 이는, 예를 들어 문헌 (Chapter 11 of Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999)에 기재된 바와 같은, 항체-항원 복합체의 결정 구조를 해석하는 방법, 경쟁 검정, 유전자 단편 발현 검정, 및 합성 펩티드-기반 검정을 포함한다. 부가 예에서는, 에피토프 맵핑을 이용하여 PDGF-B 항체와 결합하는 서열을 결정할 수 있다. 에피토프 맵핑은 각종 공급처, 예를 들어 펩스캔 시스템즈 (Pepscan Systems; 네덜란드 PH 렐리스타트 8219 에델헤르트베크 15)로부터 시판되고 있다. 에피토프는 선형 에피토프, 즉 아미노산의 단일 연장물에 함유된 에피토프, 또는 반드시 단일 연장물에 함유되지 않을 수 있는 아미노산의 3차원 상호 작용에 의해 형성된 입체 형태적 에피토프일 수 있다. 다양한 길이 (예를 들어, 4 내지 6개 이상의 아미노산 길이)의 펩티드를 단리 또는 합성할 수 있고 (예를 들어, 재조합적으로 합성함), 이를 PDGF-B 항체와의 결합 검정에 사용할 수 있다. 또 다른 예에서, PDGF-B 항체와 결합하는 에피토프는 PDGF-B 서열로부터 유래된 중복 펩티드를 사용하고 이러한 항체에 의한 결합을 결정함으로써 체계적으로 스크리닝하는 데에서 결정할 수 있다. 유전자 단편 발현 검정에 따르면, PDGF-B를 코딩하는 개방 판독 프레임을 무작위로 또는 특이적 유전적 구축에 의해 단편화할 수 있고, PDGF-B의 발현된 단편과 시험하고자 하는 항체의 반응성을 결정한다. 유전자 단편은, 예를 들어 PCR에 의해 생성된 다음, 방사성 아미노산의 존재 하에 시험관 내에서 단백질로 전사 및 번역될 수 있다. 이어서, 방사성 표지된 PDGF-B 단편에 대한 상기 항체의 결합은 면역침전 및 겔 전기영동에 의해 결정한다. 파지 입자 (파지 라이브러리) 또는 효모 (효모 디스플레이)의 표면 상에 디스플레이된 무작위 펩티드 서열의 대형 라이브러리를 이용함으로써 특정의 에피토프를 또한 확인할 수 있다. 또 다른 한편으론, 중복 펩티드 단편의 규정된 라이브러리를 대상으로 하여, 간단한 결합 검정에서 시험 항체에 대한 결합을 알아보기 위하여 시험할 수 있다. 부가의 예에서는, 항원의 돌연변이 유발, 도메인 스와핑 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발을 수행하여, 에피토프 결합을 위해 요구되고, 이에 충분하며/하거나 필요한 잔기를 확인할 수 있다. 예를 들어, PDGF-B 폴리펩티드의 각종 잔기를 알라닌으로 대체시킨 돌연변이체 PDGF-B를 이용하여 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 실험을 수행할 수 있다. 돌연변이체 PDGF-B에 대한 항체의 결합을 평가함으로써, 항체 결합에 대한 특별한 PDGF-B 잔기의 중요성을 평가할 수 있다.
PDGF-B 항체를 명확히 규명하기 위해 사용될 수 있는 또 다른 방법은 PDGF-B 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프와 결합하는 지를 결정하기 위하여, 동일한 항원, 즉 PDGF-B 상의 각종 단편과 결합하는 것으로 공지된 다른 항체와의 경쟁 검정을 이용하는 것이다. 경쟁 검정은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
추가로, 소정의 항체/항원 결합 쌍에 대한 에피토프는 각종 실험적 및 계산적 에피토프 맵핑 방법을 이용하여 상이한 상세 수준에서 규정되고 명확히 규명될 수 있다. 실험적 방법은 돌연변이 유발, X선 결정학, 핵 자기 공명 (NMR) 분광법, 수소 중수소 교환 질량 분광측정법 (HX-MS) 및 각종 경쟁 결합 방법을 포함한다. 각 방법은 독특한 원리에 의존하기 때문에, 에피토트에 관한 설명은 이를 결정하는 방법과 밀접하게 연계되어 있다. 따라서, 소정의 항체/항원 쌍에 대한 에피토프는 이용된 에피토프 맵핑 방법에 따라서 차별적으로 규정될 것이다.
그의 가장 상세 수준에서, Ag와 Ab 간의 상호 작용에 대한 에피토프는 Ag-Ab 상호 작용에 존재하는 원자 접촉을 규정하는 공간 좌표뿐만 아니라 결합 열역학에 대한 그들의 상대적 기여도에 관한 정보에 의해 규정될 수 있다. 덜 상세 수준에서는, 에피토프가 Ag와 Ab 간의 원자 접촉을 규정하는 공간 좌표에 의해 명확히 규명될 수 있다. 추가의 덜 상세 수준에서는, 에피토프가 특이적 기준, 예를 들어 Ab 중의 원자와 Ag 중의 원자 간의 거리에 의해 규정된 바와 같이 포함되는 아미노산 잔기에 의해 명확히 규명될 수 있다. 추가의 덜 상세 수준에서는, 에피토프가 기능을 통하여, 예를 들어 다른 Ab와의 경쟁 결합에 의해 명확히 규명될 수 있다. 에피토프는 또한, 또 다른 아미노산에 의한 치환이 Ab와 Ag 간의 상호 작용 (예를 들어, 알라닌 스캐닝)의 특징을 변경시킬 아미노산 잔기를 포함하는 것으로서 보다 일반적으로 규정될 수 있다.
Ab, 예를 들어 Fab 단편과 그의 Ag 간의 복합체의 공간 좌표에 의해 규정된 X선 유래 결정 구조의 맥락에서, 용어 에피토프는 달리 명시되거나 또는 문맥상 모순되지 않는 한, Ab 중의 중원자로부터 4 Å의 거리 이내에 중원자 (즉, 비-수소 원자)를 갖는 것을 특징으로 하는 PDGF-B 잔기로서 본원에 특이적으로 규정된다.
이용된 에피토프 맵핑 방법에 따라서 에피토프에 관한 설명 및 정의가 상이한 상세 수준에서 수득된다는 사실로부터, 동일한 Ag 상의 상이한 Ab에 대한 에피토프를 비교하는 것은 상이한 상세 수준에서 유사하게 수행될 수 있다는 결론이 나온다.
아미노산 수준 상에서 언급된, 예를 들어 X선 구조로부터 결정된 에피토프는, 이들이 동일한 아미노산 잔기 세트를 함유하는 경우에 동일한 것으로 여겨진다. 에피토프는 1개 이상의 아미노산이 이러한 에피토프에 의해 공유되는 경우에 중복되는 것으로 여겨진다. 에피토프는 이러한 에피토프에 의해 공유되는 아미노산이 전혀 없는 경우에 별개인 (독특한) 것으로 여겨진다.
경쟁 결합을 특징으로 하는 에피토프는 상응하는 항체의 결합이 상호 배타적인 경우, 즉 한 항체의 결합이 다른 항체의 동시 또는 연속 결합을 배제하는 경우에 중복되는 것으로 여겨진다. 에피토프는 항원이 상응하는 두 항체의 결합을 동시에 도모할 수 있는 경우에 별개인 (독특한) 것으로 여겨진다.
용어 "파라토프"의 정의는 관점을 반전시킴으로써 상기 "에피토프"의 정의로부터 유래된다. 따라서, 용어 "파라토프"는 항원과 특이적으로 결합하는, 즉 항원 (PDGF-B)과 물리적으로 접촉하게 되는 항체 상의 부위 또는 영역을 지칭한다.
항체, 예를 들어 Fab 단편 또는 2개의 Fab 단편과 그의 항원 간의 복합체의 공간 좌표에 의해 규정된 X선 유래 결정 구조의 맥락에서, 용어 파라토프는 달리 명시되거나 또는 문맥상 모순되지 않는 한, PDGF-B 중의 중원자로부터 4 Å의 거리 이내에 중원자 (즉, 비-수소 원자)를 갖는 것을 특징으로 하는 항체 잔기로서 본원에 특이적으로 규정된다.
소정의 항체/항원 쌍에 대한 에피토프 및 파라토프는 통상적인 방법에 의해 확인할 수 있다. 예를 들어, 에피토프의 일반적인 위치는 앞서 본원의 다른 곳에 보다 상세히 기재된 바와 같은 상이한 단편 또는 변이체 PDGF-B 폴리펩티드와 결합할 수 있는 항체의 능력을 평가함으로써 결정할 수 있다. 항체와 접촉하는 PDGF-B 내의 특이적 아미노산 (에피토프), 및 PDGF-B와 접촉하는 항체 내의 특이적 아미노산 (파라토프)은 또한, 통상적인 방법, 예컨대 본 실시예에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 항체와 표적 분자를 합할 수 있고 항체/항원 복합체를 결정화할 수 있다. 이러한 복합체의 결정 구조는 결정할 수 있고 이를 이용하여 항체와 그의 표적 간의 상호 작용의 특이적 부위를 확인할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같이, 이러한 결정 구조 분석은 MOR8457 항체와 PDGF-BB 이량체 간의 상호 작용에 대해 수행하였다. 이러한 분석은 본 실시예에 보다 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 따르는 항체의 파라토프는 다음과 같이 정의될 수 있다: 상기 항체의 경쇄 가변 도메인은 서열 1의 서열에 대해 카바트 넘버링에 기초하여 잔기 G28, S29, Y30, F31, D49, D50, F90, T91, H92, N93, S94를 포함하고, 상기 항체의 중쇄 가변 도메인은 서열 2의 서열에 대해 카바트 넘버링에 기초하여 잔기 Y50, L57, Y59, Y60, D62, W102, Y103, G104, G105를 포함한다.
본 발명의 항체의 파라토프는 서열 1의 서열에 대해 경쇄 가변 도메인의 잔기 N65 및 서열 2의 서열에 대해 중쇄 가변 도메인의 잔기 W47을 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따르는 항체의 경쇄 가변 도메인은 서열 1의 서열의 다음 위치에 상응하는 위치에 다음 아미노산 잔기, 즉
· 위치 28에 상응하는 위치에 G를 포함하고,
· 위치 29에 상응하는 위치에 S를 포함하며,
· 위치 30에 상응하는 위치에 Y를 포함하고,
· 위치 31에 상응하는 위치에 F를 포함하며,
· 위치 49에 상응하는 위치에 D를 포함하고,
· 위치 50에 상응하는 위치에 D를 포함하며,
· 위치 65에 상응하는 위치에 N을 포함하고,
· 위치 90에 상응하는 위치에 F를 포함하며,
· 위치 91에 상응하는 위치에 T를 포함하고,
· 위치 92에 상응하는 위치에 H를 포함하며,
· 위치 93에 상응하는 위치에 N을 포함하고,
· 위치 94에 상응하는 위치에 S를 포함할 수 있으며;
항체의 중쇄 가변 도메인은 서열 2의 서열의 다음 위치에 상응하는 위치에 다음 아미노산 잔기, 즉
· 위치 50에 상응하는 위치에 Y를 포함하고,
· 위치 57에 상응하는 위치에 L을 포함하며,
· 위치 59에 상응하는 위치에 Y를 포함하고,
· 위치 60에 상응하는 위치에 Y를 포함하며,
· 위치 62에 상응하는 위치에 D를 포함하고,
· 위치 102에 상응하는 위치에 W를 포함하며,
· 위치 103에 상응하는 위치에 Y를 포함하고,
· 위치 104에 상응하는 위치에 G를 포함하며,
· 위치 105에 상응하는 위치에 G를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르는 항체의 경쇄는 서열 1의 서열의 위치 65에 상응하는 위치에 N을 추가로 포함할 수 있고; 중쇄 가변 도메인은 서열 2의 서열의 위치 47에 상응하는 위치에 W를 추가로 포함할 수 있다.
MOR8457의 경우, 에피토프는 서열 33에 제시된 바와 같은 PDGF-B의 서열에 대해 아미노산 Leu 38, Val 39 및 Trp 40, Asn 54, Arg 56, Glu 71, Arg 73, Ile 75, Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, Pro 82, Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86으로 구성되는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 항체에 의해 결합된 에피토프는 서열 33에 제시된 바와 같은 PDGF-B의 서열에 대해 Leu 38, Val 39 및 Trp 40, Asn 54, Arg 56, Glu 71, Arg 73, Ile 75, Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, Pro 82, Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86으로 이루어진 아미노산 잔기로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게 2개 이상의 아미노산 잔기, 보다 더 바람직하게 3개 이상의 아미노산 잔기, 또한 보다 바람직하게 4개 이상의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게 5개 이상의 아미노산 잔기, 보다 더 바람직하게 6개 이상의 아미노산 잔기, 보다 더 바람직하게 7개 이상의 아미노산 잔기, 보다 더 바람직하게 8개 이상의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게 9개 이상의 아미노산 잔기, 보다 더 바람직하게 10개 이상의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게 11개 이상의 아미노산 잔기, 보다 더 바람직하게 12개 이상의 아미노산 잔기, 보다 더 바람직하게 13개 이상의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게 14개 이상의 아미노산 잔기, 보다 더 바람직하게 15개 이상의 아미노산 잔기, 보다 더 바람직하게 16개 이상의 아미노산 잔기, 보다 더 바람직하게 17개 모든 아미노산 잔기를 포괄한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 1의 서열에 대해 카바트 넘버링에 기초하여 경쇄 가변 도메인 잔기 G28, S29, Y30, F31, D49, D50, F90, T91, H92, N93, S94, 및 서열 2의 서열에 대해 카바트 넘버링에 기초하여 중쇄 가변 도메인 잔기 Y50, L57, Y59, Y60, D62, W102, Y103, G104, G105를 포괄하는 파라토프를 포함하는데; 상기 항체는 서열 33에 제시된 바와 같은 PDGF-B의 서열에 대해 넘버링된, PDGF-B (에피토프)의 다음 아미노산 잔기, 즉 Leu 38, Val 39 및 Trp 40, Asn 54, Arg 56, Glu 71, Arg 73, Ile 75, Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, Pro 82, Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86를 포함하는 PDGF-B 상의 에피토프와 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 파라토프를 포함하는데, 이러한 파라토프의 아미노산 잔기는 실시예 7의 표 4에 제시된 바와 같이 PDGF-B의 상응하는 아미노산 잔기 (에피토프)와 접촉한다 (4 Å 이하). 즉, 상기 항체의 경쇄 가변 도메인의 경우, Trp 47은 PDGF-B의 Lys 82와 접촉하고, Leu 57은 PDGF-B의 Ile 77과 접촉하며, Tyr 59는 PDGF-B의 Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, 및 Pro 82와 접촉하고; Trp 102는 PDGF-B의 Leu 8, Val 39, Trp 40, Asn 54, Arg 56, Ile 75, 및 Phe 84와 접촉하며, Tyr 103은 PDGF-B의 Trp 40, Arg 73, Ile 75, 및 Phe 84와 접촉하고, Gly 104는 PDGF-B의 Arg 73 및 Phe 84와 접촉하며, Gly 105는 PDGF-B의 Phe 84와 접촉하고; 항체의 중쇄 가변 도메인의 경우, Gly 28는 PDGF-B의 Lys 86과 접촉하고, Ser 29는 PDGF-B의 Lys 85 및 Lys 86과 접촉하며, Tyr 30은 PDGF-B의 Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86과 접촉하고, Phe 31은 PDGF-B의 Gln 71, Arg 73, Phe 84 및 Lys 86과 접촉하며, Asp 49는 PDGF-B의 Arg 73과 접촉하고, Asp 50은 PDGF-B의 Lys 86과 접촉하며, Asn 65는 PDGF-B의 Lys 86과 접촉하고, Phe 90은 PDGF-B의 Pro 82, Ile 83, 및 Phe 84와 접촉하며, Thr 91은 PDGF-B의 Lys 81 및 Ile 83과 접촉하고, His 92는 PDGF-B의 Lys 81 및 Ile 83과 접촉하며, Asn 93은 PDGF-B의 Lys 81과 접촉하고, Ser 94는 PDGF-B의 Lys 81과 접촉하는데, PDGF-B 접촉 잔기의 잔기 넘버링은 서열 33의 서열에 대해 제시된다.
본 발명의 항체는 2개의 PDGF-B 폴리펩티드 쇄의 동종-이량체화에 의해 형성된 2개의 에피토프 중 어느 하나와 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명은 PDGF-BB의 하나의 에피토프와 결합하는 항체를 포괄하는데, 이러한 에피토프는 서열 33에 제시된 바와 같은 PDGF-B의 서열에 대해 아미노산 Leu 38, Val 39 및 Trp 40, Asn 54, Arg 56, Glu 71, Arg 73, Ile 75, Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, Pro 82, Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86을 포함하는 에피토프 1; 및 서열 33에 제시된 바와 같은 PDGF-B의 서열에 대해 아미노산 Trp 40, Asn 54, Glu 71, Arg 73, Ile 75, Glu 76, Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, Pro 82, Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86을 포함하는 에피토프 2로부터 선택된다.
본 발명의 항체는 두 에피토프와 동시에 결합할 수 없는 항체를 포괄한다. 따라서, 한 실시양태에서 본 발명의 항체는 에피토프 1과 에피토프 2 둘 다와 결합할 수 있지만, 이들 에피토프가 PDGF-BB 동종-이량체 분자 상에 서로 대략 190 Å 떨어져서 위치하기 때문에 동시에 결합할 수 없는 항체를 포괄한다.
본 발명에 따르는 항체는 본원에 구체적으로 개시되는 본 발명의 항체와 동일한 PDGF-B의 에피토프 또는 도메인과 결합할 수 있다. 예를 들어, 아직까지 확인되지 않은 본 발명의 기타 항체는 PDGF-B에 대한 그의 결합을 모노클로날 항체 MOR8457 및 그의 배선화 변이체의 결합과 비교하거나 또는 아직까지 확인되지 않은 항체의 기능을 MOR8457의 기능과 비교함으로써 확인할 수 있다. 이러한 확인을 위해 사용될 수 있는 분석 및 검정은 PDGF-B와의 결합에 대해 관심 항체와 PDGFRβ 간의 경쟁 및 각종 항-PDGF-B 항체들 간의 경쟁을 평가하는 검정, 예컨대 실시예 6에 기재된 검정, PDGF-B를 이용한 항체의 결정 구조의 분석, 예컨대 실시예 7에 기재된 분석, 인간 혈관간 세포 증식의 억제에 대한 실시예 8에 기재된 검정, 및 래트 신염 모델에서 항체의 효과를 평가하기 위한 실시예 9에 기재된 생체내 모델을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 본원에 기재된 MOR8457 항체와 동일한 에피토프 또는 영역과 결합할 수 있다. PDGF-B에 대한 이들 항체의 결합은 본원의 다른 곳에 보다 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 항체는 MOR8457 항체와 동일한, PDGF-B 중의 에피토프와 결합하는 항체일 수 있다. 이는 상기 언급된 바와 같은 PDGF-B의 특별한 아미노산과 접촉되어 있는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 이것이 서열 33에 제시된 바와 같은 PDGF-B의 서열에 대해 아미노산 Leu 38, Val 39 및 Trp 40, Asn 54, Arg 56, Glu 71, Arg 73, Ile 75, Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, Pro 82, Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86과 접촉되거나 또는 서열 33에 제시된 바와 같은 PDGF-B의 서열에 대해 아미노산 Trp 40, Asn 54, Glu 71, Arg 73, Ile 75, Glu 76, Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, Pro 82, Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86과 접촉되는 방식으로 PDGF-B와 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열 33의 서열에 대해 Leu 38, Val 39 및 Trp 40, Asn 54, Arg 56, Glu 71, Arg 73, Ile 75, Glu 76, Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, Pro 82, Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기를 포함하는 에피토프와 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열 33에 제시된 바와 같은 PDGF-B의 서열에 대해 잔기 Leu 38, Val 39 및 Trp 40, Asn 54, Arg 56, Glu 71, Arg 73, Ile 75, Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, Pro 82, Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86을 포함하는 에피토프; 또는 서열 33에 제시된 바와 같은 PDGF-B의 서열에 대해 잔기 Trp 40, Asn 54, Glu 71, Arg 73, Ile 75, Glu 76, Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, Pro 82, Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86을 포함하는 에피토프와 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 본원에 기재된 바와 같이 PDGF-B와의 결합에 대해 본 발명의 또 다른 항체와 경쟁할 수 있는 능력을 지닐 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 PDGF-B, 또는 MOR8457 항체에 의해 결합되는 PDGF-B의 적합한 단편 또는 변이체와의 결합에 대해 본원에 기재된 MOR8457 항체와 교차 경쟁할 수 있다. 이러한 교차 경쟁하는 항체는 표준 결합 검정에서 본 발명의 공지된 항체와 교차 경쟁할 수 있는 그들의 능력에 근거하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 비아코어™ 시스템을 이용하는 SPR, ELISA 검정 또는 유동 세포계수법을 이용하여 교차 경쟁을 입증할 수 있다. 이러한 교차 경쟁은 상기 두 항체가 동일하거나, 중복되거나 또는 유사한 에피토프와 결합한다는 것을 제안할 수 있다.
본 발명의 항체는 문헌 (Ogawa et al., 2010, Hepatol. Res. 40:1128-1141)에 기재된 AbyD3263 보다 고 친화도로 PDGF-B와 결합할 수 있는 항체를 포괄한다.
따라서, 본 발명의 항체는 시험 항체가 표적 분자 상의 결합 부위를 놓고 본 발명의 공지된 항체와 경쟁할 수 있는지를 평가하는 결합 검정을 포함하는 방법에 의해 확인할 수 있다. 경쟁적 결합 검정을 수행하는 방법은 본원에 개시되어 있고/있거나 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 본 발명의 공지된 항체가 표적 분자와 결합할 수 있는 조건을 이용하여, 상기 항체를 표적 분자와 결합시키는 것을 포함할 수 있다. 이어서, 항체/표적 복합체를 시험 항체에 노출시킬 수 있고, 이 시험 항체가 항체/표적 복합체로부터 본 발명의 항체를 대체할 수 있는 정도를 평가할 수 있다. 또 다른 방법은 항체 결합을 허용하는 조건 하에 시험 항체를 표적 분자와 접촉시킨 다음, 이러한 표적 분자와 결합할 수 있는 본 발명의 항체를 가하고, 본 발명의 항체가 항체/표적 복합체로부터 시험 항체를 대체할 수 있는 정도를 평가하는 것을 포함할 수 있다.
표적에 대한 본 발명의 항체의 결합을 억제할 수 있는 시험 항체의 능력은, 시험 항체가 표적과의 결합에 대해 본 발명의 항체와 경쟁할 수 있으므로, 시험 항체가 본 발명의 공지된 항체와 동일한, PDGF-B 단백질 상의 에피토프 또는 영역과 결합한다는 것을 입증해준다. 이러한 방법에서 본 발명의 공지된 항체와 경쟁하는 것으로서 확인되는 시험 항체는 또한, 본 발명에 따르는 잠재적 항체이다. 시험 항체가 본 발명의 공지된 항체와 동일한 영역 중의 PDGF-B와 결합할 수 있고 본 발명의 공지된 항체와 경쟁할 수 있다는 사실은, 시험 항체가 상기 공지된 항체와 동일한 결합 부위에서 리간드로서 작용할 수 있다는 것과, 이에 따라 시험 항체가 상기 공지된 항체의 작용을 모방할 수 있다는 것을 제안하고 있다. 이는 본원에 기재된 바와 같이 시험 화합물의 존재 하에 PDGF-B의 활성을 평가함으로써 확증될 수 있다.
본 발명의 공지된 항체는 본원에 기재된 바와 같은 항체, 예컨대 MOR8457, 또는 PDGF-B와 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있는 본원에 기재된 바와 같은 그의 모든 변이체 또는 단편, 예컨대 배선화 항체 [그중 하나가 배선화 VH (MOR8457-GL-VH; 서열 6) 및 배선화 VL (MOR8457-GL-VL; 서열 4)을 포함하는 것으로 본원에 개시되어 있다], 또는 변이체, 예컨대 변형된 VH (MOR8457-15-VH; 서열 44) 및 변형된 VL (MOR8457-15-VL; 서열 34)을 포함하는 MOR8457-15, 및 MOR8457-15와 동일한 변형된 VH (또한, MOR8457-16-VH 또는 MOR8457-15/16-VH로서 확인됨; 서열 44) 및 변형된 VL (MOR8457-16-VL; 서열 39)을 포함하는 MOR8457-16일 수 있다. 본 발명의 항체는 본원에 기재된 바와 같은 MOR8457 항체, 또는 PDGF-B와 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있는 본원에 기재된 바와 같은 그의 모든 변이체 또는 단편과 동일한 에피토프와 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 본 실시예에 추가로 기재되는 MOR8457 에피토프와 동일하거나, 중복되거나 또는 유사한 에피토프와 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 MOR8457의 결합을 위해 상기 제시된 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 또는 10개 또는 12개 또는 14개 또는 16개 이상의 아미노산 잔기와 결합할 수 있다. 예를 들어, 서열 33의 폴리펩티드와 접촉되는 경우, 본 발명의 항체는 이러한 폴리펩티드와 결합할 수 있고, 아미노산 Leu 38, Val 39 및 Trp 40, Asn 54, Arg 56, Glu 71, Arg 73, Ile 75, Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, Pro 82, Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86; 또는 아미노산 Trp 40, Asn 54, Glu 71, Arg 73, Ile 75, Glu 76, Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, Pro 82, Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86, 또는 이들 아미노산의 하위세트, 예컨대 이들 아미노산 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 또는 17개 이상과 접촉할 수 있다.
앞서 본원의 다른 곳에 언급된 바와 같이, 특이적 결합은 표적이 아닌 분자에 대한 항체의 결합을 참조로 하여 평가할 수 있다. 이러한 비교는 표적과 결합할 수 있는 항체의 능력과 또 다른 분자와 결합할 수 있는 항체의 능력을 비교함으로써 이루어질 수 있다. 이러한 비교는 KD 또는 Ki의 평가에서 상기 언급된 바와 같이 이루어질 수 있다. 이러한 비교에 사용된 다른 분자는 표적 분자가 아닌 어떠한 분자일 수도 있다. 바람직하게, 다른 분자는 표적 분자와 동일하지 않다. 바람직하게 표적 분자는 이러한 표적 분자의 단편이 아니다.
본 발명의 항체의 KD는 69 pM 미만, 예컨대 50 pM 미만, 예컨대 30 pM 미만, 예컨대 25 pM 미만, 예컨대 15 pM 미만, 예컨대 13 pM 미만, 예컨대 12 pM 미만, 예컨대 10 pM 미만, 예컨대 4 pM 미만, 예컨대 2 pM 미만, 예컨대 2 pM 미만, 예컨대 15 pM 내지 2 pM일 수 있다.
특이적 결합을 결정하기 위해 사용된 다른 분자는 표적에 대한 구조나 기능에 있어서 무관할 수 있다. 예를 들어, 다른 분자는 무관한 물질 또는 환경에 수반되는 물질일 수 있다.
특이적 결합을 결정하기 위해 사용된 다른 분자는 표적 분자, 즉 PDGF-B와 동일한 생체내 경로에 관여하는 또 다른 분자일 수 있다. 예를 들어, 표적이 PDGF-B인 경우, 비교를 위해 사용된 다른 분자는 PDGF-B/PDGFRβ 신호 전달 케스케이드의 일부를 형성하는 단백질일 수 있다. 본 발명의 항체가 이러한 또 다른 분자에 비해 PDGF-BB에 대한 특이성을 반드시 지니게 함으로써, 불필요한 생체내 교차 반응성을 피할 수 있다.
본 발명의 항체는 표적 분자와 관계가 있는 일부 분자와 결합할 수 있는 능력을 보유할 수 있다. 예를 들어, 전장 성숙한 인간 PDGF-B를 표적으로서 사용할 수 있지만, 항체는 또한, 예를 들어 인간 PDGF-B의 프로펩티드 형태, 인간 PDGF-B의 단편 또는 절단된 형태, 지단백질 또는 세포와 결합되는 PDGF-B, 또는 다른 종으로부터의 PDGF-B, 예컨대 다른 포유동물 PDGF-B와 결합할 수 있다.
또 다른 한편, 본 발명의 항체는 특별한 표적 분자에 대한 특이성을 지닐 수 있다. 예를 들어, 이는 본원에 기재된 바와 같은 하나의 표적 분자와 결합할 수 있지만, 본원에 기재된 바와 같은 상이한 표적 분자와는 결합할 수 없거나 또는 상당히 감소된 친화도로 결합할 수 있다. 예를 들어, 전장 성숙한 인간 PDGF-B를 표적으로서 사용할 수 있지만, 이러한 표적과 결합하는 항체는, 예를 들어 다른 PDGF (PDGF-A 또는 PDGF-C, 또는 PDGF-D), 또는 다른 종으로부터의 PDGF-B, 예컨대 다른 포유동물 PDGF-B와 결합할 수 없거나 또는 덜한 친화도로 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 PDGF-B와 결합할 수 있고, 그렇게 함으로써 PDGF-B의 활성을 억제할 수 있다.
용어 "결합 친화도"는 두 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 항원 간의 비-공유적 상호 작용의 강도에 관한 측정기준으로서 본원에 사용된다. 용어 "결합 친화도"는 1가 상호 작용 (고유의 활성)을 언급하기 위해 사용된다.
상이한 분자 상호 작용과 연관된 상기 결합 친화도의 정의에 따라서, 예를 들어 소정의 항원에 대한 상이한 항체의 결합 친화도를 비교하는 것은 개개의 항체/항원 복합체에 대한 KD 값을 비교함으로써 이루어질 수 있다.
유사하게, 이러한 상호 작용의 특이성은 관심 상호 작용, 예를 들어 항체와 항원 간의 특이적 상호 작용에 대한 KD 값을 결정하고, 이를 관심없는 상호 작용, 예를 들어 PDGF-B와 결합하지 않는 것으로 공지된 대조군 항체의 상호 작용의 KD 값과 비교함으로써 평가할 수 있다.
전형적으로, PDGF-B를 기준으로 한 본 발명의 항체에 대한 KD는 다른 비-PDGF-B 분자, 예컨대 무관한 물질 또는 환경에 수반되는 물질을 기준으로 한 KD 보다 2배, 바람직하게 5배, 보다 바람직하게 10배 적을 것이다. 보다 바람직하게, KD는 50배 적을 것인데, 예컨대 100배 또는 200배 적을 것이고; 보다 더 바람직하게 500배 적을 것인데, 예컨대 1,000배 또는 10,000배 적을 것이다.
해리 상수의 값은 널리 공지된 방법에 의해 직접적으로 결정할 수 있고, 예를 들어 문헌 [Caceci et al. (1984, Byte 9: 340-362)]에 제시된 바와 같은 방법에 의해 심지어 복합체 혼합물에 대해서도 계산할 수 있다. 예를 들어, KD는 문헌 [Wong & Lohman (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5428-5432)]에 의해 개시된 바와 같은 이중-필터 니트로셀룰로스 필터 결합 검정을 이용하여 정립할 수 있다. 표적 항원에 대한 리간드, 예컨대 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 기타 표준 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 이는 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, RIA, 및 유동 세포계수법 분석, 및 본원의 다른 곳에 예시된 기타 검정을 포함한다. 항체의 결합 동역학 및 결합 친화도는 또한, 관련 기술분야에 공지된 표준 검정, 예컨대 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해, 예를 들어 비아코어™ 시스템을 이용함으로써 평가할 수 있다.
항원에 대한 항체의 결합을, 표적의 또 다른 리간드, 예컨대 또 다른 항체 또는 이러한 표적과 달리 결합하는 가용성 수용체 (예를 들어, PDGFRβ-IgG1)에 의한 상기 표적의 결합과 비교하는 경쟁적 결합 검정을 수행할 수 있다. 50% 억제가 발생되는 농도는 Ki로서 공지되어 있다. 이상적 조건 하에서는, Ki가 KD와 등가이다. Ki 값은 결코 KD 보다 적지 않을 것이므로, KD에 대한 상한치를 제공하기 위하여 Ki의 측정을 편리하게 대체시킬 수 있다.
본 발명의 항체는 1 x 10-7 M 이하, 1 x 10-8 M 이하, 또는 1 x 10-9 M 이하, 또는 1 x 10-10 M 이하, 1 x 10-11 M 이하, 또는 1 x 10-12 M 이하, 또는 1 x 10-13 M 이하, 1 x 10-14 M 이하, 또는 1 x 10-15 M 이하의 PDGF-B에 대한 KD를 가질 수 있다.
그의 표적과 특이적으로 결합하는 항체는 그의 표적과 고 친화도로 결합할 수 있는데, 즉 상기 논의된 바와 같이 낮은 KD를 나타낼 수 있고, 다른 비-표적 분자와 보다 낮은 친화도로 결합할 수 있다. 예를 들어, 항체는 1 x 10-6 M 이상, 보다 바람직하게 1 x 10-5 M 이상, 보다 바람직하게 1 x 10-4 M 이상, 보다 바람직하게 1 x 10-3 M 이상, 보다 더 바람직하게 1 x 10-2 M 이상의 KD로 비-표적 분자와 결합할 수 있다. 본 발명의 항체는 바람직하게, 또 다른 비-PDGF-B 분자에 대한 그의 결합 친화도 보다 적어도 2배, 10배, 50배, 100배, 200배, 500배, 1,000배 또는 10,000배 더 큰 친화도로 그의 표적과 결합할 수 있다.
기타 실시양태에서, PDGF-B에 대한 PDGF-B 항체의 결합 친화도 (KD)는 약 0.001 내지 약 250 nM일 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도는 약 200 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 약 2 pM, 또는 약 1 pM 중 어느 것이다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도는 약 250 nM, 약 200 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 약 50 pM, 약 20 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 2 pM 중 어느 것 보다 적다. 일부 실시양태에서, PDGF-B 항체의 KD는 약 70 pM 내지 약 1 pM의 범위이다. 일부 실시양태에서, 인간 PDGF-B에 대한 PDGF-B 항체의 KD는 약 30 pM 내지 약 2 pM의 범위이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 PDGF-B 항체의 결합 친화도는 약 69 pM, 약 28 pM, 약 25 pM, 약 15 pM, 약 13 pM, 약 10 pM, 약 4 pM, 및 약 2 pM이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 문헌 (Ogawa et al., 2010, Hepatology Res. 40:1128-1141)에 기재된 바와 같은 항체 AbyD3263이 아니다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 AbyD3263의 결합 친화도 (KD) 보다 더 낮은 KD, 즉 13 nM로 인간 PDGF-BB와 결합한다.
본 발명은 MOR8457로부터 유래된, 경쇄 서열 또는 그의 일부, 및 중쇄 또는 그의 일부를 갖는 항체, 또는 이를 포함하는 조성물 (제약 조성물 포함) 중 어느 것을 제공한다.
본 발명에 따르는 폴리펩티드 또는 항체 "단편" 또는 "부분"은 절단에 의해, 예를 들어 1개 이상의 아미노산을 특정 폴리펩티드의 N 및/또는 C-말단 끝으로부터 제거함으로써 만들 수 있다. 이러한 방식으로 10개 이하, 20개 이하, 30개 이하, 40개 이하 또는 그 초과의 아미노산을 N 및/또는 C 말단으로부터 제거할 수 있다. 단편은 또한, 하나 이상의 내부 결실에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 항체는 MOR8457 항체의 단편 또는 그의 변이체일 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 이러한 항체의 항원 결합 부분 또는 그의 변이체일 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 이러한 항체의 Fab 단편 또는 그의 변이체일 수 있거나, 또는 상기 항체로부터 유래된 단일 쇄 항체 또는 그의 변이체일 수 있다.
MOR8457 항체의 경쇄 가변 도메인 (MOR8457-VL) 및 중쇄 가변 도메인 (MOR8457-VH)의 아미노산 서열이 서열 1 및 2에 각각 제공되어 있다. 배선화 MOR8457 항체의 VL 및 VH 가변 도메인의 아미노산 서열은 서열 4 (MOR8457-GL-VL) 및 서열 6 (MOR8457-GL-VH)에 각각 제공되어 있다. 전장 배선화 경쇄의 아미노산 서열 (MOR8457-GL-LC)이 서열 16에 제공되어 있고, 불변 도메인 내에 이펙터 기능 삼중 돌연변이를 추가로 포함하는 전장 배선화 중쇄의 아미노산 서열 (MOR8457-GL-hIgG1-3m-HC)이 서열 14에 제공되어 있다. 또한, 변이체 항체 MOR8457-15 및 MOR8457-16의 아미노산 서열이 제공되어 있다. MOR8457-15의 VL 및 VH의 아미노산 서열이 서열 34 (MOR8457-15-VL) 및 서열 44 (MOR8457-15-VH)에 각각 제공되어 있다. 전장 MOR8457-15 경쇄의 아미노산 서열 (MOR8457-15-LC)이 서열 37에 제공되어 있고, 불변 도메인 내에 이펙터 기능 삼중 돌연변이를 추가로 포함하는 전장 MOR8457-15 중쇄의 아미노산 서열 (MOR8457-15-HC)이 서열 46에 제공되어 있다. MOR8457-16의 VL 및 VH의 아미노산 서열이 서열 39 (MOR8457-16-VL) 및 서열 44 (MOR8457-16-VH)에 각각 제공되어 있다. 전장 MOR8457-16 경쇄의 아미노산 서열 (MOR8457-16-LC)이 서열 42에 제공되어 있고, 불변 도메인 내에 이펙터 기능 삼중 돌연변이를 추가로 포함하는 전장 MOR8457-16 중쇄의 아미노산 서열 (MOR8457-16-HC)이 서열 46에 제공되어 있다. 따라서, MOR8457-15와 MOR8457-16은 서열 44에 제시되는 동일한 VH 아미노산 서열을 공유하는 것으로 이해된다.
본 발명의 항체는 서열 1 또는 서열 4의 VL 아미노산 서열, 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 서열 2 또는 서열 6의 VH 아미노산 서열, 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 (a) 서열 1의 VL 아미노산 서열, 또는 그의 단편 또는 변이체와 서열 2의 VH 아미노산 서열, 또는 그의 단편 또는 변이체 둘 다, 또는 (b) 서열 1의 VL 아미노산 서열, 또는 그의 단편 또는 변이체와 서열 6의 VH 아미노산 서열, 또는 그의 단편 또는 변이체 둘 다, 또는 (c) 서열 4의 VL 아미노산 서열, 또는 그의 단편 또는 변이체와 서열 2의 VH 아미노산 서열, 또는 그의 단편 또는 변이체 둘 다, 또는 (d) 서열 4의 VL 아미노산 서열, 또는 그의 단편 또는 변이체와 서열 6의 VH 아미노산 서열, 또는 그의 단편 또는 변이체 둘 다를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 또한, 서열 34 또는 서열 39의 VL 아미노산 서열, 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 서열 44의 VH 아미노산 서열, 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 (a) 서열 34의 VL 아미노산 서열, 또는 그의 단편 또는 변이체와 서열 44의 VH 아미노산 서열, 또는 그의 단편 또는 변이체 둘 다, 또는 (b) 서열 39의 VL 아미노산 서열, 또는 그의 단편 또는 변이체와 서열 44의 VH 아미노산 서열, 또는 그의 단편 또는 변이체 둘 다를 포함할 수 있다.
한 측면에서, 상기 항체는 서열 1, 서열 4, 서열 34, 또는 서열 39의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 또 다른 측면에서, 항체는 서열 2, 서열 6, 또는 서열 44의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 또 다른 측면에서, 항체는 서열 1, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 34, 서열 39, 및 서열 44의 서열의 변이체를 포함하는데, 이러한 변이체는 보존적 및 비-보존적 치환, 결실 및/또는 부가를 포함할 수 있고, 전형적으로 본원에 개시된 특이적 서열 중 어느 것과도 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 87% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 공유하는 펩티드를 포함한다.
예를 들어, 한 측면에서, 본 개시내용은 서열 2, 서열 6 또는 서열 44에 제시된 바와 같은 VH 아미노산 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제공한다. 한 측면에서, 상기 항체 변이체는 서열 2, 서열 6 또는 서열 44에 대한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 보존적 또는 비-보존적 치환, 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 부가 및/또는 결실을 포함한다. 추가 측면에서, 상기 변이체는 서열 2, 서열 6 또는 서열 44와 65% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 공유하고, 상기 항체 또는 항원 결합 부분은 PDGF-B와 특이적으로 결합한다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 서열 1, 서열 4, 서열 34 또는 서열 39에 제시된 바와 같은 VL 아미노산 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제공한다. 한 측면에서, 상기 항체 변이체는 서열 1, 서열 4, 서열 34 또는 서열 39에 대한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 보존적 또는 비-보존적 치환, 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 부가 및/또는 결실을 포함한다. 추가 측면에서, 상기 변이체는 서열 1, 서열 4, 서열 34 또는 서열 39와 65% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 공유하고, 상기 항체 또는 항원 결합 부분은 PDGF-B와 특이적으로 결합한다.
본 발명의 항체는 서열 2, 서열 6 또는 서열 44의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함할 수 있는데, 이러한 항체는 중쇄 불변 도메인을 추가로 포함한다. 본원의 다른 곳에 보다 상세히 제시된 바와 같이, 상기 항체 중쇄 불변 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역으로부터 선택될 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 불변 영역이다. IgG 불변 영역 서열은 상이한 개체들 간에 발생하는 것으로 공지된 각종 대립 유전자 또는 동종이형, 예컨대 Gm(1), Gm(2), Gm(3), 및 Gm(17) 중 어느 것일 수 있다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또 다른 DNA 분자와 작동적으로 연결될 수 있다. 이러한 CH1 중쇄 불변 영역은 상기 중쇄 유전자 중 어느 것으로부터 유래될 수 있다.
한 측면에서, 항체는 서열 2, 서열 6 또는 서열 44의 아미노산 서열을 포함하는 VH로부터 선택된 VH를 포함하고 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 인간 야생형 IgG1 불변 도메인을 추가로 포함하는 중쇄를 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, IgG1 불변 도메인은 Fc 이펙터 기능을 감소 또는 폐지하는 삼중 돌연변이를 포함한다 (hIgG1-3m; 서열 21). 한 측면에서, 본 발명의 항체는 서열 6의 서열을 포함하는 배선화 VH를 포함하고 인간 IgG1-3m 불변 도메인을 추가로 포함하는 중쇄를 포함하여, 전장 중쇄 아미노산 서열이 서열 14 (MOR8457-GL-hIgG1-3m-HC)를 포함하도록 할 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 서열 44의 서열을 포함하고 인간 IgG1-3m 불변 도메인을 추가로 포함하는 중쇄를 포함하여, 전장 중쇄 아미노산 서열이 서열 46 (MOR8457-15-HC 또는 MOR8457-16-HC)를 포함하도록 할 수 있다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 서열 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 또는 그의 변이체를 제공한다. 한 측면에서, 상기 항체 변이체는 서열 14에 대한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 보존적 또는 비-보존적 치환, 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 부가 및/또는 결실을 포함한다. 추가 측면에서, 상기 변이체는 서열 14와 65% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 공유하고, 상기 항체 또는 항원 결합 부분은 PDGF-B와 특이적으로 결합한다.
본 발명의 항체는 서열 1, 서열 4, 서열 34, 또는 서열 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있는데, 이러한 항체는 경쇄 불변 도메인을 추가로 포함한다. 본원의 다른 곳에 보다 상세히 제시된 바와 같이, 상기 항체 경쇄 불변 도메인은 Cκ 또는 Cλ 불변 영역으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 Cλ 불변 영역일 수 있다.
한 측면에서, 항체는 서열 1, 서열 4, 서열 34, 또는 서열 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL로부터 선택된 VL을 포함하고 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 인간 야생형 Cλ 불변 도메인을 추가로 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 항체는 본래의 VL 서열 (서열 1)을 포함하고, 서열 TVL을 IKR로 치환시키는 우연의 삼중 돌연변이를 포함하는 인간 Cλ 불변 도메인을 추가로 포함할 수 있다 (서열 17; MOR8457-IKR-LC). 한 측면에서, 본 발명의 항체는 서열 4의 서열을 포함하는 배선화 VL을 포함하고 인간 야생형 Cλ 불변 도메인 (서열 23)을 추가로 포함하는 경쇄를 포함하여, 전장 경쇄 아미노산 서열이 서열 16 (MOR8457-GL-LC)을 포함하도록 할 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 서열 34 또는 서열 39의 서열을 포함하는 변이체 VL을 포함하는 경쇄를 포함하여, 전장 경쇄 아미노산 서열이 서열 37 (MOR8457-15-LC) 또는 서열 42 (MOR8457-16-LC)를 포함하도록 할 수 있다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 서열 16, 서열 17, 서열 37, 또는 서열 42에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 전장 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 또는 그의 변이체를 제공한다. 한 측면에서, 상기 항체 변이체는 서열 16, 서열 17, 서열 37, 또는 서열 42에 대한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 보존적 또는 비-보존적 치환, 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 부가 및/또는 결실을 포함한다. 추가 측면에서, 상기 변이체는 서열 16, 서열 17, 서열 37, 또는 서열 42와 65% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 공유하고, 상기 항체 또는 항원 결합 부분은 PDGF-B와 특이적으로 결합한다.
본 발명은 2012년 11월 6일에 MOR8457-GL-VH로서 ATCC에 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13303)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열의 3개 CDR을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포괄한다. 한 측면에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 MOR8457-GL-VH로서 ATCC에 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13303)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 VH 도메인 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 2012년 11월 6일에 MOR8457-GL-VH로서 ATCC에 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13303)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열의 2개 CDR, 즉 CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포괄한다. 한 측면에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 MOR8457-GL-VH로서 ATCC에 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13303)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 VH 도메인 아미노산 서열을 포함하는데, 이때 CDR-H1은 존재할 필요가 없다.
본 발명은 2012년 11월 6일에 MOR8457-GL-VL로서 ATCC에 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13302)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열의 3개 CDR을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포괄한다. 한 측면에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 MOR8457-GL-VL로서 ATCC에 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13302)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 VL 도메인 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 2012년 11월 6일에 MOR8457-GL-VL로서 ATCC에 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13302)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열의 3개 CDR, 및 MOR8457-GL-VH로서 ATCC에 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13303)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열의 3개 CDR을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포괄한다.
본 발명은 2012년 11월 6일에 MOR8457-GL-VL로서 ATCC에 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13302)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열의 3개 CDR, 및 MOR8457-GL-VH로서 ATCC에 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13303)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열의 2개 CDR, 즉 CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포괄한다.
본 발명은 2012년 11월 6일에 MOR8457-GL-VL로서 ATCC에 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13302)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열, 및 MOR8457-GL-VH로서 ATCC에 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13303)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포괄한다.
VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA는, 이러한 VL-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 코딩하는 또 다른 DNA 분자와 작동적으로 연결시킴으로써 전장 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환시킬 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다. 카파 불변 영역은 상이한 개체들 간에 발생하는 것으로 공지된 각종 대립 유전자, 예컨대 Inv(1), Inv(2), 및 Inv(3) 중 어느 것일 수 있다. 람다 불변 영역은 상기 3가지 람다 유전자 중 어느 것으로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 항체는 도 1에 제시된 VL 또는 VH 아미노산 서열 중 하나의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 서열 4, 6, 34, 40, 또는 44로부터의 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 15개 이상, 18개 이상, 20개 이상 또는 25개 이상의 연속되는 아미노산의 단편을 포함할 수 있다. 이러한 단편은 바람직하게, 상기 논의된 기능들 중 한 가지 이상, 예컨대 PDGF-B와 결합할 수 있는 능력을 보유할 것이다.
이들 VH 또는 VL 서열 중 어느 것의 적합한 단편 또는 변이체는 PDGF-B와 결합할 수 있는 능력을 보유할 것이다. 이는 바람직하게, PDGF-B와 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유할 것이다. 이는 바람직하게, 그로부터 유래되는 항체 (MOR8457)와 동일하거나 유사한, PDGF-B 분자의 에피토프 또는 영역과 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유할 것이다. 이는 바람직하게, 그로부터 유래되는 항체의 한 가지 이상의 부가 기능, 예컨대 특히, 그의 수용체에 대한 PDGF-B 결합을 억제할 수 있는 능력, PDGFR 신호 전달을 억제할 수 있는 활성 또는 능력, 세포 증식의 PDGF-B 유도를 억제할 수 있는 능력을 보유할 것이다.
적합한 단편 또는 변이체 VL 서열은 바람직하게, 서열 1 또는 서열 4의 아미노산 서열에 근거하여 위치 G28, S29, Y30, F31, D49, D50, F90, T91, H92, N93, S94에 아미노산을 보유할 것이다. 적합한 단편 또는 변이체 VH 서열은 바람직하게, 서열 2 또는 서열 6의 서열에 대해 위치 Y50, L57, Y59, Y60, D62, W102, Y103, G104, G105에 아미노산을 보유할 것이다. 표 2 및 3에서 확인된 바와 같이, 이들은 MOR8457이 PDGF-BB와 결합되는 경우에 PDGF-B의 중원자로부터 4 Å의 거리 이내에 중원자를 갖는 MOR8457 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 서열 내의 잔기이다.
본 발명의 항체는 본원에서 확인된 특이적 항체로부터의 CDR 영역, 예컨대 서열 1, 2, 4, 6, 34, 39, 또는 44 내로부터의 CDR 영역을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 바람직하게, 본원에 기재된 바와 같이 PDGF-B와 결합할 수 있는 능력을 보유할 것이다.
예를 들어, 도 1에 도시된 바와 같이, 카바트 정의를 이용하여, MOR8457의 경쇄 내의 CDR 서열은 아미노산 SGDSLGSYFVH (MOR8457 CDR-L1; 서열 10), DDSNRPS (MOR8457 CDR-L2; 서열 11), 또는 SAFTHNSDV (MOR8457 CDR-L3; 서열 12)로서 확인될 수 있다. 또한, 변이체 항체 MOR8457-15의 경쇄 내의 CDR 서열은 아미노산 SGDSLGSYFVH (MOR8457 CDR-L1; 서열 10), DDSNRPS (MOR8457 CDR-L2; 서열 11), 또는 SAFTHNSNV (MOR8457-15 CDR-L3; 서열 36)로서 확인될 수 있다. 더욱이, 변이체 항체 MOR8457-16의 경쇄 내의 CDR 서열은 아미노산 SGDSLGSYFVH (MOR8457 CDR-L1; 서열 10), DDSKRPS (MOR8457-16 CDR-L2; 서열 41), 또는 SAFTHNSDV (MOR8457 CDR-L3; 서열 12)로서 확인될 수 있다. MOR8457의 중쇄 내의 CDR 서열은 아미노산 GFTFSSYAMS (MOR8457 CDR-H1; 서열 7), YISDDGSLKYYADSVKG (MOR8457 CDR-H2; 서열 8) 또는 HPYWYGGQLDL (MOR8457 CDR-H3; 서열 9)로서 확인될 수 있다. 본 발명의 항체는 도 1c 내지 1f 및 1i 내지 1k에 도시된 CDR 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 서열 7, 8 및 9에 제시된 아미노산 서열 중 1개, 2개 또는 3개를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 또 다른 한편 또는 부가적으로, 서열 10, 11, 12, 36, 및 41에 제시된 아미노산 서열 중 1개, 2개 또는 3개를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 서열 7-12, 또는 서열 7, 8, 9, 10, 12, 41, 또는 서열 7, 8, 9, 10, 11, 36에 제시된 6개 아미노산 서열 모두를 포함할 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 서열 7-12, 또는 서열 7, 8, 9, 10, 12, 41, 또는 서열 7, 8, 9, 10, 11, 36의 서열을 포함하는 6개 CDR을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 또는 그의 변이체를 제공한다. 한 측면에서, 상기 항체 변이체는 서열 7-12, 또는 서열 7, 8, 9, 10, 12, 41, 또는 서열 7, 8, 9, 10, 11, 36의 서열을 포함하는 CDR에 대한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 보존적 또는 비-보존적 치환, 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 부가 및/또는 결실을 포함한다. 추가 측면에서, 상기 변이체는 서열 7-12, 또는 서열 7, 8, 9, 10, 12, 41, 또는 서열 7, 8, 9, 10, 11, 36의 서열과 65% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 공유하고, 상기 항체 또는 항원 결합 부분은 PDGF-B와 특이적으로 결합한다.
본 발명의 항체는 또 다른 한편 또는 부가적으로, MOR8457 또는 그의 변이체의 CDR 서열 중 5개를 포함할 수 있다. 즉, 본원의 다른 곳에 개시된 (실시예 7) 결정 구조 데이터는 CDR-H1이 PDGF-B와 접촉하지 않는다는 것 (즉, 서열 7의 서열의 중원자 중 어느 것도 PDGF-B의 잔기의 중원자의 4 Å 이내에 있지 않다)을 입증해 주는데, 이는 MOR8457 CDR-H1이 PDGF-B에 대한 결합에 기여하지 않을 수 있다는 것을 제안한다. 따라서, 본 발명의 항체는, 예를 들어 5개 CDR 도메인의 다음 조합을 포함할 수 있다: CDR-H2 (서열 8), CDR-H3 (서열 9), CDR-L1 (서열 10), CDR-L2 (서열 11) 및 CDR-L3 (서열 12); 또는 CDR-H2 (서열 8), CDR-H3 (서열 9), CDR-L1 (서열 10), CDR-L2 (서열 11) 및 CDR-L3 (서열 36); 또는 CDR-H2 (서열 8), CDR-H3 (서열 9), CDR-L1 (서열 10), CDR-L2 (서열 41) 및 CDR-L3 (서열 12).
한 측면에서, 본 개시내용은 8-12, 서열 8, 9, 10, 11 및 36, 서열 8, 9, 10, 41, 및 12의 서열을 포함하는 5개 CDR을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 또는 그의 변이체를 제공한다. 한 측면에서, 상기 항체 변이체는 서열 8-12, 36, 및 41의 서열을 포함하는 CDR에 대한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 보존적 또는 비-보존적 치환, 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 부가 및/또는 결실을 포함한다. 추가 측면에서, 상기 변이체는 서열 8-12의 서열과 65% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 공유하고, 상기 항체 또는 항원 결합 부분은 PDGF-B와 특이적으로 결합한다.
본 발명의 항체는 접촉 잔기가 아닌 아미노산 잔기를 치환시킬 수 있는 CDR 서열을 포함할 수 있다. 즉, 항체가 다음 CDR 중 어느 것을 포함하는 경우, 밑줄치지 않은 아미노산 잔기는 치환되거나 결실될 수 있는데, 이는 이들이 PDGF-B 상의 에피토프 (1 또는 2)와 접촉하지 않기 때문이다:
· MOR8457 CDR-H1 GFTFSSYAMS (서열 7)
· MOR8457 CDR-H2 YISDDGSLKYYADSVKG (서열 8)
· MOR8457 CDR-H3 HPYWYGGQLDL (서열 9)
· MOR8457 CDR-L1 SGDSLGSYFVH (서열 10)
· MOR8457 CDR-L2 DDSNRPS (서열 11)
· MOR8457 CDR-L3 SAFTHNSDV (서열 12).
본 발명에 따르는 항체의 중쇄는 GFTFSSYAMS (서열 7)의 CDR-H1 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 이들 아미노산 중 1개 이상은 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 바람직하게, 이들 아미노산 모두가 치환될 수 있다.
본 발명에 따르는 항체의 중쇄는 YISDDGSLKYYADSVKG (서열 8)의 CDR-H2 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 여기서 밑줄치지 않은 1개 이상의 잔기 (밑줄친 잔기는 Y50, L57, Y59, Y60, D62이다)는 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있다.
본 발명에 따르는 항체의 중쇄는 HPYWYGGQLDL (서열 9)의 CDR-H3 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 여기서 밑줄치지 않은 1개 이상의 잔기 (밑줄친 잔기는 W102, Y103, G104, G105이다)는 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있다.
본 발명에 따르는 항체의 경쇄는 SGDSLGSYFVH (서열 10)의 CDR-L1 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 여기서 밑줄치지 않은 1개 이상의 잔기 (밑줄친 잔기는 G28, S29, Y30, F31이다)는 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있다.
본 발명에 따르는 항체의 경쇄는 DDSNRPS (서열 11)의 CDR-L2 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 여기서 밑줄치지 않은 1개 이상의 잔기 (밑줄친 잔기는 D49, D50이다)는 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있다.
본 발명에 따르는 항체의 경쇄는 SAFTHNSDV (서열 12)의 CDR-L3 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 여기서 밑줄치지 않은 1개 이상의 잔기 (밑줄친 잔기는 F90, T91, H92, N93, S94이다)는 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있다.
변이체 항체는 상기 논의된 특이적 서열 및 단편으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 10개 이하, 20개 이하, 또는 30개 이하 또는 그 초과의 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. "결실" 변이체는 개개 아미노산의 결실, 작은 아미노산 군, 예컨대 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 결실, 또는 보다 큰 아미노산 영역의 결실, 예컨대 특이적 아미노산 도메인 또는 기타 특색의 결실을 포함할 수 있다. "삽입" 변이체는 개개 아미노산의 삽입, 작은 아미노산 군, 예컨대 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 삽입, 또는 보다 큰 아미노산 영역의 삽입, 예컨대 특이적 아미노산 도메인 또는 기타 특색의 삽입을 포함할 수 있다. "치환" 변이체는 바람직하게, 1개 이상의 아미노산을 동일한 수의 아미노산으로 대체시키고 보존적 아미노산 치환을 만드는 것을 포함한다. 예를 들어, 특정 아미노산은 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산, 예를 들어 또 다른 염기성 아미노산, 또 다른 산성 아미노산, 또 다른 중성 아미노산, 또 다른 하전된 아미노산, 또 다른 친수성 아미노산, 또 다른 소수성 아미노산, 또 다른 극성 아미노산, 또 다른 방향족 아미노산 또는 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 적합한 치환체를 선택하기 위해 사용될 수 있는 20개 주요 아미노산의 일부 특성은 다음과 같다.
치환 변이체는 항체 분자 내의 1개 이상의 아미노산 잔기가 제거되고, 그 자리에 상이한 잔기가 삽입된다. 치환적 돌연변이 유발을 위한 가장 관심있는 부위는 초가변 영역을 포함하지만, 프레임워크 변경 또한 고려된다. 보존적 치환이 "보존적 치환"이란 표제 하에 표 3에 제시되어 있다. 이러한 치환으로 인해 생물학적 활성 상의 변화가 발생한다면, 다음에 제시되거나 또는 아미노산 부류를 참조로 하여 다음에 추가로 기재되는 바와 같은 "예시적 치환"으로 표시된 보다 실질적인 변화가 도입될 수 있고 그 생성물을 스크리닝할 수 있다.
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항체의 생물학적 특성에 있어서의 실질적인 변형은 (a) 치환 부위에서 폴리펩티드 주쇄의 구조를, 예를 들어 β-시트 또는 나선 입체 형태로서 유지시키는 데에 대한 그의 효과, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성을 유지시키는 데에 대한 그의 효과, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지시키는 데에 대한 그의 효과 측면에서 상당히 상이한 치환을 선택함으로써 달성한다. 자연 발생 잔기는 공통의 측쇄 특성에 근거하여 다음 군으로 나눈다:
(1) 비-극성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 전하를 수반하지 않은 극성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성 (음 전하를 띰): Asp, Glu;
(4) 염기성 (양 전하를 띰): Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe, His.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류의 구성원으로 교환시킴으로써 이루어진다.
예를 들어, 만들어질 수 있는 한 가지 유형의 치환은 화학적으로 반응성일 수 있는 항체 중의 하나 이상의 시스테인을 또 다른 잔기, 예컨대 제한없이 알라닌 또는 세린으로 변화시키는 것이다. 예를 들어, 비-표준 시스테인의 치환이 있을 수 있다. 이러한 치환은 항체의 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역 내에서 또는 불변 영역 내에서 만들어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 시스테인은 표준이다. 항체의 적당한 입체 형태를 유지시키는데 관여하지 않은 어떠한 시스테인 잔기도, 일반적으로 세린으로 치환시켜 분자의 산화적 안정성을 개선시키고 비정상적인 교차 결합을 방지시킬 수 있다. 역으로, 특히 항체가 항체 단편, 예컨대 Fv 단편인 경우에, 시스테인 결합(들)을 이러한 항체에 가하여 그의 안정성을 개선시킬 수 있다.
본 발명은 또한, PDGF-B 항체의 생성, 선별 및 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 관련 기술분야에 공지된 과정에 의해 만들 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 재조합적으로 만들 수 있고, 관련 기술분야에 공지된 모든 방법을 이용하여 발현시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 파지 디스플레이 기술에 의해 제조 및 선별할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 및 6,265,150; 및 문헌 [Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455, 1994] 참조). 또 다른 한편, 파지 디스플레이 기술 (문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-553, 1990])을 사용하여, 면역시키지 않은 공여자로부터의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관 내에서 생성시킬 수 있다. 이러한 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자를 섬유상 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 소수의 외피 단백질 유전자 내로 동일 프레임 내에서 클로닝시키고, 파지 입자의 표면 상에서 기능적 항체 단편으로서 디스플레이한다. 섬유상 입자는 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피(copy)를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 근거하여 선별하게 되면, 이들 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자를 선별할 수도 있다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성들 중 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 각종 포맷으로 수행할 수 있으며, 이들에 대한 검토는, 예를 들어 다음 문헌을 참조할 수 있다 (Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571, 1993). V-유전자 절편의 몇 가지 공급원을 파지 디스플레이를 위해 사용할 수 있다. 문헌 (Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991)에서는 면역시킨 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 소형 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 단리하였다. 인간 공여자로부터의 V 유전자 레퍼토리를 구축할 수 있고, 다양한 항원 (자기 항원 포함) 어레이에 대한 항체는 본질적으로, 문헌 [Mark et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-597], 또는 [Griffith et al., 1993, EMBO J. 12:725-734]에 기재된 기술에 따라서 단리시킬 수 있다. 자연 면역 반응에서는, 항체 유전자가 돌연변이를 고속으로 축적한다 (체세포 과돌연변이). 도입된 변화 중 일부는 보다 높은 친화도를 부여할 것이고, 고 친화도 표면 이뮤노글로불린을 디스플레이하는 B 세포가 우선적으로 복제되며, 후속 항원 시험감염 동안 분화된다. 이러한 자연적 과정은 "연쇄 셔플링(chain shuffling)"으로서 공지된 기술을 이용함으로써 모방될 수 있다 (Marks et al., 1992, Bio/Technol. 10:779-783). 이러한 방법에서, 파지 디스플레이에 의해 수득된 "1차" 인간 항체의 친화도는, 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를 면역되지 않은 공여자로부터 수득된 V 도메인 유전자의 자연 발생 변이체의 레퍼토리로 순차적으로 대체시킴으로써 개선될 수 있다. 이러한 기술로 인해, pM 내지 nM 범위의 치환도를 나타내는 항체 및 항체 단편이 생성될 수 있다. 극대형 파지 항체 레퍼토리 ("최대의 라이브러리"로서 공지되기도 함)를 제조하기 위한 전략은 문헌 (Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266, 1993)에 기재되어 있다. 유전자 셔플링을 또한 사용하여 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도시킬 수 있는데, 이러한 인간 항체는 출발 설치류 항체와 유사한 친화성과 특이성을 갖는다. "에피토프 임프린팅(imprinting)"으로서 지칭되기도 하는 상기 방법에 따르면, 파지 디스플레이 기술에 의해 수득된 설치류 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자를 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체시키면, 설치류-인간 키메라 집단이 창출된다. 항원에 기초하여 선별하면 기능적 항원 결합 부위를 복원할 수 있는 인간 가변 영역이 단리되는데, 즉 에피토프가 파트너의 선택을 좌우한다 (영향을 미친다). 나머지 설치류 V 도메인을 대체시키기 위해 상기 과정을 반복하는 경우, 인간 항체가 수득된다 (PCT 공개 번호 WO 93/06213 참조). CDR 이식화에 의한 설치류 항체의 전통적인 인간화와는 달리, 상기 기술은 설치류 기원의 프레임워크 또는 CDR 잔기가 전혀 없는 완전한 인간 항체를 제공해 준다.
일부 실시양태에서, 하이브리도마 기술을 이용하여 항체를 만들 수 있다. 인간을 포함한 모든 포유동물 대상체 또는 그로부터의 항체 생산 세포를, 포유동물 (인간 포함) 하이브리도마 세포주의 생성을 위한 기준으로서 제공되도록 조작할 수 있는 것으로 고려된다. 숙주 동물의 면역 경로 및 스케줄은 일반적으로, 본원에 추가로 기재되는 바와 같은, 항체 자극과 생성을 위해 정립된 통상적인 기술에 따른다. 전형적으로, 숙주 동물에게 본원에 기재된 바와 같은 것을 포함한, 특정 양의 면역원을 복강내, 근육내, 경구, 피하, 발바닥내, 및/또는 피내 접종한다.
하이브리도마는 문헌 (Kohler, B. and Milstein, C., 1975, Nature 256:495-497)의 일반적 체세포 혼성화 기술을 이용하거나 또는 문헌 (Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381, 1982)에 의해 변형된 바와 같이, 림프구 및 불멸화 골수종 세포로부터 제조할 수 있다. X63-Ag8.653 및 솔크 인스티튜트, 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute, Cell Distribution Center; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)로부터의 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 입수 가능한 골수종 세포주를 상기 혼성화에 사용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 기술은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 융합 유도제를 이용하거나 또는 통상의 기술자에 널리 공지된 전기적 수단에 의해 골수종 세포와 림프계 세포를 융합시키는 것을 포함한다. 이러한 융합 후, 상기 세포를 융합 배지로부터 분리시키고, 선택적 성장 배지, 예컨대 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘 (HAT) 배지에서 성장시켜 혼성화되지 않은 모 세포를 제거한다. 혈청으로 보충시켰거나 보충시키지 않은, 본원에 기재된 배지 중 어느 것도, 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 세포 융합 기술에 대한 또 다른 대안으로서, EBV 불멸화 B 세포를 사용하여 본 발명의 PDGF-B 모노클로날 항체를 생성시킬 수 있다. 하이브리도마 또는 기타 불멸화 B-세포를 필요에 따라, 확장하고 서브클로닝하며, 상청액을 대상으로 하여 통상적인 면역검정 과정 (예를 들어, 방사성 면역검정, 효소 면역검정, 또는 형광 면역검정)에 의해 항-면역원 활성에 관하여 검정한다.
항체의 공급원으로서 사용될 수 있는 하이브리도마는 모든 유도체, PDGF-B에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 생산하는 모 하이브리도마의 자손 세포, 또는 그의 일부를 포괄한다.
이러한 항체를 생산하는 하이브리도마는 공지된 과정을 이용하여 시험관 내에서 또는 생체 내에서 성장시킬 수 있다. 모노클로날 항체는 필요에 따라, 통상적인 이뮤노글로불린 정제 과정, 예컨대 황산암모늄 침전, 겔 전기영동, 투석, 크로마토그래피, 및 한외여과에 의해 배양 배지 또는 체액으로부터 단리할 수 있다. 존재하는 경우, 원하지 않는 활성은, 예를 들어 고체 상에 부착된 면역원으로 제조된 흡착제 전반에 걸친 제조를 수행하고, 이러한 면역원으로부터 목적 항체를 용출 또는 방출시킴으로써 제거할 수 있다. 이관능성 또는 유도체화 작용제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기서, R 및 R1은 상이한 알킬 기이다)을 이용하여, 면역시키고자 하는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제와 접합된 표적 아미노산 서열을 함유하는 PDGF-B 폴리펩티드 또는 그의 단편으로 숙주 동물을 면역시키면, 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체) 집단이 산출될 수 있다.
필요에 따라, 관심 PDGF-B 항체 (모노클로날 또는 폴리클로날)를 서열화할 수 있고, 그 다음 폴리뉴클레오티드 서열을 발현 또는 증식을 위해 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 관심 항체를 코딩하는 서열을 숙주 세포 내의 벡터에 유지시킨 다음, 이러한 숙주 세포를 나중의 사용을 위해 확장 및 동결시킬 수 있다. 세포 배양물 중에서 재조합 모노클로날 항체를 생성시키는 것은 관련 기술분야에 공지된 수단에 의해 B 세포로부터 항체 유전자를 클로닝함으로써 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Tiller et al., 2008, J. Immunol. Methods 329, 112]; 미국 특허 번호 7,314,622 참조).
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 항체를 "인간화"시키거나 또는 항체의 친화도 또는 기타 특징을 개선시키기 위한 유전자 조작을 위해 사용될 수 있다. 항체는, 예를 들어 개, 고양이, 영장류, 말 및 소에 사용하기 위한 맞춤형일 수도 있다.
일부 실시양태에서, 완전한 인간 항체는 특이적 인간 이뮤노글로불린 단백질을 발현하도록 조작시킨 시판용 마우스를 이용함으로써 수득할 수 있다. 보다 바람직한 항체 (예를 들어, 완전한 인간 항체) 또는 보다 강건한 면역 반응을 생성하도록 설계되는 트랜스제닉 동물이 또한, 인간화 또는 인간 항체를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술의 예는 제노마우스(Xenomouse™) [아브게닉스, 인크. (Abgenix, Inc.; 미국 캘리포니아주 프리몬트)로부터 입수됨] 및 HuMAb-마우스(HuMAb-Mouse®) 및 TC 마우스(TC Mouse™) [메다렉스, 인크. (Medarex, Inc.; 미국 뉴저지주 프린스턴)로부터 입수됨]이다.
항체는 먼저, 숙주 동물로부터 항체 및 항체 생산 세포를 단리하고, 유전자 서열을 수득하며, 이러한 유전자 서열을 이용하여 항체를 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)에서 재조합적으로 발현시킴으로써 재조합적으로 만들 수 있다. 이용될 수 있는 또 다른 방법은 항체 서열을 식물 (예를 들어, 담배) 또는 트랜스제닉 유액에서 발현시키는 것이다. 항체를 식물 또는 유액에서 재조합적으로 발현시키는 방법은 개시되었다 (예를 들어, 문헌 [Peeters, et al. Vaccine 19:2756, 2001]; [Lonberg, N. and D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65, 1995]; 및 [Pollock, et al., J Immunol Methods 231:147, 1999] 참조). 항체의 유도체, 예를 들어 도메인, 단일 쇄 등을 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
면역검정 및 유동 세포계수법 분류 기술, 예컨대 형광 활성화 세포 분류법 (FACS)을 또한 이용하여 PDGF-B에 대해 특이적인 항체를 단리시킬 수 있다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 과정을 이용하여 (예를 들어, 이러한 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리 및 서열 분석한다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 제공된다. 일단 단리되면, 그 DNA를 발현 벡터 (예컨대 PCT 공개 번호 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터) 내로 놓아둘 수 있고, 이어서 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 수득한다 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 87/04462 참조). DNA는 또한, 예를들어 코딩 서열을 상동 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인으로 치환시키거나 (문헌 [Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851, 1984]) 또는 이뮤노글로불린 코딩 서열에 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유적으로 연결시킴으로써 변형시킬 수 있다. 그러한 방식으로, 본원의 PDGF-B 항체의 결합 특이성을 지닌 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체를 제조한다.
항체 단편은 항체의 단백질 분해적 또는 다른 분해에 의해, 상기 언급된 바와 같은 재조합 방법에 의해 (즉, 단일 또는 융합 폴리펩티드), 또는 화학적 합성에 의해 생성시킬 수 있다. 항체의 폴리펩티드, 특히 약 50개 이하의 아미노산의 보다 짧은 폴리펩티드는 화학적 합성에 의해 편리하게 제조한다. 화학적 합성 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고 시판되고 있다. 예를 들어, 항체는 고체 상 방법을 이용하는 자동화 폴리펩티드 합성기에 의해 생성될 수 있었다 (또한, 미국 특허 번호 5,807,715; 4,816,567; 및 6,331,415 참조).
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 항체 MOR8457, 또는 그의 배선화 버전의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함한다. 관심 항체를 코딩하는 서열을 숙주 세포 내의 벡터에 유지시킨 다음, 이러한 숙주 세포를 나중의 사용을 위해 확장 및 동결시킬 수 있다. 벡터 (발현 벡터 포함) 및 숙주 세포는 본원에 추가로 기재되어 있다.
본 발명은 친화성 성숙된 실시양태를 포함한다. 예를 들어, 친화성 성숙된 항체는 관련 기술분야에 공지된 과정에 의해 생성될 수 있다 (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783; Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Schier et al., 1995, Gene, 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9; Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896; 및 PCT 공개 번호 WO2004/058184).
항체의 친화도를 조정하고 CDR을 명확히 규명하기 위한 다음 방법을 사용할 수 있다. 특정 항체의 CDR을 명확히 규명하고/하거나 특정 폴리펩티드, 예컨대 항체의 결합 친화도를 변경 (예컨대 개선)시키는 한 가지 방식이 "라이브러리 스캐닝 돌연변이 유발"로 명명된다. 일반적으로, 라이브러리 스캐닝 돌연변이 유발은 다음과 같이 수행된다. CDR 내의 1개 이상의 아미노산 위치를, 관련 기술분야에서 인식되고 있는 방법을 이용하여 2개 이상 (예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개)의 아미노산으로 대체시킨다. 이로써, (일부 실시양태에서, 분석되는 모든 아미노산 위치에 대해 하나의) 소형 클론 라이브러리가 생성되는데, (2개 이상의 아미노산이 모든 위치에서 치환되는 경우) 각각은 2개 이상의 구성원의 복잡한 특징을 수반한다. 일반적으로, 이러한 라이브러리는 또한, 천연 (치환되지 않은) 아미노산을 포함하는 클론을 포함한다. 각 라이브러리로부터 소수의 클론, 예를 들어 약 20 내지 80개의 클론 (라이브러리의 복잡성에 좌우된다)을 대상으로 하여, 표적 폴리펩티드 (또는 기타 결합 표적)에 대한 결합 친화도에 관하여 스크리닝하고, 결합이 증가되거나, 동일하거나, 감소되거나 또는 전혀 없는 후보를 확인한다. 결합 친화도를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 결합 친화도는, 예를 들어 약 2배 또는 그 초과의 결합 친화도 상의 차이를 검출해 주는 비아코어™ 표면 플라스몬 공명 분석, 키넥사(Kinexa®) 바이오센서, 신틸레이션 근접 검정, ELISA, ORIGEN® 면역검정, 형광 켄칭, 형광 전이, 및/또는 효모 디스플레이를 이용하여 결정할 수 있다. 결합 친화도는 또한, 적합한 생물학적 검정을 이용하여 스크리닝할 수 있다. 출발 항체가 이미 비교적 고 친화도, 예를 들어 약 10 nM 이하의 KD로 결합하는 경우에는 비아코어™가 특히 유용하다.
일부 실시양태에서, CDR 내의 모든 아미노산 위치를, 관련 기술분야에서 인식되고 있는 돌연변이 유발 방법 (이중 일부가 본원에 기재되어 있다)을 이용하여 20개 모든 자연 아미노산으로 대체시킨다 (일부 실시양태에서는, 한번에 하나씩 대체시킨다). 이로써, (일부 실시양태에서는, 분석되는 모든 아미노산 위치에 대해 하나의) 소형 클론 라이브러리가 생성되는데, (20개 모든 아미노산이 모든 위치에서 치환되는 경우) 각각은 20개 구성원의 복잡한 특징을 수반한다.
일부 실시양태에서, 스크리닝하고자 하는 라이브러리는 동일한 CDR 내이거나 2개 이상의 CDR 내일 수 있는 2개 이상의 위치에서 치환을 포함한다. 따라서, 라이브러리는 하나의 CDR 내의 2개 이상의 위치에서 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 2개 이상의 CDR 내의 2개 이상의 위치에서 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 3, 4, 5, 또는 그 초과의 위치에서 치환을 포함할 수 있는데, 각 위치는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR에서 발견된다. 이러한 치환은 낮은 중복성 코돈을 이용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Balint et al., 1993, Gene 137(1):109-18]의 표 2 참조).
이러한 CDR은 중쇄 가변 영역 (VH) CDR3 및/또는 경쇄 가변 영역 (VL) CDR3일 수 있다. 이 CDR은 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및/또는 VL CDR3 중 하나 이상일 수 있다. CDR은 카바트 CDR, 코티아 CDR, 연장된 CDR, AbM CDR, 접촉 CDR, 또는 입체 형태적 CDR일 수 있다.
개선된 결합을 지닌 후보를 서열 분석함으로써, 개선된 친화성을 가져다 주는 CDR 치환 돌연변이체 (또한, "개선된" 치환으로 명명됨)을 확인할 수 있다. 결합되는 후보를 또한 서열 분석함으로써, 결합을 보유하고 있는 CDR 치환을 확인할 수 있다.
여러 차례의 스크리닝을 수행할 수 있다. 예를 들어, 개선된 결합을 지닌 후보 (각각 하나 이상의 CDR의 1개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함한다)는 또한, 각각의 개선된 CDR 위치 (즉, 치환 돌연변이체가 개선된 결합을 나타낸 CDR 내의 아미노산 위치)에서 적어도 본래의 아미노산과 치환된 아미노산을 함유하는 제2의 라이브러리를 설계하는데 유용하다. 이러한 라이브러리의 제조, 및 스크리닝 또는 선별은 다음에 추가로 논의된다.
개선된 결합, 동일한 결합 또는 감소된 결합을 나타내거나 결합을 전혀 나타내지 않는 클론의 빈도가 또한, 항체-항원 복합체의 안정성에 대한 각 아미노산 위치의 중요성과 관련된 정보를 제공하는 한에 있어서는, 라이브러리 스캐닝 돌연변이 유발이 또한, CDR을 명확히 규명하기 위한 수단을 제공한다. 예를 들어, CDR의 특정 위치가 20개 모든 아미노산으로 변한 경우에도 결합을 보유한다면, 이러한 위치는 항원 결합을 위해 요구될 것 같지 않은 위치로서 확인된다. 역으로 언급하면, CDR의 특정 위치가 단지 적은 비율의 치환에서만 결합을 보유한다면, 이러한 위치는 CDR 기능에 중요한 위치로서 확인된다. 따라서, 라이브러리 스캐닝 돌연변이 유발 방법에 의해, 상이한 많은 아미노산 (20개 모든 아미노산 포함)으로 변할 수 있는 CDR 내의 위치와, 변할 수 없거나 또는 소수의 아미노산으로만 변할 수 있는 CDR 내의 위치에 관한 정보를 얻을 수 있다.
개선된 친화성을 지닌 후보는 개선된 아미노산, 그 위치에서 본래의 아미노산을 포함하는 제2의 라이브러리에서 합할 수 있고, 목적하는 스크리닝 또는 선별 방법을 이용하여 허용되거나 또는 요망되는 라이브러리의 복잡성에 따라서 그 위치에서 부가의 치환을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 필요에 따라, 인접한 아미노산 위치가 적어도 2개 이상의 아미노산으로 무작위 배정될 수 있다. 인접한 아미노산의 무작위 배정으로 인해, 돌연변이체 CDR 내에서 부가의 입체 형태적 유연성이 허용될 수 있고, 이는 결국, 보다 다수의 개선 돌연변이의 도입을 허용하거나 촉진시킬 수 있다. 상기 라이브러리는 또한, 제1 라운드의 스크리닝에서는 개선된 친화성을 나타내지 않았던 위치에서 치환을 포함할 수 있다.
제2의 라이브러리를 대상으로 하여, 키넥사™ 바이오센서 분석을 이용하는 스크리닝, 및 선별을 위해 관련 기술분야에 공지된 모든 방법 (파지 디스플레이, 효모 디스플레이 및 리보솜 디스플레이 포함)을 이용하는 선별을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 모든 방법을 이용하여 개선되고/되거나 변경된 결합 친화성을 지닌 라이브러리 구성원에 관하여 스크리닝하거나 선별한다.
본 발명의 PDGF-B 항체를 발현하기 위하여, VH 및 VL 영역을 코딩하는 DNA 단편을 먼저, 상기 언급된 방법 중 어느 것을 이용하여 수득할 수 있다. 각종 변형, 예를 들어 돌연변이, 결실 및/또는 부가를, 통상의 기술자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 DNA 서열 내로 도입할 수도 있다. 예를 들어, 돌연변이 유발은 표준 방법, 예컨대 PCR-매개된 돌연변이 유발을 이용하여 수행할 수 있는데, 이러한 방법에서는 돌연변이된 뉴클레오티드를 PCR 프라이머 내로 혼입하여 PCR 생성물이 목적하는 돌연변이 또는 부위-지시된 돌연변이 유발을 함유하도록 한다.
본 발명은 도 1에 도시된 가변 영역 및 도 1에 표시된 CDR에 대한 변형을 포괄한다. 예를 들어, 본 발명은 항체의 특성에 상당한 영향을 미치지 않는, 기능상 등가의 가변 영역 및 CDR을 포함하는 항체뿐만 아니라 증강되거나 감소된 활성 및/또는 친화성을 갖는 변이체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산 서열을 돌연변이시켜 PDGF-B에 대한 목적하는 결합 친화성을 지닌 항체를 수득할 수 있다. 폴리펩티드의 변형은 관련 기술분야에서 통상적으로 실시되는 것이므로, 본원에 상세히 기재할 필요는 없다. 변형된 폴리펩티드의 예는 아미노산 잔기의 보존적 치환, 기능적 활성을 상당히 유해하게 변화시키지 않거나 또는 폴리펩티드의 그의 리간드에 대한 친화성을 성숙 (증강)시키는 아미노산의 하나 이상의 결실 또는 부가, 또는 화학적 유사체의 사용를 수반하는 폴리펩티드를 포함한다.
아미노산 서열 삽입물은 길이가 1개 잔기부터 수 백개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위인 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합물 뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입물을 포함한다. 말단 삽입물의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 에피토프 태그와 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 기타 삽입 변이체는 혈액 순환시 항체의 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소가 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.
항체는 또한, 예를 들어 이러한 항체의 결합 특성을 변경시키기 위해, 예를 들어 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인에서 변형될 수 있다. 가변 영역에서의 변화는 결합 친화성 및/또는 특이성을 변경시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 내지 5개 이하의 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인 내에서 이루어진다. 다른 실시양태에서, 1개 내지 3개 이하의 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인 내에서 이루어진다. 예를 들어, PDGF-B에 대한 항체의 KD를 증가 또는 감소시키기 위해, koff를 증가 또는 감소시키기 위해, 또는 항체의 결합 특이성을 변경시키기 위해 CDR 영역 중 하나 이상에서 돌연변이가 이루어질 수 있다. 부위-지시된 돌연변이 유발의 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 상기 문헌 [Sambrook et al.] 및 [Ausubel et al.] 참조).
변형 또는 돌연변이는 또한, PDGF-B 항체의 반감기를 증가시키기 위해 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서 이루어질 수 있다 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 00/09560 참조). 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서의 돌연변이는 또한, 항체의 면역원성을 변경시키거나, 또 다른 분자에 대한 공유적 또는 비-공유적 결합을 위한 부위를 제공하거나, 또는 보체 고정, FcR 결합 및 항체-의존성 세포-매개된 세포독성과 같은 특성을 변경시키기 위해 이루어질 수 있다. 본 발명에 따르면, 단일 항체는 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역 중 어느 하나 이상에서 또는 불변 영역에서 돌연변이를 가질 수 있다.
변형은 또한, 글리코실화 및 비-글리코실화 폴리펩티드뿐만 아니라 기타 번역 후 변형, 예컨대 예를 들어 상이한 당을 이용한 글리코실화, 아세틸화 및 인산화를 수반한 폴리펩티드를 포함한다. 항체는 그의 불변 영역 내의 보존된 위치에서 글리코실화된다 (Jefferis and Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). 이뮤노글로불린의 올리고사카라이드 측쇄는 단백질의 기능에 영향을 미치고 (문헌 [Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318]; [Wittwe and Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180]), 당단백질의 제시된 3차원적 표면 및 입체 형태에 영향을 미칠 수 있는, 이러한 당단백질의 부분들 간의 분자내 상호 작용에 영향을 미친다 (Jefferis and Lund, 상기 참조; Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). 올리고사카라이드는 또한, 소정의 당단백질이 특이적 인식 구조에 근거하여 특정 분자를 표적으로 하는데 제공될 수 있다. 항체의 글리코실화는 또한, 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)에 영향을 미치는 것으로 보고되었다. 특히, 이등분 GlcNAc의 형성을 촉매하는 글리코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII)의 테트라시클린-조절된 발현을 이용하여 CHO 세포에 의해 생성된 항체가 개선된 ADCC 활성을 지니는 것으로 보고되었다 (Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180).
항체의 글리코실화는 전형적으로, N-연결 또는 O-연결된다. N-연결된이란 탄수화물 부분을 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착시킨 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린, 아스파라긴-X-트레오닌 및 아스파라긴-X-시스테인 (여기서, X는 프롤린을 제외한 모든 아미노산이다)은 탄수화물 부분을 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중 어느 하나가 폴리펩티드에 존재하는 것은 잠재적 글리코실화 부위를 창출시켜 준다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.
글리코실화 부위를 항체에 부가하는 것은 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우에는) 상기 언급된 트리펩티드 서열 중 하나 이상을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 수행된다. 이러한 변경은 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 본래의 항체 서열에 부가하거나, 또는 이들 잔기에 의해 치환시킴으로써 만들 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
항체의 글리코실화 패턴은 또한, 기초가 되는 뉴클레오티드 서열을 변경시키지 않으면서 변경될 수 있다. 글리코실화는 대개, 항체를 발현시키기 위해 사용된 숙주 세포에 좌우된다. 잠재적 치료제로서의 재조합 당단백질, 예를 들어 항체의 발현을 위해 사용된 세포 유형이 거의 천연 세포가 아니기 때문에, 항체의 글리코실화 패턴 상의 변이가 예상될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070] 참조).
숙주 세포를 선택하는 것 이외에도, 항체의 재조합 생성 동안 글리코실화에 영향을 미치는 요인은 성장 방식, 배지 제형, 배양물 밀도, 산소화, pH, 정제 도식 등을 포함한다. 올리고사카라이드 생성에 관여한 특정의 효소를 도입하거나 또는 과발현시키는 것을 포함한, 특별한 숙주 유기체에서 달성된 글리코실화 패턴을 변경시키는 각종 방법이 제안되었다 (미국 특허 번호 5,047,335; 5,510,261 및 5,278,299). 글리코실화, 또는 특정 유형의 글리코실화는, 예를 들어 엔도글리코시다제 H (엔도 H), N-글리코시다제 F, 엔도글리코시다제 F1, 엔도글리코시다제 F2, 엔도글리코시다제 F3을 이용하여, 당단백질로부터 효소적으로 제거할 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포는 특정 유형의 폴리사카라이드를 프로세싱하는데 있어서 결함이 있도록 유전자 조작할 수 있다. 이들 및 유사한 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
기타 변형 방법은 관련 기술분야에 공지된 커플링 기술을 이용하는 것을 포함하는데, 이는 효소적 수단, 산화적 치환 및 킬레이트화를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 면역검정을 위해 표지를 부착시키기 위한 변형을 사용할 수 있다. 변형된 폴리펩티드는 관련 기술분야에 정립된 과정을 이용하여 만들고, 관련 기술분야에 공지된 표준 검정을 이용하여 스크리닝할 수 있는데, 이중 일부는 다음 및 본 실시예에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 Fc 감마 수용체에 대한 증가되거나 감소된 결합 친화성을 지닌 변형된 불변 영역을 포함하거나, 면역학적으로 불활성 또는 부분 불활성, 예를 들어 보체 매개된 용해를 촉발시키지 않거나, 항체-의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC)을 자극하지 않거나 또는 미세신경교세포를 활성화시키지 않거나; 또는 다음 중 어느 하나 이상에서 (변형되지 않은 항체와 비교해서) 저하된 활성을 갖는다: 보체 매개된 용해를 촉발시키는 활성, ADCC를 자극하는 활성, 또는 미세신경교세포를 활성화시키는 활성. 불변 영역의 상이한 변형을 이용하여 이펙터 기능의 최적 수준 및/또는 조합을 달성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Morgan et al., Immunology 86:319-324, 1995]; [Lund et al., J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969, 1996]; [Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184, 2000]; [Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989]; 및 [Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998] 참조). 일부 실시양태에서, 불변 영역은 문헌 (Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624; PCT 출원 번호 PCT/GB99/01441; 및/또는 UK 특허 출원 번호 9809951.8)에 기재된 바와 같이 변형시킨다.
일부 실시양태에서, 항체 불변 영역은 Fc 감마 수용체와 보체 및 면역 시스템과의 상호 작용을 피하도록 변형시킬 수 있다. 이러한 항체를 제조하기 위한 기술은 WO 99/58572에 기재되어 있다. 예를 들어, 불변 영역은 항체를 인간의 임상 시험과 처치에 사용하는 경우에 면역 반응을 피하기 위해 인간 불변 영역과 보다 유사하도록 조작할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,997,867 및 5,866,692 참조).
일부 실시양태에서, 불변 영역은 문헌 (Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624; PCT 출원 번호 PCT/GB99/01441; 및/또는 UK 특허 출원 번호 9809951.8)에 기재된 바와 같이 변형시킨다. 이러한 실시양태에서, Fc는 인간 IgG2 또는 인간 IgG4일 수 있다. Fc는 A330P331에서 S330S331로의 돌연변이 (여기서, 아미노산 잔기는 야생형 IgG2 서열을 참조로 하여 넘버링된다)를 함유하는 인간 IgG2 (IgG2Δa)일 수 있다 (Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624). 일부 실시양태에서, 항체는 다음 돌연변이를 포함하는 IgG4의 불변 영역을 포함한다 (문헌 [Armour et al., 2003, Molecular Immunology 40 585-593]): E233F234L235에서 P233V234A235로의 돌연변이 (IgG4Δc) (여기서, 넘버링은 야생형 IgG4를 참조로 한 것이다). 또한 또 다른 실시양태에서, Fc는 결실 G236을 수반한 E233F234L235에서 P233V234A235로의 돌연변이를 함유하는 인간 IgG4 (IgG4Δb)이다. 또 다른 실시양태에서, Fc는 S228에서 P228로의 힌지 안정화 돌연변이를 함유하는 모든 인간 IgG4 Fc (IgG4, IgG4Δb 또는 IgG4Δc)이다 (Aalberse et al., 2002, Immunology 105, 9-19).
일부 실시양태에서, 항체는 다음 돌연변이를 포함하는 인간 중쇄 IgG2 불변 영역을 포함한다: A330P331에서 S330S331로의 돌연변이 (여기서, 아미노산 넘버링은 야생형 IgG2 서열을 참조로 한 것이다) (Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624). 또한 다른 실시양태에서, 불변 영역은 N-연결된 글리코실화를 위해 비-글리코실화된다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 올리고사카라이드 부착 잔기를 돌연변이시키고/시키거나 불변 영역 내의 N-글리코실화 인식 서열의 일부인 잔기를 플랭킹함으로써 N-연결된 글리코실화를 위해 비-글리코실화된다. 예를 들어, N-글리코실화 부위 N297은, 예를 들어 A, Q, K, 또는 H로 돌연변이될 수 있다 (문헌 [Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989]; 및 [Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998] 참조). 일부 실시양태에서, 불변 영역은 N-연결된 글리코실화를 위해 비-글리코실화된다. 불변 영역은 효소적으로 (예컨대, 효소 PNGase에 의해 탄수화물을 제거한다) 또는 글리코실화 결핍성 숙주 세포에서 발현시킴으로써 N-연결된 글리코실화를 위해 비-글리코실화된다.
기타 항체 변형물은 PCT 공개 번호 WO 99/58572에 기재된 바와 같이 변형시킨 항체를 포함한다. 이들 항체는 표적 분자에서 지시된 결합 도메인 이외에도, 인간 이뮤노글로불린 중쇄의 불변 영역의 전부 또는 일부와 실질적으로 상동인 아미노산 서열을 갖는 이펙터 도메인을 포함한다. 이들 항체는 상당한 보체 의존성 용해, 또는 표적의 세포-매개된 파괴를 촉발시키지 않으면서 표적 분자와 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 이펙터 도메인은 FcRn 및/또는 FcγRIIb와 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 전형적으로, 2개 이상의 인간 이뮤노글로불린 중쇄 CH2 도메인으로부터 유래된 키메라 도메인에 기초하여다. 이러한 방식으로 변형된 항체는 통상적인 항체 요법에 대한 염증성 및 기타 불리한 반응을 피하기 위하여, 만성 항체 요법에 사용하기 특히 적합하다.
본 개시내용은 또한, 추가로 변형시킬 수 있는 항체 불변 도메인을 제공한다. Fc 영역의 변이체, 예를 들어 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 부가 및/또는 결실은 이펙터 기능을 증강 또는 저하시키는 것으로 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., 2002, Biochem. Soc. Trans. 30:487-490]; [Strohl, 2009, Curr. Opin. Biotechnol. 20(6):685-691]; 미국 특허 5,624,821, 5,648,260, 5,885,573, 6,737,056, 7,317,091; PCT 공개 번호 WO 99/58572, WO 00/42072, WO 04/029207, WO 2006/105338, WO 2008/022152, WO 2008/150494, WO 2010/033736; 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0132101, 2006/0024298, 2006/0121032, 2006/0235208, 2007/0148170; 문헌 [Armour et al., 1999, Eur. J. Immunol. 29(8):2613-2624 (저하된 ADCC 및 CDC)]; [Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276(9):6591-6604 (저하된 ADCC 및 CDC)]; [Idusogie et al., 2000, J. Immunol. 164(8):4178-4184 (증가된 ADCC 및 CDC)]; [Steurer et al., 1995, J. Immunol. 155(3):1165-1174 (저하된 ADCC 및 CDC)]; [Idusogie et al., 2001, J. Immunol. 166(4):2571-2575 (증가된 ADCC 및 CDC)]; [Lazar et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(11): 4005-4010 (증가된 ADCC)]; [Ryan et al., 2007, Mol. Cancer. Ther., 6: 3009-3018 (증가된 ADCC)]; [Richards et al., 2008, Mol. Cancer Ther. 7(8):2517-2527] 참조).
일부 실시양태에서, 항체는 변형되지 않은 항체와 비교해서, FcRn에 대한 증가된 결합 친화성 및/또는 증가된 혈청 반감기를 갖는 변형된 불변 영역을 포함한다.
"배선화"로서 공지된 과정에서는, VH 및 VL 서열 중의 특정의 아미노산을, 배선 VH 및 VL 서열에서 자연적으로 발견되는 것과 부합되도록 돌연변이시킬 수 있다. 특히, VH 및 VL 서열 중의 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 항체를 투여하는 경우에 면역원성의 위험을 저하시키기 위해 배선 서열과 부합되도록 돌연변이시킬 수 있다. 인간 VH 및 VL 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, "Vbase" 인간 배선 서열 데이터베이스 참조; 또한, 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]; [Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798]; 및 [Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836] 참조).
만들어질 수 있는 또 다른 유형의 아미노산 치환은 항체 내의 잠재적 단백질 분해적 부위를 제거하는 것이다. 이러한 부위는 항체의 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역 내에 또는 불변 영역 내에 존재할 수 있다. 시스테인 잔기의 치환과 단백질 분해적 부위의 제거는 항체 생성물 내에서의 이질성의 위험을 감소시킬 수 있으므로, 그의 동질성을 증가시킬 수 있다. 또 다른 유형의 아미노산 치환은 아스파라긴과 글리신 잔기 중 하나 또는 둘 다를 변경시킴으로써, 잠재적 탈아미드화 부위를 형성하는 아스파라긴-글리신 쌍을 제거하는 것이다. 또 다른 예에서는, 본 발명의 PDGF-B 항체의 중쇄의 C-말단 리신을 절단할 수 있거나 그렇지 않으면 제거할 수 있다. 본 발명의 각종 실시양태에서, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄는 임의로, 신호 서열을 포함할 수 있다.
일단 본 발명의 VH 및 VL 절편을 코딩하는 DNA 단편을 수득하면, 이들 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작하여, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시킬 수 있다. 이들 조작에서는, VL-코딩 또는 VH-코딩 DNA 단편을 또 다른 단백질, 예컨대 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 DNA 단편에 작동적으로 연결시킨다. 이러한 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "작동적으로 연결된"이란 상기 2개의 DNA 단편에 의해 코딩된 아미노산 서열이 동일 프레임 내에 남아 있도록 하기 위해 이들 2개의 DNA 단편을 연결시키는 것을 의미한다.
VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH-코딩 DNA를, 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 불변 영역이다. 이러한 IgG 불변 영역 서열은 상이한 개체들 간에 존재하는 것으로 공지된 각종 대립 유전자 또는 동종이형, 예컨대 Gm(1), Gm(2), Gm(3), 및 Gm(17) 중 어느 것일 수 있다. 이들 동종이형은 IgG1 불변 영역 내의 자연 발생 아미노산 치환을 나타낸다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또 다른 DNA 분자와 작동적으로 연결될 수 있다. 이러한 CH1 중쇄 불변 영역은 상기 중쇄 유전자 중 어느 것으로부터 유래될 수 있다.
VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA는, 이러한 VL-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 코딩하는 또 다른 DNA 분자와 작동적으로 연결시킴으로써 전장 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환시킬 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공개 번호 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다. 카파 불변 영역은 상이한 개체들 간에 발생하는 것으로 공지된 각종 대립 유전자, 예컨대 Inv(1), Inv(2), 및 Inv(3) 중 어느 것일 수 있다. 람다 불변 영역은 상기 3가지 람다 유전자 중 어느 것으로부터 유래될 수 있다.
scFv 유전자를 창출하기 위하여, VH-코딩 DNA 단편과 VL-코딩 DNA 단편을, VH 서열과 VL 서열이 연속되는 단일 쇄 단백질로서 발현될 수 있고 VL 영역과 VH 영역이 가요성 링커에 의해 연결되도록 이러한 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 단편과 작동적으로 연결시킨다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., 1988, Science 242:423-426]; [Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; [McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554] 참조). 연결성 펩티드의 한 예는 (GGGGS)3 (서열 18)인데, 이는 하나의 가변 영역의 카르복시 말단과 다른 가변 영역의 아미노 말단 간의 대략 3.5 nm를 메워준다. 다른 서열의 링커를 설계하고 사용하였다 (Bird et al., 1988, 상기 참조). 링커는 궁극적으로, 부가 기능, 예컨대 약물의 부착 또는 고체 지지체로의 부착을 위해 변형시킬 수 있다. 단일 쇄 항체는 단지 단일 VH와 VL을 사용한 경우에는 1가일 수 있거나, 2개의 VH와 VL을 사용한 경우에는 2가일 수 있거나, 또는 2개 초과의 VH와 VL을 사용한 경우에는 다가일 수 있다. PDGF-B 및 또 다른 분자와 특이적으로 결합하는 이중-특이적 또는 다가 항체를 생성시킬 수 있다. 단일 쇄 변이체는 재조합적으로 또는 합성적으로 생성시킬 수 있다. scFv를 합성 생성하는 경우에는, 자동화 합성기를 사용할 수 있다. scFv를 재조합 생성하는 경우에는, 이러한 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적합한 플라스미드를 적합한 진핵성 숙주 세포, 예컨대 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포, 또는 적합한 원핵성 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 내로 도입할 수 있다. 관심 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 통상적인 조작, 예컨대 폴리뉴클레오티드의 연결에 의해 만들 수 있다. 이로써 생성되는 scFv는 관련 기술분야에 공지된 표준 단백질 정제 기술을 이용하여 단리시킬 수 있다.
기타 형태의 단일 쇄 항체, 예컨대 디아바디가 또한 포괄된다. 디아바디는 VH와 VL이 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 발현되지만, 동일한 쇄 상에서 두 도메인 간에 쌍형성를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 이들 도메인을 또 다른 쇄의 상보적 도메인와 쌍형성하여 2개의 항원 결합 부위를 창출시키는 2가의 이중-특이적 항체이다 (예를 들어, 문헌 [Holliger, P., et al., 1993, Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448]; [Poljak, R. J., et al., 1994, Structure 2:1121-1123] 참조).
2개의 공유적으로 연결된 항체를 포함하는 이종-접합체 항체가 또한, 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 항체는 면역계 세포가 불필요한 세포를 표적으로 하고 (미국 특허 번호 4,676,980), HIV 감염을 치료하기 위해 사용되어 왔다 (PCT 공개 번호 WO 91/00360 및 WO 92/200373; EP 03089). 이종-접합체 항체는 편리한 모든 가교 결합 방법을 이용하여 만들 수 있다. 적합한 가교 결합제 및 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 미국 특허 번호 4,676,980에 기재되어 있다.
키메라 또는 하이브리드 항체는 또한, 가교 결합제가 관여하는 방법을 포함한, 합성 단백질 화학의 공지된 방법을 이용하여 시험관 내에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 디술피드 교환 반응을 이용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 면역독소를 구축할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 포함한다.
본 발명은 또한, 본원에 개시된 항체로부터의 하나 이상의 단편 또는 영역을 포함하는 융합 단백질을 포괄한다. 일부 실시양태에서, 또 다른 폴리펩티드와 연결된 본 발명의 PDGF-B 항체의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 항체를 만들 수 있다. 또 다른 실시양태에서, PDGF-B 항체의 가변 도메인만이 상기 폴리펩티드와 연결된다. 또 다른 실시양태에서, PDGF-B 항체의 VH 도메인은 제1 폴리펩티드와 연결되는 반면, PDGF-B 항체의 VL 도메인은, VH 도메인과 VL 도메인이 서로 상호 작용하여 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 방식으로 제1 폴리펩티드와 연합되는 제2 폴리펩티드와 연결된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, VH 도메인은 이러한 VH 도메인과 VL 도메인이 서로 상호 작용할 수 있도록 링커에 의해 VL 도메인으로부터 떨어져 있다. 이어서, VH-링커-VL 항체를 관심 폴리펩티드와 연결시킨다. 또한, 2개 (또는 그 초과의) 단일 쇄 항체가 서로 연결되는 융합 항체가 창출될 수 있다. 이는 단일 폴리펩티드 쇄 상에 2가 또는 다가 항체를 창출시키고자 하는 경우 또는 이중-특이적 항체를 창출시키고자 하는 경우에 유용하다.
일부 실시양태에서, 서열 1 또는 4에 제시된 가변 경쇄 영역의 10개 이상의 연속되는 아미노산 및/또는 서열 2 또는 6에 제시된 가변 중쇄 영역의 10개 이상의 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 다른 실시양태에서, 가변 경쇄 영역의 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 약 25개 이상, 또는 약 30개 이상의 연속되는 아미노산 및/또는 가변 중쇄 영역의 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 약 25개 이상, 또는 약 30개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 서열 1과 2 및 4와 6으로부터 선택된 서열 쌍 중 어느 것에 제시된 바와 같은, 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 하나 이상의 CDR(들)을 포함한다. 또한 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 VH CDR3 및/또는 VL CDR3을 포함한다. 본 발명의 목적상, 융합 단백질은 하나 이상의 항체, 및 천연 분자에서는 이에 부착되지 않는 또 다른 아미노산 서열, 예를 들어 또 다른 영역으로부터의 이종 서열 또는 동종 서열을 함유한다. 예시되는 이종 서열은 "태그", 예컨대 FLAG 태그 또는 6His 태그를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 태그는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
융합 폴리펩티드는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 합성적으로 또는 재조합적으로 창출될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 융합 단백질은 본원에 기재된 재조합 방법을 이용하여 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현함으로써 제조하지만, 이들은 예를 들어, 화학적 합성을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 기타 수단에 의해 제조할 수도 있다.
다른 실시양태에서, 기타 변형된 항체는 PDGF-B 항체를 코딩하는 핵산 분자를 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, "카파 바디" (문헌 [Ill et al., 1997, Protein Eng. 10:949-57]), "미니바디" (문헌 [Martin et al., 1994, EMBO J. 13:5303-9]), "디아바디" (상기 문헌 [Holliger et al.] 참조), 또는 "야누신(Janusin)" (문헌 [Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659] 및 [Traunecker et al., 1992, Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52])은 본 명세서의 교시에 따라서 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
예를 들어, 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 지닌 이중-특이적 항체, 모노클로날 항체는 본원에 개시된 항체를 이용하여 제조할 수 있다. 이중-특이적 항체의 제조 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210] 참조). 예를 들어, 이중-특이적 항체 또는 항원 결합 단편은 하이브리도마의 융합에 의해 또는 Fab' 단편을 연결시킴으로써 생성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Songsivilai & Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321], [Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553] 참조). 전통적으로, 이중-특이적 항체의 재조합 생성은 2개 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현에 근거하였는데, 이들 두 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein and Cuello, 1983, Nature 305, 537-539). 또한, 이중-특이적 항체는 "디아바디" 또는 "야누신"으로서 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중-특이적 항체는 PDGF-B의 2개의 상이한 에피토프와 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 언급된 변형된 항체는 본원에 제공된 PDGF-B 항체로부터의 가변 도메인 또는 CDR 영역 중 하나 이상을 이용하여 제조한다.
이중-특이적 항체를 제조하기 위한 한 가지 접근방식에 따르면, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 지닌 항체 가변 도메인을 이뮤노글로불린 불변 영역 서열과 융합시킨다. 이러한 융합은 바람직하게, 힌지, CH2 및 CH3 영역 중 적어도 일부를 포함하는, 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역을 수반한다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하고, 융합물 중 적어도 하나에 존재하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합물을 코딩하는 DNA, 및 필요에 따라 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동-형질감염시킨다. 이는 구축에 사용된 3개 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비가 최적의 수율을 제공하는 경우의 실시양태에서 3개 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는 데에 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비의 2개 이상의 폴리펩티드 쇄의 발현으로 인해 고 수율이 초래되는 경우 또는 이러한 비가 특별히 중요하지 않은 경우에 하나의 발현 벡터 내에 2개 또는 3개 모든 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
한 접근방식에서, 이중-특이적 항체는 한 암에 제1 결합 특이성을 지닌 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른 암에 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공한다)으로 구성된다. 이중-특이적 분자의 1/2에만 이뮤노글로불린 경쇄를 수반하는 상기 비대칭 구조는 목적하는 이중-특이적 화합물을 불필요한 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터 분리하는 것을 촉진시켜 준다. 이러한 접근방식은 PCT 공개 번호 WO 94/04690에 기재되어 있다.
본 발명은 또한, 고체 지지체 (예컨대, 비오틴 또는 아비딘)와의 커플링을 촉진시켜 주는 작용제와 접합된 (예를 들어, 연결된) 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 편의상, 이들 방법이 본원에 기재된 PDGF-B 결합 및/또는 길항제 실시양태 중 어느 것에 적용된다는 이해와 함께 일반적으로 항체에 대해 언급될 것이다. 접합은 일반적으로, 본원에 기재된 바와 같은 이들 성분을 연결시키는 것을 지칭한다. 이러한 연결 (이는 일반적으로, 이들 성분을 적어도 투여를 위해 근접하게 연합하여 고정시키는 것이다)은 수많은 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 특정 작용제와 항체가 각각, 다른 것과 반응할 수 있는 치환체를 보유하는 경우에는, 이들 작용제와 항체 간의 직접적인 반응이 가능하다. 예를 들어, 하나의 것 상에서의 친핵기, 예컨대 아미노 또는 술프히드릴 기는 다른 것 상에서의 카르보닐-함유 기, 예컨대 무수물 또는 산 할라이드와 반응할 수 있거나 또는 우수한 이탈기 (예를 들어, 할라이드)를 함유하는 알킬 기와 반응할 수 있다.
항체는 상이한 많은 운반체와 결합할 수 있다. 운반체는 활성이고/이거나 불활성일 수 있다. 널리 공지된 운반체의 예는 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 유리, 자연 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 자철석(magnetite)을 포함한다. 운반체의 성질은 본 발명의 목적상 가용성이거나 불용성일 수 있다. 통상의 기술자는 항체를 결합시키는데 적합한 다른 운반체를 알고 있거나 또는 통상적인 실험을 이용하여 이를 확인할 수 있을 것이다. 일부 실시양태에서, 운반체는 폐, 심장 또는 심장 판막을 표적으로 하는 부분을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 표지화 작용제, 예컨대 형광성 분자, 방사성 분자, 또는 관련 기술분야에 공지된 기타 모든 표지와 연결시킬 수 있다. 일반적으로 (직접 또는 간접적으로) 신호를 제공하는 표지는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편 및 변형된 항체를 포함한 항체 중 어느 것, 예컨대 예를 들어, 이펙터 기능 장애를 나타내는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 어느 것의 제조 방법을 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야에 공지된 과정에 의해 제조 및 발현될 수 있다. 따라서, 본 발명은 다음 PDGF-B 항체 및 그의 항원 결합 단편 중 어느 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 (제약 조성물 포함)을 제공한다: MOR8457 VL (서열 1), MOR8457 VH (서열 2), MOR8457-GL-VL (서열 4), MOR8457-GL-VH (서열 6), MOR8457-Gl-hIgG1-3m-HC (서열 14), MOR8457-GL-LC (서열 16), MOR8457-GL-IKR-LC (서열 17), MOR8457-hIgG1-3m-HC (서열 18), MOR8457-15-VL (서열 34), MOR8457-15-LC (서열 37), MOR8457-16-VL (서열 39), MOR8457-16-LC (서열 42), MOR8457-15-VH/MOR8457-16-VH (서열 44), MOR8457-15-HC/MOR8457-16-HC (서열 46), MOR8457 CDR-H1 (서열 7), MOR8457 CDR-H2 (서열 8), MOR8457 CDR-H3 (서열 9), MOR8457 CDR-L1 (서열 10), MOR8457 CDR-L2 (서열 11), MOR8457 CDR-L3 (서열 12), MOR8457-15-CDR-L3 (서열 36), MOR8457-16-CDR-L2 (서열 41), 또는 PDGF-B와 결합할 수 있는 능력을 갖는 그의 모든 단편 또는 일부.
본 발명은 다음을 포함한, 본 발명의 PDGF-B 항체 및 그의 항원 결합 단편 중 어느 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다: MOR8457 VL (서열 1), MOR8457 VH (서열 2), MOR8457-GL-VL (서열 4), MOR8457-GL-VH (서열 6), MOR8457-Gl-hIgG1-3m-HC (서열 14), MOR8457-GL-LC (서열 16), MOR8457-GL-IKR-LC (서열 17), MOR8457-hIgG1-3m-HC (서열 18), MOR8457-15-VL (서열 34), MOR8457-15-LC (서열 37), MOR8457-16-VL (서열 39), MOR8457-16-LC (서열 42), MOR8457-15-VH/MOR8457-16-VH (서열 44), MOR8457-15-HC/MOR8457-16-HC (서열 46), MOR8457 CDR-H1 (서열 7), MOR8457 CDR-H2 (서열 8), MOR8457 CDR-H3 (서열 9), MOR8457 CDR-L1 (서열 10), MOR8457 CDR-L2 (서열 11), MOR8457 CDR-L3 (서열 12), MOR8457-15-CDR-L3 (서열 36), MOR8457-16-CDR-L2 (서열 41), 또는 PDGF-B와 결합할 수 있는 능력을 갖는 그의 모든 단편 또는 일부 [여기서, 상기 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열 3 (MOR8457-GL-VL을 코딩함), 서열 5 (MOR8457-GL-VH를 코딩함), 서열 13 (MOR8457-GL-hIgG1-3m-HC를 코딩함), 서열 15 (MOR8457-GL-LC를 코딩함), 서열 35 (MOR8457-15-VL을 코딩함), 서열 38 (MOR8457-15-LC를 코딩함), 서열 40 (MOR8457-16-VL을 코딩함), 서열 43 (MOR8457-16-LC를 코딩함), 서열 45 (MOR8457-15-VH/MOR8457-16-VH를 코딩함), 및 서열 47 (MOR8457-15-HC/MOR8457-16-HC를 코딩함)의 서열을 포괄한다].
또 다른 측면에서, 본 발명은 PDGF-B 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 그의 변이체를 제공하는데, 이러한 변이체 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 특이적 핵산 중 어느 것과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 87% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 공유한다.
상기 서열 어느 것과도 상보적인 폴리뉴클레오티드가 또한, 본 발명에 의해 포괄된다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 (코딩 또는 안티센스) 또는 이중 가닥일 수 있고, DNA (게놈성, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 함유하고 일대일 방식으로 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 부가의 코딩 또는 비-코딩 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없고, 폴리뉴클레오티드는 다른 분자 및/또는 지지체 물질과 연결될 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다.
폴리뉴클레오티드는 천연 서열 (즉, 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 내인성 서열)을 포함할 수 있거나 또는 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩된 폴리펩티드의 면역반응성이 천연 면역반응성 분자와 비교해서 감소되지 않도록 하는 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 코딩된 폴리펩티드의 면역반응성에 대한 효과는 일반적으로, 본원에 기재된 바와 같이 평가할 수 있다. 변이체는 바람직하게, 천연 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 약 70% 이상의 동일성, 보다 바람직하게 약 80% 이상의 동일성, 보다 더 바람직하게 약 90% 이상의 동일성, 가장 바람직하게 약 95% 이상의 동일성을 나타낸다.
2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 이들 두 서열 내의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열이 다음에 기재되는 바와 같이 최대 상응도를 위해 정렬된 경우에 동일하다면, "동일한" 것으로 여겨진다. 두 서열 간의 비교는 전형적으로, 이들 서열을 비교 윈도우(window) 전반에 걸쳐 비교하여 서열 유사성의 국부 영역을 확인 및 비교함으로써 수행한다. 본원에 사용된 바와 같은 "비교 윈도우"는 약 20개 이상의 연속되는 위치의 절편, 통상적으로 30 내지 약 75개, 또는 40 내지 약 50개의 연속되는 위치의 절편을 지칭하는데, 여기서 서열 및 동일한 수의 연속되는 위치의 참조 서열을 최적으로 정렬시킨 후에 서열을 상기 참조 서열과 비교할 수 있다.
비교를 위해 서열들을 최적으로 정렬시키는 것은 디폴트(default) 파라미터를 이용하여, 생물 정보학 소프트웨어의 레이저진(Lasergene®) 스위트 중의 메그얼라인(MegAlign®) 프로그램 (DNASTAR®, 인크.; 미국 위스콘신주 매디슨)을 사용하여 수행할 수 있다. 이 프로그램은 다음 참고 문헌에 기재된 몇 가지 정렬 도식을 구체화한다 (Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730).
바람직하게, "서열 동일성의 비율(%)"은 20개 이상 위치의 비교 윈도우 전반에 걸쳐 최적으로 정렬된 두 서열을 비교함으로써 결정하는데, 여기서 비교 윈도우 중의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 정렬을 위한 참조 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않는다)과 비교해서 20% 이하, 통상적으로 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 이러한 비율(%)은 부합된 위치의 수를 산출하기 위해 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열에 존재하는 위치의 수를 결정하고, 이와 같이 부합된 위치의 수를 참조 서열 내의 총 위치 수 (즉, 윈도우 크기)로 나눈 다음, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 비율(%)을 산출함으로써 계산한다.
변이체는 또한, 또는 또 다른 한편으론, 천연 유전자, 또는 그의 일부 또는 보체와 실질적으로 상동성일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 변이체는 적당히 엄격한 조건 하에, 천연 항체 (또는 상보성 서열)를 코딩하는 자연 발생 DNA 서열과 혼성화할 수 있다.
적합한 "적당히 엄격한 조건"은 5 X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0)의 용액 중에서 미리-세척하고; 50℃ 내지 65℃ 하에, 5 X SSC를 밤새 혼성화한 다음; 0.1% SDS를 함유하는 2X, 0.5X 및 0.2X SSC 각각으로 65℃ 하에 20분 동안 2회 세척하는 것을 포함한다.
본원에 정의된 바와 같은 "고도로 엄격한 조건" 또는 "고 엄격성 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도와 고온, 예를 들어 50℃ 하에 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 소듐 시트레이트/0.1% 소듐 도데실 술페이트를 이용하는 조건; (2) 혼성화 동안 42℃ 하에 변성제, 예컨대 포름아미드, 예를 들어 750 mM 염화나트륨, 75 mM 소듐 시트레이트를 수반한 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충제 (pH 6.5)을 수반한 50% (v/v) 포름아미드를 이용하는 조건; 또는 (3) 42℃ 하에 50% 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 소듐 시트레이트), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5x 덴하르츠 (Denhardt) 용액, 초음파 처리시킨 연어 정액 DNA (50 ㎍/ml), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 술페이트를 이용하고, 42℃ 하에 0.2 x SSC (염화나트륨/소듐 시트레이트)에서 세척하고 55℃ 하에 50% 포름아미드로 세척한 다음, 55℃ 하에 EDTA를 함유하는 0.1 x SSC로 이루어진 고 엄격성 세척을 수행하는 조건이다. 통상의 기술자는 프로브 길이 등과 같은 요인들을 수용하는데 필요한 정도로 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 인식하고 있을 것이다.
유전 암호의 축중에 따른 결과로서, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 많은 뉴클레오티드 서열이 있다는 것을 통상의 기술자는 인지할 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드 중 일부는 모든 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대한 최소한의 상동성을 보유하고 있다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용빈도 상의 차이로 인해 다양한 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 의해 특이적으로 고려된다. 추가로, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립 유전자는 본 발명의 범위 내에 있다. 대립 유전자는 뉴클레오티드의 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 결실, 부가 및/또는 치환의 결과로서 변경되는 내인성 유전자이다. 이로써 생성되는 mRNA와 단백질은 변경된 구조 또는 기능을 가질 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 대립 유전자는 표준 기술 (예컨대, 혼성화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 이용하여 확인할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성, 재조합 방법, 또는 PCR을 이용하여 수득할 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오티드 합성 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 상세히 기재될 필요는 없다. 통상의 기술자는 본원에 제공된 서열을 이용할 수 있고 목적하는 DNA 서열을 생성시키기 위한 상업적 DNA 합성기를 이용할 수 있다.
재조합 방법을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 제조하는 경우에는, 목적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 적합한 벡터 내로 삽입할 수 있고, 이러한 벡터를 궁극적으로, 본원에 추가로 논의되는 바와 같이 복제 및 증폭을 위해 적합한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 관련 기술분야에 공지된 모든 수단에 의해 숙주 세포 내로 삽입할 수 있다. 세포는 직접적인 흡수, 세포내 이입, 형질감염, F-쌍형성 또는 전기천공에 의해 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 형질전환시킨다. 일단 도입되면, 이러한 외인성 폴리뉴클레오티드를 비-통합된 벡터 (예컨대, 플라스미드)로서 세포 내에 유지시킬 수 있거나 또는 숙주 세포 게놈 내로 통합시킬 수 있다. 이로써 증폭된 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야 내에서 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989] 참조).
또 다른 한편으론, PCR은 DNA 서열을 재생시킬 수 있다. PCR 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 미국 특허 번호 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 및 4,683,202 뿐만 아니라 문헌 (PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994)에 기재되어 있다.
RNA는 적당한 벡터 중의 단리된 DNA를 이용하고, 이를 적합한 숙주 세포 내로 삽입함으로써 수득할 수 있다. 세포가 복제되고 DNA가 RNA로 전사되면, 이때 예를 들어, 문헌 ([Sambrook et al., 1989] 상기 참조)에 제시된 바와 같이, 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 이용하여 RNA를 단리할 수 있다.
적합한 클로닝 벡터를 표준 기술에 따라서 구축할 수 있거나, 또는 관련 기술분야에서 입수 가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택할 수 있다. 선택된 클로닝 벡터가 사용하고자 하는 숙주 세포에 따라서 다양할 수 있긴 하지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로, 자가 복제할 수 있는 능력을 가질 것이고, 특별한 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 보유할 수 있고/있거나 상기 벡터를 함유하는 클론을 선별하는데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 수반할 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 박테리아성 바이러스, 예를 들어 pUC18, pUC19, 블루스크립트(Bluescript) (예를 들어, pBS SK+) 및 그의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 셔틀(shuttle) 벡터, 예컨대 pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이들 및 많은 기타 클로닝 벡터가 상업적 판매인, 예컨대 바이오라드(BioRad), 스트라테젠(Strategene), 및 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 입수 가능하다.
발현 벡터가 추가로 제공된다. 발현 벡터는 일반적으로, 본 발명에 따르는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복제 가능한 폴리뉴클레오티드 구조물이다. 이는 발현 벡터가 에피솜(episome)으로서 또는 염색체성 DNA의 절대 필요한 요소로서 숙주 세포에서 복제 가능해야만 한다는 것을 암시한다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스성 벡터 (아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 레트로바이러스 포함), 코스미드, 및 PCT 공개 번호 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터(들)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 벡터 성분은 일반적으로, 다음 중 하나 이상을 포함하지만, 그에 제한되지 않을 수 있다: 신호 서열; 복제 기점; 하나 이상의 마커 유전자; 적합한 전사 제어 요소 (예컨대, 프로모터, 증강인자 및 종결인자). 발현 (즉, 번역)을 위해, 하나 이상의 번역 제어 요소, 예컨대 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위 및 정지 코돈이 또한 통상적으로 요구된다.
관심 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리뉴클레오티드 그 자체를 함유하는 벡터는 전기천공; 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 기타 물질을 이용하는 형질감염; 미소발사체 충격; 리포펙션(lipofection); 및 감염 (예를 들어, 벡터가 감염체, 예컨대 백시니아 바이러스인 경우)을 포함한, 적당한 수많은 수단 중 어느 것에 의해 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 도입되는 벡터 또는 폴리뉴클레오티드의 선택은 종종, 숙주 세포의 특색에 좌우될 것이다.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 어느 것을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 이종 DNA를 과발현할 수 있는 어떠한 숙주 세포도 관심 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 단리할 목적으로 사용될 수 있다. 포유동물 숙주 세포의 비-제한적 예는 COS, HeLa, 및 CHO 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다 (또한, PCT 공개 번호 WO 87/04462 참조). 적합한 비-포유동물 숙주 세포는 원핵 생물 [예컨대, 이. 콜라이 또는 비. 서브틸리스 (B. subtillis)] 및 효모 [예컨대, 에스. 세레비지아에 (S. cerevisiae), 에스. 폼베 (S. pombe); 또는 케이. 락티스 (K. lactis)]를 포함한다. 바람직하게, 숙주 세포는 이러한 숙주 세포에 존재하는 경우, 상응하는 관심 내인성 항체 또는 단백질의 수준 보다 약 5배 이상, 보다 바람직하게 10배 이상, 보다 더 바람직하게 20배 이상 더 높은 수준으로 cDNA를 발현한다. PDGF-B에 대한 특이적 결합을 알아보기 위하여 숙주 세포를 스크리닝하는 것은 면역검정 또는 FACS에 의해 수행된다. 관심 항체 또는 단백질을 과발현하는 세포를 확인할 수 있다.
발현 벡터를 사용하여 PDGF-B 항체의 발현을 지시할 수 있다. 통상의 기술자는 발현 벡터를 투여하여 생체 내에서 외인성 단백질의 발현을 수득하는 것을 잘 알고 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,436,908; 6,413,942; 및 6,376,471 참조). 발현 벡터의 투여는 국부 또는 전신 투여 (주사, 경구 투여, 입자 총 또는 카테터를 통한 투여 포함), 및 국소 투여를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 발현 벡터는 교감 신경 줄기 또는 신경절, 또는 관상 동맥, 심방, 심실, 또는 심장막에 직접 투여한다.
발현 벡터, 또는 서브게놈성 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물의 표적화 전달을 또한 사용할 수 있다. 수용체-매개된 DNA 전달 기술이, 예를 들어 문헌 (Findeis et al., Trends Biotechnol., 1993, 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer, J.A. Wolff, ed., 1994; Wu et al., J. Biol. Chem., 1988, 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem., 1994, 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem., 1991, 266:338)에 기재되어 있다. 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물은 유전자 요법 프로토콜에서 국부 투여하는 경우에 약 100 ng 내지 약 200 mg의 범위의 DNA로 투여한다. 유전자 요법 프로토콜 동안 약 500 ng 내지 약 50 mg, 약 1 ㎍ 내지 약 2 mg, 약 5 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 및 약 20 ㎍ 내지 약 100 ㎍의 농도 범위의 DNA를 사용할 수도 있다. 치료 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 유전자 전달 비히클을 이용하여 전달할 수 있다. 이러한 유전자 전달 비히클은 바이러스성 기원 또는 비-바이러스성 기원일 수 있다 (일반적으로, 문헌 [Jolly, Cancer Gene Therapy, 1994, 1:51]; [Kimura, Human Gene Therapy, 1994, 5:845]; [Connelly, Human Gene Therapy, 1995, 1:185]; 및 [Kaplitt, Nature Genetics, 1994, 6:148] 참조). 이러한 코딩 서열의 발현은 내인성 포유동물 또는 이종 프로모터를 이용하여 유도시킬 수 있다. 코딩 서열의 발현은 구성적 또는 조절성일 수 있다.
목적하는 폴리뉴클레오티드를 전달하고 이를 목적하는 세포에서 발현하기 위한 바이러스-기반 벡터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예시되는 바이러스-기반 비히클은 재조합 레트로바이러스 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; 미국 특허 번호 5,219,740 및 4,777,127; GB 특허 번호 2,200,651; 및 EP 특허 번호 0 345 242 참조), 알파바이러스-기반 벡터 [예를 들어, 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 셈리키(Semliki) 삼림열 바이러스 (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 강(Ross River) 바이러스 (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네수엘라 말뇌염(Venezuelan equine encephalitis) 바이러스 (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)], 및 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655 참조)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 문헌 (Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147)에 기재된 바와 같은 사멸 아데노바이러스와 연결된 DNA의 투여를 이용할 수도 있다.
비-바이러스성 전달 비히클 및 방법을 이용할 수도 있는데, 이는 사멸 아데노바이러스 단독과 연결되거나 연결되지 않은 다가 양이온성 축합 DNA (예를 들어, 문헌 [Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147] 참조); 리간드-연결된 DNA (예를 들어, 문헌 [Wu, J. Biol. Chem., 1989, 264:16985] 참조); 진핵 세포 전달 비히클 세포 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,814,482; PCT 공개 번호 WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; 및 WO 97/42338 참조) 및 핵 전하 중화 또는 세포막과의 융합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 네이키드 DNA를 이용할 수도 있다. 예시되는 네이키드 DNA 도입 방법은 PCT 공개 번호 WO 90/11092 및 미국 특허 번호 5,580,859에 기재되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포솜은 미국 특허 번호 5,422,120; PCT 공개 번호 WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; 및 EP 0524968에 기재되어 있다. 부가의 접근방식이 문헌 ([Philip, Mol. Cell Biol., 1994, 14:2411] 및 [Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci., 1994, 91:1581])에 기재되어 있다.
치료 방법
치료 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료상 유효량 또는 "유효량"의 본 발명의 PDGF-B 항체 또는 항원 결합 부분을 투여하는 것을 포함하고, 본 개시내용에 의해 포괄된다. 본원에 사용된 바와 같은, "치료상 유효량" 또는 "유효량"은 단독으로 또는 다른 작용제와 병용해서, 단일 용량으로서 또는 수 회분 용량 요법에 따라서 질환 증상의 중증도를 감소시키거나, 질환 증상이 없는 기간의 횟수 및 지속 기간을 증가시키거나, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애를 방지시키는데 충분한 양인, 항체 또는 그의 일부의 양을 지칭한다. 통상의 기술자는 대상체의 크기, 대상체의 증상의 중증도, 및 선택된 특별한 조성물 또는 투여 경로와 같은 요인들에 근거하여 이러한 양을 결정할 수 있을 것이다. 대상체는 인간 또는 비-인간 동물 (예를 들어, 토끼, 래트, 마우스, 원숭이 또는 기타 하등 영장류)일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 부분은 공지된 의약과 함께 공동-투여될 수도 있고, 일부 경우에는 항체 자체가 변형될 수도 있다. 예를 들어, 항체는 효능을 잠재적으로 추가 증가시키기 위하여 면역독소 또는 방사성 동위원소와 접합시킬 수 있었다. 부가의 치료제와의 공동-투여에 관해서는, 이러한 치료제가 세포독성제, 방사성 독성제 또는 면역억제제를 포함할 수 있다. 항체를 이러한 작용제와 연결시킬 수 있거나 (면역복합체로서) 또는 상기 작용제와 별개로 투여할 수 있다. 후자의 경우에는 (별개 투여), 항체를 상기 작용제의 투여 이전, 이후 또는 동시에 투여할 수 있거나 또는 기타 공지된 치료제, 예를 들어 항암 요법, 예를 들어 방사선 요법과 공동-투여할 수 있다. 이러한 치료제는 특히, 단독으로는 환자에게 독성이거나 아독성인 수준에서만 유효한 항종양제, 예컨대 독소루비신 (아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 술페이트, 카르무스틴, 클로람부실, 및 시클로포스파미드 히드록시우레아를 포함한다. 시스플라틴은 4주마다 1회씩 100 mg 용량으로서 정맥내 투여할 수 있고, 아드리아마이신은 21일마다 1회씩 60 내지 75 mg 용량으로서 정맥내 투여한다. 본 개시내용의 PDGF-B 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 특정 치료제와 공동-투여하면, 상이한 기전을 통하여 작동되는 2개의 작용제가 제공되어, 인간 질환에 대한 치료적 효과 및 아마도 상승적 효과를 제공할 수 있다. 이러한 공동-투여는 약물에 대한 저항성의 발생으로 인한 문제점을 해결할 수 있거나, 또는 종양발생 및/또는 불필요한 세포 증식을 치료하는데 있어서, 종양 세포가 항체와 비반응성이 되도록 할 수 있는 종양 세포의 항원성 상의 변화를 해결할 수 있다.
본원에 개시된 항체 및 항원 결합 부분은 PDGF-B가 문헌 (Trojanowska, 2008, Rheumatology 47:v2-v4; Andrae et al. 2008 Genes Dev. 22:1276-1312; Heldin and Westermark, 1999, Physiological Revs. 79(4):1238-1316; Laimer et al., 2012, Nature Med. 18(11):1699-1704)에서 검토된 바와 같이 바람직하지 못하게 발현되거나 발견되는 각종 상황 하에서 치료 또는 진단 도구로서 사용될 수 있다. PDGF-B가 종양발생에 관여한다는 것과, PDGF-B가 혈관형성, 세포 증식 및 세포 이동, 및 세포외 매트릭스의 과도한 침착에 일정 역할을 할 뿐만 아니라 PDGFRβ 및 PDGF-B가 수많은 질환, 장애 및 상태에 일정 역할을 한다는 것을 고려해 볼때, 이러한 많은 질환, 장애 또는 상태가 본 발명의 항체 또는 항원 결합 부분을 이용한 치료에 특히 적합하다. 이들 질환, 장애 또는 상태는 비정상적인 세포 성장과 관련된 상태, 예를 들어 중피종, 간암종, 전립선 암종, 선암종, 신경교종, 교모세포종, 난소 암종, 담관암종, NPM-ALK 유도 림프종, 결장직장암, 피부암, 유방암, 췌장암, 폐암, 또는 이들 암 중 하나 이상의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 이용하여 치료할 수 있는 추가의 PDGF-B 매개된 상태는 염증성 질환 (예를 들어, 아테롬성동맥경화증, 재협착증, 골관절염, 류마티스 관절염, 제1형 당뇨병, 만성 폐쇄성 폐 질환, 허혈, 졸중, 혈전증), 섬유성 상태 [예를 들어, 특발성 폐 섬유증, 신질환, 담도성 섬유증, 간 섬유증, 특발성 복막 섬유증, 사구체신염, IgA 신병증, 루푸스 신염, 알포트(Alport) 증후군, 판코니(Fanconi) 질환, 초점성 분절성 사구체 경화증, 고혈압성 신경화증, 신염 질환, 경피증 (SSc), 심장 비대증, 원발성 담즙성 경화증, 페이로니(Peyronie) 질환, 자궁 유섬유종, 자궁내막증, 폐고혈압, 수술후 유착, 피부 상처, 폐동맥 고혈압, 원발성 경화성 담관염, 심장 동종이식편 혈관병증 및 섬유증]; 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 황반 부종, 안구 건조, 협착증, 신생 혈관 내막 형성, 이식편 대 숙주 질환, 양성 전립선 비대증, 육종, 당뇨병성 신병증, 혈관염, 역형성 성상세포종, 중피종, 백혈병, 뇌 출혈, 골절 치유, 뇌경색, 아폽토시스, 후천성 면역 결핍 증후군/HIV 감염, 만성 신부전, 간경변증, 전이, 원발성 폐고혈압, 속발성 폐고혈압, 가와사키(Kawasaki) 증후군, 재관류 손상, 점막피부 림프절 증후군, 양성 종양, 고지혈증, 복압성 요실금, 만성 골수성 백혈병, 피부섬유종, 과민증, 수모세포종, 골수성 백혈병 (급성 및 만성), 골다공증, 그레이브(Grave) 안병증, 뇌염, 섬유 근육통, 신경계 손상, 노화, 담석증, 간 질환, 고콜레스테롤 혈증, 바이러스성 뇌막염, 생식 독성, 크레아틴 대사의 장애, 망막 질환, 전신 홍반성 루푸스, 흡수 장애 증후군, 이질통, 악성 고혈압, 골수 섬유증, 선천성 기형, 안구 독성, 알츠하이머(Alzheimer) 치매, 카르시노이드, 폐 섬유증, 비강 폴립, 자반증, 동맥류, 편평 상피 세포 암종, 만성 췌장염, 소화기계 신생물, 갑상선 신생물, 비정형 폐렴, 노쇠, 알레르기, 독성, 고형 종양, 제II형 당뇨병, 피부 반흔형성, 신경 내분비 암, 천식, 선종, 신경병증성 통증, 시토메갈로바이러스 감염, 신경모세포종, 망막병증, 위축, 뇌병증, 쇼크, CNS 암, 패혈증, 고산소증, 장암, 박테리아성 호흡기 질환, 기관 이식, 뇌하수체 암, 비만, 켈로이드 반흔, 니코틴 중독, 범불안 장애, 식도 암, 기저 및 편평 세포 피부암, 고칼슘혈증, 배아 치사, 폐렴, 폐의 염증, 신경계 질환, 신경계 암, 카포시(Kaposi) 육종, 응고 장애, 안 질환, 췌장염, 모세 혈관 확장증, 호흡기 질환, 안구 및 안와 염증, 한랭 글로불린혈증, 간세포성 암, 심혈관 장애, 및 파킨슨(Parkinson) 질환을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
전술된 장애 중 어느 것을 치료하기 위하여, 본 개시내용에 따라서 사용하기 위한 제약 조성물은 다음에 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 하나 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 통상적인 방식으로 제제화한 다음, 이를 투여할 수 있다.
본 개시내용에 따르는 항체 또는 항원 결합 부분의 치료상 유효량을 결정하는 것은 특별한 환자 특징, 투여 경로, 및 치료하고자 하는 장애의 성질에 상당히 좌우될 것이고, 이는 다음에 보다 상세히 논의되어 있다.
항체의 투여 및 투여량은 다음의 다른 곳에 보다 상세히 논의되어 있다.
진단 방법
본 발명의 항체, 조작된 항체, 및 조작된 항체 접합체는 진단 영상화에 사용될 수 있다. 예를 들어, 조작된 항체 접합체는 방사성 표지된 모노클로날 항체일 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Srivastava (ed.), Radiolabeled Monoclonal Antibodies For Imaging And Therapy, Plenum Press (1988)]; [Chase, "Medical Applications of Radioisotopes," in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Gennaro et al. (eds.), Mack Publishing Co., pp. 624-652 (1990)]; 및 [Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies," in Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto et al. (eds.), Chapman and Hall, pp. 227-249 (1993)]; [Grossman, 1986, Urol. Clin. North Amer. 13:465-474]; [Unger et al., 1985, Invest. Radiol. 20:693-700]; 및 [Khaw et al., 1980, Science 209:295-297] 참조). 면역영상으로서 공지되기도 하는 이러한 기술은 모노클로날 항체와 접합된 감마-방출성 방사성 동위원소의 위치를 검출하기 위해 감마 카메라를 이용한다. 진단 영상화를 이용하여 암, 자가면역 질환, 감염성 질환 및/또는 심혈관계 질환을 진단할 수 있다 (예를 들어, 상기 문헌 [Brown] 참조).
한 실시양태에서, 상기 조작된 항체 접합체를 사용하여 심혈관계 질환을 진단할 수 있다. 예를 들어, 항미오신 항체 단편을 포함하는 조작된 항체 접합체는 특히 급성 심근 경색과 연관된 심근 괴사를 영상화하는데 사용할 수 있다.
진단 이외에도, 모노클로날 항체 영상화를 이용하여 치료적 반응을 모니터링할 수 있고, 질환의 재발을 검출할 수 있으며, 후속 임상 결정을 인도할 수 있다.
진단 및 모니터링 목적을 위해서는, 중개 관능기를 이용함으로써 방사성 동위원소를 직접 또는 간접적으로 항체 단편과 결합시킬 수 있다. 이러한 중개 관능기는 예를 들어, DTPA (디에틸렌트리아민펜타아세트산) 및 EDTA (에틸렌 디아민 테트라아세트산)를 포함한다. 환자에게 전달된 방사선량은 전형적으로, 가능한 한 낮은 수준으로 유지시킨다. 이는 검출과 정확한 측정을 허용해 줄 최대 반감기, 최소 체내 잔류 및 최소량의 동위원소의 최상의 조합을 위해 동위원소를 선택함으로써 달성될 수 있다. 항체와 결합될 수 있고 진단 영상화에 적당한 방사성 동위원소의 예는 99mTc 및 111In을 포함한다.
연구 결과, 항체 단편, 특히 Fab 및 Fab'가 적합한 종양/배경 비를 제공하는 것으로 나타났다 (예를 들어, 상기 문헌 [Brown] 참조).
상기 조작된 항체 접합체는 또한, 생체내 진단 목적을 위해 상자성 이온으로 표지시킬 수 있다. 자기 공명 영상화에 특히 유용한 원소는 Gd, Mn, Dy, 및 Fe 이온을 포함한다.
이러한 조작된 항체 접합체는 또한, 시험관 내에서 특별한 항원의 존재를 검출할 수 있다. 이러한 면역검정에서는, 조작된 항체 접합체를 액체 상에서 활용할 수 있거나 또는 고체 상 운반체와 결합시킬 수 있다. 예를 들어, 온전한 항체 또는 그의 항원 결합 단편를 중합체, 예컨대 아미노덱스트란에 부착시켜, 항체 성분을 불용성 지지체, 예컨대 중합체-코팅된 비드, 플렐이트 또는 튜브와 연결시킬 수 있다.
또 다른 한편, 조작된 항체 접합체를 사용하여 조직학적 표본으로부터 제조된 조직 박편에서의 특별한 항원의 존재를 검출할 수 있다. 이러한 계내 검출은 예를 들어, 검출 가능하게 표지된 면역접합체를 상기 조직 박편에 적용함으로써 달성할 수 있다. 계내 검출을 이용하여 특별한 항원의 존재를 결정할 수 있고, 조사된 조직 내에서의 상기 항원의 분포도를 결정할 수 있다. 계내 검출의 일반적 기술은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ponder, "Cell Marking Techniques and Their Application," in Mammalian Development: A Practical Approach, Monk (ed.), IRL Press, pp. 115-138 (1987)]; 상기 문헌 [Coligan et al.] 참조).
검출 가능한 표지, 예컨대 효소, 형광성 화합물, 전자 이동제 등을 관련 기술분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 운반체에 연결시킬 수 있다. 이들 표지된 운반체 및 이로부터 제조된 조작된 항체 접합체는 시험관내 면역검정 및 계내 검출을 위해 사용될 수 있지만, 특정 항체 접합체는 표지를 항체에 직접적으로 부착시킴으로써 제조될 수 있다. 조작된 항체 접합체에 복수 개의 표지를 부하하면, 면역검정 또는 조직학적 과정의 감수성이 증가될 수 있는데, 표적 항원에 대한 항체 또는 항체 단편의 낮은 결합 정도만이 달성된다.
조성물
본 발명은 또한, 본원에 기재된 유효량의 PDGF-B 항체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 이러한 조성물의 예뿐만 아니라 제제화하는 방법이 또한, 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 하나 이상의 PDGF-B 항체를 포함한다. 다른 실시양태에서, PDGF-B 항체는 PDGF-B를 인식한다. 다른 실시양태에서, PDGF-B 항체는 인간 항체이다. 다른 실시양태에서, PDGF-B 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, PDGF-B 항체는 목적하는 면역 반응, 예컨대 항체-매개된 용해 또는 ADCC를 촉발시킬 수 있는 불변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, PDGF-B 항체는 불필요하거나 바람직하지 못한 면역 반응, 예컨대 항체-매개된 용해 또는 ADCC를 촉발시키지 않는 불변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, PDGF-B 항체는 항체의 하나 이상의 CDR(들) (예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 일부 실시양태에서, 6개 모든 CDR)을 포함한다.
상기 조성물은 둘 이상의 PDGF-B 항체 (예를 들어, PDGF-B의 상이한 에피토프를 인식하는 PDGF-B 항체의 혼합물)를 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 기타 예시적 조성물은 동일한 에피토프(들)를 인식하는 둘 이상의 PDGF-B 항체, 또는 PDGF-B의 상이한 에피토프와 결합하는 상이한 종의 PDGF-B 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 PDGF-B의 상이한 변이체를 인식하는 PDGF-B 항체의 혼합물, 또는 각종 PDGF, 예를 들어 PDGF-A, -B, -C 및 -D를 인식하는 PDGF 항체의 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 PDGF-B의 에피토프 1 및 에피토프 2를 인식하는 단일 PDGF-B 항체를 포함한다.
본 발명에 사용된 조성물은 동결건조된 제제 또는 수성 용액의 형태로, 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다 (Remington: The Science and practice of Pharmacy 20th Ed., 2000, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 투여량과 농도에서 수용자에게 무독성이고, 완충제, 예컨대 인산염, 시트레이트 및 기타 유기 산; 항산화제 (아스코르브산 및 메티오닌 포함); 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물 (글루코스, 만노스 또는 덱스트란 포함); 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제가 본원에 추가로 기재되어 있다.
PDGF-B 항체 및 그의 조성물은 또한, 상기 항체의 유효성을 증강하고/하거나 보충하기 위해 제공되는 기타 작용제와 연계해서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 어느 것을 포함하는 조성물 (제약 조성물 포함)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 항체 중 어느 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 또한 다른 실시양태에서, 조성물은 서열 3 및 서열 5에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열 13 및 서열 15에 제시된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열 35 및 서열 45에 제시된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열 38 및 서열 47에 제시된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열 40 및 서열 45에 제시된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 또는 서열 43 및 서열 47에 제시된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함한다.
또 다른 측면에서, 이러한 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항체의 VH, VL 및/또는 둘 다를 코딩할 수 있다. 즉, 상기 조성물은 본 발명의 항체, 또는 그의 항원 결합 부분을 코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드 또는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 개시내용의 제약 조성물은 또한, 병용 요법으로, 예컨대 다른 작용제와 병용해서 투여할 수 있다. 예를 들어, 병용 요법은 본 개시내용의 조작된 항체 또는 그의 접합체를 한 가지 이상의 기타 요법과 병용하는 것을 포함할 수 있는데, 이러한 기타 요법은 수술, 면역요법, 화학요법, 방사선 치료 또는 약물 요법일 수 있다.
본 개시내용의 제약 화합물은 하나 이상의 제약상 허용되는 염을 포함할 수 있다. 이러한 염의 예는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가 염은 무독성 무기 산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등으로부터 유래된 것 뿐만 아니라 무독성 유기 산, 예컨대 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알카노산, 히드록시 알카노산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기 부가 염은 알칼리 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유래된 것 뿐만 아니라 무독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것을 포함한다.
본 개시내용의 제약 조성물은 또한, 제약상 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예는 (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 소듐 비술페이트, 소듐 메타비술파이트, 아황산나트륨 등; (2) 지용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
본 개시내용의 제약 조성물에 이용될 수 있는 적합한 수성 및 비-수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적당한 유동성은, 예를 들어 코팅재, 예컨대 레시틴을 사용하고, 분산제의 경우에 요구되는 입자 크기를 유지하며, 계면활성제를 사용함으로써 유지시킬 수 있다.
이들 조성물은 또한, 아주반트, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물의 존재를 방지하는 것은 멸균 과정에 의해 그리고 각종 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 봉입시킴으로써 보장할 수 있다. 등장제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 상기 조성물 내로 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 주사 가능한 제약 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 봉입시킴으로써 야기시킬 수 있다.
제약 조성물은 전형적으로, 제조 및 저장 조건 하에서 멸균성이고 안정적이어야만 한다. 이러한 조성물은 용제, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 기타 주문 구조물로서 제제화할 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 분산 배지 또는 용매일 수 있다. 적당한 유동성은, 예를 들어 코팅재, 예컨대 레시틴을 사용하고, 분산제의 경우에 요구되는 입자 크기를 유지하며, 계면활성제를 사용함으로써 유지시킬 수 있다. 많은 경우에 있어서, 등장제, 예를 들어 당, 다가 알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 상기 조성물에 포함시키는 것이 적합할 것이다. 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물 내에 포함시킴으로써 야기시킬 수 있다.
멸균성의 주사 가능한 용제는 적당한 용매 중의 요구되는 양의 활성 화합물을 필요한 만큼 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 조합물과 함께 혼입시킨 다음, 멸균 미세여과함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산제는 활성 화합물을, 기본 분산 배지와 상기 열거된 것으로부터 요구되는 기타 성분을 함유하는 멸균성 비히클 내로 혼입함으로써 제조한다. 멸균성 주사 가능한 용제를 제조하기 위한 멸균성 산제의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 냉동 건조 (동결 건조)인데, 이는 앞서 멸균-여과된 그의 용액으로부터의 부가의 모든 목적 성분이 부가된 활성 성분의 분말을 산출시킨다.
본 발명의 제약 조성물은 안과 투여용으로 적합한 제제로 제조되거나, 패키지되거나 또는 판매된다. 이러한 제제는, 예를 들어 수성 또는 오일성 액상 담체 중의 활성 성분의 0.1 내지 1.0% (w/w) 용제 또는 현탁제를 포함한 점안제의 형태일 수 있다. 이러한 점안제는 완충제, 염, 또는 본원에 기재된 기타 부가 성분들 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 유용한 기타 안과용으로 투여 가능한 제제는 활성 성분을 미세결정성 형태 또는 리포솜성 제제로 포함하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "부가 성분"은 다음 중 하나 이상을 포함하지만, 그에 제한되지 않는다: 부형제; 표면 활성제; 분산제; 불활성 희석제; 과립화제 및 붕해제; 결합제; 윤활제; 감미제; 향미제; 착색제; 보존제; 생리학상 분해 가능한 조성물, 예컨대 젤라틴; 수성 비히클 및 용매; 오일성 비히클 및 용매; 현탁제; 분산 또는 습윤제; 유화제, 점활제; 완충제; 염; 증점제; 충전제; 유화제; 항산화제; 항생제; 항진균제; 안정화제; 및 제약상 허용되는 중합체성 및 소수성 물질. 본 발명의 제약 조성물에 포함될 수 있는 기타 "부가 성분"은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1985); 본원에 참고로 포함된다)에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 항체, 조작된 항체 또는 조작된 항체 접합체는 5 mg/ml, 또는 보다 바람직하게 약 10 mg/ml, 또는 보다 더 바람직하게 약 15 mg/ml, 또는 보다 더 바람직하게 약 20 mg/ml의 항체를 약 5 내지 6의 범위의 pH 하의 염화나트륨, 소듐 아세테이트 및 폴리소르베이트 80과 함께 함유하는 멸균성 수성 용제로서의 정맥내 제제로 투여된다. 바람직하게, 이러한 정맥내 제제는 5 또는 10 mg/ml의 항체를 pH 5.5의 140 mM 염화나트륨, 20 mM 소듐 아세테이트, 및 0.2 mg/ml 폴리소르베이트 80과 함께 함유하는 멸균성 수성 용제이다. 추가로, 조작된 항체 또는 조작된 항체 접합체를 포함하는 용제는 많은 다른 화합물들 중에서, 히스티딘, 만니톨, 슈크로스, 트레할로스, 글리신, 폴리(에틸렌) 글리콜, EDTA, 메티오닌 및 그의 모든 조합물, 및 관련 분야에 공지된 기타 많은 화합물을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 용량의 일부를 정맥내 거환으로써 투여하고, 나머지는 항체, 조작된 항체 또는 조작된 항체 접합체 제제를 주입함으로써 투여한다. 예를 들어, 항체, 조작된 항체 또는 조작된 항체 접합체의 0.01 mg/kg 정맥내 주사제가 거환으로서 제공될 수 있고, 미리 결정된 조작된 항체 또는 조작된 항체 접합체의 나머지 용량은 정맥내 주사에 의해 투여할 수 있다. 항체 또는 조작된 항체의 미리 결정된 용량은 예를 들어, 1시간 반 내지 2시간 내지 5시간의 기간에 걸쳐 투여할 수 있다.
치료제와 관련해서, 이러한 치료제가, 예를 들어 소분자인 경우, 이는 생리학상 허용되는 에스테르 또는 염의 형태로, 예컨대 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같은 생리학상 허용되는 양이온 또는 음이온과 조합하여 제약 조성물에 존재할 수 있다.
본원에 기재된 제약 조성물의 제제는 약리학 분야에 공지되어 있거나 또는 나중에 개발된 모든 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 담체 또는 하나 이상의 기타 보조 성분과 연합되게 하는 단계, 및 그 다음, 필요하거나 원하는 대로, 상기 생성물을 목적하는 단일 용량 또는 다수 용량 단위로 성형 또는 패키징하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 내독소 및/또는 관련 발열성 물질이 실질적으로 없는 발열원-무함유 제제이다. 내독소는 미생물 내부에 한정되고 미생물이 붕괴되거나 사멸되는 경우에 방출되는 독소를 포함한다. 발열성 물질은 또한, 박테리아 및 기타 미생물의 외막으로부터의 열-유도성, 열안정성 물질 (당단백질)을 포함한다. 이들 물질 둘 다는 인간에게 투여되는 경우에 열, 저혈압 및 쇼크를 유발시킬 수 있다. 잠재적으로 해로운 효과로 인해, 정맥내 투여되는 제약 약물 용제로부터는 심지어 적은 양의 내독소도 제거하는 것이 유리하다. 미국 식품 의약국 ("FDA")는 정맥내 약물 적용을 위한 단일 1시간 기간 내에 체중 1 kg당 1회 용량당 5 내독소 단위 (EU)의 상한치를 설정하였다 (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). 치료용 단백질을 체중 1 kg당 수백 또는 수천 밀리그램의 양으로 투여하는 경우에는, 심지어 미량의 내독소도 제거하는 것이 유리하다. 한 실시양태에서, 조성물 중의 내독소 및 발열원 수준은 10 EU/mg 미만, 또는 5 EU/mg 미만, 또는 1 EU/mg 미만, 또는 0.1 EU/mg 미만, 또는 0.01 EU/mg 미만, 또는 0.001 EU/mg 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중의 내독소 및 발열원 수준은 약 10 EU/mg 미만, 또는 약 5 EU/mg 미만, 또는 약 1 EU/mg 미만, 또는 약 0.1 EU/mg 미만, 또는 약 0.01 EU/mg 미만, 또는 약 0.001 EU/mg 미만이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 조성물을 투여하는 것을 포함하는데, 이러한 투여는 경구, 비경구, 근육내, 비내, 질내, 직장, 혀, 설하, 볼, 볼내, 정맥내, 피부, 피하 또는 경피이다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 조성물을 다른 요법, 예컨대 수술, 화학요법, 호르몬 요법, 생물학적 요법, 면역요법 또는 방사선 요법과 병용해서 투여하는 것을 추가로 포함한다.
투여
본 개시내용의 항체, 조작된 항체 또는 조작된 항체 접합체를 포함하는 제약 또는 멸균성 조성물을 제조하기 위하여, 이러한 항체/항체 접합체를 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합한다. 치료제와 진단제의 제제는, 예를 들어 동결건조된 산제, 슬러리, 수성 용제, 로션 또는 현탁제의 형태로 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.]; [Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N. Y.]; [Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY]; [Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY]; [Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY]; [Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.] 참조).
치료제에 대한 투여 요법을 선택하는 것은 실재물의 혈청 또는 조직 교체율, 증상의 수준, 실재물의 면역원성, 및 생물학적 매트릭스 중의 표적 세포의 접근성을 포함한 여러 가지 요인들에 좌우된다. 특정의 실시양태에서, 투여 요법은 허용되는 부작용의 수준에 따라서 환자에게 전달되는 치료제의 양을 최대화한다. 따라서, 전달되는 생물제제의 양은 부분적으로, 특별한 실제물과 치료하고자 하는 상태의 중증도에 좌우된다. 항체, 사이토킨, 및 소분자의 적당한 용량을 선택하는데 있어서의 지침은 입수 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Wawrzynczak, 1996, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK]; [Kresina (ed.), 1991, Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y.]; [Bach (ed.),1993, Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N. Y.]; [Baert, et al., 2003, New Engl. J. Med. 348:601-608]; [Milgrom, et al., 1999, New Engl. J. Med. 341:1966-1973]; [Slamon, et al., 2001, New Engl. J. Med. 344:783-792]; [Beniaminovitz, et al., 2000, New Engl. J. Med. 342:613-619]; [Ghosh, et al., 2003, New Engl. J. Med. 348:24-32]; [Lipsky, et al., 2000, New Engl. J. Med. 343:1594-1602] 참조).
적당한 용량을 결정하는 것은, 예를 들어 치료에 영향을 미치거나 또는 치료에 영향을 미치는 것으로 예측되는 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있거나 의심되는 파라미터 또는 요인을 이용하여 임상의가 수행한다. 일반적으로, 용량은 최적의 용량 보다 다소 적은 양으로 시작하고, 그 후 부정적인 모든 부작용과 비교해서 목적하거나 최적의 효과가 달성될 때까지 소량씩 증가시킨다. 중요한 진단 측정기준은, 예를 들어 염증의 증상, 또는 생성된 염증성 사이토킨의 수준을 포함한다.
본 개시내용의 제약 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성을 나타내지 않으면서, 특별한 환자, 조성물 및 투여 방식에 대한 목적하는 치료 반응을 달성하는데 유효한 활성 성분의 양을 수득하도록 다양할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 이용된 본 개시내용의 특별한 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 이용되는 특별한 화합물의 배출율, 치료 지속 기간, 이용된 특별한 조성물과 병용해서 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받고자 하는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적 건강 및 기존 병력, 및 의학 분야에 널리 공지된 기타 요인을 포함한 각종 약동학적 요인에 좌우될 것이다.
본 개시내용의 항체, 조작된 항체 또는 조작된 항체 접합체를 포함하는 조성물은 연속적으로 주입하거나, 또는 예를 들어 1일, 1주의 간격, 또는 매주 1 내지 7회의 용량으로 투여함으로써 제공될 수 있다. 용량은 정맥내, 피하, 국소, 경구, 비내, 직장, 근육내, 뇌내 또는 흡입에 의해 제공될 수 있다. 특이적 용량 프로토콜은 상당히 바람직하지 못한 부작용을 피하는 최대 용량 또는 용량 횟수를 포함하는 것이다. 총 1주 용량은 체중 kg당 0.05 ㎍ 이상, 0.2 ㎍/kg 이상, 0.5 ㎍/kg 이상, 1 ㎍/kg 이상, 10 ㎍/kg 이상, 100 ㎍/kg 이상, 0.2 mg/kg 이상, 1.0 mg/kg 이상, 2.0 mg/kg 이상, 10 mg/kg 이상, 15 mg/kg 이상, 20 mg/kg 이상, 25 mg/kg 이상, 또는 50 mg/kg 이상일 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Yang, et al., 2003, New Engl. J. Med. 349:427-434]; [Herold, et al., 2002, New Engl. J. Med. 346:1692-1698]; [Liu, et al., 1999, J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456]; [Portielji, et al., 2003, Cancer. Immunol. Immunother. 52: 133-144] 참조). 용량은 15 ㎍ 이상, 20 ㎍ 이상, 25 ㎍ 이상, 30 ㎍ 이상, 35 ㎍ 이상, 40 ㎍ 이상, 45 ㎍ 이상, 50 ㎍ 이상, 55 ㎍ 이상, 60 ㎍ 이상, 65 ㎍ 이상, 70 ㎍ 이상, 75 ㎍ 이상, 80 ㎍ 이상, 85 ㎍ 이상, 90 ㎍ 이상, 95 ㎍ 이상, 또는 100 ㎍ 이상일 수 있다. 대상체에게 투여되는 용량의 수는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12번, 또는 그 초과일 수 있다.
본 개시내용의 항체, 조작된 항체 또는 조작된 항체 접합체의 경우, 환자에게 투여되는 투여량은 환자의 체중 kg당 0.0001 mg 내지 100 mg일 수 있다. 투여량은 0.0001 mg/kg 내지 20 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 10 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 5 mg/kg, 0.0001 내지 2 mg/kg, 0.0001 내지 1 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.75 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.5 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.25 mg/kg, 0.0001 내지 0.15 mg/kg, 0.0001 내지 0.10 mg/kg, 0.001 내지 0.5 mg/kg, 0.01 내지 0.25 mg/kg 또는 0.01 내지 0.10 mg/환자의 체중 kg일 수 있다.
본 개시내용의 항체, 조작된 항체 또는 조작된 항체 접합체의 투여량은 환자의 체중 킬로그램 (kg)에 투여될 용량을 곱함으로써 계산할 수 있다 (mg/kg). 본 개시내용의 항체의 투여량은 150 ㎍/kg 이하, 125 ㎍/kg 이하, 100 ㎍/kg 이하, 95 ㎍/kg 이하, 90 ㎍/kg 이하, 85 ㎍/kg 이하, 80 ㎍/kg 이하, 75 ㎍/kg 이하, 70 ㎍/kg 이하, 65 ㎍/kg 이하, 60 ㎍/kg 이하, 55 ㎍/kg 이하, 50 ㎍/kg 이하, 45 ㎍/kg 이하, 40 ㎍/kg 이하, 35 ㎍/kg 이하, 30 ㎍/kg 이하, 25 ㎍/kg 이하, 20 ㎍/kg 이하, 15 ㎍/kg 이하, 10 ㎍/kg 이하, 5 ㎍/kg 이하, 2.5 ㎍/kg 이하, 2 ㎍/kg 이하, 1.5 ㎍/kg 이하, 1 ㎍/kg 이하, 0.5 ㎍/kg 이하, 또는 0.1 ㎍/환자의 체중 kg 이하일 수 있다.
본 개시내용의 조작된 항체 또는 조작된 항체 접합체의 단위 용량은 0.1 mg 내지 20 mg, 0.1 mg 내지 15 mg, 0.1 mg 내지 12 mg, 0.1 mg 내지 10 mg, 0.1 mg 내지 8 mg, 0.1 mg 내지 7 mg, 0.1 mg 내지 5 mg, 0.1 내지 2.5 mg, 0.25 mg 내지 20 mg, 0.25 내지 15 mg, 0.25 내지 12 mg, 0.25 내지 10 mg, 0.25 내지 8 mg, 0.25 mg 내지 7 mg, 0.25 mg 내지 5 mg, 0.5 mg 내지 2.5 mg, 1 mg 내지 20 mg, 1 mg 내지 15 mg, 1 mg 내지 12 mg, 1 mg 내지 10 mg, 1 mg 내지 8 mg, 1 mg 내지 7 mg, 1 mg 내지 5 mg, 또는 1 mg 내지 2.5 mg일 수 있다.
본 개시내용의 항체, 조작된 항체 또는 조작된 항체 접합체의 투여량은 특정 대상체 중에서 0.1 ㎍/ml 이상, 0.5 ㎍/ml 이상, 1 ㎍/ml 이상, 2 ㎍/ml 이상, 5 ㎍/ml 이상, 6 ㎍/ml 이상, 10 ㎍/ml 이상, 15 ㎍/ml 이상, 20 ㎍/ml 이상, 25 ㎍/ml 이상, 50 ㎍/ml 이상, 100 ㎍/ml 이상, 125 ㎍/ml 이상, 150 ㎍/ml 이상, 175 ㎍/ml 이상, 200 ㎍/ml 이상, 225 ㎍/ml 이상, 250 ㎍/ml 이상, 275 ㎍/ml 이상, 300 ㎍/ml 이상, 325 ㎍/ml 이상, 350 ㎍/ml 이상, 375 ㎍/ml 이상, 또는 400 ㎍/ml 이상의 혈청 역가를 달성할 수 있다. 또 다른 한편, 본 개시내용의 항체의 투여량은 특정 대상체 중에서 0.1 ㎍/ml 이상, 0.5 ㎍/ml 이상, 1 ㎍/ml 이상, 2 ㎍/ml 이상, 5 ㎍/ml 이상, 6 ㎍/ml 이상, 10 ㎍/ml 이상, 15 ㎍/ml 이상, 20 ㎍/ml 이상, 25 ㎍/ml 이상, 50 ㎍/ml 이상, 100 ㎍/ml 이상, 125 ㎍/ml 이상, 150 ㎍/ml 이상, 175 ㎍/ml 이상, 200 ㎍/ml 이상, 225 ㎍/ml 이상, 250 ㎍/ml 이상, 275 ㎍/ml 이상, 300 ㎍/ml 이상, 325 ㎍/ml 이상, 350 ㎍/ml 이상, 375 ㎍/ml 이상, 또는 400 ㎍/ml 이상의 혈청 역가를 달성할 수 있다.
본 개시내용의 항체, 조작된 항체 또는 조작된 항체 접합체의 용량은 반복될 수 있고, 그 투여는 적어도 1일, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3개월, 또는 적어도 6개월 정도의 간격을 둘 수 있다.
특별한 환자에 대한 유효량은 치료하고자 하는 상태, 환자의 전반적인 건강 상태, 투여 경로 및 용량, 및 부작용의 중증도에 따라서 다양할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Maynard, et al., 1996, A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FIa.]; [Dent, 2001, Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ, London, UK] 참조). 투여 경로는, 예를 들어 국소 또는 피부 적용, 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내, 뇌척수내, 병변내 주사 또는 주입, 또는 지속 방출 시스템 또는 이식제에 의할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sidman et al., 1983, Biopolymers 22:547-556]; [Langer, et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277]; [Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105]; [Epstein, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692]; [Hwang, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034]; 미국 특허 번호 6,350,466 및 6,316,024 참조). 필요한 경우, 조성물은 또한, 주사 부위에서의 통증을 경감시켜 주는 국소 마취제, 예컨대 리도카인, 및 안정화제를 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸화제를 수반한 제제를 이용함으로써 폐 투여를 이용할 수도 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,019,968, 5,985,320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540, 및 4,880,078; 및 PCT 공개 번호 WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, 및 WO 99/66903 참조; 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다). 한 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 항체 또는 조작된 항체 접합체, 병용 요법 또는 조성물은 알케르메스(Alkermes) AIR™ 폐 약물 전달 기술 (알케르메스, 인크.; 미국 매사추세츠주 케임브리지)을 이용하여 투여한다.
본 개시내용의 조성물은 또한, 관련 기술분야에 공지된 각종 방법 중 하나 이상을 이용하여 하나 이상의 투여 경로를 통하여 투여할 수 있다. 통상의 기술자에 의해 인지되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라서 다양할 것이다. 본 개시내용의 항체에 대해 선택된 투여 경로는, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 기타 비경구 투여 경로를 포함한다. 비경구 투여는 장내 및 국소 투여 외의 투여 방식, 통상적으로 주사에 의한 투여 방식을 나타낼 수 있고, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 제한없이 포함한다. 또 다른 한편, 본 개시내용의 조성물은 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어 비내, 경구, 질내, 직장, 설하 또는 국소 경로를 통하여 투여할 수 있다.
본 개시내용의 항체, 조작된 항체 또는 조작된 항체 접합체를 제어 방출 또는 지속 방출 시스템으로 투여하는 경우에는, 펌프를 사용하여 제어 또는 지속 방출을 달성할 수 있다 (문헌 [Langer, 상기 참조]; [Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20]; [Buchwald et al., 1980, Surgery 88:501]; [Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:514] 참조).
중합체성 물질을 사용하여 본 개시내용의 치료제의 제어 또는 지속 방출을 달성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, FIa. (1974)]; [Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)]; [Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. ScL Rev. Macromol. Chem. 23:61]; 또한, [Levy et al, 1985, Science 11 225:190]; [During et al., 19Z9, Ann. Neurol. 25:351]; [Howard et al, 1989, J. Neurosurg. 71: 105)]; 미국 특허 번호 5,679,377; 미국 특허 번호 5,916,597; 미국 특허 번호 5,912,015; 미국 특허 번호 5,989,463; 미국 특허 번호 5,128,326; PCT 공개 번호 WO 99/15154; 및 PCT 공개 번호 WO 99/20253 참조). 지속 방출 제제에 사용된 중합체의 예는 폴리(2-히드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-공-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜리드 (PLG), 폴리무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리락티드 (PLA), 폴리락티드-공-글리콜리드 (PLGA), 및 폴리오르토에스테르를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 지속 방출 제제에 사용된 중합체는 불활성이고, 걸러낼 수 있는 불순물이 없으며, 저장시 안정적이고, 멸균성이며 생분해 가능하다. 제어 또는 지속 방출 시스템을 예방적 또는 치료적 표적 근처에 놓아둠으로써, 전신 용량의 적은 일부만을 필요로 할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)] 참조).
제어 방출 시스템은 문헌 (Langer, 1990, Science 249:1527-1533]에 의한 검토에서 논의되어 있다. 통상의 기술자에게 공지된 모든 기술을 이용하여 본 개시내용의 하나 이상의 항체 또는 그의 접합체를 포함하는 지속 방출 제제를 생성시킬 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,526,938, 국제 특허 공개 번호 WO 91/05548, WO 96/20698, 문헌 [Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy and Oncology 59:179-189], [Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 50:372-397], [Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Ml. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854], 및 [Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Ml. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-160] 참조; 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다).
본 개시내용의 항체, 조작된 항체 또는 조작된 항체 접합체를 국소적으로 투여하는 경우에는, 이를 연고, 크림, 경피 패치, 로션, 젤, 샴푸, 스프레이, 에어로졸, 용제, 에멀젼의 형태, 또는 통상의 기술자에게 널리 공지된 기타 형태로 제제화할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)] 참조). 분무 가능하지 않은 국소 투여 형태의 경우에는, 국소 적용과 화합성인 담체 또는 하나 이상의 부형제를 포함하고 일부 경우에 물 보다 더 큰 동점도를 갖고 있는 점성 내지 반고형 또는 고형 형태가 전형적으로 이용된다. 적합한 제제는, 필요에 따라 각종 특성, 예컨대 삼투압에 영향을 미치기 위한 보조제 (예를 들어, 보존제, 안정화제, 습윤제, 완충제 또는 염)와 혼합되거나 또는 멸균되는 용제, 현탁제, 에멀젼, 크림, 연고, 산제, 바르는 약, 연고제 등을 제한없이 포함한다. 기타 적합한 국소 투여 형태는 분무 가능한 에어로졸 제제를 포함하는데, 여기서는 활성 성분을, 일부 경우에 고형 또는 액상 불활성 담체와 조합하여 가압 휘발물 (예를 들어, 가스 추진제, 예컨대 프레온)과의 혼합물에 패키징하거나 또는 눌러 짜내는 플라스틱 병에 패키징한다. 모이스처라이저 또는 보습제를 또한, 필요에 따라 제약 조성물 및 투여 형태에 가할 수 있다. 이러한 부가 성분의 예는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
항체, 조작된 항체 또는 조작된 항체 접합체를 포함하는 조성물을 비내 투여하는 경우, 이는 에어로졸 형태, 스프레이, 미스트, 또는 비말의 형태로 제제화할 수 있다. 특히, 본 개시내용에 따라서 사용하기 위한 예방제 또는 치료제는 적합한 추진제 (예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 가스)를 이용하여, 가압 팩 또는 분무기로부터의 에어로졸 스프레이 제시의 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우에는, 계측된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 투여 단위를 결정할 수 있다. 화합물과 적합한 분말 기재, 예컨대 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하는, 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 캡슐 및 카트리지 (예를 들어, 젤라틴으로 구성됨)를 제제화할 수 있다.
제2의 치료제, 예를 들어 사이토킨, 스테로이드, 화학요법제, 항생제 또는 방사선과 함께 공동-투여하거나 치료하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10 th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.]; [Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams and Wilkins, Phila., Pa.]; [Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams and Wilkins, Phila., Pa.] 참조). 치료제의 유효량은 증상을 10% 이상; 20% 이상; 약 30% 이상; 40% 이상; 또는 50% 이상 감소시킬 수 있다.
본 개시내용의 조작된 항체 또는 조작된 항체 접합체와 병용해서 투여될 수 있는 부가의 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 본 개시내용의 항체와 5분 미만 간격으로, 30분 미만 간격으로, 1시간 간격으로, 약 1시간 간격으로, 약 1 내지 약 2시간 간격으로, 약 2시간 내지 약 3시간 간격으로, 약 3시간 내지 약 4시간 간격으로, 약 4시간 내지 약 5시간 간격으로, 약 5시간 내지 약 6시간 간격으로, 약 6시간 내지 약 7시간 간격으로, 약 7시간 내지 약 8시간 간격으로, 약 8시간 내지 약 9시간 간격으로, 약 9시간 내지 약 10시간 간격으로, 약 10시간 내지 약 11시간 간격으로, 약 11시간 내지 약 12시간 간격으로, 약 12시간 내지 18시간 간격으로, 18시간 내지 24시간 간격으로, 24시간 내지 36시간 간격으로, 36시간 내지 48시간 간격으로, 48시간 내지 52시간 간격으로, 52시간 내지 60시간 간격으로, 60시간 내지 72시간 간격으로, 72시간 내지 84시간 간격으로, 84시간 내지 96시간 간격으로, 또는 96시간 내지 120시간 간격으로 투여할 수 있다. 2가지 이상의 요법을 한번의 동일한 환자 방문시에 투여할 수 있다.
본 개시내용의 항체, 조작된 항체 또는 조작된 항체 접합체, 및 기타 요법은 주기적으로 투여할 수 있다. 주기적인 요법은 제1 요법 (예를 들어, 제1 예방제 또는 치료제)를 일정 기간 동안 투여한 다음, 제2 요법 (예를 들어, 제2 예방제 또는 치료제)를 일정 기간 동안 투여하고, 임의로 그 다음에, 제3 요법 (예를 들어, 제3 예방제 또는 치료제)를 일정 기간 동안 투여하고, 상기 요법 중 하나에 대한 저항성의 발생을 저하시키고/시키거나, 상기 요법 중 하나의 부작용을 피하거나 감소시키고/시키거나 상기 요법의 효능을 개선시키기 위해, 상기 순차적 투여, 즉 주기를 반복하는 것을 포함한다.
특정의 실시양태에서, 본 개시내용의 항체, 조작된 항체 또는 조작된 항체 접합체는 생체 내에서의 적당한 분포를 보장하도록 제제화할 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 고도로 친수성인 많은 화합물을 배제시킨다. 본 개시내용의 치료 화합물이 (필요에 따라) 반드시 BBB를 가로지르기 위해서는, 이를 예를 들어, 리포솜에서 제제화할 수 있다. 리포솜의 제작 방법은, 예를 들어 미국 특허 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331을 참조할 수 있다. 리포솜은 특이적 세포 또는 기관 내로 선택적으로 수송되므로, 표적화 약물 전달을 증강시키는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [V.V. Ranade, 1989, J. Clin. Pharmacol. 29:685] 참조). 예시되는 표적화 부분은 엽산염 또는 비오틴 (예를 들어, 미국 특허 5,416,016 참조); 만노시드 (문헌 [Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038]); 항체 (문헌 [P. G. Bloeman et al., 1995, FEBS Lett. 357: 140]; [M. Owais et al., 1995, Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180]); 계면활성제 단백질 A 수용체 (문헌 [Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134]); pl20 (문헌 [Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090])을 포함한다 (또한, 문헌 [K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994, FEBS Lett. 346:123]; [Killion; Fidler, 1994; Immunomethods 4:273] 참조).
본 개시내용은 본 개시내용의 항체, 조작된 항체 또는 조작된 항체 접합체를 포함하는 제약 조성물을 단독으로 또는 기타 치료제와 병용해서, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 프로토콜을 제공한다. 본 개시내용의 병용 요법의 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 대상체에게 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 본 개시내용의 병용 요법의 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 또한, 주기적으로 투여할 수 있다. 주기적인 요법은 제1 요법 (예를 들어, 제1 예방제 또는 치료제)를 일정 기간 동안 투여한 다음, 제2 요법 (예를 들어, 제2 예방제 또는 치료제)를 일정 기간 동안 투여하고, 상기 요법 (예를 들어, 작용제) 중 하나에 대한 저항성의 발생을 저하시키고/시키거나, 상기 요법 (예를 들어, 작용제) 중 하나의 부작용을 피하거나 감소시키고/시키거나 상기 요법의 효능을 개선시키기 위해, 상기 순차적 투여, 즉 주기를 반복하는 것을 포함한다.
본 개시내용의 병용 요법의 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 대상체에게 동시에 투여할 수 있다. 용어 "동시에"는 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)을 정확하게 동시에 투여하는 것으로 제한되지 않고, 오히려 본 개시내용의 항체, 조작된 항체 또는 조작된 항체 접합체를 포함하는 제약 조성물을, 본 개시내용의 항체 또는 그의 접합체가 다른 요법(들)과 함께 작용하여, 이들을 다른 방식으로 투여한 경우 보다 증가된 이득을 제공할 수 있도록 해주는 시간 간격 이내에서 그리고 그러한 순서로 대상체에게 투여한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 각 요법은 대상체에게 동시에 투여할 수 있거나, 또는 알맞은 때의 상이한 시점에서 어떠한 순서로든지 순차적으로 투여할 수 있지만, 동시에 투여되지 않은 경우, 이들은 목적하는 치료적 또는 예방적 효과를 제공해주는 알맞은 때에 충분히 근접해서 투여해야 한다. 각 요법은 대상체에게 별개로, 적당한 어떠한 형태로든지, 그리고 적합한 모든 경로에 의해 투여할 수 있다. 각종 실시양태에서, 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 대상체에게 15분 미만, 30분 미만, 1시간 미만 간격으로, 약 1시간 간격으로, 약 1시간 내지 약 2시간 간격으로, 약 2시간 내지 약 3시간 간격으로, 약 3시간 내지 약 4시간 간격으로, 약 4시간 내지 약 5시간 간격으로, 약 5시간 내지 약 6시간 간격으로, 약 6시간 내지 약 7시간 간격으로, 약 7시간 내지 약 8시간 간격으로, 약 8시간 내지 약 9시간 간격으로, 약 9시간 내지 약 10시간 간격으로, 약 10시간 내지 약 11시간 간격으로, 약 11시간 내지 약 12시간 간격으로, 24시간 간격으로, 48시간 간격으로, 72시간 간격으로, 또는 1주 간격으로 투여한다. 다른 실시양태에서, 2가지 이상의 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)을 동일한 환자 방문 내에 투여할 수 있다.
병용 요법의 예방제 또는 치료제는 동일한 제약 조성물로 대상체에게 투여할 수 있다. 또 다른 한편, 병용 요법의 예방제 또는 치료제는 별개의 제약 조성물로 대상체에게 동시에 투여할 수 있다. 이러한 예방제 또는 치료제는 동일하거나 상이한 투여 경로에 의해 대상체에게 투여할 수 있다.
키트
본 발명은 본원에 기재된 항체 중 어느 것 또는 모두를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 본원에 기재된 PDGF-B 항체를 포함하는 1개 이상의 용기, 및 본원에 기재된 본 발명의 방법 중 어느 것에 따르는 사용 설명서를 포함한다. 일반적으로, 이들 사용 설명서는 상기 언급된 치료적 처치에 대한 본 발명의 항체의 투여에 관한 설명을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 용량 투여 단위를 생성시키기 위한 키트가 제공된다. 특정의 실시양태에서, 이러한 키트는 건조된 단백질을 갖는 제1 용기와 수성 제제를 갖는 제2 용기 둘 다를 함유할 수 있다. 특정의 실시양태에서, 국소 기구, 예를 들어 단일 및 다중 챔버의 예비-충진된 주사기 [예를 들어, 액체 주사기 및 리오시린지(lyosyringe)]를 함유하는 키트가 포함된다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. PDGF-B 항체의 사용에 관한 설명서는 일반적으로, 의도한 처치에 대한 투여량, 투여 스케줄 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 상기 용기는 단위 용량, 벌크 패키지 (예를 들어, 다수-용량 패키지) 또는 서브유닛 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 공급된 설명서는 전형적으로, 표지 또는 패키지 삽입물 (예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트) 상에 작성된 설명서이지만, 기계-판독 가능한 설명서 (예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 수반된 설명서) 또한 허용된다.
본 발명의 키트는 적합하게 패키징되어 있다. 적합한 패키징은 바이알, 병, 자르(jar), 유연 패키징 [예를 들어, 밀폐 마일라(Mylar) 또는 비닐 봉지] 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특이적 장치, 예컨대 흡입기, 비내 투여용 장치 (예를 들어, 분무기) 또는 주입 장치, 예컨대 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 또한 포함된다. 키트는 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 봉지 또는 바이알일 수 있다). 용기는 또한, 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 봉지 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 한 가지 활성제는 본 발명의 PDGF-B 항체이다. 용기는 제2의 제약상 활성제를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 임의로, 부가 성분, 예컨대 완충제 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 정상적으로, 키트는 특정 용기와, 이러한 용기 상에 있거나 이와 연합된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 중 어느 것 또는 모두를 포함하는 진단 키트를 제공한다. 이러한 진단 키트는, 예를 들어 특정 샘플 중의 PDGF-B의 존재를 검출하는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 진단 키트는 PDGF-B 매개된 질환, 장애 또는 상태의 발병 위험에 처할 수 있게 하는 잠재적 질환, 장애 또는 상태를 지닌 개체를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진단 키트는 특정 개체가 스타필로코쿠스성(staphylococcal) 질환에 걸릴 위험이 있는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진단 키트는 PDGF-B 매개된 질환이 있는 것으로 의심되는 개체에게서 PDGF-B의 존재 및/또는 수준을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 진단 키트는 본원에 기재된 PDGF-B 항체를 포함하는 하나 이상의 용기와, 본원에 기재된 본 발명의 방법 중 어느 것에 따르는 사용 설명서를 포함한다. 일반적으로, 이들 사용 설명서는 PDGF-B 매개된 질환에 걸릴 위험이 있거나 이러한 질환이 있는 것으로 의심되는 개체에게서 PDGF-B의 존재를 검출하기 위한 PDGF-B 항체의 용도에 관한 설명을 포함한다. 일부 실시양태에서, 예시되는 진단 키트는 시약, 예컨대 예를 들어, PDGF-B 항체, 음성 대조군 샘플, 양성 대조군 샘플, 및 키트의 사용에 관한 지시서를 함유하도록 설정될 수 있다.
생물학적 기탁
본 발명의 대표적인 물질은 2012년 11월 6일에 아메리칸 타입 컬처 컬렉션 (American Type Culture Collection; 미국 버지니아주 20110-2209 매너서스 유니버서티 불러바드 10801)에 기탁하였다. ATCC 수탁 번호 PTA-13303을 갖는 벡터 MOR8457-GL-VH는 배선화 MOR8457 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 삽입물을 포함하고, ATCC 수탁 번호 PTA-13302를 갖는 벡터 MOR8457-GL-VL은 배선화 MOR8457 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 삽입물을 포함한다. 상기 기탁은 특허 절차 및 그에 따른 규칙상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 (부다페스트 조약)의 규정하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 살아있는 배양의 유지를 보장한다. 상기 기탁은 부다페스트 조약의 규정에 따라 ATCC에 의해 입수 가능하고, 어느 것이든 먼저 도래하는 관련 미국 특허의 허여시 또는 모든 미국 또는 외래 특허 출원의 공표시 대중에게 기탁 배양물의 자손의 영구적이고 제한 없는 입수 가능성을 보증하고, 35 U.S.C. 섹션 122에 따라서 그에 대한 권리가 있는 미국 특허 상표 감독관 및 그에 따르는 감독관의 규칙 (886 OG 638을 특별히 참조한 37 C.F.R. 섹션 1.14 포함)에 의해 결정된 것에 대한 자손의 입수 가능성을 보증하는, 화이자 인크. (Pfizer Inc.)와 ATCC 간의 합의에 따른 것이다.
본 출원의 수탁자는 기탁시의 상기 물질의 배양물이 적합한 조건 하에 배양될 경우에 사멸하거나 분실되거나 또는 파괴되어야 한다면, 이 물질을 동일한 다른 것으로 즉시 대체하고 고지할 것에 동의하였다. 기탁된 물질의 입수 가능성은 특허법에 따라서 정부의 권한에 따라 부여된 권리에 위반하여 본 발명을 실시할 수 있는 라이센스로서 해석되는 것은 아니다.
등가
전술된 명세서는 통상의 기술자가 본 개시내용을 실시할 수 있기에 충분한 것으로 간주된다. 전술된 설명과 실시예는 본 개시내용의 특정의 예시적 실시양태를 상세히 열거하고 있다. 그러나, 전술된 내용을 아무리 텍스트에 상세히 나타낼 수 있다 하더라도, 본 개시내용은 많은 방식으로 실시할 수 있고 본 개시내용은 첨부된 청구범위 및 그의 모든 등가 내용에 따라서 해석되어야 한다는 것을 인지해야 할 것이다.
본원에 인용된 모든 참고 문헌 (특허, 특허 출원, 서류, 텍스트 북 등 포함), 및 이미 그렇지 않은 정도까지 그에 인용된 참고 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
예시적 실시양태
본 발명은 추가로, 다음 실험적 실시예를 참조로 하여 상세히 기재되어 있다. 이들 실시예는 단지 예시 목적으로 제공되고, 달리 명시되지 않는 한 제한적이지 않다. 따라서, 본 발명은 어떠한 방식으로든 다음 실시예로 제한되는 것으로 해석되지 말아야 하고, 오히려 본원에 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 모든 변동을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예
실시예 1: HuCAL ® 라이브러리로부터의 항체 생성
PDGF-BB에 대항한 치료적 항체를 생성하기 위하여, 모르포시스(MorphoSys) HuCAL 골드(GOLD®) 파지미드 라이브러리를 이용한 선별을 수행하였다. 이러한 파지미드 라이브러리는 HuCAL® 개념에 기초하여 것이고 (문헌 [Knappik et al., J Mol Biol, 2000, 296; 57-86]), Fab를 파지 표면 상에 디스플레이하기 위해 시스디스플레이(CysDisplay™) 기술을 이용하였다 (Loehning, 2001 WO 01/05950). 상이한 프레임워크의 HuCAL 골드® 항체-파지를 조합하여 하나의 풀 (VH1-6)을 형성하였거나 또는 서브-풀 (예를 들어, VH1/5, VH2/4/6, VH3)로 분할한 다음, 연속해서 이들 서브-풀을 개별적으로, 다음에 기재되는 바와 같이 항원 상에서 선별 라운드를 수행하였다. 인라인 친화성 성숙을 위해 또한 사용되었던 파지 풀의 경우에는, 카파와 람다 파지를 분리된 채로 유지하였다. 패닝(panning)의 제1 라운드를 위한 파지는 하이퍼파지(Hyperphage) [M13KO7ΔpIII, 프로겐 (Progen; 독일 하이델베르크)]에 의해 제조하였다.
PDGF -BB에 대항한 고체 상 패닝
재조합 인간 PDGF-BB [PHG0043, 로트 032001; 바이오소스 인터내셔날 인크.(Biosource Int. Inc.)]를 이용하여 고체 상 패닝을 수행하였다. 패닝의 3라운드 모두에 대해, PBS 중에 희석된 400 nM (10 ㎍/ml) hPDGF-BB를 맥시소르프(Maxisorp) 플레이트 [F96 맥시소르프™, 442402, 눈크(Nunc)] 상에서 적당한 수의 웰 내로 충전시켰다.
이어서, 각각의 플레이트를 4℃ 하에 밤새 인큐베이션하였다. 그 다음날, 상기 웰을 PBS로 2회 세척한 다음, 실온 (RT) 하에 2시간 동안 MPBST [5% (w/v) 분유, PBS, 0.05% 트윈(Tween) 20 (시그마 (Sigma; 미국 미주리주 세인트 루이스))]로 차단시켰다. 본래의 HuCAL 골드® 서브풀 (VH1-6, VH1/5 및 VH3; 하이퍼파지를 이용하여 제조됨)로부터의 파지 (100 ㎕)를 사용하였다. 2.5% 분유, 2.5% 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.05% 트윈20을 함유하는 PBS 용액 중에서 파지를 미리-차단시켰다. 이와 같이 파지를 미리-차단시키는 것은 회전기 상에서 RT 하에 2시간 동안 2 ml용 반응 튜브에서 수행하였다.
PDGF-AA와 결합하지 않았던 항체를 선별하기 위하여, 각 서브풀의 파지를, 10배 몰 과량의 PDGF-AA (PHG0035; 바이오소스 인터내셔날, 인크.), 2.5% 분유, 2.5% BSA 및 0.05% 트윈20을 함유하는 PBS 용액 중에서 병렬 접근 방식으로 미리-차단시켰다.
이러한 선별 공정을 위해, 항원 용액을 플레이트로부터 제거하고, 웰을 PBS로 3회 세척하였다. 미리-차단된 파지를 상응하는 웰에 가하고, 플레이트를 마이크로플레이트 진탕기 상에서 RT 하에 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 파지 용액을 제거하고, 웰을 PBST (PBS, 0.05% 트윈20)로 수 차례 세척한 다음 (세척 엄격도는 패닝 전략과 선별 라운드에 좌우되었다), PBS로 동일한 세척 단계를 수행하였다. 세척 엄격도는 라운드가 진행됨에 따라 증가시켰다. PBS는 마지막 세척 단계 후 용출을 시작하기 전에 제거하였다. 특이적으로 결합된 파지를 용출시키기 위하여, 10 mM 트리스(Tris)/HCl, pH 8.0 중의 20 mM 디티오트레이톨 (DTT)를 가하고, 샘플을 RT 하에 10분 동안 인큐베이션하였다. 용출액을 사용하여 대수기 이. 콜라이 TG1 배양물을 감염시켰다. 감염된 이. 콜라이는 원심분리함으로써 수거하고, 이를 34 ㎍/ml 클로람페니콜 및 1% 글루코스로 보충시킨 LB 한천 플레이트 상으로 도말하였다. 이러한 한천 플레이트를 30℃ 하에 밤새 인큐베이션하였다. 그 다음날, 집락을 긁어내고, 0.5의 OD600nm에 도달할 때까지 성장시켜 헬퍼(helper) 파지 감염으로 진행시켰다.
헬퍼 파지 감염: TG1 세포를 37℃ 하에 헬퍼 파지 VCSM13 (감염 다중도 20 이상)으로 감염시켰다. 이와 같이 감염된 세포를 원심분리에 의해 수거하고, Fab 발현의 유도를 위해 34 ㎍/ml 클로람페니콜, 50 ㎍/ml 카나마이신 및 0.25 mM IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드)를 함유하는 2x YT 배지에 재현탁시켰다. 상기 세포를 밤새 성장시키고, 생성된 파지를 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)/NaCl로 상청액으로부터 침전시키며, 파지를 PBS에 재현탁시켰다. 입력 및 출력 역가를 스폿(spot) 적정에 의해 결정하였다.
PDGF -BB에 대항한 용액 패닝
선별을 위해 사용된 모든 튜브는 케미블로커(ChemiBLOCKER) [케미콘 (Chemicon; 미국 캘리포니아주 테메큘라)]로 미리-차단시켰다. HuCAL 골드® 파지는 케미블로커 (+0.05% 트윈20)로 차단시키고, M-280 스트렙타비딘 다이나비드(Dynabeads®) [다이날 바이오텍 (Dynal Biotech; 노르웨이 오슬로)] 상에서 2회 미리-흡착시켰다. 미리-차단된 파지와 비오티닐화 PDGF-BB (비오틴-PDGF-BB) 항원을 회전기 상에서 RT 하에 2시간 동안 2 ml용 튜브에서 인큐베이션하였다. 제1 선별 라운드의 경우에는, 100 nM 비오틴-hPDGF-BB를 비드 커플링에 사용하였다. 제2 및 제3 패닝 라운드는 10 nM 비오틴-hPDGF-BB를 사용하여 수행하였다. 이들 패닝을 위해, PDGF-AA를 경쟁인자로서 사용하였고, 파지를 미리-차단시키기 위해 10배 몰 과량의 PDGF-AA를 사용하였다.
미리-흡착된 스트렙타비딘 다이나비드®를 파지-항원 용액에 가하고, 회전기 상에서 RT 하에 10분 더 인큐베이션하였다. 자기 입자 분리기인 MPC-E (다이날 바이오텍; 노르웨이 오슬로)를 이용하여, 포획된 항원과 결합된 파지를 분리하였다. 이 비드를 PBST (PBS, 0.05% 트윈 20)로 수 차례 세척한 다음, PBS로 수 차례의 세척 단계를 수행하였다. 세척 엄격도는 매 패닝 라운드가 진행됨에 따라 증가하였다. PBS는 마지막 세척 단계 후 용출을 지속하기 전에 제거하였다. 용출 및 추가의 단계는 고체 상 패닝에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다.
RapMAT ™ 기술을 이용하는 인라인 친화성 성숙
PDGF-BB에 대한 강화된 HuCAL 골드® Fab 결합의 개선된 친화성을 나타내는 특이적 항체를 수득하기 위하여, 상기 기재된 용액 패닝의 제2 라운드 출력 파지를 LCDR3 다양화를 위해 사용하였다. 제2 라운드 패닝 풀로부터의 Fab 단편을 코딩하는 파지 디스플레이 벡터의 플라스미드 DNA는 퀴아젠 미디프렙 키트(Qiagen Midiprep Kit) (Cat. No.12243)를 이용함으로써 제조하였다. LCDR3 RapMAT™-라이브러리의 경우에는, 상기 DNA를 BbsI 및 SphI로 절단함으로써, LCDR3-CL 삽입물을 방출시키고, 1% 아가로스 겔 상에서 분리하였다. HCDR2 RapMAT™-라이브러리는 상기 DNA를 EcoRI 및 XbaI로 절단하여, HCDR2-CH 삽입물을 방출시킴으로써 수행하였는데, 이는 또한, 1% 아가로스 겔 상에서 벡터 백본으로부터 분리시켰다.
pMORPH®23 벡터 백본의 예상된 밴드 (약 4650 bp)를 상기 겔로부터 절제하고, 이지 퓨어 키트(Easy Pure Kit) [바이오자임(Biozyme); Cat. No.390001]를 이용하여 정제하였다. 벡터 백본을 HuCAL® 카파 또는 람다 경쇄 CDR 카세트 또는 HuCAL® 중쇄 CDR 카세트에 각각 1:4의 몰 비로 연결시켰다. 이. 콜라이 Top10F 전기적격 세포를 상기 연결 샘플로 형질전환시켰다. HCDR2 및 LCDR3 라이브러리를 증폭시키기 위하여, 34 ㎍/ml 클로람페니콜 및 1% 글루코스를 함유하는 2xYT 배지에 형질전환된 세포를 접종하고, 1.5 내지 2.0의 OD600nm에 도달할 때까지 배양물을 성장시켰다. 세포를 펠릿화하고, 글리세롤 배지에 재현탁시켰다. 생성된 카파와 람다 라이브러리의 파지를 사용 전에 합하였다. 파지를 미리 차단시키는 것은 차단 용액 (PBS, 10% 분유, 10% BSA, 10% 인간 트랜스페린, 및 0.2% 트윈20)에서 수행하였다. 용액 패닝의 제3 및 제4 라운드를 상기 언급된 바와 같이 수행하였다. 고 친화성 항체를 강화하기 위하여, 비오틴-PDGF-BB의 항원 농도는 제3 라운드에서 비드 커플링을 위해 0.5 nM의 비오틴-PDGF-BB을 이용하고 제4 라운드에서는 0.025 nM의 비오틴-PDGF-BB을 이용하여 저하시켰다. 세척 엄격도를 증가시켰다.
선별된 Fab 단편의 서브클로닝 및 미세발현
가용성 Fab의 신속한 발현을 촉진시키기 위하여, 상기 선별된 HuCAL 골드® 파지의 Fab 코딩 삽입물을 XbaI 및 EcoRI을 통하여 발현 벡터 pMORPH®X9_MH 내로 서브클로닝하였다. 발현 플라스미드를 이. 콜라이 TG1 F-세포 내로 형질전환시킨 후, 클로람페니콜-저항성 단일 클론을 2xYT 배지 (34 ㎍/ml 클로람페니콜 및 1% 글루코스로 보충시킴)로 미리-충전시킨 멸균성 384-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰 내로 골라내고 37℃ 하에 밤새 성장시켰다. 이들 플레이트를 마스터 플레이트로서 간주하였다. 마스터 플레이트를 -80℃ 하에 저장하기 전에, 이. 콜라이 TG1 F-배양물을, 웰당 34 ㎍/ml 클로람페니콜 및 0.1% 글루코스로 보충시킨 40 ㎕ 2xYT 배지로 미리-충전시킨 새로운 멸균성 384-웰 마이크로타이터 플레이트 내로 접종하였다. 이러한 마이크로타이터 플레이트을, 배양물이 약 0.5의 OD600 nm으로 약간 혼탁해질 때까지 (약 2 내지 4 h) 마이크로플레이트 진탕기 상에서 400 rpm으로 진탕시키면서 30℃ 하에 인큐베이션하였다. 이들 플레이트를 발현 플레이트로서 간주하였고, 34 ㎍/ml 클로람페니콜 및 5 mM IPTG로 보충시킨 10 ㎕ 2xYT 배지를 웰당 가하며 (종결 농도 1 mM IPTG), 미세역가 플레이트를 기체-투과성 테이프로 밀봉시키고, 400 rpm으로 진탕시키면서 30℃ 하에 밤새 인큐베이션하였다. 완전 세포 용해물 (BEL 추출물)의 생성: 상기 발현 플레이트의 각 웰에 15 ㎕ BEL 완충액을 가하고, 마이크로타이터 플레이트 진탕기 (400 rpm) 상에서 22℃ 하에 1 h 동안 인큐베이션하였다. BEL 완충액: 24.7 g/l 붕산, 18.7 g NaCl/l, 1.49 g EDTA/l, pH 8.0; 2.5 mg/ml 리소자임으로 보충시킴.
실시예 2: PDGF -BB 양성 클론의 스크리닝
PDGF-BB 양성 클론은, ELISA를 이용하여 항원 결합을 알아보기 위하여 클론을 스크리닝할 뿐만 아니라 수용체 억제 검정을 동시에 이용하여 기능적 PDGF-BB 억제 활성을 알아보기 위하여 클론을 스크리닝함으로써 확인하였다.
방법
직접적으로 코팅된 PDGF -BB 상에서의 스크리닝
인간 PDGF-BB을 5 ㎍/ml의 농도로 (PBS에 희석됨) 4℃ 하에 맥시소르프 미세역가 플레이트를 밤새 코팅하는데 사용하였다. 밤새 인큐베이션한 후, 코팅된 플레이트를 PBST (PBS/0.05% 트윈20)로 2회 세척하고, 마이크로플레이트 진탕기 상에서 RT 하에 1시간 동안 5% MPBST (PBST 중의 5% 분유)로 차단시켰다. 이 플레이트를 PBST로 2회 세척한 후, 1차 항체를 가하였다 (미세발현된 HuCAL® Fab, 정제된 HuCAL® Fab의 조 추출물, 대조군 항체 Fab_MOR07295). 상기 1차 항체를 함유하는 플레이트를 마이크로플레이트 진탕기 상에서 RT 하에 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 플레이트를 PBST로 2회 세척하고, HuCAL® Fab의 검출을 위해, 2차 항체 (염소 항-인간 F(ab)2- 단편 특이적 - AP 표지됨; 잭슨(Jackson) Cat. No. 109-055-097)를 가하고, 0.5% MPBST (PBST 중의 0.5% 분유)에서 1:5,000 희석시켰다. 이러한 2차 항체를 함유하는 플레이트를 마이크로플레이트 진탕기 상에서 RT 하에 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 TBST (TBS/0.05% 트윈20)로 5회 세척하였고, 아토포스(Attophos) (아토포스 기질 세트, 로슈(Roche), Cat.No. 11681982001)를 가하고 (수중 1:10 희석됨), 535 nm에서의 형광 방출을 430 nm에서의 여기를 이용하여 기록하였다.
비오티닐화 PDGF -BB를 이용한 포획 스크리닝
맥시소르프 (눈크; 미국 뉴욕주 로체스터) 384 웰 플레이트을 4℃ 하에 16 h 동안 PBS, pH 7.4 중에 1:1,000 희석된 20 ㎕ 양 항-인간 IgG, Fd 단편 특이적 항체로 코팅하였다. 플레이트를 PBST (PBS/0.05% 트윈20)로 2회 세척한 다음, 마이크로플레이트 진탕기 상에서 RT 하에 1시간 동안 5% MPBST (PBST 중의 5% 분유)로 차단시켰다. 플레이트를 PBST (PBS/0.05% 트윈20)로 2회 세척한 후 1차 항체를 가하고 (미세발현된 HuCAL® Fab, 정제된 HuCAL® Fab의 조 추출물, 대조군 항체 Fab_MOR07295), 마이크로플레이트 진탕기 상에서 RT 하에 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST (PBS/0.05% 트윈20)로 2회 세척하고, 비오틴-PDGF-BB 항원 (PBS 중에 희석된 0.5 ㎍/ml)을 마이크로플레이트 진탕기 상에서 RT 하에 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST (PBS/0.05% 트윈20)로 2회 세척한 다음, 스트렙타비딘-AP [자이메드(Zymed); Cat.No. 43-8322; 로트: 51102099; 0.5% MPBS 중에서 1:2,000 희석됨]를 마이크로플레이트 진탕기 상에서 RT 하에 1시간 동안 인큐베이션하였다. 최종적으로, 웰을 TBST (TBS/0.05% 트윈20)로 5회 세척하였고, 아토포스 (아토포스 기질 세트, 로슈, Cat.No. 11681982001)를 가하고 (ddH20 중 1:10 희석됨), 535 nm에서의 형광 방출을 430 nm에서의 여기를 이용하여 기록하였다.
수용체 억제 검정을 이용한 기능적 스크리닝
384 웰 MSD 플레이트를 4℃ 하에 밤새 2.5 ㎍/ml PDGF-Rβ-Fc 융합 단백질 [Cat.No. 385-PR, R&D 시스템즈(Systems)]로 코팅하였다. 그 다음, 20 ㎕의 이. 콜라이 조 추출물을 마이크로플레이트 진탕기 상에서 RT 하에 1시간 동안 BV-완충액 (PBS/0.02% 트윈20/0.5% BSA) 중에 희석된 20 ㎕의 30 ng/ml 비오틴-PDGF-BB와 함께 미리-인큐베이션하였다. MSD 플레이트를 50㎕ BV-완충액으로 3회 세척한 다음, 상기 미리-인큐베이션한 조 추출물:비오틴-PDGF-B 복합체를 전이시켰다. 플레이트를 마이크로플레이트 진탕기 상에서 RT 하에 1시간 동안 인큐베이션한 다음, BV-완충액으로 3회 세척하였다. 플레이트를 스트렙타비딘-BV (BV-완충액 중에 1:400 희석됨)를 이용하여 37℃ 하에 1시간 동안 인큐베이션한 다음, BV-완충액으로 다시 3회 세척하고 30 ㎕의 MSD 판독 완충액 농도 계면활성제 (MSD; dH2O 중에 1:4 희석됨)를 가하였다. MSD MA6000 장치를 이용하여 검출을 수행하였다.
결과
총 9,568개 1차 표적물을 대상으로 하여, ELISA를 이용하여 항원 결합에 관하여 스크리닝하였고, 이와 동시에 PDGF-BB/PDGFRβ-Fc 결합의 억제에 관하여 스크리닝하였다. 결합 검정에서는, (모든 패닝 전략으로부터의) 6008개 1차 ELISA 표적물은 배경에 비해 5배 많은 신호를 나타내었다. 이들 중에서, 2,949개 1차 표적물은 수용체 결합 억제 검정에서 80% 초과 억제 활성의 신호를 나타내었다. 이들 표적물은 그들의 ELISA 활성을 기준으로 하여 등급을 매기고, 가변 영역 서열 분석을 위한 540개 클론을 선별하였다. 서열 분석 결과, 168개의 독특한 서열이 생성되었다.
실시예 3: HuCAL 골드® Fab 및 IgG의 특징 확인
선별된 HuCAL 골드® Fab 및 IgG는 다음에 기재된 바와 같은 몇 가지 검정뿐만 아니라 실시예 2에 기재된 바와 같은 ELISA 기술을 이용하여 추가로 명확히 규명하였다.
방법
K D 결정을 위한 용액 평형 적정 (SET) 방법 및 교차-반응성 연구
용액 중에서의 친화도 결정은 문헌 (Friguet et al., 1985, J. Immunol. Methods 77:305-319)에 기재된 바와 같이 수행하였다. SET 방법의 민감도와 정확도를 개선하기 위하여, 이를 전통적인 ELISA에서 전기화학발광 (ECL)에 의거한 바이오베리스(BioVeris) 기술로 전환시켰다 (Haenel et al., 2005, Anal. Biochem. 339:182-184). 염소-항-인간 (Fab)2 또는 염소-항-마우스 IgG, Fc 단편 특이적 항체 [잭슨 임뮤노 리서치 (Jackson Immuno Research)]를 제조업자의 지시에 따라서 BV-태그™ NHS-에스테르 [바이오베리스 유럽 (Bioveris Europe; 영국 옥스퍼드셔주 위트니)]로 표지하였다. 이 실험을 폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트, 및 검정 완충액으로서 0.5% BSA 및 0.02% 트윈 20을 수반한 PBS pH 7.4에서 수행하였다. 표지되지 않은 항원을 4n 시리즈로 희석시켰다. 항원을 수반하지 않은 웰을 사용하여 Smax 값을 결정하였다. 100 pM Fab 또는 IgG (75 ㎕ 최종 용적 중의 최종 농도)를 부가한 후, 혼합물을 RT 하에 2시간 동안 인큐베이션하였다. 연속해서, 항-인간 Fab의 경우에는 1:4,000의 최종 희석도 또는 항-마우스 IgG의 경우에는 1:2,000의 최종 희석도로 0.25 ㎍/ml 비오티닐화 항원 및 BV-태그 표지된 검출 항체로 코팅된 25 ㎕ 다이나비드 (0.4 mg/ml M-280 스트렙타비딘, 다이날; 독일 함부르크)의 혼합물을 웰당 가하였다. RT 하에 에펜도르프(Eppendorf) 진탕기 (700 rpm) 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후, M-384 시리즈(SERIES®) 워크스테이션 (바이오베리스 유럽)을 이용하여 ECL 신호를 검출하였다. 맞춤형 피팅 모델을 적용하는 오리진(Origin) 5.0 [마이크로칼(Microcal)] 소프트웨어를 이용하여 데이터를 평가하였다 (Fab의 경우에는, 문헌 [Haenel et al., 2005]을 참조하고; IgG의 경우에는, 문헌 [Piehler et al., 1997]을 참조할 수 있다).
이. 콜라이에서의 HuCAL - Fab 항체의 발현 및 정제
TG-1 F-세포 중에서 pMORPHX9_FH에 의해 코딩된 Fab 단편의 발현은 34 ㎍/ml 클로람페니콜로 보충시킨 1 l의 2xTY 배지를 수반한 진탕기 플라스크 배양물에서 수행하였다. 0.5 mM IPTG로 유도시킨 후, 세포를 30℃ 하에 20시간 동안 성장시켰다. 세포 펠릿의 완전 세포 용해물 (리소자임)을 준비하고, Fab 단편을 HT-IMAC-정제에 의해 단리하였다. 겉보기 분자량은 교정 표준기를 이용하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)함으로써 결정하였다. 농도는 UV-분광 광도 측정법에 의해 결정하였다.
PAE - PDGF - Rβ 인산화 검정
PDGF-BB 리간드에 의한 PDGF-Rβ 수용체 인산화는, 10% FBS [PAN 바이오텍(Biotech), 로트 P250112], 2 mM L-글루타민 (PAA, Cat.No. P04-80100) 및 500 ㎍/ml 제네티신 (PAA; Cat.No. P11-012)으로 보충시킨 배양 배지 [L-글루타민을 수반한 F12 영양 햄(ham) 배지 (깁코(Gibco); Cat.No. 21765)]에서 배양된 PDGF-Rβ로 안정적으로 형질감염된 PAE 세포를 이용하여 분석하였다. 검정을 시작하기 전날, 5x105개 세포/웰을 96-웰 플레이트 [눈클론(Nunclon) #167008] 내로 시딩하였다. 6시간 후, 배양 배지를 절식 배지 (배양 배지 농도 0.1% FBS)로 교환하고 밤새 인큐베이션하였다. 그 다음날, 상이한 농도의 항체 (30 nm 내지 1.5 pM)를 절식 배지에서 희석된 0.4 nM PDGF-BB (최종 농도)와 함께 미리 인큐베이션하였다. 세포의 상청액을 따라 내고, 항체:PDGF-BB 복합체를 세포에 가하였다. 37℃ (인큐베이션기 중) 하에 정확히 10분 후, 세포를 빙냉 PBS로 1회 세척한 다음, MSD 세포 용해 완충액을 이용하여 세포 용해시켰다. PDGF-Rβ의 Tyr751의 인산화는 제조업자의 프로토콜을 이용하여 MSD 멀티스폿 PDGFR베타 완전 세포 용해 키트 [메소스케일 디스커버리(Mesoscale Discovery)]를 사용하여 정량화하였다.
친화도 결정 ( 비아코어 )
역학 상수 kon 및 koff는 비아코어(BIAcore) 3000 기기 (비아코어; 스웨덴 웁살라)를 이용하여 공유적으로 고정화된 항원 PDGF-BB에 대한 각각의 Fab 결합의 일련의 희석물을 이용하여 결정하였다. 공유적 항원 고정화를 위해, 표준 EDC-NHS 아민 커플링 화학을 사용하였다. 동역학 측정은 1.5 내지 500 nM의 Fab 농도 범위를 이용하여 20 ㎕/min의 유속 하에 PBS (136 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.76 mM KH2PO4, pH 7.4) 중에서 수행하였다. 각 농도에 대한 주사 시간은 1분이었고, 이어서 3분 해리 상이 있었다. 재생을 위해, 5 ㎕ 10 mM HCl을 사용하였다. BIA 평가 소프트웨어 3.1 (비아코어)을 이용하여 모든 센서그램을 피팅하였다.
결과
결합 및 특이성
168개의 독특한 모든 클론을 SET 친화도 등급 매기기에 사용하였고, 이를 MOR0729511 대조군 클론과 비교하였다. 가장 우수한 친화도를 나타내는 41개 클론 (서열 다양성 및 패닝 기원을 고려하여 선택됨)을 경화용으로 선별하였다. Fab 발현 및 정제 후, 37개가 품질 관리 기준을 통과하였고, 이를 추가로 시험하였다.
37개 Fab 모두는 인간 PDGF-BB (hPDGF-BB)에 대해 특이적이었고, 뮤린 PDGF-BB (mPDGF-BB)와 교차 반응성이었다. 이러한 37개 Fab 중 어느 것도 ELISA에 의해 PDGF-AA와의 결합을 나타내지 않았다.
억제 활성
37개 Fab 모두를 대상으로 하여, 수용체 인산화 검정에서 그들의 억제 활성에 관하여 시험하였다. 안정적으로 형질감염된 PAE PDGF-Rβ 세포는 PDGF-β 수용체를 구성적으로 발현하고 PDGF-BB에 의해 자극되어, 위치 Tyr751 상에 수용체 인산화가 초래될 수 있다. 인산화를 검출하기 위하여, 특이적 항-P-Tyr751 항체에 의한 P-Tyr751의 검출에 기초하여 포스포-PDGFR베타 키트 (메소스케일 디스커버리)를 사용하였다.
적정될 Fab의 수를 줄이기 위하여, 37개 모든 항체를 초기에는, 단지 4개 농도에서만 시험하여 인산화 활성을 억제할 수 있는 그들의 능력을 알아 보았다. 이들 중에서, 3개의 Fab가 덜 활성인 것으로 결정되었으므로, 37개 중 34개 Fab가 완전한 적정을 위해 사용되었다.
Fab의 완전한 적정은 1:3 단계에서 60 nM 내지 27 pM 또는 10 nM 내지 13 pM으로 수행하였고, 400 pM (10 ng/ml) PDGF-BB의 예비-인큐베이션을 위해 사용하여, 이론적 검정 민감도 한계 200 pM을 초래하였다. 세 번 되풀이한 값의 평균 값을 IC50 결정을 위해 사용하였다.
<표 1>
Figure pct00002
인산화 검정 및 생화학적 수용체 결합 억제 검정으로부터의 데이터를 사용하여 Fab의 패널을 37개에서 16개로 줄였다. 이들 중에서, 4개의 Fab가 NIH3T3 세포의 증식을 지속적으로 억제시켰다: MOR8457, MOR8494, MOR8487 및 MOR8488. 선도 서열을 추가로 줄여서, 잠재적인 화학적 부담, 예컨대 유리 시스테인, 및 Asp-Pro 절단 부위를 함유한 서열을 제거하였다.
따라서, 상기 실시예 1 내지 3에 기재된 과정을 사용하여 몇 가지 완전한 인간 항-PDGF-BB IgG 항체 (MOR8457로서 지명된 항체, 및 본원에 기재되는 그의 변이체 포함)를 생성시켰다.
MOR8457 가변 중쇄 도메인의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00003
MOR8457 가변 경쇄 도메인의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00004
실시예 4: 전장 IgG의 발현
전장 IgG를 발현하기 위하여, 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 도메인 단편을 Fab 발현 벡터로부터 인간 IgG로서 발현하기에 적당한 벡터 내로 서브클로닝하였다. 일부 경우에는, 항-PDGF-BB 항체의 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 합성 DNA 삽입물을 상업적 유전자 합성을 통하여 창출시켰다. 단편을 인간 또는 마우스 불변 영역과 동일 프레임 내에서 일시적 발현을 위한 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. 적용에 따라서, 상기 불변 영역은 인간 야생형 IgG2 (서열 22), 야생형 인간 IgG1 (서열 19), "IgG1-3m"으로 명명된 이펙터 기능을 제거하기 위한 표적화 돌연변이를 수반한 인간 IgG1 (서열 21), 또는 마우스 IgG1 (서열 20)로 이루어졌다. 일부 경우에는, 배선화 MOR8457 VL (서열 4)을 포함하고 경쇄 불변 도메인 내에서의 의도하지 않은 서열 변경을 추가로 포함하는 경쇄를 수반한 MOR8457을 구축하였는데, 여기서는 아미노산 서열 TLV가 PCR 클로닝 오차의 결과로서 IKR에 의해 치환되었다. 배선화 MOR8457 VL을 포함하는 전장 경쇄 및 IKR 돌연변이를 포함하는 경쇄 불변 람다 도메인은 "MOR8457-GL-IKR-LC" (서열 17)로서 지명된다. "IKR" 돌연변이를 포함하는 경쇄 불변 도메인을 포함하는 모든 항체가 그 이름에 "IKR"을 포함함으로써 본원에 지명된다. 따라서, 배선화 MOR8457 VL 서열 (서열 4)을 포함하고 불변 도메인 내에 IKR 서열 변경을 포함하는 불변 도메인 (서열 17)을 포함하는 경쇄와, 배선화 MOR8457 VH (서열 6)를 포함하고 불변 영역 내에 인간 IgG1 삼중 이펙터 널 돌연변이 (서열 14)를 추가로 포함하는 중쇄를 포함하는 항체가 본원에서 항체 "MOR-8457-GL-IKR-hIgG1-3m"으로서 지칭된다. 하나 이상의 배선화 V 도메인을 포함하는 항체는 "GL"의 명칭으로써 본원에 지칭되고, 배선화 도메인을 포함하지 않는 모든 항체는 그의 이름에 상기 명칭을 포함하지 않는다. 보다 바람직하게, VH 도메인과 VL 도메인 둘 다는 배선화되므로, 항체는 "GL"로서 지명된다.
전장 IgG의 일시적 발현 및 정제
전장 IgG의 일시적 발현은 HKB11 또는 HEK-293F 세포에서 수행하였는데, 이는 중쇄와 경쇄를 별개로 코딩하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염시킨지 3일 내지 7일 후에 세포 배양 상청액을 수거하고, 원심분리함으로써 청정하게 하였다.
여과시킨 후 (0.22 ㎛ 또는 0.45 ㎛), 상기 상청액을 대상으로 하여 표준 단백질 A 또는 G 친화 크로마토그래피 [맵셀렉트 슈어 (MabSelect SURE; 독일)]하였다. 단백질을 pH 3에서 용출시키고 3 M TRIS, pH 8에서 중화시켰다. 추가의 하류 프로세싱은 1x 둘벡코(Dulbecco) PBS (인비트로젠)로의 완충제 교환과 멸균성 여과 [0.2 ㎛; 밀리포어(Millipore) 또는 사르토리우스(Sartorius)]를 포함하였다. SDS-PAGE 중에서 변성, 환원성 조건 및 변성, 비-환원성 조건 하에 또는 모세관 전기영동에 의해 순도를 분석하였다. HP-SEC를 수행하여 그들의 천연 상태에서의 IgG 제제를 분석하였다.
실시예 5: MOR8457의 배선화 항체 변이체를 코딩하는 유전자의 설계 및 생성
7개 중쇄와 7개 경쇄 가변 영역 각각으로부터 유래된 컨센서스 서열을 이용하여 모르포시스 HuCAL 라이브러리를 구축하였다. 따라서, 이러한 라이브러리로부터 수득한 선도 서열은 그들의 인간 배선 대응물과 상이한 다중 위치에서 아미노산을 함유하고, 이론적 면역원성 위험을 나타낼 수 있었다. 이들 비-배선 위치에서의 서열을 배선 잔기로 복귀 돌연변이시켜 ("배선화"로 명명됨) 이러한 잠재적 부담을 없앴다.
파지 유래된 MOR-8457 선도의 가변 쇄 서열을 임뮤노제네틱스(ImmunoGenetics) (IMGT) 이뮤노글로불린 레퍼토리에서 입수 가능한 것과 비교하였다. 가장 적당한 인간 중쇄 (도 1a) 및 경쇄 (도 1b) 배선 가변 서열을 정렬에 의해 확인하였다. 도 1a 및 1b는 MOR8457 VH (도 1a) 및 VL (도 1b)과 각각의 각종 배선 서열 간에 공유된 서열 동일성 % 및 정렬을 도시한 것이다.
중쇄 V 도메인의 배선화
MOR-8457 중쇄 (서열 2)를 배선화하는 경우, 98.6% 서열 동일성을 공유하는, IMGT IGHV3-23*01 (DP-54; 서열 25)에 의해 코딩된 배선 가변 영역이 가장 적당한 것으로 결정되었다. 도 1a에 도시된 바와 같이, 이러한 가변 유전자의 프레임워크 영역은 다음 치환 V5L 및 R94K (카바트 넘버링)를 함유하고 있다. 따라서, 각각의 상기 치환된 아미노산을 DP-54 배선 가변 영역으로부터의 아미노산으로 대체시킴으로써 새로운 배선화 중쇄 V 도메인 서열 (본원에서 "MOR8457-GL-VH"로서 지칭됨, 서열 6)을 선별하였다.
경쇄 V 도메인의 배선화
MOR-8457 경쇄 (서열 1)를 배선화하는 경우, MOR8457 VL과 92.7% 서열 동일성을 공유하는, IMGT IGLV3-1*01 (DPL-23; 서열 29)에 의해 코딩된 배선 가변 영역이 가장 적당한 것으로 결정되었다. 도 1b에 도시된 바와 같이, 이러한 가변 유전자의 프레임워크 영역은 MOR8457 (서열 1)과 비교해서 5개 위치에 치환을 함유하고 있다: A14S, R20S, S22T, A43S 및 E81M (카바트 넘버링). 따라서, 각각의 상기 치환된 아미노산을 DPL-23 배선 가변 영역으로부터의 아미노산으로 대체시킴으로써 새로운 배선화 서열 (본원에서 "MOR8457-GL-VL"로서 지칭됨, 서열 4)을 선별하였다.
실시예 6: MOR -8457 및 IgG로서의 서열 변이체의 특징 확인
MOR -8457의 결합 친화성, 특이성 및 교차 종 반응성
MOR8457의 3가지 IgG 변이체의 결합 친화성은 비아코어 2000 (GE 헬스케어; 미국 뉴저지주 피스카타웨이)을 이용하여 결정하였다. "MOR8457-IKR-hIgG1-3m"으로서 지칭된 하나의 변이체 항체는 본래의 MOR8457 VH 영역 서열 (서열 2) 및 이펙터 널 돌연변이를 함유하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 (MOR8457-hIgG1-3m; 서열 21)을 포함하는 전장 중쇄 (MOR8457-hIgG1-3m-HC; 서열 18)와, 본래의 VL 영역 서열 (서열 1) 및 인간 람다 경쇄 불변 도메인 (Cλ; 서열 23)을 포함하는 전장 경쇄 (서열 17; MOR8457-IKR-LC)를 포함하는데, 경쇄 서열은 앞서 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 의도하지 않은 서열 돌연변이를 포함한다.
"MOR8457-mIgG1"로서 지칭된 또 다른 변이체는 본래의 MOR8457 VH 영역 서열 (서열 2)을 포함하고 마우스 야생형 IgG1 중쇄 불변 도메인 (서열 20)을 추가로 포함하는 전장 중쇄를 포함하여 "MOR8457-mIgG1-HC"로 명명된 전장 중쇄를 제공한다. MOR8457-mIgG1 항체는 추가로, 본래의 MOR8457 VL 영역 서열 (서열 1) 및 마우스 야생형 람다 불변 도메인 (서열 24)을 포함하는 전장 경쇄 (MOR8457-m-LC)를 포함한다.
배선화 MOR8457 VH 영역 서열 (MOR8457-GL-VH; 서열 6) 및 이펙터 널 돌연변이를 함유하는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 (hIgG1-3m; 서열 21)을 포함하는 전장 중쇄 (MOR8457-GL-hIgG1-3m-HC; 서열 14)를 포함하는, "MOR8457-GL-hIgG1-3m"으로 명명된 또 다른 변이체 MOR8457 항체를 구축하였고, 이러한 항체는 추가로, 배선화 MOR8457 VL 영역 서열 (서열 4; MOR8457-GL-VL) 및 야생형 인간 람다 경쇄 불변 도메인 (서열 23)을 포함하는 전장 경쇄 (서열 16; MOR8457-GL-LC)를 포함한다.
MOR8457 항체는 PDGF -BB에 대해 특이적이다
특이성과 교차 종 반응을 시험하기 위하여, 인간 PDGF-AA, -AB, -DD 뿐만 아니라 래트 PDGF-BB [모두 R&D 시스템즈 (미국 미네소타주 미니애폴리스)로부터 수득함] 및 마우스 PDGF-BB (인비트로젠; 미국 캘리포니아주 칼즈배드)를 포함한 상이한 인간 PDGF 리간드에 대한 3가지 MOR8457 IgG 변이체, 즉 MOR8457-IKR-hIgG1-3m, MOR8457-mIgG1, 및 MOR8457-GL-hIgG1-3m의 결합 친화성을 시험하였다. 간략하게 언급하면, 항-인간 또는 항-마우스 IgG (GE 헬스케어) 항체는 제조업자에 의해 지시된 바와 같이 아민 커플링을 이용하여 8,000 내지 10,000 공명 단위 (RU)의 CM5 센서 칩의 인접한 유동 세포에서 고정화시켰다. 항체를 PBS-NET (10 mM 인산염 pH 7.4, 287 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 3.2 mM EDTA, 0.01% 트윈 20) 내로 희석시켜 1 ㎍/mL가 되도록 하였고, 각각의 항-인간 또는 항-마우스 표면 상으로 10초 동안 독립적으로 주사하면, 50 내지 100 RU의 안정적인 항-PDGF 표면이 생성되었다. PDGF 단백질을 PBS-NET에서 1 nM이 되도록 희석시키고, 0.25 nM이 되도록 일련으로 2배 희석시켰다. 이어서, PDGF의 각 농도를 100 ㎕/min의 유속으로 2분 동안 상기 항체 표면 상으로 주사하였다. 복합체를 10분 동안 해리하게 두었다. 10 mM 염화마그네슘을 30초 주사하여 상기 표면을 재생시키고, 이 표면을 항-PDGF 항체 포획 및 PDGF 결합 동역학의 또 다른 라운드용으로 남겨두었다. 동역학 데이터는 스크러버(scrubber)2 소프트웨어 [바이오-로직 소프트웨어(Bio-Logic Software)]를 이용하여 이중 참조하였고 (문헌 [Myszka et al., 1999, J. Mol. Recognit. 12 279]), 이어서 비아코어 평가 소프트웨어 버전 4.1을 이용하여 1:1 결합 모델에 피팅하였다. 제시된 결과는 3가지 독립적인 결합 연구의 평균이었다. 도 2는 대표적인 센서그램을 나타내고 표 2는 결합 친화도를 요약한 것이다.
<표 2>
Figure pct00005
3가지 항체 모두는 인간 PDGF-BB에 대한 낮은 pM 결합 친화도를 명확하게 보여주었다. 배선화 가변 도메인은 KD=13 pM ± 3의 치밀한 결합을 보유하였다. 마우스 IgG1 프레임워크로의 전환은 모든 PDGF에 대한 MOR8457-mIgG1 항체 결합의 이탈 속도를, 비아코어 상에서의 동역학 결합의 한계치를 벗어나는 정도로 느리게 하였다 (표 2에서 "NA*"로서 표시됨). 이러한 유형의 결합의 친화도는 10 pM 미만 (<10)이고 비아코어 기기의 한계치를 벗어나는 것으로 추정되었다. 각종 MOR8457 항체 구조물은 PDGF-B에 대해 특이적이었는데, 이는 MOR8457 변이체가 단지 PDGF-BB 및 PDGF-AB와는 결합하였지만 (표 2), PDGF-AA 뿐만 아니라 PDGF-DD와는 결합하지 않았다는 사실 (데이터는 제시되지 않음)에 의해 입증되었다. MOR8457이 PDGF-AB 및 PDGF-BB와는 결합하지만, PDGF-AA와는 그렇지 않다는 것은 이러한 이량체 중의 각 PDGF-B 서브유닛가 하나의 노출된 MOR8457 결합 부위를 갖는다는 것을 제안하고 있다. PDGF-AB에 대한 결합 친화도와 PDGF-BB에 대한 결합 친화도는 69 pM과 28 pM으로 약간의 차이를 나타냈는데, 이는 이종-이량체 PDGF-AB 및 동종-이량체 PDGF-BB에 존재하는 PDGF-B의 사소한 입체 형태적 차이에 기인될 수 있다.
PDGF-BB는 동종-이량체성 PDGFR-αα와 PDGFR-ββ 수용체 복합체와 결합할 뿐만 아니라 이종-이량체성 PDGFR-αβ 수용체 복합체와 결합하는 반면, PDGF-AB는 동종-이량체성 PDGFR-αα 및 이종-이량체성 PDGFR-αβ 수용체와 결합하여 각종 질환 또는 장애에 관여하는 하류 신호 전달을 촉발시킨다. PDGF-B와 그의 수용체의 결합을 차단시키는, PDGF-AB 및 PDGF-BB에 대한 MOR8457의 결합을 이용하여, PDGF-AB 및 PDGF-BB와 그의 각각의 수용체 복합체 간의 상호 작용을 차단시킴으로써, 각종 질환 상태를 매개하거나 이러한 질환 상태와 연관되는 하류 신호 전달을 억제시킬 수 있었다. 따라서, MOR8457은 모든 PDGF-AB 및 PDGF-BB 관련 질환에 대한 신규의 치료제를 제공할 수 있다. 추가로, MOR8457은 마우스 및 래트 PDGF-BB와 유사한 특징으로, 즉 각각 10 pM 및 25 pM으로 결합하였는데, 이로써 이는 전임상 동물 모델 연구에 사용하는데 유용한 대용 항체가 되므로, PDGF-B-매개된 신호 전달 질환 또는 장애를 치료하기 위한 잠재적 치료제를 개발하는데 있어서 그의 잠재적 유용성을 추가로 증가시켜 준다.
PDGF -BB에 대한 MOR8457 결합의 결합 화학량론 및 에피토프 맵핑
본원의 다른 곳에 개시된 바와 같이 MOR8457이 PDGF-AB와 결합하였다는 것을 입증하는 데이터는 각 PDGF-B 서브유닛가 하나 이상의 MOR8457 결합 부위를 포함한다는 것을 제안하였다. 이로써, PDGF-BB 동종-이량체 상의 2개의 결합 부위가 하나의 항체로부터 또는 2개의 항체로부터의 2개의 IgV 도메인과 상호 작용하는 지에 관한 의문이 야기되었는데, 달리 언급하면 PDGF-BB에 대한 항체 결합의 화학량론이 1:1인지 아니면 2:1인지는 명확하지 않았다. 이 문제를 해결하기 위해, 동일한 IgV 도메인이지만, 상이한 Fc 도메인이 MOR8457-mIgG1 (마우스) 및 MOR8457-GL-IKR-hIgG1-3m (인간) 상에 존재한다는 사실을 활용하여, 비아코어를 이용한 순차적 경쟁 결합 검정을 수행하여 PDGF-BB에 대한 MOR8457 결합의 화학량론을 평가하였다.
첫 번째 순차적 경쟁 결함 검정에서는, CM5 센서 칩 상으로 고정화된 항-마우스 IgG (GE 헬스케어)를 통하여 MOR8457-mIgG1을 포획하였는데, 이로써 200 내지 400 RU의 안정한 표면이 생성되었다. 이어서, 1 nM 하의 인간 PDGF-BB를 6분 동안 주사한 다음, 도 3에 도시된 도면 및 주사 2 후 실선으로써 나타낸 센서그램에 예시된 바와 같이 MOR8457-IKR-hIgG1-3m을 주사하였다. 도 3에서, 주사 3 후 주기 1에 대해 개시된 센서그램 데이터는 MOR8457-IKR-hIgG1-3m이 미리-조립된 MOR8457-mIgG/PDGF-BB 복합체 (주사 2 후에 형성됨)와 결합하였다는 것을 입증하였는데, 이는 MOR8457-mIgG가 PDGF-BB 상의 하나의 부위와만 결합한 반면, PDGF-BB 상의 다른 결합 부위는 제2의 항체에 대해 이용 가능하였고, 이러한 경우에는 제2 부위가 MOR8457-IKR-hIgG1-3m 결합에 이용 가능하였다는 것을 표시한다. 따라서, 이들 데이터는 PDGF-BB에 대한 MOR8457의 결합 화학량론이 2:1이라는 것을 입증해준다. 이는 PDGF-BB에 대한 PDGFRββ 동종-이량체 세포외 도메인의 1:1 화학량론 결합과 대비된다 (Shim et al., 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:11307-11312). 임의의 특정한 이론으로 제한되는 것을 원하지는 않지만, MOR8457:PDGF-BB의 2:1 화학량론 결합 방식으로 인해, 항체와 PDGF-BB 간의 교대 교차 결합에 의해 고분자량 MOR8457:PDGF-BB 복합체가 형성될 수 있는데, 이는 약물 청소를 증강시킬 수 있고/있거나 항-약물 항체 반응을 자극할 수 있다. 따라서, 통상의 기술자는 MOR8457 항체를 재포맷하여 단일 암 항체를 제공함으로써, 다수의 PDGF-BB와 항체 간의 어떠한 잠재적 교차 결합도 피하거나 저하시키는 것이 바람직할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
PDGFRβ에 대한 PDGF -BB 결합의 항체 억제
앞서 본원의 다른 곳에 논의된 바와 같이, PDGF-BB 신호 전달은 세포 표면 PDGF 수용체 β 이량체와의 결합 후에 활성화된다. PDGF-BB에 대한 MOR8457 항체의 결합이 수용체에 대한 이러한 결합을 차단시킴으로써 하류 신호 전달을 억제하였는지를 시험하기 위하여, MOR8457과, PDGFRβ의 세포외 도메인 및 인간 야생형 IgG1 불변 도메인을 포함하는 PDGFRβ-hIgG1 융합 단백질 간의 경쟁적 결합 분석을 수행하여, 칩 상에서 순차적으로 결합시키거나 또는 용액 중에서 PDGF-BB를 중화시킴으로써 비아코어 상에 가용성 PDGFRβ를 제공하였다.
고체 지지체 ( 비아코어 칩) 상에서의 순차적 결합 분석
칩 상에서 순차적 결합 분석하기 위하여, PDGFRβ-hIgG1을 도 4A의 도면에 예시된 바와 같이 항-인간 IgG 항체를 통하여 CM5 센서 칩 상으로 포획하였다. 이어서, 인간 PDGF-BB를 1 nM의 농도로 6분 동안 주사하여 PDGFRβ-hIgG1 상의 결합 부위를 포화시킨 다음, MOR8457-mIgG1을 주사하였다. PDGF-BB에 대한 PDGFRβ-hIgG1의 결합은 PDGF-BB에 대한 MOR8457-mIgG1의 결합을 차단시켰다 (도 4에 도시된 주기 1에 대한 센서그램 참조). 역으로는, MOR8457-mIgG1 항체를 칩 상에 먼저 포획하는 경우, 도 3에 도시된 주기 2 센서그램에 의해 제시된 바와 같이, PDGF-BB에 대한 MOR8457-mIgG1의 결합이 PDGF-BB에 대한 PDGFRβ-hIgG1 융합 단백질의 결합을 차단시켰다. 이들 결과는 MOR8457이 PDGF-BB와의 결합에 대해 PDGFRβ와 교차 경쟁한다는 것을 입증해주고, MOR8457에 의한 단일 부위 점유율이 PDGF-BB와 PDGFRβ 간의 상호 작용을 차단시키기에 충분하다는 것을 추가로 입증해준다. 이들 데이터는 MOR8457과 PDGF-BB 간의 결합 상호 작용을 나타내는, 다음에 개시된 상세한 컴퓨터 모델링에 의해 제공된 데이터와 일치한다. 간략하게 언급하면, 다음에 보다 상세히 논의되는 바와 같이, PDGF-BB와 MOR8457 Fab의 공-결정 구조에 의해 밝혀진 상세한 에피토프 맵핑 결과, PDGF-BB와 MOR8457 간의 인터페이스가 수용체 결합 부위와 중복된다는 사실이 확인되었다. 따라서, MOR8457은 PDGF-BB와의 결합에 대해 PDGFRβ 수용체와 직접적으로 경쟁하는데, 이는 PDGF-BB가 그의 수용체 (PDGFRαβ 및 PDGFRββ)와 결합함으로써 매개된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 잠재적 신규 치료제로서의 MOR8457의 용도를 추가로 뒷받침해준다.
용액 중에서의 순차적 결합 분석
2:1 결합 화학량론의 복잡성 때문에, 그리고 칩 상에 순차적 결합에 의해 도입된 어떠한 잠재적 인공물을 피하기 위하여, 도 5A에 도시된 다이어그램에 의해 예시된 바와 같이 용액 중에서 PDGF-BB를 MOR8457로 중화시킴으로써 경쟁적 결합을 추가로 확인하였다. MOR8457-mIgG1을 PBS에서 일련으로 희석시킨 다음, 이를 1 mM의 인간 PDGF-BB와 혼합하고, 2 내지 8℃ 하에 20시간 동안 인큐베이션하여 평형에 도달하게 하였다. 이어서, 도 5A에서 [각 괄호] 사이에 나타낸 각각의 MOR8457-mIgG1과 PDGF-BB 희석 혼합물을 CM5 칩 상에 항-인간 IgG1에 의해 포획된 PDGFRβ-hIgG1의 표면 상으로 주사하였다. 도 5B는 MOR8457 억제의 농도 반응 곡선을 나타낸 그래프를 도시한 것이다. 농도가 증가함에 따라, MOR8457-mIgG1은 칩 상에서 PDGFRβ-hIgG1에 대한 PDGF-BB의 결합을 완전히 차단시켰다. 이들 데이터 모두는 PDGF-BB 상으로의 MOR8457과 PDGFRβ 간의 공유된 결합 부위를 입증해준다. 이들 데이터는 PDGF-BB에 대한 MOR8457의 결합 부위가 PDGF-BB에 대한 수용체의 결합 부위와 직접적으로 경쟁한다는 것과, PDGF-BB 상에서의 하나의 MOR8457의 결합이 리간드와 그의 수용체의 결합을 차단시키기에 충분하다는 것을 추가로 입증해준다. 이들 데이터는 PDGF-B와 그의 수용체의 결합에 의해 매개되거나 또는 이러한 결합과 연관된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 신규 치료제로서의 MOR8457의 잠재적 유용성을 추가로 확인시켜 준다.
실시예 7: 중화 항체 단편 Fab - MOR8457과의 복합체 중의 PDGF -BB의 결정 구조
PDGF -BB에 대한 MOR8457의 결합 방식에 관한 구조적 통찰력
MOR8457-Fab와의 복합체 중의 PDGF-BB는 22% PEG 3350 및 0.1 M 트리스, pH 7.0을 함유하는 용액으로부터 18℃ 하에 결정화시켰다. 이 결정은 세포 파라미터 a=90.2 Å, b=68.5 Å; c=95.3 Å, β=97.6°을 수반하고 비대칭 단위 세포 중에 하나의 단백질 복합체를 수반하는 단사(monoclinic) 공간 군 P21과 일치하는 대칭을 갖는다. 2.3 Å 해상도로 설정된 데이터를 아르곤 국립 연구소 (Argonne National Laboratory) (APS)에서 IMCA 빔라인 17-ID 하에 단일 동결 결정으로부터 수집하였다. 이 데이터는 오토PROC 및 SCALA를 이용하여 처리하고 크기를 조정하였다. 설정된 최종 데이터는 3.4의 평균 중복성과 5.8%의 Rsym으로 99.7% 완료되었다.
이 구조는 브룩헤이븐(Brookhaven) PDB 엔트리: 2adg 및 8fab로부터 제조된 fab 단편 모델로 시작하고, 엔트리: 3mjg로부터 제조된 PDGF-BB 모델로 시작하여 PHASER로 분자상 대체시킴으로써 해석하였다. 초기 해석은 Fab 분자의 4개 도메인 각각을 별개로 조사함으로써 획득하였다. 이러한 부분 해석을 이용하여 Fab 단편의 제2 카피를 조사한 다음, PDGF-BB 분자를 최종적으로 조사하였다. 최종 완료된 분자상 대체 해석은 하나의 PDGF-BB 이량체와 결합된 2개의 MOR8457-Fab 단편을 함유하였다. COOT를 이용하여 모델 수동 조정과 모델 재건축을 수차례 반복한 다음, 오토BUSTER을 이용하여 결정학적 개선시키면, 결정학적 Rwork가 21.1%이고 Rfree가 24.47%인 복합체의 최종 개선 모델이 산출되었다. 최종 MOR8457-Fab +PDGF-BB 모델은 제1 Fab 카피의 2개 쇄 H 및 L (중쇄 H의 잔기 1H-133H, 142H-191H, 200H-220H 및 경쇄 L의 잔기 3L-205L), 제2 Fab 카피의 2개 쇄 B 및 A (중쇄 B의 1B-134B, 141B-220B 및 경쇄 A의 2A-207A) 및 PDGF-BB의 2개 쇄 C 및 D (쇄 C의 10C-101C 및 쇄 D의 7D-102D)를 포함한다. 일부 영역에 아미노산이 누락된 것은 장애로 인한 가능성이 매우 크기 때문에 전자 밀도의 결여로 인해 구조로 모델화하지 않았다. 상기 모델에 존재하는 비-단백질 원자는 327개의 물 분자를 포함한다.
결정 구조 분석 결과, 도 6에 도시된 리본 다이어그램에 의해 예시된 바와 같이, 단일 PDGF-BB 사이토킨의 2개 반대편 말단에서 2개의 MOR8457-Fab 분자가 2개의 대칭적 부위와 결합하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 2개의 MOR8457-Fab 분자의 C-말단은 약 190 Å 정도 떨어져 있는데, 이는 관찰된 화학량론에 대해 특정의 기하학적 제약을 부과하고 MOR8457과 PDGF-BB에 대한 2:1 결합 화학량론을 추가로 확인시켜 주는데, 하나의 PDGF-BB 분자는 공간적으로 먼 거리에 있는 2개의 MOR8457 항체에 의해 교차 결합된다.
유사한 상호 작용을 나타내는 2개의 결합 에피토프
앞서 언급된 바와 같이, 결정 구조 분석 결과, 단일 PDGF-BB 사이토킨의 2개 반대편 말단에서 2개의 MOR8457-Fab 분자가 2개의 대칭적 부위와 결합하는 것으로 밝혀졌다 (도 6에서의 리본 다이어그램). 이러한 2개의 MOR8457-Fab 분자의 C-말단은 약 190 Å 정도 떨어져 있는데, 이는 관찰된 화학량론에 대해 특정의 기하학적 제약을 부과한다.
관찰된 결정 구조 및 이를 PDGF-BB/PDGFβ-수용체 복합체 (문헌 [Shim et al., 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:11307-11312])와 비교한 결과는 MOR8457의 중화 효과가 PDGF-BB 상의 동일한 결합 결정기를 놓고 PDGFβ-수용체와 항체가 직접적으로 경쟁하는 것에 기인한다는 사실을 추가로 입증해준다. 문헌 (Shim et al.)에 제시된 바와 같이, PDGFβ-수용체를 이용한 경우에는, PDGF-BB의 각각의 반대 말단에 대한 MOR8457의 결합으로 인해, 2개의 상호 작용성 표면이 생성되므로, 상기 사이토킨 표면 상에 2개의 결합 에피토프 번호 1 및 2가 창출된다. 이들 결합 표면 둘 다가 유사한 상호 작용을 포함하기 때문에, 도 7에 표시된 세부 사항은 항체 쇄 H 및 L (도 7에 제시된 분자 표면으로써 나타냄)을 포함하는 단지 하나의 에피토프인 결합 에피토프 번호 1을 지칭하고, 사이토킨 단량체 C 및 D는 도 7에 리본 다이어그램으로써 나타낸다.
2개의 인터페이스 각각에서, 결합에 필수적인 PDGF-BB 잔기는 두 PDGF-B 단량체에 의해 기여되는데, 상호 작용의 87%는 하나의 단량체로부터 비롯되고 (루프 1 및 루프 3) 나머지 13% (루프 2)는 다른 단량체로부터 비롯된다. PDGF-BB로부터의 총 17개 잔기와 MOR8457-Fab로부터의 총 22개 잔기가 각 인터페이스에서의 상호 작용에 관여하는데, 이는 이들이 4 옹스트롬 (4 Å) 미만 떨어져 있으므로 "접촉 잔기"로 간주된다는 사실로써 표시된 바와 같다. CDR-H1을 제외한 모든 CDR 영역은 PDGF-BB와의 상호 작용에 관여하는데, 가장 큰 기여는 CDR-H3으로부터 비롯된다. 각 결합 인터페이스는 수소 결합의 상호 작용과 방향족 환 상호 작용으로부터 비롯되는데, PDGF-BB 상의 양 하전된 Arg/Lys 잔기와 음 하전된 CDR 사이가 상보적으로 현저하다. 결합 에피토프 #1과 #2 둘 다를 포괄하는, 4 Å 이내의 모든 직접적인 상호 작용이 다음 표 3에 제시되어 있다. 따라서, 항체 파라토프와 결합 에피토프 #1 및 #2 둘 다를 포괄하는, 4 Å 이내의 모든 직접적인 상호 작용이 다음 표 3에 열거되어 있다.
<표 3>
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
표 3에 제시된 결과를 요약하기 위하여, 다음은 항체 상의 접촉 잔기 (파라토프)이다:
MOR8457 중쇄 HC의 경우: CDR-H2로부터의 Trp 47, Tyr 50, Leu 57, Tyr 59, Tyr 60 및 Asp 62; CDR-H3으로부터의 Trp 102, Tyr 103, Gly 104 및 Gly 105, 및 경쇄 L의 경우: CDR-L1로부터의 Gly 28, Ser 29, Tyr 30 및 Phe 31; CDR-L2로부터의 Asp 49, Asp 50 및 Asn 65; CDR-L3으로부터의 Phe 90, Thr 91, His 92, Asn 93 및 Ser 94.
PDGF-B 상의 접촉 잔기 (에피토프)는 에피토프 번호 1의 경우에 다음과 같다:
모두 서열 33의 서열 (NCBI Ref. Seq. NP_002599.1)을 기준으로 하여, 쇄 C: 루프 1로부터의 Leu 38, Val 39 및 Trp 40; 루프 3으로부터의 Glu 71, Arg 73, Ile 75, Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, Pro 82, Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86; 및 쇄 D: 루프 2로부터의 Asn 54 및 Arg 56.
MOR8457 상의 아미노산 잔기, 및 PDGF-BB 상에서의 그들의 각각의 접촉 (4 Å 미만 떨어져 있다) 잔기가 다음 표 4 (에피토프 1) 및 표 5 (에피토프 2)에 제공되어 있다.
<표 4>
Figure pct00014
Figure pct00015
<표 5>
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
본원에 개시된 데이터는 PDGF-BB 이량체 상의 MOR8457에 의해 결합된 2개의 에피토프가 극도로 유사하긴 하지만, 동일하지 않다는 것을 입증해준다.
임의의 특정한 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, PDGF-AB에 대한 결합 (KD = 69 pM)과 비교해서 PDGF-BB에 대한 MOR8457 결합 (KD = 28 pM) 간에 비아코어에 의해 관찰된 결합 상의 비교적 작은 (대략 3배) 감소에 근거하여, PDGF-AB에 대한 MOR8457의 결합 방식이 본질적으로, PDGF-BB에 대한 MOR8457의 결합을 위한 결정 구조에서 관찰된 것일 수 있는데, 단 이종-이량체 내로의 PDGF-AB 연합은 대개, PDGF-BB 동종-이량체의 두 B 서브유닛의 연합과 동일하다. 이러한 서브유닛가 AB 및 BB 이량체 내로 연합하는 것이 본질적으로 동일하다면, 4 Å 이내의 직접적인 접촉물 상의 유일한 차이는 단량체 D에서인데 (에피토프 1의 경우), 여기서는 PDGF-B 중의 Arg 56이 PDGF-A 중의 Ser 50으로 치환된다. 이러한 단일 치환은 PDGF-AB에 대한 결합 (KD = 69 pM)과 비교해서 PDGF-BB에 대한 MOR8457 결합 (KD = 28 pM) 간에 비아코어에 의해 관찰된 결합 상의 약간의 감소의 이유가 될 수 있다.
실시예 8: 인간 혈관간 세포 증식의 억제
관련 기술분야에 축적된 증거는 혈관간증식성 질환, 예컨대 IgA 신염의 진행 동안 혈관간 세포 증식 및 사구체 매트릭스 확장에 있어서의 PDGF-B 및/또는 -D 매개된 PDGFR-β 활성화의 중추적 역할을 뒷받침해준다. 더욱이, PDGFR-β 신호 전달의 특이적 개입에 의한 혈관간 세포 증식과 매트릭스 축적의 저하는 설치류 모델에서의 다수의 연구 하에 입증되었다 (Ostendorf et al., 2012, Pediatric Nephrol. 27:1041-1050). 앞서 본원에 보다 상세히 제시된 바와 같이 (예를 들어, 도 3, 주기 2 센서그램, 및 도 5B 참조), PDGF-BB에 대한 MOR8457 결합이 PDGFRβ에 대한 리간드의 결합을 차단시켰기 때문에, 일차 인간 혈관간 세포에서 PDGF-BB 유도된 혈관간 증식을 기능적으로 억제할 수 있는 MOR8457-IKR-IgG1-3mM의 능력을 평가하였다.
일차 인간 혈관간 세포 [사이언셀 리서치 (ScienCell Research; 미국 캘리포니아주 칼즈배드)]를 배양하고 흑색 고체-바닥 96-웰 플레이트 [Cat#353376, BD 바이오사이언스 (BD Biosciences; 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)]에서 15,000개 세포/웰로 시딩하였다. 이 세포를 세척하고 혈청-무함유 MCM 배지 (사이언셀 리서치; 미국 캘리포니아주 칼즈배드)로 24시간 동안 성장-저지시켰다. 24시간 후, 상기 세포를 37℃ 하에 4시간 동안 일련으로 희석된 PDGF-BB (R&D 시스템즈; 미국 미네소타주 미니애폴리스)로 자극하였다. 마지막 16시간 동안, 제조업자 (로슈; 독일 맨하임)의 지시에 따라서 5-브로모-2'-데옥시우리딘 (BrdU) 혼입 검정을 이용하여 DNA 합성을 결정하였다. 그 다음날, 세포를 고정시키고 제조업자의 프로토콜에 따라서 BrdU 혼입에 관하여 검정하였다.
도 8A는 MOR8457의 부재 하에 증가 농도의 PDGF-BB에 의해 유도된 혈관간 세포 증식에 있어서의 용량-의존적 증가를 보여주는 농도 반응 곡선을 나타내는 그래프를 도시한 것이다. PDGF-BB는 EC50=2.3 ng/mL (100 pM)로 인간 혈관간 세포 증식을 강력하게 자극하였다. 이어서, MOR8457-IKR-hIgG1-3m에 의한 세포 증식의 억제를 결정하였다. MOR8457-IKR-hIgG1-3m을 100 nM에서 0.1 nM으로 반-로그 희석시킨 다음, 이를 0.1% BSA를 수반한 혈청-무함유 MCM 배지에서 30분 동안 2.5 ng/ml의 PDGF-BB와 혼합한 후, 상기 세포에 가하였다. 도 8B는 증가 농도의 MOR8457-IKR-hIgG1-3m을 이용하여 혈관간 세포 증식의 억제를 보여주는 대표적인 용량-의존적 곡선을 도시한 것이다. 평균 IC50은 3가지 독립적인 실험으로부터 결정되었고 13.4 ± 2.8 pM이며, 최대 억제는 87.9 ± 5.7%인데, 이는 MOR8457-IKR-hIgG1-3m이 PDGF-B/PDGFR-β 매개된 인간 혈관간 증식의 기능상 강력한 억제제라는 것을 입증해준다.
앞서 본원에 개시된 데이터는 비아코어를 이용하여 PDGF-BB의 결합에 대해 MOR8457-IKR-hIgG1-3m과 PDGFR-β 융합 단백질 간의 경쟁적 억제를 입증해 주었다 (예를 들어, 도 4, 주기 1 센서그램 참조). 비아코어를 이용하여 관찰된 결합 상호 작용에 대한 경쟁적 억제가 인간 혈관간 세포 증식 기능성 검정에서 경쟁적 억제로 해석되었는지를 결정하기 위하여, 쉴트 분석 (문헌 [Arunklakshana & Schild, 1959, Br. J. Pharmacol. 65:48-58)]을 수행하였다. 보다 구체적으로 언급하면, 일정 량의 항체를 일련의 희석된 PDGF-BB와 혼합한 후, 세포에 가하였다. 항체의 부재 하 및 존재 하에 측정된 PDGF-BB의 EC50을 사용하여 용량 비 (DR)를 계산하였다. 일련의 로그 [B] 항체 농도에 대한 일련의 로그 (DR-1) 값을 그래프 상에 플롯하고, PDGF-BB 농도 반응 곡선의 2배 이동을 유발시키는 항체의 농도로서 지칭되는 pA2를 상기 그래프로부터 추론한다. pA2의 값은 시스템 독립적이고, 기능적 세포 검정에서 항체의 고유 친화도를 반영하고 있다.
도 9A에 도시된 바와 같이, MOR8457-IKR-hIgG1-3m의 농도 증가에 따라 우측으로 이동한 PDGF-BB의 농도 반응 곡선과 억제 정도는 극복할 수 있었다 (도 9A). 추론된 pA2는 약 20 pM이었는데, 이는 비아코어에 의해 결정된 바와 동일한 범위 내였다 (13 pM, 표 2). PDGF-BB에 대한 MOR8457-IKR-hIgG1-3m의 2:1 결합 방식때문에, 농도 반응 곡선의 우측 이동은 간단한 1:1 경쟁적 억제제를 이용한 경우에 예상된 바와 같은 평행을 나타내지 않았다. 이는 또한, 도 9B 상에 도시된 쉴트 플롯의 <1 기울기에 반영되었다. 그럼에도 불구하고, 곡선의 우측 이동, 극복할 수 있는 억제 및 낮은 pM pA2 값은 MOR8457-IKR-hIgG1-3m이 인간 혈관간 세포 증식의 강력한 경쟁적 PDGF-BB 억제제라는 것을 확인시켜 주었다.
혈관간 세포 증식은 혈관간증식성 질환, 예컨대 IgA 신병증에서 중요한 역할을 하는 것으로 널리 공지되어 있다. 몇 가지 증거 라인은 PDGF-BB 발현 증가가 IgA 신병증과 연관이 있었고, PDGF-BB 발현 또는 신호 전달의 봉쇄가 질환 중증도를 저하시켰다는 것을 나타낸다. 따라서, 본원에 제공된 개시내용으로 보강된 통상의 기술자는 혈관간 세포 증식을 기능적으로 억제하는 PDGF-BB의 강력한 경쟁적 억제제인 MOR8457이 PDGF-BB 및/또는 PDGF-B 매개된 신호 전달의 수준 증가와 연관된 혈관간증식성 질환을 치료하기 위한 신규의 잠재적 치료제라는 사실을 인지할 것이다.
실시예 9: 급성 Thy1 .1 래트 모델에서 MOR8457 - mIgG1의 평가
대조군 IgG와 비교하여 혈관간 세포 증식에 대한 효과를 알아보기 위하여 MOR8457-mIgG1을 생체 내에서 평가하는 것은 문헌 (Boor et al., 2007, Nephrol. Dial. Transplant. 22:1323-1331)에 공개된 방법에 따라서 당해 기술분야에서 승인되고 있는 신염의 항-Thy1.1 래트 모델에서 수행하였다. 간략하게 언급하면, 모노클로날 항-Thy 1.1 항체 OX-7 (1 mg/kg)을 정맥내 거환 주사함으로써 150 내지 200 g의 숫컷 위스타르 래트에서 신염을 개시시켰다. MOR8457-mIgG1 (3, 10 및 30 mg/kg) 및 이소형 대조군 IgG (30 mg/kg)를 피하 투여하여, 질환 유도 후 1.5일째에 동물 (n=6)의 코호트를 분리시켰다. 8일째에, 모든 래트에게 50 mg/kg 브로모데옥시우리딘 (BrdU)을 복강내 주사하여 세포 주기의 DNA (S) 상의 세포를 표지시켰다. 9일째에 동물을 희생시키고 혈청 및 신장 조직 샘플을 수득하여, mAb 노출을 확인하였고 조직학/면역조직화학적 기술에 의해, 세포 증식에 대한 MOR8457-mIgG1의 효과 [분열상(mitotic figure)의 정량화에 의해 결정된 바와 같음] 및 혈관간 및 족세포 활성화에 대한 MOR8457-mIgG1의 효과 [알파-평활근 액틴 (α-SMA), 데스민(desmin)에 대한 면역조직화학에 의해 평가된 바와 같음]를 평가하였다. MOR8457-mIgG1은 혈관간 세포 증식에 있어서 용량 의존적 감소를 유도시켰는데, 이는 도 10A에 도시된 바와 같이 BrdU의 축적에 의해 결정되었다. 추가로, MOR8457-mIgG1은 알파-평활근 액틴 양성 염색 상의 감소로써 제시된 바와 같이 혈관간 세포 증식에 있어서 용량 의존적 감소를 유도시켰다 (도 10B). 이들 데이터는 MOR8457이 PDGF-BB-PDGFRβ 상호 작용 및/또는 하류 신호 전달에 의해 매개되거나 또는 이와 연관된 질환을 치료하기 위한 잠재적 신규 치료제라는 것을 추가로 제안하고 있다.
실시예 10: 조작을 통한 MOR8457 항체의 점도 감소
고 농도 하에서의 모노클로날 항체의 점도는 전하, 외형, 용적 및 특이적 자가-상호 작용을 포함한 수많은 요인들에 의해 결정된다 (Yadav et al., 2010, J. Pharm. Sci., 99(12):4812-4829). 실험 결과는 총 전하가 고 농도 하에서의 일부 점도에 영향을 주지만, 또한 근거리의 특이적 상호 작용이 동등하게 중요한 것으로 보인다는 것을 나타낸다 (Yadav 2010, 상기 참조). 총 전하는 전하의 정확한 패턴화와 함께, 고 농도에서의 자가-연합을 결정하는데 중요하다. 대단위 분자 동역학 시뮬레이션은 용액 중에서의 점도 감소가 Fab-Fab 인력의 감소와 상관이 있다는 것을 제안한다. 이는 분자의 순전하 상의 전반적인 증가와 연관이 있다 (Chaudhri et al., 2013, J. Phys. Chem. B, 117(5):1269-1279). 전하 분포의 비대칭 본질을 저하시키는 전하 스와핑 실험은 점도 상의 감소와 상관이 있다 (Ketchem et al., 2012, "Modification of Protein Viscosity by Modification of Protein Surface Charge" PEGS Symposium, Boston MA, and Yadav et al., 2012, Mol. Pharmaceutics 9(4):791-802). 이들은 음 전하 패치에 의해 매개되는 자가-연합이 고도로 점성인 항체를 초래한다고 제안하고 있다. 따라서, 반발력을 증가시키기 위하여 총 전하를 증가시키거나 또는 음 전하 패치의 크기 또는 효과를 저하시키는 것은 고 농도 하에서의 항체의 점도를 저하시키기 위한 접근 방식이다. 이러한 설계가 항체-항원 복합체의 주요 상호 작용의 지식을 이용해서는 하지 못하는 경우일지라도 상기 항체의 활성은 피해를 입을 수 있다 (Ketchem 2012, 상기 참조).
따라서, 존재하는 경우, 파라미터가 점도 상의 변화와 강력한 상관이 있었는지를 결정하기 위해 몇 가지 파라미터를 조사하였다. 이는 7개 상이한 항체를 조사함으로써 수행되었다. 5개 항체: AAB-001 [바피네우주맙(bapineuzumab), CAS 등록 번호 648895-38-9), RK35 (미국 특허 번호 7,888,486), IMA-638 [안루킨주맙(anrukinzumab), CAS 등록 번호 910649-32-0), MOR8457 및 MOR8457-GL의 고 농도 하에서의 점도는 다음에 기재되는 바와 같이 측정하였다. MAb1 및 MAb2는 문헌 (Yadav 2012, 상기 참조)에 기재되어 있는데, 이는 고 농도 하에서의 그들의 점도를 측정하는 것을 포함한다. 이 점도를 Fab의 총 전하 (도 11), Fab의 쌍극자 모멘트 (도 12) 및 CDR의 순전하 (도 13)와 비교하였다. 바피네우주맙 및 IMA-638의 경우에는, Fab의 구조적 모델이 요구되었다. RK35, MAb1 및 MAb2의 경우에는, 결정 구조가 이용 가능하였다. AAB-001, IMA-638, MOR8457 및 MOR8457-GL의 경우에는, 디스커버리 스튜디오 3.5로부터의 모델러 패키지를 이용하여 상동성 모델을 생성시켰다. 이들 모델 각각에 대해, 디스커버리 스튜디오 3.5로부터의 "단백질 이온화 및 잔기 pK의 계산"을 이용하여 전하 할당을 생성시켰다. 계산된 전하를 이용하여, pH 6.0에서의 Fab의 총 전하 및 쌍극자 모멘트를 계산하였다. CDR의 순전하는 양 하전된 잔기 +1, 음 하전된 잔기 -1, 및 His +1/2 전하를 제공하는 서열로부터 취하였다. 이러한 측정 결과를 비교해 보면, CDR의 총 전하 (R2=0.95)와 순전하 (R2=0.55)는 항체의 고 농도 점도와 상관이 있었다는 것이 명백하다. 쌍극자 모멘트 (R2=0.29) 또한, 점도와 다소 상관이 있었지만, 강력한 것은 아니였다. 점 전하 특성 외에도, 정전기 퍼텐셜 에너지 표면 지도는 델피(Delphi) 디폴트 전하를 수반한 디스커버리 스튜디오 3.5의 델피 패키지를 이용하여 계산하였다. 각 항체의 정전기 퍼텐셜 에너지 표면이 도 14에 도시되어 있는데, 저 점도 항체는 패널 A 내지 D (각각 AAB-001, RK35, MAb2 및 IMA-638)에 제시되고, 보다 고 점도 항체는 패널 E 내지 G (각각 Mab1, MOR8457-GL, 및 MOR8457)에 제시된다. 이들 데이터는 보다 고 점도 항체가 보다 저 점도 항체 보다 그들의 CDR 영역 내에 보다 큰 음전하 패치 (도면에서 보다 큰 백색 패치)를 갖고 있다는 것을 입증해준다.
설계 전략
도 11 내지 14에 도시된, 고 농도 하에서의 항체의 점도에 대한 전하 및 전하 분포의 효과는 상기 언급된 발견 내용과 강력하게 상관이 있다 (Yadav 2010, 상기 참조, Yadav 2012, 상기 참조, Ketchem 2012, 상기 참조, 및 Chaudhri 2013, 상기 참조). 더욱이, 고 농도 하에서 고 점도를 갖는 MOR8457-GL의 경우에는, 이러한 항체가 낮은 총 전하 (도 11), CDR 영역 내의 음성 순전하 (도 13), 및 음 하전된 큰 패치 (도 14F)를 갖는 것으로 입증되었다. 이들 발견 내용을 고려해 볼때, 총 전하를 증가시킬 수 있고/있거나, CDR 내의 음 하전된 잔기를 감소시키고/시키거나 음 하전된 패치를 차단 또는 감소시킬 수 있었던 잔기를 확인해 주는 방식이 고안되었다. 항체의 활성을 유지하는데 있어서의 다른 최적화의 어려움을 고려해 볼때 (Ketchem 2012, 상기 참조), 결합 친화도가 손실되지 않도록 해주고 프레임워크 영역이 인간 배선과 여전히 고도로 상동성이 되도록 해주는 부가의 제약이 포함되었다. MOR8457-GL의 아미노산 서열에 근거하여, 프레임워크 -H1, -H2, -H3, -H4, -L1, -L2, -L3 및 -L4 및 CDR-H1, -H2, -H3, -L1, -L2, 및 -L3에서 각 부위에 대한 인간 항체로부터의 아미노산 확률 분포도를 생성시켰다. 각 절편에 대해, 공개적으로 입수 가능한 데이터베이스, 예컨대 IMGT 및 PDB로부터의 동일한 길이 절편을 수반한 모든 인간 항체를 정렬시키고, 각 위치에서의 빈도를 결정하였다. 이러한 프레임워크 잔기 세트로부터, Lys 또는 Arg 잔기의 확률이 높은 (> 10%) 모든 부위 또는 또 다른 중성 잔기의 확률이 높은 (> 10%) 야생형 Glu 또는 Asp를 수반한 부위를 확인하였다. 각각의 부위에 대해, 돌연변이시 안정성 상의 변화와 돌연변이시 결합 친화도 상의 변화는 디스커버리 스튜디오 3.5 및 MOR8457:PDGF-B 결정 구조를 이용하여 계산하였다. CDR 영역에 대해서는, (a) Glu 또는 Asp의 Gln, Asn 및 가장 흔한 잔기 유형으로의 모든 돌연변이, 및 (b) Arg, Lys 또는 His로의 돌연변이를 위한 모든 기타 부위를 대상으로 하여, 돌연변이시 안정성 상의 변화와 돌연변이시 결합 친화도 상의 변화에 관하여 평가하였다. 이들 계산으로부터, 안정성 또는 결합 친화도에 전혀 영향을 미치지 않으면서 순전하를 증가시키는 것으로 예상되었던 돌연변이 세트를 결정하였다 (예측된 ΔΔG < 0.5 kcal/mol). 돌연변이의 목록이 표 6에 제시되어 있다.
<표 6>
Figure pct00019
Figure pct00020
이들 돌연변이의 하위세트를 실험적으로 시험하였다. 그의 총 절편 또는 주변 잔기가 인간 배선에서 발견되었던 돌연변이와, CDR 내의 음 전하 패치와 아주 근접해 있는 돌연변이를 포함하도록 이들을 우선적으로 처리하였다 (도 14F에 도시된 바와 같음). 또한, 그의 절편이 인간 배선에서 발견되었던 하나의 이중 돌연변이체를 선별하였다 (DP-21, IGHV7-4-1, IMGT 수탁 번호 Z12323). 최종적으로, 중쇄 돌연변이와 경쇄 돌연변이의 조합을 또한 선별하였다. 이는 점도를 바람직한 수준으로 감소시키기 위해서는 +2 또는 +3의 전하 변화를 요구할 수 있다는 것을 도 11이 제안하고 있기 때문에 수행되었다. 실험적으로 시험된 이들 MOR8457 변이체 및 이에 혼입된 각각의 돌연변이체가 표 7에 제시되어 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 이량체성이기 때문에, 단일 돌연변이체가 항체 분자당 2개의 돌연변이 (즉, 각 H 또는 L 쇄 상에 하나씩)를 포함하는 것으로 이해된다. 유사하게, 이중 돌연변이가 존재하는 경우, 항체는 4개의 돌연변이체를 포함하는데, 이는 2개의 중쇄와 2개의 경쇄가 있기 때문이다. H 또는 L 쇄 상에 하나의 돌연변이체를 갖고 다른 H 또는 L 쇄 상에 2개의 돌연변이체를 갖는 3개의 돌연변이체가 존재하는 경우에는, 항체가 6개의 돌연변이체를 포함한다.
<표 7>
Figure pct00021
점도 측정
전장 IgG의 일시적 발현을 HEK-293F 세포에서 수행하였는데, 이는 중쇄 및 경쇄를 별개로 코딩하는 발현 벡터로 형질감염시켰다 (표 7로부터의 MOR8457-2 내지 MOR8457-18). 형질감염시킨지 3일 내지 7일 후에 세포 배양 상청액을 수거하고 원심분리함으로써 청정하게 하였다.
여과시킨 후 (0.22 ㎛ 또는 0.45 ㎛), 상기 상청액을 대상으로 하여 표준 단백질 A 또는 G 친화 크로마토그래피 (맵셀렉트 슈어; 독일)하였다. 단백질을 pH 3에서 용출시키고 3 M TRIS, pH 8에서 중화시켰다. 추가의 하류 프로세싱은 1x 둘벡코 PBS (인비트로젠)로의 완충제 교환과 멸균성 여과 (0.2 ㎛; 밀리포어 또는 사르토리우스)를 포함하였다. SDS-PAGE 중에서 변성, 환원성 조건 및 변성, 비-환원성 조건 하에 또는 모세관 전기영동에 의해 순도를 분석하였다. HP-SEC를 수행하여 그들의 천연 상태에서의 IgG 제제를 분석하였다.
MOR8457의 조작된 변이체의 점도를 다음과 같이 측정하였다. PBS 중의 단백질을, 막 카세트 장치 10K MWCO [더모 사이언티픽(Thermo Scientific)]을 이용하여 20 mM 히스티딘, 85 mg/ml 슈크로스, 0.05 mg/ml EDTA pH 6.0에 대항하여 광범위하게 투석하였다. 단백질을 투석으로부터 수거하고, 0.2 마이크로미터 주사기 필터를 이용하여 여과하였다. 비바스핀(Vivaspin) 원심분리용 농축기 10K MWCO (GE 헬스케어)를 이용하여 단백질을 농축시켰다. 단백질 용적이 감소되고 단백질 농도가 증가함에 따라 샘플 분취액 (12 ㎕)을 농축기 보존물로부터 제거하였다. 300 nm 비드 [나노스피어 (Nanosphere), 더모 사이언티픽]를 상기 단백질 샘플 및 완충제 블랭크에 가하였다. 이 비드를 20 mM 히스티딘, 85 mg/ml 슈크로스, 0.05 mg/ml EDTA pH 6.0에서 1:10으로 희석시키고, 0.75 ㎕ 희석된 비드를 단백질 샘플 내로 스파이킹하였다. 단백질/비드와 완충제/비드 샘플을 온화하게 와동시킴으로써 혼합하였다. 동적 광 산란 측정 (DLS)에 의해 분석하기 위하여 8 ㎕ 샘플을 1536 웰 플레이트 [센소플레이트(SensoPlate), 유리 바닥, 그라이너 바이오-원(Greiner Bio-One)]으로 옮겼다. 이 플레이트를 광학상 투명한 테이프로 밀봉하고, 2,000 RPM 하에 2분 동안 원심분리시켜 거품을 제거하였다.
다이나프로(DynaPro) 프레이트 판독기 [와이어트 테크놀러지 (Wyatt Technology; 미국 캘리포니아주 산타바바라)]를 이용하여 DLS 측정을 수행하였다. 샘플을 25℃ 하에 인큐베이션하고, 15 연속 25초 포착을 이용하여 측정하였다. 허용되는 붕괴 곡선을 가졌던 데이터 수집을 위해 비드 반경의 평균을 냈다. 스토크-아인슈타인(Stokes-Einstein) 방정식에 근거하여 점도를 계산하였다. 샘플 점도는 측정된 겉보기 반경을 공칭 비드 반경으로 나눈 값에 0.893 cP (25℃ 하의 물의 점도)를 곱한 것으로 계산하였다.
데이터는 변이체 MOR8547-16이 모 MOR-8457 항체 또는 배선화 MOR8457-GL 구조물과 비교해서 실질적으로 감소된 점도를 나타냈다는 것을 입증해 준다 (도 15). MOR8457-15는 MOR8457-GL과 비교해서 감소된 점도를 나타내지 않았지만, 모 MOR8457 항체와 비교해서 상당히 감소된 점도를 명확히 보여주었다.
최고 클론의 분석
2개 클론, 즉 MOR8457-15와 MOR8457-16은 모 mAb MOR8457-GL과 비교해서 증가된 안정성과 발현을 보여주었다 (실시예 11, 12 참조). 안정성과 발현의 개선 이외에도, MOR8457-16은 MOR8457 모 항체 및 MOR8457-GL과 비교해서 감소된 점도를 나타내었다. 두 클론은 중쇄 E6Q 및 Q13K 돌연변이를 공유한 반면, MOR8457-15는 또한, 경쇄 D96N 돌연변이를 갖고 있고, MOR8457-16은 경쇄 N53K 돌연변이를 가졌는데, 즉 이들은 공통의 중쇄를 공유하고, 경쇄에 있어서 단일 아미노산 잔기가 상이하다. PDGF-B와의 복합체 중의 이들 두 돌연변이체의 상동성 모델이 도 16에 도시되어 있다. 이들 상동성 모델은 디스커버리 스튜디오 3.5의 모델러 패키지 및 MOR8457:PDGF-B 결정 구조를 이용하여 생성시켰다. 중쇄 H6 부위와 H13 부위는 결합 부위로부터 먼 거리에 있는 반면, 경쇄 부위 L96과 L53은 결합 부위와 가깝지만, PDGF-B와 직접적으로 상호 작용하지는 않는다. 부가적으로, 도 17은 L53 부위가 경쇄 CDR 영역 내의 음 하전된 패치와 근접해 있다는 것을 도시하고 있다. 이러한 음 하전된 패치는 상기 결정 구조 및 상동성 모델에서 PDGF-B와 직접적으로 접촉하게 된다. 임의의 특정한 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 돌연변이된 경쇄 N53K 잔기는 상기 음 전하 패치와 관계되거나 이에 의해 매개되는 자가-연합의 일부를 차단시킬 수 있는 것으로 보이지만, PDGF-B 결합 부위로부터 상당히 멀리 떨어져 있어 결합 친화성에 영향을 미치지 못한다.
점도 감소는 단백질 치료제의 성공적인 상업화에 있어서 중요한 요인인데, 이는 이것이 응집 감소를 제공하고 단백질을 비경구 또는 피하 전달하기 위해 단백질을 농축시킬 수 있는 능력에 영향을 미칠 수 있다는 점에서 단백질을 제조할 수 있는 능력에 관한 것이기 때문이다. 또한, 점도 감소는 항체를 환자에게 전달하는 것을 촉진시킬 수 있는데, 이는 보다 작은 보어(bore) (즉, 내부 직경) 및/또는 게이지 (즉, 외부 직경) 및/또는 보다 신속한 전달 속도를 포함하는 전달 장치를 통하여 투여할 수 있는 능력을 포함한다. 또한, 응집체가 항-약물 항체 (ADA)의 발생과 연관이 있을 수 있기 때문에, 그리고 점도 증가가 응집 감소와 관계될 수 있기 때문에, 점도 감소는 단백질 치료제의 성공적인 상업화에 있어서 중요한 요인일 수 있다. 따라서, MOR8457 변이체의 감소된 점도는 잠재적 신규 치료제로서 항체에 상당한 이점을 제공할 수 있는 중요하고도 바람직한 특징이다.
실시예 11: 조작된 MOR8457 변이체의 개선된 안정성
MOR8457 변이체 항체의 열 안정성을 평가하기 위하여, 단백질 샘플을 400 ㎕의 용적에서 PBS (8.1 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl pH 7.2) 중에 희석시켜 0.3 mg/ml로 만들었다. PBS를 참조 세포 중의 완충제 블랭크로서 사용하였다. 오토샘플러 [GE 헬스케어 바이오-사이언스(Bio-Sciences); 미국 뉴저지주 피스카타웨이]를 이용하여 샘플을 마이크로칼 VP-모세관 DSC의 샘플 트레이 내로 주입하였다. 샘플을 10℃ 하에 5분 동안 평형시킨 다음, 시간당 100℃의 속도로 110℃까지 스캔하였다. 16초의 여과 기간을 선택하였다. 미가공 데이터는 기준선 교정되었고, 단백질 농도는 표준화하였다. 오리진 소프트웨어 7.0 [오리진랩 코포레이션 (OriginLab Corporation; 미국 매사추세츠주 노샘프턴)]을 사용하여 상기 데이터를 적당한 수의 전이를 수반하는 MN2-스테이트 모델에 피팅하였다.
항체 변이체 중 두 가지, 즉 MOR8457-15와 MOR8457-16은 모 mAb MOR8457-GL과 비교해서 증가된 열 안정성 (도 18) 및 발현 (도 19)을 나타내었다. 잠재적 치료제의 열 안정성과 발현 수준은 신규 치료제의 성공적인 상업화에 있어서 중요한 요인인데, 이는 이들이 특히, 제품의 비용에 강한 영향력을 미치기 때문이다.
실시예 12: 조작된 MOR8457 변이체의 개선된 생산 능력 프로파일
MOR8457 - GL 및 조작된 변이체의 수율 및 순도 분석
분석적 크기-배제 크로마토그래피 (SEC) 및 UV 흡수 분광법을 이용하여, HEK293 세포에서 일시적으로 발현된 MOR8457 항체의 패널의 단백질 A 포획에 따른 순도와 수율을 평가하였다 (도 19 패널 A). 단백질 A 친화 크로마토그래피는 먼저, HEK293 적응용 배지를 0.2 mm PES 필터를 통하여 여과시킨 다음, 이를 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 2.7 mM KH2PO4, pH 7.2 (PBS)로 평형시킨 맵 셀렉트 슈어 (GE 헬스케어) 단백질 A 칼럼 상에 부하함으로써 수행하였다. 이어서, 칼럼을 PBS로 세척하고, 결합된 단백질은 20 mM 시트르산, 150 mM 염화나트륨 pH 2.5를 이용하여 용출시켰다. 피크 분획을 모으고, 2 M 트리스, pH 8.0로 중화시켰다. 포획된 총 단백질의 정량화는 280 nm에서의 UV 흡수 측정 및 각 항체에 대한 몰 흡광 계수를 이용하여 수행하였다. 흡광 계수는 Trp 및 Tyr에 대한 흡광 계수 (문헌 [Pace et al., 1995, Protein Sci. 4:2411-2423])를 사용한 에델호크(Edelhoch) 방법 (문헌 [Edelhoch H., 1967, Biochemistry 6:1948-1954])을 이용하여 유도하였다. SEC는 슈퍼덱스(Superdex)200 (GE 헬스케어)으로 피팅된 애질런트(Agilent) 1200 HPLC [애질런트 테크놀러지(Agilent Technologies)] 상에서 수행하였다. 이를 위하여, 대략 20 내지 30 ㎍의 단백질을 0.5 mL/min의 유속으로 PBS에 평형시킨 칼럼 상으로 주사하고 60분 동안 동용매 용출시켰다. 280 nm 하에서 흡수시킴으로써 단백질을 검출하였다. 이러한 분석 결과는 조합 변이체 중에서의 순도 및 단백질 A 수율 상의 증가로서 제시된다 (도 19 패널 A; 백색 막대와 비교한 회색 막대). 특히, MOR8457-16은 단백질 A 수율 상의 증가 이외에도, 단백질 A 용출액 중의 >99% 관심 피크 (POI)를 나타내었다 (도 19 패널 B). 감소된 점도 및 증가된 수율과 같은 특징을 포함한, 개선된 생산 능력은 치료제의 상업적 개발에 있어서 중요한 요인인데, 이는 치료제의 생산 비용과 상업화에 강한 영향을 미치기 때문이다.
실시예 13: MOR8457 -16 변이체의 결합 친화도, 특이성 및 효력
상이한 PDGF 이소형에 대한 MOR8457-16의 결합 친화도는 비아코어 3000 (GE 헬스케어; 미국 뉴저지주 피스카타웨이)을 이용하여 앞서 기재된 바와 같이 (실시예 6) 결정하였다. 간략하게 언급하면, 항-인간 IgG (GE 헬스케어) 항체는 제조업자에 의해 지시된 바와 같이 아민 커플링을 이용하여 8,000 내지 10,000 공명 단위 (RU)의 CM5 센서 칩의 유동 세포에서 고정화시켰다. 시험 항체를 PBS-NET (10 mM 인산염 pH 7.4, 287 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 3.2 mM EDTA, 0.01% 트윈 20) 내로 희석시켜 0.5 ㎍/mL가 되도록 하였고, 항-인간 항체 표면 상으로 30초 동안 주사하면, 82 내지 122 RU의 안정적인 항-PDGF 표면이 생성되었다. PDGF 단백질을 PBS-NET에서 1 nM이 되도록 희석시키고, 0.25 nM이 되도록 일련으로 2배 희석시켰다. 이어서, PDGF의 각 농도를 100 ㎕/min의 유속으로 2분 동안 상기 항체 표면 상으로 주사하였다. 복합체를 10분 동안 해리하게 두었다. 3 M 염화마그네슘을 30초 주사하여 상기 표면을 재생시키고, 이 표면을 항-PDGF 항체 포획 및 PDGF 결합 동역학의 또 다른 라운드용으로 남겨두었다. 동역학 데이터는 스크러버2 소프트웨어 (바이오-로직 소프트웨어)를 이용하여 이중 참조하였고 (문헌 [D.G. Myszka et al., J. Mol . Recognit . 12:279, 1999]), 이어서 비아코어 평가 소프트웨어 버전 4.1을 이용하여 1:1 결합 모델에 피팅하였다. 모든 PDGF 이소형의 단백질 농도는 제한성 질량 수송 조건 하에 결정된 활성 농도를 이용하여 교정하였다 (Karlsson et al., METHODS: A companion to Methods in Enzymology 6:99-110, 1994). 제시된 결과는 2가지 독립적인 결합 연구의 평균이었다.
MOR8457-16 항체는 인간 PDGF-AB 및 BB에 대한 낮은 pM 결합 친화도와 마우스 및 래트 PDGF-BB에 대한 교차 반응성을 보유하였다 (도 20 및 표 8). 그의 결합 친화도와 특이성은 모 MOR8457-GL과 거의 동등한 수준이었는데 (실시예 6), 이는 점도의 개선을 초래하는 돌연변이가 PDGF에 대한 결합을 포함하지 않았다는 것을 제안하고 있다.
MOR8457-16의 기능적 활성을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 그의 혈관간 세포 증식의 억제를 시험하였다. 이 검정은 앞서 기재된 바와 같이 수행하였다 (실시예 8). 간략하게 언급하면, 항체를 100 nM에서 0.1 nM으로 반-로그 희석시킨 다음, 이를 0.1% BSA를 수반한 혈청-무함유 MCM 배지에서 30분 동안 2.5 ng/ml의 PDGF-BB와 혼합한 후, 상기 세포에 가하였다. 도 21은 동일한 실험에서 모 MOR8457-GL (B)과 비교한 MOR8457-16 (A)의 억제 곡선을 도시한 것이다. MOR8457-16의 IC50은 14 pM인데, 이는 모 MOR8457의 IC50 20 pM과 유사하다.
<표 8>
Figure pct00022
서열 목록의 요약
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
개시된 교시가 각종 적용, 방법, 키트 및 조성물을 참조로 하여 기재되긴 하였지만, 각종 변화 및 변형이 본원의 교시 및 다음 청구된 발명으로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있는 것으로 인지될 것이다. 전술된 실시예는 개시된 교시를 보다 잘 예시하기 위해 제공된 것이고, 본원에 제시된 교시의 범위를 제한하는 것은 아니다. 본 교시가 이들 예시적 실시양태 측면에서 기재되긴 하였지만, 통상의 기술자는 이들 예시적 실시양태의 수많은 변동 및 변형이 과도한 실험없이도 가능하다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 이러한 모든 변동 및 변형은 본 교시의 범위 내에 있다.
본원에 인용된 모든 참고 문헌 (특허, 특허 출원, 서류, 텍스트 북 등 포함), 및 이미 그렇지 않은 정도까지 그에 인용된 참고 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 포함된 문헌 및 유사한 물질 중 하나 이상 (정의된 용어, 용어 활용, 기재된 기술 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다)이 본 출원과 상이하거나 상반되는 경우에는, 본 출원이 우선한다.
전술된 설명 및 실시예는 본 발명의 특정의 구체적 실시양태를 상세히 열거한 것이고, 본 발명자들에 의해 고려된 최상의 방식을 기재한 것이다. 그러나, 전술된 내용을 아무리 텍스트에 상세히 나타낼 수 있다 하더라도, 본 발명은 많은 방식으로 실시될 수 있고, 본 발명은 첨부된 청구범위 및 그의 모든 등가에 따라서 해석되어야 한다는 것을 인지할 것이다.
Figure pct00030
SEQUENCE LISTING <110> Arch, Robert Carven, Gregory Kuai, Jun Mosyak, Lydia Ogawa, Shinji Ponsel, Dirk Rauchenberger, Robert <120> PLATELET-DERIVED GROWTH FACTOR B SPECIFIC ANTIBODIES AND COMPOSITIONS AND USES THEREOF <130> PC071978 <150> 61/724,888 <151> 2012-11-09 <160> 47 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MOR8457 light chain V domain <400> 1 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Leu Gly Ser Tyr Phe Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ala Phe Thr His Asn Ser Asp Val 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MOR8457 heavy chain V domain <400> 2 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120 cccggcaagg gcctggagtg ggtgagctac atcagcgacg acggcagcct gaagtactac 180 gccgacagcg tgaagggcag attcaccatc agcagagaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc caaacacccc 300 tactggtacg gcggccagct ggacctgtgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtcctca 360 gcgtcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc cgctggggca 720 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320 cagaagagcc tctccctgtc ccccgga 1347 <210> 14 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MOR8457 full length heavy chain germlined with triple effector null mutant IgG1 constant domain <400> 14 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Asp Asp Gly Ser Leu Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln 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Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 15 <211> 636 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> germlined MOR8457 full length light chain <400> 15 agctacgagc tgacccagcc ccccagcgtg agcgtgtccc ccggccagac cgccagcatc 60 acctgcagcg gcgacagcct gggcagctac ttcgtacact ggtaccagca 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Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Asp Asp Gly Ser Leu Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Pro Tyr Trp Tyr Gly Gly Gln Leu Asp Leu Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 47 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MOR8457-15/16 hIgG1 full length heavy chain with engineered V domain and triple effector null mutant IgG1 constant domain <400> 47 gaggtgcagc tgctgcagag cggcggcggc ctggtgaagc ccggcggcag cctgagactg 60 agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt gagacaggcc 120 cccggcaagg gcctggagtg ggtgagctac atcagcgacg acggcagcct gaagtactac 180 gccgacagcg tgaagggcag attcaccatc agcagagaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagacacccc 300 tactggtacg gcggccagct ggacctgtgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtcctca 360 gcgtcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc cgctggggca 720 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320 cagaagagcc tctccctgtc ccccgga 1347

Claims (26)

  1. PDGF-B와 특이적으로 결합하고,
    (a) 서열 6의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열의 VH 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 4의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열의 VL CDR1 (CDR-L1), CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL;
    (b) 서열 6의 VH 아미노산 서열의 CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 4의 VL 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL;
    (c) 서열 7의 CDR-H1 아미노산 서열, 서열 8의 CDR-H2 아미노산 서열, 및 서열 9의 CDR-H3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 10의 CDR-L1 아미노산 서열, 서열 11의 CDR-L2 아미노산 서열, 및 서열 12의 CDR-L3 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (d) 서열 8의 CDR-H2 아미노산 서열, 및 서열 9의 CDR-H3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 10의 CDR-L1 아미노산 서열, 서열 11의 CDR-L2 아미노산 서열, 및 서열 12의 CDR-L3 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (e) MOR8457-GL-VH로서 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13303)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 VH 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 MOR8457-GL-VL로서 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13302)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL;
    (f) MOR8457-GL-VH로서 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13303)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 VH 아미노산 서열의 CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 MOR8457-GL-VL로서 기탁된 벡터 (ATCC 수탁 번호 PTA-13302)의 폴리뉴클레오티드 삽입물에 의해 코딩된 VL 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL;
    (g) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (h) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (i) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (j) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (k) 서열 14의 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (l) 서열 5의 핵산 서열에 의해 코딩된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 3의 핵산 서열에 의해 코딩된 VL CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
    (m) 서열 5의 핵산 서열에 의해 코딩된 CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 3의 핵산 서열에 의해 코딩된 VL CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
    (n) 서열 5의 핵산 서열에 의해 코딩된 VH; 및 서열 3의 핵산 서열에 의해 코딩된 VL;
    (o) 서열 13의 핵산 서열에 의해 코딩된 중쇄; 및 서열 15의 핵산 서열에 의해 코딩된 경쇄;
    (p) 서열 44의 VH 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 39의 VL 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL;
    (q) 서열 44의 VH 아미노산 서열의 CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 39의 VL 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL;
    (r) 서열 7의 CDR-H1 아미노산 서열, 서열 8의 CDR-H2 아미노산 서열, 및 서열 9의 CDR-H3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 10의 CDR-L1 아미노산 서열, 서열 41의 CDR-L2 아미노산 서열, 및 서열 12의 CDR-L3 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (s) 서열 8의 CDR-H2 아미노산 서열 및 서열 9의 CDR-H3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 10의 CDR-L1 아미노산 서열, 서열 41의 CDR-L2 아미노산 서열, 및 서열 12의 CDR-L3 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (t) 서열 44의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (u) 서열 46의 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (v) 서열 44의 VH 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 34의 VL 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL;
    (w) 서열 44의 VH 아미노산 서열의 CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 34의 VL 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL;
    (x) 서열 7의 CDR-H1 아미노산 서열, 서열 8의 CDR-H2 아미노산 서열, 및 서열 9의 CDR-H3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 10의 CDR-L1 아미노산 서열, 서열 11의 CDR-L2 아미노산 서열, 및 서열 36의 CDR-L3 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (y) 서열 8의 CDR-H2 아미노산 서열 및 서열 9의 CDR-H3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 10의 CDR-L1 아미노산 서열, 서열 11의 CDR-L2 아미노산 서열, 및 서열 36의 CDR-L3 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (z) 서열 44의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
    (aa) 서열 46의 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 제1항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산.
  3. PDGF-B와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하고,
    (a) 서열 3의 핵산 서열;
    (b) 서열 5의 핵산 서열;
    (c) 서열 13의 핵산 서열;
    (d) 서열 15의 핵산 서열;
    (e) 서열 3의 핵산 서열 및 서열 5의 핵산 서열;
    (f) 서열 13의 핵산 서열 및 서열 15의 핵산 서열;
    (g) ATCC 수탁 번호 PTA-13303을 갖는 MOR8457-GL-VH로서 기탁된 벡터의 삽입물의 핵산 서열;
    (h) ATCC 수탁 번호 PTA-13302를 갖는 MOR8457-GL-VL로서 기탁된 벡터의 삽입물의 핵산 서열;
    (i) 서열 35의 핵산 서열;
    (j) 서열 40의 핵산 서열;
    (k) 서열 45의 핵산 서열;
    (l) 서열 38의 핵산 서열;
    (m) 서열 43의 핵산 서열;
    (n) 서열 47의 핵산 서열;
    (o) 서열 35 및 서열 45의 핵산 서열;
    (p) 서열 40 및 서열 45의 핵산 서열;
    (q) 서열 38 및 서열 47의 핵산 서열;
    (r) 서열 43 및 서열 47의 핵산 서열; 또는
    (s) ATCC 수탁 번호 PTA-13303을 갖는 MOR8457-GL-VH로서 기탁된 벡터의 삽입물의 핵산 서열 및 ATCC 수탁 번호 PTA-13302를 갖는 MOR8457-GL-VL로서 기탁된 벡터의 삽입물의 핵산 서열
    을 포함하는 단리된 핵산.
  4. 제3항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  5. 제3항의 핵산을 포함하는 벡터.
  6. 제5항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  7. 제4항에 있어서, 박테리아 세포 또는 포유동물 세포인 숙주 세포.
  8. 제4항의 숙주 세포를, PDGF-B와 특이적으로 결합하는 항체가 발현되는 조건 하에 배양하는 것을 포함하고, 상기 항체를 단리하는 것을 추가로 포함하는, PDGF-B와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 생성 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    (a) VL이 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고 CDR 내에 있지 않은 아미노산 중에 1개 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하거나;
    (b) VH가 서열 6의 아미노산 서열을 포함하고 CDR 내에 있지 않은 아미노산 중에 1개 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하거나; 또는
    (c) VL이 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고 CDR 내에 있지 않은 아미노산 중에 1개 이상의 아미노산 치환 내지 5개 이하의 아미노산 치환을 추가로 포함하며; VH가 서열 6의 아미노산 서열을 포함하고 CDR 내에 있지 않은 아미노산 중에 1개 이상의 아미노산 치환 내지 5개 이하의 아미노산 치환을 추가로 포함하는
    단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  10. PDGF-B와 특이적으로 결합하고; 제1항의 항체와 동일한 에피토프와 결합하거나 또는 제1항의 항체와 PDGF-B에 대한 PDGFRββ 상의 결합 부위에서 중복되며; AbyD3263이 아닌, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  11. PDGF-B와 특이적으로 결합하고; PDGF-B와의 결합에 대해 PDGFRββ와 교차 경쟁하며; 추가로 2 pM 내지 100 pM의 범위의 KD로 PDGF-B와 결합하는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  12. 제10항에 있어서, PDGF-BB 상의 하나 이상의 에피토프와 결합하며, 여기서 상기 에피토프는
    (a) 서열 33의 아미노산 서열에 대해 잔기 Leu 38, Val 39 및 Trp 40, Asn 54, Arg 56, Glu 71, Arg 73, Ile 75, Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, Pro 82, Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86을 포함하는 에피토프; 및
    (b) 서열 33의 아미노산 서열에 대해 잔기 Trp 40, Asn 54, Glu 71, Arg 73, Ile 75, Glu 76, Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, Pro 82, Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86을 포함하는 에피토프
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  13. 제10항에 있어서, 파라토프를 포함하며, 여기서 상기 파라토프는 서열 1의 서열에 대해 카바트 넘버링에 기초하여 아미노산 잔기 G28, S29, Y30, F31, D49, D50, F90, T91, H92, N93, S94; 및 서열 2의 서열에 대해 카바트 넘버링에 기초하여 아미노산 잔기 Y50, L57, Y59, Y60, D62, W102, Y103, G104, G105로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것인 항체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 파라토프가 서열 1의 서열에 대해 카바트 넘버링에 기초하여 아미노산 잔기 N65 및/또는 서열 2의 서열에 대해 카바트 넘버링에 기초하여 잔기 W47을 추가로 포함할 수 있는 것인 항체.
  15. 약 2 pM 내지 69 pM의 범위의 KD로 PDGF-B와 특이적으로 결합하고, PDGF-B와의 결합에 대해 PDGFRβ와 교차 경쟁하며, PDGFRβ에 대한 PDGF-B 결합에 의해 매개되는 활성을 억제하는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  16. 제15항에 있어서, 상기 PDGFRβ에 대한 PDGF-B 결합에 의해 매개되는 활성이 상기 PDGFRβ의 인산화, 세포 증식의 유도, 세포 이동의 유도, 및 세포외 매트릭스의 침착 증가로 이루어진 군으로부터 선택된 한 가지 이상인 항체.
  17. 제15항에 있어서, PDGF-B와의 결합에 대해 제1항 또는 제9항의 항체와 경쟁하는 항체.
  18. 약 13 pM의 KD로 인간 PDGF-BB와 특이적으로 결합하고,
    (a) PDGF-BB와의 결합에 대해 PDGFRββ와 교차 경쟁하고;
    (b) (i) 서열 33의 아미노산 서열에 대해 잔기 Leu 38, Val 39 및 Trp 40, Asn 54, Arg 56, Glu 71, Arg 73, Ile 75, Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, Pro 82, Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86을 포함하는 에피토프; 및
    (ii) 서열 33의 아미노산 서열에 대해 잔기 Trp 40, Asn 54, Glu 71, Arg 73, Ile 75, Glu 76, Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, Pro 82, Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86을 포함하는 에피토프
    (상기 에피토프들은 PDGF-BB 상에 대략 190 Å 떨어져 있음)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 에피토프와 결합하며;
    (c) 서열 1의 서열에 대해 카바트 넘버링에 기초하여 아미노산 잔기 G28, S29, Y30, F31, D49, D50, F90, T91, H92, N93, S94; 및 서열 2의 서열에 대해 카바트 넘버링에 기초하여 아미노산 잔기 Y50, L57, Y59, Y60, D62, W102, Y103, G104, G105를 포함하는 파라토프를 포함하고;
    (d) 상기 파라토프의 아미노산 잔기는 4 Å 이내에서, 다음과 같이 하나의 상기 에피토프의 아미노산 잔기와 접촉되며:
    (i) 경쇄 가변 도메인의 경우, Trp 47은 PDGF-B의 Lys 82와 접촉하고, Leu 57은 PDGF-B의 Ile 77과 접촉하며, Tyr 59는 PDGF-B의 Ile 77, Arg 79, Lys 80, Lys 81, 및 Pro 82와 접촉하고; Trp 102는 PDGF-B의 Leu 8, Val 39, Trp 40, Asn 54, Arg 56, Ile 75, 및 Phe 84와 접촉하며, Tyr 103은 PDGF-B의 Trp 40, Arg 73, Ile 75, 및 Phe 84와 접촉하고, Gly 104는 PDGF-B의 Arg 73 및 Phe 84와 접촉하며, Gly 105는 PDGF-B의 Phe 84와 접촉하고 (이러한 경쇄 가변 도메인 아미노산의 넘버링은 서열 1을 기준으로 하여 카바트 넘버링에 기초함);
    (ii) 중쇄 가변 도메인의 경우, Gly 28은 PDGF-B의 Lys 86과 접촉하고, Ser 29는 PDGF-B의 Lys 85 및 Lys 86과 접촉하며, Tyr 30은 PDGF-B의 Ile 83, Phe 84, Lys 85 및 Lys 86과 접촉하고, Phe 31은 PDGF-B의 Gln 71, Arg 73, Phe 84 및 Lys 86과 접촉하며, Asp 49는 PDGF-B의 Arg 73과 접촉하고, Asp 50은 PDGF-B의 Lys 86과 접촉하며, Asn 65는 PDGF-B의 Lys 86과 접촉하고, Phe 90은 PDGF-B의 Pro 82, Ile 83, 및 Phe 84와 접촉하며, Thr 91은 PDGF-B의 Lys 81 및 Ile 83과 접촉하고, His 92는 PDGF-B의 Lys 81 및 Ile 83과 접촉하며, Asn 93은 PDGF-B의 Lys 81과 접촉하고, Ser 94는 PDGF-B의 Lys 81과 접촉하며 (이러한 중쇄 가변 도메인 아미노산의 넘버링은 서열 2를 기준으로 하여 카바트 넘버링에 기초함);
    추가로 PDGF-B 접촉 잔기의 아미노산 잔기 넘버링은 서열 33의 아미노산 서열에 대한 것인
    단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  19. 제1항, 제2항 및 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  20. 세포외 매트릭스의 침착을 감소시킬 필요가 있는 대상체에게 제19항의 제약 조성물의 유효량을 투여함으로써, 대상체에서 세포외 매트릭스의 과도한 침착을 억제하는 것을 포함하는, 세포외 매트릭스의 침착을 감소시킬 필요가 있는 대상체에서 세포외 매트릭스의 침착을 감소시키는 방법.
  21. PDGFRβ에 대한 PDGF-B 결합에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 상태의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 제19항의 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환, 장애 또는 상태의 예방 또는 치료 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 상태가 아테롬성동맥경화증, 재발 협착증, 폐 고혈압, 망막 혈관 질환, 심장 섬유증, 폐 섬유증, 간 섬유증, 신장 섬유증, 전신 경화증, 류마티스 관절염, 골관절염, 및 종양발생으로 이루어진 군으로부터 선택된 한 가지 이상인 방법.
  23. 세포외 매트릭스의 침착을 감소시킬 필요가 있는 대상체에서 세포외 매트릭스의 침착을 감소시키는데 사용하기 위한, 제1항, 제2항 및 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 제19항의 제약 조성물.
  24. PDGFRβ에 대한 PDGF-B 결합에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 상태를 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한, 제1항, 제2항 및 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 제19항의 제약 조성물.
  25. 세포외 매트릭스의 침착을 감소시킬 필요가 있는 대상체에서 세포외 매트릭스의 침착을 감소시키기 위한 의약을 제조하는데 있어서, 제1항, 제2항 및 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 제19항의 제약 조성물의 용도.
  26. PDGFRβ에 대한 PDGF-B 결합에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 상태를 예방 또는 치료하기 위한 의약을 제조하는데 있어서, 제1항, 제2항 및 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 제19항의 제약 조성물의 용도.
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