KR20180064541A - 항-il-2 항체 및 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20180064541A
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이삭 제이. 런던
나타샤 크렐린
폴 베셋
엘레오노라 트로타
제프리 에이. 블루스톤
로렌 케이. 일리
케난 크리스토퍼 가르시아
Original Assignee
화이자 인코포레이티드
더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본 발명은 IL-2에 특이적으로 결합하여, IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 IL-2 결합의 친화도를 감소시키는, 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 본 발명은 상기 항체 및 이를 암호화하는 핵산을 수득하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 상기 항체 및 IL-2를 포함하는 복합체를 투여하는 단계를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는, 자가면역 질환, 장애 또는 병태를 치료 및/또는 예방하고, 면역억제를 위한 이러한 항체의 조성물 및 이러한 항체를 사용하는 치료 방법을 추가로 제공한다.

Description

항-IL-2 항체 및 조성물 및 이의 용도
공동 연구 협약에 대한 당사자
청구된 본 발명은 하기에 열거된 공동 연구 협약에 대한 당사자에 의해서 또는 그들을 대표하여 발명되었다. 공동 연구 협약은 청구된 발명이 수행된 날 또는 그 이전에 그리고 공동 연구 협약의 범주 내에서 수행된 활동의 결과로서 청구된 발명이 수행된 날 또는 그 이전에 발효되었다. 공동 연구 협약에 대한 당사자는 화이자 인크(PFIZER INC.) 및 더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아(THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA)이다.
관련 출원
본 출원은 2016년 10월 14일자로 출원된 국제 가출원 제62/408,360호; 및 2015년 10월 23일자로 출원된 미국 가출원 제62/245,600호의 이익을 청구하며, 이들 출원 각각의 내용은 이들의 전문이 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷의 텍스트 파일로 전자적으로 제출되고, 그의 전문이 참고로 포함된 서열 목록을 포함한다. 2016년 10월 21일자로 생성된, 상기 텍스트 파일은 파일명이 PCFC-993-WO1-SL.txt이고, 크기가 106,549바이트이다.
기술분야
본 개시내용은 항체, 예를 들어 인터류킨-2(IL-2)에 특이적으로 결합하는 전장 항체 및 이의 항원-결합 부분에 관한 것이다. 본 개시내용은 추가로 IL-2에 대한 항체를 포함하는 조성물, 및 의약으로서 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 항-IL-2 항체는 면역억제를 위해서 자가면역 질환, 장애 및 병태를 치료 및 예방하기에 유용하다.
인터류킨-2(IL-2)는 면역 반응과 연관된 질환, 예컨대 자가면역 질환, 장이 및 병태를 치료하기 위한 잠재적인 표적 및 면역억제를 위한 잠재적인 표적이다. IL-2 매개 질환, 장애 및 병태를 치료하기 위한 신규 요법에 대한 오랫동안 느껴온 충족되지 못한 요구가 존재한다. 본 개시내용은 이러한 요구를 충족시킨다.
본 발명자들은 새롭고 이로운 항-IL-2 항체를 생성하였다. 특정 양상에서, 본 개시내용은 인간 IL-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이며, 여기서 항체는 IL-2 수용체 쇄 IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 결합하는 hIL-2를 감소시키고, 조절 T(Treg) 세포에서보다 더 높은 정도로 CD8+ T 세포에서 활성을 저해한다.
특정 양상에서, 본 개시내용 인간 IL-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이며, 여기서 항체는 hIL-2의 헬릭스 A 및 C, 및 B-C 루프에 결합한다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 서열번호 13 및 14의 아미노산 서열을 포함하는 항체와 동일한, hIL-2의 에피토프와 인간 IL-2(hIL-2)에 대한 결합에 대해서 경쟁하거나, 또는 그 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 인간 IL-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이며, 여기서 항체는 IL-2Rα에 대한 hIL-2의 결합 친화도를 1 내지 199배 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 항체는 IL-2Rα에 대한 hIL-2의 결합 친화도룰 10배 감소시킨다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 hIL-2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이며, 여기서 항체 또는 부분은 IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 hIL-2 결합을 감소시키고, CD8+ T 세포에서 STAT5 포스포릴화를 Treg 세포에서보다 더 높은 정도로 저해한다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 hIL-2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이며, 여기서 항체 또는 부분은 IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 hIL-2 결합을 감소시키고, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 배양 또는 재구성 검정법에 의해서 평가되는 경우, 신체에서 CD8+ 또는 CD4+ T 세포 또는 NK 세포에 대한 Treg 세포의 비를 증가시킨다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 hIL-2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이며, 여기서 항체 또는 부분은 IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 hIL-2 결합을 감소시키고, Treg 세포에서 FOXP3, CD25, 및 Icos 중 하나 이상의 발현을 증가시킨다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 단리된 항체 또는 항원-결합 부분에 관한 것이며, 여기서 항체 또는 부분은 a) 약 4.53 x 10-4s-1 이상의 hIL-2 결합 오프-레이트; 및/또는 b) 약 1.14 x 10-10M 이상의 hIL-2에 대한 결합 친화도를 갖는다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 단리된 항체 또는 항원-결합 부분에 관한 것이며, 여기서 항체 또는 부분은 하기를 포함한다:
(a) 서열번호 73(카바트(Kabat)), 74(코티아(Chothia)), 또는 75(확장된)를 포함하는 HCDR1; 서열번호 76(카바트), 또는 77(코티아)을 포함하는 HCDR2; 서열번호 78을 포함하는 HCDR3; 서열번호 79를 포함하는 LCDR1; 서열번호 80을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 81을 포함하는 LCDR3;
(b) 서열번호 82(카바트), 83(코티아), 또는 84(확장된)를 포함하는 HCDR1; 서열번호 85(카바트), 또는 86(코티아)을 포함하는 HCDR2; 서열번호 87을 포함하는 HCDR3; 서열번호 88을 포함하는 LCDR1; 서열번호 89를 포함하는 LCDR2; 및 LCDR3 서열번호 90을 포함하는;
(c) 서열번호 91(카바트), 92(코티아), 또는 93(확장된)을 포함하는 HCDR1; 서열번호 94(카바트), 또는 95(코티아)를 포함하는 HCDR2; 서열번호 96을 포함하는 HCDR3; 서열번호 97을 포함하는 LCDR1; 서열번호 98을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 99를 포함하는 LCDR3;
(d) 서열번호 100(카바트), 101(코티아), 또는 102(확장된)를 포함하는 HCDR1; 서열번호 103(카바트), 또는 104(코티아)를 포함하는 HCDR2; 서열번호 105를 포함하는 HCDR3; 서열번호 106을 포함하는 LCDR1; 서열번호 107을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 108을 포함하는 LCDR3;
(e) 서열번호 109(카바트), 110(코티아), 또는 111(확장된)을 포함하는 HCDR1; 서열번호 112(카바트), 또는 113(코티아)을 포함하는 HCDR2; 서열번호 114를 포함하는 HCDR3; 서열번호 115를 포함하는 LCDR1; 서열번호 116을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 117을 포함하는 LCDR3;
(f) 서열번호 118(카바트), 119(코티아), 또는 120(확장된)을 포함하는 HCDR1; 서열번호 121(카바트), 또는 122(코티아)를 포함하는 HCDR2; 서열번호 123을 포함하는 HCDR3; 서열번호 124를 포함하는 LCDR1; 서열번호 125를 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 126을 포함하는 LCDR3;
(g) 서열번호 127(카바트), 128(코티아), 또는 129(확장된)를 포함하는 HCDR1; 서열번호 130(카바트), 또는 131(코티아)을 포함하는 HCDR2; 서열번호 132를 포함하는 HCDR3; 서열번호 133을 포함하는 LCDR1; 서열번호 134를 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 135를 포함하는 LCDR3;
(h) 서열번호 136(카바트), 137(코티아), 또는 138(확장된)을 포함하는 HCDR1; 서열번호 139(카바트), 또는 140(코티아)을 포함하는 HCDR2; 서열번호 141을 포함하는 HCDR3; 서열번호 142를 포함하는 LCDR1; 서열번호 143을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 144를 포함하는 LCDR3;
(i) 서열번호 145(카바트), 146(코티아), 또는 147(확장된)을 포함하는 HCDR1; 서열번호 148(카바트), 또는 149(코티아)를 포함하는 HCDR2; 서열번호 150을 포함하는 HCDR3; 서열번호 151을 포함하는 LCDR1; 서열번호 152를 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 153을 포함하는 LCDR3;
(j) 서열번호 154(카바트), 155(코티아), 또는 156(확장된)을 포함하는 HCDR1; 서열번호 157(카바트), 또는 158(코티아)을 포함하는 HCDR2; 서열번호 159를 포함하는 HCDR3; 서열번호 160을 포함하는 LCDR1; 서열번호 161을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 162를 포함하는 LCDR3;
(k) 서열번호 163(카바트), 164(코티아), 또는 165(확장된)를 포함하는 HCDR1; 서열번호 166(카바트), 또는 167(코티아)을 포함하는 HCDR2; 서열번호 168을 포함하는 HCDR3; 서열번호 169를 포함하는 LCDR1; 서열번호 170을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 171을 포함하는 LCDR3;
(l) 서열번호 172(카바트), 173(코티아), 또는 174(확장된)를 포함하는 HCDR1; 서열번호 175(카바트), 또는 176(코티아)을 포함하는 HCDR2; 서열번호 177을 포함하는 HCDR3; 서열번호 178을 포함하는 LCDR1; 서열번호 179를 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 180을 포함하는 LCDR3;
(m) 서열번호 181(카바트), 182(코티아), 또는 183(확장된)을 포함하는 HCDR1; 서열번호 184(카바트), 또는 185(코티아)를 포함하는 HCDR2; 서열번호 186을 포함하는 HCDR3; 서열번호 187을 포함하는 LCDR1; 서열번호 188을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 189를 포함하는 LCDR3;
(n) 서열번호 190(카바트), 191(코티아), 또는 192(확장된)를 포함하는 HCDR1; 서열번호 193(카바트), 또는 194(코티아)를 포함하는 HCDR2; 서열번호 195를 포함하는 HCDR3; 서열번호 196을 포함하는 LCDR1; 서열번호 197을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 198을 포함하는 LCDR3;
(o) 서열번호 199(카바트), 200(코티아), 또는 201(확장된)을 포함하는 HCDR1; 서열번호 202(카바트), 또는 203(코티아)을 포함하는 HCDR2; 서열번호 204를 포함하는 HCDR3; 서열번호 205를 포함하는 LCDR1; 서열번호 206을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 207을 포함하는 LCDR3;
(p) 서열번호 208(카바트), 209(코티아), 또는 210(확장된)을 포함하는 HCDR1; 서열번호 211(카바트), 또는 212(코티아)를 포함하는 HCDR2; 서열번호 213을 포함하는 HCDR3; 서열번호 214를 포함하는 LCDR1; 서열번호 215를 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 216을 포함하는 LCDR3; 또는
(q) 서열번호 217을 포함하는 HCDR1; 서열번호 218을 포함하는 HCDR2; 서열번호 219를 포함하는 HCDR3; 서열번호 220을 포함하는 LCDR1; 서열번호 221을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 222를 포함하는 LCDR3.
일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 부분은 a) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 또는 71의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 3; 또는 b) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 또는 71의 HCDR1-3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 부분은 a) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 또는 72의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 3; 또는 b) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 또는 72의 LCDR1-3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
상기 실시형태 중 일부에서, 항체 또는 항원-결합 부분은 a) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 또는 71의 HCDR1-3; 및/또는 b) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 72의 LCDR1-3을 포함한다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 a) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 71의 HCDR3; b) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 71의 HCDR1-3; 또는 c) 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 71의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는, 인간 인터류킨-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 a) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 72의 LCDR3; b) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 72의 LCDR1-3; 또는 c) 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 72의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는, hIL-2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 VH가 a) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 71의 HCDR3; b) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 71의 HCDR1-3; 또는 c) 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 71의 아미노산 서열을 포함하고, VL이 a) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 72의 LCDR3; b) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 72의 LCDR1-3; 또는 c) 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 72의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 항원-결합 부분에 관한 것이다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 hIL-2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이며, 여기서 항체는 각각 표 7에 나타낸 바와 같은
서열번호 1 및 2,
서열번호 3 및 4,
서열번호 5 및 6,
서열번호 7 및 8,
서열번호 9 및 10,
서열번호 11 및 12,
서열번호 13 및 14,
서열번호 15 및 16,
서열번호 17 및 18,
서열번호 19 및 20,
서열번호 21 및 22,
서열번호 23 및 24,
서열번호 25 및 26,
서열번호 27 및 28,
서열번호 29 및 30,
서열번호 31 및 32 또는
서열번호 71 및 72의 HCDR1-3 및 LCDR1-3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이며, 이의 VH 및 VL 은 각각
서열번호 1 및 2,
서열번호 3 및 4,
서열번호 5 및 6,
서열번호 7 및 8,
서열번호 9 및 10,
서열번호 11 및 12,
서열번호 13 및 14,
서열번호 15 및 16,
서열번호 17 및 18,
서열번호 19 및 20,
서열번호 21 및 22,
서열번호 23 및 24,
서열번호 25 및 26,
서열번호 27 및 28,
서열번호 29 및 30,
서열번호 31 및 32 또는
서열번호 71 및 72의 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 단리된 항체는 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)이다. 항체는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역, 및/또는 서열번호 34 또는 35의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 이들 실시형태 중 일부에서, 중쇄 C-말단 라이신은 존재하지 않는다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 hIL-2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이며, 항체는 상기에 기술된 항체 중 임의의 것과 동일한 에피토프에 결합하거나, 또는 상기에 기술된 항체 중 임의의 것과 IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 결합에 대해서 경쟁한다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 VH 아미노산 서열 및 VL 아미노산 서열이 각각 하기 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 95%, 98%, 또는 99%) 동일한 항체 또는 항원-결합 부분에 관한 것이다:
서열번호 1 및 2,
서열번호 3 및 4,
서열번호 5 및 6,
서열번호 7 및 8,
서열번호 9 및 10,
서열번호 11 및 12,
서열번호 13 및 14,
서열번호 15 및 16,
서열번호 17 및 18,
서열번호 19 및 20,
서열번호 21 및 22,
서열번호 23 및 24,
서열번호 25 및 26,
서열번호 27 및 28,
서열번호 29 및 30, 또는
서열번호 31 및 32.
본 개시내용의 상기 기술된 실시형태 중 일부에서, 항체는 인간 항체이다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 부분의 중쇄, 경쇄 또는 둘 모두를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 특정 양상에서, 단리된 핵산은 a) 서열번호 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 또는 66의 뉴클레오타이드 서열; b) 서열번호 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65 또는 67의 뉴클레오타이드 서열; 또는 c) a)와 b) 둘 모두를 포함한다. 예를 들어, 단리된 핵산은 하기의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
서열번호 36 및 37,
서열번호 38 및 39,
서열번호 40 및 41,
서열번호 42 및 43,
서열번호 44 및 45,
서열번호 46 및 47,
서열번호 48 및 49,
서열번호 50 및 51,
서열번호 52 및 53,
서열번호 54 및 55,
서열번호 56 및 57,
서열번호 58 및 59,
서열번호 60 및 61,
서열번호 62 및 63,
서열번호 64 및 65, 또는
서열번호 66 및 67.
특정 양상에서, 본 개시내용은 상기 단리된 핵산 중 하나 이상을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 다른 양상에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 부분의 중쇄, 경쇄 또는 둘 모두를 암호화하는 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 포유동물 세포, 예컨대 NS0 세포 및 CHO 세포)를 제공한다. 본 개시내용은 또한 a) 상기 항체 또는 항원-결합 부분이 발현되는 것을 허용하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 숙주 세포는 항체 또는 항원-결합 부분의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 배양하는 단계, 및 b) 배양물로부터 상기 항체 또는 항원-결합 부분을 단리하는 단계를 포함하는, hIL-2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 생산 방법을 제공한다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 부분 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 염증성 병태, 예컨대 자가면역 질환의 치료 또는 면역억제의 유도를 필요로 하는 인간 대상체에서 염증성 병태, 예컨대 자가면역 질환을 치료하거나 또는 면역억제를 유도하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 대상체에게 유효량의 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 부분 또는 본 개시내용의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 IL-2와의의 복합체로 투여된다. 관련된 양상에서, 본 개시내용은 염증성 병태, 예컨대 자가면역 질환을 갖거나 면역억제를 필요로 하는 인간 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 부분 또는 본 개시내용의 약제학적 조성물(여기서 항체 또는 부분은 임의로 IL-2와의 복합체로 투여됨); 및 염증성 병태, 예컨대 자가면역 질환을 치료하거나 또는 면역억제를 유도하기 위한 의약의 제조에서의 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 부분의 용도(여기서 항체 또는 부분은 임의로 IL-2와의 복합체로 투여됨)를 제공한다.
본 조성물(본 명세서에 기술된 항체 또는 항체/IL-2 복합체를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않음)로 치료될 수 있는 병태 및 방법은 건선 및 피부염(예를 들어, 아토피성 피부염)을 비롯한 염증성 피부 질환; 피부근염; 전신 경화증 및 경화증; 염증성 장 질환(예컨대, 크론병 및 궤양성 대장염)과 연관된 병태; 대장염; 위염; 호흡 곤란 증후군(성인 호흡 곤란 증후군 및 ARDS 포함); 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 사구체신염; 알레르기 병태, 예컨대 습진 및 천식 및 T 세포의 침윤 및 만성 염증성 반응에 관여되는 다른 병태; 죽상경화증; 백혈구 부착 결핍증; 류마티스 관절염; 전신 홍반 루푸스(SLE); 진성 당뇨병(예를 들어, 제I형 진성 당뇨병); 다발성 경화증; 레이노이드 증후군(Reynaud's syndrome); 자가면역 갑상선염; 알레르기성 뇌척수염; 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome); 청소년 발병 당뇨병; 및 결핵, 유육종증, 다발성근염, 육아종증 및 혈관염에서 전형적으로 발견되는 사이토카인 및 T-림프구에 의해서 매개된 급성 및 지연 과민반응과 연관된 면역 반응; 베게너병(Wegener's diease); 악성 빈혈(에디슨병(Addison’s disease)); 백혈구 유출에 관여된 질환; 중추 신경계(CNS) 염증성 장애; 다발성 장기 손상 증후군(multiple organ injury syndrome); 용혈성 빈혈(저온글로빈혈증 또는 늑막 양성 빈혈을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음); 중증 근무력증; 항원-항체 복합체 매개 질환; 항-사구체 기저막 질환; 항인지질 증후군; 알레르기성 신경증; 그레이브스병(Graves' disease); 람베르트-이튼 근무력 증후군(Lambert-Eaton myasthenic syndrome); 수포성 유천포창; 천포창; 자가면역 다발성내분비병증; 백반증; 라이터병(Reiter's diease); 스티프-만 증후군(stiff-man syndrome); 베체트병(Behcet's disease); 거대 세포 동맥염; 면역 복합 신염; IgA 신증; IgM 다발성신경염; 면역 혈소판 감소성 자반증(ITP) 또는 자가면역 혈소판 감소증 및 자가면역 용혈성 질환; 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis); 자가면역 간염; 자가면역 혈우병; 자가면역 림프세포증식 증후군 (ALPS); 자가면역 포도막염; 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome); 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome); 혼합 결합 조직병; 자가면역-연관 불임; 결절성 다발동맥염; 원형 탈모증; 특발성 점액수종; 이식편 대 숙주병; 및 근육 위축병(뒤시엔느(Duchenne), 베커(Becker), 근긴장성, 지대근(Limb-girdle), 안면견갑상완근, 선천성, 안구인두근, 원위, 및 에머리-드레이푸스(Emery-Dreifuss))을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 본 조성물(본 명세서에 기술된 항체 또는 항체/IL-2 복합체를 포함하지만 이것으로 제한되지 않음) 및 방법으로 치료될 수 있는 병태는 진성 당뇨병(예를 들어, 제I형 진성 당뇨병)이다. 일부 실시형태에서, 본 조성물(본 명세서에 기술된 항체 또는 항체/IL-2 복합체를 포함하지만 이것으로 제한되지 않음) 및 방법으로 치료될 수 있는 병태는 제I형 진성 당뇨병이다. 일부 실시형태에서, 본 조성물(본 명세서에 기술된 항체 또는 항체/IL-2 복합체를 포함하지만 이것으로 제한되지 않음) 및 방법으로 치료될 수 있는 병태는 청소년 발병 당뇨병이다
본 개시내용의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 예시적인 실시형태로부터 자명할 것이다.
본 특허 또는 출원 파일은 색상으로 구현된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 유색 도면(들)이 있는 본 특허 또는 특허 출원 공개물의 인쇄물이 요청 및 필요한 비용의 지불 시에 특허청에 의해서 제공될 것이다.
도 1은 항체/IL-2 친화도 및 IL-2Rα 및 IL-2Rβ 결합을 도시한 도면. 반응은 60초 후에 IL-2α 및 IL-2Rβ에 대한 결합으로서 IL-2와의 복합체의 2개의 대표적인 클론인 d1C7 및 16C3의 각각 IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 결합의 백분율로서 보고된다.
도 2는 항체/IL-2 친화도 및 IL-2Rα 및 IL-2Rβ 결합을 도시한 도면. 모 클론 및 친화도 성숙된 클론 둘 모두는 클론 d1C7/IL-2 복합체와 비교할 때 IL-2Rβ 에 대한 항체/IL-2 복합체 결합의 완전한 저해 및 IL-2Rα에 대한 결합의 감소를 나타내었다.
도 3은 IL-2:항-IL-2 mAb 처리 후 Treg의 표현형을 도시한 도면. Treg 집단은 hCD45+ CD3+ CD4+ 헬리오스+ FoxP3+ 세포에 대해서 게이팅형(gated)이었다.
도 4A 내지 C는 hIL-2와의 복합체의 16C3(25㎍) 및 F5.1.11.02(1, 5, 및 25㎍)가 Treg/CD4, Treg/CD8 및 Treg/NK 세포 비율을 증가시켰음을 도시한 도면. 도 4D 내지 F는 hIL-2와의 복합체의 16C3(25㎍) 및 F5.1.11.02(1㎍, 5㎍ 및 25㎍)가 Treg/CD4, Treg/CD8 및 Treg/NK 세포 비율을 증가시켰음을 도시한 도면.
도 5A 내지 C는 hIL-2와의 복합체의 16C3(25㎍) 및 F5.1.11.02(1, 5 및 25㎍)가 비장에서 CD4+, CD8+ 세포 및 Treg의 총 수를 증가시켰음을 도시한 도면. 도 5D 내지 F는 hIL-2와의 복합체의 16C3(25㎍) 및 F5.1.11.02(1㎍, 5㎍ 및 25㎍)가 비장에서 CD4+, CD8+ 세포 및 Treg의 총 수를 증가시켰음을 도시한 도면.
도 6A 내지 C는 항체 처리 후 Treg 상의 CD25, Icos 및 FoxP3 평균 형광 강도(MFI)를 도시한 도면
도 7A 내지 V는 항체 처리 후 CD8+ 효과기 T 세포 및 Treg 세포에서 pSTAT5 신호전달을 도시한 도면. 곡선은 0.2ng/㎖ hIL-2, 10ng/㎖ hIL-2 또는 500ng/㎖ hIL-2로의 처리를 나타낸다.
도 8A 내지 F는 항체 처리 후 CD8+ 효과기 T 세포 및 Treg 세포에서 pSTAT5 신호전달을 도시한 도면. 곡선은 0.5ng/㎖ hIL-2, 5ng/㎖ hIL-2, 50ng/㎖ hIL-2 또는 500ng/㎖ hIL-2로의 처리를 나타낸다.
도 9A 내지 D는 항체 처리 후 CD8+/CD25 고 T 세포, CD8+/CD25 저 T 세포 및 Treg 세포에서 pSTAT5 신호전달을 도시한 도면. x-축은 nM 항체이다. 곡선은 0.8ng/㎖ hIL-2, 20ng/㎖ hIL-2 또는 500ng/㎖ hIL-2로의 처리를 나타낸다.
도 10A 내지 B는 IL-2의 농도를 변화시키면서 CD8+/CD25 고 T 세포, CD8+/CD25 저 T 세포 및 Treg 세포에서의 pSTAT5 신호전달을 도시한 도면.
도 11A 내지 H는 항체 F5.1.9, F5.1.9.5 및 F5.1.11.04 처리 후 CD8+ 효과기 T 세포 및 Treg 세포에서의 pSTAT5 신호전달을 도시한 도면, x-축은 nM 항체이다. 곡선은 0.8ng/㎖ hIL-2, 20ng/㎖ hIL-2 또는 500ng/㎖ hIL-2로의 처리를 나타낸다.
도 12A 및 B는 PMA/아이오노마이신으로 마우스 비장세포를 시험관내 자극시킨 후 IL-2의 생산을 도시한 도면.
도 13A 및 B는 hIL-2Tg, NOD, 또는 NOD mIL-2+/- 마우스에서 활성화된 (CD44+CD62L-) CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 백분율을 도시한 도면.
도 14는 hIL-2 Tg, NOD 또는 NOD mIL-2+/- 마우스로부터의 Treg 상에서의 CD25의 세포 표면 발현을 도시한 도면.
도 15는 7일에 비장의 전체 세포질에 대한 F5.1.11.02:IL-2 복합체의 효과를 도시한 도면.
도 16A 내지 I는 비장, pLN 및 췌장에서 Treg 백분율에 대한 F5.1.11.02:IL-2 복합체의 효과를 도시한 도면.
도 17A 내지 F는 비장, pLN 및 췌장에서 Treg/CD4 및 Treg/CD8 비율에 대한 hIL-2와의 복합체의 F5.1.11.02(25㎍)의 효과를 도시한 도면.
도 18A 내지 C는 비장, pLN 및 췌장에서 Treg 상의 CD25 평균 형광 강도(MFI)에 대한 F5.1.11.02:IL-2 복합체(5㎍ 및 25㎍ F5.1.11.02)의 효과를 도시한 도면.
도 19A 및 B는 총 비장세포의 수에 대한 hIL-2와의 복합체의 F5.1.11.02 25㎍의 효과를 도시한 도면.
도 20A 내지 F는 비장에서 Teff 및 Treg 총 세포 수에 대한 F5.1.11.02 항체:IL-2 복합체의 효과를 도시한 도면. Treg 집단은 hCD45+ CD3+ CD4+ 헬리오스+ FoxP3+ 세포에 대해서 게이팅형이었다.
도 21A 내지 D는 비장에서 Treg/CD4 및 Treg/CD8 비율에 대한 F5.1.11.02 항체:IL-2 복합체의 효과를 도시한 도면. Treg 집단은 hCD45+ CD3+ CD4+ 헬리오스+ FoxP3+ 세포에 대해서 게이팅형이었다.
도 22A 내지 H는 Treg의 증식에 대한 F5.1.11.02 항체:IL-2 복합체 처리의 효과를 도시한 도면.
도 23A 내지 H는 CD8 T 세포의 증식에 대한 F5.1.11.02 항체:IL-2 복합체 처리의 효과를 도시한 도면.
도 24A 및 B는 F5.1.11.02 항체:IL-2 복합체의 두 용량 모두로의 처리가 아이소타입 대조군과 비교할 때 비장에서 Treg 및 CD8 집단 상의 CD25 평균 형광 강도(MFI)의 증가를 유도하였음을 도시한 도면.
도 25A 내지 D는 Treg 및 CD8 세포수에 대한 F5.1.11.02의 효과와 F5.1.11의 효과 간의 비교를 도시한 도면.
도 26A 내지 C는 Treg/CD8 비율에 대한 F5.1.11.02의 효과와 F5.1.11의 효과 간의 비교를 도시한 도면.
도 27A 내지 H는 다양한 용량에서 Treg 증식에 대한 항체의 효과를 도시한 도면.
도 28A 내지 H는 다양한 용량에서 CD8 세포 증식에 대한 항체의 효과를 도시한 도면.
도 29A 및 B는 IL-2(A) 및 IL-2/F5.1.11 Fab(B)의 증가하는 농도에 따른 IL-2Rα 결합에 대한 평형 결합 분석을 도시한 도면.
도 30은 경쇄(LC) CDR1 루프 및 CDR3 루프 및 중쇄(HC) CDR2 루프 및 CDR3 루프를 통한 IL-2와의 F5.1.11 Fab 상호작용을 도시한 도면.
도 31은 F5.1.11 Fab 및 IL- 2Rβ의 결합 부위를 나타내는 IL-2-수용체 4차 복합체가 위에 놓인 F5.1.11 Fab/IL-2 복합체가 겹쳐져 있는 것을 도시한 도면(좌측 패널). F5.1.11 Fab에 결합되는 경우 IL-2 컨포메이션은 수용체 결합된 IL-2에 관련하여 컨포메이션 변화를 나타내어, IL-2Rα 결합 부위의 알로스터릭 변화를 유발한다(우측 패널).
도 32는 비-인간 영장류 교차-반응을 위한 구조-기반 라이브러리 설계를 도시한 도면. 인간(서열번호 224; NCBI 수탁 번호 NP_000577.2) 및 cyno(서열번호 225; 표준 게놈 NCBI 수탁 번호 NC_022276.1로부터 예측됨) IL-2 아미노산 서열의 정렬은 IL-2 가변 루프가 F5.1.11 Fab 결합 경계면에 상응한다는 것을 나타낸다.
도 33A 및 B는 비장세포 및 hCD45+ 세포질에 대한 F5.1.11.02의 효과와 F5.1.11의 효과 간의 비교를 도시한 도면.
도 34A 및 B는 Treg 및 CD8 세포 CD25 발현에 대한 F5.1.11.02의 효과와 F5.1.11의 효과 간의 비교를 도시한 도면.
도 35A 및 B는 처리 5일 후 Treg, CD4, 및 CD8 총 세포수에 대한 F5.1.11.02 항체:IL-2 복합체 효과를 도시한 도면.
도 36A 및 B는 처리 5일 후 Treg/CD4 및 Treg/CD8 세포 비율에 대한 F5.1.11.02 항체:IL-2 복합체 효과를 도시한 도면.
도 37A 및 B는 아이소타입 대조군과 비교된 Treg 및 CD8 집단 상의 CD25 평균 형광 강도(MFI)에 대한 F5.1.11.02 항체:IL-2 복합체로의 처리 효과를 도시한 도면.
도 38은 Treg 상의 FoxP3 평균 형광 강도(MFI)에 대한 F5.1.11.02 항체:IL-2 복합체로의 처리의 효과를 도시한 도면.
도 39A 및 B는 IL-2 상의 상이한 에피토프에 결합하는 항체를 사용한 차동 차동 Treg 확장을 촉진시켜, 상이한 수용체 에피토프/결합 도메인: IL-2Rα 차단제(16C3.4), IL2Rβ 차단제(d1C7), 및 IL-2Rα에 대한 IL2의 결합을 또한 감소시킨 IL2Rβ 차단제(F5.1.11.02)에 대한 결합을 억제한 것을 도시한 도면.
도 40은 아이소타입 대조군과 비교된 Treg 및 CD8 집단 상의 CD25 평균 형광 강도(MFI)에 대한 16C3.4, d1C7, 및 F5.1.11.02로의 처리 효과를 도시한 도면.
도 41은 F5.1.11.02 항체:IL-2 복합체에 의한 당뇨병 차도를 도시한 도면.
도 42는 췌장에서 Treg 수 및 특징에 대한 F5.1.11.02 항체:IL-2 복합체 효과의 효과를 도시한 도면.
본 발명자들은 hIL-2에 특이적으로 결합하고, IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 hIL-2 결합을 감소시키는 새롭고 이로운 항-IL-2 항체 또는 항원-결합 부분을 발명하였다. 이러한 항체 및 부분은 이것이 Treg의 증식 세포를 저해하는 것보다 더 크게 비-Treg 세포(효과기 CD8+, 비-Treg CD4+ 및 NK 세포 포함))의 증식을 저해할 수 있고/있거나; 아이소타입 대조군 항체와 비교할 때 Treg 증식을 증가시킬 수 있고/있거나; Treg 세포 대 비-Treg 세포의 비율을 증가시키거나 Treg 마커를 유지시킬 수 있다. 본 항체는 전문이 참고로 포함된 국제 출원 제PCT/US2015/011794호(현재 국제 공개 제WO 2015/109212호로서 2015년 7월 23일자로 공개됨)에 기술된 IL-2Rα 차단 항체와 구별되는데, 그 이유는 본 항체는 IL-2Rα에 대한 hIL-2 결합을 감소시키지만 파기시키지 않고, IL-2Rβ에 대한 hIL-2 결합을 차단하기 때문이다.
항-IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 IL-2 활성에 의해서 유발되고/되거나 이것과 연관된 질환, 장애 또는 병태의 예방, 치료 및/또는 개선에서 사용될 수 있다. 이러한 질환, 장애 또는 병태는 본 명세서에 개시된 교시가 제공된 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 인식될 바와 같이 특히 제1형 당뇨병, 자가면역 질환, 이식편 대 숙주병 및 Treg이 염증을 매개하는 다른 면역 질환을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일반 기술
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 의미를 가져야 한다. 추가로, 맥락에 의해서 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함해야 하고, 복수 용어는 단수를 포함해야 한다. 일반적으로, 본 명세서에 기술된 세포 및 조직 배양학, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전자 및 단백질 및 핵산 화학 및 교배학과 관련하여 사용되는 명명법 및 이의 기술은 관련 기술 분야에 널리 공지되고 일반적으로 사용되는 것이다.
본 개시내용의 실시는 달리 제시되지 않는 한 관련 기술 분야의 기술에 포함되는 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래의 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌, 예컨대,
Figure pct00001
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에 완전히 설명되어 있다.
효소 반응 및 정제 기술은 관련 기술 분야에서 널리 달성되거나 또는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 제조사의 설명서에 따라서 수행된다. 본 명세서에 기술된 분석 화학, 생화학, 면역학, 분자 생물학, 합성 유기 화학 및 의약 및 약제 화학과 연관된 명명법 및 이들의 실험 절차 및 기술은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고 일반적으로 사용되는 것이다. 화학 합성, 화학 분석 및 약제학 제제, 제형, 및 전달 및 환자의 치료를 위해서 표준 기술이 사용된다.
정의
달리 제시되지 않는 한, 하기 용어는 하기 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다: 용어 "단리된 분자"(분자가 예를 들어, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 또는 이의 항체 또는 부분은 이의 기원 또는 도출원으로 인해서 (1) 이의 네이티브 상태에서 동반되는 자연 연관된 성분과 회합되지 않은 분자, (2) 동일한 종으로부터의 다른 반자가 실질적으로 없는 분자, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해서 불현된 분자, 또는 (4) 자연에 존재하지 않는 분자이다. 따라서, 그것이 본래 유래한 세포와 상이한 세포계에서 화학적으로 합성되거나, 또는 발현된 분자는 이의 본래 연관된 성분으로부터 "단리"될 것이다. 분자는 또한 관련 기술 분야에 널리 공지된 정제 기술을 사용하여, 단리에 의해서 본래 연관된 성분이 실질적으로 존재하지 않게 될 수 있다. 분자 순도 및 균질성은 관련 기술 분야에 널리 공지된 다수의 수단에 의해서 검정될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 샘플의 순도는 관련 기술 분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 및 폴리펩타이드를 가시화하기 위한 겔의 염색을 사용하여 검정될 수 있다. 특정 목적을 위해서, HPLC 또는 정제를 위해서 관련 기술 분야에 널리 공지된 다른 수단에 의해서 더 높은 분할(resolution)이 제공될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로 순수한"은 목적으로 하는 종이 존재하는 우세한 종(즉, 몰 기준으로 그것이 조성물 중의 임의의 다른 개별 종보다 더 풍부함)임을 의미하고, 일부 실시형태에서, 실질적으로 정제된 분획은 목적으로 하는 종(예를 들어, 항체 또는 수용체를 비롯한, 당단백질)이 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 50%를 차지하는 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물 중에 존재하는 모든 거대분자 종의 약 80% 초과, 일부 실시형태에서는, 약 85%, 90%, 95%, 및 99% 초과를 차지할 것이다. 일부 실시형태에서, 목적으로 하는 종은, 조성물이 단일 거대분자 종으로 본질적으로 이루어진 본질적인 동질성(오염 종이 종래의 검출 방법에 의해서 조성물 중에서 검출될 수 없음)으로 정제된다. 특정 실시형태에서 실질적으로 순수한 재료는 적어도 50% 순수하고(즉, 오염물이 존재하지 않음), 일부 실시형태에서, 적어도 90% 순수하고, 일부 실시형태에서, 적어도 95% 순수하고, 추가의 일부 실시형태에서, 적어도 98% 순수하고, 일부 실시형태에서, 적어도 99% 순수하다. 이러한 양은 제한인 것으로 의미되지 않고, 언급된 백분율들 사이의 증분이 본 개시내용의 부분으로서 구체적으로 예상된다.
"항체"는 면역글로불린 분자의 가변 도메인에 위치된, 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해서, 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 폴리펩타이드 등에 대해서 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 이 용어는 무손상 다클론성 또는 단클론성 항체뿐만 아니라, 달리 명시되지 않는 한, 특이적 결합에 대해서 무손상 항체와 경쟁하는 임의의 이의 항원-결합 부분, 항원-결합 부분을 포함하는 융합 단백질 및 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함한다. 항원-결합 부분은 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, 도메인 항체(dAb, 예를 들어, 상어 및 낙타과 항체), 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 부분, 단일 쇄 가변 단편 항체(scFv), 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv, 및 폴리펩타이드에 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 함유하는 폴리펩타이드를 포함한다. 이의 중쇄의 불변 영역의 항체 아미노산 서열에 따라서, 면역글로불린은 상이한 부류로 배정될 수 있다. 면역글로불린의 주요 5가지 부류(즉, 아이소타입): IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류(하위유형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤라 지칭된다. 상이한 부류의 면역글로불린의 소단위 구조 및 3-차원 구성은 널리 공지되어 있다.
항체의 용어 "항원-결합 부분" 또는 "항원-결합 단편"(또는 단순히 "항체 부분")은, 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되는 바와 같이, 항원(예를 들어, IL-2)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 부분을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 부분에 의해서 수행될 수 있다고 밝혀져 있다. 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포함되는 결합 부분의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 부분인, Fab 부분; (ii) 힌지 영역에서 다이설파이드 브릿지에 의해서 연결된 2개의 Fab 부분을 포함하는 2가 부분인, F(ab')2; (iii) VH 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 부분; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 도메인 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 부분, (v) VH 도메인으로 이루어진, dAb 부분(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 다이설파이드-연결된 Fv(dsFv), 및 항-이디오타입(항-Id) 항체 및 인트라바디를 포함한다. 추가로, Fv 부분의 2개의 도메인, 즉 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해서 암호화되더라도, 이것은, 이것이 VL 영역 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단일 쇄 Fv(scFv)라 공지됨)를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조되는 것을 가능하게 하는 합성 링커에 의해서, 재조합 방법을 사용하여 결합될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bird et al. Science 242:423-426 (1988)] 및 [Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988)] 참고). 이러한 단일 쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포함되도록 의도된다. 단일 쇄 항체의 다른 형태, 예컨대 다이아바디가 또한 포함된다. 다이아바디는, VH 도메인 및 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 쇄 상에서 발현되지만, 너무 짧아서 동일한 쇄 상의 2개의 도메인들 사이에서 쌍을 이루는 것을 허용하지 않는 링커를 사용하기 때문에, 도메인이 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루게 하여 2개의 항원 결합 부위를 생성하는 2가의 이중특이적 항체이다(예를 들어, 문헌[Holliger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993); Poljak et al., 1994, Structure 2:1121-1123] 참고).
항체의 "가변 도메인"은 단독 또는 조합의 항체 경쇄(VL)의 가변 도메인 또는 항체 중쇄(VH)의 가변 도메인을 지칭한다. 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 초가변 영역이라고도 공지된 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해서 연결된 4개의 프레임워크 영역(FR)으로 이루어지고, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. 특히 CDR 외부의 아미노산 잔기에서(즉, 프레임워크 영역에서) 치환을 갖는, 대상 가변 도메인의 변이체가 바람직한 경우, 대상 가변 도메인을 대상 가변 도메인과 동일한 정규 부류의 CDR1 서열 및 CDR2 서열을 함유하는 다른 항체의 가변 도메인과 비교함으로써 적절한 아미노산 치환, 일부 실시형태에서는, 보존적 아미노산 치환이 식별될 수 있다(예를 들어, 문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196(4): 901-917, 1987] 참고).
특정 실시형태에서, CDR의 최종 설명 및 항체의 결합 부위를 포함하는 잔기의 식별은 항체의 구조를 해석하고/하거나 항체-리간드 복합체의 구조를 해석함으로써 성취된다. 특정 실시형태에서, 그것은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 기술 중 임의의 것, 예컨대 X-선 결정학에 의해서 성취될 수 있다. 특정 실시형태에서, 다양한 분석 방법을 사용하여 CDR을 식별 또는 추정할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 방법의 예는 카바트 정의, 코티아 정의, AbM 정의, 접촉 정의, 컨포메이션 정의 및 IMGT 정의를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
카바트 정의는 항체 내의 잔기를 넘버링하기 위한 표준이고, CDR 영역을 식별하기 위해서 전형적으로 사용된다(예를 들어, 문헌[Johnson & Wu, 2000, 핵산s Res., 28: 214-8] 참고). 코티아 정의는 카바트 정의와 유사하지만, 코티아 정의는 특정 구조 루프 영역의 위치를 고려한다(예를 들어, 문헌[Chothia et al., 1986, J. Mol. Biol., 196: 901-17; Chothia et al., 1989, Nature, 342: 877-83] 참고). AbM 정의는 항체 구조를 모델링하는 옥스포드 몰레큘러 그룹(Oxford Molecular Group)에 의해서 제조된 컴퓨터 프로그램의 통합 세트를 사용한다(예를 들어, 문헌[Martin et al., 1989, Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272; "AbMTM, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies", Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd.] 참고). AbM 정의는 지식 데이터베이스와 압 이니시오(ab initio) 방법, 예컨대 문헌[Samudrala et al., 1999, "Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach," in PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194-198]에 의해서 기술된 것의 조합을 사용하여 1차 서열로부터 항체의 3차 구조를 모델링한다. 접촉 정의는 입수 가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기반으로 한다(예를 들어, 문헌[MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 5:732-45] 참고). 본 명세서에서 CDR의 "컨포메이션 정의"로 언급되는 또 다른 접근법에서, CDR의 위치는 항원 결합에 엔탈피가 기여하는 잔기로서 식별될 수 있다(예를 들어, 문헌[Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166] 참고). 또 다른 CDR 경계 정의는 상기 접근법 중 하나를 엄격하게 따르지 않을 수 있지만, 그럼에도 불구하고 카바트 CDR의 적어도 일부와 겹칠 것이지만, 특정 잔기 또는 잔기의 군이 항원 결합에 유의한 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험 결과에 비추어 이들은 단축되거나 길어질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, CDR은 접근법의 조합을 비롯한, 관련 기술 분야에 공지된 임의의 접근법에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 방법은 이들 접근법 중 임의의 방법에 따라 정의된 CDR을 이용할 수 있다. 하나 초과의 CDR을 함유하는 임의의 제시된 실시형태에 있어서, CDR은 카바트, 코티아, 확장된, AbM, 접촉 및/또는 컨포메이션 정의 중 어느 하나에 따라 정의될 수 있다. 특정 실시형태에서, 확장된 CDR은 카바트 방법 및 코티아 방법에 의해서 식별된 아미노산 잔기 모두를 지칭한다.
"접촉 잔기"는 이에 의해서 특이적으로 결합된 항체 또는 항원과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 동족 항체/항원 상에 존재하는 아미노산 잔기의 중원자(heavy atom)의 4Å 이하 이내에 적어도 하나의 중원자(즉, 수소가 아님)를 포함하는 항체/항원 상에 존재하는 아미노산 잔기를 지칭한다.
관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, 항체의 "불변 영역"은 항체 경쇄의 불변 영역 또는 항체 중쇄의 불변 영역을 단독으로 또는 조합하여 지칭하는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "단클론성 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉, 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연-발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론성 항체는 매우 특이적이고, 단일 항원 부위에 대해 지향된다. 추가로, 전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대해 지향되는 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체 제제와 달리, 각각의 단클론성 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지향된다. 수식어 "단클론성"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻어지는 바와 같은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단클론성 항체는 문헌[Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495]에 의해 처음 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 미국 특허 제4,816,567호에 기술된 바와 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 단클론성 항체는 또한 예를 들어 문헌[McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554]에 기술된 기술을 사용하여 생성된 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "인간화" 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 부분(예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)인 비-인간(예를 들어, 뮤린)의 형태를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 인간화 항체는 수여자의 CDR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종(공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기에 의해서 교체된 인간 면역글로불린(수여자 항체)이다. 인간화 항체는 수여자 항체 또는 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않지만 항체 성능을 더 개선하고 최적화하기 위해 포함되는 잔기를 포함할 수 있다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하고/하거나 본 명세서에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 사용하여 제조된 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 명확하게 배제한다.
용어 "키메라 항체"는 가변 도메인 서열이 하나의 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열은 또 다른 종으로부터 유래된 항체, 예컨대 가변 도메인 서열이 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열은 인간 항체로부터 유래되거나 또는 그역인 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 이 용어는 또한 하나의 종으로부터 하나의 개인(예를 들어, 제1 마우스)으로부터의 V 영역 및 동일한 종로부터의 또 다른 개인(예를 들어, 제2 마우스)으로부터의 불변 영역을 포함하는 항체를 포함한다.
용어 "항원(Ag)"은 Ag를 인식하는 항체(Ab)를 생산하거나 또는 발현 라이브러리(예를 들어, 특히 파지, 효모 또는 리보솜 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝하기 위한 면역적격 척추동물의 면역법을 위해서 사용되는 분자 실체를 지칭한다. 본 명세서에서, Ag는 보다 넓게는 Ab에 의해서 특이적으로 인식되고, 따라서 Ab를 증가시키기 위한 면역법 공정 및 Ab를 선택하기 위한 라이브러리 스크리닝에서 사용되는 분자의 부분 또는 모방체를 포함하는, 표적 분자를 지칭하고, 일반적으로는 이것을 포함하도록 의도된다. 따라서, IL-2에 결합하는 본 개시내용의 항체의 경우, IL-2의 단량체 및 이의 다량체, 예컨대 이량체, 삼량체 등뿐만 아니라 절두된 변이체 및 다른 변이체를 비롯한, 포유동물 종(예를 들어, 인간, 원숭이, 마우스 및 래트 IL-2)으로부터의 전장 IL-2가 항원이라 지칭된다.
일반적으로, 용어 "에피토프"는 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 면적 또는 영역, 즉 항체와 물리적으로 접촉하는 면적 또는 영역을 지칭한다. 따라서, 용어 "에피토프"는 항체의 항원-결합 영역 중 하나 이상에서 항체에 의해서 인식되고 결합될 수 있는 분자의 부분을 지칭한다. 전형적으로, 에피토프는 "항체, 또는 이의 항원-결합 부분"(Ab)과 이의 상응하는 항원 사이에서의 분자 상호작용의 맥락에서 정의된다. 에피토프는 종종 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 표면 기로 이루어지고, 구체적인 3차원 구조적 특성 및 특이적 전하 특성을 가지고 있다. 일부 실시형태에서, 에피토프는 단백질 에피토프일 수 있다. 단백질 에피토프는 선형 또는 컨포메이션일 수 있다. 선형 에피토프에서, 단백질과 상호작용 분자(예컨대 항체) 사이의 모든 상호작용점은 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 발생한다. "비선형 에피토프" 또는 "컨포메이션 에피토프"는 에피토프에 특이적인 항체가 결합하는 항원 단백질 내의 인접하지 않은 폴리펩타이드(또는 아미노산)를 포함한다. 용어 "항원 에피토프"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 관련 기술 분야에 널리 공지된 임의의 방법, 예를 들어 종래의 면역검정에 의해 결정되는 바와 같은 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 일부로서 정의된다. 대안적으로, 발견 과정 동안, 항체의 생성 및 특징규명은 바람직한 에피토프에 대한 정보를 규명할 수 있다. 이 정보로부터, 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 경쟁적으로 스크리닝하는 것이 가능하다. 이를 달성하기 위한 접근법은 IL-2에 대한 결합에 대해서 서로와 경쟁하거나 교차-경쟁하는 항체, 예를 들어 항체가 항원에 대한 결합을 위해 경쟁하는 항체를 찾기 위해 경쟁 및 교차-경쟁 연구를 수행하는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "야생형 아미노산", "야생형 lgG", "야생형 항체", 또는 "야생형 mAb"는 특정 집단(예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 세포 등) 내의 자연 발생하는 아미노산 또는 핵산의 서열을 지칭한다.
본 명세서 다른 곳에 설명된 바와 같이, 항체 분자의 특정 위치는 변경될 수 있다. "위치"라는 것은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 단백질의 서열에서의 위치를 의미한다. 위치는 순차적으로 또는 설정된 포맷에 따라서 넘버링될 수 있고, 예를 들어, EU 지침 및 카바트 지침이 항체의 아미노산 잔기를 넘버링하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 위치 297은 인간 항체 IgG1에서의 위치이다. 상응하는 위치는 일반적으로 다른 모 서열과의 정렬을 통해서, 상기에 설명되어 있는 바와 같이 결정된다.
"잔기"라는 것은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 단백질 및 이의 연관된 아미노산 내의 위치 및 이의 연관된 아미노산 아이덴터티 내의 위치를 의미한다. 예를 들어, 아스파라긴 297(Asn297이라고도 지칭되고, N297이라고도 지칭됨)은 인간 항체 IgG1 내의 잔기이다.
용어 "T 조절 세포" 또는 "Treg"는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 기능 또는 생물 마커를 특징으로 할 수 있는 T 세포의 유형을 지칭한다(예를 들어, 문헌[Schmetterer et al., FASEB Vol. 26 (2012)] 참고). 특정 실시형태에서, Treg 세포는 FOXP3 유전자좌의 중요 게놈 요소의 탈메틸화를 기반으로 하기 마커 중 하나 이상을 발현한다: TCR/CD3, CD4, CD25 및 안정화된 FOXP3.
용어 "Treg 스퍼링(sparing) 항체"는 IL-2에 결합하고, Treg 세포에 우호적으로 Treg:CD8+ 세포의 비율을 검출 가능하게 이동시키는 항체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, Treg 스퍼링 항체는 CD8+ 세포의 증식을 그것이 Treg의 증식을 저해하는 것보다 더 큰 정도로 저해한다. 일부 실시형태에서, Treg 스퍼링 항체는 Treg:CD8+ 세포 비율을 적어도 2-배 증가시킨다.
관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, "폴리뉴클레오타이드", 또는 "핵산"은, 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되는 바와 같이, 임의의 길이의 뉴클레오타이드를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해서 쇄 내에 혼입될 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 이의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변경은 쇄의 조립 전에 또는 그 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해서 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 중합 이후에, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해서 추가로 변형될 수 있다. 변형의 다른 유형은 예를 들어, 자연 발생 뉴클레오타이드 중 하나의 유사체, 뉴클레오타이드간 변형, 예컨대, 예를 들어 비하전된 링키지(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트라이에스터, 포스포아미데이트, 카바메이트 등)를 갖는 것 및 하전된 링키지(예를 들어, 포스포로싸이오에이트, 포스포로다이싸이오에이트 등)를 갖는 것, 펜던트 모이어티를 함유하는 것, 예컨대, 예를 들어, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 톡신, 항체, 신호 펩타이드, 폴리-L-라이신 등), 인터칼레이터(예를 들어, 아크리딘, 프소라렌 등)를 갖는 것, 킬레이터(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)을 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 변형된 링키지를 갖는 것(예를 들어, 알파 애노머 핵산 등), 뿐만 아니라 폴리뉴클레오타이드(들)의 비변형된 형태로의 치환인, "cap"을 포함한다. 추가로, 당에 통상적으로 존재하는 하이드록실기 중 임의의 것은 예를 들어, 포스포네이트기, 포스페이트기에 의해서 대체되거나, 표준 보호기에 의해서 보호되거나, 또는 추가적인 뉴클레오타이드에 대한 추가적인 링키지를 제조하기 위해서 활성화될 수 있거나, 또는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 포스포릴화되거나 또는 아민 또는 1 내지 20개의 탄소 원자의 유기 캡핑기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 하이드록실이 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 예를 들어, 2'-O- 메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카보사이클릭 당 유사체, 알파- 또는 베타-애노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 퓨나노스 당, 세도헵툴로스, 비환식 유사체 및 비염기성(abasic) 뉴클레오사이드 유사체, 예컨대 메틸 리보사이드를 비롯한, 관련 기술 분야에 일반적으로 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사한 형태를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포다이에스터 링키지는 대안적인 연결기에 의해서 대체될 수 있다. 이러한 대안적인 연결기는 포스페이트가 P(O)S("싸이오에이트"), P(S)S("다이싸이오에이트"), (O)NR2("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2("폼아세탈")(식 중, 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 에터(-O-) 링키지를 임의로 함유하는 치환 또는 비치환된 알킬(1 내지 20개의 C), 아릴, 알켄일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일 또는 아르알딜임)에 의해서 대체된 실시형태를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 폴리뉴클레오타이드 내의 모든 링키지가 동일할 필요는 없다. 상기 설명은 RNA 및 DNA를 비롯한, 본 명세서에 지칭된 모든 폴리뉴클레오타이드에 적용된다.
에피토프에 "우선적으로 결합한다" 또는 "특이적으로 결합한다" (본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용됨) 항체는 관련 기술 분야에서 널리 이해되는 용어이고, 이러한 특이적 또는 우세한 결합을 결정하는 방법 또한 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 분자는 대안적인 세포 또는 물질을 사용하는 것보다 특정 세포 또는 물질과 더 자주, 더 신속하게, 더 긴 기간 및/또는 더 큰 친화도로 반응하거나 회합할 경우, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타낸다고 언급된다. 항체는 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합능(avidity)으로, 보다 쉽게 및/또는 더 긴 기간으로 결합할 경우, 표적에 "특이적으로 결합" 또는 "우선적으로 결합"한다. 또한, 항체는 샘플 중에 존재하는 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합능으로, 보다 쉽게 및/또는 더 긴 기간으로 결합할 경우, 표적에 "특이적으로 결합" 또는 "우선적으로 결합"한다. 예를 들어, IL-2 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는 다른 IL-2 에피토프 또는 비-IL-2 에피토프에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합능으로, 보다 용이하게 및/또는 더 긴 기간으로 이 에피토프 서열에 결합하는 항체이다. 또한, 이 정의를 읽음으로써, 예를 들어, 제1 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체(또는 모이어티 또는 에피토프)가 제 2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있음이 이해된다. 따라서, "특이적 결합"또는 "우선적인 결합"은 배타적인 결합을 (포함할 수 있지만) 반드시 필요로 하는 것은 아니다.
다양한 검정 포맷을 사용하여 관심 분자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 펩타이드를 선택할 수 있다. 많은 분석 중에서 예를 들어, 고체-상 ELISA 면역검정, 면역침강, 바이아코어(Biacore)(상표명)(지이 헬쓰케어(GE Healthcare), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재), 키넥사(KinExA), 형광-활성화 세포 분류(FACS), 옥텟(Octet)(상표명)(포르테바이오 인크.(
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), 미국 캘리포니아주 먼로 파크 소재) 및 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 항원 또는 수용체와 특이적으로 결합하는 항체, 또는 동족 리간드 또는 결합 파트너와 특이적으로 이의 결합하는 리간드 결합 부분을 식별할 수 있다. 전형적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 배경 신호 또는 노이즈의 적어도 2배, 보다 전형적으로는 배경의 10배 초과, 보다 더 전형적으로는 배경의 50배 초과, 보다 전형적으로는 배경의 100배 초과, 보다 더 전형적으로는, 배경의 500배, 보다 전형적으로는 배경의 1000배 초과, 보다 더 전형적으로는 배경의 10,000배 초과일 것이다. 또한, 항체는 평행 해리 상수(KD)가 7nM 이하인 경우 항원에 "특이적으로 결합한다"고 지칭된다.
용어 "결합 친화도"는 본 명세서에서 두 분자, 예를 들어 항체 또는 이의 부분과 항원 간의 비-공유 상호작용의 강도의 측정치로서 사용된다. 용어 "결합 친화도"는 1가 상호작용(고유 활성)을 기술하는 데 사용된다. 두 분자 간의 결합 친화도는 해리 상수(KD)의 결정에 의해서 정량분석될 수 있다. 차례로, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명(SPR) 방법(바이아코어)을 사용하여 복합체 형성 및 해리의 동역학을 측정함으로써 KD를 결정할 수 있다. 1가 복합체의 회합 및 해리에 상응하는 속도 상수는 각각 회합 속도 상수 k a (또는 k on ) 및 해리 속도 상수 k d (또는 k off )라 지칭된다. KD는 수학식 KD = k d / k a 를 통해서 k a 및 k d 에 관련된다. 해리 상수의 값은 널리 공지된 방법에 의해서 직접 결정될 수 있고, 문헌[Caceci et al. (1984, Byte 9: 340-362)]에 언급된 것과 같은 방법에 의해서 복합체 혼합물에 대해서도 컴퓨터 계산될 수 있다. 예를 들어, KD는 이중-필터 나이트로셀룰로스 필터 결합 검정, 예컨대 문헌[Wong & Lohman (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5428- 5432)]에 개시된 것을 사용하여 설정될 수 있다. 표적 항원에 대한 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 다른 표준 검정은, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, RIAs 및 유세포 분석법 분석 및 본 명세서에 다른 부분에 예시된 다른 검정을 비롯하여, 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 항체의 결합 동역학 및 결합 친화도 또한 관련 기술 분야에 공지된 표준 검정, 예컨대 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해서, 예를 들어 바이아코(상표명) 시스템 또는 키넥사를 사용함으로써 평가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체는 약 1.14 x 10-10M 이상의 KD로 hIL-2에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항체는 약 9 x 10-11M 이상의 KD로 hIL-2에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 약 8 x 10-11M 이상의 KD로 hIL-2에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 약 7 x 10-11M 이상의 KD로 hIL-2에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 약 6 x 10-11M 이상의 KD로 hIL-2에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 약 5.00 x 10-11M 이상의 KD로 hIL-2에 결합할 수 있다. 이들 양은 제한인 것으로 의미되지 않고, 언급된 값들 사이의 증분이 본 개시내용의 부분으로서 구체적으로 예상된다. 일부 실시형태에서, 항체는 표 3에 제시된 바와 같은 항체의 KD 와 대략적으로 동일한 k d 로 hIL-2에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체는 약 4.53 x 10-4s-1 이상의 k d 로 hIL-2에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항체는 약 3 x 10-4s-1 이상의 k d 로 hIL-2에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 약 1 x 10-4s-1 이상의 k d 로 hIL-2에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 약 9 x 10-5s-1 이상의 k d 로 hIL-2에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 약 7 x 10-5s-1 이상의 k d 로 hIL-2에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 약 5.00 x 10-5s-1 이상의 k d 로 hIL-2에 결합할 수 있다. 이들 양은 제한인 것으로 의미되지 않고, 언급된 값들 사이의 증분이 본 개시내용의 부분으로서 구체적으로 예상된다. 일부 실시형태에서, 항체는 표 3에 제시된 바와 같은 항체의 k d 와 대략적으로 동일한 k d 로 hIL-2에 결합할 수 있다.
경쟁 결합 검정이 수행될 수 있는데, 여기서 표적 항원에 대한 항체의 결합을 그 표적의 또 다른 리간드, 예컨대 표적에 달리 결합하는 또 다른 항체 또는 가용성 수용체에 의한 표적의 결합과 비교한다. 50% 저해가 일어나는 농도가 Ki로 알려져 있다. 이상적인 조건 하에서, Ki는 KD에 동일하다. Ki 값은 KD보다 낮지는 않을 것이어서, Ki의 측정치는 KD에 대한 상한을 제공하도록 편리하게 치환될 수 있다.
상기 정의 이후에, 상이한 분자 상호작용과 연관된 결합 친화도, 예를 들어, 주어진 항원에 대한 상이한 항체의 결합 친화도의 비교는 개별 항체/항원 복합체에 대한 KD 값을 비교함으로써 비교될 수 있다. 유사하게, 상호작용의 특이성은 관심 상호작용, 예를 들어, 항체와 항원 간의 특이적 상호작용에 대한 KD 값을 결정하고, 비관심 상호작용, 예를 들어, IL-2에 결합하지 않는다고 공지된 대조군 항체와 비교함으로써 평가될 수 있다.
이의 표적에 특이적으로 결합하는 항체는 높은 친화도를 갖는, 즉 상기에 논의된 바와 같이 저 KD를 나타내는 이의 표적에 결합할 수 있고, 더 낮은 친화도로 다른, 비-표적 분자에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항체는 1 x 10-6M 이상, 일부 실시형태에서, 1 x 10-5M 이상, 일부 실시형태에서, 1 x 10-4M 이상, 일부 실시형태에서, 1 x 10-3M 이상, 일부 실시형태에서, 1 x 10-2M 이상의 KD로 비-표적 분자에 결합할 수 있다. 본 개시내용의 항체는 일부 실시형태에서 또 다른 비-IL-2 분자에 대한 결합에 대한 이의 친화도보다 적어도 2-배, 10-배, 50-배, 100-배 200-배, 500-배, 1,000-배 또는 10,000-배 이상인 친화도로 이의 표적에 결합할 수 있다. 이들 양은 제한인 것으로 의미되지 않고, 언급된 값들 사이의 증분이 본 개시내용의 부분으로서 구체적으로 예상된다.
항체:IL-2 "복합체"는 이 용어가 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, IL-2 및 적어도 하나의 IL-2 사이토카인 분자에 특이적으로 결합하는 본 개시내용의 적어도 하나의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 복합체를 지칭한다. 복합체는 공유, 비-공유, 또는 임의의 다른 힘에 의해서 회합된 항체 및 IL-2 분자를 포함한다. 바람직하게는, 항체 및 IL-2는 복합체가 투여된 후에도 복합체로서 회합되어 유지될 수 있다. 항체 및 IL-2는 다른 변수 중에서, 이들 간의 결합 상호작용에 대한 KD 값을 기초로 복합체를 형성할 것이라는 것이 이해된다.
"숙주 세포"는 폴리뉴클레오타이드 삽입물의 혼입을 위해서 벡터(들)에 대한 수여자일 수 있거나 수여자인 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 그 자손은 자연, 우연, 또는 의도 돌연변이로 인해서 본래 모 세포와 완전히 동일할 필요는 없을 수 있다(모폴로지 또는 게놈 DNA 보체에서). 숙주 세포는 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드로 생체내에서 형질주입 및/또는 형질전환된 세포를 포함한다.
관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, 용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. "Fc 영역"은 네이티브 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 위치 Cys226에서의 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230로부터 이의 카복시-말단까지 신장되는 것으로 정의된다. Fc 영역에서의 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]에 기술된 바와 같은 EU 지침의 것이다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인, CH2 및 CH3을 포함한다. 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, Fc 영역은 이량체 또는 단량체 형태로 존재할 수 있다.
"기능성 Fc 영역"은 네이티브 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 효과기 기능을 갖는다. 예시적인 "효과기 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성; 식균작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체)의 하향-조절 등을 포함한다. 이러한 효과기 기능은 일반적으로 결합 도메인(예를 들어, 항체 가변 도메인 또는 이의 항원-결합 부분)과 조합될 Fc 영역을 필요로 하고, 이러한 항체 효과기 기능을 평가하기 위해서 관련 기술 분야에 공지된 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
"네이티브 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해서 네이티브 서열 Fc 영역의 것과 상이하지만, 네이티브 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 효과기 기능을 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체 Fc 영역은 네이티브 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 비교하여 네이티브 서열 Fc 영역에서 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역에서 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 일부 실시형태에서, 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본 명세서에서 변이체 Fc 영역은 일부 실시형태에서 네이티브 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 적어도 약 80% 서열 동일성, 일부 실시형태에서, 이와 적어도 약 90% 서열 동일성, 일부 실시형태에서, 이와 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 서열 동일성을 가질 것이다. 이들 양은 제한인 것으로 의미되지 않고, 언급된 백분율들 사이의 증분이 본 개시내용의 부분으로서 구체적으로 예상된다.
관련 기술 분야에서 사용되는 바와 같이, "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술한다. 일부 실시형태에서, FcR은 네이티브 서열 인간 FcR이다. 또한, 일부 실시형태에서, FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하고, 대립유전자 변이체 및 대안적으로 이들 수용체의 스플라이싱된 형태를 비롯한, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 하위부류를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("저해 수용체")를 포함하는데, 이들은 이들의 세포질 도메인이 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. FcR은 문헌[Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34]; 및 [de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41]에 검토되어 있다. "FcR"은 또한 신생아(neonatal) 수용체, FcRn를 포함하는데, 이것은 태아로의 모계 IgG의 전달을 담당한다(Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; 및 Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 제1 항체는 제1 항체의 존재가 항원(또는 제2 항체의 에피토프)에 대한 제2 항체의 결합을 검출 가능하게 감소시킬 때 항원(또는 에피토프)에 대한 결합에 대해서 제2 항체와 경쟁한다고 지칭된다. 항원(또는 이의 에피토프)에 대한 제1 항체의 결합이 또한 제2 항체의 존재 하에서 검출 가능하게 감소될 때, 그 역이 사실일 수 있지만, 필수적인 것은 아니다. 그러나, 각각의 항체가 공통 항원에 대한 다른 항체의 결합을 동일한 정도이든 상이한 정도이든 간에 검출 가능하게 저해하는 경우, 항체는 항원의 결합에 대해서 서로와 "교차-경쟁"한다고 지칭된다. 경쟁 항체 및 교차-경쟁 항체 둘 모두가 본 개시내용에 포함된다. 이러한 경쟁 또는 교차-경쟁이 발생하는 기전(예를 들어, 입체 장애, 컨포메이션 변화 또는 이의 공통 에피토프 또는 부분(들)에 대한 결합)과 무관하게, 통상의 기술자는 이러한 경쟁 및/또는 교차-경쟁 항체가 본 명세서에 개시된 방법에 포함되고, 유용할 수 있다는 것을 본 명세서에 제공된 교시를 기반으로 인식할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료"는 이로운 또는 목적하는 임상 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 개시내용의 목적을 위해서, 이로운 또는 목적하는 임상 결과는 하기 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다: 생존율 개선(사망률 감소), 염증 감소, 조직 섬유증의 양 감소, 질환 병변의 외관 개선, 병소 부위에 대한 병리학적 병변의 제한, 질환으로부터의 손상 정도 감소, 질환의 기간 감소, 및/또는 질환과 관련된 증상의 수, 정도 또는 기간의 감소. 이 용어는 질환의 증상, 합병증 또는 질환의 생화학적 표지의 발병을 예방 또는 지연시켜서 증상을 완화시키거나 또는 질환, 병태 또는 장애의 추가 발생을 정지 또는 저해하기 위한 본 개시내용의 화합물 또는 작용제의 투여를 포함한다. 치료는 예방적(질환의 발병을 예방 또는 지연시키거나, 또는 이의 임상 또는 준임상 증상의 표현을 예방하는 것)이거나 또는 질환의 표현 이후의 증상의 치료적 억제 또는 완화일 수 있다.
"개선시키는"은 IL-2 항체를 투여하지 않았을 때와 비교할 때 하나 이상의 증상의 경감 또는 향상을 의미한다. "개선시키는"은 또한 증상의 기간의 단축 또는 감소를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 약제학적 조성물의 "유효 투여량" 또는 "유효량"은 임의의 하나 이상의 이로운 또는 목적하는 결과를 얻기에 충분한 양이다. 보다 구체적인 양상에서, 유효량은 질환 또는 감염의 증상을 예방, 완화 또는 개선시키고/거나 치료될 대상체의 생존을 연장시킨다. 예방적 사용의 경우, 이로운 또는 목적하는 결과는 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 특징적 증상을 비롯한, 질환, 이의 합병증 및 질환의 발생 동안 나타나는 중간체 병리학적 표현형의 위험을 제거 또는 감소시키기거나, 중증도를 경감시키거나, 또는 발병을 지연시키는 것을 포함한다. 치료적 사용의 경우, 이로운 또는 목적하는 결과는 IL-2 매개 질환, 장애 또는 병태, 또는 IL-2 결핍 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상의 감소, 질환을 치료하는 데 필요한 다른 의약의 용량 감소, 또 다른 의약의 효과 향상, 및/또는 환자의 질환의 진행의 지연과 같은 임상적 결과를 포함한다. 유효 투여량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해서, 약물, 화합물 또는 약제학적 조성물의 유효 투여량은 예방적 또는 치료적 치료를 직접 또는 간접적으로 성취하기에 충분한 양이다. 임상 맥락에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물, 또는 약제학적 조성물의 유효 투여량은 또 다른 약물, 화합물, 또는 약제학적 조성물과 함께 달성될 수 있거나, 달성될 수 없다. 따라서, "유효 투여량"은 1종 이상의 치료제를 투여하는 맥락에서 고려될 수 있고, 단일 작용제는 1종 이상의 다른 작용제와 함께, 목적하는 결과가 달성될 수 있거나 달성되는 경우 유효량으로 제공된 것으로 간주될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "벡터"는 숙주 세포에서 1종 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달, 및 일부 실시형태에서는 발현시킬 수 있는 작제물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드(naked) DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제(condensing agent)와 연관된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜 중에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵 세포, 예컨대 생산자 세포를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "발현 대조군 서열"은 핵산의 전사를 안내하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 대조군 서열은 프로모터, 예컨대 구성적 또는 유도성 프로모터, 또는 인핸서일 수 있다. 발현 대조군 서열은 전사될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용 가능한 담체" 또는 "약제학적 허용 가능한 부형제"는 활성 성분과 조합되는 경우, 성분이 생물 활성을 보유하는 것을 허용하고, 대상체의 면역계와 비-반응성인 임의의 재료를 포함한다. 예는 표준 약제학적 담체, 예컨대 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀션, 예컨대 오일/물 에멀션, 및 다양한 유형의 습윤제 중 임의의 것을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 에어로졸 또는 비경구 투여를 위한 희석제는 인산염 완충 염수(PBS) 또는 생리 식염수(0.9%)이다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 종래의 방법(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990]; 및 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000] 참고)에 의해서 제형화된다.
본 명세서에서 값 또는 파라미터에서 "약"에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 관한 실시형태를 포함한다(그리고 기술한다). 예를 들어, "약 X"를 지칭하는 설명은 "X"의 설명을 포함한다. 수치 범위는 그 범위를 한정하는 수치를 포함한다.
본 개시내용의 넓은 범주를 언급하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 구체적인 실시형태에서 언급된 수치 값은 가능한 정확하게 보고된다. 그러나, 임의의 수치 값은 본질적으로 이의 각각의 시험 측정치에서 발견되는 표준 편차로부터 필수적으로 유래하는 특정 오차를 포함한다. 더욱이, 본 명세서에 개시된 모든 범위는 그 내에 포함된 임의의 및 모든 하위범위를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, "1 내지 10"의 언급된 범위는 1의 최소값과 10의 최대값(이들 값 포함) 사이의 임의의 및 모든 하위범위; 즉 1 이상의 최소값에서 시작하는 모든 하위범위, 예를 들어 1 내지 6.1, 및 10 이하의 최대값으로 끝나는 모든 하위 범위, 예를 들어, 5.5 내지 10을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 속한 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 일반적으로 의미되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 정의를 비롯하여 본 명세서가 우세할 것이다. 본 명세서 및 청구범위 전체에서, 단어 "포함하는", 또는 변형, 예컨대 "포함하다" 또는 "포함하는"은 언급된 정수 또는 정수의 군을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수의 군을 배제하지 않는 것을 시사하는 것으로 이해될 것이다. 맥락에 의해서 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함해야 하고, 복수 용어는 단수를 포함해야 한다. 용어 "예를 들면" 또는 "예를 들어" 이후의 임의의 예(들)는 철저하거나 제한인 것으로 의미되지 않는다.
실시형태가 본 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 기술되는 경우, "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"과 관련하여 기술된 다른 유사한 실시형태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.
본 개시내용의 양상 또는 실시형태가 마쿠시 군 또는 대안의 다른 분류와 관련하여 기술되는 경우, 본 개시내용은 전체로서 열거된 전체 군 및 그 군 개개의 각각의 구성원 및 주요 군의 모든 가능한 하위군뿐만 아니라 그 군 구성원의 하나 이상이 존재하지 않는 주요 군을 포함한다. 본 개시내용은 또한 청구된 개시내용에서 군 구성원 중 임의의 것의 하나 이상을 명시적으로 제외하는 것을 예견한다.
예시적인 방법 및 재료가 본 명세서에 기술되어 있지만, 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시 또는 시험에서 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법 및 예는 단지 예시이며, 제한인 것으로 의도되지 않는다.
개요
인터류킨-2(IL-2)은 T 세포 및 자연 살해(NK) 세포를 비롯한, 매우 다양한 백혈구에 대한 성장 인자로서 기능하는 제I형 사이토카인인, 4-헬릭스 번들이다. AIDS부터 암의 범위의 다양한 면역 장애를 위한 치료 표적으로서 IL-2의 연구에서 상당한 노력이 있었다. 재조합 인간 IL-2(프로류킨(Proleukin)(등록상표))가 전이성 흑색종 및 신장 세포 암종을 치료하기 위해서 고용량으로 사용된다. 그러나, 환자의 적은 하위세트(5 내지 10%) 만이 이러한 치료로부터 장기간 생존을 경험한다. 독감-유사 증상으로부터 생명-위협 혈관 누출 증후군 및 폐 부종까지의 범위의, 고용량 IL-2 요법의 역효과가 이의 사용을 상당히 제한하여 왔다. 중요하게는, IL-2 치료는 예측 가능하지 않은 생물 효과를 갖는다.
IL-2는 3개의 쇄 CD25(IL-2Rα), CD122(IL-2Rβ), 공통 감마 쇄(γc,)로 구성된 복합체 수용체에 대한 결합에 의해서 이의 효과를 매개하여, 그 수용체는 IL-2Rαβγ라 지칭된다. 3개의 쇄는 최고 친화도를 나타내는 수용체 삼량체와 상이하게 발현된다. 개별적으로, 4차 복합체에서 3개의 수용체 쇄 각각은 낮은 친화도로 hIL-2 에 결합하고, hIL-2Rα가 가장 강한 상대적인 친화도(KD 약 10nM)를 갖는다. hIL-2Rα의 발현은 T 세포에 대해서 hIL-2의 온-레이트를 증가시키고, 3개의 수용체는 KD 약 10pM로 hIL-2에 협력하여 결합한다. IL-2Rα에 의한 포획 시에, IL-2는 IL-2Rβ에 제시되고, 그 다음 가능 하게는 미리-형성된 수용체 이량체에서는 γc에 제시되어 4차 신호전달 복합체를 형성한다. hIL-2 단독은 낮은 친화도(KD 약 150 내지 300nM)로 hIL-2Rβ에 결합하는 반면, hIL-2/hIL-2Rα 복합체는 더 높은 친화도(KD 약 60nM)로 hIL-2Rβ에 결합하지만, 4차 수용체 복합체에서 IL-2Rα와 IL-2Rβ 간의 직접적인 접촉은 존재하지 않는다. 최근 연구는 야생형 lL-2가 IL-2Rα와 관련된 높은 친화도 형태를 나타내는 구조적으로-변경된 컨포메이션으로 유도된 "휴지(quiescent)" 형태로 존재한다는 것을 시사한다.
T 효과기 세포(Teff) 또는 T 조절 세포(Treg)를 선택적으로 표적화하는 IL-2의 능력을 변형시킴으로써 이의 치료 가능성을 개선시키도록 IL-2을 조작 또는 변형시키려는 시도가 있어왔다. 흥미롭게도, 보다 효과적이고 지향성인 IL-2에 대한 다수의 접근법이 존재하여 왔다. 인간과 직접적으로 유사하지 않은 마우스 모델에서, 보이만(Boyman) 및 동료들은 일부 상황에서, 래트 항-마우스 IL-2 mAb(JES6-1)가 야생형 IL-2과 함께 복합체를 형성할 수 있고, TREG 집단을 우선적으로 향상시키는 데 사용될 수 있다는 것을 입증하였다(Boyman et al., 2006, Science 311:1924-1927; 및 국제 특허 공개 제WO 2007/095643호). 이러한 효과에 대한 기전적인 근본이 설명되지 않지만, 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 아마도, 특정 항체와의 복합체의 IL-2는 개별 TREG 또는 TEFF 세포 하위세트의 선택적인 확장을 유발하는 차별적인 신호를 선택적으로 촉발하는 컨포메이션으로 "고정"된다. 또한, 몇몇 노력은 삼분자 IL-2R 복합체 CD25에 대한 IL-2 결합을 증가시킴으로써 CD25+ T 세포의 활성화를 향상시키고, CD25-NK 세포의 활성화를 최소화하는 IL-2 돌연변이 단백질을 개발하는 것에 초점을 맞춰왔다. 이와 관련하여, IL-2Rβγc에 대해서 상당히 더 낮은 친화도를 갖는 돌연변이 IL-2가 바이엘(Bayer)에 의해서 제조되었으며, 이러한 변이체 IL-2로의 치료는 NK 또는 기억 CD8+ T 세포를 활성화시킬 수 없다고 예상된다. 그러나, 상기에 기술된 IL-2 돌연변이 및 IL-2/항-IL-2 항체 복합체 접근법 둘 모두는 염증성 T 세포 반응 동안 생성될 내인성 야생형 IL-2를 변경시키는 약물의 잠재적은 무능력을 고려하지 않는다. 더욱이, 내인성 IL-2를 유도하는 IL-2 변이체로의 임의의 치료(입증된 피드백 기전)는 생체내에서 야생형 IL-2 효과를 유발할 수 있고, 이는 시험관내에서 관찰될 수 없다.
따라서, IL-2는 효과기 T 세포(TEFF) 및 NK 기능을 향상시키는 이의 능력으로 인해서 면역 자극제로서 본래 개발되었지만, 현재 IL-2의 1차 기능은 면역력의 활성화가 아니라, 면역 반응을 저해하고 자가면역 질환을 예방하는 기능을 하는, TREG의 생성 및 생존이라고 여겨진다. IL-2가 TREG 세포에 의해서 매개되는 말초 면역 관용(peripheral immune tolerance)에서 중요한 역할을 한다는 것이 IL-2 및 IL-2 수용체(IL-2R)-결핍 마우스를 비롯한, 동물 모델을 사용하여 상당히 이해되었다. 연구는, 저용량 IL-2 요법이 고친화도 IL-2R의 구성적 발현으로 인해서 TREG를 우선적으로 활성화시킨다는 것을 보여주었다. 보다 구체적으로, 다수의 동물 연구는, TREG가 GVHD 자가면역력을 억제할 수 있다는 것을 입증하였다. 추가로, 이러한 잠재적인 억제 역할은 최근의 2가지 연구로 인간에서 입증되었는데, 하나는 GVHD에서이며, 나머지는 자가면역 혈관염에서이고, 여기서 단기간 저용량 요법은 일부 개인에서 질환의 개선으로 이어졌다. 따라서, 면역관용(tolerogenic) 대 효과기 면역 반응을 선택적으로 활성화시키는 IL-2-기반 치료제, 즉 TREG: TEFF 균형을 TREG로 이동시켜서, 매우 다양한 질환을 치료하도록 설계된 요법에 대한 오래된 요구가 존재한다. 본 개시내용은 이러한 요구를 충족시킨다.
IL-2 항체
본 발명은 IL-2에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이며, 즉 이것은 IL-2에 결합하지만, 이것은 다른 분자에 검출 가능하게 결합하지 않거나, 또는 더 낮은 친화도로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간 IL-2에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체는 hIL-2의 헬릭스 A 및 C, 및 B-C 루프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체는 hIL-2의 헬릭스 A에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체는 hIL-2의 헬릭스 C에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체는 hIL-2의 헬릭스 A 및 C에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체는 hIL-2의 B-C 루프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 13, 14, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 및 134의 아미노산 서열을 포함하는 항체와 인간 IL-2(hIL-2)에 대한 결합에 대해서 경쟁하거나, 또는 이것과 동일한, hIL-2의 에피토프에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간 IL-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하고, IL-2Rα에 대한 hIL-2의 결합 친화도를 약 1배 내지 약 199배 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 항체는 IL-2Rα에 대한 hIL-2의 결합 친화도를 약 10배 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 항체는 IL-2Rα에 대한 hIL-2의 결합 친화도를 약 2, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 또는 175배 감소시킨다.
일부 실시형태에서, IL-2 항체는 IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 IL-2 결합을 감소시키고, 조절 T(Treg) 세포의 활성을 저해하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, IL-2 항체는 IL-2Rβ에 대한 IL-2 결합을 차단하고, IL-2Rα에 대한 hIL-2 결합의 친화도를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, IL-2 항체는 IL-2Rα에 대한 IL-2 결합을 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 99% 감소시킨다. 일부 실시형태에서, IL-2 항체는 IL-2Rβ에 대한 IL-2 결합을 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 99% 감소시킨다. 일부 실시형태에서, IL-2 항체는 IL-2Rβ에 대한 IL-2 결합을 완전히 차단한다. 특히, 본 개시내용은 IL-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 추가로 아이소타입 대조군 항체와 비교할 때 이것이 Treg의 증식 세포를 저해하거나 Treg 증식을 증가시키는 것보다 더 많이 비-Treg 세포(효과기 CD8+, 비-Treg CD4+ 및 NK 세포 포함)의 증식을 저해하거나 또는 Treg 세포 대 비-Treg 세포의 비율을 증가시키거나 또는 Treg 마커를 유지시키거나 또는 이들의 조합인 항체에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 항체는, 상기 항체가 Treg의 증식을 저해하는 것보다 적어도 2-배 초과로 CD8+, 비-Treg CD4+ 또는 NK 세포의 증식을 저해한다. 일부 실시형태에서, 항체는, 상기 항체가 Treg의 증식을 저해하는 것보다 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20-배를 초과하게 CD8+, 비-Treg CD4+ 또는 NK 세포의 증식을 저해한다. 일부 실시형태에서, 항체는 IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 IL-2 결합을 감소시키고, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 배양물 또는 재구성 검정에서 T 조절 세포(Treg) 대 CD8+, 비-Treg CD4+ 또는 NK 세포의 비율을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 이 비율은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20-배 또는 그 초과만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 항체는 Treg:CD8+ 세포 비율을 두(2)배 이상만큼 증가시키고, 증가된 Treg 증식을 반영할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 IL-2가 예를 들어, 시험관내에서 1 nM 미만의 농도로 제한되는 경우, 아이소타입 대조군보다 크게 T 조절 세포(Treg) 증식을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 항체는 CD8+ 세포의 증식을 저해한다. 일부 실시형태에서, 항체는 IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 IL-2 결합을 감소시키고, Treg 세포에서 1종 이상의 FOXP3, CD25 및 Icos의 발현을 유지시킨다. 일부 실시형태에서, 항체는 IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 IL-2 결합을 감소시키고, Treg 세포에서 1종 이상의 FOXP3, CD25 및 Icos의 발현을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 IL-2 항체는 이들 특징 중 적어도 하나를 갖고, 일부 실시형태에서, 항체는 이들 특징 중 2개 이상을 갖는다. 일부 실시형태에서, 항체는 이들 특징 전부를 갖는다.
일부 실시형태에서, IL-2에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은, IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 IL-2 결합을 감소시키고, 조절 T(Treg) 세포에서보다 더 높은 정도로 CD8+ T 세포에서 STAT5 포스포릴화를 저해한다. 일부 실시형태에서, IL-2 항체, 또는 항원-결합 부분은 Treg에서의 STAT5 포스포릴화를 50% 초과만큼 유지시킨다. 일부 실시형태에서, IL-2 항체, 또는 항원-결합 부분은 Treg에서의 STAT5 포스포릴화를 60% 초과만큼 유지시킨다. 일부 실시형태에서, IL-2 항체, 또는 항원-결합 부분은 Treg에서의 STAT5 포스포릴화를 70% 초과만큼 유지시킨다. 일부 실시형태에서, IL-2 항체, 또는 항원-결합 부분은 Treg에서의 STAT5 포스포릴화를 80% 초과만큼 유지시킨다. 일부 실시형태에서, IL-2 항체, 또는 항원-결합 부분은 Treg에서의 STAT5 포스포릴화를 90% 초과만큼 유지시킨다. 일부 실시형태에서, 항체는 hIL-2에 특이적으로 결합한다. 이들 양은 제한인 것으로 의미되지 않고, 언급된 백분율들 사이의 증분이 본 개시내용의 부분으로서 구체적으로 예상된다.
본 개시내용은 또한 이러한 항체를 포함하는 조성물뿐만 아니라 이러한 항체에 대한, 치료적 용도 및 약제학적 용도를 비롯한, 용도에 관한 것이다.
용어 "IL-2"라는 것은, 단량체이든 또는 이량체, 삼량체 등을 비롯한 다량체이든, 임의의 적합한 유기체로부터 유래될 수 있는, IL-2의 임의의 자연 발생 형태를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "IL-2"는 포유동물 IL-2, 예컨대 인간, 래트 또는 마우스뿐만 아니라, 비-인간 영장류, 소, 양, 또는 돼지 IL-2를 지칭한다. 일부 실시형태에서, IL-2는 인간(예를 들어, 젠뱅크(Genbank) 수탁 번호 P60568 참고) 또는 "hIL-2"이다. IL-2는 또한 시노몰거스(cynomolgus) 원숭이 IL-2(예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 Q29615 참고)일 수 있다. 용어 "IL-2"는 또한 이러한 IL-2 분자의 부분, 변이체, 아이소폼(isoform), 및 다른 유사체를 포함한다. 변이체 IL-2 분자는 일반적으로 자연 발생 IL-2와 동일한 유형의 활성, 예컨대 IL-2 수용체에 결합하는 능력, 및 수용체-매개 활성을 유도하는 능력을 갖는 것을 특징으로 한다.
IL-2는 IL-2의 표면의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 또는 5개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 12개 이상 또는 15개 이상 표면 접근 가능한 잔기를 포함할 수 있다. IL-2가 IL-2의 동종다량체 형태를 포함하는 경우, 표적은 IL-2의 제1 소단위의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 또는 15개 이상의 표면 접근 가능한 잔기, 및 IL-2의 제2 소단위 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 또는 15개 이상의 표면 접근 가능한 잔기를 포함할 수 있다
표적 분자는 IL-2로부터의 공지된 에피토프를 포함할 수 있다. 표적 분자는 hIL-2로부터의 공지된 에피토프를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 hIL-2의 헬릭스 A를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 hIL-2의 헬릭스 C를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 hIL-2의 헬릭스 A 및 C를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 hIL-2의 B-C 루프를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 hIL-2의 헬릭스 A 및 C 및 B-C 루프를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 하기 또는 하기 항체 중 임의의 것으로부터 유래된, 경쇄 서열, 또는 이의 일부, 및 중쇄, 또는 이의 일부를 갖는 항체를 포함하는 조성물(약제학적 조성물 포함) 중 임의의 것을 제공한다: F4.7.6, F4.7.8, F5.1.11, F5.1.9, F4.7.062, F5.11.1.01, F5.1.11.02, F5.1.11.03, F5.1.11.04, F5.1.11.05, F5.1.11.06, F5.1.11.07, F5.1.11.08, F5.1.11.09, F5.1.9.5, 또는 d1C7. 항체 F5.1.11은 항체 F5111, 5.1.11, 5111이라고도 지칭된다. 이러한 용어는 상호 교환 가능하다. 이러한 모 항체의 변이체는 추가 번호를 갖는 이러한 명명법, 예를 들어 항체 F5111.2, 5.1.11.2, F5.1.11.02, 또는 5111.2; 또는 항체 F5.1.11.01, F5111.1, 5.1.11.1, 또는 5111.1에 의해서 지칭될 수 있다.
본 개시내용에서 유용한 항체는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 항체 부분s(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 키메라 항체, 이중특이적 항체, 이종접합체 항체, 단일 쇄 (ScFv), 이의 돌연변이, 항체 부분(예를 들어, 도메인 항체)을 포함하는 융합 단백질, 인간화 항체, 및 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체, 및 공유 변형된 항체를 비롯한, 요구되는 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함할 수 있다. 항체는 뮤린, 래트, 인간, 또는 임의의 다른 기원(키메라 항체 또는 인간화 항체 포함)일 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-2 항체는 단클론성 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간 또는 인간화 항체이다.
본 개시내용의 IL-2 항체는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해서 제조될 수 있다. 인간 항체 및 마우스 항체의 생산에 대한 일반적인 기술은 관련 기술 분야에 공지되어 있고/있거나 본 명세서에 기술되어 있다.
IL-2 항체는 관련 기술 분야에 공지된 방법, 예를 들어, pAKT 및/또는 pSTAT5를 사용하여 식별 또는 특징규명될 수 있고, 이에 의해서 IL-2 활성의 감소, 개선 또는 중화가 검출 및/또는 측정된다. 일부 실시형태에서, IL-2 항체는 후보 작용제(예를 들어, IL-2)를 IL-2 수용체와 함께 인큐베이션시키고, 결합 및 IL-2의 생물학적 활성의 수반된 감소 또는 저해를 모니터링함으로써 식별된다. 일부 실시형태에서, hIL-2 항체는 관련 기술 분야에 공지된 방법, 예를 들어, pAKT 및/또는 pSTAT5를 사용하여 식별 또는 특징규명될 수 있고, 이에 의해서 hIL-2 활성의 감소, 개선 또는 중화가 검출 및/또는 측정된다. 일부 실시형태에서, hIL-2 항체는 후보 작용제(예를 들어, hIL-2)를 hIL-2 수용체와 함께 인큐베이션시키고, 결합 및 hIL-2의 생물학적 활성의 수반된 감소 또는 저해를 모니터링함으로써 식별된다. 결합 검정은 예를 들어, 정제된 IL-2 폴리펩타이드(들)를 사용하거나, 또는 다양한 수용체를 자연적으로 발현하는 세포, 또는 IL-2 수용체를 발현하도록 형질주입된 세포를 사용하여 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, 결합 검정은 경쟁적 결합 검정인데, 여기서 IL-2 결합에 대해서 공지된 IL-2 항체와 경쟁하는 후보자 항체의 능력이 평가된다. 검정은 ELISA 포맷을 비롯한, 다양한 포맷으로 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-2 항체는 후보 항체를 IL-2과 함께 인큐베이션시키고, 결합을 모니터링함으로써 식별된다.
초기 식별 이후에, 후보 IL-2 항체의 활성을 표적화 생물 활성을 시험하도록 공지된, 생물검정에 의해서 추가로 확인 및 재정의할 수 있다. 일부 실시형태에서, 시험관내 세포 검정을 사용하여 후보 IL-2 항체를 추가로 특징규명한다. 예를 들어, 생물검정을 사용하여 후보자를 직접 스크리닝할 수 있다. IL-2 항체를 식별 및 특징규명하는 방법 중 일부가 실시예에 상세하게 기술되어 있다.
IL-2 항체는 관련 기술 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 특징규명될 수 있다. 예를 들어, 한 방법은 그것이 결합하는 에피토프, 또는 "에피토프 맵핑"을 식별하는 것이다. 예를 들어, 문헌[Chapter 11 of Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999]에 기술된 것과 같은, 항체-항원 복합체의 결정 구조의 해석, 경쟁 검정, 유전자 단편 발현 검정, 및 합성 펩타이드-기반 검정을 비롯한, 단백질 상의 에피토프의 위치를 맵핑 및 특징규명하는 관련 기술 분야에 공지된 많은 방법이 존재한다. 추가 예에서, 에피토프 맵핑을 사용하여 IL-2 항체가 결합하는 서열을 결정할 수 있다. 에피토프 맵핑은 다양한 공급원, 예를 들어, 펩스캔 시스템즈(Pepscan Systems)(네덜란드 8219 PH 레일리스타트 에델허트베그 15 소재)로부터 상업적으로 입수 가능하다. 에피토프는 즉, 아미노산의 단일 스트레치를 함유한, 선형 에피토프, 또는 단일 스트레치에 필수적으로 함유되지 않을 수 있는 아미노산의 3-차원 상호작용에 의해서 형성된 컨포메이션 에피토프일 수 있다. 다양한 길이(예를 들어, 적어도 4 내지 6개의 아미노산 길이)의 펩타이드가 단리 또는 합성(예를 들어, 재조합방식으로)될 수 있고, IL-2 항체와 함께 결합 검정을 위해서 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, IL-2 항체가 결합하는 에피토프는 IL-2 서열로부터 유래된 중첩 펩타이드를 사용하고, 항체에 의해서 결합을 결정함으로써 시스템 스크리닝으로 결정될 수 있다. 유전자 단편 발현 검정에 따라서, IL-2를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 무작위로 또는 특이적 유전자 작제에 의해서 단편화될 수 있고, 시험하고자 하는 항체를 사용한 IL-2 의 발현된 단편의 재활성이 결정된다. 유전자 단편은 예를 들어, PCR에 의해서 생산되고, 이어서 방사성 아미노산의 존재 하에서, 시험관내에서 단백질로 번역될 수 있다. 이어서, 방사성 표지된 IL-2 단편에 대한 항체의 결합이 면역침강 및 겔 전기영동에 의해서 결정된다. 특정 에피토프는 또한 파지 입자(파지 라이브러리) 또는 효모(효모 디스플레이)의 표면 상에 디스플레이된, 무작위 펩타이드 서열의 큰 라이브러리를 사용함으로써 식별될 수 있다. 대안적으로, 중첩 펩타이드 단편의 정의된 라이브러리는 단순한 결합 검정으로 시험 항체에 대한 결합에 대해서 시험될 수 있다. 추가 예에서, 항원의 돌연변이유발, 도메인 스와핑 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여 에피토프 결합에 대해서 요구되고/거나 충분하고/거나 필요한 잔기를 식별할 수 있다. 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 실험은 IL-2 폴리펩타이드의 다양한 잔기가 알라닌으로 대체된 돌연변이 IL-2를 사용하여 수행될 수 있다. 돌연변이 IL-2에 대한 항체의 결합을 평가함으로써, 항체 결합에 대한 특정 IL-2 잔기의 중요성을 평가할 수 있다.
IL-2 항체를 특징규명하기 위해서 사용될 수 있는 추가의 또 다른 방법은 동일한 항원, 즉 IL-2 상의 다양한 단편에 결합하는 것으로 공지된 다른 항체와의 경쟁 검정을 사용하여, IL-2 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지를 결정하는 것이다. 경쟁 검정은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
추가로, 제공된 항체/항원 결합 쌍에 대한 에피토프는 다양한 실험 및 컴퓨터 에피토프 맵핑 방법을 사용하여 세부 사항의 상이한 수준에서 정의되고, 특징규명될 수 있다. 실험 방법은 돌연변이유발, X-선 결정학, 핵 자기 공명(NMR) 분광학, 수소/중수소 교환 질량 분석법(H/D-MS) 및 관련 기술 분야에 널리 공지된 다양한 경쟁 결합 방법을 포함한다. 각각의 방법이 독특한 원리에 관련되기 때문에, 에피토프의 설명은 이것이 결정된 방법에 밀접하게 연관된다. 따라서, 주어진 항체/항원 쌍에 대한 에피토프는 사용된 에피토프 맵핑 방법에 따라서 상이하게 정의될 것이다.
이의 가장 상세한 수준에서, Ag와 Ab 간의 상호작용을 위한 에피토프는 Ag-Ab 상호작용에 존재하는 원자 접촉을 한정하는 공간 좌표, 뿐만 아니라 결합 열역학에 대한 이의 상대적인 기여에 관한 정보에 의해서 정의될 수 있다. 덜 상세한 수준에서, 에피토프는 Ag와 Ab 간의 원자 접촉을 한정하는 공간 좌표에 의해서 특징규명될 수 있다. 추가의 덜 상세한 수준에서, 에피토프는, 특정 기준, 예를 들어 Ab 및 Ag에서 원자들(예를 들어, 중원자들, 즉, 비-수소 원자들) 간의 거리에 의해서 정의되는 바와 같이, 그것이 포함하는 아미노산 잔기에 의해서 특징규명될 수 있다. 추가로 덜 상세한 수준에서, 에피토프는 기능을 통해서, 예를 들어 다른 Ab와의 경쟁 결합에 의해서 특징규명될 수 있다. 에피토프는 또한 또 다른 아미노산에 의한 치환이 (예를 들어, 알라닌 스캐닝을 사용하여) Ab와 Ag 간의 상호작용의 특징을 변경시킬 아미노산 잔기를 포함하는 것으로서 보다 일반적으로 정의된다.
사용되는 에피토프 맵핑 방법에 따라서, 에피토프의 설명 및 정의가 세부 사항의 상이한 수준으로 수득된다는 사실로부터, 동일한 Ag 상에서의 상이한 Ab에 대한 에피토프의 비교는 세부 사항의 상이한 수준에서 유사하게 수행될 수 있다.
예를 들어, X-선 구조로부터 결정된, 아미노산 수준으로 기술된 에피토프는, 이것이 동일한 세트의 아미노산 잔기를 함유하면 동일하다고 언급된다. 에피토프는 적어도 하나의 아미노산이 이 에피토프에 의해서 공유되면 중첩된다고 언급된다. 에피토프는 아미노산 잔기가 에피토프에 의해서 공유되지 않으면 별개인(고유한) 것으로 언급된다.
경쟁 결합을 특징으로 하는 에피토프는 상응하는 항체의 결합이 상호 배타적인 경우, 즉 한 항체의 결합이 다른 항체의 동시 또는 연속 결합을 배제하는 경우에 중첩되는 것으로 언급된다. 에피토프는 항원이 상응하는 항체 둘 모두의 결합을 동시에 수용할 수 있는 경우에 별개인(고유한) 것으로 언급된다
용어 "파라토프"의 정의는 상기 "에피토프"의 정의로부터 관점을 반전시킴으로써 유래된다. 따라서, 용어 "파라토프"는 항원에 특이적으로 결합하는 항체 상의 면적 또는 영역, 즉 본 명세서의 다른 곳에서 "접촉"으로서 정의된 바와 같이 항원 (IL-2)과 접촉하는 항체 상의 아미노산 잔기를 지칭한다.
주어진 항체/항원 쌍에 대한 에피토프 및 파라토프는 일상적인 방법에 의해서 식별될 수 있다. 예를 들어, 에피토프의 일반적인 위치는 상이한 단편 또는 변이체 IL-2 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항체의 능력을 평가함으로써 결정할 수 있다. 항체와 접촉하는 IL-2 내의 특이적 아미노산(에피토프), 및 IL-2와 접촉하는 항체 내의 특이적 아미노산(파라토프)은 또한, 일성적인 방법, 예컨대 실시예에 기재된 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 항체와 표적 분자를 조합할 수 있고, 항체/항원 복합체를 결정화할 수 있다. 복합체의 결정 구조를 결정할 수 있고, 이를 사용하여 항체와 이의 표적 사이의 상호작용의 특이적 부위를 식별할 수 있다.
본 개시내용에 따른 항체는 본 명세서에 구체적으로 개시된 본 개시내용의 항체와 동일한 IL-2의 에피토프 또는 도메인에 결합할 수 있다. 예를 들어, 다른 아직 식별되지 않은 본 개시내용의 항체는 IL-2에 대한 이의 대한 결합을 임의의 하기 단클론성 항체: F4.7.6, F4.7.8, F5.1.11, F5.1.9, F4.7.062, F5.11.1.01, F5.1.11.02, F5.1.11.03, F5.1.11.04, F5.1.11.05, F5.1.11.06, F5.1.11.07, F5.1.11.08, F5.1.11.09, F5.1.9.5, 또는 d1C7, 및 이의 변이체의 결합과 비교함으로써; 또는 아직 식별되지 않은 항체의 기능을 본 명세서에 기술된 항체의 기능과 비교함으로써; 및/또는 아직 식별되지 않은 항체의 IL-2 상의 에피토프/접촉 잔기를 본 개시내용의 항체의 것과 비교함으로써 식별할 수 있다. 이러한 식별 목적을 위해 사용될 수 있는 분석 및 검정은 실시예 1 내지 5에 기술된 바와 같은 생물학적 활성 검정에서, 그리고 항체의 결정 구조의 분석에서 관심 항체와 IL-2 수용체 간의 IL-2의 결합에 대한 경쟁을 평가하는 검정을 포함한다.
본 개시내용의 항체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 IL-2에 대한 결합에 대해서 본 개시내용의 또 다른 항체와 교차-경쟁하는 능력을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 항체는 IL-2, 또는 본 명세서에 개시된 항체에 의해 결합되는 IL-2의 적합한 단편 또는 변이체에 대한 결합에 대해서 본 명세서에 기술된 항체와 경쟁 또는 교차-경쟁할 수 있다.
즉, 제1 항체가 제2 항체와 IL-2에 대한 결합에 대해 경쟁하지만, 제2 항체가 IL-2에 먼저 결합한 경우에는 경쟁하지 않는다면, 이는 제2 항체와 경쟁하는 것으로 간주된다(단방향성 경쟁으로도 지칭됨). 항체가 IL-2에 먼저 결합된 것과 관계없이 항체가 또 다른 항체와 경쟁하는 경우에, 항체는 다른 항체와 IL-2에 대한 결합에 대해 "교차 경쟁한다". 이러한 경쟁 또는 교차-경쟁 항체는 표준 결합 검정에서 본 개시내용의 공지된 항체와 경쟁/교차-경쟁하는 이의 능력에 기초하여 식별될 수 있다. 예를 들어, 예를 들어 바이아코어(상표명) 시스템을 사용하는 것에 의한 SPR, ELISA 검정 또는 유세포 분석법을 사용하여 경쟁/교차-경쟁을 입증할 수 있다. 이러한 경쟁/교차-경쟁은 2개의 항체가 동일하거나, 중첩되거나 또는 유사한 에피토프에 결합한다는 것을 시사할 수 있다.
따라서 본 개시내용의 항체는 시험 항체가 본 개시내용의 참조 항체(예를 들어, F4.7.6, F4.7.8, F5.1.11, F5.1.9, F4.7.062, F5.11.1.01, F5.1.11.02, F5.1.11.03, F5.1.11.04, F5.1.11.05, F5.1.11.06, F5.1.11.07, F5.1.11.08, F5.1.11.09, F5.1.9.5, 또는 d1C7)와 표적 분자 상의 결합 부위에 대해 경쟁/교차-경쟁할 수 있는지 여부를 평가하는 결합 검정을 포함하는 방법에 의해 식별될 수 있다. 경쟁적 결합 검정을 수행하는 방법은 본 명세서에 개시되어 있고/있거나 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 이는 항체가 표적 분자에 결합할 수 있는 조건을 사용하여 본 개시내용의 참조 항체를 표적 분자에 결합시키는 것을 포함할 수 있다. 이어서 항체/표적 복합체를 시험/제2 항체에 노출시킬 수 있고, 시험 항체가 항체/표적 복합체로부터 본 개시내용의 참조 항체를 대체할 수 있는 정도를 평가할 수 있다. 대안적인 방법은 항체 결합을 허용하는 조건 하에서 시험 항체를 표적 분자와 접촉시키고, 이어서 그 표적 분자가 결합할 수 있는 본 개시내용의 참조 항체를 첨가하고, 본 개시내용의 참조 항체가 항체/표적 복합체로부터 시험 항체를 대체할 수 있는 정도 또는 표적에 동시에 결합할 수 있는 정도(즉, 비-경쟁 항체)를 평가하는 것을 포함할 수 있다.
표적에 대한 본 개시내용의 참조 항체의 결합을 저해하는 시험 항체의 능력은, 시험 항체가 본 개시내용의 참조 항체와 표적에 대한 결합에 대해 경쟁할 수 있고, 따라서 시험 항체가 본 개시내용의 참조 항체와 IL-2 단백질 상의 동일한 또는 실질적으로 동일한 에피토프 또는 영역에 결합한다는 것을 입증한다. 이러한 방법에서 본 개시내용의 참조 항체와 경쟁하는 것으로 식별된 시험 항체는 또한 본 개시내용의 항체이다. 시험 항체가 본 개시내용의 참조 항체와 동일한 영역에서 IL-2에 결합할 수 있고, 본 개시내용의 참조 항체와 경쟁할 수 있다는 사실은 시험 항체가 본 개시내용의 항체와 동일한 결합 부위에서 리간드로서 작용할 수 있고, 따라서 시험 항체가 참조 항체의 작용을 모방할 수 있고, 따라서 이는 본 개시내용의 항체임을 시사한다. 이는 본 명세서의 다른 곳에서 보다 충분하게 기술된 바와 같은 검정을 사용하여 시험 항체의 존재 하의 IL-2의 활성을 참조 항체의 존재 하의 IL-2의 활성과 그 외에는 동일한 조건 하에 비교하는 것에 의해 확인될 수 있다.
본 개시내용의 참조 항체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체, 예컨대 예컨대 F4.7.6, F4.7.8, F5.1.11, F5.1.9, F4.7.062, F5.11.1.01, F5.1.11.02, F5.1.11.03, F5.1.11.04, F5.1.11.05, F5.1.11.06, F5.1.11.07, F5.1.11.08, F5.1.11.09, F5.1.9.5, 또는 d1C7, 또는 IL-2에 대한 결합 능력을 보유하는 본 명세서에 기술된 바와 같은 이의 임의의 변이체, 또는 부분일 수 있다. 본 개시내용의 항체는 본 명세서에 기술된 참조 항체 또는 IL-2에 대한 결합 능력을 보유하는 본 명세서에 기술된 바와 같은 이의 임의의 변이체 또는 부분과 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
상기 본 명세서의 다른 곳에 언급된 바와 같이, 특이적 결합은 표적이 아닌 분자에 대한 항체의 결합을 참고하여 평가될 수 있다. 이러한 비교는 표적에 결합하는 항체의 능력을 또 다른 분자에 결합하는 항체의 능력과 비교함으로써 이루어질 수 있다. 이러한 비교는 KD 또는 Ki의 평가에서 상기 기술된 바와 같이 이루어질 수 있다. 이러한 비교에 사용된 다른 분자는 표적 분자가 아닌 임의의 분자일 수 있다. 일부 실시형태에서, 다른 분자는 표적 분자와 동일하지 않다. 일부 실시형태에서, 표적 분자는 표적 분자의 부분이 아니다.
특이적 결합을 결정하기 위해 사용된 다른 분자는 표적에 대한 구조 또는 기능에 있어서 관련되지 않을 수 있다. 예를 들어, 다른 분자는 미관련 재료 또는 환경에 수반되는 재료일 수 있다.
특이적 결합을 결정하기 위해 사용된 다른 분자는 표적 분자, 즉 IL-2와 동일한 생체내 경로에 관여하는 또 다른 분자일 수 있다. 본 개시내용의 항체가 이러한 또 다른 분자를 초과하는 IL-2에 대한 특이성을 반드시 갖게 함으로써, 원치않는 생체내 교차-반응성이 회피될 수 있다.
본 개시내용의 항체는 표적 분자와 관련된 일부 분자에 결합하는 능력을 보유할 수 있다.
대안적으로, 본 개시내용의 항체는 특정 표적 분자에 대한 특이성을 가질 수 있다. 예를 들어, 그것은 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나의 표적 분자에 결합할 수 있지만, 본 명세서에 기술된 것과 상이한 표적 분자에는 결합할 수 없거나 또는 유의하게 감소된 친화도로 결합할 수 있다. 예를 들어, 전장 성숙 인간 IL-2를 표적으로서 사용할 수 있지만, 그러한 표적에 결합하는 항체는, 예를 들어 다른 종으로부터의 다른 IL-2 단백질, 예컨대 다른 포유동물 IL-2에는 결합할 수 없거나 또는 보다 낮은 친화도로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간 IL-2 및 마우스 IL-2 둘 모두에 결합한다.
본 개시내용에 따른 폴리펩타이드 또는 항체 "단편" 또는 "부분"은 절두에 의해, 예를 들어 폴리펩타이드의 N 및/또는 C-말단 단부로부터 1개 이상의 아미노산을 제거하는 것에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방식으로 최대 10개, 최대 20개, 최대 30개, 최대 40개 또는 그 초과의 아미노산을 N 및/또는 C 말단으로부터 제거할 수 있다. 부분은 또한, 1개 이상의 내부 결실에 의해 생성될 수 있다.
본 개시내용의 항체는 항체 F4.7.6, F4.7.8, F5.1.11, F5.1.9, F4.7.062, F5.11.1.01, F5.1.11.02, F5.1.11.03, F5.1.11.04, F5.1.11.05, F5.1.11.06, F5.1.11.07, F5.1.11.08, F5.1.11.09, F5.1.9.5, 또는 d1C7 중 어느 하나의 일부, 또는 이의 변이체일 수 있거나, 또는 이를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 항체는 이러한 항체의 항원-결합 부분 또는 이의 변이체일 수 있거나, 또는 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 항체는 이러한 항체의 Fab 부분 또는 이의 변이체일 수 있거나, 또는 이러한 항체 또는 이의 변이체로부터 유래된 단일 쇄 항체일 수 있다.
변이체 항체는 상기 논의된 특이적 서열 및 부분으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 최대 10개, 최대 20개, 또는 최대 30개 또는 그 초과의 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. "결실" 변이체는 개별 아미노산의 결실, 작은 군의 아미노산, 예컨대 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산의 결실, 또는 보다 큰 아미노산 영역의 결실, 예컨대 특이적 아미노산 도메인 또는 다른 특징부의 결실을 포함할 수 있다. "삽입" 변이체는 개별 아미노산의 삽입, 작은 군의 아미노산 군, 예컨대 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 삽입, 또는 보다 큰 아미노산 영역의 삽입, 예컨대 특이적 아미노산 도메인 또는 다른 특징부의 삽입을 포함할 수 있다. "치환" 변이체는 일부 실시형태에서 1개 이상의 아미노산의 동일한 수의 아미노산으로의 대체 및 보존적 아미노산 치환시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 아미노산은 유사한 특성을 갖는 대안적 아미노산, 예를 들어 또 다른 염기성 아미노산, 또 다른 산성 아미노산, 또 다른 중성 아미노산, 또 다른 하전된 아미노산, 또 다른 친수성 아미노산, 또 다른 소수성 아미노산, 또 다른 극성 아미노산, 또 다른 방향족 아미노산 또는 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 적합한 치환기를 선택하기 위해 사용될 수 있는 20개의 주요 아미노산의 일부 특성은 다음과 같다.
치환 변이체는, 항체 분자 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고 그 위치에 상이한 잔기가 삽입된다. 치환 돌연변이유발을 위한 가장 관심 부위는 초가변 도메인을 포함하지만, 프레임워크 변경도 또한 고려된다. 보존적 치환은 표 1에서 "보존적 치환"의 표제 하에 제시된다. 이러한 치환이 생물학적 활성에서 변화를 발생시키는 경우에, 하기에 제시되거나 또는 아미노산 부류와 관련하여 하기에 추가로 기재되는 바와 같은 "예시적인 치환"으로 명명된 보다 실질적인 변화가 도입될 수 있고 생성물이 스크리닝될 수 있다.
Figure pct00004
항체의 생물학적 특성에 있어서의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 β-시트 또는 나선형 컨포메이션으로서, 치환 면적 내의 폴리펩타이드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 것에 대한 이의 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 자연 발생 잔기는 공통 측쇄 특성을 기반으로 하기 군으로 분류된다:
(1) 비-극성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 하전되지 않은 극성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성(음으로 하전됨): Asp, Glu;
(4) 염기성(양으로 하전됨): Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe, His.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것에 의해 이루어진다.
예를 들어, 이루어질 수 있는 치환 중 한 유형은 화학적으로 반응성일 수 있는 항체 내의 1개 이상의 시스테인을 또 다른 잔기, 예컨대 비제한적으로 알라닌 또는 세린으로 변화시키는 것이다. 예를 들어, 비-정규 시스테인의 치환이 존재할 수 있다. 치환은 항체의 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역에서 또는 불변 영역에서 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 시스테인은 정규이다. 또한, 항체의 적절한 컨포메이션 유지에 관여되지 않는 임의의 시스테인 잔기는 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 개선시키고 이상 가교-결합을 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)이 항체에 첨가되어 이의 안정성을 개선시킬 수 있고, 이는 특히 항체가 항체 부분, 예컨대 Fv 부분인 경우이다.
본 개시내용은 또한 IL-2 항체를 생성하고, 선택하고, 제조하는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 항체는 관련 기술 분야에 공지된 절차에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 재조합방식으로 제조될 수 있고, 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 발현될 수 있다. 본 개시내용은 또한 hIL-2 항체를 생성하고, 선택하고, 제조하는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 항체는 관련 기술 분야에 공지된 절차에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 재조합방식으로 제조될 수 있고, 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 발현될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체는 파지 디스플레이 기술에 의해 제조 및 선택될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,565,332호; 제5,580,717호; 제5,733,743호; 및 제6,265,150호; 및 문헌[Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455, 1994] 참고). 대안적으로, 파지 디스플레이 기술(McCafferty et al., Nature 348:552-553, 1990)을 사용하여, 비면역화된 공여자로부터의 먼역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 인간 항체 및 항체 부분을 생산할 수 있다. 이러한 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 사상 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 소수 코트 단백질 유전자 내로 인-프레임으로 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 부분으로서 디스플레이된다. 사상 입자는 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성을 기초로 한 선택은 또한 이러한 특성을 나타내는 항체를 암호화하는 유전자의 선택을 발생시킨다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있고; 검토를 위해 예를 들어 문헌[Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571, 1993]을 참고한다. V-유전자 분절의 몇몇 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991]은 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 다양한 어레이의 항-옥사졸론 항체를 단리하였다. 인간 공여자로부터의 V 유전자 레퍼토리를 작제할 수 있고, 다양한 어레이의 항원(자기-항원 포함)에 대한 항체는 본질적으로, 문헌[Mark et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-597], 또는 [Griffith et al., 1993, EMBO J. 12:725-734]에 기술된 기술에 따라 단리할 수 있다. 자연 면역 반응에서, 항체 유전자는 높은 비율로 돌연변이를 축적한다(체성 초돌연변이). 도입된 변화 중 일부는 보다 높은 친화도를 부여할 것이고, 고-친화도 표면 면역글로불린을 디스플레이하는 B 세포가 후속 항원 챌린지 동안 우선적으로 복제 및 분화된다. "쇄 셔플링"으로 공지된 기술을 사용함으로써 이러한 자연 과정을 모방할 수 있다(Marks et al., 1992,Bio/Technol. 10:779- 783). 이러한 방법에서, 파지 디스플레이에 의해 수득된 "1차" 인간 항체의 친화도는, 비면역화된 공여자로부터 수득된 V 도메인 유전자의 자연 발생 변이체(레퍼토리)의 레퍼토리로 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를 순차적으로 대체함으로써 개선시킬 수 있다. 이러한 기술은 친화도가 pM 내지 nM 범위인 항체 및 항체 부분의 생산을 가능하게 한다. 초대형 파지 항체 레퍼토리("모든 라이브러리의 모체"라고도 공지됨)를 제조하기 위한 전략은 문헌[Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266, 1993]에 기술되어 있다. 유전자 셔플링은 또한 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하는데 사용될 수 있고, 여기서 인간 항체는 출발 설치류 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. "에피토프 각인"으로도 지칭되는 이러한 방법에 따르면, 파지 디스플레이 기술에 의해 수득된 설치류 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자는 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어, 설치류-인간 키메라를 생성한다. 항원에 기초한 선택은 기능적 항원-결합 부위를 복원할 수 있는 인간 가변 도메인의 단리를 발생시키고, 즉 에피토프는 파트너의 선택을 좌우(각인)한다. 남아있는 설치류 V 도메인을 대체하기 위해 과정을 반복하는 경우에, 인간 항체가 수득된다(PCT 공개 제WO 93/06213호 참고). CDR 그래프팅에 의한 설치류 항체의 전통적인 인간화와 달리, 이러한 기술은 설치류 기원의 프레임워크 또는 CDR 잔기가 없는, 완전 인간 항체를 제공한다.
일부 실시형태에서, 항체는 하이브리도마 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 인간을 비롯한 임의의 포유동물 대상체 또는 이로부터의 항체 생산 세포는 인간을 비롯한 포유동물의 하이브리도마 세포주의 생산을 위한 기초로서의 역할을 하도록 조작될 수 있다고 여겨진다. 본 명세서에 추가로 기술된 바와 같이, 숙주 동물 면역법의 경로 및 스케줄은 일반적으로 항체 자극 및 생산에 대해 확립된 통상적인 기술을 따른다. 전형적으로, 본 명세서에 기술된 것을 비롯하여, 임의의 양의 면역원이 숙주 동물에게 복강내로, 근육내로, 경구로, 피하로, 족저내로 및/또는 피내로 접종된다.
하이브리도마는 문헌[Kohler, B. and Milstein, C., 1975, Nature 256:495-497]의, 또는 문헌[Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381, 1982]에 의해 변형된 바와 같은 일반적 체세포 혼성화 기술을 사용하여 림프구 및 불멸화된 골수종 세포로부터 제조될 수 있다. X63-Ag8.653 및 솔크 인스티튜트의 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute, Cell Distribution Center)(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터의 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 입수 가능한 골수종 세포주를 혼성화에 사용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 기술은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 융합원을 사용하거나, 또는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 전기적 수단에 의해 골수종 세포 및 림프성 세포를 융합시키는 것을 포함한다. 융합 후에, 세포를 융합 배지로부터 분리하고, 선택 성장 배지, 예컨대 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘(HAT) 배지 중에서 성장시켜 혼성화되지 않은 모 세포를 제거한다. 혈청이 보충되거나 보충되지 않은 본 명세서에 기술된 임의의 배지가 단클론성 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양하는 데 사용될 수 있다. 세포 융합 기술에 대한 또 다른 대안으로서, EBV 불멸화 B 세포를 본 개시내용의 IL-2 단클론성 항체 생산에 사용할 수 있다. 하이브리도마 또는 다른 불멸화된 B 세포는 확장되고, 서브클로닝되고, 원하는 경우에 상청액은 통상적인 면역검정 절차(예를 들어, 방사성면역검정, 효소 면역검정, 또는 형광 면역검정)에 의해 항-면역원 활성에 대해 검정된다.
항체의 공급원으로서 사용될 수 있는 하이브리도마는 IL-2에 대해 특이적인 단클론성 항체 또는 이의 일부를 생산하는 모 하이브리도마의 모든 유도체, 자손 세포를 포함한다.
이러한 항체를 생산하는 하이브리도마는 공지된 절차를 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 성장시킬 수 있다. 원하는 경우에, 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예컨대 황산암모늄 침전, 겔 전기영동, 투석, 크로마토그래피 및 한외여과에 의해 단클론성 항체를 배양 배지 또는 체액으로부터 단리할 수 있다. 존재하는 경우, 바람직하지 않은 활성은 예를 들어 고체 상에 부착된 면역원으로 이루어진 흡착제 상에 제제를 통과시키고, 목적 항체를 면역원으로부터 용리 또는 방출시킴으로써 제거할 수 있다. 이작용성 작용제 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스터(시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시석신이미드(리신 잔기를 통해서), 글루타르알데하이드, 석신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR(식 중, R 및 R1은 상이한 알킬기임)을 사용하여 숙주 동물을 IL-2 폴리펩타이드, 또는 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 저해제에 접합된 표적 아미노산 서열을 함유하는 부분으로 면역화시켜 항체(예를 들어, 단클론성 항체) 집단을 수득할 수 있다.
원하는 경우, 관심 IL-2 항체(단클론성 또는 다클론성)를 서열결정할 수 있고, 이어서 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현 또는 증식을 위해 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 관심 항체를 암호화하는 서열은 숙주 세포 내의 벡터 내에 유지될 수 있고, 이어서 숙주 세포는 추후의 사용을 위해 확장 및 동결될 수 있다. 세포 배양물 중 재조합 단클론성 항체의 생산은 관련 기술 분야에 공지된 수단에 의해 B 세포로부터 항체 유전자를 클로닝하는 것을 통해 수행될 수 있다(예를 들어 문헌[Tiller et al., 2008, J. Immunol. Methods 329, 112]; 미국 특허 제7,314,622호를 참고).
표 2에 제시된 플라스미드가 문헌[Budapest Treaty with the American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209]에 따른 용어 하에 기탁되어 있다. 플라스미드는 하기 수탁 번호로 배정되어 있다:
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일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 항체를 "인간화"하거나 항체의 친화도 또는 다른 특징을 개선시키기 위한 유전자 조작에 사용될 수 있다. 항체는 또한, 예를 들어 개, 고양이, 영장류, 말 및 소에서의 사용을 위해 맞춤화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 완전 인간 항체는 특이적 인간 면역글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 상업적으로 입수 가능한 마우스를 사용하여 수득될 수 있다. 보다 바람직한(예를 들어, 완전 인간 항체) 또는 보다 강한 면역 반응을 생성하도록 설계된 유전자이식 동물이 또한 인간화 또는 인간 항체의 생성을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술의 예는 아브게닉스, 인크.(Abgenix, Inc.)(미국 캘리포니아주 프리몬트 소재)의 제노마우스(Xenomouse)(상표명) 및 메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.)(미국 뉴저지주 프린스턴 소재)의 HuMAb-마우스(등록상표) 및 TC 마우스(상표명)이다.
먼저 숙주 동물로부터 항체 및 항체 생산 세포를 단리하고, 유전자 서열을 수득하고, 유전자 서열을 사용하여 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포)에서 항체를 재조합방식으로 발현시킴으로써 항체를 재조합방식으로 제조할 수 있다. 사용될 수 있는 또 다른 방법은 식물(예를 들어, 담배) 또는 유전자이식 우유에서 항체 서열을 발현시키는 것이다. 식물 또는 우유에서 항체를 재조합적으로 발현시키는 방법이 개시되어 있다.(예를 들어, 문헌[Peeters, et al. Vaccine 19:2756, 2001; Lonberg, N. and D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65, 1995]; 및 [Pollock, et al., J Immunol Methods 231:147, 1999] 참고). 항체의 유도체, 예를 들어 도메인, 단일 쇄 등을 제조하는 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있다.
또한, 면역검정 및 유세포 분석법 분류 기술, 예컨대 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 IL-2에 특이적인 항체를 단리할 수 있다.
통상적인 절차를 사용하여(예를 들어, 단클론성 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여) 단클론성 항체를 암호화하는 DNA가 용이하게 단리되고 서열결정된다. 일부 실시형태에서, 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서의 역할을 한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터(예컨대, PCT 공개 제WO 87/04462호에 개시된 발현 벡터) 내에 위치시킬 수 있고, 이어서 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질주입시켜, 재조합 숙주 세포에서 단클론성 항체의 합성을 수득한다(예를 들어, PCT 공개 제WO 87/04462호 참고). DNA는 또한, 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환시키거나(Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851, 1984), 또는 비-면역글로불린 폴리펩타이드에 대한 암호 서열의 모두 또는 부분을 면역글로불린 암호 서열에 공유 연결시키는 것에 의해 변형될 수 있다. 그러한 방식으로, 본 명세서의 IL-2 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드 항체"가 제조된다.
항체 부분은 단백질분해 또는 항체의 다른 분해에 의해, 상기 기술된 바와 같은 재조합 방법에 의해(즉, 단일 또는 융합 폴리펩타이드), 또는 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. 항체의 폴리펩타이드, 특히 최대 약 50개의 아미노산의 보다 짧은 폴리펩타이드는 화학적 합성에 의해 편리하게 제조된다. 화학적 합성 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들어, 항체는 고체상 방법을 사용하여 자동화된 폴리펩타이드 합성기에 의해 생산될 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,807,715호; 제4,816,567호; 및 제6,331,415호를 참고한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 본 개시내용의 IL-2 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함한다. 관심 항체를 암호화하는 서열은 숙주 세포 내의 벡터 내에 유지될 수 있고, 이어서 숙주 세포는 추후의 사용을 위해 확장 및 동결될 수 있다. 벡터(발현 벡터 포함) 및 숙주 세포는 본 명세서에 추가로 기술된다.
본 개시내용은 친화도 성숙 실시형태를 포함한다. 예를 들어, 친화도 성숙 항체는 관련 기술 분야에 공지된 절차에 의해 생산될 수 있다(Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783; Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Schier et al., 1995, Gene, 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9; Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896; 및 PCT 공개 제WO2004/058184호).
하기 방법이 항체의 친화도를 조정하고, CDR을 특징규명하는데 사용될 수 있다. 항체의 CDR을 특징규명하고/거나 폴리펩타이드, 예컨대 항체의 결합 친화도를 변경(예컨대, 개선)시키는 하나의 방식은 "라이브러리 스캐닝 돌연변이유발"로 지칭된다. 일반적으로, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발은 다음과 같이 수행한다. CDR 내의 1개 이상의 아미노산 위치가 관련 기술 분야에서 인식되는 방법을 사용하여 2개 이상(예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개)의 아미노산으로 대체된다. 이는 클론의 소형 라이브러리를 생성하고(일부 실시형태에서, 분석되는 모든 아미노산 위치에 대해서 하나), 각각은 2개 이상의 구성원의 복잡성을 갖는다(2개 이상의 아미노산이 모든 위치에서 치환된 경우). 일반적으로, 라이브러리는 또한 네이티브(비치환) 아미노산을 포함하는 클론을 포함한다. 각각의 라이브러리로부터 적은 수의 클론, 예를 들어 약 20 내지 80개의 클론(라이브러리의 복잡성에 좌우됨)을 표적 폴리펩타이드(또는 다른 결합 표적)에 대한 결합 친화도에 대해 스크리닝하고, 결합이 증가되었거나 동일하거나 감소되었거나 또는 결합되지 않은 후보를 식별한다. 결합 친화도를 결정하는 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 결합 친화도는, 예를 들어 약 2-배 또는 그 초과의 결합 친화도의 차이를 검출하는 바이아코어(상표명) 표면 플라즈몬 공명 분석, 키넥사(Kinexa)(등록상표) 바이오센서, 섬광 근접 검정, ELISA, 오리겐(ORIGEN)(등록상표) 면역검정, 형광 켄칭, 형광 전달, 및/또는 효모 디스플레이를 사용하여 결정할 수 있다. 결합 친화도는 또한 적합한 생물검정을 사용하여 스크리닝할 수 있다. 바이아코어(상표명)는 출발 항체가 이미 비교적 높은 친화도, 예를 들어 약 10nM 이하의 KD로 결합하는 경우에 특히 유용하다.
일부 실시형태에서, CDR 내의 모든 아미노산 위치는 관련 기술 분야에서 인식되는 돌연변이유발 방법(일부는 본 원에 기술됨)을 사용하여 모든 20종의 자연 아미노산으로 대체된다(일부 실시형태에서, 한 번에 하나). 이는 클론의 소형 라이브러리를 생성하고(일부 실시형태에서, 분석되는 모든 아미노산 위치에 대해서 하나), 각각은 20개 구성원의 복잡성을 갖는다(모든 20종의 아미노산이 모든 위치에서 치환된 경우). 일부 실시형태에서, CDR 내의 모든 아미노산 위치는 관련 기술 분야에서 인식되는 돌연변이유발 방법을 사용하여 시스테인을 제외한, 모든 20개의 자연 아미노산으로 대체된다(일부 실시형태에서, 한번에 하나).
일부 실시형태에서, 스크리닝될 라이브러리는 2개 이상의 위치에서 치환을 포함하고, 이는 동일한 CDR 내 또는 2개 이상의 CDR 내에 존재할 수 있다. 따라서, 라이브러리는 1개의 CDR 내의 2개 이상의 위치에서 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 2개 이상의 CDR 내의 2개 이상의 위치에서 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR에서 발견되는 3, 4, 5개 또는 그 초과의 위치에서 치환을 포함할 수 있다. 치환은 낮은 중복도의 코돈을 사용하여 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Balint et al., 1993, Gene 137(1):109- 18.]의 표 2를 참고).
CDR은 중쇄 가변 영역(VH) CDR3 및/또는 경쇄 가변 영역(VL) CDR3일 수 있다. CDR은 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및/또는 VL CDR3 중 하나 이상일 수 있다. CDR은 카바트 CDR, 코티아 CDR, 확장된 CDR, AbM CDR, 접촉 CDR, 또는 컨포메이션 CDR일 수 있다.
일부 실시형태에서, 라이브로리는 서열번호 71 및 72에 따라서 제조된다.
개선된 결합을 갖는 후보를 서열결정함으로써, 개선된 친화도("개선된" 치환으로도 불림)를 발생시키는 CDR 치환 돌연변이를 식별할 수 있다. 결합하는 후보를 또한 서열결정함으로써, 결합을 보유하는 CDR 치환을 식별할 수 있다.
다중 라운드의 스크리닝을 수행할 수 있다. 예를 들어, 개선된 결합을 갖는 후보(각각 1개 이상의 CDR의 1개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함함)는 또한 각각의 향상된 CDR 위치(즉, 치환 돌연변이가 향상된 결합을 나타내는 CDR 내의 아미노산 위치)에서 적어도 본래의 아미노산 및 치환된 아미노산을 함유하는 제2 라이브러리를 설계하는데 유용하다. 이러한 라이브러리의 제조, 및 스크리닝 또는 선택은 하기에 추가로 논의된다.
라이브러리 스캐닝 돌연변이유발은 또한 개선된 결합, 동일한 결합, 감소된 결합, 또는 비결합을 갖는 클론의 빈도가 또한 항체-항원 복합체의 안정성에 대한 각각의 아미노산 위치의 중요성에 관한 정보를 제공하는 한, CDR을 특징규명하는 수단을 제공한다. 예를 들어, CDR의 한 위치가 모든 20종의 아미노산으로 변화된 경우에도 결합을 보유한다면, 그 위치는 항원 결합에 대해서 필요하지 않을 수 있는 위치로서 식별된다. 반대로, CDR의 한 위치가 단지 적은 백분율의 치환에서만 결합을 보유한다면, 그 위치는 CDR 기능에 중요한 위치로서 식별된다. 따라서, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발 방법은, 많은 상이한 아미노산(모든 20종의 아미노산 포함)으로 변화될 수 있는 CDR 내의 위치, 및 변화될 수 없거나 소수의 아미노산으로만 변화될 수 있는 CDR 내의 위치에 관한 정보를 생성한다.
개선된 친화도를 갖는 후보는 그 위치에서 개선된 아미노산, 본래 아미노산을 포함하는 제2 라이브러리 중에 조합될 수 있고, 목적하는 스크리닝 또는 선택 방법을 사용하여 목적하거나 허용되는 라이브러리의 복합성에 따라 그러한 위치에서 추가의 치환을 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 원하는 경우에, 인접한 아미노산 위치는 적어도 2개 이상의 아미노산에 대해 무작위화될 수 있다. 인접한 아미노산의 무작위화는 돌연변이체 CDR에 추가의 컨포메이션 유연성을 허용할 수 있고, 이는 결국 보다 많은 수의 돌연변이를 개선시키는 도입을 허용하거나 용이하게 할 수 있다. 라이브러리는 또한 제1 라운드의 스크리닝에서 개선된 친화도를 나타내지 않는 위치에서의 치환을 포함할 수 있다.
제2 라이브러리는 바이아코어, 키넥사(상표명) 바이오센서 분석을 사용한 스크리닝, 및 파지 디스플레이, 효모 디스플레이 및 리보솜 디스플레이를 비롯한 선택에 대해 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법을 사용한 선택을 포함하는, 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 개선된 및/또는 변경된 결합 친화도를 갖는 라이브러리 구성원에 대해 스크리닝되거나 또는 선택된다.
본 개시내용의 IL-2 항체를 발현하기 위해서, 상기에 기술된 임의의 방법을 사용하여 VH 영역 및 VL 영역을 암호화하는 DNA 단편을 먼저 수득할 수 있다. 다양한 변형, 예를 들어 돌연변이, 결실 및/또는 첨가가 또한 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 DNA 서열 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이유발은 표준 방법, 예컨대 PCR-매개 돌연변이유발을 사용하여 수행될 수 있고, 여기서 돌연변이된 뉴클레오타이드는 PCR 프라이머 내로 혼입되어 PCR 생성물이 목적하는 돌연변이 또는 부위-지향된 돌연변이유발을 함유하게 한다.
본 개시내용은 표 7에 제시된 가변 도메인 및 CDR에 대한 변형을 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용은 그의 특성에 유의한 영향을 미치지 않는 기능적으로 동등한 가변 도메인 및 CDR을 포함하는 항체뿐만 아니라 향상 또는 감소된 활성 및/또는 친화도를 갖는 변이체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산 서열은 IL-2에 대해 목적하는 결합 친화도를 갖는 항체를 수득하기 위해 돌연변이될 수 있다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열은 IL-2에 대해 목적하는 결합 친화도를 갖는 항체를 수득하기 위해 돌연변이될 수 있다 변형된 폴리펩타이드의 예는 아미노산 잔기의 보존적 치환, 기능적 활성에 유의하게 유해한 변화를 야기하지 않거나 또는 이의 리간드에 대한 폴리펩타이드의 친화도를 성숙(향상)시키는 아미노산의 1개 이상의 결실 또는 부가, 또는 화학적 유사체의 사용을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드의 길이 범위인 아미노 및/또는 카복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메싸이오닐 잔기를 갖는 항체 또는 에피토프 태그에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 혈액 순환 중 항체의 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩타이드의 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 N- 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.
항체는 또한 예를 들어, 항체의 결합 특성을 변경시키기 위해서, 예를 들어 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인에서 변형될 수 있다. 가변 도메인에서의 변화는 결합 친화도 및/또는 특이성을 변경시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 1개 이하 내지 5개의 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인 내에서 행해진다. 다른 실시형태에서, 1개 이하 내지 3개의 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인 내에서 행해진다. 예를 들어, 돌연변이는 CDR 영역 중 1개 이상에서 IL-2에 대한 항체의 KD가 증가 또는 감소하도록, koff가 증가 또는 감소하도록, 또는 항체의 결합 특이성이 변경되도록 행해질 수 있다. 부위-지향된 돌연변이유발의 기술은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 상기 문헌[Sambrook et al. and Ausubel et al] 참고).
변형 또는 돌연변이는 또한 IL-2 항체의 반감기를 증가시키기 위해 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서 행해질 수 있다(예를 들어, PCT 공개 제WO 00/09560호 참고). 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서의 돌연변이는 또한 항체의 면역원성을 변경시키거나, 또 다른 분자에의 공유 또는 비-공유 결합을 위한 부위를 제공하거나, 또는 보체 고정, FcR 결합 및 항체-의존성 세포-매개 세포독성과 같은 특성을 변경시키기 위해 행해질 수 있다. 본 개시내용에 따라서, 단일 항체는 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역 중 임의의 하나 이상 또는 불변영역에서 돌연변이를 가질 수 있다.
변형은 또한 글리코실화된 폴리펩타이드 및 비글리코실화된 폴리펩타이드, 뿐만 아니라 다른 번역후 변형, 예컨대, 예를 들어 상이한 당으로의 글리코실화, 아세틸화 및 인산화를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 항체는 이의 불변 영역 내의 보존된 위치에서 글리코실화된다(Jefferis and Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). 면역글로불린의 올리고사카라이드 측쇄는 단백질의 기능(Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180) 및 당단백질의 부분들 사이의 분자내 상호작용에 영향을 미치고, 이는 당단백질의 컨포메이션 및 제시된 3차원 표면에 영향을 미칠 수 있다 (상기 문헌[Jefferis and Lund]; [Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416]). 올리고사카라이드는 또한 특정 인식 구조에 기초하여 주어진 당단백질을 특정 분자에 대해서 표적화하는 역할을 할 수 있다. 항체의 글리코실화는 또한 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)에 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다. 특히, 양분성 GlcNAc의 형성을 촉매작용하는 글루코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII)의 테트라사이클린-조절된 발현을 갖는 CHO 세포에 의해 생산된 항체는 개선된 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되어 있다(Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180).
항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 모이어티의 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 부착을 지칭한다. 트라이펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린, 아스파라긴-X-트레오닌 및 아스파라긴-X-시스테인(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)이 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드에서 이들 트라이펩타이드 서열 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결된 글리코실화는 하이드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌에 대한 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나의 부착을 지칭하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신도 사용될 수 있다.
항체에 대한 글리코실화 부위의 부가는, 그것이 상기에 기술된 트라이펩타이드 서열 중 1개 이상을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 성취된다(N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 변경은 또한 본래 항체의 서열에 대한 1개 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 행해질 수 있다(O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
항체의 글리코실화 패턴은 또한 근본적인 뉴클레오타이드 서열을 변경하지 않고 변경될 수 있다. 글리코실화는 주로 항체를 발현하는 데 사용된 숙주 세포에 좌우된다. 잠재적 치료제로서, 재조합 당단백질, 예를 들어 항체의 발현을 위해 사용되는 세포 유형은 거의 네이티브 세포가 아니기 때문에, 항체의 글리코실화 패턴에서의 변화는 예상될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070] 참고).
숙주 세포의 선택에 더하여, 항체의 재조합 생산 동안 글리코실화에 영향을 미치는 인자는 성장 모드, 배지 제형, 배양 밀도, 산소화, pH, 정제 스킴 등을 포함한다. 올리고사카라이드 생산에 수반되는 특정 효소의 도입 또는 과발현을 비롯하여 특정한 숙주 유기체에서 달성되는 글리코실화 패턴을 변경하기 위해서 다양한 방법이 제안되어 왔다(미국 특허 제5,047,335호; 제5,510,261호 및 제5,278,299호). 글리코실화, 또는 특정 유형의 글리코실화는, 예를 들어 엔도글리코시다제 H(Endo H), N-글리코시다제 F, 엔도글리코시다제 F1, 엔도글리코시다제 F2, 엔도글리코시다제 F3을 사용하여 당단백질로부터 효소적으로 제거될 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포는 특정 유형의 폴리사카라이드의 가공에서 결함이 있도록 유전자 조작될 수 있다. 이들 기술 및 유사 기술은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다.
다른 변형 방법은 효소적 수단, 산화적 치환 및 킬레이트화를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 관련 기술 분야에 공지된 커플링 기술을 사용하는 것을 포함한다. 변형은, 예를 들어 면역검정을 위한 표지의 부착을 위해서 사용될 수 있다. 관련 기술 분야의 확립된 절차를 사용하여 변형된 폴리펩타이드가 제조되고, 관련 기술 분야에 공지된 표준 검정을 사용하여 스크리닝될 수 있으며, 그 중 일부가 하기 및 실시예에 기술된다.
일부 실시형태에서, 항체는 인간 Fc 감마 수용체에 대해 증가 또는 감소된 결합 친화도를 갖는 변형된 불변 영역을 포함하거나, 면역학적으로 불활성 또는 부분적으로 불활성, 예를 들어 보체 매개 용해를 촉발시키지 않거나, 항체-의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 자극하지 않거나, 또는 소교세포를 활성화시키지 않거나; 또는 하기 중 어느 하나 이상에서 (비변형된 항체와 비교할 때) 감소된 활성을 갖는다: 보체 매개 용해의 촉발, ADCC 자극, 또는 소교세포 활성화. 불변 영역의 상이한 변형을 사용하여 효과기 기능의 최적 수준 및/또는 조합을 달성할 수 있다(예를 들어, 문헌[Morgan et al., Immunology 86:319-324, 1995]; [Lund et al., J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969, 1996]; [Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184, 2000]; [Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989]; 및 [Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998] 참고). 일부 실시형태에서, 불변 영역은 문헌[Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624]; PCT 출원 제PCT/GB99/01441호; 및/또는 영국 특허 출원 제9809951.8호에 기술된 바와 같이 변형된다.
일부 실시형태에서, 항체 불변 영역은 Fc 감마 수용체 및 보체 및 면역계의 상호작용을 회피하기 위해서 변형될 수 있다. 이러한 항체를 제조하는 기술은 국제 특허 공개 제WO 99/58572호에 기술되어 있다. 예를 들어, 항체가 인간에서 임상 시험 및 치료에 사용되는 경우 면역 반응을 회피하기 위해 불변 영역이 인간 불변 영역과 더 유사하도록 조작될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,997,867호 및 제5,866,692호 참고).
일부 실시형태에서, 불변 영역은 문헌[Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624]; PCT 출원 제PCT/GB99/01441호; 및/또한 영국 특허 출원 제9809951.8호에 기술된 바와 같이 변형된다. 이러한 실시형태에서, Fc는 인간 IgG2 또는 인간 IgG4일 수 있다. Fc는 A330P331에서 S330S331로의 돌연변이를 함유하는 인간 IgG2(IgG2△a)일 수 있고, 여기서 아미노산 잔기는 야생형 IgG2 서열을 참고로 넘버링된다(Eur. J. Immunol.,1999, 29:2613-2624). 일부 실시형태에서, 항체는 하기 돌연변이(Armour et al., 2003, Molecular Immunology 40 585-593): E233F234L235에서 P233V234A235(IgG4△c)를 포함하는 IgG4의 불변 영역을 포함하며, 여기서 넘버링은 야생형 IgG4를 참고로 한다. 추가의 또 다른 실시형태에서, Fc는 인간 IgG4 E233F234L235에서 결실 G236을 갖는 P233V234A235(IgG4△b)이다. 또 다른 실시형태에서, Fc는 S228에서 P228로의 힌지 안정화 돌연변이를 함유하는 임의의 인간 IgG4 Fc (IgG4, IgG4△b 또는 IgG4△c)이다(Aalberse et al., 2002, Immunology 105, 9-19).
일부 실시형태에서, 항체는 하기 돌연변이: A330P331에서 S330S331 (야생형 IgG2 서열에 대한 아미노산 넘버링)을 포함하는 인간 중쇄 IgG2 불변 영역을 포함한다(Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624). 추가의 다른 실시형태에서, 불변 영역은 N-연결된 글리코실화에 대해 비-글리코실화된다. 일부 실시형태에서, 불변 영역은 불변 영역 내의 올리고사카라이드 부착 잔기를 돌연변이시키고/거나 N-글리코실화 인식 서열의 일부인 잔기를 플랭킹시키는 것에 의해 N-연결된 글리코실화에 대해 비글리코실화된다. 예를 들어, N-글리코실화 부위 N297은 예를 들어 A, Q, K, 또는 H로 돌연변이 될 수 있다(문헌[Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989]; 및 [Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998] 참고). 일부 실시형태에서, 불변 영역은 N-연결 글리코실화에 대해 비글리코실화된다. 불변 영역은 효소적으로 (예컨대, 효소 PNGase에 의해 탄수화물을 제거함), 또는 글리코실화 결핍 숙주 세포에서의 발현에 의해 N-연결 글리코실화에 대해 비글리코실화될 수 있다.
다른 항체 변형은 PCT 공개 제WO 99/58572호에 기술된 바와 같이 변형된 항체를 포함한다. 이들 항체는 표적 분자에서 지향된 결합 도메인에 더하여, 인간 면역글로불린 중쇄의 불변 영역 모두 또는 일부에 실질적으로 상동성인 아미노산 서열을 갖는 효과기 도메인을 포함한다. 이들 항체는 유의한 보체 의존적 용해, 또는 표적의 세포-매개 파괴를 촉발하지 않으면서 표적 분자에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 효과기 도메인은 FcRn 및/또는 FcγRIIb에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 전형적으로 2개 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 CH2 도메인으로부터 유래된 키메라 도메인을 기반으로 한다. 이러한 방식으로 변형된 항체는 종래의 항체 요법에 대한 염증성 및 다른 유해 반응을 회피하기 위해 만성 항체 요법에서 사용하기에 특히 적합하다.
본 개시내용은 또한, 추가로 변형될 수 있는 항체 불변 도메인을 제공한다. Fc 영역의 변이체, 예를 들어 아미노산 치환, 삽입 및/또는 부가 및/또는 결실은 효과기 기능을 향상시키거나 저하시키는 것으로 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Presta et al, 2002, Biochem. Soc. Trans. 30:487-490; Strohl, 2009, Curr. Opin. Biotechnol. 20(6):685-691]; 미국 특허 제5,624,821호, 제5,648,260호, 제5,885,573호, 제6,737,056호, 제7,317,091호; PCT 공개 제WO 99/58572호, 제WO 00/42072호, 제WO 04/029207호, 제WO 2006/105338호, 제WO 2008/022152호, 제WO 2008/150494호, 제WO 2010/033736호; 미국 특허 출원 공개 제2004/0132101호, 제2006/0024298호, 제2006/0121032호, 제2006/0235208호, 제2007/0148170호; 문헌[Armour et al., 1999, Eur. J. Immunol. 29(8):2613-2624(감소된 ADCC 및 CDC)]; [Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276(9):6591-6604(감소된 ADCC 및 CDC)]; [Idusogie et al., 2000, J. Immunol. 164(8):4178-4184(증가된 ADCC 및 CDC)]; [Steurer et al., 1995, J. Immunol. 155(3):1165-1174(감소된 ADCC 및 CDC)]; [Idusogie et al., 2001, J. Immunol. 166(4):2571-2575(증가된 ADCC 및 CDC)]; [Lazar et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(11): 4005-4010(증가된 ADCC)]; [Ryan et al., 2007, Mol. Cancer. Ther., 6: 3009-3018(증가된 ADC)]; [Richards et al., 2008, Mol. Cancer Ther. 7(8):2517-2527] 참고).
일부 실시형태에서, 항체는 비변형된 항체와 비교할 때 FcRn에 대한 증가된 결합 친화도 및/또는 증가된 혈청 반감기를 갖는 변형된 불변 영역을 포함한다.
"생식계열화(germlining)"로 공지된 과정에서, VH 서열 및 VL 서열 내의 특정 아미노산은 생식계열 VH 서열 및 VL 서열에서 자연에서 발견되는 것과 매칭되도록 돌연변이될 수 있다. 특히, VH 서열 및 VL 서열 내의 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 항체 투여 시 면역원성의 위험을 감소시키기 위해서 생식계열 서열과 매칭되도록 돌연변이될 수 있다. 인간 VH 및 VL 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열은 관련 기술 분야에 공지되어 있다(예를 들어, "Vbase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스 참고; 또한 문헌[Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798]; 및 [Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836] 참고).
행해질 수 있는 또 다른 유형의 아미노산 치환은 항체 내의 잠재적인 단백질분해 부위를 제거하는 것이다. 이러한 부위는 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역 또는 항체의 불변 영역에서 발생할 수 있다. 시스테인 잔기의 치환 및 단백질분해 부위의 제거는 항체 생성물 내 이종성의 위험을 감소시킬 수 있고, 따라서 이의 동질성을 증가시킬 수 있다. 또 다른 유형의 아미노산 치환은 잔기 중 하나 또는 둘 모두를 변경시킴으로써 잠재적인 탈아미드화 부위를 형성하는 아스파라긴-글리신 쌍을 제거하는 것이다. 또 다른 예에서, 본 개시내용의 IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 중쇄의 C-말단 라이신을 절단할 수 있거나 달리 제거할 수 있다. 본 개시내용의 다양한 실시형태에서, 항체의 중쇄 및 경쇄는 임의로 신호 서열을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 VH 분절 및 VL 분절을 암호화하는 DNA 단편이 수득되면, 이들 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술에 의해서 추가로 조작하여, 예를 들어 가변 도메인 유전자를 전장 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시킬 수 있다. 이들 조작에서, VL- 또는 VH-암호화 DNA 단편은 또 다른 단백질, 예컨대 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 암호화하는 또 다른 DNA 단편에 작동 가능하게 연결된다. 용어 "작동 가능하게 연결된"은 이러한 맥락에서 사용된 바와 같이, 2개의 DNA 단편에 의해 암호화된 아미노산 서열이 인-프레임으로 유지되도록 2개의 DNA 단편이 연결되는 것을 의미하는 것으로 의도된다.
VH 영역을 암호화하는 단리된 DNA는 VH-암호화 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술 분야에 공지되어 있고(예를 들어, 문헌[Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 일부 실시형태에서, 이것은 IgG1 또는 IgG2 불변 영역이다. IgG 불변 영역 서열은 상이한 개체 간에 발생하는 것으로 공지된 다양한 대립유전자 및 동종이형, 예컨대 Gm(1), Gm(2), Gm(3), 및 Gm(17) 중 임의의 것일 수 있다. 이러한 동종이형은 IgG1 불변 영역에서의 자연 발생 아미노산 치환을 나타낸다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우에, VH-암호화 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. CH1 중쇄 불변 영역은 중쇄 유전자 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다.
VL 영역을 암호화하는 단리된 DNA는 VL-암호화 DNA를 경쇄 불변 영역, CL을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결시킴으로써 전장 경쇄 유전자(뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술 분야에 공지되어 있고(예를 들어, 문헌[Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다. 카파 불변 영역은 상이한 개체 간에 발생하는 것으로 공지된 다양한 대립유전자, 예컨대 Inv(1), Inv(2), 및 Inv(3) 중 임의의 것일 수 있다. 람다 불변 영역은 3개의 람다 유전자 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해서, VH- 및 VL-암호화 DNA 단편을 가요성 링커를 암호화하는 또 다른 단편에 작동 가능하게 연결시켜, VH 서열 및 VL 서열이 가요성 링커에 의해 연결된 VL 영역 및 VH 영역을 갖는 인접 단일-쇄 단백질로서 발현될 수 있게 한다(예를 들어, 문헌[Bird et al., 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554] 참고). 다른 서열의 링커가 설계되고 사용되고 있다(상기 문헌[Bird et al., 1988]). 결국, 링커는 추가의 기능, 예컨대 약물의 부착 또는 고체 지지체에의 부착을 위해 변형될 수 있다. 단일 쇄 항체는 단일 VH 및 VL만이 사용되는 경우에는 1가, 2개의 VH 및 VL이 사용되는 경우에는 2가, 또는 2개 초과의 VH 및 VL이 사용되는 경우에는 다가일 수 있다. IL-2 및 또 다른 분자에 특이적으로 결합하는 이중특이적 또는 다가 항체가 생성될 수 있다. 단일 쇄 변이체는 재조합방식으로 또는 합성적으로 생성될 수 있다. scFv의 합성 생성의 경우에, 자동화 합성기가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 생산의 경우, scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 적합한 플라스미드는 진핵세포, 예컨대 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포 또는 원핵세포, 예컨대 이. 콜라이의 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 관심 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드의 결찰과 같은 일상적인 조작에 의해 제조될 수 있다. 생성된 scFv는 관련 기술 분야에 공지된 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 단리될 수 있다.
단일 쇄 항체의 다른 형태, 예컨대 다이아바디가 또한 포함된다. 다이아바디는 VH 및 VL이 단일 폴리펩타이드 쇄 상에서 발현되지만, 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이에서 쌍을 이루는 것을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써 도메인이 또 다른 쇄의 상보 도메인과 쌍을 이루게 하여 2개의 항원 결합 부위를 생성한, 2가의 이중특이적 항체이다(예를 들어, 문헌[Holliger, P., et al., 1993, Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448; 및 [Poljak, R. J., et al., 1994, Structure 2:1121-1123)] 참고).
2개의 공유 결합된 항체를 포함하는 이종접합체 항체가 또한 본 개시내용의 범주에 포함된다. 이러한 항체는 면역계 세포를 원치않는 세포에 대해 표적화하고(미국 특허 번호 4,676,980), HIV 감염을 치료하는데(PCT 공개 제WO 91/00360호 및 제WO 92/200373호; 유럽 특허 제EP 03089호) 사용되어 왔다. 임의의 편리한 가교-결합 방법을 사용하여 이종접합체 항체를 제조할 수 있다. 적합한 가교제 및 기술은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 미국 특허 제4,676,980에호 기술되어 있다.
가교제를 포함시키는 것을 비롯한, 합성 단백질 화학의 공지된 방법을 사용하여 키메라 또는 혼성 항체를 또한 시험관내에서 제조할 수 있다. 예를 들어, 다이설파이드 교환 반응을 사용하거나 싸이오에터 결합을 형성하는 것에 의해서 면역독소를 작제할 수 있다. 이러한 목적을 위한 적합한 시약의 예는 이미노싸이올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트를 포함한다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 항체로부터의 1개 이상의 부분 또는 영역을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 또 다른 폴리펩타이드에 연결된 본 개시내용의 IL-2 항체의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 항체가 제조될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, IL-2 항체의 가변 도메인만이 폴리펩타이드에 연결된다. 또 다른 실시형태에서, IL-2 항체의 VH 도메인은 제1 폴리펩타이드에 연결되는 반면, IL-2 항체의 VL 도메인은 VH 도메인 및 VL 도메인이 서로 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성할 수 있도록 하는 방식으로 제1 폴리펩타이드와 회합된 제2 폴리펩타이드에 연결된다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, VH 도메인은 VH 도메인 및 VL 도메인이 서로 상호작용할 수 있도록 링커에 의해 VL 도메인으로부터 분리된다. 이어서, VH-링커-VL 항체는 관심 폴리펩타이드에 연결된다. 또한, 2개(또는 그 초과의) 단일-쇄 항체가 서로 연결된 융합 항체가 생성될 수 있다. 이는 단일 폴리펩타이드 쇄 상의 2가 또는 다가 항체를 생성하기를 원하거나 또는 이중특이적 항체를 생성하기를 원하는 경우에 유용하다.
일부 실시형태에서, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 72에 제시된 가변 경쇄 영역의 적어도 10개의 인접 아미노산 및/또는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 71에 제시된 가변 중쇄 영역의 적어도 10개의 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩타이드가 제공된다. 다른 실시형태에서, 가변 경쇄 영역의 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개 또는 적어도 약 30개의 인접 아미노산 및/또는 가변 중쇄 영역의 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개 또는 적어도 약 30개의 인접 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩타이드가 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드는 1개 이상의 CDR(들)을 포함한다. 추가의 다른 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드는 VH CDR3 및/또는 VL CDR3을 포함한다. 본 개시내용의 목적을 위해서, 융합 단백질은 1개 이상의 항체, 및 네이티브 분자에서 부착되지 않은 또 다른 아미노산 서열, 예를 들어 또 다른 영역으로부터의 이종 서열 또는 상동 서열을 함유한다. 예시적인 이종 서열은 "태그", 예컨대 FLAG 태그 또는 6His 태그(서열번호 223)를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 태그는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
융합 폴리펩타이드는 관련 기술 분야에 공지된 방법에 의해서, 예를 들어 합성적으로 또는 재조합방식으로 생성될 수 있다. 전형적으로, 본 개시내용의 융합 단백질은 본 명세서에 기술된 재조합 방법을 사용하여 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제조 및 발현시키는 것에 의해 제조되지만, 예를 들어 화학적 합성을 비롯한 관련 기술 분야에 공지된 다른 수단에 의해 제조될 수도 있다.
다른 실시형태에서, 다른 변형된 항체는 IL-2 항체를 암호화하는 핵산 분자를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, "카파 바디"(Ill et al., 1997, Protein Eng. 10:949-57), "미니바디"(Martin et al., 1994, EMBO J. 13:5303-9), "다이아바디"(상기 문헌[Holliger et al.]), 또는 "야누신(Janusin)"(Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659 및 Traunecker et al., 1992, Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52)은 표준 분자 생물학적 기술을 사용하여 본 명세서의 교시에 따라 제조될 수 있다.
예를 들어, 적어도 2종의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 단클론성 항체인, 이중특이적 항체는 본 명세서에 개시된 항체를 사용하여 제조될 수 있다. 이중특이적 항체를 제조하는 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210] 참고). 예를 들어, 이중특이적 항체 또는 항원-결합 부분은 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 부분의 연결에 의해 생산될 수 있다(예를 들어, 문헌[Songsivilai & Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321], 및 [Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553] 참고). 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 상이한 특이성을 갖는 2개의 중쇄를 사용한, 2종의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현을 기반으로 하였다(Millstein and Cuello, 1983,Nature 305, 537-539). 또한, 이중특이적 항체는 "다이아바디" 또는 "야누신"으로서 형성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체는 IL-2의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 실시형태에서, 상기 기술된 변형된 항체는 본 명세서에 제공된 IL-2 항체로부터의 가변 도메인 또는 CDR 영역 중 1개 이상을 사용하여 제조된다.
이중특이적 항체를 제조하기 위한 하나의 접근법에 따라서, 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인(항체-항원 결합 부위)은 면역글로불린 불변 영역 서열에 융합된다. 일부 실시형태에서, 융합은 힌지, CH2 영역 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는, 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 갖는다. 일부 실시형태에서, 경쇄 결합을 위해서 필요한 부위를 함유하는, 제1 중쇄 불변 영역(CH1)이 융합물 중 적어도 하나에 존재한다. 면역글로불린 중쇄 융합물 및 원하는 경우에, 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA는 별개의 발현 벡터 내로 삽입되고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동형질주입된다. 이는, 작제에 사용된 3종의 폴리펩타이드 쇄의 동등하지 않은 비율이 최적의 수율을 제공하는 경우의 실시형태에서 3종의 폴리펩타이드 부분의 상호 비율을 조정하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 적어도 2종의 폴리펩타이드 쇄의 동등한 비율의 발현이 높은 수율을 발생시키거나 또는 그 비율이 특정 유의성을 갖지 않는 경우, 2종 또는 모든 3종의 폴리펩타이드 쇄에 대한 암호 서열을 1개의 발현 벡터 내에 삽입하는 것이 가능하다.
하나의 접근법에서, 이중특이적 항체는 하나의 아암에서 제1 결합 특이성을 갖는 혼성 면역글로불린 중쇄, 및 다른 아암에 혼성 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 하나의 절반부에만 면역글로불린 경쇄가 있는, 이러한 비대칭 구조는 원치않는 면역글로불린 쇄 조합물로부터 목적하는 이중특이적 화합물을 분리하는 것을 용이하게 한다. 이러한 접근법은 PCT 공개 제WO 94/04690호에 기술되어 있다.
본 개시내용은 또한 고체 지지체(예컨대, 바이오틴 또는 아비딘)에 대한 커플링을 용이하게 하는 작용제에 접합된(예를 들어, 연결된) 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 단순화를 위해서, 이들 방법이 본 명세서에 기술된 IL-2 결합 실시형태 중 임의의 것에 적용된다는 것을 이해하면서 일반적으로 항체를 참고할 것이다. 접합은 일반적으로 본 명세서에 기술된 바와 같은 이들 성분을 연결시키는 것을 지칭한다. 연결(일반적으로, 적어도 투여를 위해서 이들 성분을 근접하게 회합시켜 고정시킴)은 임의의 수의 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 작용제 및 항체가 각각 서로 반응할 수 있는 치환기를 갖는 경우, 작용제 및 항체 사이의 직접 반응이 가능하다. 예를 들어, 한쪽의 친핵성기, 예컨대 아미노 또는 설프하이드릴기는, 다른쪽의 카보닐-함유기, 예컨대 무수물 또는 산 할라이드, 또는 우수한 이탈기(예를 들어, 할라이드)를 함유하는 알킬기와 반응할 수 있다.
항체는 많은 상이한 담체에 결합될 수 있다. 담체는 활성 및/또는 불활성일 수 있다. 널리 공지된 담체의 예는 폴리프로필렌, 폴리스타이렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 유리, 천연 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아마이드, 아가로스 및 자철석을 포함한다. 담체의 성질은 본 개시내용의 목적을 위해서 가용성 또는 불용성일 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 항체를 결합시키기 위한 다른 적합한 담체를 알고 있거나, 또는 일상적인 실험을 사용하여 이를 식별할 수 있을 것이다.
본 개시내용의 항체 또는 폴리펩타이드는 표지제, 예컨대 형광 분자, 방사성 분자 또는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 다른 표지에 연결될 수 있다. 표지는 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 이는 일반적으로 신호를 (직접 또는 간접적으로) 제공한다.
본 명세서에 개시된 IL-2 항체의 경쇄 가변 도메인(VL) 및 중쇄 가변 도메인(VH)의 아미노산 서열은 서열 식별 번호에 의해서 표 7에 요약되어 있다.
본 개시내용의 항체는 하기의 둘 모두를 포함할 수 있다:
a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
c) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
d) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
e) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
f) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
g) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
h) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
i) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
j) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
k) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
l) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
m) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
n) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
o) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
p) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL 또는
q) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL.
또 다른 양상에서, 항체는 이들 서열의 변이체를 포함하며, 여기서 이러한 변이체는 보존적 및 비-보존적 치환, 결손 및/또는 부가 둘 모두를 포함할 수 있고, 전형적으로는 본 명세서에 개시된 특정 서열 중 임의의 것과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유하는 펩타이드를 포함한다.
예를 들어, 일 양상에서, 본 개시내용은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32 또는 서열번호 72에 제시된 바와 같은 VL 쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 이들의 변이체를 제공한다. 일 양상에서, 상기 항체 변이체는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32 또는 서열번호 72에 대한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 보존적 또는 비-보존적 치환, 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 부가 및/또는 결실을 포함한다. 추가 양상에서, 상기 변이체는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32 또는 서열번호 72와 적어도 65%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유하며, 여기서 상기 항체 또는 항원-결합 부분은 IL-2에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 항원-결합 부분은 hIL-2에 특이적으로 결합한다.
추가 양상에서, 본 개시내용은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31 또는 서열번호 71에 제시된 바와 같은 VH 쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 항원-결합 부분, 또는 이의 변이체를 제공한다. 일 양상에서, 상기 항체 변이체는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31 또는 서열번호 71에 대한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 보존적 또는 비-보존적 치환, 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 부가 및/또는 결실을 포함한다. 추가 양상에서, 상기 변이체는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31 또는 서열번호 71과 적어도 65%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유하며, 여기서 상기 항체 또는 항원-결합 부분은 IL-2에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 항원-결합 부분은 hIL-2에 특이적으로 결합한다.
본 개시내용의 항체는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31 또는 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함할 수 있으며, 여기서 항체는 중쇄 불변 도메인을 추가로 포함한다.
본 명세서의 다른 곳에서 보다 충분하게 제시되는 바와 같이, 항체 중쇄 불변 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역으로부터 선택될 수 있지만, 일부 실시형태에서, 이것은 IgG1 또는 IgG2 불변 영역이다. IgG 불변 영역 서열은 상이한 개체 간에 발생하는 것으로 공지된 임의의 다양한 대립유전자 및 동종이형, 예컨대 Gm(1), Gm(2), Gm(3), 및 Gm(17)일 수 있다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-암호화 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. CH1 중쇄 불변 영역은 중쇄 유전자 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다.
일 양상에서, 항체는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31 또는 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH로부터 선택된 VH를 포함하고, Fc 효과기 기능을 감소 또는 무효화하는 삼중 돌연변이(hIgG1-3m; 서열번호 2)를 포함하는 IgG1 불변 도메인을 추가로 포함하는 중쇄를 포함할 수 있다. 일 양상에서, 상기 항체 변이체는 전장 중쇄에 대한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 보존적 또는 비-보존적 치환, 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 부가 및/또는 결실을 포함한다. 추가 양상에서, 상기 변이체는 전장 중쇄와 적어도 65%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유하며, 여기서 상기 항체 또는 항원-결합 부분은 IL-2에 특이적으로 결합한다.
본 개시내용의 항체는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32 또는 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있으며, 여기서 항체는 경쇄 불변 도메인을 추가로 포함한다. 본 명세서의 다른 곳에서 보다 충분하게 제시되는 바와 같이, 항체 경쇄 불변 도메인은 Cκ 또는 Cλ 불변 영역, 예를 들어 서열번호 1의 Cλ 불변 영역으로부터 선택될 수 있다. 일 양상에서, 상기 항체 변이체는 전장 경쇄에 대한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 보존적 또는 비-보존적 치환, 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 부가 및/또는 결실을 포함한다. 추가 양상에서, 상기 변이체는 전장 경쇄와 적어도 65%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유하며, 여기서 상기 항체 또는 항원-결합 부분은 IL-2에 특이적으로 결합한다.
본 개시내용의 항체는 표 7에 제시된 VL 또는 VH 아미노산 서열 중 하나의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 항체는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31 또는 서열번호 71을 포함하는 VH로부터, 또는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32 또는 서열번호 72를 포함하는 VL로부터 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 15, 적어도 18, 적어도 20 또는 적어도 25개의 연속 아미노산의 일부를 포함할 수 있다. 이러한 일부는 바람직하게는 상기에 논의된 기능 중 하나 이상, 예컨대 IL-2에 결합하는 능력을 보유할 것이다. 일부 실시형태에서, 이러한 일부는 바람직하게는 상기에 논의된 기능 중 하나 이상, 예컨대 hIL-2에 결합하는 능력을 바람직하게 보유할 것이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체는 카바트, 코티아, 또는 확장된 서열에 따른 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 및/또는 표 7에 나타낸 바와 같은 카바트 및/또는 코티아 아미노산 서열에 따른 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체는 하기 카바트 아미노산 서열에 따른 VH CDR1을 포함한다: 서열번호 73, 서열번호 82, 서열번호 91, 서열번호 100, 서열번호 109, 서열번호 118, 서열번호 127, 서열번호 136, 서열번호 145, 서열번호 154, 서열번호 163, 서열번호 172, 서열번호 181, 서열번호 190, 서열번호 199, 또는 서열번호 208. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체는 하기 코티아 아미노산 서열에 따른 VH CDR1을 포함한다: 서열번호 74, 서열번호 83, 서열번호 92, 서열번호 101, 서열번호 110, 서열번호 119, 서열번호 128, 서열번호 137, 서열번호 146, 서열번호 155, 서열번호 164, 서열번호 173, 서열번호 182, 서열번호 191, 서열번호 200, 또는 서열번호 209. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체는 하기 조합 아미노산 서열에 따른 VH CDR1을 포함한다: 서열번호 75, 서열번호 84, 서열번호 93, 서열번호 102, 서열번호 111, 서열번호 120, 서열번호 129, 서열번호 138, 서열번호 147, 서열번호 156, 서열번호 165, 서열번호 174, 서열번호 183, 서열번호 192, 서열번호 201, 또는 서열번호 210. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체는 하기 카바트 아미노산 서열에 따른 VH CDR2를 포함한다: 서열번호 76, 서열번호 85, 서열번호 94, 서열번호 103, 서열번호 112, 서열번호 121, 서열번호 130, 서열번호 139, 서열번호 148, 서열번호 157, 서열번호 166, 서열번호 175, 서열번호 184, 서열번호 193, 서열번호 202, 또는 서열번호 211. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체는 하기 코티아 아미노산 서열에 따른 VH CDR2를 포함한다: 서열번호 77, 서열번호 86, 서열번호 95, 서열번호 104, 서열번호 113, 서열번호 122, 서열번호 131, 서열번호 140, 서열번호 149, 서열번호 158, 서열번호 167, 서열번호 176, 서열번호 185, 서열번호 194, 서열번호 203, 또는 서열번호 212. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체는 하기 아미노산 서열에 따른 VH CDR3을 포함한다: 서열번호 78, 서열번호 87, 서열번호 96, 서열번호 105, 서열번호 114, 서열번호 123, 서열번호 132, 서열번호 141, 서열번호 150, 서열번호 159, 서열번호 168, 서열번호 177, 서열번호 186, 서열번호 195, 서열번호 204, 또는 서열번호 213. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체는 하기 아미노산 서열에 따른 VL CDR1을 포함한다: 서열번호 79, 서열번호 88, 서열번호 97, 서열번호 106, 서열번호 115, 서열번호 124, 서열번호 133, 서열번호 142, 서열번호 151, 서열번호 160, 서열번호 169, 서열번호 178, 서열번호 187, 서열번호 196, 서열번호 205, 서열번호 214 또는 서열번호 220. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체는 하기 아미노산 서열에 따른 VL CDR2를 포함한다: 서열번호 80, 서열번호 89, 서열번호 98, 서열번호 107, 서열번호 116, 서열번호 125, 서열번호 134, 서열번호 143, 서열번호 152, 서열번호 161, 서열번호 170, 서열번호 179, 서열번호 188, 서열번호 197, 서열번호 206, 서열번호 215, 또는 서열번호 221. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체는 하기 아미노산 서열에 따른 VL CDR3을 포함한다: 서열번호 81, 서열번호 90, 서열번호 99, 서열번호 108, 서열번호 117, 서열번호 126, 서열번호 135, 서열번호 144, 서열번호 153, 서열번호 162, 서열번호 171, 서열번호 180, 서열번호 189, 서열번호 198, 서열번호 207, 서열번호 216, 또는 서열번호 222.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체는 서열번호 217에 따른 VH CDR1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체는 서열번호 218에 따른 VH CDR2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체는 서열번호 219에 따른 VH CDR3을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 항체는 표 7에 나타낸 바와 같은 F4.7.6 VH, F4.7.8 VH, F5.1.11 VH, F5.1.9 VH, F4.7.062 VH, F5.1.11.01 VH, F5.1.11.02 VH, F5.1.11.03 VH, F5.1.11.04 VH, F5.1.11.05 VH, F5.1.11.06 VH, F5.1.11.07 VH, F5.1.11.08 VH, F5.1.11.09 VH, F5.1.9.5 VH, d1C7 VH, F4.7.6 VL, F4.7.8 VL, F5.1.11 VL, F5.1.9 VL, F4.7.062 VL, F5.1.11.01 VL, F5.1.11.02 VL, F5.1.11.03 VL, F5.1.11.04 VL, F5.1.11.05 VL, F5.1.11.06 VL, F5.1.11.07 VL, F5.1.11.08 VL, F5.1.11.09 VL, F5.1.9.5 VL, 또는 d1C7 VL로부터 선택된 항체의 카바트, 코티아, 또는 확장된 서열에 따른 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 및/또는 카바트 및/또는 코티아에 따른 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 항체는 표 7에 나타낸 바와 같은 항체 F5.1.11.02의 카바트, 코티아, 또는 확장된 서열에 따른 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 및/또는 카바트 및/또는 코티아 아미노산 서열에 따른 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다.
이들 VH 서열 또는 VL 서열 중 임의의 것의 적합한 부분 또는 변이체는 IL-2에 결합하는 능력을 보유할 것이다. 일부 실시형태에서, 그것은 바람직하게는 IL-2에 특이적으로 결합하는 능력을 보유할 것이다. 일부 실시형태에서, 그것은 바람직하게는 그것이 유래된 항체와 동일하거나 유사한 IL-2 분자의 에피토프 또는 영역에 특이적으로 결합하는 능력을 보유할 것이다. 일부 실시형태에서, 그것은 바람직하게는 그것이 유래된, 예컨대 특히, hIL-2에 결합하고, IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 hIL-2 결합을 감소시키고, 및 Treg 스퍼링인 항체의 1개 이상의 추가 기능을 보유할 것이다.
일부 실시형태에서, 이들 VH 서열 또는 VL 서열 중 임의의 것의 적합한 부분 또는 변이체는 hIL-2에 결합하는 능력을 보유할 것이다. 일부 실시형태에서, 그것은 바람직하게는 hIL-2에 특이적으로 결합하는 능력을 보유할 것이다. 일부 실시형태에서, 그것은 바람직하게는 그것이 유래된 항체와 동일하거나 유사한 hIL-2 분자의 에피토프 또는 영역에 특이적으로 결합하는 능력을 보유할 것이다. 일부 실시형태에서, 그것은 바람직하게는 그것이 유래된, 예컨대 특히, hIL-2에 결합하고, hIL-2Rα 및 hIL-2Rβ에 대한 hIL-2 결합을 감소시키고, 및 Treg 스퍼링인 항체의 1개 이상의 추가 기능을 보유할 것이다.
본 개시내용의 항체는 본 명세서에 식별된 특이적 항체로부터의 CDR 영역, 예컨대 서열번호 1 내지 32 내로부터의 CDR 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 항체는 바람직하게는 본 명세서에 기술된 바와 같은 IL-2에 결합하는 능력을 보유할 것이다. 일부 실시형태에서, 이러한 항체는 바람직하게는 본 명세서에 기술된 바와 같은 hIL-2에 결합하는 능력을 보유할 것이다. 예를 들어, 본 개시내용의 항체의 CDR 서열은 서열 목록 표(표 7)에 나타내고, 서열번호는 표 6에 나타낸다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 항체는 본 개시내용의 항체 내로부터의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 상기에 열거된 CDR 중 1개 이상에 대한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 보존적 또는 비-보존적 치환, 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 부가 및/또는 결실을 포함하는 항체 변이체를 제공한다. 추가 양상에서, 변이체는 상기에 열거된 CDR 서열의 1개 이상과 적어도 65%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유하며, 여기서 항체 또는 항원-결합 부분은 IL-2에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 부분은 hIL-2에 특이적으로 결합한다.
폴리뉴클레오타이드, 벡터, 및 숙주 세포
본 개시내용은 또는 본 명세서에 기술된 항체 부분 및 변형된 항체, 예컨대 예를 들어 손상된 효과기 기능을 갖는 항체를 비롯한, 항체 중 임의의 것을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 또 다른 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오타이드 중 임의의 것의 제조 방법을 제공한다. 폴리뉴클레오타이드는 관련 기술 분야에 공지된 절차에 의해서 제조 및 발현될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 하기 IL-2 항체 및 이의 항원-결합 부분 중 임의의 것을 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드, 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 약제학적 조성물을 비롯한, 조성물을 제공한다: F4.7.6 VH, F4.7.8 VH, F5.1.11 VH, F5.1.9 VH, F4.7.062 VH, F5.1.11.01 VH, F5.1.11.02 VH, F5.1.11.03 VH, F5.1.11.04 VH, F5.1.11.05 VH, F5.1.11.06 VH, F5.1.11.07 VH, F5.1.11.08 VH, F5.1.11.09 VH, F5.1.9.5 VH, d1C7 VH, F4.7.6 VL, F4.7.8 VL, F5.1.11 VL, F5.1.9 VL, F4.7.062 VL, F5.1.11.01 VL, F5.1.11.02 VL, F5.1.11.03 VL, F5.1.11.04 VL, F5.1.11.05 VL, F5.1.11.06 VL, F5.1.11.07 VL, F5.1.11.08 VL, F5.1.11.09 VL, F5.1.9.5 VL, 또는 d1C7 VL 또는 IL-2에 결합하는 능력을 갖는 이의 임의의 부분 또는 부분.
일 실시형태에서, VH 도메인 및 VL 도메인, 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 전장 HC 또는 LC는 별개의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된다. 대안적으로, VH 및 VL 둘 모두, 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 HC 및 LC는 단일 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 IL-2 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 이의 변이체를 제공하며, 여기서 이러한 변이체 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 개시된 특정 핵산 중 임의의 것과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유한다. 이들 양은 제한인 것으로 의미되지 않고, 언급된 백분율들 사이의 증분이 본 개시내용의 부분으로서 구체적으로 예상된다.
임의의 이러한 서열에 상보적인 폴리뉴클레오타이드가 또한 본 개시내용에 포함된다. 폴리뉴클레오타이드는 단일-가닥(암호화 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수 있고, DNA(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 함유하고 1-대-1 방식으로 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 추가의 암호화 또는 비-암호화 서열이 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 내에 존재할 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없고, 폴리뉴클레오타이드는 다른 분자 및/또는 지지체 재료에 연결될 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없다.
폴리뉴클레오타이드는 네이티브 서열(즉, 항체 또는 이의 일부를 암호화하는 내인성 서열)을 포함할 수 있거나, 또는 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는 암호화된 폴리펩타이드의 면역반응성이 네이티브 면역반응성 분자에 비해서 저하되지 않도록 1개 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 암호화된 폴리펩타이드의 면역반응성에 대한 효과는 일반적으로 본 명세서에 기술된 바와 같이 평가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 변이체는 이의 네이티브 항체 또는 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70% 동일성, 일부 실시형태에서는, 적어도 약 80% 동일성, 일부 실시형태에서는, 적어도 약 90% 동일성, 일부 실시형태에서는, 적어도 약 95% 동일성을 나타낸다. 이들 양은 제한인 것으로 의미되지 않고, 언급된 백분율들 사이의 증분이 본 개시내용의 부분으로서 구체적으로 예상된다.
2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열은, 2개의 서열 내의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 서열이 하기에 기술된 바와 같이 최대한 상응하게 정렬되었을 때 동일하면 "동일"한 것으로 언급된다. 2개의 서열 사이의 비교는 비교 윈도우에 걸쳐서 서열을 비교하여 서열 유사성의 국지적 영역을 식별 및 비교함으로써 수행된다. "비교 윈도우"는 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 적어도 약 20개의 인접 위치, 통상적으로는 30개 내지 약 75개, 또는 40개 내지 약 50개 인접 위치의 분절절편을 지칭하고, 여기서 2개의 서열을 최적으로 정렬한 후에 서열을 인접 위치의 수가 동일한 참조 서열과 비교할 수 있다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 디폴트 파라미터를 사용하여 생물정보학 소프트웨어의 레이저진(Lasergene)(등록상표) 세트 내의 메그얼라인(MegAlign)(등록상표) 프로그램(디엔에이스타(등록상표), 인크.(DNASTAR(등록상표), Inc.), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 사용하여 수행될 수 있다. 이 프로그램은 하기 참고 문헌에 기술된 여러 정렬 도식을 포함한다: Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins,D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.
일부 실시형태에서, "서열 동일성의 백분율"은 적어도 20개 위치의 비교 윈도우에 걸쳐서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되고, 여기서 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 부분은 2개 서열의 최적의 정렬을 위해서 참조 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교할 때 20 퍼센트 이하, 통상적으로 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 둘 모두의 서열에서 발생한 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 참조 서열 내의 위치의 총 수(즉, 윈도우 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
변이체는 또한 또는 대안적으로, 네이티브 유전자, 또는 이의 일부 또는 보체에 실질적으로 상동성일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드 변이체는 네이티브 항체를 암호화하는 자연 발생 DNA 서열(또는 상보적 서열)에 중간 정도의 엄격한 조건 하에 혼성화될 수 있다.
적합한 "중간 정도의 엄격한 조건"은 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0)의 용액에서 미리세척하고; 50℃ 내지 65℃, 5X SSC에서 밤새 혼성화시킨 후; 0.1% SDS를 함유하는 각각 2X, 0.5X 및 0.2X SSC 각각으로 65℃에서 20분 동안 2회 세척하는 것을 포함한다.
"고도로 엄격한 조건" 또는 "고 엄격도 조건"은 본 명세서에 사용되는 바와 같이 (1) 세척 동안 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들어 50℃에서 0.015M 염화나트륨/0.0015M 시트르산나트륨/0.1% 소듐 도데실 설페이트를 사용하거나; (2) 혼성화 동안 42℃에서 변성제, 예컨대 폼아마이드, 예를 들어 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/750mM 염화나트륨, 75mM 시트르산나트륨을 함유하는 50 mM 인산나트륨 완충제(pH 6.5)를 함유하는 50% (v/v) 폼아마이드를 사용하거나; 또는 (3) 42℃에서 50% 폼아마이드, 5x SSC(0.75M NaCl, 0.075M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5x 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 초음파처리된 연어 정자 DNA(50㎍/㎖), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 설페이트를 사용하고, 42℃에서 0.2X SSC(염화나트륨/시트르산 나트륨) 및 55℃에서 50% 폼아마이드 중에서 세척한 다음, 55℃에서 EDTA가 함유된 0.1X SSC로 이루어진 고엄격도 세척을 수행하는 것이다. 통상의 기술자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 조절하기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등의 조정 방법을 인식할 것이다.
유전자 암호의 축중성(degeneracy)으로 인해서 본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 많은 뉴클레오타이드 서열이 존재한다는 것을 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 인지할 것이다. 이들 폴리뉴클레오타이드 중 일부는 임의의 네이티브 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 대해 최소의 상동성을 보유한다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용에서의 차이로 인해 달라지는 폴리뉴클레오타이드가 본 개시내용에서 구체적으로 고려된다. 추가로, 본 명세서에 제공되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자는 본 개시내용의 범주 내에 속한다. 대립유전자는 뉴클레오타이드의 1개 이상의 돌연변이, 예컨대 결실, 부가 및/또는 치환의 결과로서 변경된 내인성 유전자이다. 생성된 mRNA 및 단백질은 변경된 구조 또는 기능을 가질 수 있지만, 반드시 그러할 필요는 없다. 대립유전자는 표준 기술(예컨대, 혼성화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 사용하여 확인될 수 있다.
본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드는 화학적 합성, 재조합 방법 또는 PCR을 사용하여 수득될 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오타이드 합성 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있어서, 본 명세서에 상세하게 기재될 필요가 없다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 명세서에 제공되는 서열 및 상업적 DNA 합성기를 사용하여 목적하는 DNA 서열을 생성할 수 있다.
재조합 방법을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 경우, 본 명세서에 추가로 논의된 바와 같이, 목적하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 적합한 벡터 내로 삽입할 수 있고, 이어서 벡터를 복제 및 증폭을 위해 적합한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다. 직접 흡수, 세포내이입, 형질주입, F-정합 또는 전기천공에 의해 외인성 폴리뉴클레오타이드를 도입하여 세포를 형질전환시킨다. 도입되면, 외인성 폴리뉴클레오타이드는 세포 내에서 비-통합 벡터(예컨대, 플라스미드)로서 유지될 수 있거나, 또는 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있다. 이렇게 증폭된 폴리뉴클레오타이드는 관련 기술 분야에 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 1989] 참고).
대안적으로, PCR은 DNA 서열의 재생산을 허용한다. PCR 기술은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,800,159호, 제4,754,065호 및 제4,683,202호, 뿐만 아니라 문헌[PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994]에 기술되어 있다.
RNA는 적절한 벡터 내의 단리된 DNA를 사용하여, 이를 적합한 숙주 세포 내로 삽입함으로써 수득할 수 있다. 세포가 복제되고 DNA가 RNA로 전사되면, 예를 들어 상기 문헌[Sambrook et al., 1989]에 제시된 바와 같이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 RNA를 단리할 수 있다.
적합한 클로닝 벡터는 표준 기술에 따라 작제될 수 있거나, 또는 관련 기술 분야에서 입수 가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용하고자 하는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자기-복제 능력을 가질 것이고/거나 특정한 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 보유할 수 있고/있거나 벡터를 함유하는 클론을 선택하는데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 보유할 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어 pUC18, pUC19, 블루스크립트(Bluescript)(예를 들어, pBS SK+) 및 이들의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 셔틀 벡터, 예컨대 pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이들 및 많은 다른 클로닝 벡터는 상업적인 판매처, 예컨대 바이오라드(BioRad), 스트라테진(Strategene) 및 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 입수 가능하다.
발현 벡터가 추가로 제공된다. 발현 벡터는 일반적으로 본 개시내용에 따른 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오타이드 작제물이다. 이는 발현 벡터가 숙주 세포 내에서 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 통합 부분으로서 복제 가능해야 한다는 것을 의미한다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스, 코스미드, 및 PCT 공개 제WO 87/04462호에 개시된 발현 벡터(들)를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 벡터 성분은 일반적으로 하기 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다: 신호 서열; 복제 기원; 1개 이상의 마커 유전자; 적합한 전사 제어 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서 및 종결인자). 발현(즉, 번역)을 위해서는 통상적으로 1개 이상의 번역 제어 요소, 예컨대 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위 및 정지 코돈이 또한 필요하다.
관심 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터 및/또는 폴리뉴클레오타이드 그 자체는 전기천공; 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 다른 물질을 사용한 형질주입; 미세발사체 충격; 리포펙션; 및 감염(예를 들어, 벡터가 감염원, 예컨대 백시니아 바이러스인 경우)을 비롯한, 많은 적절한 수단 중 임의의 것에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 도입 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드의 선택은 종종 숙주 세포의 특징부에 따라 달라질 것이다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오타이드 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 이종 DNA를 과발현할 수 있는 임의의 숙주 세포가 관심 항체, 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 유전자를 단리하는 목적을 위해서 사용될 수 있다. 포유동물 숙주 세포의 비제한적 예는 COS, HeLa 및 CHO 세포를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다(또한 PCT 공개 제WO 87/04462호를 참고). 적합한 비-포유동물 숙주 세포는 원핵생물(예컨대, 이. 콜라이 또는 비. 서브틸리스(B. subtillis)) 및 효모(예컨대, 에스. 세레비지아에(S. cerevisae) 및 에스. 폼베(S. pombe) 또는 케이. 락티스(K. lactis))를 포함한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 존재한하는 경우, 숙주 세포 내의 상응하는 관심 내인성 항체 또는 단백질의 것보다 약 5배 더 높은 수준, 보다 바람직하게는 10배 더 높은 수준, 보다 더 바람직하게는 20배 더 높은 수준으로 cDNA를 발현한다. IL-2에 대한 특이적 결합에 대해서 숙주 세포를 스크리닝하는 것은 면역검정 또는 FACS에 의해 수행된다. 관심 항체 또는 단백질을 과다현하는 세포가 식별될 수 있다.
발현 벡터를 사용하여 IL-2 항체의 발현을 지시할 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 생체내에서 외인성 단백질의 발현을 수득하기 위해서 발현 벡터를 투여하는 것에 익숙하다(예를 들어, 미국 특허 제6,436,908호; 제6,413,942호; 및 제6,376,471호 참고). 발현 벡터의 투여는 국부 또는 전신 투여, 예컨대 주사, 경구 투여, 입자 총 또는 카테터 투여, 및 국소 투여를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 발현 벡터는 교감신경 줄기 또는 신경절에, 또는 관상 동맥, 심방, 심실 또는 심막 내로 직접 투여된다.
발현 벡터, 또는 서브게놈 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 치료 조성물의 표적화 전달이 또한 사용될 수 있다. 수용체-매개 DNA 전달 기술은 예를 들어, 문헌[Findeis et al., Trends Biotechnol., 1993, 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer, J.A. Wolff, ed., 1994]; [Wu et al., J. Biol. Chem., 1988, 263:621]; [Wu et al., J. Biol. Chem., 1994, 269:542]; [Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:3655]; [Wu et al., J. Biol. Chem., 1991, 266:338]에 기술되어 있다. 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 치료 조성물은 유전자 요법 프로토콜에서 국부 투여를 위해서 약 100ng 내지 약 200㎎의 DNA의 범위로 투여된다. 약 500ng 내지 약 50㎎, 약 1㎍ 내지 약 2㎎, 약 5㎍ 내지 약 500㎍, 및 약 20㎍ 내지 약 100㎍의 DNA의 농도 범위가 또한 유전자 요법 프로토콜 동안 사용될 수 있다. 치료 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드는 유전자 전달 비히클을 사용하여 전달될 수 있다. 유전자 전달 비히클은 또한 바이러스 또는 비-바이러스 기원일 수 있다(일반적으로, 문헌[Jolly, Cancer Gene Therapy, 1994, 1:51;Kimura, Human Gene Therapy, 1994, 5:845]; [Connelly, Human Gene Therapy, 1995, 1:185]; 및 [Kaplitt, Nature Genetics, 1994, 6:148] 참고). 내인성 포유동물 또는 이종 프로모터를 사용하여 이러한 암호화 서열의 발현을 유도할 수 있다. 암호화 서열의 발현은 구성적일 수 있거나, 또는 조절될 수 있다.
목적하는 폴리뉴클레오타이드의 전달 및 목적하는 세포에서의 발현을 위한 바이러스-기반 벡터는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 예시적인 바이러스-기반 비히클은 재조합 레트로바이러스(예를 들어, PCT 공개 제WO 90/07936호; 제WO 94/03622호; 제WO 93/25698호; 제WO 93/25234호; 제WO 93/11230호; 제WO 93/10218호; 제WO 91/02805; 미국 특허 제5, 219,740호 및 제4,777,127호; 영국 특허 제2,200,651호; 및 유럽 특허 제0 345 242호 참고), 알파바이러스-기반 벡터(예를 들어, 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 셈리키 포레스트(Semliki forest) 바이러스(ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버(Ross River) 바이러스(ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532), 및 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터(예를 들어, PCT 공개 제WO 94/12649호, 제WO 93/03769호; 제WO 93/19191호; 제WO 94/28938호; 제WO 95/11984호 및 제WO 95/00655호 참고)를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 문헌[Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147]에 기술된 바와 같은 사멸된 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여가 또한 사용될 수 있다.
비-바이러스 전달 비히클 및 방법이 또한 사용될 수 있고, 이는 사멸된 아데노바이러스 단독과 연결되거나 연결되지 않은 다가양이온성 축합 DNA(예를 들어, 문헌[Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147] 참고); 리간드-연결된 DNA(예를 들어, 문헌[Wu, J. Biol. Chem., 1989, 264:16985] 참고); 진핵 세포 전달 비히클 세포(예를 들어, 미국 특허 제5,814,482호; PCT 공개 제WO 95/07994호; 제WO 96/17072호; 제WO 95/30763호; 및 제WO 97/42338호 참고) 및 핵 전하 중화 또는 세포막과의 융합을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 네이키드 DNA가 또한 사용될 수 있다. 예시적인 네이키드 DNA 도입 방법은 PCT 공개 제WO 90/11092호 및 미국 특허 제5,580,859호에 기술되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포솜은 미국 특허 제5,422,120호; PCT 공개 제WO 95/13796호; 제WO 94/23697호; 제WO 91/14445호; 및 유럽 특허 제EP 0524968호에 기술되어 있다. 추가의 접근법은 문헌[Philip, Mol. Cell Biol., 1994, 14:2411, 및 [Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci., 1994, 91:1581]에 기술되어 있다.
치료 방법
치료 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량 또는 "유효량"의 본 개시내용에 기술된 바와 같은 IL-2 항체, 항원-결합 부분, 또는 IL-2 항체를 포함하는 항체:IL-2 복합체를 투여하는 것을 포함하고, 이것은 본 개시내용에 의해서 고려된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료 유효" 또는 "유효"량은 단독으로 또는 다른 작용제와 조합하여, 단일 용량으로서 또는 다중 용량 치료요법에 따라서, 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 예방을 유발하기에 충분한 양인, 항체 또는 이의 부분의 양을 지칭한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 대상체의 체격, 대상체의 증상의 중증도, 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 인자에 기초하여 이러한 양을 결정할 수 있을 것이다. 대상체는 인간 또는 비-인간 동물(예를 들어, 토끼, 래트, 마우스, 원숭이 또는 다른 하등 영장류)일 수 있다.
본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 부분, 또는 IL-2 항체를 포함하는 항체:IL-2 복합체는 공지된 의약과 함께 공동-투여될 수 있고, 일부 예에서 항체는 그 자체가 변형될 수 있다. 예를 들어, 항체는 효능을 잠재적으로 추가로 증가시키기 위해서 면역독소 또는 방사성동위원소에 접합될 수 있었다. 추가의 치료제와의 공동-투여와 관련하여, 이러한 작용제는 세포독성제, 방사성독성제 또는 면역억제제를 포함할 수 있다. 항체는 작용제에 연결될 수 있거나(면역복합체로서) 또는 작용제와 별개로 투여될 수 있다. 후자의 경우에 (별개의 투여), 항체는 작용제 이전에, 이후에 또는 그와 공동으로 투여될 수 있거나, 또는 다른 공지된 요법, 예를 들어 항암 요법, 예를 들어 방사선과 공동-투여될 수 있다. 본 개시내용의 IL-2 항체, 이의 항원-결합 부분, 또는 IL-2 항체를 포함하는 항체:IL-2 복합체와 치료제의 공동-투여는, 상이한 기전을 통해서 작동하는 2종의 작용제를 제공하여, 인간 질환에 대한 치료적 및 아마도 상승작용적 효과를 제공할 수 있다.
본 명세서에 개시된 항체, 항원-결합 부분 및 IL-2 항체를 포함하는 항체:IL-2 복합체는 IL-2가 바람직하지 않게 활성인 다양한 상황, 예컨대 염증성 병태, 예컨대 자가면역 질환, 또는 면역억제가 바람직한 상황에서 치료 또는 진단 도구로서 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 면역억제 요법은 기관 또는 골수 이식을 위한 제제에서 존재할 수 있다. 염증 경로 및 다수의 질환, 장애, 및 병태에서 IL-2의 관여를 고려하면, 많은 이러한 질환, 장애 또는 병태는 본 개시내용의 항체, 항원-결합 부분 또는 IL-2 항체를 포함하는 항체:IL-2 복합체를 사용한 치료에 특히 적합하다. 따라서, 본 개시내용의 항체, 항원-결합 부분 또는 IL-2 항체를 포함하는 항체:IL-2 복합체는 IL-2-매개 장애 또는 IL-2-결핍 장애의 치료 또는 예방에서 사용될 수 있다. 또한, 본 개시내용은 IL-2-매개 장애 또는 IL-2-결핍 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 의약의 제조에서의 항체, 항원-결합 부분 또는 IL-2 항체를 포함하는 항체:IL-2 복합체의 용도를 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 본 출원은 IL-2-매개 장애 또는 IL-2-결핍 장애의 치료에 사용하기 위한 본 개시내용의 항체, 항원-결합 부분 또는 IL-2 항체를 포함하는 항체:IL-2 복합체를 개시한다. 추가 실시형태에서, 본 출원은 IL-2-매개 질환 또는 IL-2-결핍 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 개시내용의 IL-2 항체, 이의 항원-결합 부분, 또는 IL-2 항체를 포함하는 항체:IL-2 복합체를 포함하는 약제학적 조성물을 개시한다. 특정 실시형태에서, 항체는 hIL-2에 특이적으로 결합한다.
특정 실시형태에서, 이들 질환은 면역 질환, 예컨대 이식편 대 숙주병을 포함한다. 특정 실시형태에서, 질환은 IL-2와 연관된 임의의 질환, 예컨대 근육 위축병 및 비만일 수 있다. 본 명세서에 제공된 항체, 이의 항원-결합 부분, 또는 IL-2 항체를 포함하는 항체:IL-2 복합체로 치료될 수 있는 자가면역 질환 및 장애의 예는 예를 들어, 염증 반응, 예컨대 염증성 피부 질환, 예컨대 건선 및 피부염(예를 들어, 아토피성 피부염); 피부근염; 전신 경화증 및 경화증; 염증성 장 질환과 연관된 반응(예컨대 크론병 및 궤양성 대장염); 호흡 곤란 증후군(성인 호흡 곤란 증후군; 및 ARDS); 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 대장염; 위염; 사구체신염; 알레르기성 병태, 예컨대 습진 및 천식 및 T 세포의 침윤 및 염증 반응을 포함하는 다른 병태; 죽상경화증; 백혈구 부착 결핍증; 류마티스 관절염; 전신 홍반 루푸스(SLE); 진성 당뇨병(예를 들어, 제I형 진성 당뇨병); 다발성 경화증; 레이노이드 증후군; 자가면역 갑상선염; 알레르기성 뇌척수염; 쇼그렌 증후군; 청소년 발병 당뇨병; 및 결핵, 유육종증, 다발성근염, 육아종증 및 혈관염에서 전형적으로 발견되는 사이토카인 및 T-림프구에 의해서 매개되는 급성 및 지연 과민반응과 연관된 면역 반응; 베게너병; 악성 빈혈(에디슨병); 백혈구 유출에 관여된 질환; 중추 신경계(CNS) 염증성 장애; 다발성 장기 손상 증후군; 용혈성 빈혈(저온글로빈혈증 또는 늑막 양성 빈혈을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음); 중증 근무력증; 항원-항체 복합체 매개 질환; 항-사구체 기저막 질환; 항인지질 증후군; 알레르기성 신경증; 그레이브스병; 람베르트-이튼 근무력 증후군; 수포성 유천포창; 천포창; 자가면역 다발성내분비병증; 백반증; 라이터병(Reiter's diease); 스티프-만 증후군; 베체트병; 거대 세포 동맥염; 면역 복합 신염; IgA 신증; IgM 다발성신경염; 면역 혈소판 감소성 자반증 (ITP) 또는 자가면역 혈소판 감소증 및 자가면역 용혈성 질환; 하시모토 갑상선염; 자가면역 간염; 자가면역 혈우병; 자가면역 림프세포증식 증후군(ALPS); 자가면역 포도막염; 길랑-바레 증후군; 굿파스처 증후군; 혼합 결합 조직병; 자가면역-연관 불임; 결절성 다발동맥염; 원형 탈모증; 및 특발성 점액수종을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 조성물 및 방법으로 치료될 수 있는 병태는 진성 당뇨병(예를 들어, 제I형 진성 당뇨병)이다. 일부 실시형태에서, 질환은 제I형 진성 당뇨병이다. 일부 실시형태에서, 질환은 청소년 발병 당뇨병이다.
상기 장애 중 임의의 것을 치료하기 위해서, 본 개시내용에 따라서 사용하기 위한 약제학적 조성물은 하기에 보다 충분하게 논의되는 바와 같이, 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화되고 투여될 수 있다.
본 개시내용에 따른 본 개시내용의 항체, 이의 항원-결합 부분, 또는 IL-2 항체를 포함하는 항체:IL-2 복합체의 치료 유효량을 결정하는 것은 특정 환자 특징, 투여 경로, 및 치료하고자 하는 장애의 본성에 주로 좌우될 것이고, 이는 하기에 보다 충분하게 논의된다.
본 개시내용의 항체, 이의 항원-결합 부분, 또는 IL-2 항체를 포함하는 항체:IL-2 복합체의 투여 및 투약은 하기 다른 곳에 보다 충분하게 논의된다.
진단 방법
본 명세서에 개시된 IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 진단 시험 또는 영상화에 사용될 수 있다. 예를 들어, IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 ELISA 검정에서 사용될 수 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 또한 방사성표지된 단클론성 항체로서 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Srivastava (ed.), Radiolabeled Monoclonal Antibodies For Imaging And Therapy, Plenum Press (1988)]; [Chase, "Medical Applications of Radioisotopes," in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Gennaro et al. (eds.), Mack Publishing Co., pp. 624-652 (1990)]; 및 [Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies," in Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto et al. (eds.), Chapman and Hall, pp. 227-249 (1993)]; [Grossman, 1986, Urol. Clin. North Amer. 13:465-474]; [Unger et al., 1985, Invest. Radiol. 20:693-700]; 및 [Khaw et al., 1980, Science 209:295-297] 참고). 면역섬광조영술(immunoscintigraphy)로도 공지된 이러한 기술은 단클론성 항체에 접합된 감마-방출 방사성동위원소의 위치를 검출하기 위해 감마 카메라를 사용한다. 진단 영상화는 암, 자가면역 질환, 감염성 질환 및/또는 심혈관 질환을 진단하는데 사용될 수 있다(예를 들어, 상기 문헌[Brown] 참고).
일 실시형태에서, IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 면역-관련 질환을 비롯한, IL-2-관련 질환, 장애, 또는 병태를 진단하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 다른 용도 중에서, 환자에서 IL-2 수준을 검출하는데 사용될 수 있다.
진단에 더하여, IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 치료 반응을 모니터링하고, 질환의 재발을 검출하고, 후속 임상 결정을 안내하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 진단 및 모니터링 목적의 경우, 방사성동위원소는 직접적으로 또는 중간 작용기를 사용하는 것에 의해 간접적으로 항체 부분에 결합될 수 있다. 이러한 중간 작용기는 예를 들어 DTPA(다이에틸렌트라이아민펜타아세트산) 및 EDTA(에틸렌 다이아민 테트라아세트산)를 포함한다. 환자에게 전달되는 방사선량은 전형적으로 가능한 한 낮은 수준으로 유지된다. 이는 검출 및 정확한 측정을 가능하게 할 동위원소의 최소 반감기, 최소 체내 잔류 및 최소량의 최상의 조합을 위해서 동위원소를 선택하는 것을 통해서 성취될 수 있다. 항체에 결합될 수 있고 진단 영상화에 적절한 방사성동위원소의 예는 99mTc 및 111In을 포함한다.
연구는 항체 부분, 특히 Fab 및 Fab'가 적합한 종양/배경 비율을 제공함을 나타낸다(예를 들어, 상기 문헌[Brown] 참고).
IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 또한 생체내 진단의 목적을 위해서 상자성 이온으로 표지될 수 있다. 자기공명 영상화에 특히 유용한 원소는 Gd, Mn, Dy, 및 Fe 이온을 포함한다.
IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 또한 시험관내에서 IL-2의 존재를 검출할 수 있다. 이러한 면역검정에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 액체 상으로 사용될 수 있거나, 또는 고체-상 담체에 결합될 수 있다. 예를 들어, 무손상 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 항체 성분을 불용성 지지체, 예컨대 중합체-코팅된 비드, 플레이트 또는 튜브에 연결시키기 위해 중합체, 예컨대 아미노덱스트란에 부착될 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 IL-2는 인간 IL-2(hIL-2)이다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 0.1ng/㎖ 내지 1000ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 0.1ng/㎖ 내지 750ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 0.5ng/㎖ 내지 500ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 0.5ng/㎖ 내지 250ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 0.5ng/㎖ 내지 100ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 0.5ng/㎖ 내지 50ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 0.5ng/㎖ 내지 25ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 0.5ng/㎖ 내지 10ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 0.5ng/㎖ 내지 5ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 0.5ng/㎖ 내지 1ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 0.1ng/㎖ 내지 5ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 0.1ng/㎖ 내지 1ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 0.8ng/㎖ 내지 500ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 1ng/㎖ 내지 500ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 1ng/㎖ 내지 250ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 1ng/㎖ 내지 100ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 1ng/㎖ 내지 50ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 1ng/㎖ 내지 25ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 1ng/㎖ 내지 10ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 50ng/㎖ 내지 500ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 100ng/㎖ 내지 500ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 250ng/㎖ 내지 500ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 400ng/㎖ 내지 500ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 500ng/㎖ 내지 1000ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 750ng/㎖ 내지 1000ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 0.8ng/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 검출을 위한 hIL-2는 시험관내에서 500ng/㎖의 농도로 존재한다. 이들 양은 제한임을 의미하지 않으며, 언급된 값들 사이의 증분이 본 개시내용의 부분으로서 구체적으로 예상된다.
대안적으로, IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 조직학적 시편으로부터 제조된 조직 절편에서 특정 항원의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다. 이러한 동일계내 검출은 예를 들어, 검출 가능하게-표지된 IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 조직 절편에 적용함으로써 성취될 수 있다. 동일계내 검출은 특정 항원의 존재를 결정하고, 시험된 조직에서 항원의 분포를 결정하는 데 사용될 수 있다. 동일계내 검출의 일반적인 기술은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Ponder, "Cell Marking Techniques and Their Application," in Mammalian Development: A Practical Approach, Monk (ed.), IRL Press, pp. 115-138 (1987)]; 상기 문헌[Coligan et al.] 참고).
검출가능한 표지, 예컨대 효소, 형광 화합물, 전자 전달제 등을 관련 기술 분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 담체에 연결시킬 수 있다. 이들 표지된 담체 및 이로부터 제조된 항체 접합체는 시험관내 면역검정 및 동일계내 검출을 위해 사용될 수 있고, 마찬가지로 항체 접합체는 표지를 항체에 직접 부착시킴으로써 제조될 수 있다. 항체 접합체를 복수 개의 표지로 로딩하는 것은 면역검정 또는 조직학적 절차의 감도를 증가시킬 수 있고, 여기서 표적 항원에 대한 항체 또는 항체 부분의 낮은 정도의 결합 만이 달성된다.
조성물
본 개시내용은 또한 유효량의 본 명세서에 기술된 IL-2 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물의 예뿐만 아니라 제형화 방법이 또한 본 명세서에 기술된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 1종 이상의 IL-2 항체를 포함한다. 다른 실시형태에서, IL-2 항체는 IL-2를 인식한다. 다른 실시형태에서, IL-2 항체는 인간 항체이다. 다른 실시형태에서, IL-2 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시형태에서, IL-2 항체는 목적하는 면역 반응, 예컨대 항체-매개 용해 또는 ADCC를 촉발할 수 있는 불변 영역을 포함한다. 다른 실시형태에서, IL-2 항체는 원치 않는 또는 바람직하지 않은 면역 반응, 예컨대 항체-매개 용해 또는 ADCC를 촉발하지 않는 불변 영역을 포함한다. 다른 실시형태에서, IL-2 항체는 항체의 1개 이상의 CDR(들)(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 일부 실시형태에서는 모든 6개의 CDR)을 포함한다.
조성물은 1종 초과의 IL-2 항체(예를 들어, IL-2의 상이한 에피토프를 인식하는 IL-2 항체의 혼합물)를 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 다른 예시적인 조성물은 동일한 에피토프(들)를 인식하는 1종 초과의 IL-2 항체, 또는 IL-2의 상이한 에피토프에 결합하는 상이한 종의 IL-2 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 IL-2의 상이한 변이체를 인식하는 IL-2 항체의 혼합물을 포함한다.
본 개시내용에 사용되는 조성물은 동결건조 제형 또는 수성 용액의 형태로 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다(Remington: The Science and practice of Pharmacy 20th Ed., 2000, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover). 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 투여량 및 농도에서 수여자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제(예컨대 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트란을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물(예를 들어 Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)(상표명), 플루로닉스(PLURONICS)(상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 본 명세서에 추가로 기술되어 있다.
IL-2 항체 및 이의 조성물은 또한 작용제의 유효성을 향상 및/또는 보충하는 작용을 하는 다른 작용제와 함께 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, IL-2 항체는 투여 전에 IL-2와 복합된다. 특정 실시형태에서, IL-2 항체 투여 전에 IL-2와 복합된다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 중 임의의 것을 포함하는 약제학적 조성물을 비롯한 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 다른 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 기술된 항체 중 임의의 것을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 추가의 다른 실시형태에서, 조성물은 서열번호 1 및 서열번호 2에 제시된 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 5 및 서열번호 6에 제시된 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 7 및 서열번호 8에 제시된 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 9 및 서열번호 10에 제시된 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 11 및 서열번호 12에 제시된 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 13 및 서열번호 14에 제시된 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 15 및 서열번호 16에 제시된 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 17 및 서열번호 18에 제시된 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 19 및 서열번호 20에 제시된 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 21 및 서열번호 22에 제시된 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 23 및 서열번호 24에 제시된 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 25 및 서열번호 26에 제시된 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 27 및 서열번호 28에 제시된 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 29 및 서열번호 30에 제시된 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 또는 서열번호 31 및 서열번호 32에 제시된 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함한다. 추가의 다른 실시형태에서, 조성물은 서열번호 36 및 서열번호 37에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 38 및 서열번호 39에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 40 및 서열번호 41에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 42 및 서열번호 43에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 44 및 서열번호 45에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 46 및 서열번호 47에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 48 및 서열번호 49에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 50 및 서열번호 51에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 52 및 서열번호 53에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 54 및 서열번호 55에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 56 및 서열번호 57에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 58 및 서열번호 59에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 60 및 서열번호 61에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 62 및 서열번호 63에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 서열번호 64 및 서열번호 65에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두, 또는 서열번호 66 및 서열번호 67에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
또 다른 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 본 개시내용의 항체의 VH, VL 및/또는 VH과 VL 둘 모두를 암호화할 수 있다. 즉, 조성물은 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 암호화하는 단일 폴리뉴클레오타이드 또는 1종 초과의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 또한 병용 요법으로, 예컨대 다른 작용제와 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 병용 요법은 적어도 하나의 다른 요법과 조합된 본 개시내용의 IL-2 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 포함할 수 있고, 여기서 요법은 수술, 면역요법, 화학요법, 또는 약물 요법일 수 있다.
본 개시내용의 약제학적 화합물은 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다. 이러한 염의 예는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가 염은 비독성 무기 산, 예컨대 염화수소산, 질산, 인산, 황산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산, 아인산 등으로부터 유래된 것, 뿐만 아니라 비독성 유기 산, 예컨대 지방족 모노- 및 다이카복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 설폰산 등으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기 부가 염은 알칼리 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유래된 것, 뿐만 아니라 비독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-다이벤질에틸렌다이아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것을 포함한다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용 가능한 항산화제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 항산화제의 예는 다음을 포함한다: (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 유용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예컨대 시트르산, 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타타르산, 인산 등을 포함한다.
본 개시내용의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비-수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스터, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅 재료, 예컨대 레시틴의 사용에 의해서, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해서, 및 계면활성제의 사용에 의해서 유지될 수 있다.
이러한 조성물은 또한 아주반트, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물의 존재의 예방은 멸균 절차에 의해서, 그리고 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 함유시키는 것 둘 모두에 의해서 보장될 수 있다. 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 주사 가능한 약제학적 형태의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시키는 것에 의해서 수행될 수 있다.
약제학적 조성물은 전형적으로, 제조 및 저장 조건 하에서 멸균되고 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀션, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제형화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해서, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해서, 및 계면활성제의 사용에 의해서 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 적합할 것이다. 주사 가능한 조성물의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시키는 것에 의해서 수행될 수 있다.
멸균 주사 가능한 용액은 필요한 양의 활성 화합물을 상기에 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후에, 필요에 따라 멸균 정밀여과하여 제조될 수 있다.
일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기에 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분과 이미 멸균-여과된 이의 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 산출하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)이다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 안과적 투여에 적합한 제형으로 제조, 패키징 또는 판매될 수 있다. 이러한 제형은, 예를 들어 수성 또는 유성 액체 담체 중의 활성 성분의 0.1 내지 1.0%(w/w) 용액 또는 현탁액을 포함하는 점안액의 형태일 수 있다. 이러한 점안액은 완충제, 염, 또는 본 명세서에 기술된 1종 이상의 다른 추가의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 유용한 다른 안과적으로 투여 가능한 제형은 미세결정질 형태 또는 리포좀 제제로 활성 성분을 포함하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "추가 성분"은 부형제; 표면 활성제; 분산제; 불활성 희석제; 과립화제 및 붕해제; 결합제; 윤활제; 감미제; 향미제; 착색제; 보존제; 생리학적으로 분해성인 조성물, 예컨대 젤라틴; 수성 비히클 및 용매; 유성 비히클 및 용매; 현탁화제; 분산제 또는 습윤제; 유화제, 완화제; 완충제; 염; 증점제; 충전제; 유화제; 항산화제; 항생제; 항진균제; 안정화제; 및 약제학적으로 허용 가능한 중합체 또는 소수성 재료 중 1종 이상을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 개시내용의 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 다른 "추가 성분"은 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1985)]에 기술되어 있다.
일 실시형태에서, IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 분분은 5㎎/㎖, 또는 일부 실시형태에서는 약 10㎎/㎖, 또는 일부 실시형태에서는 약 15㎎/㎖, 또는 일부 실시형태에서는 약 20㎎/㎖의 항체를, 아세트산나트륨, 폴리소르베이트 80, 및 염화나트륨과 함께 함유하는 약 5 내지 6 범위 pH의 멸균 수성 용액으로서 정맥내 제형으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 정맥내 제형은 5 또는 10㎎/㎖의 항체를 20mM 아세트산나트륨, 0.2㎎/㎖ 폴리소르베이트 80, 및 140mM 염화나트륨과 함께 함유하는 pH 5.5의 멸균 수용액이다. 추가로, 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 용액은 많은 다른 화합물 중에서, 히스티딘, 만니톨, 수크로스, 트레할로스, 글리신, 폴리(에틸렌) 글리콜, EDTA, 메티오닌 및 이들의 임의의 조합물, 및 관련 기술 분야에 공지된 많은 다른 화합물을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 하기 성분을 포함한다: 100㎎의 본 개시내용의 IL-2 항체 또는 항원-결합 부분, 10mM의 히스티딘, 5%의 수크로스, 및 0.01%의 폴리소르베이트 80, pH 5.8. 이러한 조성물은 동결건조 분말로서 제공될 수 있다. 분말이 전체 부피로 재구성되는 경우, 조성물은 동일한 제형을 유지한다. 대안적으로, 분말은 절반 부피로 재구성될 수 있고, 이 경우 조성물은 100㎎의 본 개시내용의 IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 20mM의 히스티딘, 10%의 수크로스, 및 0.02%의 폴리소르베이트 80, pH 5.8을 포함한다.
일 실시형태에서, 용량의 일부는 정맥내 볼러스(bolus)에 의해서 투여되고, 나머지는 항체 제형의 주입에 의해서 투여된다. 예를 들어, IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 0.01㎎/㎏의 정맥내 주사는 볼러스로서 주어질 수 있고, 항체 용량의 나머지는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 미리 결정된 용량은, 예를 들어 1시간 30분 내지 2시간 내지 5시간의 기간에 걸쳐서 투여될 수 있다.
작용제가, 예를 들어, 소분자인 치료제와 관련하여, 이는 관련 기술 분야에 널리 공지된 바와 같이, 생리학적으로 허용 가능한 에스터 또는 염의 형태로, 예컨대 생리학적으로 허용 가능한 양이온 또는 음이온과 조합하여 약제학적 조성물 중에 존재할 수 있다.
본 명세서에 기술된 약제학적 조성물의 제형은 약리학 기술 분야에 공지되어 있거나 이후에 개발될 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 담체 또는 1종 이상의 다른 보조 성분과 회합시키는 단계, 및 이어서, 필요한 경우 또는 바람직한 경우에, 생성물을 목적하는 단일- 또는 다중-용량 단위로 정형화 또는 패키징하는 단계를 포함한다
일 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 내독소 및/또는 관련 발열성 물질이 실질적으로 존재하지 않는 발열원-무함유 제형이다. 내독소는 미생물 내부에 한정되고 미생물이 붕괴되거나 사멸되는 경우에 방출되는 독소를 포함한다. 발열성 물질은 또한, 박테리아 및 다른 미생물의 외막으로부터의 열-유도성, 열안정성 물질(당단백질)을 포함한다. 이들 물질 둘 모두는 인간에게 투여되는 경우 열, 저혈압 및 쇼크를 유발할 수 있다. 잠재적으로 유해한 효과로 인해서, 정맥내로 투여되는 약제학적 약물 용액으로부터 심지어 적은 양의 내독소도 제거하는 것이 유리하다. 미국 식품 의약품국(FDA)은 정맥내 약물 적용을 위한 단일 1시간 기간 내에 체중 킬로그램당 용량당 5 내독소 단위(EU)의 상한치를 설정하였다(The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). 치료 단백질을 체중 킬로그램당 수백 또는 수천 밀리그램의 양으로 투여하는 경우, 심지어 미량의 내독소도 제거하는 것이 유리하다. 일 실시형태에서, 조성물 중의 내독소 및 발열원 수준은 10EU/㎎ 미만, 또는 5EU/㎎ 미만, 또는 1EU/㎎ 미만, 또는 0.1EU/㎎ 미만, 또는 0.01EU/㎎ 미만, 또는 0.001EU/㎎ 미만이다. 또 다른 실시형태에서, 조성물 중의 내독소 및 발열원 수준은 약 10EU/㎎ 미만, 또는 약 5EU/㎎ 미만, 또는 약 1EU/㎎ 미만, 또는 약 0.1EU/㎎ 미만, 또는 약 0.01EU/㎎ 미만, 또는 약 0.001EU/㎎미만이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 투여는 경구, 비경구, 근육내, 비강내, 질, 직장, 설측, 설하, 협측, 협측내, 정맥내, 피부, 피하 또는 경피이다.
또 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 조성물을 다른 요법, 예컨대 수술, 화학요법, 호르몬 요법, 생물학적 요법, 면역요법 또는 방사선 요법과 조합하여 투여하는 것을 추가로 포함한다.
투약/투여
본 개시내용의 IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 약제학적 또는 멸균 조성물을 제조하기 위해서, 항체는 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 혼합된다. 치료제 및 진단제의 제형은 예를 들어 동결건조 분말, 슬러리, 수용액, 로션 또는 현탁액 형태로 생리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 함께 혼합함으로써 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.]; [Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N. Y.]; [Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY]; [Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY]; [Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY]; [Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y] 참고).
치료를 위해서 투여 치료요법을 선택하는 것은 개체의 혈청 또는 조직 교체율, 증상 수준, 개체의 면역원성 및 생물학적 매트릭스에서의 표적 세포의 접근성을 비롯한 몇몇 인자에 좌우된다. 특정 실시형태에서, 투여 치료요법은 허용 가능한 부작용 수준과 일치하여 환자에게 전달되는 치료제의 양을 최대화한다. 따라서, 전달되는 생물제의 양은 부분적으로 특정 개체 및 치료될 병태의 중증도에 좌우된다. 항체, 사이토카인, 및 소분자의 적절한 용량을 선택하는 것에 대한 지침은 입수 가능하다(예를 들어, 문헌[Wawrzynczak, 1996, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK]; [Kresina (ed.), 1991, Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y.]; [Bach (ed.),1993, Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N. Y.]; [Baert, et al., 2003, New Engl. J. Med. 348:601-608]; [Milgrom, et al., 1999, New Engl. J. Med. 341:1966-1973]; [Slamon, et al., 2001, New Engl. J. Med. 344:783-792]; [Beniaminovitz, et al., 2000, New Engl. J. Med. 342:613-619]; [Ghosh, et al., 2003, New Engl. J. Med. 348:24-32]; [Lipsky, et al., 2000, New Engl. J. Med. 343:1594-1602] 참고).
적절한 용량을 결정하는 것은 예를 들어, 치료에 영향을 미치는 것으로 관련 기술 분야에 공지되어 있거나 그러한 것으로 의심되거나, 또는 치료에 영향을 미칠 것으로 예측되는 파라미터 또는 인자를 사용하여 임상의에 의해서 행해진다. 일반적으로, 용량은 최적 용량보다 다소 적은 양에서 시작하고, 그후 임의의 부정적인 부작용에 비해서 목적하거나 최적인 효과가 달성될 때까지 소량 증분으로 증가된다. 중요한 진단 척도는, 예를 들어 염증의 증상 또는 생산된 염증성 사이토카인의 수준을 포함한다.
본 개시내용의 약제학적 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이지 않으면서, 특정 환자, 조성물 및 투여 모드에 대해서 목적하는 치료 반응을 달성하기에 유효한 활성 성분의 양을 수득하도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 개시내용의 특정 조성물, 또는 이의 에스터, 염 또는 아마이드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용될 특정 화합물의 배출 속도, 치료의 지속기간, 사용된 특정 조성물과 조합하여 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 재료, 치료될 환자의 연령, 성별, 체중, 병태, 일반적인 건강 및 과거 병력, 및 의학 기술 분야에 널리 공지된 기타 인자를 비롯한 다양한 약동학적 인자에 좌우될 것이다.
본 개시내용의 IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 조성물은 연속적인 주입에 의해서, 또는 예를 들어 1일, 1주, 또는 1주당 1 내지 7회 간격의 투여에 의해서 제공될 수 있다. 용량은 정맥내로, 피하로, 국소로, 경구로, 비강으로, 직장으로, 근육내로, 뇌내로 또는 흡입에 의해서 제공될 수 있다. 구체적인 용량 프로토콜은 유의한 바람직하지 않은 부작용을 회피하는 최대 용량 또는 투여 빈도를 포함하는 것이다. 총 매주 용량은 적어도 0.05㎍/㎏ 체중, 적어도 0.2㎍/㎏, 적어도 0.5㎍/㎏, 적어도 1㎍/㎏, 적어도 10㎍/㎏, 적어도 100㎍/㎏, 적어도 0.2㎎/㎏, 적어도 1.0㎎/㎏, 적어도 2.0㎎/㎏, 적어도 10㎎/㎏, 적어도 15㎎/㎏, 적어도 20㎎/㎏, 적어도 25㎎/㎏, 또는 적어도 50㎎/㎏일 수 있다(예를 들어, 문헌[Yang, et al., 2003, New Engl. J. Med. 349:427-434]; [Herold, et al., 2002, New Engl. J. Med. 346:1692-1698]; [Liu, et al., 1999, J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456]; [Portielji, et al., 2003, Cancer. Immunol. Immunother. 52: 133-144] 참고). 용량은 적어도 15㎍, 적어도 20㎍, 적어도 25㎍, 적어도 30㎍, 적어도 35㎍, 적어도 40㎍, 적어도 45 ㎍, 적어도 50㎍, 적어도 55㎍, 적어도 60㎍, 적어도 65㎍, 적어도 70㎍, 적어도 75㎍, 적어도 80㎍, 적어도 85㎍, 적어도 90㎍, 적어도 95㎍, 또는 적어도 100㎍일 수 있다. 대상체에게 투여되는 용량은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 또는 그 초과의 횟수일 수 있다.
본 개시 내용의 IL-2 항체 또는 항원-결합 부분의 경우, 환자에게 투여되는 투여량은 0.0001㎎/환자의 체중 ㎏ 내지 100㎎/㎏일 수 있다. 투여량은 0.0001㎎/환자의 체중 ㎏ 내지 20㎎/㎏, 0.0001㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏, 0.0001㎎/㎏ 내지 5㎎/㎏, 0.0001 내지 2㎎/㎏, 0.0001 내지 1㎎/㎏, 0.0001㎎/㎏ 내지 0.75㎎/㎏, 0.0001㎎/㎏ 내지 0.5㎎/㎏, 0.0001㎎/㎏ 내지 0.25㎎/㎏, 0.0001 내지 0.15㎎/㎏, 0.0001 내지 0.10㎎/㎏, 0.001 내지 0.5㎎/㎏, 0.01 내지 0.25㎎/㎏ 또는 0.01 내지 0.10㎎/㎏일 수 있다.
IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 투여량은 킬로그램(㎏) 단위의 환자의 체중에 ㎎/㎏ 단위로 투여 되는 용량을 곱한 값을 사용하여 계산될 수 있다. 본 개시내용의 항체의 투여량은 150㎍/환자의 체중 ㎏ 이하, 125㎍/㎏ 이하, 100㎍/㎏ 이하, 95㎍/㎏ 이하, 90㎍/㎏ 이하, 85㎍/㎏ 이하, 80㎍/㎏ 이하, 75㎍/㎏ 이하, 70㎍/㎏ 이하, 65㎍/㎏ 이하, 60㎍/㎏ 이하, 55㎍/㎏ 이하, 50㎍/㎏ 이하, 45㎍/㎏ 이하, 40㎍/㎏ 이하, 35㎍/㎏ 이하, 30㎍/㎏ 이하, 25㎍/㎏ 이하, 20㎍/㎏ 이하, 15㎍/㎏ 이하, 10㎍/㎏ 이하, 5㎍/㎏ 이하, 2.5㎍/㎏ 이하, 2㎍/㎏ 이하, 1.5㎍/㎏ 이하, 1㎍/㎏ 이하, 0.5㎍/㎏ 이하, 또는 0.1㎍/㎏ 이하일 수 있다.
본 개시내용의 IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 단위 용량은 0.1㎎ 내지 200㎎, 0.1㎎ 내지 175㎎, 0.1㎎ 내지 150㎎, 0.1㎎ 내지 125㎎, 0.1㎎ 내지 100㎎, 0.1㎎ 내지 75㎎, 0.1㎎ 내지 50㎎, 0.1㎎ 내지 30㎎, 0.1㎎ 내지 20㎎, 0.1㎎ 내지 15㎎, 0.1㎎ 내지 12㎎, 0.1㎎ 내지 10㎎, 0.1㎎ 내지 8㎎, 0.1㎎ 내지 7㎎, 0.1㎎ 내지 5㎎, 0.1 내지 2.5㎎, 0.25㎎ 내지 20㎎, 0.25 내지 15㎎, 0.25 내지 12㎎, 0.25 내지 10㎎, 0.25 내지 8㎎, 0.25㎎ 내지 7㎎, 0.25㎎ 내지 5㎎, 0.5㎎ 내지 2.5㎎, 1㎎ 내지 20㎎, 1㎎ 내지 15㎎, 1㎎ 내지 12㎎, 1㎎ 내지 10㎎, 1㎎ 내지 8㎎, 1㎎ 내지 7㎎, 1㎎ 내지 5㎎, 또는 1㎎ 내지 2.5㎎일 수 있다.
본 개시내용의 IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 투여량은 대상체에서 적어도 0.1㎍/㎖, 적어도 0.5㎍/㎖, 적어도 1㎍/㎖, 적어도 2㎍/㎖, 적어도 5㎍/㎖, 적어도 6㎍/㎖, 적어도 10㎍/㎖, 적어도 15㎍/㎖, 적어도 20㎍/㎖, 적어도 25㎍/㎖, 적어도 50㎍/㎖, 적어도 100㎍/㎖, 적어도 125㎍/㎖, 적어도 150㎍/㎖, 적어도 175㎍/㎖, 적어도 200㎍/㎖, 적어도 225㎍/㎖, 적어도 250㎍/㎖, 적어도 275㎍/㎖, 적어도 300㎍/㎖, 적어도 325㎍/㎖, 적어도 350㎍/㎖, 적어도 375㎍/㎖, 또는 적어도 400㎍/㎖의 혈청 역가(serum titer)를 달성할 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용의 항체의 투여량은 대상체에서 적어도 0.1㎍/㎖, 적어도 0.5㎍/㎖, 적어도 1㎍/㎖, 적어도, 2㎍/㎖, 적어도 5㎍/㎖, 적어도 6㎍/㎖, 적어도 10㎍/㎖, 적어도 15㎍/㎖, 적어도 20㎍/㎖, 적어도 25㎍/㎖, 적어도 50㎍/㎖, 적어도 100㎍/㎖, 적어도 125㎍/㎖, 적어도 150㎍/㎖, 적어도 175㎍/㎖, 적어도 200㎍/㎖, 적어도 225㎍/㎖, 적어도 250㎍/㎖, 적어도 275㎍/㎖, 적어도 300㎍/㎖, 적어도 325㎍/㎖, 적어도 350㎍/㎖, 적어도 375㎍/㎖, 또는 적어도 400㎍/㎖의 항체 역가를 달성할 수 있다.
본 개시내용의 IL-2 항체, 또는 이의 항원-결합 부분의 투여량은 반복될 수 있고, 투여는 적어도 1일, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3개월, 또는 적어도 6개월이 분리될 수 있다.
특정한 환자에 대한 유효량은 인자, 예컨대 치료하고자 하는 병태, 환자의 전반적인 건강, 방법 경로, 투여 용량 및 부작용의 중증도에 따라서 달라질 수 있다(예를 들어, 문헌[Maynard, et al., 1996, A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FIa.; Dent, 2001, Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ, London, UK] 참고).
투여 경로는 예를 들어, 국소 적용 또는 피부 적용, 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내, 뇌척수내, 병변내 주사 또는 주입, 또는 지속 방출 시스템 또는 임플란트에 의해서 일 수 있다(예를 들어, 문헌[Sidman et al., 1983, Biopolymers 22:547-556]; [Langer, et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277]; [Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105]; [Epstein, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692]; [Hwang, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034]; 미국 특허 제6,350,466호 및 제6,316,024호 참고). 필요한 경우, 조성물은 가용화제 및 주사 부위에서 통증을 완화시키기 위한 국부 마취제, 예컨대 리도카인을 또한 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어, 흡입기 또는 네뷸라이저의 사용, 및 에어로졸화제를 갖는 제형에 의한 폐 투여가 또한 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,019,968호, 제5,985,320호, 제5,985,309호, 제5,934,272호, 제5,874,064호, 제5,855,913호, 제5,290,540호, 및 제4,880,078호; 및 PCT 공개 제WO 92/19244호, 제WO 97/32572호, 제WO 97/44013호, 제WO 98/31346호, 및 제WO 99/66903호 참고, 이들 각각은 이들의 전문이 참고로 포함됨). 일 실시형태에서, 본 개시내용의 IL-2 항체, 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 조성물은 알커메스 에어(Alkermes AIR)(상표명) 폐 약물 전달 기술(알커메스, 인크.(Alkermes, Inc.), 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)을 사용하여 투여된다.
본 개시내용의 조성물은 또한, 관련 기술 분야에 공지된 다양한 방법 중 하나 이상을 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해서 투여될 수 있다. 통상의 기술자가 인지할 바와 같이, 투여 경로 및/또는 모드는 목적하는 결과에 따라서 달라질 것이다. 본 개시내용의 항체에 대해 선택된 투여 경로는, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 비경구 투여는 장관 투여 및 국소 투여가 아닌, 통상적으로 주사에 의한 투여 모드를 나타낼 수 있고, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 대안적으로, 본 개시내용의 조성물은 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해서, 예를 들어 비강내로, 경구로, 질내로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다.
본 개시내용의 IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 제어 방출 또는 지속 방출 시스템으로 투여되는 경우, 제어 또는 지속 방출을 달성하기 위해서 펌프가 사용될 수 있다(예를 들어, 상기 문헌[Langer; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20]; [Buchwald et al., 1980, Surgery 88:501]; [Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:514] 참고).
중합체 재료가 본 개시내용의 치료제의 제어 또는 지속 방출을 달성하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, FIa. (1974)]; [Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); [Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. ScL Rev. Macromol. Chem. 23:61]; 참고 또한 [Levy et al, 1985, Science 11 225:190]; [During et al., 19Z9, Ann. Neurol. 25:351]; [Howard et al, 1989, J. Neurosurg. 71: 105] 참고; 미국 특허 제5,679,377호; 미국 특허 제5,916,597호; 미국 특허 제5,912,015호; 미국 특허 제5,989,463호; 미국 특허 제5,128,326호; PCT 공개 제WO 99/15154호; 및 PCT 공개 제. WO 99/20253호 참고). 지속 방출 제제에 사용되는 중합체의 예는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜리드(PLG), 폴리무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리락티드(PLA), 폴리락티드-코-글리콜리드(PLGA), 및 폴리오쏘에스터를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일 실시형태에서, 지속 방출 제형에 사용되는 중합체는 불활성이고, 침출 가능한 불순물이 없고, 저장 안정성이고, 멸균되어 있고, 생분해성이다. 제어 또는 지속 방출 시스템은 예방적 또는 치료적 표적에 인접하여 위치될 수 있고, 따라서 전신 용량의 분획만을 필요로 한다(예를 들어, 문헌Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)] 참고).
제어 방출 시스템은 문헌[Langer, 1990, Science 249:1527-1533]에 의한 검토에 논의되어 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 기술을 사용하여 본 개시내용의 1종 이상의 항체 또는 이의 접합체를 포함하는 지속 방출 제형을 생성할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,526,938호, 국제 특허 공개 제WO 91/05548호, 제WO 96/20698호, 문헌[Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy and Oncology 59:179-189], [Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 50:372-397], [Cleek et ah, 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Ml. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854], 및 [Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Ml. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-160] 참고, 이들 각각은 이들의 전문이 참고로 포함됨).
본 개시내용의 IL-2 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 국소로 투여되는 경우, 이것은 연고, 크림, 경피 패치, 로션, 겔, 샴푸, 스프레이, 에어로졸, 용액, 에멀션, 또는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다른 형태의 형태로 제형화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)] 참고). 비-분무 가능한 국소 투여 형태의 경우에, 국소 적용에 상용성인 담체 또는 1종 이상의 부형제를 포함하고 일부 경우에 물보다 큰 동적 점도를 갖는 점성 내지 반고체 또는 고체 형태가 전형적으로 사용된다. 적합한 제형는, 바람직한 경우, 멸균되거나, 또는 예를 들어 삼투압과 같은 다양한 특성에 영향을 미치기 위한 보조제(예를 들어, 보존제, 안정화제, 습윤제, 완충제, 또는 염)와 혼합되는, 용액, 현탁액, 에멀션, 크림, 연고, 분말, 도찰제(liniment), 살브(salve) 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 다른 적합한 국소 투여 형태는 활성 성분이 일부 경우에 고체 또는 액체 불활성 담체와 조합되어 가압 휘발성 물질(예를 들어, 기체상 추진제, 예컨대 프레온)과의 혼합물 중에 또는 압착병 내에 패키징되는 분무 가능한 에어로졸 제제를 포함한다. 보습제 또는 함습제가 또한 바람직한 경우, 약제학적 조성물 및 투여형에 첨가될 수 있다. 이러한 추가 성분의 예는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다.
IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 조성물이 비강내로 투여되는 경우, 이것은 에어로졸 형태, 스프레이, 미스트 또는 점적제의 형태로 제형화될 수 있다. 특히, 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 예방제 또는 치료제는 적합한 추진제(예를 들어, 다이클로로다이플루오로메탄, 트라이클로로플루오로메탄, 다이클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체)를 사용하여, 가압 팩 또는 네뷸라이저로부터 에어로졸 스프레이 제공물의 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우에, 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 캡슐 및 카트리지(예를 들어, 젤라틴으로 구성됨)는 화합물의 분말 믹스 및 적합한 분말 베이스, 예컨대 락토스 또는 전분을 함유하여 제형화될 수 있다.
제2 치료제, 예를 들어 사이토카인, 스테로이드, 화학요법제, 항생제 또는 방사선과 함께 공동-투여 또는 치료하는 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다(문헌[Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10 th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.]; [Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams and Wilkins, Phila., Pa.]; [Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams and Wilkins, Phila., Pa.] 참고). 치료제의 유효량은 증상을 적어도 10%; 적어도 20%; 적어도 약 30%; 적어도 40%, 또는 적어도 50%만큼 감소시킬 수 있다.
본 개시내용의 IL-2 항체, 또는 항원-결합 부분과 조합하여 투여될 수 있는, 추가 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 본 개시내용의 항체로부터 5분 미만의 간격, 30분 미만의 간격, 1시간 간격, 약 1시간 간격, 약 1 내지 약 2시간 간격, 약 2시간 내지 약 3시간 간격, 약 3시간 내지 약 4시간 간격, 약 4시간 내지 약 5시간 간격, 약 5시간 내지 약 6시간 간격, 약 6시간 내지 약 7시간 간격, 약 7시간 내지 약 8시간 간격, 약 8시간 내지 약 9시간 간격, 약 9시간 내지 약 10시간 간격, 약 10시간 내지 약 11시간 간격, 약 11시간 내지 약 12시간 간격, 약 12시간 내지 18시간 간격, 18시간 내지 24시간 간격, 24시간 내지 36시간 간격, 36시간 내지 48시간 간격, 48시간 내지 52시간 간격, 52시간 내지 60시간 간격, 60시간 내지 72시간 간격, 72시간 내지 84시간 간격, 84시간 내지 96시간 간격, 또는 96시간 내지 120시간 간격으로 투여될 수 있다. 2종 이상의 요법은 동일한 환자 방문일 내에 투여될 수 있다.
본 개시내용의 IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 및 다른 요법은 주기적으로 투여될 수 있다. 주기 요법은 임의의 시간 기간 동안 제1 요법(예를 들어, 제1 예방제 또는 치료제)의 투여, 그 다음 임의의 시간 기간 동안 제2 요법(예를 들어, 제2 예방제 또는 치료제)의 투여, 임의로 그 다음 임의의 시간 기간 동안의 제3 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)의 투여 등, 및 이러한 순차적인 투여의 반복, 즉 요법 중 하나에 대한 내성의 발생을 감소시키고/거나, 요법 중 하나의 부작용을 회피 또는 감소시키고/거나, 요법의 효능을 개선시키기 위한 주기를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 IL-2 항체는 아드리마이신, 아자싸이오퓨린, 부설판, 사이클로포스파마이드, 사이클로스포린 A, 사이톡산, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트 모페틸, 6-머캅토퓨린, 코르티코스테로이드, 비스테로이드성 항-염증제, 시롤리무스(라파마이신), 및 타크롤리무스(FK-506)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 자가면역 질환 및 장애를 치료하기 위한 조성물과 공동-투여될 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 면역조절제 또는 면역억제제는 무로모맙-CD3, 알렘투주맙(캄패쓰(Campath)(등록상표)), 바실릭시맙, 다클리주맙, 무로모맙(OKT3(등록상표)), 리툭시맙, 항-흉선세포 글로불린 및 IVIg 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체이며, 이들은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 IL-2 항체는 바이구아나이드(예를 들어, 부포민, 메트포민 및 펜포민), 호르몬 및 이의 유사체(아밀린, 인슐린, 인슐린 아스파트, 인슐린 데테미어, 인슐린 글라진, 인슐린 글루리신, 인슐린 리스프로, 리라글루타이드, 및 프람린타이드), 설포닐우레아 유도체(아세토헥사마이드, 카르부타마이드, 클로르프로파마이드, 글리보르누라이드, 글리클라자이드, 글리메피라이드, 글리피자이드, 글리퀴돈, 글리속세피드, 글리부라이드, 글리부싸이아졸, 글리부졸, 글리헥사마이드, 글리미딘, 톨라자마이드, 툴부타마이드, 및 톨사이클라마이드), 싸이아졸리딘다이온(피오글리타존, 로지글리타존 및 트로글리타존), 아카보스, 엑세나타이드, 미글리톨, 미티글리나이드, 무라글리타자, 나테글리나이드, 레파글리나이드, 시타글립틴, 테사글리자타자, 빌다글립틴, 보글리보스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 당뇨병을 위한 조성물과 공동-투여될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 IL-2 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 생체내에서 적절한 분포를 보장하기 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽(BBB)은 많은 고도로 친수성인 화합물을 배제시킨다. 본 개시내용의 치료 화합물이 (원하는 경우에) BBB를 통과하는 것을 보장하기 위해서, 이것을 예를 들어 리포솜 내에 제형화할 수 있다. 리포솜을 제조하는 방법에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 제4,522,811호; 제5,374,548호; 및 제5,399,331호를 참고한다. 리포솜은 특정 세포 또는 기관 내로 선택적으로 수송되는 1개 이상의 모이어티를 포함할 수 있고, 따라서 표적화 약물 전달을 향상시킬 수 있다(예를 들어, 문헌[V.V. Ranade, 1989, J. Clin. Pharmacol. 29:685] 참고). 예시적인 표적화 모이어티는 폴레이트 또는 바이오틴(예를 들어, 미국 특허 제5,416,016호); 만노사이드(Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); 항체 (P. G. Bloeman et al., 1995, FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al., 1995, Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); 계면활성제 단백질 A 수용체(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134); pl20 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)을 포함한다(또한 문헌[K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994, FEBS Lett. 346:123; Killion; Fidler, 1994; Immunomethods 4:273] 참고).
본 개시내용은 본 개시내용의 IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 약제학적 조성물을 단독으로 또는 다른 요법 조합하여, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 프로토콜을 제공한다. 본 개시내용의 병용 요법의 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 대상체에게 부수적으로(concomitantly) 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 본 개시내용의 병용 요법의 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 또한, 주기적으로 투여될 수 있다. 주기 요법은 임의의 시간 기간 동안 제1 요법(예를 들어, 제1 예방제 또는 치료제)의 투여, 그 다음 임의의 시간 기간 동안 제2 요법(예를 들어, 제2 예방제 또는 치료제)의 투여, 및 이러한 순차적 투여의 반복, 즉 요법(예를 들어, 작용제) 중 하나에 대한 내성의 발생을 감소시키고/거나, 요법 (예를 들어, 작용제) 중 하나의 부작용을 회피 또는 감소시키고/거나, 요법의 효능을 개선시키기 위한 주기를 포함한다.
본 개시내용의 병용 요법의 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 대상체에게 공동으로(concurrently) 투여될 수 있다. 용어 "공동으로"는 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)을 정확하게 동시에 투여하는 것으로 제한되지 않고, 오히려 본 개시내용의 IL-2 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 약제학적 조성물을 본 개시내용의 항체 또는 이의 접합체가 다른 요법(들)과 함께 작용하여 이들을 달리 투여한 경우보다 증가된 이익을 제공할 수 있도록 하는 순서로 그러한 시간 간격 내에서 대상체에게 투여하는 것을 의미한다. 예를 들어, 각각의 요법은 동시에 또는 상이한 시간 지점에서 임의의 순서로 순차적으로 대상체에게 투여될 수 있지만; 동시에 투여되지 않는 경우에도, 이들은 목적하는 치료 또는 예방 효과를 제공하기 위해서 충분히 가까운 시간 내에 투여되어야 한다. 각각의 요법은 임의의 적절한 형태로 그리고 임의의 적합한 경로에 의해서 대상체에게 개별적으로 투여될 수 있다. 각종 실시형태에서, 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)는 대상체에게 15분 미만, 30분 미만, 1시간 미만의 간격, 약 1시간 간격, 약 1시간 내지 약 2시간 간격, 약 2시간 내지 약 3시간 간격, 약 3시간 내지 약 4시간 간격, 약 4시간 내지 약 5시간 간격, 약 5시간 내지 약 6시간 간격, 약 6시간 내지 약 7시간 간격, 약 7시간 내지 약 8시간 간격, 약 8시간 내지 약 9시간 간격, 약 9시간 내지 약 10시간 간격, 약 10시간 내지 약 11시간 간격, 약 11시간 내지 약 12시간 간격, 24시간 간격, 48시간 간격, 72시간 간격, 또는 1주 간격으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 2종 이상의 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 동일한 환자 방문일 내에 투여된다.
조합 요법의 예방제 또는 치료제는 대상체에게 동일한 약제학적 조성물로 투여될 수 있다. 대안적으로, 조합 요법의 예방제 또는 치료제는 대상체에게 별개의 약제학적 조성물로 공동으로 투여될 수 있다. 예방제 또는 치료제는 대상체에게 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로에 의해서 투여될 수 있다.
키트
본 개시내용은 또한 본 명세서에 기술된 항체 중 임의의 것 또는 모두를 포함하는 키트를 제공한다. 본 개시내용의 키트는 본 명세서에 기술된 IL-2 항체를 포함하는 1개 이상의 용기, 및 본 명세서에 기술된 본 개시내용의 방법 중 임의의 것에 따른 사용 지시서를 포함한다. 일반적으로, 이들 지시서는 상기에 기술된 치료적 치료를 위한 항체의 투여의 설명을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 단일-용량 투여 단위를 생성하기 위해서 제공된다. 특정 실시형태에서, 키트는 건조된 단백질을 갖는 제1 용기 및 수성 제형을 갖는 제2 용기 둘 모두를 함유할 수 있다. 특정 실시형태에서, 어플리케이터, 예를 들어 단일 및 다중-챔버 사전-충전된 주사기(예를 들어, 액체 주사기 및 라이오시린지(lyosyringe))를 함유하는 키트가 포함된다.
IL-2 항체의 사용에 관련된 지시서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 스케줄, 및 투여 경로에 대한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 개시내용의 키트에 제공되는 지시서는 전형적으로 레이블 또는 패키지 삽입물(예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트) 상의 서면 지시서이지만, 기계-판독 가능한 명령어(예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크에 저장된 명령어)가 또한 허용된다.
본 개시내용의 키트는 적합한 패키징 내에 존재한다. 적합한 패키징은 바이알, 병, 자(jar), 가요성 패키징(예를 들어, 밀봉된 마일라(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또한, 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치(예를 들어, 아토마이저) 또는 주입 장치, 예컨대 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해서 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 용기가 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해서 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 적어도 1종의 활성제는 본 개시내용의 IL-2 항체이다. 용기는 제2의 약제학적 활성제를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 임의로 추가 성분, 예컨대 완충제 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 일반적으로, 키트는 용기, 및 용기 상의 또는 그와 연관된 레이블 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 기술된 항체 중 임의의 것 또는 모두를 포함하는 진단 키트를 제공한다. 진단 키트는, 예를 들어, 샘플에서 IL-2의 존재를 검출하는데 유용하다. 일부 실시형태에서, 진단 키트는 개인이 IL-2-매개 질환, 장애 또는 병태가 발생할 위험에 처할 수 있는 잠재성 질환, 장애 또는 병태를 가진 개인을 식별하기 위해서 사용될수 있다. 일부 실시형태에서, 진단 키트는 IL-2 매개 질환 또는 IL-2 결핍 질환, 장애 또는 병태를 갖는 것으로 의심되는 개인에서 IL-2의 존재 및/ 또는 수준을 검출하는데 사용될 수 있다.
본 개시내용의 진단 키트는 본 명세서에 기술된 IL-2 항체를 포함하는 1개 이상의 용기, 및 본 명세서에 기술된 본 개시내용의 임의의 방법에 따른 사용 지시서를 포함한다. 일반적으로, 이들 지시서는 IL-2 매개 질환 또는 IL-2 결핍 질환, 장애 또는 병태의 위험이 있거나 이러한 질환을 갖는 것으로 의심되는 개인에서 IL-2의 존재를 검출하기 위한 IL-2 항체의 사용에 관한 설명을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예시적인 진단 키트는 시약, 예컨대, 예를 들어 IL-2 항체, 음성 대조군 샘플, 양성 대조군 샘플, 및 키트의 사용에 대한 지시서를 함유하도록 구성될 수 있다.
등가물
상기 설명 및 하기 실시예는 본 개시내용의 구체적인 특정 실시형태를 상술하고, 본 발명자에 의해서 고려되는 최상의 모드를 기술한다. 그러나, 상술된 상기 내용이 텍스트로 존재할 수 있더라도, 본 개시내용은 많은 방식으로 실시될 수 있고, 본 개시내용은 첨부된 청구범위 및 이의 임의의 등가물에 따라 해석되어야 한다는 것이 인지될 것이다
개시된 교시는 다양한 적용, 방법, 키트 및 조성물을 참고로 기술되어 있지만, 본 명세서의 교시 및 하기 청구된 개시내용으로부터 벗어남 없이 다양한 변화 및 변형이 행해질 수 있음이 인식될 것이다. 하기 실시예는 개시된 교시를 보다 양호하게 예시하기 위해서 제공되는 것이며, 본 명세서에 제시된 교시의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다. 본 개시는 이들 예시적인 실시형태와 관련하여 기술되지만, 통상의 기술자는 이들 예시적인 실시형태의 다수의 변경 및 변형이 과도한 실험 없이 가능함을 쉽게 이해할 것이다. 모든 이러한 변경 및 변형은 본 교시의 범주에 속한다.
특허, 특허 출원, 논문, 교과서 등 및 이들에 인용된 참고문헌을 비롯한, 본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌은 이미 인용되지 않은 정도까지 이들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 포함된 문헌 및 유사한 문헌 중 하나 이상이 정의된 용어, 용어 사용, 기술된 기술 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 본 출원과 상이하거나 모순되는 경우, 본 출원이 우선시된다.
예시적인 실시형태
본 개시내용은 하기 실험 실시예를 참고로 상세하게 추가로 기술된다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 달리 명시되지 않는 한 제한이도록 의도되지 않는다. 따라서, 본 개시내용은 어떠한 방식으로도 하기 실시예에 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되고, 본 명세서에 제공된 교시의 결과로서 명백해진 임의의 및 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예
실시예 1. IL-2 항체 결합 동역학 및 친화도
IL-2에 대한 항체의 친화도를 바이아코어 T200 기기(지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해서 결정하였다. 항-IL-2 IgG를 제조사 설명서(지이 헬쓰케어)에 따라서 바이아코어 인간 항체 캡처 키트를 사용하여 제조된 항-인간 IgG에 의해서 CM5 센서 칩 상에 캡처하였다. 마우스 항-인간 IL-2 클론 5344(클론 5344.111, 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))를 제조사 설명서(지이 헬쓰케어)에 따라서 바이아코어 마우스 항체 캡처 키트를 사용하여 제조된 항-마우스 IgG 캡처 표면 상에 캡처하였다. 0.01M HEPES(pH 7.4), 0.15M NaCl 및 0.005% v/v 계면활성제 P20(HBS-P) 완충제 중에서 30㎕/분 유량을 사용하여 25℃에서 실험을 수행하였다. 각각의 사이클 후, 칩 표면을 3M MgCl2 및 캡처된 새로운 항체를 사용하여 재생시켰다. 재조합 IL-2(휴먼자임(Humanzyme), 미국 일리노이주 시카고 소재)를 3분 동안 표면 상에 주사하고, 추가 20분 동안 회합을 모니터링하였다. 바이아코어 T200 평가 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, 단지 고정된 캡처 항체를 갖는 인접한 대조군 유동 세포로부터의 신호를 각각의 항체에 대한 완충액 단독 주사와 함께 배경 뺄셈하였다. 1:1 랭뮈어(Langmuir) 결합 모델을 사용하여 모든 결합 곡선을 핏팅하였다.
결과
시험된 인간 항체는 536pM 내지 13.4nM 범위의 친화도로 IL-2에 결합한다(표 3). d1C7/IL-2 복합체에 대해서 상대적으로 IL-2Rβ 결합을 저해하고, IL-2Rα에 대한 결합을 감소시키는 이의 능력에 대해서 식별된 항체는, 비교인자 클론 16C3 및 d1C7과 비교할 때 IL-2에 대해서 더 약한 친화도를 갖는다. 5344 항체는 바이아코어 기기의 검출 한계를 초과하는 매우 안정한 오프-레이트를 가짐을 발견하였고, 계산된 친화도는 50pM 이하인 것으로 추정되며, 시험된 인간 항체 클론과 비교할 때 상당히 더 느린 오프-레이트를 갖는다. 5344의 상당히 더 느린 오프-레이트는 하기 본 출원(실시예 5)에 기술된 다른 hIL-2 항체에 의해서 나타난 목적하는 Treg 스퍼링 특성을 갖지 않는 항체에 기여할 수 있다.
Figure pct00006
항체 F5.1.11, d1C7, 13A10, 및 16C3을 사용한 mIL-2 및 hIL-2 결합 연구는, F5.1.11 및 d1C7은 mIL-2에 결합하지 않고, 13A10 및 16C3은 hIL-2와 비교할 때 감소된 친화도로 mIL-2에 결합하는 것을 나타낸다(데이터 나타내지 않음).
실시예 2. IL-2/항체 복합체 수용체 결합
IL-2 수용체 IL- 2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 IL-2 결합을 변형시키는 항체의 능력을 바이아코어 T200 기기(지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 사용하여 평가하였다. 재조합 IL-2α 및 IL-2Rβ 단백질을 바이오틴 표지화하였고, 바이아코어 스트렙타비딘 칩(지이 헬쓰케어) 상에 캡처하였다. 실험을 10mM HEPES(pH 7.4), 150mM NaCl 및 0.005% v/v 계면활성제 P20 완충제 중에서 10㎕/분 유량을 사용하여 25℃에서 수행하였다. IL-2(333nM)를 적어도 20분 동안 IgG(1000nM)과 함께 사전-인큐베이션시켰다. IL-2/항체 복합체를 60초 동안 수용체 커플링된 칩 표면 상에 주사하고, 20분 동안 해리되게 하였다. 데이터를 인접한 대조군 유동 세포 및 완충제 단독 주사를 사용하여 배경 뺄셈하였다. 반응을 60초 후에 IL-2α 및 IL-2Rβ에 대한 결합으로서, 각각 IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한, IL-2와의 복합체의 2개의 대표적인 클론, d1C7 및 16C3의 결합 백분율로서 보고한다.
결과
클론 16C3/IL-2 복합체는 IL-2Rβ에 결합한 반면, d1C7/IL-2 복합체는 IL-2Rβ가 아닌 IL-2Rα에 결합하였다. 이들 2종의 항체/IL-2 복합체를 대표적인 클론으로서 사용하여 IL-2Rα 및 IL-2Rβ 결합에 대해서 정규화하였다. 시험된 항체/IL-2 복합체 각각을 수용체 각각에 대한 이의 상대적인 결합으로서 보고한다. 클론 4.7.062, F5.1.11, F4.7.6, F4.7.8, F5.1.9 및 상업적으로 입수 가능한 5344(클론 5344.111, 비디 바이오사이언시스)는 모두 d1C7/IL-2 복합체와 유사하게 IL-2Rβ에 대한 결합으로부터 IL-2를 저해하였고, d1C7/IL-2 복합체와 비교할 때 IL-2Rα에 대해서 감소된 결합을 나타내었다. 따라서, 이들 항체는 IL-2Rβ에 대한 IL-2 결합을 차단하고, IL-2Rα에 대한 결합 비율을 감소시키는 이의 능력이 식별되었다(도 1).
실시예 3. 항체/IL-2 친화도 및 친화도 성숙 클론에 대한 수용체 결합
친화도-성숙 F5.1.11 항체/IL-2 복합체의 결합 동역학 및 수용체 결합 프로파일을 모 항체에 대해서 기술된 바와 같이(실시예 1) 표면 플라스몬 공명을 사용하여 측정하였다.
결과
친화도 성숙 조작은 IL-2에 대한 클론 F5.1.11의 겉보기 결합 친화도를 16-배까지 증가시켰다. 3종의 친화도-성숙 변이체, F5.1.11.02, F5.1.11.04 및 F5.1.11.08은, IL-2에 대한 결합 친화도가 각각 114, 624 및 205pM인 것으로 측정되었다. IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 결합하는 항체/IL-2 복합체의 특징규명은, 더 높은 친화도 변이체의 수용체 결합 프로파일이 모 분자와 비교할 때 유지되었다는 것을 발견하였다. 모 클론 및 친화도 성숙 클론 둘 모두는 클론 d1C7/IL-2 복합체와 비교할 때 IL-2Rβ에 대한 항체/IL-2 복합체 결합의 완전한 저해 및 IL-2Rα에 대한 결합 감소를 나타내었다. IL-2Rα에 대한 모 F5.1.11/IL-2 결합에서의 일부 변화가 실험 과정 전반에서 관찰되었는데, 이는 잠재적인 범위를 도시하기 위해서 그래프 상에서 점선으로 표시된다. 3종의 더 높은 친화도 변이체, F5.1.11.02, F5.1.11.04 및 F5.1.11.08은 모두 이 범위 내에 포함된다(표 4 및 도 2).
Figure pct00007
실시예 4. IL-2:항-IL-2 mAb 치료 후의 Treg의 표현형
IL-2-항-IL-2 복합체 치료
PBMC를 피콜에 의해서 건강한 공여자로부터 단리하고, 12.5ng/㎖ 항CD3 및 25ng/㎖ 항CD28로 밤새 활성화시켰다. 밤새 인큐베이션시킨 후, 세포를 수거하고, PBS 중에서 철저히 세척하고, 200㎕의 PBS 중의 30x106개 세포의 농도로 재현탁시켰다. PBMC를 NSG 수여자에게 i.v. 주사하였다. 인간 PBMC가 주사된 NSG 마우스에게 30분 동안 37℃에서 25㎍의 아이소타입, 25㎍의 16C3, 1㎍, 5㎍ 또는 25㎍의 Ab F5.1.11.02와 복합된 8,000U hIL-2(프로류킨)를 5일 동안 복강내 주사로 제공하였다.
비장세포의 단리 및 세포 염색
마우스를 CO2로 희생시키고, 비장세포를 수거하고, 항 인간 CD45 퍼시픽 오렌지, CD4 PercPCy 5.5, CD3 PeCy7/퍼시픽 블루/PercP, CD25 APC-Cy7/Pe, CD238 Pe, CD39 PeCy7, CD8 APC-H7, Ki67 Pe, NKG2D PeCy7, CD44 V450으로 세포외 염색하고, 항 인간 헬리오스 FITC 및 FoxP3 APC로 세포내 염색하였다. 표지된 항체는 비디 파민젠(BD PharMingen) 또는 이바이오사이언스(Ebioscience)로부터 구입하였다. 염색된 단일 세포 현탁물을 플로우조(FlowJo) 소프트웨어와 함께 분석 및 제공되는 FACSDiva(비디 바이오사이언시스) 및 FSC 3.0 파일을 구동시키는 포테사(Fortessa) 유세포 분석기로 분석하였다.
결과
hIL-2와의 복합체의 항체 16C3은 비장에서 Treg 백분율을 증가시켰다. Treg 백분율의 증분 증가가 또한 항체 F5.1.11.02의 2개의 상이한 용량(5㎍ 및 25㎍)으로의 치료에 대한 반응으로 관찰되었다. Treg 집단은 hCD45+ CD3+ CD4+ 헬리오스+ FoxP3+ 세포에 대해서 게이팅형이었다(도 3). hIL-2와의 복합체의 16C3 및 F5.1.11.02 둘 모두는 Treg/Teff 및 Treg/NK 세포 비율을 증가시킨다
hIL-2와의 복합체의 16C3(25㎍)은 Treg/CD4, Treg/CD8 및 Treg/NK 세포 비율을 증가시켰다. 제1 실험에서 최저 용량(1㎍)에서의 F5.1.11.02로의 치료는 이 비율의 증가를 나타내지 않았다. 대신에 hIL-2와의 복합체의 5㎍ 및 25㎍의 F5.1.11.02에 대한 반응으로 Treg/CD4, Treg/CD8 및 Treg/NK 세포 비율의 상당한 증가가 관찰되었다(도 4A 내지 C). 제2 실험에서, 16C3 및 5㎍ 및 25㎍의 F5.1.11.02에 대해서 동일한 결과가 관찰되었고, 또한, 이 비율의 증가는 또한 저용량의 F5.1.11.02(1㎍)로도 명백하였다(도 4D 내지 F). hIL-2와의 복합체의 16C3 및 F5.1.11.02 둘 모두는 Teff 및 Treg 총 세포수를 증가시킨다. hIL-2와의 복합체의 16C3(25㎍)은 두 실험에서 비장에서 CD4+, CD8+ 세포 및 Treg의 총수를 증가시켰다.
hIL-2와의 복합체의 F5.1.11.02가 또한 CD4+, CD8+, 및 Treg 총 세포수의 증가를 나타내었다. 이 효과는 제1 실험에서 5㎍ 및 25㎍의 F5.1.11.02의 용량에서 보다 명백하였다(도 5A 내지 C). 제2 실험은 F5.1.11.02에 대한 반응으로 용량 의존적 방식으로 CD4+, CD8+ 세포 및 Treg의 총수의 증가를 나타내었다(도 5D 내지 F). F5.1.11.02로의 치료는 또한 Treg 상에서 CD25, Icos 및 FoxP3 평균 형광 강도(MFI)의 증가를 유도하였는데, 이는 16C3의 존재 하에서는 관찰되지 않았다(도 6A 내지 C).
실시예 5. 항-IL-2 항체는 pSTAT5를 저해한다
Foxp3 프로모터의 제어 하에서 GFP를 발현하는 C57Bl6으로부터의 비장세포를 수거하고, 단일 세포 현탁물로 가공하고, RPMI 0.1% BSA 중에 재현탁시켰다. 세포를 검정 시까지(1 내지 2시간) 조직 배양 인큐베이터에서 37℃에 두었다.
PBMC를 인간 트리마(Trima) 잔류물(블러드 센터즈 오브 퍼시픽(Blood Centers of the Pacific))로부터 정제하고, RPMI 0.1% BSA 중에 재현탁시켰다. 세포를 검정시까지(1 내지 2시간) 조직 배양 인큐베이터에서 37℃에 두었다.
IL-2-유도된 pSTAT5 검정
PBMC 또는 비장세포를 96웰 V-바닥 플레이트에 플레이팅하여, 1백만개의 세포가 각각의 웰에 50㎕(RPMI, 0.1% BSA)의 부피로 존재하였다. 플레이트를 37℃ 인큐베이터에 다시 넣어 온도를 유지시켰다. 항체(JES6-1(JES6-1A12 이바이오사이언스) 또는 항-인간 IL-2)를 적정하고, IL-2를 4개의 농도: 500ng/㎖, 50ng/㎖, 5ng/㎖, 및 0.5ng/㎖에서 시험하였다.
상업적으로 입수 가능한 마우스 IL-2 단클론성 항체 JES6-1은 IL2Rα 및 IL2Rβ 인터페이스 둘 모두를 차단한다(
Figure pct00008
et al. 2013, "Mathematical models of the impact of IL2 modulation therapies on T cell dynamics," Frontiers in Immunology, 4:439, 이의 전문은 본 명세서에 참고로 포함됨). JES6-1은 hIL-2가 아닌 mIL-2에 결합하는데, 그 이유는 에피토프가 hIL-2에서 보존되기 때문이다. hIL-2 잔기 Q22 및 M23에 상응하는 mIL-2 잔기 Q36 및 E37을 비롯한, IL-2에 대한 JES6-1의 결합을 위한 주요 아미노산 잔기는 문헌[Spangler et al. 2015, "Antibodies to Interleukin-2 Elicit Selective T Cell Subset Production through Distinct Conformational Mechanisms," Immunity, 42: 815](이의 전문이 참고로 본 명세서에 포함됨)의 도 3, 4, S2, S3, 및 S4에 상술되어 있다. mIL-2/mIL-2Rβ의 KD는 스판글러(Spangler) 등에 의해서 7μM 초과로서 보고되어 있고, mIL-2/mIL-2Rα의 경우 KD는 hIL-2에서보다 2 내지 4배 더 약하다. 마우스 IL-2 아미노산 서열과 인간 IL-2 아미노산 서열의 비교는 문헌[Yokota et al. 1985, "Use of a cDNA expression vector for isolation of mouse interleukin 2 cDNA clones: Expression of T-cell growth-factor activity after transfection of monkey cells," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 68](이의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨)의 도 6에서 입수 가능하다.
동일 부피(50㎕)의 2x IL2:항체 복합체(37℃에서 1시간 동안 제조됨)를 웰에 첨가하고, 세포를 37℃ 인큐베이터에서 40분 동안 배양하였다. 100㎕의 IC 고정 완충제(이바이오사이언스)를 첨가하여 세포를 고정시켰다. 15분 고정 후, 세포를 세척하고, 염색 시까지 FACs 완충제(PBS+0.2%BSA) 중에 저장하였다.
검정 플레이트를 원심분리시켜 세포를 펠렛화하고, 관통 완충제 III(비디 바이오사이언시스)를 사용하여 세포를 재현탁시키고, 그 다음 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 세포를 FACs 완충제 중에서 2회 세척하고, PBMC에 대해서 하기 Ab로 염색하였다: 이바이오사이언스로부터의, 항-인간 CD3 APC e780, CD4 Percp e710, 및 CD127(PE). CD8 FITC, CD25(PeCy7), FoxP3(e660) 및 pSTAT5(퍼시픽 블루)를 비디 바이오사이언시스로부터 구입하였다. 비장세포의 경우, 하기 항-마우스 항체를 사용하였다: 이바이오사이언스로부터의, CD4 e660 및 CD8a PeCy7. pSTAT5 퍼시픽 블루(비디 바이오사이언시스)를 마우스 및 인간 세포 둘 모두에 대해서 사용하였다.
데이터를 LSR 포테사 상에서 수집하고, 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 데이터를 배경 뺄셈된 MFI로서 플롯팅하고, 각각의 세포 유형(IL2 500ng/㎖+아이소타입)에 대한 최대 신호에 정규화하였다. 배경은 비-자극되지만, 염색된, pSTAT5로서 정의된다. 인간 Treg는 CD3+CD8-CD4+CD25hiCD127lo로서 정의된다. 마우스 Treg는 CD8-CD4+Foxp3.GFP+ 세포로서 정의된다.
결과
PBMC: F5.1.11 친화도 변이체에서의 pSTAT5의 저해
F5.1.11의 친화도 변이체는, IL-2에 대해서 증가된 친화도를 갖는 항체, 예컨대 F5.1.11.02 및 F5.1.11.08이 CD8+ 효과기 T 세포, 및 비-Treg CD4+ T 세포에서 pSTAT5 신호전달을 저해하는 데 보다 효과적임을 입증하였다. Treg pSTAT5는 5 내지 500ng/㎖의 IL-2 농도에서 50% 초과로 유지되었다. 시험된 IL-2의 최저 농도(0.5ng/㎖)에서, Treg에서 pSTAT5 수준은 최대 신호의 50% 미만으로 저해되었지만, pSTAT5는 모든 Ab 농도 전체에서 여전히 검출되었다(도 7A 내지 V). 5344 항체를 또한 pSTAT5 신호전달 검정에서 시험하였고, Treg pSTAT5에서, IL-2의 낮은 농도에서 더 이상 검출되지 않았다(데이터 나타내지 않음).
JES6-1과 항체 F5.1.11.02의 비교
마우스 IL-2 항체 JES6-1은 아이소타입 대조군과 유사하게, 시험된 대부분의 IL-2 농도에서 Treg pSTAT5 신호전달을 스퍼링하였다(도 8A 내지 F). 반대로, IL-2 유도된 pSTAT5 신호전달은 마우스 CD8+ T 세포에서, 시험된 모든 IL-2 농도에서, JES6-1에 의해서 강하게 저해되었다. 이러한 데이터는, IL-2와의 복합체의 JES6-1이 생체내에서 Treg 세포의 성장을 촉진시킨다는 공개된 관찰과 일치한다.
항-인간 IL-2 항체 F5.1.11.02는 시험된 대부분의 IL-2 농도에서 인간 Treg pSTAT5 신호전달을 상당히 스퍼링하였다. CD8+ T 세포 pSTAT5는 시험된 모든 IL-2 농도에서 IL-2 항체 F5.1.11.02에 의해서 저해되었다. 종합적으로, CD8 및 Treg에서 IL-2 항체 F5.1.11.02의 pSTAT5 저해의 패턴은 마우스 IL-2 항체 JES6-1에서 관찰된 것과 유사하다.
표 5에서, 도 8A 내지 F로부터의 pSTAT5 %최대 값을 사용하여 아이소타입 또는 항-IL-2 항체로 처리된, Treg 또는 CD8 세포에 대한 곡선 하 면적 값을 생성하였다. IL-2의 각각의 농도에 대한 Treg/CD8 AUC의 비율을 열거하였다. 아이소타입 처리된 샘플에서, IL-2의 양의 감소는 AUC 비율을 증가시켰는데, 이는 CD8+ 효과기 세포에서보다 Treg에서 더 양호한 pSTAT5 신호전달을 반영한다. 절대 수치가 상이하지만, 이러한 관찰은 마우스 세포와 인간 세포 간에 일관되었다.
JES6-1 처리는 IL-2의 더 높은 농도에서 Treg에 우호적으로 비율이 이동되었다. AUC 비율에서의 유사한 변화가 F5.1.11.02 항체로 처리된 인간 세포에서 발생하였다.
종합적으로, F5.1.11.02는 JES6-1에 대해서 유사한 pSTAT5 신호전달 프로파일을 갖는 것으로 보였다.
Figure pct00009
CD25hi CD8 + T 세포의 pSTAT5 저해에 대한 항체 에피토프의 효과
일부 말초 CD8+ T 세포는 CD25(IL-2Rα)를 발현한다. 도 10A 및 B에 나타낸 바와 같이, 세포가 CD25 발현을 기초로 게이트형인 경우, CD25hi CD8 세포는 IL-2의 낮은 수준에 대해서 보다 감응성이었다. 따라서, 전체적으로 또는 부분적으로, CD25 결합의 IL-2 항체의 차단은 CD25hi CD8+ T 세포에서 pSTAT5 신호전달을 저해하는 데 필요할 수 있다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 낮은 용량의 IL-2(0.8ng/㎖)에 의해서 유도된 pSTAT5는 IL-2에 대한 IL-2Rα 결합을 차단한 IL-2 항체, 예컨대 13A10 또는 F5.1.11.02에 의해서 최적으로 저해되었다. 반대로, 신호전달을 가능하게 하는 데 IL-2Rα의 존재가 아마도 필요하지 않은, 고농도의 IL-2(500ng/㎖)는, IL-2Rβ에 대한 IL-2의 결합을 차단하는 항체, 예컨대 d1C7 또는 F5.1.11.02에 의해서 최적으로 저해되었다. 항체 F5.1.11.02는 다양한 IL-2 농도에 걸쳐서 CD8+ 효과기 T 세포에서 pSTAT5 신호전달을 최적으로 저해할 수 있었다.
L-2 항체 F5.1.9에 의한 pSTAT5 저해
IL-2 항체 F5.1.9 및 변이체 F5.1.9.5를 pSTAT5의 저해에 대해서 평가하였다(도 11A 내지 H). F5.1.9의 친화도 변이체 F5.1.9.5는 그것이 Treg에서 pSTAT5 신호전달을 저해한 것보다 더 높은 정도로 CD8+ 효과기 T 세포에서 pSTAT5 신호전달을 저해하는 데 효과적이었다. F5.1.9.5 k a (M-1s-1)는 1.23E+06이었고, k d (s-1)는 8.18E-04였고, KD(M)는 6.63E-10이었다.
실시예 6. NOD mIL-2 -/- hIL-2 +/- 마우스의 생성
마우스 IL-2-함유 박테리아 인공 염색체(BAC)(클론 RP23-290D8)를 인간 IL-2 암호 서열을 발현하도록 조작하였다. 하기 변형을 BAC에서 행하였다: 마우스 IL-2 프로모터, 5' 및 3' UTR 및 인트론은 무손상으로 유지시켰고; 마우스 신호 펩타이드를 인간의 것으로 대체하였고; 신호 펩타이드의 하류의 엑손 1의 3' 절반, 엑손 2 및 3을 인간 서열로 대체하였고; 엑손 4의 5' 절반을 인간 암호 서열로 대체하였다.
그 다음, 조작된 BAC를 FVB/NJ(프렌드 바이러스 B) 암컷 마우스(잭슨(Jackson))의 수정된 난모세포에 전핵 주사(pronuclear injection)를 통해서 전달하였다. 이어서, 수정된 난모세포를 FVB 암컷 마우스에 이식하여 FVB mIL-2 +/+ hIL-2 BAC + 마우스를 생성하였다. mIL2의 발현이 결여된 NOD 배경에서 마우스를 생성하기 위해서, FVB mIL-2 +/+ hIL-2 BAC + 마우스를 NOD mIL-2 -/- 마우스와 역교배하였다. 제I형 당뇨병을 가진 마우스를 생성하기 위해서 이러한 처음 번식으로부터 생성된 NOD mIL-2 -/- hIL-2 BAC +/- 마우스를 NOD mIL-2 -/- 마우스와 8세대 동안 역교배하였다. 수득된 마우스를 실험을 위해서 사용하였다.
방법
ACK 용해 후, 전혈(100㎕)을 밤새 PMA/아이오노마이신으로 자극시키고, 상청액(125㎕)을 수집하고, mIL-2(50㎕) 및 hIL-2(50㎕) 둘 모두에 대해서 ELISA를 수행하였다(ELISA: 이바이오사이언스).
14주령에서 암컷 NOD mIL2 -/- hIL2 +/- 마우스에게 주사하였고, 이들에게 25㎍의 아이소타입, 또는 5㎍ 또는 25㎍의 F5.1.11.02 항체와의 복합체의 8,000IU hIL-2(프로류킨)를 5일 동안 복강내 주사에 의해서 제공하였다. 30분 동안 37℃에서 IL-2 및 항체를 함께 인큐베이션시킴으로써 IL2:항체 복합체를 형성하였다.
상이한 기관의 단리 및 세포 염색
마우스를 CO2로 희생시키고, 유출물이 투명하게 배출될 때까지 PBS로 좌심실을 통해서 즉시 관류시켰다. 비장세포 및 췌장 림프절(pLN)을 수거하고, CD25 PeCy7, CD4 BV605, CD8 PercP-Cy5.5, CD44 Pe, CD62L Al647로의 세포외 염색 및 FoxP3 FITC로의 세포내 염색을 수행하였다.
30분 동안 37℃에서 0.8㎎/㎖ 콜라게나제 P 및 20㎍/㎖ DNase(로슈(Roche))로 소화시키고, 그 다음 다져서(mincing) 전체 췌장을 준비하였다. 소화 후, 호모게네이트(homogenate)를 40㎛ 세포 염색기를 사용함으로써 2회 여과하였고, CD45 PercP Cy5.5, CD25 Pe, CD4 PeCy7, CD8 Al647, Thy1.2 BV605로의 세포외 염색 및 FoxP3 FITC로의 세포내 염색을 수행하였다. 표지된 항체를 비디 파민젠 또는 이바이오사이언스로부터 구입하였다. 염색된 단일 세포 현탁물을 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석 및 제시하였다.
결과
인간 IL-2 유전자이식(hIL-2 Tg) 마우스의 표현형
PMA/아이오노마이신으로의 마우스 비장세포의 시험관내 자극(도 12A 및 B)은, 인간 IL-2가 야생형 마우스로부터의 마우스 IL2보다 더 낮은 수준으로 생성되었지만, 유전자이식 마우스로부터의 인간 IL-2의 생산을 확인해 주었다. hIL-2 Tg /mIL-2-/- 마우스는 건강하고, 생존 가능하게 보였다. 그러나, hIL-2Tg 마우스는 NOD 또는 NOD mIL-2+/- 마우스와 비교할 때, 활성화된 (CD44+CD62L-) CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 증가된 백분율을 가졌다(도 13A 및 B). Treg 빈도는 NOD 또는 NOD mIL-2+/- 마우스와 유사하였지만, hIL-2 Tg 마우스로부터의 Treg는 CD25의 감소된 세포 표면 발현을 가졌다(도 14).
F5.1.11.02:hIL-2 복합체로의 hIL-2 Tg 마우스의 치료
hIL-2 Tg 마우스를 상기에 기술된 바와 같이(방법), F5.1.11.02:IL-2 복합체로 치료하였다. 치료는 7일에 비장의 전체 세포질을 증가시키지 않았고, 총 비장세포에서의 약간의 감소가 5㎍ 치료군에서 관찰되었다(도 15). Treg 백분율의 증가는, pLN을 제외한 모든 기관에서 아이소타입 대조군과 비교할 때 hIL-2와의 복합체의 F5.1.11.02의 두 용량 모두로의 처리에 대한 반응에서 관찰되었고, 췌장에서 보다 유의하게 증가하였다(도 16A 내지 I). 비장 및 pLN에서, Treg 집단은 CD4+ CD25+ FoxP3+ 세포에 대해서 게이팅형이었고, 췌장에서 Treg 세포는 CD45+ Thy1.2+ CD4+ CD25+ FoxP3+ 세포 상의 게이팅에 의해서 식별되었다.
복합체로의 치료 후, CD4, CD8 및 Treg 총 세포수의 감소가 비장 및 pLN에서 관찰되었다. 그러나, 췌장에서, F5.1.11.02 복합체 치료는 F5.1.11.02의 25㎍ 용량에 대한 반응에서 Treg 총 세포수에서 약간의 증가를 유도하였다. 췌장에서는 CD4 및 CD8 총 세포수에서의 어떠한 변화도 관찰되지 않았다(데이터 나타내지 않음).
hIL-2와의 복합체의 F5.1.11.02(25㎍)로의 hIL-2 Tg 마우스의 치료는 비장에서 Treg/CD4 및 Treg/CD8 세포 비율의 상당한 증가를 유도하였다(도 17A 내지 F). 동일한 결과가 췌장에서 관찰되었고, Treg/CD4 및 Treg/CD8 둘 모두에 대한 비율에서의 상당한 증가가 5㎍ 및 25㎍의 F5.1.11.02에서 관찰되었다. F5.1.11.02:IL2 복합체 치료는 췌장 림프절에서 세포 비율에 약간의 효과를 가졌다.
마지막으로, F5.1.11.02:IL-2 복합체(5㎍ 및 25㎍ F5.1.11.02)로의 huIL2 Tg 마우스의 치료는 모든 기관에서 Treg 상의 CD25 평균 형광 강도(MFI)의 증가를 유도하였다(도 18A 내지 C). 이러한 증가는, Treg CD25가 치료 이전에는 매우 낮았던, 췌장에서 특히 상당하였다.
CTV를 사용한 NSG 실험
PBMC를 피콜에 의해서 건강한 공여자로부터 단리하고, 12.5ng/㎖ 항CD3 및 25ng/㎖ 항CD28로 밤새 활성화시켰다. 밤새 인큐베이션시킨 후, 세포를 수거하고, 1㎕ CTV/10x106개 세포의 농도로 셀트레이스 바이올렛(CellTrace Violet)(라이프 테크놀로지(Life technology)로 표지하였다. 염색 후, 세포를 PBS 중에서 철저히 세척하고, 200㎕의 PBS 중의 30x106개 세포의 농도로 재현탁시켰다. PBMC를 NSG 수여자에게 i.v. 주사하였다. 인간 PBMC가 주사된 NSG 마우스에게 30분 동안 37℃에서 제시된 양의 아이소타입 또는 항체와의 복합체의 8,000U hIL-2(프로류킨)를 5일 동안 매일 복강내 주사로 제공하였다.
비장세포의 단리 및 세포 염색
마우스를 3일 및 5일에 CO2로 희생시키고, 비장세포를 수거하고, 항 인간 CD45 퍼시픽 오렌지, CD4 PercPCy5.5, CD25Pe, CD8 APC-H7, NKG2D PeCy7로 세포외 염색하고, 항 인간 헬리오스 FITC 및 FoxP3 APC로 세포내 염색하였다. 표지된 항체는 비디 파민젠 또는 이바이오사이언스로부터 구입하였다. 염색된 단일 세포 현탁물을 플로우조 소프트웨어와 함께 분석 및 제공되는 FACSDiva(비디 바이오사이언시스) 및 FSC 3.0 파일을 구동시키는 포테사 유세포 분석기로 분석하였다.
결과
hIL-2와의 복합체의 25㎍의 F5.1.11.02로의 치료는 3일이 아니라 5일에 총 비장세포의 수의 증가를 유도하였다(도 19A 및 B).
F5.1.11.02 항체:IL-2 복합체는 또한 Teff 및 Treg 총 세포수를 증가시킬 수 있었고(도 20A 내지 F), 비장에서 5일에 Treg/CD4 및 Treg/CD8 비율을 증가시킬 수 있었는데(도 21A 내지 D), 이는 3일에서는 관찰되지 않은 결과였다. Treg 집단은 hCD45+ CD3+ CD4+ 헬리오스+ FoxP3+ 세포에 대해서 게이팅형이었다.
전달 및 치료 전에 CTV 표지를 포함시킴으로써, 본 발명자들은 F5.1.11.02 항체:IL-2 복합체로의 치료가 아이소타입에 비해서 Treg의 증식을 유도함을 관찰하였는데, 그 효과는 3일에 이미 명백하였고, 5일까지 분리되지 않은 적은 수의 세포를 생성하였다(도 22A 내지 H). CD8 T 세포의 증식이 또한 F5.1.11.02 항체:IL-2 복합체로의 치료에 의해서 증가되었지만, 이는 5일에만 단지 상당하였고, Treg 집단에서보다 남아있는 분리되지 않은 세포의 수가 더 많았다(도 23A 내지 H). 종합적으로, 이러한 CTV 데이터는 관찰된 Treg/CD8 비율에서의 이동을 기반으로 하는 바와 같이 Treg 증식에서의 증가를 지지한다.
마지막으로, 비장에서 복합체의 두 용량 모두로의 치료는 아이소타입 대조군과 비교할 때 Treg 및 CD8 집단 상의 CD25 평균 형광 강도(MFI)의 증가를 유도하였다(도 24A 및 B). 그러나, Treg 상의 CD25의 절대 발현은 CD8 세포 상에서보다 많은 배수로 더 높았다.
후속 실험에서, 본 발명자들은 더 낮은 친화도를 갖는 F5.1.11.02, '모' 항체, F5.1.11를 비교하였다. 본 발명자들은, hIL2와의 복합체의 125㎍의 항체에 대한 용량 범위를 연장시켜, 더 높은 용량의 더 낮은 친화도 항체가 생체내에서 대등한 효과를 갖는지를 평가하였다. 125㎍에서, F5.1.11은 25㎍의 F5.1.11.02와 대등하게, Treg 및 CD8 세포수에 대해서 대등한 효과를 가졌고, Treg/CD8 비율, 및 세포질을 증가시켰다(도 25A 내지 D, 26A 내지 C, 및 33A 내지 B). 이는, CTV 희석에 의해서 관찰되는 바와 같이, 증가된 Treg 증식에 의해서 다시 지지되었다(도 27A 내지 H, 28A 내지 H, 및 38A 및 B), 본 발명자들은, 시험관내에서, F5.1.11.02가 인간 Treg 상에서 Foxp3 및 CD25 단백질 수준을 유사하게 증가시킬 것이라고 예상한다.
실시예 7. 시노몰거스 원숭이 IL-2에 대한 IL-2 항체 결합 친화도
재조합 시노몰거스 원숭이(필리핀 원숭이(Macaca fascicularis)) IL-2를 포유동물 세포에서 발현하고, 고정된 금속 이온 친화도크로마토그래피(IMAC)를 사용하여 정제하였다. 시노몰거스 원숭이 IL-2(1 내지 100nM)에 대한 항체의 친화도를 인간 IL-2(실시예 1)에 대해서 기술된 바와 같이 표면 플라스몬 공명을 사용하여 측정하였다. 1:1 랭뮈어 결합 모델을 사용하여 결합 곡선을 핏팅하거나, 또는 정상-상태 친화도 상수를 농도-반응 곡선으로부터 계산하였다. 1 내지 100 nM의 IL-2에 대해서 관찰된 농도-반응 관계식이 겉보기 결합 친화도를 계산하기에 불충분한 경우 클론은 "매우 약한"것으로 지정되었다.
결과
시험된 인간 항체 클론은 516pM에서 본 검정에서 정량분석될 수 없는 매우 약한 회합까지의 범위의 친화도로 시노몰거스 원숭이 IL-2에 결합한다(표 6).
IL-2Rβ 결합을 저해하는 이의 능력(실시예 2 및 3)을 기반으로 선택된 클론의 대부분을 시험하였고, 이들 클론은 인간 IL-2와 비교하는 경우 시노몰거스 원숭이 IL-2에 대해서 상당한 친화도 손실을 나타내었다. IL-2Rα 결합을 저해하는 것으로 관찰된 16C3(실시예 2)은, 인간 IL-2 및 시노몰거스 원숭이 IL-2 둘 모두에 동일한 결합을 나타내었다. 이러한 결과는, 인간 IL-2와 시노몰거스 원숭이 IL-2 사이에서 다른 영역이 IL-2Rβ 결합 부위 및 F5.1.11 항체 클론의 에피토프 둘 모두 내에 포함되는 것을 발견한 본 발명자들의 구조 분석과 일치한다(실시예 9).
Figure pct00010
실시예 8. IL-2/ Fab 복합체 수용체 결합 친화도
IL-2 또는 IL-2/F5.1.11 Fab 복합체에 대한 IL-2Rα의 친화도를 바이아코어 T200 기기(지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 사용하여 측정하였다. 재조합 IL-2α를 바이오틴 표지하고, 바이아코어 스트렙타비딘 칩(지이 헬쓰케어) 상에 캡처하였다. 10mM HEPES(pH7.4), 150mM NaCl 및 0.005% v/v 계면활성제 P20 완충제 중에서 10㎕/분 유량을 사용하여 25℃에서 실험을 수행하였다. IL-2(1 내지 50nM) 또는 IL-2/ F5.1.11 Fab(과량의 Fab 사전-복합된 1 내지 500nM IL-2)를 수용체 커플링된 칩 표면 상에 120초 동안 30㎕/분으로 주사하여, 5분 동안 해리되게 하였다. 데이터를 인접한 대조군 유동 세포 및 완충제 단독 주사를 사용하여 배경 뺄셈하였다. 상호작용의 친화도를 평형에서 농도-반응 관계식으로부터 계산하였다.
결과
IL-2/F5.1.11 Fab 복합체는 리간드결합되지 않은(unliganded) IL-2에 비해서 더 낮은 친화도로 IL-2Rα에 결합한다. 복합체 및 리간드결합되지 않은 IL-2의 평형 결합 분석은 F5.1.11 Fab 결합된 IL-2가 IL-2Rα에 대해서 대략 7-배 더 약한 친화도를 가짐을 발견하였다(70.1 nM에 비해서 9.97 nM)(도 29A 및 B). 이러한 결과는 IL-2/항체 복합체 수용체 결합 검정(실시예 2) 및 IL-2/F5.1.11 Fab 결정 구조의 분석(실시예 9)에서 관찰된 감소된 결합과 일치하였다
실시예 9. 인간 IL-2에 결합된 F5.1.11 Fab의 결정 구조
인터류킨-2 발현 및 정제
전장 IL-2(잔기 1 내지 133)를 기술된 바와 같이 정제하였다(Rickert et al., 2004). 간략하면, 유전자를 벡터의 gp67A 신호 서열 및 그 다음 C-말단 헥사히스티딘 태그(서열번호 223)과 함께 pAcgp67A 벡터 내로 인-프레임으로 클로닝하였다. 스포돕테라 푸르기페르다(Spodoptera frugiperda)(Sf9) 세포를 사용하여 고-역가 재조합 바이러스를 생성하였다. 인섹트 엑스프레스(Insect Xpress) 배지(론자(Lonza))에서 성장된 트리초풀시아 니(Trichopulsia ni)(하이-파이브(High-Five)) 세포를 바이러스로 감염시키고, 48시간 동안 28℃에서 단백질을 발현하게 하였다. 단백질을 Ni-NTA에 의해서 정제하고, 4℃에서 카복시펩티다제 A 및 B로 밤새 소화시키고, 이어서 슈퍼덱스(Superdex) 200 겔 여과 칼럼(지이 헬쓰케어) 상에서 정제하였다.
5.1.11 인터류킨-2를 갖는 Fab 복합체의 결정화
F5.1.11 Fab를 1.5-배 과량의 IL-2와 혼합하고, 복합체를 슈퍼덱스 200 칼럼(지이 헬쓰케어) 상에서 FPLC에 의해서 정제하였다. 정제된 Fab/IL-2 복합체를 1.49㎖*㎎-1*cm-1의 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 측정되는 바와 같이 10㎎/㎖로 농축시켰다. 복합체를 동일한 부피의 침전 용액(100mM 시트르산 나트륨, pH 5.0; 20% 폴리에틸렌 글리콜 6000)과 혼합하고, 침전 용액의 용기 상에서의 시팅 드롭 베이퍼 디퓨전(sitting drop vapor diffusion)에 의해서 결정화하였다. 프리즘 결정이 1주일 이내에 형성되었다. 30%(v/v)까지 글리세롤을 첨가하고, 수거하고, 액체 질소의 플런징에 의해서 신속하게 냉각시킴으로써 결정을 저온보호하였다.
결정학적 데이터 수집 및 세밀화
어드밴스트 라이트 소스 빔라인(Advanced Light Source Beamline) 8.2.1(미국 캘리포니아주 버클리 소재)에서 회절 데이터를 수집하였다. 결정을 단위 격자 치수 a = 86.01Å, b = 145.73Å, c = 107.32Å, β = 95.38°를 갖는 P21 공간군으로 인덱싱하였다. 2.75Å의 최대 분해능을 구조 해석 및 세밀화를 위해서 사용하였다. 프로그램 페이저(Phaser)를 사용한 분자 대체에 의해서 구조를 해석하였다(McCoy et al., 2007). 검색 모델은 PDB 엔트리 3U1S로부터의 중쇄 불변 도메인, 4NPY로부터의 중쇄 가변 도메인, 3N9G로부터의 경쇄 불변 도메인, 4HP0로부터의 경쇄 가변 도메인, 및 2B5I로부터의 인터류킨-2를 포함하였다(Wang et al., 2005; McLellan et al., 2011; Ogata et al., 2013; Sok et al., 2013; Kaufmann et al.). Fab/IL-2 복합체의 4개의 카피를 비대칭 단위로 모델링하였다. 구조를 프로그램 쿠트(Coot)(Emsley et al., 2010) 및 페닉스(PHENIX)(Adams et al., 2010)를 사용하여 수동으로 재구성 및 재정밀화하는 반복 주기에 의해서 구성하였다. 단백질-단백질 상호작용을 쿠트에서 그리고 PISA로 육안으로 관찰함으로써 분석하였다(Krissinel and Henrick, 2005; 2007). 시노몰거스 원숭이(필리핀 원숭이)의 상동성 모델에서, 템플레이트로서 인간 apo-IL-2(PDB ID 1M47(Arkin et al., 2003))을 사용하여, I-TASSER로 IL-2를 제조하였다(Roy et al., 2010; Yang et al., 2015).
결과
F5.1.11은 경쇄 CDR1 루프 및 CDR3 루프 및 중쇄 CDR2 및 CDR3 루프를 통해서 헬릭스 A 및 C, 및 B-C 루프에서 IL-2와 상호작용한다(도 30). IL-2/IL-2Rβ/γc/CD25 4차 구조(PDB ID 2B5I)의 비교는, F5.1.11이 CD25 또는 γc 결합 부위가 아닌 IL-2의 IL-2Rβ 결합 부위를 막는 것을 보여준다. IL-2의 전체 구조는 apo 구조(95 Cα 원자 상의 RMSD 0.359Å)와 유사하다. F5.1.11이 IL-2의 B-C 루프에 결합하는 경우 유의한 교란이 일어나고; 이러한 교란은 인접한 IL-2 A-B 루프로 전파된다(도 31). A-B 루프는 4차 복합체에서 CD25 결합 부위의 부분을 형성하기 때문에, 이러한 이동은 CD25에 대한 F5.1.11/IL-2의 감소된 친화도를 설명할 수 있다.
시노몰거스 원숭이 IL-2에 대한 F5.1.11의 약한 교차-반응을 설명하기 위해서, 본 발명자들은 apo 인간 IL-2 구조를 기반으로 시노몰거스 원숭이 IL-2의 상동성 모델을 생성하였다. 서열이 95% 동일하지만, cyno IL-2의 B-C 루프에서의 삽입은 경쇄 CDR1 잔기(Ala30, Ser31, Asn32, 및 Tyr33) 및 중쇄 CDR3 잔기(Gly105 및sp106)와의 상호작용을 방해할 가능성이 있는 것으로 보인다(도 32).
비-인간 영장류 IL-2에 대한 mAb F5.1.11.02의 결합을 개선시키기 위해서, 측쇄가 인간과 cyno IL-2 사이에서 상이한 IL-2 루프를 접촉하는 표적 mAb 잔기를 F5.1.11 Fab/hIL-2 결정 구조를 기반으로 선택하였다. 잔기 Gly105, 중쇄에서 CDRH3의 Asp106 및 경쇄에서 CDRL1의 Ala30, Ser31, Asn32, Tyr33에 상응하는 코돈을 19개의 아미노산(시스테인 제외)을 암호화하는 축퇴 올리고뉴클레오타이드를 사용한 PCR에 의해서 조합방식으로 무작위화하였다. scFv 포맷의 생성된 라이브러리를 cyno IL-2 및 인간 IL-2 둘 모두에 대한 결합에 대해서 표면 디스플레이 방법에 의해서 스크리닝하였다.
실시예 10. IL-2 복합체 항-IL- 2:IL -2 복합체 치료에 의한 당뇨병 차도
PBMC를 피콜에 의해서 건강한 공여자로부터 단리하고, 12.5ng/㎖ 항CD3 및 25ng/㎖ 항CD28로 밤새 활성화시켰다. 밤새 인큐베이션시킨 후, 세포를 수거하고, 1㎕ CTV/10x106개 세포의 농도로 셀트레이스 바이올렛(라이프 테크놀로지)로 표지하였다. 염색 후, 세포를 PBS 중에서 철저히 세척하고, 200㎕의 PBS 중의 30x106개 세포의 농도로 재현탁시켰다. PBMC를 NSG 수여자에게 i.v. 주사하였다. 제시된 농도의 아이소타입 또는 항-IL-2 항체를 8000U 인간 IL2(프로류킨)와 함께 30분 동안 37℃에서 인큐베이션시킴으로써 항체:IL-2 복합체를 형성하였다. 인간 PBMC가 주사된 NSG 마우스에게 항체:IL-2 복합체를 5일 동안 매일 복강내 주사로 제공하였다.
비장세포의 단리 및 세포 염색
마우스를 CO2로 희생시키고, 비장세포를 수거하고, 항 인간 CD45 퍼시픽 오렌지, CD4 PercPCy 5.5, CD3 PeCy7/Pacific Blue/PercP, CD25 APC-Cy7/Pe, CD238 Pe, CD39 PeCy7, CD8 APC-H7, Ki67 Pe, NKG2D PeCy7, CD44 V450으로 세포외 염색하고, 항 인간 헬리오스 FITC 및 FoxP3 APC로 세포내 염색하였다. 세포내 염색 이전에, FoxP3 완충제 키트(이바이오사이언스)를 제조사의 지시서에 따라서 고정화 및 관통을 위해서 사용하였다. 표지된 항체는 비디 파민젠 또는 이바이오사이언스로부터 구입하였다. 염색된 단일 세포 현탁물을 플로우조 소프트웨어와 함께 분석 및 제공되는 FACSDiva(비디 바이오사이언시스) 및 FSC 3.0 파일을 구동시키는 포테사 유세포 분석기로 분석하였다.
IL2 복합체에 의한 당뇨병 차도
자발성 신규-발병 당뇨병 NOD 마우스(한 방울 혈당 농도(one blood glucose concentration) 250㎎/㎗ 내지 350㎎/㎗)를 5일 동안 125㎍의 아이소타입과 복합된 8,000U hIL-2(프로류킨) 또는 5㎍의 JES6-1이바이오사이언스)과 복합된 125㎍의 F5.1.11.02 및 0.5㎍의 mIL2(이바이오사이언스)로 치료하였다. 혈당 농도를 시간에 따라서 모니터링하였다.
차도 1주 후에, 일부 마우스를 희생시키고, 췌장을 분석하였다. 30분 동안 37℃에서 0.8㎎/㎖ 콜라게나제 P 및 20㎍/㎖ DNase(로슈)로 소화시키고, 그 다음 다져서 전체 췌장을 준비하였다. 소화 후, 호모게네이트를 40㎛ 세포 염색기를 사용함으로써 2회 여과하였고, CD45 PercP Cy5.5, CD25 Pe, CD4 PeCy7, CD8 Al647, Thy1.2 BV605로의 세포외 염색 및 FoxP3 FITC로의 세포내 염색을 수행하였다. 표지된 항체를 비디 파민젠 또는 이바이오사이언스로부터 구입하였다. 염색된 단일 세포 현탁물을 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석 및 제시하였다.
결과
hIL2와의 복합체의 F5.1.11.02(F5.1.11.02:IL2 복합체)로의 치료는 비장에서 Treg의 백분율의 증가를 유도하였다. Treg 집단은 hCD45+ CD3+ CD4+ 헬리오스+ FoxP3+ 세포에 대해서 게이팅형이었다. F5.1.11.02 항체:IL-2 복합체는 Treg 총 세포수를 증가시켰지만, 총 CD4 및 CD8 세포수의 증가가 또한 관찰되었다(도 35A 및 B). 종합하면, Treg/CD4 및 Treg/CD8의 비율(도 36A)은 용량 의존 방식으로 증가하였다. 효과는 1㎍용량에서 유의하게 시작되었다.
전달 및 치료 전에 CTV 표지를 포함시킴으로써, 본 발명자들은 F5.1.11.02 항체:IL-2 복합체로의 치료가 아이소타입에 비해서 Treg의 증식의 증가를 유도함을 관찰하였다. CD8 T 세포의 증식이 또한 F5.1.11.02 항체:IL-2 복합체로의 치료에 의해서 증가되었지만, Treg 집단에서보다 CD8 집단에 남아있는 분리되지 않은 세포의 수가 더 많았다(도 36B). 종합적으로, 이러한 CTV 데이터는 관찰된 Treg/CD8 비율에서의 이동을 기반으로 하는 바와 같이 Treg 증식에서의 증가를 지지한다.
비장에서 모든 용량의 복합체로의 치료는 아이소타입 대조군과 비교할 때 Treg 및 CD8 집단 상의 CD25 평균 형광 강도(MFI)의 증가를 유도하였다. 그러나, Treg 상의 CD25의 절대 발현은 CD8 세포 상에서보다 많은 배수로 더 높았다(도 37A 및 B). 또한, F5.1.11.02:IL-2 복합체로의 치료 후, Treg 상에서의 FoxP3 MFI의 증가가 또한 관찰되었다(도 38). 함께, 이러한 데이터는 확장된 Treg가 표현형 및 기능을 유지한다는 것을 시사한다.
시험관내 데이터는 IL-2에 대한 IL2Rb의 결합을 차단하는 항-IL2 항체는 차동 Treg 확장을 보다 양호하게 촉진시킬 수 있을 것이라는 것을 시사한다. 이러한 가설을 직접 시험하기 위해서, 본 발명자들은 IL-2 상의 상이한 수용체 에피토프를 차단한 항체: IL-2Rα 차단제(16C3.4), IL2Rβ 차단제(d1C7), 및 IL-2Rα에 대한 IL2의 결합을 또한 감소시킨 IL2Rβ 차단제(F5.1.11.02)를 비교하였다. hIL2와의 복합체의 3종의 항체 모두는 Treg 세포수를 증가시켰고, 더 낮은 정도로 CD4 및 CD8 세포수를 또한 증가시켰다. CD8 세포수의 증가는 IL-2Rb 차단 항체(d1C7 또는 F5.1.11.02) 중 어느 하나에 대한 것보다 16C3.4에 대한 반응에서 훨씬 더 컸다(도 39A).
변경된 세포수와 일치하게, d1C7 및 F5.1.11.02:IL-2 복합체는 Treg/CD4 및 Treg/CD8 비율의 증가를 나타내었는데, 이는 16C3.4에서는 관찰되지 않았다(도 39B). 복합체의 d1C7 및 F5.1.11.02로의 치료는 Treg 및 CD8 상의 CD25 MFI를 증가시켰지만, CD8 상의 CD25 발현은 d1C7을 사용하는 경우 더 높았는데, 이는 F5.1.11.02가 Trge에 대해서 보다 선택적일 수 있음을 시사한다(도 40).
마지막으로, 본 발명자들은 5일의 F5.1.11.02:IL-2 복합체 투여가 NOD 마우스에서 임상적인 당뇨병을 치유하는 데 효과적일 수 있는지를 평가하였다. 현저하게, 이러한 치료는 마우스의 50%에서 1주일 이내에 당뇨병 차도를 유도하였고, 이들 중 대부분은 실험 동안 4주에 걸쳐서 정상 혈당을 유지하였다. JES6-1:마우스 IL-2 복합체는 F5.1.11.02보다 더 낮은 치유 효과를 제공하였고, 아이소타입에 대한 반응에서는 어떤 효과도 관찰되지 않았다(도 41).
F5.1.11.02 항체:IL-2 복합체 효과가 췌장에서 Treg 수 및 특징의 변경에 관련되었는지를 확립하기 위해서, 본 발명자들은 차도 1주일 후에 췌장에서 이의 일부를 정량분석하였다. 본 발명자들은 췌장 Treg의 백분율이 복합체의 F5.1.11.02로의 처리 후에 상당히 증가하였다는 것을 관찰하였다. 본 발명자들은 또한 복합체로의 치료가 Treg 세포 기능과 연관된 마커, 예컨대 CD25 및 FoxP3의 발현의 증가와 연관되었으며, 이는 아이소타입 대조군에서는 관찰되지 않았다(도 42). 종합적으로, 이러한 데이터는 치료 후에 췌장에서 Treg 증가는 당뇨병 마우스에서 파괴적 췌도염으로의 진행을 제어할 수 있는 것을 시사하였다.
참고 문헌
Figure pct00011
Figure pct00012
본 발명의 특정 실시형태가 하기 번호의 단락에 제시된다.:
1. 인간 IL-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 항체는 hIL-2의 헬릭스 A 및 C, 및 B-C 루프에 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
2. 서열번호 13 및 14의 아미노산 서열을 포함하는 항체와 인간 IL-2(hIL-2)에 대한 결합에 대해서 경쟁하거나, 또는 이와 동일한 hIL-2의 에피토프에 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
3. 인간 IL-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 항체는 IL-2Rα에 대한 hIL-2의 결합 친화도를 1 내지 199배 감소시키는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
4. 단락 3에 있어서, 항체는 IL-2Rα에 대한 hIL-2의 결합 친화도를 10 배 감소시키는, 단리된 항체 또는 항원-결합 부분.
5. 인간 IL-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 항체는 IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 hIL-2 결합을 감소시키고, CD8+ T 세포에서의 활성을 조절 T(Treg) 세포에서보다 더 높은 정도로 저해하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 부분.
6. 인간 인터류킨-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 항체는 IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 hIL-2 결합을 감소시키고, CD8+ T 세포에서의 STAT5 포스포릴화를 조절 T(Treg) 세포에서보다 더 높은 정도로 저해하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
7. 인간 인터류킨-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 항체는 IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 hIL-2 결합을 감소시키고, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 배양물 또는 재구성 검정으로 측정되는 경우 조절 T(Treg) 세포 대 CD8+ 또는 CD4+ T 세포, 또는 NK 세포의 비율을 증가시키는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
8. 인간 인터류킨-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 항체는 IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 hIL-2 결합을 감소시키고, 조절 T(Treg) 세포에서 FOXP3, CD25 및 Icos 중 하나 이상의 발현을 증가시키는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
9. 단락 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 항원-결합 부분은 하기 특성 중 적어도 하나를 갖는, 단리된 항체 또는 항원-결합 부분:
a) 약 4.53 x 10-4s-1 초과의 오프-레이트로 hIL-2에 결합함; 및
b) 약 1.14 x 10-10M 초과의 KD로 hIL-2에 결합함.
10. 단락 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 항체는 인간 항체인, 항체 또는 항원-결합 부분.
11. 단락 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 하기를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 부분:
(a) 서열번호 73(카바트), 74(코티아), 또는 75(확장된)를 포함하는 HCDR1; 서열번호 76(카바트), 또는 77(코티아)을 포함하는 HCDR2; 서열번호 78을 포함하는 HCDR3; 서열번호 79를 포함하는 LCDR1; 서열번호 80을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 81을 포함하는 LCDR3;
(b) 서열번호 82(카바트), 83(코티아), 또는 84(확장된)을 포함하는 HCDR1; 서열번호 85(카바트), 또는 86(코티아)을 포함하는 HCDR2; 서열번호 87을 포함하는 HCDR3; 서열번호 88을 포함하는 LCDR1; 서열번호 89를 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 90을 포함하는 LCDR3;
(c) 서열번호 91(카바트), 92(코티아), 또는 93(확장된)을 포함하는 HCDR1; 서열번호 94(카바트), 또는 95(코티아)를 포함하는 HCDR2; 서열번호 96를 포함하는 HCDR3; 서열번호 97을 포함하는 LCDR1; 서열번호 98을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 99를 포함하는 LCDR3;
(d) 서열번호 100(카바트), 101(코티아), 또는 102(확장된)를 포함하는 HCDR1; 서열번호 103(카바트), 또는 104(코티아)를 포함하는 HCDR2; 서열번호 105를 포함하는 HCDR3; 서열번호 106을 포함하는 LCDR1; 서열번호 107을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 108을 포함하는 LCDR3;
(e) 서열번호 109(카바트), 110(코티아), 또는 111(확장된)을 포함하는 HCDR1; 서열번호 112(카바트), 또는 113(코티아)을 포함하는 HCDR2; 서열번호 114를 포함하는 HCDR3; 서열번호 115를 포함하는 LCDR1; 서열번호 116을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 117을 포함하는 LCDR3;
(f) 서열번호 118(카바트), 119(코티아), 또는 120(확장된)을 포함하는 HCDR1; 서열번호 121(카바트), 또는 122(코티아)를 포함하는 HCDR2; 서열번호 123을 포함하는 HCDR3; 서열번호 124를 포함하는 LCDR1; 서열번호 125를 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 126을 포함하는 LCDR3;
(g) 서열번호 127(카바트), 128(코티아), 또는 129(확장된)를 포함하는 HCDR1; 서열번호 130(카바트), 또는 131(코티아)을 포함하는 HCDR2; 서열번호 132를 포함하는 HCDR3; 서열번호 133을 포함하는 LCDR1; 서열번호 134를 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 135를 포함하는 LCDR3;
(h) 서열번호 136(카바트), 137(코티아), 또는 138(확장된)을 포함하는 HCDR1; 서열번호 139(카바트), 또는 140(코티아)을 포함하는 HCDR2; 서열번호 141을 포함하는 HCDR3; 서열번호 142를 포함하는 LCDR1; 서열번호 143을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 144를 포함하는 LCDR3;
(i) 서열번호 145(카바트), 146(코티아), 또는 147(확장된)을 포함하는 HCDR1; 서열번호 148(카바트), 또는 149(코티아)를 포함하는 HCDR2; 서열번호 150을 포함하는 HCDR3; 서열번호 151을 포함하는 LCDR1; 서열번호 152를 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 153을 포함하는 LCDR3;
(j) 서열번호 154(카바트), 155(코티아), 또는 156(확장된)을 포함하는 HCDR1; 서열번호 157(카바트), 또는 158(코티아)을 포함하는 HCDR2; 서열번호 159를 포함하는 HCDR3; 서열번호 160을 포함하는 LCDR1; 서열번호 161을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 162를 포함하는 LCDR3;
(k) 서열번호 163(카바트), 164(코티아), 또는 165(확장된)를 포함하는 HCDR1; 서열번호 166(카바트), 또는 167(코티아)을 포함하는 HCDR2; 서열번호 168을 포함하는 HCDR3; 서열번호 169를 포함하는 LCDR1; 서열번호 170을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 171을 포함하는 LCDR3;
(l) 서열번호 172(카바트), 173(코티아), 또는 174(확장된)를 포함하는 HCDR1; 서열번호 175(카바트), 또는 176(코티아)을 포함하는 HCDR2; 서열번호 177을 포함하는 HCDR3; 서열번호 178을 포함하는 LCDR1; 서열번호 179를 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 180을 포함하는 LCDR3;
(m) 서열번호 181(카바트), 182(코티아), 또는 183(확장된)을 포함하는 HCDR1; 서열번호 184(카바트), 또는 185(코티아)를 포함하는 HCDR2; 서열번호 186을 포함하는 HCDR3; 서열번호 187을 포함하는 LCDR1; 서열번호 188을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 189를 포함하는 LCDR3;
(n) 서열번호 190(카바트), 191(코티아), 또는 192(확장된)를 포함하는 HCDR1; 서열번호 193(카바트), 또는 194(코티아)를 포함하는 HCDR2; 서열번호 195를 포함하는 HCDR3; 서열번호 196을 포함하는 LCDR1; 서열번호 197을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 198을 포함하는 LCDR3;
(o) 서열번호 199(카바트), 200(코티아), 또는 201(확장된)을 포함하는 HCDR1; 서열번호 202(카바트), 또는 203(코티아)을 포함하는 HCDR2; 서열번호 204를 포함하는 HCDR3; 서열번호 205를 포함하는 LCDR1; 서열번호 206을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 207을 포함하는 LCDR3;
(p) 서열번호 208(카바트), 209(코티아), 또는 210(확장된)을 포함하는 HCDR1; 서열번호 211(카바트), 또는 212(코티아)를 포함하는 HCDR2; 서열번호 213을 포함하는 HCDR3; 서열번호 214를 포함하는 LCDR1; 서열번호 215를 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 216을 포함하는 LCDR3; 또는
(q) 서열번호 217을 포함하는 HCDR1; 서열번호 218을 포함하는 HCDR2; 서열번호 219를 포함하는 HCDR3; 서열번호 220을 포함하는 LCDR1; 서열번호 221을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 222를 포함하는 LCDR3.
12. 단락 1 내지 10 중 임의의 하나에 있어서, 하기를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 부분:
(a) i) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 또는 71의 HCDR3; 또는
ii) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 또는 71의 HCDR1-3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 또는
(b) i) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 또는 72의 LCDR3; 또는
ii) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 또는 72의 LCDR1-3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL).
13. 인간 인터류킨-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 하기를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분:
a) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 71의 HCDR3;
b) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 71의 HCDR1-3; 또는
c) 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 71의 아미노산 서열.
14. 인간 인터류킨-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 하기를 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분:
a) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 72의 LCDR3;
b) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 72의 LCDR1-3; 또는
c) 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 20 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 72의 아미노산 서열.
15. 인간 IL-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 항체는 각각 표 7에 나타낸 바와 같은 하기의 HCDR1-3 및 LCDR1-3 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분:
서열번호 1 및 2,
서열번호 3 및 4,
서열번호 5 및 6,
서열번호 7 및 8,
서열번호 9 및 10,
서열번호 11 및 12,
서열번호 13 및 14,
서열번호 15 및 16,
서열번호 17 및 18,
서열번호 19 및 20,
서열번호 21 및 22,
서열번호 23 및 24,
서열번호 25 및 26
서열번호 27 및 28,
서열번호 29 및 30
서열번호 31 및 32 또는
서열번호 71 및 72.
16. 단락 15에 있어서, 항체는 하기의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 부분:
서열번호 1 및 2,
서열번호 3 및 4,
서열번호 5 및 6,
서열번호 7 및 8,
서열번호 9 및 10,
서열번호 11 및 12,
서열번호 13 및 14,
서열번호 15 및 16,
서열번호 17 및 18,
서열번호 19 및 20,
서열번호 21 및 22,
서열번호 23 및 24,
서열번호 25 및 26,
서열번호 27 및 28,
서열번호 29 및 30,
서열번호 31 및 32 또는
서열번호 71 및 72.
17. 단락 15 또는 16에 있어서, 항체는 IgG 항체인, 항체 또는 항원-결합 부분.
18. 단락 17에 있어서, 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 더 포함하는, 항체 또는 항원-결합 부분.
19. 단락 17에 있어서, C-말단 라이신이 없는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 더 포함하는, 항체 또는 항원-결합 부분
20. 단락 18 또는 19에 있어서, 서열번호 34 또는 35의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 더 포함하는, 항체 또는 항원-결합 부분.
21. 단락 11 내지 20 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 부분의 중쇄, 경쇄 또는 둘 모두를 암호화하는 단리된 핵산.
22. 인간 인터류킨-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 부분의 중쇄, 경쇄 또는 둘 모두를 암호화하는 단리된 핵산으로서, 상기 핵산은 하기를 포함하는, 단리된 핵산:
a) 서열번호 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 또는 66의 뉴클레오타이드 서열;
b) 서열번호 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 또는 67의 뉴클레오타이드 서열; 또는
c) 하기 뉴클레오타이드 서열 쌍 중 하나:
서열번호 36 및 37,
서열번호 38 및 39,
서열번호 40 및 41,
서열번호 42 및 43,
서열번호 44 및 45,
서열번호 46 및 47,
서열번호 48 및 49,
서열번호 50 및 51,
서열번호 52 및 53,
서열번호 54 및 55,
서열번호 56 및 57,
서열번호 58 및 59,
서열번호 60 및 61,
서열번호 62 및 63,
서열번호 64 및 65, 또는
서열번호 66 및 67.
23. 단락 21 또는 22의 핵산을 포함하는 벡터.
24. 단락 21 또는 22의 핵산 또는 단락 23의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
25. 단락 24의 숙주 세포로서, 세포가 포유동물 세포인, 숙주 세포.
26. 하기 단계들을 포함하는, 인간 인터류킨-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 생산하는 방법:
a) 상기 항체 또는 항원-결합 부분이 발현되도록 하는 조건 하에서 단락 24 또는 25의 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 숙주 세포는 항체 또는 항원-결합 부분의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단계, 및
b) 배양물로부터 상기 항체 또는 항원-결합 부분을 단리하는 단계.
27. 인간 인터류킨-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 항체는 단락 16의 항체 또는 항원-결합 부분과 hIL-2에 대한 결합에 대해서 경쟁하거나, 또는 이와 동일한 에피토프에 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
28. 단락 27에 있어서, 항체는 각각 하기 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 VH 아미노산 서열 및 VL 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 부분:
서열번호 1 및 2,
서열번호 3 및 4,
서열번호 5 및 6,
서열번호 7 및 8,
서열번호 9 및 10,
서열번호 11 및 12,
서열번호 13 및 14,
서열번호 15 및 16,
서열번호 17 및 18,
서열번호 19 및 20,
서열번호 21 및 22,
서열번호 23 및 24,
서열번호 25 및 26,
서열번호 27 및 28,
서열번호 29 및 30, 또는
서열번호 31 및 32.
29. 단락 1 내지 20, 27, 및 28 중 임의의 것의 항체 또는 항원-결합 부분, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
30. 인간 대상체에서 염증성 병태를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 유효량의 단락 1 내지 20, 27, 및 28 중 임의의 하나의 항체 또는 항원-결합 부분, 또는 단락 29의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
31. 면역억제의 유도를 필요로 하는 인간 대상체에서 면역억제를 유도하는 방법으로서, 대상체에게 유효량의 단락 1 내지 20, 27, 및 28 중 임의의 하나의 항체 또는 항원-결합 부분, 또는 단락 29의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
32. 염증성 병태를 갖거나 또는 면역억제를 필요로 하는 인간 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한, 단락 1 내지 20, 27, 및 28 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 부분, 또는 단락 29의 약제학적 조성물.
33. 염증성 병태의 치료 또는 면역억제의 유도를 필요로 하는 인간 대상체에서 염증성 병태의 치료 또는 면역억제의 유도를 위한 의약의 제조에서의, 단락 1 내지 20, 27, 및 28 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 부분의 용도.
34. 대상체는 자가면역 질환 또는 이식편 대 숙주병을 갖는, 단락 30 또는 31의 방법, 단락 32의 항체, 부분 또는 약제학적 조성물 또는 단락 33의 용도.
35. 항체 또는 부분은 IL-2와의 복합체로 투여되는, 단락 30 또는 31의 방법, 단락 32의 항체, 부분 또는 약제학적 조성물 또는 단락 33의 용도.
36. 대상체는 진성 당뇨병인, 단락 30 또는 31의 방법, 단락 32의 항체, 부분 또는 약제학적 조성물 또는 단락 33의 용도.
37. 대상체는 제I형 진성 당뇨병인, 단락 30 또는 31의 방법, 단락 32의 항체, 부분 또는 약제학적 조성물 또는 단락 33의 용도.
38. 인간 IL-2와 복합된 단락 1 내지 20, 27, 및 27 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 부분을 포함하는 조성물.
39. 인간 IL-2와 복합된 단락 1 내지 20, 27, 및 28 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 부분, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
40. 인간 대상체에서 염증성 병태를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 유효량의 인간 IL-2와 복합된 단락 1 내지 20, 27, 및 28 중 어느 하나의 항체 항원-결합 부분, 단락 29의 약제학적 조성물, 단락 38의 조성물, 또는 단락 39의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
41. 인간 인터류킨-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 F5.1.11.02 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 항체는 ATCC 수탁 번호 하에 기탁된 플라스미드의 cDNA 삽입물에 의해서 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및/또는 ATCC 수탁 번호 하에 기탁된 플라스미드의 cDNA 삽입물에 의해서 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는, 단리된 항체 F5.1.11.02 또는 이의 항원-결합 부분.
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
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Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
SEQUENCE LISTING <110> PFIZER INC. THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JUNIOR UNIVERSITY <120> ANTI-IL-2 ANTIBODIES AND COMPOSITIONS AND USES THEREOF <130> WO/2017/070561 <140> PCT/US2016/058249 <141> 2016-10-21 <150> US 62/408,360 <151> 2016-10-14 <150> US 62/245,600 <151> 2015-10-23 <160> 225 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly 100 105 110 Gln Gly 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ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180 gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240 atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagaccta 300 acgtttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cgagc 345 <210> 39 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 39 gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcgt ctgtaggaga cagggtcacc 60 atcacttgcc aggcgagtca ggacattttc aacctcttaa attggtatag gcagaaacca 120 gggaaagccc ctgacctcct ggtctaccgc gcttccaatt tggagacagg ggtcccatcc 180 aggttcagtg gaagtgggtc tgggacagac tttactttca ccattagtag cctgcagcct 240 gaagatgttg gaacctatta ttgtcaacag agtgctaatc tccccctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 40 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 40 cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc 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Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 42 gaggtgcagc tggtggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctctggtta ctccatcagc agtggttact actggggctg gatccggcag 120 cccccaggga aggggctgga gtggattggg agtatctatc atagtgggag cacctactac 180 aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca cgtccaagaa ccagttctcc 240 ctgaagctga gctctgtgac cgccgcagac acggccgtgt attactgtgc gagagaggcc 300 tactccgatc gggcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 43 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 43 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac gataaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agcgactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120 ccgggcagtt cccccagcac tgtgatctat gcggataacc aaagaccctc tgaagtccct 180 gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240 ctgatgactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgatagcaa catcgtgata 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 44 <211> 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 53 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120 ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaggataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgataccag ggatgtcgta 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 54 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 54 cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt ggatacattt attacagcgg gagcaactac 180 tggaatccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgaggact 300 cctacggtga ccggggactg gttcgacccc tggggccgtg gcaccctggt caccgtctcc 360 tca 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 66 caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagtggac 300 cggtattata actggaacta ctttttaggc tcctttgact actggggcca gggaaccctg 360 gtcaccgtct cgagc 375 <210> 67 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 67 agctatgtgc tgactcagcc accctcagtg tcagtggccc caggaaagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gaaacaacat tagaagtaaa agtgtgcact ggtaccagca gaagcccggc 120 caggcccctg tggtggtcat ctattatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 atctctgggt ccaactctgg aaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240 gatgaggccg actatttttg tcaggtgtgg gatagtagta gtgaccatca tgtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt ccta 324 <210> 68 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 68 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc cgctggggca 360 ccgtcagtct tcctcttccc tccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990 <210> 69 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 69 cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg t 321 <210> 70 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 70 ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact ctgttcccac cctcctctga ggagcttcaa 60 gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg 120 gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa 180 caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag 240 tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg 300 gcccctacag aatgttca 318 <210> 71 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 71 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Lys Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Thr Pro Thr Val 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Synthetic peptide <400> 74 Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr 1 5 <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 75 Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 10 <210> 76 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 76 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Val <210> 77 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 77 Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr 1 5 <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 78 Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 79 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 79 Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln 1 5 10 <210> 80 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 97 Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln 1 5 10 <210> 98 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 98 Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 99 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 99 Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Asn Val Val 1 5 <210> 100 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 100 Ser Gly Tyr Tyr Trp Gly 1 5 <210> 101 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 101 Tyr Ser Ile Ser Ser Gly Tyr 1 5 <210> 102 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 102 Tyr Ser Ile Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Gly 1 5 10 <210> 103 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 103 Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Val <210> 104 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 104 Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr 1 5 <210> 105 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 105 Glu Ala Tyr Ser Asp Arg Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 106 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 106 Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asp Tyr Val Gln 1 5 10 <210> 107 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 107 Ala Asp Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 108 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 108 Gln Ser Tyr Asp Ser Asn 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 114 Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 115 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 115 Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln 1 5 10 <210> 116 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 116 Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 117 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 117 Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Asn Val Val 1 5 <210> 118 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 118 Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 119 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 119 Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr 1 5 <210> 120 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial 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Synthetic peptide <400> 125 Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 126 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 126 Gln Ser Tyr Asp Thr Arg Asp Val Val 1 5 <210> 127 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 127 Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 128 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 128 Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr 1 5 <210> 129 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 129 Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 10 <210> 130 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 130 Gly Tyr Ile Tyr Lys Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ser Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Val <210> 131 <211> 8 <212> PRT <213> 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 142 Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln 1 5 10 <210> 143 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 143 Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 144 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 144 Gln Ser Tyr Asp Thr Leu Asn Val Tyr 1 5 <210> 145 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 145 Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 146 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 146 Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr 1 5 <210> 147 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 147 Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 10 <210> 148 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial 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Gln Ser Tyr Asp Thr Arg Asp Val Val 1 5 <210> 154 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 154 Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 155 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 155 Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr 1 5 <210> 156 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 156 Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 10 <210> 157 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 157 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Asn Tyr Trp Asn Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Val <210> 158 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 158 Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Asn Tyr 1 5 <210> 159 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 159 Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 160 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 160 Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln 1 5 10 <210> 161 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 161 Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 162 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 162 Gln Thr Tyr Asp Ser Ile Asp Val Tyr 1 5 <210> 163 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 163 Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 164 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 164 Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr 1 5 <210> 165 <211> 11 <212> PRT <213> 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 187 Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln 1 5 10 <210> 188 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 188 Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 189 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 189 Gln Thr Tyr Asp Ser Ile Asp Val Tyr 1 5 <210> 190 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 190 Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 191 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 191 Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr 1 5 <210> 192 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 192 Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 10 <210> 193 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 193 Gly Tyr Ile Tyr Lys Ser Gly Ser Asn Tyr Trp Asn Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Val <210> 194 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 194 Ile Tyr Lys Ser Gly Ser Asn Tyr 1 5 <210> 195 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 195 Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 196 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 196 Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln 1 5 10 <210> 197 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 197 Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 198 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 198 Gln Ser Tyr Asp Thr Leu Asn Val Tyr 1 5 <210> 199 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 199 Ser Gly Tyr Tyr Trp Gly 1 5 <210> 200 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 200 Tyr Ser Ile Ser Ser Gly Tyr 1 5 <210> 201 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 201 Tyr Ser Ile Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Gly 1 5 10 <210> 202 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 202 Gly Leu Ser Tyr His Thr Arg Ser Thr Tyr Tyr Asp Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Val <210> 203 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 203 Ser Tyr His Thr Arg Ser Thr Tyr 1 5 <210> 204 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 204 Glu Ala Tyr Ser Asp Arg Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 205 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 205 Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asp Tyr Val Gln 1 5 10 <210> 206 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 206 Ala Asp Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 207 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 207 Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Ile Val Ile 1 5 <210> 208 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 208 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 209 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 209 Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 1 5 <210> 210 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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peptide <400> 215 Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 216 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 216 Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His His Val 1 5 10 <210> 217 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 217 Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 218 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 218 Gly Tyr Ile Tyr Lys Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ser Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Val <210> 219 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 219 Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 220 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 220 Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln 1 5 10 <210> 221 <211> 7 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Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 145 150 <210> 225 <211> 154 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 225 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Arg His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Ser Phe His Leu Arg Asp Thr Lys Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val 100 105 110 Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Leu Met Cys Glu Tyr 115 120 125 Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr 130 135 140 Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 145 150

Claims (29)

  1. 인간 IL-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 상기 항체는 hIL-2의 헬릭스 A 및 C, 및 B-C 루프에 결합하는, 인간 IL-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  2. 인간 IL-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 상기 항체는 IL-2Rα에 대한 hIL-2의 결합 친화도를 1 내지 199배 감소시키는, 인간 IL-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항체는 상기 IL-2Rα에 대한 hIL-2의 결합 친화도를 10배 감소시키는, 인간 IL-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  4. 인간 IL-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 상기 항체는
    (a) IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 hIL-2 결합을 감소시키고, CD8+ T 세포에서의 활성을 조절 T(Treg) 세포에서보다 더 높은 정도로 저해하거나;
    (b) IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 hIL-2 결합을 감소시키고, CD8+ T 세포에서의 STAT5 포스포릴화를 조절 T(Treg) 세포에서보다 더 높은 정도로 저해하거나;
    (c) IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 hIL-2 결합을 감소시키고, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 배양물 또는 재구성 검정으로 측정되는 경우 조절 T(Treg) 세포 대 CD8+ 또는 CD4+ T 세포, 또는 NK 세포의 비율을 증가시키거나; 또는
    (d) IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 hIL-2 결합을 감소시키고, 조절 T(Treg) 세포에서 FOXP3, CD25 및 Icos 중 하나 이상의 발현을 증가시키는, 인간 IL-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 부분은 하기 특성 중 적어도 하나를 갖는, 인간 IL-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분:
    a) 약 4.53 x 10-4s-1 초과의 오프-레이트로 hIL-2에 결합함; 및
    b) 약 1.14 x 10-10M 초과의 KD로 hIL-2에 결합함.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체는 인간 항체인, 인간 IL-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  7. 인간 IL-2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 인간 IL-2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분:
    (i) (a) 서열번호 73, 74, 또는 75를 포함하는 HCDR1; 서열번호 76, 또는 77을 포함하는 HCDR2; 서열번호 78을 포함하는 HCDR3; 서열번호 79를 포함하는 LCDR1; 서열번호 80을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 81을 포함하는 LCDR3;
    (b) 서열번호 82, 83, 또는 84를 포함하는 HCDR1; 서열번호 85, 또는 86을 포함하는 HCDR2; 서열번호 87을 포함하는 HCDR3; 서열번호 88을 포함하는 LCDR1; 서열번호 89를 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 90을 포함하는 LCDR3;
    (c) 서열번호 91, 92, 또는 93을 포함하는 HCDR1; 서열번호 94, 또는 95를 포함하는 HCDR2; 서열번호 96을 포함하는 HCDR3; 서열번호 97을 포함하는 LCDR1; 서열번호 98을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 99를 포함하는 LCDR3;
    (d) 서열번호 100, 101, 또는 102를 포함하는 HCDR1; 서열번호 103, 또는 104를 포함하는 HCDR2; 서열번호 105를 포함하는 HCDR3; 서열번호 106을 포함하는 LCDR1; 서열번호 107을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 108을 포함하는 LCDR3;
    (e) 서열번호 109, 110, 또는 111을 포함하는 HCDR1; 서열번호 112, 또는 113을 포함하는 HCDR2; 서열번호 114를 포함하는 HCDR3; 서열번호 115를 포함하는 LCDR1; 서열번호 116을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 117을 포함하는 LCDR3;
    (f) 서열번호 118, 119, 또는 120을 포함하는 HCDR1; 서열번호 121, 또는 122를 포함하는 HCDR2; 서열번호 123을 포함하는 HCDR3; 서열번호 124를 포함하는 LCDR1; 서열번호 125를 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 126을 포함하는 LCDR3;
    (g) 서열번호 127, 128, 또는 129를 포함하는 HCDR1; 서열번호 130, 또는 131을 포함하는 HCDR2; 서열번호 132를 포함하는 HCDR3; 서열번호 133을 포함하는 LCDR1; 서열번호 134를 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 135를 포함하는 LCDR3;
    (h) 서열번호 136, 137, 또는 138을 포함하는 HCDR1; 서열번호 139, 또는 140을 포함하는 HCDR2; 서열번호 141을 포함하는 HCDR3; 서열번호 142를 포함하는 LCDR1; 서열번호 143을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 144를 포함하는 LCDR3;
    (i) 서열번호 145, 146, 또는 147을 포함하는 HCDR1; 서열번호 148, 또는 149를 포함하는 HCDR2; 서열번호 150을 포함하는 HCDR3; 서열번호 151을 포함하는 LCDR1; 서열번호 152를 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 153을 포함하는 LCDR3;
    (j) 서열번호 154, 155, 또는 156을 포함하는 HCDR1; 서열번호 157, 또는 158을 포함하는 HCDR2; 서열번호 159를 포함하는 HCDR3; 서열번호 160을 포함하는 LCDR1; 서열번호 161을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 162를 포함하는 LCDR3;
    (k) 서열번호 163, 164, 또는 165를 포함하는 HCDR1; 서열번호 166, 또는 167을 포함하는 HCDR2; 서열번호 168을 포함하는 HCDR3; 서열번호 169를 포함하는 LCDR1; 서열번호 170을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 171을 포함하는 LCDR3;
    (l) 서열번호 172, 173, 또는 174를 포함하는 HCDR1; 서열번호 175, 또는 176을 포함하는 HCDR2; 서열번호 177을 포함하는 HCDR3; 서열번호 178을 포함하는 LCDR1; 서열번호 179를 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 180을 포함하는 LCDR3;
    (m) 서열번호 181, 182, 또는 183을 포함하는 HCDR1; 서열번호 184, 또는 185를 포함하는 HCDR2; 서열번호 186을 포함하는 HCDR3; 서열번호 187을 포함하는 LCDR1; 서열번호 188을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 189를 포함하는 LCDR3;
    (n) 서열번호 190, 191, 또는 192를 포함하는 HCDR1; 서열번호 193, 또는 194를 포함하는 HCDR2; 서열번호 195를 포함하는 HCDR3; 서열번호 196을 포함하는 LCDR1; 서열번호 197을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 198을 포함하는 LCDR3;
    (o) 서열번호 199, 200, 또는 201을 포함하는 HCDR1; 서열번호 202, 또는 203을 포함하는 HCDR2; 서열번호 204를 포함하는 HCDR3; 서열번호 205를 포함하는 LCDR1; 서열번호 206을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 207을 포함하는 LCDR3;
    (p) 서열번호 208, 209, 또는 210을 포함하는 HCDR1; 서열번호 211, 또는 212를 포함하는 HCDR2; 서열번호 213을 포함하는 HCDR3; 서열번호 214를 포함하는 LCDR1; 서열번호 215를 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 216을 포함하는 LCDR3; 또는
    (q) 서열번호 217을 포함하는 HCDR1; 서열번호 218을 포함하는 HCDR2; 서열번호 219를 포함하는 HCDR3; 서열번호 220을 포함하는 LCDR1; 서열번호 221을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 222를 포함하는 LCDR3;
    (ii) a) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 또는 71의 HCDR3; 또는
    b) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 또는 71의 HCDR1-3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH);
    (iii) a) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 또는 72의 LCDR3; 또는
    b) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 또는 72의 LCDR1-3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
    (iv) a) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 71의 HCDR3;
    b) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 71의 HCDR1-3; 또는
    c) 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 71의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH);
    (v) a) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 72의 LCDR3;
    b) 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 72의 LCDR1-3; 또는
    c) 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 72의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
    (vi) 표 7에 나타낸 바와 같은
    a) 각각 서열번호 1 및 2;
    b) 각각 서열번호 3 및 4;
    c) 각각 서열번호 5 및 6;
    d) 각각 서열번호 7 및 8;
    e) 각각 서열번호 9 및 10;
    f) 각각 서열번호 11 및 12;
    g) 각각 서열번호 13 및 14;
    h) 각각 서열번호 15 및 16;
    i) 각각 서열번호 17 및 18;
    j) 각각 서열번호 19 및 20;
    k) 각각 서열번호 21 및 22;
    l) 각각 서열번호 23 및 24;
    m) 각각 서열번호 25 및 26;
    n) 각각 서열번호 27 및 28;
    o) 각각 서열번호 29 및 30;
    p) 각각 서열번호 31 및 32; 또는
    q) 각각 서열번호 71 및 72에 제시된 바와 같은 HCDR1-3 및 LCDR1-3 아미노산 서열;
    (vii) a) 각각 서열번호 1 및 2;
    b) 각각 서열번호 3 및 4;
    c) 각각 서열번호 5 및 6;
    d) 각각 서열번호 7 및 8;
    e) 각각 서열번호 9 및 10;
    f) 각각 서열번호 11 및 12;
    g) 각각 서열번호 13 및 14;
    h) 각각 서열번호 15 및 16;
    i) 각각 서열번호 17 및 18;
    j) 각각 서열번호 19 및 20;
    k) 각각 서열번호 21 및 22;
    l) 각각 서열번호 23 및 24;
    m) 각각 서열번호 25 및 26;
    n) 각각 서열번호 27 및 28;
    o) 각각 서열번호 29 및 30;
    p) 각각 서열번호 31 및 32; 또는
    q) 각각 서열번호 71 및 72에 제시된 바와 같은 아미노산 서열.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항체는 IgG 항체인, 인간 IL-2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  9. 제8항에 있어서, C-말단 라이신을 갖거나 또는 갖지 않는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 더 포함하는, 인간 IL-2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  10. 제7(vii)(g)항에 있어서, 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 더 포함하는, 인간 IL-2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  11. 제7항의 항체 또는 항원-결합 부분의 중쇄, 경쇄 또는 둘 모두를 암호화하는 단리된 핵산.
  12. 인간 인터류킨-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 중쇄, 경쇄 또는 둘 모두를 암호화하는 단리된 핵산으로서, 상기 핵산은 하기를 포함하는, 단리된 핵산:
    a) 서열번호 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 또는 66의 뉴클레오타이드 서열;
    b) 서열번호 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 또는 67의 뉴클레오타이드 서열; 또는
    c) 하기 뉴클레오타이드 서열쌍 중 하나:
    서열번호 36 및 37,
    서열번호 38 및 39,
    서열번호 40 및 41,
    서열번호 42 및 43,
    서열번호 44 및 45,
    서열번호 46 및 47,
    서열번호 48 및 49,
    서열번호 50 및 51,
    서열번호 52 및 53,
    서열번호 54 및 55,
    서열번호 56 및 57,
    서열번호 58 및 59,
    서열번호 60 및 61,
    서열번호 62 및 63,
    서열번호 64 및 65, 또는
    서열번호 66 및 67.
  13. 제12항의 핵산을 포함하는, 벡터.
  14. 제13항의 핵산을 포함하는, 숙주 세포.
  15. 제14항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포인, 숙주 세포.
  16. 하기 단계들을 포함하는, 인간 인터류킨-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제조하는 방법:
    a) 상기 항체 또는 항원-결합 부분을 발현되게 하는 조건 하에서 제15항의 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 숙주 세포는 상기 항체 또는 항원-결합 부분의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 상기 배양하는 단계, 및
    b) 상기 배양물로부터 상기 항체 또는 항원-결합 부분을 단리하는 단계.
  17. 인간 인터류킨-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 상기 항체는 제7항의 항체 또는 항원-결합 부분과 hIL-2에 대한 결합에 대해서 경쟁하거나, 또는 이것과 동일한 에피토프에 결합하는, 인간 인터류킨-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항체는 각각 제7(vii)(g)항의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 VH 아미노산 서열 및 VL 아미노산 서열을 포함하는, 인간 인터류킨-2(hIL-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  19. 제7항의 항체 또는 항원-결합 부분, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  20. 인간 대상체에서 염증성 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 제7항의 항체 또는 항원-결합 부분을 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상체에서 염증성 병태를 치료하는 방법.
  21. 면역억제 유도를 필요로 하는 인간 대상체에서 면역억제를 유도하는 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 제7항의 항체 또는 항원-결합 부분을 투여하는 단계를 포함하는, 면역억제 유도를 필요로 하는 인간 대상체에서 면역억제를 유도하는 방법.
  22. 염증성 병태를 갖거나 또는 면역억제를 필요로 하는 인간 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한, 제7항의 항체 또는 항원-결합 부분.
  23. 염증성 병태의 치료 또는 면역억제의 유도를 필요로 하는 인간 대상체에서 염증성 병태의 치료 또는 면역억제의 유도를 위한 의약의 제조에서의 제7항의 항체 또는 항원-결합 부분의 용도.
  24. 제21항에 있어서, 상기 대상체는 자가면역 질환 또는 이식편 대 숙주병을 갖는, 면역억제 유도를 필요로 하는 인간 대상체에서 면역억제를 유도하는 방법.
  25. 제21항에 있어서, 상기 항체는 IL-2와의 복합체로 투여되는, 면역억제 유도를 필요로 하는 인간 대상체에서 면역억제를 유도하는 방법.
  26. 제21항에 있어서, 상기 대상체는 제1형 당뇨병을 갖는, 면역억제 유도를 필요로 하는 인간 대상체에서 면역억제를 유도하는 방법.
  27. 인간 IL-2와 복합된 제7항의 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 조성물.
  28. 인간 IL-2와 복합된 제7항의 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  29. 인간 대상체에서 염증성 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 인간 IL-2와 복합된 제7항의 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상체에서 염증성 병태를 치료하는 방법.
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