CN115636880A - 抗il-2抗体及其组合物和用途 - Google Patents

抗il-2抗体及其组合物和用途 Download PDF

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艾萨克·J·朗登
娜塔莎·克雷林
保罗·贝塞特
埃莉奥诺拉·洛塔
杰弗里·A·布卢斯通
劳伦·K·伊利
柯南·克里斯托弗·加西亚
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Pfizer Ltd
University of California
Leland Stanford Junior University
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Pfizer Ltd
University of California
Leland Stanford Junior University
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Abstract

本发明提供了特异性结合IL‑2并且降低IL‑2与IL‑2Rα和IL‑2Rβ结合的亲和力的抗体或其抗原结合部分。本发明还提供了获得这种抗体和编码所述抗体的核酸的方法。本发明还涉及使用这些抗体用于治疗和/或预防自身免疫疾病、病症或状况以及用于免疫抑制的组合物和治疗方法，所述方法包括但不限于施用包含抗体和IL‑2的复合物。

Description

抗IL-2抗体及其组合物和用途
联合研究协议的缔约方
本发明由或代表下文列出的联合研究协议的缔约方做出。该联合研究 协议在本发明完成日期之时或之前生效，并且本发明由于在联合研究协议 范围内采取的活动而完成。联合研究协议的缔约方是PFIZER INC.和THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OFCALIFORNIA。
相关申请
本专利申请是申请号为201680068098.1的中国专利申请的分案申请， 并且要求于2016年10月14日提交的美国临时申请号62/408,360的权益； 以及于2015年10月23日提交的美国临时申请号62/245,600的利益，所 述美国临时申请的内容在此以引用的方式全文并入。
序列表
本专利申请包含序列表，所述序列表已作为以ASCII格式的文本文件 电子提交，并且在此以引用的方式全文并入。所述文本文件于2016年10 月21日创建，名称为PCFC-993-WO1-SL.txt，并且大小为106,549字节。
技术领域
本公开涉及抗体，例如特异性结合白细胞介素-2(IL-2)的全长抗体及 其抗原结合部分。本公开还涉及包含针对IL-2的抗体的组合物，以及使用 所述抗体作为药剂的方法。抗IL-2抗体可用于治疗和预防自身免疫疾病、 病症和状况以及用于免疫抑制。
背景技术
白细胞介素-2(IL-2)在免疫应答中发挥重要作用，并且是治疗与免疫 应答相关的疾病如自身免疫疾病、病症和状况以及用于免疫抑制的潜在 靶。对于治疗IL-2介导的疾病、病症和状况的新型疗法存在长期未满足的 需求。本公开满足了这些需求。
发明内容
本发明人已生成了新的且有利的抗IL-2抗体。在某些方面，本公开涉 及特异性结合人IL-2(hIL-2)的经分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述 抗体降低hIL-2与IL-2受体链IL-2Rα和IL-2Rβ的结合，并且抑制CD8+ T 细胞中的活性至比调节性T(Treg)细胞中更高的程度。
在某些方面，本公开涉及特异性结合人IL-2(hIL-2)的经分离的抗体或 其抗原结合部分，其中所述抗体结合hIL-2的螺旋A和C以及B-C环。
在某些方面，本公开涉及经分离的抗体或其抗原结合部分，所述经分 离的抗体或其抗原结合部分与包含SEQ ID NO:13和14的氨基酸序列的 抗体竞争结合人IL-2(hIL-2)、或者与包含SEQ ID NO:13和14的氨基酸 序列的抗体结合相同的hIL-2表位。
在某些方面，本公开涉及特异性结合人IL-2(hIL-2)的经分离的抗体或 其抗原结合部分，其中所述抗体将hIL-2与IL-2Rα的结合亲和力降低1至 199倍。在某些实施例中，所述抗体将hIL-2与IL-2Rα的结合亲和力降低 10倍。
在某些方面，本公开涉及特异性结合hIL-2的经分离的抗体或其抗原 结合部分，其中所述抗体或部分降低hIL-2与IL-2Rα和IL-2Rβ的结合， 并且抑制CD8+ T细胞中的STAT5磷酸化至比Treg细胞中更高的程度。
在某些方面，本公开涉及特异性结合hIL-2的经分离的抗体或其抗原 结合部分，其中所述抗体或部分降低hIL-2与IL-2Rα和IL-2Rβ的结合， 并且通过在外周血单核细胞(PBMC)培养物或重构测定中所测量的，增加 体内Treg细胞与CD8+或CD4+ T细胞或NK细胞的比率。
在某些方面，本公开涉及特异性结合hIL-2的经分离的抗体或其抗原 结合部分，其中所述抗体或部分降低hIL-2与IL-2Rα和IL-2Rβ的结合， 并且增加Treg细胞中FOXP3、CD25和Icos中的一种或多种的表达。
在某些方面，本公开涉及经分离的抗体或抗原结合部分，其中所述抗 体或部分具有a)等于或大于约4.53x10-4s-1的hIL-2结合解离速率；和/或 b)等于或大于约1.14x10-10M的与hIL-2的结合亲和力。
在某些方面，本公开涉及经分离的抗体或抗原结合部分，其中所述抗 体或部分包含：
(a)包含SEQ ID NO:73(Kabat)、74(Chothia)或75(延伸)的HCDR1； 包含SEQ IDNO:76(Kabat)或77(Chothia)的HCDR2；包含SEQ ID NO:78 的HCDR3；包含SEQ ID NO:79的LCDR1；包含SEQ ID NO:80的LCDR2； 和包含SEQ ID NO:81的LCDR3；
(b)包含SEQ ID NO:82(Kabat)、83(Chothia)或84(延伸)的HCDR1； 包含SEQ IDNO:85(Kabat)或86(Chothia)的HCDR2；包含SEQ ID NO:87 的HCDR3；包含SEQ ID NO:88的LCDR1；包含SEQ ID NO:89的LCDR2； 和包含SEQ ID NO:90的LCDR3；
(c)包含SEQ ID NO:91(Kabat)、92(Chothia)或93(延伸)的HCDR1； 包含SEQ IDNO:94(Kabat)或95(Chothia)的HCDR2；包含SEQ ID NO:96 的HCDR3；包含SEQ ID NO:97的LCDR1；包含SEQ ID NO:98的LCDR2； 和包含SEQ ID NO:99的LCDR3；
(d)包含SEQ ID NO:100(Kabat)、101(Chothia)或102(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:103(Kabat)或104(Chothia)的HCDR2；包含 SEQ ID NO:105的HCDR3；包含SEQ IDNO:106的LCDR1；包含SEQ ID NO:107的LCDR2；和包含SEQ ID NO:108的LCDR3；
(e)包含SEQ ID NO:109(Kabat)、110(Chothia)或111(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:112(Kabat)或113(Chothia)的HCDR2；包含SEQ ID NO:114的HCDR3；包含SEQ ID NO:115的LCDR1；包含SEQ ID NO: 116的LCDR2；和包含SEQ ID NO:117的LCDR3；
(f)包含SEQ ID NO:118(Kabat)、119(Chothia)或120(延伸)的HCDR1； 包含SEQID NO:121(Kabat)或122(Chothia)的HCDR2；包含SEQ ID NO: 123的HCDR3；包含SEQ IDNO:124的LCDR1；包含SEQ ID NO:125 的LCDR2；和包含SEQ ID NO:126的LCDR3；
(g)包含SEQ ID NO:127(Kabat)、128(Chothia)或129(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:130(Kabat)或131(Chothia)的HCDR2；包含 SEQ ID NO:132的HCDR3；包含SEQ IDNO:133的LCDR1；包含SEQ ID NO:134的LCDR2；和包含SEQ ID NO:135的LCDR3；
(h)包含SEQ ID NO:136(Kabat)、137(Chothia)或138(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:139(Kabat)或140(Chothia)的HCDR2；包含 SEQ ID NO:141的HCDR3；包含SEQ IDNO:142的LCDR1；包含SEQ ID NO:143的LCDR2；和包含SEQ ID NO:144的LCDR3；
(i)包含SEQ ID NO:145(Kabat)、146(Chothia)或147(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:148(Kabat)或149(Chothia)的HCDR2；包含 SEQ ID NO:150的HCDR3；包含SEQ IDNO:151的LCDR1；包含SEQ ID NO:152的LCDR2；和包含SEQ ID NO:153的LCDR3；
(j)包含SEQ ID NO:154(Kabat)、155(Chothia)或156(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:157(Kabat)或158(Chothia)的HCDR2；包含 SEQ ID NO:159的HCDR3；包含SEQ IDNO:160的LCDR1；包含SEQ ID NO:161的LCDR2；和包含SEQ ID NO:162的LCDR3；
(k)包含SEQ ID NO:163(Kabat)、164(Chothia)或165(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:166(Kabat)或167(Chothia)的HCDR2；包含 SEQ ID NO:168的HCDR3；包含SEQ IDNO:169的LCDR1；包含SEQ ID NO:170的LCDR2；和包含SEQ ID NO:171的LCDR3；
(l)包含SEQ ID NO:172(Kabat)、173(Chothia)或174(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:175(Kabat)或176(Chothia)的HCDR2；包含 SEQ ID NO:177的HCDR3；包含SEQ IDNO:178的LCDR1；包含SEQ ID NO:179的LCDR2；和包含SEQ ID NO:180的LCDR3；
(m)包含SEQ ID NO:181(Kabat)、182(Chothia)或183(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:184(Kabat)或185(Chothia)的HCDR2；包含 SEQ ID NO:186的HCDR3；包含SEQ IDNO:187的LCDR1；包含SEQ ID NO:188的LCDR2；和包含SEQ ID NO:189的LCDR3；
(n)包含SEQ ID NO:190(Kabat)、191(Chothia)或192(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:193(Kabat)或194(Chothia)的HCDR2；包含 SEQ ID NO:195的HCDR3；包含SEQ IDNO:196的LCDR1；包含SEQ ID NO:197的LCDR2；和包含SEQ ID NO:198的LCDR3；
(o)包含SEQ ID NO:199(Kabat)、200(Chothia)或201(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:202(Kabat)或203(Chothia)的HCDR2；包含 SEQ ID NO:204的HCDR3；包含SEQ IDNO:205的LCDR1；包含SEQ ID NO:206的LCDR2；和包含SEQ ID NO:207的LCDR3；
(p)包含SEQ ID NO:208(Kabat)、209(Chothia)或210(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:211(Kabat)或212(Chothia)的HCDR2；包含SEQ ID NO:213的HCDR3；包含SEQ ID NO:214的LCDR1；包含SEQ ID NO: 215的LCDR2；和包含SEQ ID NO:216的LCDR3；或
(q)包含SEQ ID NO:217的HCDR1；包含SEQ ID NO:218的HCDR2； 包含SEQ ID NO:219的HCDR3；包含SEQ ID NO:220的LCDR1；包含 SEQ ID NO:221的LCDR2；和包含SEQ IDNO:222的LCDR3。
在一些实施例中，抗体或抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)，所 述重链可变结构域(VH)包含以下：a)表7中所示的SEQ ID NO:1、3、5、 7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或71中的重链互补决 定区(HCDR)3；或b)表7中所示的SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或71中的HCDR1-3。
在一些实施例中，本公开的抗体或抗原结合部分包含轻链可变结构域 (VL)，所述轻链可变结构域(VL)包含以下：a)表7中所示的SEQ ID NO:2、 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或72中的轻链互 补决定区(LCDR)3；或b)表7中所示的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、 14、16、18、20、22、24、26、28、30或72中的LCDR1-3。
在一些上述实施例中，抗体或抗原结合部分包含：a)表7中所示的 SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、 31或71中的HCDR1-3；和/或b)表7中所示的SEQ ID NO:2、4、6、8、 10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或72中的LCDR1-3。
在某些方面，本公开涉及特异性结合人白细胞介素-2(hIL-2)的经分离 的抗体或其抗原结合部分，所述经分离的抗体或其抗原结合部分包含重链 可变结构域(VH)，所述重链可变结构域(VH)包含：a)表7中所示的SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或 71中的HCDR3；或b)表7中所示的SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、 13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或71中的HCDR1-3；或c)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31 或71的氨基酸序列。
在某些方面，本公开涉及特异性结合hIL-2的经分离的抗体或其抗原 结合部分，所述经分离的抗体或其抗原结合部分包含轻链可变结构域(VL)， 所述轻链可变结构域(VL)包含：a)表7中所示的SEQ ID NO:2、4、6、8、 10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或72中的LCDR3；或 b)表7中所示的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、 24、26、28、30、32或72中的LCDR1-3；或c)SEQ ID NO:2、4、6、8、 10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或72的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开涉及经分离的抗体或抗原结合部分，其VH包含a)表7中所示的SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、 21、23、25、27、29、31或71中的HCDR3；或b)表7中所示的SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或 71中的HCDR1-3；或c)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、 19、21、23、25、27、29、31或71的氨基酸序列；并且其VL包含a)表 7中所示的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、 26、28、30、32或72中的LCDR3；或b)表7中所示的SEQ ID NO:2、4、 6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或72中的LCDR1-3； 或c)SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、 30、32或72的氨基酸序列。
在某些方面，本公开涉及特异性结合hIL-2的经分离的抗体或其抗原 结合部分，其中所述抗体包含分别在表7中所示的以下序列中的HCDR1-3 和LCDR1-3氨基酸序列：
SEQ ID NO:1和2，
SEQ ID NO:3和4，
SEQ ID NO:5和6，
SEQ ID NO:7和8，
SEQ ID NO:9和10，
SEQ ID NO:11和12，
SEQ ID NO:13和14，
SEQ ID NO:15和16，
SEQ ID NO:17和18，
SEQ ID NO:19和20，
SEQ ID NO:21和22，
SEQ ID NO:23和24，
SEQ ID NO:25和26，
SEQ ID NO:27和28，
SEQ ID NO:29和30，
SEQ ID NO:31和32或
SEQ ID NO:71和72。
在某些方面，本公开涉及经分离的抗体或其抗原结合部分，其VH和VL分别包含以下氨基酸序列：
SEQ ID NO:1和2，
SEQ ID NO:3和4，
SEQ ID NO:5和6，
SEQ ID NO:7和8，
SEQ ID NO:9和10，
SEQ ID NO:11和12，
SEQ ID NO:13和14，
SEQ ID NO:15和16，
SEQ ID NO:17和18，
SEQ ID NO:19和20，
SEQ ID NO:21和22，
SEQ ID NO:23和24，
SEQ ID NO:25和26，
SEQ ID NO:27和28，
SEQ ID NO:29和30，
SEQ ID NO:31和32或
SEQ ID NO:71和72。
在本公开的一些实施例中，所述经分离的抗体是IgG(例如IgG1、IgG2、 IgG3或IgG4)。所述抗体可包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链 恒定区，和/或含有SEQ IDNO:34或35的氨基酸序列的轻链恒定区。在 这些实施例的一些中，重链C末端赖氨酸不存在。
在某些方面，本公开涉及特异性结合hIL-2的经分离的抗体或其抗原 结合部分，其中所述抗体与上述抗体中的任一种结合相同的表位、或者与 上述抗体中的任一种竞争结合IL-2Rα和IL-2Rβ。
在某些方面，本公开涉及抗体或抗原结合部分，其VH和VL氨基酸序 列分别与下述氨基酸序列至少90％(例如95％、98％或99％)相同：
SEQ ID NO:1和2，
SEQ ID NO:3和4，
SEQ ID NO:5和6，
SEQ ID NO:7和8，
SEQ ID NO:9和10，
SEQ ID NO:11和12，
SEQ ID NO:13和14，
SEQ ID NO:15和16，
SEQ ID NO:17和18，
SEQ ID NO:19和20，
SEQ ID NO:21和22，
SEQ ID NO:23和24，
SEQ ID NO:25和26，
SEQ ID NO:27和28，
SEQ ID NO:29和30或
SEQ ID NO:31和32。
在本公开的一些上述实施例中，抗体是人抗体。
本公开还提供了编码本公开的抗体或抗原结合部分的重链、轻链或两 者的经分离的核酸。在某些方面，经分离的核酸包含：a)SEQ ID NO:36、 38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64或66的核苷 酸序列；b)SEQ ID NO:37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、 59、61、63、65或67的核苷酸序列；或c)a)和b)。例如，经分离的核酸 可包含以下核苷酸序列：
SEQ ID NO:36和37，
SEQ ID NO:38和39，
SEQ ID NO:40和41，
SEQ ID NO:42和43，
SEQ ID NO:44和45，
SEQ ID NO:46和47，
SEQ ID NO:48和49，
SEQ ID NO:50和51，
SEQ ID NO:52和53，
SEQ ID NO:54和55，
SEQ ID NO:56和57，
SEQ ID NO:58和59，
SEQ ID NO:60和61，
SEQ ID NO:62和63，
SEQ ID NO:64和65或
SEQ ID NO:66和67。
在某些方面，本公开涉及包含上述经分离的核酸中的一种或多种的载 体。在其它方面，本公开提供了包含经分离的核酸或载体的宿主细胞(例 如哺乳动物细胞，例如NS0细胞和CHO细胞)，所述经分离的核酸或载体 编码本公开的抗体或抗原结合部分的重链、轻链或两者。本公开还提供了 生产特异性结合hIL-2的抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括： a)在允许所述抗体或抗原结合部分表达的条件下培养宿主细胞，其中所述 宿主细胞包含编码所述抗体或抗原结合部分的重链和轻链的核苷酸序列， 和b)从培养物中分离所述抗体或抗原结合部分。
在某些方面，本公开涉及包含本公开的抗体或抗原结合部分以及药学 可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
在某些方面，本公开涉及用于在有需要的人受试者中治疗炎性状况如 自身免疫疾病或诱导免疫抑制的方法，所述方法包括向受试者施用有效量 的本公开的抗体或抗原结合部分或者本公开的药物组合物。在一些实施例 中，抗体与IL-2复合施用。在相关方面，本公开提供了用于治疗患有炎性 状况如自身免疫疾病或需要免疫抑制的人受试者的本公开的抗体或抗原 结合部分或者本公开的药物组合物，其中所述抗体或部分任选与IL-2复合 施用；以及本公开的抗体或抗原结合部分在制备用于治疗炎性状况如自身 免疫疾病或诱导免疫抑制的药物中的用途，其中所述抗体或部分任选与 IL-2复合施用。
可用本发明的组合物(包括但不限于本文所述的抗体或抗体/IL-2复 合物)和方法治疗的状况包括但不限于：炎性皮肤病，包括牛皮癣和皮炎 (例如特应性皮炎)；皮肌炎；系统性硬皮病和硬化症；与炎性肠病相关 的状况(例如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)；结肠炎；胃炎；呼吸窘迫综 合征(包括成人呼吸窘迫综合征和ARDS)；皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；肾小球肾炎；过敏性状况如湿疹和哮喘以及涉及T细胞浸润和慢性 炎症应答的其它状况；动脉粥样硬化；白细胞粘附缺陷；类风湿性关节炎； 系统性红斑狼疮(SLE)；糖尿病(例如I型糖尿病)；多发性硬化症；雷诺 氏综合征；自身免疫性甲状腺炎；变态反应性脑脊髓炎；干燥综合征；青 少年型糖尿病；以及通常在结核、肉瘤样病、多肌炎、肉芽肿病和血管炎 中发现的由细胞因子和T淋巴细胞介导的与急性和迟发性超敏反应相关的 免疫应答；韦格纳氏病；恶性贫血(阿狄森氏病)；涉及白细胞渗出的疾 病；中枢神经系统(CNS)炎性病症；多器官损伤综合征；溶血性贫血(包 括但不限于冷球蛋白血症或库姆氏阳性贫血)；重症肌无力；抗原-抗体复 合物介导的疾病；抗肾小球基底膜病；抗磷脂综合征；过敏性神经炎；格 雷夫斯病；朗-爱二氏肌无力综合征；类天疱疮；天疱疮；自身免疫性多内 分泌腺疾病；白癜风；赖特氏病；僵人综合征；白塞病；巨细胞动脉炎； 免疫复合物肾炎；IgA肾病；IgM多发性神经病；免疫性血小板减少性紫 癜(ITP)或自身免疫性血小板减少症和自身免疫性溶血性疾病；桥本氏甲状 腺炎；自身免疫性肝炎；自身免疫性血友病；自身免疫性淋巴细胞增生综 合征(ALPS)；自身免疫性葡萄膜视网膜炎；格-巴二氏综合征；古德帕斯丘 综合征；混合性结缔组织病；自身免疫相关性不孕症；结节性多动脉炎； 斑秃；特发性粘液性水肿；移植物抗宿主病；和肌营养不良(杜兴氏肌营 养不良、贝克型肌营养不良、强直性肌营养不良、肢带型肌营养不良、面 肩肱型肌营养不良、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端型营养 不良和埃德型营养不良)。在一些实施例中，可用本发明的组合物(包括 但不限于本文所述的抗体或抗体/IL-2复合物)和方法治疗的状况是糖尿病 (例如I型糖尿病)。在一些实施例中，可用本发明的组合物(包括但不限 于本文所述的抗体或抗体/IL-2复合物)和方法治疗的状况是I型糖尿病。 在一些实施例中，可用本发明的组合物(包括但不限于本文所述的抗体或 抗体/IL-2复合物)和方法治疗的状况是青少年型糖尿病。
根据下述详细描述以及示例性实施例，本公开的其它特征和优点将是 显而易见的。
附图说明
专利或申请文件包含以颜色执行的至少一个图。具有彩色附图的本专 利或专利申请出版物的拷贝在申请且支付必要的费用后由专利局提供。
图1描绘了抗体/IL-2亲和力以及IL-2Rα和IL-2Rβ结合。应答报告 为在60秒后与IL-2α和IL-2Rβ的结合，作为与IL-2复合的两种代表性克 隆d1C7和16C3分别与IL-2Rα和IL-2Rβ的结合百分比。
图2描绘了抗体/IL-2亲和力以及IL-2Rα和IL-2Rβ的结合。亲本和亲 和力成熟的克隆两者均显示抗体/IL-2复合物与IL-2Rβ结合的完全抑制， 以及与克隆d1C7/IL-2复合物相比，与IL-2Rα的结合中的降低。
图3描绘了在IL-2:抗IL-2mAb处理后Treg的表型。Treg群体对 hCD45+CD3+CD4+Helios+FoxP3+细胞进行门控。
图4A-C描绘了与hIL-2复合的16C3(25μg)和F5.1.11.02(1、5和25 μg)增加Treg/CD4、Treg/CD8和Treg/NK细胞比率。图4D-F描绘了与 hIL-2复合的16C3(25μg)和F5.1.11.02(1μg、5μg和25μg)增加Treg/CD4、 Treg/CD8和Treg/NK细胞比率。
图5A-C描绘了与hIL-2复合的16C3(25μg)和F5.1.11.02(1、5和25 μg)增加了脾中CD4+、CD8+细胞和Treg的总数目。图5D-F描绘了与hIL-2 复合的16C3(25μg)和F5.1.11.02(1μg、5μg和25μg)增加了脾中CD4+、 CD8+细胞和Treg的总数目。
图6A-C描绘了在抗体处理后，在Treg上的CD25、Icos和FoxP3平 均荧光强度(MFI)。
图7A-V描绘了在抗体处理后，在CD8+效应T细胞和Treg细胞中的 pSTAT5信号传导。曲线代表用0.2ng/mL hIL-2、10ng/mL hIL-2或500 ng/mL hIL-2的处理。
图8A-F描绘了在抗体处理后，在CD8+效应T细胞和Treg细胞中的 pSTAT5信号传导。曲线代表用0.5ng/mL hIL-2、5ng/mL hIL-2、50ng/mL hIL-2或500ng/mL hIL-2的处理。
图9A-D描绘了在抗体处理后，在CD8+/CD25高T细胞、CD8+/CD25 低T细胞和Treg细胞中的pSTAT5信号传导。x轴是nM抗体。曲线代表 用0.8ng/mL hIL-2、20ng/mL hIL-2或500ng/mL hIL-2的处理。
图10A-B描绘了具有不同浓度的IL-2的CD8+/CD25高T细胞、 CD8+/CD25低T细胞和Treg细胞中的pSTAT5信号传导。
图11A-H描绘了在抗体F5.1.9、F5.1.9.5和F5.1.11.04处理后，在CD8+效应T细胞和Treg细胞中的pSTAT5信号传导。x轴是nM抗体。曲线代 表用0.8ng/mL hIL-2、20ng/mLhIL-2或500ng/mL hIL-2的处理。
图12A-B描绘了用PMA/离子霉素体外刺激小鼠脾细胞后的IL-2产 生。
图13A-B描绘了在hIL-2Tg、NOD或NOD mIL-2+/-小鼠中活化的 (CD44+CD62L-)CD4+或CD8+ T细胞的百分比。
图14描绘了来自hIL-2Tg、NOD或NOD mIL-2+/-小鼠的Treg上CD25 的细胞表面表达。
图15描绘了F5.1.11.02:IL-2复合物在第7天时对脾的总体细胞性的作 用。
图16A-I描绘了F5.1.11.02:IL-2复合物对脾、pLN和胰腺中的Treg百 分比的作用。
图17A-F描绘了与hIL-2复合的F5.1.11.02(25μg)对脾、pLN和胰腺 中的Treg/CD4和Treg/CD8比率的作用。
图18A-C描绘了F5.1.11.02:IL-2复合物(5μg和25μg F5.1.11.02)对 脾、pLN和胰腺中的Treg上的CD25平均荧光强度(MFI)的作用。
图19A-B描绘了25μg与hIL-2复合的F5.1.11.02对总脾细胞数目的 作用。
图20A-F描绘了F5.1.11.02抗体:IL-2复合物对脾中的Teff和Treg总 细胞数目的作用。Treg群体对hCD45+CD3+CD4+Helios+FoxP3+细胞进行 门控。
图21A-D描绘了F5.1.11.02抗体:IL-2复合物对脾中的Treg/CD4和 Treg/CD8比率的作用。Treg群体对hCD45+CD3+CD4+Helios+FoxP3+细 胞进行门控。
图22A-H描绘了F5.1.11.02抗体:IL-2复合物处理对Treg增殖的作用。
图23A-H描绘了F5.1.11.02抗体:IL-2复合物处理对CD8T细胞增殖 的作用。
图24A-B描绘了与同种型对照相比，用两种剂量的F5.1.11.02抗 体:IL-2复合物处理诱导脾中的Treg和CD8群体上的CD25平均荧光强度 (MFI)增加。
图25A-D描绘了F5.1.11.02和F5.1.11对Treg和CD8细胞数目的作 用之间的比较。
图26A-C描绘了F5.1.11.02和F5.1.11对Treg/CD8比率的作用之间的 比较。
图27A-H描绘了抗体在各种剂量下对Treg增殖的作用。
图28A-H描绘了抗体在各种剂量下对CD8细胞增殖的作用。
图29A-B描绘了IL-2Rα与增加浓度的IL-2(A)和IL-2/F5.1.11Fab(B) 结合的平衡结合分析。
图30描绘了F5.1.11Fab经由轻链(LC)CDR1和CDR3环以及重链(HC) CDR2和CDR3环与IL-2相互作用。
图31描绘了由IL-2受体四元复合物覆盖的F5.1.11Fab/IL-2复合物， 显示F5.1.11Fab和IL-2Rβ的结合位点重叠(左侧图)。当与F5.1.11Fab 结合时，IL-2构象显示了相对于受体结合的IL-2的构象变化，导致IL-2Rα 结合位点的变构调节(右侧图)。
图32描绘了关于非人灵长类动物交叉反应性的基于结构的文库设计。 人(SEQ IDNO:224；NCBI登录号NP_000577.2)和食蟹猴(cyno)(SEQ ID NO:225；由参考基因组NCBI登录号NC_022276.1预测)IL-2氨基酸序 列的比对显示了IL-2可变环对应于F5.1.11Fab结合界面。
图33A-B描绘了F5.1.11.02和F5.1.11对脾细胞和hCD45+细胞性的作 用之间的比较。
图34A-B描绘了F5.1.11.02和F5.1.11对Treg和CD8细胞CD25表达 的作用之间的比较。
图35A-B描绘了F5.1.11.02抗体:IL-2复合物在处理后5天对Treg、 CD4和CD8总细胞数目的作用。
图36A-B描绘了F5.1.11.02抗体:IL-2复合物在处理后5天对Treg/CD4 和Treg/CD8细胞比率的作用。
图37A-B描绘了与同种型对照相比，用F5.1.11.02抗体:IL-2复合物处 理对Treg和CD8群体上的CD25平均荧光强度(MFI)的作用。
图38描绘了用F5.1.11.02抗体:IL-2复合物处理对Treg上的FoxP3平 均荧光强度(MFI)的作用。
图39A-B描绘了使用抗体促进差异Treg扩增，所述抗体结合IL-2上 的不同表位，从而抑制与不同受体表位/结合结构域的结合：IL-2Rα阻断 剂(16C3.4)、IL2Rβ阻断剂(d1C7)和还降低IL2与IL-2Rα的结合的IL2Rβ 阻断剂(F5.1.11.02)。统计学单因素方差分析16C3.4相对于d1c7或16C3.4 相对于F5.1.11.02。
图40描绘了与同种型对照相比，用16C3.4、d1C7和F5.1.11.02处理 对Treg和CD8群体上的CD25平均荧光强度(MFI)的作用。
图41描绘了通过F5.1.11.02抗体:IL-2复合物的糖尿病缓解。
图42描绘了F5.1.11.02抗体:IL-2复合物对胰腺中的Treg数目和特征 的作用。
具体实施方式
本发明人已发明了新的和有利的抗-IL-2抗体或其抗原结合部分，其特 异性结合hIL-2并且降低hIL-2与IL-2Rα和IL-2Rβ的结合。这些抗体和 部分可抑制非Treg细胞(包括效应CD8+、非Treg CD4+和NK细胞)的 增殖超过它们抑制Treg细胞的增殖；与同种型对照抗体相比，增加Treg 增殖；和/或增加Treg细胞/非Treg细胞的比率或维持Treg标记物。本抗体不同于国际申请PCT/US2015/011794(现在作为国际公开号WO 2015/109212于2015年7月23日公开，以引用的方式全文并入)中描述 的IL-2Rα阻断抗体，因为本抗体减少但不取消hIL-2与IL-2Rα的结合， 并且阻断hIL-2与IL-2Rβ的结合。
抗IL-2抗体或其抗原结合部分可用于预防、治疗和/或改善由IL-2活 性引起和/或与IL-2活性相关的疾病、病症或状况。这些疾病、病症或状 况尤其包括但不限于1型糖尿病、自身免疫疾病、移植物抗宿主病和其中 Treg介导炎症的其它免疫疾病，如提供给本文公开的教导的本领域技术人 员所了解的。
一般技术
除非在本文中另有定义，否则与本公开结合使用的科学和技术术语应 该具有由本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要 求，否则单数术语应该包括复数，并且复数术语应该包括单数。一般地， 与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学 以及蛋白质和核酸化学和杂交结合使用的术语以及这些的技术是本领域 众所周知和常用的那些。
除非另有说明，否则本公开的实践将采用在本领域技术内的分子生物 学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规 技术。这些技术在文献中充分解释，例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989)ColdSpring Harbor Press； Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，1984)；Methods inMolecular Biology, Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis，编辑，1998) Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，编辑，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press； Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G. Newell，编辑，1993-1998)J.Wiley和Sons；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell，编辑)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos，编辑，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel 等人，编辑，1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人，编 辑，1994)；CurrentProtocols in Immunology(J.E.Coligan等人，编辑，1991)； Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY(2001)；Ausubel等人， Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,NY(2002)；Harlow and Lane Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1998)；Coligan等人，Short Protocols in Protein Science,John Wiley&Sons,NY(2003)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley和Sons，1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers， 1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:apractical approach(D.Catty.， 编辑，IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach(P. Shepherd和C.Dean，编辑，Oxford University Press,2000)；Using antibodies: a laboratory manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring HarborLaboratory Press, 1999)；和The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra，编辑，HarwoodAcademic Publishers,1995)。
根据制造商的说明书执行酶促反应和纯化技术，如本领域通常完成的 或如本文所述的。与本文描述的分析化学、生物化学、免疫学、分子生物 学、合成有机化学、以及药物和药物化学结合使用的术语以及这些的实验 室程序和技术是本领域众所周知和常用的。标准技术用于化学合成、化学 分析、药物制备、制剂和递送以及患者的治疗。
定义
除非另有说明，否则下述术语应该理解为具有下述含义：术语“经分 离的分子”(其中分子是例如多肽、多核苷酸或抗体或其部分)是这样的 分子，由于其起源或衍生来源，所述分子(1)不与在其天然状态下伴随其的 天然结合组分结合，(2)基本上不含来自相同物种的其它分子，(3)由来自不 同物种的细胞表达，或(4)在自然界中不存在。因此，化学合成或在与它天 然源于其的细胞不同的细胞系统中表达的分子与其天然结合的组分“分离”。使用本领域众所周知的纯化技术，分子也可通过分离致使基本上不 含天然结合的组分。分子纯度或同质性可通过本领域众所周知的多种方法 进行测定。例如，可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和使用本领域众所周知的技 术染色凝胶以显现多肽来测定多肽样品的纯度。出于某些目的，可通过使 用HPLC或本领域众所周知的用于纯化的其它手段来提供更高的分辨率。
如本文使用的，“基本上纯的”意指目标种类是存在的占优势种类(即， 在摩尔基础上，它比组合物中的任何其它各个种类更丰富)，并且在一些 实施例中，基本上纯化的级分是组合物，其中目标种类(例如糖蛋白，包 括抗体或受体)包含存在的所有大分子种类的至少约50百分比(在摩尔 基础上)。一般地，基本上纯的组合物包含组合物中存在的所有大分子种 类的超过约80百分比，在一些实施例中，超过约85％、90％、95％和99％。 在一些实施例中，目标种类被纯化至基本上同质性(通过常规检测方法无 法在组合物中检测到污染物种类)，其中所述组合物基本上由单一大分子 种类组成。在某些实施例中，基本上纯的材料至少50％纯(即不含污染物)， 在一些实施例中，至少90％纯，在一些实施例中，至少95％纯，另外在一 些实施例中，至少98％纯，并且在一些实施例中，至少99％纯。这些量并 不意味着是限制性的，并且所述百分比之间的增量被具体设想为本公开的 部分。
“抗体”是能够通过位于免疫球蛋白分子的可变结构域中的至少一个 抗原识别位点与靶例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等特异性结合 的免疫球蛋白分子。如本文使用的，该术语不仅涵盖完整的多克隆或单克 隆抗体，而且还包括(除非另有说明)与完整抗体竞争特异性结合的其任 何抗原结合部分、包含抗原结合部分的融合蛋白、以及包含抗原识别位点 的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。抗原结合部分包括例如Fab、Fab’、 F(ab’)2、Fd、Fv、结构域抗体(dAb，例如鲨鱼和骆驼科抗体)、包括互补 决定区(CDR)的部分、单链可变片段抗体(scFv)、巨型抗体(maxibody)、微 型抗体(minibody)、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双scFv、 以及含有足以赋予与多肽的特异性抗原结合的免疫球蛋白的至少一部分 的多肽。取决于其重链恒定区的抗体氨基酸序列，可将免疫球蛋白分配至 不同类别。存在免疫球蛋白的五个主要类别(即，同种型)：IgA、IgD、 IgE、IgG和IgM，并且其中几个还可分成亚类(亚型)，例如IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区分 别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是 众所周知的。
如本文可互换使用的，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段” (或简称“抗体部分”)指抗体的一个或多个部分，其保留与抗原(例如IL-2) 特异性结合的能力。已显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的部分执 行。在术语抗体的“抗原结合部分”内涵盖的结合部分的例子包括(i)Fab部 分，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价部分；(ii)F(ab')2部分，包含 在铰链区由二硫键连接的两个Fab部分的二价部分；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd部分；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv部分，(v) 由VH结构域组成的dAb部分(Ward等人，(1989)Nature 341:544-546)；和 (vi)经分离的互补决定区(CDR)、二硫键连接的Fv(dsFv)以及抗独特型(抗 Id)抗体和胞内抗体。此外，尽管Fv部分的两个结构域VL和VH由分开的 基因编码，但它们可使用重组方法通过合成接头连接，所述合成接头使得 它们能够制备为单一蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称 为单链Fv(scFv))；参见例如Bird等人Science 242:423-426(1988)和Huston 等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。这样的单链抗体也预 期涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。还涵盖了其它形式的单链抗体， 例如双抗体。双抗体是二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多 肽链上表达，但使用的接头太短而不允许在相同链上的两个结构域之间的 配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并且产生两个抗原 结合位点(参见例如Holliger等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)；Poljak等人，1994,Structure 2:1121-1123)。
抗体的“可变结构域”指单独或组合的抗体轻链(VL)的可变结构域或抗 体重链(VH)的可变结构域。如本领域中已知的，重链和轻链的可变结构域 各自由通过也称为高变区的三个互补决定区(CDR)连接的四个构架区(FR) 组成，并且有助于形成抗体的抗原结合位点。如果期望主题可变结构域的 变体，特别是在CDR外(即，构架区中)的氨基酸残基中的取代，则适 当的氨基酸取代，在一些实施例中，保守氨基酸取代可通过比较主题可变 结构域与其它抗体的可变结构域进行鉴定，所述其它抗体包含与主题可变 结构域相同的规范类别中的CDR1和CDR2序列(参见例如Chothia和 Lesk，J.Mol.Biol.196(4):901-917,1987)。
在某些实施例中，通过分辨抗体的结构和/或分辨抗体-配体复合物的 结构来完成CDR的确定性描绘和包含抗体的结合位点的残基的鉴定。在 某些实施例中，这可通过本领域技术人员已知的各种技术中的任一种，例 如X射线晶体学来实现。在某些实施例中，各种分析方法可用于鉴定或接 近CDR。在某些实施例中，各种分析方法可用于鉴定或接近CDR。这些 方法的例子包括但不限于Kabat定义、Chothia定义、AbM定义、接触定 义、构象定义和IMGT定义。
Kabat定义是用于编号抗体中残基的标准并且通常用于鉴定CDR区 域。参见例如Johnson&Wu,2000,Nucleic Acids Res.,28:214-8。Chothia定 义与Kabat定义类似，但Chothia定义考虑了某些结构环区域的位置。参 见例如Chothia等人，1986,J.Mol.Biol.,196:901-17；Chothia等人，1989, Nature,342:877-83。AbM定义使用建模抗体结构的由Oxford Molecular Group生产的计算机程序集成套件。参见例如Martin等人，1989,ProcNatl Acad Sci(USA),86:9268-9272；“AbMTM,A Computer Program for ModelingVariable Regions of Antibodies,”Oxford,UK；Oxford Molecular,Ltd。AbM定 义使用知识数据库和从头开始方法的组合，从基本序列建模抗体的三级结 构，所述方法例如由Samudrala等人，1999，在PROTEINS,Structure,Function and Genetics Suppl.,3:194-198中的“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined HierarchicalApproach”描述的那些。接触定义基于可用复杂晶体 结构的分析。参见例如MacCallum等人，1996,J.Mol.Biol.,5:732-45。在本 文中称为CDR的“构象定义”的另一种方法中，CDR的位置可鉴定为对抗 原结合做出焓贡献的残基。参见例如Makabe等人，2008,Journal ofBiological Chemistry,283:1156-1166。另外其它的CDR边界定义可能不严格遵循上述 方法之一，但仍然与Kabat CDR的至少一部分重叠，尽管根据特定残基或 残基组不显著影响抗原结合的预测或实验结果，它们可缩短或延长。如本 文使用的，CDR可指通过本领域已知的任何方法(包括方法的组合)定义 的CDR。本文使用的方法可利用根据这些方法中的任一种定义的CDR。 对于包含超过一个CDR的任何给定实施例，可根据Kabat、Chothia、延伸 的、AbM、接触和/或构象定义中的任一个来定义CDR。在某些实施例中， 延伸的CDR指由Kabat和Chothia方法鉴定的所有氨基酸残基。
如本文关于抗体或由其特异性结合的抗原使用的，“接触残基”指包含 至少一个重原子(即，非氢)的抗体/抗原上存在的氨基酸残基，其在同源 抗体/抗原上存在的氨基酸残基的重原子的
Figure BDA0003717294580000181
或更少内。
如本领域已知的，抗体的“恒定区”指单独或组合的抗体轻链的恒定区 或抗体重链的恒定区。
如本文使用的，“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体获得的抗 体，即除了可能以少量存在的可能天然存在的突变之外，群体包含的各个 抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外， 与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反， 每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”指示如从基本 上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定 方法产生抗体。例如，根据本公开使用的单克隆抗体可通过首先由Kohler 和Milstein，1975,Nature 256:495描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过例 如美国专利号4,816,567中所述的重组DNA方法来制备。例如，单克隆抗 体也可从使用McCafferty等人，1990,Nature 348:552-554中描述的技术，从 所生成的噬菌体文库中分离。如本文使用的，“人源化”抗体指其为嵌合免 疫球蛋白、免疫球蛋白链或其一部分(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体 的其它抗原结合子序列)的非人(例如鼠)抗体形式，其含有源自非人免 疫球蛋白的最小序列。在一些实施例中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受 体抗体)，其中来自受体的CDR的残基替换为来自非人物种(供体抗体) 如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基，所述非人物种具有所需特异性、亲和 力和能力。人源化抗体可包含这样的残基，所述残基在受体抗体和输入 CDR或构架序列中都未发现，但被包括以进一步改良和优化抗体性能。
“人抗体”是具有氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人产生 的抗体的氨基酸序列和/或已使用如本文公开的用于制备人抗体的任何技 术制备。人抗体的该定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗 体。
术语“嵌合抗体”预期指其中可变结构域序列源自一个物种，并且恒定 区序列源自另一个物种的抗体，例如其中可变结构域序列源自小鼠抗体， 并且恒定区序列源自人抗体或反之亦然的抗体。该术语还涵盖包含来自一 个物种的一个个体(例如第一小鼠)的V区和来自同一物种的另一个个体 (例如第二小鼠)的恒定区的抗体。
术语“抗原(Ag)”指用于免疫接种免疫活性的脊椎动物的分子，以产生 识别Ag的抗体(Ab)，或筛选表达文库(例如尤其是噬菌体、酵母或核糖 体展示文库)。在本文中，Ag被更广义地定义，并且一般预期包括由Ab 特异性识别的靶分子，因此包括用于产生Ab的免疫接种过程或用于选择 Ab的文库筛选中使用的分子的一部分或模拟物。因此，对于本公开的与IL-2结合的抗体，来自哺乳动物物种的全长IL-2(例如人、猴、小鼠和大 鼠IL-2)，包括其单体和多聚体，例如二聚体、三聚体等，以及IL-2的截 短变体和其它变体被称为抗原。
一般地，术语“表位”指抗体与之特异性结合的抗原的区域或区，即与 抗体物理接触的区域或区。因此，术语“表位”指能够在抗体的抗原结合区 中的一个或多个处被抗体识别且由抗体结合的分子的那部分。通常，表位 在“抗体或其抗原结合部分”(Ab)与其对应抗原之间的分子相互作用的上 下文中定义。表位经常由分子的表面分组例如氨基酸或糖侧链组成，并且 具有特定的三维结构特征以及比电荷特征。在一些实施例中，表位可为蛋 白质表位。蛋白质表位可为线性或构象的。在线性表位中，蛋白质和相互 作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用点都沿着蛋白质的一级氨基酸 序列线性出现。“非线性表位”或“构象表位”包含抗原蛋白质内的非邻接多 肽(或氨基酸)，抗体对于表位结合的所述抗原蛋白质具有特异性。如本 文使用的，术语“抗原表位”定义为抗体可与之特异性结合的抗原的一部 分，如通过本领域众所周知的任何方法(例如通过常规免疫测定)确定的。 可替代地，在发现过程期间，抗体的生成和表征可阐明关于所需表位的信 息。根据这些信息，随后能够竞争性筛选与相同表位结合的抗体。实现这 一点的方法是进行竞争和交叉竞争研究，以发现彼此竞争或交叉竞争结合 IL-2的抗体，例如抗体竞争结合抗原。
如本文使用的，术语“野生型氨基酸”、“野生型IgG”、“野生型抗体” 或“野生型mAb”指在某一群体(如人、小鼠、大鼠、细胞等)内天然存在 的氨基酸或核酸序列。
如本文其它地方概述的，抗体分子的某些位置可被改变。如本文使用 的，“位置”意指蛋白质序列中的位置。位置可序贯编号，或根据确定的格 式编号，例如EU索引和Kabat索引可用于编号抗体的氨基酸残基。例如， 位置297是人抗体IgG1中的位置。一般通过与其它亲本序列比对，如上 文概述的确定相应位置。
如本文使用的，“残基”意指蛋白质中的位置及其相关的氨基酸身份。 例如，天冬酰胺297(也称为Asn297，也称为N297)是人抗体IgG1中的 残基。
术语“T调节性细胞”或“Treg”指可特征在于本领域技术人员已知的功 能或生物学标记物的T细胞类型(参见Schmetterer等人，FASEB第26卷(2012))。在某些实施例中，Treg细胞表达下述标记物中的一种或多种： TCR/CD3、CD4、CD25和基于FOXP3基因座的关键基因组元件的去甲基 化的稳定FOXP3。
术语“Treg保留抗体”指与IL-2结合，并且使Treg:CD8+细胞的比率可 检测地转向有利于Treg细胞的抗体。在一些实施例中，Treg保留抗体抑 制CD8+细胞增殖的程度大于它抑制Treg的增殖。在一些实施例中，Treg 保留抗体使Treg:CD8+细胞比率增加至少两倍。
如本领域已知的，如本文可互换使用的，“多核苷酸”或“核酸”指任何 长度的核苷酸链，并且包括DNA和RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、 核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物、或者可通过DNA或 RNA聚合酶掺入链内的任何底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，例如 甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在的话，可在链组装之前或链组装之 后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可被非核苷酸组分间断。多核 苷酸还可在聚合后进行修饰，例如通过与标记组分缀合。其它类型的修饰 包括例如“帽”，用类似物取代天然存在的核苷酸中的一个或多个，核苷酸 间修饰，例如具有不荷电键的那些(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷 酸酯、氨基甲酸酯等)和具有荷电键的那些(例如硫代磷酸酯、二硫代磷 酸酯等)，含有悬垂部分例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、 聚-L-赖氨酸等)的那些，含有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的那些、 含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些，含有烷 化剂的那些，具有经修饰的键的那些(例如α异头核酸等)以及未修饰形 式的多核苷酸。此外，通常存在于糖中的任何羟基都可例如替换为膦酸酯 基团、磷酸基，被标准保护基团保护，或被活化以制备与另外核苷酸的另 外连接，或可缀合至固体支持物。5'和3'末端OH可磷酸化或者被胺或1 至20个碳原子的有机封端基团取代。其它羟基也可衍生为标准保护基团。 多核苷酸还可含有本领域一般已知的核糖或脱氧核糖糖的类似形式，包括 例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α- 或β-异头糖、差向异构糖(如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、 景天庚酮糖)、无环类似物和无碱基核苷类似物如甲基核糖苷。一个或多 个磷酸二酯键可替换为替代的连接基团。这些可替代的连接基团包括但不 限于这样的实施例，其中磷酸盐被替换为P(O)S(“硫代酸盐”)、P(S)S(“二 硫代酸盐”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲缩 醛”)，其中每个R或R'独立地为H，或者任选含有醚(-O-)键、芳基、烯基、 环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)的取代或未取代的烷基(1-20C)。并非多 核苷酸中的所有键都必需是相同的。前述描述适用于本文提及的所有多核 苷酸，包括RNA和DNA。
“优先结合”或“特异性结合”(在本文中可互换使用)表位的抗体是本 领域中充分了解的术语，并且确定此类特异性或优先结合的方法也是本领 域众所周知的。如果与分子与可替代细胞或物质的反应或结合相比，它与 特定细胞或物质更频繁、更快速、以更长的持续时间和/或以更大的亲和力 反应或结合，则它被说成显示出“特异性结合”或“优先结合”。如果与抗体 与其他物质的结合相比，它以更大的亲和力、亲合力、更容易和/或以更长的持续时间与靶结合，则抗体“特异性结合”或“优先结合”该靶。此外，如 果与抗体结合样品中存在的其它物质相比，它以更大的亲和力、亲合力、 更容易和/或以更长的持续时间结合样品中的靶，则抗体“特异性结合”或 “优先结合”该靶。例如，特异性或优先结合IL-2表位的抗体是与它结合其 它IL-2表位或非IL-2表位相比，以更大的亲和力、亲合力、更容易和/或 以更长的持续时间结合该表位的抗体。通过阅读该定义也可理解，例如， 特异性或优先结合第一靶的抗体(或部分或表位)可特异性或优先结合第 二靶或者可不特异性或优先结合第二靶。因此，“特异性结合”或“优先结合” 不一定要求(尽管它可包括)排他性结合。
各种测定形式可用于选择特异性结合目的分子的抗体或肽。例如，固 相ELISA免疫测定、免疫沉淀、BiacoreTM(GE Healthcare,Piscataway,NJ)、 KinExA、荧光激活细胞分选(FACS)、OctetTM(FortéBio,Inc.,Menlo Park,CA) 和蛋白质印迹分析在可用于鉴定抗体(其与抗原或受体特异性反应)或其 配体结合部分(其与同源配体或结合配偶体特异性结合)的许多测定中。 通常，特定性或选择性反应是本底信号或噪声的至少两倍，更通常超过本 底的10倍，甚至更通常超过本底的50倍，更通常超过本底的100倍，再 更通常超过本底的500倍，甚至更通常超过本底的1000倍，且甚至更通 常超过本底的10,000倍。此外，当平衡解离常数(KD)≤7nM时，抗体被 说成“特异性结合”抗原。
术语“结合亲和力”在本文中用作两个分子(例如抗体或其部分与抗 原)之间的非共价相互作用的强度量度。术语“结合亲和力”用于描述单价 相互作用(固有活性)。两个分子之间的结合亲和力可通过确定解离常数(KD)来量化。依次地，可通过使用例如表面等离子共振(SPR)方法(Biacore) 测量复合物形成和解离的动力学来确定KD。对应于单价复合物的结合和 解离的速率常数分别被称为结合速率常数ka(或kon)和解离速率常数kd (或koff)。KD通过方程KD＝kd/ka与ka和kd有关。解离常数的值可通过 众所周知的方法直接确定，并且可通过方法例如Caceci等人(1984,Byte 9: 340-362)中所述的那些甚至对于复杂混合物进行计算。例如，可使用双重 过滤硝化纤维素滤器结合测定如Wong&Lohman(1993,Proc.Natl.Acad. Sci.USA 90:5428-5432)中公开的那种来确定KD。评估抗体针对靶抗原的结 合能力的其它标准测定是本领域已知的，包括例如ELISA、蛋白质印迹、 RIA和流式细胞术分析、以及本文其它地方例举的其它测定。抗体的结合 动力学和结合亲和力也可通过本领域已知的标准测定，例如表面等离子共 振(SPR)，例如通过使用BiacoreTM系统或KinExA来评价。
在一些实施例中，抗体可以约1.14x10-10M或更大的KD与hIL-2结 合。例如，抗体可以约9x10-11M或更大的KD与hIL-2结合。在一些实施 例中，抗体可以约8x10-11M或更大的KD与hIL-2结合。在一些实施例中， 抗体可以约7x10-11M或更大的KD与hIL-2结合。在一些实施例中，抗体 可以约6x10-11M或更大的KD与hIL-2结合。在一些实施例中，抗体可以 约5.00x10-11M或更大的KD与hIL-2结合。这些量并不意味着是限制性 的，并且所述值之间的增量被特别设想作为本公开的部分。在一些实施例 中，如表3中所示，抗体可以与抗体的KD大约相同的kd与hIL-2结合。
在一些实施例中，抗体可以约4.53x10-4s-1或更大的kd与hIL-2结合。 例如，抗体可以约3x10-4s-1或更大的kd与hIL-2结合。在一些实施例中， 抗体可以约1x10-4s-1或更大的kd与hIL-2结合。在一些实施例中，抗体 可以约9x10-5s-1或更大的kd与hIL-2结合。在一些实施例中，抗体可以 约7x10-5s-1或更大的kd与hIL-2结合。在一些实施例中，抗体可以约5.00 x10-5s-1或更大的kd与hIL-2结合。这些量并不意味着是限制性的，并且 所述值之间的增量被特别设想作为本公开的部分。在一些实施例中，如表 3中所示，抗体可以与抗体的kd大约相同的kd与hIL-2结合。
可进行竞争性结合测定，其中抗体与靶抗原的结合与靶和该靶的另一 种配体(例如以其它方式结合靶的另一种抗体或可溶性受体)的结合进行 比较。在其下发生50％抑制的浓度称为Ki。在理想条件下，Ki等于KD。 Ki值决不小于KD，因此Ki的测量可方便地取代以提供KD的上限。
根据上述定义，可通过比较各个抗体/抗原复合物的KD值来比较与不 同分子相互作用相关的结合亲和力，例如，不同抗体对于给定抗原的结合 亲和力的比较。类似地，相互作用的特异性可通过确定和比较目的相互作 用(例如抗体和抗原之间的特异性相互作用)的KD值与非目的相互作用 (例如已知不结合IL-2的对照抗体)的KD值进行评价。
特异性结合其靶的抗体可以以高亲和力地结合其靶，即如上文讨论的 显示出低KD，并且可以较低的亲和力结合其它非靶分子。例如，抗体可 以1x10-6M或更高，在一些实施例中，1x10-5M或更高，在一些实施例 中，1x10-4M或更高，在一些实施例中，1x10-3M或更高，在一些实施 例中，1x10-2M或更高的KD结合非靶分子。在一些实施例中，本公开的 抗体能够与其靶结合的亲和力比它与另一种非IL-2分子结合的亲和力大 至少2倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或10,000倍。 这些量并不意味着是限制性的，并且所述值之间的增量被特别设想作为本 公开的部分。
如该术语在本文中使用的，抗体:IL-2“复合物”指包含本公开的至少一 种抗体或其抗原结合部分的复合物，其特异性结合IL-2和至少一种IL-2 细胞因子分子。该复合物包含通过共价力、非共价力或任何其它力结合的 抗体和IL-2分子。优选地，即使在施用复合物后，抗体和IL-2仍可作为 复合物保持结合。应理解，在其它变量中，抗体和IL-2将基于它们之间的 结合相互作用的KD值而形成复合物。
“宿主细胞”包括各个细胞或细胞培养物，其可为或已是用于掺入多核 苷酸插入片段的载体的受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，并且由 于天然、偶然或有意的突变，子代可不一定与原始亲本细胞完全相同(在 形态学或基因组DNA互补体中)。宿主细胞包括用本公开的多核苷酸在体 内转染和/或转化的细胞。
如本领域已知的，术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区。 “Fc区”可为天然序列Fc区或变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的 边界可变化，但人IgG重链Fc区通常被定义为从在位置Cys226或Pro230 处的氨基酸残基到其羧基末端的段。Fc区中残基的编号是如Kabat等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991中所述的EU索引的编号。 免疫球蛋白的Fc区一般包含两个恒定结构域，CH2和CH3。如本领域已 知的，Fc区可以二聚体或单体形式存在。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的至少一种效应子功能。示例性的 “效应子功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依 赖性细胞介导的细胞毒性；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体) 的下调等。此类效应子功能一般需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变 结构域或其抗原结合部分)组合，并且可使用本领域已知用于评估此类抗 体效应子功能的各种测定进行评价。
“天然序列Fc区”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨 基酸序列。“变体Fc区”包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列由于至 少一个氨基酸修饰而不同于天然序列Fc区的那种，但仍保留天然序列Fc 区的至少一种效应子功能。在一些实施例中，与天然序列Fc区或亲本多 肽的Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如约1至约10 个氨基酸取代，并且在一些实施例中，在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc 区中的约1至约5个氨基酸取代。在一些实施例中，本文的变体Fc区与 天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区具有至少约80％的序列同一性，并且 在一些实施例中，与其至少约90％的序列同一性，在一些实施例，与其至 少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％序列同一 性。这些量并不意味着是限制性的，并且所述值之间的增量被特别设想作 为本公开的部分。
如本领域使用的，“Fc受体”和“FcR”描述了结合抗体的Fc区的受体。 在一些实施例中，FcR是天然序列人FcR。此外，在一些实施例中，FcR 是结合IgG抗体(γ受体)的FcR，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚 类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包 括具有相似氨基酸序列的FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)， 所述相似氨基酸序列主要在其胞质结构域中不同。FcR在Ravetch和Kinet，1991,Ann.Rev.Immunol.,9:457-92；Capel等人，1994,Immunomethods, 4:25-34；以及deHaas等人，1995,J.Lab.Clin.Med.,126:330-41中综述。“FcR” 还包括负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿受体FcRn(Guyer等人，1976, J.Immunol.,117:587；和Kim等人，1994,J.Immunol.,24:249)。
如本文使用的，当第一抗体的存在可检测地减少第二抗体与抗原(或 第二抗体的表位)的结合时，第一抗体被说成与第二抗体竞争结合抗原(或 表位)。其中在第二抗体的存在下，第一抗体与抗原(或其表位)的结合 也可检测地降低的相反情况可以但不一定是真实的。然而，当每种抗体可 检测地抑制另一抗体与共同抗原的结合(无论至相同程度还是不同程度) 时，抗体被称为彼此“交叉竞争”结合该抗原。本公开涵盖竞争性和交叉竞 争性抗体两者。不管通过其发生这种竞争或交叉竞争的机制(例如空间位 阻、构象变化或者与其共同表位或其一部分的结合)，基于本文提供的教 导，技术人员应了解，这种竞争性和/或交叉竞争性抗体被涵盖并且可用于 本文公开的方法中。
如本文使用的，“治疗”是用于获得有益或所需临床结果的方法。为了 本公开的目的，有益或所需临床结果包括但不限于下述中的一种或多种： 改善的存活率(降低的死亡率)、炎症的减轻、组织纤维化量的减少、疾 病病灶外观的改善、病理损伤对病灶性部位的局限性、来自疾病的损害程 度降低、疾病持续时间减少和/或与疾病有关的症状的数目、程度或持续时 间的减少。该术语包括施用本公开的化合物或试剂，以预防或延迟疾病的 症状的发作、并发症或生化指标，减轻症状或者阻止或抑制疾病、状况或 病症的进一步发展。治疗可为预防性的(预防或延迟疾病的发作、或者预 防其临床或亚临床症状的表现)或在疾病表现后症状的治疗性抑制或减 轻。
“改善”意指与未施用IL-2抗体相比，一种或多种症状的减小或改善。 “改善”还包括症状的持续时间的缩短或减少。
如本文使用的，药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量” 是足以影响任何一种或多种有益或所需结果的量。在更具体的方面，有效 量预防、减轻或改善疾病或感染症状，和/或延长待治疗的受试者的存活。 对于预防使用，有益或所需结果包括消除或降低风险，减轻严重程度或延 迟疾病的发作，包括疾病、其并发症和在疾病发展期间呈现的中间病理学 表型的生物化学、组织学和/或行为症状。对于治疗使用，有益或所需结果包括临床结果，例如减少IL-2介导的疾病、病症或状况或者IL-2缺陷疾 病、病症或状况的一种或多种症状，减少治疗疾病所需的其它药剂的剂量， 增强另一种药剂的效应，和/或延迟患者疾病的进展。有效剂量可在一次或 多次施用中施用。为了本公开的目的，药物、化合物或药物组合物的有效 剂量是足以直接或间接完成预防性或治疗性治疗的量。如在临床背景中理 解的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量可与另一种药物、化合物或 药物组合物一起实现，或者可不与另一种药物、化合物或药物组合物一起 实现。因此，在施用一种或多种治疗剂的背景下，可考虑“有效剂量”，并 且如果与一种或多种其它试剂结合可达到或达到期望结果，则单一试剂可 视为以有效量给予。
如本文使用的，“载体”意指能够在宿主细胞中递送并且在一些实施例 中表达一种或多种目的基因或序列的构建体。载体的例子包括但不限于病 毒载体、裸露DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离 子缩合剂结合的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA 表达载体、以及某些真核细胞如生产细胞。
如本文使用的，“表达控制序列”意指指导核酸转录的核酸序列。表达 控制序列可为启动子例如组成型或诱导型启动子或增强子。表达控制序列 与待转录的核酸序列可操作地连接。
如本文使用的，“药学可接受的载体”或“药学可接受的赋形剂”包括当 与活性成分组合时，允许该成分保留生物学活性并且不与受试者的免疫系 统反应的任何材料。例子包括但不限于任何标准药物载体，例如磷酸盐缓 冲盐水溶液、水、乳剂如油/水乳剂、和各种类型的润湿剂。在一些实施例 中，用于气雾剂或肠胃外施用的稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或生理 (0.9％)盐水。包含此类载体的组合物通过众所周知的常规方法配制(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro，编辑， MackPublishing Co.,Easton,PA,1990；以及R Remington,The Science and Practice ofPharmacy第20版Mack Publishing，2000)。
本文提及“约”值或参数包括(且描述)针对该值或参数本身的实施例。 例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。数字范围包括定义该范围的数 字在内。
尽管阐述本公开的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实 施例中阐述的数值尽可能精确地报道。然而，任何数值固有地包含必然来 源于它们各自测试测量中发现的标准差的某些误差。此外，本文公开的所 有范围都应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如，“1至10”的 所述范围应该视为包括最小值1和最大值10之间的任何和所有子范围(且 包括端值在内)；即以最小值1或更大的值开始的所有子范围，例如1至 6.1，并且以最大值10或更小的值结束的所有子范围，例如5.5至10。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本公开 所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在冲突的情况下，以本 说明书包括定义为准。在本说明书和权利要求自始至终，单词“包含 (comprise)”或者变化例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应理解为 暗示包含所述整体或整体组，但不排除任何其它整体或整体组。除非上下 文另有要求，否则单数术语应该包括复数，并且复数术语应该包括单数。在术语“如”或“例如”之后的任何例子都不意味着是穷尽或限制性的。
应理解，无论在何处实施例在本文中用语言“包含”进行描述时，还提 供了按照“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的在其它方面类似 的实施例。
当本公开的方面或实施例按照Markush组或其它分组的替代方案进行 描述时，本公开不仅涵盖作为整体列出的整个组、该各组的每个成员以及 主要组的个别和所有可能的亚组，还涵盖了不存在组成员中的一个或多个 的主要组。本公开还设想明确排除请求保护的公开内容中的任何组成员中 的一个或多个。
本文描述了示例性方法和材料，尽管与本文所述那些相似或等价的方 法和材料也可用于本公开的实践或测试中。材料、方法和例子仅是说明性 的而不是限制性的。
概述
白细胞介素-2(IL-2)是四螺旋束I型细胞因子，其充当广泛范围的白 细胞，包括T细胞和自然杀伤(NK)细胞的生长因子。在IL-2作为范围从 AIDS到癌症的各种免疫病症的治疗靶的研究中已投入了相当大的努力。 重组人
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以高剂量使用，以治疗转移性黑素瘤和肾细胞癌。 然而，仅患者的小子集(5-10％)经历由这种治疗的长期存活。高剂量IL-2 疗法的不利效应范围从流感样症状到威胁生命的血管渗漏综合征和肺水肿，已极大地限制了其使用。重要的是，IL-2治疗具有不可预测的生物学 效应。
IL-2通过与复合受体结合而介导其效应，所述复合受体由3条链CD25 (IL-2Rα)、CD122(IL-2Rβ)和共同的γ链(γc)组成，使得该受体被称为 IL-2Rαβγ。三条链由显示出最高亲和力的受体三聚体差异表达。个别地， 四元复合物中的三条受体链各自都以低亲和力与hIL-2结合，其中hIL-2Rα 具有最强的相对亲和力(KD～10nM)。hIL-2Rα的表达增加了hIL-2对于T 细胞的结合速率，并且三种受体以KD～10pM协同地结合hIL-2。在被IL-2Rα捕获后，IL-2被呈递给IL-2Rβ，然后γc，可以在预先形成的受体 二聚体中，以形成四元信号复合物。尽管hIL-2单独以低亲和力(KD～ 150-300nM)结合hIL-2Rβ，但hIL-2/hIL-2Rα复合物以更高的亲和力(KD～ 60nM)结合hIL-2Rβ，然而不存在四元受体复合物中IL-2Rα和IL-2Rβ之 间的直接接触。最近的研究提示野生型IL-2以“休眠”形式存在，其被诱导 成代表接合IL-2Rα的高亲和力形式的结构改变构象。
已尝试通过修饰其选择性靶向T效应细胞(Teff)或T调节细胞(Treg)的 能力来改造或修饰IL-2，以改善其治疗潜力。有趣的是，已存在更有效和 指导性IL-2的许多方法。在与人不直接类似的小鼠模型中，Boyman及同 事已证实，在某些情况下，大鼠抗小鼠IL-2mAb(JES6-1)可与野生型IL-2 复合，并且用于优先增强TREG群体(Boyman等人，2006,Science311:1924-1927；和国际专利公开号WO 2007/095643)。尽管这种效应的机 理基础尚未阐明，但不希望受任何特定理论的束缚，与某些抗体复合的 IL-2可以在选择性触发辨别信号的构象中“固定”，导致各个TREG或TEFF细胞亚群的选择性扩增。另外，一些努力已集中于开发IL-2突变蛋白，所 述IL-2突变蛋白通过增加IL-2与三分子IL-2R复合物CD25的结合来增强CD25+ T细胞的活化，并且最小化CD25-NK细胞的活化。在这点上， 由Bayer制备的突变型IL-2对IL-2Rβγc具有明显较低的亲和力，预期用这 种变体IL-2的处理可不激活NK或记忆CD8+ T细胞。然而，上述IL-2突 变体和IL-2/抗-IL-2抗体复合物方法两者均未考虑药物改变内源性野生型 IL-2的潜在无能，所述内源性野生型IL-2在炎性T细胞应答期间产生。 此外，用诱导内源性IL-2(证实的反馈机制)的IL-2变体的任何治疗都可 导致体内野生型IL-2效应，这在体外可能未观察到。
因此，虽然IL-2最初由于其增强效应T细胞(TEFF)和NK功能的能力 而作为免疫刺激剂开发，但现在认为IL-2的主要功能不是免疫的激活而是 TREG的生成和存活，所述TREG作用于抑制免疫应答和预防自身免疫疾病。 已存在使用动物模型(包括IL-2和IL-2受体(IL-2R)缺陷小鼠)的增加理 解，即IL-2在由TREG细胞介导的外周免疫耐受中起关键作用。研究已显 示低剂量IL-2疗法由于其高亲和性IL-2R的组成性表达而优先激活TREG。 更具体而言，增加数目的动物研究已证实TREG可抑制GVHD和自身免疫。 此外，这种潜在的抑制作用已在最近的两个研究中在人中得到证实，一个 在GVHD中，并且另一个在自身免疫性血管炎中，其中短期低剂量疗法导 致某些个体中的疾病改善。因此，长期以来需要基于IL-2的治疗剂，以选 择性激活耐受性相对于效应性免疫应答，即设计为使TREG:TEFF平衡朝向 TREG倾斜的治疗，从而治疗广泛多样的疾病。本公开满足了该需求。
IL-2抗体
本发明涉及与IL-2特异性结合的抗体，即它们与IL-2结合，但它们 无法与其它分子可检测地结合或以较低的亲和力与其它分子结合。在一些 实施例中，抗体特异性结合人IL-2。在一些实施例中，抗体特异性结合hIL-2 的螺旋A和C以及B-C环。在一些实施例中，抗体特异性结合hIL-2的螺 旋A。在一些实施例中，抗体特异性结合hIL-2的螺旋C。在一些实施例 中，抗体特异性结合hIL-2的螺旋A和C。在一些实施例中，抗体特异性 结合hIL-2的B-C环。在一些实施例中，抗体与包含SEQ ID NO:13、14、 126、127、128、129、130、131、132、133和134的氨基酸序列的抗体竞 争结合人IL-2(hIL-2)，或者与包含SEQ ID NO:13、14、126、127、128、 129、130、131、132、133和134的氨基酸序列的抗体结合相同的hIL-2表 位。在一些实施例中，该抗体特异性结合人IL-2(hIL-2)，并且将hIL-2与 IL-2Rα的结合亲和力降低约1至约199倍。在一些实施例中，该抗体将 hIL-2与IL-2Rα的结合亲和力降低约10倍。在一些实施例中，该抗体将 hIL-2与IL-2Rα的结合亲和力降低约2、10、25、50、75、100、125、150或175倍。
在一些实施例中，IL-2抗体降低IL-2与IL-2Rα和IL-2Rβ的结合，并 且不抑制调节性T(Treg)细胞的活性。例如，在一些实施例中，IL-2抗体 阻断IL-2与IL-2Rβ的结合，并且降低hIL-2与IL-2Rα结合的亲和力。在 一些实施例中，IL-2抗体将IL-2与IL-2Rα的结合降低约5、10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99％。 在一些实施例中，IL-2抗体将IL-2与IL-2Rβ的结合降低至少50、55、60、 65、70、75、80、85、90、95或99％。在一些实施例中，IL-2抗体完全阻 断IL-2与IL-2Rβ的结合。特别地，本公开涉及特异性结合IL-2的抗体， 以及进一步地，抑制非Treg细胞(包括效应CD8+、非Treg CD4+和NK 细胞)的增殖超过它们抑制Treg细胞的增殖，或与同种型对照抗体相比， 增加Treg增殖，或增加Treg细胞/非Treg细胞的比率或维持Treg标记物 或其组合的抗体。在一些实施例中，抗体抑制CD8+、非Treg CD4+或NK 细胞的增殖超过所述抗体抑制Treg的增殖至少2倍。在一些实施例中，抗 体抑制CD8+、非Treg CD4+或NK细胞的增殖超过所述抗体抑制Treg的 增殖至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20倍。在一些实施例中，在外周血单核细胞(PBMC)培养物或重构测 定中，抗体降低IL-2与IL-2Rα和IL-2Rβ的结合，并且增加T调节细胞(Treg) 与CD8+、非Treg CD4+或NK细胞的比率。在一些实施例中，该比率增加 至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20倍或更多。在一些实施例中，抗体使Treg:CD8+细胞比率增加两(2)倍或 更多，并且可反映增加的Treg增殖。在一些实施例中，当IL-2在体外限 制为例如小于1nM的浓度时，抗体增强T细胞(Treg)增殖大于同种型对照。 在一些实施例中，抗体抑制CD8+细胞的增殖。在一些实施例中，抗体降 低IL-2与IL-2Rα和IL-2Rβ的结合，并且维持Treg细胞中FOXP3、CD25 和Icos中的一种或多种的表达。在一些实施例中，抗体降低IL-2与IL-2Rα 和IL-2Rβ的结合，并且增加Treg细胞中FOXP3、CD25和Icos中的一种 或多种的表达。在一些实施例中，本公开的IL-2抗体具有这些特征中的至少一个，并且在一些实施例中，抗体具有这些特征中的两个或更多个。在 一些实施例中，抗体具有所有的特征。
在一些实施例中，特异性结合IL-2的抗体或其抗原结合部分降低IL-2 与IL-2Rα和IL-2Rβ的结合，并且抑制CD8+ T细胞中的STAT5磷酸化至 比调节性T(Treg)细胞中更高的程度。在一些实施例中，IL-2抗体或抗原 结合部分维持Treg中的STAT5磷酸化大于50％。在一些实施例中，IL-2 抗体或抗原结合部分维持Treg中的STAT5磷酸化大于60％。在一些实施 例中，IL-2抗体或抗原结合部分维持Treg中的STAT5磷酸化大于70％。 在一些实施例中，IL-2抗体或抗原结合部分维持Treg中的STAT5磷酸化 大于80％。在一些实施例中，IL-2抗体或抗原结合部分维持Treg中的STAT5 磷酸化大于90％。在一些实施例中，抗体与hIL-2特异性结合。这些量并 不意味着是限制性的，并且所述百分比之间的增量被特别设想作为本公开 的部分。
本公开还涉及包含此类抗体的组合物以及此类抗体的用途，包括治疗 和药物用途。
术语“IL-2”意指IL-2的任何天然存在形式，无论是单体还是多聚体 的，包括二聚体、三聚体等，其可源自任何合适的生物。如本文使用的， “IL-2”指哺乳动物IL-2，如人、大鼠或小鼠，以及非人灵长类动物、牛、 羊或猪IL-2。在一些实施例中，IL-2是人(参见例如Genbank登录号P60568) 或“hIL-2”。IL-2也可为食蟹猴IL-2(参见例如Genbank登录号Q29615)。 术语“IL-2”还涵盖此类IL-2分子的一部分、变体、同种型和其它同系物。 变体IL-2分子的特征一般在于具有与天然存在的IL-2相同类型的活性， 例如结合IL-2受体的能力和诱导受体介导的活性的能力。
IL-2可包含IL-2的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个 或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、 九个或更多个、十个或更多个、十二个或更多、或者十五个或更多个表面 可及的残基。当IL-2包含IL-2的同源多聚体形式时，靶可包含IL-2的第 一亚基的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五 个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多 个、十个或更多个、十二个或更多、或者十五个或更多个表面可及的残基， 以及IL-2的第二亚基的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个 或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、 九个或更多个、十个或更多个、十二个或更多、或者十五个或更多个表面 可及的残基。
靶分子可包含来自IL-2的已知表位。靶分子可包含来自hIL-2的已知 表位。在一些实施例中，靶可包含hIL-2的螺旋A。在一些实施例中，靶 可包含hIL-2的螺旋C。在一些实施例中，靶可包含hIL-2的螺旋A和C。 在一些实施例中，靶可包含hIL-2的B-C环。在一些实施例中，靶可包含 hIL-2的螺旋A和C以及B-C环。
在一个实施例中，本公开提供了下述中的任一种、或包含下述的组合 物(包括药物组合物)：具有源自下述抗体中任意者的轻链序列或其一部 分和重链或其一部分的抗体：F4.7.6、F4.7.8、F5.1.11、F5.1.9、F4.7.062、 F5.11.1.01、F5.1.11.02、F5.1.11.03、F5.1.11.04、F5.1.11.05、F5.1.11.06、 F5.1.11.07、F5.1.11.08、F5.1.11.09、F5.1.9.5或d1C7。抗体F5.1.11也被称 为抗体F5111、5.1.11、5111。这些术语是可互换的。该亲本抗体的变体可 通过该命名法用另外的数字提及，例如抗体F5111.2、5.1.11.2、F5.1.11.02 或5111.2；或者抗体F5.1.11.01、F5111.1、5.1.11.1或5111.1。
可用于本公开中的抗体可涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、抗体部分(例 如Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv、Fc等)、嵌合抗体、双特异性抗体、异源缀合 物抗体、单链(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白(例如结构域 抗体)、人源化抗体以及免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型，其包含具 有所需特异性的抗原识别位点，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序 列变体和共价修饰的抗体。抗体可为鼠、大鼠、人或任何其它起源(包括 嵌合或人源化抗体)。在一些实施例中，IL-2抗体是单克隆抗体。在一些 实施例中，抗体是人或人源化抗体。
本公开的IL-2抗体可通过本领域已知的任何方法制备。用于产生人 和小鼠抗体的一般技术是本领域已知和/或在本文中描述的。
可使用本领域已知的方法鉴定或表征IL-2抗体，由此检测和/或测量 IL-2活性的减少、改善或中和，例如pAKT和/或pSTAT5。在一些实施例 中，通过将候选试剂(例如IL-2)与IL-2受体一起温育，且监测IL-2的 结合和/或生物学活性的伴随减少或抑制来鉴定IL-2抗体。在一些实施例 中，可使用本领域已知的方法鉴定或表征hIL-2抗体，由此检测和/或测量 hIL-2活性的减少、改善或中和，例如pAKT和/或pSTAT5。在一些实施 例中，通过将候选试剂(例如hIL-2)与hIL-2受体一起温育，且监测hIL-2 的结合和/或生物学活性的伴随减少或抑制来鉴定hIL-2抗体。结合测定可 用例如纯化的IL-2多肽或天然表达各种受体或经转染以表达IL-2受体的 细胞执行。在一个实施例中，结合测定是竞争性结合测定，其中评估了候 选抗体与已知IL-2抗体竞争IL-2结合的能力。该测定可以各种形式包括 ELISA形式执行。在一些实施例中，通过将候选抗体与IL-2温育且监测结 合来鉴定IL-2抗体。
在初步鉴定之后，候选IL-2抗体的活性可通过已知用于测试靶向生 物学活性的生物测定进一步证实且精制。在一些实施例中，体外细胞测定 用于进一步表征候选IL-2抗体。例如，生物测定可用于直接筛选候选物。 用于鉴定和表征IL-2抗体的一些方法在实例中详细描述。
IL-2抗体可使用本领域众所周知的方法来表征。例如，一种方法是鉴 定它与之结合的表位或“表位作图”。本领域已知用于定位和表征在蛋白质 上的表位位置的许多方法，包括分辨抗体-抗原复合物的晶体结构、竞争性 测定，基因片段表达测定和基于合成肽的测定，如例如在Harlow和Lane， Using Antibodies,a Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,New York,1999的第11章中所述。在另外的例子中，表 位作图可用于确定IL-2抗体与之结合的序列。表位作图可以各种来源商购可得，例如Pepscan Systems(Edelhertweg 15,8219PH Lelystad，荷兰)。该 表位可为线性表位，即包含在氨基酸的单个段中，或通过可不一定包含在 单个段中的氨基酸的三维相互作用形成的构象表位。可分离或合成(例如 重组)不同长度(例如长至少4-6个氨基酸)的肽，并且用于与IL-2抗体 的结合测定。在另一个例子中，通过使用源自IL-2序列的重叠肽且确定通 过抗体的结合，可在系统筛选中确定IL-2抗体所结合的表位。根据基因片 段表达测定，编码IL-2的开放读码框可随机或通过特定的遗传构建体片段 化，并且测定IL-2的表达片段与待测抗体的反应性。例如，基因片段可通 过PCR产生，然后在放射性氨基酸的存在下在体外转录且翻译成蛋白质。 然后通过免疫沉淀和凝胶电泳确定抗体与放射性标记的IL-2片段的结合。 某些表位还可通过使用在噬菌体颗粒(噬菌体文库)或酵母(酵母展示) 表面上展示的随机肽序列的大型文库来鉴定。可替代地，确定的重叠肽片 段文库可在简单结合测定中测试与测试抗体的结合。在另外的例子中，可 执行抗原的诱变、结构域交换实验和丙氨酸扫描诱变，以鉴定表位结合所 需、充分和/或必需的残基。例如，丙氨酸扫描诱变实验可使用其中IL-2 多肽的各种残基已被丙氨酸替换的突变型IL-2执行。通过评价抗体与突变 型IL-2的结合，可评价特定IL-2残基对抗体结合的重要性。
可用于表征IL-2抗体的另一种方法是使用具有已知结合相同抗原(即 IL-2上的各种片段)的其它抗体的竞争测定，以确定IL-2抗体是否结合与 其它抗体相同的表位。竞争测定是本领域技术人员众所周知的。
此外，可使用各种实验和计算表位作图方法在不同细节水平下限定且 表征关于给定抗体/抗原结合对的表位。实验方法包括本领域众所周知的诱 变、X射线晶体学、核磁共振(NMR)光谱学、氢/氘交换质谱法(H/D-MS) 和各种竞争结合方法。由于每种方法依赖独特的原理，表位的描述与它已 通过其确定的方法紧密联系。因此，取决于所采用的表位作图方法，将不 同地限定关于给定的抗体/抗原对的表位。
在其最详细的水平下，Ag和Ab之间的相互作用的表位可由限定存在 于Ag-Ab相互作用中的原子接触的空间坐标，以及关于它们对结合热力学 的相对贡献的信息来限定。在更不详细的水平下，表位可通过限定Ag和 Ab之间的原子接触的空间坐标来表征。在进一步更不详细的水平下，表 位可由其包含的氨基酸残基来表征，如特定标准限定的，例如通过Ab和 Ag中的原子(例如重的，即非氢原子)之间的距离。在进一步更不详细 的水平下，可通过功能例如通过与其它Ab竞争结合来表征表位。表位还 可更一般地定义为包含氨基酸残基，关于其由另一个氨基酸的取代改变 Ab和Ag之间相互作用的特征(例如使用丙氨酸扫描)。
根据在不同详细水平下获得取决于所使用的表位作图方法的表位描 述和限定的事实，随后相同Ag上的不同Ab的表位比较可类似地在不同 详细水平下进行。
如果它们含有相同组的氨基酸残基，则在氨基酸水平下描述的，例如 从X射线结构确定的表位被说成是相同的。如果至少一个氨基酸被表位共 享，则表位被说成重叠。如果没有氨基酸残基被表位共享，则表位被说成 是分开的(独特的)。
如果相应抗体的结合是相互排斥的，即一个抗体的结合排除了另一个 抗体的同时或连续结合，则通过竞争结合表征的表位被说成是重叠的。如 果抗原能够同时容纳两种相应抗体的结合，则表位被说成是分开的(独特 的)。
术语“互补位”的定义来源于通过反转视角的上述“表位”定义。因此， 术语“互补位”指抗体上特异性结合抗原的区域或区，即抗体上与抗原(IL-2) 接触的氨基酸残基，如“接触”在本文其它地方定义的。
关于给定抗体/抗原对的表位和互补位可通过常规方法来鉴定。例如， 表位的一般位置可通过评价抗体结合不同片段或变体IL-2多肽的能力来 确定。IL-2内与抗体接触的特定氨基酸(表位)和抗体中与IL-2接触的特 定氨基酸(互补位)也可使用常规方法例如实施例中所述的那些来测定。 例如，抗体和靶分子可被组合并且抗体/抗原复合物可被结晶。可确定复合 物的晶体结构，并且用于鉴定抗体与其靶之间的相互作用的特定位点。
根据本公开的抗体可结合与本文具体公开的本公开的抗体相同的 IL-2表位或结构域。例如，本公开的其它尚未鉴定的抗体可通过下述来鉴 定：比较它们与IL-2的结合与下述单克隆抗体中任一种的那种：F4.7.6、 F4.7.8、F5.1.11、F5.1.9、F4.7.062、F5.11.1.01、F5.1.11.02、F5.1.11.03、F5.1.11.04、 F5.1.11.05、F5.1.11.06、F5.1.11.07、F5.1.11.08、F5.1.11.09、F5.1.9.5或d1C7 及其变体；和/或比较尚未鉴定的抗体在IL-2上的表位/接触残基与本公开 的抗体的那些。可用于这种鉴定目的的分析和测定包括在如实施例1-5中 描述的生物活性测定中，以及在抗体晶体结构的分析中，评价目的抗体和 IL-2受体之间的IL-2结合竞争的测定。
如本文所述，本公开的抗体可具有与本公开的另一种抗体竞争或交叉 竞争结合IL-2的能力。例如，本公开的抗体可与本文所述的抗体竞争或交 叉竞争结合IL-2，或者由本文公开的抗体结合的IL-2的合适片段或变体。
即，如果第一抗体与第二抗体竞争结合IL-2，但在第二抗体首先与IL-2 结合时它不竞争，则它被认为与第二抗体“竞争”(也称为单向竞争)。当 抗体与另一种抗体竞争时，无论哪种抗体首先与IL-2结合，则抗体与另一 种抗体“交叉竞争”结合IL-2。这种竞争性或交叉竞争性抗体可基于其在标 准结合测定中与本公开的已知抗体竞争/交叉竞争的能力来鉴定。例如， SPR例如通过使用BiacoreTM系统、ELISA测定或流式细胞术可用于证实竞争/交叉竞争。这种竞争/交叉竞争可提示两种抗体结合相同、重叠或相似 的表位。
因此可通过包括结合测定的方法来鉴定本公开的抗体，所述结合测定 评价测试抗体是否能够与本公开的参考抗体(例如F4.7.6、F4.7.8、F5.1.11、 F5.1.9、F4.7.062、F5.11.1.01、F5.1.11.02、F5.1.11.03、F5.1.11.04、F5.1.11.05、 F5.1.11.06、F5.1.11.07、F5.1.11.08、F5.1.11.09、F5.1.9.5或d1C7)竞争/交 叉竞争结合靶分子上的位点。用于进行竞争性结合测定的方法在本文中公 开和/或是本领域众所周知的。例如，它们可涉及使用在其下抗体可结合靶 分子的条件，将本公开的参考抗体与靶分子结合。然后可将抗体/靶复合物 暴露于测试/第二抗体，并且可评价测试抗体能够从抗体/靶复合物中置换 本公开的参考抗体的程度。替代方法可涉及在允许抗体结合的条件下使测 试抗体与靶分子接触，然后添加能够结合该靶分子的本公开的参考抗体， 并且评价本公开的参考抗体能够从抗体/靶复合物中置换测试抗体或同时 结合靶(即非竞争性抗体)的程度。
测试抗体抑制本公开的参考抗体与靶结合的能力证实测试抗体可与 本公开的参考抗体竞争结合靶，并且因此测试抗体结合IL-2蛋白上与本公 开的参考抗体相同或基本上相同的表位或区域。在这种方法中被鉴定为与 本公开的参考抗体竞争的测试抗体也是本公开的抗体。测试抗体可在与本 公开的参考抗体相同的区域中结合IL-2，并且可与本公开的参考抗体竞争 的事实提示测试抗体可在与本公开的抗体相同的结合位点处充当配体，并 且测试抗体因此可模拟参考抗体的作用，并且因此是本公开的抗体。这可 通过比较在测试抗体的存在下的IL-2活性与在其它方面相同的条件下在 参考抗体的存在下的IL-2活性来确认，使用如在本文其它地方更充分描述 的测定。
本公开的参考抗体可为如本文所述的抗体，例如F4.7.6、F4.7.8、 F5.1.11、F5.1.9、F4.7.062、F5.11.1.01、F5.1.11.02、F5.1.11.03、F5.1.11.04、 F5.1.11.05、F5.1.11.06、F5.1.11.07、F5.1.11.08、F5.1.11.09、F5.1.9.5或d1C7、 或者如本文所述的保留与IL-2结合的能力的其任何变体或一部分。本公开 的抗体可结合与本文所述的参考抗体、或者如本文所述的保留与IL-2结合 的能力的其任何变体或一部分相同的表位。
如本文其它地方先前所述，可参考抗体与并非靶的分子的结合来评价 特异性结合。这种比较可通过比较抗体结合靶和结合另一种分子的能力来 进行。这种比较可如上所述在KD或Ki的评价中进行。用于这种比较中的 另一种分子可为并非靶分子的任何分子。在一些实施例中，另一种分子与 靶分子不同。在一些实施例中，靶分子并非靶分子的片段。
用于确定特异性结合的其它分子在结构或功能中可与靶无关。例如， 其它分子可为环境中的无关材料或伴随材料。
用于确定特异性结合的另一种分子可为涉及与靶分子(即IL-2)相同 的体内途径的另一种分子。通过确保本公开的抗体对于IL-2具有的特异性 超过另一种此类分子，可避免不需要的体内交叉反应性。
本公开的抗体可保留结合与靶分子相关的一些分子的能力。
可替代地，本公开的抗体可对于特定靶分子具有特异性。例如，它可 如本文所述与一个靶分子结合，但可如本文所述的不结合不同靶分子，或 可以以显著降低的亲和力结合不同靶分子。例如，全长成熟的人IL-2可用 作靶，但与该靶结合的抗体可能无法结合或可以较低的亲和力结合例如来 自其它物种的其它IL-2蛋白，如其它哺乳动物IL-2。在一些实施例中，抗 体结合人和小鼠IL-2两者。
根据本公开的多肽或抗体“片段”或“部分”可通过截短来制备，例如通 过从多肽的N和/或C末端去除一个或多个氨基酸。以这种方式，可从N 和/或C末端去除至多10个、至多20个、至多30个、至多40个或更多 个氨基酸。部分也可通过一个或多个内部缺失生成。
本公开的抗体可为或可包含抗体F4.7.6、F4.7.8、F5.1.11、F5.1.9、 F4.7.062、F5.11.1.01、F5.1.11.02、F5.1.11.03、F5.1.11.04、F5.1.11.05、F5.1.11.06、F5.1.11.07、F5.1.11.08、F5.1.11.09、F5.1.9.5或d1C7中的任一种的一部分 或其变体。本公开的抗体可为或可包含这种抗体或其变体的抗原结合部 分。例如，本公开的抗体可为该抗体的Fab部分或其变体，或者可为源自 该抗体或其变体的单链抗体。
变体抗体可包含来自上文讨论的特定序列和部分的1个、2个、3个、 4个、5个、至多10个、至多20个、至多30个或更多个氨基酸取代和/ 或缺失和/或插入。“缺失”变体可包含个别氨基酸的缺失，小氨基酸组例如 2、3、4或5个氨基酸的缺失，或更大氨基酸区域的缺失，例如特定氨基 酸结构域或其它特点的缺失。“插入”变体可包含个别氨基酸的插入，小氨 基酸组例如2、3、4或5个氨基酸的插入，或更大氨基酸区域的插入，例 如特定氨基酸结构域或其它特点的插入。在一些实施例中，“取代”变体涉 及用相同数目的氨基酸取代一个或多个氨基酸并且进行保守性氨基酸取 代。例如，氨基酸可用具有相似性质的替代氨基酸取代，例如另一个碱性 氨基酸、另一个酸性氨基酸、另一个中性氨基酸、另一个荷电氨基酸、另 一个亲水性氨基酸、另一个疏水性氨基酸、另一个极性氨基酸、另一个芳 香族氨基酸或另一个脂肪族氨基酸。可用于选择合适取代基的20种主要 氨基酸的一些性质如下所述。
取代变体具有在抗体分子中去除的至少一个氨基酸残基和在其位置 中插入的不同残基。对于取代诱变最有利的位点包括高变结构域，但也考 虑了构架改变。保守取代显示在表1中的“保守取代”标题下。如果这样的 取代导致生物活性的改变，则可引入下文显示的或如下文关于氨基酸进一 步描述的命名为“示例性取代”的更大量的改变，且筛选产物。
表1：氨基酸取代
Figure BDA0003717294580000381
Figure BDA0003717294580000391
抗体的生物学性质的基本修饰通过选择取代来完成，所述取代在其维 持下述的作用中显著不同：(a)取代区域中的多肽主链的结构，例如作为β- 片层或螺旋构象，(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。 基于常见的侧链性质将天然存在的残基分成几组：
(1)非极性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)极性无电荷：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性(带负电)：Asp、Glu；
(4)碱性(带正电)：Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe、His。
通过将这些类别之一的成员交换为另一类别来进行非保守取代。
例如，可进行的一类取代是将抗体中可为化学反应性的一个或多个半 胱氨酸改变为另一个残基，例如但不限于丙氨酸或丝氨酸。例如，可存在 非规范半胱氨酸的取代。取代可在抗体的可变结构域的CDR或构架区或 者恒定区中进行。在一些实施例中，半胱氨酸是规范的。不涉及维持抗体 的正确构象的任何半胱氨酸残基也可一般用丝氨酸取代，以改善分子的氧 化稳定性并且防止异常交联。相反，可将半胱氨酸键加入抗体中，以改善 其稳定性，特别是当抗体为抗体部分如Fv部分时。
本公开还提供了生成、选择且制备IL-2抗体的方法。本公开的抗体 可通过本领域已知的程序制备。在一些实施例中，抗体可使用本领域已知 的任何方法重组制备且表达。本公开还提供了生成、选择且制备hIL-2抗 体的方法。本公开的抗体可通过本领域已知的程序制备。在一些实施例中， 抗体可使用本领域已知的任何方法重组制备且表达。
在一些实施例中，抗体可通过噬菌体展示技术来制备且选择。参见例 如美国专利号5,565,332；5,580,717；5,733,743；和6,265,150；和Winter等 人，Annu.Rev.Immunol.12:433-455,1994。可替代地，噬菌体展示技术 (McCafferty等人，Nature 348:552-553,1990)可用于从来自未免疫接种供 体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因储库，体外产生人抗体和抗体部分。根 据该技术，将抗体V结构域基因框内克隆到丝状噬菌体的主要或次要外壳 蛋白基因如M13或fd内，并且在噬菌体颗粒的表面上展示为功能性抗体 部分。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体 功能性质的选择也导致选择编码显示出那些性质的抗体的基因。因此，噬 菌体模拟B细胞的一些性质。噬菌体展示可以各种形式执行；关于综述参 见例如Johnson,Kevin S.和Chiswell,DavidJ.,Current Opinion in Structural Biology 3:564-571,1993。几种来源的V基因区段可用于噬菌体展示。 Clackson等人，Nature 352:624-628,1991，从源自免疫接种小鼠的脾的V基 因的小型随机组合文库中分离抗噁唑酮抗体的多样性阵列。可构建来自人 供体的V基因储库，并且可基本上遵循由Mark等人，1991,J.Mol.Biol. 222:581-597或Griffith等人，1993,EMBO J.12:725-734.描述的方法，分离针 对抗原(包括自身抗原)的多样性阵列的抗体。在天然免疫应答中，抗体 基因以高速率累积突变(体细胞超突变)。引入的一些变化将赋予更高的 亲和力，并且展示高亲和性表面免疫球蛋白的B细胞在后续抗原攻击期间 优先复制且分化。这种自然过程可通过采用称为“链改组”的技术来模拟 (Marks等人，1992,Bio/Technol.10:779-783)。在该方法中，通过用从未免 疫接种的供体获得的V结构域基因的天然存在的变体(储库)连续替换重 链和轻链V区基因，可改善通过噬菌体展示获得的“主要”人抗体的亲和力。 该技术允许产生具有在pM-nM范围内的亲和力的抗体和抗体部分。用于 制备非常大型噬菌体抗体储库的策略(也称为“所有文库之母(mother-of-alllibraries)”)已由Waterhouse等人，Nucl.Acids Res.21:2265-2266,1993描述。 基因改组也可用于从啮齿类动物抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始 啮齿类动物抗体相似的亲和力和特异性。根据也被称为“表位印记”的这种 方法，通过噬菌体展示技术获得的啮齿类动物抗体的重链或轻链V结构域 基因被替换为人V结构域基因的储库，产生啮齿类动物-人嵌合体。关于 抗原的选择导致能够恢复功能性抗原结合位点的人可变结构域的分离，即表位支配(印记)配偶体的选择。当重复该过程以便替换剩余的啮齿类动 物V结构域时，获得人抗体(参见PCT公开号WO 93/06213)。与通过 CDR移植的啮齿类动物抗体的传统人源化不同，该技术提供完全的人抗 体，其没有啮齿类动物起源的构架或CDR残基。
在一些实施例中，可使用杂交瘤技术制备抗体。考虑可操纵包括人的 任何哺乳动物受试者或来自其的抗体生产细胞，以充当用于生产哺乳动物 (包括人)杂交瘤细胞系的基础。如本文进一步描述的，宿主动物的免疫 接种途径和时间表一般与用于抗体刺激和生产的已建立的和常规的技术 保持一致。通常，用一定量的免疫原(包括如本文所述的)腹膜内、肌内、 经口、皮下、足内(intraplantar)和/或皮内接种宿主动物。
可使用Kohler,B.和Milstein,C.,1975,Nature 256:495-497的一般体细胞 杂交技术，或如由Buck,D.W.等人，In Vitro,18:377-381,1982修改的，从 淋巴细胞和永生化骨髓瘤细胞制备杂交瘤。可用的骨髓瘤系包括但不限于 X63-Ag8.653和来自SalkInstitute,Cell Distribution Center,San Diego,Calif., USA的那些，可用于杂交。一般地，该技术涉及使用融合剂如聚乙二醇融 合骨髓瘤细胞和淋巴样细胞，或通过本领域技术人员众所周知的电子手 段。融合后，将细胞与融合培养基分开，并且在选择性生长培养基如次黄 嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基中生长，以消除未杂交的亲本细胞。本文 所述的补充有或未补充血清的任何培养基均可用于培养分泌单克隆抗体 的杂交瘤。作为细胞融合技术的另一种替代方案，EBV永生化B细胞可 用于产生本公开的IL-2单克隆抗体。需要时，将杂交瘤或其它永生化B 细胞扩增且亚克隆，并且通过常规免疫测定程序(例如放射性免疫测定、 酶免疫测定或荧光免疫测定)测定上清液的抗免疫原活性。
可用作抗体源的杂交瘤涵盖产生对IL-2特异性的单克隆抗体或其一 部分的亲本杂交瘤的所有衍生物、子代细胞。
产生这种抗体的杂交瘤可使用已知程序在体外或体内生长。需要时， 可通过常规的免疫球蛋白纯化程序，如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、层 析和超滤，从培养基或体液分离单克隆抗体。如果存在的话，例如可通过 使制备物在由附着于固相的免疫原制成的吸附剂上运行，并且从免疫原洗 脱或释放所需抗体来去除不需要的活性。用IL-2多肽或含有与蛋白质缀合 的靶氨基酸序列的一部分免疫接种宿主动物可产生抗体群体(例如单克隆 抗体)，所述蛋白质在待免疫接种的物种中是免疫原性的，例如匙孔血蓝 蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶，所述缀合使用双功 能或衍生剂例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基 缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基。
需要时，可测序目的IL-2抗体(单克隆或多克隆的)，然后可将多核 苷酸序列克隆到载体内用于表达或繁殖。编码目的抗体的序列可维持在宿 主细胞的载体中，然后可扩增宿主细胞且冷冻用于将来使用。在细胞培养 中的重组单克隆抗体产生可通过本领域已知的方法通过从B细胞克隆抗 体基因来进行。参见例如Tiller等人，2008,J.Immunol.Methods 329,112； 美国专利号7,314,622。
表2中所示的质粒按照布达佩斯条约保藏于美国典型培养物保藏中 心(ATCC),10801University Blvd.,Manassas,VA 20110-2209。质粒已被分配 下述登录号：
表2
抗体 菌株命名 保藏日期
F5.1.11.02VH F5.1.11.02-VH 2016年9月8日
F5.1.11.02VL F5.1.11.02-VL 2016年9月8日
在一些实施例中，多核苷酸序列可用于遗传操作，以使抗体“人源化” 或改善抗体的亲和力或其它特征。抗体也可定制用于例如犬、猫、灵长类 动物、马和牛。
在一些实施例中，可通过使用商购可得的小鼠获得全人抗体，所述小 鼠已进行改造以表达特定人免疫球蛋白蛋白质。设计为产生更期望的(例 如全人抗体)或更强大的免疫应答的转基因动物也可用于生成人源化或人 抗体。这种技术的例子是来自Abgenix,Inc.(Fremont,CA)的XenomouseTM以 及来自Medarex,Inc.(Princeton,NJ)的
Figure BDA0003717294580000431
和TC MouseTM。
通过首先从宿主动物中分离抗体和抗体产生细胞，获得基因序列，并 使用该基因序列在宿主细胞(例如CHO细胞)中重组表达抗体，可重组 制备抗体。可采用的另一种方法是在植物(例如烟草)或转基因乳中表达 抗体序列。已公开了在植物或乳中重组表达抗体的方法。参见例如Peeters 等人Vaccine 19:2756,2001；Lonberg,N.和D.HuszarInt.Rev.Immunol 13:65, 1995；和Pollock等人，J Immunol Methods 231:147,1999。用于制备抗体衍 生物例如结构域、单链等的方法是本领域已知的。
免疫测定和流式细胞术分选技术例如荧光激活细胞分选(FACS)也可 用于分离对于IL-2特异性的抗体。
使用常规程序(例如通过使用能够与编码单克隆抗体的重链和轻链的 基因特异性结合的寡核苷酸探针)，容易地分离且测序编码单克隆抗体的 DNA。在一些实施例中，杂交瘤细胞充当此类DNA的来源。一旦分离， 就可将DNA置于表达载体(如PCT公开号WO 87/04462中公开的表达载 体)内，然后将所述表达载体转染到宿主细胞如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿 猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或否则不产生免疫球蛋白蛋白质的 骨髓瘤细胞，以获得单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。参见例如PCT 公开号WO 87/04462。例如，也可通过用人重链和轻链恒定结构域的编码 序列取代同源鼠序列，Morrison等人，Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851,1984， 或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或 部分共价连接来修饰DNA。以这种方式，制备具有本文IL-2抗体的结合 特异性的“嵌合”或“杂交”抗体。
抗体部分可通过抗体的蛋白酶解或其它降解，通过如上所述的重组方 法(即，单一或融合多肽)或通过化学合成来生产。通过化学合成方便地 制备抗体的多肽，特别是至多约50个氨基酸的较短多肽。化学合成的方 法是本领域已知并且商购可得的。例如，抗体可通过使用采用固相方法的 自动化多肽合成仪产生。也参见美国专利5,807,715；4,816,567；和 6,331,415。
在一些实施例中，多核苷酸包含编码本公开的IL-2抗体的重链和/或 轻链可变结构域的序列。编码目的抗体的序列可维持在宿主细胞中的载体 中，然后可扩增且冷冻宿主细胞用于将来使用。本文还描述了载体(包括 表达载体)和宿主细胞。
本公开包括亲和力成熟的实施例。例如，亲和力成熟的抗体可通过本 领域已知的程序产生(Marks等人，1992,Bio/Technology,10:779-783；Barbas 等人，1994,ProcNat.Acad.Sci,USA 91:3809-3813；Schier等人，1995,Gene, 169:147-155；Yelton等人，1995,J.Immunol.,155:1994-2004；Jackson等人， 1995,J.Immunol.,154(7):3310-9；Hawkins等人，1992,J.Mol.Biol., 226:889-896；和PCT公开号WO2004/058184)。
下列方法可用于调节抗体的亲和力且用于表征CDR。表征抗体的CDR 和/或改变(例如改善)多肽如抗体的结合亲和力的一种方式称为“文库扫 描诱变”。一般地，文库扫描诱变如下工作。使用领域公认的方法，用两 个或更多个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19或20个)氨基酸替换CDR中的一个或多个氨基酸位置。这生 成小型克隆文库(在一些实施例中，对于分析的每一个氨基酸位置为一 个)，所述文库各自具有两个或更多个成员的复杂性(如果两个或更多个 氨基酸在每一个位置都被取代)。一般地，文库还包括包含天然(未取代) 氨基酸的克隆。在来自每个文库的少量克隆，例如约20-80个克隆(取决 于文库的复杂性)中筛选与靶多肽(或其它结合靶)的结合亲和力，并且 鉴定具有增加、相同、减少的结合或无结合的候选物。用于确定结合亲和 力的方法是本领域众所周知的。结合亲和力可使用例如下述来确定：检测 约2倍或更大的结合亲和力的差异的BiacoreTM表面等离子共振分析、
Figure BDA0003717294580000441
生物传感器、闪烁邻近测定、ELISA、
Figure BDA0003717294580000442
免疫测定、荧光猝 灭、荧光转移和/或酵母展示。还可使用合适的生物测定来筛选结合亲和力。 当起始抗体已以相对高的亲和力例如约10nM或更低的KD结合时， BiacoreTM是特别有用的。
在一些实施例中，使用本领域公认的诱变方法(其中一些在本文中描 述)，用所有20种天然氨基酸替换(在一些实施例中，一次一个)CDR中 的每一个氨基酸位置。这生成小型克隆文库(在一些实施例中，对于分析 的每一个氨基酸位置为一个)，所述文库各自具有20个成员的复杂性(如 果所有20种氨基酸在每一个位置都被取代)。在一些实施例中，使用本领 域公认的诱变方法，用除了半胱氨酸之外的所有20种天然氨基酸替换(在 一些实施例中，一次一个)CDR中的每一个氨基酸位置。
在一些实施例中，待筛选的文库包含在两个或更多个位置中的取代， 所述两个或更多个位置可在相同的CDR中或者在两个或更多个CDR中。 因此，文库可包含在一个CDR中的两个或更多个位置中的取代。文库可 包含在两个或更多个CDR中的两个或更多个位置中的取代。文库可包含 在3、4、5个或更多个位置中的取代，所述位置在2、3、4、5或6个CDR 中发现。可使用低冗余密码子来制备取代。参见例如Balint等人，1993,Gene 137(1):109-18的表2。
CDR可为重链可变结构域(VH)CDR3和/或轻链可变结构域(VL) CDR3。CDR可为VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2 和/或VL CDR3中的一个或多个。CDR可为KabatCDR、Chothia CDR、 延伸CDR、AbM CDR、接触CDR或构象CDR。
在一些实施例中，文库根据SEQ ID NO:71和72制备。
可测序具有改善结合的候选物，从而鉴定导致亲和力改善的CDR取 代突变体(也称为“改善”取代)。也可测序结合的候选物，从而鉴定保留 结合的CDR取代。
可进行多轮筛选。例如，具有改善结合的候选物(各自包含在一个或 多个CDR的一个或多个位置处的氨基酸取代)也可用于设计第二文库， 所述第二文库含有在每个改善的CDR位置(即在其上取代突变体显示改 善结合的CDR中的氨基酸位置)处的至少原始和取代的氨基酸。下文进 一步讨论该文库的制备、筛选或选择。
文库扫描诱变还提供了用于表征CDR的手段，只要具有改善的结合、 相同的结合、减少的结合或无结合的克隆的频率也提供了关于每个氨基酸 位置对于抗体-抗原复合物的稳定性的重要性的信息。例如，如果CDR的 位置在改变为所有20种氨基酸时保持结合，则该位置被鉴定为对于抗原 结合不太可能需要的位置。相反，如果CDR的位置仅在小百分比的取代 中保留结合，则该位置被鉴定为对于CDR功能重要的位置。因此，文库 扫描诱变方法生成关于CDR中可改变为许多不同氨基酸(包括所有20种 氨基酸)的位置，以及CDR中不能改变或只能改变为少数氨基酸的位置 的信息。
具有改善亲和力的候选物可在第二文库中组合，所述第二文库包括改 善的氨基酸，在该位置处的原始氨基酸，并且还可包括在该位置处的另外 取代，这取决于所需的文库复杂性，或者允许使用所需的筛选或选择方法。 另外，需要时，相邻的氨基酸位置可被随机化为至少两个或更多个氨基酸。 相邻氨基酸的随机化可允许突变CDR中另外的构象灵活性，这依次又可 允许或促进更大数目的改善突变的引入。该文库还可包含在第一轮筛选中没有显示改善亲和力的位置处的取代。
使用本领域已知的任何方法在第二文库中筛选或选择具有改善的和/ 或改变的结合亲和力的文库成员，所述方法包括使用Biacore、KinexaTM生 物传感器分析和使用本领域已知用于选择的任何方法选择，包括噬菌体展 示、酵母展示和核糖体展示。
为了表达本公开的IL-2抗体，可首先使用上述任何方法获得编码VH 和VL区的DNA片段。还可使用本领域技术人员已知的标准方法，将各 种修改，例如突变、缺失和/或添加引入DNA序列内。例如，可使用标准 方法进行诱变，例如PCR介导的诱变，其中突变的核苷酸掺入PCR引物 内，使得PCR产物含有所需的突变或定点诱变。
本公开涵盖对表7中所示的可变结构域和CDR的修饰。例如，本公 开包括包含不显著影响其性质的功能上等价的可变结构域和CDR的抗体， 以及具有增强或降低的活性和/或亲和力的变体。例如，氨基酸序列可突变 以获得对IL-2具有所需结合亲和力的抗体。在一些实施例中，氨基酸序列 可突变以获得对IL-2具有所需结合亲和力的抗体。经修饰的多肽的例子包 括具有氨基酸残基的保守取代的多肽，不显著有害地改变功能活性或成熟(增强)多肽对其配体的亲和力的氨基酸的一个或多个缺失或添加，或化 学类似物的使用。
氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残 基的多肽的氨基末端和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序 列内插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体或与附加 表位融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括与酶或多肽的抗体的N- 或C-末端融合，所述融合增加抗体在血液循环中的半衰期。
抗体还可例如在重链和/或轻链的可变结构域中进行修饰，例如以改变 抗体的结合性质。可变结构域中的变化可改变结合亲和力和/或特异性。在 一些实施例中，在CDR结构域内制备不超过一至五个保守性氨基酸取代。 在其它实施例中，在CDR结构域内制备不超过一至三个保守性氨基酸取 代。例如，可在一个或多个CDR区中制备突变，以增加或减少抗体对于IL-2的KD，增加或减少koff，或者改变抗体的结合特异性。定点诱变技术 是本领域众所周知的。参见例如Sambrook等人和Ausubel等人，同上。
还可在构架区或恒定区中制备修饰或突变，以增加IL-2抗体的半衰 期。参见例如PCT公开号WO 00/09560。还可制备构架区或恒定区中的突 变，以改变抗体的免疫原性，提供与另一种分子共价或非共价结合的位点， 或者改变这种性质例如补体固定、FcR结合和抗体依赖性细胞介导的细胞 毒性。根据本公开，单个抗体可具有在可变结构域的任何一个或多个CDR 或构架区或者恒定区中的突变。
修饰还包括糖基化和非糖基化多肽，以及具有其它翻译后修饰，例如 用不同糖的糖基化、乙酰化和磷酸化的多肽。抗体在其恒定区的保守位置 处被糖基化(Jefferis和Lund，1997,Chem.Immunol.65:111-128；Wright和 Morrison,1997,TibTECH 15:26-32)。免疫球蛋白的寡糖侧链影响蛋白质的 功能(Boyd等人，1996,Mol.Immunol.32:1311-1318；Wittwe和Howard,1990, Biochem.29:4175-4180)和糖蛋白的部分之间的分子内相互作用，其可影 响构象并呈现糖蛋白的三维表面(Jefferis和Lund，同上；Wyss和Wagner, 1996,Current Opin.Biotech.7:409-416)。基于特定的识别结构，寡糖也可作 用于将给定的糖蛋白靶向某些分子。抗体的糖基化据报道影响抗体依赖性 细胞毒性(ADCC)。特别地，通过具有四环素调节的β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基 转移酶III(GnTIII)(催化形成二等分GlcNAc的糖基转移酶)表达的CHO 细胞产生的抗体据报道具有改善的ADCC活性(Umana等人，1999,Nature Biotech.17:176-180)。
抗体的糖基化通常是N-联或O-联的。N-联指碳水化合物部分与天冬 酰胺残基侧链的附着。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸 和天冬酰胺-X-半胱氨酸(其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸)是用 于将碳水化合物部分酶促附着至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中 这些三肽序列中任一的存在产生潜在的糖基化位点。O-联糖基化指糖N- 乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着至羟基氨基酸，最常见为丝氨酸或 苏氨酸，尽管也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
向抗体添加糖基化位点通过改变氨基酸序列，使得其含有上述三肽序 列中的一个或多个而方便地实现(对于N-联糖基化位点)。该改变还可通 过向原始抗体的序列添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基，或者用一个或 多个丝氨酸或苏氨酸残基取代来进行(对于O-联糖基化位点)。
也可改变抗体的糖基化模式而不改变潜在的核苷酸序列。糖基化在很 大程度上取决于用于表达抗体的宿主细胞。因为用于表达作为潜在治疗剂 的重组糖蛋白例如抗体的细胞类型很少是天然细胞，可预期抗体的糖基化 模式中的变化(参见例如Hse等人，1997,J.Biol.Chem.272:9062-9070)。
除宿主细胞的选择之外，在抗体的重组生产期间影响糖基化的因素包 括生长模式、培养基配方、培养密度、氧合作用、pH、纯化方案等等。已 提出了各种方法来改变特定宿主生物中获得的糖基化模式，包括引入或过 表达涉及寡糖生产的某些酶(美国专利号5,047,335；5,510,261和 5,278,299)。糖基化或某些类型的糖基化可例如使用内切糖苷酶H(Endo H)、N-糖苷酶F、内切糖苷酶F1、内切糖苷酶F2、内切糖苷酶F3从糖蛋 白中酶促去除。另外，重组宿主细胞可被遗传改造，以在加工某些类型的 多糖方面是缺陷的。这些和类似的技术是本领域众所周知的。
其它修饰方法包括使用本领域已知的偶联技术，包括但不限于酶促手 段、氧化取代和螯合。例如，修饰可用于附着用于免疫测定的标签。经修 饰的多肽使用本领域建立的程序制备，并且可使用本领域已知的标准测定 来筛选，所述标准测定中的一些在下文和实例中描述。
在一些实施例中，抗体包含经修饰的恒定区，其对人Fcγ受体具有增 加的或降低的结合亲和力，是免疫学惰性或部分惰性的，例如不触发补体 介导的裂解，不刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，或不激活小 胶质细胞；或在下述中的任何一种或多种中具有降低的活性(与未修饰的 抗体相比)：触发补体介导的裂解，刺激ADCC或激活小胶质细胞。恒定 区的不同修饰可用于实现效应子功能的最佳水平和/或组合。参见例如 Morgan等人，Immunology 86:319-324,1995；Lund等人，J.Immunology 157:4963-9 157:4963-4969,1996；Idusogie等人，J.Immunology 164:4178-4184, 2000；Tao等人，J.Immunology 143:2595-2601,1989；和Jefferis等人， Immunological Reviews 163:59-76,1998。在一些实施例中，恒定区如Eur.J. Immunol.,1999,29:2613-2624；PCT申请号PCT/GB99/01441；和/或英国专 利申请号9809951.8中所述进行修饰。
在一些实施例中，可修饰抗体恒定区以避免与Fcγ受体以及补体和免 疫系统的相互作用。在WO 99/58572中描述了用于制备这种抗体的技术。 例如，如果抗体用于人中的临床试验和治疗，则可将恒定区改造为更类似 于人恒定区，以避免免疫应答。参见例如，美国专利号5,997,867和5,866,692。
在一些实施例中，恒定区如Eur.J.Immunol.,1999,29:2613-2624；PCT 申请号PCT/GB99/01441；和/或英国专利申请号9809951.8中所述进行修 饰。在这样的实施例中，Fc可为人IgG2或人IgG4。Fc可为含有突变 A330P331至S330S331(IgG2Δa)的人IgG2，其中氨基酸残基参考野生型IgG2序列进行编号。Eur.J.Immunol.,1999,29:2613-2624。在一些实施例中，抗 体包括包含下述突变的IgG4恒定区(Armour等人，2003,Molecular Immunology40 585-593)：E233F234L235至P233V234A235(IgG4Δc)，其中编 号参考野生型IgG4进行。在又一个实施例中，Fc是具有缺失G236(IgG4Δb) 的人IgG4 E233F234L235至P233V234A235。在另一个实施例中，Fc是含 有铰链稳定突变S228至P228的任何人IgG4 Fc(IgG4、IgG4Δb或IgG4Δc) (Aalberse等人，2002,Immunology 105,9-19)。
在一些实施例中，抗体包括包含下述突变的人重链IgG2恒定区： A330P331至S330S331(氨基酸编号参考野生型IgG2序列)。Eur.J.Immunol., 1999,29:2613-2624。在另外其它实施例中，恒定区对于N-联糖基化是无糖 基化的。在一些实施例中，通过突变寡糖附着残基和/或侧翼残基(其是恒 定区中的N-糖基化识别序列的部分)，使恒定区对于N-联糖基化是无糖基 化的。例如，N-糖基化位点N297可突变为例如A、Q、K或H。参见Tao 等人，J.Immunology 143:2595-2601,1989；和Jefferis等人，Immunological Reviews 163:59-76,1998。在一些实施例中，恒定区对于N-联糖基化是无糖 基化的。恒定区可以酶促方式(例如通过酶PNGase去除碳水化合物)、或 通过在糖基化缺陷宿主细胞中表达而对于N-联糖基化是无糖基化的。
其它抗体修饰包括已如PCT公开号WO 99/58572中所述进行修饰的 抗体。除针对靶分子的结合结构域之外，这些抗体还包含具有与人免疫球 蛋白重链的全部或部分恒定区基本上同源的氨基酸序列的效应子结构域。 这些抗体能够结合靶分子，而不触发显著的补体依赖性裂解或细胞介导的 靶破坏。在一些实施例中，效应子结构域能够特异性结合FcRn和/或 FcγRIIb。这些通常基于源自两个或更多个人免疫球蛋白重链CH2结构域 的嵌合结构域。以这种方式修饰的抗体特别适用于慢性抗体疗法，以避免 对常规抗体疗法的炎症和其它不良反应。
本公开还提供了可进一步修饰的抗体恒定结构域。已知Fc区的变体 (例如氨基酸取代、插入和/或添加和/或缺失)增强或减少效应子功能。 参见例如Presta等人，2002,Biochem.Soc.Trans.30:487-490；Strohl,2009,Curr. Opin.Biotechnol.20(6):685-691；美国专利5,624,821、5,648,260、5,885,573、 6,737,056、7,317,091；PCT公开号WO 99/58572、WO 00/42072、WO 04/029207、WO 2006/105338、WO 2008/022152、WO 2008/150494、WO 2010/033736；美国专利申请公开号2004/0132101、2006/0024298、 2006/0121032、2006/0235208、2007/0148170；Armour等人，1999,Eur.J. Immunol.29(8):2613-2624(减少的ADCC和CDC)；Shields等人，2001,J.Biol. Chem.276(9):6591-6604(减少的ADCC和CDC)；Idusogie等人，2000,J. Immunol.164(8):4178-4184(增加的ADCC和CDC)；Steurer等人，1995,J. Immunol.155(3):1165-1174(减少的ADCC和CDC)；Idusogie等人，2001,J.Immunol.166(4):2571-2575(增加的ADCC和CDC)；Lazar等人，2006,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(11):4005-4010(增加的ADCC)；Ryan等人，2007,Mol.Cancer.Ther.,6:3009-3018(增加的ADCC)；Richards等人，2008,Mol.Cancer Ther.7(8):2517-2527。
在一些实施例中，该抗体包含经修饰的恒定区，与未修饰的抗体相比， 所述经修饰的恒定区具有对于FcRn增加的结合亲和力和/或增加的血清半 衰期。
在称为“种系化(germlining)”的过程中，VH和VL序列中的某些氨基酸 可突变，以与种系VH和VL序列中天然发现的那些匹配。特别地，VH 和VL序列中的构架区的氨基酸序列可突变以匹配种系序列，以降低在抗 体施用时的免疫原性风险。人VH和VL基因的种系DNA序列是本领域 已知的(参见例如“Vbase”人种系序列数据库；还参见Kabat,E.A.等人，1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department ofHealth and Human Services，NIH出版号91-3242；Tomlinson等人，1992,J.Mol.Biol.227:776-798；和Cox等人，1994,Eur.J.Immunol.24:827-836)。
可制备的另一类氨基酸取代是去除抗体中潜在的蛋白酶解位点。这样 的位点可存在于抗体的可变结构域的CDR或构架区或者恒定区中。半胱 氨酸残基的取代和蛋白酶解位点的去除可降低抗体产物中的异质性风险， 并且因此增加其同质性。另一类氨基酸取代是通过改变一个或两个残基来 消除形成潜在脱酰胺位点的天冬酰胺-甘氨酸对。在另一个例子中，本公开 的IL-2抗体的重链的C-末端赖氨酸可被切割或以其它方式去除。在本公开的各种实施例中，抗体的重链和轻链可任选包括信号序列。
一旦获得编码本公开的VH和VL区段的DNA片段，就可通过标准 重组DNA技术进一步操纵这些DNA片段，例如将可变结构域基因转化为 全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操纵中，编码VL或 VH的DNA片段与编码另一种蛋白质(例如抗体恒定区或柔性接头)的另 一个DNA片段可操作地连接。如在该上下文中使用的，术语“可操作地连 接”预期意指两个DNA片段连接成使得由两个DNA片段编码的氨基酸序 列保持在框内。
通过将编码VH的DNA可操作地连接至编码重链恒定区(CH1、CH2 和CH3)的另一个DNA分子，可将编码VH区的经分离的DNA转化为全 长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E. A.等人，1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242)，并且涵盖 这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可为IgG1、 IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但在一些实施例中， 是IgG1或IgG2恒定区。IgG恒定区序列可为已知在不同个体中出现的各 种等位基因或同种异型中的任一种，例如Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)和Gm(17)。 这些同种异型体代表IgG1恒定区中天然存在的氨基酸取代。对于Fab片段 重链基因，可将编码VH的DNA可操作地连接至仅编码重链CH1恒定区 的另一个DNA分子。CH1重链恒定区可源自重链基因中的任一种。
通过将编码VL的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区CL的另一 个DNA分子，可将编码VL区的经分离的DNA转化为全长轻链基因(以 及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如 Kabat,E.A.等人，1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5 版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242)， 并且涵盖这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可为κ或λ恒定区。κ恒定区可为已知在不同个体中出现的各种等位基因中 的任一种，例如Inv(1)、Inv(2)和Inv(3)。λ恒定区可源自三种λ基因中的 任一种。
为了产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段可操作地连接至 编码柔性接头的另一个片段，使得VH和VL序列可作为邻接的单链蛋白 表达，其中VL和VH区通过柔性接头连接(参见例如Bird等人，1988, Science 242:423-426；Huston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty等人，1990,Nature 348:552-554；其它序列的接头 已得到设计且使用(Bird等人，1988，同上)。接头可依次又进行修饰用 于另外的功能，例如药物附着或固体支持物附着。如果仅使用单个VH和 VL，则单链抗体可为单价的，如果使用两个VH和VL，则可为二价的， 或者如果使用超过两个VH和VL，则可为多价的。可生成特异性结合IL-2 和另一个分子的双特异性或多价抗体。单链变体可重组或合成产生。对于 scFv的合成产生，可使用自动合成仪。对于scFv的重组生产，可将含有 编码scFv的多核苷酸的合适质粒引入合适的宿主细胞内，所述宿主细胞 或为真核的例如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞，或为原核的例如大肠 杆菌。编码目的scFv的多核苷酸可通过常规操作例如多核苷酸的连接来 制备。可使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得的scFv。
还涵盖了其它形式的单链抗体，例如双抗体。双抗体是二价双特异性 抗体，其中VH和VL在单条多肽链上表达，但使用的接头太短而不允许 在相同链上的两个结构域之间的配对，从而迫使结构域与另一条链的互补 结构域配对，并且产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger，P。等，1993， Proc.Natl.Acad Sci.USA 90：6444-6488；和Poljak，RJ等，1994，Structure 2：1121-1123)。
包含两个共价连接的抗体的异源缀合抗体也在本公开的范围内。这种 抗体已用于将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利号4,676,980)， 并且用于治疗HIV感染(PCT公开号WO 91/00360和WO 92/200373；以 及EP 03089)。可使用任何方便的交联方法制备异源缀合抗体。合适的交 联剂和技术是本领域众所周知的，并且在美国专利号4,676,980中描述。
嵌合或杂交抗体还可使用合成蛋白质化学的已知方法在体外制备，所 述方法包括涉及交联剂的那些方法。例如，可使用二硫键交换反应或通过 形成硫醚键来构建免疫毒素。用于此目的的合适试剂的例子包括亚氨基硫 醇盐和甲基-4-巯基丁酰亚氨酸盐。
本公开还涵盖了包含来自本文公开的抗体的一个或多个部分或区域 的融合蛋白。在一些实施例中，可制备融合抗体，其包含与另一种多肽连 接的本公开的IL-2抗体的全部或一部分。在另一个实施例中，仅IL-2抗 体的可变结构域连接至多肽。在另一个实施例中，IL-2抗体的VH结构域 连接至第一多肽，而IL-2抗体的VL结构域连接至第二多肽，所述第二多 肽以这样的方式与第一多肽结合，使得VH和VL域可彼此相互作用，以 形成抗原结合位点。在另一个实施例中，VH结构域通过接头与VL结构 域分开，使得VH和VL结构域可彼此相互作用。然后将VH-接头-VL抗 体连接至目的多肽。另外，可产生融合抗体，其中两个(或更多个)单链 抗体彼此连接。如果希望在单条多肽链上产生二价或多价抗体，或希望产生双特异性抗体，则这是有用的。
在一些实施例中，提供了融合多肽，其包含SEQ ID NO:2、4、6、8、 10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或72中所示的可变轻 链区的至少10个邻接氨基酸，和/或SEQID NO:1、3、5、7、9、11、13、 15、17、19、21、23、25、27、29、31或71中所示的可变重链区的至少10个氨基酸。在其它实施例中，提供了融合多肽，其包含可变轻链区的至 少约10、至少约15、至少约20、至少约25或至少约30个邻接氨基酸，和 /或可变重链区的至少约10、至少约15、至少约20、至少约25或至少约30 个邻接氨基酸。在另一个实施例中，融合多肽包含一个或多个CDR。在另 外其它实施例中，融合多肽包含VH CDR3和/或VL CDR3。为了本公开的 目的，融合蛋白包含一种或多种抗体和它与其在天然分子中不附着的另一 种氨基酸序列，例如异源序列或来自另一个区域的同源序列。示例性的异 源序列包括但不限于“标签”，例如FLAG标签或6His标签(SEQ ID NO: 223)。标签是本领域众所周知的。
融合多肽可通过本领域已知的方法例如合成或重组产生。通常，通过 使用本文描述的重组方法制备且表达编码其的多核苷酸，制备本公开的融 合蛋白，尽管它们也可通过本领域已知的其它手段包括例如化学合成进行 制备。
在其它实施例中，可使用编码IL-2抗体的核酸分子制备其它经修饰的 抗体。例如，“κ体”(Ill等人，1997,Protein Eng.10:949-57)、“微型抗体” (Martin等人，1994,EMBOJ.13:5303-9)、“双抗体”(Holluger等人，同上) 或“Janusins”(Traunecker等人，1991,EMBO J.10:3655-3659和Traunecker 等人，1992,Int.J.Cancer(Suppl.)7:51-52)可遵循说明书的教导使用标准分 子生物学技术来制备。
例如，可使用本文公开的抗体制备双特异性抗体，对于至少两种不同 抗原具有结合特异性的单克隆抗体。用于制备双特异性抗体的方法是本领 域已知的(参见例如Suresh等人，1986,Methods in Enzymology 121:210)。 例如，双特异性抗体或抗原结合部分可通过杂交瘤的融合或Fab'部分的连 接来产生。参见例如Songsivilai&Lachmann,1990,Clin.Exp.Immunol. 79:315-321，以及Kostelny等人，1992,J.Immunol.148:1547-1553。传统上， 双特异性抗体的重组生产基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中 两个重链具有不同的特异性(Millstein和Cuello，1983,Nature 305, 537-539)。另外，双特异性抗体可形成为“双抗体”或“Janusins”。在一些实 施例中，双特异性抗体结合IL-2的两个不同表位。在一些实施例中，使用 来自本文提供的IL-2抗体的可变结构域或CDR区中的一个或多个制备上 述经修饰的抗体。
根据制备双特异性抗体的一种方法，将具有所需结合特异性的抗体可 变结构域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定区序列融合。在一些实 施例中，融合使用免疫球蛋白重链恒定区，包含铰链区、CH2和CH3区 的至少一部分。在一些实施例中，含有轻链结合所需位点的第一重链恒定 区(CH1)存在于至少一种融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物和(需 要时)免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体内，并且共转染到合 适的宿主生物内。当在构建中使用的三种多肽链的不等比率提供最佳产率 时，这在实施例中提供了在调节三种多肽部分的相互比例中的极大灵活 性。然而，当至少两种多肽链以相同比率的表达产生高产率时，或者当比 率没有特别意义时，能够将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表 达载体中。
在一种方法中，双特异性抗体由下述组成：在一个臂中具有第一结合 特异性的杂交免疫球蛋白重链，以及在另一个臂中的杂交免疫球蛋白重链 -轻链对(提供第二结合特异性)。在双特异性分子的仅一半中具有免疫球 蛋白轻链的这种不对称结构，促进所需的双特异性化合物与不需要的免疫 球蛋白链组合的分开。这种方法在PCT公开号WO 94/04690中描述。
本公开还提供了包含与试剂缀合(例如连接)的抗体的组合物，所述 试剂促进与固体支持物(如生物素或抗生物素蛋白)的偶联。为了简单起 见，一般提及抗体理解为这些方法适用于本文所述的任何IL-2结合实施 例。缀合一般指如本文所述的连接这些组分。连接(一般将这些组分固定 在最接近的结合中至少为了施用)可通过许多方式来实现。例如，当各自 具有能够与另一个反应的取代基时，试剂与抗体之间的直接反应是可能 的。例如，一个上的亲核基团如氨基或硫氢基可能能够与另一个上的含羰 基基团如酸酐或酰基卤、或含有良好离去基团(例如卤化物)的烷基反应。
抗体可与许多不同的载体结合。载体可为活性和/或惰性的。众所周知 的载体的例子包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、 玻璃、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。为了本公开的 目的，载体的性质可为可溶的或不溶的。本领域技术人员将知道用于结合 抗体的其它合适载体，或能够使用常规实验来确定这点。
本公开的抗体或多肽可与标记试剂例如荧光分子、放射性分子或本领 域已知的任何其它标记连接。本领域已知一般提供(直接或间接)信号的 标记。
本文公开的IL-2抗体的轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH) 的氨基酸序列在表7中由序列标识号总结。
本公开的抗体可包含以下两者：
a)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:2的氨 基酸序列的VL，
b)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:4的氨 基酸序列的VL，
c)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:6的氨 基酸序列的VL，
d)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:8的氨 基酸序列的VL，
e)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:10的氨 基酸序列的VL
f)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:12的 氨基酸序列的VL
g)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:14的 氨基酸序列的VL
h)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:16的 氨基酸序列的VL
i)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:18的 氨基酸序列的VL
j)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:20的 氨基酸序列的VL
k)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:22的 氨基酸序列的VL
1)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:24的 氨基酸序列的VL
m)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:26的 氨基酸序列的VL
n)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:28的 氨基酸序列的VL
o)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:30的 氨基酸序列的VL
p)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:32的 氨基酸序列的VL，或
q)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:72的 氨基酸序列的VL。
在另一个方面，抗体包含这些序列的变体，其中这些变体可包括保守 性和非保守性取代、缺失和/或添加，并且通常包括与本文公开的特异性序 列中的任一种共享至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、 至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少 93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％ 序列同一性的肽。
例如，在一个方面，本公开提供了经分离的抗体或其抗原结合部分， 其包含如SEQID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:28、 SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:72中所示的VL链氨基酸序列 或其变体。在一个方面，所述抗体变体包含对SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、 SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、 SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:32或 SEQ ID NO:72的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15 个保守性或非保守性取代，和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14或15个添加和/或缺失。在一个进一步方面，所述变体与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、 SEQ IDNO:32或SEQ ID NO:72共享至少65％、至少75％、至少85％、至少 90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性， 并且其中所述抗体或抗原结合部分特异性结合IL-2。在一些实施例中，所 述抗体或抗原结合部分特异性结合hIL-2。
在一个进一步方面，本公开提供了经分离的抗体或其抗原结合部分， 其包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQID NO:25、SEQ ID NO:27、 SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:71中所示的VH链氨基酸序列 或其变体。在一个方面，所述抗体变体包含对SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、 SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、 SEQ ID NO:15、SEQID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQID NO:29、SEQ ID NO:31或 SEQ ID NO:71的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15 个保守性或非保守性取代，和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14或15个添加和/或缺失。在一个进一步方面，所述变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、 SEQ IDNO:31或SEQ ID NO:71共享至少65％、至少75％、至少85％、至少 90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性， 并且其中所述抗体或抗原结合部分特异性结合IL-2。在一些实施例中，所 述抗体或抗原结合部分特异性结合hIL-2。
本公开的抗体可包括包含VH的重链，所述VH包含SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、 SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQID NO:29、 SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:71的氨基酸序列，其中所述抗体还包含重链 恒定结构域。如本文其它地方更充分阐述的，抗体重链恒定结构域可选自 IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但在一些实施 例中，是IgG1或IgG2恒定区。IgG恒定区序列可为已知在不同个体中出 现的各种等位基因或同种异型中的任一种，例如Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)和 Gm(17)。对于Fab片段重链基因，可将编码VH的DNA可操作地连接至 仅编码重链CH1恒定区的另一个DNA分子。CH1重链恒定区可源自重链 基因中的任一种。
在一个方面，抗体可包括包含选自下述的VH的重链，所述VH包含 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、 SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:71的氨基酸序列，并且还包含IgG1 恒定结构域，其包含降低或消除Fc效应子功能的三重突变(hIgG1-3m； SEQ ID NO:2)。在一个方面，所述抗体变体包含对全长重链的1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个保守性或非保守性取代， 和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个添加和/或缺失。在一个进一步方面，所述变体与全长重链共享至少65％、至少75％、 至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少 99％序列同一性，并且其中所述抗体或抗原结合部分特异性结合IL-2。
本公开的抗体可包括包含VL的轻链，所述VL包含SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、 SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQID NO:30、 SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:72的氨基酸序列，其中所述抗体还包含轻链 恒定结构域。如本文其它地方更充分阐述的，抗体轻链恒定结构域可选自 Cκ或Cλ恒定区，例如SEQ ID NO:1的Cλ恒定区。在一个方面，所述抗 体变体包含对全长轻链的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14或15个保守性或非保守性取代，和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14或15个添加和/或缺失。在一个进一步方面，所述变体与 全长轻链共享至少65％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至 少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，并且其中所述抗体 或抗原结合部分特异性结合IL-2。
本公开的抗体可包含表7中所示的VL或VH氨基酸序列之一的一部 分。例如，本公开的抗体可包含来自VH或VL的至少7、至少8、至少9、 至少10、至少12、至少15、至少18、至少20或至少25个连续氨基酸的一 部分，所述VH包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、 SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、 SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:71，所述VL来自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、 SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:72。这样的部分将优选保留上文讨论 的功能中的一种或多种，例如与IL-2结合的能力。在一些实施例中，这样 的部分将优选保留上文讨论的功能中的一种或多种，例如与hIL-2结合的 能力。
在一些实施例中，本公开的抗体包含根据Kabat、Chothia或延伸序列 的VH CDR1、CDR2和CDR3和/或根据Kabat和/或Chothia氨基酸序列 的VL CDR1、CDR2和CDR3，如表7中所示。在一些实施例中，本公开 的抗体包含根据下述Kabat氨基酸序列的VH CDR1：SEQ IDNO:73、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:163、SEQ IDNO:172、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:199 或SEQ ID NO:208。在一些实施例中，本公开的抗体包含根据下述Chothia 氨基酸序列的VH CDR1：SEQ ID NO:74、SEQ IDNO:83、SEQ ID NO:92、 SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:173、 SEQ IDNO:182、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:200或SEQ ID NO:209。在一 些实施例中，本公开的抗体包含根据下述组合氨基酸序列的VH CDR1： SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:138、SEQID NO:147、 SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:201或SEQ ID NO:210。在一些实施例中，本公开的 抗体包含根据下述Kabat氨基酸序列的VH CDR2：SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:121、 SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:193、SEQ IDNO:202 或SEQ ID NO:211。在一些实施例中，本公开的抗体包含根据下述Chothia 氨基酸序列的VH CDR2：SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:95、 SEQ ID NO:104、SEQ IDNO:113、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:176、 SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:203或SEQID NO:212。在一 些实施例中，本公开的抗体包含根据下述氨基酸序列的VH CDR3：SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:114、 SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:168、SEQ IDNO:177、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:195、 SEQ ID NO:204或SEQ ID NO:213。在一些实施例中，本公开的抗体包含根 据下述氨基酸序列的VL CDR1：SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:88、SEQID NO:97、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:133、 SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:187、SEQID NO:196、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:214 或SEQ ID NO:220。在一些实施例中，本公开的抗体包含根据下述氨基酸 序列的VL CDR2：SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:143、 SEQ IDNO:152、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:215或SEQ ID NO:221。在一些实施例中，本公开的抗体包含根据下述氨基酸序列的VL CDR3：SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:108、 SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:189、 SEQ ID NO:198、SEQ IDNO:207、SEQ ID NO:216或SEQ ID NO:222。在一 些实施例中，本公开的抗体包含根据SEQID NO:217的VH CDR1。在一 些实施例中，本公开的抗体包含根据SEQ ID NO:218的VHCDR2。在一 些实施例中，本公开的抗体包含根据SEQ ID NO:219的VH CDR3。
在某些实施例中，本公开的抗体包含选自下述的抗体的根据Kabat、 Chothia或延伸序列的VH CDR1、CDR2和CDR3和/或根据Kabat和/或 Chothia氨基酸序列的VL CDR1、CDR2和CDR3：F4.7.6 VH、F4.7.8 VH、 F5.1.11 VH、F5.1.9 VH、F4.7.062 VH、F5.1.11.01 VH、F5.1.11.02 VH、F5.1.11.03 VH、F5.1.11.04 VH、F5.1.11.05 VH、F5.1.11.06 VH、F5.1.11.07 VH、F5.1.11.08 VH、F5.1.11.09 VH、F5.1.9.5 VH、d1C7 VH、F4.7.6 VL、F4.7.8 VL、F5.1.11 VL、F5.1.9 VL、F4.7.062 VL、F5.1.11.01 VL、F5.1.11.02 VL、F5.1.11.03 VL、 F5.1.11.04 VL、F5.1.11.05 VL、F5.1.11.06 VL、F5.1.11.07 VL、F5.1.11.08 VL、 F5.1.11.09 VL、F5.1.9.5 VL或d1C7 VL，如表7中所示。在某些实施例中，本公开的抗体包含抗体F5.1.11.02的根据Kabat、Chothia或延伸序列的VH CDR1、CDR2和CDR3和/或根据Kabat和/或Chothia氨基酸序列的VL CDR1、CDR2和CDR3，如表7中所示。
这些VH或VL序列中任一个的合适部分或变体将保留与IL-2结合的 能力。在一些实施例中，它将优选保留与IL-2特异性结合的能力。在一些 实施例中，它将优选保留与抗体源自其的IL-2分子的相同或相似表位或区 域特异性结合的能力。在一些实施例中，它将优选保留它源自其的抗体的 一种或多种另外功能，尤其是例如结合hIL-2，降低hIL-2与IL-2Rα和 IL-2Rβ的结合，以及是Treg保留的。
在一些实施例中，这些VH或VL序列中任一个的合适部分或变体将 保留与hIL-2结合的能力。在一些实施例中，它将保留与hIL-2特异性结 合的能力。在一些实施例中，它将保留与抗体源自其的hIL-2分子的相同 或相似表位或区域特异性结合的能力。在一些实施例中，它将保留它源自 其的抗体的一种或多种另外功能，尤其是例如结合hIL-2，降低hIL-2与 IL-2Rα和IL-2Rβ的结合，以及是Treg保留的。
本公开的抗体可包含来自本文鉴定的特异性抗体的CDR区，例如来 自SEQ ID NO:1-32内的CDR区。在一些实施例中，这样的抗体将优选保 留如本文所述的与IL-2结合的能力。在一些实施例中，这样的抗体将优选 保留如本文所述的与hIL-2结合的能力。例如，本公开的抗体的CDR序列 显示于序列表(表7)中，并且SEQ ID NO显示于表6中。在某些实施例中，本公开的抗体包含来自本公开的抗体内的1、2、3、4、5或6个CDR。
在一个方面，本公开提供了包含对上文列出的一个或多个CDR的1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个保守性或非保守性 取代，和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个添 加和/或缺失。在一个进一步方面，该变体与上文列出的一个或多个CDR序列共享至少65％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、 至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，并且其中抗体或抗原结合 部分特异性结合IL-2。在一些实施例中，抗体或抗原结合部分特异性结合 hIL-2。
多核苷酸、载体和宿主细胞
本公开还提供了编码任何抗体的多核苷酸，所述抗体包括本文所述的 抗体部分和经修饰的抗体，例如如具有受损效应子功能的抗体。在另一个 方面，本公开提供了制备本文所述的任何多核苷酸的方法。多核苷酸可通 过本领域已知的程序制备且表达。相应地，本公开提供了多核苷酸或组合 物，包括药物组合物，其包含编码下述IL-2抗体及其抗原结合部分中的任 一种的多核苷酸：F4.7.6 VH、F4.7.8 VH、F5.1.11 VH、F5.1.9 VH、F4.7.062 VH、F5.1.11.01 VH、F5.1.11.02 VH、F5.1.11.03 VH、F5.1.11.04 VH、F5.1.11.05 VH、F5.1.11.06 VH、F5.1.11.07 VH、F5.1.11.08 VH、F5.1.11.09 VH、F5.1.9.5 VH、d1C7 VH、F4.7.6 VL、F4.7.8 VL、F5.1.11 VL、F5.1.9 VL、F4.7.062 VL、F5.1.11.01 VL、F5.1.11.02 VL、F5.1.11.03 VL、F5.1.11.04 VL、F5.1.11.05 VL、F5.1.11.06 VL、F5.1.11.07 VL、F5.1.11.08 VL、F5.1.11.09 VL、F5.1.9.5 VL 或d1C7 VL或者其具有结合IL-2能力的任何一部分或部分。
在一个实施例中，VH和VL结构域、或其抗原结合部分、或者全长 HC或LC由分开的多核苷酸编码。可替代地，VH和VL两者、或其抗原 结合部分、或者HC和LC由单个多核苷酸编码。
在另一个方面，本公开提供了编码IL-2抗体的多核苷酸及其变体，其 中这样的变体多核苷酸与本文公开的任何特定核酸共享至少70％、至少 75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、 至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％或至少99％的序列同一性。这些量并不意味着是限制性的，并且所述 百分比之间的增量被特别设想作为本公开的部分。
与任何这样的序列互补的多核苷酸也由本公开涵盖。多核苷酸可为单 链的(编码或反义的)或双链的，并且可为DNA(基因组、cDNA或合成 的)或RNA分子。RNA分子包括含有内含子且以一对一的方式对应于 DNA分子的HnRNA分子，以及不含内含子的mRNA分子。另外的编码 或非编码序列可但无需存在于本公开的多核苷酸内，并且多核苷酸可但无 需与其它分子和/或支持材料连接。
多核苷酸可包含天然序列(即，编码抗体或其一部分的内源序列)或 可包含此类序列的变体。多核苷酸变体含有一个或多个取代、添加、缺失 和/或插入，使得相对于天然免疫反应性分子，所编码的多肽的免疫反应性 不降低。一般可如本文所述评价对所编码的多肽的免疫反应性的作用。在 一些实施例中，变体显示出与编码天然抗体或其一部分的多核苷酸序列至 少约70％的同一性，在一些实施例中，至少约80％的同一性，在一些实施 例中，至少约90％的同一性，以及在一些实施例中，至少约95％的同一性。 这些量并不意味着是限制性的，并且所述百分比之间的增量被特别设想作 为本公开的部分。
如果当如下所述就最大对应性比对时，两个序列中的核苷酸或氨基酸 序列是相同的，则两个多核苷酸或多肽序列被说成是“相同的”。两个序列 之间的比较通常通过比较在比较窗上的序列来执行，以鉴定且比较序列相 似性的局部区域。如本文使用的，“比较窗”指至少约20，通常30至约75、 或40至约50个邻接位置的区段，其中在两个序列最佳比对后，序列可与 具有相同数目的邻接位置的参考序列进行比较。
用于比较的序列的最佳比对可使用
Figure BDA0003717294580000631
生物信息学软件套件 (
Figure BDA0003717294580000633
Inc.,Madison,WI)中的
Figure BDA0003717294580000632
程序，使用默认参数进行。 该程序体现了下述参考文献中描述的几种比对方案：Dayhoff,M.O.,1978,A model of evolutionarychange in proteins-Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff,M.O.(编辑)Atlas of Protein Sequence and Structure, National BiomedicalResearch Foundation,Washington DC第5卷，Suppl.3,第 345-358页；Hein J.,1990,Unified Approach to Alignment and Phylogenes第 626-645页Methods in Enzymology第183卷，Academic Press,Inc.,San Diego, CA；Higgins,D.G.和Sharp,P.M.,1989,CABIOS 5:151-153；Myers,E.W.和 Muller W.,1988,CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11:105； Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4:406-425；Sneath,P.H.A.和Sokal, R.R.,1973,Numerical Taxonomy the Principles and Practice ofNumerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.,1983, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:726-730。
在一些实施例中，通过在至少20个位置的比较窗上比较两个最佳比 对的序列来确定“序列同一性的百分比”，其中比较窗中的多核苷酸或多肽 序列的一部分可包含与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，20百分比 或更少、通常为5至15百分比、或10至12百分比的添加或缺失(即缺 口)，用于两个序列的最佳比对。通过确定在其下相同核酸碱基或氨基酸 残基在两个序列中出现的位置数目，以产生匹配位置的数目，将匹配位置 的数目除以参考序列中的位置总数目(即窗口大小)，并将结果乘以100 以产生序列同一性的百分比，来计算百分比。
变体还可或可替代地与天然基因或其一部分或互补体基本上同源。此 类多核苷酸变体能够在中等严格条件下与编码天然抗体的天然存在的 DNA序列(或互补序列)杂交。
合适的“中等严格条件”包括在5X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中预洗涤；在50℃-65℃、5X SSC下过夜杂交；随后在65℃下 用含有0.1％SDS的2X、0.5X和0.2X SSC洗涤两次，共20分钟。
如本文使用的，“高度严格条件”或“高严格性条件”是这样的：(1)采用 低离子强度和高温用于洗涤，例如在50℃下的0.015M氯化钠/0.0015M 柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交过程中采用变性剂，例如甲酰 胺，例如在42℃下的50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％ Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/以pH 6.5的50mM磷酸钠缓冲液与750mM 氯化钠、75mM柠檬酸钠；或(3)采用在42℃下的50％甲酰胺、5X SSC(0.75 M NaCl、0.075M柠檬酸钠)50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5X Denhardt's溶液、超声处理的鲑精DNA(50μg/mL)、0.1％SDS和10％葡聚 糖硫酸酯，其中洗涤在42℃下在0.2X SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中以及在 55℃下在50％甲酰胺中，随后为由在55℃下含有EDTA的0.1X SSC组成 的高严格性洗涤。本领域技术人员将认识到如何根据需要调整温度、离子 强度等，以适应因素例如探针长度等等。
本领域普通技术人员应了解，由于遗传密码的简并性，存在编码如本 文所述的多肽的许多核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因 的核苷酸序列具有最低限度同源性。尽管如此，由于密码子使用中的差异 而不同的多核苷酸由本公开特别考虑。此外，包含本文提供的多核苷酸序 列的基因的等位基因在本公开的范围内。等位基因是由于核苷酸的一个或 多个突变(例如缺失、添加和/或取代)而改变的内源基因。所得到的mRNA和蛋白质可但无需具有改变的结构或功能。可使用标准技术(例如杂交、 扩增和/或数据库序列比较)来鉴定等位基因。
本公开的多核苷酸可使用化学合成、重组方法或PCR来获得。化学 多核苷酸合成的方法是本领域众所周知的，并且无需在本文中详细描述。 本领域技术人员可使用本文提供的序列和商业DNA合成仪来产生所需 DNA序列。
为了使用重组方法制备多核苷酸，可将包含所需序列的多核苷酸插入 合适的载体内，并且依次又可将载体引入合适的宿主细胞内用于复制和扩 增，如本文进一步讨论的。可通过本领域已知的任何手段将多核苷酸插入 宿主细胞内。通过经由直接摄取、胞吞作用、转染、F-接合或电穿孔引入 外源多核苷酸来转化细胞。一旦引入，外源多核苷酸就可作为非整合载体 (例如质粒)维持在细胞内或整合到宿主细胞基因组内。如此扩增的多核苷酸可通过本领域众所周知的方法从宿主细胞中分离。参见例如Sambrook 等人，1989。
可替代地，PCR允许复制DNA序列。PCR技术是本领域众所周知的， 并且在美国专利号4,683,195、4,800,159、4,754,065和4,683,202以及PCR: The Polymerase ChainReaction,Mullis等人编辑，Birkauswer Press,Boston, 1994中描述。
通过在适当的载体中使用经分离的DNA并且将其插入合适的宿主细 胞内可获得RNA。当细胞复制并且DNA被转录成RNA时，然后可使用 本领域技术人员众所周知的方法分离RNA，如例如Sambrook等人，1989， 同上中所述。
合适的克隆载体可根据标准技术构建，或可选自本领域可用的大量克 隆载体。尽管所选择的克隆载体可根据预期使用的宿主细胞而变化，但有 用的克隆载体一般具有自我复制的能力，可具有针对特定限制性内切核酸 酶的单个靶，和/或可携带可用于选择含有载体的克隆的标记物的基因。合 适的例子包括质粒和细菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如 pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、 RP4、噬菌体DNA和穿梭载体如pSA3和pAT28。这些和许多其它克隆载 体可从商业供应商如BioRad、Strategene和Invitrogen获得。
进一步提供了表达载体。表达载体一般是含有根据本公开的多核苷酸 的可复制多核苷酸构建体。这暗示表达载体必须在宿主细胞中可或作为附 加体或作为染色体DNA的集成部分复制。合适的表达载体包括但不限于 PCT公开号WO 87/04462中公开的质粒、病毒载体包括腺病毒、腺伴随病 毒、逆转录病毒、粘粒和表达载体。载体组分一般可包括但不限于下述中 的一个或多个：信号序列；复制起点；一种或多种标记物基因；合适的转 录控制元件(如启动子、增强子和终止子)。为了表达(即翻译)，通常还 需要一个或多个翻译控制元件，例如核糖体结合位点、翻译起始位点和终 止密码子。
含有目的多核苷酸和/或多核苷酸本身的载体可通过多种适当手段中 的任一种引入宿主细胞内，所述手段包括电穿孔、采用氯化钙的转染、氯 化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质；微粒轰击；脂转染；和感染(例 如当载体是传染剂如牛痘病毒时)。引入载体或多核苷酸的选择经常取决 于宿主细胞的特点。
本公开还提供了包含本文所述的任何多核苷酸的宿主细胞。能够过表 达异源DNA的任何宿主细胞都可用于分离编码目的抗体、多肽或蛋白质 的基因。哺乳动物宿主细胞的非限制性例子包括但不限于COS、HeLa和 CHO细胞。也参见PCT公开号WO 87/04462。合适的非哺乳动物宿主细 胞包括原核生物(如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌(B.subtillis))和酵母(如酿 酒酵母(S.cerevisae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)；或乳酸克鲁维酵母(K. lactis))。在一些实施例中，宿主细胞表达cDNA的水平以比宿主细胞中相 应的目的内源抗体或蛋白(如果存在的话)的水平高约5倍，在一些实施 例中高10倍，并且在一些实施例中高20倍。筛选宿主细胞与IL-2的特异 性结合通过免疫测定或FACS实现。可鉴定过表达目的抗体或蛋白质的细 胞。
表达载体可用于指导IL-2抗体的表达。本领域技术人员熟悉表达载体 的施用，以在体内获得外源蛋白的表达。参见例如美国专利号6,436,908； 6,413,942；和6,376,471。表达载体的施用包括局部或全身施用，包括注射、 经口施用、粒子枪或插入导管的施用，以及局部施用。在另一个实施例中， 表达载体直接施用于交感干或神经节，或者施用到冠状动脉、心房、心室 或心包膜内。
还可使用含有表达载体或亚基因组多核苷酸的治疗组合物的靶向递 送。受体介导的DNA递送技术在例如下述中描述：Findeis等人，Trends Biotechnol.,1993,11:202；Chiou等人，Gene Therapeutics:Methods And Applications Of Direct Gene Transfer,J.A.Wolff,ed.,1994；Wu等人，J.Biol. Chem.,1988,263:621；Wu等人，J.Biol.Chem.,1994,269:542；Zenke等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87:3655；Wu等人，J.Biol.Chem.,1991, 266:338。含有多核苷酸的治疗组合物以约100ng至约200mg DNA的范围 施用，用于基因治疗方案中的局部施用。在基因治疗方案过程中，也可使 用约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg和约20μg 至约100μg DNA的浓度范围。治疗性多核苷酸和多肽可使用基因递送媒 介物递送。基因递送媒介物可具有病毒或非病毒起源(一般参见Jolly, Cancer Gene Therapy,1994,1:51；Kimura,Human Gene Therapy,1994,5:845； Connelly,Human Gene Therapy,1995,1:185；和Kaplitt,Nature Genetics,1994,6:148)。这种编码序列的表达可使用内源哺乳动物或异源启动子来诱导。 编码序列的表达可为组成性或调节的。
用于递送所需多核苷酸和在所需细胞中表达的基于病毒的载体是本 领域众所周知的。示例性的基于病毒的载体包括但不限于重组逆转录病毒 (参见例如PCT公开号WO90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；WO 93/11230；WO 93/10218；WO 91/02805；美国专利号5,219,740 和4,777,127；GB专利号2,200,651；和EP专利号0 345 242)、基于甲病毒 的载体(例如辛德毕斯病毒载体、塞姆利基森林病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑 炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532)) 和腺伴随病毒(AAV)载体(参见例如PCT公开号WO 94/12649,WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)。还可采用如Curiel,Hum.Gene Ther.,1992,3:147中所述与被杀死的腺病毒连 接的DNA的施用。
也可采用非病毒递送载体和方法，包括但不限于与单独的被杀死的腺 病毒连接或未连接的聚阳离子缩合DNA(参见例如Curiel,Hum.Gene Ther., 1992,3:147)；配体连接的DNA(参见例如Wu,J.Biol.Chem.,1989, 264:16985)；真核细胞递送媒介物细胞(参见例如美国专利号5,814,482； PCT公开号WO 95/07994；WO 96/17072；WO 95/30763；和WO 97/42338) 以及核酸电荷中和或与细胞膜融合。也可采用裸露DNA。示例性的裸露 DNA引入方法在PCT公开号WO 90/11092和美国专利号5,580,859中描述。 可充当基因递送媒介物的脂质体在美国专利号5,422,120；PCT公开号WO 95/13796；WO 94/23697；WO 91/14445；和EP0524968中描述。另外的方 法在Philip,Mol.Cell Biol.,1994,14:2411和Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci., 1994,91:1581中描述。
治疗方法
治疗方法涉及向需要治疗的受试者施用治疗有效量或“有效量”的IL-2 抗体、抗原结合部分、或包含如本文所述的IL-2抗体的抗体:IL-2复合物， 其由本公开考虑。如本文使用的，“治疗有效”或“有效”量指抗体或其一部 分的量具有足够的数量，以导致疾病症状严重程度的降低、疾病无症状时 期的频率和持续时间的增加、或预防由于疾病折磨的损害或残疾-或作为单 一剂量或根据多重剂量方案，单独或与其它试剂组合。本领域普通技术人 员将能够基于因素例如受试者的大小、受试者症状的严重程度以及所选择 的特定组合物或施用途径来确定这样的量。受试者可为人或非人动物(例 如兔、大鼠、小鼠、猴子或其它低等灵长类动物)。
抗体、抗原结合部分或包含本公开的IL-2抗体的抗体:IL-2复合物可 与已知药剂共施用，并且在一些情况下，抗体本身可被修饰。例如，可将 抗体缀合至免疫毒素或放射性同位素，以潜在地进一步增加功效。关于与 另外的治疗剂的共施用，这样的试剂可包括细胞毒素剂、放射性毒试剂或 免疫抑制剂。抗体可与试剂连接(作为免疫复合物)或可与试剂分开施用。 在后一种情况下(分开施用)，抗体可在试剂之前、在试剂之后或与试剂 同时施用，或者可与其它已知疗法例如抗癌疗法例如辐射共施用。IL-2抗 体、其抗原结合部分或包含本公开的IL-2抗体的抗体:IL-2复合物与治疗 剂的共施用提供了两种试剂，其经由不同机制操作可对人疾病提供治疗效 应和可能的协同效应。
抗体、抗原结合部分和包含本文公开的IL-2抗体的抗体:IL-2复合物 可在各种情况下用作治疗或诊断工具，在所述情况下IL-2是不期望活性 的，例如炎性状况如自身免疫疾病，或其中需要免疫抑制的情况。在某些 实施例中，免疫抑制疗法可制备用于器官或骨髓移植。鉴于IL-2在炎症途 径和众多疾病、病症和状况中的牵涉，许多此类疾病、病症或状况特别适 合于用抗体、抗原结合部分或包含本文公开的IL-2抗体的抗体:IL-2复合 物的治疗。相应地，IL-2抗体、其抗原结合部分或包含本文公开的IL-2 抗体的抗体:IL-2复合物可用于治疗或预防IL-2介导的病症或IL-2缺乏病 症。另外，本公开提供了IL-2抗体、其抗原结合部分或包含本文公开的IL-2 抗体的抗体:IL-2复合物在制造用于治疗或预防IL-2介导的病症或IL-2缺 陷病症的药剂中的用途。在另一个实施例中，本专利申请公开了用于治疗 IL-2介导的病症或IL-2缺乏病症的IL-2抗体、其抗原结合部分或包含本 文公开的IL-2抗体的抗体:IL-2复合物。在一个进一步的实施例中，本专 利申请公开了用于治疗或预防IL-2介导的病症或IL-2缺陷病症的药物组 合物，其包含IL-2抗体、其抗原结合部分或包含本文公开的IL-2抗体的 抗体:IL-2复合物。在某些实施例中，抗体特异性结合hIL-2。
在某些实施例中，这些疾病包括免疫性疾病，例如移植物抗宿主病。 在某些实施例中，疾病可为与IL-2相关的任何疾病，例如肌营养不良和肥 胖。可用抗体、其抗原结合部分或包含本文提供的IL-2抗体的抗体:IL-2 复合物治疗的示例性自身免疫疾病和病症包括例如炎性反应，例如炎症性 皮肤病，包括牛皮癣和皮炎(例如特应性皮炎)；皮肌炎；系统性硬皮病 和硬化症；与炎性肠病相关的应答(例如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)； 呼吸窘迫综合征(包括成人呼吸窘迫综合征和ARDS)；皮炎；脑膜炎； 脑炎；葡萄膜炎；结肠炎；胃炎；肾小球肾炎；过敏性状况如湿疹和哮喘 以及涉及T细胞浸润和慢性炎症应答的其它状况；动脉粥样硬化；白细胞 粘附缺陷；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)；糖尿病(例如I型糖 尿病)；多发性硬化症；雷诺氏综合征；自身免疫性甲状腺炎；变应性脑 脊髓炎；干燥综合征；青少年型糖尿病；以及通常在结核病、肉瘤样病、 多肌炎、肉芽肿病和血管炎中发现的由细胞因子和T淋巴细胞介导的与急 性和迟发性超敏反应相关的免疫反应；韦格纳氏病；恶性贫血(阿狄森氏 病)；涉及白细胞渗出的疾病；中枢神经系统(CNS)炎性病症；多器官损伤 综合征；溶血性贫血(包括但不限于冷球蛋白血症或库姆氏阳性贫血)； 重症肌无力；抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基底膜病；抗磷脂综 合征；过敏性神经炎；格雷夫斯病；朗-爱二氏肌无力综合征；类天疱疮； 天疱疮；自身免疫性多内分泌腺疾病；白癜风；赖特氏病；僵人综合征； 白塞病；巨细胞动脉炎；免疫复合物肾炎；IgA肾病；IgM多发性神经病； 免疫性血小板减少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板减少症和自身免疫性 溶血性疾病；桥本氏甲状腺炎；自身免疫性肝炎；自身免疫性血友病；自 身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)；自身免疫性葡萄膜视网膜炎；格- 巴二氏综合征；古德帕斯丘综合征；混合性结缔组织病；自身免疫相关性 不孕症；结节性多动脉炎；斑秃；和特发性粘液性水肿。在一些实施例中， 可用本发明的组合物和方法治疗的状况是糖尿病(例如I型糖尿病)。在一些实施例中，该疾病是I型糖尿病。在一些实施例中，该疾病是青少年型 糖尿病。
为了治疗前述病症中的任一种，根据本公开使用的药物组合物可使用 一种或多种药学可接受的载体或赋形剂以常规方式配制，并且如下文更充 分地讨论的施用。
根据本公开测定抗体、其抗原结合部分或包含本公开的IL-2抗体的抗 体:IL-2复合物的治疗有效量在很大程度上取决于特定患者特征、施用途径 以及待治疗病症的性质，并且在下文更充分地讨论。
抗体、其抗原结合部分或包含本公开的IL-2抗体的抗体:IL-2复合物 的施用和给药在下文其它地方更充分地讨论。
诊断方法
本文公开的IL-2抗体或其抗原结合部分可用于诊断测试和成像。例 如，IL-2抗体或其抗原结合部分可用于ELISA测定中。抗体或其抗原结合 部分也可用作放射性标记的单克隆抗体。参见例如Srivastava(编辑)， Radiolabeled Monoclonal Antibodies ForImaging And Therapy,Plenum Press (1988)；Chase,"Medical Applications ofRadioisotopes,"in Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版，Gennaro等人(编辑)，Mack Publishing Co., pp.624-652(1990)；和Brown,"Clinical Use of MonoclonalAntibodies,"in Biotechnology and Pharmacy,Pezzuto等人(编辑)，Chapman and Hall，第 227-249页(1993)；Grossman,1986,Urol.Clin.North Amer.13:465-474；Unger 等人，1985,Invest.Radiol.20:693-700；和Khaw等人，1980,Science 209:295-297。这种技术，也称为免疫闪烁成像术，使用γ照相机检测与单 克隆抗体缀合的γ发射放射性同位素的位置。诊断成像可用于诊断癌症、 自身免疫疾病、传染病和/或心血管疾病。(参见例如Brown，同上)。
在一个实施例中，IL-2抗体或其抗原结合部分可用于诊断IL-2相关疾 病、病症或状况，包括免疫相关疾病。例如，在其它用途中，抗体或其抗 原结合部分可用于检测患者中的IL-2水平。
除诊断之外，IL-2抗体或其抗原结合部分可用于监测治疗应答、检测 疾病的复发并指导后续的临床决策。
在一些实施例中，为了诊断和监测目的，可通过使用中间官能团直接 或间接地使放射性同位素与抗体部分结合。这样的中间官能团包括例如 DTPA(二乙烯三胺五乙酸)和EDTA(乙二胺四乙酸)。递送给患者的辐 射剂量通常维持在尽可能低的水平下。这可通过选择同位素来实现，用于 最低限度半衰期、体内的最低限度保留时间、以及允许检测和准确测量的 同位素最低限度数量的最佳组合。可与抗体结合且适于诊断成像的放射性 同位素的例子包括99mTc和111In。
研究指示抗体部分，特别是Fab和Fab'提供合适的肿瘤/背景比率。(参 见例如Brown，同上)。
IL-2抗体或其抗原结合部分也可用顺磁性离子标记用于体内诊断的 目的。对于磁共振成像特别有用的元素包括Gd、Mn、Dy和Fe离子。
IL-2抗体或其抗原结合部分也可在体外检测IL-2的存在。在这种免 疫测定中，抗体或其抗原结合部分可在液相中利用或与固相载体结合。例 如，可将完整抗体或其抗原结合部分附着到聚合物(例如氨基葡聚糖)， 以便将抗体组分连接到不溶性支持物如聚合物包被的珠、平板或管。在一 些实施例中，用于检测的IL-2是人IL-2(hIL-2)。在一些实施例中，用于 检测的hIL-2在体外以0.1ng/mL至1000ng/mL的浓度存在。在一些实施 例中，用于检测的hIL-2在体外以0.1ng/mL至750ng/mL的浓度存在。在 一些实施例中，用于检测的hIL-2在体外以0.5ng/mL至500ng/mL的浓度 存在。在一些实施例中，用于检测的hIL-2在体外以0.5ng/mL至250ng/mL 的浓度存在。在一些实施例中，用于检测的hIL-2在体外以0.5ng/mL至 100ng/mL的浓度存在。在一些实施例中，用于检测的hIL-2在体外以0.5 ng/mL至50ng/mL的浓度存在。在一些实施例中，用于检测的hIL-2在体 外以0.5ng/mL至25ng/mL的浓度存在。在一些实施例中，用于检测的 hIL-2在体外以0.5ng/mL至10ng/mL的浓度存在。在一些实施例中，用 于检测的hIL-2在体外以0.5ng/mL至5ng/mL的浓度存在。在一些实施例 中，用于检测的hIL-2在体外以0.5ng/mL至1ng/mL的浓度存在。在一些 实施例中，用于检测的hIL-2在体外以0.1ng/mL至5ng/mL的浓度存在。 在一些实施例中，用于检测的hIL-2在体外以0.1ng/mL至1ng/mL的浓度 存在。在一些实施例中，用于检测的hIL-2在体外以0.8ng/mL至500ng/mL 的浓度存在。在一些实施例中，用于检测的hIL-2在体外以1ng/mL至500 ng/mL的浓度存在。在一些实施例中，用于检测的hIL-2在体外以1ng/mL 至250ng/mL的浓度存在。在一些实施例中，用于检测的hIL-2在体外以 1ng/mL至100ng/mL的浓度存在。在一些实施例中，用于检测的hIL-2 在体外以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在。在一些实施例中，用于检测的 hIL-2在体外以1ng/mL至25ng/mL的浓度存在。在一些实施例中，用于 检测的hIL-2在体外以1ng/mL至10ng/mL的浓度存在。在一些实施例中， 用于检测的hIL-2在体外以50ng/mL至500ng/mL的浓度存在。在一些实 施例中，用于检测的hIL-2在体外以100ng/mL至500ng/mL的浓度存在。 在一些实施例中，用于检测的hIL-2在体外以250ng/mL至500ng/mL的 浓度存在。在一些实施例中，用于检测的hIL-2在体外以400ng/mL至500 ng/mL的浓度存在。在一些实施例中，用于检测的hIL-2在体外以500ng/mL 至1000ng/mL的浓度存在。在一些实施例中，用于检测的hIL-2在体外以 750ng/mL至1000ng/mL的浓度存在。在一些实施例中，用于检测的hIL-2 在体外以0.8ng/mL的浓度存在。在一些实施例中，用于检测的hIL-2在 体外以500ng/mL的浓度存在。这些量并不意味着是限制性的，并且所述 值之间的增量被特别设想作为本公开的部分。
可替代地，IL-2抗体或其抗原结合部分可用于检测由组织学标本制备 的组织切片中特定抗原的存在。这种原位检测可例如通过将可检测标记的 IL-2抗体或其抗原结合部分应用于组织切片来完成。原位检测可用于确定 特定抗原的存在，并且确定所检查的组织中抗原的分布。原位检测的一般 技术是普通技术人员众所周知的。(参见例如Ponder,"Cell Marking Techniques and Their Application,"in Mammalian Development:APractical Approach,Monk(编辑)，IRL Press，第115-138页(1987)；Coligan等人，同 上)
可通过本领域众所周知的常规方法将可检测标记如酶、荧光化合物、 电子转移剂等等与载体连接。这些标记的载体和由其制备的抗体缀合物可 用于体外免疫测定和原位检测，虽然可通过标记与抗体的直接附着来制备 抗体缀合物。具有多个标记的抗体缀合物的加载可增加免疫测定或组织学 程序的灵敏度，其中仅达到抗体或抗体部分与靶抗原的低程度结合。
组合物
本公开还提供了包含有效量的本文所述的IL-2抗体的药物组合物。本 文还描述了这种组合物的例子以及如何配制。在一些实施例中，组合物包 含一种或多种IL-2抗体。在其它实施例中，IL-2抗体识别IL-2。在其它实 施例中，IL-2抗体是人抗体。在其它实施例中，IL-2抗体是人源化抗体。 在一些实施例中，IL-2抗体包含能够触发所需免疫应答(例如抗体介导的 裂解或ADCC)的恒定区。在其它实施例中，IL-2抗体包含不触发不需要 或不期望的免疫应答(例如抗体介导的裂解或ADCC)的恒定区。在其它 实施例中，IL-2抗体包含抗体的一个或多个CDR(例如一个、两个、三个、 四个、五个，或在一些实施例中，所有六个CDR)。
应理解，组合物可包含超过一种IL-2抗体(例如识别IL-2的不同表 位的IL-2抗体的混合物)。其它示例性组合物包含识别相同表位的超过一 种IL-2抗体、或与IL-2的不同表位结合的不同种类的IL-2抗体。在一些 实施例中，组合物包含识别IL-2的不同变体的IL-2抗体的混合物。
本公开中使用的组合物还可包含以冻干制剂或水溶液形式的药学可 接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington:The Science and practice of Pharmacy第20版，2000,Lippincott Williams and Wilkins，编辑K.E.Hoover)。 可接受的载体、赋形剂或稳定剂在剂量和浓度下对受体无毒，并且可包含 缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫 氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯 铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲 酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间 甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶 或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰 胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物， 包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖醇、 海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质复 合物)；和/或非离子型表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二 醇(PEG)。本文还描述了药学可接受的赋形剂。
IL-2抗体及其组合物还可与作用于增强和/或补充试剂有效性的其它 试剂结合使用。
在某些实施例中，IL-2抗体在施用前与IL-2复合。在某些实施例中， IL-2抗体在施用前不与IL-2复合。
本公开还提供了包含本公开的任何多核苷酸的组合物，包括药物组合 物。在一些实施例中，组合物包含表达载体，所述表达载体包含编码如本 文所述的抗体的多核苷酸。在其它实施例中，组合物包含表达载体，所述 表达载体包含编码本文所述的任何抗体的多核苷酸。在另外其它实施例 中，组合物包含编码SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中所示序列的多核苷 酸中的任一或两者、编码SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中所示序列的多 核苷酸中的任一或两者、编码SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中所示序列的 多核苷酸中的任一或两者、编码SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中所示序列 的多核苷酸中的任一或两者、编码SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中所示 序列的多核苷酸中的任一或两者、编码SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:12 中所示序列的多核苷酸中的任一或两者、编码SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中所示序列的多核苷酸中的任一或两者、编码SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16中所示序列的多核苷酸中的任一或两者、编码SEQ ID NO:SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18中所示序列的多核苷酸中的任一或两者、编码 SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中所示序列的多核苷酸中的任一或两者、 编码SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22中所示序列的多核苷酸中的任一或两 者、编码SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24中所示序列的多核苷酸中的任一 或两者、编码SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26中所示序列的多核苷酸中的 任一或两者、编码SEQ ID NO:27和SEQ IDNO:28中所示序列的多核苷酸 中的任一或两者、编码SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30中所示序列的多核 苷酸中的任一或两者、或者编码SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32中所示序 列的多核苷酸中的任一或两者。在另外其它实施例中，组合物包括包含 SEQ ID NO:36和SEQ IDNO:37中所示序列的多核苷酸中的任一或两者、 包含SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39中所示序列的多核苷酸中的任一或 两者、包含SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41中所示序列的多核苷酸中的 任一或两者、包含SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43中所示序列的多核苷 酸中的任一或两者、包含SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45中所示序列的 多核苷酸中的任一或两者、包含SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47中所示 序列的多核苷酸中的任一或两者、包含SEQ IDNO:48和SEQ ID NO:49 中所示序列的多核苷酸中的任一或两者、包含SEQ ID NO:50和SEQID NO:51中所示序列的多核苷酸中的任一或两者、包含序列SEQ ID NO:52 和SEQ ID NO:53中所示序列的多核苷酸中的任一或两者、包含SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55中所示序列的多核苷酸中的任一或两者、包含 SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57中所示序列的多核苷酸中的任一或两者、 包含SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59中所示序列的多核苷酸中的任一或两者、包含SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61中所示序列的多核苷酸中的 任一或两者、包含SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63中所示序列的多核苷 酸中的任一或两者、包含SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65中所示序列的 多核苷酸中的任一或两者、或者包含SEQ ID NO:66和SEQID NO:67中 所示序列的多核苷酸中的任一或两者。
在另一个方面，多核苷酸可编码本公开的抗体的VH、VL和/或VH 和VL两者。即，组合物包含编码本公开的抗体或其抗原结合部分的单个 多核苷酸或超过一个多核苷酸。
本公开的药物组合物还可以组合疗法施用，例如与其它试剂组合施 用。例如，组合疗法可包括与至少一种其它疗法组合的本公开的IL-2抗体 或其抗原结合部分，其中所述疗法可为手术、免疫疗法或药物疗法。
本公开的药物化合物可包括一种或多种药学可接受的盐。这种盐的例 子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括源自无毒无机酸如盐酸、硝酸、 磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等等，以及无毒有机酸如脂族一元和 二元羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺 酸等等的那些。碱加成盐包括源自碱土金属如钠、钾、镁、钙等等，以及 无毒有机胺如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、 二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等等的那些。
本公开的药物组合物还可包含药学可接受的抗氧化剂。药学可接受的 抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、 硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等等；(2)油溶性抗氧化剂，例如棕榈酸 抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、 α-生育酚等等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山 梨醇、酒石酸、磷酸等等。
可用于本公开的药物组合物中的合适水性和非水性载体的例子包括 水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)及其合适的混合 物、植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。例如，通过使用包衣 材料如卵磷脂，通过在分散体的情况下维持所需粒度，并且通过使用表面 活性剂，可维持适当的流动性。
这些组合物还可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。 可通过灭菌程序和通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸 酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等等)两者来确保防止微生物的存在。还可能 期望将等渗剂例如糖、氯化钠等等包括在组合物内。另外，可通过包括延 迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来达到可注射药物形式的延长吸收。
药物组合物通常在制造和贮存条件下必须是无菌的和稳定的。该组合 物可配制为适合于高药物浓度的溶液、微乳剂、脂质体或其它有序结构。 载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇 等等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。例如，通过使用包衣如卵磷脂， 通过在分散体的情况下维持所需粒度，并且通过使用表面活性剂，可维持 适当的流动性。在许多情况下，在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇 如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠将是合适的。可通过在组合物中包括延迟吸 收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶来达到可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可通过将以所需量的活性化合物与上文列举的成分 之一或组合(根据需要)一起掺入适当溶剂中，随后无菌微量过滤来制备。
一般地，通过将活性化合物掺入无菌媒介物内来制备分散体，所述无 菌媒介物含有基础分散介质和来自上文列举的那些的所需其它成分。在用 于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥 和冷冻干燥(冻干)，这从其先前的无菌过滤溶液产生活性成分加任何另 外的所需成分的粉末。
本公开的药物组合物可以适合于眼部施用的制剂制备、包装或销售。 例如，这样的制剂可为滴眼剂的形式，包括例如活性成分在水性或油性液 体载体中的0.1％-1.0％(w/w)溶液或悬浮液。这样的滴剂还可包含本文所述 的缓冲试剂、盐或者一种或多种其它成分。有用的其它可眼部施用制剂包 括含有以微晶形式或在脂质体制剂中的活性成分的那些。
如本文使用的，“另外的成分”包括但不限于下述中的一种或多种：赋 形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；造粒剂和崩解剂；结合剂；润 滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理可降解组合物如明胶；水 性媒介物和溶剂；油性媒介物和溶剂；悬浮剂；分散剂或润湿剂；乳化剂， 缓和剂；缓冲剂；盐；增稠剂；填料；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；和药学可接受的聚合或疏水材料。可包括在本公开的药物 组合物中的其它“另外的成分”是本领域已知的，并且在例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Genaro，编辑，Mack Publishing Co.,Easton,PA (1985) 中描述，所述参考文献以引用的方式并入本文。
在一个实施例中，IL-2抗体或其抗原结合部分以静脉内制剂作为无菌 水溶液施用，所述无菌水溶液包含5mg/mL，或在一些实施例中，约10 mg/mL，或在一些实施例中，约15mg/mL，或在一些实施例中，约20mg/mL 的抗体与乙酸钠、聚山梨醇酯80和氯化钠，在范围为约5至6的pH下。 在一些实施例中，静脉内制剂是含有5或10mg/mL抗体，以及20mM乙 酸钠、0.2mg/mL聚山梨醇酯80和140mM氯化钠在pH 5.5下的无菌水溶 液。此外，在许多其它化合物中，包含抗体或其抗原结合部分的溶液可包 含组氨酸、甘露醇、蔗糖、海藻糖、甘氨酸、聚(乙)二醇、EDTA、甲硫氨 酸及其任何组合，以及相关领域已知的许多其它化合物。
在一个实施例中，本公开的药物组合物包含下述组分：100mg本公开 的IL-2抗体或抗原结合部分、10mM组氨酸、5％蔗糖和0.01％聚山梨醇 酯80，在pH 5.8下。该组合物可作为冻干粉末提供。当粉末以全体积重 构时，组合物保持相同的配方。可替代地，粉末可以一半体积重构，在这 种情况下，组合物包含100mg本公开的IL-2抗体或其抗原结合部分、20mM组氨酸、10％蔗糖和0.02％聚山梨醇酯80，在pH 5.8下。
在一个实施例中，剂量的部分通过静脉内推注施用，并且剩余部分通 过抗体制剂的输注施用。例如，0.01mg/kg IL-2抗体或其抗原结合部分的 静脉内注射可作为推注给予，并且抗体剂量的剩余部分可通过静脉内注射 施用。IL-2抗体或其抗原结合部分的预定剂量可例如经过一个半小时至2 小时至5小时的时期施用。
关于治疗剂，当试剂为例如小分子时，它可以生理学可接受的酯或盐 的形式，例如与生理学可接受的阳离子或阴离子组合存在于药物组合物 中，如本领域众所周知的。
本文所述药物组合物的制剂可通过药理学领域已知或以后开发的任 何方法制备。一般而言，这样的制备方法包括以下步骤：使活性成分与载 体或一种或多种其它辅助成分结合，然后如果需要或期望的话，将产物成 形或包装成所需单剂量或多剂量单元。
在一个实施例中，本公开的组合物是基本上不含内毒素和/或相关致热 原物质的无热原制剂。内毒素包括限制在微生物内部的毒素，并且当微生 物分解或死亡时被释放。致热原物质还包括来自细菌外膜和其它微生物的 发热诱导热稳定物质(糖蛋白)。如果施用于人，则这两种物质均可引起 发烧、低血压和休克。由于潜在的有害效应，从静脉内施用的药物溶液中 去除甚至少量的内毒素是有利的。美国食品和药物管理局("FDA")已对于静脉内药物应用设定了在单个一小时时期内5个内毒素单位(EU)/剂量/千克 体重的上限(The United States Pharmacopeial Convention,Pharmacopeial Forum 26(1):223(2000))。当治疗性蛋白质以数百或数千毫克/千克体重的量 施用时，去除甚至痕量的内毒素也是有利的。在一个实施例中，组合物中 的内毒素和热原水平小于10EU/mg、或小于5EU/mg、或小于1EU/mg、或 小于0.1EU/mg、或小于0.01EU/mg、或小于0.001EU/mg。在另一个实施例中，组合物中的内毒素和热原水平小于约10EU/mg、或小于约5EU/mg、 或小于约1EU/mg、或小于约0.1EU/mg、或小于约0.01EU/mg、或小于约 0.001EU/mg。
在一个实施例中，本公开包括施用组合物，其中所述施用是经口、肠 胃外、肌内、鼻内、阴道、直肠、舌、舌下、颊、颊内、静脉内、皮肤、 皮下或透皮。
在另一个实施例中，本公开还包括将组合物与其它疗法例如手术、化 学疗法、激素疗法、生物疗法、免疫疗法或放射疗法组合施用。
给药/施用
为了制备包括本公开的IL-2抗体或其抗原结合部分的药物或无菌组 合物，将抗体与药学可接受的载体或赋形剂混合。治疗剂和诊断剂的制剂 可通过以例如冻干粉末、浆料、水溶液、洗剂或悬浮液形式与生理学可接 受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备(参见例如Hardman等人(2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis ofTherapeutics, McGraw-Hill,New York,N.Y.；Gennaro(2000)Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,N.Y.；Avis等人(编辑)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications, MarcelDekker,NY；Lieberman等人(编辑)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,MarcelDekker,NY；Lieberman等人(编辑)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms:DisperseSystems,Marcel Dekker,NY；Weiner and Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity andSafety,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.)。
选择用于治疗的施用方案取决于几种因素，包括实体的血清或组织更 新率、症状水平、实体的免疫原性和靶细胞在生物基质中的可接近性。在 某些实施例中，施用方案使与副作用的可接受水平一致的递送至患者的治 疗量达到最大。相应地，所递送的生物制剂的量部分取决于特定的实体和 所治疗状况的严重程度。选择适当剂量的抗体、细胞因子和小分子的指导 是可获得的(参见例如Wawrzynczak,1996,Antibody Therapy,BiosScientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(编辑)，1991,Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,N.Y.；Bach(编辑)，1993,Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,MarcelDekker,New York,N.Y.；Baert等人，2003,New Engl.J.Med.348:601-608； Milgrom等人，1999,New Engl.J.Med.341:1966-1973；Slamon等人，2001, New Engl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz等人，2000,New Engl.J.Med. 342:613-619；Ghosh等人，2003,NewEngl.J.Med.348:24-32；Lipsky等人， 2000,New Engl.J.Med.343:1594-1602)。
适当剂量的确定由临床医生，例如使用本领域已知或怀疑影响治疗或 预测为影响治疗的参数或因素来进行。一般地，剂量以略微低于最佳剂量 的量开始，并且它其后以小增量增加，直到达到相对于任何负面副作用的 所需或最佳效应。重要的诊断措施包括例如所产生的炎症或炎性细胞因子 水平的症状的那些。
本公开的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可变化，以便获得有 效实现对于特定患者、组合物和施用模式的所需治疗应答，而对患者无毒 的活性成分的量。所选择的剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括 采用的本公开的特定组合物的活性、或其酯、盐或酰胺，施用途径，施用 时间，采用的特定化合物的排泄速率，治疗持续时间，与采用的特定组合 物组合使用的其它药物、化合物和/或材料，待治疗患者的年龄、性别、重 量、状况、一般健康和既往病史，以及医学领域众所周知的类似因素。
包含本公开的IL-2抗体或其抗原结合部分的组合物可通过连续输注 提供，或以例如一天、一周或每周1-7次的间隔的剂量提供。可通过静脉 内、皮下、局部、经口、经鼻、直肠、肌内、大脑内或通过吸入来提供剂 量。特定剂量方案是涉及避免显著不期望的副作用的最大剂量或剂量频率 的方案。总周剂量可为至少0.05μg/kg体重、至少0.2μg/kg、至少0.5μg/kg、 至少1μg/kg、至少10μg/kg、至少100μg/kg、至少0.2mg/kg、至少1.0mg/kg、 至少2.0mg/kg、至少10mg/kg、至少15mg/kg、至少20mg/kg、至少25mg/kg 或至少50mg/kg(参见例如Yang等人，2003,New Engl.J.Med.349:427-434； Herold等人，2002,NewEngl.J.Med.346:1692-1698；Liu等人，1999,J.Neurol. Neurosurg.Psych.67:451-456；Portielji等人，2003,Cancer.Immunol. Immunother.52:133-144)。剂量可为至少15μg、至少20μg、至少25μg、 至少30μg、至少35μg、至少40μg、至少45μg、至少50μg、至少55μg、 至少60μg、至少65μg、至少70μg、至少75μg、至少80μg、至少85μg、 至少90μg、至少95μg或至少100μg。施用于受试者的剂量可为至少1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次或更多次。
对于本公开的IL-2抗体或其抗原结合部分，施用于患者的剂量可为 0.0001mg/kg至100mg/kg患者体重。剂量可为0.0001mg/kg至20mg/kg、 0.0001mg/kg至10mg/kg、0.0001mg/kg至5mg/kg、0.0001至2mg/kg、0.0001 至1mg/kg、0.0001mg/kg至0.75mg/kg、0.0001mg/kg至0.5mg/kg、0.0001 mg/kg至0.25mg/kg、0.0001至0.15mg/kg、0.0001至0.10mg/kg、0.001至 0.5mg/kg、0.01至0.25mg/kg或0.01至0.10mg/kg的患者体重。
IL-2抗体或其抗原结合部分的剂量可使用以千克(kg)计的患者体重乘 以以mg/kg施用的剂量来计算。本公开的抗体的剂量可为150μg/kg或更 少、125μg/kg或更少、100μg/kg或更少、95μg/kg或更少、90μg/kg或更少、 85μg/kg或更少、80μg/kg或更少、75μg/kg或更少、70μg/kg或更少、65μg/kg 或更少、60μg/kg或更少、55μg/kg或更少、50μg/kg或更少、45μg/kg或更 少、40μg/kg或更少、35μg/kg或更少、30μg/kg或更少、25μg/kg或更少、 20μg/kg或更少、15μg/kg或更少、10μg/kg或更少、5μg/kg或更少、2.5μg/kg 或更少、2μg/kg或更少、1.5μg/kg或更少、1μg/kg或更少、0.5μg/kg或更 少、或者0.1μg/kg或更少的患者体重。
本公开的IL-2抗体或其抗原结合部分的单位剂量可为0.1mg至200 mg、0.1mg至175mg、0.1mg至150mg、0.1mg至125mg、0.1mg至100mg、 0.1mg至75mg、0.1mg至50mg、0.1mg至30mg、0.1mg至20mg、0.1mg 至15mg、0.1mg至12mg、0.1mg至10mg、0.1mg至8mg、0.1mg至7mg、0.1mg至5mg、0.1至2.5mg、0.25mg至20mg、0.25至15mg、0.25至12 mg、0.25至10mg、0.25至8mg、0.25mg至7m g、0.25mg至5mg、0.5mg 至2.5mg、1mg至20mg、1mg至15mg、1mg至12mg、1mg至10mg、 1mg至8mg、1mg至7mg、1mg至5mg、或1mg至2.5mg。
本公开的IL-2抗体或其抗原结合部分的剂量可在受试者中达到至少 0.1μg/mL、至少0.5μg/mL、至少1μg/mL、至少2μg/mL、至少5μg/mL、 至少6μg/mL、至少10μg/mL、至少15μg/mL、至少20μg/mL、至少25μg/mL、 至少50μg/mL、至少100μg/mL、至少125μg/mL、至少150μg/mL、至少 175μg/mL、至少200μg/mL、至少225μg/mL、至少250μg/mL、至少275 μg/mL、至少300μg/mL、至少325μg/mL、至少350μg/mL、至少375μg/mL 或至少400μg/mL的血清滴度。可替代地，本公开的抗体的剂量可在受试 者中达到至少0.1μg/mL、至少0.5μg/mL、至少1μg/mL、至少2μg/mL、至 少5μg/mL、至少6μg/mL、至少10μg/mL、至少15μg/mL、至少20μg/mL、 至少25μg/mL、至少50μg/mL、至少100μg/mL、至少125μg/mL、至少150 μg/mL、至少175μg/mL、至少200μg/mL、至少225μg/mL、至少250μg/mL、 至少275μg/mL、至少300μg/mL、至少325μg/mL、至少350μg/mL、至少 375μg/mL或至少400μg/mL的血清滴度。
可重复本公开的IL-2抗体或其抗原结合部分的剂量，并且施用可分 开至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75 天、3个月或至少6个月。
关于特定患者的有效量可取决于因素例如待治疗的状况、患者的总体 健康、施用方法途径和剂量、以及副作用的严重程度等而变化(参见例如 Maynard等人，1996,AHandbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press,Boca Raton,FIa.；Dent,2001,Good Laboratory and Good Clinical Practice,Urch Publ,London,UK)。
施用途径可通过例如局部或皮肤应用，通过静脉内、腹膜内、脑内、 肌内、眼内、动脉内、脑脊髓内、损伤内注射或输注，或者通过持续释放 系统或植入物(参见例如，Sidman等人，1983,Biopolymers 22:547-556；Langer 等人，1981,J.Biomed.Mater.Res.15:167-277；Langer,1982,Chem.Tech. 12:98-105；Epstein等人，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688-3692； Hwang等人，1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030-4034；美国专利号6,350466和6,316,024)。必要时，组合物还可包括增溶剂和局部麻醉剂如 利多卡因，以缓解在注射部位处的疼痛。另外，也可采用肺部施用，例如 通过使用吸入器或喷雾器，并且用气溶胶化剂配制。参见例如美国专利号 6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540 和4,880,078；以及PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、 WO 98/31346和WO 99/66903，所述专利各自以引用的方式全文并入本文。在一个实施例中，使用Alkermes AIRTM肺部药物递送技术(Alkermes,Inc., Cambridge,Mass.)施用本公开的IL-2抗体或其抗原结合部分或组合物。
本公开的组合物还可使用本领域已知的各种方法中的一种或多种，经 由一种或多种施用途径施用。如本领域技术人员应了解的，施用途径和/ 或模式取决于所需结果而变化。对于本公开的抗体所选择的施用途径包括 静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其它肠胃外施用途径，例如 通过注射或输注。肠胃外施用可表示除肠内和局部施用外的施用模式，通 常通过注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、 心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、 脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。可替代地，可经由非肠胃外途径， 例如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或 局部施用本公开的组合物。
如果本公开的IL-2抗体或其抗原结合部分以控制释放或持续释放系 统施用，则泵可用于实现控制释放或持续释放(参见Langer，同上；Sefton, 1987,CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:20；Buchwald等人，1980,Surgery 88:501；Saudek等人，1989,N.Engl.J.Med.321:514)。
聚合物材料可用于实现本公开的疗法的控制释放或持续释放(参见例 如MedicalApplications of Controlled Release,Langer和Wise(编辑)，CRC Pres.,Boca Raton,FIa.(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design andPerformance,Smolen和Ball(编辑)，Wiley,New York(1984)； Ranger和Peppas,1983,J.,Macromol.ScL Rev.Macromol.Chem.23:61；还参 见Levy等人，1985,Science 11 225:190；During等人，19Z9,Ann.Neurol. 25:351；Howard等人，1989,J.Neurosurg.71:105)；美国专利号5,679,377； 美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国 专利号5,128,326；PCT公开号WO 99/15154；以及PCT公开号WO 99/20253。 用于持续释放制剂中的聚合物的例子包括但不限于聚(2-羟乙基甲基丙烯 酸酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲 基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚乙烯醇、 聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚丙交酯(PLA)、聚(乙交酯丙交酯)(PLGA)和聚 原酸酯。在一个实施例中，用于持续释放制剂中的聚合物是惰性的、不含 可浸出杂质、贮存时稳定、无菌且可生物降解的。可将控制释放或持续释 放系统放置在预防或治疗靶附近，因此仅需要全身剂量的一小部分(参见 例如Goodson,in MedicalApplications of Controlled Release，同上，第2卷， 第115-138页(1984))。
控制释放系统在通过Langer,1990,Science 249:1527-1533的综述中进 行讨论。本领域技术人员已知的任何技术都可用于生产包含本公开的一种 或多种抗体或其缀合物的持续释放制剂。参见例如美国专利号4,526,938， 国际专利公开号WO 91/05548，WO 96/20698，Ning等人，1996,"Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon CancerXenograft Using a Sustained-Release Gel,"Radiotherapy and Oncology 59:179-189,Song等人， 1995,"Antibody Mediated Lung Targeting of Long-CirculatingEmulsions,"PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 50:372-397,Cleek et ah,1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody forCardiovascular Application,"Pro.Ml.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854，以及Lam 等人，1997,"Microencapsulation of Recombinant Humanized MonoclonalAntibody for Local Delivery,"Proc.Ml.Symp.Control Rel.Bioact.Mater. 24:759-160，所述参考文献各自以引用的方式全文并入本文。
如果局部施用本公开的IL-2抗体或其抗原结合部分，则它可以软膏、 乳膏、透皮贴剂、洗剂、凝胶、洗发剂、喷雾剂、气溶胶、溶液、乳剂形 式或本领域技术人员众所周知的其它形式进行配制。参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences and Introductionto Pharmaceutical Dosage Forms，第 19版，Mack Pub.Co.,Easton,Pa.(1995)。对于不可喷雾的局部剂型，通常 采用粘稠至半固体或固体形式，其包含载体或者与局部应用相容的一种或 多种赋形剂，并且具有在一些情况下，大于水的动态粘度。合适的制剂包 括但不限于溶液、悬浮液、乳剂、乳膏、软膏、粉末、搽剂、药膏等等， 需要时，将其灭菌或与辅助试剂(例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲剂 或盐)混合用于影响各种性质，例如渗透压。其它合适的局部剂型包括可 喷雾的气溶胶制剂，其中在一些情况下，与固体或液体惰性载体组合的活 性成分包装在具有加压挥发物(例如气态推进剂，例如氟利昂)的混合物 或挤压瓶中。需要时，也可将湿润剂或保湿剂加入药物组合物和剂型中。 这种附加成分的例子是本领域众所周知的。
如果鼻内施用包含IL-2抗体或其抗原结合部分的组合物，则它可以气 溶胶形式、喷雾剂、雾剂或以滴剂的形式配制。特别地，根据本发明使用 的预防剂或治疗剂可以来自加压包或喷雾器的气溶胶喷雾呈现形式方便 地递送，其中使用合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯 四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体)。在加压气溶胶的情况下，剂量 单位可通过提供阀来递送计量的量进行确定。用于吸入器或吹入器的胶囊 和药筒(由例如明胶组成)可配制为含有化合物和合适的粉末基质如乳糖 或淀粉的粉末混合物。
用于与第二治疗剂(例如细胞因子、类固醇、化学治疗剂、抗生素或 辐射)共施用或用第二治疗剂治疗的方法是本领域众所周知的(参见例如 Hardman等人(编辑)(2001)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill,New York,N.Y.；Poole and Peterson(编 辑)(2001)Pharmacotherapeutics forAdvanced Practice:A Practical Approach, Lippincott,Williams and Wilkins,Phila.,Pa.；Chabner and Longo(编辑)(2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams and Wilkins,Phila., Pa.)。有效量的治疗剂可使症状减轻至少10百分比；至少20百分比；至 少约30百分比；至少40百分比，或至少50百分比。
可与本公开的IL-2抗体或抗原结合部分组合施用的另外的疗法(例如 预防剂或治疗剂)可与本公开的抗体相隔少于5分钟、相隔少于30分钟、 相隔1小时、相隔约1小时、相隔约1至约2小时、相隔约2小时至约3 小时、相隔约3小时至约4小时、相隔约4小时至约5小时、相隔约5小 时至约6小时、相隔约6小时至约7小时、相隔约7小时至约8小时、相 隔约8小时至约9小时、相隔约9小时至约10小时、相隔约10小时至约 11小时、相隔约11小时至约12小时、相隔约12小时至18小时、相隔 18小时至24小时、相隔24小时至36小时、相隔36小时至48小时、相 隔48小时至52小时、相隔52小时至60小时、相隔60小时至72小时、 相隔72小时至84小时、84小时至96小时、或相隔96小时至120小时。 两种或更多种疗法可在相同患者就诊内施用。
可循环施用本公开的IL-2抗体或其抗原结合部分和其它疗法。循环 疗法涉及将第一疗法(例如第一预防剂或治疗剂)施用一段时间，随后施 用第二疗法(例如第二预防剂或治疗剂)一段时间，任选地随后施用第三 疗法(例如预防剂或治疗剂)一段时间等等，并且重复该序贯施用即循环， 以便减少对疗法之一的耐性发展，避免或减少疗法之一的副作用，和/或改 善疗法的功效。
在一个实施例中，本公开的IL-2抗体可与用于治疗自身免疫疾病和 病症的组合物共施用，所述组合物包括但不限于阿霉素、硫唑嘌呤、白消 安、环磷酰胺、环孢菌素A、Cytoxan、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、 霉酚酸酯、6-巯基嘌呤、皮质类固醇、非类固醇抗炎药、西罗莫司(雷帕 霉素)和他克莫司(FK-506)。在替代实施例中，免疫调节剂或免疫抑制剂 是选自以下的抗体：莫罗单抗-CD3、阿仑珠单抗
Figure BDA0003717294580000841
巴利昔单抗、 达克珠单抗、莫罗单抗
Figure BDA0003717294580000842
利妥昔单抗、抗胸腺细胞球蛋白和IVIg 及其他，这是本领域技术人员已知的。
在一个实施例中，本公开的IL-2抗体可与用于治疗糖尿病的组合物共 施用，所述组合物包括但不限于双胍类(例如丁双胍、二甲双胍和苯乙双 胍)、激素及其类似物(淀粉不溶素、胰岛素、门冬胰岛素、地特胰岛素、 甘精胰岛素、谷赖胰岛素、赖脯胰岛素、利拉鲁肽和普兰林肽)、磺酰脲 类衍生物(乙酰己脲、氨磺丁脲、氯磺丙脲、格列波脲、格列齐特、格列 美脲、格列吡嗪、格列喹酮、格列派特、格列本脲、格列噻唑、格列丁唑、 格列己脲、格列嘧啶、妥拉磺脲、甲苯磺丁脲和甲磺环已脲)、噻唑烷二 酮类(吡格列酮、罗格列酮和曲格列酮)、阿卡波糖、艾塞那肽、米格列 醇、米格列奈、莫格列他、那格列奈、瑞格列奈、西格列汀、替格列扎、 维达列汀和伏格列波糖。
在某些实施例中，本公开的IL-2抗体或其抗原结合部分可配制为以确 保在体内的正确分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高亲水性化合物。 为确保本公开的治疗性化合物穿过BBB(如果需要的话)，它们可为例如 在脂质体中配制。对于制造脂质体的方法，参见例如美国专利4,522,811； 5,374,548；和5,399,331。脂质体可包含一个或多个部分，其选择性转运到 特定细胞或器官内，因此增强靶向药物递送(参见例如V.V.Ranade,1989,J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如 美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，Biochem.Biophys.Res. Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等人，1995,FEBS Lett.357:140； M.Owais等人，1995,Antimicrob.AgentsChemother.39:180)；表面活性剂 蛋白A受体(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；pl20(Schreier 等人(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen, 1994,FEBS Lett.346:123；Killion；Fidler,1994；Immunomethods 4:273。
本公开提供了用于向有需要的受试者施用单独或与其它疗法组合的 药物组合物的方案，所述药物组合物包含本公开的IL-2抗体或其抗原结合 部分。本公开的组合疗法的疗法(例如预防剂或治疗剂)可同时或序贯施 用于受试者。本公开的组合疗法的疗法(例如预防剂或治疗剂)也可循环 施用。循环疗法涉及将第一疗法(例如第一预防剂或治疗剂)施用一段时 间，随后施用第二疗法(例如第二预防剂或治疗剂)一段时间，并且重复 该序贯施用即循环，以便减少对疗法(例如试剂)之一的耐性发展，避免 或减少疗法(例如试剂)之一的副作用，和/或改善疗法的功效。
本公开的组合疗法的疗法(例如预防剂或治疗剂)可同时施用于受试 者。术语“同时”并不限于确切地在同一时间施用治疗剂(例如预防剂或治 疗剂)，而是意指包含本公开的IL-2抗体或其抗原结合部分的药物组合物 以一定顺序且在一定时间间隔内施用于受试者，使得本公开的抗体或其缀 合物可与其它疗法一起发挥作用，以提供比它们以其它方式施用时增加的 益处。例如，每种疗法可在同一时间或在不同时间点以任何次序序贯施用于受试者；然而，如果不是在同一时间施用，则它们应该在时间上足够接 近地施用，以便提供所需治疗或预防效应。每种疗法可分别以任何适当的 形式和通过任何合适的途径施用于受试者。在各种实施例中，疗法(例如 预防剂或治疗剂)少于15分钟、少于30分钟、相隔少于1小时、相隔约 1小时、相隔约1小时至约2小时、相隔约2小时至约3小时、相隔约3 小时至约4小时、相隔约4小时至约5小时、相隔约5小时至约6小时、 相隔约6小时至约7小时、相隔约7小时至约8小时、相隔约8小时至约 9小时、相隔约9小时至约10小时、相隔约10小时至约11小时、相隔约 11小时至约12小时、相隔24小时、相隔48小时、相隔72小时或相隔1 周施用于受试者。在其它实施例中，在相同患者就诊内施用两种或更多种 疗法(例如预防剂或治疗剂)。
组合疗法的预防剂或治疗剂可在相同药物组合物中施用于受试者。可 替代地，组合疗法的预防剂或治疗剂可在分开的药物组合物中同时施用于 受试者。预防剂或治疗剂可通过相同或不同的施用途径施用于受试者。
试剂盒
本公开还提供了包含本文所述的任何抗体或所有抗体的试剂盒。本公 开的试剂盒包括包含本文描述的IL-2抗体的一个或多个容器和根据本文 所述的本公开的任何方法的使用说明书。一般地，这些说明书包括用于上 述治疗性处理的抗体施用的描述。在一些实施例中，提供用于产生单剂量 施用单元的试剂盒。在某些实施例中，试剂盒可含有具有干燥蛋白质的第 一容器和具有水性制剂的第二容器两者。在某些实施例中，包括包含涂药器，例如单室和多室预填充注射器(例如液体注射器和冻干剂注射器 (lyosyringe))的试剂盒。
有关IL-2抗体使用的说明书一般包括用于预期治疗的剂量、施用方案 和施用途径的信息。容器可为单位剂量、散装包装(例如多剂量包装)或 亚单位剂量。在本公开的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装插页 (例如包括在试剂盒中的纸张)上的书写说明，但机器可读指令(例如在 磁性或光学存储盘上承载的说明书)也是可接受的。
本公开的试剂盒处于合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、 瓶、罐、柔性包装(例如密封的聚脂薄膜或塑料袋)等等。还考虑了与特 定装置(例如吸入器、鼻施用装置(例如雾化器))或输注装置(例如微 型泵)组合使用的包装。试剂盒可具有无菌访问端口(例如容器可为静脉 内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。容器还可具有无菌 访问端口(例如容器可为静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子 的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本公开的IL-2抗体。容器还可包 含第二药物活性剂。
试剂盒可任选地提供了另外的组分，例如缓冲液和解释性信息。通常， 试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页。
本公开还提供了包含本文所述的任何抗体或所有抗体的诊断试剂盒。 诊断试剂盒可用于例如检测样品中IL-2的存在。在一些实施例中，诊断试 剂盒可用于鉴定患有潜伏疾病、病症或状况的个体，所述潜伏疾病、病症 或状况可使其处于发展IL-2介导的疾病、病症或状况或者IL-2缺陷疾病、 病症或状况的危险中。在一些实施例中，诊断试剂盒可用于检测疑似患有 IL-2介导的疾病或IL-2缺陷疾病、病症或状况的个体中IL-2的存在和/或水平。
本公开的诊断试剂盒包括包含本文描述的IL-2抗体的一个或多个容 器和根据本文所述的本公开的任何方法的使用说明书。一般地，这些说明 书包括IL-2抗体检测个体中IL-2的存在的用途的描述，所述个体处于患 有IL-2介导的疾病或者IL-2缺陷疾病、病症或状况的危险中，或者疑似 患有IL-2介导的疾病或者IL-2缺陷疾病、病症或状况。在一些实施例中， 示例性诊断试剂盒可配置为含有试剂，例如IL-2抗体、阴性对照样品、阳 性对照样品和使用该试剂盒的说明书。
等价方案
前述描述和下述实例详细描述了本公开的某些具体实施例，并且描述 了由发明人考虑的最佳模式。然而，应了解，无论前述如何详细地在文本 中出现，本公开都可以多种方式实践，并且本公开应该根据所附权利要求 及其任何等价物来解释。
尽管已参考各种应用、方法、试剂盒和组合物描述了所公开的教导， 但应了解，可做出各种改变和修改而不背离本文的教导和下文请求保护的 公开内容。提供下述实例以更好地说明所公开的教导，并且不预期限制本 文呈现的教导的范围。尽管已根据这些示例性实施例描述了本教导，但技 术人员将容易理解，这些示例性实施例的众多变化和修改没有过度实验是 可能的。所有这些变化和修改都在本教导的范围内。
本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等等， 以及其中引用的参考文献，在它们尚未被引用的范围内，在此以引用的方 式全文并入。在引入的文献和类似材料中的一个或多个与本专利申请不同 或相矛盾的情况下，包括但不限于定义的术语、术语使用、所描述的技术 等等，以本专利申请为准。
示例性实施例
通过参考下述实验实例进一步详细描述本公开。提供这些实例仅用于 说明的目的，并不预期是限制性的，除非另有说明。因此，本公开决不应 被解释为限于下述实例，而是应解释为涵盖由于本文提供的教导而变得显 而易见的任何和所有变化。
实例
实例1.IL-2抗体结合动力学和亲和力
使用Biacore T200仪器(GE Healthcare,Piscataway,NJ)，通过表面等离 子共振测定抗体对于IL-2的亲和力。根据制造商指导(GE Healthcare)，通 过使用Biacore HumanAntibody Capture Kit制备的抗人IgG，在CM5传感 器芯片上捕获抗IL-2IgG。根据制造商指导(GE Healthcare)，在使用Biacore Mouse Antibody Capture Kit制备的抗小鼠IgG捕获表面上捕获小鼠抗人 IL-2克隆5344(克隆5344.111，BD Biosciences)。在0.01M HEPESpH 7.4、 0.15M NaCl和0.005％v/v表面活性剂P20(HBS-P)缓冲液中，在25℃下使 用30μL/分钟的流速执行实验。在每次循环后，芯片表面用3M MgCl2再 生且捕获新抗体。将重组IL-2(Humanzyme,Chicago,IL)注射到表面上3分 钟，并且将结合再监测20分钟。使用BiacoreT200 Evaluation软件分析数 据，来自仅固定捕获抗体的邻近对照流动池的信号进行本底扣除，连同每 种抗体的仅缓冲液注射。1:1兰米尔结合模型用于拟合所有结合曲线。
结果
测试的人抗体以范围为536pM至13.4nM的亲和力结合IL-2(表3)。 与比较物克隆16C3和d1C7相比，就其相对于d1C7/IL-2复合物抑制IL-2Rβ 结合且降低与IL-2Rα的结合的能力鉴定的抗体具有较弱的关于IL-2的亲 和力。发现5344抗体具有超过Biacore仪器的检测极限的非常稳定的解离 速率，计算的亲和力假定为50pM或更低，与所测试的人抗体克隆相比， 具有明显更慢的解离速率。5344明显更慢的解离速率可促成抗体不具有由 本专利申请下文(实例5)描述的其它hIL-2抗体显示出的所需Treg保留 性质。
表3
克隆 ka(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) kd(s<sup>-1</sup>) K<sub>D</sub>(M)
F4.7.062 3.77E+06 5.80E-03 1.54E-09
F4.7.6 2.44E+06 7.38E-03 3.03E-09
F5.1.11 2.21E+06 6.88E-03 3.12E-09
F4.7.8 2.31E+05 3.10E-03 1.34E-08
F5.1.9 2.48E+05 3.28E-03 1.33E-08
16C3 9.89E+05 6.19E-04 6.37E-10
d1C7 1.13E+06 6.07E-04 5.36E-10
5344 1.02E+06 <＝5.00E-05* <＝5.00E-11
*解离速率超出了仪器的规格，已假定5.0E-05或更低的解离速率
用抗体F5.1.11、d1C7、13A10和16C3的mIL-2和hIL-2结合研究指 示F5.1.11和d1C7不结合mIL-2，并且13A10和16C3结合mIL-2，与hIL-2 相比具有减少的亲和力(数据未显示)。
实例2.IL-2/抗体复合物受体结合
使用Biacore T200仪器(GE Healthcare,Piscataway,NJ)评价抗体修饰 IL-2与IL-2受体IL-2Rα和IL-2Rβ结合的能力。将重组IL-2α和IL-2Rβ 蛋白质用生物素标记，并且在Biacore Streptavidin芯片(GE Healthcare)上捕 获。使用在10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl和0.005％v/v表面活性 剂P20缓冲液中的10μL/分钟流速，在25℃下执行实验。将IL-2(333nM) 与IgG(1000nM)一起预温育至少20分钟。将IL-2/抗体复合物注射到受体偶联的芯片表面上60秒，并允许解离20分钟。使用相邻的对照流动单元 和仅缓冲液注射将数据进行本底扣除。应答报告为在60秒后与IL-2α和 IL-2Rβ的结合，作为与IL-2复合的两个代表性克隆d1C7和16C3分别与 IL-2Rα和IL-2Rβ的结合百分比。
结果
克隆16C3/IL-2复合物结合IL-2Rβ而不是IL-2Rα，而d1C7/IL-2复合 物结合IL-2Rα而不是IL-2Rβ。这两种抗体/IL-2复合物用作代表性克隆， 以标准化IL-2Rα和IL-2Rβ结合。测试的抗体/IL-2复合物各自报告为其与 受体各自的相对结合。克隆4.7.062、F5.1.11、F4.7.6、F4.7.8、F5.1.9和商 购可得的5344(克隆5344.111，BD Biosciences)都抑制IL-2与IL-2Rβ 结合，类似于d1C7/IL-2复合物，并且与d1C7/IL-2复合物相比显示与IL-2Rα减少的结合。因此，鉴定了这些抗体阻断IL-2与IL-2Rβ结合并且 降低与IL-2Rα结合的速率的能力(图1)。
实例3.关于亲和力成熟克隆的抗体/IL-2亲和力和受体结合
亲和力成熟的F5.1.11抗体/IL-2复合物的结合动力学和受体结合概况 使用表面等离子共振进行测量，如对于亲本抗体描述的(实例1)。
结果
亲和力成熟活动将克隆F5.1.11对于IL-2的表观结合亲和力增加至多 16倍。三种亲和力成熟的变体F5.1.11.02、F5.1.11.04和F5.1.11.08测量为 分别对于IL-2具有114、624和205pM的结合亲和力。与IL-2Rα和IL-2Rβ 结合的抗体/IL-2复合物的表征发现，与亲本分子相比，较高亲和力变体的 受体结合概况保持不变。与克隆d1C7/IL-2复合物相比，亲本和亲和力成 熟的克隆两者均显示与IL-2Rβ结合的抗体/IL-2复合物的完全抑制，与 IL-2Rα的结合的降低。经过实验过程观察到亲本F5.1.11/IL-2与IL-2Rα 结合中的一些变化，这由图上的虚线表示，以描述潜在的范围。三种亲和 力较高的变体F5.1.11.02、F5.1.11.04和F5.1.11.08都落入此范围内(表4 和图2)。
表4
Figure BDA0003717294580000901
Figure BDA0003717294580000911
实例4.IL-2:抗-IL-2mAb处理后Treg的表型
IL-2-抗IL-2复合物处理
通过ficoll从健康供体中分离PBMC，并且用12.5ng/mL抗CD3和 25ng/mL抗CD28活化过夜。在过夜温育后，收获细胞并且用PBS充分洗 涤，并且以30x106个细胞的浓度重悬浮于200μL PBS中。PBMC在NSG 受体中i.v.注射。用人PBMC注射的NSG小鼠接受与25μg同种型，25μg 16C3，1μg、5μg或25μg Ab F5.1.11.02复合的8,000U hIL-2(Proleukin)的 每天腹膜内注射共5天，在37℃下30分钟。
脾细胞的分离和细胞染色
将小鼠用CO2处死且收获脾细胞，并且用抗人CD45 Pacific Orange、 CD4PercPCy 5.5、CD3 PeCy7/Pacific Blue/PercP、CD25 APC-Cy7/Pe、CD238 Pe、CD39 PeCy7、CD8 APC-H7、Ki67 Pe、NKG2D PeCy7、CD44 V450细 胞外染色，且用抗人Helios FITC和FoxP3 APC细胞内染色。标记的抗体购 自BD PharMingen或Ebioscience。用运行FACSDiva(BD Biosciences)的 Fortess流式细胞仪分析染色的单细胞悬浮液，并且用FLOWJO软件分析 且呈现FSC 3.0文件。
结果
与hIL-2复合的抗体16C3增加脾中的Treg百分比。响应用两种不同 剂量(5μg和25μg)的抗体F5.1.11.02处理也观察到Treg百分比中的增 量增加。Treg群体对hCD45+CD3+CD4+Helios+FoxP3+细胞进行门控(图 3)。与hIL-2复合的16C3和F5.1.11.02两者均增加Treg/Teff和Treg/NK 细胞比。
与hIL-2复合的16C3(25μg)增加Treg/CD4、Treg/CD8和Treg/NK细 胞比。在第一个实验中用F5.1.11.02以最低剂量(1μg)的处理没有显示比率 的增加。相反，观察到响应5μg和25μg与hIL-2复合的F5.1.11.02，在 Treg/CD4、Treg/CD8和Treg/NK细胞比中的显著增加(图4A-C)。在第二 个实验中，观察到对于16C3以及5μg和25μg F5.1.11.02的相同结果，并且另外，比率的增加对于低剂量的F5.1.11.02(1μg)也是显而易见的(图 4D-F)。与hIL-2复合的16C3和F5.1.11.02两者均增加Teff和Treg总细胞 数目。在两个实验中，与hIL-2复合的16C3(25μg)增加了脾中CD4+、CD8+细胞和Treg的总数目。
与hIL-2复合的F5.1.11.02也显示CD4+、CD8+细胞和Treg总细胞数 目的增加。在第一个实验中，效应在5μg和25μg F5.1.11.02的剂量下更 显而易见(图5A-C)。第二个实验显示以剂量依赖性方式响应F5.1.11.02 在CD4+、CD8+细胞和Treg总数目中的增加(图5D-F)。用F5.1.11.02处 理也诱导了在Treg上的CD25、Icos和FoxP3平均荧光强度(MFI)的增加，这在16C3的存在下未观察到(图6A-C)。
实例5.抗IL-2抗体抑制pSTAT5
收获来自在Foxp3启动子控制下的表达GFP的C57B16的脾细胞，加 工成单细胞悬液，并且重悬浮于RPMI 0.1％BSA中。细胞在组织培养箱 中在37℃下静置至测定时间(1-2小时)。
从人Trima残留物(Blood Centers of the Pacific)纯化PBMC，并且重悬 浮于RPMI 0.1％BSA中。细胞在组织培养箱中在37℃下静置至测定时间 (1-2小时)。
IL-2诱导的pSTAT5测定
将PBMC或脾细胞置于96孔V型底部板中，使得在每个孔中在50μL (RPMI,0.1％BSA)的体积中有100万个细胞。将平板放回37℃培养箱中以 维持温度。滴定抗体(JES6-1(JES6-1A12 eBioscience)或抗人IL-2)，并且 以4种浓度测试IL-2：500ng/mL、50ng/mL、5ng/mL和0.5ng/mL。
商购可得的小鼠IL-2单克隆抗体JES6-1阻断IL-2的IL2Rα和IL2Rβ 界面两者(León等人，2013,"Mathematical models of the impact of IL2 modulation therapies onT cell dynamics,”Frontiers in Immunology,4:439，以引 用的方式全文并入本文)。JES6-1结合mIL-2而不是hIL-2，因为该表位在 hIL-2中不是保守的，关于JES6-1与IL-2结合的关键氨基酸残基包括对应 于hIL-2残基Q22和M23的mIL-2残基Q36和E37，在以引用的方式全文 并入本文的Spangler等人，2015,“Antibodies to Interleukin-2ElicitSelective T Cell Subset Production through Distinct ConformationalMechanisms,”Immunity, 42:815中的图3、4、S2、S3和S4中详述。mIL-2/mIL-2Rβ的KD由Spangler 等人报告为>7μM，并且对于mIL-2/mIL-2Rα，KD比hIL-2弱2-4倍。小鼠 和人IL-2氨基酸序列的比较在Yokota等人，1985,“Use of a cDNA expression vector forisolation of mouse interleukin 2 cDNA clones:Expression of T-cell growth-factor activity after transfection of monkey cells,”Proc.Natl.Acad.Sci. USA,82:68的图6中可获得，所述参考文献以引用的方式全文并入本文。
将等体积(50μL)的2x IL2:抗体复合物(在37℃下制备1小时)加入孔 中，并且将细胞在37℃培养箱中培养40分钟。通过加入100μL IC固定缓 冲液(eBioscience)来固定细胞。在15分钟固定后，将细胞洗涤且贮存于FAC 缓冲液(PBS+0.2％BSA)中直至染色。
将测定板离心以使细胞形成团块，并且渗透化缓冲液III(BD Biosciences)用于重悬浮细胞，随后在冰上的30分钟温育。将细胞在FAC 缓冲液中洗涤2次，并且用下述Ab对于PBMC进行染色：来自eBioscience 的抗人CD3 APC e780、CD4 Percp e710和CD127(PE).CD8 FITC、CD25 (PeCy7)、FoxP3(e660)和pSTAT5(Pacific blue)购自BD Biosciences。对于脾 细胞，使用下述抗小鼠抗体：来自eBioscience的CD4 e660和CD8a PeCy7。 pSTAT5Pacific Blue(BD Biosciences)用于小鼠和人细胞两者。
数据在LSR Fortessa上收集，并且使用FlowJo软件分析。数据绘制为 本底扣除的MFI，对每种细胞类型(IL2 500ng/mL+同种型)的最大信号 标准化。本底被定义为非刺激但被染色的pSTAT5。人Treg被定义为 CD3+CD8-CD4+CD25hiCD127lo。小鼠Treg被定义为CD8-CD4+Foxp3.GFP+c 细胞。
结果
PBMC中pSTAT5的抑制：F5.1.11亲和力变体
F5.1.11的亲和力变体证实对于IL-2具有增加的亲和力的抗体如 F5.1.11.02和F5.1.11.08在抑制CD8+效应子T细胞和非Treg CD4+ T细胞 中的pSTAT5信号传导方面更有效。在5-500ng/mL的IL-2浓度下，Treg pSTAT5维持大于50％。在测试的IL-2的最低浓度(0.5ng/mL)下，Treg中 的pSTAT5水平被抑制低于最大信号的50％，然而跨越所有Ab浓度仍可 检测到pSTAT5(图7A-V)。还在pSTAT5信号传导测定中测试了5344抗 体，并且在Treg中，在低浓度的IL-2下pSTAT5无法检测到(数据未显 示)。
JES6-1和抗体F5.1.11.02的比较
与同种型对照(图8A-F)类似，小鼠IL-2抗体JES6-1在测试的大多 数IL-2浓度下保留Treg pSTAT5信号传导。相比之下，IL-2诱导的pSTAT5 信号传导在测试的所有IL-2浓度下在小鼠CD8+ T细胞中被JES6-1强烈抑 制。该数据和与IL-2复合的JES6-1促进体内Treg细胞的生长的公布观察 一致。
在测试的大多数IL-2浓度下，抗人IL-2抗体F5.1.11.02在很大程度上 保留人Treg pSTAT5信号传导。在测试的所有IL-2浓度下，CD8+ T细胞 pSTAT5被IL-2抗体F5.1.11.02抑制。总之，CD8和Treg中IL-2抗体 F5.1.11.02的pSTAT5抑制模式类似于用小鼠IL-2抗体JES6-1观察到的那 种。
在表5中，来自图8A-F的pSTAT 5％max值用于生成关于用同种型或 抗IL-2抗体处理的Treg或CD8细胞的曲线下面积值。列出了关于每个IL-2 浓度的Treg/CD8 AUC比。在同种型处理的样品中，递减量的IL-2导致 AUC比率增加，反映Treg中比CD8+效应细胞中更多的pSTAT5信号传导。 虽然绝对数字不同，但这种观察在小鼠和人细胞之间一致。
在更高浓度的IL-2下，JES6-1处理将该比率转变为有利于Treg。在 用F5.1.11.02抗体处理的人细胞中发生AUC比率中的类似变化。
总之，F5.1.11.02看起来具有与JES6-1类似的pSTAT5信号传导概况。
表5
Figure BDA0003717294580000941
抗体表位对CD25hi CD8+ T细胞的pSTAT5抑制的影响
一些外周CD8+ T细胞表达CD25(IL-2Rα)。如图10A-B中所示，如果 基于CD25表达门控细胞，则CD25hi CD8细胞对低水平的IL-2更敏感。 因此可能需要IL-2抗体全部或部分阻断CD25结合，以抑制CD25hi CD8+ T细胞中的pSTAT5信号传导。
如图9中所示，通过阻断IL-2Rα与IL-2结合的IL-2抗体(如13A10 或F5.1.11.02)最佳地抑制由低剂量的IL-2(0.8ng/mL)诱导的pSTAT5。相 反，高浓度的IL-2(500ng/mL)(推测不需要IL-2Rα的存在以实现信号传 导)被阻断IL-2与IL-2Rβ结合的抗体(如d1C7或F5.1.11.02)最佳地抑 制。跨越一系列IL-2浓度，抗体F5.1.11.02能够最佳地抑制CD8+效应子T 细胞中的pSTAT5信号传导
通过IL-2抗体F5.1.9的pSTAT5抑制
评估IL-2抗体F5.1.9和变体F5.1.9.5对pSTAT5的抑制(图11A-H)。 F5.1.9的亲和力变体F5.1.9.5有效抑制CD8+效应子T细胞中的pSTAT5信 号传导比它抑制Treg中的pSTAT5信号传导更大的程度。F5.1.9.5ka(M-1s-1) 为1.23E+06，kd(s-1)为8.18E-04，并且KD(M)为6.63E-10。
实例6.NOD mIL-2-/-hIL-2+/-小鼠的生成
小鼠含IL-2的细菌人工染色体(BAC)(克隆RP23-290D8)被改造为 表达人IL-2编码序列。在BAC中做出下述修饰：小鼠IL-2启动子、5'和 3'UTR和内含子保持完整；小鼠信号肽替换为人信号肽；信号肽下游的外 显子1的3'一半、外显子2和3替换为人序列；外显子4的5'一半替换为 人编码序列。
随后通过原核注射将改造的BAC转移到FVB/NJ(Friend Virus B)雌性 小鼠(Jackson)的受精卵母细胞中。然后将受精卵母细胞植入FVB雌性小鼠 中，以生成FVB mIL-2+/+hIL-2BAC+小鼠。为了生成缺乏mIL2表达的 在NOD背景中的小鼠，将FVB mIL-2+/+hIL-2BAC+小鼠与NOD mIL-2-/- 小鼠回交。从该初始品种生成的NOD mIL-2-/-hIL-2BAC+/-小鼠与NOD mIL-2-/-小鼠回交8代，以便生成具有I型糖尿病的小鼠。获得的小鼠用于 实验。
方法
在ACK裂解后，全血(100μL)用PMA/离子霉素刺激过夜，收集上清 液(125μL)，并且对于mIL-2(50μL)和hIL-2(50μL)执行ELISA(ELISA: ebioscience)。
雌性NOD mIL2-/-hIL2+/-小鼠在14周龄时进行注射，并且它们接受 与25μg同种型、或者5μg或25μg F5.1.11.02复合的8,000IU hIL-2 (Proleukin)的每天腹膜内注射共5天。通过将IL-2和抗体一起在37℃温育 30分钟形成IL2:抗体复合物。
不同器官的分离和细胞染色
小鼠用CO2处死并且立即用PBS通过左心室灌注，直至流出物变得 澄清。收获脾细胞和胰淋巴结(pLN)，并且执行用CD25 PeCy7、CD4 BV605、 CD8 PercP-Cy5.5、CD44 Pe、CD62L Al647的细胞外染色和用FoxP3 FITC的 细胞内染色。
通过用0.8mg/mL胶原酶P和20μg/mL DNA酶(Roche)在37℃下消化 30分钟，随后切碎来制备整个胰腺。在消化后，匀浆物通过使用40μm细 胞滤器过滤两次，并且执行用CD45PercP Cy5.5、CD25 Pe、CD4 PeCy7、 CD8 Al647、Thy1.2 BV605的细胞外染色和用FoxP3FITC的细胞内染色。 标记的抗体购自BD Pharmingen或Ebioscience。分析染色的单细胞悬浮液 并且用FLOWJO软件呈现。
结果
人IL-2转基因(hIL-2Tg)小鼠的表型
用PMA/离子霉素体外刺激小鼠脾细胞(图12A-B)证实了来自转基 因小鼠的人IL-2的产生，尽管人IL-2产生的水平比来自野生型小鼠的小 鼠IL2低。hIL-2Tg/mIL-2-/-小鼠看起来健康而有活力。然而，与NOD或 NOD mIL-2+/-小鼠相比，hIL-2Tg小鼠具有增加百分比的活化 (CD44+CD62L-)CD4+或CD8+ T细胞(图13A-B)。尽管Treg频率类似于 NOD或NODmIL-2+/-小鼠，但来自hIL-2Tg小鼠的Treg具有降低的CD25 的细胞表面表达(图14)。
用F5.1.11.02:hIL-2复合物处理hIL-2Tg小鼠
如上所述(方法)，用F5.1.11.02:IL-2复合物处理hIL-2Tg小鼠。处理 在第7天时并未增加脾的总体细胞性，并且在5μg处理组中观察到总脾细 胞的轻微减少(图15)。与同种型对照相比，响应用两种剂量的与hIL-2 复合的F5.1.11.02处理，在除了pLN之外的所有器官中，观察到Treg百 分比的增加，伴随胰腺中的更显著增加(图16A-I)。在脾和pLN中，Treg 群体对CD4+CD25+FoxP3+细胞进行门控，并且在胰腺中，通过对CD45+ Thy1.2+CD4+CD25+FoxP3+细胞进行门控来鉴定Treg细胞。
在用复合物处理后，在脾和pLN中观察到CD4、CD8和Treg总细胞 数目的减少。然而，在胰腺中，响应25μg剂量的F5.1.11.02，F5.1.11.02 复合物处理诱导Treg总细胞数目中的轻微增加。在胰腺中未观察到CD4 和CD8总细胞数目中的差异(数据未显示)。
用与hIL-2复合的F5.1.11.02(25μg)处理hIL-2Tg小鼠诱导了脾中 Treg/CD4和Treg/CD8细胞比率的显著增加(图17A-F)。在胰腺中观察到 相同的结果，具有对于用5μg和25μg F5.1.11.02观察到的Treg/CD4和 Treg/CD8的比率的显著增加。F5.1.11.02:IL2复合物处理对胰腺淋巴结中的 细胞比率具有很少作用。
最后，用F5.1.11.02:IL-2复合物(5μg和25μg F5.1.11.02)处理huIL2 Tg小鼠诱导所有器官中的Treg上的CD25平均荧光强度(MFI)的增加(图 18A-C)。这种增加在胰腺中特别显著，其中Treg CD25 MFI在处理前非常 低。
用CTV的NSG实验
通过ficoll从健康供体中分离PBMC，并且用12.5ng/mL抗CD3和 25ng/mL抗CD28活化过夜。在过夜活化后，收获细胞并且用以1μL CTV/10x106细胞浓度的CellTrace Violet(Life technology)标记。在染色后， 将细胞用PBS充分洗涤，并且以30x106个细胞的浓度重悬浮于200μL PBS 中。PBMC在NSG受体中i.v.注射。用人PBMC注射的NSG小鼠接受与 同种型或抗体复合的8,000U hIL-2(Proleukin)以所示量的腹膜内注射共5 天，在37℃下30分钟。
脾细胞的分离和细胞染色
在第3天和第5天时将小鼠用CO2处死且收获脾细胞，并且用抗人 CD45 PacificOrange、CD4 PercPCy5.5、CD25Pe、CD8 APC-H7、NKG2D PeCy7 细胞外染色，且用抗人HeliosFITC和FoxP3 APC细胞内染色。标记的抗体 购自BD PharMingen或Ebioscience。用运行FACSDiva(BD Biosciences)的 Fortess流式细胞仪分析染色的单细胞悬浮液，并且用FLOWJO软件分析 且呈现FSC 3.0文件。
结果
用25μg与hIL-2复合的F5.1.11.02的处理在第5天而不是第3天时诱 导总脾细胞数目的增加(图19A-B)。
F5.1.11.02抗体:IL-2复合物还能够在第5天时增加脾中Teff和Treg 总细胞数目(图20A-F)以及Treg/CD4和Treg/CD8比率(图21A-D)， 这是在第3天时未观察到的结果。Treg群体对hCD45+CD3+CD4+Helios+ FoxP3+细胞进行门控。
通过在转移和处理之前包括CTV标记，我们观察到与同种型相比， 用F5.1.11.02抗体:IL-2复合物的处理诱导Treg的增殖，在第3天时已经 显而易见的效果，并且到第5天时导致低数目的未分裂的细胞(图22A-H)。 通过用F5.1.11.02抗体:IL-2复合物处理，CD8T细胞的增殖也增加，然而， 这仅在第5天时显著，并且更多数目的未分裂细胞保持得比在Treg群体中 更多(图23A-H)。总之，该CTV数据支持Treg增殖的增加，因为观察到 Treg/CD8比率中的潜在转变。
最后，在脾中，与同种型对照相比，用两种剂量的复合物处理诱导Treg 和CD8群体上的CD25平均荧光强度(MFI)的增加(图24A-B)。然而，在 Treg上CD25的绝对表达比在CD8细胞上高很多倍。
在后续实验中，我们比较了F5.1.11.02与较低亲和力的‘亲本’抗体 F5.1.11。我们将剂量范围扩展至125μg与hIL2复合的抗体，以评价较高 剂量的较低亲和力抗体在体内是否具有可比较的效果。在125μg时， F5.1.11对Treg和CD8细胞数目、增加的Treg/CD8比率和细胞性具有可 比较的作用，等价于25μg F5.1.11.02(图25A-D、26A-C和33A-B)。如 在CTV稀释度中观察到的，这再次得到增加的Treg增殖的支持(图27A-H、 28A-H和38)。我们预测在体外，F5.1.11.02将类似地增加人Treg上的Foxp3 和CD25蛋白水平。
实例7.对于食蟹猴IL-2的IL-2抗体结合亲和力
重组食蟹猴(食蟹猕猴(Macaca fascicularis))IL-2在哺乳动物细胞中 表达，并且使用固定化金属离子亲和层析(IMAC)纯化。使用如对于人IL-2 所述的表面等离子共振测量抗体对食蟹猴IL-2(1-100nM)的亲和力(实例 1)。1:1兰米尔结合模型用于拟合结合曲线或从浓度-响应曲线计算的稳态 亲和常数。在其中对于1-100nM IL-2观察到的浓度-应答关系不足以计算 表观结合亲和力的情况下，克隆被指定为“非常弱的”。
结果
所测试的人抗体克隆与食蟹猴IL-2结合，其亲和力范围为516pM到 在该测定中无法定量的非常弱的结合(表6)。当基于其抑制IL-2Rβ结合 的能力进行选择时，大多数克隆被测试(实例2和3)，当与人IL-2相比 时，这些克隆显示对于食蟹猴IL-2的亲和力的显著丧失。已观察到抑制 IL-2Rα结合的16C3(实例2)显示与人和食蟹猴IL-2两者的等价结合。 这些结果与我们的结构分析一致，所述结构分析发现人和食蟹猴IL-2之间 的趋异区域落入IL-2Rβ结合位点和F5.1.11抗体克隆的表位两者内(实例 9)。
表6
克隆 人IL-2KD(M) 食蟹猴IL-2KD(M)
F5.1.11 3.12E-09 非常弱
F4.7.8 1.34E-08 9.24E-08
F5.1.9 1.33E-08 非常弱
16C3 6.37E-10 5.16E-10
d1C7 5.36E-10 >＝1.08E-07
5344 <＝5.00E-11* >＝5.0E-08
F5.1.11.02 1.14E-10 ～2.11E-07
*解离速率超出了仪器的规格，已假定5.0E-05或更低的解离速率。
实例8.IL-2/Fab复合物受体结合亲和力
使用Biacore T200仪器(GE Healthcare,Piscataway,NJ)测量IL-2Rα对于 IL-2或IL-2/F5.1.11Fab复合物的亲和力。将重组IL-2α用生物素标记，并 且在BiacoreStreptavidin芯片(GE Healthcare)上捕获。使用在10mM HEPES (pH 7.4)、150mM NaCl和0.005％v/v表面活性剂P20缓冲液中的10μL/分 钟流速，在25℃下执行实验。将IL-2(1-50nM)或IL-2/F5.1.11Fab(预复合 的具有过量Fab的1-500nM IL-2)以30μL/分钟注射到受体偶联的芯片表 面上120秒，并允许解离5分钟。使用相邻的对照流动单元和仅缓冲液注射将数据进行本底扣除。相互作用的亲和力由平衡时的浓度-应答关系计 算。
结果
与无配体的IL-2相比，IL-2/F5.1.11Fab复合物以较低的亲和力与 IL-2Rα结合。复合物和无配体的IL-2的平衡结合分析发现F5.1.11Fab结 合的IL-2对于IL-2Rα具有弱约7倍的亲和力(与70.1nM相比的9.97nM) (图29A-B)。该结果与在IL-2/抗体复合物受体结合测定(实例2)中观 察到的结合减少以及IL-2/F5.1.11 Fab晶体结构(实例9)的分析一致。
实例9.与人IL-2结合的F5.1.11 Fab的晶体结构
白细胞介素-2表达和纯化
如(Rickert等人，2004)所述纯化全长IL-2(残基1-133)。简言之， 将该基因与载体的gp67A信号序列一起框内克隆到pAcgp67A载体内，随 后为C-末端六组氨酸标签(SEQID NO:223)。草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)细胞用于生成高滴度重组病毒。在Insect Xpress培养基 (Lonza)中生长的粉纹夜蛾(Trichopulsia ni)(High-Five)细胞用病毒感染，并 且允许在28℃下表达蛋白质48小时。蛋白质通过Ni-NTA纯化并且用羧 肽酶A和B在4℃下消化过夜，然后在Superdex 200凝胶过滤柱(GE Healthcare)上纯化。
与白细胞介素-2的5.1.11Fab复合物的结晶
将F5.1.11Fab与1.5倍过量的IL-2混合，并且将复合物在Superdex 200 柱(GEHealthcare)上通过FPLC纯化。如使用1.49mL*mg-1*cm-1的消光系数 在280nm处测量的，将纯化的Fab/IL-2复合物浓缩至10mg/mL。将该复 合物与等体积的沉淀剂溶液(100mM柠檬酸钠，pH 5.0；20％聚乙二醇 6000)混合，并且通过坐滴蒸气扩散在沉淀剂溶液的储库上结晶。棱柱形 晶体在一周内形成。通过加入甘油至30％(v/v)对晶体进行低温保护，收获， 并且通过投入液氮内快速冷却。
晶体学数据收集和改进
在Advanced Light Source Beamline 8.2.1(Berkeley,CA)收集衍射数据。 晶体在空间群P21中编入索引，其中晶胞尺寸为
Figure BDA0003717294580001001
Figure BDA0003717294580001002
β＝95.38°。最大分辨率
Figure BDA0003717294580001003
用于结构分辨和改进。该结构 通过使用程序Phaser(McCoy等人，2007)的分子替换来解决。搜索模型 包括来自PDB条目3U1S的重链恒定结构域、来自4NPY的重链可变结构 域、来自3N9G的轻链可变结构域、来自4HP0的轻链可变结构域和来自2B5I的白细胞介素-2(Wang等人，2005；McLellan等人，2011；Ogata等 人，2013；Sok等人，2013；Kaufmann等人)。Fab/IL-2复合物的四个拷 贝在不对称单位中建模。该结构通过使用程序Coot(Emsley等人，2010) 和PHENIX(Adams等人，2010)的手动重建和改进的迭代循环来构建。 通过Coot中的目视检查和用PISA(Krissinel和Henrick，2005；2007)分 析蛋白质-蛋白质相互作用。使用人apo-IL-2(PDB ID 1M47(Arkin等人， 2003)作为模板，用I-TASSER(Roy等人，2010；Yang等人，2015)制 备食蟹猴(食蟹猕猴)IL-2的同源性模型。
结果
F5.1.11经由轻链CDR1和CDR3环以及重链CDR2和CDR3环在螺 旋A和C以及B-C环处与IL-2相互作用(图30)。与IL-2/IL-2Rβ/γc/CD25 四级结构(PDB ID 2B5I)的比较揭示F5.1.11阻断IL-2的IL-2Rβ结合位点， 而不是CD25或γc结合位点。IL-2的总体结构类似于apo结构(在95个Cα 原子上的RMSD
Figure BDA0003717294580001011
)。当F5.1.11结合IL-2的B-C环时，发生显著的扰动；该扰动传播到相邻的IL-2A-B环(图31)。由于A-B环构成四元复 合物中的CD25结合位点的部分，这种移动可解释F5.1.11/IL-2对于CD25 降低的亲和力。
为了解释F5.1.11与食蟹猴IL-2的弱交叉反应性，我们基于apo人IL-2 结构生成了食蟹猴IL-2的同源性模型。尽管序列是95％相同的，但在食蟹 猴IL-2的BC环中的插入看起来破坏了与轻链CDR1残基(Ala30、Ser31、 Asn32和Tyr33)和重链CDR3残基(Gly105和Asp106)的相互作用(图 32)。
为了改善mAb F5.1.11.02与非人灵长类动物IL-2的结合，基于F5.1.11 Fab/hIL-2晶体结构，选择其侧链接触在人和食蟹猴IL-2之间不同的IL-2 环的靶mAb残基。对应于重链中的CDRH3的残基Gly105、Asp106和轻 链中的CDRL1的Ala30、Ser31、Asn32、Tyr33的密码子通过PCR与编码 19种氨基酸(排除半胱氨酸)的简并寡核苷酸随机化组合。通过表面展示方法筛选scFv形式的所得到的文库与食蟹猴和人IL-2两者的结合。
实例10.通过IL-2复合物抗IL-2:IL-2复合物处理的糖尿病缓解
通过ficoll从健康供体中分离PBMC，并且用12.5ng/mL抗CD3和 25ng/mL抗CD28活化过夜。在过夜温育后，收获细胞并且用以1μL CTV/10x106细胞浓度的CellTrace Violet(Life technology)标记。在染色后， 将细胞用PBS充分洗涤，并且以30x106个细胞的浓度重悬浮于200μL PBS 中。PBMC在NSG受体中i.v.注射。通过将所示浓度的同种型或抗IL-2抗体与8000U人IL2(Proleukin)一起在37℃下温育30分钟形成抗体:IL-2复 合物。用人PBMC注射的NSG小鼠接受抗体:IL-2复合物的每天腹膜内注 射，共5天。
分离脾细胞和细胞染色
将小鼠用CO2处死且收获脾细胞，并且用抗人CD45 Pacific Orange、 CD4PercPCy 5.5、CD3 PeCy7/Pacific Blue/PercP、CD25 APC-Cy7/Pe、CD238 Pe、CD39 PeCy7、CD8 APC-H7、Ki67 Pe、NKG2D PeCy7、CD44 V450细 胞外染色，且用抗人Helios FITC和FoxP3 APC细胞内染色。在细胞内染色 之前，根据制造商的说明，使用FoxP3缓冲液试剂盒(eBioscience)用于固定 和渗透化。标记的抗体购自BD PharMingen或Ebioscience。用运行 FACSDiva(BD Biosciences)的Fortess流式细胞仪分析染色的单细胞悬浮 液，并且用FLOWJO软件分析且呈现FSC 3.0文件。
通过IL2复合物的糖尿病缓解
用8,000U与125μg同种型或125μg F5.1.11.02复合的 hIL-2(Proleukin)，以及与5μg JES6-1(Ebioscience)复合的0.5μg mIL2 (Ebioscience)处理自发性新发糖尿病NOD小鼠(血糖浓度在250mg/dl和 350mg/dl之间)共5天。随着时间经过监测血糖浓度。
在1周缓解后，处死一些小鼠并且分析胰腺。通过用0.8mg/mL胶原 酶P和20μg/mLDNA酶(Roche)在37℃下消化30分钟，随后切碎来制备 整个胰腺。在消化后，匀浆物通过使用40μm细胞滤器过滤两次，并且用 CD45 PercP Cy5.5、CD25 Pe、CD4 PeCy7、CD8 Al647、Thy1.2 BV605细胞 外染色，且用FoxP3 FITC细胞内染色。标记的抗体购自BD Pharmingen或Ebioscience。分析染色的单细胞悬浮液并且用FLOWJO软件呈现。
结果
用与hIL2复合的F5.1.11.02(F5.1.11.02:IL2复合物)处理诱导脾中Treg 百分比的增加。Treg群体对hCD45+CD3+CD4+Helios+FoxP3+细胞进行门 控。F5.1.11.02抗体:IL-2复合物增加Treg总细胞数目，尽管还观察到总 CD4和CD8细胞数目的增加(图35A-B)。总之，Treg/CD4和Treg/CD8 比率(图36A)以剂量依赖性方式增加。从1μg的剂量开始，效应是显著的。
通过在转移和处理之前包括CTV标记，我们观察到与同种型相比， 用F5.1.11.02抗体:IL-2复合物的处理诱导Treg的增殖增加。通过用F5.1.11.02抗体:IL-2复合物处理，CD8 T细胞的增殖也增加，然而CD8群 体中保留的未分裂细胞数目多于在Treg群体中(图36B)。总之，该CTV 数据支持Treg增殖的增加，因为观察到Treg/CD8比率的潜在转变。
在脾中，与同种型对照相比，用所有剂量的复合物处理诱导Treg和 CD8群体上的CD25平均荧光强度(MFI)的增加。然而，Tregs上CD25的 绝对表达比在CD8细胞上高很多倍(图37A-B)。另外，在用F5.1.11.02:IL-2 复合物处理后，也观察到Treg上FoxP3 MFI的增加(图38)。总之，这些 数据提示扩增的Treg维持表型和功能。
体外数据已提示阻断IL2Rb与IL-2结合的抗IL2抗体能够更好地促 进差异Treg扩增。为了直接测试该假设，我们比较了阻断IL-2上不同受 体表位的抗体：IL-2Rα阻断剂(16C3.4)、IL2Rβ阻断剂(d1C7)、以及也降低 了IL2与IL-2Rα的结合的IL2Rβ阻断剂(F5.1.11.02)。与hIL2复合的所有 三种抗体都增加Treg细胞数目，并且在较小程度上CD4和CD8细胞数目 也增加。CD8细胞数目的增加响应16C3.4比IL-2Rb阻断抗体中的任一(d1C7或F5.1.11.02)大得多(图39A)。
与改变的细胞数目一致，d1C7和F5.1.11.02:IL-2复合物显示Treg/CD4 和Treg/CD8比率的增加，这用16C3.4未观察到(图39B)。用复合物中的 d1C7和F5.1.11.02处理增加了Treg和CD8上的CD25 MFI，然而CD8上 的CD25表达高于d1C7，提示F5.1.11.02对Treg可能更有选择性(图40)。
最后，我们评价F5.1.11.02:IL-2复合物施用5天是否可有效治愈NOD 小鼠中的临床糖尿病。值得注意的是，这种处理在1周内在50％的小鼠中 诱导了糖尿病缓解，并且其中大部分经过实验的4周持续时间保持血糖正 常。JES6-1:小鼠IL-2复合物提供了比F5.1.11.02更小的治愈效果，并且没 有观察到响应同种型的效应(图41)。
为了确定F5.1.11.02抗体:IL-2复合物效应是否与胰腺中的Treg数目 和特征的修饰相关，我们定量了它们在1周缓解后在胰腺中的比例。我们 观察到在用复合物中的F5.1.11.02处理后胰腺Treg的百分比显著增加。我 们还观察到用复合物的处理与Treg细胞功能相关的标记物(例如CD25和 FoxP3)表达的升高相关，这用同型对照并未观察到(图42)。总之，这些 数据提示在处理后胰腺中的Treg增加可控制糖尿病小鼠中发展成破坏性胰岛炎。
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本发明的特定实施例在下述编号段落中阐述：
1.特异性结合人IL-2(hIL-2)的经分离的抗体或其抗原结合部分，其 中所述抗体结合hIL-2的螺旋A和C以及B-C环。
2.经分离的抗体或其抗原结合部分，所述经分离的抗体或其抗原结 合部分与包含SEQ ID NO:13和14的氨基酸序列的抗体竞争结合人IL-2 (hIL-2)，或者与包含SEQ IDNO:13和14的氨基酸序列的抗体结合相同的 hIL-2表位。
3.特异性结合人IL-2(hIL-2)的经分离的抗体或其抗原结合部分，其 中所述抗体将hIL-2与IL-2Rα的结合亲和力降低1至199倍。
4.段落3的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体将hIL-2与IL-2Rα 的结合亲和力降低10倍。
5.特异性结合人IL-2(hIL-2)的经分离的抗体或其抗原结合部分，其 中所述抗体降低hIL-2与IL-2Rα和IL-2Rβ的结合，并且抑制CD8+ T细胞 中的活性至比调节性T(Treg)细胞中更高的程度。
6.特异性结合人白细胞介素-2(hIL-2)的经分离的抗体或其抗原结合 部分，其中所述抗体降低hIL-2与IL-2Rα和IL-2Rβ的结合，并且抑制CD8+ T细胞中的STAT5磷酸化至比调节性T(Treg)细胞中更高的程度。
7.特异性结合人白细胞介素-2(hIL-2)的经分离的抗体或其抗原结合 部分，其中所述抗体降低hIL-2与IL-2Rα和IL-2Rβ的结合，并且通过在 外周血单核细胞(PBMC)培养物或重构测定中所测量的，增加调节性T细 胞(Treg)与CD8+或CD4+ T细胞或NK细胞的比率。
8.特异性结合人白细胞介素-2(hIL-2)的经分离的抗体或其抗原结合 部分，其中所述抗体降低hIL-2与IL-2Rα和IL-2Rβ的结合，并且增加调 节性T(Treg)细胞中FOXP3、CD25和Icos中的一种或多种的表达。
9.段落1-8中任何一个的经分离的抗体或抗原结合部分，其中所述抗 体或抗原结合部分具有下述性质中的至少一种：
a)以大于约4.53x10-4s-1的解离速率与hIL-2结合；和
b)以大于约1.14x10-10M的KD与hIL-2结合。
10.段落1-9中任何一个的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体是人 抗体。
11.段落1-10中任何一个的抗体或抗原结合部分，所述抗体或抗原结 合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO:73(Kabat)、74(Chothia)或75(延伸)的HCDR1； 包含SEQ IDNO:76(Kabat)或77(Chothia)的HCDR2；包含SEQ ID NO:78 的HCDR3；包含SEQ ID NO:79的LCDR1；包含SEQ ID NO:80的LCDR2； 和包含SEQ ID NO:81的LCDR3；
(b)包含SEQ ID NO:82(Kabat)、83(Chothia)或84(延伸)的HCDR1； 包含SEQ IDNO:85(Kabat)或86(Chothia)的HCDR2；包含SEQ ID NO:87 的HCDR3；包含SEQ ID NO:88的LCDR1；包含SEQ ID NO:89的LCDR2； 和包含SEQ ID NO:90的LCDR3；
(c)包含SEQ ID NO:91(Kabat)、92(Chothia)或93(延伸)的HCDR1； 包含SEQ IDNO:94(Kabat)或95(Chothia)的HCDR2；包含SEQ ID NO:96 的HCDR3；包含SEQ ID NO:97的LCDR1；包含SEQ ID NO:98的LCDR2； 和包含SEQ ID NO:99的LCDR3；
(d)包含SEQ ID NO:100(Kabat)、101(Chothia)或102(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:103(Kabat)或104(Chothia)的HCDR2；包含 SEQ ID NO:105的HCDR3；包含SEQ IDNO:106的LCDR1；包含SEQ ID NO:107的LCDR2；和包含SEQ ID NO:108的LCDR3；
(e)包含SEQ ID NO:109(Kabat)、110(Chothia)或111(延伸)的HCDR1；包含SEQ IDNO:112(Kabat)或113(Chothia)的HCDR2；包含SEQ ID NO:114的HCDR3；包含SEQ ID NO:115的LCDR1；包含SEQ ID NO: 116的LCDR2；和包含SEQ ID NO:117的LCDR3；
(f)包含SEQ ID NO:118(Kabat)、119(Chothia)或120(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:121(Kabat)或122(Chothia)的HCDR2；包含 SEQ ID NO:123的HCDR3；包含SEQ IDNO:124的LCDR1；包含SEQ ID NO:125的LCDR2；和包含SEQ ID NO:126的LCDR3；
(g)包含SEQ ID NO:127(Kabat)、128(Chothia)或129(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:130(Kabat)或131(Chothia)的HCDR2；包含 SEQ ID NO:132的HCDR3；包含SEQ IDNO:133的LCDR1；包含SEQ ID NO:134的LCDR2；和包含SEQ ID NO:135的LCDR3；
(h)包含SEQ ID NO:136(Kabat)、137(Chothia)或138(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:139(Kabat)或140(Chothia)的HCDR2；包含 SEQ ID NO:141的HCDR3；包含SEQ IDNO:142的LCDR1；包含SEQ ID NO:143的LCDR2；和包含SEQ ID NO:144的LCDR3；
(i)包含SEQ ID NO:145(Kabat)、146(Chothia)或147(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:148(Kabat)或149(Chothia)的HCDR2；包含 SEQ ID NO:150的HCDR3；包含SEQ IDNO:151的LCDR1；包含SEQ ID NO:152的LCDR2；和包含SEQ ID NO:153的LCDR3；
(j)包含SEQ ID NO:154(Kabat)、155(Chothia)或156(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:157(Kabat)或158(Chothia)的HCDR2；包含 SEQ ID NO:159的HCDR3；包含SEQ IDNO:160的LCDR1；包含SEQ ID NO:161的LCDR2；和包含SEQ ID NO:162的LCDR3；
(k)包含SEQ ID NO:163(Kabat)、164(Chothia)或165(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:166(Kabat)或167(Chothia)的HCDR2；包含 SEQ ID NO:168的HCDR3；包含SEQ IDNO:169的LCDR1；包含SEQ ID NO:170的LCDR2；和包含SEQ ID NO:171的LCDR3；
(l)包含SEQ ID NO:172(Kabat)、173(Chothia)或174(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:175(Kabat)或176(Chothia)的HCDR2；包含 SEQ ID NO:177的HCDR3；包含SEQ IDNO:178的LCDR1；包含SEQ ID NO:179的LCDR2；和包含SEQ ID NO:180的LCDR3；
(m)包含SEQ ID NO:181(Kabat)、182(Chothia)或183(延伸)的HCDR1；包含SEQ IDNO:184(Kabat)或185(Chothia)的HCDR2；包含 SEQ ID NO:186的HCDR3；包含SEQ ID NO:187的LCDR1；包含SEQ ID NO:188的LCDR2；和包含SEQ ID NO:189的LCDR3；
(n)包含SEQ ID NO:190(Kabat)、191(Chothia)或192(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:193(Kabat)或194(Chothia)的HCDR2；包含 SEQ ID NO:195的HCDR3；包含SEQ IDNO:196的LCDR1；包含SEQ ID NO:197的LCDR2；和包含SEQ ID NO:198的LCDR3；
(o)包含SEQ ID NO:199(Kabat)、200(Chothia)或201(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:202(Kabat)或203(Chothia)的HCDR2；包含 SEQ ID NO:204的HCDR3；包含SEQ IDNO:205的LCDR1；包含SEQ ID NO:206的LCDR2；和包含SEQ ID NO:207的LCDR3；
(p)包含SEQ ID NO:208(Kabat)、209(Chothia)或210(延伸)的 HCDR1；包含SEQID NO:211(Kabat)或212(Chothia)的HCDR2；包含SEQ ID NO:213的HCDR3；包含SEQ ID NO:214的LCDR1；包含SEQ ID NO: 215的LCDR2；和包含SEQ ID NO:216的LCDR3；或
(q)包含SEQ ID NO:217的HCDR1；包含SEQ ID NO:218的HCDR2； 包含SEQ ID NO:219的HCDR3；包含SEQ ID NO:220的LCDR1；包含 SEQ ID NO:221的LCDR2；和包含SEQ IDNO:222的LCDR3。
12.段落1-10中任何一个的抗体或抗原结合部分，所述抗体或抗原结 合部分包含：
(a)包含以下的重链可变结构域(VH)：
i)表7中所示的SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、 21、23、25、27、29或71中的HCDR3；或
ii)表7中所示的SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、 21、23、25、27、29或71中的HCDR1-3；或
(b)包含以下的轻链可变结构域(VL)：
i)表7中所示的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、 22、24、26、28、30或72中的LCDR3；或
ii)表7中所示的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、 22、24、26、28、30或72中的LCDR1-3。
13.特异性结合人白细胞介素-2(hIL-2)的经分离的抗体或其抗原结合 部分，所述经分离的抗体或其抗原结合部分包括包含以下的重链可变结构 域(VH)：
a)表7中所示的SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、 21、23、25、27、29、31或71中的HCDR3；
b)表7中所示的SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、 21、23、25、27、29、31或71中的HCDR1-3；或
c)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、 27、29、31或71的氨基酸序列。
14.特异性结合人白细胞介素-2(hIL-2)的经分离的抗体或其抗原结合 部分，所述经分离的抗体或其抗原结合部分包括包含以下的轻链可变结构 域(VL)：
a)表7中所示的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、 22、24、26、28、30、32或72中的LCDR3；
b)表7中所示的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、 22、24、26、28、30、32或72中的LCDR1-3；或
c)SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、 28、30、32或72的氨基酸序列。
15.特异性结合人IL-2(hIL-2)的经分离的抗体或其抗原结合部分，其 中所述抗体包含分别在表7中所示的以下序列中的HCDR1-3和LCDR1-3 氨基酸序列：
SEQ ID NO:1和2，
SEQ ID NO:3和4，
SEQ ID NO:5和6，
SEQ ID NO:7和8，
SEQ ID NO:9和10，
SEQ ID NO:11和12，
SEQ ID NO:13和14，
SEQ ID NO:15和16，
SEQ ID NO:17和18，
SEQ ID NO:19和20，
SEQ ID NO:21和22，
SEQ ID NO:23和24，
SEQ ID NO:25和26，
SEQ ID NO:27和28，
SEQ ID NO:29和30，
SEQ ID NO:31和32，或
SEQ ID NO:71和72。
16.段落15的经分离的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体包含以下 氨基酸序列
SEQ ID NO:1和2，
SEQ ID NO:3和4，
SEQ ID NO:5和6，
SEQ ID NO:7和8，
SEQ ID NO:9和10，
SEQ ID NO:11和12，
SEQ ID NO:13和14，
SEQ ID NO:15和16，
SEQ ID NO:17和18，
SEQ ID NO:19和20，
SEQ ID NO:21和22，
SEQ ID NO:23和24，
SEQ ID NO:25和26，
SEQ ID NO:27和28，
SEQ ID NO:29和30，
SEQ ID NO:31和32，或
SEQ ID NO:71和72。
17.段落15或16的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体是IgG抗体。
18.段落17的抗体或抗原结合部分，所述抗体或抗原结合部分还包含 重链恒定区，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
19.段落17的抗体或抗原结合部分，所述抗体或抗原结合部分还包含 重链恒定区，所述重链恒定区包含不含C-末端赖氨酸的SEQ ID NO:33的 氨基酸序列。
20.段落18或19的抗体或抗原结合部分，所述抗体或抗原结合部分 还包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:34或35的氨基酸 序列。
21.经分离的核酸，所述经分离的核酸编码段落11-20中任何一个的 抗体或抗原结合部分的重链、轻链或两者。
22.经分离的核酸，所述经分离的核酸编码特异性结合人白细胞介素 -2(hIL-2)的抗体或其抗原结合部分的重链、轻链或两者，其中所述核酸包 含：
a)SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、 60、62、64或66的核苷酸序列；
b)SEQ ID NO:SEQ ID NO:37、39、41、43、45、47、49、51、53、 55、57、59、61、63、65或67的核苷酸序列；或
c)下述核苷酸序列对之一：
SEQ ID NO:36和37，
SEQ ID NO:38和39，
SEQ ID NO:40和41，
SEQ ID NO:42和43，
SEQ ID NO:44和45，
SEQ ID NO:46和47，
SEQ ID NO:48和49，
SEQ ID NO:50和51，
SEQ ID NO:52和53，
SEQ ID NO:54和55，
SEQ ID NO:56和57，
SEQ ID NO:58和59，
SEQ ID NO:60和61，
SEQ ID NO:62和63，
SEQ ID NO:64和65或
SEQ ID NO:66和67。
23.载体，所述载体包含段落21或22的核酸。
24.宿主细胞，所述宿主细胞包含段落21或22的核酸或者段落23 的载体。
25.段落24的宿主细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
26.生产特异性结合人白细胞介素-2(hIL-2)的抗体或其抗原结合部分 的方法，所述方法包括：
a)在允许所述抗体或抗原结合部分表达的条件下培养段落24或25 的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码所述抗体或抗原结合部分的重链 和轻链的核苷酸序列，和
b)从培养物中分离所述抗体或抗原结合部分。
27.特异性结合人白细胞介素-2(hIL-2)的经分离的抗体或其抗原结合 部分，其中所述抗体与段落16所述的抗体或抗原结合部分竞争结合hIL-2、 或者与段落16的抗体或抗原结合部分结合相同的表位。
28.段落27的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体包含分别与下述氨 基酸序列至少95％相同的VH氨基酸序列和VL氨基酸序列：
SEQ ID NO:1和2，
SEQ ID NO:3和4，
SEQ ID NO:5和6，
SEQ ID NO:7和8，
SEQ ID NO:9和10，
SEQ ID NO:11和12，
SEQ ID NO:13和14，
SEQ ID NO:15和16，
SEQ ID NO:17和18，
SEQ ID NO:19和20，
SEQ ID NO:21和22，
SEQ ID NO:23和24，
SEQ ID NO:25和26，
SEQ ID NO:27和28，
SEQ ID NO:29和30，或
SEQ ID NO:31和32。
29.药物组合物，所述药物组合物包含段落1-20、27和28中任何一 个的抗体或抗原结合部分，以及药学可接受的载体或赋形剂。
30.用于治疗人受试者中的炎性状况的方法，所述方法包括向所述受 试者施用有效量的段落1-20、27和28中任何一个的抗体或抗原结合部分、 或者段落29的药物组合物。
31.用于在有需要的人受试者中诱导免疫抑制的方法，所述方法包括 向所述受试者施用有效量的段落1-20、27和28中任何一个的抗体或抗原 结合部分、或者段落29的药物组合物。
32.段落1-20、27和28中任何一个的抗体或抗原结合部分、或者段 落29的药物组合物，其用于治疗患有炎性状况或需要免疫抑制的人受试 者。
33.段落1-20、27和28中任何一个的抗体或抗原结合部分在制备用 于在有需要的人受试者中治疗炎性状况或诱导免疫抑制的药物中的用途。
34.段落30或31的方法，段落32的抗体、一部分或药物组合物，或 者段落33的用途，其中所述受试者患有自身免疫疾病或移植物抗宿主病。
35.段落30或31的方法，段落32的抗体、一部分或药物组合物，或 者段落33的用途，其中所述抗体或部分与IL-2复合施用。
36.段落30或31的方法，段落32的抗体、一部分或药物组合物，或 者段落33的用途，其中所述受试者患有糖尿病。
37.段落30或31的方法，段落32的抗体、一部分或药物组合物，或 者段落33的用途，其中所述受试者患有I型糖尿病。
38.组合物，所述组合物包含与人IL-2复合的段落1-20、27和27中 任何一个的抗体或抗原结合部分。
39.药物组合物，所述药物组合物包含与人IL-2复合的段落1-20、27 和28中任何一个的抗体或抗原结合部分，以及药学可接受的载体或赋形 剂。
40.用于治疗人受试者中的炎性状况的方法，所述方法包括向所述受 试者施用有效量的与人IL-2复合的段落1-20、27和28中任何一个的抗体 或抗原结合部分，段落29的药物组合物，段落38的组合物或段落39的 药物组合物。
41.特异性结合人白细胞介素-2(hIL-2)的经分离的抗体F5.1.11.02或 其抗原结合部分，其中所述抗体包含：重链可变结构域(VH)，所述重链可 变结构域(VH)包含由在ATCC登录号__________下保藏的质粒的cDNA插 入片段编码的氨基酸序列，和/或轻链可变结构域(VL)，其包含由在ATCC 登录号__________下保藏的质粒的cDNA插入片段编码的氨基酸序列。
表7：序列表
Kabat CDR氨基酸序列以粗体显示。Chothia CDR氨基酸序列被加下划 线。延伸的CDR氨基酸序列包括加了下划线和粗体的氨基酸残基。
Figure BDA0003717294580001141
Figure BDA0003717294580001151
Figure BDA0003717294580001161
Figure BDA0003717294580001171
Figure BDA0003717294580001181
Figure BDA0003717294580001191
Figure BDA0003717294580001201
Figure BDA0003717294580001211
Figure BDA0003717294580001221
Figure BDA0003717294580001231
Figure BDA0003717294580001241
Figure BDA0003717294580001251
Figure BDA0003717294580001261
Figure BDA0003717294580001271
Figure BDA0003717294580001281
Figure BDA0003717294580001291
Figure BDA0003717294580001301
Figure BDA0003717294580001311
Figure BDA0003717294580001321
Figure BDA0003717294580001331
Figure BDA0003717294580001341
Figure BDA0003717294580001351
Figure BDA0003717294580001361
Figure BDA0003717294580001371
Figure BDA0003717294580001381
Figure BDA0003717294580001391
Figure BDA0003717294580001401
Figure BDA0003717294580001411
Figure BDA0003717294580001421
Figure BDA0003717294580001431
Figure BDA0003717294580001441
Figure BDA0003717294580001451
表8
Figure BDA0003717294580001452
Figure BDA0003717294580001461
Figure BDA0003717294580001462
序列表
<110> 辉瑞有限公司(PFIZER INC.)
加利福尼亚大学董事会(THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA)
莱兰斯坦福初级大学评议会(THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORDJUNIOR UNIVERSITY)
<120> 抗IL-2抗体及其组合物和用途
<130> PCFC-993
<140>
<141>
<150> 62/408,360
<151> 2016-10-14
<150> 62/245,600
<151> 2015-10-23
<160> 225
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 2
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Ser Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 3
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 4
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Phe Asn Leu
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asp Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala Asn Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 5
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 6
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Ser Asn Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 7
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115
<210> 8
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 8
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ile Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asp
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Ser Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Ala Asp Asn Gln Arg Pro Ser Glu Val Pro Asp Arg Phe Ser
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Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Met Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Asn Ile Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 9
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
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65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
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100 105 110
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115 120
<210> 10
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 10
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
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Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
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Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
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100 105 110
<210> 11
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 11
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
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Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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<210> 12
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 12
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
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Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
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<210> 13
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 13
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
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Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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115 120
<210> 14
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 14
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1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
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<210> 15
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 15
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
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115 120
<210> 16
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 16
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
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Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
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<210> 17
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 17
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
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115 120
<210> 18
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 18
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1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
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Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
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<210> 19
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 19
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
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115 120
<210> 20
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 20
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
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<210> 21
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 21
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
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100 105 110
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115 120
<210> 22
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 22
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
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Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
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Leu Asn Val Tyr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 23
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 23
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
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100 105 110
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115 120
<210> 24
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 24
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
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Arg Asp Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 25
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 25
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
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Cys Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 26
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
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65 70 75 80
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Ile Asp Val Tyr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 27
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 27
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 28
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
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Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr
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Leu Asn Val Tyr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 29
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
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65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Tyr Ser Asp Arg Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 30
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ile Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asp
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Ser Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Ala Asp Asn Gln Arg Pro Ser Glu Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Asn Ile Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 31
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Val Asp Arg Tyr Tyr Asn Trp Asn Tyr Phe Leu Gly Ser Phe
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 32
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 32
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Arg Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Tyr
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Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
His Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 33
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 33
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 34
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 35
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 35
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 36
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 36
gaggtccagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgaggact 300
cctacggtga ccggggactg gttcgacccc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcg 360
agc 363
<210> 37
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 37
aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120
ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaggataacc aaagaccctc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240
ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgatagcag caccgtggta 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 38
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 38
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180
gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240
atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagaccta 300
acgtttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cgagc 345
<210> 39
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 39
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcgt ctgtaggaga cagggtcacc 60
atcacttgcc aggcgagtca ggacattttc aacctcttaa attggtatag gcagaaacca 120
gggaaagccc ctgacctcct ggtctaccgc gcttccaatt tggagacagg ggtcccatcc 180
aggttcagtg gaagtgggtc tgggacagac tttactttca ccattagtag cctgcagcct 240
gaagatgttg gaacctatta ttgtcaacag agtgctaatc tccccctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 40
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 40
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgaggact 300
cctacggtga ccggggactg gttcgacccc tggggccgtg gcaccctggt caccgtctcg 360
agc 363
<210> 41
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 41
aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120
ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaggataacc aaagaccctc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240
ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgatagcag caatgtggta 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 42
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 42
gaggtgcagc tggtggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctctggtta ctccatcagc agtggttact actggggctg gatccggcag 120
cccccaggga aggggctgga gtggattggg agtatctatc atagtgggag cacctactac 180
aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca cgtccaagaa ccagttctcc 240
ctgaagctga gctctgtgac cgccgcagac acggccgtgt attactgtgc gagagaggcc 300
tactccgatc gggcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcgagc 357
<210> 43
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 43
aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac gataaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agcgactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120
ccgggcagtt cccccagcac tgtgatctat gcggataacc aaagaccctc tgaagtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240
ctgatgactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgatagcaa catcgtgata 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 44
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 44
caggtgcagc tacaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgaggact 300
cctacggtga ccggggactg gttcgacccc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcg 360
agc 363
<210> 45
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 45
aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120
ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaggataacc aaagaccctc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240
ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgatagcag caatgtggta 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 46
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 46
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt ggatatatct ataagagtgg gagcgcgtac 180
tacagcccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgaggact 300
cctacggtga ccggggactg gttcgacccc tggggccgtg gcaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 47
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 47
aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120
ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaggataacc aaagaccctc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240
ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgataccag ggatgtcgta 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 48
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 48
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt ggatatatct ataagagtgg gagcgcgtac 180
tacagcccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgaggact 300
cctacggtga ccggggactg gttcgacccc tggggccgtg gcaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 49
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 49
aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120
ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaggataacc aaagaccctc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240
ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagactt atgacagcat cgatgtgtat 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 50
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 50
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt ggatatatct ataagagtgg gagcgcgtac 180
tacagcccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgaggact 300
cctacggtga ccggggactg gttcgacccc tggggccgtg gcaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 51
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 51
aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120
ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaggataacc aaagaccctc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240
ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgataccct taatgtgtat 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 52
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 52
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt ggatacattt attacagcgg gagcaactac 180
tggaatccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgaggact 300
cctacggtga ccggggactg gttcgacccc tggggccgtg gcaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 53
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 53
aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120
ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaggataacc aaagaccctc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240
ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgataccag ggatgtcgta 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 54
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 54
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt ggatacattt attacagcgg gagcaactac 180
tggaatccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgaggact 300
cctacggtga ccggggactg gttcgacccc tggggccgtg gcaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 55
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 55
aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120
ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaggataacc aaagaccctc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240
ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagactt atgacagcat cgatgtgtat 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 56
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 56
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt ggatacattt attacagcgg gagcaactac 180
tggaatccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgaggact 300
cctacggtga ccggggactg gttcgacccc tggggccgtg gcaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 57
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 57
aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120
ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaggataacc aaagaccctc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240
ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgataccct taatgtgtat 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 58
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 58
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct ataagagcgg gagcaactac 180
tggaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgaggact 300
cctacggtga ccggggactg gttcgacccc tggggccgtg gcaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 59
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 59
aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120
ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaggataacc aaagaccctc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240
ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgataccag ggatgtcgta 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 60
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 60
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct ataagagcgg gagcaactac 180
tggaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgaggact 300
cctacggtga ccggggactg gttcgacccc tggggccgtg gcaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 61
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 61
aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120
ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaggataacc aaagaccctc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240
ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagactt atgacagcat cgatgtgtat 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 62
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 62
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct ataagagcgg gagcaactac 180
tggaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgaggact 300
cctacggtga ccggggactg gttcgacccc tggggccgtg gcaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 63
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 63
aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120
ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaggataacc aaagaccctc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240
ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgataccct taatgtgtat 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 64
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 64
gaggtgcagc tggtggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctctggtta ctccatcagc agtggttact actggggctg gatccggcag 120
cccccaggga aggggctgga gtggattggt ttgagctacc acactcgttc tacctactac 180
gatccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca cgtccaagaa ccagttctcc 240
ctgaagctga gctctgtgac cgccgcagac acggccgtgt attactgtgc gagagaggcc 300
tactccgatc gggcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 65
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 65
aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac gataaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agcgactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120
ccgggcagtt cccccagcac tgtgatctat gcggataacc aaagaccctc tgaagtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240
ctgatgactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgatagcaa catcgtgata 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 66
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 66
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagtggac 300
cggtattata actggaacta ctttttaggc tcctttgact actggggcca gggaaccctg 360
gtcaccgtct cgagc 375
<210> 67
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 67
agctatgtgc tgactcagcc accctcagtg tcagtggccc caggaaagac ggccaggatt 60
acctgtgggg gaaacaacat tagaagtaaa agtgtgcact ggtaccagca gaagcccggc 120
caggcccctg tggtggtcat ctattatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180
atctctgggt ccaactctgg aaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240
gatgaggccg actatttttg tcaggtgtgg gatagtagta gtgaccatca tgtattcggc 300
ggagggacca agctgaccgt ccta 324
<210> 68
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 68
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc cgctggggca 360
ccgtcagtct tcctcttccc tccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990
<210> 69
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 69
cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg t 321
<210> 70
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 70
ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact ctgttcccac cctcctctga ggagcttcaa 60
gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg 120
gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa 180
caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag 240
tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg 300
gcccctacag aatgttca 318
<210> 71
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 71
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Lys Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 72
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 72
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Asp Ser
85 90 95
Ile Asp Val Tyr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 73
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 73
Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 74
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr
1 5
<210> 75
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 75
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 76
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 76
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Ser Arg Val
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 77
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr
1 5
<210> 78
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 78
Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 79
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 79
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln
1 5 10
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 80
Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 81
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Thr Val Val
1 5
<210> 82
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 82
Gly Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 83
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 83
Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
1 5
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 84
Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 85
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 85
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
1 5 10 15
Gln Gly Arg Val
20
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 86
Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn
1 5
<210> 87
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 87
Asp Leu Thr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 88
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 88
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Phe Asn Leu Leu Asn
1 5 10
<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 89
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 90
Gln Gln Ser Ala Asn Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 91
Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 92
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 92
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr
1 5
<210> 93
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 93
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 94
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 94
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Ser Arg Val
<210> 95
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 95
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr
1 5
<210> 96
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 96
Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 97
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 97
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln
1 5 10
<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 98
Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 99
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Asn Val Val
1 5
<210> 100
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 100
Ser Gly Tyr Tyr Trp Gly
1 5
<210> 101
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 101
Tyr Ser Ile Ser Ser Gly Tyr
1 5
<210> 102
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 102
Tyr Ser Ile Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Gly
1 5 10
<210> 103
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 103
Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Ser Arg Val
<210> 104
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 104
Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr
1 5
<210> 105
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 105
Glu Ala Tyr Ser Asp Arg Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 106
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 106
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asp Tyr Val Gln
1 5 10
<210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 107
Ala Asp Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 108
Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Ile Val Ile
1 5
<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 109
Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 110
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 110
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr
1 5
<210> 111
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 111
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 112
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 112
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Ser Arg Val
<210> 113
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 113
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr
1 5
<210> 114
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 114
Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 115
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 115
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln
1 5 10
<210> 116
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 116
Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 117
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Asn Val Val
1 5
<210> 118
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 118
Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 119
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 119
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr
1 5
<210> 120
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 120
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 121
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 121
Gly Tyr Ile Tyr Lys Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ser Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Ser Arg Val
<210> 122
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 122
Ile Tyr Lys Ser Gly Ser Ala Tyr
1 5
<210> 123
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 123
Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 124
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 124
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln
1 5 10
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 125
Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser
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<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 126
Gln Ser Tyr Asp Thr Arg Asp Val Val
1 5
<210> 127
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 127
Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 128
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 128
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 129
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 130
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 130
Gly Tyr Ile Tyr Lys Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ser Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Ser Arg Val
<210> 131
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 131
Ile Tyr Lys Ser Gly Ser Ala Tyr
1 5
<210> 132
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 132
Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro
1 5 10
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 133
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln
1 5 10
<210> 134
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 134
Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 135
Gln Thr Tyr Asp Ser Ile Asp Val Tyr
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<210> 136
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 136
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<210> 137
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 137
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr
1 5
<210> 138
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 138
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 139
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 139
Gly Tyr Ile Tyr Lys Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ser Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Ser Arg Val
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 140
Ile Tyr Lys Ser Gly Ser Ala Tyr
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<210> 141
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 141
Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro
1 5 10
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 142
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 143
Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser
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<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 144
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 145
Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 146
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 147
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 148
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 148
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Asn Tyr Trp Asn Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Ser Arg Val
<210> 149
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 149
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Asn Tyr
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<210> 150
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 150
Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 151
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 151
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln
1 5 10
<210> 152
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 152
Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser
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<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 153
Gln Ser Tyr Asp Thr Arg Asp Val Val
1 5
<210> 154
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 154
Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 155
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 155
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr
1 5
<210> 156
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 156
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 157
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 157
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Asn Tyr Trp Asn Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Ser Arg Val
<210> 158
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 158
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Asn Tyr
1 5
<210> 159
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 159
Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro
1 5 10
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 160
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln
1 5 10
<210> 161
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 161
Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 162
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 162
Gln Thr Tyr Asp Ser Ile Asp Val Tyr
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<210> 163
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 163
Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 164
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 164
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr
1 5
<210> 165
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 165
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 166
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 166
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Asn Tyr Trp Asn Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Ser Arg Val
<210> 167
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 167
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Asn Tyr
1 5
<210> 168
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 168
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1 5 10
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 169
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1 5 10
<210> 170
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 170
Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 171
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 171
Gln Ser Tyr Asp Thr Leu Asn Val Tyr
1 5
<210> 172
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 172
Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 173
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 173
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr
1 5
<210> 174
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 174
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 175
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 175
Gly Tyr Ile Tyr Lys Ser Gly Ser Asn Tyr Trp Asn Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Ser Arg Val
<210> 176
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 176
Ile Tyr Lys Ser Gly Ser Asn Tyr
1 5
<210> 177
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 177
Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 178
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 178
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln
1 5 10
<210> 179
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 179
Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 180
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 180
Gln Ser Tyr Asp Thr Arg Asp Val Val
1 5
<210> 181
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 181
Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 182
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 182
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr
1 5
<210> 183
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 183
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 184
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 184
Gly Tyr Ile Tyr Lys Ser Gly Ser Asn Tyr Trp Asn Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Ser Arg Val
<210> 185
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 185
Ile Tyr Lys Ser Gly Ser Asn Tyr
1 5
<210> 186
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 186
Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro
1 5 10
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 187
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln
1 5 10
<210> 188
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 188
Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser
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<210> 189
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 189
Gln Thr Tyr Asp Ser Ile Asp Val Tyr
1 5
<210> 190
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 190
Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 191
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 191
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr
1 5
<210> 192
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 192
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 193
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 193
Gly Tyr Ile Tyr Lys Ser Gly Ser Asn Tyr Trp Asn Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Ser Arg Val
<210> 194
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 194
Ile Tyr Lys Ser Gly Ser Asn Tyr
1 5
<210> 195
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 195
Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 196
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 196
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln
1 5 10
<210> 197
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 197
Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 198
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 198
Gln Ser Tyr Asp Thr Leu Asn Val Tyr
1 5
<210> 199
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 199
Ser Gly Tyr Tyr Trp Gly
1 5
<210> 200
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 200
Tyr Ser Ile Ser Ser Gly Tyr
1 5
<210> 201
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 201
Tyr Ser Ile Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Gly
1 5 10
<210> 202
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 202
Gly Leu Ser Tyr His Thr Arg Ser Thr Tyr Tyr Asp Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Ser Arg Val
<210> 203
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 203
Ser Tyr His Thr Arg Ser Thr Tyr
1 5
<210> 204
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 204
Glu Ala Tyr Ser Asp Arg Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 205
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 205
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asp Tyr Val Gln
1 5 10
<210> 206
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 206
Ala Asp Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 207
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 207
Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Ile Val Ile
1 5
<210> 208
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 208
Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 209
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 209
Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 210
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 210
Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 211
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 211
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
1 5 10 15
Gln Gly Arg Val
20
<210> 212
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 212
Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn
1 5
<210> 213
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 213
Val Asp Arg Tyr Tyr Asn Trp Asn Tyr Phe Leu Gly Ser Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 214
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 214
Gly Gly Asn Asn Ile Arg Ser Lys Ser Val His
1 5 10
<210> 215
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 215
Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser
1 5
<210> 216
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 216
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His His Val
1 5 10
<210> 217
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 217
Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 218
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 218
Gly Tyr Ile Tyr Lys Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ser Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Ser Arg Val
<210> 219
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 219
Thr Pro Thr Val Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 220
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 220
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln
1 5 10
<210> 221
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 221
Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 222
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 222
Gln Thr Tyr Asp Ser Ile Asp Val Tyr
1 5
<210> 223
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成6xHis标签
<400> 223
His His His His His His
1 5
<210> 224
<211> 153
<212> PRT
<213> 智人
<400> 224
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 225
<211> 154
<212> PRT
<213> 食蟹猕猴(Macaca fascicularis)
<400> 225
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Arg His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Ser Phe His Leu Arg Asp Thr Lys Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val
100 105 110
Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Leu Met Cys Glu Tyr
115 120 125
Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr
130 135 140
Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150

Claims (10)

1.特异性结合人IL-2(hIL-2)的经分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合hIL-2的螺旋A和C以及B-C环。
2.特异性结合人IL-2(hIL-2)的经分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体将hIL-2与IL-2Rα的结合亲和力降低1至199倍。
3.特异性结合人IL-2(hIL-2)的经分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体：
(a)降低hIL-2与IL-2Rα和IL-2Rβ的结合，并且抑制CD8+T细胞中的活性至比调节性T(Treg)细胞中更高的程度；
(b)降低hIL-2与IL-2Rα和IL-2Rβ的结合，并且抑制CD8+T细胞中的STAT5磷酸化至比调节性T(Treg)细胞中更高的程度；
(c)降低hIL-2与IL-2Rα和IL-2Rβ的结合，并且通过在外周血单核细胞(PBMC)培养物或重构测定中所测量的，增加调节性T细胞(Treg)与CD8+或CD4+T细胞或NK细胞的比率；或
(d)降低hIL-2与IL-2Rα和IL-2Rβ的结合，并且增加调节性T(Treg)细胞中FOXP3、CD25和Icos中的一种或多种的表达。
4.特异性结合人IL-2的经分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体包含：
(i)(a)包含SEQ ID NO:73、74或75的HCDR1；包含SEQ ID NO:76或77的HCDR2；包含SEQID NO:78的HCDR3；包含SEQ ID NO:79的LCDR1；包含SEQ ID NO:80的LCDR2；和包含SEQ IDNO:81的LCDR3；
(b)包含SEQ ID NO:82、83或84的HCDR1；包含SEQ ID NO:85或86的HCDR2；包含SEQ IDNO:87的HCDR3；包含SEQ ID NO:88的LCDR1；包含SEQ ID NO:89的LCDR2；和包含SEQ ID NO:90的LCDR3；
(c)包含SEQ ID NO:91、92或93的HCDR1；包含SEQ ID NO:94或95的HCDR2；包含SEQ IDNO:96的HCDR3；包含SEQ ID NO:97的LCDR1；包含SEQ ID NO:98的LCDR2；和包含SEQ ID NO:99的LCDR3；
(d)包含SEQ ID NO:100、101或102的HCDR1；包含SEQ ID NO:103或104的HCDR2；包含SEQ ID NO:105的HCDR3；包含SEQ ID NO:106的LCDR1；包含SEQ ID NO:107的LCDR2；和包含SEQ ID NO:108的LCDR3；
(e)包含SEQ ID NO:109、110或111的HCDR1；包含SEQ ID NO:112或113的HCDR2；包含SEQ ID NO:114的HCDR3；包含SEQ ID NO:115的LCDR1；包含SEQ ID NO:116的LCDR2；和包含SEQ ID NO:117的LCDR3；
(f)包含SEQ ID NO:118、119或120的HCDR1；包含SEQ ID NO:121或122的HCDR2；包含SEQ ID NO:123的HCDR3；包含SEQ ID NO:124的LCDR1；包含SEQ ID NO:125的LCDR2；和包含SEQ ID NO:126的LCDR3；
(g)包含SEQ ID NO:127、128或129的HCDR1；包含SEQ ID NO:130或131的HCDR2；包含SEQ ID NO:132的HCDR3；包含SEQ ID NO:133的LCDR1；包含SEQ ID NO:134的LCDR2；和包含SEQ ID NO:135的LCDR3；
(h)包含SEQ ID NO:136、137或138的HCDR1；包含SEQ ID NO:139或140的HCDR2；包含SEQ ID NO:141的HCDR3；包含SEQ ID NO:142的LCDR1；包含SEQ ID NO:143的LCDR2；和包含SEQ ID NO:144的LCDR3；
(i)包含SEQ ID NO:145、146或147的HCDR1；包含SEQ ID NO:148或149的HCDR2；包含SEQ ID NO:150的HCDR3；包含SEQ ID NO:151的LCDR1；包含SEQ ID NO:152的LCDR2；和包含SEQ ID NO:153的LCDR3；
(j)包含SEQ ID NO:154、155或156的HCDR1；包含SEQ ID NO:157或158的HCDR2；包含SEQ ID NO:159的HCDR3；包含SEQ ID NO:160的LCDR1；包含SEQ ID NO:161的LCDR2；和包含SEQ ID NO:162的LCDR3；
(k)包含SEQ ID NO:163、164或165的HCDR1；包含SEQ ID NO:166或167的HCDR2；包含SEQ ID NO:168的HCDR3；包含SEQ ID NO:169的LCDR1；包含SEQ ID NO:170的LCDR2；和包含SEQ ID NO:171的LCDR3；
(1)包含SEQ ID NO:172、173或174的HCDR1；包含SEQ ID NO:175或176的HCDR2；包含SEQ ID NO:177的HCDR3；包含SEQ ID NO:178的LCDR1；包含SEQ ID NO:179的LCDR2；和包含SEQ ID NO:180的LCDR3；
(m)包含SEQ ID NO:181、182或183的HCDR1；包含SEQ ID NO:184或185的HCDR2；包含SEQ ID NO:186的HCDR3；包含SEQ ID NO:187的LCDR1；包含SEQ ID NO:188的LCDR2；和包含SEQ ID NO:189的LCDR3；
(n)包含SEQ ID NO:190、191或192的HCDR1；包含SEQ ID NO:193或194的HCDR2；包含SEQ ID NO:195的HCDR3；包含SEQ ID NO:196的LCDR1；包含SEQ ID NO:197的LCDR2；和包含SEQ ID NO:198的LCDR3；
(o)包含SEQ ID NO:199、200或201的HCDR1；包含SEQ ID NO:202或203的HCDR2；包含SEQ ID NO:204的HCDR3；包含SEQ ID NO:205的LCDR1；包含SEQ ID NO:206的LCDR2；和包含SEQ ID NO:207的LCDR3；
(p)包含SEQ ID NO:208、209或210的HCDR1；包含SEQ ID NO:211或212的HCDR2；包含SEQ ID NO:213的HCDR3；包含SEQ ID NO:214的LCDR1；包含SEQ ID NO:215的LCDR2；和包含SEQ ID NO:216的LCDR3；或
(q)包含SEQ ID NO:217的HCDR1；包含SEQ ID NO:218的HCDR2；包含SEQ ID NO:219的HCDR3；包含SEQ ID NO:220的LCDR1；包含SEQ ID NO:221的LCDR2；和包含SEQ ID NO:222的LCDR3；
(ii)包含以下的重链可变结构域(VH)：
a)表7中所示的SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或71中的HCDR3；或
b)表7中所示的SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或71中的HCDR1-3；
(iii)包含以下的轻链可变结构域(VL)：
a)表7中所示的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或72中的LCDR3；或
b)表7中所示的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或72中的LCDR1-3；
(iv)包含以下的重链可变结构域(VH)：
a)表7中所示的SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或71中的HCDR3；或
b)表7中所示的SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或71中的HCDR1-3；或
c)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或71的氨基酸序列；
(v)包含以下的轻链可变结构域(VL)：
a)表7中所示的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或72中的LCDR3；或
b)表7中所示的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或72中的LCDR1-3；或
c)SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或72的氨基酸序列；
(vi)表7中所示的以下序列中所示的HCDR1-3和LCDR1-3氨基酸序列：
a)分别为SEQ ID NO:1和2；
b)分别为SEQ ID NO:3和4；
c)分别为SEQ ID NO:5和6；
d)分别为SEQ ID NO:7和8；
e)分别为SEQ ID NO:9和10；
f)分别为SEQ ID NO:11和12；
g)分别为SEQ ID NO:13和14；
h)分别为SEQ ID NO:15和16；
i)分别为SEQ ID NO:17和18；
j)分别为SEQ ID NO:19和20；
k)分别为SEQ ID NO:21和22；
1)分别为SEQ ID NO:23和24；
m)分别为SEQ ID NO:25和26；
n)分别为SEQ ID NO:27和28；
o)分别为SEQ ID NO:29和30；
p)分别为SEQ ID NO:31和32；或
q)分别为SEQ ID NO:71和72；
(vii)以下序列中所示的氨基酸序列：
a)分别为SEQ ID NO:1和2；
b)分别为SEQ ID NO:3和4；
c)分别为SEQ ID NO:5和6；
d)分别为SEQ ID NO:7和8；
e)分别为SEQ ID NO:9和10；
f)分别为SEQ ID NO:11和12；
g)分别为SEQ ID NO:13和14；
h)分别为SEQ ID NO:15和16；
i)分别为SEQ ID NO:17和18；
j)分别为SEQ ID NO:19和20；
k)分别为SEQ ID NO:21和22；
l)分别为SEQ ID NO:23和24；
m)分别为SEQ ID NO:25和26；
n)分别为SEQ ID NO:27和28；
o)分别为SEQ ID NO:29和30；
p)分别为SEQ ID NO:31和32；或
q)分别为SEQ ID NO:71和72。
5.经分离的核酸，所述经分离的核酸编码权利要求7所述的抗体或抗原结合部分的重链、轻链或两者。
6.经分离的核酸，所述经分离的核酸编码特异性结合人白细胞介素-2(hIL-2)的抗体或其抗原结合部分的重链、轻链或两者，其中所述核酸包含：
a)SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64或66的核苷酸序列；
b)SEQ ID NO:37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65或67的核苷酸序列；或
c)下述核苷酸序列对之一：
SEQ ID NO:36和37，
SEQ ID NO:38和39，
SEQ ID NO:40和41，
SEQ ID NO:42和43，
SEQ ID NO:44和45，
SEQ ID NO:46和47，
SEQ ID NO:48和49，
SEQ ID NO:50和51，
SEQ ID NO:52和53，
SEQ ID NO:54和55，
SEQ ID NO:56和57，
SEQ ID NO:58和59，
SEQ ID NO:60和61，
SEQ ID NO:62和63，
SEQ ID NO:64和65，或
SEQ ID NO:66和67。
7.载体，所述载体包含权利要求6所述的核酸。
8.宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求7所述的核酸。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
10.生产特异性结合人白细胞介素-2(hIL-2)的抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括：
a)在允许所述抗体或抗原结合部分表达的条件下培养权利要求9所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码所述抗体或抗原结合部分的重链和轻链的核苷酸序列，和
b)从培养物中分离所述抗体或抗原结合部分。
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