CN105026426A - 血小板衍生生长因子b之特异性抗体及其组合物和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供与PDGF-B特异性结合之抗体或其抗原结合片段。本发明进一步提供一种获得这些抗体及编码这些抗体之核酸的方法。本发明进一步涉及使用这些抗体以治疗及/或预防PDGF-B介导的疾病、疾患或症状之组合物及治疗方法。

Description

血小板衍生生长因子B之特异性抗体及其组合物和用途
技术领域
本发明关于与血小板衍生生长因子B(PDGF-B)特异性结合之抗体，例如全长抗体及其抗原结合片段。本发明进一步关于包含PDGF-B抗体之组合物，及使用所述抗体作为药物之方法。PDGF-B抗体可用于治疗及预防由PDGF-B与PDGFRβ(包括PDGFRββ同源二聚体受体及PDGFRαβ异源二聚体受体)结合所介导之疾病和疾患。
背景技术
许多慢性疾病之特征为持续不断之发炎、受伤、组织重构及纤维化。例如，在进行性肾病包括糖尿病肾病、IgA肾病及增生性狼疮性肾炎之病患中，这些疾病的组织学特征为系膜细胞扩张及肾小球和肾小管间质性纤维化。在这方面，血小板衍生生长因子(PDGF)受体β之配体可能是到目前为止特征描述最完整之介导物。
PDGF是间叶及神经外胚层来源之细胞的主要有丝分裂原。PDGF家族由四个不同的多肽链组成，分别为PDGF-A、B、C及D，其藉由同源二聚化及异源二聚化形成5种不同的蛋白质PDGF-AA、-AB、-BB、-CC及-DD。PDGF藉由活化二种结构相关之酪氨酸激酶受体PDGF-Rα及β展现其生物学活性，所述受体形成同源二聚体及异源二聚体(例如PDGFRαα、PDGFRαβ、PDGFRββ)。PDGF-A活化PDGFRαα，而PDGF-B可活化所有三种受体二聚体，即PDGF-Rαα、PDGF-Rαβ、PDGF-Rββ。PDGF-AB及PDGF-C活化PDGF-Rαα及PDGF-Rαβ，然而PDGF-D优先活化PDGF-Rββ，见Trojanowska之综述(2008,Rheumatology 47:v2-v4)。
PDGF已被认为与广泛种类之人疾病有关，包括但不限于动脉粥样硬化、再狭窄、肺动脉高压、视网膜血管疾病、器官纤维化(例如心肌、肺、肾)、类风湿性关节炎、骨关节炎、肿瘤形成及系统性硬化症(SSc；硬皮症)(见例如Trojanowska,2008,Rheumatology 47:v2-v4；Andrae et al.2008Genes Dev.22:1276-1312)。
更特别地，所有四种PDGF同种型以及两种受体链皆于肾脏表达，PDGF于肾小球及/或间质位置之表达增加已在多种肾病中记录。此外，PDGF受体的表达增加发生于实验性及人的肾病。PDGF-B及PDGF-D两者似乎对人肾病特别重要。系膜细胞体外产生PDGF-B，且许多生长因子经由诱导自分泌或旁分泌的PDGF-B链分泌而诱发系膜细胞增生(Silver etal.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1056–1060；Floege et al.,1991,Clin.Exp.Immunol.86:334-341)。PDGF-B链之过表达诱导系膜细胞增生及基质扩张(Floege et al.,1993,J.Clin.Invest.92:2952–2962；Isaka et al.,1993,J.Clin.Invest.92:2597–2601)，且PDGF-B链或β受体敲除小鼠无法发育肾小球膜(Leveen et al.,1994,Genes Dev.8:1875–1887；Soriano P.,1994,GenesDev.8:1888-1896)。
利用抗体、适体、可溶性PDGF受体或PDGFβ受体酪氨酸激酶阻断剂特定抑制PDGF-B，可在一些不同的临床前模型中减少系膜细胞增生性变化、防止长期肾瘢痕形成且改善肾功能(Floege et al.,1999,Am.J.Pathol.154:169–179；Gilbert et al.,2001,Kidney Int.59:1324–1332；Nakamuraet al.,2001,Kidney Int.59:2134–2145；Ostendorf et al.,2001,J.Am.Soc.Nephrol.12:909-918)。
同样地，肝纤维化常见于慢性肝脏损伤。肝纤维生成的主要事件为肝星状细胞及肌纤维母细胞增生及由肝星状细胞及肌纤维母细胞产生胶原蛋白。如同肾小球性肾炎，PDGF为强烈有丝分裂原，造成肝星状细胞及肌纤维母细胞之趋化性(Czochra et al.,2006,J.Hepatol.45:419-28)。在人肝硬化肝脏中，PDGF-BB及PDGFRβ蛋白表达相较于正常肝脏显著增加(Ikuraet al.,1997,J Gastroenterol.32:496-501)。在藉由胆管结扎(BDL)诱导之大鼠胆汁郁积性肝损伤模型中，已发现胆管区段、胆管上皮细胞、浸润性巨噬细胞及肝星状细胞中的PDGF-B mRNA表达及PDGF-BB蛋白产生增加(Kinnman et al.,2000,Lab.Invest.80:697–707；Grappone et al.,1999,J.Hepatol.31:100–109；Bonner,JC,2004,Cytokine Growth Factor Rev.15:255-273)。最近，抗体抑制PDGF-B/PDGF-Rβ受体结合减少肝纤维化之发展(Ogawa etal.,2010,Hepatol.Res.40:1128-1141)，显示PDGF-B信号传导于肝纤维化之作用。
经由PDGFRβ的PDGF-BB诱发之信号传导强烈促使肝星状细胞增生、迁移及表型变成肌纤维母细胞，随后发生胶原蛋白沉积及纤维生成(Kinnman et al.,2001,Lab.Invest.81:1709–1716；Kinnman et al.,2003,Lab.Invest.83:163-173)。在BDL诱导之大鼠肝纤维化模型中，藉由反义、阻断性mAb、显性阴性可溶性PDGFRβ或伊马替尼(STI571、 其为PDGFRα及β之酪氨酸激酶包括抑制剂)抑制PDGF-B之作用，减少肝脏羟基脯氨酸含量及PDGF-B、PDGFRβ及第1型胶原蛋白的mRNA表达(Ogawa et al.,2010,Hepatol.Res.40:1128–1141；Kinnman et al.,2000,Lab.Invest.80:697–707；Kinnman et al.,2001,Lab.Invest.81:1709-1716；Kinnman et al.,2003,Lab.Invest.83:163–173；Borkham et al.,2004,Biochem.Biophys.Res.Commun.321:413–423；Borkham et al.,2004,Lab.Invest.84:766–777；Neef et al.,2006,J.Hepatol.44:167-175)。
综合在临床前纤维化模型观察到的数据，特别是肾及肝模型，强调藉由抑制PDGF-B/PDGFRβ结合及/或信号传导所介导之重要潜在治疗效应，以限制非想要的细胞外基质沉积及维持器官功能。
总结来说，由PDGF-AB及/或PDGF-BB信号传导经由这些配体(包括PDGF-B)与PDGFRβ之相互作用所介导之纤维化疾病和疾患造成严重的人类疾病和死亡。因此，长久以来一直需要新颖的有效治疗剂以治疗或改善这些疾病/疾患，本发明符合这项需求。
发明内容
本发明包括与PDGF-B特异性结合之经分离之抗体或其抗原结合片段，其包含：包含SEQ ID NO:6之重链可变区(VH)氨基酸序列之VH互补决定区1(CDR-H1)、CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含SEQ ID NO:4之轻链可变区(VL)氨基酸序列之VL CDR1(CDR-L1)、CDR-L2及CDR-L3之VL。
在一方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:6之VH氨基酸序列之CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含SEQ ID NO:4之VL氨基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL。
在另一方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:7之CDR-H1氨基酸序列、SEQ ID NO:8之CDR-H2氨基酸序列及SEQ ID NO:9之CDR-H3氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:10之CDR-L1氨基酸序列、SEQ IDNO:11之CDR-L2氨基酸序列及SEQ ID NO:12之CDR-L3氨基酸序列之VL。
在又一方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:8之CDR-H2氨基酸序列及SEQ ID NO:9之CDR-H3氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:10之CDR-L1氨基酸序列、SEQ ID NO:11之CDR-L2氨基酸序列及SEQ IDNO:12之CDR-L3氨基酸序列之VL。
在另一方面中，该抗体包含：包含由以MOR8457-GL-VH(ATCC编号PTA-13303)保藏之载体的多核苷酸插入物所编码之VH氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含由以MOR8457-GL-VL(ATCC编号PTA-13302)保藏之载体的多核苷酸插入物所编码之VL氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之轻链可变区(VL)。
在一方面中，该抗体包含：包含由以MOR8457-GL-VH(ATCC编号PTA-13303)保藏之载体的多核苷酸插入物所编码之VH氨基酸序列的CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含由以MOR8457-GL-VL(ATCC编号PTA-13302)保藏之载体的多核苷酸插入物所编码之VL氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL。
在另一方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:2之氨基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列的VL。
在另一方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:6之氨基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO:4之氨基酸序列的VL。
在另一方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:6之氨基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列的VL。
在其它方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:2之氨基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO:4之氨基酸序列的VL。
在另一方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:14之序列的重链，及包含SEQ ID NO:16之氨基酸序列的轻链。
在一方面中，该抗体包含：包含由SEQ ID NO:5之核酸序列所编码之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，及由SEQ ID NO:3之核酸序列所编码之VL CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在另一方面中，该抗体包含：包含由SEQ ID NO:5之核酸序列所编码之CDR-H2及CDR-H3之VH，及由SEQ ID NO:3之核酸序列所编码之VLCDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在另一方面中，该抗体包含：由SEQ ID NO:5之核酸序列所编码之VH，及由SEQ ID NO:3之核酸序列所编码之VL。
在其它方面中，该抗体包含：由SEQ ID NO:13之核酸序列所编码之重链，及由SEQ ID NO:15之核酸序列所编码之轻链。
在另一方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:44之VH氨基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含SEQ ID NO:39之VL氨基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL。
在其它方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:44之VH氨基酸序列之CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含SEQ ID NO:39之VL氨基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL。
在又一方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:7之CDR-H1氨基酸序列、SEQ ID NO:8之CDR-H2氨基酸序列及SEQ ID NO:9之CDR-H3氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:10之CDR-L1氨基酸序列、SEQ IDNO:41之CDR-L2氨基酸序列及SEQ ID NO:12之CDR-L3氨基酸序列之VL。
在另一方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:8之CDR-H2氨基酸序列及SEQ ID NO:9之CDR-H3氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:10之CDR-L1氨基酸序列、SEQ ID NO:41之CDR-L2氨基酸序列及SEQ IDNO:12之CDR-L3氨基酸序列之VL。
在一方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:44之氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之VL。
在另一方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:46之序列的重链，及包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列的轻链。
在一方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:44之VH氨基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含SEQ ID NO:34之VL氨基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL。
在其它方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:44之VH氨基酸序列之CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含SEQ ID NO:34之VL氨基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL。
在另一方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:7之CDR-H1氨基酸序列、SEQ ID NO:8之CDR-H2氨基酸序列及SEQ ID NO:9之CDR-H3氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:10之CDR-L1氨基酸序列、SEQ IDNO:11之CDR-L2氨基酸序列及SEQ ID NO:36之CDR-L3氨基酸序列之VL。
在其它方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:8之CDR-H2氨基酸序列及SEQ ID NO:9之CDR-H3氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:10之CDR-L1氨基酸序列、SEQ ID NO:11之CDR-L2氨基酸序列及SEQ IDNO:36之CDR-L3氨基酸序列之VL。
在另一方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:44之氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:34之氨基酸序列之VL。
在其它方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:46之序列的重链，及包含SEQ ID NO:37之氨基酸序列的轻链。
本发明包括编码抗体或其抗原结合片段之经分离之核酸，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:6之重链可变区(VH)氨基酸序列之VH互补决定区1(CDR-H1)、CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含SEQ ID NO:4之轻链可变区(VL)氨基酸序列之VL CDR1(CDR-L1)、CDR-L2及CDR-L3之VL。
在一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含SEQ ID NO:6之VH氨基酸序列之CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含SEQ ID NO:4之VL氨基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL。
在另一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含SEQ ID NO:7之CDR-H1氨基酸序列、SEQ ID NO:8之CDR-H2氨基酸序列及SEQ IDNO:9之CDR-H3氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:10之CDR-L1氨基酸序列、SEQ ID NO:11之CDR-L2氨基酸序列及SEQ ID NO:12之CDR-L3氨基酸序列之VL。
在又一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含SEQ ID NO:8之CDR-H2氨基酸序列及SEQ ID NO:9之CDR-H3氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:10之CDR-L1氨基酸序列、SEQ ID NO:11之CDR-L2氨基酸序列及SEQ ID NO:12之CDR-L3氨基酸序列之VL。
在另一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含由以MOR8457-GL-VH(ATCC编号PTA-13303)保藏之载体的多核苷酸插入物所编码之VH氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含由以MOR8457-GL-VL(ATCC编号PTA-13302)保藏之载体的多核苷酸插入物所编码之VL氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之轻链可变区(VL)。
在一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含由以MOR8457-GL-VH(ATCC编号PTA-13303)保藏之载体的多核苷酸插入物所编码之VH氨基酸序列的CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含由以MOR8457-GL-VL(ATCC编号PTA-13302)保藏之载体的多核苷酸插入物所编码之VL氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL。
在另一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含SEQ ID NO:2之氨基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列的VL。
在另一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含SEQ ID NO:6之氨基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO:4之氨基酸序列的VL。
在又一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含SEQ ID NO:6之氨基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列的VL。
在其它方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含SEQ ID NO:2之氨基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO:4之氨基酸序列的VL。
在另一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含SEQ ID NO:14之序列的重链，及包含SEQ ID NO:16之氨基酸序列的轻链。
在另一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含SEQ ID NO:44之VH氨基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含SEQ IDNO:39之VL氨基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL。
在其它方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含SEQ ID NO:44之VH氨基酸序列之CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含SEQ ID NO:39之VL氨基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL。
在另一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含SEQ ID NO:7之CDR-H1氨基酸序列、SEQ ID NO:8之CDR-H2氨基酸序列及SEQ IDNO:9之CDR-H3氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:10之CDR-L1氨基酸序列、SEQ ID NO:41之CDR-L2氨基酸序列及SEQ ID NO:12之CDR-L3氨基酸序列之VL。
在又一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含SEQ ID NO:8之CDR-H2氨基酸序列及SEQ ID NO:9之CDR-H3氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:10之CDR-L1氨基酸序列、SEQ ID NO:41之CDR-L2氨基酸序列及SEQ ID NO:12之CDR-L3氨基酸序列之VL。
在一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含SEQ ID NO:44之氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之VL。
在另一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含SEQ ID NO:46之序列的重链，及包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列的轻链。
在一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含SEQ ID NO:44之VH氨基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含SEQ IDNO:34之VL氨基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL。
在其它方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含SEQ ID NO:44之VH氨基酸序列之CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含SEQ ID NO:34之VL氨基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL。
在另一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含SEQ ID NO:7之CDR-H1氨基酸序列、SEQ ID NO:8之CDR-H2氨基酸序列及SEQ IDNO:9之CDR-H3氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:10之CDR-L1氨基酸序列、SEQ ID NO:11之CDR-L2氨基酸序列及SEQ ID NO:36之CDR-L3氨基酸序列之VL。
在其它方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含SEQ ID NO:8之CDR-H2氨基酸序列及SEQ ID NO:9之CDR-H3氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:10之CDR-L1氨基酸序列、SEQ ID NO:11之CDR-L2氨基酸序列及SEQ ID NO:36之CDR-L3氨基酸序列之VL。
在另一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含SEQ ID NO:44之氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:34之氨基酸序列之VL。
在其它方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:46之序列的重链，及包含SEQ ID NO:37之氨基酸序列的轻链。
在一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含由SEQ ID NO:5之核酸序列所编码之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，及由SEQ ID NO:3之核酸序列所编码之VL CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在另一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含由SEQ ID NO:5之核酸序列所编码之CDR-H2及CDR-H3之VH，及由SEQ ID NO:3之核酸序列所编码之VL CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在另一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：由SEQ ID NO:5之核酸序列所编码之VH，及由SEQ ID NO:3之核酸序列所编码之VL。
在其它方面中，该核酸编码包含下列之抗体：由SEQ ID NO:13之核酸序列所编码之重链，及由SEQ ID NO:15之核酸序列所编码之轻链。
本发明包括一种编码与PDGF-B特异性结合之抗体或其抗原结合片段之经分离之核酸，其中该核酸包含SEQ ID NO:3之核酸序列。
在一方面中，该核酸包含SEQ ID NO:5之核酸序列。
在另一方面中，该核酸包含SEQ ID NO:13之核酸序列。
在又一方面中，该核酸包含SEQ ID NO:15之核酸序列。
在其它方面中，该核酸包含SEQ ID NO:3之核酸序列及SEQ ID NO:5之核酸序列。
在另一方面中，该核酸包含SEQ ID NO:13之核酸序列及SEQ IDNO:15之核酸序列。
在又一方面中，该核酸包含具有ATCC编号PTA-13303之保藏载体MOR8457-GL-VH之插入物的核酸序列。
在另一方面中，该核酸包含具有ATCC编号PTA-13302之保藏载体MOR8457-GL-VL之插入物的核酸序列。
在一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含由SEQ ID NO:45之核酸序列所编码之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，及由SEQ IDNO:35之核酸序列所编码之VL CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在另一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含由SEQ ID NO:45之核酸序列所编码之CDR-H2及CDR-H3之VH，及由SEQ ID NO:35之核酸序列所编码之VL CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在另一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：由SEQ ID NO:45之核酸序列所编码之VH，及由SEQ ID NO:35之核酸序列所编码之VL。
在其它方面中，该核酸编码包含下列之抗体：由SEQ ID NO:47之核酸序列所编码之重链，及由SEQ ID NO:38之核酸序列所编码之轻链。
在一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含由SEQ ID NO:45之核酸序列所编码之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，及由SEQ IDNO:40之核酸序列所编码之VL CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在另一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：包含由SEQ ID NO:45之核酸序列所编码之CDR-H2及CDR-H3之VH，及由SEQ ID NO:40之核酸序列所编码之VL CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在另一方面中，该核酸编码包含下列之抗体：由SEQ ID NO:45之核酸序列所编码之VH，及由SEQ ID NO:40之核酸序列所编码之VL。
在其它方面中，该核酸编码包含下列之抗体：由SEQ ID NO:47之核酸序列所编码之重链，及由SEQ ID NO:43之核酸序列所编码之轻链。
在其它方面中，该核酸包含SEQ ID NO:35之核酸序列。
在另一方面中，该核酸包含SEQ ID NO:40之核酸序列。
在一方面中，该核酸包含SEQ ID NO:45之核酸序列。
在另一方面中，该核酸包含SEQ ID NO:38之核酸序列。
在又一方面中，该核酸包含SEQ ID NO:43之核酸序列。
在其它方面中，该核酸包含SEQ ID NO:47之核酸序列。
在另一方面中，该核酸包含SEQ ID NO:35及SEQ ID NO:45之核酸序列。
在一方面中，该核酸包含SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:45之核酸序列。
在其它方面中，该核酸包含SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:47之核酸序列。
在另一方面中，该核酸包含SEQ ID NO:43及SEQ ID NO:47之核酸序列。
在一方面中，本发明包括包含该核酸之宿主细胞。
在一方面中，本发明包括包含该核酸之载体。
在另一方面中，本发明包括包含该载体之宿主细胞。
在又一方面中，该宿主细胞系细菌细胞或哺乳动物细胞。
本发明包括一种产生与PDGF-B特异性结合之抗体或其抗原结合片段之方法，该方法包括在使该抗体得以表达之条件下培养宿主细胞，且进一步包括分离该抗体。
本发明包括权利要求1之经分离之抗体或其抗原结合片段，其中该VL包含SEQ ID NO:4之氨基酸序列且进一步包含至少一个非CDR内之氨基酸的氨基酸取代。
在另一方面中，该抗体包含含有SEQ ID NO:6之氨基酸序列且进一步包含至少一个非CDR内之氨基酸的氨基酸取代之VH。
在又一方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:4之氨基酸序列且进一步包含至少一个非CDR内之氨基酸的氨基酸取代之VL，及包含SEQ IDNO:6之氨基酸序列且进一步包含至少一个非CDR内之氨基酸的氨基酸取代之VH。
本发明包括一种与PDGF-B特异性结合之经分离之抗体或其抗原结合片段，其中该抗体与如本文揭示之抗体结合相同表位，或如同如本文揭示之抗体与PDGFRββ上结合PDGF-B之结合位点重迭，且其中该抗体不是AbyD3263。
本发明包括一种与PDGF-B特异性结合之经分离之抗体或其抗原结合片段，其中该抗体与PDGFRββ交叉竞争与PDGF-B之结合，且进一步，其中该抗体以2pM至100pM之KD与PDGF-B结合。
在一方面中，该抗体与PDGF-BB上之至少一个表位结合，其中该表位系选自：
包含相应于SEQ ID NO:33之氨基酸序列之残基Leu 38、Val 39、Trp40、Asn 54、Arg 56、Glu 71、Arg 73、Ile 75、Ile 77、Arg 79、Lys 80、Lys 81、Pro 82、Ile 83、Phe 84、Lys 85及Lys 86的表位；及
包含相应于SEQ ID NO:33之氨基酸序列之残基Trp 40、Asn 54、Glu71、Arg 73、Ile 75、Glu 76、Ile 77、Arg 79、Lys 80、Lys 81、Pro 82、Ile83、Phe 84、Lys 85及Lys 86的表位。
在另一方面中，该抗体包含抗体决定簇，其中该抗体决定簇包含至少一个选自下列之氨基酸：基于相应于SEQ ID NO:1之序列的卡巴(Kabat)编号之氨基酸残基G28、S29、Y30、F31、D49、D50、F90、T91、H92、N93、S94及基于相应于SEQ ID NO:2之序列的卡巴编号之氨基酸残基Y50、L57、Y59、Y60、D62、W102、Y103、G104、G105。
在另一方面中，该抗体决定簇可另包含基于相应于SEQ ID NO:1之序列的卡巴编号之氨基酸残基N65及/或基于相应于SEQ ID NO:2之序列的卡巴编号之残基W47。
本发明包括一种经分离之抗体或其抗原结合片段，其中该抗体以约2pM至69pM之KD与PDGF-B特异性结合、与PDGFRβ交叉竞争与PDGF-B之结合及抑制由PDGF-B与PDGFβ结合所介导之活性。
在一方面中，该由PDGF-B与PDGFβ结合所介导之活性为选自下列中至少一者：该PDGFRβ之磷酸化、诱导细胞增生、诱导细胞迁移及增加细胞外基质沉积。
本发明包括一种以约13pM之KD与人PDGF-BB特异性结合之经分离之抗体或其抗原结合片段，其中该抗体：
(a)与PDGFββ交叉竞争与PDGF-BB之结合；
(b)与至少一种选自下列之表位结合：
(i)包含相应于SEQ ID NO:33之氨基酸序列之残基Leu 38、Val39、Trp 40、Asn 54、Arg 56、Glu 71、Arg 73、Ile 75、Ile 77、Arg 79、Lys 80、Lys 81、Pro 82、Ile 83、Phe 84、Lys 85及Lys 86的表位；及
(ii)包含相应于SEQ ID NO:33之氨基酸序列之残基Trp 40、Asn 54、Glu 71、Arg 73、Ile 75、Glu 76、Ile 77、Arg 79、Lys 80、Lys81、Pro 82、Ile 83、Phe 84、Lys 85及Lys 86的表位；
其中所述表位在PDGF-BB上相隔约
(c)包含抗体决定簇，该抗体决定簇包含基于相应于SEQ ID NO:1之序列的卡巴编号之氨基酸残基G28、S29、Y30、F31、D49、D50、F90、T91、H92、N93、S94及根据SEQ ID NO:2之序列的卡巴编号之氨基酸残基Y50、L57、Y59、Y60、D62、W102、Y103、G104、G105；且
(d)其中该抗体决定簇之氨基酸残基以下列方式与该表位之氨基酸残基在内接触：
(i)对该轻链可变结构域，Trp 47与PDGF-B之Lys 82接触，Leu57与PDGF-B之Ile 77接触，Tyr 59与PDGF-B之Ile 77、Arg 79、Lys80、Lys 81及Pro 82接触，Trp 102与PDGF-B之Leu 8、Val 39、Trp40、Asn 54、Arg 56、Ile 75及Phe 84接触，Tyr 103与PDGF-B之Trp40、Arg 73、Ile 75及Phe 84接触，Gly 104与PDGF-B之Arg 73及Phe84接触，且Gly 105与PDGF-B之Phe 84接触，其中该轻链可变结构域氨基酸之编号系基于相应于SEQ ID NO:1之卡巴编号；及
(ii)对该重链可变结构域，Gly 28与PDGF-B之Lys 86接触，Ser29与PDGF-B之Lys 85及Lys 86接触，Tyr 30与PDGF-B之Ile 83、Phe84、Lys 85及Lys 86接触，Phe 31与PDGF-B之Gln 71、Arg 73、Phe 84及Lys 86接触，Asp 49与PDGF-B之Arg 73接触，Asp 50与PDGF-B之Lys 86接触，Asn 65与PDGF-B之Lys 86接触，Phe 90与PDGF-B之Pro82、Ile 83及Phe 84接触，Thr 91与PDGF-B之Lys 81及Ile 83接触，His92与PDGF-B之Lys 81及Ile 83接触，Asn 93与PDGF-B之Lys 81接触，且Ser 94与PDGF-B之Lys 81接触，其中该重链可变结构域氨基酸之编号系基于相应于SEQ ID NO:2之卡巴编号；
且进一步，其中PDGF-B接触残基之氨基酸残基编号系相应于SEQID NO:33之氨基酸序列。
本发明包括包含本发明之抗体或其抗原结合片段及药学可接受之载剂或赋形剂之药物组合物。
本发明包括一种用于减少有需要之个体的细胞外基质沉积之方法。该方法包含给该个体施用有效量之该药物组合物，从而抑制该个体之细胞外基质的过度沉积。
本发明进一步包括本发明之抗体或其抗原结合片段或药物组合物在制备用于减少有需要之个体的细胞外基质之沉积的药物中之用途。
本发明进一步提供一种用于减少有需要之个体的细胞外基质沉积之本发明之抗体或其抗原结合片段或药物组合物。
本发明包括用于预防或治疗由PDGF-B与PDGFRβ结合所介导之疾病、疾患或症状之方法。该方法包括给有需要之个体施用有效量之该药物组合物。
本发明进一步提供本发明之抗体或其抗原结合片段或药物组合物在制备用于预防或治疗由PDGF-B与PDGFRβ结合所介导之疾病、疾患或症状的药物中之用途。
本发明进一步提供用于预防或治疗由PDGF-B与PDGFRβ结合所介导之疾病、疾患或症状之本发明之抗体或其抗原结合片段或药物组合物。
在一方面中，该疾病、疾患或症状系选自下列中至少一者：动脉粥样硬化、再狭窄、肺动脉高压、视网膜血管疾病、心肌纤维化、肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、系统性硬化症、类风湿性关节炎、骨关节炎及肿瘤发生。
附图说明
本发明之前述简要说明及下列详细说明搭配附图一起阅读时，将更能清楚了解。为了说明本发明之目的，在附图中描绘目前优选之实施方案。然而应了解的是，本发明并不限于所示之特定方法及手段。
在附图中：
图1(包含A至N幅)描述MOR-8457重链可变区(图1A)及轻链可变区(图1B)与IMGT数据库中最近的四个个别种系V区之序列比对。相同残基以(.)表示，并标示出框架区及CDR1和CDR2。图1C列出无种系化之MOR8457-VL之氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，CDR以下划线标示。图1D列出无种系化之MOR8457-VH之氨基酸序列(SEQ ID NO:2)，CDR以下划线标示。图1E列出种系化后之MOR8457-GL-VL之氨基酸序列(SEQ IDNO:4)，CDR以下划线标示。图1F列出种系化后之MOR8457-GL-VH之氨基酸序列(SEQ ID NO:6)，CDR以下划线标示。图1G列出MOR8457-GL-LC(SEQ ID NO:16)全长轻链之氨基酸序列，其中该VL区系经种系化。图1H列出包含种系化VH区及具有效应子无效三突变(3m)之人IgG1之MOR8457-GL-hIgG1-3m-HC(SEQ ID NO:14)全长重链之氨基酸序列，其中野生型序列LLGL系突变成AAGA。亮氨酸变成丙氨酸取代之位点系以下划线标示。图1I列出经工程化之变体MOR8457-15-VL(SEQ IDNO:34)之轻链可变结构域之氨基酸序列，其中CDR以下划线标示。图1J列出经工程化之变体MOR8457-15-VH及MOR8457-16-VH(SEQ IDNO:44)之重链可变结构域之氨基酸序列，其中CDR以下划线标示。二种经工程化之变体MOR8457-15及MOR8457-16共享相同的重链序列。图1K列出经工程化之变体MOR8457-16-VL(SEQ ID NO:39)之轻链可变结构域之氨基酸序列，其中CDR以下划线标示。图1L列出MOR8457-15(SEQ ID NO:37)全长轻链之氨基酸序列，其中该VL区系经工程化以改善生物物理特性。图1M列出MOR8457-15-HC及MOR8457-16-HC(SEQ IDNO:46)之全长重链之氨基酸序列，其包含经工程化之VH区及具有效应子无效三突变(3m)之人IgG1，其中该VH区系经工程化以改善生物物理特性且恒定区野生型序列LLGL系突变成AAGA。亮氨酸变成丙氨酸取代之位点系以下划线标示。图1N列出MOR8457-16-LC(SEQ ID NO:42)全长轻链之氨基酸序列，其中该VL区系经工程化以改善生物物理特性。
图2(包含A至K幅)是显示MOR8457抗体与不同PDGF之结合动力学之Biacore传感图。抗人(A至D，I至K)或抗小鼠(E至H)IgG抗体系经固定于CM5传感芯片之流动池。1μg/mL之MOR8457-IKR-hIgG1-3m(A至D)、MOR8457-mIgG1(E至H)或MOR8457-GL-hIgG1-3m(I至K)系独立注射于个别抗人或抗小鼠表面10秒，导致介于50至100RU之稳定的抗PDGF表面。不同浓度之PDGF蛋白(0.25、0.5及1nM)接着以100μl/min之流速被注射至该抗体表面2分钟以供结合。允许复合物解离10分钟。该表面以10mM氯化镁注射30秒再生，使该表面得以进行另一次抗PDGF抗体捕捉及PDGF结合动力学。三种抗体中每一种皆与人(A、E、I)、小鼠(B、F、J)及大鼠(C、G、K)PDGF-BB紧密结合。MOR8457-IKR-hIgG1-3m(D)及MOR8457-mIgG1(H)与人PDGF-AB结合。各所示之传感图系三次独立实验中代表性的一次。
图3之传感图及图例说明MOR8457-IKR-hIgG1-3m而非PDGFRβ-hIGg1与已经结合至MOR8457-mIgG1之人PDGF-BB结合。MOR8457-mIgG1经由被固定至CM5传感芯片之抗小鼠IgG捕捉，导致200至400RU之稳定表面(注射1)。人PDGF-BB以1nM注射6分钟以达到表面饱和(注射2)，然后注射MOR8457-IKR-hIgG1-3m(循环1，注射3，黑线)或PDGFRβ-hIGg1(循环2，注射3，灰线)或缓冲液(循环3，注射3，虚线)。不同于不显示结合之PDGFRβ-hIgG1及缓冲液(循环2及循环3的线显示RU在注射3之后没有增加)，MOR8457-IKR-hIgG1-3m与芯片上预先组合之MOR8457-mIgG1/PDGF-BB复合物结合(循环1的传感图显示注射3之后的共振增加)，显示PDGF-BB二聚体与二个MOR8457分子结合且一个MOR8457与PDGF-BB结合足以阻断PDGFRββ受体结合。所示数据来自二个独立实验中的一个代表性实验。
图4之传感图及图例说明MOR8457-IKR-hIgG1-3m无法与人PDGF-BB结合，当PDGF-BB已与hPDGFRβ-hIGg1结合。PDGFRβ-hIgG1经由抗人IgG抗体被捕捉至CM5传感芯片上(注射1)。接着注射浓度1nM之人PDGF-BB 6分钟以饱和PDGFRβ-hIgG1上的结合位点(注射2)，然后注射MOR8457-IKR-hIgG1-3m(循环1，注射3，黑线)或缓冲液(循环2，注射3，灰线)。MOR8457-IKR-hIgG1-3m不与预先组合之PDGFRβ-hIgG1/PDGF-BB复合物结合，提示MOR8457与PDGFR竞争PDGF-BB上相同的结合位点。所示数据来自二个独立实验中的一个代表性实验。
图5(包含A及B幅)显示MOR8457阻断人PDGF-BB与溶液中之PDGFRβ-hIgG1结合。图5A说明溶液竞争试验之Biacore设计。MOR8457-mIgG1系经PBS连续稀释，然后与1mM之人PDGF-BB混合，在2至8℃温育20小时以达到平衡如[括号]所示。各种MOR8457-mIgG1与PDGF-BB稀释混合物接着被注射至由CM5芯片上之抗人IgG1所捕捉之PDGFRβ-hIgG1表面。图5B之浓度反应曲线显示MOR8457抑制PDGF-BB与PDGFRβ-hIgG1之结合。所示数据来自二个独立实验中的一个代表性实验。
图6说明MOR8457与PDGF-BB二聚体之结合模式。该图说明在PDGF-BB分子上之表位1及2大约相隔使得单一MOR8457抗体无法同时与表位1及2结合。因此，该模型显示本文他处观察到之2:1结合化学计量系因该二个表位相隔太远之几何限制。
图7之模型图显示一个MOR8457与一个PDGF-B上之一个结合表位结合。该图进一步显示MOR8457之VH及VL结构域与PDGF-B之下列氨基酸残基结合(即相隔不到之接触残基)：Leu 38、Val 39、Trp 40、Asn 54、Arg 56、Glu 71、Arg 73、Ile 75、Ile 77、Arg 79、Lys 80、Lys81、Pro 82、Ile 83、Phe 84、Lys 85及Lys 86。
图8(包含A及B幅)显示MOR8457有效地抑制PDGF-BB诱导之人系膜细胞增生。图8A显示无MOR8457存在时PDGF-BB诱导之人系膜细胞增生之浓度反应曲线。原发性人系膜细胞系经培养及接种于96孔板。细胞以不含血清之MCM培养基停止生长24小时。24小时之后，细胞以连续稀释之PDGF-BB于37℃刺激4小时。DNA合成系于最后16小时期间利用BrdU掺入试验测定。PDGF-BB有效地诱导系膜细胞增生，EC50为2.3ng/mL。图8B显示在如图8A所示之相同试验中MOR8457之代表性抑制曲线。也就是，MOR8457-IKR-IgG1-3m系经半对数稀释自100nM至0.1nM，然后与2.5ng/ml之PDGF-BB于不含血清之MCM培养基混合30分钟，然后将该混合物添加至细胞。增生试验系如图8A所述进行。自三个独立实验测定之平均IC50系13.4±2.8pM，最大抑制为87.9±5.7％。
图9(包含A及B幅)描述MOR8457之竞争性抑制的Schild分析。图9A显示在MOR8457-IKR-IgG1-3m不存在及以0.01、0.1、1及10nM存在时，PDGF-BB之浓度反应曲线。抗体系与PDGF-BB混合，并于25℃温育2.5小时，然后将该混合物加入细胞中。细胞增生试验系如图8所述进行。图9A显示曲线随着MOR8457-IKR-IgG1-3m之浓度增加偏移至右侧，且抑制程度可在高浓度之PDGF-BB达成，显示该抑制为竞争性。图9B显示Schild回归分析。Schild分析系如文献所述进行(Arunklakshana&Schild,1959,Br.J.Pharmacol.65:48-58)。在无抗体及有抗体存在时测量之PDGF-BB的EC50被用于计算剂量比(DR)。一系列之log(DR-1)对一系列之log[B]抗体浓度作图。自该图推导出之pA2系约20pM，其与由Biacore测出之结合亲和性(约13pM)一致。这些数据显示MOR8457在功能性试验中系有效且具竞争性之抑制剂。
图10(包含A及B幅)显示在OX-7诱导后第9天之大鼠抗Thy1.1肾炎肾组织样品上，MOR8457-mIgG1对系膜细胞增生之影响。肾炎系藉由静脉注射单克隆抗体OX-7(1mg/kg)至Wistar雄鼠诱发。MOR8457-mIgG1(3、10及30mg/kg)及同型(isotype)对照IgG(30mg/kg)在疾病诱发后第1.5天经皮下施用至不同动物组别(n＝6)。到第8天，所有大鼠给予腹腔注射50mg/kg之溴脱氧尿苷(BrdU)，以标记处于细胞周期中DNA(S)期之细胞。动物于第9天牺牲，取得肾组织样品以评价MOR8457-mIgG1对细胞增生(图10A)及系膜细胞及足细胞活化(α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)之免疫组织化学，图10B)之影响。数据显示MOR8457-mIgG1诱导系膜细胞增生之剂量依赖性减少(图10A)且减少α-平滑肌肌动蛋白阳性染色(图10B)。
图11显示7种抗体在浓度100mg/ml、低盐及pH6.0下之黏性对pH6.0之预期的FAB电荷作图。该预期的FAB电荷系利用DiscoveryStudio 3.5pKa predictor计算。抗体AAB-001、RK35、IMA-638、MOR8457及MOR8457-GL之黏性系如方法中所述测量。MAb1及MAb2黏性测量系如Yadav 2012(同上)所述。
图12显示7种抗体在浓度100mg/ml、低盐及pH6.0下之黏性对pH6.0之预期的Fab偶极矩量级作图。预期的FAB电荷系利用DiscoveryStudio 3.5pKa predictor计算。接着利用这些电荷计算偶极矩。AAB-001、RK35、IMA-638、MOR8457及MOR8457-GL之黏性系如方法中所述测量。MAb1及MAb2黏性测量系如Yadav 2012(同上)所述。
图13显示7种抗体在浓度100mg/ml、低盐及pH6.0下之黏性对CDR区中之残基的净电荷作图。净电荷系藉由给正电残基+1，负电残基-1及His+1/2电荷计算。AAB-001、RK35、IMA-638、MOR8457及MOR8457-GL之黏性系如方法中所述测量。MAb1及MAb2黏性测量系如Yadav2012(同上)所述。
图14(包含A至G幅)显示强调(A)AAB-001(B)RK35(C)MAb2(D)IMA-638(E)MAb1(F)MOR8457-GL(G)MOR8457之CDR区之静电位能面。表面电荷系以黑色代表正电区至白色代表负电区之光谱显示，如该图右下之长条所示。所有分子皆以同一方向显示，各CDR区皆面向外(从纸面向外)，重链向左，轻链向右。
图15以增加的浓度的函数显示MOR84575及其经工程化的变体之黏性测量值。亲代MOR8457抗体以实线显示。种系MOR8457-GL以虚线及实心方形显示。经工程化的变体MOR8457-15以虚线及实心圆形显示。经工程化的变体MOR8457-16以虚线及实心三角形显示。该图之数据显示MOR8457-16之黏性相较于其它三种MOR8457抗体为低。
图16(包含A及B幅)显示(A)MOR8457-15及(B)MOR8457-16与PDGF-BB二聚体复合之结构模型。Fab以灰色带状显示，PDGF-BB二聚体以淡灰色表面表现。与PDGF-BB直接接触之残基系以灰色棒显示，相对于亲代抗体为突变之残基以黑色棒显示。该数据显示二种经工程化的MOR8457变体之三个突变皆不与PDGF-B二聚体相互作用。
图17(包含A及B幅)描述(A)MOR8457-GL及(B)MOR8457-16之静电位能面。此图放大显示之电荷表面与图14所示者相同。自MOR8457-GL中之Asn突变成MOR8457-16中之Lys的位点L53以箭头指示。此残基紧邻轻链CDR中之大型负电区(在L53位点上方的白色区)，这些数据提示此残基负责降低相较于亲代抗体之黏性。
图18显示MOR8457-GL(方形)、MOR8457-15(圆形)及MOR8457-16(三角形)于磷酸盐缓冲盐水中之示差扫描量热(DSC)谱。
图19(包含A及B幅)分别显示MOR8457及其工程化的变体之表达及纯化谱。A幅之柱状图显示各抗体在293培养中暂时表达后之表达量(白色柱以mg/mL显示)及蛋白A捕捉后之纯化产量(以感兴趣的百分比峰面积的灰色柱表示)。B幅显示MOR8457-16在蛋白A洗脱后之分析性大小排除层析，其显示单峰。
图20(包含A至D幅)显示MOR8457-16与不同PDGF异构体之结合动力学之Biacore传感图。MOR8457-16经由抗人IgG抗体被捕捉至CM5芯片上。每一种PDGF异构体之结合动力学系藉由使不同浓度之各种PDGF同种型流过该捕捉之MOR8457-16表面加以评估。Hu-PDGF-BB(A)及Mu-PDGF-BB(C)之浓度为0.25、0.5及1nM，Hu-PDGF-AB(B)及Rat-PDGF-BB(D)之浓度为0.5及1nM。各传感图系二次独立实验中代表性的一次。动力学数据系经双重参照，并使用Biacore评估软件4.1版契合。在此图显示之结合及解离速率及结合亲和性列于表8。
图21(包含A及B幅)显示MOR8457-16(A)及MOR8457-GL(B)于系膜细胞增生试验中之抑制曲线。细胞增生系由2.5ng/ml之PDGF-BB刺激。该试验系如实施例8所述进行。MOR8457-16之IC50为14pM，亲代MOR8457-GL之IC50为20pM。
发明详述
本文揭示与PDGF-B特异性结合且抑制PDGF-B与PDGFRβ之结合的抗体。提供制备PDGF-B抗体之方法、包含这些抗体之组合物及使用这些抗体之方法。PDGF-B抗体可被用于预防及/或治疗由PDGF-B与PDGFRβ结合所造成及/或相关之疾病、疾患或症状。这些疾病、疾患或症状包括但不限于动脉粥样硬化、泡沫化损伤诱导之再狭窄、肺动脉高压、器官纤维化(例如心肌、肺、肾)、系统性硬化症、类风湿性关节炎、骨关节炎及肿瘤发生。
一般技术
除非本文另外加以定义，关于本发明所使用之科学性及技术性术语应具有本领域技术人员所通常了解之意义。另外，除非上下文另外要求，单数术语应包括复数意义且复数术语应包括单数意义。一般来说，与本文所描述之细胞培养、组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、基因学以及蛋白质及核酸化学和杂交有关所使用之命名法及技术系本领域所广为周知且经常使用者。
除非另外说明，本发明之实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学之常规技术，这些技术系本领域之常规技艺。这些技术系于文献中充分解释，诸如Molecular Cloning:ALaboratory Manual,second edition(Sambrook et al.,1989)Cold Spring HarborPress；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in MolecularBiology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.)；Gene Transfer Vectors for MammalianCells(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987)；Current Protocols in MolecularBiology(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et al.,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991)；Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd.ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(2001)；Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(2002)；Harlow and Lane Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1998)；Coligan et al.,ShortProtocols in Protein Science,John Wiley&Sons,NY(2003)；Short Protocolsin Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janewayand P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:a practicalapproach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies:apractical approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000)；Using antibodies:a laboratory manual(E.Harlow and D.Lane(ColdSpring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995)。
酶促反应及纯化技术系根据制备商说明书，以本领域经常完成或本文所描述之方式进行。与本文所述之分析化学、生物化学、免疫学、分子生物学、合成有机化学、医学及制药化学有关所使用之命名和实验室方法及技术系本领域所广为周知且经常使用者。标准技术系用于化学合成、化学分析、药物制备、药物配制、药物递送及病患治疗。
定义
下列术语除非另外说明，应被了解为具有下列意义：术语“经分离之分子”(其中该分子系例如多肽、多核苷酸或抗体)系指因为其来源或衍生来源而具有下列特性之分子：(1)不与在其天然状态下伴随其之天然相关成分相关，(2)实质上不含来自该相同物种之其它分子，(3)系由来自不同物种之细胞表达，或(4)不在自然界存在。因此，经化学合成或在不同于该分子之天然来源细胞之细胞系统中表达之分子将与其天然相关成分“分离”。亦可藉由使用本领域广为周知之纯化技术分离，使分子实质上不含天然相关成分。分子纯度或均质状态可藉由本领域广为周知之多种方法检测。例如，多肽样品之纯度可利用聚丙酰胺凝胶电泳及染色该凝胶以看见该多肽这类本领域广为周知之技术检测。为了某些目的，可利用HPLC或本领域广为周知之其它纯化方法提供更高分辨率。
本发明所使用之“基本上纯的”系指目的种类系存在之优势种类(即以摩尔数计算其系多过该组合物中之任何其它个别种类)，且优选地，基本上经纯化之组分系其中该目的种类(例如醣蛋白，包括抗体或受体)占所有存在之大分子种类之至少约50％(以摩尔数计算)之组合物。通常，实质上纯的组合物将包含超过约80％之所有存在于该组合物中之大分子种类，更优选地超过约85％、90％、95％、及99％。最优选地，该目的种类系经纯化至实质均质性(利用常规检测方法未检测到污染种类存在于该组合物中)，其中该组合物实质上系由单一大分子种类组成。
“抗体”系免疫球蛋白分子，其可透过位于该免疫球蛋白分子之可变区的至少一个抗原识别位点特异性地与目标结合，诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。除非另行说明，本文所使用之该术语不仅包含完整之多克隆或单克隆抗体，也包含与该完整抗体竞争特异性结合之其任何抗原结合部分、包含抗原结合部分之融合蛋白及包含抗原识别位点之免疫球蛋白分子之任何其它经修饰之构型。抗原结合部分包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、结构域抗体(dAb，例如鲨鱼及骆驼抗体)、包含互补决定区(CDR)之片段、单链可变片段抗体(scFv)、大型抗体(maxibodies)、迷你抗体(minibodies)、细胞内抗体(intrabodies)、双价抗体(diabodies)、三价抗体、四价抗体、v-NAR及bis-scFv，以及这样的多肽，其包含足以赋予所述多肽特异性抗原结合之至少一部分的免疫球蛋白。抗体包括任何类型之抗体，诸如IgG、IgA或IgM(或其亚型)，且该抗体不需要是任何特定类型。根据其重链的恒定区之抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可被分成不同类型。有五种主要的免疫球蛋白类型：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其中数种又可进一步分成亚型(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应不同类型之免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类型之免疫球蛋白的亚基结构及三维构型系广为周知。
在本文可交换使用之术语抗体之“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简称“抗体部分”)，系指保留与抗原(例如PDGF)特异性结合之能力的抗体之一或多个片段。研究显示，抗体之抗原结合功能可由全长抗体之片段进行。术语抗体之“抗原结合部分”所涵盖之结合片段之实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH1结构域组成之单价片段，(ii)F(ab′)2片段，包含由绞链区之双硫键连接之二个Fab片段的双价片段，(iii)由VH及CH1结构域组成之Fd片段，(iv)由抗体之单臂的VL及VH结构域组成之Fv片段，(v)dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546)，其系由VH结构域组成，及(vi)经分离之互补决定区(CDR)、双硫键连接之Fv(dsFv)、抗个体基因型(anti-Id)抗体及细胞内抗体。另外，虽然Fv片段的二个结构域VL及VH系由不同基因编码，可利用重组方法藉由合成的接头将两者连接，以使其成为其中该VL及VH区配对以形成单价分子之单一蛋白链(称为单链Fv(scFv))；见例如Bird et al.Science 242:423-426(1988)and Huston et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。这些单链抗体亦意图被包含于该术语抗体之“抗原结合部分”之内。亦包含其它形式之单链抗体诸如双价抗体。双价抗体系双价、双特异性之抗体，其中VH及VL结构域系表达于单一多肽链上，但使用的接头过短无法使该同一链上之两个结构域配对，藉此促使这些结构域与另一链之互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(见例如Holliger et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)；Poljak et al.,1994,Structure 2:1121-1123)。
抗体可能衍生自任何哺乳动物，包括但不限于人、猴、猪、马、兔、犬、猫、小鼠等，或其它动物诸如鸟(例如鸡)、鱼(例如鲨鱼)及骆驼(例如无峰驼)。
抗体之“可变区”系指抗体轻链之可变区或抗体重链之可变区(不论单独或组合)。如本领域所知，重链及轻链之可变区各由四个框架区(FR)及连接该四个框架区之三个互补决定区(CDR)(亦称为高变区)组成，并形成该抗体之抗原结合位点。若主体可变区之变体是想要的，特别是具有CDR区以外(即框架区)之氨基酸残基取代，适当之氨基酸取代(优选地保守性氨基酸取代)可藉由比较该主体可变区与其它包含和该主体可变区相同之典范类型(canonical class)的CDR1及CDR2序列之抗体的可变区加以鉴定(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196(4):901-917,1987)。
在某些实施方案中，明确描述CDR及鉴定包含抗体之结合位点的残基系藉由解析(solve)该抗体之结构及/或解析该抗体-配体复合物之结构达成。在某些实施方案中，其可藉由本领域技术人员所知之多种技术之任一种达成，诸如X光结晶学。在某些实施方案中，许多分析方法可被用于鉴定或大致鉴定该CDR区。在某些实施方案中，许多分析方法可被用于鉴定或大致鉴定该CDR区。这些方法之实例包括但不限于卡巴定义、柯西亚(Chothia)定义、AbM定义、接触定义及构形定义。
卡巴定义系编号抗体中之残基之标准方法，通常被用于鉴定CDR区。见例如Johnson&Wu,2000,Nucleic Acids Res.,28:214-8。柯西亚定义与卡巴定义类似，但柯西亚定义考虑某些结构环区之位置。见例如Chothia et al.,1986,J.Mol.Biol.,196:901-17；Chothia et al.,1989,Nature,342:877-83。AbM定义使用Oxford Molecular Group开发之用于模型化抗体结构之计算机程序集成套件。见例如Martin et al.,1989,Proc Natl AcadSci(USA),86:9268-9272；“AbMTM,A Computer Program for ModelingVariable Regions of Antibodies,”Oxford,UK；Oxford Molecular,Ltd.。AbM定义利用知识数据库与全始算法之组合，诸如那些由Samudrala et al.,1999,“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined HierarchicalApproach,”in PROTEINS,Structure,Function and Genetics Suppl.,3:194-198描述者，自抗体之一级序列建构三级结构之模型。接触定义系根据可获得之复合物结晶结构之分析。见例如MacCallum et al.,1996,J.Mol.Biol.,5:732-45。在本文称为CDR之“构形定义”之另一方法中，CDR之位置可能被鉴定为对抗原结合做出焓贡献之残基。见例如Makabe et al.,2008,Journal of Biological Chemistry,283:1156-1166。其它CDR边界定义可能仍不严格遵守上述方法中之一者，但将与至少部分之卡巴CDR重迭，不过根据特定残基或残基群不显著影响抗原结合之预测或实验结果，它们可能被缩短或延长。本文所使用之CDR可能指由本领域已知之任何方法(包括多种方法之组合)所定义之CDR。本文所使用之方法可利用根据这些方法中任一者所定义之CDR。以包含超过一种CDR之任何给定实施方案而言，该CDR可根据卡巴、柯西亚、延长、AbM、接触及/或构形定义中任一者加以定义。
本文所使用之关于抗体或其所特异性结合之抗原之“接触残基”，系指存在于抗体/抗原上之包含至少一个与存在相应的(cognate)抗体/抗原上之氨基酸残基的重原子(即，非氢原子)相距以内或更小距离之重原子之氨基酸残基。
如本领域已知，抗体之“恒定区”系指单独或经组合之抗体轻链之恒定区或抗体重链之恒定区。
本文所使用之“单克隆抗体”系指自实质上同源之抗体群获得之抗体，即除了可能少量存在之可能天然发生之突变以外，组成该族群之个别抗体系相同的。单克隆抗体具高度特异性，其系以单一抗原位点为目标。另外，和通常包含拮抗不同决定簇(表位)之不同抗体的多克隆抗体制剂不同的是，各单克隆抗体系以抗原上之单一决定簇为目标。修饰语“单克隆”表示抗体系自实质上同源之抗体族群获得之特征，不应被视为需要藉由任何特定之方法产生该抗体。举例来说，本发明所使用之单克隆抗体可藉由最早由Kohler and Milstein,1975,Nature 256:495所描述之杂交瘤方法制备，或可藉由重组DNA方法诸如美国专利第4,816,567号所述者制备。该单克隆抗体亦可自例如利用McCafferty et al.,1990,Nature 348:552-554描述之技术所产生之噬菌体文库分离。本文所使用之“人源化”抗体系指非人(例如鼠)抗体之形式，其为包含源自非人免疫球蛋白之最少序列之嵌合性免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体之其它抗原结合子序列)。优选地，人源化抗体系其中源自接受者之CDR的残基被源自诸如具有想要的特异性、亲和性及能力之小鼠、大鼠或兔等非人物种(捐赠者抗体)之CDR的残基所取代之人免疫球蛋白(接受者抗体)。该人源化抗体可能包含不在接受者抗体或经导入之CDR或骨架序列中之残基，但这些残基被包括以进一步改善及最优选化抗体之表达。
“人抗体”系指具有对应可由人产生及/或利用本文揭示之制备人抗体之任何技术所制备之抗体的氨基酸序列之氨基酸序列的抗体。此定义之人抗体特别排除包含非人抗原结合残基之人源化抗体。
术语“嵌合抗体”系用来指其中可变区序列系源自一物种且恒定区序列系源自另一物种之抗体，诸如其中可变区序列系源自小鼠抗体且恒定区序列系源自人抗体之抗体。
术语“抗原(Ag)”系指用于免疫接种免疫活性脊椎动物以产生识别该Ag之抗体(Ab)或筛选表达文库(例如噬菌体、酵母或核糖体展示库等)之分子实体。本文中，Ag的定义更为广泛，通常意图包括由Ab特异性识别之标靶分子，因此包括用于提高Ab之免疫接种方法或用于选择Ab之文库筛选中所使用之分子之片段或拟似物。因此，对于本发明之与PDGF-B结合之抗体，源自哺乳动物物种(例如人、小鼠及大鼠PDGF-B)之全长PDGF-B(包括其单体及二聚体)以及截短PDGF-B及其它PDGF-B之变体皆被称为抗原。
通常，术语“表位”系指抗原上被抗体特异性结合之范围或区域，即与抗体物理接触之范围或区域。因此，术语“表位”系指能被抗体之一或多个抗原结合区所识别及结合之分子的部位。通常，表位系根据“抗体或其抗原结合片段”(Ab)与其对应抗原之间的分子相互作用定义。表位通常由分子之表面基团组成，诸如氨基酸或糖侧链，且具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。在一些实施方案中，表位可为蛋白表位。蛋白表位可为线性或构型。在线性表位中，所有该蛋白与该相互作用分子(诸如抗体)之间的相互作用之点沿着该蛋白之一级氨基酸序列线性存在。“非线性表位”或“构型表位”包含对该表位具特异性之抗体所结合之抗原性蛋白内之不连续多肽(或氨基酸)。本文使用之术语“抗原性表位”系定义为可被抗体特异性结合之抗原的部分，该结合藉由本领域广为周知之任何方法(例如常规之免疫测定法)测定。在抗原上之确定想要的表位后，即可使用例如本文所述之技术，针对该表位产生抗体。或者，在发现过程中，抗体之产生及表征可阐释有关想要的表位之信息。由此信息即有可能竞争性地筛选与该相同表位结合之抗体。一种达到此目的之方法系进行竞争及交叉竞争试验，以找到彼此竞争或交叉竞争与PDGF-B结合之抗体，例如竞争与抗原结合之抗体。
本文所使用之术语“野生型氨基酸”、“野生型IgG”、“野生型抗体”或“野生型mAb”，系指在某些群体(例如人、小鼠、大鼠、细胞等)内天然存在之氨基酸或核酸序列。
如同在本文他处所述，抗体分子的某些位置可被改变。本文所使用之“位置”系指蛋白质的序列中之位置。位置系依序或根据已建立之格式编号，例如EU指数及卡巴指数可被用于编号抗体之氨基酸残基。例如，位置297系人抗体IgG1中之一位置。对应位置系如上述测定，通常经由与其它亲代序列之比对。
本文所使用之“残基”系指蛋白中之一位置及其相关之氨基酸特性。例如，天冬酰氨酸297(亦称为Asn297或N297)系人抗体IgG1中之一残基。
术语“拮抗抗体”系指与标靶结合且阻止或减少该标靶之生物学作用之抗体。在一些实施方案中，该术语可表示藉由与标靶例如PDGF-B结合以防止该标靶进行生物学功能例如与其相应的受体PDGFR-αα、PDGFRαβ及PDGFRββ结合之抗体。
本文所使用之“PDGF-B拮抗抗体”，系指能抑制PDGF-B生物学活性或包含PDGF-B之同源二聚体或异源二聚体(例如PDGF-AB及PDGF-BB)之活性及/或由PDGF-B所介导之下游事件(包括但不限于与其同源酪氨酸激酶受体结合且藉以介导信号传导且藉以造成细胞增生、迁移及/或细胞外基质沉积等事件)之抗体。PDGF-B拮抗抗体包含阻断、拮抗、抑制或减少(任何程度，包括显著地)PDGF-B生物学活性之抗体，该生物学活性包括由PDGF-B介导之下游事件，诸如PDGF受体结合及下游信号传导、诱导细胞增生及细胞迁移。就本发明之目的而言，将明确了解术语“PDGF-B拮抗抗体”(可交换使用之术语“拮抗性PDGF-B抗体”、“拮抗性抗PDGF-B抗体”、“抗PDGF-B拮抗抗体”、“拮抗性PDGF-BB抗体”、“拮抗性抗PDGF-BB抗体”、“抗PDGF-BB拮抗抗体”、“拮抗性PDGF-AB抗体”、“拮抗性抗PDGF-AB抗体”或“抗PDGF-AB拮抗抗体”)包含藉以实质上废止、降低或中和任何有意义程度之PDGF-B本身、PDGF-B生物学活性(包括但不限于其与受体结合及诱导细胞增生之能力)或该生物学活性之后果之所有先前定义之术语、名称、功能状态及功能特征。在一些实施方案中，PDGF-B抗体与PDGF-B结合且阻止PDGF-B与PDGFRβ结合。在一些实施方案中，该拮抗能力系经由细胞生长试验表征及/或描述。在一些实施方案中，该拮抗能力系以IC50或EC50之值描述。本发明提供PDGF-B抗体之实例。
本文使用之术语“PDGFRβ”包含含有至少一PDGFRβ多肽链之受体。也就是说，本文使用之PDGFRβ包括单一PDGFRβ多肽链，以及PDGFRββ同源二聚体及PDGFRαβ异源二聚体。
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”以及“蛋白质”在本文可交换使用，这些术语系指任何长度之氨基酸之链。该链可为线性或分支，其可能包含经修饰之氨基酸及/或可能被非氨基酸中断。这些术语亦包含经天然或人为干预修饰之氨基酸链；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵或修饰，诸如与标记成份缀合。该定义亦包括例如包含一或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)之多肽，以及包含本领域常规之其它修饰之多肽。应了解的是该多肽可以单链或相连之链存在。
如本领域所知之“多核苷酸”或“核酸”在本文可交换使用，其系指任何长度之核苷酸之链，包括DNA及RNA。该核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰之核苷酸或碱基及/或其类似物，或任何可藉由DNA或RNA聚合酶被掺入链中之底物。多核苷酸可包含经修饰之核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。若存在的话，对核苷酸结构之修饰可在该链组装之前或之后进行。核苷酸之序列可被非核苷酸成份中断。多核苷酸在聚合之后可进一步被修饰，诸如与标记成份缀合。其它类型之修饰包括例如“加盖(caps)”、以类似物取代一或多个天然存在之核苷酸、核苷酸间修饰例如那些具有不带电键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物(phosphoamidate)、胺基甲酸酯等)及带电键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)者、那些含有悬挂部分者，诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)、那些具有嵌入剂者(例如吖啶、补骨脂素等)、那些含有螯合剂者(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)、那些含有烷化剂者、那些具有经修饰之键者(例如α异位性核酸等)以及未经修饰之多核苷酸形式。进一步，任何通常存在于糖类中之羟基可能被例如膦酸基、磷酸基取代、被标准保护基保护或被活化以制备与其它核苷酸之额外键，或可能与固体支持物缀合。该5’及3’端OH可被磷酸化或被胺类或自1至20个碳原子之有机加盖基团取代。其它羟基亦可被衍生成为标准保护基。多核苷酸亦可包含本领域通常已知之核糖或脱氧核糖糖类之类似形式，包括例如2’-O-甲基-核糖、2’-O-烯丙基核糖、2’-氟代-核糖、2’-迭氮基-核糖、碳环糖类似物、α或β异位性糖类、差向异构体糖类诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖糖类、呋喃糖糖类、景天庚酮糖、非环类似物及无碱基核苷类似物诸如甲基核糖苷。一或多个磷酸二酯键可被替代性连接基团取代。那些替代性连接基团包括但不限于其中磷酸盐被P(O)S(“硫代盐”)、P(S)S(“二硫代盐”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲缩醛”)取代之实施方案，其中各R或R’系独立地H或经取代或未经取代之烷基(1至20个碳)，该烷基可选择地含有醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。多核苷酸中之所有键不需要完全相同。前面的叙述适用于本文所指涉之所有多核苷酸，包括RNA及DNA。
如本文所使用，抗体与PDGF-B“相互作用”系指藉由本文之实施例6及8所述之方法测量时，平衡解离常数等于或小于100pM、优选地小于约69pM、更优选地小于约50pM、最优选地小于约30pM、更优选地小于约20pM、又更优选地小于约15pM、甚至更优选地小于约10pM、甚至更优选地小于约4pM、且更优选地小于约2pM。在一实施方案中，当KD介于约69pM至约2pM时，该抗体与PDGF-B相互作用。在一实施方案中，当KD约10pM时，该抗体与PDGF-B相互作用。
与表位“优先结合”或“特异性结合”(在本文可互换使用)之抗体，系本领域理解清楚之术语，测定这些特异性或优先结合之方法亦为本领域所广为周知。若分子与特定细胞或物质之反应或相连相较于与其它细胞或物质之反应或相连系更频繁、更快速、持续更长时间及/或具有更高亲和性，该分子被称为展现“特异性结合”或“优先结合”。若抗体与标靶之结合相较于与其它物质之结合具有更高亲和性、亲合力(avidity)、更快速及/或更长时间，则该抗体与标靶“特异性结合”或“优先结合”。举例来说，与PDGF-B表位特异性或优先地结合之抗体，系指相较于其与其它PDGF-B表位或非PDGF-B表位结合，以更高之亲和性、亲合力、更快速及/或更长持续时间地与此表位结合之抗体。藉由阅读此定义亦可了解，举例来说，与第一标靶特异性或优先结合之抗体(或部分或表位)可能与第二标靶特异性或优先结合或可能不与第二标靶特异性或优先结合。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(虽然可包括)排他性结合。一般来说(但不必然)，所谓的结合系指优先结合。“特异性结合”或“优先结合”包括识别特定分子并与之结合，但基本上不识别或结合样品中之其它分子之化合物(例如蛋白、核酸、抗体等)。例如，识别且结合样品中之相应的配体或结合伴但基本上不识别或结合该样品中之其它分子之抗体或肽受体(例如与肿瘤抗原结合之抗人肿瘤抗原抗体)，与该同源配体或结合伴特异性结合。因此，在指定分析条件下，该特定结合基团(例如抗体或其抗原结合部分或受体或其配体结合部分)优先地与特定标靶分子结合且不与存在于测试样品中之其它成份以显著量结合。
多种分析格式可被使用，以选择与感兴趣之分子特异性结合之抗体或肽。例如，固相ELISA免疫测定、免疫沉淀、BIAcoreTM(GE Healthcare,Piscataway,NJ)、荧光激活之细胞分选(FACS)、OctetTM(FortéBio,Inc.,Menlo Park,CA)及蛋白质印迹分析等许多测试方法，可被用于鉴定与抗原特异性反应之抗体或与同源配体或结合伴特异性结合之受体或其配体结合部分。通常，特异性或选择性反应将至少为背景信号或噪音之两倍且更典型地超过10倍背景值，甚至更特定地，当该平衡解离常数(KD)系≤1μM、优选地≤100nM、更优选地≤10nM、甚至更优选地≤100pM、又更优选地≤10pM且甚至更优选地≤1pM时，抗体被称为与抗原“特异性结合”。
本文所使用之术语“结合亲和性”系二个分子(例如抗体或其片段与抗原)之间非共价相互作用之强度的测量值。术语“结合亲和性”系用来描述单价相互作用(内在活性)。
二分子(例如抗体或其片段与抗原)之间经由单价相互作用之结合亲和性可藉由测定解离常数(KD)量化。接着，KD可藉由测量复合物形成及解离之动力学求出，例如使用表面等离子体共振(SPR)方法(Biacore)。对应单价复合物之结合及解离的速率常数分别被称为结合速率常数ka(或kon)及解离速率常数kd(或koff)。KD与ka及kd有关，藉由等式KD＝kd/ka计算。
根据上述定义，与不同分子相互作用有关之结合亲和性例如比较不同抗体与给定抗原之结合亲和性，可能藉由比较个别抗体/抗原复合物之KD值加以比较。抗体或其它结合伴侣之KD值可利用本领域完整建立之方法测定。一种用于测定KD之方法系藉由利用表面等离子体共振，通常使用诸如系统之生物传感器系统。
本文所使用之“基本上纯的”系指其为至少50％纯的(也就是不含污染物)，更优选地至少90％纯的，更优选地至少95％纯的，甚至更优选地至少98％纯的，且最优选地至少99％纯的物质。
“宿主细胞”包括可以或已经接受载体以导入多核苷酸插入物之个别细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单一宿主细胞之后代，且该后代可能因为天然、偶然或蓄意突变而不一定与原始亲代细胞完全相同(在形态学或基因组DNA互补性上)。宿主细胞包括经本发明之多核苷酸体内转染之细胞。
如本领域所知，术语“Fc区”系用于定义免疫球蛋白重链之C端区域。该“Fc区”可能为天然序列Fc区或变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链之Fc区的边界可能不同，人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或Pro230位置之氨基酸残基至其羧基端之片段。Fc区中之残基编号系如卡巴(Kabat)所述之EU指数(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。免疫球蛋白之Fc区通常包含两个恒定结构域CH2及CH3。如本领域所知，Fc区可以二聚体或单体形式存在。
本领域所使用之“Fc受体”或“FcR”描述与抗体之Fc区结合之受体。优选之FcR系天然序列之人FcR。另外，优选之FcR系与IgG抗体结合之受体(γ受体)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII亚型之受体，包括等位基因变体及这些受体之可变剪切形式。FCγRII受体包括FcγRIIA(“活化性受体”)及FcγRIIB(“抑制性受体”)，其具有类似之氨基酸序列但主要差异在于其细胞质结构域。FcR系于Ravetch and Kinet,1991,Ann.Rev.Immunol.,9:457-92；Capel et al.,1994,Immunomethods,4:25-34；and de Haaset al.,1995,J.Lab.Clin.Med.,126:330-41中进行综述。“FcR”亦包括新生儿受体FcRn，其负责转运母体IgG至胎儿(Guyer et al.,1976,J.Immunol.,117:587；and Kim et al.,1994,J.Immunol.,24:249)。
本文关于抗体所使用之术语“竞争”，系指第一抗体或其抗原结合部分与表位结合之方式，充分类似于第二抗体或其抗原结合部分之结合，使得第一抗体与其相应的表位在第二抗体存在时之结合结果相较于第二抗体不存在时第一抗体之结合可检测地降低。或者，该情况可为但不一定是该第二抗体与其表位之结合亦因第一抗体之存在而可检测地降低。也就是说，第一抗体可抑制第二抗体与其表位之结合，但第二抗体不抑制该第一抗体与其个别表位之结合。然而，当各种抗体不论以相同、较高或较低程度可检测地抑制另一抗体与其相应的表位或配体结合时，这些抗体被称为彼此“交叉竞争”与其各个表位之结合。本发明包含竞争抗体及交叉竞争抗体。不论该竞争或交叉竞争所藉以发生之机制为何(例如空间位阻、构形变化或与共同表位或其部分结合)，本领域技术人员将了解根据本文所提供之揭示，本发明包含竞争及/或交叉竞争抗体且其可被用于本文所揭示之方法。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区之至少一种效应功能。例示性“效应功能”包括C1q结合、补体依赖性细胞毒性、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体)之下调等。这些效应功能通常需要该Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)结合，且可利用本领域已知之各种用于评估这些抗体效应功能之测定检测。
“天然序列Fc区”包含与在自然界中发现之Fc区的氨基酸序列完全相同之氨基酸序列。“变体Fc区”包含与天然序列Fc区有至少一个氨基酸修饰之差异的氨基酸序列，但仍保留该天然序列Fc区之至少一种效应功能。优选地，该变体Fc区相较于天然序列Fc区或亲代多肽之Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区或亲代多肽之Fc区中自约1至约10个氨基酸取代，且优选地自约1至约5个氨基酸取代。本文之变体Fc区将优选地具有与天然序列Fc区及/或与亲代多肽之Fc区至少约80％之序列相同性，最优选地具有至少约90％之序列相同性，更优选地具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％之序列相同性。
本文所使用之“治疗”系指得到有益或想要的临床结果之方法。以本发明之目的而言，有益或想要的临床结果包括但不限于下列一或多项：改善存活率(降低死亡率)、减少疾病之炎性应答、减少组织纤维化之量、改善病灶之表现、将病理性损害限制于病灶位点、减少疾病之损伤程度、缩短疾病持续时间及/或减少与疾病有关之病症的数量、程度或持续时间。该术语包括施用本发明之化合物或药剂，以防止或延迟疾病之症状、并发症或生化标志(indicia)之发生、缓和该症状、或控制或抑制该疾病、病状或疾患之进一步发展。治疗可能为预防性(以防止或延迟该疾病之发生，或防止疾病之临床或亚临床症状之表现)或治疗性抑制或缓和该疾病表现后之症状。
“改善”系指一或多种症状相较于未施用PDGF-B抗体时减轻或改善。“改善”亦包括缩短或减少症状之持续时间。
本文所使用之药物、化合物或药物组合物之“有效剂量”或“有效量”系指足以造成任一或多种有益或想要的结果之量。在更特定之方面中，有效量预防、缓和或改善疾病或感染之症状，及/或延长接受治疗之个体的存活。就预防性用途而言，有益或想要的结果包括消除或减少风险、减轻严重性或延迟疾病之开始，包括疾病之生物化学、组织学及/或行为学之症状、其并发症及在疾病发展期间所表现之中间病理学表型。就治疗性用途而言，有益或想要的结果包括诸如减少一或多种PDGF-B介导的疾病、疾患或病状之症状，降低治疗该疾病所需之其它药物之剂量，提高其它药物之效应，及/或延缓病患之疾病进程之临床结果。有效剂量可分一或多次施用。就本发明之目的而言，药物、化合物或药物组合物之有效剂量系足以直接或间接完成预防性或治疗性治疗之量。如在临床上所了解的，药物、化合物或药物组合物之有效剂量可能与或可能不与另一药物、化合物或药物组合物组合达到。因此，“有效剂量”可在施用一或多种治疗剂之情况中被考虑，且可考虑给予有效量之单一剂，若(配合一或多种其它剂)可能或能达成想要的结果。
“个体”或“对象”系哺乳动物，更优选者系人。哺乳动物亦包括但不限于农场动物(例如牛、猪、马、鸡等)、竞赛动物、宠物、灵长类动物、马、犬、猫、小鼠及大鼠。在一些实施方案中，个体被认为具有罹患由PDGF-B与其受体结合及其介导的信号传导所介导或相关之疾病、疾患或症状之风险。
本文所使用之“载体”系指构建体，其能在宿主细胞中递送及优选地表达一或多种感兴趣之基因或序列。载体之实例包括但不限于病毒性载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂有关之DNA或RNA表达载体、包封于脂质体中之DNA或RNA表达载体及某些真核细胞诸如生产细胞。
本文使用之“表达控制序列”系引导核酸转录之核酸序列。表达控制序列可为启动子，诸如组成型或诱导型启动子，或增强子。表达控制序列系可操作地与所欲转录之核酸序列连接。
本文所使用之“药学可接受之载剂”或“药学可接受之赋形剂”包括当与活性成分组合时能使该成分保留生物学活性且不与个体之免疫系统反应之任何物质。实例包括但不限于任何标准药物载剂诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液诸如油/水乳液及各种类型之润湿剂。优选之用于气雾剂或非经肠施用之稀释剂系磷酸盐缓冲盐水(PBS)或生理(0.9％)盐水。包含这些载剂之组合物系由众所周知之常规方法调制(见例如Remington’sPharmaceutical Sciences,18th edition,A.Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990；and Remington,The Science and Practice of Pharmacy,20thEd.Mack Publishing,2000)。
在本文提及“约”某数值或参数时，其包括(且描述)与该数值或参数本身相关之实施方案。例如，“约X”之叙述包括“X”之叙述。数字范围包含界定该范围之数字。
虽然用于阐述本发明之广泛范围之数字范围及参数系大约值，但在特定实施例中阐述之数值尽可能精确地报告。然而，任何数值均固有地包含因个别之测试测量值之标准差所必然导致之若干误差。另外，本文揭示之所有范围应被理解为包含其中所包含之任何及所有子范围。例如，所述之“1至10”之范围应被认为包括该最小值1及该最大值10之间(且包含1及10)的任何及所有子范围；也就是，所有自最小值1或大于1开始(例如1至6.1)且终于最大值10或小于10(例如5.5至10)之子范围。
应了解的是，只要本文之实施方案系以术语“包含”描述，其亦提供其它以“由...组成”及/或“基本上由...组成”之术语所描述之类似实施方案。
本发明之方面或实施方案系以Markush群组或其它选择性形式之群组描述，本发明不仅包含被标示为整体之整个群组，但亦包含该群组之个别成员及该主要群组中所有可能之亚群，且亦包含不含其中一或多个群组成员之主要群组。本发明亦设想明确排除该申请专利之发明中任何群组成员之一或多者。
除非另行定义，本文所使用之所有技术及科学术语和本发明所属领域之技术人员所通常了解之意义相同。若发生冲突，以本说明书(包括定义)为准。在本说明书及申请专利范围中，术语“包含(comprise)”或变化术语诸如“包括(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为意指包括被叙述之整体或整体之群，但不排除任何其它整体或整体之群。除非上下文另外要求，单数术语应包括复数意义且复数术语应包括单数意义。任何在术语“例如”或“如”之后的实例并不具无遗漏或限制之意。
示例性方法及材料系于本文叙述，不过与本文所述之方法及材料类似或相等者亦可被用于实施或检测本发明。这些材料、方法及实施例仅用来示例而非意图限制。
PDGF-B抗体
本发明关于与单体及/或二聚体PDGF-B结合之抗体。这些抗体优选地与PDGF-B特异性结合，即这些抗体与PDGF-B结合，但不与其它分子可检测地结合或以较低亲和性结合。特别是，本发明关于与PDGF-B结合且调节PDGF-B之活性的抗体。例如，本发明之抗体可能具有降低或抑制PDGF-B与相应的PDGFRβ受体(PDGFRαβ、PDGFRββ及PDGFRβ-IgG1)结合之能力且藉以减少或抑制受体信号传导。本发明亦关于包含这些抗体之组合物以及这些抗体之用途，包括治疗及药物用途。
术语“PDGF-B”系指可能衍生自任何适当之生物体之任何天然存在形式之PDGF-B，不论是单体或二聚体。该术语涵盖任何包含PDGF-B之二聚体，即PDGF-AB及PDGF-BB。如本文所使用，“PDGF-B”系指哺乳动物PDGF-B(诸如人、大鼠或小鼠)，以及非人灵长动物、牛、绵羊或猪PDGF-B。优选地，该PDGF-B系人PDGF-B。术语“PDGF-B”亦涵盖该PDGF-B分子之片段、变体、同种型及其它同源物。变体PDGF-B分子之特征通常为具有与天然发生之PDGF-B相同类型之活性，诸如与PDGFRβ结合之能力、诱导该受体磷酸化之能力、介导藉由该受体信号传导之能力、诱导细胞迁移或增生之能力及诱导或增加细胞外基质沉积之能力。
本发明之抗体与PDGF-B(即PDGF-B、PDGF-AB及PDGF-BB)特异性结合且抑制其与PDGFRβ(例如PDGFRββ及PDGFRαβ)之相互作用，藉以抑制PDGF-B活性。术语“PDGF-B介导的活性”、“PDGF-B介导的效应”、“PDGF-B活性”、“PDGF-B生物学活性”或“PDGF-B功能”在本文可交换使用，系指由PDGF-B与同源受体相互作用所介导之任何活性，包括但不限于PDGF-B与PDGFRβ结合、PDGFRβ之磷酸化、增加细胞迁移、增加细胞增生、增加细胞外基质沉积及任何其它PDGF-B已知或将来可能被发现之活性。
因此，本发明之方法使用阻断、抑制或减少(包括显著减少)PDGF-B活性(包括由PDGF-B介导之下游事件)之本发明之抗体。本发明之PDGF-B抗体应展现任一或多种下列特征：(a)与PDGF-B特异性结合；(b)阻断PDGF-B与细胞表面受体之相互作用及下游信号传导事件；(c)阻断PDGFRβ之磷酸化；(d)阻断PDGF-B介导之诱导细胞增生；(e)阻断诱导细胞迁移；及(f)阻断或减少PDGF-B介导之细胞外基质沉积。
就本发明之目的而言，该抗体优选地以阻断PDGF-B与细胞表面受体(例如PDGFRαβ及PDGFRββ)相互作用之方式与PDGF-B反应。
本发明所使用之抗体可包含单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)、嵌合抗体、双特异性抗体、异源缀合抗体、单链抗体(ScFv)、其突变体、包含抗体部位之融合蛋白(例如结构域抗体)、人源化抗体及任何其它含有该所需特异性之抗原识别位点的免疫球蛋白分子之经修饰之构型，包括抗体之糖基化变体、抗体之氨基酸序列变体及经共价修饰之抗体。该抗体可为小鼠、大鼠、人或任何其它来源(包括嵌合或人源化抗体)。在一些实施方案中，该PDGF-B抗体系单克隆抗体。在一些实施方案中，该抗体系人或人源化抗体。
本发明之PDGF-B抗体可由本领域中已知之任何方法制备。用于产生人及小鼠抗体之通用技术系本领域已知及/或系于本文描述。
PDGF-B抗体可利用本领域已知之方法鉴定或表征，藉此检测及/或测量PDGF-B活性之减少、改善或中和。在一些实施方案中，PDGF-B抗体系藉由将候选剂(例如PDGFRββ或PDGFRβ-IgG1)与PDGF-B温育且监测结合及/或随之而来的PDGF-B之生物学活性的减少或抑制加以鉴定。该结合试验可能利用例如经纯化之PDGF-B多肽进行，或利用天然表达多种受体或经转染以表达PDGF-B受体之细胞进行。在一实施方案中，该结合测定系竞争性结合测定，其中候选抗体与已知之PDGF-B抗体竞争与PDGF-B结合之能力系经评估。该测定可以不同形式进行，包括ELISA形式。在一些实施方案中，PDGF-B抗体系藉由将候选抗体与PDGF-B温育及监测结合加以鉴定。在一些实施方案中，PDGF-B系藉由将候选抗体(例如人抗PDGF-B抗体)与PDGF-B温育及监测第二PDGF-B抗体(例如包含非人恒定区之PDGF-B抗体)与PDGF-B之结合，以评估一抗体是否与该第二抗体竞争与PDGF-B之结合加以鉴定。
在初步鉴定之后，候选PDGF-B抗体之活性可藉由生物测定进一步证实及定义，这些生物测定已知可用于测试标靶生物学活性。在一些实施方案中，活体外细胞试验被用于进一步表征候选PDGF-B抗体。例如，候选抗体系与PDGF-B一起温育，加入第二PDGF-B抗体或包含PDGFRβ受体之胞外域的可溶性PDGFRβ(例如PDGFRβ-IgG1)，然后监测该第二抗体或可溶性受体与PDGF-B之结合。或者，生物测定可被用来直接筛选候选物。若干用于鉴定及表征PDGF-B抗体之方法系于实施例中详细描述。
本发明之PDGF-B抗体展现下列一或多项特征：(a)与PDGF-B特异性结合；(b)阻断PDGF-B与细胞表面受体之相互作用及下游信号传导事件；(c)阻断PDGF-B介导之诱导细胞增生或迁移；及(d)阻断或减少PDGF-B介导之细胞外基质沉积。优选地，本发明之PDGF-B抗体具有二或多项这些特征。更优选地，该抗体具有三或多项这些特征。更优选地，该抗体具有所有四项特征。
PDGF-B抗体可利用本领域众所周知之方法加以表征。举例来说，一种方法系鉴定其所结合之表位，或称“表位定位”。本领域有许多已知之用于定位及表征蛋白质上表位的位置之方法，包括拆开抗体-抗原复合物之晶体结构、竞争测定、基因片段表达测定及合成性肽基底测定，例如于Harlow and Lane,Using Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1999第11章所述。在另一实例中，表位定位可被用于测定PDGF-B抗体所结合之序列。表位定位可自不同之商业来源获得，例如Pepscan系统(Edelhertweg 15,8219 PHLelystad,The Netherlands)。该表位可为线性表位(即包含于单一氨基酸段中)，或由不一定包含在单一片段中之氨基酸的三维相互作用所形成之构型表位。各种长度之肽(例如至少4至6个氨基酸长)可被分离或合成(例如重组合成)，以用于PDGF-B抗体之结合检测。在另一实例中，PDGF-B抗体所结合之表位可利用系统化筛选测定，使用源自PDGF-B序列之重迭肽并测定该抗体之结合。根据基因片段表达测定，编码PDGF-B之开放阅读框系经随机分段或按特异性遗传构建分段，且PDGF-B之表达片段与所欲测试之抗体的反应性系经测定。该基因片段可能举例来说藉由PCR产生，接着于试管内有放射性氨基酸存在时被转录及翻译成蛋白质。该抗体与该经放射性标记之PDGF-B片段之结合接着藉由免疫沉淀及凝胶电泳测定。某些表位亦可藉由使用噬菌体颗粒(噬菌体文库)或酵母(酵母展示)表面所展示之随机肽序列的大型文库加以鉴定。或者，可于简单结合测定中测试经定义之重迭肽片段文库与该检测抗体之结合。在另一实例中，可进行抗原突变形成、结构域交换实验及丙氨酸扫描突变形成以鉴定表位结合所需、足够及/或必要之残基。例如，丙氨酸扫描突变形成实验可利用突变PDGF-B进行，其中该PDGF-B多肽之不同残基可经丙氨酸取代。藉由检测该抗体与该突变PDGF-B之结合力，可评估特定PDGF-B残基对抗体结合力之重要性。
另一可用于表征PDGF-B抗体之方法系使用已知和相同抗原(即PDGF-B之各种片段)结合之其它抗体的竞争试验，以测定该PDGF-B抗体是否和其它抗体一样与相同之表位结合。竞争试验为本领域技术人员所广为周知。
另外，给定抗体/抗原结合对之表位可利用各种实验及计算机表位定位方法，依不同的详细程度定义及表征。实验方法包括突变形成、X光结晶学、核磁共振(NMR)光谱分析、氢氘交换质谱分析(HX-MS)及各种竞争结合方法。由于各方法依赖独特原理，对表位之描述与用来测定之方法有密切关系。因此，给定抗体/抗原对之表位将依赖所采用之表位定位方法而有不同定义。
在最详细的程度上，用于Ag与Ab之间相互作用的表位，可藉由定义存在Ag-Ab相互作用中之原子接触的空间坐标，以及有关彼等对于结合热力学之相对贡献的信息定义。在较不详细的程度上，该表位可藉由定义Ag与Ab之间的原子接触之空间坐标表征。在更不详细的程度上，该表位可藉由其根据特定标准定义所包含之氨基酸残基表征，例如在该Ab与该Ag中原子之间的距离。在更不详系的程度上，该表位可经由功能表征，例如藉由与其它Ab之竞争结合。该表位亦可被更笼统的定义为包含经另一氨基酸取代将改变该Ab与Ag之间相互作用之特征的氨基酸残基(例如丙氨酸扫描)。
在以Ab(例如Fab片段)与其Ag之间的复合物之空间坐标所定义之X光衍生性结晶结构之情况中，本文之术语表位除非上下文另行指明或抵触，系特别定义为特征为具有与该Ab中之重原子(即非氢原子)相距不到4A之重原子的PDGF-B残基。
由于表位之叙述及定义依所使用之表位定位方法而有不同的详细程度，因此相同Ag上之不同的Ab的表位可以不同的详细程度进行类似比较。
在氨基酸层面描述之表位例如以X光结构决定者，若包含相同的氨基酸残基则被称为一致。若表位之间有至少一个相同的氨基酸则被称为重迭。若表位之间没有相同的氨基酸残基，则被称为分离(独特)。
特征在于竞争结合之表位被称为重迭，若这些对应抗体之结合系互相排斥，即一抗体之结合排除另一抗体之同时或连续结合。若抗原能与两种对应抗体同时结合，这些表位被称为分离(独特)。
术语“抗体决定簇”之定义系由相反观点衍生自上述“表位”之定义。因此，术语“抗体决定簇”系指抗体上被抗原特异性结合之范围或区域，即与抗原(PDGF-B)物理性接触之范围或区域。
在以抗体(例如Fab片段或二个Fab片段)与其抗原之间的复合物之空间坐标所定义之X光衍生性结晶结构之情况中，本文之术语抗体决定簇除非上下文另行指明或抵触，系特别定义为特征为具有与PDGF-B中之重原子(即非氢原子)相距不到之重原子的抗原残基。
给定抗体/抗原对之表位及抗体决定簇可藉由例行方法鉴定。例如，表位之大致位置可藉由评估抗体与不同片段或变体PDGF-B多肽结合的能力测定，如前文他处较详细之说明所述。在PDGF-B内与抗体接触之特定氨基酸(表位)及抗体中与PDGF-B接触之特定氨基酸(抗体决定簇)亦可利用例行方法测定，诸如实施例中所述之方法。例如，抗体及标靶分子可被组合，且该抗体/抗原复合物可被结晶化。该复合物之结晶结构可被测定并用于鉴定该抗体与其标靶之间的相互作用之特定位点。
如本文所揭示，该结晶结构分析系针对MOR8457抗体与PDGF-BB二聚体之间的相互作用进行。此分析于实施例中更详细说明。
本发明之抗体的抗体决定簇可如下述定义：该抗体之轻链可变结构域包含基于相应于SEQ ID NO:1之序列的卡巴编号之残基G28、S29、Y30、F31、D49、D50、F90、T91、H92、N93、S94，且该抗体之重链可变结构域包含基于相应于SEQ ID NO:2之序列的卡巴编号之残基Y50、L57、Y59、Y60、D62、W102、Y103、G104、G105。
本发明之抗体的抗体决定簇可进一步包含基于相应于SEQ ID NO:1之序列的轻链可变结构域之残基N65，及基于相应于SEQ ID NO:2之序列的重链可变结构域之残基W47。
本发明之抗体的轻链可变结构域因此可能包含SEQ ID NO:1之序列中对应下列位置的氨基酸残基：
·在对应位置28之位置的G，
·在对应位置29之位置的S，
·在对应位置30之位置的Y，
·在对应位置31之位置的F，
·在对应位置49之位置的D，
·在对应位置50之位置的D，
·在对应位置65之位置的N，
·在对应位置90之位置的F，
·在对应位置91之位置的T，
·在对应位置92之位置的H，
·在对应位置93之位置的N，及
·在对应位置94之位置的S；
且该抗体之重链可变结构域可能包含SEQ ID NO:2之序列中对应下列位置之氨基酸残基：
·在对应位置50之位置的Y，
·在对应位置57之位置的L，
·在对应位置59之位置的Y，
·在对应位置60之位置的Y，
·在对应位置62之位置的D，
·在对应位置102之位置的W，
·在对应位置103之位置的Y，
·在对应位置104之位置的G，及
·在对应位置105之位置的G。
本发明之抗体的轻链可能进一步包含在对应SEQ ID NO:1之序列的位置65之位置的N；且该重链可变结构域可能进一步包含在对应SEQ IDNO:2之位置47的位置之W。
对MOR8457，发现该表位系由如SEQ ID NO:33所述之PDGF-B序列中的氨基酸Leu 38、Val 39、Trp 40、Asn 54、Arg 56、Glu 71、Arg 73、Ile 75、Ile 77、Arg 79、Lys 80、Lys 81、Pro 82、Ile 83、Phe 84、Lys 85及Lys 86组成。
因此，在一实施方案中，由本发明之抗体所结合之表位包含选自由如SEQ ID NO:33所述之PDGF-B序列中的Leu 38、Val 39、Trp 40、Asn54、Arg 56、Glu 71、Arg 73、Ile 75、Ile 77、Arg 79、Lys 80、Lys 81、Pro 82、Ile 83、Phe 84、Lys 85及Lys 86所组成之氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基，更优选地至少二个氨基酸残基，甚至更优选地至少三个氨基酸残基，又更优选地至少四个氨基酸残基，更优选地至少五个氨基酸残基，另更优选地至少六个氨基酸残基，甚至更优选地至少七个氨基酸残基，又更优选地至少八个氨基酸残基，更优选地至少九个氨基酸残基，甚至更优选地至少十个氨基酸残基，更优选地至少11个氨基酸残基，甚至更优选地至少12个氨基酸残基，又更优选地至少13个氨基酸残基，更优选地至少14个氨基酸残基，又更优选地至少15个氨基酸残基，甚至更优选地至少16个氨基酸残基，且甚至更优选地所有17个氨基酸残基。
在另一实施方案中，该抗体包含抗体决定簇，该抗体决定簇包含基于相应于SEQ ID NO:2之序列的卡巴编号之轻链可变结构域残基G28、S29、Y30、F31、D49、D50、F90、T91、H92、N93、S94及基于相应于SEQ ID NO:2之序列的卡巴编号之重链可变结构域残基Y50、L57、Y59、Y60、D62、W102、Y103、G104、G105，其中该抗体与PDGF-B上包含下列PDGF-B之氨基酸残基(表位)的表位结合：如SEQ ID NO:33所述之PDGF-B序列编号之Leu 38、Val 39、Trp 40、Asn 54、Arg 56、Glu 71、Arg 73、Ile 75、Ile 77、Arg 79、Lys 80、Lys 81、Pro 82、Ile 83、Phe84、Lys 85及Lys 86。
在另一实施方案中，本发明之抗体包含抗体决定簇，其中该抗体决定簇之氨基酸残基与PDGF-B之对应氨基酸残基(表位)接触(小于或等于 )，如实施例7之表4所示。也就是说，对该抗体之重链可变结构域，Trp 47接触PDGF-B之Lys 82，Leu 57接触PDGF-B之Ile 77，Tyr 59接触PDGF-B之Ile 77、Arg 79、Lys 80、Lys 81及Pro 82，Trp 102接触PDGF-B之Leu 8、Val 39、Trp 40、Asn 54、Arg 56、Ile 75及Phe 84，Tyr 103接触PDGF-B之Trp 40、Arg 73、Ile 75及Phe 84，Gly 104接触PDGF-B之Arg 73及Phe 84且Gly 105接触PDGF-B之Phe 84；且对该抗体之轻链可变结构域，Gly 28接触PDGF-B之Lys 86，Ser 29接触PDGF-B之Lys 85及Lys 86，Tyr 30接触PDGF-B之Ile 83、Phe 84、Lys 85及Lys 86，Phe 31接触PDGF-B之Gln 71、Arg 73、Phe 84及Lys 86，Asp49接触PDGF-B之Arg 73，Asp 50接触PDGF-B之Lys 86，Asn 65接触PDGF-B之Lys 86，Phe 90接触PDGF-B之Pro 82、Ile 83及Phe 84，Thr91接触PDGF-B之Lys 81及Ile 83，His 92接触PDGF-B之Lys 81及Ile83，Asn 93接触PDGF-B之Lys 81且Ser 94接触PDGF-B之Lys 81，其中PDGF-B接触残基之残基编号系根据SEQ ID NO:33之序列所述。
本发明之抗体可与藉由二条PDGF-B多肽链同源二聚化所形成之二种表位之任一种结合。因此，本发明包含与PDGF-BB之一表位结合之抗体，其中该表位系选自表位1及表位2，表位1包含如SEQ ID NO:33所述之PDGF-B序列之氨基酸Leu 38、Val,39、Trp 40、Asn 54、Arg 56、Glu 71、Arg 73、Ile 75、Ile 77、Arg 79、Lys 80、Lys 81、Pro 82、Ile83、Phe 84、Lys 85及Lys 86，表位2包含如SEQ ID NO:33所述之PDGF-B序列之氨基酸Trp 40、Asn 54、Glu 71、Arg 73、Ile 75、Glu 76、Ile 77、Arg 79、Lys 80、Lys 81、Pro 82、Ile 83、Phe 84、Lys 85及Lys86。
本发明之抗体包含无法同时与二种表位结合之抗体。因此，在一实施方案中，该抗体包含可与表位1及表位2二者结合之抗体，但非同时结合，因为在该PDGF-BB同源二聚体分子上，这些表位彼此相隔约
本发明之抗体可能与本文特别揭示之本发明之抗体所结合之PDGF-B之相同表位或结构域结合。例如，本发明之其它尚未鉴定之抗体可能藉由比较其与PDGF-B之结合及单克隆抗体MOR8457及其种系变体与PDGF-B之结合加以鉴定，或藉由比较尚未鉴定之抗体与MOR8457之功能加以鉴定。可被用于这些鉴定目的之分析及检测，包括评估受到关注之抗体及PDGFRβ之间竞争与PDGF-B之结合以及多种抗PDGF-B抗体之间竞争与PDGF-B之结合，如实施例6所述之检测；分析抗体与PDGF-B之结晶结构，诸如实施例7所述之分析；实施例8中用于抑制人系膜细胞增生之检测；及实施例9所述之检测抗体于大鼠肾炎模型之作用的体内模型。
在一实施方案中，本发明之抗体可与本文所述之MOR8457抗体所结合之相同表位或区域结合。这些抗体与PDGF-B之结合系于本文他处更详细说明。本发明之抗体可为与MOR5457抗体所结合至PDGF-B之相同表位结合之抗体。此可能包括其与如上所述之PDGF-B的特定氨基酸接触。例如，本发明之抗体可能以与如SEQ ID NO:33所述之PDGF-B序列之氨基酸Leu 38、Val,39、Trp 40、Asn 54、Arg 56、Glu 71、Arg 73、Ile 75、Ile 77、Arg 79、Lys 80、Lys 81、Pro 82、Ile 83、Phe 84、Lys 85及Lys 86接触，或与如SEQ ID NO:33所述之PDGF-B序列之氨基酸Trp 40、Asn54、Glu 71、Arg 73、Ile 75、Glu 76、Ile 77、Arg 79、Lys 80、Lys 81、Pro 82、Ile 83、Phe 84、Lys 85及Lys 86接触之方式与PDGF-B结合。
本发明之抗体可能可与包含一或多个选自SEQ ID NO:33序列之Leu38、Val 39、Trp 40、Asn 54、Arg 56、Glu 71、Arg 73、Ile 75、Ile 77、Arg 79、Lys 80、Lys 81、Pro 82、Ile 83、Phe 84、Lys 85及Lys 86的残基之表位结合。
本发明之抗体可能可与包含残基Leu 38、Val,39、Trp 40、Asn 54、Arg 56、Glu 71、Arg 73、Ile 75、Ile 77、Arg 79、Lys 80、Lys 81、Pro82、Ile 83、Phe 84、Lys 85及Lys 86之表位，或包含残基Trp 40、Asn54、Glu 71、Arg 73、Ile 75、Glu 76、Ile 77、Arg 79、Lys 80、Lys 81、Pro 82、Ile 83、Phe 84、Lys 85及Lys 86之表位结合，所有上述残基皆相应于如SEQ ID NO:33所述之PDGF-B序列。
本发明之抗体可能具有与本发明之另一抗体竞争与本文所述之PDGF-B结合之能力。例如，本发明之抗体可能与本文所述之MOR8457抗体交叉竞争与PDGF-B或MOR8457抗体所结合之PDGF-B之适当片段或变体之结合。这些交叉竞争之抗体可根据其与本发明之已知抗体在标准结合试验中交叉竞争之能力鉴定。例如，SPR(例如藉由使用BiacoreTM系统)、ELISA试验或流式细胞分析可被用于证明交叉竞争。该交叉竞争可能显示二种抗体与相同、重迭或类似之表位结合。
本发明之抗体包含能以相较于Ogawa et al.,2010,Hepatol.Res.40:1128-1141所述之AbyD3263更高之亲和性与PDGF-B结合之抗体。
本发明之抗体因此可藉由包含结合试验之方法鉴定，该方法评估测试抗体是否能与本发明之已知抗体竞争该标靶分子上之结合位点。用于进行竞争性结合测定之方法系于本文揭示及/或为本领域所广为周知。例如，这些方法可能涉及在本发明之已知抗体与标靶分子可结合之条件下，使该抗体与该标靶分子结合。接着使该抗体/标靶复合物暴露于测试抗体，评估该测试抗体能取代抗体/标靶复合物中之本发明之抗体之程度。替代方法可能涉及使测试抗体与标靶分子在允许抗体结合之条件下接触，接着添加本发明之能结合该标靶分子之抗体，评估本发明之抗体能取代抗体/标靶复合物中之该测试抗体之程度。
测试抗体抑制本发明之抗体与标靶结合之能力，显示该测试抗体可与本发明之抗体竞争与该标靶之结合，因此该测试抗体和本发明之已知抗体与PDGF-B蛋白上之相同表位或区域结合。以该方法被鉴定为与本发明之已知抗体竞争之测试抗体也是本发明之潜在抗体。该测试抗体可与本发明之已知抗体所结合之PDGF-B相同区域结合且可与本发明之已知抗体竞争之事实，显示该测试抗体可能如同该已知抗体作为该相同结合位点之配体，因此该测试抗体可能模拟该已知抗体之作用。此可藉由评估当本文所述之测试化合物存在时之PDGF-B活性证实。
本发明之已知抗体可为本文所述之抗体，诸如MOR8457，或如本文所述之保留与PDGF-B结合之能力的其任何变体或片段，诸如种系抗体，其中之一在本文揭示为包含种系VH(MOR8457-GL-VH；SEQ ID NO:6)及种系VL(MOR8457-LG-VL；SEQ ID NO:4)，或变体诸如MOR8457-15(其包含经修饰之VH(MOR8457-15-VH；SEQ ID NO:44)及经修饰之VL(MOR8457-15-VL；SEQ ID NO:34))及MOR8457-16(其包含和MOR8457-15相同之经修饰之VH(亦称为MOR8457-16-VH或MORE8457-15/16-VH；SEQ ID NO:44)及经修饰之VL(MOR8457-16-VL；SEQ ID NO:39))。本发明之抗体可能与如本文所述之MOR8457抗体或如本文所述之保留与PDGF-B结合之能力的其任何变体或片段所结合之相同表位结合。
本发明之抗体可能与和实施例中进一步描述之MOR8457表位一致、重迭或类似之表位结合。例如，本发明之抗体可能与上述用于MOR8457结合之五或更多、六或更多、七或更多、八或更多或十或12、或14、或16或更多个氨基酸残基结合。例如，当与SEQ ID NO:33之多肽接触时，本发明之抗体可能与该多肽结合且与氨基酸Leu 38、Val 39、Trp 40、Asn54、Arg 56、Glu 71、Arg 73、Ile 75、Ile 77、Arg 79、Lys 80、Lys 81、Pro 82、Ile 83、Phe 84、Lys 85及Lys 86接触，或与氨基酸Trp 40、Asn54、Glu 71、Arg 73、Ile 75、Glu 76、Ile 77、Arg 79、Lys 80、Lys 81、Pro 82、Ile 83、Phe 84、Lys 85及Lys 86接触，或与这些氨基酸之亚群接触，诸如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、或至少17个这些氨基酸。
如前文他处所述，特异性结合可参考该抗体与非标靶之分子的结合评估。藉由比较抗体与标靶及与另一分子结合之能力可做出此比较。此比较可如上述以评估KD或Ki进行。用于该比较之其它分子可为不是该标靶分子之任何分子。优选地，该其它分子不与该标靶分子相同。优选地，该标靶分子不是该标靶分子之片段。
本发明之抗体之KD可能小于69pM，诸如小于50pM，诸如小于30pM，诸如小于25pM，诸如小于15pM，诸如小于13pM，诸如小于12pM，诸如小于10pM，诸如小于4pM，诸如小于2pM，诸如小于2pM，诸如介于15pM至2pM。
用于测定特异性结合之其它分子可能与标靶分子之结构或功能无关。例如，该其它分子可能为环境中之非相关物质或伴随物质。
用于测定特异性结合之其它分子可能是涉及与标靶分子(即PDGF-B)相同之活体内途径之另一分子。例如，当该标靶为PDGF-B时，该用于比较之其它分子可为形成该PDGF-B/PDGFRβ信号传导级联之部分的蛋白。藉由确定本发明之抗体对PDGF-BB而非对另一该分子具有特异性，可避免在活体内发生非所欲之交叉反应。
本发明之抗体可能保留和该标靶分子相关之若干分子结合之能力。例如，全长成熟人PDGF-B可被用来做为标靶，但抗体也可能能和例如人PDGF-B之前肽形式、人PDGF-B之片段或截短形式、与脂蛋白或细胞结合之PDGF-B或源自其它物种之PDGF-B诸如其它哺乳动物PDGF-B结合。
或者，本发明之抗体可能对特定标靶分子具有特异性。例如，该抗体可能与本文所述之一标靶分子结合，但可能不与本文所述之不同的标靶分子结合，或以显著较低之亲和性与其结合。例如，全长成熟人PDGF-B可能被用来作为标靶，但是与该标靶结合之抗体可能无法与例如其它PDGF(PDGF-A或PDGF-C或PDGF-D)或源自其它物种之PDGF-B诸如其它哺乳动物PDGF-B结合或可能以较低亲和性与彼等结合。
本发明之抗体可与PDGF-B结合，且藉由与PDGF-B结合可能抑制PDGF-B之活性。
本文所使用之术语“结合亲和性”系二个分子(例如抗体或其抗原结合片段与抗原)之间非共价相互作用之强度的测量值。术语“结合亲和性”系用来描述单价相互作用(内在活性)。
根据上述定义，与不同分子相互作用有关之结合亲和性例如比较不同抗体与一给定抗原之结合亲和性，可能藉由比较个别抗体/抗原复合物之KD值加以比较。
同样地，相互作用之特异性可能藉由测定及比较感兴趣之相互作用(例如抗体及抗原之间的特定相互作用)的KD值与不感兴趣之相互作用(例如已知不与PDGF-B结合之对照抗体)之KD值加以评估。
通常，该抗体对PDGF-B之KD相较于对其他非PDGF-B分子诸如环境中之不相关物质或伴随物质之KD将小2倍、优选5倍、更优选10倍。更优选地，该KD将小50倍，诸如小100倍，或小200倍；甚至更优选地小500倍，诸如小1,000倍或小10,000倍。
解离常数之值可藉由广为周知之方法直接测定，甚至可计算复杂混合物之解离常数，例如藉由那些于Caceci et al.(1984,Byte 9:340-362)中所述之方法。例如，KD可利用双过滤硝化纤维素膜结合试验建立，诸如由Wong&Lohman(1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5428-5432)所揭示者。其它用于评估配体诸如抗体与标靶抗原之结合能力的标准检测系本领域已知，包括例如ELISA、蛋白质印迹分析、RIA、流式细胞分析及其它本文他处所示之试验。抗体之结合动力学及结合亲和性亦可藉由本领域已知之标准检测评估，诸如使用BiacoreTM系统之表面等离子体共振(SPR)。
可进行竞争性结合测定，其中抗体与抗原之结合系与该标靶与该标靶之另一配体之结合比较，诸如与该标靶以不同方式结合之另一抗体或可溶性受体(例如PDGFRβ-IgG1)。发生50％抑制之浓度称为Ki。在理想条件下，Ki等于KD。Ki值绝不会小于KD，因此可方便地以Ki之测量值取代以提供KD之上限。
本发明之抗体对PDGF-B之KD可能为1×10-7M或更小、1×10-8M或更小、或1×10-9M或更小、或1×10-10M或更小、1×10-11M或更小、或1×10-12M或更小、或1×10-13M或更小、1×10-14M或更小、或1×10-15M或更小。
与其标靶特异性结合之抗体可能以高亲和性与其标靶结合，也就是展现如上讨论之KD低值，且可能以较低亲和性与其它非标靶分子结合。例如，该抗体可能以1×10-6M或更高、更优选地1×10-5M或更高、更优选地1×10-4M或更高、更优选地1×10-3M或更高、甚至更优选地1×10-2M或更高之KD与非标靶分子结合。本发明之抗体系优选地能以相较于其对另一非PDGF-B分子之结合亲和性至少为2倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或10,000倍或更高之亲和性与其标靶结合。
在其它实施方案中，PDGF-B抗体对PDGF-B之结合亲和性(KD)可为约0.001至约250nM。在一些实施方案中，该结合亲和性系约200nM、约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM、约60pM、约50pM、约20pM、约15pM、约10pM、约5pM、约2pM或约1pM之任一者。在一些实施方案中，该结合亲和性系小于约250nM、约200nM、约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM、约50pM、约20pM、约10pM、约5pM、或约2pM之任一者。在一些实施方案中，PDGF-B抗体之KD介于约70pM至约1pM。在一些实施方案中，PDGF-B抗体对人PDGF-B之KD介于约30pM至约2pM。在一些实施方案中，本发明之PDGF-B抗体之结合亲和性系约69pM、约28pM、约25pM、约15pM、约13pM、约10pM、约4pM或约2pM。
在一实施方案中，本发明之抗体不是如Ogawa et al.,2010,HepatologyRes.40:1128-1141所述之抗体AbyD3263。
在一实施方案中，本发明之抗体以低于AbyD3263之KD(即13nM)之结合亲和性(KD)与人PDGF-BB结合。
本发明提供下列任一者或包含下列之组合物(包括药物组合物)：具有衍生自MOR8457之轻链序列(或其部分)及重链(或其部分)之抗体。
本发明之多肽或抗体“片段”或“部分”可能藉由截短制备，例如藉由移除多肽之N及/或C端之一或多个氨基酸。多达10、多达20、多达30、多达40或更多个氨基酸可以此方式自该N及/或C端移除。片段亦可藉由一或多个内部删除产生。
本发明之抗体可为或可包含MOR8457抗体或其变体之片段。本发明之抗体可为或可包含此抗体或其变体之抗原结合部分。例如，本发明之抗体可为此抗体或其变体之Fab片段或可为衍生自此抗体或其变体之单链抗体。
MOR8457抗体之轻链可变结构域(MOR8457-VL)及重链可变结构域(MOR8457-VH)之氨基酸序列，分别提供于SEQ ID NO:1及2。种系MOR8457抗体之VL及VH可变结构域之氨基酸序列，分别提供于SEQID NO:4(MOR8457-GL-VL)及6(MOR8457-GL-VH)。全长种系轻链(MOR8457-GL-LC)之氨基酸序列系提供于SEQ ID NO:16，且在恒定结构域另包含效应功能三突变之全长种系重链(MOR8457-GL-hIgG1-3m-HC)之氨基酸序列系提供于SEQ ID NO:14。此外，也提供变体抗体MOR8457-15及MOR8457-16之氨基酸序列。MOR8457-15之VL及VH之氨基酸序列系分别提供于SEQ ID NO:34(MOR8457-15-VL)及44(MOR8457-15-VH)。全长MOR8457-15轻链(MOR8457-15-LC)之氨基酸序列系提供于SEQ IDNO:37，且在恒定结构域另包含效应功能三突变之全长MOR8457-15重链(MOR8457-15-HC)之氨基酸序列系提供于SEQ ID NO:46。MOR8457-16之VL及VH之氨基酸序列系分别提供于SEQ ID NO:39(MOR8457-16-VL)及44(MOR8457-16-VH)。全长MOR8457-16轻链(MOR8457-16-LC)之氨基酸序列系提供于SEQ ID NO:42，且在恒定结构域另包含效应功能三突变之全长MOR8457-16重链(MOR8457-16-HC)之氨基酸序列系提供于SEQ IDNO:46。因此，应了解MOR8457-15及MOR8457-16共有如SEQ ID NO:44所示之相同的VH氨基酸序列。
本发明之抗体可能包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4之VL氨基酸序列或其片段或变体。本发明之抗体可能包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6之VH氨基酸序列或其片段或变体。本发明之抗体可能包含(a)SEQ IDNO:1之VL氨基酸序列或其片段或变体及SEQ ID NO:2之VH氨基酸序列或其片段或变体，或(b)SEQ ID NO:1之VL氨基酸序列或其片段或变体及SEQ ID NO:6之VH氨基酸序列或其片段或变体，或(c)SEQ ID NO:4之VL氨基酸序列或其片段或变体及SEQ ID NO:2之VH氨基酸序列或其片段或变体，或(d)SEQ ID NO:4之VL氨基酸序列或其片段或变体及SEQID NO:6之VH氨基酸序列或其片段或变体。
本发明之抗体亦可能包含SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:39之VL氨基酸序列或其片段或变体。本发明之抗体可能包含SEQ ID NO:44之VH氨基酸序列或其片段或变体。本发明之抗体可能包含(a)SEQ ID NO:34之VL氨基酸序列或其片段或变体及SEQ ID NO:44之VH氨基酸序列或其片段或变体，或(b)SEQ ID NO:39之VL氨基酸序列或其片段或变体及SEQ IDNO:44之VH氨基酸序列或其片段或变体。
在一方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQID NO:34或SEQ ID NO:39之序列的VL。在另一方面中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:44之氨基酸序列的VH。在另一方面中，该抗体包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:39及SEQ ID NO:44之序列的变体，其中这些变体可包括保守性及非保守性取代、删除及/或添加，且通常包括与本文揭示之特测序列之任一者具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％之序列相同性。
例如，在一方面中，本发明提供包含如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:44所示之VH链氨基酸序列之经分离之抗体或其抗原结合部分或其变体。在一方面中，该抗体变体包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:44之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个保守性或非保守性取代，及/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个添加及/或删除。在其它方面中，该变体与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:44具有至少65％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％之序列相同性，且其中该抗体或其抗原结合部分与PDGF-B特异性结合。
在其它方面中，本发明提供包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:39所示之VL链氨基酸序列之经分离之抗体或其抗原结合部分或其变体。在一方面中，该抗体变体包含SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:39之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个保守性或非保守性取代，及/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个添加及/或删除。在其它方面中，该变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQID NO:34或SEQ ID NO:39具有至少65％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％之序列相同性，且其中该抗体或其抗原结合部分与PDGF-B特异性结合。
本发明之抗体可能包含重链，该重链包含含有SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:44之氨基酸序列的VH，其中该抗体另包含重链恒定结构域。如本文他处更详细的阐述，该抗体重链恒定结构域可选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选地系IgG1或IgG2恒定区。IgG恒定区序列可为任何已知发生在不同个体之各种等位基因或同种异型，诸如Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)及Gm(17)。就Fab片段重链基因而言，该编码VH之DNA可与另一仅编码重链CH1恒定区之DNA分子可操作性连接。该CH1重链恒定区可源自任何重链基因。
在一方面中，该抗体可能包含重链，该重链包含选自包含SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:44之氨基酸序列之VH的VH且另包含含有SEQ ID NO:19之氨基酸序列之人野生型IgG1恒定结构域。在另一方面中，该IgG1恒定结构域包含减少或废除Fc效应功能之三突变(hIgG1-3m；SEQ ID NO:21)。在一方面中，本发明之抗体可包含重链，该重链包含含有SEQ ID NO:6之序列之种系VH且另包含人IgG1-3m恒定结构域，以使该全长重链氨基酸序列包含SEQ ID NO:14(MOR8457-GL-hIgG1-3m-HC)。在另一方面中，本发明之抗体可包含重链，该重链包含SEQ IDNO:44之序列且另包含人IgG1-3m恒定结构域，以使该全长重链氨基酸序列包含SEQ ID NO:46(MOR8457-15-HC或MOR8457-16-HC)。
在其它方面中，本发明提供包含含有如SEQ ID NO:14所示之氨基酸序列之全长重链之经分离之抗体或其抗原结合部分或其变体。在一方面中，该抗体变体包含SEQ ID NO:14之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个保守性或非保守性取代，及/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个添加及/或删除。在其它方面中，该变体与SEQ ID NO:14具有至少65％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％之序列相同性，且其中该抗体或其抗原结合部分与PDGF-B特异性结合。
本发明之抗体可能包含轻链，该轻链包含含有SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:39之氨基酸序列的VL，其中该抗体另包含轻链恒定结构域。如本文他处更详细之阐述，该抗体轻链恒定结构域可选自Cκ或Cλ恒定区，优选为Cλ恒定区。
在一方面中，该抗体可能包含轻链，该轻链包含选自包含SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:39之氨基酸序列之VL的VL且另包含含有SEQ ID NO:23之氨基酸序列之人野生型Cλ恒定结构域。在另一方面中，该抗体可能包含原始VL序列(SEQ ID NO:1)且另包含含有以IKR非故意的三突变取代序列TVL之人Cλ恒定结构域(SEQID NO:17；MOR8457-IKR-LC)。在一方面中，本发明之抗体可包含轻链，该轻链包含含有SEQ ID NO:4之序列之种系VL且另包含人野生型Cλ恒定结构域(SEQ ID NO:23)，以使该全长轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO:16(MOR8457-GL-LC)。在另一方面中，本发明之抗体可能包含轻链，该轻链包含含有SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:39之序列之变体VL，以使该全长轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO:37(MOR8457-15-LC)或SEQ ID NO:42(MOR8457-16-LC)。
在其它方面中，本发明提供包含含有如SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:42所示之氨基酸序列之全长轻链之经分离之抗体或其抗原结合部分或其变体。在一方面中，该抗体变体包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:42之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个保守性或非保守性取代，及/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个添加及/或删除。在其它方面中，该变体与SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:42具有至少65％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％之序列相同性，且其中该抗体或其抗原结合部分与PDGF-B特异性结合。
本发明涵盖包含由2012年11月6日保藏于ATCC为MOR8457-GL-VH(ATCC编号PTA-13303)之载体的多核苷酸插入物所编码之重链可变结构域氨基酸序列之三个CDR的抗体或其抗原结合片段。在一方面中，本发明之该抗体或其抗原结合片段包含由保藏于ATCC为MOR8457-GL-VH(ATCC编号PTA-13303)之载体的多核苷酸插入物所编码之VH结构域氨基酸序列。
本发明涵盖包含由2012年11月6日保藏于ATCC为MOR8457-GL-VH(ATCC编号PTA-13303)之载体的多核苷酸插入物所编码之重链可变结构域氨基酸序列之二个CDR(CDR-H2及CDR-H3)的抗体或其抗原结合片段。在一方面中，本发明之该抗体或其抗原结合片段包含由保藏于ATCC为MOR8457-GL-VH(ATCC编号PTA-13303)之载体的多核苷酸插入物所编码之VH结构域氨基酸序列，其中CDR-H1不需要存在。
本发明涵盖包含由2012年11月6日保藏于ATCC为MOR8457-GL-VL(ATCC编号PTA-13302)之载体的多核苷酸插入物所编码之轻链可变结构域氨基酸序列之三个CDR的抗体或其抗原结合片段。在一方面中，本发明之该抗体或其抗原结合片段包含由保藏于ATCC为MOR8457-GL-VL(ATCC编号PTA-13302)之载体的多核苷酸插入物所编码之VL结构域氨基酸序列。
本发明涵盖一种抗体或其抗原结合片段，其包含由2012年11月6日保藏于ATCC为MOR8457-GL-VL(ATCC编号PTA-13302)之载体的多核苷酸插入物所编码之轻链可变结构域氨基酸序列之三个CDR，及由保藏于ATCC为MOR8457-GL-VH(ATCC编号PTA-13303)之载体的多核苷酸插入物所编码之重链可变结构域氨基酸序列之三个CDR。
本发明包含一种抗体或其抗原结合片段，其包含由2012年11月6日保藏于ATCC为MOR8457-GL-VL(ATCC编号PTA-13302)之载体的多核苷酸插入物所编码之轻链可变结构域氨基酸序列之三个CDR，及由保藏于ATCC为MOR8457-GL-VH(ATCC编号PTA-13303)之载体的多核苷酸插入物所编码之重链可变结构域氨基酸序列之二个CDR(CDR-H2及CDR-H3)。
本发明涵盖一种抗体或其抗原结合片段，其包含由2012年11月6日保藏于ATCC为MOR8457-GL-VL(ATCC编号PTA-13302)之载体的多核苷酸插入物所编码之轻链可变结构域氨基酸序列，及由保藏于ATCC为MOR8457-GL-VH(ATCC编号PTA-13303)之载体的多核苷酸插入物所编码之重链可变结构域氨基酸序列。
编码VL区之经分离之DNA可藉由可操作地连接该编码VL之DNA与另一编码轻链恒定区(CL)之DNA分子以转换成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因之序列系本领域已知(见例如Kabat,E.A.,etal.,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publ.No.91-3242)且包含这些区之DNA片段可藉由标准PCR扩增获得。该轻链恒定区可为κ或λ恒定区。κ恒定区序列可为任何已知发生在不同个体之各种等位基因，诸如Inv(1)、Inv(2)及Inv(3)。λ恒定区可源自三个λ基因之任一基因。
本发明之抗体可能包含如图1所示之VL或VH氨基酸序列中之一者之片段。例如，本发明之抗体可能包含源自SEQ ID NO:4、6、34、40或44之至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少15、至少18、至少20或至少25个连续氨基酸之片段。该片段将优选地保留如上述之一或多种功能，诸如与PDGF-B结合之能力。
任何这些VH或VL序列之适当片段或变体将保留与PDGF-B结合之能力。其将优选地保留与PDGF-B特异性结合之能力。其将优选地保留与其所衍生之抗体(MOR8457)所结合之PDGF-B分子之该相同或类似表位或区域特异性结合之能力。其将优选地保留其所衍生之抗体的一或多种其它功能，诸如抑制PDGF-B与其受体结合之能力、抑制PDGFR信号传导之活性或能力、抑制PDGF-B诱导细胞增生之能力等。
适当之片段或变异VL序列将优选地保留根据SEQ ID NO:1或SEQID NO:4之氨基酸序列的位置G28、S29、Y30、F31、D49、D50、F90、T91、H92、N93、S94之氨基酸。适当之片段或变异VH序列将优选地保留根据SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6之序列的位置Y50、L57、Y59、Y60、D62、W102、Y103、G104、G105之氨基酸。如表2及3所示，这些是当MOR8457与PDGF-BB结合时，在MOR8457轻链及重链可变结构域序列中，具有与PDGF-B之重原子相距不到之重原子的残基。
本发明之抗体可包含源自本文所述之特定抗体之CDR区，诸如源自SEQ ID NO:1、2、4、6、34、39或44内之CDR区。该抗体将优选地保留与本文所述之PDGF-B结合之能力。
例如，如图1所示，使用卡巴定义，在MOR8457之轻链内的CDR序列可被鉴定为氨基酸SGDSLGSYFVH(MOR8457CDR-L1；SEQ IDNO:10)、DDSNRPS(MOR8457CDR-L2；SEQ ID NO:11)或SAFTHNSDV(MOR8457CDR-L3；SEQ ID NO:12)。此外，在变异抗体MOR8457-15之轻链内的CDR序列可被鉴定为氨基酸SGDSLGSYFVH(MOR8457CDR-L1；SEQ ID NO:10)、DDSNRPS(MOR8457CDR-L2；SEQ ID NO:11)或SAFTHNSNV(MOR8457-15CDR-L3；SEQ ID NO:36)。另外，在变异抗体MOR8457-16之轻链内的CDR序列可被鉴定为氨基酸SGDSLGSYFVH(MOR8457CDR-L1；SEQ ID NO:10)、DDSKRPS(MOR8457-16CDR-L2；SEQ ID NO:41)或SAFTHNSDV(MOR8457CDR-L3；SEQ ID NO:12)。在MOR8457之重链内的CDR序列可被鉴定为氨基酸GFTFSSYAMS(MOR8457CDR-H1；SEQ ID NO:7)、YISDDGSLKYYADSVKG(MOR8457CDR-H2；SEQ ID NO:8)或HPYWYGGQLDL(MOR8457CDR-H3；SEQ IDNO:9)。本发明之抗体可能包含如图1C-F及1I-K所示之一或多个CDR序列。例如，本发明之抗体可能包含如SEQ ID NO:7、8及9所示之一、二或三个氨基酸序列。本发明之抗体可选择性或另外包含如SEQ IDNO:10、11、12、36及41所示之一、二或三个氨基酸序列。本发明之抗体可能包含如SEQ ID NO:7至12或SEQ ID NO:7、8、9、10、12、41或SEQ ID NO:7、8、9、10、11、36所示之所有六个氨基酸序列。
在一方面，本发明提供包含含有SEQ ID NO:7至12，SEQ ID NO:7、8、9、10、12、41或SEQ ID NO:7、8、9、10、11、36之序列的六个CDR之经分离之抗体或其抗原结合部分或其变体。在一方面中，该抗体变体包含含有SEQ ID NO:7至12、SEQ ID NO:7、8、9、10、12、41或SEQ ID NO:7、8、9、10、11、36之序列的CDR之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个保守性或非保守性取代，及/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个添加及/或删除。在其它方面中，该变体与SEQ ID NO:7至12，SEQ ID NO:7、8、9、10、12、41或SEQ ID NO:7、8、9、10、11、36之序列具有至少65％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％之序列相同性，且其中该抗体或其抗原结合部分与PDGF-B特异性结合。
本发明之抗体可能选择性或另外包含MOR8457或其变体的5个CDR序列。也就是，本文他处所揭示之结晶结构数据(实施例7)显示CDR-H1不与PDGF-B接触(即SEQ ID NO:7序列中之重原子没有一个位在PDGF-B之残基的重原子之之内)，表示MOR8457CDR-H1可能不造成与PDGF-B之结合。因此，本发明之抗体可能包含例如下列五个CDR结构域之组合：CDR-H2(SEQ ID NO:8)、CDR-H3(SEQ ID NO:9)、CDR-L1(SEQID NO:10)、CDR-L2(SEQ ID NO:11)及CDR-L3(SEQ ID NO:12)；或CDR-H2(SEQ ID NO:8)、CDR-H3(SEQ ID NO:9)、CDR-L1(SEQ IDNO:10)、CDR-L2(SEQ ID NO:11)及CDR-L3(SEQ ID NO:36)；或CDR-H2(SEQ ID NO:8)、CDR-H3(SEQ ID NO:9)、CDR-L1(SEQ ID NO:10)、CDR-L2(SEQ ID NO:41)及CDR-L3(SEQ ID NO:12)。
在一方面，本发明提供包含含有SEQ ID NO:8至12，SEQ ID NO:8、9、10、11及36，或SEQ ID NO:8、9、10、41及12之序列的五个CDR之经分离之抗体或其抗原结合部分或其变体。在一方面中，该抗体变体包含含有SEQ ID NO:8至12、36及41之序列的CDR之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个保守性或非保守性取代，及/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个添加及/或删除。在其它方面中，该变体与SEQ ID NO:8至12之序列具有至少65％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％之序列相同性，且其中该抗体或其抗原结合部分与PDGF-B特异性结合。
本发明之抗体可能包含其中不是接触残基之氨基酸残基可能被取代之CDR序列。也就是，当抗体包含下列任何CDR时，未画线之氨基酸残基可能被取代或删除，因为其不与PDGF-B上之表位(1或2)接触：
·MOR8457CDR-H1    GFTFSSYAMS(SEQ ID NO:7)
·MOR8457CDR-H2    YISDDGSLKYYADSVKG(SEQ ID NO:8)
·MOR8457CDR-H3    HPYWYGGQLDL(SEQ ID NO:9)
·MOR8457CDR-L1    SGDSLGSYFVH(SEQ ID NO:10)
·MOR8457CDR-L2    DDSNRPS(SEQ ID NO:11)
·MOR8457CDR-L3    SAFTHNSDV(SEQ ID NO:12)
本发明之抗体的重链可能包含GFTFSSYAMS(SEQ ID NO:7)之CDR-H1氨基酸序列，其中这些氨基酸之至少一者可能被不同氨基酸取代。优选地，所有这些氨基酸可能被取代。
本发明之抗体的重链可能包含YISDDGSLKYYADSVKG(SEQ IDNO:8)之CDR-H2氨基酸序列，其中至少一个未画线之残基(其中画线残基系Y50、L57、Y59、Y60、D62)可能经不同氨基酸取代。
本发明之抗体的重链可能包含HPYWYGGQLDL(SEQ ID NO:9)之CDR-H3氨基酸序列，其中至少一个未画线之残基(其中画线残基系W102、Y103、G104、G105)可能经不同氨基酸取代。
本发明之抗体的轻链可能包含SGDSLGSYFVH(SEQ ID NO:10)之CDR-L1氨基酸序列，其中至少一个未画线之残基(其中画线残基系G28、S29、Y30、F31)可能经不同氨基酸取代。
本发明之抗体的轻链可能包含DDSNRPS(SEQ ID NO:11)之CDR-L2氨基酸序列，其中至少一个未画线之残基(其中画线残基系D49、D50)可能经不同氨基酸取代。
本发明之抗体的轻链可能包含SAFTHNSDV(SEQ ID NO:12)之CDR-L3氨基酸序列，其中至少一个未画线之残基(其中画线残基系F90、T91、H92、N93、S94)可能经不同氨基酸取代。
变异抗体可能包含上述特测序列及片段之1、2、3、4、5、最多10、最多20、最多30或更多氨基酸取代及/或删除及/或插入。“删除”变体可能包含删除个别氨基酸、删除小群之氨基酸诸如2、3、4或5个氨基酸、或删除较大氨基酸区域，诸如删除特定氨基酸结构域或其它结构。“插入”变体可能包含插入个别氨基酸、插入小群之氨基酸诸如2、3、4或5个氨基酸、或插入较大氨基酸区域，诸如插入特定氨基酸结构域或其它结构。“取代”变体优选地涉及以一或多个氨基酸取代相同数量之氨基酸且进行保守性氨基酸取代。例如，氨基酸可能经具有类似性质之替代氨基酸取代，例如另一碱性氨基酸、另一酸性氨基酸、另一中性氨基酸、另一带电氨基酸、另一亲水性氨基酸、另一疏水性氨基酸、另一极性氨基酸、另一芳族氨基酸或另一脂族氨基酸。20种主要氨基酸中可被用于选择适当取代基之一些特性如下。
取代变体是指该抗体分子中之至少一个氨基酸残基被移除且在该位置插入不同之残基。最受到关注之取代性突变形成之位置包括高变区，但亦可考虑架构之改变。保守性取代系显示于表3中标题“保守性取代”之栏。若这些取代导致生物学活性改变，则更显著之改变(以下称为“示例性取代”)或如下参照氨基酸分类进一步描述者可被导入，然后筛选该产物。
氨基酸取代
抗体生物特性之实质修饰可藉由选择在维持下列特性上有显著差异之取代加以完成：(a)取代区之多肽骨架结构，例如β折板状或螺旋构型，(b)目标部位之分子的带电或疏水性，或(c)侧链之主体。天然存在之残基根据常见之侧链性质分成下列群组：
(1)非极性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)极性不带电：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性(带负电)：Asp、Glu；
(4)碱性(带正电)：Lys、Arg；
(5)影响链方向性之残基：Gly、Pro；及
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe、His。
非保守性取代系指以上述分类中之一个分类的成员交换另一分类之成员。
可能被实施之一种取代举例来说系改变抗体中一或多个半胱氨酸，这些半胱氨酸可能对另一残基诸如但不限于丙氨酸或丝氨酸具化学反应性。举例来说，可发生非规范的半胱氨酸之取代。该取代可发生于抗体之可变结构域之CDR或框架区或恒定区中。在一些实施方案中，该半胱氨酸系典型半胱氨酸。任何与维持抗体之适当构型无关之半胱氨酸残基亦可被取代(通常以丝氨酸取代)，以增进该分子之氧化稳定性及防止异常交联。相反地，半胱氨酸键可被加入抗体以增进抗体之稳定性，特别是当该抗体系抗体片段诸如Fv片段时。
本发明亦提供产生、筛选及制备PDGF-B抗体之方法。本发明之抗体可利用本领域已知之方法制备。在一些实施方案中，抗体可利用本领域已知之任何方法重组制备及表达。
在一些实施方案中，抗体可藉由噬菌体展示技术制备及筛选。见例如美国专利第5,565,332、5,580,717、5,733,743及6,265,150号，及Winter etal.,Annu.Rev.Immunol.12:433-455,1994。或者，噬菌体展示技术(McCafferty et al.,Nature 348:552-553,1990)可被用于活体外自未经免疫接种之捐赠者的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库产生人抗体及抗体片段。根据此项技术，抗体V结构域基因被符合读框地克隆至丝状噬菌体(诸如M13或fd)之主要或次要外壳蛋白基因中，且以功能性抗体片段被展示于该噬菌体颗粒之表面。由于该丝状颗粒包含该噬菌体基因组之单链DNA拷贝，因此根据该抗体之功能特性所进行之筛选亦导致选择展现这些特性之抗体的编码基因。因此，该噬菌体模拟B细胞之若干特性。噬菌体展示可以各种形式进行；回顾文献见例如Johnson,Kevin S.and Chiswell,DavidJ.,Current Opinion in Structural Biology 3:564-571,1993。不同来源之V基因区段可被用于噬菌体展示。Clackson et al.,Nature 352:624-628,1991自V基因之小型随机组合库分离出多种抗恶唑啉酮抗体，这些V基因系源自经免疫接种之小鼠的脾脏。来自人捐赠者的V基因贮库可被构建，针对各类抗原(包括自体抗原)之抗体可实质上依照Mark et al.,1991,J.Mol.Biol.222:581-597或Griffith et al.,1993,EMBO J.12:725-734所述之技术分离。在天然免疫反应中，抗体基因以高比例累积突变(体细胞超突变)。若干被导入之改变将授予更高之亲和性，且展示高亲和性表面免疫球蛋白之B细胞在后续抗原攻击时将被优先复制及分化。此天然过程可藉由采用已知之“链替换(chain shuffling)”技术模拟(Marks et al.,1992,Bio/Technol.10:779-783)。在此方法中，藉由噬菌体展示获得之“初级”人抗体的亲和性，可藉由以得自未经免疫接种之捐赠者的天然发生之V区基因变体库依序取代该重链及轻链之V区基因加以改善。此技术允许产生亲和性介于pM至nM范围之抗体及抗体片段。制备非常大型之噬菌体抗体库(亦称为“文库之母(the mother-of-all libraries)”)之策略已由Waterhouseet al.,Nucl.Acids Res.21:2265-2266,1993描述。基因替换亦可被用于自鼠抗体衍生人抗体，其中该人抗体具有与该起始鼠抗体类似之亲和性及特异性。根据此方法(又名“表位印记”)，由噬菌体展示技术得到之鼠抗体的重链或轻链V区基因被人V区基因库取代，因此产生鼠-人嵌合抗体。筛选抗原导致分离能恢复功能性抗原结合位点之人可变区，亦即该表位掌管伴之选择(具有印记)。重复该方法以取代剩余之鼠V区可得到人抗体(见PCT公开号WO 93/06213)。和惯用之藉由CDR移植以人源化鼠抗体不同的是，此技术提供全人抗体，其不具鼠来源之架构残基或CDR残基。
在一些实施方案中，抗体可能利用杂交瘤技术制备。应考虑任何哺乳动物个体包括人或源自该个体之抗体产生细胞可经操纵以作为产生哺乳动物(包括人)杂交瘤细胞系之基础。免疫接种宿主动物之途径及时程通常与已建立及常规之抗体刺激及产生技术一致，如本文进一步描述。通常，该宿主动物系经腹膜内、肌肉内、经口、皮下、脚掌内及/或皮内接种一定量之免疫原，包括如本文所述。
杂交瘤可自淋巴细胞及永生化之骨髓瘤细胞制备，其使用Kohler,B.and Milstein,C.,1975,Nature 256:495-497之常规体细胞杂交技术或由Buck,D.W.,et al.,In Vitro,18:377-381,1982所改良之技术。可用之骨髓瘤细胞系(包括但不限于X63-Ag8.653及那些来自Salk Institute Cell DistributionCenter,San Diego,Calif.,USA之细胞)可被用于杂交。通常，该技术涉及使用促融剂诸如聚乙二醇或藉由本领域技术人员众所周知之电装置使骨髓瘤细胞与淋巴样细胞融合。在融合后，使这些细胞自融合培养基中分离并于选择性生长培养基诸如次黄嘌呤-胺喋呤-胸苷(HAT)培养基中生长以消除未杂交之亲代细胞。任何本文所描述之培养基不论有无添加血清皆可被用于培养分泌单克隆抗体之杂交瘤。在细胞融合技术之另一替代技术中，EBV永生化B细胞可被用于产生本发明之PDGF-B单克隆抗体。杂交瘤或其它永生化B细胞系经扩增及亚克隆(若需要)，上清液之抗免疫原活性藉由常规之免疫测定方法(例如放射性免疫测定、酶免疫测定或荧光免疫测定)检测。
可用来作为抗体来源之杂交瘤包含所有衍生物、该产生对PDGF-B具特异性之单克隆抗体之亲代杂交瘤的子细胞或其部分。
产生这些抗体之杂交瘤可利用已知方法在活体外或活体内生长。这些单克隆抗体可藉由常规之免疫球蛋白纯化方法自培养基或体液中分离，诸如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、色层分析及若需要之超过滤。非想要的活性(若有的话)可被移除，例如藉由使该制剂通过由免疫原连接固相所制成之吸附物，然后自该免疫原洗脱或释放该想要的抗体。以PDGF-B多肽或含有该标靶氨基酸序列之片段免疫接种宿主动物，且该PDGF-B多肽或含有该标靶氨基酸序列之片段系与对所欲免疫接种之物种具免疫原性之蛋白例如钥孔状帽贝血蓝素、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂缀合，该缀合系利用双功能剂或衍生剂进行，例如马来酰亚胺苯甲酰基磺酸基琥珀酰亚胺酯(经由半胱氨酸残基缀合)、N-羟琥珀酰亚胺(经由赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1系不同的烷基，可产生抗体(例如单克隆抗体)群。
若有需要，可对该感兴趣之PDGF-B抗体(单克隆或多克隆)测序，接着该多核苷酸序列可被克隆至载体以供表达或扩增。编码该感兴趣之抗体的序列可被维持于宿主细胞中之载体，接着该宿主细胞可被扩增及冷冻以供将来使用。在细胞培养中产生重组单克隆抗体可透过本领域已知之方法自B细胞克隆抗体基因加以进行。见例如Tiller et al.,2008,J.Immunol.Methods 329,112；美国专利第7,314,622号。
在一些实施方案中，该多核苷酸序列可能被用于基因调整以“人源化”该抗体或改善该抗体之亲和性或其它特征。抗体亦可经客制调整以用于例如犬、猫、灵长类动物、马及牛。
在一些实施方案中，全人抗体可藉由使用自商业途径获得之小鼠得到，该小鼠已经工程化以表达特定人免疫球蛋白。经设计以产生更为想要的(例如全人抗体)或更有力之免疫反应的转基因动物亦可被用于产生人源化抗体或人抗体。该技术之实例系XenomouseTM(Abgenix公司(Fremont,CA))及和TC MouseTM(Medarex公司(Princeton,NJ))。
抗体可经重组制备，首先自宿主动物分离抗体及抗体产生细胞，接着取得基因序列，然后使用该基因序列以于宿主细胞(例如CHO细胞)中重组表达该抗体。另一可被采用之方法系于植物(例如烟草)或转基因乳中表达该抗体序列。于植物或乳中重组表达抗体之方法已被揭示。见例如Peeters,et al.Vaccine 19:2756,2001；Lonberg,N.and D.Huszar Int.Rev.Immunol13:65,1995；及Pollock,et al.,J Immunol Methods 231:147,1999。用于制备抗体之衍生物(例如结构域抗体、单链抗体等)之方法系本领域所知。
免疫测定及流式细胞分选技术诸如荧光激活细胞分选(FACS)亦可被用来分离对PDGF-B具特异性之抗体。
编码单克隆抗体之DNA可利用常规方法轻易地分离及测序(例如藉由使用能与编码这些单克隆抗体之重链及轻链之基因特异性结合之寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞被用来当作该DNA之优选来源。分离后，这些DNA可被置入表达载体中(诸如PCT公开号WO 87/04462所揭示之表达载体)，这些表达载体接着被转染至原本不产生免疫球蛋白之宿主细胞诸如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在这些重组宿主细胞中获得单克隆抗体之合成。见例如PCT公开号WO87/04462。这些DNA亦可经修饰，例如藉由以人重链及轻链恒定区之编码序列取代同源鼠序列(Morrison et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851,1984)，或藉由共价连接免疫球蛋白编码序列与所有或部分之非免疫球蛋白多肽之编码序列。在该方式中，“嵌合”或“杂交”抗体系经制备以具有本文之PDGF-B抗体之结合特异性。
抗体片段可藉由蛋白水解或以其它方式降解抗体、藉由上述之重组方法(即单一或融合多肽)或藉由化学合成方法制备。这些抗体之多肽特别是最多约50个氨基酸之较短多肽系方便地藉由化学合成制备。化学合成之方法系本领域所知且可自商业途径获得。举例来说，抗体可藉由采用固相方法之自动多肽合成仪产生。见例如美国专利第5,807,715、4,816,567及6,331,415号。
在一些实施方案中，多核苷酸包含编码抗体MOR8457之重链及/或轻链可变区之序列或其种系版本的序列。编码该感兴趣之抗体的序列可被维持于宿主细胞中之载体中，接着该宿主细胞可被扩增及冷冻以供将来使用。载体(包括表达载体)及宿主细胞另于本文说明。
本发明包括亲和性成熟之实施方案。例如，亲和性成熟抗体可藉由本领域已知之方法产生(Marks et al.,1992,Bio/Technology,10:779-783；Barbaset al.,1994,Proc Nat.Acad.Sci,USA 91:3809-3813；Schier et al.,1995,Gene,169:147-155；Yelton et al.,1995,J.Immunol.,155:1994-2004；Jackson et al.,1995,J.Immunol.,154(7):3310-9；Hawkins et al.,1992,J.Mol.Biol.,226:889-896及PCT公开号WO2004/058184)。
下列方法可被用于调整抗体之亲和性及表征CDR。一种表征抗体之CDR及/或改变(诸如改善)多肽诸如抗体之结合亲和性之方法被称为“文库扫描突变形成”。通常，文库扫描突变形成如下述进行。CDR中之一或多个氨基酸位置系利用本领域已建立之方法以二或多个(诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)氨基酸取代。如此产生小型克隆库(在一些实施方案中，每个经分析之氨基酸位置皆有一个克隆)，每个克隆皆有二或多个成员之复杂性(若各位置被二或多个氨基酸取代)。通常，该文库亦包括包含天然(未经取代)氨基酸之克隆。来自各文库之少数克隆例如约20至80个克隆(依该文库之复杂性而定)系经筛选与该目标多肽(或其它结合目标)之结合亲和性，并鉴定具有增加、相同、降低或不具结合力之候选克隆。测定结合亲和性之方法系本领域所广为周知。结合亲和性可利用例如BiacoreTM表面等离子体共振分析(其检测约2倍或更高之结合亲和性之差异)、生物传感器、邻近闪烁检测、ELISA、免疫检测、荧光淬灭、荧光转移及/或酵母展示测定。结合亲和性亦可利用适当之生物测定筛选。BiacoreTM特别适用于当起始抗体已经以相对高之亲和性结合时，例如约10nM或小于10nM之KD。
在一些实施方案中，CDR中之每个氨基酸位置(在一些实施方案中一次一个位置)皆利用本领域已知之突变形成方法(某些方法于本文描述)以所有20个天然氨基酸取代。如此产生小型克隆文库(在一些实施方案中，每个经分析之氨基酸位置有一个克隆)，各克隆具有20个成员之复杂性(若每个位置被所有20个氨基酸取代)。
在一些实施方案中，该经筛选之库包含二或多个位置之取代，该两或多个位置可能在相同CDR内或在二或多个CDR内中。因此，该库可能包含在一个CDR中之二或多个位置之取代。该库可能包含在二或多个CDR中之二或多个位置之取代。该库可能包含3、4、5或多个位置之取代，这些位置见于二、三、四、五或六个CDR中。该取代可利用低多余性密码子制备。见例如Balint et al.,1993,Gene 137(1):109-18之表2。
该CDR可能是重链可变区(VH)CDR3及/或轻链可变区(VL)CDR3。该CDR可能是VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3之一或多者。该CDR可能是卡巴CDR、柯西亚CDR、延伸CDR、AbM CDR、接触CDR或构形CDR。
具有改善结合性之候选物可被测序，藉以鉴定导致改善亲和性之CDR取代突变(亦称为“改善”取代)。结合之候选物亦可被测序，藉以鉴定保留结合力之CDR取代。
可进行多次筛选。举例来说，具有改善结合性之候选物(各候选物在一或多个CDR之一或多个位置包含氨基酸取代)亦可被用于设计在每个经改善之CDR位置(即CDR中取代突变显示改善结合性之氨基酸位置)包含至少该原始及经取代之氨基酸之第二文库。此文库之制备、筛选及选择另于下讨论。
文库扫描突变形成亦提供表征CDR之方法，因为具有改善结合力、相同结合力、降低结合力或无结合力之克隆的频率亦提供有关各氨基酸位置对抗体-抗原复合物之稳定性的重要性之信息。举例来说，如果CDR之一个位置被改变成所有20个氨基酸仍保留结合力，该位置被认为不可能是抗原结合所必需之位置。相反地，如果CDR之一个位置只有在低比例取代才保留结合力，该位置被认为是对CDR之功能具重要性之位置。因此，库扫描突变形成方法产生有关CDR中之位置的信息，有些位置可被改变成许多不同之氨基酸(包括所有20个氨基酸)，有些位置无法被改变或仅能被改变成少数几种氨基酸。
具有改善亲和性之候选物可利用所希望之筛选或选择方法被组合于第二文库中，该文库包括在该位置经改善之氨基酸及原始氨基酸，且可能另外包括该位置之其它取代，视所希望或所允许之该库之复杂性而定。此外若有需要的话，邻近之氨基酸位置可被随机化成至少两或多种氨基酸。邻近氨基酸之随机化可能允许该突变CDR之额外构型可塑性，此可能进而允许或促进导入更多之改善突变。该文库亦可能包含在第一次筛选时不显示改善亲和性之取代位置。
该第二文库系利用本领域已知之任何方法筛选或选择具有改善及/或改变之结合亲和性之库成员，包括利用KinexaTM生物传感器分析筛选，及利用本领域已知之任何用于选择之方法选择，包括噬菌体展示、酵母展示及核糖体展示。
为了表达本发明之PDGF-B抗体，编码VH及VL区之DNA片段可先利用上述之任何方法获得。各种修饰例如突变、删除及/或添加亦可利用本领域技术人员所知之标准方法被导入该DNA序列。举例来说，可利用标准方法诱发突变形成，诸如PCR介导的突变形成，其中该突变之核苷酸被掺入PCR引物以使该PCR产物包含想要的突变或定点突变形成。
本发明涵盖对图1所示之可变区及图1所示之CDR之修饰。例如，本发明包括包含不显著影响其性质之功能上相等之可变区及CDR之抗体，也包括具有增强或减低活性及/或亲和性之变体。例如，氨基酸序列可能经突变以获得具有想要的PDGF-B结合亲和性之抗体。多肽之修饰系本领域之常规技术，无需在此详细说明。经修饰之多肽实例包括具有保守性取代之氨基酸残基、具有一或多个不显著有害地改变该功能活性之氨基酸删除或添加、具有一或多个使该多肽对其配体之亲和性成熟(增进)之氨基酸删除或添加或使用化学类似物之多肽。
氨基酸序列插入包括长度介于一个残基至包含一百或更多个残基之多肽的氨基端及/或羧基端融合，也包括在序列内插入单一或多个氨基酸残基。末端插入之实例包括具有N端甲硫胺酰基残基之抗体或与表位标签融合之抗体。抗体分子之其它插入变体包括在抗体之N端或C端融合酶或多肽以增加该抗体于血液循环中之半衰期。
亦可在抗体之例如重链及/或轻链之可变结构域进行修饰，以例如改变该抗体之结合特性。可变区之改变可改变结合亲和性及/或特异性。在一些实施方案中，在一CDR结构域内不发生超过一至五个保守性氨基酸取代。在其它实施方案中，在一CDR结构域内不发生超过一至三个保守性氨基酸取代。举例来说，可在一或多个CDR区制备突变以增加或降低该抗体对PDGF-B之KD、增加或降低koff或改变该抗体之结合特异性。定点突变形成之技术系本领域所广为周知。见例如Sambrook et al.及Ausubel etal.(同上)。
修饰或突变亦可于框架区或恒定区发生以增加PDGF-B抗体之半衰期。见例如PCT公开号WO 00/09560。在框架区或恒定区之突变亦可被创造以改变该抗体之免疫原性、提供与另一分子共价或非共价结合之位点或改变像是补体固定、FcR结合及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性等之特性。根据本发明，单一抗体可能在可变区之任一或多个CDR或框架区或恒定区中具有突变。
修饰亦包括糖基化及非糖基化多肽，也包括具有其它翻译后修饰之多肽，诸如举例来说以不同之糖进行糖基化、乙酰化及磷酸化。抗体系于其恒定区中之保守位置经糖基化(Jefferis and Lund,1997,Chem.Immunol.65:111-128；Wright and Morrison,1997,TibTECH 15:26-32)。免疫球蛋白之寡糖侧链影响该蛋白之功能(Boyd et al.,1996,Mol.Immunol.32:1311-1318；Wittwe and Howard,1990,Biochem.29:4175-4180)以及该糖蛋白不同部分之间的分子内相互作用，其可影响该糖蛋白之构形及所呈现之三维表面(Jefferis and Lund,supra；Wyss and Wagner,1996,Current Opin.Biotech.7:409-416)。根据特定识别结构，寡糖亦可被用来使给定糖蛋白靶向某些分子。也有报告指出抗体之糖基化会影响抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。特别是，由经四环素调节表达β(1,4)-N-乙酰葡萄氨基转移酶III(GnTIII，一种催化形成平分型GlcNAc之糖基转移酶)之CHO细胞所产生之抗体被报告具有增强之ADCC活性(Umana et al.,1999,Nature Biotech.17:176-180)。
抗体之糖基化通常是N-连接或O-连接。N-连接系指碳水化合物基团连接至天冬酰氨酸残基之侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸及天冬酰胺-X-半胱氨酸系供碳水化合物基团与天冬酰胺侧链酶促连接之识别序列，其中X系除脯氨酸以外之任何氨基酸。因此，多肽中有任何这些三肽序列之存在即产生可能的糖基化位点。O-连接糖基化系指连接糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一者与羟基氨基酸，最常见为丝氨酸或苏氨酸，不过5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸亦可被使用。
在抗体中加入糖基化位置可藉由改变氨基酸序列以使该序列包含一或多个上述之三肽序列(供N-连接糖基化位置)而方便地完成。该改变亦可藉由在原始抗体之序列加入或取代一或多个丝氨酸或苏氨酸残基加以完成(供O-连接糖基化位置)。
抗体之糖基化模式亦可在不改变基础核苷酸序列下加以改变。糖基化大多取决于用来表达该抗体之宿主细胞。由于用来表达重组糖蛋白(例如抗体)以作为潜在治疗剂之细胞种类很少为天然细胞，因此抗体之糖基化模式的变化可被预期(见例如Hse et al.,1997,J.Biol.Chem.272:9062-9070)。
除了宿主细胞之选择以外，在重组产生抗体期间可影响糖基化之因素包括生长模式、培养基配方、培养密度、充氧、pH、纯化方案等。各种方法已被提出以改变在特定宿主生物体中达成之糖基化模式，包括导入或过表达与寡糖产生有关之某些酶(美国专利第5,047,335、5,510,261及5,278,299号)。糖基化(或某些类型之糖基化)可藉由酶自糖蛋白移除，举例来说利用内切糖苷酶H(Endo H)、N-糖苷酶F、内切糖苷酶F1、内切糖苷酶F2、内切糖苷酶F3。此外，该重组宿主细胞可经基因工程化以无法处理某些种类之多醣。这些及类似之技术系本领域所广为周知。
其它修饰之方法包括使用本领域已知之偶合技术，包括但不限于酶方法、氧化性取代及螯合。修饰可被用于例如连接免疫测定之标记。经修饰之多肽系利用本领域已建立之方法制备，且可利用本领域已知之标准测定筛选，这些方法中有些系于下面及实施例中描述。
在一些实施方案中，该抗体包含经修饰之恒定区，该经修饰之抗体对人Fcγ受体之结合亲和性增加或减少、呈免疫惰性或部分惰性(例如不引发补体介导的溶解、不刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或不活化小神经胶质细胞)或在下列任一或多项具有减少之活性(相较于未经修饰之抗体)：引发补体介导的溶解、刺激ADCC或活化小神经胶质细胞。恒定区之不同修饰可被用于达到效应功能之最佳量及/或组合。见例如Morgan et al.,Immunology 86:319-324,1995；Lund et al.,J.Immunology157:4963-9157:4963-4969,1996；Idusogie et al.,J.Immunology 164:4178-4184,2000；Tao et al.,J.Immunology 143:2595-2601,1989；and Jefferis et al.,Immunological Reviews 163:59-76,1998。在一些实施方案中，该恒定区系经如Eur.J.Immunol.,1999,29:2613-2624；PCT申请案PCT/GB99/01441及/或英国专利申请案9809951.8所述之修饰。
在一些实施方案中，抗体恒定区可经修饰以避免与Fcγ受体及补体及免疫系统之相互作用。用于制备这些抗体之技术系于WO 99/58572中描述。举例来说，该恒定区可经工程化以更类似于人之恒定区，避免该抗体用于人之临床试验及治疗时之免疫反应。见例如美国专利第5,997,867及5,866,692号。
在一些实施方案中，该恒定区系经如Eur.J.Immunol.,1999,29:2613-2624；PCT申请案PCT/GB99/01441及/或英国专利申请案9809951.8所述之修饰。在那些实施方案中，Fc可为人IgG2或人IgG4。该Fc可为含有突变A330P331至S330S331之人IgG2(IgG2Δa)，其中该氨基酸残基系参考野生型IgG2序列编号(Eur.J.Immunol.,1999,29:2613-2624)。在一些实施方案中，该抗体包含含有下列突变之IgG4之恒定区(Armour et al.,2003,Molecular Immunology 40585-593)：E233F234L235至P233V234A235(IgG4Δc)，其中该编号系参考野生型IgG4。在另一实施方案中，该Fc系人IgG4E233F234L235至P233V234A235并删除G236(IgG4Δb)。在另一实施方案中，该Fc系包含绞链稳定突变S228至P228之任何人IgG4Fc(IgG4、IgG4Δb或IgG4Δc)(Aalberse et al.,Immunology 2002,9105,-19)。
在一些实施方案中，该抗体包含含有下列突变之人重链IgG2恒定区：A330P331至S330S331(氨基酸编号参考野生型IgG2序列)(Eur.J.Immunol.,1999,29:2613-2624)。在其它实施方案中，该恒定区系无N-连接糖基化。在一些实施方案中，该恒定区系藉由使该寡糖连接残基及/或该恒定区中属于N-糖基化辨认序列之部份的侧翼残基突变而无N-连接糖基化。例如，N糖基化位置N297可经突变为例如A、Q、K或H。见Tao et al.,J.Immunology 143:2595-2601,1989及Jefferis et al.,Immunological Reviews163:59-76,1998。在一些实施方案中，该恒定区系无N-连接糖基化。该恒定区可经酶处理(诸如藉由酶PNGase移除碳水化合物)，或藉由在糖基化缺陷之宿主细胞中表达以无N-连接糖基化。
其它抗体修饰包括如PCT公开号WO 99/58572所述经修饰之抗体。这些抗体除了包含针对标靶分子之结合结构域，还包含具有实质上与人免疫球蛋白重链之所有或部分恒定区同源之氨基酸序列的效应结构域。这些抗体能与标靶分子结合但不引发显著之补体依赖性溶解或细胞介导的标靶破坏。在一些实施方案中，该效应结构域能与FcRn及/或FcγRIIb特异性结合。这些作用通常是根据衍生自两或多个人免疫球蛋白重链CH2结构域之嵌合结构域。以此方式修饰之抗体特别适用于慢性抗体治疗，以避免传统抗体治疗所引发之发炎及其它不良反应。
本发明亦提供可经进一步修饰之抗体恒定区。已知Fc区之变体(例如氨基酸取代、插入及/或添加及/或删除)增进或减少效应功能。见例如Presta et al,2002,Biochem.Soc.Trans.30:487-490；Strohl,2009,Curr.Opin.Biotechnol.20(6):685-691；美国专利第5,624,821、5,648,260、5,885,573、6,737,056、7,317,091号；PCT公开号WO 99/58572、WO 00/42072、WO04/029207、WO 2006/105338、WO 2008/022152、WO 2008/150494、WO2010/033736；美国专利申请公开案2004/0132101、2006/0024298、2006/0121032、2006/0235208、2007/0148170；Armour et al.,1999,Eur.J.Immunol.29(8):2613-2624(减少ADCC及CDC)；Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.276(9):6591-6604(减少ADCC及CDC)；Idusogie et al.,2000,J.Immunol.164(8):4178-4184(增加ADCC及CDC)；Steurer et al.,1995,J.Immunol.155(3):1165-1174(减少ADCC及CDC)；Idusogie et al.,2001,J.Immunol.166(4):2571-2575(增加ADCC及CDC)；Lazar et al.,2006,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(11):4005-4010(增加ADCC)；Ryan et al.,2007,Mol.Cancer.Ther.,6:3009-3018(增加ADCC)；Richards et al.,2008,Mol.Cancer Ther.7(8):2517-2527。
在一些实施方案中，该抗体包含具有相较于未经修饰之抗体增加FcRn结合亲和性及/或增加血清半衰期之经修饰之恒定区。
在称为“种系化”之过程中，在VH及VL序列中之某些氨基酸可经突变以符合在种系VH及VL序列中天然发现之氨基酸。特别是在VH及VL序列之框架区中之氨基酸序列可经突变成种系序列以降低该抗体在施用时之免疫原性风险。人VH及VL基因之种系DNA序列系本领域所知(见例如Vbase人种系序列数据库；亦见Kabat,E.A.,et al.,1991,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Healthand Human Services,NIH Publ.No.91-3242；Tomlinson et al.,1992,J.Mol.Biol.227:776-798及Cox et al.,1994,Eur.J.Immunol.24:827-836)。
另一种可能产生之氨基酸取代系移除抗体中潜在之蛋白水解位置。该位置可能出现在抗体可变区之CDR或框架区中或在抗体恒定区中。取代半胱氨酸残基及移除蛋白水解位置可能降低抗体产物之异质性之风险，因此增加其均质性。另一类型之氨基酸取代系消除天冬酰氨酸-甘氨酸对，其藉由改变这些残基之一或两者以形成潜在之脱酰胺位置。在另一实例中，本发明之PDGF-B抗体之重链的C端离氨酸可被切掉或以其它方式移除。在本发明之各种实施方案中，抗体之重链及轻链可任意选择地包括信号序列。
当获得编码本发明之VH及VL区段之DNA片段后，可进一步利用标准重组DNA技术操纵这些DNA片段，例如转换该可变区基因成为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操纵中，编码VL或VH之DNA片段系可操作地与编码另一蛋白之另一DNA片段连接，诸如抗体恒定区或可弯折之接头。在此上下文所使用之术语“可操作地连接”系意图指涉两个DNA片段系经连接以使由该两个DNA片段所编码之氨基酸序列维持读框顺序。
编码VH区之经分离之DNA可藉由可操作地连接编码该VH之DNA与另一编码重链恒定区(CH1、CH2及CH3)之DNA分子以转换成全长重链基因。人重链恒定区基因之序列系本领域所知(见例如Kabat,E.A.,et al.,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publ.No.91-3242)且包含这些区之DNA片段可藉由标准PCR扩增获得。该重链恒定区可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选者为IgG1或IgG2恒定区。IgG恒定区序列可为任何已知发生在不同个体之各种等位基因或同种异型，诸如Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)及Gm(17)。那些同种异型代表在IgG1恒定区中天然发生之氨基酸取代。就Fab片段重链基因而言，该编码VH之DNA可与另一仅编码重链CH1恒定区之DNA分子可操作性连接。该CH1重链恒定区可源自任何重链基因。
编码VL区之经分离之DNA可藉由可操作地连接该编码VL之DNA与另一编码轻链恒定区(CL)之DNA分子以转换成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因之序列系本领域所知(见例如Kabat,E.A.,etal.,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publ.No.91-3242)且包含这些区之DNA片段可藉由标准PCR扩增获得。该轻链恒定区可为κ或λ恒定区。κ恒定区序列可为任何已知发生在不同个体之各种等位基因，诸如Inv(1)、Inv(2)及Inv(3)。该λ恒定区可源自三个λ基因中之任一基因。
为了产生scFv基因，编码VH及VL之DNA片段系可操作性与另一编码可弯折接头之片段连接，以使得该VH及VL序列可被表达为连续单链蛋白，且该VL及VH区藉由可弯折之接头连接(见例如Bird et al.,1988,Science 242:423-426；Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty et al.,1990,Nature 348:552-554)。连接肽之实例为(GGGGS)3(SEQ ID NO:18)，其桥接一可变区之羧基端与另一可变区之胺基端之间约3.5nm之距离。其它序列之接头已被设计及使用(Bird et al.,1988，同上)。接头亦可经修饰以得到额外功能，诸如与药物连接或与固态支持物连接。该单链抗体可为单价(若仅使用单一VH及VL)、双价(若使用二个VH及VL)或多价(若使用超过二个VH及VL)。双特异性或多价抗体可被产生以与PDGF-B及另一分子特异性结合。该单链变体可经重组或合成产生。就scFv之合成产生而言，可使用自动化合成仪。就scFv之重组产生而言，包含编码该scFv之多核苷酸之适当质粒可被导入适当之宿主细胞中，不论是真核细胞诸如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞，抑或是原核细胞诸如大肠杆菌(E.coli)。编码感兴趣之scFv之多核苷酸可藉由例行操作加以制备，诸如接合多核苷酸。该形成之scFv可利用本领域已知之标准蛋白质纯化技术分离。
亦包含其它形式之单链抗体诸如双价抗体(diabodies)。双价抗体系双价、双特异性之抗体，其中VH及VL系表达于单一多肽链上，但使用过短以防止该同一链上之两个结构域配对之接头，藉此促使这些结构域与另一链之互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(见例如Holliger,P.,et al.,1993,Proc.Natl.Acad Sci.USA 90:6444-6448；Poljak,R.J.,et al.,1994,Structure 2:1121-1123)。
包含两个共价连接抗体之异源缀合抗体亦属于本发明之范围内。这些抗体被用于靶向免疫系统细胞至非所欲之细胞(美国专利第4,676,980号)及用于治疗HIV感染(PCT公开号WO 91/00360及WO 92/200373及EP03089)。异源缀合抗体可利用任何方便之交联方法制备。适当之交联剂及技术系本领域所广为周知且描述于美国专利第4,676,980号。
嵌合或杂交抗体亦可利用已知之合成蛋白质化学方法于活体外制备，包括那些涉及交联剂之方法。举例来说，免疫毒素可利用双硫交换反应或藉由形成硫醚键加以构建。为达此目的之适当试剂实例包括亚胺基硫醇盐及甲基-4-巯基丁亚胺(methyl-4-mercaptobutyimidate)。
本发明亦包含融合蛋白，其包含一或多个源自本文揭示之抗体的片段或区域。在一些实施方案中，融合抗体可被制备以包含与另一多肽连接之所有或部分之本发明之PDGF-B抗体。在另一实施方案中，仅PDGF-B抗体之可变区系与该多肽连接。在另一实施方案中，PDGF-B抗体之VH结构域系与第一多肽连接，同时PDGF-B抗体之VL结构域系与第二多肽连接，该第二多肽与第一多肽系以使该VH及VL结构域得以彼此相互作用以形成抗原结合位点之方式相连。在另一优选之实施方案中，该VH结构域与VL结构域被接头分开，以使该VH及VL结构域可彼此相互作用。该VH-接头-VL抗体接着与感兴趣之多肽连接。此外，融合抗体可被产生，其中二个(或多个)单链抗体系彼此相连。这可被用于若想在单一多肽链上产生双价或多价抗体或想产生双特异性抗体。
在一些实施方案中，本发明提供包含如SEQ ID NO:1或4所示之轻链可变区之至少10个连续氨基酸，及/或如SEQ ID NO:2或6所示之重链可变区之至少10个氨基酸之融合多肽。在其它实施方案中，本发明提供包含该轻链可变区之至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个或至少约30个连续氨基酸，及/或该重链可变区之至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个或至少约30个连续氨基酸之融合多肽。在另一实施方案中，该融合多肽包含轻链可变区及/或重链可变区，如选自SEQ ID NO:1及2、4及6之序列对之任一者所示。在另一实施方案中，该融合多肽包含一或多个CDR。在其它实施方案中，该融合多肽包含VH CDR3及/或VL CDR3。就本发明之目的而言，融合蛋白包含一或多种抗体及在天然分子中未与其连接之另一氨基酸序列，例如异源性序列或来自另一区之同源性序列。示例性异源序列包括但不限于“标签”诸如FLAG标签或6His标签。标签系本领域所广为周知。
融合多肽可藉由本领域已知之方法产生，例如合成或重组。通常，本发明之融合蛋白系藉由使用本文所描述之重组方法使编码其多核苷酸表达加以制备，不过亦可藉由本领域所知之其它方法制备，包括例如化学合成。
在其它实施方案中，其它经修饰之抗体可利用编码PDGF-B抗体之核酸分子产生。举例来说，“κ抗体”(Ill et al.,1997,Protein Eng.10:949-57)、“迷你抗体”(Martin et al.,1994,EMBO J.13:5303-9)、“双价抗体”(Holliger et al.,同上)或“杰鲁斯抗体(Janusin)”(Traunecker et al.,1991,EMBO J.10:3655-3659and Traunecker et al.,1992,Int.J.Cancer(Suppl.)7:51-52)可依照本说明书之揭示利用标准分子生物技术制备。
举例来说，双特异性抗体(对至少两种不同抗原具有结合特异性之单克隆抗体)可利用本文所揭示之抗体制备。制备双特异性抗体之方法系本领域所知(见例如Suresh et al.,1986,Methods in Enzymology 121:210)。例如，双特异性抗体或抗原结合片段可藉由融合杂交瘤或连接Fab’片段产生。见例如Songsivilai&Lachmann,1990,Clin.Exp.Immunol.79:315-321,Kostelny etal.,1992,J.Immunol.148:1547-1553。传统上，双特异性抗体之重组产生系基于共表达二个免疫球蛋白重链-轻链对，其中该二个重链具有不同特异性(Millstein and Cuello,1983,Nature 305,537-539)。此外，双特异性抗体可能被形成为“双价抗体”或“杰鲁斯抗体”。在一些实施方案中，该双特异性抗体与PDGF-B之二个不同表位结合。在一些实施方案中，上述经修饰之抗体系利用本文提供之PDGF-B抗体的一或多个可变结构域或CDR区制备。
根据一种制备双特异性抗体之方法，具有想要的结合特异性之抗体可变区(抗体-抗原结合位点)系与免疫球蛋白恒定区序列融合。该融合优选地系利用免疫球蛋白重链恒定区，包含至少部份之绞链区、CH2区及CH3区。优选地是使第一重链恒定区(CH1)(其包含轻链接合所需之部位)存在于这些融合体之至少一者。编码免疫球蛋白重链融合体及若需要之免疫球蛋白轻链之DNA被插入分开之表达载体，并被共转染至适当之宿主生物体。在使用不等比例之三个多肽链构建以提供最优选产量之实施方案中，此提供调整三个多肽片段之相互比例的高度灵活性。然而，当以相等比例表达至少二个多肽链导致高产量，或该比例不具特别显著性时，有可能在一个表达载体中插入二个或所有三个多肽链之编码序列。
在一方面中，该双特异性抗体系由一臂为具有第一结合特异性之杂交免疫球蛋白重链与另一臂为杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)所组成。此种免疫球蛋白轻链仅位于该双特异性分子之一半的不对称结构有利于自非想要的免疫球蛋白链组合中分离该想要的双特异性化合物。此方法系描述于PCT公开号WO 94/04690。
本发明亦提供组合物，这些组合物包含与药剂缀合(例如连接)以利与固相支持物(诸如生物素或抗生物素蛋白)偶合之抗体。为了简单起见大致将以抗体为例，但应了解这些方法适用于本文所述之任何PDGF-B结合及/或拮抗剂实施方案。缀合一般系指如本文所述连接这些成分。该连接(通常以近距离相连固定这些成分以至少供施用)可以数种方式达成。举例来说，当药剂与抗体各自具有能与彼此反应之取代基时，两者间之直接反应系可能的。例如，一者之亲核基团(诸如胺基或氢硫基)可能能与另一者之含有羰基之基团(诸如酐或酸性卤化物)或含有良好离去基(例如卤化物)之烷基反应。
这些抗体可与许多不同之载剂结合。载剂可为活性及/或惰性。广为周知之载剂实例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、玻璃、天然及经修饰之纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖及磁铁矿。该载剂之性质就本发明之目的而言可为可溶性或不可溶性。本领域技术人员知道其它用于结合抗体之适当载剂，或可利用例行实验加以确认。在一些实施方案中，该载剂包含靶向肺、心或心瓣膜之部分。
本发明之抗体或多肽可能与标示剂诸如荧光分子、放射性分子或任何其它本领域已知之标记连接。标记在本领域中一般系用于(直接或间接)提供信号。
多核苷酸、载体及宿主细胞
本发明亦提供编码本文所述之任何抗体(包括抗体片段及经修饰之抗体，诸如具有受损的效应功能之抗体)之多核苷酸。在另一方面中，本发明提供制备本文所述之任何多核苷酸之方法。多核苷酸可利用本领域已知之方法制备及表达。因此，本发明提供编码下列PDGF-B抗体及其抗原结合片段之任一者之多核苷酸或包含多核苷酸之组合物(包括药物组合物)：MOR8457VL(SEQ ID NO:1)、MOR8457VH(SEQ ID NO:2)、MOR8457-GL-VL(SEQ ID NO:4)、MOR8457-GL-VH(SEQ ID NO:6)、MOR8457-Gl-hIgG1-3m-HC(SEQ ID NO:14)、MOR8457-GL-LC(SEQ ID NO:16)、MOR8457-GL-IKR-LC(SEQ ID NO:17)、MOR8457-hIgG1-3m-HC(SEQ IDNO:18)、MOR8457-15-VL(SEQ ID NO:34)、MOR8457-15-LC(SEQ IDNO:37)、MOR8457-16-VL(SEQ ID NO:39)、MOR8457-16-LC(SEQ IDNO:42)、MOR8457-15-VH/MOR8457-16-VH(SEQ ID NO:44)、MOR8457-15-HC/MOR8457-16-HC(SEQ ID NO:46)、MOR8457CDR-H1(SEQ IDNO:7)、MOR8457CDR-H2(SEQ ID NO:8)、MOR8457CDR-H3(SEQ IDNO:9)、MOR8457CDR-L1(SEQ ID NO:10)、MOR8457CDR-L2(SEQ IDNO:11)、MOR8457CDR-L3(SEQ ID NO:12)、MOR8457-15-CDR-L3(SEQID NO:36)、MOR8457-16-CDR-L2(SEQ ID NO:41)或其具有结合PDGF-B之能力之任何片段或部分。
本发明提供编码下列PDGF-B抗体及其抗原结合片段之任一者之多核苷酸(或包含多该核苷酸之组合物)：MOR8457VL(SEQ ID NO:1)、MOR8457VH(SEQ ID NO:2)、MOR8457-GL-VL(SEQ ID NO:4)、MOR8457-GL-VH(SEQ ID NO:6)、MOR8457-Gl-hIgG1-3m-HC(SEQ IDNO:14)、MOR8457-GL-LC(SEQ ID NO:16)、MOR8457-GL-IKR-LC(SEQID NO:17)、MOR8457-hIgG1-3m-HC(SEQ ID NO:18)、MOR8457-15-VL(SEQ ID NO:34)、MOR8457-15-LC(SEQ ID NO:37)、MOR8457-16-VL(SEQ ID NO:39)、MOR8457-16-LC(SEQ ID NO:42)、MOR8457-15-VH/MOR8457-16-VH(SEQ ID NO:44)、MOR8457-15-HC/MOR8457-16-HC(SEQ ID NO:46)、MOR8457CDR-H1(SEQ ID NO:7)、MOR8457CDR-H2(SEQ ID NO:8)、MOR8457CDR-H3(SEQ ID NO:9)、MOR8457CDR-L1(SEQ ID NO:10)、MOR8457CDR-L2(SEQ ID NO:11)、MOR8457CDR-L3(SEQ ID NO:12)、MOR8457-15-CDR-L3(SEQ ID NO:36)、MOR8457-16-CDR-L2(SEQ ID NO:41)或其具有结合PDGF-B之能力之任何片段或部分，其中该多核苷酸之序列包含SEQ ID NO:3(编码MOR8457-GL-VL)、SEQ ID NO:5(编码MOR8457-GL-VH)、SEQ ID NO:13(编码MOR8457-GL-hIgG1-3m-HC)、SEQ ID NO:15(编码MOR8457-GL-LC)、SEQ IDNO:35(编码MOR8457-15-VL)、SEQ ID NO:38(编码MOR8457-15-LC)、SEQ ID NO:40(编码MOR8457-16-VL)、SEQ ID NO:43(编码MOR8457-16-LC)、SEQ ID NO:45(编码MOR8457-15-VH/MOR8457-16-VH)及SEQID NO:47(编码MOR8457-15-HC/MOR8457-16-HC)之序列。
在另一方面中，本发明提供编码PDGF-B抗体之多核苷酸及其变体，其中该多核苷酸变体与本文所揭示之任何特定核酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％之序列相同性。
与任何这些序列互补之多核苷酸亦包含于本发明中。多核苷酸可能为单链(编码或反义)或双链，且可能为DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子及mRNA分子，该HnRNA分子包含内含子且以一对一之方式对应DNA，该mRNA分子不包含内含子。其它编码或非编码序列可能(但不一定)存在于本发明之多核苷酸内，且多核苷酸可能(但不一定)与其它分子及/或支持物质连接。
多核苷酸可能包含天然序列(即编码抗体或其部分之内源性序列)或可能包含该序列之变体。多核苷酸变体包含一或多个取代、添加、删除及/或插入，以使所编码之多肽的免疫反应性相对于天然免疫反应性分子不被减少。对所编码之多肽的免疫反应性之影响通常系如本文所述检测。变体优选地展现与编码天然抗体或其片段之多核苷酸序列具有至少约70％之相同性，更优选地至少约80％之相同性，甚至更优选地至少约90％之相同性及最优选地至少约95％之相同性。
若二个多核苷酸或多肽序列如下所述比对以得到最高对应性且该二个序列中之核苷酸或氨基酸序列相同，则该二个序列被称为“相同”。两序列之间的比较通常藉由在比较窗中比较序列加以进行，以鉴定及比较具有序列相似性之局部区域。本文所使用之“比较窗”系指至少约20个、通常30个至约75个、或40个至约50个连续位置之区段，在该窗中一序列可与具有相同连续位置数量之参考序列在该二序列经最佳比对后比较。
供比较之序列的最佳比对可利用生物信息软件包之程序(Inc.,Madison,WI)以默认参数进行。此程序实现以下参考文献所描述之多种比对方案：Dayhoff,M.O.,1978,A model ofevolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships.InDayhoff,M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure,NationalBiomedical Research Foundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358；Hein J.,1990,Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp.626-645Methods in Enzymology vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.and Sharp,P.M.,1989,CABIOS 5:151-153；Myers,E.W.andMuller W.,1988,CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11:105；Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4:406-425；Sneath,P.H.A.and Sokal,R.R.,1973,Numerical Taxonomy the Principles and Practice of NumericalTaxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:726-730。
优选地，“序列相同性之百分比”系藉由在至少20个位置之比较窗中比较二个经最优选比对之序列加以决定，其中在比较窗中多核苷酸或多肽序列之部分相较于供二序列最佳比对之参考序列(其不包含添加或删除)可能包含20％或低于20％、通常5％至15％、或10％至12％之添加或删除(即缺口)。百分比之计算系藉由测定二个序列中出现相同之核酸碱基或氨基酸残基之位置的数目，以得到匹配位置之数目，将该匹配位置之数目除以参考序列之位置总数(即窗之大小)，并将该结果乘以100以得到序列相同性百分比。
变体亦可能或选择性地与天然基因或其部分或互补部分实质上同源。这些多核苷酸变体能在中度严谨条件下与编码天然抗体之天然存在之DNA序列(或互补序列)杂交。
适当之“中度严谨条件”包括在5倍SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)之溶液中预先清洗；于50℃至60℃之5倍SSC中过夜杂交；接着于65℃中各以含有0.1％SDS之2倍、0.5倍及0.2倍SSC清洗20分钟两次。
本文所使用之“高度严谨条件”或“高严谨度条件”系那些：(1)采用低离子张力及高温清洗，例如于50℃之0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二基硫酸钠；(2)在42℃之杂交期间采用变性剂，诸如甲酰胺，例如具有0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯基吡咯烷酮/含有750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠之pH 6.5之50mM磷酸钠缓冲液之50％(体积/体积)甲酰胺；或(3)于42℃采用50％甲酰胺、5倍SSC(0.75摩尔NaCl、0.075摩尔柠檬酸钠)、50毫摩尔磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5倍丹哈德(Denhardt’s)溶液、经超音波化之鲑鱼精子DNA(50微克/毫升)、0.1％SDS及10％硫酸葡聚糖，并于42℃以0.2倍SSC(氯化钠/柠檬酸钠)清洗及于55℃以50％甲酰胺清洗，之后于55℃以含有EDTA之0.1倍SSC进行高严谨度清洗。本领域技术人员将知道如何视需要调整温度、离子强度等条件以配合像是探针长度等类似之因子。
本领域技术人员将了解的是，由于基因密码简并之结果，有许多核苷酸序列编码本文所描述之多肽。这些多核苷酸中有些与任何天然基因之核苷酸序列具有极低之同源性。然而，本发明特别考虑因为使用不同的密码子而有所差异之多核苷酸。另外，包含本文所提供之多核苷酸序列之基因的等位基因系属于本发明之范围内。等位基因系因为一或多个突变，诸如核苷酸之删除、添加及/或取代而被改变之内源性基因。该形成之mRNA及蛋白质可能但不一定具有经改变之结构或功能。等位基因可利用标准技术(诸如杂交、扩增及/或数据库序列比较)加以鉴定。
本发明之多核苷酸可利用化学合成、重组方法或PCR获得。化学多核苷酸合成之方法系本领域所广为周知，不需在此详细说明。本领域技术人员可利用本文所提供之序列及商用DNA合成仪产生想要的DNA序列。
在利用重组方法制备多核苷酸时，包含想要的序列之多核苷酸可被插入适当之载体中，该载体接着可被导入适当之宿主细胞以供复制及扩增，在下面进一步讨论。多核苷酸可藉由本领域所知之任何方法被插入宿主细胞中。细胞之转化系藉由直接摄取、内吞作用、转染、F接合(F-mating)或电穿孔导入外源性多核苷酸。导入后，该外源性多核苷酸可以非整合性载体(诸如质粒)或整合至该宿主细胞之基因组中而被维持于该细胞内。经此扩增之多核苷酸可利用本领域所熟习之方法自该宿主细胞分离。见例如Sambrook et al.,1989。
另外，PCR能复制DNA序列。PCR技术系本领域所广为周知，于美国专利第4,683,195、4,800,159、4,754,065及4,683,202号及PCR:ThePolymerase Chain Reaction,Mullis et al.eds.,Birkauswer Press,Boston,1994中描述。
RNA可藉由使用适当载体中经分离之DNA且将其插入适当之宿主细胞中获得。当细胞复制且该DNA被转录成为RNA时，该RNA即可利用本领域技术人员所广为周知之方法分离，例如于Sambrook et al.,1989(同上)所述。
适当之克隆载体可根据标准技术构建，或可选自本领域为数众多之可用克隆载体。虽然该经选择之克隆载体可能因所意图使用之宿主细胞而异，适用之克隆载体通常具有自我复制之能力、可能具有特定限制内切酶之单一目标及/或可能带有可用于选择含有该载体之克隆的标志基因。适当实例包括质粒及细菌性病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBSSK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA及穿梭载体诸如pSA3及pAT28。这些及许多其它克隆载体可购自商业卖方诸如BioRad、Stratagene及Invitrogen。
本发明另提供表达载体。表达载体通常是可复制之多核苷酸构建体，其包含本发明之多核苷酸。这表示表达载体必需能在宿主细胞中以附加体或染色体DNA之组成部分被复制。适当之表达载体包括但不限于质粒、病毒载体(包括腺病毒、腺病毒相关病毒、反转录病毒)、粘粒及PCT公开号WO 87/04462中所揭示之表达载体。载体成份通常包括但不限于下列一或多项：信号序列、复制起点、一或多种标志基因、适当之转录控制组件(诸如启动子、增强子及终止子)。就表达(即翻译)而言，通常也需要一或多种翻译控制组件，诸如核糖体结合位置、翻译起始位置及终止密码子。
含有感兴趣之多核苷酸之载体及/或这些多核苷酸本身可藉由任何适当之方法导入宿主细胞，包括电穿孔、使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质之转染、微弹撞击、脂质体转染及感染(例如该载体为感染剂诸如牛痘病毒)。导入载体或多核苷酸之选择通常将视该宿主细胞之特征而定。
本发明亦提供包含本文所述之任何多核苷酸之宿主细胞。任何能过表达异源性DNA之宿主细胞可被使用以分离编码该感兴趣之抗体、多肽或蛋白质之基因。哺乳动物宿主细胞之非限制性实例包括但不限于COS、HeLa及CHO细胞。亦见PCT公开号WO 87/04462。适当之非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(诸如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌(B.subtillis))及酵母(诸如酿酒酵母(S.cerevisae)、裂殖酵母(S.pombe)或乳酸克鲁维酵母(K.lactis))。优选地，该宿主细胞中cDNA表达水平比宿主细胞中对应之感兴趣之内源性抗体或蛋白质的基因(若存在)高约5倍、更优选为高10倍、甚至更优选为高20倍。筛选与PDGF-B特异性结合之宿主细胞系由免疫测定或FACS进行。过度表达感兴趣之抗体或蛋白之细胞可被鉴定。
表达载体可被用于直接表达PDGF-B抗体。本领域技术人员熟悉施用表达载体以获得外源性蛋白于活体内之表达。见例如美国专利第6,436,908、6,413,942及6,376,471号。表达载体之施用包括局部或系统性施用，包括注射、经口施用、粒子枪或经导管施用及局部施用。在另一实施方案中，该表达载体系直接施用至交感神经干或神经节，或施用至冠状动脉、心房、心室或心包膜中。
靶向性递送含有表达载体之治疗性组合物或亚基因组多核苷酸亦可被使用。受体介导的DNA递送技术系描述于例如Findeis et al.,TrendsBiotechnol.,1993,11:202；Chiou et al.,Gene Therapeutics:Methods AndApplications Of Direct Gene Transfer,J.A.Wolff,ed.,1994；Wu et al.,J.Biol.Chem.,1988,263:621；Wu et al.,J.Biol.Chem.,1994,269:542；Zenke etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87:3655；Wu et al.,J.Biol.Chem.,1991,266:338。含有多核苷酸之治疗性组合物系以约100ng至约200mg之DNA范围施用以供基因治疗计划中之局部施用。约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg及约20μg至约100μg之DNA浓度范围亦可被用于基因治疗计划。治疗性多核苷酸及多肽可利用基因递送载体递送。该基因递送载体可为病毒性或非病毒性来源(通常参考Jolly,CancerGene Therapy 1:51,1994；Kimura,Human Gene Therapy 1994:5,845；Connelly,Human Gene Therapy,1995,1:185及Kaplitt,Nature Genetics 6:148,148)。这些编码序列之表达可利用内源性哺乳动物或异源性启动子诱导。编码序列之表达可为组成型或受调控的。
用于递送想要的多核苷酸及在想要的细胞中表达之病毒基底载体系本领域所熟知。示例性病毒基底载体包括但不限于重组反转录病毒(见例如PCT公开号WO 90/07936、WO 94/03622、WO 93/25698、WO 93/25234、WO 93/11230、WO 93/10218、WO 91/02805、美国专利第5,219,740及4,777,127号、GB专利第2,200,651号及EP专利第0345242号)、阿尔法病毒基底载体(例如辛德毕斯病毒载体、塞姆利基森林病毒(ATCC VR-67、ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(ATCC VR-373、ATCC VR-1246)及委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923、ATCC VR-1250、ATCC VR 1249、ATCC VR-532))及腺相关病毒(AAV)载体(见例如PCT公开号WO94/12649、WO 93/03769、WO 93/19191、WO 94/28938、WO 95/11984及WO 95/00655)。亦可采用如Curiel,Hum.Gene Ther.,1992,3:147所述之施用与死腺病毒连接之DNA。
非病毒性递送载体及方法亦可被采用，包括但不限于不论有无与单独死腺病毒连接之经聚阳离子缩合之DNA(见例如Curiel,Hum.Gene Ther.,1992,3:147)、与配体连接之DNA(见例如Wu,J.Biol.Chem.,1989,264:16985)、真核细胞递送载体细胞(见例如美国专利第5,814,482号、PCT公开号WO 95/07994、WO 96/17072、WO 95/30763及WO 97/42338)及核电荷中和或与细胞膜融合。裸DNA亦可被采用。示例性裸DNA导入方法系于PCT公开号WO 90/11092及美国专利第5,580,859号中描述。可被用来作为基因递送载体之脂质体系描述于美国专利第5,422,120号、PCT公开号WO 95/13796、WO 94/23697、WO 91/14445及EP 0524968。其它方法系描述于Philip,Mol.Cell Biol.,1994,14:2411及Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.,1994,91:1581。
治疗方法
治疗方法涉及给需要治疗之个体施用治疗有效量或“有效量”之本发明之PDGF-B抗体或其抗原结合部分，并由本揭示说明。本文所使用之“治疗有效”或“有效”量，系指抗体或其部分足以导致疾病症状之严重性降低、无疾病症状期之频率及时间增加或预防因罹患疾病所致之损伤或残疾之量，该量可为单一剂量或根据多剂量计划单独或与其它剂组合施用。具本领域技术人员将可根据诸如个体(体型)大小、个体症状之严重性及该选择之特定组合物或施用途径等因素来决定该量。该个体可为人或非人动物(例如兔、大鼠、小鼠、猴或其它低级灵长动物)。
本发明之抗体或其抗原结合部分可能与已知药物共施用，在一些情况中该抗体本身可能经修饰。例如，抗体可与免疫毒素或放射性同位素缀合以进一步增加潜在疗效。至于与其它治疗剂共施用，这些剂可包括细胞毒性剂、放射线毒性剂或免疫抑制剂。该抗体可与药剂连接(成为免疫复合物)或可与药剂分开施用。在后者(分开施用)之情况中，该抗体可在药剂施用之前、之后或同时施用，或可与其它已知之治疗共施用，例如抗癌治疗，例如放射线。这些治疗剂包括但不限于抗癌剂诸如多柔比星(亚德里亚霉素)、顺铂、硫酸博来霉素、卡氮芥、苯丁酸氮芥、及环磷酰胺羟脲，这些抗癌剂本身只有在对病患有毒性或次毒性之量时才有效。顺铂可经静脉施用100mg剂量每四周一次，亚德里亚霉素系经静脉施用60至75mg剂量每21天一次。共施用本发明之PDGF-B抗体或其抗原结合片段与治疗剂提供二种经由不同机制作用之药剂，如此可能对人疾病提供治疗作用且可能有协同作用。该共施用可解决产生药物抗药性的问题，或在治疗肿瘤发生及/或非所欲之细胞增生时因肿瘤细胞之抗原性改变导致对抗体无反应之问题。
本文揭示之抗体及抗原结合部分可被用来作为其中PDGF-B被非所欲地表达或发现之许多病状的治疗或诊断工具，如Trojanowska,2008,Rheumatology 47:v2-v4；Andrae et al.2008Genes Dev.22:1276-1312；Heldinand Westermark,1999,Physiological Revs.79(4):1238-1316；Laimer et al.,2012,Nature Med.18(11):1699-1704所综述。由于PDGF-B涉及肿瘤形成以及PDGF-B于血管生成、细胞增生、细胞迁移及细胞外基质过度沉积中之作用还有PDGFRβ与PDGF-B于多种疾病、疾患及症状中之影响，许多这些疾病、疾患或症状特别适合用于以本发明之抗体或抗原结合部分治疗。这些疾病、疾患或症状包括但不限于与异常细胞生长有关之症状，例如间皮瘤、肝癌、前列腺癌、腺癌、神经胶质瘤、神经胶母细胞瘤、卵巢癌、胆管癌、NPM-ALK驱动性淋巴瘤、大肠直肠癌、皮肤癌、乳癌、胰脏癌、肺癌或一或多种前述癌症之组合。其它可利用本发明之抗体或其片段治疗之PDGF-B介导的症状包括但不限于发炎症状(例如动脉粥样硬化、再狭窄、骨关节炎、类风湿性关节炎、I型糖尿病、慢性阻塞性肺病、缺血、中风、血栓)、纤维化症状(例如自发性肺纤维化、肾脏疾病、胆管纤维化、肝纤维化、自发性腹膜纤维化、肾小球肾炎、IgA肾病、狼疮性肾炎、Alport综合征、范可尼氏症(Fanconi disease)、局部节段性肾小球硬化、高血压性肾硬化、肾炎性疾病、硬皮病(SSc)、心脏肥大、原发性胆管硬化、派尼尔氏症(Peyronie’s disease)、子宫纤维瘤、子宫内膜异位、肺性高血压、手术后粘连、皮肤疤痕、肺动脉高血压、原发性硬化性胆管炎、心脏异体移植血管病变及纤维化)、老年性黄斑部病变、糖尿病黄斑水肿、干眼症、狭窄(strictures)、新生内膜形成、移植物对抗宿主疾病、良性前列腺增生、肉瘤、糖尿病肾病、血管炎、退行性星状细胞瘤(anaplasticastrocytoma)、间皮瘤、白血病、脑出血、骨折愈合、脑梗塞、细胞凋亡、获得性免疫缺陷综合征/HIV感染、慢性肾衰竭、肝硬化、转移、原发性肺性高血压、继发性肺性高血压、川崎氏综合征、再灌注损伤、黏膜皮肤淋巴结综合征、良性肿瘤、高脂血症、压力性尿失禁、慢性骨髓性白血病、皮肤纤维瘤、过敏反应、神经管胚细胞瘤、骨髓性白血病(急性及慢性)、骨质疏松症、Grave’s眼病、脑炎、纤维肌痛症、神经系统损伤、老化、胆石症、肝病、高胆固醇血症、病毒性脑膜炎、生殖系统毒性(reprotox)、肌酸代谢异常、视网膜病、全身性红斑狼疮、吸收不良综合征、触摸痛、恶性高血压、骨髓纤维变性、先天性异常、眼毒性、阿兹海默氏症、类癌、肺纤维化、鼻息肉、紫斑症、动脉瘤、鳞状细胞癌、慢性胰脏炎、消化系统肿瘤、甲状腺肿瘤、非典型性肺炎、虚弱、过敏、毒性、实体肿瘤、II型糖尿病、皮肤疤痕、神经内分泌癌、哮喘、腺瘤、神经性疼痛、巨细胞病毒感染、成神经细胞瘤、视网膜病、萎缩症、脑病、休克、CNS癌、败血症、过氧症、肠癌、细菌性呼吸系统疾病、器官移植、脑垂体癌、肥胖症、瘢痕瘤(keloid scars)、尼古丁成瘾、广泛性焦虑症、食道癌、基底和鳞状细胞皮肤癌、高钙血症、胚胎致死、肺炎、肺部炎症、神经学疾病、神经系统肿瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposis sarcoma)、凝血功能障碍、眼疾、胰脏炎、毛细血管扩张症、呼吸系统疾病、眼睛及眼框发炎、冷凝球蛋白血症、肝细胞癌、心血管疾病及帕金森氏病。
为了治疗前述疾病，根据本发明使用之药物组合物可利用一或多种药学可接受之载剂或赋形剂以常规方式配制，并如下详述方式施用。
本发明之抗体或抗原结合部分之治疗有效量的决定，主要将依病患特征、施用途径及所欲治疗之疾病特性而定，将于下更充分讨论。
该抗体之施用及给药将于以下他处更充分讨论。
诊断方法
本发明之抗体、经工程化之抗体及经工程化之抗体缀合物可被用于影像诊断。例如，该经工程化之抗体缀合物可为放射标记单克隆抗体。见例如Srivastava(ed.),Radiolabeled Monoclonal Antibodies For Imaging AndTherapy,Plenum Press(1988)；Chase,"Medical Applications of Radioisotopes,"in Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Edition,Gennaro et al.(eds.),Mack Publishing Co.,pp.624-652(1990)；and Brown,"Clinical Use ofMonoclonal Antibodies,"in Biotechnology and Pharmacy,Pezzuto et al.(eds.),Chapman and Hall,pp.227-249(1993)；Grossman,1986,Urol.Clin.NorthAmer.13:465-474；Unger et al.,1985,Invest.Radiol.20:693-700；and Khaw etal.,1980,Science 209:295-297。此技术又称为免疫闪烁法，使用伽玛摄影机检测与单克隆抗体缀合之γ射线放射性同位素之位置。影像诊断可被用于诊断癌、自体免疫性疾病、感染性疾病及/或心血管疾病。(见例如Brown，同上。)
在一实施方案中，该经工程化之抗体缀合物可被用于诊断心血管疾病。例如，包含抗肌球蛋白抗体片段之经工程化之抗体缀合物可被用于成像与急性心肌梗塞有关之心肌坏死等。
除了诊断之外，单克隆抗体成像可被用于监测治疗反应、检测疾病复发及引导后续临床决定。
以诊断及监测目的而言，放射性同位素可能与抗体片段直接结合，或藉由使用中介官能基与之间接结合。这些中介官能基包括例如二伸乙三胺五乙酸(DTPA)及乙二胺四乙酸(EDTA)。施用至病患之放射线剂量通常维持在尽可能最低的量。此可能经由选择具有最短半衰期、体内最少滞留及能被检测且正确测量之同位素最小量的最优选组合之同位素达成。可与抗体结合且适用于影像诊断之放射性同位素之实例包括99mTc及111In。
研究显示抗体片段特别是Fab及Fab'提供适当之肿瘤/背景比。(见例如Brown，同上。)
该经工程化之抗体缀合物亦可利用顺磁离子标记以供活体内诊断目的使用。特别适用于磁共振摄影之元素包括Gd、Mn、Dy及Fe离子。
该经工程化之抗体缀合物亦可体外检测之特定抗原之存在。在这些免疫测定中，可使用呈液相或与固相载体结合之该经工程化之抗体缀合物。例如，完整抗体或其抗原结合片段可附着于聚合物(诸如胺基葡聚糖)，以连接该抗体成分至不可溶支持物诸如聚合物包覆珠、板或管。
或者，该经工程化之抗体缀合物可被用于检测由组织学样品制备之组织切片中之特定抗原。该原位检测可例如藉由施用经可检测标记之免疫缀合物至该组织切片进行。原位检测可用于决定特定抗原之存在及决定该抗原于检查组织中之分布。原位检测之常规技术系本领域技术人员所熟知。(见例如Ponder,"Cell Marking Techniques and Their Application,"inMammalian Development:A Practical Approach,Monk(ed.),IRL Press,pp.115-138(1987)；Coligan et al.,同上。)
可检测之标记诸如酶、荧光化合物、电子转移剂等可利用本领域广为周知之常规方法与载体连接。这些经标记之载体及利用其制备之经工程化之抗体缀合物可被用于活体外免疫测定及原位检测，抗体缀合物可藉由直接连接这些标记至抗体制备。该经工程化之抗体缀合物所包含之多种标记可增加免疫测定或组织学检查之敏感性，其中达到仅低程度之该抗体或抗体片段与标靶抗原之结合。
组合物
本发明亦提供包含有效量之本文所述之PDGF-B抗体之药物组合物。这些组合物之实例以及如何配制也于本文说明。在一些实施方案中，该组合物包含一或多种PDGF-B抗体。在其它实施方案中，该PDGF-B抗体识别PDGF-B。在其它实施方案中，该PDGF-B抗体系人抗体。在其它实施方案中，该PDGF-B性抗体系人源化抗体。在一些实施方案中，该PDGF-B抗体包含能引发想要的免疫反应(诸如抗体介导的溶解或ADCC)之恒定区。在其它实施方案中，该PDGF-B抗体包含不引发非所需或非想要的免疫反应(诸如抗体介导的溶解或ADCC)之恒定区。在其它实施方案中，该PDGF-B抗体包含该抗体之一或多个CDR(诸如一、二、三、四、五或在一些实施方案中所有六个CDR)。
应了解这些组合物可包含超过一种PDGF-B抗体(例如识别PDGF-B之不同表位之PDGF-B抗体之混合物)。其它示例性组合物包含超过一种识别相同表位之PDGF-B抗体，或与PDGF-B之不同表位结合之不同的PDGF-B抗体。在一些实施方案中，该组合物包含识别PDGF-B之不同变体之PDGF-B抗体之混合物，或识别多种PDGF(例如PDGF-A、-B、-C及-D)之PDGF-B抗体之混合物。在一些实施方案中，该组合物包含识别PDGF-B之表位1及表位2之单一PDGF-B抗体。
本发明所使用之组合物可另包含药学可接受之载剂、赋形剂或稳定剂(Remington:The Science and practice of Pharmacy 20th Ed.,2000,LippincottWilliams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover)，以呈冷冻干燥制剂或水溶液之形式。可接受之载剂、赋形剂或稳定剂在所采用之剂量及浓度下对接受者不具毒性，且可能包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸及甲硫氨酸；保存剂(诸如十八基二甲基芐基氯化铵、六甲氯胺、氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵、苯酚、丁醇或苄醇、烷基对羟苯甲酸酯类诸如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单醣、二醣及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；盐形成反离子诸如钠；金属复合物(例如锌蛋白复合物)；及/或非离子性界面活性剂诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。药学可接受之赋形剂另于本文说明。
该PDGF-B抗体及其组合物亦可与其它剂一起使用，以用于增进及/或补充这些剂之有效性。
本发明亦提供包含本发明之任何多核苷酸之组合物，包括药物组合物。在一些实施方案中，该组合物包含含有编码本文所述之抗体之多核苷酸之表达载体。在其它实施方案中，该组合物包含含有编码本文所述之抗体之任一者之多核苷酸之表达载体。在其它实施方案中，该组合物包含如SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:5所示之多核苷酸序列之一或二者、如SEQID NO:13及SEQ ID NO:15所示之多核苷酸之一或二者、如SEQ ID NO:35及SEQ ID NO:45所示之多核苷酸之一或二者、如SEQ ID NO:38及SEQID NO:47所示之多核苷酸之一或二者、如SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:45所示之多核苷酸之一或二者、或如SEQ ID NO:43及SEQ ID NO:47所示之多核苷酸之一或二者。
在另一方面中，该多核苷酸可编码本发明之抗体之VH、VL及/或二者。也就是说，该组合物包含编码本发明之抗体或其抗原结合部分之单一多核苷酸或超过一种多核苷酸。
本发明之药物组合物亦可在组合疗法中施用，诸如与其它剂组合。例如，该组合疗法可包括本发明之经工程化之抗体或其缀合物与至少一种其它治疗组合，其中该治疗可能是手术、免疫疗法、化学疗法、放射治疗或药物治疗。
本发明之药物化合物可包括一或多种药学可接受之盐。这些盐之实例包括酸添加盐及碱添加盐。酸添加盐包括那些源自非毒性无机酸(诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)之盐，以及源自非毒性有机酸(诸如脂肪族一元及二元羧酸、经苯基取代之烷基烷酸、羟基烷基烷酸、芳香族酸、脂肪族及芳香族磺酸等)之盐。碱添加盐包括那些源自碱土金属(诸如钠、钾、镁、钙等)之盐，以及源自非毒性有机胺(诸如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)之盐。
本发明之药物组合物亦可包括药学可接受之抗氧化剂。药学可接受之抗氧化剂实例包括：(1)可溶于水之抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)可溶于油之抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α生育酚等；及(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本发明之药物组合物中之适当水性及非水性载剂的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适当混合物、植物油(诸如橄榄油)及可注射的有机酯诸如油酸乙酯。适当之流动性可藉由使用例如包覆材料(诸如卵磷酯)、藉由维持分散液所需之颗粒大小及藉由使用界面活性剂加以维持。
这些组合物亦可包含佐剂诸如保存剂、润湿剂、乳化剂及分散剂。防止微生物之存在可藉由灭菌程序及藉由包含各种抗细菌及抗真菌剂(例如苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)二种方式加以确保。在组合物中包括等张剂诸如糖、氯化钠等亦为所欲。此外，延长该可注射的药物剂型之吸收可藉由包括延迟吸收之剂达成，诸如一硬脂酸铝及明胶。
药物组合物通常在制备及储存的条件下必须为无菌及稳定。该组合物可被调制为溶液、微乳化物、脂质体、或其它适合高药物浓度之有序结构。载剂可为溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其适当混合物。藉由例如使用包覆剂诸如卵磷脂、藉由维持在分散液中需要之颗粒大小及藉由使用界面活性剂可维持适当之流动性。于许多情况下，适当的是该组合物包括等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇)、山梨糖醇或氯化钠。延长注射型组合物之吸收可藉由在该组合物中包含延长吸收之剂质例如单硬脂酸盐及明胶以达成。
无菌注射溶液之制备可藉由将所需量之活性化合物及视需要之一或多种上述成分掺入适当溶剂，接着经过无菌微过滤。
通常，制备分散液系藉由将该活性化合物并入无菌载体中，该无菌载体含有基本之分散媒质和取自上述列举成分之其它所需成分。以用于制备无菌注射溶液之无菌粉末而言，优选之制备方法系真空干燥和冷冻干燥(冻干)，以自彼等先前经过滤灭菌之溶液产生该活性成分以及任何额外想要的成分之粉末。
本发明之药物组合物可经制备、包装或贩卖为适合眼用之配制物。这些配制物可能呈例如眼滴剂之形式，包括例如活性成分于水性或油性液体载剂中之0.11.0％(w/w)溶液或悬浮液。这些滴剂可能另包含缓冲剂、盐或一或多种本文所述之其它成分。可使用之其它可供眼用之配制物包括：包含该活性成分呈微结晶型式或呈脂质体制剂之配制物。
本文所使用之“其它成分”包括但不限于下列一或多者：赋形剂、表面活性剂、分散剂、惰性稀释剂、造粒剂、崩解剂、结合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂、保存剂、生理可降解之组合物诸如明胶、水性载体及溶剂、油性载体及溶剂、悬浮剂、分散或潮湿剂、乳化剂、缓和剂、缓冲剂、盐、增稠剂、调料、乳化剂、抗氧化剂、抗生素、抗真菌剂、稳定剂及药学可接受之聚合性或疏水性材料。其它可包括于本发明之药物组合物中之“其它成分”系本领域所知，且描述于例如Remington'sPharmaceutical Sciences,Genaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1985)，其以参照方式并入本文。
在一实施方案中，该抗体、经工程化之抗体或经工程化之抗体缀合物系以无菌水溶液之静脉配制物施用，其包含5mg/ml、或更优选约10mg/ml、或更优选约15mg/ml、或甚至更优选约20mg/ml之抗体及醋酸钠、聚山梨醇酯80及氯化钠，pH介于约5至6。优选地，该静脉配制物系包含5或10mg/ml之抗体、20mM醋酸钠、0.2mg/ml聚山梨醇酯80及140mM氯化钠pH 5.5之无菌水溶液。另外，包含经工程化之抗体或经工程化之抗体缀合物之溶液可包含但不限于组氨酸、甘露醇、蔗糖、海藻糖、甘氨酸、聚乙二醇、EDTA、甲硫氨酸及其任何组合及该相关领域已知之许多其它化合物。
在一实施方案中，该抗体、经工程化之抗体或经工程化之抗体缀合物配制物之部分剂量系以静脉推注方式施用，其余以输注方式施用。例如，0.01mg/kg静脉注射之该抗体、经工程化之抗体或经工程化之抗体缀合物可以推注方式给予，其余预定之经工程化之抗体或经工程化之抗体缀合物之剂量可以静脉注射施用。该抗体或经工程化之抗体的预定剂量可在例如一个半小时至二小时至五小时之期间施用。
至于治疗剂，当该剂为例如小分子时，其可以生理可接受之酯或盐之形式存在于药物组合物中，诸如本领域所广为周知之与生理上可接受之阳离子或阴离子组合。
本文所述之药物组合物之配制物可以任何药理学领域已知或以后开发之方法制备。通常，该制备方法包括使活性成分与载剂或一或多种其它附属成分结合之步骤，之后若有需要或系为所欲，将该产品塑形或包装成想要的单一或多剂量单位。
在一实施方案中，本发明之组合物系无致热原配制物，其实质上不含内毒素及/或相关致热物质。内毒素包括局限于微生物内之毒素，当该微生物分解或死亡时会被释出。致热物质亦包括源自细菌及其它微生物之外膜的诱导发烧之热稳定物质(糖蛋白)。这两种物质若施用至人，皆可造成发烧、低血压及休克。由于这些潜在有害效应，必须自静脉注射之药物制剂移除即使少量之内毒素。美国食品药物管理局(FDA)规定静脉药物注射1小时之上限为每公斤体重剂量每剂量5内毒素单位(EU)(The United StatesPharmacopeial Convention,Pharmacopeial Forum 26(1):223(2000))。当治疗性蛋白质以每公斤体重数百或数千毫克之量施用时，移除即使微量之内毒素系有利的。在一实施方案中，内毒素及致热原于组合物中之量系少于10EU/mg、或少于5EU/mg、或少于1EU/mg、或少于0.1EU/mg、或少于0.01EU/mg、或少于0.001EU/mg。在另一实施方案中，内毒素及致热原于组合物中之量系少于约10EU/mg、或少于约5EU/mg、或少于约1EU/mg、或少于约0.1EU/mg、或少于约0.01EU/mg、或少于约0.001EU/mg。
在一实施方案中，本发明包含施用一组合物，其中该施用系口服、非经肠、肌肉内、鼻内、经阴道、直肠、舌上、舌下、经颊、口内、静脉内、皮肤、皮下或经皮。
在另一实施方案中，本发明另包含施用一组合物与其它治疗诸如手术、化学治疗、激素治疗、生物学疗法、免疫疗法或放射疗法之组合。
剂量/施用
为了制备包括本发明之抗体、经工程化之抗体或经工程化之抗体缀合物之药物或无菌组合物，该抗体/抗体缀合物系与药学可接受之载剂或赋形剂混合。治疗及诊断剂之配制物可藉由与例如呈冷冻干燥粉末、浆液、水溶液、乳液或悬浮液之形式的生理上可接受之载剂、赋形剂或安定剂混合制备(见例如Hardman,et al.(2001)Goodman and Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,N.Y.；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,N.Y.；Avis,et al.(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,MarcelDekker,NY；Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical DosageForms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner and Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.)。
选择治疗剂之施用方案取决于多项因素，包括该实体之血清或组织代谢速率、症状程度、该实体之免疫原性及生物基质中之标靶细胞之易接近性。在某些实施方案中，施用方案在可接受之不良反应下最大化递送至病患之治疗剂之量。因此，所递送之生物剂之量部分取决于特定实体及所欲治疗之症状的严重性。选择适当剂量之抗体、细胞因子及小分子的指南系可得(见例如Wawrzynczak,1996,Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(ed.),1991,Monoclonal Antibodies,Cytokines andArthritis,Marcel Dekker,New York,N.Y.；Bach(ed.),1993,MonoclonalAntibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,NewYork,N.Y.；Baert,et al.,2003,New Engl.J.Med.348:601-608；Milgrom,et al.,1999,New Engl.J.Med.341:1966-1973；Slamon,et al.,2001,New Engl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz,et al.,2000,New Engl.J.Med.342:613-619；Ghosh,et al.,2003,New Engl.J.Med.348:24-32；Lipsky,et al.,2000,NewEngl.J.Med.343:1594-1602)。
适当剂量之决定系由临床医生做出，例如利用本领域已知或疑似会影响治疗或预期会影响治疗之参数或因子。通常，该剂量从稍微低于理想剂量之量开始，之后少量渐增直到相对于任何不良反应达到该想要的或理想之效应。重要的诊断指标包括例如发炎症状或所产生之发炎性细胞因子之量。
在本发明之药物组合物中之活性成分的实际剂量可能互有不同，以获得就特定病患、组合物及施用模式而言能有效达成该想要的治疗反应的活性成分之量，而不造成对病患之毒性。该经选择之剂量将视各种药物动力学因素而定，包括本发明所采用之特定组合物(或其酯、盐或酰胺)的活性、施用途径、施用时间、所采用之特定化合物的排泄速率、治疗期间、与所采用之特定组合物组合使用之其它药物、化合物及/或材料、所治疗之病患的年龄、性别、体重、病状、整体健康及医学病史及医学领域中广为周知之类似因素。
包含本发明之抗体、经工程化之抗体或经工程化之抗体缀合物之组合物可藉由连续输注提供，或藉由例如每天、每周或每周1至7次间隔给药提供。剂量可经静脉、皮下、局部、经口、经鼻、经直肠、肌肉内、脑内或吸入提供。特定投药计划涉及避免显著非想要的不良反应之最大剂量或给药频率。每周总剂量可为至少0.05μg/kg体重、至少0.2μg/kg、至少0.5μg/kg、至少1μg/kg、至少10μg/kg、至少100μg/kg、至少0.2mg/kg、至少1.0mg/kg、至少2.0mg/kg、至少10mg/kg、至少15mg/kg、至少20mg/kg、至少25mg/kg或至少50mg/kg(见例如Yang,et al.,2003,New Engl.J.Med.349:427-434；Herold,et al.,2002,New Engl.J.Med.346:1692-1698；Liu,et al.,1999,J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456；Portielji,et al.,2003,Cancer.Immunol.Immunother.52:133-144)。该剂量可为至少15μg、至少20μg、至少25μg、至少30μg、至少35μg、至少40μg、至少45μg、至少50μg、至少55μg、至少60μg、至少65μg、至少70μg、至少75μg、至少80μg、至少85μg、至少90μg、至少95μg或至少100μg。给个体施用之剂量次数可能至少为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或更多次。
就本发明之抗体或经工程化之抗体或经工程化之抗体缀合物而言，施用至病患之剂量可能为0.0001mg/kg至100mg/kg之病患体重。该剂量可为0.0001mg/kg至20mg/kg、0.0001mg/kg至10mg/kg、0.0001mg/kg至5mg/kg、0.0001至2mg/kg、0.0001至1mg/kg、0.0001mg/kg至0.75mg/kg、0.0001mg/kg至0.5mg/kg、0.0001mg/kg至0.25mg/kg、0.0001至0.15mg/kg、0.0001至0.10mg/kg、0.001至0.5mg/kg、0.01至0.25mg/kg或0.01至0.10mg/kg之病患体重。
本发明之抗体或经工程化之抗体或经工程化之抗体缀合物之剂量可利用病患公斤体重(kg)乘以以mg/kg施用之剂量计算。本发明之抗体之剂量可能为150μg/kg或小于150μg/kg、125μg/kg或小于125μg/kg、100μg/kg或小于100μg/kg、95μg/kg或小于95μg/kg、90μg/kg或小于90μg/kg、85μg/kg或小于85μg/kg、80μg/kg或小于80μg/kg、75μg/kg或小于75μg/kg、70μg/kg或小于70μg/kg、65μg/kg或小于65μg/kg、60μg/kg或小于60μg/kg、55μg/kg或小于55μg/kg、50μg/kg或小于50μg/kg、45μg/kg或小于45μg/kg、40μg/kg或小于40μg/kg、35μg/kg或小于35μg/kg、30μg/kg或小于30μg/kg、25μg/kg或小于25μg/kg、20μg/kg或小于20μg/kg、15μg/kg或小于15μg/kg、10μg/kg或小于10μg/kg、5μg/kg或小于5μg/kg、2.5μg/kg或小于2.5μg/kg、2μg/kg或小于2μg/kg、1.5μg/kg或小于1.5μg/kg、1μg/kg或小于1μg/kg、0.5μg/kg或小于0.5μg/kg或0.1μg/kg或小于0.1μg/kg之病患体重。
本发明之该经工程化之抗体或经工程化之抗体缀合物的单位剂量可能为0.1mg至20mg、0.1mg至15mg、0.1mg至12mg、0.1mg至10mg、0.1mg至8mg、0.1mg至7mg、0.1mg至5mg、0.1至2.5mg、0.25mg至20mg、0.25至15mg、0.25至12mg、0.25至10mg、0.25至8mg、0.25mg至7mg、0.25mg至5mg、0.5mg至2.5mg、1mg至20mg、1mg至15mg、1mg至12mg、1mg至10mg、1mg至8mg、1mg至7mg、1mg至5mg或1mg至2.5mg。
本发明之抗体、经工程化之抗体或经工程化之抗体缀合物之剂量可于个体达到至少0.1μg/ml、至少0.5μg/ml、至少1μg/ml、至少2μg/ml、至少5μg/ml、至少6μg/ml、至少10μg/ml、至少15μg/ml、至少20μg/ml、至少25μg/ml、至少50μg/ml、至少100μg/ml、至少125μg/ml、至少150μg/ml、至少175μg/ml、至少200μg/ml、至少225μg/ml、至少250μg/ml、至少275μg/ml、至少300μg/ml、至少325μg/ml、至少350μg/ml、至少375μg/ml或至少400μg/ml之血清力价。或者，本发明之抗体之剂量可于该个体达到至少0.1μg/ml、至少0.5μg/ml、至少1μg/ml、至少2μg/ml、至少5μg/ml、至少6μg/ml、至少10μg/ml、至少15μg/ml、至少20μg/ml、至少25μg/ml、至少50μg/ml、至少100μg/ml、至少125μg/ml、至少150μg/ml、至少175μg/ml、至少200μg/ml、至少225μg/ml、至少250μg/ml、至少275μg/ml、至少300μg/ml、至少325μg/ml、至少350μg/ml、至少375μg/ml或至少400μg/ml之血清力价。
本发明之抗体、经工程化之抗体或经工程化之抗体缀合物之剂量可重复施用，且这些施用可相隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。
对特定病患之有效量可能因许多因素而异，诸如所欲治疗之症状、该病患之整体健康、该施用方法、途径及剂量以及不良反应之严重性(见例如Maynard,et al.,1996,A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice,Interpharm Press,Boca Raton,FIa.；Dent,2001,Good Laboratory and GoodClinical Practice,Urch Publ,London,UK)。施用途径可能为例如局部或皮肤施用，经由静脉、腹膜内、脑内、肌肉内、眼内、动脉内、脑脊髓内、病灶内注射或输注，或藉由持续释放系统或植入物施用(见例如Sidman et al.,1983,Biopolymers 22:547-556；Langer,et al.,1981,J.Biomed.Mater.Res.15:167-277；Langer,1982,Chem.Tech.12:98-105；Epstein,et al.,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688-3692；Hwang,et al.,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030-4034；美国专利第6,350466及6,316,024号)。当需要时，该组合物亦可包括助溶剂及局部麻醉剂像是利多卡因以纾解注射部位之疼痛。此外，亦可采用肺部施用，例如藉由使用吸入器或喷雾器及具有雾化剂之配制物。见例如美国专利第6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540及4,880,078号，及PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO97/44013、WO 98/31346及WO 99/66903，这些专利各以参照方式整体并入本文。在一实施方案中，本发明之经工程化之抗体或经工程化之抗体缀合物、组合治疗或组合物系利用Alkermes AIRTM肺部药物递送技术(Alkermes,Inc.,Cambridge,Mass.)施用。
本发明之组合物亦可使用本领域已知之一或多种方法经由一或多种施用途径施用。如本领域技术人员所了解的，该施用之途径及/或模式将视想要的结果而定。本发明之抗体的选定施用途径包括例如藉由注射或输注之静脉内、肌肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊椎或其它非经肠施用途径。非经肠施用可能代表除经肠及局部施用以外之通常藉由注射之施用模式，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、脊椎鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊椎内、硬膜外及胸骨内注射及输注。或者，本发明之组合物可经由非经肠之途径施用，诸如局部、表皮或黏膜途径施用，例如鼻内、经口、经阴道、经直肠、经舌下或局部。
若本发明之抗体、经工程化之抗体或经工程化之抗体缀合物系以控制释放或持续释放系统施用，可能使用泵以达到控制或持续释放(见Langer,supra；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:20；Buchwald et al.,1980,Surgery 88:501；Saudek et al.,1989,N.Engl.J.Med.321:514)。
聚合物材料可被用于达成本发明之治疗之控制或持续释放(见例如Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),CRCPres.,Boca Raton,FIa.(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug ProductDesign and Performance,Smolen and Ball(eds.),Wiley,New York(1984)；Ranger and Peppas,1983,J.,Macromol.ScL Rev.Macromol.Chem.23:61；亦见Levy et al,1985,Science 11225:190；During et al.,19Z9,Ann.Neurol.25:351；Howard et al,1989,J.Neurosurg.71:105)；美国专利第5,679,377号；美国专利第5,916,597号；美国专利第5,912,015号；美国专利第5,989,463号；美国专利第5,128,326号；PCT公开号WO 99/15154及PCT公开号WO 99/20253。用于持续释放配制物中之聚合物的实例包括但不限于聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸、乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚甲基丙烯酸、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚丙交酯(PLA)、聚乙丙交酯(polyoeactide-co-glycolides，PLGA)及聚正酯。在一实施方案中，用于持续释放配制物中之聚合物系惰性、不含可溶滤杂质、储存稳定、无菌且可生物降解。控制或持续释放系统可被放在预防性或治疗性标靶附近，因此仅需系统性剂量之一小部分(见例如Goodson,in Medical Applications ofControlled Release,supra,vol.2,pp.115-138(1984))。
控制释放系统系由Langer,1990,Science 249:1527-1533回顾讨论。本领域技术人员所知之任何技术可被用于产生包含本发明之一或多种抗体或其缀合物之持续释放配制物。见例如美国专利第4,526,938号、国际专利公开号WO 91/05548、WO 96/20698、Ning et al.,1996,"IntratumoralRadioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel,"Radiotherapy and Oncology 59:179-189、Song et al.,1995,"Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions,"PDAJournal of Pharmaceutical Science and Technology 50:372-397、Cleek et ah,1997,"Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody forCardiovascular Application,"Pro.Ml.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854及Lam et al.,1997,"Microencapsulation of Recombinant HumanizedMonoclonal Antibody for Local Delivery,"Proc.Ml.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-160，各文献以参照方式整体并入本文。
若本发明之抗体、经工程化之抗体或经工程化之抗体缀合物系经局部施用，其可被调制成软膏、乳膏、经皮贴片、乳液、凝胶、洗剂、喷剂、气雾剂、溶液、乳剂之形式或本领域技术人员所广为周知之其它形式。见例如Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to PharmaceuticalDosage Forms,19th ed.,Mack Pub.Co.,Easton,Pa.(1995)。以非喷雾之局部剂型而言，通常施用包含与局部施用相容之载剂或一或多种赋形剂且具有在一些情况中高于水之动态黏度之黏性至半固体或固体形式。适当之配制物包括但不限于溶液、悬浮液、乳剂、乳膏、软膏、粉剂、擦剂、药膏及类似剂型，这些剂型若有需要系经灭菌或与助剂(例如保存剂、安定剂、润湿剂、缓冲剂或盐)混合以改变多种性质，诸如渗透压。其它适当之局部剂型包括可喷雾之气雾制剂，其中该活性成分(在一些情况中与固体或液体惰性载剂组合)系包装于加压挥发剂(例如气体推进剂，诸如氟氯烷)之混合物或于挤压瓶中。若希望的话，潮湿剂或润湿剂液可被加入药物组合物及剂型。该额外成份之实例系本领域所广为周知。
若包含抗体、经工程化之抗体或经工程化之抗体缀合物之组合物系经鼻施用，其可被调制成气雾形式、喷剂、雾剂或滴剂之形式。特别是，本发明所使用之预防或治疗剂可利用适当推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当气体)，方便的以气雾喷剂形式自加压包装或喷雾器递送。在加压气雾剂之例中，该剂量单位可藉由提供递送经计量之量之阀决定。用于吸入器或吹入器中之胶囊及卡匣(由例如明胶制成)可能经调制为包含该化合物及适当粉剂基诸如乳糖或蔗糖之粉剂混合。
共施用第二治疗剂(例如细胞因子、类固醇、化学治疗剂、抗生素或放射线)或以第二治疗剂治疗之方法系本领域所广为周知(见例如Hardman,etal.(eds.)(2001)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis ofTherapeutics,10th ed.,McGraw-Hill,New York,N.Y.；Poole and Peterson(eds.)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach,Lippincott,Williams and Wilkins,Phila.,Pa.；Chabner and Longo(eds.)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams and Wilkins,Phila.,Pa.)。有效量之治疗剂可能降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、或至少50％之症状。
可与本发明之经工程化之抗体或经工程化之抗体缀合物组合施用之其它治疗(例如预防性或治疗性剂)，可与本发明之抗体相隔不到5分钟、相隔不到30分钟、相隔1小时、相隔约1小时、相隔约1至约2小时、相隔约2小时至约3小时、相隔约3小时至约4小时、相隔约4小时至约5小时、相隔约5小时至约6小时、相隔约6小时至约7小时、相隔约7小时至约8小时、相隔约8小时至约9小时、相隔约9小时至约10小时、相隔约10小时至约11小时、相隔约11小时至约12小时、相隔约12小时至18小时、相隔18小时至24小时、相隔24小时至36小时、相隔36小时至48小时、相隔48小时至52小时、相隔52小时至60小时、相隔60小时至72小时、相隔72小时至84小时、相隔84小时至96小时或相隔96小时至120小时施用。该二或多种疗法可于同一次门诊时施用。
本发明之抗体、经工程化之抗体或经工程化之抗体缀合物及其它治疗可周期性施用。周期性疗法涉及施用第一治疗(例如第一预防或治疗剂)一段时间，随后施用第二治疗(例如第二预防或治疗剂)一段时间，随后选择性地施用第三治疗(例如预防或治疗剂)一段时间以及如此第四治疗，且重复此顺序施用(即周期循环)，以减少任一治疗抗药性之发生、避免或减少任一治疗之不良反应及/或改善这些治疗之疗效。
在某些实施方案中，本发明之抗体、经工程化之抗体或经工程化之抗体缀合物可经调制以确保于活体内之适当分布。例如，血脑障壁(BBB)阻绝许多高亲水性化合物。为了确保本发明之治疗化合物能通过BBB(若为所欲)，彼等可经调制为例如脂质体。制备脂质体之方法见例如美国专利第4,522,811、5,374,548及5,399,331号。脂质体可包含一或多种选择性运送至特定细胞或器官之基团，因此增进标靶药物之递送(见例如V.V.Ranade,1989,J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向基团包括叶酸盐或生物素(见例如美国专利第5,416,016号)；甘露糖苷(Umezawa et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman et al.,1995,FEBSLett.357:140；M.Owais et al.,1995,Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe et al.(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；pl20(Schreier et al.(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；亦见K.Keinanen；M.L.Laukkanen,1994,FEBS Lett.346:123；Killion；Fidler,1994；Immunomethods 4:273。
本发明提供单独施用包含本发明之抗体、经工程化之抗体或经工程化之抗体缀合物之药物组合物或与其它治疗组合施用至有需要之个体之方法。本发明之组合疗法中之治疗(例如预防剂或治疗剂)可被同时或依序施用至个体。本发明之组合疗法中之治疗(例如预防剂或治疗剂)亦可周期性施用。周期性疗法涉及施用第一治疗(例如第一预防或治疗剂)一段时间，随后施用第二治疗(例如第二预防或治疗剂)一段时间，且重复此顺序施用(即周期循环)，以减少任一治疗(或剂)抗药性之发生、避免或减少任一治疗(或剂)之不良反应及/或改善这些治疗之疗效。
本发明之组合疗法中之治疗(例如预防剂或治疗剂)可被同时施用至个体。术语“同时”不限于在完全相同的时间施用治疗(例如预防或治疗剂)，而是代表包含本发明之抗体、经工程化之抗体或经工程化之抗体缀合物之药物组合物系依序在一段时间间隔内施用至个体，以使本发明之抗体或其缀合物可与其它治疗一起作用以提供相较于以其它方式施用时增加之好处。例如，各治疗可同时施用或在不同的时间点以任何顺序依序施用至个体；然而，若不是同时施用，则应在足够接近之时间内施用以提供想要的治疗或预防效应。各治疗可以任何适当形式及任何适当途径分开施用至个体。在不同的实施方案中，这些治疗(例如预防或治疗剂)系相隔不到15分钟、相隔不到30分钟、相隔不到1小时、相隔约1小时、相隔约1小时至约2小时、相隔约2小时至约3小时、相隔约3小时至约4小时、相隔约4小时至约5小时、相隔约5小时至约6小时、相隔约6小时至约7小时、相隔约7小时至约8小时、相隔约8小时至约9小时、相隔约9小时至约10小时、相隔约10小时至约11小时、相隔约11小时至约12小时、相隔24小时、相隔48小时、相隔72小时或相隔1周施用。在其它实施方案中，二或多种治疗(例如预防或治疗剂)系于同一次门诊时施用。
组合疗法之预防或治疗剂可以相同药物组合物施用至个体。或者，组合疗法之预防或治疗剂可以分开之药物组合物同时施用至个体。该预防或治疗剂可藉由相同或不同投药途径施用至个体。
试剂盒
本发明亦提供包含本文所述之任何或所有抗体之试剂盒。本发明之试剂盒包括一或多个含有本文所述之PDGF-B抗体之容器及根据本文所述之本发明之任何方法使用之说明。通常，这些说明包含施用抗体以供上述治疗性治疗之描述。在一些实施方案中，试剂盒系用以提供单剂量施用单位。在某些实施方案中，该试剂盒可包含具有干燥蛋白之第一容器及具有水性配制物之第二容器。在某些实施方案中，包括包含施用器例如单室及多室预填充针筒(例如液体针筒及冻干针筒)之试剂盒。
在一些实施方案中，该抗体系人抗体。在一些实施方案中，该抗体系人源化抗体。在一些实施方案中，该抗体系单克隆抗体。有关使用PDGF-B抗体之说明通常包括该意图治疗之剂量、给药计划及施用途径之信息。这些容器可为单位剂量、大量包装(例如多剂量包装)或亚单位剂量。本发明之试剂盒所提供之说明通常为在标签或包装仿单上之书面说明(例如包含在试剂盒中之纸张)，但机器读取之说明(例如磁性或光学储存磁盘上携有之说明)亦可被接受。
本发明之试剂盒系经适当包装。适当之包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐、可弯折之包装(例如密封之美拉(Mylar)或塑料袋)等。亦考虑的是与特殊装置组合使用之包装，诸如吸入器、经鼻施用装置(例如雾化器)或输注装置诸如小型泵。试剂盒可能具有无菌接口(例如该容器可能为具有可被皮下注射针穿刺之塞子的静注溶液袋或小瓶)。该容器也可能具有无菌接口(例如该容器可能为具有可被皮下注射针穿刺之塞子的静注溶液袋或小瓶)。该组合物中之至少一种活性剂系本发明之PDGF-B抗体。该容器可能另包含第二药物活性剂。
试剂盒可能可任意选择地提供额外成份诸如缓冲剂及解说信息。通常，该试剂盒包含容器及在该容器上或与该容器相关之标签或包装仿单。
本发明亦提供包含本文所述之任何或所有抗体之诊断试剂盒。该诊断试剂盒可用于例如检测样品中PDGF-B之存在。在一些实施方案中，诊断试剂盒可被用于鉴定具有潜在性疾病、疾患或症状而使个体有发展PDGF-B介导的疾病、疾患或症状之风险的个体。在一些实施方案中，诊断试剂盒可用于测定个体是否有罹患葡萄球菌疾病之风险。在一些实施方案中，诊断试剂盒可被用于检测PDGF-B于疑似罹患PDGF-B介导的疾病之个体之存在及/或量。
本发明之诊断试剂盒包括一或多个含有本文所述之PDGF-B抗体之容器及根据本文所述之本发明之任何方法使用之说明。通常，这些说明包含使用PDGF-B抗体以检测PDGF-B于有PDGF-B介导的疾病风险或疑似罹患PDGF-B介导的疾病之个体之存在之叙述。在一些实施方案中，示例性诊断试剂盒可经配置为包含试剂诸如PDGF-B抗体、阴性对照样品、阳性对照样品及试剂盒之使用说明。
生物保藏
本发明之代表性材料系于2012年11月6日保藏于美国菌种保存中心(10801 University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209,USA)。载体MOR8457-GL-VH(ATCC编号PTA-13303)包含编码种系MOR8457重链可变区之DNA插入物，载体MOR8457-GL-VL(ATCC编号PTA-13302)包含编码种系MOR8457轻链可变区之DNA插入物。这些保藏系根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约之规定进行。此确保自保藏日开始30年内维持该保藏物为活的培养物。该保藏物将依照布达佩斯条约之规定由ATCC提供，且将受限于辉瑞(Pfizer,Inc.)与ATCC之合约，该合约确保当签发相关美国专利或公开任何美国或外国专利申请案时(以先到者为主)，该保藏物之培养子代可永久且不受限制地供公众使用，且确保由美国专利商标委员依据35 U.S.C.122及该委员所依据之法则(包括37C.F.R.1.14，特别参照886 OG 638)判定有权获得该子代者之可得性。
本申请案之代理人同意，若该保藏中之材料的培养物在适当条件培养下死亡或遗失或毁损，一经通知应立即以另一相同材料取代该材料。不得将该保藏材料之可得性视为可藉以实施本发明而侵犯由任何政府机关依据该国专利法所授予之权利之许可。
相等物
前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员据以实施本发明。前述说明及实例详细叙述本发明之某些例示性实施方案。然而应了解的是，不论前述内容说明得多详细，本发明可以许多方式实施，且应根据该伴随之申请专利范围及其任何相等范围被解读。
本文之引证文献(包括专利、专利申请案、论文、教科书及该类似文献)以及这些文献中所引证之文献若未经本发明参照，则以参照方式整体并入本文。
示例性实施方案
本发明另详细描述于下列实验实施例。除非另外说明，这些实施例系仅用于说明之目的，并无限制本发明之意图。因此，本发明不应被视为被下列实施例所限制，反而应被视为包含任何及所有因本文所提供之揭示而变得明显之变型。
实施例
实施例1：自文库产生抗体
要产生拮抗PDGF-BB之治疗抗体，利用MorphoSys HuCAL噬菌体文库进行筛选。该噬菌体文库系基于概念(Knappik et al.,J Mol Biol,2000,296；57-86)并采用CysDisplayTM技术以于噬菌体表面展示Fab(2001 WO 01/05950)。不同框架之HuCAL 抗体-噬菌体系经组合以形成一库(VH1-6)或分成子库(例如VH1/5、VH2/4/6、VH3)，然后对这些子库个别进行如下述之抗原筛选。也被用于系内亲和性成熟之κ及λ噬菌体之噬菌体库被分开保存。在第一轮筛选中使用之噬菌体系以Hyperphage制备(M13KO7ΔpIII,Progen,Heidelberg,Germany)。
以PDGF-BB进行固相筛选
固相筛选系使用重组人PDGF-BB(PHG0043,Lot 032001；Biosource Int.Inc.)进行。在所有三次筛选中，经稀释于PBS之400nM(10μg/ml)hPDGF-BB被加入Maxisorp板(F96MaxisorpTM,442402,Nunc)上适当数量之孔槽中。
各个板接着于4℃温育过夜。隔天，孔槽以PBS清洗二次，然后以MPBST(5％(w/v)奶粉、PBS、0.05％Tween20(Sigma,St.Louis,MO,USA))于室温(RT)封闭2小时。使用来自原始HuCAL 子库(VH1-6、VH1/5及VH3，利用hyperphage制备)之噬菌体(100μl)。噬菌体于含有2.5％奶粉、2.5％牛血清白蛋白(BSA)及0.05％Tween20之PBS溶液中预先封闭。噬菌体之预先封闭系于RT中于旋转器上之2ml反应管进行2小时。
为了选择不与PDGF-AA结合之抗体，各子库之噬菌体系分别于含有10倍摩尔过量之PDGF-AA(PHG0035,Biosource Int.Inc.)、2.5％奶粉、2.5％BSA及0.05％Tween20之PBS溶液中预先封闭。
进行筛选时，将抗原溶液自该板移除，以PBS清洗孔槽三次。将该预先封闭之噬菌体加入对应孔槽，于RT中在微量孔板震荡器上温育该板2小时。然后，移除噬菌体溶液，以PBST(PBS,0.05％Tween20)清洗孔槽数次(清洗严谨度取决于筛选策略及筛选回合)，然后以PBS进行同样清洗步骤。该清洗严谨度随每次清洗递增。最后一次清洗步骤之后移除PBS，接着进行洗脱。要洗脱特异性结合之噬菌体，添加于10mM Tris/HCl,pH 8.0中之20mM二硫苏糖醇(DTT)，样品于RT温育10分钟。使用洗出液以感染对数期之大肠杆菌TG1培养物。经感染之E.coli藉由离心收集，并接种至添加34μg/ml氯霉素及1％葡萄糖之LB琼脂板上。该洋菜胶板于30℃温育过夜。隔天刮取菌落，使之生长直到到达0.5之OD600值，以进行辅助噬菌体感染。
辅助噬菌体感染：TG1细胞系于37℃经辅助噬菌体VCSM13感染(感染复数至少20)。该经感染之细胞藉由离心收集，重悬于含有34μg/ml氯霉素、50μg/ml卡那霉素及0.25mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)之2x YT培养基中以诱导Fab表达。这些细胞过夜生长，利用聚乙二醇(PEG)/NaCl自上清液沉淀所产生之噬菌体，以PBS重悬该噬菌体。藉由噬菌体斑滴定测定投入及产出力价。
针对PDGF-BB之溶液筛选
所有用于筛选之试管皆预先经ChemiBLOCKER(Chemicon,Temecula,CA,USA)封闭。HuCAL噬菌体系经ChemiBLOCKER(+0.05％Tween20)封闭，并于M-280链霉抗生物素蛋白(Dynal Biotech,Oslo,Norway)预先吸附二次。使预先封闭之噬菌体及经生物素化之PDGF-BB(生物素-PDGF-BB)抗原于2ml试管中在RT中、旋转器上温育2小时。在第一筛选回合，使用100nM生物素-hPDGF-BB进行珠偶合。第二及第三筛选回合则利用10nM生物素-hPDGF-BB进行。在这些筛选中，PDGF-AA系用来作为竞争，其量为用于预先封闭噬菌体之PDGF-AA的10倍摩尔过量。
添加预先吸附之链霉抗生物素蛋白至该噬菌体-抗原溶液，并于RT中、旋转器上再温育10分钟。使用磁粒分离器MPC-E(Dynal Biotech,Oslo,Norway)分离与该经捕捉之抗原结合之噬菌体。以PBST(PBS,0.05％Tween 20)清洗珠数次，然后以PBS清洗数次。该清洗严谨度随每次筛选回合递增。最后一次清洗步骤之后移除PBS，接着进行洗脱。洗脱及其它步骤系如固相筛选所述进行。
利用RapMATTM技术进行系内亲和性成熟
为了获得富集HuCAL  Fab结合PDGF-BB之亲和性改善之特异性抗体，使用上述第二轮溶液筛选产出之噬菌体以进行LCDR3多样化。制备源自第二轮筛选库之编码Fab片段之噬菌体展示载体的质粒DNA，使用Qiagen Midiprep试剂盒(Cat.No.12243)。LCDR3RapMATTM库之DNA系以BbsI及SphI切割，藉以释放LCDR3-CL插入物，并于1％洋菜糖凝胶上分离。HCDR2RapMATTM库之DNA藉由EcoRI及XbaI切割，因此释放HCDR2-CH插入物，其亦于1％洋菜糖凝胶上与载体骨架分离。
载体骨架之预期条带(～4650bp)系使用Easy Pure试剂盒(Biozyme；Cat.No.390001)自凝胶切割及纯化。载体骨架分别以1:4之摩尔比与 κ或λ轻链CDR卡匣或重链CDR卡匣连接。大肠杆菌Top10F电穿孔感受态(electrocompetent)细胞系经该连接样品转化。为了扩增该HCDR2及LCDR3库，接种转化细胞于含有34μg/ml氯霉素及1％葡萄糖之2xYT培养基，温育直到到达1.5至2.0之OD600nm值。使细胞形成团块，并重悬于甘油培养基。产生κ及λ库之噬菌体在使用前先经组合。噬菌体之预先封闭系于封闭溶液(PBS、10％奶粉、10％BSA、10％人运铁蛋白及0.2％Tween20)中进行。第三及第四轮之溶液筛选系如上述进行。为了富集高亲和性之抗体，使用降低之生物素-PDGF-BB抗原浓度，第三轮之珠耦合使用0.5nM之生物素-PDGF-BB，第四轮使用0.025nM之生物素-PDGF-BB。清洗严谨度系增加。
选定Fab片段之亚克隆及微表达
为了利于可溶性Fab之快速表达，选定HuCAL噬菌体之Fab编码插入物系经由XbaI及EcoRI亚克隆至表达载体将该表达质粒转化至大肠杆菌TG1F细胞中之后，刮取抗氯霉素之单一菌落至预先装填2xYT培养基(添加34μg/ml氯霉素及1％葡萄糖)之无菌384孔微量板，于37℃生长过夜。这些板被视为主板。将主板储存于-80℃之前，该大肠杆菌TG1F培养物被接种于新的无菌384孔微量板，该板之每一孔预先装填40μl 2xYT培养基(添加34μg/ml氯霉素及0.1％葡萄糖)。该微量板系于30℃、微量板震荡器上以400rpm震荡温育，直到培养物稍微混浊(约2至4小时)，具有约0.5之OD600nm值。这些板被视为表达板，添加含有34μg/ml氯霉素及5mM IPTG之10μl 2xYT培养基至每一孔(终浓度1mM IPTG)，该微量板以气体通透性胶带密封，于30℃震荡400rpm温育过夜。产生全细胞溶解物(BEL萃取物)：在表达板之各孔槽中添加15μl BEL缓冲液，于22℃、微量板震荡器(400rpm)上温育1小时。BEL缓冲液：24.7g/l硼酸、18.7g NaCl/l、1.49g EDTA/l，pH 8.0添加2.5mg/ml溶菌酶。
实施例2：筛选PDGF-BB阳性克隆
PDGF-BB阳性克隆系藉由同时进行ELISA以及受体抑制试验测定功能性PDGF-BB抑制活性，以鉴定筛选与抗原结合之克隆。
方法
在直接包覆之PDGF-BB上筛选
使用人PDGF-BB于4℃过夜包覆Maxisorp微滴定盘，浓度为5μg/ml(于PBS中稀释)。经过夜温育后，经包覆之盘以PBST(PBS/0.05％Tween20)清洗二次，并以5％MPBST(5％奶粉于PBST中)于RT、微盘震荡器上封闭1小时。该盘以PBST清洗二次，然后添加一抗(微量表达之 Fab粗制萃取物、经纯化之 Fab、对照抗体Fab_MOR07295)。含有一抗之盘系于RT、微盘震荡器上温育1小时。以PBST清洗该盘二次，为了检测 Fab，添加二抗(山羊抗人F(ab)2片段特异性-AP标记，Jackson Cat.No.109-055-097)，该二抗以0.5％MPBST(0.5％奶粉于PBST中)稀释1:5000。含有二抗之盘系于RT、微盘震荡器上温育1小时。孔槽以TBST(TBS/0.05％Tween20)清洗五次，添加Attophos(AttoPhos底物组，Roche,Cat.No.11681982001，以水稀释1:10)，记录以430nm激发时于535nm之荧光发射。
使用生物素化PDGF-BB之捕捉筛选
Maxisorp(Nunc,Rochester,NY,USA)384孔板系以20μl于PBS pH7.4中稀释1:1000之绵羊抗人IgG(Fd片段特异性)抗体于4℃包覆16小时。以PBST(PBS/0.05％Tween20)清洗孔板二次，然后以5％MPBST(5％奶粉于PBST中)于RT、微量板震荡器上封闭1小时。该盘以PBST(PBS/0.05％Tween20)清洗二次，然后添加一抗(微量表达之 Fab粗制萃取物、经纯化之 Fab、对照抗体Fab_MOR07295)并于RT、微量板震荡器上温育1小时。该盘以PBST(PBS/0.05％Tween20)清洗二次，添加生物素-PDGF-BB抗原(0.5μg/ml，经PBS稀释)于RT、微量板震荡器上温育1小时。孔盘以PBST(PBS/0.05％Tween20)清洗二次，然后与链霉抗生物素蛋白-AP(Zymed；Cat.No.43-8322；Lot:51102099；经0.5％MPBS稀释1:2000)于RT、微量盘震荡器上温育1小时。最后，孔槽以TBST(TBS/0.05％Tween20)清洗五次，添加Attophos(AttoPhos底物组，Roche,Cat.No.11681982001，以ddH2O稀释1:10)，记录以430nm激发时于535nm之荧光发射。
使用受体抑制试验之功能性筛选
384孔槽MSD板系经2.5μg/ml PDGF-Rβ-Fc融合蛋白(Cat.No.385-PR,R&D Systems)于4℃包覆过夜。接着，20μl之E.coli粗萃取物系与20μl之30ng/ml生物素-PDGF-BB(经BV缓冲液(PBS/0.02％Tween20/0.5％BSA)稀释)于RT、微量板震荡器上预先温育1小时。MSD孔板以50μl BV缓冲液清洗三次，然后转移该预先温育之粗萃取物：生物素-PDGF-B复合物。孔板于RT、微量板震荡器上温育1小时，然后以BV缓冲液清洗三次。孔板利用链霉抗生物素蛋白-BV(经BV缓冲液稀释1:400)于37℃温育1小时，然后再次以BV缓冲液清洗3次，添加30μl之含表面活性剂之MSD读取缓冲液(MSD，经dH2O稀释1:4)。检测利用MSD MA6000设备进行。
结果
总计共有9568个初级命中(primary hits)并行于ELISA中筛选与抗原之结合及筛选抑制PDGF-BB/PDGFRβ-Fc之结合。在结合试验中，6008个初级ELISA命中(来自所有筛选策略)显示高于背景值5倍之信号。其中，2949个初级命中在受体结合抑制试验中显示超过80％抑制活性之信号。这些命中根据其ELISA活性排序，选出540株进行可变区测序。序列分析结果得到168个独特序列。
实施例3：HuCAL  Fab及IgG之特征
选定之HuCAL  Fab及IgG利用许多下述试验以及实施例2所述之ELISA技术进一步测试。
方法
用于测定KD及交叉反应试验之溶液平衡滴定(SET)方法
在溶液中之亲和性测定系如文献所述进行(Friguet et al.,1985,J.Immunol.Methods 77:305-319)。为了提高SET方法之敏感性及正确性，从典型ELISA方法改为电化学发光(ECL)基底之BioVeris技术(Haenel et al.,2005,Anal.Biochem.339:182-184)。山羊抗人(Fab)2或山羊抗小鼠IgG之Fc片段特异性抗体(Jackson Immuno Research)系以BV-tagTM NHS酯(BioverisEurope,Witney,Oxfordshire,UK)标记，根据厂商说明进行。这些实验系于聚丙烯微滴定盘中进行，使用含0.5％BSA及0.02％Tween 20之PBS pH7.4作为检测缓冲液。未经标记之抗原以4n系列稀释。无抗原之孔槽用于测定Smax值。在添加100pM之Fab或IgG后(在75μL终体积中之终浓度)，该混合物系于室温中温育2小时。接着，在每一孔添加25μl之包覆0.25μg/ml生物素化抗原之免疫磁珠(Dynabead)(0.4mg/ml M-280链霉抗生物素蛋白，DYNAL,Hamburg)及经BV标签标记之检测抗体(抗人Fab最终稀释1:4000或抗小鼠IgG最终稀释1:2000)之混合物。在RT、Eppendorf震荡器(700rpm)上温育30分钟后，ECL信号利用M-384 工作站(Bioveris Europe)检测。数据利用Origin 5.0(Microcal)软件评估，采用客制化拟合模型(有关Fab：Haenel et al.,2005；有关IgG：Piehler et al.,1997)。
HuCAL-Fab抗体于大肠杆菌之表达及纯化
由pMORPHX9_FH编码之Fab于TG-1F细胞中之表达，系于含有1l之添加34μg/ml氯霉素之2xTY培养基之震荡角瓶培养液中进行。在经0.5mM IPTG诱导后，细胞于30℃生长20小时。制备细胞团块的全细胞溶解物(溶菌酶)，藉由HT-IMAC-纯化分离Fab片段。表观分子量系藉由含校正标准之大小排除层析(SEC)测定。浓度利用UV分光光度计测定。
PAE-PDGF-Rβ磷酸化试验
PDGF-BB配体导致之PDGF-Rβ受体磷酸化，系利用经PDGF-Rβ稳定转染之PAE细胞分析，该细胞于培养基(含L-麸酰氨酸之F12营养ham培养基(Gibco；Cat.No.21765)，添加10％FBS(PAN Biotech,Lot P250112)、2mM L麸酰氨酸(PAA,Cat.No.P04-80100)及500μg/ml遗传霉素(PAA；Cat.No.P11-012))中培养。在测试开始前一天，接种5x105细胞/孔于96孔盘(Nunclon#167008)。经6小时之后，将培养基换成饥饿培养基(含0.1％FBS之培养基)并温育过夜。隔天，不同浓度之抗体(30nm至1.5pM)系与经饥饿培养基稀释之0.4nM PDGF-BB(终浓度)预先温育。倒掉细胞上清液，添加抗体：PDGF-BB复合物至该细胞。在37℃(培养箱)温育正好10分钟之后，以冰冷PBS清洗细胞一次，然后利用MSD溶胞缓冲液溶解细胞。PDGF-Rβ之Tyr751的磷酸化系利用MSD Multispot PDGFRbeta全细胞溶胞试剂盒(Mesoscale Discovery)定量，根据厂商说明进行。
亲和性测定(Biacore)
动力学速率常数kon及koff系由该各别Fab之连续稀释液与共价固定之抗原PDGF-BB之结合测定，使用BIAcore 3000仪器设备(Biacore,Uppsala,Sweden)。利用标准EDC-NHS胺偶合化学进行共价抗原固定。动力学测量系于流速20μl/分钟之PBS(136mM NaCl,2.7mM KCl,10mMNa2HPO4,1.76mM KH2PO4,pH 7.4)中进行，使用介于约1.5至500nM之Fab浓度。各种浓度之注射时间为1分钟，之后为3分钟之解离相。以再生而言，使用5μl之10mM HCl。所有传感图系利用BIA评估软件3.1(Biacore)拟合。
结果
结合及特异性
所有168个独特克隆被用于SET亲和性分级测定，并与MOR0729511对照克隆比较。41个具有最佳亲和性之克隆(考虑到序列多变性及筛选来源选择)系经选择以供合并。在Fab表达及纯化之后，37个通过质量控制标准并进一步测试。
所有37种Fab对人PDGF-BB(hPDGF-BB)具特异性且与小鼠PDGF-BB(mPDGF-BB)交叉反应。其中没有一种Fab在ELISA中显示与PDGF-AA结合。
抑制活性
测试所有37种Fab于受体磷酸化试验中之抑制活性。经稳定转染之PAE PDGF-Rβ细胞组成性表达PDGF-β受体，其可藉由PDGF-BB之刺激导致位置Tyr751上之受体磷酸化。为了检测磷酸化，使用以特定抗P-Tyr751抗体检测P-Tyr751之Phospho-PDGFRbeta试剂盒(MesoscaleDiscovery)。
为了减少用于滴定之Fab数量，所有37种抗体最初仅以4种浓度测试其抑制磷酸化活性之能力。其中，3种Fab较不具活性，因此，34/37Fab被用于全滴定。
Fab之全滴定系自60nM至27pM或10nM至13pM以1:3步骤进行，并用于400pM(10ng/ml)PDGF-BB之预先温育，导致理论测试敏感性限值200pM。使用三次测试之平均值求出IC50。
表1：所选的34中Fab的PDGF-BB抑制的总结
使用磷酸化试验之数据以及生化受体结合抑制试验，将Fab数量自37种减少到16种。其中，4种Fab一致性抑制NIH3T3细胞之增生，包括MOR8457、MOR8494、MOR8487及MOR8488。进一步缩短前导序列，以移除包含潜在化学弱势之序列，诸如游离半胱氨酸及Asp-Pro切割位点。
因此，上述实施例1至3中所描述之方法被用来产生数种全人抗PDGF-BB IgG抗体，包括命名为MOR8457及其如本文所述之变体之抗体。
MOR8457重链可变结构域之氨基酸序列为：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSYISDDGSLKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHPYWYGGQLDLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：1)
MOR8457轻链可变结构域之氨基酸序列为：
SYELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSLGSYFVHWYQQKPGQAPVLVIYDDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCSAFTHNSDVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：2)
实施例4：全长IgG之表达
为了表达全长IgG，重链可变结构域片段(VH)及轻链可变结构域片段(VL)系自Fab表达载体亚克隆至适当载体以表达为人IgG。在一些情况中，编码抗PDGF-BB抗体之重链或轻链可变区之合成性DNA插入物系经由商用基因合成产生。片段被亚克隆至表达载体，其符合读框地与人或小鼠恒定区连接以供暂时表达。依其应用而定，该恒定区系由人野生型IgG2(SEQ ID NO:22)、野生型人IgG1(SEQ ID NO:19)、具有标靶突变以废除效应功能之称为“IgG1-3m”之人IgG1(SEQ ID NO:21)或小鼠IgG1(SEQ IDNO:20)组成。在一些情况中，MOR8457系以包含种系MOR8457VL(SEQID NO:4)之轻链构建，该轻链另包含轻链恒定结构域中之无意序列改变，其中氨基酸序列TLV因为PCR克隆错误被IKR取代。包含种系MOR8457VL及具有IKR突变之轻链λ恒定结构域之全长轻链被命名为“MOR8457-GL-IKR-LC”(SEQ ID NO:17)。任何包含“IKR”突变之轻链恒定结构域之抗体在本文之命名为在名称中包括“IKR”。因此，包含具有种系MOR8457VL序列(SEQ ID NO:4)且另具有在恒定结构域含有IKR序列改变之恒定结构域之轻链(SEQ ID NO:17)以及包含具有种系MOR8457VH(SEQ ID NO:6)且在恒定区另具有人IgG1三效应子无效突变之重链(SEQ ID NO:14)之抗体，在本文被称为“MOR-8457-GL-IKR-hIgG1-3m”抗体。包含至少一个种系V结构域之抗体在本文以“GL”命名，任何不包含种系结构域之抗体的名称不会包含GL。更优选地，当该抗体系以“GL”命名，VH及VL结构域皆为种系。
全长IgG之瞬时表达及纯化
全长IgG之瞬时表达系于HKB11或HEK-293F细胞中进行，这些细胞系经编码重链及轻链之表达载体分开转染。在转染后3至7天收集细胞培养上清液并离心澄清该上清液。
将上清液过滤后(0.22μm或0.45μm)，进行标准蛋白A或G亲和性层析(MabSelect SURE,GE)。蛋白于pH 3洗脱，以3M TRIS,pH 8中和。进一步下游处理涉及缓冲液交换至1x Dulbecco’s PBS(Invitrogen)且经无菌过滤(0.2μm；Millipore或Sartorius)。纯度在变性还原及变性非还原之条件下于SDS-PAGE或藉由毛细管电泳分析。HP-SEC系经进行以分析呈其自然状态之IgG制剂。
实施例5：设计及产生编码MOR8457的种系抗体变体之基因
利用分别衍生自7个重链可变区及7个轻链可变区之一致序列构建Morphosys HuCAL文库。因此，自该库获得之先导序列在多个位置包含与其人种系对应物不同之氨基酸，可能代表理论上之免疫原性风险。使这些非种系位置之序列突变回到种系残基(称为“种系化”)系经进行以消除此潜在风险。
噬菌体衍生性MOR-8457先导物之可变区序列系与得自ImmunoGenetics(IMGT)免疫球蛋白库之序列比较。最适当之人重链(图1A)及轻链(图1B)种系可变区系列系藉由比对鉴定。图1A及1B显示MOR8457VH(图1A)及VL(图1B)与各种不同种系序列之间的比对及序列相同性百分比。
重链V结构域之种系化
以MOR-8457重链(SEQ ID NO:2)之种系化而言，由IMGT IGHV3-23*01(DP-54；SEQ ID NO:25)编码之种系可变区具有98.6％序列相同性，被决定最为适当。如图1A所示，此可变区基因之框架区包含下列取代：V5L及R94K(卡巴编号)。因此，藉由以源自DP-54种系可变区之氨基酸取代各经取代之氨基酸，以选择新的种系重链V结构域序列(以下称为“MOR8457-GL-VH”，SEQ ID NO:6)。
轻链V结构域之种系化
以MOR-8457轻链(SEQ ID NO:1)之种系化而言，由IMGT IGLV3-1*01(DPL-23；SEQ ID NO:29)编码之种系可变区与MOR8457 VL具有92.7％序列相同性，被决定最为适当。如图1B所示，此可变区基因之框架区相较于MOR8457(SEQ ID NO:1)包含在5个位置之取代：A14S、R20S、S22T、A43S及E81M(卡巴编号)。因此，藉由以源自DPL-23种系可变区之氨基酸取代各经取代之氨基酸，以选择新的种系序列(以下称为“MOR8457-GL-VL”，SEQ ID NO:4)。
实施例6：MOR-8457及IgG序列变体之表征
MOR8457之结合亲和性、特异性及交叉物种反应性
MOR8457之三种IgG变体之结合亲和性利用Biacore 2000(GEHealthcare,Piscataway NJ)测定。称为“MOR8457-IKR-hIgG1-3m”之变体抗体包含全长重链(MOR8457-hIgG1-3m-HC；SEQ ID NO:18)及全长轻链(SEQ ID NO:17；MOR8457-IKR-LC)，该全长重链包含原始MOR8457 VH区序列(SEQ ID NO:2)及含有效应功能无效突变之人IgG1重链恒定结构域(MOR8457-hIgG1-3m；SEQ ID NO:21)，该全长轻链包含原始VL区序列(SEQ ID NO:1)及人λ轻链恒定结构域(Cλ；SEQ ID NO:23)，其中该轻链序列包含如本文他处先前所述之无意序列突变。
另一变体称为“MOR8457-mIgG1”，其包含含有原始MOR8457 VH区序列(SEQ ID NO:2)之全长重链，且另包含小鼠野生型IgG1重链恒定结构域(SEQ ID NO:20)以提供称为“MOR8457-mIgG1-HC”之全长重链。该MOR8457-mIgG1抗体另包含全长轻链(MOR8457-m-LC)，该全长轻链包含原始MOR8457VL区序列(SEQ ID NO:1)及小鼠野生型λ恒定结构域(SEQID NO:24)。
构建称为“MOR8457-GL-hIgG1-3m”之又一变体MOR8457抗体，其包含含有种系MOR8457 VH区序列(MOR8457-GL-VH；SEQ ID NO:6)及含有效应功能无效突变之人IgG1重链恒定结构域(hIgG1-3m；SEQ ID NO:21)之全长重链(MOR8457-GL-hIgG1-3m-HC；SEQ ID NO:14)，且该抗体另包含含有种系MOR8457 VL区序列(SEQ ID NO:4；MOR8457-GL-VL)及野生型人λ轻链恒定结构域(SEQ ID NO:23)之全长轻链(SEQ ID NO:16；MOR8457-GL-LC)。
MOR8457抗体对PDGF-BB具有特异性
为了测试特异性及交叉物种反应性，三种MOR8457 IgG变体MOR8457-IKR-hIgG1-3m、MOR8457-mIgG1及MOR8457-GL-hIgG1-3m对不同人PDGF配体(包括人PDGF-AA、-AB、-DD)以及大鼠PDGF-BB(皆得自R&D systems,Minneapolis,MN)及小鼠PDGF-BB(Invitrogen,Carlsbad,CA)之结合亲和性系经测试。简言之，抗人或抗小鼠IgG(GEHealthcare)抗体系以8000至10,000共振单位(RU)根据厂商说明使用胺偶合固定于CM5传感芯片之邻近流动池。抗体系经稀释于PBS-NET(10mMPhosphate pH 7.4,287mM NaCl,2.7mM KCl,3.2mM EDTA,0.01％Tween20)至1μg/mL，独立注射至个别抗人或抗小鼠表面10秒，导致介于50至100RU之稳定抗PDGF表面。PDGF蛋白系经PBS-NET稀释至1nM，并连续稀释二倍至0.25nM。各种浓度之PDGF接着以100μl/min之流速被注射至该抗体表面2分钟。允许复合物解离10分钟。该表面以10mM氯化镁注射30秒再生，使该表面得以进行另一次抗PDGF抗体捕捉及PDGF结合动力学。动力学数据使用scrubber2软件(Bio-Logic Software)双重参照(Myszka et al.,1999,J.Mol.Recognit.12279)，然后利用Biacore评估软件4.1版契合至1:1结合模型。显示之结果为三个独立结合试验之平均值。图2显示代表性传感图，表2摘列出结合亲和性。
表2：于Biacore测定的MOR8457变体与不同PDGF结合亲和性总结
所有三种抗体对人PDGF-BB皆显示低pM结合亲和性。种系可变结构域维持紧密结合，KD＝13pM±3。转换成小鼠IgG1骨架延缓MOR8457-mIgG1抗体与所有PDGF结合之解离速率，延缓程度超过Biacore测试之结合动力学极限(在表2显示为“NA*”)。此类型之结合亲和性预估为小于10pM(<10)且超过Biacore设备之极限。不同的MOR8457抗体工程化体对PDGF-B具有特异性，此由MOR8457变体仅结合PDGF-BB及PDGF-AB(表2)但不与PDGF-AA或PDGF-DD结合(数据未显示)显示。MOR8457与PDGF-AB及PDGF-BB结合，但不结合PDGF-AA的事实显示，二聚体中之各PDGF-B子单位具有一个暴露的MOR8457结合位点。对PDGF-AB及PDGF-BB之结合亲和性显示些许差异(69pM及28pM)，这可能是因为存在于异源二聚体PDGF-AB及同源二聚体PDGF-BB内之PDGF-B的微小构形差异所致。
PDGF-BB与同源二聚体PDGFR-αα及PDGFR-ββ受体复合物以及异源二聚体PDGFR-αβ受体复合物结合，而PDGF-AB与同源二聚体PDGFR-αα及异源二聚体PDGFR-αβ受体结合，以引发涉及多种疾病或疾患之下游信号传导。MOR8457与PDGF-AB及PDGF-BB的结合阻断PDGF-B与其受体之结合，可被用于阻断PDGF-AB及PDGF-BB与其个别受体复合物之相互作用，藉以抑制介导多种疾病状态或与其相关之下游信号传导。因此，MOR8457可提供用于任何PDGF-AB及PDGF-BB相关疾病之新颖治疗剂。另外，MOR8457以类似特征与小鼠及大鼠PDGF-BB结合，分别为10pM及25pM，使其成为可用于临床前动物模型试验之有用代理抗体，因此进一步增加彼于发展治疗PDGF-B介导的信号传导疾病或疾患之潜在治疗剂之用途。
MOR8457与PDGF-BB结合之结合化学计量及表位定位
数据显示本文他处揭示之MOR8457与PDGF-AB结合显示每一个PDGF-B子单位包含至少一个MOR8457结合位点。此导致在PDGF-BB同源二聚体上之二个结合位点是否与来自一个抗体或来自二个抗体之二个IgV结构域相互作用的问题，换句话说，目前不清楚抗体与PDGF-BB结合之化学计量系1:1或2:1。为了解决此问题，利用相同IgV结构域但不同Fc结构域存在于MOR8457-mIgG1(小鼠)及MOR8457-GL-IKR-hIgG1-3m(人)的事实，使用Biacore进行依序竞争性结合测定以评估MOR8457与PDGF-BB结合之化学计量。
在第一依序竞争性结合测定中，MOR8457-mIgG1系经由固定于CM5传感芯片上之抗小鼠IgG(GE Healthcare)捕捉，导致200至400RU之稳定表面。接着，人PDGF-BB以1nM注射6分钟然后注射MOR8457-IKR-hIgG1-3m，如图3之图片及传感图中注射2之后的实线所示。在图3中，循环1在注射3之后的传感图数据显示，MOR8457-IKR-hIgG1-3m与预先组合之MOR8457-mIgG/PDGF-BB复合物(在注射2之后形成)结合，显示MOR8457-mIgG仅与PDGF-BB上的一个位点结合，使PDGF-BB上的另一结合位点可与第二抗体结合，在此例中该第二位点被用于MOR8457-IKR-hIgG1-3m之结合。因此，这些数据显示MOR8457与PDGF-BB之结合化学计量系2:1。此与PDGFRββ同源二聚体胞外域与PDGF-BB结合之1:1化学计量不同(Shim et al.,2010,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107:11307-11312)。无意受限于任何特定理论，但MOR8457:PDGF-BB之2:1化学计量结合模式可能使其可藉由选择性交联抗体与PDGF-BB形成大分子量MOR8457:PDGF-BB复合物，如此可能加速药物廓清及/或刺激抗药物抗体反应。因此，技艺人士将了解可能想要改变MOR8457抗体之形式以提供单臂抗体，以避免或减少多个PDGF-BB与抗体之间任何可能的交联。
抗体抑制PDGF-BB与PDGFRβ结合
如本文前述，PDGF-BB信号传导系于彼与细胞表面PDGF受体β二聚体结合之后活化。为了测试MOR8457抗体与PDGF-BB结合是否阻断其与该受体之结合藉以抑制下游信号传导，进行MOR8457与包含PDGFRβ之胞外域及人野生型IgG1恒定结构域之PDGFRβ-hIgG1融合蛋白之间的竞争性结合分析，以在Biacore上经由依序结合至芯片或中和溶液中之PDGF-BB提供可溶性PDGFRβ。
在固体支持物上之依序结合分析(Biacore芯片)
在芯片上之依序结合分析中，PDGFRβ-hIgG1经由抗人IgG抗体被捕捉至CM5传感芯片上(如图4A之图片所示)。接着注射人PDGF-BB(浓度1nM)6分钟以饱和PDGFRβ-hIgG1上之结合位点，然后注射MOR8457-mIgG1。PDGFRβ-hIgG1与PDGF-BB之结合阻止MOR8457-mIgG1与PDGF-BB之结合(见图4之循环1传感图)。相反地，当MOR8457-mIgG1抗体先被捕捉于芯片上时，MOR8457-mIgG1与PDGF-BB之结合阻止PDGFRβ-hIgG1融合蛋白与PDGF-BB结合，如图3之循环2传感图所示。这些结果显示MOR8457与PDGFRβ交叉竞争与PDGF-BB之结合，且进一步显示MOR8457之单位点结合足以阻断PDGF-BB与PDGFRβ之相互作用。这些数据与以下显示MOR8457与PDGF-BB之间的结合相互作用之详细计算机模型构建所提供的结果一致。简言之，如下所详述，由PDGF-BB与MOR8457Fab之共结晶结构显示的详细表位定位证实PDGF-BB与MOR8457之间的接口与该受体结合位点重迭。因此，MOR8457与PDGFRβ受体直接竞争与PDGF-BB之结合，进一步支持MOR8457作为潜在新颖治疗剂以治疗由PDGF-BB与其受体(PDGFRαβ及PDGFRββ)结合所介导之疾病或病状之用途。
在溶液中之依序结合分析
由于2:1结合化学计量之复杂性，也为了避免由依序结合至芯片可能产生的任何误差，该竞争结合另外藉由在溶液中以MOR8457中和PDGF-BB证实，如图5A所示。MOR8457-mIgG1系经PBS连续稀释，然后与1mM之人PDGF-BB混合，在2至8℃温育20小时以达到平衡。如图5A之[括号]中所示之各种MOR8457-mIgG1与PDGF-BB稀释混合物接着被注射至由CM5芯片上之抗人IgG1所捕捉之PDGFRβ-hIgG1表面。图5B绘示MOR8457抑制之浓度反应曲线。随着浓度增加，MOR8457-mIgG1完全阻断PDGF-BB与芯片上之PDGFRβ-hIgG1结合。所有这些数据显示MOR8457与PDGFRβ在PDGF-BB上具有相同的结合位点。这些数据另外显示，MOR8457之PDGF-BB结合位点直接与该受体之PDGF-BB结合位点竞争，且一MOR8457结合至PDGF-BB即足以阻断该配体与其受体之结合。这些资料另外证实MOR8457作为新颖治疗剂以治疗由PDGF-B与其受体结合所介导或与之相关之疾病或病状的潜在用途。
实施例7：与中和性抗体片段Fab-MOR8457复合之PDGF-BB的结晶结构MOR8457与PDGF-BB之结合模型的结构分析
与MOR8457-Fab复合之PDGF-BB系于18℃在含有22％PEG 3350及0.1M Tris,pH 7.0之溶液中形成结晶。该结晶与单斜空间群P21，晶格常数β＝97.6°具有一致之对称性，且在不对称单胞中有一蛋白复合物。于Argonne National Laboratory(APS)以IMCA射束线17-ID自单一冷冻结晶收集数据数据，分辨率为数据利用autoPROC及SCALA处理计算。最终数据数据之完整度为99.7％，平均冗余度3.4，Rsym为5.8％。
该结构系藉由PHASER分子置换解析，始于Brookhaven PDB输入2adg及8fab所制备之fab片段模型及输入3mjg所制备之PDGF-BB模型。初步解析藉由分开搜寻Fab分子四个结构域之每一个结构域获得。此部分解析系用于搜寻第二份Fab片段，接着最后搜寻PDGF-BB分子。最终完整分子置换解法包含与一PDGF-BB二聚体结合之二个MOR8457-Fab片段。使用COOT反复进行数次模型手动调整及模型重建，然后利用autoBUSTER进行结晶优化，产生该复合物之最终优化模型，其结晶Rwork为21.1％，Rfree为24.47％。最终MOR8457-Fab+PDGF-BB模型包含第一个Fab分子之二链H及L(重链H之残基1H-133H、142H-191H、200H-220H，轻链L之残基3L-205L)、第二个Fab分子之二链B及A(重链B之1B-134B、141B-220B，轻链A之2A-207A)及PDGF-BB之二链C及D(链C之10C-101C，链D之7D-102D)。某些区域中之漏失氨基酸因为缺乏电子密度并未构建于模型中，很有可能是因为紊乱。存在该模型中之非蛋白原子包括327个水分子。
该结晶结构显示二个MOR8457-Fab分子与单一PDGF-BB细胞因子之二相反端的二个对称位点结合，如图6之缎带图所示。该二个MOR8457-Fab分子的C端大约相隔为观察到的化学计量带来若干几何限制，进一步证实MOR8457与PDGF-BB之2:1结合化学计量，即一PDGF-BB分子与二个相隔遥远之MOR8457抗体交联。
具有类似相互作用之二个结合表位
如前所述，该结晶结构显示二个MOR8457-Fab分子与单一PDGF-BB细胞因子之二相反端的二个对称位点结合(图6之缎带图)。该二个MOR8457-Fab分子之C端大约相隔对观察到的化学计量带来若干几何限制。
所观察到的结晶结构及其与PDGF-BB/PDGFβ受体复合物之比较(Shim et al.,2010,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107:11307-11312)，另外显示MOR8457之中和效应，系因该抗体与该PDGFβ受体直接竞争PDGF-BB上之相同的结合决定簇所致。如Shim et al.所述，以PDGFβ受体为例，MOR8457与PDGF-BB之相反端的各端结合在该细胞因子表面上产生二个相互作用之表面及二个结合表位1及2号。由于这二个结合表面涉及类似的相互作用，图7仅显示一个表位(1号结合表位)的细节，包括抗体链H及L(由图7之分子表面表示)及由图7之缎带图表示之细胞因子单体C及D。
在二个接口中之各者，结合所需之PDGF-BB残基系由二个PDGF-B单体提供，其中87％之相互作用来自一单体(环1及环3)，其余13％(环2)来自另一单体。在各界面共有来自PDGF-BB之17个残基及来自MOR8457-Fab之22个残基涉及相互作用，因为彼等相隔不到4埃因此被视为“接触残基”。所有CDR区(除了CDR-H1)皆与PDGF-BB之相互作用有关，最大作用来自于CDR-H3。各结合接口系由氢键与芳香环相互作用之相互作用所致，其中带负电之CDR与PDGF-BB上带正电之Arg/Lys残基之间有高度互补性。所有在内之直接相互作用(涵盖结合表位#1及#2)皆显示于下表3。因此，所有在内之直接相互作用(涵盖抗体的抗体决定簇及结合表位#1及#2)皆列于下表3。
总结表3之结果，下列为抗体上之接触残基(抗体决定簇)：
MOR8457重链HC：CDR-H2之Trp 47、Tyr 50、Leu 57、Tyr 59、Tyr 60及Asp 62；CDR-H3之Trp 102、Tyr 103、Gly 104及Gly 105，轻链L：CDR-L1之Gly 28、Ser 29、Tyr 30及Phe 31；CDR-L2之Asp 49、Asp 50及Asn 65；CDR-L3之Phe 90、Thr 91、His 92、Asn 93及Ser 94。
PDGF-B上1号表位之接触残基(表位)系如下述：
链C：环1之Leu 38、Val 39及Trp 40，环3之Glu 71、Arg 73、Ile75、Ile 77、Arg 79、Lys 80、Lys 81、Pro 82、Ile 83、Phe 84、Lys 85及Lys 86；及链D：环2之Asn 54及Arg 56，所有残基皆参照SEQ IDNO:33之序列(NCBI Ref.Seq.NP_002599.1)。
MOR8457上之氨基酸残基及彼等在PDGF-BB上之个别接触(相隔不到)残基系提供于以下表4(表位1)及表5(表位2)。
表4
表位1之內之直接残基接触
表5
表位2之內之直接残基接触
本文揭示之数据显示PDGF-BB二聚体上由MOR8457所结合的二个表位极度类似但不完全相同。
无意受到任何特定理论限制，但根据Biacore观察到MOR8457与PDGF-BB之结合(KD＝28pM)相较于与PDGF-AB之结合(KD＝69pM)相对少量(大约三倍)之减少，可能是因为MOR8457与PDGF-AB之结合模式实质上即为MOR8457与PDGF-BB结合之结晶结构中所观察到者，表示PDGF-AB结合成异源二聚体几乎与PDGF-BB同源二聚体之二个B亚基之结合相同。若亚基结合成AB及BB二聚体系实质上相同，则在内之直接接触的唯一差异仅在单体D(表位1)，其中PDGF-B之Arg 56取代成PDGF-A之Ser 50。此单一取代可能造成在Biacore观察到之结合力的些微减少(MOR8457与PDGF-BB之结合(KD＝28pM)相较于与PDGF-AB之结合(KD＝69pM))。
实施例8：抑制人系膜细胞增生
本领域累积之证据支持PDGF-B及/或-D介导的PDGFR-β-活化于系膜增生性疾病诸如IgA肾炎发展期间造成系膜细胞增生及肾小球基质扩张之关键角色。另外，藉由特定干预PDGFR-β信号传导造成系膜细胞增生及基质累积之减少，已在多项试验中之鼠模型显示(Ostendorf et al.,2012,Pediatric Nephrol.27:1041-1050)。由于MOR8457与PDGF-BB之结合阻断该配体与PDGFRβ之结合，如前述详细说明(见例如图3循环2传感图及图5B)，因此评估MOR8457-IKR-IgG1-3mM功能性抑制PDGF-BB诱导之原发性人系膜细胞中之系膜增生之能力。
原发性人系膜细胞(ScienCell Research,Carlsbad,CA)系经培养，并以15,000细胞/孔接种于黑色实底96孔盘(Cat#353376,BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)。细胞经过清洗，以不含血清之MCM培养基(ScienCellResearch,Carlsbad,CA)停止生长24小时。24小时之后，细胞以连续稀释之PDGF-BB(R&D Systems,Minneapolis,MN)于37℃刺激4小时。在最后16小时测定DNA之合成，使用5-溴基-2'-脱氧尿苷(BrdU)掺入试验根据厂商说明(Roche,Mannheim,Germany)进行。第二天，将细胞固定，根据厂商说明测定BrdU掺入。
图8A之浓度反应曲线显示无MOR8457存在时，藉由增加PDGF-BB之浓度所诱导之系膜细胞增生的剂量依赖性增加。PDGF-BB强烈刺激人系膜细胞增生，EC50＝2.3ng/mL(100pM)。接着，测定MOR8457-IKR-hIgG1-3m抑制之细胞增生。MOR8457-IKR-hIgG1-3m系经半对数稀释自100nM至0.1nM，然后与2.5ng/ml之PDGF-BB于不含血清之MCM培养基(含0.1％BSA)混合30分钟，然后添加至细胞。图8B之代表性剂量依赖性曲线显示增加浓度之MOR8457-IKR-hIgG1-3m抑制系膜细胞增生。自三个独立实验决定之平均IC50为13.4±2.8pM，最大抑制为87.9±5.7％，显示MOR8457系PDGF-B/PDGF-β介导的人系膜细胞增生之有效的功能性抑制剂。
本文前述数据显示MOR8457-IKR-hIgG1-3m与PDGFR-β融合蛋白之间竞争性抑制与PDGF-BB之结合，使用Biacore测定(见例如图4周期1之传感图)。为了决定使用Biacore所观察到之对结合相互作用的竞争性抑制，是否也能在人系膜细胞增生功能性试验达到竞争性抑制，进行Schild分析(Arunklakshana&Schild,1959,Br.J.Pharmacol.65:48-58)。更具体地，定量之抗体系与经连续稀释之PDGF-BB混合，然后加入细胞中。在无抗体及有抗体存在时测量之PDGF-BB的EC50被用于计算剂量比(DR)。一系列log(DR-1)之值对一系列log[B]抗体浓度作图，自该图推导出pA2，代表造成PDGF-BB浓度反应曲线二倍偏移之抗体浓度。该pA2之值与系统无关，反映该抗体于功能性细胞测定之固有亲和性。
如图9A所示，PDGF-BB之浓度反应曲线随着MOR8457-IKR-hIgG1-3m之浓度增加向右偏移，且抑制程度可被达到(图9A)。该推导出之pA2系约20pM，其与Biacore测量之范围相同(13pM，表2)。由于MOR8457-IKR-hIgG1-3m对PDGF-BB之2:1结合模型，向右偏移之浓度反应曲线不会呈现如单纯1:1竞争性抑制剂中所预期可见之平行偏移。此亦反应于图9B所示之Schild图的斜率<1。然而，曲线向右偏移、可达到之抑制及低pM pA2值证实MOR8457-IKR-hIgG1-3m系有效且具竞争性之人系膜细胞增生之PDGF-BB抑制剂。
已知系膜细胞增生在系膜增生性疾病诸如IgA肾病扮演重要角色。许多证据显示增加PDGF-BB表达与IgA肾病有关且阻断PDGF-BB表达或信号传导减少疾病严重性。因此，本领域技术人员在孰悉本文提供之揭示内容后将了解，MOR8457系有效的PDGF-BB竞争性抑制剂，其功能性抑制系膜细胞增生，因此将是治疗与PDGF-BB之量增加及/或PDGF-B介导的信号传导有关之系膜增生性疾病之新的潜在治疗剂。
实施例9：于急性Thy1.1大鼠模型中评估MOR8457-mIgG1
活体内评估MOR8457-mIgG1相较于对照IgG对系膜细胞增生之影响，系于根据发表文献之方法建立之抗Thy1.1大鼠肾炎模型中评估(Booret al.,2007,Nephrol.Dial.Transplant.22:1323-1331)。简言之，肾炎系藉由静脉推注单株抗Thy 1.1抗体OX-7(1mg/kg)至100至200g之Wistar雄鼠诱发。MOR8457-mIgG1(3、10及30mg/kg)及同型对照IgG(30mg/kg)在疾病诱发后第1.5天经皮下施用至不同动物组别(n＝6)。到第8天，所有大鼠给予腹腔注射50mg/kg之溴脱氧尿苷(BrdU)，以标记处于细胞周期中DNA(S)期之细胞。动物于第9天牺牲，取得血清及肾脏组织样品，以证实mAb暴露及藉由组织学/免疫组织化学技术检测MOR8457-mIgG1对细胞增生(由细胞分裂图片定量测定)及系膜细胞与足细胞活化(由α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)之免疫组织化学评估)之影响。MOR8457-mIgG1诱导剂量依赖性系膜细胞增生之减少，由图10A中BrdU之累积决定。另外，MOR8457-mIgG1诱导剂量依赖性系膜细胞增生之减少可由α-平滑肌肌动蛋白阳性染色减少显示(图10B)。这些数据进一步显示MOR8457系用于治疗由PDGF-BB-PDGFRβ相互作用及/或下游信号传导所介导或与之相关之疾病的潜在新颖治疗剂。
实施例10：经由工程化减少MOR8457抗体之黏性
单克隆抗体在高浓度下之黏性系由多种因素决定，包括电荷、形状、体积及特定自我相互作用(Yadav et al.,2010,J.Pharm.Sci.,99(12):4812–4829)。实验结果显示总电荷影响高浓度下之若干黏性，但近距离特定相互作用似乎也同样重要(Yadav 2010，同上)。总电荷以及电荷之精确分布决定高浓度下之自我结合。粗粒度之分子动力学仿真显示溶液黏性降低与Fab-Fab引力减少有关。此与分子之静电荷整体增加有关(Chaudhri et al.,2013,J.Phys.Chem.B,117(5):1269–1279)。降低电荷分布之不对称性的电荷交换实验与黏度降低有关(Ketchem et al.,2012,“Modification of ProteinViscosity by Modification of Protein Surface Charge”PEGS Symposium,Boston MA,and Yadav et al.,2012,Mol.Pharmaceutics 9(4):791–802)。此显示由负电区介导之自我结合导致高黏性抗体。因此，增加总带电量以增加斥力或减少负电区之大小或作用系一种减少高浓度抗体黏性之方法。但若不知抗体-抗原复合物之关键相互作用而进行此设计，可能因此降低抗体之活性(Ketchem 2012，同上)。
在此，检测数种参数以决定哪一种(若有的话)参数与黏性改变高度相关。此由测试7种不同的抗体进行。高浓度之5种抗体的黏度：AAB-001(bapineuzumab，CAS编号648895-38-9)、RK35(美国专利第7,888,486号)、IMA-638(anrukinzumab，CAS编号910649-32-0)、MOR8457及MOR8457-GL如下述测量。MAb1及MAb2系如Yadav 2012(同上)所述，文献包括彼等于高浓度之黏性的测量值。黏性与Fab之总电荷(图11)、Fab之偶极矩(图12)及CDR之净电荷(图13)比较。以bapineuzumab及IMA-638而言，需要Fab之结构模型。RK35、MAb1及MAb2之结晶结构系可用。AAB-001、IMA-638、MOR8457及MOR8457-GL之同源性模型利用Discovery Studio 3.5之Modeler软件包产生。这些模型各者之电荷分配系利用Discovery Studio 3.5之“Calculate Protein Ionization and ResiduepK”软件包产生。使用计算出之电荷，计算Fab于pH6.0之总电荷及偶极矩。CDR之净电荷系由序列计算，正电残基+1，负电残基-1及His为+1/2电荷。检视测量值之比较，很清楚总电荷(R2＝0.95)及CDR之净电荷(R2＝0.55)与抗体之高浓度黏性相关。偶极矩(R2＝0.29)亦与黏性相关但不那么强烈。除了点电荷性质以外，利用Discovery Studio 3.5之Delphi软件包及Delphi内建电荷计算静电位能面图。各抗体之静电位能面系显示于图14，低黏性抗体显示于图A至D(分别为AAB-001、RK35、MAb2及IMA-638)，高黏性抗体显示于图E至G(分别为Mab1、MOR8457-GL及MOR8457)。这些数据显示较高黏性抗体相较于较低黏性抗体在其CDR区具有较大负电区(图中较大之白色区)。
设计策略
电荷及电荷分布对高浓度抗体之黏性的影响(如图11至14所示)与上述发现有高度相关(Yadav 2010，同上，Yadav 2012，同上，Ketchem2012，同上，及Chaudhri 2013，同上)。另外，对于高浓度具有高黏性之MOR8457-GL而言，研究显示该抗体具有低总电荷(图11)、在CDR区带净负电(图13)及大型负电区(图14F)。由于这些发现，设计一种方法以鉴定可增加总电荷、减少CDR中之负电残基及/或封闭或减少负电区之残基。由于其它优化方法难以维持抗体之活性(Ketchem 2012，同上)，因此包括其它限制以确保不会丧失结合亲和性且该框架区维持与人种系之高度同源性。根据MOR8457-GL之氨基酸序列，自人抗体产生架构-H1、-H2、-H3、-H4、-L1、-L2、-L3及-L4及CDR-H1、-H2、-H3、-L1、-L2及-L3中之各位点的氨基酸机率分布。在各区段中，所有具有相同长度区段之来自公众数据库如IMGT及PDB之人抗体系经比对并决定各位置之频率。在框架残基组当中，所有具有高机率Lys或Arg残基(>10％)之位点或具有高机率之另一中性残基(>10％)之野生型Glu或Asp位点系经鉴定。每一个这些位点经突变后之稳定性改变及经突变后之结合亲和性改变系利用Discovery Studio 3.5及MOR8457:PDGF-B结晶结构计算。在CDR区中，(a)所有Glu或Asp突变成Gln、Asn及最常见的残基种类及(b)所有其它突变成Arg、Lys或His之位点皆评估经突变后之稳定性改变及经突变后之结合亲和性改变。自这些计算得到一组突变，预期可增加静电荷但不影响稳定性或结合亲和性(预期ΔΔG<0.5kcal/mol)。这些突变列示于表6。
表6：预期可增加净电荷而不影响稳定性或结合亲和性的突变列表
这些突变中之亚群系经实验测试。优先包括总区段或周围残基可见于人种系中之突变以及靠近CDR中之负电区之突变(如图14F所示)。另外，选择一个区段可见于人种系中之双重突变(DP-21，IGHV7-4-1，IMGT编号Z12323)。最后，亦选择重链及轻链突变之组合。这么做是因为图11显示可能需要+2或+3之电荷改变才能减少黏性至想要的程度。这些经实验测试之MOR8457变体及掺入其中之个别突变系如表7所示。应了解由于这些抗体或其抗原结合位点系二聚体，因此每一抗体分子之单一突变包含二个突变，即H链或L链上各一。同样地，当双重突变存在时，该抗体包含4个突变因为有二重链及二轻链。当有3个突变时(一突变在H或L链上，二突变在另一H或L链上)，该抗体包含6个突变，以此类推。
表7：实验测试的突变
MOR8457变体 相对于MOR8457-GL的突变 氨基酸突变数
MOR8457-2 单一重链(E6Q) 1
MOR8457-3 单一重链(Q13K) 1
MOR8457-4 单一重链(A23R) 1
MOR8457-5 单一重链(D52aN) 1
MOR8457-6 单一重链(Q105R) 1
MOR8457-7 双重链(E6Q,Q13K) 2
MOR8457-8 单一轻链(E3V) 1
MOR8457-9 单一轻链(T18R) 1
MOR8457-10 单一轻链(N53K) 1
MOR8457-11 单一轻链(D96N) 1
MOR8457-12 双重链(E6Q,Q13K)+单一轻链(E3V) 3
MOR8457-13 单一重链(E6Q)+单一轻链(T18R) 2
MOR8457-14 双重链(E6Q,Q13K)+单一轻链(T18R) 3
MOR8457-15 双重链(E6Q,Q13K)+单一轻链(D96N) 3
MOR8457-16 双重链(E6Q,Q13K)+单一轻链(N53K) 3
MOR8457-17 单一重链(Q13K)+单一轻链(T18R) 2
MOR8457-18 单一重链(Q105R)+单一轻链(T18R) 2
黏性测量
全长IgG之瞬时表达系于HEK-293F细胞中进行，这些细胞系经编码重链及轻链之表达载体分开转染(表7之MOR8457-2至MOR8457-18)。在转染后3至7天收集细胞培养上清液并离心澄清该上清液。
将上清液过滤后(0.22μm或0.45μm)，进行标准蛋白A或G亲和性层析(MabSelect SURE,GE)。蛋白于pH 3洗脱，以3M TRIS,pH 8中和。进一步下游处理涉及缓冲液交换至1x Dulbecco’s PBS(Invitrogen)且经无菌过滤(0.2μm；Millipore或Sartorius)。纯度在变性还原及变性非还原之条件下于SDS-PAGE或藉由毛细管电泳分析。HP-SEC系经进行以分析呈其自然状态之IgG制剂。
MOR8457之工程化变体之黏性系如下测量。在PBS中之蛋白以20mM组氨酸、85mg/ml蔗糖、0.05mg/ml EDTA pH 6.0使用膜卡匣装置10K MWCO(Thermo Scientific)进行完整透析。自透析液收集蛋白并使用0.2微米针筒过滤器过滤。蛋白利用Vivaspin离心浓缩仪10K MWCO(GEHealthcare)浓缩。当蛋白体积减少且蛋白浓度增加时，自浓缩滞留物移出样品等分(12μl)。添加300nm微珠(Nanosphere,Thermo Scientific)至蛋白样品及缓冲液空白样品。该珠系经20mM组氨酸、85mg/ml蔗糖、0.05mg/ml EDTA pH 6.0稀释1:10，添加0.75μl经稀释之珠至该蛋白样品。该蛋白/珠及缓冲液/珠样品藉由缓和震荡混合。将8μl样品转移至1536孔盘(SensoPlate,glass bottom,Greiner Bio-One)以分析动态光散射(DLS)。孔盘以光学透明胶布封闭，于2000RPM离心2分钟以移除气泡。
DLS测量系利用DynaPro孔盘读取仪(Wyatt Technology,Santa Barbara,CA)进行。样品于25℃温育，连续15次25秒读取测量。有可接受之衰退曲线之微珠半径数据系经平均。黏性根据Stokes-Einstein方程式计算。样品黏性系以该测得之表观半径除以标称珠半径乘以0.893cP(水于25℃之黏性)计算。
该数据显示变体MOR8547-16相较于亲代MOR-8457抗体或种系MOR8457-GL工程化体具有实质上减少之黏性(图15)。MOR8457-15相较于MOR8457-GL不显示降低之黏性，但相对于亲代MOR8457抗体显示显著降低之黏性。
最佳克隆之分析
二个克隆MOR8457-15及MOR8457-16相较于亲代单克隆抗体MOR8457-GL显示增加稳定性及表达(见实施例11、12)。除了稳定性及表达改善之外，MOR8457-16显示比MOR8457亲代抗体及MOR8457-GL降低之黏性。二个克隆有相同的重链E6Q及Q13K突变，然而MOR8457-15还有一轻链D96N突变，且MOR8457-16有一轻链N53K突变，也就是其具有相同重链且在轻链具有单一氨基酸残基之差异。这二个突变物与PDGF-B复合之同源性模型系如图16所示。这些同源性模型系利用Discovery Studio 3.5之Modeler软件包及MOR8457:PDGF-B结晶结构产生。重链H6及H13位点与结合位点相距甚远，然而轻链位点L96及L53虽然靠近该结合位点但不与PDGF-B直接相互作用。此外，图17显示L53位点靠近轻链CDR区中之负电区。此负电区在结晶结构和同源性模型中与PDGF-B直接接触。无意受限于任何特定理论，但该突变轻链N53K残基似乎能阻断与此负电区相关或由其介导之若干自我结合，但也和PDGF-B结合位点保持够远之距离而不影响结合亲和性。
降低黏性系蛋白治疗剂成功商业化之重要因素，此与制备蛋白之能力有关，因为降低黏性可能提供降低聚集且可能影响浓缩该蛋白以经由非经肠或皮下途径递送蛋白之能力。此外，降低黏性可能有利于输送抗体至病患，包括经由包含较小孔径(内径)及/或规格(外径)之递送装置及/或以较快输送速率施用之能力。同时，由于聚集可能导致形成抗药物抗体(ADA)，且由于增加黏性可能与聚集减少有关，因此降低黏性可能是成功商业化蛋白治疗剂之重要因素。因此，MOR8457变体之黏性降低系重要想要的特征，可能为该抗体提供作为潜在新颖治疗剂之显著优点。
实施例11：改善安定性之MOR8457工程化变体
为了评估MOR8457变异抗体之热稳定性，蛋白样品系于PBS(8.1mM Na2HPO4,1.47mM KH2PO4,137mM NaCl,2.7mM KCl pH 7.2)稀释至0.3mg/ml，体积400μl。PBS系用于参照池作为缓冲液空白对照。样品利用自动取样器(GE Healthcare Bio-Sciences,Piscataway,NJ)分配至MicroCalVP-Capillary DSC之试样盘。样品系于10℃平衡5分钟，接着以每小时100℃之速率扫瞄至110℃。选择16秒之过滤期。原始数据系经基准校正，该蛋白浓度系经归一化。Origin软件7.0(OriginLab Corporation,Northampton,MA)被用于适配该数据至具有适当数量之同类碱基置换之MN2-State模型。
二种抗体变体MOR8457-15及MOR8457-16相较于亲代单克隆抗体MOR8457-GL显示增加之热安定性(图18)及表达(图19)。潜在治疗剂之热安定性及表达量系成功商业化该新颖治疗剂之重要因素，因为这会影响商品成本等。
实施例12：工程化之MOR8457变体的改善的制备性谱
MOR8457-GL及工程化变体之产量及纯度分析
使用分析性大小排除层析(SEC)及UV吸收光谱分析评估在HEK293细胞中暂时表达之MOR8457抗体群经蛋白A捕捉后之纯度及产量(图19A)。蛋白A亲和性层析首先藉由过滤HEK293条件培养基通过0.2mmPES滤膜，然后将之装入经137mM NaCl,2.7mM KCl,8.1mM Na2HPO4,2.7mM KH2PO4,pH 7.2(PBS)平衡之Mab Select Sure(GE Healthcare)蛋白A管柱完成。接着用PBS清洗该管柱，利用20mM柠檬酸、150mM氯化钠pH 2.5洗脱结合蛋白。收集尖峰组分，以2M Tris,pH8.0中和。总捕捉蛋白之定量系以测量各抗体于280nm之UV吸光度及摩尔消光系数进行。消光系数系利用Edelhoch法(Edelhoch H.,1967,Biochemistry 6:1948-1954)计算，Trp及Tyr之消光系数以他法求得(Pace et al.,1995,Protein Sci.4:2411-2423)。SEC系于装设Superdex200(GE Healthcare)之Agilent 1200HPLC(Agilent Technologies)上进行。为此，大约20至30ug之蛋白以0.5mL/min之流速注射至经PBS平衡之管柱并等度冲提60分钟。蛋白藉由280nm之吸光度检测。此分析结果显示组合变体之纯度及蛋白A产量增加(图19A；灰色柱与白色柱)。特别是，MOR8457-16显示除了蛋白A产量增加之外，蛋白A洗出液中>99％受关注尖峰(POI)(图19B)。改善制备性包括诸如黏性降低及产量增加之特征，系治疗剂商业化发展之重要因素，因为其影响治疗剂之制备及商品化之成本。
实施例13：MOR8457-16变体之结合亲和性、特异性及效力
MOR8457-16与不同PDGF异构体之结合亲和性系如前述(实施例6)利用Biacore 3000(GE Healthcare,Piscataway NJ)测定。简言之，抗人IgG(GE Healthcare)抗体系以8,000至10,000共振单位(RU)根据厂商说明使用胺偶合固定于CM5传感芯片之流动池。测试抗体系经稀释于PBS-NET(10mM Phosphate pH 7.4,287mM NaCl,2.7mM KCl,3.2mM EDTA,0.01％Tween-20)至0.5ug/mL，注射至抗人抗体表面30秒，导致介于82至122RU之稳定抗PDGF表面。PDGF蛋白系经PBS-NET稀释至1nM，并连续稀释二倍至0.25nM。各种浓度之PDGF接着以100ul/min之流速被注射至该抗体表面2分钟。允许复合物解离10分钟。该表面以3M氯化镁注射30秒再生，使该表面得以进行另一次抗PDGF抗体捕捉及PDGF结合动力学。动力学数据使用Scrubber2软件(Bio-Logic Software)双重参照(D.G.Myszka et al.,J.Mol.Recognit 12:279,1999)，然后利用Biacore评估软件4.1版契合至1:1结合模型。所有PDGF异构体之蛋白浓度系经在限制质量输送之条件下测定之活性浓度校正(Karlsson et al.,METHODS:Acompanion to Methods in Enzymology 6:99-110,1994)。显示之结果为二个独立结合试验之平均值。
MOR8457-16抗体保留与人PDGF-AB及BB之低pM结合亲和性，及对小鼠及大鼠PDGF-BB之交叉反应性(图20及表8)。其结合亲和性及特异性与亲代MOR8457-GL相当(实施例6)，显示导致黏性改善之突变不包含与PDGF之结合性。
为了证实MOR8457-16之功能活性，我们测试其对系膜细胞增生之抑制。该试验系如前述(实施例8)进行。简言之，抗体系经半对数稀释自100nM至0.1nM，然后与2.5ng/ml之PDGF-BB于不含血清之MCM培养基(含0.1％BSA)混合30分钟，然后添加至细胞。图21显示MOR8457-16(A)相较于亲代MOR8457-GL(B)于相同实验中之抑制曲线。MOR8457-16之IC50为14pM，其类似亲代MOR8457之IC5020pM。
表8：通过Biacore确定的MOR8457-16与不同PDGF同种型的结合亲和性和
分析物 配体 ka(M-1s-1) kd(s-1) KD(M)
Hu PDGF-BB MOR8457-16 1.73(±0.06)x 107 1.69(±0.58)x 10-4 9.75(±3.43)x10-9
Mu PDGF-BB MOR8457-16 2.16(±0.29)x 107 1.80(±0.47)x 10-4 8.62(±3.15)x10-9
Rat PDGF-BB MOR8457-16 1.29(±0.14)x 107 1.14(±0.04)x 10-4 8.88(±1.31)x10-9
Hu PDGF-AB MOR8457-16 3.39(±4.73)x 106 4.28(±3.06)x 10-7 8.02(±11.29)x10-9
序列表概要
虽然本发明之揭示内容已藉由各种应用、方法、试剂盒及组合物加以说明，应了解可进行各种改变及修饰而不背离本文之揭示内容及以下之申请专利范围。前述之实施例系为了更清楚地说明本发明之揭示内容而提供，并无意限制本发明之范围。虽然本发明已藉由这些示例性实施方案说明，本领域技术人员将轻易了解可能针对这些示例性实施方案进行许多变异及修饰而无须过度实验。所有这些变异及修饰皆包含在本揭示发明之范围内。
本文之引证文献(包括专利、专利申请案、论文、教科书及该类似文献)以及这些文献中所引证之文献若未经本发明参照，则以参照方式整体并入本文。若一或多篇这些并入文献及类似材料与本申请案有不同或冲突之处，包括但不限于经定义之术语、术语之使用、经描述之技术或该类似物，以本申请案为主。
前述之详细说明及实施方式详细描述本发明之某些特定实施方案，并说明发明人所考虑之最优选模式。然而应了解的是，不论前述内容说明得多详细，本发明可以许多方式实施，且应根据该伴随之申请专利范围及其任何相等范围被解读。

Claims (26)

1.一种与PDGF-B特异性结合之经分离之抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:6之重链可变区(VH)氨基酸序列之VH互补决定区1(CDR-H1)、CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含SEQ ID NO:4之轻链可变区(VL)氨基酸序列之VL CDR1(CDR-L1)、CDR-L2及CDR-L3之VL；
(b)包含SEQ ID NO:6之VH氨基酸序列之CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含SEQ ID NO:4之VL氨基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL；
(c)包含SEQ ID NO:7之CDR-H1氨基酸序列、SEQ ID NO:8之CDR-H2氨基酸序列及SEQ ID NO:9之CDR-H3氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:10之CDR-L1氨基酸序列、SEQ ID NO:11之CDR-L2氨基酸序列及SEQ ID NO:12之CDR-L3氨基酸序列之VL；
(d)包含SEQ ID NO:8之CDR-H2氨基酸序列及SEQ ID NO:9之CDR-H3氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:10之CDR-L1氨基酸序列、SEQ ID NO:11之CDR-L2氨基酸序列及SEQ ID NO:12之CDR-L3氨基酸序列之VL；
(e)包含由以MOR8457-GL-VH(ATCC编号PTA-13303)保藏之载体的多核苷酸插入物所编码之VH氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含由以MOR8457-GL-VL(ATCC编号PTA-13302)保藏之载体的多核苷酸插入物所编码之VL氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之轻链可变区(VL)；
(f)包含由以MOR8457-GL-VH(ATCC编号PTA-13303)保藏之载体的多核苷酸插入物所编码之VH氨基酸序列的CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含由以MOR8457-GL-VL(ATCC编号PTA-13302)保藏之载体的多核苷酸插入物所编码之VL氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL；
(g)包含SEQ ID NO:2之氨基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列的VL；
(h)包含SEQ ID NO:6之氨基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO:4之氨基酸序列的VL；
(i)包含SEQ ID NO:6之氨基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列的VL；
(j)包含SEQ ID NO:2之氨基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO:4之氨基酸序列的VL；
(k)包含SEQ ID NO:14之序列的重链，及包含SEQ ID NO:16之氨基酸序列的轻链；
(l)包含由SEQ ID NO:5之核酸序列所编码之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，及由SEQ ID NO:3之核酸序列所编码之VL CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；
(m)包含由SEQ ID NO:5之核酸序列所编码之CDR-H2及CDR-H3之VH，及由SEQ ID NO:3之核酸序列所编码之VL CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；
(n)由SEQ ID NO:5之核酸序列所编码之VH，及由SEQ ID NO:3之核酸序列所编码之VL；
(o)由SEQ ID NO:13之核酸序列所编码之重链，及由SEQ ID NO:15之核酸序列所编码之轻链；
(p)包含SEQ ID NO:44之VH氨基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含SEQ ID NO:39之VL氨基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL；
(q)包含SEQ ID NO:44之VH氨基酸序列之CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含SEQ ID NO:39之VL氨基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL；
(r)包含SEQ ID NO:7之CDR-H1氨基酸序列、SEQ ID NO:8之CDR-H2氨基酸序列及SEQ ID NO:9之CDR-H3氨基酸序列之VH，及包含SEQID NO:10之CDR-L1氨基酸序列、SEQ ID NO:41之CDR-L2氨基酸序列及SEQ ID NO:12之CDR-L3氨基酸序列之VL；
(s)包含SEQ ID NO:8之CDR-H2氨基酸序列及SEQ ID NO:9之CDR-H3氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:10之CDR-L1氨基酸序列、SEQ ID NO:41之CDR-L2氨基酸序列及SEQ ID NO:12之CDR-L3氨基酸序列之VL；
(t)包含SEQ ID NO:44之氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之VL；
(u)包含SEQ ID NO:46之序列的重链，及包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列的轻链；
(v)包含SEQ ID NO:44之VH氨基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含SEQ ID NO:34之VL氨基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL；
(w)包含SEQ ID NO:44之VH氨基酸序列之CDR-H2及CDR-H3之VH，及包含SEQ ID NO:34之VL氨基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL；
(x)包含SEQ ID NO:7之CDR-H1氨基酸序列、SEQ ID NO:8之CDR-H2氨基酸序列及SEQ ID NO:9之CDR-H3氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:10之CDR-L1氨基酸序列、SEQ ID NO:11之CDR-L2氨基酸序列及SEQ ID NO:36之CDR-L3氨基酸序列之VL；
(y)包含SEQ ID NO:8之CDR-H2氨基酸序列及SEQ ID NO:9之CDR-H3氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:10之CDR-L1氨基酸序列、SEQ ID NO:11之CDR-L2氨基酸序列及SEQ ID NO:36之CDR-L3氨基酸序列之VL；
(z)包含SEQ ID NO:44之氨基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:34之氨基酸序列之VL；或
(aa)包含SEQ ID NO:46之序列的重链，及包含SEQ ID NO:37之氨基酸序列的轻链。
2.一种经分离之核酸，其编码权利要求1之抗体或其抗原结合片段。
3.一种编码与PDGF-B特异性结合之抗体或其抗原结合片段之经分离之核酸，其中该核酸包含：
(a)SEQ ID NO:3之核酸序列；
(b)SEQ ID NO:5之核酸序列；
(c)SEQ ID NO:13之核酸序列；
(d)SEQ ID NO:15之核酸序列；
(e)SEQ ID NO:3之核酸序列及SEQ ID NO:5之核酸序列；
(f)SEQ ID NO:13之核酸序列及SEQ ID NO:15之核酸序列；
(g)具有ATCC编号PTA-13303之保藏载体MOR8457-GL-VH之插入物的核酸序列；
(h)具有ATCC编号PTA-13302之保藏载体MOR8457-GL-VL之插入物的核酸序列；
(i)SEQ ID NO:35之核酸序列；
(j)SEQ ID NO:40之核酸序列；
(k)SEQ ID NO:45之核酸序列；
(l)SEQ ID NO:38之核酸序列；
(m)SEQ ID NO:43之核酸序列；
(n)SEQ ID NO:47之核酸序列；
(o)SEQ ID NO:35及SEQ ID NO:45之核酸序列；
(p)SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:45之核酸序列；
(q)SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:47之核酸序列；
(r)SEQ ID NO:43及SEQ ID NO:47之核酸序列；或
(s)具有ATCC编号PTA-13303之保藏载体MOR8457-GL-VH之插入物的核酸序列及具有ATCC编号PTA-13302之保藏载体MOR8457-GL-VL之插入物的核酸序列。
4.一种宿主细胞，其包含权利要求3之核酸。
5.一种载体，其包含权利要求3之核酸。
6.一种宿主细胞，其包含权利要求5之载体。
7.权利要求4之宿主细胞，其中该细胞系细菌细胞或哺乳动物细胞。
8.一种产生与PDGF-B特异性结合之抗体或其抗原结合片段之方法，该方法包括在使该抗体得以表达之条件下培养权利要求4之宿主细胞，且进一步包括分离该抗体。
9.权利要求1之经分离之抗体或其抗原结合片段，其中：
(a)该VL包含SEQ ID NO:4之氨基酸序列且进一步包含非CDR内之氨基酸的至少一个氨基酸取代；
(b)该VH包含SEQ ID NO:6之氨基酸序列且进一步包含非CDR内之氨基酸的至少一个氨基酸取代；或
(c)该VL包含SEQ ID NO:4之氨基酸序列且进一步包含非CDR内之氨基酸的至少一个氨基酸取代但不超过5个氨基酸取代，且该VH包含SEQ ID NO:6之氨基酸序列且另包含非CDR内之氨基酸的至少一个氨基酸取代但不超过5个氨基酸取代。
10.一种与PDGF-B特异性结合之经分离之抗体或其抗原结合片段，其中该抗体与权利要求1之抗体结合相同表位，或如同权利要求1之抗体与PDGFRββ上结合PDGF-B之结合位点重迭，且其中该抗体不是AbyD3263。
11.一种与PDGF-B特异性结合之经分离之抗体或其抗原结合片段，其中该抗体与PDGFRββ交叉竞争与PDGF-B之结合，且进一步，其中该抗体以2pM至100pM之KD与PDGF-B结合。
12.权利要求10之抗体，其中该抗体与PDGF-BB上之至少一个表位结合，其中该表位选自：
(a)包含相应于SEQ ID NO:33之氨基酸序列之残基Leu 38、Val 39、Trp 40、Asn 54、Arg 56、Glu 71、Arg 73、Ile 75、Ile 77、Arg 79、Lys80、Lys 81、Pro 82、Ile 83、Phe 84、Lys 85及Lys 86的表位；及
(b)包含相应于SEQ ID NO:33之氨基酸序列之残基Trp 40、Asn 54、Glu 71、Arg 73、Ile 75、Glu 76、Ile 77、Arg 79、Lys 80、Lys 81、Pro82、Ile 83、Phe 84、Lys 85及Lys 86的表位。
13.权利要求10之抗体，其中该抗体包含抗体决定簇，其中该抗体决定簇包含至少一个选自下列之氨基酸：基于相应于SEQ ID NO:1之序列的卡巴编号之氨基酸残基G28、S29、Y30、F31、D49、D50、F90、T91、H92、N93、S94及基于相应于SEQ ID NO:2之序列的卡巴编号之氨基酸残基Y50、L57、Y59、Y60、D62、W102、Y103、G104、G105。
14.如权利要求13之抗体，其中该抗体决定簇可进一步包含基于相应于SEQ ID NO:1之序列的卡巴编号之氨基酸残基N65及/或基于相应于SEQ ID NO:2之序列的卡巴编号之残基W47。
15.一种经分离之抗体或其抗原结合片段，其中该抗体以约2pM至69pM之KD与PDGF-B特异性结合，与PDGFRβ交叉竞争与PDGF-B之结合，及抑制由PDGF-B与PDGFβ结合所介导之活性。
16.权利要求15之抗体，其中该由PDGF-B与PDGFβ结合所介导之活性为选自下列中至少一者：该PDGFβ之磷酸化、诱导细胞增生、诱导细胞迁移及增加细胞外基质沉积。
17.权利要求15之抗体，其中该抗体与权利要求1或9之抗体竞争与PDGF-B之结合。
18.一种以约13pM之KD与人PDGF-BB特异性结合之经分离之抗体或其抗原结合片段，其中该抗体：
(a)与PDGFββ交叉竞争与PDGF-BB之结合；
(b)与至少一种选自下列之表位结合：
(i)包含相应于SEQ ID NO:33之氨基酸序列之残基Leu 38、Val 39、Trp 40、Asn 54、Arg 56、Glu 71、Arg 73、Ile 75、Ile 77、Arg 79、Lys80、Lys 81、Pro 82、Ile 83、Phe 84、Lys 85及Lys 86的表位；及
(ii)包含相应于SEQ ID NO:33之氨基酸序列之残基Trp 40、Asn 54、Glu 71、Arg 73、Ile 75、Glu 76、Ile 77、Arg 79、Lys 80、Lys 81、Pro82、Ile 83、Phe 84、Lys 85及Lys 86的表位；
其中所述表位在PDGF-BB上相隔约
(c)包含抗体决定簇，该抗体决定簇包含基于相应于SEQ ID NO:1之序列的卡巴编号之氨基酸残基G28、S29、Y30、F31、D49、D50、F90、T91、H92、N93、S94及基于相应于SEQ ID NO:2之序列的卡巴编号之氨基酸残基Y50、L57、Y59、Y60、D62、W102、Y103、G104、G105；且
(d)其中该抗体决定簇之氨基酸残基以下列方式与一个所述表位之氨基酸残基在内接触：
(i)对该轻链可变结构域，Trp 47与PDGF-B之Lys 82接触，Leu 57与PDGF-B之Ile 77接触，Tyr 59与PDGF-B之Ile 77、Arg 79、Lys 80、Lys 81及Pro 82接触，Trp 102与PDGF-B之Leu 8、Val 39、Trp 40、Asn54、Arg 56、Ile 75及Phe 84接触，Tyr 103与PDGF-B之Trp 40、Arg73、Ile 75及Phe 84接触，Gly 104与PDGF-B之Arg 73及Phe 84接触，且Gly 105与PDGF-B之Phe 84接触，其中该轻链可变结构域氨基酸之编号系基于相应于SEQ ID NO:1之卡巴编号；及
(ii)对该重链可变结构域，Gly 28与PDGF-B之Lys 86接触，Ser 29与PDGF-B之Lys 85及Lys 86接触，Tyr 30与PDGF-B之Ile 83、Phe 84、Lys 85及Lys 86接触，Phe 31与PDGF-B之Gln 71、Arg 73、Phe 84及Lys 86接触，Asp 49与PDGF-B之Arg 73接触，Asp 50与PDGF-B之Lys86接触，Asn 65与PDGF-B之Lys 86接触，Phe 90与PDGF-B之Pro82、Ile 83及Phe 84接触，Thr 91与PDGF-B之Lys 81及Ile 83接触，His92与PDGF-B之Lys 81及Ile 83接触，Asn 93与PDGF-B之Lys 81接触，且Ser 94与PDGF-B之Lys 81接触，其中该重链可变结构域氨基酸之编号系基于相应于SEQ ID NO:2之卡巴编号；
且进一步，其中PDGF-B接触残基之氨基酸残基编号系相应于SEQID NO:33之氨基酸序列。
19.一种药物组合物，其包含如权利要求1、2及9-18中任一项之抗体或其抗原结合片段及药学可接受之载剂或赋形剂。
20.一种用于减少有需要之个体的细胞外基质之沉积的方法，该方法包括给该个体施用有效量的权利要求19的药物组合物，从而抑制个体中细胞外基质的过度沉积。
21.一种用于预防或治疗由PDGF-B与PDGFRβ结合所介导的疾病、疾患或症状的方法，该方法包括给有需要的个体施用有效量的权利要求19的药物组合物。
22.权利要求21的方法，其中所述疾病、疾患或症状是选自下列的至少一种：动脉粥样硬化、再狭窄、肺动脉高压、视网膜血管疾病、心肌纤维化、肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、系统性硬化症、类风湿性关节炎、骨关节炎及肿瘤发生。
23.一种权利要求1、2、9-18中任一项之抗体或其抗原结合片段，或权利要求19的药物组合物，其系用于减少有需要之个体的细胞外基质之沉积。
24.一种权利要求1、2、9-18中任一项之抗体或其抗原结合片段，或权利要求19的药物组合物，其系用于预防或治疗由PDGF-B与PDGFRβ结合所介导之疾病、疾患或症状。
25.权利要求1、2、9-18中任一项之抗体或其抗原结合片段，或权利要求19的药物组合物，在制备用于减少有需要之个体的细胞外基质之沉积的药物中的用途。
26.权利要求1、2、9-18中任一项之抗体或其抗原结合片段，或权利要求19的药物组合物，在制备用于预防或治疗由PDGF-B与PDGFRβ结合所介导之疾病、疾患或症状的药物中的用途。
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