EA045275B1

EA045275B1 - Анти-pd-l1/анти-4-1bb биспецифические антитела и их применения

Info

Publication number: EA045275B1
Application number: EA202191457
Authority: EA
Inventors: Ынюнг Пак; Янгсоон Ли; Хёчин Чон; Ынсил Сон; Чисон Ю; Минчи Пак; Ёнг-Куи Сон; Хёчу Цой; Ынчон Ким; Чаехо Чон; Вон-Кё Ю; Сан Хоон Ли; Лэй ФАН; Вэньцин Цзян
Original assignee: Эбиэл Био Инк.; Ай-Маб Биофарма Ко., Лтд.
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2019-02-15
Publication date: 2023-11-10

Description

Уровень техники настоящего изобретения

Лиганд 1 белка программируемой смерти (PD-L1), также известный как кластер дифференциации 274 (CD274) или В7 гомолог 1 (В7-Н1), представляет собой трансмембранный белок типа 1 массой 40 кДа, который, как полагают, играет основную роль в подавлении иммунной системы в ходе конкретных событий, таких как беременность, тканевые аллотрансплантаты, аутоиммунные заболевания и другие болезненные состояния, такие как гепатит. Связывание PD-L1 с PD-1 или В7.1 передает сигнал ингибирования, который снижает пролиферацию Т-клеток CD8+ в лимфатических узлах, и в дополнение к этому PD-1 также способен контролировать накопление чужеродных антиген-специфических Т-клеток в лимфатических узлах посредством апоптоза, который дополнительно опосредуется более низкой регуляцией гена Bcl-2.

Было показано, что повышающая регуляция PD-L1 может позволить раку ускользнуть от иммунной системы хозяина. Анализ образцов опухолей, взятых у пациентов с почечно-клеточной карциномой, показал, что высокая экспрессия PD-L1 в опухоли связана с повышенной агрессивностью опухоли и повышенным риском смерти. Многие ингибиторы PD-L1 находятся на стадии разработки в качестве иммуноонкологической терапии и показывают хорошие результаты в клинических испытаниях.

4-1ВВ является членом суперсемейства TNF-рецепторов (TNFRSF) и является костимулирующей молекулой, которая экспрессируется после активации иммунных клеток, как врожденной, так и адаптивной иммунной системы. 4-1ВВ играет важную роль в модуляции активности различных иммунных клеток. Агонисты 4-1ВВ усиливают пролиферацию иммунных клеток, выживаемость, секрецию цитокинов и цитолитическую активность Т-клеток CD8. Многие другие исследования показали, что активация 4-1ВВ усиливает иммунный ответ для устранения опухолей у мышей. Следовательно, предполагают, что 4-1ВВ является многообещающей молекулой-мишенью в иммунологии рака. Несмотря на свою противоопухолевую эффективность антитело против 4-1ВВ вызывает тяжелую токсичность для печени при клиническом применении.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифическому антителу, способному эффективно блокировать взаимодействия между PD-L1 и его рецептором PD-1 и между 4-1ВВ и его лигандом. Биспецифическое антитело может иметь высокую аффинность связывания как с белком PD-L1 (например, человеческий белок PD-L1), так и с белком 4-1ВВ (например, человеческий белок 4-1ВВ).

Анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифическое антитело может содержать анти-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в качестве PD-L1-нацеленной составляющей, которая способна специфически распознавать и/или связываться с белком PD-L1, и анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в качестве 4-1ВВ-нацеленной составляющей, которая способна специфически распознавать и/или связываться с белком 4-1ВВ.

Анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифическое антитело может содержать анти-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в качестве PD-L1-нацеленной составляющей.

Согласно варианту осуществления анти-PD-L1 антитело или его фрагмент, содержащиеся в биспецифическом антителе, могут специфически связываться с доменом иммуноглобулина С (IgC) белка PD-L1 (например, человеческий PD-L1). Согласно некоторым вариантам осуществления домен IgC состоит из аминокислотных остатков 133-225 человеческого белка PD-L1. Согласно некоторым вариантам осуществления анти-PD-L1 антитело или его фрагмент могут связываться с по меньшей мере одним из аминокислотных остатков Y134, K162 и N183 человеческого белка PD-L1. Согласно некоторым вариантам осуществления анти-PD-L1 антитело или его фрагмент не способны связываться с доменом иммуноглобулина V (IgV) белка PD-L1, и, например, домен IgV состоит из аминокислотных остатков 19-127 человеческого белка PD-L1. Например, человеческий белок PD-L1 может быть выбран без ограничения из группы, состоящей из белков, представленных в GenBank под номером доступа NP_001254635.1, NP_001300958.1, NP_054862.1 и т.д. Эти анти-PD-L1 антитела могут быть полезны для терапевтических целей, таких как лечение различных типов рака и т.д., а также могут применяться для диагностических и прогностических целей. Согласно варианту осуществления анти-PD-L1 антитело или его фрагмент способны к специфичности в отношении человеческого белка PD-L1.

Анти-PD-L1/анти-4-1BB биспецифическое антитело содержит анти-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где анти-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны специфически связываться с доменом иммуноглобулина С (IgC) человеческого белка лиганд 1 белка программируемой смерти (PD-L1), где домен IgC состоит из аминокислотных остатков 133-225, анти-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и 3, CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5, 262, 263, 264, 265, 266 и 267, CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, 268 и 269, CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, 270, 271 и 272, и анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность,

- 1 045275 выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10 и 11, CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12 и 13, CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 15, 16 и 17, CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.

Согласно варианту осуществления анти-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и 3, CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4 и 5, CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

Согласно варианту осуществления αнтu-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны связываться с по меньшей мере одним из аминокислотных остатков Y134, K162 или N183 белка PD-L1.

Согласно варианту осуществления aнтu-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны связываться с аминокислотными остатками Y134, K162 и N83 белка PD-L1.

Согласно варианту осуществления анти-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не способны связываться с доменом иммуноглобулина V (IgV) белка PD-L1, где домен IgV состоит из аминокислотных остатков 19-127.

Согласно варианту осуществления анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифическое антитело активирует передачу сигналов 4-1ВВ или иммунный ответ, в зависимости от PD-L1, экспрессируемого на клеточных поверхностях.

Согласно варианту осуществления каждое из анти-PD-L1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и анти-4-1ВВ антитела или его антигенсвязывающего фрагмента независимо представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или полностью человеческое антитело.

Анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифическое антитело содержит анти-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где анти-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат (1) CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (2) CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и 3, (3) CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5, 262, 263, 264, 265, 266 и 267, (4) CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, 268 и 269, (5) CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и (6) CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, 270, 271 и 272; и анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат (i) CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10 и 11, (ii) CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12 и 13, (iii) CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 15, 16 и 17, (iv) CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, (v) CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и (vi) CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.

Анти-PD-LI антитело или его фрагмент могут содержать (1) CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1;

(2) CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и 3;

(3) CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5, 262, 263, 264, 265, 266 и 267;

(4) CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, 268 и 269;

(5) CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; и (6) CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, 270, 271 и 272.

Например, анти-PD-L1 антитело или его фрагмент могут содержать CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или 3, CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, 5, 262, 263, 264, 265, 266 или 267, CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, 268 или 269, CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и CDR3 VL,

- 2 045275 имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, 270, 271 или 272.

Согласно варианту осуществления анти-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент сдержат CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и 3, CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4 и 5, CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

Анти-PD-L1/анти-4-1BB биспецифическое антитело может содержать анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в качестве 4-1ВВ-нацеленной составляющей. Согласно варианту осуществления анти-4-1ВВ антитело или его фрагмент могут специфически связываться с белком 4-1ВВ (например, человеческий 4-1ВВ).

Анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны усиливать иммунный ответ и/или лечить опухоль (рак) у млекопитающего. Анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент характеризуются локализацией и/или активацией только в микроокружении опухоли (ТМЕ) и/или значительно сниженной токсичностью для печени по сравнению с ранее существовавшими анти-4-1ВВ антителами, при сохранении эффективности усиления иммунного ответа и/или лечения опухоли.

Например, человеческий белок 4-1ВВ может быть выбран без ограничения из группы, состоящей из белков, представленных в NCBI под номером доступа NP_001552 и т.д. Эти анти-4-1ВВ антитела могут быть полезны для терапевтических целей, таких как лечение различных типов рака и т.д., а также могут использоваться для диагностических и прогностических целей.

Согласно варианту осуществления анти-4-1ВВ антитело или его фрагмент способны к специфичности в отношении человеческого белка 4-1ВВ. Анит-4-1ВВ антитело или его фрагмент могут содержать (i) CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10 и 11;

(ii) CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12 и 13;

(iii) CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 15, 16 и 17;

(iv) CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18;

(v) CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; и (vi) CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.

Например, анти-4-1ВВ антитело или его фрагмент могут содержать CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 или 11, CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или 13, CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, 15, 16 или 17, CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.

Согласно варианту осуществления анти-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой гуманизированные антитела.

Согласно варианту осуществления αнти-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 103 и 104, или полипептид, имеющий идентичность последовательности по меньшей мере 90% с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 103 и 104.

Согласно варианту осуществления aнти-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 105 и 106, или пептид, имеющий идентичность последовательности по меньшей мере 90% с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 105 и 106.

Согласно варианту осуществления анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21, 22, 23 и 24, или полипептид, имеющий идентичность последовательности по меньшей мере 90% с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21, 22, 23 и 24.

Согласно варианту осуществления анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область легкой цепи содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25 и 26, или пептид, имеющий идентичность последова- 3 045275 тельности по меньшей мере 90% с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25 и 26.

Согласно варианту осуществления анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифическое антитело активирует передачу сигналов 4-1ВВ в зависимости от PD-L1, экспрессируемого на клеточных поверхностях.

Согласно варианту осуществления анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифическое антитело находится в форме IgG-scFv.

Анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифическое антитело может содержать тяжелый компонент, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 и 43, и легкий компонент, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 и 44.

Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей биспецифическое антитело, как описано выше. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция может применяться для лечения и\или профилактики рака.

Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения и\или профилактики рака у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающему введение субъекту фармацевтически эффективного количества биспецифического антитела или фармацевтической композиции. Способ может дополнительно предусматривать стадию идентификации субъекта, нуждающегося в лечении и/или профилактике рака, перед стадией введения.

Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению биспецифического антитела или фармацевтической композиции для лечения и\или профилактики рака. Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению биспецифического антитела для получения фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рака.

В отношении фармацевтических композиций, способов и/или применений, раскрытых в настоящем документе, раком может быть солидный рак или рак крови, предпочтительно солидный рак.

Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к композиции для обнаружения PD-L1, 4-1ВВ или и того и другого одновременно в биологическом образце, причем композиция содержит биспецифическое антитело. Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу обнаружения PD-L1, 4-1ВВ или и того и другого одновременно в биологическом образце, причем способ предусматривает приведение биологического образца в контакт с биспецифическим антителом и обнаружение (измерение) реакции антиген-антитело (связывания) между биспецифическим антителом и PD-L1, 4-1ВВ или и тем, и другим.

Способ обнаружения может после стадии обнаружения дополнительно предусматривать определение присутствует ли PD-L1, 4-1ВВ или и то, и другое в биологическом образце, когда реакция антигенантитело обнаружена, и/или отсутствует ли (не присутствует) PD-L1, 4-1ВВ или и то, и другое в биологическом образце, когда реакция антиген-антитело не обнаружена.

Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для диагностики заболевания, связанного с PD-L1, 4-1ВВ или и тем, и другим, причем композиция содержит биспецифическое антитело. Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению биспецифического антитела для диагностики заболевания, связанного с PD-L1, 4-1ВВ или и тем, и другим.

Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу диагностики заболевания, связанного с PD-L1, 4-1ВВ или и тем, и другим, причем способ предусматривает приведение в контакт биологического образца, взятого у пациента, с биспецифическим антителом и обнаружение реакции антиген-антитело или измерение уровня реакция антиген-антитело в биологическом образце. Согласно некоторым вариантам осуществления способ может дополнительно предусматривать приведение в контакт нормального образца с биспецифическим антителом и измерение уровня реакции антиген-антитело в нормальном образце. Кроме того, способ может дополнительно предусматривать сравнение уровня реакции антиген-антитело в биологическом образце и в нормальном образце после стадии измерения. Кроме того, после стадии обнаружения или стадии сравнения способ может дополнительно предусматривать определение пациента как пациента с заболеванием, связанным с PD-L1, 4-1ВВ или и тем, и другим, когда реакция антиген-антитело обнаружена в биологическом образец или уровень реакции антиген-антитело в биологическом образце выше, чем в нормальном образце.

Заболевание, связанное с PD-L1, 4-1ВВ или и тем, и другим, может быть связано с активацией (например, аномальной активацией или чрезмерной активацией) и/или избыточной продукцией (сверхэкспрессией) PD-L1, 4-1ВВ или и того и другого. Например, заболевание может представлять собой рак, как описано выше.

Согласно варианту осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему биспецифическое антитело. В частности, согласно варианту осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему тяжелую цепь биспецифического антитела в форме IgG-scFv, которая содержит IgG полной длины и scFv, связанный с С-концом и/или N-концом IgG полной длины. Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, коди- 4 045275 рующему легкую цепь биспецифического антитела в форме IgG-scFv. Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, содержащему полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь биспецифического антитела, полинуклеотид, кодирующий легкую цепь биспецифического антитела, или и то, и другое. Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантной клетке, трансфицированной рекомбинантным вектором.

Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу получения биспецифического антитела, предусматривающему экспрессию полинуклеотида, кодирующего тяжелую цепь биспецифического антитела, полинуклеотида, кодирующего легкую цепь биспецифического антитела, в клетке. Стадию экспрессии полинуклеотида можно проводить путем культивирования клетки, содержащей полинуклеотид (например, в рекомбинантном векторе), в условиях, позволяющих экспрессию полинуклеотида. Способ может дополнительно предусматривать выделение и/или очистку биспецифического антитела из клеточной культуры после стадии экспрессии или культивирования.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1А и 1В схематически проиллюстрировано анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифическое антитело согласно варианту осуществления.

На фиг. 2 схематически проиллюстрирован механизм действия анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифического антитела согласно варианту осуществления.

На фиг. 3 приведены графики, демонстрирующие критерии отбора вариантов PD-L1 для того, чтобы идентифицировать необходимые остатки для связывания Hu1210-41.

На фиг. 4 проиллюстрированы расположения Y134, K162 и N183, остатков (сферы), участвующих в связывании с анти-PD-L1 антителом согласно варианту осуществления.

На фиг. 5 показано, что анти-4-1ВВ антитела согласно вариантам осуществления могут связываться с человеческим 4-1ВВ с высокой аффинностью.

На фиг. 6 показано, что анти-4-1ВВ антитела согласно вариантам осуществления могут эффективно связываться с 4-1ВВ, экспрессируемым на клетках млекопитающих.

На фиг. 7А и 7В приведены графики, иллюстрирующие связывание анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифического антитела согласно варианту осуществления с человеческим PD-L1 и человеческим 4-1ВВ, как измерено посредством DACE (ELISA с захватом двойного антигена).

На фиг. 8 показано, что анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифические антитела согласно варианту осуществления являются стабильными в сыворотке человека.

На фиг. 9A-9F показано, что биспецифические антитела PD-L1x4-1BB согласно варианту осуществления активируют передачу сигнала 4-1ВВ в зависимости от экспрессии PD-L1 на клетках-мишенях.

На фиг. 10А и 10В показаны результаты анализа РВМС для анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифических антител согласно вариантам осуществления. Также приведены графики, иллюстрирующие активности промотирования Т-клеток анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифических антител согласно вариантам осуществления.

На фиг. 11 приведен график, иллюстрирующий эффект ингибирования роста опухоли анти-PDL1/анти-4-1ВВ биспецифического антитела согласно варианту осуществления.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Определения.

Необходимо отметить, что форма единственного числа объекта относится к одному или нескольким из этих объектов, например, антитело следует понимать, как одно или несколько антител. Таким образом, форма единственного числа, термины один или несколько и по меньшей мере один могут использоваться взаимозаменяемо в настоящем документе.

В контексте настоящего изобретения термин полипептид предназначен для охвата единственного полипептида, а также множества полипептидов и относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (также известными как пептидные связи). Термин полипептид относится к любой цепи или цепям из двух или более аминокислот и не относится к конкретной длине продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, белок, аминокислотная цепь или любой другой термин, используемый для обозначения цепи или цепей из двух или более аминокислот, включены в определение полипептид, и термин полипептид может использоваться вместо или взаимозаменяемо с любым из этих терминов. Термин полипептид также предназначен для обозначения продуктов постэкспрессионных модификаций полипептида, включая без ограничения гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию известными защитными/блокирующими группами, протеолитическое расщепление или модификацию не встречающимися в природе аминокислотами. Полипептид может быть получен из природного биологического источника или получен с помощью рекомбинантной технологии, но не обязательно транслируется с указанной последовательности нуклеиновой кислоты. Он может быть создан любым способом, в том числе путем химического синтеза.

Термин выделенные, используемый в настоящем документе в отношении клеток, нуклеиновых кислот, таких как ДНК или РНК, относится к молекулам, отделенным от других ДНК или РНК соответственно, которые присутствуют в природном источнике макромолекулы. В контексте настоящего изо- 5 045275 бретения термин выделенная также относится к нуклеиновой кислоте или пептиду, которые по существу не содержат клеточный материал, вирусный материал или культуральную среду при получении методиками рекомбинантной ДНК, или химические предшественники или другие химические вещества при химическом синтезе. Более того, выделенная нуклеиновая кислота предназначена для включения фрагментов нуклеиновой кислоты, которые не встречаются в природе в виде фрагментов и не могут быть обнаружены в природном состоянии. В контексте настоящего изобретения термин выделенные также относится к клеткам или полипептидам, которые отделены от других клеточных белков или тканей. Подразумевается, что выделенные полипептиды охватывают как очищенные, так и рекомбинантные полипептиды.

В контексте настоящего изобретения термин рекомбинантный в отношении полипептидов или полинуклеотидов означает форму полипептида или полинуклеотида, которая не существует в природе, неограничивающий пример которой может быть создан путем объединения полинуклеотидов или полипептидов, которые обычно не встречаются в природе вместе.

Гомология, или идентичность, или сходство относится к сходству последовательностей между двумя пептидами или между двумя молекулами нуклеиновой кислоты. Гомология может быть определена путем сравнения положения в каждой из последовательностей, которые могут быть выровнены в целях сравнения. Когда положение в сравниваемой последовательности занято тем же основанием или аминокислотой, тогда молекулы гомологичны в этом положении. Степень гомологии между последовательностями является функцией числа совпадающих или гомологичных положений, общих для последовательностей. Неродственная или негомологичная последовательность имеет менее 40% идентичности, хотя предпочтительно менее 25% идентичности, с одной из последовательностей согласно настоящему изобретению.

Полинуклеотид или полинуклеотидная область (или полипептид или полипептидная область) имеет определенный процент (например, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99%) идентичности последовательности с другой последовательностью, что означает, что при выравнивании этот процент оснований (или аминокислот) является таким же, как при сравнении двух последовательностей. Это выравнивание и процент гомологии или идентичности последовательностей можно определить с применение программных обеспечений, известных в данной области техники, например, программных обеспечений, описанных в Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology. Предпочтительно для выравнивания используются параметры по умолчанию. Одним программным обеспечением для выравнивания является BLAST с использованием параметров по умолчанию. В частности, программными обеспечениями являются BLASTN и BLASTP, использующие следующие параметры по умолчанию: генетический код=стандартный, фильтр=нет, нить=обе, отсечка=60, ожидание=10, матрица=BLOSUM62, описания=50 последовательностей, сортировать по=ВЫСОКАЯ ОЦЕНКА, базы данных=неизбыточные, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS трансляции+SwissProtein+SPupdate+PIR. Биологически эквивалентные полинуклеотиды представляют собой те, которые имеют указанный выше процент гомологии и кодируют полипептид, обладающий такой же или подобной биологической активностью.

Термин эквивалентная нуклеиновая кислота или полинуклеотид относится к нуклеиновой кислоте, имеющей нуклеотидную последовательность, имеющую определенную степень гомологии или идентичности последовательности с нуклеотидной последовательностью нуклеиновой кислоты или ее комплементом. Подразумевается, что гомолог двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает нуклеиновые кислоты, имеющие нуклеотидную последовательность, которая имеет определенную степень гомологии с нуклеотидной последовательностью нуклеиновой кислоты или ее комплементом. Согласно одному аспекту гомологи нуклеиновых кислот способны гибридизоваться с нуклеиновой кислотой или ее комплементом. Подобным образом, эквивалентный полипептид относится к полипептиду, имеющему определенную степень гомологии или идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью эталонного полипептида. Согласно некоторым аспектам идентичность последовательности составляет по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%. Согласно некоторым аспектам эквивалентный полипептид или полинуклеотид имеет одно, два, три, четыре или пять добавлений, делеций, замен и их комбинаций по сравнению с эталонным полипептидом или полинуклеотидом. Согласно некоторым аспектам эквивалентная последовательность сохраняет активность (например, связывание эпитопа) или структуру (например, солевой мостик) эталонной последовательности.

Реакции гибридизации можно проводить в условиях разной жесткости. В общем реакцию гибридизации низкой жесткости проводят при температуре приблизительно 40°С в приблизительно 10xSSC или растворе с эквивалентной ионной силой/температурой. Гибридизацию средней жесткости, как правило, проводят при приблизительно 50°С в приблизительно 6xSSC, а реакцию гибридизации высокой жесткости, как правило, проводят при приблизительно 60°С в приблизительно 1xSSC. Реакции гибридизации также можно проводить в физиологических условиях, которые хорошо известны специалисту в данной области техники. Неограничивающим примером физиологического условия является температура, ионная сила, значение рН и концентрация Mg²⁺, обычно обнаруживаемые в клетке.

- 6 045275

Полинуклеотид состоит из определенной последовательности из четырех нуклеотидных оснований: аденина (А), цитозина (С), гуанина (G), тимина (Т) и урацила (U) вместо тимина, когда полинуклеотид представляет собой РНК. Таким образом, термин полинуклеотидная последовательность представляет собой алфавитное представление молекулы полинуклеотида. Это алфавитное представление может быть введено в базы данных на компьютере, имеющем центральный процессор, и использоваться для приложений биоинформатики, таких как функциональная геномика и поиск гомологии. Термин полиморфизм относится к сосуществованию более чем одной формы гена или его части. Часть гена, у которой существуют по меньшей мере две разные формы, т.е. две разные нуклеотидные последовательности, называется полиморфной областью гена. Полиморфная область может быть одним нуклеотидом, идентичность которого различается в разных аллелях.

Термины полинуклеотид и олигонуклеотид используются взаимозаменяемо и относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо дезоксирибонуклеотидов, либо рибонуклеотидов, либо их аналогов. Полинуклеотиды могут иметь любую трехмерную структуру и могут выполнять любую функцию, известную или неизвестную. Ниже приведены неограничивающие примеры полинуклеотидов: ген или фрагмент гена (например, зонд, праймер, метка EST или SAGE), экзоны, интроны, информационная РНК (мРНК), транспортная РНК, рибосомная РНК, рибозимы, кДНК, дцРНК, миРНК, микроРНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенная ДНК любой последовательности, выделенная РНК любой последовательности, зонды нуклеиновых кислот и праймеры. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов. Если присутствуют, модификации нуклеотидной структуры могут быть внесены до или после сборки полинуклеотида. Последовательность нуклеотидов может прерываться ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид можно дополнительно модифицировать после полимеризации, как например, путем конъюгации с вносящим метку компонентом. Термин также относится как к двухцепочечным, так и к одноцепочечным молекулам. Если не указано или не требуется иное, любой вариант осуществления настоящего изобретения, который представляет собой полинуклеотид, охватывает как двухцепочечную форму, так и каждую из двух комплементарных одноцепочечных форм, которые, как известно или предсказано, образуют двухцепочечную форму.

Термин кодировать при применении в отношении полинуклеотидов относится к полинуклеотиду, который, как указано, кодирует полипептид, если в его нативном состоянии или при манипулировании способами, хорошо известными специалистам в данной области техники, он может быть транскрибирован и/или транслирован с получением мРНК полипептида и/или его фрагмента. Антисмысловая цепь представляет собой комплемент такой нуклеиновой кислоты, и кодирующая последовательность может быть выведена из нее.

В контексте настоящего изобретения антитело или антигенсвязывающий полипептид относится к полипептиду или полипептидному комплексу, который специфически распознает антиген и связывается с ним. Антителом может быть целое антитело и любой его антигенсвязывающий фрагмент или его одна цепь. Таким образом, термин антитело включает любую молекулу, содержащую белок или пептид, которая содержит по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, обладающую биологической активностью связывания с антигеном. Их примеры включают без ограничения определяющую комплементарность область (CDR) тяжелой или легкой цепи или ее лиганд-связывающую часть, вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи, константную область тяжелой цепи или легкой цепи, каркасную область (FR) или любую ее часть, или по меньшей мере одну часть связывающего белка.

В контексте настоящего изобретения термины фрагмент антитела или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой часть антитела, такую как F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, Fv, scFv и т.п. Независимо от структуры фрагмент антитела связывается с тем же антигеном, который распознается интактным антителом. Термин фрагмент антитела включает аптамеры, шпигельмеры и диатела. Термин фрагмент антитела также включает любой синтетический или полученный методом генной инженерии белок, который действует как антитело посредством связывания со специфическим антигеном с образованием комплекса.

Одноцепочечный вариабельный фрагмент или scFv относится к слитому белку вариабельных областей тяжелой (VH) и легкой цепей (V_L) иммуноглобулинов. Согласно некоторым аспектам области соединены коротким линкерным пептидом, состоящим из 10-25 аминокислот. Линкер может быть богат глицином для гибкости, а также серином или треонином для растворимости, и может либо соединять Nконец V_H с С-концом V_L, либо наоборот. Этот белок сохраняет специфичность исходного иммуноглобулина, несмотря на удаление константных областей и введение линкера. Молекулы ScFv известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США № 5892019.

Термин антитело охватывает различные широкие классы полипептидов, которые можно различить биохимическим образом. Специалистам в данной области техники очевидно, что тяжелые цепи классифицируются как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон (γ, μ, α, δ, ε) с некоторыми подклассами среди них (например, γ1-γ4). Именно природа цепи определяет класс антитела как IgG, IgM, IgA, IgG или IgE, соответственно. Подклассы (изотипы) иммуноглобулинов, например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5 и т.д.,

- 7 045275 хорошо охарактеризованы и, как известно, придают функциональную специализацию. Модифицированные варианты каждого из этих классов и изотипов легко различимы для квалифицированного специалиста с учетом настоящего раскрытия и, соответственно, находятся в пределах объема настоящего раскрытия. Все классы иммуноглобулинов явно входят в объем настоящего раскрытия, следующее обсуждение в целом будет направлено на класс молекул иммуноглобулина IgG. Что касается IgG, стандартная молекула иммуноглобулина содержит два идентичных полипептида легкой цепи с молекулярной массой приблизительно 23000 Да и два идентичных полипептида тяжелой цепи с молекулярной массой 53000-70000. Четыре цепи обычно соединены дисульфидными связями в конфигурации Y, где легкие цепи захватывают в вилку тяжелые цепи, начиная с устья Y и далее через вариабельную область.

Антитела, их антигенсвязывающие полипептиды, варианты или производные согласно настоящему изобретению включают без ограничения поликлональные, моноклональные, мультиспецифические, человеческие, гуманизированные, приматизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела, эпитоп-связывающие фрагменты, например, Fab, Fab' и F(ab')₂, Fd, Fvs, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, дисульфид-связанные Fv (sdFv), фрагменты, содержащие либо домен VL, либо VH, фрагменты, продуцируемые библиотекой экспрессии Fab, и антиидиотипические (анти-Id) антитела (включая, например, анти-К-антитела к антителам LIGHT, описанным в настоящем документе). Молекулы иммуноглобулина или антитела согласно настоящему раскрытию могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса молекул иммуноглобулина.

Легкие цепи классифицируются как каппа или лямбда (K, λ). Каждый класс тяжелой цепи может быть связан с легкой цепью либо каппа, либо лямбда. В общем легкая и тяжелая цепи ковалентно связаны друг с другом, а хвостовые части двух тяжелых цепей связаны друг с другом ковалентными дисульфидными связями или нековалентными связями, когда иммуноглобулины генерируются либо гибридомами, либо В-клетками, либо генно-инженерными клетками-хозяевами. В тяжелой цепи аминокислотные последовательности проходят от N-конца на разветвленных концах Y-конфигурации до С-конца внизу каждой цепи.

Как легкие, так и тяжелые цепи разделены на области структурной и функциональной гомологии. Термины константная и вариабельная используются функционально. В этом отношении следует понимать, что вариабельные домены участков как легкой (VL), так и тяжелой (VH) цепи определяют распознавание антигена и специфичность к нему. Напротив, константные домены легкой цепи (CK) и тяжелой цепи (CH1, CH2 или СН3) придают важные биологические свойства, такие как секреция, трансплацентарная подвижность, связывание с рецептором Fc, связывание комплемента и т.п. Условно нумерация доменов константной области увеличивается по мере того, как они становятся более удаленными от антигенсвязывающего сайта или аминоконца антитела. N-концевая часть представляет собой вариабельную область, а С-концевая часть является константной областью, домены СН3 и CK фактически содержат карбокси-конец тяжелой и легкой цепи, соответственно.

Как указано выше, вариабельная область позволяет антителу селективно распознавать и специфически связывать эпитопы на антигенах. Т.е. домен VL и домен VH или подмножество определяющих комплементарность областей (CDR) антитела объединяются с образованием вариабельной области, которая определяет трехмерный антигенсвязывающий сайт. Эта четвертичная структура антитела образует антигенсвязывающий сайт, присутствующий на конце каждого плеча Y. Более конкретно, антигенсвязывающий сайт определяется тремя CDR на каждой из цепей VH и VL (т.е. CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3). В некоторых случаях, например, определенных молекул иммуноглобулинов, происходящих из видов верблюдовых или созданных на основе иммуноглобулинов верблюдовых, полная молекула иммуноглобулина может состоять только из тяжелых цепей без легких цепей. См., например, Hamers-Casterman et al., Nature, 363:446-448 (1993).

В встречающихся в природе антителах шесть определяющих комплементарность областей или CDR, присутствующие в каждом антигенсвязывающем домене, представляют собой короткие несмежные последовательности аминокислот, которые специфически расположены с образованием антигенсвязывающего домена, поскольку антитело принимает его трехмерную конфигурацию в водной среде. Остальные аминокислоты в антигенсвязывающих доменах, называемые каркасными областями, демонстрируют меньшую межмолекулярную вариабельность. Каркасные области в значительной степени принимают конформацию β-листа, a CDR образуют петли, которые соединяют и в некоторых случаях образуют часть структуры β-листа. Таким образом, каркасные области действуют, образуя каркас, который обеспечивает правильную ориентацию CDR посредством межцепочечных нековалентных взаимодействий. Антигенсвязывающий домен, образованный расположенными CDR, определяет поверхность, комплементарную эпитопу на иммунореактивном антигене. Эта комплементарная поверхность способствует нековалентному связыванию антитела с его родственным эпитопом. Аминокислоты, содержащие CDR и каркасные области, соответственно, для любой данной вариабельной области тяжелой или легкой цепи, могут быть легко идентифицированы специалистом в данной области техники, поскольку они были точно определены (см. www.bioinf.org.uk: Dr. Andrew C.R. Martin's Group; Sequences of Proteins of Immu- 8 045275 nological Interest, Kabat, E. et al., U.S., Department of Health and Human Services (1983); и Chothia and

Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)).

В случае когда существует два или более определений термина, который используется и/или принят в данной области техники, определение термина, используемое в настоящем документе, предназначено для включения всех таких значений, если явно не указано иное. Конкретным примером является использование термина определяющая комплементарность область (CDR) для описания несмежных антигенсвязывающих сайтов антитела, обнаруживаемых в вариабельной области полипептидов как тяжелой, так и легкой цепи. Эта конкретная область была описана Kabat et al., U.S., Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983); и Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987), которые включены в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте. Определения CDR по Кабату и Чотиа включают перекрывания или подгруппы аминокислотных остатков при сравнении друг с другом. Тем не менее предполагается, что применение любого определения для обозначения CDR антитела или его вариантов находится в пределах объема термина, определенного и используемого в настоящем документе. Соответствующие аминокислотные остатки, которые включают CDR, как определено в каждом из приведенных выше ссылочных источников, представлены в таблице ниже для сравнения. Точные номера остатков, которые охватывают конкретную CDR, будут варьироваться в зависимости от последовательности и размера CDR. Специалисты в данной области могут обычным образом определить какие остатки содержат конкретную CDR, учитывая аминокислотную последовательность вариабельной области антитела.

	Кабат	Таблица 1 Чотиа
CDR-H1	31-35	26-32
CDR-H2	50-65	52-58
CDR-H3	95-102	95-102
CDR-L1	24-34	26-32
CDR-L2	50-56	50-52
CDR-L3	89-97	91-96

Kabat et al. также определили систему нумерации последовательностей вариабельных доменов, которая применима к любому антителу. Специалист в данной области техники может однозначно применять эту систему нумерации по Кабату для любой последовательности вариабельного домена, не полагаясь на какие-либо экспериментальные данные, помимо самой последовательности. В настоящем документе нумерация по Кабату относится к системе нумерации, установленной в Kabat et al., U.S., Dept. of Health and Human Services, Sequence of Proteins of Immunological Interest (1983).

В дополнение к приведенной выше таблице система нумерации по Кабату описывает области CDR следующим образом: CDR-H1 начинается приблизительно в положении аминокислоты 31 (т.е. приблизительно 9 остатков после первого остатка цистеина), включает приблизительно 5-7 аминокислот и заканчивается следующим остатком триптофана. CDR-H2 начинается в положении пятнадцатого остатка после конца CDR-H1, включает приблизительно 16-19 аминокислот и заканчивается следующим остатком аргинина или лизина. CDR-H3 начинается приблизительно в положении тридцать третьего аминокислотного остатка после конца CDR-H2, включает 3-25 аминокислот и заканчивается последовательностью WG-X-G, где X представляет собой любую аминокислоту. CDR-L1 начинается приблизительно в положении остатка 24 (т.е. после остатка цистеина), включает приблизительно 10-17 остатков и заканчивается следующим остатком триптофана. CDR-L2 начинается приблизительно в положении шестнадцатого остатка после конца CDR-L1 и включает приблизительно 7 остатков. CDR-L3 начинается приблизительно в положении тридцать третьего остатка после конца CDR-L2 (т.е. после остатка цистеина), включает приблизительно 7-11 остатков и заканчивается последовательностью F или W-G-X-G, где X представляет собой любую аминокислоту.

Раскрытые в настоящем документе антитела могут быть любого животного происхождения, включая птиц и млекопитающих. Предпочтительно антитела представляют собой антитела человека, мыши, осла, кролика, козы, морской свинки, верблюда, ламы, лошади или курицы. Согласно другому варианту осуществления вариабельная область может происходить из хрящевых рыб (например, из акул).

В контексте настоящего изобретения термин константная область тяжелой цепи включает аминокислотные последовательности, происходящие из тяжелой цепи иммуноглобулина. Полипептид, содержащий константную область тяжелой цепи, содержит по меньшей мере одно из домена СН1, шарнирного домена (например, верхней, средней и/или нижней шарнирной области), домена СН2, домена СН3 или его варианта или фрагмента. Например, антигенсвязывающий полипептид для применения согласно настоящему изобретению может содержать полипептидную цепь, содержащую домен СН1, полипептидную цепь, содержащую домен СН1, по меньшей мере часть шарнирного домена и домен СН2, полипептидную цепь, содержащую домен СН1 и домен СН3, полипептидную цепь, содержащую домен СН1, по

- 9 045275 меньшей мере часть шарнирного домена и домен СН3, или полипептидную цепь, содержащую домен СН1, по меньшей мере часть шарнирного домена, домен СН2 и домен СН3. Согласно другому варианту осуществления полипептид согласно настоящему изобретению содержит полипептидную цепь, содержащую домен СН3. Кроме того, антитело для применения согласно настоящему изобретению может не содержать по меньшей мере часть домена СН2 (например, весь домен СН2 или его часть). Как изложено выше, специалисту в данной области техники понятно, что константная область тяжелой цепи может быть модифицирована таким образом, что отличается по аминокислотной последовательности от встречающейся в природе молекулы иммуноглобулина.

Константная область тяжелой цепи антитела, описанного в настоящем документе, может происходить из различных молекул иммуноглобулина. Например, константная область тяжелой цепи полипептида может включать домен СН1, происходящий из молекулы IgG1, и шарнирную область, происходящую из молекулы IgG3. В другом примере константная область тяжелой цепи может включать шарнирную область, частично происходящую из молекулы IgG1 и частично из молекулы IgG3. В другом примере часть тяжелой цепи может включать химерный шарнир, частично происходящий из молекулы IgG1 и частично из молекулы IgG4.

В контексте настоящего изобретения термин константная область легкой цепи включает аминокислотные последовательности, происходящие из легкой цепи антитела. Предпочтительно константная область легкой цепи содержит по меньшей мере один из константного каппа-домена или константного лямбда-домена.

Пара легкая цепь-тяжелая цепь относится к совокупности легкой цепи и тяжелой цепи, которые могут образовывать димер посредством дисульфидной связи между доменом CL легкой цепи и доменом СН1 тяжелой цепи.

Как указано ранее, структуры субъединиц и трехмерная конфигурация константных областей различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. В контексте настоящего изобретения термин домен VH включает аминоконцевой вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, а термин домен СН1 включает первый (наиболее аминоконцевой) домен константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Домен СН1 является соседним с доменом VH и является аминоконцевым по отношению к шарнирной области молекулы тяжелой цепи иммуноглобулина.

В контексте настоящего изобретения термин домен СН2 включает часть молекулы тяжелой цепи, которая простирается, например, приблизительно от остатка 244 до остатка 360 антитела с использованием обычных схем нумерации (остатки 244-360, система нумерации по Кабату, и остатки 231- 340, ЕС система нумерации; см. Kabat et al., U.S., Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983). Домен CH2 уникален тем, что он не спарен с другим доменом. Скорее, две N-связанные разветвленные углеводные цепи расположены между двумя доменами СН2 интактной нативной молекулы IgG. Также хорошо задокументировано, что домен СН3 простирается от домена СН2 до С-конца молекулы IgG и включает приблизительно 108 остатков.

В контексте настоящего изобретения термин шарнирная область включает часть молекулы тяжелой цепи, которая соединяет домен СН1 с доменом СН2. Эта шарнирная область состоит приблизительно из 25 остатков и является гибкой, что позволяет двум N-концевым антигенсвязывающим областям двигаться независимо. Шарнирные области можно подразделить на три отдельных домена: верхний, средний и нижний шарнирные домены (Roux et al., J. Immunol., 161:4083 (1998)).

В контексте настоящего изобретения термин дисульфидная связь включает ковалентную связь, образованную между двумя атомами серы. Аминокислота цистеин содержит тиольную группу, которая может образовывать дисульфидную связь или мостик со второй тиольной группой. В большинстве встречающихся в природе молекул IgG области СН1 и CK связаны дисульфидной связью, а две тяжелые цепи связаны двумя дисульфидными связями в положениях, соответствующих 239 и 242, с использованием системы нумерации по Кабату (положение 226 или 229, ЕС система нумерации).

В контексте настоящего изобретения термин химерное антитело означает любое антитело, в котором иммунореактивная область или сайт получены или происходят из первого вида, а константная область (которая может быть интактной, частичной или модифицированной в соответствии с настоящим изобретением) происходит из второго вида. Согласно некоторым вариантам осуществления целевая область или сайт связывания будет происходить из источника, не относящегося к человеку (например, мыши или примата), а константная область является человеческой.

В контексте настоящего изобретения термин процент гуманизации рассчитывается путем определения числа аминокислотных различий каркасной области (т.е. не-CDR различия) между гуманизированным доменом и доменом зародышевой линии, вычитания этого числа из общего числа аминокислот, а затем деления полученного числа на общее число аминокислот и умножения на 100.

Специфически связывается или имеет специфичность в отношении в общем означают, что антитело связывается с эпитопом через свой антигенсвязывающий домен, и что связывание придает некоторую комплементарность между антигенсвязывающим доменом и эпитопом. Согласно этому определению указывают, что антитело специфически связывается с эпитопом, когда оно связывается с этим эпитопом через свой антигенсвязывающий домен более легко, чем оно могло бы связываться со случай- 10 045275 ным, неродственным эпитопом. В контексте настоящего изобретения термин специфичность используется для определения относительной аффинности, с помощью которой определенное антитело связывается с определенным эпитопом. Например, можно считать, что антитело А имеет более высокую специфичность для данного эпитопа, чем антитело В, или можно сказать, что антитело А связывается с эпитопом С с более высокой специфичностью, чем для родственного эпитопа D. Предпочтительно антитело связывается с антигеном (или эпитопом) с высокой аффинностью, а именно с KD, равной 1х10^-7 М или менее, более предпочтительно 5х10^-8 М или менее, более предпочтительно 3х10^-8 М или менее, более предпочтительно 1х10^-8 М или менее, более предпочтительно 25х10^-9 М или менее или даже более предпочтительно 1х10^-9 М или менее.

В контексте настоящего изобретения термины лечить или лечение могут относиться как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам, где цель состоит в предотвращении или замедлении (уменьшении) нежелательного физиологического изменения или нарушения, такого как прогрессирование рака. Благоприятные или желаемые клинические результаты включают без ограничения облегчение симптомов, уменьшение степени заболевания, стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) состояния заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, облегчение или паллиативное течение заболевания и ремиссию (частичную или полную), обнаруживаемые или не обнаруживаемые. Лечение также может означать увеличение продолжительности жизни по сравнению с ожидаемой продолжительностью жизни при отсутствии лечения. Те, кто нуждается в лечении, включают тех, кто уже имеет состояние или нарушение, а также тех, кто склонен к приобретению состояния или нарушения, или тех, у кого состояние или нарушение необходимо предотвратить.

Термином субъект, или индивидуум, или животное, или пациент, или млекопитающее может быть обозначен любой субъект, в частности, млекопитающее, для которого желательна постановка диагноза, составление прогноза или терапия. Субъекты-млекопитающие включают людей, домашних животных, сельскохозяйственных животных, животных, содержащихся в зоопарке, спортивных или домашних животных, таких как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, крупный рогатый скот, коровы и т.д.

В контексте настоящего изобретения фразы, такие как пациент, нуждающийся в лечении или субъект, нуждающийся в лечении включают субъектов, таких как субъекты-млекопитающие, которым будет полезно введение антитела или композиции согласно настоящему изобретению, применяемых, например, для обнаружения, для диагностической методики и/или для лечения.

Анти-PD-LI антитело.

Анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифическое антитело может содержать анти-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в качестве PD-Ll-нацеленной составляющей. Анти-PD-LI антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может проявлять эффективные активности связывания и ингибирования в отношении PD-L1 и может быть полезным для терапевтических и диагностических применений.

Белок PD-L1 представляет собой трансмембранный белок типа 1, массой 40 кДа. Белком PD-L1 может быть человеческий белок PD-L1, и человеческий белок PD-L1 может быть выбран без ограничения из группы, состоящей из белков, представленных в GenBank с номером доступа NP_001254635.1, NP_001300958.1, NP_054862.1 и т.д. Человеческий белок PD-L1 включает внеклеточную часть, включающую N-концевой домен иммуноглобулина V (IgV) (аминокислоты 19-127) и С-концевой домен иммуноглобулина С (IgC) (аминокислоты 133-225). В отличие от ранее существовавших анти-PD-L1 антител, которые связываются с доменом IgV в PD-L1, тем самым нарушая связывание между PD-1 и PD-L1, анти-PD-L1 антитело или его фрагмент, содержащиеся в биспецифическом антителе, не могут связываются с доменом иммуноглобулина V (IgV) белка PD-L1, но связываются с доменом IgC в PD-L1 с эффективным ингибированием PD-L1, тем самым улучшая терапевтические эффекты.

В частности, анти-PD-L1 антитело или его фрагмент, содержащиеся в биспецифическом антителе, могут специфически связываться с доменом иммуноглобулина С (IgC) белка PD-L1. В случае человеческого белка PD-L1, домен IgC содержит или состоит по существу из аминокислотных остатков 133-225 полной длины человеческого белка PD-L1. Более конкретно, анти-PD-L1 антитело или его фрагмент могут связываться с по меньшей мере одним остатком, выбранным из аминокислотных остатков Y134, K162 и N183 человеческого белка PD-L1. Согласно некоторым вариантам осуществления анти-PD-L1 антитело или его фрагмент могут связываться с по меньшей мере двумя остатками, выбранными из ами- 11 045275 нокислотных остатков Y134, K162 и N183 человеческого белка PD-L1. Согласно некоторым вариантам осуществления анти-PD-L1 антитело или его фрагмент не способны связываться с доменом иммуноглобулина V (IgV) белка PD-L1, где домен IgV состоит из аминокислотных остатков 19-127 человеческого белка PD-L1.

Согласно варианту осуществления анти-PD-L1 антитело или его фрагмент способны проявлять специфичность в отношении человеческого белка PD-L1.

(2) CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3;

Таблица 2

Название	CDR анти-PD-L1 антител Последовательность SEQ ID NO:
CDR1VH	SYDMS	1
CDR2 VH	TIS D AGG YIY YS DS V KG	2
	TISDAGGYIYYRDSVKG	3
CDR3VH	EFGKRYAEDY	4
	ELPWRYALDY	5
	EFGKRYALDS	262
	EIFNRYALDY	263
	ELHFRYALDY	264
	ELYFRYALDY	265
	ELLHRYALDY	266
	ELRGRYALDY	267
CDR1VL	KASQDVTPAVA	6
	KAKQDVTPAVA	268
	KASQDVWPAVA	269
CDR2 VL	STSSRYT	7
CDR3 VL	QQHYTTPLT	8
	MQHYTTPLT	270
	QQHSTTPLT	271
	QQHSDAPLT	272

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его фрагмент включают не более одного, не более двух или не более трех из вышеуказанных замещений. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его фрагмент включают CDR1 VH последовательности SEQ ID NO: 1, CDR2 VH последовательности SEQ ID NO: 2 или 3, CDR3 VH последовательности SEQ ID NO: 4, 5, 262, 263,264, 265,266 или 267, CDR1 VL последовательности SEQ ID NO: 6, 268 или 269, CDR2 VL последовательности SEQ ID NO: 7 и CDR3 VL последовательности SEQ ID NO: 8, 270, 271 или 272.

Например, анти-PD-L1 антитело или его фрагмент могут содержать CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или 3, CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или 5, CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, CDR2 VL, имеющую амино- 12 045275 кислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

Обратные мутации могут быть полезными для сохранения определенных характеристик анти-PDL1 антител. Согласно некоторым вариантам осуществления анти-PD-L1 антитела согласно настоящему изобретению, в частности человеческие или гуманизированные антитела, могут включать одну или более из обратных мутаций. Согласно некоторым вариантам осуществления обратная мутация (т.е. включенная аминокислота в специфическом положении) в вариабельной области тяжелой цепи (VH) представляет собой одну или несколько, выбранные из (a) Ser в положении 44, (b) Ala в положении 49, (с) Ala в положении 53, (d) Ile в положении 91, (е) Glu в положении 1, (f) Val в положении 37, (g) Thr в положении 40, (h) Val в положении 53, (i) Glu в положении 54, (j) Asn в положении 77, (k) Arg в положении 94 и (l) Thr в положении 108 вариабельной области тяжелой цепи, согласно нумерации по Кабату, и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам осуществления обратные мутации в VH выбраны из (a) Ser в положении 44, (b) Ala в положении 49, (с) Ala в положении 53 и/или (d) Ile в положении 91 вариабельной области тяжелой цепи согласно нумерации по Кабату и их комбинаций.

Согласно некоторым вариантам осуществления обратная мутация в вариабельной области легкой цепи (VL) представляет собой одну или несколько, выбранные из (a) Ser в положении 22, (b) Gln в положении 42, (с) Ser в положении 43, (d) Asp в положении 60 и (е) Thr в положении 63 вариабельной области легкой цепи согласно нумерации по Кабату и их комбинаций.

Согласно некоторым вариантам осуществления анти-PD-L1 антитело или его фрагмент дополнительно содержит константную область тяжелой цепи, константную область легкой цепи, область Fc или их комбинации. Согласно некоторым вариантам осуществления константная область легкой цепи может представлять собой константную область цепи каппа или лямбда. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело имеет изотип IgG, IgM, IgA, IgE или IgD, например человеческий IgG, человеческий IgM, человеческий IgA, человеческий IgE или человеческий IgD. Согласно некоторым вариантам осуществления изотипом может быть IgG, например, человеческий IgG, такой как IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Согласно некоторым вариантам осуществления фрагментом (антигенсвязывающим фрагментом анти-PD-L1 антитела) может быть любой фрагмент, содержащий CDR тяжелой цепи и/или CDR легкой цепи антитела, и, например, он может быть выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')2, Fd (содержащего вариабельную область тяжелой цепи и домен CH1), Fv (вариабельная область тяжелой цепи и/или вариабельная область легкой цепи), одноцепочечного Fv (scFv, содержащего или по существу состоящего из вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, в любом порядке, и пептидный линкер между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи), одноцепочечных антител, дисульфид-связанных Fv (sdFv) и т.п.

Анти-PD-LI антитело или его фрагмент представляет собой без ограничения химерное антитело, гуманизированное антитело или полностью человеческое антитело. Согласно одному аспекту антитело или его фрагмент имеют не природное происхождение или являются химически или рекомбинантно синтезированными.

Связывание антитела согласно настоящему изобретению с PD-L1 можно оценить с использованием одного или нескольких методов, хорошо известных в данной области техники. Например, согласно предпочтительному варианту осуществления антитело можно протестировать с помощью анализа проточной цитометрии, в котором антитело реагирует с клеточной линией, экспрессирующей человеческий PD-L1, такой как клетки СНО, которые были трансфицированы для экспрессии PD-L1, например, человеческого PD-L1 или обезьяньего PD-L1, например, макак-резус или яванских макак, или мышиного PD-L1, на их клеточной поверхности. Другие подходящие клетки для использования в анализах проточной цитометрии включают анти-CD3-стимулированные CD4+ активированные Т-клетки, которые экспрессируют нативный PD-L1. Другие подходящие анализы связывания включают анализы ELISA, например, с использованием рекомбинантного белка PD-L1. Дополнительно или альтернативно связывание антитела, включая кинетику связывания (например, значение KD), можно протестировать в анализе Biacore. Предпочтительные аффинности связывания антитела согласно настоящему изобретению включают аффинности с константой диссоциации или KD, равной 4,25x10’9 М или менее.

Учитывая, что каждое из этих антител может связываться с PD-L1, таким как человеческий PD-L1, последовательности CDR или последовательности V_H и VL могут быть смешанными и совпадающими с созданием других анти-PD-L1 связывающих молекул согласно настоящему изобретению. Предпочтительно последовательности CDR или цепи V_H и VL являются смешанными или совпадающими, например, последовательность V_H из конкретной пары V_H/V_L замещается аналогичной по структуре последовательностью VH. Аналогичным образом, предпочтительно последовательность VL из конкретной пары VH/VL замещается аналогичной по структуре последовательностью VL.

Анти-4-1ВВ антитело.

Анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифическое антитело может содержать анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в качестве 4-1ВВ-нацеленной составляющей.

Согласно варианту осуществления анти-4-1ВВ антитело или его фрагмент может специфически связываться с белком 4-1ВВ (например, человеческий 4-1ВВ).

- 13 045275

Например, человеческий белок 4-1ВВ может быть выбран без ограничения из группы, состоящей из белков, представленных в NCBI под номером доступа NP_001552 и т.д. Эти анти-4-1ВВ антитела или их антигенсвязывающие фрагменты способны усиливать иммунный ответ и/или лечить опухоль (рак) у млекопитающего. Анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент характеризуются локализацией и/или активацией только в микроокружении опухоли (ТМЕ) и/или значительно сниженной токсичностью для печени по сравнению с ранее существовавшими анти-4-1ВВ антителами, при сохранении эффективности усиления иммунного ответа и/или лечения опухоли.

Термин 4-1ВВ относится к CD137 или TNFRSF9 (член 9 суперсемейства 25 TNF рецепторов), является членом суперсемейства TNF-рецепторов (TNFRSF) и является костимулирующей молекулой, которая экспрессируется после активации иммунных клеток, как клеток врожденной иммунной системы, так и клеток адаптивной иммунной системы. В контексте настоящего изобретения 4-1ВВ может происходить из млекопитающих, например, Homo sapiens (человека) (номер доступа NCBI NP_001552). Например, человеческий белок 4-1ВВ (NP_001552) может быть представлен аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 9), как показано ниже:

mgnscyniva tlllvlnfcr trslqdpcsn cpagtfcdnn rnqicspcpp nsfssaggqr

161 tcdicrqckg vfrtrkecss tsnaecdctp gfhclgagcs mceqdckqgq eltkkgckdc

121 cfgtfndqkr gicrpwtncs Idgksvlvng tkerdvvcgp spadlspgas svtppapare

181 pghspqiisf flaltstall fllffltlrf svvkrgrkkl lyifkqpfmr pvqttqeedg

241 cscrfpeeee ggcel

Как описано в настоящем документе, термин 4-1ВВ включает варианты, изоформы, гомологи, ортологи и паралоги. Например, антитела, специфические для белка человеческого 4-1ВВ, могут в некоторых случаях перекрестно реагировать с белком 4-1ВВ других видов, отличных от человека. Согласно другим вариантам осуществления антитела, специфические для человеческого белка 4-1ВВ, могут быть полностью специфическими для человеческого белка 4-1ВВ и могут проявлять видовые или другие типы перекрестной реактивности или могут перекрестно реагировать с 4-1ВВ других определенных видов, но не всех других видов (например, перекрестная реакция с обезьяньим 4-1ВВ, но не с мышиным 4-1ВВ). Термин человеческий 4-1ВВ относится к человеческой последовательности 4-1ВВ, такой как полная аминокислотная последовательность человеческого 4-1ВВ, имеющая регистрационный номер NCBI NP_001552. Термин мышиный 4-1ВВ относится к мышиной последовательности 4-1ВВ, такой как полная аминокислотная последовательность мышиного 4-1ВВ, имеющая регистрационный номер NCBI NP 033430.1. 4-1BB также может быть известным в данной области техники, например, CD137. Последовательность человеческого 4-1ВВ согласно настоящему раскрытию может отличаться от последовательности человеческого 4-1ВВ с регистрационным номером NCBI NP_001552, например, наличием консервативных мутаций или мутаций в неконсервативных областях, и 4-1ВВ согласно настоящему раскрытию имеет по существу такую же биологическую функцию, что и человеческий 4-1ВВ с регистрационным номером NCBI NP_001552.

Как показано в экспериментальных примерах, анти-4-1ВВ антитела, раскрытые в настоящем документе, показывают способности связываться с 4-1ВВ, способности связываться с 4-1ВВ, который экспрессируется на клеточной поверхности, и высокие аффинности связывания с 4-1ВВ. Кроме того, как продемонстрировано в экспериментальном примере, анти-4-1ВВ антитело, раскрытое в настоящем документе, особенно в комбинации с αнти-PD-L1 антителом, раскрытым в настоящем документе, способно активировать Т-клетки. Кроме того, как показано в экспериментальном примере, анти-4-1ВВ антитело, раскрытое в настоящем документе, имеет усиленный противоопухолевый эффект in vivo.

Эти анти-4-1ВВ антитела могут быть полезными для терапевтических целей, таких как лечение различных типов рака и т.д., а также могут быть полезны для диагностических и прогностических целей.

Согласно варианту осуществления анти-4-1ВВ антитело или его фрагмент способны к специфичности в отношении человеческого белка 4-1ВВ. Анти-4-1ВВ антитело или его фрагмент могут содержать (i) CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10 и 11;

Например, анти-4-1ВВ антитело или его фрагмент могут содержать CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 или 11, CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или 13, CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, 15, 16 или 17, CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDR2 VL,

- 14 045275 имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.

Таблица 3

Название CDR1VH	CDR анти-4-1ВВ антител Последовательность SEQ ID NO: SYDMS 10
	GYDMS	11
CDR2 VH	WISYSGGSIYYADSVKG VIYPDDGNTYYADSVKG	12 13
CDR3 VH	DGQRNSMREFDY HGGQKPTTKSSSAYGMDG DAQRNSMREFDY DAQRQSMREFDY	14 15 16 17
CDR1VL	SGSSSNIGNNYVT	18
CDR2 VL	ADSHRPS	19
CDR3 VL	ATWDYSLSGYV	20

В неограничивающих примерах анти-4-1ВВ антитела или его фрагмента, (1) вариабельная область тяжелой цепи может содержать или по существу состоять из полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21, 22, 23 и 24, или полипептида, имеющего идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с вышеописанными аминокислотными последовательностями, и/или (2) вариабельная область легкой цепи может содержать или по существу состоять из полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25 и 26, или полипептида, имеющего идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% с вышеописанными аминокислотными последовательностями.

Неограничивающие примеры анти-4-1ВВ антитела или его фрагмента могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую или по существу состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, 22, 23 или 24.

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKCLEWVSWISYS

GGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGQRNSMREFDYW

GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 21)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYDMSWVRQAPGKCLEWVSVIYPD DGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDAAVYYCAKHGGQKPTTKSSSAY GMDGWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 22)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKCLEWVSWISYS GGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAQRNSMREFDYW GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 23)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKCLEWVSWISYS GGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAQRQSMREFDYW GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 24)

Неограничивающие примеры анти-4-1ВВ антитела или его фрагмента могут содержать вариабельную область легкой цепи, содержащую или по существу состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25 или 26.

- 15 045275

QSVLTQPPSASGTPGRRVTISCSGSSSNIGNNYVTWYQQLPGTAPKLLIYADSHRP SGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDYSLSGYVFGCGTKLTVL (SEQ ID NO: 25)

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNYVTWYQQLPGTAPKLLIYADSHRP

SGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDYSLSGYVFGCGTKLTVL (SEQ ID

NO: 26)

Антитела согласно настоящему изобретению характеризуются конкретными функциональными признаками или свойствами антител. Например, антитела специфически связываются с человеческим 4-1ВВ и могут связываться с 4-1ВВ некоторых других видов, например, обезьяньим 4-1ВВ, например, яванских макак, макак-резус, но могут по существу не связываться с 4-1ВВ некоторых других видов, например, мышиным 4-1ВВ. Предпочтительно антитело согласно настоящему изобретению связывается с человеческим 4-1ВВ с высокой аффинностью.

Кроме того, антитело согласно настоящему изобретению, в частности, как биспецифическое антитело, содержащее анти-PD-L1 антитело, согласно настоящему изобретению, обладает способностью усиливать пролиферацию иммунных клеток, выживаемость, секрецию цитокинов и цитолитическую активность Т-клеток CD8. Согласно определенным вариантам осуществления антитело согласно настоящему изобретению, в частности, как биспецифическое антитело, содержащее анти-PD-L1 антитело, согласно настоящему изобретению, связывается с человеческим 4-1ВВ и проявляет способность активировать Т-клетки.

Другие средства оценки способности антитела стимулировать иммунный ответ включают способность антитела ингибировать рост опухоли, например, на модели с трансплантатом опухоли in vivo.

Связывание антитела согласно настоящему изобретению с 4-1ВВ можно оценить с использованием одного или нескольких методов, хорошо известных в данной области техники. Например, согласно предпочтительному варианту осуществления антитело можно протестировать с помощью анализа проточной цитометрии, в котором антитело реагирует с клеточной линией, экспрессирующей человеческий 4-1ВВ, такой как клетки СНО, которые были трансфицированы для экспрессии 4-1ВВ, например, человеческого 4-1ВВ или обезьяньего 4-1ВВ, например макак-резус или яванских макак, или мышиного 4-1ВВ, на их клеточной поверхности. Другие подходящие клетки для использования в анализах проточной цитометрии включают анти-CD3-стимулированные CD4+ активированные Т-клетки, которые экспрессируют нативный 4-1ВВ. Другие подходящие анализы связывания включают анализы ELISA, например, с использованием рекомбинантного белка 4-1ВВ.

Дополнительно или альтернативно связывание антитела, включая кинетику связывания (например, значение KD), можно протестировать в анализе Octet. Предпочтительные аффинности связывания антитела согласно настоящему изобретению включают аффинности с константой диссоциации или KD, равной 1,80х10^-9 М или менее.

Согласно некоторым вариантам осуществления anti-4-1BB антитело или его фрагмент дополнительно содержит константную область тяжелой цепи, константную область легкой цепи, область Fc или их комбинации. Согласно некоторым вариантам осуществления константная область легкой цепи может представлять собой константную область цепи каппа или лямбда. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело имеет изотип IgG, IgM, IgA, IgE или IgD, например человеческий IgG, человеческий IgM, человеческий IgA, человеческий IgE или человеческий IgD. Согласно некоторым вариантам осуществления изотипом может быть IgG, например человеческий IgG, такой как IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Согласно некоторым вариантам осуществления фрагментом (антигенсвязывающим фрагментом анти-PD-L1 антитела) может быть любой фрагмент, содержащий CDR тяжелой цепи и/или CDR легкой цепи антитела, и, например, он может быть выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')₂, Fd (содержащего вариабельную область тяжелой цепи и домен CH1), Fv (вариабельная область тяжелой цепи и/или вариабельная область легкой цепи), одноцепочечного Fv (scFv, содержащего или по существу состоящего из вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, в любом порядке, и пептидный линкер между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи), одноцепочечных антител, дисульфид-связанных Fv (sdFv) и т.п.

Анти-4-1ВВ антитело или его фрагмент без ограничения представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или полностью человеческое антитело. Согласно одному аспекту антитело или его фрагмент имеют не природное происхождение или являются химически или рекомбинантно синтезированными.

Учитывая, что каждое из этих антител может связываться с 4-1ВВ, таким как человеческий 4-1ВВ, последовательности CDR или последовательности VH и V_L могут быть смешанными и совпадающими с созданием других анти-4-1ВВ связывающих молекул согласно настоящему изобретению. Предпочтительно последовательности CDR или цепи VH и VL являются смешанными или совпадающими, например, последовательность VH из конкретной пары VH/VL замещается аналогичной по структуре последовательностью VH. Аналогичным образом, предпочтительно последовательность VL из конкретной пары

- 16 045275

VH/VL замещается аналогичной по структуре последовательностью V_L.

Aнти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифическое антитело.

В биспецифическом антителе, содержащем PD-L1-нацеленную составляющую и 4-1ВВ-нацеленную составляющую, одна из PD-L1-нацеленной составляющей и 4-1ВВ-нацеленной составляющей может быть антителом полной длины, а другая может быть антигенсвязывающим фрагментом (например, scFv), содержащим CDR тяжелой цепи, CDR легкой цепи или их комбинацию. Антитело полной длины, нацеленное на один из белков PD-L1 и 4-1ВВ, и антигенсвязывающий фрагмент, нацеленный на другой белок, могут быть химически связаны (например, ковалентно связаны) напрямую или через пептидный линкер. Антигенсвязывающий фрагмент (например, scFv) может быть связан напрямую или через пептидный линкер с N-концом антитела полной длины (например, N-концом легкой цепи или тяжелой цепи антитела полной длины), С-концом антитела полной длины (например, С-концом тяжелой цепи (или Fc или домен СН3) антитела полной длины) или и тем, и другим (см. фиг. 1А и 1В).

Согласно варианту осуществления биспецифическое антитело может содержать анти-PD-L1 антитело полной длины, антигенсвязывающий фрагмент (например, scFv) анти-4-1ВВ антитела и пептидный линкер между ними. Согласно другому варианту осуществления биспецифическое антитело может содержать ати-4-1ВВ антитело полной длины, антигенсвязывающий фрагмент (например, scFv) анти-PD-L1 антитела и пептидный линкер между ними.

Согласно варианту осуществления scFv, содержащийся в биспецифическом антителе, может содержать вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи в любом порядке. Например, scFv, содержащийся в биспецифическом антителе, может содержать вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи в направлении от N-конца к С-концу и необязательно пептидный линкер между ними или альтернативно scFv, содержащийся в биспецифическом антителе, может содержать вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи в направлении от N-конца к С-концу и необязательно пептидный линкер между ними.

Согласно варианту осуществления анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифическое антитело активирует передачу сигналов 4-1ВВ и, в результате, иммунный ответ, в зависимости от PD-L1, экспрессируемого на клеточных поверхностях.

Применение пептидного линкера для биспецифического антитела может привести к высокой чистоте антитела.

В контексте настоящего изобретения термин пептидный линкер может включать любые аминокислоты от 1 до 100, в частности от 2 до 50, и любые виды аминокислот могут быть включены без какихлибо ограничений. Пептидный линкер может включать, например, остатки Gly, Asn и/или Ser, а также включать нейтральные аминокислоты, такие как Thr и/или Ala. Аминокислотные последовательности, подходящие для пептидного линкера, могут быть известными в соответствующей области. Между тем, длина пептидного линкера может быть определена различно внутри такого предела, при котором функции слитого белка не будут затронуты. Например, пептидный линкер может быть образован включением в общем от приблизительно 1 до приблизительно 100, от приблизительно 2 до приблизительно 50 или от приблизительно 5 до приблизительно 25 из одной или нескольких аминокислот, выбранных из группы, состоящей из Gly, Asn, Ser, Thr и Ala. Согласно одному варианту осуществления пептидный линкер может быть представлен как (GmS1)_n (m, 1 и n независимо представляют собой целое число от приблизительно 1 до приблизительно 10, в частности целое число от приблизительно 2 до приблизительно 5). Например, примеры пептидных линкеров обобщены следующим образом:

- 17 045275

ΤΙρΕхеры

Фунжзжя

Слитый белок «ылк. |

	sfw	гибкий	В A ., n.S.	\|
	*SS - м	гибкий	А‘-· .мм
: Увеличение : стабильности	НИМ M.S.	гибкий	к Л а А.,	%
складчатости	Mnl М\|.	гибкий	п.М,
	альбумин \м	гибкий		'^Н
	белок оболочки вируса	жесткий	>1 хххк-	¹
	бета глюканаза ксиланз за жесткий	и М\к« <Г. Ь'·
Повышение	спим* в Ык.н	жесткий ХМ хххкмы хм хххю.х	.М
: экспрессии	η ₍ М Г: и На,·. М	жесткий \ хмл: 1 хнх х хко	•у

Улучшение

п < SF П'	гибкий	MM .ns.	Mi
п < Si Щ	жесткий	X f X X ХМ, Mt \<< ХХХМ, X	ρ·1
h. И !r	жести!	ΧΊ X XXL у XI 1 Хй \ \ чкч	4< ;
	гибкий		ui.inS	ИЧ
HE X-H X- MS	жесткий		ГМ’ хг	РЧ
USX HX ?-·	жестки!		М'.х X ХМ X X XX X	цц
HA HHS	гибкий		_Н н а и м_к\| П, .
интерферон - ,.·ρ. s ·	жееии		А..ММ, ,г. Unn	М\|
	расщепляемый	дисульфидная	. м
J V. \	расшепляемый	дисульфидная	М.;

IA альбумин расщепляемый ъуЬМ Hi и .'ХИ'П’Ч

-и

Придание

ХГ I! Ч

ШжвИИжГ

PV

ГЦ 1 >х \ ' м X ипл« t smsy < MU.R <,S‘ /•С^: мм

MARX KR Мп

RRKKKKR Е Н‘>

i'k <. < Si С и МН И жесткий хл \ \\ю, х; I хн \ х \К \ м расшеп-тчемый дисульфидная |

Согласно другому варианту осуществления как PD-L1-нацеленная составляющая, так и 4-1ВВнацеленная составляющая могут представлять собой антитело полной длины или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR тяжелой цепи, CDR легкой цепи или их комбинацию.

Согласно другому варианту осуществления биспецифическое антитело может быть в гетеродимерной форме, которая содержит первое плечо, включающее пару из первой тяжелой цепи и первой легкой цепи, нацеленных на один из PD-L1 и 4-1ВВ, и второе плечо, включающее пару второй тяжелой цепи и второй легкой цепи, нацеленных на другой.

Согласно варианту осуществления антитело полной длины может быть в форме иммуноглобулина полной длины (например, IgG, IgM, IgA, IgE или IgD, как например, человеческий IgG, человеческий IgM, человеческий IgA, человеческий IgE или человеческий IgD), и антигенсвязывающий фрагмент может быть выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')₂, Fd, Fv, scFv, одноцепочечных антител, sdFv и т.п., как описано выше. Например, антитело полной длины может быть в форме человеческого IgG полной длины (человеческий IgG1, человеческий IgG2, человеческий IgG3 или человеческий IgG4), а антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой scFv.

Например, антитело, описанное в настоящем документе, может содержать гибкую линкерную последовательность или может быть модифицировано с добавлением функциональной составляющей (например, ПЭГ, лекарственное средство, токсин или метка).

Антитела или варианты, описанные в настоящем документе, могут содержать производные, которые модифицированы, например, ковалентным присоединением любого типа молекулы к антителу, так что ковалентное присоединение не препятствует связыванию антитела с антигеном (например, эпитопом). Например, без ограничения антитела можно модифицировать, например, по меньшей мере одним, выбранным из группы, состоящей из гликозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфорилиро

- 18 045275 вания, фосфорилирования, амидирования, дериватизации известными защитными/блокирующими группами, протеолитического расщепления, связи с клеточным лигандом или другим белком и т.п. Любая из многочисленных химических модификаций может быть проведена известными способами, включая без ограничения специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникамицина и т.д. Кроме того, антитела могут содержать одну или несколько неклассических аминокислот.

Антитела или их фрагменты могут быть помечены детектируемой меткой посредством введения метки (связывания) с обычным вносящими метку веществами, выбранным из хемилюминесцентных соединений, флуоресцентных соединений (например, металлов, излучающих флуоресценцию), радиоизотопов, красителей и т.д. Присутствие меченных антител или их фрагментов может быть обнаружено путем измерения сигнала, возникающего в ходе химической реакции между антителом (или его фрагментом) и вносящим метку веществом. Примерами особенно подходящего вносящего метку вещества могут быть по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из люминола, изолюминола, тероматического сложного эфира акридиния, имидазола, соли акридиния, сложного эфира оксалата, металлов, излучающих флуоресценцию, и т.п. Например, излучающие флуоресценцию металлы могут представлять собой ¹⁵²Eu или другие из ряда лантаноидов. Эти металлы могут быть присоединены к антителу с использованием таких хелатирующих групп металлов, как диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA) или этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA).

Согласно определенным вариантам осуществления полученные биспецифические антитела не будут вызывать вредный иммунный ответ у животного, которое подлежит лечению, например, у человека. Согласно одному варианту осуществления биспецифическое антитело можно модифицировать для снижения его иммуногенности с использованием любых обычных методик. Например, биспецифическое антитело может быть гуманизированным, приматизированным, деиммунизированным или химерным антителом. Эти типы антител происходят из нечеловеческого антитела, как правило, из мышиного антитела или антитела приматов, которое сохраняет или в значительной степени сохраняет антигенсвязывающие свойства родительского антитела, но которое менее иммуногенно для человека. Это может быть достигнуто различными способами, включая (а) трансплантацию целых нечеловеческих вариабельных доменов на человеческие константные области с образованием химерных антител;

(b) прививание по меньшей мере части одной или нескольких нечеловеческих определяющих комплементарность областей (CDR) в человеческий каркас и константные области с сохранением или без сохранения критических остатков каркаса; или (с) трансплантацию целых нечеловеческих вариабельных доменов, но маскировку их участком, подобным человеческому, путем замены поверхностных остатков.

Деиммунизацию также можно использовать для снижения иммуногенности антитела. В контексте настоящего изобретения термин деиммунизация может включать изменение антитела с модификацией Т-клеточных эпитопов (см., например, публикации международных заявок № WO/9852976 A1 и WO/0034317 A2). Например, анализируют вариабельные последовательности тяжелой цепи и вариабельные последовательности легкой цепи исходного антитела и создают карту Т-клеточных эпитопов человека из каждой V (вариабельной) области, показывающую расположение эпитопов по отношению к определяющим комплементарность областям (CDR) и другим ключевым остаткам в последовательности. Индивидуальные Т-клеточные эпитопы из карты Т-клеточных эпитопов анализируют для того, чтобы идентифицировать альтернативные аминокислотные замены с низким риском изменения активности конечного антитела. Разрабатывают ряд альтернативных вариабельных последовательностей тяжелой цепи и вариабельных последовательностей легкой цепей, включающих комбинации аминокислотных замен, и эти последовательности затем включают в ряд связывающих полипептидов. Как правило, создают от 12 до 24 вариантных антител и тестируют на связывание и/или функцию. Полные гены тяжелой и легкой цепей, содержащие модифицированные вариабельные и человеческие константные области, затем клонируют в экспрессионные векторы, а последующие плазмиды вводят в клеточные линии с получением полного антитела. Затем антитела сравнивают в соответствующих биохимических и биологических анализах, и определяют оптимальный вариант.

Специфичность и/или аффинность связывания биспецифического антитела к каждому белкумишени можно определить с помощью любого обычного анализа, например, без ограничения анализов in vitro, таких как иммунопреципитация, радиоиммуноанализ (RIA) или ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA).

В качестве альтернативы способы, описанные для получения одноцепочечных единиц (патент США № 4694778 и т.д.), могут быть адаптированы для получения одноцепочечных единиц согласно настоящему изобретению. Одноцепочечные единицы образуются путем связывания фрагментов тяжелой и легкой цепей области Fv через аминокислотный мостик (пептидный линкер), в результате чего получают одноцепочечный слитый пептид (scFv). Также можно использовать способы сборки функциональных фрагментов Fv в Е.coli.

Примеры методик, которые можно использовать для получения одноцепочечных Fv (scFv) и анти

- 19 045275 тел, включают методики, описанные в патентах США № 4946778, 5258498 и т.д.). Для некоторых применений, включая использование антител in vivo у людей и анализы обнаружения in vitro, может быть предпочтительным использование химерных, гуманизированных или человеческих антител. Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой разные части антитела происходят из разных видов животных, такие как антитела, имеющие вариабельную область, полученную из мышиного моноклонального антитела, и константную область иммуноглобулина человека. Способы получения химерных антител известны в данной области техники. См., например, патент США № 5807715, 4816567 и 4816397, которые включены в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Гуманизированные антитела представляют собой молекулы антител, происходящие из антител видов, не относящихся к человеку, которые связывают желаемый антиген, имеющие одну или несколько определяющих комплементарность областей (CDR) из видов, не относящихся к человеку, и каркасные области из молекулы иммуноглобулина человека. Часто каркасные остатки в каркасных областях человека заменяют соответствующим остатком из CDR-донорного антитела для изменения, предпочтительно улучшения, связывания антигена. Эти замены каркаса идентифицируются способами, хорошо известными в данной области техники, например, путем моделирования взаимодействий CDR и остатков каркаса для идентификации остатков каркаса, важных для связывания антигена, и сравнения последовательностей для идентификации необычных остатков каркаса в определенных положениях (см., например, Queen et al., патент США № 5585089, которые включены в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте). Антитела можно гуманизировать, используя различные способы, известные в данной области техники, включая, например, прививание CDR (патенты США № 5225539, 5530101, 5585089 и т.д., каждый из которых включен посредством ссылки во всей своей полноте), маскировку поверхностных остатков или перекладку (ЕР 592106; ЕР 519596, каждый из которых включен посредством ссылки во всей своей полноте) и перестановку цепей (патент США № 5565332, который включен посредством ссылки во всей своей полноте).

Полностью человеческие антитела особенно предпочтительны для терапевтического лечения пациентов-людей. Человеческие антитела можно получить множеством способов, известных в данной области техники, включая способы фагового дисплея с использованием библиотек антител, происходящих из последовательностей иммуноглобулинов человека. См. также патенты США. № 4444887, 4716111 и т.д., каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Человеческие антитела также могут быть получены с использованием трансгенных мышей, которые неспособны экспрессировать функциональные эндогенные иммуноглобулины, но которые могут экспрессировать гены иммуноглобулина человека. Например, комплексы генов иммуноглобулина тяжелой и легкой цепей человека можно вводить случайным образом или путем гомологичной рекомбинации в мышиные эмбриональные стволовые клетки. Альтернативно человеческая вариабельная область, константная область и область разнообразия могут быть введены в мышиные эмбриональные стволовые клетки в дополнение к генам тяжелой и легкой цепей человека.

Мышиные гены иммуноглобулина тяжелой и легкой цепи могут быть сделаны нефункциональными отдельно или одновременно с введением локусов иммуноглобулина человека путем гомологичной рекомбинации. В частности, гомозиготная делеция области JH предотвращает продукцию эндогенных антител. Модифицированные эмбриональные стволовые клетки размножают и вводят посредством микроинъекции в бластоцисты с получением химерных мышей. Затем химерных мышей разводят с получением гомозиготного потомства, экспрессирующего человеческие антитела. Трансгенных мышей иммунизируют обычным образом выбранным антигеном, например, всем или частью желаемого полипептидамишени. Моноклональные антитела, направленные против антигена, можно получить от иммунизированных трансгенных мышей с использованием общепринятой гибридомной технологии. Трансгены человеческого иммуноглобулина, которые несут трансгенные мыши, перестраиваются в ходе дифференцировки В-клеток, а затем подвергаются переключению классов и соматической мутации. Таким образом, используя такой способ, можно получить терапевтически полезные антитела IgG, IgA, IgM и IgE.

Полностью человеческие антитела, которые распознают выбранный эпитоп, также могут быть получены с использованием способа, называемого управляемый отбор. В этом подходе выбранное моноклональное антитело нечеловеческого происхождения, например, мышиное антитело, используются для направления выбора полностью человеческого антитела, распознающего тот же эпитоп.

Согласно другому варианту осуществления ДНК, кодирующая желаемые моноклональные антитела, может быть легко выделена и секвенирована с использованием обычных методик (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи мышиных антител). Выделенные и субклонированные клетки гибридомы служат предпочтительным источником такой ДНК. После выделения ДНК может быть помещена в экспрессионные векторы, которые затем трансфицируют в прокариотические или эукариотические клетки-хозяева, такие как клетки Е.coli, клетки COS обезьяны, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые в противном случае не продуцируют иммуноглобулины. Более конкретно, выделенная ДНК (которая может быть синтетической, как описано в настоящем документе) может быть использована для клонирования последовательностей константной и вариабельной области с получением

- 20 045275 антител, как описано в Newman et al., патент США № 5658570, который включен в настоящий документ посредством ссылки. По существу, это приводит к экстракции РНК из выбранных клеток, превращению в кДНК и амплификации посредством ПЦР с использованием праймеров, специфичных для Ig. Подходящие для этой цели праймеры также описаны в патенте США № 5658570. Как будет более подробно описано ниже, трансформированные клетки, экспрессирующие желаемое антитело, можно выращивать в относительно больших количествах для обеспечения клинических и коммерческих поставок иммуноглобулина.

Кроме того, посредством применения обычных методик рекомбинантной ДНК, одна или несколько CDR биспецифического антитела могут быть вставлены в каркасные области, например, в каркасные области человека для того, чтобы гуманизировать нечеловеческое антитело. Каркасные области могут быть природного происхождения или консенсусными каркасными областями и предпочтительно человеческими каркасными областями (см., например, Chothia et al., J. Mol. Biol., 278:457-479 (1998) в отношении перечня человеческих каркасных областей). Например, полинуклеотид, создаваемый комбинацией каркасных областей и CDR, кодирует антитело, которое специфически связывается по меньшей мере с одним эпитопом желаемого полипептида, например, LIGHT. Предпочтительно одна или несколько аминокислотных замен могут быть сделаны в каркасных областях, и предпочтительно аминокислотные замены улучшают связывание антитела с его антигеном (или эпитопом). Кроме того, такие способы можно использовать для аминокислотных замен или делеций одного или нескольких остатков цистеина вариабельной области, участвующих во внутрицепочечной дисульфидной связи, для создания молекул антител, лишенных одной или нескольких внутрицепочечных дисульфидных связей. Другие изменения полинуклеотида охватываются настоящим раскрытием и находятся в рамках компетенции специалиста в данной области техники.

Кроме того, можно использовать методики, разработанные для получения химерных антител путем сплайсинга генов из молекулы мышиного антитела с соответствующей антигенной специфичностью, вместе с генами из молекулы человеческого антитела с соответствующей биологической активностью. В контексте настоящего изобретения химерное антитело представляет собой молекулу, в которой разные части происходят из разных видов животных, например, имеющую вариабельную область, полученную из мышиного моноклонального антитела, и константную область человеческого иммуноглобулина.

Альтернативно клеточные линии, продуцирующие антитела, могут быть отобраны и культивированы с использованием методик, хорошо известных специалисту в данной области техники. Такие методики описаны в различных лабораторных руководствах и первичных публикациях.

Кроме того, стандартные методики, известные специалистам в данной области техники, могут быть использованы для введения мутаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело согласно настоящему изобретению, включая без ограничения сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез, которые приводят к аминокислотным заменам. Предпочтительно варианты (включая производные) кодируют менее 50 аминокислотных замен, менее 40 аминокислотных замен, менее 30 аминокислотных замен, менее 25 аминокислотных замен, менее 20 аминокислотных замен, менее 15 аминокислотных замен, менее 10 аминокислотных замен, менее 5 аминокислотных замен, менее 4 аминокислотных замен, менее 3 аминокислотных замен или менее 2 аминокислотных замен относительно эталонной вариабельной области тяжелой цепи, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, вариабельной области легкой цепи, CDR-L1, CDR-L2 или CDR-L3. Альтернативно мутации могут быть введены случайным образом вдоль всей или части кодирующей последовательности, например, с помощью насыщающего мутагенеза, и полученные мутанты могут быть подвергнуты скринингу на биологическую активность для выявления мутантов, которые сохраняют активность.

Неограничивающие примеры анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифического антитела приведены в табл. 4 ниже.

В контексте настоящего изобретения тяжелый компонент означает компонент анти-PD-L1/анти-41ВВ биспецифического антитела согласно настоящему изобретению, который содержит (1) тяжелую цепь анти-PD-L1 антитела и (2) тяжелую цепь и легкую цепь анти-4-1ВВ антитела.

В контексте настоящего изобретения легкий компонент означает компонент анти-PD-L1/анти-41BB биспецифического антитела согласно настоящему изобретению, который содержит легкую цепь анти-PD-L1 антитела.

- 21 045275

Таблица 4

Примеры анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифического антитела

ABLPNB.01

Тяжелый компонент

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDM SWVRQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYSDSVKGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICAREFG KRYALDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVS

SEQ ID NO: 27

		VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASG TPGRRVTISCSGSSSNIGNNYVTWYQQLPGTAPK LLIYADSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSE DEADYYCATWDYSLSGYVFGCGTKLTVLGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSL RLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKCLEWVSWI SYSGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNS LRAEDTAVYYCARDGQRNSMREFDYWGQGTLV TVSS
Легкий компонент	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVA WYQQKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSG TDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTK LEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPRE AKVQWKVDNALQS GNS QES VTEQDS KDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC	SEQ ID NO: 28
ABLPNB.02	Тяжелый компонент	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDM SWVRQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYSDSVKGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICAREFG KRYALDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASG TPGQRVTISCSGSSSNIGNNYVTWYQQLPGTAPK	SEQ ID NO: 29

- 22 045275

		LLIYADSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSE DEADYYCATWDYSLSGYVFGCGTKLTVLGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSL RLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKCLEWVSWI SYSGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNS LRAEDTAVYYCARDAQRNSMREFDYWGQGTLV TVSS
Легкий компонент	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVA WYQQKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSG TDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTK LEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPRE AKVQWKVDNALQS GNS QES VTEQDS KDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC	SEQ ID NO: 30
ABLPNB.03	Тяжелый компонент	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDM SWVRQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYSDSVKGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICAREFG KRYALDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASG TPGRRVTISCSGSSSNIGNNYVTWYQQLPGTAPK LLIYADSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSE DEADYYCATWDYSLSGYVFGCGTKLTVLGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSL RLSCAASGFTFSGYDMSWVRQAPGKCLEWVSVI YPDDGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN	SEQ ID NO: 31

- 23 045275

		SLRAEDAAVYYCAKHGGQKPTTKSSSAYGMDG WGQGTLVTVSS
Легкий компонент	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVA WYQQKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSG TDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTK LEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC	SEQ ГО NO: 32
ABLPNB.04	Тяжелый компонент	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDM SWVRQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICARELP WRYALDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSAS GTPGRRVTISCSGSSSNIGNNYVTWYQQLPGTAP KLLIYADSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRS EDEADYYCATWDYSLSGYVFGCGTKLTVLGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKCLEWVS WISYSGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAEDTAVYYCARDGQRNSMREFDYWGQGT LVTVSS	SEQ ГО NO: 33

- 24 045275

	Легкий компонент	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVA WYQQKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSG TDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTK LEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC	SEQ ID NO: 34
ABLPNB.05	Тяжелый компонент	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDM SWVRQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICARELP WRYALDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTS GGT AALGCLVKD YFPEPVTVS WNS GALTS G VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSAS GTPGRRVTISCSGSSSNIGNNYVTWYQQLPGTAP KLLIYADSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRS EDEADYYCATWDYSLSGYVFGCGTKLTVLGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKCLEWVS WISYSGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAEDTAVYYCARDAQRNSMREFDYWGQGT LVTVSS	SEQ ГО NO: 35
Легкий компонент	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVA WYQQKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSG TDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTK LEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST	SEQ ID NO: 36

- 25 045275

		YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC
ABLPNB.06	Тяжелый компонент	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDM SWVRQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICARELP WRYALDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSAS GTPGRRVTISCSGSSSNIGNNYVTWYQQLPGTAP KLLIYADSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRS EDEADYYCATWDYSLSGYVFGCGTKLTVLGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKCLEWVS WISYSGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAEDTAVYYCARDAQRQSMREFDYWGQGT LVTVSS	SEQ ID NO: 37
Легкий компонент	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVA WYQQKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSG TDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTK LEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC	SEQ ID NO: 38

- 26 045275

ABLPNB.07	Тяжелый компонент	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDM SWVRQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICARELP WRYALDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSAS GTPGQRVTISCSGSSSNIGNNYVTWYQQLPGTAP KLLIYADSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRS EDEADYYCATWDYSLSGYVFGCGTKLTVLGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKCLEWVS WISYSGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAEDTAVYYCARDAQRNSMREFDYWGQGT LVTVSS	SEQ ID NO: 39
Легкий компонент	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVA WYQQKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSG TDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTK LEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC	SEQ ID NO: 40

- 27 045275

ABLPNB.O8	Тяжелый компонент	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDM SWVRQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICARELP WRYALDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSAS GTPGQRVTISCSGSSSNIGNNYVTWYQQLPGTAP KLLIYADSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRS EDEADYYCATWDYSLSGYVFGCGTKLTVLGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKCLEWVS WISYSGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAEDTAVYYCARDAQRQSMREFDYWGQGT LVTVSS	SEQ ID NO: 41
Легкий компонент	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVA WYQQKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSG TDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTK LEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC	SEQ ID NO: 42

- 28 045275

ABLPNB.09	Тяжелый компонент	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDM SWVRQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICARELP WRYALDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSAS GTPGRRVTISCSGSSSNIGNNYVTWYQQLPGTAP KLLIYADSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRS EDEADYYCATWDYSLSGYVFGCGTKLTVLGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTFSGYDMSWVRQAPGKCLEWVS VIYPDDGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDAAVYYCAKHGGQKPTTKSSSAYGM DGWGQGTLVTVSS	SEQ ID NO: 43
Легкий компонент	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVA WYQQKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSG TDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTK LEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC	SEQ ID NO: 44

Терапевтическое применение биспецифического антитела.

Биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению способно одновременно блокировать активности PD-L1 и 4-1ВВ, тем самым проявляя улучшенные эффекты при иммунотерапии и/или лечении рака, например, путем активации иммунного ответа (см. фиг. 2). Учитывая способность биспецифических антитела согласно настоящему изобретения ингибировать связывание PD-L1 с молекулами PD-1 и стимулировать антиген-специфические Т-клеточные ответы, настоящее изобретение также относится к композиции или in vitro и in vivo способам применения антител согласно настоящему изобретению, усиления или повышающего регулирования антиген-специфических Т-клеточных ответов.

Согласно варианту осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей биспецифическое антитело, как описано выше. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция может применяться для стимуляции иммунного ответа (например, антиген-специфического Т-клеточного ответа) и/или лечения и/или профилактики заболевания, связанного с PD-L1, 4-1ВВ или и тем, и другим.

Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу стимуляции иммунного ответа (например, антиген-специфического Т-клеточного ответа) и/или лечения и/или профилактики заболевания, связанного с PD-L1, 4-1ВВ или и тем, и другим, у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающему введение субъекту фармацевтического эффективного количества биспецифического антитела или фармацевтической композиции. Способ может дополнительно предусматривать идентификацию субъекта, нуждающегося в лечении и/или профилактике заболевания, связанного с PD-L1, 4-1ВВ или и тем, и другим, перед стадией введения.

Заболевание, связанное с PD-L1, 4-1ВВ или и тем, и другим, может быть выбрано из рака (или опухолей), инфекционных заболеваний, аутоиммунных реакций, нарушений нервной системы и т.п.

Согласно варианту осуществления субъект может быть выбран из млекопитающих, включая людей, например, млекопитающего (например, человека), имеющего раковые клетками млекопитающих. Согласно другому варианту осуществления субъект может представлять собой клетку, отделенную (выделенную) от млекопитающего, например, млекопитающего, страдающего заболеванием, выбранным из

- 29 045275 раковых, инфекционных заболеваний, аутоиммунных реакций, нарушений нервной системы и т.п. (например, раковая клетка или клетка, отделенная (выделенная) от инфекционной области у млекопитающего, или Т-клетка, такая как инфильтрирующий опухоль Т-лимфоцит, Т-клетка CD4+, Т-клетка CD8+ или их комбинация).

Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению биспецифического антитела или фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рака. Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению биспецифического антитела для получения фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рака.

В фармацевтических композициях, способах и/или применениях согласно настоящему изобретению заболевание, связанное с PD-L1, 4-1ВВ или и тем, и другим, может быть связано с активацией (например, аномальной активацией или чрезмерной активацией) и/или избыточной продукцией (сверхэкспрессией) PD-L1, 4-1ВВ или и того и другого. Например, заболеванием может быть рак.

Раком может быть солидный рак или рак крови, предпочтительно солидный рак.

Введение биспецифического антитела можно проводить одним или несколькими способами, хорошо известными в данной области техники.

Терапевтически эффективная доза антитела согласно настоящему изобретению предпочтительно приводит к уменьшению тяжести симптомов заболевания, увеличению частоты и продолжительности бессимптомных периодов заболевания или предотвращению ухудшения или потери дееспособности изза заболевания. Например, для лечения субъектов, несущих опухоль, терапевтически эффективная доза предпочтительно ингибирует рост опухоли на по меньшей мере приблизительно 20%, более предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 40%, даже более предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 60% и еще более предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 80% по сравнению с субъектами, не получавшими лечение. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может уменьшить размер опухоли или иным образом облегчить симптомы у субъекта, которым обычно является человек или другое млекопитающее.

Фармацевтические композиции могут содержать эффективное количество биспецифического антитела и приемлемый носитель. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция дополнительно включает второй противоопухолевый агент (например, ингибитор иммунных контрольных точек).

Согласно конкретному варианту осуществления термин фармацевтически приемлемый может относиться к одобренному регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или перечисленному в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения животными и, более конкретно, человеком. Кроме того, фармацевтически приемлемый носитель, как правило, представляет собой нетоксичный твердый, полутвердый или жидкий наполнитель, разбавитель, инкапсулирующий материал или вспомогательное вещество для получения состава любого типа.

Композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель представляет собой носитель, обычно используемый при получении состава.

Диагностическое применение биспецифического антитела.

Сверхэкспрессия и/или чрезмерная активация PD-L1 и/или 4-1ВВ наблюдается в биологическом образце (например, клетках, тканях, крови, сыворотке и т.д.), взятом у пациента, страдающего определенным раком (например, опухолевая клетка), и/или пациенты, у которых есть клетки, сверхэкспрессирующие PD-L1 и/или 4-1ВВ, вероятно, отвечают на лечение биспецифическим антителом. Соответственно биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению также можно применять для диагностических и прогностических целей.

Согласно варианту осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для диагностики заболевания, связанного с PD-L1, 4-1ВВ или и тем, и другим, причем композиция содержит биспецифическое антитело. Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению биспецифического антитела для диагностики заболевания, связанного с PD-L1, 4-1ВВ или и тем, и другим.

Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу диагностики заболевания, связанного с PD-L1, 4-1ВВ или и тем, и другим, причем способ предусматривает приведение в контакт биологического образца, взятого у пациента, с биспецифическим антителом, и обнаружение реакции антиген-антитело или измерение уровня реакция антиген-антитело в биологическом образце. Согласно этому способу, когда реакция антиген-антитело обнаружена в биологическом образец или уровень реакции антиген-антитело в биологическом образце выше, чем в нормальном образце, пациент, у которого взят биологический образец, может быть определен как пациент, страдающий заболеванием, связанным с PD-L1, 4-1ВВ, или и тем, и другим. Поэтому согласно некоторым вариантам осуществления способ может дополнительно предусматривать приведение в контакт нормального образца с биспецифическим антителом и измерение уровня реакции антиген-антитело в нормальном образце. Кроме того, способ может дополнительно предусматривать сравнение уровня реакции антиген-антитело в биологическом образце и в нормальном образце после стадии измерения. Кроме того, после стадии обнаружения или стадии сравнения способ может дополнительно предусматривать определение пациента как

- 30 045275 пациента с заболеванием, связанным с PD-L1, 4-1ВВ или и тем, и другим, когда реакция антигенантитело обнаружена в биологическом образец или уровень реакции антиген-антитело в биологическом образце выше, чем в нормальном образце.

В диагностической композиции и способе биологический образец может быть по меньшей мере одним, выбранным из группы, состоящей из клетки, ткани, биологической жидкости (например, кровь, сыворотка, лимфа и т.д.) и т.п., полученным (взятом) у пациента для постановки диагноза. Нормальный образец может быть по меньшей мере одним, выбранным из группы, состоящей из клетки, ткани, биологической жидкости (например, кровь, сыворотка, лимфа, моча и т.д.) и т.п., полученным (взятом) у пациента, не имеющего заболевание, связанное с PD-L1, 4-1ВВ или и тем, и другим. Пациент может быть выбран из млекопитающего, такого как человек. После необязательной предварительной обработки образца образец можно инкубировать с биспецифическим антителом согласно настоящему изобретению в условиях, позволяющих антителу взаимодействовать с белком PD-L1 и/или 4-1ВВ, потенциально присутствующим в образце.

Присутствие и/или уровень (концентрация) белка PD-L1 и/или 4-1ВВ в образце можно использовать для идентификации пациента, который является подходящим для лечения биспецифическим антителом, или пациента, который отвечает на или восприимчив к лечению биспецифическим антителом.

Согласно варианту осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, идентифицирующей пациента, который подходит для лечения биспецифическим антителом, или пациента, который отвечает на или восприимчив к лечению биспецифическим антителом, причем композиция содержит биспецифическое антитело. Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению биспецифического антитела для идентификации пациента, который подходит для лечения биспецифическим антителом, или пациента, который отвечает на или восприимчив к лечению биспецифическим антителом. Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу идентификации пациента, который подходит для лечения биспецифическим антителом, или пациента, который отвечает на или восприимчив к лечению биспецифическим антителом, причем способ предусматривает приведение в контакт биологического образца, взятого у пациента, с биспецифическим антителом и обнаружение реакции антиген-антитело или измерение уровня реакции антиген-антитело в биологическом образце.

Согласно варианту осуществления настоящее изобретение относится к композиции для обнаружения PD-L1, 4-1ВВ или их обоих одновременно в биологическом образце, причем композиция содержит биспецифическое антитело. Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу обнаружения PD-L1, 4-1ВВ или их обоих одновременно в биологическом образце, причем способ предусматривает приведение в контакт биологического образца и биспецифического антитела и обнаружение (измерение) реакции антиген-антитело (связывания) между биспецифическое антителом и PD-L1, 4-1ВВ или и тем, и другим.

В композиции для обнаружения и способе обнаружения термин обнаружение PD-L1, 4-1BB или и того и другого может относиться без ограничения к обнаружению присутствия (и/или отсутствия) и/или уровня PD-L1, 4-1ВВ или и того и другого в биологическом образце.

В способе обнаружения, когда обнаруживается реакция антиген-антитело, может быть определено, что PD-L1, 4-1ВВ или и то, и другое присутствуют в биологическом образце, и когда реакция антигенантитело не обнаруживается, можно определить, что PD-L1, 4-1BB или и то, и другое отсутствуют (не присутствуют) в биологическом образце. Следовательно, способ обнаружения может дополнительно предусматривать после стадии обнаружения определение присутствует ли PD-L1, 4-1ВВ или и то, и другое в биологическом образце, когда реакция антиген-антитело обнаружена, и/или отсутствует ли (не присутствует) PD-L1, 4-1ВВ или и то, и другое в биологическом образце, когда реакция антиген-антитело не обнаружена.

В способе обнаружения уровень PD-L1, 4-1ВВ или обоих может быть определен в соответствии со степенью реакции антиген-антитело (например, количество комплекса антиген-антитело, образованного реакцией антиген-антитело, интенсивность любого сигнала, полученного реакцией антиген-антитело, и т.п., которые могут быть измерены любыми общепринятыми средствами).

Биологический образец может содержать по меньшей мере один образец, выбранный из группы, состоящей из клетки (например, опухолевой клетки), ткани (например, опухолевой ткани), жидкости организма (например, крови, сыворотки и т.д.) и т.п., взятый у или выделенный из млекопитающего, такого как человек. Стадии способа обнаружения могут быть проведены in virto.

В способе диагностики и/или способе обнаружения стадию обнаружения реакции антиген-антитело или измерения уровня реакции антиген-антитело можно проводить любым общепринятым способом, известным в соответствующей области техники, таким как общие ферментативные реакции, флуоресцентные реакции, люминесцентные реакции и/или обнаружение излучения. Например, стадию можно

- 31 045275 проводить способом, выбранным без ограничения из группы, состоящей из иммунохроматографии, иммуногистохимии (IHC), твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), радиоиммуноанализа (RIA), иммуноферментного анализа (EIA), флуоресцентного иммуноанализа. (FIA), люминесцентного иммуноанализа (LIA), вестерн-блоттинга, микроматриц, проточной цитометрии, поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и т.п.

Полинуклеотиды, кодирующие антитела, и способы получения антител.

Согласно варианту осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему биспецифическое антитело. В частности, согласно варианту осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему тяжелую цепь биспецифического антитела в форме IgG-scFv. Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему легкую цепь биспецифического антитела в форме IgG-scFv. Форма IgG-scFv может относиться к любому виду биспецифического антитела, содержащего антитело IgG полной длины, нацеленное на (связывающееся с) один из белков PD-L1 и 4-1ВВ, и фрагмент scFv, нацеленный на (связывающийся с) другой, где scFv связан с С-концом и/или N-концом антитела IgG полной длины напрямую (без пептидного линкера) или через пептидный линкер.

Согласно варианту осуществления, когда биспецифическое антитело в форме IgG-scFv содержит антитело IgG полной длины против PD-L1, и фрагмент scFv против 4-1ВВ, полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь биспецифического антитела, может кодировать тяжелую цепь антитела IgG полной длины против PD-L1, и фрагмент scFv против 4-1ВВ, который связан с С-концом и/или N-концом антитела IgG полной длины, напрямую или через пептидный линкер, и полинуклеотид, кодирующий легкую цепь биспецифического антитела, может кодировать легкую цепь антитела IgG полной длины против PD-L1.

Согласно другому варианту осуществления, когда биспецифическое антитело в форме IgG-scFv содержит антитело IgG полной длины против 4-1ВВ и фрагмент scFv против PD-L1, полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь биспецифического антитела, может кодировать тяжелую цепь антитела IgG полной длины против 4-1ВВ, и фрагмент scFv против PD-L1, который связан с С-концом и/или N-концом антитела IgG полной длины напрямую или через пептидный линкер, и полинуклеотид, кодирующий легкую цепь биспецифического антитела, может кодировать легкую цепь антитела IgG полной длины против 4-1ВВ.

Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, содержащему полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь биспецифического антитела, полинуклеотид, кодирующий легкую цепь биспецифического антитела, или и то, и другое. Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантной клетке, трансфицированной рекомбинантным вектором.

Примеры

Далее настоящее изобретение описано более подробно посредством примеров. Следующие примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения, но не предназначены для его ограничения.

Пример 1. Получение анти-PD-L1 моноклональных антител.

1.1. Получение мышиных моноклональных антител против человеческого PD-L1 и их анализ.

Мышиные моноклональные антитела против человеческого PD-L1 конструировали с применением гибридомной методики, как раскрыто в публикации международной заявки WO 2017-215590.

Аминокислотные и полинуклеотидные последовательности вариабельных областей супернатантов гибридомы, названной Гибридома HL1210-3, приведены в табл. 5 ниже.

- 32 045275

	Вариабельные последовательности HL1210-3	Таблица 5
Название	Последовательность	SEQ ID NO:
HL1210-3 VH	GAAGTGAAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAG TGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGC AGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGACATGT CTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGTCTGGA GTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTGGTTAC ATCTACTATTCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTTA CCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTA CCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACG GCCTTGTATATTTGTGCAAGAGAATTTGGTAAGC GCTATGCTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTC AGTCACCGTCTCCTCA	45
HL1210-3 VH	EVKLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYDMS WVRQTPEKSLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTIS RDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYICAREFGKRYAL	46
HL1210-3 VL	DYWGQGTSVT GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGT CCACATCGGTAGGAGACAGGGTCAGCATCTCCTG CAAGGCCAGTCAGGATGTGACTCCTGCTGTCGCC TGGTATCAACAGAAGCCAGGACAATCTCCTAAAC TACTGATTTACTCCACATCCTCCCGGTACACTGGA GTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGA CGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCT GAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAACATT ATACTACTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAA	47
HL1210-3 VL	GCTGGAGCTGAAA DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSISCKASQDVTPAVAW YQQKPGQSPKLLIYSTSSRYTGVPDRFTGSGSGTDF TFTISSVQAEDLAVYYCQQHYTTPLTFGAGTKLELK	48

1.2. Гуманизация мышиных mAb HL1210-3.

Гены вариабельной области моноклонального антитела (mAb) HL1210-3 применяли для создания гуманизированного моноклонального антитела посредством способов, широко используемых в области техники и раскрытых в публикации международной заявки WO 2017-215590.

Аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности некоторых полученных гуманизированных антител приведены в табл. 6 ниже.

- 33 045275

Таблица 6

Последовательности гуманизированных антител (жирным шрифтом показана CDR)

Название	Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:
HL1210-VH	EVKLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYDMSW VRQTPEKSLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRD NAKNNLYLQMSSLRSEDTALYICAREFGKRYALDYW GQGTSVTVSS
Hul210 VH.l	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW VRQAPGKGLEWVSTISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREFGKRYALDY ' WGQGTTVTVSS

Hul210 VH.la EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW

VRQAPGKGLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISR DNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREFGKRYALD ' YWGQGTTVTVSS

Hul210 VH.lb EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW

Hul210 VH.2

VRQAPGKSLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYICAREFGKRYALDY ' WGQGTTVTVSS EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWI RQAPGKGLEWVSTISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREFGKRYALDYW GQGTTVTVSS

Hul210 VH.2a EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWI

RQAPGKGLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREFGKRYALDY ' WGQGTTVTVSS

Hu 1210 VH.2b EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW

VRQAPGKSLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRD 55 NAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYICAREFGKRYALDY

- 34 045275

WGQGTTVTVSS

Hu 1210 VH.3 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFSSYDMSW V

RQAPGKGLEWVSTISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDN

SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREFGKRYALDYW '

GQGTTVTVSS

Hul210 VH.3a	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV RQAPGKSLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYICAREFGKRYALDYW	57
Hul210 VH.4	GQGTTVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW VRQAPGKGLEWVSTISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAREFGKRYALDY	58
Hul210 VH.4a	WGQGTTVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW VRQAPGKGLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISR	50
	DNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAREFGKRYALD YWGQGTTVTVSS
Hul210 VH.4b	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW VRQAPGKSLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRD	AO
	NAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICAREFGKRYALDY WGQGTTVTVSS
Hul210 VH.4c	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW VRQAPGKSLEWVATISEGGGYIYYSDSVKGRFTISRD	A1
	NAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICAREFGKRYALDY WGQGTTVTVSS
Hu 1210 VH.4d EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW
(H12 VH)	VRQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYSDSVKGRFTISRD
	NAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICAREFGKRYALDY
Hul210 VH.4c	WGQGTTVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW VRQAPGKSLEWVATISDVGGYIYYSDSVKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICAREFGKRYALDY WGQGTTVTVSS	63

- 35 045275

Hu 1210 VH.5 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW VRQAPGKGLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISR DNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREFGKRYALD YWGQGTLVTVSS

HU 1210 VH.5a EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW VRQAPGKGLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISR DNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYICAREFGKRYALD ' YWGQGTLVTVSS

HU 1210 VH.5b EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW VRQAPGKGLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISR

DNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYICAREFGKRYALD

YWGQGTTVTVSS

HU 1210 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW

VH.5C VRQAPGKGLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISR

DNAKNNLYLQMNSLRAEDTAVYICAREFGKRYALD YWGQGTLVTVSS

HU 1210 VH.5d EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW

VRQTPEKSLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRD 68

NAKNNLYLQMNSLRAEDTAVYICAREFGKRYALDY WGQGTLVTVSS

HL1210-VK DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSISCKASQDVTPAVAWY

QQKPGQSPKLLIYSTSSRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTI 69 SSVQAEDLAVYYCQQHYTTPLTFGAGTKLELK

Hul210 VK.l DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ (H12VL) QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTIS 70

S LQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIK

Hu 1210 VL. 1 a DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ QKPGKSPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTIS 71 S LQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIK

Hul210 VK.2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS 72 SLQPEDFATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIKR

Hul210 VK.2a DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ 73

- 36 045275

QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIKR
Hul210 VK.2b	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ
	QKPGQSPKLLIYSTSSRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIKR	74
Hul210 VK.2c	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCKASQDVTPAVAWYQ
	QKPGQSPKLLIYSTSSRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIKR	75
Название	Последовательность нуклеиновой кислоты	SEQ ID NO:
HL1210 VH	GAGGTGAAGCTGGTGGAGAGCGGCGGAGATCTGGT GAAGCCTGGCGGCAGCCTGAAGCTGAGCTGTGCCG CCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCT GGGTGAGGCAGACCCCCGAGAAGAGCCTGGAGTGG GTGGCCACCATCAGCGATGGCGGCGGCTACATCTA
	CTACAGCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCA GCAGGGACAACGCCAAGAACAACCTGTACCTGCAG ATGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCCTGTA CATCTGCGCCAGGGAGTTCGGCAAGAGGTACGCCC TGGACTACTGGGGACAGGGCACCAGCGTGACCGTG AGCAGC	76
Hul210 VH.l	GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGT GAAGCCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTG CCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCT GGGTGAGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAGTGG GTGAGCACCATCTCCGATGGCGGCGGCTACATCTAT
	TACTCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAG CAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGA TGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTAC TACTGCGCCAGGGAGTTCGGCAAAAGGTACGCCCT GGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGA GCAGC	77
Hul210 VH.la	GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGT GAAGCCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTG	78

- 37 045275

CCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCT GGGTGAGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAGTGG GTGGCCACCATCTCCGATGGCGGCGGCTACATCTAT TACTCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAG CAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGA TGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTAC TACTGCGCCAGGGAGTTCGGCAAAAGGTACGCCCT GGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGA

GCAGC

Hu 1210 VH. 1 b GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGT

GAAGCCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTG CCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCT GGGTGAGACAGGCCCCTGGCAAAAGCCTGGAGTGG GTGGCCACCATCTCCGATGGCGGCGGCTACATCTAT TACTCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAG 79 CAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGA TGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTAC ATCTGCGCCAGGGAGTTCGGCAAAAGGTACGCCCT GGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGA GCAGC

Hu 1210 VH.2 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGT GAAGCCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTG CCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCT GGATCAGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAGTGG GTGAGCACCATCTCCGATGGCGGCGGCTACATCTAT TACTCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAG 80 CAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGA TGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTAC TACTGCGCCAGGGAGTTCGGCAAAAGGTACGCCCT GGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGA GCAGC

Hu 1210 VH.2a GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGT

GAAGCCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTG 81

CCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCT

- 38 045275

GGATCAGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAGTGG GTGGCCACCATCTCCGATGGCGGCGGCTACATCTAT TACTCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAG
Hul210 VH.2b	CAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGA TGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTAC TACTGCGCCAGGGAGTTCGGCAAAAGGTACGCCCT GGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGA GCAGC GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGT
	GAAGCCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTG CCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCT GGGTGAGACAGGCCCCTGGCAAAAGCCTGGAGTGG GTGGCCACCATCTCCGATGGCGGCGGCTACATCTAT TACTCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAG	82
Hul210 VH.3	CAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGA TGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTAC ATCTGCGCCAGGGAGTTCGGCAAAAGGTACGCCCT GGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGA GCAGC GAGGTGCAGCTGCTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGT
	GCAACCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTG CCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCT GGGTGAGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAGTGG GTGAGCACCATCTCCGATGGCGGCGGCTACATCTAT TACTCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAG	83
Hul210 VH.3a	CAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGA TGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTAC TACTGCGCCAGGGAGTTCGGCAAAAGGTACGCCCT GGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGA GCAGC GAGGTGCAGCTGCTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGT
	GCAACCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTG CCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCT GGGTGAGACAGGCCCCTGGCAAAAGCCTGGAGTGG	84

- 39 045275

GTGGCCACCATCTCCGATGGCGGCGGCTACATCTAT TACTCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAG CAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGA TGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTAC ATCTGCGCCAGGGAGTTCGGCAAAAGGTACGCCCT GGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGA GCAGC

Hu 1210 VH.4 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGT GCAACCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTG CCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCT GGGTGAGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAGTGG GTGAGCACCATCTCCGATGGCGGCGGCTACATCTAT TACTCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAG 85 CAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGA TGAACAGCCTGAGGGATGAGGACACCGCCGTGTAC TACTGCGCCAGGGAGTTCGGCAAAAGGTACGCCCT GGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGA GCAGC

Hu 1210 VH.4a GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGT

GCAACCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTG CCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCT GGGTGAGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAGTGG GTGGCCACCATCTCCGATGGCGGCGGCTACATCTAT TACTCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAG 86 CAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGA TGAACAGCCTGAGGGATGAGGACACCGCCGTGTAC TACTGCGCCAGGGAGTTCGGCAAAAGGTACGCCCT GGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGA GCAGC

Hu 1210 VH.4b GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGT

GCAACCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTG CCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCT 87 GGGTGAGACAGGCCCCTGGCAAAAGCCTGGAGTGG GTGGCCACCATCTCCGATGGCGGCGGCTACATCTAT

- 40 045275

Hul210 VH.4c	TACTCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAG CAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGA TGAACAGCCTGAGGGATGAGGACACCGCCGTGTAC ATCTGCGCCAGGGAGTTCGGCAAAAGGTACGCCCT GGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGA GCAGC GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGT GCAACCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTG
CCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCT GGGTGAGACAGGCCCCTGGCAAAAGCCTGGAGTGG GTGGCCACCATCTCCGAAGGCGGCGGCTACATCTAT TACTCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAG CAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGA TGAACAGCCTGAGGGATGAGGACACCGCCGTGTAC ATCTGCGCCAGGGAGTTCGGCAAAAGGTACGCCCT GGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGA	88
	GCAGC
Hul210 VH.4d	GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGT GCAACCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTG CCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCT GGGTGAGACAGGCCCCTGGCAAAAGCCTGGAGTGG GTGGCCACCATCTCCGATGCGGGCGGCTACATCTAT
	TACTCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAG CAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGA TGAACAGCCTGAGGGATGAGGACACCGCCGTGTAC ATCTGCGCCAGGGAGTTCGGCAAAAGGTACGCCCT GGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGA GCAGC	89
Hul210 VH.4c	GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGT GCAACCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTG CCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCT GGGTGAGACAGGCCCCTGGCAAAAGCCTGGAGTGG GTGGCCACCATCTCCGATGTTGGCGGCTACATCTAT TACTCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAG	90

- 41 045275

CAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGA TGAACAGCCTGAGGGATGAGGACACCGCCGTGTAC ATCTGCGCCAGGGAGTTCGGCAAAAGGTACGCCCT GGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGA GCAGC

Hu 1210 VH.5 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCCTGGT GCAACCTGGAGGCTCCCTGAGGCTGTCCTGTGCCGC TTCCGGCTTCACCTTCAGCTCCTACGATATGAGCTG GGTGAGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTGGAGTGGG TGGCCACCATCTCCGACGGAGGCGGCTACATCTACT ACTCCGACTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCC 91 GGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATG AACTCTCTCAGGGCTGAGGACACCGCCGTGTATTAC TGCGCCAGGGAGTTTGGCAAGAGGTACGCCCTGGA TTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACAGTGAGCT cc

Hul210 VH.5a GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCCTGGT GCAACCTGGAGGCTCCCTGAGGCTGTCCTGTGCCGC TTCCGGCTTCACCTTCAGCTCCTACGATATGAGCTG GGTGAGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTGGAGTGGG TGGCCACCATCTCCGACGGAGGCGGCTACATCTACT ACTCCGACTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCC 92 GGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATG AACTCTCTCAGGGCTGAGGACACCGCCGTGTATATC TGCGCCAGGGAGTTTGGCAAGAGGTACGCCCTGGA TTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACAGTGAGCT CC

Hu 1210 VH.5b GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCCTGGT GCAACCTGGAGGCTCCCTGAGGCTGTCCTGTGCCGC TTCCGGCTTCACCTTCAGCTCCTACGATATGAGCTG GGTGAGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTGGAGTGGG 93 TGGCCACCATCTCCGACGGAGGCGGCTACATCTACT ACTCCGACTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCC GGGACAACGCCAAGAACAACCTGTACCTGCAGATG

- 42 045275

AACTCTCTCAGGGCTGAGGACACCGCCGTGTATATC

TGCGCCAGGGAGTTTGGCAAGAGGTACGCCCTGGA TTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACAGTGAGCT cc

Hu 1210 VH.5c GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCCTGGT

GCAACCTGGAGGCTCCCTGAGGCTGTCCTGTGCCGC TTCCGGCTTCACCTTCAGCTCCTACGATATGAGCTG GGTGAGGCAGACCCCTGAGAAGAGCCTGGAGTGGG TGGCCACCATCTCCGACGGAGGCGGCTACATCTACT ACTCCGACTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCC 94 GGGACAACGCCAAGAACAACCTGTACCTGCAGATG AACTCTCTCAGGGCTGAGGACACCGCCGTGTATATC TGCGCCAGGGAGTTTGGCAAGAGGTACGCCCTGGA TTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACAGTGAGCT CC

Hul210 VH.5d GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCCTGGT GCAACCTGGAGGCTCCCTGAGGCTGTCCTGTGCCGC TTCCGGCTTCACCTTCAGCTCCTACGATATGAGCTG GGTGAGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTGGAGTGGG TGGCCACCATCTCCGACGGAGGCGGCTACATCTACT ACTCCGACTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCC 95 GGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATG AACTCTCTCAGGGCTGAGGACACCGCCGTGTATATC TGCGCCAGGGAGTTTGGCAAGAGGTACGCCCTGGA TTACTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACAGTGAGCT CC

HL 1210 VK GACATCGTGATGACCCAGAGCCАСАAGTTCATGAG

CACCAGCGTGGGCGATAGGGTGAGCATCAGCTGCA

AGGCCAGCCAGGATGTGACCCCTGCCGTGGCCTGG

TACCAGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCAAGCTGCT

GATCTACAGCACCAGCAGCAGGTACACCGGCGTGC

CCGACAGGTTCACAGGAAGCGGCAGCGGCACCGAC TTCACCTTCACCATCAGCAGCGTGCAGGCCGAGGA CCTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGCACTACACCAC

- 43 045275

	CCCTCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCT GAAG
Hul210 VK.l	GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAG CGCTAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCA AGGCCAGCCAGGATGTGACCCCTGCCGTGGCCTGG TACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCT GATCTACAGCACCAGCAGCAGGTACACCGGCGTGC 97 CCAGCAGGTTTAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGAC TTCACCTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGAC ATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACACCACC CCTCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGAT CAAG
Hul210 VK.la	GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAG CGCTAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCA AGGCCAGCCAGGATGTGACCCCTGCCGTGGCCTGG TACCAGCAGAAGCCCGGCAAGTCCCCCAAGCTGCT GATCTACAGCACCAGCAGCAGGTACACCGGCGTGC 98 CCAGCAGGTTTAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGAC TTCACCTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGAC ATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACACCACC CCTCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGAT CAAG
Hul210 VK.2	GACATTCAGATGACCCAGTCCCCTAGCAGCCTGTCC GCTTCCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAA GGCCAGCCAGGACGTGACACCTGCTGTGGCCTGGT ATCAACAGAAGCCTGGCAAGGCTCCTAAGCTCCTG ATCTACAGCACATCCTCCCGGTACACCGGAGTGCCC 99 TCCAGGTTTAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGATTTC ACCCTGACCATTTCCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTC GCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACACCACACCC CTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAA GCGG
Hul210 VK.2a	GACATTCAGATGACCCAGTCCCCTAGCAGCCTGTCC 100 GCTTCCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAA

- 44 045275

GGCCAGCCAGGACGTGACACCTGCTGTGGCCTGGT ATCAACAGAAGCCTGGCAAGGCTCCTAAGCTCCTG ATCTACAGCACATCCTCCCGGTACACCGGAGTGCCC GACAGGTTTACCGGCAGCGGCTCCGGCACCGATTTC ACCCTGACCATTTCCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTC GCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACACCACACCC CTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAA

GCGG

Hu 1210 VK.2b GACATTCAGATGACCCAGTCCCCTAGCAGCCTGTCC GCTTCCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAA

GGCCAGCCAGGACGTGACACCTGCTGTGGCCTGGT ATCAACAGAAGCCTGGCCAGAGCCCTAAGCTCCTG ATCTACAGCACATCCTCCCGGTACACCGGAGTGCCC 101

GACAGGTTTACCGGCAGCGGCTCCGGCACCGATTTC ACCCTGACCATTTCCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTC GCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACACCACACCC CTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAA GCGG

Hul210 VK.2c GACATTCAGATGACCCAGTCCCCTAGCAGCCTGTCC GCTTCCGTGGGCGACAGGGTGACCATCAGCTGCAA GGCCAGCCAGGACGTGACACCTGCTGTGGCCTGGT ATCAACAGAAGCCTGGCCAGAGCCCTAAGCTCCTG ATCTACAGCACATCCTCCCGGTACACCGGAGTGCCC 102

GACAGGTTTACCGGCAGCGGCTCCGGCACCGATTTC ACCCTGACCATTTCCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTC

GCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACACCACACCC

CTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAA GCGG

Гуманизированные гены VH и VK были получены синтетически и затем соответственно клонированы в векторы, содержащие константные домены гамма-1 человека и каппа человека. Спаривание VH человека и VK человека приводило к созданию 40 гуманизированных антител (см. табл. 7).

Таблица 7

Гуманизированные антитела с их VH и VL областями

VH VK	Ни1210 VH.1	Ни1210 VH.la	Ни1210 VH.lb	Ни1210 VH.2	Ни1210 VH.2a	Ни1210 VH 2.b	Hul210 VH
Ни 1210 VK.1	Ни1210-1	Ни1210-2	Ни1210-3	Ни1210-4	Ни1210-5
Ни1210 VK.la	Ни1210-7	Ни1210-8	Ни1210-9	Ни1210-10	Ни1210-11
Ни 1210 VK							H1210 Химера

VH VK	Hul210 VH.3	Hul210 VH.3a	Hul210 VH.4	Hul210 VH.4a	Hul210 VH.4b
Hu 1210 VK.l	Hu1210-13	Hul210-14	Hul210-15	Hul210-16	Hul210-17
Hul210 VK.la	Hul210-18	Hul210-19	Hul210-20	Hul210-21	Hul210-22

- 45 045275

VH VK	Hul210 VH.5	HU1210 VH.5a	HU1210 VH.5b	HU1210 VH.5c	HU1210 VH.5d
Ни1210 VK.2	Hul210-23	Hul210-27	Hul210-31	Hul210-32	Hul210-36
Ни1210 VK.2a	Hul210-24	Hul210-28		Hul210-33	Hul210-37
Hul210 VK.2b	Hu 1210-25	Hu 1210-29		Hul210-34	Hul210-38
Hul210 VK.2c	Hul210-26	Hul210-30		Hul210-35	Hul210-39

VH VK	Hul210 VH.4c	Hul210 VH.4d	Hul210 VH.4e
Hul210 VK.l	Hul210-40	Hul210-41	Hul210-42

1.3. Идентификация эпитопа PD-L1.

Это исследование проводили для идентификации аминокислотных остатков, участвующих в связывании PD-L1 с антителом согласно настоящему изобретению.

Конструировали библиотеку аланинового сканирования для PD-L1. Кратко, 217 мутантных клонов PD-L1 создавали на интегральной молекулярной платформе инженерии белка. Связывание Fab Hu1210-41 с каждым вариантом в библиотеке мутаций PD-L1 определяли в двух экземплярах с помощью высокопроизводительной проточной цитометрии. Из каждой точки исходных данных вычитали фоновую флуоресценцию и нормализовали по реактивности с PD-L1 дикого типа (WT). Для каждого варианта PD-L1 среднее значение связывания наносили на график как функцию от экспрессии. Для определения предварительных критических клонов (кружки с крестиками) применяли пороговые значения (пунктирные линии)>70% от связывания дикого типа с контрольным моноклональным антителом (MAb) (Mab MIH1, полученное в лаборатории) и реактивности <30% от дикого типа в отношении Fab Hul210-41 (фиг. 3). Y134, K162 и N183 остатки PD-L1 идентифицировали как необходимые остатки для связывания Hu1210-41. Низкая реактивность клона N183A с Fab Hu1210-41 предполагает, что он является основным энергетическим участником связывания Hu1210-41 с меньшим вкладом Y134 и K162.

Критические остатки (сферы) были идентифицированы на 3D-структуре PD-L1, как показано на фиг. 4. Эти остатки, Y134, K162 и N183, таким образом, составляют эпитопы PD-L1, ответственные за связывание с антителами согласно различным вариантам осуществления настоящего раскрытия.

Интересно отметить, что Y134, K162 и N183 все расположены в пределах домена IgC белка PD-L1. Внеклеточные части как PD-1, так и PD-L1 имеют домен IgV и домен IgC. Общеизвестно, что PD-L1 связывается с PD-1 посредством связывания между их доменами IgV. Однако в отличие от таких обычных антител Hu1210-41 связывается с доменом IgC, который, как можно было ожидать, неэффективен при ингибировании связывания PD-1/PD-L1. Этот другой эпитоп Hu1210-41, что удивительно, вероятно способствует отличным активностям Hu1210-41.

1.4. Инженерия антител для анти-PD-L1 антитела.

В примерах 1.4 предприняли попытку идентифицировать дополнительно улучшенные антитела на основе Hu1210-41 с использованием мутагенеза.

Четыре подбиблиотеки конструировали для инженерии антител моноклонального анти-PD-L1 антитела с использованием любой из следующих стратегий. В стратегии 1 мутагенез вариабельного домена тяжелой цепи CDR3 VH или VL-CDR3 осуществляли путем весьма случайной мутации. В стратегии 2 две комбинированные библиотеки CDR, состоящие из (VH-CDR3, VL-CDR3 и VL-CDR1) или (VH-CDR1, VH-CDR2 и VL-CDR2), создавали с помощью прохода по CDR с контролируемыми частотами мутаций.

Био-пэннинг. Способы фагового пэннинга адаптировали путем сокращения времени инкубации/связывания перед жесткими условиями промывки. Кратко, 100 мкл магнитных стрептавидиновых шариков (Invitrogen, США) блокировали 1 мл MPBS в течение 1 ч при комнатной температуре. В другой пробирке фаговую библиотеку предварительно инкубировали (5х10^Л11~12 на каждый цикл) со 100 мкл магнитных стрептавидиновых шариков в 1 мл MPBS для удаления нежелательных связывающих веществ. Концентратор магнитных частиц использовался для разделения фага и шариков. Биотинилированный белок PD-L1 добавляли к фагу и инкубировали 2 ч при комнатной температуре и осторожно перемешивали, используя верхний шейкер. Шарики, несущие фаг из раствора, отделяли в концентраторе магнитных частиц, а супернатант отбрасывали. Шарики промывали свежим промывочным буфером, десять раз PBST и десять раз PBS (рН 7,4). Добавляли 0,8 мл 0,25% трипсина в PBS (Sigma, США) и инкубировали в течение 20 мин при 37°С для элюирования фага. Полученный фаг титровали и исключали из следующего цикла пэннинга, уменьшая концентрацию антигена от цикла к циклу.

- 46 045275

Скрининг посредством ELISA и ранжирование включен/выключен

Клоны отбирали и индуцировали на основании желаемого результата пэннинга, анализ ELISA фагов проводили для первичного скрининга, положительные клоны анализировали путем секвенирования, находили уникальные горячие точки.

В табл. 8 показаны идентифицированные мутации. Как показано ниже, остатки мутаций горячих точек и/или их заместители подчеркнуты.

Таблица 8

Мутации в CDR

	CDR-H1 (SEQ ID No.)	CDR-H2 (SEQ ID No.)	CDR-H3 (SEQ ID No.)
WT (Н12)	SYDMS (107)	TISDAGGYIYYSDSVKG (117)	EFGKRYALDY (127)
вз	SYDMS (108)	TISDAGGYIYYRDSVKG (118)	EFGKRYALDY (128)
С4	SYDMS (109)	TISDAGGYIYYRDSVKG (119)	EFGKRYALDS (129)
В1	SYDMS (110)	TISDAGGYIYYRDSVKG (120)	EIFNRYALDY (130)
Вб	SYDMS (111)	TISDAGGYIYYRDSVKG (121)	ELPWRYALDY (131)
сз	SYDMS (112)	TISDAGGYIYYRDSVKG (122)	ELHFRYALDY (132)
С6	SYDMS (113)	TISDAGGYIYYRDSVKG (123)	ELYFRYALDY (133)
А1	SYDMS (114)	TISDAGGYIYYRDSVKG (124)	ELLHRYALDY (134)
А2	SYDMS (115)	TISDAGGYIYYRDSVKG (125)	ELRGRYALDY (135)
АЗ	SYDMS (116)	TISDAGGYIYYRDSVKG (126)	EFGKRYALDY (136)

	CDR-L1 (SEQ ID No.)	CDR-L2 (SEQ ID No.)	CDR-L3 (SEQ ID No.)
WT	KASQDVTPAVA (137)	STSSRYT (147)	QQHYTTPLT (157)
вз	KAKQDVTPAVA (138)	STSSRYT (148)	MQHYTTPLT (158)
С4	KASQDVWPAVA (139)	STSSRYT (149)	QQHSTTPLT (159)
В1	KASQDVTPAVA (140)	STSSRYT (150)	QQHYTTPLT (160)
Вб	KASQDVTPAVA (141)	STSSRYT (151)	QQHYTTPLT (161)
сз	KASQDVTPAVA (142)	STSSRYT (152)	QQHYTTPLT (162)
С6	KASQDVTPAVA (143)	STSSRYT (153)	QQHYTTPLT (163)
А1	KASQDVTPAVA (144)	STSSRYT (154)	QQHYTTPLT (164)
А2	KASQDVTPAVA (145)	STSSRYT (155)	QQHYTTPLT (165)
АЗ	KASQDVTPAVA (146)	STSSRYT (156)	QQHSDAPLT (166)

Аминокислотные последовательности вариабельных областей этих антител показаны в табл. 9 ниже.

- 47 045275

Таблица 9 Последовательности антител

Название Последовательность SEQ ID NO:

WT-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 167

RQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRDNA KNSLYLQMNSLRDEDTAVYICAREFGKRYALDYWGQ GTTVTVSS

WT-VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQQ 168

KPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSL

QPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIK

B3-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS YDMSWV 169

B3-VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAKQDVTPAVAWYQ 170

QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTTSS LQPEDIATYYCMQHYTTPLTFGQGTKLEIK

C4-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 171

RQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRDNA KNSLYLQMNSLRDEDTAVYICAREFGKRYALDSWGQG TTVTVSS

C4-VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVWPAVAWYQ QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFT1SS 172 LQPEDIATYYCQQHSTTPLTFGQGTKLEIK

В1 -VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW

VRQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRD

NAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICAREIFNRYALDYW

GQGTTVTVSS

Bl-VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFT1S 174 SLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIK

B6-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW

VRQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICARELPWRYALDY WGQGTTVTVSS

B6-VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTIS 176 SLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIK

C3-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW

VRQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICARELHFRYALDYW GQGTTVTVSS

C3-VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ 178

- 48 045275

C6-VH	QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTIS SLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIK EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW VRQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICARELYFRYALDYW GQGTTVTVSS	179
C6-VK	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTIS SLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIK	180
A1-VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW VRQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRD	1 21
A1-VK	NAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYTCARELLHRYALDYW GQGTTVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTIS	182
A2-VH	SLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIK EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW VRQAPGKSLEWVAT1SDAGGY1YYRDSVKGRFT1SRD NAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICARELRGRYALDY WGQGTTVTVSS	183
A2-VK	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTIS S LQPEDIAT YYCQQH YTTPLTFGQGTK LEIК	184

АЗ-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW

VRQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGRFT1SRD NAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICAREFGKRYALDY '

WGQGTTVTVSS

A3-VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTIS 186 SLQPEDIATYYCQQHSDAPLTFGQGTKLEIK

Таблица 10

Вариабельные области тяжелой цепи для клонов Н12 и В6

Антитело №	VH	SEQ ID NO:
H12	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW VRQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYSDSVKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICAREFGKRYALDY WGQGTTVTVSS	103
Вб	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW VRQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICARELPWRYALDY WGQGTTVTVSS	104

- 49 045275

Таблица 11 Вариабельные области легкой цепи для клонов Н12 и В6
Антитело №	VL	SEQ ID NO:
Н12	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISS LQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIK	105
Вб	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISS LQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIK	106

1.5. Кинетика белка для PD-L1.

Для того чтобы исследовать кинетику связывания гуманизированного антитела, в этом примере проводили ранжирование аффинности с использованием Biacore. Как показано в табл. 12 ниже, Н12 и В6.

	Т аблица 12
Антитело	KD(M)	kon(l/Mc)	kdis(l/c)	Chi
H12	6.122Е-09	7.124E+04	4.361E-04	0.0415
Вб	4.248Е-09	9.827E+04	4.175E-04	0.0766

Как показано в табл. 12, протестированные анти-PD-L1 антитела показывают высокие аффинности связывания с PD-L1.

Пример 2. Получение анти-4-1ВВ моноклональных антител.

2.1. Скрининг полных человеческих моноклональных антител против 4-1ВВ Пэннинг фаговой библиотеки в иммунопробирке в отношении 4-1ВВ.

Для пэннинга библиотеки в отношении молекул-мишеней проводили в общем четыре раунда пэннинга с использованием иммунопробирок, покрытых 4-1ВВ.

Бактериальные колонии в результате 3 циклов пэннинга выращивали в SB-карбеницилине на 96-луночном планшете до помутнения, после чего в каждую лунку добавляли 1011 БОЕ вспомогательного фага VCSM13. Через 1 ч инфицирования при 37°С и осторожном встряхивании (80 об/мин) добавляли 70 мкг/мл канамицина, и клетки культивировали в течение ночи при 30°С со встряхиванием при 200 об/мин.

На следующий день планшеты центрифугировали и супернатанты, содержащие фаги, добавляли на планшеты для ELISA, покрытые антигеном 4-1ВВ, блокированные 3% BSA в PBST. После 1 ч инкубации при комнатной температуре планшеты трижды промывали PBST и добавляли антитело анти-М13 антитело. Планшеты инкубировали в течение 1 ч, трижды промывали PBST и измеряли активность связывания с использованием тетраметилбензидина (ТМВ).

Специфические связывающие 4-1ВВ амплифицировали для секвенирования плазмидной ДНК. V-гены (VL) легкой цепи Ig и последовательности VH анализировали для идентификации уникальных последовательностей и определения разнообразия последовательностей.

Таблица 13

Вариабельные области тяжелой цепи

Антитело №	VH	SE Q ID NO:
41B01	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGK GLEWVSWISYSGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCARDGQRNSMREFDYWGQGTLVTVSS	187
41B01.01	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGK GLEWVSWISYSGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCARDAQRNSMREFDYWGQGTLVTVSS	188

- 50 045275

41В01.02	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGK GLEWVSWISYSGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCARDAQRQSMREFDYWGQGTLVTVSS	189
41ВО1.ОЗ	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGK GLEWVSWISYSGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCARDAQRNSMREFDYWGQGTLVTVSS	190
41В01.04	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGK GLEWVSWISYSGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCARDAQRQSMREFDYWGQGTLVTVSS	191
41В02	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYDMSWVRQAPGK GLEWVSVIYPDDGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL RAEDAAVYYCAKHGGQKPTTKSSSAYGMDGWGQGTLVTVSS	192

Таблица 14

CDR тяжелой цепи

Антитело No.	CDR Н1	SE Q ID NO:	CDR H2	SE Q ID NO:	CDR H3	SE Q ID NO:
41В01	SYDM S	10	WISYSGGSIYYADS VKG	12	DGQRNSMREFDY	14
41В01.01	SYDM S	10	WISYSGGSIYYADS VKG	12	DAQRNSMREFDY	16
41В01.02	SYDM S	10	WISYSGGSIYYADS VKG	12	DAQRQSMREFDY	17
41В01.03	SYDM s	10	WISYSGGSIYYADS VKG	12	DAQRNSMREFDY	16
41В01.04	SYDM s	10	WISYSGGSIYYADS VKG	12	DAQRQSMREFDY	17
41В02	GYDM S	11	VIYPDDGNTYYAD SVKG	13	HGGQKPTTKSSS AYGMDG	15

Таблица 15

Вариабельны области легкой цепи

Антите ло №	VL	SEQ ID NO:
41B01	QSVLTQPPSASGTPGRRVTISCSGSSSNIGNNYVTWYQQLPGT APKLLIYADSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADY YCATWDYSLSGYVFGGGTKLTVL	193
41B01.0 1	QSVLTQPPSASGTPGRRVTISCSGSSSNIGNNYVTWYQQLPGT APKLLIYADSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADY YCATWDYSLSGYVFGGGTKLTVL	194
41B01.0 2	QSVLTQPPSASGTPGRRVTISCSGSSSNIGNNYVTWYQQLPGT APKLLIYADSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADY YCATWDYSLSGYVFGGGTKLTVL	195
41B01.0 3	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNYVTWYQQLPGT APKLLIYADSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADY YCATWDYSLSGYVFGGGTKLTVL	196

-51 045275

41В01.0 4	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNYVTWYQQLPGT APKLLIYADSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADY YCATWDYSLSGYVFGGGTKLTVL	197
41В02	QSVLTQPPSASGTPGRRVTISCSGSSSNIGNNYVTWYQQLPGT APKLLIYADSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADY YCATWDYSLSGYVFGGGTKLTVL	198

Таблица 16

CDR легкой цепи

Антитело №	CDRL1	SE Q ID NO	CDR L2	SE Q ID NO:	CDR L3	SE Q ID NO:
41В01	SGSSSNIGNNYVT	18	ADSHRP S	19	ATWDYSLS GYV	20
41В01.01	SGSSSNIGNNYVT	18	ADSHRP S	19	ATWDYSLS GYV	20
41В01.02	SGSSSNIGNNYVT	18	ADSHRP S	19	ATWDYSLS GYV	20
41В01.03	SGSSSNIGNNYVT	18	ADSHRP S	19	ATWDYSLS GYV	20
41В01.04	SGSSSNIGNNYVT	18	ADSHRP S	19	ATWDYSLS GYV	20
41В02	SGSSSNIGNNYVT	18	ADSHRP S	19	ATWDYSLS GYV	20

2.2. Антигенсвязывающие способности анти-4-1ВВ антител с человеческим 4-1ВВ.

(1) Связывание антигена, измеренное посредством ELISA.

Для оценки антигенсвязывающей активности антитела-кандидаты подвергали анализу ELISA. Кратко, микротитровальные планшеты покрывали человеческим белком 4-lBB-Fc при концентрации 0,1 мкг/мл в PBS, 100 мкл/лунка при 4°С в течение ночи, затем блокировали 100 мкл/лунка 5% BSA. Пятикратные разведения гуманизированных антител {41В01 и 41В02}, начиная с 10 мкг/мл, добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1-2 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали PBS/Tween, а затем инкубировали с козьим антителом против человеческого IgG, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP), в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки планшеты проявляли субстратом ТМВ и анализировали на спектрофотометре при OD 450-630 нм. Как показано на фиг. 5, протестированные анти-4-1ВВ антитела демонстрировали способность связываться с 4-1 ВВ.

(2) Клеточное связывание, измеренное посредством FACS.

Для того, чтобы оценить свойство связывания антигена, антитела-кандидаты анализировали на их связывание с экспрессированным белком 4-1ВВ млекопитающего с помощью FACS. Кратко, клетки 4-lBB-Jurkat инкубировали с антителами (41В01 и 41В02). После промывки буфером FACS (1% BSA в PBS) в каждую лунку добавляли FITC-антитело против человеческого IgG и инкубировали при 4°С в течение 1 ч. MFI для FITC оценивали посредством FACS Caliber. Как показано на фиг. 6, протестированные анти-4-1ВВ антитела проявляют способность связываться с 4-1ВВ, который экспрессируется на клеточной поверхности и может эффективно связываться с 4-1ВВ, экспрессируемым на клетках млекопитающих.

(3) Белковая кинетика для 4-1ВВ.

Чтобы исследовать кинетику связывания гуманизированного антитела, в этом примере выполняли ранжирование аффинности с использованием Octet Red 96. Как показано в табл. 17 ниже, 41В01 и 41В02.

Таблица 17

Антитело	KD(M)	kon(l/Mc)	kdis( 1/c)	Chi	R²
41B01	1.80E-10	6.58E+05	1.19E-04	0.0392	0.9987
41B02	1.01E-09	5.95E+05	6.03 E-04	0.0525	0.9973

Как показано в табл. 17, протестированные анти- 4-1ВВ антитела демонстрируют высокую аффин

-52045275 ность связывания с 4-1ВВ.

Пример 3. Получение aHTu-PD-L1/aHTu-4-1BB биспецифических антител.

В качестве примера были отобраны клоны Hu1210-41 (Hu1210 VH.4dxHu1210 VK.1, см. табл. 6, далее Н12) и В6 (см. табл. 12) среди анти-PD-L1 клонов, полученных в примере 1, клоны 41В01, 41В01.01, 41В01.02, 41ВО1.03, 41В01.04 и 41В02 среди анти-4-1ВВ клонов, полученных в примере 2, для получения анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифического антитела в форме scFv IgG X полной длины. Когда PD-L1 помещали в часть полного IgG, применяли IgG1 с ADCC усеченной мутантной основной цепью (N297A мутация, патент США № 7332581, 8219149 и т.д.), и когда 4-1ВВ помещали в часть полного IgG, применяли IgG4.

Сегмент ДНК 1, имеющий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела IgG анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифического антитела, вставляли в pcDNA 3.4 (Invitrogen, A14697; плазмида 1), и сегмент ДНК 2, имеющий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела IgG анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифического антитела, вставляли в pcDNA 3.4 (Invitrogen, A14697; плазмида 2). После этого сегмент ДНК 3, кодирующий scFv, сливали в части сегмента ДНК 1, соответствующей С-концу области Fc антитела IgG, вставленного в плазмиду 1, с использованием сегмента ДНК 4, кодирующего линкерный пептид, имеющий в длину 10 аминокислот, состоящий из (GGGGS)2, для конструирования векторов для экспрессии биспецифических антител. Кроме того, чтобы стабилизировать scFv применяли дополнительную модификацию для создания дисульфидного мостика, сливающего VL103-VH44 с С-концом легкой цепи и С-концом тяжелой цепи соответственно.

Последовательности тяжелой цепи, легкой цепи, scFv и ДНК сегментов приведены в табл. 18.

Таблица 18 Биспецифическое антитело, содержащее анти-PD-L1 клон в форме IgG и анти-4-1ВВ клон в форме scFv (PD-L1x4-1BB)

ABLPNB.01 ; (биспецифическое антитело, содержащее анти-PD-Ll Н12 клон в форме IgG и анти-41 ВВ 41 Β0Ί клон в форме scFv)

	Аминокислотная Нуклеотидная последовательность последовательность (5’—>3’) (N’^C’) (Seq ID (SeqIDNo.) No.)
Тяжелый	Тяжелая	цепь EVQLVESGGGLVQ GAGGTGCAGCTGGTGGAGA
; компонент	Н12	PGGSLRLSCAASG GCGGAGGAGGACTGGTGCA FTFSSYDMSWVRQ ACCCGGAGGCAGCCTGAGA APGKSLEWVATIS CTGAGCTGCGCTGCCAGCGG DAGGYIYYSDSVK CTTCACCTTCAGCAGCTACG GRFTISRDNAKNS ACATGAGCTGGGTGAGACA LYLQMNSLRDEDT GGCCCCTGGCAAAAGCCTGG AVYICAREFGKRY AGTGGGTGGCCACCATCTCC ALDYWGQGTTVT GATGCGGGCGGCTACATCTA VSSASTKGPSVFPL TTACTCCGACAGCGTGAAGG APSSKSTSGGTAA GCAGGTTCACCATCAGCAGG LGCLVKDYFPEPV GACAACGCCAAGAACAGCC TVSWNSGALTSGV TGTACCTGCAGATGAACAGC HTFPAVLQSSGLY CTGAGGGATGAGGACACCG SLSSVVTVPSSSLG CCGTGTACATCTGCGCCAGG TQTYICNVNHKPS GAGTTCGGCAAAAGGTACG NTKVDKKVEPKSC CCCTGGACTACTGGGGCCAG

- 53 045275

	DKTHTCPPCPAPEL	GGCACAACCGTGACCGTGA
	LGGPSVFLFPPKPK	GCAGCgctAgcAccAAgGGCCC
	DTLMISRTPEVTCV	CTCTGTGTTCCCTCTGGCCCC
	VVDVSHEDPEVKF	TTCCTCTAAATCCACCTCTG
	NWYVDGVEVHNA	GCGGAACCGCTGCTCTGGGC
	KTKPREEQYASTY	TGTCTGGTCAAGGACTACTT
	RVVSVLTVLHQD	CCCTGAGCCCGTGACCGTGT
	WLNGKEYKCKVS	CTTGGAATTCTGGCGCTCTG
	NKALPAPIEKTISK	ACCAGCGGAGTGCACACCTT
	AKGQPREPQVYTL	TCCAGCTGTGCTGCAGTCCT
	PPSREEMTKNQVS	CCGGCCTGTACTCTCTGTCC
	LTCLVKGFYPSDIA	TCTGTCGTGACAGTGCCTTC
	VEWESNGQPENN	CAGCTCTCTGGGCACCCAGA
	YKTTPPVLDSDGS	CCTACATCTGCAACGTGAAC
	FFLYSKLTVDKSR	CACAAGCCCTCCAACACCAA
	WQQGNVFSCSVM	GGTGGACAAGAAGGTGGAA
	HEALHNHYTQKSL	CCCAAGTCCTGCGACAAGAC
	SLSPGK	CCACACCTGTCCTCCATGTC
	(199)	CTGCTCCAGAACTGCTGGGC
Линкер	GGGGSGGGGSGG	GGACCCTCCGTGTTCCTGTT
	GGS (200)	CCCTCCAAAGCCTAAGGACA
scFv VL		CCCTGATGATCTCCCGGACC
41B01	QSVLTQPPSASGTP	CCTGAAGTGACCTGCGTGGT
	GRRVTISCSGSSSN	GGTGGATGTGTCCCACGAGG
	IGNNYVTWYQQL	ATCCCGAAGTGAAGTTCAAT
	PGTAPKLLIYADS	TGGTACGTGGACGGCGTGGA
	HRPSGVPDRFSGS	AGTGCACAACGCCAAGACC
	KSGTSASLAISGLR	AAGCCTAGAGAGGAACAGT
	SEDEADYYCATW	ACgccTCCACCTACCGGGTGG
	DYSLSGYVFGCGT	TGTCCGTGCTGACCGTTCTG
	KLTVL (201)	CACCAGGATTGGCTGAACGG
Линкер	GGGGSGGGGSGG	CAAAGAGTACAAGTGCAAG
	GGSGGGGS (202)	GTGTCCAACAAGGCCCTGCC
VH	EVQLLESGGGLVQ	TGCCCCTATCGAAAAGACC A
	PGGSLRLSCAASG	TCTCTAAGGCCAAGGGCCAG
	FTFSSYDMSWVRQ	CCCCGGGAACCTCAAGTGTA
	APGKCLEWVSWIS	CACCTTGCCTCCCAGCCGGG
	YSGGSIYYADSVK	AAGAGATGACCAAGAACCA
	GRFTISRDNSKNTL	GGTGTCCCTGACCTGCCTGG
	YLQMNSLRAEDTA	TTAAGGGCTTCTACCCCTCC
	VYYCARDGQRNS	GATATCGCCGTGGAATGGGA
	MREFDYWGQGTL	GTCTAACGGCCAGCCCGAGA
	VTVSS	ACAACTACAAGACCACCCCT
	(203)	CCTGTGCTGGACTCCGACGG

CTCATTCTTCCTGTACTCCAA

GCTGACCGTGGACAAGTCTC

- 54 045275

GGTGGCAGCAGGGCAACGT

GTTCTCCTGCTCTGTGATGC ACGAGGCCCTGCACAACCAC TACACCCAGAAGTCCCTGTC CCTGTCTCCCGGCAAAGGTG GGGGGGGATCTGGTGGTGGT GGATCAGGGGGTGGGGGGT CTCAAAGCGTACTCACCCAA CCTCCATCTGCATCCGGTAC ACCTGGTCGGCGAGTAACCA TCTCCTGCTCTGGGAGCTCT TCTAATATTGGTAACAACTA TGTCACCTGGTATCAGCAGT TGCCTGGGACAGCACCCAAA CTTCTTATATATGCCGATAG CCATCGGCCTTCCGGCGTAC CCGATCGCTTCTCCGGGTCA AAATCTGGAACATCTGCCTC ACTCGCAATTAGTGGATTGC GATCTGAGGATGAAGCAGA TTATTATTGCGCTACCTGGG ATTATTCACTTTCTGGCTAC GTCTTTGGTtgtggaACAAAAC TTACCGTGTTGGGCGGCGGA GGAAGCGGAGGCGGCGGTT CTGGTGGTGGCGGTAGCGGA GGTGGTGGATCTGAAGTACA GCTTCTTGAGTCTGGCGGAG GATTGGTCCAGCCAGGCGGT TCCCTCCGCCTGTCATGTGC CGCATCCGGCTTTACTTTCTC TAGTTATGATATGAGCTGGG TTCGCCAAGCTCCTGGCAAA tgcCTGGAGTGGGTCTCCTGG atttcatactcaggtggcag

- 55 045275

CATCTATTATGCTGACAGTG

Легкий Легкая цепь Η12 компонент

TGAAAGGTCGCTTTACAATC TCCCGAGATAACAGCAAAA ACACCTTGTACCTGCAAATG AACAGCCTTCGCGCAGAGG ACACAGCCGTATATTATTGC GCTCGCGATGGACAACGTAA TTCTATGCGTGAGTTTGACT ACTGGGGACAGGGGACATT GGTCACTGTATCTTCCtga (204)

DIQMTQSPSSLSAS GACATCCAGATGACCCAGA

VGDRVTITCKASQ GCCCTAGCAGCCTGAGCGCT DVTPAVAWYQQK AGCGTGGGCGACAGGGTGA PGKAPKLLIYSTSS CCATCACCTGCAAGGCCAGC RYTGVPSRFSGSG CAGGATGTGACCCCTGCCGT SGTDFTFTISSLQPE GGCCTGGTACCAGCAGAAG DIATYYCQQHYTT CCCGGCAAGGCCCCCAAGCT PLTFGQGTKLEIK GCTGATCTACAGCACCAGCA RTVAAPSVFIFPPS GCAGGTACACCGGCGTGCCC DEQLKSGTASVVC AGCAGGTTTAGCGGAAGCG LLNNFYPREAKVQ GCAGCGGCACCGACTTCACC WKVDNALQSGNS TTCACCATCAGCAGCCTGCA QESVTEQDSKDST GCCCGAGGACATCGCCACCT YSLSSTLTLSKADY ACTACTGCCAGCAGCACTAC EKHKVYACEVTH ACCACCCCTCTGACCTTCGG QGLSSPVTKSFNR CCAGGGCACCAAGCTGGAG GEC (28) ATCAAGAGAACCGTGGCCG

CTCCCTCCGTGTTCATCTTCC

CACCATCTGACGAGCAGCTG AAGTCCGGCACCGCTTCTGT CGTGTGCCTGCTGAACAACT TCTACCCTCGGGAAGCCAAG GTGCAGTGGAAGGTGGACA ATGCCCTGCAGTCCGGCAAC

- 56 045275

TCCCAAGAGTCTGTGACCGA

GCAGGACTCCAAGGACAGC ACCTACTCCCTGTCCTCTAC CCTGACCCTGTCCAAGGCCG ACTACGAGAAGCACAAGGT GTACGCCTGCGAAGTGACCC ACCAGGGACTGTCTAGCCCC GTGACCAAGTCCTTCAACAG

AGGCGAGTGCTGA (205)

ABLPNB.02 (биспецифическое антитело, содержащее анти-PD-Ll H12 клон в форме IgG и анти-41 ВВ 41 В01.03 клон в форме scFv)

	Аминокислотная Нуклеотидная последовательность последовательность (5’—>3’) (Ν’—>С’) (Seq ID (Seq ID No.) No.)
Тяжелый	Тяжелая	цепь EVQLVESGGGLVQ GAGGTGCAGCTGGTGGAGA
компонент	Н12	PGGSLRLSCAASG GCGGAGGAGGACTGGTGCA FTFSSYDMSWVRQ ACCCGGAGGCAGCCTGAGA APGKSLEWVATIS CTGAGCTGCGCTGCCAGCGG DAGGYIYYSDSVK CTTCACCTTCAGCAGCTACG GRFTISRDNAKNS ACATGAGCTGGGTGAGACA LYLQMNSLRDEDT GGCCCCTGGCAAAAGCCTGG AVYICAREFGKRY AGTGGGTGGCCACCATCTCC ALDYWGQGTTVT GATGCGGGCGGCTACATCTA VSSASTKGPSVFPL TTACTCCGACAGCGTGAAGG APSSKSTSGGTAA GCAGGTTCACCATCAGCAGG LGCLVKDYFPEPV GACAACGCCAAGAACAGCC TVSWNSGALTSGV TGTACCTGCAGATGAACAGC HTFPAVLQSSGLY CTGAGGGATGAGGACACCG S LS S VVTVPSSS LG CCGTGTACATCTGCGCCAGG TQTYICNVNHKPS GAGTTCGGCAAAAGGTACG NTKVDKKVEPKSC CCCTGGACTACTGGGGCCAG DKTHTCPPCPAPEL GGCACAACCGTGACCGTGA

LGGPSVFLFPPKPK GCAGCgctAgcAccAAgGGCCC

- 57 045275

DTLM IS RTPE VTC V CTCTGTGTTCCCTCTGGCCCC

	VVDVSHEDPEVKF	TTCCTCTAAATCCACCTCTG
	NWYVDGVEVHNA KTKPREEQYASTY RVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSL SLSPGK (206)	GCGGAACCGCTGCTCTGGGC TGTCTGGTCAAGGACTACTT CCCTGAGCCCGTGACCGTGT CTTGGAATTCTGGCGCTCTG ACCAGCGGAGTGCACACCTT TCCAGCTGTGCTGCAGTCCT CCGGCCTGTACTCTCTGTCC TCTGTCGTGACAGTGCCTTC CAGCTCTCTGGGCACCCAGA CCTACATCTGCAACGTGAAC CACAAGCCCTCCAACACCAA GGTGGACAAGAAGGTGGAA CCCAAGTCCTGCGACAAGAC CCACACCTGTCCTCCATGTC
Линкер	GGGGSGGGGSGG GGS (207)	CTGCTCCAGAACTGCTGGGC GGACCCTCCGTGTTCCTGTT
scFv VL	QSVLTQPPSASGTP	CCCTCCAAAGCCTAAGGACA
41B01	GQRVTISCSGSSSN	CCCTGATGATCTCCCGGACC
.03	IGNNYVTWYQQL PGTAPKLLIYADS HRPSGVPDRFSGS KSGTSASLAISGLR SEDEADYYCATW DYSLSGYVFGCGT KLTVL (208)	CCTGAAGTGACCTGCGTGGT GGTGGATGTGTCCCACGAGG ATCCAGAAGTGAAGTTCAAT TGGTACGTGGACGGCGTGGA AGTGCACAATGCCAAGACC AAGCCTAGAGAGGAACAGT ACGCCTCCACCTACAGAGTG
Линкер	GGGGSGGGGSGG GGSGGGGS (209)	GTGTCCGTGCTGACTGTGCT GCACCAGGATTGGCTGAACG
VH	EVQLLESGGGLVQ PGGSLRLSCAASG FTFSSYDMSWVRQ APGKCLEWVSWIS YSGGSIYYADSVK	GCAAAGAGTACAAGTGCAA GGTGTCCAACAAGGCCCTGC CTGCTCCTATCGAAAAGACC ATCAGCAAGGCCAAGGGCC AGCCTAGGGAACCCCAGGTT TACACCCTGCCTCCAAGCCG

- 58 045275

GRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTA VYYCARDAQRNS MREFDYWGQGTL

VTVSS (210)

GGAAGAGATGACCAAGAAC

CAGGTGTCCCTGACCTGCCT

CGTGAAGGGCTTCTACCCTT

CCGATATCGCCGTGGAATGG

GAGAGCAATGGCCAGCCTG

AGAACAACTACAAGACAAC

CCCTCCTGTGCTGGACTCCG

ACGGCTCATTCTTCCTGTAC

TCCAAGCTGACCGTGGACAA

GTCCAGATGGCAGCAGGGC

AACGTGTTCTCCTGCTCCGT

GATGCACGAGGCCCTGCACA

ATCACTACACCCAGAAGTCC

CTGTCTCTGAGCCCTGGAAA

AGGCGGCGGAGGATCTGGC

GGAGGTGGTAGCGGAGGCG

GTGGATCTCAGTCTGTTCTG

ACCCAGCCTCCTTCCGCTTC

TGGCACCCCTGGAcAGAGAG

TGACCATCTCTTGCTCCGGC

TCCTCCTCCAACATCGGCAA

CAACTACGTGACCTGGTATC

AGCAGCTGCCCGGCACAGCT

CCCAAACTGCTGATCTACGC

CGACTCTCACAGACCTTCCG

GCGTGCCCGATAGATTCTCC

GGCTCTAAGTCTGGCACCTC

TGCCAGCCTGGCTATCAGCG

GCCTGAGATCTGAGGACGA

GGCCGACTACTACTGCGCCA

CCTGGGATTATTCCCTGTCC

GGCTACGTGTTCGGCTGCGG

CACAAAACTGACAGTGCTCG

GAGGCGGAGGAAGTGGTGG

CGGAGGTTCAGGTGGTGGTG

- 59 045275

GTAGTGGCGGAGGCGGATC

AGAAGTTCAGCTGTTGGAGT

CAGGTGGCGGCTTGGTGCAA

CCAGGTGGAAGTCTGAGACT

CAGCTGTGCTGCCAGCGGCT

TTACCTTCAGCTCCTACGAC

ATGAGCTGGGTTCGACAAGC

TCCCGGAAAGTGCTTGGAGT

GGGTTTCCTGGATCTCCTAC

TCCGGCGGCAGCATCTATTA

CGCCGACAGCGTGAAAGGC

CGGTTTACCATCTCTCGGGA

TAACAGCAAGAATACCCTCT

ACCTCCAAATGAACTCTCTG

AGAGCCGAGGACACTGCTGT

GTACTATTGCGCCAGAGATG ccCAGCGGAACTCCATGAGA

GAGTTCGACTACTGGGGACA

AGGCACCCTGGTCACCGTGT

CTAGTTGA (211)

Легкий

Легкая цепь Η12 DIQMTQSPSSLSAS

GACATCCAGATGACCCAGA компонент

VGDRVTITCKASQ

GCCCTAGCAGCCTGAGCGCT

DVTPAVAWYQQK

AGCGTGGGCGACAGGGTGA

PGKAPKLLIYSTSS

CCATCACCTGCAAGGCCAGC

RYTGVPSRFSGSG

CAGGATGTGACCCCTGCCGT

SGTDFTFTISSLQPE

GGCCTGGTACCAGCAGAAG

DIATYYCQQHYTT

CCCGGCAAGGCCCCCAAGCT

PLTFGQGTKLEIK

GCTGATCTACAGCACCAGCA

RTVAAPSVFIFPPS

GCAGGTACACCGGCGTGCCC

DEQLKSGTASVVC

AGCAGGTTTAGCGGAAGCG

LLNNFYPREAKVQ

GCAGCGGCACCGACTTCACC

WKVDNALQSGNS

TTCACCATCAGCAGCCTGCA

QESVTEQDSKDST

GCCCGAGGACATCGCCACCT

YSLSSTLTLSKADY

ACTACTGCCAGCAGCACTAC

EKHKVYACEVTH

ACCACCCCTCTGACCTTCGG

- 60 045275

QGLSSPVTKSFNR	CCAGGGCACCAAGCTGGAG
GEC (30)	ATCAAGAGAACCGTGGCCG CTCCCTCCGTGTTCATCTTCC CACCATCTGACGAGCAGCTG AAGTCCGGCACCGCTTCTGT CGTGTGCCTGCTGAACAACT TCTACCCTCGGGAAGCCAAG GTGCAGTGGAAGGTGGACA ATGCCCTGCAGTCCGGCAAC TCCCAAGAGTCTGTGACCGA GCAGGACTCCAAGGACAGC ACCTACTCCCTGTCCTCTAC CCTGACCCTGTCCAAGGCCG ACTACGAGAAGCACAAGGT GTACGCCTGCGAAGTGACCC ACCAGGGACTGTCTAGCCCC GTGACCAAGTCCTTCAACAG AGGCGAGTGCTGA (212)

ABLPNB.03 (биспецифическое антитело, содержащее анти-PD-LI Н12 клон в форме IgG и анит-41ВВ 41В02 клон в форме scFv

Аминокислотная	Нуклеотидная
последовательность	последовательность (5’—>3’)
(Ν’—>C’) (Seq ID	(Seq ID No.)

No.)

Тяжелый Тяжелая цепь EVQLVESGGGLVQ	GAGGTGCAGCTGGTGGAGA
компонент H12 PGGSLRLSCAASG	GCGGAGGAGGACTGGTGCA
FTFSSYDMSWVRQ	ACCCGGAGGCAGCCTGAGA
APGKSLEWVATIS	CTGAGCTGCGCTGCCAGCGG
DAGGYIYYSDSVK	CTTCACCTTCAGCAGCTACG
GRFTISRDNAKNS	ACATGAGCTGGGTGAGACA
LYLQMNSLRDEDT	GGCCCCTGGCAAAAGCCTGG
AVYICAREFGKRY	AGTGGGTGGCCACCATCTCC
ALDYWGQGTTVT	GATGCGGGCGGCTACATCTA
VSSASTKGPSVFPL	TTACTCCGACAGCGTGAAGG

- 61 045275

	APSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPV
		TVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPEL LGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNA KTKPREEQYASTY RVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSL SLSPGK(213)
Линкер		GGGGSGGGGSGG GGS (214)
scFv 41B02	VL	QSVLTQPPSASGTP GRRVTISCSGSSSN IGNNYVTWYQQL PGTAPKLLIYADS HRPSGVPDRFSGS KSGTSASLAISGLR SEDEADYYCATW

GCAGGTTCACCATCAGCAGG

GACAACGCCAAGAACAGCC

TGTACCTGCAGATGAACAGC

CTGAGGGATGAGGACACCG

CCGTGTACATCTGCGCCAGG

GAGTTCGGCAAAAGGTACG

CCCTGGACTACTGGGGCCAG

GGCACAACCGTGACCGTGA

GCAGCgctAgcAccAAgGGCCC

CTCTGTGTTCCCTCTGGCCCC

TTCCTCTAAATCCACCTCTG

GCGGAACCGCTGCTCTGGGC

TGTCTGGTCAAGGACTACTT

CCCTGAGCCCGTGACCGTGT

CTTGGAATTCTGGCGCTCTG

ACCAGCGGAGTGCACACCTT

TCCAGCTGTGCTGCAGTCCT

CCGGCCTGTACTCTCTGTCC

TCTGTCGTGACAGTGCCTTC

CAGCTCTCTGGGCACCCAGA

CCTACATCTGCAACGTGAAC

CACAAGCCCTCCAACACCAA

GGTGGACAAGAAGGTGGAA

CCCAAGTCCTGCGACAAGAC

CCACACCTGTCCTCCATGTC

CTGCTCCAGAACTGCTGGGC

GGACCCTCCGTGTTCCTGTT

CCCTCCAAAGCCTAAGGACA

CCCTGATGATCTCCCGGACC

CCTGAAGTGACCTGCGTGGT

GGTGGATGTGTCCCACGAGG

ATCCCGAAGTGAAGTTCAAT

TGGTACGTGGACGGCGTGGA

AGTGCACAACGCCAAGACC

- 62 045275

DYSLSGYVFGCGT KLTVL(215)

Линкер GGGGSGGGGSGG

GGSGGGGS (216)

VH EVQLLESGGGLVQ PGGSLRLSCAASG

FTFSGYDMSWVR QAPGKCLEWVSVI YPDDGNTYYADS

VKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAE DAAVYYCAKHGG QKPTTKSSSAYG

MDGWGQGTLVTV SS (217)

AAGCCTAGAGAGGAACAGT ACgccTCCACCTACCGGGTGG TGTCCGTGCTGACCGTTCTG CACCAGGATTGGCTGAACGG CAAAGAGTACAAGTGCAAG GTGTCCAACAAGGCCCTGCC TGCCCCTATCGAAAAGACCA TCTCTAAGGCCAAGGGCCAG CCCCGGGAACCTCAAGTGTA CACCTTGCCTCCCAGCCGGG AAGAGATGACCAAGAACCA GGTGTCCCTGACCTGCCTGG TTAAGGGCTTCTACCCCTCC GATATCGCCGTGGAATGGGA GTCTAACGGCCAGCCCGAGA ACAACTACAAGACCACCCCT CCTGTGCTGGACTCCGACGG CTC ATTCTTCCTGT ACTCC A A GCTGACCGTGGACAAGTCTC GGTGGCAGCAGGGCAACGT GTTCTCCTGCTCTGTGATGC ACGAGGCCCTGCACAACCAC TACACCCAGAAGTCCCTGTC CCTGTCTCCCGGCAAAGGTG GGGGGGGATCTGGTGGTGGT GGATCAGGGGGTGGGGGGT CTCAAAGCGTACTCACCCAA CCTCCATCTGCATCCGGTAC ACCTGGTCGGCGAGTAACCA TCTCCTGCTCTGGGAGCTCT TCTAATATTGGTAACAACTA TGTCACCTGGTATCAGCAGT TGCCTGGGACAGCACCCAAA CTTCTTATATATGCCGATAG CCATCGGCCTTCCGGCGTAC

- 63 045275

CCGATCGCTTCTCCGGGTCA AAATCTGGAACATCTGCCTC

ACTCGCAATTAGTGGATTGC GATCTGAGGATGAAGCAGA TTATTATTGCGCTACCTGGG ATTATTCACTTTCTGGCTAC GTCTTTGGTtgtGGAACAAAA CTTACCGTGTTGGGCGGCGG AGGAAGCGGAGGCGGCGGT TCTGGTGGTGGCGGTAGCGG AGGTGGTGGATCTGAGGTTC AACTGTTGGAGTCAGGTGGC GGACTTGTCCAGCCTGGCGG GTCTCTGAGGCTGAGTTGCG CTGCTTCTGGGTTTACTTTTT CAGGATATGACATGAGTTGG GTACGTCAGGCTCCAGGTAA GtgcCTCGAATGGGTCTCCGT TATCTATCCCGATGATGGAA ATACTTACTACGCTGACAGT GTGAAAGGCAGGTTCACAAT CAGTAGGGACAATTCTAAAA ATACACTCTACCTCCAGATG AACTCACTTCGAGCCGAGGA CGCCGCCGTATATTACTGTG CCAAACACGGCGGGCAAAA ACCCACTACTAAATCCAGTA GTGCTTACGGGATGGATGGC TGGGGACAGGGGACATTGG

TCACTGTATCTTCCtga (218)

Легкий компонент

Легкая цепь Η12 DIQMTQSPSSLSAS GACATCCAGATGACCCAGA

VGDRVTITCKASQ GCCCTAGCAGCCTGAGCGCT

DVTPAVAWYQQK AGCGTGGGCGACAGGGTGA

PGKAPKLLIYSTSS CCATCACCTGCAAGGCCAGC

RYTGVPSRFSGSG CAGGATGTGACCCCTGCCGT

- 64 045275

SGTDFTFTISSLQPE GGCCTGGTACCAGCAGAAG D1ATYYCQQHYTT CCCGGCAAGGCCCCCAAGCT PLTFGQGTKLEIK GCTGATCTACAGCACCAGCA RTVAAPSVFIFPPS GCAGGTACACCGGCGTGCCC DEQLKSGTASVVC AGCAGGTTTAGCGGAAGCG LLNNFYPREAKVQ GCAGCGGCACCGACTTCACC WKVDNALQSGNS TTCACCATCAGCAGCCTGCA QESVTEQDSKDST GCCCGAGGACATCGCCACCT YSLSSTLTLSKADY ACTACTGCCAGCAGCACTAC EKHKVYACEVTH ACCACCCCTCTGACCTTCGG QGLSSPVTKSFNR CCAGGGCACCAAGCTGGAG GEC (32) ATCAAGAGAACCGTGGCCG

CTCCCTCCGTGTTCATCTTCC CACCATCTGACGAGCAGCTG AAGTCCGGCACCGCTTCTGT CGTGTGCCTGCTGAACAACT TCTACCCTCGGGAAGCCAAG GTGCAGTGGAAGGTGGACA ATGCCCTGCAGTCCGGCAAC TCCCAAGAGTCTGTGACCGA GCAGGACTCCAAGGACAGC ACCTACTCCCTGTCCTCTAC CCTGACCCTGTCCAAGGCCG ACTACGAGAAGCACAAGGT GTACGCCTGCGAAGTGACCC ACCAGGGACTGTCTAGCCCC GTGACCAAGTCCTTCAACAG AGGCGAGTGCTGA (219)

ABLPNB.04 (биспецифическое антитело, содержащее анти-PD-Ll Вб клон в форме IgG и анти-4-1ВВ

ВО 1 клон в форме scFv)

Аминокислотная Нуклеотидная последовательность последовательность (5’—>3’) (Seq ID No.)

- 65 045275

	(Ν’—>С’) (Scq ID No.)
Тяжелый	Тяжелая цепь EVQLVESGGGLVQ GAAGTGCAGCTGGTTGAATC
компонент	B6 PGGSLRLSCAASG TGGCGGCGGATTGGTTCAGC FTFSSYDMSWVRQ CTGGCGGATCTCTGAGACTG APGKSLEWVATIS TCTTGTGCCGCCTCCGGCTT DAGGYIYYRDSV CACCTTCTCCAGCTACGATA KGRFTISRDNAKN TGTCCTGGGTCCGACAGGCC SLYLQMNSLRDED CCTGGCAAGTCTTTGGAATG T A V Y IC ARELPWR GGTCGCC ACC ATCTCTG ACG YALDYWGQGTTV CTGGCGGCTACATCTACTAC TVSSASTKGPSVFP CGGGACTCTGTGAAGGGCA LAPSS KSTSGGT A G ATTC ACC АТС AGCCGGG AC ALGCLVKDYFPEP AACGCCAAGAACTCCCTGTA VTVSWNSGALTSG CCTGCAGATGAACAGCCTGC VHTFPAVLQSSGL GCGACGAGGATACCGCCGT YSLSSVVTVPSSSL GTACATCTGTGCTAGAGAGC GTQTYICNVNHKP TGCCTTGGAGATACGCCCTG SNTKVDKKVEPKS GATTATTGGGGCCAGGGCAC CDKTHTCPPCPAP CACAGTGACCGTGTCCTCTG ELLGGPSVFLFPPK CTTCTACCAAGGGACCCAGC PKDTLMISRTPEVT GTGTTCCCTCTGGCTCCTTCC CVVVDVSHEDPEV AGCAAGTCTACCTCTGGCGG KFNWYVDGVEVH AACAGCTGCTCTGGGCTGCC NAKTKPREEQYAS TGGTCAAGGACTACTTTCCT TYRVVSVLTVLHQ GAGCCTGTGACAGTGTCCTG DWLNGKEYKCKV GAACTCTGGCGCTCTGACAT SNKALPAPIEKTIS CTGGCGTGCACACCTTTCCA KAKGQPREPQVYT GCAGTGCTGCAGTCCTCCGG LPPSREEMTKNQV CCTGTACTCTCTGTCCTCTGT S LTCLVKGFYPS DI CGTGACCGTGCCTTCC AGCT AVEWESNGQPEN CTCTGGGAACCCAGACCTAC NYKTTPPVLDSDG ATCTGCAATGTGAACCACAA S FFLYS KLTVDKS R GCCTTCC AAC ACC AAGGTGG WQQGNVFSCSVM ACAAGAAGGTGGAACCCAA

- 66 045275

	HEALHNHYTQKSL GTCCTGCGACAAGACCCACA SLSPGK (220) CCTGTCCTCCATGTCCTGCTC
Линкер scFv	VL	GGGGSGGGGSGG CAGAACTGCTCGGCGGACCT GGS (221) TCCGTGTTCCTGTTTCCTCCA QSVLTQPPSASGTP AAGCCTAAGGACACCCTGAT
41В01	Линкер VH	GRRVTISCSGSSSN GATCTCTCGGACCCCTGAAG IGNNYVTWYQQL TGACCTGCGTGGTGGTGGAT PGTAPKLLIYADS GTGTCCCACGAGGATCCAGA HRPSGVPDRFSGS AGTGAAGTTCAATTGGTACG KSGTSASLAISGLR TGGACGGCGTGGAAGTGCA SEDEADYYCATW CAATGCCAAGACCAAGCCTA DYSLSGYVFGCGT GAGAGGAACAGTACGCCTC KLTVL (222) CACCTACAGAGTGGTGTCCG GGGGSGGGGSGG TGCTGACTGTGCTGCACCAG GGSGGGGS (223) GATTGGCTGAACGGCAAAG EVQLLESGGGLVQ AGTACAAGTGCAAGGTGTCC PGGSLRLSCAASG AACAAGGCCCTGCCTGCTCC FTFSSYDMSWVRQ T ATCGAAAAGACCАТСAGCA APGKCLEWVSWIS AGGCCAAGGGCCAGCCTAG YSGGSIYYADSVK GGAACCCCAGGTTT ACACCC GRFTISRDNSKNTL TGCCTCCAAGCCGGGAAGA YLQMNSLRAEDTA GATGACCAAGAACCAGGTG VYYCARDGQRNS TCCCTGACCTGCCTCGTGAA MREFDYWGQGTL GGGCTTCTACCCTTCCGATA VTVSS (224) TCGCCGTGGAATGGGAGAG CAATGGCCAGCCTGAGAAC AACTACAAGACAACCCCTCC TGTGCTGGACTCCGACGGCT cattcttcctgtactccaag CTGACCGTGGACAAGTCCAG ATGGCAGCAGGGCAACGTG TTCTCCTGCTCCGTGATGCA CGAGGCCCTGCACAATCACT ACACCCAGAAGTCCCTGTCT CTGAGCCCTGGAAAAGGCG

- 67 045275

GCGGAGGATCTGGCGGAGG

TGGTAGCGGAGGCGGTGGA

TCTCAGTCTGTTCTGACCCA

GCCTCCTTCCGCTTCTGGCA

CCCCTGGAAGAAGAGTGAC

CATCTCTTGCTCCGGCTCCTC

CTCCAACATCGGCAACAACT

ACGTGACCTGGTATCAGCAG

CTGCCCGGCACAGCTCCCAA

ACTGCTGATCTACGCCGACT

CTCACAGACCTTCCGGCGTG

CCCGATAGATTCTCCGGCTC

TAAGTCTGGCACCTCTGCCA

GCCTGGCTATCAGCGGCCTG

AGATCTGAGGACGAGGCCG

ACTACTACTGCGCCACCTGG

GATTATTCCCTGTCCGGCTA

CGTGTTCGGCTGCGGCACAA

AACTGACAGTGCTCGGAGGC

GGAGGAAGTGGTGGCGGAG

GTTCAGGTGGTGGTGGTAGT

GGCGGAGGCGGATCAGAAG

TTCAGCTGTTGGAGTCAGGT

GGCGGCTTGGTGCAACCAGG

TGGAAGTCTGAGACTCAGCT

GTGCTGCCAGCGGCTTTACC

TTCAGCTCCTACGACATGAG

CTGGGTTCGACAAGCTCCCG

GAAAGTGCTTGGAGTGGGTT

TCCTGGATCTCCTACTCCGG

CGGCAGCATCTATTACGCCG

ACAGCGTGAAAGGCCGGTTT

ACCATCTCTCGGGATAACAG

CAAGAATACCCTCTACCTCC

AAATGAACTCTCTGAGAGCC

- 68 045275

		GAGGACACTGCTGTGTACTA TTGCGCCAGAGATGGCCAGC GGAACTCCATGAGAGAGTTC GACTACTGGGGACAAGGCA CCCTGGTCACCGTGTCTAGT
Легкий Легкая цепь Вб компонент	DIQMTQSPSSLSAS VGDRVT1TCKASQ	TGA (225) GACATCCAGATGACCCAGA GCCCTAGCAGCCTGAGCGCT
	DVTPAVAWYQQK	AGCGTGGGCGACAGGGTGA
	PGKAPKLLIYSTSS	CCATCACCTGCAAGGCCAGC
	RYTGVPSRFSGSG	CAGGATGTGACCCCTGCCGT
	SGTDFTFTISSLQPE	GGCCTGGTACCAGCAGAAG
	DIATYYCQQHYTT	CCCGGCAAGGCCCCCAAGCT
	PLTFGQGTKLEIK	GCTGATCTACAGCACCAGCA
	RTVAAPSVFIFPPS	GCAGGTACACCGGCGTGCCC
	DEQLKSGTASVVC	AGCAGGTTTAGCGGAAGCG
	LLNNFYPREAKVQ	GCAGCGGCACCGACTTCACC
	WKVDNALQSGNS	TTCACCATCAGCAGCCTGCA
	QESVTEQDSKDST	GCCCGAGGACATCGCCACCT
	YSLSSTLTLSKADY	ACTACTGCC AGCAGC ACT АС
	EKHKVYACEVTH	ACCACCCCTCTGACCTTCGG
	QGLSSPVTKSFNR	CCAGGGCACCAAGCTGGAG
	GEC (34)	ATCAAGAGAACCGTGGCCG

CTCCCTCCGTGTTCATCTTCC CACCATCTGACGAGCAGCTG AAGTCCGGCACCGCTTCTGT CGTGTGCCTGCTGAACAACT TCTACCCTCGGGAAGCCAAG GTGCAGTGGAAGGTGGACA ATGCCCTGCAGTCCGGC A AC TCCCAAGAGTCTGTGACCGA GCAGGACTCCAAGGACAGC ACCTACTCCCTGTCCTCTAC

CCTGACCCTGTCCAAGGCCG ACTACGAGAAGCACAAGGT

- 69 045275

GTACGCCTGCGAAGTGACCC

ACCAGGGACTGTCTAGCCCC

GTGACCAAGTCCTTCAACAG

AGGCGAGTGCTGA (226)

ABLPNB.05 (биспецифическое антитело, содержащее анти-PD-Ll Вб клон в форме IgG и анти-4-1 В В

ВО 1.01 клон в форме scFv)

Аминокислотная Нуклеотидная последовательность последовательность (5’—>3’) (Ν’—>С’) (Seq ID (Seq ID No.) No.)
Тяжелый	Тяжелая	цепь EVQLVESGGGLVQ GAAGTGCAGCTGGTTGAATC
компонент	Вб	PGGSLRLSCAASG TGGCGGCGGATTGGTTCAGC FTFSSYDMSWVRQ CTGGCGGATCTCTGAGACTG APGKSLEWVATIS TCTTGTGCCGCCTCCGGCTT DAGGYIYYRDSV CACCTTCTCCAGCTACGATA KGRFTISRDNAKN TGTCCTGGGTCCGACAGGCC SLYLQMNSLRDED CCTGGCAAGTCTTTGGAATG TAVYICARELPWR GGTCGCCACCATCTCTGACG YALDYWGQGTTV CTGGCGGCTACATCTACTAC TVSSASTKGPSVFP CGGGACTCTGTGAAGGGCA LAPSSKSTSGGTA GATTCACCATCAGCCGGGAC ALGCLVKDYFPEP AACGCCAAGAACTCCCTGTA VTVSWNS GALTS G CCTGCAGATGAACAGCCTGC VHTFPAVLQSSGL GCGACGAGGATACCGCCGT YSLSSVVTVPSSSL GTACATCTGTGCTAGAGAGC GTQTYICNVNHKP TGCCTTGGAGATACGCCCTG SNTKVDKKVEPKS GATTATTGGGGCCAGGGCAC CDKTHTCPPCPAP CACAGTGACCGTGTCCTCTG ELLGGPSVFLFPPK CTTCTACCAAGGGACCCAGC PKDTLMISRTPEVT GTGTTCCCTCTGGCTCCTTCC CVVVDVSHEDPEV AGCAAGTCTACCTCTGGCGG KFNWYVDGVEVH AACAGCTGCTCTGGGCTGCC NAKTKPREEQYAS TGGTCAAGGACTACTTTCCT TYRVVSVLTVLHQ GAGCCTGTGACAGTGTCCTG

- 70 045275

DWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTIS	GAACTCTGGCGCTCTGACAT CTGGCGTGCACACCTTTCCA
Линкер	KAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSL SLSPGK (227) GGGGSGGGGSGG	GCAGTGCTGCAGTCCTCCGG CCTGTACTCTCTGTCCTCTGT CGTGACCGTGCCTTCCAGCT CTCTGGGAACCCAGACCTAC ATCTGCAATGTGAACCACAA GCCTTCCAACACCAAGGTGG ACAAGAAGGTGGAACCCAA GTCCTGCGACAAGACCCACA CCTGTCCTCCATGTCCTGCTC CAGAACTGCTCGGCGGACCT
scFv	GGS (228) VL QSVLTQPPSASGTP	TCCGTGTTCCTGTTTCCTCCA AAGCCTAAGGACACCCTGAT
41B01	GRRVTISCSGSSSN	GATCTCTCGGACCCCTGAAG
.01	IGNNYVTWYQQL	TGACCTGCGTGGTGGTGGAT
	PGTAPKLLIYADS HRPSGVPDRFSGS KSGTSASLAISGLR SEDEADYYCATW DYSLSGYVFGCGT KLTVL (229) Линкер GGGGSGGGGSGG	GTGTCCCACGAGGATCCAGA AGTGAAGTTCAATTGGTACG TGGACGGCGTGGAAGTGCA CAATGCCAAGACCAAGCCTA GAGAGGAACAGTACGCCTC CACCTACAGAGTGGTGTCCG TGCTGACTGTGCTGCACCAG
	GGSGGGGS (230) VH EVQLLESGGGLVQ	GATTGGCTGAACGGCAAAG AGTACAAGTGCAAGGTGTCC
	PGGSLRLSCAASG FTFSSYDMSWVRQ APGKCLEWVSWIS YSGGSIYYADSVK GRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTA VYYCARDAQRNS MREFDYWGQGTL VTVSS (231)	AACAAGGCCCTGCCTGCTCC TATCGAAAAGACCATCAGCA AGGCCAAGGGCCAGCCTAG GGAACCCCAGGTTTACACCC TGCCTCCAAGCCGGGAAGA GATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGCCTCGTGAA GGGCTTCTACCCTTCCGATA TCGCCGTGGAATGGGAGAG CAATGGCCAGCCTGAGAAC

- 71 045275

AACTACAAGACAACCCCTCC

TGTGCTGGACTCCGACGGCT

CATTCTTCCTGTACTCCAAG

CTGACCGTGGACAAGTCCAG

ATGGCAGCAGGGCAACGTG

TTCTCCTGCTCCGTGATGCA

CGAGGCCCTGCACAATCACT

ACACCCAGAAGTCCCTGTCT

CTGAGCCCTGGAAAAGGCG

GCGGAGGATCTGGCGGAGG

TGGTAGCGGAGGCGGTGGA

TCTCAGTCTGTTCTGACCCA

GCCTCCTTCCGCTTCTGGCA

CCCCTGGAAGAAGAGTGAC

CATCTCTTGCTCCGGCTCCTC

CTCCAACATCGGCAACAACT

ACGTGACCTGGTATCAGCAG

CTGCCCGGCACAGCTCCCAA

ACTGCTGATCTACGCCGACT

CTCACAGACCTTCCGGCGTG

CCCGATAGATTCTCCGGCTC

TAAGTCTGGCACCTCTGCCA

GCCTGGCTATCAGCGGCCTG

AGATCTGAGGACGAGGCCG

ACTACTACTGCGCCACCTGG

GATTATTCCCTGTCCGGCTA

CGTGTTCGGCTGCGGCACAA

AACTGACAGTGCTCGGAGGC

GGAGGAAGTGGTGGCGGAG

GTTCAGGTGGTGGTGGTAGT

GGCGGAGGCGGATCAGAAG

TTCAGCTGTTGGAGTCAGGT

GGCGGCTTGGTGCAACCAGG

TGGAAGTCTGAGACTCAGCT

GTGCTGCCAGCGGCTTTACC

- 72 045275

Легкий компонент

Легкая цепь Вб

TTCAGCTCCTACGACATGAG

CTGGGTTCGACAAGCTCCCG

GAAAGTGCTTGGAGTGGGTT

TCCTGGATCTCCTACTCCGG

CGGCAGCATCTATTACGCCG

ACAGCGTGAAAGGCCGGTTT

ACCATCTCTCGGGATAACAG

CAAGAATACCCTCTACCTCC

AAATGAACTCTCTGAGAGCC

GAGGACACTGCTGTGTACTA

TTGCGCCAGAGATGccCAGC

GGAACTCCATGAGAGAGTTC

GACTACTGGGGACAAGGCA

CCCTGGTCACCGTGTCTAGT

TGA (232)

DIQMTQSPSSLSAS GACATCCAGATGACCCAGA

VGDRVTITCKASQ GCCCTAGCAGCCTGAGCGCT DVTPAVAWYQQK AGCGTGGGCGACAGGGTGA PGKAPKLLIYSTSS CCATCACCTGCAAGGCCAGC RYTGVPSRFSGSG CAGGATGTGACCCCTGCCGT SGTDFTFTISSLQPE GGCCTGGTACCAGCAGAAG DIATYYCQQHYTT CCCGGCAAGGCCCCCAAGCT PLTFGQGTKLEIK GCTGATCTACAGCACCAGCA RTVAAPSVFIFPPS GCAGGTACACCGGCGTGCCC DEQLKSGTASVVC AGCAGGTTTAGCGGAAGCG LLNNFYPREAKVQ GCAGCGGCACCGACTTCACC WKVDNALQSGNS TTCACCATCAGCAGCCTGCA QESVTEQDSKDST GCCCGAGGACATCGCCACCT YSLSSTLTLSKADY ACTACTGCCAGCAGCACTAC EKHKVYACEVTH ACCACCCCTCTGACCTTCGG QGLSSPVTKSFNR CCAGGGCACCAAGCTGGAG GEC (36) ATCAAGAGAACCGTGGCCG

CTCCCTCCGTGTTCATCTTCC

CACCATCTGACGAGCAGCTG

AAGTCCGGCACCGCTTCTGT

- 73 045275

CGTGTGCCTGCTGAACAACT TCTACCCTCGGGAAGCCAAG GTGCAGTGGAAGGTGGACA ATGCCCTGCAGTCCGGCAAC TCCCAAGAGTCTGTGACCGA GCAGGACTCCAAGGACAGC ACCTACTCCCTGTCCTCTAC CCTGACCCTGTCCAAGGCCG ACTACGAGAAGCACAAGGT GTACGCCTGCGAAGTGACCC ACCAGGGACTGTCTAGCCCC GTGACCAAGTCCTTCAACAG AGGCGAGTGCTGA (233)

ABLPNB.06 (биспецифическое антитело, содержащее анти-PD-Ll Вб клон в форме IgG и анти-4-1 В В

ВО 1.02 клон в форме scFv)

Аминокислотная	Нуклеотидная
последовательность	последовательность (5’—>3’)
(N’^C’) (Seq ID	(Seq ID No.)

No.)

Тяжелый Тяжелая цепь EVQLVESGGGLVQ	GTGCAGCTGGTTGAATCTGG
компонент B6 PGGSLRLSCAASG	CGGCGGATTGGTTCAGCCTG
FTFSSYDMSWVRQ	GCGGATCTCTGAGACTGTCT
APGKSLEWVATIS	TGTGCCGCCTCCGGCTTCAC
DAGGYIYYRDSV	CTTCTCCAGCTACGATATGT
KGRFTISRDNAKN	CCTGGGTCCGACAGGCCCCT
SLYLQMNSLRDED	GGCAAGTCTTTGGAATGGGT
TAVYICARELPWR	CGCCACCATCTCTGACGCTG
YALDYWGQGTTV	GCGGCTACATCTACTACCGG
TVSSASTKGPSVFP	GACTCTGTGAAGGGCAGATT
LAPSSKSTSGGTA	CACCATCAGCCGGGACAAC
ALGCLVKDYFPEP	GCCAAGAACTCCCTGTACCT
VTVSWNSGALTSG	GCAGATGAACAGCCTGCGC
VHTFPAVLQSSGL	GACGAGGATACCGCCGTGTA
YSLSSVVTVPSSSL	CATCTGTGCTAGAGAGCTGC

- 74 045275

	GTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVEPKS	CTTGGAGATACGCCCTGGAT TATTGGGGCCAGGGCACCAC
Линкер scFv	VL	CDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYAS TYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSL SLSPGK (234) GGGGSGGGGSGG GGS (235) QSVLTQPPSASGTP	AGTGACCGTGTCCTCTGCTT CTACCAAGGGACCCAGCGTG TTCCCTCTGGCTCCTTCCAGC AAGTCTACCTCTGGCGGAAC AGCTGCTCTGGGCTGCCTGG TCAAGGACTACTTTCCTGAG CCTGTGACAGTGTCCTGGAA CTCTGGCGCTCTGACATCTG GCGTGCACACCTTTCCAGCA GTGCTGCAGTCCTCCGGCCT GTACTCTCTGTCCTCTGTCGT GACCGTGCCTTCCAGCTCTC TGGGAACCCAGACCTACATC TGCAATGTGAACCACAAGCC TTCCAACACCAAGGTGGACA AGAAGGTGGAACCCAAGTC CTGCGACAAGACCCACACCT GTCCTCCATGTCCTGCTCCA GAACTGCTCGGCGGACCTTC CGTGTTCCTGTTTCCTCCAA AGCCTAAGGACACCCTGATG
41В01 .02	Линкер	GRRVTISCSGSSSN IGNNYVTWYQQL PGTAPKLLIYADS HRPSGVPDRFSGS KSGTSASLAISGLR SEDEADYYCATW DYSLSGYVFGCGT KLTVL (236) GGGGSGGGGSGG GGSGGGGS (237)	ATCTCTCGGACCCCTGAAGT GACCTGCGTGGTGGTGGATG TGTCCCACGAGGATCCAGAA GTGAAGTTCAATTGGTACGT GGACGGCGTGGAAGTGCAC AATGCCAAGACCAAGCCTA GAGAGGAACAGTACGCCTC CACCTACAGAGTGGTGTCCG TGCTGACTGTGCTGCACCAG GATTGGCTGAACGGCAAAG

- 75 045275

VH EVQLLESGGGLVQ AGTACAAGTGCAAGGTGTCC

PGGSLRLSCAASG AACAAGGCCCTGCCTGCTCC FTFSSYDMSWVRQ TATCGAAAAGACCATCAGCA APGKCLEWVSWIS AGGCCAAGGGCCAGCCTAG

YSGGSIYYADSVK GGAACCCCAGGTTTACACCC

GRFTISRDNSKNTL TGCCTCCAAGCCGGGAAGA

YLQMNSLRAEDTA GATGACCAAGAACCAGGTG

VYYCARDAQRQS TCCCTGACCTGCCTCGTGAA MREFDYWGQGTL GGGCTTCTACCCTTCCGATA

VTVSS (238) TCGCCGTGGAATGGGAGAG

CAATGGCCAGCCTGAGAAC

AACTACAAGACAACCCCTCC

TGTGCTGGACTCCGACGGCT CATTCTTCCTGTACTCCAAG CTGACCGTGGACAAGTCCAG ATGGCAGCAGGGCAACGTG TTCTCCTGCTCCGTGATGCA CGAGGCCCTGCACAATCACT ACACCCAGAAGTCCCTGTCT CTGAGCCCTGGAAAAGGCG GCGGAGGATCTGGCGGAGG TGGTAGCGGAGGCGGTGGA TCTCAGTCTGTTCTGACCCA GCCTCCTTCCGCTTCTGGC A CCCCTGGAAGAAGAGTGAC CATCTCTTGCTCCGGCTCCTC CTCCAACATCGGCAACAACT ACGTGACCTGGTATCAGCAG CTGCCCGGCACAGCTCCCAA ACTGCTGATCTACGCCGACT CTCACAGACCTTCCGGCGTG CCCGATAGATTCTCCGGCTC TAAGTCTGGCACCTCTGCCA GCCTGGCTATCAGCGGCCTG AGATCTGAGGACGAGGCCG

- 76 045275

	ACTACTACTGCGCCACCTGG GATTATTCCCTGTCCGGCTA CGTGTTCGGCTGCGGCACAA AACTGACAGTGCTCGGAGGC GGAGGAAGTGGTGGCGGAG GTTCAGGTGGTGGTGGTAGT GGCGGAGGCGGATCAGAAG TTCAGCTGTTGGAGTCAGGT GGCGGCTTGGTGCAACCAGG TGGAAGTCTGAGACTCAGCT GTGCTGCCAGCGGCTTTACC TTCAGCTCCTACGACATGAG CTGGGTTCGACAAGCTCCCG GAAAGTGCTTGGAGTGGGTT TCCTGGATCTCCTACTCCGG CGGCAGCATCTATTACGCCG ACAGCGTGAAAGGCCGGTTT ACCATCTCTCGGGATAACAG CAAGAATACCCTCTACCTCC AAATGAACTCTCTGAGAGCC GAGGACACTGCTGTGTACTA TTGCGCCAGAGATGccCAGC GGCAATCCATGAGAGAGTTC GACTACTGGGGACAAGGCA CCCTGGTCACCGTGTCTAGT TGA (239)
Легкий Легкая цепь Вб DIQMTQSPSSLSAS	GACATCCAGATGACCCAGA
компонент VGDRVTITCKASQ	GCCCTAGCAGCCTGAGCGCT
DVTPAVAWYQQK	AGCGTGGGCGACAGGGTGA
PGKAPKLLIYSTSS	CCATCACCTGCAAGGCCAGC
RYTGVPSRFSGSG	CAGGATGTGACCCCTGCCGT
SGTDFTFTISSLQPE	GGCCTGGTACCAGCAGAAG
DIATYYCQQHYTT	CCCGGCAAGGCCCCCAAGCT
PLTFGQGTKLEIK	GCTGATCTACAGCACCAGCA
RTVAAPSVFIFPPS	GCAGGTACACCGGCGTGCCC

- 77 045275

DEQLKSGTASVVC AGCAGGTTTAGCGGAAGCG

LLNNFYPREAKVQ GCAGCGGCACCGACTTCACC WKVDNALQSGNS TTCACCATCAGCAGCCTGCA QESVTEQDSKDST GCCCGAGGACATCGCCACCT YSLSSTLTLSKADY ACTACTGCCAGCAGCACTAC EKHKVYACEVTH ACCACCCCTCTGACCTTCGG QGLSSPVTKSFNR CCAGGGCACCAAGCTGGAG GEC (38) ATCAAGAGAACCGTGGCCG

CTCCCTCCGTGTTCATCTTCC CACCATCTGACGAGCAGCTG AAGTCCGGCACCGCTTCTGT CGTGTGCCTGCTGAACAACT TCTACCCTCGGGAAGCCAAG GTGCAGTGGAAGGTGGACA ATGCCCTGCAGTCCGGCAAC TCCCAAGAGTCTGTGACCGA GCAGGACTCCAAGGACAGC ACCTACTCCCTGTCCTCTAC CCTGACCCTGTCCAAGGCCG ACTACGAGAAGCACAAGGT GTACGCCTGCGAAGTGACCC ACCAGGGACTGTCTAGCCCC GTGACCAAGTCCTTCAACAG AGGCGAGTGCTGA (240)

ABLPNB.07 (биспецифическое антитело, содержащее анти-PD-Ll Вб клон в форме IgG и анти-4-1 В В 41В01.03 клон в форме scFv)

Тяжелый Тяжелая цепь	Аминокислотная Нуклеотидная последовательность последовательность (5’—>3’) (Ν’—>С’) (Scq ID (Scq ID No.) No.) EVQLVESGGGLVQ GAAGTGCAGCTGGTTGAATC
компонент Вб	PGGSLRLSCAASG TGGCGGCGGATTGGTTCAGC FTFSSYDMSWVRQ CTGGCGGATCTCTGAGACTG APGKSLEWVATIS TCTTGTGCCGCCTCCGGCTT

- 78 045275

DAGGYIYYRDSV CACCTTCTCCAGCTACGATA

KGRFT1SRDNAKN TGTCCTGGGTCCGACAGGCC SLYLQMNSLRDED CCTGGCAAGTCTTTGGAATG TAVYICARELPWR GGTCGCCACCATCTCTGACG YALDYWGQGTTV CTGGCGGCTACATCTACTAC TVSSASTKGPSVFP CGGGACTCTGTGAAGGGCA LAPSSKSTSGGTA GATTCACCATCAGCCGGGAC ALGCLVKDYFPEP AACGCCAAGAACTCCCTGTA VTVSWNSGALTSG CCTGCAGATGAACAGCCTGC VHTFPAVLQSSGL GCGACGAGGATACCGCCGT YSLSSVVTVPSSSL GTACATCTGTGCTAGAGAGC GTQTYICNVNH KP TGCCTTGGAGATACGCCCTG SNTKVDKKVEPKS GATTATTGGGGCCAGGGCAC CDKTHTCPPCPAP CACAGTGACCGTGTCCTCTG ELLGGPSVFLFPPK CTTCTACCAAGGGACCCAGC PKDTLMISRTPEVT GTGTTCCCTCTGGCTCCTTCC CVVVDVSHEDPEV AGCAAGTCTACCTCTGGCGG KFNWYVDGVEVH AACAGCTGCTCTGGGCTGCC NAKTKPREEQYAS TGGTCAAGGACTACTTTCCT TYRVVSVLTVLHQ GAGCCTGTGACAGTGTCCTG DWLNGKEYKCKV GAACTCTGGCGCTCTGACAT SNKALPAPIEKTIS CTGGCGTGCACACCTTTCCA KAKGQPREPQVYT GCAGTGCTGCAGTCCTCCGG LPPSREEMTKNQV CCTGTACTCTCTGTCCTCTGT

S LTCLVKGFYPS DI CGTGACCGTGCCTTCC AGCT AVEWESNGQPEN CTCTGGGAACCCAGACCTAC NYKTTPPVLDSDG ATCTGCAATGTGAACCACAA SFFLYSKLTVDKSR GCCTTCCAACACCAAGGTGG WQQGNVFSCSVM ACAAGAAGGTGGAACCCAA HEALHNHYTQKSL GTCCTGCGACAAGACCCACA SLSPGK (241) CCTGTCCTCCATGTCCTGCTC

GGGGSGGGGSGG

CAGAACTGCTCGGCGGACCT

GGS (242)

TCCGTGTTCCTGTTTCCTCCA

VL QSVLTQPPSASGTP AAGCCTAAGGACACCCTGAT

GQRVTISCSGSSSN GATCTCTCGGACCCCTGAAG

- 79 045275

scFv IGNNYVTWYQQL	TGACCTGCGTGGTGGTGGAT
41B01 PGTAPKLLIYADS	GTGTCCCACGAGGATCCAGA
.03 HRPSGVPDRFSGS	AGTGAAGTTCAATTGGTACG
KSGTSASLAISGLR	TGGACGGCGTGGAAGTGCA
SEDEADYYCATW	CAATGCCAAGACCAAGCCTA
DYSLSGYVFGCGT	GAGAGGAACAGTACGCCTC
KLTVL (243)	CACCTACAGAGTGGTGTCCG
; Линкер GGGGSGGGGSGG	TGCTGACTGTGCTGCACCAG
GGSGGGGS (244)	GATTGGCTGAACGGCAAAG
VH EVQLLESGGGLVQ	AGTACAAGTGCAAGGTGTCC
PGGSLRLSCAASG	AACAAGGCCCTGCCTGCTCC
FTFSSYDMSWVRQ	TATCGAAAAGACCATCAGCA
APGKCLEWVSWIS	AGGCCAAGGGCCAGCCTAG
YSGGSIYYADSVK	GGAACCCCAGGTTTACACCC
GRFTISRDNSKNTL	TGCCTCCAAGCCGGGAAGA
YLQMNSLRAEDTA	GATGACCAAGAACCAGGTG
VYYCARDAQRNS	TCCCTGACCTGCCTCGTGAA
MREFDYWGQGTL	GGGCTTCTACCCTTCCGATA
VTVSS (245)	TCGCCGTGGAATGGGAGAG CAATGGCCAGCCTGAGAAC AACTACAAGACAACCCCTCC TGTGCTGGACTCCGACGGCT CATTCTTCCTGTACTCCAAG CTGACCGTGGACAAGTCCAG ATGGCAGCAGGGCAACGTG TTCTCCTGCTCCGTGATGCA CGAGGCCCTGCACAATCACT ACACCCAGAAGTCCCTGTCT CTGAGCCCTGGAAAAGGCG GCGGAGGATCTGGCGGAGG TGGTAGCGGAGGCGGTGGA TCTCAGTCTGTTCTGACCCA GCCTCCTTCCGCTTCTGGCA CCCCTGGAcAGAGAGTGACC ATCTCTTGCTCCGGCTCCTCC

- 80 045275

ТССAACATCGGCA AC A ACTA

CGTGACCTGGTATCAGCAGC

TGCCCGGCACAGCTCCCAAA

CTGCTGATCTACGCCGACTC

TCACAGACCTTCCGGCGTGC

CCGATAGATTCTCCGGCTCT

AAGTCTGGCACCTCTGCCAG

CCTGGCTATCAGCGGCCTGA

GATCTGAGGACGAGGCCGA

CTACTACTGCGCCACCTGGG

ATTATTCCCTGTCCGGCTAC

GTGTTCGGCTGCGGCACAAA

ACTGACAGTGCTCGGAGGCG

GAGGAAGTGGTGGCGGAGG

TTCAGGTGGTGGTGGTAGTG

GCGGAGGCGGATCAGAAGT

TCAGCTGTTGGAGTCAGGTG

GCGGCTTGGTGCAACCAGGT

GGAAGTCTGAGACTCAGCTG

TGCTGCCAGCGGCTTTACCT

TCAGCTCCTACGACATGAGC

TGGGTTCGACAAGCTCCCGG

AAAGTGCTTGGAGTGGGTTT

CCTGGATCTCCTACTCCGGC

GGCAGCATCTATTACGCCGA

CAGCGTGAAAGGCCGGTTTA

CCATCTCTCGGGATAACAGC

AAGAATACCCTCTACCTCCA

AATGAACTCTCTGAGAGCCG

AGGACACTGCTGTGTACTAT

TGCGCCAGAGATGccCAGCG

GAACTCCATGAGAGAGTTCG

ACTACTGGGGACAAGGCAC

CCTGGTCACCGTGTCTAGTT

GA (246)

- 81 045275

Легкий Легкая цепь Вб DIQMTQSPSSLSAS	GACATCCAGATGACCCAGA
компонент VGDRVTITCKASQ	GCCCTAGCAGCCTGAGCGCT
DVTPAVAWYQQK	AGCGTGGGCGACAGGGTGA
PGKAPKLLIYSTSS	CCATCACCTGCAAGGCCAGC
RYTGVPSRFSGSG	CAGGATGTGACCCCTGCCGT
SGTDFTFTISSLQPE	GGCCTGGTACCAGCAGAAG
DIATYYCQQHYTT	CCCGGCAAGGCCCCCAAGCT
PLTFGQGTKLEIK	GCTGATCTACAGCACCAGCA
RTVAAPSVFIFPPS	GCAGGTACACCGGCGTGCCC
DEQLKSGTASVVC	AGCAGGTTTAGCGGAAGCG
LLNNFYPREAKVQ	GCAGCGGCACCGACTTCACC
WKVDNALQSGNS	ТТС АСС АТС AGC AGCCTGC А
QESVTEQDSKDST	GCCCGAGGACATCGCCACCT
YSLSSTLTLSKADY	ACTACTGCCAGCAGCACTАС
EKHKVYACEVTH	ACCACCCCTCTGACCTTCGG
QGLSSPVTKSFNR	CCAGGGCACCAAGCTGGAG
GEC (40)	ATCAAGAGAACCGTGGCCG CTCCCTCCGTGTTCATCTTCC CACCATCTGACGAGCAGCTG AAGTCCGGCACCGCTTCTGT CGTGTGCCTGCTGAACAACT TCTACCCTCGGGAAGCCAAG GTGCAGTGGAAGGTGGACA ATGCCCTGCAGTCCGGCAAC TCCCAAGAGTCTGTGACCGA GCAGGACTCCAAGGACAGC ACCTACTCCCTGTCCTCTAC CCTGACCCTGTCCAAGGCCG ACTACGAGAAGCACAAGGT GTACGCCTGCGAAGTGACCC ACCAGGGACTGTCTAGCCCC GTGACCAAGTCCTTCAACAG AGGCGAGTGCTGA (247)

ABLPNB.08

- 82 045275 (биспецифическое антитело, содержащее анти-PD-Ll Вб клон в форме IgG и анти-4-1 В В 41 ВО 1.04 клон в форме scFv)

Аминокислотная последовательность	Нуклеотидная последовательность (5’—>3’)
(Ν’—>С’) (Scq ID	(Scq ID No.)
No.)
Тяжелый Тяжелая цепь EVQLVESGGGLVQ	GAAGTGCAGCTGGTTGAATC
компонент Вб PGGSLRLSCAASG	TGGCGGCGGATTGGTTCAGC

FTFSSYDMSWVRQ	CTGGCGGATCTCTGAGACTG
APGKSLEWVATIS	TCTTGTGCCGCCTCCGGCTT
DAGGYIYYRDSV	CACCTTCTCCAGCTACGATA
KGRFTISRDNAKN	TGTCCTGGGTCCGACAGGCC
SLYLQMNSLRDED	CCTGGCAAGTCTTTGGAATG
TAVYICARELPWR	GGTCGCCACCATCTCTGACG
YALDYWGQGTTV	CTGGCGGCTACATCTACTAC
TVSSASTKGPSVFP	CGGGACTCTGTGAAGGGCA
LAPSSKSTSGGTA	GATTCACCATCAGCCGGGAC
ALGCLVKDYFPEP	AACGCCAAGAACTCCCTGTA
VTVSWNSGALTSG	CCTGCAGATGAACAGCCTGC
VHTFPAVLQSSGL	GCGACGAGGATACCGCCGT
YSLSSVVTVPSSSL	GTACATCTGTGCTAGAGAGC
GTQTYICNVNHKP	TGCCTTGGAGATACGCCCTG
SNTKVDKKVEPKS	GATTATTGGGGCCAGGGCAC
CDKTHTCPPCPAP	CACAGTGACCGTGTCCTCTG
ELLGGPSVFLFPPK	CTTCTACCAAGGGACCCAGC
PKDTLMISRTPEVT	GTGTTCCCTCTGGCTCCTTCC
CVVVDVSHEDPEV	AGCAAGTCTACCTCTGGCGG
KFNWYVDGVEVH	AACAGCTGCTCTGGGCTGCC
NAKTKPREEQYAS	TGGTCAAGGACTACTTTCCT
TYRVVSVLTVLHQ	GAGCCTGTGACAGTGTCCTG
DWLNGKEYKCKV	GAACTCTGGCGCTCTGACAT
SNKALPAPIEKTIS	CTGGCGTGCACACCTTTCCA
KAKGQPREPQVYT	GCAGTGCTGCAGTCCTCCGG
LPPSREEMTKNQV	CCTGTACTCTCTGTCCTCTGT
SLTCLVKGFYPSDI	CGTGACCGTGCCTTCCAGCT

- 83 045275

AVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSR	CTCTGGGAACCCAGACCTAC ATCTGCAATGTGAACCACAA GCCTTCCAACACCAAGGTGG
WQQGNVFSCSVM	ACAAGAAGGTGGAACCCAA
HEALHNHYTQKSL	GTCCTGCGACAAGACCCACA
SLSPGK (248)	CCTGTCCTCCATGTCCTGCTC
Линкер GGGGSGGGGSGG	CAGAACTGCTCGGCGGACCT
GGS (249)	TCCGTGTTCCTGTTTCCTCCA
scFv VL QSVLTQPPSASGTP	AAGCCTAAGGACACCCTGAT
41 BOI GQRVTISCSGSSSN	GATCTCTCGGACCCCTGAAG
.04 IGNNYVTWYQQL	TGACCTGCGTGGTGGTGGAT
PGTAPKLLIYADS	GTGTCCCACGAGGATCCAGA
HRPSGVPDRFSGS	AGTGAAGTTCAATTGGTACG
KSGTSASLAISGLR	TGGACGGCGTGGAAGTGCA
SEDEADYYCATW	CAATGCCAAGACCAAGCCTA
DYSLSGYVFGCGT	GAGAGGAACAGTACGCCTC
KLTVL (250)	CACCTACAGAGTGGTGTCCG
Линкер GGGGSGGGGSGG	TGCTGACTGTGCTGCACCAG
GGSGGGGS (251)	GATTGGCTGAACGGCAAAG
VH EVQLLESGGGLVQ	AGTACAAGTGCAAGGTGTCC
PGGSLRLSCAASG	AACAAGGCCCTGCCTGCTCC
FTFSSYDMSWVRQ	TATCGAAAAGACCATCAGCA
APGKCLEWVSWIS	AGGCCAAGGGCCAGCCTAG
YSGGSIYYADSVK	GGAACCCCAGGTTTACACCC
GRFTISRDNSKNTL	TGCCTCCAAGCCGGGAAGA
YLQMNSLRAEDTA	GATGACCAAGAACCAGGTG
VYYCARDAQRQS	TCCCTGACCTGCCTCGTGAA
MREFDYWGQGTL	GGGCTTCTACCCTTCCGATA
VTVSS (252)	TCGCCGTGGAATGGGAGAG

CAATGGCCAGCCTGAGAAC

AACTACAAGACAACCCCTCC

TGTGCTGGACTCCGACGGCT

CATTCTTCCTGTACTCCAAG

CTGACCGTGGACAAGTCCAG

ATGGCAGCAGGGCAACGTG

- 84 045275

TTCTCCTGCTCCGTGATGCA

CGAGGCCCTGCACAATCACT ACACCCAGAAGTCCCTGTCT CTGAGCCCTGGAAAAGGCG GCGGAGGATCTGGCGGAGG TGGTAGCGGAGGCGGTGGA TCTCAGTCTGTTCTGACCCA GCCTCCTTCCGCTTCTGGCA CCCCTGGAcAGAGAGTGACC ATCTCTTGCTCCGGCTCCTCC TCCAACATCGGCAACAACTA CGTGACCTGGTATCAGCAGC TGCCCGGCACAGCTCCCAAA CTGCTGATCTACGCCGACTC TCACAGACCTTCCGGCGTGC CCGATAGATTCTCCGGCTCT AAGTCTGGCACCTCTGCCAG CCTGGCTATCAGCGGCCTGA GATCTGAGGACGAGGCCGA CTACTACTGCGCCACCTGGG ATTATTCCCTGTCCGGCTAC GTGTTCGGCTGCGGCACAAA ACTGACAGTGCTCGGAGGCG GAGGAAGTGGTGGCGGAGG TTCAGGTGGTGGTGGTAGTG GCGGAGGCGGATCAGAAGT TCAGCTGTTGGAGTCAGGTG GCGGCTTGGTGCAACCAGGT GGAAGTCTGAGACTCAGCTG TGCTGCCAGCGGCTTTACCT TCAGCTCCTACGACATGAGC TGGGTTCGACAAGCTCCCGG AAAGTGCTTGGAGTGGGTTT CCTGGATCTCCTACTCCGGC GGCAGCATCTATTACGCCGA

- 85 045275

	CAGCGTGAAAGGCCGGTTTA CCATCTCTCGGGATAACAGC AAGAATACCCTCTACCTCCA AATGAACTCTCTGAGAGCCG AGGACACTGCTGTGTACTAT TGCGCCAGAGATGccCAGCG GCAATCCATGAGAGAGTTCG ACTACTGGGGACAAGGCAC CCTGGTCACCGTGTCTAGTT GA (253)
Легкий Легкая цепь Вб DIQMTQSPSSLSAS	GACATCCAGATGACCCAGA
компонент VGDRVTITCKASQ	GCCCTAGCAGCCTGAGCGCT
DVTPAVAWYQQK	AGCGTGGGCGACAGGGTGA
PGKAPKLLIYSTSS	CCATCACCTGCAAGGCCAGC
RYTGVPSRFSGSG	CAGGATGTGACCCCTGCCGT
SGTDFTFTISSLQPE	GGCCTGGTACCAGCAGAAG
DIATYYCQQHYTT	CCCGGCAAGGCCCCCAAGCT
PLTFGQGTKLEIK	GCTGATCTACAGCACCAGCA
RTVAAPSVFIFPPS	GCAGGTACACCGGCGTGCCC
DEQLKSGTASVVC	AGCAGGTTTAGCGGAAGCG
LLNNFYPREAKVQ	GCAGCGGCACCGACTTCACC
WKVDNALQSGNS	TTCACCATCAGCAGCCTGCA
QESVTEQDSKDST	GCCCGAGGACATCGCCACCT
YSLSSTLTLSKADY	ACTACTGCCAGCAGCACTAC
EKHKVYACEVTH	ACCACCCCTCTGACCTTCGG
QGLSSPVTKSFNR	CCAGGGCACCAAGCTGGAG
GEC (42)	ATCAAGAGAACCGTGGCCG CTCCCTCCGTGTTCATCTTCC CACCATCTGACGAGCAGCTG AAGTCCGGCACCGCTTCTGT CGTGTGCCTGCTGAACAACT TCTACCCTCGGGAAGCCAAG GTGCAGTGGAAGGTGGACA ATGCCCTGCAGTCCGGCAAC TCCCAAGAGTCTGTGACCGA

- 86 045275

GCAGGACTCCAAGGACAGC

ACCTACTCCCTGTCCTCTAC

	CCTGACCCTGTCCAAGGCCG ACTACGAGAAGCACAAGGT GTACGCCTGCGAAGTGACCC ACCAGGGACTGTCTAGCCCC GTGACCAAGTCCTTCAACAG AGGCGAGTGCTGA (254)
ABLPNB.09

(биспецифическое антитело, содержащее анти-PD-Ll Вб клон в форме IgG и анти-4-1 В В 41 В02 клон в форме scFv)

	Аминокислотная Нуклеотидная последовательность последовательность (5’—>3’) (N’^C’) (Seq ID (Seq ID No.) No.)
Тяжелый	Тяжелая	цепь EVQLVESGGGLVQ GAAGTGCAGCTGGTTGAATC
компонент	Вб	PGGSLRLSCAASG TGGCGGCGGATTGGTTCAGC FTFSSYDMSWVRQ CTGGCGGATCTCTGAGACTG APGKSLEWVATIS TCTTGTGCCGCCTCCGGCTT DAGGYIYYRDSV CACCTTCTCCAGCTACGATA KGRFTISRDNAKN TGTCCTGGGTCCGACAGGCC SLYLQMNSLRDED CCTGGCAAGTCTTTGGAATG TAVYICARELPWR GGTCGCCACCATCTCTGACG YALDYWGQGTTV CTGGCGGCTACATCTACTAC TVSSASTKGPSVFP CGGGACTCTGTGAAGGGCA LAPSSKSTSGGTA GATTCACCATCAGCCGGGAC ALGCLVKDYFPEP AACGCCAAGAACTCCCTGTA VTVSWNSGALTSG CCTGCAGATGAACAGCCTGC VHTFPAVLQSSGL GCGACGAGGATACCGCCGT YSLSSVVTVPSSSL GTACATCTGTGCTAGAGAGC GTQTYICNVNHKP TGCCTTGGAGATACGCCCTG SNTKVDKKVEPKS GATTATTGGGGCCAGGGCAC CDKTHTCPPCPAP CACAGTGACCGTGTCCTCTG ELLGGPSVFLFPPK CTTCTACCAAGGGACCCAGC PKDTLMISRTPEVT GTGTTCCCTCTGGCTCCTTCC

- 87 045275

	CVVVDVSHEDPEV	AGCAAGTCTACCTCTGGCGG
	KFNWYVDGVEVH	AACAGCTGCTCTGGGCTGCC
	NAKTKPREEQYAS	TGGTCAAGGACTACTTTCCT
	TYRVVSVLTVLHQ	GAGCCTGTGACAGTGTCCTG
	DWLNGKEYKCKV	GAACTCTGGCGCTCTGACAT
	SNKALPAPIEKTIS	CTGGCGTGCACACCTTTCCA
	KAKGQPREPQVYT	GCAGTGCTGCAGTCCTCCGG
	LPPSREEMTKNQV	CCTGTACTCTCTGTCCTCTGT
	SLTCLVKGFYPSDI	CGTGACCGTGCCTTCCAGCT
	AVEWESNGQPEN	CTCTGGGCACCCAGACCTAC
	NYKTTPPVLDSDG	ATCTGCAACGTGAACCACAA
	SFFLYSKLTVDKSR	GCCCTCCAACACCAAGGTGG
	WQQGNVFSCSVM	ACAAGAAGGTGGAACCCAA
	HEALHNHYTQKSL	GTCCTGCGACAAGACCCACA
	SLSPGK (255)	CCTGTCCTCCATGTCCTGCTC
Линкер	GGGGSGGGGSGG	CAGAACTGCTGGGCGGACCC
	GGS (256)	TCCGTGTTCCTGTTCCCTCCA
scFv VL	QSVLTQPPSASGTP	A AGCCTA AGGACACCCTGAT
41B02	GRRVTISCSGSSSN	GATCTCCCGGACCCCTGAAG
	IGNNYVTWYQQL	TGACCTGCGTGGTGGTGGAT
	PGTAPKLLIYADS	GTGTCCCACGAGGATCCCGA
	HRPSGVPDRFSGS	AGTGAAGTTCAATTGGTACG
	KSGTSASLAISGLR	TGGACGGCGTGGAAGTGCA
	SEDEADYYCATW	CAACGCCAAGACCAAGCCT
	DYSLSGYVFGCGT	AGAGAGGAACAGTACgccTC
	KLTVL (257)	CACCTACCGGGTGGTGTCCG
Линкер	GGGGSGGGGSGG	TGCTGACCGTTCTGCACCAG
	GGSGGGGS (258)	GATTGGCTGAACGGCAAAG
VH	EVQLLESGGGLVQ	AGTACAAGTGCAAGGTGTCC
	PGGSLRLSCAASG	AACAAGGCCCTGCCTGCCCC
	FTFSGYDMSWVR	TATCGAAAAGACCATCTCTA
	QAPGKCLEWVSVI	AGGCCAAGGGCCAGCCCCG
	YPDDGNTYYADS	GGAACCTCAAGTGTACACCT
	VKGRFTISRDNSK	TGCCTCCCAGCCGGGAAGAG

ATGACCAAGAACCAGGTGTC

- 88 045275

NTLYLQMNSLRAE DAAVYYCAKHGG QKPTTKSSSAYG MDGWGQGTLVTV SS (259)

CCTGACCTGCCTGGTTAAGG GCTTCTACCCCTCCGATATC

GCCGTGGAATGGGAGTCTAA CGGCCAGCCCGAGAACAAC TACAAGACCACCCCTCCTGT GCTGGACTCCGACGGCTCAT TCTTCCTGTACTCCAAGCTG ACCGTGGACAAGTCTCGGTG GCAGCAGGGCAACGTGTTCT CCTGCTCTGTGATGCACGAG GCCCTGCACAACCACTACAC CCAGAAGTCCCTGTCCCTGT CTCCCGGCAAAGGTGGGGG GGGATCTGGTGGTGGTGGAT CAGGGGGTGGGGGGTCTCA AAGCGTACTCACCCAACCTC CATCTGCATCCGGTACACCT GGTCGGCGAGTAACCATCTC CTGCTCTGGGAGCTCTTCTA ATATTGGTAACAACTATGTC ACCTGGTATCAGCAGTTGCC TGGGACAGCACCCAAACTTC TTATATATGCCGATAGCCAT CGGCCTTCCGGCGTACCCGA TCGCTTCTCCGGGTCAAAAT CTGGAACATCTGCCTCACTC GCAATTAGTGGATTGCGATC TGAGGATGAAGCAGATTATT ATTGCGCTACCTGGGATTAT TCACTTTCTGGCTACGTCTTT GGTtgtGGAACAAAACTTACC GTGTTGGGCGGCGGAGGAA GCGGAGGCGGCGGTTCTGGT GGTGGCGGTAGCGGAGGTG

GTGGATCTGAGGTTCAACTG

- 89 045275

	TTGGAGTCAGGTGGCGGACT TGTCCAGCCTGGCGGGTCTC TGAGGCTGAGTTGCGCTGCT TCTGGGTTTACTTTTTCAGG ATATGACATGAGTTGGGTAC GTCAGGCTCCAGGTAAGtgcC TCGAATGGGTCTCCGTTATC TATCCCGATGATGGAAATAC TTACTACGCTGACAGTGTGA AAGGCAGGTTCACAATCAGT AGGGACAATTCTAAAAATAC ACTCTACCTCCAGATGAACT CACTTCGAGCCGAGGACGCC GCCGTATATTACTGTGCCAA ACACGGCGGGCAAAAACCC ACTACTAAATCCAGTAGTGC TTACGGGATGGATGGCTGGG GACAGGGGACATTGGTCACT GTATCTTCCtga (260)
Легкий Легкая цепь Вб DIQMTQSPSSLSAS	GACATCCAGATGACCCAGA
компонент VGDRVT1TCKASQ	GCCCTAGCAGCCTGAGCGCT
DVTPAVAWYQQK	AGCGTGGGCGACAGGGTGA
PGKAPKLLIYSTSS	CCATCACCTGCAAGGCCAGC
RYTGVPSRFSGSG	CAGGATGTGACCCCTGCCGT
SGTDFTFTISSLQPE	GGCCTGGTACCAGCAGAAG
DIATYYCQQHYTT	CCCGGCAAGGCCCCCAAGCT
PLTFGQGTKLEIK	GCTGATCTACAGCACCAGCA
RTVAAPSVFIFPPS	GCAGGTACACCGGCGTGCCC
DEQLKSGTASVVC	AGCAGGTTTAGCGGAAGCG
LLNNFYPREAKVQ	GCAGCGGCACCGACTTCACC
WKVDNALQSGNS	TTCACCATCAGCAGCCTGCA
QESVTEQDSKDST	GCCCGAGGACATCGCCACCT
YSLSSTLTLSKADY	ACTACTGCCAGCAGCACTAC
EKHKVYACEVTH	ACCACCCCTCTGACCTTCGG CCAGGGCACCAAGCTGGAG

- 90 045275

QGLSSPVTKSFNR

GEC (44)

ATCAAGAGAACCGTGGCCG CTCCCTCCGTGTTCATCTTCC CACCATCTGACGAGCAGCTG AAGTCCGGCACCGCTTCTGT CGTGTGCCTGCTGAACAACT TCTACCCTCGGGAAGCCAAG GTGCAGTGGAAGGTGGACA ATGCCCTGCAGTCCGGCAAC TCCCAAGAGTCTGTGACCGA GCAGGACTCCAAGGACAGC ACCTACTCCCTGTCCTCTAC CCTGACCCTGTCCAAGGCCG ACTACGAGAAGCACAAGGT GTACGCCTGCGAAGTGACCC ACCAGGGACTGTCTAGCCCC GTGACCAAGTCCTTCAACAG AGGCGAGTGCTGA (261)

Сконструированные векторы транзиентно экспрессировали в клетках ExpiCHO-S™ (Thermo Fisher, A29127) с использованием набора (ExpiFectamine™ CHO Kit, Thermo, А29129), культивированных в среде для экспрессии ExpiCHO™ (Thermo, A29100-01) в условиях от 30 до 37°С в течение 7-15 дней в CO₂-инкубаторе, оборудованном вращающимся шейкером. Плазмидную ДНК (250 мкг) и реагент ExpiFectamin CHO (800 мкл) смешивали со средой Opti-MEM® I (конечный объем 20 мл) и оставляли при комнатной температуре на 5 мин. В смешанный раствор добавляли к 6х10⁶ клеток ExpiCHO, культивированных в среде для экспрессии ExpiCHO, и осторожно перемешивали в шейкере-инкубаторе при 37°С в увлажненной атмосфере с 8% СО₂ в воздухе. Через 18 ч после трансфекции в каждую колбу добавляли 1,5 мл ExpiFectamin CHO Transfection Enhancer 1 и 60 мл ExpiFectamin CHO Transfection Feed.

Каждое BsAb очищали от супернатанта клеточной культуры с помощью аффинной хроматографии с рекомбинантным белком A (Hitrap Mabselect Sure, GE Healthcare, 28-4082-55) и гель-фильтрационной хроматографии на колонке HiLoad 26/200 Superdex200 prep grade column (GE Healthcare, 28-9893-36). SDS-PAGE (NuPage 4-12% Bis-Tris gel, NP0321) и эксклюзионную по размеру ВЭЖХ (Agilent, 1200 series) с колонкой SE-HPLC (SWXL SE-HPLC колонка, TOSOH, G3000SWXL) проводили для обнаружения и подтверждения размера и чистоты каждого BsAb. Очищенные белки концентрировали в PBS с помощью ультрафильтрации с использованием устройства Amicon Ultra 15 30K (Merck, UFC903096), и концентрации белка оценивали с помощью нанокапель (Thermo, Nanodrop One). При применении двухвекторной системы, соотношение между легкой и тяжелой цепями может составлять от 1:1 до 1:3 по массе. В качестве альтернативы также может использоваться одновекторная система, которая содержит обе цепи в одном единственном векторе.

Полученные анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифические антитела названы H12x41B01(ABLPNB.01), H12x41B01.03(ABLPNB.02), H12x41B02(ABLPNB.03), B6x41B01(ABLPNB.04), B6x41B01.01(ABLPNB.05), B6x41B01.01(ABLPNB.06), B6x41B01.03(ABLPNB.07), B6x41B01.04(ABLPNB.08) и B6x41B02(ABLPNB.09) соответственно, где первый относится к клону в форме IgG, а последний относится к клону в форме scFv.

Пример 4. Определение характеристик биспецифических антител PD-L1x4-1BB 4.1. Связывание биспецифических антител.

Чтобы оценить активность связывания с PD-L1 и 4-1ВВ биспецифических антител, полученных в примере 3, BsAb (ABLPNB.01, ABLPNB.03, ABLPNB.04 и ABLPNB.07) подвергали испытанию DACE (ELISA с захватом двойного антигена). Кратко микротитровальные планшеты покрывали 100 нг/лунка человеческого белка PD-L1-Fc (Sinobio, 10084-H02H) в PBS при 4°С в течение ночи, затем блокировали 100 мкл/лунка 1% BSA в течение 2 ч при 37°С. Трехкратные разведения каждого из BsAb, начиная с 100 нМ, добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Планшеты промывали PBS/Tween, а затем инкубировали с 50 нг/лунка человеческого белка 4-lBB-His (Sinobio, 16498-H08H) в 1% BSA в течение 1 ч при 37°С. Планшеты промывали PBS/Tween, а затем инкубировали с Anti-His HRP (Roche, номер по каталогу: 11965085001) в течение 1 ч при 37°С. После промывки планшеты проявляли субстратом ТМВ и анализировали на спектрофотометре при OD 450-650 нм. Результаты показаны на фиг. 7А и 7В. Как показано на фиг. 7А и 7В, все протестированные BsAb могут связываться как с человеческими белками PD-L1, так и с человеческими белками 4-1ВВ с высокой активностью.

- 91 045275

4.2 Стабильность в сыворотке биспецифического антитела.

Чтобы оценить стабильность сыворотки биспецифических антител против PD-L1 и 4-1ВВ (ABLPNB.05, ABLPNB.06, ABLPNB.07 и ABLPNB.08), BsAb инкубировали в сыворотке человека в течение 3,7, 14 дней при 37°С. Активность связывания анализировали с помощью теста DACE (ELISA с захватом двойного антигена). Кратко, микротитровальные планшеты покрывали 100 нг/лунка человеческого белка PD-L1-Fc (Sinobio, 10084-H02H) в PBS при 4°С в течение ночи, затем блокировали 100 мкл/лунка 1% BSA в течение 2 ч при 37°С. Трехкратные разведения каждого из BsAb, начиная с 100 нМ, добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Планшеты промывали PBS/Tween, а затем инкубировали с 50 нг/лунка человеческого белка 4-1BB-His (Sinobio, 16498-H08H) в 1% BSA в течение 1 ч при 37°С. Планшеты промывали PBS/Tween, а затем инкубировали с Anti-His HRP (Roche, номер по каталогу: 11965085001) в течение 1 ч при 37°С. После промывки планшеты проявляли субстратом ТМВ и анализировали на спектрофотометре при OD 450-650 нм. Активность связывания каждого из BsAb (ABLPNB.05 - ABLPNB.08) с обоими антигенами была сопоставимой для каждого образца. Это означает, что BsAb стабильны в сыворотке крови человека в течение 2 недель при 37°С. Репрезентативные данные приведены на фиг. 8.

4.3. Возможность разработки биспецифических антител.

Была оценена возможность разработки в отношении физико-химических свойств PD-L1 и 4-1ВВ BsAb (ABLPNB.02 и ABLPNB.07). Признаки качества биспецифических антител (BsAb) оценивали несколькими аналитическими методами. Кратко, чистоту измеряли с помощью эксклюзионной по размеру высокоэффективной жидкостной хроматографии (SE-ВЭЖХ), и оба BsAb показали высокую чистоту более 99%. Анализировали термическую стабильность по тепловому сдвигу белка (PTS) с флуоресцентной меткой в ходе полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT-ПЦР). Их температура плавления превышала 67°С, что указывает на стабильную структурную целостность исследуемых веществ. Для оценки растворимости молекул белки концентрировали до 20 мг/мл с помощью ультрафильтрации (центробежный концентратор Amicon Ultra-15). В результате видимые частицы не наблюдались при визуальном осмотре, и увеличение агрегатов не было подтверждено при SE-ВЭЖХ. Изоэлектрическая точка (pI) ABLPNB.02 и ABLPNB.07, измеренная с помощью капиллярного изоэлектрического фокусирования (cIEF), составила 8,26 и 8,35 соответственно. Этот диапазон pI подходит для последующих обработок и разработки состава. В целом, как показано в табл. 19, испытания показали, что протестированные BsAb (ABLPNB.02 и ABLPNB.07) обладают надлежащими физико-химическими свойствами для успешной разработки.

Таблица 19

Характеристика	Способ	ABLPNB.07	ABLPNB.02
Чистота	SEC	99,6	99,8
Термическая стабильность	PTS	67,0	67,1
76,8	80,5
Растворимость	Визуальный осмотр	Легко концентрировать до 20 мг/мл, прозрачный	Легко концентрировать до 20 мг/мл, прозрачный
pi	cIEF	8,26	8,35

4.4. Активность биспецифических антител стимулировать сигнал 4-1ВВ.

Для проверки способности биспецифических антител (ABLPNB.01, ABLPNB.03, ABLPNB.07 и ABLPNB.08) стимулировать сигнал 4-1ВВ использовали клеточный анализ 4-1ВВ. В этом анализе использовали клеточную линию GloResponse™ NFkB-1uc2/4-1BB Jurkat (Promega, номер по каталогу CS196004) в качестве эффекторных клеток, а в качестве клеток-мишеней использовали линию раковых клеток, экспрессирующую или не экспрессирующую PD-L1. Клеточная линия GloResponse™ NFkB-1uc2/4-1BB Jurkat генетически модифицирована для стабильной экспрессии 4-1ВВ и люциферазы ниже по ходу транскрипции от ответного элемента. Экспрессия люциферазы индуцируется при связывании антитела с рецептором 4-1ВВ. Кратко, планшет с НСС1954 (экспрессия PD-L1) или ВТ474 или NCI-N87 (не экспрессии PD-L1) в количестве 2,5x104 клеток на лунку на белом 96-луночном планшете для анализа в 100 мкл культуральной среды (RPMI1640+10% FBS). Культивировали в течение ночи в инкубаторе с увлажнением 37°С+5% CO2. После культивирования в течение ночи удаляли 100 мкл культуральной среды и добавляли 25 мкл среды для анализа (RPMI1640+1% FBS) к предварительно высеянным на чашках клеткаммишеням. 25 мкл биспецифических антител (начиная с 15 нМ разводили в 8 раз или начиная с 1,5 нМ разводили в 4 раза) и BMUR или моноклональное антитело 41В01 (начиная с 20 нМ разводили в 10 раз или начиная с 133 нМ разводили в 6 раз) добавляли на планшет. Собранную клеточную линию GloResponse™ NFkB-1uc2/4-1BB Jurkat ресуспендировали в среде для анализа. Добавляли 25 мкл клеточной

-

Claims

линии GloResponse™ NFkB-1uc2/4-1BB Jurkat на лунку с получением 2,5х104 клеток на лунку на планшете. Культивировали 6 ч при 37°С+5% CO2 в инкубаторе с увлажнением. В ходе времени инкубирования добавляли восстанавливающий реагент Bio-Glo™ согласно инструкциям производителя. После 6 ч инкубации добавляли 75 на лунку реагента Bio-Glo™ на аналитический планшет. Ждали 5 мин и анализировали люминесценцию с помощью считывающего устройства для микропланшета. Анализ четырехпараметрической логистической кривой выполняли с помощью программного обеспечения GraphPad. Результаты показаны на фиг. 9A-9F. Как показано на фиг. 9А, 9В, моноклональное антитело против 4-1ВВ показало очень ограниченную активацию сигнала 4-1ВВ по сравнению с BUMR. 41B01 (проанализированный в сшитой с Fc форме) показал только слабую активацию сигнала 4-1ВВ (фиг. 9В). В случае биспецифического антитела, совместно культивированного с PD-L1-отрицательными раковыми клетками (фиг. 9С и 9D), биспецифическое антитело PD-L1x4-1BB не показало активации сигнала 4-1ВВ (фиг. 9С) и активацию слабого сигнала 4-1ВВ при Fc-сшивании, как представлено на фиг. 9С и 9D соответственно. В присутствии PD-L1, т.е. при совместном культивировании с PD-L1-положительными клетками-мишенями (фиг. 9Е и 9F), биспецифическое антитело PD-L1x4-1BB показало активацию сигнала 4-1ВВ, которая зависела от присутствия опухолевого антигена (PD-L1).

1. Анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифическое антитело, содержащее αнmu-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где aнти-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; и анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14,

- 93 045275

CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.

2. Анти-PD-L1/анти-4-1BB биспецифическое антитело, содержащее антu-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где αнтu-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; и анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.

3. Анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифическое антитело, содержащее αнтu-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где aнтu-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; и анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.

4. Анти-PD-L1/анти-4-1BB биспецифическое антитело, содержащее aнтu-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где aнтu-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; и анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.

4.6. Ингибирование роста опухоли биспецифическими антителами (анализ in vivo).

Использовали гуманизированных мышей, экспрессирующих внеклеточный домен 4-1ВВ человека. Клетки мышиной аденокарциномы толстой кишки (МС38) конструировали для экспрессии человеческого PD-L1. Гуманизированным мышам (h4-1BB) подкожно имплантировали клетки MC38-hPD-L1. Мышам внутрибрюшинно вводили Q3D 5 раз (пятикратная инъекция антитела каждые три дня) со следующими антителами: изотипический контроль (10 мг/кг), анти-PD-L1 антитело (Н12, 10 мг/кг), анти-4-1ВВ антитело (41В01, 10 мг/кг), комбинация анти-PD-L1 (Н12, 10 мг/кг) и анти-4-1ВВ (41В01, 10 мг/кг) антител и биспецифическое антитело PD-L1x4-1BB (BsAb) {BLPNB.01, 13,3 мг/кг}. Объем опухолей контролировали с помощью штангенциркуля два раза в неделю в течение эксперимента. Ингибирование роста опухоли, индуцированное ABLPNB.01, было значительно больше, чем наблюдаемое для комбинации каждого нацеливающего моноклонального антитела (см. фиг. 11).

Объем настоящего раскрытия не должен ограничиваться описанными конкретными вариантами осуществления, которые предназначены как отдельные иллюстрации отдельных аспектов настоящего раскрытия, и любые композиции или способы, которые являются функционально эквивалентными, входят в объем настоящего раскрытия. Для специалистов в данной области техники очевидно, что различные модификации и изменения могут быть сделаны в способах и композициях согласно настоящему изобретению без отклонения от сущности или объема настоящего раскрытия. Таким образом, предполагается, что настоящее раскрытие охватывает модификации и вариации настоящего изобретения, при условии, что они входят в объем прилагаемой формулы изобретения и ее эквивалентов.

Все публикации и заявки на патенты, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была специально и индивидуально указана как включенная посредством ссылки.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

4.5. Активность биспецифических антител стимулировать Т-клеточный иммунный ответ у человека.

Чтобы проверить способность биспецифических антитела стимулировать ответ человеческих РВМС, использовали анализ продукции цитокинов. Человеческие РВМС, стимулированные человеческим анти-CD3-антителом, использовали в качестве эффекторных клеток. Клетки НСС1954, которые экспрессируют PD-L1, использовали в качестве клеток-мишеней. В этой системе РВМС (3х10⁴) культивировали совместно с НСС1954 (1х10⁴) в присутствии человеческого анти-CD3-антитела. Биспецифические антитела (ABLPNB.01 и ABLPNB.04) (начиная с 20 нМ (=4 мкг/мл), разведенные на 10 доз) и их аналогичные моноклональные антитела (41В01 и Н12) (начиная с 26,67 нМ (=4 мкг/мл), разведенные на 10 доз) добавляли к смешанной культуре. Как показано на фиг. 10А и 10В, только биспецифические антитела могут активировать Т-клетки в присутствии опухолевых клеток, экспрессирующих PD-L1 (см. фиг. 10А). Более того, биспецифические антитела активировали Т-клетки зависимым от дозы образом (см. фиг. 10В).

5. Анти-PD-L1/анти-4-1ВВ биспецифическое антитело, содержащее aнтu-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где aнтu-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; и анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.

6. Анти-PD-L1/анти-4-1BB биспецифическое антитело, содержащее aнтu-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и анти-4-1ВВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где aнтu-PD-L1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, CDR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, CDR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; и

-