EA042716B1 - Фармацевтическая композиция, содержащая антитело к il-23р19, и ее применение - Google Patents

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение в целом относится к антителам к IL-23p19, предназначенным для диагностического и терапевтического применения. Прежде всего, описаны фармацевтические композиции, содержащие антитела к IL-23p19, и способы их применения для лечения различных заболеваний или нарушений, ассоциированных сIL-23.

Предпосылки создания изобретения

У высших эукариотических организмов в процессе эволюции развился сложный ответ на патогены, который сначала проявляется в виде врожденного иммунного ответа, после чего запускается адаптивный иммунный ответ. В сочетании друг с другом эти два механизма не только уничтожают патогены, которые заражают организм, но и создают также долговременный иммунологический ответ против последующих воздействий. Дефицит указанных ответов может приводить к повышенной чувствительности к инфекциям и/или изменениям адаптивного иммунного ответа, что приводит к хроническому воспалению и аутоиммунитету. IL-12, гетеродимерный цитокин, состоящий из белковых субъединиц р40 и р35, в течение многих лет рассматривался как цитокин, являющийся отличительным признаком врожденного иммунного ответа, который оказывает очень большое влияние на адаптивный иммунитет. Однако данные исследований биологической роли этого цитокина привели к неоднозначным результатам. Например, в то время как мыши с дефицитом р40 обладали устойчивостью к индуцированному коллагеном артриту (CIA) и экспериментальному аутоиммунному энцефаломиелиту (ЕАЕ), мыши с дефицитом р35 обладали чувствительностью к обоим заболеваниям, и у них отмечалось даже обострение болезни. Указанные загадки начали разрешаться с открытием в конце 1990-х годов нового представителя семейства IL-12-цитокинов, играющего особую роль в иммунном ответе, а именно, IL-23.

IL-23 состоит из общей с IL-12 субъединицы (р40) и уникальной субъединицы р19. Несмотря на присутствие общей субъединицы р40, роли IL-23 и IL-12 являются совершенно различными. IL-12 играет важную роль для Th1-ответов посредством усиления дифференцировки, пролиферации и активации Th1клеток. В противоположность этому, IL-23 обеспечивает развитие и поддержание недавно обнаруженной популяции CD4⁺-Т-клеток-хелперов, обозначенных как Th17-клетки из-за их способности продуцировать IL-17 и родственные цитокины. Имеются убедительные данные о том, что IL-23 принимает участие в хроническом аутоиммунном воспалении, и модуляция активности IL-23 может представлять собой перспективный терапевтический подход к лечению аутоиммунных заболеваний.

Таким образом, существует необходимость в обладающих ценными фармакологическими свойствами молекулах-антагонистах IL-23, которые можно применять в качестве терапевтических средств для лечения заболеваний, в частности, иммунологических и аутоиммунных заболеваний у людей.

Таким образом, одна из задач заключалась в том, чтобы разработать анти-IL-23 антагонистические молекулы, в частности анти-Ш-23 антагонистические молекулы, которые обладают высокой аффинностью связывания с IL-23.

Следующая задача заключалась в том, чтобы разработать анти-IL-23 антагонистические молекулы, которые обладают высокой специфичностью в отношении IL-23.

Следующая задача заключалась в том, чтобы разработать анти-IL-23 антагонисты, которые обладают высокой блокирующей активностью в отношении ассоциации IL-23 с его рецептором.

Следующая задача заключалась в том, чтобы разработать анти-IL-23 антагонисты, которые обладают высокой клеточной активностью.

Следующая задача заключалась в том, чтобы разработать анти-IL-23 антагонисты, которые обладают предпочтительной биодоступностью.

Следующая задача заключалась в том, чтобы разработать анти-IL-23 антагонисты, которые обладают предпочтительными биофизическими свойствами.

Следующая задача заключалась в том, чтобы разработать фармацевтические композиции для молекул антител, в частности антител к IL23p19. Конкретная задача, положенная в основу настоящего изобретения, заключалась в том, чтобы разработать фармацевтические композиции для молекул антител с предпочтительной стабильностью и способностью к хранению.

Следующими задачами являются комбинации любых из указанных выше задач.

Краткое изложение сущности изобретения

Изобретением согласно заявке является фармацевтическая композиция, содержащая антитело к IL23P19, где указанное антитело включает легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 174, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 176, где указанная фармацевтическая композиция содержит: 90 мг/мл указанного антитела и 0.16 ммоль/л полисорбата 20, где указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит (i) 240 ммоль/л сорбитола или (ii) 0,5 ммоль/л янтарной кислоты, 3,9 ммоль/л гексагидрата двунатриевого сукцината и 225 ммоль/л сорбитола, где значение рН указанной фармацевтической композиции составляет от 5,5 до 6,5.

В другом варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит 90 мг/мл указанного антитела и 0,16 ммоль/л полисорбата 20, где указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит 240 ммоль/л сорбита.

В другом варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит 90 мг/мл

- 1 042716 указанного антитела и 0,16 ммоль/л полисорбата 20, где указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит 0,5 ммоль/л янтарной кислоты, 3,9 ммоль/л динатрийсукцината гексагидрата и

225 ммоль/л сорбита.

В другом варианте осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, где значение рН указанной фармацевтической композиции составляет от 5,5 до 6,1.

Другим изобретением согласно заявке является применение фармацевтической композиции, содержащей антитело к IL-23P19 по п.1, для лечения индивидуума, имеющего ассоциированное с IL-23 нарушение, где указанное антитело связывается с человеческим IL-23, где нарушение является воспалительным заболеванием, аутоиммунным, респираторным, метаболическим или раковым. В другом варианте осуществления изобретения применение фармацевтической композиции для лечения заболевания, которое представляет собой псориаз, воспалительное заболевание кишечника, псориатический артрит, рассеянный склероз, ревматоидный артрит или спондилоартрит.

В другом варианте осуществления изобретения применение фармацевтической композиции для лечения заболевания, которое представляет собой бляшковидный псориаз, хронический бляшковидный псориаз или хронический бляшковидный псориаз от умеренного до серьезного.

В другом варианте осуществления изобретения применение фармацевтической композиции для лечения заболевания, которое представляет собой ладонный пустулезный псориаз, каплевидный псориаз, инверсный псориаз, пустулезный псориаз или эритродермный псориаз.

В другом варианте осуществления изобретения применение фармацевтической композиции для лечения заболевания, которое представляет собой болезнь Крона или неспецифический язвенный колит.

В другом варианте осуществления изобретения применение фармацевтической композиции для лечения заболевания, которое представляет собой анкилозирующий спондилит, аксиальный спондилоартрит без радиографических признаков или периферический спондилоартрит.

В другом варианте осуществления изобретения применение фармацевтической композиции для лечения заболевания, которое представляет собой дискоидную красную волчанку, малярию, злокачественную меланому, гипопластическую анемию, болезнь Гентингтона, ладонно-подошвенный пустулез, IgAнефрит, ANCA-ассоциированный васкулит, склерит или сепсис.

Краткое описание чертежей

На чертежах показано следующее.

На фиг. 1 - сравнительный анализ первичной структуры мышиной и гуманизированных вариабельных областей. На фиг. 1а - сконструированные Vk-области антитела к IL-23p19 6B8. На фиг. 1б - сконструированные VH-области антитела к IL-23p19 6B8.

Нумерация аминокислот соответствует стандартной системе нумерации Кэбота. Обычным шрифтом обозначены участки человеческой последовательности; выделены курсивом/подчеркнуты участки мышиной последовательности; выделены затемненным шрифтом участки синтетической последовательности; выделены жирным шрифтом/курсивом/подчеркнуты обозначены CDR.

На фиг. 2 - результаты анализа связывания в конкурентных условиях человеческого IL-23 с IL23R/Fc.

Подробное описание изобретения

Субъединица р19 IL-23 (которую в настоящем описании обозначают также как IL-23p19 и субъединица р19) представляет собой состоящий из 189 аминокислот полипептид, содержащий состоящую из 21 аминокислоты (ак) лидерную последовательность (Oppmann и др., Immunity 13, 2000, с. 715, SEQ ID NO: 181). Биологическую активность молекулы можно обнаружить только после ее спаривания с субъединицей IL-12p40 с образованием IL-23. IL-23 экспрессируется главным образом активированными дендритными клетками (DC) и фагоцитарными клетками. Установлено, что рецептор IL-23 состоит из субъединицы IL-12Re1 IL-12-рецептора, спаренной с уникальной субъединицей, обозначенной как IL23R (Parham и др., J. Immunol. 168, 2002, с. 5699). Экспрессия рецептора главным образом имеет место на Т-клетках памяти и NK-клетках. Таким образом, экспрессия указанной пары цитокин: рецептор, вероятно, ограничена конкретными популяциями иммунных клеток. Хотя сначала предполагалось, что IL-12 и IL-23 могут обладать многими общими функциями, получены данные, свидетельствующие о том, что картина является другой. В то время как IL-12 играет основную роль в производстве Th1-клеток, установлено, что IL-23 играет решающее значение в производстве и поддержании недавно обнаруженной подпопуляции Th-клеток, обозначенных как Th17 (Kikly и др., Curr. Opin. Immunol. 18, 2006, с. 670, Kastelein и др., Ann. Rev. Immunol. 25, 2007, с. 221). Эти клетки продуцируют IL-17A, IL-17F, IL-22 и другие провоспалительные цитокины, такие как IL-6 и TNF-α. Как будет описано ниже, изучение на животных моделях роли указанных Th17-клеток продемонстрировало их важность в качестве движущей силы при хроническом воспалении и аутоиммунитете.

В настоящей заявке раскрыты антитела, которые связываются с субъединицей р 19 IL-23, в частности человеческой IL-23p19. В ней раскрыты также гуманизированные антитела, которые распознают субъединицу р19 IL-23. Согласно конкретным вариантам последовательность указанных гуманизированных антител идентифицировали на основе последовательностей некоторых наиболее предпочтительных

- 2 042716 (лидерных) мышиных антител.

Лидерные мышиные антитела, предлагаемые в настоящей заявке, выводили из мышиных гибридом. Иммунизацию мышей осуществляли с использованием различных методик. Например, антитела, специфические в отношении человеческих белков IL-23p19 или их фрагментов, могут вырабатываться против иммуногенного антигена, такого как выделенный белок IL-23p19, выделенный белок IL-23, выделенный гибридный белок IL-23 и/или фрагмент любого из указанных выше белков (включая синтетические пептиды). Например, для иммунизации мышей используют гибридный белок IL-23, содержащий мышиную субъединицу IL-23p40 и человеческую субъединицу П.-23р19. Для получения иммуногенных антигенов и производства моноклональных антител можно применять любую приемлемую методику, известную в данной области.

Лидерные мышиные антитела выбирали на основе их высокой аффинности к человеческому IL23. Таким образом, в изобретении раскрыто антитело, которое связывается с человеческим IL-23 с высокой аффинностью. Отобранные мышиные антитела гуманизировали с получением гуманизированных антител. Гуманизированные антитела, предлагаемые в настоящей заявке, связываются с человеческим IL-23 с высокой аффинностью. Таким образом, другим объектом может быть гуманизированное антитело, которое связывается с человеческим IL-23 с высокой аффинностью.

Таким образом, одним из вариантов может быть антитело к IL-23p19, характеризующееся величиной K_D, составляющей менее чем 40пМ. Следующим вариантом может быть антитело к IL-23p19, характеризующееся величиной K_D, составляющей менее чем 20пМ. Следующим вариантом может быть антитело к IL-23p19, характеризующееся величиной K_D, составляющей менее чем 10пМ. Следующим вариантом может быть антитело к IL-23p19, характеризующееся величиной K_D, составляющей менее чем 1пМ.

Согласно другому варианту, антитело может связываться с IL-23p19 с высокой аффинностью в отсутствии человеческой сыворотки или в присутствии 50% человеческой сыворотки.

Согласно другому возможному объекту, гуманизированное антитело может связываться с высокой аффинностью также с IL-23 обезьян циномолгус.

Согласно другому возможному объекту, антитело может связываться с IL-23, но не связываться с IL-12. Согласно другому объекту, антитело может не оказывать интерферирующего воздействия на биологическую активность IL-12, который является близкородственным к IL-23 представителем семейства.

Согласно другому возможному объекту антитело может ингибировать стимулируемое IL-23 производство IL-17 мышиными спленоцитами.

Согласно другому возможному объекту гуманизированное антитело может ингибировать индуцируемое IL-23 фосфорилирование STAT3 в DB-клетках.

Согласно другому возможному объекту гуманизированное антитело может антагонизировать действие IL-23 посредством связывания с субъединицей р19 IL-23, например, при оценке по ингибированию цитокинов, таких как IL-17 и IL-22, производство которых стимулируется IL-23, и что определяют по снижению уровней указанных цитокинов.

Согласно другому возможному объекту гуманизированное антитело может обладать предпочтительным фармакокинетическим (ФК) профилем, например, временем полужизни in vivo в организме обезьян циномолгус.

Согласно следующему возможному объекту гуманизированное моноклональное антитело может обладать предпочтительными биофизическими свойствами, такими, например, как качество, стабильность или растворимость.

Согласно возможному объекту, антитело к IL-23p19 может представлять собой гуманизированное антитело. Кроме того, антитело к IL-23p19 может представлять собой моноклональное антитело. Согласно возможному объекту антитело к IL-23p19 может представлять собой полноразмерное антитело. Согласно одному из возможных объектов, антитело к IL-23p19 может представлять собой гуманизированное моноклональное антитело, например, полноразмерное гуманизированное моноклональное антитело.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, раскрытое в настоящей заявке, специфически распознает антигенный эпитоп IL-23p19 или эпитоп IL-23p19. В контексте настоящего описания эти понятия относятся к молекуле (например, пептиду) или фрагменту молекулы, которая/который обладает способностью к иммунологической реакции с антителом к IL-23p19, и, например, включает антигенную детерминанту IL-23p19, распознаваемую любым из антител, имеющих следующую комбинацию последовательностей легкой цепи/тяжелой цепи: SEQ ID NO: 84/121, 86/123, 88/125, 90/127, 91/128, 93/130, 95/132, 97/134, 99/136, 101/138, 103/140, 105/142, 107/144, 109/146, 111/148, 113/150, 115/152, 117/154, 119/156, 160/166, 160/168, 158/166 или 158/168. Антигенные эпитопы IL-23p19 могут быть включены в белки, белковые фрагменты, пептиды и т.п. Эпитопы в большинстве случаев представляют собой белки, короткие олигопептиды, миметики олигопептидов (например, органические соединения, которые имитируют связывающую способность антигена IL-23p19) или их комбинации. Считается, что минимальный размер пептидного или полипептидного эпитопа для антитела должен составлять примерно 4-5 аминокислот. Пептидные или полипептидные эпитопы содержат, например, по меньшей мере семь аминокислот, или, например, по меньшей мере девять аминокислот, или, например, от примерно 15 до примерно 20 аминокислот. Поскольку антитело может распознавать антигенный пептид или полипептид в его тре- 3 042716 тичной форме, то не требуется, чтобы аминокислоты, входящие в эпитоп, были смежными, в некоторых случаях они могут даже не находиться на одной и той же пептидной цепи. Эпитопы можно определять с помощью различных методик, известных в данной области, таких как рентгеновская кристаллография, масс-спектрометрия дейтеро/водородного обмена (HXMS), сайт направленный мутагенез, аланинсканирующий мутагенез и методы пептидного скрининга.

Общая структура антител или иммуноглобулина хорошо известна специалистам в данной области. Эти молекулы представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины, как правило с молекулярной массой примерно 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей, и, как правило, их обозначают как полноразмерные антитела. Каждая легкая цепь ковалентно связана с тяжелой цепью с помощью одной дисульфидной связи с образованием гетеродимера, и гетеротетрамерная молекула образуется посредством ковалентной дисульфидной связи между двумя идентичными тяжелыми цепями гетеродимеров. Хотя легкие и тяжелые цепи связаны с помощью одной дисульфидной связи, количество дисульфидных связей между двумя тяжелыми цепями варьируется в зависимости от изотипа иммуноглобулина. Каждая тяжелая и легкая цепь имеет также равномерно распределенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет аминоконцевой вариабельный домен (VH), за которым расположены три или четыре константных домена (C_H1, C_H2, C_H3 и C_H4), а также шарнирный участок между C_H1 и C_H2. Каждая легкая цепь имеет два домена, аминоконцевой вариабельный домен (VL) и карбоксиконцевый константный домен (C_L). V_L-Домен нековалентно связ ан с VH-доменом, а CL-домен, как правило, ковалентно связан с C_H1-доменом через дисульфидную связь. Считается, что определенные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными областями легких и тяжелых цепей (Chothia и др., J. Mol. Biol. 186, 1985, cc. 651-663). В контексте настоящего описания вариабельные домены обозначают также как вариабельные области.

Определенные участки в вариабельных доменах значительно различаются у различных антител, т.е. они являются гипервариабельными. Эти гипервариабельные участки содержат остатки, которые непосредственно участвуют в связывании и определяют специфичность каждого конкретного антитела в отношении специфической для него антигенной детерминанты. Гипервариабельность в вариабельных доменах, как легкой цепи, так и тяжелой цепи, концентрируется в трех сегментах, которые обозначают как определяющие комплементарность участки (гипервариабельные участки) (CDR) или гипервариабельные петли (HVL). CDR определяют путем сравнения последовательностей согласно методу, описанному у Kabat и др. в: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991, a HVL (которые обозначают также как CDR) структурно определяют на основе трехмерной структуры вариабельного домена согласно методу, описанному у Chothia и Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, cc. 901-917. Эти два метода приводят к некоторым различиям при идентификации CDR. Согласно номенклатуре Кэбота CDR-L1 расположен примерно на остатках 24-34, CDR-L2 примерно на остатках 50-56 и CDR-L3 примерно на остатках 89-97 в вариабельном домене легкой цепи; CDR-H1 расположен примерно на остатках 31-35, CDR-H2 примерно на остатках 50-65 и CDRH3 примерно на остатках 95-102 в вариабельном домене тяжелой цепи. Точные номера остатков, которые образуют конкретный CDR, должны варьироваться в зависимости от последовательности и размера CDR. Специалисты в данной области могут на основе аминокислотной последовательности вариабельной области антитела с использованием общепринятых методов определять, какие остатки содержатся в конкретном CDR. Таким образом, CDR1, CDR2, CDR3 тяжелых и легких цепей определяют уникальные и функциональные свойства, специфические для данного антитела. Три CDR в каждой из тяжелых и легких цепей разделены каркасными участками (FR), которые содержат последовательности, в меньшей степени имеющие тенденцию к вариабельности. Начиная с аминоконца по направлению к карбоксиконцу вариабельных доменов тяжелых и легких цепей, FR и CDR упорядочены следующим образом: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. В значительно степени β-складчатая конфигурация FR позволяет CDR в каждой из цепей находиться в непосредственной близости друг с другом, а также с CDR из другой цепи. Полученная конформация присуща антигенсвязывающему центру (см. Kabat и др., NIH Publ. № 913242, т. I, 1991, cc. 647-669), хотя не является необходимым условием, чтобы все остатки CDR непосредственно участвовали в связывании антигена.

Остатки FR и константные домены Ig не вовлечены непосредственно в связывание антигена, но участвуют в связанной с антигеном и/или опосредуемой антигеном эффекторной функции. Некоторые остатки FR, вероятно, оказывают выраженное воздействие на связывание антигена по меньшей мере тремя путями: путем нековалентного связывания непосредственно с эпитопом, путем взаимодействия с одним или несколькими остатками CDR и путем влияния на поверхность раздела между тяжелыми и легкими цепями. Константные домены не участвуют непосредственно в связывании антигена, но опосредуют различные эффекторные функции Ig, такие как участие антитела в антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичности (ADCC), комплементзависимой цитотоксичности (CDC) и антителообусловленном клеточном фагоцитозе (ADCP).

Легкие цепи иммуноглобулинов позвоночных животных относят к одному из двух четко различимых классов, каппа (к) и лямбда (λ), на основе аминокислотной последовательности константного доме- 4 042716 на. Для сравнения, тяжелые цепи иммуноглобулинов млекопитающих относят к одному из пяти основных классов с учетом последовательности константных доменов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. IgG и IgA дополнительно подразделяют на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG₃, IgG₄, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелых цепей, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, обозначают как α, δ, ε, γ и μ соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации классов нативных иммуноглобулинов хорошо известны.

Понятия антитело, антитело к IL-23p19, гуманизированное антитело к IL-23p19, гуманизированное антитело к эпитопу IL-23p19 и вариант гуманизированного антитела к эпитопу IL-23p19 относятся, в частности, к моноклональным антителам (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональным антителам, мультиспецифическим антителам (например, биспецифическим антителам) и фрагментам антител, таким как вариабельные домены и другие участки антител, которые обладают требуемой биологической активностью, например, способностью связываться с IL-23p19. Понятие моноклональное антитело (МАт) относится к антителу, которое является высокоспецифическим, его мишенью является индивидуальная антигенная детерминанта, эпитоп. Таким образом, прилагательное моноклональные указывает на отличительный признак антител, мишенью которых является идентичный эпитоп, и оно не связано с требованием к получению антител с помощью какого-либо конкретного метода. Должно быть очевидно, что моноклональные антитела можно получать с помощью любой техники или методологии, известной в данной области; включая, например, метод гибридом (Kohler и др., Nature 256, 1975, с. 495), или методы рекомбинантной ДНК, известные в данной области (см., например, US № 4816567), или методы выделения моноклональных полученных с помощью рекомбинантной ДНК антител с использованием фаговых библиотек антител с помощью методик, которые описаны у Clackson и др., Nature 352, 1991, сс. 624-628 и у Marks и др., J. Mol. Biol. 222, 1991, сс. 581-597.

Понятие мономер относится к гомогенной форме антитела. Например, в случае полноразмерного антитела мономер означает мономерное антитело, которое имеет две идентичные тяжелые цепи и две идентичные легкие цепи.

Химерные антитела состоят из вариабельных областей тяжелых и легких цепей антител из одного вида (например, из млекопитающего кроме человека, такого как мышь) и константных областей тяжелой и легкой цепи антитела из других видов (например, человека), и их можно получать путем соединения последовательностей ДНК, кодирующих вариабельные области антитела из первого вида (например, мыши), с последовательностями ДНК константных областей антитела из второго вида (например, человека), и трансформации хозяина экспрессионным вектором, содержащим связанные последовательности, что позволяет хозяину продуцировать химерное антитело. В альтернативном варианте химерное антитело может также представлять собой антитело, в котором одна или несколько областей или доменов тяжелой и/или легкой цепи идентичны, гомологичны или являются вариантом соответствующей последовательности в моноклональном антителе из другого класса или изотипа иммуноглобулина или из консенсусной последовательности, или последовательности зародышевой линии. Химерные антитела могут включать фрагменты указанных антител при условии, что фрагмент антитела обладает требуемой биологической активностью родительского антитела, например, способностью связываться с одним и тем же эпитопом (см., например, US № 4816567; и Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, сс. 6851-6855).

Понятия фрагмент антитела, фрагмент антитела к IL-23p19, фрагмент антитела к эпитопу IL23p19, фрагмент гуманизированного антитела к IL-23p19, фрагмент гуманизированного антитела к эпитопу IL-23p19, фрагмент варианта гуманизированного антитела к эпитопу IL-23p19 относятся к части полноразмерного антитела к IL-23p19, в которой сохраняется вариабельная область или ее функциональная способность, например, специфичность связывания с эпитопом IL-23p19. Примерами фрагментов антител являются (но, не ограничиваясь только ими) Fab-, Fab'-, F(ab')₂-, Fd-, Fv-, scFv- и scFv-Fcфрагмент, димерное антитело (диабоди), линейное антитело, одноцепочечное антитело, минитело, димерное антитело, образованное из фрагментов антитела, и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Полноразмерные антитела можно обрабатывать ферментами, такими как папаин или пепсин, с получением требуемых фрагментов антител. Расщепление папаином применяют для получения двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов антител, которые называют Fab-фрагментами, каждый с одним антигенсвязывающим центром, при этом оставшуюся часть обозначают как Fc-фрагмент. Fabфрагмент содержит также константный домен легкой цепи и C_H1-домен тяжелой цепи. После обработки пепсином получают F(ab')2-фрагмент, который несет два антигенсвязывающих центра и все еще сохраняет способность к перекрестному сшиванию с антигеном.

Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов присутствием дополнительных остатков, включая один или несколько остатков цистеина из шарнирной области антитела на С-конце C_H1-домена. F(ab')₂фрагменты антител представляют собой пары Fab'-фрагментов, связанных с помощью остатков цистеина в шарнирной области. Известны другие химические сочетания фрагментов антител.

Ev-фрагмент содержит полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий центр, состоящий из димера, включающего вариабельный домен одной тяжелой и одной легкой цепи, которые находятся в тесной нековалентной ассоциации. В этой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаи- 5 042716 модействуют с определенным антигенсвязывающим центром на поверхности димера V_h-Vl. В целом, шесть CDR обусловливают специфичность антитела в отношении связывания антигена.

Одноцепочечный Fv или scFv-фрагмент антитела представляет собой одноцепочечный Fvвариант, содержащий V_H- и VL-домены антитела, при этом домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Одноцепочечный Fv обладает способностью распознавать антиген и связываться с ним. Полипептид scFv необязательно может содержать также полипептидный линкер, расположенный между V_H- и VL-доменами, для облегчения образования трехмерной структуры, требуемой для связывания scFv с антигеном (см., например, у Pluckthun, в: The Pharmacology of monoclonal Antibodies, т. 113, под ред. Rosenburg и Moore, изд-во Springer-Verlag, New York, 1991, cc. 269-315).

Понятие димерное антитело (диабоди) относится к небольшим фрагментам антитела с двумя антигенсвязывающими центрами, при этом фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), сцепленный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) в одной и той же полипептидной цепи (V_H-V_L или V_L-V_H). Димерные антитела описаны более подробно например, у Holliger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, cc. 6444-6448.

Другие обладающие способностью к распознаванию фрагменты антител включают фрагменты, которые содержат пару расположенных в виде тандема Fd-сегментов (V_H-C_H1-V_H-C_H1), образующих пару антигенсвязывающих участков. Указанные линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими, что описано, например, у Zapata и др., Protein Eng. 8(10), 1995, cc. 1057-1062.

Гуманизированное антитело или фрагмент гуманизированного антитела представляет собой специфический тип химерного антитела, которое включает вариант аминокислотной последовательности иммуноглобулина или его фрагмента, который обладает способностью связываться с предварительно определенным антигеном и который содержит один или несколько FR, который(ые) имеет(ют) аминокислотную последовательность, практически соответствующую последовательности человеческого иммуноглобулина, и один или несколько CDR, который(ые) имеет(ют) аминокислотную последовательность, которая практически соответствует аминокислотной последовательности нечеловеческого иммуноглобулина. Указанную нечеловеческую аминокислотную последовательность, которую часто обозначают как импортная последовательность, как правило, получают из импортного домена антитела, в частности, вариабельного домена. В целом, гуманизированное антитело включает по меньшей мере CDR или HVL нечеловеческого антитела, встроенные между FR вариабельного домена человеческой тяжелой или легкой цепи. В настоящей заявке описаны специфические гуманизированные антитела к IL-23p19, которые содержат CDR, выведенные из мышиных моноклональных антител, или гуманизированные CDR, которые представлены в табл. 3 и 4, встроенные между FR в последовательностях вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи человеческой зародышевой линии. Должно быть очевидно, что определенные остатки мышиного FR можно импортировать для обеспечения функции гуманизированных антител, и поэтому определенные остатки последовательностей вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи человеческой зародышевой линии модифицируют для того, чтобы они были такими же как в соответствующей мышиной последовательности.

В другом варианте гуманизированное антитело к IL-23p19 может содержать практически полностью по меньшей мере один и, как правило, два вариабельных домена (таких, например, как входящие в Fab-, Fab'-, F(ab')₂-, Fabc- и Fv-фрагменты), в которых все или практически все CDR соответствуют CDR нечеловеческих иммуноглобулинов, и все CDR могут представлять собой мышиные или гуманизированные последовательности, подробно описанные в представленных ниже в табл. 1-4, и все или практически все FR представляют собой FR, которые имеют консенсусную последовательность или последовательность зародышевой линии человеческого иммуноглобулина. В другом варианте гуманизированное антитело к IL-23p19 может включать также по меньшей мере часть Fc-области иммуноглобулина, как правило, человеческого иммуноглобулина. Как правило, антитело должно содержать как легкую цепь, так и по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи. Антитело может включать также при необходимости один или несколько из следующих участков: C_H1, шарнирная область, C_H2, C_H3 и/или C_H4 тяжелой цепи.

Гуманизированное антитело к IL-23p19 можно выбирать из любого класса иммуноглобулинов, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа, включая IgG1, IgG2, IgG₃, IgG₄, IgA1 и IgA2. Например, константный домен может представлять собой комплементфиксирующий константный домен, если требуется, чтобы гуманизированное антитело обладало цитотоксической активностью, и изотип, как правило, представляет собой IgG1. Если указанная цитотоксическая активность не требуется, то константный домен может относиться к другому изотипу, например, IgG₂. В альтернативном варианте гуманизированное антитело к IL-23p19 может содержать последовательности более чем из одного класса или изотипа иммуноглобулинов, и выбор конкретных константных доменов для оптимизации требуемых эффекторных функций находится в компетенции обычного специалиста в данной области. Антитела могут представлять собой антитела изотипа IgG1 и прежде всего антитела изотипа IgG1, в которых выключены эффекторные функции.

FR- и CDR- или HVL-участки гуманизированного антитела к IL-23p19 не обязательно должны точно соответствовать родительским последовательностям. Например, один или несколько остатков в импортном CDR или HVL или в консенсусной последовательности или последовательности зародышевой

- 6 042716 линии FR можно изменять (например, посредством мутагенеза) путем замены, инсерции или делеции, в результате чего полученный аминокислотный остаток становится не идентичным исходному остатку в соответствующем положении любой родительской последовательности, но, тем не менее, антитело сохраняет функцию, такую как способность связываться с IL-23p19. Указанное изменение, как правило, не должно быть обширным и должно представлять собой консервативные изменения. Как правило, по меньшей мере 75% остатков, чаще по меньшей мере 90% и наиболее часто более 95% или более 98%, или более 99%, гуманизированного антитела должно соответствовать остаткам родительской консенсусной последовательности или последовательности FR зародышевой линии и импортных последовательностей CDR.

Остатки иммуноглобулина, которые влияют на поверхность раздела между вариабельными областями тяжелой и легкой цепи (поверхность раздела VL-VH), представляют собой остатки, которые влияют на близость или ориентацию двух цепей относительно друг друга. Конкретными остатками, которые могут участвовать во взаимодействиях между цепями, являются остатки V_L 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96 и 98 и остатки VH 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100 и 103 (согласно системе нумерации, предложенной Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)). В US № 6407213 обсуждается также, что в указанном взаимодействии могут участвовать такие остатки, как остатки V_L 43 и 85 и остатки VH 43 и 60. Хотя эти остатки указаны только для человеческого IgG, их можно рассматривать и для других видов. Важные остатки антитела, которые, как ожидается, могут участвовать во взаимодействиях между цепями, отбирают для замены в консенсусной последовательности.

Понятия консенсусная последовательность и консенсусное антитело относятся к аминокислотной последовательности, которая содержит наиболее часто встречающийся аминокислотный остаток в каждом положении во всех иммуноглобулинах любого класса, изотипа или в любой субъединичной структуре, например, вариабельном домене человеческого иммуноглобулина. Консенсусная последовательность может базироваться на иммуноглобулинах конкретных видов или множества видов. Под консенсусной/консенсусным последовательностью, структурой или антителом подразумевают консенсусную человеческую последовательность, указанную в конкретных вариантах, и понятие относится к аминокислотной последовательности, которая содержит наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки в каждом положении во всех человеческих иммуноглобулинах конкретного класса, изотипа или конкретной субъединичной структуры. Таким образом, консенсусная последовательность содержит аминокислотную последовательность, которая имеет в каждом положении аминокислоту, которая присутствует в одном или нескольких известных иммуноглобулинах, но которая может не представлять собой точную копию полной аминокислотной последовательности любого индивидуального иммуноглобулина. Вариабельную область консенсусной последовательности не получают из какого-либо встречающегося в естественных условиях антитела или иммуноглобулина (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991) и его вариантов. Консенсусные последовательности FR тяжелой и легкой цепи и их варианты представляют собой ценные последовательности для получения гуманизированных антител к IL-23p19 (см., например, US №№ 6037454 и 6054297).

Последовательности человеческой зародышевой линии присутствуют в естественных условиях в популяции человеческих антител. Комбинация этих генов зародышевой линии создает разнообразие антител. Последовательности зародышевой линии антитела легкой цепи антитела получают из консервативных v-генов и j-генов человеческой зародышевой линии каппа или лямбда. Аналогично этому последовательности тяжелой цепи получают из v-, d- и j-генов зародышевой линии (LeFranc М-Р и LeFranc G, The Immunoglobulin Facts Book, изд-во Academic Press, 2001).

В контексте настоящего описания каждое из понятий вариант, вариант антитела к IL-23p19, гуманизированный вариант антитела к IL-23p19 или вариант гуманизированного антитела к IL-23p19 относится к гуманизированного антителу к IL-23p19, которое имеет по меньшей мере последовательность мышиного CDR вариабельной области легкой цепи, выбранную из любых последовательностей, представленных в табл. 1, или последовательность мышиного CDR тяжелой цепи, выведенную из мышиного моноклонального антитела, представленного в табл. 2. К вариантам относятся последовательности, имеющие одну или несколько аминокислотных замен в вариабельных областях одной или обеих легких цепей или тяжелых цепей, при условии, что аминокислотная замена не оказывает существенного воздействия на связывание антитела с IL-23p19. Примерами гуманизированных антител, описанных в изобретении являются антитела, обозначенные как Антитело А, Антитело В, Антитело С и Антитело D и их различные тяжелые и легкие цепи, представленные в SEQ ID NO: 174 и 180 и SEQ ID NO: 176 и 178 соответственно.

Выделенное антитело представляет собой антитело, которое идентифицировано и отделено и/или очищено от компонента его естественного окружения. Загрязняющие компоненты естественного окружения антитела представляют собой субстанции, которые могут влиять на диагностическое или терапевтическое применение антитела и могут представлять собой ферменты, гормоны или другие белковые или небелковые растворенные вещества. В одном из случаев выделенное антитело может представлять собой

- 7 042716 антитело, очищенное до степени, превышающей 95 мас.%.

Выделенное антитело представляет собой антитело in situ внутри рекомбинантных клеток, в которых оно продуцировано, если в нем не присутствует ни один компонент естественного окружения антитела. Однако, как правило, выделенное антитело получают с помощью по меньшей мере одной стадии очистки, во время которой удаляют рекомбинантный клеточной материал.

Понятие характеристика антитела относится к факторам, которые участвуют в распознавании антителом антигена или эффективности антитела in vivo. Изменения в аминокислотной последовательности антитела могут влиять на свойства антитела, такие как фолдинг, и могут влиять на физические факторы, такие как начальная скорость связывания антитела с антигеном (k_a), константа диссоциации антитела от антигена (kd), константа аффинности антитела к антигену (Kd), конформация антитела, стабильность белка и время полужизни антитела.

В контексте настоящего описания понятие эпитопное мечение относится к антителу к IL-23p19, слитому с эпитопной меткой. Эпитопная метка представляет собой полипептид, состоящий из достаточного количества аминокислот для создания эпитопа для производства антитела, при этом ее создают так, чтобы она не оказывала воздействия на требуемую активность гуманизированного антитела к IL23p19. Эпитопная метка, как правило, является в значительной степени уникальной, в результате чего антитело, которое образуется против эпитопной метки, не дает выраженную перекрестную реакцию с другими эпитопами. Приемлемые полипептиды-метки, как правило, содержат по меньшей мере 6 аминокислотных остатков и, как правило, содержат примерно 8-50 аминокислотных остатков или примерно 930 остатков. Примерами эпитопных меток и антител, которые связываются с эпитопом, являются полипептид-метка flu НА (НА вируса гриппа) и соответствующее ему антитело 12СА5 (Field и др., Mol. Cell. Biol. 8, 1988, cc. 2159-2165); c-myc-метка и соответствующие ей антитела 8F9, 3С7, 6Е10, G4, В7 и 9Е10 (Evan и др., Mol. Cell. Biol. 5(12), 1985, cc. 3610-3616); и метка, включающая гликопротеин D (gD) вируса герпеса простого, и соответствующее ей антитело (Paborsky и др. Protein Engineering 3(6), 1990, cc. 547553). Эпитопная метка может представлять собой эпитоп, связывающийся с рецептором спасения. В контексте настоящего описания понятие эпитоп, связывающийся с рецептором спасения относится к эпитопу Fc-области молекулы IgG (такой как IgG1, IgG₂, IgG₃ или igG₄), ответственному за удлинение времени полужизни молекулы IgG in vivo в сыворотке.

В некоторых вариантах антитела можно конъюгировать с цитотоксическим агентом. Он может представлять собой любую субстанцию, которая ингибирует или препятствует функции клеток и/или вызывает деструкцию клеток. Под понятие подпадают радиоактивные изотопы (такие как I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰ и Re¹⁸⁶), химиотерапевтические средства и токсины, такие как обладающие ферментативной активностью токсины, полученные из бактерий, грибов, растений или животных, и их фрагменты. Указанные цитотоксические агенты можно сшивать с гуманизированными антителами с помощью стандартных процедур и применять, например, для лечения пациента, которому показана терапия на основе антитела.

Химиотерапевтическое средство представляет собой химическое соединение, которое можно применять для лечения рака. Известны многочисленные примеры химиотерапевтических средств, которые можно конъюгировать с терапевтическими антителами. Примерами указанных химиотерапевтических средств являются алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (прежде всего буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адозелесин, карзелесин и бизелесин); криптофицины (прежде всего криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин, ауристатины (включая такие аналоги, как монометил-ауристатин Е и монометил-ауристатин F); дуокармицин (включая синтетические аналоги KW2189 и CBI-TMI); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотные аналоги горчичного газа (иприта), такие как хлорамбуцил, хломафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, гидрохлорид оксида мехлорметамина, мелфалан, новембихин, фенэстерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин (азотистоипритовое производное урацила); нитрозмочевины, такие как кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеаминцин, прежде всего калихеамицин гамма II и калихеаминцин phiI1 (см., например, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33, cc. 183-186); динемицин, включая динемицин А; бисфосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также неокарзиностатиновый хромофор и родственный хромопротеин хромофоров энедииновых антибиотиков), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофелин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диаза-5-оксо-Ь-норлейцин, доксорубицин (Adriamycin™) (включая морфолино-доксорубицин, цианморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофенольная кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, хеломицин, родарубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-ФУ); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноп- 8 042716 терин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; пуриновые аналоги, такие как флударабин, 6меркаптопурин, тиамитрин, тиогуанин; пиримидиновые аналоги, такие как анцитабин, азацитидин, 6азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуредин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолонпропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадренергетики, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; заменитель фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамидгликозид; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демоколцин; диазихон; элформитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; майтансиноиды, такие как майтансин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамед; пирарубицин; лосоксантрон; подафиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK®; разоксан; ризоксин; сизофуран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазихон; 2,2',2трихлортриэтиламин; трихотецены (прежде всего токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндесин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид (Ara-С); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например паклитаксел (TAXOL®, фирма BristolMyers Squibb Oncology, Принстон, штат Нью-Джерси) и доцетаксел (TAXOTERE®, фирма RhonePoulenc Rorer, Энтони, Франция); хлорамбуцил; гемцитабин (Gemzar™); 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорелбин (Navelbine™); новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS-2000; дифторметилорнитин (ДМПО); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин, и их фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше соединений. Также под объем этого определения подпадают антигормональные агенты, которые регулируют или ингибируют действие гормона на опухоли, такие как антиэстрогены и селективные модуляторы рецепторов эстрогена (SERM), включая, например, тамоксифен (включая Nolvadex™), ралоксифен, дролоксифен, 4гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен (Fareston™); ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, регулируют производство эстрогена надпочечниками, такие, например, как 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, мегестрола ацетат (Megace™), эксеместан, форместан, фадрозол, ворозол (Rivisor™), летрозол (Femara™) и анастрозол (Arimidex™); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, леупролид и госерелин, а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого из указанных выше соединений. Любое одно или несколько этих средств можно конъюгировать с гуманизированными антителами с получением ценного терапевтического средства, которое можно применять для лечения различных нарушений.

Антитела можно конъюгировать также с пролекарствами. Пролекарство представляет собой предшественник или производное фармацевтически активной субстанции, которое является менее цитотоксичным в отношении опухолевых клеток по сравнению с исходным лекарственным средством и обладает способностью активироваться или превращаться в более активную исходную форму под действием ферментов (см., например, Wilman в: Prodrugs in Cancer Chemotherapy, Biochemicals Society Transactions, 14, 1986, cc. 375-382, 615-й симпозиум в Белфасте (1986); и Stella и др. в: Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, Directed Drug Delivery, под ред. Borchardt и др., изд- во Humana Press, 1985, cc. 247-267). Пригодные пролекарства включают (но не ограничиваясь ими) фосфатсодержащие пролекарства, тиофосфатсодержащие пролекарства, сульфатсодержащие пролекарства, пептидсодержащие пролекарства, модифицированные D-аминокислотой пролекарства, гликозилированные пролекарства, β-лактамсодержащие пролекарства, пролекарства, содержащие необязательно замещенный феноксиацетамид, или пролекарства, содержащие необязательно замещенный фенилацетамид, 5-фторцитозин- и другие 5-фторуридинсодержащие пролекарства, которые могут превращаться в более активную цитотоксическую свободную лекарственную форму. Примеры цитотоксических лекарственных средств, которые могут образовывать производные в виде пролекарства, включают (но не ограничиваясь ими) описанные выше химиотерапевтические средства.

Для диагностических целей, а также для мониторинга лечения, предлагаемые антитела можно конъюгировать также с меткой, либо только с меткой, либо с меткой в сочетании с дополнительным вторым агентом (пролекарство, химиотерапевтическое средство и т.п.). Метка в отличие от второго дополнительно агента представляет собой субстанцию, которая является выявляемым соединением или выявляемой композицией, и ее можно конъюгировать прямо или косвенно с гуманизированным антителом, предлагаемым в настоящей заявке. Метка сама по себе может представлять собой выявляемую субстанцию (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или, как в случае ферментативной метки, она может катализировать химическое изменение соединения или композиции, представляющего/представляющей собой субстрат, которое можно выявлять. Меченое гуманизированное антитело к IL23p19 можно получать и применять для различных целей, включая диагностику in vitro и in vivo.

Антитела, предлагаемые в настоящей заявке, можно приготавливать таким образом, чтобы они представляли собой часть препарата в виде липосомы, для их эффективного введения in vivo. Липосома представляет собой небольшой пузырек, состоящий из различного типа липидов, фосфолипидов

- 9 042716 и/или поверхностно-активных веществ. Липосомы можно применять для введения млекопитающему соединения или композиции, например, гуманизированного антитела к IL-23p19, представленного в настоящем описании, необязательно в сочетании или в комбинации с одним или несколькими фармацевтическими действующими веществами и/или метками. Компоненты липосом обычно упорядочены в виде двухслойной структуры, аналогичной липидной структуре биологических мембран.

В изобретении также описаны выделенные нуклеиновые кислоты, которые могут кодировать один или несколько доменов гуманизированных антител. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена по меньшей мере от одной молекулы нуклеиновой кислоты-примеси, с которой она обычно связана в естественном источнике нуклеиновой кислоты антитела. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от молекулы нуклеиновой кислоты, существующей во встречающихся в естественных условиях клетках.

Согласно заявке можно осуществлять рекомбинантную экспрессию одного или нескольких доменов гуманизированных антител. Для осуществления указанной рекомбинантной экспрессии можно применять одну или несколько контролирующих последовательностей, т.е. полинуклеотидных последовательностей, необходимых для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Пригодные для прокариотических клеток контролирующие последовательности включают, например, последовательности промотора, оператора и сайта связывания рибосомы. В эукариотических клетках контролирующие последовательности включают (но не ограничиваясь только ими) промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры. Указанные контролирующие последовательности можно применять для экспрессии и производства гуманизированного антитела к IL-23p19 в прокариотических и эукариотических клетках-хозяевах.

Нуклеиновая кислота функционально связана, если она находится в функциональной связи с другой нуклеотидной последовательностью. Например, нуклеиновая кислота предпоследовательности или секреторного лидера функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если она экспрессируется в виде предпротеина, который принимает участие в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он оказывает воздействие на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что может облегчать трансляцию. Как правило, функционально связаны обозначает, что связанные последовательности ДНК являются смежными, а в случае секреторного лидера, являются смежными и находятся в рамке считывания. Однако энхансеры не обязательно должны быть смежными. Связывание осуществляют путем встраивания лигированием в соответствующие сайты рестрикции. Если такие сайты не существуют, то можно применять синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.

В контексте настоящего описания понятия клетка, линия клеток и культура клеток используются взаимозаменяемо, и все такие понятия включают потомство. Так, понятия трансформанты и трансформированные клетки включают первичную представляющую интерес клетку и полученные из нее культуры, вне зависимости от количества пересевов.

Понятие млекопитающее, подлежащее лечению, относится к любому животному, которое принадлежит к классу млекопитающих, включая людей, домашних и сельскохозяйственных животных, а также живущих в зоопарке животных, предназначенных для спорта или комнатных животных, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и т.п. Предпочтительно млекопитающее представляет собой человека.

В контексте настоящего описания понятие нарушение означает любое состояние, которое можно облегчать посредством лечения гуманизированным антителом к IL-23p19, представленным в настоящем описании. Оно включает хронические и острые нарушения или заболевания, в том числе патологические состояния, которые приводят к предрасположенности млекопитающего к рассматриваемому нарушению. Примерами нарушений, которые можно лечить, являются (но не ограничиваясь только ими) воспалительные, ангиогенные, аутоиммунные и иммунологические нарушения, респираторные нарушения, рак, гематологические злокачественные заболевания, доброкачественные и злокачественные опухоли, лейкозы и лимфоидные злокачественные заболевания.

Понятия рак и раковый относятся или описывают физиологическое состояние у млекопитающего, которое, как правило, отличается нерегулируемым ростом клеток. Примерами рака являются (но не ограничиваясь только ими) карцинома, лимфома, бластома, саркома и лейкоз.

В контексте настоящего описания понятие ассоциированное с IL-23 нарушение или ассоциированное с IL-23 заболевание относится к состоянию, при котором активность IL-23 принимает участие в заболевании, и, как правило, происходит аномальная экспрессия IL-23. Ассоциированное с IL-23 нарушение включает заболевания и нарушения иммунной системы, такие как аутоиммунные нарушения и воспалительные нарушения. Указанные состояния включают (но не ограничиваясь только ими) ревматоидный артрит (RA), системную красную волчанку (SLE), склеродермию, синдром Шегрена, рассеянный склероз, псориаз, псориатический артрит, воспалительное заболевание кишечника (например, неспецифический язвенный колит и болезнь Крона), воспаление легких, астму и идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP) и спондилоартрит, например, анкилозирующий спондилит, аксиальный спондилоартрит без радиографических признаков или периферический спондилоартрит.

- 10 042716

Понятие внутривенная инфузия относится к интродукции агента в вену больного животного или человека в течение периода времени, превышающего примерно 15 мин, как правило, в течение примерно

30-90 мин.

Понятие внутривенный болюс или внутривенный импульс относится к введению лекарственного средства животному или человеку таким образом, чтобы лекарственное средство поступало в организм в течение примерно 15 мин или менее, как правило, 5 мин или менее.

Понятие подкожное введение относится к интродукции агента под кожу больного животного или человека, предпочтительно в карман между кожей и низлежащей тканью, путем относительно медленного пролонгированного введения из содержащего лекарственное средство резервуара. Путем прищипывания или оттягивания кожи вверх и в сторону от низлежащей ткани можно создавать карман.

Понятие подкожная инфузия относится к интродукции лекарственного средства под кожу больного животного или человека, предпочтительно в карман между кожей и низлежащей тканью, путем относительно медленного пролонгированного введения из содержащего лекарственное средство резервуара в течение периода времени, составляющего (но не ограничиваясь только указанным) 30 мин или менее или 90 мин или менее. Инфузию необязательно можно осуществлять путем подкожной имплантации насоса для введения лекарственного средства, имплантированного под кожу больного животного или человека, при этом насос обеспечивает введение лекарственного средства в предварительно определенном количестве в течение предварительно определенного периода времени, составляющего 30 мин, 90 мин или периода времени, соответствующего продолжительности схемы лечения.

Понятие подкожный болюс относится к введению лекарственного средства под кожу больного животного или человека, при этом продолжительность введения лекарственного средства в виде болюса составляет менее примерно 15 мин; или менее 5 мин, или в течение менее 60 с. В следующем объекте введение можно осуществить в карман между кожей и низлежащей тканью, где карман можно создавать путем прищипывания или оттягивания кожи вверх и в сторону от низлежащей ткани.

В контексте настоящего описания понятие терапевтически эффективное количество относится к количеству действующего вещества, при использовании которого происходит ослабление или облечение одного или нескольких симптомов нарушения, на которое направлено лечение. В другом варианте терапевтически эффективное количество относится к концентрации в сыворотке пациента, при которой, как установлено, действующее вещество является эффективным, например, в отношении замедления развития болезни. Эффективность можно оценивать общепринятыми путями в зависимости от подлежащего лечению состояния.

В контексте настоящего описания понятия лечение и терапия и т.п. относятся к терапевтическим, а также профилактическим или подавляющим мероприятиям в отношении заболевания или нарушения, которые приводят к любому клинически важному или благоприятному действию, включая (но не ограничиваясь только ими) облегчение или ослабление одного или нескольких симптомов, регресс, замедление или прекращение развития заболевания или нарушения. Таким образом, например, под понятие лечение подпадает введение агента до или после начала проявления симптома заболевания или нарушения, что приводит к предупреждению или устранению одного или нескольких признаков заболевания или нарушения. В другом примере понятие относится к введению агента после клинического проявления болезни для борьбы с симптомами болезни. Кроме того, в контексте настоящего описания понятие лечение или терапия относятся к введению агента после возникновения и после развития клинических симптомов, где введение оказывает воздействие на клинические параметры заболевания или нарушения, такие как степень повреждения ткани или количество и распространение метастазов, вне зависимости от того, приводит или нет лечение к облегчению заболевания. Кроме того, если применение композиций либо индивидуально, либо в сочетании с другим терапевтическим средством купирует или облегчает по меньшей мере один из симптомов подлежащего лечению нарушения по сравнению с указанным симптомом без применения содержащей гуманизированное антитело к IL-23p19 композиции, то результат следует рассматривать как эффективное лечение требуемого нарушения вне зависимости от того, происходит или нет облегчение всех симптомов нарушения.

Понятие листовка-вкладыш в упаковку относится к инструкциям, которые принято включать в предназначенные для продажи упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, методах применения, введения, противопоказаниях и/или мерах предосторожности при применении указанных терапевтических продуктов.

Антитела

В настоящей заявке описаны и предложены гуманизированные антитела к IL-23, в частности гуманизированные антитела к IL-23p19, и композиции и полученные изделия, содержащие одно или несколько антител к IL-23, в частности одно или несколько гуманизированных антител к IL-23p19. Описаны также связывающие агенты, которые включают антигенсвязывающий фрагмент антитела к IL-23, в частности, гуманизированное антитело к IL-23p19. Гуманизированные антитела к IL-23p19 и связывающие агенты могут ингибировать производство ассоциированных с Th17 цитокинов, которые принимают участие в хронических аутоиммунных и воспалительных заболеваниях. Таким образом, гуманизированные антитела к IL-23p19 и связывающие агенты можно применять для лечения различных заболеваний или

- 11 042716 нарушений. И гуманизированное антитело к IL-23p19, и Ш23р19-связывающий агент, включают по меньшей мере участок, который специфически распознает эпитоп IL-23p19 (т.е. антигенсвязывающий фрагмент).

При осуществлении первичной оценки отбирали мышиные антитела на основе их характеристик связывания IL-23p19.

Таким образом, согласно одному из вариантов антитело можно характеризовать величиной K_D в отношении IL-23, в частности в отношении человеческого IL-23, составляющей менее чем 100пМ. Согласно другому варианту, антитело можно характеризовать величиной K_D, составляющей менее чем 40пМ. Согласно другому варианту, антитело можно характеризовать величиной K_D, составляющей менее чем 20пМ. Согласно другому варианту антитело можно характеризовать величиной KD, составляющей менее чем 10пМ. Согласно другому варианту антитело можно характеризовать величиной K_D, составляющей менее чем 1пМ.

Отобранные мышиные антитела имеют вариабельные области легких цепей и вариабельные области тяжелых цепей, которые представлены ниже в табл. 1 и 2.

- 12 042716

Таблица 1

Мышиные лидерные антитела к IL-23p19 -последовательности VK

2Dlvk	GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGGTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGG GCCACCATATCCTGCAGAACCAGTGAAAGTGTTTATAGTTATGGCCAAAATTTT ATACACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCG TGCATCCAACCTGGAATCTGGGATCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTA GGACAGACTTCACCCTCACCATGAATCCTGTGGAGGCTGATGATGTTGCAACC TATTACTGTCAGCAAACTAATGAGGATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAA GCTGGAAATAAGA (SEQ ID NO: 83)
	DIVLTQSPGSLAVSLGQRATISCRTSESVYSYGQNFIHWYQQKPGQPPKLLIY RASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTMNPVEADDVATYYCQQTNEDPYTFGGG TKLEIR (SEQ ID NO: 84)
6B8Vk	GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCTTGTCCACATCAGTGGGAGA CAGGGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCGGGATGTGGCTATTGCTGTAG CCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAACTACTTCTTTTCTGG GCATCCACCCGACACACTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATC TCGGACAGATTTCACTCTCACCATTAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGG CAGATTATTTCTGTCACCAATATAGCAGCTATCCATTCACGTTCGGCTCGG GGACAAAGTTGGAAATAAAG (SEQ ID NO: 85)
	DIVMTQSHKFLSTSVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGQSPKLLLFWAS TRHTGVPDRFTGSGSRTDFTLTISNVQSEDLADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEI К (SEQ ID NO: 86)
9D12-Vk	GACATTGCGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTGGGGCAG AGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAACTATTAATTTTTATGGCAC TAGTTTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGTCACCCAAACTCC TCATCTATCGTGCATCCAACCTAGAATCTGGGATCCCTGCCAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTAATCCTGTGGAGGC TGATGATGTTGCAACCTATTACTGTCAGCAAACTAATGAGGATCCGTACA CGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 87)
	DIALTQSPASLAVSLGQRATISCRASETINFYGTSFMHWYQQKPGQSPKLLIYRASN LESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQTNEDPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 88)
15Cllvk	GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGAT CAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGG AAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGC TCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAACAGAGTGG AGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCG TACACGTTCGGAGGGGGGACCCAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 89)
	DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLL IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGG GTQLEIK (SEQ ID NO: 90)
15Flvk	DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQRSHESPRLLIKYASQ SISGIPSRFSGSGSGSDFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 91)
18D3vk	GACATTGTGATGACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGA TAGAGTCTCTCTTTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATTAGCGACTACTTAT ACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAATTT GCTTCCCAATCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCACTGGCAGTGGATC AGGGTCAGATTTCACTCTCAGTATCGACAGTGTGGAACCTGATGATGTTG GAGTCTTTTTCTGTCAAAATGGTCACAGCTTTCCGTTCACGTTCGGAGGGG GGACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 92)
	DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLYWYQQKSHESPRLLIKFASQ SISGIPSRFTGSGSGSDFTLSIDSVEPDDVGVFFCQNGHSFPFTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 93)

- 13 042716

18C4vk	GACATTGTGATGACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGA TAGAGTCTCTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAGAGTATTAGCGAGTACTTAC ACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAATAT GCTTCCCAATCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATC AGGGTCAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAACCTGAAGATGTTG GAGTGTATTACTGTCAAAATGGTCACAGCTTTCCATTCACGTTCGGCTCG GGGACAAAGTTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 94)
	DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISEYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQ SISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 95)
18E5vk	GACATTGTGATGACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGA TAGAGTCTCTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAGAGTATTAGCGACTACTTAT ACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAATTT GCTTCCCAATCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCACTGGCAGTGGATC AGGGTCAGATTTCACTCTCAGTATCGACAGTGTGGAACCTGATGATGTTG GAGTCTTTTTCTGTCAAAATGGTCACAGCTTTCCGTTCACGTTCGGAGGGG GGACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 96)
	DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLYWYQQKSHESPRLLIKFASQ SISGIPSRFTGSGSGSDFTLSIDSVEPDDVGVFFCQNGHSFPFTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 97)
20E8vk	GACATTGTGATGACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGA TAGAGTCTCTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAGAGTATTAGCGAGTATTTAC ACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAATAT GCTTCCCAATCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATC AGGGTCAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAACCTGAAGATGTTG GAGTTTATTACTGTCAAAATGGTCACAGCTTTCCATTCACGTTCGGCTCGG GGACAAAGTTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 98)
	DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISEYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQ SISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 99)
22E2vk	GACATTGTGATGACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGA TAGAGTCTCTCTCTCCTGCAGGGCCAGCCAGAGTATTAGCGTCTACTTAC ACTGGTATCAACAAAAATCACCTGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAATAT GCTTCCCAATCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATC AGGGTCAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAACCTGAAGATGTTG GAGTTTATTACTGTCAAAATGGTCACAGCTTTCCATTCACGTTCGGCTCGG GGACAAAGTTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 100)
	DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISVYLHWYQQKSPESPRLLIKYASQ SISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 101)
24A54vk	GACATTGTGATGACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAAA TAGAGTCTCTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAGAGTATTAGCGACTACTTAC ACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAATAT GCTTCCCAATCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATC AGGGTCAAATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAACCTGAAGATGTTG GAGTGTATTATTGTCAAAATGGTCACAGCTTTCCATTCACGTTCGGCTCGG GGACAAAGTTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 102)
	DIVMTQSPATLSVTPGNRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQ SISGIPSRFSGSGSGSNFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 103)
26F7Vk	GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTTTCTCTGGGGCAG AGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGATTCTCTGACTA TTTTTATATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCC TCATCTACCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGA GGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGAACAGTAGGGAGCTTCCGTACA CGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATAAAA (SEQ ID NO: 104)

- 14 042716

	DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVRFSDYFYMHWYQQKPGQPPKLLI YLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQNSRELPYTFGG GTKLEIK (SEQ ID NO: 105)
27G8vk	GACATTGTGTTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAG AGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTA TAGTTATATACACTGGTACCAACAGAAACCGGGACAGCCACCCAAATTCC TCATCTATCTTGCATCCAACCTAGATTCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTG GCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAG GAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGCTTCCGTACAC GTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 106)
	DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYIHWYQQKPGQPPKFLIY LASNLDSGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPYTFGGG TKLEIK (SEQ ID NO: 107)
31H9vk	GACATTGTGATGACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGA TAGAGTCTCTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAGAGTATTAGCGACTACTTAC ACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAATAT GCTTCCCAATCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATC AGGGTCAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAACCTGAAGATGTTG GAGTGTATTACTGTCAAAATGGTCACAGCTTTCCGTACACGTTCGGAGGG GGGACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 108)
	DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQ SISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 109)
34G3Vk	GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGAT CAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGG AAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGC TCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCCGACAGGTTCA GTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGA GGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGT ACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAT (SEQ ID NO: 110)
	DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLL IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGG GTKLEIN (SEQ ID NO: 111)
34D9Vk	GACATTATGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGA CAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGGGTAATGCTGTGG TCTGGTATCAACAAAAACCAGGGCAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGG GCATCCACCCGGCACATTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATC TGGGACAGATTTCACTCTCACCATTACCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGG CAGATTATTTCTGTCAGCAATATAGCAGCTATCTCACGTTCGGTGCTGGG ACCAAGCTGGAGCTGAAA (SEQ ID NO: 112)
	DIMMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGNAVVWYQQKPGQSPKLLIYW ASTRHIGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCQQYSSYLTFGAGTKL ELK (SEQ ID NO: 113)
43F5vk	GATGTTGTGATGACCCAATCTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGAT CAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGG AAACACCTATCTACATTGGTACCTGCTGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGC TCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGG AGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCG TACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 114)
	DVVMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLLKPGQSPKLLI YKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGG GTKLEIK (SEQ ID NO: 115)

- 15 042716

73H10Vk	GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGTTTTCCTGTCTGCATCTGTGGGAGA AACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTGACAGTTATTTAG CATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTTTGCT GCACGAAACTTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATC AGGCACACAGTATTCTCTCAAGATCAACAGAATGCAGTCTGAAGATGTTG CGAGATACTACTGTCAACATTATTATAGTACTCCATTCACGTTCGGCTCGG GGACAAAGTTGGAAATAGAA (SEQ ID NO: 116)
	DIQMTQSPVFLSASVGETVTITCRASENIDSYLAWYQQKQGKSPQLLVFAARNLAD GVPSRFSGSGSGTQYSLKINRMQSEDVARYYCQHYYSTPFTFGSGTKLEIE (SEQIDNO: 117)
74H3Vk	GACATCCAGATGACTCAGTCGCCAGCTTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGAAACT GTCATCTTCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTGACAGTTATTTAGCATGGTAT CAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATGCTGCAACAAACTT AGCAGATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTATT CTCTCAAGATCAACAGCCTGCAGTCTGAAGATGTTGCGAGATATTACTGTCTAC ATTATTATAGTACTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAGAGTTGGAAATAAAA (SEQIDNO: 118)
	DIQMTQSPASLSASVGETVIFTCRASENIDSYLAWYQQKQGKSPQLLVYAATNLAD GVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDVARYYCLHYYSTPFTFGSGTELEIK (SEQIDNO: 119)

Таблица 2

Мышиные лидерные антитела к IL-23p19 -последовательности VH

2Dlvh	CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAG CCTGTCCATCACATGCACTGTCTCTGGGTTCTCATTAACCACCTATGCTATA AGCTGGGTTCGCCAGTCACCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTTGGAGTCAT ATGGACTGGTGGAGGCACAAAATATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGA GCATCAGCAAAGACAACTCCAAGAGTCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGT CTGCAAACTGATGACACAGCCAGGTACTACTGTGCCAGAAAGGACTATAA TTACGGGGGTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTC CTCA (SEQ ID NO: 120)
	QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTTYAISWVRQSPGKGLEWLGVIWT GGGTKYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARKDYNYGG AMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 121)
6B8VH	CAGGTTCAGCTGCAACAGTCTGACGCTGAGTTGGTGAAACCTGGCACTTCA GTGAAGACATCCTGCAAAATTTCTGGCAACACCTTCACTGACCAAACTATT CACTGGATGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAATGGATTGGATATAT TTATCCTAGAGATGATAGTCCTAAGTACAATGAGAACTTCAAGGGCAAGG CCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAAC AGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAATCCCAGACAGG TCAGGCTACGCCTGGTTTATTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTC TCTTCA (SEQ ID NO: 122)
	QVQLQQSDAELVKPGTSVKTSCKISGNTFTDQTIHWMKQRPEQGLEWIGYIYP RDD SPKYNENFKGKATLT ADKS S ST AYMQLNSLTSED S AVYFC AIPDRSGY A WFIYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 123)
9D12VH	CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGTCCTGGTGGCGCCCTCACAGAG CCTGTCCATCACATGCACTGTCTCTGGGTTCTCATTAAACAACTTTGCTATA AGTTGGGTTCGTCAGCCACCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTTGGAGCAAT ATGGACTGGTGGAGGCACAAATTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGA GCATCAGCAAAGACAACTCCAAGAGTCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGT CTGCAAACTGATGACACAGCCAGGTATTATTGTGTCAGAAAGGACTATAG TTACGGGGGTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTC CTCA (SEQ ID NO: 124)

- 16 042716

	QVQLKESGPVLVAPSQSLSITCTVSGFSLNNFAISWVRQPPGKGLEWLGAIWTGGGT NYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCVRKDYSYGGAMDYWGQ GTSVTVSS (SEQ ID NO: 125)
15Cllvh	GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGTGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTC AGTGAAGATGTCCTGTAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACTATAT GAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGTTA TTATTCCTTACAACGGTGGTACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAG GCCACATTGACTGTTGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAAC AGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCACGAGATGGTCAC CGCTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 126)
	EVQLQQSGPVLVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGVI IPYNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCARDGHR WYFDVWGTGTTVTVSS (SEQ ID NO: 127)
15Flvh	EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTCCIMHWVKQKPGQGLEWIGYI NP YND GTKYNEKFKGK ATLT SDKS S ST AYMEL S SLT SED S A VYY C ARRWDE AYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 128)
18D3vh	GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTCAAGCCTGGGGCTTA GTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTCGCTATCTTATT CACTGGGTGAAACAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATAT TAATCCTTACAATGATGGTACTAAATACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGG CCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGC AGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACCTCTAACTGGGAC CTCGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 129)
	EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTRYLIHWVKQKPGQGLEWIGYIN PYND GTKYNEKFKGK ATLT SDKS S ST AYMEL S SLTSED S AVYYCTSNWDLD Y WGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 130)
18C4vh	GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAAGTGGTAAAGCCTGGGGCTTC AGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCTCTGGATACACATTCACTAGTTCTGTTAT ACACTGGGTGAAGCAGAAGGCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATA TCAATCCCTATAATGATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAG GCCACACTGACTTCAGACAGATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAG CAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGACGGTTGGA CGAGGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 131)
	EVQLQQSGPEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSSVIHWVKQKAGQGLEWIGYIN PYNDGTKYNEKFKGKATLTSDRSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCTRRLDEAY WGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 132)
18E5vh	GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTGC AGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTCGCTATCTTAT TCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATA TTAATCCTTACAATGATGGTACTAAATATAATGAGAAGTTCAAAGGCAAG GCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAG CAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACCTCTAATTGGGA CCTCGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 133)
	EVQLQQSGPELVKPGAAVKMSCKASGYTFTRYLIHWVKQKPGQGLEWIGYIN PYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCTSNWDLDY WGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 134)

- 17 042716

20E8vh	GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTAAAGCCTGGGGCTTC AGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCTCTGGATACACATTCACTAGTTCTGTTAT GCACTGGGTGAAGCAGAAGGCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATA TCAATCCCTATAATGATGGTACTCAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAG GCCACACTGACTTCAGACAAATTTTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGC AGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGACGGTTGGAC GAGGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 135)
	EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSSVMHWVKQKAGQGLEWIGYI NP YND GTQ YNEKFKGK ATLT SDKF S S T AYMEL S SLT SED S A VY YCTRRLDE A YWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 136)
22E2vh	GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTC AGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTCTATTAT TCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATA TTAATCCTTACGATGATGTTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAG GCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAG CAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGACGGTGGGA CGAGTCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 137)
	EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSSIIHWVKQRPGQGLEWIGYINP YDDVTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARRWDESY WGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 138)
24A5vh	GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTC AGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACTTTCACTACCTCTATTAT GCACTGGGTGAAACAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATA TTAATCCTTACGATGATGTTACTAAGTACAATGAAAAGTTCAAAGGCAAG GCCACATTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAG CAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGTAAGACGGTGGGA CGAGGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 139)
	EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTTSIMHWVKQKPGQGLEWIGYIN PYDDVTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCVRRWDEA YWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 140)
26F7VH	GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTC AGTGAAGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACACGTTTACTGACTACTACAT GAACTGGGTGAGGCAGAGCCATGGAGAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATT TTAATCATAACAATGATGTTATTACTTACAACCCGAAGTTCAAGGGCAAGG TCACATTGACTGTAGAGAAGTCTTCCACCACAGCCTACATGGAGCTCCGCA GCCTGTCATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGGGGGCTACGAG GCTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCT CA (SEQ ID NO: 141)
	EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVRQSHGESLEWIGDFN HNND VITYNPKFKGKVTLT VEKS STT AYMELRSL SSED S AVY YCARGLRGYY AMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 142)
27G8vh	CAGGTTCAGCTGCAACAGTCTGACGCTGAGTTGGTGAAACCTGGAGCTTC AGTGAAGATATCCTGCAAGGTTTCTGGCTACACCTTCACTGACCATACTAT TCACTGGATGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAATGGATTGGATATA TTTATCCTAGAGATGGTTATCCTAAGTTCAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGG CCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAAC AGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGACGGCCCCCT TACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCGCCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 143)
	QVQLQQSDAELVKPGASVKISCKVSGYTFTDHTIHWMKQRPEQGLEWIGYIY PRDGYPKFNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCARRPPYYA MDYWGQGTSVAVSS (SEQ ID NO: 144)

- 18 042716

31H9vh	GAGGTCCAACTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTC AGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGGTATCTTAT GCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGTTATA TTAATCCTTACAATGATGGTACTAATTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAG GCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAG CAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTTCCCTTAACTGGGA CTATGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 145)
	EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTRYLMHWVKQKPGQGLEWIGYI NP YND GTNYNEKFKGK ATLT SDKS S ST AYMEL S SLT SED S A VYYC SLN WD Y A YWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 146)
34G3VH	GAGTTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGCGCTTC AGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGACTACAACAT GAACTGGGTGAAGCAGAGCAAAGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGTA ATTATTCCTAACTATGGTTTTACTAGCTACAATCAGAACTTCAAGGGCAAG GCCACTTTGACTGTAGACCAGTCTTCCAGCACAGCCCACATGCAGCTCAAC AGTGTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGTAAGAGATGGGGG AATACTCCTCTGGTATCTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGT CTCCTCA (SEQ ID NO: 147)
	EFQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYNMNWVKQSKGKSLEWIGVIIP NYGFTSYNQNFKGKATLTVDQSSSTAHMQLNSVTSEDSAVYYCVRDGGILL WYLDVWGTGTTVTVSS (SEQ ID NO: 148)
34D9VH7	GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTC AGTGAAGATACCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACAACAT GGACTGGGTGAAGAAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATA TCAATCCTCACAATGGTGGTACTATCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAG GCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCCACATGGAGCTCCG CAGCCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAAATTACTA CGGTAGTAGTTACGGCTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGG TCACCGTCTCGTCA (SEQ ID NO: 149)
	EVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKKSHGKSLEWIGDIN PHNGGTIYNQKFKGKATLTVDKSSSTAHMELRSLTSEDTAVYYCARNYYGSS YGWYFDVWGTGTTVTVSS (SEQ ID NO: 150)
43F5vh	GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTC AGTGAAGATTTCCTGCAGGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACTACAT GAACTGGGTGAAGCAAAGTCCTGAAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGAGA TTATTCCTACCACTGGTGGTACTTCCTACAACCAGAAGTTCAAGGCCAAGG CCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAAG AGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGAGAGCGG TGGGTTCTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGT CTCCTCA (SEQ ID NO: 151)
	EVQLQQSGPELVKPGASVKISCRASGYSFTGYYMNWVKQSPEKSLEWIGEIIP TTGGTSYNQKFKAKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCARESGGFY WYFDVWGTGTTVTVSS (SEQ ID NO: 152)
73H10VH	GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTC AGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGGTATGTTAT GCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATA TTAATCCTTACAATGATGTTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAG GCCACACTGACTTCAGACAGATCCTCCAGCACAGCCTACATGAAACTCAG CAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGAAACTGGGA CGTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGATCACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 153)
	EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTRYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPY NDVTKYNEKFKGKATLTSDRSSSTAYMKLSSLTSEDSAVYYCARNWDVPYWGQG TLITVSA (SEQ ID NO: 154)
74H3VH	GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTG AAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGGTATCTTATGCACTGG GTGAAGCAGAAGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTAC AATGATGGTACTAAGTACAATGAGAGGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTC AGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGA CTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAAACTGGGACGTACCTTACTGGGGCCAAGG GACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 155)
	EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTRYLMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYN DGTKYNERFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARNWDVPYWGQGTL VTVSA (SEQ ID NO: 156)

- 19 042716

Последовательности человеческих каркасных участков отбирали для каждого мышиного лидерного антитела на основе гомологии каркасных участков, структуры CDR, консервативных канонических остатков, консервативных остатков, образующих поверхность раздела, и других параметров.

CDR мышиных тяжелых цепей и легких цепей различных мышиных антител представлены в табл. 3 и табл.4 соответственно. В табл. 4 представлены также три CDR тяжелых цепей, выведенные из мышиного антитела 6В8 при осуществлении процесса гуманизации.

Таблица 3

Последовательности CDR легких цепей

	L-CDR1	L-CDR2	L-CDR3
18С4	RASQSISEYLH (SEQ ID NO: 1)	YASQSIS (SEQ ID NO: 2)	QNGHSFPFT (SEQ ID NO: 3)
18Е5	RASQSISDYLY (SEQ ID NO: 4)	FASQSIS (SEQ ID NO: 5)	QNGHSFPFT (SEQ ID NO: 3)
18D3	RASQSISDYLY (SEQ ID NO: 4)	FASQSIS (SEQ ID NO: 5)	QNGHSFPFT (SEQ ID NO: 3)
20Е8	RASQSISEYLH (SEQ ID NO: 1)	YASQSIS (SEQ ID NO: 2)	QNGHSFPFT (SEQ ID NO: 3)
22Е2	RASQSISVYLH (SEQ ID NO: 6)	YASQSIS (SEQ ID NO: 2)	QNGHSFPFT (SEQ ID NO: 3)
24А5	RASQSISDYLH (SEQ ID NO: 7)	YASQSIS (SEQ ID NO: 2)	QNGHSFPFT (SEQ ID NO: 3)
15С11	RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 8)	KVSNRFS (SEQ ID NO: 9)	SQSTHVPYT (SEQ ID NO: 10)
43F5	RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 8)	KVSNRFS (SEQ ID NO: 9)	SQSTHVPYT (SEQ ID NO: 10)
27G8	RASKSVSTSGYSYIH (SEQ ID NO: 11)	LASNLDS (SEQ ID NO: 12)	QHSRELPYT (SEQ ID NO: 13)
31Н9	RASQSISDYLH (SEQ ID NO: 7)	YASQSIS (SEQ ID NO: 2)	QNGHSFPYT (SEQ ID NO: 14)
2D1	RTSESVYSYGQNFIH (SEQ ID NO: 15)	RASNLES (SEQ ID NO: 16)	QQTNEDPYT (SEQ ID NO: 17)
9D12	RASETINFYGTSFMH (SEQ ID NO: 18)	RASNLES (SEQ ID NO: 16)	QQTNEDPYT (SEQ ID NO: 17)
6В8	KASRDVAIAVA (SEQ ID NO: 19)	WASTRHT (SEQ ID NO: 20)	HQYSSYPFT (SEQ ID NO: 21)

73H10	RASENIDSYLA (SEQ ID NO: 22)	AARNLAD (SEQ ID NO: 23)	QHYYSTPFT (SEQ ID NO: 24)
74H3	RASENIDSYLA (SEQ ID NO: 22)	AATNLAD (SEQ ID NO: 25)	LHYYSTPFT (SEQ ID NO: 26)
35H8	RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 8)	KVSNRFS (SEQ ID NO: 9)	SQSTHVPYT (SEQ ID NO: 10)
26F7	RASKSVRFSDYFYMH (SEQ ID NO: 27)	LASNLES (SEQ ID NO: 28)	QNSRELPYT (SEQ ID NO: 29)
34G3	RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO:8)	KVSNRFS (SEQ ID NO: 9)	SQSTHVPYT (SEQ ID NO: 10)
34D9	KASQDVGNAVV (SEQ ID NO:30)	WASTRHI (SEQ ID NO: 31)	QQYSSYLT (SEQ ID NO: 32)

- 20 042716

Таблица 4

Последовательности CDR тяжелых цепей

	H-CDR1	H-CDR2	H-CDR3
18С4	GYTFTSSVIH (SEQ ID NO: 33)	YINP YND GTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 34)	RLDEAY (SEQ ID NO: 35)
18Е5	GYTFTRYLIH (SEQ ID NO: 36)	YINP YND GTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 34)	NWDLDY (SEQ ID NO: 37)
18D3	GYTFTRYLIH (SEQ ID NO: 36)	YINP YND GTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 34)	NWDLDY (SEQ ID NO: 37)
20Е8	GYTFTSSVMH (SEQ ID NO: 38)	YINP YND GTQ YNEKFKG (SEQ ID NO: 39)	RLDEAY (SEQ ID NO: 35)
22Е2	GYTFTSSIIH (SEQ ID NO: 40)	YINPYDDVTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 41)	RWDESY (SEQ ID NO: 42)
24А5	GYTFTTSIMH (SEQ ID NO: 43)	YINPYDDVTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 41)	RWDEAY (SEQ ID NO: 44)
15С11	GYTFTDYYMN (SEQ ID NO: 45)	VIIPYNGGTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 46)	DGHRWYFDV (SEQ ID NO: 47)
43F5	GYSFTGYYMN (SEQ ID NO: 48)	EIIPTTGGTSYNQKFKA (SEQ ID NO: 49)	ESGGFYWYFDV (SEQ ID NO: 50)
27G8	GYTFTDHTIH (SEQ ID NO: 51)	YI YPRD GYPKFNEKFKG (SEQ ID NO: 52)	RPPYYAMDY (SEQ ID NO: 53)
31Н9	GYTFTRYLMH (SEQ ID NO: 54)	YINP YND GTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 55)	NWDYAY (SEQ ID NO: 56)
2D1	GFSLTTYAIS (SEQ ID NO: 57)	VIWTGGGTKYNSALKS (SEQ ID NO: 58)	KDYNYGGAMDY (SEQ ID NO: 59)
9D12	GFSLNNFAIS (SEQ ID NO: 60)	AIWTGGGTNYNSALKS (SEQ ID NO: 61)	KDYSYGGAMDY (SEQ ID NO: 62)
6В8	GNTFTDQTIH (SEQ ID NO: 63)	YI YPRDD SPKYNENFKG (SEQ ID NO: 64)	PDRSGYAWFIY (SEQ ID NO: 65)
Ни_6В8-2	GYTFTDQTIH (SEQ ID NO: 66)	YI YPRDD SPKYNENFKG (SEQ ID NO: 64)	PDRSGYAWFIY (SEQ ID NO: 65)
Ни_6В8-5	GFTFTDQTIH (SEQ ID NO: 67)	YI YPRDD SPKYNENFKG (SEQ ID NO: 64)	PDRSGYAWFIY (SEQ ID NO: 65)
Ни_6В8-36/65	GGTFTDQTIH (SEQ ID NO: 68)	YI YPRDD SPKYNENFKG (SEQ ID NO: 64)	PDRSGYAWFIY (SEQ ID NO: 65)
73Н10	GYTFTRYVMH (SEQ ID NO: 69)	YINPYNDVTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 70)	NWDVPY (SEQ ID NO: 71)
74НЗ	GYTFTRYLMH (SEQ ID NO: 54)	YINP YND GTKYNERFKG (SEQ ID NO: 72)	NWDVPY (SEQ ID NO: 71)
35Н8	GYTFTDYYMN (SEQ ID NO: 45)	VIIPYNGGISYNQKFKG (SEQ ID NO: 73)	NDYDWYFDV (SEQ ID NO: 74)
26F7	GYTFTDYYMN (SEQ ID NO: 45)	DFNHNNDVITYNPKFKG (SEQ ID NO: 75)	GLRGYYAMDY (SEQ ID NO: 76)
34G3	GYSFTDYNMN (SEQ ID NO: 77)	VIIPNYGFTSYNQNFKG (SEQ ID NO: 78)	DGGILLWYLDV (SEQ ID NO: 79)
34D9	GYTFTDYNMD (SEQ ID NO: 80)	DINPHNGGTIYNQKFKG (SEQ ID NO: 81)	NYYGSSYGWYFDV (SEQ ID NO: 82)

CDR, представленные выше в табл. 3 и 4, определены согласно номенклатуре Хотиа (Al-Lazikani и др., JMB 273, 1997, cc. 927-948).

Fab-фрагменты, для которых обнаружено улучшенное или эквивалентное связывание по сравнению с химерным родительским Fab-фрагментом, отбирали для конверсии в формат IgG. 6B8 превращали в формат IgG1KO. IgG1KO (выключение (knock-out) эффекторных функций) имеет две мутации в Fcобласти, а именно, Leu234Ala и Leu235Ala, которые снижают эффекторную функцию, такую как связывание FcyR и комплемента. IgG-формат описан в литературе (см., например, Hezareh и др., Journal of Virology 75, 2001, cc. 12161-12168). В примере 1 более подробно описан процесс гуманизации. В результате осуществления указанной гуманизации удалось создать последовательности гуманизированных антител. Репрезентативные примеры вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи, которые выведены из мышиного антитела 6В8, представлены в табл. 5 и 6. Сравнительный анализ первичной структуры гуманизированных вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи, которые выведены из мышиного антитела 6В8, и вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи, которые выведены из мышиного антитела 6В8, представлен на фиг. 1.

Отобранные комбинации гуманизированных вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи,

- 21 042716 которые выведены из мышиного антитела 6В8, позволили создать антитела А, В, С и D.

Антитело A: 6B8-IgG1KO-2 с IgK-66 (вариабельная область тяжелой цепи 6B8CVH-02 и вариабельная область легкой цепи 6B8CVK-66).

Антитело В: 6B8-IgG1KO-5 ch IgK-66 (вариабельная область тяжелой цепи 6B8CVH-05 и вариабельная область легкой цепи 6B8CVK-66).

Антитело С: 6B8-IgG1KO-2 с IgK-65 (вариабельная область тяжелой цепи 6B8CVH-02 и вариабельная область легкой цепи 6B8CVK-65).

Антитело D: 6B8-IgG1KO-5 с IgK-65 (вариабельная область тяжелой цепи 6B8CVH-05 и вариабельная область легкой цепи 6B8CVK-65).

Антитела А, В, С и D имеют последовательности тяжелых и легких цепей, которые представлены в табл. 7.

Таблица 5

Гуманизированные последовательности 6B8-VK

6B8CVK-65	Gacatccagatgacccagagcccaagcagcctgagcgccagcgtgggcgaccgcgtgaccatcacctgc aaggccagccgcgacgtggccatcgccgtggcctggtaccagcagaagccaggcaaggtgccaaagctg ctgctgttctgggccagcacccgccacaccggcgtgccagaccgcttcagcggcagcggcagcggcacc gacttcaccctgaccatcagcagcctgcagccagaggacctggccgactactactgccaccagtacagcag ctacccattcaccttcggccagggcaccaagctggagatcaag (SEQ ID NO: 157)
	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLL FWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLADYYCHQYSSYPFT FGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 158)
6B8CVK-66	Gacatccagatgacccagagcccaagcagcctgagcgccagcgtgggcgaccgcgtgaccatcacctgc aaggccagccgcgacgtggccatcgccgtggcctggtaccagcagaagccaggcaaggtgccaaagctg ctgatctactgggccagcacccgccacaccggcgtgccaagccgcttcagcggcagcggcagccgcacc gacttcaccctgaccatcagcagcctgcagccagaggacgtggccgactacttctgccaccagtacagcag ctacccattcaccttcggcagcggcaccaagctggagatcaag (SEQ ID NO: 159)
	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLI YWASTRHTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFT FGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 160)
6B8CVK-67	Gacatccagatgacccagagcccaagcagcctgagcgccagcgtgggcgaccgcgtgaccatcacctgc aaggccagccgcgacgtggccatcgccgtggcctggtaccagcagaagccaggcaaggtgccaaagctg ctgctgtactgggccagcacccgccacaccggcgtgccaagccgcttcagcggcagcggcagccgcacc gacttcaccctgaccatcagcagcctgcagccagaggacgtggccacctactactgccaccagtacagcag ctacccattcaccttcggcagcggcaccaagctggagatcaag (SEQ ID NO: 161)
	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLL YWASTRHTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVATYYCHQYSSYPFT FGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 162)
6B8CVK-78	Gacatccagatgacccagagcccaagcagcctgagcgccagcgtgggcgaccgcgtgaccatcacctgc aaggccagccgcgacgtggccatcgccgtggcctggtaccagcagaagccaggcaaggtgccaaagctg ctgctgttctgggccagcacccgccacaccggcgtgccagaccgcttcagcggcagcggcagccgcacc gacttcaccctgaccatcagcagcctgcagccagaggacctggccgactactactgccaccagtacagcag ctacccattcaccttcggcagcggcaccaagctggagatcaag (SEQ ID NO: 163)
	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLL FWASTRHTGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDLADYYCHQYSSYPFT FGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 164)

Таблица 6

Гуманизированные последовательности 6B8-VH

6B8CVH-02	Caggtgcagctggtgcagagcggcgccgaggtgaagaagccaggcagcagcgtgaaggtgagctgcaa ggccagcggctacaccttcaccgaccagaccatccactggatgcgccaggccccaggccagggcctgga gtggatcggctacatctacccacgcgacgacagcccaaagtacaacgagaacttcaagggcaaggtcacc atcaccgccgacaagagcaccagcaccgcctacatggagctgagcagcctgcgcagcgaggacaccgcc gtgtactactgcgccatcccagaccgcagcggctacgcctggttcatctactggggccagggcaccctggt gaccgtgagcagc (SEQ ID NO: 165)
	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLE WIGYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVY YCAIPDRSGYAWFIYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 166)
6B8CVH-05	Caggtgcagctggtgcagagcggcgccgaggtgaagaagccaggcagcagcgtgaaggtgagctgcaa ggccagcggcttcaccttcaccgaccagaccatccactgggtgcgccaggccccaggccagggcctgga gtggatgggctacatctacccacgcgacgacagcccaaagtacaacgagaacttcaagggcaaggtcacc ctgaccgccgacaagagcaccagcaccgcctacatggagctgagcagcctgcgcagcgaggacaccgcc gtgtactactgcgccatcccagaccgcagcggctacgcctggttcatctactggggccagggcaccctggt gaccgtgagcagc (SEQ ID NO: 167)

- 22 042716

	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTDQTIHWVRQAPGQGLEW MGYIYPRDDSPKYNENFKGKVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYY CAIPDRSGYAWFIYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 168)
6B8CVH-36	Caggtgcagctggtgcagagcggcgccgaggtgaagaagccaggcagcagcgtgaagaccagctgcaa ggccagcggcggcaccttcaccgaccagaccatccactgggtgcgccagcgcccaggccagggcctgga gtggatgggctacatctacccacgcgacgacagcccaaagtacaacgagaacttcaagggccgcgtcacc atcaccgccgacaagagcaccagcaccgcctacatggagctgagcagcctgcgcagcgaggacaccgcc gtgtactactgcgccatcccagaccgcagcggctacgcctggttcatctactggggccagggcaccctggt gaccgtgagcagc (SEQ ID NO: 169)
	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKTSCKASGGTFTDQTIHWVRQRPGQGLEW MGYIYPRDDSPKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYY CAIPDRSGYAWFIYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 170)
6B8CVH-65	Caggtgcagctggtgcagagcggcgccgaggtgaagaagccaggcagcagcgtgaaggtgagctgcaa ggccagcggcggcaccttcaccgaccagaccatccactgggtgcgccaggccccaggccagggcctgga gtggatgggctacatctacccacgcgacgacagcccaaagtacaacgagaatttcaagggccgcgtcaccc tgaccgccgacaagagcaccagcaccgcctacatggagctgagcagcctgcgcagcgaggacaccgcc gtgtacttctgcgcccgcccagaccgcagcggctacgcctggttcatctactggggccagggcaccctggt gaccgtgagcagc (SEQ ID NO: 171)
	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFTDQTIHWVRQAPGQGLEW MGYIYPRDDSPKYNENFKGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYF CARPDRSGYAWFIYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 172)

Таблица 7

Последовательности ДНК и аминокислотные последовательности тяжелых и легких цепей антител А, В, С и D

Антитело A	IgK, легкая цепь № 66	Gacatccagatgacccagagcccaagcagcctgagcgccagcgtgggcgaccgc
gtgaccatcacctgcaaggccagccgcgacgtggccatcgccgtggcctggtacca
gcagaagccaggcaaggtgccaaagctgctgatctactgggccagcacccgccaca
ccggcgtgccaagccgcttcagcggcagcggcagccgcaccgacttcaccctgacc
atcagcagcctgcagccagaggacgtggccgactacttctgccaccagtacagcag
ctacccattcaccttcggcagcggcaccaagctggagatcaagcgtactgtggctgc
accatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgtt gtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggata acgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggac agcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaaca caaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaaga gcttcaacaggggagagtgt (SEQ ID NO: 173)
		DIOMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYOO
KPGKVPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSL
QPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIF
PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 174)
	IgGl KO, тяжелая цепь № 2	Caggtgcagctggtgcagagcggcgccgaggtgaagaagccaggcagcagcgtg
aaggtgagctgcaaggccagcggctacaccttcaccgaccagaccatccactggat
gcgccaggccccaggccagggcctggagtggatcggctacatctacccacgc gac
gacagcccaaagtacaacgagaacttcaagggcaaggtcaccatcaccgccgacaa
gagcaccagcaccgcctacatggagctgagcagcctgcgcagcgaggacaccgcc
gtgtactactgcgccatcccagaccgcagcggctacgcctggttcatctactggggcc
agggcaccctggtgaccgtgagcagcgcctccaccaagggcccatcggtcttcccc ctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggt caaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgacca gcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcag cgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaa tcacaagcccagcaacaccaaggtcgacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaa aactcacacatgcccaccgtgcccagcaccagaagctgctgggggaccgtcagtctt

- 23 042716

		cctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcaca tgcgtcgtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtg gacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggca aggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacc atctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatc ccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttct atcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaacta caagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctc accgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcat gaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggt (SEQ ID NO: 175)
		OVOLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWM
ROAPGOGLEWIGYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKST
STAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSGYAWFIYWGOGT
LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GN VF S CS VMHE ALHNH YTQK SL SL SPG (SEQ ID NO: 176)
Антитело В	IgK, легкая цепь № 66	(SEQ ID NO: 173)
		(SEQ ID NO: 174)
	IgGlKO, тяжелая цепь № 5	caggtgcagctggtgcagagcggcgccgaggtgaagaagccaggcagcagcgtg
aaggtgagctgcaaggccagcggcttcaccttcaccgaccagaccatccactgggtg
cgccaggccccaggccagggcctggagtggatgggctacatctacccacgcgacg
acagcccaaagtacaacgagaacttcaagggcaaggtcaccctgaccgccgacaag
agcaccagcaccgcctacatggagctgagcagcctgcgcagcgaggacaccgccg
tgtactactgcgccatcccagaccgcagcggctacgcctggttcatctactggggcca
gggcaccctggtgaccgtgagcagcgcctccaccaagggcccatcggtcttccccct ggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtca aggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagc ggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcg tggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatca caagcccagcaacaccaaggtcgacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaa ctcacacatgcccaccgtgcccagcaccagaagctgctgggggaccgtcagtcttcc tcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatg cgtcgtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtgga cggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagc acgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaag gagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatc tccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccg ggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcc cagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaag accacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgt ggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgagg ctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggt (SEQ ID NO: 177)

- 24 042716

		О VOL VO S GAE VKKPGS S VK V S СК AS GFTFTDOTIH W VR
QAPGOGLEWMGYIYPRDDSPKYNENFKGKVTLTADKS
TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSGYAWFIYWGOG
TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEP VT VS WNS G ALT S G VHTFP A VLQ S S GL Y SL S S V VT V PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 178)
Антитело С	IgK, легкая цепь № 65	Gacatccagatgacccagagcccaagcagcctgagcgccagcgtgggcgaccgc
gtgaccatcacctgcaaggccagccgcgacgtggccatcgccgtggcctggtacca
gcagaagccaggcaaggtgccaaagctgctgctgttctgggccagcacccgccaca
ccggcgtgccagaccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgac
catcagcagcctgcagccagaggacctggccgactactactgccaccagtacagca
gctacccattcaccttcggccagggcaccaagctggagatcaagcgtactgtggctg
caccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgt tgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggat aacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaagga cagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaac acaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaaga gcttcaacaggggagagtgt (SEQ ID NO: 179)
		DIOMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYOO
KPGKVPKLLLFWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISS
LQPEDLADYYCHQYSSYPFTFGOGTKLEIKRTVAAPSVF IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 180)
	IgGlKO, тяжелая цепь № 2	(SEQ ID NO: 175)
		(SEQ ID NO: 176)
Антитело D	IgK, легкая цепь № 65	(SEQ ID NO: 179)
		(SEQ ID NO: 180)
	IgGlKO, тяжелая цепь № 5	(SEQ ID NO: 177)
		(SEQ ID NO: 178)

В приведенной выше табл.7 подчеркнуты вариабельные области легких цепей и тяжелых цепей антител А, В, С и D.

Согласно одному из вариантов гуманизированное антитело к IL-23p19 может обладать по меньшей мере одним из указанных ниже свойств. Согласно другому варианту гуманизированное антитело к IL23p19 может обладать любой комбинацией по меньшей мере двух или по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 из указанных ниже свойств. Согласно другому варианту гуманизированное антитело к IL23p19 может обладать всеми указанными ниже свойствами.

KD в отношении человеческого IL-23 составляет <1пМ (отсутствует сдвиг скорости ассоциации в 50%-ной человеческой сыворотке).

Блокирует связывание IL-23 с человеческим IL-23R/Fc in vitro.

- 25 042716

Не связывается с человеческим IL-12.

Ингибирует индуцируемое человеческим IL-23 производство IL-17 в мышиных спленоцитах, что характеризуется 1С₅₀<20пМ.

Ингибирует индуцируемое человеческим IL-23 фосфорилирование STAT3 в человеческих DBклетках, что характеризуется 1С₅₀<40пМ.

Не прогнозируется наличие ADCC/CDC-активности.

K_D<1пМ в отношении IL-23 обезьян циномолгус.

Отсутствует перекрестная реактивность с мышиным или крысиным IL-23.

Ингибирует индуцируемое человеческим IL-23 производство IL-17 и IL-22 в мышином ухе (>80%-ное ингибирование обоих цитокинов при концентрации 1 мг/кг).

Стабильность до температуры 83°С (температура плавления 83°С по данным измерений с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии).

Растворимость >100 мг/мл (по данным измерений с помощью УФ-спектроскопии и мониторинга мутности).

При подкожном введении в дозе 1,0 мг/кг трем обезьянам циномолгус имеет место длительная (>10нМ) экспозиция в течение примерно 28 дней при биологической доступности примерно 70%.

Под понятием не прогнозируется наличие ADCC/CDC-активности в контексте настоящего описания подразумевается, что гуманизированное антитело к IL-23p19 обладает пониженной аффинностью к Fc-рецептору и следовательно у него прогнозируется отсутствие ADCC/CDC-активности.

Согласно одному из вариантов гуманизированное антитело к IL-23p19 может обладать по меньшей мере одним из указанных ниже свойств. Согласно другому варианту гуманизированное антитело к IL23р19 может обладать любой комбинацией по меньшей мере двух или по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 указанных ниже свойств. Согласно другому объекту варианту гуманизированное антитело к IL23p19 может обладать всеми указанными ниже свойствами.

K_D в отношении человеческого IL-23 составляет <1пМ (отсутствует сдвиг скорости ассоциации в 50%-ной человеческой сыворотке).

Блокирует связывание IL-23 с человеческим IL-23R/Fc in vitro.

Не связывается с человеческим IL-12.

Ингибирует индуцируемое человеческим IL-23 производство IL-17 в мышиных спленоцитах, что характеризуется 1С₅₀<20пМ.

Ингибирует индуцируемое человеческим IL-23 фосфорилирование STAT3 в человеческих DBклетках, что характеризуется 1С₅₀<40пМ.

Не прогнозируется наличие ADCC/CDC-активности. K_D<1пМ в отношении IL-23 обезьян циномолгус.

Отсутствует перекрестная реактивность с мышиным или крысиным IL-23.

Ингибирует индуцируемое человеческим IL-23 производство IL-17 и IL-22 в мышином ухе (>80%ное ингибирование обоих цитокинов при концентрации 1 мг/кг).

Стабильность до температуры 83°С (температура плавления 83°С по данным измерений с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии).

Растворимость >100 мг/мл (по данным измерений с помощью УФ-спектроскопии и мониторинга мутности).

Согласно другому варианту гуманизированное антитело может обладать по меньшей мере одной из указанных ниже особенностей связывания (свойства А). Или гуманизированное антитело к IL-23p19 может обладать любой комбинацией по меньшей мере двух или по меньшей мере трех указанных ниже свойств. Или гуманизированное антитело к IL-23p19 может обладать всеми указанными ниже свойствами.

KD в отношении человеческого IL-23 составляет <1пМ (отсутствует сдвиг скорости ассоциации в 50%-ной человеческой сыворотке).

Не связывается с человеческим IL-12.

K_D<1пМ в отношении IL-23 обезьян циномолгус.

Отсутствует перекрестная реактивность с мышиным или крысиным IL-23. В частности, гуманизированное антитело характеризуется KD в отношении человеческого IL-23, составляющей <1пМ (отсутствует сдвиг скорости ассоциации в 50%-ной человеческой сыворотке), и не связывается с человеческим IL-12.

Согласно другому варианту гуманизированное антителоможет обладать по меньшей мере одним из указанных ниже функциональных свойств (свойства Б). Или гуманизированное антитело к IL-23p19 может обладать любой комбинацией по меньшей мере двух или по меньшей мере трех из указанных ниже свойств. Или гуманизированное антитело к IL-23p19 может обладать всеми указанными ниже свойствами.

Блокирует связывание IL-23 с человеческим IL-23R/Fc in vitro.

Ингибирует индуцируемое человеческим IL-23 производство IL-17 в мышиных спленоцитах, что характеризуется 1С₅₀<20пМ.

- 26 042716

Ингибирует индуцируемое человеческим IL-23 фосфорилирование STAT3 в человеческих DBклетках, что характеризуется 1С₅₀<40пМ.

Ингибирует индуцируемое человеческим IL-23 производство IL-17 и IL-22 в мышином ухе (>80%ное ингибирование обоих цитокинов при концентрации 1 мг/кг).

Согласно другому варианту гуманизированное антитело обладать по меньшей мере одним из указанных ниже свойств (свойства В). Согласно другому варианту гуманизированное антитело к IL-23p19 можно характеризовать любой комбинацией по меньшей мере двух или по меньшей мере трех из указанных ниже свойств. Согласно другому варианту гуманизированное антитело к IL-23p19 может обладать всеми указанными ниже свойствами.

Не прогнозируется наличие ADCC/CDC-активности.

Стабильность до температуры 83°С (температура плавления 83°С по данным измерений с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии).

Растворимость >100 мг/мл (по данным измерений с помощью УФ-спектроскопии и мониторинга мутности).

При подкожном введении в дозе 1,0 мг/кг трем обезьянам циномолгус имеет место длительная (>10нМ) экспозиция в течение примерно 28 дней при биологической доступности примерно 70%.

Согласно другому варианту гуманизированное антитело может обладать по меньшей мере одним из указанных ниже свойств (свойства В). Согласно другому варианту гуманизированное антитело к IL23p19 может обладать любой комбинацией по меньшей мере двух из указанных ниже свойств. Согласно другому варианту гуманизированное антитело к IL-23p19 может обладать всеми указанными ниже свойствами.

Не прогнозируется наличие ADCC/CDC-активности.

Стабильность до температуры 83°С (температура плавления 83°С по данным измерений с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии).

Растворимость >100 мг/мл (по данным измерений с помощью УФ-спектроскопии и мониторинга мутности).

Согласно другому варианту гуманизированное антитело может обладать по меньшей мере одним свойством А, по меньшей мере одним свойством Б и по меньшей мере одним свойством В. Согласно другому варианту гуманизированное антитело к IL-23p19 может обладать любой комбинацией по меньшей мере двух или по меньшей мере трех свойств А, Б и В.

Согласно другому варианту гуманизированное антитело может обладать блокирующей активностью, при этом оно снижает связывание IL-23 с рецептором IL-23 по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95%. Способность антитела блокировать связывание IL-23 с рецептором IL-23 можно оценивать с помощью анализов связывания в конкурентных условиях, известных в данной области. Альтернативно этому блокирующую активность антитела можно измерять путем оценки биологических действий IL-23, таких как производство IL-17 и IL-22, для определения того, ингибируется ли опосредуемая рецептором IL-23 передача сигналов.

Другим вариантом может быть гуманизированное антитело к IL-23p19, которое обладает благоприятными биофизическими свойствами. Согласно одному из вариантов гуманизированное антитело к IL23p19 присутствует в буфере по меньшей мере на 90% в мономерной форме или по меньшей мере на 92% в мономерной форме, или по меньшей мере на 95% в мономерной форме.

Согласно другому варианту гуманизированное антитело к IL-23p19 может сохраняться в буфере по меньшей мере на 90% в мономерной форме или по меньшей мере на 92% в мономерной форме, или по меньшей мере на 95% в мономерной форме в течение 1 месяца или в течение 4 месяцев.

Согласно одному из вариантов гуманизированное антитело может представлять собой антитело А, антитело В, антитело С или антитело D. Таким образом, гуманизированное антитело может содержать последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 174 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 176 (антитело А). Согласно другому варианту гуманизированное антитело может содержать последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 174 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 178 (антитело В). Согласно другому варианту гуманизированное антитело может содержать последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 180 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 176 (антитело С). Согласно другому варианту гуманизированное антитело содержит последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 180 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 178 (антитело D).

Согласно другому варианту гуманизированное антитело может состоять из последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 174 и последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 176 (антитело А). Согласно другому варианту гуманизированное антитело может состоять из последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 174 и последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 178 (антитело В) или гуманизированное антитело может состоять из последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 180 и последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 176 (антитело С), или гуманизированное антитело может состоять из последователь- 27 042716 ности легкой цепи SEQ ID NO: 180 и последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 178 (антитело D).

В некоторых вариантах гуманизированные антитела к IL-23p19, включая их антигенсвязывающие фрагменты, такие как вариабельные области тяжелых и легких цепей, могут содержать последовательность аминокислотных остатков, выведенную из антитела А (последовательность легкой цепи: SEQ ID NO: 174; последовательность тяжелой цепи: SEQ ID NO: 176), антитела В ((последовательность легкой цепи: SEQ ID NO: 174; последовательность тяжелой цепи: SEQ ID NO: 178), антитела С (последовательность легкой цепи: SEQ ID NO: 180; последовательность тяжелой цепи: SEQ ID NO: 176) или антитела D (последовательность легкой цепи: SEQ ID NO: 180; последовательность тяжелой цепи: SEQ ID NO: 178). Согласно другому варианту возможно антитело к IL-23p19 или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который способно связываться с человеческим IL-23p19 в эпитопе, состоящем из аминокислотных остатков 108-126 и аминокислотных остатков 137-151 SEQ ID NO: 181.

Согласно другому варианту возможно антитело к IL-23p19 или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который конкурирует за связыванием с человеческой субъединицей IL-23p19 с антителом, например, антителом А, антителом В, антителом С или антителом D, представленным в настоящем описании. Способность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента конкурировать за связыванием с IL23p19 можно оценивать с помощью анализов связывания в конкурентных условиях, известных в данной области.

Гуманизированные антитела к IL-23p19 необязательно включают специфические аминокислотные замены в консенсусных каркасных участках или каркасных участках зародышевой линии. Специфическая замена аминокислотных остатков в этих положениях в каркасных участках может улучшать различные аспекты характеристик антител, такие как аффинность связывания и/или стабильность, по сравнению с теми, которые характерны для гуманизированных антител, полученных путем непосредственного обмена CDR или HVL на каркасные участки человеческой зародышевой линии.

В некоторых вариантах описаны другие моноклональные антитела, имеющие аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 84, 86, 88, 90, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117 или 119. В некоторых вариантах описаны другие моноклональные антитела, имеющие аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 121, 123, 125, 127, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154 или 156 (см. табл.1 и 2, выше). CDR-последовательности этих мышиных антител представлены в табл. 3 и 4. Интродукция указанных CDR в FR человеческих консенсусных вариабельных областей тяжелых и легких цепей может приводить к получению приемлемых гуманизированных антител.

В частности, в настоящей заявке предложены моноклональные антитела, имеющие следующую комбинацию вариабельных областей легких цепей и вариабельных областей тяжелых цепей: SEQ ID NO: 84/121, 86/123, 88/125, 90/127, 91/128, 93/130, 95/132, 97/134, 99/136, 101/138, 103/140, 105/142, 107/144, 109/146, 111/148, 113/150, 115/152, 117/154 или 119/156. Указанные вариабельные области можно объединять с человеческими константными областями.

В некоторых вариантах описаны другие гуманизированные антитела, последовательности вариабельных областей легких цепей которых имеют аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 158, 160, 162 или 164, или другие гуманизированные антитела, последовательности вариабельных областей тяжелых цепей которых имеют аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 166, 168, 170 или 172 (см. табл.5 и 6, выше). Последовательности CDR этих антител представлены в табл. 3 и 4. В частности, в настоящей заявке предложены моноклональные антитела, имеющие следующие комбинации вариабельных областей легких цепей и вариабельных областей тяжелых цепей: SEQ ID NO: 160/166, 160/168, 158/166 или 158/168. Указанные вариабельные области можно объединять с человеческими константными областями.

Следующим вариантом может быть антитело к IL-23p19 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее/содержащий вариабельный домен гуманизированной легкой цепи, содержащий CDRучастки из SEQ ID NO: 160, и каркасные участки, имеющие аминокислотную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 90%, идентична по меньшей мере на 93% или идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности каркасных участков вариабельного домена легкой цепи, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 160, и вариабельный домен гуманизированной тяжелой цепи, содержащий CDR-участки из SEQ ID NO: 166, и каркасные участки, имеющие аминокислотную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 90%, идентична по меньшей мере на 93% или идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности каркасных участков вариабельного домена тяжелой цепи, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166. Согласно одному из вариантов антитело к IL-23p19 может представлять собой гуманизированное моноклональное антитело.

Следующим вариантом может быть антитело к IL-23p19 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее/содержащий вариабельный домен гуманизированной легкой цепи, содержащий CDRучастки из SEQ ID NO: 160, и каркасные участки, имеющие аминокислотную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 90%, идентична по меньшей мере на 93% или идентична по меньшей

- 28 042716 мере на 95% аминокислотной последовательности каркасных участков вариабельного домена легкой цепи, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 160, и вариабельный домен гуманизированной тяжелой цепи, содержащий CDR-участки из SEQ ID NO: 168, и каркасные участки, имеющие аминокислотную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 90%, идентична по меньшей мере на 93% или идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности каркасных участков вариабельного домена тяжелой цепи, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 168. Согласно одному из вариантов антитело к IL-23p19 может представлять собой гуманизированное моноклональное антитело.

Следующим вариантом может быть антитело к IL-23p19 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее/содержащий вариабельный домен гуманизированной легкой цепи, содержащий CDRучастки из SEQ ID NO: 158, и каркасные участки, имеющие аминокислотную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 90%, идентична по меньшей мере на 93% или идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности каркасных участков вариабельного домена легкой цепи, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 158, и вариабельный домен гуманизированной тяжелой цепи, содержащий CDR-участки из SEQ ID NO: 166, и каркасные участки, имеющие аминокислотную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 90%, идентична по меньшей мере на 93% или идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности каркасных участков вариабельного домена тяжелой цепи, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166. Согласно одному из вариантов антитело к IL-23p19 может представлять собой гуманизированное моноклональное антитело.

Следующим вариантом может быть антитело к IL-23p19 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее/содержащий вариабельный домен гуманизированной легкой цепи, содержащий CDRучастки из SEQ ID NO: 158, и каркасные участки, имеющие аминокислотную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 90%, идентична по меньшей мере на 93% или идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности каркасных участков вариабельного домена легкой цепи, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 158, и вариабельный домен гуманизированной тяжелой цепи, содержащий CDR-участки из SEQ ID NO: 168, и каркасные участки, имеющие аминокислотную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 90%, идентична по меньшей мере на 93% или идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности каркасных участков вариабельного домена тяжелой цепи, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 168. Согласно одному из вариантов антитело к IL-23p19 может представлять собой гуманизированное моноклональное антитело.

В некоторых конкретных вариантах гуманизированные антитела к IL-23p19, представленные в настоящем описании, содержат по меньшей мере вариабельный домен тяжелой или легкой цепи, содержащий CDR или HVL мышиных моноклональных антител или гуманизированных антител, представленных выше в табл. 1-6, и FR вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи человеческой зародышевой линии.

CDR этих последовательностей представлены в табл. 3 и 4. Таким образом, раскрыто антитело к IL23p19 или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который содержит последовательность CDR1 легкой цепи (L-CDR1) SEQ ID NO: 1, 4, 6, 7, 8, 11, 15, 18, 19, 22, 27 или 30; последовательность CDR2 легкой цепи (L-CDR2) SEQ ID NO: 2, 5, 9, 12, 16, 20, 23, 25, 28 или 31; последовательность CDR3 легкой цепи (L-CDR3) SEQ ID NO: 3, 10, 13, 14, 17, 21, 24, 26, 29, или 32; последовательность CDR1 тяжелой цепи CDR1 (H-CDR1) SEQ ID NO: 33, 36, 38, 40, 43, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 67, 68, 69, 77 или 80; последовательность CDR2 тяжелой цепи (H-CDR2) SEQ ID NO: 34, 39, 41, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 70, 72, 73, 75, 78 или 81; и последовательность CDR3 тяжелой цепи (H-CDR3) SEQ ID NO: 35, 37, 42, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 71, 74, 76, 79 или 82. Согласно одному из вариантов антитело к IL-23p19 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, включающую указанный выше L-CDR1, указанный выше L-CDR2 и указанный выше L-CDR3, и вариабельную область тяжелой цепи, включающую указанный выше H-CDR1, указанный выше H-CDR2 и указанный выше H-CDR3. Следующим вариантом может быть антитело к IL-23p19 или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который содержит

а) последовательность L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 33, 34 и 35 соответственно; или

б) последовательность L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 SEQ ID NO: 4, 5, 3, 36, 34 и 37 соответственно; или

в) последовательность L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 38, 39 и 35 соответственно; или

г) последовательность L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 SEQ ID NO: 6, 2, 3, 40, 41 и 42 соответственно; или

д) последовательность L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 SEQ ID NO: 7, 2, 3, 43, 41 и 44 соответственно; или

е) последовательность L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 SEQ ID NO: 8, 9, 10, 45, 46 и 47 соответственно; или

- 29 042716

ж) последовательность L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 SEQ ID NO: 8, 9,

10, 48, 49 и 50 соответственно; или

з) последовательность L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 SEQ ID NO: 11, 12,

13, 51, 52 и 53 соответственно; или

и) последовательность L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 SEQ ID NO: 7, 2, 14, 54, 55 и 56 соответственно; или

к) последовательность L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 SEQ ID NO: 15, 16, 17, 57, 58 и 59 соответственно; или

л) последовательность L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 SEQ ID NO: 18, 16, 17, 60, 61 и 62 соответственно; или

м) последовательность L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 SEQ ID NO: 19, 20, 21, 63, 66, 67 или 68, 64 и 65 соответственно; или

н) последовательность L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 SEQ ID NO: 22, 23, 24, 69, 70 и 71 соответственно; или

о) последовательность L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 SEQ ID NO: 22, 25, 26, 55, 72 и 71 соответственно; или

п) последовательность L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 SEQ ID NO: 8, 9, 10, 45, 73 и 74 соответственно; или

р) последовательность L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 SEQ ID NO: 27, 28, 29, 45, 75 и 76 соответственно; или

с) последовательность L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 SEQ ID NO: 8, 9, 10, 77, 78 и 79 соответственно; или

т) последовательность L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 SEQ ID NO: 30, 31, 32, 80, 81 и 82 соответственно.

Согласно одному из вариантов антитело к IL-23p19 или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельную область легкой цепи, включающую указанную выше комбинацию L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3, и вариабельную область тяжелой цепи, включающую указанную выше комбинацию H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3.

В конкретных вариантах может подразумеваться, что на основе химерных антител с заменой (переключением) CDR-участков (т.е., например, с заменой одного или двух CDR одного из мышиных антител или выведенных из них гуманизированных антител, на аналогичные CDR из другого мышиного антитела или выведенного из него гуманизированного антитела) между этими приведенными в качестве примера иммуноглобулинами, можно получать ценные антитела.

В конкретных вариантах гуманизированное антитело к IL-23p19 может представлять собой фрагмент антитела. Различные фрагменты антител описаны в целом выше, и разработаны методики для получения фрагментов антител. Фрагменты можно получать путем протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto и др., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24, 1992, cc. 107-117 и Brennan и др., Science 229, 1985, с. 81). Альтернативно этому фрагменты можно получать непосредственно в рекомбинантных клетках-хозяевах. Например, Fab'-SH-фрагменты можно выделять непосредственно из Е. coli и химически сшивать с получением F(ab')2-фрагментов (см., например, Carter и др., Bio/Technology 10, 1992, cc. 163-167). Согласно другому подходу F(ab')2-фрагменты можно выделять непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Другие методики получения фрагментов антител должны быть очевидны специалисту в данной области. Таким образом, одним из объектов могут быть фрагменты антител, содержащие CDR, указанные в настоящем описании, в частности одну из комбинаций L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3, указанных в настоящем описании. Еще одним объектом могут быть фрагменты антител, содержащие вариабельные области, указанные в настоящем описании, например, одну из комбинаций вариабельных областей легких цепей и вариабельных областей тяжелых цепей, указанных в настоящем описании.

Конкретными вариантами могут быть F(ab')2-фрагмент гуманизированного антитела к IL-23p19, который содержит любую из последовательностей легкой цепи SEQ ID NO: 174 или SEQ ID NO: 180 в сочетании с последовательностью тяжелой цепи SEQ ID NO: 176 или SEQ ID NO: 178. Указанные варианты могут включать интактное антитело, содержащее указанные F(ab')2-фрагменты.

В некоторых вариантах антитело или фрагмент антитела может включать константную область, которая опосредует эффекторную функцию. Константная область может опосредовать ответы, представляющие собой антитело-обусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (ADCC), антителообусловленный клеточный фагоцитоз (ADCP) и/или комплементзависимую цитотоксичность (CDC), в отношении клетки-мишени, экспрессирующей IL-23. Эффекторный(ые) домен(ы) может(могут) представлять собой, например, Fc-область молекулы Ig.

Эффекторный домен антитела можно получать из организма любых приемлемых видов позвоночных животных и любых изотипов. Изотипы из организма различных видов животных отличаются по способности опосредовать эффекторные функции. Например, по способности опосредовать CDC и ADCC/ADCP человеческие иммуноглобулины, как правило, располагаются в следующем порядке

- 30 042716

IgM®IgG1®IgG₃>IgG₂>IgG₄ и IgG1®IgG₃>IgG₂/IgM/IgG₄ соответственно. Мышиные иммуноглобулины по своей способности опосредовать CDC и ADCC/ADCP, как правило, располагаются в следующем порядке: мышиный IgM®IgG₃>>IgG_2b>IgG_2a»IgG₁ и IgG_2b>IgG_2a>IgG₁>>IgG₃ соответственно. В другом примере мышиный IgG_2a опосредует ADCC, а мышиный IgG_2a и IgM оба опосредуют CDC.

Модификации антител

Гуманизированные анти-ГЬ-23р19 антитела и агенты могут включать модификации гуманизированного антитела к IL-23p19 или его антигенсвязывающего фрагмента. Например, может потребоваться модифицировать антитело в отношении его эффекторной функции, повышая тем самым эффективность антитела при лечении рака. Одной из таких модификаций является интродукция остатка(ов) цистеина в Fc-область, что приводит к образованию в этой области дисульфидной связи между цепями. Полученное таким образом гомодимерное антитело может обладать улучшенной способностью к интернализации и/или повышенной комплементзависимой цитотоксичностью и антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC) (см., например, Caron и др., J. Exp. Med., 176, 1992, cc. 1191-1195 и Shopes, J. Immunol., 148, 1992, cc. 2918-2922). Гомодимерные антитела с повышенной противоопухолевой активностью можно получать также с использованием гетеробифункциональных перекрестносшивающих линкеров, описанных у Wolff и др., Cancer Research, 53, 1993, cc. 2560-2565. Альтернативно этому можно сконструировать антитело, имеющее удвоенные Fc-области, благодаря чему оно может иметь повышенную способность к зависящему от комплемента лизису и ADCC (см. Stevenson и др., Ant-Cancer Drug Design, 3, 1989, cc. 219-230).

Антитела с повышенной способностью поддерживать ADCC получали путем модификации схемы гликозилирования их Fc-области. Это представляется возможным, поскольку гликозилирование антитела на остатке аспарагина, N297, в C_H2-домене участвует во взаимодействии между IgG и Fcy-рецепторами, которое необходимо для ADCC. Конструировали линии клеток-хозяев для экспрессии антител с измененным гликозилированием, например, с повышенным уровнем бисекционнирующего Nацетилглюкозамина или пониженным уровнем фукозы. Пониженный уровень фукозы обеспечивает более значительное повышение ADCC-активности, чем увеличение уровня бисекционирующего Nацетилглюкозамина. Кроме того, повышенная ADCC-активность антител с низким уровнем фукозы не зависит от V/F-полиморфизма FcyRIIIa.

Модификация аминокислотной последовательности Fc-области антител является альтернативой гликозилирования в отношении повышения ADCC-активности. Сайт связывания на человеческом IgG1 для Fcy-рецепторов был определен с помощью расширенного мутационного анализа. Это позволило создавать гуманизированные антитела изотипа IgG1 c мутациями в Fc-области, которые повышали аффинность связывания с FcyRIIIa и усиливали ADCC-активность in vitro. Кроме того, получали варианты Fc с многочисленными различными пермутациями способности к связыванию, например, с повышенной способностью к связыванию со специфическими FcyR-рецепторами, но с неизмененной или пониженной способностью к связыванию с другими FcyR-рецепторами.

Другим объектом могут быть иммуноконъюгаты, содержащие гуманизированное антитело или его фрагменты, конъюгированное/конъюгированные с цитотоксическим агентом, таким как химиотерапевтическое средство, токсин (например, обладающий ферментативной активностью токсин бактериального, грибного, растительного или животного происхождения или их фрагменты) или радиоактивный изотоп (т.е. радиоконъюгат).

Химиотерапевтические средства, которые можно применять для получения таких иммуноконъюгатов, описаны выше. Обладающие ферментативной активностью токсины и их фрагменты, которые можно применять, включают цепь А дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модеццина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор из Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор из Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин, трикотецены и т.п. Для получения радиоконъюгатов гуманизированных антител к IL-23p19 можно применять различные радионуклиды. Их примерами являются ²¹²Bi, ¹³¹1,¹³¹In, ⁹⁰Y и ¹⁸⁶Re.

Конъюгаты гуманизированного антитела к IL-23p19 и цитотоксического или химиотерапевтического средства можно получать известными методами, с использованием целого ряда бифункциональных связывающих белки агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные сложных имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаровый альдегид), бисазидосоединения (такие как бис(пара-азидобензоил)гександиамин), производные бисдиазония (такие как бис(пара-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицина можно получать согласно методу, описанному у Vitetta и др., Science, 238, 1987, с. 1098). Меченная с помощью С¹⁴ 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота

- 31 042716 (MX-DTPA) является примером хелатирующего агента для конъюгации радионуклеотида с антителом.

Конъюгаты можно получать также с использованием расщепляемого линкера.

Гуманизированные антитела к IL-23p19, представленные в настоящем описании, можно приготавливать также в виде иммунолипосом. Липосомы, содержащие антитело, получают методами, известными в данной области, например, описанными у Epstein и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1985, с 3688; Hwang и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 1980, с 4030; и в US №№ 4485045 и 4544545. Липосомы с удлиненным временем жизни в кровотоке описаны, например, в US № 5013556.

Наиболее предпочтительные липосомы можно получать методом упаривания с обращенной фазой с использованием липидной композиции, включающей фосфатидилхолин, холестерин и дериватизированный с помощью ПЭГ фосфатидилэтаноламин (ПЭГ-ФЭ). Липосомы экструдируют через фильтры с определенным размером пор, получая липосомы требуемого диаметра. Fab'-фрагменты антитела можно включать в липосомы согласно методу, описанному у Martin и др., J. Biol. Che., 257, 1982, cc. 286-288, посредством реакции образования дисульфидной связи. В липосомы необязательно можно включать химиотерапевтическое средство (такое как доксорубицин) (см., например, Gabizon и др., J. National Cancer Inst., 81(19), 1989, с. 1484).

Антитела, представленные в настоящем описании, можно применять в ADEPT (процедуры на основе антитело-направленного фермента пролекарственной терапии) путем конъюгации антитела с активирующим пролекарство ферментом, который превращает пролекарство (например, пептидильный химиотерапевтический агент) в активное противораковое лекарственное средство (см., например, WO 81/01145, WO 88/07378 и US №4975278). Компонент иммуноконъюгата, представляющий собой фермент, который можно применять в ADEPT, может представлять фермент, который обладает способностью оказывать такое воздействие на пролекарство, в результате которого оно превращается в более активную цитотоксическую форму. Конкретные ферменты, которые можно применять в ADEPT, включают (но не ограничиваясь только ими) щелочную фосфатазу для превращения содержащих фосфат пролекарств в свободные лекарственные субстанции; арилсульфатазу для превращения содержащих сульфат пролекарств в свободные лекарственные субстанции; цитозиндеаминазу для превращения нетоксичного 5-фторцитозина в противораковую лекарственную субстанцию 5-фторурацил; протеазы, такие как протеиназа Serratia, термолизин, субтилизин, карбоксипептидазы и катепсины (такие как катепсины В и L), для превращения содержащих пептид пролекарств в свободные лекарственные субстанции; Dаланилкарбоксипептидазы для превращения пролекарств, содержащих D-аминокислотные заместители; расщепляющие углеводы ферменты, такие как β-галактозидаза и нейраминидаза, для превращения гликозилированных пролекарств в свободные лекарственные субстанции; β-лактамазу для превращения пролекарств, дериватизированных β-лактамами, в свободные лекарственные субстанции; и амидазы пенициллина, такие как амидаза пенициллина V или амидаза пенициллина G, для превращения лекарственных субстанций, дериватизированных по азотам амина феноксиацетильной или фенилацетильной группами, соответственно, в свободные лекарственные субстанции. В альтернативном варианте можно применять антитела с ферментативной активностью (абзимы) для превращения пролекарств в свободные активные лекарственные субстанции (см., например, Massey, Nature 328, 1987, cc. 457-458). Конъюгаты антитело-абзим можно получать с помощью известных в данной области методов, предназначенных для введения абзима в популяцию опухолевых клеток, например, путем ковалентного связывания фермента с гуманизированным антителом к ГЬ-23р19/гетеробифункциональными перекресносшивающими реагентами, которые описаны выше. В альтернативном варианте слитые белки, которые содержат по меньшей мере антигенсвязывающую область антитела, сцепленную по меньшей мере с функционально активной областью фермента, представленного в настоящем описании, можно конструировать с использованием метода рекомбинантной ДНК (см., например, Neuberger и др., Nature 312, 1984, cc. 604-608).

В конкретных вариантах может требоваться применение фрагмента гуманизированного антитела к IL-23p19 вместо интактного антитела, например, для повышения способности проникать в ткань, например, может потребоваться модифицировать фрагмент антитела для удлинения времени полужизни в сыворотке. Для этой цели можно, например, включать эпитоп, связывающийся с рецептором спасения, в фрагмент антитела. Согласно одному из методов соответствующую область фрагмента антитела можно изменять (например, подвергать мутации) или эпитоп можно встраивать в пептидную метку, которую затем сливают с фрагментом антитела на любом конце или в середине, например, с использованием ДНК или пептидного синтеза (см., например, WO 96/32478).

В других вариантах можно применять также ковалентные модификации гуманизированного антитела к IL-23p19. Ковалентные модификации включают модификацию цистеинильных остатков, гистидильных остатков, лизинильных и аминоконцевых остатков, аргинильных остатков, тирозильных остатков, карбоксильных боковых групп (аспартил или глутамил), глутаминильных и аспарагинильных остатков, или серильных, или треонильных остатков. Другой тип ковалентной модификации включает химическое или ферментативное сшивание гликозидов с антителом. Указанные модификации можно осуществлять с помощью химического синтеза или путем ферментативного или химического расщепления антитела, если это возможно. Для интродукции других типов ковалентных модификаций в молекулу анти- 32 042716 тела можно применять взаимодействие меченых аминокислотных остатков антитела с органическим дериватизирующим агентом, который может взаимодействовать с выбранными боковыми цепями или аминоконцевыми или карбоксиконцевыми остатками.

Удаление любых углеводных фрагментов, присутствующих на антителе, можно осуществлять химическим или ферментативным путем. Химическое дегликозилирование описано у Hakimuddin и др., Arch. Biochem. Biophys. 259, 1987, с. 52 и у Edge и др., Anal. Biochem., 118, 1981, с. 131. Ферментативное отщепление углеводных фрагментов на антителах можно осуществлять с помощью различных эндо- и экзогликозидаз согласно методу, описанному у Thotakura и др., Meth. Enzymol., 138, 1987, с. 350.

Другой тип пригодной ковалентной модификации предусматривает связывание антитела с одним из многочисленных небелковых полимеров, например с полиэтиленгликолем (ПЭГ), полипропиленгликолем или полиоксиалкиленами, с помощью методов, описанных в одном или нескольких из US № 4640835, US № 4496689, US № 4301144, US № 4670417, US № 4791192 и US №4179337.

Гуманизация и варианты аминокислотной последовательности

Варианты аминокислотной последовательности антитела к IL-23p19 можно получать путем интродукции соответствующих нуклеотидных изменений в ДНК антитела к IL-23p19 или с помощью пептидного синтеза. Указанные варианты включают, например, делеции и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антител к IL-23p19, представленных в качестве примера в настоящем описании. Для получения конечной конструкции применяют любую комбинацию делеций, инсерций и замен при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками. Аминокислотные замены могут изменять также пост-трансляционный процессинг гуманизированного антитела к IL-23p19 или его варианта, например, изменение количества или положения сайтов гликозилирования.

Пригодным методом идентификации конкретных остатков или областей в антителе к IL-23p19, которые представляют собой предпочтительные сайты для мутагенеза, является так называемый аланинсканирующий мутагенез, описанный у Cunningham и Wells, Science, 244, 1989, cc. 1081-1085. С его помощью идентифицируют остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженные остатки, такие как arg, asp, his, lys и glu) и заменяют на нейтральную или отрицательно заряженную аминокислоту (как правило, на аланин) для воздействия на взаимодействие аминокислот с антигеном IL-23p19. Те положения аминокислот, для которых продемонстрирована функциональная чувствительность к заменам, затем усовершенствуют путем интродукции дополнительных или других вариантов в сайты замены или для сайтов замены. При этом, хотя сайт для интродукции вариации аминокислотной последовательности является предопределенным, природа самой мутации не является предопределенной. Например, для анализа эффективности мутации в рассматриваемом сайте осуществляют сканирование аланином или неспецифический мутагенез кодона-мишени или области-мишени и полученные в результате экспрессии варианты антитела к IL-23p19 подвергают скринингу в отношении требуемой активности.

Инсерции в аминокислотную последовательность включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния различной длины от одного остатка до полипептидов, которые содержат сто или большее количество остатков, а также инсерции внутрь последовательности одного или нескольких аминокислотных остатков. Примерами концевых инсерций является антитело к IL-23p19, слитое с эпитопом-меткой. Другие инсерционные варианты молекулы антитела к П.-23р19 включают слияние с N- или С-концом антитела к IL-23p19 фермента или полипептида, который удлиняет время полужизни антитела в сыворотке.

Другим типом варианта является вариант, включающий аминокислотную замену. В этих вариантах по меньшей мере один аминокислотный остаток в молекуле антитела к IL-23p19 удален, а другой остаток встроен на его место. Представляющими наибольший интерес сайтами для мутагенеза путем замен являются гипервариабельные участки, но можно осуществлять также изменения в FR. Консервативные замены представлены в таблице 8 под названием предпочтительные замены. Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то можно интродуцировать более существенные замены, обозначенные как Примеры замен, или другие замены, описанные ниже при ссылке на класс аминокислот, и затем продукты можно подвергать скринингу.

- 33 042716

Таблица 8

Исходный остаток	Примеры замен	Предпочтительные замены
Ala (А)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn (Ν)	Gln; His; Asp; Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu;Asn	Glu
Cys (C)	Ser; Ala	Ser
Gln (Q)	Asn; Glu	Asn
Glu (E)	Asp; Gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Arg; Asn; Gln; Lys	Arg
He (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; норлейцин	Leu
Leu (L)	lie; норлейцин; Val; Met; Ala; Phe	lie
Lys (K)	Arg; Phe; lie	Arg
Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe(F)	Tyr; Leu; Val; Ile; Ala	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Phe; Trp; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Leu; Ile; Met; Phe; Ala; норлейцин	Leu

В химии белков является общепринятым, что биологические свойства антитела можно модифицировать путем выбора замен, которые в значительной степени различаются по их воздействию на поддержание (а) структуры каркаса полипептида в области замены, например, складчатой или спиральной конформации, (б) заряда или гидрофобности молекулы в сайте-мишени или (в) размера боковой цепи. Встречающиеся в естественных условиях остатки подразделяют на группы на основе общих свойств боковых цепей:

(1) гидрофобные: норлейцин, met, ala, val, leu, ile;

(2) нейтральные гидрофильные: cys, ser, thr;

(3) кислые: asp, glu;

(4) основные: asn, gln, his, lys, arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: gly, pro; и (6) ароматические: trp, tyr, phe.

Неконсервативные замены предусматривают замену представителя одного из этих классов на представителя другого класса.

Любой из остатков цистеина, не участвующий в поддержании соответствующей конформации гуманизированного антитела к IL-23p19 или его варианта, можно заменять так же, как правило, на серии, с целью повышения устойчивости молекулы к окислению и предупреждению аномального перекрестного сшивания или для создания точек для конъюгации с цитотоксическим или цитостатическим соединением. И наоборот, можно вводить в антитело цистеиновую(е) связь(и) для повышения его стабильности (особенно если антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как Fv-фрагмент).

Один из типов создаваемого путем замены варианта включает замену одного или нескольких остатков гипервариабельного участка родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, полученный(е) в результате вариант(ы), отобранный(е) для дальнейшего усовершенствования, должен(ы) обладать улучшенными биологическими свойствами относительно родительского антитела, из которого оно (они) получено(ы). Приемлемый путь получения таких вариантов на основе замены включает созревание аффинности с использованием фагового дисплея. В целом, метод состоит в следующем: несколько сайтов гипервариабельного участка (например, 6-7 сайтов) подвергают мутации, получая все возможные аминокислотные замены в каждом сайте. Полученные таким образом варианты антитела экспонируются в одновалентной форме на поверхности частиц нитчатого фага в виде слияний с продуктом гена III фага М13, который упакован в каждой частице. Варианты, которые экспонируются фагом, затем подвергают скринингу в отношении их биологической активности (например, аффинности связывания). Для того чтобы выявлять перспективные с точки зрения модификации сайты гипервариабельного участка, можно осуществлять аланин-сканирующий мутагенез с целью идентификации остатков гипервариабельного участка, которые наиболее важны для связывания антигена. В альтернативном или дополнительном варианте может оказаться целесообразным анализировать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело с целью выявления точек соприкосновения между антителом и человеческим IL-23p19. Такие остатки в точках соприкосновения и соседние остатки являются кандидатами для замены с помощью способов, раскрытых в описании. После создания таких вариантов панель вариантов подвергают скринингу, представленному в данном описании, и антитела с улучшенными свойствами по данным одного или нескольких соответствующих анализов можно отбирать для

- 34 042716 дальнейшей разработки.

Другим типом получения аминокислотного варианта антитела является изменение исходной схемы гликозилирования антитела. Под изменением подразумевают делецию одного или нескольких углеводных фрагментов, присутствующих в антителе, и/или добавление одного или нескольких сайтов гликозилирования, не присутствующих в антителе.

В некоторых вариантах может требоваться модифицировае антитела путем добавления сайтов гликозилирования. Гликозилирование антител обычно происходит посредством либо N-связывания, либо Освязывания. N-связывание предусматривает присоединение углеводного фрагмента к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X обозначает любую аминокислоту кроме пролина, представляют собой распознаваемые последовательности, предназначенные для ферментативного присоединения углеводного фрагмента к боковой цепи остатка аспарагина. Так, присутствие любой их этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. О-связанное гликозилирование предусматривает присоединение одного из сахаров, таких как N-ацетилгалактозамин, галактоза или ксилоза, к гидроксиаминокислоте, наиболее часто к серину или треонину, хотя можно применять также 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин. Таким образом, для гликозилирования данного белка, например, антитела, создают аминокислотную последовательность белка, которая содержит одну или несколько описанных выше трипептидных последовательностей (для сайтов N-гликозилирования). Изменение может также представлять собой добавление или замену одного или нескольких остатков серина или треонина в последовательности исходного антитела (для сайтов О-гликозилирования).

Молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют варианты аминокислотных последовательностей антитела к IL-23p19, получают с помощью различных методов, известных в данной области. Эти методы включают (но не ограничиваясь только ими) выделение из природного источника (в случае встречающихся в естественных условиях вариантов аминокислотных последовательностей) или получение с помощью мутагенеза с использованием олигонуклеотидов (или сайтнаправленного мутагенеза), ПЦР-мутагенеза и кассетного мутагенеза полученного ранее варианта или невариантной версии антитела к IL-23p19.

Полинуклеотиды, векторы, клетки-хозяева и методы рекомбинации

В изобретении также раскрыты выделенные полинуклеотиды, которые содержат последовательность, кодирующую гуманизированное антитело к IL-23p19, векторы и клетки-хозяева, которые содержат полинуклеотиды, и методы рекомбинации, предназначенные для получения гуманизированного антитела. Выделенные полинуклеотиды могут кодировать любую требуемую форму антитела к IL-23p19, включая, например, полноразмерные моноклональные антитела, Fab-, Fab'-, F(ab')₂- и Fv-фрагменты, димерные антитела, линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител и мультиспецифические антитела, полученные из фрагментов антител.

Раскрыты в описании выделенные полинуклеотиды, которые содержат последовательности, кодирующие вариабельную область легкой цепи антитела или фрагмента антитела, которая имеет любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 84, 86, 88, 90, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117 или 119. Примерами полинуклеотидных последовательностей, кодирующих указанные аминокислотные последовательности, являются SEQ ID NO: 83, 85, 87, 89, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116 и 118, а также выделенные полинуклеотиды, которые содержат последовательности, кодирующие вариабельную область тяжелой цепи антитела или фрагмента антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 121, 123, 125, 127, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154 или 156. Примерами полинуклеотидных последовательностей, кодирующих указанные аминокислотные последовательности, являются SEQ ID NO: 120, 122, 124, 126, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153 или 155.

Другими вариантами могут быть выделенные полинуклеотиды, которые содержат последовательности, кодирующие вариабельную область легкой цепи антитела или фрагмента антитела, которая имеет любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 158, 160, 162 или 164. Примерами полинуклеотидных последовательностей, кодирующих указанные аминокислотные последовательности, являются SEQ ID NO: 157, 159, 161 или 163. Или выделенные полинуклеотиды, которые содержат последовательности, кодирующие вариабельную область тяжелой цепи антитела или фрагмента антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166, 168, 170 или 172. Примерами полинуклеотидных последовательностей, кодирующих указанные аминокислотные последовательности, являются SEQ ID NO: 165, 167, 169 или 171.

Следующими вариантами могут быть выделенные полинуклеотиды, которые содержат последовательности, кодирующие легкую цепь антитела, имеющую любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 174 или SEQ ID NO: 180. Примерами полинуклеотидных последовательностей, кодирующих указанные аминокислотные последовательности, являются SEQ ID NO: 173 или SEQ ID NO: 179. Так же выделенные полинуклеотиды могут содержать последовательности, кодирующие тяжелую цепь антитела, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 176 или SEQ ID NO: 178. Примерами полинуклеотидных последовательностей, кодирующих указанные аминокислотные последо- 35 042716 вательности, являются SEQ ID NO: 175 или SEQ ID NO: 177.

Выделенная(е) полинуклеотидная(е) последовательность(и) может (могут) кодировать антитело или фрагмент антитела, имеющего вариабельную область легкой цепи и тяжелой цепи, которые содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 174 и SEQ ID NO: 176 соответственно; SEQ ID NO: 174 и SEQ ID NO: 178 соответственно; SEQ ID NO: 180 и SEQ ID NO: 176 соответственно; SEQ ID NO: 180 и SEQ ID NO: 178 соответственно. Примерами полинуклеотидных последовательностей, кодирующих указанные аминокислотные последовательности, являются SEQ ID NO: 173 и SEQ ID NO: 175 соответственно, SEQ ID NO: 173 и SEQ ID NO: 177 соответственно, SEQ ID NO: 179 и SEQ ID NO: 175 соответственно, SEQ ID NO: 179 и SEQ ID NO: 177 соответственно.

Полинуклеотид(ы), который(ые) содержит(ат) последовательность, кодирующую гуманизированное антитело к IL-23p19 или его фрагмент или цепь, можно сливать с одной или несколькими регуляторными или контролирующими последовательности, известными в данной области, и можно включать в приемлемые экспрессионные векторы или клетку-хозяина, известные в данной области. Каждую из молекул полинуклеотида, кодирующего вариабельные домены тяжелой или легкой цепи, можно независимо друг от друга сливать с полинуклеотидной последовательностью, которая кодирует константный домен, например, человеческий константный домен, что позволяет получать интактные антитела. Альтернативно этому полинуклеотиды или их участки можно сливать вместе, создавая матрицу для получения одноцепочечного антитела.

Для получения с помощью методов рекомбинации полинуклеотид, кодирующий антитело, встраивают в реплицируемый вектор для клонирования (амплификация ДНК) или для экспрессии. Известно и доступно много приемлемых векторов для экспрессии рекомбинантного антитела. Компонентами вектора, как правило, являются (но не ограничиваясь только ими) один или несколько следующих элементов: сигнальная последовательность, сайт инициации репликации, один или несколько маркерных генов, энхансерный элемент, промотор и последовательность терминатора транскрипции.

Гуманизированные антитела к IL-23p19 можно получать также в виде слитых полипептидов, в которых антитело слито с гетерологичным полипептидом, таким как сигнальная последовательность или другой полипептид, несущий специфический сайт расщепления на аминоконце зрелого белка или полипептида. Выбранная гетерологичная сигнальная последовательность, как правило, представляет собой последовательность, которая распознается и процессируется (т.е. отщепляется сигнальной пептидазой) в клетке-хозяине. Для прокариотических клеток-хозяев, которые не могут распознавать и процессировать сигнальную последовательность гуманизированного антитела к IL-23p19, сигнальную последовательность можно заменять на прокариотическую сигнальную последовательность. Сигнальная последовательность может представлять собой, например, лидерные последовательности щелочной фосфатазы, пенициллиназы, липопротеина или термостабильного энтеротоксина II и т.п. Для секреции из дрожжей нативную сигнальную последовательность можно заменять, например, на лидерную последовательность, полученную из а-фактора дрожжевой инвертазы (включая лидерные последовательности α-фактора Saccharomyces и Kluyveromyces), кислой фосфатазы, глюкоамилазы С. albicans или сигнальную последовательность, описанную в WO 90/13646. Для экспрессии в клетках млекопитающих можно применять сигнальные последовательности млекопитающих, а также вирусные секреторные лидерные последовательности, например, gD-сигнал вируса герпеса простого. ДНК, кодирующую указанную областьпредшественник, лигируют в рамке считывания с ДНК, которая кодирует гуманизированное антитело к IL-23p19.

Экспрессионные и клонирующие векторы содержат нуклеотидную последовательность, которая позволяет вектору реплицироваться в одной или нескольких выбранных клетках-хозяевах. Как правило, в клонирующих векторах эта последовательность представляет собой последовательность, которая обеспечивает репликацию вируса, не зависящую от хромосомной ДНК хозяина, и она включает сайт инициации репликации или автономно реплицирующиеся последовательности. Такие последовательности хорошо известны для различных бактерий, дрожжей и вирусов. Сайт инициации репликации из плазмиды pBR322 пригоден для большинства грамотрицательных бактерий, сайт инициации плазмиды 2μ пригоден для дрожжей, а различные вирусные сайты инициации (SV40 (обезьяний вирус 40), вируса полиомы, аденовируса, VSV (вирус везикулярного стоматита) или BPV (вирус папилломы крупного рогатого скота)) пригодны для клонирующих векторов, применяемых в клетках млекопитающих. Как правило, для экспрессионных векторов млекопитающих не требуется компонент, представляющий собой сайт инициации репликации (как правило, можно применять только сайт инициации репликации SV40, поскольку он содержит ранний промотор).

Экспрессионные и клонирующие векторы могут содержать ген, который кодирует селектируемый маркер, для облегчения идентификации экспрессии. Как правило, гены селектируемых маркеров кодируют белки, которые обусловливают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, таким как ампициллин, неомицин, метотрексат или тетрациклин, или в альтернативном варианте восполняют ауксотрофную недостаточность, или в другом альтернативном варианте пополняют специфические питательные вещества, которые не присутствуют в комплексных средах, например ген, кодирующий D

- 36 042716 аланинрацемазу для Bacilli.

В одной из приведенных в качестве примерах схем селекции применяют лекарственное средство для прекращения роста клетки-хозяина. В тех клетках, которые успешно трансформированы гетерологичным геном, образуется белок, обусловливающий устойчивость к лекарственному средству, и поэтому клетки выживают при такой схеме селекции. Примерами лекарственных средств, применяемых для такой доминантной селекции, являются неомицин, микофеноловая кислота и гигромицин. Общепринятыми селектируемыми маркерами для клеток млекопитающих являются маркеры, позволяющие идентифицировать клетки, компетентные в отношении поглощения нуклеиновой кислоты, которая кодирует гуманизированное антитело к IL-23p19, такие как DHFR (дигидрофолатредуктаза), тимидинкиназа, металлотионеин-I и -II (например, гены металлотионеина приматов), аденозиндеаминаза, орнитиндекарбоксилаза и т.п. Клетки, трансформированные применяемым для селекции геном DHFR, идентифицируют, прежде всего, путем культивирования всех трансформантов в культуральной среде, которая содержит метотрексат (Mtx), конкурентный антагонист DHFR. Приемлемой клеткой-хозяином, когда применяют DHFR дикого типа, является линия клеток яичника китайского хомячка (СНО) с дефицитом DHFR-активности (например, DG44).

Альтернативно этому клетки-хозяева (прежде всего, хозяева дикого типа, которые содержат эндогенный ген DHFR), трансформированные или совместно трансформированные последовательностями ДНК, которые кодируют антитело к IL-23p19, белок DHFR дикого типа и другой селектируемый маркер, такой как аминогликозид-3'-фосфотрансфераза (АРН), можно отбирать по признаку роста клетки в среде, содержащий селектирующий агент для селектирующего маркера, такой как аминогликозидный антибиотик, например, канамицин, неомицин или G418 (см., например, US № 4965199).

Когда получение методом рекомбинации осуществляют с использованием дрожжевой клетки в качестве клетки-хозяина, то в качестве маркера можно применять ген TRP1, который присутствует в полученной из дрожжей плазмиде YRp7 (Stinchcomb и др., Nature, 282, 1979, с. 39). Ген TRP1 является селектирующим маркером для мутантного штамма дрожжей, лишенного способности расти в среде с добавлением триптофана, например штамма АТСС № 44076 или РЕР4-1 (Jones, Genetics, 85, 1977, с. 12). Таким образом, наличие повреждения trp1 в геноме дрожжевой клетки-хозяине обеспечивает эффективное окружение для выявления трансформации по признаку роста в отсутствии триптофана. Аналогично этому, штаммы дрожжей с дефицитом Leu2p, такие как АТСС 20622 и 38626, дополняют с помощью известных плазмид, несущих ген LEU2.

Кроме того, векторы, полученные из кольцевой плазмиды pKD1 размером 1,6 мкм, можно применять для трансформации дрожжей Kluyveromyces. С другой стороны, известна экспрессионная система для крупномасштабного получения рекомбинантного телячьего химозина в K. lactis (Van den Berg, Bio/Technology 8, 1990, с. 135). Описаны также стабильные мультикопийные экспрессионные векторы для секреции зрелого рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина с помощью промышленных штаммов Kluyveromyces (Fleer и др., Bio/Technology 9, 1991, cc. 968-975).

Экспрессионные и клонирующие векторы, как правило, содержат промотор, распознаваемый организмом-хозяином и функционально связанный с молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело к IL-23p19 или его полипептидную цепь. Промоторы, которые пригодны для применения в прокариотических хозяевах, представляют собой промотор phoA, промоторные системы β-лактамазы и лактозы, промоторные системы щелочной фосфатазы, триптофана (trp) и гибридные промоторы, такие как промотор tac. Можно применять также и другие известные промоторы бактерий. Промоторы, предназначенные для применения в бактериальных системах, содержат также последовательность ШайнаДальгарно (S.D.), функционально связанную с ДНК, которая кодирует гуманизированное антитело к IL23p19.

Известны многие промоторные последовательности эукариот. Фактически все гены эукариот имеют богатую AT область, локализованную примерно на расстоянии 25-30 оснований против хода транскрипции от сайта инициации транскрипции. Другая последовательность, обнаруженная на расстоянии 70-80 оснований от сайта инициации транскрипции многих генов, представляет собой CNCAAT-область, в которой N может обозначать любой нуклеотид. На 3'-конце большинства генов эукариот находится последовательность ААТААА, которая может представлять собой сигнал для добавления поли-А-хвоста к 3'концу кодирующей последовательности. Все эти последовательности можно встраивать в эукриотические экспрессионные векторы.

Примеры промоторных последовательностей, которые можно применять в дрожжевых клеткаххозяевах, включают промоторы 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, таких как енолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа.

Индуцибельные промоторы имеют дополнительное преимущество, связанное с транскрипцией, которая контролируется условиями роста. Они включают дрожжевые промоторные области алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, расщепляющих ферментов, связанных с метаболизмом азота, металлтионеина, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и ферментов, ответственных за ути- 37 042716 лизацию мальтозы и галактозы. Кроме того, приемлемые векторы и промоторы, которые можно применять при экспрессии в дрожжах, описаны в ЕР 73657. Энхансеры из дрожжей целесообразно применять также в сочетании с промотрами из дрожжей.

Транскрипцию гуманизированного антитела к IL-23p19 с векторов в клетках-хозяевах млекопитающих контролируют, например, с помощью промоторов, полученных из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус оспы птиц, аденовирус (такой как аденовирус 2), вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В и обезьяний вирус 40 (SV40), с помощью гетерологичных промоторов млекопитающих, например, промотора актина или промотора иммуноглобулина, или промоторов теплового шока, при условии, что такие промоторы совместимы с системами клетки-хозяина.

Ранний и поздний промоторы вируса SV40 целесообразно получать в виде рестрикционного фрагмента SV40, который содержит также сайт инициации репликации вируса SV40. Немедленно-ранний промотор человеческого цитомегаловируса целесообразно получать в виде рестрикционного HindIII Eфрагмента. Система экспрессии ДНК в клетках-хозяевах млекопитающих, в которой применяли вирус бычьей папилломы в качестве вектора, описана в US № 4419446. Модификация указанной системы описана в US № 4601978 (см. также у Reyes и др., Nature 297, 1982, cc. 598-601 описание экспрессии кДНК человеческого р-интерферона в мышиных клетках под контролем промотора тимидинкиназы из вируса герпеса простого). Альтернативно этому в качестве промотора можно применять длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса.

Другим важным элементом, который можно применять в рекомбинантном экспрессионном векторе, является энхансерная последовательность, которую используют для повышения транскрипции ДНК, кодирующей гуманизированное антитело к IL-23p19, в высших эукариотических организмах. Известны многие энхансерные последовательности генов млекопитающих (генов глобина, эластазы, альбумина, αфетопротеина и инсулина). Однако, как правило, применяют энхансер из вируса эукариотической клетки. Примерами являются энхансер SV40, расположенный на удаленной стороне от сайта инициации репликации (пары оснований 100-270), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы, расположенный на удаленной стороне от сайта инициации репликации, и энхансеры аденовирусов (см. также приведенное у Yaniv, Nature 297, 1982, cc. 17-18 описание энхансерных элементов, применяемых для активации эукариотических промоторов). Энхансер можно встраивать путем сплайсинга в вектор в 5'или 3'-положение относительно кодирующей последовательности гуманизированного антитела к IL-23p19, но предпочтительно его помещают в сайт, расположенный в 5'-направлении относительно промотора.

Экспрессионные векторы, применяемые в эукариотических клетках-хозяевах (клетки дрожжей, грибов, насекомых, растений, животных, людей или содержащие ядро клетки других многоклеточных организмов), должны содержать также последовательности, необходимые для терминации транскрипции и стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно получают из 5'- и иногда из 3'нетранслируемых областей эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Эти области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибированные в виде полиаденилированных фрагментов в нетранслируемой области мРНК, которая кодирует антитело к IL-23p19. Одним из пригодных компонентов терминации транскрипции является область полиаденилирования бычьего гормона роста (см. WO 94/11026 и представленный в указанной заявке экспрессионный вектор). Кроме того, гуманизированные антитела к IL23p19 можно экспрессировать с помощью системы CHEF (см., например, US № 5888809, описание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки).

Приемлемыми клетками-хозяевами для клонирования или экспрессии ДНК в векторах, указанных в настоящем описании, являются клетки прокариот, дрожжей или высших эукариот. Приемлемыми прокариотами являются (но не ограничиваясь ими) эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы, например, сем. Enterobacteriaceae, такие как Е. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например, Salmonella typhimurium, Serratia, например, Serratia marcescans, и Shigella, а также Bacilli, такие как В. subtilis и В. licheniformis (например, штамм В. licheniformis 41P, который описан в DD 266710, опубликованной 12 апреля 1989 г.), Pseudomonas, такие как P. aeruginosa, и Streptomyces. Одним из предпочтительных штаммов Е. coli, который применяют в качестве хозяина при клонировании, является штамм Е. coli 294 (АТСС 31446), хотя можно использовать и другие штаммы Е. coli В, Е. coli X1776 (АТСС 31537) и Е. coli W3110 (АТСС 27325). Эти примеры приведены в качестве иллюстрации и не ограничивают объем изобретения.

Помимо прокариотических организмов в качестве хозяев для клонирования или экспрессии векторов, которые кодируют гуманизированное антитело к Ш-23р19, можно использовать эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи. Наиболее часто применяемым низшим эукариотическим микроорганизмом-хозяином является Saccharomyces cerevisiae, т.е. обычные пекарские дрожжи. Однако согласно настоящей заявке можно применять из многочисленных известных и доступных представителей других родов, видов и штаммов, таких как Schizosaccharomyces pombe; хозяев из сем. Kluyveromyces таких, например, как K. lactis, K. fragilis (АТСС 12424), K. bulgaricus (АТСС 16045), K. wickeramii (АТСС 24178), K. waltii (АТСС 56500), K. drosophilarum (АТСС 36906), K. thermotolerans и K. marxianus; Yarrowia (ЕР 402226); Pichiapastoris (Ер 183070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234);

- 38 042716

Neurospora crassa (Case и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1979, cc. 5259-5263); Schwanniomyces, такие как Schwanniomyces occidentalis; и нитчатые грибы, такие, например, как Neurospora, Penicillium, Tolypocladium и хозяева р. Aspergillus, такие как A. nidulans и A. niger.

Клетки-хозяева, пригодные для экспрессии гликозилированного гуманизированного антитела к IL23p19, получают из многоклеточных организмов. Примерами клеток беспозвоночных являются клетки растений и клетки насекомых, например, многочисленные бакуловирусные штаммы и их варианты и соответствующие пригодные для них в качестве хозяев клетки насекомых, таких как Spodoptera frugiperda (гусеница), Aedes aegipti (комар), Aedes albopictus (комар), Drosophila melanogaster (плодовая муха) и Bombyx mori (шелковичный червь). Широко известны разнообразные штаммы вирусов, которые можно использовать для трансфекции, например вариант L-1 NPV Autographa californica и штамм NPV Bombyx mori Bm-5, и такие вирусы можно применять, прежде всего, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.

В качестве хозяев можно применять также культуры клеток хлопчатника, кукурузы, картофеля, сои, петуньи, томатов и табака.

Экспрессию гуманизированного антитела к IL-23p19 можно осуществить в клетках позвоночных животных. В настоящее время размножение клеток позвоночных в культуре (культура ткани) стало стандартной процедурой, и соответствующие методики являются широко распространенными. Примерами пригодных в качестве хозяев линий клеток млекопитающих являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированная SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линия клеток почки эмбриона человека (293 или клетки линии 293, субклонированные с целью выращивания в суспензионной культуре, Graham и др., J. Gen. Virol., 36, 1977, с. 59); клетки почки детеныша хомячка (ВНК, АТСС CCL 10); клетки яичника китайского хомячка/’DHFR (CHO, Urlaub и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1980, с. 4216); клетки Сертоли мыши (ТМ4, Mather, Biol. Reprod., 23, 1980, cc. 243-251); клетки почки обезьяны (CV1, АТСС CcL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, АТСС CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, АТСС CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, АТСС CCL 34); клетки печени бычьей крысы (BRL 3А, АТСС CRL 1442); клетки легкого человека (W138, АТСС CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, НВ 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562, АТСС CCL51); клетки TRI (Mather и др., Ann als N.Y. Acad. Sci., 383, 1982, cc. 44-68); клетки MRC 5; клетки FS4 и линия клеток гепатомы человека (Hep G2).

Клетки-хозяева трансформируют с помощью описанных выше экспрессионных или клонирующих векторов с целью получения гуманизированного антитела к IL-23p19 и культивируют в пригодных питательных средах, соответствующим образом модифицированных для индукции промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих требуемые последовательности.

Клетки-хозяева, которые применяют для получения гуманизированного антитела к IL-23p19, представленного в настоящем описании, можно культивировать в широком разнообразии сред. Для культивирования клеток-хозяев можно использовать имеющиеся в продаже среды, такие как среда Хэма F10 (фирма Sigma-Aldrich Co., Сент-Луис, шт. Миссури), минимальная поддерживающая среда ((MEM), фирма Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (фирма Sigma-Aldrich Co.) и модифицированная по методу Дульбекко среда Игла ((DMEM), фирма Sigma-Aldrich Co.). Кроме того, в качестве сред для культивирования клеток-хозяев можно использовать любые из сред, которые описаны в одной или нескольких следующих публикациях: Ham и др., Meth. Enz. 58, 1979, с. 44, Barnes и др., Anal. Biochem. 102, 1980, с. 255, US № 4767704, US № 4657866, US № 4927762, US № 4560655, US № 5122469, WO 90/103430 и WO 87/00195. Любую из этих сред при необходимости можно дополнять гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлорид и фосфат натрия, кальция, магния), буферами (такими как HEPES), нуклеотидами (такими как аденозин и тимидин), антибиотиками (такими как гентамицин), микроэлементами (т.е. неорганическими соединениями, которые обычно присутствуют в конечных концентрациях, находящихся в микромолярном диапазоне) и глюкозой или эквивалентным источником энергии. Специалистам в данной области должно быть очевидно, что можно включать также любые другие необходимые добавки в соответствующих концентрациях. Условия культивирования, такие как температура, значение рН и т.п., представляют собой условия, которые использовались ранее для клеток-хозяев, отобранных для экспрессии, и они должны быть очевидны обычному специалисту в данной области.

При использовании методов рекомбинации антитело может продуцироваться внутри клетки, в периплазматическом пространстве или непосредственно выделяться в среду. Если антитело продуцируется внутри клетки, то на первой стадии клетки можно разрушать для высвобождения белка.

Состоящий из отдельных частиц дебрис либо клеток-хозяев, либо лизированных фрагментов, можно удалять, например, с помощью центрифугирования или ультрафильтрации. У Carter и др., Bio/Technology, 10, 1992, cc. 163-167 описан метод выделения антител, секретируемых в периплазматическое пространство Е. coli. В целом, метод состоит в следующем: клеточную массу в виде пасты подвергают оттаиванию приблизительно в течение 30 мин в присутствии ацетата натрия (рН 3,5), ЭДТК и фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ). Клеточный дебрис можно удалять центрифугированием. Если антитело секретируется в среду, то супернатанты таких экспрессионных систем, как правило, сначала концентрируют с помощью имеющегося в продаже фильтра для концентрирования белков, например

- 39 042716 устройства для ультрафильтрации типа Amicon или Millipore Pellicon. На любой из предыдущих стадий для ингибирования протеолиза можно добавлять ингибитор протеазы, такой как ФМСФ, а для предупреждения увеличения нежелательных примесей можно добавлять антибиотики. Для выделения антитела из клетки-хозяина можно применять широкое разнообразие методов.

Композицию антитела, полученную из клеток, можно очищать, например, хроматографией на гидроксилапатите, гель-электрофорезом, диализом и аффинной хроматографией, при этом предпочтительным методом очистки является аффинная хроматография. Возможность применения белка А в качестве аффинного лиганда зависит от вида и изотипа Fc-области любого иммуноглобулина, присутствующей в антителе. Белок А можно использовать для очистки антител, основой которых являются человеческие тяжелые гамма1-, гамма2- или гамма4-цепи (Lindmark и др., J. Immunol. Meth., 62, 1983, cc. 1-13). Белок G рекомендуется для применения для всех мышиных изотипов и для человеческой гамма3-цепи (Guss и др., EMBO J., 5, 1986, cc. 1567-1575). В качестве матрицы, с которой связывается аффинный лиганд, наиболее часто применяют агарозу, однако можно использовать и другие матрицы. Устойчивые к механическим воздействиям матрицы, такие как стекло или поли(стиролдивинил)бензол с контролируемым размером пор, позволяют достигать более высоких скоростей потока и более короткого времени процесса по сравнению с характеристиками, достигаемыми при использовании агарозы. Если антитело содержит C_H3-домен, то для очистки можно использовать смолу типа Bakerbond ABX™ (фирма J.T. Baker, Филлипсбург, шт. Нью-Джерси). В зависимости от антитела, подлежащего выделению, можно применять также другие методы очистки белка, такие как фракционирование на ионообменной колонке, осаждение этанолом, ЖХВР с обращенной фазой, хроматография на силикагеле, хроматография на гепаринSEPHAROSE™, хроматография на анионо- или катионообменной смоле (например на колонке с полиаспартамовой кислотой), хроматофокусирование, ДСН-ПААГ и осаждение сульфатом аммония.

После любой(ых) из предыдущей(их) стадии (стадий) очистки смесь, содержащую представляющее интерес антитело и примеси, можно подвергать хроматографии, основанной на гидрофобном взаимодействии, при низком значении рН с использованием буфера для элюции, который имеет значение рН приблизительно от 2,5 до 4,5, хроматографию предпочтительно осуществляют при низких концентрациях солей (например, с использованием приблизительно 0-0,25М солей).

В изобретении раскрыты также нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются в расслабленных, умеренных или строгих условиях, указанных в настоящем описании, со всей или с частью (например, с участком, который кодирует вариабельную область) нуклеотидной последовательности, которая представляет собой выделенную(ые) полинуклеотидную(ие) последовательность(и), кодирующую(ие) антитело или фрагмент антитела, предлагаемое/предлагаемый в настоящей заявке. Гибридизующаяся область гибридизующейся нуклеиновой кислоты, как правило, состоит по меньшей мере из 15 (например, 20, 25, 30 или 50) нуклеотидов. Гибридизующаяся область гибридизующейся нуклеиновой кислоты идентична по меньшей мере на 80%, например, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% последовательности участка или всей нуклеиновой кислоты, которая кодирует анти-IL23р19 полипептид (например, вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи), или ее комплементу. Гибридизующиеся нуклеиновые кислоты представленного в настоящем описании типа можно применять, например, в качестве зонда для клонирования, праймера, например, ПЦР-праймера, или диагностического зонда.

Кроме того, в изобретении раскрыты выделенные полинуклеотиды, включающие последовательности, которые кодируют антитело или фрагмент антитела, имеющее/имеющий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 84, 86, 88, 90, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117 или 119, и которые по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичны полинуклеотидным последовательностям SEQ ID NO: 83, 85, 87, 89, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116 или 118.

А также выделенные полинуклеотиды, включающие последовательности, которые кодируют антитело или фрагмент антитела, имеющее/имеющий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 158, 160, 162 или 164, и которые по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичны полинуклеотидным последовательностям SEQ ID NO: 157, 159, 161 или 163.

В изобретении раскрыты также выделенные полинуклеотиды, включающие последовательности, которые кодируют антитело или фрагмент антитела, имеющее/имеющий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 121, 123, 125, 127, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154 или 156, и которые по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичны полинуклеотидным последовательностям SEQ ID NO: 120, 122, 124, 126, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153 или 155.

А также выделенные полинуклеотиды, включающие последовательности, которые кодируют антитело или фрагмент антитела, имеющее/имеющий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 166, 168, 170 или 172, и которые по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей

- 40 042716 мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичны полинуклеотидным последовательностям SEQ ID NO: 165, 167, 169 или 171.

И в изобретении раскрыты выделенные полинуклеотиды, включающие последовательности, которые кодируют антитело или фрагмент антитела, имеющее/имеющий аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична любой из аминокислотных последовательностей SeQ ID NO: 84, 86, 88, 90, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117 или 119.

В изобретении раскрыты также выделенные полинуклеотиды, включающие последовательности, которые кодируют антитело или фрагмент антитела, имеющее/имеющий аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 158, 160, 162 или 164; и выделенные полинуклеотиды, включающие последовательности, которые кодируют антитело или фрагмент антитела, имеющее/имеющий аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 121, 123, 125, 127, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154 или 156; и выделенные полинуклеотиды, включающие последовательности, которые кодируют антитело или фрагмент антитела, имеющее/имеющий аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 166, 168, 170 или 172. В контексте настоящего описания понятия идентичный или процент идентичности касательно двух или большего количества нуклеотидных или полипептидных последовательностей относится к двум или большему количеству последовательностей или подпоследовательностей, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент одинаковых нуклеотидов или аминокислотных остатков при сравнении и выравнивании для максимального соответствия. Для определения процента идентичности последовательности выравнивают для оптимального сравнения (например, можно интродуцировать бреши в последовательность первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности для оптимального сравнительного анализа первичной структуры со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или положениях нуклеотидов. Когда в положении в первой последовательности находится такой же аминокислотный остаток или нуклеотид, что и в соответствующем положении во второй последовательности, то молекулы являются идентичными в указанном положении. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией от количества идентичных положений в последовательностях (т.е. % идентичности = количество идентичных положений/общее количество положений (например, перекрывающихся положений) х100). Две сравниваемые последовательности могут иметь одинаковую длину после интродукции при необходимости брешей в последовательности (например, исключая дополнительную последовательность, простирающуюся за пределы последовательностей, подлежащих сравнению). Например, когда сравнивают последовательности вариабельных областей, то не рассматривают лидерные последовательности и/или последовательности константных доменов. При сравнении последовательностей двух последовательностей, соответствующий CDR относится к CDR, расположенному в одинаковом положении в обеих последовательностях (например, CDR-H1 каждой последовательности).

Определение процента идентичности или процента сходства между двумя последовательностями можно осуществлять с помощью математического алгоритма. Предпочтительным примером математического алгоритма, который можно применять для сравнения двух последовательностей, является (но не ограничиваясь только им) алгоритм Karlin и Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1990, cc. 2264-2268, модифицированный согласно Karlin и Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, cc. 5873-5877. Указанный алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST, описанные у Altschul и др., J. Mol. Biol. 215, 1990, cc. 403-410. Анализ нуклеотидов с помощью BLAST можно осуществлять с помощью программы NBLAST, в которой балл = 100, длина слова =12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных нуклеиновой кислоте, кодирующей представляющей интерес белок. Анализ белков с помощью BLAST можно осуществлять с помощью программы XBLAST, в которой балл = 50, длина слова = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных представляющему интерес белку. Для осуществления сравнительных анализов первичной структуры, включающей бреши, можно применять программу Gapped BLAST, описанную у Altschul и др., Nucleic Acids, 25, 1997, cc. 3389-3402. В другом варианте можно применять PSI-Blast для осуществления итерационного поиска, позволяющего определять отдаленные взаимосвязи между молекулами (Id.). При применении программ BLAST, Gapped BLAST и PSI-Blast можно применять задаваемые по умолчанию параметры соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). Другим предпочтительным примером (но не ограничиваясь только им) математического алгоритма, который можно применять для сравнения последовательностей, является

- 41 042716 алгоритм, описанный у Myers и Miller, CABIOS, 1989. Указанный алгоритм включен в программу ALIGN (версия 2.0), которая является частью пакета программ для сравнительного анализа первичной структуры последовательностей GCG. Когда программу ALIGN применяют для сравнения аминокислотных последовательностей, то можно применять таблицу взвешенных остатков РАМ120, штраф за длину бреши 12 и штраф за брешь 4. Дополнительные алгоритмы для анализа последовательностей известны в данной области и включают ADVANCE и ADAM, описанные у Torellis и Robotti, Comput. Appl. Biosci. 10, 1994, cc. 3-5; и FASTA, описанный у Pearson и Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1988, cc. 2444-2448. В программе FASTA параметр ktup обозначает контрольный параметр, который задает чувствительность и скорость поиска. Если ktup = 2, то сходные области в двух подлежащих сравнению последовательностях выявляют путем просмотра пар выровненных остатков; если ktup = 1, то оценивают индивидуальные выровненные аминокислоты. Для белковых последовательностей можно задавать значение ktup, равное 2 или 1, а для последовательностей ДНК значения в пределах от 1 до 6. Задаваемое по умолчанию значение ktup, если его не определяют специально, равно 2 в случае белков и равно 6 в случае ДНК. Альтернативно этому сравнительный анализ первичной структуры белковых последовательностей можно осуществлять с помощью алгоритма CLUSTAL W, описанного у Higgins и др., Methods Enzymol. 266, 1996, cc. 383-402.

Нетерапевтическое применение

Антитела, представленные в настоящем описании, можно применять в качестве средств, используемых для очистки на основе аффинности. При осуществлении этого процесса антитела иммобилизуют на твердой фазе, такой как смола, содержащая белок А, с помощью методов, хорошо известных в данной области. Иммобилизованное антитело приводят в контакт с образцом, содержащим белок IL-23p19 (или его фрагмент), который подлежит очистке, и затем подложку отмывают приемлемым растворителем, который должен удалять практически весь материал в образце кроме белка IL-23p19, связанного с иммобилизованным антителом. И, наконец, подложку отмывают другим приемлемым растворителем, который должен отделять белок IL-23p19 от антитела.

Антитела к IL-23p19, например, гуманизированные антитела к IL-23p19, можно применять также в диагностических анализах для выявления и/или количественной оценки белка IL-23, например, путем определения экспрессии IL-23 в конкретных клетках, тканях или сыворотке. Антитела к IL-23p19 можно использовать с целью диагностики, например, для мониторинга развития или прогрессирования заболевания, в качестве части клинической процедуры тестирования, например, для определения эффективности данной схемы лечения и/или профилактики. Выявление можно облегчать путем связывания антитела к IL-23p19. Примерами выявляемых субстанций являются различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминисцентные материалы, биолюминисцентные материалы, радиоактивные материалы, испускающие позитроны металлы, для выявления которых используют позитронэмиссионную томографию, и ионы нерадиоактивных парамагнитных металлов (см., например, US № 4741900, в котором описаны ионы металлов, которые можно конъюгировать с антителами для применения в диагностике, предлагаемой в настоящей заявке.

Антитела к IL-23p19 можно применять в методах диагностирования ассоциированного с IL-23 нарушения (например, нарушения, характеризующегося аномальной экспрессией IL-23) или для определения того, имеет ли индивидуум повышенный риск развития ассоциированного с IL-23 нарушения. Такие методы включают приведение в контакт биологического образца из организма индивидуума с антителом к IL-23p19 и определения связывания антитела с IL-23p19. Под биологическим образцом подразумевается любой биологический образец, полученный из индивидуума, клеточной линии, культуры ткани или другого источника клеток, потенциально экспрессирующих IL-23. Методы получения биопсий ткани и общей воды организма млекопитающих хорошо известны в данной области.

Метод может заключаться также в сравнении уровня IL-23 в образце из организма пациента и в контрольном образце (например, из организма индивидуума, у которого отсутствует ассоциированное с IL-23 нарушение) для определения того, имеет ли пациент ассоциированное с IL-23 нарушение или риск развития ассоциированного с IL-23 нарушения.

Целесообразно, например, для диагностических целей, метить антитело с помощью выявляемого фрагмента. Известны и доступны многочисленные выявляемые метки, такие как радиоизотопы, флуоресцентные метки, метки, представляющие собой субстраты для ферментов, и т.п. Метку можно конъюгировать с антителом опосредованным путем с помощью различных известных методик. Например, антитело можно конъюгировать с биотином, и любую из указанных выше меток, относящихся к трем широким категориям, можно конъюгировать с авидином, или наоборот. Биотин избирательно связывается с авидином и поэтому метку можно конъюгировать с антителом опосредованным путем. Альтернативно этому для достижения опосредованной конъюгации метки с антителом антитело можно конъюгирововать с небольшим гаптеном (таким как дигоксин) и одну из различных типов указанных выше меток конъюгировать с антителом к гаптену (например, антителом к дигоксину). Таким путем можно осуществлять опосредованную конъюгацию метки с антителом.

Примерами радиоизотопных меток являются ³⁵S, ¹⁴С, ¹²⁵ I, 3H и ¹³¹I. Антитело можно метить радиоизотопом с помощью методик, описанных, например, в Current Protocols in Immunology, т. 1 и 2, 1991,

- 42 042716 под ред. Coligen и др., изд-во Wiley-Interscience, New York, N.Y., 1991. Радиоактивность можно измерять, например, с помощью сцинтилляционного счетчика.

Примерами флуоресцентных меток являются известные метки, полученные на основе хелатов редкоземельных металлов (хелаты европия), или метки на основе флуоресцеина и его производных, родамина и его производных, дансила, лиссамина, фикоэритрина и техасского красного. Флуоресцентные метки можно конъюгировать с антителом с помощью известных методик, например, описанных в Current Protocols in Immunology, выше. Флуоресценцию можно оценивать количественно с помощью флуориметра.

В данной области известны различные хорошо охарактеризованные фермент-субстратные метки (см., например, обзор, приведенный в US № 4275149). Фермент, как правило, катализирует химическое изменение хромогенного субстрата, которое можно оценивать с помощью различных методик. Например, изменение может представлять собой изменение цвета субстрата, которое можно оценивать спектрофотометрически. В другом варианте фермент может изменять флуоресценцию или хемилюминисценцию субстрата. Методики количественной оценки изменения флуоресценции описаны выше. В результате химической реакции в хемилюминисцентном субстрате возникает электронно-возбужденнное состояние, вследствие чего он может испускать свет, который можно оценивать, например, с помощью хемилюминометра, или он является донором энергии для флуоресцентного акцептора.

Примерами ферментативных меток являются люциферазы, такие как люцифераза светляка и бактериальная люцифераза (US №4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малатдегидрогеназа, уреаза, пероксидаза, например, пероксидаза из хрена (HRPO), щелочная фосфатаза, фф-галактозидаза, глюкоамилаза, лизоцим, оксидазы сахаридов (такие как оксидаза глюкозы, оксидаза галактозы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа), оксидазы гетероциклических соединений (такие как уриказа и оксидаза ксантина), лактопероксидаза, микропероксидаза и т.п. Методики конъюгации ферментов с антителами описаны, например, у O'Sullivan и др., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, в: Methods in Enzym., под ред. J. Langone и Н. Van Vunakis, изд-во Academic Press, N.Y., 73, 1981, cc. 147-166.

Примерами комбинаций фермент-субстрат являются, например: пероксидаза из хрена (HRPO) и гидрогенпероксидаза в качестве субстрата, при этом гидрогенпероксидаза окисляет красительпредшественник, такой как ортофенилендиамин (OPD) или гидрохлорид 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ); щелочная фосфатаза (АР) и пара-нитрофенилфосфонат в качестве хромогенного субстрата; и βD-галактозидаза (β-D-Gal) и хромогенный субстрат, такой, например, как пара-нитрофенил-в-Dгалактозидаза, или флуорегенный субстрат, такой как 4-метилумбеллиферил-в-О-галактозидаза.

Специалистам в данной области известны многочисленные другие комбинации фермент-субстрат. Общий обзор представлен, например, в US № 4275149 и US №4318980.

В других вариантах гуманизированное антитело к IL-23p19 можноприменять в немеченом виде и выявляют с помощью меченого антитела, связанного с гуманизированным антителом к IL-23p19.

Антитела, представленные в настоящем описании, можно применять в любом известном методе анализа, таком как анализы связывания в условиях конкуренции, прямые и косвенные сэндвич-анализы и анализы на основе иммунопреципитации (см., например, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, изд-во CRC Press, Inc., 1987, cc. 147-158).

Антитело к IL-23p19 или его антигенсвязывающий фрагмент можно применять для ингибирования связывания IL-23 с рецептором IL-23. Указанные методы заключаются в том, что вводят антитело к IL23p19 или его антигенсвязывающий фрагмент в клетку (например, клетку млекопитающего) или окружающую клетку среду, тем самым ингибируя передачу сигналов, опосредуемую рецептором IL-23. Эти методы можно осуществлять in vitro или in vivo. Под окружающей клетку средой подразумевается ткань, среда или внеклеточный матрикс, окружающий клетку. Антитело к IL-23p19 или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в окружающую клетку среду таким образом, что антитело или его фрагмент обладает способностью связываться с молекулами IL-23 вне клеточного окружения или в клеточном окружении, тем самым препятствуя связыванию IL-23 с его рецептором.

Диагностические наборы

Можно применять гуманизированное антитело к IL-23p19, входящее в состав диагностического набора, представляющего собой упаковку, которая содержит комбинацию реагентов, взятых в предварительно определенных количествах, в сочетании с инструкциями по осуществлению диагностического анализа. Если антитело мечено ферментом, то набор может включать необходимые для фермента субстраты и кофакторы, такие как субстрат-предшественник, образующий выявляемый хромофор или флуорофор. Кроме того, можно включать другие добавки, такие как стабилизаторы и буферы (например, блокирующий буфер или лизирующий буфер) и т.п. Относительные количества различных реагентов могут варьироваться в широких пределах, обеспечивая концентрации реагентов в растворе, которые в значительной степени оптимизируют чувствительность анализа. Реагенты могут представлять собой сухие порошки, как правило, лиофилизированные, включающие эксципиенты, которые при растворении должны образовывать раствор реагента, имеющий соответствующую концентрацию.

- 43 042716

Терапевтическое применение

Гуманизированное антитело к IL-23p19, представленное в настоящем описании, можно применять для лечения различных нарушений, ассоциированных с экспрессией IL-23p19, которые указаны в настоящем описании. Методы лечения ассоциированного с IL-23 нарушения заключаются в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве гуманизированное антитело к IL-23p19 индивидууму, который нуждается в этом.

Гуманизированное анти-Ш-23р19 антитело или агент вводят любыми приемлемыми путями, включая парентеральный, подкожный, внутрибрюшинный, внутрилегочный и интраназальный пути введения и, если требуется местное иммуносупрессорное лечение, путем введения в пораженную область (включая перфузию или другой путь обеспечения контакта трансплантата с антителом перед трансплантацией). Гуманизированное анти-ГЬ-23р19 антитело и агент можно вводить, например, с помощью инфузии или в виде болюса. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Кроме того, гуманизированное антитело к IL-23p19 можно вводить путем пульсирующей инфузии, прежде всего с использованием понижающих доз антитела. Дозирование можно осуществить путем инъекций, наиболее предпочтительно внутривенных или подкожных инъекций, в том числе в зависимости от того является ли обработка кратковременной или пролонгированной.

Для предупреждения или лечения заболевания соответствующая доза антитела должна зависеть от ряда факторов, таких как тип заболевания, подлежащего лечению, серьезность и процесс течения заболевания, применяют ли антитело для профилактических или терапевтических целей, предшествующая терапия, история болезни пациента и ответ на антитело, а также от предписания лечащего врача. Антитело можно вводить пациенту однократно или путем серий обработок.

В зависимости от типа и серьезности заболевания пациенту можно сначала вводить примерно от 1 мкг/кг до 20 мг/кг (например, 0,1-15 мг/кг) антитела в виде начальной предполагаемой дозы, например, посредством одного или нескольких введений или путем непрерывной инфузии. Как правило, суточная доза должна составлять от примерно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от указанных выше факторов. Для повторных введений в течение нескольких дней или более продолжительного периода времени, в зависимости от состояния, лечение продолжают до требуемого подавления имеющихся симптомов заболевания. Однако можно применять другие схемы введения доз. Успех указанной терапии легко оценивать общепринятыми методами и анализами. Пример схемы введения доз представлен в WO 94/04188. В контексте настоящего описания понятие подавление имеет такое же значение, что и понятия облегчение и купирование, и относится к ослаблению одной или нескольких характеристик заболевания.

Композицию антитела можно включать в препаративную форму, дозировать и вводить в соответствии с надлежащей клинической практикой. Важные в этом плане факторы включают конкретное нарушение, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние индивидуального пациента, причину нарушения, область введения агента, метод введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим медикам. В этой связи терапевтически эффективное количество антитела, подлежащего введению, регулируют таким образом, чтобы оно представляло собой минимальное количество, необходимое для предупреждения, облегчения или лечения нарушения, ассоциированного с экспрессией IL-23.

Антитело необязательно, но в определенных случаях, включают в препаративную форму в сочетании с одним или несколькими средствами, применяемыми в настоящее время для предупреждения или лечения рассматриваемого нарушения. Эффективное количество указанных других средств зависит от количества гуманизированного антитела к IL-23p19, присутствующего в препаративной форме, типа нарушения или лечения и других указанных выше факторов. Их, как правило, применяют в таких же дозах и с использованием таких же путей введения, в которых их применяли ранее, или с использованием в дозе, составляющей примерно от 1 до 99% от их принятых для применения доз.

Ассоциированные с IL-23 нарушения

Антитела или агенты к IL-23p19 можно применять для лечения или предупреждения иммунологического нарушения, характеризующегося аномальной экспрессией IL-23, например, несоответствующей активацией иммунных клеток (например, лимфоцитов или дендритных клеток). Указанная аномальная экспрессия IL-23 может быть связана, например, с повышенными уровнями белка IL-23. Антитела к IL23p19 или их антигенсвязывающие фрагменты могут найти применение также и для лечения или предупреждения респираторных нарушений, метаболических нарушений, например, сахарного диабета, и определенных типов рака. Лечение или предупреждение иммунологического нарушения, респираторного нарушения, метаболического нарушения или рака с использованием способов, указанных в настоящем описании, осуществляют путем введения индивидууму, который нуждается в таком лечении или предупреждении, в эффективном количестве анти-IL-23р19 антитело или агент, при этом антитело уменьшает активность IL-23, ассоциированную с болезненным состоянием.

Иммунологические заболевания, которые отличаются несоответствующей активацией иммунных клеток и которые можно лечить или предупреждать с помощью способов, предлагаемых в настоящем

- 44 042716 описании, можно классифицировать, например, по типу(ам) реакции(ий) гиперчувствительности, которая(ые) лежит(ат) в основе нарушения. Эти реакции, как правило, разделяют на 4 типа: анафилактические реакции, цитотоксические (цитолитические) реакции, иммунные комплексные реакции или реакции клеточно-опосредованного иммунитета (CMI) (которые обозначают также как реакции замедленной гиперчувствительности (DTH) (см., например, Fundamental Immunology, под ред. William E. Paul, изд-во Raven Press, N.Y., 3-е изд., 1993). Иммунологические заболевания включают воспалительные заболевания и аутоиммунные заболевания.

Конкретными примерами указанных иммунологических заболеваний являются: ревматоидный артрит, аутоиммунные демиелинизирующие заболевания (например, рассеянный склероз, аллергический энцефаломиелит), эндокринная офтальмопания, увеоретинит, системная красная волчанка, тяжелая псевдопаралитическая миастения, болезнь Грейвса, гломерулонефрит, аутоиммунное гепатологическое нарушение, воспалительное заболевание кишечника (например, болезнь Крона или неспецифический язвенный колит), анафилаксия, аллергическая реакция, синдром Шегрена, сахарный диабет типа I, первичный билиарный цирроз, грануломатоз Вегенера, фибромиалгия, полимиозит, дерматомиозит, воспалительный миозит, множественная эндокринная недостаточность, синдром Шмидта, аутоиммунный увеит, болезнь Аддисона, воспаление надпочечника, тиреоидит, тиреоидит Хашимото, аутоиммунное заболевание щитовидной железы, пернициозная анемия, атрофия желудка, хронический гепатит, волчаночный гепатит, атеросклероз, подострая кожная красная волчанка, гипопаратиреоидзм, синдром Дресслера, аутоиммунная тромбоцитопения, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, гемолитическая анемия, пузырчатка обыкновенная, пузырчатка, дерматит герпетиформный, гнездная алопеция, пемфигоид, склеродерма, прогрессирующий системный склероз, CREST-синдром (кальциноз, болезнь Рейно, эзофагит (нарушение моторики пищевода), склеродактилия и телеангиоэктазия), мужское и женское аутоиммунное бесплодие, анкилозирующий спондилит, неспецифический язвенный колит, смешанная соединительнотканная болезнь, нодозный полиартериит, системный некротизирующий васкулит, атопический дерматит, атопический ринит, синдром Гудпасчера, болезнь Шагаса, саркоидоз, ревматическая атака, астма, привычный выкидыш, антифосфолипидный синдром, экзогенный аллергический альвеолит, полиформная эритема, посткардиотомический синдром, синдром Кушинга, аутоиммунный хронический активный гепатит, аллергия птицеловов, токсический эпидермальный некролиз, синдром Альпорта, альвеолит, аллергический альвеолит, фиброзный альвеолит, интерстициальное заболевание легких, узловатая эритема, гангренозная пиодермия, реакция на трансфузию, артерит Такаясу, ревматическая полимиалгия, преходящий артерит, шистосомоз, гингантоклеточный артерит, аскариоз, аспергиллез, синдром Самптера, экзема, лимфоматоидный грануломотоз, болезнь Бехчета, синдром Каплана, болезнь Кавасаки (известная также как синдром Кавасаки или кожно-слизисто-лимфожелезистный синдром), лихорадка Денге, энцефаломиелит, эндокардит, эндомиокардиальный фиброз, эндофтальмит, стойкая возвышающаяся эритема, псориаз, псориатический артрит, эритробластоз плода, эозинофильный фасциит, синдром Шульмана, синдром Фелти, филариоз, циклит, хронический циклит, гетерохронический циклит, циклит Фукса, IgA-нефропатия, пурпура Геноха-Шенлейна, реакция трансплантат-против-хозяина, отторжение трансплантата, кардиомиапатия, синдром Итона-Лэмберта, рецидивирующий полихондрит, криоглобулинемия, макроглобулемия Вальденстрема, синдром Эванса, острый респираторный дистресс-синдром, воспаление легких, остоеопороз, реакция замедленной гиперчувствительности и аутоиммунная гонадная дисфункция.

Иммунологическое заболевание может представлять собой также псориаз. Псориаз представляет собой хроническое воспалительное заболевание кожи, характеризующееся дисфункциональной дифференцировкой и гиперпролиферацией кератиноцитов и значительным накоплением воспалительных Тклеток. Например, воспалительное заболевание включает бляшковидный псориаз, например, хронический бляшковидный псориаз, например, хронический бляшковидный псориаз от умеренного до серьезного, например, у пациентов, которые являются кандидатами для лечения с использованием системной терапии или фототерапии. Например, иммунологическое заболевание включает ладонный пустулезный псориаз, каплевидный псориаз, инверсный псориаз, пустулезный псориаз или эритродермный псориаз.

Кроме того, иммунологическое заболевание может представлять собой болезнь Крона. Болезнь Крона (CD) представляет собой воспалительное заболевание пищеварительного тракта, характеризующееся хроническими трансмуральными воспалительными повреждениями эпителиального барьера и слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта. CD может поражать любую область ЖК-тракта, наиболее часто терминальный отдел подвздошной кишки. CD, как правило, состоит из процесса рецидивов и ремиссий и приводит к постоянному острому и длительному опасному заболеванию и повышенно смертности. У пациентов часто развиваются местные осложнения (например, свищи, абсцессы), системные осложнения (например, увеиты, артриты) или связанные с лечением побочные действия, и они могут нуждаться в обширном хирургическом вмешательстве. Примерно по одной трети пациентов относится к каждой из таких категорий как слабая умеренная и серьезная болезнь. Пациенты с болезнью Крона от умеренной до серьезной имеют истощающее заболевание с такими клиническими признаками как боль в брюшной области, диарея, образование абсцесса и свищи.

Иммунологическое заболевание представляет собой спондилоартрит. В другом случае заболевание

- 45 042716 представляет собой анкилозирующий спондилит (так называемый спондилоартрит с радиографическими признаками). Анкилозирующий спондилит (AS; радиографический аксиальный спондилоартрит) представляет собой прототипическую форму спондилоартритов (SpA). Оно представляет собой калечащее развивающееся бессимптомно ревматологическое заболевание, которое чаще встречается у мужчин, чем у женщин, и оно поражает молодых индивидуумов; у 80% пациентов симптомы начинают проявляться в возрасте менее 30 лет. Оно характеризуется воспалительным компонентом, который соответствует определенному баллу активности анкилозирующего спондилита (Ankylosing Spondylitis Activity Score (ASAS)), который применяют в качестве меры улучшения в опытах по оценке лечения. Кроме того, аномальный рост кости приводит к образованию костных выростов (синдесмофиты), видимых на обзорной рентгенографии, что сопровождается повышенной спинальной ригидностью, приводящей в конце концов к анкилозу кости и деформациям позвоночника. А также иммунологическое заболевание может представлять собой аксиальный спондилоартрит без радиографических признаков. Аксиальный спондилоартрит без радиографических признаков (nrSpA), открыт позднее, чем AS, вероятно, он представляет собой более раннее проявление таких же патологических процессов, что и свойственные AS, хотя, как часто установлено для некоторых пациентов (особенно женщин) может не развиваться до болезни с радиографическими признаками, и поэтому может рассматриваться как другой подтип указанного заболевания. Заболевание может представлять собой периферический спондилоартрит. Периферический спондилоартрит можно определять по присутствию артрита, энтезита или дактилита в сочетании либо по меньшей мере с одним специфическим для SpA-признаком (псориаз, воспалительное заболевание кишечник, предшествующая инфекция, HLA-B27, увеит, саркоилиит при визуализации), либо по меньшей мере с двумя остальными SpA-признаками (артрит, энтезит, дактилит, воспалительная боль в спине, наличие в семейном анамнезе SpA). Это определение применяют, например, в ASAS (Международное общество по изучению спондилоартритов), см., например, Carron Р. и др., Curr Opinion Rheumatol 24, 2012, cc. 370374). Иммунологическое нарушение представляет собой опосредуемое Т-клетками иммунологическое нарушение и, таким образом, антитела или агенты к IL-23p19, представленные в настоящем описании, можно применять также для лечения или предупреждения опосредуемых Т-клетками иммунологических нарушений.

IL-23p19 антитела или агенты можно применять для лечения или предупреждения респираторного нарушения, при котором происходит аномальная экспрессия IL-23. Лечение или предупреждение респираторного нарушения с использованием способов, указанных в настоящем описании, осуществляют путем введения индивидууму, который нуждается в таком лечении или предупреждении, в эффективном количестве анти-Ш-23р19 антитело или агент, при этом антитело уменьшает активность IL-23, ассоциированную с болезненным состоянием. Они включают (но не ограничиваясь только ими): жалобы, связанные с респираторной функцией, обструктивные легочные заболевания различного происхождения, эмфизему легких различного происхождения, облитерирующие легочные заболевания, интерстициальные пульмональные заболевания, интерстициальную болезнь легких, муковисцидоз, бронхиты различного происхождения, бронхоэктаз, РДСВ (респираторный дистрес-синдром взрослых) и все формы легочного отека; обструктивные легочные заболевания, выбранные из ХОЗЛ (хроническое обструктивное заболевание легких), астмы, бронхиальной астмы, педиатрической астмы, серьезной астмы, острых приступов астмы и хронического бронхита; эмфизему легких, происхождение которой связано с ХОЗЛ (хроническое обструктивное заболевание легких) или с дефицитом ингибитора а1-протеиназы; облитерирующие легочные заболевания, выбранные из аллергического альвеолита, облитерирующих легочных заболеваний, которые инициируются работой с вредными токсичными веществами, таких как асбестоз или силикоз, и облитерации, связанной с опухолями легких, такими как карциноматозный лимфагиоз, бронхоальвеолярная карцинома и лимфомы; пневмонию, вызванную инфекциями, такими, например, как инфекция, связанная с вирусами, бактериями, грибами, простейшими, гельминтами или другими патогенами, пневмонит, вызываемый различными факторами, такими, например, как аспирация и левожелудочковая сердечная недостаточность, индуцированный облучением пневмонит или фиброз, коллагеноз, такой, например, как красная волчанка, системная склеродермия или саркоидоз, грануломатоз, такой, например, как болезнь Бека, идиопатическая интерстициальная пневмония или идиопатический пневмосклероз (ИПФ); муковисцидоз, бронхит, вызванный бактериальной или вирусной инфекцией, аллергический бронхит и токсический бронхит; бронхоэктаз; отек легких, например, токсический отек легких после аспирации или ингаляции токсических субстанций и чужеродных субстанций; ринит, артрит и родственные артропатии, псориаз, миелоидный лейкоз, рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, гломерулонефрит и хронический атопический дерматит.

Анти-ГЕ-23р19 антитела или агенты можно применять также для лечения различных типов рака, при которых происходит аномальная экспрессия IL-23.

Типы рака, при которых происходит экспрессия IL-23, которые можно лечить с помощью способов, предлагаемых в настоящем описании, включают, например, лейкоз, например, острый лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз (например, миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный лейкоз или эритролейкоз), хронический лейкоз, хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз или хронический лимфоцитарный лейкоз; истинную полиците

- 46 042716 мию; лимфому (например, болезнь Ходжкина или неходжкинскую лимфому); множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема; болезнь тяжелых цепей; плотные (солидные) опухоли, такие как саркомы и карциномы (например, фибросаркома, миксосаркома, липосаркома, хондросаркома, остеогенная саркома, остеосаркома, хордома, ангиосаркома, эндотелиосаркома, лимфангиосаркома, лимфангиоэндотелиосаркома, синовиома, мезотелиома, опухоль Юинга, лейомиосаркома, рабдомиосаркома, карцинома ободочной кишки, колоректальная карцинома, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичника, рак предстательной железы, плоскоклеточная карцинома, базальноклеточная карцинома, аденокарцинома, карцинома потовой железы, карцинома сальной железы, папиллярная карцинома, папиллярные аденокарциномы, цистаденокарцинома, медуллярная карцинома, бронхогенная карцинома, почечноклеточная карцинома, гепатома, карцинома желчного протока, хориокарцинома, семинома, эмбриональная карцинома, опухоль Вильмса, рак шейки матки, рак матки, рак яичка, карцинома легкого, мелкоклеточная карцинома легкого, немелкоклеточная карцинома легкого, карцинома мочевого пузыря, эпителиальная карцинома, глиома, астроцитома, медуллобластома, краниофарингиома, эпендимома, пинеалома, гемангиобластома, невринома слухового нерва, олигодендроглиома, менингиома, маланома, нейробластома, ретинобластома, назофаренгиальная карцинома или эзофагеальная карцинома).

Анти-ГЬ-23р19 антитела и агенты также можно применять также для лечения дискоидной красной волчанки, малярии, злокачественной меланомы, гипопластической анемии, болезни Гентигтона, ладонно-подошвенного пустулеза, IgA-нефрита, ANCA-ассоциированного васкулита, склерита или сепсиса.

Фармацевтические композиции и их введение

Композицию, содержащую IL-23р19-связывающий агент (например, антитело к IL-23p19), можно вводить индивидууму, который страдает или имеет риск развития иммунологического нарушения, респираторного нарушения или рака. В изобретении раскрыто применение IL-23р19-связывающего агента (например, антитела к IL-23p19) для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики или лечения рака, респираторного нарушения или иммунологического нарушения. Понятие индивидуум в контексте настоящего описания означает любого больного млекопитающего, которому можно вводить ГЬ-23р19-связывающий агент, включая, например, человека и млекопитающих кроме человека, таких как приматы, грызуны и собаки. С использованием способов, представленных в настоящем описании, можно лечить, в частности людей. Антитела или агенты можно вводить индивидуально или в сочетании с другими композициями для профилактики или лечения иммунологического нарушения, респираторного нарушения или рака. Такие композиции, которые можно применять в сочетании с антителами или агентами, включают метотрексат (МТХ) и иммуномодуляторы, например, антитела или малые молекулы.

Примерами антител для применения в указанных фармацевтических композициях являются антитела, представляющие собой гуманизированное антитело или фрагмент антитела, которое/который имеет любую из аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 84, 86, 88, 90, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117 или 119. Примерами антител для применения в указанных фармацевтических композициях являются также антитела, представляющие собой гуманизированное антитело или фрагмент антитела, которое/который имеет любую из аминокислотных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 121, 123, 125, 127, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154 или 156.

Дополнительными примерами антител для применения в указанных фармацевтических композициях являются антитела, представляющие собой гуманизированное антитело или фрагмент антитела, которое/который имеет любую из аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 158, 160, 162 или 164. Предпочтительными антителами для применения в указанных фармацевтических композициях являются также антитела, которые представляют собой гуманизированное антитело или фрагмент антитела, которое/который имеет любую из аминокислотных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 166, 168, 170 или 172.

Дополнительными примерами антител для применения в указанных фармацевтических композициях являются антитела, представляющие собой гуманизированное антитело или фрагмент антитела, которое/который имеет любую из аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 160 и 166, SEQ ID NO: 160 и 168, SEQ ID NO: 158 и 166 или SEQ ID NO: 158 и 168.

Дополнительными примерами антител для применения в указанных фармацевтических композициях являются антитела, представляющие собой гуманизированное антитело, которое имеет любую из аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 174 или 180. Предпочтительными антителами для применения в указанных фармацевтических композициях являются также антитела, которые представляют собой гуманизированное антитело, которое имеет любую из аминокислотных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 176 или 178.

Дополнительными примерами антител для применения в указанных фармацевтических композициях являются антитела, представляющие собой Антитело А, Антитело В, Антитело С или Антитело D.

Известны различные системы введения и их можно использовать для введения Ш-23р19связывающего агента. Методы интродукции включают (но не ограничиваются только ими) внутрикож

- 47 042716 ный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и оральный пути. ГЕ-23р19-связывающий агент можно вводить, например, путем инфузии, в виде болюса или инъекции, и его можно вводить вместе с другими биологически активными средствами, такими как химиотерапевтические средства. Введение может быть системным или местным. Введение может представлять собой подкожную инъекцию. Препаративные формы для таких инъекций можно приготавливать, например, в виде предварительно заполненных шприцев, и их можно применять с недельным интервалом.

IL-23р19-связывающий агент можно вводить с помощью инъекции, с помощью катетера, с помощью суппозитория или с помощью имплантата, где имплантат состоит из пористого, непористого или гелеобразного материала, включая мембрану, такую как мембрана из силастика, или волокно. Как правило, при введении композиции используют вещества, которые не абсорбируют анти-IL-23p19 антитело или агент.

В других вариантах анти-IL-23р19 антитело или агент можно вводить с помощью системы с контролируемым высвобождением. Или можно использовать насос (см. например, Langer, Science 249, 1990, cc. 1527-1533; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14, 1989, с 201; Buchwald и др., Surgery 88, 1980, с. 507; Saudek и др., N. Engl. J. Med., 321, 1989, с 574), а такжне можно использовать полимерные материалы (см., например, Medical Applications of Controlled Release, под ред. Langer и Wise, изд-во CRC Press, Boca Raton, Florida, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, под ред. Smolen и Ball, изд-во Wiley, New York, 1984; Ranger и Peppas, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23, 1983, с 61; см. также Levy и др., Science 228, 1985, с. 190; During и др., Ann. Neurol. 25, 1989, с. 351; Howard и др., J. Neurosurg. 81, 1989, с. 105). У Langer, выше, обсуждены другие системы с контролируемым высвобождением.

IL-23р19-связывающий агент (например, антитело к IL-23p19) можно вводить в виде фармацевтических композиций, содержащих в терапевтически эффективном количестве связывающий агент и один или несколько фармацевтически совместимых ингредиентов.

Фармацевтическую композицию можно приготавить согласно общепринятым процедурам с получением фармацевтической композиции, пригодной для внутривенного или подкожного введения человеку. Как правило, композиции для введения путем инъекции представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости фармацевтическое средство может содержать также солюбилизирующий агент и местный анестетик, такой как лигнокаин, для снятия боли в месте инъекции. Как правило, ингредиенты поставляются либо по отдельности, либо их смешивают с получением стандартной дозы лекарственного средства, например, в виде сухого лиофилизованного порошка или не содержащего воду концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества действующего вещества. В тех случаях, когда фармацевтическое средство предназначено для введения путем инфузии, то его можно разливать по бутылям для инфузий, содержащим стерильную воду или физиологический раствор фармацевтической степени чистоты. В тех случаях, когда фармацевтическое средство вводят с помощью инъекции, то можно использовать ампулу со стерильной водой для инъекций или физиологическим раствором для того, чтобы ингредиенты можно было перемешивать перед введением.

Кроме того, фармацевтическую композицию можно включать в фармацевтический набор, который содержит (а) контейнер с IL-23p19-связывающим агентом (например, антителом к IL-23p19) в лиофилизованной форме и (б) второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый разбавитель (например, стерильную воду) для инъекций. Фармацевтически приемлемый разбавитель можно использовать для восстановления или разведения лиофилизованного анти-Ш-23р19 антитела или агента. Необязательно к указанному(ым) контейнеру(ам) может прилагаться уведомление в форме, утвержденной официальным агентством, разрешающим производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, где в уведомлении отражено разрешение агентства на производство, применение или продажу с целью введения людям.

Количество ГЬ-23р19-связывающего агента (например, антитела к ГЕ-23р19), которое является эффективным для лечения или профилактики иммунологического нарушения или рака, можно определять обычными методами клинических исследований. Кроме того, необязательно можно использовать анализы in vitro, результаты которых могут способствовать определению оптимальных пределов доз. Точная доза для применения в препаративной форме должна зависеть также от пути введения и стадии развития иммунологического нарушения или рака, и она должна приниматься на основе рекомендаций лечащего врача и обстоятельств, характерных для каждого пациента. Эффективные дозы можно определять путем экстраполяции на основе кривых дозовой зависимости, полученных по результатам опытов in vitro или на модельных тест-системах с использованием животных.

Как правило, доза антитела к IL-23p19 или Ш-23р19-связывающего агента, которую вводят пациенту с иммунологическим нарушением или с раком, для которого характерна экспрессия IL-23p19, составляет примерно от 0,1 до примерно 100 мг/кг веса тела индивидуума. Доза, вводимая индивидууму, составляет от примерно 0,1 до примерно 50 мг/кг, от примерно 1 до примерно 30 мг/кг, от примерно 1 до примерно 20 мг/кг, от примерно 1 до примерно 15 мг/кг или от примерно 1 до примерно 10 мг/кг веса

- 48 042716 тела индивидуума.

Примерами доз являются (но не ограничиваются только ими) дозы, составляющие от 1 нг/кг до 100 мг/кг. Доза может составлять примерно 0,5, примерно 1, примерно 2, примерно 3, примерно 4, примерно 5, примерно 6, примерно 7, примерно 8, примерно 9, примерно 10, примерно 11, примерно 12, примерно 13, примерно 14, примерно 15 или примерно 16 мг/кг. Дозу можно вводить, например, каждый день, раз в неделю (каждую неделю), два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, раз в две недели или ежемесячно, каждые два месяца или каждые три месяца. Доза может составлять примерно 0,5 мг/кг/неделю, примерно 1 мг/кг/неделю, примерно 2 мг/кг/неделю, примерно 3 мг/кг/неделю, примерно 4 мг/кг/неделю, примерно 5 мг/кг/неделю, примерно 6 мг/кг/неделю, примерно 7 мг/кг/неделю, примерно 8 мг/кг/неделю, примерно 9 мг/кг/неделю, примерно 10 мг/кг/неделю, примерно 11 мг/кг/неделю, примерно 12 мг/кг/неделю, примерно 13 мг/кг/неделю, примерно 14 мг/кг/неделю, примерно 15 мг/кг/неделю или примерно 16 мг/кг/неделю. В некоторых вариантах пределы доз могут составлять от примерно 1 мг/кг/неделю до примерно 15 мг/кг/неделю.

Фармацевтические композиции, содержащие ГЬ-23р19-связывающий агент, могут дополнительно включать терапевтическое средство, конъюгированное или неконъютированное со связывающим агентом. Антитело к IL-23p19 или IL-23р19-связывающий агент можно вводить совместно с одним или несколькими терапевтическими средствами, применяемыми для лечения или профилактики иммунологических нарушений или рака.

Такая комбинированная терапия может область аддитивным или синергетическим действием в отношении признаков заболевания (например, тяжести проявления симптома, количества симптомов или частоты рецидивов).

При применении схем лечения при комбинированном введении антитело к IL-23p19 или Ш23р19связывающий агент можно вводить одновременно с терапевтическим средством. Или ввести до или после введения антитела к Ш23р19 или Ш23р19-связывающего агента, по меньшей мере, в течение периода времени, составляющего от 1 ч до нескольких месяцев, например, в течение по меньшей мере 1 ч, 5 ч, 12 ч, одних суток, недели, месяца или трех месяцев до или после введения антитела к IL-23p19 или ГЬ-23р19-связывающего агента.

Например, фармацевтическая композицияможет содержать молекулу антитела, например, молекулу антитела, представленную в настоящем описании, и сукцинатный буфер, кроме того может содержать сукцинатный буфер в концентрации 50мМ или менее.

Фармацевтическая композиция может содержать молекулу антитела, например, молекулу антитела, представленную в настоящем описании, в концентрации 1-40 мг/мл, а также содержит сукцинатный буфер в концентрации от 5 до 50мМ и хлорид натрия в концентрации от 50 до 200мМ. В одном из вариантов рН фармацевтической композиции может составлять от 6,0 до 7,0. В одном из вариантов фармацевтическая композиция может содержать молекулу антитела в концентрации от 2,5 до 30 мг/мл, или она может содержать молекулу антитела в концентрации от 5 до 20 мг/мл. В другом варианте фармацевтическая композиция может содержать сукцинатный буфер в концентрации от 10 до 40мМ или в концентрации от 20 до 30мМ. Кроме того, фармацевтическая композиция может содержать хлорид натрия в концентрации от 75 до 175мМ или в концентрации от 100 до 150мМ. Фармацевтическая композиция может содержать также поверхностно-активное вещество, например, полисорбат 20 (Твин 20), например, в концентрации 0,20 г/л. Молекула антитела в фармацевтической композиции может представлять собой антитело А, антитело В, антитело С или антитело D.

Фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящей заявке, содержит молекулу антитела в концентрации 10 мг/мл, сукцинатный буфер в концентрации 25мМ, хлорид натрия в концентрации 125мМ, Твин 20 в концентрации 0,02%, и имеет рН от 6,0 до 7.0. Значение рН фармацевтической композиции может составлять 6,5. Или молекула антитела в фармацевтической композиции может представлять собой антитело А, антитело В, антитело С или антитело D.

Следующим вариантом может быть фармацевтическая композиция, содержащая молекулу антитела в концентрации от 70 до 100 мг/мл, например, молекулу антитела, представленную в настоящем описании, и сорбит в концентрации от 100 до 300мМ или фармацевтическая композиция, содержащая также сукцинатный буфер в концентрации 25мМ или менее. В одном из вариантов значение рН указанной фармацевтической композиции может составлять от 5,5 до 6,5 или рН может составлять от 5,5 до 6,1. Фармацевтическая композиция может содеожать молекулу антитела в концентрации от 80 до 95 мг/мл. В другом варианте фармацевтическая композиция может содержать сукцинатный буфер в концентрации 10мМ или менее, в другом варианте она может содержать сукцинатный буфер в концентрации 5мМ или менее, или в концентрации по меньшей мере 1мМ, или в концентрации по меньшей мере 2,5мМ, или в концентрации от 1 до 10мМ, или в концентрации от 2,5 до 5мМ. Фармацевтическая композиция может содержать сорбит в концентрации от 150 до 300мМ, в следующем варианте она может содержать сорбит в концентрации от 175 до 275мМ, в следующем варианте она может содержать сорбит в концентрации от 200 до 250мМ. В другом варианте фармацевтическая композиция может содержать также поверхностноактивное вещество, например, полисорбат 20 (Твин 20), например, в концентрации 0,20 г/л. Молекула антитела в фармацевтической композиции может представлять собой антитело А, антитело В, антитело С

- 49 042716 или антитело D.

В другом варианте фармацевтическая композиция может содержать молекулу антитела в концентрации 90 мг/мл, сукцинатный буфер в концентрации 4,4мМ, сорбит в концентрации 225мМ и Твин 20 в концентрации 0,02%, и имеет рН от 5,5 до 6,5. Или рН указанной фармацевтической композиции может составлять от 5,5 до 6,1. В одном из вариантов значение рН фармацевтической композиции может составлять 5,8. Молекула антитела в фармацевтической композиции может представлять собой антитело А, антитело В, антитело С или антитело D.

В другом варианте фармацевтическая композицияможет содержать молекулу антитела в концентрации 90 мг/мл, сорбит в концентрации 240мМ, и Твин 20 в концентрации 0,02%, и имеет рН от 5,5 до 6,5. Значение рН указанной фармацевтической композиции может составлять от 5,5 до 6,1 или значение рН фармацевтической композиции может составлять 5,8. Молекула антитела в фармацевтической композиции может представлять собой антитело А, антитело В, антитело С или антитело D.

Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем описании, более подробно описаны ниже. Фармацевтические композиции, указанные в настоящем описании, обладают физико-химической стабильностью и сохраняют целостность антитела, входящего в указанную фармацевтическую композицию, например, при хранении в течение 8 недель при 40°С, что продемонстрировано ниже.

Изделия

В изобретении раскрыто изделие, содержащее вещества, пригодные для лечения нарушений, описанных выше. Изделие включает контейнер и этикетку. Приемлемыми контейнерами являются, например, бутыли, флаконы, шприцы и лабораторные пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая является эффективной для лечения конкретного состояния, и может иметь стерильный порт доступа. Например, контейнер может представлять собой мешок или флакон для внутривенного раствора, имеющий запирающее устройство, проницаемое для инъекционной иглы для подкожного введения. Действующее вещество в композиции представляет собой гуманизированное антитело к IL-23p19. На этикетке на контейнере или связанной с ним указывается, что композиция используется для лечения выбранного состояния. Изделие может дополнительно включать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно может дополнительно включать другие вещества, присутствие которых желательно с коммерческой и потребительской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковку с инструкциями по применению.

Изобретение описано ниже с помощью представленных примеров, которые не направлены на ограничение объема изобретения.

Примеры

Пример 1. Получение гуманизированных антител к IL-23p19.

Мышиное лидерное антитело 6В8 превращали в химерное антитело, состоящее из вариабельного домена мышиного 6В8 и константного домена человеческого IgG1KO. Мышиное антитело 6В8 представлено выше в табл. 1 и 2. IgG1KO (knock out, выключение) несет две заместительные мутации (трансверсии) (Leu234Ala и Leu235Ala), которые элиминируют ADCC- и CDC-активность путем снижения эффекторных функций, таких как связывание с FcyR и комплементом. Вариабельные домены мышиных и химерных антител являются идентичными. Химерные антитела создавали для подтверждения функции антитела и для гарантии того, что получена правильная последовательность. Затем вариабельную область антитела гуманизировали посредством конструирования и процесса скрининга. Получали библиотеку, в которой человеческие и мышиные остатки варьировали таким образом, чтобы в любом конкретном положении мог находиться либо человеческий, либо мышиный остаток. Указанную библиотеку создавали для тех аминокислотных остатков, которые были различными у человеческой зародышевой линии и мышиного антитела. Отбирали только те клоны, у которых сохранялась функция родительского мышиного антитела. Репрезентативные гуманизированные вариабельные области антитела 6В8 представлены в табл. 5 и 6.

Таким образом, антитело А, антитело В, антитело С и антитело D представляли собой гуманизированные антитела, выведенные из мышиного антитела 6В8 (клонированного в каркасе человеческого IgG1-KO (KO: сокращение knock-out)/каппа). Антитела А, В, С и D представлены в табл. 7.

Пример 2. Связывание антител с рекомбинантным белком IL-23.

А) Данные о кинетике и аффинности связывания мышиных антител к IL-23p19 с рекомбинантным человеческим IL-23 представлены ниже (табл.9). Кинетические характеристики и аффинность связывания оценивали на основе технологии Fortebio Octet (фирма Fortebio, Менло-Парк, шт. Калифорния), используя материал, полученный из гибридомы, после одной очистки на колонке. Поскольку Octet не представляет собой технологию на основе жидкостей, то этот метод не позволяет точно определять скорость диссоциации. В некоторых случаях удавалось оценить только аффинность.

- 50 042716

Таблица 9

Антитело	ка(1/Мс)	kd(l/c)	KD(nM)
18С4	3,84Е+05	2Д4Е-06	5,57
18Е 5	3,29Е+05	2,61Е-06	7,93
18D3	ЗД9Е+05	2Д6Е-06	6,78
20Е8	4,21Е+05	2,69Е-04	638
22Е2	3,46Е+05	3,53Е-04	1024
24А5	2,02Е+05	4,57Е-06	22,6
15С11	4Д1Е+05	1,07Е-05	26
43F5	1,72Е+05	5,96Е-06	34,6
27G8	1,57Е+05	4,26Е-06	27,2
31Н9	2,99Е+05	3,45Е-06	И,5
2D1		< 1Е-6	< 1
9D12		< 1Е-6	< 1
6В8		< 1Е-6	< 1
73Н10	5,29Е+04	5,24Е-06	99,2
74НЗ	3,06Е+04	2,09Е-06	68,3
35Н8
26F7	4,76Е+05	1Д4Е-05	28,1
34G3	9Д8Е+05	ЗД0Е-05	32,8
34D9	3,44Е+03	1,87Е-06	544

Б) Оценивали аффинность гуманизированных антител, выведенных из мышиного антитела 6В8. Данные о кинетике связывания, измеренные с помощью устройства ProteON XPR36 (фирма Biorad, Геркулес, шт. Калифорния) и глобальной аппроксимации на основе модели связывания 1:1, продемонстрировали, что взаимодействия между рекомбинантным IL-23, который либо содержал состоящий из 21 аминокислот линкер, ковалентно связанный с субъединицами р19 и р40, либо не содержал указанный линкер, характеризовались высокой аффинностью в диапазоне 1пМ ~ 100пМ (табл. 10). Тестировали также антитело 6Н12 (описанное в WO 2007/027714), антитело QF20 (описанное в WO 2007/024846) и антитело С1273 (описанное в WO 2007/005955).

Таблица 10

Антитело	Человеческий IL-23 с линкером	Человеческий IL-23 без линкера
ка (1/Мс)	kd (1/с)	KD (пМ)	ка (1/Мс)	kd (1/с)	KD (пМ)
мышиное антитело 6В8				5,57Е+05	1,38Е-05	24,5
Антитело А	6,27Е+05	< 1Е-6	< 1	5,51Е+05	< 1Е-6	< 1
Антитело В	3,56Е+05	< 1Е-6	< 1	5Д7Е+05	< 1Е-6	< 1
Антитело С	3,74Е+05	1Д9Е-05	31,8	4,54Е+05	1,65Е-05	36,3
Антитело D	3,82Е+05	4,07Е-05	107	3,66Е+05	4,93Е-05	135
С-1273				3,60Е+05	5,75Е-06	15,8
6Н12				4,99Е+05	1,07Е-04	214
QF20				2,03Е+05	5,89Е-06	2,91

В) Аффинность и кинетические характеристики связывания антител к IL-23p19 с IL-23 обезьян циномолгус измеряли с помощью устройства ProteON XPR36 и глобальной аппроксимации на основе модели связывания 1:1 (табл. 11). Тестировали также антитело 6Н12 (описанное в WO 2007/027714), антитело QF20 (описанное в WO 2007/024846) и антитело С1273 (описанное в WO 2007/005955).

Таблица 11

Антитело	KD (пМ)	ка (1/Мс)	kd (1/с)
Антитело А	< 1	2,95Е+06	< 1Е-6
Антитело В	< 1	2,99Е+06	< 1Е-6
Антитело С	2,9	3,23Е+06	9,36Е-06
Антитело D	15,9	2,07Е+06	3,29Е-05
С-1273	>5000	п/а	п/а

- 51 042716

6Н12	157	9,91Е+05	1,56Е-04
QF20	1,2	3,90Е+06	4,78Е-06

Г) Селективность на молекулярном уровне в отношении человеческого IL-12.

Антитела к IL-23p19 в концентрации 100нМ инъецировали также на поверхность, покрытую человеческим IL-12. Сигнал связывания указанных антител, измеренный с использованием технологии Fortebio Octet, равнялся нулю, что свидетельствует о том, что эти антитела избирательно связываются с человеческим IL-23. Связывание антител к IL-23p19 с IL-23 анализировали также в присутствии 50% человеческой сыворотки, и обнаруженное отсутствие существенного воздействия сыворотки на скорость ассоциации демонстрирует высокую специфичность.

Пример 3. Анализ связывания в конкурентных условиях человеческого IL-23, связывающегося с человеческим IL-23R/Fc.

Человеческий IL-23R-Fc иммобилизовали на поверхности биосенсора и инъецировали 10нМ человеческий IL-23. Сенсограммы свидетельствовали о специфическом связывании между IL-23 и рецептором IL-23 (фиг. 2, верхний график). Затем антитела совместно инъецировали с 10нМ человеческим IL-23 для решения вопроса о том, может ли связывание антитела с IL-23 ингибировать взаимодействие между IL-23 и рецептором IL-23. В этом примере было установлено, что, если антитело связывается с человеческим IL-23 и обладает способностью ингибировать взаимодействие, то имеет место пониженное связывание или отсутствие связывания (фиг. 2, нижний график). В этом примере представлены данные для Антитела А, которое применяли в эквивалентной молярной концентрации, инъецировали совместно с 10нМ рекомбинантным человеческим IL-23.

Пример 4. Функциональные клеточные анализы, ингибирование производства IL-17 в стимулированных IL-23 мышиных спленоцитах.

Один из функциональных клеточных анализов антител к IL-23p19 позволял измерять способность ингибировать стимулированное IL-23 производство IL-17 в мононуклеарных клетках, выделенных из селезенки мышей. Человеческий рекомбинантный белок IL-23 обладает способностью стимулировать высвобождение IL-17 из мышиных спленоцитов. Кроме того, для стимуляции производства IL-17 в мышиных мононуклеарных клетках можно применять встречающийся в естественных условиях источник человеческого IL-23, присутствующий в супернатанте активированных человеческих моноцитарных ТНР-1-клеток.

Человеческий рекомбинантный IL-23 или встречающийся в естественных условиях IL-23 из активированных ТНР-1-клеток предварительно инкубировали с титрованными антителами к IL-23p19. Затем комбинации IL-23/антитело добавляли к свежевыделенным мышиным спленоцитам. Образец, в который входил только рекомбинантный IL-23, применяли в качестве положительного контроля. После культивирования в течение 2 дней клеточные супернатанты собирали и анализировали в отношении IL-17 с помощью ELISA (фирма R&D Systems, Миннеаполис, шт. Миннесота). Ниже приведены репрезентативные величины IC₅₀ для антител к IL-23p19. Изученные антитела представляли собой мышиные антитела, выведенные из гибридом (строки 1-19, см. табл.1 и 2), химерные антитела (строки 20-23) и Антитела A-D. Тестировали также антитело 6Н12 (описанное в WO 2007/027714), антитело QF20 (описанное в WO 2007/024846) и антитело С1273 (описанное в WO 2007/005955).

- 52 042716

Таблица 12

Антитело	Величины 1С5о (пМ), рекомбинантный человеческий IL23	Величины 1С5о (пМ), встречающийся в естественных условиях человеческий IL-23
18С4	471	100,413
18Е5	не определяли	9, 9, 13
18D3	234	не определяли
20Е8	не определяли	438, 561
22Е2	61, 130	117,35
24А5	22, 37	85, 31
15С11	126	232
43F5	250,8000	8000
27G8	235	5000
31Н9	960	2000
2D1	не определяли	2336, 1911, 1597
9D12	59	281, 138
6В8	13	8,2
73Н10	1411	не определяли
74НЗ	1352	не определяли
36Н8	не определяли	не определяли
26F7	27	2, 8
34G3	336	27, 25
34D9	510	456
химерное 18Е5	31	8, 36, 10, 9
химерное 22Е2	100	9, 178
химерное 24А5	404	95, 102
химерное 6В8	26, 37, 57	5,2,6, 3
Антитело А	5, 5, 5, 15	1,1
Антитело В	13, 30, 54, 42	9, 8
Антитело С	53, 71, 162, 89	16, 32
Антитело D	236,225,614,458	133,125
6Н12	1600,806, 1300	957,4400, 1013,439
QF20	не определяли	7, 12
С1273	не определяли	93, 44

Пример 5. Определение функциональной специфичности в отношении IL-12 с помощью анализа с использованием человеческих активированных Т-клеток.

Тестировали антитела к IL-23p19 в отношении функционального ингибирования IL-12 с помощью анализа с использованием человеческих активированных Т-клеток. Человеческий рекомбинантный IL-12 (1 нг/мл) предварительно инкубировали с антителами к IL-23p19 в концентрации 5 мкг/мл. Затем добавляли комбинацию IL-12/антитело к полученным с использованием ФГА (фитогемагглютинин) бластным Т-клеткам. Образец, содержащий только рекомбинантный IL-12, применяли в качестве положительного контроля. Антитело к IL-12p70 (фирма Bender MedSystems, Вена, Австрия) применяли в качестве контрольного ингибирующего антитела. После культивирования в течение 2 дней клеточные супернатанты собирали и анализировали в отношении IFN-γ с помощью ELISA (фирма R&D Systems). Образцы оценивали в трех повторностях и определяли средний уровень IFN-γ. Результаты (с указанием стандартных отклонений) приведены ниже в таблице.

- 53 042716

Таблица 13

Антитело	Стимуляция цитокина	Средний уровень (пг/мл) IFN-γ ± стандартное отклонение
антитело отсутствует	нет	87 ± 7
антитело отсутствует	1 нг/мл IL-12	532 ± 51
химерное 18Е5	1 нг/мл IL-12	511 ± 3
химерное 6В8	1 нг/мл IL-12	523 ± 60
Антитело А	1 нг/мл IL-12	497 ± 30
Антитело В	1 нг/мл IL-12	537 ± 2
Антитело С	1 нг/мл IL-12	495 ± 25
Антитело D	1 нг/мл IL-12	539 ± 38
антитело к IL12р70	1 нг/мл IL-12	119 ± 12

Пример 6. Ингибирование индуцируемого IL-23 фосфорилирования STAT3 на человеческой клеточной линии DB.

Человеческая клеточная линия DB (ATCC, Манасас, шт. Виргиния) отвечает на стимуляцию IL-23 при использовании эндогенного комплекса IL-23R (IL-23R и IL-12Re1) и в ней происходит фосфорилирование STAT3 в зависимости от дозы IL-23. Осуществляли анализ для оценки ингибирования антителом к IL-23p19 индуцируемого IL-23 фосфорилирования STAT3. DB-клетки высевали из расчета 1х10Е6 клеток/лунку в 96-луночный планшет. Подлежащие тестированию антитела серийно разводили и предварительно инкубировали с рекомбинантным человеческим IL-23 (10 нг/мл) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем к клетками добавляли смесь антитело/IL-23 в течение 30 мин при 37°С. Клетки собирали центрифугированием при 4°С в течение 10 мин и затем лизировали в охлажденном на льду буфере (фирма Cell Signaling Technology, Беверли, шт. Массачусетс). Часть лизата использовали для анализа с помощью ELISA, предназначенного для оценки фосфо-STAT3 (фирма Invitrogen). Величины IC50 для антител рассчитывали в виде процента ингибирования фосфорилирования STAT3 по сравнению с контрольными лунками без антитела. Репрезентативные величины IC50 приведены ниже в таблице.

Таблица 14

Антитело	1С50 (пМ)
Антитело А	25, 15, 38, 23, 13, 18
Антитело В	73, 84
Антитело С	132, 80
Антитело D	158
QF20	26, 26, 27
С-1273	163,438

Пример 7. Модель in vivo индуцируемого IL-23 производства цитокинов в ухе мышей.

Применяли созданную на мышах модель in vivo. Рекомбинантный человеческий IL-23 инъецировали в кожу уха мышей в течение 4 последовательных дней, что приводило к эпидермальному утолщению и повышающей регуляции белков IL-17 и IL-22. На этой модели оценивали антитела к IL-23p19. Осуществляли одну внутрибрюшинную инъекцию антитела в дозе 1 мг/кг или 5 мг/кг за 1 ч до начала введения IL-23 в кожу. Рекомбинантный человеческий IL-23 (с линкером) инъецировали один раз в день в течение 3 дополнительных дней, и получали образцы ткани для оценки цитокинов. Продемонстрировано, что антитела ингибировали производство цитокинов. Ниже в таблице представлены результаты трех экспериментов (пример 1: строки 1-7, пример 2: строки 8-10, пример 3: строки 11-14).

- 54 042716

Таблица 15

	Ткань уха, IL-17 пг/мл среднее значение ± ско	Ткань уха, процент ингибирования IL-17	Ткань уха, IL-22 пг/мл среднее значение ± СКО	Ткань уха, процент ингибирования IL-22
0,1% БСА + цитратный буфер i.p. (нестимулированный контроль)	3 ± 1	NA	1 ± 0	NA
0,3 мкг IL-23 + цитратный буфер i.p. (наполнитель в качестве контроля)	25 ± 3	NA	274 ± 30	NA
0,3 мкг IL-23 + 1 мг/кг антитела 6В8	7± 2	81	57 ± 19	80
0,3 мкг IL-23 + 1 мг/кг Антитела А	2± 1	101	17 ± 3	94
0,3 мкг IL-23 + 1 мг/кг Антитела В	5 ± 1	93	30 ± 2	89
0,3 мкг IL-23 + 1 мг/кг Антитела С	11 ± 1	66	108 ± 12	61
0,3 мкг IL-23 + 1 мг/кг Антитела D	10 ± 1	67	151 ± 12	45
0,1% БСА + наполнитель (нестимулированный контроль)	14 ± 1	NA	1 ± 1	NA
0,3 мкг IL-23 + наполнитель	31 ± 4	NA	129 ± 29	NA
0,3 мкг IL-23 + 5 мг/кг 24А5	14 ± 1	102	10 ± 5	93
0,1% БСА + mlgG (нестимулированный контроль)	17 ± 1	NA	4 ± 1	NA
0,3 мкг IL-23 + mlgG (наполнитель в качестве контроля)	30 ± 2	NA	208 ± 40	NA
0,3 мкг IL-23 + 5 мг/кг 24А5	16 ± 0	109	28 ± 5	88
0,3 мкг IL-23 + 5 мг/кг 18Е5	21 ± 2	70	53 ± 41	80

Пример 8. Фармакокинетические исследования на обезьянах циномолгус.

Гуманизированные антитела к IL-23p19 вводили путем десятиминутной внутривенной инфузии в дозе 1,0 мг/кг трем обезьянам циномолгус. Образцы сыворотки получали в течение 6-недельного периода и концентрации свободных антител оценивали с помощью специфического ELISA. Профили зависимости концентрации в сыворотке от времени для антител и соответствующие фармакокинетические параметры обобщены ниже в табл. 16.

Таблица 16

Антитело	CL (мл/д/кг)	Объем (мл/кг)	AUC (нМ ч/мл)	Т1/2 (дни)	MRT (дни)
Антитело А	5,2	88	32262	12,1	17,2
Антитело В	6,0	87	27030	10,1	14,8
Антитело С	4,7	91	34642	14,1	19,6
Антитело D	3,4	67	47633	12,6	19,8

Пример 9. Экспрессия в NSO-клетках и биофизические данные.

Трансфекция NSO-клеток и получение стабильных пулов: NSO-клетки выращивали в присутствии 1% FBS перед трансфекцией. Собирали 40х10⁶ клеток и ресуспендировали в 0,8 мл в средах, содержащих 2% FBS, с 20 мкг линеаризованной ДНК (экспрессионные векторы тяжелой цепи и легкой цепи) и затем клетки инкубировали на льду в течение примерно 15 мин перед электропорацией клеток при 750 В/25 мкФ (фирма Bio-Rad, устройство Gene Pulser Xcell). Клетки выделяли с помощью 2% FBS в течение примерно 48 ч при 37°С и 5% CO₂, затем высевали из расчета 2х10⁵ клеток/мл в 96-луночные планшеты, содержащие G418 и микофеноловую кислоту, и выдерживали в течение 14-21 дня до форми

- 55 042716 рования колоний.

Супернатанты из 96-луночных планшетов, содержащих колонии, подвергали скринингу с помощью ELISA. Планшеты для ELISA сенсибилизировали козьим антителом к каппа-цепи в концентрации 1 мкг/мл (фирма Southern Biotech, Бирмингем, шт. Алабама) в ЗФР и разведенный супернатант инкубировали и затем оценивали с помощью козьего антитела к человеческому IgG Fc-HRP (фирма Jackson ImmunoResearch Laboratories, Вест-Гроув, шт. Пенсильвания). Дающие положительную реакцию колонии объединяли для размножения. Титры образовавшихся антител определяли с помощью устройства фирмы ForteBio, используя покрытые белком А насадки согласно протоколу производителя. Титры антитела А и антитела D составляли 250-350 мг/л, при этом извлечение белка после очистки составляло более 80%, и после очистки электродиализом и ионообменом (IEX) обнаружено более 94% мономеров. Белки ресуспендировали в конечном буфере, содержащем 20мМ цитрат натрия и 115мМ NaCl, pH 6,0, и они сохраняли стабильность при 4°С в течение по меньшей мере 4 месяцев и их растворимость в указанном буфере составляла вплоть до 100 мг/мл.

Таблица 17

	Колонка с белком А	1ЕХ-колонка
Титр (мг/л)	Выход (мг/л)	Извлечение	Выход (мг/л)	Извлечение
Антитело А	345	275	80%	221	80%
Антитело D	248	225	90%	175	78%

Таблица 18

	Качество	Стабильность	Растворимость
АУЦ, свежевыделенное (%М)	ГФХ, свежевыделенное (%М)	АУЦ 1 мес. (%М)	ГФХ 1 мес. (%М)	АУЦ 4 мес. (%М)	ГФХ 4 мес. (%М)	АУЦ при 100 мг/мл (%М)
Антитело А	98	99	97	99	96	99	99
Антитело D	94	100	98	100	99	99	97

АУЦ: аналитическое ультрацентрифугирование, основанное на измерении скорости осаждения при концентрациях 0,5-1 мг/мл; ГФХ: гель-фильтрационнная хроматография; %М: процент мономеров.

Пример 10. Эпитопное картирование.

Применяли масс-спектрометрию на основе водородно/дейтериевого обмена (HXMS) для картирования эпитопа антитела А, связывающегося с человеческой субъединицей IL-23p19. С помощью этого метода определяли чувствительность водородного амидного каркаса IL-23p19 к обмену на D₂O. Эксперимент проводили с использованием только IL-23 и IL-23 с добавлением антитела А. Таким путем идентифицировали области в последовательности IL-23p19, для которых установлена выраженная защита от обмена в результате связывания с антителом А. Разрешение метода определяли по пептидам, образовавшимся при расщеплении пепсином или протеазой XVIII. Указанные выведенные из IL-23p19 пептиды идентифицировали с помощью дополнительных контрольных экспериментов с образцами, в которых не осуществляли обмен, применяя стандартные точные методики определения массы и ЖХВР-МС/МС.

Применяли рекомбинантный человеческий IL-23. В случае образца, содержащего белок + антитело, 50 мкл IL-23 (0,8 мг/мл) инкубировали с 10 мкл антитела А (12,7 мг/мл) в течение 15 мин при комнатной температуре. Конечное молярное соотношение антитело A/IL-23 составляло 1,2:1.

Для осуществления обмена 5 мкл белка IL-23 добавляли к 50 мкл дейтерированного буфера (50мМ ЗФР в D₂O) и инкубировали в течение 100 с при комнатной температуре. Добавляли 50 мкл 2М мочевины/0,5М ТСЕР и инкубировали в течение 60 с при комнатной температуре. Добавляли 5 мкл пепсина или протеазы XVIII (4 мг/мл в 0,1% муравьиной кислоты) и образец немедленно охлаждали до 4°С.

Через 5 мин 50 мкл образца инъецировали в ЖХВР-систему Shimadzu (контролирующее устройство SCL10A и два насоса LC10AD) в следующих условиях.

Подвижная фаза А: 99/1/0,1 (вода/ацетонитрил/муравьиная кислота).

Подвижная фаза Б: 95/5/0,1 (ацетонитрил/вода/муравьиная кислота).

Скорость потока: 100 мкл/мин.

Колонка: Phenomenex Jupiter C5, 5 мкм, 50x1,0 мм.

Линии подвижных фаз, колонка, петля инжектора находились в ледяных банях.

Градиент: момент времени 0 (3%Б), момент времени 2,2 (3%Б), момент времени 10,1 (90%Б), момент времени 12,0 (90%Б), момент времени 12,1 (3%Б).

Масс-спектрометрию осуществляли следующим образом:

Масс-спектрометр: Thermo Orbitrap Velos (0900865).

- 56 042716

Методы.

А. Фрагментация (до ID-пептидов): 12 мин - время захвата (3-минутная задержка на старте), полное сканирование на основе масс-спектрометрии с Фурье-преобразованием (FTMS) при разрешении 30000, семь сканированных изображений данных в зависимости от ионного захвата (CID).

Б. МС-погоны: 12 мин - время захвата (3-минутная задержка на старте), полное сканирование на основе FTMS при разрешении 60000.

Пептиды, полученные после обработки пепсином и протеазой XVIII, идентифицировали с использованием данных о фрагментации и программы Proteome Discoverer (фирма Thermoscientific, Уолтем, шт. Массачусетс). Идентифицированные пептиды визуализировали путем сравнения (индивидуальный белок в сравнении с белком в присутствии антитела), используя программу Xcalibur (фирма Thermoscientific). При осуществлении обмена вне IL-23р19-области не обнаружено никаких существенных сдвигов при оценке IL-23 индивидуально по сравнению с IL-23 в присутствии Антитела А. Для р19-области белка данные анализировали с использованием программы РерМар (фирма Thermoscientific). Эта программа позволяет рассчитывать среднюю массу измененных пептидов. Проверяли результаты, полученные с помощью РерМар, и те пептиды, для которых не были получены подтвержденные результаты, рассчитывали с помощью Microsoft Excel.

Области последовательности IL-23, для которых установлена выраженная защита от обмена в результате связывания с Антителом А, идентифицировали как содержащие аминокислотные остатки 108126 SEQ ID NO: 181 и аминокислотные остатки 137-151 SEQ ID NO: 181.

Пример 11. Фармацевтические композиции.

Ниже представлены примеры препаративных форм, пригодных для антитела, предлагаемого в настоящей заявке. Применяемые в указанных препаративных формах антитела, представляли собой, например, антитело А, антитело В, антитело С или антитело D.

Препаративная форма 1

Компоненты	Концентрация [ммоль/л]	Концентрация [г/л]	Номинальное количество [мг/флакон] V = 10,0 мл
антитело		10,0	100,0
янтарная кислота	0,7	0,083	0,8
гексагидрат динатрийсукцината	24,3	6,564	65,6
хлорид натрия	125	7,305	73,1
полисорбат 20	0,16	0,20	0,20
вода для инъекций	-	до 1 л	до 1 мл

Значение рН препаративной формы 1, как правило, составляет от 6,0 до 7,0, например, рН 6,5. Указанная препаративная форма наиболее пригодна для внутривенного введения.

Молекулярная масса (ММ в г/моль) применяемых эксципиентов: гексагидрат динатрийсукцината = 270,14 г/моль; янтарная кислота = 118,09 г/моль; хлорид натрия = 58,44 г/моль.

Осмотическое давление препаративной формы составляет 300 ± 30 мОсмолей/кг, что определено с помощью устройства Osmomat 030 (фирма Gonotec GmbH, Берлин, Германия). Плотность препаративной формы при 20°С составляла примерно 1,0089 г/см³, что определено с помощью устройства DMA 4500 (фирма Anton Paar GmbH, Остфильден-Шарнхаузен, Германия).

Препаративная форма 2

Компоненты	Концентрация [ммоль/л]	Концентрация [г/л]	Номинальное количество [мг/шприц] V = 1,0 мл
антитело	0,6	90,0	90,0
янтарная кислота	0,5	0,059	0,059
гексагидрат динатрийсукцината	3,9	1,054	1,054
сорбит	225	41,00	41,00
полисорбат 20	0,16	0,20	0,20
вода для инъекций	-	до 1 л	до 1 мл

Значение рН препаративной формы 2, как правило, составляет от 5,5 до 6,5, например, от 5,5 до 6,1, например, рН составляет 5,8. Эта препаративная форма наиболее пригодна для подкожного введения.

- 57 042716

Молекулярная масса(ММ в г/моль) применяемых эксципиентов:

ММ: янтарная кислота (СЩ^О,^ 118,09 г/моль.

ММ: гексагидрат динатрийсукцинат (СфОфХагНц ^х бЩО) = 270,14 г/моль.

ММ: сорбит = 182,17 г/моль.

ММ: полисорбат 20 = 1227,72 г/моль.

Осмотическое давление препаративной формы составляет 300±30 мОсмоль/кг, что определено с помощью устройства Osmomat 030 (фирма Gonotec GmbH, Берлин, Германия). Плотность препаративной формы при 20°С составляла примерно 1,040 г/см³, что определено с помощью устройства DMA 4500 (фирма Anton Paar GmbH, Остфильден-Шарнхаузен, Германия).

Препаративная форма 3

Компоненты	Концентрация [ммоль/л]	Концентрация [г/л]	Номинальное количество [мг/шприц] V = 1,0 мл
антитело	0,6	90,0	90,0
сорбит	240	43,733	43,733
полисорбат 20	0,16	0,20	0,20
вода для инъекций	-	ДО 1 л	до 1 мл

Значение рН препаративной формы 3, как правило, составляет от 5,5 до 6,5, например, от 5,5 до 6,1, например, рН составляет 5,8. Эта препаративная форма наиболее пригодна для подкожного введения.

Молекулярная масса(ММ в г/моль) применяемых эксципиентов: ММ: сорбит = 182,17 г/моль. ММ: полисорбат 20 = 1227,72 г/моль.

Осмотическое давление препаративной формы составляет 300±30 мОсмоль/кг, что определено с помощью устройства Osmomat 030 (фирма Gonotec GmbH, Берлин, Германия).

Пример 12. Стабильность фармацевтических композиций.

Фармацевтические композиции хранили при 40°С в течение 8 недель в шприце в случае препаративных форм 2 и 3. Свойства препаративных форм оценивали в начале опыта и после 8 недель хранения при 40°С, и полученные результаты представлены ниже.

Мутность выражали в нефелометрических единицах мутности (стандарт по формазину) (FNU), которые определяли с помощью нефелометрии. Процентное содержание мономеров определяли с помощью гель-фильтрации высокого разрешения (ВР-ГФХ).

Стабильность при хранении препаративных форм 2 и 3

	Препаративная форма 2 (начало/после хранения в течение 8 недель)	Препаративная форма 3 (начало/после хранения в течение 8 недель)
pH	5,7 / 5,8	5,6 / 5,7
осмотическое давление	298 / 301	312 / 308
мутность (FNU)	7 / 8	2 / 3
мономеры, %	99 / 97	99 / 97

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (11)

1. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело к IL-23P19, где указанное антитело включает легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 174, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 176, где указанная фармацевтическая композиция содержит 90 мг/мл указанного антитела и 0,16 ммоль/л полисорбата 20, где указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит (i) 240 ммоль/л сорбитола или (ii) 0,5 ммоль/л янтарной кислоты, 3,9 ммоль/л гексагидрата двунатриевого сукцината и 225 ммоль/л сорбитола, где значение рН указанной фармацевтической композиции составляет от 5,5 до 6,5.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанная фармацевтическая композиция содержит 90 мг/мл указанного антитела и 0,16 ммоль/л полисорбата 20, где указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит 240 ммоль/л сорбита.

3. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанная фармацевтическая композиция содержит 90 мг/мл указанного антитела и 0,16 ммоль/л полисорбата 20, где указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит 0,5 ммоль/л янтарной кислоты, 3,9 ммоль/л динатрий сукцината гексагидрата и 225 ммоль/л сорбита.

- 58 042716

4. Фармацевтическая композиция по п.1, где значение рН указанной фармацевтической композиции составляет от 5,5 до 6,1.

5. Применение фармацевтической композиции, содержащей антитело к IL-23P19 по п.1, для лечения индивидуума, имеющего ассоциированное с IL-23 нарушение, где указанное антитело связывается с человеческим IL-23, где нарушение является воспалительным заболеванием, аутоиммунным, респираторным, метаболическим или раковым.

6. Применение фармацевтической композиции по п.5, где заболевание представляет собой псориаз, воспалительное заболевание кишечника, псориатический артрит, рассеянный склероз, ревматоидный артрит или спондилоартрит.

7. Применение фармацевтической композиции по п.5, в котором заболевание представляет собой бляшковидный псориаз, хронический бляшковидный псориаз или хронический бляшковидный псориаз от умеренного до серьезного.

8. Применение фармацевтической композиции по п.5, в котором заболевание представляет собой ладонный пустулезный псориаз, каплевидный псориаз, инверсный псориаз, пустулезный псориаз или эритродермный псориаз.

9. Применение фармацевтической композиции по п.5, в котором заболевание представляет собой болезнь Крона или неспецифический язвенный колит.

10. Применение фармацевтической композиции по п.5, в котором заболевание представляет собой анкилозирующий спондилит, аксиальный спондилоартрит без радиографических признаков или периферический спондилоартрит.

11. Применение фармацевтической композиции по п.5, в котором заболевание представляет собой дискоидную красную волчанку, малярию, злокачественную меланому, гипопластическую анемию, болезнь Гентингтона, ладонно-подошвенный пустулез, IgA-нефрит, ANCA-ассоциированный васкулит, склерит или сепсис.