KR20160084472A - 항―ｖｅｇｆ 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 본원에서 VEGF에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 본 발명은 추가로, 항-VEGF 항체 및 항-VEGF 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 제조 방법을 제공한다.

Description

항―ＶＥＧＦ 항체 {ANTI-VEGF ANTIBODIES}

본 발명은 일반적으로 연구, 치료 및 진단 목적으로 유익한 특성을 갖는 항-VEGF 선택된 폴리펩티드 서열 및 항체에 관한 것이다.

혈관계의 발생은 많은 생리적 및 병리적 과정에서 기본적으로 요구되는 사항이다. 활발하게 성장하는 조직, 예를 들어, 배아 및 종양은 적절한 혈액 공급을 필요로 한다. 이들은 혈관신생으로 불리는 과정을 통해 새로운 혈관 형성을 촉진하는 전-혈관신생 인자를 생산함으로써 상기 필요를 만족시킨다. 혈관 형성은 하기 단계 모두를 또는 그들 다수를 포함하는, 복잡하지만 체계적인 생물학적 사건이다: a) 내피 세포 (EC)가 현존하는 EC로부터 증식하거나 기원 세포로부터 분화하고; b) EC가 이동하고 융합하여 코드-유사 구조를 형성하고; c) 이어서 혈관 코드는 관생성을 거쳐 중심 관강을 갖는 관을 형성하고; d) 현존 코드 또는 관이 싹을 내어 2차 관을 형성하고; e) 원시 혈관총은 추가의 재형성 및 재성형을 거치고; f) 주변-내피 세포가 동원되어 내피관을 둘러싸, 관에 유지 및 조절 기능을 제공하며; 상기 세포는 작은 모세혈관에 대한 혈관주위세포, 보다 큰 혈관에 대한 평활근 세포, 및 심장의 심근 세포를 포함한다 (문헌 [Hanahan, D. Science 277:48-50 (1997)]; [Hogan, B. L. & Kolodziej, P. A. Nature Reviews Genetics. 3:513-23 (2002)]; [Lubarsky, B. & Krasnow, M. A. Cell. 112:19-28 (2003)]).

혈관신생이 다양한 질병의 발병기전과 연루되어 있다는 것은 잘 확립되어 있다. 여기에는 고형 종양 및 전이, 아테롬성 동맥경화증, 수정체후 섬유증식증, 혈관종, 만성 염증, 안내 신생혈관 질환, 예컨대 증식 망막병증, 예를 들어, 당뇨 망막병증, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 신생혈관 녹내장, 이식된 각막 조직 및 다른 조직의 면역 거부, 류마티스성 관절염, 및 건선이 포함된다 (문헌 [Folkman et al., J. Biol . Chem ., 267:10931-10934 (1992)]; [Klagsbrun et al., Annu . Rev. Physiol. 53:217-239 (1991)]; 및 [Garner A., "Vascular diseases," In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710]).

종양 성장의 경우에, 혈관신생은 과다증식에서 신생물로의 이행 및 종양의 성장 및 전이를 위한 자양분을 공급하는데 있어 중요한 것으로 보인다 (문헌 [Folkman et al., Nature 339:58 (1989)]). 신생혈관형성은 정상 세포에 비해 종양 세포가 성장 이익과 증식 자율성을 획득하도록 한다. 종양은 보통 이용가능한 모세혈관층으로부터의 거리 때문에 수 세제곱 밀리미터의 크기로만 증식할 수 있는 비전형적인 단일 세포로서 시작하고, 장시간 동안 추가의 성장 및 전파없이 '휴면 상태'로 머무를 수 있다. 이어서 몇몇 종양 세포는 혈관신생 표현형으로 전환되어 내피 세포를 활성화시키고, 이는 증식하여 새로운 모세혈관으로 성숙해진다. 이들 새로 형성된 혈관은 원발성 종양의 지속적인 성장을 허용할 뿐만 아니라, 전이성 종양 세포의 전파 및 재콜로니 형성을 허용한다. 따라서, 종양 절편 내의 미세혈관의 밀도와 유방암 및 몇몇 다른 종양에서 환자 생존율 사이에 상호관련성이 있다는 것이 관찰되었다 (문헌 [Weidner et al., N. Engl . J. Med 324: 1-6 (1991)]; [Horak et al., Lancet 340: 1120-1124 (1992)]; [Macchiarini et al., Lancet 340:145-146 (1992)]). 혈관신생 전환을 제어하는 정확한 기전은 잘 알려지지 않았지만, 종양 덩어리의 신생혈관형성은 많은 혈관신생 자극제와 억제제의 순 균형으로부터 야기되는 것으로 생각된다 (문헌 [Folkman, Nat Med 1(1):27-31 (1995)]).

혈관 발생 과정은 긴밀하게 조절된다. 지금까지 현저하게 많은 분자 (주로 주변 세포에 의해 생성되어 분비된 인자)들이 EC 분화, 증식, 이동 및 코드-유사 구조로의 융합을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 혈관신생을 자극하고 혈관 투과성을 유도하는 핵심 인자로서 확인되었다 (문헌 [Ferrara et al., Endocr . Rev. 18:4-25 (1997)]). 심지어 단일 VEGF 대립유전자의 상실이 배아 치사 (embryonic lethality)를 야기한다는 발견은 혈관계의 발생 및 분화에 있어서 상기 인자에 의한 대체불가능한 역할을 지적한다. 또한, VEGF는 종양 및 안내 질병과 관련된 신생혈관형성의 핵심 조절자임이 밝혀졌다 (상기 문헌 [Ferrara et al., Endocr . Rev.]). VEGF mRNA는 검사된 대부분의 인간 종양에서 과다발현된다 (문헌 [Berkman et al., J. Clin . Invest. 91:153-159 (1993)]; [Brown et al., Human Pathol . 26:86-91 (1995)]; [Brown et al., Cancer Res. 53:4727-4735 (1993)]; [Mattern et al., Brit. J. Cancer 73:931-934 (1996)]; [Dvorak et al., Am. J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)]).

또한, 눈의 유액 내 VEGF의 농도 수준은 당뇨 및 그밖의 허혈-관련 망막병증에 걸린 환자에서 혈관이 활발하게 증식하는 것과 밀접하게 연관된다 (문헌 [Aiello et al., N. Engl . J. Med . 331:1480-1487 (1994)]). 또한, 연구에 의해 AMD 환자에서 맥락 신생혈관막에서 VEGF의 편재화가 증명되었다 (문헌 [Lopez et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37:855-868 (1996)]).

항-VEGF 중화 항체는 누드 마우스에서 다양한 인간 종양 세포주의 성장을 억제하고 (문헌 [Kim et al., Nature 362:841-844 (1993)]; [Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995)]; [Borgstrom et al., Cancer Res. 56:4032-4039 (1996)]; [Melnyk et al., Cancer Res. 56:921-924 (1996)]), 또한 허혈 망막 질병 모델에서 안내 혈관신생을 억제한다 (문헌 [Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996)]). 그러므로, 항-VEGF 모노클로날 항체 또는 다른 VEGF 작용의 억제제는 종양 및 다양한 안내 신생혈관 질병의 치료를 위한 유망한 후보물이다. 상기 항체는 예를 들어, EP 817,648 (1998년 1월 14일자 공개); 및 W098/45331과 W098/45332 (둘 모두 1998년 10월 15일자 공개)에 기재되어 있다. 항-VEGF 항체의 하나인 베바시주맙 (bevacizumab)은 전이성 결장직장암(CRC) 및 비-소세포 폐암 (NSCLC)을 치료하기 위한 화학치료 요법과의 조합 사용에 대하여 FDA에서 승인을 받았다. 다양한 암 적응증 치료를 위해 베바시주맙은 현재 많은 임상 시험에서 연구 진행되고 있다.

그밖의 항-VEGF 항체, 항-Nrp1 항체 및 항-Nrp2 항체도 역시 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Liang et al., J Mol Biol 366, 815-829 (2007)] 및 [Liang et al., J Biol Chem 281, 951-961 (2006)], PCT 공개공보 제WO2007/056470호 및 PCT 출원 제PCT/US2007/069179호에 기재되어 있고, 이들 특허 출원의 개시내용은 분명하게 본원에 참조로 포함된다.

본 발명은 신규한 항-VEGF 항체 및 그의 용도를 제공한다.

본원에서는 수많은 항-VEGF 항체가 제공된다. 예를 들어,

(i) 아미노산 서열 X₁X₂R X₃SL을 포함하는 HVR-L1 (이때 HVR-L1은 다음의 위치에서 임의의 조합으로 1, 2 또는 3개의 치환을 포함한다: X₁은 G 또는 A; X₂는 V 또는 I; 및/또는 X₃은 T 또는 R);

(ii) 아미노산 서열 DASSLA (서열 6)를 포함하는 HVR-L2;

(iii) 아미노산 서열 SYKSPL (서열 7)을 포함하는 HVR-L3;

(iv) 아미노산 서열 SISGSWIF (서열 1)를 포함하는 HVR-H1;

(v) 아미노산 서열 GAIWPFGGYTH (서열 2)를 포함하는 HVR-H2; 및

(vi) 아미노산 서열 RWGHSTSPWAMDY (서열 3)를 포함하는 HVR-H3

으로부터 선택된 6개의 HVR을 포함하는, VEGF에 결합하는 항체 또는 그의 단편이 제공된다.

다른 실시양태에서는,

(1) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;

(2) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;

(3) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;

(4) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;

(5) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및

(6) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3

을 포함하는, VEGF에 결합하는 항체 또는 그의 단편이 제공된다.

다른 실시양태에서는,

(1) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;

(2) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;

(3) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;

(4) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;

(5) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및

(6) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3

을 포함하는, VEGF에 결합하는 항체 또는 그의 단편이 제공된다.

다른 실시양태에서는, 경쇄 가변 도메인이 서열 44 또는 서열 45의 아미노산 서열을 포함하는 것인, VEGF에 결합하는 항체 또는 그의 단편이 제공된다.

다른 실시양태에서는, 항-VEGF 항체가 서열 43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열 44 또는 45의 아미노산 서열을 포함하는 것인 VEGF에 결합하는 항체 또는 그의 단편이 제공된다. 또다른 실시양태에서는, 항-VEGF 항체가 서열 43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열 44의 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 실시양태에서는, 항-VEGF 항체가 서열 43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열 45의 아미노산 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 상기 항체 중 어떤 것은 모노클로날 항체이다. 일 실시양태에서, 항체는 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 또는 (Fab')₂ 단편으로부터 선택된 항체 단편이다. 일 실시양태에서, 항체는 인간화된 것이다. 일 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 또다른 실시양태에서, 프레임워크 서열의 적어도 일부는 인간 컨센서스 프레임워크 서열이다.

본 발명은 상기 항체 중 임의의 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공한다. 일 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다. 항-VEGF 항체를 제조하는 방법 또한 제공된다. 예를 들어, 그러한 방법은 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 적합한 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계 및, 항체를 단리하는 단계를 포함한다.

일 측면에서는, 생물학적 시료 중에서 VEGF의 존재를 검출하는 방법이 제공되며, 그러한 방법은 본 발명의 항체가 VEGF에 결합가능하게 하는 조건하에서 생물학적 시료를 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계 및, 항체와 VEGF 사이에 복합체가 형성되었는지 유무를 검출하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 생물학적 시료 중에서 VEGF-항-VEGF 항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하며, 이때 항-VEGF 항체의 아미노산 서열은 서열 43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및, 서열 44 또는 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 상기 방법은 생물학적 시료 중에서 VEGF-항-VEGF 항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하며, 이때 항-VEGF 항체의 아미노산 서열은 서열 43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및, 서열 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 상기 방법은 생물학적 시료 중에서 VEGF-항-VEGF 항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하며, 이때 항-VEGF 항체의 아미노산 서열은 서열 43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및, 서열 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 검출가능하게 표지된다.

또한, 제약 조성물 및 치료 방법도 제공된다. 일 측면에서는, 본 발명의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 다른 측면에서는, 암을 치료하는 방법이 제공되며, 예를 들어 이 방법은 상기 항체 중 임의의 것을 포함하는 제약 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 치료되는 암에는 편평 세포 암, 소-세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포 암 (hepatocellular cancer), 위암 (gastric cancer), 위장관 암, 위장관 기질 암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암 (hepatoma), 유방암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 콩팥 또는 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 다양항 유형의 두경부암, 흑색종, 표재 확장성 흑색종, 악성 흑자 흑색종, 선단 흑자성 흑색종, 결절성 흑색종, B-세포 림프종, 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프모세포성 백혈병 (ALL); 모상 세포 백혈병; 만성 골수모세포성 백혈병; 이식후 림프증식성 질병 (PTLD), 모반증과 관련된 비정상적 혈관 증식, 뇌종양과 관련된 부종, 또는 메이그스 증후군 (Meigs' syndrome)이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 특정 실시양태에서, 치료 대상 종양, 암 또는 세포 증식성 질병은 결장암, 폐암, 유방암 또는 아교모세포종이다. 또다른 실시양태에서, 치료 대상체는 인간이다.

본 발명은 추가로 작용제, 예컨대 약물 또는 세포독성제와 접합된 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.

도 1은 항-VEGF 항체의 중쇄 및 경쇄 HVR 루프 서열이다. 본 도면은 중쇄 HVR 서열, H1, H2, 및 H3, 및 경쇄 HVR 서열, L1, L2, 및 L3을 도시한다. 서열 넘버링은 다음과 같다: 클론 B20-4.1.1 (HVR-H1은 서열 1이고; HVR-H2는 서열 2이고; HVR-H3은 서열 3이고; HVR-L1은 서열 4이고; HVR-L2는 서열 6이고; HVR-L3은 서열 7이다); 클론 B20-4.1.1RR (HVR-H1은 서열 1이고; HVR-H2는 서열 2이고; HVR-H3은 서열 3이고; HVR-L1은 서열 5이고; HVR-L2는 서열 6이고; HVR-L3은 서열 7이다).
아미노산 위치는 이하에서 기재하는 바와 같은 카바트 넘버링 시스템 (Kabat numbering system)에 따라 넘버링한다.
도 2a 및 2b는 본 발명을 서열 식별자와 함께 수행하는데 사용하기 위한, 다음과 같은 예시적인 수용자 인간 컨센서스 프레임워크 서열을 도시한다:
가변 중쇄 (VH) 컨센서스 프레임워크
인간 VH 하위군 I 컨센서스 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 8)
인간 VH 하위군 I 컨센서스 프레임워크 마이너스 확장된 초가변 영역 (서열 9-11)
인간 VH 하위군 II 컨센서스 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 12)
인간 VH 하위군 II 컨센서스 프레임워크 마이너스 확장된 초가변 영역 (서열 13-15)
인간 VH 하위군 II 컨센서스 프레임워크 마이너스 확장된 것
인간 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 16)
인간 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크 마이너스 확장된 초가변 영역 (서열 17-19)
인간 VH 수용자 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 20)
인간 VH 수용자 프레임워크 마이너스 확장된 초가변 영역 (서열 21-22)
인간 VH 수용자 2 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 23)
인간 VH 수용자 2 프레임워크 마이너스 확장된 초가변 영역 (서열 24-26)
아미노산 위치는 이하에서 기재하는 바와 같은 카바트 넘버링 시스템에 따라 넘버링한다.
도 3은 본 발명을 서열 식별자와 함께 수행하는데 사용하기 위한, 다음과 같은 예시적인 수용자 인간 컨센서스 프레임워크 서열을 도시한다:
가변 경쇄 (VL) 컨센서스 프레임워크
인간 VL 카파 하위군 I 컨센서스 프레임워크 (서열 27)
인간 VL 카파 하위군 II 컨센서스 프레임워크 (서열 28)
인간 VL 카파 하위군 III 컨센서스 프레임워크 (서열 29)
인간 VL 카파 하위군 IV 컨센서스 프레임워크 (서열 30)
도 4는 huMAb4D5-8 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 영역 서열을 도시한다. 윗첨자/볼드체의 숫자는 카바트에 따른 아미노산 위치를 나타낸다.
도 5는 huMAb4D5-8 중쇄 및 경쇄의 변형된/변이체 프레임워크 영역 서열을 도시한다. 윗첨자/볼드체의 숫자는 카바트에 따른 아미노산 위치를 나타낸다.
도 6은 항-VEGF 항체 B20-4.1.1 및 B20-4.1.1RR에 대한 경쇄 HVR 서열 L1, L2 및 L3의 아미노산 서열을 도시한다.
도 7은 항-VEGF 항체 B20-4.1.1 및 B20-4.1.1RR에 대한 중쇄 HVR 서열 H1, H2, 및 H3의 아미노산 서열을 도시한다.
도 8은 항체 클론 B20-4.1.1 (서열 44) 및 B20-4.1.1RR (서열 45)의 경쇄 가변 영역을 도시한다.
도 9는 항체 클론 B20-4.1.1 및 B20-4.1.1RR (서열 43)의 중쇄 가변 영역을 도시한다.
도 10은 인간 VEGF 및 뮤린 VEGF에 대한 B20 변이체 IgG의 역학 결합 친화도의 측정치를 요약한 표이다. 인간 또는 뮤린 VEGF를 고정시켜 대략 60 반응 단위를 달성하였다.
도 11은 인간 VEGF 및 뮤린 VEGF에 대한 B20 변이체 IgG의 역학 결합 친화도의 측정치를 요약한 표이다. 인간 또는 뮤린 VEGF를 고정시켜 대략 1000 반응 단위를 달성하였다.
도 12는 B20 변이체가 HUVEC 세포 증식을 효과적으로 억제할 수 있음을 보여주는 HUVEC 티미딘 혼입 검정을 도시한다.
도 13은 VEGF-유도된 BRME 증식에 대한 B20-4.1.1의 효과를 도시한다.
도 14는 치료 일수에 대한 종양 부피로 측정한, 인간 종양 세포 (A549 세포)가 이종이식된 누드 마우스에서의 종양 성장에 대한 B20-4.1.1의 효과를 도시한다.
도 15는 치료 일수에 대한 종양 부피로 측정한, 인간 종양 세포 (MDA-MB231 세포)가 이식된 누드 마우스에서의 종양 성장에 대한 B20-4.1.1의 효과를 도시한다.
도 16은 VEGF-유도된 BRME 증식에 대한 아바스틴 항체의 효과를 도시한다. 1500 nM 이하의 아바스틴 항체 농도에서 mVEGF의 억제는 관찰되지 않았다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 본원에서 VEGF에 결합하는 단리된 항체 및 그의 용도를 제공한다. 또한, 제약 조성물 및 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로, 항-VEGF 항체, 및 항-VEGF 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 제조 방법을 제공한다.

일반 기술

본원에서 기재하거나 언급하는 기술 및 절차는 일반적으로 널리 이해되고 있으며, 당업자에 의해 통상적인 방법론, 예를 들어 광범위하게 사용되는 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003))]; 일련의 문헌 [METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987))]; [Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press]; [Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press]; [Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987)]; [Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press]; [Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons]; [Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987)]; [PCR : The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); [Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991)]; [Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)]; [Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); [Antibodies (P. Finch, 1997)]; [Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; [Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; [Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; [The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]; 및 [Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)]에 기재되어 있는 방법론에 따라 보편적으로 사용되고 있다.

정의

본 명세서를 설명하기 위해 다음과 같은 정의가 적용될 것이며, 적절한 경우 단수로 사용되는 용어는 또한 복수도 포함하며, 그 반대도 그러할 것이다. 이하에서 언급하는 임의의 정의가 본원에서 참조로 포함되는 임의의 문헌과 충돌할 경우, 이하에서 언급하는 정의는 조정될 것이다.

용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, (전장 모노클로날 항체를 비롯한) 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 아우른다.

본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득되는 항체를 말하고, 즉 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 별개 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특징을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 그러한 모노클로날 항체에는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체가 포함되며, 이때 표적-결합 폴리펩티드 서열은 복수의 폴리펩티드 서열로부터 단일의 표적 결합 폴리펩티드 서열을 선택하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득된다. 예를 들어, 선택 방법은 복수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론, 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 특유한 클론을 선택하는 것일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은, 예를 들어 표적에 대한 친화도를 개선시키고, 표적 결합 서열을 인간화하고, 세포 배양물에서의 그의 생산을 개선시키고, 생체내 면역원성을 감소시키고, 다중특이적 항체를 제조하는 등을 위해 추가로 변경될 수 있으며, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체도 본 발명의 모노클로날 항체임을 이해해야 한다. 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일의 결정자에 대해 작용한다. 그들의 특이성에 더하여, 모노클로날 항체 제제는 이들이 전형적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유익하다.

수식어 "모노클로날"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득되는 것으로서 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 제조를 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는, 예를 들어 하이브리도마 방법 (예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)]; [Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)], [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조), 파지-디스플레이 기술 (예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol . 222: 581-597 (1992)]; [Sidhu et al., J. Mol . Biol . 338(2): 299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol . Biol . 340(5): 1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Natl . Acad . Sci . USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)] 참조), 및 인간 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 로커스 또는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 인간 또는 인간-유사 항체를 동물에서 생산하기 위한 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; 문헌 [Jakobovits et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immunol . 7:33 (1993)]; 미국 특허 제5,545,807호; 동 제5,545,806호; 동 제5,569,825호; 동 제5,625,126호; 동 제5,633,425호; 및 동 제5,661,016호; 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnol . 14: 845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnol . 14: 826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol . 13: 65-93 (1995)] 참조)을 비롯한 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.

본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종에서 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이면서, 사슬(들)의 나머지는 다른 종에서 유래되거나 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 및 상기 항체의 단편을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌 [Morrison et al. Proc . Natl. Acad . Sci . USA 81:6851-6855 (1984)] 참조). 키메라 항체에는 항체의 항원-결합 영역이, 예를 들어 마카쿠 원숭이를 관심 항원으로 면역화하여 생산한 항체로부터 유래된 것인, 프리마티즈드 (PRIMATIZED^®) 항체가 포함된다.

비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린에서 유래한 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일 실시양태에서, 인간화 항체는 수여자의 HVR 유래의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및/또는 능력을 갖는 비-인간종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 HVR 유래의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수여자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 FR 잔기가 대응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수여자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위한 것일 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 초가변 루프에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 FR이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 Fc를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은, 예를 들어 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr . Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 문헌 [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol . 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem . Soc . Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr . Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]; 및 미국 특허 제6,982,321호 및 동 제7,087,409호를 참조한다.

"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 보유하고/보유하거나 본원에 개시된 인간 항체의 제조 기술 중 임의의 기술에 의해 제조된 항체이다. 인간 항체의 상기 정의에서 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 제외된다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리를 비롯한 당업계 공지의 다양한 기술을 이용하여 생산할 수 있다 (문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol ., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol ., 222:581 (1991)]). 또한, 인간 모노클로날 항체의 제조에 이용가능한 방법이 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; [Boerner et al., J. Immunol ., 147(1):86-95 (1991)]에 기재되어 있다. 또한, 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr . Opin . Pharmacol ., 5: 368-74 (2001)]을 참조한다. 인간 항체는 항원을 트랜스제닉 동물, 즉 항원 자극에 대해 반응하여 그러한 항체를 생산하도록 변형되었지만 그의 내생적 로커스는 불능화된, 예를 들어 면역화된 제노마우스 (xenomice)에 투여하여 제조할 수 있다 (예를 들어, 제노마우스 (XENOMOUSE)^TM 기술에 관한 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호 참조). 또한, 예를 들어 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관한 문헌 [Li et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 103:3557-3562 (2006)]을 참조한다.

"종-의존적 항체"는 제1 포유동물 종 유래의 항원에 대한 결합 친화도가 그러한 항원과 동종인 제2 포유동물 종 유래의 것에 대한 결합 친화도보다 더 강한 것을 말한다. 통상적으로, 종-의존적 항체는 인간 항원에 "특이적으로 결합하지만" (즉, 결합 친화도 (K_d) 값이 약 1 x 10^-7 M 이하이고, 바람직하게는 약 1 x 10^-8 M 이하이며, 가장 바람직하게는 약 1 x 10^-9 M 이하이지만), 제2의 비인간 포유동물 종 유래의 동종의 항원에 대해서는 인간 항원에 대한 그의 결합 친화도에 비해 적어도 약 50배, 또는 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1000배 약한 결합 친화도를 갖는다. 종-의존적 항체는 상기에서 정의한 바와 같은 다양한 유형의 항체 중 임의의 것일 수 있지만, 바람직한 것은 인간화된 것 또는 인간 항체이다.

본원에서 사용되는 "항체 돌연변이체" 또는 "항체 변이체"는 종-의존적 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기가 변형된 종-의존적 항체의 아미노산 서열 변이체를 말한다. 그러한 돌연변이체는 필연적으로 종-의존적 항체와 100％ 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 일 실시양태에서, 항체 돌연변이체는 종-의존적 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 75％의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이고, 다른 실시양태에서는 적어도 80％, 다른 실시양태에서는 적어도 85％, 다른 실시양태에서는 적어도 90％, 또다른 실시양태에서는 적어도 95％일 것이다. 본원에서 이러한 서열에 관한 동일성 또는 유사성은, 최대 ％의 서열 동일성을 달성하기 위해 필요하다면 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후에, 종-의존적 항체 잔기와 동일 (즉, 동일한 잔기) 또는 유사 (즉, 통상적인 측쇄 특성을 기초로 하여 동일한 기 유래의 아미노산 잔기, 이하 참조)한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분률로 정의한다. 가변 도메인의 바깥쪽 항체 서열에서의 N-말단, C-말단, 또는 내부 연장, 결실 또는 삽입은 서열 동일성 또는 유사성에 영향을 끼치는 것으로 해석되지 않아야 한다.

"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 항체이다. 자연 환경의 오염 성분이란 항체에 대한 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질이 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 (1) 예를 들어, 로우리 (Lowry) 방법으로 측정시 항체의 95 중량％ 초과, 일부 실시양태에서는 99 중량％ 초과 수준까지, (2) 예를 들어, 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 예를 들어, 쿠마시 (Coomassie) 블루 또는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제된다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분도 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

"천연 항체"는 통상적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 이루어진, 약 150,000 달톤의 이종4량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 디술피드 결합에 의해 중쇄에 연결되지만, 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄 사이의 디술피드 연결의 수는 다양하다. 또한 각각의 중쇄 및 경쇄는 규칙적인 간격으로 사슬간 디술피드 가교를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_H)에 이어 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_L)을 다른쪽 말단에 불변 도메인을 갖고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되며, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에 접점을 형성하는 것으로 여겨진다.

항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 말한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"라 칭할 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"이라 칭할 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 최대 가변 부위이고, 항원-결합 부위를 함유한다.

"가변"이라는 용어는 가변 도메인의 특정 부분의 서열이 항체들 사이에 크게 상이함을 의미하고, 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두에서 초가변 영역 (HVR)으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 루프 연결부를 형성하고 일부 경우에는 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 HVR에 의해 연결된, 주로 베타-시트 형태를 취하는 4개의 FR 영역을 각각 포함한다. 각 쇄 내의 HVR은 FR 영역에 의해 서로 근접하게 유지되고, 다른 쇄의 HVR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에는 직접 관여하지 않지만, 예컨대 항체-의존적 세포 독성에 항체가 참여하는 것과 같은, 다양한 효과기 기능을 나타낸다.

임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2개의 명백하게 구분되는 유형 중 하나로 분류될 수 있다.

그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (면역글로불린)은 상이한 부류로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂로 추가로 나누어질 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다. 상이한 부류의 면역글로불린의 하위유니트 구조 및 3차원 형상은 널리 알려져 있고, 예를 들어 문헌 [Abbas et al., Cellular and Mol . Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000)]에 일반적으로 기술되어 있다. 항체는 항체와 1종 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비-공유적 회합에 의해 형성된, 보다 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.

용어 "전장 항체," "무손상 항체" 및 "전체 항체"는, 이하에서 정의하는 항체 단편이 아닌, 실질적으로 무손상 형태의 항체를 칭하기 위해 상호교환적으로 본원에서 사용된다. 상기 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 말한다.

본원의 목적상 "네이크드 항체"는 세포독성 모이어티 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 말한다.

"항체 단편"은, 바람직하게는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.

항체를 파파인 소화시키면 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 및 나머지 "Fc" 단편 (상기 명칭은 쉽게 결정화되는 그의 능력을 반영한다)이 생성된다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원에 가교-연결될 수 있는 F(ab')₂ 단편을 생성시킨다.

"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 일 실시양태에서, 2쇄 Fv 종은 강하게 비공유 회합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 단일쇄 Fv (scFv) 종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2쇄 Fv 종에서와 유사한 "이량체" 구조로 회합될 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 연결될 수 있다. 상기 배열에서, 각 가변 도메인의 3개의 HVR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 규정한다. 집합적으로, 6개의 HVR이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 HVR 만을 포함하는 Fv의 절반)도, 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도이지만, 항원을 인식하여 결합하는 능력을 갖는다.

Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고, 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 수개의 잔기가 부가된다는 점에서 Fab 단편과 다르다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 갖는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 원래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.

"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬로 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하고, 이는 scFv가 항원 결합에 요구되는 구조를 형성하도록 한다. scFv의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315]을 참조한다.

용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 말하고, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 페어링하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 2가이거나, 이중특이적일 수 있다. 디아바디는, 예를 들어 EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med . 9:129-134 (2003)]; 및 [Hollinger et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 90: 6444-6448 (1993)]에 보다 충분히 기재되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med . 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.

본원에서 사용되는 용어 "초가변 영역," "HVR," 또는 "HV"는 서열에서 초가변이고/이거나 구조상 규정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 말한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH 내에 3개 (H1, H2, H3), 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체 중, H3 및 L3은 6개의 HVR 중에서 최대의 다양성을 나타내고, 특히 H3은 항체에 양호한 특이성을 부여하는데 있어서 독특한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 문헌 [Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000)]; [Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]을 참조한다. 실제로, 단 하나의 중쇄로 이루어진 자연 발생 카멜리드 (camelid) 항체는 경쇄가 없지만 기능성이며 안정하다. 예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)]; [Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)]을 참조한다.

많은 HVR 묘사가 사용되고 있고 본원에 포함된다. 카바트 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성에 기초하고, 가장 흔히 사용된다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]). 코티아(Chothia)는 그 대신 구조 루프의 위치를 말한다 (문헌 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987)]). AbM HVR은 카바트 HVR과 코티아 구조 루프 사이의 절충안을 나타내고, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" HVR은 이용가능한 복합 결정 구조 분석에 기초한다. 각각의 상기 HVR의 잔기를 이하에 나타낸다.

HVR은 다음과 같은 "연장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3), 및 VH에서 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각 상기 정의에 대해 상기 카바트 등의 문헌에 따라 넘버링된다.

"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 HVR 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기이다.

용어 "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 그의 변형은 상기 카바트 등의 문헌에서 항체 편집물의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 사용된 넘버링 시스템을 의미한다. 이러한 넘버링 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 그 내로의 삽입에 해당하는 소수의 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입물 (카바트에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 "표준" 카바트 넘버링된 서열을 갖는 항체의 서열의 상동성 영역에서의 정렬에 의해 소정의 항체에 대해 결정될 수 있다.

카바트 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인에서의 잔기 (대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 언급하는 경우에 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 지수"는 일반적으로 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 잔기를 언급하는 경우에 사용된다 (예를 들어, 상기 카바트 등의 문헌에 보고된 EU 지수). "카바트에서와 같은 EU 지수"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 의미한다. 본원에 달리 기재되지 않는 한, 항체의 가변 도메인에서의 잔기 번호에 대한 언급은 카바트 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다. 본원에 달리 기재되지 않는 한, 항체의 불변 도메인에서의 잔기 번호에 대한 언급은 EU 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다 (예를 들어, 미국 가출원 번호 제60/640,323호, EU 넘버링에 대한 도면 참조).

"친화도 성숙" 항체는 변경(들)되지 않은 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는, 하나 이상의 HVR에서의 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 일 실시양태에서, 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 특정 과정을 사용하여 생산할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에는 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙이 기재되어 있다. HVR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은, 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc Nat. Acad . Sci . USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al., Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al., J. Immunol . 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol . 154(7):3310-9 (1995)] 및 [Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)])에 기재되어 있다.

"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 그가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제 또는 감소시키는 항체이다. 특정 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제시킨다.

본원에 사용된 "효능제 항체"는 관심 폴리펩티드의 기능적 활성 중 하나 이상을 부분적으로 또는 전부 모방하는 항체이다.

"성장 억제" 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포의 증식을 방지 또는 감소시키는 항체이다.

항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인한 생물학적 활성을 의미하고, 항체 이소형에 따라 변한다. 항체 효과기 기능의 예로는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화가 포함된다.

본원에서 용어 "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 보통 위치 Cys226의 아미노산 잔기로부터 또는 Pro230으로부터 카르복실-말단까지 걸쳐 있는 것으로 정의된다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어, 항체의 생산 또는 정제시에, 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산을 재조합에 의해 공학처리함으로써 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, 어떤 K447 잔기도 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기를 갖는 항체와 K447 잔기를 갖지 않는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.

"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "효과기 기능"을 갖는다. "효과기 기능"의 예로는 C1q 결합; CDC; Fc 수용체 결합; ADCC; 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등이 포함된다. 이러한 효과기 기능을 위해서는 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 결합하여야 하며, 효과기 기능은 예를 들어, 본원 정의부에 개시된 다양한 검정을 사용함으로써 평가될 수 있다.

"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 뿐만 아니라, 자연 발생된 그의 변이체를 포함한다.

"변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형, 바람직하게는 하나 이상의 아미노산 치환(들)에 의해서 천연 서열 Fc 영역과 차이를 보이는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역, 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 중에 적어도 1개의 아미노산 치환, 예를 들어, 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환, 및 바람직하게는 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80％의 상동성을, 가장 바람직하게는 그와 적어도 약 90％의 상동성을, 더욱더 바람직하게는 그와 적어도 약 95％의 상동성을 가질 것이다.

"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 말한다. 일부 실시양태에서, FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 일부 실시양태에서, FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것이며, 상기 수용체의 대립유전자 변이체 및 교대로 스플라이싱된 형태를 비롯한, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 그의 세포질 도메인에서 주로 상이한 유사 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 (예를 들어, 문헌 [Daeron, Annu . Rev. Immunol . 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 예를 들어, 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)] 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin . Med . 126:330-41 (1995)])에서 검토되어 있다. 추후에 확인되는 것을 포함하여 기타 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다.

용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 또한 모체 IgG에서 태아로의 전달 (문헌 [Guyer et al., J. Immunol . 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol . 24:249 (1994)) 및 면역글로불린의 항상성 조절을 담당하는 신생아의 수용체인 FcRn을 포함한다. FcRn에의 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ghetie and Ward., Immunol . Today 18(12):592-598 (1997)]; [Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)]; [Hinton et al., J. Biol . Chem . 279(8):6213-6216 (2004)]; WO 2004/92219 (Hinton et al.) 참조).

생체내 인간 FcRn에 대한 결합 및 인간 FcRn 고친화도 결합 폴리펩티드의 혈청 반감기는 예를 들어, 인간 FcRn을 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주에서, 또는 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드를 투여받은 영장류에서 검정될 수 있다. WO 2000/42072 (Presta)에는 FcR에 대한 결합이 향상 또는 감소된 항체 변이체가 기재되어 있다. 또한, 예를 들어, 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)]을 참조한다.

"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 특정 실시양태에서, 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고 ADCC 효과기 기능(들)을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 자연 살해 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함한다. 효과기 세포는 천연 공급원, 예들 들어 혈액으로부터 단리될 수 있다.

"항체-의존적 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포 (예들 들어, NK 세포, 호중구 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 분비된 Ig가 상기 세포독성의 효과기 세포를 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합시킨 후, 표적 세포를 세포독소로 사멸시키도록 만들 수 있는 세포독성의 한 형태를 의미한다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464 페이지 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호 또는 미국 특허 제6,737,056호 (Presta)에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 수행할 수 있다. 상기 검정에 유용한 효과기 세포는 PBMC 및 NK 세포를 포함한다. 별법으로, 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, 문헌 [Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.

"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에 이루어지는 표적 세포의 용해를 의미한다. 고전적 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)을 동족 항원에 결합된 항체 (적절한 하위부류의 항체)에 결합시킴으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해서, 예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 CDC 검정을 수행할 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열 갖는 폴리펩티드 변이체 (변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드) 및 C1q 결합 능력이 증가되었거나 감소된 폴리펩티드 변이체는 예를 들어, 미국 특허 제6,194,551호 B1 및 WO 1999/51642에 기재되어 있다. 또한, 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]도 참조한다.

용어 "Fc 영역-포함 항체"는 Fc 영역을 포함하는 항체를 의미한다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어, 항체의 정제 동안 또는 항체를 코딩하는 핵산의 재조합 공학처리에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc 영역을 갖는 항체를 포함하는 조성물은 K447을 갖는 항체, 모든 K447 잔기가 제거된 항체, 또는 K447 잔기를 갖는 항체와 K447 잔기를 갖지 않는 항체의 혼합물을 포함할 수 있다.

"결합 친화도"는 일반적으로 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유결합 상호작용의 전체 강도를 의미한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합쌍 구성원 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화도를 의미한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 비롯하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 저-친화도 항체는 일반적으로 서서히 항원에 결합하며 용이하게 해리되는 경향이 있는 반면, 고-친화도 항체는 일반적으로 신속히 항원에 결합하며 오랫동안 결합된 채 남아있는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 방법은 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 특정 설명적 및 예시적 실시양태가 하기에 기재되어 있다.

일 실시양태에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 하기 검정에 기재된 바와 같이 관심 항체의 Fab 버젼 및 그의 항원으로 수행된 방사성표지 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 Fab를 최소 농도의 (¹²⁵I)-표지 항원과 평형화시킨 다음, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정된다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol . Biol . 293:865-881(1999)] 참조). 검정에 대한 조건을 설정하기 위해, 마이크로티터(MICROTITER)^® 다중-웰 플레이트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후, 실온 (대략 23℃)에서 2시간 내지 5시간 동안 PBS 중의 2％ (w/v) 소 혈청 알부민으로 차단한다. 비-흡착 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [¹²⁵I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석물 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]에서의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치하는 것)과 혼합한다. 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하며, 평형화에 도달하도록 하기 위해 보다 긴 시간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 이후, 혼합물을 실온에서 (예를 들어 1시간 동안) 인큐베이션을 위한 포획 플레이트로 옮긴다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1％ 트윈(TWEEN)-20^TM으로 8회 세척한다. 플레이트가 건조되었을 때, 150 μl/웰의 섬광제 (마이크로신트(MICROSCINT)-20^TM; 팩커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TOPCOUNT)^TM 감마 카운터 (팩커드) 상에서 10분 동안 계수한다. 경쟁적 결합 검정에 사용하기 위해 20％ 이하의 최대 결합을 제공하는 각 Fab의 농축액을 선택한다.

또다른 실시양태에 따라, Kd 또는 Kd 값은 25℃에서 ~10 반응 단위 (RU)의 고정된 항원 CM5 칩으로 비아코어(BIACORE)^®-2000 또는 비아코어^®-3000 (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.))을 사용하여 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 측정한다. 요컨대, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)은 공급자 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원은 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 이용하여 5 μg/ml (~0.2 μM)로 희석한 후 5 μl/분의 유속으로 주입하여 대략 10 반응 단위 (RU)의 커플링된 단백질을 얻는다. 항원의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응기를 차단한다. 역학 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 25℃에서 대략 25 μl/분의 유속으로 0.05％ 트윈-20^TM 계면활성제 (PBST)를 함유한 PBS 중에 주입한다. 회합률 (k_on) 및 해리율 (k_off)을 간단한 일대일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어^® 평가 소프트웨어 버젼 3.2)을 사용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 핏팅시켜 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 k_off/k_on 비율로서 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 회합률(on-rate)이 106 M^{- 1} s^-1을 초과한다면, 정지-유동 장착된 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐빗을 갖는 8000-시리즈 SLM-AMINCO^TM 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))와 같은 분광계로 측정된 증가하는 농도의 항원의 존재 하에, 25℃에서 PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용하여 회합률을 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 회합률 ("on-rate," "rate of association," "association rate," 또는 "k_on")은 또한 비아코어^®-2000 또는 비아코어^®-3000 시스템 (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 비아코어, 인크.)을 사용하여 상기 기재된 바와 같이 결정할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"은, 두 수치 (예를 들어, 본 발명의 항체와 관련된 한 수치 및 참조/비교 항체와 관련된 다른 수치) 사이의 유사성 정도가 충분히 높아서, 당업자가 두 수치 사이의 차이를 상기 수치 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징의 문맥 내에서 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 거의 없거나 전혀 없다고 간주함을 의미한다. 상기 두 수치 사이의 차이는 예를 들어, 참조/비교 수치의 함수로서 약 50％ 미만, 약 40％ 미만, 약 30％ 미만, 약 20％ 미만, 및/또는 약 10％ 미만이다.

본원에 사용된 어구 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"은, 두 수치 (일반적으로, 분자와 관련된 한 수치 및 참조/비교 분자와 관련된 다른 수치) 사이의 상이성 정도가 충분히 높아서, 당업자가 두 수치 사이의 차이를 상기 수치 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징의 문맥 내에서 통계적으로 유의하다고 간주함을 의미한다. 상기 두 수치의 차이는 예를 들어, 참조/비교 분자에 대한 수치의 함수로서 약 10％ 초과, 약 20％ 초과, 약 30％ 초과, 약 40％ 초과, 및/또는 약 50％ 초과이다.

본원의 목적상 "수용자 인간 프레임워크"는 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 VL 또는 VH 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 기존 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기존 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 기존 아미노산 변화가 VH에 존재하는 경우, 바람직하게는 그러한 변화는 위치 71H, 73H 및 78H 중 단지 3개, 2개 또는 1개 위치에서 일어나며, 예를 들어 그러한 위치에서의 아미노산 잔기는 71A, 73T 및/또는 78A일 수 있다. 일 실시양태에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 서열에 있어서 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 동일하다.

"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 통상적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 수행된다. 일반적으로, 서열의 하위군은 상기 카바트 등의 문헌에서와 같은 하위군이다. 일 실시양태에서, VL의 경우, 하위군은 상기 카바트 등의 문헌에서와 같은 하위군 카파 I이다. 일 실시양태에서, VH의 경우, 하위군은 상기 카바트 등의 문헌에서와 같은 하위군 III이다.

"VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크"는 카바트 등의 가변 중쇄 하위군 III에서의 아미노산 서열로부터 얻은 컨센서스 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크 아미노산 서열은 다음 서열 중 적어도 일부 또는 각각 모두를 포함한다:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (서열 31)-H1-

WVRQAPGKGLEWV (서열 32)-H2-

RFTISADTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (서열 33)-H3-

WGQGTLVTVSS (서열 34). 도 4를 참조한다.

"VL 하위군 I 컨센서스 프레임워크"는 카바트 등의 가변 경쇄 카파 하위군 I에서의 아미노산 서열로부터 얻은 컨센서스 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, VH 하위군 I 컨센서스 프레임워크 아미노산 서열은 다음 서열 중 적어도 일부 또는 각각 모두를 포함한다:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 35)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (서열 36)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 37)-L3-FGQGTKVEIK (서열 38). 도 5를 참조한다.

본원에 사용된 "코돈 세트"는 목적하는 변이체 아미노산을 코딩하는데 사용되는 상이한 뉴클레오티드 트리플렛(triplet) 서열의 세트를 의미한다. 올리고뉴클레오티드 세트는 예를 들어 고체상 합성에 의해 합성될 수 있으며, 코돈 세트에 의해 제공된 뉴클레오티드 트리플렛의 모든 가능한 조합을 나타내고 목적하는 아미노산 군을 코딩할 서열을 포함한다. 코돈 지명의 표준 형태는, 당업계에 알려져 있고 본원에 기재된 IUB 코드의 형태이다. 코돈 세트는 전형적으로 3개의 대문자를 이탤릭체로, 예를 들어 NNK, NNS, XYZ, DVK 등으로 표시한다. 따라서, 본원에 사용된 "비-무작위 코돈 세트"는 본원에 기재된 아미노산 선택에 대한 기준을 부분적으로, 바람직하게는 완전히 충족시키는 선택 아미노산을 코딩하는 코돈 세트를 의미한다. 선택된 뉴클레오티드가 특정 위치에서 "퇴화"된 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에, 예를 들어 TRIM 접근법 (문헌 [Knappek et al. (1999) J. Mol . Biol. 296:57-86]; [Garrard ＆ Henner (1993) Gene 128:103])에 잘 알려져 있다. 이러한 특정 코돈 세트를 갖는 올리고뉴클레오티드 세트는 시판용 핵산 합성기 (예를 들어, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터 입수가능함)를 사용하여 합성할 수 있거나, 또는 (예를 들어, 미국 메릴랜드주 록빌 소재의 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)로부터) 구입할 수 있다. 따라서, 특정 코돈 세트를 갖는 합성된 올리고뉴클레오티드 세트는 전형적으로 상이한 서열을 갖는 다수의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 상이성은 전체 서열 내에서 코돈 세트에 의해 확립된다. 본 발명에 따라 사용된 올리고뉴클레오티드는 가변 도메인 핵산 주형에의 혼성화를 허용하는 서열을 가지며, 또한 필수적이진 않지만, 예를 들어 클로닝 목적에 유용한 제한 효소 부위를 포함할 수 있다.

표현 "선형 항체"는 문헌 [Zapata et al., 1995 Protein Eng , 8(10):1057-1062]에 기재된 항체를 의미한다. 요컨대, 이들 항체는 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 항원 결합 영역 쌍을 형성하는 직렬 Fd 세그먼트 쌍 (V_H-C_H1-V_H-C_H1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.

본원에 사용된 "라이브러리"는 다수의 항체 또는 항체 단편 서열 (예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드), 또는 이들 서열을 코딩하는 핵산을 의미하며, 상기 서열은 본 발명의 방법에 따라 이들 서열에 도입되는 변이체 아미노산의 조합에서 상이하다.

"파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 섬유상 파지의 표면 상에 적어도 일부분의 코트 단백질에 대한 융합 단백질, 입자로서 디스플레이하는 기술이다. 파지 디스플레이의 이용성은 무작위추출된 단백질 변이체의 거대 라이브러리가 표적 항원에 고친화도로 결합하는 서열에 대해 신속하고 효율적으로 분류될 수 있다는 사실에 있다. 파지 상의 펩티드 및 단백질 라이브러리의 디스플레이는 특이적 결합 성질을 갖는 폴리펩티드를 위해 수백만의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다. 다가 파지 디스플레이 방법은 작은 무작위 펩티드 및 작은 단백질을 섬유상 파지의 유전자 III 또는 유전자 VIII에 대한 융합을 통해 디스플레이하는데 사용되어 왔다. 문헌 [Wells and Lowman (1992) Curr . Opin . Struct. Biol . 3:355-362] 및 여기서 인용된 문헌 참조. 일가 파지 디스플레이에서, 단백질 또는 펩티드 라이브러리는 유전자 III 또는 이의 일부분에 융합되고, 파지 입자가 융합 단백질 중 한 카피를 디스플레이하거나 모두 디스플레이하지 않도록 야생형 유전자 III 단백질의 존재 하에 낮은 수준으로 발현된다. 결합도(Avidity) 효과는 분류가 고유 리간드 친화도를 기준으로 이루어지도록 다가 파지에 대해 감소하며, DNA 조작을 단순화하는 파지미드 벡터가 사용된다. 문헌 [Lowman and Wells (1991) Methods: A companion to Methods in Enzymology 3:205-0216] 참조.

"파지미드"는 박테리아 복제 기점, 예를 들어 Co1E1 및 박테리오파지의 내부유전자 영역의 카피를 갖는 플라스미드 벡터이다. 파지미드는 섬유상 박테리오파지 및 람다형 박테리오파지를 비롯한 임의의 공지된 박테리오파지에 대해 사용될 수 있다. 플라스미드는 또한 일반적으로 항생제 내성에 대한 선택가능한 마커를 함유할 것이다. 이들 벡터 내로 클로닝된 DNA 세그먼트는 플라스미드로서 증식할 수 있다. 이들 벡터를 보유하는 세포에 파지 입자의 생성에 필요한 모든 유전자가 제공되는 경우, 플라스미드의 복제 모드는 회전환 복제로 변화하여 플라스미드 DNA 한 가닥의 카피 및 팩키지 파지 입자를 생성한다. 파지미드는 감염성 또는 비-감염성 파지 입자를 형성할 수 있다. 이 용어는, 이종 폴리펩티드가 파지 입자의 표면 상에 디스플레이되도록 유전자 융합으로서 이종 폴리펩티드 유전자에 연결되는 파지 코트 단백질 유전자 또는 그의 단편을 함유하는 파지미드를 포함한다.

용어 "파지 벡터"는 이종 유전자를 함유하며 복제가 가능한 이중 가닥 복제 형태의 박테리오파지를 의미한다. 파지 벡터는 파지 복제 및 파지 입자 형성을 허용하는 파지 복제 기점을 갖는다. 파지는 바람직하게는 섬유상 박테리오파지, 예컨대 M13, f1, fd, Pf3 파지 또는 이들의 유도체이거나, 람다형 파지, 예컨대 람다, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434 등 또는 이들의 유도체이다.

본원에 사용된 "용매 접근가능한 위치"는, 항체-특이적 항원과 같은 분자와의 접촉 및/또는 용매 접근에 대해 잠재적으로 이용가능한 것으로서, 항체 또는 항원 결합 단편의 구조, 전체 구조 및/또는 모델 구조를 기준으로 결정된 공급원 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 있어서의 아미노산 잔기의 위치를 의미한다. 이들 위치는 전형적으로 단백질의 CDR 및 외부에서 발견된다. 본원에 정의된 항체 또는 항원 결합 단편의 용매 접근가능한 위치는 당업계에 공지된 다수의 알고리즘 중 임의의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 일 실시양태에서, 용매 접근가능한 위치는 항체의 3차원 모델로부터의 좌표를 사용하여, 바람직하게는 인사이트(Insight)II 프로그램 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 액셀리스(Accelrys))과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정된다. 용매 접근가능한 위치는 또한 당업계에 공지된 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Lee and Richards (1971) J. Mol . Biol . 55, 379] 및 [Connolly (1983) J. Appl . Cryst. 16, 548]). 용매 접근가능한 위치의 결정은 단백질 모델링에 적합한 소프트웨어 및 항체로부터 얻은 3차원 구조 정보를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 목적에 이용될 수 있는 소프트웨어에는 SYBYL 바이오폴리머 모듈 소프트웨어(SYBYL Biopolymer Module software) (트리포스 어소시에이츠(Tripos Associates))가 포함된다. 일반적으로, 알고리즘 (프로그램)이 사용자 입력 크기 파라미터를 필요로 하는 경우, 계산에 사용되는 프로브의 "크기"는 반경 약 1.4 Å 이하로 설정된다. 또한, 퍼스널 컴퓨터용 소프트웨어를 사용하여 용매 접근가능한 영역 및 면적 방법을 결정하는 것은 문헌 [Pacios (1994) Comput . Chem . 18(4): 377-386]에 기재되어 있다.

"혈관신생 인자 또는 작용제"는 혈관의 발달을 자극하는, 예를 들어 혈관신생, 내피 세포 성장, 혈관 안정성 및/또는 맥관형성 등을 촉진하는 성장 인자이다. 예를 들어, 혈관신생 인자에는 예를 들어 VEGF 및 VEGF 패밀리의 구성원, PlGF, PDGF 패밀리, 섬유아세포 성장 인자 패밀리 (FGF), TIE 리간드 (안지오포이에틴), 에프린, 델타-유사 리간드 4 (DLL4), Del-1, 섬유아세포 성장 인자: 산성 (aFGF) 및 염기성 (bFGF), 폴리스타틴, 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 간세포 성장 인자 (HGF)/분산 인자 (SF), 인터류킨-8 (IL-8), 렙틴, 미드킨, 뉴로필린, 태반 성장 인자, 태반-유래 내피 세포 성장 인자 (PD-ECGF), 혈소판-유래 성장 인자, 특히 PDGF-BB 또는 PDGFR-베타, 플레이오트로핀 (PTN), 프로그래눌린, 프롤리페린, 형질전환 성장 인자-알파 (TGF-알파), 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-베타), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파) 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상처 치유를 가속화하는 인자, 예컨대 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-I (IGF-I), VIGF, 표피 성장 인자 (EGF), CTGF 및 이 패밀리의 구성원, 및 TGF-알파 및 TGF-베타가 포함될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Klagsbrun and D'Amore (1991) Annu . Rev. Physiol. 53:217-39]; [Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179]; [Ferrara ＆ Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364]; [Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (예를 들어, 공지된 혈관신생 인자를 나열한 표 1); 및 [Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206]을 참조한다.

"항-혈관신생제" 또는 "혈관신생 억제제"는 혈관신생, 맥관형성, 또는 바람직하지 못한 혈관 투과성을 직접 또는 간접적으로 억제시키는, 소분자량 물질, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 억제성 RNA (RNAi 또는 siRNA) 포함), 폴리펩티드, 단리된 단백질, 재조합 단백질, 항체, 또는 그의 접합체 또는 융합 단백질을 의미한다. 항-혈관신생제는 혈관신생 인자 또는 그의 수용체에 결합하여 혈관신생 활성을 차단하는 작용제를 포함한다고 이해해야 한다. 예를 들어, 항-혈관신생제는 상기 정의된 바와 같은 혈관신생제에 대한 항체 또는 다른 길항제, 예를 들어, VEGF-A에 대한 항체, VEGF-A 수용체 (예를 들어, KDR 수용체 또는 Flt-1 수용체)에 대한 항체, 항-PDGFR 억제제, 예컨대 글리벡(Gleevec)^TM (이마티닙 메실레이트), VEGF 수용체 신호전달을 차단하는 소분자 (예를 들어, PTK787/ZK2284, SU6668, 수텐트(SUTENT)^®/SU11248 (수니티닙 말레이트), AMG706, 또는 예를 들어, 국제 특허 출원 WO 2004/113304에 기재되어 있는 것)이다. 항-혈관신생제는 또한 천연 혈관신생 억제제, 예를 들어, 안지오스타틴, 엔도스타틴 등도 포함한다. 예를 들어, 문헌 ([Klagsbrun and D'Amore (1991) Annu . Rev. Physiol . 53:217-39]; [Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179 (예를 들어, 악성 흑색종에서의 항-혈관신생 요법을 나열한 표 3)]; [Ferrara ＆ Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364]; [Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (예를 들어, 공지된 항혈관신생 인자를 나열한 표 2)]; 및 [Sato (2003) Int . J. Clin . Oncol . 8:200-206 (예를 들어, 임상 시험에서 사용된 항-혈관신생제를 나열한 표 1)])을 참조한다.

본원에 사용된 용어 "VEGF" 및 "VEGF-A"는 그의 자연 발생한 대립유전자 형태 및 프로세싱된 형태와 함께, 문헌 ([Leung et al. (1989) Science 246:1306], 및 [Houck et al. (1991) Mol . Endocrin , 5:1806])에 기재되어 있는 바와 같은, 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자 및 관련 121-, 189- 및 206-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자를 의미한다. 용어 "VEGF"는 또한 비-인간 종, 예컨대 마우스, 래트 또는 영장류로부터의 VEGF를 의미한다. 때로는, 특정 종으로부터의 VEGF가, 인간 VEGF에 대해서는 hVEGF, 뮤린 VEGF에 대해서는 mVEGF 등과 같은 용어로 나타내어 진다. 용어 "VEGF"는 또한 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자의 아미노산 8 내지 109 또는 1 내지 109를 포함하는 절단된 형태의 폴리펩티드를 언급하는데 사용된다. 이러한 임의의 형태의 VEGF에 대한 언급은 본원에서 예를 들어 "VEGF (8-109)," "VEGF (1-109)" 또는 "VEGF₁₆₅"에 의해 확인될 수 있다. "절단된" 천연 VEGF에 대한 아미노산 위치는 천연 VEGF 서열에서 나타낸 바와 같이 넘버링된다. 예를 들어, 절단된 천연 VEGF에서의 아미노산 위치 17 (메티오닌)은 또한 천연 VEGF에서의 위치 17 (메티오닌)이다. 절단된 천연 VEGF는 천연 VEGF에 필적하는 KDR 및 Flt-1 수용체에 대한 결합 친화도를 갖는다.

"항-VEGF 항체"는 충분한 친화도와 특이성으로 VEGF에 결합하는 항체이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항-VEGF 항체는 항체 B20-4.1.1이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 항-VEGF 항체는 항체 B20-4.1.1RR이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 항-VEGF 항체는 VEGF 활성이 관여하는 질환 또는 병태를 표적화하고 방해하는데 있어서 치료제로서 사용될 수 있다. 항-VEGF 항체는 통상적으로 다른 VEGF 상동체, 예컨대 VEGF-B 또는 VEGF-C, 또는 다른 성장 인자, 예컨대 PlGF, PDGF 또는 bFGF에 결합하지 않을 것이다.

"rhuMAb VEGF" 또는 "아바스틴(AVASTIN)^®"으로도 알려져 있는, 항-VEGF 항체 "베바시주맙 (BV)"은 문헌 [Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에 따라 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체이다. 이는 돌연변이화된 인간 IgG1 프레임워크 영역, 및 인간 VEGF의 그의 수용체에 대한 결합을 차단하는 뮤린 항-hVEGF 모노클로날 항체 A.4.6.1로부터의 항원 결합 상보성-결정 영역을 포함한다. 프레임워크 영역의 대부분을 포함하는, 베바시주맙의 아미노산 서열의 대략 93％는 인간 IgG1로부터 유래된 것이며, 서열의 약 7％는 뮤린 항체 A4.6.1로부터 유래된 것이다. 베바시주맙의 분자량은 약 149,000 달톤이며, 이는 당화된 것이다.

본원에 사용된 용어 "B20 시리즈 폴리펩티드"는 VEGF에 결합하는 항체를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. B20 시리즈 폴리펩티드에는 미국 공보 제20060280747호, 미국 공보 제20070141065호 및/또는 미국 공보 제20070020267호 (이들 특허 출원의 내용은 명백히 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있는 B20 항체 또는 B20-유래된 항체의 서열로부터 유래된 항체가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 일 실시양태에서, B20 시리즈 폴리펩티드는 미국 공보 제20060280747호, 미국 공보 제20070141065호 및/또는 미국 공보 제20070020267호에 기재된 B20-4.1이다.

본원에 사용된 용어 "B20-4.1.1"은, VEGF에 결합하며 HVR-H1이 서열 1이고 HVR-H2가 서열 2이고 HVR-H3이 서열 3이고 HVR-L1이 서열 4이고 HVR-L2가 서열 6이고 HVR-L3이 서열 7인 항체를 포함하는 항체를 의미한다.

본원에 사용된 용어 "B20-4.1.1RR"은, VEGF에 결합하며 HVR-H1이 서열 1이고 HVR-H2가 서열 2이고 HVR-H3이 서열 3이고 HVR-L1이 서열 5이고 HVR-L2가 서열 6이고 HVR-L3이 서열 7인 항체를 포함하는 항체를 의미한다.

본원에 사용된 용어 "G6-31"은 미국 공보 제20060280747호, 미국 공보 제20070141065호 및/또는 미국 공보 제20070020267호에 기재되어 있는 G-6 시리즈 폴리펩티드 중 하나이다. 미국 공보 제20060280747호, 미국 공보 제20070141065호 및/또는 미국 공보 제20070020267호에 기재되어 있는 다른 G-6 시리즈 폴리펩티드는 G6-8 및 G6-23이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.

VEGF 폴리펩티드와 관련하여 용어 "생물학적 활성" 및 "생물학적으로 활성인"은 VEGF와 관련된 물리/화학적 성질 및 생물학적 기능을 의미한다.

"VEGF 길항제"는 하나 이상의 VEGF 수용체에 대한 결합을 포함하는 (이에 한정되지 않음), VEGF 활성을 중화, 차단, 억제, 취소, 감소 또는 방해시킬 수 있는 분자를 의미한다. VEGF 길항제에는 항-VEGF 항체 및 그의 항원-결합 단편, VEGF에 특이적으로 결합하여 하나 이상의 수용체에 대한 결합을 격리하는 수용체 분자 및 유도체, 항-VEGF 수용체 항체 및 VEGF 수용체 길항제, 예컨대 VEGFR 티로신 키나제의 소분자 억제제가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 본원에 사용된 용어 "VEGF 길항제"는 구체적으로 항체, 항체 단편, 다른 결합 폴리펩티드, 펩티드 및 비-펩티드 소분자를 비롯한, VEGF에 결합하여 VEGF 활성을 중화, 차단, 억제, 취소, 감소 또는 방해시킬 수 있는 분자를 포함한다. 따라서, 용어 "VEGF 활성"은 구체적으로 VEGF의 VEGF 매개된 생물학적 활성 (상기 정의된 바와 같음)을 포함한다. 일 실시양태에서, VEGF-길항제는 항-VEGF 항체 B20-4.1.1이다. 또다른 실시양태에서, VEGF-길항제는 항-VEGF 항체 B20-4.1.1RR이다.

본원에 사용된 "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 변형어)는 치료되는 개체 또는 세포의 자연적 과정을 변경시키려는 시도로 수행되는 임상적 개입을 의미하고, 임상적 병상의 예방을 위해 또는 그 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 호전, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환 또는 질병의 발달을 지연시키거나 질환 또는 질병의 진행을 늦추는데 사용된다.

"만성" 투여는 급성 모드와 반대로 연속 모드로 작용제(들)을 투여하여, 연장된 기간 동안 초기 치료 효과 (활성)를 유지하는 것을 의미한다. "간헐적" 투여는 중지 없이는 연속적으로 수행되지 않으며 오히려 성질상 주기적인 치료이다.

"질병"은 (예를 들어, 비정상적 혈관신생 (과도하거나, 부적절하거나 또는 제어되지 않는 혈관신생) 또는 혈관 투과성을 겪거나 이에 대한 예방이 필요한 포유동물) 치료로부터 이익을 얻을 임의의 병태이다. 이는 포유동물이 해당 질병에 걸리기 쉽게 하는 병적 상태를 비롯한, 만성 및 급성 질병 또는 질환을 포함한다. 본원에서 치료하고자 하는 질병의 비제한적인 예로는 악성 및 양성 종양, 비-백혈병 및 림프성 악성종양, 및 특히 종양 (예를 들어, 암) 전이가 포함된다.

용어 "세포 증식성 질병" 및 "증식성 질병"은 어느 정도의 비정상적인 세포 증식과 관련이 있는 질병을 의미한다. 일 실시양태에서, 세포 증식성 질병은 암이다.

본원에 사용된 "종양"은 악성이든지 양성이든지 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전-암성 및 암성 세포 및 조직을 의미한다. 용어 "암," "암성," "세포 증식성 질병," "증식성 질병" 및 "종양"은 본원에서 언급되는 바와 같이 상호 배타적인 것은 아니다.

용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는, 포유동물의 생리학적 병태를 의미하거나 설명한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 상기 암의 보다 특정한 예로는 편평 세포 암, (소-세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평세포 암종을 비롯한) 폐암, 복막암, 간세포 암 (hepatocellular cancer), (위장관 암 및 위장관 기질 암을 비롯한) 위암 (gastric 또는 stomach cancer), 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암 (hepatoma), 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 콩팥 또는 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 다양한 유형의 두경부암, 흑색종, 표재 확장성 흑색종, 악성 흑자 흑색종, 선단 흑자성 흑색종, 결절성 흑색종, 뿐만 아니라 (저등급/여포성 비-호지킨 (non-Hodgkin's) 림프종 (NHL); 소 림프구성 (SL) NHL; 중등급/여포성 NHL; 중등급 확산성 NHL; 고등급 면역모세포성 NHL; 고등급 림프모세포성 NHL; 고등급 소 비-균열 세포 NHL; 거대 질환 NHL; 덮개 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증 (Waldenstrom's Macroglobulinemia)을 비롯한) B-세포 림프종; 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프모세포성 백혈병 (ALL); 모상 세포 백혈병; 만성 골수모세포성 백혈병; 및 이식후 림프증식성 질병 (PTLD) 외에도 모반증과 관련된 비정상적 혈관 증식, 부종 (예컨대 뇌종양과 관련된 것), 및 메이그스 증후군이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.

"개체", "대상체" 또는 "환자"는 척추동물이다. 특정 실시양태에서, 척추동물은 포유동물이다. 포유동물로는 농장 동물 (예컨대 소), 경주용 동물, 애완 동물 (예컨대 고양이, 개 및 말), 영장류, 마우스 및 래트가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.

용어 "제약 제제"는 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태로 존재하며 제제를 투여받는 대상체에게 허용되지 않는 독성을 나타내는 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 의미한다. 이러한 제제는 멸균성일 수 있다.

"멸균성" 제제는 무균성이거나 모든 살아있는 생물체 및 그의 포자가 없다.

"유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하는데 효과적인 양을 의미한다.

본 발명의 물질/분자의 "치료적 유효량"은 예를 들어, 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 유도할 수 있는 물질/분자의 능력과 같은 요인에 따라 변할 수 있다. 치료적 유효량은 물질/분자의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 치료적으로 유익한 효과에 의해 능가하는 양을 포함한다. "예방적 유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 목적하는 예방 결과를 달성하는데 효과적인 양을 의미한다. 반드시 그러한 것은 아니지만, 대개 예방 용량은 질환의 보다 이른 초기 단계 전에, 또는 보다 이른 초기 단계에서 대상체에게 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 것이다.

하나 이상의 추가의 치료제와 "함께" 투여한다는 것은 동시에 (동시 발생적으로) 및 임의 순서로 연속 투여하는 것을 포함한다.

본원에 사용된 "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에서 노출되는 세포 또는 포유동물에게 비독성인 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함한다. 종종, 생리적으로 허용되는 담체는 수성 pH 완충처리된 용액이다. 생리적으로 허용되는 담체의 예는 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 다른 유기산; 항산화제 (아스코르브산 포함); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류 및 다른 당질 (글루코스, 만노스, 또는 덱스트린 포함); 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당 알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온계 계면활성제, 예를 들어, 트윈™, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 플루로닉스(PLURONICS)™가 포함된다.

"리포좀"은 포유동물에 약물 (예컨대, VEGF 폴리펩티드 또는 그에 대한 항체)을 전달하는데 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소포체이다. 리포좀의 성분은 일반적으로 생물학적 막의 지질 배열과 유사하게 이중층 형성으로 배열된다.

용어 "항-신생물성 조성물"은 예를 들어, "항암제"와 같이 적어도 하나의 활성 치료제를 포함하는 것으로, 암 치료에 유용한 조성물을 의미한다. 치료제 (항암제)의 예로는 예를 들어, 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 요법에서 사용되는 작용제, 항-혈관신생제, 아폽토시스제, 항-튜불린제, 및 암 치료용의 기타 다른 제제, 예컨대 항-HER-2 항체, 항-CD20 항체, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 길항제 (예를 들어, 티로신 키나제 억제제), HER1/EGFR 억제제 (예를 들어, 에를로티닙 (타르세바(Tarceva^TM)), 혈소판-유래 성장 인자 억제제 (예를 들어, 글리벡^TM (이마티닙 메실레이트)), COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브), 인터페론, 사이토카인, 다음 표적 ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-베타, BlyS, APRIL, BCMA 또는 VEGF 수용체(들) 중 하나 이상에 결합하는 길항제 (예를 들어, 중화 항체), TRAIL/Apo2, 및 기타 다른 생물학적 활성제 및 유기 화학제 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 이들의 조합물이 또한 본 발명에 포함된다.

본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방해하고/하거나 세포의 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 의미한다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At²¹¹, I^l31, I^l25, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제, 효소 및 그의 단편, 예컨대 뉴클레오티드 분해 효소, 항생제, 및 독소, 예컨대 소분자 독소 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함), 및 하기 개시하는 각종 항종양제 또는 항암제를 포함하는 것으로 의도된다. 다른 세포독성제는 하기에 기술한다. 살종양제는 종양 세포를 파괴한다.

"독소"는 세포의 성장 또는 증식에 대해 유해한 효과를 나타낼 수 있는 임의의 물질이다.

"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로스포스파미드 (사이톡산(CYTOXAN)®); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민 (알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸로멜라민 포함); 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄포테신 (합성 유사체 토포테칸 (하이캄틴(HYCAMTIN)®) 포함), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토자르(CAMPTOSAR)®), 아세틸캄토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님누스틴; 항생제, 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Nicolaou et al., Angew . Chem Intl . Ed. Engl ., 33: 183-186 (1994)] 참조); CDP323, 경구 알파-4 인테그린 억제제; 다이네미신 (다이네미신 A 포함); 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 발색단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우쓰라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (아드리아마이신(ADRIAMYCIN)®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포좀 주사 (독실(DOXIL)®), 리포좀 독소루비신 TLC D-99 (미오세트(MYOCET)®), 페길화 리포좀 독소루비신 (카엘릭스(CAELYX)®) 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사제, 예컨대 메토트렉세이트, 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)®), 테가푸르 (우프토랄(UFTORAL)®), 카페시타빈 (제로다(XELODA)®), 에포틸론, 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 콤브레타스타틴; 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토크산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소크산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체 (미국 오레곤주 유진 소재의 JHS 내츄럴 프로덕츠(JHS Natural Products)); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2'-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)®), 파클리탁셀의 알부민-처리된 나노입자 제제 (아브락산(ABRAXANE)^TM), 및 도세탁셀 (탁소티어(TAXOTERE)®); 클로란부실; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 (예를 들어, 엘록사틴(ELOXATIN)®) 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)®), 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)®), 빈데신 (엘디신®, 필데신®), 및 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)®)을 비롯한, 튜불린 중합이 미세소관을 형성하는 것을 방지하는 빈카; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토크산트론; 류코보린; 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산 (벡사로텐 (타르그레틴(TARGRETIN)®) 포함); 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)® 또는 오스탁(OSTAC)®), 에티드로네이트 (디드로칼(DIDROCAL)®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (조메타(ZOMETA)®), 알렌드로네이트 (포사맥스(FOSAMAX)®), 파미드로네이트 (아레디아(AREDIA)®), 틸루드로네이트 (스켈리드(SKELID)®), 또는 리세드로네이트 (악토넬(ACTONEL)®); 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 관여하는 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R) (예를 들어, 에를로티닙 (타르세바^TM); 및 세포 증식을 감소시키는 VEGF-A; 백신, 예컨대 테라토프(THERATOPE)® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신, 및 박시드(VAXID)® 백신; 토포이소머라제 1 억제제 (예를 들어, 루르토테칸(LURTOTECAN)®); rmRH (예를 들어, 아바렐릭스(ABARELIX)®); BAY439006 (소라페닙; 바이엘(Bayer)); SU-11248 (수니티닙, 수텐트®, 화이자(Pfizer)); 페리포신, COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브 또는 에토리콕시브), 프로테오좀 억제제 (예를 들어, PS341); 보르테조밉 (벨케이드(VELCADE)®); CCI-779; 티피파르닙 (R11577); 오라페닙, ABT510; Bcl-2 억제제, 예컨대 오블리머센 나트륨 (게나센스(GENASENSE)®); 픽산트론; EGFR 억제제; 티로신 키나제 억제제; 세린-트레오닌 키나제 억제제, 예컨대 라파마이신 (시롤리무스, 라파문(RAPAMUNE)®); 파르네실트랜스퍼라제 억제제, 예컨대 로나파르닙 (SCH 6636, 사라사르(SARASAR)^TM); 및 상기 임의의 작용제의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 2개 이상의 상기 작용제의 조합물, 예컨대 CHOP (사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어) 및 FOLFOX (5-FU 및 류코보린과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴™)을 이용한 치료 요법에 대한 약어), 및 상기 임의의 작용제의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 2개 이상의 상기 작용제의 조합물을 포함한다.

본원에 정의된 화학요법제는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하는 "항-호르몬제" 또는 "내분비 치료제"를 포함한다. 이들은 호르몬 자체일 수 있으며, 하기를 포함하나 이제 한정되지 않는다: 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절인자 (SERM), 예를 들어, 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)® 타목시펜 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 파레스톤(FARESTON) 토레미펜; 부신선에서 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가제(MEGASE)® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)® 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, 리비소르(RIVISOR)® 보로졸, 페마라(FEMARA)® 레트로졸, 및 아리미덱스(ARIMIDEX)® 아나스트로졸; 및 항-안드로겐제, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 관여하는 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어, PKC-알파, Raf 및 H-Ras; 리보자임, 예컨대 VEGF 발현 억제제 (예를 들어, 안지오자임(ANGIOZYME)® 리보자임) 및 HER2 발현 억제제; 유전자 요법 백신과 같은 백신, 예를 들어, 알로벡틴® 백신, 류벡틴® 백신, 및 박시드® 백신; 프로류킨(PROLEUKIN)® rIL-2; 루르토테칸® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스® rmRH; 비노렐빈 및 에스페라미신 (미국 특허 제4,675,187호 참조), 및 상기 임의의 작용제의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 2개 이상의 상기 작용제의 조합물.

본원에 사용되는 경우 "성장 억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 세포 (예컨대 VEGF를 발현하는 세포)의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 따라서, 성장 억제제는 S기에서 세포 (예컨대 VEGF를 발현하는 세포)의 비율을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 다른 시기에) 차단하는 작용제, 예컨대 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 작용제를 포함한다. 고전적 M기 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산 및 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 작용제, 예를 들어, DNA 알킬화제, 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C는 S기 정지로까지 이어진다. 추가의 정보는 문헌 [Mendelsohn and Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995), e.g., p. 13]에서 찾을 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 둘 다 주목에서 유래된 항암 약물이다. 유럽 주목에서 유래된 도세탁셀 (탁소티어®, 롱-프랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer))은 파클리탁셀 (탁솔®, 브리스톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb))의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터 미세소관의 조립을 촉진하고, 세포의 유사분열을 억제하는 탈중합을 방지함으로써 미세소관을 안정화시킨다.

질환의 "병상"이란 환자의 웰빙을 위협하는 모든 현상을 포함하다. 암의 경우에는, 제한없이, 비정상적이거나 제어되지 않는 세포 성장, 전이, 이웃 세포의 정상적인 기능 방해, 사이토카인 또는 기타 다른 분비 생성물의 비정상적인 수준으로의 방출, 염증 반응 또는 면역 반응의 억제 또는 악화 등을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "전구약물"은 모 약물에 비하여 종양 세포에 대한 세포독성이 더 약하고, 효소에 의해서 더욱 활성을 띠는 모 형태로 활성화되거나 전환될 수 있는, 제약상 활성인 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 의미한다. 예를 들어, 문헌 ([Wilman (1986) "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast] 및 [Stella et al. (1985) "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press])을 참조한다. 본 발명의 전구약물로는 보다 활성을 띠며 세포독성이 없는 약물로 전환될 수 있는 것인, 포스포네이트-함유 전구약물, 티오포스포네이트-함유 전구약물, 술페이트-함유 전구약물, 펩티드-함유 전구약물, D-아미노산-변형 전구약물, 당화된 전구약물, 베타-락탐-함유 전구약물, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 기타 다른 5-플루오로우리딘 전구약물이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용하기 위한 전구약물 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예로는 상기 기술된 화학요법제가 포함되나, 이에 한정되지 않는다.

"소분자"는 분자량이 약 500 달톤 미만인 것으로 본원에 정의된다.

"정제된"은 분자가 그를 함유하는 시료 중 95 중량％ 이상, 또는 98 중량％ 이상의 농도로 시료에 존재하는 것을 의미한다.

"단리된" 핵산 분자는 예를 들어 그의 자연 환경에서 통상적으로 관련되는 1종 이상의 다른 핵산 분자로부터 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 또한 핵산 분자를 통상적으로 발현하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외부 또는 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.

본원에 사용된 용어 "벡터"는 연결된 또다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 의미하는 것으로 의도된다. 한 유형의 벡터는 추가의 DNA 세그먼트가 라이게이션될 수 있는 환형 이중가닥 DNA를 의미하는 "플라스미드"이다. 또다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 그가 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제될 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피좀 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있으며, 그 결과 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 그와 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" 또는 간단히 "발현 벡터"로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 이용되는 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 플라스미드는 가장 통상적으로 사용되는 형태의 벡터이다.

본원에서 상호 교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의 길이의 뉴클레오티드들의 중합체를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제 또는 합성 반응에 의해 중합체로 도입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 중합체의 조립 이전 또는 이후에 뉴클레오티드 구조의 변형이 이루어질 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에서는 비-뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 후에 생성된 변형(들), 예컨대 표지에 대한 접합을 포함할 수 있다. 여타 유형의 변형으로는, 예를 들어 "캡(cap)", 즉 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드가 유사체로 치환된 것, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 비하전 결합 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등) 및 하전 결합 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것들, 펜던트 모이어티, 예컨대 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, ply-L-리신 등)를 함유하는 것들, 삽입자 (예를 들어, 아크리딘, 프솔라렌 등)를 갖는 것들, 킬레이트제 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 것들, 알킬화제를 함유하는 것들, 변형 결합 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 갖는 것들, 및 비-변형 형태의 폴리뉴클레오티드(들)이 포함된다. 또한, 당에 통상적으로 존재하는 히드록실 기들 중 임의의 것이, 예를 들어 포스포네이트 기, 포스페이트 기로 치환되거나, 표준 보호기로 보호되거나, 활성화되어 추가의 뉴클레오티드로의 추가의 결합을 생성할 수 있거나, 또는 고체 또는 반-고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 1 내지 20개의 탄소 원자의 유기 캡핑 모이어티 또는 아민으로 치환되거나 인산화될 수 있다. 또한, 다른 히드록실이 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한, 당업계에 일반적으로 알려져 있는 유사체 형태의 리보스 또는 데옥시리보스 당, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴-, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 크실로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비-시클릭 유사체, 및 염기성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 결합은 대체가능한 결합기로 대체될 수 있다. 이러한 대체가능한 결합기로는, 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR₂ ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH₂ ("포름아세탈") (여기서, 각 R 또는 R'는 독립적으로, H, 또는 에테르 (-O-) 결합, 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알딜을 임의로 함유하는 치환 또는 비치환 알킬 (1-20 C)임)로 대체된 실시양태들이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드에서의 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 위 설명은 RNA 및 DNA를 비롯한, 본원에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.

일반적으로, 본원에서 사용되는 "올리고뉴클레오티드"는, 일반적으로 (반드시는 아님) 약 200개 미만의 뉴클레오티드 길이를 갖는, 짧고, 일반적으로 단일-가닥이며, 일반적으로 합성의 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 설명은 올리고뉴클레오티드에 동등하게 및 완전히 적용된다.

기준 폴리펩티드 서열과 관련한 "아미노산 서열 동일성(％)"은, 서열을 정렬하고, 필요하다면 최대 서열 동일성(％)을 얻기 위해 갭을 도입한 후, 임의의 보존적인 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않은 상태에서 기준 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성(％)을 측정하기 위한 정렬은 당업계의 기술에 속하는 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign; DNASTAR) 소프트웨어와 같이 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교될 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리듬을 비롯하여 서열의 정렬을 위해 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 아미노산 서열 동일성 값(％)은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성한다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크. (Genentech, Inc.)사가 개발하였으며, 그 소스 코드는 미국 저작권청 (미국 20559 워싱턴 D.C.)의 사용자 문서로 보관되어 있는데, 이는 미국 저작권 등록 제TXU510087호 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (미국 캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코)로부터 공개적으로 입수할 수 있거나, 소스 코드로부터 컴파일링할 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 체제, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서의 사용을 위해 컴파일링될 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며, 다양하지 않다.

아미노산 서열 비교를 위해 ALIGN-2가 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성(％) (주어진 아미노산 서열 B에 대한 특정 아미노산 서열 동일성(％)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:

분수 X/Y × 100

여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2의 A 및 B 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 개수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성(％)이 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성(％)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다. 달리 언급하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 값(％)은 직전 단락에 기재되어 있는 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻는다.

"조절 서열"이란 표현은, 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 조절 서열에는, 예를 들어 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위가 포함된다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.

핵산은, 이것이 또다른 핵산 서열과의 기능적 관계에 놓일 때 "작동가능하게 연결된" 것이다. 예를 들어, 프리서열 또는 분비 리더를 위한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구단백질로서 발현되는 경우에, 폴리펩티드를 위한 DNA에 작동가능하게 연결된 것이고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이고; 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 위치한 경우에, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"이란, 연결된 DNA 서열들이 연속적이고, 분비 리더의 경우에는 연속적이면서 판독 단계에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 반드시 연속적일 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 실무에 따라 사용된다.

본원에서 사용되는 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호 교환적으로 사용되며, 모든 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, 용어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 전달 회수에 무관하게, 그로부터 유래된 1차 대상 세포 및 배양물을 포함한다. 또한, 모든 자손은 의도적이거나 의도하지 않은 돌연변이로 인해 DNA 함량이 정확히 일치하지 않을 수 있는 것으로 이해한다. 최초 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다. 별개의 명칭이 의도되는 경우, 이는 문맥으로부터 명백할 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "동시에"는, 적어도 일부의 투여 시간이 겹치는 2종 이상의 치료제를 투여하는 경우를 지칭한다. 따라서, 동시 투여는 하나 이상의 다른 작용제(들)의 투여를 중단한 후에 하나 이상의 작용제(들)의 투여를 계속하는 투여 요법을 포함한다.

본원에서 "암 재발"은 치료 후 암의 재발을 지칭한다. 일 실시양태에서, 암 재발은 유방에서의 암 재발, 및 유방 외부에서 암이 재발하는 먼거리 재발을 포함한다.

본 발명의 조성물

본 발명은 단리된 항체 및 폴리뉴클레오티드 실시양태를 포함한다. 일 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 정제된다.

또한, 본 발명은 항-VEGF 항체; 및 항-VEGF 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 (제약 조성물 포함)을 포함한다. 본원에서 사용되는 조성물은 VEGF에 결합하는 하나 이상의 항체, 및/또는 VEGF에 결합하는 하나 이상의 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이들 조성물은 당업계에 잘 알려져 있는 적합한 담체, 예컨대 제약상 허용되는 부형제 (완충제 포함)를 추가로 포함할 수 있다.

일 실시양태에서, 본 발명의 항-VEGF 항체는 모노클로날이다. 또다른 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 폴리클로날이다. 본원에서 제공되는 항-VEGF 항체의 Fab, Fab', Fab'-SH 및 F(ab')₂ 단편도 본 발명의 범주 내에 포함된다. 이들 항체 단편은 종래 수단, 예컨대 효소적 분해에 의해 생성될 수 있거나, 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 이러한 항체 단편은 키메라 또는 인간화된 것일 수 있다. 이들 단편은 하기 진단 및 목적에 유용하다. 일 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체이다.

모노클로날 항체는 실질적으로 동질성인 항체 집단으로부터 수득된다 (즉, 최소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외한, 집단을 포함하는 개개의 항체들은 동일함). 따라서, 수식어구 "모노클로날"은 항체의 특징이 별개 항체들의 혼합이 아님을 나타낸다.

파지 라이브러리로부터 유래된 예시적인 모노클로날 항체는 본원에 제공되어 있고, 실시예 1에 기술되어 있다. 이러한 항체는 B20-4.1.1 및 B20-4.1.1RR로 지칭된다. B20-4.1.1 및 B20-4.1.1RR의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 서열은 도 1 및 6 내지 9에 제시되어 있다.

관심 항원 상의 특정 에피토프에 결합하는 항체에 대한 스크리닝을 위해, 일반적인 교차-차단 검정법, 예컨대 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 검정법을 수행할 수 있다. 별법으로, 항체가 관심 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 예를 들어 문헌 [Champe et al. (1995) J. Biol . Chem . 270:1388-1394]에 기재된 바와 같은 에피토프 맵핑을 수행할 수 있다. 항-VEGF 항체의 또다른 예시적인 실시양태가 하기 제공된다.

항-VEGF 항체의 특정 실시양태

일 실시양태에서, 본 발명은

(i) 서열 1의 서열을 포함하는 HVR-H1 서열;

(ii) 서열 2의 서열을 포함하는 HVR-H2 서열;

(iii) 서열 3의 서열을 포함하는 HVR-H3 서열;

(iv) 서열 4의 서열을 포함하는 HVR-L1 서열;

(v) 서열 6의 서열을 포함하는 HVR-L2 서열;

(vi) 서열 7의 서열을 포함하는 HVR-L3 서열

을 포함하는 항체를 제공한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은

(i) 서열 1의 서열을 포함하는 HVR-H1 서열;

(ii) 서열 2의 서열을 포함하는 HVR-H2 서열;

(iii) 서열 3의 서열을 포함하는 HVR-H3 서열;

(iv) 서열 5의 서열을 포함하는 HVR-L1 서열;

(v) 서열 6의 서열을 포함하는 HVR-L2 서열;

(vi) 서열 7의 서열을 포함하는 HVR-L3 서열

을 포함하는 항체를 제공한다.

서열 1 내지 7의 아미노산 서열은 도 1에 나타낸 개별 HVR (즉, H1, H2 또는 H3)과 관련하여 넘버링된 것이며, 그 넘버링은 하기 카바트 넘버링 시스템과 일치한다.

일 측면에서, 본 발명은 도 1에 제시된 중쇄 HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다.

본 발명의 항체의 일부 실시양태는 하기 서열 39에 제시된 바와 같은, 인간화된 4D5 항체 (huMAb4D5-8) (허셉틴(HERCEPTIN)^®, 제넨테크, 인크., 미국 캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코) (미국 특허 제6,407,213호 및 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93]에서도 언급됨)의 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

일 실시양태에서, huMAb4D5-8 경쇄 가변 도메인 서열은 30번, 66번 및 91번 위치 (각각, 상기에서 볼드/이탤릭체로 표시된 Asn, Arg 및 His) 중 하나 이상에서 변형된다. 일 실시양태에서, 변형된 huMAb4D5-8 서열은 30번 위치에서 Ser, 66번 위치에서 Gly, 및/또는 91번 위치에서 Ser을 포함한다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 하기 서열 40에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

huMAb4D5-8와 비교시, 치환된 잔기들은 상기에서 볼드/이탤릭체로 표시되어 있다.

본 발명의 항체는, VEGF로의 결합 활성이 실질적으로 유지되는 경우라면, 임의의 적합한 프레임워크 가변 도메인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 하위군 III 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 포함한다. 이들 항체의 일 실시양태에서, 프레임워크 컨센서스 서열은 71번, 73번 및/또는 78번 위치에서 치환을 포함한다. 이들 항체의 일부 실시양태에서, 71번 위치는 A이고, 73번 위치는 T이고/거나 78번 위치는 A이다. 일 실시양태에서, 이들 항체는 huMAb4D5-8 (허셉틴^®, 제넨테크, 인크., 미국 캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코) (미국 특허 제6,407,213호 및 제5,821,337호, 및 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93]에서도 언급되어 있음)의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 이들 항체는 인간 κI 경쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다. 일 실시양태에서, 이들 항체는 미국 특허 제6,407,213호 및 제5,821,337호에 기재된 huMAb4D5-8의 경쇄 HVR 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 이들 항체는 huMAb4D5-8 (허셉틴^®, 제넨테크, 인크., 미국 캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코) (미국 특허 제6,407,213호 및 제5,821,337호, 및 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93]에서도 언급되어 있음)의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.

일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열이 서열 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 및/또는 26의 서열 (도 2a 및 2b)을 포함하고, HVR H1, H2 및 H3 서열이 각각 서열 1, 2 및/또는 3인 것인 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열이 서열 27, 28, 29 및/또는 30의 서열 (도 3)을 포함하고, HVR L1 서열이 서열 4 또는 5이고, HVR L2 서열이 서열 6이고, HVR L3 서열이 서열 7인 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 43의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 44 또는 45의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 43의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 45의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 44의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 45의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

일 측면에서, 본 발명은 VEGF로의 결합에 대하여 상기-언급한 항체들 중 임의의 것과 경쟁하는 항체를 제공한다. 일 측면에서, 본 발명은 상기 언급된 항체들 중 임의의 것과 동일한, VEGF 상의 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.

항체 단편

본 발명은 항체 단편을 포함한다. 항체 단편은 종래 수단, 예컨대 효소적 분해, 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 특정 경우에서, 전체 항체보다 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 단편의 크기가 작을수록, 신속한 제거가 가능해지며, 고체 종양으로의 개선된 접근이 이루어질 수 있다. 특정 항체 단편의 검토를 위해서는 문헌 [Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134]를 참조한다.

항체 단편을 생성하기 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해성 분해를 통해 유도되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)]; 및 [Brennan et al, Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생성될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 E. 콜라이에서 발현되고 이로부터 분비될 수 있으며, 이에 따라 다량의 상기 단편이 쉽게 생성될 수 있다. 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 E. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')₂ 단편을 형성할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또다른 접근법에 따라, F(ab')₂ 단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리시킬 수 있다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하며 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')₂ 단편은 미국 특허 제5,869,046호에 기재되어 있다. 항체 단편의 생성 기술은 당업자에게 자명할 것이다. 특정 실시양태에서, 항체는 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 제5,587,458호를 참조한다. Fv 및 scFv는 불변 영역이 없는 무손상 결합 부위를 갖는 유일의 종이며, 따라서 이들은 생체내 이용 동안 감소된 비-특이적 결합을 위해 적합하다. scFv 융합 단백질을 작제하여 scFv의 아미노 또는 카르복시 말단에서 이펙터 단백질의 융합을 생성할 수 있다. 상기 문헌 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck]을 참조한다. 또한, 항체 단편은 예를 들어, 미국 특허 제5,641,870호에 기재되어 있는 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체는 단일-특이적 또는 이중-특이적일 수 있다.

인간화된 항체

본 발명은 인간화된 항체를 포함한다. 비-인간 항체를 인간화시키는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 인간화된 항체는 비-인간 공급원으로부터 그 내부로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 "도입" 잔기로서 종종 언급되고, 이는 전형적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 본질적으로, 윈터(Winter) 및 공동연구자들의 방법 (문헌 [Jones et al. (1986) Nature 321:522-525]; [Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327]; [Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536])에 따라, 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 대체함으로써 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는, 실질적으로 보다 적은 무손상 인간 가변 도메인이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로, 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.

인간화된 항체의 제조에 사용되는 경쇄 및 중쇄의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성의 감소에 있어서 중요할 수 있다. 소위 "최적-맞춤(best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이후, 설치류의 것과 가장 근접한 인간 서열이 인간화된 항체를 위한 인간 프레임워크로서 허용된다 (예를 들어, 문헌 [Sims et al. (1993) J. Immunol . 151:2296]; [Chothia et al. (1987) J. Mol . Biol . 196:901] 참조). 또다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래한 특정 프레임워크 영역을 이용한다. 동일한 프레임워크가 수개의 상이한 인간화된 항체를 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Carter et al. (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:4285]; [Presta et al. (1993) J. Immunol, 151:2623] 참조).

항체가 항원에 대한 높은 결합 친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것이 보다 일반적으로 바람직하다. 이러한 목적을 달성하기 위해서, 한 방법에 따르면, 모체 서열 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 이용하는, 모체 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 인간화된 항체를 제조한다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하며, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 그리고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용될 수 있다. 이들 디스플레이를 조사하면, 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, 수용체 서열 및 도입 서열로부터 FR 잔기들을 선택 및 조합하여 목적하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합으로의 영향에 직접적으로, 그리고 가장 실질적으로 관여한다.

인간 항체

본 발명의 인간 항체는 인간-유래의 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 앞서 기재된 공지된 인간 불변 도메인 서열(들)과 조합함으로써 작제할 수 있다. 별법으로, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생성을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는, 예를 들어 문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibodies Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]; 및 [Boerner et al., J. Immunol , 147: 86 (1991)]에 기재된 바 있다.

현재, 면역화시에 내인성 면역글로불린 생성의 부재하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생성할 수 있다. 예를 들면, 키메라 및 생식계열 돌연변이체 마우스의 항체 중쇄 연결 영역 (J H) 유전자의 동종접합성 결실은 내인성 항체 생성을 완전히 억제시키는 것으로 설명된 바 있다. 이러한 생식계열 돌연변이체 마우스 내로 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이를 전달하면, 항원 시험 접종시에 인간 항체가 생성될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA, 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immunol, 7: 33 (1993)]을 참조한다.

또한, 인간 항체가 출발 비-인간 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 갖는 것인, 비-인간 (예를 들어, 설치류) 항체로부터의 인간 항체를 유도하기 위해 유전자 셔플링이 이용될 수 있다. 소위 "에피토프 각인"으로도 명명되는 상기 방법에 따라, 상기 기술된 바와 같은 파지 디스플레이 기술에 의해 수득된 비-인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 인간 V 도메인 유전자 레퍼토리로 대체하여 비-인간 쇄/인간 쇄 scFv 또는 Fab 키메라 집단을 생성할 수 있다. 항원을 사용하여 선별함으로써, 1차 파지 디스플레이 클론 중의 상응하는 비-인간 쇄를 제거할 때 파괴되는 항원 결합 부위를 인간 쇄가 수복하는 것인 비-인간 쇄/인간 쇄 키메라 scFv 또는 Fab를 단리시킬 수 있으며, 즉 에피토프가 인간 쇄 파트너의 선택을 지배한다 (각인시킨다). 남아있는 비-인간 쇄를 대체하기 위해 상기 방법을 반복할 경우, 인간 항체를 수득하게 된다 (1993년 4월 1일 공개된 PCT WO 93/06213 참조). 종래의 CDR 이식에 의한 비-인간 항체의 인간화와는 달리, 상기 기술은 비-인간 기원의 FR 또는 CDR 잔기를 갖지 않는 완전한 인간 항체를 제공한다.

이중특이적 항체

이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는, 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 특정 실시양태에서, 하나의 결합 특이성은 VEGF에 대한 것이며, 나머지는 임의의 기타 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 VEGF의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한, 세포독성제를, VEGF를 발현하는 세포에 편재시키는 데 사용될 수 있다. 이들 항체는 VEGF-결합 암(arm), 및 세포독성제 (예를 들어, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 (ricin) A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 암을 갖는다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')₂ 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.

이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생성은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현에 기초하는데, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature, 305:537 (1983)]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류 때문에, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마(quadroma))는 그 중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는 10종의 상이한 항체 분자들의 잠재적인 혼합물을 생성한다. 보통 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829 (1993년 5월 13일 공개) 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991)]에 개시되어 있다.

또다른 접근법에 따르면, 목적하는 결합 특이성(항체-항원 결합 부위)를 갖는 항체 가변 도메인을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 예를 들어, 융합체는, 적어도 일부의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 특정 실시양태에서, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 불변 영역 (CH1)이 적어도 하나의 융합체에 존재한다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및 필요한 경우, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 개별 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 동시-형질감염시킨다. 이는 작제에 사용된 3개의 폴리펩티드 쇄의 불균등한 비율이 최적의 수율을 제공하는 실시양태에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 큰 탄력성을 제공한다. 그러나, 균등 비율의 적어도 2개의 폴리펩티드 쇄가 높은 수율로 발현될 때, 또는 상기 비율이 특별히 유의하지 않을 때, 하나의 발현 벡터 내에 2 또는 3개 전부의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.

상기 접근법의 일 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 쪽 암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 손쉬운 분리 방법을 제공하므로, 상기 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 쇄 조합물로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성하는 추가의 상세한 내용에 대해서는 예를 들면, 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.

또다른 방법에 따르면, 한쌍의 항체 분자들 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화하도록 조작될 수 있다. 계면은 항체 불변 도메인의 C_H3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)으로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써, 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "캐비티(cavity)"가 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 다른 원치않는 최종 생성물 (예컨대, 동종이량체)에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키기 위한 기전을 제공한다.

이중특이적 항체는 가교된 또는 "이종접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체는 예를 들면, 면역계 세포를 원치않는 세포에 표적화시키기 위해 (미국 특허 제4,676,980호), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 91/00360, WO 92/00373 및 EP 03089) 제안되었다. 이종접합체 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교제는 당업계에 잘 알려져 있고, 수많은 가교 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.

항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하기 위한 기술은 또한, 문헌에서 설명된 바 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 화학적 결합을 이용하여 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]에는 무손상 항체가 단백질분해적 방식으로 절단되어 F(ab')₂ 단편을 생성하는 절차가 기재되어 있다. 이들 단편은 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지하기 위해 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재하에 환원된다. 이어서, 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. 이어서, Fab'-TNB 유도체들 중 하나가 머캅토에틸아민에 의한 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 물질로서 사용될 수 있다.

최근의 진보는, 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는, E. 콜라이로부터의 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp . Med ., 175: 217-225 (1992)]에서는 완전 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')₂ 분자의 생성을 기술하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 E. 콜라이로부터 따로 분비시키고, 이중특이적 항체를 형성하도록 시험관 내에서 유도 화학 커플링 반응시켰다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 HER2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수 있었다.

또한, 이중특이적 항체 단편을 재조합 세포 배양물로부터 직접 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술이 기술되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생성되었다 (문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성한 후, 재산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 상기 방법은 또한, 항체 동종이량체의 생성에 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 다른 기전을 제공하였다. 이 단편은 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이에서 페어링되기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 또다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 페어링하고, 이에 의해 2개의 항원 결합 부위가 형성된다. 단일 쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용한 이중특이적 항체 단편의 또다른 제조 전략도 보고된 바 있다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol, 152:5368 (1994)]를 참조한다.

2가 초과의 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다 (문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991)]).

다가 항체

다가 항체는, 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 빠르게 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 항원 결합 부위가 3 개 이상인 (예를 들어, 4가 항체) 다가 항체 (IgM 부류 이외의 것)일 수 있고, 이는 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생성될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이로 구성된다). 상기 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역의 아미노 말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 특정 실시양태에서, 다가 항체는 3 내지 약 8개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이로 구성된다). 이러한 일 실시양태에서, 다가 항체는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이로 구성된다). 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄 (예를 들어, 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하는데, 여기서 폴리펩티드 쇄(들)는 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들면, 폴리펩티드 쇄(들)는 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc (여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 하나의 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1임) 를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본원의 다가 항체는 적어도 2개 (예를 들어, 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 다가 항체는 예를 들어 약 2 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.

단일-도메인 항체

일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 단일-도메인 항체이다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도맨티스, 인크.(Domantis, Inc.), 미국 매사추세츠주 월썸; 예를 들어, 미국 특허 제6,248,516 B1호 참조). 일 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부로 구성된다.

항체 변이체

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변형을 도입하거나, 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열내 잔기로부터의 결실 및/또는 그로의 삽입 및/또는 그의 치환을 포함한다. 최종 작제물이 목적하는 특징을 갖는다면, 최종 작제물을 달성하도록 결실, 삽입 및 치환의 임의 조합이 이루어질 수 있다. 아미노산 변경은 서열이 제조될 때 대상 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.

돌연변이유발에 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 영역을 확인하기 위한 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 여기서, 표적 잔기들의 잔기 또는 기가 확인되고 (예를 들어, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu와 같은 하전된 잔기), 항원과 아미노산의 상호작용에 영향을 주도록 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체된다. 이어서, 치환에 대한 기능적 감도를 나타내는 이들 아미노산 위치는 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대해 추가의 또는 다른 변이체를 도입함으로써 개량된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 자체의 성질은 미리 결정될 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위해 ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발법이 표적 코돈 또는 영역에서 수행되고, 발현된 면역글로불린은 목적하는 활성에 대해 스크리닝된다.

아미노산 서열 삽입은 길이가 1개의 잔기, 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합체, 및 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예에는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체가 포함된다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드로의, 항체의 N- 또는 C-말단의 융합체를 포함한다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항체가 당화되는 정도를 증가 또는 감소시키도록 변경된다. 폴리펩티드의 당화는 전형적으로, N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄로 탄수화물 모이어티의 부착을 의미한다. 트리펩티드 서열, 즉 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄로의 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내의 상기 트리펩티드 서열의 존재는 잠재적인 당화 부위를 생성한다. O-연결 당화는 당 N-아세일갈락토스아민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나가 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신도 사용될 수 있다.

항체로의 당화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 상기 기재된 트리펩티드 서열이 생성 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다 (N-연결 당화 부위의 경우). 또한, 변경은 원래 항체의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결 당화 부위의 경우).

항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 그에 부착되는 탄수화물을 변경시킬 수 있다. 전형적으로, 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 항체는 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297로의 N-연결에 의해 일반적으로 부착된 분지형 이중안테나 올리고당을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al. (1997) TIBTECH 15:26-32]를 참조한다. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코스아민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산, 및 이중안테나 올리고당 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해, 본 발명의 항체에서 올리고당의 변형이 이루어질 수 있다.

예를 들어, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조물을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 이러한 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공보 제US 2003/0157108호 (프레스타, L.); 제US 2004/0093621호 (교와 하꼬 고교 컴퍼니, 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))를 참조한다. "탈푸코실화된" 또는 "푸코스-결핍성" 항체와 관련된 공개 문헌의 예에는 다음이 포함된다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol . Biol . 336:1239-1249 (2004)]; [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng . 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예에는, 단백질 푸코실화 결핍성인 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al. Arch. Biochem . Biophys. 249:533-545 (1986)]; US 2003/0157108 A1 (프레스타, L.); 및 WO 2004/056312 A1 (아담스(Adams) 등, 특히 실시예 11), 및 넉아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng . 87: 614 (2004)]; [Kanda, Y. et al., Biotechnol . Bioeng ., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO 2003/085107 참조)가 포함된다.

예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고당이 GlcNAc로 이등분된 이등분 올리고당을 갖는 항체 변이체가 추가로 제공된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는, 예를 들어 WO 2003/011878 (쟝-메레(Jean-Mairet) 등); 미국 특허 제6,602,684호 (우마냐(Umana) 등); 및 US 2005/0123546 (우마냐 등)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고당 내에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체도 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는, 예를 들어 WO 1997/30087 (파텔(Patel) 등); WO 1998/58964 (라주 (Raju), S.) 및 WO 1999/22764 (라주, S.)에 기재되어 있다.

특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 추가로 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334에서의 치환 (잔기의 Eu 넘버링)을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 치환은 상기 변이들 중 임의의 것과 함께 발생할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 항체가, 생체 내에서 항체의 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능 (예컨대, 보체 및 ADCC)에는 불필요하거나 유해한 수많은 적용을 위한 바람직한 후보가 되도록 하는, 전부는 아니지만 일부의 이펙터 기능을 갖는 변경된 항체를 고려한다. 특정 실시양태에서, 항체의 Fc 활성을 측정하여, 목적하는 특성만이 유지되는 것을 확인한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행하여, CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행하여, 항체가 FcγR 결합은 결여되었으나 (따라서 ADCC 활성이 없을 수 있음) FcRn 결합 능력은 보유하는지에 대해 확인할 수 있다. ADCC를 매개하는 일차적인 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 제464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적인 예는 미국 특허 제5,500,362호 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I., et al. Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 83:7059-7063 (1986)] 및 [Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad . Sci . USA 82:1499-1502 (1985)] 참조); 제5,821,337호 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp . Med . 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 별법으로, 비-방사성 검정 방법이 이용될 수 있다 (예를 들어, 유세포 검정을 위한 ACTI™ 비-방사성 세포독성 검정 (셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰) 및 사이토톡스(CytoTox) 96^® 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 메디슨) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포로는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 들 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. 또한, C1q 결합 검정을 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 결여되었는지 확인할 수 있다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods 202:163 (1996)]; [Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)]; 및 [Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). 또한, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 FcRn 결합 및 생체내 제거율/반감기 측정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).

하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 다른 항체 변이체가 제공된다. 치환성 돌연변이유발을 위한 관심 부위에는 초가변 영역이 포함되지만, FR 변경도 고려된다. 보존적 치환은 하기 표 1에서 "바람직한 치환"의 표제 하에 제시된다. 보다 실질적인 변화, 즉 명명된 "예시적인 치환"은 표 1에 제공되거나, 아미노산 부류와 관련하여 아래에 상세히 기재되어 있다. 아미노산 치환은 관심 항체로 도입될 수 있고, 생성물은, 예를 들어 목적하는 활성, 예컨대 개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 개선된 ADCC 또는 CDC 등을 위해 스크리닝될 수 있다.

본래 잔기	예시적인 치환	바람직한 치환
Ala (A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn (N)	Gln; His; Asp, Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu; Asn	Glu
Cys (C)	Ser; Ala	Ser
Gln (Q)	Asn; Glu	Asn
Glu (E)	Asp; Gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신	Leu
Leu (L)	노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Val; Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신	Leu

항체의 생물학적 특성의 변형은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 형태로서의 치환 영역 내 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크에 영향을 미치는 치환을 선택함으로써 달성될 수 있다. 아미노산은 측쇄의 특성의 유사성에 따라 다음과 같이 분류될 수 있다 (문헌 [A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)]):

(1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)

(2) 비하전 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

(3) 산성: Asp (D), Glu (E)

(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His (H).

별법으로, 자연 발생 잔기는 통상적인 측쇄 특성에 기초하여 다음과 같이 분류될 수 있다:

(1) 소수성: 노르뉴신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비보존적 치환은 상기 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류와 교환하는 것을 수반할 것이다. 이러한 치환된 잔기는 또한, 보존적 치환 부위 내로, 또는 나머지 (비-보존된) 부위 내로 도입될 수 있다.

한 종류의 치환성 변이체는 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 개발을 위해 선택되는 생성된 변이체(들)은 이들이 생성되는 모 항체에 비해 변형된 (예를 들어, 개선된) 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적인 치환성 변이체는 친화도 성숙 항체이고, 이는 파지 디스플레이-기재 친화도 성숙 기술을 이용하여 편리하게 생성할 수 있다. 간단히 설명하면, 몇몇 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6-7개의 부위)가 각 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성하도록 돌연변이된다. 이렇게 생성된 항체는, 각 입자 내에 패키징된 파지 코트 단백질의 적어도 일부 (예를 들어, M13의 유전자 III 산물)로의 융합체로서의 필라멘트상 파지 입자로부터 디스플레이된다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 그 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인하도록 스캐닝 돌연변이유발 (예를 들어, 알라닌 스캐닝)을 수행할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 상기 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 본원에서 설명된 기술을 비롯한, 당업계에 공지된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 일단 그러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널을 본원에 기재된 기술을 비롯한, 당업계에 공지된 기술을 이용하여 스크리닝하고, 추가의 개발을 위해, 하나 이상의 관련 검정에서 우수한 특성을 갖는 항체를 선택할 수 있다.

항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 상기 방법에는 자연 공급원으로부터의 단리 (자연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 항체의 앞서 제조된 변이체 또는 비-변이체 형태의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 변형을 도입하여 Fc 영역 변이체를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. Fc 영역 변이체는 힌지 시스테인의 위치를 포함하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.

본 명세서 및 선행기술의 교시에 따르면, 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 야생형의 대응 항체에 비해, 예를 들어 Fc 영역에 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다는 것이 주시된다. 그럼에도 불구하고, 이러한 항체는 그의 야생형의 대응 항체와 비교할 때 치료 유용성에 필요한 실질적으로 동일한 특성을 보유할 것이다. 예를 들어, WO 99/51642에 기재된 바와 같이 변경된 (즉, 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 야기하는 특정 변경이 Fc 영역에서 이루어질 수 있다고 판단된다. 또한, Fc 영역 변이체의 다른 예에 대해서는 문헌 [Duncan ＆ Winter Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호; 및 WO 94/29351을 참고한다. WO 00/42072 (프레스타) 및 WO 2004/056312 (로만(Lowman))에는 FcR로의 결합이 개선되거나 감소된 항체 변이체가 기재되어 있다. 상기 특허 공보의 내용은 본원에서 참고로 구체적으로 인용된다. 또한, 문헌 [Shields et al. J. Biol . Chem . 9(2): 6591-6604 (2001)]을 참조한다. 모체 IgG의 태아로의 전달을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (문헌 [Guyer et al., J. Immunol . 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol . 24:249 (1994)])로의 개선된 결합 및 증가된 반감기를 갖는 항체는 US 2005/0014934 A1 (힌톤(Hinton) 등)에 기재되어 있다. 상기 항체는 Fc 영역과 FcRn의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 그 내부에 갖는 Fc 영역을 포함한다. Fc 영역 아미노산 서열이 변경되고 C1q 결합 능력이 증가 또는 감소된 폴리펩티드 변이체는 미국 특허 제6,194,551 B1호 및 WO 99/51642에 기재되어 있다. 상기 특허 공보의 내용은 본원에서 참고로 구체적으로 인용된다. 또한, 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol . 164: 4178-4184 (2000)]도 참조한다.

다른 측면에서, 본 발명은 Fc 영역을 포함하는 Fc 폴리펩티드의 계면에, 이종이량체화를 용이하게 하고/거나 촉진시키는 변형을 포함하는 항체를 제공한다. 상기 변형은 제1 Fc 폴리펩티드 내에 돌출부를, 제2 Fc 폴리펩티드 내에 캐비티를 도입하는 것을 포함하고, 여기서 돌출부는 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드의 복합체화를 촉진시키기 위해 캐비티 내에 위치할 수 있다. 상기 변형을 갖는 항체를 생성시키는 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,731,168호에 기재되어 있는 바와 같이 당업계에 공지되어 있다.

또다른 측면에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작 항체, 예를 들어 "thioMAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시양태에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 발생한다. 이러한 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 위치하게 되며, 항체를 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시키는 데 사용될 수 있다 (본원에 보다 상세하게 기재되어 있음). 특정 실시양태에서, 다음 잔기들 중 임의의 하나 이상은 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링).

항체 유도체

본 발명의 항체는 당업계에 공지되고 용이하게 이용할 수 있는 추가의 비-단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 바람직하게는, 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비-제한적인 예로는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 그의 혼합물이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서 안정하기 때문에, 제조상의 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있으며, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착되는 중합체의 개수는 다양할 수 있으며, 1개를 넘는 중합체가 부착될 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 개수 및/또는 종류는 개선할 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 정해진 조건하에서 요법에 사용될 것인지 여부 등 (이에 제한되지는 않음)을 비롯한 고려사항에 기초하여 결정될 수 있다.

다른 실시양태에서, 항체와, 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비-단백질성 모이어티와의 접합체가 제공된다. 일 실시양태에서, 비-단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (문헌 [Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있고, 통상적인 세포에는 유해하지 않지만 항체-비-단백질성 모이어티에 근접한 세포를 치사시키는 온도로 비-단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하되, 이에 제한되지는 않는다.

면역접합체

본 발명은 또한, 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 또는 이들의 단편) 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성 접합체)에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체 ("항체-약물 접합체" 또는 "ADC"로 상호 교환적으로 지칭됨)를 제공한다.

면역접합체는, 암의 치료에서 세포독성제, 즉 세포의 성장 또는 증식을 사멸 또는 억제하는 약물의 국소 전달을 위해 사용되어 왔다 (문헌 [Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549]; [Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146]; [Payne, G. (2003) i 3:207-212]; [Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614]; [Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv . Drug Deliv . Rev. 26:151-172]; 미국 특허 제4,975,278호). 면역접합체는 약물 모이어티가 종양으로 표적화 전달되어 그곳에서 세포내 축적될 수 있도록 하고, 이때 비-접합 약물의 전신 투여는 정상 세포 및 제거할 종양 세포에 허용불가능한 수준의 독성을 야기할 수 있다 (문헌 [Baldwin et al., Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05]; [Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds) pp. 475-506]). 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체는 이러한 전략에서 유용한 것으로 보고되었다 (문헌 [Rowland et al., (1986) Cancer Immunol . Immunother. 21:183-87]). 상기 방법에서 사용되는 약물로는 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트 및 빈데신이 포함된다 (상기 문헌 [Rowland et al., (1986)]). 항체-독소 접합체에서 사용되는 독소에는 디프테리아 독소와 같은 박테리아 독소, 리신과 같은 식물 독소, 젤다나마이신 (문헌 [Mandler et al. (2000) J. Nat. Cancer Inst . 92(19):1573-1581]; [Mandler et al. (2000) Bioorganic ＆ Med . Chem . Letters 10:1025-1028]; [Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem . 13:786-791]), 메이탄시노이드 (EP 1391213; 문헌 [Liu et al., (1996) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:8618-8623]) 및 칼리케아미신 (문헌 [Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928]; [Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342])과 같은 소분자 독소가 포함된다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합 또는 토포이소머라제 억제를 비롯한 기전에 의해 세포독성 효과를 나타낼 수 있다. 일부 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합되는 경우에 불활성 또는 보다 낮은 활성이 되는 경향이 있다.

제발린(ZEVALIN)^® (이브리투모맙 티욱세탄, 바이오젠/이덱(Biogen/Idec))은 티오우레아 링커-킬레이트제에 의해 결합된 ¹¹¹In 또는 ⁹⁰Y 방사성 동위원소, 및 정상 및 악성 B 림프구의 표면 상에서 발견되는 CD20 항원에 대해 작용하는 뮤린 IgG1 카파 모노클로날 항체로 이루어진 항체-방사성 동위원소 접합체이다 (문헌 [Wiseman et al. (2000) Eur . Jour. Nucl . Med . 27(7):766-77]; [Wiseman et al. (2002) Blood 99(12):4336-42]; [Witzig et al. (2002) J. Clin . Oncol . 20 (10):2453-63]; [Witzig et al. (2002) J. Clin . Oncol . 20(15): 3262-69]). 제발린이 B-세포 비-호지킨 림프종 (NHL)에 대한 활성을 갖지만, 이를 투여하면 대부분의 환자에서 중증의 장기 혈구감소증이 나타난다. 칼리케아미신에 연결된 huCD33 항체로 구성된 항체-약물 접합체인 마일로타그(MYLOTARG)™ (겜투주맙 오조가미신, 와이어스 파마슈티칼스(Wyeth Pharmaceuticals))는 주사에 의해 급성 골수성 백혈병 치료용으로 2000년에 승인되었다 (문헌 [Drugs of the Future (2000) 25(7):686]; 미국 특허 제4970198호; 제5079233호; 제5585089호; 제5606040호; 제5693762호; 제5739116호; 제5767285호; 제5773001호). 디술피드 링커 SPP를 통하여 메이탄시노이드 약물 모이어티인 DM1에 연결된 huC242 항체로 이루어진 항체-약물 접합체인 칸투주맙 메르탄신 (이뮤노겐, 인크.(Immunogen, Inc.))에 대해, CanAg를 발현하는 암, 예컨대 결장암, 췌장암, 위암 및 여타 암을 치료하기 위한 II상 시험이 진행중이다. 메이탄시노이드 약물 모이어티인 DM1에 연결된 항-전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 모노클로날 항체로 이루어진 항체-약물 접합체인 MLN-2704 (밀레니엄 팜.(Millennium Pharm.), BZL 바이올로직스(BZL Biologics), 이뮤노겐, 인크.)는 전립선 종양의 잠재적 치료를 위해 개발중이다. 오리스타틴 펩티드인 오리스타틴 E (AE) 및 모노메틸오리스타틴 (MMAE) (돌라스타틴의 합성 유사체)을 키메라 모노클로날 항체 cBR96 (암종 상의 루이스 Y에 대해 특이적임) 및 cAC10 (혈액학적 악성종양 상의 CD30에 대해 특이적임)에 접합시켰고 (문헌 [Doronina et al., (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784]), 이는 치료제 개발 중에 있다.

특정 실시양태에서, 면역접합체는 항체 및 화학요법제 또는 다른 독소를 포함한다. 면역접합체 생성에 유용한 화학요법제는 본원에 기재되어 있다 (예를 들어, 상기 참조). 사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다. 예를 들어, WO 93/21232 (1993년 10월 28일 공개)를 참조한다. 다양한 방사선핵종이 방사성접합된 항체의 생성에 이용될 수 있다. 그 예로는 ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y 및 ¹⁸⁶Re가 포함된다. 항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 2기능성 단백질-커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2기능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조한다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14 표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 대한 방사성핵종의 접합을 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO 94/11026을 참조한다.

항체와, 하나 이상의 소분자 독소, 예컨대 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 오리스타틴, 트리코테센 및 CC1065, 및 독성 활성을 갖는 상기 독소의 유도체와의 접합체도 본원에서 고려된다.

메이탄신 및 메이탄시노이드

일부 실시양태에서, 면역접합체는 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 접합된 항체 (전장 또는 단편)를 포함한다.

메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제시킴으로써 작용하는 유사분열(mitototic) 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테누스 세라타(Maytenus serrata)로부터 최초 단리되었다 (미국 특허 제3,896,111호). 이어서, 특정 미생물도 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생성하는 것으로 밝혀졌다 (미국 특허 제4,151,042호). 합성 메이탄시놀 및 그의 유도체 및 유사체는, 예를 들어 미국 특허 제4,137,230호; 제4,248,870호; 제4,256,746호; 제4,260,608호; 제4,265,814호; 제4,294,757호; 제4,307,016호; 제4,308,268호; 제4,308,269호; 제4,309,428호; 제4,313,946호; 제4,315,929호; 제4,317,821호; 제4,322,348호; 제4,331,598호; 제4,361,650호; 제4,364,866호; 제4,424,219호; 제4,450,254호; 제4,362,663호; 및 제4,371,533호에 개시되어 있다.

메이탄시노이드 약물 모이어티는, 이들이 (i) 발효 또는 화학적 변형, 발효 생성물의 유도체화에 의해 제조하는 것이 비교적 접근가능하고, (ii) 비-디술피드 링커를 통해 항체에 접합되기에 적합한 관능기에 의해 유도체화될 수 있고, (iii) 혈장에서 안정하며, (iv) 다양한 종양 세포주에 대해 효과적이기 때문에, 항체 약물 접합체에서 관심을 끄는 약물 모이어티이다.

메이탄시노이드를 함유하는 면역접합체, 그의 제조 방법, 및 그의 치료적 용도는, 예를 들어 미국 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 (상기 문헌의 개시 내용은 본원에 참고로 명백히 포함됨)에 개시되어 있다. 문헌 [Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623 (1996)]에는 인간 결장직장암에 대해 작용하는 모노클로날 항체 C242에 연결된, DM1로 명명된 메이탄시노이드를 포함하는 면역접합체가 기재되어 있다. 접합체는 배양된 결장암 세포에 대해 높은 세포독성을 보이는 것으로 나타났고, 생체내 종양 성장 검정에서 항종양 활성을 보였다. 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에서는 메이탄시노이드가 인간 결장암 세포주 상의 항원에 결합하는 뮤린 항체 A7에, 또는 HER-2/neu 종양유전자에 결합하는 또다른 뮤린 모노클로날 항체 TA.1에 디술피드 링커를 통해 접합된 면역접합체를 기재하고 있다. TA.1-메이탄시노이드 접합체의 세포독성은 시험관 내에서, 세포 당 3 x 105개 HER-2 표면 항원을 발현하는 인간 유방암 세포주 SK-BR-3에 대해 시험하였다. 약물 접합체는 유리 메이탄시노이드 약물과 유사한 수준의 세포독성을 달성하였고, 이는 항체 분자 당 메이탄시노이드 분자의 개수를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. A7-메이탄시노이드 접합체는 마우스에서 낮은 전신 세포독성을 보였다.

항체-메이탄시노이드 접합체는 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 유의하게 감소시키지 않으면서 항체를 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 결합시킴으로써 제조된다. 예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호 (그의 개시 내용은 본원에 참고로 명백히 포함됨)를 참조한다. 심지어 하나의 독소/항체 분자라도 네이크드 항체의 사용에 비해 세포독성을 증대시킬 것으로 예상되기는 하지만, 1개의 항체 분자에 접합된 평균 3-4개의 메이탄시노이드 분자는 항체의 기능 또는 용해도에 부정적인 영향 없이 표적 세포의 세포독성을 증대시키는 효능을 나타낸다. 메이탄시노이드는 당업계에 잘 알려져 있으며, 공지된 기술에 의해 합성되거나 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 적합한 메이탄시노이드는, 예를 들어 미국 특허 제5,208,020호, 및 본원에서 상기 언급된 다른 특허 및 비특허 간행물에 개시되어 있다. 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄시놀, 및 메이탄시놀 분자의 방향족 고리 또는 다른 위치에서 변형된 메이탄시놀 유사체, 예컨대 각종 메이탄시놀 에스테르이다.

예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호 또는 유럽 특허 제0 425 235 B1호, 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)], 및 미국 특허 출원 제10/960,602호 (2004년 10월 8일 출원) (상기 문헌의 개시 내용은 본원에 참고로 명백히 포함됨)에 개시된 것들을 비롯한, 항체-메이탄시노이드 접합체의 제조를 위한 수많은 결합이 당업계에 공지되어 있다. 링커 성분 SMCC를 포함하는 항체-메이탄시노이드 접합체는 미국 특허 출원 제10/960,602호 (2004년 10월 8일 출원)에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다. 연결기로는 상기 특허에 개시된 바와 같은 디술피드기, 티오에테르기, 산-불안정성 기, 광-불안정성 기, 펩티다제-불안정성 기 또는 에스테라제-불안정성 기가 포함되며, 디술피드 및 티오에테르기가 바람직하다. 추가의 링커기가 본원에 기재 및 예시되어 있다.

항체와 메이탄시노이드의 접합체는 다양한 2기능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2기능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 디술피드 연결을 제공하는 특히 바람직한 커플링제로는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) (문헌 [Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)]) 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP)가 포함된다.

링커는 결합의 유형에 따라, 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결은 통상적인 커플링 기술을 이용하여 히드록실기와 반응시킴으로써 형성될 수 있다. 상기 반응은 히드록실기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.

오리스타틴 및 돌라스타틴

몇몇 실시양태에서, 면역접합체는 돌라스타틴 또는 돌라스타틴 펩티드 유사체 및 유도체, 즉 오리스타틴에 접합된 항체를 포함한다 (미국 특허 제5,635,483호; 제5,780,588호). 돌라스타틴 및 오리스타틴은 미세관 역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분열을 방해하며 (문헌 [Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584]), 항암 활성 (미국 특허 제5,663,149호) 및 항진균 활성(문헌 [Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965])을 갖는 것으로 밝혀졌다. 돌라스타틴 또는 오리스타틴 약물 모이어티는 펩티드성 약물 모이어티의 N (아미노) 말단 또는 C (카르복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다 (WO 02/088172).

예시적인 오리스타틴 실시양태는 미국 출원 제10/983,340호 (발명의 명칭: "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", 2004년 11월 5일 출원) (상기의 개시 내용 전문이 참고로 명백히 포함됨)에 개시된 N-말단 연결된 모노메틸오리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF를 포함한다.

전형적으로, 펩티드-기반 약물 모이어티는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이에 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은, 예를 들어 펩티드 화학 분야에 잘 알려져 있는 액체상 합성 방법 (문헌 [E. Schroeder and K. Luebke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press] 참조)에 따라 제조될 수 있다. 오리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티는 US 5,635,483; US 5,780,588; 문헌 [Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465]; [Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277]; [Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725]; 및 [Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863]의 방법에 따라 제조될 수 있다. 또한, 문헌 [Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784]; 미국 출원 제10/983,340호 (발명의 명칭: "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", 2004년 11월 5일 출원) (그의 전문이 본원에 참고로 포함됨) (예를 들면, 링커, 및 링커에 접합된 MMAE 및 MMAF와 같은 모노메틸발린 화합물의 제조 방법을 개시함)도 참조한다.

칼리케아미신

다른 실시양태에서, 면역접합체는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 항체를 포함한다. 항생제 중 칼리케아미신 부류는 피코몰 미만의 농도에서 이중가닥 DNA 절단을 생성할 수 있다. 칼리케아미신 부류의 접합체를 제조하는 것에 대해서는 미국 특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호 및 제5,877,296호 (모두 아메리칸 시아나미드 컴퍼니(American Cyanamid Company)의 특허임)를 참조한다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체로는 γ1I, α2I, α3I, N-아세틸-γ1I, PSAG 및 θI1이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다 (문헌 [Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993)], [Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998)]; 및 상기 언급된 아메리칸 시아나미드 컴퍼니의 미국 특허). 항체가 접합될 수 있는 또다른 항-종양 약물은 항엽산제인 QFA이다. 칼리케아미신 및 QFA는 둘 다 세포내 작용 부위를 갖고, 원형질막을 쉽게 통과하지 못한다. 따라서, 항체-매개 내재화를 통한 이들 물질의 세포내 흡수는 세포독성 효과를 크게 증진시킨다.

다른 세포독성제

항체에 접합될 수 있는 다른 항종양제로는 BCNU, 스트렙토조신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 제5,053,394호, 제5,770,710호에 기재된, LL-E33288 복합체로 집합적으로 알려진 물질의 부류, 및 에스페라미신 (미국 특허 제5,877,296호)가 포함된다.

사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다. 예를 들어, WO 93/21232 (1993년 10월 28일 공개)를 참조한다.

본 발명은 항체, 및 뉴클레오티드분해성 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이에 형성된 면역접합체를 추가로 고려한다.

종양의 선택적인 파괴를 위해, 항체는 고수준 방사성 원자를 포함할 수 있다. 방사성접합된 항체의 생성을 위해 다양한 방사성 동위원소가 이용가능하다. 그 예로는 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 접합체를 검출용으로 사용하는 경우, 접합체는 섬광조영 연구용 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 핵자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로도 알려져 있음)를 위한 스핀 표지, 예컨대 다시 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.

방사성 표지 또는 다른 표지는 공지된 방식으로 접합체 내에 도입할 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성할 수 있거나, 또는 예를 들어, 수소 대신에 불소-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 이용한 화학적 아미노산 합성에 의해 합성할 수 있다. tc⁹⁹m 또는 I¹²³, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸ 및 In¹¹¹과 같은 표지는 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통하여 부착시킬 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통하여 부착시킬 수 있다. 요오도겐 (IODOGEN) 방법 (문헌 [Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57])을 이용하여 요오드-123을 도입할 수 있다. 문헌 ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]에는 다른 방법이 상세히 기재되어 있다.

항체와 세포독성제의 접합체는 다양한 2기능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2기능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체로의 방사성핵종 접합을 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO 94/11026을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광-불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 제5,208,020호)가 사용될 수 있다.

화합물은 (예를 들어, 미국 일리노이주 록퍼드 소재의 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.)로부터) 시판되는 가교 시약인 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 사용하여 제조된 ADC를 명백히 고려하지만, 이에 제한되지는 않는다. 문헌 [2003-2004 Applications Handbook and Catalog, pages 467-498]을 참조한다.

항체 약물 접합체의 제조

항체 약물 접합체 (ADC)에서, 항체 (Ab)는 링커 (L)를 통해 항체 당 하나 이상의 약물 모이어티 (D), 예를 들어 약 1개 내지 약 20개의 약물 모이어티에 접합된다. 하기 화학식 I의 ADC는 (1) 항체의 친핵성 기를 2가 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통해 Ab-L을 형성시킨 후, 이를 약물 모이어티 D와 반응시키는 것; 및 (2) 약물 모이어티의 친핵성 기를 2가 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통해 D-L을 형성시킨 다음, 이를 항체의 친핵성 기와 반응시키는 것을 비롯한, 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 이용하여 여러 경로에 의해 제조할 수 있다. ADC를 제조하기 위한 추가의 방법은 본원에 기재되어 있다.

<화학식 I>

Ab -(L-D) _p

링커는 하나 이상의 링커 성분으로 구성될 수 있다. 예시적인 링커 성분에는 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시트룰린 ("val-cit"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카르보닐 ("PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 ("SPP"), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1 카르복실레이트 ("SMCC") 및 N-숙신이미딜 (4-요오도-아세틸)아미노벤조에이트 ("SIAB")가 포함된다. 추가의 링커 성분은 당업계에 공지되어 있으며, 일부는 본원에 기재되어 있다. 또한, 미국 출원 제10/983,340호 (발명의 명칭: "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands," 2004년 11월 5일 출원) (그의 전문은 본원에 참고로 포함됨)를 참조한다.

몇몇 실시양태에서, 링커는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예시적인 아미노산 링커 성분에는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 또는 펜타펩티드가 포함된다. 예시적인 디펩티드에는 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe)이 포함된다. 예시적인 트리펩티드에는 글리신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly)이 포함된다. 아미노산 링커 성분을 포함하는 아미노산 잔기로는 자연 발생 아미노산 잔기뿐만 아니라, 소수 아미노산 및 비-자연 발생 아미노산 유사체, 예컨대 시트룰린이 포함된다. 아미노산 링커 성분은 특정 효소, 예를 들어 종양-관련 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단에 대한 특이성 측면에서 설계 및 최적화될 수 있다.

항체 상의 친핵성 기는 (i) N-말단 아민기; (ii) 측쇄 아민기, 예를 들어 리신; (iii) 측쇄 티올기, 예를 들어 시스테인; 및 (iv) 당 히드록실 또는 아미노기 (여기서, 항체는 당화됨)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 아민, 티올 및 히드록실기는 친핵성이며, 반응하여 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기, 예를 들어 (i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기와 함께 공유 결합을 형성할 수 있다. 특정 항체는 환원가능한 쇄간 디술피드, 즉 시스테인 브릿지를 갖는다. 항체를 DTT (디티오트레이톨)와 같은 환원제로 처리함으로써 링커 시약과의 접합에 대한 반응성이 되도록 할 수 있다. 따라서, 각각의 시스테인 브릿지는 이론상 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 아민을 티올로 전환시키는 2-이미노티올란 (트라우트(Traut) 시약)과 리신의 반응을 통해 추가의 친핵기룰 항체 내로 도입할 수 있다. 반응성 티올기는 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 도입함으로써 (예를 들어, 하나 이상의 비-천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이체 항체를 제조함으로써) 항체 (또는 그의 단편) 내로 도입될 수 있다.

또한, 항체 약물 접합체는 항체의 변형에 의해 링커 시약 또는 약물 상의 친핵성 치환기와 반응할 수 있는 친전자성 모이어티를 도입함으로써 생성될 수 있다. 당화된 항체의 당을, 예를 들어 퍼요오데이트 산화 시약으로 산화시켜, 링커 시약 또는 약물 모이어티의 아민기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤 기를 형성할 수 있다. 생성된 이민 쉬프(Schiff) 염기 기는 안정한 결합을 형성할 수 있거나, 또는 예를 들어, 보로히드라이드 시약에 의해 환원되어 안정한 아민 결합을 형성할 수 있다. 일 실시양태에서, 당화된 항체의 탄수화물 부분을 갈락토스 옥시다제 또는 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 약물 상의 적절한 기와 반응할 수 있는 카르보닐 (알데히드 및 케톤) 기가 단백질 내에 생성될 수 있다 (문헌 [Hermanson, Bioconjugate Techniques]). 또다른 실시양태에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 단백질을 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 제1 아미노산 대신에 알데히드가 생성될 수 있다 (문헌 [Geoghegan ＆ Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146]; US 5,362,852). 이러한 알데히드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.

유사하게, 약물 모이어티 상의 친핵기에는 (i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기를 포함하는, 링커 부분 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는, 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드기가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

별법으로, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은, 예를 들어 재조합 기법 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. DNA의 길이는 접합체의 목적하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리되거나 또는 서로 인접해 있는 접합체의 두 부분을 코딩하는 각각의 영역을 포함할 수 있다.

추가의 또다른 실시양태에서는, 항체를 종양 예비표적화에 활용하기 위해 "수용체" (예컨대 스트렙트아비딘)에 접합시킬 수 있는데, 여기서 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 다음, 소실제를 사용하여 결합되지 않은 접합체를 순환으로부터 제거하고, 이어서 세포독성제 (예를 들어, 방사성 뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.

항체를 제조하는 특정한 방법

특정한 하이브리도마-기반 방법

본 발명의 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재되고, 예를 들어 문헌 [Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)], [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)], 및 인간-인간 하이브리도마와 관련된 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)]에 추가로 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 추가 방법에는, 예를 들어, 하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 천연 IgM 항체 생산과 관련된 미국 특허 제7,189,826호에 기재된 것이 포함된다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마 기술)은 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)] 및 문헌 [Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.

다양한 다른 하이브리도마 기술에 대해서는, 예를 들어 US 2006/258841; US 2006/183887 (완전 인간 항체); US 2006/059575; US 2005/287149; US 2005/100546; US 2005/026229; 및 미국 특허 제7,078,492호 및 제7,153,507호를 참조한다. 하이브리도마 방법을 사용하여 모노클로날 항체를 생산하는 예시적인 프로토콜은 다음과 같이 기술된다. 일 실시양태에서는, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터를 면역화시킴으로써, 면역화를 위해 사용되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. VEGF 또는 그의 단편 및 보조제, 예컨대 모노포스포릴 지질 A (MPL)/트레할로스 디크리노미콜레이트 (TDM) (미국 몬타나주 해밀턴 소재의 리비 이뮤노켐 리서치, 인크.(Ribi Immunochem. Research, Inc.))를 포함하는 폴리펩티드를 피하 (sc) 또는 복강내로 (ip) 다회 주사하여 동물에서 항체를 유도한다. VEGF 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 그 일부가 본원에서 추가로 기재되는, 재조합 방법과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 면역화된 동물로부터의 혈청을 항-VEGF 항체에 대해 분석하고, 부스터 면역화를 임의로 투여한다. 항-VEGF 항체를 생산하는 동물로부터 림프구를 단리한다. 별법으로는, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다.

이어서, 림프구를 하이브리도마 세포를 형성하는 데 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합시킨다. 예를 들어, 문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]을 참조한다. 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생산을 지지하고, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 골수종 세포가 사용될 수 있다. 예시적인 골수종 세포주에는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)로부터 입수가능), 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 (미국 메릴랜드주 록빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수가능)로부터 유도된 것이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주 또한 인간 모노클로날 항체 생산을 위한 것으로 기재된 바 있다 (문헌 [Kozbor, J. Immunol ., 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]).

이와 같이 제조한 하이브리도마 세포는 적합한 배양 배지, 예를 들어, 융합되지 않은 모체 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 배양 배지에 시딩하고 성장시킨다. 예를 들어, 모체 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결핍된 경우라면, 하이브리도마의 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함하는데, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방해한다. 바람직하게는, 예를 들어 문헌 [Even et al., Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006)]에 기재된 바와 같이, 우태 혈청과 같은 동물-유래 혈청의 사용을 감소시키기 위해서 무-혈청 하이브리도마 세포 배양 방법을 사용한다.

문헌 [Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005)]에는 하이브리도마 세포 배양의 생산성을 개선하기 위한 도구로서 올리고펩티드가 기재되어 있다. 특히, 표준 배양 배지를 특정한 아미노산 (알라닌, 세린, 아스파라긴, 프롤린)이나 단백질 가수분해물 분획으로 풍부하게 하면, 3 내지 6개의 아미노산 잔기로 구성된 합성 올리고펩티드에 의해서 세포자멸사가 유의하게 억제될 수 있다. 펩티드는 밀리몰 또는 더 높은 농도로 존재한다.

하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 VEGF에 결합하는 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정할 수 있다. 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침강법 또는 시험관내 결합 검정법, 예컨대 방사성 면역검정법 (RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA)으로 측정할 수 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는, 예를 들어 스캐챠드(Scatchard) 분석에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]을 참조한다.

목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후에, 클론을 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Goding, 상기와 동일]을 참조한다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지에는, 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다. 서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다. 하이브리도마 세포로부터 단백질을 단리하는 하나의 절차가 US 2005/176122 및 미국 특허 제6,919,436호에 기재되어 있다. 상기 방법은 결합 과정에서 최소량의 염, 예컨대 이액순의 염의 사용을 포함하고, 바람직하게는 또한 용출 과정에서 소량의 유기 용매의 사용을 포함한다.

특정한 라이브러리 스크리닝 방법

본 발명의 항체는 조합 라이브러리를 사용하여 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체를 스크리닝함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 이러한 라이브러리를 목적하는 결합 특징을 보유한 항체에 대해 스크리닝하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에 일반적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 관심의 대상이 되는 항체를 생성하는 하나의 방법은 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93]에 기재된 바와 같은 파지 항체 라이브러리의 사용을 통해서 한다.

원칙적으로, 합성 항체 클론은 파지 외피 단백질에 융합된 항체 가변 영역 (Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파지를 함유하는 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 선택된다. 이러한 파지 라이브러리는 목적하는 항원에 대한 친화도 크로마토그래피에 의해 패닝된다. 목적하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론은 항원에 흡착됨으로써, 라이브러리 내의 비-결합 클론으로부터 분리된다. 이어서, 결합 클론을 항원으로부터 용출시키고, 항원 흡착/용출의 반복되는 추가의 사이클에 의해 더욱 농축시킬 수 있다. 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에 기재된 바와 같이, 임의의 본 발명의 항체는 관심의 대상이 되는 파지 클론에 대해 선택하는 데 적합한 항원 스크리닝 절차를 디자인한 후, 관심의 대상이 되는 파지 클론으로부터의 Fv 서열 및 적합한 불변 영역 (Fc) 서열을 사용하여 전장 항체 클론을 작제함으로써 얻을 수 있다.

특정 실시양태에서, 항체의 항원 결합 도메인은, 둘 모두가 3개의 초가변 루프 (HVR) 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 제공하는 것인, 약 110개의 아미노산으로 이루어진 2개의 가변 (V) 영역 (각각 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)로부터 하나씩)으로부터 형성된다. 가변 도메인은 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이, 단일 쇄 Fv (scFv) 단편으로서 (여기서, VH 및 VL은 짧은 가요성 펩티드를 통해 공유적으로 연결됨), 또는 Fab 단편으로서 (여기서, 이들을 각각 불변 도메인에 융합되고, 비-공유적으로 상호작용함) 파지 상에 기능적으로 디스플레이될 수 있다. 본원에서 사용될 때, scFv 코딩 파지 클론 및 Fab 코딩 파지 클론은 통칭하여 "Fv 파지 클론" 또는 "Fv 클론"으로서 지칭된다.

VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol ., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 따로 클로닝되어, 파지 라이브러리 내에서 무작위로 재조합될 수 있고, 이어서 이것은 항원 결합 클론에 대해 검색될 수 있다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 작제할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 별법으로, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이, 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자가 및 자가 항원에 대한 인간 항체의 단일 공급원을 제공하기 위해, 나이브 레퍼토리가 클로닝될 수 있다. 마지막으로, 나이브 라이브러리는 또한 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol, 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 세그먼트를 클로닝하고, 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열을 달성함으로써 합성적으로 제조될 수 있다.

특정 실시양태에서는, 사상형 파지가 부(minor) 외피 단백질 pIII에의 융합에 의해 항체 단편을 디스플레이하는 데 사용된다. 항체 단편은 단일 쇄 Fv 단편으로서 (여기서, VH 및 VL 도메인은, 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol . Biol, 222: 581-597 (1991)]에 기재된 바와 같이 가요성 폴리펩티드 스페이서에 의해 동일한 폴리펩티드 쇄 상에서 연결됨), 또는 Fab 단편으로서 (여기서는, 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al.,, Nucl . Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)]에 기재된 바와 같이, 하나의 쇄는 pIII에 융합되고, 다른 쇄는 세균 숙주 세포 원형질막 내로 분비되어 여기서 Fab-외피 단백질 구조의 조립체가 야생형 외피 단백질의 일부를 치환함으로써 파지 표면 상에 디스플레이됨) 디스플레이될 수 있다.

일반적으로, 항체 유전자 단편을 코딩하는 핵산은 인간 또는 동물로부터 수거한 면역 세포로부터 수득한다. 항-VEGF 클론에 유리하게 편향된 라이브러리가 바람직한 경우, 대상체를 VEGF로 면역화시켜 항체 반응을 일으키고, 비장 세포 및/또는 순환 B 세포 또는 다른 말초혈 림프구 (PBL)를 라이브러리 작제를 위해 회수한다. 바람직한 실시양태에서, 항-VEGF 클론에 유리하게 편향된 인간 항체 유전자 단편 라이브러리는 VEGF 면역화가 VEGF에 대한 인간 항체를 생산하는 B 세포를 유도하도록 기능적 인간 면역글로불린 유전자 어레이를 갖는 (또한 기능적 내인성 항체 생산 시스템이 결핍된) 트랜스제닉 마우스에서 항-VEGF 항체 반응을 생성함으로써 수득한다. 인간 항체-생산 트랜스제닉 마우스의 생성은 이하에 기술한다.

항-VEGF 반응성 세포 집단을 추가로 풍부하게 하는 것은, 예를 들어 VEGF 친화도 크로마토그래피 또는 플루오로크롬-표지된 VEGF에 대한 세포의 흡착 후 유동-활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하는 세포 분리에 의해 VEGF-특이적 막 결합 항체를 발현하는 B 세포를 단리하기에 적합한 스크리닝 절차를 사용하여 수득할 수 있다.

별법으로, 비면역화 공여자로부터의 비장 세포 및/또는 B 세포 또는 다른 PBL을 사용함으로써, 가능한 항체 레퍼토리의 보다 우수한 예시를 제공하고, 또한 VEGF가 항원성이 아닌 임의의 동물 (인간 또는 비-인간) 종을 사용한 항체 라이브러리의 작제를 허용한다. 시험관내 항체 유전자 작제물을 포함하는 라이브러리를 위해, 대상체로부터 줄기 세포를 수거하여 재배열되지 않은 항체 유전자 세그먼트를 코딩하는 핵산을 제공한다. 관심의 대상이 되는 면역 세포는 각종 동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 토끼, 이리, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 및 조류 종 등으로부터 얻을 수 있다.

항체 가변 유전자 세그먼트 (VH 및 VL 세그먼트 포함)를 코딩하는 핵산을 관심의 대상이 되는 세포로부터 회수하고 증폭시킨다. 재배열된 VH 및 VL 유전자 라이브러리의 경우에, 목적하는 DNA는 림프구로부터 게놈 DNA 또는 mRNA를 단리시킨 후, 문헌 [Orlandi et al., Proc . Natl . Acad . Sci . ( U.S.A ), 86:3833-3837 (1989)]에 기재된 바와 같이 재배열된 VH 및 VL 유전자의 5' 및 3' 말단을 매치시킨 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하여 발현을 위한 다양한 V 유전자 레퍼토리를 제조함으로써 수득할 수 있다. V 유전자는 문헌 ([Orlandi et al., (1989)] 및 [Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)])에 기재된 바와 같이, 성숙 V-도메인을 코딩하는 엑손의 5' 말단에서의 역방향 프라이머 및 J-세그먼트 내에 기반한 정방향 프라이머를 사용하여 cDNA 및 게놈 DNA로부터 증폭시킬 수 있다. 그러나, cDNA로부터 증폭시키기 위해서는, 역방향 프라이머 또한 문헌 [Jones et al., Biotechnol, 9: 88-89 (1991)에 기재된 바와 같이 리더 엑손에 기반할 수 있고, 정방향 프라이머는 문헌 [Sastry et al., Proc . Natl . Acad . Sci . (U.S.A), 86: 5728-5732 (1989)]에 기재된 바와 같이 불변 영역 내에 기반할 수 있다. 상보성을 최대화하기 위해, 문헌 ([Orlandi et al. (1989)] 또는 [Sastry et al. (1989)])에 기재된 바와 같이 프라이머 내에 축퇴성을 혼입시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 라이브러리 다양성은, 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol . Biol, 222: 581-597 (1991)]의 방법 또는 문헌 [Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993)]의 방법에 기재된 바와 같이 면역 세포 핵산 샘플 내에 존재하는 모든 이용가능한 VH 및 VL 배열을 증폭하기 위해 각각의 V-유전자 패밀리에 표적화된 PCR 프라이머를 사용함으로써 최대화된다. 증폭된 DNA를 발현 벡터 내로 클로닝하기 위해, 희귀 제한 부위가 문헌 [Orlandi et al. (1989)]에 기재된 바와 같이 한 말단에서 태그로서, 또는 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 태깅된 프라이머를 사용하는 추가의 PCR 증폭에 의해 PCR 프라이머 내에 도입될 수 있다.

합성적으로 재배열된 V 유전자의 레퍼토리는 V 유전자 세그먼트로부터 시험관내에서 유도될 수 있다. 대부분의 인간 VH-유전자 세그먼트는 클로닝 및 서열 분석되었고 (문헌 [Tomlinson et al., J. Mol . Biol, 227: 776-798 (1992)]에 보고됨), 지도화되었고 (문헌 [Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993)]에 보고됨); 상기 클로닝된 세그먼트 (H1 및 H2 루프의 주요 형태를 모두 포함하는 세그먼트)는 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol, 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이 다양한 서열 및 길이의 H3 루프를 코딩하는 PCR 프라이머를 사용하여 다양한 VH 유전자 레퍼토리를 생성하는 데 사용될 수 있다. VH 레퍼토리는 또한 문헌 [Barbas et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A , 89: 4457-4461 (1992)]에 기재된 바와 같이 단일 길이의 긴 H3 루프에 집중된 모든 서열 다양성을 갖도록 제조될 수 있다. 인간 Vκ 및 Vλ 세그먼트가 클로닝 및 서열 분석되었고 (문헌 [Williams and Winter, Eur . J. Immunol, 23: 1456-1461 (1993)]에 보고됨), 합성 경쇄 레퍼토리를 제조하는 데 사용될 수 있다. VH 및 VL 폴드의 범위, 및 L3 및 H3 길이에 기반하는 합성 V 유전자 레퍼토리는 상당히 구조적으로 다양한 항체를 코딩할 것이다. V-유전자 코딩 DNA의 증폭 후, 생식계열 V-유전자 세그먼트는 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol , 227: 381-388 (1992)]의 방법에 따라 시험관내에서 재배열될 수 있다.

항체 단편의 레퍼토리는 VH 및 VL 유전자 레퍼토리를 몇 가지 방식으로 함께 조합함으로써 작제될 수 있다. 각각의 레퍼토리는 상이한 벡터 내에 생성될 수 있고, 벡터는 예를 들어 문헌 [Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993)]에 기재된 바와 같이 시험관내에서, 또는 조합 감염, 예를 들어 문헌 [Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993)]에 기재된 loxP 시스템에 의해 생체내에서 재조합될 수 있다. 생체내 재조합 접근법은 E. 콜라이 형질전환 효율에 의해 부과된 라이브러리 크기의 제한을 극복하기 위해 Fab 단편의 2-쇄 특성을 활용한다. 나이브 VH 및 VL 레퍼토리는 하나는 파지미드 내로, 다른 하나는 파지 벡터 내로 따로 클로닝된다. 이어서, 각각의 세포가 상이한 조합을 함유하고, 라이브러리 크기가 존재하는 세포의 수에 의해서만 제한되도록 (약 10¹²개 클론), 2개의 라이브러리를 파지미드-함유 세균의 파지 감염에 의해 조합시킨다. 두 벡터 모두는 생체내 재조합 신호를 함유하여, VH 및 VL 유전자가 단일 레플리콘 상으로 재조합되고, 파지 비리온 내로 공동 패킹된다. 상기 큰 라이브러리는 우수한 친화도 (약 10^-8 M의 K_d ^-1)를 갖는 다수의 다양한 항체를 제공한다.

별법으로, 레퍼토리들은 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc . Natl . Acad . Sci. U.S.A, 88: 7978-7982 (1991)]에 기재된 바와 같이 동일한 벡터 내로 순차적으로 클로닝되거나, 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 함께 조립된 후 클로닝될 수 있다. PCR 조립은 또한 VH 및 VL DNA를 가요성 펩티드 스페이서를 코딩하는 DNA와 연결시켜 단일 쇄 Fv (scFv) 레퍼토리를 형성하는 데 사용될 수 있다. 추가의 또다른 기술에서, 문헌 [Embleton et al., Nucl . Acids Res., 20: 3831-3837 (1992)]에 기재된 바와 같이, "세포내 PCR 조립"은 VH 및 VL 유전자를 림프구 내에서 PCR에 의해 조합시킨 후, 연결된 유전자의 레퍼토리를 클로닝하는 데 사용된다.

나이브 라이브러리 (천연 또는 합성)에 의해 생산된 항체는 중간 정도의 친화도 (약 10⁶ 내지 10⁷ M^-1의 K_d ^{- 1})의 것일 수 있지만, 친화도 성숙은 또한 문헌 [Winter et al., (1994), 상기와 동일]에 기재된 바와 같이 2차 라이브러리를 작제하고 그로부터 재선택함으로써 시험관내에서 모사될 수도 있다. 예를 들어, 돌연변이는 문헌 [Hawkins et al., J. Mol . Biol, 226: 889-896 (1992)]의 방법 또는 문헌 [Gram et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA, 89: 3576-3580 (1992)]의 방법에서 오류-허용 중합효소 (문헌 [Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)]에 보고됨)를 사용함으로써 시험관내에서 무작위로 도입될 수 있다. 추가로, 친화도 성숙은, 예를 들어 선택된 개별 Fv 클론에서 관심의 대상이 되는 CDR에 이르는 무작위 서열을 갖는 프라이머를 사용한 PCR을 이용하여 하나 이상의 CDR을 무작위로 돌연변이화시키고, 보다 고친화도의 클론을 스크리닝함으로써 수행될 수 있다. WO 9607754 (1996년 3월 14일 공개)에서는 경쇄 유전자의 라이브러리를 생성하기 위해 면역글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역에서 돌연변이를 유발하는 방법을 기재한 바 있다. 또다른 효과적인 접근법은 비면역화 공여자로부터 얻은 자연 발생된 V 도메인 변이체의 레퍼토리를 사용하는 파지 디스플레이에 의해 선택된 VH 또는 VL 도메인을 재조합하고, 문헌 [Marks et al., Biotechnol, 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바와 같이 수회의 쇄 재셔플링으로 보다 고친화도에 대해 스크리닝하는 것이다. 상기 기술을 통해 친화도가 약 10^-9 M 이하인 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있다.

라이브러리의 스크리닝은 당업계에 공지된 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, VEGF는 흡착 플레이트의 웰을 코팅하는 데 사용될 수 있거나, 흡착 플레이트에 고정된 숙주 세포 상에서 발현될 수 있거나, 세포 분류에서 사용될 수 있거나, 스트렙트아비딘-코팅된 비드로 포획하기 위해 비오틴에 접합될 수 있거나, 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝하기 위한 임의의 기타 다른 방법에서 사용될 수 있다.

파지 라이브러리 샘플을 파지 입자의 적어도 일부를 흡착제와 결합시키는 데 적합한 조건하에 고정된 VEGF와 접촉시킨다. 보통, pH, 이온 강도, 온도 등을 비롯한 조건은 생리학적 조건을 모사하도록 선택된다. 고체상에 결합된 파지를 세척한 후, 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기재된 바와 같이 산에 의해, 또는 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol . Biol, 222: 581-597 (1991)]에 기재된 바와 같이 알칼리에 의해, 또는 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]의 항원 경쟁 방법과 유사한 절차의 VEGF 항원 경쟁에 의해 용출시킨다. 파지는 1회의 선택 주기로 20-1,000배 농축될 수 있다. 또한, 농축된 파지를 세균 배양물 내에서 성장시키고, 추가 회차의 선택 주기를 실행할 수 있다.

선택 효율은 세척하는 동안의 해리 역학 및 단일 파지 상에서 다수 항체 단편이 항원과 동시에 결합할 수 있는지의 여부를 비롯한 많은 요인에 따라 달라질 수 있다. 고속 해리 역학 (및 약한 결합 친화도)을 갖는 항체는 단시간의 세척, 다가 파지 디스플레이 및 고체상인 높은 코팅 밀도의 항원을 사용하여 보유시킬 수 있다. 고밀도는 다가 상호작용을 통해 파지를 안정화시킬 뿐만 아니라, 해리된 파지의 재결합에 유리하다. 저속 해리 역학 (및 우수한 결합 친화도)을 갖는 항체의 선택은 문헌 [Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990)] 및 WO 92/09690에 기재된 바와 같은 장기간의 세척 및 1가 파지 디스플레이, 및 문헌 [Marks et al., Biotechnol, 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바와 같은 낮은 코팅 밀도의 항원을 사용하여 촉진될 수 있다.

VEGF에 대한 상이한 친화도, 심지어 근소하게 상이한 친화도를 갖는 파지 항체 사이에서 선택하는 것도 가능하다. 그러나, (예를 들어, 일부 친화도 성숙 기술에서 수행되는 바와 같은) 선택된 항체의 무작위 돌연변이화는 대부분은 항원에 결합하고 몇몇은 보다 고친화도를 갖는 다수의 돌연변이체를 초래하는 경향이 있다. VEGF를 제한하면, 희귀한 고친화도 파지가 경쟁에 의해 제거될 수 있다. 보다 고친화도의 돌연변이체를 모두 보유하기 위해, 파지를 과량의 비오틴화된 VEGF와 함께 인큐베이션시킬 수 있지만, 비오틴화된 VEGF는 VEGF에 대한 표적 몰 친화도 상수보다 더 낮은 몰농도의 농도로 사용된다. 이어서, 고친화도 결합 파지를 스트렙트아비딘-코팅된 상자성 비드에 의해 포획할 수 있다. 이러한 "평형 포획"에 의해 항체를 그들의 결합 친화도에 따라 선택할 수 있고, 그의 감도로 인해 매우 큰 과량의 보다 낮은 친화도를 갖는 파지로부터 2배 더 높은 정도로 낮은 친화도를 갖는 돌연변이체 클론을 단리시킬 수 있다. 고체상에 결합된 파지를 세척하는 데 사용되는 조건은 또한 해리 역학을 기초로 하여 차별화되도록 조작될 수 있다.

항-VEGF 클론은 활성에 기초하여 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 VEGF를 자연적으로 발현하는 살아있는 세포에 결합하는 항-VEGF 항체를 제공한다. 일 실시양태에서, 본 발명은 VEGF 리간드와 VEGF 사이의 결합은 차단하지만, VEGF 리간드와 제2 단백질 사이의 결합은 차단하지 않는 항-VEGF 항체를 제공한다. 이러한 항-VEGF 항체에 상응하는 Fv 클론은 (1) 상기 기술된 바와 같은 파지 라이브러리로부터 항-VEGF 클론을 단리하고, 단리된 파지 클론 집단을 적합한 세균 숙주에서 성장시킴으로써 상기 집단을 임의로 증폭시키고; (2) 각각 차단 및 비-차단 활성이 요구되는 VEGF 및 제2 단백질을 선택하고; (3) 항-VEGF 파지 클론을 고정된 VEGF에 흡착시키고; (4) 과량의 제2 단백질을 사용하여, 제2 단백질의 결합 결정자와 중복되거나 이것과 공유하는 VEGF-결합 결정자를 인식하는 임의의 원하지 않는 클론을 용출시키고; (5) 단계 (4) 후에도 여전히 흡착되어 있는 클론을 용출시킴으로써 선택될 수 있다. 임의로는, 목적하는 차단/비-차단 특성을 갖는 클론을 본원에 기재된 선택 절차를 1회 이상 반복함으로써 추가로 농축시킬 수 있다.

본 발명의 하이브리도마-유도 모노클로날 항체 또는 파지 디스플레이 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 통상의 절차를 사용하여 (예를 들어, 하이브리도마 또는 파지 DNA 주형으로부터 관심의 대상이 되는 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 서열 분석된다. 일단 단리되고 나면, DNA를 발현 벡터 내로 도입할 수 있고, 이어서 이를 재조합 숙주 세포 내에서 목적하는 모노클로날 항체를 합성하기 위해 숙주 세포, 예를 들어 E. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염시킨다. 세균에서의 항체-코딩 DNA의 재조합 발현에 관한 검토 논문에는 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol, 5: 256 (1993)] 및 [Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992)]이 포함된다.

본 발명의 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 코딩하는 공지의 DNA 서열 (예를 들어, 적절한 DNA 서열은 문헌 [Kabat et al. 상기와 동일]으로부터 수득할 수 있음)과 조합되어, 전장 또는 부분 길이 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 클론을 형성할 수 있다. IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 불변 영역을 포함한 임의의 이소형의 불변 영역을 상기 목적을 위해 사용할 수 있고, 이러한 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 얻을 수 있다는 것을 인지할 것이다. 하나의 동물 (예컨대 인간) 종의 가변 도메인 DNA로부터 유래된 후 또다른 동물 종의 불변 영역 DNA에 융합되어 "하이브리드" 전장 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성하는 Fv 클론은 본원에 사용된 "키메라" 및 "하이브리드" 항체의 정의에 포함된다. 특정 실시양태에서, 인간 가변 DNA로부터 유래된 Fv 클론은 인간 불변 영역 DNA에 융합되어 전장 또는 부분 길이의 인간 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성한다.

본 발명의 하이브리도마로부터 유래된 항-VEGF 항체를 코딩하는 DNA는 또한, 예를 들어 하이브리도마 클론으로부터 유래된 상동성 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환함으로써 (예를 들어, 문헌 [Morrison et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81: 6851-6855 (1984)]의 방법에서와 같이) 변형시킬 수 있다. 하이브리도마- 또는 Fv 클론-유래된 항체 또는 단편을 코딩하는 DNA는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유적으로 연결시켜 추가로 변형시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 Fv 클론 또는 하이브리도마 클론-유래된 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체를 제조한다.

벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법

항체는 또한 재조합 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 항-VEGF 항체의 재조합 생산을 위해, 이것을 코딩하는 핵산을 단리하여 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능 벡터 내로 삽입시킨다. 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다. 다수의 벡터가 이용될 수 있다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

신호 서열 성분

본 발명의 항체는 직접적으로 재조합 방식으로 생산될 수 있을 뿐만 아니라, 바람직하게는 신호 서열, 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드인 이종성 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합 방식으로 생산될 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱된 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단된) 것이다. 천연 항체 신호 서열을 인식하고 프로세싱하지 못하는 원핵 숙주 세포에 대해서는, 신호 서열이, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열-안정성 장독소 II 리더로 구성된 군으로부터 선택되는 원핵 신호 서열에 의해 치환된다. 효모 분비를 위해서는, 천연 신호 서열이, 예를 들어 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) α-인자 리더 포함), 또는 산 포스파타제 리더, C. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 WO 90/13646에 기재된 신호에 의해 치환될 수 있다. 포유동물 세포 발현에서는, 포유동물 신호 서열뿐 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 헤르페스 gD 신호가 이용가능하다.

복제 기점

발현 및 클로닝 벡터 둘 다 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 벡터가 복제할 수 있는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 상기 서열은 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 벡터가 복제할 수 있고 복제 기점 또는 자동 복제 서열을 포함하는 것이다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 익히 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 세균에 대해 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 대해 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 대해 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 대해서는 필요하지 않다 (SV40 기점이 전형적으로 사용될 수 있는데, 그 이유는 단지 이것이 초기 프로모터를 함유하기 때문임).

선별 유전자 성분

발현 및 클로닝 벡터는 선별가능한 마커로도 명명되는 선별 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보충하거나, (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양물을 공급하는 단백질을 코딩하고, 예를 들어 바실러스에 대한 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자이다.

선별 계획의 한 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 상기 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성하고, 따라서 선별 계획 시에도 생존한다. 이러한 우세한 선별의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 하이그로마이신을 사용한다.

포유동물 세포에 적합한 선별가능 마커의 또다른 예는 항체-코딩 핵산, 예컨대 DHFR, 글루타민 신테타제 (GS), 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등을 섭취할 수 있는 세포의 확인을 가능하게 하는 것이다.

예를 들어, DHFR 유전자로 형질전환된 세포는 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 확인된다. 이들 조건하에, DHFR 유전자는 임의의 다른 공동-형질전환된 핵산과 함께 증폭된다. 내인성 DHFR 활성이 결여된 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예를 들어, ATCC CRL-9096)를 사용할 수 있다.

별법으로, GS 유전자로 형질전환된 세포는 GS의 억제제인 L-메티오닌 술폭시민 (Msx)을 함유하는 배양 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 확인된다. 이들 조건하에, GS 유전자는 임의의 다른 공동-형질전환된 핵산과 함께 증폭된다. GS 선별/증폭 시스템은 상기 기술된 DHFR 선별/증폭 시스템과 함께 사용될 수 있다.

별법으로, 관심의 대상이 되는 항체, 야생형 DHFR 유전자 및 또다른 선별가능 마커, 예컨대 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환되거나 공동-형질전환된 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 선별가능 마커에 대한 선별제, 예컨대 아미노글리코시드계 항생제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신 또는 G418을 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선별될 수 있다. 미국 특허 제4,965,199호를 참조한다.

효모에서 사용하기에 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (문헌 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)]). trp1 유전자는 트립토판 중에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어, ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1에 대한 선별 마커를 제공한다 (문헌 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]). 이어서, 효모 숙주 세포 게놈 내 trp1 병변의 존재는 트립토판의 부재 중 성장에 의해 형질전환을 검출하는 데 효과적인 환경을 제공한다. 비슷하게, Leu2-결핍 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 갖는 공지된 플라스미드에 의해 보충된다.

또한, 1.6 ㎛ 원형 플라스미드 pKD1으로부터 유래한 벡터가 클루이베로마이세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 별법으로, 재조합 송아지 키모신의 대규모 생산을 위한 발현 시스템이 K. 락티스(K. lactis)에 대해 보고되어 있다 (문헌 [Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)]). 클루이베로마이세스의 산업적 균주에 의한 성숙한 재조합 인간 혈청 알부민의 분비에 적합한 다중-카피 발현 벡터도 개시되어 있다 (문헌 [Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)]).

프로모터 성분

발현 및 클로닝 벡터는 보통 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주와 함께 사용하기 적합한 프로모터에는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제 프로모터, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 프로모터가 포함된다. 그러나, 다른 공지된 세균 프로모터도 적합하다. 세균 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 또한 항체를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) (S.D.) 서열을 함유할 것이다.

진핵 세포에 대한 프로모터 서열은 공지되어 있다. 실질적으로 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 상류에 위치하는 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 출발부로부터 70 내지 80개 염기 상류에서 발견되는 또다른 서열은 CNCAAT 영역 (여기서, N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)이다. 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단에는 코딩 서열의 3' 말단에 대한 폴리 A 테일의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 존재한다. 이들 서열 모두가 진핵 발현 벡터 내에 적합하게 삽입될 수 있다.

효모 숙주와 함께 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예로는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예컨대 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제를 위한 프로모터가 포함된다.

성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알코올 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스와 갈락토스 이용을 담당하는 효소를 위한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다. 효모 인핸서를 또한 이스트 프로모터와 함께 사용하는 것이 유리하다.

포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 항체 전사는, 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용가능할 경우, 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터, 또는 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 또는 열-충격 프로모터로부터 얻은 프로모터에 의해 제어될 수 있다.

SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는, SV40 바이러스 복제 기점을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 인간 사이토메갈로바이러스의 극초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 소 유두종 바이러스를 벡터로서 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 이 시스템의 변형은 미국 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 또한, 단순 헤르페스 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA를 발현시키는 것에 대한 문헌 [Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)]을 참조한다. 별법으로, 라우스 육종 바이러스의 장쇄 말단 반복부가 프로모터로서 사용될 수도 있다.

인핸서 요소 성분

고등 진핵 세포에 의한 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA의 전사는 흔히 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로는 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예로는 복제 기점의 하류 (bp 100-270) 쪽의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 또한, 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소에 대한 문헌 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 항체-코딩 서열에 대한 위치 5' 또는 3'에서 벡터로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터부터 부위 5'에 위치한다.

전사 종결 성분

진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 통상적으로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 이용가능하다. 이들 영역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 함유한다. 한가지 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. W0 94/11026 및 그 안에 개시된 발현 벡터를 참조한다.

숙주 세포의 선택 및 형질전환

본원에서 벡터 내 DNA의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 상기 기술된 원핵, 효모, 또는 고등 진핵 세포이다. 이 목적에 적합한 원핵 세포에는 진정세균, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae), 예컨대 에스케리치아(Escherichia), 예를 들어 E. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실러스(Bacilli), 예컨대 B. 섭틸리스(B. subtilis) 및 B. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일 공개된 DD 266,710에 개시된 B. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 P. 아에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)가 포함된다. 하나의 바람직한 E. 콜라이 클로닝 숙주는 E. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, E. 콜라이 B, E. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537) 및 E. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)과 같은 다른 균주도 적합하다. 이들 예는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것이다.

전장 항체, 항체 융합 단백질 및 항체 단편은, 특히 당화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 예컨대 그 자체가 종양 세포 파괴에 유효성을 나타내는 세포독성제 (예를 들어, 독소)에 치료용 항체가 접합된 경우에 세균에서 생산될 수 있다. 전장 항체는 순환에서 보다 큰 반감기를 갖는다. E. 콜라이에서의 생산이 보다 빠르고 비용 효과적이다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 발현 및 분비를 최적화하기 위한 신호 서열 및 번역 개시 영역 (TIR)을 기재한 U.S. 5,648,237 (Carter et. al.), U.S. 5,789,199 (Joly et al.), U.S. 5,840,523 (Simmons et al.)을 참조한다. 또한, E. 콜라이에서의 항체 단편의 발현을 기재한 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254]을 참조한다. 발현 후에는, 항체를 가용성 분획 내 E. 콜라이 세포 페이스트로부터 단리시킬 수 있고, 예를 들어 이소형에 따라 단백질 A 또는 G 칼럼을 통해 정제시킬 수 있다. 최종 정제는, 예를 들어 CHO 세포에서 발현되는 항체의 정제 방법과 유사하게 수행할 수 있다.

원핵세포 이외에, 진핵 미생물, 예컨대 사상형 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 또는 통상적인 빵 효모가 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 다수의 다른 속, 종 및 균주, 예컨대 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예컨대 K. 락티스(K. lactis), K. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), K. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), K. 위커라미(K. wickeramii) (ATCC 24,178), K. 왈티(K. waltii) (ATCC 56,500), K. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), K. 테르모톨레란스(K. thermotolerans) 및 K. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 쉬반니오마이세스(Schwanniomyces), 예컨대 쉬반니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상형 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 A. 니둘란스(A. nidulans) 및 A. 니거(A. niger)도 본원에서 통상적으로 이용가능하고 유용하다. 치료용 단백질의 생산을 위한 효모 및 사상형 진균의 사용을 논의한 검토에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)]을 참조한다.

당화 경로가 "인간화"됨으로써 부분적으로 또는 완전하게 인간 당화 경로를 갖는 항체를 생산하는 특정 진균 및 효모 균주를 선택할 수도 있다. 예를 들어, 문헌 [Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)] (피키아 파스토리스에서의 당화 경로의 인간화를 기재함) 및 [Gerngross et al., 상기와 동일]을 참조한다.

당화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 다수의 배큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (쐐기벌레), 아에데스 아에집티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (초파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 상응하는 허용된 곤충 숙주 세포가 확인되어 있다. 형질감염을 위한 각종 바이러스 균주, 예를 들어 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주도 대중적으로 이용가능하고, 이러한 바이러스들은 본원에서, 특히 스포돕테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위한, 본 발명에 따른 바이러스로서 사용될 수 있다.

면, 옥수수, 감자, 대두, 피튜니아, 토마토, 덕위드 (렘나세애(Lemnaceae)), 알파파 (M. 트룬카툴라(M. truncatula)) 및 담배의 식물 세포 배양물도 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호 및 제6,417,429호 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하는 플랜티바디즈(PLANTIBODIES)™ 기술을 기재함)를 참조한다.

척추동물 세포가 숙주로 사용될 수도 있는데, 배양물 (조직 배양물) 중에서의 척추동물 세포의 증식은 통상적인 절차로 되어 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장주 (293, 또는 현탁 배양물 중에서 성장시키기 위해 서브클로닝된 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1997)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol . Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (문헌 [Mather et al., Annals N.Y . Acad . Sci . 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주 (Hep G2)이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주에는 DHFR^- CHO 세포를 비롯한 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 (문헌 [Urlaub et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA 77:4216 (1980)]); 및 NS0 및 Sp2/0와 같은 골수종 세포주가 포함된다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 255-268]을 참조한다.

숙주 세포를 상기 기술된 항체 생산을 위한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염시킨 다음, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형시킨 통상의 영양 배지에서 배양시킨다.

숙주 세포의 배양

본 발명의 항체를 생산하는 데 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대 햄 (Ham) F10 (시그마 (Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM, 시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) (DMEM, 시그마)가 숙주 세포를 배양하기에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth . Enz . 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem . 102:225 (1980)], 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기재된 임의의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충액 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 젠타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), 미량 원소 (보통 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 등가의 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수 보충물 또한 당업자에게 잘 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이며, 당업자에게는 명백할 것이다.

항체의 정제

재조합 기술을 사용할 때, 항체는 세포 내 원형질막 주위 공간에서 생산되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생산되면, 제1 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 입자형 파쇄물은, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]은 E. 콜라이의 원형질막 주위 공간으로 분비된 항체를 단리하는 절차를 기재한다. 간단하게는, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분 동안 해동시킨다. 세포 파쇄물은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우에는, 상기 발현 시스템으로부터의 상등액을 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킬 수 있다. 단백질 분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF가 임의의 선행 단계에서 포함될 수도 있고, 우발적인 오염물의 출현을 방지하기 위해 항생제가 포함될 수도 있다.

세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있는데, 이들 중에서 친화도 크로마토그래피가 전형적으로 바람직한 정제 단계의 하나이다. 친화도 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제하는 데 사용될 수 있다 (문헌 [Lindmark et al. J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)]). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 추천된다 (문헌 [Guss et al. EMBO J. 5: 15671575 (1986)]). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 조절형 공극을 갖는 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 빠른 유동 속도 및 짧은 처리 시간을 가능하게 한다. 항체가 C_H3 도메인을 포함하는 경우에는, 베이커본드(Bakerbond) ABX™ 수지 (뉴저지주 필립스버그 소재의 J.T. 베이커(J.T. Baker))가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온-교환 칼럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스™ 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대 폴리아스파르트산 칼럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전도 회수되는 항체에 따라 이용가능하다.

임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심의 대상이 되는 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물을, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25M 염)에서 수행되는, 약 2.5-4.5의 pH에서 용출 완충액을 사용하는 저 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용시킬 수 있다.

일반적으로, 관심의 대상이 되는 특정 항체에 대해 상기 기술된 방법론과 일치하고/거나 당업자에 의해 적절한 것으로 판단되는 연구, 시험 및 임상에서 사용하기 위한 항체를 제조하는 다양한 방법론이 당업계에 잘 확립되어 있다.

제약 제제 및 투여량

항체 조성물은 양질의 의료 실무에 따른 방식으로 제제화되고 용량 분배되어 투여될 것이다. 상기 맥락에서 고려할 인자에는 치료할 특정 질병, 치료할 특정 포유동물, 개별적인 환자의 임상적 상태, 질병의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 실무자에게 알려진 기타 다른 인자가 포함된다. 투여할 항체의 "치료적 유효량"은 이러한 고려사항에 의해 좌우될 것이며, 질환 또는 질병을 예방, 개선 또는 치료하는 데 필요한 최소량이다. 항체는 그럴 필요는 없지만, 임의로는 관심의 대상이 되는 질병을 예방 또는 치료하는 데 현재 사용되는 1종 이상의 작용제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제에 존재하는 항체의 양, 질병 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 상기 사용된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로, 또는 이전에 이용된 투여량의 약 1 내지 99％로 사용된다. 일반적으로, 질환 또는 질병의 완화 또는 치료는 질환 또는 질병과 관련된 하나 이상의 증상 또는 의학적 문제점을 감소시키는 것을 포함한다. 암의 경우에, 약물의 치료적 유효량은 하기 중 하나 또는 이들의 조합을 달성시킬 수 있다: 암 세포 수의 감소; 종양 크기의 감소; 암 세포의 주변 장기로의 침입 억제 (즉, 어느 정도까지의 감소 및/또는 정지); 종양 전이의 억제; 종양 성장의 어느 정도까지의 억제; 및/또는 암과 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도까지의 경감. 약물은 그것이 존재하는 암 세포의 성장을 방해하고/거나 존재하는 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 대상체 또는 포유동물에서 질환 또는 질병의 발병 또는 재발을 방지하기 위해 사용될 수 있다.

질환을 예방 또는 치료하기 위한 본 발명의 항체의 적절한 투여량은 (단독으로 사용되거나 1종 이상의 다른 추가 치료제와 조합하여 사용되는 경우에) 치료할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 진행 상태, 항체가 예방 목적으로 투여되는지 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 기시행된 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 항체는 환자에게 1회 투여하거나 일련의 치료기간에 걸쳐 투여하는 것이 적합하다.

특정 실시양태에서는, 질환의 유형 및 중증도에 따라, 항체 약 1 ㎍/kg 내지 50 mg/kg (예를 들어, 0.1-20 mg/kg)이, 예를 들어 1회 이상의 별도 투여에 의한 것인지, 또는 연속 주입에 의한 것인지와는 상관없이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 또다른 실시양태에서는, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg - 10 mg/kg)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1일 투여량의 범위는 상기 언급한 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg, 또는 그 이상일 수 있다. 수일에 걸쳐 또는 그보다 장기간에 걸쳐 반복 투여하는 경우에는, 병태에 따라서, 질환의 증상이 목적하는 만큼 억제될 때까지 치료를 지속한다.

항체에 대한 하나의 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 15 mg/kg 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 7.5 mg/kg, 10 mg/kg 또는 15 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량을 환자에게 투여할 수 있다. 이러한 용량은, 예를 들어 매일, 매 3일마다, 매주 또는 매 2주 내지 3주마다 (예를 들어, 환자가 약 2 내지 약 20, 또는 예를 들어 약 6회 분의 항체를 투여받도록) 간헐적으로 투여될 수 있다. 일 실시양태에서는, 약 10 mg/kg의 용량이 매 3일마다 투여된다. 초기의 보다 높은 로딩 용량에 이어, 하나 이상의 보다 낮은 용량이 투여될 수 있다. 일 실시양태에서, 예시적인 투약 계획은 항체 약 4 mg/kg의 초기 로딩 용량에 이은, 약 2 mg/kg의 주 1회 유지 용량을 포함한다. 그러나, 다른 투약 계획도 유용할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에서 논의된 투약 계획은 전이성 결장직장암의 치료를 위한 최일선 요법으로서의 화학요법 계획과 조합하여 사용된다. 일부 측면에서, 화학요법 계획은 전통적인 고-용량 간헐 투여를 포함한다. 일부 다른 측면에서, 화학요법제는 예정된 중단 없이 보다 적은 용량으로 보다 빈번하게 투여된다 ("메트로놈 화학요법(metronomic chemotherapy)").

본 발명의 요법의 진행 상태는 통상의 기술 및 검정법에 의해 쉽게 모니터링된다.

본 발명의 항체 (및 임의의 추가 치료제 또는 보조제)는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비내를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 국소 치료를 위해 필요하다면, 병변내 투여될 수 있다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 또한, 항체는 특히 감소하는 용량의 항체로 펄스 주입에 의해 투여되는 것이 적합하다. 투약은 부분적으로는 투여가 단기간인지 장기간인지에 따라, 임의의 적합한 경로, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 이루어질 수 있다.

본원에서 제약 제제는 또한 치료할 특정 징후에 필요하면 1종 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않으며 상보적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 존재하는 것이 적절하다.

본 발명의 항체를 포함하는 제약 제제는 보관을 위해서, 목적하는 순도를 갖는 항체를 임의적인 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 (문헌 [Remington : The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)]) 수용액, 동결건조되거나 기타 다른 건식 제제의 형태로 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용체에게 비독성이며, 여기에는 완충액, 예컨대 포스포네이트, 시트레이트, 히스티딘 및 기타 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 방부제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤즈알코늄, 염화벤즈에토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 다른 당질, 예를 들어, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈™, 플루로닉스™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다.

활성 성분은 또한, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합화에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 마크로에멀젼에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)]에 개시되어 있다.

생체내 투여를 위해 사용되는 제약 제제는 멸균성을 띠어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.

서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예에는 본 발명의 면역글로불린을 함유하는 소수성 고체 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포 (LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로스피어) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 넘게 분자를 방출할 수 있지만, 특정 히드로겔은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출한다. 봉입된 면역글로불린이 장기간 동안 신체에서 유지될 때, 이는 37℃에서 습기에 노출되면 변성되거나 응집되어 생물학적 활성을 손실하게 될 수 있고, 면역원성이 변경될 가능성도 있다. 관여하는 기전에 따라서 안정화를 위한 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 안정화는 술피드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량 조절, 적절한 첨가제의 사용 및 특이적 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성될 수 있다.

방법

치료 방법

본 발명의 항체는, 예를 들어 시험관내, 생체외 및 생체내 치료 방법에서 사용될 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 종양, 암 및/또는 세포 증식성 질병 (예를 들어, VEGF의 증가된 발현 및/또는 활성과 관련된 질병)의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 항-VEGF 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 종양, 암 및/또는 세포 증식성 질병의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

일 측면에서, 본 발명은 종양 또는 암 성장의 감소, 억제, 차단 또는 방해를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 항-VEGF 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 종양 또는 암 성장의 감소, 억제, 차단 또는 방해 방법을 제공한다.

일 측면에서, 본 발명은 혈관신생의 억제를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 항-VEGF 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 혈관신생의 억제 방법을 제공한다.

일 측면에서, 본 발명은 혈관 투과성의 억제를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 항-VEGF 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 혈관 투과성의 억제 방법을 제공한다.

일 측면에서, 본 발명은 혈관신생과 관련된 병적 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 항-VEGF 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 혈관신생과 관련된 병적 상태의 치료 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 혈관신생과 관련된 병적 상태는 종양, 암 및/또는 세포 증식성 질병이다.

본 발명의 항체는 치료 목적으로 인간에게 투여될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 증가된 VEGF 발현 및/또는 활성과 관련된 질병을 앓고 있는 개체에게 항체를 투여함으로써 개체 내 VEGF에 결합시키는 것을 포함하는, 상기 개체에서 VEGF를 결합시키는 방법에 사용된다. 일 실시양태에서, VEGF는 인간 VEGF이고, 개체는 인간 개체이다. 다르게는, 개체는 본 발명의 항체가 결합하는 VEGF를 발현하는 포유동물일 수 있다. 보다 추가적으로 개체는 (예를 들어, VEGF의 투여 또는 VEGF를 코딩하는 트랜스진의 발현에 의해) VEGF를 도입시킨 포유동물일 수 있다.

일 측면에서, 본 발명의 항체 중 적어도 일부는 인간 이외의 종으로부터 유래된 VEGF에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 인간 대상체 또는 본 발명의 항체가 교차-반응하는 항원을 갖는 다른 포유동물 대상체 (예를 들어, 침팬지, 비비, 마모셋, 시아노몰거스 및 붉은털원숭이, 돼지 또는 마우스)에서, 예를 들어 항원을 함유하는 세포 배양물 중에서 특정 항원 활성을 결합시키는 데 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항원 활성이 억제되도록 항체를 항원과 접촉시킴으로써 항원 활성을 억제하는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 항원은 인간 단백질 분자이다.

또한, 본 발명의 항체는 수의학적 목적을 위해서 또는 인간 질환의 동물 모델로서, 상기 항체가 교차-반응하는 VEGF를 발현하는 비-인간 포유동물 (예를 들어, 영장류, 돼지, 래트 또는 마우스)에 투여될 수 있다. 후자와 관련하여, 이러한 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가 (예를 들어, 투여량 및 투여 시간 경과를 시험)하는 데 유용할 수 있다.

본 발명의 항체는 1종 이상의 항원 분자의 발현 및/또는 활성과 관련된 질환, 질병 또는 병태를 치료, 억제, 진행 지연, 재발 방지/지연, 개선 또는 예방하는 데 사용될 수 있다.

본 발명은 종양 성장을 지지하기 위해 영양을 제공하는 데 필요한 종양 혈관의 발생을 억제하는 것을 목적으로 하는 신규 암 치료 전략인 항-혈관신생 암 요법, 및 종양 전이의 예방 및 치료를 포괄한다. 본 발명은 특히 1차 부위에서의 종양의 신생물성 성장을 억제하는 것뿐만 아니라, 2차 부위에서의 종양 전이를 예방 및/또는 치료하는 것을 포함하므로, 다른 치료제에 의한 종양 공격을 허용한다. 본원에서 치료할 (예방 포함) 암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프계 악성종양이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포 암 (예를 들어, 편평 상피 세포 암), 소-세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평세포 암종을 비롯한 폐암, 복막암, 간세포 암 (hepatocellular cancer), 위장관 암 및 위장관 기질 암을 비롯한 위암 (gastric 또는 stomach cancer), 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요로암, 간세포암 (hepatoma), 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 콩팥 또는 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 흑색종, 표재 확장성 흑색종, 악성 흑자 흑색종, 선단 흑자성 흑색종, 결절성 흑색종, 다발성 골수종 및 (저등급/여포성 비-호지킨 림프종 (NHL); 소 림프구성 (SL) NHL; 중등급/여포성 NHL; 중등급 확산성 NHL; 고등급 면역모세포성 NHL; 고등급 림프모세포성 NHL; 고등급 소 비-균열 세포 NHL; 거대 질환 NHL; 덮개 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증을 비롯한) B-세포 림프종; 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프모세포성 백혈병 (ALL); 모상 세포 백혈병; 만성 골수모세포성 백혈병; 및 이식후 림프증식성 질병 (PTLD), 뿐만 아니라 모반증과 관련된 비정상적 혈관 증식, 부종 (예컨대 뇌종양과 관련된 것), 메이그스 증후군, 뇌암 및 두경부암, 및 관련 전이가 포함된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체에 의한 치료를 받을 수 있는 암에는 유방암, 결장직장암, 직장암, 비-소세포 폐암, 비-호지킨 림프종 (NHL), 신장 세포암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연-조직 육종, 카포시 육종, 카르시노이드 암종, 두경부암, 난소암, 중피종 및 다발성 골수종이 포함된다. 일부 실시양태에서, 암은 소세포 폐암, 신경모세포종, 흑색종, 유방 암종, 위암 (gastric cancer), 결장직장암 (CRC) 및 간세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 일부 실시양태에서, 암은 전이 형태를 포함하는, 비-소세포 폐암, 결장직장암 및 유방 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특정 실시양태에서는, 1종 이상의 세포독성제(들)과 접합시킨 항체를 포함하는 면역접합체가 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체가 결합된 면역접합체 및/또는 항원은 세포에 의해 내재화됨으로써, 항체가 결합된 표적 세포를 사멸시키는 면역접합체의 치료 효능을 증가시킨다. 일 실시양태에서, 세포독성제는 표적 세포 내 핵산을 표적으로 하거나 이것을 방해한다. 일 실시양태에서, 세포독성제는 미세관 중합을 표적으로 하거나 이것을 방해한다. 이러한 세포독성제의 예에는 본원에서 언급한 임의의 화학요법제 (예컨대 메이탄시노이드, 오리스타틴, 돌라스타틴 또는 칼리케아미신), 방사성 동위원소, 또는 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제가 포함된다.

항체의 결합 표적이 뇌에 위치한 경우, 본 발명의 특정 실시양태는 혈액-뇌 장벽을 통과하는 항체를 제공한다. 물리적 방법, 지질-기반 방법, 줄기 세포-기반 방법, 및 수용체 및 채널-기반 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 수송 분자에 대한 당업계에 공지된 몇몇 접근법이 존재한다.

혈액-뇌 장벽을 가로지르는 항체를 수송하는 물리적 방법에는, 혈액-뇌 장벽을 완전히 포위하는 것, 또는 혈액-뇌 장벽에 구멍을 생성시키는 것이 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 포위 방법에는 뇌로의 직접 주사법 (예를 들어, 문헌 [Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)] 참조), 세포간 주입/전달-강화 전달법 (예를 들어, 문헌 [Bobo et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91: 2076-2080 (1994)] 참조), 및 뇌 내 전달 장치 이식 (예를 들어, 문헌 [Gill et al., Nature Med . 9: 589-595 (2003)]; 및 길포드 파마슈티칼(Guildford Pharmaceutical)의 글리아델 웨이퍼즈(Gliadel Wafers)™가 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 장벽 내 구멍 생성 방법에는 초음파 (예를 들어, 미국 특허 공개 제2002/0038086호 참조), 삼투압 (예를 들어, 고장성 만니톨의 투여에 의함 (문헌 [Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 ＆ 2, Plenum Press, N.Y. (1989)]), 예를 들어 브래디키닌 또는 투과화제 A-7에 의한 투과화 (예를 들어, 미국 특허 제5,112,596호, 제5,268,164호, 제5,506,206호 및 제5,686,416호 참조), 및 항체를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터에 의한, 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 뉴런의 형질감염 (예를 들어, 미국 특허 공개 제2003/0083299호 참조)이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.

혈액-뇌 장벽을 가로지르는 항체를 수송하는 지질-기반 방법에는, 혈액-뇌 장벽의 혈관 내피세포 상의 수용체에 결합하는 항체 결합 단편에 커플링되는 리포좀에 항체를 봉입시키는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제20020025313호 참조), 및 저-밀도 리포단백질 입자 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제20040204354호 참조) 또는 아포리포단백질 E (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제20040131692호 참조)로 항체를 코팅하는 것이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.

혈액-뇌 장벽을 가로지르는 항체를 수송하는 줄기 세포-기반 방법은 신경 전구 세포 (NPC)가 관심의 대상이 되는 항체를 발현하도록 유전자 조작한 다음, 치료할 개체의 뇌에 줄기 세포를 이식하는 것을 수반한다. 2005년 12월 15자 온라인판 문헌 [Behrstock et al. (2005) Gene Ther .] (신경영양 인자 GDNF를 발현하도록 유전자 조작된 NPC는 설치류 및 영장류 모델의 뇌에 이식 시, 파킨슨 질환의 증상을 감소시킴을 보고함)을 참조한다.

혈액-뇌 장벽을 가로지르는 항체를 수송하는 수용체 및 채널-기반 방법에는 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키기 위한 글루코코르티코이드 차단제의 사용 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2002/0065259호, 제2003/0162695호 및 제2005/0124533호 참조); 칼륨 채널의 활성화 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2005/0089473호 참조); ABC 약물 수송체의 억제 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2003/0073713호 참조); 트랜스페린에 의한 항체 코팅 및 하나 이상의 트랜스페린 수용체의 활성 조절 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2003/0129186호 참조); 및 항체의 양이온화 (예를 들어, 미국 특허 제5,004,697호 참조)가 포함되지만 이에 한정되지 않는다.

임의의 상기 치료 방법은 항-VEGF 항체 대신 또는 이것 이외에 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.

조합 요법

본 발명의 항체는 한 요법에서 단독으로 또는 다른 조성물과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 또다른 항체, 화학요법제(들) (화학요법제들의 칵테일 포함), 다른 세포독성제(들), 항-혈관신생제(들), 사이토카인 및/또는 성장 억제제(들)와 함께 공동-투여될 수 있다. 본 발명의 항체가 종양 성장을 억제하는 경우에는, 이것을 종양 성장을 또한 억제하는 1종 이상의 다른 치료제(들), 예를 들어 항-혈관신생제 및/또는 화학요법제와 조합하는 것이 특히 바람직할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 환자는 조합된 방사선 요법 (예를 들어, 외부 빔 조사 또는 방사성 표지된 작용제, 예컨대 항체에 의한 요법)을 받을 수도 있다. 상기 언급된 이러한 조합 요법에는 조합 투여 (2종 이상의 작용제가 동일 또는 별개 제제에 포함된 경우) 및 별개 투여 (이 경우, 본 발명의 항체의 투여는 보조 요법 또는 요법들의 투여 전 및/또는 후에 이루어질 수 있음)가 포함된다.

일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 적어도 1종의 추가 치료제 및/또는 보조제와 함께 공동-투여될 수 있다. 예를 들어, 항-VEGF 항체는 다양한 신생물성 또는 비-신생물성 병태를 치료하기 위한 항암 치료법 또는 항-신생혈관형성 치료법과 조합하여 사용된다. 일 실시양태에서, 신생물성 또는 비-신생물성 병태는 비전형적이거나 바람직하지 못한 혈관신생과 관련된 병적 질병을 특징으로 한다. 항-VEGF 항체는 상기 목적에 유효한 또다른 작용제와 함께 순차적으로 또는 조합하여 동일 조성물 또는 별개 조성물로 투여될 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 다수의 VEGF 억제제가 투여될 수 있다.

전형적으로, 항-VEGF 항체 및 항암제는 동일하거나 유사한 질환에 대하여 병적 질병, 예컨대 종양, 암 또는 세포 증식성 질병을 차단 또는 감소시키는 데 적합하다. 일 실시양태에서, 항암제는 항-혈관신생제이다.

다수의 항-혈관신생제가 확인되었고, 당업계에 공지되어 있으며, 여기에는 본원에 나열되어 있는 것, 예를 들어 "정의" 섹션, 및 예를 들어 문헌 [Carmeliet and Jain, Nature 407:249-257 (2000)]; [Ferrara et al., Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004)]; 및 [Sato Int. J. Clin . Oncol , 8:200-206 (2003)])에 나열되어 있는 것이 포함된다. 또한, 미국 특허 출원 US20030055006도 참조한다.

일 실시양태에서, 본 발명의 항-VEGF는 1종 이상의 항-VEGF 중화 항체 (또는 단편), 또다른 VEGF 패밀리 (예를 들어, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 태반 성장 인자 (PLGF))에 대한 길항제, 또는 예를 들어 가용성 VEGF 수용체 (예를 들어, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, 뉴로필린 (예를 들어, NRP1, NRP2)) 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는 VEGF 수용체 길항제, VEGF 또는 VEGFR을 차단할 수 있는 압타머, 중화 항-VEGFR 항체, VEGFR 티로신 키나제 (RTK)의 저분자량 억제제, VEGF에 대한 안티센스 전략, VEGF 또는 VEGF 수용체에 대한 리보자임, VEGF의 길항제 변이체; 및 이들의 임의 조합과 조합하여 사용된다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 항-VEGF 항체는 1종 이상의 티로신 키나제 수용체, 예컨대 VEGF 수용체, FGF 수용체, EGF 수용체 및 PDGF 수용체를 표적으로 하는 소분자 수용체 티로신 키나제 억제제 (RTKI)와 조합하여 사용될 수 있다. 바탈라닙 (PTK787), 엘로티닙 (타르세바(TARCEVA)^®), OSI-7904, ZD6474 (자크티마(ZACTIMA)^®), ZD6126 (ANG453), ZD1839, 수니티닙 (수텐트(SUTENT)^®), 세막사닙 (SU5416), AMG706, AG013736, 이마티닙 (글리벡^®), MLN-518, CEP-701, PKC-412, 라파티닙 (GSK572016), 벨케이드(VELCADE)^®, AZD2171, 소라페닙 (넥사바르(NEXAVAR)^®), XL880 및 CHIR-265를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 치료용 소분자 RTKI가 당업계에 공지되어 있다.

본 발명의 항체와의 조합 종양 요법에 유용한 다른 치료제에는 EGFR, ErbB2 (Her2로도 알려짐) ErbB3, ErbB4 또는 TNF와 같은 종양 성장에 관여하는 기타 다른 인자의 길항제가 포함된다.

특정 실시양태에서는, VEGF 길항제 및 기타 다른 작용제 이외에도 2종 이상의 혈관신생 억제제가 환자에게 임의로 공동-투여될 수 있다. 보다 또다른 실시양태에서는, 1종 이상의 추가 치료제, 예를 들어 항암제가 본 발명의 항-VEGF 항체, 또다른 VEGF 패밀리에 대한 길항제 및/또는 항-혈관신생제와 조합하여 투여될 수 있다.

본 발명의 특정 측면에서, 항-VEGF-항체와의 조합 종양 요법에서 유용한 기타 다른 치료제에는 기타 다른 암 요법 (예를 들어, 수술, 방사선 치료 (예를 들어, 방사성 물질의 조사 또는 투여를 포함함), 화학요법, 본원에 나열되어 있고 당업계에도 공지되어 있는 함암제를 사용한 치료, 또는 이들의 조합)이 포함된다. 고려되는 화학요법제의 예시적이고 비-제한적인 목록은 본원에서 "정의" 섹션 하에 제공된다.

별법으로 또는 추가로, 본원에 개시된, 동일하거나 2종 이상의 상이한 항원에 결합하는 2종 이상의 항체가 환자에게 공동-투여될 수 있다. 때때로, 1종 이상의 사이토카인을 환자에게 투여하는 것도 유익할 수 있다.

항-VEGF 항체와 조합하여 투여되는 치료제의 유효량은 의사 또는 수의사의 재량에 따라 달라질 것이다. 치료하고자 하는 병태를 최고로 관리하기 위한 투여량이 투여되고 그에 대한 조정이 이루어진다. 용량은 사용되는 치료제의 유형 및 치료받을 특정 환자와 같은 인자에 따라서 추가로 달라질 것이다. 항암제의 적합한 투여량은 현재 사용되는 양이고, 이는 항암제 및 항-VEGF 항체의 조합 작용 (상승작용)에 기인하여 낮출 수 있다. 특정 실시양태에서, 억제제의 조합은 단일 억제제의 효능을 증강시킨다. 상기 "증강시킨다"라는 용어는 치료제의 통상의 용량 또는 허가받은 용량에서 치료제의 효능 개선을 의미한다. 본원의 제약 제제 및 투여량 표제의 섹션도 참조한다.

화학요법제

일 측면에서, 본 발명은 유효량의 항-VEGF 항체 및/또는 혈관신생 억제제(들) 및 1종 이상의 화학요법제를 투여하여 질병 (예컨대 종양, 암 또는 세포 증식성 질병)을 치료하는 방법을 제공한다. 다양한 화학요법제가 본 발명의 조합 치료 방법에서 사용될 수 있다. 고려되는 화학요법제의 예시적이고 비-제한적인 목록은 본원에서 "정의" 섹션 하에 제공된다. 항-VEGF 항체 및 화학요법제의 투여는, 예를 들어 단일 조성물로서 또는 2종 이상의 별개 조성물로서, 동일하거나 상이한 투여 경로를 사용하여 동시에 수행될 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 투여는 임의 순서로 순차적으로 수행될 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 상기 단계는 임의 순서의 순차적 투여 및 동시 투여, 둘 다의 조합으로서 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 2종 이상의 조성물 투여 사이에는 수분 내지 수일, 수주, 수개월 범위의 간격이 존재할 수 있다. 예를 들어, 화학요법제를 먼저 투여한 후, 항-VEGF 항체를 투여할 수 있다. 그러나, 항-VEGF 항체를 동시에 투여하거나 먼저 투여하는 것도 고려된다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은 항-VEGF 항체 (예컨대 B20-4.1.1 항체 또는 B20-4.1.1RR 항체)를 투여한 후, 화학요법제를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서는, 2종 이상의 조성물 투여 사이에 수분 내지 수일, 수주, 수개월 범위의 간격이 존재할 수 있다.

당업자라면 이해할 수 있는 바와 같이, 화학요법제의 적절한 용량은 일반적으로 대략 화학요법제가 단독으로 또는 기타 다른 화학요법제와 조합하여 투여되는 임상 요법에서 이미 사용되고 있는 양일 것이다. 치료할 병태에 따라서 투여량에는 변동이 있을 것이다. 치료를 행하는 의사는 개별적인 대상체에 적절한 용량을 결정할 수 있을 것이다.

재발성 종양 성장

본 발명은 또한 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장을 억제하거나 예방하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장은 1종 이상의 현재 이용가능한 요법 (예를 들어, 암 요법, 예컨대 화학요법, 방사선 요법, 수술, 호르몬 요법 및/또는 생물학적 요법/면역요법, 항-VEGF 항체 요법, 특히 특정 암에 대한 표준 치료 계획)을 받았거나 이것으로 치료한 환자에 있어서, 그를 치료하는 것이 임상적으로 적당하지 않거나, 또는 환자가 추가의 유효한 요법을 필요로 할 정도로 상기 요법으로부터 임의의 유익한 효과를 받는 것이 더 이상 가능하지 않은 상태를 기술하기 위해 사용된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 상기 문구는 또한, 예를 들어 요법에 반응한 환자가 여전히 부작용을 겪고 있거나, 내성이 발달하거나, 요법에 반응하지 않거나, 요법에 만족스럽게 반응하지 않는 등을 기술하는 "비-반응성/난치성" 환자의 상태를 가리킬 수 있다. 다양한 실시양태에서, 암은 암 세포의 수가 유의하게 감소하지 않거나 증가하거나, 또는 종양 크기가 유의하게 감소하지 않거나 증가하거나, 또는 암 세포의 크기 또는 수에서 임의의 추가적인 감소에 이르지 못한 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장이다. 암 세포가 재발성 종양 성장인지 재발성 암 세포 성장인지에 대한 결정은 해당 맥락에서의 "재발성" 또는 "난치성" 또는 "비-반응성"에 대한 업계 용인 의미를 사용하여, 생체내 또는 시험관내에서 암 세포에 대한 치료 유효성을 분석하는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 항-VEGF 치료에 내성인 종양은 재발성 종양 성장의 예이다.

본 발명은 대상체에서 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장을 차단하거나 감소시키기 위해 1종 이상의 본 발명의 항-VEGF 항체를 투여함으로써, 대상체에서 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장을 차단하거나 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체는 암 치료법에 이어 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 암 요법과 동시에 투여된다. 별법으로 또는 추가로, 항-VEGF 항체 요법은 또다른 암 요법과 교대로 하며, 이는 임의 순서로 수행될 수 있다. 본 발명은 또한 1종 이상의 억제제 항체를 투여하여 암에 걸리기 쉬운 환자에서 암의 발병 또는 재발을 예방하는 방법을 포괄한다. 일반적으로, 대상체는 암 요법을 받았거나 현재 받고 있다. 일 실시양태에서, 암 요법은 항-혈관신생제, 예를 들어 VEGF-C 길항제를 사용하는 치료이다. 항-혈관신생제에는 당업계에 공지되어 있는 것 및 본원에서 "정의" 섹션 하에 제공된 것이 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 일 실시양태에서, 항-혈관신생제는 항-VEGF 중화 항체 또는 단편 (예를 들어, 인간화된 A4.6.1, 아바스틴^® (미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨테크), Y0317, M4, G6, B20, 2C3 등)이다. 예를 들어, 미국 특허 제6,582,959호, 제6,884,879호, 제6,703,020호; WO98/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1; 미국 특허 출원 20030206899, 20030190317, 20030203409 및 20050112126; 문헌 [Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)]; 및 WO2005012359를 참조한다. 추가의 작용제가 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장을 차단하거나 감소시키기 위해 항-VEGF 항체와 조합하여 투여될 수 있다 (예를 들어, 본원의 조합 요법 표제의 섹션 참조).

진단 방법 및 검출 방법

일 측면에서, 본 발명은 VEGF의 증가된 발현과 관련된 질병의 진단 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 시험 세포를 항-VEGF 항체와 접촉시키는 단계; VEGF에 대한 항-VEGF 항체의 결합을 검출함으로써, 시험 세포에 의한 VEGF의 (양적 또는 질적) 발현 수준을 측정하는 단계; 및 시험 세포에 의한 VEGF의 발현 수준을 대조군 세포 (예를 들어, 시험 세포와 동일한 조직 기원의 보통 세포 또는 이러한 보통 세포와 동등한 수준으로 VEGF를 발현하는 세포)에 의한 VEGF의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 대조군 세포에 비해 더 높은 시험 세포에 의한 VEGF의 발현 수준은 VEGF의 증가된 발현과 관련된 질병의 존재를 가리킨다. 특정 실시양태에서, 시험 세포는 VEGF의 증가된 발현과 관련된 질병을 앓고 있을 것으로 의심되는 개체로부터 얻는다. 특정 실시양태에서, 질병은 종양, 암 및/또는 세포 증식성 질병이다.

본 발명의 항체를 사용하여 진단할 수 있는 예시적인 질병에는 편평 세포 암, 소-세포 폐암, 비-소 세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포 암 (hepatocellular cancer), 위암 (gastric cancer), 위장관 암, 위장관 기질 암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암 (hepatoma), 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 콩팥 또는 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 다양항 유형의 두경부암, 흑색종, 표재 확장성 흑색종, 악성 흑자 흑색종, 선단 흑자성 흑색종, 결절성 흑색종, B-세포 림프종, 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프모세포성 백혈병 (ALL); 모상 세포 백혈병; 만성 골수모세포성 백혈병; 이식후 림프증식성 질병 (PTLD), 모반증과 관련된 비정상적 혈관 증식, 뇌종양과 관련된 부종, 및 메이그스 증후군이 포함된다.

또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 항-VEGF 항체와 VEGF의 복합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 복합체는 생체내 또는 시험관내에 존재한다. 일부 실시양태에서, 상기 복합체는 암 세포를 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 생물학적 샘플 내에서 VEGF의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "검출"은 양적 또는 질적 검출을 포괄한다.

특정 실시양태에서, 상기 방법은 VEGF에 대한 항-VEGF 항체의 결합을 허용하는 조건하에 생물학적 샘플을 항-VEGF 항체와 접촉시키는 단계, 및 항-VEGF 항체와 VEGF 사이에 복합체가 형성되었는지를 검출하는 단계를 포함한다.

항-VEGF 항체는 익히 공지된 다수의 검출 검정 방법 중 어느 하나에서 VEGF를 검출하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 목적하는 공급원으로부터 샘플을 얻고, 상기 샘플을 항-VEGF 항체와 혼합하여 항체가 혼합물에 존재하는 임의의 VEGF와 함께 항체/VEGF 복합체를 형성하도록 하고, 혼합물에 존재하는 임의의 항체/VEGF 복합체를 검출함으로써, 생물학적 샘플을 VEGF에 대해 검정할 수 있다. 생물학적 샘플은 특정 샘플에 적합한 당업계에 공지된 방법에 의해서 검정용으로 제조될 수 있다. 샘플을 항체와 혼합하는 방법 및 항체/VEGF 복합체를 검출하는 방법은 사용된 검정법의 유형에 따라 선택된다.

VEGF에 대한 검정 방법은 모두 하기 시약 중 하나 이상을 사용한다: 표지된 VEGF 유사체, 고정된 VEGF 유사체, 표지된 항-VEGF 항체, 고정된 항-VEGF 항체 및/또는 입체 접합체. 표지된 시약은 "추적자"로도 알려져 있다.

특정 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 검출가능하게 표지된다. 사용되는 표지는 VEGF와 항-VEGF 항체의 결합을 방해하지 않는 임의의 검출가능한 관능기이다. 표지에는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대 형광, 발색단, 전자-조밀, 화학발광, 및 방사성 표지), 뿐만 아니라, 예를 들어 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 효소 또는 리간드와 같은 모이어티가 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 예시적인 표지에는 방사성 동위원소 ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H 및 ¹³¹I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트, 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라제, 예를 들어 반딧불이 루시페라제 및 세균 루시페라제 (미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당류 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 과산화수소를 이용하여 HRP, 락토퍼옥시다제 또는 마이크로퍼옥시다제와 같은 염료 전구체를 산화시키는 효소와 커플링된, 우리카제 및 크산틴 옥시다제와 같은 헤테로시클릭 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.

이들 표지를 단백질 또는 폴리펩티드에 공유 결합시키는 데에는 통상의 방법이 이용가능하다. 예를 들어, 디알데히드, 카르보디이미드, 디말레이미드, 비스-이미데이트, 비스-디아조화 벤지딘 등과 같은 커플링제를 사용하여 전술한 형광, 화학발광, 및 효소 표지를 항체에 태깅할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제3,940,475호 (형광검정법) 및 제3,645,090호 (효소); 문헌 [Hunter et al., Nature, 144: 945 (1962)]; [David et al., Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974)]; [Pain et al., J. Immunol . Methods, 40: 219-230 (1981)]; 및 [Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407-412 (1982)]을 참조한다. 본원에서 바람직한 표지는 호스래디쉬 퍼옥시다제 및 알칼리성 포스파타제와 같은 효소이다. 효소를 비롯한 이러한 표지의 항체에 대한 접합은 면역검정 기술에서 당업자에게 표준인 조작 절차이다. 예를 들어, 문헌 [O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay," in Methods in Enzymology, ed. J.J. Langone and H. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, New York, New York, 1981), pp. 147-166]을 참조한다.

특정 실시양태에서, 항체는 불용성 매트릭스 상에 고정된다. 고정은 용액 중에 유리된 상태로 남아 있는 임의의 VEGF로부터 항-VEGF 항체를 분리하는 것을 수반할 수 있다. 이는 통상적으로 검정 절차 전에 항-VEGF 항체를 수-불용성 매트릭스 또는 표면에 대한 흡착 (벤니치(Bennich)등의 U.S. 3,720,760) 또는 공유 커플링 (예를 들어, 글루타르알데히드 교차-결합 사용)에 의해서와 같이 불용성화하거나, 또는 항-VEGF 항체와 VEGF 사이의 복합체 형성 후에, 예를 들어 면역침강에 의해 항-VEGF 항체를 불용성화함으로써 달성된다.

VEGF에 대한 항-VEGF 항체의 결합을 검출하는 데 사용되는 검정법에는 당업계에 익히 공지되어 있는 항원-결합 검정법, 예컨대 웨스턴 블롯, 방사성 면역검정법, ELISA (효소 결합 면역흡착 검정법), 경쟁적 및 "샌드위치" 검정법, 면역침강 검정법, 형광 면역검정법, 단백질 A 면역검정법, 면역조직화학 (IHC) 및 입체적 억제 검정법이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.

일 실시양태에서, 샘플 내 단백질 발현은 면역조직화학 및 염색 프로토콜을 사용하여 검사할 수 있다. 조직 절편의 면역조직화학적 염색은 샘플 내 단백질 발현의 존재를 평가 또는 검출하는 신뢰할 만한 방법인 것으로 나타나 있다. 면역조직화학 ("IHC") 기술은, 일반적으로 발색 또는 형광 방법에 의해, 동일계 내에서 세포성 항원을 탐사하여 시각화하는 항체를 이용한다. 샘플 제조를 위해서는, 포유동물 (전형적으로는 인간 환자)로부터의 조직 또는 세포 샘플을 사용할 수 있다. 샘플의 예에는 암 세포, 예컨대 결장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 폐암, 위암, 췌장암, 림프종, 및 백혈병 암 세포가 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 샘플은 수술적 절제, 흡인 또는 생검이 포함되지만 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 다양한 절차에 의해 얻을 수 있다. 조직은 신선한 것이거나 냉동된 것일 수 있다. 일 실시양태에서는, 샘플을 고정시켜 파라핀 등에 포매시킨다. 조직 샘플은 통상의 방법론에 의해 고정 (즉, 보존)될 수 있다. 당업자라면 샘플을 조직학적으로 염색하거나 달리 분석하는 목적에 의해 고정액의 선택이 결정됨을 인지하고 있을 것이다. 당업자라면 또한 고정의 길이가 조직 샘플의 크기 및 사용된 고정액에 따라 달라짐을 인지하고 있을 것이다.

IHC는 형태학적 염색 및/또는 형광 동소 교잡법과 같은 추가 기술과 조합하여 수행될 수 있다. IHC의 2가지 일반적인 방법이 이용가능하다: 직접 검정법 및 간접 검정법. 첫 번째 검정법에 따르면, 표적 항원 (예를 들어, VEGF)에 대한 항체의 결합이 직접 측정된다. 이러한 직접 검정법은 추가의 항체 상호작용 없이 시각화될 수 있는 표지된 시약, 예컨대 항체 태그 또는 효소-표지된 1차 항체를 사용한다. 전형적인 간접 검정법에서는, 비-접합 1차 항체를 항원에 결합시킨 다음, 표지된 2차 항체를 1차 항체에 결합시킨다. 2차 항체를 효소 표지에 접합시킨 경우에는, 발색 또는 형광발생 기질을 첨가하여 항원의 시각화를 제공한다. 몇몇 2차 항체는 1차 항체 상의 상이한 에피토프와 반응할 수 있기 때문에 신호 증폭이 발생한다. 면역조직화학에 사용되는 1차 및/또는 2차 항체는 전형적으로는 검출가능한 모이어티로 표지될 것이다.

상기 논의된 샘플 제조 절차 외에, IHC 전, 동안 또는 후의 조직 절편 추가 처리가 바람직할 수 있다. 예를 들어, 조직 샘플을 시트레이트 완충액 중에서 가열하는 것과 같은 에피토프 복구 방법이 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Leong et al. Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996)] 참조).

임의적 차단 단계 후, 1차 항체가 조직 샘플 내 표적 단백질 항원에 결합하기 충분한 시간 및 적합한 조건하에 조직 절편을 1차 항체에 노출시킨다. 이를 달성하기에 적절한 조건은 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다. 샘플에 대한 항체의 결합 정도는 상기 논의된 검출가능 표지 중 어느 하나를 사용함으로써 측정된다. 바람직하게는, 표지는 3,3'-디아미노벤지딘 발색원과 같은 발색 기질의 화학적 변동에 촉매작용을 하는 효소 표지 (예를 들어, HRPO)이다. 바람직하게는, 효소 표지를 1차 항체에 특이적으로 결합하는 항체에 접합시킨다 (예를 들어, 1차 항체는 토끼 폴리클로날 항체이고 2차 항체는 염소 항-토끼 항체임).

이로써 제조된 피검물을 슬라이드에 올리고 커버슬립으로 덮을 수 있다. 이어서, 슬라이드 평가를, 예를 들어 현미경을 사용하여 측정하고, 당업계에서 일상적으로 사용되는 염색 강도 표준을 이용할 수 있다. 염색 강도 표준은 하기와 같이 평가될 수 있다:

염색 패턴	점수
세포에서 염색이 관찰되지 않음	0
세포의 10％ 초과에서 희미한/겨우 인지가능한 염색이 검출됨	1+
세포의 10％ 초과에서 약한 정도 내지 중간 정도의 염색이 검출됨	2+
세포의 10％ 초과에서 중간 정도 내지 강한 정도의 염색이 검출됨	3+

전형적으로는, IHC 검정법에서 약 2+ 이상의 염색 패턴 점수가 진단 및/또는 예후에 쓰인다. 일부 실시양태에서는, 약 1+ 이상의 염색 패턴 점수가 진단 및/또는 예후에 쓰인다. 다른 실시양태에서는, 약 3 이상의 염색 패턴 점수가 진단 및/또는 예후에 쓰인다. 종양 또는 결장 선종으로부터의 세포 및/또는 조직을 IHC를 사용하여 검사하는 경우, 염색은 일반적으로 (샘플에 존재할 수 있는 기질 조직 또는 주변 조직이 아니라) 종양 세포 및/또는 조직에서 측정 또는 평가되는 것으로 이해된다.

경쟁적 또는 샌드위치 검정법으로 알려져 있는 다른 검정 방법도 잘 확립되어 있으며, 상업적 진단 산업에서 널리 사용된다.

경쟁적 검정법은 제한된 수의 항-VEGF 항체 항원-결합 부위에 대해 시험 샘플 VEGF와 경쟁하는 추적자 VEGF 유사체의 능력에 의존한다. 항-VEGF 항체를 일반적으로는 경쟁 전 또는 후에 불용성화시킨 다음, 항-VEGF 항체에 결합된 추적자 및 VEGF를 결합되지 않은 추적자 및 VEGF로부터 분리한다. 이러한 분리는 경사분리 (결합 파트너를 사전에 불용성화시킨 경우) 또는 원심분리 (결합 파트너를 경쟁 반응 후에 침전시킨 경우)에 의해 달성된다. 시험 샘플 VEGF의 양은 마커 물질에 의해 측정된 바와 같은 결합된 추적자의 양에 역비례한다. 기지의 양의 VEGF에 대한 용량-반응 곡선을 제작하여 시험 결과와 비교함으로써 시험 샘플에 존재하는 VEGF의 양을 양적으로 측정한다. 상기 검정법은 효소를 검출가능한 마커로 사용하는 경우에 ELISA 시스템으로 지칭된다.

"동종" 검정법이라 불리는 또다른 종류의 경쟁적 검정법은 상 분리를 필요로 하지 않는다. 여기서는, 항-VEGF 항체가 VEGF에 결합하는 경우에 항-VEGF 항체의 존재가 효소 활성을 변형시키도록, VEGF와 효소의 접합체를 제조하여 사용한다. 이러한 경우, VEGF 또는 그의 면역학적으로 활성인 단편을 이관능성 유기 가교에 의해 퍼옥시다제와 같은 효소에 접합시킨다. 항-VEGF 항체의 결합이 표지의 효소 활성을 억제하거나 강화시키도록 항-VEGF 항체와 함께 사용하기 위한 접합체가 선택된다. 상기 방법 그 자체는 EMIT라는 명칭하에 널리 실시되고 있다.

동종 검정법을 위한 입체 장애 방법에서는 입체 접합체를 사용한다. 상기 접합체는, 합텐에 대한 항체가 실질적으로 항-VEGF 항체와 동시에 접합체에 결합할 수 없도록, 작은 VEGF 단편에 저분자량 합텐을 공유 결합시킴으로써 합성한다. 이 검정 절차하에서, 시험 샘플에 존재하는 VEGF는 항-VEGF 항체와 결합함으로써 항-합텐이 접합체에 결합하게 하여, 접합체 합텐의 특징 변화, 예를 들어 합텐이 형광단인 경우에는 형광의 변화를 일으킬 것이다.

샌드위치 검정법은 VEGF 또는 항-VEGF 항체의 측정에 유용하다. 순차적 샌드위치 검정법에서는, 고정된 항-VEGF 항체를 사용하여 시험 샘플 VEGF를 흡착하고, 세척에 의해 시험 샘플을 제거하고, 결합된 VEGF를 사용하여 제2의 표지된 항-VEGF 항체를 흡착한 다음, 결합된 물질을 잔류 추적자로부터 분리한다. 결합된 추적자의 양은 시험 샘플 VEGF에 직접적으로 비례한다. "동시" 샌드위치 검정법에서는, 표지된 항-VEGF를 첨가하기 전에 시험 샘플을 분리하지 않는다. 항-VEGF 모노클로날 항체를 하나의 항체로 사용하고, 폴리클로날 항-VEGF 항체를 다른 항체로 사용하는 순차적 샌드위치 검정이, VEGF에 대해 샘플을 시험하는 데 유용하다.

상기 내용은 단지 VEGF에 대한 예시적인 검출 검정법이다. VEGF의 측정을 위해 항-VEGF 항체를 사용하는 현재 또는 그 이후에 개발된 다른 방법도 본 발명의 범위 내에 포함된다.

진단 또는 검출에 대한 상기 실시양태 중 임의의 것은 항-VEGF 항체 대신 또는 이것 이외에 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.

제품

본 발명의 또다른 측면에서는, 상기 기술된 질병의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 제품은 용기 및 라벨, 또는 용기 위의 또는 용기와 결합된 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 용기는 각종 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는, 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 단독 또는 또다른 다른 조성물과 조합된 조성물을 보유하며, 멸균된 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 봉지 또는 바이알일 수 있음). 조성물 중 적어도 1종의 활성제는 본 발명의 항체 또는 면역접합체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택 병태를 치료하는 데 사용됨을 표시해준다. 또한, 제품은 (a) 본 발명의 항체 또는 면역접합체가 포함된 조성물을 함유하는 제1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제가 포함된 조성물을 함유하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시양태에서의 제품은, 조성물이 특정 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 표시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 제품은 제약상 허용가능한 완충제, 예컨대 주사용 정균수 (BWFI), 인산염-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 기타 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 비롯한, 상업적 측면 및 사용자 측면에서 바람직한 기타 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명의 실시양태를 단지 예시하고자 한 것이지 제한으로서 제공된 것은 아니다. 본원에서 언급된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 명확하게 전체로서 본원에 참고로 포함된다.

실시예

실시예 1

항-VEGF 항체의 생성 및 특성화

중쇄 및 경쇄의 상보성-결정 영역 (CDR) 내에 다양성을 도입함으로써 단일 프레임워크 (인간화 항-ErbB2 항체, 4D5) 상에 합성 파지 항체 라이브러리를 구축하였다 (문헌 [Lee, C. V. et al. J Mol Biol 340, 1073-93 (2004)]). 간단하게는, 중쇄 상보성-결정 영역 (CDR) 내 용매-노출 위치에 합성 다양성을 도입함으로써 단일 인간 프레임워크 상에 파지-디스플레이된 합성 항체 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리 성능을 개선하기 위해, 1가 및 2가 항원-결합 단편 (Fab) 라이브러리를 작제하고, 아미노산 조성물 및 CDR 길이를 다양하게 함으로써 상이한 CDR-H3 다양성을 탐색하였다. 이어서, CDR-H3 길이의 가변성을 증가시키고, 천연 CDR-H3 서열의 아미노산 조성을 모방하는 맞춤형 코돈을 사용함으로써, 라이브러리를 확장시켰다. 단일 스캐폴드 상에 디스플레이된 완전 합성 CDR을 갖는 이들 라이브러리를 사용하여, 고 친화도 항체를 생성시켰다. 단일 주형을 갖는 합성 항체 라이브러리를 생성하는 전략 및 방법의 추가 상세에 대해서는, 예를 들어, 전체 개시내용이 본원에 명확하게 참고로 포함되는, 2005년 2월 10일자로 공개된 WO　2005/012359를 참조한다.

나이브 라이브러리에 의한 용액상 패닝을 용액 중 비오티닐화된 뮤린 VEGF에 대해 수행한 다음, 막시소르프(MaxiSorp)™ 면역플레이트 상에 고정된 5 ㎍/ml 뉴트라비딘에 의해 포획시켰다. 비오티닐화된 뮤린 VEGF의 농도를 감소시켜 3회 선별한 후, 클론을 무작위로 추출하고, 파지 ELISA를 사용하여 특이적 결합제를 확인하였다. 각각의 양성 파지 클론에 대해, 전장 IgG 쇄를 발현하도록 조작시킨 pRK 발현 벡터로 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 서브클로닝하였다. 중쇄 및 경쇄 작제물을 293 또는 CHO 세포로 공동-형질감염시키고, 발현된 항체를 단백질 A 친화도 칼럼을 사용하여 무-혈청 배지로부터 정제하였다. 친화도 성숙을 위해, 관심의 대상이 되는 초기 클론으로부터 유래한 CDR 루프 (CDR-H1 및 H2, CDR-L1, L2 및 L3)의 상이한 조합을 갖는 파지 라이브러리를, 각각의 선택된 위치가 약 50:50 빈도로 비-야생형 잔기로 돌연변이화되거나 야생형으로 유지되도록 하는 유연한 무작위화 전략에 의해 작제하였다 (문헌 [Lee, C. V et al., Blood, 108:3103-3111, 2006]). 이어서, 기술한 바와 같은 비오티닐화된 인간 VEGF에 대한 4회의 용액상 패닝을 통해 고 친화도 클론을 확인하였다. 비오티닐화된 항원 농도의 감소는 보다 엄격한 패닝을 허용하였다.

실시예 2

항-VEGF 항체 결합 친화도

항-VEGF IgG의 결합 친화도를 측정하기 위해, 비아코어(BIAcore)™-3000 장비에 의한 표면 플라스몬 공명 (SRP) 측정법을 사용하였다. 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어 인크.)을 공급자의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시켰다. 인간 또는 뮤린 VEGF를 고정시켜 대략 60 반응 단위 (RU)의 커플링된 단백질을 획득하였다. 도 10을 참조한다. 역학 측정을 위해, 항-VEGF IgG의 2배 계열 희석물 (7.8 nM 내지 500 nM)을 37℃에서 25 ㎕/분의 유속으로 PBT 완충액 (0.05％ (v/v) 트윈 20을 포함하는 PBS)에 별도로 주입하였다. 2가 결합 모델 (비아코어 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 회합률 (k_on) 및 해리율 (k_off)을 계산하였다. 평형 해리 상수 (K_D)를 k_off/k_on 비율로 계산하였다.

B20.4.1의 측정 불가능한 해리율에 기인하여, IgG를 고정시켜 대략 1000 반응 단위 (RU)의 커플링된 단백질을 획득하였다. 도 11을 참조한다. 인간 또는 뮤린 VEGF의 2배 계열 희석물 (7.8 nM 내지 500 nM)을 37℃에서 25 ㎕/분의 유속으로 PBT 완충액 (0.05％ (v/v) 트윈 20을 포함하는 PBS)에 주입하였다. 간단한 일대일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 회합률 (k_on) 및 해리율 (k_off)를 계산함으로써, 평형 해리 상수 (K_D)를 얻었다.

실시예 3

HUVEC 티미딘 혼입 검정

VEGF-유도 세포 증식을 억제하는 항-VEGF 항체의 기능을 연구하기 위해, HUVEC 티미딘 혼입 검정을 수행하였다. 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC) (미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 클론테크(Clontech))를 기술된 바와 같이 성장시켜 검정하였다. 대략 3000개의 HUVEC를 96-웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 플레이팅하고 1.5％ (v/v) 우태 혈청을 보충한 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)/F12 배지 (검정 배지)에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 고정된 양의 인간 VEGF (0.1 nM 최종 농도)를 포함하는 신선한 검정 배지를, 먼저 최대하 DNA 합성을 자극할 수 있는 VEGF를 적정함으로써 측정한 다음, 증가시킨 농도의 항-VEGF IgG를 세포에 첨가하였다. 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션한 후, 0.5 μCi/웰의 [³H] 티미딘으로 세포에 24시간 동안 펄스를 발생시키고, 세포를 수거하여 기술된 바와 같은 탑카운트 마이크로플레이트 신틸레이션(TopCount Microplate Scintillation) 계수기로 계수하였다.

HUVEC 티미딘 혼입 검정은 B20 변이체가 HUVEC 세포 증식을 유효하게 억제할 수 있음을 나타낸다. 도 12는 B20-4.1.1 및 B20-4.1.1RR이 G6-31과 유사한 억제율을 가짐을 나타낸다.

실시예 4

내피 세포 증식 검정

B20-4.1.1의 결합 특이성 및 차단 활성을 측정하기 위해, 소 망막 미세혈관 내피 세포 (BRME)를 사용하여 세포-기반 검정을 수행하였는데, 여기서는 인간 또는 뮤린 VEGF-유도 세포 증식을 차단하는 항체의 능력에 대해 시험하였다. BRME를 성장 배지 (10％ 송아지 혈청, 2 mM 글루타민, 및 항생물질로 보충한 저-글루코스 DMEM) 중 96-웰 플레이트에 500개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 억제율 검정을 위해, B20-4.1.1을 3벌의 웰에 지시된 농도 (ng/ml)로 첨가하였다 (도 13). 0.5시간 후, 인간 VEGF-A (hVEGF) 또는 마우스 VEGF-A (mVEGF)를 6 ng/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 6 내지 7일 후, 알라마 블루 (바이오소스(BioSource); 인비트로젠(Invitrogen))로 세포 성장을 측정하였다. 530 nm 여기 파장 및 590 nm 방출 파장에서 형광을 모니터링하였다.

도 13에 나타낸 바와 같이, B20-4.1.1은 BRME 증식을 촉진하는 hVEGF 및 mVEGF 둘 다의 능력을 감소시켰다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 아바스틴 항체는 BRME 증식을 촉진하는 hVEGF의 능력을 감소시켰다. 1500 nM까지의 아바스틴 항체 농도에서 mVEGF의 억제가 관찰되지 않았기 때문에, 아바스틴 항체는 mVEGF-유도 증식을 억제하지 않았다.

실시예 5

생체내 종양 억제 연구

A549 세포 (인간 폐암 세포) 및 MDA-MB231 세포 (인간 유방암 세포)를 세포 배양 배지 중에서 성장시켜, 8 내지 12주령의 베이지 누드 마우스에 약 5 x 10⁶개 세포/마우스의 세포 밀도로 피하 주사하였다. 종양 세포 접종 48시간 후 또는 종양이 대략 200 ㎣ 크기에 도달했을 때, 마우스 (n=10)에 5 mg/kg 농도의 B20-4.1.1 또는 비히클 완충액을 복강내 주사하였다. 그 후, 항체를 주당 2회 투여하였다. 지정된 시점에 캘리퍼스로 종양 부피를 측정하였다.

도 14 및 15에 나타낸 바와 같이, B20-4.1.1은 A549 세포 (도 14) 또는 MDA-MB231 세포 (도 15)를 주사한 마우스에서 종양 부피를 감소시키는 데 유효하였다.

상기 기재에서 본 발명을 특정 실시양태를 참조로 하여 예시하였지만, 본 발명이 이로써 제한되는 것은 아니다. 오히려, 본원에 나타내고 기재한 것들 이외에 본 발명의 다양한 변형이 당업자에게는 상기 기재로부터 명백할 것이며, 이러한 것들도 첨부된 특허청구범위에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc. Fuh, Germaine Lee, Chingwei V. <120> Anti-VEGF Antibodies <130> 50474/021WO2 <150> 60/991,302 <151> 2007-11-30 <160> 45 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 1 Ser Ile Ser Gly Ser Trp Ile Phe 5 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 2 Gly Ala Ile Trp Pro Phe Gly Gly Tyr Thr His 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 3 Arg Trp Gly His Ser Thr Ser Pro Trp Ala Met Asp Tyr 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 4 Gly Val Arg Thr Ser Leu 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 5 Ala Ile Arg Arg Ser Leu 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 6 Asp Ala Ser Ser Leu Ala 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is 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Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg

Claims (1)

1. (i) 아미노산 서열 X₁X₂RX₃SL을 포함하는 HVR-L1 (이때 HVR-L1은 다음의 위치에서 임의의 조합으로 1, 2 또는 3개의 치환을 포함한다: X₁은 G 또는 A; X₂는 V 또는 I; 및/또는 X₃은 T 또는 R);
   (ii) 아미노산 서열 DASSLA (서열 6)를 포함하는 HVR-L2;
   (iii) 아미노산 서열 SYKSPL (서열 7)을 포함하는 HVR-L3;
   (iv) 아미노산 서열 SISGSWIF (서열 1)를 포함하는 HVR-H1;
   (v) 아미노산 서열 GAIWPFGGYTH (서열 2)를 포함하는 HVR-H2; 및
   (vi) 아미노산 서열 RWGHSTSPWAMDY (서열 3)를 포함하는 HVR-H3
   으로부터 선택된 6개의 HVR을 포함하는 단리된 항-혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 항체의 유효량을 종양, 암, 또는 세포 증식성 질병의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 그에 의해 상기 종양, 암, 또는 세포 증식성 질병이 치료되는 것인, 종양, 암, 또는 세포 증식성 질병의 치료 방법.

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