CN101918442A - 抗vegf抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了分离的与VEGF结合的抗体。本发明还提供了制备抗VEGF抗体和编码抗VEGF抗体的多核苷酸的方法。

Description

抗VEGF抗体
发明领域
本发明一般涉及抗VEGF选择的多肽序列和具有用于研究、治疗和诊断目的的有益特性的抗体。
发明背景
血管系统的发育对于许多生理和病理过程是基础要求。诸如胚胎和肿瘤的活跃生长组织要求充分的血液供应。它们通过产生促血管生成因子来满足这种需求，该促血管生成因子通过称为血管生成的过程促进新血管形成。血管形成是复杂但有序的生物事件，其包括全部或许多下述步骤：a)内皮细胞(EC)从现有的EC增殖或从祖细胞分化；b)EC迁移并聚结以形成索样结构；c)血管索(vascular cord)然后进行小管形成(tubulogenesis)以形成具有中心管腔的血管；d)现有的血管索或血管发出芽，形成次级血管；e)原始血管丛进行进一步的重塑和改造(reshape)；以及f)募集周边内皮细胞以包装内皮管，从而为血管提供维持和调节功能，这类细胞包括小毛细血管的外膜细胞、较大血管的平滑肌细胞以及心脏中的心肌细胞。Hanahan，D.Science 277：48-50(1997)；Hogan，B.L.&Kolodziej，P.A.Nature Reviews Genetics.3：513-23(2002)；Lubarsky，B.&Krasnow，M.A.Cell.112：19-28(2003)。
已完全确定的是，血管生成涉及各种病症的发病机理。这些病症包括实体瘤和肿瘤转移；动脉粥样硬化；晶状体后纤维组织形成；血管瘤；慢性炎症；诸如增殖性视网膜病变的眼内新血管疾病，如糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性(AMD)、新血管性青光眼、移植的角膜组织和其他组织的免疫排斥；风湿性关节炎以及银屑病。Folkman et al.，J.Biol.Chem.，267：10931-10934(1992)；Klagsbrun et al.，Annu.Rev.Physiol.53：217-239(1991)；和Garner A.，Pathobiology of Ocular Disease.ADynamic Approach(眼病的病理学.动态方法)中的“Vascular diseases(血管疾病)，”，Garner A.，Klintworth GK，eds.，2nd Edition(Marcel Dekker，NY，1994)，pp 1625-1710。
在肿瘤生长的情况下，血管生成看起来对于从增生到瘤形成的转变是关键的，并且对于为肿瘤的生长和转移提供营养是关键的。Folkman etal.，Nature 339：58(1989)。与正常细胞相比，新血管形成允许肿瘤细胞获得生长优势和增殖自主性。肿瘤通常以异常的细胞开始，该异常的细胞其由于距离可用的毛细血管床的距离而仅增殖成几个立方毫米的大小，并且肿瘤可以保持长时间段的“休眠”而不进一步生长和扩散。某些肿瘤随后转变成血管表型以激活内皮细胞，其增殖并成熟为新的毛细血管。这些新形成的血管不仅允许原发肿瘤的连续生长，还允许转移性肿瘤细胞的扩散和再建群(recolonization)。因此，在肿瘤切片的微血管密度与幸免于乳腺癌及几种其他肿瘤的患者之间观察到了相关性。Weidner et al.，N.Engl.J.Med 324：1-6(1991)；Horak et al.，Lancet 340：1120-1124(1992)；Macchiarini et al.，Lancet 340：145-146(1992)。尚未理解控制血管生成转变的精确机制，但是认为肿瘤块的新血管形成是由许多血管生成刺激物与抑制剂的净差额(net balance)导致的。(Folkman，Nat Med 1(1)：27-31(1995))。
血管发育过程受到严紧调节。迄今为止，相当数目的分子，大部分是由周围细胞所产生的分泌因子，已经证实调节EC分化、增殖、迁移和聚结成索样结构。例如，血管内皮生长因子(VEGF)已经被鉴定为与刺激血管生成和诱导血管通透性有关的关键因子。Ferrara et al.，Endocr.Rev.18：4-25(1997)。甚至一个VEGF等位基因的损失导致胚胎致死的发现表明这种因子在血管系统的发育和分化中所起到的不可替代的作用。而且，已经证实，VEGF是与肿瘤和眼内病症有关的新血管形成的关键介质(mediator)。Ferrara et al.，Endocr.Rev.见上文。检查的大部分人肿瘤过量表达VEGF mRNA。Berkman et al.，J.Clin.Invest.91：153-159(1993)；Brown et al.，Human Pathol.26：86-91(1995)；Brown et al.，Cancer Res.53：4727-4735(1993)；Mattern et al.，Brit.J.Cancer 73：931-934(1996)；Dvorak et al.，Am.J.Pathol.146：1029-1039(1995)。
此外，眼睛液体中VEGF的浓度水平与患有糖尿病和其它缺血相关视网膜病变的患者中血管的活性增殖的存在高度相关。Aiello et al.，N.Engl.J.Med.331：1480-1487(1994)。而且，研究已经证明了VEGF在受AMD影响的患者的脉络膜新血管膜中的定位。Lopez et al.，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.37：855-868(1996)。
抗VEGF中和抗体在裸小鼠中抑制各种人肿瘤细胞系的生长(Kim etal.，Nature 362：841-844(1993)；Warren et al.，J.Clin.Invest.95：1789-1797(1995)；et al.，Cancer Res.56：4032-4039(1996)；Melnyk et al.，Cancer Res.56：921-924(1996))，还在缺血性视网膜病症模型中抑制眼内血管生成。Adamis et al.，Arch.Ophthalmol.114：66-71(1996)。因此，抗VEGF单克隆抗体或VEGF作用的其他抑制剂对于治疗肿瘤和各种眼内新血管病症是有希望的候选物。这类抗体描述于，例如，1998年1月14日公开的EP 817,648中；和1998年10月15日公开的WO98/45331和WO98/45332中。这类抗体中的一种，贝伐单抗(bevacizumab)已经获得FDA批准，与化疗方案联合使用，治疗转移性结肠直肠癌(CRC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。并且许多进行的临床试验正在研究贝伐单抗对各种癌症适应症的治疗。
其他抗VEGF抗体、抗Nrp1抗体和抗Nrp2抗体也是已知的，并且描述于，例如Liang et al.，J Mol Biol 366，815-829(2007)和Liang et al.，JBiol Chem 281，951-961(2006)，PCT公开WO2007/056470号和PCT申请PCT/US2007/069179号中，这些专利申请的内容通过引用明确地并入本文中。
发明概述
本发明提供了新的抗VEGF抗体及其用途。
本发明提供了许多抗VEGF抗体。例如，提供了与VEGF结合的抗体或其片段，其中所述抗体包含6种选自以下的HVR：
(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列X1X2RX3SL，其中HVR-L1包含下述位置的任何组合中的1、2或3种取代：X1为G或A；X2为V或I；和/或X3为T或R；
(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列DASSLA(SEQ ID NO：6)；
(iii)HVR-L3，其包含氨基酸序列SYKSPL(SEQ ID NO：7)；
(iv)HVR-H1，其包含氨基酸序列SISGSWIF(SEQ ID NO：1)；
(v)HVR-H2，其包含氨基酸序列GAIWPFGGYTH(SEQ ID NO：2)；以及
(vi)HVR-H3，其包含氨基酸序列RWGHSTSPWAMDY(SEQ IDNO：3)。
在另一实施方案中，提供了与VEGF结合的抗体或其片段，其中，该抗体包含：
(1)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；
(2)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(3)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；
(4)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
(5)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；以及
(6)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
在另一实施方案中，提供了与VEGF结合的抗体或其片段，其中，该抗体包含：
(1)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；
(2)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(3)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；
(4)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；
(5)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；以及
(6)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
在另一实施方案中，本发明提供了与VEGF结合的抗体或其片段，其中轻链可变域包含SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45的氨基酸序列。
在另一实施方案中，本发明提供了与VEGF结合的抗体或其片段，其中该抗VEGF抗体包含重链可变域(variable domain)和轻链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列，该轻链可变域包含SEQ IDNO：44或45的氨基酸序列。仍然在另一实施方案中，抗VEGF抗体包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列，该轻链可变域包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列。仍然在另一实施方案中，抗VEGF抗体包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列，该轻链可变域包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列。
在某些实施方案中，任何上述的抗体都是单克隆抗体。在一实施方案中，抗体是选自Fab、Fab’-SH、Fv、scFv或(Fab’)2片段的抗体片段。在一实施方案中，抗体是人源化的。在一实施方案中，抗体是人抗体。仍然在另一实施方案中，至少一部分框架序列是人共有框架序列(consensus framework sequence)。
本发明提供了编码任何上述抗体的多核苷酸以及包含该核苷酸的载体和包含本发明的载体的宿主细胞。在一实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在另一实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。还提供了制备抗VEGF抗体的方法。例如，方法包括在适合表达编码抗体的多核苷酸的条件下培养宿主细胞和分离抗体。
一方面，本发明提供了检测生物样品中VEGF存在的方法，该方法包括使生物样品与本发明的抗体在允许抗体与VEGF结合的条件下接触，并检测在抗体与VEGF之间是否形成复合物。在一实施方案中，方法包括检测生物样品中的VEGF-抗VEGF抗体复合物，其中该抗VEGF抗体的氨基酸序列包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含SEQ IDNO：43的氨基酸序列，该轻链可变域包含SEQ ID NO：44或45的氨基酸序列。仍然在另一实施方案中，方法包括检测生物样品中的VEGF-抗VEGF抗体复合物，其中该抗VEGF抗体的氨基酸序列包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列，该轻链可变域包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列。仍然在另一实施方案中，方法包括检测生物样品中的VEGF-抗VEGF抗体复合物，其中该抗VEGF抗体的氨基酸序列包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含SEQID NO：43的氨基酸序列，该轻链可变域包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列。仍然在另一实施方案中，可检测地标记了抗VEGF抗体。
本发明还提供了药物组合物及治疗方法。一方面，本发明提供了包含本发明的抗体和药物可接受的媒介物(carrier)的药物组合物。另一方面，本发明提供了治疗癌症的方法，例如，该方法包括向个体给予包含任何上述抗体的药物组合物。本发明的方法所治疗的癌症包括但不限于鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜的癌症、肝细胞癌、胃癌、胃肠癌、胃肠基质癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾癌(kidney or renalcancer)、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头和颈癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端雀斑样痣性黑素瘤、结节性黑素瘤、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、多毛细胞白血病、慢性粒细胞白血病(chronic myeloblastic leukemia)、移植后淋巴组织增生病症(PTLD)、与斑痣性错构瘤病(phakomatoses)有关的异常血管增殖、与脑瘤有关的水肿或梅格斯综合征(Meigs’syndrome)。在某些实施方案中，被治疗的肿瘤、癌症或细胞增殖性病症是结肠癌、肺癌、乳腺癌或成胶质细胞瘤。仍然在另一实施方式中，被治疗的个体是人。
本发明还提供包含与诸如药物或细胞毒性剂的试剂偶联的抗体的免疫偶联物。
附图简述
图1：抗VEGF抗体的重链和轻链HVR环式序列。该图表示重链HVR序列H1、H2和H3以及轻链HVR序列L1、L2和L3。序列编号如下：克隆B20-4.1.1(HVR-H1为SEQ ID NO：1；HVR-H2为SEQ ID NO：2；HVR-H3为SEQ ID NO：3；HVR-L1为SEQ ID NO：4；HVR-L2为SEQ IDNO：6；HVR-L3为SEQ ID NO：7)；和克隆B20-4.1.1RR(HVR-H1为SEQID NO：1；HVR-H2为SEQ ID NO：2；HVR-H3为SEQ ID NO：3；HVR-L1为SEQ ID NO：5；HVR-L2为SEQ ID NO：6；HVR-L3为SEQ ID NO：7)。
氨基酸位置根据下文所述的Kabat编号系统进行编号。
图2a和2b：描述具有下述序列标志的用于实施本发明的示例性接受体(acceptor)人共有框架序列：
可变重(VH)共有框架
除去Kabat CDR的人VH亚组I共有框架(SEQ ID NO：8)
除去延伸的高变区的人VH亚组I共有框架(SEQ ID NOs：9-11)
除去Kabat CDR的人VH亚组II共有框架(SEQ ID NO：12)
除去延伸的高变区的人VH亚组II共有框架(SEQ ID NOs：13-15)
除去无Kabat CDR的延伸人VH亚组III共有框架的人VH亚组II共有框架(SEQ ID NO：16)
除去延伸的高变区的人VH亚组III共有框架(SEQ ID NOs：17-19)
除去Kabat CDR的人VH接受体框架(SEQ ID NO：20)
除去延伸的高变区的人VH接受体框架(SEQ ID NOs：21-22)
除去Kabat CDR的人VH接受体2框架(SEQ ID NO：23)
除去延伸的高变区的人VH接受体2框架(SEQ ID NOs：24-26)
氨基酸位置根据下文所述的Kabat编号系统进行编号。
图3：描述具有下述序列标志的用于实施本发明的示例性接受体人共有框架序列：
可变轻(VL)共有框架
人VLκ亚组I共有框架(SEQ ID NO：27)
人VLκ亚组II共有框架(SEQ ID NO：28)
人VLκ亚组III共有框架(SEQ ID NO：29)
人VLκ亚组IV共有框架(SEQ ID NO：30)
图4：描述huMAb4D5-8重链和轻链的框架区序列。上标/粗体的数字表示根据Kabat的氨基酸位置。
图5：描述huMAb4D5-8重链和轻链的修饰的/变异的框架区序列。上标/粗体的数字表示根据Kabat的氨基酸位置。
图6：抗VEGF抗体B20-4.1.1和B20-4.1.1RR的轻链HVR序列L1、L2和L3的氨基酸序列。
图7：抗VEGF抗体B20-4.1.1和B20-4.1.1RR的重链HVR序列H1、H2和H3的氨基酸序列。
图8：描述抗体克隆B20-4.1.1(SEQ ID NO：44)和B20-4.1.1RR(SEQID NO：45)的轻链可变区。
图9：描述抗体克隆B20-4.1.1和B20-4.1.1RR的重链可变区(SEQ IDNO：43)。
图10：总结B20变体IgG对人VEGF和鼠VEGF的动力学结合亲和力测量的表格。将人或鼠VEGF固定以实现约60个应答单位。
图11：总结B20变体IgG对人VEGF和鼠VEGF的动力学结合亲和力测量的表格。将人或鼠VEGF固定以实现约1000个应答单位。
图12：HUVEC胸苷吸收测定，其表明B20变体可以有效地抑制HUVEC细胞增殖。
图13：描述B20-4.1.1对VEGF诱导的BRME增殖的影响。
图14：描述如通过根据治疗天数的肿瘤体积所测量的，B20-4.1.1对异种移植了人肿瘤细胞(A549细胞)的裸小鼠中肿瘤生长的影响。
图15：描述如通过根据治疗天数的肿瘤体积所测量的，B20-4.1.1对异种移植了人肿瘤细胞(MDA-MB231细胞)的裸小鼠中肿瘤生长的影响。
图16：描述阿瓦斯丁抗体(avastin antibody)对VEGF诱导的BRME增殖的影响。在高达1500nM的阿瓦斯丁抗体浓度下，没有观察到mVEGF的抑制。
发明详述
本发明提供了分离的与VEGF结合的抗体及其用途。本发明还提供了药物组合物及治疗方法。
本发明还提供制备抗VEGF抗体和编码抗VEGF抗体的多核苷酸的方法。
一般技术
本文所述和所引用的技术和方法通常是本领域技术人员熟知的，并且通常由本领域技术人员利用常规方法实施，例如，在下述文献中描述的广泛使用的方法：Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual 3rd.Edition(分子克隆：实验室手册)(2001)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(分子生物学最新方法)(F.M.Ausubel，et al.eds.，(2003))；the series METHODS IN ENZYMOLOGY(酶学方法系列)(Academic Press，Inc.)：PCR 2：A PRACTICAL APPROACH(PCR 2：实用方法)(M.J.MacPherson，B.D.Hames and G.R.Taylor eds.(1995))，Harlow and Lane，eds.(1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，and ANIMAL CELL CULTURE(抗体，实验室手册和动物细胞培养)(R.I.Freshney，ed.(1987))；Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)(M.J.Gait，ed.，1984)；Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)，Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(细胞生物学：实验室手册)(J.E.Cellis，ed.，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(动物细胞培养)(R.I.Freshney)，ed.，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(细胞和组织培养介绍)(J.P.Mather and P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell and TissueCulture：Laboratory Procedures(细胞和组织培养：实验方法)(A.Doyle，J.B.Griffiths，and D.G.Newell，eds.，1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook ofExperimental Immunology(实验免疫学手册)(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(哺乳动物细胞基因转移载体)(J.M.Miller and M.P.Calos，eds.，1987)；PCR：ThePolymerase Chain Reaction(PCR：聚合酶链式反应)，(Mullis et al.，eds.，1994)；Current Protocols in Immunology(最新免疫学方法)(J.E.Coligan etal.，eds.，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(分子生物学简单方法)(Wiley and Sons，1999)；Immunobiology(免疫学)(C.A.Janeway and P.Travers，1997)；Antibodies(抗体)(P.Finch，1997)；Antibodies：A PracticalApproach(抗体：实用方法)(D.Catty.，ed.，IRL Press，1988-1989)；Monoclonal Antibodies：A Practical Approach(单克隆抗体：实用方法)(P.Shepherd and C.Dean，eds.，Oxford University Press，2000)；UsingAntibodies：A Laboratory Manual(抗体的使用：实验室手册)(E.Harlowand D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；The Antibodies(抗体)(M.Zanetti and J.D.Capra，eds.，Harwood Academic Publishers，1995)；以及Cancer：Principles and Practice of Oncology(癌症：肿瘤学原理和实践)(V.T.DeVita et al.，eds.，J.B.Lippincott Company，1993)。
定义
为解释本说明书的目的，将使用下述定义，并且合适时，以单数使用的术语也包括复数形式，反之亦然。在下文所列的定义与通过引用并入本文的任何文档冲突的情况下，以下文所列的定义为准。
术语“抗体”以最广泛的含义使用，并特别地包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及抗体片段，只要它们表现出期望的生物活性。
本文所用的术语“单克隆抗体”意指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即包含个体抗体的群体是相同的，除了可能的突变，例如可以少量存在的天然存在的突变。因此，修饰词“单克隆”表示抗体的特征并不是离散抗体的混合物。在某些实施方案中，这类单克隆抗体通常包括含有与靶标结合的多肽序列的抗体，其中靶标结合多肽序列通过包括从多个多肽序列选择单个靶标结合多肽序列的方法来获得。例如，选择方法可以是从从多个克隆选择特定的克隆，例如杂交瘤克隆池(pool)、噬菌体克隆池或重组DNA克隆池。应当理解，可以进一步改变所选的靶标结合序列，例如，改进对靶标的亲和力、将靶标结合序列人源化、改进其在细胞培养中的产生、减少其体内免疫原性、产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。相对于通常包含抗不同决定簇(表位)的抗体的多克隆抗体制剂，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体都针对抗原上的一个决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体制剂的优势在于，它们通常不被其它免疫球蛋白所污染。
修饰词“单克隆”表明了从基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，并且不应理解为要求通过任何特定方法来制备抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可以根据各种技术来制备，其包括，例如杂交瘤方法(例如，Kohler and Milstein，Nature，256：495-97(1975)；Hongo et al.，Hybridoma，14(3)：253-260(1995)，Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)；Hammerling et al.，in：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridoma(单克隆抗体与T细胞杂交瘤)563-681(Elsevier，N.Y.，1981))；重组DNA方法(参见，例如美国专利4,816,567号)；噬菌体展示技术(参见，例如Clacksonet al.，Nature，352：624-628(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Sidhu et al.，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee et al.，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；和Lee et al.，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)；以及在具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中制备人或人样抗体的技术(参见，例如WO1998/24893、WO 1996/34096、WO 1996/33735、WO 1991/10741；Jakobovitset al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature362：255-258(1993)；Bruggemann et al.，Year in Immunol.7：33(1993)；美国专利5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425以及5,661,016号；Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-813(1994)；Fishwild et al.，Nature Biotechnol.14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnol.14：826(1996)；以及Lonberg and Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。
本文的单克隆抗体特别地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或者属于特定抗体集合或子集的抗体的对应序列相同或者同源，而链的剩余部分与源自另一物种或者属于另一抗体集合或子集的抗体的对应序列相同或同源，只要它们表现出期望的生物活性(参见，例如美国专利4,816,567号和Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。嵌合抗体包括PRIMATIZED
Figure GPA00001142297500111
抗体，其中抗体的抗原结合区源自通过例如用目的抗原免疫恒河猴(rhesus)所产生的抗体。
非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一实施方案中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体HVR的残基被非人物种(供体抗体)的HVR的残基取代，该非人物种例如具有期望的特异性、亲和力和/或能力(capacity)的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类。在某些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基取代。而且，人源化抗体可以包含未在受体抗体或供体抗体中发现的残基。可以进行这些修饰以进一步完善抗体性能。通常，人源化抗体基本上包含至少一个、通常两个可变域的全部，其中全部或基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体还任选地包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区。更多的细节，参见，例如Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature332：323-329(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。还参见，例如Vaswani and Hamilton，Ann.Allergy，Asthma & Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；Hurle and Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)；以及美国专利6,982,321号和7,087,409号。
“人抗体”是具有氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列对应于由人产生和/或利用如本文所公开的用于制备人抗体的任何技术产生的抗体的氨基酸序列。人抗体的这个定义特别地排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可以利用本领域已知的包括噬菌体展示文库在内的各种技术来制备。Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Markset al.，J.Mol.Biol.，222：581(1991)。制备人单克隆抗体其他可用的方法是Cole et al.，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体与癌症治疗)，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner et al.，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)中所述的方法。还参见，van Dijk and van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.，5：368-74(2001)。人抗体可以通过向诸如免疫的异种小鼠(xenomice)的转基因动物给予抗原来制备，该转基因动物已经被修饰为对抗原激发(antigenic challenge)应答而产生这类抗体，但是该转基因动物的内源基因组已经丧失能力。(参见，例如，关于XENOMOUSETM技术的美国专利6,075,181号和6,150,584号)。关于通过人B细胞杂交瘤技术所产生的人抗体，还参见，例如，Li et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)。
“物种依赖性抗体”是对来自第一哺乳动物物种的抗原比对来自第二哺乳动物物种的该抗原的同源物具有更强的结合亲和力的抗体。通常，物种依赖性抗体“特异地结合”于人抗原(即，结合亲和力(Kd)值不大于约1×10-7M，优选不大于约1×10-8M，并且最优选不大于约1×10-9M)，但是其对来自第二非人哺乳动物物种的抗原的同源物的结合亲和力比其对人抗原的结合亲和力至少弱约50倍，或者至少弱约500倍，或者至少弱约1000倍。物种依赖性抗体可以是如上文所定义的任何类型的抗体，但是优选为人源化抗体或人抗体。
如本文所用的，“抗体突变体”或“抗体变异”意指物种依赖性抗体的氨基酸序列变体，其中该物种依赖性抗体的一个或多个氨基酸残基已经被修饰了。这类突变体与物种依赖性抗体的序列同一性或相似性必须小于100％。在一实施方案中，抗体突变体的氨基酸序列与物种依赖性抗体的重链可变域或轻链可变域的氨基酸序列具有至少75％的氨基酸序列同一性或相似性，在另一实施方案中为至少80％，在另一实施方案中为至少90％，仍然在另一实施方案中为至少95％。与这中序列的同一性或相似性在本文中定义为，比对了序列并且，若需要，引入缺口，以实现最大序列同一性百分比后，候选序列中与物种依赖性抗体的残基相同(即，相同的残基)或相似(即，基于共同侧链属性的相同基团的氨基酸残基，参见下文)的氨基酸残基的百分比。抗体序列可变域以外的N-末端、C-末端或内部延伸(internal extension)、缺失或插入不应理解为影响序列同一性或相似性。
“分离的”抗体是从其天然环境的组分鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是会干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其他蛋白或非蛋白溶质。在一些实施方案中，将抗体(1)纯化至如通过，例如劳里(Lowry)方法所确定的，按重量计大于抗体的95％，并且在一些实施方案中，将抗体纯化至按重量计大于99％；(2)纯化至使用例如，旋杯式测序仪足以获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或者(3)纯化至通过利用例如考马斯蓝染色或银染色的还原或非还原条件的SDS-PAGE的同质性。由于抗体的天然环境的至少一种组分不会存在，所以分离的抗体包括重组细胞中的原位抗体。然而，分离的抗体通常通过至少一个纯化步骤来制备。
“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，尽管二硫键连接的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链中变化。每条重链和轻链还具有规律间隔的链内二硫键。每条重链在一个末端具有跟随了许多恒定域的可变域(VH)。每条轻链在一个末端具有可变域(VL)，在其另一末端具有恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐，轻链可变域与重链可变域对齐。特定的氨基酸残基被认为在轻链可变域与重链可变域之间形成界面。
抗体的“可变区”或“可变域”意指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变域可称为“VH”。轻链的可变域可称为“VL”。这些结构域通常是抗体最可变的部分，并且含有抗原结合位点。
术语“可变”意指以下事实，即可变域的某些部分在抗体的序列中广泛地变化，并且用于每种特定的抗体对其特定的抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布于抗体的全部可变域中。其集中在轻链可变域和重链可变域中的称为高变区(HVR)的三个节段中。可变域更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和天然轻链的可变域各自包含4个FR区，其主要采取β-折叠构型，由3个HVR连接，该HVR形成环式连接，并且在某些情况下形成部分β-折叠结构。每条链上的HVR通过FR区紧密地结合在一起，并且与其他链上的HVR一起促进抗体的抗原结合位点的形成(参见，Kabat et al.，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，Fifth Edition(免疫学所关注的蛋白的序列，第5版)，NationalInstitute of Health，Bethesda，MD(1991))。恒定域并不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以分为称为κ(kappa)和λ(lambda)的两种截然不同的类型中的一种，基于它们恒定域的氨基酸序列。
抗体(免疫球蛋白)根据它们重链恒定域的氨基酸序列可以分为不同的种类。有5种主要种类的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM；并且这些免疫球蛋白中的几种还可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同种类的免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是已知的，并且描述于，例如Abbas et al.，Cellular and Mol.Immunology，4th ed.(W.B.Saunders，Co.，2000)。抗体可以是更大的融合分子的一部分，该融合分子通过抗体与一种或多种其他蛋白或肽的共价或非共价结合形成。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中互换地使用，并意指基本上处于完整形式的抗体，而不意指下文所定义的抗体片段。该术语特别地意指具有含有Fc区的重链的抗体。
“裸抗体”在本文中的目的是指没有与细胞毒性部分或放射性标记偶联的抗体。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选地包括其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体(linear antibody)；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生称为“Fab”片段的两个相同的抗体结合片段和残留的“Fc”片段，每个Fab片段都具有一个抗原结合位点，Fc片段的名字反映其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原的F(ab’)2片段。
“Fv”是含有完整的抗原结合位点的最小抗体片段。在一实施方案中，双链Fv分子由二聚体组成，该二聚体是紧密非共价联系形式的一个重链可变域和一个轻链可变域。在单链Fv(scFv)分子中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽连接物共价连接，从而该轻链和重链能够以类似于双链Fv分子中结构的“二聚体”结构结合。正是在这种构型中，每个可变域的三个HVR相互作用来限定VH-VL二聚体表面的抗原结合位点。6个HVR共同地赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至一个可变域(或仅包含3个对抗原特异性的HVR的Fv的一半)能够识别并结合抗原，尽管亲和力比完整的结合位点要低。
Fab片段含有重链可变域和轻链可变域，而且还含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同在于，在重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基，其包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab’-SH在本文中表示恒定域的半胱氨酸残基带有游离的巯基的Fab’。F(ab’)2抗体片段最早作为在它们之间具有铰链半胱氨酸的Fab’片段对而产生。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
“单链Fv”或“scFv”片段包含抗体的VH和VL结构域，其中，这些结构域存在于单多肽链中。通常，scFv多肽还包含VH与VL结构域之间的多肽连接物，这使得scFv形成对抗体结合所期望的结构。对于scFv的综述，参见，例如Pluckthün，in The Pharmacology of MonoclonalAntibodies(单克隆抗体的药学)，vol.113，Rosenburg and Moore eds.，(Springer-Verlag，New York，1994)，pp.269-315。
术语“双抗体”意指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段包含在相同多肽链(VH-VL)中与轻链可变域(VL)相连的重链可变域(VH)。通过利用过短以至于不能允许相同链上的两个结构域配对的连接物，强制使该结构域与另一链上的互补结构域配对从而产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价或双特异性的。双抗体更完整地描述于，例如EP404,097；WO 1993/01161；Hudson et al.，Nat.Med.9：129-134(2003)；以及Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也描述于Hudson et al.，Nat.Med.9：129-134(2003)。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”，当在本文中使用时，意指抗体可变域的区域，其在序列中是高变的和/或形成结构上确定的环。通常，抗体包含6个HVR，3个位于VH(H1、H2、H3)，3个位于VL(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3表现出6个HVR的最强的多态性，并且H3特别地被认为在赋予对抗体的高特异性中起到独特的作用。参见，例如Xu et al.，Immunity(免疫力)13：37-45(2000)；Johnson and Wu，inMethods in Molecular Biology(分子生物学方法)248：1-25(Lo，ed.，HumanPress，Totowa，NJ，2003)。实际上，只由重链组成的天然存在的骆驼(camelid)抗体在没有轻链时是有功能并且稳定的。参见，例如，Hamers-Casterman et al.，Nature 363：446-448(1993)；Sheriff et al.，NatureStruct.Biol.3：733-736(1996)。
本文使用并包括了许多HVR描述。Kabat互补性决定区(CDR)基于序列可变性，并且是最常用的。(Kabat et al.，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5th Ed(免疫学所关注的蛋白的序列，第5版).Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。相反，Chothia意指结构环的位置(Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM HVR表示Kabat HVR与Chothia结构环之间的折中，并且仅被Oxford Molecular′s AbM抗体建模软件所使用。“contact(接触)”HVR基于可用的复杂晶体结构的分析。来自这些HVR的每一个的残基如下所示：
环    Kabat       AbM         Chothia    Contact
----  -----       ---         -------    -------
L1    L24-L34     L24-L34     L26-L32    L30-L36
L2    L50-L56     L50-L56     L50-L52    L46-L55
L3    L89-L97     L89-L97     L91-L96    L89-L96
H1    H31-H35B    H26-H35B    H26-H32    H30-H35B
      (Kabat编号)
H1    H31-H35     H26-H35     H26-H32    H30-H35
      (Chothia编号)
H2    H50-H65     H50-H58     H53-H55    H47-H58
H3    H95-H102    H95-H102    H96-H101   H93-H101
HVR可以包含如下的“延伸的HVR”：VL上的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)以及VH上的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义的每一个，可变域残基根据上文的Kabat et al.来编号。
“框架”或“FR”残基是除了本文所定义的HVR残基以外那些可变域残基。
术语“如Kabat中的可变域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变化，意指在Kabat et al.，见上文中用于编辑抗体的重链可变域或轻链可变域的编号系统。利用这个编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有对应于可变域的FR或HVR的缩短或插入的更少或额外的氨基酸序列。例如，重链可变域可以包含H2的52号残基后的单个氨基酸插入(根据Kabat的52a残基)和重链FR 82号残基后插入的残基(例如，根据Kabat的82a号、82b号和82c号残基等)。给定抗体的残基的Kabat编号可以通过用“标准”Kabat编号的序列比对抗体序列的同源性区域来确定。
Kabat编号系统通常在涉及可变域中的残基时使用(大约轻链的1-107个残基和重链的1-113个残基)(例如，Kabat et al.，Sequences ofImmunological Interest.5th Ed(免疫学所关注的蛋白的序列，第5版)。“EU编号系统”或“EU索引(EU index)”通常在涉及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如，上文的Kabat et al.，所报道的EU索引)。“Kabat中的EU索引”意指人IG1EU抗体的残基编号。除非本文中另外指明，对抗体可变域中残基号码的涵义表示Kabat编号系统的残基编号(例如，参见美国临时申请60/640,323号，EU编号的附图)。
“亲和力成熟”的抗体是在其一个或多个HVR中具有一个或多个改变的抗体，与不具有那些改变的亲本抗体(parent antibody)相比，所述改变改善了抗体对抗原的亲和力。在一实施方案中，亲和力成熟的抗体具有对靶抗原的纳摩尔甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体可以利用本领域已知的某些方法来制备。例如，Marks et al.，Bio/Technology10：779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组(shuffling)的亲和力成熟。描述了HVR残基和/或框架残基的随机诱变描述于：Barbas et al.，Proc Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Schier et al.，Gene169：147-155(1995)；Yelton et al.，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson et al.，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；和Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。
“封闭性”抗体(“blocking”antibody)或“拮抗”抗体(“antagonist”antibody)是抑制或降低其结合的抗原的生物活性的抗体。某些封闭性抗体或拮抗抗体基本或完全抑制抗原的生物活性。
本文所用的“激动抗体(agonist antibody)”是部分或完全模拟所目的多肽的至少一种功能活性的抗体。
“生长抑制”抗体是防止或降低表达该抗体结合的抗原的细胞增殖的那些抗体。
抗体“效应子功能”意指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变异Fc区)并随抗体同种型而变化的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调以及B细胞活化。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，其包括天然序列Fc区和变异Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc的边界可能变化，但是人IgG重链Fc区通常限于从Cys226或Pro230位置的氨基酸残基伸展至该重链的羧基末端。Fc区的C-末端赖氨酸(EU编号系统的447号残基)可以被去除，例如，在抗体的制备或纯化期间，或者通过对编码该抗体重链的核酸进行重组改造。因此，完整抗体的组合物可以包含全部K447残基被去除的抗体群、K447残基未被去除的抗体群以及含有和不含K447残基的抗体的混合物的抗体群。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括C1q结合、CDC、Fc受体结合、ADCC、吞噬作用、细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调等。这些效应子功能通常要求Fc区与结合域(例如，抗体可变域)结合，并且可以利用例如在本文的定义中所公开的各种测定来评价。
“天然序列Fc区”包含与在自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包含天然序列人IgG1 Fc区(非A和A异型)、天然序列人IgG2 Fc区、天然序列人IgG3 Fc和天然序列人IgG4 Fc区，以及上述的天然存在的变体。
“变异Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰，优选一个或多个氨基酸取代而与天然序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。优选地，变异Fc区与天然序列Fc区相比或与亲本多肽的Fc区相比，在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸取代，例如约1至约10个氨基酸取代，优选约1至约5个氨基酸取代。优选地，本文Fc区的变体与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区具有至少约80％的同源性，最优选至少约90％的同源性，更优选至少约95％的同源性。
“Fc受体”或“FcR”描述与抗体的Fc区结合的受体。在一些实施方案中，FcR是天然的人FcR。在一些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚组的受体，包括这些受体的等位基因变体和可选择的剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有类似的氨基酸序列，该氨基酸序列主要的不同在于它们的胞质域。激活受体FcγRIIA在其胞质域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见，例如Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。例如，FcR总结于Ravetchand Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capel et al.，Immunomethods 4：25-34(1994)和de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995))中。本文的术语“FcR”包含其他FcR，其包括将来要鉴定的那些FcR。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生受体FcRn，其负责母体IgG向胎儿的转移(Guyer et al.，J.Immunol.117：587(1976)和Kim et al.，J.Immunol.24：249(1994))和免疫球蛋白体内平衡的调节。测量结合FcRn的方法是已知的(参见，例如，Ghetie and Ward.，Immunol.Today18(12)：592-598(1997)；Ghetie et al.，Nature Biotechnology，15(7)：637-640(1997)；Hinton et al.，J.Biol.Chem.279(8)：6213-6216(2004)；WO2004/92219(Hinton et al.)。
可以在体内测定与人FcRn的结合及人FcRn高亲和力结合多肽的血清半衰期，例如在转基因小鼠或转染的表达人FcRn的人细胞系中，或者在给予了具有变异Fc区的多肽的灵长类中。WO 2000/42072(Presta)描述了与FcR的结合获得改善或减弱的抗体变体。还参见，例如Shields et al.，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并行使效应子功能的白细胞。在某些实施方案中，细胞表达至少FcγRIII并行使ADCC效应子功能。调节ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞以及嗜中性粒细胞。效应细胞可以分离自天然来源，例如血液。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”意指细胞毒性的形式，其中，分泌的Ig结合至存在于某些细胞毒性细胞(例如，NK细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)，从而使这些细胞毒性效应细胞特异地结合至带有抗原的靶细胞并随后用细胞毒素杀死该靶细胞。介导ADCC的初级细胞，即NK细胞，只表达FcγRIII；而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上FcR的表达总结于Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)的第464页的表3中。为了评价目的分子的ADCC活性，可以进行如美国专利5,500,362号或5,821,337号或者美国专利6,737,056号(Presta)所述的体外ADCC测定。这类测定可用的效应细胞包括PBMC和NK细胞。可选择地，或者另外，可以体内评价目的分子的ADCC活性，例如在Clynes et al.，PNAS(USA)95：652-656(1998)所公开的动物模型中。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”意指靶细胞在补体的存在下的裂解。经典补体途径的活化由补体系统的第一组分(C1q)与(合适亚组的)抗体的结合引发，该抗体结合至它们的同源抗原。为了评价补体活化，可以进行CDC测定，如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods202：163(1996)所述的CDC测定。Fc区氨基酸序列发生改变(具有变异Fc区的多肽)且C1q结合能力增加或减少的多肽变体描述于美国专利6,194,551 B1号和WO 1999/51642中。还参见，例如Idusogie et al.，J.Immunol.164：4178-4184(2000)。
术语“包含Fc区的抗体”意指包含Fc区的抗体。Fc区的C-末端赖氨酸(根据EU编号系统的447号残基)可以被去除，例如，在抗体的制备或纯化期间，或者通过对编码该抗体重链的核酸进行重组改造。因此，包含具有Fc区的抗体的本发明的组合物可以包含具有K447的抗体、去除了全部K447的抗体，或者含有和不含K447残基的抗体的混合物。
“结合亲和力”通常指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合对象(例如，抗原)之间非共价相互作用总和的强度。除非另外指明，本文所用的“结合亲和力”意指内在结合亲和力，其反映结合对(例如，抗体与抗原)的成员之间1∶1的相互作用。分子X对其对象Y的亲和力通常表示为解离常数(Kd)。亲和力可以通过包括本文所述的那些方法在内的本领域已知的方法来测量。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原，并容易趋向于分离，而高亲和力抗体通常较快地结合抗原并趋向于保持较长的结合。测量结合亲和力的各种方法在本领域内是已知的，其中任何方法都可以用于本发明的目的。在下文中描述了用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案。
在一实施方案中，如下文的测定所述的，本发明的“Kd”或“Kd值”通过用目的抗体的Fab形式及其抗原进行的放射性标记的抗原结合测定(RIA)来测量。Fab对抗原的溶液结合亲和力通过下述步骤来测量：用最小浓度的(125I)标记的抗原在滴定系列(titration series)的未标记的抗原的存在下平衡Fab，然后用涂有抗-Fab抗体的板捕获结合的抗原。(参见，例如Chen et al.，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。为了建立该测定的条件，将MICROTITER
Figure GPA00001142297500221
多孔板(Thermo Scientific)用在50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉抗-Fab抗体(Cappel Labs)过夜涂覆，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温下(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板中(Nunc#269620)，将100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的目的Fab(例如，与抗VEGF抗体的评价一致的Fab-12，Presta et al.，Cancer Res.57：4593-4599(1997))混合。然后将目的Fab孵育过夜；然而，孵育可以持续更长的时间(例如，约65小时)，以确保达到平衡。随后，将混合物转移至捕捉板以在室温下孵育(例如，1小时)。然后去除溶液去除并将板用PBS中的0.1％TWEEN-20TM洗涤8次。将板干燥后，添加150μl/孔的闪烁剂(scintillant)(MICROSCINT-20TM；Packard)，并将板在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上计数10分钟。选择给出小于或等于20％的最大结合的每种Fab的浓度用于竞争性结合测定。
根据另一实施方案，Kd或Kd值利用表面等离子共振测定来测量，其利用BIACORE
Figure GPA00001142297500222
-2000或BIACORE-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)，用约10应答单位(RU)的固定抗原CM5芯片在25℃下进行。简而言之，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)根据供应商的说明书活化。将抗原用pH 4.8的10mM乙酸钠稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入以实现约10应答单位(RU)的偶联蛋白。注入抗原后，注入1M的乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃下，以约25μl/min的流速注入在含有0.05％TWEEN-20TM表面活性剂的PBS中(PBST)两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。结合速率(kon)和解离速率(koff)利用简单的一对一朗缪尔(Langmuir)结合模型(BIACORE
Figure GPA00001142297500224
评价软件，3.2版)，通过同时拟合结合和解离传感图(sensorgram)来计算。平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon比值。参见，例如，Chen et al.，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。如果通过上文的表面等离子共振测定的结合速率超过106M-1s-1，则该结合速率可以利用荧光淬灭技术来确定，其测量pH为7.2的PBS中20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm通带)，其条件是25℃和存在通过分光计测量的渐增浓度的抗原，例如配备停流(stop-flow)的分光光度计(spectrophometer)(Aviv Instruments)或具有搅拌的比色杯的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)。
本发明的“结合速率(on-rate)”、“结合速率(rate of association)”、“结合速率(association rate)”或“kon”可以如上文所述地利用BIACORE-2000或BIACORE
Figure GPA00001142297500232
-3000系统(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)来确定。
本文所用的术语“基本上类似”或“基本上相同”表示两个数值(例如，与本发明的抗体相关的一个数值和与参考/比较抗体相关的另一数值)之间充分的高度相似性，从而本领域技术人员将认为两个值之间的差异在通过所述值(例如，Kd值)测量的生物学特征的语境中具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。作为参考/比较值的函数，所述两个值之间的差异为，例如，小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％和/或小于约10％。
本文所用的短语“基本上减少”或“基本上不同”表示两个数值之间充分的高度差异(通常，与分子有关的一个数值和与参考/比较分子有关的另一数值)，从而本领域技术人员将认为两个值之间的差异在在通过所述值(例如，Kd值)测量的生物学特征的语境中具有统计学显著性。作为参考/比较值的函数，所述两个值之间的差异为，例如，大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％和/或大于约50％。
用于本文目的的“接受体人框架”是包含源自人免疫球蛋白框架或人共有框架的VL框架或VH框架的氨基酸序列的框架。“源自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的接受体人框架可以包含与人免疫球蛋白框架或人共有框架相同的氨基酸序列，或者其可以含有已存在的氨基酸变化。在一些实施方案中，已存在的氨基酸变化的数目是10或小于10、9或小于9、8或小于8、7或小于7、6或小于6、5或小于5、4或小于4、3或小于3或者2或小于2。当已存在的氨基酸变化存在于VH中时，优选地这些氨基酸变化仅发生在71H、73H和78H位置的3个、2个或1个处，例如，位于这些位置的氨基酸残基可以是71A、73T和/或78A。在一实施方案中，VL接受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
“人共有框架”是在选择人免疫球蛋白VL或VH框架序列时，代表最常出现的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选自可变域序列的子群。通常序列的子群是上文Kabat et al.中的子群。在一实施方案中，对于VL，子群是上文Kabat et al.中的子群κI。在一实施方案中，对于VH，子群是上文Kabat et al.中的子群III。
“VH子群III共有框架”包含获得自Kabat et al.的可变重链子群III中的氨基酸序列的共有序列。在一实施方案中，VH子群III共有框架氨基酸序列包含每个下述序列的至少一部分或全部：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ IDNO：31)-H1-WVRQAPGKGLEWV(SEQ IDNO：32)-H2-RFTISADTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ IDNO：33)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：34)。参见图4。
“VL子群I共有框架”包含获得自Kabat et al.的可变轻链κ子群I中的氨基酸序列的共有序列。在一实施方案中，VH子群I共有框架氨基酸序列包含每个下述序列的至少一部分或全部：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ IDNO：35)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ IDNO：36)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ IDNO：37)-L3-FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：38)。参见图5。
如本文所用的，“密码子组(codon set)”意指用于编码期望的变异氨基酸的一组不同的核苷酸三联序列。例如，可以通过固相合成合成一组寡核苷酸，其包含代表由密码子组所提供的核苷酸三联密码的全部可能组合的序列并且编码期望组的氨基酸。标准形式的密码子命名(designation)是IUB编码的命名，其在本领域中是已知的并且描述于本文中。密码子组通常由3个斜体大写字母表示，例NNK、NNS、XYZ、DVK等。因此，本文所用的“非随机密码子组”意指编码所选氨基酸的密码子组，其部分地，优选完全地执行如本文所述氨基酸选择标准。在某些位置具有所选的核苷酸“简并性”的寡核苷酸的合成在该领域是已知的，例如，TRIM方法(Knappek et al.(1999)J.Mol.Biol.296：57-86)；Garrard & Henner(1993)Gene 128：103)。具有确定密码子组的这些寡核苷酸组可以利用商业核酸合成仪(例如，可商购自Applied Biosystems，FosterCity，CA)合成，或者是可以商购的(例如，购自Life Technologies，Rockville，MD)。因此，具有特定密码子组的一组合成的寡核苷酸通常包含具有不同序列的多个寡核苷酸，并且由密码子组在整体序列中建立差异。本发明所用的寡核苷酸具有允许与可变域核酸模板杂交的序列，并且还可以，但不是必须地包含用于，例如克隆目的的限制性酶切位点。
表述“线性抗体”意指在Zapata et al.(1995 Protein Eng，8(10)：1057-1062)中所述的抗体。简而言之，这些抗体包含的一对串联的Fd节段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
如本文所用的，“文库”意指多个抗体序列或抗体片段序列(例如，本发明的多肽)，或编码这些序列的核酸，并且序列在根据本发明的方法导入这些序列的变异氨基酸的组合中是不同的。
“噬菌体展示”是将各种变异多肽作为与至少一部分外壳蛋白的融合蛋白展示到噬菌体表面的技术，例如丝状噬菌体、颗粒。噬菌体展示的用途在于可以将随机蛋白变体的大文库快速和有效地对以高亲和力与靶抗原结合的那些序列进行分类。肽和蛋白文库在噬菌体上的展示已经用于从上百万种多肽筛查具有特定结合特性的多肽。多价噬菌体展示方法已经用于通过与丝状噬菌体基因III或基因VIII融合展示小随机肽和小蛋白。Wells and Lowman(1992)Curr.Opin.Struct.Biol.3：355-362，和本文所引用的参考文献。在单价噬菌体展示中，将蛋白或肽文库与基因III或其部分融合，并在野生型基因III蛋白的存在下低水平表达，从而噬菌体颗粒展示该融合蛋白的一个拷贝或不展示该融合蛋白。相对于多价噬菌体，降低了亲和力影响，从而分类基于内在配体亲和力，并且使用噬菌粒载体，这简化了DNA操作。Lowman and Wells(1991)Methods：Acompanion to Methods in Enzymology(方法：酶学方法参考书)3：205-0216。
“噬菌粒”是具有细菌复制起点如Co1E1和噬菌体基因间区拷贝的质粒载体。噬菌粒可以用于任何已知的噬菌体，包括丝状噬菌体和λ噬菌体。质粒通常还含有抗生素抗性选择标志物。克隆入这些载体的DNA节段可以作为质粒增殖。当为带有这些载体的细胞提供了产生噬菌体颗粒所需的全部基因时，质粒的复制模式变成滚环复制以产生质粒DNA一条链的拷贝并包装噬菌体颗粒。噬菌粒可以形成感染性或非感染性噬菌体颗粒。这个术语包括噬菌粒，其含有与异源多肽基因连接的、作为基因融合物的噬菌体外壳蛋白基因或其片段，从而该异源多肽展示在噬菌体颗粒的表面。
术语“噬菌体载体”表示含有异源基因并且能够复制的双链复制形式的噬菌体。噬菌体载体具有允许噬菌体复制和噬菌体颗粒形成的噬菌体复制起点。优选地，噬菌体是丝状噬菌体，如M13、f1、fd、Pf3噬菌体或上述的衍生物；或者λ噬菌体，如λ、21、phi80、phi81、82、424、434等，或上述的衍生物。
本文所用的“溶剂可及位置”意指来源抗体或抗原结合片段的重链和轻链的可变区中氨基酸残基的位置，该位置是基于抗体或抗原结合片段的结构、整体结构和/或模拟结构确定的，其对于溶剂与诸如抗体特异性抗原的分子的接近和/或接触是潜在可用的。通常在CDR和蛋白的外面发现这些位置。如本文所定义的抗体或抗原结合片段的溶剂可及位置可以利用本领域已知的许多算法中的任何算法来确定。在一实施方案中，溶剂可及位置利用抗体的三维模型的坐标来确定，优选地利用诸如InsightII程序(Accelrys，San Diego，CA)的计算机程序来确定。溶剂可及位置还可以利用本领域已知的算法来确定(例如，Lee and Richards(1971)J.Mol.Biol.55，379and Connolly(1983)J.Appl.Cryst.16，548)。溶剂可及位置的确定可以利用适合蛋白建模的软件和获得自抗体的三维结构信息来进行。可以用于这些目的的软件包括SYBYL Biopolymer Module(SYBYL生物高分子模块)软件(Tripos Associates)。通常，当算法(程序)要求用户输入大小参数时，将计算中所用的探针的“大小”设为半径为1.4埃或更小。另外，Pacios(1994)Comput.Chem.18(4)：377-386已经描述了利用个人计算机的软件确定溶剂可及区和面积的方法。
“血管生成因子或试剂(angiogenic factor or agent)”是刺激血管发育，例如，促进血管生成、内皮细胞生长、血管稳定性和/或血管形成等的生长因子。例如，血管生成因子包括但不限于，例如VEGF和VEGF家族的成员；PlGF家族的成员；PDGF家族的成员；成纤维细胞生长因子家族(FGF)的成员；TIE配体(促血管生成素)；肝配蛋白；δ样配体4(DLL4)；Del-1；成纤维细胞生长因子：酸性(aFGF)和碱性(bFGF)；滤泡素抑制素；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；肝细胞生长因子(HGF)/分散因子(SF)；白细胞介素-8(IL-8)；瘦蛋白；中期因子；神经毡蛋白；胎盘生长因子；血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)；血小板衍生生长因子，特别是PDGF-BB或PDGFR-β；多营养因子(PTN)；颗粒蛋白前体(Progranulin)、增殖蛋白、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等。血管生成因子还包括加速伤口愈合的因子，如生长激素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生长因子(EGF)、CTGF和其家族的成员以及TGF-α和TGF-β。参见，例如Klagsbrun and D’Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53：217-39；Streit and Detmar(2003)Oncogene22：3172-3179；Ferrara & Alitalo(1999)Nature Medicine 5(12)：1359-1364；Tonini et al.(2003)Oncogene 22：6549-6556(例如，表1所列的已知血管生成因子)；和Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8：200-206。
“抗血管生成剂”或“血管生成抑制剂”意指小分子量的物质、多核苷酸(包括，例如，抑制性RNA(RNAi or siRNA))、多肽、分离的蛋白、重组蛋白、抗体或其偶联物或融合蛋白，它们直接或间接地抑制血管生成、血小管生成(vasculogenesis)或不期望的血管通透性。应当理解，抗血管生成剂包括结合并阻断血管生成因子或其受体的血管生成活性的那些试剂。例如，抗血管生成剂是如上文所定义的血管生成试剂的抗体或其他拮抗剂，例如，VEGF-A的抗体或VEGF-A受体(例如，KDR受体或Flt-1受体)的抗体、诸如GleevecTM(甲磺酸伊马替尼)的抗PDGFR抑制剂、阻断VEGF受体信号的小分子(例如，PTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT
Figure GPA00001142297500271
/SU11248(苹果酸舒尼替尼)、AMG706或在例如国际专利申请WO 2004/113304中所述的那些小分子)。抗血管生成剂还包括天然血管生成抑制剂，例如血管生成抑制素(angiostatin)、内皮抑制素(endostatin)等。参见，例如Klagsbrun and D’Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53：217-39；Streit and Detmar(2003)Oncogene 22：3172-3179(例如，表3列举了恶性黑素瘤中的抗血管生成疗法)；Ferrara & Alitalo(1999)Nature Medicine5(12)：1359-1364；Tonini et al.(2003)Oncogene 22：6549-6556(例如，表2列举了已知的抗血管生成因子)；以及Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8：200-206(例如，表1列举了用于临床试验的抗血管生成试剂)。
本文所用的术语“VEGF”或“VEGF-A”意指如Leung et al.(1989)Science 246：1306和Houck et al.(1991)Mol.Endocrin，5：1806所述的165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，和相关的121、189和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，及上述的天然存在的等位基因形式和加工形式。术语“VEGF”还意指来自诸如小鼠、大鼠或灵长类的非人物种的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF用下述术语表示：hVEGF表示人VEGF、mVEGF表示鼠VEGF等。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子中的氨基酸8-109或1-109的多肽的截短形式。可以通过例如“VEGF(8-109)”、“VEGF(1-109)”或“VEGF165”确定本申请中所引用的任何这类形式的VEGF。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置通过天然VEGF序列中所标明的位置来编号。例如，截短的天然VEGF中的氨基酸位置17(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的位置17(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF对KDR和Flt-1受体的结合亲和力与天然VEGF相当。
“抗VEGF抗体”是以足够的亲和力和特异性与VEGF结合的抗体。在一实施方案中，本发明的抗VEGF抗体是抗体B20-4.1.1。仍然在另一实施方案中，本发明的抗VEGF抗体是B20-4.1.1RR。仍然在另一实施方案中，本发明的抗VEGF抗体可以用作靶向和干扰涉及VEGF活性的疾病或疾病状态(condition)中的治疗剂。抗VEGF抗体通常不与诸如VEGF-B或VEGF-C的其他VEGF同源物结合，也不与诸如PlGF、PDGF或bFGF的其他生长因子结合。
抗VEGF抗体“贝伐单抗(BV)”，也称作“rhuMAb VEGF”或“AVASTIN
Figure GPA00001142297500281
”，是根据Presta et al.(1997)Cancer Res.57：4593-4599产生的重组人源化抗VEGF单克隆抗体。其包含突变的人IgG1框架区和来自鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1的抗原结合互补性决定区，所述单克隆抗体阻断人VEGF与其受体的结合。约93％的贝伐单抗的氨基酸序列，包括大部分框架区，源自人IgG1；而约7％的序列源自鼠抗体A4.6.1。贝伐单抗的分子量为约149,000，并且是糖基化的。
本文所用的术语“B20系列多肽”意指包括与VEGF结合的抗体在内的多肽。B20系列多肽包括但不限于如美国公开20060280747号、美国公开20070141065和/或美国公开20070020267号所述的源自B20抗体序列的抗体或者B20来源的抗体，这些专利申请的内容通过引用明确地并入本文。在一实施方案中，B20系列多肽是如美国公开20060280747号、美国公开20070141065号和/或美国公开20070020267号所述的B20-4.1。
本文所用的术语“B20-4.1.1”指与VEGF结合的抗体，并包含抗体，其中HVR-H1为SEQ ID NO：1；HVR-H2为SEQ ID NO：2；HVR-H3为SEQ ID NO：3；HVR-L1为SEQ ID NO：4；HVR-L2为SEQ ID NO：6；HVR-L3为SEQ ID NO：7。
本文所用的术语“B20-4.1.1RR”意指与VEGF结合的抗体，并包含抗体，其中HVR-H1为SEQ ID NO：1；HVR-H2为SEQ ID NO：2；HVR-H3为SEQ ID NO：3；HVR-L1为SEQ ID NO：5；HVR-L2为SEQ ID NO：6；HVR-L3为SEQ ID NO：7。
本文所用的术语“G6-31”是如美国公开20060280747号、美国公开20070141065号和/或美国公开20070020267号所述的G6系列多肽中的一种。如美国公开20060280747号、美国公开20070141065号和/或美国公开20070020267号所述的其他G-6系列多肽，包括但不限于G6-8和G6-23。
对于VEGF多肽，术语“生物活性(biological activity)”和“生物活性(biologically active)”指与VEGF有关的物理/化学特性和生物学功能。
“VEGF拮抗剂”意指能够中和、阻断、抑制、终止、降低或干扰VEGF活性的分子，该VEGF活性包括但不限于其与一种或多种VEGF受体的结合。VEGF拮抗剂包括但不限于抗VEGF抗体及其抗原结合片段；受体分子和衍生物，其与VEGF特异性结合，借此使其不能与一种或多种受体结合；抗VEGF受体抗体和VEGF受体拮抗剂，如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂。本文所用的术语“VEGF拮抗剂”特别包括与VEGF结合并且能够中和、阻断、抑制、终止、降低或干扰VEGF活性的分子，包括抗体、抗体片段、其他结合多肽、肽以及非肽小分子在内。因此，术语“VEGF活性”特别包括VEGF的VEGF介导的生物活性(如上文所定义的)。在一实施方案中，VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体B20-4.1.1。仍然在另一实施方案中，VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体B20-4.1.1RR。
如本文所用的，“治疗”(和诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”的变体)意指意图改变被治疗的个体或细胞的自然过程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理学过程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓和症状、减少疾病的任何直接或间接病理结果、预防转移、降低疾病恶化的速率、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延缓疾病或病症的发展或者用于减慢疾病或病症的恶化。
“长期”给药意指与和急性模式相反的连续模式的试剂的给药，从而将初始治疗效果(活性)维持至延长的时间段。“间歇”给药指治疗不是连续不间断进行的，但是本身是周期的。
“病症”是会从治疗受益的任何疾病状态(例如，患有或需要预防异常血管生成(过度、不合适或不受控制的血管生成)或异常血管通透性的哺乳动物)。这包括包括那些病理状况在内的慢性和急性病症或疾病，其使哺乳动物容易患有所讨论的病症。本文要治疗的病症的非限制性实例包括恶性和良性肿瘤、非白血病和淋巴恶性肿瘤；以及特别地，肿瘤(癌症)转移。
术语“细胞增殖病症”和“增殖病症”意指与某种程度的异常细胞增殖有关的病症。在一实施方案中，细胞增殖病症是癌症。
本文所用的“肿瘤”意指无论是恶性还是良性的全部肿瘤细胞生长和增殖，以及全部癌前和癌细胞和组织。本文所引的术语“癌症”、“癌”、“细胞增殖病症”、“增殖病症”和“肿瘤”不是互斥的。
术语“癌症”和“癌”意指或描述哺乳动物的生理状况，通常其特征为不受调控的细胞生长。癌症的实例包括但不限于癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这些癌症更具体的实例包括但不限于鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric cancer)或胃癌(stomach cancer)(包括胃肠癌和胃肠基质癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头和颈癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端雀斑样痣性黑素瘤、结节性黑素瘤及B细胞淋巴瘤(包括低度/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中度/滤泡性NHL；中度弥散性NHL；高度免疫母细胞NHL；高度原始淋巴细胞NHL；高度小无裂细胞(small non-cleaved cell)NHL；肿块性病变(bulky disease)NHL；套细胞淋巴瘤、AIDS相关的淋巴瘤；以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、多毛细胞白血病、慢性粒细胞白血病和移植后淋巴组织增生病症(PTLD)以及与斑痣性错构瘤病有关的异常血管增殖、水肿(例如，与脑瘤有关的水肿)和梅格斯综合征。
“个体(individual)”、“个体(subject)”或“患者”是脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家畜(例如奶牛)、运动动物(sport animal)、宠物(例如猫、犬和马)、灵长类、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，哺乳动物是人。
术语“药物制剂”意指使得活性成分的生物活性有效的形式的制剂，且其不含有对给予制剂的个体具有不可接受的毒性的其他组分。这类制剂可以是无菌的。
“无菌”制剂是消毒的或不含全部活微生物及其孢子。
“有效量”意指以剂量和在所需的时间段内有效实现期望的治疗或预防结果的量。
本发明的物质/分子的“治疗有效量”可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及该物质/分子在个体中引起期望的应答的能力而变化。治疗有效量包括治疗有益效果超过物质/分子的任何毒性或不良影响的量。“预防有效量”意指以剂量和在所需的时间段内有效地实现期望的预防结果的量。通常但非必须，由于在疾病的较早期阶段之前或早期阶段时使用预防剂量，所以预防有效量小于治疗有效量。
与一种或多种其他治疗剂“联合”给药包括同时(同时(concurrent))给药和以任何次序连续给药。
本文所用的“媒介物(carrier)”包括药物可接受的媒介物、赋形剂或稳定剂，其对以所用的剂量和浓度暴露于其下的细胞或哺乳动物是无毒的。通常生理可接受的媒介物是pH缓冲的水溶液。生理可接受的媒介物的实例包括诸如磷酸、柠檬酸和其他有机酸的缓冲液；包括抗坏血酸在内的抗氧化剂；低分子量(小于10个残基)多肽；诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白的蛋白质；诸如聚乙烯吡咯烷酮的亲水聚合物；诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸的氨基酸；单糖、二糖和包括葡萄糖、甘露糖或糊精在内的其他碳水化合物；诸如EDTA的螯合剂；诸如甘露醇或山梨醇的糖醇；诸如钠的成盐反离子；和/或诸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM的非离子表面活性剂。
“脂质体”是由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小媒介物，其用于将药物(例如VEGF多肽或其抗体)递送至哺乳动物。脂质体的组分通常以双层形式排列，这类似于生物膜的脂质排列。
术语“抗肿瘤组合物”意指用于治疗癌症的组合物，其包含至少一种活性治疗剂，例如，“抗癌剂”。治疗剂(抗癌剂)的实例包括但不限于，例如化疗剂；生长抑制剂；细胞毒性剂；用于放射疗法的试剂；抗血管生成剂；凋亡剂；抗微管蛋白剂以及治疗癌症的其他试剂，例如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如厄洛替尼(TarcevaTM)、血小板衍生生长因子抑制剂(例如GleevecTM(甲磺酸伊马替尼))、COX-2抑制剂(例如塞来昔布)、干扰素、细胞因子，与下述靶标的一种或多种的结合拮抗剂(例如中和抗体)：ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体、TRAIL/Apo2；以及其他生物活性和有机化学试剂等。本发明还包括上述试剂的组合。
本文所用的术语“细胞毒性剂”意指抑制或防止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂(例如氨甲蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春花碱、依托泊苷)；多柔比星(doxorubicin)、苯丙氨酸氮芥、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂；诸如溶核酶的酶及其片段、抗生素；和诸如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活毒素的毒素，包括其片段和/或变体；以及下文公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
“毒素”是能够具有对细胞的生长或增殖具有不利效果的物质。
“化疗剂”是用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括烷化剂，如塞替派和环磷酰胺(CYTOXAN
Figure GPA00001142297500331
)；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡和和哌泊舒凡；吖丙啶，如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylomelamine)；多聚乙酰(acetogenin)(特别是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚，MARINOL)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇；秋水仙碱；桦木酸；喜树碱(包括合成的类似物托泊替康(HYCAMTIN
Figure GPA00001142297500333
)、CPT-11(伊立替康，CAMPTOSAR
Figure GPA00001142297500334
)、乙酰喜树碱、东莨菪素(scopolectin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素；海绵多烯酮类化合物(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；念珠藻环肽(特别是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；海兔毒素；倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴素；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵素；氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥；氯磷酰胺(chlorophosphamide)；雌莫司汀；异环磷酰胺；氮芥；盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)；苯丙氨酸氮芥；新氮芥；苯芥胆甾醇(phenesterine)；泼尼莫司汀；曲磷胺；尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，如卡莫司汀、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如刺孢霉素，特别是刺孢霉素γ1I和刺孢霉素ωI1(参见，例如Nicolaou et al.，Angew.Chem Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))；CDP323，即口服α-4整联蛋白抑制剂；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关的色素蛋白烯二炔类抗生素发色团)；阿克拉霉素；放线菌素；安曲霉素(authramycin)；重氮丝氨酸；博来霉素；放线菌素C；卡柔比星(carabicin)；洋红霉素；嗜癌霉素(carzinophilin)；色霉素；放线菌素D；柔红霉素；地托比星；6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸；多柔比星(包括ADRIAMYCIN吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)、盐酸多柔比星脂质体注射剂(DOXIL
Figure GPA00001142297500342
)、脂质体多柔比星TLC D-99(MYOCET
Figure GPA00001142297500343
)、聚乙二醇化(peglylated)的脂质体多柔比星(CAELYX
Figure GPA00001142297500344
)和脱氧多柔比星)；表柔比星；依索比星；伊达比星；马赛罗霉素；丝裂霉素，如丝裂霉素C；麦考酚酸；诺拉霉素；橄榄霉素；培洛霉素；泊非霉素；嘌罗霉素；三铁阿霉素；罗多比星；链黑霉素；链佐星；杀结核菌素；乌苯美司；净司他丁；佐柔比星；抗代谢物，如氨甲蝶呤、吉西他滨(GEMZAR
Figure GPA00001142297500345
)、替加氟(UFTORAL
Figure GPA00001142297500346
)、卡培他滨(XELODA)、埃坡霉素和5-氟尿嘧啶(5-FU)；康普瑞汀；叶酸类似物，如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，如卡鲁睾酮、丙酸曲他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺物(anti-adrenal)，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充物，如甲酰四氢叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；5-氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；伊达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋胺；埃坡霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱，如美登素和美登木素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK
Figure GPA00001142297500351
多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生；利索新(rhizoxin)；细佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2’，2’-三氯三乙胺；单端孢菌毒素(特别是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇形毒素(anguidine))；乌拉坦；长春地辛(ELDISINE
Figure GPA00001142297500352
FILDESIN
Figure GPA00001142297500353
)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C(阿糖胞苷)”)；塞替派；紫杉烷(taxoid)，例如紫杉醇(TAXOL
Figure GPA00001142297500354
)、紫杉醇白蛋白改造的纳米颗粒制剂(ABRAXANETM)和多西他赛(TAXOTERE
Figure GPA00001142297500355
)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂试剂，如顺铂、奥沙利铂(例如，ELOXATIN
Figure GPA00001142297500356
)和卡铂；长春花属(vincas)，其防止微管蛋白聚合形成微管，包括长春花碱(VELBAN
Figure GPA00001142297500357
)、长春新碱(ONCOVIN)、长春地辛(ELDISINE
Figure GPA00001142297500359
FILDESIN)和长春瑞滨(NAVELBINE
Figure GPA000011422975003511
)；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；亚叶酸；诺安托；伊达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，如视黄酸，包括贝沙罗汀(TARGRETIN
Figure GPA000011422975003512
)；二膦酸盐，如氯膦酸盐(例如BONEFOS
Figure GPA000011422975003513
或OSTAC
Figure GPA000011422975003514
)、依替膦酸盐(DIDROCAL
Figure GPA000011422975003515
)、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(ZOMETA
Figure GPA000011422975003516
)、阿仑膦酸盐(FOSAMAX
Figure GPA000011422975003517
)、帕米膦酸盐(AREDIA
Figure GPA000011422975003518
)、替鲁膦酸盐(SKELID
Figure GPA000011422975003519
)或利塞膦酸盐(ACTONEL
Figure GPA000011422975003520
)；曲沙他滨(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制涉及异常细胞增殖信号途径中的基因表达的那些反义核苷酸，例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)(例如厄洛替尼(TarcevaTM))；和减少细胞增殖的VEGF-A；疫苗，如THERATOPE
Figure GPA000011422975003521
疫苗，及基因治疗疫苗，例如ALLOVECTIN
Figure GPA000011422975003522
疫苗、LEUVECTIN
Figure GPA000011422975003523
疫苗和VAXID
Figure GPA000011422975003524
疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如LURTOTECAN
Figure GPA000011422975003525
)；rmRH(例如ABARELIX
Figure GPA000011422975003526
)；BAY439006(索拉非尼；Bayer)；SU-11248(舒尼替尼，SUTENT
Figure GPA000011422975003527
Pfizer)；哌立福辛；COX-2抑制剂(例如塞来考昔或艾托考昔)；蛋白体抑制剂(例如PS341)；硼替佐米(VELCADE
Figure GPA000011422975003528
)；CCI-779；替匹法尼(R11577)；orafenib；ABT510；Bcl-2抑制剂，如奥利美生钠(GENASENSE)；匹蒽醌；EGFR抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，如雷帕霉素(西罗莫司，RAPAMUNE
Figure GPA00001142297500361
)；法尼基转移酶抑制剂，如氯那法尼(lonafarnib)(SCH 6636，SARASARTM)；和上述的药物可接受的盐、酸或衍生物；及上述的两种或更多种的组合，如代表环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙的联合疗法的缩写的CHOP和代表奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-FU和亚叶酸的联合治疗方案的缩写的FOLFOX；及上述任何的药物可接受的盐、酸或衍生物；以及上述的两种或更多种的组合。
本文所定义的化疗剂包括“抗激素剂”或“内分泌治疗”，其用于调节、降低、阻断或抑制促进癌症生长的激素的效果。它们可以是激素自身，包括但不限于抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，其包括例如他莫昔芬(包括NOLVADEX
Figure GPA00001142297500362
他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奥那司酮和FARESTON·托瑞米芬；抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节肾上腺中雌激素的产生，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、MEGASE
Figure GPA00001142297500363
醋酸甲地孕酮、AROMASIN依西美坦、福美坦(formestanie)、法倔唑、RIVISOR
Figure GPA00001142297500365
伏氯唑、FEMARA
Figure GPA00001142297500366
来曲唑和ARIMIDEX
Figure GPA00001142297500367
阿那曲唑；和抗雄激素物(anti-androgen)，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙立德和戈舍瑞林；及曲沙他滨(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制涉及异常细胞增殖信号途径中的基因表达的那些反义核苷酸，例如PKC-α、Raf和H-Ras；核酶，如VEGF表达抑制剂(例如ANGIOZYME核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗，如基因治疗疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN
Figure GPA000011422975003610
疫苗和VAXID
Figure GPA000011422975003611
疫苗；PROLEUKIN
Figure GPA000011422975003612
rIL-2；LURTOTECAN
Figure GPA000011422975003613
拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIX
Figure GPA000011422975003614
rmRH；长春瑞滨和埃斯波霉素(参见美国专利4,675,187号)；及任何上述的药物可接受的盐、酸或衍生物；以及上述的两种或更多种的组合。
本文所用的“生长抑制剂”意指在体外或体内抑制细胞(例如表达VEGF的细胞)生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是明显减少S期的细胞(例如表达VEGF的细胞)的百分比的试剂。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进程(处于除了S期以外的位置)，例如诱导G1停滞和M期停滞的试剂。经典的M期阻断剂包括长春花(长春新碱和长春花碱)、紫杉烷和诸如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博来霉素的拓扑异构酶II抑制剂。诸如DNA烷化剂的停滞G1的那些试剂还深入至S期停滞，如他莫昔芬、泼尼松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。其他信息可以在下述参考文献中找到：在Mendelsohn和Israel编辑的The Molecular Basis of Cancer(癌症的分子基础)的第一章，Murakami等的题为“Cell cycle regulation，oncogenes，andantineoplastic drugs(细胞周期调控、癌基因和抗肿瘤药物)”(W.B.Saunders，Philadelphia，1995)中，如第13页。紫杉烷(紫杉醇和多西他赛)都是源自紫杉的抗癌药。源自欧洲紫杉的多西他赛(TAXOTERE
Figure GPA00001142297500371
Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(TAXOL
Figure GPA00001142297500372
Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进微管蛋白二聚体的微管的组装并通过防止解聚来稳定微管，这抑制了细胞的有丝分裂。
疾病的“病理学”包括损害患者身体健康(well-being)的全部现象。对于癌症，这包括但不限于异常和不可控制的细胞生长、转移、对相邻细胞正常功能的干扰、异常水平的细胞因子或其他分泌产物的释放、炎症性应答或免疫应答的抑制或加重等。
本申请中所用的术语“前体药物”指药物活性物质的前体或衍生形式，其与母体药物相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小，并且能够被酶促活化或转化成更有活性的母体形式。参见，例如Wilman(1986)“Prodrugsin Cancer Chemotherapy(癌症化疗中的前体药物)”Biochemical SocietyTransactions，14，pp.375-382，615th Meeting Belfast and Stella et al.(1985).“Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery(前体药物：靶向药物递送的化学方法)，”Directed Drug Delivery，Borchardt et al.，(ed.)，pp.247-267，Humana Press。本发明的前体药物包括但不限于含磷酸酯(phosphate)的前体药物、含硫代磷酸酯(thiophosphate)的前药、含硫酸酯(sulfate)的前体药物、含肽的前体药物、D-氨基酸-修饰的前药、糖基化的前体药物、含β-内酰胺的前体药物、含任选地被取代的苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选地被取代的苯乙酰胺的前体药物、能够被转换为更具活性的细胞毒性游离药物的5-氟胞嘧啶和其他5-氟尿苷前体药物。可以被衍生为用于本发明的前体药物形式的细胞毒性药物包括但不限于上述的那些化疗剂。
本文所定义的“小分子”的分子量低于约500道尔顿。
“纯化”表示在含有分子的样品中，该分子的浓度按重量计为样品的至少95％或者按重量计为样品的至少98％。
“分离的”核酸分子是这样的核酸分子，即其分离自至少一种与其通常相关的其他核酸分子，例如，在该核酸分子的天然环境中。分离的核酸分子还包括细胞中所含的核酸分子，该细胞通常表达该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置。
术语“载体”旨在表示能够运输与其相连的其他核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其意指可以连接其他DNA节段的环式双链DNA。另一类型的载体是噬菌体载体。另一类型的载体是病毒载体，其中其他DNA节段可以连接至病毒基因组中。某些载体能够在其被导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在被导入宿主细胞时整合至宿主细胞基因组中，从而随宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。这类载体在本文中称为“重组表达载体”或简单地称为“表达载体”。通常，重组DNA技术中所用的表达载体一般是质粒形式的。在本说明书中，“质粒”和“载体”互换地使用，因为质粒是载体的最常用形式。
“多核苷酸”或“核酸”在本文中互换地使用，意指任何长度的核苷酸的聚合物，并包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物、或者可以由DNA或RNA聚合酶通过合成反应整合入聚合物的任何物质。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸及它们的类似物。如果存在，可以在聚合物组装前或组装后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分打断。多核苷酸可以包含合成后的修饰，例如与标记物偶联。其他类型的修饰包括，例如“帽”，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，例如具有不带电连接的修饰(例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电连接的修饰(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)；含有侧链部分的那些修饰，如蛋白(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)；具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的那些修饰；含有螯合剂的那些修饰(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)；含有烷化剂(alkylator)的那些修饰；具有修饰的连接的那些修饰(例如α异头核酸等)；以及未修饰形式的多核苷酸。而且，通常存在于糖上的羟基可以被替代，例如，被膦酸基、磷酸基替代；被标准保护基保护；或被激活以准备与其他核苷酸的连接；或者可以与固体或半固体支持物偶联。5’和3’末端OH可以被磷酸化或被1-20个碳原子的胺或有机封端基团部分取代。也可以将其他羟基衍生为标准保护基。多核苷酸还可以含有类似物形式的核糖或脱氧核糖，其在本领域通常是已知的，并且包括，例如2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基-、2’-氟-或2’-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖的差向异构糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、脂肪族类似物以及诸如甲基核苷的基本核苷类似物。一个或多个磷酸二酯键可以被替代连接基团取代。这些替代连接基团包括但不限于磷酸被P(O)S(“硫代(thioate)”)、P(S)S(“二硫代(dithioate)”)、(O)NR2(“酰胺化”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“formacetal”)取代的实施方案，其中R或R’各自独立地为H或者取代或未被取代的烷基(1-20C)，其任选地含有醚键(-O-)、烷基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中全部的连接必须相同。上述描述适用于本文所引的包括RNA和DNA在内的全部多核苷酸。
本文所用的“寡核苷酸”通常意指短的、通常是单链的、通常是合成的多核苷酸，其长度通常但非必须是小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不是互斥的。上文对多核苷酸的描述等同于并完全适用于寡核苷酸。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并且，若需要，引入缺口以实现最大序列同一性百分比，并且不将任何保守取代视为序列同一性的部分后，候选序列中与参考多肽序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的取代可以通过本领域中的各种方式来实现，例如，利用公开可得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定比对序列的合适参数，其包括在比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，对于本文的目的，利用序列比较计算机程序ALIGN-2，产生氨基酸序列同一性％值。该ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.创作，并且已经随用户文档一起在美国版权局(U.S.Copyright Office)，Washington D.C.，20559提交了源代码，其中该程序以美国版权注册TXU510087号进行了注册。ALIGN-2程序可从Genentech，Inc.，South San Francisco，California公开获得，或者可以从源代码进行编译。ALIGN-2程序应当在UNIX操作系统上编译使用，优选数字UNIX V4.0D。全部序列比较参数由ALIGN-2设定，并且不变。
在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比对的情况下，给定氨基酸序列A比、与或对给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者其可以表示为给定氨基酸序列A具有或包含比、与或对给定氨基酸序列B的特定氨基酸序列同一性％)按如下进行计算：
100乘以分数X/Y，
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，而Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A比B的氨基酸序列同一性％不等于B比A的氨基酸序列同一性％。除非另外指明，本文所用的全部氨基酸序列同一性％值是利用ALIGN-2计算机程序，如在上一段中所述的步骤获得的。
表述“调控序列”意指在特定宿主有机体中表达可操作地连接的编码序列所需的DNA序列。例如，适合于原核生物的调控序列包括启动子、任选的操纵基因序列以及核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
当核酸与其他核酸序列有功能性关系时，其是“可操作地连接的”。例如，如果序列或分泌性前导序列的DNA被表达为参与该多肽分泌的前蛋白，则该前序列或分泌性前导序列的DNA可操作地连接至多肽的DNA；如果启动子或增强子影响该序列的转录，则该启动子或增强子可操作地连接至编码序列；或者，如果核糖体结合位点促进翻译，则核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”表示连接的DNA序列是相邻的，并且对于分泌性前导序列，该DNA序列是相邻并且是阅读相(reading phase)的。然而，增强子不必是相邻的。连接通过常规限制位点处的连接完成。如果不存在这类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸接头(adaptor)或连接物。
如本文所用的，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养”互换地使用，并且全部这类命名包括子代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代个体细胞和从其衍生的培养物，而不考虑转移的次数。还应当理解，由于故意或非故意的突变，全部子代的DNA含量可以不是精确地相同的。本文包括了在原始转化的细胞中筛查具的有相同功能或生物活性的突变子代。当意图不同的命名时，将从语境清楚地理解不同的命名。
本文所用的术语“同时”意指两种或更多种治疗剂的给药，其中至少部分给药在时间上是重叠的。因此，当一种或多种试剂的给药在一种或多种其他试剂的给药停止后连续时，同时给药包括剂量方案。
本文的“癌症复发”意指癌症在治疗后恢复。在一实施方案中，癌症复发包括乳房中癌症的恢复，以及癌症在乳房外恢复的远端复发。
本发明的组合物
本发明涉及分离的抗体和多核苷酸的实施方案。在一实施方案中，抗VEGF抗体是纯化的。
本发明还涉及包括药物组合物在内的组合物，其包含抗VEGF抗体；和多核苷酸，其包含编码抗VEGF抗体的序列。如本文所用的，组合物包含与VEGF结合的一种或多种抗体，和/或一种或多种多核苷酸，其包含编码与VEGF结合的一种或多种抗体的序列。这些组合物还可以包含合适的媒介物，例如包括缓冲剂在内的药物可接受的赋形剂，其在本领域内是已知的。
在一实施方案中，本发明的抗VEGF抗体是单克隆的。仍然在另一实施方案中，抗VEGF抗体是多克隆的。本文所提供的抗VEGF抗体的Fab、Fab′、Fab’-SH和F(ab’)2片段也包括在本发明的范围内。这些抗体片段通过诸如酶消化的常规方法制备，或者可以通过重组技术产生。这些抗体片段可以是嵌合的或人源化的。这些片段用于诊断和下文所列的目的。在一实施方案中，抗VEGF抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
单克隆抗体获得自基本上同质的抗体群，即除了可能少量存在的天然存在的突变以外，组成的群体个体抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆”表明抗体的特征是，其并不是不同抗体的混合物。
本文提供了源自噬菌体文库的示例性单克隆抗体，并且描述于实施例1中。这些抗体命名为B20-4.1.1和B20-4.1.1RR。B20-4.1.1和B20-4.1.1RR的重链可变域和轻链可变域的序列示于图1和图6-9中。
为了筛查与目的抗原的特定表位结合的抗体，可以进行如Antibodies，A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow and David Lane(1988)所述的常规交叉阻断(cross-blocking)测定。或者，可以进行Champe et al.(1995)J.Biol.Chem.270：1388-1394所述的表位作图来确定抗体是否结合目的表位。下文提供了抗VEGF抗体的其他示例性实施方案。
抗VEGF抗体的具体实施方案
在一实施方案中，本发明提供了抗体，其包含：
(i)HVR-H1序列，其包含SEQ ID NO：1的序列；
(ii)HVR-H2序列，其包含SEQ ID NO：2的序列；
(iii)HVR-H3序列，其包含SEQ ID NO：3的序列；
(iv)HVR-L1序列，其包含SEQ ID NO：4的序列；
(v)HVR-L2序列，其包含SEQ ID NO：6的序列；
(vi)HVR-L3序列，其包含SEQ ID NO：7的序列。
在另一实施方案中，本发明提供了抗体，其包含：
(i)HVR-H1序列，其包含SEQ ID NO：1的序列；
(ii)HVR-H2序列，其包含SEQ ID NO：2的序列；
(iii)HVR-H3序列，其包含SEQ ID NO：3的序列；
(iv)HVR-L1序列，其包含SEQ ID NO：5的序列；
(v)HVR-L2序列，其包含SEQ ID NO：6的序列；
(vi)HVR-L3序列，其包含SEQ ID NO：7的序列。
如图1所示，SEQ ID NOs：1-7的氨基酸序列相对于单个HVR来编号(即，H1、H2或H3)，该编号与本文所述的Kabt编号系统一致。
一方面，如图1所示，本发明提供了包含重链HVR序列的抗体。
如下述SEQ ID NO：39所示，本发明的某些实施方案包含人源化4D5抗体的轻链可变域(huMAb4D5-8)(HERCEPTIN
Figure GPA00001142297500431
，Genentech，Inc.，SouthSan Francisco，CA，USA)(还参见美国专利6,407,213号和Lee et al.，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-93)。
1Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly AspArg Val Thr Ile Thr Cys 
Figure GPA00001142297500432
TrpTyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly SerSer Gly Thr Asp PheThr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
Figure GPA00001142297500434
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys107(SEQ ID NO：39)(HVR残基用下划线标出)。
在一实施方案中，在位置30、66和91(分别是上文的粗体/斜体所标明的Asn、Arg和His)中的一个或多个位置，对huMAb4D5-8轻链可变域进行了修饰。在一实施方案中，修饰的huMAb4D5-8序列包含位置30处的Ser、位置66处的Gly和/或位置91处的Ser。因此，在一实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含下述SEQ ID NO：40所示的序列：
1Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly AspArg Val Thr Ile Thr Cys
Figure GPA00001142297500435
TrpTyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 
Figure GPA00001142297500436
Ser Gly Thr Asp PheThr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
Figure GPA00001142297500437
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys107(SEQ ID NO：40)(HVR残基用下划线标出)。
关于huMAb4D5-8被取代的残基在上文用黑体/斜体标明。
本发明的抗体可以包含任何合适的框架可变域序列，其条件是基本上保持了对VEGF的结合活性。例如，在某些实施方案中，本发明的抗体包含人亚组III重链框架共有序列。在这些抗体的一实施方案中，框架共有序列包含位置71、73和/或78处的取代。在这些抗体的某些实施方案中，位置71是A，位置73是T和/或位置78是A。在一实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8的重链可变域框架序列(HERCEPTIN
Figure GPA00001142297500441
，Genentech，Inc.，South San Francisco，CA，USA)(还参见美国专利6,407,213号和5,821,337号，以及Lee et al.，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-93)。在一实施方案中，这些抗体还包含人κI轻链框架共有序列。在一实施方案中，这些抗体包含如美国专利6,407,213号和5,821,337号所述的huMAb4D5-8的轻链HVR序列。在一实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8的轻链可变域序列(HERCEPTIN
Figure GPA00001142297500442
，Genentech，Inc.，SouthSan Francisco，CA，USA)(还参见6,407,213号和5,821,337号，以及Lee etal.，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-93)。
在一实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域，其中框架序列包含SEQ ID NOS：8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和/或26(图2a和2b)的序列，并且HVR H1、H2和H3序列分别是SEQ ID NOS：1、2和/或3。在一实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，其中框架序列包含SEQ ID NOS：27、28、29和/或30(图3)的序列，并且HVR L1序列为SEQ ID NOS：4或5，HVR L2序列为SEQ ID NO：6，而HVR L3序列为SEQ ID NO：7。
在一实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域，其包含SEQ IDNO：43的序列。在一实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，其包含SEQ ID NO：44或45的序列。在一实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：43的序列，该轻链可变域包含SEQ ID NO：45的序列。仍然在另一实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：44的序列，该轻链可变域包含SEQ ID NO：45的序列。
一方面，本发明提供了与任何上述抗体竞争结合VEGF的抗体。一方面，本发明提供了与任何上述抗体结合VEGF上相同表位的抗体。
抗体片段
本发明涉及抗体片段。抗体片段可以通过诸如酶消化的常规方法产生，或者通过重组技术产生。在某些情况下，使用抗体片段而不是全抗体，是有优势的。大小较小的片段允许快速的清除，并且可以导致更好地接近实体瘤。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson et al.(2003)Nat.Med.9：129-134。
已经开发了用于产生抗体片段的各种技术。常规地，通过完整抗体的蛋白水解消化获得这些片段(参见，例如Morimoto et al.，Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)；和Brennan et al.，Science，229：81(1985))。然而，这些片段现在可以通过重组宿主细胞直接产生。Fab、Fv和ScFv抗体片段可以在大肠杆菌(E.coli)中表达并分泌，因而允许容易地产生大量的这些片段。抗体片段可以分离自上文所讨论的抗体噬菌体文库。或者，Fab’-SH片段可以直接从大肠杆菌中回收并化学偶联以形成F(ab’)2片段(Carter et al.，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根据另一方法，F(ab’)2片段可以直接分离自重组宿主细胞培养物。在美国专利5,869,046号中讨论了体内半衰期增加的Fab和F(ab’)2片段，其包含补救受体(salvage receptor)结合表位残基。产生抗体片段的其他技术，对本领域技术人员是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185、美国专利5,571,894号和5,587,458号。Fv是scFv仅有的具有完整的结合位点且没有恒定区的分子，因此，它们可以适合于在体内用途中减少非特异性结合。可以构建scFv融合蛋白以在scFv的氨基末端或羧基末端获得效应蛋白的融合。参见Antibody Engineering(抗体工程)，ed.Borrebaeck，见上文。例如，如美国专利5,641,870号所述，抗体片段也可以是“线性抗体”。这类线性抗体可以是单特异性的或双特性的。
人源化抗体
本发明涉及人源化抗体。各种将非人抗体人源化的方法在本领域是已知的。例如，人源化抗体可以具有一个或多个从非人来源导入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，其通常来自“输入”可变域。人源化可以基本上按照Winter和合作者(Jones et al.(1986)Nature 321：522-525；Riechmann et al.(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen et al.(1988)Science 239：1534-1536)的如下方法进行：用高变区序列取代人抗体的相应序列。因此，这类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567号)，其中基本上小于完整的人可变域被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中某些高变区残基和可能的FR残基被来自啮齿类抗体的类似位点的残基取代。
制备人源化抗体中所用的人可变域的选择，既包括轻链又包括重链可变域，对于降低抗原性是重要的。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变域序列的完全文库，筛查啮齿类抗体的可变域序列。然后，接受最接近啮齿类序列的人序列，作为人源化抗体的人框架。参见，例如Sims et al.(1993)J.Immunol.151：2296；Chothia et al.(1987)J.Mol.Biol.196：901。另一方法使用源自轻链或重链的特定亚组的全部人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可以用于几种不同的人源化抗体。参见，例如Carter et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285；Presta et al.(1993)J.Immunol.，151：2623。
通常还期望的是，被人源化的抗体保持对抗原的高亲和力和其他有利的生物特性。为了实现这个目的，根据一种方法，利用亲本序列和人源化序列的三维模型，通过分析亲本序列和各种概念的人源化产物的过程，制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可用的，并且为本领域技术人员所熟悉。说明并展示所选的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可用的。这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能的作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。通过这种方法，可以从受体和输入序列选择并组合FR残基，从而实现期望的抗体特征，如增加对靶抗原的亲和力。通常，高变区残基直接并几乎与抗原结合的影响有关。
人抗体
如上文所述，本发明的人抗体可以通过组合选自人来源的噬菌体展示文库的Fv克隆可变域序列与已知的人恒定域序列来构建。或者，本发明的人单克隆抗体可以通过杂交瘤方法来制备。例如，Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications(单克隆抗体制备技术和应用)，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)和Boerner et al.，J.Immunol.，147：86(1991)描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。
现在可能产生转基因动物(例如，小鼠)，其能够在免疫时，在不产生内源免疫球蛋白的情况下，产生人抗体的完整集合(repertoire)。例如，已经描述，在嵌合和种系突变体小鼠的抗体重链连接区(JH)基因的纯合性缺失，导致内源抗体产生的完全抑制。这种种系突变体小鼠中人种系免疫球蛋白基因阵列的转移，会在抗原激发时导致人抗体产生。参见，例如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A，90：2551(1993)；Jakobovits etal.，Nature，362：255(1993)；Bruggermann et al.，Year in Immunol.，7：33(1993)。
基因改组也能用于从诸如啮齿类的非人抗体衍生人抗体，其中该人抗体对起始的非人抗体具有类似的亲和力和特异性。根据又称为“表位印迹”的这种方法，用人V域基因的集合取代通过本文所述的噬菌体展示技术获得的非人抗体片段的重链可变区或轻链可变区，从而产生非人链/人链scFv或Fab嵌合体的群体。使用抗原的选择导致非人链/人链嵌合scFv或Fab分离，其中人链恢复在原代噬菌体展示克隆中去除相应的非人链时破坏的抗原结合位点，即表位控制(印迹)人链对象的选择。当重复该过程以取代剩余的非人链时，获得了人抗体(参见1993年4月1日公开的PCT WO 93/06213)。和通过CDR移植的常规非人抗体人源化不同，这种技术提供完全的人抗体，其不含非人来源的FR或CDR残基。
双特异性抗体
双特异性抗体是对至少两种不同的抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体是人抗体或人源化抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一是对VEGF的，而另一个是对任何其他抗原的。在某些实施方案中，双特异性抗体可以与两种不同的VEGF的表位结合。双特异性抗体还可以用于将细胞毒性剂定位于表达VEGF的细胞。这些抗体具有VEGF结合臂和结合细胞毒性剂的臂，例如皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原。双特异性抗体可以被制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。
制备双特异性抗体的方法在本领域是已知的。常规地，双特异性抗体的重组产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条重链具有不同的特异性(Milstein and Cuello，Nature，305：537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，所以这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化，通常通过亲和层析步骤进行，是相当繁琐的，并且产物的产量不高。1993年5月13日公开的WO 93/08829和Trauneckeret al.，EMBO J.，10：3655(1991)公开了类似的方法。
根据不同的方法，将具有期望的结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。该融合，例如，具有免疫球蛋白重链恒定域，其包含铰链区、CH2区和CH3区的至少一部分。在某些实施方案中，含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)存在于至少一种融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物的DNA，以及若需要，编码免疫球蛋白轻链的DNA，插入单独的表达载体中，并将其共转染于合适的宿主有机体中。这在构建中所用的不等比率的三种多肽链提供最优产率的实施方案中，为调节三种多肽片段的相互比例提供了相当的灵活性。然而，当至少两种相等比率的多肽的表达获得高产率或者当比率不具有特殊的重要性时，可能将两种或全部三种多肽链的编码序列插入一个表达载体中。
在这种方法的一个实施方案中，双特异性抗体由在一条臂上具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链和在另一条臂上的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现这种不对称结构促进期望的双特异性化合物与不期望的免疫球蛋白链组成的分离，因为免疫球蛋白轻链在仅一半双特异性分子中的存在提供了容易的分离方式。这种方法公开于WO 94/04690。产生双特异性抗体的其他细节，参见，例如Sureshet al.，Methods in Enzymology，121：210(1986)。
根据另一方法，抗体分子对之间的界面可以经改造，将从重组细胞培养中回收的异源二聚体的百分比最大化。该界面包含至少一部分抗体恒定区的CH3结构域。在这种方法中，来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大的侧链(酪氨酸或色氨酸)取代。通过用较小的氨基酸侧链取代大氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生了与大侧链相同或类似大小的补偿“腔”。这提供了相对于诸如同型二聚体的不期望的副产物增加异源二聚体产率的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源偶联(heteroconjugate)”抗体。例如，异源偶联物中的一个抗体可以与抗生物素蛋白偶联，而另一个抗体与生物素偶联。例如，这类抗体被认为将免疫系统细胞靶向不期望的细胞(美国专利4,676,980号)，并且用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/00373和EP 03089)。异源偶联抗体可以利用任何常规交联方法来制备。合适的交联剂在本领域内是已知的，并且随许多交联技术一起公开于美国专利4,676,980号中。
文献中也描述了从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，双特异性抗体可以利用化学连接来制备。Brennan et al.，Science，229：81(1985)描述了将完整抗体蛋白水解剪切以产生F(ab’)片段的方法。这些片段在二巯基配合剂亚砷酸钠的存在下被还原，以稳定邻近的二巯基并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’s片段转变成硫代硝基苯甲酸(TNB)衍生物。然后将Fab’s-TNB衍生物之一通过用巯基乙胺还原再转变为Fab’-巯基，并与等摩尔量的其他Fab’s-TNB衍生物混合，形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可以用作酶的选择性固定的试剂。
最近的进展促进了从大肠杆菌中直接回收Fab’-SH片段，其可以经化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby et al.，J.Exp.Med.，175：217-225(1992)描述了完全人源化双特异性抗体F(ab’)2分子的产生。每个Fab’片段分别分泌自大肠杆菌，并且将其进行体外定向化学偶联以形成双特异性抗体。因此而形成的双特异性抗体能够与过量表达HER2受体的细胞和正常的人T细胞结合，并且能够引发人细胞毒性淋巴细胞对人乳腺瘤靶标的裂解活性。
也描述了直接由重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，利用亮氨酸拉链产生双特异性抗体。Kostelny et al.，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos蛋白和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合连接至两种不同抗体的Fab’部分。在铰链区将抗体同型二聚体还原以形成单体，然后将其再氧化以形成抗体异源二聚体。这种方法还可以用于产生抗体同型二聚体。Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，90：6444-6448(1993)所述的“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的可选机制。该片段包含通过连接物与轻链可变域(VL)相连的重链可变域(VH)，该连接物太短而不允许相同链上的两个结构域之间的配对。因此，一个片段的VH域和VL域被强制与另一个片段上的互补的VL域和VH域配对，从而形成两个抗原结合位点。还报道了使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一策略。参见Gruber et al.，J.Immunol.，152：5368(1994)。
本发明考虑了多于二价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tuttet al.J.Immunol.147：60(1991)。
多价抗体
可以通过表达抗体所结合的抗原的细胞，将多价抗体比二价抗体更快地内化(和/或异化)。本发明的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(其不同于IgM类)(例如，四价抗体)，其可以通过编码抗体的多肽链的核酸的重组表达来容易地制备。多价抗体可以包含二聚化结构域和3个或更多个抗原结合位点。在某些实施方案中，二聚化结构域包含Fc区或铰链区(或由Fc区或铰链区组成)。在这个方案中，抗体包含Fc区和Fc区氨基末端的三个或更多个抗体结合位点。在某些实施方案中，多价抗体包含3个至约8个抗原结合位点(或由3个至约8个抗原结合位点组成)。在一个这样的实施方案中，多价抗体包含4个抗原结合位点(或由4个抗原结合位点组成)。多价抗体包含至少一条多肽链(例如，两条多肽链)，其中该多肽链包含两个或更多个可变域。例如，多肽链可以包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2表示氨基酸或多肽，并且n为0或1。例如，多肽链可以包含VH-CH1-弹性连接物(flexiblelinker)-VH-CH1-Fc区链，或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体还可以包含至少两条(例如，4条)轻链可变域多肽。本文的多价抗体可以，例如，包含约2至约8条轻链可变域多肽。本文所涉及的轻链可变域多肽包含轻链可变域，并且任选地还包含CL结构域。
单域抗体
在一些实施方案中，本发明的抗体是单域抗体(single-domainantibody)。单域抗体是单多肽链，其包含抗体的重链可变域的全部或一部分或者包含抗体的轻链可变域的全部或一部分。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见，例如美国专利6,248,516 B1号)。在一实施方案中，单域抗体由抗体的重链可变域的全部或部分组成。
抗体变体
一些实施方案中考虑了本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过向编码该抗体的核苷酸序列导入合适的变化来制备，或者通过肽合成来制备。这类修饰包括，例如抗体的氨基酸序列中残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合，以获得最终构建体，其条件是最终构建体具有期望的特征。可以在生成序列时在个体抗体氨基酸序列中导入氨基酸变异。
用于鉴定诱变的优选位置的抗体的某些残基或区域的方法被称为如Cunningham and Wells(1989)Science，244：1081-1085所述的“丙氨酸扫描诱变”。此处，靶残基的残基或基团被鉴定(例如，带电残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并且被中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)取代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后，通过在取代位点，或为取代位点导入另外或其他变异来改进(refine)证明对取代功能性敏感的那些氨基酸位置。因此，尽管用于导入氨基酸序列变异的位点是预定的，但是突变自身本质上不必是预定的。例如，为了分析给定位点突变的性能，在靶密码子或区域进行ala扫描或随机诱变，并针对期望的活性筛查表达的免疫球蛋白。
氨基酸序列插入包括氨基-末端和/或羧基末端融合，其长度范围是1个残基至含有1百或更多残基的多肽；以及单个或多个氨基酸残基的序列间插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N-末端或C-末端与增加抗体的血清半衰期的酶或多肽的融合。
在某些实施方案中，改变本发明的抗体，以增强或减少糖基化的程度。抗体的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接意指糖类部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列即天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸，是糖类部分连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任何一个的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化意指糖即N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种连接至羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
抗体糖基化位点的添加或缺失，通常通过改变氨基酸序列，从而可以产生或去除一个或多个上文所述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)，而方便地完成。还可以通过向原始抗体添加、缺失或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行改变(对于O-连接的糖基化)。
当抗体包含Fc区时，可以改变与该抗体连接的糖类。哺乳动物细胞所产生的天然抗体通常包含分支的、二分支的寡糖，其通常通过N-连接而连接于Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如Wright et al.(1997)TIBTECH 15：26-32。寡糖可以包括各种糖类，如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸；以及与二分支低聚糖结构“茎”中的GlcNAc相连的岩藻糖。在一些实施方案中，还可以修饰本发明抗体中的寡糖以产生某些特性获得改善的抗体变体。
例如，可以提供具有糖类结构的抗体变体，该糖类结构缺乏与Fc区连接(直接或间接)的岩藻糖。这些变体的ADCC功能可以获得改善。参见，例如美国专利公开2003/0157108号(Presta，L.)、2004/0093621号(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)。涉及“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”的抗体的公开的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki et al.J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白岩藻糖基化的Lec13CHO细胞(Ripka et al.Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；US 2003/0157108 A1，Presta，L；和WO 2004/056312 A1，Adams etal.，特别是实施例11)；以及敲除细胞系，如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除CHO细胞(参见，例如Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda，Y.et al.，Biotechnol.Bioeng.，94(4)：680-688(2006)；and WO2003/085107)。
本发明还提供具有二等分的寡糖(bisected oligosaccharide)的抗体变体，例如，其中连接至抗体的Fc区的二分支寡糖被GlcNAc二等分。这类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的实例描述于，例如WO 2003/011878(Jean-Mairet et al.)；美国专利6,602,684号(Umana et al.)；和US 2005/0123546(Umana et al.)。本发明还提供在与Fc区连接的低聚糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这类抗体变体的CDC功能可以获得改善。这类抗体变体描述于，例如WO 1997/30087(Patel et al.)、WO 1998/58964(Raju，S.)和WO1999/22764(Raju，S.)中。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个氨基酸取代的Fc区，这进一步改善ADCC，例如，在Fc区的298、333和/或334位置(残基的Eu编号)处的取代。这类取代可以与任何上述变异组合发生。
在某些实施方案中，本发明虑及具有某些但并非全部效应子功能的抗体变体，效应子功能使得该抗体变体对于许多应用而言是期望的候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，然而某些效应子功能(例如，补体和ADCC)不是必须的或者是不利的。在某些实施方案中，测量抗体的Fc活性，以确保只保留了期望的特性。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以证实CDC和/或ADCC活性的减少/耗尽。例如，可以进行Fc受体(FcR)测定，以确保抗体缺乏FcγR结合(因而可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞，即NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上FcR的表达总结于Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)的第464页的表3中。评价目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利5,500,362号(参见，例如Hellstrom，I.，et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))和Hellstrom，I et al.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA82：1499-1502(1985)；美国专利5,821,337号(参见Bruggemann，M.et al.，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。或者，可以使用非放射性测定方法，参见，例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA)；和CytoTox 96
Figure GPA00001142297500541
非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI)。用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选择地，或者另外，可以在体内评价目的分子的ADCC活性，例如在Clynes et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)所公开的动物模型中。还可以进行C1q结合测定，证实抗体不能结合C1q并因而缺乏CDC活性。为了评价补体激活，可以进行CDC测定(参见，例如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods202：163(1996)；Cragg，M.S.et al.，Blood 101：1045-1052(2003)；和Cragg，M.S.and M.J.Glennie，Blood 103：2738-2743(2004))。还可以利用本领域已知的方法来进行FcRn结合和体内清除/半衰期确定(参见，例如Petkova，S.B.et al.，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
本发明提供了具有一个或多个氨基酸取代的其他抗体变体。取代诱变的目的位点包括高变区，但是也考虑了FR改变。保守性取代显示于标题为“优选的取代”的表1中。名为“示例性取代”的更多基本变化提供于表1中，或者在下文中对氨基酸分类的引用中进一步进行描述。可以将氨基酸取代导入目的抗体中，并例如，对产物筛查期望活性，例如，改善的抗原结合、降低的免疫原性、改善的ADCC或CDC等。
表1
  原始残基  示例性取代   优选的取代
  Ala(A)  Val；Leu；Ile   Val
  Arg(R)  Lys；Gln；Asn   Lys
  Asn(N)  Gln；His；Asp，Lys；Arg   Gln
  Asp(D)  Glu；Asn   Glu
  Cys(C)  Ser；Ala   Ser
  Gln(Q)  Asn；Glu   Asn
  Glu(E)  Asp；Gln   Asp
  Gly(G)  Ala   Ala
  His(H)  Asn；Gln；Lys；Arg   Arg
  Ile(I)  Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸   Leu
  Leu(L)  正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe   Ile
  Lys(K)  Arg；Gln；Asn   Arg
  Met(M)  Leu；Phe；Ile   Leu
  Phe(F)  Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr   Tyr
  Pro(P)  Ala   Ala
  Ser(S)  Thr   Thr
  Thr(T)  Val；Ser   Ser
  Trp(W)  Tyr；Phe   Tyr
  Tyr(Y)  Trp；Phe；Thr；Ser   Phe
  Val(V)  Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸   Leu
抗体生物特性的修饰可以通过选择取代来完成，所述取代影响(a)取代区域多肽骨架的结构，例如折叠或螺旋构象；(b)靶位点分子的电荷或疏水性；或者(c)侧链体积。可以根据氨基酸侧链的特性的相似性，将氨基酸进行分类(在A.L.Lehninger著的Biochemistry，second ed.，pp.73-75，Worth Publishers，New York(1975)中)：
(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)不带电的极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)
(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)
或者，天然存在的侧链可以基于共有侧链的特性进行分类：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性His、Lys、Arg；
(5)影响侧链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将引起把这些类别之一的成员换成另一类。还可以将这类取代的残基导入保守取代位点，或者导入剩下(例如非保守的)位点。
一种类型的取代变体包括取代亲本抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，相对于产生它们的亲本抗体，选择用于进一步开发的所得变体的生物特性获得修饰(例如，改善)。示例性取代变体的实例是亲和力成熟的抗体，其可以方便地利用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术来产生。简而言之，使几个高变区位点(例如，6-7个位点)突变以在每个位点产生全部可能的氨基酸取代。将由此产生的抗体通过丝状噬菌体颗粒展示为与每个颗粒中所包装的噬菌体外壳蛋白(例如，M13的基因III产物)的至少一部分的融合物。然后筛查噬菌体展示的变体的生物活性(例如，结合亲和力)。为了鉴定修饰的候选高变区位点，可以进行扫描诱变(例如，丙氨酸扫描)以鉴定明显促进抗原结合的高变区残基。可选择地，或者另外，有利的是，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体与抗原之间的接触点。根据包括本文所详述的技术在内的本领域已知的技术，这类接触残基和相邻残基是取代的候选物。一旦产生了这类变体，则对变体的组利用包括本文所述的那些技术在内的本领域已知的技术进行筛查，并且选择在一个或多个相关测定中具有优秀特性的变体，用于进一步开发。
编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子通过各种本领域已知的方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列的变体的情况下)或者通过寡核苷酸介导(或定点)诱变、PCR诱变以及较早制备的变体或非变体形式的抗体的盒式诱变。
期望的是，将一个或多个氨基酸修饰导入本发明抗体的Fc区，从而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，其在包括铰链半胱氨酸在内的一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如，取代)。
根据本说明书和本领域的技术，所考虑的是，在某些实施方案中，与野生型对应抗体相比，本发明的抗体可以在例如Fc区中包含一个或多个改变。但是与野生型对应部分相比，这些抗体将基本上保持治疗用途所需的相同特征。例如，认为可对Fc区进行某些改变，这将导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的改变，例如，如WO99/51642所述。还参见Duncan & Winter，Nature 322：738-40(1988)；美国专利5,648,260号；美国专利5,624,821号；以及有关Fc区变体的其他实例的WO94/29351。WO00/42072(Presta)和WO 2004/056312(Lowman)描述了与FcR的结合获得改善或降低的抗体变体。这些专利公开的内容特别地通过引用并入本文。还参见，Shields et al.，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。US2005/0014934A1(Hinton et al.)描述了半衰期增加和与新生Fc受体(FcRn)的结合获得改善的抗体，其负责将母体IgG向胎儿的转移(Guyer et al.，J.Immunol.117：587(1976)和Kim et al.，J.Immunol.24：249(1994))。这些抗体包含具有一个或多个取代的Fc区，这些取代改善了Fc区与FcRn的结合。美国专利6,194,551B1号、WO99/51642描述了Fc区氨基酸序列发生改变和C1q结合能力增加或降低的多肽变体。这些专利公开的内容特别通过引用并入本文。还参见Idusogie et al.，J.Immunol.164：4178-4184(2000)。
另一方面，本发明在包含Fc区的Fc多肽的界面中含有修饰的抗体，其中该修饰促进和/或有助于异源二聚化作用。这些修饰包括将隆凸(protuberance)导入第一Fc多肽和将空腔(cavity)导入第二Fc多肽，其中隆凸可位于空腔中，从而促进第一Fc多肽和第二Fc多肽的复合(complexing)。产生具有这些修饰的抗体的方法在本领域内是已知的，例如，美国专利5,731,168号所述的方法。
仍然在另一方面，可以期望产生半胱氨酸改造的抗体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在具体的实施方案中，取代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸取代这些残基，从而可以使反应性巯基位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其他部分偶联，如药物部分或连接物-药物部分，如下文进一步所述。在某些实施方案中，任何一个或多个下述残基都可以被半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。
抗体衍生物
可以将本发明的抗体进一步修饰以含有本领域已知且容易得到的其他非蛋白质部分。优选地，适于抗体衍生化的部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇(propropyleneglycol)均聚物、聚环氧丙烷(prolypropylene oxide)/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及上述的混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而具有制造优势。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是分支或非分支的。与抗体连接的聚合物的数目可以变化，并且如果连接了多于一个的聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于包括但不限于要改善的抗体的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等考虑而确定。
在另一实施方案中，本发明了提供了抗体和非蛋白质部分的偶联物，该非蛋白质部分可以通过暴露于辐射而选择性加热。在一实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长，并且包括但不限于不损伤普通细胞但将非蛋白质部分加热至杀死接近抗体-非蛋白质部分的细胞的温度的波长。
免疫偶联物
本发明还提供免疫偶联物(互换地称为“抗体-药物偶联物”或“ADC”)，其包含与一种或多种细胞毒性剂偶联的抗体，该细胞毒性剂例如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白毒素；细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素)或放射性同位素(即，放射偶联物)。
免疫偶联物已经用于细胞毒性剂，即在癌症治疗中杀死细胞或抑制细胞生长或增殖的药物的局部递送(Lambert，J.(2005)Curr.Opinion inPharmacology 5：543-549；Wu et al.(2005)Nature Biotechnology23(9)：1137-1146；Payne，G.(2003)i 3：207-212；Syrigos and Epenetos(1999)Anticancer Research 19：605-614；Niculescu-Duvaz and Springer(1997)Adv.Drug Deliv.Rev.26：151-172；美国专利4,975,278号)。免疫偶联物允许药物向肿瘤的定向递送和肿瘤中的细胞间积累，其中未偶联药物的全身给药可以导致对正常细胞和要被除去的肿瘤细胞的不可接受的水平的毒性(Baldwin et al.，Lancet(Mar.15，1986)pp.603-05；Thorpe(1985)Monoclonal′84：Biological And Clinical Applications(A.Pinchera et al.，eds)pp.475-506中的“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review(癌症治疗中细胞毒性剂的抗体媒介物：综述)”。多克隆抗体和单克隆抗体都用于这些策略已有报道(Rowland et al.，(1986)CancerImmunol.Immunother.21：183-87)。用于这些方法的药物包括道诺霉素、多柔比星、氨甲蝶呤和长春地辛(Rowland et al.，(1986)见上文)。用于抗体-毒素偶联物的毒素包括细菌毒素，如白喉毒素；植物毒素，如蓖麻毒蛋白；小分子毒素，如格尔德霉素(Mandler et al(2000)J.Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581；Mandler et al(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters10：1025-1028；Mandler et al(2002)Bioconjugate Chem.13：786-791)、美登木素生物碱(maytansinoids)(EP 1391213；Liu et al.，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623)和刺孢霉素(calicheamicin)(Lode et al(1998)Cancer Res.58：2928；Hinman et al(1993)Cancer Res.53：3336-3342)。毒素可以通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制来发挥它们的细胞毒性效果。某些细胞毒性药物在与大抗体或蛋白质受体配体偶联时趋向于是非活性的或活性较低。
ZEVALIN
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(替伊莫单抗，Biogen/Idec)是抗体-放射性同位素偶联物，其由抗在正常和恶性B淋巴细胞表面发现的CD20抗原的鼠IgGlκ单克隆抗体和与硫脲连接物-螯合剂结合的111In或90Y放射性同位素组成(Wiseman et al(2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7)：766-77；Wiseman et al(2002)Blood 99(12)：4336-42；Witzig et al(2002)J.Clin.Oncol.20(10)：2453-63；Witzig et al.(2002)J.Clin.Oncol.20(15)：3262-69)。尽管ZEVALIN具有抗B细胞非霍奇金淋巴瘤的活性，但是在大部分患者中给药导致严重和延长的血细胞减少症。MYLOTARGTM(吉妥珠单抗奥佐米星，Wyeth Pharmaceuticals)是由连接至刺孢霉素的huCD33抗体组成的抗体-药物偶联物，于2000年被批准用于通过注射治疗急性骨髓性白血病(Drugs of the Future(2000)25(7)：686；美国专利4970198号、5079233号、5585089号、5606040号、5693762号、5739116号、5767285号、5773001号)。美坎珠单抗(Immunogen，Inc.)是抗体-药物偶联物，其由通过二硫键连接物(disulfide linker)SPP与美登木素生物碱药物部分DM1连接的huC242抗体组成，正进入治疗诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌的表达CanAg的癌症或其他癌症的II期临床试验。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZLBiologics，Immunogen Inc.)是抗体-药物偶联物，其由与美登木素生物碱药物部分DM1连接的抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)单克隆抗体组成，正处于前列腺瘤潜在治疗的开发中。将海兔毒素的合成类似物即澳瑞他汀(auristatin)肽、澳瑞他汀E(AE)和一甲基澳瑞他汀(MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96(对癌上的Lewis Y特异)和cAC10(对恶性血液病(hematological malignancy)的CD30特异)偶联(Doronina et al(2003)NatureBiotechnol.21(7)：778-784)，并且其处于治疗开发中。
在某些实施方案中，免疫偶联物包含抗体和化疗剂或其他毒素。本文描述了用于产生免疫偶联物的化疗剂(例如，见上文)。可用的酶活性毒素及其片段包括，白喉A链、白喉毒素的无结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Pytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、泻果素、巴豆毒蛋白、石碱草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢菌毒素(tricothecenes)。参见例如1993年10月28日公开的93/21232。各种放射性核素可用于制备放射性偶联的抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。利用各种双功能蛋白-偶联剂来制备抗体与细胞毒性剂的偶联物，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯基)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐(dimethyladipimidate HCl))、活性酯(如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta et al.，Science，238：1098(1987)所述，制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫代氰酸基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸偶联至抗体的示例性螯合剂。参见WO94/11026。
本文还考虑了抗体与诸如刺孢霉素、美登木素生物碱、海兔毒素、澳瑞他汀(aurostatin)、单端孢菌毒素和CC1065的一种或多种小分子毒素及具有毒素活性的这些毒素衍生物的偶联物。
美登素和美登木素生物碱
在一些实施方案中，免疫偶联物包含与一个或多个美登木素生物碱分子偶联的抗体(全长或片段)。
美登木素生物碱是有丝分裂(mitototic)抑制剂，其通过抑制微管蛋白起作用。美登素最早分离自东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)(美国专利3,896,111号)。随后发现某些微生物也产生美登木素生物碱，如美登木醇和C-3美登木醇酯(美国专利4,151,042号)。合成的美登木醇及其衍生物和类似物公开于，例如美国专利4,137,230号、4,248,870号、4,256,746号、4,260,608号、4,265,814号、4,294,757号、4,307,016号、4,308,268号、4,308,269号、4,309,428号、4,313,946号、4,315,929号、4,317,821号、4,322,348号、4,331,598号、4,361,650号、4,364,866号、4,424,219号、4,450,254号、4,362,663号和4,371,533号。
美登木素生物碱药物部分是抗体药物偶联物中有吸引力的药物部分，因为它们是(i)容易通过发酵或化学修饰、发酵产物的衍生化进行制备；(ii)容易用官能团进行衍生化，该官能团适合于通过非二硫键连接物与抗体偶联；(iii)在血浆中稳定；以及(iv)有效地抗各种肿瘤细胞系。
美国专利5,208,020号、5,416,064号和欧洲专利EP 0 425 235 B1公开了含有美登木素生物碱的免疫偶联物及其制备方法和它们的治疗用途，这些专利的公开通过引用明确地并入本文。Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)描述了免疫偶联物，其包含名为DM1、与抗人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的美登木素生物碱。发现该偶联物对培养的结肠癌细胞具有强细胞毒性，并且在体内肿瘤生长测定中表现出抗肿瘤活性。Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)描述了免疫免疫偶联物，其中美登木素生物碱生物碱通过二硫键连接物和与人结肠癌细胞系上的抗原结合的鼠抗体A7偶联，或者和结合HER-2/neu癌基因的其他鼠单克隆抗体TA.1偶联。在体外测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物对人乳腺癌细胞系SK-BR-3的细胞毒性，该人乳腺癌细胞系SK-BR-3每个细胞表达3×105个HER-2表面抗原。药物偶联物实现了与游离的美登木素生物碱药物类似程度的细胞毒性，该细胞毒性可以通过增加每个抗体分子的美登木素生物碱分子的数目来升高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠中表现出低的全身细胞毒性。
抗体-美登木素生物碱偶联物通过将抗体与美登木素生物碱分子连接而不明显地降低抗体或美登木素生物碱分子的生物活性来制备。参见，例如美国专利5,208,020号(其公开通过引用明确地并入本文)。尽管期望毒素/抗体的单个分子相对于使用裸抗体增强细胞毒性，但是每个抗体偶联的平均3-4个美登木素生物碱分子表现出有效地增强靶细胞的细胞毒性而不给抗体的功能或溶解性带来不利影响。美登木素生物碱在本领域内是已知的，并且可以通过已知技术合成或从天然来源分离。合适的美登木素生物碱公开于，例如美国专利5,208,020号和上文所引的其他专利或非专利公开。优选的美登木素生物碱是美登木醇和在美登木醇分子的芳环或其他位置修饰的美登木醇类似物，如各种美登木醇酯。
本领域已知有许多用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物的连接基团，例如在下述文献中公开的那些连接基团：美国专利5,208,020号、欧洲专利0 425 235 B1号、Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)以及2004年10月8日提交的美国专利申请10/960,602号，上述文献的公开通过引用明确地并入本文。包含连接物组分SMCC的抗体-美登木素生物碱偶联物可以如2004年10月8日提交的美国专利申请10/960,602号所公开地制备。连接基团包括二硫基团、硫醚基团、对酸敏感的基团、对光敏感的基团、对肽酶敏感的基团或对酯酶敏感的基团，如上文的专利所公开的，二硫基团和硫醚基团是优选的。本文描述和示例了其他连接基团。
抗体与美登木素生物碱的偶联物可以利用各种双功能蛋白偶联剂来制备，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2，6-二异氰酸酯)以及双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。特别优选的偶联剂包括提供二硫键的N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯基)丙酸酯(SPDP)(Carlsson et al.，Biochem.J.173：723-737(1978))和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶巯基)戊酸酯(SPP)。
取决于连接的类型，连接物可以在各种位置与美登木素生物碱分子连接。例如，酯连接可以利用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成。该反应可以发生于具有羟基的C-3位置、用羟甲基修饰的C-14位置、用羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置。在优选的实施方案中，在美登木醇或美登木醇类似物的C-3位置形成连接。
澳瑞他汀和海兔毒素
在某些实施方案中，免疫偶联物包含与海兔毒素或海兔毒素(dolostatin)肽类似物和衍生物即澳瑞他汀(美国专利5,635,483号、5,780,588号)偶联的抗体。已证实海兔毒素和澳瑞他汀干扰微管的动力学、GTP水解及核和细胞分裂(Woyke et al.(2001)Antimicrob.Agents andChemother.45(12)：3580-3584)，并且具有抗癌活性(美国专利5,663,149号)和抗真菌活性(Pettit et al.(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。海兔毒素或澳瑞他汀药物部分可以通过肽药物部分的N(氨基)末端或C(末端)与抗体相连(WO 02/088172)。
示例性澳瑞他汀的实施方案包括N-末端连接的一甲基澳瑞他汀药物部分DE和DF，其公开于2004年11月5日提交的“MonomethylvalineCompounds Capable of Conjugation to Ligands(能够与配体偶联的一甲基缬氨酸化合物)”美国申请10/983,340号，其公开通过引用明确地整体并入本文。
通常，基于肽的药物部分可以通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。这类肽键可以例如根据液相合成方法来制备(参见E.and K.Lübke，“The Peptides(肽)，”volume 1，pp 76-136，1965，Academic Press)，该方法在肽化学领域是熟知的。澳瑞他汀/海兔毒素药物部分可以根据下述文献的方法来制备：US 5,635,483；US5,780,588；Pettit et al.(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465；Pettit et al.(1998)Anti-Cancer Drug Design(抗癌药物设计)13：243-277；Pettit，G.R.，etal.Synthesis，1996，719-725；和Pettit et al.(1996)J.Chem.Soc.PerkinTrans.15：859-863。还参见Doronina(2003)Nat Biotechnol 21(7)：778-784；2004年11月5日提交的“能够与配体偶联的一甲基缬氨酸化合物”美国申请10/983,340号，其公开通过引用明确地整体并入本文(公开了例如连接物和制备诸如与连接物偶联的MMAE和MMAF的一甲基缬氨酸化合物的方法)。
刺孢霉素
在其他实施方案中，免疫偶联物包含与一个或多个刺孢霉素分子偶联的抗体。抗生素的刺孢霉素家族能够以亚皮摩尔的浓度产生双链DNA断裂。对于刺孢霉素家族偶联物的制备，参见美国专利5,712,374号、5,714,586号、5,739,116号、5,767,285号、5,770,701号、5,770,710号、5,773,001号、5,877,296号(都属于American Cyanamid Company)。可以使用的刺孢霉素结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和θI1(Hinman et al.，Cancer Research 53：3336-3342(1993)；Lode etal.，Cancer Research 58：2925-2928(1998)和上文所述的AmericanCyanamid的美国专利)。可以与抗体偶联的另一抗肿瘤药物是QFA，其是叶酸拮抗剂(antifolate)。刺孢霉素和QFA都具有细胞内作用位点并且不容易穿过质膜。因此，这些试剂通过抗体介导的内化的细胞吸收，极大地增强了它们的细胞毒性效果。
其他细胞毒性剂
可以与抗体偶联的其他抗肿瘤剂包括BCNU；链佐星；长春新碱及5-氟尿嘧啶；美国专利5,053,394号、5,770,710号所述的已知的全体LL-E33288复合物的试剂家族；以及埃斯波霉素(美国专利5,877,296号)。
可用的酶活性毒素及其片段包括，白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、泻果素、巴豆毒蛋白、石碱草抑制剂、多花白树毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢菌毒素。参见，例如1993年10月28日公开的WO93/21232。
本发明还考虑了在抗体与具有溶核活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，如脱氧核糖核酸酶；DNase)之间所形成的免疫偶联物。
对于肿瘤的选择性破坏，抗体可以包含高放射性的原子。各种放射性同位素可用于制备放射性偶联的抗体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当偶联物用于检测时，其可以包含用于闪烁图像研究的放射性原子，例如tc99m或I123；或者可以包含用于核磁共振(NMR)成像(又称为磁共振成像，mri)的自旋标记，如再次碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
放射性标记或其他标记可以通过已知的方式并入偶联物中。例如，肽可以生物合成或可以通过化学氨基酸合成来合成，化学氨基酸合成所利用的合适氨基酸前体包括，例如代替氢的氟-19。诸如tc99m或I123、Re186、Re188和In111的标记，可以通过肽中的半胱氨酸残基来连接。钇-90可以通过氨基酸残基来连接。IODOGEN方法(Fraker et al.(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57)可以用于并入碘-123。“MonoclonalAntibodies in Immunoscintigraphy(免疫闪烁图像中的单克隆抗体)”(Chatal，CRC Press 1989)详细地描述了其他方法。
抗体与细胞毒性剂的偶联物可以利用各种双功能蛋白偶联剂来制备，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2，6-二异氰酸酯)以及双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta et al.，Science，238：1098(1987)所述，制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫代氰酸基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸偶联至抗体的示例性螯合剂。参见WO94/11026。连接物可以是促进细胞中细胞毒性药物释放的“可切割连接物”。例如，可以使用对酸敏感的连接物、肽酶敏感性连接物、对光敏感的连接物、二甲基连接物或含二硫键的连接物(Chari etal.，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利5,208,020号)。
化合物明确地包括但不限于用下述交联剂制备的ADC：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)，它们是可以商购的(例如，购自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)。参见应用手册和产品目录2003-2004的第467-498页。
抗体药物偶联物的制备
在抗体药物偶联物中(ADC)，通过连接物(L)，将抗体与一个或多个药物部分(D)偶联，例如，每个抗体约1至约20个药物部分。通式I的ADC可以通过几种途径，使用对本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂来制备，其包括：(1)抗体的亲核基团与二价连接试剂反应来通过共价键形成Ab-L，然后与药物部分D反应；和(2)药物部分的亲核基团与二价连接试剂反应来通过共价键形成D-L，然后与抗体的亲核基团反应。本文描述了制备ADC的其他方法。
Ab-(L-D)p         I
连接物可以由一种或多种连接物组分组成。示例性的连接物组分包括6-马来酰亚胺基己酰(“MC”)、马来酰亚胺基丙酰(maleimidopropanoyl)(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧基羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶巯基)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1羧酸酯(“SMCC”)和N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。其他连接物组分在本领域内是已知的，并且某些描述于本文中。还参见，2004年11月5日提交的“Monomethylvaline Compounds Capable ofConjugation to Ligands(能够与配体偶联的一甲基缬氨酸化合物)”美国申请10/983,340号，其内容通过引用明确地整体并入本文。
在某些实施方案中，连接物可以包含氨基酸残基。示例性氨基酸连接物包括二肽、三肽、四肽或五肽。示例性二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。示例性三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。包含氨基酸连接物组分的氨基酸残基包括那些天然存在的氨基酸以及稀有氨基酸(minor amino acid)和非天然存在的氨基酸类似物，如瓜氨酸。可以设计氨基酸连接物组分，并优化其由特定的酶特异性地酶切的选择性，所述酶为例如肿瘤相关的蛋白酶；组织蛋白酶B、C和D；或纤维蛋白溶酶蛋白酶。
抗体上的亲核基团包括但不限于：(i)N-末端氨基；(ii)侧链氨基，如赖氨酸；(iii)侧链巯基，如半胱氨酸；以及(iv)抗体被糖基化时的糖羟基或氨基。氨基、巯基和羟基是亲核的，并且能够与连接物部分和连接试剂上的亲电子基团反应形成共价键，该亲电子基团包括：(i)活性酯，如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯(haloformate)和酸性卤化物；(ii)烷基和苄基卤化物，如卤代乙酰胺；(iii)醛基、酮基、羧基和马来酰亚胺基。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥(cysteine bridge)。抗体可以用诸如DTT(二硫苏糖醇)的还原剂处理来具有对与连接试剂偶联的反应性。因此，每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性巯基亲核体。可以通过赖氨酸与2-亚氨基硫杂环戊烷(Traut试剂(Traut’s reagent))反应将另外的亲核基团导入抗体，从而将胺转化为硫醇。可以通过导入1个、2个、3个、4个或更多的半胱氨酸残基来向抗体(或其片段)导入反应性巯基(例如，制备突变抗体，其包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基)。
抗体药物偶联物还可以通过将抗体修饰以导入亲电子部分来产生，该亲电子部分可以和连接试剂或药物上的亲核取代基反应。可以将糖基化抗体的糖氧化，例如用高碘酸氧化剂氧化来形成可以与连接试剂或药物部分的氨基反应的醛基或酮基。所得的亚胺席夫碱基团可以形成稳定的连接，或者可以被还原，例如通过氢硼化物试剂还原以形成稳定的胺连接。在一实施方案中，糖基化抗体的糖类部分与半乳糖(glactose)氧化酶或偏高碘酸钠的反应，可以在蛋白质中产生可以与药物上的合适基团反应的羰基(醛和酮)(Hermanson，Bioconjugate Techniques)。在另一实施方案中，含有N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可以与偏高碘酸钠反应，从而产生代替第一氨基酸的醛(Geoghegan & Stroh，(1992)BioconjugateChem.3：138-146；US 5,362,852)。这类醛可以与药物部分或连接亲核体反应。
同样，药物部分上的亲核基团包括但不限于氨基、巯基、羟基、酰肼基、肟基、肼基、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基，上述基团能够与连接物部分和连接试剂上的亲电子基团反应以形成共价键，该亲电子基团包括(i)活性酯，如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酸性卤化物；(ii)烷基和苄基卤化物，如卤代乙酰胺；(iii)醛基、酮基、羧基和马来酰亚胺基。
或者，可以制备包含抗体和细胞毒性剂的融合蛋白，例如通过重组技术或肽合成。DNA的长度可以包括编码偶联物的两个部分的各自区域，该两个部分互相邻接或被编码不破坏偶联物的期望特性的连接肽的区域所分离。
仍然在另一实施方案中，抗体可以与“受体”(如链霉抗生物素)偶联，用于肿瘤预定位(pre-targeting)，其中向患者给予抗体受体偶联物，然后利用清除剂(clearing agent)从循环中除去未结合的偶联物，随后给予与细胞毒性剂(例如，放射性核苷酸)偶联的“配体”(例如，抗生物素蛋白)。
制备抗体的某些方法
某些基于杂交瘤的方法
本发明的单克隆抗体可以利用杂交瘤方法来制备，该杂交瘤方法首次描述于Kohler et al.，Nature，256：495(1975)，并且进一步描述于，例如关于人-人杂交瘤的Hongo et al.，Hybridoma，14(3)：253-260(1995)；Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，(ColdSpring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)；Hammerling et al.，在Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(单克隆抗体和T细胞杂交瘤)563-681(Elsevier，N.Y.，1981)中以及Ni，Xiandai Mianyixue，26(4)：265-268(2006)。其他方法包括关于从杂交瘤细胞系产生单克隆人天然IgM抗体的美国专利7,189,826所述的那些方法。人杂交瘤技术(三源杂交瘤(Trioma)技术)描述于Vollmers and Brandlein，Histology andHistopathology，20(3)：927-937(2005)及Vollmers and Brandlein，Methodsand Findings in Experimental and Clinical Pharmacology，27(3)：185-91(2005)中。
对于各种其他杂交瘤技术，参见，例如US 2006/258841；US2006/183887(完全人抗体)；US 2006/059575；US 2005/287149；US2005/100546；US 2005/026229；以及美国专利7,078,492号和7,153,507号。利用杂交瘤方法产生单克隆抗体的示例性方法如下文所述。在一实施方案中，将小鼠或诸如仓鼠的其他合适的宿主动物免疫以产生淋巴细胞，该淋巴细胞产生或能够产生与用于免疫的蛋白特异性结合的抗体。通过多次皮下(sc)注射或腹膜内(ip)注射包含VEGF或其片段的多肽和佐剂来产生抗体，该佐剂例如单磷酰脂质A(MPL)/海藻糖二霉菌酸脂(trehalose dicrynomycolate)(TDM)(Ribi Immunochem.Research，Inc.，Hamilton，MT)。包含VEGF或其片段的多肽可以利用本领域已知的方法来制备，例如重组方法，本文进一步描述了其中某些方法。测定了来自免疫的动物的血清的抗VEGF抗体，并且任选地给予了加强免疫。分离了来自产生抗VEGF抗体的动物的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。
然后利用诸如聚乙二醇的合适融合剂(fusing agent)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。参见，例如Goding，MonoclonalAntibodies：Principles and Practice(单克隆抗体：原理和实践)，pp.59-103(Academic Press，1986)。可以使用的骨髓瘤细胞有效地融合、支持所选的产抗体细胞的稳定高水平地产生抗体并且对诸如HAT培养基的培养基是敏感的。示例性骨髓瘤细胞包括但不限于鼠骨髓瘤细胞系，如源自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些细胞系，其可从索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，California USA)获得；和可从美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection，Rockville，Maryland USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。还描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications(单克隆抗体制备技术及应用)，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
将由此产生的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种并培养，例如含有一种或多种抑制未融合的母骨髓瘤细胞生长或存活的物质的培养基。例如，如果母骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常会包括次黄嘌呤、氨基蝶呤、和胸苷(HAT培养基)，这些物质抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。优选地，例如，如Evenet al.，Trends in Biotechnology，24(3)，105-108(2006)所述，无血清杂交瘤细胞培养方法用于减少诸如胎牛血清的动物来源的血清的使用。
Franek，Trends in Monoclonal Antibody Research，111-122(2005)描述了作为改进杂交瘤细胞培养物产率的工具的寡肽。特别是，标准培养基富集了某些氨基酸(丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、脯氨酸)或蛋白水解物组分，并且由3-6个氨基酸残基构成的合成寡肽可以明显地抑制凋亡。存在的肽的浓度为毫摩尔或更高的浓度。
对于与VEGF结合的单克隆抗体的产生，可以测定杂交瘤细胞生长的培养基。杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性，可以通过免疫沉淀法或通过诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)的体外结合测定来确定，单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过斯卡查德分析(Scatchard analysis)来测定。参见，例如Munson et al.，Anal.Biochem.，107：220(1980)。
鉴定了产生具有期望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过限制稀释方法将克隆亚克隆并通过标准方法使克隆生长。参见，例如Goding，见上文。用于此目的的合适培养基包括，例如D-MEM培养基或RPMI-1640培养基。另外，可以使杂交瘤细胞作为腹水瘤在动物体内生长。通过常规免疫球蛋白纯化方法，例如蛋白A琼脂糖凝胶(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石层析(hydroxylapatite chromatography)、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清适当地分离。从杂交瘤细胞分离蛋白的一种方法描述于US2005/176122和美国专利6,919,436号中。该方法包括在结合过程中使用诸如感胶离子盐(lyotropic salt)的最少量盐(minimal salt)，并且优选地在洗脱过程中使用少量的有机溶剂。
某些文库筛选方法
本发明的抗体可以利用组合文库筛查具有期望活性的抗体来制备。例如，产生噬菌体展示文库和筛查这些文库的具有期望结合特征的抗体的各种方法在本领域内是已知的。这些方法一般描述于Hoogenboom et al.的Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien et al.，ed.，Human Press，Totowa，NJ，2001)。例如，产生目的抗体的一种方法是使用Lee et al.，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-93所述的噬菌体抗体文库。
原则上，通过筛查含有展示与噬菌体外壳蛋白融合的各种抗体可变区(Fv)片段的噬菌体的噬菌体文库来选择合成的抗体。针对期望的抗原，通过亲和层析来筛选这类噬菌体文库。表达能够与期望的抗原结合的Fb片段的克隆被吸附至抗原，因而与文库中非结合抗原分离。然后将结合克隆从抗原洗脱，并通过另一轮抗原吸附/洗脱循环进一步富集。本发明的任何抗体都可以通过下述步骤获得：设计合适的抗原筛查方法以选择目的噬菌体克隆，然后利用来自目的噬菌体克隆的Fv序列和如Kabat etal.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition(免疫学所关注的蛋白的序列，第5版)，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，vols.1-3所述的合适恒定区(Fc)序列构建全长抗体克隆。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合域由约110个氨基酸的各自来自轻链(VL)和重链(VH)的两个可变(V)区形成，其均含有3个高变环(HVR)或互补性决定区(CDR)。如Winter et al.，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)所述，可变域可以在噬菌体上进行功能性展示，或者作为单链Fv(scFv)片段，其中VH和VL通过短的柔性肽共价连接；或者作为Fab片段，其中它们各自与恒定域融合并且非共价地相互作用。如本文所用的，编码scFv的噬菌体克隆和编码Fab的噬菌体克隆共同称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。
如Winter et al.，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)所述，VH和VL基因的集合可以通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆并在噬菌体文库中随机重组，然后可以搜寻该噬菌体文库的抗原结合克隆。来自免疫的来源的文库提供对免疫原的高亲和力的抗体而不要求构建杂交瘤。或者，如Griffiths et al.，EMBO J，12：725-734(1993)所述，可以克隆天然集合(
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repertoire)来为大范围的没有任何免疫作用的非自身抗原以及自身抗原提供单一来源的人抗体。最后，如Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述，天然文库也可以通过下述步骤来合成地制备：克隆来自干细胞的未重排的V基因节段，并利用含有随机序列的PCR引物来编码高变的CDR3区并在体外完成重排。
在某些实施方案中，丝状噬菌体用于展示抗体片段，这是通过与小外壳蛋白pIII融合实现的。抗体片段可以展示为单链Fv片段，其中如Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述，VH域和VL域通过柔性多肽间隔区连接在相同的多肽链上；或者展示为Fab片段，其中，例如如Hoogenboom et al.，Nucl.Acids Res.，19：4133-4137(1991)所述，一条链与pIII融合而另一条链被分泌至细菌宿主细胞周质，其中Fab-外壳蛋白结构的组装通过取代某些野生型外壳蛋白被展示在噬菌体表面。
通常，编码抗体基因片段的核酸获得自从人或动物收获的免疫细胞。如果期望偏好抗VEGF克隆的文库，则将个体用VEGF免疫以产生抗体应答，并回收脾细胞和/或循环B细胞其他外周血淋巴细胞(PBL)，用于构建文库。在优选的实施方案中，偏好抗VEGF克隆的人抗体基因片段文库通过下述方法获得：在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列的转基因小鼠(并且缺乏功能性内源抗体产生系统)中产生抗VEGF抗体应答，从而使VEGF免疫产生B细胞，所述B细胞产生抗VEGF的人抗体。
抗VEGF反应性细胞群的其他富集物可以利用合适的筛查方法分离表达VEGF特异性膜结合抗体的B细胞，通过例如利用VEGF亲和层析或者细胞对荧光染料标记的吸附，然后进行流式活化细胞分选(flow-activated cell sorting，FACS)，分离细胞。
或者，使用来自未免疫供体的脾细胞和/或B细胞或其他PBL提供可能的抗体集合的更好表现度(representation)，并且还允许利用VEGF不是抗原性的任何动物(人或非人)物种构建抗体文库。对于包含体外抗体基因构建体的文库，从个体收获干细胞以提供编码未重排的抗体基因节段的核酸。目的免疫细胞可以获得自各种动物物种，如人、小鼠、大鼠、兔(lagomorpha)、luprine、犬(canine)、猫(feline)、猪(porcine)、牛(bovine)、马(equine)和鸟(avian)类物种等。
从目的细胞回收编码抗体可变基因节段(包括VH和VL节段)的核酸，并将其扩增。在重排的VH和VL基因文库的情况下，如Orlandi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A)，86：3833-3837(1989)所述，期望的DNA可以通过下述方法获得：从淋巴细胞分离基因组DNA或mRNA，然后进行使用匹配重排的VH和LV基因5’和3’末端的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，从而制备用于表达的不同V基因的集合。如Orlandi et al.(1989)和Ward et al.，Nature，341：544-546(1989)所述，V基因可以利用位于编码成熟V域的外显子的5’末端的反向引物和基于J-节段内的正向引物，从cDNA和基因组DNA扩增。然而，为了从cDNA扩增，如Jones et al.，Biotechnol.，9：88-89(1991)所述，反向引物还可以基于前导外显子内；并且如Sastry et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A)，86：5728-5732(1989)所述，正向引物可以基于恒定区中。为了将互补性最大化，可以如Orlandi et al.(1989)或Sastry et al.(1989)所述，在引物中包括简并性。在某些实施方案中，例如，如Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)的方法所述，或如Orum et al.，Nucleic Acids Res.，21：4491-4498(1993)的方法所述，通过利用靶向每个V基因家族的PCR引物以扩增存在于免疫细胞核酸样品中的全部可用VH和VL排列，将文库多样性最大化。为了将扩增的DNA克隆于表达载体中，如Orlandi et al.(1989)所述，可以将作为一个末端的标签的少数限制性酶切位点导入PCR引物，或者如Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)所述，通过使用标记的引物进行进一步PCR扩增。
合成重排的V基因的集合可以体外源自V基因节段。已经克隆并测序了大部分人VH基因节段(据Tomlinson et al.，J.Mol.Biol.，227：776-798(1992)报道)，并且进行了定位(据Matsuda et al.，Nature Genet.，3：88-94(1993)报道)；如Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述，这些克隆的节段(包括H1和H2环的全部主要构象)可以用于利用编码不同序列和长度的H3环的PCR引物来产生不同VH基因的集合。如Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，89：4457-4461(1992)所述，VH集合还可以用集中于单一长度的长H3环的全部序列多样性来制备。已经克隆并测序了人Vκ和Vλ节段(据Williams and Winter，Eur.J.Immunol.，23：1456-1461(1993)报道)，并且可以用于制备合成的轻链集合。基于一系列VH和VL倍数及L3和H3长度，合成的V基因集合将编码具有结构多相当样化的抗体。扩增编码V基因的DNA后，可以根据Hoogenboomand Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)的方法，在体外将种系V基因节段重排。
抗体片段的集合可以通过将VH和VL基因集合以几种方式组合在一起来构建。可以在不同的载体中产生每个集合，并且将该载体进行体外重组，例如如Hogrefe et al.，Gene，128：119-126(1993)所述，或者通过组合感染进行体内重组，例如使用Waterhouse et al.，Nucl.Acids Res.，21：2265-2266(1993)所述的loxP系统。体内重组方法利用Fab片段的双链特性克服大肠杆菌转化效率所施加的对文库大小的限制。分别克隆天然NH和VL集合，一个克隆入噬菌粒，另一个克隆入噬菌体载体。然后将两个文库通过含有噬菌粒的细菌的噬菌体感染组合，从而使每个细胞含有不同的组合，并且文库的大小仅受存在的细胞数目(约1012个克隆)的限制。两种载体都含有体内重组信号，从而使VH和VL基因重组至单个复制子并且共包装于噬菌体病毒粒子中。这些巨大的文库了提供大量具有良好亲和力(Kd -1为约10-8M)的不同抗体。
或者，可以例如如Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，88：7978-7982(1991)所述，将集合顺序地克隆于相同的载体中，或者例如如Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)所述，将集合通过PCR组装在一起然后克隆。PCR组装还可以用于将VH和VL DNA与编码柔性肽间隔区的DNA连接，形成单链Fv(scFv)集合。仍然在其他技术中，如Embleton et al.，Nucl.Acids Res.，20：3831-3837(1992)所述，“细胞内PCR组装”用于组合淋巴细胞内的VH和VL基因，然后克隆连接的基因。
由自然文库(天然或合成)产生的抗体可以具有中等的亲和力(Kd -1为106-107M-1)，但是也可以通过构建次级文库并从其中进行再选择来体外模拟亲和力成熟，如上文的Winter et al.(1994)所述。例如，根据Hawkinset al.，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992)的方法，或者根据Gram et al.，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A，89：3576-3580(1992)的方法，可以通过易错聚合酶(据Leung et al.，Technique，1：11-15(1989)报道)在体外随机导入突变。另外，亲和力成熟可以通过下述方法来进行：例如，在所选的单个Fv克隆中，利用使用携带跨越目的CDR的随机序列的引物进行PCR，并筛查较高亲和力的克隆，随机突变一个或多个CDR。WO 9607754(公开于1996年3月14日)描述了在免疫球蛋白轻链的互补性决定区中进行诱变以产生轻链基因文库的方法。如Marks et al.，Biotechnol.，10：779-783(1992)所述，另一有效的方法是通过噬菌体展示，将所选的VH或VL域与获得自未免疫供体的天然存在的V域变体重组，并在几轮链再改组中筛查较高的亲和力。这种技术允许产生亲和力为约10-9M或更低的抗体或抗体片段。
文库的筛查可以通过本领域已知的各种技术完成。例如，VEGF可以用于涂覆吸附板的孔，在附着至吸附板上的宿主细胞上表达，或者用于细胞分选，或者与生物素偶联至用于捕捉涂覆了链霉抗生物素的珠，或者用于筛选(pan)噬菌体展示文库的任何其他方法。
在适合使至少一部分噬菌体颗粒与吸附剂接触的条件下，使噬菌体文库样品与固定的VEGF接触。通常，选择包括pH、离子强度、温度等的条件来模拟生理条件。将与固相结合的噬菌体洗涤，然后例如如Barbaset al.，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A，88：7978-7982(1991)所述地用酸洗脱，或例如如Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述地用碱洗脱，或者根据例如类似于Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)的抗原竞争方法的方法，通过VEGF抗原竞争来洗脱。可以在一轮选择中将噬菌体富集20-1,000倍。而且，可以使富集的噬菌体生长在细菌培养中，并进行另外轮次的选择。
选择的效率取决于许多因素，包括洗涤期间的解离动力学，以及单个噬菌体上的多个抗体片段是否能同时与抗原结合。具有快解离动力学(弱结合亲和力)的抗体可以利用短洗涤、多价噬菌体展示和固相中高涂覆密度的抗原来保留。高密度不仅通过多价相互作用稳定噬菌体，还促进解离的噬菌体的再结合。具有慢解离动力学(强结合亲和力)的抗体的选择可以利用长洗涤和如Bass et al.，Proteins，8：309-314(1990)和WO92/09690所述的单价噬菌体展示以及如Marks et al.，Biotechnol.，10：779-783(1992)所述的低涂覆密度的抗原来促进。
对于VEGF，可能在不同亲和力甚至是稍微不同的亲和力的噬菌体抗体之间进行选择。然而，所选抗体的随机突变(例如，如在某些亲和力成熟技术中所进行的)可能产生许多突变体，大部分突变体与抗原结合，并且一些突变体具有较高的亲和力。通过限制VEGF，可以竞争出少量高亲和力噬菌体。为了保留全部较高亲和力的突变体，可以用过量生物素化的VEGF孵育噬菌体，但是该生物素化的VEGF的体积摩尔浓度比VEGF的靶摩尔亲和常数低。然后可以通过涂覆了链霉抗生物素的顺磁珠捕捉高结合亲和力的噬菌体。这种“平衡捕捉”允许根据抗体的结合亲和力来选择抗体，并且其灵敏度允许从非常过量的较低亲和力的噬菌体分离低至2倍的较高亲和力的突变体克隆。也可以控制洗涤与固相结合的噬菌体所用的条件来基于解离动力学进行区分。
抗VEGF克隆可以基于活性进行选择。在某些实施方案中，本发明提供与天然表达VEGF的活细胞结合的抗VEGF抗体。在一实施方案中，本发明提供阻断VEGF配体与VEGF之间的结合、但是不阻断VEGF配体与第二蛋白之间的结合的抗VEGF抗体。对应于这种抗VEGF抗体的Fc克隆可以根据下述方法进行选择：(1)从如上文所述的噬菌体文库分离抗VEGF克隆，并且任选地通过使噬菌体克隆的分离群体在合适细菌宿主中生长来扩增该群体；(2)分别选择VEGF和阻断及不阻断抗其活性的第二蛋白是期望的；(3)将抗VEGF噬菌体克隆吸附至固定的VEGF；(4)利用过量的第二蛋白来洗脱任何不期望的克隆，其识别与第二蛋白的结合决定簇重合或共享的VEGF结合决定簇；以及(5)洗脱在步骤(4)后保留吸附的克隆。任选地，可以将本文所述的选择方法重复一次或更多次来进一步富集具有期望的阻断/非阻断特性的克隆。
利用常规方法(例如，利用设计为特异地从杂交瘤或噬菌体DNA模板扩增所关注的重链和轻链编码区的寡核苷酸引物)，容易地分离并测序DNA，其编码本发明的源自杂交瘤的单克隆抗体或噬菌体展示Fv克隆。一旦分离，可以将DNA置于表达载体中，然后将其转染入不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞，如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，来在重组宿主细胞中合成期望的单克隆抗体。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述，包括Skerra et al.，Curr.Opinion in Immunol.，5：256(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs，130：151(1992)。
可以将编码本发明的Fv克隆的DNA与已知的编码重链和/或轻链恒定区的DNA序列(例如，可以获得自上文的Kabat et al.的合适的DNA序列)组合，以形成编码全长或部分长度的重链和/或轻链的克隆。应当理解，任何同种型的恒定区可以用于这个目的，其包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且这些恒定区可以获得自任何人或动物物种。本文所用的“嵌合”和“杂交”抗体的定义包括Fv克隆，其源自一种动物(如人)物种的可变域DNA，随后与其他动物物种的恒定区融合以形成“杂交”的全长重链和/或轻链的编码序列。在某些实施方案中，使源自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合以形成全长或部分长度的人重链和/或轻链的编码序列。
还可以修饰编码源自杂交瘤的本发明的抗VEGF抗体的DNA，例如，通过用人重链和轻链恒定域的编码序列取代源自杂交瘤克隆的同源鼠序列(例如，通过如Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，81：6851-6855(1984)的方法)。编码源自杂交瘤或Fv克隆的抗体或片段的DNA，可以通过下述方法进一步修饰：共价地连接至免疫球蛋白编码序列、全部或部分非免疫球蛋白多肽的编码序列。通过这种方法，制备了“嵌合”或“杂交”抗体，其对源自Fv克隆或杂交瘤克隆的本发明的抗体具有结合特异性。
载体、宿主细胞和重组方法
抗体还可以利用重组方法产生。为了重组产生抗VEGF抗体，分离编码该抗体的核酸，并将其插入用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达的复制载体。编码该抗体的DNA可以容易地利用常规方法分离和测序(例如，利用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。许多载体是可用的。通常，载体组分通常包括但不限于一种或多种下述组分：信号序列、复制起点、一个或多个标志物基因、增强子元件、启动子以及转录终止序列。
信号序列组分
本发明的抗体不但可以直接重组制备，还可以作为与异源多肽的融合多肽来制备，该异源多肽优选是在成熟蛋白或多肽的N-末端具有特异性切割位点的信号序列或其他多肽。所选的异源信号序列优选是被宿主细胞识别并加工(即，被信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞而言，信号序列被，例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列取代。对于酵母分泌物而言，天然信号序列可以被下述序列取代：例如，酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括酵母(Saccharomyces)和克鲁维酵母(Kluyveromyces)α因子前导序列)或酸性磷酸酶前导序列、白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前导序列或WO 90/13646中所述的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及诸如单纯疱疹gD信号的病毒分泌前导序列是可用的。
复制起点
表达和克隆载体都含有能使该载体在一种或多种所选的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列是能使该载体独立于宿主染色体DNA进行复制的序列，并且包括复制起点或自主复制序列。这种序列对于各种细菌、酵母和病毒是已知的。来自质粒pBR322的复制起点适合于大部分革兰氏阴性菌，2μ质粒起点适合于酵母，且各种病毒起点(SV40、多瘤、腺病毒、VSV或BPV)对于哺乳动物细胞的克隆载体是有用的。通常，复制起点组分并非哺乳动物表达载体所需的(通常可以使用SV40起点，仅因为其含有早期启动子)。
选择基因组分
表达和克隆载体可以含有选择基因，其又称为选择性标志物。通常的选择基因编码蛋白，其(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，如氨苄西林、新霉素、氨甲蝶呤或四环素；(b)补充营养缺陷；或者(c)供应从复合培养基中不可得的关键营养，如杆菌(Bacilli)的编码D丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个实例利用使宿主细胞生长停滞的药物。成功地转化了异源基因的那些细胞产生赋予抗药性的蛋白，因而幸免于选择方案。这类显性选择的实例利用药物新霉素、麦考酚酸和潮霉素。
用于哺乳动物细胞的合适选择性标志物的另一实例是，能鉴定细胞组分的那些选择性标志物，所述细胞组分吸收编码抗体的核酸，例如DHFR；谷氨酰胺合成酶(GS)；胸苷激酶；金属硫蛋白I和II，优选灵长类金属硫蛋白基因；腺苷脱氨酶；鸟氨酸脱羧酶等。
例如，转化了DHFR基因的细胞，通过将转化体在含有DHFR的竞争性拮抗剂氨甲蝶呤(Mtx)的培养基中进行培养来鉴定。在这些条件下，DHFR随任何其他共转化的核酸一起扩增。可以使用缺乏内源DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(如，ATCC CRL-9096)。
或者，转化了GS基因的细胞，通过将转化体在含有GS抑制剂L-甲硫氨酸亚砜(sulfoximine)(Msx)的培养基中进行培养来鉴定。在这些条件下，GS基因随任何共转化的核酸一起扩增。GS选择/扩增系统可以与上文所述的DHFR选择/扩增系统组合使用。
或者，转化或共转化了编码目的抗体的DNA序列、野生型DHFR基因和诸如氨基糖苷3’-磷酸转移酶(APH)的另一选择性标志物的宿主细胞(特别是含有内源DHFR的野生型宿主)，可以通过培养基中的细胞生长来选择，该培养基含有用于选择性标志物的选择试剂，例如氨基糖苷类抗生素，如卡那霉素、新霉素或G418。参见美国专利4,965,199号。
用于酵母的合适的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb et al.，Nature，282：39(1979))。trp1基因提供缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株的选择标志物，例如ATCC No.44076或PEP4-1。Jones，Genetics，85：12(1977)。酵母宿主细胞基因组中trp1损伤的存在为通过缺乏色氨酸下的生长检测转化提供有效环境。类似地，Leu2缺陷的酵母株(ATCC 20,622或38,626)由携带Leu2基因的已知质粒补偿。
另外，源自1.6μm环状质粒pKD1的载体可以用于克鲁维酵母(Kluyveromyces)的转化。或者，报道了乳酸克鲁维酵母(K.lactis)的用于大规模产生重组小牛凝乳酶的表达系统。Van den Berg，Bio/Technology，8：135(1990)。还公开了通过克鲁维酵母的工业株分泌成熟的重组人血清白蛋白的稳定的多拷贝表达载体。Fleer et al.，Bio/Technology，9：968-975(1991)。
启动子组分
表达和克隆载体通常含有启动子，其被宿主有机体识别并与编码抗体的核酸可操作地连接。适合用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统和杂交启动子，如tac启动子。然而，其他已知的细菌启动子是合适的。用于细菌系统的启动子也含有与编码抗体的DNA可操作地连接的细菌mRNA核糖体结合序列(Shine-Dalgamo(S.D.)sequence)。
真核生物的启动子序列是已知的。实际上全部真核基因都具有位于转录起始位点上游约25-30个碱基的富含AT的区域。在许多基因转录开始的上游70-80个碱基处发现的另一序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大部分真核基因的3’末端处是AATAAA序列，其可以是向编码序列的3’末端添加聚腺苷酸的信号。全部这些序列都适合于插入真核表达载体。
用于酵母宿主的合适启动子序列的实例包括3-磷酸甘油酸酯激酶或其他糖酵解酶的启动子，如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡糖异构酶以及葡糖激酶。
其他酵母启动子，是具有由生长条件控制的转录的额外优势的诱导型启动子，是醇脱氢酶2、isocytochrome C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。用于酵母表达的适合的载体和启动子，还描述于EP73,657。还有利地与酵母启动子一起使用酵母增强子。
可以控制抗体从哺乳动物宿主细胞载体的转录，例如通过获得自病毒基因组的启动子，如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、鸟肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒、猿猴病毒40(SV40)；或者通过获得自异源哺乳动物启动子的启动子，如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子；或者通过获得自热休克启动子的启动子，其条件是这些启动子与宿主细胞系统是相容的。
SV40病毒的早期和晚期启动子通常以SV40限制片段获得，该片段也含有SV40病毒复制起点。人巨细胞病毒的即时早期启动子通常以HindIII E限制片段获得。在哺乳动物宿主中利用牛乳头状瘤病毒作为载体表达DNA的系统公开于美国专利4,419,446号。这种系统的改进描述于美国专利4,601,978号。关于人β-干扰素cDNA在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下在小鼠细胞中的表达，还参见Reyes et al.，Nature 297：598-601(1982)。或者，可以用劳斯肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
增强子元件组分
通过高等真核生物转录编码本发明的抗体的DNA，通常由向载体中插入增强子序列而增加。哺乳动物基因的许多增强子序列目前是已知的(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点下游(late side)(bp 100-270)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点下游的多瘤增强子和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件，还参见Yaniv，Nature 297：17-18(1982)。可以将增强子剪接入载体的抗体编码序列的5’或3’位置，但是优选地位于启动子的5’位点。
转录终止组分
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞有机体的有核细胞)的表达载体也含有转录终止和稳定mRNA所需的序列。这些序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5’、有时是3’的未翻译区域获得。这些区域含有核苷酸节段，其转录为编码抗体的mRNA的未翻译部分的聚腺苷酰化片段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素聚腺苷酸化区域。参见WO94/11026和本文公开的表达载体。
宿主细胞的选择和转化
本文用于克隆和表达载体中的DNA的合适宿主细胞是上文所述的原核细胞、酵母或高等真核细胞。用于该目的的合适原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性有机体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，如大肠杆菌；肠杆菌属(Enterobacter)；欧文氏菌属(Erwinia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；变形杆菌属(Proteus)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)；志贺氏菌属(Shigella)；以及芽孢杆菌(Bacilli)，如枯草杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公开的DD 266,710所公开的地衣芽孢杆菌)；假单胞菌属(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌；和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC27,325)的其他菌株也是合适的。这些实例是示例性的而不是限制性的。
特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时，例如，当治疗抗体与自身有效地破坏肿瘤细胞的细胞毒性剂(例如，毒素)偶联时，可以在细菌中产生全长抗体、抗体融合蛋白和抗体片段。全长抗体在循环中有较长的半衰期。在大肠杆菌中的产生更快并且更有效。对于细菌中抗体片段和多肽的表达，参见，例如U.S.5,648,237(Carter et.al.)、U.S.5,789,199(Jolyet al.)、U.S.5,840,523(Simmons et al.)，其描述了优化表达和分泌的翻译起始区(TIR)和信号序列。还参见Charlton，Methods in Molecular Biology，Vol.248(B.K.C.Lo，ed.，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，pp.245-254，其描述了大肠杆菌中抗体片段的表达。表达后，可以从可溶性组分中的大肠杆菌细胞团(cell paste)中分离抗体，并且可以通过例如，取决于同种型的蛋白A或G柱来进行纯化。最终纯化可以类似于表达于例如，CHO细胞的抗体的纯化过程来进行。
除了原核生物以外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也是用于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母(baker’s yeast)，是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属、种和菌株通常是可得的并且可用于本文中，例如，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母宿主，如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)、魏氏克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、瓦尔特克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶罗维亚酵母(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；念珠菌(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；施氏酵母(Schwanniomyces)，如西方施氏酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，如脉孢菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、弯颈霉(Tolypocladium)；以及曲霉(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。对于讨论用于产生治疗蛋白的酵母和丝状真菌的综述，参见，例如Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)。
可以选择某些真菌和酵母菌株，其中糖基化途径已经被“人源化”，从而导致具有部分或全部人糖基化方式的抗体的产生。参见，例如Li et al.，Nat.Biotech.24：210-215(2006)(描述巴斯德毕赤酵母中糖基化途径的糖基化)；和Gerngross et al.，见上文。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞还源自多细胞有机体(无脊椎动物和脊柱动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体以及来自诸如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bnombyxmori)的宿主的相应允许性昆虫宿主细胞。公众可获得用于转染的各种毒株，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5的毒株，并且这些病毒可以用作本发明的病毒，特别是用于草地贪夜蛾细胞的转染。
棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、浮萍(浮萍科(Lemnaceae))、苜蓿(蒺藜苜蓿(M.truncatula))和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。参见，例如美国专利5,959,177号、6,040,498号、6,420,548号、7,125,978号和6,417,429号(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞可以用作宿主，并且培养(组织培养)的脊椎动物细胞的增殖已经是常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是转化了SV40的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(悬浮液培养中生长的293或293个亚克隆细胞，Graham et al.，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠赛托利(sertoli)细胞(CV1 ATCC CCL 70)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather et al.，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其包括DHFR-CHO细胞(Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，如NS0和Sp2/0。关于适合抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如Yazaki and Wu，Methods in Molecular Biology，Vol.248(B.K.C.Lo，ed.，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，pp.255-268。
将宿主细胞用上文所述的表达或克隆载体转化，用于产生抗体，并在改良为适合诱导启动子的常规营养培养基中培养，从而选择转化体或者扩增编码期望序列的基因。
培养宿主细胞
可以将用于产生本发明的抗体的宿主细胞培养于各种培养基中。可商购的培养基适合于培养宿主细胞，如Ham’s F10(Sigma)、最小必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle′s Medium，DMEM，Sigma)。另外，下述文献中所述的任何培养基都可以用作宿主细胞的培养基：Ham et al.，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes et al.，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利4,767,704号、4,657,866号、4,927,762号、4,560,655号或5,122,469号；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985。这些培养基中的任何培养基都可以按需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙盐、镁盐和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔的终浓度存在的无机化合物)以及葡萄糖或相当的能量来源。还可以以本领域技术人员已知的合适浓度包括任何其他必需补充物。诸如温度、pH等的培养条件是选择用于表达的宿主细胞以前所用的那些条件，并且对普通技术人员是显而易见的。
抗体的纯化
当使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间产生抗体，或者将抗体直接分泌至培养基中。如果在细胞内产生抗体，作为第一步，例如通过离心或超滤，去除宿主细胞或裂解片段的颗粒碎片。Carter et al.，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了分离被分泌至大肠杆菌周质空间的抗体的方法。简言之，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在的情况下，将细胞团融化约30min(分钟)。可以通过离心去除细胞碎片。当抗体被分泌至培养基时，通常首先将这类表达系统的上清液利用可商购的蛋白浓缩滤器浓缩，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元。可以在任何前述步骤中加入诸如PMSF的蛋白酶抑制剂，以抑制蛋白水解，并且可以加入抗生素以防止外来污染物的生长。
从细胞制备的抗体组合物可以利用下述方法纯化：例如羟基磷灰石层析、疏水相互作用层析、凝胶电泳、透析和亲和层析，并且亲和层析是通常优选的纯化步骤之一。蛋白A作为亲和配体的适用性取决于存在于抗体中的任何免疫球蛋白Fc域的种类和同种型。蛋白A可以用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。推荐蛋白G用于全部小鼠同种型和用于人γ3(Guss et al.，EMBO J.5：15671575(1986))。亲和配体附着的基质最常见为琼脂糖，但是其他基质也是可用的。诸如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯的物理上稳定的基质，允许实现比琼脂糖更快的流动速率和更短的处理时间。当抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)可用于纯化。取决于要回收的抗体，其他蛋白纯化技术也是可用的，例如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅石上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的层析、聚焦层析、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
任何初级纯化步骤后，利用pH为约2.5-4.5的洗脱缓冲液，可以对包含目的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，优选地在低盐浓度下进行(例如，约0-0.25M的盐)。
通常，制备用于研究、测试和临床的抗体的各种确立的方法，在本领域内是确立已久的，与用于所关注的特定抗体的上文所述的方法一致和/或被本领域技术人员认为是合适的。
药物制剂和剂量
将以符合良好医药实践的方式来配制、剂量给予(dose)和给予抗体组合物。本文上下文中的考虑因素包括，治疗的具体病症、治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的原因、试剂递送位点、给药方法、给药方案以及对临床医师已知的的其他因素。要给予的抗体的“治疗有效量”将通过这些考虑来控制，并且是预防、改善或治疗疾病或病症所需的最小量。抗体不需要，但是任选地与一种或多种当前使用的试剂一起配制来预防或治疗所考虑的病症。这些其他试剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量、病症或治疗的类型以及上文所讨论的其他因素。这些试剂通常以相同的剂量和以上文中所用的给药途径或者在这之前所用剂量的约1％-99％来使用。通常，疾病或病症的缓和或治疗涉及一种或多种症状或与疾病或病症有关的医疗问题的减轻。在癌症的情况下，治疗有效量的药物可以实现下述结果之一或组合：减少癌细胞的数目；减小肿瘤的大小；抑制(即降低至某种程度和/或阻止)癌细胞渗入周围器官；抑制肿瘤转移；将肿瘤生长抑制至某种程度；和/或将与癌症有关的一种或多种症状缓解至某种程度。对于药物可以防止现有癌细胞的生长和/或杀死现有癌细胞的长度而言，药物可以是抑制细胞的和/或细胞毒性的。在某些实施方案中，本发明的组合物可以用于预防个体或哺乳动物的疾病或病症的发作或复发。
对于疾病的预防或治疗而言，本发明抗体的合适剂量(当单独使用或与一种或多种其他额外的治疗剂组合使用时)，将取决于要治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和进程、是否为预防或治疗目的给予抗体、以前的治疗、患者的病历(clinical history)和对抗体的应答以及主治医师的意见。以一次或在一系列的治疗内向患者合适地给予抗体。
在某些实施方案中，取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg-50mg/kg(即0.1-20mg/kg)的抗体是给予患者的初始候选剂量，而无论是通过一次或多次单独给药或是通过连续输注。在另一实施方案中，约1μg/kg-15mg/kg(即0.1mg/kg-10mg/kg)是向给予患者的初始候选剂量。取决于上文所述的因素，通常的每日剂量为约1μg/kg-100mg/kg或更多。对于几天或更长的重复给药，取决于疾病状态，持续治疗至出现期望的对疾病症状的抑制。
抗体的一种示例性剂量是约0.05mg/kg至约15mg/kg。因此，可以向患者给予约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg或15mg/kg(或其任何组合)的剂量的一种或多种。这些剂量可以间隔地给予，例如每天、每3天、每周或每2至3周(例如，从而使患者接受约2至约20、或例如约6份剂量的抗体)。在一实施方案中，每3天给予约10mg/kg的剂量。可以给予初始较高的负荷剂量，然后给予一种或多种较低的剂量。在一实施方案中，示例性剂量给药方案包括给予约4mg/kg抗体的初始负荷剂量，然后每周保持约2mg/kg抗体的剂量。然而，其他剂量方案也是有用的。
在某些实施方案中，本文所讨论的剂量给药方案与化学疗法方案联合使用，作为治疗转移性结肠直肠癌的一线治疗(first line therapy)。在某些方面，化学疗法方案涉及常规高剂量间隔给药。在某些其他方面，以较少和更高频率的剂量而不安排中断地给予化疗剂(“节拍化疗”)。
本发明的治疗进展通过常规技术和测定容易地监测。
本发明的抗体(和任何其他治疗剂或佐剂)可以通过任何合适的方式给药，包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内给药，并且若需要，用于局部治疗、病灶内给药。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。另外，抗体适合通过脉冲输注给予，特别是以逐渐减少的抗体剂量。剂量给药可以通过任何合适的途径，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分地取决于给药是短期还是长期的。
本文的药物制剂还可以含有要治疗的特定指标(indication)所需的了多于一种的活性化合物，优选那些具有不互相产生不良效果的互补活性化合物。这些分子合适以对预期的目的有效的量组合存在。
通过将具有期望程度的纯度的抗体与任选的生理可接受的媒介物、赋形剂或稳定剂混合(Remington：The Science and Practice of Pharmacy20th edition(雷明顿：制药的科学和实践，第20版)(2000))，制备水溶液、冷冻干燥或其他干燥制剂形式的药物制剂，用于储藏。在所用剂量和浓度下，可接受的媒介物、赋形剂或稳定剂对受体是无毒的，并且包括缓冲剂，如磷酸、柠檬酸、组氨酸和其他有机酸缓冲液；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚醇、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
例如通过凝聚技术或通过界面聚合，还可以将活性成分装入制备的微胶囊，分别例如装入羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯(methylmethacylate))微胶囊中，装入在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳状液和纳米胶囊)或在粗乳状液中。这类技术公开于Remington：The Science and Practice of Pharmacy 20th edition(雷明顿：制药的科学和实践，第20版)(2000)。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这由通过无菌滤膜的过滤容易地完成。
可以制备缓释剂。缓释剂的合适实例包括含有本发明的免疫球蛋白的固体疏水聚合物的半透基质，该基质是成形的物体(article)，例如膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯；水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)；聚交酯(美国专利3,773,919号)；L-谷氨酸与γ-L-乙基-谷氨酸(γethyl-L-glutamate)的共聚物；不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯；可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)组成的可注射微球体)；以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物允许分子释放超过100天，但是某些水凝胶在较短的时间段内释放蛋白质。当封装的免疫球蛋白在体内长时间保留时，它们可以由于暴露于37℃下的水分而变性或聚集，这导致了生物活性的损失和可能的免疫源性改变。根据涉及的机制，可以设计出用于稳定的合理策略。例如，如果发现聚集机制是通过巯基-二硫键交换的分子间S-S键形成，则可以通过修饰硫氢基残基、从酸性溶液冷冻干燥、控制水分含量、使用合适的添加剂以及开发特定的聚合物基质成分来实现稳定。
方法
治疗方法
本发明的抗体可以用于，例如体外、离体(ex vivo)和体内治疗方法。
一方面，本发明提供了治疗或预防肿瘤、癌症和/或细胞增殖病症(与VEGF的表达和/或活性的增加有关的病症)的方法，其包括向需要这种治疗的个体给予有效量的抗VEGF抗体。
一方面，本发明提供减少、抑制、阻断或防止肿瘤或癌症生长的方法，该方法包括向需要这种治疗的个体给予有效量的抗VEGF抗体。
一方面，本发明提供抑制血管生成的方法，其包括向需要这种治疗的个体给予有效量的抗VEGF抗体。
一方面，本发明提供抑制血管通透性的方法，其包括向需要这种治疗的个体给予有效量的抗VEGF抗体。
一方面，本发明提供治疗与血管生成有关的病理状况的方法，其包括向需要这种治疗的个体给予有效量的抗VEGF抗体。在某些实施方案中，与血管生成有关的病理状况是肿瘤、癌症和/或细胞增殖病症。
出于治疗目的，可以向人给予本发明的抗体。在一实施方案中，本发明的抗体用于结合个体的VEGF的方法，该个体患有与VEGF表达和/或活性增加有关的病症，所述方法包括向该个体给予抗体，从而使个体的VEGF被结合了。在一实施方案中，VEGF是人VEGF，并且个体时人个体。或者，个体是表达与本发明的抗体结合的VEGF的哺乳动物。仍然更进一步地，个体可以是被导入了VEGF(例如，通过VEGF的给药或通过编码VEGF的转基因的表达)的哺乳动物。
一方面，至少某些本发明的抗体可以与除了人以外的物种的VEGF结合。因此，本发明的抗体可以用于与特异性抗原活性结合，例如在含有抗原的细胞培养物中，在具有与本发明的抗体交叉反应的抗原的人个体或其他哺乳动物个体中(例如黑猩猩、狒狒、绒猴、猕猴(cynomolgus)和恒河猴、猪或小鼠)。在一实施方案中，本发明的抗体可以用于抑制抗原活性，其通过使抗体与抗原接触来抑制抗原活性。优选地，抗原是人蛋白分子。
而且，用于兽医目的或作为人疾病的动物模型，可以将本发明的抗体给予表达与抗体交叉反应的VEGF的非人哺乳动物(例如灵长类、猪、大鼠或小鼠)。关于后者，这些动物模型可以用于评价本发明的抗体的治疗效果(例如剂量测试和给药时程)。
本发明的抗体可以用于治疗、抑制疾病、病症或与一种或多种抗原分子的表达和/或活性有关的疾病状态；延缓疾病、病症或与一种或多种抗原分子的表达和/或活性有关的疾病状态的进程；预防/延缓疾病、病症或与一种或多种抗原分子的表达和/或活性有关的疾病状态的复发；或预防疾病、病症或与一种或多种抗原分子的表达和/或活性有关的疾病状态。
本发明包括预防和质量肿瘤转移和抗血管生成癌症疗法、新癌症治疗策略，其目的是抑制为支持肿瘤生长提供营养所要求的肿瘤血管发展。本发明特别包括在原发部位(primary site)抑制肿瘤的肿瘤性生长以及在继发部位(secondary site)抑制预防和/或治疗肿瘤的转移，从而允许通过其他疗法来攻击肿瘤。本文中要治疗(包括预防)的癌症的实例包括但不限于癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这些癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)；肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌；肺的腺癌和肺的鳞癌；腹膜的癌症；肝细胞癌；胃癌或胃癌，包括胃肠癌和胃肠基质癌；胰腺癌；成胶质细胞瘤；宫颈癌；卵巢癌；肝癌；膀胱癌；尿道的癌症；肝细胞瘤；乳腺癌；结肠癌；直肠癌；结肠直肠癌；子宫内膜癌或子宫癌；唾液腺癌；肾癌或肾癌；前列腺癌；外阴癌；甲状腺癌；肝癌(hepatic carcinoma)；肛癌；阴茎癌；黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；恶性雀斑样痣黑素瘤；肢端雀斑样痣性黑素瘤；结节性黑素瘤；多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤(包括低度/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中度/滤泡性NHL；中级弥散性NHL；高度免疫母细胞型NHL；高级原始淋巴细胞型NHL；高度小无裂细胞NHL；肿块性病变NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关的淋巴瘤；以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性成淋巴细胞白血病(ALL)；多毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病；和移植后淋巴组织增生病症(PTLD)及与斑痣性错构瘤病有关的异常血管增殖；水肿(如与脑瘤有关的水肿)；梅格斯综合征；脑癌以及头和颈癌以及相关的转移。在某些实施方案中，可通过本发明的抗体治疗的癌症包括乳腺癌、结肠直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西肉瘤、类癌肿瘤、头和颈癌、卵巢癌、间皮瘤以及多发性骨髓瘤。在某些实施方案中，癌症选自小细胞肺癌、成神经细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌(CRC)和肝细胞癌。仍然，在某些实施方案中，癌症选自非小细胞肺癌、结肠直肠癌和乳腺癌，并且包括那些癌症的转移形式。
在某些实施方案中，向患者给予免疫偶联物，其包含与一种或多种细胞毒性剂偶联的抗体。在某些实施方案中，免疫偶联物和/或抗与其结合的抗原被细胞内化，从而使免疫偶联物杀伤与其结合的靶细胞的效率增加。在一实施方案中，细胞毒性剂靶向或感染靶细胞中的核酸。在一实施方案中，细胞毒性剂靶向或干扰微管聚合。这类细胞毒性剂的实例包括本文所述的任何化疗剂(如登木素生物碱、澳瑞他汀、海兔毒素或刺孢霉素)、放射性同位素或核糖核酸酶或DNA内切核酸酶。
当抗体的结合靶标位于脑中时，本发明的某些实施方案提供穿越血脑屏障的抗体。存在几种本领域已知的转运分子穿越血脑屏障的方法，其包括但不限于物理方法、基于脂质的方法、基于干细胞的方法及基于受体和通道的方法。
转运抗体穿越血脑屏障的物理方法包括但不限于，完全绕过血脑屏障或在血脑屏障上产生开口。绕过方法包括但不限于向脑中直接注射(参见，例如Papanastassiou et al.，Gene Therapy 9：398-406(2002))、间隙输注(interstitial infusion)/对流增强递送(参见，例如Bobo et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2076-2080(1994))和在脑中植入递送装置(参见，例如Gill etal.，Nature Med.9：589-595(2003)；和Gliadel WafersTM，GuildfordPharmaceutical)。在屏障中产生开口的方法包括但不限于超声(参见，例如美国专利公开2002/0038086号)、渗透压(例如通过给药高渗的甘露糖醇(Neuwelt，E.A.，Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation(血脑屏障的应用及其操作)，Vols 1 & 2，Plenum Press，N.Y.(1989))、通过例如缓激肽或通透剂A-7的透化作用(参见，例如美国专利5,112,596号、5,268,164号、5,506,206号和5,686,416号)和用含有编码抗体的基因的载体转染跨越血脑屏障的神经元(参见，例如美国专利公开2003/0083299号)。
转运抗体穿越血脑屏障的基于脂质的方法包括但不限于，将抗体封装于与抗体结合片段偶联的脂质体中，该抗体片段与血脑屏障的血管内皮上的受体结合(参见，例如美国专利申请公开20020025313号)；和将抗体包被在低密度脂蛋白颗粒(参见，例如美国专利申请公开20040204354号)或载脂蛋白E(参见，例如美国专利申请公开20040131692号)中。
转运抗体穿越血脑屏障的基于干细胞的方法，需要遗传改造神经祖细胞(NPC)以表达目的抗体，然后将干细胞植入要治疗的个体的脑中。参见Behrstock et al.(2005)Gene Ther.15 Dec.2005后期在线公开(其报道，经遗传改造表达神经营养因子GDNF的NPC在植入啮齿动物和灵长类模型时减少了帕金森病的症状)。
运送抗体穿越血脑屏障的基于受体和通道的方法包括但不限于，利用糖皮质激素阻断剂增强血脑屏障的通透性(参见，例如美国专利申请公开2002/0065259号、2003/0162695号和2005/0124533号)；激活钾通道(参见，例如美国专利申请公开2005/0089473号)、抑制ABC药物转运蛋白(参见，例如美国专利申请公开2003/0073713号)；用转铁蛋白涂覆抗体并调节一种或多种转铁蛋白受体的活性(参见，例如美国专利申请公开2003/0129186号)，以及将抗体阳离子化(参见，美国专利5,004,697号)。
应当理解，任何上述治疗方法可以利用本发明的免疫偶联物代替抗VEGF抗体或除了抗VEGF抗体外又利用本发明的免疫偶联物来进行。
联合疗法
在治疗中，本发明的抗体可以单独使用或与其他组合物联合使用。例如，可以共给予本发明的抗体与另一种抗体、化疗剂(包括化疗剂混合物)、其他细胞毒性剂、抗血管生成剂、细胞因子和/或生长抑制剂。当本发明的抗体抑制肿瘤生长时，特别期望将其与也抑制肿瘤生长的一种或多种其他治疗剂组合，如抗血管生成剂和/或化疗剂。可选择地，或另外，患者可以接受联合辐射疗法(例如，外照射(external beam irradiation)或使用诸如抗体的放射性标记试剂的疗法)。上文指出的这类联合疗法包括联合给药(其中，两种或更多种试剂包含在相同或分离的制剂中)和单独给药，在这种情况下，本发明的抗体的给药可以发生在一种或多种附加疗法之前或之后。
在一实施方案中，可以共给予本发明的抗体与至少一种其他治疗剂和/或佐剂。例如，将抗VEGF抗体与抗癌疗法或抗新血管形成疗法联合使用来治疗各种肿瘤或非肿瘤疾病状态。在一实施方案中，该肿瘤或非肿瘤疾病状态特征为与异常或不期望的血管生成有关的病理病症。可以连续给予抗VEGF抗体；或与在相同的组合物中或在分离的组合物中的对于这些目的有效的另一试剂，联合给予。可选择地，或另外，可以给予VEGF的多种抑制剂。
通常，抗VEGF抗体和抗癌剂适合于相同或类似的疾病以阻断或减少病理病症，如肿瘤、癌症或细胞增殖病症。在一实施方案中，抗癌剂是抗血管生成剂。
本领域已经鉴定并已知了许多抗血管生成剂，其包括本文所列的那些抗血管生成剂，例如在“定义”中所列的抗血管生成剂，以及例如下述文献所列的抗血管生成剂：Carmeliet and Jain，Nature 407：249-257(2000)；Ferrara et al.，Nature Reviews：Drug Discovery，3：391-400(2004)；和Sato Int.J.Clin.Oncol.，8：200-206(2003)。还参见美国专利申请US20030055006。
在一实施方案中，将本发明的抗VEGF与下述试剂联合使用：一种或多种抗VEGF中和抗体(或片段)；另一VEGF家族(例如VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、胎盘生长因子(PLGF))的拮抗剂；或VEGF受体拮抗剂，其包括但不限于，例如水溶性VEGF受体(例如VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、神经毡蛋白(neuropillin)(例如NRP1、NRP2))片段、能够阻断VEGF或VEGFR的适配体、中和性抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶(RTK)的小分子量抑制剂、VEGF的反义策略、抗VEGF或VEGF受体的核酶、VEGF的拮抗剂的变体；以及上述的任何组合。
在另一实施方案中，可以将本发明的抗VEGF抗体与小分子受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKI)联合使用，该抑制剂靶向一种或多种酪氨酸激酶受体，如VEGF受体、FGF受体、EGF受体和PDGF受体。许多治疗性小分子RTKI在本领域内是已知的，其包括但不限于伐他拉尼(PTK787)、厄洛替尼(TARCEVA
Figure GPA00001142297500941
)、OSI-7904、ZD6474(ZACTIMA)、ZD6126(ANG453)、ZD1839、舒尼替尼(SUTENT
Figure GPA00001142297500943
)、司马沙尼(SU5416)、AMG706、AG013736、伊马替尼(GLEEVEC)、MLN-518、CEP-701、PKC-412、拉帕替尼(GSK572016)、VELCADE
Figure GPA00001142297500945
、AZD2171、索拉非尼(NEXAVAR
Figure GPA00001142297500946
)、XL880以及CHIR-265。
与本发明的抗体的一起用于联合肿瘤疗法的其他治疗剂包括，与肿瘤生长有关的其他因子如EGFR、ErbB2(又称为Her2)、ErbB3、ErbB4或TNF的拮抗剂。
在某些实施方案中，除了VEGF拮抗剂和其他试剂以外，可以任选地向患者共给予两种或更多种血管生成抑制剂。仍然在另一实施方案中，可以将诸如抗癌剂的一种或多种其他治疗剂与本发明的抗VEGF抗体、另一VEGF家族的拮抗剂和/或抗血管生成剂联合给药。
在本发明的某些方面，与抗VEGF-抗体的一起用于联合肿瘤疗法的其他治疗剂包括其他癌症疗法(例如手术、放射学治疗(例如，包括放射性物质的照射或给药)、化学疗法、用本文所列和本领域已知的抗癌剂治疗或上述的组合)。在“定义”中提供了所考虑的化疗剂的示例性且非限制性的列表。
可选择地，或另外，可以向患者共给予本文所公开的结合相同或两种或更多种不同抗原的两种或多种抗体。有时，有利的是，还向患者给予一种或多种细胞因子。
与抗VEGF抗体联合给药的治疗剂的有效量遵循医生或兽医师的意见。进行剂量给药和调整以实现要治疗的疾病状态的最大控制。剂量还取决于诸如要使用的治疗剂的类型和治疗的具体患者的因素。抗癌剂的合适剂量是目前使用的剂量，并且由于抗癌剂与抗VEGF抗体的联合作用(协同)而可以降低。在某些实施方案中，抑制剂的组合增强单一抑制剂的效果。术语“增强”指改善通常或批准剂量的治疗剂的效果。还参见本文的题为“药物制剂和剂量”章节。
化疗剂
在一方面，本发明提供通过给予有效量的抗VEGF抗体和/或血管生成抑制剂及一种或多种化疗剂来治疗病症(如肿瘤、癌症或细胞增殖病症)的方法。各种化疗剂可以用于本发明的联合治疗方法中。在“定义”中提供了所考虑的化疗剂的示例性且非限制性的列表。抗VEGF抗体和化疗剂的给药可以使用相同或不同的给药途径同时进行，例如作为单一组合物或作为两种或更多种不同的组合物。可选择地，或另外，可以以任何顺序依次给药。可选择地，或另外，可以以任何次序，作为依次和同时的组合来进行步骤。在某些实施方案中，两种或更多种组合物给药之间的时间间隔可以为数分钟至数天、至数周、至数月。例如，可以首先给予化疗剂，然后给予抗VEGF抗体。然而，也考虑了同时给药，或者先给予抗VEGF抗体。因此，一方面，本发明提供包括给予抗VEGF抗体(如B20-4.1.1抗体或B20-4.1.1RR抗体)、然后给予化疗剂的方法。在某些实施方案中，两种或更多种组合物给药之间的时间间隔可以为数分钟至数天、至数周、至数月。
本领域技术人员应当理解，化疗剂的合适剂量通常在临床疗法中已经使用的那些剂量的附近，其中单独地或者与其他化学疗法联合给予化学疗法。取决于所治疗的疾病状况，剂量可能发生变化。负责治疗的医师能够决定单独个体的合适剂量。
复发性肿瘤生长
本发明还提供了用于抑制或预防复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的方法和组合物。复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长用于描述这样的状况，在该状况中，患者正经历的或用来治疗患者的一种或多种目前可用的疗法(例如癌症疗法，如化学疗法、放射疗法、手术、激素疗法和/或生物疗法/免疫疗法、抗VEGF抗体疗法、特别是特定癌症的标准治疗方案)不适合在临床上治疗患者或者患者不再从该疗法中获得任何有益效果，从而这些患者需要其他有效的疗法。如本文所用的，该短语还指“无应答性/顽固性”患者的疾病疾病状态，例如，其描述对疗法应答但仍然患有副作用、发展抗性、对疗法不应答、对疗法不令人满意地应答等的患者。在各种实施方案中，癌症是复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长，其中癌细胞的数目没有明显低减少，或增加了；或者肿瘤大小没有明显低减小，或者增加了；或者未能进一步减小癌细胞的大小或减少癌细胞的数目。利用这类语境中“复发性”或“顽固性”或“无应答性”的本领域接受的含义，通过用于测定治疗对癌细胞的效果的本领域已知的任何方法，可以在体内或体外确定癌细胞是否是复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长。对抗VEGF治疗具有抗性的肿瘤是复发性肿瘤生长的实例。
本发明提供了通过给予本发明的一种或多种抗VEGF抗体来阻断或减少个体的复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长来阻断或减少个体的复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的方法。在某些实施方案中，可以在癌症治疗后给予抗体。在某些实施方案中，与癌症疗法同时给予抗VEGF抗体。可选择地，或另外，抗VEGF抗体疗法与另一种癌症疗法交替，并且可以以任何顺序进行。本发明还涉及给予一种或多种抑制性抗体以预防易于患有癌症的患者的癌症发作或复发的方法。通常，患者曾经或正在同时进行癌症疗法。在一实施方案中，癌症疗法是用抗血管生成剂进行的治疗，如VEGF-C拮抗剂。抗血管生成剂包括但不限于本领域已知的那些抗血管生成剂和本文的“定义”中发现的那些抗血管生成剂。在一实施方案中，抗血管生成剂是抗VEGF中和性抗体或片段(例如，人源化的A4.6.1，AVASTIN
Figure GPA00001142297500971
(Genentech，South San Francisco，CA)、Y0317、M4、G6、B20、2C3等)。参见，例如美国专利6,582,959、6,884,879、6,703,020；WO98/45332；WO 96/30046；WO94/10202；EP 0666868B1；美国专利申请20030206899、20030190317、20030203409和20050112126；Popkov et al.，Journal of Immunological Methods 288：149-164(2004)；以及WO2005012359。可以与抗VEGF抗体联合给予其他试剂来阻断或减少复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长，例如参见本文的题为联合疗法的章节。
诊断方法和检测方法
一方面，本发明提供诊断与VEGF表达增加有关的病症的方法。在某些实施方案中，该方法包括使测试细胞与抗VEGF抗体接触；通过检测抗VEGF抗体与VEGF的结合来确定测试细胞的VEGF表达水平(定性或定量)；并且比较测试细胞的VEGF表达水平与对照细胞(例如与测试细胞组织来源相同的正常细胞或与这种正常细胞的VEGF表达水平相当的细胞)的VEGF表达水平，其中与对照细胞相比，测试细胞的更高的VEGF表达水平表明存在与VEGF表达增加有关的病症。在某些实施方案中，测试细胞获得自疑似患有与VEGF表达增加有关的病症的个体。在某些实施方案中，病症是肿瘤、癌症和/或细胞增殖病症。
可以利用本发明的抗体诊断的示例性病症包括但不限于：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜的癌症、肝细胞癌、胃癌、胃肠癌、胃肠基质癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头和颈癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端雀斑样痣性黑素瘤、结节性黑素瘤、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、多毛细胞白血病、慢性粒细胞白血病、移植后淋巴组织增生病症(PTLD)、与斑痣性错构瘤病有关的异常血管增殖、与脑瘤有关的水肿以及梅格斯综合征。
另一方面，本发明提供任何本文所述的抗VEGF抗体与VEGF的复合物。在某些实施方案中，复合物是体内或体外的。在某些实施方案中，复合物包含癌细胞。
另一方面，本发明提供检测生物样品中VEGF的存在的方法。本文所用的术语“检测”包括定量或定性检测。
在某些实施方案中，方法包括使生物样品与抗VEGF抗体在允许抗VEGF抗体与VEGF的条件下接触，并检测在抗VEGF抗体与VEGF之间是否形成复合物。
抗VEGF抗体可以在许多已知的检测测定方法中的任意一种方法中用于检测VEGF。例如，可以通过下述步骤测定生物样品的VEGF：从期望的来源获得样品；将该样品与抗VEGF抗体混合以允许抗体与存在于混合物中的任何VEGF形成抗体/VEGF复合物，并检测存在于该混合物中的任何抗体/VEGF复合物。可以通过本领域已知的适合于具体样品的方法来制备用于测定的生物样品。根据所用测定的类型，选择将样品与抗体混合的方法和检测抗体/VEGF复合物的方法。
VEGF的分析方法全都是用一种或多种下述试剂：标记的VEGF类似物、固定的VEGF类似物、标记的抗VEGF抗体、固定的抗VEGF抗体和/或空间偶联物(steric conjugate)。标记的试剂也称为“追踪物”。
在某些实施方案中，将抗VEGF抗体可检测地标记。所用的标记是任何不干扰VEGF与抗VEGF抗体的结合的可检测的功能性。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(例如，荧光标记、发色团标记、电子致密标记(electron-dense label)、化学发光标记以及放射性标记)；以及诸如酶或配体的部分，其例如通过酶促反应或分子相互作用间接地检测。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I；荧光团，如稀土螯合物或荧光素及其衍生物；若丹明及其衍生物；丹酰；7-羟基香豆素；荧光素酶(luceriferase)，如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利4,737,456号)；荧光素；2，3-二氢酞嗪二酮(2，3-dihydrophthalazinedione)；辣根过氧化物酶(HRP)；碱性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶菌酶；糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；杂环氧化酶，如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶；与使用过氧化氢来氧化染料前体的酶如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶偶联；生物素/抗生物素蛋白；自旋标记、噬菌体标记、稳定的自由基等。
将这些标记与蛋白或多肽共价结合的常规方法是可用的。例如，偶连剂，如二醛、碳二亚胺、双马来酰亚胺、双亚氨酸酯(bis-imidate)、双重氮化的联苯胺等，可用于使用上文所述的荧光、化学发光和酶标记来标记抗体。参见，例如美国专利3,940,475号(荧光测定法)和3,645,090号(酶)；Hunter et al.，Nature，144：945(1962)；David et al.，Biochemistry，13：1014-1021(1974)；Pain et al.，J.Immunol.Methods，40：219-230(1981)；以及Nygren，J.Histochem.and Cytochem.，30：407-412(1982)。本文优选的标记是酶，如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。包括酶在内的这类标记与抗体的偶联对于免疫测定技术人员是标准操作方法。参见，例如Methods inEnzymology，ed.J.J.Langone and H.Van Vunakis，Vol.73(Academic Press，New York，New York，1981)，pp.147-166中的O′Sullivan et al.，“Methodsfor the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in EnzymeImmunoassay(用于酶免疫测定的酶-抗体偶联物的制备方法)”。
在某些实施方案中，将抗体固定于不溶性基质上。固定需要分离抗VEGF抗体与在溶液中保持游离的任何VEGF。这通常通过下述方法来完成：通过吸附至不溶于水的基质或表面(Bennich et al.，U.S.3,720,760)或通过共价偶联(例如，利用戊二醛交联)在测定程序前使抗VEGF抗体不溶；或者在形成抗VEGF抗体于VEGF的复合物后使抗VEGF抗体不溶，例如通过免疫沉淀。
用于检测抗VEGF抗体与VEGF的测定包括但不限于本领域已知的抗原结合测定，如蛋白印迹、放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、竞争性和“夹心(sandwich)”测定、免疫沉淀测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定、免疫组织化学(IHC)和空间抑制测定(steric inhibitionassay)。
在一实施方案中，样品中蛋白的表达可以利用免疫组织化学和染色方法来检查。组织切片的免疫组织化学染色已经证实是评价或检测样品中蛋白质的存在的可靠方法。免疫组织化学(“IHC”)技术利用抗体来原位探测细胞抗原和使之可视，通常通过发色或荧光方法。对于样品制备，可以使用来自哺乳动物(通常是人患者)的组织或细胞样品。样品的实例包括但不限于癌细胞，如结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、淋巴瘤和白血病癌细胞。样品可以通过本领域已知的各种方法获得，其包括但不限于手术切除、吸引术(aspiration)或活组织检查。组织可以是新鲜或冷冻的。在一实施方案中，将样品固定或包埋在石蜡等中。组织样品可以通过常规方法固定(即保存)。本领域技术人员应当理解，固定剂的选择由进行组织染色或其他分析的样品的目的决定。本领域技术人员还应当理解，固定的长度取决于组织样品的大小和所用的固定剂。
IHC可以与其他技术联合进行，如形态染色和/或荧光原位杂交。两种通常的IHC方法是可用的，即直接和间接测定。根据第一种测定，直接确定抗体与靶抗原(即VEGF)的结合。这种直接测定使用标记的试剂，例如荧光标签或酶标记的第一抗体，其可以不需要其他抗体相互作用下可视。在典型的间接测定中，未偶联的第一抗体与抗原结合，然后标记的第二抗体与该第一抗体结合。当第二抗体与酶标记偶联时，添加发色或荧光物质以提供抗原的可视化。由于几个第二抗体可以与第一抗体上的不同表位反应，所以发生了信号放大。用于免疫组织化学的第一抗体和/或第二抗体通常用可检测的部分进行标记。
除了上文所讨论的样品制备方法以外，在IHC之前、期间或之后，进一步处理组织切片也是期望的。例如，可以进行表位修复(epitoperetrieval)方法，如将组织样品在柠檬酸盐缓冲液中加热(参见，例如Leonget al.Appl.Immunohistochem.4(3)：201(1996))。
任选的封闭步骤后，将组织切片在合适的条件下暴露于第一抗体足够的时间，从而该第一抗体与组织样品中的靶蛋白抗原结合。实现这个目的的合适条件可以通过常规实验来确定。抗体与样品结合的程度通过利用上文所讨论的任一可检测标记来确定。优选地，标记是酶标记(例如HRPO)，其催化诸如3，3’-二氨基联苯胺铬精的发色物质的化学改变。优选地，酶标记偶联至特与第一抗体异性结合的抗体(例如，第一抗体是兔多克隆抗体而第二抗体是山羊抗兔抗体)。
可以将如此制备的样本封片和盖片。然后确定玻片评价(Slideevaluation)，例如可以使用本领域常规使用的显微镜和染色强度标准。染色强度标准可以按如下进行评价：
表2
  染色方式   得分
  在细胞中没有观察到染色   0
  在多于10％的细胞中检测到微弱/很少的可观测的染色   1+
  在多于10％的细胞中观察到弱至中等的染色   2+
  在多于10％的细胞中观察到中等至强的染色   3+
通常，IHC测定中约2+或更高的染色方式得分是诊断和/或预后的。在某些实施方案中，约1+或更高的染色方式得分是诊断和/或预后的。在其他实施方案中，约3或更高的染色方式得分是诊断和/或预后的。应当理解，当利用IHC检查来自肿瘤或结肠腺瘤的细胞和/或组织时，通常在肿瘤细胞和/或肿瘤组织中确定或评价染色(与可存在于样品中的基质或周围组织相反)。
称为竞争性或夹心测定的其他测定方法确立已久，并且广泛地用于商业诊断工业中。
竞争性测定依赖于追踪物VEGF类似物与测试样品竞争有限数目的抗VEGF抗体抗原结合位点的能力。通常在竞争之前或之后，使抗VEGF抗体不溶，然后分离与抗VEGF抗体结合的追踪物及VEGF与未结合的追踪物及VERGF。这种分离通过倾析(其中预先使结合对象不溶)或者通过离心(其中在竞争性反应后使结合对象沉淀)完成。测试样品VEGF的量与通过标志物质测量的结合的追踪物的量成反比。用已知量的VEGF做出剂量-应答曲线，并且与测试结果进行比较以定量地确定存在于测试样品中VEGF的量。当用酶作为可检测标志物时，这些测定称为ELISA系统。
称为“均相”测定的另一竞争性测定不要求相分离。此处，制备并使用酶与VEGF的偶联物，从而当抗VEGF抗体与VEGF结合时，抗VEGF抗体的存在改变了酶的活性。在这种情况下，VEGF或其免疫活性片段通过双功能有机桥(organic bridge)与诸如过氧化物酶的酶偶联。选择与抗VEGF抗体使用的偶联物，从而抗VEGF抗体的结合抑制或增强标记的酶活性。称为EMIT这种方法本身得到了广泛的应用。
空间偶联物用于均相测定的空间位阻方法。这些偶联物通过下述方法合成：使低分子量半抗原与小VEGF片段共价连接，从而半抗原的抗体基本上不能与抗VEGF抗体结合的同时与偶联物结合。在这种测定方法中，存在于测试样品中的VEGF将与抗VEGF抗体结合，从而允许抗半抗原与偶联物结合，这改变了偶联物半抗原的特征，例如当半抗原是荧光团时，荧光的改变。
夹心测定对于VEGF或抗VEGF抗体的确定是特别有用的。在依次夹心测定中，用固定的抗VEGF抗体吸附测试样品VEGF，通过洗涤去除测试样品，用结合的VEGF吸附第二标记的抗VEGF抗体，然后分离结合的材料与残留追踪物。结合的追踪物的量与测试样品VEGF成正比。在“同步”夹心测定中，在添加标记的抗VEGF前，不分离测试样品。利用抗VEGF单克隆抗体作为一种抗体，并且利用多克隆抗VEGF抗体作为另一种抗体的顺序夹心测定对于测试样品的VEGF是有用的。
上述测定只不过是VEGF的示例性检测测定。使用抗VEGF抗体确定VEGF的现在或以后开发的其他方法，包括在本发明的范围中。
应当理解，任何上述诊断或检测实施方案可以利用本发明的免疫偶联物代替抗VEGF抗体或除该抗VEGF抗体外又利用本发明的免疫偶联物进行。
制品
另一方面，本发明提供了含有用于治疗、预防和/或诊断上文上述的病症的制品。制品包括容器和容器上的标记或包装插页或与容器有关的标记或包装插页。合适的容器包括，例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由诸如玻璃或塑料的各种材料制成。容器装有组合物，该组合物自身或与有效地治疗、预防和/或诊断疾病状态的另一组合物组合；并且容器可以具有无菌入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或小瓶，其具有可被皮下注射针刺穿的塞子)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体或免疫偶联物。标记或包装插页表明组合物用于治疗疾病状况的选择。而且，制品可以包含(a)在其中含有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的抗体或免疫偶联物；及(b)在其中含有组合物的第二容器，其中该组合物包含其他细胞毒性剂或另外的治疗剂。这个实施方案中的制品还可以包含包装插页，其表明组合物可以用于治疗具体疾病状态。可选择地，或另外，制品还可以包含第二(第三)容器，其包含药物可接受的缓冲剂，如用于注射的抑菌水(BWFI)、磷酸缓冲盐溶液、林格溶液(Ringer’s solution)和葡萄糖溶液。制品还可以包含商业和用户立场期望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针以及注射器。
下文的实施例仅旨在示例本发明的实施，而不是作为限制而提供。本文所引用的所有专利和科学文献的公开明确地通过引用整体地并入本文。
实施例
实施例1
抗VEGF抗体的产生和表征
通过在重链和轻链的互补性决定区(CDR)导入多样性，在单个框架上构建合成噬菌体抗体文库(人源化的抗ErbB2抗体，4D5)(Lee，C.V.et al.J Mol Biol 340，1073-93(2004))。简言之，通过在重链互补性决定区(CDR)的溶剂暴露位置导入合成的多样性，在单个人框架上构建噬菌体展示的合成多肽文库。为了改善文库性能，构建了单价和二价抗原结合片段(Fab)文库，并且通过改变氨基酸组成和CDR长度来研究不同的CDR-H3多样性。然后通过增加CDR-H3长度的可变性并利用模拟天然CDR-H3序列的氨基酸组成的定制密码子扩充文库。利用具有展示于单支架结构上的完整的合成CDR，产生了高亲和力抗体。对于用单个模板产生合成抗体文库的策略和方法的其他细节，参见，例如公开于2005年2月10日的WO 2005/012359，其完整公开通过引用明确地并入本文。
用天然文库针对溶液中的生物素化的鼠VEGF进行溶液相筛选，然后通过固定于MaxiSorpTM免疫板上的5ug/ml中性抗生物素蛋白(neutravidin)进行捕捉。用递减浓度的生物素化的鼠VEGF进行三轮选择后，随机选取克隆，并利用噬菌体ELISA鉴定特异性结合物(binder)。对于每个阳性噬菌体克隆，将重链和轻链的可变区亚克隆至经改造表达全长IgG链的pRK表达载体。将重链和轻链构建体共转染至293细胞或CHO细胞中，然后利用蛋白A亲和柱从无血清培养基中纯化表达的抗体。对于亲和力成熟，通过软随机化策略构建具有源自目的初始克隆的CDR环(CDR-H1和H2，CDR-L1、L2和L3)的组合的噬菌体文库，从而以约50∶50的频率，将每个所选的位置突变为非野生型残基或保留为野生型(Lee，C.V et al.，Blood，108：3103-3111，2006)。然后通过4轮所述针对生物素化的人VEGF的溶液相筛选，鉴定高亲和力克隆。递减的生物素化的抗原的浓度允许更严紧的筛选。
实施例2
抗VEGF抗体结合亲和力
为了确定抗VEGF IgG的结合亲和力，用BIAcoreTM-3000装置进行表面等离子共振(SRP)测量。根据供应商的说明书，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。将人或鼠VEGF固定，以实现约60的应答单位(RU)的偶联的蛋白。参见图10。对于动力学测量，在37℃下，以25μl/min的流速单独地注入在PBT缓冲液(含有0.05％(v/v)Tween 20的PBS)中两倍连续稀释的抗VEGF IgG(7.8nM至500nM)。结合速率(kon)和解离速率(koff)利用二价结合模型(BIACORE
Figure GPA00001142297501041
评价软件，3.2版)计算。将平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon比值。
由于B20.4.1的解离速率(off-rate)不可测量，所以将IgG固定以实现约1000应答单位(RU)的偶联的蛋白。参见图11。在37℃下，以25μl/min的流速注入在PBT缓冲液(含有0.05％(v/v)Tween 20的PBS)中两倍连续稀释的人或鼠VEGF(7.8nM至500nM)。结合速率kon)和解离速率(koff)利用简单的一对一朗缪尔(Langmuir)结合模型(BIACORE
Figure GPA00001142297501051
评价软件，3.2版)来计算，以获得平衡解离常数(KD)。
实施例3
HUVEC胸苷吸收测定
为了通过抑制VEGF诱导的细胞增殖来研究抗VEGF抗体的功能，进行了HUVEC胸苷吸收测定。如所述，使人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(Clontech，Mountain View，CA)生长并进行测定。将约3000个HUVEC在96孔细胞培养板的每个孔中进行平板接种，并且在补充了1.5％(v/v)胎牛血清的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)/F12培养基(测定培养基)中孵育18小时。然后，向细胞添加含有通过第一滴定VEGF确定的可以刺激次于最大的DNA合成的固定量的人VEGF(0.1nM的终浓度)的测定培养基和渐增浓度的抗VEGF IgG。于37℃下孵育18小时后，将细胞用0.5μCi/孔的[3H]胸苷脉冲24小时，并且收获以通过所述的TopCount微板闪烁计数器(TopCount Microplate Scintillation counter)进行计数。
HUVEC胸苷掺入测定(thymidine incorporation assay)显示，B20变体可以有效地抑制HUVEC细胞增殖。图12显示B20-4.1.1和B20-4.1.1RR具有和G6-31类似的抑制。
实施例4 内皮细胞增殖测定
为了测定B20-4.1.1的结合特异性和阻断活性，进行了利用牛视网膜微血管内皮细胞(BRME)的基于细胞的测定，其中测试了抗体阻断人或鼠VEGF诱导的细胞增殖的能力。将BRME以500个细胞/孔的密度接种在96孔板中的生长培养基(补充了10％小牛血清、2mM谷氨酰胺和抗生素的低葡萄糖DMEM)中。对于抑制测定，将B20-4.1.1以标明的浓度添加至一式三份的孔中(图13)。0.5小时后，添加人VEGF-A(hVEGF)或小鼠VEGF-A(mVEGF)至终浓度为6ng/ml。6-7天后，通过阿尔玛蓝(Alamarblue)(BioSource；Invitrogen)测定细胞生长。在530nm的激发波长和590nm的发射波长处监测荧光。
如图13所示，B20-4.1.1降低了hVEGF和mVEGF促进BRME增殖的能力。如图16所示，阿瓦斯丁抗体降低了hVEGF促进BRME增殖的能力。阿瓦斯丁抗体不抑制mVEGF诱导的增殖，因为在高达1500nM的阿瓦斯丁抗体浓度下没有观察到mVEGF的抑制。
实施例5
肿瘤体内抑制研究
使A549细胞(人肺癌细胞)和MDA-MB231细胞(人乳腺癌细胞)生长于细胞培养中，并以约5x106个细胞/小鼠的细胞密度皮下注射到8-12周龄的米色裸小鼠中。肿瘤细胞接种48小时后，或当肿瘤的大小达到约200mm3时，用媒介物缓冲液或浓度为5mg/kg的B20-4.1.1腹膜内注射小鼠(n＝10)。其后每周给予两次抗体。用测径器在指定的时间点测量肿瘤体积。
图14和15所示，B20-4.1.1有效地减小注射了A549细胞(图14)或MDA-MB231细胞(图15)的小鼠的肿瘤体积。
尽管在上述的说明书中，参照某些实施方案，对本发明进行了举例说明，但是本发明并不受其限制。实际上，除了本文所示和所述的那些变化以外，根据前述说明书，本发明的各种变化对于本领域技术人员是显而易见的，并且落入所附权利要求的范围内。

Claims (34)

1.分离的抗血管内皮生长因子(VEGF)抗体，其中所述抗体包含选自以下的6种HVR：
(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列X1X2RX3SL，其中所述HVR-L1包含下述位置的任何组合中的1、2或3个取代：X1为G或A，X2为V或I；和/或X3为T或R；
(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列DASSLA(SEQ ID NO：6)；
(iii)HVR-L3，其包含氨基酸序列SYKSPL(SEQ ID NO：7)；
(iv)HVR-H1，其包含氨基酸序列SISGSWIF(SEQ ID NO：1)；
(v)HVR-H2，其包含氨基酸序列GAIWPFGGYTH(SEQ ID NO：2)；以及
(vi)HVR-H3，其包含氨基酸序列RWGHSTSPWAMDY(SEQ IDNO：3)。
2.分离的抗VEGF抗体，其中所述抗体包含：
(1)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；
(2)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(3)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；
(4)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
(5)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；以及
(6)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
3.分离的抗VEGF抗体，其中所述抗体包含：
(1)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；
(2)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(3)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；
(4)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；
(5)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；以及
(6)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
4.分离的抗VEGF抗体，其中轻链可变域包含SEQ ID NO：44或45的氨基酸序列。
5.分离的抗VEGF抗体，其中重链可变域包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列，并且轻链可变域包含SEQ ID NO：44或45的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的抗体，其中所述重链可变域包含SEQ IDNO：43的氨基酸序列，并且所述轻链可变域包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列。
7.如权利要求5所述的抗体，其中所述重链可变域包含SEQ IDNO：43的氨基酸序列，并且所述轻链可变域包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列。
8.如权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
9.如权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人源化的。
10.如权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人。
11.如权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中至少一部分框架序列是人共有框架序列。
12.多核苷酸，其编码权利要求1-7中任一项所述的抗体。
13.载体，其包含权利要求12所述的多核苷酸。
14.如权利要求13所述的载体，其中所述载体是表达载体。
15.宿主细胞，其包含权力要求13或14所述的载体。
16.如权利要求15所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核的。
17.如权利要求15所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核的。
18.如权利要求15所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物的。
19.制备抗VEGF抗体的方法，所述方法包括(a)在合适的宿主细胞中表达权利要求14所述的载体，和(b)回收所述抗体。
20.制备抗VEGF免疫偶联物的方法，所述方法包括(a)在合适的宿主细胞中表达权利要求14所述的载体，和(b)回收所述抗体。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述宿主细胞是原核的。
22.如权利要求19或20所述的方法，其中所述宿主细胞是真核的。
23.组合物，其包含权利要求1-7中任一项所述的抗VEGF抗体。
24.组合物，其包含权利要求12-14中任一项所述的多核苷酸。
25.如权利要求23或24所述的组合物，其中所述组合物还包含媒介物。
26.检测VEGF的方法，所述方法包括检测生物样品中的VEGF-抗VEGF抗体复合物，其中所述抗VEGF抗体的氨基酸序列包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列，所述轻链可变域包含SEQ ID NO：44或45的氨基酸序列。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述抗VEGF抗体的氨基酸序列包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含SEQ IDNO：43的氨基酸序列，所述轻链可变域包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述抗VEGF抗体的氨基酸序列包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含SEQ IDNO：43的氨基酸序列，所述轻链可变域包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列。
29.权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述抗VEGF抗体被可检测地标记。
30.治疗肿瘤、癌症或细胞增殖病症的方法，所述方法包括向需要这种治疗的个体给予有效量的权利要求1-7中任一项所述的抗VEGF抗体，从而治疗所述肿瘤、癌症或细胞增殖病症。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述个体是人。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述肿瘤、癌症或细胞增殖病症是结肠癌、肺癌、乳腺癌或成胶质细胞瘤。
33.抑制个体的血管生成的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的权利要求1-7中任一项所述的抗VEGF抗体。
34.抑制血管通透性的方法，所述方法包括向个体给予有效量的权利要求1-7中任一项所述的抗VEGF抗体。
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