HU229776B1 - Interleukin 15-re (IL-15-re) specifikus emberi antitestek - Google Patents

Interleukin 15-re (IL-15-re) specifikus emberi antitestek Download PDF

Info

Publication number
HU229776B1
HU229776B1 HU0402653A HUP0402653A HU229776B1 HU 229776 B1 HU229776 B1 HU 229776B1 HU 0402653 A HU0402653 A HU 0402653A HU P0402653 A HUP0402653 A HU P0402653A HU 229776 B1 HU229776 B1 HU 229776B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
human
antibody
cells
antibodies
seq
Prior art date
Application number
HU0402653A
Other languages
English (en)
Inventor
De Winkel Jan G J Van
Dijk Marcus Antonius Van
Janine Schuurman
Arnout F Gerritsen
Ole Baadsgaard
Original Assignee
Genmab As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genmab As filed Critical Genmab As
Publication of HUP0402653A2 publication Critical patent/HUP0402653A2/hu
Publication of HUP0402653A3 publication Critical patent/HUP0402653A3/hu
Publication of HU229776B1 publication Critical patent/HU229776B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

A találmány tárgyát izolált, IL-15-öt (például, emberi IL-15-öt) specifikusan megkötni képes, emberi monoklonális antitestek, és ezen antitesteken alapuló készítmények és molekulák képezik. Az emberi antitestek előállíthatok transzfektómában vagy embertől eltérő állatban, például transzgénikus egérben, amelyben V-D-J rekombinációval és izotípus-átrendeződéssel lehetséges emberi monoklonális antitestek többféle izotípusát előállítani. A találmány tárgyát képezik továbbá az emberi antitesteket tartalmazó gyógyászati készítmények, az emberi antitesteket előállítani képes, embertől eltérő transzgénikus állatok, és hibridőmák, illetve az emberi antitestek alkalmazásával történő terápiás és diagnosztikai eljárások.
I&ierleutdsr iS-re ((L-lS-re) speelrikas emberi antitestek
Az interlenkíe-'l 5 (IL-15 > z\ mlaüasheho crtokmek közé tartozó. 14-15 kD motekuíarömegri giikoprotein. E estukín kmísílíativ expresszivta; különféle étekben é« szövetekben - így »xKKx;itákban és rnakrofágokbam Sbroblaszmfcbaxt, keratimmtukbars cs demdríbkns >.<?ífekhen is leinák már í'Wafdmarm és Tagava (1999); Bebsiger és Caligiuri 12Ó91)], Gyulladás „setén az tt -)5 espressziója íbkozólag szabályozott — lásd például IFN-y-val és LPS-sel, vagy vírusokkal, IraktéríntnAkkai vagy protozoákkal serkenteti isoaeeiták esetében leírtakat | Kinm» és mtsai, (1998)(: Wattosam és mlsss, (1998); Wsldmaanés Tagaya (1999?; Fohniger és Calígíuri (2001)1 Továbbá krónikás gyulladásos betegségekben, nőst amilyet): tó izületi esüz (rheumatoid arthritis), a lokálisan tennclődiltíIL-lS - a. sztaovisöis T-sejtek et&ítésé'vd és aktiválásával - feltehetően fokozza a gyatfadast ! .1 az 0 .8 z.tii ndikri a^ut i?\ok ívm \ ι e e oo<. a tó ep-e,- ρ.η.νοη,νηοίνη fk« iuiii c» «'sj' <, '•msi MUnnes és tntsai. (19961; Mdr.nes és mtsai, (1997); Mclsmes és kién·' (1998); Fehtnger és Cikgmn (2, o 0’
In vitro kísértetekkel kirnntetták,.hogy - a ko/os rcceptor.ilUroki'.ak kövönhetóeo - az 1L-I5 es az 11-2 számos: közös biológiai aktivitást mutat Az: 11-15, T-sciteken tévő recepiopa egyedi o-láneoí ÍLL- 15Hte), de az 11,-2 R-bea is meglévő p-láncot és y-látieot i&rhtasz. fámák kővoikeztaényekést, mindkét receptor ugyantól. a JaklSTAT-szígnálelsmekei.s&ateszza. Azonban, sz IL~2 és 1I.-LS, illetve ezek receptorai komplex szabályozása és dilfereneíálts expressziöja alapján az: in vívó funkciók közötti különbségek az trodalombaa ismertetésre kerülitek [Kírrttaxt és mtsai. (1998); Wsldmann és Tagaya (1999); Waldmano és xutsat. 12091)], Fontos» otegjegyezaörtk az 11,-(5 nem: nélkülözhető szerepet tölt be a természetes ölősejtek (NK-sejtek), NX-T-sejtek és az. epítéduiuon belüli limfomták fejlődésében, túlóiésébeo, terjedésében és tonkcíójában (Kennedy é.s mtsai. (2000); Lm. és mtsai. (2900)].
Az irodalomban már ismertették azt is, hogy ízületi esőzés páciensekből származó T-,sejtekben 1;..-15-tel etem se tsen est s,oe<.zn \l z <rt< c>ikx ttxt kalofes ,\fe'fnes <--· n s, \kín\s <s í i„v (1998)]. Továbbá, perifériáiis vérből származó, IL~i5-íei aktivált T-sójfékroi líimnfahsk, hogy - sejtek közötti érintkezéssel függő mechanizmus útján - jelentős TNF-o tetmelödés indukálnak. Moel a INF-et destruktív szerepet tőit be az ízületi csázban, e ei-okin gátlása csökkenti a betegség aktivitását (Baritett és mísai. 12809); Klippel (20í!<;ι, I mell es miaut \2t!0ök Maim vs Taxlor töAfe)] .Az US 57959ÓŐ sz; szabadalmi irat emlős 11-15 am&gonistáit ismerteti, belépve az lL-15 mnieinjeíl, II15 ellesi monoklonális antitesteket és 1L-1 ó-konjugátmnokaí, amelyek: esekkonttfc az IL-15 képességét arra, hogy stimulálja a T-llnríbekák pro! iterációját te CTLL-vizsgálatban.
Az alábbiakban s-öviáen összefoglalj ük a találmány szermti megoldást,
A találmány tárgyát képezi emberi monoklonális antitest, amely (a) emberi ílv i 5-fe kötődik;
tb> az 11 -15 által iaáuiíáhgytdlíKláskeiiö hatásokat gátolni képes;
U) CDR1. CDK2 és: CDR3 amiaosav-szskveneiát tartalmazó, emberi nehéziánc variábilis régiót és (DR1, CDR2 eak.DR.5 aminosav-szekvencát tartalmazó, enberi köt-nyüláne variábilis régiót tanalmz. ahol
V í a CPR3 amluoisiv-szekyeseiát tartalmazó emberi nehézlánc variábilis régió a szokvencloüsíában SEQ ID N«\ 2. azoik-sitoszátnon megadott aminosav-sgekvencia 19(1-(()7, anunosavait tartalmazza, es a GUS.3 aminoxav-szekveneiát tartalmazó emberi kötmyütáoc variábilis régió a szekvencktlssíában SEQ II) No. 4. azonosí8X11 87- ÍÖ45/SG tószátnou megadott andnosav-szukveoeiá 90-97, anusosav&it tartalmazza;
(íl) a C0R2 artnnosav-szekvenctát tartalmazó emberi nehezlánc variábilis régió .a szekveusigílstáfesta SBQ 5D No. 2, azoa-östtószámon megádon mninesav-szekvencia 5b~óö. smiuessvait tartalmazza, és a CDR2 <mi\vi- '\.M vitt trf.Ó n>i H''i\· \O«U-m?fS. WS IpJOs ><WO - M?Ő.iO M Q ID 4 ά,Ό aesbó^ámon megadott aminosav-szekveneia 51-57. aminosavait t&rtnhnnzzs;
<m) 3 CDR1 aminosav-szekveneiát tartalmazó emberi nehézláríc variábilis -régió a szekvencialístábau SEQ ÍÖ No. 2. azonosítószámon megadott amtnosav-szekvencia 25-25. aminosavait tartalmam, és a CDRÍ. atmnosav-szekvenetái tartalmazó emberi könnyülánc variábilis régió a :^8^venelafistábatt $KQ 5D W,. 4. azoaevddszámou megadott aaüaíssav-szekvencia 24-25. aminosavait tartalmazza.
Á találmány emberi II - 15-őt specifikusan megkötő, az ÍI.-15 által Indukál? gyullndáske5tő hatásokat géto.m «.epés teljesen emberi monoklonális antitest - első alkalommal megvalésholí - generálásán és izolálásán, illetve az Ilyen új ann testek jellemzésén és különféle, az Π..-Ι5 állal közvetített 'betegségek kezelésében betöltőit Híap.ss értékének bemutatásán alapul, A leírtak szerint például kimaísítuk, hogy ezek az emberi antilmek gátolják a gyulladásos betegségekben integrálisán egyaránt résztvevő WF-ö fennelődését és a t-sejtek proliferáetóját Eszerint, a találmány szerinti wuestek tökéletesebb módót blzfesiíanuk az. ilyen betegségek (és bármely más, IL-15 állal közvetített. «1 változás) kezelésére és megclozoxere avhat azért, mert egyedi specitkikasságíít (például, epitóp- és íajspecítlkusság), atfnutásí, íürteiesális aktivitási mutatnak és egyedi szerkezetnek, illetve annaka ténynek köszönbetően, hegy ezek az ant aestek tettes mert ékben emberiek, ezáltal lényegesen kevésbé- immtmogéssk és terápiássá hatékonyabbak és emberi pácienseknek történő beadásra alfeaímasabbttk, mint s korábban előállított antitestek (példád, egéreredetö és humanizált antitestek!. A találmány továbbá azon a felismerésen is alapúi, hogy az Π.- 1.5-oí: gátló mwstek, mútí példád a találmány szerinti antitestek, u terápiás célokra -· így gyulladásos betegségek, mint például izületi esóz, psoriasfe, 'öanszplantáeiós kilökődések és rákos megbetegedések···· is alkaferszluttök.
A. találmány szerinti izolált antitestek kézé az aatitestek .különféle- bmfspastti,. mist például IgGl, IgGl, &G:k 5gG4, igM, 5gAl, IgA2, IgAsee, Igö és IgE, tartoznak, Az k-O-rpu»ok jellemzően az 5gG 1 (például, IgGlkh IgGÖ és IgM izotigrsoksí foglalják utagnkban. Az antitestek lehetnek teljes hosszúságú antitestek ípéldául, IgGl vagy igG3 antitest) vagy íunnlmazhamsk mindössze egy étién zttdgéa-kötőhelyet {például, Fafe, F(afe’)2, Fv. egyszálú Fv-féagpientöra.
A találmány egyik megvalósítási módjában, .az emberi antitestek sekou-feináns antitestek, A találmány előnyös megvalósítást módjában, az emberi antitestet: emberi IgG-eredetü nehézláneoí és emberi te kosgyűláncot kódoló stukleotídazekvenelák kódolják, amelyek variábilis régiót a szekvesesaltstában NEQ ID No, 1, azonosítószámon megadott szekvencia és a szekvenviulisíábím SEQ IÖ No. 2, azonositőszámon megadott: szekvencia, megfelelően, szerinti nokleoiidszekvenGákat, vagy azok konzervatív módosításait tartalmazzák. A találmány egy másik megvalósítást módjában, az emberi antitest a szekvencialistában S.EQ lö No, 2, azonotilöszámon megadott sndnouav-szekve-reíát tartalmazó Igö mdfezlámí-erededi variábilis régiót, vagy annak koszervatlv változatait, és a sgökyenciatisiában SÍ.Q l£s No. 4. azouositöszáuK>n megadott, amtimsav-szekvenetáí tariaínmő κ kőn nyű lánc-eredetű variábilis tegtot, vagy annak konzervatív változatai? hordozza,
A találmány szerinti emberi antitesteket előállíthatjuk valamilyen g.udwjtben rekombináns úton, mint például az antitest nehéz- és kőnttyülancatt kódoló nukleinsavakat tartalmazó Iranszléktórt-akén? (például, őrökéleid CHO-sejteket vagy nyiroksejleket tartalmazó transzfer tóm a), vagy közvetlenül előállíthatlak az .asrtííesfeí töbíSI-KMSNG espresszáfó Isfeídómábőí (példád, ristiszgénllöK,, embertől különböző dllathök példád az autitesJet kódoló, emberi rtebezlánsra nézve transzgémlíns és· emberi kőnnyüiáRera nézve öartszgértíkos egérből származó 8sejteket tartalmazó, orökéleiü sejttel történt Ibriőval készek: hibridömábói). A találmány előnyös megvalósítási mótijá&an, az atáitestet emberi nehézláasot (tsnelynek variábilis téglája a azékvmtiaSstában SEQ 10 No. 1. tizonöstíószárRös megadott szekvenciái tartalmazza) és emberi köaeyőlaneot (amelynek variábilis régiója a szekvsserdtslában SEQ 2© Na 3. Mososítös-rismoa .megadott szekvenciát tariaünazza) kódoló ««kleotldszekvenciákat, vagy szók konzervatív módosításait tas-íalmazó I4§8? ebe vezesd biöridnmávat vagy gazdasejttel (például ClIO-sejrel) állíílak elő. Á leírásban szintén ismertetett antitestet 14®?, 140(15, 4Ó4.E4 és 4Q4A8 hlbrióómőkka! átütjük elő. A találmány előnyős megvalósítási snódjábas, az antitest specifikusan kötődik az 11,1 5 0-és/vagy γ-iáneáoak a kölcsóabatásbzn résztvevő dotnénjéti tévő epítópboz.
A találmány szerinti emberi antitestek specifikusan kötődnek az emberi lk-15-höz és gátoljak az 1E-15 gydladáskeltő hatást kiváltó képességét, példád gátolják az TNF-α termelődését és/vagy gátolják a (-sejteknek - így a P8MC vagy CT1.L-2' T-sejtek - az 8.-15-nek az IL-15 teesptoritoz, való kötődése következtében tönénő proliferáeíójat. 8JACQRE 3őöö műszerrel, rekómbínárts emberi 11,-15 (analizált vegyidet, „atmlyie·') és az antitest: (ligádban) aikaösazásával végzett tolüfril plazmonrezesartctás méréssel (SPR) meghatározottak szerint, az emberi antitestek jellemzően kevesebb, mint körülbelül 1.0'' M - mint példán! kevesebb, nőni feörnlheíd 1O'S M vagy 10Λ .M, vagy ennéi Is alacsonyabb - dísszociációs egyensúlyi áilandövaí (Kg) kötődnek az 11,-15boz. A találmány előnyös megvnlöstiási módjában, az antitest az emberi IL-1S-Í& koralheinl ő,5*!ós M dlszszoojáesős egyenstüyi állandóval -(Ko i koK-dsk
A találmány egy másik szempontja szerint, a találmány tárgyát a találmány szerinti tmíiíesfekei, vagy antigént kötő részeket kódoló auklesnsav-moletelák képezik. Eszermt, s találmány szerinti antitesteket kódoló nukfemsavakat tartalmazó rekotőhínáns expressziós vektorok és az ilyen vektorokkal írzaszfsktált gazdssejlek melleit a találmány szerinti antitesteknek e gazdaseítek tenyésztésével főricnő előállítására szolgáló eljárások is a találmány tárgyát képezik.
A találmány tárgya továbbá, a tsláteásy szerittb antitesteknek a szekveaeialísfában SEQ ID No, 2. azonosltőszámo© megadott smmesav-szekvesdát tartalmazó, nehézláne-eredetn variábilis régióját, vagy annak konzervatív változaiait, és a szokveneiaüstában SEQ 18 No, 4. azonosiiószáötor; megadott ammosavszefcvencíát tartalmazó, könny ü lánc ettedeüí variábilis régióját, vagy ásnák konzervatív változataié kódoló nddeotldszekvenciái tartalmazó expressziós vektor. Ilyen expressziós vektorok a teohíxtkábao jól ismertek, és ezek közé tartoznak példánk a rcükttlocíía-iizáíamökar alkalmazó ss vitro trtmszferipciös/íraaszlaeiós vektorok.
.A leírásban szántén ismertetünk transzgéníkas emberiül különböző állatbői, példád az IL-I S-őí specifikusan kötő stábért monökbnáüs antitestek különböző ízotíptrsaínak (például IgG, IgA és /vagy IgM) expressxáíásara képes transzgénikes egérből, származó izolált B-scjtokeí. Előnyős, ha az izolált B-sejteket tisztítom vagy dúsított 11,-15 antigén-késziíméstoycl és/vagy iL-15-őt sxpresszálö sejtekkel immnsizáü transz·· géidkíts. embertől különböző állatból, például transzgénlkus egérből nyerjük kí. Előnyös, ba a transzsénikns, embertől különböző állat, például transzgémkus egér. genomja emberi nefeézlánc-eredétS transzgént és emberi könnyű lánc-eredetű transzgém tartalmaz. Az izolált B-sejteket ezttfátr. az .11.-15 elleni emberi tnonokipttábs ,«r toskk >os rm. u \ m \ 'Iránra Nos? , λ , t tk ' ok <'tok n 1 1 b murává'
Eszerint, a találmány tárgyát az IL-IS-öt speclliknssn megkötni képes a. találmány szerinti emlmrt monoklonális antitestek termelésére képes hibridőma képezi A találmány egyik megvalósítást módjában, a í 00187-1045/SC ~ 4 hibridóma olyan, transzgenikus, embertől különböző állatból, például tsunszsénikas egérből nyerj B-sejtetzr, i'i . 'v< ge tonni viAi'tn !/törtet ot v ' ο, κ ',a>K etede u , e. ·~ uhu kcr.u lánc-eredete transzgént tanaisnaz. Az antitestet termelő hibridómák elöSfiltá&a céljából a tomsxgénikus,, embertől különböző állatot immunizálhatjuk tisztított vagy ílúsitot; 1L-15 antigén-készítménnyel és/vagy ΙΕ-15-öt expresszáió sejtekkel. találmány tárgyát képző előnyős bibridóíaák közé tartoznak a 14687,146115, 484E4 és 4Ő4AÓ hibridótnák.
Λ találmány még további szempontja szerint, a találmány tárgya Π..-15-öí speedíkasanmegkötni képes g: találmány szerinti manoktoálís antitestet expresszáíő banszgéníktts, embertől kölöttböző állat, például transzgétíikus egér. A találmány előnyős megvalóslíási módjában, a tmnszgénlkas állat olyan transzgenikus. egér, amelynek getvorpja emberi. netózláne-eredete trauszgént és emberi isortuyűiaoe-eredeta transzgéní tartalmaz. A transzgéníkus állatéi Immmdzálhsíjuk iisziiíott vagy dúsított 1L-15 amigén-készittnénnyel és/vagy ÍLi$-öí expresszáló sejtekkel. Előnyös, ha a transzgenikus, embertől különböző állat, például tnmszgéaikus egér, amely V-D-J tokombmáoiöval és izotipus-áírendszedéssel képes előállítani az emberi, mwofclosáüs antitestek többféle izotipusái, Az izotlpus-átreníféződés történtet például klasszikus vagy nem klasszikus áfétedéződéssel·
A találmány »5ég; további szoinpontja szerint, a találmány tárgyát lk-15-tel specifikusan reagálni képes a találmány szerinti estben ínonokkmátis anbtesíek előállítására szolgáló eljárások képezik. A találmány egyik meg valósítási móáiabaö, az eljárásban olyan tnmszgéoikus állatot, például trauszgénikus egeret, jnmmnhéluak tisztított vagv díbitott IL-15 araigén-készrtmémjyei és/vagy 11-15-őt expresszáló sejtekkel, amely állatgenomja emberi neberiam eretem tumszgém és emberi könnyiiláne-sredetü transzként tartalmaz. Ezt követően az állasból B-sejbtei (petete iéperederú ö-sejféketj áílitunk elő és mlelőma sejtekkel tuztonálíaíluk 11,-15 elleni emberi monoktoíten <ml;te.ne-<eé szekretálo, öfökáletü hibridóma sejtek előállítása céljából.
A tataimén) egy másik szempontja szerint, a találmány tárgya terápiás csoporthoz - például citotoxikus drog, enaámatíkusan akor taxin, vagy ásnák hagmeutama, radioízotóp, vagy kismolekulájú, rálseUenes: hatóanyag - konjugált IL-15 elleni a találmány szerinti etuberl antitest,
A találmány egy másik szempontja szerint, a találmány tárgyát legalább egy, a taláknásry szerinti, 1I.-15öt specifikusait megkötni képes emberi tnonokhuáiis antitestet és gyógyászati szempontból oltógadható hordozót tartalmazó készítmények, például gyógyászati és diagnosztíkm/készmoenyek. képezik., A készítmény ezenfelül tartalmazhat más terápiás ágensetet, mint például Innm-nssupptesszt',' ágenseket, vagy kemoterápiás ágenseket.
A találmány még további szempontja szering a találmány tárgyát az IL-1S gyustsdásteitő hatásának mmt például az 11-1$ által indukált Tbih-s-teiuieiődés es vagy a f-sejtek prailféráetöjának gathsa, előnyösen á szerkezetileg rokon Sbhériék/citoktnek (/például IE-2) aktiv-nasanak /például ΤΝΕ-ο-ίΟΓ’κΙοοοο és/vagy a Tsejtsk proliíeráeié) gátlása nélkül·- egy vagy több, a mldhnány szerinti emberi: antitestek alkalmazásával történő gátlására szolgáló in vitro eljárások képezik.
A találmátív szériáit etnfceri antitestek alkalmsztetők külentéle, 11,-15 által közvetített betegségek kezelésére és/vagy megelőzésére oly módon, irogy az antitesteket az ilyen betegségektől szenvedő páesensekőek adjuk he,
A leírásban ismertetett eljárásokkal és készítményekkel kezelhető (enyhíthető) vagy megakadályozható betegségek például - minden korlátozás nélkül - a gyulladásos elváltozások, mint például arthritis (például psorísslsos arthritis és izületi: esáz, ideértve az aktív izületi esuzt és az ijjúkori: Izületi esőzt), gyulladásos bélbeIÖÖ i:$?-lÖ45/St$ tegség, Például az antitestekről kimutattuk, ángy-csökkentik a pamkemtostst. csökkentik az epidermisz megvastagodását éspsariasis esetén: csökkentik a keraóneelták proitferációját. Az antitestekről azt is kimutattok, hogy csökkenek a gyulladást és/vagy megakadályozzák az taxiiéit cstlzban résztvevő sktiválí leukociták kemntexisát. Az antitesteket ezenfelül álkaimazhaíiuk fertőző betegség, például HÍV fertőzés, kezelésére, Továbbá, az aubtesteket alkalmazhatjuk. jranszplantátumsk sík xude'-of ek kezelésére. Továbbá, az antitesteketalkalmazhattek ’ ’ \-.red-.')s»^rtd\z.rek 5 P'i ! vnftt<t\i. ..'LWi x eg^eges r xtt álltai dat,a «Mfejlődós és rakok, például T-sejt leukémia, fezeié χνο
A találmány szerinti emberi authestekc: kombn db.! >ak egy vagy több további terápiás ágensekkel, nrint például gytilladásgátlő áaesrsekkel, DMARÜ-eKL· u scuse-ncátfying msti-rhenmatic átugs. betegséget vnófdtv siló reumaeilenes drogok), ímmtnszuppresszt - tgvaxAke: kemoterápiás szerekkel, es psoriasis elfeni ágensekkel.
A találmány egyik: megvalósítási stödláháre az alanyt kezelhetjük egy vagy lőbb, sz antitestek gyalladáskeltö .hatásának gátlását foltozó ágenssel, például gsulladásgátló ágenssel, rntnt például szteroid természetű droggal vagy NSAIÖ-dré (uoasleroidal anririndaumuíopy drng. nem szteroid természetű, gyulíadásgátló drog), HotoX 'ge' '-ex kenu m.tvtcte ouTsl ’’ ' < >but t'-.u r n <o n as „de, at>kko\é nu'<\ítok nn pe dául rofeeoxsb iVioxx) és celecoxlb (£lelel>rex), INSAlD-ok. mint például ibupmfen (Motrin, Adrii), íénsprolea (Ríllbni, naproxén fNapnwn), sulüxlac (Ottoríl), dselofeaac (Voltaién), piroxieant (Feldeue), ketoprofen (Orttdis), dtfenisai (Dofefed), stabusgettw tWIa&s), «toáolao (Ledine), oxaprozín (Daypíok és indonteísetít Ondóéin).
A txláhnány egy másik megvalósítási utódjában, a találmány szerinti emberi antitestek egy vagy több DMAKD-dal ~ tnitít például tnetotrsxáí (kheunsate). lüdroxtkksrokin íFlaquenil), szulíaszateztn (Asalfídtne), pírt r st. mszinrézist gátldk, például lerlunomtde (Asava). II.-I receptort gátié ágensek, például anakiora í Kü-eret) és TNT-öt-S: blokkoló ágensek, például etanereepf (Huhrol), mtlsximsb (Rsmieaáe) és adaíímauiah kosnbíuáciőbalt történő beadásra szolgálnak,
A találmány egy másik megvalósítási tuődíábau, a találmány szeried emberi antitestek egy vagy több iammnszuppressziv ágenssel - mint például, dkioxporin (Sandimmnoe, Ifeorsl) és azaiiopría (Tsxnmat koitsbinádóban történd beadásra szolgálnak
A találmány egy másik megvalósítási íttódjában, a találmány szerinti emberi antitestek egy vagy több ketnoíerápiás ágenssel - mint például tloxorubtein (Adriamycítri,: eiszplatin (Plariöolj, bleömiein (Blenoxanel, earmustine (Gliadel). ctklofosstamid (Cyloxtm, Froeytnx, feeosar) és kloraiubueil (Leofceomí kombinációban történő beadásra szolgáinak. A találmány szerinti emberi asiitestek: besíigárzásos terápiával kombinké tóban történő beadásra is szolgálnak,.
A találmány egy másik snegvalódíási médiában, s találmány szerinti emberi antitestek egy vagy több, a psoriasis kezelésére szolgáló ágenssel mint például szénport, A vitamint, kertixont vagy más kortikoszteroíöokat tartalmazó, topíkálísan alkalmazandó gyógyszerek, orális vagy injektálható gyógyszerek, mint például korttkrts/tercídok. raetotrexát, retinoidok, például aeíereria (Neogitasots) vagy ciklosporin (Snndimmuné, \eorak kombinációban történő beadásra szolgálnak. Más kezelések soréit alkalmazhatunk napfény- vagy fetotemptat
A találmány egy másik. ínsgvniősitásl médiában, a találmány szerinti -emberi antitestek más antitestekkel
- példánl CQ4-re specirikus antitestek és ΙΙ.-2-re specifikus .antitestek kombinádohsm történő beadásra szolgáiíW1SaíŐ45/SG fisak. A tnlálruáoy szerinti ember! asstíteisfc és CD4~r« specifikus antitestek vagy 11,-2-re specifikus tmtileslek \ 'ί Ή va vük o w' i -' oart a t Au rak > « η. o e^,e„segvk es üo,’ br' n u r \>lbk<x co\ kv/e _ sere.
.4 leírásban isme-tetih-k egy 11.-15 antigén \aiajmlyen mintában valójelenlétének ín vitro vagy ín vivő kimutatására szolgáló eljárást, például 11,-15 által közvetített Itelegségek: diagímszkizálására. A tnlálmátty egyik megvalósítási módjában, az eljárást ágy végezzük el, begy & tesztelni kívánt ntiatáí - kontroll mintával párhuzamosan - olyan körülmények között érimkeztetjúk a találmány szerinti monoklonális antitesttel, vagy annak antigént kőtő részévek amely kőrtiltnények lehetővé teszik, hogy az antitest és az Ik-15 között komplex, alakuljon ki. Ezután a kompiezek kialakulását a mintákban Mmutaíiuk (például ELISA. alkalmazásával).. A kontroll és tesztelendő mintákban kialakult komplexek közötti, statiszlikailsg kitnatatbató bármilyen szignifikáns különbség jelzi az IL-15 jelenlétét a tesztelni kívánt mintában,
A találmány más ínlaldnnságai és előnyei az alábbi részletes leírásból és a szabadalmi ígénypontokböl egyértelműek lesznek.
Az alábbiakban röviden: leírtuk a találmányhoz tartozó ábrákat,
1. ábra; Az emberi 1Ε-Ι5ηη specifikus antitestek (146B7, 14ÖB5. 4Ö4E4 es 4Ö4&8) embert íL-15-höz fblt-15) es a mutáns lb-15 fehérjékhez (QIOSS es iákSQlbdS) történő kötődéséi matató grafikon. Az antitestekből készített higitásí sorozatokat ELISA-vsl vizsgáltunk az hlL-iö-hoz: vagy a nmtáss lk-15 fehérjékhez (01Ö8S és D8SQ1Ö8S) történő kötődésükre ttózvé,
...5 ab. \ -o3 . rí>te\.'\ 1 - rtmzok es \ .. η n 'sav r.t <. ekseruiah adun bEQ ti.) No. 2. és 5.EQ ID No. 4. nxonositószámon megadott szekvem ukl és nukleotiászekvenctái (a •./ekveodabstabarí SEQ ID No, 1. és SEQ ID: No. 3. azonosítöszámon megadott szekvenciák}:, megfelelően, Az ,ibu.ken jeleztük s vázrégiókat {íramework, FR, régiók) és kotnpíeruetrtantart meghatározás régiókat (CDR-ek).
4A-D. ábrák; Az lL-15 által közvetített TNF-α felszabadulás gátlása 14ŐB7 antitesttel. Emberi PBMC-t *”* órai n tnkuhaltios híl-íp (C po \)d ug trfi os 14nE antitest s.igv '.alamdv.'u t'eímusu kömre5! antitest ííí.í, I.M pg/W} kombinációsával. A termelődött TNF-ot mennyiségét FIISA-vat mértük. A grafikonokon két egészséges önkéntes hol származó adatokat tnotaíjnk be.
5. ábra; A 1407 antitestnek azíL-2 vagy 11-15 által közvetített TNF-α termelődésre a\akosok hatását bemutató grafikon. Embert EBhíC-t 72 órán át ínfetbálínak híL-lÖ (9, Öt), 1:ÖO ttg/mi} vagy Ml -2 í lob rg ml} és 14ÓS7 antitest (Ö, l, 1, l.Ö pg/ml) kötnbtöácíőtítval A. rentmlödötí TNf-a meunyíségét EL IS A-sal itkrtu.
ő, ábra; A 14687 Möli5, 404E4 és 4Ö4A8 antitestnek a GTI,L~2 felL-l$ által indukált proliferáoiójára gyakorolt hatását ábrázoló grafikon. hl'L-2 hiányában tartott ü'FLL-2 sejteket Ml,··IS (60 pg/mfi és 146B7 14ÓI-Í5, 4Ö4E4 és 404A.8 antitestekből készített hígkási sorozatok kombinációjával inkubáltuk 48 órán át. A 'f.ovívObícczi.'w.r. cpurt ( L η J· χψΜΟ'χί mrSt κ \ ' ,m ’-va.mevet a ’gortekek. termi,abstt mulatínk be..
7-9, ábrák: A MSB? (7. áhrak 4D4E4 (8. ábra) és 4Ö4A5 ami-esi (9. álnál 11.-15 által indukált PBMC p terrénum'. Ά lUiof -\M > .ötösein pemUato cnftken labort EBML-r 72 oran at jnkubafinns hlL~L5 (ti, 25, líIO ng/ml; rendien ?A., ŐA, és SA, ábrák) vagy hIE-2 fii, 10, IÖO ag/ml: 78.. 88, és 98. ábrák, megíéieoe'es IdőB'* antre^ t abrak mit t(X „msei. 10448 amuevt íw abwuV, \ ;d eg-íut> ko-nbtnaemmx'al A prqbíezácíő kilói ezésósr; (epsa) [Ltj-hmMin beépülését mértük.
to abm Λ t4oB7 untáért kmédA·.; Ιί\-γ.\Μ serkeoseo monomukhoz Ember! PBML-ket 2 napig, ínot<.i<>4S St!
/.
r'{\'B tejr\é».'tetn..nk UN-, <>0» 1 ml· uledetebe?! A'andasos vitonOt; nr\al es '.no?toe’tafou történt :apuzássul legalább 5008 sejt fluoreszeendáját határoztuk meg az egyes mintákba;?.. Az adatok s serkentési indexet íSX-fírtofeoűnöojsxs. nézve pozitív sejtek átlagos száma/átlagos háttérflaoreszceacia) mutstjás be.
II. ábra: Emberi monodtsk kötődése 14687 antitesthez (8 panel) vagy sz. izotipns kontroll antitesthez. (A panel). lArmeri FEMC-ket teeíáínmk, a sejteket líFAi-y jelenlétében tenyésztettük, majd seabd&gáíással izoláltuk. A sejteket: hetnatoxillanal utántestettűk, td. ábra: Emberi psoriasísos bőr kötődése 14687 atttlfosféez (8 pasmi) vagy szizotipas :k<míroil: ajnhesthe?. í A panel). Páciensektől. emberi psoriastsos iefegokeí gj’öjtMnk (a? érintettek. ItoZKájárukisávsl), és a vizsgalatig -80ftC-on tárolíuk. Szö veteket festetitek biotiteíált antitestekkel, majd a kötődött antitesteket rétekerede;ű perextdáz aktiválásával tettük iátkatővá,
OÁ., ábra: A sejtmaggal rendelkező sejtek aranya .14687 antitesttel vagy hordozóval kezek SCID egerekből származó izületi csázos szövetben (grafikon}. Szöveteket festettünk hematoxíiitmal es eoxmmd (ri&b) és Photo Shög (ver. 0.6) programmal analizáltuk. A bemutatott adatok .a sejtmagok átlagát és tsz átlagos hibát (s.ears.) ábrázolják (ts teljes terület arányában) 14687 antitesttel (iM) vagy hordozóval kezelt egerek (o~2) esetében. 138, ábra: Xenegráfi KA szövet ívpa-zenmUs ikkl festése 146137 antitesttel (8 panel) vagy EBS-sel kezdi SC1Í> egetekben (A panel·.
14, ábra: A -14687 aoróesttel végzett kezelés hatása SClS/psorkrsisos egetekben. Siopszíákat fixáltunk formalinhsu, pmafbnha ágysztnk. U&E-vel és Ki~67 sejtmag-antigénre testeitek. 14.4. ábra: ts prorfasis súlyosságának: értékelése az epidermisz vastagságának, a felhám és a ,,«;íe ^seg^-ek közötti távolság mérésével, H8. ábra: Az epidermisz, a felhám és a „reíe peg’-ek legmélyebb része közötti távolság mérésével megállapított vastagsága. f4'C. ábra:: A pamtóaaosls mértéke. 14D. ábra: A gyulladásos, egysejtmagvú sejtek száma az epidermisz.felső rétegében, 14E, ábra:: A Ki-ó7-re pozitív, ciklusosán visszatérő kera-modíák száma.
I S, ábra: A i 4687' antitesttel panel), CsA-val (8 panel) vagy hordozóval kezel; SCID egérbe átültetett psoriasisös, ember? bőr feslődése H&fcAek. A kaöszplasíádó mán háswj héttel az, egereknek PBS-t (piasefeo), CsA-t teikloxporin A) (Sandoz) (lö mg/kg minden második napost, 1.5 napon, át), vagy 14687 antitestet (28 mg/kg az '1. napon, 10 mgtkg ts S. és 15. napon) adtunk be. A legutolsó injekció után. egv héttel az egereket elöltük. és az egyes xenograftokböl 4 mm átmérőjű blopszlát vettünk. A fcfopsziákat formaimban Okátek, paraffinba ágyaztok. és H&E-vel festettük.
17, ábra: A 14687 antitest kötődése a reesptesTóz kötött ΙΕ-15-hoz. Lemezeket vontunk be ll,~ i SRö-val és lL-15-tel ínkubáltuk. Tíz perced később a lyukakhoz bioliidiált 14687 antitestei: adtunk A 14687 antitestnek a recepforlsoz kötött: IL- IS-höz történő kötődését ELlSA-kanvasóban, 405 ron-en mértük.
Id, ábra: A 14687 aotitest kötődése ksjóitejiekes exprosszáh IX-ló-receptor által. megkötött il,~15-höz, Mifote. 11..-IóR-et expresszáló Raji-sejteket lX-15-tel mkubáitenk ül percig, hioaoiiáii 14687 antitestet adtunk a sejtekhez. A 14687 antitest receptorhoz kötött ík-lS-bőz való kötődését FÁCS-analkdssd értekeitük.
Az alábbiakban részletese??! leírjak a teiáhoány szerinti megoldást.
A taláhsáíxy tárgyát az lt-i5 által közvetített különféle elváltozások (azaz az ÍI..-I5 gyulladáskeltő hatásai által ksvá-íoii elváltozások) kezelésére és diagnosztizálására szolgáló áj, antitesten alapuló gyógykezelés képez' A leírás szeriöti értelemben, az ,,1(,--13 gynliadáskeltö hatásai” kifejezés jelent bármely, az it-15 által otenkaz hmno-alte .agy sejt altul kv.-oeiuetí imtnmnalaszt. rsnnt poklául a l XF-o es ma» gyulladásos medtetor urrm lo? leset, e\ . I -sejtek összegytiiését/proiiiérádöiáí; A találmány szermd terápkíkbas az 11,-1 >ön jeie:rlévö iÖ01:k?-l:045íSG
-s valamelyik epltopot: -specifikasas megkötni képes, butáit .emberi mopöSteáfe aHiliesíes aikahnazusk,
A taiáteáuy egyik' íttegvalósitási módjába®, az emberi ajtóósleket elvan, netn emberi teszgéníkw áílatban, például truuszgénikus egérben állitjuk elő, amely V-D-J rekotubináo lóval és izotípus-áfrendezödéssei képes az H..-L5 ellesi emberi .momddonóiis antitestek többféle izotlpusát (példáéi, IgG, IgA és/vagy IgE} előállítási.. így, a találmány különböző szempontjai szerint a találmány tárgyát antitestek és azokból Részűit gyógyászati készítmények mellett, az. ilyen monoklonális antitestek előállítására szolgáló nem emberi transzgénikus állatok, B-seltek. gazdasejl-Wiszfekténsák, és hibridómák képezik, A leírásban ismertetünk a találmány szerinti aaíitöstek .alkalmazására szolgáló eljárásokat rs, amelyekkel kimutathatók azok a sejtek, amelyekhez 1I.-1S kötődik, és/vagy .amelyek az IL-15 által közvetítő·; fijnkciök itt vívó vagy is vitro gátlására szolgálnak, A teásba® ismertetőnk továbbá bizonyos ágenseknek az IL-15-őt kótö sejtekhez történő irányrtására szolgáló eljárásokat ss.
A salálotány jobb megértése céljából először bizonyos kiíéiezósefc meghatározására van szükség. További meghatározásokat a részletes bírásban Ismertetőnk.
A leírás szerinti értelembe®, sz „IL- I S”, „11.-15 antigén és .Jnterleukm-15 kifejezéseket egymással fel? eseréteöea alkalmazzuk, és e kifejezésbe tartozik bármely, a sejtek által természetes körülmények között expresszit változat vagy tzeíoma,.
A.leírás -szerinti értelemben, az „uístitest kifejezés magában foglalja a teljes antitesteket és bánnely, anivfw, un»< '<o u <j <m<, ' <o‘ í-'-u í \,ca ,-Á»\.>v<!t s< \ tt, t V , nt te-, ’Λ. v/es 'legalább két aébéslteof í.H) és azdsitoz áiszalfíd-h Idákkal kapcsolódó két könnyöiáneos (L), vagy azok snrigéskötö-részéí, tartalmaz. Az egyes; nebézláacok nebézlánc-eredetű variábilis régiót (rövidítve Víf) és nehézlánc-eredstd konstans régiót (rövidítve v<) tartalmaznak. A nehózlánc-ereáeni konstans régiót három dómén - ölt, CH2 és Cffi - alkotja. Az egyes könayáláncok kőnnyülánc-eredetű variábilis régiót (rövidítve vk) és kőnnyülánc-eredetö konstans régiét tartalmaznak. A könnyülánc-eredetu konstans régió; egy dómén - a CL alkotja, A Vy és Vt. régiók,Jkonzen.-áltabh régiókkal (vázrégiók. ER) kever; komplementaritást meghatározó régiókból (CBR-ek) álló. hipervaríahihtári régiók szerint tovább csoportosíthatók. Minden egyes V$s és Vt három CDR-ből ás uégy FR-bol áll, amelyek a C-terminálistól kiindulva az alább; sorrendben helyezkednek el; ÍRI. CDR1, FR.?.. CDR2, ÍR3, CDR3.PR4, A nehéz- os kösuniiláncoR variábilis régió; turtaknazzák a kérdéses att g,?; u !-oU ösva ;sro cro - ttououjen V a-trivA ksnst’- régies L·'?'e* ♦acttk r smm^rg -sb, ;; kötődéséi a gazda szöveteihez vagy íakterAoz. ideértve az immunrendszer különféle sejtjeit (például, effektor sejtek) és a klasszikus kompteesfrmdszer első komponensét (C1 g).
A leírás szerinti értelemben. valamely antitest. ,.antsgén-kőtó része” tvagy egyszerűen „antitesíresz” satuméi} antitest egy vagy több olyan frap-nentusnat jzlent·, amely no<k\ke:ok azzal;; Repesseggei. hogy specifikusan kőfödjön egy adott antigénhez (például, H,· 15-höz). Kimutatták. hogy egy adott amirest antigént kötő imdsciéjá.í a teljes bosszüságű antitest fragmentumai is képesek betölteni. Az „antigén-kőtö rész kifejezésbe tartozó kötófragmentumok közé somijuk például az alábbiakat: (il Fub fragmentum (a V£· VB, Ci.. és CH) doménekbol úhó mooovaiens fragmentum;, (ii? Eíab'h fragmentum {két egymással a esukiórégióban áiszullidluddal o^zekapcsoh Eab fragmentumból álló bivalens fragmentum), íiii) a VH és CH; do-tnéneRbö; álló íd fragmentum. (M egy adott antitest egyik karjának VL és doménjeíból álló ís- fragmentum, t v) egy adott V?.{ tejént tartalmazó dAb fm-amennm- [W&rd és nttstn.. Natúré 34j., 544-546 (1939)1, és (vi) izolált, komplementaritás·· meghatározó régió (CDR) 'vagy (vtj) két vagy több - igény szerint szimetikus linkeméi egymással őszszekapcsoh - szolalt CDR kombiuáoiöia. Továbbá, bar az Fv fragmentum két: doméujéf (V, és V·.,) kólSnálk;
100l8?-1045tSG ~
gének kódolják, rekombínáns eljárásokkal e gének osszekapcsolttatok valamilyen szintetikus linkerrel, igy itiyast ·, K’ h Ο μ í ki'1 ál Ibk ι > Ο vht i k j \ \ vteév P'fbi S.ttő„ ’odsc 1. 3<. V , ?s f U A t ’ í n kútnak (lásd, egyszáte Fv febtgle efesin FV, x<FV) [Bírd ós mtsai., Science 2,4,), 425-426 U98S); Huston ós mtsai., Proc, blat.1, Acad. Scf. USA kő, 5k?9-5k8.3 11988)). Az ilyen egyszálú antitesteket is egy adott antitest „anfigés-kötó részének tekbiiük. Ezeket sz aBtítest-fragtaentumokat a szakember szamara ismeri eljárásokkal állíthatjuk elő, és a O-agtstersdisítokm az intakt antitesteknél alkalmazottaknak megíeMŐea szkrincljíík.
A leírás szerinti értelemben, .a „rtíostoklonáiss antitest kifejezés olyan asttttestef jelent, amely egyetkm konkrét epitóp elten mutat kötőspeelílkusságot ós atflnitást. Eszerint, az „etnberi monoklonális aníiíesf olyan, egyetlen kötési speedimtást mutató antitest, amelynek variábilis és konaíans régiói emberi csíravaoalbast kódolt bmoanglöbuiín-szekvencsáböl szárrnazn&k. A találmány egyik megvalósítási nfedjábisn, az emberi monoklostális antitesteket olyan n-anszgémfcus, embertől különböző állatból, például trassszgénikus egérből származó B-selteket lázionáitatunk öröltelefe sejttel, amely egér genom-u emberi nebézlaníi-eredotti srauszgéat és: erőben irikssyuláneterédeíu traaszgóttt tartalmaz,
A leírás szerimi «rtelesoben, a „rekombínáns embert antitest'’ ki létezésbe beletertoznak mindazon emberi antitestek, amelyeket rekonibináns úton preparáltunk. expresszáltunk, készitetlíisik vagy szolaltunk. mint például iá) embert irammtglöhulim kódoló gem-kre ioeiszgéruktis vagy transzkromoszósstálís állatból (például egérből) vagy azokból készített hlbriáómából Izolált antitestek, t lásd az alábbi I. részt), (bjaz antitest expresszáiására trassztbrmált gaz.dásepből, például ttans/rektaniábol, izolált antitestek, (e) rekombínáns, kombinatorikai emberi antítestAőuyvIásból izolált antítéstek, es íd) emberi inzmunglobuhn gósssekvencíák más DNS-szekvenciákba történő beépítésével járó bármely más eljárással preparált, expresszák. készített vagy izolált antitestek, ilyen rekombínáns embert antitestek variábilis és konstans régiói emberi csiravcsalban kódolt jmmunglobslisaszekveoejábol származnak. A találmány bizonyos megvalósítási módjaiban, azonban, az ilyen rekombínáns emberi antitesteket in vitte mutagestezisnek (vagy ka emberi lg szekvenciára tmnszgénikus állatot alkalmazunk, akkor ín vivő szomatikus: mutagcstezíssek) vethetjük ató és így a rekombínáns antitestek VH és V) régióinak amiaosav-szekveoetái olyasok, hogy bár emberi esíravoualbars kódolt V(i és V; szekvenciáiból xzársmsznak vagy azzal rokonok, íettofeszeiés kbriílttiésyek között mégsem fordulnak elő az emberi esiravonal génrepertoárjáb;m isi fevo.
,A leírás szerinti érteletttben, n „keterológ antitestei’' azassíitesíet előállító, iranszgésíkus nem emberi szervezettel kapcsolatban alkalmazzuk. E kifejezés a tmnszgénikus, embertől különböző állattól eltérő organízmssbau, és általában a transzgémkos, esubertbl különböző állattól eltérő fajból származó annaosav-szekveamával vagy az azt kődeks ntsktóssav-szekvenorival megegyező szekvssriájú antitestet jelent.
A leírás szerinti értelemben, az „izolált antitest kifejezés olyan antitestei jelent, amely létryegébes mentes más, eltérő astigés-speeitíekású antitestektől (például, 11..-15-öt specifikusan kötő. Izolált antlíest. tenyegében taeutes az IL-15-től eltérő antmé-teket specifikusan megkötni képes antitestektől). Az 1L-15 valanxtiyík epilopját specdlktssao m.egkőím képes, izolált antitest, azonban, keresztreagálbat más rokon, citekinekkel vagy más fejből származó 1L-1S valamelyik epitőpjávaí. Azonban előnyős, ha az antitest tssirsdtg emberi lL-15-böz kötődik. Ezersfeittl, egy adott izolált antitest jellemzően mentes más sejtes ányagtöl és/vagy kemikáliától. A aialsomy ,'<?©'>. mvgsaí untam -©όρΆ-η. ll -15 te verve ettero speMtedáeu. „szolalt sn^nokkOctlts ,intsíe.>fek >< st b ·. ,)C - as < > meg tata o.ot < vtee.vtos, \ mr.is s/e'-mi. értetekben,„*p«cshku konxteri' e’ösa megb-n.sts’f.-otí .s-utgefetez saio Lotodett fe'vrt
1'50187-1045/50 .leifesnzd, hogy Bi.ACORE 3fe8ű műszerrel, rekesnbkfons emben IL-15 ínnah/ait tegyülert és sz antitest (Itgattduat) alkalmazásával végzett felületi plazmotrrezönaseius méréssel 1$PR) meghatároz otfok szériát. az ib'hí'· «svcv'tóoe mim .-.-.. rubetoi A \I - mi pe,dtu kexe-tób! i< * fkot,, lódul O'V ” Vv.ívíí V <,£·> CÜK sUUs'v' h'-ulűj Sav (\ '1 \0t0öK8. i s ,/ «. O , ' Ugl at trö/ U! Γ’^Ί, V OIC nezra urm-1 antigéntől vagy ahhoz közeli antigéntől eltérő, nem specifikus antigénnél (példánk BSA, kazein) legalább hétszer nagyabb affinitással köti. Az „antigént felismerő antitest” vagy „antigénre specifikus antitest” kilejézésekel az „egy adott antigént spécirtkusan kötő antitest'' kifejezéssel folcserélhetöeo; alkalmazzuk.
A. leírás szériáéi értelemben, a „Kt>'v kifejezés egy adott antdest-antigés kSfesönhsíás drsszociáciős egyensúly· állandójára vonatkozik.
A leírás szerinti éneimben, az .,!zot!pus-átrendeződés”kifejszésasra a jelenségre vonatkozik, amelyben egy adott antitest, osztálya vagy izetipusa az egyik ;lg osztályról egy másik lg osztályra változik,
A leírás szerinti értelemben, a „nem átváltott izotípus” kifejezés a nehézláneofc olyan izotipus-oszíályát jelend, ahol nem történt izobpu»-átrendeződés; a nem átválton izotipust kódoló CM gén jellemzőm a foukefenáns újrarendezett VDJ géntől 3' Irány bán közvetlenül elhelyezkedő első CH gén. Az rzoiiptis-átrendeződést klasszikus vagy nem klasszikus ízotlpus-átrendezöd-esi csoportokba tisztjük, Klasszikus izotipus-átrendsződés a transzgénben legalább egy átrendeződést szekvenciát alkotó régió közreműködésével történő rekombinációs események esetén fordái elő. Nem klasszikus izodpus-átrendeződés elfordulás^ például, embert σ.; és Xf, közötti homológ rekombináció esetén (S-asszoclált deléclő); Alternatív nem klasszikus izodpus-áírendezódésl medsafozimrs, mist például transzgenek közötti és/vagy kromoszómák közötti rekombináció, is előfordulhat és létrehozhat izotípus- au ctideiódésr.
A leírás v.. w értetekben, az „átrendeződési szekvencia/’ kifejezés az átrendeződési tököntblsúcídérí felelős íűNS-szefcveneiáfcsí jelend. A „átrendeződési donor” szekvencia, jellemzően g átrendeződési régió, a konstrukcíóuzon 5' regtóm, amcb uz ammde/odést rekombináció során törlődni lóg. Az „átrendeződési akceptor’ régié a törlendő régió és a helyettesnési konstans régió spéidánl, γ, a. stb.) közőst lesz. Mivel nincs olyan: specifikus hely, ahol a rekombsnáuiő rendszerint előfordul, a végső génszekveueiát ,a koasóukelőbdi jellemzően nem tehet előrejósotó,
A leifos szerint) értelemben, a „glikuziteelös mstázat” kifejezés egy adod febérjébez, ifodkrétabhan valamilyen. imnmngiobnlinrlshérjébez: kovalensén kapcsolódó szénhidrát-egységek mintázatát jelenik Egy adott heferoidg antitest gdköziláesős imrttázafom jellemző, hogy a nem embert transzgénikus állattátok által termeit antitesteken természetes körülmények között előforduló glikoziláeiós mintázathoz hasonlít, igy a szakember felismeri, hogy a heterelőg: antitest glikoziiáciés mintázata jobban hasonlít a nem emberi transzgérukus áílartinek fehérjék, gilkozdáslós mintázathoz, mint sas·» fejők esetében. ahonnan a tmnsxgén CB-géujei szárntaztak.
A .leírás szerinti értelemben, valaíu ilyen objektumra vonatkozó „természetes körülmény ek közön előtórdűlő” kifejezés azt jelend, hogy-az öbjekamr a íersfeszeíhen megtaiálharő. Például, egy adott szervezetben (így vírusokban is) jelenlévő polipeptid- vagy pohtaűkiöödd-ssekveneíát izolálhatunk a természetben előforduló kt a-vd ·.·. rí-. '..'vet u, urKt vám okosai >\ -< nem- ·. <?. . Άο- a kemc-es tei nesze <.\ a, tulstények között előfordul,
A lesfos szerinti értelemben, az „áteendeződört” kifejezés a nehéz lánc és könnyuláse iruísangfobuiis lőkusz olyan konfigurációját jelenti, ahol lényegében komplett Vj.: vagy V(. dornént kódoló konformációban V szegmens helyezkedik el kőzvetlettal & D-l vagy .1 szegmens, megfelelően, mellett. Átrendeződött imnumglobu1001S? -:ií)45/SC ka génlokosz a/o.a'Atomé az örökölt DNS-ssl történő összehasonlítással;: valamely átrendeződött fokasz légibb egy «tan et r afedott aepí&tKes/mn* femtofogiaefomet tartalmaz.
A leírás $ -erőt? c« ofembsn, egy .adott V szegmenssel kapcsolatban alkalmazott „sem átrendeződött” vagy ,paírsvonaí-eredeiít: konflgnrácló” kifejezések oiyao konfíg-ítecíóra. vonaí&oznsk, ahol a V szegmens nem mkombfeálódotí, igy D vagy .1 szegmens tnejteít kfesvesfettei helyezkednek ek
A leírás szerinti értelemben, a .afefoefestm-imheki.tta''' kifejezés DNS és RNS sttolekulákat jelent Egy adott nnklemsav-mofeknia. iebet: egyessxáfo vagy kettösszálö, de elönj öscn scttósszcdu DNS,
A leírás szerinti értelembe»,, az IE-15~et smgkötní kéfms antitestek! \agv antítest-réssekeí (pékiául, V«·, V:, CDR3t kódoló nukletnsavakkaí kapcsolatba» alkalmazott „izolált mikktusav-tnolekala'' kifejezés olyan naklemsav-molekűktt jeleni, amelybe® az antitestet vagy as antitest egy részéi kódoló tmkleoridszekvesela mentes más, az kk.-lS-töi eltérő antigéneket kötő antitesteket vagy antitest-részeket kódoló fUíkleottrissekversciákiók ttmely más· sukléotidszekvesöjsk az emberi genotnikns. DNS-bea a nukleinsavat természetes körülmények között esetleg övezhetik a szekvencia! tatában SEQ IP No. 1-4. azomtsttósztmtort megadott szekvenciák a találmány szerinti, emberi IL-IS elleni, 146B7 jeiti atrreo nehézláne- tV.fj és könny öiáncrégióit (Vb) tartalmazó oakleoiid- és aatlöosav-szekvertciáknak felelnek meg, Konkrétan, a szekveneialistában SEQ IP No. 1. és SEQ ID No. 2. azooosttószásrtön megadott szekvencia a 146B7 jelű antitest Vh domépjések, a szekvencialistában SEQ lö No. 3. és SEQ IO No. 4. azonosiíószátrton megadott szekvencia pedig a 14ÖB7 jelű antitest VL áoménjének felel wg:.
A találmány oltalmi köre kiterjed a. szekvescislistábarr SE'Q ID No. 14. azonosttószárnon megadok szekvenciák „konzervatív szskveneiatnödosításaírá” is, azaz olyas nukleottd- és asnutosavszekvencia-módosíiásokra. amelyek nem gyakorolnak jelentős hatást a sakleotidszekvenoia által kódolt vagy az aramosav-szekvettetás tartalmazó antitest jellemzőit, vagy nem változtatják meg azokat, ilyen, konzervatív szekvenciamödositások közé tartoznak nakleotid- vagy sstteösav-szöfesstítüsiók,. addfeiék és -delének, A szekvenciái istában SEQ ID No. 1-4, azsnosiiészátnos ssegsdott szekvenciákba módosításokat a technikában ismeri standard eljárásokká!, mint például irársyitoít möSageoezissei és PCR-tel közvetített muiagesezissei vihetünk be A konzervatív tmusosgv-szafesztifoeíók ósdién sz: smúmsavar hasonló oidaiíánoű taftmsvvaí helyettesítünk. Hasonló oldalláncú aminosavak családja a technikában ismert. E. családokba tartezrsak bázrkus oldalláncú s példánk lízin, arglnin, hisztidín), savas oldálláosokat (példánk aszparaginsav, ghtíammsav), töltés ttélküb, poláros oldaliáncokat (példánk gllcin, aszparagin, glstamin, szerte, íreotiis, tirozin, ciszteln, trlptefánj, poláros oidailáncokat (példánk alanss, valin, tettein, izeleaete, prolin, fenílalanin, msriosi»}, S-elsgszásokaí hordozó oldalláncokat (például, treogm,: valte. izoleucia) és aromás eldalláncokat: (például, tirozin, fendálitmn, irigtoísn, felsztídte) hordozó atnioosavak. így, az Π..-15 ellent emberi antitestben az előrejelzés szerint nem esszenciális atslnesavat elöoyösen az azonos oldailáneokttt hordozó aminosavak alkotta családból szamtaző aminosavval helyettesítjük..
bsstkg, a találmány egy mástk megvalósítási tnödtábatí, mteációkat vihetünk be az 11,-IS elleni antitestei kódolo szekvencia teljes hosszába vagy ásnák egy részébe, példáid telítési mötagenezissel, és az eredményűi kapott, 11-1^ elleni módosított antitesteket kötést aktivitásra nézve szkrteelheijíík.
k'szermt, az ismertetett (nehéz- és kön nyit íáne-eredetü variábilis régiói tníkleotidszekvenciák álfel kódolt ««estek és/vagy as Ismertetett (nehéz- és könsyűsönc-eredeiii varíaöiht tagtól axninosav-szekveneiákat (azaz a szekveacfeiistában SEQ ID No. 14. azonestíószátnott megadott szekvsretak'· nrtaínfezó antitestek közé tartoznak konzervatív módosításon: átesett: szekvenciák által kódolt vagy azokat tartalmazó, lényegében hasonló anílKW74045/SÖ testek. Az alábbiakban ísmertebök azt áz öliárást, ahogyan ilyen iényegebett hasonló antitestek elöáikthatók a táláintány tárgyát képező,a szekveneiallstáfean SEO ID No. 1-4. azonos kószámon tnegadoít szekvenciák roszei (azaz, nelfexláne- és könnyüláne-eredetu variábilis régiók) alapján,
A önkiéi«savakra vonatkozóan. a leírás szerinti értelemben, a „lényeges ntértékti horaológis” kifejezés jelzi, hogy két nokleirssav, vagy az azokból kijelölt szekvenciák, optimális összerendezése utáni összehasonlítás Szerint, á. megfelelő tmkleofidinzereiók vagy -áeléciök esetén, a nukioctidok legalább kórülbeiül 80%-a., általában legalább körülbelül 90-95%-a, és előnyösebben legalább körülbelül 98-99.5'fe~z azonos, Esetleg, lényeges mértékű honwlógia abban az esetben áll fenn, ha szelektív 1; i lm dizációs körülmények között a szegmentumok a komplensent szállal híhrídízáloak.
Két szekvencia közötti százalékos azonosság: a szekvenciákban közös, azonos poziciók: számátöi tngg (azaz %-os homológia:fí azonos pozíciók számafez Összes pozíciók száma '* löö), (igyeiembe véve azon rések számát, és az egyes rések hosszát, amelyeket a két szekvencia optimális összerendezése céljából szükséges volt beilfesztem. A szekvenciák összehasonlítása és két szekvencia közötti: százalékos azonosság nteghaíározáss történhet matematikai .algoritmus alkalmazásával flásd az alábbi, a: taláhaányt semmiben se-ro korlátozó példákban leírtakat).
Két naklsotídszekvencia közötti százalékos azonosság meghatározható a GCG szoftvercsomag (iütp:fwww,geg.cotn) részét képező GAP programmal (NWSgapdna,CMP mátrix; pap oeight: 48, 50, 68. 70, vngy 80; k-ngbt vreígkt: 1,2,: 3,4, S, vagy ö). Két nukleotid- vagy aminosav-szekvencia közötti százalékos azonosság kis, arOt-nt ·> az t M<-\ <.rs és W. Miller által kidolgozott [CABIOS 4, 1 {-1? < 1989)}. és az AÖGN programba (2.0 verzió) beépített algoritmus alkatmazásával (P AM 120 neigbt resldne tahié; gap lengik penalty: 12;: gap psnalty: 4). Ezenfelül. két amtnos&v-szeksvBcía közötti százalékos azottosság kiszámítható a GCG szofttervsomag pmp nv,w pop eorn rcazet képező G KP pmmau-ba beépített. Kcecleman e- U u<«.ch ?kf kak-lg··» zott algoritmust ÍJ. öíok Bioi. 48, 444-453 tartalmazó GAP programmal (Blossmn 62 mátrix vagy
PAM2SS mátrix; gap wíght: lö, 14,12, 18,8, ó, vagy 4; lenght weight; 1, 2, 3,4,5, vagy 6),
Á mlálmáray szerinti nukleinsav- vagy fehétjeszekvenciák alkalmazhatók „keresési szekvenciának”, amellyel a nyilvánosság számára elérhető adatbázisokban keresésre, például rokon szekvenciák keresésére, ulLaíroarhu'uuk, llxn kereseteket végezhetünk az Altrdtu! munkatársa; ahol kidolgozott N81 AST és XBLAbf pto^ia'ttokkd, fe 0 verzió· ÍAltsehm és mtsai.. ,1. Mól. Biok 215, 403-4W (1990)1:. A találmány szerinti· nJCe ííksv molekifakkai homológ nokleoudszekvenciák azonosítása céljából BLAST aakleehdkereséseket végezhetünk az NBLAS’f programmal (score-~lö0; wordieoght-12). A takbmány szerinti fehérjemslekmákkal homológ ammosav-sxekvetteiák azonosítása céljából Bt AST fehérjokereséseket végezhetünk az XBLAS1' progtamraal (seore-óO; wordleaghb-5). Abból a célból, hogy összehasonlításokhoz mseket tartalmazó M^zerenceze-etáie; jussunk, az Alisaiul és munkatársai által kidolgozott (fenéi; Acid Rés. 25. 3388-3483 tl99?)j Gapped BS..AST programokat alkalmazhatjuk. Ida ΒΕ.Α8Γ és Gapped Bi. AST programokat hasznosítunk, a megfelelő programok (például, XBLAS és MBLAST) alapbeállításait alkalmazhatjuk (lásd, httpÁwwis nebt nlts.jyh.gmk
A önkiéin··.»', ak 1.Ί a ttsek egész sejtekben, sejdfeátmoban, illetve részlegeseit tiszta vagy lényégében tw ta íörmabass. Egy adott: mddémsavat akkor tekintünk „izolállnak” vagy „iessyegében tfezritoímakfe ha utas settes komponensektől vagy·· szennyező anyagoktól - például: a sejtben található más oakfelnsavaktöl vagy fehérjéktől
-standard eljárások - így, alkalikusfSDS kezelés, CsCI oentritngáías, osxlopkromstogmfía, agarózgólen végzett |S)818?-l845íSG eíektrutörézis és a -technikában jől ismert más eljárások íCurtest Frotocols in Melecular Btöingy, szerk: Ausohei és mtsai., kiad.: Gteene Publishíng anó Witöy bsterseienee, New York (1987)) - alkalmazásával ;negtísxtitoáak,
A tslálmány szerinti, gyakran natív szekvencia (módosított restrikeiős helyek és hasonlók kivételével) lomoáisösu lévő, cDNS-ből, genotnikus DNS-ből vagy ezek keverékéből származó nukletssav-készsönényekcs mutációkat végezhetünk génszekveneíák előállítására szolgáló standard eljárások alkalmazásával. Ha szükséges, akkor a kódoló szekvenciák esetében e mutációk hatással lehetnek az amittosav-szekveaejára. .A találmány tárgyát képezik a natív V, D. J, átrendeződési-, konstans vagy más, a találmányban ismertetett szekvenciával lényegében homológ vagy abból származó DNS-szekvenciák (aixsl a „származó” kifejezés jelzi,, hogy egy adott szekvencia azonos vagy más szekvenciából lett módosítva).
\ Yra\ .'cn m erie'ermen, i í> adott n ikk-mms Am'?,! akkor van nukoeokepe'-ef; hapC'OÁY, ha más mkieinsav-szekvenciával funkcionális kapcsolatba lett helyezve. Például, promóter vagy az rRNS szintéziséf; serkentő szekvencia akkor van működőképesen kapcsolva egy adott kódolás szekvenciához, ha a promóter vagy az rtöNS szintézisét serkentő szekvencia hatást gyakorol a szekvencia -ranszkrípclójára.. Transzkripciós •szabályozó szekvenciák vonatkozásában, a működőképesen kapcsolt kifejezés azt jelenti, hogy a D'NSszekvenciákat folyamatosan, és ahol szükséges két fehérjét kódoló régtöt is folyamatosan, es leolvasási keretbe kapcsoljuk össze. Az átrendeződési szekvenciák esetében, a működőképesen kapcsol; ksiejezés azt jelest!, hogy a szekvenciák kó;x:;;ek az átrendeződési rekombinációt befolyásolni.
A leírás Szerinti értelemben, a „vektor” olyas sukleinsávohölekrda, amely- a hozzá kapcsok más nekleinsav transzportálásant képes, A vektorok egyik típusa a ..plazmid, atnely olyat; cirkuláris, kettős-szálú DNShurok, amelybe további DNS-szegmensek ligálhatők. A vektorok egy másik típusát s vúttsvektorok alkotják, amelyeknél további DNS-szegmenseket ágálhatunk a vírus gertomjába. Bizonyos vektorok, a kérdéses vektorokat tartalmazó, ntegfeíeló gazdasejíben autonóm replikáctóra képesek í például, baktériumból származórepukásíös origót hordozó bakteriális vektorok és episzómálls emiósvektorokl. Már. vektorok (például, nem epíszőtttális erslősvektötök) a gazdaseáhe történő bevitel esetén beépíthetők a gázoláséit genomjába, es igy a gazda geoomjávai egybe repb&álődmtk. Továbbá, bizonyos vektorok képesek a hozzájuk működőképesen kapcsolt gének expressxiéjái irányítani. A leírás szerinti érielemben, az dyen vektorokat „rekombiaáns exprosssiős vektorok’' (vagy egyszerűen „expressziös vektorok) néven említjük. Általában, a rekombináns DNS eljárásokban alkalmazható expressziös vektorok gyakran plazmidok formájában léteznek. .A leírás szerinti értelemben, > »-ei \ekto kém ·.telux -tbxn pi-zindof . lkaién'mk Λ mind e^ vAr mtepvesek euvw^-a •í&fcserélhetően alkaimazfcatók. Azonban, a telaímány tárgykörébe tartoznak az expressziös vektorok: más-femáí. mint például olyan virusvektorok (például, replikádéra képtelen rofmvlrusók» adenovirtssok és -adéítojsszovtek vírusoké amelyek egyeneríCKU Junkc'okat véig áltatnak
A leírás szerinti értelemben, a „rekombináns gazdasejt” (vagy egyszerűen „gazdnspii”) kifejezés olystn sejtet jelem, amelybe rekombmátts vektort vittünk be. Egyértelmű, hogy az ilyen kifejezések nemcsak a konkrét senet. hanem az ilyen sej; utódjait is jelenti. Mivel, mutációk \agy környezeti hatásos következtében, bizonyos módosítások előfordulhatnak a következő generációban, az ilyen utód. de facto, feltehetően nem azonos az eredeti sejttel, azonban az ilyen sejt is a leírás szerinti értelemben alkalmazott „gazdasejí” kifejezésbe tartozik.
A bírás szerinti értelemben^ «z „alany” kifejezésbe tartozik az -ember ős bármely, embertől különböző állat. Pólósul, a találmány szerinti eljárásokat és készltoxtoyefceí alkahnaxhatonk gyulladásos betegségben - sutot wkmö45/sö
-14pétdául arthritis, például ízületi csúz - szenvedő alásy kezelésére. A leírás szériáit érteismbesy a .^emberiől különböző állat” kifejezésbe tartozik minden gerinces, például emlősök és nem emlősök, mto például nem em béri ioetniösök, juh, eh, tehén, csirkék- kétéltűek, hallök, stb,
A találmány különböző szempontjait az alábbi alfejezetckben résélétespn elírjuk,
A találmány szerinti emberi mortöklosrilis multesteket kíilöuíéte ismert eliárásukkm, mint például a Kókler és Msllsteia által leírt {Natúré 256.495 (1975 il standard, szomatikus sejtek hibridizációján alapélé eljárással, Sár előnyösek & szomatikus sejtek hibridizációjával történő eljárások, elvben, a monokloaúlís antitestek előállítására szolgáié egyéb eljárások - például. B-lítnfociták vírusokkal vagy onkogénekkel történő transzferna-ása. embert antitesteket ködeié génkor vAai a» ‘-Arneri fag-knunusá'-; eljárásnál - s alkalmazhatók
A találmány szerinti emberi tnonoklonális antitesteket termelő hibrídómák előállítására alkalmas előnyös álíntrendszer az égémeodszer. Hibrídómák egérben történő előállítása ·· így. az rmmuiüzálási rendek, illetve az Immunizált lepsfetek izolálására és faionálásáxa szolgáló eljárások - a technikában jól femert.
A találmány egyik megvalósítási módjában, az IL-15 elleni emberi monoklenália antitesteket sz emberi humtmrendszer, és nem az egéreredetö immunrendszer részeit hordozó, transzgénikus vagy rtanszkromoszómáiís egér alkalmazásával állítják elő. A találmány egyik megvalósítási módjában, a találmányban transzgésiims, „BáMab egér” elnevezésű egeret aShsltna/nnk, amely az étrendéZsilen -emberi nehériánc (μ.és γ) és a κ könnyüláíte imtuturglöbtditt szekvenciákat, es az endogén μ és κ iokuszékai maktlyálé, célzott mutációkat [Lonberg: éS: rotsaL, ölaiure 368. 856-859 (1994)1 együtt kódoló, embert insnuuglobulro-mmiisfeiszokat: tartalmaz. Eszei 'itt, az egérben az egéreredető Igéd vagy κ gxpresszíója leesökken, és. immunizálás esetén, a bevitt smben neíte; kme- és kömmléne-ersdetd transzgének csoport-áttendézedésen és szomatikus mutáción átes ve magas affinitssú emberi Igöu monoklonális antitesteket generálnak [Lonberg és mtsai. (1994), rolni lenti; -áttekiatve Lonberg, Handbook of Expertraentaí Pharmacoíogy 1 i 3. 49-1(51 (1994); Lonberg és Huszar, lat. Rév. Immunoi L*. 65-{U (19*55); Hordma és Lotmerg, Ληη. Ν λ’, Ae,nl Au 7 6-t, 536-546 feőOSíj, a HuMab egét előállítása a IL részben van leírva és az irodalomban ismert ffaylor és mtsai,, Noel. .Aeid Rés. 29, 6287-5295 (1992); Chen és mtsai., int. immunoi. 5. 647-656 (1995); Tuailloa -és mtsai,, Proc. Kati. Acaő- Sci;. USA 99, 3726-3^24 {lóo.tti; Chot a» mtsai.. Natúré Génét. 4, 117-123 (1993); Clten és mtsai,, EMBO I. .12, 821-83(5 fe094s- Tnailion és roísah, A femmnol. 152. 2912-2929 (19945; Lonberg és mtsai., Natúré 3o8. 854-859 {1994); Lonberg, HandbookofLxperimemai Phartnacology 1.1.3,49-191 ( 1994); LoubergésLíasz.n, bd Rév. Immuno). 13, 65-93 (1995 >; Hsrding és Lonberg, Attn. N. ¥. Acad, Sci, 704,536-546 11995); Fisluvild és ottsaL, Natúré Bioteehnol. .14, 845-851 (|99óí; lásd még az US 5.545.806 sz., US 5 569.825 sz., US 5.625.126 sz., US 5.653.425 sz„ US 5.789.650 az.. US 5.877.597 sz, US 5.661.016 sz„ US 5.814.318 sz., US 5.874.299 és US 5.77(5,429 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadulod iratokat (Loáhers és Kay, és GenPbarm imern&tiörtal); US 5.545,807 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (Smani és mtsai,); WÖ 98124884 sz nemzetközi közzétételi irat (1998. június 1).); WO 94/25585 sz. nemzetközi közzétételi írat (1994. rsoverober lö.); WÖ 4- 122~ \/ nemzetközi közzétételi irat (1993. jünios 24,); WÖ 92/22645 sz, nemzetközi közzétételi irat (1992, decentbej 23,); WÖ 92/93918 sz. nemzetközi közzétételi írat (1992. oíároios (9.)j. A 110012 iranszgémkns KuMafe egér előállítását konkrétan a 2, példában: írjuk le..
fetnupfeáfesok
Az )1--15 elleni teljesest emberi mcuoklonálls antitestek előállítása eeljáisöl, emberi Inwtsígtóbsiro géi(K3I87-1045/SG
-15nekei íurtalmaző transzgétükas vagy trasszkromoszőmáhs egereket (például, HCol2. í-ICo vagy KM egerei) tsrinssferníálhatusk tisztított vagy dúsított IL~ 15'készítménnyel és/vagy 1.1,-:5-6- expresszáló sejtekkel, például az inMaionibau leírtak szerint ILonhetg e? ndvü,, Nstrne 3é§> 856-859 (19941; Ftshwtid és mtsai., Natúré Bloteebsol. 14,845-851 (1996):; WO 98/24864 sz, nemzetközi közzétételi irat]. Esetleg, egereket tmummzáíhaSnnk: ©miben ít-15-öt ködölő DbkS-seí. Előnyös, M sz egerek az első !f5)í?tt)rti.záláskor 6·· 16 hetes koróak. Példáiul,. az iL-15 antigént (5-5Ő pg) íartalnmzó, tisztított vagy tkishoít készittnesyí alkalmazhatunk a BuMab egér iutmperttoneális ínummizálására:.. Abban az esetheti, ha az IL-15 antigént tartalmazó, tisztított vagy dúsított készítmény nem eredményez-: antitesteket, az ksmanválasz elősegítésére az egeteket tmsnnntzálbaljak az 11,-15öt expresszálö sejtekkel, például sejivoaalisk
A kőiönfeíe antigénekkel kapcsolatban feiibnhnoződott ismeretanyag szerint a HuMafc transzgéníkns egerek akkor reagálunk a fesjobhan, ha először Prewá-féíe komplett adjnvánshan felvett antigénnel intraperitoneális (IP) vagy szubkután (SC) innönnizálást, majd kmund-ieie ínkomplett .adjuvánsban felvett antigénnel mindet tn«s,'dtk t 'ion vcg/unv IP immunizálást (maxisaim kö aíkalottitztal), Az iranmnválaszt redwtbiíálistm veti vórtnirttakbói készített plazmammtákkal nyömonkővethetjük az immunizálás; teljes időtartama alatt. A plazmát szfeinelhsiitifc LLISA-val (lásd alább), és a megfelelő- szintű, ft-15 elleni embert immunglobulint termelő egereket atkaimazhaíjuis fúzióra. Az egereknek az elöiés és a lépeltávolítás előtt 3- nappal rásegítő iátravénős injekcióban antigént adhmunk be.
A.J.5.v.hv,ii v.....iyy,,..v\nokifín tó ajt,'esteve* tér nek) htbrmo cloOlma
11..-15 ellet)! embert wnoklonáits antitesteket termelő hifertdónták előállítására, Immttttizált egerekből lépsejteket és nyivokesotnőböl: származó sejtekét izolálhatunk és megfelelő örökéleta s<jt vonalhoz, mint példás! sgértmelőtísi-seiívonaiboz, fezionáltathafjak. Az eredményül: kapott bibridémákat az antigénre speedlkus antitestek termelésére nézve szkt'taefeetjiik Példás I, immunizált: egerek lépőből származó, kalőnállö lírnibcitákm tartafeaző sejtszuszpenziókat 5P2-'O-Ag8 653 kódjelt), egéreredetü, nem szekretálő, mielóma sej:fekfeez(ATCC, CRL 1530) Ibzíonáitaibatirik 50%-os EEG alkalmazásával. Lyukasként .· körülbelül (Mik sejtet lapos fenekű zoikrotiter-lemezre vibmünk át, majd a szokásos reagensek mellett (ŐM feetáhs: Clooe >$erum~oí, 5-(059 origen bibridőma klónozó fektéit ÜGESSI) és (MíAT-oi: (Sigma) tartalmazó szelektív tápoisfelban tskúbáljuk 2 hétig. Körülbelül két héttel később, a sejteket HAT helyett :HT-t tartaimszö iépoláatban tenyészthetjük. Ezután, egyed: lyukakat vizsgálónk ELISA-val 1:..-15 ellet-i: emberi mosokloaális IgM és IgG antitestek jeleokhévte nézve. Miután a idhrklómák intenzív növekedésnek ináabak, általában lö-14 nap mán a iápoldaíot megvizsgáljak, Az antitestet szekretálö hibridómákat átletsezeljük, újra szktineljük, és ha valamelyiket emberi IgO-re nézve még minőm pozitívnak találjuk, akkor az IL-15 elleni monsklonábs tnüitestekef korlátozott hígítás alkahnazásávai legalább kétszer vzabklősözhatjuk. A. stabil szabklőnokní in vitro tenyésztl-ettök a szöveuet-yésztő tápoldalban történő antitest előállítás, és azvtmítest jellemzése célíáből.
Il-JAklho)iig)d^^
A találmány szerinti emberi antitestek elhal lifkatők gazeasé't-i'asszfektömában, például, a technikába® ismert rekombináns DNS eljárások és géntranszl'ekeíös eljárások ^MotUson, Science 229, 1202 11985)) alkalmazásával
Például, a találmány egyék megoldásában, az érdeklődésre, számoítartó géniek). például emberi antitestet kődsdő gének, expressziős vektorba - min; például eüfeartöla expressziős piazmidba, mist amilyet a WO
87/Ö4462 sz., WO §9/0 lönő sz, nesíízetközi közzétételi iratokban, es EP 338 841 sz, emópai közzétételi iratban i(M(87-lÖ45/SG ismertetett GS génezpresszíős rendszer alkalmaz: - varr n.j- ,- tecbuk, ο, n )Mne» ,vpvw.<« 'rtak/uK ísgá!hatök, Az .antitestet hódoló, klőtrozoff: géneket hordozó tiszfoott pk-zmidot bevihetjük sukatíóta gazdasejíekbe, mini például, GEfÖ-sejfekbe vagy MSO-scjtekbe vagy esetleg más eukariótu sejtekbe, mim amilyenek a növényi eredetű sejtek., élesztő- vagy gombasejrek, Az e gének bevitelére szolgáló eljárások lehetnek a tecixsikábatt ismert eljárások, mist például elektroporáció, lipofoetis, lípofeGntnírt vagy mások, Miután e géneket beviítök tt gazdasejtekbe, azonosíthatjuk és kiválaszthatjuk az antitestet expresszálö sejteket. E sejtek tesznek a tmnszfékfomák, antekckben az cxpresszitis szintet fokozhatjuk és e sejteket anutestek termelése céljából félsz. nerithaíjnk, Rcknmbtnans antitestek izolálhatok és tísztiíhatók e tenyészetek foMúvoxhól és/vagy a sejtekEsetleg az: antitest kódoló, klónozott gének más expressziét; rertászerben, mini például E, cohbam vagy '.ulanulyen komplett szervezetben expresszálhatók vagy szintetikusan expresszáihatók.
FA' jvj k <K ’m , n, r£ Vn v- 4 Λ> s ι
Az antitestek főként a hat nehézlárse- és könnyúlánc-eredetti, komplementaritást. meglratároző régiókat (CDR-eket) alkotó aminosavak vajas lépnek kölcsönhatásba a megcélzott amígénekkel, Ezért, a CDK-ekes belüli amlnosav-szekvenciák az egyedi antitestek között sokkal diverzebb. mint aCfíkfaa kívüli szekvenciák. Mivel, a CDR-szekvencták felelősek az antitestek és antigének közötti legtöbb köíesönhatásérf, lehetséges a természetes körülmények között előforduló specifikus antitestek tulajdonságokat utánzó, rekombináns antitesteket expresszálni úgy, hogy különféle tulajdonságokat mutató különféle antitestekből szármázó \ a izekre ne Iákba ültetett, természetes körülmények között előforduló specifikus antitestekből x/rtte>.zo «'2>K s/,'k<. mexákat magukban foglaló expressziás vektorokat készítünk [Rteehmsnn és mtsai., Natúré H3 527 t'APfo. Jones és mtsai., .Natúré 321., 522-525 (19R6J; Queen és mtsai., Proc. Natl. .Acad. Sci. IX A Só, 13« >2^* U«>35 11989)1, Ilyen vázszekveneták elérhetők a nagyközönség számára elérhető, esiravonal-etedc',! .imaesteket kódoló gén'Λν,.Ί υ-u!*! ’aletazo f>\\ .a itb osoklvl 1 zm ? s n^ond eredetű mt \ az ^rut estite- ·. \sh k gémszekvenciák tói különböznek abban, hogy nem tartalmaznak teljesen összeáílitott változékony géneket, amelyek a. VfDt.1 kapcsolat sorát} alakulnak ki a B-sejtek érése során. CsirtiYonai-eredefii szekvenciák különbözni fognák a variábilis régió mentén egyenletesen elhelyezkedő, egyedi, magas affinitása másodlagos repertoárba tartozó afoitesí-szekvettefáktei. Például, szomatikus mutációkat viszonylag kevés számban találunk s vázrógíó aminotermmáite részén. Például, a szomatikus mutációk viszonylag “tsvan fordulnak elő az 1, vázrégio áminotermíuálís részén és a 4. vázréaiő katboKitenaiuális részén. Továbbá, számos szomatikus mutáció nem változtatja megjelentésen az átültért kötési tulajdonságait. E célból, nincs szükség arra, hogy egy adott antitest teljes DNS-szekvenciái át előállítsuk -az eredeti antitestéhez, hasonló kötési: fuiajdőösáaá, intakt rekombiísáss antitest elkészítéséhez IPCT US 99 05535 sz nemzetközi bejelentés. 19«e. merem? 12.1 A CDR régiókat áthidaló nehéz- és könnyúláneot kódoló részleges szekvencia jellemzően elegendő e célra. A részleges szekvenciát alkalmazzuk annak megheíarczasára. hogy a csíravonal melyik variábilis és csatlakozó génszegtnensei vesznek reszt a rekembimins antitestet kodoló variábilis régtök kialakításában. A csiravonaii-etedetn szekveircist ezután a xartabslm regsok húnyzó része etek pótlására alkalmazzuk. Nehézlánc- és köisnytiláno-eredcfti ieader szekvenciák a tehesse totuo lch.a,adnak és a végső antitest iüiajdösságitmnk alakításában nem játszanak szerepet. A iruns/o restek póriasa edjubel, klónozott eDNS-szekvenciákat lígáeidvsl vagy EÜR-aínpliEkáelövak szintetikus vligonukieondokkai kombmálhaúntk. Esetleg, a telles variábilis régió megszintetizáfhaíó rövid, egymással átfedő obgcnukleottdok snrvzatakést, ás ezeket PCR-auipbőkáciöval kotnblnáfva juthatunk egy adott teljes
WÍ87-W45/SÖ
-πszimetikus variábilis régiói tartalmazó klönboz. Ezen eljárásnak vannak bizonyos előnyei, mint példáid hizotsyos restrikciós helyek eliminálására, be-kelésére, vagy koskrét kofemok optimalizálására.
Egy adott hibridómóhől származó sehéxláíte- ós kőnnyuláns-íranszkriptunrokat kódoló íuikiooliászekvgneiákar alkalmazzuk szinretikus oiígotmideotídök egy-rsássalátfedő sorozatának tervezésére. iákból a célból, bogi a természetes szekvenciáknak megfelelő, amiawavakat kódoló kapacifesu, sriotetikös. V-szekvenesákat állltsarik elő. A szinterike» nohóidánc- és: κ-láne-szekvenciák háromfeteképpeatérhetnek el a természetes szekvenciáktól: ismétlődőnnkleoiidházísoi; sorát megszakítjuk abból a célból, hogy elősegítsük az: obgomskleotidok szintézisét és a PCR-amplifíkáeiöv, optimális transzlációs ioiciációs helyekét épitsikrk be a Kozák-fele szabály szerint (Kozák, I. Bioi. Chem. .20.6, 19867-19k?b (HEH)]; és Hindin helyeket viszünk be a transzlációs inicláeiös hely éktől 3' Irányba.
Misei a nehózlase- és misei pediga kőnavuláne-eredeíü t arsabih» regsok esetében az opí imahzált kódoló ~ és a megfelelő oem kódoló -· szál szekvenciákat 3Ö-5Ö nukleotid hos/ás&gu vakus vtkrn kordinéiül a megfelelő: nem kódoló ohgonukieotki felére, daraboljuk szét. Így, az egyes láncoknál. az ohgöttuMeoridök egymással átfedő, keitösszálú sorozatokká állíthatók Össze, amelyek IStMoö lukleittidokhő ,feo szegmenseket hidalnak át. írtakeslet eztttr etnpk Ikt v alkalmazz jL 1*9 409 -teó, riRO&br tílo Rí i\ , mpl h<a, os értekék előállítására, jellemző, hogy egyetlen variábilis régióból származó ehgenukieosíthsorozatol két készletre bot?tsrrk le, amelyeket elkülönülten amplífíkáleok két. átfedésben lévő RCR-termék előállítására. Ezeket az átfedő termékeket ezután PCR-amplíőkációval kombinálva alakítjuk ki a teljes variábilis régiót. Szükség lehet arra is, hogy a oehéziáae- és könnyüíánc-eredetű konstans régióba olyan fragmentumot (Ideértve a κ könnyüíánc Bbsl helyét, vagy a gamma nehezlánc -esetében az Ageí helyet) illesztőnk he a kCR-ampliilkáció soráss abból a célból, hogy a generált fragmentumokat az expressziós: veklorkonsírukclókba kottnyon kiőooz.ha-ók legyenek.
A rekonstruált «stódáne- éykörusyólátií-eredeíü: variábilis régiókat szuíán klónozott promóterrel, looder szekvenciával, tran- n hricíásotrail, konstans régióval, 3’ nem hartszlálödő régióval, pohadeniláció» és transzkripciós termtue os szekvesetákkai kombinálunk expressziós vektoritonstrnkefek készítése céljából. A nehéz- és könnyűkttkot kódoló evpresszlés konstrukciókat egyetlen vektorba kombittólhatíak, msáá gazdasejtbe ko-transzfektálhatjuk, sorozatosan. írsuszfekíálfediuk, vagy elkülönülten transzfektálhaljnk, mid ezeket: &zlosáíva jpttmfca nündkét szálat: sspresszáhr gasdasejlbez.
Az emberi. ígös-r expresszálására szolgáló vektor előállításában alkalmazható piazwdokat: az alábbiakban ismertetjük (I. példa). A glazrniáokat agy alakítsuk ki, hogy a RCE-rol ampliSkált V nehéz- és V κ ι kuppM wrsnsulas.eo’ tarabodv í !)\$ όό·>λ „'·,.'\:1Ά a Lakna/m mű uk a tehes eeaez’\eos e,- >onnst’!ane<'t fodolo mmigéoek rekousduáiására.. E pUzm\k>kat atkain'azbatluk emberi: íg£A«: VW rortttesfek kotsplett expmszálására. A taláhnány szoros. νφ,νοϊϊ ember: antuestefc közé tartoznak l'göd, tgvr.h fel. tg \ IgM, és igö antitestek is. Hasonló plhznsdnk készíthetők más esbőziáac-izodgusok, vagy λ (latnfedal köstavűláncokal. Inttölmazó antitestek espresszálásárs, így a leírásban bemutatott Π..-15 elleni emberi antitestek fe-tfefe, 14 Ή5,4ÍI4A8 és 4Ö4E4) szerkezeti saíariaga?í alkfemn.fefetts, (.hat., veAc'euleg Okon fl -l> ehet» ensbert antitestek ckriílfrtsái?, „meh-'v uegtartják a találmány szerinti antitestek legalább egy tunkeionáris sajátságát, miig például az íL-lá-böz töriénó kötődést. Előnyösebb, ha a 146B7. 147115, 404A8 és 4Ö4E4 antitestek CDR-fegíói közül egyet vagy többet: trtiKtt uuht, iVi.'.ivU, .‘ADR.kk^ n kenibtr oo C, arasovsa, xortmnmu us. a Ool, ,efed ho;\ W.obi íekoutblnáns módon készített, találmány szériád, it-15 elleni emberi antitesteket áiliísojtk elő.
HittiÓ?- I045.SC *
-lö
Egy további megvalósítás: mód szerint a adáiníány tárgya 11,-1 S elieni antitest eiőálliíását'a szolgáló eljárás, amelyben;
(1) Emberi rteisézláiíé-ercdetö vázrégiőkat és emberi nehéziárse-eredető CDR-efeet tattaisrsaző,. a találmány szerinti antitestet álktoak elő, amelyben az emberi Kehézlásto-eredetó Gi>R-ek közöl legalább egy íarisimsz a 2. ábrás bemutatott CDR-ek arainosav-szekvenetái (vagy a sKekveRcíaEsíábas SEQ ID Nó. 2. azöaesóöszámon megadott szekvenciában lévő megfelelő arsmosavak szekvenciái) közöl kiválasztott amtsosavszekvenciát; és (2) emberi köimvittáno-ereáetö vázrégiókat és emberi kömxyílláíte-ereáetü GDR-ekeí tartalmazó antitestet sál Utónk elő, amelyben az emberi könnyőlánc-etódotó GDR-ek közül legalább egy tartalmaz a $. ábrás benmtatott CBMt ammosav-szekvencíáí (vagy a szekveuciabstábaa SEQ ifi No. 4. trzoKosítőszánton megadőtí szekvenciában lévő megfelelő aminosavak szekvenciái) közül kiválasztott amEinosav-szekvcKciát;
almi m antitest megtartja ít- 15-őt kötő képességét
Az antitest i!,-;5-ö; kötő képességét stasdard kötési vizsgálatokkal, mint példás! a példákban leírtakkal (példán!, ELIS A-val), imtsrozhatidí meg.
A Emilekben ismertetett találmány szerinti rekombínáns antitestek tortaimazzák a J4Ő87 antitest Keltezés könnyőiáitésbak CDR3 doménlelt a I46B7 antitest CDR2 domémett es a KIS? .antitest GflRi áomérgeiíis.
Az. íL-15 szimpla kötésén kívül, a génsebészeti álon előállított antitesteket, példán!m fentiekben leírt antitestek, szeiektsihatjok & találmány szerinti antitestek más mtikcíonálts tnitgrtonságatnak iernttartásám nézve, például;
<I> emberi lf-15 kötése és íí-15 által mdttkált gyölísőáskeltő hatások gátlása;
(2) aTNF-ö Π..-15 által issisxkálí temjelésések vagy T-sejtek prolítícráeíőjáöak gátlása;
(3 s 31ACORE 3ÖOÖ műszerrel, rekombínáns emberi ÍL-15 (analizált vegyüiet) és az ámítást (iígandnmá alkalmazásával végzett ddett plazmonrezonaaeiás méréssel (SPR) meghatározottak szerint az 1L-15 kötése kevesebb mint körülbelül 1 \í álsszociácfos egyensidvi. állandóval (Kö);
(4) az IL-IS β- és/vagy '/láncán lévő kölcsönhatási dómén valamely epitőpiáfeoz való kötődés;
(5) az emberi 11-1S Asp amtsosavának az emberi 11,-15 receptor ^egységéhez való kötődésének és/vagy az ember; íl-l 5 Gin1* armttösavának as estei 11-1.5 receptor y-egységéhez vaió kötődésének tnegztrvarása;
(ó) receptorhoz kötőik embert í!-:t5~höz való kötődés:
(7) kötődés ttz emberi 11-15-höz és az e-tttberí 11-15 pttrakeraíesisr isdttkáló képességének gátlása;
(S) kötődés az emberi' 11,-15-höz és az emberi íL-15 epiderntlsz-megvasíagodást indukáló képességének gátlása;
(9) kötődés az emberi !L-TS-ltoz és ez emberi 11-15-nek a kemínoetták proliferációját htoríkáló képességének gátlást}; és/vagy (lö) kötődés az, emberi 11,-i5-höz és az emberi Π..-15-nek az aktival! leukociták kemotaxisál indukáló képességének gátlása.
Í!a±5eilgn;jnmxír:. mpnokooelantií^tefejelfegSS
A találmány szerinti emberi nsoaoklonáíis antitesteket az IL-lS-lkto való kötődésre nézve killőhléle ismer; eljárások aíkalmazásával teilesnezltetjük, Attnláfeanf: az antitesteket ki tnduhricém ELISA -va! jellemezzük, Rövides,. mikrodter-lensezekct vonhatónk be ISS-beó oldott tisztított 11,-: 5-tel. maid ttz irreleváns téitérjékeí példán! PBS-ben oldott, borjtieredető szérumalbuminnsl blokkoljak. lt-15-te.t immtmizáll egerekből származó.
; 00187-1045. SG
-19-.
különböző mértékben hígított plazmát adunk az egyes lyukakhoz, és 1-2 órán át 37°C-oa lakúba Íjuk. A lemezekét PHS/Tween 20 oldattal mossuk. majd alkalikus foszfatázhoz konjugált, emberi IgG Fe-te specifikus, kecskeeredefá .políklonális reagenssel 1 őrárs £(.3750-08 ínkubáljuk. Mosás után, & lemezeket: ABTS szríbszüátunrmai hívjak elő, és az OD 405 run-en mért mérésével analizáljuk. Előnyös;, ha a legmagasabb (keféket kífejtesztett egereket alkalmazzuk fúziókra.
A fentiekben leírt ELISA vizsgálatot alkalmazhatjuk antitestek, igy az ÍI.-1S immunogénnet pozttiv teakciót mutató antitesteket termelő bíbriMrták .sakrinelésére, ÍL-15-öt. előnyösen magas affinításssü, .megkötni képes hiöridótnákat szühkíóöozhaijsk és tovább jeMemezhetjük. A kiindulási sejtek reaktivitását (ELISA szerinti megtartó egyes hibridőmák közül egyet klánt kiválasztunk sejtbank készítésére és antitest-tisztítására,.
Az IL-'iS elleni emberi antitestek tisztítására, a kiválasztott hibridómákat forgó üvegekben (kétliteres íőrgőüvegí vagy más tenyésztési rendszerekbe··! szaporítjuk. A tenyészetekből származó féíülnszokat szűrhetjük:, tömény&hetiűk, majd. protein A Sephaföse-nn (Fbatísíacia, Piseataway. NI) végzet· affinitáskromategráfiával tisztíthatjuk a fehérjét. Miután a puffért PBS-re cseréltük, a koncentrációt az OD 2S0 am-en történő mérésével (extinkctós koefficiens; 1,43} vagy előnyösen, nefelomieriás analízissel .meghatározzuk, .Az Igö-t ellenőri?·· hetjűfe néteiektKsíorézíssd. és antigénre specifikus eljárással,.
Annak, meghatározására, hogy a kiválasztöd, 11,-15 ellem emberi monoklonális antitestek egyedi epítópokhoz kötődnek-e, az egyes ístfitestsket kereskedelmi íbfgalomim beszerezhető reagensekkel (Piértte, Rockford, 1.D bíotinMfeatjsffc. A biotlndált Msfe kötődéséi: streptavidinnal jelzett próbával mutathatjuk ki. Á tsfíi, o estek oo típusai ak n' >h.v > ot pus l A k 1 ?» ^ge/re unk a u, m sabar tsnert cba« s snk alkalmazásával. Például, a mikrofiíer-iemezzík lyukait bevodhafipk 10 gg/nü ember elfed lg-vei <'4Έ, 1.2 h). Majd 5%-os BS A-val törtem .blokkolás után, a lemezeket 1:0 pg/ml twnoklonálés antitesttel vagy fisztíteü izötipus-konaoiíokkal resgálíaljnk (szobahőmésék let, 2 óra), A lyukakat vagy emberi IgGl-él. vagy pedig: más, emberi izodpasia specifikus, konjugált próbákkal magáüatpik. A'lemezeket a fentiekben leírtak szerint hívtuk elő es analizáljuk.
A njceokicnáíis antitesteknek: II..-1 S-öí expresszálö elő sejtekhez valő kötődésének tesztelésére, áramlási ritometriát alkalmazhatunk, Röviden, membránhoz kötött ÍL-15-őt expresszálö sejtvosalakat étvágy emberi PBMC-ket standard kőrülmen\<ri, között tenyésztünk, majd PBS-ben <·:· ö,l% BSA, 0,01% N&Hs) különböző koncentrációban oldott monoklonális antitestekkel keveriúk össze <4°C, 1 h). Mosás után, a sejteket fiuereszcetts jelzéssel ellátott ember elleni ígG antitestekkel reagáltatjuk az elsődleges antitesttel végzett festés során alkalmazott körülmények között. A miutáktsl FACScan műszerrel fény és öhlaiszőrás alkalmazásával analizálhattuk ágy, hog\ egyetlen sejtre kapaznak és meghatározzuk a jelzett antitestek kötődését. Esetleg fluoreszcens mikroszkópián alapuló vizsgálatot is végezhetünk az áramlási citometriás vizsgálat mellett vagy a helyett. A sejteket pontosan a fentiekben leírtak szerint festjük, és fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáljuk. í zen eljárás tehetővé teszi egyedi sejtek láthatóvá teleiét, szórtban sz antigén sűrűségétől (üggifet & vizsgálat kevésbé érzékeny lehet.
11.-t 5 elleni emberi l«fi-keí az 1L-15 mtiigénael kapcsolatos reaktivitás szempontjából tesztelhetünk Átestem bloteal is. Rm acn.il.,-15-öt expresszálö sejtekből sejlklvonatet készíthetünk és a kivonatot oáaiumdodecdsxriilátet tartal.m<wA. psliátólamid-gélw végzett eleküoferézissel elválasztjuk. Az elektroforézis után. az elválasztott: antigéneket. nhroeelluíőz-niessbránfs transzieráljuk, 20%-os egérszéntmmai blokkoljuk, és a tesztelni kívánt monokltmáíiá antitestekkel ínkubáljuk, Az emberi IgG kötődését ember elleni, alkalikus foszfátázzal
100127-1045, SG
20· konjogák Isö-vel nanathatjA ki es BCIP/NBT sztebszsrátumoí tartalmazó tábferiákkal (Sigma Chem.. Co., St touis. MÖ* hívjuk eső.
V transzgénlkus cs tmnszkrom oszómá fis, emhertóikőlőuböző
pes, a tmannany szertári emberi menokionsús atáiíeslels expresszálására képes traaszkromoszómáiís embertől különböző áilarok, unni: például transzgénikas vagy trznszkrorncszottsális egerek, képezik. A találmány előnyös megvalósítási módjában, a találmány tárgya emberi nelrézláneot kódoló traasxgént hordozó íraaszgéaifcas vagy írnnszkromoszómálls egerek képezik, amelyek íL-lS antigénnel és/vagy ΙΙ.-15-öt expresszálő sejtekkel történ
Ínímníílzálást követően lk-15 elleni a találmány szerinti emberi antitesteket termelnek. As emberi nehéziánoot kódoló transzgéo beépíthető az egér kroínoszőstsális: :DNS-ébe, ez tönéoik a transzgénikus állatok esetében, lásd például HuMafe egerek, amelyeket részletssen leírunk, és: a példákban ismertetünk. Esetleg, az emberi nehéziáncet kódoló iranszgén exjrafowoszómlísa& is fenntartható. ez történik a WO 02/43473 sz. nemzetközi közzétételi iratban 0.1003. június 6.) ismertetett transzkrorooszóínális ipéldául &M j egerek esetében. Ilyen transzgénikus és iranszkromoszómális egerek. V-D-.I rekombinációs és izottpas-átrendezödési folyamatot követően, képesek az 1X45 elleni emberi msmoktoijáiís antitestek tebbieto jzoiípusát termelni. Az Izöripes-fetouderikiés törteteket például klasszikus vagy neta klasszikus izotípos-ádendeződéssel.
Olyan, Izsnszgésriirtts vagy írauszkromoszósteáEs emberiül különböző állatok tervezésekor, mnsiyek Idegen antigénnel történt serkentésre heterológ snütest-repertoártal váktSzs?inak, arra van szükség, hogy a ranszgémkus allatokbsn a heterológ mmmnglöbulinoksí'kódoló iranszgéneka B-sejtek fejlődésének őtvösaián pontosan működjenek. Ebbe beletartozik, például, a heterológ: nehézláneot kódoló trtmszgéa izotípusáuak. átrendeződése, Eszerint, a transzgénekeí.ágy alakítjuk ki, hegy egyrészt az izorípns-áírendezódést, másrészt pedig az alabbí aniítesick közül egy vagy több termelődését lehetővé tegyék: il) magas szintit és sejíspeertlkus expresszié, Í2) S'unketooáh's génaírendeződés, |3> uíléhkus kizárás aktiválása és az tara adott válasz, (4> megfelelő primer repertoár expresszálása, 15) jelátvitel Iszigoál-traeszdnkeiő), tő) szomatikus bipermtriáció. és (7) az ipimanválasz során a trawgéntkuá antitestet kódoló iotesz dominálása.
Nem szükséges a fentiekben említeti összes feltételnek megieletó, Eéldául, a találmány azon tnegvaleaíSási módjaiban, amelyekben a transzgénlkas egér endogén Immunglobulinját kódoló lókusz funkcloná&an tönkretettük. a traaszgénuefc: nem szükséges az alledrizárást aktiválni. Továbbá, a találmány azon megvalósítást módjaiban, amelyekben a transzgm fuokcktsálisan átrendezett Imrasmglobnlin nehéz- és/vagy könoyöiáncát kódoló gfeit inrtalsnaz, a tnasndm tehetek azaz funkcionális géitáöőudezódés nem szükséges, legalábbis arra a transzferre, nézve, amely már átrendeződött <a. molekuláris immunológiával kapcsolatos háttér-információkért lásd: femdnmstetal ímmanology, szerk.:: Wílllatn, kiad.: Ráveti Press, JXY.j.
A taíálmásty bizonyos megvalósítási módjaiban, a találmány szerűm emberi monokkmáiis antitestek előállításúra a'.Lnma/en tsetr. ember; íranveemkus vagy traaszkmui.'s/eínalfe ültetői esem on.ü.mak genkevricteiben átrendezőit, at m rendezeti, vagy génkészletükben átrendezőit és át nem rendezett heterológ immungíobulm-eredstű nehezlsns- és korsoyűiánc-transzyénekid hordoznak. Minden egyes öohézláaoöt kódoló íranszgés tartalmaz legalább egy Cy gént tartalmaz. Szentéiül, a nehézláneot kódoló transzáén tartalmazhat az izotlpus átrendeződéséhez szükséges szekvenciákat, amelyek képesek clösegnent a tmnszgánfkos állat B-sejtiéíben többszörös C{: géneket kódoló heterológ transzáén Izotípasánuk átrendeződését. Ilyen, az izetípas átrendeződéséhez
1Ő0IŐ7- Í045 SG
-21szűkséges szekvencia származhat a trstuszgérs Cí; génekburásául szolgáló fej csiravonalának immuugióbuimk'kus 'J'.ío természetes: körülmények között: dőlóríiuiő szekvencia. vagy származhat olyan fajból, amelybe & i an- írn u márukelőí he kívánjak építem {nassxgémkas állat), Pékláuk transzáé» ikos egér előállítására alkalmazott emberi trosagén-teosí-rskerő· nagyobb gyakorisággal vált ki iztsttpua-átrerídezödéssel járó eseményt,- te olyan átrendeződési szekvenciákat: tartalmaz, melyek tomiteak az egér nehézíáocáf kódoló lokaszhtm természetes- körülmények kozott előforduló szekveuelákhoz., ahogyaat feltételezhető. hogy az egében lévő átrsndézödösí szekvenciák sz egér átrendeződésért felelős: rekombínáz •enzimrendszerrel való működésre optisrsalizálödnak, mig az emberi átrendeződést .szekvenciák nem. Átrendeződési szekvenciákat hagyományos klónozást eljárásokkal Izolálhatunk és klónozhatunk, vagy immuaglobalin-eredetö átrendeződési régiókat kódoló szekvenciákon alapulva tervezett, egymással átfedő szintetikus ollgonukleotidokból megszinterizáffeatjuk de sovo jMlils és ittasai., Mset Acid Ros, 15, 7305-7316(1991); Sideras és mtsai.. Inti, Immunoi,. L 631-Μ2 idfeWj. »A fentiekben Ismertetett minden egyes tmaszgénikus állatban ömkcionálisan átrendeződött, iramunglohullttí kódoló nehéziánc- es könnydláos-transzgéíteket lalákmk a traaszgérúkus állat B-sejijeinek jelentős {legalább 10%) hányadában.
A találmány szerinti tzanszgémkus állatuk előállítására alkalmazott: tfunszgének közte tartozik legalább egy -variábilb genszegmetslomoí kódoló Döfe-t tartalmazó nehezk'mc-transzgen, legalább egy, diverritás kódoló génszegínenmm, legalább «gy, kapcsolódást kódoló génszeginentutn, és legalább egy, konstans régiót kódoló génsze&tnenten. Az imsmmglohuiis^ kóusyii láncát hordozó franszgért tartalmaz legalább egy, variábilis génszegmeníömot, legalább egy, kapcsolódást kódold géoszegrsensnmot, és legalább egg k.mut<rns: régiét kódoló génszegmeutumot. A könnyű- és nehéziánc- génszegruentuntoí kódoló génszegmeníuutok heteroiógok arra trattszgéttskus állatra nézve, atnelyhö! szármszfátk, vagy amelyek a transzgenlkus, embertől kösönböző állattól eltérd fajból származó immpnglobuiiu ncbézláae- és kőnnyniánc-génszegmetrtumát ködeié DMS-aek feleinek: meg, A találmány egyik szempontja szerint, atrsnszgént ügy alakítjuk ki, hogy az egyedi genszegmentunmk ne tegyenek átresifezstték, aztsz :ne: égy legyetssk űjrarendezettek. hogy funkoioasiís kötrnyü- vagy nebéziáncot kódoljanak, ilyen ót nem rendeződött trauszgének elősegítik a V. 1A cs j, szegmentumok rekombinációját (feírkelonábs átrendeződés) és előnyös, ha. az 11,-15 amigéntrel történt kstettseg eseten a frans.zgenAoSí, embertől különböző állatfean ax erednrényüi kapott, ájrarendezödöfí im:mímciohujtn-uctíe/iaucö.íu clo'-egátk a D régió egy részének vagy teljes egészének beépülését.
A találmány egy alternatív megvalósítási módjában, a tmnssgének átrendeződén „mini lokuszA tariafsnaznak. Ilyen írsusxgének jellemzően tartalmazzák: a C, D, és: f szegmentumok lényeges részét, és a V gétíszegmetítamek részhalmazát. Ax ilyen fwszg&s-konstnikciókban, a különféle szabályozó szekvenciák, például promőterek, az rRNS szintézisét serkentő szekvenciák, osztályváhásl-régiók, splice donor ás sgiiee akceptor szekvenciák az. RNS processzálása céljából, rekombinációs szignálok és hasonlók, tstrtaknszzák a heteroiőg: DNS-höl származó tnegtelcid szekvenciákat, ilyen szabályozó szekvenciák beépíthetők a taláimányhan aláaknázott embertől különböző állattal azonos vagy azzal rokon fajokból származó transzgénhe, kéidául, emberi intmrtngksbuiínöóí .származó génszegmentuniókat kombinálhatunk valamilyen rágcsálóból származó, az rfeHS szintézisét serkentő. imtuunglobuiin-eredetd szekvenciával abból a célhói. hogy a keststrukeiőt transiígénikus egerekben alkalmazzuk. Esetleg. szírttetlkus szabályozó szekvenciát építhetünk a. transzgénbe, ahol az Ilyen szintetikus. szabályozó szekvencia nem homológ olyas, Ihnkclonáiis ONS-szekvenclával, amelyről í- C'·' \.í\ v es ge ' mm te-n ^z. <, ke ulmeu\ v\ vozott e oío dúl Sz met,kin s.m' d>,'zo szekmi87-1045/SG venciákat konszenzus szabályok, mint például spb.cs akceptor helyet vagy promóser/az rk/NS szintézisét serke®.tő moOwstöt' kódoló megfelelő szekvenciát specifikáló szabályok. szerint tervezünk. Béláéul, a tonnészaies körülmények között előtibráulő csiravöaul lg lokuszával összehasonlítva, egy adok mini lokusz tartalmazza. a genoroi eredetik legalább egy belső íazaz nem az illető rész végén elhelyezkedő), nem esszenciális DriS-rész (példáid, közbenső szekvencia; kifess vagy annak egy része) delémójáí hordozó önmungtofexltSrktexsnak egy részét.
A találmány előnyös megvalósítási módjában, az Π„-15 elleni emberi asöfeslek: generálására alkalmazott, a WO 98/24884 sz, nemzetközt közzétételt írat 12. példájában leírt íranszgás 1példánkpHCl vagy pi-IC2) legalább egy, jellemzően 2-10, és rtena 25-50 kóptájáí -artahnazó írantógénikus vagy trsaszkrömoszömálls állatot a WO 98/2-1-88^ sz. nemzetközi közzétételi írat 5., 6., 8 . vagy 14, példájában/leírt kőnnyülánc-ttaísszgeu egyetlen kópiá-át tartalmazó állónál pározíatmk. és a kapott utódokat pedig a. WO 98/24884 sz. nemzetközi közzétételi irat 10. példájában leír;, .lK-deléeiöt hordozo állatjai pároztattuk. Az állatokat e három jellemvonás mindegyikére nézve homozigótává tenyésztettük. ilyen állatok genotípusa az alábbiakat .tartalmazza·: emberi nshszláncoi kódoló átrendezetlen mini {osonsz t lásd; WO 98/24884 sz, nemzetközi közzétételi irat 12, példán) egyebem kópiája (haploíd kromoszómánként), újrarendezett, emberi v kőnnyűláne-kon,stmkci.ó (lásd; WO 98 24884 sz. nemzetközi közzétételi irat 14, példája) egyetlen kopárja jhsploid kromoszómánként), és delécio az eger endogén nehéziáncái: kódoló egyes fókuszokban, amely ekávoliöa az összes fenkctoitálts JH; szegmemaötoi (lásd; WO 98-24884 sz, nemzetközi közzétételi irat 19. példája). Ilyen állatokat pároztaittink a .h; szegmentum deiécsójára (lásd; WO 98/24884 sz, nemzetközi' közzétételi írat 10, példája) nézve homo sgota egerekkel abból a célból, hogy a J., szegmentum deláeiőjára homológ és az: emberi nefeézláoc- és temvtik nc-kosstrufeciókra nézve pedig betniztóorn unxfekhnz jussunk, A kapott állatokat antigénekkel injektáltok, és ezen autígéaek elleni emberi mén en d \ en s estek tei 5 JeMse a h.-b ra tűk.
.Az ilyen állatokból izolált B-sejtek az emberi nehéz- és: köímyőláficok tekintetében rnonospecitikosak, mivel az egyes génekből esak egyesien kópiás hordoznak. Továbbá, az emberi és egéreredetn oeln-z- es körmytsktueok tekintetében is mosospecitikosak lesznek, mivel az egér endogén nehezláneát kódoló genkóptak. a Ji( régióba a WO 98/24884 sz. nemzetközt közzétételi Irat: 9. és 1-8. példájában leírtak szerint bevitt deteuok következtében nem műkődnek. T-övábbá, a B-sejiek lényeges hányadaaz emberi és egéreredetű kötmvuláncok tekintetében monospeeiltkas, mivel az újrnrssdezödött, emberi κ körmyőlánsot kódoló gé® egyetlen kópiája i-lióiiküsati és izotlpusosan ís kizárja: ;rz .«gér endogén κ és λ láncát kódoló gének újrarendeződését a S-sejtek jelentős hányadában.
A UxAnirvban eka m <W tt s s/ntn a··, <.s ι s'U tx a?M ben lényegében 'hasonló, jelentős .mennyiségű teinmnglobulátí termeinek, így például, a találmány azon megys\fHUsi nío,ha)b,.n ahol endogén lg geoeset -n.A.uvaln.nx. a .eves nrmeogbbulm-í ontok 0 1 0 murai -zernm, előny ösen 9,5-5 nig/tul szérum, ideális esetben legalább körülbelül 1,8 mg-’mi szérum tartományba esnek.
így vípcs sr '-.zz-rikux< b ix VÍUíLV P , t fel'otí ezt.
s e vro'·., \ . itt ’t\l nt> > \ ''i in ko U xk 1 91 8/ nA .A a tm , x ® e x tt i^roii Ak n alacsonyabb lesz. Általában, a lép és a nyirokcsomó B-sejíjeinek körülbelül 19%-áriál több, előnyösen 40-80%;s kizárólag ember; IgG fehérjét expresszit.
Ideális esetben, a repertoár körülbelül a natív egérnél -apaszíaltakkai egyezik meg, általában legalább körülbelül 10%-os. előnyösen 25-50%-os vagy annál íöhb.Általában legalább ezer különbek immunglobulin (íde109187-1945/Sö á!ls: esetben Igö), előnyösen töMffi vagy ennél is több, fog tsr;ne!ödni, elsősorban az egér geo<s?njáb& bevitt különböző V, J. és D régiók számától függően. Ezen itumunglobulinok jellemzően. felismerik a magasan immusogen fehérjéknek, például Síaphylococcus-eredetü protein A, körülbelül a felél vagy annál többéi, jellemzően. az előre kiválasztod antigénekkel szemben az linntunglobnlínok offisriritsa (&») 19 M alá esik, mini példáid 10'a M. 10 M ki vagy iG'hí M, vagy akár ennél alacsonyabb.
A találmány bizonyos megvalósítási módjaiban, előnyös lehet, ba olyan egeret állítunk eló. amelyben egy adott, előre meghatározott antlgén-n'pusm adott antitest-válasz esetén a V gének kiválasztása egy előre meghatározod repertoárra korlátozódik. Előre meghatározott repetloátá uehé.dm:c-hsnszgéü tmtalnsazhat, például. az emberekben az előre meghatározott sntigés-ítpasra adott antitest-válaszban előnyösen alkalmazott, emberi Vf> géneket. Írieíleg, egy -adod, definiált repertoárból bizonyos VH géneket különféle okokból (példáid, alacsony yaloszmőség arra nézve, hogy a meghatározott antigénre a kérdéses gén magas affinitásé V régiót kódol; szotnarikas imitációra és affinitás-koncentrálásra való csökkent hajlam; vagy ha bizonyos emberekben ámnunögéuak) kizárhatunk !gv különböző nehéziáne- vagy feö:nnyüláEn;-génszegmentti-m<>kat tariateaző transzgéu őjra átrendeződések megelőzően, az ilyen génszegmentumokat könnyen azonosíthatjuk, példán! hihridizábissal vagyöNS-szekvenálással (mivel ezek a transzgénlkus állattól eltérő szervezetből származnak).
A fentiekben leírt ííanszgémkus es transzkromöszőmsiis egereket innriuírizálhaíjiik, példán;, 11.-15 antigént tartalmazó tisztított vagy dúsítod keszüméitnyel és/vagy IL-15-öt expresszálö sejtekkel. Esetleg, a. íranszgénikas egereket: emberi 11-15-öt kódok) DNS-’Cs ímswnizálhatjuk, Ezt követben az egerek B-sejiekeí termelnek, amelyek intraírsnszg&t átrendeződési rekombinációval osztály-átrendeződésen scis-so/hchíug) métanek át és ΪΙ,-115-tel reagáló immunglobulinokat expresszáfaak. As immunglobulinok lehetnek emberi antitestek (másnéven „emberi szekvencia antitestek”}, amelyekben a nehéz- és kőimyüláneot alkotó polípeptideket. szo~ inatikns mutációval vagy V régiót érintő rekombinációs kapcsolódásból, dlelve csíravonal által kódolt szekvenciákból származó szekveneiákaí esetleg tartalmazó, emberi transzgén-szekvenciák kódolják. Ezek az emberi antitesteket az emberi ¥{. vagy ¥í} és emberi J(. vagy E?n és íB génszeginentum által kődoh pobpcpsidszekvenc iával lényegeven azonosnak tekintjük, bár szomatikus mutáció és különféle V-J és V-D-l rekombinációs kapcsolódások eredmésyekám más, nem csíravonal eredetű, szekvmáák is.jelet! lehetitek. Az egyes antitestláncok variábilis régióit jellemzően legalább 80%-ban emberi esírsvoxnd-eredetü V, J, és a nebéziumok esetében (xdig D génszementautök kódolják. Gyakran előfordul, hogy az emberi csíravonal-szekvenciák oka! kódol! variábilis régiók legalább 85%-a jelen van a transzgénbea, gyakran: a variábilis régiók 90 '/agy 95%-át,. vagy ennél :is nagyobb részétu transzgénbeo jelei;lévő emberi: csimvmud-szckvcnoák hódolják. Azonban, mivel á uemt cshsvosal-eredetű szekvenciákat szomuttküs mutációval, V! és. Vili kapcsol-;kiássál vittük b, az emberi'. aathost-sKekveseidk gyakran: tartalmaznak variábilis régiót kódoló olyan vokve-ftoiaktt vés kevésbé gyükrao, konstans régiét: kódoló szekvenciákat), amelyeket' nem emberi V, D vagy .1 sz<gmcn.umok kódolnak (lásd az egerek eslravonalábait lévő emberi transggés(cl> p icMcmző, hogy az ilyen, .sem CMrax onal-ereáetú szekvenciák (vagy egyedi nakleoridheiyek) CDR-ekbea vagv ?/ok közelében, illetve olyan régiókban, ahol ismert, hogy ott szotnariktis mutációk szoktak előfordulni, csox'ttowinak.
A meghatározott, ant igéid megkötő antitestük képződhetiték wt^psslitmideaődé^sl, így emberi ydáscot (mint például yl, y2a, yéS, vagy v3> kódoló szekvenciái és emberi könnyű láncot (mint példáid x) kódoló szekvenciát tartalmazó emberi antitestek tennelödnek. Ilyen, izotipus-átrcndeződéssel képződött emberi szekvencia gyakran tartalma?, egy vagy több, jellemzően a. vsriáfedis régióban és gyakran a CDR. körülbelül ló amlaosaván
100187-IÖ45/SG
-24helüi található, .szomatikus mutációt, amelyet sz affinitást érés: és aartgéa általi B-sfilt-kíválasztás. különösen pedig sz anilgésnel végzett iákővetkezö második (vagy második) provokáció eredményez. Ezen magas afünitásu embert antitestek kötési affinitásai (Ko). Iö'; M„ sóst például BT* M, IS'” M vagy Ifi'”’ M, esetleg auaáí alacsonyabb,
A találmány egy másik szempontjába otagábas foglalja a tmaszgémkua vagy transzkromoszómális egemkhól származó B-sej teket, A B-sejreket nikuhnazhatjok; emberi (l..-15-öt magas (például 10'' M~uát alacsonyabb) affinitással megkötő embert monekienálls antitesteket ezpresszalo hsbri dómok generálására, így a találmány egy másik megvalósítási módjában, a találmány tárgya olyas a találmány szerinti antitestet termeit? hibridóma, amely antitest a BÍAC'ORE 3000 műszerrel, rekombináns emberi 1I..-I5 (analizál· vegyület) és az auíues· (hsandurnl alkalmazásával végzett felületi plazmotsrezonanciás méréssel ISPR'i meghatározottak szerint, kevesebb mist körülbelül 10' M - mini például kevesebb mint körülbelül 10s M. iö'ft M vagy IQ'1” M, vagy ennél is alacsonyabb - afRaitással tKö) kod az embert IL-15-ót, ahol az antitest az alábbiakat tartalmazza:
(1) emberi V; génsaegmen&KBöt -és emberi )t szegmentemet kódoló pohpepdd-szekvenc iával lényegében azonos polipeptiá-szekveoekgó, könnyűSáne-ersdefü variábilis régióból, és (2} emberi Cj. génszegmentemol kódoló polipcptid-szckveneiával lényegében azonos pokpepttd-szekvemeiájá, könnyúláne-erettesü konstans régióból álló emberi kOnnyűláoeos kódoló szekvencia; és í, 1 < emben VH gcnszcgmentamot, rgens ,-zermt D-régiot, és emberi .IS szegmentumot kódoló peitpepadsze»< vette sasai mnvegefem azonos pobpepó.l s ^kwteisjó, aubézlásc-eredthü variábilis régióból, es «2) embert Cf; gc nszeg monon re ’ fe\o o pré-pept d-xZvkvetciávsii lényegében azonos poílpepbd-szexeenciáut, nebe/kmc eredeto kenteans regínból Jio on boti nehezlaocot kódoló szekvencia,
-V 11.-14 ellen n tgas afimtus; maone, embert mormkfonálts antitestek kite|!cv:c%r eio-cgnhe s az fiúsben r tuS , ·- tegmlxé s/armez·'· ev non untok repertoárjának, integrált on bo, mu t ryjebu n- rar.szgéstí tartalmazó tmnszgeniktss egérben történő kiterjesztésére szolgáló eljárás, amelyoen a' curindf megró t emberi .isnnms.globuíin-transzgént nem tartalmazó v régiót ködeié génszegmemumokai ínoabn. zo \ gén transzáén! Levisszük s genomba, Gyakorta megesik az, hogy a V régiót kódoló transageu emberi VH vagy VL (VK) génszegmetitum-sorozatot - a tenneszetes Körülmények között az emberi genomban előforduló formájában vagy esetleg níkomömáns eljárásuk alkalmazásával egyenként egymáshoz üleszrie tvű« <.,/> esetleg a kikapcsolt: vagy kihagyott: V géoszsgmontumokat tartalmazó, éiesztóeredeíti mesrémoves νο-neszen a, A YAC gyakran legalább öt vagy annál több funkcionális V génszfigmestuntot tartalmaz. FI ben a saltezetbsn, a V repertoár kiterjesztésén alapuló eljárással lehetséges olyan transzgén .Ikus, egeret előad hon, .mtets a V régiót kódold transzgénen lévő V régiót kötloló gén slhtl kódol! variábilis régiót: és azethbetí lg fiarszgenen kódolt C régiót tartalmazd immmsgl<;bn.hn-iáncot expresszál. A repertoár kherjesziésérs alapuló ebara^al, legalább öt különálló V gént tartalmazó trtmszgénikus egeret lehet clóáliitanfi igy az egerek tartalmazhatnak legalább 24, vagy annál több V gént. Bizonyos V génszegmentumok lehetitek mnkbdéskóptei.enok (például pszeuöegének és hasonlók); e szegmentutnok belyreáibihaíök vagy bs szükséges, akkor & szakember számára ismert, rekombináns eljárásokkal deletáihatók.
Miután sz egér eslravonakit ágy módóskottuL hogy olyan kiterjesztett V szegmentumokat tartalmazó V szegmenseket hordozó, iunkcionális YAC-< tartalmazzon. amely lényegében tűnés jeles a. J és: € génszegmenfomokaí wtateaaá embert lg tmaszgénben. a törzset tenyészthetjük és más genetikai hátterekbe vihetjük he, igy olyan hátterekbe, ahol kiíerieszíott V szegmentum-repertoárt hordozó fenketonális YAC-ot slte100187-1045/80
-7<.
ró lg transzgént hordozó egerek esíravonalába tenyésztéssel illesztettük be. Kiterjesztett V szagnsentumrepertqáris, többszörös, feskcicaáli» V'AC-ok emberi lg ttanszgénnel (vagy többszörös, emberi, lg teanszgénekkei) végzendő twnka céliából csteavosalbtt illeszthetők be, Bár a leírásban YAC transzáén nősen említettük, ha ilyen transzgének beistegráidának. a gettómba, akkor lényegében elvesztik az élesztőből á/attwv <mk\enmákas, példáid az élesztőben való .ntaonótn replikádéhoz szükséges szekvenciákat; mintán az élesztőben tcrenö repbkáelóra a továbbiakban nincs szükség (azaz, egétetedetü ES-sejthe vagy egéreredstu prozriomba történő bevitelt megelőzően), igény szerint, az Ilyen szekvenciákat génsebészed eljárásokkal {példán! restrikciós emésztéssel és: pulzáli mezővel végzett géleiektrolbrézissel, vagy más alkalmas eljárással) ekávoliífetjuk. Az emberi immunglobulint kódoló szekvencia expressztójára vonatkozó jellemvonás: felszsperitására szolgáló ellátások. közé tartozik az lg transsgéít(ek)ct, és igény szerint kiterjesztett V szegraeatrartreperriíáfá, fentetonális: YAC-oi tartalmazó, ttmtszgénikus egér szaporítása. A YAC bán ;elen lehetetek mind VH és mind pedig VL gőnszegmsstömok. A transzgéniktis egerei bármely, a gyakorlat! szakember számára kívánatos hátterű egérrel ^áraztathatjuk, így más, emberi ixariszgénekeí így emberi lg transzgéneket és/vagy más emberi: hnsifeiiákból szármázó fehérjéket ködoló transzgénekeí - hordozó egerekkel. Emberi eredetű szekvenciára, magas: aiímlíású, inumraglobóliíi előállítható kiterjesztett Y szegmennunrepertoárú YAC transzgént hordozó írnnszgértikus egér' áltat. Sár a femekben. leírtuk a találmány szerinti franszgéniku» állat előnyös megvalósítási módját, más, az alábbi négy csoportba osztályozott oiegvaiósitási módok is lehetségesek:
Ϊ, tljra át ne® rendeződött és njrareadezödőtt immungiobulin-eredsíű kfenyőláncot: kődöld tramzgént. tartalmazó, trauszgénikus állatok:
B. híjra át nem rendeződött immunglőbulin-eredetö nehéz- és újra át nem rendeződött immangloböliueredeíti ktey&í&neoí láncot kódoló transzként tartalmazó, teamszgémkus állatok:
Hl. Újra átrendeződött, immungíobulln-eredetó nehéz- és újra át nem rendeződött inmmngíeWisveredetu kSonyölárssot láncot kódoló transzgént tartalmazó, transzgémkus alteok::
IV. tijra átrendeződött immnngiobuhn-eredeid nehéz- és újra áteeadezödört íninrasglobateesadalű környöíáscot láncot kódoló transzgést tartalmazó, transzgeníkus· állatok.
A. teartszgéniktis állatok e kategóriái között az előnyös sorrendek az alábbiak: 1Ι>Ι>ίΠ>ϊΥ, ahol az endogén: könnyűláncískai kódoló géneket (vagy legalábbis a s gént) homológ rekorabiaációval (vagy más eljárással) kiStőtfSk, és. í>ri>IO>ÍV, ahol az endogén: köfinyúláncokaí kódoló géneket nem Slőttük kí és alíélikus kizárás következtében domoánsakaak: kell leiratuk.
HLAnjbes^
A találmány egy másik szempontja szériát, a találmány tárgya terápiás csoporttal, például cltotoxtmal, droggal (például immúrtszupprasszánssal) vagy radsoszotöppal konjngált. emberi il.- i 5 elfed a találmány szerinti muKokiosális antitest. Ha ezen antitesteket eítotoxinhoz konjugáljuk. ezeket az autitest-konjugátumokaí „Irarautttoxittoknak nevezzük. Ciíofoxls vagy vhotöxikns ágens lehet bármily es. a sejtekre káros t példán! ölő hatáső) ágens, Ilyenek példán! az alábbiak.: távol, vltohalazin 8. aratóié iáin D, etidiumbround, emeriu. mdotnlcln. etopozid, teuopozíd, viskrísznn, virmkisxíls, koihrcin, dexorubieta, dihidroxianlraem-diott, mitox&níros, mthatrtíefa, aktinottriein D, i-debfdroteszíoszleroő, gíSkókorttkoidok, próbáin, tetrakam, lldokam, prupranolok, és psurouőcirs, és nsfsak analógjai vagy homológjai, Terápiás ágensek közé - mlíiden korlátozás nélkül - az alábbiak tartóznák: .ammtetabolttikaraok (például, metotrexát, ó-merkaptopuriu, ó-tiogusniu, eferabln, 5-ílaorouraeil, dekgrbszin), alkiiezó ágensek (például, meklrőretamm, tloepa klorambnell, tnelfábs. karnrasztist i 0(118'?· 1045 A<1
-26<Ö$NU) es iomnsztin tCCMl), ciktofazfamíd, tee&s, dibromonatnmtol, szierpiozoiocm, nilíomíem C, és <isz-diktorodíamíí-~pbtimzm (H.) (ÖDF) crszplatin), antfseiklmek (poklául, dausxsrubuán (korábbi nevén dannon-ikm? es dororobicinj, antibiotikumok (például, dakíittömfem (korábbi sevén afctiuomfein}, bleomlcin, mibamíein, és íiritrzmicin (AMC), mlíózist gátló ágensek (például. vinkriszíin és visbktsztml R-l 5-tel kapcsolatos elváltozás, például rák, kezelésére szolgáld eitotoxikux radísgyógyszer eioállításá céljából. a találmány szerinti aotiíestet kxinjugálteíhatisk radioixotöppai, például radioaktív jóddal.
A találmány szerinti antltest-kosuugótenokm alkalmazhatjuk, egy adott biológiai válasz módosítására, A terápiás csoportot úgy konstruáljuk, hogy nem ko-iátozödton a klasszikus terápiás ágensekre. Féldáui, s drogcsoport lehet a kívánt biológiai aktivitást kifejtő fehérje \agy polipeptid Ilyen fehérje lehet például oszínmiikusan. aktív toxin, vágy annak aktív itegmérduróá, útin· például abrnt, nem A, Fseudomooas-ból származó exotoxú·, vagy di kérte toxia; vagy olyas feherie, mint a tuíntunekrözis-lakíor vagy a y-iatej-feroa; vagy a <' i'gta teoev/ rodoOíuu kepe·» fenére rmte peteat Irrio-otex xatercukm-, ( ,l-! ) mu.iC ' < .1C2), mterieukm-ö („It-ó), grasuiocitaereáeiű makro fagRo Hordákat serkentő faktor („GM-CSF”), gr«ttochakotíóníákat serkentő faktort .O-CSF·’*?. vagymás citokiaeR Illetve növekedési ktktorok.
Ilyet! terápiás csoportok antitestekhez Λ konjugálására .alkáhruis ellátások jól ismertek (Amoa es mtsai., „Moroclonal Amibodies fór femsunetmgeiiogof Dmgsfe Csnccr TfeerapyA Monoclonal Aotihodíes and Caneer i'herapy. 24,1-250, szerkó Reisfeid és ratsai,, kiad.: Alatt R. Liss (.1985):; i-lellstmm és mtsai,, „Arilibodies fór Drug Delivery', Cottftc-lled Drug Dskvery, 623-653, szerk.:: Robinson és misai., kiad,: Marcel Dekker !re, íHS~); Tbmpe, „Antít-uh Camers of Cytotoxic Agents in Caneer Therapy: a feaevt. Mosódénál Araibödíes '84: Bíologica; and Ciliden! Applications. 475-5ÖÖ, szerk.: Pmchera és mtsaj., (1985); „Analysss. Sesuks. :utd Furi-re prospeetive of the Therapeuiic Őse of Radiolábeled Atáihody itt Caneer Therapy'. Monoc lónál Attíibodies fór Caneer Eteteetí.en and Therapy, 3Ö3-31Ó, szerk.:: Baldwin és mtsai,, kiad.:.' Acadenric Press (19351: Ikorpe és nttsai.. bntmtnk Rév. 63, 11:9-:158 11982}].
láC-Gyógyászati keszúmonxek
A találmány egy rumok szempontja szermt, a találmány tárgyát készitaésty, például egy vagy főbb, íaláltnány szerinti esőben monoklooátts antitestei, vagy unnak asugóekötő-feszét, és gyógyászati szempontból elfogadható hordozó kombinációját tartalmazó gyógyászati készítmény., képezi.. A telálmány előnyős megvalósítási módjában, a készítmények több (például sgy vagy két), találmány szerinti izolált esőben antitest kombinációját tartalmazzák. Előnyös., ha a készítményben lévő egyes antitestek az: 1L-I5 különálló, előre kiválasztott epsiópjak kötik.
A ialálmásy szerintr gyógyászati készítmények kombinációs tetápiáfem - azaz más ágensekkel kotnbirsálva - is alfedmazhatok. Például, a kombinációs tompáiban a találmány szeriuli készítményt kombinálhatjuk legalább egy vagy több további, terápiás ágenssel, például gyaliadásgátió ágensekkel. DMARD-okktri tdínsase modifvisrg attti-rhegtttarie drags, betegségei módosító reumaelten&s dtögskk inmamszuppresszlv ágensekkel, kemoterápiás szerekkel, és psoriasís ellem ágensekkel. A találmány szerinti készítményt beadhatjuk radioaktív terápiával kapcsolatosan is, Más antitestekkel - például Ci'M-re specifikus antitestek és JL-3-re specifikus antitestek - való együttes beadás is a. tahdmásy tárgykörébe tartozik, ilyen, CD-i- te specifikus- antitestekkel és 1L-2,re speetrikus antitestekkel készült, kombinációkat különöset! alkalmasnak véljük az amotmtnun betegségek és írímszpiefeádös kilökődések kezelésére.
A leírás szerinti értelemben, a „gyógyászati szén-pontból elfogadható hordozó’' kifejezés jelent bármiW0183-4045/6Ö
-27íyen és mtndetv feiolögkiííag kmupsirbííís oldószert, diszpergálő közeget bevonatot, aruibakteriálss és gombásodás elleni ágenseket, isötöfrsku» és abszorpciót tófeítetó ágenseket, és hasonlókat. Előnyös, ba a hordozó alkalmas intravénás, iutninmszkalárts, szubkután, paroatetális, gerincvelőbe történő vagy epidenrtális t például, injekcióval vagy infúzióval történő) beadásra. A beadás módjának lőggvényéhett, az aktív vegyűlet (azaz antitest biápeciftkus és jntíittspeeííitos ntelekula) bevönható a vegyűletet esetleg Inak» váló a savas vagy más természetes köráiményektöt védő anyaggal.
A leírás szerinti értelemben, a „gyógyászait szempontból elfogadható ső” kifejezés olyan so i k rt amely megőrzi a kiindulási vegyidéi biológiai aktivitását és nem vált ki semmilyen nem kívánt to teológia hatást sem [Berge és mtsai,, J. bhann. Sei, őö, 1-19 t19?7}j. Ilyen sók lehetnek például savas adőkiús sók és házikas addiciós sók. Savas add&áős sók közé tartoznak a nem toxikus szervetlen savakból származó sók, például bldrokiorittok, nitritek, iőszSttok, 'szulfátok, hidrobromtdok, hídrojodidok, íószforossavak sót mellett a nem •toxikus szerves savak, például alifás mono- és dikarhoxilsavak, fenollal szubsztítuált karhexilsavsk, bidroxi.karfeozii-savak, aromás savak, alifás és aromás szttitottsavak és hasonlók, Bázlkus addíciós sók közé lartözsak alkálifémekből és alkáll-íölófaefcből. például nátrium, kálium, magnézium, kalcium és hasonlók mellett nem töxrku», szerves uirmckhők nnnt példán N,\'-thbeotlenien.srtnn. N-rretilghtemn n. koropr.teun kod», dietasolamln, etllén -diasriía, prőkain és hasonlók, származó sók.
A találmány szerinti készítmény beadhatjuk különféle. a technikában ismén: djásámt A szakember számára egyértelmű, hogy & beadás útja-é»''vagy módja ez elérni kívánt eredményektől függ. Az akiív vegyületeket: elké-szhfeetlök a vegyűletet a gyors felszabadulástól védő hordozókkal, Így előállíthatunk szabály ozott felssahíídul.ást biztosíié kőszsístesyt, mint például inpíantátumokat. traoszdejntális tapaszokat, és jnikrokspu \í xv It reniBierekf A arrt„ Kbo t t <. bo\ »-[ nm h\ p hm k - i \ o a tik’ polúmhldriáeket poligbfeolsavaf kollagént polloífö-észterekeá és lejsav-polimert - iv alkalmazhatunk. Számos, 11yen készítmények előállítására szolgáló eljárás van szahadaítnaztatva vagy ezeket a szakember általában ismeri [Sastatneá and Controlled Relesse Drog Delivery Systems, szerk.: Robinson. kiad.: Marcel Dekker, fac„ New York (1978)),
Ha a találmány szerinti készítményt: bizonyos módokon történő beadása esetén szükséges, hogy a vegyületet, vegyidet inaktiválődásáí megakadályozó anyaggal bevonjuk vagy azzal egyutí adjuk be. Például, egy adott alanynak a vegyűletet beadhatjuk megfelelő -hordozóban, például isposzómákban, vagy díluessheo. Gyógyászati szempontból elfogadható áiiueus lehet sóoldat vagy vizes puíferoldat. Llposzóroák közé tartoznak víz - olajban - vízben CGF enntizíók és:hagyományos itpevzórnák (Strejao és mtsai., I. Neuroümntrooi. 7. 2.7 ( 1984)1,
Gyógyászati szempontból elfogadható hordozók közé tartoznak steril vizes oldatok vagy diszperziók év re, er ne t_m re kes/ult ster:· sr akta h.-.to éltettek \ agy djszpcrt mk előállttá ma alkalmas rterú poro*. Λ 'echrrkábim ismert: az ilyen közegek es ágensek alkalmazása a győgyászatilag aktív anyagok előállítására. Azon hagyományos közeg vagy ágens kivételével, amely közeg vagy ágens inkompatibilis az aktív vegynlettel, bőrmély hagymnányos ágens vagy közeg alkalmazása a találmány szerinti gyógyászati készítményben rt találmásy tárgykörébe tartozik. A készítményekbe kiegészítő aktív vegy ideiek is beépíthetők.
Jdtemzó, hogy a terápiás késztttménvekaek sterilnek és a gyártási és raktározási kőrüknésyck között stabiluk kell lenniük \ név tmorveket t'ma In mat'uk o’dauem nuks-Virui/v'L·’ s * pes/otnaLLtí, mgs max a magas dmgkoncent-ráeiő: biztosítósára alkalmas, rendezett szerkezeiken! A hordoz > például vizet, otanob, políok (például, glíeerint. proptténglikolt és íóiyékouy pölí-etílenglikolD, és ezek alkalmas keverékét 'tartalmazó
I őől 87-10-15 SG oldószer vagy díszpemós: közeg, A megfelelő Iblyéköítyságot íénntariltetejttk példán; bevouatok, mini amilyen a lecitro, alkalmazásával diszperziók esetében az előirt mmesemáfet biztosításával és a íélilietakíív anyagok alkalsnazásávat, Sok esetben előnyös, ha a készítmény tartalmaz izotonlkusságot biztosító ágensekei - például cukrokat. poiíaikoholokat, mint példáid tnantsitoh.. szóróitok -, vagy sátríamklorídot. Az injektálható készítmények elhúzódó ábszerpeiéjat úgy vtitóstíhaijuk meg, ba a készítményhez az abszorpciót fcéxlslsetö ágeask például mpxsosmeasrát sókat és zseiatiut, adnak.
Steril, infektálhaté oldatokat álfehatuek sió oly mődon, hogy az aktív vegyűlet előirt meany íségát megtétele oldatba építjük be a fentiekben felsorolt összetevők egyikével vagy azok valamilyen kombinációjával együtt, és: míkroszürásse) sterilizáljak. A diszperziókat általában úgy állójuk elő, hogy az aktív vegyűíetet as alaptsl szolgáló diszperziós közeget és a feuttekben felsorolt összetevők közöl előirt anyagot tartalmazó, steril hordozóba épkjttk he. Steril, injektálható okiatok készítésére szolgáló, steril porok esetében, az elkészítés előnyös módja a vákuum-szárítás és fbgyaszíva-szárhás (iioóiizálás), amely -az akhv összetevőt és bármely más. az előzőleg sterilre szűrt oldalban lé vő szükséges összetevőt tana Imazö port eredményez.
A. beadási rendeket ágy választjuk meg, hogy az optimális 'választ {például terápiás választ) biztosítsák. Például, beadható egyetlen boltosként, számos megoszlott dózisban is beadható egy bizonyos időtartam alatt vagy a dózis csökkenthetet vagy növelhető terápiás helyzet követelményeinek megfelelően. Például, a találmány szeriun emberi antitestek szubkután iojekclöként beadhatók. hetente egyszer vagy kétszer illetve havonta egyszer vagy kétszer. Kőlősőseo: előnyős, ha a beadás megkönnyítésére es a dozirozás egységes voltának biztosítására, a pszsmíerális; készítményeket egységes dózisokba (dórisegysegekbe) formuiázzuk. A leírás szerinti értelemben, a ..dózisegység” főnna olyan, tizikaíiag különálló egységet jelent, amely egységnyi dózisként alkalmas a kezelni kívánt alany egységes dozúosására; az egyes dózisok a kívánt terápiás hatás kiváltására kíszánsstott, előre meghatározott mennyiségű aktív vegyűíetet és az előirt gyógyászati hordozót tartalmazzák. A találmány szerinti dózisegység-tómták jellemzőit az alábbi tényezők határozzák meg és az alábbi tényezőktől lügg: ta) az aktív vegyidet egyedi jellemzői és az elérni kívánt: konkrét terápiás hatás, és (bl «gyedekben fellépő érzékenység kt etesse kapcsok? os ?/>t,vn ek v vem ; tteA keveres i„J νν??,ben re le l<o etek
Gyógyászati szempontból elfogadható antioxídánsok például az alábbiak: ί 1) vizoldékony antioxídánsok, mint; például asskorbstsav, cisztem-hidreklorid, uáiriüm-díszállat, náírittm-meíabiszaifit uátrmmszulfit és hasötilök; (2) óimban oldódó -antioxídánsok. mint például aszkorbilpalmstát baíilezett hídrosiastizoi <BH\> bút ifeze te. hidroxi toluol (SÍIT), lecitin, propíigailál, alfa-tokoíéroi, és hasonlók: 13) fémkelátot képző ágensek, mitttpéldául. cttoSínsav.ettiéödiiSiíRÍís-tetoaeeeísav (EDTA), szóróitól, borkösav. íoszforsav és hasonlók.
A terápiás Itesrimtotsyekre vonatkozóan, a lalálmáay szerinti formaláclók közé tartoznak orálisan, nazálisait, topihálíssn (ideértve a szájöregen és nyelv-alatti bevitelt), rekíábstm. vagináikba és/vagy p&mnteráiísaa. beadható formuláelok. A formuláé tokát kényelmesen kiszerelhetjük egységnyi dózis formájában és előállíthatjuk a gyógyszerészeli technikában ismert bármely eljárással. Az egyetlen egységnyi dózis elő;;;Irtásához az aktívösszetevőnek a hordozóanyaggal kombinálható ntettnyisége függ a kezelni kívánt alanytól és a beadás konkrét: módjától. Az egyetlen egységnyi dózis előállításához az aktív összetevőnek a hordozóanyaggal kombinálható mennyisége áWábaa a készítmény azon mennyisége, amely a terápiás hatást kiváltja. Általában, ha a kőszitmény mennyiségét lóó'G-n&k tekintsük, akkor ez a menny iség az akriv összetevőnek körhiheíül ít,öől.-§{)%-&. előnyösen körülbelül ö,ö0$-7Ö%-a, legelőnyösebben körülbelül 0,01 -3ö%-a,
Vaginán át történő beadásra alkalmas, találmány szerint; ídrrnuláelék közé tartózó pesszáríuntok, tatopoíŐölk7-iíMSAG
-29ίκόρ ktéas ·,. g, h \ pM)* < h a \, $ y tlyeu bordozőkai: tartalmazó spray tamlációk a íenhtdfeabnu jól ismertek. A ulal naiv sz.» « i <s' tnoaek: nydlsalis vagy transzdexmáib. beadásra szolgáló dózisfortrtái közé tartoznak go-ok spt j\ »v > e km sv », ά >zták, kfoutek, borogató vizek, gélek, oldatok, tapaszok és itthalálészerek. Az skdv vegyületeket sterd körülmények kezek összekeverhetjük gyógyászait szempontból elfogadható hordozóval, és ha szükséges bármilyen tartósítószerrel, pufiméi vagy hajtogázzat.
A foírás szerinti: értetette), a „paremefohs beadás” és a „paseaterálisaB beadva” kifejezés az entefolis es topikális beadástól eltérő - általába» injekcióval történő - beadási módokat, így - minden korlátozás- nélkül ~ intravénás, íiitratnuszkakiris, btraarieriálls, isíraisaefeeáHs, latrakapszuláris, iatrsofbitális. bnraterdiális, iuírademtális, mtrttperiloneálís:. tmnszíracbcáiis. szubkután, szubkudkulárls, irtrwtikuláris, sznbkapszfoárís, sznbarscbnoidábs, foirssptnális, egiáurális és tsüsoszíernális mmkciókai és infúziókat jelent,
A találmány szerte! gyógyászati ksszkrsényekben alkalmazható vizes vagy nem vizes hordozók közé tartozik például a viz, etanol, poifofok (tfont példánk gbcerol, propilénglikol, polietílénglikol, és hasonlók), és ezek alkalmas keverékei, .zöiáségolajok, mist: például olívaolaj, és injektálható szerves észterek, mint etifofeáí. A mcgfolsfo folyékonyságot fontáarthaffok például bevonások, mint amilyen a létein. alkalmazásával,, diszperziók esetében.az elölrtszewseiséret hhAosltásával és a felöletakllv anyagok alkalmazásával.
E készítmények tarifomuzbmaak aájwáasotet: - például tartósítószereket nedvesítő szereket emulgeátó szereket és dixzpepgálő szereket — ín, A uíikroorgatírz-musok megjelenésének megakadályozását sterilizációs folyamatokkal (lásd fenő) és kálóidéi© gnbhateríális és gomhaeliehes szerek, példáid parsbén, kiórbutanöí, fonolszofosnsav, és hasonlók, hozzáadásával. Kívánatos lehel továbbá az is, hogy s.zoíoniknsságot biztosító ágenseket mint példáid cukrokat, fokritrmktoriifos és hasonlőkataáínok a készítményekhez. Ezenfelül. az injektálható gyógyászait forma ©llfoződö abszorpcióját olyan ágensek segítségével érttetjük eh amelyek az abszorpciót késleltetik tpckl.ifo, sdtonmiusi-monosztoarát és zselatin).
Ha a találmány szériáit vegyületeket gyógyszerként embernek és állatoknak beadhatjuk önmagukhtm vagy 0,00 i -90% (előnyösebben '0,065-70%» mint példáid 0,01-30%) aktív összetevő és gyógy ászait szempontból elfogadható hordozó kombinációját inrifomaaó gyógyászati készítményként,
A beadás módjától foggedenul. a találmány szerinti, alkalmas .hidraiáit formában alkaimazbfoó vegyületek. és/vagy a találmány szerinti gyógyászati készítmények a szakember számara ismeri, hagyomásyös eljárásokkal foroífoázhsfok gyógyászati szempontból elfogadható dózisfonfoíkha.
A 'találmány szerinti gyógyászati késziünényben az aktív Összetevő dózisának: aktuális- szintje változtatható ügy, hogy egy adott páciens, összetétel, és beadási mód esetében a lávám terápiás- válasz eléréséhez elegeudö mennyiségű aktív összetevőt tartaitriazztm, anélkül, hogy toxikus lenne a páciensre. A dózis kiválasztott szintje külősfols fomjaknkfoeíikfo faktortól - így az alkalmazón, találmány szerinti konkrét készítményektől, vagy azok észtereitől, sóitól vagy asofojaitól, a beadás módjától, a beadás időpontjától. az alkalmazón konkrét vegyület iciüritlési rátájától, a kezelés időtartamától, más drogostól, a konkrétet a lkai mázott készítményekkel kombinálva alkalmazod vegyi) leiektől és/vagy anyagoktól, a kezelni kívánt páciens korától, nemétől, testtömegétől, állapotától, általános egészségi állapotától, és megelőző orvosi kórtörténetétől, és hasonló, a gyógyászait technikában :issso« mkíofoldől - függ. A gyakorló orvos vagy állatorvos könnyén meg tudja ádspfomt, és fol tudta tn. a \> Ass'gcs zwiA a a* k ar«t «w t a.eket v mén ivk.Például, a gyakori© ©r ,a , vgv állatorvos .a gyógyászati készítményben alkalmazott, találmány szerinti vegyietekből kezdetben a kívánt terápiás hálás elérés© céljából szükségesnél alacsonyabb dózisokat, jelölhet ki, majd -a dózist fokozatosan addig noveb, ásóig a
10018-!04? KG
-3όkivánt hatást eí nem éri. Általában, a találmány szerinti készítmóayek alkalmas napi dózisa a vegyület azon ötennyiségo, -amely a kérdéses terápiás hatás dereséhez szükségest legalacsonyabb dózis. Ilyen, hatékony dózis áltáléban a fentiekben leírt laktatóktól fogg. Sl&ayös, ha a beadás módja az intravénás. Intramuszkölárís. mtrapertioasátis. vagy szbbkntán, előnyösen a célhavert hely középpontjához közelebb eső helyre történő beadás. Ha szükséges, a terápiás készítmények hatékony napi dozüat tteadmtijnk két. hárma, négy, Öt, hat vagy több áldozásként, a nap során egymástól snogtelelő intervaltutnokkJ dkülönítetten, igény szerint egységnyi dózisfermsiibati, Bár a találmány szerinti vegyületet öEtmagában is beadhatjuk, előnyös, ha a: vegySfeíei gyógyászati lórenatócíőbss {kó^ritriiénykém) adjuk be.
Terápiás készítmények beadhatók a technikában ismeri gyógyászati eszközökkel Péidáui, a jaláhsasy előnyős megvalósítási módjában, a találmány szerinti készítményt beadhatjuk foseiköíi, higodertrbkns injektáló eszköznek példád a?, US 5309.163 sz . US S.3S3A51 sz., US 5.312.335 sz., US 5,064.413 sz., US 4.941.839 sz., Ub 4.79ÖS24 sz., vagy US 4.596.556 sz. amerikai egyesült á&mokbeti szabadalmi irtstófcb® ismerteteti eszközökkel A mlálmáayhan alkalmazható jól Ismert inpladátumnkat és modulokig példád az US 4.487.6Ö3 ss.. amerikai egyesült .államokbeli szabadalmi írat ismertet; amelybe® a. gyógyszert: szabsílyoziiató ütemben adagoló, bedkribstő mikromfozíós-pumtrá· írnak le; a bőrön at történő beadásra alkalmas, terápiás: eszközt ismertetnek az US 4,436. :194 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban; a gyógyszert: precíz tólziós: rátávsí adagoló gyógyászat; infúzióst pumpát irtsak ie az US 4.447233 sz, amerikai egyest1 llamokfeeii szabadalmi iratban;: folyamatos dtogbevitdre alkalmas, változtatható áramlást biztosító, be„ k *ulb btózíóS: · eszközt ismertet az US 4.447.224 sz. amerikai egyesült állatnokbeli szabadalmi irat; több kamrás kompatósentómot tartalmazó, ozmotikus árogbeviteli-rendszert ismertet az US 4 459,196 sz, amerikai egyesük államokbeli· ssahadaísti dó;: ús ozmotikus díogbeviteli-reodszert írtak le az US 4.475.196 sz. amerikai egyesült áiferapkfeeh szabadalmi hídban, A szakember számos más ilyen mpkmtátsmokai, beviteli rendszereket és modulokat ismer.
Á tsiáhnáuy fcfeonvo* megvoiősí tási módjaiban, a lalábsárty szerinti, emberi moookloiiáhs aatitesteket ftoauiázbaljök a mcg&sde ,n utó eloszlás bíztositósátrt:. Példád, a vér-agy gát (BBB.s számos, erősen hidrofób <,együletet e/<:r \nnaL m/tesítasar,., hogy a !a1,i, suti’, χ/es -rt v .'gvu'ek-s, áthaladjanak a BB8-n u.m'-tnstbc szükséges}:, a vegyületeket tórmdázhatiuk.. például. liposzömákban. Itposzótnák gyártását például az US 4.522.811 sz., US 5.374.548 sz. és US 5,399,331 sz. amerikai egyeséit államokbeli szabadalmi hat ismerted, A hposzömák tarrtslmazhaitjak egy vagy több. specifikus sejtekhez vagy szervekhez szeiektivea tmxszporiátódo csoportot, fokozva ezzel a célzok dregbevitdt [lásd például. Ranade. J, Clis. kb&rm&cok 29, 685 (1989}}. Célbsjuttatö csoportok közé tartozik például az alábbiak: foiát vagy biotin [US: 5,416,1516 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, Low és mtsai, I; mamto2idok [Umez&’Aa és mtsai., Bjecters. Biophys. te. Commazi, 153, 1038 (19S8)J; antitestek [Bloeman és mtsai., Ϊ-ΈΒ8 Lett. 557. 140 (19935: Osvais és mtsai,, Aatíatimsh. Agenís Chcmoshcr. 29, I8Ö (19955); felületaktív protein A receptor [Brrscoe és mtsai,, Ara, ,1. Physiol. 1233, 134 (199551; a találmány szerinti fonmdáciőkai és a találmány szfirinű molekulák komponenseit esetleg tartalmazó. különböző készítmények. pí20 [Schreíer és mtsai:., 5. Bioi.. Chem, 269. 9099 (1994); Kemamm és taukkanen, 1 IBb le», 34o. 12' < 190;\ KiOsón és Mer, temuwmeihods 4, 273 (1994)1. A találmány egyik megvakww módjábstt, a t.dalmanv szerinti terápiás vegyületeket llposzémákba íortnuiázzuk, a találmány előirt >Aehb mv«v,dúsítási jmkhab.ot, a itpv»zomák céibajattató csoportot tartalmaznak. A találmány legelőnyösebb mm .tiósít-ist módjában, a Itposzómkhar, lévő terápiás vegyületeket botos injekcióként adjuk be a .tumor vagy fertőzés Középpontjához közelebb csn helyre. A készlhnényoek a ..fecskendővel való könnyű lel100187-1045 SG szlvhatóság biztosítására ioíyckmrwík kell .tennie. A. készítménynek a gyártási és tárolási kőriihtriayek között stabilnak kell. feaw. és toosöani keli a mikroorganizmusok, példáal baktériumok és gombák, kontamináló hatása el lem védelmet
A leírás szerinti ótteíet»benx szülöd csózzal kapcsolatban alkalmazott ..terápiásán hatékony dózis” meg' határozta a. páciensekben' ». javulás előzetes meghatározásának (Pre-ltaiftón DeSniüon of Improvetneal) ACR2Ö értekének, előnyösebbért a javulás előzetes meghatározásának ACR5P értékének.. még előnyösebben a javulás előzetes meghatározásának ACR7Ö értékének .megállapításával történik.
A javulás előzetes meghatározásának ACR20 értékét az alábbiak szerint állapítjuk meg: zöóf-osnáí nagyobb, vagy azzal.-egyenlő mértékű javulás az érzékeny Ízületek számában (Tender jóim Count, ΓΟ) és adóztat ízületek: számában (Swllea Jóim Cotrnr, SWJ) és 20%-osnál nagyobb, vagy azzal egyenlő mértéké javulás a következő 5 diagnózis közűi 3-ban: páciensben jelentkező fájdalom értékelése ÍPaíient P&tn Assessment, VAS), a páciens globális diagnózisa (Pátiéul: Global assessmest, VAS), a gyakorló orvos globális véleménye (Physisiart Global Assessínsst, VAS), a páciens önmaga által megállapított nyilvánvaló rokkantság (Patejtt SellAssesseá Dísablllty, HAQ), ókat fázisú reaktáns (Acate Phase Reacianl. CRP vagy ESB1
ÁCR5Ő es ACR7Sfenekeket ugyanígy, 50 vagy 70%-osnál nagyobb, vagy azzal egyenlő mértékű javulásként. megfelelően, határozzuk meg. További tesztetekért lásd Felsős és mtsai., American College of Rheumaiology Preliminary Defínitíon <<f Imprc-vemeul in Rkemrnrten! Arthritis, Arthritis Rheumatism 3S, 727735 <1995).
Egy adott vegyidéi rákos megbetegedést gátló képesseget az emberi daganatok értékelésére alkalmas állati modelleken vizsgálhatjuk Esetleg. eg\ adott készítmény ezen fulsj-.ktns.iga crtekelhctö úgy ί», ho a szakember számára ismert is vitte pótlási vizsgálatban megvizsgáljuk a készítmény gátlást képességét. Terápiásai? bstókoöy mennyiségit terápiás vagyaiét képes csökkenteni a daganat méretét, vagy egy adott alanyban valahogy másként eaybiteni a szimpióatákst. A szakember az ilyen mennyiséget bizonyos faktorok - mint például. az alany arérete, az alanynál tapasztalt: szimptómák súlyossága, és a kiválasztott konkrét vegyűlet vagy beadási mód - alapján képes meghatározni.
Az antitestek azon tulajdonságát, hogy képesek-e kezelni -vagy mcgakadályozsi a psomsist.értékelhetjük a technikában jól ismert ellátások szerint.
A készítménynek siertisek és jfe.lyCkvm.msk keli lennie ahhoz, hogy fecskendővel be lehessen adót \ víz melleit, a hordozó lehet izotömás psfferek sooldat, etanol, pokol (például, glicerin, propilénglikol és folyékony 'pob-etilénglikol, és hasonlók), és. ezek alkalmas kévéteké. A megfelelő folyékonyságot fenntarthatjuk példáiul bevonatok, mint amilyen a leeitin, alkalmazásával. diszperziók esetében az előirt szemesemére? biztosításával és a.felületaktív agyagok alkalsiazásával. Sok esetben előnyös, ha a készítmény tartalmaz izotonlknsságot biztosító ágenseket - például cukrokat, políolkohoiokart mint például tn&nnitolt, szorbitolt vagy aátriamklorírtot. Az s, e\t< 'ha o ον- ΐ u oe-v e húrodé e\Z05pv utat úgy \Λ \m k msg h„ , k 'szunx nshez ,u ná^m'Os.sot kes.ctte..·' ágenst, peré,t J ne mvte,,r,u sok.-. ,X/\, In.th. ahtnu
Ha biztosijuk az aktív vegyüie- megfelelő védelmét (lásd lenn), a vegyűlet orálisan i$: beadható, példán! semleges diluenssel vagy asszimilálható fogyasztható hordozóval együtt.
1001S7-1C45/SG késell&teáök
A. miátoány szerinti, 11.-15 elleni emberi antitesteket (ideértve: az antitestek szártnazx'kah: es kenteg.mnníort es ez .nsíUer-fokcl t irtaíuu.-'n ko/umenyekv? Jkaima.'hauuk kulonkte m sure es m \no durgnoszokai és: terápiás alkuimnzásrskban,
A találmány «gyík tttegvalósitási médjábnu, a találmány szerinti emberi antitestek a. H. -13 által a Tsejtekbeu és/vagy monoeiiákban/inakmíáuokbsm íadakált ΪΝΕ-α: terwlés gátlásában való alkalmazásra szolgálnak, előnyösen ágy, hogy más eitokínek, például IL-2. állal indukált TNE-tz termelést nem gátoljuk, Ha az antitestet !t-l5-tei érimkeatetjűk(például, az antitestet egy adóit alanynak beadjuk), gátoljuk az l'L-15-nek az IL-15 receptoron át történő jelátviteléi, és Így gátoljuk a T-sejrekben és/vogy ntonöcilákbam’makrolhgokban a TNF-α termelést is, íL-1 5-re specifikus epitopokst (például, konkrét alegységeket, mini például a gamma alegységet) kötő, előnyös ««estek bár előnyösen gátolják az IL-lő ál-al asáökálí TNF-α termelést, nem zavarják meg a szerkezetileg rokon élteidnek, mint amilyen az 1L-2, által indukált TNF-α termelést.
A találmány egy másik megvalósítási módjában, a találmány szerinti emberi antitestek a T-sepw ri -'5 által indukált összegyűlésének és/vagy proliíéráeiőjáoak gátlásában való nlkahttazásra szolgáinál, elemese·} anélkül, hogy gátolnánk más. szerkezetileg rokon chokinek. mint amilyen az lt-2, által indukált t^e.tprelíiéráciot. Minin TNF-o. termelés esetében, fea az antitestet 11 -15-tel erm-keztetjök (például, az antitestet v.g> adok alanyo&k beadjuk), gátoljuk az IL-15-nek az IL-IS reeepmron nt törtette jelátvitelét, ás így gátoljuk a Tsejtek iil.-15-tei történő serkentését:.
A találmány még további megvalósítást módjában, a találmány tárgya a találmány szerinti emberi antitestek 11-15 által közvetített elváltozások (például autoimmun betegségek. mini amilyen a psoriasís, izületi esuz, vagy gyulladásos bélbetegség, vagy lenéző betegség, mist amilyen a lílV) kezelésére vagy megelőzésére szolgáló eljárásban való alkalmazásra szolgál. Az. eljárásban egy adott alanynak a betegség kezelésére vagy h egelo/cv. e aU. mm, - x ?a\ v- \ üp k s Salaim mv von t e ubert autite*- u \ Η ’ς aln I ko/vemet betegség kezelése vagy megakadályozása céljából, az antitest beadható önmagában vagy más terápiás ágenssel, mint például gyulladásgátló ágenssel, például sztezoid típusú vagy nem szteroid típusú gyuiladásgádő ágenssel, vagy az antitesttől, kapcsolatban vagy szinergists módon ható eítotozismal együtt.
A találmány előnyös megvalósítást módjában, a találmány szsfbdi emberi antitestek íztíteri esáz (rheumatoid arthritis, RÁ) kezelésébe!? vágy megakadályozásában való slksísnazssra szolgák Az antitesíek korlátozzak az il-15-rtek bizonyos gyulladásos betegségek, mint például RA, előrehaladásában játszott: szerepét. Az RA gyulladásos loíyaoutóamak beindításában és íémnurtásábun T-sejtek, különösen a CD4-r T-sejtek, vesznek részt, A TNE-et, egy másik eiteidm szinten szerepet játszik abban a gyulladásos fitiyamaíban, amely egyértelműen az RA-ban szenvedő páciensek ízületeinek roncsolódásához és munkaképtelenné válásához: vezet. Az 1L-15 helyi sxnneiizálőáása kulcsszerepet tolt láe a T-sejtek aktiválásábun és összegyűlésében, illetve s ΪΝΕ<x és más, gyulladásos citokinek mdukálásábun. Az IL-15 az RÁ előrehaladásában betöltött szerepébe tartozik egy olyan folyatnak amelyben az lt-15 a nt&krofágök által szintetizált 11.-15 a T-sejtek összegyűlését indukálja.
aktnak 5 -tejte ekkor A? t vart rrtiU\ a náktotegov cko^a^ o„u ,A INI > te m, odéV tt.ekalnak s serkentett makroiágak még: több IL-15 szmtézrsét és még több T-sejt aktiválását segítik elő, igy folytatva a eiklüst A TW-ot-ra és a mafeeBgöha krimiéi! itatásai mellett az IL-13 aktiválja a neulroriieket és hatást gyakorol a helyi B-sejtek általi immungiobulin-szekrécióra, és különöseit a reumás faktorok szintézisére.
ksKerint, a találmány szeri-só, ÍL-15 elten· antitesteket aikstlmazhatjuk az l.L-15 lent említette RA-t okozó hatásainak megelőzésére vagy blokkolására, és igy alkalmazhatjuk e betegség megelőzésére vagy kezelésére,
Félíláub a találmány szerinti, IL-15 elleni antitesteket alknhnazásatiuk gyuliudásgátlásra és/vagy az RA-ta résztvevő: aktivált: lenkeeilnk kemofas kának megelőzésére.
Í8W7-ÍQ45/$<J
A találmány szerinti emberi^ antitestek alkalmazhatók szerkezed károsodások előrehaladásának megelőzésére olyas pátensek esetében, akik metotrexátro nem megfelelte reagáltak, vagy alkalmazhatók olyan, közepes vagy súlyos aktív teled esóztól szenvedd paciensekben a szét kezelt károsodások jeleinek es sziótptó* matek csökkentésére, illetve a károsodások késleltetésére, amely pácienseknél a LMARD-dal végzett kezelés eredménymk-rte bizonyult.
Λ találmány szerroti emberi antitestek alkalmazhatók az 1L--1.S más liafásamak: blokkolására vagy gátlására is. Különféle sejtek és tervetek (példánk xsjsmocíták, makrolagok, ribroblassk dendritikos sejtek, és keratinomnte expresszálnak Ιϊ..-15-οί. A keratmociták az epidermisz és a nyálkahártyát alkotó szövet epitéiiélis bélésének fö összetevői. A kersfinociták szaporodását ciíokiuek és növekedési faktorok haroelyefc: közéi néhányat taagak a keratteciták termelnek) komplex hálózata szabályozza. Á. kerafinocítákbél származó IL-15 reszt <<-' a F-\Ojtc,\ rokíiomicnoöaMbu, p'ol temető? ter. a psotea^tsos ptekoítet, való nJelesuktteo Szamos olyan betegséget ismerünk, nutelyber; a keratteciták számának növekedése bizrsnyrss, rokon betegségek szimptótnáiérf felelős epidermális roperptemhoz vezet, E betegségek közé tartoznak krónikás betegségek, adni például psoriasts és utópikus dermatttm. és olyast állapotok, mint amilyen a kéz krónikus ekcémája, érintkezési bórgyuitadás, i'HPY-vei kapcsolatos) vírusos szemölcsök, a bőr T-sejt límtetája, kőrös sehgyögytdás, mint például tebetes következtében történő kóros sebgyógyttlás, Eszerint, a íatóteáay szerinti antitestek ilyen elváltozások kezelésére vagy megelőzésére szolgáló eljárásokban való alkalmazásra szolgálnak, amelyek során a találmány s/ermn. Ii -15 ellem embert antitest a betegség: kezelésére vagy megelőzésére alkalmas mennyiségben egy adott páciensnek beadjak. Például, a találmány szerinti, 11.-15 elleni antitesteket alkalmazhaduk psoriasisban a psrsketsnosis blokkolására vagy gátlására, psoriasishtm sz epidermisz vastagságának esökkemésére, és psoriasisban a kerafirmcifás proliiérácicjának csökkentésére.
,V 11 -; 5 modulálja a bélrendszer epitéllumsejtjelnek működését is [Keineeker és mtsai., Gastroeneterol.. i l t. 17ÖÖ-1713 (literi. Specifikusan, az 11..-1 5 képes módositásokní kiváltam u nyáikakartya. epkéiium sejtjeiben és a bélrendszerből származó epiíéliumerdetö sejtvonaíakban. és ezért részi vesz st gyulladásos tebetegség, például a hasért betegség, patogenezisében. .Az il..-15 ilyen betegségekben betöltőd szerepét bsstiri betegségben ‘tersen» Uzelete' pavctte sekombe „z k,-'1' tetcs. vetetts fe sza vnxlasu mua a WO ÖV Ő1582 sz. ncuizetközi közzétételi tratl. Így, kimutatták, hogy az I.L-15 közvetlenül részt vesz:a hasűri betegség beindításában és fenntartásában. Eszerint, a taiálroáuy egy másik megvalósítást módjában, a találmány szerinti:, íL-15 ellem emberi antitestek (azaz az 11..-15 gynlhdsskeliö hatását gátló antitestek) a hasért betegség kezelésére vagy megelőzésére alkalmas mennyiségben páciensnek beadva hasért betegség kezelésében és te-agy megakadályozásában való alkalmazásra szolgálnak.
Ezenfelül, ügy talattuk, h»gv sz 11 15 elősegíti az új véredénysk kialakulását «gy ueevaszknlerixáelős vagy angiogenesis elnew.C'm RAun,íf?.m Eszerint, a találmány szerte antitestek még tedbóí alkalmazása közé tartozik a neovaszkukifirzctosai mro betegségek megelőzése vagy kezelése, Érbetegségek közé tartoznak, a gyulladásos betegségek mellett, a te neevaszkölarizáeiöo alapuló vagy azzal jellemezhető válloztte.
A találmány szerinti emberi antitestek alkateazhsttök nz lk-i 5, fertőző betegségekkel - rolni például 1-Í1V - kapcsolatos hatásainak blokkolására vagy gátlására. Eszerint, a találmány szerte antitestek másik alkalmazdaába tartozik a fertőző betegségek - mint például JI1Y-I - megakadályozása vagy kezelése.
Példán!, az antitesteket alkalmazhatjuk különféle, az 1L-15 által közvetíted betegségek itt vitro vagy in vivő diagnosztizálására. Speeidkastm, az antitesteket aikalroazhsitttk 11,-15 szintek kimutatására, vagy olyan ldÖI87-Kí457SÖ sejtek szintjeinek ittogbatározásáta, -melyek. it-15-öt teriáltrtamk. a membránjaik fetóttén vagy az 11-Ί5 receptetokhísz kötve (receptorhoz kötötte embert IL-15}. Az 11,-15 ilyen: szirtijeinek kimutatását bizonyos betegségek szimpiőmáival korrelálbstők, Esetleg, at antitesteket slkttimszhatjíík az IL-i 5 azon funkcióinak gátlására, vagy blokkolására, másfelől, az IL-15 fenkeioja által okozott betegség szimptótnáínak megelőzésére vagy enyhítésére.
.Ahogyan a lentiekben leírtuk, tt találmány szerinti antitesteket beadhatjuk egy vagy több terápiás ágenssel -- példán!, Immanszappressziv ágenssel vagy gyű iladásgásló ágenssel - együtt abból a célból, hogy fokozzuk, az általános gyulladásgátió hatást. Az antitestet kapcsolhatjuk az ágenshez (fomrunkomptexkentj vagy beadhatjuk az ágenstől slkatönttifen. £z utóbbi esetben (elkülönített beadásX az unritesfet besdbatjsk az ágens előtt átért vagy azzal megegyezően. Alkalmas terápiás ágensek köze tarfozrutk: példáéi gyullsdásgátló ágensek, Dkí.ÁRD-ok (disease-modiíymg asü-rheuwane drags, betegséget: módosító reumaelien.es drogok), inmrunsztsppressziv ágensek, kemoterápiás szerek, és psoríssis ellesi ágensek. Á találmány szerinti emberi antitestek bsadlsatók besugárzási terápiával kapcsolatosait ís.
A találmány egy másik meg valósítási módjában, a találmány szerinti embert antitestek más antitestekkel való beadásra szolgál, mint például Cl)4-re specifikus antitestekkel és lL-2-re specifikus antitestekkel. A találmány szerinti: emberi antitestek kombinációját. CD4-re specifikus antitestekkel vagy Π,-2-re specifikus antitestekkel,. kölönősen atkahnaznak tekintjük autoimmun betegségek és transzplantációs kilökődések kex-riévére.
A lehás-batt szirtién ismertettük a találmány szerinti, Π..-1.5 ellett! emberi artiiiesteket, és igény szerint, azok: alkalmazásának leírását tartalmazó készleteket. Ezek mellett, a készlet tartalmazhat egy vagy több további reagenst, mist például üasausszuppresszív reagenst, vagy egy vagy több, találmány szerinti antitestet (például, az első emberi antitest .által: kötött epiroptöl eiterö epitőphoz kötődő, komplementer aktivnoxá embert snittest t
Eszerint, a találmány szerinti antitestekkel kezelt pácienseknek beadhatunk (a taláimattj s/oontt emberi antitest beadását megelőzően, szimultán, vagy azt követően) más, az emberi mtitestek «etaptax hatosat fokozóvagy növelő terápiás ágenst is, mist példáéi gy ulkidásgátló ágenst,
A találmány még további meg valósé ás > módjában, a találmány szeritől emberi antitestek más vegyületek (például. Terápiás ágensek, jelzések, etfofoxínok, immmszuppresszanxok, stb,} célzott (az: ilyen vegyöieteknek az antitesthez való kapcsolásával} eljuttatásában való alkalmazásra szolgálnak olyast sejtekre, amelyek felszínéhez: IX.-15 kötődött fel (például membránhoz kötött vagy ÖL-15 receptorhoz kötött lE-f 5). így, a telráshtm ismertetünk. IT.-l5-öt és (L--15 receptort evorasszálö sejtek ex vivő, rn \d-ro vagy ín vivő lokalizálására szolgáló eljárásokat: is (például, kinnttethate' jrizessel, mint ahtilyen a radioizotóp, fluoreszcens vegyidet, enzim, enzim kofoktor).
A tnlálmány mris üteg valósítási módjait az alábbi példákban inak le, \ tedúhoám. -vvtum ’-ot.goteL.sf .<.· a-abbi peldtkkal tovább ti fosztod sok, azonban e n. telük a tsks.m&nv1 semmiben sem korlátozzák,
EÉIti)Ári
Lágfe
Cmu-val célzott egér generálása
A píCEmu piazmid a Baib-'c geaomíkus A-fágkőtsyteárből (teforeu és Ceti 22, 1 §? (19£ö)j előállított. a mu gént is magában foglaló, egércrectető Ig-ből származó nehézlánc teskuor EcoRl-Xboi fragmentumát
I8Ö187-1Ö45/SÖ
-3btaxteltnazza.. g geoomikttsfragmitaoirtoí a pfCEh-1191-1 plazmid [Marsh és mtsai., Gene 32, 481-435 ti 984)1 EeoRl/'Xhoí helyeire szubklŐHoztuk:. A giCEmu plazmádban a neKvUtx ‘ \\\λs A KoRt ich t-M 5’ i tmb s > > '-mu ux lm vk c xs,?, ·. ν *l -ϊ í Utó l ' j j, e' η χ x m\ - n ? ·<
«.«•ónjától körtilbe-lül I kb-m léve Xhol helyig lerísdnek hú .axonban, a mu átváltási ismétlődő régió legnagyobb részét £. etaba történő passzfesolás során dfilstáíódott.
A céíbajuttató vektoré az alábbiak «' ni hb <» <nk -κ· \ρ J mu .la nudl ' . o- < ko i'ndiil Mr u feagmcnnuíror kivágtak és HindlILSnstí enzimekkel emésztett pBlnescnpt vektorba · Stratagene, La Jolla, CA) szübkíénozLík. E píCEmu Eagteestum.a CmtxMől 5' irányban körülbelül l kfc~re található Hindii! helytől a tmui-cn belül léve Smai heh tg terjed. A? etedtnoneüt k-axut pkt/nudvt Smal ’xpel enzimekkel emexzteüuh ös a plCEma plazmádból kivágod körülbelül 4 kb méretű - a Crau 3’ végén lévő Smal. helytől a Cmu tdoiső ezunjatö! közvetlenül 5’ irányban lévő Xbál helyig terjedd - SmaEXbal fragmetamot az emésztett plazmidha tóllesőet&tk \.·· etultaüysi kapuét, p'fAMl elnevezésű plazmidot a Smal helynél linearíznbuk, és egy neo sxpfeaöztós kazettát illesztésiünk be, E kazetta az egérerederü tószfogiieerát kinéz tpgkt promóter taJSzkAptanális szabályozása alatt IXbaLTagl fegmeaíum; Adta és misaj,, Geáe öö, 55-74 t.E’S'’], tártálmázzá a jkv gént es a pgk pehnden iacmx hetaí fital! ibuditt fracnteimtri, Bocr ex utat, B-eenem tícnct 2S, 2l)9 3(?h/AMb] r Li/ettat r t'K’ p r/tdb<'l i\taev\z ex rrsai, Coll tA Lta t ín) (tat)] tanjük elő, amelyből a neo kazskát EcoRl/ilínálIl íragtnen tant ként vágtuk kt és EcoRl/Hindlil enzimekkel emésztett ρ0ΕΜ-7Ζί?Α} piaznödha szábklősüzva kaptuk a pGEM-? (KJÍ) konstrukciót A neo kazettát EeoRLSsíi emésztéssel kivágtuk a pGEhd-7 (KJÍ) korsstmkeióbók tompnvéguvé alakítottuk és a pTARl plazmid Somi helyére szubkk'tazttA, a genemtas Cmu szekvenciákkal ellentétes orientációban. Az eredményül kapott pkísmidot Motí enzimmel hnearizáííuk, és herpes mmplex. virttaöl származó itmxlixtkmáz (tk) kazettát illcszteétak be, hogy lehetővé tegyük a homológ rekomhinánseka; hordozó ES kiónok fddúsuláaát [Mansour és mtsai., Matere 336. 348-352 (1988)), £ kazetta tartalmazza az egéreredetö pgk promóter és poiiadeoiláeiós hely által közrsíbgotí, tk gént kódoló szekvenciákat iTybafevócz és mísaz, Cell 65, 1153-1163 (199! )j. A kao>tí ( ΜΡ céíbajuttató vektor tartalmaz egy összesen mintegy 5,3 kb méretű, a nehéziáncot kódoló ioktjsszai hömelóg szakaszt, amelyet az első Crna exon egyedi Smaí helyére klónozva a neo ekoresszíős kazettába illesztedühk be. A. eétbajoítátó vektort, ES-sejtekbe történő elekíroporáelöt megelőzően - a ptenúdszekvenciáknu belül hasító ital eszanmél lírtearizáhuk,
Λ8-1 ES· sejteket íXlcMttfeon ös Bradléy, Célt 52, 1073-1085 (1990)] mitotikusan inaktív SNL7Ö/7 tefer sejtek tömgen [mint fenni szaporiíottök lényegébe® a Rofeerison és mtsai. által leírtak szerint (Rofcortsort és mtsai., 1 eralocareótomas és Esubrionlc Stem Cellst A Practical Approach, 71-112., szexk.: Robertson, kiad.; Oxford, i'EL Press t b’8”t; A linearízáit CMD célbajnttató vektor! llasty ös mísai. áltaí leírt eljárás (Hasty és mtsak, Natúré 350;, 243-246 <1991)] alkalmazásával ekkétopoxáitek Λ8-1 sejtekbe, Eiektroporúk sejteket lőí) nnn-es csészékre iemezekünh kt t-2*IO6 sejtksösze sűrűségben. Huszonnégy órával később, a lápoldatboz <í4 i8-at (az aktív komponens tekintetében 200 pg/ml koncentrációban) és FIAIM (5*íö' M) adtak, és drogra rezísztens klőnokat szaporítottunk fel 8-9 nap alatt. Klánokat vettünk lék tripszinetak két részre osztottuk és tovább saaporhottuk. Az egyes klőnokból szárajtta sejtek lelet le fagyasztó tóik, es a má«k telő! a '•ektor- és céíszekvesciák közötti homológ rekombinációra nézve analizáltuk,
Southern biot hibridizációval DNS analízist végeztünk, A kiötlőkből. DNS-í izoláltak a kábé és sttsak
1ŐŐ1S7-IÖ45/SG álítd leírtak szerint (Lmrd és nttsai,, Nucl. Add Rés, 19. 4293 (i 99Dj. ízoláh: genomtkus DNSEt 8pei-el emésztettünk és egy 9 IS bp mérettl Saól fragmentumml próba, lásd is ábra) teszteltük, amely a tm; müsnskus enhsncer és tt mtt. átváltási rógió közöd;, szekversclával bihridizál, Az ,<A” próba a vad típusú lokuszbaa egy 9,9 kb Spel fiagineráutHol, és a CMI> eéibajeltalő vektorral lmu;ológ rekombinációval tekornbluálódott ma lokuszból pedig egy áiagnoszftkus 7ró kb sávéi: mulat ki (a neo expresszié» kazetta Spel helyéi tártaimat), A G418-ra és FXAU-ra rezisztens, Southern biot tsnnlizissel ansíszal? 1132 klón kézül 3-ban atatattuk ki a nm lokusznál történi homelög rókesnbináeiöi jelző 7,6 kb Spei .sávot, A antik igazolására, hogy a vektor homológ módon integrálódott a.nm génbe, e 3 idóöt tovább etnésztettük Bell., BstXÍ. és LcoR.1 enzimekkel. Amikor „A’· próbával hibridlzáltuk, a B:glL BstXk és EcoRI enzitnekkei emészted vad típusú DNS-sei készük. Sombora btoíbar, 15,7. 7,3 és 12,5 kb fragmentumokat (megfélelóen) nmiatimtk ki, inig a céibaveú ;«« alléi jelenlétéi 7,7.6,6 és 14,5 kb ttagmerttumok (tneglblelöen)jeizik, Mind a 5. Spei enzrnntei történt esnésztéssei kimutatott, poztró kiön rmnutta a -várt Bgli, BstXl, és· EcoRI restrikciós fragmentumokat, amely a· neo génnek a Cmed eaenbs való bei fczíődését igazolta.
A^&wA^?ásiís,mrá.ss?s§íéjfe
A barom célzott (264,272 és 408 azortoslrószámu) £$ kiönt kioivssztottuk és CS7BUÖÍ hlasztocisztakba injektáltuk (lásd, Bradley, Tfer&tösarc'ísssmas és Embrionic Sióm Cella; A Fraeílcal Approach. 11.3-151, szerk.; Robertsoa, kiad.: öxlörd, 1R.L Press (1987)):. Injektált biasztoeiszíákat élvembe»: nőstények tnerusaixt transzferáltuk a bevitt ES-soitek és a gazda blasztoessztákból származó keveréknek megfelelő, kimérikus egerek előállítása céljából. Az ES-sejíek részvételének mértékéi a kimérábaa ügy batározbitjnk rseg. hogy vizaábstm megbecsüljük az ES-sejtvos&ihol származó agait bevonat mennyiségét a fekete C57BL/6J háttéren. A 272-es és 408-as klóook csak alacsony százalékos kimérákat (azaz aktcsotty mértékű agntt pigrnentáeió} produkállak, azonban a 264-es klón magas arányban produkált hím kimérákat B kimérákat €5713:1203 nőstényekkel pároztmíuk és aguts leszármazoítakat generáltunk, amely jelzi az E8-sejt genontjánák csíravonnlba történt transzmisszióját A célzott ma génre sranyule szkrrnelést sarokból vett biopsziákól származó, Bgli enzimmel: emésztett DNS Southern biot muönos.’,U végeztük. rVz agníl utódoknak körülbelül az 5d%-ásak esetében találtunk, bibridizáió 7.7 kb mérető Bgli fragtrton’un’O’ a vad opusa 15 “ kb sut tt,ellett nmeh skmmt^ífaba « edzett tris gén evtrnon.dör tettem trauszíutssz tóját,
Ik»StóÍM^gSSSkel®lMA2SösMO Rmkmona h* tóSfefeáltelÉaig
Amsük xsegbaíátvzásara, hogy a nee kazettának a e mai-he történt illesztése inaké.,iba c az ig nehezksncát kódoló gént, a 264-es kimérni tartalmazó klónt - a JH génszegiuentnm deieeténna; a nehtvlanc expressztojánsk inaktiválását sretitnenyező fCbeo és mtsai., immunoi. 5, 847-656 11993)) - 3HD mutációra homozigóta egérbe vittük be, Négy agnti uródoí generáltunk:. Ezekből az állatokból, az 1 hónapos korban, nyert szérumot ego retedéin IgM jelenlétére nézve ELISA-val: vizsgáltuk. A ttégy utód közül kettőből teljesen hiányzott ez igöl (lásd I, táblázat), A négy állat geítoEpusátuk meghatározására, larokbói vett bíopszjáböl preparált. Bgll-ei emésztett és „A próbával hlbsáttlzált (1, ábra), illetve Stuf-et etrtészlett és 473 bp EcoRi Stai íragntentuttttttál (mint lenn) hlbrldlzáis: DKS-t Seaíkera blottal: analizáltuk. Az mutRzis kimutatta, hogy az állatokban, amelyek nem expresszálnak szértnneredatu IgM-et, a nebézláucot kódoló lekuv egük alléije a JHD mutációt hordozza, a másik allé; pedig a Gmu; mutációt. A 3HD mutációm nezse hvuoztgote egetek a vad opusra jellemző szérum: lg szintekei mulatnak. Ezek az sadatok benntlayák. hogy a Latul mutx'o makttvaha a -«ο, gén eypressaiöjár.
föttl: 87-1043/80 ~ >7 *
1. táblázat
Egér Szénán IgM í gg/ml): tg lebcoasic genotípusa
42 <0,902 CM13-JH13
43 196 X4H0
............................44............. <0.002 CMLXlilD
45 {74 <4H13
i29sRLón 15:3 ó/j-
4.110 <0,002 41 ID Ilin
Az 1, táblázat bemutaíja: a szénösweáe^ IgM szintien (FidbÁ) a CM.D és JH D mutációkat (CMIXIRD) hordozó, a JHD ntnmdóra nézve betfemigóta (r/4á(D), vad típusé (129Sv x CSOIkL-M-bl egerek (-'-!, és a ílffi mmáeióra ijörnozigőta, B-sejtre nézve hiányos egerek (4HD/4RD) esetében.
A A€t?!2 ttam- --'en a ott SC kb nen ι cm·. k lor e> nAts ho In r trw ο ί'ύ 'M (1994)] és a pVxő 25 kb mérete Inzertjének együttes- ÍRjelttálásával állítottuk dó. A. pVxó plazmklo· a;; alábbiak szerint készítettük,
Az euiberi csira vonalból szánrwo Vs-1-18(DR-Í4) gént a körülbelül 2,5 kb 5’ szegélyező, és az 5 kb 3’ szegélyezi) geocmíkus szekvenciával együtt tartalmazó 8,5 kb Hluttlll/bali ÖNS-fi-sgmentümot pS.P72 plazmidvekíofba (Promega, Msdison, Wl) szabklónozütk a p343,7.16 plazmid előállításit céljából. Az emberi cstravonalbói származó Va 5-51 (BP-73) gént a körülbelül 5 kb 5' szegélyező, és az 1 kb 3’ szegélyező gexíotnikns szekvenciával együtt tartalmazó: 7 kb mérető Bamill/Hindlll DNS-Fragmsnínmst a pBR322-Ön alapuló pGPl f plazmid klónozó vektorba (Taylor és mtsai.. Náci. Add Rés. 20, 6287-6293 (10920 klónozva álli-tottük elő a p251f píazundct. A pGPl Xből származó di: klónozó vektort, a pGPl k-t (a szekvepeiahsfában SEQ 113 Ne 14. azonos tío--,'úrnőn megadott szekvencia) EcőRV/Bamril' enzimekkel esttészlettők, és az embm csirawnalfcvl j'anna/o \\t 3-23 (ΠΡ-4-7) gént a körülbelül 4: :kb 5’ szegélyező, és: az 5 kb 3’ szegélyezd gv no k t- masai egyre- tretakna/o 10 -,b ituvtu ' ωΚ\ bamrii l)\ó-ín,g.'ia íren na ogil υ», \ \a pott: pl 12.2RR ~ ?l3zmJ«'i Barslli Seal enzmiekkel eniészíettők és ősszeligáltttk a p251í-hói tisztított, 7 kb SamktBSdí Inzerttel. A kapott:pVx4 plasnudot .Xkol-el emésztettük és összellgáltuk a p343.7. id 8,5 kb méreíii Xliöí/Sail inzerttével.
Olyan klánhoz jytelhmk, amely a V8 1-18 gént a másik két V génnel azenos oriemádőbas tarínlsnazla. Ezt a kkmt. amelyet pVxó-sak neveztünk eh Nötl-el emésztettük és a tisztítóit .26 kb inzertet a pHC2 8(1 kb méretű Notl Ismerőével együtt 0:1 moláris arányban) másfél napos kora (€578(261 s 13BA/24)F2 embriók pronakleuszába sn ekt ittak a ífegan és misai. által lelrsak: szedni: [Bogán és mtsai., Manipnls.ii.ng the Moase Ernbryo, A Laberalory Marssal, kiad.: Colö Spring: Harhor kaboratory Press, Plainvlew ΝΎ 11994)1, Az injektált em-bríéfeból kllejlőddtt,Vx6 és HC2 eredőül szekvenciákat tartalmazó iranszgéniRus egerekből bárom, egymástól független tt-ovészvcmalat alapítottunk. F bárom vonalnak (HCOÍ2U4881, 110012)15083 ős , 4A' ·ίί\'λο o ... h,\ \ ‘ θ'-ο χ m t u ‘ p·. dfen h»*t v MD ^uti ot (k>x < < a mlvti. 1 MBO I 12 SÍ .-Ό 099iv 3 skt.on)9272 transzgettt ]fsslnvsld és nttka.. Natúré Bto-echnok 14,
845-85:1: ():996)1 hordozd: egerekkel pároztstttik. Az eredményül kapott egerek emberi nehézláncoi és te könnyű100187-1045/Sö
-38iáncot kódoló traaszgésete sxpresszáirsak és· egyébkám pedig 'homozigóták sz ögéreredatit endogén néfeéz- és κ könnyalsncot kódoló loLusa ieitiíhőtébesí.
A fentiekben leírtak szerint eiöálHfórt, és a Vfetiarex eégíől (San Jósé. CA, USA)beszerzett UCe42 és HCo7 transzgéasfcus egereket Fteuxtd-iele ko-nplert (CFA. kaíalőgusszásna; 121024LA, Difeö; Labsr&isrfes, Detnoir. Michigan, USA) vagy Fxetatd-féie inbompleu siijnváassal (1CFA, katelőgussasma: 121Í95LÁ, Dühe Laboratones) kiegészített, emberi rekotnbmáas lL~t5-tei szabkxóán. (SC), iutraperhööeáhsarÍ (IC), vagy iötiavé®»»3ίί (IV í immunizáltoak. ímmmfeáláskor számos esetben KJUd-vaí .kapcsolt ML- 15-St alkalmaztofe. Számos. Freund-feíe komplett vagy Fxetmd-féle mkompfett: adjavásstó 'kiegészített híL-lS-tó. történt rásegítő oltás, uíáa, az egerek szórómat teszteltük az K45 eltel estben antitestek jteitiétóre íteve.
o?.ínjyHz;uasLreoü os saort'í ,’go (.>/< 45,zLaXL. fiXACáCá
170699 SC 52 i.g bil 1 ~ ί. Γ \ ,. π (Dtibo, katalógusszáma: 12IÖ24LA1
910799 SC 12 tg ItiC-l 5 ICFAAsm (Difco, kstelógusazámai 121Í95LA)
159799 SC 12 tg h?L-15 iCFÁ-te
020899 SC 17 í g 111 fe K. .0 ki A bán.
070999 SC 12 μ§ bíC4 S-&LH ÍCFÁ-te·
2S0999 SC 12 tg ML45-KLH CFA-bart
Lí 1099 IV 30 p.g hí 14 5 PBS-tiea
121099 ÍV 39 tg bíL-15 PBS-ben
151099 ezen egérből származó oytekesoteó- és lépsejtek Mziójs SF2/0~víti
Ctefe-AAACCLOVUfeó
201099 IP 23 tg Mt-t 5-KIH CFA-bao (Diíeo. katóóguwánu: i' 4241 U
031199 IF 124 ng hH-fe. 12.5 ng UL-fe-KI H ICfeUbun tUste.
I2H95LA) kataiögusszároa:
41199
121199 19 I 199
ÍV 12,5 gg blL-l 5. U,S.M Μί,-05-ΚΧΗ
ÍV 12,5 (ig hít.» 15,12,5 gg bit-15-KLÖ ezen egérből származó nyirokcsomó- és lépsejtek Száója SFXŐ-val
Tápoidal
190 bíCtei peoxtóUmtó, 100 tg/mi streptormcimtó, 5 íbM náírmmplraváíteL 0,5 ;aM S-merkaptoetanolíai (Lóé Technologies. Faísley, Skóciai és 10%, hővel inaktivált foetáíts borjúszérummal ilUVlone, Utak, USA) hegesztett, láceves által módosított Duíbeeco-féle tápold&t dscoves Moditied Dulbeeeo's Médium).
CA_A4VC_ >A^CkX<lLfe44_ snl Origea Hyhritie®» Cfertmg: tasior-rai (ICEH, Gshhersburg, MD, USA), ííAJ-tal (i fiola, a gysziő .áltó javasolt íkotmentóciófcan Sigma Gbemtel Co>, St Louis, MU, USA) és 0,5 isgtisl kaasmichtól (Life
4047· 445. SG
-39Technologies, Psistey, Skócia) kiegészített Élte.
mi Orlgen Bybriden-a Cfening Fnotor-ras {IGEN, öaiiitersbnrg, MO, USA), HA'T-tfl (1 fiola, a gyártó által javasok kmeestmac^s Stgxaa Chemteai Co., St Lotas, MO, USA) és 9,5 tagúnl kanomisionel (Life Teciiselegles, Palsley, bkomat eiegészitett FPM.
Hited'ma tózkésejnyimtógarahésÁ^ t’ferfoomák előállítása céljából, az egerekből eltávolitottuk a lép. lágyéktáj; és az aorta fotói oynnkesootílkat. A lépből és nyirokcsomóból különálló sejteket tartalmazó szeszgenziói készítettjük és a szuszpenziót: SE2I9 utielőmasejtekkel kevertük össze 1:2 arányban. A sej:teket lecenuúfogáltuk és az üledéket óvatosan :íeiszuszpexíáákuk: 1 ml poiíefiléngkkolban ($&% név, ESS-ben, Slgma-Aídriel® Erviné, Ük) ÓTte-on. A sejteket 1 porcig: kevertük, majd 25 snl FPM-2-t adtunk a sznszgenzienoz, és 37'C-oo Jü-óö percig mkubáftuk. .Az inkubálás arán, a sejtéte: ö,75* tó sojí'iyuk koncentrációban í fbÖ gl térfogatban), 76-lynkú fersrezeken, FSMben ííikubóliuk. Három nappal később, a lyukakhoz löfi pl FSM-eí adtunk.
HhL~i 3~iel íommnizáli HCo-7 és HCoí2 egerek légének és nyirokcsomóinak fúziója számos. az IL-1S ellőni antitesteket termelő hibridótnái eredményezett. Az alábbi négy, az, i.t-15 eted, teljesen emberi aof .testeket termelő stabil klőnokat ízolákuk.: fi t ttetyD7F7B? másnéven I4ÓB7; í2) íóDB2E12A3:B5 másnévea l-föiió, (2) 404CC1IB7E4 másnéven 4Q4E.4; és (4) 4Ó4ESÍ2E7A8 orásnéven 4<)4 4A E klánok mindegyike az embert IgOl/k alosztályba tartozott.
A.lúbndóir:ák.s^nelé>te
A fúzió után 7-11 nappal, a lyukakat: az emberi atnltestek: jelenlétére aézs® szkrinoltük az alábbi ELfSAk alkalmazásával:
.-tekteeri toG-neLaterotóíteb^
Az emberi IgG-oek a tenyészet felűlószóiban való jeietáeleaek szkrmelésére szolgáló l· 1 ISA kivitelezés· éhez, Nuac Maxison» ELISA-lemez egyes lyukaihoz iöö pl, fossiáííal pofeelt sóöláalban <PB$> oldott 0,9 pg ml kouceutractoju. ny ui-o-e-kenoynianc-antrtesteket (DA:KG, Glosbup, Dánia) adtunk és 12 órán át, szobahőmérsékleten í.okabaltok, Miután a lemezt csirkcszérummsl {2%, Lile Technologies., Eaisley, Skócia) és Tween-29-al (ő.őS'lá) kiegészített EBS-sel <P8STC> blokkoltuk, a tenyészet felnfuszólhól vett mintákat adtunk az, egyes lyizkakhoz. Másfél órás inkubálás után. a lemezeket mostuk és BBSTC-he® oldod, 8,5 pgimf koncentrációjú, tormaperoxidázzai konjugált nyál-o-ember IgG-£ <Fa£b2-fegmmuraok) (DAKO, ölostrup, Dánia) adtunk: a lyukakhoz. Egyénbe fokubálús után, a lyukakat mostuk, májú n gyártó útmutatásai szerint hezzáadiuk a szabsztrátnínot (Alkí'S; 2,2’-szinobisz-3-etilbeazínízofe-szuiíbn-av s es az antitest kötődésé? 495 nm-en. E1S08
EOSA-leolvasobaa (Bio-Tek ínstruments, Wioooski, VT, USA? ooekehük Az Et-1.5ellem:speelllkus ^testekleleÍdéténekszkrmelésére.:szolgálőEEf$Á
Emberi ígívk antitesteket tartalmazó lyukakat teszteltünk az-11-15 elleni specifikus antitestek jelenlétének szkríselésére szolgáló: ELlSA-vtd, A? FI IS A kit itelozeséhez, Nőne Maxísorp ELÍSA-lemez egyes lyukaihoz 190 «1, foszfáttal púdereit sóoldaiban (BBS) oldott, 1 ágúul koncenimcrőj:ó:lL--I5--öí adtunk és 12 Órán át, szobabómérsékietef? inkuhálíuk:. Mintán a lemezt csirkeszémsutnál (27>, Life Technologies. Paisfey, Skócia) és Twea-28-af f0.05%! kiegészített EBS-sel tPBSTCj blokkoltuk, a tenyészet folülüszóibói vett mintákat adtunk sz egyes lyukakhoz. Másfél órás Inkubálás után, a lemezeket mostuk és FBSTC-ben 1/SflOÖ arányban oldott,
I08Í87-1045/SG tormaperoxlúázzai koojagált: «-emberi IgG-t {Jaekson fommnöResearek, West Grove, Fennsyfvsma, BSA) adtunk a lyukakhez, Egyórás iakuhálás után. a lyukakat s®osíh&c. majd a gyártó úőnutatásai szerint hozzáadtuk a sznbsztrátutnot (ABTS; 2,2'-azmobÍ8Z«3-ettlbenztta?,oi}n-»zullonssv) és az antitest kötődését 405 nm-s®, EIA08 ELISA· leolvasóban (Bio-Tek lasfeuméms, Wtrwski, VT. USA) értékeltük.
b%n iStfen e. n,texak>, ) h»h d,—-a<t 0(- \Att b«n '.%a a v tA ko<% <. e * vitásával (0,5 sejt'mit szubklönczíuk-.
Körülbelül 10 nap múlva a szabktówkat a tóniiekbcs említeti 1.1. -15 EETSA-val teszteltük. A számos szubktótiozási eljárás sotán, az- tSM-eí táztsonként FC.M-e® keresztül fPM-re cseréltük. A szubklónok ízctípusát, as alábbiakban leírt ELlSA-val határuziuk meg.
AzjT4£dfeüjmíií(^^.izm
Az izotipus analizálására szolgáló ELISA kivitelezésére. Nunc Maxtsorp EÍASA-leme? egyes lyukaihoz 100 μΐ. foszfáttal pvífterelt sorúdéiban íPEAí elöott, 100 ugönl koneentrae-vban emberi Ec ellesi antitestet (Jtícksott hnmnnoteeaíeh. Ur>· bnnc. Pennsj Ivama, USA? adtunk és 12 tárán át, szobahőmérsékleten: jaknbáitufc. Mintán- a lemezt csjtkeszerantmü (2Α>. 1 tie Technologies, Psístey, Skócia) és Ttvses-SŐ-al (0,05%) kiegészített PSS-sel (PBSTO blokkoltuk, az egye» lyukakhoz a tenyészet felöfezóiból vett mintákat .adtok. Másfél Áfás 1 nkahálás- níá®, a lemezeket mosbak és a Irakakba -alkalíkus (öszláíázzai kerti egált egériariM'gö 1 ci (Zynmá, plaaís, landt, vagy tormaperoxidázzal koxyugált cgér-a-ílalgGO-at (Zymsd) töhSd&k, Egyórás: mkubálás után, a lyukakat u-osink. majd a gyártó útmutatásai szerint itozzáadísk a szubsatrátumöt (ABT5; 2,2'aziítofeísz-3-eidbvn/uazoHn-sztj|fonsav) és az smlfest kötődését 495 ntn-ea, EL8Ö8 LLÍSA-teolvasófean (BícTék fsstrnménís, W-trnoskt. VT, USA) értékeltük.
anritestekeullwspecifkltása
Ahhoz hogy it-15-re spee-tikn'. amitexA textntasan kópss®^ legyenek működni, és it-15 által indukált gyultadáskekó hatásokat gátolni, a.-· antitestek nek lel keh ismerni az lL-15-nck az IL-2R3-iás;c és/vagy az Π..-15 receptor y-iá®ca közötti köicsőnhatáshan résztvevő epiíbpjait.
Mutáns fefeértélíst (lásd Petiit és mtsai.) alkafetazmsk az TE-15 -ellem teljesen emberi antitestek - 140137, 145115, 404Ab és 4Ö4E4 - epdóuspeíóEciidsásíík értékelésére. Az alkalmazod IL-15 mutánsok közé tartozik a QfÜ8S(a 108. helyen lévő Gin Ser-re csereivé; mutáció a y-iá®c kőiesofthatási helyen) és aDSSQMS (a 108. helyen lévő Gin Ser-re cserélve és a 8. helyen lévő Asp Ser-re cserélve; mutációk az IL-15 3 és y-láneának kölcsönhatási helyén) 1L-15 mutáns.
hb_Vjc^\ uifkos__ -OB' ,14 LA 40-i (A e·, 4< 414 entiteyojnl «Jw mm, ο Τ I' tel e^síc, történő kötödéséstek iheghstározására szolgáló ELISA
As tITSA kivitelezéséhez. Musté- ELiSA-lcs5.es egyes lyukaihoz töö μί, foszfáttal paribreh sőoldatban (PSS): oldott, 1 trgms kc-ncerí-ráekg» IsIE-LS-öt vagy mután» 011.45 fehérjét adtunk és 12 érán át, -\‘\4mm<'<ketem -«af'uiuk Vexac .. emud mmw ’,ηοχξΐ-,2\\ I ttv %%bnv\\£.,.% Pa.Uw S\0v3>,s Avee®-20-al 10,05%! ktejteviu-tt PÖS-svi (PBbfO MckkoRak, maid a hlI-15-re '.pecíriku.' an-iiestekhc: ke szült higltási sorozattal inkabáltuk. A lemezeket mostuk és PBSTC-ben 1/5(8)0 arányban oldod, lorstaperoxidászal korgugáh cKtmberi IgG-t (.laeksaa InnsurtoRcsearéh, West Grove, Psnnsylva®)®, USA) íidtusik a lyukakhoz, Egyóms mkubáhís után, a lyukakat mostuk, majd a gyárrá útmutatásai szerint hozzáadtuk a •SBübsastráíamöt (ABTS:; 2(2’:-,wmobm4-'-«íiíben!ri:ta&üb‘Szulíomsv> és az antitest kötődését 405 nm-en, ELSŐS
1001874 Ö45/SG
-4)
ELlSA-leolvasőban (Bks-Tek Instroments, Winooski, VT. USA} énékehük.
Az IL-15-re specifikus, teljesen emberi I46B7, 14ÓH5, 444AR .es 4Ö4E4 antitestek hit- 15-hoz és QICÁS, illetve D8SQIÖ8S mutáns 11.-15 lehériékhez történő kötődéséi az 1. ábrán mutátjők be. Se»! a. I4ő87 se® pedig a I4ŐH5 sem volt képes kötni ezeket a inntáns ÍL-15 fehérjéket. MiVél nnndkét nmtáus hordozza a QiOdS mutációt, a 1468? és 146HS által felismeri epíióp az it-15, az Π..-15 receptor v-láncával köicsőtJitatásba lépő kritikus doménje® beiül található, A 4Ö4A8 és 4Ö4E4 képes köb» a mutáns fehérjéket ezért ezek az antitestek az 11..-15 p és v-táneászk kölcsönhatási helyé»: kiéül eső epböpet ismernek fel A. 14687 és I4ŐH5 sz 1L15 receptor γ-láncávai kölesőrtbatásba lépő régiónálköti az ih-15-δί, Bzegsl\ -ag a találmány szeriíbh ÍL-15 elleni teljesen emberi antitestek alkalmazásával végzett: prcilforáciős: vizsga v ' n \< ármazó adatokkal Ahogyan az alábhinkban részletesen leírtai, w'ra a 4<M \X sem pedig a 404E4 setn képes gátolni a CTí.l.-2-sej;ek és «mberi PShíC-k ít-15 által indokait pr<'i'f«avfo»í!, Továbbá, az íl-15-nek az 11,-15 receptor y-láncávai történő kölesőnbglásáríak blokkolásával: kikerült gátolni a proliié rációt.
ő. példa
AJáóHVAteésVK.régtoiái.kódpió szekvenciák
A ;~teö7 átíendeeett \\( és VL doménjesnek nukleotid- é.« következhetett mnínosav-szekveseláját az alábbi eljárásokkal határoztuk üteg. E szekvenciák információt szolgáltatnak az alkalmazod ¥H és V·, . osiravooat-csaláefokkai kapesoistban; s osiravoaal-szekveneiákban elöfotdnlö ponítnutéciók az állat immunizálása sói » ali sojfek aSrnhásérésének eredménye.
Í\\S-preparálás iehes RMS-í prepútáltonk 5* I Öf' 14687 bibridéma sejtből RNAzo! (Bionesesls, Psole, Angisa} aikaltuazssávah a gyártó átmutatásaí szerint.
A 1.468 -W :'Zam»:ze KNS-höl (3 pg teljes RNS) AMV reverz tonsszkripínzy portér (Roche Diagnositss mnfokh Mannáé»» \,» ei-w/zz) s'tgo dffi 1 (Pronega, Mados-st, V.L 1 SA), dMf (Fhet.i.nge. \knfoeuu Corp., USA}: és RNAsin (hromega) alkalmazásával készítettünk cDhiS-t (a gyárié? úbnoíatásai szerint).
Az alkalmazott láncfedkó-párok:
Ve
FR1 5’ láscínáitóh (31 (3)
A8Ő2 CAg gíK CAg CTg gTg CAg TG A863 :SAg gTg: CAg CTg KTg gÁg TG AfíóS gAg gTg CAg CTg gTg CAg TC
V„
14} (5) (ö) .(73:
th) leader 5’ láneinditók:
AGA5 ATggAC Tgg ACC Tgg AgC ATC ABhö ATg gAA TTg ggg CTg AgC Tg: A887 ATg gAg TTT ggR CTg AgC: Tg Afíhk ATg: AAA CAC CTg Tgg: TTC TTC AB89 AT g ggg ICA ACC aCC ATC CT
VH 3’ láneindstó 19} A890 F < ‘' \g ggg e \ \ gAC CgA Tgg
Íöi}Ih?-lÖ45iSG
V..:
ERI 5' táneirtdliók
Gi ABS RÁC ATC CAs Aís AYC CAz IC
C) ABO gYC ATC YRg Aíg ACC C.Ag TC
P) AB 10 gAT Λ ΓΤ zTg ATg ACC CAg AC
14) AB Cl gAA ATT g'íg I Tg ACR C Ag TC
0) ΛΒΙ2 g k.A \ ΓΆ g ÍR .Víg Ae A C Ag FC
yi ABC gA Í gTT gTg A í g ACA CAG TC
í?) AB 14 gAA ATT sTg CTg ACT CAg IC
Vx leader láncittóílők:
(8 ? AB 1.23 CCC gCT Cag Cí C Cí g ggg GTC CTg (Ö! AB 1.24 CCC TgC TCA gC Ϊ CCT ggg gCT gC (10) EB EB CCC AgC gCAgCT TCTCTT CCÍ CCC gC
01} ABÍ2Ő ATg gAA CCA Tgn AAg CCC CAg CAC AgC
V,. 3' iáneiuditó (12} EB 16 Cg g gA A. gAÍ g AA gAC Ag A Tg
CCTtokt/B <-O < e tolv.to. η P dvCEUSE B'B
PCR-reaksriókat Amph/ÍAu vvírenzzal {Pemn-Eímer) GertoAntp PCR. System C'öO rendszere© í\ - ι ι' λ •'phed B os.'-C r*> k >- ervatv. t,A. LtoAt vegemk.
PCR-Gkhix:
44»e 2 pere
; 1 ciklus orc 30 tnp
BE/ 72°C // mp. mint 30 top tsz CC
30 ciklus ACC // mg
>5eC 30 mp
72Χ' 30: tnp
32:,C 10 perc
Intés-CC-s-a
A Vues VuÁCók któEXgaúgtpCmΓ- V<yÍ<;r.Systgni.Cbe
Miután a. PCR-temékeket agazézseíett analizáltuk, a ieraxékeket 8-400 vagy 8-300 mifcmcesjtriíuga oszlop (Amersfeant Pbamacsa Rinteeb -te,,. Fwafomy, Mi, HSA), vagy a Ql.AEX H Gél Extraction Kit tOíagea CmbH,: Hilden, Németország) alkalmazóéval ssztitoiítút, Az egy es kísértetekhez. 2, egymástóliüggedeaül, FI vagy ieader iánertuldókkal atopiüikáh, A/í: és Vt régiót tartalmazó PCR-terméket pöEMT-Vector Systeto Ebe. (Rrötoegá) kiósyzttmk a gyártó útmutatásai aluppm,
E. coli ÖHSa-ba történt íransziltrmáiás stán, egyedi telepeket szkriueltünk koitóríia-BCR-rel T? és SFÓ láneinditék alkalmazásával (30 ciklus 5S°C-0K}, Egyedi telepekből plazmiá-DbiS-t preparáltunk <<Jisgexs Spin íslaiprep kit: Qtageni. További analízis céljából Neel/Metí enzimekkel (NE: Biolabs, Egyesült Királyság, és
Roehe Dsasnosíies} emésztést végeztünk és a kapott Slagmentonsokní agarqzgéles analizáltuk.
Í00187-1045/SG
A pi iF MT- Ve. Sor '•'Vsicm 1-be ionosst k lenn Art. kendő·.')'! a Y ϊ .'-.dokaí p'.\>/ek\ c-saltnk !' es '<p:. láncindfiékaí :(&rogentee, Lóik, Belgium; alkabnazlattk az ΛΒ1 Prisni StgDye Terminator Cyele Ready Reaciloa O ( Applied Bíosystems, Wamagmn, Egyesült Királyság) szekvenáíó készlettel kombinálva, a gyártó útmutatásai alapján. A reakcióka t ABIRRiSM 377 Szekvenáíó berendezésen (Applied Biosysiems) végeztük és a sz-.'k.emrn-m i l)\<Sü·, Kvsm.mli orograrnsral anakí-aknk ' vvo.'Mk! \B\St N.s ouwn.” cpe.üam.ae.uk.siínt-dots/pnbisí.' itató htot), cakavonal-eredetö V-gén szekvenciákkal egyeztettük.
A ΜόΒ V, e» V - régióinak.kl^czástó
A 4ί'&-* t jbj xlómábót származó V és VL régiókat BCR-rel ainpltfikáliuk és a eDNS-szekveneín meghatározása céljából pGEMT-Vector System 1-be klotx'Puk. A nukleotidszskvaueiákat és mrazokből következtetett. amínosav-szokvencxákat a 2. ábrás sa szekveiujJt»tafean SEO ID No. 1. és 2. azonosúószámon megadott szekvenciák) ás a 3. ábrán (a szekvencialistáb&n SEQ ÍD No. 3. és 4. azonosuószátnon megadott szekvenciák), tnegfeteioös, matatjuk be.. Az. ábrákon jeleztük a váz (FR) és a komplementaritást meghatározó régiókat (CDR). A VBASK-bes végzett egyeztetés szerisí, a I46B7 Vti régiója az alábbi esxravonal-eredetü családba tartozik: V)-f5-5í (VjéS alcsoport),/02-15/173 (D^-szegmentum), JH4b (1-H-szegmentum), A VBASE-ben végzett egyeztetés szerint, a 14ÓB7 Vt régiója az alábbi csiravonal-eredeíti családba tartozik: A27 (VAU alcsoport) és V (-1 :,;xzis.sn-emi.ms A '% és V:;;. dontenekkel kapcsolatos további írtferntációk a Rabat-ísle adatbázisban <hbp;//íítrtntrt:O;brttg.nwtt,edtt): vagy a http://VP3ss.com honlapokon érhetők- «I
6. példa
A 14687 kötési affistsdásának leljamzói
A 14687 affeitltásáttélsztní pfeztttonivzsnaáQás (SER) ellátással, B1ACÖRE 3(100 műszer alkalmazásával analizáltak a bienaolekuláos tchérje-kölesösbaíssok meghatározása céljából, Kimutattuk a bíomoleknla felszínhez történt kötődése eredményeként, a felszíni rétegben bekövetkezett tömegkoneeníráció-változás eredményeként az SPR-jelteen lőném safe'/ásokaS. Az: alíinltási az alábbi definíciók alkalmazásával fejeztük ki: kj-asszíxááeiő.s ráta konstans (M'!see'\k ky----d!sszoc.iáeiós ráta konstans (seck Ky-asszoetációs egyensúlyi állandó’-'ks/AílM'5); ésK;y--disszo<tö<<os ensólyí ί&ηύό^ΚΙΜ),
Különböző eljár ->kat Og, ztunk a 146B7 emberi 1L-.15 (810-15) fehérjével szembeni aOinítasának meg határozására, Két különböze ο ιόι (Itnmunex Corp., Seattíe, USA; Peproíeeh, Rocky Hill, N.t, USA; származó emberi rekombiuáus lt-»5-».v k, tx-Sölíouk CMS szenzorchíphez, A szenzorcbiphez kapcsolt vegyületet tekintetlek liganduntimk. Más kísérletekben hgasdumként 14687 antitestet alkalmaztok.
Az egyes kinetikai analízisben, attal-tzák vegyuletként 1:4687 vagy hll;.-15 a szenzordúphez kötött ligandamhoz való kötődését hasonlstoifetk Össze a 14Ö87 vagy ML-15,- mint analizált vegyűleteknék CMS -szetszorcblphez, mint referencia kontrolihoz történő kötődésé vel. Az analizált vegyületböl készült hígítás! sorozatot (ó, 3,135, 6,25, 13.5,25. 50 ug/ml) teszteltünk, Langmuir i rt tuoddlhen, asszociációs és djsszöeíácíes görbéket illesztettünk monomer kölcsönhatás megtetárpeásátex a ks es fej: ínegáltaphásg. Illetve a KA és Κ» kiszámítása cellából. .Az összes adatot Rí \-i s rtnanen programmal (ver. 3.1) analizáltuk Btvalens kölcsönhatás esetén a „blvafeíss analizál? vegyüíet'' medel't alkahzsazmk. Az -analíziseket az alapvonal eltolódásához:komgátísk.
A 146S7 antitest alnoitásáoak meghatározására, B:1ACÖRE3ÖÓÖ műszeren mértüké. 14687 antitest affinitását két, különböző gyártótól (hnmunev és Beproteeh) származó emberi rekotnbináus ÍL- 15-hez. Λ ΙαΆ-Γ
ItgfíOdumkéni és a hí 1,-15 analizált vegyöleikén? történt alkalmazásával. meghatároztak a monot alens kekken1(101 Ó7-ÍÖ45/SÖ hatást (görbeillesztés, Lertgmtsif 1A).
Ά 1-W17 hit · 15 -re ílmotopox Corp.) vonatkozó atthátásál az alábbiaknak mértük;
Az ssszoGitóés sála konstans fe: i ,07 í±0. 17> * áÖ;' kf Sec!
A d-sszouaraes rata korstous fe r>,>ot~ts ,Wj * |G 1 s<o )
Az esszocláeids egyejrfelyi áil&rsdö KA: 1,55 feödll) * 10' M'!
A.disszoeiáciős egyensúlyi állandó Kö: 6,59 í±ö,á,fe * IO'S M
A I46B7 antitest affinitásának tneghaiárözásáta. i; gázáranként. IL-iS-öt (Tmmunex Corp,) analizált vegsáífetkéot pedig 14687 antitestet alkalmazrunk. A kapott adatok analizálásával (az antitest bivalens kölcsönhatására alkalmazod kstopnöir 11 1; /otimúluszíessel s meghatároztok az antitest aviálrását,
A HóB'T bO.,-1 S-re {Immuno Cotp.) vonatkozó avtditásáí az alábbiaknakmértük:
Az esszoéiáeiós ráta fcömtass· fe. 7.30 (:0),81) * W' M''sec':
A disszoeiáelós ráta konstans fe; I ,45 (±2,05) * ló sec'1
Az asszociációs egyensúlyi állandó K< 5,03 (±3,40) * ΒΙΑ·!··!'
A dísszociációs egyensúlyi állandóKt>:· 1,55 (i 1,24.! * lö'9 M
Meghatároztak a 14687 affinitását és avidítását a Peprotsch -től származó U,-ÍS-tol szemben is. A két különböző forrásból beszerzőit 11,-15 között az affinitás vagy svídítás tekhrfeíében nem találtunk lényeges kik lősbséget.
Ati,yrtao a Íeníi pzkkib.m. a Ct; 1 -2 tekm 1- es Pb\iC-knek az ettmert tnierienk'.n-;5 íltli- = 5? attd indukált proliterációjának 11.-15 elleni teljesen emberi antstestekkei való gátlására voaslkozőan leírtaik, pilóta iáin beépüléssel mértek szerint, a 14687. dózistól függően gátolta az II.-1S által indukált proliferácsőt. Az: 50%-os gátlásnál megállapított: ICfe. koncentráció - amely használhatóbb tnódja az e proiiferáerós gátlást kísérletekből az alllniías tneghatározásáttak - értékét 3.1:1:0,91 nM-sak számítóitok. Ezer; l€fe érték megfelel a BlACOlíE 30öÖ: rabszerrel méri; aviditáatíak ffey 1,55 aki) · ahol-a mérés során hgandumkent 14M37 antitestet, analizált vegyhletkéni pedig rekombináns IL-iS-ötaíkaimaziutsk - és Igazolta a kapod atfinhási es ja uh tásl mérési eredményeket.
7, példa
ΗΠ.-15 által indukált TAF-tz termelés gátlása 11.-15 elleni, teljesen emberi antitestekkel
V 11-15 olktn, til;es^n etttben. 140bA <4?1l5. -k'd.ád es 4ö~I * antstextes hatas.it \t Simlnts TT -1 * al lal iuáíAáli TNE-sz termelésre nézve, egészséges önkéntesekből származó perifériális vérből tisztított: raonomikleáris sejtek (P8MC) alkalmazásával az alábbi eljárást .követve. Áz: Tk-15-re votmlkozó sgeefficitás értékelésére, megvizsgáltak ezen antitestek hatását az Γ 2 a ml közveti tett 'WF-se tensteiésre nézve is, bej Penyészet \ enx (.v^uLt 2 fel . ct'ntr 1 \> λ! n fexm > ’ 1 « \í t.g ni -napion n t (I, ·. A Jen k<'?x fe'siev ,χ 1' os 1 >% tmd ra-tsx.v \x;a ? to jt.sran.moi <lo í fene 1 ul (Vi art. 1 mzo R. All-.64ö t :ipo Ida sban tartottuk.
Perifériális vérből kivont mononukleárís sejtek (P8MCT bsztitása t uxv.'temkho, ,? *. *\ ess. raxme ft - cm tor' sor g\« ttrutts „χ, t fe ez & koaguláció ellen, heparint adtunk, A T’BMC-ket bieoll (Pfeatmaekt, Ilppsala, Svédország) alkalmazásával végzett sóröséggradleos eentrifegáléssal íisAltoítuk,
1ÖÖ1A7-IÖ45/SG
-45Tesztyegyül&t:
1Τ1Ι.-Ι5. katalógusszáma: 687Ö-Ö11 (laununex Corp.. Sestile, WA,. USA)
ΓΊ << t -or Bei ek \ 3\ V' - orv η 8 n u i o
Az alkalmazón teljesen emberi antitestek: 14687 (070101 sz. iníniaj és 14óB7ItD.IWÖ7,404A8 (030:101 s/ «mifii o te0 (t sop I m.u'o * v tt pás -t. i1 ' . <n'test <4 Ή, ; h’gopg ntnas les tökké:
P8MC-t teuyészteitarüt háromszoros vagy négyszeres ismétlésben. 96-íyukü, lapöátésékü. lemezen, 1,5 * 10” sejt/lynk mennyiségben, bíL-2 vagy hit-15 jelenlétében vagy hiányában, .11.-15 elleni antitestek hozzáadásával vagy anélkül. Negatív kontroliként izotípus kontroll antitestet (TI) aikahnaztunk. A prolilsráció posniv kontrolijaként konkanavalin Att (2,5 yg.'ml. Calbiocbem) adtunk bizonyos lyukakhoz, A sejteket 72: órán át; 3?oCroa és 5% CQ> tartaiont mellett inkubáltuk. A felttlászókar összegyűjtöttük .azentberl TNF-« mennyiségének fiLISA-val :(ö-CyTech, (ilrecht. Hollandia) történő meghatározására.
A 14687 és az Izotípus fente!! mhitest hatásait teszteltük PBblC-khen a hlL-15 altul közvetített W-a termelésre. A 14687 dózistól fílggően gátolta a fill,-!5 által közvetett TNF-rt termelést, mig az izöítpus kontroli antitest sem gátolta a hite-15 által indukált W-a termelési (4, ábra). Két, egészséges önkéntestől származó adatokat nnhatink be. A 4Θ4Ε4 vagy a 404Ah arttest sem volt képes gátolni a blL-ld által közvetíteti: TN8-U termeiért
Az 11.-15 elleni antitestek specifikusságáííak megállapít cte-t ovimból, értékeltük az antitesteknek a hlL-2 által közvetített T’NF-ot termelésre gyakorolt hatását. A :4687 twt tettet: ki gátló hatást nklL-2 által közvetített TNE-et terme lésre (5. ábra), A 4Ó4F4 vagy a 4(4 A 8 antitest nem volt uepes: dózistól függő módost gátolni a hik2 által közvetített TAF-et termelést.
A. hIí..-2 által közvetített: TNF-o: termelés dózistól fiiggö gátlását csak a 1.4687 antitest: esetében tapaszisiink, míg a 404E4 vagy a 4Q4AS antitesteknél nem figyeltünk meg Ilyen hatást, A gátló hatás a hit- í 5-re \ oh specifikus; as IL-2 által közvetített TNF-ö termelést az antitestek nem gátolták.
6. példa
CTbte-2 és FBMC, emberi imerleuksn-15 (hlL-IS) által indtskáit prolífcrációjánafc gátlása 11,-15
Az IL-15 elleni, teljesen emberi, 14687.146145, 4Ó4A8 és 4Ö4E4 antitesteket teszteltük CTLL-2 sejtek: (öülis és ttttsúí. (167S) és puriléttáíis vérből származó menottuklsáris sejtek: (FBMF t hlitekuazásával T-segíek proliterációjái gátló képesség szempontjából.
A tenyészeteket .2 ?»M .L-gimatnínt, lÖöNf/tnl pemrillirtí. 100 pg/n-l steeutoroletat (Lile Toefemlogíes. Iktisley, Skócia jós lö%. hővel inaktivált ibetáii» borjászénnttot (HyCIene, Ut&b, USA) íartaíínazö REMI-164(1 tápoldaihati tartottuk.
A fenti: tápokkttban tartott CTLL-2 sejtekhez töillis és mtsai, (I$78) 36 Eteti hll.-2-t (Chiron Benelux
BV, Aatsterdttra, Hollandia) adtunk és s kísérlet megkezdése előtt hlL-2-re nézve 3-4 napon át: éheztettnk. Alkalmazás előtt, a CT11.-2 scpokot háromszor mostuk.
I00187-IÖ45/SG
Egészséges Snkmtosekból azok belegyezésével, friss, emberi véri gyéjtöttilstk, és a vérhez a koaguláció elten ’í'pjm', adtunk. Á PBMC-ket Fieoll (Eharötaeía, Uppsala, Svédország) aktaimazásával végzett 'Uririeggraötoos cerstrimgálással tisztítottuk.
Lyzri ogyumt fiit k&íaiógu^záraa: 6870-Oi 1 (Iramnnex Corp,, Seattle WA. VSA) fiíL-5 (Chiroo Bemste BV, Amsterdw, BoBandla)
A CTLF-2 vizsgáksibtos alkafenaxüt atsiiíestekei a 8: ábrás matatjuk be: 14ÓB7,146B5,404A8 és 4Ö4E4 antitostok,
P8MC vizsgálatban aikslmazois, 11,-15 ettem antitestek: 146B7 (070101 sz, nzisia), 404Á8 (03Ö1Ö1 sz. minta) és404E4 {080lö: sz. minta).
Az egyes kísérletekben a sejteket 5 * 103 sejtdyufc mensysségben, háromszoros isméöéshes, 06-lyukú lemezekre transzferáltok (hlt-2 vagy WL-15 jelenlétében vagy hiányában). A. proiiisrációrs gyakorolt hatás értékelésére a lyekakbm.a négy, IL·! 5 elleni assihesl valamelyiké: adtuk. A sejteket 37“C-on és 5% COj tartatom mellett ló órán át inkubáltuk. Begyűjtés (Harvester 96 Mach 11 M, Totmec, Orange, CT, USA) dóst 4 órával a sejtekhez f/Hj-hmídint (I pChlyuk; Aasmham Life Sciences, Liriie Cbaltont Suckiahantsbire, Egyesük Királysági adtunk.
Ahogyan a h. ábrán bemutattuk, a CTLF-2 sejtek 1L-Í5 által indukált proliforációja dózistól függően csökkeni a 14ÓB7 és 14ÓH5 aaSitostök esetében (lásd esőkként fííj-dmidia beépülése lecsökkeni). A 4Ó4A.8 és 40484 antitestek nem blokkolták a CTLL.-2 sejtek 1.1,-V5 állal indukál· prolr&ráráójűt.
PBMC-t tenyésztettünk háromszoros vagy négyszeres ismétlésben, 96-lyuhá, laposiéseká lemezen. 1,5 * 1 ír sejfelyuk mennyiségben, hIL-2 vagy ldL-15 jelenlétében vagy hiányában, 11,-15 elleni antitestek hozzáadásával vagy anélkül. Negatív kontroliként izoöpus kontroll antitestei (TI) alkalmaztunk. A. prtdribrácsó pezniv kontrolljaként konkanavalin A-t (2,5 .ugdnl, Calbiochent) adtunk bizonyos lyukakhoz. A sejteket ?2 órán át, 37’h''-on és 5%; GCF tortafos» mellett inkubáltuk. Begyűjtés· (Hsrvesier 96, Tourtec, örauge, CT, USA) előtt 16 érával a sejtekhez: l ’Hj-tlmldisí i i pCVlyuk; Ainersham Lile Scfesees, Iá: tte Chaitont, Bímkinhmsslnre, Egyesült Királyság) adtunk.
A 14687 dózistól 18^0 mértékben gátolta a ('kfi-iimidisrlL-15 álial indukált beépülései és -· ennek, küveikesíeben - gátolta a prohtorSciói (ÍCSíto3,110,91 n&í). A 4S4A8 és 404F4 antitestek nem blokkolták a FBMC, Π-lő ,'Jí.d indukált pm-ld.:á..i'í,tt koMbH kt.-«l.uk efedmetm» aiapiUti a I4mH5 untísesiet sem teszteltük. A 14o8~, -K»4\b es 4041% antitestek ILfiő-m vonatkozó speeidkusságának igazolására. ezeket az antitesteket az JL-2 alul köziemet: p-oiiteraetom is vizsgáltuk, A tesztek antitestek egyke sem gyakorolt kásást a.z il -.? okai közvetített proliién.,©:© abraks
Egészséges önkéntesekből, azok be i. 1 , unbes; PBMC ke! ab’tottonk elő.
146B7 antitest (MDX015 sz, prepa ,k s 0 edn Isv Milpttos. CA, VSA
100187-5 045/SO ,-41
X ,züv<.3x»nsd<.-' ‘ré '-H51 -Os/O’’ DMSO o<re < \> n*c \vgbetes! ms d „ » M
NMCOj-bas. <1 mgriní-es vógbigitás) oldoénk, Az: antitesthez (1 rel-ss oldat) mi&lgm^őWst ŐöO ul biotin oldatot adtunk (sötét. 2 óra, szohahömérsákloiíi, Aotiiest-bfetin oldatot. dializálmnk sltífe-a-lyzsr™ diaiizískazeiíábar. (I 0.000 MWCö, Piérix Fc-or A ,tw. ifelhisrdia) <12 óra, 4‘'€): a nőre kötődői? bintiaellávdn.is eclreM ó lakőv érkező napon, a bíotnikík antitestek k-wenu-acicjai speMTefouimetriasa! (Tsr^pee 2l OOpro, ÖD 280 nm) meghatároztuk.
.ferifértájnsyvőrsrekentésg
11,-15 redukálására, egészséges öítkéáiesektői vénás vért gyűjtöttünk. FBMC-kot ’vnvS/u-ttöHM. 2 mM L~ gfefamfof, 5 NBZm) penicillint, 50 pg/rei steepíomicreí (BioWhittaker Europe) ás 10%, hővel maki ivók loetátis x>n av unó? A' ito 1t24l \h t ,o ; V, t-οπ Inc > t\,\t> « v> RPMH'-.u „p<. ra.\u (Ro\\, ,tU.’i _ t topé) maximum 2 napig (3?*€), és serkentehtmk 500 NE. tat lFN-γ- vai (Boehringer sngelboim)..
Ámmlári, “jhiiökiod
A sej tehet 10% emberi .AS szérumot <CLB, Amsterdam, ifollMditt) tartalmazó. 2 mM L-gluíaminl, 5 NEvní penicillin!, 50 pg/ml streptorrdcins (BsoWbirtaker Europe) ás 10%, bével inaktivált (bétáiig- bojjúszérumot töptimum C241, Mulúcell, Wisent Inc.» kíegészttett RPM1-1640 tápoldatban (ösöWbíttafeer Buropei riöiokubáhuk. Perníeabíiízáiás f20 perc. 4nC, Cyrefi>;;Cyropertn':'í Kjf Reuott ö»vu sn \Ή>>, >o ( \tc Perm.AVas.h'-w pufíend (Cyiofix/Cytopesm™ töt) végzett mosás alán, a .PSkíC-keí: .áramlása euömetrssvsl IL15-fel festékük. A festési folyama? során a folyamatos penneahiiilást IVm Wa>h™ pylterrei (Cytofoc < stoportaM töt) biztosítottadé. A sejteket bsoti-tilált 1407 antitesttel vagy? bionntult hlg<~ri~el un.uhaltck (20 t g rel, 30 pere, 4*C) és Eezm/Wiash'·' púderrel mostuk, majd strepatavidia-ilkoer-friimei (D.AKl ?} nkubreiuk 50 percig (4°C>. Mintánként legalább 5001) sejt esetében, áramlási dtostelmvaí (FACSCslifeu, Bcuv) l >«. <re>.ors), monocitákxa kapuzva reeghttiárezíuk a fluoreszcencia intenzitását (CeliQuest Pro program a ka/nma-reai) kz adatok a serfcentósi indexei (SX) mutatják be, amelyet az alábbiak szerrel sztaitoKuok ki S l rtiuorecxenciára nézve pozitív festés átlaga í/fátlsgos báírér-fluoreszeenoía).
tatuimoifökémfe l ftrtc 5 «Onouhivbat Jcr\-.dri 1 > wtnuausrea te ,νπηυahboí < nxtun u<puaumma, k<v< tettunk. Miután 5 * 10* sejtet (200 ni) SnperfeostA-Pius mikroszkóp lemezekre (Meszel) centrifugáltunk, a lemezeket levegőn msgszáriíotiuk (<őö pere), 2%~os p&referrealdehid/PBS-ben fixáltuk (8 perc, 4®C), PBS-ael n őriül te'Vvuot o-e e. ttcgs l \ testi» <. ot s ^do^m prepantu toxat pBs Ko (t<' l s' ponti
PR8\ amit a festési folyamat ezt köveid részeiben aüdtatuutuik) penseabilizáiíuk. Az endogén peroxidáaahuvuas blokkolására, .a eiíespin preparátumokat 0,05%-os (\ \ h eltromsavfoszfát pnfferfees (pH 5,8.) hígított indrögátj-peroxiddal (:H?O'> refutökak <20 puse, s'vMu'wterselUen PBSS se! \ egerei mosás titán, az endogén bfetisaktivitási a gyártó msui,oa-re ihpym i<l<'kk»'ituk >,Βκ««.η Aleckmg Kn. Vektor ! ab.. DAKO). PBSS-sei végzett stoéás után, a τ cm spoeutkcs helyek blokkolása ve'rebol a citospir. prepirsiureokat 10%»os. PBSS-bes oldott A3 szérummal ív 18. Amsterdam, iktilandias reketölmk <50 perel Ezt tünetem, tt ritospiu preparátumokat bsetisrták primer antitesttel (b0 perc. .mhy-.'üSR-r'R'hk'í> PB^S-sel tegzes mosás utíre, biatiísiált iormaperoxkiázzal komptexalt rtrcp’uvdsanal (streptASOenplex HRP, DAtöri ? 1 Wö FHSS-bes, ·; 2% emberi ΛΒ szerűm t inkubáituk ?.'» pere, savhattdttteo-okteO. PBtbrt-sel u-g/er? mosás után, a IffkP aktivitás krereiatá11)0187- 1Ö45ZSG
-4§sára a etespín pteparátumokat á-atencMteíiikafbazollal (0.5 ng nh e* H<>, vei íő,01%) inkubúhuk 150 mM nátmmácefot puffer, pH 4Λ 10 perc, szobahemőrséklA), A dtosmn preparattnnokat cs<ápvizfeen moslak 5 percig, kéísstoxílrnnai (DAKOt festettük 1 percig, itejd isméi osapviZbcn mostuk 5 percig, és femmonnr-ha vagy glyeergel-be (ΡΆΚΗ» beágyaztuk,
Λ 14687 auátesí IFN-y által serkentett emberi tntxax'úakhoz való kötődéséi a tő. ahaa mutahuk be Sioimilált 1.4687 nem serkentett monomtákboz való kötődése muratía, hogy a sem serkentett pestekben 11.-15 vau jelen, fia a monocitákat serkentünk IEN~y~ve!, a 14687 antitest sefeteez való kötődése fokozódik, a kötődés maximumát: a. tenyésztés első napján érte el. A klsGl kontroll. antitest kissé kötődik a nem serkentett monocháktez. IFŐí-y-te « torlene scAejus esetén, az Fcy receptorok fokozott exgressziója a raoaoeitákoa a hlgGl kötődésének növeuc cse· v C5.% tw, luptagnátekémia
A 11. ábra bemutatja az emberi ntonociták · 4687-vel, vagy a hlgGl: kontroll antitesttel törtenő festödesét. A sejtek Í4687 antitesttel történt inknhálása után a citoplazma egyértelműen vörösre: festöéölt, azonban a kontroll: antitest esetében nem figyeltünk nseg ilyen jelenséget. Eszerint, a. snőnocitákban a 146B7 kötődik a klL-15-hűz és e kötődést fokozölag szabályőzödéit az IFN-y-vei történt serkentést kővetően, A 11. ábra szerint, az 11,-15: fesíödése elsődlegesen teracelluláris.
kémiával l®«őíggkofotek
Emberi psoriaslsös bőr — szövetmintákat: gyűjtöttünk az érintettek beleegyezésével (l.oalse Vílhdscn, Department of Itemaíology, Gentofe ünlvershy ffospúaí, Koppenhága, Dánia}.
1:4687 antitest (MDXÖIS sz, preparátum), Medarex: Inc. Mllphas, CA. USA.
N-hlőrosrszakeiniísido-biotlat (Sigma) először DMSO-ban (löö íng/sol-es végldalíás) ;maj.d 0,1 M NailCÖ?-ban (1 mg/nd-es végbigitás) oldottuk. Az átülteikhez fi ml-es oldal} nnillgranunonkéíü 6Ö0 gl fefotin oldatot adtunk (sötét, 2 óra, szobahőmérséklet}, Antitest-biten oldatot dializáítnak slide-a-lyzer™ ώ t /’4.< /< t ib m í ló Ή (. \l\sf o foerec °e to Su.eÍtee Π vundte ,12 esa s- < ' a f efn sete oh ' ot n est i sobtas vcoabol \ ífees etkez' f spnn <·. biosnolah ni Etetek kon,<.nu.EíOteí ^pekno'.otontetr.asal A loo-mce zlOOpro, ÖD 280 nm) stegbatározluk,
A vizsgálatig a szöveteket -8ÖcC-oa tároltuk, A felolvasztás utás, a szövetnretszeteket acetonban festek t í'\n v.t'twnv ..,>o es^^ot 1 ,o. »*ünk ptoxajo >\s ' Ί kkolav'm , musteteket 0,05%-os (v/v's, cilromsav/iőszfát pufferbea (pH 5,8,) hígított hídrogéa-peroxíddal (HAL) Inktibálfok (20 pere. szobanöntérséklet). ESS-Tsveen 28 oldatlal fPSST, 0,0554 v-'vj végzett mosás után, tsz endogén őfotlnakfeitást s gyártó úbn«tatásai alapján blokkoltak (Biottn Bloeking: O, Vector Láb,, DAKÖ). BBST-vsl végzett mosás alán, a nem spscí&ns helyek blokkolása céljából a szövetmetszeteket 10%-ös, PRST-beu oldott AB szérummal <CLB, Amsterdam, Hollandia} mknbáitok (30- perc}. Ezt kővetően, a szérumot télitaáuk és a metszeteket: 2% AH szérumot tartalmazó LBS-bes hígított, biotteiáli primer antitesttel »f>0 perc, szobaltomer1 Őiíl8?-.lí545/:Sős •49x ksí ί.-· ?3ö| λμ·> a ,ii bnfsmlA >·> « apOxoxidv zzvi κου.χιΙ >u*i}v<lnn,i (streptASContplex/llRR, DÁKÖ) (1: 100 FBb-bea, ·* 2% emberi AB szénán·) Inkuháltuk (36 perc, szobahőmérséklet),. PBST-vo vc„ ut mosás «táti, a HRP aktivitás kttnataíásáta a metszeteket 3-amlno-9~etiikarbazollal (0,5 !>!!,;<. 5 C> st. 0 ¢, lnne \A ó * ι ν'n tna ruift ’ fulu pH-u ö ’x-j, \mpmo5tk \;et> A ntefszetekeí csapv »κη mostuk 5 percig, hemato’uiianal tDAROt tetettük i percig, majd ismét ssapvízbsa mostuk 3 percig, és iáramouat-ba vagy giycergd-be tÖAROt beágyaztuk.
A psoríasisos bőrben tevő kumtinociták eiioplazmája, a I46B7 antitesttel teteti szövetmotszetekben egyértelműen meg festődön:, azonban a kontroli antitestek esetében nem a vizsgáit szövetben nem óg\ éltünk meg festödéss {12, abr&i a 1468? testi a psoriasisos plakkokbói gyűjtött, IL- lS-re nézve pozitív keseamoatakatí.
áJ*&gLÍlz*£<felgm^n.g&t^ íteűLYggDiteek feihovialis szövet - fiatalkori izületi esúzos páciensektől, áz érintettek beleegyezésé vek Imgyüitvs (Aiexei Orom, Dtvlslon of ftediatrie Rheumatoiogy, Chiliben’» Hosphal Modieaf Center Cincmnati, Öt!, US Aj.
Kermöma-biopteák - az érmének beteg;· e/cte el: gyűjtött szövetminták (totósé Völsdsen, Deparfnsent ofDenmaclogy, Genofte ( mterolv Itepna, C'ppennagtn tenia),
A1 au <visMl)\é is ρ?~ρ’ it! Mvkrev ,c AíiKus í, v (. S '
H6B7 antitest t 15-ÖORÍ>JWO? sz, preparáttm·; Mcns'ex 1 κ Mt p « s, CA, USA} az izületi osúzzal kapesoküns kísérletekhez,
Ikllfe^fefea^ffiLtó^^tó^Míá^kszwe^oitafótnárakfe
Friss sztnoviáiis szövetet gyűjtöttünk fiatalkori izületi csúzos páciensektől azok valamelyik tetessek sebészi eltávolítása és ínás Ízülettel történő helyettesítése cián. A mintákat, steril körülmények között:gyűjtöttük. A teljes sztnoviííHs szövetminta feisprháss után nyert fragmentumokat, az egyes preparátumok homogenitásának biztosítása céljából gondosan összekevertük. Az összekevert szöveteket <2-4 grati/állat; ottlanfcéut' löö: mg) SC1D NOD egerek Uackson 1. aboratories) hátába szubkután beültettük, A graft beültetés napján és a beültetés után 7, 14 és 21 nappal az egerekbe Ϊ.4687 antitestet <500 pg, hp.) vagy R8S*t adtunk be. Az Mátokat a. beültetés után 28 nappal elöltük. Szinoviálís gráf tokát metszettünk ki és fetmalmbas feáltuk Begtatöxilinkozíunal történő festés céljából,
SsjAlÁvertoŰ72b:SA!.Viyh:7SAlAAö.AlC.:fLCŰviji:>öAynöy7^zSryp;yv>
.MáésásdUüssW&áiásiüij&L^^
Miután a S€1I> egér és embert szirov i uk szövet alkotta kimérákbói származó szövetekről digitális képékét (2ŐÓ0A2ÖŐÖ, jpg) készitettünk (XIÖ objektív, Zeiss mikroszkóp; Axiovlsiou szoftvert, az adatokat szánd* tógéppel ansitzáftnk (Adobe: Pbottosbop ver, óik Adobe Systems, Monntain Vi«w. CA? és & felbontást IöÖfeSMÖ pixelre csökkentettük. Az.egye» meu/eteket beiül, hat Xlö mezőt választottunk ki ügy, begy azok a legjobban tükrözzék a képen lévő szövet általános teíödését, Az összes testődötf sejtmag kiválasztása (varázsvessző a sötét sejtmagon, lö-es tolerancia) mán, elkészítettük s kiválasztott terület optikai sűrűségi grafikonját és az átlagos festödest tntetizites rögzítettük {hssonló/kép hisztogramm (similarrimage hístogran?? utasítás kiválasztás» uhfe), Ezt köveidet!, kivátezíeítuk a hátteret és kvaniitesiíuk annak teíödését (varázsvessző a hátié1.04187-1445/80
50res, 10-es totemneia).. A festödés erősségét a sejtnmg festedáse és a háttér festőd黩 közötti külSöbségnek. vetítik Ezt az értőket neveztük tetszőleges egységekben megadott, fotokémiai indexnek. A bernulatott adatok átlagos adatok ds szók hibahatárai (s.e,m.). Az adatokat Sfodest-feie t-teszítel analizáltak.
: 'bfokLdkk^kOlfeAIAőAC bi- Α^ΛόΧ'.ί,.νΙ kom, v mu Ah m
Két páciens psoriasisos pakkjából származó fceratöma bioírsziákat .szétválasztottuk és C.B-i7 SCID egerekbe iJsoksoa Laboratories) transzpiamáimk. A transzplantáció után három héttel a transzpornál: egereknek BBS-t (oiaeebo), lő sápon át, minden második ttap lö mg/kg £sA-l (ciklospurin A) tSaadoz). vagy az: első napors 2í) mg/kg,. a R és 13. napos pedig 10 mg/kg 14ŐB7 antitestet adtunk be Az utolsó injekció atáa egy héttel az egereket elöltük, és az egyes xvnograftokhóí 4 mm-es biopszlát gyűjtöttünk. A biopsziákat formaimban nyaltuk, paraiBnba ágyaztuk és Heoratoxthtt-Bezutnai illetve Ki-b7 sejtmag-antigénre festettük.
feáAljfikálága
A BeHistosiiis-Eozinstd festett szöveteket az epidermisz vastagságára (utók a paraketanosís mértékére (0-3 pímtszüm) és az epidermisz felső rétegében a gyulladásos monónnkfeárís: sejtek számára nézve értékeltük. A Kr-ö?-re festett rtteíszeieken négyzettnillíméíereskéní tttsgáilapitoitnk a visszatérő kerafinoehák szántát. Az egyes, 4-4 egér alkotta kezelési esesportökm, középértákekei. számítottunk, és az egyes páciensekből származó adatokat átlagoltak, fo- s.e.sn.),.
A metszetek mikroszkópos vizsgálat® kimutatta, hogy a legsötétebbre festődön sejtek a beszűrődő sejtek közé tartoznak, fezért, a sejtmagok szántát (amelyet relatív felszánt területként mértünk) a beszőrődés mértekének tekintettük. A 14ŐB7 injektálása a gyulladásos szinovlábs sző veibe, a. hordozóval tőrtért kezeléssel ''s$zehasonllíva lecsökkentette a beszűrődő se jtek számát (13a. ábra. p-<0.05,!. A 13b. ábra illusztrálja a 14όΒ7 antitestnek az átültetett szlnoviáli» szövetbe történő aejtbeszürődésre gyakorolt hatásait, és bemutatja. hogy a hordozóval történt kezeléssel összevetve, a sötét nukleuszí tartalmazó sejtek szórna lecsökkent.
bCllfopsooíuds.nmdell
A 14, ábra mutatja be a 14ÖB7 astítesttfo kezelt vagy kontroli kezelést kapott SCID/psoriasis egereket A hordozóval (BBS) összehasonlítva, a 143B7 csökkentette a psoriasis súlyosságát: (amit az epidermisz sfestum coroeuru rétege és a „rete pefo'-ek kezdete közötti rész vastagságának mérésével állapítottunk meg) (14A. ábra):; PBS (177,:8442/2 um), CsA (91 ,0415,2 pm), 14Ő137 (ő2,349,1 pm). Az. epideinrisz siratom comew rétege és a „iteóí peg’y-ek legmélyebb része: közötti rész vastagságában is csökkenést, ügyeltünk meg (lőB. ábra); BBS (433,843:2,1 ^m), C'sA (393,8462,9 pm), és I46B7 (298,0433,8 pm). Továbbá, a parakeratesfe roétíéke csőkkent a I4őfe? kezelés: eredményekést (14C, ábra); PBS (:1,0:0.),4), CsA. (1,340.3). és 146B7 (0,540,3). Ezenfelül, tz ettders!»/ -e »o te operett a 1 46'te a gud ctta.os nonotukle.r» »epek tevmmt t i-d.5. aurai: PBS í53.3é 5,9 ínoooíu.k.e.om tett). CsA 5 '4»-sOS és 14éB7 ί 1 6,440.1). Az emberi Ki-ó? ieheríe expressziója szorosan kötődik a sejtek proliferáciéjáboz. Az interiázis sorún, az antigént kizárólag a sejtmagon beiül lehet kintnlafei, mag obtöziskőr a fehérje legnagyobb része: a kromoszómák felszínére kerül. Mivel a Kí-67 fehérje a sejteikíus összes aktív fázisában (6(1 s, S, ö(2), és mitözis) jelen vas, de a nyugvó sejtekből (6(00 hiányzik. s.,’,zio ma ke; om tea t settpopulecío u.}omérett nosCxedesr fe/isunk ov-’batm' mted'o' \ cteAkenu a Ki-ő?-re pozitív. keringő kemtínoteták számát (lőB, ábra): PBS (247,9477,01, CsA íl 16,0±24,is, és felóB?
(73,849,9),
100187-1045/SG
V zt ,j! v υ v i p n\á. >v.i,\.n a 1l'iH ; -, ,. \· , xe^yut ke te ,s n ,< < \ rhi L \ s sejtek feexzúrődéséí a gyulladt szövetbe. Továbbá, beültetett, .emberi pscrustaov ^lakkokat tartalmazó SC1Ö egerekben, a CsA-hoz képest n 146S7antitesttel végzett kezelés csökkentette a psoríasis súlyosságát Valóban, a 14ŐB7 antitesttel végzete kezelés eredményeként a gyulladás. a* sptéetnovz vastagsága, ax osztódó keratlnöcnák száma és tt parafceratosts súlyossága jelentős mértékben esőkként a? embert'8C1D egerekben.
Teszivegyület h IgG i embert kontrolt antitest (Sigma)
1-folP antitest - (MDAOIS sz. preparátum: Meáarex Inc.).
UL-lSHa-t köustitntivsn expresszál» Raji-sejtek (martin Glenrac, Téoovós Research Laboratories,. Sómbampfon General l-tospítal, Soatkainptoú, Egyesült Királyság}.
N-kidroxúzukciulmido-blotlnt (SIgma) először DMSO-ban (löd mgéml-es véghtgitás) majd 0,1 M NaHCOrbsa (1 mgónt-es véghígitás) oldottuk. Az aníilesiitez (1 ml-es oldat) miiiigramtttéfikéní bOÖ pl bíotin «kfeM adtunk (sötét, 2 óra, szobabőmétséktel). Aatitest-biutis oldatot uiaitzálttmk slirié-d-lytser^ dialtziskazctíában (IB.8ÖÖ klWCO, Pterce, Eerbio Science, Hollandia) (12 óta, 4aC) a nem kötődött bíolio eitávoiltás céljából. A rákövetkező napon, a blotlsllált antitestek koncentrációját spekbofoíometriával (Uhrosgee zlOOpto, OD 280 nm) meghatározni.
:41dígí4immgSLtLGjBIAi®^
Laijostenekh rniktöiitet-lemezekst: (Gremer) IL-lSRcí-val (BA.D bystems, Mínaeapobs, MN, HSA) vontunk be (12 éra, szobahőmérséklet), majd a kmmxeket PBS-set és csirkéből származó szérummal (2%> inkuháhuk (6Ö pere, szobahőmérséklet), A lemezeket PBS- >H \ >·ft 04»,, }v>zen 20: PBSTt mostak, ért kővetően különböző hsgitású, Jeteden Ι:1,-15ό1 (50 pl, femwsm Seat.le. I '-uV mkúbáltuk. Tíz perc múlva, különböző kooeenmiciójú bioíiiíitált.antitesteket)5u pl)adtunk:a lyukaknoz vX> posees inkubálás, szobahőmérsékleten). A lemezeket PBST-vel mostuk, majd: PBST-C-vet (PBST és 2% eshkeszérum) 1:10000 arányban higitott strepíavídm-retekperoxídáz komplexszel (CI..B, Amsterdam, Hollandia) Ínkubáltuk (óö pere, szobahőmérséklet). Végül a lemezeket mostuk, majd ABTS-sel (azinobisz-3-etlbenzt-azobn-szultbnsav. Rcche Ebagttosíics, Maratheim, Németország} ABTS-pufferben inouba. uk a gyártő útmutatásai alapján. A szinrcaketőt. 2%-os oxálsawal állítottuk te. A kötődést.405 nm-en, £í.Sö& EI.íSA-leotvasóijan (Bté-Tek Instruments Winooskí, VT, USA) értékelték.
Rab-sebeket löff-es összeérhet: AB szérumét (Ci.B, Amsterdam. Hollandia) tartalmazö FACS pullerbea (FBS. ο,ο5% BS A, 0.02% N&NO.) momkuhaituk (2» perc, 4Ύ1). Rali-seitekeí (1-2*10* setém!) íranszlétálbmk a lyvkaKba, és ezekhez Sóul, 10®/» embert AB szérumot íaffstmszé FACS pufférben különböző mértékben hígított IL-15-őt adtunk. Miután a sejteket 30 perein Ínkubáltuk (4°C), majd FACS púderben kétszer mostuk. a lyukakhoz 50 )d bsoiisdtálí wftteStet 04687 vagy hlgGí) adtunk és 30 percig ínkubáltuk (4°C). A sejteket FACS pufférrel kétszer mostuk, majd 200 pl FACS pufférben (elvették, és mintánként legalább SOÖO sejt esetében. áramlási eiíomeíriával (FACSCabóur, Bestén Dickíttsott) meghatároztuk a íiuoteszeencia intenzitását
1Ö0137-1045ÍSÖ
3?, (ÜeBQsmt. 'Pro- program aikabmízásáva®,. Az adatok a serkentés! indexei mutatják be, amelyet az alábbiak: szerísc számítoltunk ki: S.L ==: ttiuareszetrociárs nézve pozitív festés átlagaid adagos háttér-duoreszceufiiai. BUSA
A LléS? antitest IL-lő-fL-íSRa komplexhez való kötődését EUSA-hsn a 17. ábrás mutatlak be, A 146® 7 kötődése nő a reeeptöránoz kötött IL-IS konceotráínbinak növekedésével.. A kontroll antitest nem kötődőit az II.-15-höz vagy i L-15R-hez.
A 14613? antitest. Kaji-sejteken lévő 11,-15-IL-ISRöt komplexhez való kötődését a 13. ábra ntaddid be. A 146®? antitest koneentr&e létől függő módon kötődik az IL-lS-lL-i SKa komplexhez, Megfigyelésem szermt, a htgG t nem kötődik a Kaji-sejíekeu lévő ÍL-15-11,- 15®.« komplexhez (18. ábra),
A 14.6137 képes kötődni a receptorához már kötődőit iL-15-sőz kapcsolódat. A 146®7 az IL-15 olyan en topjához. kötődik, -amely séta vesz részt az IL- 1 S-nek a receptorához való kapesolődásában.
SSStCZSMCTALXSSA
A).léte ÍS®, Eh Ab, ' <32® » EtSSW MBIWS3EA AgEEO'flA :A3A 3ATSALLÉKÉ® 23 Ofe-íő! <3Ó0> 2A0-02hP:2 <350> ÖS 60/ sí 4 /EB --'3,- 7001-08-20
ALőöo 4
Al'7Ő:> EASASEó EB BBSOfáíWS YőASAtM A ,2 <2: lí> 1 <22 I> 330
A202V ÓLA
-íLOÁB LAKK ΑΑΚΕΕΚΕ
SZZ: o:v <221:> 2LK
-<222:> U)< . . í 320) <4000 I lM)187-104:5/Stj
999 Qlv 1 9^9 V.%1 tag ctg gtg cag tet aga Alá gag gtg aaa rag cec ggg Glu Vai Lys lys és©· Gly 989 Gl« 48
Gi® Lse Vai Gin 5 W siy
10 15
tefc ctg as.g etr. fccc tgt 83$ gtt tet gga CISC tec ttt ac© ecc tag 98 ·
Ser Lea Lys Iie Ser Cys Lys Vaj. Ser Gly Tyr The Aha Thr Thr Tyr
20 25 30
T93 at© 99© tgg gtg epe cag afeg ccc 999 aaa get ctg gag tat atg 144
Trp 22« Gly Trp Val Arg Gin «et Vro c.iy lys Gly Lee Glu Tyr hét
35 48 45
999 at© éte- tel cet ggfc gsc tet gat ace aga tar agc cég tec tt© 192
W Ize lié Tyr ?» Gly Asp Sex w Thr Arg Tyr Ser Fr© Ser Phe
52 55 60
sas ggc es© gtc se© at© tea ÍJGC gac tag tec atc agc sec ©ce- ta© 240
Gin Őíy Gin val Thr Iie Ser Al® Asp lys Ser 11® Ser Thr tlié ’lyt
SS 70 75 80
©tg eag &99 agc ege ctg aag gcc teg gac acc gcc atg tat ta© tgt 288
Leu Gin Trp Ser Ser Lee Lys Alá Ser Aap Thr Alá hét Tyr Tyr Cys
05 98 95
9©9 &g® 999 W aac tgg esc tgc ttt gac ta© tgg gg© cag gga ace 338
A.lh: Arg Giy Gly Asn Trp Ast. Cys Fbe Asp Tyr Ttp siy Gin Giy Thr
100 105 118
ctg gtc aee gtc tec tea gr© tec acc s&g 99© CCS te© gt© tte ee© 384
leu Val Thr Val Ser Ser Aia Ser Thr Lys Gly Pro Ser vai Ft©
US 120 US
Ctg «03 Lee Alá
130
39© <2'iŰV 2 <214> 132 <212> 3®3 <333> 12330 3A2122S <4203 2
Giu val Gin Leu Val Sin Ser Giy Alá Cin Val Lys lys Pro Giy 01©
1 5 W IS
Ser Leu Lys lla Ser Cys Lys Vei Ser Gly Tyr Phe Ah® Thr Thr Tyr
20 25 30
2rp 1 le Giy Ttp Val Arg Gi© két Pro Sly Lys Giy len Glu Tyr Ne©
35 48 45
GIv 12® Tle Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pr© Ser Phe
.90 55 «8
Gin Giy Gin Vai *XA>A? 12« Ser Al® Asp Lys Ser Tle Ser Thr Alá Tyr
83 7(3 75 00
Lee Gin Trp Ser Ser Lee Lys Al® Ser Asp Thr Alá hat Tyr Tyr Cys
SS 98 95
Al® Arg Gly Giy Ash Trp Asn Oys Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Giy Thr
100 103 110
Lep Vai Thr Vei Ser Ser Aia Ser Thr Lya Gly Pro Ser Vei The Ft©
125 120 125
len Aia 130 <3i3> 3 vilii- 333 <2i3r 223 <233.> 3220 3221323 ;0öi 8 7-3 045.33
-S4-
<222 B G SS
<22:7 B i 37 . . , OB 57 i
<BÖÖ>
gaa art 2&3 fefcg a cg cag fcct cca 39« aee CtS tét ttg fcct cca ggg 48
Gio Hs val Lea Thr Gin Ser ©ro Giy Thr Fee Ser Lse Ser Pro Giy
2 S 10 IS
gae aga gcc acc efct tcc tee «39 gcc agt cag agt gtt <&<$c aga sec .95
Glo Atg Alá The Lse Sár Cys Arc Ál a Ser Girs Ser Val Ser Sár Ser
20 25 38
t®C fcta gcc tgg fcac cég tag aaa cet ggc eag get ccc 399 ctc ctc .144
Tyr LöO Ála Trp Tyr Gin SX»· Lys ©ro Giy Gin Alá Pro Arg Leó tea
33 48 O
stc tat ggt goa tcc ege agg cet ast ggc atc cca gac agg ttc agt 152
iie Tyr Giy Alá Sár Arg Arg Áia Thr Giy lle Pro Asp Arg ©he Ser
58 55 88
9§':C agt 85§ tét 9W aca gac ttc act ere acc ate agc aga ctg S«3 249
Giy Sár Giy Ser Giy Thr Asp The Thr Fen Thr lle Ser Arg Lee Gic
65 73 “S 80
cet gaa gat tett gca g”3 tat tao tgt cag egg tat ggt agc tea cac ©SS
©ro Gin Aap Phe Alá Val Tyr Tyr Cys Gin Arg Tyr Giy Ser Ser öia
85 SÖ SS
act tfcfc ggo cag 333 acc aag ctg 3»g st* sgc ege act gtg gcfc gc® 336
Thr ©he Giy Gin Gry Thr Lys Tea Glo lis Ser Arg Thr Vai Alá Alá
30 185 119
c©a tót gtc ttc ate ttc heg 357
©re Ser '«. ©he lle ©he Pro
US
<2137 4
<2BB 139
BB' FAT
<2 3 B ·· EEB'sö SXETWiS
<$8ΒΒ; 4
Glo iie Val 1©W Thr Gin. Ser ©ro Giy Thr Leó Ser Leó ser ©ro Giy
1 5 13 15
Glo Arg Alá Thr Lee Ser Gys Arg Alá Ser Sin Ser Val Ser Ser Sör
28 25 30
Tyr Fsa Aia Trp Tyr Gin Sle Fyo Pro 81 y Gin Alá Pro Arg Leó Leó
35 4 Ρ 73
lle Tyr Giy Alá Ser Arg Arg Are Thr Sly 11® pro Aap Arg Phe Ser
53 55 68
Giy Ser Giy Ser Sly Thr Aap ©ha Thr lao Thr iis Ser Arg Geo G.U
SS 79 75 80
Pro Giu Asp Phe Alá Val. Tyr Tyr Cys Arg Tyr Giy Ser Ser His
55 38 93
Thr Phe Giy Glo ily Thr lys Lea Cla üe Ser Arg Thr Vai Alá Ai®
108 1.0 5 118
Pro Sex vai Pne iie ©he Pro
115
BO187 -1Ö45/SÖ
AVATKOZÁSOK
Beiben X :M., Mattís R- W.s Fk'K'broáxm R, M., Tesser J. R„ SehíERL H.v Keystoae E. €,, Genovese
M. ü.., Waste M C, MereWd L. W , W<nvr 4, í„, Markéssuo J. aed Fsaois B, R, (2400} A eomparisoB eí elaneteept and methofcrexate in patienb Altit e&rly ritenmateid arthritis, H Esgl 3 Med 343. 1586-93.
Fe'nniger 7.A. and Ctijigturi M.A. (2001) Interleulán 1.5: bt Megy and relevaíice to hunján disease. Stood 97: 14-28.
fishwilá D.M.» OlVormel! S.t,, Sengoedtca I, Iludsoa DA , Hatdiag E, Besrthard S.L,, Josses fí,. R&y R.M.. Higgins K.M.. Schramm SLR. and .Laaterg N, (1996) Tiiglí-<tttd«y barna 'nmedösal aaiibodies front a növel stratn oímmiloeostrassgemormce. Natúré hioieekn. 19; 895-53,
Gilhs S„ Fenn M, M.. On W, and Sáriik K. A, i; 978) Teell gmAth í&ctor; paramétere of prodecíion ;rt;d a quaotítative niietOaxsay fos scíivby. J fowaaol7 29, 2027-32,
Kennedy Μ K . vi al i 10073 Keserűbb' deferri sn natural kdler and aiemen CO8 1 eell bneages m 1L15 de&teni srácé, I, Exp, Med, t9L 771-:80
Kásása, t, Vasaes 8, and Nielsers Ο. !L (1998) ínterieakm-15 and its roíe in ehronic inilannaatory dtseases, ItrOarenr Rés 97, 2854?,
Klippel.1. H, (2000) Bielogic thetrtpy ior rfeeataafoxd arthritis, 19 Engl JMeá 393,, 1640-1.,
Kóbier G. and MOstein C, (1975) Condanoas cnhtjres of Ibsed oel.ls seoteiing anabody of predelmed speciftetty. Narure 254: 495-7.
Liu C. C, Perussia B. and Young .1, IV (2000) The emergtsg role öf 8,-15 in NK-eed deveíopmsnt. ínmumoi Today 21, 113- 6.
Lövell D. .1., Gtannsni Ε. H.. líetfi' A,, CáwkweS G, IV, Sáh’eratm. El IV, Noéim.1. V» Síéin L, IV, GedsÜa A., Ilowtte N. T.. Walbee C, A„ Whittnore L and Étnek 8. R. (2000? Etanercept írt elbldren svíth polyariieular javeniie rfeeetnsteid arthritis, fsdiairie. Rbeansafofogy Coliadéra; ive Stndy Gronp, N Engl. 5 Med 342, 763-9
Matat R N, and Táyiör P. C, (2000) Ánti-eyíokise sherapy for riíeirnrttíekl arthritis, Anna Rév Med. 51, 207-29,
Moinnes 1. IV, al- Mugbales -V, Eteld M·, Leang 8, Haang f, P., DIxen R., Starrock R. D„, Wiikinsos 's G and Ltevv I 7 ;RGn) ; de rok-of tnterkusiír-15 ta 1 -teli msgsatton and aet \at^<n n rhennWosd a thrrm Mai Med 2, 175-82.
Mckntes h 8,, Learig. 8. Ρ., Smrrock R. ÍV, Ι-kdd M, and Liew F, Y, (1997) lníerleokin-i5 nrediaiss T eeSi-depenáent regaiahon of tumor necrosie feeíor-tdph» prodsetion bt rbesmntioid arthritis . Mai Med 3, 189-95.
MAnnex 1 8 and l ina. 1 V ίΙυ’-Α) loterieuk-n 15- 3 prosníbinsanory role m rheumatoid arthnu» syjtovitis, Inantmol Today 19,75-9.
Oppeaheimsr-Marks, et al. (1997) I Glia, htoestig. 101; 1261-72. Pefeií: D. K,, Rónáért T. P., Eisentnan .L, Srfoxvw» Pajtiért ,R., Bernt C., Lynch D,:,
Miller 8,, Yosí 3,, ömWsin K, H, and Gorslsotz W, lt (1997) SírtteOne-hmclion stúdiós of Inlerfeusis 1.5· astag site-specific matagenesis, pGÍyöthyles5© glyceí cosmgalieu, and bomology modelmg. J Bioidon 272, 2312-8,
Rrtehstz, et al, (1998) L hntsartol. lS0::5é59~íkk
Wakhnann T,, Tagaya Y. and Ramihr© R.. (1098) ínterle»kia-2, mtertekta-15, and their recepíors. Int: Rév imnmnoi 1A, 205-26.
Wítldímmn T. A„ Dubois·$. ttad Tagava Y. (2001) Contrasting RMes oFIL-2 aadTL-15 irt the Life and Fteaih of Lyeipboeyíes. Itnpiicaíioos fer lómrmtíSíhetupy. fomrurtity 14,105-110,
100187-1045·SG
-56Wakkoassa Τ. Λ, and Tssgaya V. t'l999j The utaltlfacesed íegtslaüoaof ;»t§rkakin-i5 expressz» and the mié oTtbis eytokíse In NK coli dinemriiaíloa and hőst fespoaa® to íraracelkibr pathogeas. Anno Kev Immunoi Π, 19-49.
A szakember egyszerű -rutin vizsgálatok siskán megbizeöywdhtü afelől» vagy nyilvánvaló szfeíárst hogy & uAia'ánv tri tvtnestetett, specitite toegvalőak&n soőáíaissk szásw ekvivalens® Khezüs. Ilyen ekvivs.lenseket az abhbs igénypontok magukban foglalják. Az igtóygmntokbaa lein magvalósítást módok MrmOyea kombinációja a blálssxáay okádni körébe ssrtoalb

Claims (5)

  1. SZABADALMI sCÉNYPONTOK
    1. izolált, emberi monoktonábs antitest, amely (<;) emberi IL-ló-böz kötődik;
    (bt aa 1 1. 1 5 áltat indukált gyidfedáskettő hatásokat. gáfebii képit»; és 5 (e) CDRI. CDR2 és CDR? &tnísöwv-w^wn«t^· ririateaző, emberi nehezfese variábilis régiét és
    CDRI, CDR2 és CDR? ajamesav-szíekveReWw^mtó» ettőeri k&myfiláae variábilis régiót tartalma^ abol (1) a CD.R3 wíamv-writwróái. tarfeimaző emberi tfehézláos variábilis régió a szekvenolaristéhao. SEQ ID No. 2. szonosítószámot! megadott stntnosav-szekvencja 100-t07. aminosavait tartalmazza. és a CDR.3 aminosav-szekveneiát tartalmazó emberi könnyüíánc variábilis régió & szekvencialistában SEQ ID Ne.
    ΙÖ 4, azötiositószámon megadott aminos&v -szekvencia 90-9?. a-nínosavajt tartalmazza;
    (10 a CDR2 antinosav-szekvenciát tartalmazó etnhetj nehézi-inc variábilis régió a széki mio feli; táiiao Stl.Q 113 No. 2. azooosnószátnof; megadott armoc-sav-szekvcncia 50 óó. aminosavait tartalmazza, es a CDR? amirtösav-szókveneiát tartalmazó emberi köonyüiáne variábilis régió a szekvenciaüstában SEQ ID .No, 4. azonositószánxm megadott arotnossv-azek verte ia 5 í -57. aminosavait tartalmazza; és
    15 «ι ρ χ s'iOt' t,< is Nui'i.,! w '>),< ηΚ'?Λ v ?b '< sgiőn s/i'Ms\*e ;
    SFQ 113 No, 2, azonos kószámon megadott aminosav-szekvencta .11-35. aminosavait tarsairoazza, es a CI3RI amínosav-szekvííKiát tartalmazó emberi köttnyiilanc variábilis régió a szekveacialtstőban SEQ N? No, 4, azooosi'tószámon megadott annnosav-szekvencia z4- ?5. aminosavait tartalmazza.
  2. 2. Az 1. igánypottt szerinti antitest, amely
    20 (a) gátolja a ΓNF-α termelődést;
    (b) gátolja a 'r~sejtprohferá.riőí;
    íe) gátolja a keratmoeiták probteráctójáí; és (d) gátolja az akti vált Imikomták kemofexlsát,
  3. 3. Az I. vagy & 2. igénypont szerinti afeifesi, amely nem kötődik a mutáns 11,-15 QIÖSS és
    25 DSSQ10SS fehérjékhez.
  4. 4 Az eiöz.ö igénypontok bármelyike szerinti antitest, amely a szekvetxi3í;srában SEQ ID No. 2, azonosítószámen megadott iunt-xísav-szek-venctát tartalmazó,. emberi nebézlánc variábilis régiót és a szekvemrialistában SEQ 113 No. 4. azonosítósz&moxs ntegaóoit atninosav-szekvenmá· tartalmazó, emberi könnyőtáoe variábilis régiót, vagy azok konzervatív szekvvndamódoskásaií tartalmazza.
    30 S. Az előző igénypontok bármelyike szerinti antitest, amely antitest IgGl. ígG2, IgCfe, l'gCfe, IgM.
    IgÁC l.gA2, IgAstx, IgD vagy IgE antitest.
    6, Az előző igénypontok bármelyike 'szerinti antitest, amely Igöi nebézláncot és x-kötinydláncot Wtalmag.
    7. A;z efezó Igéttyponiok bármelyike szeristi asttltesk atsiely teljes sotifest,, amkesí-feagöifeittím vagy 35 egyiáséő antitest,
    S. Az elózó igénypontok bármelyike szerinti antitest, amelyet emberi nebóziánc-transzgént ós emberi könnyőláne-transzgént tartalmazó genomó, h&ttszgéttiktt?, etttbettől különbőzé állatból előállított B-sejt és órökéieril sett ínziójat tartalmazó hibridóma vagy emberi nebézláoeot és ember! kSnoy&láoewt kődoki wkieotidszekvettriát iarfelmaző tmaszfektőtna fentiéi.
    40 9. Az előző IgósypotAők Amelyike szerinti amim stsfeiy ferislww áh áfeifesi: soilgfet kőtő .rá58 szét id. ό; ν/ύ·.·,< eljárás, amely T-sejtekben vagy tnonociíákhao, I1..-15 áltól, de nem az IE-2 által, indukált TNF-« 'termelődés gátlására szolgál. azsu/ yede??;esve, hogy az. lb-15-öt az 1-9. igény port tok bármelyike szerinti antitesttel érintkemtjük.
  5. 5 II. /« ví?,-<> eljárás 11..-.15 áltól, de ttem 0.-2 áh.sl indekál; T-sejtpreiiferáeiő gátlására uerzzí/kke/ezve, ncgy m 1 9 bítí^^Kiks5· ttó-'f'u*'» ^s'íttí^Ltí Ϊ6.'ϊ?'λ„.ΐ cí*r.»k2^i»'tií.i k l 2. A 11 igénypont szerint; eljárás, ahol a T-sejtek pertíériáhs vérbői szármázó monotntkteáris sejtek tFBMC-ks vagy CTLE-2 sejtek.
    1.3. Emberi tiehézlátie-íranszgént és emberi könnyöláne-ímn-zzgéns mrtólrmtzo grmötrtú, transz,gérbkus. 10 emberi ól különböző áiletbői előállított B-sejt és őrökéietú sej; fúzsójál tartóbtmzó bibridótitó, ahol a hibridőnm az 1-9. igénypontok bártnelyske szerint; antitestet termel.
    14, Emberi nalteidáosot ós emlteri kösnyőiáneot kódoló ítókfebtsavtikíd tartalmazó trasaztektőntó, ahol a teaw4Wő.tns az; 1-9, igóiwbntok Wmsiyike szerish aerikatből ktmwtbato nmsmyisdgdi temek
    15, A 14, igénypont szerinti.ttanszfektóma, ahol a aaktemvak a szokvenclalistábatt SEQ ID ko, 1,
    15 sportos kószámét! ntegodott saukleotidszekvenciat és a szekvencia listában SEQ lö No. 3. azonositöszámon megadott tmkteotidszekvenciá; vagy ezek konzervatív szék venriaetódositásah taítóitnttzzák.
    lő. Az. 1-8. igénypontok bármelyike szerinti antiteste; expressz.;; lő, ttasszgénskns, e;nber;ői különböző állat, amelynek genotnis emberi nebézláo.e-transzyérti és emberi könnsdliáne-ttanszgém tartalma?..
    17 Eljárás az T-9. igénypontok bármelyike szerinti antitest elöálihására omö//etteo?;trtóy hogy 2Ö emberi nehézláne-transzgém' és emberi könnyű láne-Ototazgónt tartóimazó eenomó, iraoszgótriktjs, etnberlől kteőobOz.0 álhitből izolált és emberi íl..-15-;ei vagy ember'- il.- :5-ot ezpmsszáiő sejttel ímmmhzáii Bsejfeket mlelőma .sejtekkel Ibztonáitmk emberi, 11,-15-re spedíikt:;;, monoklonális antitesteket szekretáló, , A', , n' tV vtó,! 0Ύ ías ,' ?bo , 'x bo χ <, ’kií is >'pj< >< m >, nt eS 's a hibriáóma-tenyészet leitUüsZójábó; izoláljak az IL-IS-m speeiískm:, emberi monoklonális timheste08 g»t
    18, Az 1-9. Igénypontok bármelyike szériái! sntitaslet, valamint terápiás ágenst tortalmazó immunkonjngálwt
    19, A lg. Igénypont szermti Imn’tíakonjngáítsíis, amelyben a terápiás ágens immuossuppressziv ágens, etlc’oxikos ágens vagy & következők köztll választott gyuitodásgsdó ágensek bármelyike: szteroid típusú
    30 aytilittdásizálló ágens, nem szteroid típusú gyulladásgátló ágens vagy DMAKi>
    20 Az 1-8. Igénypontok bármelyike szerint! antitestet és gyógyászét! szempontból eliogoáható hordozta iartóbnazó gyógyászati készítmény.
    IN A 2ö igénypont szerimi készítmény, amely terápiás ágenst is jartulmiu.
    22 A 21. igénypont szerin;! készítmény, ameiybes az ágens Immwmzuppressziv ágens; antitest. 35 osoíiasis kezeiésdre szolgáló ágens; a következők közül váissztoti eytdladástohiő ágorss sztereód típusú gyoTiodásgó-tlö ágens er netn s:ztere;d típusú gyttlktdásgállö ágetis; a következők közül választott DMARD tütóoS'eváf, etanereepi és it; isis kunk', vagy a következő kemoterápiás ágensek bármelyüké: doxorttbiéto.
    dszplailn, bieomicin, kennosztiti, eikiototszEmrid és kioromboeU.
    22. A 22, igénypont széria; 1 készítmény amelyben az srortmaszuppreasste ágens elktosporm 41) 24, A 2.3. leészypöní szerimi készítmény, amelyben az at-ílies; CDn-re specifikus ;mt;te»i vagy IL-li-re fesast,
    25, Αχ M. igénypontok bármelyiké sxeriats aotkest emfe test terápiás kezelésének eijfefefess tőrisse staammx&stss,
    2 b, Az í< ggfeifeok bátmelyike szerinti antitest alkalmazása peoriafe feritig gymilfeeos bél5 betegség» rák, tmafeeetáelOe kifekőslés vssgy fertőző betegség kezelésére vstgy megelőzésére szolgáló gyógyászati kfelméoy gyfeásfe
    22. A :2ő, igánygcast szerinti aikeimsfe, fel ex feriris festi asáx,
    2b, A 2b, vegy 27, igénypont sxesmti sdkabwfe fed a Ategség kezelése va^t megelőzése aragábsa foglalja ttzás lerilgtás bgétts bettdfe Is.
    W 2§. A 28, Igénypont széfet slkalmafe ahol a terápiás sw a 22-24. igazygzmtok bármelyike szerint de&mUt,
    20. Sijáfe 11,.-12 éled kézfeitert Ategségaek IL-15 fegés vagy O-fe-őt efeesszáiö sejt jeleolétáoek kitmtfesával történő dlagsmfezákásártf mnfeam amely elléms sosátt a festet és akotmstü sfetét áz .1-9, sgfegs« «tfe felefed olyas kérifenáaynk kőxákérialkexseífefe amely fertővé feszi, hogy ex 1L15 IS A sx felest Azon fegdsz zfedjos fes és fewbfe « kamglex fefeéfe fel tt komplex klalafeásáfe a feda és a fetroll mfe kOzöfri fedés ez 1L-12 jekmléfére fe a mitnéfe,
    21. IWter, amely ax K Igéttypsemk bfealyik® sxoferi felest variábilis Agiéjfe kődoíő oakteotifeekveoeMl tfefesaa,
    20 22, A 21, tfeygwi éfettit mátleiosav χ .sxskvefetOsfebmt OBQ ID No, 1, <ezortőstfőszfe«z megfen sfesfefe a xfeAwfeOsfebán S8Q 02 No. 2, temafeémfeoe megfest sfeverssla, va^y ezek kottfe'fef v szeksmaekenbdosiiásal közti S választan otskfetrtiriátekvmsefet tartalmaz,
    22. Bapzassfes vekfe amely az K igfegafek bármelyike széfet antitest feeylBfefelg naifefefek vagy nehéz- és kfefefefek variábilis régióját kétfelé sfefefeefefeét tartalma^ fel a
    25 kfeyldfe rrnkkfedexekvefea a mzfeerfeltslfen SEQ 02 No, 3. ttxomfefeáomn saegfeit mfeösav» saekveaeiát mrixlmaz» és a rtehéxlám; onkleotiriszakveoela a szeksvfexlrifáfe ®Q ID Nő, l, aaxteosliőszámon megadott aodóosav-azeksametát tartalmaz,
    24. A 23, igénypont szeriről exptwxfes vetet htriafetxő nmzszlékiőma,
HU0402653A 2001-08-23 2002-08-23 Interleukin 15-re (IL-15-re) specifikus emberi antitestek HU229776B1 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31473101P 2001-08-23 2001-08-23
PCT/US2002/026769 WO2003017935A2 (en) 2001-08-23 2002-08-23 Human antibodies specific for interleukin 15 (il-15)

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0402653A2 HUP0402653A2 (hu) 2005-03-29
HUP0402653A3 HUP0402653A3 (en) 2010-01-28
HU229776B1 true HU229776B1 (hu) 2014-07-28

Family

ID=23221192

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0402653A HU229776B1 (hu) 2001-08-23 2002-08-23 Interleukin 15-re (IL-15-re) specifikus emberi antitestek

Country Status (25)

Country Link
US (1) US7153507B2 (hu)
EP (1) EP1425389B1 (hu)
JP (2) JP4359503B2 (hu)
KR (1) KR100911951B1 (hu)
CN (1) CN100557018C (hu)
AT (1) ATE531390T1 (hu)
AU (1) AU2002332628B2 (hu)
BR (1) BR0212136A (hu)
CA (1) CA2456648C (hu)
CY (1) CY1112447T1 (hu)
DK (1) DK1425389T3 (hu)
EA (1) EA014802B1 (hu)
ES (1) ES2375271T3 (hu)
HK (1) HK1066828A1 (hu)
HU (1) HU229776B1 (hu)
IL (2) IL160358A0 (hu)
MX (1) MXPA04001486A (hu)
NO (1) NO333152B1 (hu)
NZ (1) NZ531211A (hu)
PL (1) PL217752B1 (hu)
PT (1) PT1425389E (hu)
RS (1) RS51829B (hu)
SI (1) SI1425389T1 (hu)
WO (1) WO2003017935A2 (hu)
ZA (1) ZA200401144B (hu)

Families Citing this family (269)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2385745C (en) 2001-06-08 2015-02-17 Abbott Laboratories (Bermuda) Ltd. Methods of administering anti-tnf.alpha. antibodies
US7329405B2 (en) 2001-08-23 2008-02-12 Genmab A/S Human antibodies specific for interleukin 15 (IL-15)
JP4359503B2 (ja) 2001-08-23 2009-11-04 ゲンマブ エー／エス インターロイキン１５（ｉｌ−１５）に特異的なヒト抗体
US7247304B2 (en) * 2001-08-23 2007-07-24 Genmab A/S Methods of treating using anti-IL-15 antibodies
GB0208817D0 (en) * 2002-04-17 2002-05-29 European Molecular Biology Lab Embl Method for producing monoclonal antibodies
US8715664B2 (en) 2005-05-16 2014-05-06 Abbvie Biotechnology Ltd. Use of human TNFα antibodies for treatment of erosive polyarthritis
RS20050724A (en) * 2003-02-26 2007-11-15 Genmab A/S., Human antibodies specific for interleukin 15(il-15)
NZ570709A (en) 2003-06-13 2010-04-30 Univ Pennsylvania Nucleic acid sequences encoding and compositions comprising IgE signal peptide and/or IL-15 and methods for using the same
US20050123542A1 (en) * 2003-11-06 2005-06-09 Genmab A/S Methods for treating disorders involving monocytes
NZ554520A (en) * 2004-10-22 2010-03-26 Amgen Inc Methods for refolding of recombinant antibodies
JP2008523132A (ja) * 2004-12-13 2008-07-03 サイトス バイオテクノロジー アーゲー Ｉｌ−１５抗原アレイとその使用法
MX2007015476A (es) 2005-06-14 2008-02-25 Amgen Inc Formulaciones de proteina autoamortiguadoras.
US20070190057A1 (en) * 2006-01-23 2007-08-16 Jian Wu Methods for modulating mannose content of recombinant proteins
US9399061B2 (en) * 2006-04-10 2016-07-26 Abbvie Biotechnology Ltd Methods for determining efficacy of TNF-α inhibitors for treatment of rheumatoid arthritis
US9605064B2 (en) 2006-04-10 2017-03-28 Abbvie Biotechnology Ltd Methods and compositions for treatment of skin disorders
US20080131374A1 (en) * 2006-04-19 2008-06-05 Medich John R Uses and compositions for treatment of rheumatoid arthritis
JP2010518115A (ja) 2007-02-09 2010-05-27 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗Ｒｏｂｏ４抗体およびそれらのための使用
WO2008154543A2 (en) 2007-06-11 2008-12-18 Abbott Biotechnology Ltd. Methods for treating juvenile idiopathic arthritis
JP5570989B2 (ja) * 2007-08-31 2014-08-13 アムジエン・インコーポレーテツド 固体タンパク質製剤
CA2698809C (en) * 2007-09-14 2023-10-17 Amgen Inc. Homogeneous antibody populations
AU2008304111B2 (en) 2007-09-27 2014-04-24 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
EP3381445B1 (en) 2007-11-15 2023-10-25 Amgen Inc. Aqueous formulation of antibody stablised by antioxidants for parenteral administration
TWI580694B (zh) 2007-11-30 2017-05-01 建南德克公司 抗-ｖｅｇｆ抗體
EP2098536A1 (en) 2008-03-05 2009-09-09 4-Antibody AG Isolation and identification of antigen- or ligand-specific binding proteins
CA2717905A1 (en) * 2008-03-24 2009-10-01 Abbott Biotechnology Ltd. Methods and compositions for treating bone loss
CU23716A1 (es) 2008-09-30 2011-10-05 Ct Ingenieria Genetica Biotech Péptido antagonista de la actividad de la interleucina-15
UA109633C2 (uk) 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
WO2011014457A1 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Genentech, Inc. Combination treatments
DK2473522T3 (en) 2009-09-02 2016-11-28 Genentech Inc Smoothened MUTANT AND METHODS OF USING THE SAME
WO2011050333A1 (en) 2009-10-23 2011-04-28 Amgen Inc. Vial adapter and system
ES2565208T3 (es) 2009-12-11 2016-04-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos anti-VEGF-C y métodos de uso de los mismos
CN107095846A (zh) 2009-12-21 2017-08-29 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗体配制剂
WO2011156373A1 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Amgen Inc. Drug delivery device
LT2580243T (lt) 2010-06-09 2020-01-27 Genmab A/S Antikūnai prieš žmogaus cd38
ES2647388T3 (es) 2010-06-15 2017-12-21 Genmab A/S Conjugados farmacológicos de anticuerpos humanos contra factor tisular
EP2625197B1 (en) 2010-10-05 2016-06-29 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
AU2012236573B2 (en) 2011-03-31 2016-06-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
EP2699293B8 (en) 2011-04-20 2022-07-20 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
CN102250243B (zh) * 2011-07-01 2013-08-28 华绍炳 抗白细胞介素-15抗体
EP2734538B2 (en) * 2011-07-18 2024-07-03 IBA Lifesciences GmbH Method of reversibly staining a target cell
US9987428B2 (en) 2011-10-14 2018-06-05 Amgen Inc. Injector and method of assembly
WO2014081780A1 (en) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc. Drug delivery device
DK2958941T3 (da) * 2013-02-20 2019-06-24 Innate Pharma Forbindelse, der binder specifikt til kir3dl2, til anvendelse til behandling af perifert t-cellelymfom
US10653779B2 (en) 2013-03-13 2020-05-19 Genentech, Inc. Formulations with reduced oxidation
CN110538322A (zh) 2013-03-13 2019-12-06 豪夫迈·罗氏有限公司 抗体配制剂
IL269947B (en) 2013-03-13 2022-08-01 Genentech Inc The compounds with reduced oxidation
HUE049707T2 (hu) 2013-03-13 2020-11-30 Hoffmann La Roche Csökkent oxidációjú kiszerelések
US20140314778A1 (en) 2013-03-13 2014-10-23 Genentech, Inc. Formulations with reduced oxidation
EP2968760B1 (en) 2013-03-15 2024-01-03 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
CN105121628B (zh) 2013-03-15 2020-03-24 豪夫迈·罗氏有限公司 具有抗氧化剂的细胞培养组合物和多肽生产方法
US10492990B2 (en) 2013-03-15 2019-12-03 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
WO2014149357A1 (en) 2013-03-22 2014-09-25 Amgen Inc. Injector and method of assembly
EP3049441B1 (en) 2013-09-27 2019-11-27 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-pdl1 antibody formulations
US11097055B2 (en) 2013-10-24 2021-08-24 Amgen Inc. Injector and method of assembly
EP3957345A1 (en) 2013-10-24 2022-02-23 Amgen, Inc Drug delivery system with temperature-sensitive control
CN105899535A (zh) 2013-12-17 2016-08-24 豪夫迈·罗氏有限公司 用pd-1轴结合拮抗剂和抗cd20抗体治疗癌症的方法
NZ720515A (en) 2013-12-17 2022-12-23 Genentech Inc Methods of treating cancers using pd-1 axis binding antagonists and taxanes
MX2016007965A (es) 2013-12-17 2016-10-28 Genentech Inc Terapia de combinacion que comprende agonistas de union a ox40 y antagonistas de union al eje pd-1.
US20170044232A1 (en) 2014-02-04 2017-02-16 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
JP6588461B2 (ja) 2014-03-31 2019-10-09 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗血管新生剤及びｏｘ４０結合アゴニストを含む併用療法
SG11201609219QA (en) 2014-05-07 2016-12-29 Amgen Inc Autoinjector with shock reducing elements
US10646652B2 (en) 2014-06-03 2020-05-12 Amgen Inc. Controllable drug delivery system and method of use
EP2963057A1 (en) 2014-07-02 2016-01-06 Calypso Biotech SA Antibodies to IL-15
AU2015318001B2 (en) 2014-09-15 2021-03-25 Genentech, Inc. Antibody formulations
MX2021014323A (es) 2014-10-14 2023-02-02 Amgen Inc Dispositivo de inyección de fármaco con indicadores visuales y audibles.
MA54716A (fr) 2014-10-23 2021-11-17 Amgen Inc Réduction de la viscosité de formulations pharmaceutiques
BR112017010198A2 (pt) 2014-11-17 2017-12-26 Genentech Inc terapia de combinação compreendendo agonistas de ligação a ox40 e antagonistas de ligação ao eixo de pd-1
JP6716566B2 (ja) 2014-12-19 2020-07-01 アムジエン・インコーポレーテツド 近接センサ付き薬物送達装置
WO2016100055A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
CN107636170A (zh) 2015-02-04 2018-01-26 健泰科生物技术公司 突变型Smoothened及其使用方法
MX2017010466A (es) 2015-02-17 2018-06-06 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos con sujecion asistida de vacio y/o respuestas.
WO2016138434A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
AU2016280070B2 (en) 2015-06-17 2022-09-15 Genentech, Inc. Methods of treating locally advanced or metastatic breast cancers using PD-1 axis binding antagonists and taxanes
JOP20200312A1 (ar) 2015-06-26 2017-06-16 Novartis Ag الأجسام المضادة للعامل xi وطرق الاستخدام
TW202340452A (zh) 2015-08-04 2023-10-16 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
SI3334747T1 (sl) 2015-08-13 2024-02-29 Amgen Inc. Globinsko nabito filtriranje proteinov, ki vežejo antigen
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
US11351308B2 (en) 2015-12-09 2022-06-07 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
JP7008023B2 (ja) 2015-12-30 2022-01-25 ジェネンテック， インコーポレイテッド 低減されたポリソルベート分解を有する製剤
AU2016381694A1 (en) 2015-12-30 2018-07-05 Genentech, Inc. Use of tryptophan derivatives for protein formulations
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
AU2017205089B2 (en) 2016-01-08 2023-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of treating CEA-positive cancers using PD-1 axis binding antagonists and anti-CEA/anti-CD3 bispecific antibodies
AU2017213826A1 (en) 2016-02-04 2018-08-23 Curis, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
ES2814287T3 (es) 2016-03-15 2021-03-26 Amgen Inc Reducir la probabilidad de rotura de cristal en dispositivos de administración de fármaco
US11767362B1 (en) 2016-03-15 2023-09-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of treating cancers using PD-1 axis binding antagonists and anti-GPC3 antibodies
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
MX2018013616A (es) 2016-05-13 2019-02-21 Amgen Inc Montaje de cubierta protectora de vial.
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
TW201802121A (zh) 2016-05-25 2018-01-16 諾華公司 抗因子XI/XIa抗體之逆轉結合劑及其用途
WO2017209899A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
US20180002417A1 (en) 2016-06-15 2018-01-04 Celimmune Llc Methods and Compositions for the Treatment of Celiac Disease, Non-Celiac Gluten Sensitivity, and Refractory Celiac Disease
EP3478342A1 (en) 2016-07-01 2019-05-08 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
CN109476748B (zh) 2016-08-08 2023-05-23 豪夫迈·罗氏有限公司 用于癌症的治疗和诊断方法
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
WO2018067987A1 (en) 2016-10-06 2018-04-12 Amgen Inc. Reduced viscosity protein pharmaceutical formulations
CN114917185B (zh) 2016-10-21 2023-11-14 美国安进公司 药物配制品及其制备方法
EP3532127A1 (en) 2016-10-25 2019-09-04 Amgen Inc. On-body injector
PE20191497A1 (es) 2016-12-21 2019-10-21 Cephalon Inc Anticuerpos que se unen especificamente a il-15 humana y usos de estos
CA3048156A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Novartis Ag Factor xi antibodies and methods of use
JP2020503976A (ja) 2017-01-17 2020-02-06 アムジエン・インコーポレーテツド 注入デバイスならびに関連する使用および組立方法
AU2018220538B2 (en) 2017-02-17 2023-12-14 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
JP7280189B2 (ja) 2017-02-17 2023-05-23 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達装置用の挿入機構
JP2020508803A (ja) 2017-03-06 2020-03-26 アムジエン・インコーポレーテツド 作動防止特徴部を備える薬物送達デバイス
EP3592402A1 (en) 2017-03-07 2020-01-15 Amgen Inc. Needle insertion by overpressure
IL303449B2 (en) 2017-03-09 2024-08-01 Amgen Inc Insertion mechanism for a drug delivery device
SI3600491T1 (sl) 2017-03-28 2023-11-30 Amgen Inc. Sistem in postopek za sestavljanja droga bata in brizge
AU2018257917B2 (en) 2017-04-24 2023-05-04 University Of Massachusetts Diagnosis and treatment of vitiligo
US20200048367A1 (en) 2017-04-28 2020-02-13 Amgen Inc. N-acetylated and non-acetylated dipeptides containing arginine to reduce the viscosity of viscous compositions of therapeutic polypeptides
WO2018226515A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
AU2018282077B2 (en) 2017-06-08 2023-11-23 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
EP3641857A1 (en) 2017-06-22 2020-04-29 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
MX2019015479A (es) 2017-06-23 2020-02-20 Amgen Inc Dispositivo electronico de administracion de farmacos con tapa accionada por un conjunto de conmutador.
JP7408398B2 (ja) 2017-07-14 2024-01-05 アムジエン・インコーポレーテツド 二重ねじりばねシステムを有する針挿入後退システム
EP3655063A1 (en) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc. Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly
WO2019022951A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE WITH GEAR MODULE AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
EP3658206A1 (en) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc. Drug delivery device with container access system and related method of assembly
CN110869768B (zh) 2017-08-01 2023-11-21 安进公司 实时制备用于质谱分析的多肽样品的系统和方法
WO2019028191A1 (en) 2017-08-01 2019-02-07 Amgen Inc. SYSTEMS AND METHODS FOR PERFORMING REAL-TIME GLYCAN ASSAY OF A SAMPLE
US20200164155A1 (en) 2017-08-09 2020-05-28 Amgen Inc. Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system
WO2019036181A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Amgen Inc. BODY INJECTOR WITH STERILE ADHESIVE PATCH
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
ES2939292T3 (es) 2017-10-04 2023-04-20 Amgen Inc Adaptador de flujo para dispositivo de administración de fármacos
WO2019070552A1 (en) 2017-10-06 2019-04-11 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A LOCKOUT ASSEMBLY AND ASSOCIATED ASSEMBLY METHOD
IL273323B1 (en) 2017-10-09 2024-06-01 Amgen Inc Drug delivery device with drive assembly and related assembly method
EP3703779A1 (en) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc. Systems and approaches for sterilizing a drug delivery device
US20200261648A1 (en) 2017-11-06 2020-08-20 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
US12053618B2 (en) 2017-11-06 2024-08-06 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
EP3706826A1 (en) 2017-11-10 2020-09-16 Amgen Inc. Plungers for drug delivery devices
CA3084486A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Amgen Inc. Autoinjector with stall and end point detection
CA3079540A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Amgen Inc. Door latch mechanism for drug delivery device
MA51617A (fr) 2018-01-17 2020-11-25 Amgen Inc Mécanisme d'administration de médicament
WO2019173026A1 (en) 2018-03-07 2019-09-12 Amgen Inc. Controlled dispense syringe
WO2019173785A1 (en) 2018-03-09 2019-09-12 Amgen Inc. Backflow prevention mechanism for drug delivery device
EP4321870A3 (en) 2018-03-13 2024-04-03 Amgen Inc. Methods for the preparation of trypsin-resistant polypeptides for mass spectrometric analysis
MA52015A (fr) 2018-03-13 2021-01-20 Amgen Inc Digestion séquentielle de polypeptides pour une analyse par spectrométrie de masse
SG11202007756XA (en) 2018-03-30 2020-09-29 Amgen Inc Camera-based drug container inspection
US11583633B2 (en) 2018-04-03 2023-02-21 Amgen Inc. Systems and methods for delayed drug delivery
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
CA3103017A1 (en) 2018-06-23 2019-12-26 Genentech, Inc. Methods of treating lung cancer with a pd-1 axis binding antagonist, a platinum agent, and a topoisomerase ii inhibitor
WO2020018789A1 (en) 2018-07-18 2020-01-23 Genentech, Inc. Methods of treating lung cancer with a pd-1 axis binding antagonist, an antimetabolite, and a platinum agent
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
CN112469454B (zh) 2018-07-24 2024-01-26 安进公司 用于施用药物的输送装置
US20210228815A1 (en) 2018-07-24 2021-07-29 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
MX2021000749A (es) 2018-07-24 2021-03-29 Amgen Inc Dispositivos de suministro para administrar farmacos.
WO2020028009A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
CA3106537A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Genentech, Inc. Use of tryptophan derivatives and l-methionine for protein formulation
EP3836988A1 (en) 2018-08-17 2021-06-23 Amgen Inc. Activation mechanism for drug delivery device
EP3857230B1 (en) 2018-09-21 2023-06-07 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnostic methods for triple-negative breast cancer
US20210346601A1 (en) 2018-09-24 2021-11-11 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
AU2019350660A1 (en) 2018-09-28 2021-03-18 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
CA3110529A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
AU2019355979A1 (en) 2018-10-05 2021-03-18 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
CA3112355A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Amgen Inc. Drug delivery device having damping mechanism
EA202191038A1 (ru) 2018-10-15 2021-07-06 Эмджен Инк. Способ платформенной сборки для устройства доставки лекарственного средства
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
EP3873563A1 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
MA54048A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament avec rétraction partielle de l'organe d'administration de médicament
WO2020124008A1 (en) 2018-12-14 2020-06-18 Amgen Inc. System suitability method for use with protein concentration determination by slope
US11534547B2 (en) 2019-01-24 2022-12-27 Amgen Inc. Drug delivery systems and methods with pressure sensitive control
JP7483723B2 (ja) 2019-01-24 2024-05-15 アムジエン・インコーポレーテツド 背圧検知による薬剤送達のシステム及び方法
EP3924015A1 (en) 2019-02-12 2021-12-22 Amgen Inc. Dosing systems and approaches
WO2020167702A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 Amgen Inc. Take-home drug delivery system
WO2020167704A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 Amgen Inc. Continuous dosing systems and approaches
WO2020167910A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 Amgen Inc. Systems and approaches for drug delivery device reconstitution
EP3924019A1 (en) 2019-02-12 2021-12-22 Amgen Inc. Continuous dosing systems and approaches
EP3924018A1 (en) 2019-02-12 2021-12-22 Amgen Inc. Continuous dosing systems and approaches
EP3924083B1 (en) 2019-02-14 2024-05-15 Amgen Inc. Systems and methods for preparing a sample and performing a real-time assay of the sample
EP3928101A1 (en) 2019-02-20 2021-12-29 Amgen Inc. Methods of determining protein stability
WO2020180967A1 (en) 2019-03-04 2020-09-10 Amgen Inc. In vivo reversibility of high molecular weight species
AU2020245573A1 (en) 2019-03-27 2021-09-30 Amgen Inc. Methods of fingerprinting therapeutic proteins via a two-dimensional (2D) nuclear magnetic resonance technique at natural abundance for formulated biopharmaceutical products
EP3952950A1 (en) 2019-04-08 2022-02-16 Amgen Inc. Automated drug delivery device and container
US20220143319A1 (en) 2019-04-09 2022-05-12 Amgen Inc. Drug delivery device with smart grip
WO2020214492A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 Amgen Inc. Cassette for an autoinjector and related methods
AU2020263289A1 (en) 2019-04-24 2021-09-16 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
US20220152304A1 (en) 2019-04-24 2022-05-19 Amgen Inc. Injector accessories
MA56121A (fr) 2019-06-05 2022-04-13 Amgen Inc Procédés d'identification d'attributs de protéines thérapeutiques
CN114341189A (zh) 2019-06-12 2022-04-12 奥美药业有限公司 全新il-15前药及其应用
CN114007672A (zh) 2019-06-20 2022-02-01 美国安进公司 支持无线通信的药物递送装置和方法
US20220362474A1 (en) 2019-07-18 2022-11-17 Amgen Inc. Drug delivery device having pressurized vessel
US20220249778A1 (en) 2019-07-18 2022-08-11 Amgen Inc. Sealing arrangement for drug delivery device
MX2022001112A (es) 2019-08-01 2022-02-16 Amgen Inc Dispositivo de suministro de farmacos con medicion de la temperatura y metodo relacionado.
CA3148261A1 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
WO2021046070A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Amgen Inc. Injection device for drug delivery and packaging for the injection device
EP4025276A1 (en) 2019-09-03 2022-07-13 Amgen Inc. Activatable injection device for drug delivery
EP4028078A1 (en) 2019-09-12 2022-07-20 Amgen Inc. Backflow prevention mechanism for drug delivery device
AU2020348947A1 (en) 2019-09-16 2022-03-10 Amgen Inc. Method for external sterilization of drug delivery device
CA3152549A1 (en) 2019-09-30 2021-04-08 Amgen Inc. Drug delivery device
CA3155062A1 (en) 2019-09-30 2021-04-08 Amgen Inc. Drug delivery device
US20210093792A1 (en) 2019-09-30 2021-04-01 Amgen Inc. Drug delivery device and methods of delivering a drug
CN118161706A (zh) 2019-09-30 2024-06-11 美国安进公司 药物递送装置
WO2021067208A1 (en) 2019-09-30 2021-04-08 Amgen Inc. Drug delivery device
BR112022005996A2 (pt) 2019-09-30 2022-07-12 Amgen Inc Dispositivo de administração de fármaco
WO2021071780A1 (en) 2019-10-07 2021-04-15 Amgen Inc. Drug delivery devices having light-activated ultrasonic fluid delivery
US20220355025A1 (en) 2019-10-07 2022-11-10 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
US20220362484A1 (en) 2019-10-07 2022-11-17 Amgen Inc. Drug delivery device
EP4041649A1 (en) 2019-10-07 2022-08-17 Amgen Inc. Packages for pharmaceutical products and methods of assembly
AU2020362062A1 (en) 2019-10-08 2022-03-17 Amgen Inc. Temperature indicator for drug delivery device
WO2021071917A1 (en) 2019-10-08 2021-04-15 Amgen Inc. Cassette for an autoinjector and related methods
EP4041345A1 (en) 2019-10-08 2022-08-17 Amgen Inc. Drug delivery device
US20240100247A1 (en) 2019-10-08 2024-03-28 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
WO2021076540A1 (en) 2019-10-18 2021-04-22 Amgen Inc. Drug delivery device and system
AU2020368455A1 (en) 2019-10-18 2022-04-07 Amgen Inc. Systems and approaches for drug delivery device reconstitution
US20240091440A1 (en) 2019-10-18 2024-03-21 Amgen Inc. Drug delivery device and system
CA3153762A1 (en) 2019-10-18 2021-04-22 Amgen Inc. Systems and approaches for drug delivery device reconstitution
US20220401643A1 (en) 2019-10-21 2022-12-22 Amgen Inc. Drug product container and drug delivery system
WO2021081283A1 (en) 2019-10-24 2021-04-29 Amgen Inc. Drug delivery device
MX2022004943A (es) 2019-10-24 2022-05-16 Amgen Inc Sistemas y enfoques para la administracion de farmacos.
US20220387700A1 (en) 2019-10-24 2022-12-08 Amgen Inc. Systems and methods for drug delivery
EP4048345A1 (en) 2019-10-24 2022-08-31 Amgen, Inc Drug delivery device and system
US20220378657A1 (en) 2019-10-24 2022-12-01 Amgen Inc. Systems and components for drug delivery and components for preparation of the same
EP4054673A1 (en) 2019-11-07 2022-09-14 Amgen Inc. Drug delivery system and method of use
US20230001099A1 (en) 2019-12-02 2023-01-05 Amgen Inc. Lockout mechanism for drug delivery device
WO2021113070A1 (en) 2019-12-05 2021-06-10 Amgen Inc, Flow restrictor for drug delivery device
AU2021205981A1 (en) 2020-01-11 2022-07-14 AskGene Pharma, Inc. Novel masked cytokines and methods of use thereof
CN114901330A (zh) 2020-01-13 2022-08-12 美国安进公司 针头护罩移除器、药物递送装置、以及相关方法
WO2021173603A1 (en) 2020-02-24 2021-09-02 Amgen Inc. Containers and systems for use during external sterilization of drug delivery devices
WO2021188223A1 (en) 2020-03-16 2021-09-23 Amgen Inc. Drug delivery member insertion sensing assemblies, drug delivery devices, and related methods
CA3170808A1 (en) 2020-03-17 2021-09-23 Amgen Inc. Controlled dispense syringe
US20230135301A1 (en) 2020-04-28 2023-05-04 Amgen Inc. Packaging label
MX2022014688A (es) 2020-05-22 2022-12-16 Amgen Inc Sistema de almacenamiento y metodo para almacenar y transportar medicamentos.
AU2021293038A1 (en) 2020-06-16 2023-02-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and compositions for treating triple-negative breast cancer
WO2022051445A1 (en) 2020-09-02 2022-03-10 Amgen Inc. Easy open apparatus for medicament storage carton
EP4210805A1 (en) 2020-09-09 2023-07-19 Amgen Inc. Swallowable drug delivery devices
WO2022055761A1 (en) 2020-09-11 2022-03-17 Amgen Inc. Inline uv flow device for sterilizing flow cytometry sheath fluid
CA3195365A1 (en) 2020-09-18 2022-03-24 Amgen Inc. Methods of processing a sample for peptide mapping analysis
JP2023545425A (ja) 2020-10-12 2023-10-30 アムジエン・インコーポレーテツド 長期薬剤保管装置及び方法
JP2023549083A (ja) 2020-11-04 2023-11-22 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスアセンブリ及び薬物送達デバイス用アクセサリ
JP2023549088A (ja) 2020-11-04 2023-11-22 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスアセンブリ及び薬物送達デバイスのためのアクセサリ
EP4240448A1 (en) 2020-11-04 2023-09-13 Amgen Inc. Drug delivery device assembly and accessory for drug delivery device
US20230381426A1 (en) 2020-11-04 2023-11-30 Amgen Inc. Drug delivery device assembly and accessory for drug delivery device
EP4240747A1 (en) 2020-11-05 2023-09-13 Amgen Inc. Materials and methods for protein processing
US20240115462A1 (en) 2021-02-03 2024-04-11 Amgen Inc. High-throughput automated reconstitution of lyophilized drug product
US20240082110A1 (en) 2021-02-03 2024-03-14 Amgen Inc. Coaxial needle adapter and guide bracket for robotic liquid handling platform
CN116782993A (zh) 2021-02-03 2023-09-19 美国安进公司 用于药物加工的系统和方法
EP4304683A1 (en) 2021-03-08 2024-01-17 Amgen Inc. Manufacturing process for hollow plunger rod
CA3209084A1 (en) 2021-03-10 2022-09-15 Amgen Inc. Drug delivery device
CN116963793A (zh) 2021-03-10 2023-10-27 美国安进公司 药物递送装置、用于药物递送装置的子组件、注射器保持器以及组装方法
IL305212A (en) 2021-03-10 2023-10-01 Amgen Inc A drug delivery device with a removable cap
BR112023019565A2 (pt) 2021-03-25 2023-11-14 Amgen Inc Dispositivo de administração de fármacos
IL305701A (en) 2021-03-31 2023-11-01 Amgen Inc A sound-detection-based injection time measurement system for drug delivery devices
AU2022261835A1 (en) 2021-04-22 2023-08-31 Amgen Inc. Methods and systems for automated syringe quality evaluation
US20240197989A1 (en) 2021-04-28 2024-06-20 Amgen Inc. Systems for out-patient treatment of a patient, and related methods
EP4341945A1 (en) 2021-05-17 2024-03-27 Amgen Inc. Feedback system and method for a drug product
US20240208680A1 (en) 2021-05-21 2024-06-27 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
EP4348141A1 (en) 2021-06-01 2024-04-10 Amgen Inc. Lyophilization system
WO2022260925A1 (en) 2021-06-08 2022-12-15 Amgen Inc. Drug delivery devices, finger-grip elements, and related methods
WO2022266272A1 (en) 2021-06-17 2022-12-22 Amgen Inc. Drug delivery device having shock absorber
AU2022296519A1 (en) 2021-06-23 2024-01-18 Amgen Inc. Syringes, assemblies, and methods of manufacture
US20240269380A1 (en) 2021-06-28 2024-08-15 Amgen Inc. Safety device for drug delivery system
WO2023287562A1 (en) 2021-07-16 2023-01-19 Amgen Inc. Systems and approaches for drug processing single-use hardware
AU2022356197A1 (en) 2021-09-29 2024-02-08 Amgen Inc. Apparatuses, systems and methods for plunger-stopper depth measurement in pre-filled syringes
TW202322863A (zh) 2021-10-06 2023-06-16 美商安進公司 用於藥物遞送裝置的衝擊啟動式制動特徵
AU2022359717A1 (en) 2021-10-06 2024-04-04 Amgen Inc. Impact activated retention feature for drug delivery device
EP4415780A1 (en) 2021-10-11 2024-08-21 Amgen Inc. Characterization apparatus for drug delivery devices or subcomponents thereof
WO2023081324A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Amgen Inc. Drug delivery devices, components for use within drug delivery devices
AU2022388727A1 (en) 2021-11-09 2024-05-16 Amgen Inc. Production of therapeutic proteins
TW202335693A (zh) 2021-11-29 2023-09-16 美商安進公司 活塞桿移除力方法及設備
TW202335692A (zh) 2021-12-03 2023-09-16 美商安進公司 注射器中的塞子放置
AU2023231110A1 (en) 2022-03-11 2024-08-15 Amgen Inc. Adjustable depth autoinjector
WO2023196111A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Amgen Inc. Packaging for drug delivery device
WO2024028448A1 (en) 2022-08-04 2024-02-08 Calypso Biotech Sa Il-15 inhibitors useful for the treatment of atopic dermatitis
WO2024040020A1 (en) 2022-08-15 2024-02-22 Absci Corporation Quantitative affinity activity specific cell enrichment
WO2024039575A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Amgen Inc. Needle shield for syringe
WO2024039707A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Amgen Inc. Needle shield assembly for a syringe
WO2024049793A1 (en) 2022-08-30 2024-03-07 Amgen Inc. System and method of limiting subvisible particles in a syringe
CN117209605B (zh) * 2023-11-09 2024-01-30 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 特异性结合il-15的抗体及其应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991010741A1 (en) * 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6255458B1 (en) * 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5574138A (en) 1993-03-08 1996-11-12 Immunex Corporation Epithelium-derived T-cell factor
US5591630A (en) * 1994-05-06 1997-01-07 Immunex Corporation Monoclonal antibodies that bind interleukin-15 receptors
US5795966A (en) 1995-02-22 1998-08-18 Immunex Corp Antagonists of interleukin-15
US6258352B1 (en) 1995-04-02 2001-07-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Compositions and methods of treating thrombocytopenia with IL-15
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5660824A (en) 1995-05-24 1997-08-26 Grabstein; Kenneth H. Muscle trophic factor
EP0927254B1 (en) 1996-04-26 2005-06-22 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Antagonists of interleukin-15
PT932417E (pt) 1996-10-17 2003-07-31 Immunomedics Inc Conjugado de toxina nao antigenico e proteina de fusao de sistema receptor de interiorizacao
DK1273304T4 (da) 1997-02-21 2009-08-31 Amgen Inc Anvendelse af interleukin-15
AU6118998A (en) * 1997-02-28 1998-09-18 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Pluripotent cells having disrupted intrinsic genes
GB9814892D0 (en) 1998-07-10 1998-09-09 Kennedy Rheumatology Inst Treatment of celiac disease
AU6689700A (en) 1999-07-06 2001-01-22 Silvia Bulfone-Paus Method of treating psoriasis with il-15 antagonist
JP4359503B2 (ja) 2001-08-23 2009-11-04 ゲンマブ エー／エス インターロイキン１５（ｉｌ−１５）に特異的なヒト抗体

Also Published As

Publication number Publication date
DK1425389T3 (da) 2012-01-30
EP1425389A4 (en) 2007-08-01
NZ531211A (en) 2007-04-27
IL160358A0 (en) 2004-07-25
KR100911951B1 (ko) 2009-08-13
PL371946A1 (en) 2005-07-11
ZA200401144B (en) 2005-05-12
NO20040752L (no) 2004-04-24
ES2375271T3 (es) 2012-02-28
PT1425389E (pt) 2012-02-07
CA2456648A1 (en) 2003-03-06
JP2009256354A (ja) 2009-11-05
EP1425389A2 (en) 2004-06-09
BR0212136A (pt) 2004-12-07
CA2456648C (en) 2011-08-16
CN1571836A (zh) 2005-01-26
JP4359503B2 (ja) 2009-11-04
WO2003017935A3 (en) 2003-08-14
HUP0402653A3 (en) 2010-01-28
US20030138421A1 (en) 2003-07-24
PL217752B1 (pl) 2014-08-29
NO333152B1 (no) 2013-03-18
CY1112447T1 (el) 2015-12-09
CN100557018C (zh) 2009-11-04
EP1425389B1 (en) 2011-11-02
YU15104A (sh) 2006-08-17
ATE531390T1 (de) 2011-11-15
HK1066828A1 (en) 2005-04-01
AU2002332628B2 (en) 2007-07-26
KR20040047796A (ko) 2004-06-05
US7153507B2 (en) 2006-12-26
EA200400345A1 (ru) 2004-12-30
WO2003017935A2 (en) 2003-03-06
EA014802B1 (ru) 2011-02-28
HUP0402653A2 (hu) 2005-03-29
MXPA04001486A (es) 2004-10-27
JP2005503151A (ja) 2005-02-03
RS51829B (sr) 2012-02-29
IL160358A (en) 2010-12-30
SI1425389T1 (sl) 2012-02-29
WO2003017935A9 (en) 2003-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU229776B1 (hu) Interleukin 15-re (IL-15-re) specifikus emberi antitestek
TW213486B (hu)
CN103957935B (zh) 抗cgrp或抗cgrp‑r抗体或抗体片段用于治疗或预防慢性和急性形式的腹泻的用途
CN102316897B (zh) Notch结合剂和拮抗剂及其应用方法
DE69734109T2 (de) Humanisierung von anti-carcinoembryonalen Antigen anti-idiotypischen Antikörper und dessen Verwendung als Tumorvakzin und zur Markierung
DE60127143T2 (de) Bispezifische Antikörper gegen CD19 und CD16 und deren Verwendung
DE60317677T2 (de) Ox40 (=cd134) rezeptor agonisten und therapeutische verwendung
DE69531148T2 (de) Bibliotheken aus polyklonalen antikörpern
CN102209556B (zh) 改良的抗cd19抗体
HU230586B1 (hu) Anti-ErbB antitest/maytansinoid konjugátumok alkalmazása rákos betegségek kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására
CN103709250B (zh) 抗cd20的人单克隆抗体
CN100497389C (zh) 表皮生长因子受体(egfr)的人单克隆抗体
CN112125915A (zh) 一种喜树碱衍生物及其偶联物
CN101263158B (zh) 表达人源化免疫球蛋白的转基因动物中b细胞凋亡的抑制
JPH02503514A (ja) 抗体におけるまたは抗体に関する改良
CN110214026A (zh) 双特异性抗muc16-cd3抗体和抗muc16药物结合物
CN107849132A (zh) 人源化的和亲和力成熟的针对FcRH5的抗体和使用方法
AU2016247113A1 (en) Novel modulators and methods of use
HU230947B1 (hu) Eljárások anti-TNF-alfa ellenanyagok beadására
HUE034482T2 (hu) Eljárások osteoarthritis következtében fellépõ fájdalom kezelésére idegi növekedési faktor antagonista vagy azt tartalmazó készítmények beadásával
CN105859887A (zh) 拮抗性抗il-7 受体抗体及方法
EA023555B1 (ru) АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ c-fms ЧЕЛОВЕКА
US10925971B2 (en) Methods of treating PRLR positive breast cancer
JPH09506507A (ja) Ｃａ５５．１抗原指向性結合構造
EP3969120A2 (en) Therapeutic compositions and methods for treating cancer in combination with analogs of interleukin proteins

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees