CN107636170A - 突变型Smoothened及其使用方法 - Google Patents

突变型Smoothened及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107636170A
CN107636170A CN201680019259.8A CN201680019259A CN107636170A CN 107636170 A CN107636170 A CN 107636170A CN 201680019259 A CN201680019259 A CN 201680019259A CN 107636170 A CN107636170 A CN 107636170A
Authority
CN
China
Prior art keywords
smo
amino acid
antibody
cell
albumen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680019259.8A
Other languages
English (en)
Inventor
弗德里克·J·德萨万格
罗伯特·L·约奇
格里特·J·P·戴克赫拉夫
海莉·夏普
妮可·巴吉特·塞甘
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
France National Medical Association Of Health And Research
Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Universite Paris Diderot Paris 7
Genentech Inc
Curis Inc
Original Assignee
France National Medical Association Of Health And Research
Universite Paris Diderot Paris 7
Genentech Inc
Curis Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by France National Medical Association Of Health And Research, Universite Paris Diderot Paris 7, Genentech Inc, Curis Inc filed Critical France National Medical Association Of Health And Research
Publication of CN107636170A publication Critical patent/CN107636170A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5041—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving analysis of members of signalling pathways
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
    • G01N2333/4704—Inhibitors; Supressors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Abstract

本发明公开了在用分子靶向疗法治疗癌症患者后，酪氨酸激酶中的突变出现代表了获得性药物抗性的主要机制。此处，描述了蛇型受体Smoothened(SMO)中的突变，其导致如在成神经管细胞瘤中的对Hedgehog(Hh)途径抑制剂的抗性。SMO的保守残基中的氨基酸取代保持Hh信号传导，但导致Hh途径抑制剂GDC‑0449不能结合SMO并抑制该途径。在一些实施例中，本公开内容提供了新型突变型SMO蛋白和核酸，以及检测SMO突变的筛选方法和筛选特异性调节显示出药物抗性的突变型SMO的药物的方法。

Description

突变型Smoothened及其使用方法
相关申请
本专利申请要求于2015年2月4日提交的美国临时申请序列号62/112,074的优先权。上述申请的公开内容以引用的方式在此全文并入。
背景技术
分子靶向癌症疗法已在临床中显示令人印象深刻的活性。一些最知名的例子包括费城染色体阳性慢性髓性白血病(CML)或KIT/PDGFR-突变型胃肠道间质瘤(GIST)中的酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼和EGFR突变型非小细胞肺癌(NSCLC)中的厄洛替尼(Krause,D.S.和R.A.Van Etten(2005)N.Engl.J.Med.353(2):172-187)。用这些试剂的治疗已导致具有这些分子异常的患者群体中显著的抗肿瘤应答。然而，尽管有令人印象深刻的初步临床应答，但大部分患者由于药物抗性的获得而最终进展(Engelman,J.A.和J.Settleman(2008)Curr.Opin.Genet.Dev.18(1):73-79)。因此抗性机制的鉴定已开启了通向更合理的药物组合和开发“第二代”抑制剂的大门，所述“第二代”抑制剂可潜在地克服或避免抗性的出现。
成神经管细胞瘤是小脑的原始神经外胚层肿瘤，其代表儿童中最常见的脑恶性肿瘤(Polkinghorn,W.R.和N.J.Tarbell(2007)Nat.Clin.Pract.Oncol.4(5):295-304)。成神经管细胞瘤的一种治疗形式是辅助放射疗法。尽管存活率有所改善，但辅助放射与使人虚弱的副作用相关，因此支持对新分子靶向疗法的需要。
Hedgehog(Hh)信号传导途径已直接牵涉成神经管细胞瘤的发病机制。最通常是由于抑制性受体PTCH1中功能突变的潜在丧失的组成性Hh信号传导已在大约30％的散发病例中得到证实(Zurawel,R.H.等人(2000)Genes Chromosomes Cancer 27(1):44-51；Kool,M.等人(2008)PLoS ONE 3(8):e3088；Dellovade,T.等人(2006)Annu.Rev.Neurosci.29:539；Rubin,L.L和F.J.de Sauvage(2006)Nat.Rev.Drug Discov.5:1026)。Ptch1(Ptch1+/-)杂合的小鼠可自发发展成神经管细胞瘤，并且用Hh途径抑制剂治疗导致肿瘤消除和延长存活(Goodrich,L.V.等人(1997)Science 277(5329):1109-1113；Romer,J.T.等人(2004)Cancer Cell 6(3):229-240)。然而，最近已观察到用新型Hh途径抑制剂GDC-0449治疗的患者最初显示对治疗的显著应答(Charles M.Rudin等人(2009)N.Engl.J.Med.(提交的))，不料竟不能对治疗有持久的应答且具有肿瘤的复发。
BCC是最常见的人癌症，并且主要由Hh途径的过度活化驱动(Oro等人，1997；Xie等人，1998)。Hh信号传导与癌症之间的关联首先在患有戈林综合征或基底细胞痣综合征(BCNS)的患者中被发现，所述患者对成神经管细胞瘤(MB)和BCC高度敏感。这些患者一般具有在Patched 1(PTCH1)中的杂合种系突变，所述Patched 1编码Hh配体的受体(Hahn等人，1996；Johnson等人，1996)。Hh配体结合解除蛇形跨膜(TM)信号传导物Smoothened(SMO)的PTCH1抑制。绝大多数散发性BCC由PTCH1中的失活突变和杂合性丧失(LOH)驱动，而剩余部分中的大部分具有在SMO中的活化突变(Reifenberger等人，2005)。SMO通过抑制融合抑制子(SUFU)和蛋白激酶A(PKA)来促进GLI转录因子的活化和核定位。SUFU通过在细胞质中结合和隔离GLI转录因子来负调节Hh途径(Stone等人，1999)。SUFU中的功能丧失突变也与戈林综合征相关(Pastorino等人，2009；Smith等人，2014；Taylor等人，2002)。大约50％的散发性BCC也具有TP53突变(Jayaraman等人，2014)。
几种Hh途径抑制剂(HPI)目前处于对BCC和MB的临床调查(Amakye等人，2013)。维莫德吉，先前称为GDC-0449，是批准用于治疗转移性和局灶性晚期BCC的SMO抑制剂(Sekulic等人，2012)。用维莫德吉治疗的大多数BCC患者经历临床益处，包括完全和部分应答两者(Sekulic等人，2012)。
然而，初步估计提示最多至20％的晚期BCC患者在治疗的第一年内发展对维莫德吉的抗性(Chang和Oro，2012)。迄今为止，临床上对维莫德吉的获得性抗性的唯一功能表征机制来自患有转移性MB的患者。在来自复发性转移性肿瘤的活组织检查中检测到SMO-D473H突变，并且该突变在体外显示取消药物结合(Yauch等人，2009)。其他四种临床SMO突变最近在维莫德吉抗性BCC中得到报道，但未在功能上进行检查(Brinkhuizen等人，2014；Pricl等人，2014)。已从临床前模型中描绘了针对SMO抑制剂的几种抗性机制，包括另外的SMO突变、下游Hh途径组分如GLI2的扩增、以及旁路信号传导途径包括磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和非典型蛋白激酶Cι/λ(aPKC-ι/λ)的活化(Atwood等人，2013；Buonamici等人，2010；Dijkgraaf等人，2011)。然而，目前还不清楚哪种机制驱动患者中的抗性。
本领域迫切需要鉴定另外的GDC-0449抗性突变型SMO蛋白，并且找到调节这种突变型SMO蛋白中的SMO活性以克服用GDC-0449治疗时的药物抗性的化合物。还需要诊断通过其SMO基因型的天然变化或通过获得性突变和抗性而可能对治疗抗性的患者的方法。
发明内容
在某些实施例中，本公开内容涉及分离的突变型SMO核酸和蛋白质，例如与肿瘤的化疗抗性相关的那些，以及筛选结合SMO突变体或调节SMO活性的化合物的方法，以及癌症诊断和治疗且特别是其为药物抗性肿瘤的诊断和/或预后和治疗的突变的检测。
在一些实施例中，本公开内容提供了筛选抑制在氨基酸241处掺入突变的突变型SMO蛋白的信号传导的化合物的方法，所述方法包括使所述突变型SMO与测试化合物接触，并且检测所述化合物与所述突变型SMO的结合，由此所述测试化合物与突变型SMO的结合指示所述测试化合物是突变型SMO的抑制剂。
在一些实施例中，本公开内容提供了筛选抑制在氨基酸241处掺入突变的突变型SMO蛋白的信号传导的化合物的方法，所述方法包括使表达所述突变型SMO的细胞与测试化合物接触，并且检测所述细胞中的Gli活性，由此所述Gli活性的存在指示所述测试化合物不是突变型SMO的抑制剂。
在一些实施例中，本公开内容提供了筛选抑制在氨基酸469处掺入突变的突变型SMO蛋白的信号传导的化合物的方法，所述方法包括使所述突变型SMO与测试化合物接触，并且检测所述化合物与所述突变型SMO的结合，由此所述测试化合物与突变型SMO的结合指示所述测试化合物是突变型SMO的抑制剂。
在一些实施例中，本公开内容提供了筛选抑制在氨基酸469处掺入突变的突变型SMO蛋白的信号传导的化合物的方法，所述方法包括使表达所述突变型SMO的细胞与测试化合物接触，并且检测所述细胞中的Gli活性，由此所述Gli活性的存在指示所述测试化合物不是突变型SMO的抑制剂。
在一些实施例中，本公开内容提供了分离的突变型SMO蛋白，其包含与SEQ ID NO:6至少95％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在氨基酸241处包含除苏氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，分离的突变型SMO蛋白包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在氨基酸241处包含除苏氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，氨基酸序列在氨基酸241处包含甲硫氨酸(M)。
在一些实施例中，本公开内容提供了分离的突变型SMO蛋白，其包含与SEQ ID NO:8至少95％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在氨基酸469处包含除半胱氨酸(C)外的氨基酸。在一些实施例中，突变型SMO蛋白包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在氨基酸469处包含除半胱氨酸(C)外的氨基酸。在一些实施例中，氨基酸序列在氨基酸469处包含酪氨酸(Y)。
在一些实施例中，本公开内容提供了鉴定hedgehog途径抑制剂抑制剂的方法，其中所述方法包括：使细胞与一定量的测试试剂接触，其中所述细胞响应hedgehog蛋白或具有增加的hedgehog信号传导和/或hedgehog信号传导途径的活化，并且其中所述细胞表达本文公开的任何突变型SMO蛋白，以及b)与对照相比，测定所述测试试剂是否抑制所述细胞中的hedgehog信号传导，其中如果相对于所述对照，所述测试试剂抑制所述细胞中的hedgehog信号传导，则所述测试试剂被鉴定为hedgehog途径抑制剂。在一些实施例中，使用Gli1表达测定来确定测试试剂抑制细胞中hedgehog信号传导的能力。
在一些实施例中，本公开内容提供了鉴定hedgehog途径抑制剂的方法，其中所述方法包括：使细胞与一定量的测试试剂接触，其中所述细胞响应hedgehog蛋白或具有增加的hedgehog信号传导和/或hedgehog信号传导途径的活化，并且其中所述细胞表达本文公开的任何突变型SMO蛋白，以及b)与对照相比，测定所述测试试剂是否抑制所述细胞的生长和/或增殖，其中如果相对于所述对照，所述测试试剂抑制所述细胞的生长和/或增殖，则所述测试试剂被鉴定为hedgehog途径抑制剂。在一些实施例中，对照是表达野生型SMO蛋白的细胞。在一些实施例中，对照是表达与接触所述测试试剂的细胞相同的突变型SMO蛋白的细胞，其中所述对照用突变型SMO蛋白对其部分或完全抗性的对照试剂进行处理。在一些实施例中，对照试剂是维莫德吉、LY2940680、LDE225和/或化合物5。在一些实施例中，测试试剂结合突变型SMO蛋白，但不结合野生型SMO蛋白。在一些实施例中，测试试剂结合突变型SMO蛋白和野生型SMO蛋白两者。在一些实施例中，测试试剂在表达突变型SMO蛋白的细胞中比在表达野生型SMO蛋白的细胞中更有效地抑制hedgehog信号传导途径。在一些实施例中，相比表达野生型SMO蛋白的细胞，测试试剂更有效地抑制表达突变型SMO蛋白的细胞的生长和/或增殖。
在一些实施例中，本公开内容提供了编码突变型SMO蛋白的分离的核酸分子，其包含与SEQ ID NO:1至少95％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在氨基酸241处包含除苏氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，突变型SMO蛋白包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在氨基酸241处包含甲硫氨酸(M)。在一些实施例中，核酸包含SEQ ID NO:5的亲本核酸序列，其中所述序列含有改变编码氨基酸241的序列以编码不同氨基酸的突变。
在一些实施例中，本公开内容提供了编码突变型SMO蛋白的分离的核酸分子，其包含与SEQ ID NO:1至少95％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在氨基酸469处包含除半胱氨酸(C)外的氨基酸。在一些实施例中，突变型SMO蛋白包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在氨基酸469处包含酪氨酸(Y)。在一些实施例中，分离的核酸分子包含SEQ ID NO:5的亲本核酸序列，其中所述序列含有改变编码氨基酸469的序列以编码不同氨基酸的突变。
在一些实施例中，本公开内容提供了包含本文公开的任何核酸的载体。
在一些实施例中，本公开内容提供了包含本文公开的任何载体的宿主细胞。
在一些实施例中，本公开内容提供了包含并且能够表达本文公开的任何载体的宿主细胞。
在一些实施例中，本公开内容提供了鉴定hedgehog途径抑制剂抑制剂的方法，其中所述方法包括：使细胞与一定量的测试试剂接触，其中所述细胞响应hedgehog蛋白或具有增加的hedgehog信号传导和/或hedgehog信号传导途径的活化，并且其中所述细胞表达本文公开的任何载体，以及b)与对照相比，测定所述测试试剂是否抑制所述细胞中的hedgehog信号传导，其中如果相对于所述对照，所述测试试剂抑制所述细胞中的hedgehog信号传导，则所述测试试剂被鉴定为hedgehog途径抑制剂。
在一些实施例中，使用Gli1表达测定来确定测试试剂抑制细胞中hedgehog信号传导的能力。
在一些实施例中，本公开内容提供了鉴定hedgehog途径抑制剂的方法，其中所述方法包括：使细胞与一定量的测试试剂接触，其中所述细胞响应hedgehog蛋白或具有增加的hedgehog信号传导和/或hedgehog信号传导途径的活化，并且其中所述细胞表达根据本文公开的任何载体，以及b)与对照相比，测定所述测试试剂是否抑制所述细胞的生长和/或增殖，其中如果相对于所述对照，所述测试试剂抑制所述细胞的生长和/或增殖，则所述测试试剂被鉴定为hedgehog途径抑制剂。
在一些实施例中，本公开内容提供了检测样品中突变的SMO基因的方法，所述方法包括从所述样品中扩增疑似含有突变的对应于SMO的第一细胞外环的羧基末端的核酸或其片段，并且比较所述扩增的核酸的电泳迁移率与相应野生型SMO基因或其片段的电泳迁移率。在一些实施例中，电泳迁移率在聚丙烯酰胺凝胶上进行测定。
在一些实施例中，本公开内容提供了检测样品中突变的SMO基因的方法，所述方法包括从所述样品中扩增疑似含有突变的对应于SMO的跨膜结构域6的羧基末端的核酸或其片段，并且比较所述扩增的核酸的电泳迁移率与相应野生型SMO基因或其片段的电泳迁移率。在一些实施例中，电泳迁移率在聚丙烯酰胺凝胶上进行测定。
在一些实施例中，本公开内容提供了鉴定样品中的至少一个SMO突变的方法，所述方法包括使来自所述样品的核酸与核酸探针接触，所述核酸探针能够与掺入突变的编码突变的SMO蛋白的核酸或其片段特异性杂交，所述突变将编码氨基酸241的序列改变为除苏氨酸外的氨基酸，并且检测所述杂交。在一些实施例中，探针被可检测地标记。在一些实施例中，探针是反义寡聚物。在一些实施例中，扩增所述样品的所述核酸中的SMO基因或其片段，并且与所述探针接触。
在一些实施例中，本公开内容提供了鉴定样品中的至少一个SMO突变的方法，所述方法包括使来自所述样品的核酸与核酸探针接触，所述核酸探针能够与掺入突变的编码突变的SMO蛋白的核酸或其片段特异性杂交，所述突变将编码氨基酸469的序列改变为除半胱氨酸外的氨基酸，并且检测所述杂交。在一些实施例中，探针被可检测地标记。在一些实施例中，探针是反义寡聚物。在一些实施例中，扩增所述样品的所述核酸中的SMO基因或其片段，并且与所述探针接触。
在一些实施例中，本公开内容提供了用于鉴定对用GDC-0449治疗抗性的人受试者中的肿瘤的方法，所述方法包括确定所述肿瘤的样品中突变的SMO基因或突变的SMO蛋白的存在，其中所述突变的SMO基因编码在氨基酸241处包含突变的SMO蛋白，并且其中所述SMO蛋白在氨基酸241处包含突变，由此所述突变的SMO基因或突变的SMO蛋白的存在指示所述肿瘤对用GDC-0449治疗抗性。在一些实施例中，该方法还包括用结合所述突变的SMO的化合物治疗具有对用GDC-0449治疗不敏感或不再敏感的肿瘤的所述受试者。在一些实施例中，所述突变的存在或不存在通过检查核酸样品来确定。在一些实施例中，所述突变的存在或不存在通过检查蛋白质样品来确定。
在一些实施例中，本公开内容提供了用于鉴定对用GDC-0449治疗抗性的人受试者中的肿瘤的方法，所述方法包括确定所述肿瘤的样品中突变的SMO基因或突变的SMO蛋白的存在，其中所述突变的SMO基因编码在氨基酸469处包含突变的SMO蛋白，并且其中所述SMO蛋白在氨基酸469处包含突变，由此所述突变的SMO基因或突变的SMO蛋白的存在指示所述肿瘤对用GDC-0449治疗抗性。在一些实施例中，该方法还包括用结合所述突变的SMO的化合物治疗具有对用GDC-0449治疗不敏感或不再敏感的肿瘤的所述受试者。在一些实施例中，所述突变的存在或不存在通过检查核酸样品来确定。在一些实施例中，所述突变的存在或不存在通过检查蛋白质样品来确定。
在一些实施例中，本公开内容提供了抑制具有异常hedgehog信号传导的细胞的增殖或生长的方法，所述方法包括向所述细胞施用溴结构域抑制剂，其中所述细胞表达在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置241或469的氨基酸位置中的任何一个或多个处具有突变的smoothened蛋白。在一些实施例中，细胞在受试者中。在一些实施例中，细胞是癌细胞。在一些实施例中，细胞还包含SUFU突变。在一些实施例中，细胞是人细胞，并且其中所述细胞包含导致SUFU基因拷贝丢失的10q缺失突变。在一些实施例中，10q缺失还导致PTEN基因拷贝丢失。在一些实施例中，溴结构域抑制剂是I-BET762、JQ1或JQ2。
在一些实施例中，本公开内容提供了能够与编码突变的SMO蛋白的核酸或其片段特异性杂交的核酸探针，所述核酸探针在编码氨基酸241的序列中掺入突变。在一些实施例中，探针与编码突变的SMO的所述核酸或其所述片段互补。在一些实施例中，探针具有约10至约50个核苷酸的长度。在一些实施例中，探针还包含可检测标记。
在一些实施例中，本公开内容提供了能够与编码突变的SMO蛋白的核酸或其片段特异性杂交的核酸探针，所述核酸或其片段在编码氨基酸469的序列中掺入突变。在一些实施例中，探针与编码突变的SMO的所述核酸或其所述片段互补。在一些实施例中，探针具有约10至约50个核苷酸的长度。在一些实施例中，探针还包含可检测标记。
在一些实施例中，本公开内容提供了特异性结合本文公开的任何突变型SMO蛋白的抗体，其中所述抗体不结合在氨基酸241处具有苏氨酸的野生型SMO。在一些实施例中，抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，抗体与细胞毒素剂缀合。在一些实施例中，抗体与可检测标记缀合。在一些实施例中，抗体抑制SMO活性。
在一些实施例中，本公开内容提供了特异性结合本文公开的任何突变型SMO蛋白的抗体，其中所述抗体的表位不结合在氨基酸469处具有半胱氨酸的野生型SMO。在一些实施例中，抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，抗体与细胞毒素剂缀合。在一些实施例中，抗体与可检测标记缀合。在一些实施例中，抗体抑制SMO活性。
附图说明
图1A-1I显示了野生型人SMO(1A)和几种人突变型SMO(1B-1I)的氨基酸序列。图1A显示了SEQ ID NO:1。图1B显示了SEQ ID NO:2。图1C显示了SEQ ID NO:3。图1D显示了SEQID NO:4。图1E显示了SEQ ID NO:5。图1F显示了SEQ ID NO:6。图1G显示了SEQ ID NO:7。图1H显示了SEQ ID NO:8。图1I显示了SEQ ID NO:9。
图2显示了所进行的确定维莫德吉抗性BCC中的hedgehog途径信号传导水平的实验的结果。
图3显示了所进行的在治疗前和治疗后活组织检查中确定SMO-A459V突变频率的实验的结果。
图4显示了具有W281突变的SMO突变体的维莫德吉结合口袋。
图5A显示了所进行的确定SMO-A459V突变体是否对PTCH敏感的实验的结果。图5B显示了所进行的确定SMO-A459V突变体是否对维莫德吉敏感的实验的结果。图5C显示了所进行的确定SMO-A459V、SMO-W281C和SMO-W535L突变体是否是活化突变的实验的结果。图5D显示了所进行的确定SMO-W281C突变体是否对PTCH敏感的实验的结果。图5E显示了所进行的确定SMO-W281C突变体是否对维莫德吉敏感的实验的结果。图5F显示了所进行的确定SMO-A459V和SMO-W281C是否具有对维莫德吉受损的结合的实验的结果。
图6A显示了Hh途径的示意图。图6B显示了扫描照片，其显示了来自患者12(PT12)的转移到肺的的散发性BCC的初始应答和疾病进展。红色箭头指示在治疗前(PreRx)以及在4个月(显示病变大小减少)和37个月(揭示疾病进展)的维莫德吉治疗后，胸部的计算机断层(CT)扫描中的靶病变。图6C显示了来自戈林综合征患者(PT10)的两个局部晚期BCC的照片，其最初响应维莫德吉，但随后在所示治疗长度后复发(黑色箭头)。图6D显示了在11个月的维莫德吉治疗前和11个月的维莫德吉治疗后，患者9.1(PT09.1)的局部晚期散发性BCC的苏木精和曙红(H&E)染色切片。注意复发性病变维持未治疗肿瘤的组织学。比例尺表示50μm。图6E是显示在维莫德吉抗性和正常皮肤活组织检查中的GLI1和MKI67表达水平的图。皮尔森相关系数(R)＝0.96。显示标准化读数计数。图6F是12个复发性BCC患者中鉴定的Hh途径基因和TP53的遗传改变的列表概述。对于戈林BCC报道了种系PTCH1变体，而仅显示了关于散发性BCC的体细胞突变。在PT06、PT08和PT09的相同初始肿瘤再生长后，获得两个区域不同的活组织检查。两个分开的BCC在患者PT10中发展抗性。LOH通过来自SNP阵列的次要等位基因频率确定。绿色框突出显示了LOH事件，随后为突变等位基因的拷贝数增益。等位基因特异性表达通过RNAseq确定。
图7是显示了在首次治疗的散发性BCC中鉴定的SMO变体的表。SMO-A239V先前未被报道过(COSMIC/dbSNP)，而所有其他的都是先前报道的致癌突变。注意：被靶向的变体调用鉴定SMO-A239V，然而，由于不同的读数截止和降低的灵敏度，体细胞变体调用者VariantTools则没有。
图8A显示了在本研究中鉴定的SMO突变的列表概述。所有突变在性质中都是体细胞的，因为它们在来自相同患者的血液或其他组织中未检测到。图8B显示了对接到SMO TM区域(灰色螺旋；Wang等人，2013)的晶体结构上的维莫德吉(黄色)的计算模型。先前未表征的突变体残基以绿色突出显示。图8C-F是显示了在治疗前和治疗后活组织检查中SMO突变的流行率的条形图。条形图显示了对于PT03、PT04和PT12(8C)在对应于SMO-A459V的位置处，对于PT09(8D)在对应于SMO-V321M的位置处，对于PT10(8E)在对应于SMO-C469Y和SMO-T241M的位置处，以及对于PT11(8F)在对应于SMO-L412F的位置处，野生型(蓝色)或突变型(红色)核苷酸的掺入频率，如通过焦磷酸测序确定的。注意SMO突变预期是杂合的，并且SMO拷贝数确定最大Y轴值，所述最大Y轴值对于PT03、PT04、PT12、PT10和PT11(SMO拷贝数为2)为50％，并且对于PT09为25％(SMO拷贝数为4)。在所有治疗前样品中，突变核苷酸的掺入被认为在焦磷酸测序测定的背景水平内(<5％)。来自一式四份测定的数据相对于血液对照进行绘图。误差条指示数据的范围。图8G显示了来自PT11的局部晚期BCC(白色箭头)的照片，所述PT11最初响应维莫德吉，但随后在所示时间长度后复发。
图9是显示了在SMO的蛋白质结构域内的首次治疗的BCC(浅灰色-S278I)、抗性BCC(黑色)或两者(浅灰色-L412F、W535L)中鉴定的突变位置的示意图。星号突出显示了先前报道的致癌突变。TM螺旋由蓝色圆柱体表示。
图10A显示了计算对接模型，其显示了与SMO(灰色)结合的维莫德吉(黄色)的自顶而下视图，并且揭示了W281、V321、I408和C469(全部绿色)与药物结合口袋的接近。图10B，左侧显示了V321和W281(两者均为绿色)相对于维莫德吉(黄色)的位置。图10B，中间显示了来自PT02的C281突变体可能破坏与维莫德吉的相互作用。图10B，右侧显示了来自PT09的M321突变体预期影响W281的构象。图10C显示了I408(左)至缬氨酸(右)的突变被预测为影响H470和V404的包装，这两者都与维莫德吉相互作用。该突变可引起整个蛋白质主链结构中的更大变化，并且因此经由第二壳效应影响药物结合。在所有小图中，突变残基以红色文本突出显示。
图11A是显示了在用所示SMO构建体转染的C3H10T1/2细胞中，Gli-萤光素酶报道物活性的图。将值针对SMO-WT活性标准化，并且所绘制的数据是一式三份的平均值+/-SD。图11B是显示了在用所示比率的PTCH1与SMO表达构建体转染的C3H10T1/2细胞中，来自Gli-萤光素酶报道物测定的结果的图。将值针对不含PTCH1共转染的活性标准化，并且所绘制的数据是一式三份的平均值+/-SD。图11C是显示了HEK-293细胞中的SMO药物结合口袋突变体的细胞表面表达的表。所示的值是具有SMO的细胞表面表达的活细胞的百分比，如通过对于10,000个细胞事件的FACS以及对空载体转染的细胞和碘化丙啶(PI)的门控测定的。图11D是显示了来自未转导(无病毒)、对照病毒(仅tRFP)或Cre病毒(tRFP-IRES-eGFPcre)感染的患者小脑颗粒神经元前体细胞的甲基-[3H]-胸苷掺入的结果的图，所述细胞连同或不连同SHH一起培养。甲基-[3H]-胸苷掺入以每分钟计数(CPM)表示，并且所绘制的数据是一式三份的平均值+/-SD。图11E是显示了在用所示病毒构建体感染后，对于tdTomato表达阳性的Ptch1loxp/loxp Tp53loxp/loxp Rosa26LSL-tdTomato(PPT)小脑颗粒神经元前体细胞(CGNP)的百分比的条形图，如通过对于10,000个细胞事件的FACS和对未转导细胞的门控测定的。图11F是显示了通过定量RT-PCR定量来自小图E的PPT CGNP中的人SMO mRNA水平的条形图。数据是相对于鼠管家基因Rpl19的2-ΔCt值，并且绘制为一式三份的平均值+/-SD。
图12A是显示了在采用维莫德吉的剂量应答后，用所示SMO构建体转染的C3H10T1/2细胞中的标准化的Gli-萤光素酶报道物活性的图。将值针对未经处理的活性标准化，并且所绘制的数据是一式三份的平均值+/-标准差(SD)。在非线性回归拟合后计算IC50值。图12B是显示了[3H]-维莫德吉与用所示SMO构建体转染的HEK-293细胞的结合的条形图。EV代表空载体，并且以每分钟计数(cpm)测量药物结合。在与过量的未标记的维莫德吉竞争后通过从总结合中减去非特异性结合，计算特异性结合。所显示的数据是平均值+/-SD。图12C是原代CGNP的病毒转导方案的图解。在不存在SHH的情况下，仅转导的CGNP才能增殖，允许我们专门测试SMO变体在维莫德吉的存在下促进增殖的能力。图12D是显示了在去除SHH配体后，在采用维莫德吉的剂量应答后，用所示病毒转导的PPT CGNP的标准化甲基-[3H]-胸苷掺入的一系列图。每个图显示了相同的对照数据。所绘制的数据是一式三份的平均值+/-SD。
图13A是显示了总共21个残基(深灰色球)被预期具有在与SMO TM结构(灰色螺旋)结合的维莫德吉(浅灰色球)的内的原子的模型。图13B是显示了N219、D384和S387形成氢键合网络(虚线)的模型。这些残基中任一个的突变都可能改变维莫德吉结合口袋的形状。图13C显示了用所示SMO构建体转染并且用1μM维莫德吉处理的C3H10T1/2细胞中的Gli-萤光素酶报道物活性。对于每个构建体将值针对未经处理的活性水平标准化，所绘制的数据是一式三份的平均值+/-SD。
图14A显示了对接到SMO TM区域(灰色螺旋；Wang等人，2013)的晶体结构上的维莫德吉(浅灰色球)的计算模型。对药物结合口袋远端的突变残基以深灰色突出显示。图14B是显示了在用所示SMO构建体转染的C3H10T1/2细胞中，来自Gli-萤光素酶报道物活性的结果的条形图。将值针对SMO-WT的活性水平标准化，并且所绘制的数据是一式三份的平均值+/-SD。图14C是显示了在采用维莫德吉的剂量应答后，用所示SMO构建体转染的C3H10T1/2细胞中的标准化Gli-萤光素酶报道物活性的图。所绘制的数据是一式三份的平均值+/-SD。图14D是显示了在去除SHH配体后，在采用维莫德吉的剂量应答后，用所示病毒转导的PPTCGNP的标准化甲基-[3H]-胸苷掺入的图。所绘制的数据是一式三份的平均值+/-SD。
图15A是显示了在采用维莫德吉的剂量应答后，在用所示SMO构建体转染的C3H10T1/2细胞中的标准化的Gli-萤光素酶报道物活性的图。所绘制的数据是一式三份的平均值+/-SD。图15B是显示了在用所示比率的PTCH1与SMO表达构建体转染的C3H10T1/2细胞中，来自Gli-萤光素酶报道物测定的结果的图。将值针对不含PTCH1共转染的活性标准化，并且所绘制的数据是一式三份的平均值+/-SD。图15C是示出了[3H]-维莫德吉与用所示SMO构建体转染的HEK-293细胞的结合的条形图。包括未转染的细胞(Un)和用空载体(EV)转染的细胞作为对照。以每分钟计数(cpm)测量药物结合，并且在与过量的未标记的维莫德吉竞争后通过从总结合中减去非特异性结合，计算特异性结合。图15D是显示了HEK-293细胞中的活化SMO突变体的细胞表面表达的表。所示的值是具有SMO的细胞表面表达的活细胞的百分比，如通过对于10,000个细胞事件的FACS以及对空载体转染的细胞和PI的门控测定的。图15E是显示了在去除SHH配体后，在采用维莫德吉的剂量应答后，用所示病毒转导的PPT CGNP的标准化甲基-[3H]-胸苷掺入的图。所绘制的数据是一式三份的平均值+/-SD。显示了两次独立实验。
图16A显示了用各种SMO变体转导并且用500nM所示化合物处理的PPT CGNP的标准化的甲基-[3H]-胸苷掺入。对于评估的野生型(WT)或SMO突变体的每个数据集，下述处理条件各自的数据以从左到右的下述顺序呈现为条：维莫德吉、LY2940680、LDE225和化合物5。将值针对不含药物的增殖水平标准化，并且所绘制的数据是一式三份的平均值+/-SD。注意在药物的存在下，SMO-WT的残留增殖是由于这些原代CGNP培养物的成纤维细胞和神经胶质细胞污染。图16B显示了与16A中相同的数据，但用1μM的维莫德吉或JQ1处理转导的CGNP。注意在使用JQ1的SMO-WT中存在较少的残留增殖，提示该化合物也抑制Hh不依赖性细胞增殖。
具体实施方式
本发明的发现是与针对hedgehog依赖性肿瘤的化学疗法抗性相关的突变事件在Smoothened(SMO)中发生，其赋予肿瘤针对用抑制hedgehog信号传导的化合物如环巴胺和GDC-0449的治疗的抗性。本公开内容提供了可用作依赖于Hedgehog信号传导的癌症的预后、诊断和治疗的组合物和方法。
本文描述或提及的技术和程序一般是充分理解的，并且通常通过本领域技术人员使用常规方法，例如下述中描述的广泛利用的方法来采用：Sambrook等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑，(2003))；系列Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:APractical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995))，Harlow和Lane，编辑(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,and Animal Cell Culture(R.I.Freshney，编辑(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，编辑，1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis，编辑，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney)，编辑，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell，编辑，1993-8)J.Wiley和Sons；Handbook of ExperimentalImmunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell，编辑)；Gene Transfer Vectors for MammalianCells(J.M.Miller和M.P.Calos，编辑，1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction，(Mullis等人，编辑，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人，编辑，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley和Sons，1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A PracticalApproach(D.Catty.，编辑，IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A PracticalApproach(P.Shepherd和C.Dean，编辑，Oxford University Press,2000)；UsingAntibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra，编辑，Harwood AcademicPublishers,1995)；和Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人，编辑，J.B.Lippincott Company,1993)。引用的参考文献以引用的方式全文并入。
为了解释本说明书的目的，以下定义将适用，并且适当时，以单数使用的术语也将包括复数形式，并且反之亦然。在下文所述的任何定义与以引用的方式并入本文的任何文件相冲突的情况下，以下文所述的定义为准。
在继续更详细地描述本公开内容之前，应理解本公开内容并不限于特定的组合物或方法步骤，因此这些可变化。必须注意的是，如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本公开内容相关领域的普通技术人员通常理解相同的含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology,Juo,Pei-Show，第2版，2002,CRC Press；The Dictionary of Celland Molecular Biology，第3版，1999,Academic Press；以及Oxford Dictionary OfBiochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford University Press为技术人员提供了本公开内容中使用的许多术语的一般词典。
氨基酸在本文中可通过其通常已知的三个字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号提及。核苷酸同样可由它们通常公认的单字母代码来提及。
在这里方便的指出在本文中使用的“和/或”被视为具有或不具有另一个的两个特定特征或组分各自的具体公开。例如，“A和/或B”被视为(i)A、(ii)B以及(iii)A和B各自的具体公开，如同各自在本文中个别阐述一样。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。如本文使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”至少包含本文所述的任何突变型SMO蛋白、其变体或片段。
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的生物活性。
“分离的”抗体是已从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。其自然环境的污染物组分是将干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施例中，如通过例如Lowry方法测定的，抗体纯化(1)至按抗体的重量计大于95％，并且在一些实施例中，至按重量计大于99％；(2)至通过使用例如转杯式测序仪，足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至通过在还原或非还原条件下使用例如考马斯蓝或银染色的SDS-PAGE的同质性。分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。
“天然抗体”通常为约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每条重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链在一个末端处具有可变结构域(VH)，随后是多个恒定结构域。每条轻链在一个末端处具有可变结构域(VL)，并且在其另一个末端处具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一个恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。特定的氨基酸残基被认为形成轻链和重链可变结构域之间的界面。
抗体的“可变区”或“可变结构域”指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变结构域可称为“VH”。轻链的可变结构域可称为“VL”。这些结构域一般是抗体的最可变部分并且含有抗原结合位点。
术语“可变的”指可变结构域的某些部分在抗体中的序列中广泛不同，并且用于每种特定抗体对于其特定抗原的结合和特异性的这一事实。然而，可变性不均匀地分布在抗体的整个可变结构域各处。它集中在轻链和重链可变结构域两者中称为高变区(HVR)的三个区段。可变结构域的更高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，主要采用通过三个HVR连接的β-片层构型，三个HVR形成连接β-片层结构并且在某些情况下形成β-片层结构的部分的环。每条链中的HVR通过FR区紧密地保持在一起，并且来自另一条链的HVR促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，National Institute ofHealth,Bethesda,MD(1991))。恒定结构域不直接涉及抗体与抗原的结合，而是显示出各种效应子功能，例如在抗体依赖性细胞毒性中的抗体参与。
基于其恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可分配到两个明显不同的类型之一，称为kappa(κ)和lambda(λ)。
取决于其重链的恒定结构域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可分配到不同的类别。存在五个主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种还可分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的，并且一般在例如Abbas等人Cellular and Mol.Immunology，第4版(W.B.Saunders,Co.,2000)中描述。抗体可为通过抗体与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的较大融合分子的部分。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，以指以其基本上完整形式的抗体，而不是如下定义的抗体片段。该术语特别指具有含有Fc区的重链的抗体。
用于本文目的的“裸露抗体”是不与细胞毒素部分或放射性标记结合的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，并且在一些实施例中，包含其抗原结合区域。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段(各自具有单个抗原结合位点)和残留的“Fc”片段，其名称反映其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍能够交联抗原的F(ab’)2片段。
“Fv”是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施例中，双链Fv种类由紧密非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链可以类似于双链Fv种类中的那种的“二聚体”结构结合。在这种构型中，每个可变结构域的三个HVR相互作用，以限定VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。总共六个HVR对抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含对于抗原特异性的三个HVR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管以比整个结合位点更低的亲和力。
Fab片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域，并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段通过在重链CH1结构域的羧基末端处的少量残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)添加而不同于Fab片段。Fab'-SH是本文对于其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基的Fab'的指名。F(ab’)2抗体片段最初作为在其之间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对产生。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。一般地，scFv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其允许scFv形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv的综述，参见例如Pluckthün,The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，(Springer-Verlag,New York,1994)，第269-315页。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段包含与相同多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许同一链上的两个结构域之间的配对的接头，所述结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体可为二价或双特异性的。双抗体在例如EP 404,097；WO1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)中更全面地描述。三抗体和四抗体也在Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)中描述。
如本文使用的术语“单克隆抗体”指从基本上同质性的抗体群体获得的抗体，基本上同质性的抗体群体即群体包含的各个抗体是相同的，除了可以少量存在的可能突变，例如天然存在的突变之外。因此，修饰语“单克隆的”指示抗体的特征不是离散抗体的混合物。在某些实施例中，这样的单克隆抗体通常包括包含结合靶的多肽序列的抗体，其中通过包括从多个多肽序列中选择单个靶结合多肽序列的方法获得靶结合多肽序列。例如，选择过程可为从多个克隆例如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的库中选择独特的克隆。应当理解，还可改变所选择的靶结合序列，例如以改善对靶的亲和力、使靶结合序列人源化、改善其在细胞培养物中的产生、降低其在体内的免疫原性、产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶结合序列的抗体也是本公开内容的单克隆抗体。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除其特异性之外，单克隆抗体制剂也是有利的，因为它们通常不被其他免疫球蛋白污染。
修饰语“单克隆的”指示如从基本上同质的抗体群体获得的抗体特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，要根据本公开内容使用的单克隆抗体可通过各种技术制备，包括例如杂交瘤方法(例如Kohler和Milstein，Nature,256:495-97(1975)；Hongo等人，Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow等人，Antibodies:A LaboratoryManual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人，J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)、以及用于在动物中产生人或人样抗体的技术，所述动物具有人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的部分或全部(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks等人，Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,NatureBiotechnol.14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
本文中的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与源自另一个物种或者属于另一个抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及包括这些抗体的片段，只要它们显示出所需的生物活性(参见例如，美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括抗体，其中抗体的抗原结合区源自通过例如用目的抗原免疫猕猴所产生的抗体。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一个实施例中，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)：在该人免疫球蛋白中来自受体的HVR的残基被替换为来自具有所需特异性、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)的HVR的残基，所述非人物种例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被替换为相应的非人残基。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。可进行这些修饰以进一步改善抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、且通常为两个可变结构域的基本上全部，可变结构域中高变环的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的那些，并且FR的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。关于进一步的细节，参见例如Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还参见例如Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；以及美国专利号6,982,321和7,087,409。
“人抗体”是具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列和/或使用如本文所公开的用于制备人抗体的任何技术制备的氨基酸序列的抗体。人抗体的这种定义特异地排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可使用本领域已知的各种技术生产人抗体，包括噬菌体展示文库。Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581(1991)。还可用于制备人单克隆抗体的是Cole等人，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R.Liss，第77页(1985)；Boerner等人，J.Immunol.,147(1):86-95(1991)中所述的方法。还参见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。人抗体可通过将抗原施用于转基因动物来制备，所述转基因动物已被修饰以响应于抗原攻击而产生这样的抗体，但其内源基因座已被禁用，例如免疫的异种小鼠(xenomice)(关于XENOMOUSETM技术，参见例如美国专利号6,075,181和6,150,584)。关于经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体，还参见例如，Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
当在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”指抗体可变结构域的区域，其在序列中是高度可变的和/或形成结构上限定的环。一般地，抗体包含六个HVR；VH中的三个(H1、H2、H3)以及VL中的三个(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3展示了六个HVR的最大多样性，并且H3特别被认为在对抗体赋予精细特异性方面发挥独特的作用。参见例如Xu等人，Immunity 13:37-45(2000)；Johnson和Wu,Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo，编辑，Human Press,Totowa,NJ,2003)。实际上，仅由重链组成的天然存在的骆驼科抗体在不存在轻链的情况下是功能性和稳定的。参见例如Hamers-Casterman等人，Nature 363:446-448(1993)；Sheriff等人，Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
许多HVR描述正在使用中并且包括在本文中。Kabat互补决定区(CDR)基于序列变异性并且是最常用的(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。相反，Chothia参考结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR和Chothia结构环之间的折衷，并且被Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“接触”HVR基于可用的复杂晶体结构的分析。来自这些HVR各自的残基在下文注明。
HVR可包含如下“延长的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)，以及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变结构域残基根据Kabat等人同上进行编号。
“构架”或“FR”残基是除如本文定义的HVR残基外的那些可变结构域残基。
术语“如Kabat中的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变化，指用于Kabat等人，同上中的抗体集合的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可含有对应于可变结构域的FR或HVR的缩短、或者插入可变结构域的FR或HVR内的较少或另外的氨基酸。例如，重链可变结构域可包括在H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)，以及在重链FR残基82之后插入的残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可通过在抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源性区域处的比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。
Kabat编号系统一般在提及可变结构域中的残基时使用(大约为轻链的残基1-107和重链的残基1-113)(例如Kabat等人，Sequences of Immunological Interest.第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。“EU编号系统”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabat等人，同上中报道的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号。除非本文另有说明，否则提及抗体可变结构域中的残基编号意指通过Kabat编号系统的残基编号。除非本文另有说明，否则提及抗体恒定结构域中的残基编号意指通过EU编号系统的残基编号(例如关于EU编号参见美国临时申请号60/640,323的图)。
与不具有这些改变的亲本抗体相比，“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个HVR中具有一个或多个改变的抗体，所述一个或多个改变导致抗体对抗原的亲和力中的改善。在一个实施例中，亲和力成熟的抗体对于靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔亲和力。亲和力成熟的抗体可使用本领域已知的某些程序产生。例如，Marks等人Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。HVR和/或构架残基的随机诱变通过例如Barbas等人Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994)；Schier等人Gene 169:147-155(1995)；Yelton等人J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；和Hawkins等人，J.Mol.Biol.226:889-896(1992)描述。
“封闭”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其结合的抗原的生物活性的抗体。某些封闭抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。
如本文使用的，“激动剂抗体”是部分或完全模拟int多肽的功能活性中的至少一种的抗体
“生长抑制性”抗体是预防或减少表达抗体与之结合的抗原的细胞的增殖的抗体。例如，抗体可在体外和/或体内预防或减少表达Smo或突变体的癌细胞的增殖。
“诱导细胞凋亡”的抗体是诱导如通过标准细胞凋亡测定来确定的程序性细胞死亡的抗体，例如膜联蛋白V的结合、DNA的断裂、细胞收缩、内质网扩张、细胞破碎和/或膜囊泡的形成(称为细胞凋亡小体)。
抗体“效应子功能”指可归于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)并且随抗体同种型而变化的那些生物活性。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可变化，但人IgG重链Fc区通常被定义为从在位置Cys226处的氨基酸残基或从Pro230延伸到其羧基末端的段。Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可例如在抗体的产生或纯化期间，或通过重组工程化编码抗体重链的核酸来去除。相应地，完整抗体的组合物可包含其中去除所有K447残基的抗体群体、其中不去除K447残基的抗体群体以及具有含和不含K447残基的抗体混合物的抗体群体。
“功能Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性的“效应子功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。这种效应子功能一般需要将Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，并且可使用如例如在本文的定义中所公开的各种测定来评价。
“天然序列Fc区”包含与自然界中存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；和天然序列人IgG4Fc区以及其天然存在的变体。
“变体Fc区”包含的氨基酸序列通过至少一个氨基酸修饰，以及在一些实施例中，一个或多个氨基酸取代而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。在一些实施例中，与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中的约一个至约十个氨基酸取代，以及在一些实施例中，约一个至约五个氨基酸取代。在一些实施例中，本文的变体Fc区具有与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区至少约80％的同源性，并且在一些实施例中，与之至少约90％的同源性，以及在一些实施例中，与之至少约95％的同源性。
“Fc受体”或“FcR”描述了结合抗体的Fc区的受体。在一些实施例中，FcR是天然人FcR。在一些实施例中，FcR是结合IgG抗体(γ受体)的FcR，并且包括FcγRI、Fc RII和FcγRIII亚类的受体，包括等位基因变体和那些受体的可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有在其细胞质结构域中主要不同的相似氨基酸序列。活化受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见例如，Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。例如，FcR在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中得到综述。其他FcR，包括将来要鉴定的FcR，由本文的术语“FcR”包括。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括负责将母源IgG转移给胎儿和调节免疫球蛋白的稳态的新生儿受体FcRn(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))。用于测量与FcRn的结合的方法是已知的(参见例如，Ghetie和Ward.,Immunol.Today 18(12):592-598(1997)；Ghetie等人，Nature Biotechnology,15(7):637-640(1997)；Hinton等人，J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人)。
可在例如表达人FcRn的转基因小鼠或转染的人细胞系中、或在对其施用具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中，测定与人FcRn的体内结合和人FcRn高亲和力结合多肽的血清半衰期。WO 2000/42072(Presta)描述了具有与FcR的改善或减弱结合的抗体变体。还参见例如Shields等人J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。在某些实施例中，细胞至少表达FcγRIII并且执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可从天然来源例如血液中分离。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指这样的细胞毒性的形式：其中结合到某些细胞毒性细胞(例如NK细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌的Ig允许这些细胞毒性效应细胞特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞。用于介导ADCC的原代细胞，NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的第464页上的表3中概括。为了评价目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定，例如美国专利号5,500,362或5,821,337或美国专利号6,737,056(Presta)中描述的那种。用于这种测定的有用的效应细胞包括PBMC和NK细胞。可替代地或另外，可在体内例如在动物模型中，例如Clynes等人PNAS(USA)95:652-656(1998)中所述的那种中评价目的分子的ADCC活性。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在补体的存在下的靶细胞裂解。经典补体途径的活化是通过补体系统的第一组分(C1q)与结合其同源抗原的(合适亚类的)抗体的结合引发。为了评价补体活化，可进行CDC测定，例如如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods202:163(1996)中所述的。具有改变的Fc区氨基酸序列(具有变体Fc区的多肽)和增加或减少的C1q结合能力的多肽变体，例如在美国专利号6,194,551B1和WO 1999/51642中得到描述。还参见例如，Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
术语“包含Fc区的抗体”指包含Fc区的抗体。Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可被去除，例如在抗体的纯化期间或通过编码抗体的核酸的重组工程。相应地，根据本公开内容的包含具有Fc区的抗体的组合物可包含具有K447的抗体、去除所有K447的抗体或具有和不具有K447残基的抗体混合物。
“结合亲和力”一般指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文使用的，“结合亲和力”指反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域已知的常规方法，包括本文所述的那些进行测量。低亲和力抗体一般缓慢地结合抗原并且容易趋于解离，而高亲和力抗体一般更快速地结合抗原并且趋于保持结合更长时间。测量结合亲和力的各种方法是本领域已知的，其中任一种均可用于本公开内容的目的。在下文中描述了用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施例。
在一个实施例中，根据本公开内容的“Kd”或“Kd值”通过用目的抗体的Fab形式本及其抗原进行的放射性标记的抗原结合测定(RIA)进行测量，如通过下述测定描述的。通过在滴定系列的未标记抗原的存在下用最小浓度的(125I)标记的抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗原，来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了确定测定的条件，多孔板(ThermoScientific)用在50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕获抗Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，随后用在PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(大约23℃)下封闭2至5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目的Fab的连续稀释物混合(例如与Presta等人，Cancer Res.57:4593-4599(1997)中的抗-VEGF抗体，Fab-12的评价一致)。然后使目的Fab温育过夜；然而，温育可持续较长时期(例如约65小时)，以确保达到平衡。其后，将混合物转移到捕获板中，以在室温下温育(例如1小时)。然后去除溶液，并且将板用在PBS中的0.1％TWEEN-20TM洗涤8次。当板已干燥时，加入150μl/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且将板在TOPCOUNT TMγ计数器(Packard)上计数10分钟。选择给出小于或等于最大结合的20％的每个Fab浓度用于竞争性结合测定中。
根据另一个实施例，通过使用表面等离子体共振测定，使用-2000或-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃下用以～10个应答单位(RU)的固定的抗原CM5芯片测量Kd或Kd值。简言之，根据供应商的说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。在注射前以5μl/分钟的流速将抗原用10mM乙酸钠，pH 4.8稀释至5μg/ml(～0.2μM)，以达到大约10个应答单位(RU)的偶联蛋白。注射抗原后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，将Fab的两倍连续稀释物(0.78nM至500nM)在25℃下以大约25μl/分钟的流速在具有0.05％TWEEN-20TM表面活性剂的PBS(PBST)中注射。通过同时拟合结合和解离传感图，使用简单的一对一兰米尔结合模型(Evaluation Software版本3.2)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为比率koff/kon。参见例如Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上述表面等离子体共振测定的结合速率超过106M-1s-1，则可通过使用荧光淬灭技术测定结合速率，所述荧光淬灭技术测量在增加浓度的抗原的存在下，在25℃下在PBS pH 7.2中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度中的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)，如在光谱仪例如停流配备分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌比色杯的8000系列SLM-AMINCO TM分光光度计(ThermoSpectronic)中测量的。
根据本公开内容的“结合速率(on-rate)”、“结合速率(rate of association)”、“结合速率(association rate)”或“kon”也可如上所述使用-2000或-3000系统(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)进行测定。
如本文使用的，术语“基本上相似的”或“基本上相同的”指示两个数值(例如与本公开内容的抗体相关的一个以及与参考/比较抗体相关的另一个)之间足够高的相似程度，使得本领域技术人员将考虑在通过所述值(例如Kd值)测量的生物特征的上下文中，两个值之间的差异很少或不具有生物学和/或统计学显著性。根据参考/比较物的值，所述两个值之间的差异例如小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％和/或小于约10％。
如本文使用的，短语“基本上减少的”或“基本上不同的”指示两个数值(一般为与分子相关的一个以及与参考/比较分子相关的另一个)之间的足够高的差异程度，使得本领域技术人员将考虑在通过所述值(例如Kd值)测量的生物特征的上下文中，两个值之间的差异具有统计学显著性。根据参考/比较物的值，所述两个值之间的差异例如大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％和/或大于约50％。
“纯化的”意指分子以按它含有在其中的样品的重量计至少95％或至少98％的浓度存在于样品中。
“分离的”核酸分子是与其例如在其天然环境中通常与之结合的至少一个其他核酸分子分离的核酸分子。分离的核酸分子还包括通常表达核酸分子的细胞中包含的核酸分子，但核酸分子在染色体外存在或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。
“分离的”蛋白质是与其例如在其天然环境中通常与之结合的至少一种其他细胞组分分离的蛋白质。在一些实施例中，“分离的”蛋白质是在其中通常不表达蛋白质的细胞中表达的蛋白质。在一些实施例中，分离的蛋白质是重组蛋白质。
如本文使用的，术语“载体”预期指能够转运它与之连接的另一种核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，其指另外的DNA区段可连接到其内的环状双链DNA。另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可连接到病毒基因组内。某些载体能够在它们被引入其内的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞内时整合到宿主细胞的基因组内，并且由此连同宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们与之可操作连接的基因的表达。这些载体在本文中称为“重组表达载体”，或简称为“表达载体”。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。
如本文可互换使用的，“多核苷酸”或“核酸”指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。在一些实施例中，核酸是cDNA分子或其片段。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物、或可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入聚合物内的任何底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸及其类似物。如果存在，则可在聚合物装配之前或聚合物装配之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可被非核苷酸组分中断。多核苷酸可包含在合成后进行的修饰，例如与标记缀合。其他类型的修饰包括例如“帽”，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰，例如具有不带电荷的键的那些(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和具有带电荷的键的那些(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、含有悬垂部分的那些例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)、具有嵌入剂的那些(例如吖啶、补骨脂素等)、含有螯合剂的那些(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)、含有烷基化剂的那些、具有改性键的那些(例如α异头核酸等)、以及未经修饰形式的多核苷酸。此外，通常存在于糖中的任何羟基都可替换为例如由被标准保护基团保护的膦酸酯基团、磷酸酯基团，或者被活化以制备与另外核苷酸的附加连接，或者可与固体或半固体载体缀合。5'和3'末端OH可被1至20个碳原子的胺或有机封端基团部分磷酸化或取代。其他羟基也可衍生为标准保护基团。多核苷酸还可包含本领域一般已知的类似形式的核糖或脱氧核糖，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基-、2'-氟-或2'-叠氮基核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖(如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和碱基核苷类似物如甲基核苷。一个或多个磷酸二酯键可替换为可替代的连接基团。这些可替代的连接基团包括但不限于其中磷酸酯替换为P(O)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酸酯”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲缩醛”)的实施例，其中每个R或R'独立地是H或者任选含有醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)的取代或未取代的烷基(1-20C)。多核苷酸中的并非所有连接都必须是相同的。前述描述适用于本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
如本文使用的，“寡核苷酸”一般指一般但不一定长度小于约200个核苷酸的短的、一般单链的、一般合成的多核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不是相互排斥的。上文关于多核苷酸的描述可同样且完全适用于寡核苷酸。
如在本文中可互换使用的，术语“Smo”或“SMO”或“smoothened”指来自任何脊椎动物源的任何天然smoothened蛋白或核酸，所述脊椎动物源包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)，除非另有说明。该术语包括“全长”、未经处理的SMO以及来源于细胞中的加工的任何形式的SMO。该术语还包括天然存在的SMO变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一些实施例中，如本文使用的，“突变型SMO”或“突变型SMO多肽”或“突变型SMO蛋白”指在人SMO的第241位处在SMO的第一跨膜中具有突变的SMO、在人SMO的第281位处在SMO的第二跨膜中具有突变的SMO、在人SMO的第408位处在SMO的第五跨膜结构域中具有突变的SMO、在人SMO的第459或469位处在SMO的跨膜结构域6中具有突变的SMO、和/或在人SMO的第533或535位处在SMO的跨膜结构域7的羧基末端部分中具有突变的SMO。在一些实施例中，如本文使用的，“突变型SMO”或“突变型SMO多肽”或“突变型SMO蛋白”指smoothened多肽，其在对应于SEQ ID NO:1的第241、281、408、412、459、469、533和/或535位的一个或多个氨基酸处包含突变的smoothened多肽。在一些实施例中，在对应于SEQ IDNO:1的第241、281、408、412、459、469、533和/或535位的一个或多个氨基酸处的突变包含T241M、W281C、I408V、A459V、C469Y、S533N和/或W535L。类似地，突变型SMO蛋白被描述为具有在野生型人SMO的前述位置的任何一个或多个处的变化。本公开内容考虑到本文所述的任何突变多肽或核酸可相对于序列标识符进行描述或相对于野生型人SMO进行描述。此外，突变体可相对于SEQ ID NO:1进行描述或相对于任何其他序列标识符进行描述。
在一些实施例中，如本文使用的，“治疗(treatment)”(和变化例如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)指尝试改变被治疗的个体或细胞的自然过程的临床干预，并且可进行用于预防或在临床病理过程期间进行。治疗的期望效应包括预防疾病的发生或复发、症状的缓解、疾病的任何直接或间接病理后果的减轻、预防转移、降低疾病进展速度、改善或缓解疾病状态、以及缓解或改善的预后。在一些实施例中，本公开内容的抗体用于延迟疾病或病症的发展或者减缓疾病或病症的进展。在一些实施例中，如本文使用的，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“缓解”指改善、缓解和/或降低被治疗状况的一种或多种症状的严重性。例如，治疗癌症指改善(改善患者的状况)、缓解、延迟或减缓进展或发作，降低一种或多种癌症症状的严重性。例如，治疗癌症包括以下中的任何一种或多种：减少肿瘤大小、降低肿瘤大小增加速率、停止大小的增加、减少转移灶数量、减轻疼痛、增加存活和增加无进展存活。
“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“缓解”指改善、缓解和/或降低被治疗状况的一种或多种症状的严重性。例如，治疗癌症指改善(改善患者的状况)、缓解、延迟或减缓进展或发作，降低一种或多种癌症症状的严重性。例如，治疗癌症包括以下中的任何一种或多种：减少肿瘤大小、降低肿瘤大小增加速率、停止大小的增加、减少转移灶数量、减轻疼痛、增加存活和增加无进展存活。“诊断”指鉴定或确定疾病或肿瘤的区别特征的过程。在癌症的情况下，诊断过程有时也表示为基于严重性或疾病进展的分期或肿瘤分类。
“诊断”指鉴定或确定疾病或肿瘤的区别特征的过程。在癌症的情况下，诊断过程有时也表示为基于严重性或疾病进展的分期或肿瘤分类。
“个体”、“受试者”或“患者”是脊椎动物，例如人。在某些实施例中，脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于农场动物(如牛)、运动动物、宠物(如猫、犬和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施例中，哺乳动物是人。
术语“药物制剂”指这样的制剂，其采取允许活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对制剂施用于其的受试者有无法接受的毒性的另外组分。这样的制剂可为无菌的。在某些实施例中，药物制剂是无热原的。
“无菌”制剂是无菌的或不含所有活的微生物及其孢子。“有效量”指在所需剂量和时间段下有效达到所需治疗或预防结果的量。
本公开内容的物质/分子的“治疗有效量”可根据例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及物质/分子在个体中引发所需应答的能力的因素而变化。治疗有效量包括其中治疗有益效应超过物质/分子的任何有毒或不利效应的量。“预防有效量”指在所需剂量和时间段下有效达到所需预防结果的量。通常但不是必需的，因为预防剂量在疾病之前或在疾病的早期阶段在受试者中使用，所以预防有效量将小于治疗有效量。
如本文使用的，术语“细胞毒素剂”指抑制或预防细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。该术语预期包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)、化学治疗剂(例如氨甲蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂、酶及其片段如核水解酶、抗生素和毒素(例如细菌、真菌、植物或动物起源的小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段和/或变体)、以及下文公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。其他细胞毒素剂在下文描述。杀肿瘤剂引起肿瘤细胞的破坏。
“毒素”是能够对细胞的生长或增殖具有不利作用的任何物质。
“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的例子包括烷基化剂例如噻替派和环磷酰胺烷基磺酸盐例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶例如苯并多巴、卡波醌、美妥多巴(meturedopa)和脲多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲基蜜胺；乙酸配质(尤其是布拉它辛和布拉它辛酮)；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚，)；β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙碱；桦木酸；喜树碱(包括合成类似物拓泊替康CPT-11(伊立替康、)、乙酰喜树碱、东莨菪素(scopolectin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；自念珠藻环肽(cryptophycin)(特别是自念珠藻环肽1和自念珠藻环肽8)；多拉司他汀；多卡米星(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素；氮芥例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、盐酸氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯乙酰胆固醇氮芥、泼尼氮芥、曲磷胺、乌拉莫司汀；亚硝基脲例如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、罗莫司汀、尼莫司汀和雷尼司汀；抗生素例如烯二炔类抗生素(例如卡里奇霉素，尤其是卡里奇霉素γ1I和卡里奇霉素ωI1(参见例如，Nicolaou等人，Angew.ChemIntl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；CDP323，经口α-4整联蛋白抑制剂；达内霉素包括达内霉素A；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯琳多柔比星、多柔比星HCl脂质体注射剂多柔比星脂质体TLC D-99聚乙二醇化多柔比星脂质体和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素例如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、罗迈新、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药例如氨甲蝶呤、吉西他滨替加氟卡培他滨埃坡霉素和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物例如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物例如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如安西他滨、阿扎胞苷、6-阿扎尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素例如卡芦睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸再生剂例如亚叶酸(frolinicacid)；乙葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；阿莫司汀(bestrabucil)；比生群；依达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利乙胺；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；lonidainine；类美登素例如美坦辛和美登木素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；nitraerine；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；多糖复合物(JHS NaturalProducts,Eugene,OR)；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2'-三氯乙胺；单端孢霉烯(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦；长春地辛达卡巴嗪；甘露氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；噻替派；紫杉烷例如紫杉醇白蛋白改造的紫杉醇纳米颗粒制剂(ABRAXANETM)和多西他赛苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲蝶呤；铂试剂例如顺铂、奥沙利铂(例如)和卡铂；阻止微管蛋白聚合形成微管的长春胺，包括长春碱长春新碱长春地辛和长春瑞滨依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；甲酰四氢叶酸；诺消灵；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸类例如维甲酸，包括贝沙罗汀双膦酸盐例如氯膦酸盐(例如或)、依替膦酸NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐阿屈膦酸盐帕玛二磷酸替鲁膦酸盐或利塞膦酸盐曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸特别是抑制涉及异常细胞增殖的信号传导途径中的基因表达的那些，例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗例如疫苗和基因治疗疫苗，例如疫苗、疫苗和疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如)；rmRH(例如)；BAY439006(索拉非尼；Bayer)；SU-11248(舒尼替尼、Pfizer)；哌立福新、COX-2抑制剂(例如塞来昔布或依托考昔)、蛋白酶体抑制剂(例如PS341)；硼替佐米CCI-779；替吡法尼(R11577)；索拉非尼(orafenib)、ABT510；Bcl-2抑制剂例如奥利默森钠匹克生琼；EGFR抑制剂(参见下文定义)；酪氨酸激酶抑制剂(参见下文定义)；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂例如雷帕霉素(西罗莫司、)；法尼基转移酶抑制剂例如洛那法尼(SCH 6636、SARASARTM)；和上述中任一种的药学可接受的盐、酸或衍生物；以及上述中的两种或更多种的组合，例如CHOP，环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙的组合治疗的缩写；和FOLFOX，使用与5-FU和亚叶酸组合的奥沙利铂(ELOXATINTM)的治疗方案的缩写。
如本文定义的化学治疗剂包括作用于调节、减少、阻断或抑制可促进癌症生长的激素效应的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”。它们可为激素本身，包括但不限于：具有混合激动剂/拮抗剂谱的抗雌激素，包括它莫西芬4-羟基它莫西芬、托瑞米芬艾多昔芬、屈洛昔芬、雷洛昔芬曲沃昔芬、凯奥昔芬(keoxifene)，和选择性雌激素受体调节剂(SERM)例如SERM3；不含激动剂性质的纯抗雌激素，例如氟维司群和EM800(这种试剂可阻断雌激素受体(ER)二聚化、抑制DNA结合、增加ER周转、和/或抑制ER水平)；芳香酶抑制剂，包括类固醇芳香酶抑制剂例如福美坦和依西美坦和非类固醇芳香酶抑制剂例如阿那曲唑(anastrazole)来曲唑和氨鲁米特，及其他芳香酶抑制剂包括伏氯唑乙酸甲地孕酮法倔唑和4(5)-咪唑；促黄体激素释放激素激动剂，包括亮丙瑞林(和)、戈舍瑞林、布舍瑞林和曲普瑞林(tripterelin)；性类固醇包括妊娠素例如乙酸甲地孕酮和乙酸甲羟孕酮，雌激素例如己烯雌酚和倍美力，和雄激素/维甲酸类例如氟甲睾酮、全反式维甲酸和芬维A胺；奥那司酮；抗孕酮；雌激素受体下调节物(ERD)；抗雄激素例如氟他胺、尼鲁米特和比卡鲁胺；以及上述中任一种的药学可接受的盐、酸或衍生物；以及上述中的两种或更多种的组合。
当在本文中使用时，“生长抑制剂”指在体外或体内抑制细胞(例如表达SMO的细胞)生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著减少在S期中的细胞(例如表达SMO的细胞)百分比的那种。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期进展(在除S期外的位置)的试剂，例如诱导G1阻滞和M期阻滞的试剂。常规M期阻断剂包括长春胺(vincas)(长春新碱和长春碱)、紫杉烷和拓扑异构酶II抑制剂，例如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博来霉素。阻滞G1的那些试剂将漏过进入S期阻滞，例如DNA烷基化剂例如它莫西芬、泼尼松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。更多信息可在Murakami等人、名称为“Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs”的Mendelsohn和Israel，编辑，The Molecular Basis of Cancer，第1章，例如第13页中找到。紫杉烷(紫杉醇和多西他赛)是两者均源自紫杉树的抗癌药物。源自欧洲紫杉的多西他赛(Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进来自微管蛋白二聚体的微管装配，并且通过阻止解聚来稳定微管，这导致细胞中有丝分裂的抑制。
“突变型SMO拮抗剂”是抑制在人SMO的第241、281、408、459、469、533或535位处具有氨基酸取代的SMO的生物活性的化合物，所述氨基酸取代将在这个位置处的野生型氨基酸改变为任何其他氨基酸。在一些实施例中，SMO的生物活性是在用hedgehog刺激时转导信号以活化Gli转录因子的能力。
如本文使用的，术语“hedgehog途径抑制剂”预期指能够抑制细胞中的hedgehog信号传导的试剂。在特定实施例中，hedgehog拮抗剂能够抑制细胞中的hedgehog信号传导，所述细胞表达本文所述的任何突变型SMO蛋白。在一些实施例中，hedgehog途径抑制剂能够抑制细胞中的hedgehog信号传导，所述细胞表达在对应于SEQ ID NO:1的241、281、408、459、469、533或535(例如野生型人SMO中的相应位置)的一个或多个氨基酸处包含突变的smoothened多肽。在一些实施例中，hedgehog途径抑制剂能够抑制细胞中的hedgehog信号传导，所述细胞表达包含下述突变中的任一个的smoothened多肽：T241M、W281C、I408V、A459V、C469Y、S533N和/或W535L。
I.核酸
本公开内容的核酸包括分离的突变型SMO编码序列。在一些实施例中，核酸编码对维莫德吉部分或完全抗性的突变型SMO蛋白。在一些实施例中，核酸编码在细胞中对维莫德吉部分或完全抗性的突变型SMO蛋白，所述细胞在编码hedgehog信号传导途径中的蛋白质的基因中具有另外的突变。在一些实施例中，另外的突变是本文所述的任何修补和/或SUFU突变。
在一些实施例中，本公开内容提供了编码突变型SMO蛋白的分离的核酸分子，其中所述氨基酸序列在对应于野生型SMO氨基酸序列的第239位的氨基酸位置处包含除丙氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，核酸包含这样的序列，所述序列与SEQ ID NO:5的核酸序列至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，并且含有至少一个突变，使得核酸编码在对应于SEQ ID NO:1的第239位的氨基酸位置处包含除丙氨酸(A)外的氨基酸的SMO多肽。在一些实施例中，这样的核酸在对应于SEQ ID NO:1的第239位的氨基酸位置处编码缬氨酸(V)。在一些实施例中，该核酸在对应于SEQ ID NO:5的第715、716和/或717位的核苷酸位置处具有从亲本野生型SMO的至少一个突变。在一些实施例中，同一性百分比为与SEQ ID NO:5的85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，条件是在对应于SEQ ID NO:5的第715、716和/或717位的核苷酸位置处存在至少一个突变。在一些实施例中，本公开内容提供了编码突变型SMO蛋白的分离的核酸分子，其中所述氨基酸序列在对应于野生型SMO氨基酸序列的第241位的氨基酸位置处包含除苏氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，核酸包含这样的序列，所述序列与SEQ ID NO:5的核酸序列至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，并且含有至少一个突变，使得核酸编码在对应于SEQ ID NO:1的第241位的氨基酸位置处包含除苏氨酸(T)外的氨基酸的SMO多肽。在一些实施例中，这样的核酸在对应于SEQ ID NO:1的第241位的氨基酸位置处编码甲硫氨酸(M)。在一些实施例中，该核酸在对应于SEQ IDNO:5的第721、722和/或723位的核苷酸位置处具有从亲本野生型SMO的至少一个突变。在一些实施例中，同一性百分比为与SEQ ID NO:5的85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，条件是在对应于SEQ ID NO:5的第721、722和/或723位的核苷酸位置处存在至少一个突变。在一些实施例中，本公开内容提供了编码突变型SMO蛋白的分离的核酸分子，其中所述氨基酸序列在对应于野生型SMO氨基酸序列的第281位的氨基酸位置处包含除色氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，核酸包含这样的序列，所述序列与SEQ ID NO:5的核酸序列至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，并且含有至少一个突变，使得核酸编码在对应于SEQ ID NO:1的核苷酸位置281的核苷酸位置处包含除色氨酸(W)外的氨基酸的SMO多肽。在一些实施例中，该核酸在对应于SEQ ID NO:1的第281位的氨基酸位置处编码半胱氨酸(C)。在一些实施例中，该核酸在对应于SEQ ID NO:5的核苷酸位置841、842和/或843的核苷酸位置处具有从亲本野生型SMO的至少一个突变。在一些实施例中，同一性百分比为与SEQ ID NO:5的85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，条件是在对应于SEQ ID NO:5的第841、842和/或843位的核苷酸位置处存在至少一个突变。在一些实施例中，本公开内容提供了编码突变型SMO蛋白的分离的核酸分子，其中所述氨基酸序列在对应于野生型SMO氨基酸序列的第408位的氨基酸位置处包含除异亮氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，核酸包含这样的序列，所述序列与SEQ ID NO:5的核酸序列至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，并且含有至少一个突变，使得核酸编码在对应于SEQ ID NO:1的第408位的氨基酸位置处包含除异亮氨酸(I)外的氨基酸的SMO多肽。在一些实施例中，该核酸在对应于SEQ ID NO:1的第408位的氨基酸位置处编码缬氨酸(V)。在一些实施例中，该核酸在对应于SEQ ID NO:5的第1222、1223和/或1224位的核苷酸位置处具有从亲本野生型SMO的至少一个突变。在一些实施例中，同一性百分比为与SEQID NO:5的85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，条件是在对应于SEQ ID NO:5的第1222、1223和/或1224位的核苷酸位置处存在至少一个突变。在一些实施例中，本公开内容提供了编码突变型SMO蛋白的分离的核酸分子，其中所述氨基酸序列在对应于野生型SMO氨基酸序列的第459位的氨基酸位置处包含除丙氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，核酸包含这样的序列，所述序列与SEQ ID NO:5的核酸序列至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，并且含有至少一个突变，使得核酸编码在对应于SEQID NO:1的第459位的氨基酸位置处包含除丙氨酸(A)外的氨基酸的SMO多肽。在一些实施例中，该核酸在对应于SEQ ID NO:1的第459位的氨基酸位置处编码缬氨酸(V)。在一些实施例中，该核酸在对应于SEQ ID NO:5的第1375、1376和/或1377位的核苷酸位置处具有从亲本野生型SMO的至少一个突变。在一些实施例中，同一性百分比为与SEQ ID NO:5的85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，条件是在对应于SEQ ID NO:5的第1375、1376和/或1377位的核苷酸位置处存在至少一个突变。在一些实施例中，本公开内容提供了编码突变型SMO蛋白的分离的核酸分子，其中所述氨基酸序列在对应于野生型SMO氨基酸序列的第469位的氨基酸位置处包含除半胱氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，核酸包含这样的序列，所述序列与SEQ ID NO:5的核酸序列至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，并且含有至少一个突变，使得核酸编码在对应于SEQ ID NO:1的第469位的氨基酸位置处包含除半胱氨酸(C)外的氨基酸的SMO多肽。在一些实施例中，该核酸在对应于SEQ ID NO:1的第469位的氨基酸位置处编码酪氨酸(Y)。在一些实施例中，该核酸在对应于SEQ ID NO:5的第1405、1406和/或1407位的核苷酸位置处具有从亲本野生型SMO的至少一个突变。在一些实施例中，同一性百分比为与SEQ ID NO:5的85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，条件是在对应于SEQ ID NO:5的第1405、1406和/或1407位的核苷酸位置处存在至少一个突变。在一些实施例中，本公开内容提供了编码突变型SMO蛋白的分离的核酸分子，其中所述氨基酸序列在对应于野生型SMO氨基酸序列的第533位的氨基酸位置处包含除丝氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，核酸包含这样的序列，所述序列与SEQ ID NO:5的核酸序列至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，并且含有至少一个突变，使得核酸编码在对应于SEQ ID NO:1的第533位的氨基酸位置处包含除丝氨酸(S)外的氨基酸的SMO多肽。在一些实施例中，该核酸在对应于SEQ ID NO:1的第533位的氨基酸位置处编码天冬酰胺(N)。在一些实施例中，该核酸在对应于SEQ ID NO:5的第1597、1598和/或1599位的核苷酸位置处具有从亲本野生型SMO的至少一个突变。在一些实施例中，同一性百分比为与SEQ ID NO:5的85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，条件是在对应于SEQ ID NO:5的第1597、1598和/或1599位的核苷酸位置处存在至少一个突变。在一些实施例中，本公开内容提供了编码突变型SMO蛋白的分离的核酸分子，其中所述氨基酸序列在对应于野生型SMO氨基酸序列的第535位的氨基酸位置处包含除色氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，核酸包含这样的序列，所述序列与SEQ ID NO:5的核酸序列至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，并且含有至少一个突变，使得核酸编码在对应于SEQ ID NO:1的第535位的氨基酸位置处包含除色氨酸(W)外的氨基酸的SMO多肽。在一些实施例中，该核酸在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置535的核苷酸位置处编码亮氨酸(L)。在一些实施例中，该核酸在对应于SEQ ID NO:5的第1603、1604和/或1605位的核苷酸位置处具有从亲本野生型SMO的至少一个突变。在一些实施例中，同一性百分比为与SEQ ID NO:5的85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，条件是在对应于SEQ ID NO:5的核苷酸位置1603、1604和/或1605的核苷酸位置处存在至少一个突变。在一些实施例中，核酸包含这样的序列，所述序列与SEQ ID NO:5的核酸序列至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，并且含有至少一个突变，使得核酸编码包含表4中所示的任何一种或多种氨基酸变化的SMO多肽(参见实例6)。
本公开内容还考虑了这样的核酸的片段，其跨越长度至少20个核苷酸的片段中的上述突变区域。在一些实施例中，核苷酸片段为长度25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个核苷酸。片段可为跨越上述突变区域直到全长突变型SMO编码核酸分子的任何长度。分离的突变型SMO及其片段可用于例如杂交，以生成用于本公开内容的预后和诊断测定的引物和探针，并且用于在重组系统中表达(例如以生成突变型SMO蛋白或其部分以用作免疫原并用于如本文所述的本公开内容的测定中)。
本公开内容提供了可用于在本公开内容的方法中鉴定突变型SMO核酸分子的核酸探针。源自疑似具有突变型SMO的组织或其中SMO状态未知的组织的核酸样品可使用标准程序使用突变型SMO的特异性探针进行筛选，标准程序如Sambrook等人，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,1989)中所述。可替代地，可从组织中扩增编码SMO的核酸，并且用本公开内容的特异性探针探测，以确定突变型SMO的存在或不存在。PCR方法是本领域众所周知的(Sambrook等人，同上；Dieffenbach等人，PCR PRIMER:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,1995)。
编码突变型SMO的核苷酸序列(或其互补体)在分子生物学领域中具有各种应用，包括用作杂交探针，以及用于生成反义RNA和DNA探针。突变型SMO编码核酸也可用于通过本文所述的重组技术制备突变型SMO多肽，其中这些突变型SMO多肽可用于例如如本文所述的抗突变型SMO抗体的制备。
全长突变型SMO核酸或其部分可用作用于鉴定突变型SMO的杂交探针。
任选地，探针的长度为约20至约50个碱基。杂交探针可源自全长突变型SMO核苷酸序列的至少突变区域。
例如，筛选方法将包括使用已知DNA序列分离突变型SMO的编码区，以合成约40个碱基的所选探针。杂交探针可通过各种标记进行标记，包括放射性核素如32P或35S，或酶标促记如经由抗生物素蛋白/生物素偶联系统与探针偶联的碱性磷酸酶。具有与本公开内容的突变型SMO基因的序列互补的序列的标记探针可用于筛选人cDNA、基因组DNA或mRNA的文库，以确定探针与这些文库的哪些成员杂交。杂交产物可在聚丙烯酰胺凝胶上分辨。另外，可使用实例中所述的方法来确定SMO突变。Sambrook等人，同上提供了杂交条件，包括中等严格性和高严格性。
在这种文库筛选方法中鉴定的序列可与SMO和突变型SMO的已知序列进行比较和比对。可使用本领域已知的方法测定在第一、第二、第五、第六或第七跨膜结构域处，在跨膜结构域6的羧基末端区域或跨膜结构域7的羧基末端区域处的序列同一性。
SMO编码核酸的其他有用片段包括反义或有义寡核苷酸，其包含能够结合靶突变型SMO mRNA(有义)或突变型SMO DNA(反义)序列的单链核酸序列(RNA或DNA)。根据本公开内容的反义或有义寡核苷酸包含含有突变区的突变型SMO DNA的编码区的片段。这样的片段一般包含至少约14个核苷酸，并且在一些实施例中，包含约14至30个核苷酸。基于编码给定蛋白质的cDNA序列得到反义或有义寡核苷酸的能力在例如Stein和Cohen(1988)CancerRes.48:2659以及van der Krol等人(1988)BioTechniques 6:958中描述。
在一些实施例中，本公开内容提供了能够抑制本文所述的任何突变型SMO核酸的表达的核酸。反义或有义寡核苷酸与靶核酸序列的结合导致双链体的形成，所述双链体通过几种方式之一阻断靶序列的转录或翻译，所述方法包括双链体的增强降解、转录或翻译的过早终止、或通过其他方式。这些方法由本公开内容包括。反义寡核苷酸因此可用于阻断突变型SMO蛋白的表达，其中这些突变型SMO蛋白可在哺乳动物中的癌症对化学治疗剂如GDC-0449的抗性中起作用。反义或有义寡核苷酸还包含具有经修饰的糖-磷酸二酯主链(或其他糖键，例如WO 91/06629中描述的那些)的寡核苷酸，并且其中这些糖键对内源性核酸酶抗性。具有抗性糖键的这种寡核苷酸在体内是稳定的(即能够抵抗酶促降解)，但保留序列特异性以能够结合靶核苷酸序列。
可用于抑制突变型SMO蛋白表达的反义化合物的具体例子包括含有经修饰的主链或非天然核苷间键的寡核苷酸。具有经修饰的主链的寡核苷酸包括在主链中保留磷原子的那些和在主链中不具有磷原子的那些。为了本说明书的目的，并且如在本领域中有时提及的，在其核苷间主链中不具有磷原子的经修饰的寡核苷酸也可被视为寡核苷。在一些实施例中，经修饰的寡核苷酸主链包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3'-亚烷基膦酸酯、5'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、具有正常3'-5'键的硒代磷酸酯和硼酸-磷酸酯(borano-phosphate)、这些的2'-5'连接的类似物和具有反转极性的那些，其中一个或多个核苷酸间键是3'至3'、5'至5'或2'至2'键。在一些实施例中，具有反转极性的寡核苷酸包含在最3'核苷酸间键处的单个3'至3'键，即可为脱碱基(核碱基缺失或具有羟基代替其)的单个倒置核苷残基。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。教导含磷键的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号：3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050，所述专利各自以引用的方式并入本文。
在一些实施例中，核酸包含经修饰的核苷酸或经修饰的寡核苷酸主链。在一些实施例中，其中不包括磷原子的经修饰的寡核苷酸主链具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。这些包括具有下述的那些：吗啉键(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰乙酰(formacetyl)和硫代甲酰乙酰主链；亚甲基甲酰乙酰和硫代甲酰乙酰主链；核糖乙酰主链；含烯烃主链；氨基磺酸盐主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸盐和磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合的N、O、S和CH2组分部分的其他。教导这种寡核苷制备的代表性美国专利包括但不限于：美国专利号：5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，所述专利各自以引用的方式并入本文。
在反义寡核苷酸的一些实施例中，核苷酸单元的糖和核苷间键(即主链)两者均被新基团替换。维持碱基单元用于与适当的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物，已显示具有优异杂交性质的寡核苷酸模拟物，称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主链被含酰胺主链，特别是氨基乙基甘氨酸主链替换。核碱基被保留并且直接或间接地结合主链的酰胺部分的氮杂氮原子。教导PNA化合物制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号：5,539,082；5,714,331；和5,719,262，所述专利各自以引用的方式并入本文。在Nielsen等人(1991)Science 254:1497-1500中可找到PNA化合物的进一步教导。
在一些实施例中，反义寡核苷酸掺入硫代磷酸酯主链和/或杂原子主链，且特别是上文提及的美国专利号5,489,677中所述的-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-(称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链)、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-(其中天然磷酸二酯主链表示为-O-P-O-CH2-)，以及上文提及的美国专利号5,602,240的酰胺主链。在一些实施例中，反义寡核苷酸具有上文提及的美国专利号5,034,506的吗啉代主链结构。
经修饰的寡核苷酸还可含有一个或多个取代的糖部分。在一些实施例中，寡核苷酸在2'位置处包含下述之一：OH；F；O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；O-炔基、S-炔基或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可为取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。在一些实施例中，寡核苷酸是O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m为1至约10。在一些实施例中，反义寡核苷酸在2'位置处包含下述之一：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报道基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸的药物代谢动力学性质的基团、或用于改善寡核苷酸的药效学性质的基团、以及具有相似性质的其他取代基。在一些实施例中，修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH2CH2OCH3，也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin等人(1995)Helv.Chim.Acta 78:486-504)，即烷氧基烷氧基。在一些实施例中，修饰包括2'-二甲基氨氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2'-DMAOE，如下文实施例中所述，以及2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(本领域也称为2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，即2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)。
在一些实施例中，修饰包括锁核酸(LNA)，其中2'-羟基连接到糖环的3'或4'碳原子，由此形成双环糖部分。在一些实施例中，键是桥接2'氧原子和4'碳原子的亚甲基(-CH2-)n基团，其中n为1或2。LNA及其制备在WO 98/39352和WO 99/14226中描述。
在一些实施例中，修饰包括2'-甲氧基(2'-O-CH3)、2'-氨基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)、2'-烯丙基(2'-CH2-CH＝CH2)、2'-O-烯丙基(2'-O-CH2-CH＝CH2)和2'-氟(2'-F)。2'-修饰可在阿拉伯糖(上)位置或核糖(下)位置中。在一些实施例中，2'-阿拉伯糖修饰是2'-F。也可在寡核苷酸上的其他位置，特别是在3'末端核苷酸上或2'-5'连接的寡核苷酸中的糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置处进行类似的修饰。寡核苷酸还可具有糖模拟物，例如环丁基部分代替戊呋喃糖基糖。教导这种经修饰的糖结构制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号：4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；和5,700,920，所述专利各自以引用的方式全文并入本文
在一些实施例中，寡核苷酸还可包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文使用的，“未经修饰”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包括其他合成和天然核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C＝C-CH3或-CH2-C＝CH)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基和其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。进一步经修饰的核碱基包括三环嘧啶如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G夹例如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。经修饰的核碱基还可包括其中嘌呤或嘧啶碱基替换为其他杂环的那些，例如7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。进一步的核碱基包括在美国专利号3,687,808中公开的那些，在THE CONCISE ENCYCLOPEDIA OF POLYMER SCIENCE AND ENGINEERING,Kroschwitz,J.I.，编辑，John Wiley&Sons,1990，第858-859页中公开的那些，以及通过Englisch等人，ANGEWANDTE CHEMIE,INTERNATIONAL EDITION,Wiley-VCH,Germany,1991,30:613公开的那些。这些核碱基中的某些特别可用于增加本公开内容的寡聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已显示使核酸双链体稳定性改善0.6-1.2℃。(Sanghvi等人ANTISENSE RESEARCH AND APPLICATIONS,CRC Press,Boca Raton,1993，第276-278页)，并且是可能的碱基取代，甚至更特别地当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。教导经修饰的核碱基制备的代表性美国专利包括但不限于：美国专利号3,687,808，以及美国专利号：4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121、5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,830,653；5,763,588；6,005,096；5,681,941和5,750,692，所述专利各自以引用的方式并入本文。
反义寡核苷酸的另一种修饰涉及使一个或多个部分或缀合物与寡核苷酸化学连接，所述部分或缀合物增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。本公开内容的化合物可包括与官能团如伯羟基或仲羟基共价结合的缀合物基团。本公开内容的缀合物基团包括嵌入剂、报道分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚物的药效学性质的基团、以及增强寡聚物的药物代谢动力学性质的基团。典型的缀合物基团包括胆固醇、脂质、阳离子脂质、磷脂、阳离子磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。在本公开内容的上下文中增强药效学性质的基团包括改善寡聚物摄取、增强寡聚物对降解的抗性和/或加强与RNA的序列特异性杂交的基团。在本公开内容的上下文中增强药物代谢动力学性质的基团包括改善寡聚物摄取、分布、代谢或排泄的基团。缀合物部分包括但不限于脂质部分例如胆固醇部分(Letsinger等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6553-6556)、胆酸(Manoharan等人(1994)Bioorg.Med.Chem.Lett.4:1053-1060)、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660:306-309；Manoharan等人(1993)Bioorg.Med.Chem.Lett.3:2765-2770)、硫代胆固醇(Oberhauser等人(1992)Nucl.Acids Res.20:533-538)、脂族链例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人(1991)EMBO J.10:1111-1118；Kabanov等人(1990)FEBS Lett.259:327-330；Svinarchuk等人(1993)Biochimie 75:49-54、磷脂例如双十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-双-O-十六烷基-外消旋-甘油基-3-H-膦酸酯(Manoharan等人(1995)Tetrahedron Lett.36:3651-3654；Shea等人(1990)Nucl.Acids Res.18:3777-3783)、多胺或聚乙二醇链(Manoharan等人(1995)Nucleosides&Nucleotides 14:969-973)、或金刚烷乙酸(Manoharan等人(1995)Tetrahedron Lett.36:3651-3654)、棕榈基部分(Mishra等人(1995)Biochim.Biophys.Acta 1264:229-237)、或十八胺或己基氨基-羰基-氧胆固醇部分。本发明的寡核苷酸还可缀合至活性药物物质，例如阿斯匹林、华法林、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、丹磺酰肌氨酸、2,3,5-三碘苯甲酸、氟芬那酸、亚叶酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮杂卓、吲哚美辛、巴比妥酸盐、头孢菌素、磺胺药物、抗糖尿病药、抗菌剂或抗生素。寡核苷酸-药物缀合物及其制备在下述美国专利号中描述：4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717、5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203、5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928；5,688,941和6,656,730，所述专利各自以引用的方式并入本文。
给定化合物中的所有位置无需均匀地修饰，并且实际上可将多于一种上述修饰在单一化合物中、或甚至在寡核苷酸内的单核苷处掺入。本公开内容还包括作为嵌合化合物的反义化合物。在本公开内容的上下文中，“嵌合”反义化合物或“嵌合体”是反义化合物，特别是寡核苷酸，其含有两个或更多个化学上不同的区域，每个区域由至少一个单体单元(即在寡核苷酸化合物的情况下的核苷酸)构成。这些寡核苷酸通常含有至少一个区域，其中寡核苷酸被修饰为对寡核苷酸赋予增加的对核酸酶降解的抗性、增加的细胞摄取和/或增加的对靶核酸的结合亲和力。寡核苷酸的另外区域可充当能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂交物的酶的底物。例如，RNase H是切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶。因此，RNA酶H的活化导致RNA靶的切割，由此极大地增强基因表达的寡核苷酸抑制效率。因此，和与相同靶区域的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸相比，当使用嵌合寡核苷酸时，通常可获得与较短寡核苷酸相当的结果。本公开内容的嵌合反义化合物可形成为如上所述的两种或更多种寡核苷酸、经修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模拟物的复合结构。在一些实施例中，嵌合反义寡核苷酸在3'末端处掺入至少一种2'经修饰的糖(例如2'-O-(CH2)2-O-CH3)以赋予核酸酶抗性，以及具有至少4个邻接2'-H糖的区域以赋予RNase H活性。这些化合物在本领域中也被称为杂合物或缺口聚体(gapmer)。在一些实施例中，缺口聚体在由具有至少4个邻接2'-H糖的至少一个区域分开的3'末端和5'末端处具有2'经修饰的糖(例如2'-O-(CH2)2-O-CH3)的区域，并且在一些实施例中，掺入硫代磷酸酯主链连接。教导这种杂合物结构制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号：5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；和5,700,922，所述专利各自以引用的方式全文并入本文。
根据本公开内容使用的反义化合物可通过众所周知的固相合成技术方便地和常规地制备。用于这种合成的设备由若干供应商包括例如Applied Biosystems(FosterCity,Calif.)出售。可另外地或可替代地采用本领域已知的用于这种合成的任何其他方法。众所周知使用类似的技术来制备寡核苷酸，如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。本公开内容的化合物还可与其他分子、分子结构或化合物的混合物(例如脂质体、受体靶向分子、经口、直肠、局部或其他制剂)混合、封装、缀合或以其他方式相结合，用于帮助摄取、分布和/或吸收。教导这种摄取、分布和/或吸收辅助制剂制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号：5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；和5,595,756，所述专利各自以引用的方式并入本文。
有义或反义寡核苷酸的其他例子包括与有机部分(例如在WO 90/10048中所述的那些)、以及增加寡核苷酸对靶核酸序列的亲和力的其他部分(例如聚-(L-赖氨酸))共价连接的那些寡核苷酸。此外，嵌入剂如玫瑰树碱和烷基化剂或金属络合物可附着到有义或反义寡核苷酸，以修饰反义或有义寡核苷酸对靶核苷酸序列的结合特异性。
可通过任何基因转移方法将反义或有义寡核苷酸引入含有靶核酸序列的细胞中，包括例如CaPO4介导的DNA转染、电穿孔、或通过使用基因转移载体如EB病毒。在一个实施例中，将反义或有义寡核苷酸插入合适的逆转录病毒载体内。将含有靶核酸序列的细胞在体内或离体与重组逆转录病毒载体接触。合适的逆转录病毒载体包括但不限于源自鼠逆转录病毒M-MuLV的那些，N2(源自M-MuLV的逆转录病毒)，或指名为DCT5A、DCT5B和DCT5C的双拷贝载体(参见WO 90/13641)。
通过与配体结合分子形成缀合物，也可将有义或反义寡核苷酸引入含有靶核苷酸序列的细胞内，如WO 91/04753中所述。合适的配体结合分子包括但不限于细胞表面受体、生长因子、其他细胞因子、或与细胞表面受体结合的其他配体。在一些实施例中，配体结合分子的缀合基本上不干扰配体结合分子与其相应的分子或受体结合的能力，或阻断有义或反义寡核苷酸或其缀合形式进入细胞内。
可替代地，如WO 90/10448中所述，可通过形成寡核苷酸-脂质复合物将有义或反义寡核苷酸引入含有靶核酸序列的细胞内。在一些实施例中，有义或反义寡核苷酸-脂质复合物通过内源性脂肪酶在细胞内解离。
反义或有义RNA或DNA分子一般为长度至少约5个核苷酸，可替代地长度至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000个核苷酸，其中在这个背景下，术语“约”意指参考的核苷酸序列长度加上或减去参考长度的10％。
编码突变型SMO的核苷酸序列也可用于构建杂交探针，用于映射编码该SMO的基因和用于具有遗传病症的个体的遗传分析。本文提供的核苷酸序列可使用已知技术(例如原位杂交、针对已知染色体标记物的连锁分析以及与文库的杂交筛选)来映射到染色体和染色体的特定区域。
潜在的突变型SMO拮抗剂是使用反义技术制备的反义RNA或DNA构建体，其中例如反义RNA或DNA分子通过与靶mRNA杂交并且阻止蛋白质翻译来直接阻断mRNA的翻译。反义技术可通过三螺旋形成或反义DNA或RNA用于控制基因表达，这两种方法均基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，编码本文的突变型SMO的核酸用于设计长度约10至40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸被设计为与涉及转录的基因区域互补(三螺旋-参见Lee等人(1979)Nucl.Acids Res.6:3073；Cooney等人(1988)Science 241:456；Dervan等人(1991)Science 251:1360)，由此阻止突变型SMO的转录和产生。反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交，并且阻断mRNA分子翻译成突变型SMO(Okano(1991)Neurochem.56:560)；OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION,CRC Press,Boca Raton,FL,1988)。上述寡核苷酸也可递送到细胞，使得反义RNA或DNA可在体内表达以抑制突变型SMO的产生。当使用反义DNA时，在一些实施例中，可使用源自翻译起始位点的寡脱氧核糖核苷酸，例如靶基因核苷酸序列的约-10至+10位。
任何核酸都适用于表达突变型SMO蛋白，并且鉴定表达的突变型smoothened蛋白的天然靶或结合配偶体(例如相对于野生型SMO，例如野生型人SMO，具有T241M、W281C、I408V、A459V、C469Y、S533N和/或W535L突变的smoothened蛋白)。核酸也可用于研究突变型smoothened生物活性，从各种细胞和组织中纯化突变型smoothened及其结合配偶体，以及鉴定hedgehog信号传导途径的其他组分。
II.小分子
突变型SMO的潜在拮抗剂包括结合在野生型SMO中由GDC-0449占据的位点的小分子，由此阻断突变型SMO的生物活性。小分子的例子包括但不限于小肽或肽样分子例如可溶性肽、以及合成的非肽基有机或无机化合物。
核酶是能够催化RNA的特异性切割的酶促RNA分子。核酶通过与互补靶RNA的序列特异性杂交，随后为核酸内切酶切割来起作用。可通过已知技术鉴定潜在RNA靶内的特异性核酶切割位点。关于更多细节，参见例如Rossi(1994)Current Biology,4:469-471和PCT公开号WO 97/33551(1997年9月18日公开)。
用于抑制转录的三螺旋形成中的核酸分子应为单链的，并且由脱氧核苷酸组成。这些寡核苷酸的碱基组成被设计成使得它经由Hoogsteen碱基配对规则促进三螺旋形成，其一般需要在双链体的一条链上相当大的嘌呤或嘧啶段。关于更多细节，参见例如PCT公开号WO 97/33551，同上。
这些小分子可通过上文讨论的任何一种或多种筛选测定和/或通过本领域技术人员众所周知的任何其他筛选技术来鉴定。
III.蛋白质
本公开内容提供了分离的突变型SMO蛋白。野生型人SMO显示于SEQ ID NO:1中。在一些实施例中，突变型SMO蛋白对维莫德吉部分或完全抗性。在一些实施例中，突变型SMO蛋白在细胞中对维莫德吉部分或完全抗性，所述细胞在编码hedgehog信号传导途径中的蛋白质的基因中具有另外的突变。在一些实施例中，另外的突变是本文所述的任何修补和/或SUFU突变。
在一些实施例中，本公开内容提供了包含氨基酸序列的分离的突变型SMO蛋白，其中所述氨基酸序列在对应于野生型SMO氨基酸序列的第239位的氨基酸位置处包含除丙氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是在氨基酸位置239处存在取代。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:1的第239位的氨基酸位置处包含除丙氨酸(A)外的氨基酸。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是SMO蛋白在对应于SEQ ID NO:1的第239位的氨基酸位置处包含缬氨酸(V)。
在一些实施例中，本公开内容提供了包含氨基酸序列的分离的突变型SMO蛋白，其中所述氨基酸序列在对应于野生型SMO氨基酸序列的第241位的氨基酸位置处包含除苏氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是在氨基酸位置241处存在取代。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:1的第241位的氨基酸位置处包含除苏氨酸(T)外的氨基酸。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是SMO蛋白在对应于SEQ ID NO:1的第241位的氨基酸位置处包含甲硫氨酸(M)。
在一些实施例中，本公开内容提供了包含氨基酸序列的分离的突变型SMO蛋白，其中所述氨基酸序列在对应于野生型SMO氨基酸序列的第281位的氨基酸位置处包含除色氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是在氨基酸位置281处存在取代。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:1的第281位的氨基酸位置处包含除色氨酸(W)外的氨基酸。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是SMO蛋白在对应于SEQ ID NO:1的第281位的氨基酸位置处包含半胱氨酸(C)。
在一些实施例中，本公开内容提供了包含氨基酸序列的分离的突变型SMO蛋白，其中所述氨基酸序列在对应于野生型SMO氨基酸序列的第408位的氨基酸位置处包含除异亮氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是在氨基酸位置408处存在突变。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:1的第408位的氨基酸位置处包含除异亮氨酸(I)外的氨基酸。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是SMO蛋白在对应于SEQ ID NO:1的第408位的氨基酸位置处包含缬氨酸(V)。
在一些实施例中，本公开内容提供了包含氨基酸序列的分离的突变型SMO蛋白，其中所述氨基酸序列在对应于野生型SMO氨基酸序列的第459位的氨基酸位置处包含除丙氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是在氨基酸位置459处存在突变。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:1的第459位的氨基酸位置处包含除丙氨酸(A)外的氨基酸。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是SMO蛋白在对应于SEQ ID NO:1的第459位的氨基酸位置处包含缬氨酸(V)。
在一些实施例中，本公开内容提供了包含氨基酸序列的分离的突变型SMO蛋白，其中所述氨基酸序列在对应于野生型SMO氨基酸序列的第469位的氨基酸位置处包含除半胱氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是在氨基酸位置469处存在突变。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:1的第469位的氨基酸位置处包含除半胱氨酸(C)外的氨基酸。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是SMO蛋白在对应于SEQ ID NO:1的第469位的氨基酸位置处包含酪氨酸(Y)。
在一些实施例中，本公开内容提供了包含氨基酸序列的分离的突变型SMO蛋白，其中所述氨基酸序列在对应于野生型SMO氨基酸序列的第533位的氨基酸位置处包含除丝氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是在氨基酸位置533处存在突变。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:1的第533位的氨基酸位置处包含除丝氨酸(S)外的氨基酸。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是SMO蛋白在对应于SEQ ID NO:1的第533位的氨基酸位置处包含天冬酰胺(N)。
在一些实施例中，本公开内容提供了包含氨基酸序列的分离的突变型SMO蛋白，其中所述氨基酸序列在对应于野生型SMO氨基酸序列的第535位的氨基酸位置处包含除色氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是在氨基酸位置535处存在突变。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:1的第535位的氨基酸位置处包含除色氨酸(W)外的氨基酸。在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是SMO蛋白在对应于SEQ ID NO:1的第535位的氨基酸位置处包含亮氨酸(L)。
在一些实施例中，SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是SMO蛋白包含表4所示的氨基酸突变中的至少一个(参见实例6)。
在一些实施例中，突变型人SMO显示于SEQ ID NO:6中，其中氨基酸241显示为“Xaa”，就本申请而言，所述Xaa代表除苏氨酸(T)外的任何氨基酸。在一些实施例中，Xaa是甲硫氨酸(M)。
在一些实施例中，突变型人SMO显示于SEQ ID NO:2中，其中氨基酸281显示为“Xaa”，就本申请而言，所述Xaa代表除色氨酸(W)外的任何氨基酸。在一些实施例中，Xaa是半胱氨酸(C)。
在一些实施例中，突变型人SMO显示于SEQ ID NO:7中，其中氨基酸408显示为“Xaa”，就本申请而言，所述Xaa代表除异亮氨酸(I)外的任何氨基酸。在一些实施例中，Xaa是缬氨酸(V)。
在一些实施例中，突变型人SMO显示于SEQ ID NO:3中，其中氨基酸459显示为“Xaa”，就本申请而言，所述Xaa代表除丙氨酸(A)外的任何氨基酸。在一些实施例中，Xaa是缬氨酸(V)。
在一些实施例中，突变型人SMO显示于SEQ ID NO:8中，其中氨基酸469显示为“Xaa”，就本申请而言，所述Xaa代表除半胱氨酸(C)外的任何氨基酸。在一些实施例中，Xaa是酪氨酸(Y)。
在一些实施例中，突变型人SMO显示于SEQ ID NO:9中，其中氨基酸533显示为“Xaa”，就本申请而言，所述Xaa代表除丝氨酸(S)外的任何氨基酸。在一些实施例中，Xaa是天冬酰胺(N)。
在一些实施例中，Xaa是缬氨酸(V)。在一些实施例中，突变型人SMO显示于SEQ IDNO:4中，其中氨基酸535显示为“Xaa”，就本申请而言，所述Xaa代表除色氨酸(W)外的任何氨基酸。在一些实施例中，Xaa是亮氨酸(L)。
在一些实施例中，任何突变型SMO蛋白都缺乏对应于SEQ ID NO:1-9中任一个的第1位的N末端甲硫氨酸。
突变型SMO及其片段可使用本文所述的突变型SMO核酸在如本领域众所周知的重组系统中产生。这样的核酸可掺入如本领域众所周知的表达载体内，并且转染到宿主细胞内，取决于所提出的蛋白质的用途，所述宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。例如，突变型SMO的全长或片段(其中片段含有至少SMO的第一跨膜和人SMO的第241位、SMO的第二跨膜结构域和人SMO的第281位、SMO的第五跨膜结构域和人SMO的第408位、SMO的第六跨膜结构域和人SMO的第459或469位、和/或SMO的第七跨膜和人SMO的第533或533位)可用作免疫原来产生本公开内容的抗体、或纯化本公开内容的抗体。
在一些实施例中，SMO蛋白或其片段具有野生型SMO多肽(例如具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的SMO蛋白)的相同生物活性中的至少一种。在一些实施例中，与野生型SMO蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的SMO蛋白)相比，突变型SMO蛋白(例如在对应于SEQID NO:1的氨基酸241或459的氨基酸位置处具有突变的SMO蛋白)具有增加的基础生物活性。术语“生物活性(biological activity)”、“生物活性(bioactivity)”或“功能”意指SMO蛋白或其片段能够实现与野生型SMO蛋白相关的至少一种功能，例如转导hedgehog信号传导途径和/或诱导Gli1表达。在某些实施例中，SMO蛋白结合驱动蛋白运动蛋白Costal-2。术语“生物活性(biological activity)”、“生物活性(bioactivity)”和“功能”在本文中可互换使用。
在一些实施例中，任何SMO蛋白(例如本文所述的任何突变型SMO蛋白)都能够转导hedgehog信号传导。术语“具有能力”或“能够”意指所述蛋白质将在合适的条件(例如生理条件或标准实验室条件)下实现所述的生物活性。在某些实施例中，术语“可以”可用于描述这种能力(例如“可结合”或“结合”给定序列)。例如如果SMO蛋白(例如本文所述的任何突变型SMO蛋白)具有促进hedgehog信号传导的能力或能够促进hedgehog信号传导，则SMO蛋白能够在正常生理条件下促进细胞中的hedgehog信号传导。本领域普通技术人员将理解需要哪些条件来测试多肽是否具有实现所述生物活性的能力或能够实现所述生物活性。
在一些实施例中，本文所述的SMO和突变型SMO蛋白包含smoothened功能获得突变。在一些实施例中，功能获得smoothened突变导致组成型活性的smoothened蛋白。在某些实施例中，Smoothened中的突变包含在任何特异性位置处的突变，例如对应于SEQ ID NO:1中的特定位置的位置，如上文关于筛选测定所述。参见例如WO 2011/028950和WO2012047968，其各自以引用的方式并入。在一些实施例中，smoothened突变是在对应于SEQID NO:1的第535位的位置处的突变。在某些实施例中，突变是在对应于SEQ ID NO:1的第562位的位置处的突变。在某些实施例中，突变是在第535位处或在SEQ ID NO:1中的该相应位置处的W535L。在一些实施例中，smoothened突变是对应于SEQ ID NO:1的第R562Q位的突变(在第562位处或在对应于SEQ ID NO:1的第562位的位置处的R562Q突变)。在一些实施例中，smoothened突变是在对应于SEQ ID NO:1的第412位的位置处的突变，例如在SEQ IDNO:1的这种位置处的L412F。在一些实施例中，smoothened突变具有使得其对某些smoothened抑制剂抗性的突变。在一些实施例中，smoothened蛋白包含在SEQ ID NO:1的氨基酸位置518处或在对应于SEQ ID NO:1的第518位的位置处的替代氨基酸改变。在一些实施例中，氨基酸改变是在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置518的氨基酸位置处的E518K或E518A取代。在一些实施例中，smoothened蛋白包含在SEQ ID NO:1的氨基酸位置473处或对应于SEQ ID NO:1的第473位的位置处的氨基酸改变。
在一些实施例中，本文所述的任何SMO蛋白(例如本文所述的任何突变型SMO蛋白)与另一种试剂融合。在一些实施例中，SMO蛋白与另一种多肽融合。
本文所述的任何突变型SMO蛋白都适用于鉴定突变型smoothened蛋白的天然靶或结合配偶体(例如具有T241M、W281C、I408V、A459V、C469Y、S533N和/或W535L突变的smoothened蛋白)。突变型SMO蛋白也可用于研究突变型smoothened生物活性，从各种细胞和组织中纯化突变型smoothened及其结合配偶体，以及鉴定hedgehog信号传导途径的其他组分。
IV.抗体
A.抗突变型SMO抗体
在一个方面，本公开内容提供了结合SMO，特别是突变型SMO的抗体。在一些实施例中，本文公开的任何抗体特异性结合本文所述的任何突变型SMO多肽。例如，突变型SMO多肽包含由本公开内容的抗体特异性结合的表位。在一些实施例中，抗体特异性结合SMO蛋白，所述SMO蛋白包含与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是在对应于SEQ ID NO:1的第241、281、408、459、469、533和/或535位的氨基酸位置处存在突变。在一些实施例中，抗体不特异性结合具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的SMO蛋白，或与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的SMO蛋白相比，优先结合突变型SMO蛋白(例如结合对突变型SMO蛋白是选择性的)。在一些实施例中，抗体不结合在对应于SEQ ID NO:1的第241、281、408、459、469、533和/或535位的任何一个氨基酸位置处缺乏突变的SMO蛋白。
在一个实施例中，抗SMO抗体是单克隆抗体。在一个实施例中，抗SMO抗体是抗体片段，例如Fab、Fab’-SH、Fv、scFv或(Fab’)2片段。在一个实施例中，抗突变型SMO抗体是嵌合、人源化或人抗体。在一个实施例中，抗SMO抗体是纯化的。在某些实施例中，组合物是用于治疗癌症的药物制剂。
1.抗体片段
本公开内容包含抗体片段。抗体片段可通过传统手段例如酶促消化或通过重组技术生成。在某些情况下，使用抗体片段而不是整个抗体具有优点。片段的较小尺寸允许快速清除，并且可导致改善的对实体瘤的接近。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人(2003)Nat.Med.9:129-134。
已开发了用于产生抗体片段的各种技术。传统上，这些片段经由完整抗体的蛋白水解消化得到(参见例如Morimoto等人，Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24:107-117(1992)；和Brennan等人，Science,229:81(1985))。然而，这些片段现在可由重组宿主细胞直接产生。Fab、Fv和ScFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达和从其分泌，因此允许容易地产生大量的这些片段。可从上文讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。可替代地，可从大肠杆菌中直接回收Fab'-SH片段，并且化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等人，Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一种方法，可从重组宿主细胞培养物中直接分离F(ab')2片段。包含补救受体结合表位残基的具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段在美国专利号5,869,046中描述。用于生产抗体片段的其他技术对于技术人员将是显而易见的。在某些实施例中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利号5,571,894；和5,587,458。Fv和scFv是缺乏恒定区的具有完整组合位点的唯一种类；因此，它们可适合于在体内使用期间减少的非特异性结合。可构建scFv融合蛋白以得到在scFv的氨基或羧基末端处效应蛋白的融合。参见Antibody Engineering，Borrebaeck编辑，同上。抗体片段也可为“线性抗体”，例如如美国专利号5,641,870中所述。这样的线性抗体可为单特异性的或双特异性的。
2.人源化抗体
本公开内容包含人源化抗体。用于人源化非人抗体的各种方法是本领域已知的。例如，人源化抗体可具有从其为非人的源引入其内的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。人源化可通过用高变区序列取代人抗体的相应序列，基本上遵循Winter和同事的方法(Jones等人(1986)Nature321:522-525；Riechmann等人(1988)Nature 332:323-327；Verhoeyen等人(1988)Science239:1534-1536)进行。相应地，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上小于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列所取代。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些高变区残基和可能的一些FR残基被来自啮齿类动物抗体中的类似位点的残基取代。
用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻和重两者)的选择对于降低抗原性可以是重要的。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿类动物抗体的可变结构域的序列。然后接受与啮齿类动物最接近的人序列作为人源化抗体的人构架。参见例如Sims等人(1993)J.Immunol.151:2296；Chothia等人(1987)J.Mol.Biol.196:901。另一种方法使用源自轻链或重链特定亚组的完全人抗体的共有序列的特定构架。相同的构架可用于几种不同的人源化抗体。参见例如Carter等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285；Presta等人(1993)J.Immunol.,151:2623。
进一步一般期望抗体伴随对抗原的高亲和力和其他有利的生物学性质的保留被人源化。为了实现这一目标，根据一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型的亲本序列和各种概念性人源化产物的分析过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，并且是本领域技术人员所熟悉的。举例说明和展示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可获得的。检查这些展示允许残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用的分析，即影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基的分析。以这种方式，可从受体和输入序列中选择和组合FR残基，使得实现所需的抗体特征，例如增加的对靶抗原的亲和力。一般而言，高变区残基直接和最基本地涉及影响抗原结合。
3.人抗体
如上所述，可通过将选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列与已知的人恒定结构域序列组合，来构建本公开内容的人抗体。可替代地，本公开内容的人单克隆抗体可通过杂交瘤方法进行制备。用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已例如通过Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人，MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人，J.Immunol.,147:86(1991)描述。
现在能够生成转基因动物(例如小鼠)，在免疫后所述转基因动物能够在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的完全储库。例如，已描述了嵌合和种系突变小鼠中的抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。在这种种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击后人抗体的产生。参见例如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA,90:2551(1993)；Jakobovits等人，Nature,362:255(1993)；Bruggermann等人，Year in Immunol.,7:33(1993)。
基因改组也可用于从非人例如啮齿类动物抗体得到人抗体，其中人抗体具有与起始非人抗体相似的亲和力和特异性。根据也称为“表位印记”的这种方法，通过如本文所述的噬菌体展示技术获得的非人抗体片段的重链或轻链可变区被替换为人V结构域基因的储库，产生非人链/人链scFv或Fab嵌合体的群体。用抗原的选择导致非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人链恢复在去除原代噬菌体展示克隆中的相应非人链时被破坏的抗原结合位点，即表位控制(印记)人链配偶体的选择。当重复该过程以便替换剩余的非人链时，获得人抗体(参见1993年4月1日公开的PCT WO 93/06213)。与通过CDR移植的非人抗体的传统人源化不同，该技术提供了不具有非人起源的FR或CDR残基的完全人抗体。
4.双特异性抗体
双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施例中，双特异性抗体是人抗体或人源化抗体。在某些实施例中，结合特异性之一是针对SMO，并且另一种是针对任何其他抗原。在某些实施例中，双特异性抗体可结合SMO的两个不同表位。双特异性抗体也可用于将细胞毒素剂定位于表达SMO的细胞。这些抗体具有SMO结合臂和结合细胞毒素剂的臂，所述细胞毒素剂例如皂素、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原。双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异性抗体)。
用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组生产基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello，Nature,305:537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和色谱步骤完成的正确分子的纯化是相当麻烦的，并且产物产率很低。在1993年5月13日公开的WO 93/08829和Traunecker等人，EMBO J.,10:3655(1991)中公开了类似的程序。
根据不同的方法，具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合物例如具有免疫球蛋白重链恒定结构域，包含铰链、CH2和CH3区域的至少部分。在某些实施例中，含有轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)存在于融合物的至少一种中。将编码免疫球蛋白重链融合物和需要时的免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体内，并且共转染到合适的宿主生物内。当在构建中使用的三条多肽链的不相等比率提供最佳产率时，这提供了在实施例中调整三种多肽片段的相互比例的极大灵活性。然而，当相等比率的至少两条多肽链的表达导致高产率或当这些比率没有特别意义时，能够将两条或所有三条多肽链的编码序列插入一个表达载体中。
在该方法的一个实施例中，双特异性抗体由在一个臂中的具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和在另一个臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现这种不对称结构促进了所需双特异性化合物与不需要的免疫球蛋白链组合的分离，因为双特异性分子的仅一半中的免疫球蛋白轻链的存在提供了容易的分离方式。该方法公开于WO 94/04690中。关于生成双特异性抗体的更多细节，参见例如Suresh等人，Methods in Enzymology,121:210(1986)。
根据另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，以使从重组细胞培养物中回收的异二聚体百分比达到最大。界面包含抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在该方法中，来自第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链被替换为较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)。通过用较小的侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似尺寸的补偿性“空腔”。这提供了用于增加异二聚体的产率超过其他不需要的终产物例如同二聚体的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源缀合物”抗体。例如，异源缀合物中的一种抗体可与抗生物素蛋白偶联，另一种与生物素偶联。例如，已提出这样的抗体以将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利号4,676,980)，以及用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/00373和EP 03089)。异源缀合物抗体可使用任何方便的交联方法制备。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且连同许多交联技术一起公开于美国专利号4,676,980中。
用于从抗体片段生成双特异性抗体的技术也已在文献中描述。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等人，Science,229:81(1985)描述了其中完整抗体被蛋白水解切割以生成F(ab')2片段的程序。这些片段在二硫醇络合剂亚砷酸钠的存在下还原，以稳定邻位二硫醇并且阻止分子间二硫键形成。然后将生成的Fab'片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将Fab'-TNB衍生物之一再转化为Fab'-硫醇，并且与等摩尔量的其他Fab'-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可用作用于酶的选择性固定的试剂。
最近的进展已促进从大肠杆菌中直接回收Fab'-SH片段，其可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等人，J.Exp.Med.,175:217-225(1992)描述了完全人源化双特异性抗体F(ab')2分子的产生。每个Fab'片段分别从大肠杆菌分泌并且在体外经受定向化学偶联，以形成双特异性抗体。因此形成的双特异性抗体能够结合过表达HER2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶的裂解活性。
还已描述了用于从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生产双特异性抗体。Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后再氧化形成抗体异二聚体。该方法也可用于生产抗体同二聚体。通过Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术已提供了用于制备双特异性抗体片段的替代机制。片段包含通过接头连接到轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)，所述接头太短而不允许在同一链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫与另一个片段的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还已报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等人，J.Immunol.,152:5368(1994)。
考虑具有多于两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)。
5.多价抗体
通过表达抗体与之结合的抗原的细胞，多价抗体可比二价抗体更快内化(和/或分解代谢)。本公开内容的抗体可为具有三个或更多个抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(其不同于IgM类别的抗体)，所述多价抗体可通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而容易地产生。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多个抗原结合位点。在某些实施例中，二聚化结构域包含Fc区或铰链区(或由其组成)。在这种情况下，抗体将包含Fc区和Fc区氨基末端的三个或更多个抗原结合位点。在某些实施例中，多价抗体包含3至约8个抗原结合位点(或由其组成)。在一个这样的实施例中，多价抗体包含四个抗原结合位点(或由其组成)。多价抗体包含至少一条多肽链(例如两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或更多个可变结构域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2表示氨基酸或多肽，并且n是0或1。例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体还可包含至少两个(例如四个)轻链可变结构域多肽。本文的多价抗体可例如包含约2至约8个轻链可变结构域多肽。此处考虑的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，并且任选地还包含CL结构域。
6.单结构域抗体
在一些实施例中，本公开内容的抗体是单结构域抗体。单结构域抗体是包含抗体的重链可变结构域的全部或一部分或者轻链可变结构域的全部或一部分的单条多肽链。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。在一个实施例中，单结构域抗体由抗体的重链可变结构域的全部或一部分组成。
7.抗体变体
在一些实施例中，考虑了本文所述的抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质。抗体的氨基酸序列变体可通过将适当的改变引入编码抗体的核苷酸序列内，或通过肽合成来制备。这样的修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入和取代的任何组合以取得最终构建体，条件是最终构建体具有所需的特征。氨基酸改变可在制备序列时被引入主题抗体氨基酸序列中。
用于鉴定其为诱变可能位置的抗体的某些残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如通过Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。此处，鉴定残基或一组靶残基(例如荷电残基，例如arg、asp、his、lys和glu)，并且替换为中性或带负电荷的氨基酸(如丙氨酸或聚丙氨酸)，以影响氨基酸与抗原的相互作用。证实对取代的功能敏感性的那些氨基酸位置然后通过在取代位点处引入进一步变体或其他变体，或对于取代位点引入进一步变体或其他变体来进行精制。因此，虽然预先确定了用于引入氨基酸序列变化的位点，但突变本身的性质无需预先确定。例如，为了分析在给定位点处的突变的性能，在靶密码子或区域处进行ala扫描或随机诱变，并且就所需活性筛选表达的免疫球蛋白。
氨基酸序列插入包括长度从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列间插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N末端或C末端与酶(例如用于ADEPT)或增加抗体血清半衰期的多肽的融合。
在某些实施例中，改变本公开内容的抗体以增加或减少抗体被糖基化的程度。多肽的糖基化通常是N联或O联的。N联指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的附着。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸)是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶促附着的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列任一的存在产生潜在的糖基化位点。O联糖基化指糖类N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸(最常见为丝氨酸或苏氨酸)的附着，尽管也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列使得产生或去除上述三肽序列中的一个或多个(对于N联糖基化位点)，方便地实现糖基化位点对抗体的添加或缺失。也可通过一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基对原始抗体序列的添加、缺失或取代(对于O联糖基化位点)进行改变。
当抗体包含Fc区时，可改变与之附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的双触角(biantennary)寡糖，其一般通过N键与Fc区的CH2结构域的Asn297附着。参见例如Wright等人(1997)TIBTECH 15:26-32。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附着到双触角寡糖结构的“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可进行本公开内容的抗体中寡糖的修饰，以便产生具有某些改善性质的抗体变体。
例如，提供具有碳水化合物结构的抗体变体，所述碳水化合物结构缺乏与Fc区(直接或间接)附着的岩藻糖。这样的变体可具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开号US2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“脱岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”抗体变体相关的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US2003/0157108 A1，Presta，L；和WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其是在实施例11处)和敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
还提供了具有二等分寡糖的抗体变体，例如其中与抗体的Fc区附着的双触角寡糖被GlcNAc二等分。这样的抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这样的抗体变体的例子在例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)中；美国专利号6,602,684(Umana等人)；和US 2005/0123546(Umana等人)中描述。还提供了与Fc区附着的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这样的抗体变体可具有改善的CDC功能。这样的抗体变体在例如WO 1997/30087(Patel等人)中；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)中描述。
在某些实施例中，抗体变体包含具有一个或多个氨基酸取代的Fc区，所述氨基酸取代进一步改善ADCC，例如在Fc区的第298、333和/或334位处的取代(残基的Eu编号)。这样的取代可与上述变化中的任一种组合发生。
在某些实施例中，本公开内容考虑了具有一些但不是全部效应子功能的抗体变体，这使其成为许多应用的期望候选物，在这些应用中，抗体的体内半衰期很重要，但某些效应子功能(例如补体和ADCC)是不必要或有害的。在某些实施例中，测量抗体的Fc活性以确保仅保持所需的性质。可进行体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的减少/耗尽。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定，以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达Fc(RI、Fc(RII和Fc(RIII。造血细胞上的FcR表达在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)的第464页上的表3中概括。在美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中描述了评价目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性例子。可替代地，可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。用于这种测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外，可在体内例如在动物模型如Clynes等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中所公开的那种中，评价目的分子的ADCC活性。也可进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。为了评价补体活化，可进行CDC测定(参见例如，Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。FcRn结合和体内清除/半衰期测定也可使用本领域已知的方法进行(参见例如Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
提供了具有一个或多个氨基酸取代的其他抗体变体。用于取代诱变的目的位点包括高变区，但也考虑了FR改变。保守取代在表1中显示在“优选取代”的标题下。表1中提供了命名为“示例性取代”的更大量的变化，或如下文提及氨基酸类别进一步描述的。可将氨基酸取代引入目的抗体内，并且就例如所需的活性，例如改善的抗原结合、降低的免疫原性、改善的ADCC或CDC等筛选产物。
表1
可通过选择影响下述的取代来实现抗体的生物学性质的修饰：(a)取代区域中的多肽主链结构，例如作为片层或螺旋构象，(b)在靶位点处的分子电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。氨基酸可根据其侧链性质的相似性进行分组(A.L.Lehninger，Biochemistry，第二版，第73-75页，Worth Publishers,New York(1975))：
(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)不荷电的极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)
(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)
可替代地，天然存在的残基可基于共同的侧链性质分成组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要交换这些类别之一与另一个类别的成员。这些取代的残基也可引入保守的取代位点内，或引入剩余的(非保守的)位点内。
一类取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，选择用于进一步开发的所得到的变体将相对于它们由其生成的亲本抗体具有经修饰的(例如改善的)生物学性质。示例性的取代变体是亲和力成熟的抗体，其可使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简言之，使几个高变区位点(例如6-7个位点)突变，以生成在每个位点处所有可能的氨基酸取代。因此生成的抗体从丝状噬菌体颗粒展示为与每个颗粒内包装的噬菌体外壳蛋白(例如M13的基因III产物)的至少部分的融合物。然后就其生物活性(例如结合亲和力)筛选噬菌体展示的变体。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行扫描诱变(例如丙氨酸扫描)以鉴定显著促成抗原结合的高变区。可替代地或另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。这样的接触残基和相邻的残基是根据本领域已知的技术用于取代的候选物，包括本文详述的那些。一旦生成了这样的变体，就使用本领域已知的技术(包括本文所述的技术)使变体实验对象组经受筛选，并且可选择在一个或多个相关测定中具有优异性质的变体用于进一步开发。
通过本领域已知的各种方法制备编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于从天然源(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)中分离，或通过早期制备的变体或抗体的非变体形式的寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变的制备。
可能期望在本公开内容的抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，由此生成Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置处的氨基酸修饰(例如取代)(包括铰链半胱氨酸的那种)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
根据本说明书和本领域的教导，在一些实施例中，考虑本公开内容的抗体可包含与野生型配对物抗体相比，例如在Fc区中的一个或多个改变。然而，与其野生型配对物相比，这些抗体仍将保留治疗效用所需的基本上相同的特征。例如，认为可在Fc区作出某些改变，这些改变将导致改变(即改善或减弱的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如如WO99/51642中所述。关于Fc区变体的其他例子，还参见Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO94/29351。WO00/42072(Presta)和WO 2004/056312(Lowman)描述了具有与FcR改善或减弱的结合的抗体变体。这些专利出版物的内容特别以引用的方式并入本文。还参见Shields等人J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。具有增加的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体在US2005/0014934A1(Hinton等人)中描述，所述FcRn负责将母源IgG转移到胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))。这些抗体包含在其中具有一个或多个取代的Fc区，所述取代改善Fc区与FcRn的结合。具有改变的Fc区氨基酸序列和增加或减少的C1q结合能力的多肽变体在美国专利号6,194,551B1、WO99/51642中描述。这些专利公开的内容特别以引用的方式并入本文。还参见Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
在另一个方面，本公开内容提供了在包含Fc区的Fc多肽界面中包含修饰的抗体，其中所述修饰促进和/或促成异二聚化。这些修饰包含将突起引入第一Fc多肽内并且将空腔引入第二Fc多肽内，其中突起可定位在空腔中，以便促进第一Fc多肽和第二Fc多肽的络合。生成具有这些修饰的抗体的方法是本领域已知的，例如如美国专利号5,731,168中所述。
在另外一个方面，可能期望产生半胱氨酸改造的抗体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，取代的残基出现在抗体的可接近位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此定位在抗体的可接近位点处，并且可用于将抗体缀合到其他部分，例如药物部分或接头-药物部分，如本文进一步描述的。在某些实施例中，下述残基中的任何一个或多个可被半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc r的S400(EU编号)
8.抗体衍生物
还可修饰本公开内容的抗体，以含有本领域已知的并且易于获得的另外的非蛋白质性部分。在一些实施例中，适合于抗体衍生化的部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而可具有制造方面的优点。聚合物可具有任何分子量，并且可为分支或非分支的。附着到抗体的聚合物数目可变化，并且如果附着多于一个的聚合物，则它们可为相同或不同的分子。一般而言，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可基于考虑来确定，所述考虑包括但不限于要改善的抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。
在另一个实施例中，本发明提供了可通过暴露于辐射而选择性加热的抗体和非蛋白质性部分的缀合物。在一个实施例中，非蛋白质性部分是碳纳米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可具有任何波长，并且包括但不限于不伤害普通细胞，但将非蛋白质性部分加热到抗体-非蛋白质性部分附近的细胞被杀死的温度的波长。
B.制备抗体的某些方法
1.某些基于杂交瘤的方法
本公开内容的单克隆抗体可使用杂交瘤方法进行制备，所述杂交瘤方法首先由Kohler等人，Nature,256:495(1975)描述，并且例如在下述中进一步描述：Hongo等人，Hybridoma,14(3):253-260(1995)，Harlow等人，Antibodies:A Laboratory Manual，(ColdSpring Harbor Laboratory Press，第2版1988)；Hammerling等人，MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)，以及关于人-人杂交瘤，Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)。
关于从杂交瘤细胞系产生单克隆人天然IgM抗体，另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826中描述的那些。人杂交瘤技术(三源杂交瘤技术)在Vollmers和Brandlein，Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中描述。
对于各种其他杂交瘤技术，参见例如US 2006/258841；US 2006/183887(完全人抗体)，US 2006/059575；US 2005/287149；US 2005/100546；US 2005/026229；以及美国专利号7,078,492和7,153,507。使用杂交瘤方法用于产生单克隆抗体的示例性方案如下描述。在一个实施例中，使小鼠或其他适当的宿主动物例如仓鼠免疫，以引发产生或能够产生将特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射包含突变型SMO或其片段的多肽，以及佐剂例如单磷酰脂质A(MPL)/海藻糖二氰基霉菌酸酯(dicrynomycolate)(TDM)(Ribi Immunochem.Research,Inc.,Hamilton,MT)，在动物中产生抗体。包含突变型SMO或其片段的多肽可使用本领域众所周知的方法例如重组方法进行制备，所述方法中的一些在本文中进一步描述。就抗突变型SMO抗体测定来自免疫动物的血清，并且任选施用加强免疫。分离来自产生抗突变型SMO抗体的动物的淋巴细胞。可替代地，可在体外免疫淋巴细胞。
然后使用合适的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞。参见例如，Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，第59-103页(Academic Press,1986)。可使用骨髓瘤细胞，所述骨髓瘤细胞有效融合，支持通过所选择的抗体产生细胞的稳定高水平的抗体生产，并且对培养基如HAT培养基敏感。示例性骨髓瘤细胞包括但不限于鼠骨髓瘤细胞系，例如源自可从Salk Institute Cell DistributionCenter,San Diego,California USA获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，以及可得自美国典型培养物中心，Rockville,Maryland USA的SP-2或X63-Ag8-653细胞。还已描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
将因此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种并生长，所述培养基例如含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质的培养基。例如如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，所述物质阻止HGPRT缺陷细胞的生长。在一些实施例中，无血清杂交瘤细胞培养方法用于减少动物来源的血清如胎牛血清的使用，如例如Even等人，Trends in Biotechnology,24(3),105-108(2006)中所述。
作为用于改善杂交瘤细胞培养物的生产率的工具的寡肽在Franek,Trends inMonoclonal Antibody Research,111-122(2005)中描述。具体地，标准培养基富含某些氨基酸(丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、脯氨酸)或蛋白质水解级分，并且细胞凋亡可被由3至6个氨基酸残基构成的合成寡肽显著抑制。肽以毫摩尔或更高浓度存在。
可就结合突变型SMO的单克隆抗体的产生测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可通过免疫沉淀或通过体外结合测定(例如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力可例如通过Scatchard分析来测定。参见例如Munson等人，Anal.Biochem.,107:220(1980)。
在鉴定产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，克隆可通过有限稀释程序亚克隆并且通过标准方法生长。参见例如，Goding，同上。用于该目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物体内生长为腹水肿瘤。通过常规的免疫球蛋白纯化程序例如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱，从培养基、腹水或血清中适当地分离由亚克隆分泌的单克隆抗体。用于从杂交瘤细胞中分离蛋白质的一个程序在US 2005/176122和美国专利号6,919,436中描述。该方法包括在结合过程中使用最少的盐，例如易溶盐，并且在一些实施例中，在洗脱过程中也使用少量的有机溶剂。
2.某些文库筛选方法
本公开内容的抗体可通过使用组合文库来筛选具有一种或多种所需活性的抗体进行制备。例如，本领域已知用于生成噬菌体展示文库并在此类文库中筛选具有所需结合特征的抗体的各种方法。这种方法一般在Hoogenboom等人Methods in Molecular Biology178:1-37(O'Brien等人，编辑，Human Press,Totowa,NJ,2001)中描述。例如，生成目的抗体的一种方法是通过使用噬菌体抗体文库，如Lee等人，J.Mol.Biol.(2004),340(5):1073-93中所述。
原则上，通过筛选含有噬菌体的展示与噬菌体外壳蛋白融合的抗体可变区(Fv)的各种片段的噬菌体文库，来选择合成抗体克隆。这样的噬菌体文库通过针对所需抗原的亲和色谱来淘选。表达能够结合所需抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，并且因此与文库中的非结合克隆分开。然后从抗原中洗脱结合克隆，并且可通过抗原吸附/洗脱的另外循环进一步富集。本公开内容的任何抗体均可通过Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中所述获得：设计合适的抗原筛选程序来选择目的噬菌体克隆，随后为使用来自目的噬菌体克隆的Fv序列和合适的恒定区(Fc)序列构建全长抗体克隆。
在某些实施例中，抗体的抗原结合结构域由约110个氨基酸的两个可变(V)区域形成，每个区域各自来自轻(VL)链和重(VH)链，两者均呈现三个高变环(HVR)或互补决定区(CDR)。可变区可在噬菌体上以功能方式展示为单链Fv(scFv)片段，其中VH和VL通过短的、柔性的肽共价连接，或者展示为Fab片段，其中它们各自融合到恒定结构域并且非共价相互作用，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。如本文使用的，编码噬菌体克隆的scFv和编码噬菌体克隆的Fab统称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。
可通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的储库，并且在噬菌体文库中随机重组，然后可在所述噬菌体文库中搜索抗原结合克隆，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。来自免疫源的文库提供了针对免疫原的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。可替代地，如通过Griffiths等人，EMBO J,12:725-734(1993)描述的，可克隆首次用于实验的储库，以提供针对广泛范围的非自身抗原以及自身抗原的单一人抗体源，而无需任何免疫。最后，还可通过克隆来自干细胞的未重排的V基因区段，并且使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区且在体外完成重排，来合成制备首次用于实验的文库，如通过Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)描述的。
在某些实施例中，丝状噬菌体用于通过与次要外壳蛋白pIII融合来展示抗体片段。抗体片段可展示为单链Fv片段，其中VH和VL结构域通过柔性多肽间隔物在同一多肽链上连接，例如如通过Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)描述的，或者展示为Fab片段，其中一条链与pIII融合，并且另一条链分泌到细菌宿主细胞周质内，在该处Fab-外壳蛋白结构的装配通过置换一些野生型外壳蛋白变得在噬菌体表面上展示，例如如Hoogenboom等人，Nucl.Acids Res.,19:4133-4137(1991)中所述。
一般而言，编码抗体基因片段的核酸得自从人或动物收获的免疫细胞。如果需要偏向有利于抗突变型SMO克隆的文库，则用突变型SMO免疫受试者以生成抗体应答，并且回收脾细胞和/或循环B细胞其他外周血淋巴细胞(PBL)，用于文库构建。在一个实施例中，通过在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列(且缺乏功能性内源性抗体生产系统)的转基因小鼠中生成抗突变型SMO抗体应答，使得突变型SMO免疫导致产生针对突变型SMO的人抗体的B细胞，来获得偏向有利于抗突变型SMO克隆的人抗体基因片段文库。下文描述了人抗体生产转基因小鼠的生成。
通过使用合适的筛选程序来分离表达突变型SMO特异性膜结合抗体的B细胞，例如通过使用突变型SMO亲和色谱的细胞分离，或细胞吸附到荧光染料标记的突变型SMO、随后为流动活化细胞分选(FACS)，可获得对于抗突变型SMO反应性细胞群体的另外富集。
可替代地，来自未免疫供体的脾细胞和/或B细胞或其他PBL的使用提供了可能的抗体储库的更好表示，并且还允许使用在其中突变型SMO不是抗原性的任何动物(人或非人)物种的抗体文库构建。对于掺入体外抗体基因构建的文库，从受试者收获干细胞以提供编码未重排的抗体基因区段的核酸。目的免疫细胞可得自各个动物物种，例如人、小鼠、大鼠、兔、狼(luprine)、犬、猫、猪、牛、马和鸟类物种等。
编码抗体可变基因区段(包括VH和VL区段)的核酸从目的细胞中回收并扩增。在重排的VH和VL基因文库的情况下，所需DNA可通过下述获得：从淋巴细胞中分离基因组DNA或mRNA，随后为用匹配重排的VH和VL基因的5'和3'末端的引物的聚合酶链反应(PCR)，如Orlandi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:3833-3837(1989)中所述，由此制备用于表达的多样V基因储库。可从cDNA和基因组DNA扩增V基因，其中使用在编码成熟V结构域的外显子的5'末端处的反向引物和基于J区段内的正向引物，如Orlandi等人(1989)和Ward等人，Nature,341:544-546(1989)中所述。然而，为了由cDNA扩增，反向引物也可基于前导外显子，如Jones等人，Biotechnol.,9:88-89(1991)中所述，并且正向引物在恒定区内，如Sastry等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:5728-5732(1989)中所述。为了最大化互补性，简并性可掺入引物中，如Orlandi等人(1989)或Sastry等人(1989)中所述。在某些实施例中，通过使用靶向每个V基因家族的PCR引物，以便扩增免疫细胞核酸样品中存在的所有可用的VH和VL排列，来使文库多样性达到最大，例如如Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)的方法中所述，或如Orum等人，Nucleic Acids Res.,21:4491-4498(1993)的方法中所述。为了将扩增的DNA克隆到表达载体内，罕见的限制性位点可作为在一个末端处的标签引入PCR引物内，如Orlandi等人(1989)中所述，或通过用加上标签的引物的进一步PCR扩增引入PCR引物内，如Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)中所述。
合成重排的V基因的储库可在体外源自V基因区段。大多数的人VH基因区段已被克隆且测序(在Tomlinson等人，J.Mol.Biol.,227:776-798(1992)中报道)，并且作图(在Matsuda等人，Nature Genet.,3:88-94(1993)中报道；这些克隆的区段(包括H1和H2环的所有主要构象)可用于生成多样化VH基因储库，其中PCR引物编码具有不同序列和长度的H3环，如Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)中所述。也可制备所有序列多样性集中于单一长度的长H3环的VH储库，如Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4457-4461(1992)中所述。人Vκ和Vλ区段已被克隆且测序(在Williams和Winter,Eur.J.Immunol.,23:1456-1461(1993)中报道)，并且可用于制备合成轻链储库。基于一系列VH和VL折叠以及L3和H3长度的合成V基因储库将编码具有相当大的结构多样性的抗体。在扩增编码DNA的V基因之后，可根据Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)的方法在体外重排种系V基因区段。
可通过以几种方式将VH和VL基因储库组合在一起，来构建抗体片段的储库。每个储库可在不同的载体中产生，并且载体在体外重组，例如如Hogrefe等人，Gene,128:119-126(1993)中所述，或通过组合感染在体内重组，例如Waterhouse等人，Nucl.Acids Res.,21:2265-2266(1993)中描述的loxP系统。体内重组方法利用Fab片段的双链性质来克服由大肠杆菌转化效率对文库大小施加的限制。分别克隆首次用于实验的VH和VL储库，一个进入噬菌粒内，并且另一个进入噬菌体载体内。然后通过含噬菌粒细菌的噬菌体感染组合两个文库，使得每个细胞含有不同的组合，并且文库大小仅受到存在的细胞数目的限制(约1012个克隆)。两个载体均含有体内重组信号，使得VH和VL基因重组到单个复制子上，并且共同包装到噬菌体病毒粒子内。这些巨大的文库提供了具有良好亲和力的大量多样化抗体(约10-8M的Kd-1)。
可替代地，储库可序贯克隆到同一载体内，例如如Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978-7982(1991)中所述，或通过PCR装配在一起，然后克隆，例如如Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)中所述。PCR装配也可用于将VH和VL DNA与编码柔性肽间隔物的DNA连接，以形成单链Fv(scFv)储库。在另外一种技术中，“细胞内PCR装配”用于通过PCR组合在淋巴细胞内的VH和VL基因，然后克隆连锁基因的储库，如Embleton等人，Nucl.Acids Res.,20:3831-3837(1992)中所述。
由首次用于实验的文库(天然的或合成的)产生的抗体可具有中等亲和力(约106至107M-1的Kd-1)，但也可通过从二级文库中构建和重新选择在体外模拟亲和力成熟，如Winter等人(1994)，同上中所述。例如，在Hawkins等人，J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)的方法中，或在Gram等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA,89:3576-3580(1992)的方法中，可通过使用易错聚合酶(在Leung等人，Technique,1:11-15(1989)中报道)在体外随机引入突变。另外，亲和力成熟可通过下述进行：例如使用具有携带跨越目的CDR的随机序列的引物的PCR，使所选择的单个Fv克隆中的一个或多个CDR随机突变，并且筛选较高亲和力的克隆。WO 9607754(1996年3月14日公开)描述了在免疫球蛋白轻链的互补决定区诱导诱变以产生轻链基因文库的方法。另一种有效的方法是将通过噬菌体展示选择的VH或VL结构域与得自未免疫供体的天然存在的V结构域变体储库重组，并且在几轮链重组中筛选更高的亲和力，如Marks等人，Biotechnol.,10:779-783(1992)中所述。该技术允许产生具有约10-9M或更小的亲和力的抗体和抗体片段。
可通过本领域已知的各种技术来完成文库的筛选。例如，突变型SMO可用于涂布吸附板的孔，在附着于吸附板的宿主细胞上表达或用于细胞分选，或与生物素缀合以用链霉抗生物素蛋白包被的珠捕获，或用于淘选噬菌体展示文库的任何其他方法中。
噬菌体文库样品在适合于用吸附剂结合至少一部分噬菌体颗粒的条件下与固定的突变型SMO接触。通常，选择包括pH、离子强度、温度等等的条件来模拟生理条件。洗涤与固相结合的噬菌体，然后通过酸洗脱，例如如Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA,88:7978-7982(1991)中所述，或通过碱洗脱，例如如Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中所述，或通过突变型SMO抗原竞争洗脱，例如在类似于Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)的抗原竞争方法的程序中。噬菌体可在单轮选择中富集20-1,000倍。此外，富集的噬菌体可在细菌培养物中生长，并且经历更多轮的选择。
选择的效率取决于许多因素，包括在洗涤期间的解离动力学，以及单个噬菌体上的多个抗体片段是否可同时与抗原接合。具有快速解离动力学(和弱结合亲和力)的抗体可通过使用短洗涤、多价噬菌体展示和固相中的高抗原包被密度来保留。高密度不仅通过多价相互作用来稳定噬菌体，而且有利于已分离的噬菌体重新结合。通过使用如Bass等人，Proteins,8:309-314(1990)和WO 92/09690中所述的长洗涤和单价噬菌体展示，以及如Marks等人，Biotechnol.,10:779-783(1992)中所述的低抗原包被密度，可促进选择具有缓慢解离动力学(和良好的结合亲和力)的抗体。
对于突变型SMO，能够在具有不同亲和力，甚至具有略微不同的亲和力的噬菌体抗体之间选择。然而，所选择的抗体的随机突变(例如如在一些亲和力成熟技术中进行的)可能引起许多突变体，大多数与抗原结合，并且少数具有较高亲和力。使用有限的突变型SMO，可竞争出罕见的高亲和力噬菌体。为了保留所有更高亲和力的突变体，噬菌体可与过量的生物素化的突变型SMO一起温育，但是生物素化的突变型SMO处于比突变型SMO的靶摩尔亲和常数低的摩尔浓度的浓度。然后可通过链霉抗生物素蛋白包被的顺磁珠捕获高亲和力结合噬菌体。这种“平衡捕获”允许根据它们的结合亲和力来选择抗体，其灵敏度允许从具有较低亲和力的大量过量噬菌体中分离具有低至两倍高的亲和力的突变体克隆。用于洗涤结合固相的噬菌体的条件也可被操纵，以基于解离动力学来区别。
可基于活性来选择抗突变型SMO克隆。在某些实施例中，本公开内容提供了结合天然表达突变型SMO的活细胞，例如GDC-0449抗性肿瘤细胞的抗突变型SMO抗体。在一个实施例中，本公开内容提供了结合与野生型SMO中由GDC-0449结合的相同区域的抗突变型SMO抗体。对应于这种抗突变型SMO抗体的Fv克隆可通过以下来选择：(1)如上所述从噬菌体文库中分离抗突变型SMO克隆，并且任选地通过在合适的细菌宿主中培育群体来扩增分离的噬菌体克隆群体；(2)分别选择针对其的阻断和非阻断活性是需要的突变型SMO和第二蛋白质；(3)将抗突变型SMO噬菌体克隆吸附到固定的突变型SMO；(4)使用过量的第二蛋白质来洗脱识别突变型SMO结合决定簇的任何不需要的克隆，所述突变型SMO结合决定簇与第二蛋白质的结合决定簇重叠或共享；和(5)洗脱在步骤(4)之后保持吸附的克隆。任选地，通过重复本文所述的选择程序一次或多次，可进一步富集具有所需的阻断/非阻断性质的克隆。
编码本公开内容的杂交瘤衍生的单克隆抗体或噬菌体展示Fv克隆的DNA易于使用常规程序(例如通过使用设计为特异性扩增来自杂交瘤或噬菌体DNA模板的目的重链和轻链编码区的寡核苷酸引物)进行分离和测序。一旦分离，就可将DNA置于表达载体内，然后将所述表达载体转染到宿主细胞内，如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或否则不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以获得所需单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。关于抗体编码DNA在细菌中的重组表达的综述文章包括Skerra等人，Curr.Opinion inImmunol.,5:256(1993)和Pluckthun,Immunol.Revs,130:151(1992)。
编码本公开内容的Fv克隆的DNA可与编码重链和/或轻链恒定区的已知DNA序列(例如适当的DNA序列可得自Kabat等人，同上)组合，以形成编码全长或部分长度的重链和/或轻链的克隆。应了解任何同种型的恒定区都可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且可从任何人或动物物种获得这样的恒定区。如本文使用的“嵌合”和“杂合”抗体的定义中包括Fv克隆，所述Fv克隆源自一个动物(如人)物种的可变结构域DNA，然后融合到另一个动物物种的恒定区DNA，以形成“杂合”、全长重链和/或轻链的编码序列。在某些实施例中，源自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合，以形成全长或部分长度的人重链和/或轻链的编码序列。
例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代代替源自杂交瘤克隆的同源鼠序列，也可修饰编码源自本公开内容的杂交瘤的抗突变型SMO抗体的DNA(例如如在Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)的方法中)。可通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接到免疫球蛋白编码序列，来进一步修饰编码杂交瘤或Fv克隆衍生的的抗体或片段的DNA。以这种方式，制备具有本公开内容的Fv克隆或杂交瘤克隆衍生的抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。
3.载体，宿主细胞和重组方法
抗体也可使用重组方法产生。为了重组生产抗突变型SMO抗体，分离编码抗体的核酸，并且将其插入可复制载体内，用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达。可使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，容易地分离并测序编码抗体的DNA。许多载体是可用的。载体组分一般包括但不限于下述的一个或多个：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
a)信号序列组分
本公开内容的抗体不仅可直接重组产生，还可作为与异源多肽的融合多肽产生，在一些实施例中，所述异源多肽是在成熟蛋白质或多肽的N末端处具有特异性切割位点的信号序列或其他多肽。在一些实施例中，所选择的异源信号序列是由宿主细胞识别并加工(即由信号肽酶切割)的异源信号序列。对于不识别并加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，信号序列被选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导区的原核信号序列取代。对于酵母分泌，天然信号序列可被例如酵母转化酶前导区、α因子前导区(包括酵母属(Saccharomyces)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)α-因子前导区)或酸性磷酸酶前导区、白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前导区、或WO 90/13646中描述的信号取代。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导区，例如单纯疱疹病毒gD信号是可用的。
b)复制起点
表达载体和克隆载体两者均含有允许载体在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。一般地，在克隆载体中，该序列是允许载体不依赖于宿主染色体DNA复制的序列，并且包括复制起点或自主复制序列。这些序列对于各种细菌、酵母和病毒是众所周知的。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，并且各种病毒起点(SV40、多瘤、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般地，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(SV40起点通常可仅由于其含有早期启动子而使用)。
c)选择基因组分
表达载体和克隆载体可含有选择基因，也称为可选择标记。典型的选择基因编码蛋白质，所述蛋白质(a)赋予对抗生素或其他毒素例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四环素的抗性，(b)补充营养缺陷型缺陷，或(c)提供从复合培养基中无法获得的关键营养素，例如编码用于芽孢杆菌属(Bacilli)的D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个例子使用药物来停滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞产生赋予药物抗性的蛋白质，并且因此在选择方案中存活。这种优势选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
用于哺乳动物细胞的合适可选择标记的另一个例子是允许鉴定有能力吸收抗体编码核酸的细胞的那些，例如DHFR、谷氨酰胺合成酶(GS)、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II例如灵长类动物金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，通过在含有氨甲蝶呤(Mtx)(DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养转化体来鉴定用DHFR基因转化的细胞。在这些条件下，DHFR基因连同任何其他共转化的核酸一起被扩增。可使用缺乏内源性DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCC CRL-9096)。
可替代地，通过在含有L-甲硫氨酸亚磺酰亚胺(Msx)(GS的抑制剂)的培养基中培养转化体来鉴定用GS基因转化的细胞。在这些条件下，GS基因连同任何其他共转化的核酸一起被扩增。GS选择/扩增系统可与上述DHFR选择/扩增系统组合使用。
可替代地，用编码目的抗体的DNA序列、野生型DHFR基因和另一种可选择标记如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH)转化或共转化的宿主细胞(特别是含有内源性DHFR的野生型宿主)可通过在培养基中的细胞生长来选择，所述培养基含有可选择标记例如氨基糖苷类抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的选择试剂。参见美国专利号4,965,199。
用于酵母的合适选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等人，Nature,282:39(1979))。trp1基因提供了用于缺乏在色氨酸中的生长能力的酵母突变株的选择标记，所述酵母突变株例如ATCC编号44076或PEP4-1。Jones,Genetics,85:12(1977)。酵母宿主细胞基因组中trp1病变的存在然后提供了通过在不存在色氨酸的情况下生长来检测转化的有效环境。类似地，Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)由具有Leu2基因的已知质粒补充。
另外，源自1.6μm环状质粒pKD1的载体可用于克鲁维酵母属酵母的转化。可替代地，对于乳酸克鲁维酵母(K.lactis)报道了用于大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统。Van den Berg,Bio/Technology,8:135(1990)。用于通过克鲁维酵母属工业菌株分泌成熟重组人血清白蛋白的稳定的多拷贝表达载体也已得到公开。Fleer等人，Bio/Technology,9:968-975(1991)。
d)启动子组分
表达载体和克隆载体一般含有由宿主生物识别并且与编码抗体的核酸可操作地连接的启动子。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统、以及杂合启动子例如tac启动子。然而，其他已知的细菌启动子是合适的。用于细菌系统的启动子还将含有与编码抗体的DNA可操作地连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
用于真核生物的启动子序列是已知的。实际上所有的真核生物基因都具有位于转录起始位点上游大约25到30个碱基的富含AT的区域。从许多基因的转录起始上游70至80个碱基发现的另一个序列是CNCAAT区域，其中N可为任何核苷酸。在大多数真核基因的3'末端处是AATAAA序列，其可为将聚A尾加入编码序列的3'末端的信号。所有这些序列都适当地插入真核表达载体内。
与酵母宿主一起使用的合适启动子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子，所述酶如烯醇化酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶。
其为具有由生长条件控制的另外转录优点的诱导型启动子的其他酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。在EP 73,657中进一步描述了用于酵母表达的合适载体和启动子。酵母增强子也有利地与酵母启动子一起使用。
哺乳动物宿主细胞中来自载体的抗体转录可例如通过从病毒基因组获得的启动子来控制，所述病毒例如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒、猿猴病毒40(SV40)，或来自异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，来自热休克启动子，条件是这些启动子与宿主细胞系统相容。
SV40病毒的早期启动子和晚期启动子方便地作为还含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段获得。人巨细胞病毒的立即早期启动子方便地作为HindIII E限制性片段获得。在美国专利号4,419,446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利号4,601,978中描述了该系统的改善。关于在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下，在小鼠细胞中人β-干扰素cDNA的表达，还参见Reyes等人，Nature297:598-601(1982)。可替代地，可使用劳斯肉瘤病毒长末端重复作为启动子。
e)增强子元件组分
通过将增强子序列插入载体内，通常增加通过高等真核生物的编码本公开内容的抗体的DNA的转录。现在已知来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常，将使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括在复制起点的晚期侧(bp 100-270)上的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子，在复制起点的晚期侧上的多瘤增强子，和腺病毒增强子。关于活化真核启动子的增强元件，还参见Yaniv,Nature 297:17-18(1982)。增强子可在抗体编码序列的5'或3'的位置处被剪接到载体内，但在一些实施例中，位于距离启动子5'的位点处。
f)转录终止组分
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物的有核细胞)中的表达载体也将含有转录终止和稳定mRNA所需的序列。这些序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5'非翻译区和偶尔的3'非翻译区获得。这些区域含有在编码抗体的mRNA的非翻译部分中转录为多聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素多聚腺苷酸化区域。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。
g)宿主细胞的选择和转化
用于克隆或表达在本文的载体中的DNA的合适宿主细胞是上述的原核生物、酵母或高等真核细胞。用于此目的的合适原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)例如埃希氏杆菌属(Escherichia)例如大肠杆菌、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日出版的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。一种可能的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管其他菌株如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些例子是举例说明性的而不是限制性的。
全长抗体、抗体融合蛋白和抗体片段可在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时，例如当治疗性抗体与本身显示肿瘤细胞破坏中的有效性的细胞毒素剂(例如毒素)缀合时。全长抗体在循环中具有较大的半衰期。在大肠杆菌中的生产速度更快且更成本有效。为了在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如US 5,648,237(Carter等人)、US 5,789,199(Joly等人)、US 5,840,523(Simmons等人)，其描述了翻译起始区(TIR)以及用于优化表达和分泌的信号序列。还参见Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo，编辑，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254页，描述了在大肠杆菌中的抗体片段表达。在表达后，抗体可在可溶性级分中从大肠杆菌细胞糊中分离，并且取决于同种型，可通过例如蛋白A或G柱纯化。最终纯化可类似于用于纯化例如在CHO细胞中表达的抗体的方法进行。
除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是用于抗体编码载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的酵母。然而，许多其他属、物种和菌株在本文中通常是可获得且有用的，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属宿主例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、K.drosophilarum(ATCC 36,906)、耐温克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP183,070)；念珠菌属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)例如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及丝状真菌例如链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、Tolypocladium和曲霉属(Aspergillus)宿主，例如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。关于讨论酵母和丝状真菌用于生产治疗性蛋白质的用途的综述，参见例如Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)。
可选择某些真菌和酵母菌株，其中糖基化途径已被“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见例如Li等人，Nat.Biotech.24:210-215(2006)(描述巴斯德毕赤酵母中的糖基化途径的人源化)；和Gerngross等人，同上。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已鉴定了众多杆状病毒毒株和变体以及来自下述宿主的相应的容许昆虫宿主细胞：草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)以及家蚕(Bombyx mori)。用于转染的各种病毒株是可公开获得的，例如，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5毒株，并且这些病毒可在本文中用作根据本公开内容的病毒，特别是用于转染草地贪夜蛾细胞。
棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、浮萍(浮萍科(Lemnaceae))、苜蓿(蒺藜苜蓿(M.truncatula))和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞可用作宿主，并且在培养(组织培养)中繁殖脊椎动物细胞已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚胎肾细胞系(亚克隆以用于在悬浮培养中生长的293或293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠塞尔托利细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系如NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu，Methods inMolecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo，编辑，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第255-268页。
宿主细胞由上述用于抗体产生的表达载体或克隆载体转化，并且在适当修饰用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。
h)培养宿主细胞
用于产生本公开内容的抗体的宿主细胞可在各种培养基中进行培养。商购可得的培养基如Ham’s F10(Sigma)、最低必需培养基((MEM)，(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、以及达尔贝科改良伊格尔培养基((DMEM),Sigma)适合于培养宿主细胞。另外，Ham等人，Meth.Enz.58:44(1979)，Barnes等人，Anal.Biochem.102:255(1980)，美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985中所述的任何培养基都可用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任一种都可根据需要补充有激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔浓度范围内的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等价能源。任何其他必需的补充剂也可以本领域技术人员已知的适当浓度包括。培养条件例如温度、pH等等是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些，并且对于本领域普通技术人员是显而易见的。
i)抗体纯化
当使用重组技术时，抗体可在细胞内产生，在周质空间产生，或直接分泌到培养基内。如果抗体在细胞内产生，则作为第一步，例如通过离心或超滤去除颗粒碎片，宿主细胞或裂解片段。Carter等人，Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了用于分离分泌到大肠杆菌的周质空间的抗体的程序。简言之，经过约30分钟，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下，使细胞糊解冻。可通过离心去除细胞碎片。当抗体分泌到培养基内时，来自这种表达系统的上清液一般首先使用商购可得的蛋白质浓缩过滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元进行浓缩。前述步骤中的任一个可包括蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白水解，并且可包括抗生素以阻止外来污染物的生长。
从细胞制备的抗体组合物可使用例如羟基磷灰石色谱、疏水相互作用色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱进行纯化。蛋白A作为亲和配体的合适性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G被推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等人(1986)EMBO J.5:1567-1575)。亲和配体与之附着的基质最通常是琼脂糖，但其他的基质是可用的。机械稳定的基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许比用琼脂糖达到的更快的流速和更短的加工时间。当抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)可用于纯化。用于蛋白质纯化的其他技术，例如在离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、在硅胶上的色谱、在阴离子或阳离子交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)上的肝素SEPHAROSETM色谱上的色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀也是可用的，取决于要回收的抗体。
在任何初步纯化步骤之后，包含目的抗体和污染物的混合物可经受使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液的低pH疏水相互作用色谱，在一些实施例中，在低盐浓度(例如，约0-0.25M盐)下进行。
一般而言，用于制备用于研究、测试和临床中的抗体的各种方法是本领域中充分确定的，与上述方法相一致和/或如由本领域技术人员对于特定目的抗体视为适当的。
C.免疫缀合物
本公开内容还提供了包含与一种或多种细胞毒素剂缀合的抗体的免疫缀合物(可互换地称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”)，所述细胞毒素剂例如化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)。
免疫缀合物已用于在癌症的治疗中局部递送细胞毒素剂，即杀死或抑制细胞生长或增殖的药物(Lambert,J.(2005)Curr.Opinion in Pharmacology 5:543-549；Wu等人(2005)Nature Biotechnology 23(9):1137-1146；Payne,G.(2003)i 3:207-212；Syrigos和Epenetos(1999)Anticancer Research 19:605-614；Niculescu-Duvaz和Springer(1997)Adv.Drug Deliv.Rev.26:151-172；美国专利号4,975,278)。免疫缀合物允许药物部分靶向递送至肿瘤，并且在其中细胞内积累，其中未缀合药物的全身施用可导致对正常细胞以及寻求消除的肿瘤细胞的无法接受的毒性水平(Baldwin等人，Lancet(1986年3月15日)第603-05页；Thorpe(1985)“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy:A Review,”Monoclonal Antibodies'84:Biological And ClinicalApplications(A.Pinchera等人，编辑)第475-506页。多克隆抗体和单克隆抗体两者已报道在这些策略中是有用的(Rowland等人(1986)Cancer Immunol.Immunother.21:183-87)。这些方法中使用的药物包括柔红霉素、多柔比星、氨甲蝶呤和长春地辛(Rowland等人(1986)同上)。抗体-毒素缀合物中使用的毒素包括细菌毒素如白喉毒素、植物毒素如蓖麻毒蛋白、小分子毒素如格尔德霉素(Mandler等人(2000)J.Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581；Mandler等人(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028；Mandler等人(2002)Bioconjugate Chem.13:786-791)、美登木素生物碱(EP 1391213；Liu等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623)和加利车霉素(Lode等人(1998)Cancer Res.58:2928；Hinman等人(1993)Cancer Res.53:3336-3342)。毒素可通过机制包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制来发挥其细胞毒性效应。当与大抗体或蛋白质受体配体缀合时，某些细胞毒性药物趋于无活性或较不活跃。
ZEVALIN(替伊莫单抗，Biogen/Idec)是由针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1κ单克隆抗体和由硫脲接头-螯合剂结合的111In或90Y放射性同位素组成的抗体-放射性同位素缀合物(Wiseman等人(2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7):766-77；Wiseman等人(2002)Blood 99(12):4336-42；Witzig等人(2002)J.Clin.Oncol.20(10):2453-63；Witzig等人(2002)J.Clin.Oncol.20(15):3262-69)。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)的活性，但在大多数患者中，施用导致严重和长期的血细胞减少。MYLOTARG(吉妥珠单抗奥唑米星，Wyeth Pharmaceuticals)，由与加利车霉素连接的huCD33抗体组成的抗体-药物缀合物，于2000年被批准用于通过注射治疗急性髓样白血病(Drugsof the Future(2000)25(7):686；美国专利号4970198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001)。美坎珠单抗(Immunogen,Inc.)，由通过二硫键接头SPP连接到美登木素生物碱药物部分DM1的huC242抗体组成的抗体-药物缀合物，正进入用于治疗表达CanAg的癌症的II期试验内，所述癌症例如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其他癌症。MLN-2704(Millennium Pharm.,BZL Biologics,Immunogen Inc.)，由与美登木素生物碱药物部分DM1连接的抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)单克隆抗体组成的抗体-药物缀合物，处于用于前列腺肿瘤的潜在治疗的开发中。将奥里斯他汀(auristatin)肽，奥里斯他汀E(AE)和单甲基奥里斯他汀(MMAE)，多拉司他汀的合成类似物，与嵌合单克隆抗体cBR96(对癌上的Lewis Y特异性)和cAC10(对血液恶性肿瘤上的CD30特异性)(Doronina等人(2003)NatureBiotechnol.21(7):778-784)缀合并且处于治疗开发中。
在某些实施例中，免疫缀合物包含抗体和化学治疗剂或其他毒素。可用于生成免疫缀合物的化学治疗剂在本文中描述(例如上文)。可使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒素A链、蒴莲素A链、α-八叠球菌、油桐(Aleurites fordii)蛋白质、石竹素蛋白质、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、皂树(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。各种放射性核素可用于生产放射性缀合的抗体。例子包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。抗体和细胞毒素剂的缀合物使用各种双功能蛋白偶联剂进行制备，所述双功能蛋白偶联剂例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、酰亚胺酯的双功能衍生物(例如二甲基己二酸HCl)、活性酯(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮基衍生物(例如双(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人，Science,238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰苄基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于放射性核素与抗体的缀合的示例性螯合剂。参见WO94/11026。
本文还考虑了抗体和一种或多种小分子毒素以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物的缀合物，所述小分子毒素例如加利车霉素、美登木素生物碱、多拉司他汀、阿诺斯汀、单端孢霉烯和CC1065。
1.美坦辛和美登木素生物碱
在一些实施例中，免疫缀合物包含与一种或多种美登木素生物碱分子缀合的抗体(全长或片段)。
美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白聚合起作用的有丝分裂抑制剂。美坦辛首先从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)中分离(美国专利号3,896,111)。随后，发现某些微生物也产生美登木素生物碱，例如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利号4,151,042)。合成美登醇及其衍生物和类似物公开在例如美国专利号4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533中。
美登木素类药物部分是抗体药物缀合物中有吸引力的药物部分，因为它们：(i)可相对容易地通过发酵或化学修饰、发酵产物的衍生化制备，(ii)顺应用适合于经由非二硫键接头与抗体缀合的官能团衍生化，(iii)在血浆中稳定，和(iv)针对各种肿瘤细胞系有效。
包含美登木素生物碱的免疫缀合物、其制备方法及其治疗用途例如在美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP0 425 235B1B中公开，所述专利的公开内容以引用的方式在此明确并入。Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996)描述了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的指名为DM1的美登木素生物碱的免疫缀合物。发现缀合物针对培养的结肠癌细胞是高度细胞毒性的，并且在体内肿瘤生长测定中显示抗肿瘤活性。Chari等人，Cancer Research 52:127-131(1992)描述了其中美登木素生物碱经由二硫键接头与结合人结肠癌细胞系上的抗原的鼠抗体A7、或结合HER-2/neu致癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1缀合的免疫缀合物。在体外对人乳腺癌细胞系SK-BR-3测试TA.1-美登木素生物碱缀合物的细胞毒性，所述SK-BR-3表达3x 105HER-2表面抗原/细胞。药物缀合物达到类似于游离美登木素生物碱药物的细胞毒性程度，其可通过增加美登木素生物碱分子/抗体分子的数目得到增加。A7-美登木素生物缀合物在小鼠中显示低的全身细胞毒性。
通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连接而不显著降低抗体或美登木素生物碱分子的生物活性来制备抗体-美登木素生物碱缀合物。参见例如美国专利号5,208,020(其公开内容以引用的方式在此明确并入)。3-4个缀合的美登木素生物碱分子/抗体分子的平均值已显示在增强靶细胞的细胞毒性中的功效，而不负面影响抗体的功能或溶解度，尽管即使一分子的毒素/抗体也预期使细胞毒性增加超过裸露抗体的使用。美登木素生物碱是本领域众所周知的，并且可通过已知技术合成或从天然源中分离。合适的美登木素生物碱公开在例如美国专利号5,208,020以及上文提及的其他专利和非专利出版物中。在一些实施例中，美登木素生物碱是在芳环中或在美登醇分子的其他位置处修饰的美登醇和美登醇类似物，例如各种美登醇酯。
本领域已知用于制备抗体-美登木素生物碱缀合物的许多连接基团，包括例如美国专利号5,208,020或EP专利0 425 235 B1，Chari等人，Cancer Research 52:127-131(1992)和2004年10月8日提交的美国专利申请号10/960,602中公开的那些，所述参考文献的公开内容以引用的方式在此明确并入。包含接头组分SMCC的抗体-美登木素生物碱缀合物可如2004年10月8日提交的美国专利申请号10/960,602中所公开的进行制备。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团或酯酶不稳定基团，如在上述专利中所公开的，二硫化物基团和硫醚基团可用于一些实施例中。本文描述和示例了其他连接基团。
抗体和美登木素生物碱的缀合物可使用各种双功能蛋白偶联剂进行制备，所述双功能蛋白偶联剂例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、酰亚胺酯的双功能衍生物(例如二甲基己二酸HCl)、活性酯(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮基衍生物(例如双(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。在一些实施例中，偶联剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等人，Biochem.J.173:723-737(1978))和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶硫代)戊酸酯(SPP)，以提供二硫键。
取决于连接的类型，接头可在不同位置处附着至美登木素生物碱分子。例如，可通过使用常规的偶联技术与羟基反应形成酯键。该反应可在下述位置处发生：具有羟基的C-3位、用羟甲基修饰的C-14位、用羟基修饰的C-15位和具有羟基的C-20位。在一个实施例中，键在美登醇或美登醇类似物的C-3位处形成。
2.奥里斯他汀和多拉司他汀
在一些实施例中，免疫缀合物包含与多拉司他汀或多拉司他汀肽类似物和衍生物，奥里斯他汀缀合的抗体(美国专利号5635483；5780588)。多拉司他汀和奥里斯他汀已显示干扰微管动力学、GTP水解以及核和细胞分裂(Woyke等人(2001)Antimicrob.Agents andChemother.45(12):3580-3584)，并且具有抗癌(US 5663149)和抗真菌活性(Pettit等人(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965)。多拉司他汀或奥里斯他汀药物部分可通过肽药物部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端附着至抗体(WO 02/088172)。
示例性的奥里斯他汀实施例包括在“Monomethylvaline Compounds Capable ofConjugation to Ligands”，2004年11月5日提交的美国序列号10/983,340中公开的N末端连接的单甲基奥里斯他汀药物部分DE和DF，所述专利的公开内容以引用的方式明确地全文并入。
通常，可通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备基于肽的药物部分。这样的肽键可例如根据液相合成方法制备(参见E.和K.Lübke，“ThePeptides”，第1卷，第76-136页，1965,Academic Press)，这是肽化学领域中众所周知的。奥里斯他汀/多拉司他汀药物部分可根据以下方法制备：US 5635483；US 5780588；Pettit等人(1989)J.Am.Chem.Soc.111:5463-5465；Pettit等人(1998)Anti-Cancer Drug Design13:243-277；Pettit,G.R.等人Synthesis,1996,719-725；and Pettit等人(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 5:859-863。还参见Doronina(2003)Nat Biotechnol 21(7):778-784；“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”，2004年11月5日提交的美国序列号10/983,340，以引用的方式在此全文并入(公开了例如制备单甲基缬氨酸化合物如MMAE和与接头缀合的MMAF的接头和方法)。
3.加利车霉素
在其他实施例中，免疫缀合物包含与一个或多个加利车霉素分子缀合的抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度下产生双链DNA断裂。关于加利车霉素家族的缀合物的制备，参见美国专利5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001、5,877,296(全部给予American Cyanamid Company)。可使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和θI1(Hinman等人，Cancer Research 53:3336-3342(1993)，Lode等人，Cancer Research 58:2925-2928(1998)，以及给予American Cyanamid的上述美国专利)。可缀合抗体的另一种抗肿瘤药物是其为抗叶酸剂的QFA。加利车霉素和QFA两者均具有细胞内的作用位点，并且不容易穿过质膜。因此，通过抗体介导的内化的这些药物的细胞摄取极大增强了它们的细胞毒性作用。
4.其他细胞毒素剂
可与抗体缀合的其他抗肿瘤剂包括BCNU、链脲霉素、长春新碱和5-氟尿嘧啶、美国专利5,053,394、5,770,710中描述的统称为LL-E33288复合物的试剂家族以及埃斯波霉素(美国专利5,877,296)。
可使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒素A链、蒴莲素A链、α-八叠球菌、油桐蛋白质、石竹素蛋白质、美洲商陆蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、皂树抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。
本公开内容还考虑了在抗体和具有核裂解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，例如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫缀合物。
为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性的原子。各种放射性同位素可用于生产放射性缀合抗体。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当缀合物用于检测时，它可包含用于闪烁照相研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记，例如再次的碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
放射性标记或其他标记可以已知方式掺入缀合物中。例如，肽可为生物合成的，或者可通过使用合适的氨基酸前体的化学氨基酸合成来合成，所述氨基酸前体涉及例如氟-19代替氢。标记例如tc99m或I123、Re186、Re188和In111可经由肽中的半胱氨酸残基附着。钇-90可经由赖氨酸残基附着。IODOGEN方法(Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57)可用于掺入碘-123。“Monoclonal Antibodiesin Immunoscintigraphy”(Chatal,CRC Press 1989)详细描述了其他方法。
抗体和细胞毒素剂的缀合物可使用各种双功能蛋白偶联剂进行制备，所述双功能蛋白偶联剂例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、酰亚胺酯的双功能衍生物(例如二甲基己二酸HCl)、活性酯(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮基衍生物(例如双(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人，Science,238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰苄基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于放射性核素与抗体的缀合的示例性螯合剂。参见WO94/11026。接头可为促进细胞中的细胞毒性药物释放的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等人，Cancer Research 52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
化合物明确考虑但不限于使用下述交联剂试剂制备的ADC：商购可得的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、和磺基-SMPB、以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)(例如来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。参见第467-498页，2003-2004Applications Handbook and Catalog。
5.抗体药物缀合物的制备
在抗体药物缀合物(ADC)中，抗体(Ab)通过接头(L)与一个或多个药物部分(D)缀合，例如每个抗体约1至约20个药物部分(p＝1至约20)。下文所示式的ADC可通过几种途径制备，采用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂，包括：(1)抗体的亲核基团与二价接头试剂的反应，以经由共价键形成Ab-L，随后为与药物部分D的反应；和(2)药物部分的亲核基团与二价接头试剂的反应，以经由共价键形成D-L，随后为与抗体的亲核基团的反应。本文描述了用于制备ADC的另外方法。
Ab-(L-D)p
接头可由一个或多个接头组分组成。示例性接头组分包括6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)、马来酰亚胺基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(“SMCC”)和N-琥珀酰亚胺基(4-碘代-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。另外的接头组分是本领域已知的，并且一些在本文中描述。还参见“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation toLigands”，2004年11月5日提交的美国序列号10/983,340，所述专利的内容以引用的方式在此全文并入。
在一些实施例中，接头可包含氨基酸残基。示例性的氨基酸接头组分包括二肽、三肽、四肽或五肽。示例性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。示例性的三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。包含氨基酸接头组分的氨基酸残基包括天然存在的那些，以及次要氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，例如瓜氨酸。氨基酸接头组分可在其通过特定酶的酶促切割的选择性方面进行设计和优化，所述酶例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D或纤溶酶蛋白酶。
抗体上的亲核基团包括但不限于：(i)N末端胺基，(ii)侧链胺基，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸，和(iv)其中抗体被糖基化的糖羟基或氨基。胺、硫醇和羟基是亲核的，并且能够与接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应，以形成共价键，所述亲电子基团包括：(i)活性酯例如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酰基卤；(ii)烷基和苄基卤例如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。通过用还原剂如DTT(二硫苏糖醇)处理，抗体可制备为对于与接头试剂缀合反应性的。每个半胱氨酸桥因此将在理论上形成两个反应性硫醇亲核试剂。另外的亲核基团可通过赖氨酸与2-亚氨基硫烷(Traut's试剂)的反应引入抗体内，导致胺转化为硫醇。通过引入一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基(例如制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变抗体)，可将反应性硫醇基团引入抗体(或其片段)内。
抗体药物缀合物也可通过修饰抗体以引入亲电子部分而产生，所述亲电子部分可与接头试剂或药物上的亲核取代基反应。糖基化抗体的糖可被例如高碘酸盐氧化试剂氧化，以形成可与接头试剂或药物部分的胺基反应的醛基或酮基。所得到的亚胺希夫碱基可形成稳定的键，或可例如被硼氢化物试剂还原，以形成稳定的胺键。在一个实施例中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中得到羰基(醛和酮)，其可与药物上的适当基团反应(Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一个实施例中，含有N末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠反应，导致产生醛代替第一氨基酸(Geoghegan&Stroh,(1992)Bioconjugate Chem.3:138-146；US 5362852)。这样的醛可与药物部分或接头亲核试剂反应。
类似地，药物部分上的亲核基团包括但不限于：能够与接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应以形成共价键的胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基团，所述亲电子基团包括：(i)活性酯例如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酰基卤；(ii)烷基和苄基卤例如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。
可替代地，可例如通过重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒素剂的融合蛋白。DNA的长度可包含编码缀合物的两个部分的相应区域，所述两个部分彼此相邻或由编码不破坏缀合物的所需性质的接头肽的区域分开。
在又一个实施例中，抗体可与“受体”(例如链霉抗生物素蛋白)缀合以用于肿瘤预靶向，其中将抗体-受体缀合物施用于患者，随后为使用清除试剂从循环中去除未结合的缀合物，然后施用与细胞毒素剂(例如放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如抗生物素蛋白)。各种放射性核素可用于生产放射性缀合的抗体。例子包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
V.方法
A.用抗体的诊断方法和检测突变型SMO的方法
在一个方面，本公开内容的抗体可用于检测生物样品中突变型SMO的存在。如本文使用的，术语“检测”包括定量检测或定性检测。在某些实施例中，生物样品包含细胞或组织，例如肿瘤组织。
在一个方面，本公开内容提供了检测生物样品中突变型SMO的存在的方法。在某些实施例中，该方法包括在允许抗突变型SMO抗体与突变型SMO结合的条件下，使生物样品与抗突变型SMO抗体接触，并且检测在抗突变型SMO抗体与突变型SMO之间是否形成复合物。
在一个方面，本公开内容提供了诊断与突变型SMO的表达相关的病症或与突变型SMO的表达相关的状况，例如药物抗性的方法。在某些实施例中，该方法包括使测试细胞与抗突变型SMO抗体接触；通过检测抗突变型SMO抗体与突变型SMO的结合，来确定通过测试细胞的突变型SMO的表达水平(定量或定性)；并且比较通过测试细胞的突变型SMO的表达水平与通过对照细胞(例如与测试细胞具有相同组织来源的正常细胞，或表达以与这样的正常细胞可比较水平的野生型SMO的细胞)的突变型SMO的表达水平，其中与对照细胞相比，通过测试细胞的突变型SMO的更高水平的表达指示存在与增加的突变型SMO表达相关的病症。在某些实施例中，测试细胞得自疑似患有与突变型SMO表达增加相关的病症的个体。在某些实施例中，该病症是细胞增殖性病症，例如癌症或肿瘤。应了解，在例如肿瘤样品中，SMO表达中可存在异质性。因此，应了解，在样品中，样品中仅细胞子集可表达突变型SMO，并且这种表达足以例如与药物抗性相关。相应地，评估表达包括评估样品中的表达并且检测样品中的细胞子集中的突变型SMO蛋白。
使用本公开内容的抗体可诊断或可评估其药物抗性的示例性病症包括但不限于成神经管细胞瘤、胰腺癌、基底细胞癌。
某些其他方法可用于检测抗体与突变型SMO的结合。这些方法包括但不限于本领域众所周知的抗原结合测定，例如蛋白质印迹、放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定和免疫组织化学(IHC)。
在某些实施例中，抗体被标记。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(例如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记)，以及例如通过酶促反应或分子相互作用间接检测的部分，例如酶或配体。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团例如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰基，伞形酮，萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456)，萤光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶，杂环氧化酶例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，与采用过氧化氢以氧化染料前体如HRP的酶偶联，乳过氧化物酶或微过氧化物酶，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，细菌噬菌体标记，稳定自由基等等。
在某些实施例中，将抗体固定在不溶性基质上。固定可能需要将抗突变型SMO抗体与在溶液中保持游离的任何突变型SMO分开。这通常通过下述来完成：在测定程序之前使抗突变型SMO抗体不溶解(如通过吸附到水不溶性基质或表面(Bennich等人，US3,720,760)或通过共价偶联(例如使用戊二醛交联))，或例如通过免疫沉淀在抗突变型SMO抗体和突变型SMO之间形成复合物后使抗突变型SMO抗体不溶解。
应理解，诊断或检测的任何上述实施例可使用本公开内容的免疫缀合物代替或加上抗突变型SMO抗体来进行。
B.用核酸探针检测突变型SMO的方法
在一个方面，如本文所述的核酸探针可用于检测生物样品中突变型SMO核酸的存在。如本文使用的，术语“检测”包括定量检测或定性检测。在某些实施例中，生物样品包含细胞或组织，例如肿瘤组织。
在一个方面，本公开内容提供了检测生物样品中突变型SMO编码核酸的存在的方法。在某些实施例中，该方法包括使来自生物样品的核酸与如本文所述的探针接触，并且在允许在严格条件下杂交的条件下，使探针与核酸杂交，并检测在探针与核酸样品之间是否形成复合物。
可使用本领域已知的任何方法检测突变型SMO编码核酸，包括但不限于使用如本文所述的探针，或通过PCR扩增、rtPCR测序、单链构象多态性(SSCP)、DNA的差异限制性消化、杂交或本领域已知的任何其他方法。
在这些方法中，细胞中如本文所述的突变型SMO的检测指示存在与突变型SMO的表达增加相关的病症(即，对用Smo抑制剂例如GDC-0449的治疗抗性)。在某些实施例中，测试细胞从疑似患有与突变型SMO的表达相关的抗性肿瘤的个体获得。如上所述，应了解，突变可在来自样品的细胞子集，例如来自肿瘤样品的细胞子集中。
使用本公开内容的抗体可诊断的示例性病症包括但不限于成神经管细胞瘤、胰腺癌、基底细胞癌。
C.在基于细胞的测定中检测突变型SMO的方法
可在如本领域已知的基于细胞的测定中检测突变型SMO，包括但不限于突变型SMO检测抗体与细胞样品例如体外肿瘤样品的表面的结合。肿瘤样品或疑似含有突变型SMO的组织的组织学制剂的免疫组织化学染色。其中组织样品与GDC-0449和hedgehog接触以确定Hh信号传导是否发生的功能测定(例如通过测量途径组分的活化、Gli的表达等等)。使用可使用GDC-0449破坏的Hh信号传导途径的任何功能测定可用于本公开内容的方法中，以确定突变型SMO的存在和活性。
D.筛选结合突变型SMO的化合物的方法
在一些实施例中，本公开内容提供了筛选能够抑制细胞中hedgehog信号传导的hedgehog途径抑制剂的方法，所述细胞表达本文公开的任何突变型SMO蛋白。在一些实施例中，筛选是单一试剂或离散数目的试剂的。在一些实施例中，筛选是试剂库的。在一些实施例中，筛选是高流通量筛选。在一些实施例中，筛选是一个或多个化合物文库(例如小分子文库、反义寡核苷酸文库、或者抗体或肽文库)的。在一些实施例中，筛选可涉及单独的初级测定或初级测定和一种或多种次级测定。在一些实施例中，试剂可在测定(例如hedgehog信号传导测定(例如通过使用本文所述的或本领域已知的任何Gli1表达测定，以检查响应试剂的Gli1核酸或蛋白质表达)、突变型SMO蛋白结合测定(例如通过使用本文所述的任何突变型SMO结合测定)、细胞增殖测定(例如通过使用本文所述的或本领域已知的任何细胞增殖测定)中进行评价。在筛选测定中使用是本公开内容的突变型SMO蛋白和核酸的示例性用途(例如突变型SMO蛋白可用于无细胞或基于细胞的测定中；突变型SMO核酸可在载体中提供，并且用于在宿主细胞或适合于筛选测定的宿主生物中表达突变型SMO蛋白。
本公开内容提供了用于筛选与突变型SMO结合的化合物的方法。不限于任何特定的操作模式，预期在GDC-0449与野生型SMO结合并且不结合突变型SMO的方式上，充当突变型SMO抑制剂的化合物将结合突变型SMO。因此，可通过本领域已知的任何方法来表达突变型SMO蛋白或其片段，例如包含跨膜结构域6(TM6)的全部或一部分的片段，并且使用化合物文库运行结合测定。还可使用基于GDC-0449的潜在接触点的建模方法，然后对突变型SMO和GDC-0449的变化对相似的接触点建模，使用由GDC-0449的变化表示的较小的化合物文库。这样的建模程序和算法可为本领域已知的任何。可鉴定结合突变型SMO和野生型SMO的化合物，其是野生型和突变型SMO两者的抑制剂。可替代地，可发现化合物结合突变型SMO但不结合野生型SMO，因此是仅用于突变型SMO的抑制剂。在某些实施例中，评价结合和/或一些其他读数(例如hedgehog信号传导)，并且与野生型SMO或合适对照(例如空载体)的那种进行比较。
在一个实施例中，待筛选的化合物是小分子化合物，例如GDC-0449的变体。在其他实施例中，结合突变型SMO的化合物是特异性识别在与GDC-0449和野生型SMO的结合位点相同区域中的表位的抗体。在一个实施例中，抗体结合突变型SMO的TM6的羧基末端部分中的区域，并且抑制突变型SMO活性。
可替代地或另外，还可就其抑制突变型SMO活性的能力筛选化合物。在这些实施例中，可评价这些化合物在表达突变型SMO的细胞中抑制hedgehog信号传导的能力。这些测定可在细胞中进行，所述细胞具有完整的hedgehog信号传导途径，但表达具有代替或加上野生型SMO的突变的重组SMO。在这些测定中，当在候选抑制剂的存在或不存在下与hedgehog一起温育时，确定细胞具有活性hedgehog信号传导的能力。如果在候选化合物的存在下hedgehog信号传导被抑制，则这种化合物是hedgehog抑制剂。在一些实施例中，细胞表达野生型和突变型SMO两者，并且与GDC-0449和候选抑制剂一起温育。在其他实施例中，细胞仅表达突变型SMO，并且可与Hh和候选抑制剂单独温育(即，在不存在GDC-0449的情况下)。如果Hh信号传导在这种细胞中减少或抑制，则该化合物是突变型SMO的抑制剂。
在一些实施例中，本公开内容提供了鉴定hedgehog途径抑制剂的方法，其中所述方法包括：使细胞与一定量的测试试剂接触，其中所述细胞响应hedgehog蛋白或具有增加的hedgehog信号传导和/或hedgehog信号传导途径的活化，并且其中所述细胞表达本文所述的任何突变型SMO蛋白，以及b)与对照相比，测定所述测试试剂是否抑制所述细胞中的hedgehog信号传导，其中如果相对于所述对照，所述测试试剂抑制所述细胞中的hedgehog信号传导，则所述测试试剂被鉴定为hedgehog途径抑制剂。在一些实施例中，对照(或用于比较的基础)是表达野生型SMO蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的SMO蛋白)的细胞。在一些实施例中，对照是表达与接触所述测试试剂的细胞相同的突变型SMO蛋白的细胞，其中所述对照是未经处理的，或者用突变型SMO蛋白对其部分或完全抗性的对照试剂进行处理。在一些实施例中，对照试剂是维莫德吉、LY2940680、LDE225和/或化合物5。在一些实施例中，测试试剂结合突变型SMO蛋白，但不结合野生型SMO蛋白。在一些实施例中，测试试剂结合突变型SMO蛋白和野生型SMO蛋白两者。在一些实施例中，测试试剂在表达突变型SMO蛋白的细胞中比在表达野生型SMO蛋白的细胞中更有效地抑制hedgehog信号传导。
在一些实施例中，本公开内容提供了鉴定hedgehog途径抑制剂的方法，其中所述方法包括：使细胞与一定量的试剂接触，其中所述细胞响应hedgehog蛋白或具有增加的hedgehog信号传导和/或hedgehog信号传导途径的活化，并且其中所述细胞表达本文所述的任何突变型SMO蛋白，以及b)与对照相比，测定所述试剂是否抑制所述细胞的生长和/或增殖，其中如果相对于所述对照，所述试剂抑制所述细胞的生长和/或增殖，则所述试剂被鉴定为hedgehog途径抑制剂。在一些实施例中，对照是表达野生型SMO蛋白(例如具有SEQID NO:1的氨基酸序列的SMO蛋白)的细胞。在一些实施例中，对照是表达与接触所述测试试剂的细胞相同的突变型SMO蛋白的细胞，其中所述对照是未经处理的，或者用突变型SMO蛋白对其部分或完全抗性的对照试剂进行处理。在一些实施例中，对照试剂是维莫德吉、LY2940680、LDE225和/或化合物5。在一些实施例中，测试试剂结合突变型SMO蛋白，但不结合野生型SMO蛋白。在一些实施例中，测试试剂结合突变型SMO蛋白和野生型SMO蛋白两者。在一些实施例中，测试试剂在表达突变型SMO蛋白的细胞中比在表达野生型SMO蛋白的细胞中更有效地抑制生长和/或增殖
在一些实施例中，用于本文所述筛选方法的细胞在培养物中。在一些实施例中，与培养物中的细胞接触的试剂足以部分或完全抑制细胞培养中的至少10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的细胞中的hedgehog信号传导。在一些实施例中，与培养物中的细胞接触的试剂足以减少细胞培养中的至少10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的细胞的增殖速率和/或存活率，其中所述细胞表达或过表达hedgehog或者具有活性hedgehog信号传导。
在其他实施例中，细胞在动物体内。在一些实施例中，动物是哺乳动物或其他脊椎动物。在一些实施例中，动物是出生后的。在一些实施例中，动物是儿科的。在一些实施例中，动物是成年的。当提及体外细胞时，细胞可为任何脊椎动物物种的，例如哺乳动物，例如啮齿类动物、仓鼠或人。在体外或体内，细胞可为癌细胞，例如原代癌细胞、转移癌细胞或癌细胞系。在一些实施例中，细胞是成神经管细胞瘤。在一些实施例中，细胞是基底细胞癌细胞。在一些实施例中，细胞是痣样基底细胞癌细胞。在一些实施例中，细胞是戈林综合征细胞。
在一些实施例中，细胞包含hedgehog信号传导途径基因中的一个或多个突变。在一些实施例中，一个或多个突变被修补。在一些实施例中，修补的突变是功能丧失突变。在一些实施例中，一个或多个突变在smoothened中。在一些实施例中，smoothened突变是smoothened功能获得突变。在一些实施例中，功能获得的smoothened突变导致组成型活性的smoothened蛋白。在一些实施例中，一个或多个突变在suppressor-of-fused中，并且所述细胞具有suppressor-of-fused(SuFu)功能丧失。在一些实施例中，SuFu突变导致SuFu活性的部分功能丧失。在一些实施例中，SuFu突变导致SuFu活性的完全功能丧失。在一些实施例中，SuFu突变赋予对维莫德吉的抗性。
在一些实施例中，在本文所述的任何筛选方法中测试的试剂是小分子。在其他实施例中，所述试剂是多肽。在其他实施例中，所述试剂是siRNA拮抗剂。
在本文所述的任何筛选方法的一些实施例中，突变型SMO DNA在细胞中外源性表达。在一些实施例中，突变型SMO DNA在细胞中稳定表达。在一些实施例中，突变型SMO DNA在细胞中瞬时表达。
本公开内容中可用的各种hedgehog途径抑制剂的生长抑制效应可通过本领域已知的方法来评价，例如使用内源性或用相应的突变型SMO基因转染后表达突变型SMO多肽的细胞。例如，适当的肿瘤细胞系和用突变型SMO编码DNA转染的细胞可用不同浓度的本公开内容的hedgehog途径抑制剂处理几天(例如2-7天)，并且用结晶紫、MTT染色或通过一些其他基于比色或萤光素酶的(例如CellTiterGlo)测定进行分析。测量增殖的另一种方法是通过比较在这种hedgehog途径抑制剂的存在或不存在下，通过经处理的细胞的3H-胸苷摄取。在处理后，收获细胞，并且在闪烁计数器中定量掺入DNA内的放射性的量。适当的阳性对照包括用生长抑制性抗体或已知抑制该细胞系生长的小分子处理所选择的细胞系。可以本领域已知的各种方式测定体内肿瘤细胞的生长抑制。在一些实施例中，肿瘤细胞是在hedgehog途径信号传导基因中具有一个或多个突变的肿瘤细胞。在一些实施例中，与未经处理的肿瘤细胞相比，这种hedgehog途径抑制剂在体外或体内使表达hedgehog的肿瘤细胞的细胞增殖抑制约10-25％、约25-100％、约30-100％、约50-100％、或约或70-100％。生长抑制可在细胞培养中以约0.5至30μg/ml、约0.5nM至200nM、约200nM至1μM、约1μM至5μM、或约5μM至10μM的hedgehog途径抑制剂浓度下进行测量，其中在肿瘤细胞暴露于拮抗剂后1-10天确定生长抑制。如果以约1μg/kg至约100mg/kg体重施用拮抗剂和/或激动剂导致自抗体或小分子拮抗剂的第一次施用的约5天至3个月内，在一些实施例中，在约5至30天内的肿瘤大小减少或肿瘤细胞增殖减少，则拮抗剂在体内是生长抑制性的。
在一些实施例中，为了选择诱导细胞死亡的hedgehog途径抑制剂，可相对于对照评价如由例如碘化丙啶(PI)、台盼蓝或7AAD摄取所示的膜完整性的丧失。可在不存在补体和免疫效应细胞的情况下进行PI摄取测定。在一些实施例中，将表达突变型SMO蛋白的肿瘤细胞与单独培养基或含有适当hedgehog途径抑制剂的培养基一起温育。使细胞温育3天时间段。每次处理后，洗涤细胞并且将其等分到35mm过滤器封盖的12x 75管内(每管1ml，每个处理组3个管)，以去除细胞团。然后管接受PI(10μg/ml)。可使用流式细胞仪和CellQuest软件(Becton Dickinson)、或通过本领域技术人员用于分析的任何其他装置来分析样品。然后可选择如通过PI摄取测定的诱导统计学显著水平的细胞死亡的那些hedgehog途径抑制剂。
在一些实施例中，为了筛选与突变型SMO多肽上的表位结合的hedgehog途径抑制剂，可进行常规交叉阻断测定，例如在Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,Ed Harlow和David Lane(1988)中描述的那种。该测定可用于确定测试抗体、多肽、寡肽或其他有机分子是否结合与已知的hedgehog途径抑制剂相同的位点或表位。可替代地或另外，可通过本领域已知的方法进行表位作图。例如，突变型SMO蛋白序列可例如通过丙氨酸扫描或通过制备具有免疫学上不同的GPCR蛋白的嵌合体被诱变，来鉴定接触残基。最初测试突变抗原与多克隆抗体的结合，以确保正确的折叠。在不同的方法中，对应于突变型SMO蛋白的不同区域的肽可用于具有测试抗体或测试抗体和含表征或已知表位的抗体的竞争测定中。
在一些实施例中，通过共价或非共价附着，将突变型SMO蛋白或候选hedgehog途径抑制剂固定到固相例如微升板上。非共价附着一般通过用突变型SMO蛋白或候选hedgehog信号传导试剂的溶液涂布固体表面并干燥来实现。可替代地，对于要固定的突变型SMO的靶部分特异性的固定抗体，例如单克隆抗体，可用于将其锚定至固体表面。该测定可通过将可被可检测标记进行标记的未固定组分加入固定组分，例如含有锚定组分的涂布表面上进行。当反应完成时，可例如通过洗涤去除未反应的组分，并且检测到锚定在固体表面上的复合物。当最初非固定的组分携带可检测标记时，固定在表面上的标记的检测指示发生复合。当最初未固定的组分不携带标记时，可例如通过使用特异性结合固定的复合物的标记抗体来检测复合。
如果候选hedgehog途径抑制剂与本文鉴定的hedgehog信号传导多肽相互作用但不直接结合，则可通过众所周知的用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法来测定其与该多肽的相互作用。此类测定包括传统方法，例如交联、共免疫沉淀、以及通过梯度或色谱柱的共同纯化。另外，蛋白质-蛋白质相互作用可通过使用基于酵母的遗传系统进行监测，所述基于酵母的遗传系统由Fields和同事描述(Fields和Song,Nature(London).340:245-246(1989)；Chien等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:9578-9582(1991))，如由Chevray和Nathans，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:5789-5793(1991)公开。许多转录激活物，如酵母GAL4，由两个物理上离散的模块结构域组成，一个充当DNA结合结构域，另一个充当转录活化结构域。上述出版物中描述的酵母表达系统(一般称为“双杂合系统”)利用了该性质，并且采用两种杂合蛋白，其中靶蛋白与GAL4的DNA结合结构域融合的一种，以及其中候选活化蛋白质与活化结构域融合的另一种。在GAL4活化的启动子控制下的GAL1-LacZ报道基因的表达取决于经由蛋白质-蛋白质相互作用的GAL4活性重构。含有相互作用的多肽的菌落用β-半乳糖苷酶的显色底物检测。使用双杂交技术用于鉴定两种特异性蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用的完整试剂盒(MATCHMAKERTM)从Clontech商购可得。该系统还可扩展到对涉及特定蛋白质相互作用的蛋白质结构域作图，以及精确定位对这些相互作用至关重要的氨基酸残基。
测定可以各种形式进行，包括在本领域中被充分表征的蛋白质-蛋白质结合测定、生物化学筛选测定、免疫测定和基于细胞的测定。
可通过本领域技术人员众所周知的手段来测试干扰hedgehog信号传导多肽和其他细胞内或细胞外组分(例如Costal-2)相互作用的试剂。在一些实施例中，在允许两种产物的相互作用和结合的条件和时间下，制备含有突变型SMO多肽和细胞内或细胞外组分的反应混合物。在一些实施例中，为了测试候选化合物抑制结合的能力，反应在测试化合物的不存在和存在下进行。另外，可将安慰剂加入第三反应混合物中，以充当阳性对照。如上所述监测混合物中存在的测试化合物和细胞内或细胞外组分之间的结合(复合物形成)。在对照反应中而不是在含有测试试剂的反应混合物中形成复合物，指示测试试剂干扰测试化合物与其反应配偶体的相互作用。
本公开内容考虑了使用前述测定步骤中的任何一个或组合用于鉴定hedgehog途径抑制剂的方法。换言之，可组合各种筛选测定以鉴定具有例如特定活性的拮抗剂，或确认在一种测定中拮抗突变型SMO的试剂也在独立测定中抑制hedgehog信号传导。对于任何测定或鉴定方法，可将结果与一种或多种适当的对照(包括阳性对照和/或阴性对照)进行比较。
对于用于筛选和/或鉴定hedgehog途径抑制剂的上述测定方法中的任一种，可单独或在库中筛选试剂。试剂可从试剂文库或一组候选试剂中筛选。可筛选的合适试剂包括但不限于抗体、抗体片段、肽、反义寡核苷酸、RNAi和小分子(例如溴结构域抑制剂)。
在一些实施例中，本文公开的任何筛选方法中使用的细胞包含导致hedgehog信号传导活化或增加hedgehog信号传导的基因中的一个或多个突变。在一些实施例中，一个或多个突变在修补基因中，导致修补的功能丧失。在一些实施例中，修补的基因中的一个或多个突变导致编码具有下述突变中的一个或多个的修补蛋白质的突变基因：S616G、fs251、E380*、Q853*、W926*、P1387S、sp2667、Q501H、fs1017、fs108或A1380V。
在一些实施例中，导致hedgehog信号传导活化或增加hedgehog信号传导的基因中的一个或多个突变在smoothened中，并且细胞具有smoothened突变。在一些实施例中，smoothened突变是smoothened的功能获得突变。在一些实施例中，功能获得smoothened突变导致组成型活性的smoothened蛋白。参见例如WO 2011/028950和WO 2012047968，其各自以引用的方式并入。在一些实施例中，smoothened突变是在对应于SEQ ID NO:1的第535位的位置处的突变。在某些实施例中，突变是在对应于SEQ ID NO:1的第562位的位置处的突变。在某些实施例中，突变是在第535位处或在SEQ ID NO:1中的该相应位置处的W535L。在一些实施例中，smoothened突变是对应于SEQ ID NO:1的第R562Q位的突变(在第562位处或在对应于SEQ ID NO:1的第562位的位置处的R562Q突变。在一些实施例中，smoothened突变是在对应于SEQ ID NO:1的第412位的位置处的突变，例如在SEQ ID NO:1的这种位置处的L412F。在一些实施例中，smoothened突变具有使得其对某些smoothened抑制剂抗性的替代突变。在一些实施例中，smoothened蛋白包含在SEQ ID NO:1的氨基酸位置518处或在对应于SEQ ID NO:1的第518位的位置处的氨基酸改变。在一些实施例中，氨基酸改变是在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置518的氨基酸位置处的E518K或E518A取代。在一些实施例中，smoothened蛋白包含在SEQ ID NO:1的氨基酸位置473处或对应于SEQ ID NO:1的第473位的位置处的氨基酸改变。
在一些实施例中，一个或多个突变在hedgehog基因中，并且导致hedgehog蛋白的过表达。在一些实施例中，过表达的hedgehog蛋白是Sonic hedgehog蛋白。在一些实施例中，过表达的hedgehog蛋白是Indian hedgehog蛋白。在一些实施例中，过表达的hedgehog蛋白是Desert hedgehog蛋白。
在一些实施例中，一个或多个突变在suppressor-of-fused中，并且细胞具有suppressor-of-fused(SuFu或SUFU)功能丧失。在一些实施例中，导致SuFu活性的功能丧失。在一些实施例中，SuFu突变在成神经管细胞瘤、脑膜瘤、腺样囊性癌、基底细胞癌和横纹肌肉瘤癌细胞中。在一些实施例中，SuFu突变是Brugieres等人，2012,JCO,30(17):2087-2093中描述的任何突变，所述参考文献全文并入本文。在一些实施例中，SuFu突变是表1或2中描述的任何突变，或者Brugieres等人，2012,JCO,30(17):2087-2093中描述的任何突变，所述参考文献全文并入本文。
表1：种系SUFU突变
缩写：MB，成神经管细胞瘤；MBEN，具有广泛结节性的MB；NA，不可用；NOS，不另行说明。
表2.种系致病性SUFU突变
缩写：UV，未知变体。
在一些实施例中，SuFu突变包括在对应于SEQ ID NO:10中的下述氨基酸位置中任一个的位置处的突变：第15、184、123、295、187位。在某些实施例中，SuFu突变包括以下中的任何一个或多个：P15L、Q184X、R123C、L295fs或P187L，其中突变在该位置处或在对应于SEQID NO:10中的所述位置的位置处。在一些实施例中，SuFU突变是对应于SEQ ID NO:11的c.1022+1G>A(IVS8-1G>T)、c.72delC、c.72insC、143insA、c.846insC或IVS1-1A->T的任何突变。在一些实施例中，SuFu突变是下述中所述的任何突变：Taylor等人(2002)Nat Genet31:306-310(例如IVS8-1G>T(＝c.1022+1G>A)、1129del、P15L和Ng的两个(全部+LOH))；Slade等人(2011)Fam Cancer 10:337-342,2011(例如c.1022+1G>A；c.848insC)；Pastorino等人(2009)Am J Med Genet A 149A:1539-1543(例如c.1022+1G>A)；Ng等人(2005)Am J Med Genet A 134:399-403(例如143insA；IVS1-1A>T)；Kijima等人(2012)FamCancer 11:565-70(例如c.550C>T(Q184X))；Aavikko等人(2012)Am J Hum Genet 91:520–526(例如c.367C>T(R123C))；Stephens等人(2013)J Clin Invest123:2965-2968(例如x881_882insG(L295fs))；或Reifenberger等人(2005)Brit J Dermatology 152:43–51(例如c560C>T(P187L))。
在一些实施例中，细胞是人细胞，并且具有染色体10重复和/或10q的一部分的缺失，其中所述部分含有SUFU和PTEN。在一些实施例中，细胞包含Fs1017SUFU突变。
在一些实施例中，本文所述的任何筛选方法中使用的细胞是其中hedgehog信号传导途径是活性的细胞。在一些实施例中，细胞是其中hedgehog信号传导途径是组成型活性的细胞。在一些实施例中，细胞是已用hedgehog蛋白或hedgehog激动剂刺激的细胞。在一些实施例中，通过在Gli-萤光素酶报道测定中监测Gli1水平或活性来确定细胞中hedgehog途径的活性。
在一些实施例中，用于本文所述的任何筛选方法中的细胞是培养物中的细胞。在一些实施例中，本公开内容提供了包括接触包含多个细胞的培养物的方法。在一些实施例中，细胞在脊椎动物中。在一些实施例中，细胞在哺乳动物中，并且接触细胞包括向哺乳动物施用hedgehog信号传导抑制剂。在一些实施例中，哺乳动物是人受试者。在一些实施例中，细胞是癌细胞和/或哺乳动物是被诊断有癌症的哺乳动物。在一些实施例中，癌细胞是选自以下的癌细胞：结肠癌、肺癌、前列腺癌、皮肤癌、血液癌、肝癌、肾癌、乳腺癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、成神经管细胞瘤、肉瘤、基底细胞癌、胃癌、卵巢癌、食道癌、胰腺癌或睾丸癌细胞。在一些实施例中，癌细胞是成神经管细胞瘤细胞、基底细胞癌细胞、或痣样基底细胞细胞癌细胞(戈林综合征细胞)。
在某些实施例中，一旦将试剂鉴定为hedgehog途径抑制剂，就可在基于细胞或动物的测定中配制并进一步评估试剂。例如，可在基于细胞或动物的癌症模型中测试该试剂，以评估作为抗癌剂的功效。
VI.治疗方法
在一些实施例中，本公开内容涉及调节细胞的分化状态、存活和/或增殖的方法，所述细胞表达具有本文所述的任何smoothened突变的smoothened蛋白。在一些实施例中，细胞在受试者(例如人患者)中。在一些实施例中，细胞在培养物中，并且该方法包括体外方法。在某些实施例中，细胞是癌细胞。在某些实施例中，细胞的特征在于不需要的或异常的细胞增殖。在一些实施例中，细胞包含或已被预先确定为表达包含本文所述的任何smoothened突变的smoothened蛋白。在某些实施例中，细胞已被预先确定为表达smoothened多肽，其相对于野生型人SMO在对应于SEQ ID NO:1的241、281、408、459、469、533和/或535的任何一个或多个的氨基酸处包含突变。在一些实施例中，细胞表达smoothened多肽，其在对应于SEQ ID NO:1的T241M、W281C、I408V、A459V、C469Y、S533N和/或W535L的氨基酸处包含任何下述取代。
在一些实施例中，本公开内容提供了减少细胞中hedgehog信号传导的方法，其中所述细胞表达具有本文所述的任何smoothened突变的smoothened蛋白，其中所述细胞响应hedgehog蛋白或者包含在hedgehog信号传导途径基因(例如hedgehog信号传导途径的组分)中的一个或多个突变，其中所述一个或多个突变导致在不存在配体的情况下增加的hedgehog信号传导和/或hedgehog信号传导途径的活化，其中所述方法包括使所述细胞与有效量的试剂接触的步骤，其中所述试剂是hedgehog途径抑制剂。在一些实施例中，该试剂是选择性结合并且抑制突变型smoothened蛋白的化合物。在一些实施例中，该试剂抑制在细胞中的突变型smoothened蛋白下游起作用的hedgehog信号传导途径的组分。在其他实施例中，该试剂是溴结构域抑制剂。
在一些实施例中，本公开内容提供了用抗癌治疗剂治疗患有癌症的受试者的方法，其中所述受试者包含突变型SMO蛋白和/或已确定为表达突变型SMO蛋白，其中所述突变型SMO蛋白在对应于SEQ ID NO:1的第239位的位置处具有除丙氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，本公开内容提供了抑制细胞中的hedgehog信号传导的方法，其中所述细胞表达在对应于SEQ ID NO:1的第239位的位置处具有除丙氨酸外的氨基酸的突变型SMO蛋白。在一些实施例中，本公开内容提供了诊断患有癌症的受试者的方法，其包括以下步骤：a)从受试者获得样品，b)就编码突变型SMO蛋白的核酸的存在测试所述样品，所述突变型SMO蛋白在对应于SEQ ID NO:1的第239位的位置处具有除丙氨酸外的氨基酸，其中如果所述样品包含所述突变型SMO蛋白，则所述受试者患有癌症。在一些实施例中，癌症是基底细胞癌。在一些实施例中，突变型SMO蛋白在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置239的氨基酸位置处具有缬氨酸。
在一些实施例中，本公开内容提供了抑制细胞的不需要的生长、增殖或存活的方法，其中所述细胞表达具有本文所述的任何smoothened突变的smoothened蛋白，其中所述细胞响应hedgehog蛋白或者包含在hedgehog信号传导途径基因中的一个或多个突变，其中所述一个或多个突变导致在不存在配体的情况下增加的hedgehog信号传导和/或hedgehog信号传导途径的活化，其中所述方法包括使所述细胞与有效量的试剂接触的步骤，其中所述试剂是hedgehog途径抑制剂。在一些实施例中，该试剂是选择性结合并且抑制突变型smoothened蛋白的试剂。在一些实施例中，该试剂抑制在细胞中的突变型smoothened蛋白下游起作用的hedgehog信号传导途径的组分。在一些实施例中，该试剂是溴结构域抑制剂。
在一些实施例中，本公开内容提供了抑制肿瘤细胞生长、增殖或存活的方法，其中所述肿瘤细胞表达具有本文所述的任何smoothened突变的smoothened蛋白，其中所述细胞响应hedgehog蛋白或者包含在hedgehog信号传导途径基因中的一个或多个突变，其中所述一个或多个突变导致在不存在配体的情况下增加的hedgehog信号传导和/或hedgehog信号传导途径的活化，其中所述方法包括使所述细胞与有效量的试剂接触的步骤，其中所述试剂是hedgehog途径抑制剂。在一些实施例中，该试剂是选择性结合并且抑制突变型smoothened蛋白的试剂。在一些实施例中，该试剂抑制在细胞中的突变型smoothened蛋白下游起作用的hedgehog信号传导途径的组分。在其他实施例中，该试剂是溴结构域抑制剂。在一些实施例中，该方法包括向有此需要的患者施用试剂。
在一些实施例中，用本文公开的任何方法处理的细胞包含在导致hedgehog信号传导活化或增加hedgehog信号传导的基因中的一个或多个突变。在一些实施例中，一个或多个突变在修补基因中，导致修补的功能丧失。在一些实施例中，修补的基因中的一个或多个突变导致编码具有下述突变中的一个或多个的修补蛋白质的突变基因：S616G、fs251、E380*、Q853*、W926*、P1387S、sp2667、Q501H、fs1017、fs108或A1380V。
在一些实施例中，导致hedgehog信号传导活化或增加hedgehog信号传导的基因中的一个或多个突变在smoothened中，并且细胞具有smoothened突变。在一些实施例中，smoothened突变是smoothened的功能获得突变。在一些实施例中，功能获得smoothened突变导致组成型活性的smoothened蛋白。参见例如WO 2011/028950和WO 2012047968，其各自以引用的方式并入。在一些实施例中，smoothened突变是在对应于SEQ ID NO:1的第535位的位置处的突变。在某些实施例中，突变是在对应于SEQ ID NO:1的第562位的位置处的突变。在某些实施例中，突变是在第535位处或在SEQ ID NO:1中的该相应位置处的W535L。在一些实施例中，smoothened突变是对应于SEQ ID NO:1的第R562Q位的突变(在第562位处或在对应于SEQ ID NO:1的第562位的位置处的R562Q突变。在一些实施例中，smoothened突变是在对应于SEQ ID NO:1的第412位的位置处的突变，例如在SEQ ID NO:1的这种位置处的L412F。在一些实施例中，smoothened突变具有使得其对某些smoothened抑制剂抗性的替代突变。在一些实施例中，smoothened蛋白包含在SEQ ID NO:1的氨基酸位置518处或在对应于SEQ ID NO:1的第518位的位置处的氨基酸改变。在一些实施例中，氨基酸改变是在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置518的氨基酸位置处的E518K或E518A取代。在一些实施例中，smoothened蛋白包含在SEQ ID NO:1的氨基酸位置473处或在对应于SEQ ID NO:1的第473位的位置处的氨基酸改变。
在一些实施例中，一个或多个突变在hedgehog基因中，并且导致hedgehog蛋白的过表达。在一些实施例中，过表达的hedgehog蛋白是Sonic hedgehog蛋白。在一些实施例中，过表达的hedgehog蛋白是Indian hedgehog蛋白。在一些实施例中，过表达的hedgehog蛋白是Desert hedgehog蛋白。
在一些实施例中，一个或多个突变在suppressor-of-fused中，并且细胞具有suppressor-of-fused(SuFu或SUFU)功能丧失。在一些实施例中，导致SuFu活性的功能丧失。在一些实施例中，SuFu突变在成神经管细胞瘤、脑膜瘤、腺样囊性癌、基底细胞癌和横纹肌肉瘤癌细胞中。在一些实施例中，SuFu突变是Brugieres等人，2012,JCO,30(17):2087-2093中描述的任何突变，所述参考文献全文并入本文。
在一些实施例中，SuFu突变是表1或2中描述的任何突变，或者Brugieres等人，2012,JCO,30(17):2087-2093中描述的任何突变，所述参考文献全文并入本文。
表1：种系SUFU突变
缩写：MB，成神经管细胞瘤；MBEN，具有广泛结节性的MB；NA，不可用；NOS，不另行说明。
表2.种系致病性SUFU突变
缩写：UV，未知变体。
在一些实施例中，SuFu突变包括在对应于SEQ ID NO:10中的下述氨基酸位置中任一个的位置处的突变：第15、184、123、295、187位。在某些实施例中，SuFu突变包括以下中的任何一个或多个：P15L、Q184X、R123C、L295fs或P187L，其中突变在该位置处或在对应于SEQID NO:10中的所述位置的位置处。在一些实施例中，SuFU突变是对应于SEQ ID NO:11的c.1022+1G>A(IVS8-1G>T)、c.72delC、c.72insC、143insA、c.846insC或IVS1-1A->T的任何突变。在一些实施例中，SuFu突变是下述中所述的任何突变：Taylor等人(2002)Nat Genet31:306-310(例如IVS8-1G>T(＝c.1022+1G>A)、1129del、P15L和Ng的两个(全部+LOH))；Slade等人(2011)Fam Cancer 10:337-342,2011(例如c.1022+1G>A；c.848insC)；Pastorino等人(2009)Am J Med Genet A 149A:1539-1543(例如c.1022+1G>A)；Ng等人(2005)Am J Med Genet A 134:399-403(例如143insA；IVS1-1A>T)；Kijima等人(2012)FamCancer 11:565-70(例如c.550C>T(Q184X))；Aavikko等人(2012)Am J Hum Genet 91:520–526(例如c.367C>T(R123C))；Stephens等人(2013)J Clin Invest 123:2965-2968(例如x881_882insG(L295fs))；或Reifenberger等人(2005)Brit J Dermatology 152:43–51(例如c560C>T(P187L))。
在一些实施例中，细胞是人细胞，并且具有染色体10重复和/或10q的一部分的缺失，其中所述部分含有SUFU和PTEN。在一些实施例中，细胞包含Fs1017SUFU突变。
在一些实施例中，用本文所述的任何方法处理的细胞是其中hedgehog信号传导途径是活性的细胞。在一些实施例中，细胞是其中hedgehog信号传导途径是组成型活性的细胞。在一些实施例中，细胞是已用hedgehog蛋白或hedgehog激动剂刺激的细胞。在一些实施例中，通过在Gli-萤光素酶报道测定中监测Gli1水平或活性来确定细胞中hedgehog途径的活性。
在一些实施例中，用本文所述的任何方法处理的细胞是培养物中的细胞。在一些实施例中，本公开内容提供了包括接触包含多个细胞的培养物的方法。在一些实施例中，细胞在脊椎动物中。在一些实施例中，细胞在哺乳动物中，并且接触细胞包括向哺乳动物施用hedgehog信号传导抑制剂。在一些实施例中，哺乳动物是人受试者。在一些实施例中，细胞是癌细胞和/或哺乳动物是被诊断有癌症的哺乳动物。在一些实施例中，癌细胞是选自以下的癌细胞：结肠癌、肺癌、前列腺癌、皮肤癌、血液癌、肝癌、肾癌、乳腺癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、成神经管细胞瘤、肉瘤、基底细胞癌、胃癌、卵巢癌、食道癌、胰腺癌或睾丸癌细胞。在一些实施例中，癌细胞是成神经管细胞瘤细胞、基底细胞癌细胞、或痣样基底细胞细胞癌细胞(戈林综合征细胞)。
在一些实施例中，本文公开的任何方法中使用的hedgehog途径抑制剂是抑制本文所述的任何突变型smoothened蛋白的表达的多核苷酸分子。在一些实施例中，多核苷酸分子是与编码本文公开的任何突变型smoothened蛋白的核酸特异性杂交的反义寡核苷酸。在一些实施例中，反义分子不与编码野生型smoothened蛋白的核酸(例如编码具有SEQ IDNO:1的序列的蛋白质的核酸)杂交。在一些实施例中，hedgehog途径抑制剂是靶向编码公开的任何突变型smoothened多肽的mRNA转录物的RNAi拮抗剂。在一些实施例中，RNAi拮抗剂是siRNA。在一些实施例中，siRNA为长度19-23个核苷酸。在一些实施例中，siRNA是双链的，并且在一个末端或两个末端处包括短突出端。在一些实施例中，siRNA靶向编码本文公开的任何突变型smoothened多肽的mRNA转录物。在一些实施例中，RNAi或siRNA不靶向编码野生型smoothened蛋白的mRNA转录物(例如编码具有SEQ ID NO:1的序列的蛋白质的核酸)。在一些实施例中，RNAi包含shRNA。
在一些实施例中，本文公开的任何方法中使用的hedgehog途径抑制剂是与本文所述的任何突变型smoothened多肽特异性结合的小分子。在一些实施例中，小分子结合在hedgehog信号传导途径中smoothened的下游起作用的多肽。在一些实施例中，小分子结合不同于hedgehog信号传导途径的途径中的多肽。在一些实施例中，小分子是溴结构域抑制剂。在一些实施例中，溴结构域抑制剂是BRD4抑制剂。在一些实施例中，溴结构域抑制剂是Ciceri等人，2014,Nature Chemical Biology,10:305-312；Muller等人，2014,Med ChemCommun,5:288-296；Garnier等人，2014,24(2):185-199中描述的任何溴结构域抑制剂，所述参考文献各自全文并入本文。在一些实施例中，溴结构域抑制剂是I-BET762、JQ1、JQ2、通过BI-2536的BRD4和TG-101348。
在一些实施例中，本文公开的任何方法中使用的hedgehog途径抑制剂是与本文所述的任何突变型smoothened多肽特异性结合的抗体。在一些实施例中，抗体结合在hedgehog信号传导途径中smoothened的下游起作用的多肽。在一些实施例中，抗体是单克隆抗体。
在一些实施例中，根据本文所述任何方法与试剂接触的细胞还与hedgehog信号传导途径的另外抑制剂(例如HPI)接触。在一些实施例中，hedgehog信号传导途径的另外抑制剂是藜芦型甾体生物碱。在一些实施例中，藜芦型甾体生物碱是环巴胺、或KAAD-环巴胺或其任何功能衍生物(例如IPI-269609或IPI-926)。在一些实施例中，藜芦型甾族生物碱是蒜藜芦碱或其任何功能衍生物。在一些实施例中，另外的抑制剂是维莫德吉、sonidegib、BMS-833923、PF-04449913或LY2940680或其任何功能衍生物。在一些实施例中，另外的抑制剂是在化学上与藜芦生物碱或维莫德吉无关的smoothened抑制剂，包括但不限于：sonidegib、BMS-833923、PF-04449913、LY2940680、Erivedge、BMS-833923(XL319)、LDE225(Erismodegib)、PF-04449913、NVP-LDE225、NVP-LEQ506、TAK-441、XL-319、LY-2940680、SEN450、伊曲康唑、MRT-10、MRT-83或PF-04449913.)。在一些实施例中，另外的抑制剂是Amakye等人，Nature Medicine,19(11):1410-1422(其全文并入本文)中公开的任何化合物。在一些实施例中，hedgehog信号传导途径的另外抑制剂是抗体。在一些实施例中，抗体是结合例如特异性结合hedgehog蛋白的抗体。在一些实施例中，hedgehog信号传导途径的另外抑制剂是RNAi拮抗剂。
需要治疗或诊断的受试者包括已具有异常hedgehog信号传导的受试者，以及易于具有异常hedgehog信号传导的那些或在其中要预防异常hedgehog信号传导的那些。例如，如果根据本公开内容的方法，在接受hedgehog途径抑制剂之后，患者显示下述一种或多种中可观察和/或可测量的减少或不存在下述一种或多种，则受试者或哺乳动物被成功地“治疗”了异常hedgehog信号传导：肿瘤细胞数目中的减少或这种细胞的不存在；肿瘤大小中的减少；肿瘤细胞浸润到外周器官包括癌症扩散到软组织和骨内的抑制(即在一定程度上减慢，并且在一些实施例中，停止)；肿瘤转移的抑制(即在一定程度上减慢，并且在一些实施例中，停止)；肿瘤生长在一定程度上的抑制；和/或与特定癌症相关的一种或多种症状在一定程度上的缓解；降低的发病率和死亡率，以及生活质量问题中的改善。在这种hedgehog途径抑制剂可预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度上，它可以是细胞抑制和/或细胞毒性的。这些体征或症状的减轻也可被患者感觉到。另外，成功暴露于hedgehog途径抑制剂(特别是在其中肿瘤应答无法测量的情况下)可通过皮肤穿孔活组织检查或毛囊(如对于维莫德吉完成的)中的Gli1表达来监测。
在某些实施例中，用本文公开的任何hedgehog途径抑制剂治疗的受试者表达对维莫德吉抗性的突变型smoothened蛋白。在一些实施例中，受试者表达包含本文所述的任何smoothened突变的smoothened蛋白。在某些实施例中，受试者表达smoothened多肽，其在对应于SEQ ID NO:1的241、281、408、459、469、533和/或535的任何一个或多个的氨基酸处包含突变。在一些实施例中，受试者表达smoothened多肽，其在对应于SEQ ID NO:1的T241M、W281C、I408V、A459V、C469Y、S533N和/或W535L的氨基酸处包含突变。在一些实施例中，在用本文所述的任何治疗方法治疗之前，受试者已确定为表达包含本文所述的任何smoothened突变的smoothened蛋白。在某些实施例中，在用本文所述的任何治疗方法治疗之前，受试者已确定为表达smoothened多肽，其在对应于SEQ ID NO:1的241、281、408、459、469、533和/或535的任何一个或多个的氨基酸处包含突变。在一些实施例中，在用本文所述的任何治疗方法治疗之前，受试者已确定为表达smoothened多肽，其在对应于SEQ ID NO:1的T241M、W281C、I408V、A459V、C469Y、S533N和/或W535L的氨基酸处包含突变。
用于评价疾病的成功治疗和改善的上述参数可通过医生熟悉的常规程序容易地测量。对于癌症治疗，可例如通过评价疾病进展时间(TTP)和/或确定应答率(RR)来测量功效。可通过分期测试以及钙水平和其他酶的测试来确定转移，以确定转移的程度。也可进行CT扫描以寻找对肿瘤或癌症以外的区域的扩散。本文关于预后、诊断和/或治疗过程所述的公开内容涉及例如Gli1表达的确定和评估。
用于疾病(例如癌症)治疗、减轻疾病症状或疾病诊断的“哺乳动物”指分类为哺乳动物的任何动物，包括人，驯养动物和农场动物以及动物园、运动或宠物动物，例如犬、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔、雪貂等。在一些实施例中，哺乳动物是人。在一些实施例中，哺乳动物是出生后的。在一些实施例中，哺乳动物是儿科的。在一些实施例中，哺乳动物是成年的。
“与”一种或多种进一步的治疗剂“组合”施用包括以任何次序的同时(并发)和连续施用。
在某些实施例中，hedgehog途径抑制剂用于治疗选自本文所述的任何癌症的癌症，或者其中一种或多种肿瘤细胞包含hedgehog途径组分中的突变(例如本文所述的任何突变)的癌症。一般应当了解并且在本文中具体指出，肿瘤包含可能具有一定水平的异质性的细胞。相应地，并非肿瘤中的所有细胞都必然包含特定的有害突变。相应地，本公开内容考虑了其中被治疗的癌症或肿瘤包含在hedgehog途径的组分中具有突变(例如本文所述的任何突变)的细胞的方法，即使这种突变不存在于肿瘤的每一个细胞中。
还考虑使用hedgehog途径抑制剂可特异性靶向其中受影响的组织和/或细胞显示出高hedgehog途径活化的病症。由hedgehog信号传导途径活化的Gli基因(包括Gli1和Gli2)的表达与跨越广泛范围的组织和病症的hedgehog信号传导最一致地关联，而Gli3则略微较少。Gli基因编码转录因子，其活化引发hedgehog信号传导的完全效应所需的许多基因的表达。然而，Gli3转录因子也可充当hedgehog效应基因的阻遏物，并且因此，Gli3的表达可引起hedgehog信号传导途径的减少效应。Gli3是充当转录激活物还是阻遏物取决于翻译后事件，并且因此预期用于检测Gli3蛋白的活化形式(相对于阻遏形式)的方法(例如蛋白质印迹)也将是hedgehog途径活化的可靠测量。Gli1基因在广泛多样的癌症、增生和未成熟的肺中强烈表达，并且充当hedgehog途径相对活化的标记。另外，具有高Gli基因表达的组织如未成熟的肺受到hedgehog抑制剂的强烈影响。相应地，考虑Gli基因表达的检测可用作鉴定组织和病症的有力预测工具，所述组织和病症将特别受益于用hedgehog拮抗剂的治疗。在一些实施例中，通过直接检测转录物或者通过检测蛋白质水平或活性来检测Gli1表达水平。可使用广泛范围技术中的任一种来检测转录物，所述技术主要依赖于与Gli1转录物或从其合成的cDNA的杂交或对于Gli1转录物或从其合成的cDNA的探针。众所周知的技术包括RNA印迹、逆转录酶PCR和转录水平的微阵列分析。用于检测Gli蛋白水平的方法包括蛋白质印迹、免疫沉淀、二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D SDS-PAGE-在一些实施例中，针对其中已确定Gli蛋白的位置的标准进行比较)和质谱法。质谱法可与一系列纯化步骤相结合，以允许特定样品中许多不同蛋白质水平的高流通量鉴定。质谱法和2D SDS-PAGE也可用于鉴定蛋白质的转录后修饰，包括蛋白水解事件、泛素化、磷酸化、脂质修饰等。Gli活性还可通过分析与底物DNA的结合或靶启动子的体外转录活化进行评价。凝胶位移测定、DNA足迹测定和DNA-蛋白质交联测定都是可用于评价能够结合DNA上的GU结合位点的蛋白质的存在的方法。J MoI.Med 77(6):459-68(1999)；Cell 100(4):423-34(2000)；Development 127(19):4923-4301(2000)。
因为Gli1在hedgehog活化过程中是遍在表达的，所以任何程度的Gli1过表达应该都可用于确定hedgehog途径抑制剂是有效的治疗剂。在一些实施例中，Gli1应以与正常对照细胞/组织/受试者中至少两倍相当的水平表达。在一些实施例中，Gli1表达是正常细胞/组织/受试者中的四、六、八或十倍。
在某些实施例中，测量Gli1转录水平，并且用hedgehog途径抑制剂处理显示异常高的Gli1水平的患病或障碍组织。在其他实施例中，已知被治疗的状况与hedgehog途径的异常活化具有显著关联，即使在被治疗的组织中未进行Gli1表达水平的测量。早产肺组织、肺癌(例如腺癌、支气管肺泡腺癌、小细胞癌)、乳腺癌(例如下导管癌、下小叶癌、管状癌)、前列腺癌(例如腺癌)和良性前列腺增生在某些情况下均显示强烈升高的Gli1表达水平。相应地，Gli1表达水平是确定哪些组织应该用Hedgehog途径抑制剂治疗的有力诊断装置。另外，存在尿路上皮细胞癌(例如膀胱癌、其他泌尿生殖器癌)在某些情况下也具有升高的gli-1水平的明显相关证据。例如，已知在9q22染色体上的杂合性丢失在膀胱癌中是常见的。Ptch1基因位于此位置处，并且Ptch1功能丧失可能是如许多其他癌症类型中的过度增殖的部分原因。相应地，这样的癌症也显示高Gli1表达，并且特别顺应用hedgehog拮抗剂的治疗。
在某些实施例中，本文所述的任何hedgehog途径抑制剂用于治疗患有具有ptch-1和/或ptch-2突变的肿瘤的受试者，例如patched-1或patched-2功能丧失突变。ptch-1和ptch-2的表达也被hedgehog信号传导途径活化，但通常不到与gli基因相同的程度，并且因此劣于作为hedgehog途径活化标记物的gli基因。在某些组织中，虽然hedgehog途径是高度活性的，但仅表达ptch-1或ptch-2之一。例如，在睾丸发育中，desert hedgehog具有重要作用，hedgehog途径被活化，但仅表达ptc-2。相应地，这些基因作为hedgehog途径活化的标记物可能个别地是不可靠的，尽管两种基因的同时测量被视为用hedgehog拮抗剂治疗的组织的更有用指示物。
鉴于hedgehog信号传导在脊椎动物中形成分化组织的有序空间排列的广泛参与，本公开内容的hedgehog途径抑制剂可用于在体外和体内生成和/或维持不同脊椎动物组织阵列的方法。适当时，Hedgehog途径抑制剂可为上述制剂中的任一种。
在一些实施例中，hedgehog途径抑制剂可用作恶性成神经管细胞瘤和其他原发性CNS恶性神经外胚层肿瘤的治疗方案的部分。成神经管细胞瘤，原发性脑肿瘤，是儿童中最常见的脑肿瘤。成神经管细胞瘤是在后窝出现的原始神经外胚层(PNET)肿瘤。它们占所有小儿脑肿瘤的大约25％。在组织学上，它们是通常排列在真菊形团(true rosette)中的小圆形细胞肿瘤，但可展示对星形胶质细胞、室管膜细胞或神经元的一些分化。PNET可出现在大脑的其他区域，包括松果体(成松果体细胞瘤)和大脑。在地中海区域出现的那些一般具有恶化的预后。
已知成神经管细胞瘤/PNET在切除后在CNS的任何地方复发，并且甚至可转移到骨骼。治疗前评估因此应包括和检查脊髓，以排除“下行转移(dropped metastases)”的可能性。钆增强MRI已大大取代了骨髓造影术用于此目的，并且术后获得CSF细胞学作为例行程序。
在一些实施例中，hedgehog途径抑制剂用作室管膜瘤的治疗程序的部分。室管膜瘤占儿童中的小儿脑肿瘤的大约10％。大体来说，它们是起于脑室的室管膜衬里的肿瘤，并且在显微镜下形成菊形团、管和血管周菊形团。在51例报告有室管膜瘤的儿童的CHOP系列中，3/4是组织学良性的，大约2/3起于第四脑室区域，并且三分之一存在于幕上区域。呈现年龄在出生和4岁之间达到峰值。中位年龄为约5岁。因为如此多的患有这种疾病的儿童是婴儿，所以他们经常需要多模式治疗。
在一些实施例中，基于hedgehog信号传导在各种肿瘤中的参与、或者hedgehog或其受体在发育期间在这些组织中的表达，本公开内容的hedgehog途径抑制剂可用于抑制具有失调的hedgehog活性的肿瘤的生长。这样的肿瘤包括但不限于：与戈林综合征相关的肿瘤(例如成神经管细胞瘤、脑膜瘤等)、与ptch突变相关的肿瘤(例如血管瘤、横纹肌肉瘤等)、来源于Gli1扩增的肿瘤(例如成胶质细胞瘤、肉瘤等)、来源于Smo功能障碍的肿瘤(例如基底细胞癌等)、与TRC8相关的肿瘤、ptc同源物(例如肾癌、甲状腺癌等)、Ext-1相关肿瘤(例如骨癌等)、Sft/x诱导的肿瘤(例如肺癌、软骨肉瘤等)、过表达hedgehog蛋白的肿瘤和其他肿瘤(例如乳腺癌、泌尿生殖器癌(例如肾癌、膀胱癌、输尿管癌、前列腺癌等)、肾上腺癌、胃肠癌(例如胃癌、肠癌等)。
在一些实施例中，本公开内容的hedgehog途径抑制剂还可用于治疗几种形式的癌症。这些癌症包括但不限于：前列腺癌、膀胱癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、结肠癌、肾癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜或其他子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、阴茎癌、阴道癌、尿道癌、胆囊癌、食管癌或胰腺癌。另外的癌症类型包括骨骼癌或平滑肌癌、胃癌、小肠癌、唾液腺癌、肛门癌、直肠癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、垂体癌和鼻咽癌。可用本公开内容的hedgehog拮抗剂治疗的癌症的进一步示例性形式包括包含hedgehog表达细胞的癌症。可用本公开内容的hedgehog拮抗剂治疗的癌症的再进一步的示例性形式包括包含Gli表达细胞的癌症。在一个实施例中，癌症的特征在于patched-1中的突变。在一些实施例中，癌症的特征在于smoothened和/或SuFu突变。
在某些实施例中，hedgehog途径抑制剂可用于治疗患有基底细胞癌的受试者。在特定实施例中，基底细胞癌是痣样基底细胞癌。在特定实施例中，受试者患有戈林综合征。
以上仅是本公开内容的hedgehog途径抑制剂的体外和体内用途的示例。hedgehog途径抑制剂也适用于鉴定突变型smoothened蛋白(例如具有T241M、W281C、I408V、A459V、C469Y、S533N和/或W535L突变的smoothened蛋白)的天然靶或结合配偶体，以研究突变型smoothened生物活性、纯化来自各种细胞和组织的突变型smoothened及其结合配偶体、以及鉴定hedgehog信号传导途径的另外组分。
在某些实施例中，hedgehog途径抑制剂是公开的任何抗体。本公开内容的抗体可用于例如体外、离体和体内治疗方法。在一个方面，本公开内容提供了用于在体内或体外治疗癌症、抑制不需要的细胞增殖、抑制癌症转移和诱导肿瘤细胞凋亡的方法，所述方法包括在允许抗体与突变型SMO的结合的条件下，使细胞暴露于本公开内容的抗体。在某些实施例中，细胞是骨髓性白血病细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肾细胞癌细胞和成胶质细胞瘤细胞。在一个实施例中，本公开内容的抗体可用于抑制突变型SMO的活性，所述方法包括使突变型SMO暴露于本公开内容的抗体，使得突变型SMO的活性被抑制。
在一个方面，本公开内容提供了用于治疗癌症的方法，所述方法包括向个体施用有效量的本公开内容的抗体。在某些实施例中，用于治疗癌症的方法包括向个体施用有效量的药物制剂，所述药物制剂包含本公开内容的抗体和任选的至少一种另外的治疗剂，例如下文提供的那些。
本公开内容的抗体可单独使用或在治疗中与其他组合物组合使用。例如，本公开内容的抗体可与至少一种另外的治疗剂和/或佐剂共施用。在某些实施例中，另外的治疗剂是抗VEGF抗体。
上述的这类组合疗法包括组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或分开的制剂中)，以及分开的施用，在这种情况下，本公开内容的抗体的施用可在另外的治疗剂和/或佐剂施用之前、另外的治疗剂和/或佐剂施用同时、和/或另外的治疗剂和/或佐剂施用之后发生。本公开内容的抗体也可与放射疗法组合使用。
在一个实施例中，本公开内容的抗体用于结合个体中突变型SMO的方法中，所述个体患有与增加的突变型SMO表达和/或活性相关的病症，所述方法包括向个体施用抗体，使得个体中的突变型SMO是结合的。在一个实施例中，突变型SMO是人突变型SMO，并且个体是人。
本公开内容的抗体(和任何其他治疗剂或佐剂)可通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内、以及在局部治疗需要时的病灶内施用。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。另外，抗体通过脉冲输注适当地施用，特别是伴随抗体的下降剂量。给药可通过任何合适的途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是暂时的还是长期的。
在抗体制备和施用时可考虑本公开内容的抗体的结合靶的位置。当结合靶是细胞内分子时，本公开内容的某些实施例提供了要引入结合靶位于其中的细胞中的抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，本公开内容的抗体可在细胞内作为细胞内抗体表达。如本文使用的，术语“细胞内抗体”指在细胞内表达并且能够选择性结合靶分子的抗体或其抗原结合部分，如例如在Marasco,Gene Therapy 4:11-15(1997)；Kontermann,Methods 34:163-170(2004)；美国专利号6,004,940和6,329,173；美国专利申请公开号2003/0104402和PCT公开号WO2003/077945中所述的。关于使用基因疗法生成细胞内抗体，还参见例如1996年3月14日公开的WO96/07321。
可通过将编码所需抗体或其抗原结合部分的核酸(缺乏野生型前导序列和通常与编码该抗体或抗原结合片段的基因相关的分泌信号)引入靶细胞内来实现细胞内抗体的细胞内表达。编码本公开内容的抗体的全部或一部分的一种或多种核酸可递送至靶细胞，使得表达能够结合细胞内靶多肽并调节靶多肽的活性的一种或多种细胞内抗体。可使用将核酸引入细胞内的任何标准方法，包括但不限于显微注射、弹道注射、电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质体，以及用携带int核酸的逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和牛痘载体的转染
在某些实施例中，可通过体内和离体方法将核酸(任选地包含在载体中)引入患者的细胞内。在体内递送的一个例子中，核酸直接注射到患者内，例如在需要治疗干预的部位处。在体内递送的进一步例子中，使用由病毒载体(例如腺病毒、单纯疱疹I型病毒或腺相关病毒)和基于脂质的系统(用于脂质介导的基因转移的有用脂质是例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)的转染将核酸引入细胞内。关于某些基因标记和基因治疗方案的综述，参见Anderson等人，Science 256:808-813(1992)和WO 93/25673及其中引用的参考文献。在离体治疗的例子中，取出患者的细胞，将核酸引入那些分离的细胞中，并且将经修饰的细胞直接或例如封装在植入患者内的多孔膜内施用于患者(参见例如美国专利号4,892,538和5,283,187)。用于核酸离体递送的常用载体是逆转录病毒载体。
在另一个实施例中，本发明提供了内化抗体。抗体可具有增强抗体递送到细胞内的某些特征，或可被修饰以具有这种特征。用于实现这一点的技术是本领域已知的。例如，已知抗体的阳离子化促进其摄入细胞内(参见例如美国专利号6,703,019)。脂转染或脂质体也可用于将抗体递送到细胞内。当使用抗体片段时，与靶蛋白特异性结合的最小抑制片段可能是有利的。例如，基于抗体的可变区序列，可设计保留结合靶蛋白序列的能力的肽分子。这些肽可化学合成和/或通过重组DNA技术产生。参见例如Marasco等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7889-7893(1993)。
可通过本领域已知的其他方法增强抗体进入靶细胞内。例如，某些序列，例如源自HIV Tat或触角足同源结构域蛋白的序列能够指导异源蛋白质跨越细胞膜的有效摄取。参见例如Chen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999),96:4325-4329。
当抗体的结合靶位于脑中时，本公开内容的某些实施例提供了横穿血脑屏障的抗体。存在用于转运分子跨越血脑屏障的几种领域已知的方法，包括但不限于物理方法、基于脂质的方法、基于干细胞的方法以及基于受体和通道的方法。
转运抗体跨越血脑屏障的物理方法包括但不限于完全绕过血脑屏障，或通过在血脑屏障中产生开口。绕过方法包括但不限于直接注射到大脑内(参见例如Papanastassiou等人，Gene Therapy 9:398-406(2002))，间质输注/对流增强递送(参见例如Bobo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2076-2080(1994))，以及在脑中植入递送装置(参见例如Gill等人，Nature Med.9:589-595(2003)；和Gliadel WafersTM,GuildfordPharmaceutical)。在屏障中产生开口的方法包括但不限于超声波(参见例如美国专利公开号2002/0038086)、渗透压(例如通过施用高渗甘露醇(Neuwelt,E.A.,Implication of theBlood-Brain Barrier and its Manipulation，第1&2卷，Plenum Press,N.Y.(1989))、通过例如缓激肽或透化剂A-7的透化(参见例如美国专利号5,112,596、5,268,164、5,506,206和5,686,416)、以及用含有编码抗体的基因的载体转染跨越血脑屏障的神经元转染(参见例如美国专利公开号2003/0083299)。
转运抗体跨越血脑屏障的基于脂质的方法包括但不限于将抗体封装在与抗体结合片段偶联的脂质体中，所述抗体结合片段结合血脑屏障的血管内皮上的受体(参见例如美国专利申请公开号20020025313)，并且将抗体包被在低密度脂蛋白颗粒(参见例如美国专利申请公开号20040204354)或载脂蛋白E(参见例如美国专利申请公开号20040131692)中。
转运抗体跨越血脑屏障的基于干细胞的方法需要遗传改造神经祖细胞(NPC)以表达目的抗体，然后将干细胞植入要治疗个体的脑内。参见Behrstock等人(2005)GeneTher.15Dec.2005的提前在线出版物(报告称，当植入啮齿类动物和灵长类动物模型的大脑内时，遗传改造为表达神经营养因子GDNF的NPC减少帕金森病的症状)。
转运抗体跨越血脑屏障的基于受体和通道的方法包括但不限于使用糖皮质激素阻断剂来增加血脑屏障的通透性(参见例如美国专利申请公开号2002/0065259、2003/0162695和2005/0124533)；活化钾通道(参见例如美国专利申请公开号2005/0089473)，抑制ABC药物转运蛋白(参见例如美国专利申请公开号2003/0073713)；用转铁蛋白包被抗体并且调节一种或多种转铁蛋白受体的活性(参见例如美国专利申请公开号2003/0129186)和使抗体阳离子化(参见例如美国专利号5,004,697)。
本公开内容的抗体将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括被治疗的特定病症、被治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的原因、试剂的递送部位、施用方法、施用方案、以及医学从业者已知的其他因素。抗体不必，而是任选地与目前用于预防或治疗所讨论的病症的一种或多种试剂一起配制。这种其他试剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量、病症或治疗的类型、以及上文讨论的其他因素。这些一般以与如本文所述相同的剂量和施用途径，或约1至99％本文所述的剂量，或以凭经验/临床上确定为适当的任何剂量和任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，本公开内容的抗体的适当剂量(当单独使用或者与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)取决于要治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和病程、抗体施用用于预防还是治疗目的、先前的治疗、患者的临床病史和对抗体的应答、以及主治医师的判断。将抗体一次或经过一系列治疗适当地施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可为施用于患者的初始候选剂量，例如，无论是通过一个或多个分开的施用，还是通过连续输注。取决于上述因素，一个典型的日剂量范围可为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于经过几天或更长时间的反复施用，根据状况，治疗一般持续直到发生疾病症状的所需抑制。抗体的一个示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一种或多种剂量。这样的剂量可间歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2至约20个、或例如约6个剂量的抗体)。可施用初始较高的负荷剂量，随后为一个或多个较低的剂量。示例性给药方案包括施用约4mg/kg的初始负荷剂量，随后为约2mg/kg的抗体的每周维持剂量。然而，其他剂量方案可能是有用的。通过常规技术和测定容易地监测该疗法的进展。
应当理解，任何上述治疗方法都可使用本公开内容的免疫缀合物代替或加上抗突变型SMO抗体来进行。
VII.药物制剂
在一些实施例中，本文所述的hedgehog途径抑制剂或根据本公开内容的hedgehog途径抑制剂中的任一种都可配制在药物组合物中。
可通过将具有所需纯度的试剂与任选的药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，来制备以冻干制剂或水性溶液形式的根据本公开内容使用的hedgehog途径抑制剂的药物组合物用于贮存(Remington:The Science of Practice of Pharmacy.第20版，Gennaro,A.等人，编辑，Philadelphia College of Pharmacy and Science(2000))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲液例如乙酸盐、Tris、磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；张力剂(tonicifier)，例如海藻糖和氯化钠；糖类，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；表面活性剂，例如聚山梨醇酯；成盐抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如或聚乙二醇(PEG)。
在一些实施例中，根据本公开内容和/或本文所述的hedgehog途径抑制剂的任何制剂还可含有对于被治疗的特定适应症必要的多于一种活性化合物，在一些实施例中，具有不会不利地影响彼此的补充活性的那些。应当认识到，在某些实施例中，hedgehog途径抑制剂和第二活性剂一起配制(例如含有两种试剂的制剂或组合物)。在其他实施例中，两种(或更多种)活性剂分开配制，使得分开的制剂可被一起或分开上市、销售、贮存和使用。当分开配制时，本公开内容考虑到它们可在相同或不同的时间施用，并且在某些实施例中，可同时组合和施用。
例如，除上述治疗剂之外，可能期望在制剂中包括另外的抗体，例如第二种这样的治疗剂、或针对一些其他靶的抗体(例如影响肿瘤生长的生长因子)。在一些实施例中，可能期望在制剂中包括hedgehog抑制剂(例如robotkinin)。可替代地或另外，组合物还可包含化学治疗剂、细胞毒素剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂和/或心脏保护剂。这些分子合适地以对于预期目的有效的量组合存在。在一些实施例中，另外的活性化合物是甾体生物碱。在一些实施例中，甾体生物碱是环巴胺或KAAD-环巴胺或蒜藜芦碱或其任何功能衍生物(例如IPI-269609或IPI-926)。在一些实施例中，另外的活性化合物是维莫德吉、sonidegib、BMS-833923、PF-04449913、或LY2940680或其任何衍生物。在一些实施例中，另外的活性化合物是Amakye等人，Nature Medicine,19(11):1410-1422(其全文并入本文)中公开的任何化合物。在一些实施例中，另外的活性化合物是与藜芦生物碱或维莫德吉化学上无关的另一种smoothened抑制剂，包括但不限于：Erivedge、BMS-833923(XL319)、LDE225(Erismodegib)、PF-04449913、NVP-LDE225、NVP-LEQ506、TAK-441、XL-319、LY-2940680、SEN450、伊曲康唑、MRT-10、MRT-83或PF-04449913)。如上所述，本公开内容考虑其中第二活性剂连同hedgehog途径抑制剂一起配制的制剂(例如作为包含两种活性剂的单一制剂)，以及其中两种活性剂在两种分开的制剂或组合物中存在的实施例。
在一些实施例中，本公开内容的任何hedgehog途径抑制剂，例如本文所述的那些，也可诱陷在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这种技术在Remington:The Science andPractice of Pharmacy，同上中公开。
在一些实施例中，本公开内容的任何hedgehog途径抑制剂配制成持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质采取成形制品(例如薄膜或微胶囊)的形式。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)和聚-D(-)-3-羟基丁酸。
用于本公开内容的方法中的本公开内容的组合物的量可通过标准临床技术来确定，并且可根据特定适应症或用途而变化。有效剂量可从源自体外或动物模型试验系统的剂量-应答曲线推断。
在某些实施例中，本公开内容的组合物，包括药物制剂，是无热原的。换言之，在某些实施例中，组合物基本上是无热原的。在一个实施例中，本公开内容的制剂是基本上不含内毒素和/或相关致热物质的无热原制剂。内毒素包括限于微生物内的毒素，并且仅当微生物分解或死亡时才释放。致热物质还包括来自细菌外膜和其他微生物的发热诱导的热稳定物质(糖蛋白)。如果对人体施用，这两种物质均可引起发烧、低血压和休克。由于潜在的有害效应，即使少量的内毒素也必须从静脉内施用的药物溶液中去除。食品和药物管理局(“FDA”)已设定了对于静脉内药物施用在单次一小时时期内5个内毒素单位(EU)/剂量/千克体重的上限(The United States Pharmacopeial Convention,Pharmacopeial Forum26(1):223(2000))。当治疗性蛋白质以相对大的剂量和/或经过延长时间段(例如对于患者的整个寿命)施用时，即使少量的有害和危险的内毒素也可能是危险的。在某些具体实施例中，组合物中的内毒素和热原水平小于10EU/mg、或小于5EU/mg、或小于1EU/mg、或小于0.1EU/mg、或小于0.01EU/mg、或小于0.001EU/mg。
在一些实施例中，hedgehog途径抑制剂配制成无菌制剂。这通过经由无菌过滤膜的过滤容易地实现。
IX.制造物品和试剂盒
在一些实施例中，本公开内容的hedgehog途径抑制剂，例如本文公开的hedgehog途径抑制剂在制造物品中制备。类似地，本公开内容的多肽和核酸，例如突变型SMO多肽，可制备为制造物品。在一些实施例中，制造物品包括容器和在容器上或与容器相结合的标签或包装说明书，其指示用于整体或部分抑制hedgehog信号传导的用途，或者可替代地用于治疗由于hedgehog信号传导途径活化的病症或状况。在其他实施例中，制造物品包括容器和在容器上或与容器相结合的标签或包装说明书，其指示在筛选测定中的用途。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由各种材料例如玻璃或塑料形成。在一些实施例中，容器容纳对治疗癌症状况有效的组合物，并且可具有无菌进入口(例如容器可为具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是hedgehog途径抑制剂。标签或包装说明书还包括用于施用hedgehog途径抑制剂或者用于使用SMO多肽或核酸或载体或宿主细胞的说明书。另外，制造物品还可包含第二容器，其包含药学可接受的缓冲液，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。制造物品还可包括从商业和用户的观点来看期望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
在一些实施例中，本发明提供了可用于各种其他目的的试剂盒，例如用于突变型SMO蛋白表达的细胞杀死测定、用于从细胞中纯化或免疫沉淀hedgehog信号传导多肽。为了分离和纯化突变型SMO蛋白，试剂盒可含有偶联到珠(例如琼脂糖珠)的各自的突变型SMO蛋白结合试剂。可提供包含这样的分子的试剂盒，用于在体外例如在ELISA或Western印迹中检测和定量突变型SMO蛋白。在一些实施例中，与制造物品一样，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相结合的标签或包装说明书。在一些实施例中，容器容纳包含可与本公开内容一起使用的至少一种此类hedgehog途径抑制剂试剂的组合物。在一些实施例中，可包括含有例如稀释剂和缓冲液、对照抗体的另外容器。在一些实施例中，标签或包装说明书可提供组合物的描述以及预期的体外或诊断用途的说明。
实例
现在一般描述了本公开内容，它通过参考下述实例将更容易理解，所述实例仅出于举例说明本公开内容的某些方面和实施例的目的而被包括，并不预期限制本公开内容。
实例1：维莫德吉抗性基底细胞癌的遗传分析。
由于获得了赋予药物抗性的遗传改变，对靶向治疗(如癌症疗法)的临床应答可能很短暂。抗性机制的鉴定将指导新型治疗策略。不适当的Hh信号传导与几种癌症包括基底细胞癌(BCC)联系。PTCH(～90％)中的功能丧失突变和SMO(～10％)中的活化突变是BCC中的主要驱动因素。使用复发性基底细胞癌的外显子组、RNA和拷贝数分析鉴定了对维莫德吉(GDC-0449)抗性的临床机制。
如图2所示，维莫德吉抗性与患有维莫德吉抗性BCC的患者中升高的hedgehog途径信号传导相关。维莫德吉抗性BCC的外显子组测序和拷贝数分析*的结果显示于下表3中。
表3
基因分型揭示了另外的维莫德吉抗性肿瘤中SMO-A459V突变的第三种情况。SMO-A459V是在分析的九个抗性患者中的三个中的治疗后活组织检查中发现的复发突变。SMO-A459V突变仅在治疗后存在，并且不存在于42个独立的首次用于治疗的BCC样品中。(参见图3)SMO-A459V突变能够活化SMO。
SMO-W281C突变也在复发性BCC中检测到。如图4所示，SMO-W281C在维莫德吉结合口袋中。
将WT-SMO、SMO-W281C、SMO-A459V、PTCH或空载体(EV)与GLI1萤光素酶报道物一起在C3H10T1/2细胞中共转染。SMO-A459V显示为具有对PTCH1和维莫德吉的敏感性降低的活化突变。(图5A-5C。误差条表示标准差。)SMO-W281C与SMO-WT一样对PTCH抑制敏感。(图5D-5E。误差条表示标准差。)用所示构建体转染的293细胞与5nM[3H]-维莫德吉连同或不连同50μM冷维莫德吉一起温育。特异性结合＝总结合-非特异性结合。(图5E。误差条表示标准差。)
看起来存在两个临床SMO突变亚组。1)活化，伴随药物敏感性降低(包括A459V和W535L)，以及2)维持Ptch敏感性的突变，但破坏了维莫德吉结合口袋的构象(包括D473H和W281C)。
实例2：维莫德吉抗性和未经治疗的BCC的基因组分析
为了鉴定与维莫德吉抗性相关的突变，从戈林综合征(n＝5)和散发性(n＝6)患者的BCC进行全外显子组测序(WES)，以及来自另一个戈林患者的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品的靶向SMO测序。所有患者最初经历关于维莫德吉的临床益处，但随后在经历治疗时进展。
收集了来自四个患者的两种不同的活组织检查，使得分析了来自维莫德吉抗性BCC的总共十六个活组织检查。患者最初被诊断为转移性(图6B)或局部晚期BCC(图6C)，并且组织学确认药物抗性病变为BCC(图6D)。为了比较，使来自未经治疗的戈林综合征(n＝16)和散发性(n＝27)BCC患者的肿瘤经受WES。从五个戈林患者中获得了两种不同的活组织检查，得到总共48个未经治疗的BCC活组织检查。来自戈林患者的未经治疗的BCC样品的平均体细胞突变率为33.5/兆碱基(Mb)，从6.2-68.9/Mb变化，并且对于散发性患者为50.5/Mb，其范围为2.4-162.2/Mb。与其他癌症包括黑素瘤相比，这些比率很高(Lawrence等人，2013)。体细胞突变谱的整体分析揭示了在两个群组中占优势的胞嘧啶至胸腺嘧啶(C>T)转变突变，指示紫外线诱导的诱变(Miller,1985)。
使用RNA-seq的复发性BCC活组织检查(n＝11)的转录分析揭示，Hh靶基因GLI1表达是正常皮肤样品集合中的10倍高(DESeq2,p<0.003)(图6E)。另外，GLI1表达水平与增殖标记物MKI67的表达水平高度关联(R＝0.96)，与驱动BCC再生长的Hh信号传导的再活化一致。因此，分析集中于鉴定再活化Hh信号传导以避开通过维莫德吉的SMO抑制的遗传机制。为此，鉴定了所选择的癌症基因(Kandoth等人，2013)和经典Hh途径组分中的突变。接下来，使用单核苷酸多态性(SNP；n＝11)和比较基因组杂交(CGH；n＝4)阵列，测定了维莫德吉抗性BCC中的全基因组拷贝数改变和LOH。
实例3：BCC起始中的PTCH1和SMO突变
与关于BCC遗传学的先前报道(Jayaraman等人，2014；Reifenberger等人，2005)一致，所有复发性戈林(100％)和大多数散发性(75％)BCC展示出在肿瘤抑制因子PTCH1)中的突变，其发生在基因的整个长度上，并且可能是有害的：七个被截短，四个可能影响外显子剪接，并且两个通过Condel算法(Gonzalez-Perez和Lopez-Bigas，2011)被预测为有害的。戈林患者BCC(PT12)也可能已通过PTCH1的改变引发。不含PTCH1改变的复发性散发性肿瘤(n＝2)具有已知的致癌突变SMO-W535L(Xie等人，1998)。这些PTCH1和SMO变体可能是BCC中的起始事件，其首先响应并随后展示维莫德吉抗性。
在未经治疗的戈林(90％)和散发性(78％)BCC中观察到PTCH1变体频率的类似趋势，并且在三个散发性病例中鉴定了已知的致癌SMO突变(图7)。复发性BCC显示在戈林(50％)和散发性(57％)病例之间类似的TP53变体频率，而在未经治疗的群组中，TP53变体在散发性BCC(59％)中比戈林BCC(24％)中更频繁地观察到，这可反映在未经治疗的散发性BCC中观察到的更高的突变率。
实例4：SMO变体的维莫德吉依赖性选择
令人惊讶的是，大多数复发性肿瘤活组织检查具有在药物靶SMO中的突变(11/16；69％)，并且大多数与PTCH1变体共发生。相比之下，SMO变体在未经治疗的戈林BCC中完全不存在，并且仅存在于4/27(15％)未经治疗的散发性BCC中。在复发性BCC中鉴定的SMO突变在图8A中概述。SMO-L412F、SMO-W535L和SMO-S533N突变先前报道为致癌驱动因子(Reifenberger等人，1998；Sweeney等人，2014；Xie等人，1998)，而SMO-W281C和SMO-V321M最近在维莫德吉抗性BCC中鉴定(Brinkhuizen等人，2014)。发现了四个SMO突变，包括SMO-T241M、SMO-I408V、SMO-A459V和SMO-C469Y，其在未经治疗的BCC群组中或在Hh驱动的癌症的先前基因组分析中未观察到(Brastianos等人，2013；Clark等人，2013；Jayaraman等人，2014；Kool等人，2014；Reifenberger等人，1998)，强烈地暗示它们在维莫德吉抗性中。来自该研究的所有SMO突变都位于TM区域内(图8B和9A)，并且在来自几个物种的SMO蛋白中高度保守的残基中赋予氨基酸取代，可能反映其在SMO功能中的重要性。
可从头或更可能通过选择在治疗前肿瘤中存在的次要亚克隆来获得抗原机制。在这两种情况下，预期观察到负责对治疗的药物抗性的改变的富集。为了评价SMO突变体的药物依赖性选择，检查了治疗前肿瘤中的突变的检测和治疗后具有SMO突变的肿瘤细胞比例。为此，对可得自6个患者的治疗前FFPE肿瘤样品进行测序，并且分析治疗后肿瘤克隆性。在来自三个患者的治疗后活组织检查中检测到SMO-A459V，但在相应的治疗前活组织检查中无法检测到背景以上的水平(图8C)。类似地，对应于SMO-V321M、SMO-T241M和SMO-C469Y的核苷酸变化仅在治疗后样品中可检测到背景以上的水平，与从头出现或最初以测定的检测限以下的水平存在的SMO突变型细胞的药物诱导性选择一致(图8D和8E)。有趣的是，先前报道的SMO-L412F突变在来自患者PT11的治疗前和治疗后样品两者中容易地检测到，提示该变体可能是该肿瘤的致癌驱动因子(图8F)。注意突变核苷酸的频率在治疗后看起来下降；这是由于治疗后样品中较高水平的污染正常组织。拷贝数和SNP阵列分析揭示，该肿瘤最初对于PTCH1为二倍体，并在治疗后获得PTCH1拷贝数丢失。不希望被理论束缚，这个患者最初响应维莫德吉(图8H)的事实提高了在这种致癌突变的背景下降低的PTCH1水平(通过拷贝丢失)可促进在用药时的肿瘤再生长的可能性。
为了解决SMO突变是否存在于复发性BCC的优势克隆中，使用来自WES的等位基因频率以及源自SNP阵列的拷贝数和肿瘤含量信息，来计算PTCH1和SMO变体的肿瘤细胞级分(Greenman等人，2010；Nik-Zainal等人，2012；Stjernqvist等人，2011)。杂合种系PTCH1突变负责在来自戈林患者的活组织检查中的污染正常皮肤，以及在其中观察到的肿瘤细胞中的后续LOH。除PT09外，SMO是复发性BCC中的二倍体，因此，完全克隆杂合SMO变体的预期等位基因频率为肿瘤含量的50％，这然后与观察到的等位基因频率进行比较。PTCH1突变存在于>80％的肿瘤细胞中，与作为这些肿瘤中的致癌驱动因子的PTCH1中的有害事件一致。基于正常的污染和观察到的等位基因频率，估计所有SMO突变存在于这些维莫德吉抗性BCC中>60％的肿瘤细胞中，与其在药物治疗时的选择一致。
实例5：SMO的药物结合口袋中的突变赋予对维莫德吉的抗性
为了深入了解本研究中发现的SMO突变的性质，利用最近分辨的SMO TM区域的晶体结构(Wang等人，2013)。维莫德吉在SMO结构上的计算对接揭示了SMO-W281、SMO-V321、SMO-I408和SMO-C469位于药物结合口袋(DBP；图10A)的附近。SMO-W281的芳香族吲哚与维莫德吉的吡啶环形成边面π堆积相互作用，并且帮助形成窄而疏水的口袋，所述口袋通过替代SMO-W281C突变体中体积较小的硫而被破坏(图10B，中图)。此外，缬氨酸321突变为甲硫氨酸可能干扰W281的定位，对药物结合发挥二次作用(图10B，右图)。与W281不同，残基I408在测试的计算模型中不直接接触药物；相反，它用其δ甲基针对结合口袋残基H470和V404堆积(pack)，当失去时，其预期通过改变这些残基的构象来影响结合(图10C)。预测C469取代为体积大的酪氨酸引发对结合口袋的空间效应，破坏其构象。
为了测试突变在DBP中的功能影响，使用基于Gli-萤光素酶的Hh报道测定。DBP突变使维莫德吉的IC50增加12至49倍，超过SMO-WT的那种，所述SMO-WT具有80nM的IC50(图12A)。应注意的是，由于在该测定中SMO的过表达，这些IC50值是过高估计的(Dijkgraaf等人，2011)。尽管与SMO-WT相比，每个DBP突变体展示基础活性中的小(<1.5倍)增加(图11A)，除SMO-I408V外的全部容易地被PTCH1过表达抑制(图11B)。接下来测试[3H]标记的维莫德吉与SMO-I408V和SMO-W281C的结合，其分别显示出IC50中的最小增加和最大增加(图12A)。两种突变体均以类似于SMO-WT的细胞表面水平表达，但展示受损的维莫德吉结合(图12B和11C)。
在临床前肿瘤模型中已证实，Hh途径必须在转录水平上被抑制>90％，以诱导肿瘤消退(Wong等人，2011)。为了更好地理解这些SMO突变对在维莫德吉的存在下的细胞增殖的影响，开发了用于小脑颗粒神经元前体(CGNP)细胞的病毒转导的测定。先前已注意到Hh驱动的肿瘤细胞在培养过程中快速丧失其Hh途径依赖性(Sasai等人，2006)。然而，CGNP以Hh依赖的方式在体内增殖，并且在培养中维持其Hh途径依赖性有限的时段(Wechsler-Reya和Scott，1999)。用表达SMO变体的慢病毒构建体连同增强型绿色荧光蛋白(eGFP)-Cre融合蛋白一起，感染从Ptch1loxp/loxp Tp53loxp/loxp Rosa26LSL-tdTomato(PPT)幼崽中分离的CGNP(图12C)。Cre重组酶诱导Ptch1的丧失，并且因此确保仅转导的CGNP可在不存在外源性Sonic hedgehog配体(SHH；图11D)的情况下增殖。这允许我们测试在去除SHH配体后，在维莫德吉和其他抑制剂的存在下，各种SMO突变体促进增殖的能力。监测通过甲基-[3H]-胸苷掺入的增殖，而Cre依赖性串联二聚体(td)Tomato表达允许受感染细胞的显现和定量。该系统还允许更好的模型患者遗传学，因为大多数SMO突变在具有TP53突变的肿瘤中被鉴定并且由PTCH1的丧失驱动。被SMO-WT和Cre感染的PPT CGNP具有～22nM的IC50，并且增殖在100nM维莫德吉下被最大限度地抑制。相比之下，所有DBP突变对维莫德吉敏感性具有显著作用，其中受感染细胞在高水平的维莫德吉下继续增殖(>1μM；图12D)。令人惊讶的是，即使在5μM的维莫德吉的存在下，用SMO-W281C或SMO-C469Y感染的细胞在接近未经治疗的水平下也继续增殖，可能反映了这些残基在药物结合中的直接作用。通过用于Cre依赖性tdTomato报道物表达的荧光活化细胞分选(FACS)分析，证实CGNPs以相似的频率感染，并且SMO变体通过定量逆转录(qRT)PCR以等价水平表达。
实例6：通过SMO药物结合口袋的突变预测对维莫德吉的抗性
为了调查其他DBP突变是否可促进药物抗性，使用计算模型来鉴定具有位于维莫德吉的内的原子的21个SMO残基(图13A)。使用算法来鉴定160种不同的单核苷酸变体，导致对这些DBP残基的非同义改变，包括来自本研究的SMO-W281C和SMO-I408V(表4)。
表4：具有在维莫德吉和LY2940680两者的4.5埃内的原子的SMO残基的鉴定
对应于SEQ ID NO:1的第219、221、281、384、408和518位的氨基酸在维莫德吉结合口袋中。对应于SEQ ID NO:1的第241、321、387、459、469和473位的氨基酸与临床突变相关，但当与SMO结合时，在维莫德吉的4.5埃内未发现。SMO-D473用该方法未鉴定，但SMO晶体结构揭示D473与几个残基形成氢键合网络，所述几个残基不直接接触维莫德吉，包括R400、H470、E518和N521(Wang等人，2013；Yauch等人，2009)。先前通过丙氨酸扫描诱变鉴定了SMOE518作为在突变时影响维莫德吉敏感性的残基(Dijkgraaf等人，2011)。该方法还鉴定了先前涉及对SMO抑制剂sonidegib(LDE225)的抗性的临床前模型的残基，包括N219和D384(表4；Buonamici等人，2010)，所述残基被预测通过氢键合网络稳定SMO构象(图13B)。令人惊讶的是，在基于Gli萤光素酶的Hh报道物测定中，SMO-N219D、SMO-D384N和SMO-S387N都展示与SMM-WT相比降低的对维莫德吉的敏感性(图13C)。此外，发现SMO抑制剂LY2940680和维莫德吉共享14个接触残基(表4)。不希望被理论束缚，这提示化学上不同的抑制剂与重叠的SMO残基相互作用，并且抑制剂之间的交叉抗性可能在临床中出现。
实例7：在药物结合口袋外的SMO突变赋予维莫德吉抗性
相对于维莫德吉结合口袋位于远端的SMO突变也与维莫德吉抗性相关(图14A)。有趣的是，SMO-T241M和SMO-A459V两者均展示超过SMO-WT增加的基础活性，尽管比已确定的致癌突变更小的程度(图14B)。这种升高的活性与通过维莫德吉(图14C和15A)和PTCH1过表达(图15B)两者的抑制的敏感性降低相关联，其中SMO-T241M和SMO-A459V分别将维莫德吉的IC50转变大约3和9倍。另外，尽管具有与SMO-WT可比较水平的细胞表面表达，但所有测试的活化突变体都展示受损的维莫德吉结合(图15C和15D)。
使用PPT CGNP测定来调查非DBP SMO突变对在维莫德吉的存在下的增殖的影响。表达SMO-T241M、SMO-A459V和SMOW535L的CGNP在高浓度的维莫德吉下继续增殖(图14D和15E)。这些数据与在DBP外的突变一致，所述突变使SMO体系结构失稳，以促进活化并降低对拮抗剂的亲和力，如已对于GPCR观察到的(Gether等人，1997)。然而，不能排除通过这些突变对DBP的潜在变构效应，例如在仅略微增加基础活性的SMO-T241M的情况下(图8B)。为PTCH1野生型和具有致癌SMO突变的几种BCC(来自PT01、PT07和PT11)最初响应治疗，尽管这些SMO突变降低了对维莫德吉抑制的敏感性的事实(图15A)。这可提示PTCH1功能丧失在SMO突变体对维莫德吉的敏感性方面的作用。
实例8：克服维莫德吉抗性的治疗选项
已确定了多个SMO突变可赋予对维莫德吉的抗性，接下来解决化学上不同的SMO抑制剂是否可克服维莫德吉抗性。LY2940680和LDE225目前正在针对各种癌症的临床试验中(Clinicaltrials.gov)，并且化合物5是显示针对SMO-D473H的临床前功效的SMO抑制剂(Dijkgraaf等人，2011)。虽然所有化合物类似地抑制表达PPT CGNP的SMO-WT的增殖，但SMO突变体表达细胞继续增殖，尽管程度不同(图16A)。在各种SMO抑制剂之间的这种观察到的交叉抗性与结构预测一致，并且提示组合SMO拮抗剂不是克服获得性抗性的合适的治疗选项。此外，在复发性肿瘤中鉴定复发性SUFU和GLI2变体可另外支持靶向SMO下游的Hh途径组分。尽管迄今开发的GLI抑制剂缺乏效力和生物利用度，但最近的研究发现含溴结构域的蛋白质BRD4占据GLI启动子，并且是Hh途径的转录输出所必需的(Long等人，2014；Tang等人，2014)。表达维莫德吉抗性SMO突变体的PPT CGNP显示在溴结构域抑制剂JQ1的存在下减少的增殖(图16B)。
实例2-9的材料和方法
患者和组织样本
在收到根据联邦指导方针并且如通过参与临床研究SHH3925g、SHH4476g和STEVIE的捐助中心的机构审查委员会(IRB)批准的书面知情同意书之后，收集来自维莫德吉治疗的患者的样本。对于维莫德吉抗性机制的分析，在疾病进展时从12个患有局部晚期或转移性BCC的患者获得活组织检查，如先前所述，所述患者经历了先前研究者评价的治疗临床益处(LoRusso等人，2011；Sekulic等人，2012)。收集来自43个未经治疗的患者的活组织检查并测序，用于根据由University of Michigan and Stanford University IRB批准的方案的比较。
基因组分析
使来自15个维莫德吉抗性BCC样品、48个未经治疗的BCC和52个匹配的血液样品的DNA经受WES。实现了肿瘤活组织检查的WES，其最小平均覆盖率超过67倍。通过SNP或CGH阵列就维莫德吉抗性BCC评价拷贝数变化。使来自11个抗性BCC样品的RNA经受RNA-seq。通过焦磷酸测序分析来自7个FFPE样品的DNA。来自五个正常皮肤样品(得自ProteoGenex)的RNA-seq数据用作与BCC患者样品比较的基线基因表达。
动物
所有小鼠根据由Genentech Inc.机构动物护理和使用委员会批准的方案进行饲养和维持，所述方案符合Genentech Inc.的动物使用指导方针以及加利福尼亚州的法律和道德规范。
功能分析
如所述的(Dijkgraaf等人，2011；Yauch等人，2009)，在pRK5-SMO载体中生成SMO突变体，并且如所述的(Dijkgraaf等人，2011)用于Gli-萤光素酶报道物测定中，或克隆到慢病毒载体内用于转导原代CGNP培养物。使用甲基-[3H]-胸苷掺入测定增殖(Kool等人，2014)。如所述的(Dijkgraaf等人，2011)，在HEK-293细胞中进行[3H]-维莫德吉与SMO突变体的结合。
患者样品
在收到根据联邦和机构审查委员会(IRB)关于捐助中心的指导方针的书面知情同意书后，收集复发性肿瘤样品。未经处理的散发性BCC样品根据University of MichiganIRB批准的方案HUM00069052和HUM00050085获得。未经治疗的戈林患者样品根据StanfordUniversity IRB批准的方案2012-029获得。
组织学
根据标准程序将FFPE和O.C.T.化合物(Tissue-Tek)包埋的样品切片，并且进行H&E染色。使用Zeiss Axioskop 2显微镜(Zeiss)获得图像。
DNA和RNA分离
使用Bullet Blender(Next Advance)或Tissue Lyzer(Qiagen)，将冷冻的BCC肿瘤在RLT plus裂解缓冲液(Qiagen)中匀浆化。按照制造商的方案，用Allprep DNA/RNAMini Kit(Qiagen)分离核酸。使用Allprep DNA/RNA FFPE Kit(Qiagen)，将FFPE肿瘤切片宏观解剖、脱石蜡并且提取。
外显子组捕获和测序
使用Agilent SureSelect(Santa Clara,CA)Human All Exome试剂盒(50Mb)进行外显子组捕获。在HiSeq 2000(Illumina,CA)上，将外显子组捕获文库测序以生成2x 75bp配对末端数据。
变体调用
使用gsnap(Wu和Nacu，2010)版本2013-10-10与参数“-M 2-n 10-B 2-i 1--pairmax-dna＝1000--terminal-threshold＝1000--gmap-mode＝none--clip-overlap”，将Exome-Seq读数与UCSC人基因组(GRCh37/hg19)比对。使用GATK Indel Realigner(DePristo等人，2011)进行局部重排。使用Picard去除重复的读数。使用具有缺省参数的VariantTools2(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/VariantTools.html)进行肿瘤和匹配的正常样本文件上的体细胞变体调用。对于所有样品过滤出在dbSNP Build 131(Sherry等人，2001)中表现，但在COSMIC v62(Forbes等人，2010)中不存在的已知种系变化。使用Condel(Gonzalez-Perez和Lopez-Bigas，2011)预测了所有非同义体细胞突变对基因功能的作用。所有变体都使用Ensembl Release 63进行注释。
RNA测序和数据分析
使用TruSeq RNA Sample Preparation试剂盒(Illumina,CA)制备RNA-seq文库。文库多路复用三次/泳道，并且在HiSeq 2000上测序，以获得至少～30,000,000个配对末端(2x75bp)读数/样品。使用gsnap(Wu和Nacu，2010)版本2013-10-10与参数“-M 2-n 10-B2-i1-N 1-w 200000-E 1--pairmax-rna＝200000--clip-overlap”，将RNA-seq读数与UCSC人基因组(GRCh37/hg19)比对。通过计数在一对内一致地并且对每个如通过NCBI和Ensembl基因注释以及RefSeq mRNA序列所定义的基因座独特地比对的读数数目，来获得表达计数/基因。使用Bioconductor DESeq2包(Anders和Huber，2010)进行差异基因表达分析。
序列数据处理
使用Bioconductor ShortRead包(Morgan等人，2009)就质量评估所有测序读数。为了确认所有的样品都被正确鉴定，所有的外显子组和RNA-seq数据变体都被交叉比较，并且使用Bioconductor VariantTools2包检查遗传一致性。所有患者配对样品均正确匹配，并且使用90％截断与任何其他患者不匹配。
比较基因组杂交(CGH)
在Agilent Human Genome CGH 1M微阵列上测定肿瘤样品。人男性基因组DNA(Promega P/N G1471)用作参考。背景扣除的信号强度的个体log2比由Agilent FeatureExtraction软件版本10.7获得。使用基因组GC含量的1Mb窗口，对于GC含量波效应校正log2比(Diskin等人，2008)。使用cghFLasso算法(Tibshirani和Wang，2008)，将每个探针所得到的log2比值进行分段，一次一个样品和染色体。使用参数λ1＝0和λ2＝1000*在当前染色体上的探针分数进行分段。给定区段的基因组边界内的所有探针均给予该区段内探针的平均拷贝数值。
SNP阵列
使用由(Rudin等人，2012)开发的方法的先前使用的修改版本来处理IlluminaHumanOmni 2.5-8阵列。如先前，使用正常样品的大型实验对象组来了解每个SNP的两个探针的行为。对于目前的分析，使用450个HapMap正常样品。如先前，每个样本中每个探针的原始信号被转换到量表上，其中给定等位基因的0、1或2个真实潜在拷贝映射为1、2或3，如通过PICNIC的隐马尔可夫模型所要求的。每个等位基因的探针A和B的这些值用于计算拷贝数比(CNR，式1)和θ(式2)。CNR可解释为在给定基因座处的总拷贝数与整个样品倍性的比率，即跨越基因组的平均拷贝数。使用基因组GC含量的1Mb窗口，对于GC含量波效应校正CNR值(Diskin等人，2008)。
式1：CNR＝(A+B)/4
式2：θ＝2/π*arctan(B/A)
然后将CNR和θ输入PICNIC的预处理步骤，该步骤估计α，当零拷贝存在时CNR的背景值；π，来自正常细胞污染的信号分数；和φ，总体倍性或跨越所有询问的SNP位置的平均拷贝数。该估计要求沿基因组的CNR的初始分段。在本工作中，使用cghFLasso(L2L1VitPath，其中λ1＝0和λ2＝1000，(Tibshirani和Wang，2008))，已发现其提供比CBS(Venkatraman和Olshen，2007)或PICNIC的内部算法更准确的分段。此外，估计α、π和φ的PICNIC程序被校正为对于染色体X和Y使用性别特异性预期拷贝数(π)。最后，发现这三个参数的PICNIC的原始先验分布对于该阵列平台是不适当的。相反，α被建模为高斯，具有平均值0.7和标准差0.05；π被建模为β分布，具有α参数0.05和β参数100；并且φ被建模为γ分布，具有形状参数6.7143和尺度参数0.35。
一旦对每个样本估计α、π和φ，就应用PICNIC的HMM以使数据分段并且生成整数等位基因特异性拷贝数。其中等位基因特异性拷贝数中较小的等于零的基因组区段是LOH的区域。
尽管HMM拟合对于大多数样品中的大多数染色体一般是相当准确的，但观察到CNR偶尔落在对于两个相邻整数预期的值之间。这产生了两个相邻的HMM状态之间的抖动，这被认为不是生物现实的反映。为了解决这个问题，通过PICNIC的HMM产生的总拷贝数的整数估计值替换为通过cghFLasso(CNR)产生的无约束值。为了产生报告的总拷贝数并调整正常污染，估计α、π和φ，并且应用于根据PICNIC的cghFLasso结果：
式3.δ＝(1-α)/((2π)+φ(1-π)
式4.
肿瘤细胞分数
如所述的(Nik-Zainal等人，2012)计算肿瘤细胞分数。简言之，使用以下式确定携带给定突变的肿瘤细胞：
其中r是如通过SNP阵列测定的其为肿瘤细胞的活组织检查中的细胞的分数；r是报告跨越目的碱基的R总读数中的变体等位基因的读数数目；并且hT和hN分别是肿瘤和正常基因组中在该碱基处的基因组拷贝数。所有频率都转换为百分比。一些肿瘤细胞频率大于100％，因为该模型并未考虑种系突变或复制中性LOH。对于验证的种系突变，调整式以考虑在污染组织中以不同比率的突变体读数：
维莫德吉结合模型
具有LY2940680结合的SMO的晶体结构(PDB ID:4JKV)充当对接的起点。Maestro版本9.5(Schrodinger,Inc.)中可用的Schrodinger程序套件用于进行用PrepWiz的蛋白质制备，用Ligprep的维莫德吉的配体制备，以及用Glide Standard Precision的对接，对于所有步骤保留缺省参数，除了Glide对接步骤中的下述修饰之外。包括五十个姿势(pose)用于进行对接后最小化，其中应变校正项打开。前十个姿势被写出来用于分析，所有这些都给出相似的结合模式。吡啶和相邻的邻氯苯基环保持在大致相同的位置，其中酰胺扭转角中的变化引起甲基砜及其附着环的位置中的轻微变化。对于本研究中的图选择了最佳姿势，但上述变化不改变任何关于突变效应的解释。图2B、3A-C、5A-B和6A使用MOE 2013.0801(Chemical Computing Group,Inc.)进行制备。对于结合口袋所示的表面区域和Ile-408相互作用是溶剂可及的。
焦磷酸测序
使用PyroMark Assay Design软件v2.0(Qiagen)设计突变特异性PCR(BSP)引物。合成PCR引物，其中在正向引物或反向引物上具有5'生物素标记，以促进PCR产物与链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠的结合。使用PyroMark Assay Design软件v2.0(Qiagen)，在5'-生物素标记的PCR引物的相反方向设计测序引物。使用Platinum PCR Supermix(Invitrogen)在25μl反应中扩增基因组DNA(20ng)，并且将20μl PCR产物用于在Pyromark Q24(Qiagen)上的测序。将PCR产物与链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠一起温育10分钟，随后为用70％乙醇、Pyromark变性溶液和Pyromark洗涤缓冲液的洗涤。然后使用0.3μM测序引物对变性PCR产物进行测序。使热解图显现且评估序列质量，并且使用PyroMark软件版本2.0.4(Qiagen)测定在SMO位置T241、L412、A549和C469处的突变体百分比。
拷贝数测定
从血液、治疗前和治疗后肿瘤样品中分离基因组DNA，并且10ng/反应用作一式四份Taqman测定(Applied Biosystems/Life Technologies)中的模板，以使用CopyCaller软件(Applied Biosystems/Life Technologies)确定PTCH1和RNASE P(参考)拷贝数。
实时RT-PCR
使用高容量cDNA试剂盒(Applied Biosystems/Life Technologies)将1至4μg总RNA逆转录。使用TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems/LifeTechnologies)进行定量PCR反应。基因特异性Taqman引物/探针序列在请求后可获得。
质粒
使用QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)，在pRK5-SMO中生成SMO点突变体。将SMO点突变体克隆到pRK5-SMO–Flag和pRK7-gD-SMO-myc中。先前通过(Yauch等人，2009)描述了pRK5-PTCH1和pRK5-eGFP。Hh萤光素酶报道物Gli-BS构建体先前由(Murone等人，1999)描述，以及来自Promega的海肾转染对照质粒pRL-TKis。pGEIGC是基于HIV的自灭活慢病毒载体，其通过将pGIPZ(Open Biosystems)的ZeoR-CMVie-tGFP-IRES-PuroR-shRNA-WRE内容物替换为含有下述的片段而产生：EF1α启动子、多克隆位点(MCS)、内部核糖体进入位点(IRES)和融合到增强型绿色荧光蛋白C末端的Cre-重组酶(eGFP-Cre；Harfe等人，2004)。通过测序确认所有构建体；克隆细节、载体图和序列文件在请求后可获得。
萤光素酶报道物测定
将C3H10T1/2细胞(ATCC)以1.75x 10E5个细胞/孔接种到六孔板中的具有4mM谷氨酰胺、10mM Hepes pH 7.2和10％FBS的DMEM High Glucose中。在16小时后，使用GeneJuiceTransfection Reagent(Novagen)，用400ng表达构建体、400ng 9x-Gli-BS和200ng pRL-TK/孔转染细胞。对于PTCH1抑制实验，用200ng SMO表达构建体和另外200ng含有不同比率的PTCH1与空载体的DNA转染细胞。在6小时后，将来自一个孔的细胞进行胰蛋白酶消化并且重新分布在12孔板的四个孔中。在16小时后，将培养基的FBS含量降低至0.5％，以诱导初级纤毛形成，并且加入以所示浓度的小分子Hh抑制剂。24小时后用Dual-Glo LuciferaseAssay System(Promega)测定萤火虫萤光素酶活性，并且使用Wallac EnVision平板读数器(Perkin Elmer)进行读数。值除以海肾萤光素酶活性，以使转染效率标准化。个别实验一式两份或一式三份进行，并且重复至少一次。剂量应答数据与GraphPad Prism中的4参数方程拟合：
其中‘Y’是标准化的Gli-萤光素酶信号或标准化的胸苷掺入，其计算为不包括抑制剂的对照的分数，并且‘X’是抑制剂浓度。顶部和底部(B)值被约束为对于每个样品是相等的。‘H’是Hill斜率。
[3H]-维莫德吉结合测定
将2x 10E6HEK-293细胞接种到10-cm板中，并且16小时后，使用GeneJuice(Novagen)用3μg空载体或SMO表达构建体转染。40小时后，在具有1mM EDTA的PBS中收获细胞，并且在室温(RT)下在具有4％PFA的PBS中固定10分钟，这之后它们在具有1mM EDTA的PBS中洗涤3x，并且以100,000个细胞/孔在96孔板内铺平板。在50μM未标记的维莫德吉的不存在或存在下，将细胞与5nM[3H]-维莫德吉(Selcia)一起在RT下温育1小时，然后使用Filtermate Cell收集器(Perkin Elmer)转移到滤板(Perkin Elmer)。每孔加入40μmMicroScint流体(Perkin Elmer)，并且使用PerkinElmer TopCount NXT评价每分钟计数。所有样品一式三份进行分析。通过从总结合中扣除非特异性结合，在与过量的未标记的维莫德吉竞争后计算特异性结合。
gD-SMO细胞表面表达的FACS分析
将1x10E6HEK-293细胞接种到10-cm板中，并且6小时后，使用GeneJuice(Novagen)用3μg gD-SMO表达构建体转染。48小时后，在具有1mM EDTA的PBS中移出细胞，并且继续与抗GD抗体(5B6，以1μg/ml)一起温育30分钟，随后为与1:100生物素-SP缀合的Affinipure山羊抗小鼠IgG和1:50R-藻红蛋白缀合的链霉抗生物素蛋白(两者均为JacksonImmunoresearch Labs)的两次20分钟温育。将细胞重悬浮于碘化丙啶(500ng/ml)中，并且在HTS FacsCalibur(BD Biosciences)上进行分析。
病毒生产和滴定
在转染前24小时，将HEK-293T细胞在15-cm培养皿上以1.5x10E6个细胞/板在具有10％热灭活FBS的DMEM High Glucose中铺平板。通过使用6μg pGEIGC-SMO、12μg包装载体Δ8.9(Zufferey等人，1997)、3μg包膜载体pVSV-G(Clontech)和转染试剂GeneJuice(Novagen)的共转染来制备慢病毒上清液。转染后12小时更换培养基，并且在24小时后收集病毒上清液，通过0.45μm PES过滤器(Nalgene)过滤，并且在4℃下贮存直到进一步处理。通过以100,000x g超速离心1小时30分钟，将病毒上清液浓缩200倍(Zufferey和Trono，2000)。将病毒团块重悬浮于CGNP培养基中并且贮存于-80℃下。在6孔板中以2x105个细胞/孔铺平板的HEK-293T细胞上测定病毒滴度。允许细胞粘附12小时，这之后将培养基替换为2ml 1:400或1:4000稀释的病毒浓缩液。在病毒添加时计数细胞数目/孔，并且6孔的平均值用于计算病毒滴度。将病毒上清液在细胞上保留60小时，这之后收获细胞并且通过FACS分析荧光蛋白质表达。根据方程[细胞数目/100x％荧光细胞]x 1000/μl病毒浓缩液，计算以转导单位(TU)/ml的病毒滴度(Zufferey和Trono，2000)。仅使用导致少于15％荧光细胞的转录用于滴度计算。
小鼠
Ptch1loxp品系是来自R.和S.Teglund(Karolinska Institutet，Stockholm，瑞典；Kasper等人，2011)的友情赠予。Tp53loxp品系是来自A.Berns(Netherlands Cancer institute,Amsterdam，荷兰；Jonkers等人，2001)的友情赠予。Rosa26LSL.tdTomato品系购自Jackson Labs(库存号：007909；Madisen等人，2010)。根据符合加利福尼亚州的法律和道德规范的Genentech Inc.的动物使用指南，将所有小鼠饲养和维持。
CGNP的分离和转导
来自出生后第5-7天的Ptch1loxp/loxp Rosa26LSL.tdTomato Tp53loxp/loxp小鼠的小脑在0.05％胰蛋白酶中在37℃下解离10分钟。通过在4℃下以514x g离心10分钟收集细胞，重悬浮于CGNP培养基(含有1x B27(不含维生素A；Life Technologies)、0.45％葡萄糖(Sigma Aldrich)、25mM KCl、0.4％牛血清白蛋白(Sigma Aldrich)、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素(Life Technologies)、100μg/ml链霉素(Life Technologies)、200ng/ml辛基化重组SHH的Neurobasal培养基(Life Technologies))中，并且通过0.45μm过滤器(Falcon)过滤。将细胞以5x10E5个细胞/孔在聚-D-赖氨酸包被的6孔板(Corning)中铺平板，并且用慢病毒以感染复数(MOI)1感染。在24小时后，通过胰蛋白酶消化收获细胞，收集在CGNP培养基中并且重新铺平板用于下游应用。
甲基-[3H]-胸苷掺入
为了检查HPI对增殖的效应，将病毒转导的CGNP在聚-D-赖氨酸包被的96孔板(Corning)中在不含SHH的CGNP培养基中以25,000个细胞/孔铺平板。在一式三份的孔中测试抑制剂浓度，并且对于维莫德吉为25、50、100、250、500、1000和5000nM，对于LDE225为500nM，对于LY2940680为500nM，对于化合物5为500nM，对于JQ1为1μM，并且对于DMSO为0.1％(最高浓度媒介物对照)。在24小时后，用1μCi/ml甲基-[3H]-胸苷(Amersham/GEHealthcare)脉冲细胞，并且再培养16-24小时。使用Filtermate Cell Harvester(PerkinElmer)，将细胞收获到96孔滤板(Perkin Elmer)上，并且通过液体闪烁分光光度法在TopCount NXT(PerkinElmer)上定量掺入的放射性。
化合物
如WO2006028956、WO2007059157和Filippakopoulos等人，2010中所述制备GDC-0449、化合物5和JQ-1。LDE225(HY-16582)和LY2940680(HY-13242)来自MedchemExpress。
引用的参考文献
·Amakye,D.,Jagani,Z.和Dorsch,M.(2013).Unraveling the therapeuticpotential of the Hedgehog pathway in cancer.Nature medicine 19,1410-1422.
·Atwood,S.X.,Li,M.,Lee,A.,Tang,J.Y.和Oro,A.E.(2013).GLI activationby atypical protein kinase C iota/lambda regulates the growth of basal cellcarcinomas.Nature 494,484-488.
·Brastianos,P.K.,Horowitz,P.M.,Santagata,S.,Jones,R.T.,McKenna,A.,Getz,G.,Ligon,K.L.,Palescandolo,E.,Van Hummelen,P.,Ducar,M.D.等人(2013).Genomic sequencing of meningiomas identifies oncogenic SMO andAKT1mutations.Nature genetics 45,285-289.
·Brinkhuizen,T.,Reinders,M.G.,van Geel,M.,Hendriksen,A.J.,Paulussen,A.D.,Winnepenninckx,V.J.,Keymeulen,K.B.,Soetekouw,P.M.,van Steensel,M.A.和Mosterd,K.(2014).Acquired resistance to the Hedgehog pathway inhibitorvismodegib due to smoothened mutations in treatment of locally advanced basalcell carcinoma.Journal of the American Academy of Dermatology.
·Buonamici,S.,Williams,J.,Morrissey,M.,Wang,A.,Guo,R.,Vattay,A.,Hsiao,K.,Yuan,J.,Green,J.,Ospina,B.等人(2010).Interfering with resistance tosmoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway inmedulloblastoma.Sci Transl Med 2,51ra70.
·Chang,A.L.和Oro,A.E.(2012).Initial assessment of tumor regrowthafter vismodegib in advanced Basal cell carcinoma.Archives of dermatology148,1324-1325.
·Clark,V.E.,Erson-Omay,E.Z.,Serin,A.,Yin,J.,Cotney,J.,Ozduman,K.,Avsar,T.,Li,J.,Murray,P.B.,Henegariu,O.等人(2013).Genomic analysis of non-NF2meningiomas reveals mutations in TRAF7,KLF4,AKT1,and SMO.Science 339,1077-1080.
·Das Thakur,M.和Stuart,D.D.(2013).The evolution of melanomaresistance reveals therapeutic opportunities.Cancer research 73,6106-6110.
·Dijkgraaf,G.J.,Alicke,B.,Weinmann,L.,Januario,T.,West,K.,Modrusan,Z.,Burdick,D.,Goldsmith,R.,Robarge,K.,Sutherlin,D.等人(2011).Small moleculeinhibition of GDC-0449refractory smoothened mutants and downstream mechanismsof drug resistance.Cancer research 71,435-444.
·Gether,U.,Ballesteros,J.A.,Seifert,R.,Sanders-Bush,E.,Weinstein,H.和Kobilka,B.K.(1997).Structural instability of a constitutively active Gprotein-coupled receptor.Agonist-independent activation due to conformationalflexibility.The Journal of biological chemistry 272,2587-2590.
·Gonzalez-Perez,A.和Lopez-Bigas,N.(2011).Improving the assessment ofthe outcome of nonsynonymous SNVs with a consensus deleteriousness score,Condel.American journal of human genetics 88,440-449.
·Greenman,C.D.,Bignell,G.,Butler,A.,Edkins,S.,Hinton,J.,Beare,D.,Swamy,S.,Santarius,T.,Chen,L.,Widaa,S.等人(2010).PICNIC:an algorithm topredict absolute allelic copy number variation with microarray cancerdata.Biostatistics 11,164-175.
·Hahn,H.,Wicking,C.,Zaphiropoulous,P.G.,Gailani,M.R.,Shanley,S.,Chidambaram,A.,Vorechovsky,I.,Holmberg,E.,Unden,A.B.,Gillies,S.等人(1996).Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basalcell carcinoma syndrome.Cell 85,841-851.
·Inukai,M.,Toyooka,S.,Ito,S.,Asano,H.,Ichihara,S.,Soh,J.,Suehisa,H.,Ouchida,M.,Aoe,K.,Aoe,M.等人(2006).Presence of epidermal growth factorreceptor gene T790M mutation as a minor clone in non-small cell lungcancer.Cancer research 66,7854-7858.
·Jayaraman,S.S.,Rayhan,D.J.,Hazany,S.和Kolodney,M.S.(2014).Mutational landscape of basal cell carcinomas by whole-exome sequencing.TheJournal of investigative dermatology 134,213-220.
·Johnson,R.L.,Rothman,A.L.,Xie,J.,Goodrich,L.V.,Bare,J.W.,Bonifas,J.M.,Quinn,A.G.,Myers,R.M.,Cox,D.R.,Epstein,E.H.,Jr.和Scott,M.P.(1996).Humanhomolog of patched,a candidate gene for the basal cell nevus syndrome.Science272,1668-1671.
·Kandoth,C.,McLellan,M.D.,Vandin,F.,Ye,K.,Niu,B.,Lu,C.,Xie,M.,Zhang,Q.,McMichael,J.F.,Wyczalkowski,M.A.等人(2013).Mutational landscape andsignificance across 12major cancer types.Nature 502,333-339.
·Katritch,V.,Cherezov,V.和Stevens,R.C.(2013).Structure-function ofthe G protein-coupled receptor superfamily.Annual review of pharmacology andtoxicology 53,531-556.
·Kijima,C.,Miyashita,T.,Suzuki,M.,Oka,H.和Fujii,K.(2012).Two casesof nevoid basal cell carcinoma syndrome associated with meningioma caused bya PTCH1or SUFU germline mutation.Fam Cancer 11,565-570.
·Kool,M.,Jones,D.T.,Jager,N.,Northcott,P.A.,Pugh,T J.,Hovestadt,V.,Piro,R.M.,Esparza,L.A.,Markant,S.L.,Remke,M.等人(2014).Genome Sequencing ofSHH Medulloblastoma Predicts Genotype-Related Response to SmoothenedInhibition.Cancer cell 25,393-405.
·Lackner,M.R.,Wilson,T.R.和Settleman,J.(2012).Mechanisms of acquiredresistance to targeted cancer therapies.Future Oncol 8,999-1014.
·Lee,Y.,Kawagoe,R.,Sasai,K.,Li,Y.,Russell,H.R.,Curran,T.和McKinnon,P.J.(2007).Loss of suppressor-of-fused function promotestumorigenesis.Oncogene 26,6442-6447.
·Long,J.,Li,B.,Rodriguez-Blanco,J.,Pastori,C.,Volmar,C.H.,Wahlestedt,C.,Capobianco,A.,Bai,F.,Pei,X.H.,Ayad,N.G.和Robbins,D.J.(2014).TheBET bromodomain inhibitor I-BET151acts downstream of Smoothened to abrogatethe growth of Hedgehog driven cancers.The Journal of biological chemistry.
·LoRusso,P.M.,Rudin,C.M.,Reddy,J.C.,Tibes,R.,Weiss,G.J.,Borad,M.J.,Hann,C.L.,Brahmer,J.R.,Chang,I.,Darbonne,W.C.等人(2011).Phase I trial ofhedgehog pathway inhibitor vismodegib(GDC-0449)in patients with refractory,locally advanced or metastatic solid tumors.Clinical cancer research:anofficial journal of the American Association for Cancer Research 17,2502-2511.
·Metcalfe,C.,Alicke,B.,Crow,A.,Lamoureux,M.,Dijkgraaf,G.J.,Peale,F.,Gould,S.E.和de Sauvage,F.J.(2013).PTEN loss mitigates the response ofmedulloblastoma to Hedgehog pathway inhibition.Cancer research 73,7034-7042.
·Miller,J.H.(1985).Mutagenic specificity of ultraviolet light.J MolBiol 182,45-65.
·Nedelcu,D.,Liu,J.,Xu,Y.,Jao,C.和Salic,A.(2013).Oxysterol binding tothe extracellular domain of Smoothened in Hedgehog signaling.Nature chemicalbiology 9,557-564.
·Negrini,S.,Gorgoulis,V.G.和Halazonetis,T.D.(2010).Genomicinstability—an evolving hallmark of cancer.Nature reviews Molecular cellbiology 11,220-228.
·Nik-Zainal,S.,Van Loo,P.,Wedge,D.C.,Alexandrov,L.B.,Greenman,C.D.,Lau,K.W.,Raine,K.,Jones,D.,Marshall,J.,Ramakrishna,M.等人(2012).The lifehistory of 21breast cancers.Cell 149,994-1007.
·Oro,A.E.,Higgins,K.M.,Hu,Z.,Bonifas,J.M.,Epstein,E.H.,Jr.和Scott,M.P.(1997).Basal cell carcinomas in mice overexpressing sonichedgehog.Science 276,817-821.
·Pastorino,L.,Ghiorzo,P.,Nasti,S.,Battistuzzi,L.,Cusano,R.,Marzocchi,C.,Garre,M.L.,Clementi,M.和Scarra,G.B.(2009).Identification of aSUFU germline mutation in a family with Gorlin syndrome.Am J Med Genet A149A,1539-1543.
·Pesz,K.A.,Bieniek,A.,Makowska,I.和Sasiadek,M.M.(2013).Basal cellcarcinoma of the skin:whole genome screening by comparative genomehybridization revisited.Journal of cutaneous pathology 40,25-29.
·Pricl,S.,Cortelazzi,B.,Dal Col,V.,Marson,D.,Laurini,E.,Fermeglia,M.,Licitra,L.,
·Pilotti,S.,Bossi,P.和Perrone,F.(2014).Smoothened(SMO)receptormutations dictate resistance to vismodegib in basal cell carcinoma.Molecularoncology.
·Reifenberger,J.,Wolter,M.,Knobbe,C.B.,Kohler,B.,Schonicke,A.,Scharwachter,C.,Kumar,K.,Blaschke,B.,Ruzicka,T.和Reifenberger,G.(2005).Somatic mutations in the PTCH,SMOH,SUFUH and TP53genes in sporadic basalcell carcinomas.Br J Dermatol 152,43-51.
·Reifenberger,J.,Wolter,M.,Weber,R.G.,Megahed,M.,Ruzicka,T.,Lichter,P.和Reifenberger,G.(1998).Missense mutations in SMOH in sporadic basal cellcarcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the centralnervous system.Cancer research 58,1798-1803.
·Sasai,K.,Romer,J.T.,Lee,Y.,Finkelstein,D.,Fuller,C.,McKinnon,P.J.和Curran,T.(2006).Shh pathway activity is down-regulated in culturedmedulloblastoma cells:implications for preclinical studies.Cancer research66,4215-4222.
·Sekulic,A.,Migden,M.R.,Oro,A.E.,Dirix,L.,Lewis,K.D.,Hainsworth,J.D.,Solomon,J.A.,Yoo,S.,Arron,S.T.,Friedlander,P.A.等人(2012).Efficacy andsafety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma.The New England journalof medicine 366,2171-2179.
·Smith,M.J.,Beetz,C.,Williams,S.G.,Bhaskar,S.S.,O'Sullivan,J.,Anderson,B.,Daly,S.B.,Urquhart,J.E.,Bholah,Z.,Oudit,D.等人(2014).GermlineMutations in SUFU Cause Gorlin Syndrome-Associated Childhood Medulloblastomaand Redefine the Risk Associated With PTCH1Mutations.Journal of clinicaloncology:official journal of the American Society of Clinical Oncology.
·Stjernqvist,S.,Ryden,T.和Greenman,C.D.(2011).Model-integratedestimation of normal tissue contamination for cancer SNP allelic copy numberdata.Cancer informatics 10,159-173.
·Stone,D.M.,Murone,M.,Luoh,S.,Ye,W.,Armanini,M.P.,Gurney,A.,Phillips,H.,Brush,J.,Goddard,A.,de Sauvage,F.J.和Rosenthal,A.(1999).Characterization of the human suppressor of fused,a negative regulator ofthe zinc-finger transcription factor Gli.Journal of cell science 112(Pt 23),4437-4448.
·Svard,J.,Heby-Henricson,K.,Persson-Lek,M.,Rozell,B.,Lauth,M.,Bergstrom,A.,Ericson,J.,Toftgard,R.和Teglund,S.(2006).Genetic elimination ofSuppressor of fused reveals an essential repressor function in the mammalianHedgehog signaling pathway.Developmental cell 10,187-197.
·Sweeney,R.T.,McClary,A.C.,Myers,B.R.,Biscocho,J.,Neahring,L.,Kwei,K.A.,Qu,K.,Gong,X.,Ng,T.,Jones,C.D.等人(2014).Identification of recurrent SMOand BRAF mutations in ameloblastomas.Nature genetics 46,722-725.
·Tang,Y.,Gholamin,S.,Schubert,S.,Willardson,M.I.,Lee,A.,Bandopadhayay,P.,Bergthold,G.,Masoud,S.,Nguyen,B.,Vue,N.等人(2014).Epigenetictargeting of Hedgehog pathway transcriptional output through BET bromodomaininhibition.Nature medicine 20,732-740.
·Taylor,M.D.,Liu,L.,Raffel,C.,Hui,C.C.,Mainprize,T.G.,Zhang,X.,Agatep,R.,Chiappa,S.,Gao,L.,Lowrance,A.等人(2002).Mutations in SUFUpredispose to medulloblastoma.Nature genetics 31,306-310.
·Wang,C.,Wu,H.,Katritch,V.,Han,G.W.,Huang,X.P.,Liu,W.,Siu,F.Y.,Roth,B.L.,Cherezov,V.和Stevens,R.C.(2013).Structure of the human smoothenedreceptor bound to an antitumour agent.Nature 497,338-343.
·Wang,G.Y.,So,P.L.,Wang,L.,Libove,E.,Wang,J.和Epstein,E.H.,Jr.(2011).Establishment of murine basal cell carcinoma allografts:a potentialmodel for preclinical drug testing and for molecular analysis.The Journal ofinvestigative dermatology 131,2298-2305.
·Wechsler-Reya,R.J.和Scott,M.P.(1999).Control of neuronal precursorproliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog.Neuron 22,103-114.
·Wong,H.,Alicke,B.,West,K.A.,Pacheco,P.,La,H.,Januario,T.,Yauch,R.L.,de Sauvage,F.J.和Gould,S.E.(2011).Pharmacokinetic-pharmacodynamicanalysis of vismodegib in preclinical models of mutational and ligand-dependent Hedgehog pathway activation.Clinical cancer research:an officialjournal of the American Association for Cancer Research 17,4682-4692.
·Xie,J.,Murone,M.,Luoh,S.M.,Ryan,A.,Gu,Q.,Zhang,C.,Bonifas,J.M.,Lam,C.W.,Hynes,M.,Goddard,A.等人(1998).Activating Smoothened mutations insporadic basal-cell carcinoma.Nature 391,90-92.
·Yauch,R.L.,Dijkgraaf,G.J.,Alicke,B.,Januario,T.,Ahn,C.P.,Holcomb,T.,Pujara,K.,Stinson,J.,Callahan,C.A.,Tang,T.等人(2009).Smoothened mutationconfers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma.Science326,572-574.
·Anders,S.和Huber,W.(2010).Differential expression analysis forsequence count data.Genome biology 11,R106.
·DePristo,M.A.,Banks,E.,Poplin,R.,Garimella,K.V.,Maguire,J.R.,Hartl,C.,Philippakis,A.A.,del Angel,G.,Rivas,M.A.,Hanna,M.等人(2011).A frameworkfor variation discovery and genotyping using next--‐generation DNA sequencingdata.Nature genetics 43,491--‐498.
·Diskin,S.J.,Li,M.,Hou,C.,Yang,S.,Glessner,J.,Hakonarson,H.,Bucan,M.,Maris,J.M.和Wang,K.(2008).Adjustment of genomic waves in signalintensities from whole--‐genome SNP genotyping platforms.Nucleic acidsresearch 36,e126.
·Filippakopoulos,P.,Qi,J.,Picaud,S.,Shen,Y.,Smith,W.B.,Fedorov,O.,Morse,E.M.,Keates,T.,Hickman,T.T.,Felletar,,et.al.(2010).SelectiveInhibition.of BET bromodomains.Nature 468,1067--‐1073.
·Forbes,S.A.,Bindal,N.,Bamford,S.,Cole,C.,Kok,C.Y.,Beare,D.,Jia,M.,Shepherd,R.,Leung,K.,Menzies,A.等人(2011).COSMIC:mining complete cancergenomes in the Catalogue of Somatic Mutations in Cancer.Nucleic acidsresearch 39,D945--‐950.
·Forbes,S.A.,Tang,G.,Bindal,N.,Bamford,S.,Dawson,E.,Cole,C.,Kok,Y.,Jia,M.,Ewing,R.,Menzies,A.等人(2010).COSMIC(the Catalogue of SomaticMutations in Cancer):a resource to investigate acquired mutations in humancancer.Nucleic acids research 38,D652-657.
·Gonzalez--‐Perez,A.和Lopez--‐Bigas,N.(2011).Improving theassessment of the outcome of nonsynonymous SNVs with a consensusdeleteriousness score,Condel.American journal of human genetics 88,440-449.
·Harfe,B.D.,Scherz,P.J.,Nissim,S.,Tian,H.,McMahon,A.P.和Tabin,C.J.(2004).Evidence for an expansion--‐based temporal Shh gradient in specifyingvertebrate digit identities.Cell 118,517-528.
·Jonkers,J.,Meuwissen,R.,van der Gulden,H.,Peterse,H.,van der Valk,M.和Berns,A.(2001).Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 ina conditional mouse model for breast cancer.Nature genetics 29,418-425
·Kasper,M.,Jaks,V.,Are,A.,Bergstrom,A.,Schwager,A.,Svard,J.,TeglundS.,Barker,N.和Toftgard,R.(2011).Wounding enhances epidermal tumorigenesis byrecruiting hair follicle keratinocytes.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 108,4099-4104.
·Madisen,L.,Zwingman,T.A.,Sunkin,S.M.,Oh,S.W.,Zariwala,H.A.,Gu,H.,Ng,L.L.,Palmiter,R.D.,Hawrylycz,M.J.,Jones,A.R.等人(2010).Nature neuroscience13,133-140.
·Morgan,M.等人(2009).Bioinformatics 25,2607-2608.
·Murone,M.等人(1999).Current biology:CB 9,76-84.
·Rudin,C等人(2012).Nature genetics 44,1111-1116.
·Sherry,S等人(2001).Nucleic acids research 29,308-311.
·Tibshirani,R.和Wang,P.(2008).Biostatistics 9,18-29.
·Venkatraman,E.等人(2007).Bioinformatics 23,657-663.
·Wu,T.等人(2010).Bioinformatics 26,873-881.
以引用的方式并入
本文提及的所有出版物和专利以引用的方式在此全文并入，如同每个个别出版物或专利具体和个别地指出以引用的方式并入一样。
虽然已讨论了本公开内容的具体实施例，但上述说明书是举例说明性的而不是限制性的。在阅读本说明书和下文权利要求后，本公开内容的许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。本公开内容的全部范围应通过参考权利要求连同其等价物的全部范围以及说明书连同这些变化来确定。前述实例仅用于举例说明性目的，并且不应被解释为限制由所附权利要求限定的本公开内容的范围。
序列表
SEQ ID NO:1--人野生型smoothened氨基酸序列(GenBank登录号NP_005622.1)
Met Ala Ala Ala Arg Pro Ala Arg Gly Pro Glu Leu Pro Leu Leu Gly LeuLeu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Asp Pro Gly Arg Gly Ala Ala Ser Ser Gly Asn AlaThr Gly Pro Gly Pro Arg Ser Ala Gly Gly Ser Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val ThrGly Pro Pro Pro Pro Leu Ser His Cys Gly Arg Ala Ala Pro Cys Glu Pro Leu ArgTyr Asn Val Cys Leu Gly Ser Val Leu Pro Tyr Gly Ala Thr Ser Thr Leu Leu AlaGly Asp Ser Asp Ser Gln Glu Glu Ala His Gly Lys Leu Val Leu Trp Ser Gly LeuArg Asn Ala Pro Arg Cys Trp Ala Val Ile Gln Pro Leu Leu Cys Ala Val Tyr MetPro Lys Cys Glu Asn Asp Arg Val Glu Leu Pro Ser Arg Thr Leu Cys Gln Ala ThrArg Gly Pro Cys Ala Ile Val Glu Arg Glu Arg Gly Trp Pro Asp Phe Leu Arg CysThr Pro Asp Arg Phe Pro Glu Gly Cys Thr Asn Glu Val Gln Asn Ile Lys Phe AsnSer Ser Gly Gln Cys Glu Val Pro Leu Val Arg Thr Asp Asn Pro Lys Ser Trp TyrGlu Asp Val Glu Gly Cys Gly Ile Gln Cys Gln Asn Pro Leu Phe Thr Glu Ala GluHis Gln Asp Met His Ser Tyr Ile Ala Ala Phe Gly Ala Val Thr Gly Leu Cys ThrLeu Phe Thr Leu Ala Thr Phe Val Ala Asp Trp Arg Asn Ser Asn Arg Tyr Pro AlaVal Ile Leu Phe Tyr Val Asn Ala Cys Phe Phe Val Gly Ser Ile Gly Trp Leu AlaGln Phe Met Asp Gly Ala Arg Arg Glu Ile Val Cys Arg Ala Asp Gly Thr Met ArgLeu Gly Glu Pro Thr Ser Asn Glu Thr Leu Ser Cys Val Ile Ile Phe Val Ile ValTyr Tyr Ala Leu Met Ala Gly Val Val Trp Phe Val Val Leu Thr Tyr Ala Trp HisThr Ser Phe Lys Ala Leu Gly Thr Thr Tyr Gln Pro Leu Ser Gly Lys Thr Ser TyrPhe His Leu Leu Thr Trp Ser Leu Pro Phe Val Leu Thr Val Ala Ile Leu Ala ValAla Gln Val Asp Gly Asp Ser Val Ser Gly Ile Cys Phe Val Gly Tyr Lys Asn TyrArg Tyr Arg Ala Gly Phe Val Leu Ala Pro Ile Gly Leu Val Leu Ile Val Gly GlyTyr Phe Leu Ile Arg Gly Val Met Thr Leu Phe Ser Ile Lys Ser Asn His Pro GlyLeu Leu Ser Glu Lys Ala Ala Ser Lys Ile Asn Glu Thr Met Leu Arg Leu Gly IlePhe Gly Phe Leu Ala Phe Gly Phe Val Leu Ile Thr Phe Ser Cys His Phe Tyr AspPhe Phe Asn Gln Ala Glu Trp Glu Arg Ser Phe Arg Asp Tyr Val Leu Cys Gln AlaAsn Val Thr Ile Gly Leu Pro Thr Lys Gln Pro Ile Pro Asp Cys Glu Ile Lys AsnArg Pro Ser Leu Leu Val Glu Lys Ile Asn Leu Phe Ala Met Phe Gly Thr Gly IleAla Met Ser Thr Trp Val Trp Thr Lys Ala Thr Leu Leu Ile Trp Arg Arg Thr TrpCys Arg Leu Thr Gly Gln Ser Asp Asp Glu Pro Lys Arg Ile Lys Lys Ser Lys MetIle Ala Lys Ala Phe Ser Lys Arg His Glu Leu Leu Gln Asn Pro Gly Gln Glu LeuSer Phe Ser Met His Thr Val Ser His Asp Gly Pro Val Ala Gly Leu Ala Phe AspLeu Asn Glu Pro Ser Ala Asp Val Ser Ser Ala Trp Ala Gln His Val Thr Lys MetVal Ala Arg Arg Gly Ala Ile Leu Pro Gln Asp Ile Ser Val Thr Pro Val Ala ThrPro Val Pro Pro Glu Glu Gln Ala Asn Leu Trp Leu Val Glu Ala Glu Ile Ser ProGlu Leu Gln Lys Arg Leu Gly Arg Lys Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Glu ValCys Pro Leu Ala Pro Pro Pro Glu Leu His Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ser Thr IlePro Arg Leu Pro Gln Leu Pro Arg Gln Lys Cys Leu Val Ala Ala Gly Ala Trp GlyAla Gly Asp Ser Cys Arg Gln Gly Ala Trp Thr Leu Val Ser Asn Pro Phe Cys ProGlu Pro Ser Pro Pro Gln Asp Pro Phe Leu Pro Ser Ala Pro Ala Pro Val Ala TrpAla His Gly Arg Arg Gln Gly Leu Gly Pro Ile His Ser Arg Thr Asn Leu Met AspThr Glu Leu Met Asp Ala Asp Ser Asp Phe
SEQ ID NO:2--在SMO的氨基酸位置281处具有突变的人smoothened氨基酸序列
Met Ala Ala Ala Arg Pro Ala Arg Gly Pro Glu Leu Pro Leu Leu Gly LeuLeu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Asp Pro Gly Arg Gly Ala Ala Ser Ser Gly Asn AlaThr Gly Pro Gly Pro Arg Ser Ala Gly Gly Ser Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val ThrGly Pro Pro Pro Pro Leu Ser His Cys Gly Arg Ala Ala Pro Cys Glu Pro Leu ArgTyr Asn Val Cys Leu Gly Ser Val Leu Pro Tyr Gly Ala Thr Ser Thr Leu Leu AlaGly Asp Ser Asp Ser Gln Glu Glu Ala His Gly Lys Leu Val Leu Trp Ser Gly LeuArg Asn Ala Pro Arg Cys Trp Ala Val Ile Gln Pro Leu Leu Cys Ala Val Tyr MetPro Lys Cys Glu Asn Asp Arg Val Glu Leu Pro Ser Arg Thr Leu Cys Gln Ala ThrArg Gly Pro Cys Ala Ile Val Glu Arg Glu Arg Gly Trp Pro Asp Phe Leu Arg CysThr Pro Asp Arg Phe Pro Glu Gly Cys Thr Asn Glu Val Gln Asn Ile Lys Phe AsnSer Ser Gly Gln Cys Glu Val Pro Leu Val Arg Thr Asp Asn Pro Lys Ser Trp TyrGlu Asp Val Glu Gly Cys Gly Ile Gln Cys Gln Asn Pro Leu Phe Thr Glu Ala GluHis Gln Asp Met His Ser Tyr Ile Ala Ala Phe Gly Ala Val Thr Gly Leu Cys ThrLeu Phe Thr Leu Ala Thr Phe Val Ala Asp Trp Arg Asn Ser Asn Arg Tyr Pro AlaVal Ile Leu Phe Tyr Val Asn Ala Cys Phe Phe Val Gly Ser Ile Gly Xaa Leu AlaGln Phe Met Asp Gly Ala Arg Arg Glu Ile Val Cys Arg Ala Asp Gly Thr Met ArgLeu Gly Glu Pro Thr Ser Asn Glu Thr Leu Ser Cys Val Ile Ile Phe Val Ile ValTyr Tyr Ala Leu Met Ala Gly Val Val Trp Phe Val Val Leu Thr Tyr Ala Trp HisThr Ser Phe Lys Ala Leu Gly Thr Thr Tyr Gln Pro Leu Ser Gly Lys Thr Ser TyrPhe His Leu Leu Thr Trp Ser Leu Pro Phe Val Leu Thr Val Ala Ile Leu Ala ValAla Gln Val Asp Gly Asp Ser Val Ser Gly Ile Cys Phe Val Gly Tyr Lys Asn TyrArg Tyr Arg Ala Gly Phe Val Leu Ala Pro Ile Gly Leu Val Leu Ile Val Gly GlyTyr Phe Leu Ile Arg Gly Val Met Thr Leu Phe Ser Ile Lys Ser Asn His Pro GlyLeu Leu Ser Glu Lys Ala Ala Ser Lys Ile Asn Glu Thr Met Leu Arg Leu Gly IlePhe Gly Phe Leu Ala Phe Gly Phe Val Leu Ile Thr Phe Ser Cys His Phe Tyr AspPhe Phe Asn Gln Ala Glu Trp Glu Arg Ser Phe Arg Asp Tyr Val Leu Cys Gln AlaAsn Val Thr Ile Gly Leu Pro Thr Lys Gln Pro Ile Pro Asp Cys Glu Ile Lys AsnArg Pro Ser Leu Leu Val Glu Lys Ile Asn Leu Phe Ala Met Phe Gly Thr Gly IleAla Met Ser Thr Trp Val Trp Thr Lys Ala Thr Leu Leu Ile Trp Arg Arg Thr TrpCys Arg Leu Thr Gly Gln Ser Asp Asp Glu Pro Lys Arg Ile Lys Lys Ser Lys MetIle Ala Lys Ala Phe Ser Lys Arg His Glu Leu Leu Gln Asn Pro Gly Gln Glu LeuSer Phe Ser Met His Thr Val Ser His Asp Gly Pro Val Ala Gly Leu Ala Phe AspLeu Asn Glu Pro Ser Ala Asp Val Ser Ser Ala Trp Ala Gln His Val Thr Lys MetVal Ala Arg Arg Gly Ala Ile Leu Pro Gln Asp Ile Ser Val Thr Pro Val Ala ThrPro Val Pro Pro Glu Glu Gln Ala Asn Leu Trp Leu Val Glu Ala Glu Ile Ser ProGlu Leu Gln Lys Arg Leu Gly Arg Lys Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Glu ValCys Pro Leu Ala Pro Pro Pro Glu Leu His Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ser Thr IlePro Arg Leu Pro Gln Leu Pro Arg Gln Lys Cys Leu Val Ala Ala Gly Ala Trp GlyAla Gly Asp Ser Cys Arg Gln Gly Ala Trp Thr Leu Val Ser Asn Pro Phe Cys ProGlu Pro Ser Pro Pro Gln Asp Pro Phe Leu Pro Ser Ala Pro Ala Pro Val Ala TrpAla His Gly Arg Arg Gln Gly Leu Gly Pro Ile His Ser Arg Thr Asn Leu Met AspThr Glu Leu Met Asp Ala Asp Ser Asp Phe
SEQ ID NO:3在SMO的氨基酸位置459处具有突变的人smoothened氨基酸序列
Met Ala Ala Ala Arg Pro Ala Arg Gly Pro Glu Leu Pro Leu Leu Gly LeuLeu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Asp Pro Gly Arg Gly Ala Ala Ser Ser Gly Asn AlaThr Gly Pro Gly Pro Arg Ser Ala Gly Gly Ser Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val ThrGly Pro Pro Pro Pro Leu Ser His Cys Gly Arg Ala Ala Pro Cys Glu Pro Leu ArgTyr Asn Val Cys Leu Gly Ser Val Leu Pro Tyr Gly Ala Thr Ser Thr Leu Leu AlaGly Asp Ser Asp Ser Gln Glu Glu Ala His Gly Lys Leu Val Leu Trp Ser Gly LeuArg Asn Ala Pro Arg Cys Trp Ala Val Ile Gln Pro Leu Leu Cys Ala Val Tyr MetPro Lys Cys Glu Asn Asp Arg Val Glu Leu Pro Ser Arg Thr Leu Cys Gln Ala ThrArg Gly Pro Cys Ala Ile Val Glu Arg Glu Arg Gly Trp Pro Asp Phe Leu Arg CysThr Pro Asp Arg Phe Pro Glu Gly Cys Thr Asn Glu Val Gln Asn Ile Lys Phe AsnSer Ser Gly Gln Cys Glu Val Pro Leu Val Arg Thr Asp Asn Pro Lys Ser Trp TyrGlu Asp Val Glu Gly Cys Gly Ile Gln Cys Gln Asn Pro Leu Phe Thr Glu Ala GluHis Gln Asp Met His Ser Tyr Ile Ala Ala Phe Gly Ala Val Thr Gly Leu Cys ThrLeu Phe Thr Leu Ala Thr Phe Val Ala Asp Trp Arg Asn Ser Asn Arg Tyr Pro AlaVal Ile Leu Phe Tyr Val Asn Ala Cys Phe Phe Val Gly Ser Ile Gly Trp Leu AlaGln Phe Met Asp Gly Ala Arg Arg Glu Ile Val Cys Arg Ala Asp Gly Thr Met ArgLeu Gly Glu Pro Thr Ser Asn Glu Thr Leu Ser Cys Val Ile Ile Phe Val Ile ValTyr Tyr Ala Leu Met Ala Gly Val Val Trp Phe Val Val Leu Thr Tyr Ala Trp HisThr Ser Phe Lys Ala Leu Gly Thr Thr Tyr Gln Pro Leu Ser Gly Lys Thr Ser TyrPhe His Leu Leu Thr Trp Ser Leu Pro Phe Val Leu Thr Val Ala Ile Leu Ala ValAla Gln Val Asp Gly Asp Ser Val Ser Gly Ile Cys Phe Val Gly Tyr Lys Asn TyrArg Tyr Arg Ala Gly Phe Val Leu Ala Pro Ile Gly Leu Val Leu Ile Val Gly GlyTyr Phe Leu Ile Arg Gly Val Met Thr Leu Phe Ser Ile Lys Ser Asn His Pro GlyLeu Leu Ser Glu Lys Ala Ala Ser Lys Ile Asn Glu Thr Met Leu Arg Leu Gly IlePhe Gly Phe Leu Xaa Phe Gly Phe Val Leu Ile Thr Phe Ser Cys His Phe Tyr AspPhe Phe Asn Gln Ala Glu Trp Glu Arg Ser Phe Arg Asp Tyr Val Leu Cys Gln AlaAsn Val Thr Ile Gly Leu Pro Thr Lys Gln Pro Ile Pro Asp Cys Glu Ile Lys AsnArg Pro Ser Leu Leu Val Glu Lys Ile Asn Leu Phe Ala Met Phe Gly Thr Gly IleAla Met Ser Thr Trp Val Trp Thr Lys Ala Thr Leu Leu Ile Trp Arg Arg Thr TrpCys Arg Leu Thr Gly Gln Ser Asp Asp Glu Pro Lys Arg Ile Lys Lys Ser Lys MetIle Ala Lys Ala Phe Ser Lys Arg His Glu Leu Leu Gln Asn Pro Gly Gln Glu LeuSer Phe Ser Met His Thr Val Ser His Asp Gly Pro Val Ala Gly Leu Ala Phe AspLeu Asn Glu Pro Ser Ala Asp Val Ser Ser Ala Trp Ala Gln His Val Thr Lys MetVal Ala Arg Arg Gly Ala Ile Leu Pro Gln Asp Ile Ser Val Thr Pro Val Ala ThrPro Val Pro Pro Glu Glu Gln Ala Asn Leu Trp Leu Val Glu Ala Glu Ile Ser ProGlu Leu Gln Lys Arg Leu Gly Arg Lys Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Glu ValCys Pro Leu Ala Pro Pro Pro Glu Leu His Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ser Thr IlePro Arg Leu Pro Gln Leu Pro Arg Gln Lys Cys Leu Val Ala Ala Gly Ala Trp GlyAla Gly Asp Ser Cys Arg Gln Gly Ala Trp Thr Leu Val Ser Asn Pro Phe Cys ProGlu Pro Ser Pro Pro Gln Asp Pro Phe Leu Pro Ser Ala Pro Ala Pro Val Ala TrpAla His Gly Arg Arg Gln Gly Leu Gly Pro Ile His Ser Arg Thr Asn Leu Met AspThr Glu Leu Met Asp Ala Asp Ser Asp Phe
SEQ ID NO:4在SMO的氨基酸位置535处具有突变的人smoothened氨基酸序列
Met Ala Ala Ala Arg Pro Ala Arg Gly Pro Glu Leu Pro Leu Leu Gly LeuLeu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Asp Pro Gly Arg Gly Ala Ala Ser Ser Gly Asn AlaThr Gly Pro Gly Pro Arg Ser Ala Gly Gly Ser Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val ThrGly Pro Pro Pro Pro Leu Ser His Cys Gly Arg Ala Ala Pro Cys Glu Pro Leu ArgTyr Asn Val Cys Leu Gly Ser Val Leu Pro Tyr Gly Ala Thr Ser Thr Leu Leu AlaGly Asp Ser Asp Ser Gln Glu Glu Ala His Gly Lys Leu Val Leu Trp Ser Gly LeuArg Asn Ala Pro Arg Cys Trp Ala Val Ile Gln Pro Leu Leu Cys Ala Val Tyr MetPro Lys Cys Glu Asn Asp Arg Val Glu Leu Pro Ser Arg Thr Leu Cys Gln Ala ThrArg Gly Pro Cys Ala Ile Val Glu Arg Glu Arg Gly Trp Pro Asp Phe Leu Arg CysThr Pro Asp Arg Phe Pro Glu Gly Cys Thr Asn Glu Val Gln Asn Ile Lys Phe AsnSer Ser Gly Gln Cys Glu Val Pro Leu Val Arg Thr Asp Asn Pro Lys Ser Trp TyrGlu Asp Val Glu Gly Cys Gly Ile Gln Cys Gln Asn Pro Leu Phe Thr Glu Ala GluHis Gln Asp Met His Ser Tyr Ile Ala Ala Phe Gly Ala Val Thr Gly Leu Cys ThrLeu Phe Thr Leu Ala Thr Phe Val Ala Asp Trp Arg Asn Ser Asn Arg Tyr Pro AlaVal Ile Leu Phe Tyr Val Asn Ala Cys Phe Phe Val Gly Ser Ile Gly Trp Leu AlaGln Phe Met Asp Gly Ala Arg Arg Glu Ile Val Cys Arg Ala Asp Gly Thr Met ArgLeu Gly Glu Pro Thr Ser Asn Glu Thr Leu Ser Cys Val Ile Ile Phe Val Ile ValTyr Tyr Ala Leu Met Ala Gly Val Val Trp Phe Val Val Leu Thr Tyr Ala Trp HisThr Ser Phe Lys Ala Leu Gly Thr Thr Tyr Gln Pro Leu Ser Gly Lys Thr Ser TyrPhe His Leu Leu Thr Trp Ser Leu Pro Phe Val Leu Thr Val Ala Ile Leu Ala ValAla Gln Val Asp Gly Asp Ser Val Ser Gly Ile Cys Phe Val Gly Tyr Lys Asn TyrArg Tyr Arg Ala Gly Phe Val Leu Ala Pro Ile Gly Leu Val Leu Ile Val Gly GlyTyr Phe Leu Ile Arg Gly Val Met Thr Leu Phe Ser Ile Lys Ser Asn His Pro GlyLeu Leu Ser Glu Lys Ala Ala Ser Lys Ile Asn Glu Thr Met Leu Arg Leu Gly IlePhe Gly Phe Leu Ala Phe Gly Phe Val Leu Ile Thr Phe Ser Cys His Phe Tyr AspPhe Phe Asn Gln Ala Glu Trp Glu Arg Ser Phe Arg Asp Tyr Val Leu Cys Gln AlaAsn Val Thr Ile Gly Leu Pro Thr Lys Gln Pro Ile Pro Asp Cys Glu Ile Lys AsnArg Pro Ser Leu Leu Val Glu Lys Ile Asn Leu Phe Ala Met Phe Gly Thr Gly IleAla Met Ser Thr Xaa Val Trp Thr Lys Ala Thr Leu Leu Ile Trp Arg Arg Thr TrpCys Arg Leu Thr Gly Gln Ser Asp Asp Glu Pro Lys Arg Ile Lys Lys Ser Lys MetIle Ala Lys Ala Phe Ser Lys Arg His Glu Leu Leu Gln Asn Pro Gly Gln Glu LeuSer Phe Ser Met His Thr Val Ser His Asp Gly Pro Val Ala Gly Leu Ala Phe AspLeu Asn Glu Pro Ser Ala Asp Val Ser Ser Ala Trp Ala Gln His Val Thr Lys MetVal Ala Arg Arg Gly Ala Ile Leu Pro Gln Asp Ile Ser Val Thr Pro Val Ala ThrPro Val Pro Pro Glu Glu Gln Ala Asn Leu Trp Leu Val Glu Ala Glu Ile Ser ProGlu Leu Gln Lys Arg Leu Gly Arg Lys Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Glu ValCys Pro Leu Ala Pro Pro Pro Glu Leu His Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ser Thr IlePro Arg Leu Pro Gln Leu Pro Arg Gln Lys Cys Leu Val Ala Ala Gly Ala Trp GlyAla Gly Asp Ser Cys Arg Gln Gly Ala Trp Thr Leu Val Ser Asn Pro Phe Cys ProGlu Pro Ser Pro Pro Gln Asp Pro Phe Leu Pro Ser Ala Pro Ala Pro Val Ala TrpAla His Gly Arg Arg Gln Gly Leu Gly Pro Ile His Ser Arg Thr Asn Leu Met AspThr Glu Leu Met Asp Ala Asp Ser Asp Phe
SEQ ID NO:5(WT SMO)atggccgctg cccgcccagc gcgggggccg gagctcccgctcctggggct gctgctgctg ctgctgctgg gggacccggg ccggggggcg gcctcgagcg ggaacgcgaccgggcctggg cctcggagcg cgggcgggag cgcgaggagg agcgcggcgg tgactggccc tccgccgccgctgagccact gcggccgggc tgccccctgc gagccgctgc gctacaacgt gtgcctgggc tcggtgctgccctacggggc cacctccaca ctgctggccg gagactcgga ctcccaggag gaagcgcacg gcaagctcgtgctctggtcg ggcctccgga atgccccccg ctgctgggca gtgatccagc ccctgctgtg tgccgtatacatgcccaagt gtgagaatga ccgggtggag ctgcccagcc gtaccctctg ccaggccacc cgaggcccctgtgccatcgt ggagagggag cggggctggc ctgacttcct gcgctgcact cctgaccgct tccctgaaggctgcacgaat gaggtgcaga acatcaagtt caacagttca ggccagtgcg aagtgccctt ggttcggacagacaacccca agagctggta cgaggacgtg gagggctgcg gcatccagtg ccagaacccg ctcttcacagaggctgagca ccaggacatg cacagctaca tcgcggcctt cggggccgtc acgggcctct gcacgctcttcaccctggcc acattcgtgg ctgactggcg gaactcgaat cgctaccctg ctgttattct cttctacgtcaatgcgtgct tctttgtggg cagcattggc tggctggccc agttcatgga tggtgcccgc cgagagatcgtctgccgtgc agatggcacc atgaggcttg gggagcccac ctccaatgag actctgtcct gcgtcatcatctttgtcatc gtgtactacg ccctgatggc tggtgtggtt tggtttgtgg tcctcaccta tgcctggcacacttccttca aagccctggg caccacctac cagcctctct cgggcaagac ctcctacttc cacctgctcacctggtcact cccctttgtc ctcactgtgg caatccttgc tgtggcgcag gtggatgggg actctgtgagtggcatttgt tttgtgggct acaagaacta ccgataccgt gcgggcttcg tgctggcccc aatcggcctggtgctcatcg tgggaggcta cttcctcatc cgaggagtca tgactctgtt ctccatcaag agcaaccaccccgggctgct gagtgagaag gctgccagca agatcaacga gaccatgctg cgcctgggca tttttggcttcctggccttt ggctttgtgc tcattacctt cagctgccac ttctacgact tcttcaacca ggctgagtgggagcgcagct tccgggacta tgtgctatgt caggccaatg tgaccatcgg gctgcccacc aagcagcccatccctgactg tgagatcaag aatcgcccga gccttctggt ggagaagatc aacctgtttg ccatgtttggaactggcatc gccatgagca cctgggtctg gaccaaggcc acgctgctca tctggaggcg tacctggtgcaggttgactg ggcagagtga cgatgagcca aagcggatca agaagagcaa gatgattgcc aaggccttctctaagcggca cgagctcctg cagaacccag gccaggagct gtccttcagc atgcacactg tgtcccacgacgggcccgtg gcgggcttgg cctttgacct caatgagccc tcagctgatg tctcctctgc ctgggcccagcatgtcacca agatggtggc tcggagagga gccatactgc cccaggatat ttctgtcacc cctgtggcaactccagtgcc cccagaggaa caagccaacc tgtggctggt tgaggcagag atctccccag agctgcagaagcgcctgggc cggaagaaga agaggaggaa gaggaagaag gaggtgtgcc cgctggcgcc gccccctgagcttcaccccc ctgcccctgc ccccagtacc attcctcgac tgcctcagct gccccggcag aaatgcctggtggctgcagg tgcctgggga gctggggact cttgccgaca gggagcgtgg accctggtct ccaacccattctgcccagag cccagtcccc ctcaggatcc atttctgccc agtgcaccgg cccccgtggc atgggctcatggccgccgac agggcctggg gcctattcac tcccgcacca acctgatgga cacagaactc atggatgcagactcggactt ctga
SEQ ID NO:6--在SMO的氨基酸位置241处具有突变的人smoothened氨基酸序列
Met Ala Ala Ala Arg Pro Ala Arg Gly Pro Glu Leu Pro Leu Leu Gly LeuLeu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Asp Pro Gly Arg Gly Ala Ala Ser Ser Gly Asn AlaThr Gly Pro Gly Pro Arg Ser Ala Gly Gly Ser Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val ThrGly Pro Pro Pro Pro Leu Ser His Cys Gly Arg Ala Ala Pro Cys Glu Pro Leu ArgTyr Asn Val Cys Leu Gly Ser Val Leu Pro Tyr Gly Ala Thr Ser Thr Leu Leu AlaGly Asp Ser Asp Ser Gln Glu Glu Ala His Gly Lys Leu Val Leu Trp Ser Gly LeuArg Asn Ala Pro Arg Cys Trp Ala Val Ile Gln Pro Leu Leu Cys Ala Val Tyr MetPro Lys Cys Glu Asn Asp Arg Val Glu Leu Pro Ser Arg Thr Leu Cys Gln Ala ThrArg Gly Pro Cys Ala Ile Val Glu Arg Glu Arg Gly Trp Pro Asp Phe Leu Arg CysThr Pro Asp Arg Phe Pro Glu Gly Cys Thr Asn Glu Val Gln Asn Ile Lys Phe AsnSer Ser Gly Gln Cys Glu Val Pro Leu Val Arg Thr Asp Asn Pro Lys Ser Trp TyrGlu Asp Val Glu Gly Cys Gly Ile Gln Cys Gln Asn Pro Leu Phe Thr Glu Ala GluHis Gln Asp Met His Ser Tyr Ile Ala Ala Phe Gly Ala Val Xaa Gly Leu Cys ThrLeu Phe Thr Leu Ala Thr Phe Val Ala Asp Trp Arg Asn Ser Asn Arg Tyr Pro AlaVal Ile Leu Phe Tyr Val Asn Ala Cys Phe Phe Val Gly Ser Ile Gly Trp Leu AlaGln Phe Met Asp Gly Ala Arg Arg Glu Ile Val Cys Arg Ala Asp Gly Thr Met ArgLeu Gly Glu Pro Thr Ser Asn Glu Thr Leu Ser Cys Val Ile Ile Phe Val Ile ValTyr Tyr Ala Leu Met Ala Gly Val Val Trp Phe Val Val Leu Thr Tyr Ala Trp HisThr Ser Phe Lys Ala Leu Gly Thr Thr Tyr Gln Pro Leu Ser Gly Lys Thr Ser TyrPhe His Leu Leu Thr Trp Ser Leu Pro Phe Val Leu Thr Val Ala Ile Leu Ala ValAla Gln Val Asp Gly Asp Ser Val Ser Gly Ile Cys Phe Val Gly Tyr Lys Asn TyrArg Tyr Arg Ala Gly Phe Val Leu Ala Pro Ile Gly Leu Val Leu Ile Val Gly GlyTyr Phe Leu Ile Arg Gly Val Met Thr Leu Phe Ser Ile Lys Ser Asn His Pro GlyLeu Leu Ser Glu Lys Ala Ala Ser Lys Ile Asn Glu Thr Met Leu Arg Leu Gly IlePhe Gly Phe Leu Ala Phe Gly Phe Val Leu Ile Thr Phe Ser Cys His Phe Tyr AspPhe Phe Asn Gln Ala Glu Trp Glu Arg Ser Phe Arg Asp Tyr Val Leu Cys Gln AlaAsn Val Thr Ile Gly Leu Pro Thr Lys Gln Pro Ile Pro Asp Cys Glu Ile Lys AsnArg Pro Ser Leu Leu Val Glu Lys Ile Asn Leu Phe Ala Met Phe Gly Thr Gly IleAla Met Ser Thr Trp Val Trp Thr Lys Ala Thr Leu Leu Ile Trp Arg Arg Thr TrpCys Arg Leu Thr Gly Gln Ser Asp Asp Glu Pro Lys Arg Ile Lys Lys Ser Lys MetIle Ala Lys Ala Phe Ser Lys Arg His Glu Leu Leu Gln Asn Pro Gly Gln Glu LeuSer Phe Ser Met His Thr Val Ser His Asp Gly Pro Val Ala Gly Leu Ala Phe AspLeu Asn Glu Pro Ser Ala Asp Val Ser Ser Ala Trp Ala Gln His Val Thr Lys MetVal Ala Arg Arg Gly Ala Ile Leu Pro Gln Asp Ile Ser Val Thr Pro Val Ala ThrPro Val Pro Pro Glu Glu Gln Ala Asn Leu Trp Leu Val Glu Ala Glu Ile Ser ProGlu Leu Gln Lys Arg Leu Gly Arg Lys Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Glu ValCys Pro Leu Ala Pro Pro Pro Glu Leu His Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ser Thr IlePro Arg Leu Pro Gln Leu Pro Arg Gln Lys Cys Leu Val Ala Ala Gly Ala Trp GlyAla Gly Asp Ser Cys Arg Gln Gly Ala Trp Thr Leu Val Ser Asn Pro Phe Cys ProGlu Pro Ser Pro Pro Gln Asp Pro Phe Leu Pro Ser Ala Pro Ala Pro Val Ala TrpAla His Gly Arg Arg Gln Gly Leu Gly Pro Ile His Ser Arg Thr Asn Leu Met AspThr Glu Leu Met Asp Ala Asp Ser Asp Phe
SEQ ID NO:7--在SMO的氨基酸位置408处具有突变的人smoothened氨基酸序列
Met Ala Ala Ala Arg Pro Ala Arg Gly Pro Glu Leu Pro Leu Leu Gly LeuLeu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Asp Pro Gly Arg Gly Ala Ala Ser Ser Gly Asn AlaThr Gly Pro Gly Pro Arg Ser Ala Gly Gly Ser Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val ThrGly Pro Pro Pro Pro Leu Ser His Cys Gly Arg Ala Ala Pro Cys Glu Pro Leu ArgTyr Asn Val Cys Leu Gly Ser Val Leu Pro Tyr Gly Ala Thr Ser Thr Leu Leu AlaGly Asp Ser Asp Ser Gln Glu Glu Ala His Gly Lys Leu Val Leu Trp Ser Gly LeuArg Asn Ala Pro Arg Cys Trp Ala Val Ile Gln Pro Leu Leu Cys Ala Val Tyr MetPro Lys Cys Glu Asn Asp Arg Val Glu Leu Pro Ser Arg Thr Leu Cys Gln Ala ThrArg Gly Pro Cys Ala Ile Val Glu Arg Glu Arg Gly Trp Pro Asp Phe Leu Arg CysThr Pro Asp Arg Phe Pro Glu Gly Cys Thr Asn Glu Val Gln Asn Ile Lys Phe AsnSer Ser Gly Gln Cys Glu Val Pro Leu Val Arg Thr Asp Asn Pro Lys Ser Trp TyrGlu Asp Val Glu Gly Cys Gly Ile Gln Cys Gln Asn Pro Leu Phe Thr Glu Ala GluHis Gln Asp Met His Ser Tyr Ile Ala Ala Phe Gly Ala Val Thr Gly Leu Cys ThrLeu Phe Thr Leu Ala Thr Phe Val Ala Asp Trp Arg Asn Ser Asn Arg Tyr Pro AlaVal Ile Leu Phe Tyr Val Asn Ala Cys Phe Phe Val Gly Ser Ile Gly Trp Leu AlaGln Phe Met Asp Gly Ala Arg Arg Glu Ile Val Cys Arg Ala Asp Gly Thr Met ArgLeu Gly Glu Pro Thr Ser Asn Glu Thr Leu Ser Cys Val Ile Ile Phe Val Ile ValTyr Tyr Ala Leu Met Ala Gly Val Val Trp Phe Val Val Leu Thr Tyr Ala Trp HisThr Ser Phe Lys Ala Leu Gly Thr Thr Tyr Gln Pro Leu Ser Gly Lys Thr Ser TyrPhe His Leu Leu Thr Trp Ser Leu Pro Phe Val Leu Thr Val Ala Ile Leu Ala ValAla Gln Val Asp Gly Asp Ser Val Ser Gly Ile Cys Phe Val Gly Tyr Lys Asn TyrArg Tyr Arg Ala Gly Phe Val Leu Ala Pro Xaa Gly Leu Val Leu Ile Val Gly GlyTyr Phe Leu Ile Arg Gly Val Met Thr Leu Phe Ser Ile Lys Ser Asn His Pro GlyLeu Leu Ser Glu Lys Ala Ala Ser Lys Ile Asn Glu Thr Met Leu Arg Leu Gly IlePhe Gly Phe Leu Ala Phe Gly Phe Val Leu Ile Thr Phe Ser Cys His Phe Tyr AspPhe Phe Asn Gln Ala Glu Trp Glu Arg Ser Phe Arg Asp Tyr Val Leu Cys Gln AlaAsn Val Thr Ile Gly Leu Pro Thr Lys Gln Pro Ile Pro Asp Cys Glu Ile Lys AsnArg Pro Ser Leu Leu Val Glu Lys Ile Asn Leu Phe Ala Met Phe Gly Thr Gly IleAla Met Ser Thr Trp Val Trp Thr Lys Ala Thr Leu Leu Ile Trp Arg Arg Thr TrpCys Arg Leu Thr Gly Gln Ser Asp Asp Glu Pro Lys Arg Ile Lys Lys Ser Lys MetIle Ala Lys Ala Phe Ser Lys Arg His Glu Leu Leu Gln Asn Pro Gly Gln Glu LeuSer Phe Ser Met His Thr Val Ser His Asp Gly Pro Val Ala Gly Leu Ala Phe AspLeu Asn Glu Pro Ser Ala Asp Val Ser Ser Ala Trp Ala Gln His Val Thr Lys MetVal Ala Arg Arg Gly Ala Ile Leu Pro Gln Asp Ile Ser Val Thr Pro Val Ala ThrPro Val Pro Pro Glu Glu Gln Ala Asn Leu Trp Leu Val Glu Ala Glu Ile Ser ProGlu Leu Gln Lys Arg Leu Gly Arg Lys Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Glu ValCys Pro Leu Ala Pro Pro Pro Glu Leu His Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ser Thr IlePro Arg Leu Pro Gln Leu Pro Arg Gln Lys Cys Leu Val Ala Ala Gly Ala Trp GlyAla Gly Asp Ser Cys Arg Gln Gly Ala Trp Thr Leu Val Ser Asn Pro Phe Cys ProGlu Pro Ser Pro Pro Gln Asp Pro Phe Leu Pro Ser Ala Pro Ala Pro Val Ala TrpAla His Gly Arg Arg Gln Gly Leu Gly Pro Ile His Ser Arg Thr Asn Leu Met AspThr Glu Leu Met Asp Ala Asp Ser Asp Phe
SEQ ID NO:8--在SMO的氨基酸位置469处具有突变的人smoothened氨基酸序列
Met Ala Ala Ala Arg Pro Ala Arg Gly Pro Glu Leu Pro Leu Leu Gly LeuLeu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Asp Pro Gly Arg Gly Ala Ala Ser Ser Gly Asn AlaThr Gly Pro Gly Pro Arg Ser Ala Gly Gly Ser Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val ThrGly Pro Pro Pro Pro Leu Ser His Cys Gly Arg Ala Ala Pro Cys Glu Pro Leu ArgTyr Asn Val Cys Leu Gly Ser Val Leu Pro Tyr Gly Ala Thr Ser Thr Leu Leu AlaGly Asp Ser Asp Ser Gln Glu Glu Ala His Gly Lys Leu Val Leu Trp Ser Gly LeuArg Asn Ala Pro Arg Cys Trp Ala Val Ile Gln Pro Leu Leu Cys Ala Val Tyr MetPro Lys Cys Glu Asn Asp Arg Val Glu Leu Pro Ser Arg Thr Leu Cys Gln Ala ThrArg Gly Pro Cys Ala Ile Val Glu Arg Glu Arg Gly Trp Pro Asp Phe Leu Arg CysThr Pro Asp Arg Phe Pro Glu Gly Cys Thr Asn Glu Val Gln Asn Ile Lys Phe AsnSer Ser Gly Gln Cys Glu Val Pro Leu Val Arg Thr Asp Asn Pro Lys Ser Trp TyrGlu Asp Val Glu Gly Cys Gly Ile Gln Cys Gln Asn Pro Leu Phe Thr Glu Ala GluHis Gln Asp Met His Ser Tyr Ile Ala Ala Phe Gly Ala Val Thr Gly Leu Cys ThrLeu Phe Thr Leu Ala Thr Phe Val Ala Asp Trp Arg Asn Ser Asn Arg Tyr Pro AlaVal Ile Leu Phe Tyr Val Asn Ala Cys Phe Phe Val Gly Ser Ile Gly Trp Leu AlaGln Phe Met Asp Gly Ala Arg Arg Glu Ile Val Cys Arg Ala Asp Gly Thr Met ArgLeu Gly Glu Pro Thr Ser Asn Glu Thr Leu Ser Cys Val Ile Ile Phe Val Ile ValTyr Tyr Ala Leu Met Ala Gly Val Val Trp Phe Val Val Leu Thr Tyr Ala Trp HisThr Ser Phe Lys Ala Leu Gly Thr Thr Tyr Gln Pro Leu Ser Gly Lys Thr Ser TyrPhe His Leu Leu Thr Trp Ser Leu Pro Phe Val Leu Thr Val Ala Ile Leu Ala ValAla Gln Val Asp Gly Asp Ser Val Ser Gly Ile Cys Phe Val Gly Tyr Lys Asn TyrArg Tyr Arg Ala Gly Phe Val Leu Ala Pro Ile Gly Leu Val Leu Ile Val Gly GlyTyr Phe Leu Ile Arg Gly Val Met Thr Leu Phe Ser Ile Lys Ser Asn His Pro GlyLeu Leu Ser Glu Lys Ala Ala Ser Lys Ile Asn Glu Thr Met Leu Arg Leu Gly IlePhe Gly Phe Leu Ala Phe Gly Phe Val Leu Ile Thr Phe Ser Xaa His Phe Tyr AspPhe Phe Asn Gln Ala Glu Trp Glu Arg Ser Phe Arg Asp Tyr Val Leu Cys Gln AlaAsn Val Thr Ile Gly Leu Pro Thr Lys Gln Pro Ile Pro Asp Cys Glu Ile Lys AsnArg Pro Ser Leu Leu Val Glu Lys Ile Asn Leu Phe Ala Met Phe Gly Thr Gly IleAla Met Ser Thr Trp Val Trp Thr Lys Ala Thr Leu Leu Ile Trp Arg Arg Thr TrpCys Arg Leu Thr Gly Gln Ser Asp Asp Glu Pro Lys Arg Ile Lys Lys Ser Lys MetIle Ala Lys Ala Phe Ser Lys Arg His Glu Leu Leu Gln Asn Pro Gly Gln Glu LeuSer Phe Ser Met His Thr Val Ser His Asp Gly Pro Val Ala Gly Leu Ala Phe AspLeu Asn Glu Pro Ser Ala Asp Val Ser Ser Ala Trp Ala Gln His Val Thr Lys MetVal Ala Arg Arg Gly Ala Ile Leu Pro Gln Asp Ile Ser Val Thr Pro Val Ala ThrPro Val Pro Pro Glu Glu Gln Ala Asn Leu Trp Leu Val Glu Ala Glu Ile Ser ProGlu Leu Gln Lys Arg Leu Gly Arg Lys Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Glu ValCys Pro Leu Ala Pro Pro Pro Glu Leu His Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ser Thr IlePro Arg Leu Pro Gln Leu Pro Arg Gln Lys Cys Leu Val Ala Ala Gly Ala Trp GlyAla Gly Asp Ser Cys Arg Gln Gly Ala Trp Thr Leu Val Ser Asn Pro Phe Cys ProGlu Pro Ser Pro Pro Gln Asp Pro Phe Leu Pro Ser Ala Pro Ala Pro Val Ala TrpAla His Gly Arg Arg Gln Gly Leu Gly Pro Ile His Ser Arg Thr Asn Leu Met AspThr Glu Leu Met Asp Ala Asp Ser Asp Phe
SEQ ID NO:9--在SMO的氨基酸位置533处具有突变的人smoothened氨基酸序列
Met Ala Ala Ala Arg Pro Ala Arg Gly Pro Glu Leu Pro Leu Leu Gly LeuLeu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Asp Pro Gly Arg Gly Ala Ala Ser Ser Gly Asn AlaThr Gly Pro Gly Pro Arg Ser Ala Gly Gly Ser Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val ThrGly Pro Pro Pro Pro Leu Ser His Cys Gly Arg Ala Ala Pro Cys Glu Pro Leu ArgTyr Asn Val Cys Leu Gly Ser Val Leu Pro Tyr Gly Ala Thr Ser Thr Leu Leu AlaGly Asp Ser Asp Ser Gln Glu Glu Ala His Gly Lys Leu Val Leu Trp Ser Gly LeuArg Asn Ala Pro Arg Cys Trp Ala Val Ile Gln Pro Leu Leu Cys Ala Val Tyr MetPro Lys Cys Glu Asn Asp Arg Val Glu Leu Pro Ser Arg Thr Leu Cys Gln Ala ThrArg Gly Pro Cys Ala Ile Val Glu Arg Glu Arg Gly Trp Pro Asp Phe Leu Arg CysThr Pro Asp Arg Phe Pro Glu Gly Cys Thr Asn Glu Val Gln Asn Ile Lys Phe AsnSer Ser Gly Gln Cys Glu Val Pro Leu Val Arg Thr Asp Asn Pro Lys Ser Trp TyrGlu Asp Val Glu Gly Cys Gly Ile Gln Cys Gln Asn Pro Leu Phe Thr Glu Ala GluHis Gln Asp Met His Ser Tyr Ile Ala Ala Phe Gly Ala Val Thr Gly Leu Cys ThrLeu Phe Thr Leu Ala Thr Phe Val Ala Asp Trp Arg Asn Ser Asn Arg Tyr Pro AlaVal Ile Leu Phe Tyr Val Asn Ala Cys Phe Phe Val Gly Ser Ile Gly Trp Leu AlaGln Phe Met Asp Gly Ala Arg Arg Glu Ile Val Cys Arg Ala Asp Gly Thr Met ArgLeu Gly Glu Pro Thr Ser Asn Glu Thr Leu Ser Cys Val Ile Ile Phe Val Ile ValTyr Tyr Ala Leu Met Ala Gly Val Val Trp Phe Val Val Leu Thr Tyr Ala Trp HisThr Ser Phe Lys Ala Leu Gly Thr Thr Tyr Gln Pro Leu Ser Gly Lys Thr Ser TyrPhe His Leu Leu Thr Trp Ser Leu Pro Phe Val Leu Thr Val Ala Ile Leu Ala ValAla Gln Val Asp Gly Asp Ser Val Ser Gly Ile Cys Phe Val Gly Tyr Lys Asn TyrArg Tyr Arg Ala Gly Phe Val Leu Ala Pro Ile Gly Leu Val Leu Ile Val Gly GlyTyr Phe Leu Ile Arg Gly Val Met Thr Leu Phe Ser Ile Lys Ser Asn His Pro GlyLeu Leu Ser Glu Lys Ala Ala Ser Lys Ile Asn Glu Thr Met Leu Arg Leu Gly IlePhe Gly Phe Leu Ala Phe Gly Phe Val Leu Ile Thr Phe Ser Cys His Phe Tyr AspPhe Phe Asn Gln Ala Glu Trp Glu Arg Ser Phe Arg Asp Tyr Val Leu Cys Gln AlaAsn Val Thr Ile Gly Leu Pro Thr Lys Gln Pro Ile Pro Asp Cys Glu Ile Lys AsnArg Pro Ser Leu Leu Val Glu Lys Ile Asn Leu Phe Ala Met Phe Gly Thr Gly IleAla Met Xaa Thr Trp Val Trp Thr Lys Ala Thr Leu Leu Ile Trp Arg Arg Thr TrpCys Arg Leu Thr Gly Gln Ser Asp Asp Glu Pro Lys Arg Ile Lys Lys Ser Lys MetIle Ala Lys Ala Phe Ser Lys Arg His Glu Leu Leu Gln Asn Pro Gly Gln Glu LeuSer Phe Ser Met His Thr Val Ser His Asp Gly Pro Val Ala Gly Leu Ala Phe AspLeu Asn Glu Pro Ser Ala Asp Val Ser Ser Ala Trp Ala Gln His Val Thr Lys MetVal Ala Arg Arg Gly Ala Ile Leu Pro Gln Asp Ile Ser Val Thr Pro Val Ala ThrPro Val Pro Pro Glu Glu Gln Ala Asn Leu Trp Leu Val Glu Ala Glu Ile Ser ProGlu Leu Gln Lys Arg Leu Gly Arg Lys Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Glu ValCys Pro Leu Ala Pro Pro Pro Glu Leu His Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ser Thr IlePro Arg Leu Pro Gln Leu Pro Arg Gln Lys Cys Leu Val Ala Ala Gly Ala Trp GlyAla Gly Asp Ser Cys Arg Gln Gly Ala Trp Thr Leu Val Ser Asn Pro Phe Cys ProGlu Pro Ser Pro Pro Gln Asp Pro Phe Leu Pro Ser Ala Pro Ala Pro Val Ala TrpAla His Gly Arg Arg Gln Gly Leu Gly Pro Ile His Ser Arg Thr Asn Leu Met AspThr Glu Leu Met Asp Ala Asp Ser Asp Phe
SEQ ID NO:10-人Suppressor of Fused(SuFu)氨基酸序列(GenBank登录号NM_016169.2)
MAELRPSGAPGPTAPPAPGPTAPPAFASLFPPGLHAIYGECRRLYPDQPNPLQVTAIVKYWLGGPDPLDYVSMYRNVGSPSANIPEHWHYISFGLSDLYGDNRVHEFTGTDGPSGFGFELTFRLKRETGESAPPTWPAELMQGLARYVFQSENTFCSGDHVSWHSPLDNSESRIQHMLLTEDPQMQPVQTPFGVVTFLQIVGVCTEELHSAQQWNGQGILELLRTVPIAGGPWLITDMRRGETIFEIDPHLQERVDKGIETDGSNLSGVSAKCAWDDLSRPPEDDEDSRSICIGTQPRRLSGKDTEQIRETLRRGLEINSKPVLPPINPQRQNGLAHDRAPSRKDSLESDSSTAIIPHELIRTRQLESVHLKFNQESGALIPLCLRGRLLHGRHFTYKSITGDMAITFVSTGVEGAFATEEHPYAAHGPWLQILLTEEFVEKMLEDLEDLTSPEEFKLPKEYSWPEKKLKVSILPDVVFDSPLH
SEQ ID NO:11-人Suppressor of Fused(SuFu)cDNA序列(GenBank登录号NM_016169.2)
CGCCGTGCGCAGGCGCGGAGCTAGACCTCGCTGCAGCCCCCATCGCCTCGGGGAGTCTCACCCACCGAGTCCGCCCGCTGGCCCGTCAGTGCTCTCCCCGTCGTTTGCCCTCTCCAGTTCCCCCAGTGCCTGCCCTACGCACCCCGATGGCGGAGCTGCGGCCTAGCGGCGCCCCCGGCCCCACCGCGCCCCCGGCCCCTGGCCCGACTGCCCCCCCGGCCTTCGCTTCGCTCTTTCCCCCGGGACTGCACGCCATCTACGGAGAGTGCCGCCGCCTTTACCCTGACCAGCCGAACCCGCTCCAGGTTACCGCTATCGTCAAGTACTGGTTGGGTGGCCCAGACCCCTTGGACTATGTTAGCATGTACAGGAATGTGGGGAGCCCTTCTGCTAACATCCCCGAGCACTGGCACTACATCAGCTTCGGCCTGAGTGATCTCTATGGTGACAACAGAGTCCATGAGTTTACAGGAACAGATGGACCTAGTGGTTTTGGCTTTGAGTTGACCTTTCGTCTGAAGAGAGAAACTGGGGAGTCTGCCCCACCAACATGGCCCGCAGAGTTAATGCAGGGCTTGGCACGATACGTGTTCCAGTCAGAGAACACCTTCTGCAGTGGGGACCATGTGTCCTGGCACAGCCCTTTGGATAACAGTGAGTCAAGAATTCAGCACATGCTGCTGACAGAGGACCCACAGATGCAGCCCGTGCAGACACCCTTTGGGGTAGTTACCTTCCTCCAGATCGTTGGTGTCTGCACTGAAGAGCTACACTCAGCCCAGCAGTGGAACGGGCAGGGCATCCTGGAGCTGCTGCGGACAGTGCCTATTGCTGGCGGCCCCTGGCTGATAACTGACATGCGGAGGGGAGAGACCATATTTGAGATCGATCCACACCTGCAAGAGAGAGTTGACAAAGGCATCGAGACAGATGGCTCCAACCTGAGTGGTGTCAGTGCCAAGTGTGCCTGGGATGACCTGAGCCGGCCCCCCGAGGATGACGAGGACAGCCGGAGCATCTGCATCGGCACACAGCCCCGGCGACTCTCTGGCAAAGACACAGAGCAGATCCGGGAGACCCTGAGGAGAGGACTCGAGATCAACAGCAAACCTGTCCTTCCACCAATCAACCCTCAGCGGCAGAATGGCCTCGCCCACGACCGGGCCCCGAGCCGCAAAGACAGCCTGGAAAGTGACAGCTCCACGGCCATCATTCCCCATGAGCTGATTCGCACGCGGCAGCTTGAGAGCGTACATCTGAAATTCAACCAGGAGTCCGGAGCCCTCATTCCTCTCTGCCTAAGGGGCAGGCTCCTGCATGGACGGCACTTTACATATAAAAGTATCACAGGTGACATGGCCATCACGTTTGTCTCCACGGGAGTGGAAGGCGCCTTTGCCACTGAGGAGCATCCTTACGCGGCTCATGGACCCTGGTTACAAATTCTGTTGACCGAAGAGTTTGTAGAGAAAATGTTGGAGGATTTAGAAGATTTGACTTCTCCAGAGGAATTCAAACTTCCCAAAGAGTACAGCTGGCCTGAAAAGAAGCTGAAGGTCTCCATCCTGCCTGACGTGGTGTTCGACAGTCCGCTACACTAGCCTGGGCTGGGCCCTGCAGGGGCCAGCAGGGAGCCCAGCTGCTCCCCAGTGACTTCCAGTGTAACAGTTGTGTCAACGAGATCTCCACAAATAAAAGGACAAGTGTGAGGAAGACTGCGCAGTGCCACCCCGCAGCCCAGTGGGGTGCCATGCACAGGCCACAGGCCCTCCACCTCACCTCCAGCTCAGGGGCCGCACCCCGCCGCTGGCTAAGCCTTGTGACCCATCAGGCCAGTGAGTGGGCAAATGCGGACCCTCCCTGCCTGCAGCCTGCACAGATTCTGGTTTGAGGTTTGACTCTGGACCCTGGCTGTGCCCCTAGGTGGAGACAGCCCTCTTTCTCACCTACCCCCTGCCGCACAGCCCAGCAGGAGGGAGGCGGACAGCCAGATGCAGAGCGAGTGGATGCACTTCCCAGCTCATCTCTGGAAGCCTTTGCTACTCAAGCTCCTCTGGCCGCGGAACAATTCCTCTGATCATGTTTGGTTTTCTTCTTCCTTATTTTATTTTGTAGAAACCGGGTGGTATTTTATTGCTCTGCAAAGATGTCCAGAAGCCATGTATATAATGTTTTTTAAACAGAACTTCATTCCCCGTTGAACTTTCGCATTCTCTGACAGAGGCCTAGGGCTGTATCTCTCCCTGGGCTGCCACCAGAGAAGGTGCTTGGTGTTCGCCTGCCAGCCCAGAGCCCTGGAGGAGCCGGCTGCACAGAGAGGCTTTTCTTCCCAGCTGGGCCTGATGGAGCCCGGGGCAGGGGGAGAGTAGAGACACTCCCTTGTGCAGCTTTGAGCCTAGTTTAGCTGGGGCCAGGGAGGGGTGCTACTGTTTTCCAAGTGAATGGGTCTCAAAGACTTGGTGACCCCAGCCTCATCTTCTAGGCCTTTTCCATCCAACCAGGCCTACCTGGGAGAGGGTGAGGTTCAGCACATCACACACCATCCCCACTGTCATTCAGGGCCTGGGTCTCCAGCTCTGTAACCAGTCCTGTCCCATTTCCTCAGTCCCTGGGCCTCCCAGCCTTCAGGCTGTAGGGCTGCCTTACTAAAATTGAAAAATCCACCTCTTAACATCTCTTTCACTTTGGTTTTGCTAACACTGCTCTCTGCTGCCCTCCCATCCTCCCTGTATCCATTCATGCCCTATCTTTCATTCTCCACTCCTAATCCCTCTCCTTTCTGGCATCCTGGCCTCTCGTGGTCCTCAGCCCCTCACCCCCAGTACTGCAGATCTCACAGTTTGCCTTCCAGAAGCCAGCCTATCTCTAGCCCATGGTTTTGGAGTTCCTCTCGGGTTATCTCCCACGCCTGACCTGGAACCAGCAAGCCCCTTTCCTGCCTTCTTACCCCCAACTCTAGGGATGGGACTGTTACAATACTTCAAGATCACTCTTTACACCTCTTCAAAGCAAAGTCATGACAATGCAGGGCTCCTCATTGCTCCCATCTGCCTCTGCTGCACACACAGGCACCAGCAGGGATGCCACAGGAGTGCCCACAGGGTGCAGGACTCCACTGATGAGAGATCCAGCCAAAGAGCTGCCCCCAGGGGTATGAGGGCACCAGCTGGGTTCTCCAGGGAGCAGGAGTTGGACCTCCATGGAGCCACTAGGCCTGGCCTCCTCTACACATCCCCAGGGCTATCTGGTTAATTCCATCAAGCTCAGAGTTAAAAGGCATATCAGCCTGGAGTATTTGGGAGAGACTGGCTGCAGATCCCCGCCAGCCAAGATGCAAGCCACTCGGGACCTGATGTCGGCAGCTGTGCCTCTACTGCCCTGAGGACTTACCAGAGGGAGCCCTACTGGCCTTCCCCCACCACAGCAGCCCTGCCTGTGAAGCTCTTGTTTCTGACATTTCACAGGCAGAGAGGTGCCATCAGTTCGCCTCCATTCCTTGCCACCATGACCAGCCTCTCCCTGAACTCTCTCTTGCTCGGGACCTGCCTGAGGGCTCCCTGCTGCAGTTCGCCGTACTTCCATCTGCTGGGTGCCTCCATCGTTGGTTGGGTGGGGATGGGGCATTTTCTGAGCTAAGCTTTGTCATTAGTTTGTGAAGCACCTGGTCAGCAACCTGCCCCAGACCTGGAGGGTCTTTGTGGACTGAAGGTAGACACCAGCCAGCATGGTGGCCCTGTTCTGGGGGAGCAGGGTAAGGCAGGAGGAAGTGGGTGAGCTCCGAGATGATGAGCACATGAAGCCTGTGGCCCCTTCGTACCTGCAATATGTCAGGAGCCTCACGCTCACCCAAGATCCTGCAGGGGCCAGGCTCCATCTCACTGGCTCTGAGGGCAGGACAGGGTATCACACATTTCTCACCAGGCCTCCTTTCCTATGGGCATTGGTGCCTCCCAGAGGTTTCTTGGGCTGCTGGCTGGTGAGAGAGGACCCTTAAAGAAGATCAAGCCAAGCTGACCTTGGACCCTGTCCAGCACAGCTTCTGGCACAGGATGCTTGGTGAATGTACCCTTTCTTTCCCTCCCTGCAGCTCTGAGGGAGCCCCTGACCTTGTAGTGGGTGGAGGAGGTAAGGGGCCTCCCTCCCTAAATCTGCCTCTTCTGCAAGCTACTTGGAGACTTGCCTAGTTGTACCCACCCCTCCAGGTCCCTGGTGCTAGAGCTTCTGAGAAGGGCCTTTCCCTTTCCTCTTTGCCTGCTATATAAGGCAGGCTCCTGTGGCTCTGCTGGCTCAGTGTGGGCTGCAGGAGGACTGCAGACTCAGCTGCAATTCTGAGGGGGGTTTGGGAGGCTTGTGCGAGGTCTCAGGCCTGTGTGGGGAGCTGGTGCCTCTTCCTGCCCGTATCTTTCTCTTCCAAGGGCAGTGCTCCAAGGCAGGGACTGGAGAAGCCAAGGGGAGAGTCTAAAAGGGCTAGAGCATTTTTAAAAATAGACACAGGGTCTTGGGACTGGGGTTTCGGATTGAGTTGCAAGCAGGGAGAAAACCTGAAGGTCGGTGCCCCTATGGGGCTGACCAGTAGAGAATTTCCTTTACTGTATTTTTGTGTCTGGTCTTCCCTTTCTGGCTTCTAGGACATCCATGCCAGGTGAGGTGCCTGGGTCCCTGTTACAAGTCAGGAGCCCTGTAGGGAGACCCCTCCTTTTGTACAAGTACCTGAATGCTGCGACAAGCAGATTTTTGTAAAATTTTATATTAGTTTTTAATGTCAGTGGCGACTCGGTTCCTGGGGCTGCAGCCAGCCTGGGACTTTTGTAAGAATTTTTGGGTGACTCACTTAGATGTCGTTTCCTTCTTGCCCCCTCTTCCTCTCTGTAATCTAAGTGCATTAAACATCTTTGCAG
序列表
<110> 健泰科生物技术公司
柯瑞斯公司
法国国家卫生及研究医学协会
巴黎第七大学
<120> 突变型Smoothened及其使用方法
<130> P1711038WP
<140>
<141>
<150> 62/112,074
<151> 2015-02-04
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 787
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Ala Ala Ala Arg Pro Ala Arg Gly Pro Glu Leu Pro Leu Leu Gly
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Asp Pro Gly Arg Gly Ala Ala Ser
20 25 30
Ser Gly Asn Ala Thr Gly Pro Gly Pro Arg Ser Ala Gly Gly Ser Ala
35 40 45
Arg Arg Ser Ala Ala Val Thr Gly Pro Pro Pro Pro Leu Ser His Cys
50 55 60
Gly Arg Ala Ala Pro Cys Glu Pro Leu Arg Tyr Asn Val Cys Leu Gly
65 70 75 80
Ser Val Leu Pro Tyr Gly Ala Thr Ser Thr Leu Leu Ala Gly Asp Ser
85 90 95
Asp Ser Gln Glu Glu Ala His Gly Lys Leu Val Leu Trp Ser Gly Leu
100 105 110
Arg Asn Ala Pro Arg Cys Trp Ala Val Ile Gln Pro Leu Leu Cys Ala
115 120 125
Val Tyr Met Pro Lys Cys Glu Asn Asp Arg Val Glu Leu Pro Ser Arg
130 135 140
Thr Leu Cys Gln Ala Thr Arg Gly Pro Cys Ala Ile Val Glu Arg Glu
145 150 155 160
Arg Gly Trp Pro Asp Phe Leu Arg Cys Thr Pro Asp Arg Phe Pro Glu
165 170 175
Gly Cys Thr Asn Glu Val Gln Asn Ile Lys Phe Asn Ser Ser Gly Gln
180 185 190
Cys Glu Val Pro Leu Val Arg Thr Asp Asn Pro Lys Ser Trp Tyr Glu
195 200 205
Asp Val Glu Gly Cys Gly Ile Gln Cys Gln Asn Pro Leu Phe Thr Glu
210 215 220
Ala Glu His Gln Asp Met His Ser Tyr Ile Ala Ala Phe Gly Ala Val
225 230 235 240
Thr Gly Leu Cys Thr Leu Phe Thr Leu Ala Thr Phe Val Ala Asp Trp
245 250 255
Arg Asn Ser Asn Arg Tyr Pro Ala Val Ile Leu Phe Tyr Val Asn Ala
260 265 270
Cys Phe Phe Val Gly Ser Ile Gly Trp Leu Ala Gln Phe Met Asp Gly
275 280 285
Ala Arg Arg Glu Ile Val Cys Arg Ala Asp Gly Thr Met Arg Leu Gly
290 295 300
Glu Pro Thr Ser Asn Glu Thr Leu Ser Cys Val Ile Ile Phe Val Ile
305 310 315 320
Val Tyr Tyr Ala Leu Met Ala Gly Val Val Trp Phe Val Val Leu Thr
325 330 335
Tyr Ala Trp His Thr Ser Phe Lys Ala Leu Gly Thr Thr Tyr Gln Pro
340 345 350
Leu Ser Gly Lys Thr Ser Tyr Phe His Leu Leu Thr Trp Ser Leu Pro
355 360 365
Phe Val Leu Thr Val Ala Ile Leu Ala Val Ala Gln Val Asp Gly Asp
370 375 380
Ser Val Ser Gly Ile Cys Phe Val Gly Tyr Lys Asn Tyr Arg Tyr Arg
385 390 395 400
Ala Gly Phe Val Leu Ala Pro Ile Gly Leu Val Leu Ile Val Gly Gly
405 410 415
Tyr Phe Leu Ile Arg Gly Val Met Thr Leu Phe Ser Ile Lys Ser Asn
420 425 430
His Pro Gly Leu Leu Ser Glu Lys Ala Ala Ser Lys Ile Asn Glu Thr
435 440 445
Met Leu Arg Leu Gly Ile Phe Gly Phe Leu Ala Phe Gly Phe Val Leu
450 455 460
Ile Thr Phe Ser Cys His Phe Tyr Asp Phe Phe Asn Gln Ala Glu Trp
465 470 475 480
Glu Arg Ser Phe Arg Asp Tyr Val Leu Cys Gln Ala Asn Val Thr Ile
485 490 495
Gly Leu Pro Thr Lys Gln Pro Ile Pro Asp Cys Glu Ile Lys Asn Arg
500 505 510
Pro Ser Leu Leu Val Glu Lys Ile Asn Leu Phe Ala Met Phe Gly Thr
515 520 525
Gly Ile Ala Met Ser Thr Trp Val Trp Thr Lys Ala Thr Leu Leu Ile
530 535 540
Trp Arg Arg Thr Trp Cys Arg Leu Thr Gly Gln Ser Asp Asp Glu Pro
545 550 555 560
Lys Arg Ile Lys Lys Ser Lys Met Ile Ala Lys Ala Phe Ser Lys Arg
565 570 575
His Glu Leu Leu Gln Asn Pro Gly Gln Glu Leu Ser Phe Ser Met His
580 585 590
Thr Val Ser His Asp Gly Pro Val Ala Gly Leu Ala Phe Asp Leu Asn
595 600 605
Glu Pro Ser Ala Asp Val Ser Ser Ala Trp Ala Gln His Val Thr Lys
610 615 620
Met Val Ala Arg Arg Gly Ala Ile Leu Pro Gln Asp Ile Ser Val Thr
625 630 635 640
Pro Val Ala Thr Pro Val Pro Pro Glu Glu Gln Ala Asn Leu Trp Leu
645 650 655
Val Glu Ala Glu Ile Ser Pro Glu Leu Gln Lys Arg Leu Gly Arg Lys
660 665 670
Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Glu Val Cys Pro Leu Ala Pro Pro
675 680 685
Pro Glu Leu His Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ser Thr Ile Pro Arg Leu
690 695 700
Pro Gln Leu Pro Arg Gln Lys Cys Leu Val Ala Ala Gly Ala Trp Gly
705 710 715 720
Ala Gly Asp Ser Cys Arg Gln Gly Ala Trp Thr Leu Val Ser Asn Pro
725 730 735
Phe Cys Pro Glu Pro Ser Pro Pro Gln Asp Pro Phe Leu Pro Ser Ala
740 745 750
Pro Ala Pro Val Ala Trp Ala His Gly Arg Arg Gln Gly Leu Gly Pro
755 760 765
Ile His Ser Arg Thr Asn Leu Met Asp Thr Glu Leu Met Asp Ala Asp
770 775 780
Ser Asp Phe
785
<210> 2
<211> 787
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (281)..(281)
<223> 任何氨基酸
<400> 2
Met Ala Ala Ala Arg Pro Ala Arg Gly Pro Glu Leu Pro Leu Leu Gly
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Asp Pro Gly Arg Gly Ala Ala Ser
20 25 30
Ser Gly Asn Ala Thr Gly Pro Gly Pro Arg Ser Ala Gly Gly Ser Ala
35 40 45
Arg Arg Ser Ala Ala Val Thr Gly Pro Pro Pro Pro Leu Ser His Cys
50 55 60
Gly Arg Ala Ala Pro Cys Glu Pro Leu Arg Tyr Asn Val Cys Leu Gly
65 70 75 80
Ser Val Leu Pro Tyr Gly Ala Thr Ser Thr Leu Leu Ala Gly Asp Ser
85 90 95
Asp Ser Gln Glu Glu Ala His Gly Lys Leu Val Leu Trp Ser Gly Leu
100 105 110
Arg Asn Ala Pro Arg Cys Trp Ala Val Ile Gln Pro Leu Leu Cys Ala
115 120 125
Val Tyr Met Pro Lys Cys Glu Asn Asp Arg Val Glu Leu Pro Ser Arg
130 135 140
Thr Leu Cys Gln Ala Thr Arg Gly Pro Cys Ala Ile Val Glu Arg Glu
145 150 155 160
Arg Gly Trp Pro Asp Phe Leu Arg Cys Thr Pro Asp Arg Phe Pro Glu
165 170 175
Gly Cys Thr Asn Glu Val Gln Asn Ile Lys Phe Asn Ser Ser Gly Gln
180 185 190
Cys Glu Val Pro Leu Val Arg Thr Asp Asn Pro Lys Ser Trp Tyr Glu
195 200 205
Asp Val Glu Gly Cys Gly Ile Gln Cys Gln Asn Pro Leu Phe Thr Glu
210 215 220
Ala Glu His Gln Asp Met His Ser Tyr Ile Ala Ala Phe Gly Ala Val
225 230 235 240
Thr Gly Leu Cys Thr Leu Phe Thr Leu Ala Thr Phe Val Ala Asp Trp
245 250 255
Arg Asn Ser Asn Arg Tyr Pro Ala Val Ile Leu Phe Tyr Val Asn Ala
260 265 270
Cys Phe Phe Val Gly Ser Ile Gly Xaa Leu Ala Gln Phe Met Asp Gly
275 280 285
Ala Arg Arg Glu Ile Val Cys Arg Ala Asp Gly Thr Met Arg Leu Gly
290 295 300
Glu Pro Thr Ser Asn Glu Thr Leu Ser Cys Val Ile Ile Phe Val Ile
305 310 315 320
Val Tyr Tyr Ala Leu Met Ala Gly Val Val Trp Phe Val Val Leu Thr
325 330 335
Tyr Ala Trp His Thr Ser Phe Lys Ala Leu Gly Thr Thr Tyr Gln Pro
340 345 350
Leu Ser Gly Lys Thr Ser Tyr Phe His Leu Leu Thr Trp Ser Leu Pro
355 360 365
Phe Val Leu Thr Val Ala Ile Leu Ala Val Ala Gln Val Asp Gly Asp
370 375 380
Ser Val Ser Gly Ile Cys Phe Val Gly Tyr Lys Asn Tyr Arg Tyr Arg
385 390 395 400
Ala Gly Phe Val Leu Ala Pro Ile Gly Leu Val Leu Ile Val Gly Gly
405 410 415
Tyr Phe Leu Ile Arg Gly Val Met Thr Leu Phe Ser Ile Lys Ser Asn
420 425 430
His Pro Gly Leu Leu Ser Glu Lys Ala Ala Ser Lys Ile Asn Glu Thr
435 440 445
Met Leu Arg Leu Gly Ile Phe Gly Phe Leu Ala Phe Gly Phe Val Leu
450 455 460
Ile Thr Phe Ser Cys His Phe Tyr Asp Phe Phe Asn Gln Ala Glu Trp
465 470 475 480
Glu Arg Ser Phe Arg Asp Tyr Val Leu Cys Gln Ala Asn Val Thr Ile
485 490 495
Gly Leu Pro Thr Lys Gln Pro Ile Pro Asp Cys Glu Ile Lys Asn Arg
500 505 510
Pro Ser Leu Leu Val Glu Lys Ile Asn Leu Phe Ala Met Phe Gly Thr
515 520 525
Gly Ile Ala Met Ser Thr Trp Val Trp Thr Lys Ala Thr Leu Leu Ile
530 535 540
Trp Arg Arg Thr Trp Cys Arg Leu Thr Gly Gln Ser Asp Asp Glu Pro
545 550 555 560
Lys Arg Ile Lys Lys Ser Lys Met Ile Ala Lys Ala Phe Ser Lys Arg
565 570 575
His Glu Leu Leu Gln Asn Pro Gly Gln Glu Leu Ser Phe Ser Met His
580 585 590
Thr Val Ser His Asp Gly Pro Val Ala Gly Leu Ala Phe Asp Leu Asn
595 600 605
Glu Pro Ser Ala Asp Val Ser Ser Ala Trp Ala Gln His Val Thr Lys
610 615 620
Met Val Ala Arg Arg Gly Ala Ile Leu Pro Gln Asp Ile Ser Val Thr
625 630 635 640
Pro Val Ala Thr Pro Val Pro Pro Glu Glu Gln Ala Asn Leu Trp Leu
645 650 655
Val Glu Ala Glu Ile Ser Pro Glu Leu Gln Lys Arg Leu Gly Arg Lys
660 665 670
Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Glu Val Cys Pro Leu Ala Pro Pro
675 680 685
Pro Glu Leu His Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ser Thr Ile Pro Arg Leu
690 695 700
Pro Gln Leu Pro Arg Gln Lys Cys Leu Val Ala Ala Gly Ala Trp Gly
705 710 715 720
Ala Gly Asp Ser Cys Arg Gln Gly Ala Trp Thr Leu Val Ser Asn Pro
725 730 735
Phe Cys Pro Glu Pro Ser Pro Pro Gln Asp Pro Phe Leu Pro Ser Ala
740 745 750
Pro Ala Pro Val Ala Trp Ala His Gly Arg Arg Gln Gly Leu Gly Pro
755 760 765
Ile His Ser Arg Thr Asn Leu Met Asp Thr Glu Leu Met Asp Ala Asp
770 775 780
Ser Asp Phe
785
<210> 3
<211> 787
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (459)..(459)
<223> 任何氨基酸
<400> 3
Met Ala Ala Ala Arg Pro Ala Arg Gly Pro Glu Leu Pro Leu Leu Gly
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Asp Pro Gly Arg Gly Ala Ala Ser
20 25 30
Ser Gly Asn Ala Thr Gly Pro Gly Pro Arg Ser Ala Gly Gly Ser Ala
35 40 45
Arg Arg Ser Ala Ala Val Thr Gly Pro Pro Pro Pro Leu Ser His Cys
50 55 60
Gly Arg Ala Ala Pro Cys Glu Pro Leu Arg Tyr Asn Val Cys Leu Gly
65 70 75 80
Ser Val Leu Pro Tyr Gly Ala Thr Ser Thr Leu Leu Ala Gly Asp Ser
85 90 95
Asp Ser Gln Glu Glu Ala His Gly Lys Leu Val Leu Trp Ser Gly Leu
100 105 110
Arg Asn Ala Pro Arg Cys Trp Ala Val Ile Gln Pro Leu Leu Cys Ala
115 120 125
Val Tyr Met Pro Lys Cys Glu Asn Asp Arg Val Glu Leu Pro Ser Arg
130 135 140
Thr Leu Cys Gln Ala Thr Arg Gly Pro Cys Ala Ile Val Glu Arg Glu
145 150 155 160
Arg Gly Trp Pro Asp Phe Leu Arg Cys Thr Pro Asp Arg Phe Pro Glu
165 170 175
Gly Cys Thr Asn Glu Val Gln Asn Ile Lys Phe Asn Ser Ser Gly Gln
180 185 190
Cys Glu Val Pro Leu Val Arg Thr Asp Asn Pro Lys Ser Trp Tyr Glu
195 200 205
Asp Val Glu Gly Cys Gly Ile Gln Cys Gln Asn Pro Leu Phe Thr Glu
210 215 220
Ala Glu His Gln Asp Met His Ser Tyr Ile Ala Ala Phe Gly Ala Val
225 230 235 240
Thr Gly Leu Cys Thr Leu Phe Thr Leu Ala Thr Phe Val Ala Asp Trp
245 250 255
Arg Asn Ser Asn Arg Tyr Pro Ala Val Ile Leu Phe Tyr Val Asn Ala
260 265 270
Cys Phe Phe Val Gly Ser Ile Gly Trp Leu Ala Gln Phe Met Asp Gly
275 280 285
Ala Arg Arg Glu Ile Val Cys Arg Ala Asp Gly Thr Met Arg Leu Gly
290 295 300
Glu Pro Thr Ser Asn Glu Thr Leu Ser Cys Val Ile Ile Phe Val Ile
305 310 315 320
Val Tyr Tyr Ala Leu Met Ala Gly Val Val Trp Phe Val Val Leu Thr
325 330 335
Tyr Ala Trp His Thr Ser Phe Lys Ala Leu Gly Thr Thr Tyr Gln Pro
340 345 350
Leu Ser Gly Lys Thr Ser Tyr Phe His Leu Leu Thr Trp Ser Leu Pro
355 360 365
Phe Val Leu Thr Val Ala Ile Leu Ala Val Ala Gln Val Asp Gly Asp
370 375 380
Ser Val Ser Gly Ile Cys Phe Val Gly Tyr Lys Asn Tyr Arg Tyr Arg
385 390 395 400
Ala Gly Phe Val Leu Ala Pro Ile Gly Leu Val Leu Ile Val Gly Gly
405 410 415
Tyr Phe Leu Ile Arg Gly Val Met Thr Leu Phe Ser Ile Lys Ser Asn
420 425 430
His Pro Gly Leu Leu Ser Glu Lys Ala Ala Ser Lys Ile Asn Glu Thr
435 440 445
Met Leu Arg Leu Gly Ile Phe Gly Phe Leu Xaa Phe Gly Phe Val Leu
450 455 460
Ile Thr Phe Ser Cys His Phe Tyr Asp Phe Phe Asn Gln Ala Glu Trp
465 470 475 480
Glu Arg Ser Phe Arg Asp Tyr Val Leu Cys Gln Ala Asn Val Thr Ile
485 490 495
Gly Leu Pro Thr Lys Gln Pro Ile Pro Asp Cys Glu Ile Lys Asn Arg
500 505 510
Pro Ser Leu Leu Val Glu Lys Ile Asn Leu Phe Ala Met Phe Gly Thr
515 520 525
Gly Ile Ala Met Ser Thr Trp Val Trp Thr Lys Ala Thr Leu Leu Ile
530 535 540
Trp Arg Arg Thr Trp Cys Arg Leu Thr Gly Gln Ser Asp Asp Glu Pro
545 550 555 560
Lys Arg Ile Lys Lys Ser Lys Met Ile Ala Lys Ala Phe Ser Lys Arg
565 570 575
His Glu Leu Leu Gln Asn Pro Gly Gln Glu Leu Ser Phe Ser Met His
580 585 590
Thr Val Ser His Asp Gly Pro Val Ala Gly Leu Ala Phe Asp Leu Asn
595 600 605
Glu Pro Ser Ala Asp Val Ser Ser Ala Trp Ala Gln His Val Thr Lys
610 615 620
Met Val Ala Arg Arg Gly Ala Ile Leu Pro Gln Asp Ile Ser Val Thr
625 630 635 640
Pro Val Ala Thr Pro Val Pro Pro Glu Glu Gln Ala Asn Leu Trp Leu
645 650 655
Val Glu Ala Glu Ile Ser Pro Glu Leu Gln Lys Arg Leu Gly Arg Lys
660 665 670
Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Glu Val Cys Pro Leu Ala Pro Pro
675 680 685
Pro Glu Leu His Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ser Thr Ile Pro Arg Leu
690 695 700
Pro Gln Leu Pro Arg Gln Lys Cys Leu Val Ala Ala Gly Ala Trp Gly
705 710 715 720
Ala Gly Asp Ser Cys Arg Gln Gly Ala Trp Thr Leu Val Ser Asn Pro
725 730 735
Phe Cys Pro Glu Pro Ser Pro Pro Gln Asp Pro Phe Leu Pro Ser Ala
740 745 750
Pro Ala Pro Val Ala Trp Ala His Gly Arg Arg Gln Gly Leu Gly Pro
755 760 765
Ile His Ser Arg Thr Asn Leu Met Asp Thr Glu Leu Met Asp Ala Asp
770 775 780
Ser Asp Phe
785
<210> 4
<211> 787
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (535)..(535)
<223> 任何氨基酸
<400> 4
Met Ala Ala Ala Arg Pro Ala Arg Gly Pro Glu Leu Pro Leu Leu Gly
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Asp Pro Gly Arg Gly Ala Ala Ser
20 25 30
Ser Gly Asn Ala Thr Gly Pro Gly Pro Arg Ser Ala Gly Gly Ser Ala
35 40 45
Arg Arg Ser Ala Ala Val Thr Gly Pro Pro Pro Pro Leu Ser His Cys
50 55 60
Gly Arg Ala Ala Pro Cys Glu Pro Leu Arg Tyr Asn Val Cys Leu Gly
65 70 75 80
Ser Val Leu Pro Tyr Gly Ala Thr Ser Thr Leu Leu Ala Gly Asp Ser
85 90 95
Asp Ser Gln Glu Glu Ala His Gly Lys Leu Val Leu Trp Ser Gly Leu
100 105 110
Arg Asn Ala Pro Arg Cys Trp Ala Val Ile Gln Pro Leu Leu Cys Ala
115 120 125
Val Tyr Met Pro Lys Cys Glu Asn Asp Arg Val Glu Leu Pro Ser Arg
130 135 140
Thr Leu Cys Gln Ala Thr Arg Gly Pro Cys Ala Ile Val Glu Arg Glu
145 150 155 160
Arg Gly Trp Pro Asp Phe Leu Arg Cys Thr Pro Asp Arg Phe Pro Glu
165 170 175
Gly Cys Thr Asn Glu Val Gln Asn Ile Lys Phe Asn Ser Ser Gly Gln
180 185 190
Cys Glu Val Pro Leu Val Arg Thr Asp Asn Pro Lys Ser Trp Tyr Glu
195 200 205
Asp Val Glu Gly Cys Gly Ile Gln Cys Gln Asn Pro Leu Phe Thr Glu
210 215 220
Ala Glu His Gln Asp Met His Ser Tyr Ile Ala Ala Phe Gly Ala Val
225 230 235 240
Thr Gly Leu Cys Thr Leu Phe Thr Leu Ala Thr Phe Val Ala Asp Trp
245 250 255
Arg Asn Ser Asn Arg Tyr Pro Ala Val Ile Leu Phe Tyr Val Asn Ala
260 265 270
Cys Phe Phe Val Gly Ser Ile Gly Trp Leu Ala Gln Phe Met Asp Gly
275 280 285
Ala Arg Arg Glu Ile Val Cys Arg Ala Asp Gly Thr Met Arg Leu Gly
290 295 300
Glu Pro Thr Ser Asn Glu Thr Leu Ser Cys Val Ile Ile Phe Val Ile
305 310 315 320
Val Tyr Tyr Ala Leu Met Ala Gly Val Val Trp Phe Val Val Leu Thr
325 330 335
Tyr Ala Trp His Thr Ser Phe Lys Ala Leu Gly Thr Thr Tyr Gln Pro
340 345 350
Leu Ser Gly Lys Thr Ser Tyr Phe His Leu Leu Thr Trp Ser Leu Pro
355 360 365
Phe Val Leu Thr Val Ala Ile Leu Ala Val Ala Gln Val Asp Gly Asp
370 375 380
Ser Val Ser Gly Ile Cys Phe Val Gly Tyr Lys Asn Tyr Arg Tyr Arg
385 390 395 400
Ala Gly Phe Val Leu Ala Pro Ile Gly Leu Val Leu Ile Val Gly Gly
405 410 415
Tyr Phe Leu Ile Arg Gly Val Met Thr Leu Phe Ser Ile Lys Ser Asn
420 425 430
His Pro Gly Leu Leu Ser Glu Lys Ala Ala Ser Lys Ile Asn Glu Thr
435 440 445
Met Leu Arg Leu Gly Ile Phe Gly Phe Leu Ala Phe Gly Phe Val Leu
450 455 460
Ile Thr Phe Ser Cys His Phe Tyr Asp Phe Phe Asn Gln Ala Glu Trp
465 470 475 480
Glu Arg Ser Phe Arg Asp Tyr Val Leu Cys Gln Ala Asn Val Thr Ile
485 490 495
Gly Leu Pro Thr Lys Gln Pro Ile Pro Asp Cys Glu Ile Lys Asn Arg
500 505 510
Pro Ser Leu Leu Val Glu Lys Ile Asn Leu Phe Ala Met Phe Gly Thr
515 520 525
Gly Ile Ala Met Ser Thr Xaa Val Trp Thr Lys Ala Thr Leu Leu Ile
530 535 540
Trp Arg Arg Thr Trp Cys Arg Leu Thr Gly Gln Ser Asp Asp Glu Pro
545 550 555 560
Lys Arg Ile Lys Lys Ser Lys Met Ile Ala Lys Ala Phe Ser Lys Arg
565 570 575
His Glu Leu Leu Gln Asn Pro Gly Gln Glu Leu Ser Phe Ser Met His
580 585 590
Thr Val Ser His Asp Gly Pro Val Ala Gly Leu Ala Phe Asp Leu Asn
595 600 605
Glu Pro Ser Ala Asp Val Ser Ser Ala Trp Ala Gln His Val Thr Lys
610 615 620
Met Val Ala Arg Arg Gly Ala Ile Leu Pro Gln Asp Ile Ser Val Thr
625 630 635 640
Pro Val Ala Thr Pro Val Pro Pro Glu Glu Gln Ala Asn Leu Trp Leu
645 650 655
Val Glu Ala Glu Ile Ser Pro Glu Leu Gln Lys Arg Leu Gly Arg Lys
660 665 670
Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Glu Val Cys Pro Leu Ala Pro Pro
675 680 685
Pro Glu Leu His Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ser Thr Ile Pro Arg Leu
690 695 700
Pro Gln Leu Pro Arg Gln Lys Cys Leu Val Ala Ala Gly Ala Trp Gly
705 710 715 720
Ala Gly Asp Ser Cys Arg Gln Gly Ala Trp Thr Leu Val Ser Asn Pro
725 730 735
Phe Cys Pro Glu Pro Ser Pro Pro Gln Asp Pro Phe Leu Pro Ser Ala
740 745 750
Pro Ala Pro Val Ala Trp Ala His Gly Arg Arg Gln Gly Leu Gly Pro
755 760 765
Ile His Ser Arg Thr Asn Leu Met Asp Thr Glu Leu Met Asp Ala Asp
770 775 780
Ser Asp Phe
785
<210> 5
<211> 2364
<212> DNA
<213> 智人
<400> 5
atggccgctg cccgcccagc gcgggggccg gagctcccgc tcctggggct gctgctgctg 60
ctgctgctgg gggacccggg ccggggggcg gcctcgagcg ggaacgcgac cgggcctggg 120
cctcggagcg cgggcgggag cgcgaggagg agcgcggcgg tgactggccc tccgccgccg 180
ctgagccact gcggccgggc tgccccctgc gagccgctgc gctacaacgt gtgcctgggc 240
tcggtgctgc cctacggggc cacctccaca ctgctggccg gagactcgga ctcccaggag 300
gaagcgcacg gcaagctcgt gctctggtcg ggcctccgga atgccccccg ctgctgggca 360
gtgatccagc ccctgctgtg tgccgtatac atgcccaagt gtgagaatga ccgggtggag 420
ctgcccagcc gtaccctctg ccaggccacc cgaggcccct gtgccatcgt ggagagggag 480
cggggctggc ctgacttcct gcgctgcact cctgaccgct tccctgaagg ctgcacgaat 540
gaggtgcaga acatcaagtt caacagttca ggccagtgcg aagtgccctt ggttcggaca 600
gacaacccca agagctggta cgaggacgtg gagggctgcg gcatccagtg ccagaacccg 660
ctcttcacag aggctgagca ccaggacatg cacagctaca tcgcggcctt cggggccgtc 720
acgggcctct gcacgctctt caccctggcc acattcgtgg ctgactggcg gaactcgaat 780
cgctaccctg ctgttattct cttctacgtc aatgcgtgct tctttgtggg cagcattggc 840
tggctggccc agttcatgga tggtgcccgc cgagagatcg tctgccgtgc agatggcacc 900
atgaggcttg gggagcccac ctccaatgag actctgtcct gcgtcatcat ctttgtcatc 960
gtgtactacg ccctgatggc tggtgtggtt tggtttgtgg tcctcaccta tgcctggcac 1020
acttccttca aagccctggg caccacctac cagcctctct cgggcaagac ctcctacttc 1080
cacctgctca cctggtcact cccctttgtc ctcactgtgg caatccttgc tgtggcgcag 1140
gtggatgggg actctgtgag tggcatttgt tttgtgggct acaagaacta ccgataccgt 1200
gcgggcttcg tgctggcccc aatcggcctg gtgctcatcg tgggaggcta cttcctcatc 1260
cgaggagtca tgactctgtt ctccatcaag agcaaccacc ccgggctgct gagtgagaag 1320
gctgccagca agatcaacga gaccatgctg cgcctgggca tttttggctt cctggccttt 1380
ggctttgtgc tcattacctt cagctgccac ttctacgact tcttcaacca ggctgagtgg 1440
gagcgcagct tccgggacta tgtgctatgt caggccaatg tgaccatcgg gctgcccacc 1500
aagcagccca tccctgactg tgagatcaag aatcgcccga gccttctggt ggagaagatc 1560
aacctgtttg ccatgtttgg aactggcatc gccatgagca cctgggtctg gaccaaggcc 1620
acgctgctca tctggaggcg tacctggtgc aggttgactg ggcagagtga cgatgagcca 1680
aagcggatca agaagagcaa gatgattgcc aaggccttct ctaagcggca cgagctcctg 1740
cagaacccag gccaggagct gtccttcagc atgcacactg tgtcccacga cgggcccgtg 1800
gcgggcttgg cctttgacct caatgagccc tcagctgatg tctcctctgc ctgggcccag 1860
catgtcacca agatggtggc tcggagagga gccatactgc cccaggatat ttctgtcacc 1920
cctgtggcaa ctccagtgcc cccagaggaa caagccaacc tgtggctggt tgaggcagag 1980
atctccccag agctgcagaa gcgcctgggc cggaagaaga agaggaggaa gaggaagaag 2040
gaggtgtgcc cgctggcgcc gccccctgag cttcaccccc ctgcccctgc ccccagtacc 2100
attcctcgac tgcctcagct gccccggcag aaatgcctgg tggctgcagg tgcctgggga 2160
gctggggact cttgccgaca gggagcgtgg accctggtct ccaacccatt ctgcccagag 2220
cccagtcccc ctcaggatcc atttctgccc agtgcaccgg cccccgtggc atgggctcat 2280
ggccgccgac agggcctggg gcctattcac tcccgcacca acctgatgga cacagaactc 2340
atggatgcag actcggactt ctga 2364
<210> 6
<211> 787
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (241)..(241)
<223> 任何氨基酸
<400> 6
Met Ala Ala Ala Arg Pro Ala Arg Gly Pro Glu Leu Pro Leu Leu Gly
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Asp Pro Gly Arg Gly Ala Ala Ser
20 25 30
Ser Gly Asn Ala Thr Gly Pro Gly Pro Arg Ser Ala Gly Gly Ser Ala
35 40 45
Arg Arg Ser Ala Ala Val Thr Gly Pro Pro Pro Pro Leu Ser His Cys
50 55 60
Gly Arg Ala Ala Pro Cys Glu Pro Leu Arg Tyr Asn Val Cys Leu Gly
65 70 75 80
Ser Val Leu Pro Tyr Gly Ala Thr Ser Thr Leu Leu Ala Gly Asp Ser
85 90 95
Asp Ser Gln Glu Glu Ala His Gly Lys Leu Val Leu Trp Ser Gly Leu
100 105 110
Arg Asn Ala Pro Arg Cys Trp Ala Val Ile Gln Pro Leu Leu Cys Ala
115 120 125
Val Tyr Met Pro Lys Cys Glu Asn Asp Arg Val Glu Leu Pro Ser Arg
130 135 140
Thr Leu Cys Gln Ala Thr Arg Gly Pro Cys Ala Ile Val Glu Arg Glu
145 150 155 160
Arg Gly Trp Pro Asp Phe Leu Arg Cys Thr Pro Asp Arg Phe Pro Glu
165 170 175
Gly Cys Thr Asn Glu Val Gln Asn Ile Lys Phe Asn Ser Ser Gly Gln
180 185 190
Cys Glu Val Pro Leu Val Arg Thr Asp Asn Pro Lys Ser Trp Tyr Glu
195 200 205
Asp Val Glu Gly Cys Gly Ile Gln Cys Gln Asn Pro Leu Phe Thr Glu
210 215 220
Ala Glu His Gln Asp Met His Ser Tyr Ile Ala Ala Phe Gly Ala Val
225 230 235 240
Xaa Gly Leu Cys Thr Leu Phe Thr Leu Ala Thr Phe Val Ala Asp Trp
245 250 255
Arg Asn Ser Asn Arg Tyr Pro Ala Val Ile Leu Phe Tyr Val Asn Ala
260 265 270
Cys Phe Phe Val Gly Ser Ile Gly Trp Leu Ala Gln Phe Met Asp Gly
275 280 285
Ala Arg Arg Glu Ile Val Cys Arg Ala Asp Gly Thr Met Arg Leu Gly
290 295 300
Glu Pro Thr Ser Asn Glu Thr Leu Ser Cys Val Ile Ile Phe Val Ile
305 310 315 320
Val Tyr Tyr Ala Leu Met Ala Gly Val Val Trp Phe Val Val Leu Thr
325 330 335
Tyr Ala Trp His Thr Ser Phe Lys Ala Leu Gly Thr Thr Tyr Gln Pro
340 345 350
Leu Ser Gly Lys Thr Ser Tyr Phe His Leu Leu Thr Trp Ser Leu Pro
355 360 365
Phe Val Leu Thr Val Ala Ile Leu Ala Val Ala Gln Val Asp Gly Asp
370 375 380
Ser Val Ser Gly Ile Cys Phe Val Gly Tyr Lys Asn Tyr Arg Tyr Arg
385 390 395 400
Ala Gly Phe Val Leu Ala Pro Ile Gly Leu Val Leu Ile Val Gly Gly
405 410 415
Tyr Phe Leu Ile Arg Gly Val Met Thr Leu Phe Ser Ile Lys Ser Asn
420 425 430
His Pro Gly Leu Leu Ser Glu Lys Ala Ala Ser Lys Ile Asn Glu Thr
435 440 445
Met Leu Arg Leu Gly Ile Phe Gly Phe Leu Ala Phe Gly Phe Val Leu
450 455 460
Ile Thr Phe Ser Cys His Phe Tyr Asp Phe Phe Asn Gln Ala Glu Trp
465 470 475 480
Glu Arg Ser Phe Arg Asp Tyr Val Leu Cys Gln Ala Asn Val Thr Ile
485 490 495
Gly Leu Pro Thr Lys Gln Pro Ile Pro Asp Cys Glu Ile Lys Asn Arg
500 505 510
Pro Ser Leu Leu Val Glu Lys Ile Asn Leu Phe Ala Met Phe Gly Thr
515 520 525
Gly Ile Ala Met Ser Thr Trp Val Trp Thr Lys Ala Thr Leu Leu Ile
530 535 540
Trp Arg Arg Thr Trp Cys Arg Leu Thr Gly Gln Ser Asp Asp Glu Pro
545 550 555 560
Lys Arg Ile Lys Lys Ser Lys Met Ile Ala Lys Ala Phe Ser Lys Arg
565 570 575
His Glu Leu Leu Gln Asn Pro Gly Gln Glu Leu Ser Phe Ser Met His
580 585 590
Thr Val Ser His Asp Gly Pro Val Ala Gly Leu Ala Phe Asp Leu Asn
595 600 605
Glu Pro Ser Ala Asp Val Ser Ser Ala Trp Ala Gln His Val Thr Lys
610 615 620
Met Val Ala Arg Arg Gly Ala Ile Leu Pro Gln Asp Ile Ser Val Thr
625 630 635 640
Pro Val Ala Thr Pro Val Pro Pro Glu Glu Gln Ala Asn Leu Trp Leu
645 650 655
Val Glu Ala Glu Ile Ser Pro Glu Leu Gln Lys Arg Leu Gly Arg Lys
660 665 670
Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Glu Val Cys Pro Leu Ala Pro Pro
675 680 685
Pro Glu Leu His Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ser Thr Ile Pro Arg Leu
690 695 700
Pro Gln Leu Pro Arg Gln Lys Cys Leu Val Ala Ala Gly Ala Trp Gly
705 710 715 720
Ala Gly Asp Ser Cys Arg Gln Gly Ala Trp Thr Leu Val Ser Asn Pro
725 730 735
Phe Cys Pro Glu Pro Ser Pro Pro Gln Asp Pro Phe Leu Pro Ser Ala
740 745 750
Pro Ala Pro Val Ala Trp Ala His Gly Arg Arg Gln Gly Leu Gly Pro
755 760 765
Ile His Ser Arg Thr Asn Leu Met Asp Thr Glu Leu Met Asp Ala Asp
770 775 780
Ser Asp Phe
785
<210> 7
<211> 787
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (408)..(408)
<223> 任何氨基酸
<400> 7
Met Ala Ala Ala Arg Pro Ala Arg Gly Pro Glu Leu Pro Leu Leu Gly
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Asp Pro Gly Arg Gly Ala Ala Ser
20 25 30
Ser Gly Asn Ala Thr Gly Pro Gly Pro Arg Ser Ala Gly Gly Ser Ala
35 40 45
Arg Arg Ser Ala Ala Val Thr Gly Pro Pro Pro Pro Leu Ser His Cys
50 55 60
Gly Arg Ala Ala Pro Cys Glu Pro Leu Arg Tyr Asn Val Cys Leu Gly
65 70 75 80
Ser Val Leu Pro Tyr Gly Ala Thr Ser Thr Leu Leu Ala Gly Asp Ser
85 90 95
Asp Ser Gln Glu Glu Ala His Gly Lys Leu Val Leu Trp Ser Gly Leu
100 105 110
Arg Asn Ala Pro Arg Cys Trp Ala Val Ile Gln Pro Leu Leu Cys Ala
115 120 125
Val Tyr Met Pro Lys Cys Glu Asn Asp Arg Val Glu Leu Pro Ser Arg
130 135 140
Thr Leu Cys Gln Ala Thr Arg Gly Pro Cys Ala Ile Val Glu Arg Glu
145 150 155 160
Arg Gly Trp Pro Asp Phe Leu Arg Cys Thr Pro Asp Arg Phe Pro Glu
165 170 175
Gly Cys Thr Asn Glu Val Gln Asn Ile Lys Phe Asn Ser Ser Gly Gln
180 185 190
Cys Glu Val Pro Leu Val Arg Thr Asp Asn Pro Lys Ser Trp Tyr Glu
195 200 205
Asp Val Glu Gly Cys Gly Ile Gln Cys Gln Asn Pro Leu Phe Thr Glu
210 215 220
Ala Glu His Gln Asp Met His Ser Tyr Ile Ala Ala Phe Gly Ala Val
225 230 235 240
Thr Gly Leu Cys Thr Leu Phe Thr Leu Ala Thr Phe Val Ala Asp Trp
245 250 255
Arg Asn Ser Asn Arg Tyr Pro Ala Val Ile Leu Phe Tyr Val Asn Ala
260 265 270
Cys Phe Phe Val Gly Ser Ile Gly Trp Leu Ala Gln Phe Met Asp Gly
275 280 285
Ala Arg Arg Glu Ile Val Cys Arg Ala Asp Gly Thr Met Arg Leu Gly
290 295 300
Glu Pro Thr Ser Asn Glu Thr Leu Ser Cys Val Ile Ile Phe Val Ile
305 310 315 320
Val Tyr Tyr Ala Leu Met Ala Gly Val Val Trp Phe Val Val Leu Thr
325 330 335
Tyr Ala Trp His Thr Ser Phe Lys Ala Leu Gly Thr Thr Tyr Gln Pro
340 345 350
Leu Ser Gly Lys Thr Ser Tyr Phe His Leu Leu Thr Trp Ser Leu Pro
355 360 365
Phe Val Leu Thr Val Ala Ile Leu Ala Val Ala Gln Val Asp Gly Asp
370 375 380
Ser Val Ser Gly Ile Cys Phe Val Gly Tyr Lys Asn Tyr Arg Tyr Arg
385 390 395 400
Ala Gly Phe Val Leu Ala Pro Xaa Gly Leu Val Leu Ile Val Gly Gly
405 410 415
Tyr Phe Leu Ile Arg Gly Val Met Thr Leu Phe Ser Ile Lys Ser Asn
420 425 430
His Pro Gly Leu Leu Ser Glu Lys Ala Ala Ser Lys Ile Asn Glu Thr
435 440 445
Met Leu Arg Leu Gly Ile Phe Gly Phe Leu Ala Phe Gly Phe Val Leu
450 455 460
Ile Thr Phe Ser Cys His Phe Tyr Asp Phe Phe Asn Gln Ala Glu Trp
465 470 475 480
Glu Arg Ser Phe Arg Asp Tyr Val Leu Cys Gln Ala Asn Val Thr Ile
485 490 495
Gly Leu Pro Thr Lys Gln Pro Ile Pro Asp Cys Glu Ile Lys Asn Arg
500 505 510
Pro Ser Leu Leu Val Glu Lys Ile Asn Leu Phe Ala Met Phe Gly Thr
515 520 525
Gly Ile Ala Met Ser Thr Trp Val Trp Thr Lys Ala Thr Leu Leu Ile
530 535 540
Trp Arg Arg Thr Trp Cys Arg Leu Thr Gly Gln Ser Asp Asp Glu Pro
545 550 555 560
Lys Arg Ile Lys Lys Ser Lys Met Ile Ala Lys Ala Phe Ser Lys Arg
565 570 575
His Glu Leu Leu Gln Asn Pro Gly Gln Glu Leu Ser Phe Ser Met His
580 585 590
Thr Val Ser His Asp Gly Pro Val Ala Gly Leu Ala Phe Asp Leu Asn
595 600 605
Glu Pro Ser Ala Asp Val Ser Ser Ala Trp Ala Gln His Val Thr Lys
610 615 620
Met Val Ala Arg Arg Gly Ala Ile Leu Pro Gln Asp Ile Ser Val Thr
625 630 635 640
Pro Val Ala Thr Pro Val Pro Pro Glu Glu Gln Ala Asn Leu Trp Leu
645 650 655
Val Glu Ala Glu Ile Ser Pro Glu Leu Gln Lys Arg Leu Gly Arg Lys
660 665 670
Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Glu Val Cys Pro Leu Ala Pro Pro
675 680 685
Pro Glu Leu His Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ser Thr Ile Pro Arg Leu
690 695 700
Pro Gln Leu Pro Arg Gln Lys Cys Leu Val Ala Ala Gly Ala Trp Gly
705 710 715 720
Ala Gly Asp Ser Cys Arg Gln Gly Ala Trp Thr Leu Val Ser Asn Pro
725 730 735
Phe Cys Pro Glu Pro Ser Pro Pro Gln Asp Pro Phe Leu Pro Ser Ala
740 745 750
Pro Ala Pro Val Ala Trp Ala His Gly Arg Arg Gln Gly Leu Gly Pro
755 760 765
Ile His Ser Arg Thr Asn Leu Met Asp Thr Glu Leu Met Asp Ala Asp
770 775 780
Ser Asp Phe
785
<210> 8
<211> 787
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (469)..(469)
<223> 任何氨基酸
<400> 8
Met Ala Ala Ala Arg Pro Ala Arg Gly Pro Glu Leu Pro Leu Leu Gly
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Asp Pro Gly Arg Gly Ala Ala Ser
20 25 30
Ser Gly Asn Ala Thr Gly Pro Gly Pro Arg Ser Ala Gly Gly Ser Ala
35 40 45
Arg Arg Ser Ala Ala Val Thr Gly Pro Pro Pro Pro Leu Ser His Cys
50 55 60
Gly Arg Ala Ala Pro Cys Glu Pro Leu Arg Tyr Asn Val Cys Leu Gly
65 70 75 80
Ser Val Leu Pro Tyr Gly Ala Thr Ser Thr Leu Leu Ala Gly Asp Ser
85 90 95
Asp Ser Gln Glu Glu Ala His Gly Lys Leu Val Leu Trp Ser Gly Leu
100 105 110
Arg Asn Ala Pro Arg Cys Trp Ala Val Ile Gln Pro Leu Leu Cys Ala
115 120 125
Val Tyr Met Pro Lys Cys Glu Asn Asp Arg Val Glu Leu Pro Ser Arg
130 135 140
Thr Leu Cys Gln Ala Thr Arg Gly Pro Cys Ala Ile Val Glu Arg Glu
145 150 155 160
Arg Gly Trp Pro Asp Phe Leu Arg Cys Thr Pro Asp Arg Phe Pro Glu
165 170 175
Gly Cys Thr Asn Glu Val Gln Asn Ile Lys Phe Asn Ser Ser Gly Gln
180 185 190
Cys Glu Val Pro Leu Val Arg Thr Asp Asn Pro Lys Ser Trp Tyr Glu
195 200 205
Asp Val Glu Gly Cys Gly Ile Gln Cys Gln Asn Pro Leu Phe Thr Glu
210 215 220
Ala Glu His Gln Asp Met His Ser Tyr Ile Ala Ala Phe Gly Ala Val
225 230 235 240
Thr Gly Leu Cys Thr Leu Phe Thr Leu Ala Thr Phe Val Ala Asp Trp
245 250 255
Arg Asn Ser Asn Arg Tyr Pro Ala Val Ile Leu Phe Tyr Val Asn Ala
260 265 270
Cys Phe Phe Val Gly Ser Ile Gly Trp Leu Ala Gln Phe Met Asp Gly
275 280 285
Ala Arg Arg Glu Ile Val Cys Arg Ala Asp Gly Thr Met Arg Leu Gly
290 295 300
Glu Pro Thr Ser Asn Glu Thr Leu Ser Cys Val Ile Ile Phe Val Ile
305 310 315 320
Val Tyr Tyr Ala Leu Met Ala Gly Val Val Trp Phe Val Val Leu Thr
325 330 335
Tyr Ala Trp His Thr Ser Phe Lys Ala Leu Gly Thr Thr Tyr Gln Pro
340 345 350
Leu Ser Gly Lys Thr Ser Tyr Phe His Leu Leu Thr Trp Ser Leu Pro
355 360 365
Phe Val Leu Thr Val Ala Ile Leu Ala Val Ala Gln Val Asp Gly Asp
370 375 380
Ser Val Ser Gly Ile Cys Phe Val Gly Tyr Lys Asn Tyr Arg Tyr Arg
385 390 395 400
Ala Gly Phe Val Leu Ala Pro Ile Gly Leu Val Leu Ile Val Gly Gly
405 410 415
Tyr Phe Leu Ile Arg Gly Val Met Thr Leu Phe Ser Ile Lys Ser Asn
420 425 430
His Pro Gly Leu Leu Ser Glu Lys Ala Ala Ser Lys Ile Asn Glu Thr
435 440 445
Met Leu Arg Leu Gly Ile Phe Gly Phe Leu Ala Phe Gly Phe Val Leu
450 455 460
Ile Thr Phe Ser Xaa His Phe Tyr Asp Phe Phe Asn Gln Ala Glu Trp
465 470 475 480
Glu Arg Ser Phe Arg Asp Tyr Val Leu Cys Gln Ala Asn Val Thr Ile
485 490 495
Gly Leu Pro Thr Lys Gln Pro Ile Pro Asp Cys Glu Ile Lys Asn Arg
500 505 510
Pro Ser Leu Leu Val Glu Lys Ile Asn Leu Phe Ala Met Phe Gly Thr
515 520 525
Gly Ile Ala Met Ser Thr Trp Val Trp Thr Lys Ala Thr Leu Leu Ile
530 535 540
Trp Arg Arg Thr Trp Cys Arg Leu Thr Gly Gln Ser Asp Asp Glu Pro
545 550 555 560
Lys Arg Ile Lys Lys Ser Lys Met Ile Ala Lys Ala Phe Ser Lys Arg
565 570 575
His Glu Leu Leu Gln Asn Pro Gly Gln Glu Leu Ser Phe Ser Met His
580 585 590
Thr Val Ser His Asp Gly Pro Val Ala Gly Leu Ala Phe Asp Leu Asn
595 600 605
Glu Pro Ser Ala Asp Val Ser Ser Ala Trp Ala Gln His Val Thr Lys
610 615 620
Met Val Ala Arg Arg Gly Ala Ile Leu Pro Gln Asp Ile Ser Val Thr
625 630 635 640
Pro Val Ala Thr Pro Val Pro Pro Glu Glu Gln Ala Asn Leu Trp Leu
645 650 655
Val Glu Ala Glu Ile Ser Pro Glu Leu Gln Lys Arg Leu Gly Arg Lys
660 665 670
Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Glu Val Cys Pro Leu Ala Pro Pro
675 680 685
Pro Glu Leu His Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ser Thr Ile Pro Arg Leu
690 695 700
Pro Gln Leu Pro Arg Gln Lys Cys Leu Val Ala Ala Gly Ala Trp Gly
705 710 715 720
Ala Gly Asp Ser Cys Arg Gln Gly Ala Trp Thr Leu Val Ser Asn Pro
725 730 735
Phe Cys Pro Glu Pro Ser Pro Pro Gln Asp Pro Phe Leu Pro Ser Ala
740 745 750
Pro Ala Pro Val Ala Trp Ala His Gly Arg Arg Gln Gly Leu Gly Pro
755 760 765
Ile His Ser Arg Thr Asn Leu Met Asp Thr Glu Leu Met Asp Ala Asp
770 775 780
Ser Asp Phe
785
<210> 9
<211> 787
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (533)..(533)
<223> 任何氨基酸
<400> 9
Met Ala Ala Ala Arg Pro Ala Arg Gly Pro Glu Leu Pro Leu Leu Gly
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Asp Pro Gly Arg Gly Ala Ala Ser
20 25 30
Ser Gly Asn Ala Thr Gly Pro Gly Pro Arg Ser Ala Gly Gly Ser Ala
35 40 45
Arg Arg Ser Ala Ala Val Thr Gly Pro Pro Pro Pro Leu Ser His Cys
50 55 60
Gly Arg Ala Ala Pro Cys Glu Pro Leu Arg Tyr Asn Val Cys Leu Gly
65 70 75 80
Ser Val Leu Pro Tyr Gly Ala Thr Ser Thr Leu Leu Ala Gly Asp Ser
85 90 95
Asp Ser Gln Glu Glu Ala His Gly Lys Leu Val Leu Trp Ser Gly Leu
100 105 110
Arg Asn Ala Pro Arg Cys Trp Ala Val Ile Gln Pro Leu Leu Cys Ala
115 120 125
Val Tyr Met Pro Lys Cys Glu Asn Asp Arg Val Glu Leu Pro Ser Arg
130 135 140
Thr Leu Cys Gln Ala Thr Arg Gly Pro Cys Ala Ile Val Glu Arg Glu
145 150 155 160
Arg Gly Trp Pro Asp Phe Leu Arg Cys Thr Pro Asp Arg Phe Pro Glu
165 170 175
Gly Cys Thr Asn Glu Val Gln Asn Ile Lys Phe Asn Ser Ser Gly Gln
180 185 190
Cys Glu Val Pro Leu Val Arg Thr Asp Asn Pro Lys Ser Trp Tyr Glu
195 200 205
Asp Val Glu Gly Cys Gly Ile Gln Cys Gln Asn Pro Leu Phe Thr Glu
210 215 220
Ala Glu His Gln Asp Met His Ser Tyr Ile Ala Ala Phe Gly Ala Val
225 230 235 240
Thr Gly Leu Cys Thr Leu Phe Thr Leu Ala Thr Phe Val Ala Asp Trp
245 250 255
Arg Asn Ser Asn Arg Tyr Pro Ala Val Ile Leu Phe Tyr Val Asn Ala
260 265 270
Cys Phe Phe Val Gly Ser Ile Gly Trp Leu Ala Gln Phe Met Asp Gly
275 280 285
Ala Arg Arg Glu Ile Val Cys Arg Ala Asp Gly Thr Met Arg Leu Gly
290 295 300
Glu Pro Thr Ser Asn Glu Thr Leu Ser Cys Val Ile Ile Phe Val Ile
305 310 315 320
Val Tyr Tyr Ala Leu Met Ala Gly Val Val Trp Phe Val Val Leu Thr
325 330 335
Tyr Ala Trp His Thr Ser Phe Lys Ala Leu Gly Thr Thr Tyr Gln Pro
340 345 350
Leu Ser Gly Lys Thr Ser Tyr Phe His Leu Leu Thr Trp Ser Leu Pro
355 360 365
Phe Val Leu Thr Val Ala Ile Leu Ala Val Ala Gln Val Asp Gly Asp
370 375 380
Ser Val Ser Gly Ile Cys Phe Val Gly Tyr Lys Asn Tyr Arg Tyr Arg
385 390 395 400
Ala Gly Phe Val Leu Ala Pro Ile Gly Leu Val Leu Ile Val Gly Gly
405 410 415
Tyr Phe Leu Ile Arg Gly Val Met Thr Leu Phe Ser Ile Lys Ser Asn
420 425 430
His Pro Gly Leu Leu Ser Glu Lys Ala Ala Ser Lys Ile Asn Glu Thr
435 440 445
Met Leu Arg Leu Gly Ile Phe Gly Phe Leu Ala Phe Gly Phe Val Leu
450 455 460
Ile Thr Phe Ser Cys His Phe Tyr Asp Phe Phe Asn Gln Ala Glu Trp
465 470 475 480
Glu Arg Ser Phe Arg Asp Tyr Val Leu Cys Gln Ala Asn Val Thr Ile
485 490 495
Gly Leu Pro Thr Lys Gln Pro Ile Pro Asp Cys Glu Ile Lys Asn Arg
500 505 510
Pro Ser Leu Leu Val Glu Lys Ile Asn Leu Phe Ala Met Phe Gly Thr
515 520 525
Gly Ile Ala Met Xaa Thr Trp Val Trp Thr Lys Ala Thr Leu Leu Ile
530 535 540
Trp Arg Arg Thr Trp Cys Arg Leu Thr Gly Gln Ser Asp Asp Glu Pro
545 550 555 560
Lys Arg Ile Lys Lys Ser Lys Met Ile Ala Lys Ala Phe Ser Lys Arg
565 570 575
His Glu Leu Leu Gln Asn Pro Gly Gln Glu Leu Ser Phe Ser Met His
580 585 590
Thr Val Ser His Asp Gly Pro Val Ala Gly Leu Ala Phe Asp Leu Asn
595 600 605
Glu Pro Ser Ala Asp Val Ser Ser Ala Trp Ala Gln His Val Thr Lys
610 615 620
Met Val Ala Arg Arg Gly Ala Ile Leu Pro Gln Asp Ile Ser Val Thr
625 630 635 640
Pro Val Ala Thr Pro Val Pro Pro Glu Glu Gln Ala Asn Leu Trp Leu
645 650 655
Val Glu Ala Glu Ile Ser Pro Glu Leu Gln Lys Arg Leu Gly Arg Lys
660 665 670
Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Glu Val Cys Pro Leu Ala Pro Pro
675 680 685
Pro Glu Leu His Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ser Thr Ile Pro Arg Leu
690 695 700
Pro Gln Leu Pro Arg Gln Lys Cys Leu Val Ala Ala Gly Ala Trp Gly
705 710 715 720
Ala Gly Asp Ser Cys Arg Gln Gly Ala Trp Thr Leu Val Ser Asn Pro
725 730 735
Phe Cys Pro Glu Pro Ser Pro Pro Gln Asp Pro Phe Leu Pro Ser Ala
740 745 750
Pro Ala Pro Val Ala Trp Ala His Gly Arg Arg Gln Gly Leu Gly Pro
755 760 765
Ile His Ser Arg Thr Asn Leu Met Asp Thr Glu Leu Met Asp Ala Asp
770 775 780
Ser Asp Phe
785
<210> 10
<211> 480
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Met Ala Glu Leu Arg Pro Ser Gly Ala Pro Gly Pro Thr Ala Pro Pro
1 5 10 15
Ala Pro Gly Pro Thr Ala Pro Pro Ala Phe Ala Ser Leu Phe Pro Pro
20 25 30
Gly Leu His Ala Ile Tyr Gly Glu Cys Arg Arg Leu Tyr Pro Asp Gln
35 40 45
Pro Asn Pro Leu Gln Val Thr Ala Ile Val Lys Tyr Trp Leu Gly Gly
50 55 60
Pro Asp Pro Leu Asp Tyr Val Ser Met Tyr Arg Asn Val Gly Ser Pro
65 70 75 80
Ser Ala Asn Ile Pro Glu His Trp His Tyr Ile Ser Phe Gly Leu Ser
85 90 95
Asp Leu Tyr Gly Asp Asn Arg Val His Glu Phe Thr Gly Thr Asp Gly
100 105 110
Pro Ser Gly Phe Gly Phe Glu Leu Thr Phe Arg Leu Lys Arg Glu Thr
115 120 125
Gly Glu Ser Ala Pro Pro Thr Trp Pro Ala Glu Leu Met Gln Gly Leu
130 135 140
Ala Arg Tyr Val Phe Gln Ser Glu Asn Thr Phe Cys Ser Gly Asp His
145 150 155 160
Val Ser Trp His Ser Pro Leu Asp Asn Ser Glu Ser Arg Ile Gln His
165 170 175
Met Leu Leu Thr Glu Asp Pro Gln Met Gln Pro Val Gln Thr Pro Phe
180 185 190
Gly Val Val Thr Phe Leu Gln Ile Val Gly Val Cys Thr Glu Glu Leu
195 200 205
His Ser Ala Gln Gln Trp Asn Gly Gln Gly Ile Leu Leu Arg Thr Val
210 215 220
Pro Ile Ala Gly Gly Pro Trp Leu Ile Thr Asp Met Arg Arg Gly Glu
225 230 235 240
Thr Ile Phe Glu Ile Asp Pro His Leu Gln Glu Arg Val Asp Lys Gly
245 250 255
Ile Glu Thr Asp Gly Ser Asn Leu Ser Gly Val Ser Ala Lys Cys Ala
260 265 270
Trp Asp Asp Leu Ser Arg Pro Pro Glu Asp Asp Glu Asp Ser Arg Ser
275 280 285
Ile Cys Ile Gly Thr Gln Pro Arg Arg Leu Ser Gly Lys Asp Thr Glu
290 295 300
Gln Ile Arg Glu Thr Leu Arg Arg Gly Leu Glu Ile Asn Ser Lys Pro
305 310 315 320
Val Leu Pro Pro Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Gly Leu Ala His Asp
325 330 335
Arg Ala Pro Ser Arg Lys Asp Ser Leu Glu Ser Asp Ser Ser Thr Ala
340 345 350
Ile Ile Phe Leu Ile Arg Thr Arg Gln Leu Glu Ser Val His Leu Lys
355 360 365
Phe Asn Gln Glu Ser Gly Ala Leu Ile Pro Leu Cys Leu Arg Gly Arg
370 375 380
Leu Leu His Gly Arg His Phe Thr Tyr Lys Ser Ile Thr Gly Asp Met
385 390 395 400
Ala Ile Thr Phe Val Ser Thr Gly Val Glu Gly Ala Phe Ala Thr Glu
405 410 415
Glu His Pro Tyr Ala Ala His Gly Pro Trp Leu Gln Ile Leu Leu Thr
420 425 430
Glu Glu Phe Val Glu Lys Met Leu Glu Asp Leu Glu Asp Leu Thr Ser
435 440 445
Pro Glu Glu Phe Lys Leu Pro Lys Glu Tyr Ser Trp Pro Glu Lys Lys
450 455 460
Leu Lys Val Ser Ile Leu Pro Asp Val Val Phe Asp Ser Pro Leu His
465 470 475 480
<210> 11
<211> 4898
<212> DNA
<213> 智人
<400> 11
cgccgtgcgc aggcgcggag ctagacctcg ctgcagcccc catcgcctcg gggagtctca 60
cccaccgagt ccgcccgctg gcccgtcagt gctctccccg tcgtttgccc tctccagttc 120
ccccagtgcc tgccctacgc accccgatgg cggagctgcg gcctagcggc gcccccggcc 180
ccaccgcgcc cccggcccct ggcccgactg cccccccggc cttcgcttcg ctctttcccc 240
cgggactgca cgccatctac ggagagtgcc gccgccttta ccctgaccag ccgaacccgc 300
tccaggttac cgctatcgtc aagtactggt tgggtggccc agaccccttg gactatgtta 360
gcatgtacag gaatgtgggg agcccttctg ctaacatccc cgagcactgg cactacatca 420
gcttcggcct gagtgatctc tatggtgaca acagagtcca tgagtttaca ggaacagatg 480
gacctagtgg ttttggcttt gagttgacct ttcgtctgaa gagagaaact ggggagtctg 540
ccccaccaac atggcccgca gagttaatgc agggcttggc acgatacgtg ttccagtcag 600
agaacacctt ctgcagtggg gaccatgtgt cctggcacag ccctttggat aacagtgagt 660
caagaattca gcacatgctg ctgacagagg acccacagat gcagcccgtg cagacaccct 720
ttggggtagt taccttcctc cagatcgttg gtgtctgcac tgaagagcta cactcagccc 780
agcagtggaa cgggcagggc atcctggagc tgctgcggac agtgcctatt gctggcggcc 840
cctggctgat aactgacatg cggaggggag agaccatatt tgagatcgat ccacacctgc 900
aagagagagt tgacaaaggc atcgagacag atggctccaa cctgagtggt gtcagtgcca 960
agtgtgcctg ggatgacctg agccggcccc ccgaggatga cgaggacagc cggagcatct 1020
gcatcggcac acagccccgg cgactctctg gcaaagacac agagcagatc cgggagaccc 1080
tgaggagagg actcgagatc aacagcaaac ctgtccttcc accaatcaac cctcagcggc 1140
agaatggcct cgcccacgac cgggccccga gccgcaaaga cagcctggaa agtgacagct 1200
ccacggccat cattccccat gagctgattc gcacgcggca gcttgagagc gtacatctga 1260
aattcaacca ggagtccgga gccctcattc ctctctgcct aaggggcagg ctcctgcatg 1320
gacggcactt tacatataaa agtatcacag gtgacatggc catcacgttt gtctccacgg 1380
gagtggaagg cgcctttgcc actgaggagc atccttacgc ggctcatgga ccctggttac 1440
aaattctgtt gaccgaagag tttgtagaga aaatgttgga ggatttagaa gatttgactt 1500
ctccagagga attcaaactt cccaaagagt acagctggcc tgaaaagaag ctgaaggtct 1560
ccatcctgcc tgacgtggtg ttcgacagtc cgctacacta gcctgggctg ggccctgcag 1620
gggccagcag ggagcccagc tgctccccag tgacttccag tgtaacagtt gtgtcaacga 1680
gatctccaca aataaaagga caagtgtgag gaagactgcg cagtgccacc ccgcagccca 1740
gtggggtgcc atgcacaggc cacaggccct ccacctcacc tccagctcag gggccgcacc 1800
ccgccgctgg ctaagccttg tgacccatca ggccagtgag tgggcaaatg cggaccctcc 1860
ctgcctgcag cctgcacaga ttctggtttg aggtttgact ctggaccctg gctgtgcccc 1920
taggtggaga cagccctctt tctcacctac cccctgccgc acagcccagc aggagggagg 1980
cggacagcca gatgcagagc gagtggatgc acttcccagc tcatctctgg aagcctttgc 2040
tactcaagct cctctggccg cggaacaatt cctctgatca tgtttggttt tcttcttcct 2100
tattttattt tgtagaaacc gggtggtatt ttattgctct gcaaagatgt ccagaagcca 2160
tgtatataat gttttttaaa cagaacttca ttccccgttg aactttcgca ttctctgaca 2220
gaggcctagg gctgtatctc tccctgggct gccaccagag aaggtgcttg gtgttcgcct 2280
gccagcccag agccctggag gagccggctg cacagagagg cttttcttcc cagctgggcc 2340
tgatggagcc cggggcaggg ggagagtaga gacactccct tgtgcagctt tgagcctagt 2400
ttagctgggg ccagggaggg gtgctactgt tttccaagtg aatgggtctc aaagacttgg 2460
tgaccccagc ctcatcttct aggccttttc catccaacca ggcctacctg ggagagggtg 2520
aggttcagca catcacacac catccccact gtcattcagg gcctgggtct ccagctctgt 2580
aaccagtcct gtcccatttc ctcagtccct gggcctccca gccttcaggc tgtagggctg 2640
ccttactaaa attgaaaaat ccacctctta acatctcttt cactttggtt ttgctaacac 2700
tgctctctgc tgccctccca tcctccctgt atccattcat gccctatctt tcattctcca 2760
ctcctaatcc ctctcctttc tggcatcctg gcctctcgtg gtcctcagcc cctcaccccc 2820
agtactgcag atctcacagt ttgccttcca gaagccagcc tatctctagc ccatggtttt 2880
ggagttcctc tcgggttatc tcccacgcct gacctggaac cagcaagccc ctttcctgcc 2940
ttcttacccc caactctagg gatgggactg ttacaatact tcaagatcac tctttacacc 3000
tcttcaaagc aaagtcatga caatgcaggg ctcctcattg ctcccatctg cctctgctgc 3060
acacacaggc accagcaggg atgccacagg agtgcccaca gggtgcagga ctccactgat 3120
gagagatcca gccaaagagc tgcccccagg ggtatgaggg caccagctgg gttctccagg 3180
gagcaggagt tggacctcca tggagccact aggcctggcc tcctctacac atccccaggg 3240
ctatctggtt aattccatca agctcagagt taaaaggcat atcagcctgg agtatttggg 3300
agagactggc tgcagatccc cgccagccaa gatgcaagcc actcgggacc tgatgtcggc 3360
agctgtgcct ctactgccct gaggacttac cagagggagc cctactggcc ttcccccacc 3420
acagcagccc tgcctgtgaa gctcttgttt ctgacatttc acaggcagag aggtgccatc 3480
agttcgcctc cattccttgc caccatgacc agcctctccc tgaactctct cttgctcggg 3540
acctgcctga gggctccctg ctgcagttcg ccgtacttcc atctgctggg tgcctccatc 3600
gttggttggg tggggatggg gcattttctg agctaagctt tgtcattagt ttgtgaagca 3660
cctggtcagc aacctgcccc agacctggag ggtctttgtg gactgaaggt agacaccagc 3720
cagcatggtg gccctgttct gggggagcag ggtaaggcag gaggaagtgg gtgagctccg 3780
agatgatgag cacatgaagc ctgtggcccc ttcgtacctg caatatgtca ggagcctcac 3840
gctcacccaa gatcctgcag gggccaggct ccatctcact ggctctgagg gcaggacagg 3900
gtatcacaca tttctcacca ggcctccttt cctatgggca ttggtgcctc ccagaggttt 3960
cttgggctgc tggctggtga gagaggaccc ttaaagaaga tcaagccaag ctgaccttgg 4020
accctgtcca gcacagcttc tggcacagga tgcttggtga atgtaccctt tctttccctc 4080
cctgcagctc tgagggagcc cctgaccttg tagtgggtgg aggaggtaag gggcctccct 4140
ccctaaatct gcctcttctg caagctactt ggagacttgc ctagttgtac ccacccctcc 4200
aggtccctgg tgctagagct tctgagaagg gcctttccct ttcctctttg cctgctatat 4260
aaggcaggct cctgtggctc tgctggctca gtgtgggctg caggaggact gcagactcag 4320
ctgcaattct gaggggggtt tgggaggctt gtgcgaggtc tcaggcctgt gtggggagct 4380
ggtgcctctt cctgcccgta tctttctctt ccaagggcag tgctccaagg cagggactgg 4440
agaagccaag gggagagtct aaaagggcta gagcattttt aaaaatagac acagggtctt 4500
gggactgggg tttcggattg agttgcaagc agggagaaaa cctgaaggtc ggtgccccta 4560
tggggctgac cagtagagaa tttcctttac tgtatttttg tgtctggtct tccctttctg 4620
gcttctagga catccatgcc aggtgaggtg cctgggtccc tgttacaagt caggagccct 4680
gtagggagac ccctcctttt gtacaagtac ctgaatgctg cgacaagcag atttttgtaa 4740
aattttatat tagtttttaa tgtcagtggc gactcggttc ctggggctgc agccagcctg 4800
ggacttttgt aagaattttt gggtgactca cttagatgtc gtttccttct tgccccctct 4860
tcctctctgt aatctaagtg cattaaacat ctttgcag 4898

Claims (77)

1.一种筛选抑制在氨基酸241处掺入突变的突变型SMO蛋白的信号传导的化合物的方法，所述方法包括使所述突变型SMO与测试化合物接触，并且检测所述化合物与所述突变型SMO的结合，由此所述测试化合物与突变型SMO的结合指示所述测试化合物是突变型SMO的抑制剂。
2.一种筛选抑制在氨基酸241处掺入突变的突变型SMO蛋白的信号传导的化合物的方法，所述方法包括使表达所述突变型SMO的细胞与测试化合物接触，并且检测所述细胞中的Gli活性，由此所述Gli活性的存在指示所述测试化合物不是突变型SMO的抑制剂。
3.一种筛选抑制在氨基酸469处掺入突变的突变型SMO蛋白的信号传导的化合物的方法，所述方法包括使所述突变型SMO与测试化合物接触，并且检测所述化合物与所述突变型SMO的结合，由此所述测试化合物与突变型SMO的结合指示所述测试化合物是突变型SMO的抑制剂。
4.一种筛选抑制在氨基酸469处掺入突变的突变型SMO蛋白的信号传导的化合物的方法，所述方法包括使表达所述突变型SMO的细胞与测试化合物接触，并且检测所述细胞中的Gli活性，由此所述Gli活性的存在指示所述测试化合物不是突变型SMO的抑制剂。
5.一种分离的突变型SMO蛋白，所述分离的突变型SMO蛋白包含与SEQ ID NO:6至少95％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在氨基酸241处包含除苏氨酸外的氨基酸。
6.根据权利要求5所述的分离的突变型SMO蛋白，所述分离的突变型SMO蛋白包含SEQID NO:6的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在氨基酸241处包含除苏氨酸外的氨基酸。
7.根据权利要求5或6所述的分离的突变型SMO蛋白，其中所述氨基酸序列在氨基酸241处包含甲硫氨酸(M)。
8.一种分离的突变型SMO蛋白，所述分离的突变型SMO蛋白包含与SEQ ID NO:8至少95％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在氨基酸469处包含除半胱氨酸(C)外的氨基酸。
9.根据权利要求8所述的分离的突变型SMO蛋白，所述分离的突变型SMO蛋白包含SEQID NO:8的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在氨基酸469处包含除半胱氨酸(C)外的氨基酸。
10.根据权利要求8或9所述的分离的突变型SMO蛋白，其中所述氨基酸序列在氨基酸469处包含酪氨酸(Y)。
11.一种鉴定hedgehog途径抑制剂抑制剂的方法，其中所述方法包括：使细胞与一定量的测试试剂接触，其中所述细胞响应hedgehog蛋白或具有增加的hedgehog信号传导和/或hedgehog信号传导途径的活化，并且其中所述细胞表达根据权利要求5-10中任一项所述的突变型SMO蛋白，以及b)与对照相比，确定所述测试试剂是否抑制所述细胞中的hedgehog信号传导，其中如果相对于所述对照，所述测试试剂抑制所述细胞中的hedgehog信号传导，则所述测试试剂被鉴定为hedgehog途径抑制剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中使用Gli1表达测定来确定所述测试试剂抑制所述细胞中的hedgehog信号传导的能力。
13.一种鉴定hedgehog途径抑制剂的方法，其中所述方法包括：使细胞与一定量的测试试剂接触，其中所述细胞响应hedgehog蛋白或具有增加的hedgehog信号传导和/或hedgehog信号传导途径的活化，并且其中所述细胞表达根据权利要求5-10中任一项所述的突变型SMO蛋白，以及b)与对照相比，确定所述测试试剂是否抑制所述细胞的生长和/或增殖，其中如果相对于所述对照，所述测试试剂抑制所述细胞的生长和/或增殖，则所述测试试剂被鉴定为hedgehog途径抑制剂。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中所述对照是表达野生型SMO蛋白的细胞。
15.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中所述对照是表达与接触所述测试试剂的细胞相同的突变型SMO蛋白的细胞，其中所述对照用所述突变型SMO蛋白对其部分或完全抗性的对照试剂进行处理。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述对照试剂是维莫德吉、LY2940680、LDE225和/或化合物5。
17.根据权利要求11-16中任一项所述的方法，其中所述测试试剂结合突变型SMO蛋白，但不结合野生型SMO蛋白。
18.根据权利要求11-16中任一项所述的方法，其中所述测试试剂结合所述突变型SMO蛋白和野生型SMO蛋白两者。
19.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述测试试剂在表达突变型SMO蛋白的细胞中比在表达野生型SMO蛋白的细胞中更有效地抑制hedgehog信号传导途径。
20.根据权利要求13所述的方法，其中相比表达野生型SMO蛋白的细胞，所述测试试剂更有效地抑制表达突变型SMO蛋白的细胞的生长和/或增殖。
21.一种编码突变型SMO蛋白的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含与SEQ IDNO:1至少95％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在氨基酸241处包含除苏氨酸外的氨基酸。
22.根据权利要求21所述的分离的核酸分子，其中所述突变型SMO蛋白包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在氨基酸241处包含甲硫氨酸(M)。
23.根据权利要求21所述的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:5的亲本核酸序列，其中所述序列含有改变编码氨基酸241的序列以编码不同氨基酸的突变。
24.一种编码突变型SMO蛋白的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含与SEQ IDNO:1至少95％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在氨基酸469处包含除半胱氨酸(C)外的氨基酸。
25.根据权利要求24所述的分离的核酸分子，其中所述突变型SMO蛋白包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在氨基酸469处包含酪氨酸(Y)。
26.根据权利要求24所述的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:5的亲本核酸序列，其中所述序列含有改变编码氨基酸469的序列以编码不同氨基酸的突变。
27.一种载体，所述载体包含根据权利要求21-23或24-26中任一项所述的核酸。
28.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求27所述的载体。
29.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含并且能够表达根据权利要求27所述的载体。
30.一种鉴定hedgehog途径抑制剂抑制剂的方法，其中所述方法包括：使细胞与一定量的测试试剂接触，其中所述细胞响应hedgehog蛋白或具有增加的hedgehog信号传导和/或hedgehog信号传导途径的活化，并且其中所述细胞表达根据权利要求27所述的载体，以及b)与对照相比，确定所述测试试剂是否抑制所述细胞中的hedgehog信号传导，其中如果相对于所述对照，所述测试试剂抑制所述细胞中的hedgehog信号传导，则所述测试试剂被鉴定为hedgehog途径抑制剂。
31.根据权利要求30所述的方法，其中使用Gli1表达测定来确定所述测试试剂抑制所述细胞中的hedgehog信号传导的能力。
32.一种鉴定hedgehog途径抑制剂的方法，其中所述方法包括：使细胞与一定量的测试试剂接触，其中所述细胞响应hedgehog蛋白或具有增加的hedgehog信号传导和/或hedgehog信号传导途径的活化，并且其中所述细胞表达根据权利要求27所述的载体，以及b)与对照相比，确定所述测试试剂是否抑制所述细胞的生长和/或增殖，其中如果相对于所述对照，所述测试试剂抑制所述细胞的生长和/或增殖，则所述测试试剂被鉴定为hedgehog途径抑制剂。
33.一种检测样品中突变的SMO基因的方法，所述方法包括从所述样品中扩增疑似含有突变的对应于SMO的第一细胞外环的羧基末端的核酸或其片段，并且比较所述扩增的核酸的电泳迁移率与相应野生型SMO基因或其片段的电泳迁移率。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述电泳迁移率在聚丙烯酰胺凝胶上进行测定。
35.一种检测样品中突变的SMO基因的方法，所述方法包括从所述样品中扩增疑似含有突变的对应于SMO的跨膜结构域6的羧基末端的核酸或其片段，并且比较所述扩增的核酸的电泳迁移率与相应野生型SMO基因或其片段的电泳迁移率。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述电泳迁移率在聚丙烯酰胺凝胶上进行测定。
37.一种鉴定样品中的至少一个SMO突变的方法，所述方法包括使来自所述样品的核酸与核酸探针接触，所述核酸探针能够与掺入突变的编码突变的SMO蛋白的核酸或其片段特异性杂交，所述突变将编码氨基酸241的序列改变为除苏氨酸外的氨基酸，并且检测所述杂交。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述探针被可检测地标记。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述探针是反义寡聚物。
40.根据权利要求37-39中任一项所述的方法，其中扩增所述样品的所述核酸中的SMO基因或其片段，并且与所述探针接触。
41.一种鉴定样品中的至少一个SMO突变的方法，所述方法包括使来自所述样品的核酸与核酸探针接触，所述核酸探针能够与掺入突变的编码突变的SMO蛋白的核酸或其片段特异性杂交，所述突变将编码氨基酸469的序列改变为除半胱氨酸外的氨基酸，并且检测所述杂交。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述探针被可检测地标记。
43.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述探针是反义寡聚物。
44.根据权利要求40-43中任一项所述的方法，其中扩增所述样品的所述核酸中的SMO基因或其片段，并且与所述探针接触。
45.一种用于鉴定对用GDC-0449治疗抗性的人受试者中的肿瘤的方法，所述方法包括确定所述肿瘤的样品中突变的SMO基因或突变的SMO蛋白的存在，其中所述突变的SMO基因编码在氨基酸241处包含突变的SMO蛋白，并且其中所述SMO蛋白在氨基酸241处包含突变，由此所述突变的SMO基因或突变的SMO蛋白的存在指示所述肿瘤对用GDC-0449治疗抗性。
46.根据权利要求45所述的方法，所述方法还包括用结合所述突变的SMO的化合物治疗具有对用GDC-0449治疗不敏感或不再敏感的肿瘤的所述受试者。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述突变的存在或不存在通过检查核酸样品来确定。
48.根据权利要求45-47中任一项所述的方法，其中所述突变的存在或不存在通过检查蛋白质样品来确定。
49.一种用于鉴定对用GDC-0449治疗抗性的人受试者中的肿瘤的方法，所述方法包括确定所述肿瘤的样品中突变的SMO基因或突变的SMO蛋白的存在，其中所述突变的SMO基因编码在氨基酸469处包含突变的SMO蛋白，并且其中所述SMO蛋白在氨基酸469处包含突变，由此所述突变的SMO基因或突变的SMO蛋白的存在指示所述肿瘤对用GDC-0449治疗抗性。
50.根据权利要求49所述的方法，所述方法还包括用结合所述突变的SMO的化合物治疗具有对用GDC-0449治疗不敏感或不再敏感的肿瘤的所述受试者。
51.根据权利要求49或50所述的方法，其中所述突变的存在或不存在通过检查核酸样品来确定。
52.根据权利要求49-51中任一项所述的方法，其中所述突变的存在或不存在通过检查蛋白质样品来确定。
53.一种抑制具有异常hedgehog信号传导的细胞的增殖或生长的方法，所述方法包括向所述细胞施用溴结构域抑制剂，其中所述细胞表达在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置241或469的氨基酸位置中的任何一个或多个处具有突变的smoothened蛋白。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述细胞在受试者中。
55.根据权利要求53或54所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述细胞还包含SUFU突变。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述细胞是人细胞，并且其中所述细胞包含导致SUFU基因拷贝丢失的10q缺失突变。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述10q缺失还导致PTEN基因拷贝丢失。
59.根据权利要求53-58中任一项所述的方法，其中所述溴结构域抑制剂是I-BET762、JQ1或JQ2。
60.一种能够与编码突变的SMO蛋白的核酸或其片段特异性杂交的核酸探针，所述核酸或其片段在编码氨基酸241的序列中掺入突变。
61.根据权利要求60所述的探针，其中所述探针与编码突变的SMO的所述核酸或其所述片段互补。
62.根据权利要求60所述的探针，所述探针具有约10至约50个核苷酸的长度。
63.根据权利要求60所述的探针，所述探针还包含可检测标记。
64.一种能够与编码突变的SMO蛋白的核酸或其片段特异性杂交的核酸探针，所述核酸或其片段在编码氨基酸469的序列中掺入突变。
65.根据权利要求64所述的探针，其中所述探针与编码突变的SMO的所述核酸或其所述片段互补。
66.根据权利要求64所述的探针，所述探针具有约10至约50个核苷酸的长度。
67.根据权利要求64所述的探针，所述探针还包含可检测标记。
68.一种特异性结合根据权利要求5-7中任一项所述的突变型SMO蛋白的抗体，其中所述抗体不结合在氨基酸241处具有苏氨酸的野生型SMO。
69.根据权利要求68所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体或其抗原结合片段。
70.根据权利要求68或69所述的抗体，其中所述抗体与细胞毒素剂缀合。
71.根据权利要求68或69所述的抗体，其中所述抗体与可检测标记缀合。
72.根据权利要求68至71中任一项所述的抗体，其中所述抗体抑制SMO活性。
73.一种特异性结合根据权利要求8-10中任一项所述的突变型SMO蛋白的抗体，其中所述抗体的表位不结合在氨基酸469处具有半胱氨酸的野生型SMO。
74.根据权利要求73所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体或其抗原结合片段。
75.根据权利要求73或74所述的抗体，其中所述抗体与细胞毒素剂缀合。
76.根据权利要求73或74所述的抗体，其中所述抗体与可检测标记缀合。
77.根据权利要求73-76中任一项所述的抗体，其中所述抗体抑制SMO活性。
CN201680019259.8A 2015-02-04 2016-02-04 突变型Smoothened及其使用方法 Pending CN107636170A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562112074P 2015-02-04 2015-02-04
US62/112,074 2015-02-04
PCT/US2016/016614 WO2016126972A1 (en) 2015-02-04 2016-02-04 Mutant smoothened and methods of using the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107636170A true CN107636170A (zh) 2018-01-26

Family

ID=56264028

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680019259.8A Pending CN107636170A (zh) 2015-02-04 2016-02-04 突变型Smoothened及其使用方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US10330683B2 (zh)
EP (1) EP3253784B1 (zh)
JP (1) JP2018512597A (zh)
CN (1) CN107636170A (zh)
AU (1) AU2016215227A1 (zh)
CA (1) CA2975875A1 (zh)
HK (1) HK1244512A1 (zh)
WO (1) WO2016126972A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108645830A (zh) * 2018-05-15 2018-10-12 华中科技大学鄂州工业技术研究院 一种纳米荧光探针联合蛋白芯片寻找药物作用靶点的方法
CN109887553A (zh) * 2019-01-29 2019-06-14 杭州纽安津生物科技有限公司 针对肿瘤靶向药物耐药位点的多肽疫苗及其设计方法
CN111658628A (zh) * 2019-03-08 2020-09-15 中国科学院动物研究所 Gli2抑制剂的用途以及抑制gli2的化合物的筛选方法
CN112285037A (zh) * 2019-01-09 2021-01-29 北京九强生物技术股份有限公司 6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途
CN114464246A (zh) * 2022-01-19 2022-05-10 华中科技大学同济医学院附属协和医院 基于CovMutt框架检测与遗传性增加相关的突变的方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020165370A1 (en) * 2019-02-13 2020-08-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for selecting a cancer treatment in a subject suffering from cancer
CN114910643B (zh) * 2021-02-10 2023-08-11 广东菲鹏生物有限公司 一种鉴别结合突变型抗原的抗体的方法及试剂

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011028950A1 (en) * 2009-09-02 2011-03-10 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
CN102112612A (zh) * 2008-05-30 2011-06-29 健泰科生物技术公司 变体Hhip1蛋白及其方法和用途
WO2012047968A2 (en) * 2010-10-05 2012-04-12 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
WO2014107655A1 (en) * 2013-01-07 2014-07-10 St. Jude Children's Research Hospital Use of small molecule unfolder protein response modulators to treat tumors with active sonic hedgehog (ssh) signaling due to smoothened (smo) mutation

Family Cites Families (173)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US576785A (en) 1897-02-09 Cover for books
US2006118A (en) 1934-06-25 1935-06-25 Smith Corinne Sterrett Cover for chickens
US3720760A (en) 1968-09-06 1973-03-13 Pharmacia Ab Method for determining the presence of reagin-immunoglobulins(reagin-ig)directed against certain allergens,in aqueous samples
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4970198A (en) 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5079233A (en) 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5004697A (en) 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5283187A (en) 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
AU632065B2 (en) 1988-09-23 1992-12-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5009772A (en) 1989-02-27 1991-04-23 Kerr-Mcgee Corporation Solvent extraction process
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
WO1990013641A1 (en) 1989-05-10 1990-11-15 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Stably transformed eucaryotic cells comprising a foreign transcribable dna under the control of a pol iii promoter
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
EP0479909B1 (en) 1989-06-29 1996-10-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
WO1991004753A1 (en) 1989-10-02 1991-04-18 Cetus Corporation Conjugates of antisense oligonucleotides and therapeutic uses thereof
ATE139255T1 (de) 1989-10-24 1996-06-15 Gilead Sciences Inc Oligonukleotidanaloga mit neuartigen bindungen
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JP3068180B2 (ja) 1990-01-12 2000-07-24 アブジェニックス インコーポレイテッド 異種抗体の生成
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5268164A (en) 1990-04-23 1993-12-07 Alkermes, Inc. Increasing blood-brain barrier permeability with permeabilizer peptides
US5112596A (en) 1990-04-23 1992-05-12 Alkermes, Inc. Method for increasing blood-brain barrier permeability by administering a bradykinin agonist of blood-brain barrier permeability
CA2086417C (en) 1990-06-29 1999-07-06 Biosource Technologies, Inc. Melanin production by transformed organisms
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DE69222303T2 (de) 1991-04-30 1998-01-22 Eukarion Inc Kationisierte antikörper gegen intrazelluläre eiweisse
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
EP0604580A1 (en) 1991-09-19 1994-07-06 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab') 2? ANTIBODIES
DE69229477T2 (de) 1991-09-23 1999-12-09 Cambridge Antibody Tech Methoden zur Herstellung humanisierter Antikörper
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
DE69333807T2 (de) 1992-02-06 2006-02-02 Chiron Corp., Emeryville Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
DE69334095T2 (de) 1992-07-17 2007-04-12 Dana-Farber Cancer Institute, Boston Verfahren zur intrazellulären Bindung von zielgerichteten Molekülen
WO1994002178A1 (en) 1992-07-27 1994-02-03 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Targeting of liposomes to the blood-brain barrier
CA2140280A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Avi J. Ashkenazi Bispecific immunoadhesins
WO1994011026A2 (en) 1992-11-13 1994-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5910486A (en) 1994-09-06 1999-06-08 Uab Research Foundation Methods for modulating protein function in cells using, intracellular antibody homologues
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
CA2761116A1 (en) 1995-04-27 1996-10-31 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
WO1997033551A2 (en) 1996-03-15 1997-09-18 Millennium Pharmaceuticals Compositions and methods for the diagnosis, prevention, and treatment of neoplastic cell growth and proliferation
EP0921855B1 (en) 1996-08-30 2003-11-19 Upfront Chromatography A/S Isolation of immunoglobulins
US6136958A (en) * 1996-09-30 2000-10-24 Genentech, Inc. Antibodies to vertebrate smoothened proteins
KR20080059467A (ko) 1996-12-03 2008-06-27 아브게닉스, 인크. 복수의 ｖｈ 및 ｖｋ 부위를 함유하는 사람 면역글로불린유전자좌를 갖는 형질전환된 포유류 및 이로부터 생성된항체
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US20080318254A9 (en) 1997-03-10 2008-12-25 The Regents Of The University Of California PSCA antibodies and hybridomas producing them
US20020173629A1 (en) 1997-05-05 2002-11-21 Aya Jakobovits Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
DE69830315T2 (de) 1997-06-24 2006-02-02 Genentech Inc., San Francisco Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
CA2303299C (en) 1997-09-12 2016-02-23 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
EP1028751B1 (en) 1997-10-31 2008-12-31 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
DK1034298T3 (da) 1997-12-05 2012-01-30 Scripps Research Inst Humanisering af murint antistof
IL138608A0 (en) 1998-04-02 2001-10-31 Genentech Inc Antibody variants and fragments thereof
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ES2340112T3 (es) 1998-04-20 2010-05-28 Glycart Biotechnology Ag Ingenieria de glicosilacion de anticuerpos para la mejora de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
WO2000042072A2 (en) 1999-01-15 2000-07-20 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
DK1167537T3 (da) 1999-03-30 2008-11-10 Japan Tobacco Inc Fremgangsmåde til fremstilling af et monoklonalt antistof
EP1176195B1 (en) 1999-04-09 2013-05-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
KR100797667B1 (ko) 1999-10-04 2008-01-23 메디카고 인코포레이티드 외래 유전자의 전사를 조절하는 방법
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
JP4668498B2 (ja) 1999-10-19 2011-04-13 協和発酵キリン株式会社 ポリペプチドの製造方法
US6514221B2 (en) 2000-07-27 2003-02-04 Brigham And Women's Hospital, Inc. Blood-brain barrier opening
AU2001286930A1 (en) 2000-08-30 2002-03-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Glucocorticoid blocking agents for increasing blood-brain barrier permeability
PL218428B1 (pl) 2000-10-06 2014-12-31 Kyowa Hakko Kogyo Kk Komórka, sposoby wytwarzania przeciwciał, leki zawierające przeciwciała, komórka CHO i przeciwciało klasy IgG
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7034036B2 (en) 2000-10-30 2006-04-25 Pain Therapeutics, Inc. Inhibitors of ABC drug transporters at the blood-brain barrier
US20030083299A1 (en) 2000-11-04 2003-05-01 Ferguson Ian A. Non-invasive delivery of polypeptides through the blood-brain barrier
US20030104402A1 (en) 2001-01-23 2003-06-05 University Of Rochester Methods of producing or identifying intrabodies in eukaryotic cells
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
DE10121982B4 (de) 2001-05-05 2008-01-24 Lts Lohmann Therapie-Systeme Ag Nanopartikel aus Protein mit gekoppeltem Apolipoprotein E zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke und Verfahren zu ihrer Herstellung
WO2002092017A2 (en) 2001-05-16 2002-11-21 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Human antipneumococcal antibodies from non-human animals
WO2003009815A2 (en) 2001-07-25 2003-02-06 Biomarin Pharmaceutical Inc. Compositions and methods for modulating blood-brain barrier transport
EP2180044A1 (en) 2001-08-03 2010-04-28 GlycArt Biotechnology AG Antibody glycosylation variants having increased anti-body-dependent cellular cytotoxicity
US7153507B2 (en) 2001-08-23 2006-12-26 Genmab A/S Human antibodies specific for interleukin 15 (IL-15)
WO2003035835A2 (en) 2001-10-25 2003-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US20030162695A1 (en) 2002-02-27 2003-08-28 Schatzberg Alan F. Glucocorticoid blocking agents for increasing blood-brain barrier permeability
WO2003077945A1 (en) 2002-03-14 2003-09-25 Medical Research Council Intracellular antibodies
PL373256A1 (en) 2002-04-09 2005-08-22 Kyowa Hakko Kogyo Co, Ltd. Cells with modified genome
US20050031613A1 (en) 2002-04-09 2005-02-10 Kazuyasu Nakamura Therapeutic agent for patients having human FcgammaRIIIa
ES2362419T3 (es) 2002-04-09 2011-07-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Células con depresión o deleción de la actividad de la proteína que participa en el transporte de gdp-fucosa.
WO2003084569A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition anticorps
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
US20040259150A1 (en) 2002-04-09 2004-12-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to Fcgamma receptor IIIa
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
CA2507762C (en) 2002-12-03 2013-02-05 Blanchette Rockefeller Neurosciences Institute Artificial low-density lipoprotein carriers for transport of substances across the blood-brain barrier
AR042485A1 (es) 2002-12-16 2005-06-22 Genentech Inc Anticuerpo humanizado que se une al cd20 humano
US20060258841A1 (en) 2003-01-17 2006-11-16 Josef Michl Pancreatic cancer associated antigen, antibody thereto, and diagnostic and treatment methods
US7456264B2 (en) 2003-05-21 2008-11-25 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies against Bacillus anthracis protective antigen
EP1663239A4 (en) 2003-09-10 2008-07-23 Cedars Sinai Medical Center KALIUM CHANNEL-MEDIATED FEEDING OF MEDICINES BY THE BLOOD BRAIN BARRIER
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
AU2004280065A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using RNA inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
EA036531B1 (ru) 2003-11-05 2020-11-19 Роше Гликарт Аг Гуманизированное антитело типа ii к cd20 (варианты), фармацевтическая композиция, содержащая эти варианты антитела, и их применение
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
ZA200701783B (en) 2004-09-02 2009-10-28 Genentech Inc Anti-Fc-gamma RIIB receptor antibody and uses therefor
US8101610B2 (en) 2005-11-14 2012-01-24 Genentech, Inc. Bisamide inhibitors of hedgehog signaling

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102112612A (zh) * 2008-05-30 2011-06-29 健泰科生物技术公司 变体Hhip1蛋白及其方法和用途
WO2011028950A1 (en) * 2009-09-02 2011-03-10 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
WO2012047968A2 (en) * 2010-10-05 2012-04-12 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
WO2014107655A1 (en) * 2013-01-07 2014-07-10 St. Jude Children's Research Hospital Use of small molecule unfolder protein response modulators to treat tumors with active sonic hedgehog (ssh) signaling due to smoothened (smo) mutation

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GERRIT J. P. DIJKGRAAF等: ""Small Molecule Inhibition of GDC-0449 Refractory Smoothened Mutants and Downstream Mechanisms of Drug Resistance"，第435–444页", 《2011 AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH》 *
JAMES KIM等: ""ltraconazole and Arsenic Trioxide Inhibit Hedgehog Pathway Activation and Tumor Growth Associated with Acquired Resistance to Smoothened Antagonists"，第23-34页", 《CANCER CELL》 *
MARTÍN E. FERNÁNDEZ-ZAPICO: "Primers on Molecular Pathways GLI: More than Just Hedgehog?", 《PANCREATOLOGY》 *
SABRINA PRICL等: ""Smoothened (SMO) receptor mutations dictate resistance to vismodegib in basal cell carcinoma"，第389-397页", 《MOLECULAR ONCOLOGY》 *
STONE D.等: "Q99835", 《EMBL-EBI》 *
T JINTA BRINKHUIZEN等: ""Acquired resistance to the Hedgehog pathway inhibitor vismodegib due to smoothened mutations in treatment of locally advanced basal cell carcinoma"，第1005-1008页", 《JOURNAL OF THE AMERICAN ACADEMY OF DERMATOLOGY》 *
XI-DE WANG等: ""Mutations in the Hedgehog Pathway Genes SMO and PTCH1 in Human Gastric Tumors"，e54415", 《PLOS ONE》 *
YUJIE TANG等: "Epigenetic targeting of Hedgehog pathway transcriptional output through BET bromodomain inhibition", 《NATURE MEDICINE》 *
YUJUN ZHAO等: "The Making of I‑BET762, a BET Bromodomain Inhibitor Now in Clinical Development", 《JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY》 *
潘登，李艳: "Hedgehog- Gli信号通路与肿瘤", 《现代肿瘤医学》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108645830A (zh) * 2018-05-15 2018-10-12 华中科技大学鄂州工业技术研究院 一种纳米荧光探针联合蛋白芯片寻找药物作用靶点的方法
CN112285037A (zh) * 2019-01-09 2021-01-29 北京九强生物技术股份有限公司 6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途
CN109887553A (zh) * 2019-01-29 2019-06-14 杭州纽安津生物科技有限公司 针对肿瘤靶向药物耐药位点的多肽疫苗及其设计方法
CN111658628A (zh) * 2019-03-08 2020-09-15 中国科学院动物研究所 Gli2抑制剂的用途以及抑制gli2的化合物的筛选方法
CN114464246A (zh) * 2022-01-19 2022-05-10 华中科技大学同济医学院附属协和医院 基于CovMutt框架检测与遗传性增加相关的突变的方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3253784A1 (en) 2017-12-13
US10330683B2 (en) 2019-06-25
HK1244512A1 (zh) 2018-08-10
AU2016215227A1 (en) 2017-09-21
WO2016126972A8 (en) 2018-01-11
CA2975875A1 (en) 2016-08-11
WO2016126972A1 (en) 2016-08-11
JP2018512597A (ja) 2018-05-17
US20180045729A1 (en) 2018-02-15
EP3253784B1 (en) 2020-05-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107636170A (zh) 突变型Smoothened及其使用方法
US9096686B2 (en) E518A/K mutant smoothened and methods of using the same
US9910050B2 (en) Mutant smoothened and methods of using the same
JP6736467B2 (ja) 平滑化変異体及びその使用方法
US20190083646A1 (en) Mutant smoothened and methods of using the same
AU2015252098B2 (en) Mutant smoothened and methods of using the same

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1244512

Country of ref document: HK

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180126