KR20040047796A - 인터루킨 15 (ｉｌ-15)에 대하여 특이적인 인간 항체 - Google Patents

인터루킨 15 (ｉｌ-15)에 대하여 특이적인 인간 항체 Download PDF

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Abstract

IL-15 (예. 인간 IL-15)에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클론성 항체 및 관련 항체-기재 조성물 및 분자가 개시되었다. 인간 항체는, V-D-J 재조합 및 이소타입 스위칭에 의해 인간 모노클론성 항체의 복수 이소타입을 생성할 수 있는 비인간 트랜스제닉 동물 (예. 트랜스제닉 마우스) 중에서 또는 트랜스펙토마 중에서 생성될 수 있다. 인간 항체를 포함하는 제약 조성물, 비인간 트랜스제닉 동물, 및 인간 항체를 생성하는 하이브리도마, 및 인간 항체를 사용하는 치료 및 진단 방법이 또한 개시되었다.

Description

인터루킨 15 (ＩＬ-15)에 대하여 특이적인 인간 항체{HUMAN ANTIBODIES SPECIFIC FOR INTERLEUKIN 15 (IL-15)}
인터루킨-15 (IL-15)는 14-15 kD의 당단백인 전염증성 사이토카인이다. 단핵구 및 대식세포, 섬유아세포, 각질세포 및 수지상 세포를 비롯한 다양한 세포 및 조직에서 구조적 발현이 보고되었다 (문헌[Waldmann and Tagaya, 1999; Fehniger and Caligiuri, 2001]). 발현은 IFN-γ 및 LPS로 자극된 단핵구에 대하여 보고된 바와 같이 염증 상태하에서, 또는 바이러스, 세균 또는 원생생물 감염에 의해서 상승조절된다 (문헌[Kirman et al., 1998; Waldmann et al., 1998; Waldmann and Tagaya, 1999; Fehniger and Caligiuri, 2001]). 나아가, 류마티스성 관절염과 같은 만성 염증성 질환에서, 국소 생산된 IL-15는 활막 T-세포의 점증 및 활성화에 의한 염증을 증폭시킬 수 있다. 상기 IL-15 유도 효과는 질환 병태발생에서 중요한 역할을 하는 것으로 제시되었다 (문헌[Kirman et al., McInnes et al., 1996; McInnes et al., 1997; McInnes and Liew, 1998; Fehniger and Caligiuri, 2001]).
시험관내(in vitro) 연구는 공유 수용체 구성요소로 인하여 IL-15가 IL-2와 여러 생물학적 활성을 공유함을 보여준다. T-세포 상에 존재하는 IL-15 수용체는 독특한 α-사슬인 IL-15Rα로 이루어지나, IL-2R과 β-사슬 및 γ-사슬을 공유한다. 그 결과, 상기 두 수용체는 동일한 Jak/STAT-신호전달 요소를 이용한다. 그러나, IL-2 및 IL-15 및 이들의 수용체의 복잡한 조절 및 차등적 발현에 기초하여, 생체내(in vivo) 기능에서 중요한 차이가 보고되었다 (문헌[Kirman et al., 1998; Waldmann and Tagaya, 1999; Waldmann et al., 2001]). 또한, 자연 살해(natural killer; NK) 세포, NK-T 세포 및 상피내 림프구 발생, 생존, 증대 및 기능에서 IL-15에 대하여 비중복적 역할을 주목하는 것이 중요하다 (문헌[Kennedy et al., 2000; Liu et al., 2000]).
맥이네스(McInnes) 및 동료들은 류마티스성 관절염 환자로부터 유래한 T-세포에서 IL-15 자극 후 TNF-α 생산 유도를 보고하였다 (문헌[McInnes et al., 1997; McInnes and Liew, 1998]). 나아가, IL-15에 의해 활성화된 말초 혈액 T 세포는 세포-접촉-의존적 기전을 통하여 대식세포에 의한 상당한 TNF-α 생산을 유도하는 것으로 나타났다. 류마티스성 관절염에서의 TNF-α의 파괴적 역할로 인하여, 상기 사이토카인의 억제는 질환 활성을 감소시킨다 (문헌[Bethon et al., 2000; Klippel, 2000; Lovell et al., 2000; Maini and Taylor, 2000]).
발명의 요약
본 발명은 인간 IL-15에 특이적으로 결합하고, IL-15에 의해 유도되는 전염증성 효과를 억제하는 완전 인간 모노클로날 항체를 최초로 생성 및 단리하고, 상기 신규 항체를 동정하였으며, 이들의 다양한 IL-15 매개 질환의 치료에서의 치료적 가치를 증명한 것에 기초한다. 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같이, 인간 항체는 염증성 장애에 통합적으로 관여하는 TNFα 생산 및 T 세포 증식 모두를 억제하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 인간 항체는 이들의 독특한 특이성 (예: 에피토프 및 종 특이성), 친화도, 구조, 기능적 활성, 및 종래 생성된 다른 IL-15 항체 (예: 쥐 및 인간화 항체) 보다 인간 환자에 투여되는 경우 훨씬 덜 항원성이고 더욱 치료적으로 효과적이고 유용하게하는 완전한 인간(항체)라는 사실로부터 부분적으로 기인할 수 있는, 상기 장애 (및 임의의 다른 IL-15 매개 장애)를 치료 및 예방하는 개선된 수단을 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기술된 인간 항체와 같은 IL-15 억제 항체에 대한, 염증성 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염, 건선, 이식편 거부반응 및 암의 치료를 비롯한 신규 치료적 적용의 발견에 기초한다.
본 발명의 단리된 인간 항체는 다양한 항체 이소타입, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD 및 IgE를 포함한다. 통상적으로, 이들은 IgG1 (예: IgG1k), IgG3 및IgM 이소타입을 포함한다. 항체는 전장(full-length)일 수 있거나(예: IgG1 또는 IgG3 항체), 또는 항원 결합 부분 (예: Fab, F(ab')2, Fv, 단쇄 Fv 단편, 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 2 이상의 단리된 CDR의 조합)만을 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 인간 항체는 재조합 항체이다. 특정 실시태양에서, 인간 항체는 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 3에 나타낸 바와 같은 가변 영역 중에 뉴클레오티드 서열 및 이의 보존적 서열 변형을 포함하는 인간 IgG 중쇄 및 인간 카파 경쇄 핵산에 의해 코딩된다. 다른 실시태양에서, 인간 항체는 각각 서열 번호 2 및 서열 번호 4에 나타낸 아미노산 서열 및 이의 보존적 서열 변형을 포함하는 IgG중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 인간 항체는 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스펙토마(transfectoma) (예: 불멸화된 CHO 세포 또는 림프구 세포로 이루어진 트랜스펙토마)와 같은 숙주 세포 중에서 재조합적으로 제조되거나, 또는 항체를 발현하는 하이브리도마(예를 들어, 불멸화된 세포에 융합된, 항체를 코딩하는 인간 중쇄 트랜스유전자(transgene) 및 인간 경쇄 트랜스유전자를 포함하는 게놈을 갖는, 트랜스제닉 마우스와 같은 트랜스제닉 비인간 동물로부터 얻은 B 세포를 포함한다)로부터 직접 얻을 수 있다. 특정 실시태양에서, 항체는 본원에서 146B7으로 지칭하는 하이브리도마에 의해서, 또는 각각 서열 번호 1 및 3에 나타낸 바와 같은 가변 영역 중에 뉴클레오티드 서열 및 이의 보존적 변형을 포함하는 인간 중쇄 및 인간 경쇄 핵산을 포함하는 숙주 세포 (예: CHO 세포) 트랜스펙토마에 의해 생산된다. 특정 실시태양에서, 항체는 본원에서 146B7, 146H5, 404E4 및 404A8로 지칭하는 하이브리도마에 의해서 생산된다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 IL-15의 β- 및(또는) γ-사슬 상호작용 도메인 상에 위치하는 에피토프에 특이적으로 결합한다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 인간 IL-15에 특이적으로 결합하고, IL-15의 전염증성 효과를 유도하는 능력을 억제, 예를 들어 IL-15 수용체에 대한 IL-15의 결합에 따른 TNFα의 생산을 억제하고(하거나) PBMC 또는 CTLL-2 T 세포와 같은 T-세포의 증식을 억제한다. 통상적으로 인간 항체는 분석물로서 재조합 인간 IL-15 및 리간드로서 항체를 사용한 BIACORE 3000 장치에서 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술에 의해 측정하였을 때 약 10-7M 미만, 예를 들어 약 10-8M, 10-9M 또는 10-10M 미만 또는 그 미만의 해리 평형 상수 (KD)로 IL-15에 결합한다. 특정 실시태양에서, 항체는 약 6.5 x 10-8M의 해리 평형 상수 (KD)로 인간 IL-15에 결합한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항체 결합 부분을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 따라서, 본 발명의 항체 코딩 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 벡터로 형질감염된 숙주 세포 또한 본 발명에 포함되고, 상기 숙주 세포를 배양하여 본 발명의 항체를 제조하는 방법이 포함된다.
본 발명은 또한 각각 서열 번호 2 및 서열 번호 4에 나타낸 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 상기 발현 벡터는 당업계에 공지되어 있다. 이의 예로는 예를 들어, 세망세포 용해물을 사용한 시험관내 전사/번역 벡터를 들 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 IL-15에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체의 다양한 이소타입 (예: IgG, IgA 및(또는) IgM)을 발현가능한 트랜스제닉 비인간 동물 (예: 트랜스제닉 마우스)로부터 단리된 B-세포를 제공한다. 바람직하게는, 단리된 B 세포는 IL-15 항원이 정제 또는 보강된 제제 및(또는) IL-15를 발현하는 세포로 면역화된 트랜스제닉 비인간 동물 (예: 트랜스제닉 마우스)로부터 얻는다. 바람직하게는, 트랜스제닉 비인간 동물 (예: 트랜스제닉 마우스)는 인간 중쇄 트랜스유전자 및 인간 경쇄 트랜스유전자를 포함하는 게놈을 갖는다. 이어서, 단리된 B-세포는 불멸화되어서 IL-15에 대한 인간 모노클로날 항체의 원천 (예; 하이브리도마)를 제공한다.
따라서, 본 발명은 또한 IL-15에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 생산가능한 하이브리도마를 제공한다. 일 실시태양에서, 하이브리도마는 불멸화된 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스유전자 및 인간 경쇄 트랜스유전자를 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비인간 동물 (예: 트랜스제닉 마우스)로부터 얻는다. 트랜스제닉 비인간 동물은 IL-15이 정제 또는 보강된 제제 및(또는) IL-15를 발현하는 세포로 면역화되어 항체 생산 하이브리도마를 생성할 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 특정 하이브리도마는 146B7, 146H5, 404E4 및 404A8을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 IL-15에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현하는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스를 제공한다. 특정 실시태양에서, 트랜스제닉 비인간 동물은 인간 중쇄 트랜스유전자 및 인간 경쇄 트랜스유전자를 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 마우스이다. 트랜스제닉 비인간 동물은 IL-15 항원이 정제 또는 보강된 제제 및(또는) IL-15를 발현하는 세포로 면역화될 수 있다. 바람직하게는, 트랜스제닉 비인간 동물 (예: 트랜스제닉 마우스)은 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환(isotype switching)의 수행에 의하여 IL-15에 대한 복수 이소타입의 인간 모노클로날 항체 (예: IgG, IgA 및(또는) IgM)을 생산가능하다. 이소타입 전환은 예를 들어 전형적 및 비전형적 이소타입 전환에 의해 일어날 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 IL-15와 특이적으로 반응하는 인간 모노클로날 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 일 실시태양에서, 상기 방법은 인간 중쇄 트랜스유전자 및 인간 경쇄 트랜스유전자를 갖는 트랜스제닉 비인간 동물 (예: 트랜스제닉 마우스)를 IL-15 항원이 정제 또는 보강된 제제 및(또는) IL-15를 발현하는 세포로 면역화하는 것을 포함한다. 이어서, 동물의 B 세포 (예: 비장 B 세포)를 얻고 골수종 세포와 융합하여 IL-15에 대한 인간 모노클로날 항체를 분비하는 불멸 하이브리도마 세포를 형성한다.
다른 측면에서, 본 발명은 치료부, 예를 들어 세포독성 약물, 효소적으로 활성인 독소 또는 이의 단편, 방사성동위원소 또는 소분자 항암 약물에 컨쥬게이션된 인간 항 IL-15 항체를 특징으로 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 IL-15에 특이적으로 결합하는 본 발명의 1 이상의 인간 모노클로날 항체 및 제약적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 제약 및 진단용 조성물 등의 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 추가로 다른 치료제, 예를 들어 다른 면역억제제제 또는 화학요법제를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 1 이상의 본 발명의 인간 항체를 사용하여, 바람직하게는 구조적으로 관련된 단백질/사이토카인 (예: IL-2)의 활성 (예: TNFα 생산 및(또는) T 세포 증식)을 억제함이 없이, IL-5 유도 TNFα 생산 및(또는) T 세포 증식을 억제하는 것과 같은 IL-15의 전염증성 효과를 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 인간 항체를 사용하여 다양한 IL-15 매개 질환에 걸린 환자에게 항체를 투여하는 것에 의해 상기 질환을 치료 및(또는) 예방할 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 치료 (예: 개선) 또는 예방될 수 있는 질환의 예는 염증성 장애, 예를 들어 관절염 (예: 건선성 관절염 및 활동성 류마티스성 관절염 및 연소성 류마티스성 관절염을 비롯한 류마티스성 관절염), 염증성 대장 질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 항체는 이상각화증을 감소시키고, 상피 두께를 감소시키며, 건선에서 각질세포의 증식을 감소시키는 것으로 나타났다. 항체는 또한 염증을 감소시키고(시키거나) 류마티스성 관절염에 연관된 활성화된 백혈구의 화학주성을 예방하는 것으로 나타났다. 항체는 또한 감염성 질환, 예를 들어 HIV 감염을 치료하기 위하여 사용될 수 잇다. 나아가, 항체는 이식편 거부반응을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 또한, 항체는 IL-15 매개 신생혈관형성을 수반하는 다양한 질환, 예를 들어 종양 성장 및 암 (예: T-세포 백혈병)을 치료하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 인간 항체는 또한 1 이상의 추가 치료제, 예를 들어 항염증제, DMARDs (disease-modifying anti-rheumatic drug; 질환 조절 항류마티스성 약물), 면역억제제, 화학요법제 및 건선제제와 병용될 수 있다.
일 실시태양에서, 대상은 추가로 항체의 전염성성 효과의 억제를 강화하는 1 이상의 제제, 예를 들어 스테로이드성 약물 또는 NSAID (nonsteroidal anti-inflammatory drug; 비스테로이드성 항염증제)와 같은 항염증제로 치료될 수 있다. 바람직한 제제는 예를 들어, 아스피린 및 다른 살리실레이트, Cox-2 억제제, 예를들어 로페콕시브 (바이옥스(Vioxx)) 및 셀레콕시브 (세레브렉스(Celebrex)), NSAID, 예를 들어 이부프로펜 (모트린(Motrin), 아드빌(Advil)), 페노프로펜 (날폰(Nalfon)), 나프록센 (나프로신(Naprosyn)), 설린닥 (클리노릴(Clinoril)), 디클로페낙 (볼타렌(Voltaren)), 피록시캄 (펠덴(Feldene)), 케토프로펜 (오루디스(Orudis)), 디프루니살 (도로비드(Dolobid)), 나부메톤 (렐라펜(Relafen)), 에토로락 (로딘(Lodine)), 옥사프로진 (다이프로(Daypro)), 및 인도메타신 (인도신(Indocin))을 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 1 이상의 DMARDs, 예를 들어 메톡트렉세이트 (류마트렉스(Rheumatrex)), 히드록시클로로퀸 (플라퀘닐(Plaquenil)), 설파살라진 (아설피딘(Asulfidine)), 피리미딘 합성 억제제, 예를 들어 레플루노미드 (아라바(Araba)), IL-1 수용체 차단제, 예를 들어 아나킨라 (키네레트(Kineret)) 및 TNF-α 차단제, 예를 들어 에타네르셉트 (엔브렐(Enbrel)), 인플릭시마브 (레미카드(Remicade)) 및 아다리무마브와 병용되어 투여될 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 1 이상의 면역억제제, 예를 들어 시클로스포린 (산디문(Sandimmune), 네오랄(Neoral)) 및 아자티오프린 (이무랄(Imural))과 병용되어 투여될 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 1 이상의 화학요법제, 예를 들어 독소루비신 (아드리아마이신(Adriamycin)), 시스플라틴 (플라티놀(Platinol)), 블레오마이신 (블레녹산(Blenoxane)), 카르무스틴 (글리아델(Gliadel)), 시클로포스파미드 (시톡산(Cytoxan), 프로시톡스(Procytox), 네오사르(Neosar)) 및 클로람부실 (류케란(Leukeran))과 병용되어 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 인간 항체는 또한 방사선 요법과 함께 투여될 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 1 이상의 건선치료제, 예를 들어 콜타르, 비타민 A, 코르티손 또는 다른 코르티코스테로이드를 포함하는 국소 약제, 코르티코스테로이드, 메톡트렉세이트, 레티노이드, 예를 들어 아시크레틴 (네오기타손(Neogitason)) 또는 시클로스포린 (산디문(Sandimmune), 네오랄(Neoral))과 같은 경구 또는 주사 약제와 병용되어 투여될 수 있다. 다른 치료법은 태양광에의 노출 또는 광선요법을 포함할 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 다른 항체, 예를 들어 CD4 특이적 항체 및 IL-2 특이적 항체와 병용되어 투여될 수 있다. 본 발명의 인간 항체의 CD4 특이적 항체 또는 IL-2 특이적 항체와의 병용은 자가면역 질환 또는 이식편 거부반응의 치료에 특히 유용한 것으로 여겨진다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 샘플 중 IL-15 항원의 존재를 시험관내 또는 생체내에서 검출하여 예를 들어, IL-15 매개 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 일 실시태양에서, 이는 시험 샘플을 대조 샘플과 함께 본 발명의 인간 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분과 항체 및 IL-15 간의 복합체 형성을 가능하게 하는 조건하에서 접촉시키는 것에 의해 달성된다. 복합체 형성은 양 샘플 중에서 검출되고 (예를 들어, ELISA를 사용함), 샘플 간의 복합체 형성에서 임의의 통계적으로 유의한 차이는 시험 샘플 중 IL-15 항원의 존재를 나타내는 것이다.
본 발명의 다른 특징 및 잇점은 하기 상세한 설명 및 청구의 범위로부터 명백해질 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 인간 IL-15 특이적 항체인 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 인간 IL-15 (hIL-15) 및 돌연변이 IL-15 단백질인 Q109S 및 D8SQ108S에의 결합을 나타내는 그래프를 포함한다. 연속 희석 항체를 ELISA에서 hIL-15 또는 돌연변이 IL-15 단백질 D8SQ108S 및 Q108S에의 결합에 대해 검사하였다.
도 2 및 3은 항체 146B7의 각각 VH및 VL-영역의 아미노산 (서열 번호 2 및 4) 및 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1 및 3)을 나타낸다. 프레임워크 (framework; FR) 및 상보성 결정 영역 (complementarity determining region; CDR)을 표시하였다.
도 4A-D는 항체 146B7에 의한 IL-15 매개 TNF-α 방출의 억제를 나타내는 그래프를 포함한다. 인간 PBMC를 72 시간 동안 146B7 항체 또는 이소타입 대조 항체 (0.1, 1, 10 ㎍/㎖)와 함께 hIL-15 (0, 50, 100 ng/㎖)과 인큐베이션하였다. 생산된 TNF-α의 양을 ELISA로 측정하였다. 2 명의 건강한 자원자로부터 얻은 데이타를 나타내었다
도 5는 IL-2 또는 IL-15 매개 TNF-α 생산에 대한 항체 146B7의 효과를 나타낸다. 인간 PBMC를 72 시간 동안 146B7 (0.1, 1, 10 ㎍/㎖)과 함께 hIL-15 (0,50, 100 ng/㎖) 또는 hIL-2 (100 ng/㎖)과 인큐베이션하였다. 생산된 TNF-α의 양을 ELISA로 측정하였다.
도 6은 hIL-15 유도 CTLL-2 증식에 대한 항체 146B7, 146H5, 404E4 및 404A8의 억제 활성을 나타내는 그래프이다. hIL-2 결핍 CTLL-2 세포를 48 시간 동안 연속 희석시킨 146B7, 146H5, 404E4 및 404A8과 함께 hIL-15 (60 pg/㎖)과 인큐베이션하였다. [3H]-티미딘 혼입을 측정하여 증식을 표현하였다 (cpm). 결과를 평균 값으로 나타내었다.
도 7-9는 IL-15 유도 PBMC 증식에 대한 항체 146B7 (도 7), 404E4 (도 8) 및 404A8 (도 9)의 억제 활성을 나타내는 그래프를 포함한다. 인간 PBMC를 72 시간 동안 0.1, 1, 10 ㎍/㎖의 147B7 (도 7), 404E4 (도 8) 또는 404A8 (도 9)와 함께 hIL-15 (0, 25, 100 ng/㎖; 각각 도 7A, 8A 및 9A) 또는 hIL-2 (0, 10, 100 ng/㎖; 각각 도 7B, 8B 및 9B)와 인큐베이션하였다. [3H]-티미딘 혼입을 측정하여 증식을 표현하였다 (cpm).
도 10은 IFNγ-자극된 단핵구에의 항체 146B7의 결합을 나타내는 그래프이다. 인간 PBMC를 2 일 이하 동안 37℃에서 IFNγ (500 U/㎖)의 존재하에서 배양하였다. 흐름 세포계수에 의한 분석 및 단핵구에 대한 통과 후 샘플 당 5000 세포 이상의 형광 강도를 측정하였다. 데이타는 자극 인덱스(stimulation index; S.I.)를 나타낸다 [S.I. = (평균 형광 양성 염색)/(평균 형광 배경 염색)]
도 11은 항체 146B7 (패널 B) 또는 이소타입 대조 항체 (패널 A)와의 인간단핵구의 결합을 나타낸다. 인간 PBMC를 단리하고, 세포를 IFNγ (500U/㎖)과 배양한 후 사이토스피닝하였다. 세포를 헤마톡실린으로 교차염색하였다.
도 12는 146B7 (패널 B) 또는 이소타입 대조 항체 (hIgG1) (패널 A)와의 인간 건선 피부의 결합을 나타낸다. 인간 건선 플라크는 사전동의를 얻은 환자로부터 얻었으며, 분석시까지 -80℃에서 저장하였다. 조직을 비오티닐화된 항체로 염색하고, 호스 라디시 퍼옥시다제의 활성화 후 시각화하였다.
도 13A는 146B7 또는 비히클로 SCID 마우스를 처리한 후 류마티스성 관절염 조직 중 유핵 세포의 백분율을 나타내는 그래프이다. 조직을 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색하고, 포토샵 버전 6.0으로 분석하였다. 146B7 처리 (n=4) 또는 비히클 처리 (n=2) 후의 마우스의 핵의 s.e.m. (총 면적의 백분율) 및 평균으로 데이타를 나타내었다.도 13B는 146B7 (패널 B) 및 PBS (패널 A) 처리 후의, SCID 마우스에서의 이종이식된 RA 조직의 대표적인 H&E 염색을 나타낸다.
도 14는 SCID/건선 마우스에서의 항체 146B7 처리의 효과를 나타내는 그래프를 포함한다. 생검물을 파라핀 봉입용 포르말린 중에 고정하고, H&E 중에서 Ki-67 핵 항원에 대하여 염색하였다.도 14A는 각질층으로부터 레티 페그(rete peg)의 시작부까지 측정된 상피 두께에 의해 평가된 건선의 심각도를 나타낸다.도 14B는 각질층으로부터 레티 페그의 최심부까지 측정된 상피 두께를 나타낸다.도 14C는 이상각화증의 등급을 나타낸다.도 14D는 상부 진피에서의 염증성 단핵 세포의 수를 나타낸다.도 14E는 Ki-67+ 사이클링 각질세포의 수를 나타낸다.
도 15는 항체 146B7 (패널 C), CsA (패널 B) 또는 비히클 (패널 A)로 처리한후, SCID 마우스에서 이식된 인간 건선 피부의 H&E 염색을 나타낸다. 이식 3 주 후 마우스에 PBS (위약), CsA (시클로스포린 A) (Sandoz)를 10 mg/kg의 용량으로 15일 동안 2일마다 한번씩, 또는 146B7을 20 mg/kg의 용량으로 제1일에 및 10 mg/kg의 용량으로 제8일 및 제15일에 투여하였다. 최후 주사 1 주 후, 마우스를 희생시키고, 각 이식편으로부터 4 mm 펀치 생검물을 취하였다. 생검물을 파라핀 봉입용 포르말린 중에 고정하고, H&E 염색하였다.
도 16은 146B7 (패널 C), CsA (패널 B) 또는 비히클 (패널 A)로 처리한 후, SCID 마우스에서 이식된 인간 건선 피부의 Ki-67 염색을 나타낸다. 이식 3 주 후 마우스에 PBS (위약), CsA (시클로스포린 A) (Sandoz)를 10 mg/kg의 용량으로 15일 동안 2일마다 한번씩, 또는 146B7을 20 mg/kg의 용량으로 제1일에 및 10 mg/kg의 용량으로 제8일 및 제15일에 투여하였다. 최후 주사 1 주 후, 마우스를 희생시키고, 각 이식편으로부터 4 mm 펀치 생검물을 취하였다. 생검물을 파라핀 봉입용 포르말린 중에 고정하고, H&E 염색하였다.
도 17은 수용체-결합된 IL-15에 대한 항체 146B7의 결합을 나타내는 그래프이다 플레이트를 IL-15Rα로 코팅하고, IL-15로 인큐베이션하였다. 10 분 후, 비오티닐화된 146B7을 웰(well)에 첨가하였다. 수용체-결합된 Il-15에 대한 146B7의 결합을 ELISA-리더 중 405 nm에서 평가하였다.
도 18은 IL-15의 Raji 세포 상에 발현된 이의 수용체에 대한 결합 후,IL-15에 대한 항체 146B7의 결합을 나타내는 그래프이다. IL-15R-발현 Raji 세포를 IL-15와 인큐베이션한 후, 비오티닐화된 146B7을 10 분 후 상기 세포에 첨가하였다.146B7의 수용체-결합된 IL-15에 대한 결합을 FACS 분석에 의해 평가하였다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 IL-15에 의해 매개되는 다양한 장애 (즉, IL-15의 전염증성 효과에 의해 야기되는 장애)를 치료 및 진단하기 위한 신규 항체에 기재 치료제를 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "IL-15의 전염증성 효과"는 IL-15에 의해 유도되는 임의의 체액성 또는 세포-매개 면역 반응, 예를 들어 TNFα 및 다른 염증성 매개체의 생산 및 T-세포의 점증/증식을 포함한다. 본 발명의 치료법은 IL-15 상에 제시된 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체를 이용한다.
일 실시태양에서, 인간 항체는 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환을 수행하는 것에 의하여 IL-15에 대한 복수 이소타입의 인간 모노클로날 항체 (예: IgG, IgA 및(또는) IgE)를 생산가능한 비인간 트랜스제닉 동물 (예: 트랜스제닉 마우스)에서 생산된다. 따라서, 본 발명의 다양한 측면은 항체 및 이의 제약 조성물 뿐만 아니라 상기 모노클로날 항체를 제조하기 위한 비인간 트랜스제닉 동물, B-세포, 숙주 세포 트랙스펙토마 및 하이브리도마를 포함한다. 본 발명의 항체를 사용하여 IL-15가 결합하는 세포를 검출하고(하거나) 시험관내 또는 생체내에서 IL-15 매개 기능을 억제하는 방법이 또한 본 발명에 포함된다. IL-15가 결합하는 세포로 약제를 표적화하는 방법이 또한 포함된다.
본 발명을 더욱 용이하게 이해할 수 있도록 하기 위하여, 특정 용어들을 먼저 정의한다. 추가 정의는 상세한 설명에 걸쳐서 나타내었다.
용어 "IL-15", "IL-15 항원" 및 "인터루킨 15"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 세포에 의해 천연적으로 발현되는 임의의 변이체 또는 동종형태(isoform)을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "항체"는 항체 전체 및 이의 임의의 항원 결합 단편 (예: "항원 결합 부분") 또는 단일 사슬을 포함한다. "항체"는 이황화 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄 (H 사슬) 및 2 개의 경쇄 (L 사슬), 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 당단백을 지칭한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH라 약칭함) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 CL의 1개의 도메인을 포함한다. VH및 VL영역은 추가로 프레임워크 영역 (framework region; FR)로 지칭되는 보다 보존적인 영역 내에 산재된 상보성 결정 영역 (complementarity determining region; CDR)로 지칭되는 고도가변 영역으로 하위분류된다. 각 VH및 VL은 아미노 말단에서 카르복실 말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 정렬된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 다양한 세포의 면역계 (예: 효과기 세포) 및 전형적 보체계의 제1 보체 (Clq)를 비롯한 숙주 세포 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에서 사용된 항체의 "항원 결합 부분" (또는 간단하게는 "항체 부분")이라는 용어는 항원 (예: IL-15)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 1 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장(full-length) 항원의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지(hinge) 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2단편; (iii) VH및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔의 VL및 VH도메인으로 이루어지는 Fv 단편; (v) VH도메인으로 이루어지는 dAb 단편 (문헌[Ward e tal., (1989) Nature 341:544-546]); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 (vii) 합성 연결기에 의해 임의로 결합될 수 있는 2 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함한다. 나아가, FV단편의 2개의 도메인인 VL및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되더라도, 이들은 이들을 VL및 VH영역이 쌍을 이루어 1가 분자 (단일 사슬 Fv (scFV)로 공지된; 예를 들어, 문헌[Bird et al., (1988) Science 242: 423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조)를 형성하는 단일 단백질 사슬로 제조가능하게하는 합성 연결기에 의해 재조합법에 의해 결합될 수 있다. 상기 단쇄 항체가 또한 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자들에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 얻어지고,단편을 완전 항체와 동일한 방식으로 유용성을 스크리닝한다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 단일 결합 특이성 및 특정 에피토프에 대한 친화성을 나타내는 항체를 지칭한다. 따라서 "인간 모노클로날 항체"라는 용어는 단일 결합 특이성을 나타내고, 인간 생식세포계열(germline) 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 일 실시태양에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화된 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스유전자 및 경쇄 트랜스유전자를 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비인간 동물 (예: 트랜스제닉 마우스)로부터 얻은 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본원에서 사용된 "재조합 인간 항체"라는 용어는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 창작 또는 단리된 모든 인간 항체, 예를 들어 (a) 인간 면역글로불린 유전자에 대하여 트랜스제닉 또는 트랜스염색체성 동물 (예: 마우스)로부터 단리된 항체 또는 이로부터 제조된 하이브리도마 (하기 항목 I에서 추가로 기술됨), (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주세포 (예: 트랜스펙토마)로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합적 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 다른 DNA 서열에 대한 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱(splicing)을 포함하는 다른 수단에 의해 제조, 발현, 창작 또는 단리된 항체를 포함한다. 상기 재조합 인간 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변 및 불면 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시태양에서, 상기 재조합 인간 항체를 시험관내 돌연변이발생(또는, 인간 Ig 서열에 대하여 트랜스제닉 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이발생)시킬 수 있으며, 따라서, 재조합 항체의 VH및 VL영역의 아미노산 서열은 인간 생식세포계열 VH및 VL서열로부터 유래하고 이와 관련되었으나, 생체내 인간 항체 생식세포계열 레퍼토리 내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있다.
본원에서 사용된 "이종 항체"는 상기 항체를 생산하는 트랜스제닉 비인간 유기체와 관련하여 규정된다. 상기 용어는 트랜스제닉 비인간 동물을 이루지않는 유기체에서 발견되고, 일반적으로 트랜스제닉 비인간 동물과 상이한 종으로부터의 아미노산 서열 또는 상응하는 코딩 핵산 서열을 갖는 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, IL-15에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 IL-15 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나, IL-15의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 관련 사이토카인 또는 상이한 종으로부터의 다른 IL-15 단백질에 대하여 교차 반응성을 가질 수 있다. 그러나, 항체는 바람직하게는 항상 인간 IL-15에 결합한다. 또한, 단리된 항체는 통상적으로 다른 세포 물질 및(또는) 화학물질이 실질적으로 없다. 본 발명의 일 실시태양에서, 상이한 IL-15 특이성을 갖는 "단리된" 모노클로날 항체의 조합은 규정된 조성물과 병용된다.
본원에서 사용된 "특이적 결합"은 예정된 항원에 결합하는 항체를 지칭한다. 통상적으로, 항체는 재조합 인간 IL-15를 분석물로 사용하고 항체를 리간드로 사용하여 BIACORE 3000 장치에서 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술에 의해 측정하였을 때 약 10-7M 이하, 약 10-8M, 10-9M 또는 10-10M 이하의 친화도 (KD)로 결합하고, 예정된 항원 또는 밀접히 관련된 항원 이외의 비특이적 항원 (예: BSA, 카세인)에 대한 결합에 대한 친화도 보다 적어도 2배 큰 친화도로 예정된 항원에 결합한다. "항원(을) 인식(하는) 항체" 및 "항원에 대하여 특이적 항체"라는 용어는 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"라는 용어와 교환가능하게 사용된다.
본원에서 사용된 "KD"라는 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된 "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 (예: IgM 또는 IgG1)을 지칭한다.
본원에서 사용된 "이소타입 전환"은 항체의 클래스 또는 이소타입이 한 Ig 클래스에서 다른 Ig 클래스의 것으로 변화하는 현상을 지칭한다.
본원에서 사용된 "비전환된 이소타입"은 이소타입 전환이 일어나지 않는 경우 생산된 중쇄의 이소타입성 클래스를 지칭하고, 비전환된 이소타입을 코딩하는 CH 유전자는 통상적으로 기능적으로 재배열된 VDJ 유전자로로부터 바로 하류의 제1 CH 유전자이다. 이소타입 전환은 전형적 또는 비전형적 이소타입 전환으로 분류된다. 전형적 이소타입 전환은 트랜스유전자 중 1 이상의 전환 서열 영역을 포함하는 재조합에 의해 발생한다. 비전형적 이소타입 전환은 예를 들어 인간 σμ및 인간 Σμ간의 동종 재조합 (δ-연관 결실)에 의해 발생할 수 있다. 대체적인 비전형적 전환 기전, 예를 들어 다른 것 들 중에서 트랜스유전자간 및(또는) 염색체간 재조합이 발생하고 이소타입 전환을 일으킬 수 있다.
본원에서 사용된 "전환 서열"은 전환 재조합의 원인인 DNA 서열을 지칭한다. 통상적으로 μ 전환 영역인 "전환 공여체" 서열은 전환 재조합 도중에 결실되는 구조 영역의 5' (즉, 상류)일 수 있다. "전환 수용체" 서열은 결실되는 구조 영역 및 대체 불변 영역 (예: γ, ε 등) 사이에 있을 수 있다. 재조합이 항상 발생하는 특이적 부위는 없으므로, 최종 유전자 서열은 통상적으로 구조로부터 예측가능하지 않을 수 있다.
본원에서 사용된 "글리코실화 패턴"은 단백질, 더욱 구체적으로는 면역글로불린 단백질에 공유 부착되는 탄수화물 단위의 패턴으로 규정된다. 당업자가 이종 항체의 글리코실화 패턴이 트랜스유전자의 CH 유전자가 유래하는 종의 것보다 비인간 트랜스제닉 동물 종에서의 글리코실화 패턴과 보다 유사하다고 인식할 수 있는 경우, 이종 항체의 글리코실화 패턴은 비인간 트랜스제닉 동물 종에 의해서 생산되는 항체 상에 천연적으로 발생하는 글리코실화 패턴과 실질적으로 유사한 것을 특징으로 할 수 있다.
대상에 적용되는 본원에서 사용된 용어 "천연 발생"은 대상이 천연에서 발견될 수 있는 것을 지칭한다. 예를 들어, 천연의 원천으로부터 단리될 수 있는 유기체 (바이러스를 포함함)에 존재하고, 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변경되지않은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 발생이다.
본원에서 사용된 용어 "재배열된"은 V 분절이 각각 완전한 VH또는 VL도메인을 본래 코딩하는 배열로 D-J 또는 J 분절에 바로 인접하여 위치하는 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 유전자좌의 배치를 지칭한다. 재배열된 면역글로불린 유전자 유전자좌는 생식세포계열 DNA와 비교하여 확인될 수 있고, 재배열된 유전자좌는 1 이상의 재조합된 헵타머/노나머 상동성 요소를 가질 수 있다.
V 분절을 지칭하여 본원에서 사용된 용어 "재배열되지 않은" 또는 "생식세포계열 배치"는 V 분절이 D 또는 J 분절에 바로 인접하도록 재조합되지 않은 배치를 지칭한다.
본원에서 사용된 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.
IL-15에 결합하는 항체 또는 항체 부분 (예: VH, VL, CDR3)를 코딩하는 핵산을 지칭하여 본원에서 사용된 용어 "단리된 핵산 분자"는 항체 또는 항체 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 IL-15 이외의 항원에 결합하는 항체 또는 항체 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(여기서, 다른 서열은 인간 게놈 DNA 중에서 핵산에 천연적으로 인접할 수 있음)이 없는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 서열 번호 1 내지 4는 본 발명의 인간 항-IL-15 항체 146B7의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 가변 영역을 포함하는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 상응한다. 특히, 서열 번호1 및 2는 146B7 항체의 VH에 상응하고, 서열 번호 3 및 4는 146B7 항체의 VL에 상응한다.
본 발명은 또한 서열 번호 1 내지 4에 나타낸 서열의 "보존적 서열 변형", 즉 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나 아미노산 서열을 포함하는 항체에 상당히 영향을 미치거나 결합 특성을 바꾸지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변형을 포함한다. 상기 보존적 서열 변형은 뉴클레오티드 및 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 변형은 당업계에 공지된 표준 기술, 예를 들어 위치-지향 돌연변이발생 및 PCR-매개 돌연변이발생에 의해 서열 번호 1 내지 4에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 공지되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예: 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예: 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (예: 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예; 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄 (예: 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향족 측쇄 (예: 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 인간 항-IL-15 항체 중의 예상되는 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체된다.
별법으로, 다른 실시태양에서, 예를 들어 포화 돌연변이발생에 의해서 항-IL-15 항체 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라서 무작위로 돌연변이가 도입될 수 있고, 얻은 변형된 항-IL-15 항체를 결합 활성에 대해 스크리닝할 수 있다.
따라서, 본원에 개시된 (중쇄 및 경쇄 가변 영역) 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고(되거나) 본원에 개시된 (중쇄 및 경쇄 가변 영역) 아미노산 서열을 포함하는 (즉, 서열 번호 1 내지 4) 항체는 보존적으로 변형된 유사 서열에 의해 코딩되거나 이를 포함하는 실질적으로 유사한 항체를 포함한다. 어떻게 상기 실질적으로 유사한 항체가 서열 번호 1 내지 4로서 본원에 개시된 부분 (즉, 중쇄 및 경쇄 가변 영역) 서열에 기초하여 생성될 수 있는지에 대한 추가 논의는 하기 제공된다.
핵산에 대하여, 용어 "실질적 상동성"은 최적 정렬되고 비교되는 경우 2개의 핵산 또는 이의 지정 서열이 적합한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 보유하고 적어도 약 80%의 뉴클레오티드, 통상적으로 적어도 약 90% 내지 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 98% 내지 99.5%의 뉴클레오티드에서 동일한 것을 나타낸다. 별법으로, 실질적 상동성은 분절이 선택적 혼성화 조건하에서 혼성화될 수 있는 경우 가닥의 상보체에 대하여 존재할 수 있다.
2개의 서열 간의 % 동일성은 2개의 서열 간의 최적 정렬을 위하여 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 상동성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 ×100). 서열의 비교 및 2개의 서열 간의 % 동일성의 측정은 하기 비제한적 예에 기술된 바와 같은 수학적 알고리듬을 사용하여 달성될 수 있다.
2개의 뉴클레오티드 서열간의 % 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40,50, 60, 70 또는 80의 갭 중량(gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량(length weight)을 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능함)의 GAP 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다. 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 % 동일성은 또한 PAM 120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 도입된 이.메이어스(E.Meyers) 및 더블유.밀러(W.Miller) (CABIOS, 4:11-17 (1989))의 알고리듬을 사용하여 측정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 간의 % 동일성은 블로섬(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능함)의 GAP 프로그램에 도입된 니들만(Needleman) 및 분시(Wunsch) 알고리즘 (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 핵산 및 단백질 서열은 추가로 "질의 서열(query sequence)"로 사용되어 예를 들어 관련 서열을 동정하기 위하여 공개 데이타베이스에 대한 검색을 수행할 수 있다. 상기 검색은 문헌[Altschul, et al. (1990)J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색을 NBLAST 프로그램, 스코어=100, 문자길이=12로 수행되어 본 발명의 핵산 분자에 대해 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. BLAST 단백질 검색을 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 문자길이=3으로 수행하여 본 발명의 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교 목적을 위하여 갭이있는 정렬을 얻기 위하여, 갭이 있는(Gapped) BLAST를 문헌[Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]에 기술된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 갭이 있는 BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 개별 프로그램 (예: XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. 참조.
핵산은 전체 세포(whole cell) 중, 세포 용해물 중, 또는 부분적으로 정제되거나 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 알칼리성/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 일렉트로포레시스 및 다른 공지된 방법을 비롯한 표준 기술에 의해 다른 세포 구성성분 또는 다른 오염물 (예: 다른 세포 핵산 또는 단백질)로부터 정제되는 경우 "단리"되거나 또는 "실질적으로 순수하게" 된다. 문헌[F.Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)] 참조.
본 발명의 핵산 조성물은, cDNA, 또는 이들의 게놈 또는 이들의 혼합물로부터의 천연 서열(변경된 제한 위치 등을 제외하고)에서 종종 있는 일이지만, 표준 기술에 의해서 돌연변이 되어 유전자 서열을 제공할 수 있다. 코딩 서열에서, 이들 돌연변이는 아미노산 서열을 원하는 바대로 영향을 줄 수 있다. 특히, 실질적으로 천연 V,D,J, 불변성, 전환 및 본원에서 기술된 다른 서열과 상동하거나 유도된 DNA 서열을 고려할 수 있다 (여기서, "유도한"이란 다른 서열과 동일하거나 변경한 것을 의미한다).
핵산은 또다른 핵산 서열과의 기능적 관계로 위치되는 경우에 "작동적으로연결된다". 예를 들면, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결되어 있다. 전사 조절 서열에 관해 작동적으로 연결됨은 연결된 DNA 서열이 인접하고, 2 개의 단백질 코딩 영역을 연결할 필요가 있는 경우 인접하고 판독틀 내에 있다는 것을 의미한다. 전환 서열의 경우, 작동적으로 연결됨은 서열이 전환 재조합에 영향을 미칠 수 있다는 것을 나타낸다.
본원에 사용되는 용어 "벡터"는 연결된 또다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 칭한다. 벡터의 한 유형은 추가 DNA 분절이 결찰될 수 있는 환식 이중 가닥 DNA 루프를 칭하는 "플라스미드"이다. 벡터의 또다른 유형은 추가 DNA 분절이 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 도입된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다 (예컨대, 복제의 박테리아 원점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터 (예컨대, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입될 때 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 특정 벡터는 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히 "발현 벡터")로서 칭해진다. 일반적으로는, 재조합 DNA 기술 사용의 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로 서로 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 발현 벡터의 동등한 기능을 제공하는 이러한 다른 형태, 예컨대 바이러스 벡터 (예컨대, 복제 결실 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단하게는 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 칭한다. 이러한 용어는 특정 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 칭하는 것으로 이해되어야 한다. 돌연변이 또는 환경 영향으로 특정 변형이 연속되는 세대에서 발생되기 때문에, 이러한 자손은 사실 부모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에 사용되는 용어 "숙주 세포"의 범위에 속한다.
본원에 사용되는 용어 "대상"은 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 방법 및 조성물은 염증 질환, 예컨대 관절염, 예컨대 류마티스성 관절염을 앓고 있는 대상을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예컨대 포유류 및 비-포유류, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 암소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
본 발명의 각종 측면은 하기 소구분에서 추가로 상세하게 설명된다.
I.IL-15에 대한 인간 항체의 생산
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 각종 공지된 기술, 예컨대 문헌 [Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)]에 기재된 표준 체세포 혼성화 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 체세포 혼성화 과정이 바람직하지만, 원칙적으로 모노클로날 항체를 생산하는 다른 기술, 예컨대 B 림프구의 바이러스 또는 종양원성 형질전환, 인간 항체 유전자의 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 (phage display) 기술이 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생산하기 위한바람직한 동물 시스템은 쥐과 시스템이다. 면역화 프로토콜 및 면역화된 비장세포의 단리 및 융합을 위한 기술을 포함하는 마우스에서의 하이브리도마 생산은 당업계에 잘 공지되어 있다.
일 실시양태에서, IL-15를 향하는 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템보다 인간 면역계의 일부들을 갖는 트랜스제닉 또는 염색체이전 마우스를 사용하여 생산된다. 일 실시양태에서, 본 발명은 내인성 μ 및 κ 쇄 유전자좌를 불활성화시키는 표적 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄(μ 및 γ) 및 κ경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 소유전자좌를 함유한 본원에서 "HuMAb 마우스"로 칭해지는 트랜스제닉 마우스를 사용한다 [Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859]. 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 반응하여 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스유전자는 분류 전환 및 체세포 돌연변이되어 고 친화성 인간 IgGκ모노클로날 항체를 생산한다 [Lonberg, N. et al. (1994), 상기문헌; 개관용 Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113 :49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93, and Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764: 536-546]. HuMAb 마우스의 제조는 하기 II 절 및 문헌 [Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al.(1994) J. Immunol. 152: 2912-2920; Lonberg et al., (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93; Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764: 536-546; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851]에 상세히 기재되어 있다. 추가로, 문헌 [U.S. Patent Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; and 5,770,429; all to Lonberg and Kay, and GenPharm International; U. S. Patent No. 5,545,807 to Surani et al.; International Publication Nos. WO 98/24884, published on June 11, 1998; WO 94/25585, published November 10, 1994; WO 93/1227, published June 24, 1993; WO 92/22645, published December 23, 1992; WO 92/03918, published March 19, 1992]을 참고한다. 특히, HCO12 트랜스제닉 HuMAb 마우스의 제조는 실시예 2에 기재되어 있다.
면역화
IL-15에 대한 완전 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위해, 인간 면역글로불린 유전자를 함유한 트랜스제닉 또는 염색체이전 마우스 (예컨대, HCol2, HCo7 또는 KM 마우스)는 예를 들면 문헌 [Lonberg et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851] 및 WO 98/24884]에 기재된 바와 같이 IL-15 항원의 정제 또는 부유 제조물 및(또는) IL-15 발현 세포로 면역화될 수 있다. 달리, 마우스는 인간 IL-15를 코딩하는 DNA로 면역화될 수 있다. 바람직하게는, 마우스는 제1 주입시에 6 내지 16 주 생일 것이다. 예를 들면, IL-15 항원의 정제 또는 부유 제조물 (5 내지 50 ㎍)을 사용하여 복강내로 HuMAb 마우스를 면역화시킬 수 있다. IL-15 항원의 정제 또는 부유 제조물을 사용하는 면역화가 항체를 생성시키지 못하는 경우 마우스를 또한 IL-15를 발현하는 세포, 예컨대 면역 반응을 촉진하는 세포주를 사용하여 면역화시킬 수 있다.
각종 항원의 누적 경험은 완전 프로인트 아주반트 중의 항원으로 초기에 복강내 (IP) 또는 피하 (SC) 면역화시킨 후에 불완전 프로인트 아주반트 중의 항원으로 격주마다 IP/SC 면역화 (총 10 이하)하는 경우 HuMAb 트랜스제닉 마우스 반응이 최고이다는 것을 나타냈다. 안와후 출혈로 수득되는 혈장 샘플을 사용하는 면역화 프로토콜 과정에 걸쳐 면역 반응을 모니터할 수 있다. 혈장을 ELISA (하기 기재된 바와 같이)로 스크리닝할 수 있고, 항-IL-15 인간 면역글로불린의 충분한 역가를 갖는 마우스를 융합에 사용할 수 있다. 살생 및 비장 제거 3 일 전에 마우스에정맥내로 항원을 추가 투여할 수 있다.
IL-15에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생산
IL-15에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생산하기 위해 면역화된 마우스로부터의 비장세포 및 림프절 세포를 단리하고 적절한 불멸화 세포주, 예컨대 마우스 골수종 세포주에 융합시킬 수 있다. 생성된 하이브리도마를 이어서 항원-특이 항체의 생산에 대해 스크리닝할 수 있다. 예를 들면, 면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을 50% PEG (w/v)로 SP2/0-Ag8.653 비분비 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1580)에 융합시킬 수 있다. 세포를 약 1 x 105로 평평한 바닥 미세역가 플레이트에 플레이팅한 후에, 통상 시약 10% 태아 클론 세럼 (Clone Serum) 외에, 5 내지 10% 오리젠 (origen) 하이브리도마 클로닝 인자 (IGEN) 및 1 X HAT (Sigma)를 함유한 선택 배지에서 2 주 동안 인큐베이션할 수 있다. 약 2 주 후에, 세포를 HAT를 HT로 교체한 배지에서 배양할 수 있다. 개개의 웰을 이어서 ELISA로 인간 항-IL-15 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대해 스크리닝할 수 있다. 일단 대규모 하이브리도마가 성장하면, 배지는 보통 10 내지 14 일 후에 관찰될 수 있다. 항체 분비 하이브리도마를 다시 플레이팅하고, 다시 스크리닝하고 인간 IgG에 대해 여전히 양성이면 희석을 제한하여 항-IL-15 모노클로날 항체를 2 회 이상 서브클로닝할 수 있다. 안정한 서브클론을 이어서 시험관내에서 배양하여 특성화를 위한 조직 배양 배지 중에서 항체를 생산할 수 있다.
IL-15에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 트랜스펙토마 (Transfectoma)의 생산
예를 들면 당업계에 잘 공지된 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법 [Morrison, S. (1985) Science 229: 1202]의 조합을 사용하여 본 발명의 인간 항체를 또한 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산할 수 있다.
예를 들면, 일 실시양태에서, 중요 유전자(들), 예컨대 인간 항체 유전자를 예컨대 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338 841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템또는 당업게에 잘 공지된 다른 발현 시스템이 사용되는 발현 벡터, 예컨대 진핵생물 발현 플라스미드 내에 결찰시킬 수 있다. 클로닝된 항체 유전자를 갖는 정제된 플라스미드를 진핵생물 숙주 세포, 예컨대 CHO-세포 또는 NSO-세포 또는 달리 식물 유래 세포, 진균류 또는 효모 세포와 같은 다른 진핵생물 세포 내에 도입시킬 수 있다. 이들 유전자를 도입시키는 데 사용되는 방법은 당업계에 기재된 방법, 예컨대 전기충격법, 리포펙틴, 리포펙타민 등일 수 있다. 이들 항체 유전자를 숙주 세포에 도입시킨 후에, 항체를 발현하는 세포를 동정하고 선별할 수 있다. 이들 세포는 이어서 그의 발현 수준을 위해 증폭시키고 규모를 증가시켜 항체를 생산할 수 있는 트랜스펙토마를 나타낸다. 재조합 항체를 이들 배양 상등액 및(또는) 세포로부터 단리 및 정제할 수 있다.
달리, 이들 클로닝된 항체 유전자를 다른 발현 시스템, 예컨대 이. 콜라이 또는 완전 유기체에서 발현시킬 수 있거나 또는 합성적으로 발현시킬 수 있다.
무손상 항체를 발현하기 위한 부분 항체 서열의 용도
항체는 6 개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 중에 위치한 아미노산 잔기를 통해 우세하게 표적 항원과 상호작용한다. 이 이유 때문에, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR의 서열 외부보다 개개의 항체 간에 더 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용에 반응가능하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 골격 서열 상에 이식된 특정 천연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 제조함으로써 특정 천연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Riechmann, L. et al., 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986, Nature 321: 522-525; and Queen, C. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86: 10029-10033] 참조). 이러한 골격 서열을 생식세포계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이타베이스로부터 얻을 수 있다. 이들 생식세포계열 서열은 B 세포 성숙 동안 V(D)J 연결에 의해 형성되는 완전 조립된 가변성 유전자를 포함하지 않을 것이기 때문에 성숙 항체 유전자 서열과 상이할 것이다. 생식세포계열 유전자 서열은 또한 가변성 영역에 걸친 고른 개개에서 고 친화성 2차 레퍼토리 항체의 서열과 상이할 것이다. 예를 들면, 체세포 돌연변이는 골격 영역의 아미노-말단 부위에 상대적으로 드물다. 예를 들면, 체세포 돌연변이는 골격 영역 1의 아미노 말단 부위 및 골격 영역 4의 카르복시-말단 부위에 상대적으로 드물다. 또한, 많은 체세포 돌연변이는 항체의 결합 특성을 유의하게 변경시키지 않는다. 이 이유 때문에, 원래 항체와 유사한 결합 특성을 갖는 무손상 재조합 항체를 재생성시키기 위해 특정 항체의 전체 DNA 서열을 획득할 필요가 없다 (1999년 3월 12일자로 출원한 PCT/US99/05535 참조). CDR 영역을 걸친 부분 중쇄 및 경쇄 서열은 전형적으로 이 목적에 충분하다. 생식세포계열 가변성 및 연결 유전자 분절이 재조합된 항체 가변성 유전자에 기여되는 것을 결정하기 위해 부분 서열을 사용한다. 생식세포계열 서열은 이어서 가변성 영역의 누락 부위를 채우기 위해 사용된다. 중쇄 및 경쇄 리더 서열은 단백질 성숙 동안에 절단되고 최종 항체의 특성에 기여하지 않는다. 누락 서열을 첨가하기 위해, 클로닝된 cDNA 서열을 결찰 또는 PCR 증폭으로 합성 올리고뉴클레오티드와 합할 수 있다. 달리, 전체 가변성 영역을 짧고, 오버랩되는 올리고뉴클레오티드의 세트로서 합성하고 PCR 증폭으로 합하여 전체적 합성 가변성 영역 클론을 생성할 수 있다. 이 과정은 특정 장점, 예컨대 특정 코돈의 제거 또는 포함 또는 특정 제한효소 절단부위 또는 최적화를 가진다.
하이브리도마로부터의 중쇄 및 경쇄 전사물의 뉴클레오티드 서열을 사용하여 천연 서열로서 동일한 아미노산 코딩 역량을 갖는 합성 V 서열을 생성시키 위해 합성 올리고뉴클레오티드의 오버랩 세트를 디자인한다. 합성 경쇄 및 카파 쇄 서열은 천연 서열과 3 가지 방식으로 상이할 수 있다: 반복된 뉴클레오티드 염기 스트링을 개재하여 올리고뉴클레오티드 합성 및 PCR 증폭을 촉진시키고; 최적 번역 개시 부위를 코자크 (Kozak) 법칙에 따라 도입시키고 [Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266L19867019870]; HindIII 부위를 번역 개시 부위의 상류에 가공한다.
중쇄 및 경쇄 가변성 영역 모두의 경우, 최적화된 코딩 및 상응하는 비-코딩 가닥 서열은 상응하는 비-코딩 올리고뉴클레오티드의 대략 중간점인 30 내지 50 개의 뉴클레오티드 내로 파괴된다. 따라서, 각 쇄의 경우에, 올리고뉴클레오티드는 150 내지 400 개의 뉴클레오티드의 분절을 걸친 오버랩 이중 가닥 세트로 조립될 수 있다. 풀은 이어서 150 내지 400 개의 뉴클레오티드의 PCR 증폭 산물을 생산하기 위한 주형으로서 사용된다. 전형적으로, 단일 가변성 영역 올리고뉴클레오티드 세트는 2 개의 오버랩 PCR 산물을 생산하기 위해 개별적으로 증폭되는 2 개의 풀로 파괴될 것이다. 이들 오버랩 산물은 이어서 완전 가변성 영역을 형성하기 위해 PCR 증폭으로 합해진다. 또한, 용이하게 발현 벡터 구조물로 클로닝될 수 있는 단편을 생성하기 위해 PCR 증폭에서 중쇄 또는 경쇄 불변성 영역 (카파 경쇄의 BbsI부위 또는 감마 중쇄인 경우 AgeI 부위를 포함함)의 오버랩 단편을 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
다시 제조된 중쇄 및 경쇄 가변성 영역은 이어서 발현 벡터 구조물을 형성하기 위해 클로닝된 프로모터, 리더 서열, 번역 초기, 리더 서열, 불변성 영역, 3' 비번역, 폴리아데닐화, 및 전사 종결 서열과 합해진다. 중쇄 및 경쇄 발현 구조물은 단일 벡터 내로 합해지거나, 숙주 세포 내로 공동-형질감염되거나, 일련적으로 형질감염되거나, 또는 개별적으로 형질감염되어 이어서 모든 쇄를 발현하는 숙주 세포를 형성하기 위해 융합된다.
인간IgGκ에 대한 발현 벡터의 제조에 사용하기 위한 플라스미드는 하기에 기재된다 (실시예 1). PCR 증폭된 V 경쇄 및 V 카파 경쇄 cDNA 서열이 완전 중쇄 및 경쇄 소유전자를 다시 제조하는 데 사용될 수 있도록 플라스미드를 제조하였다. 이들 플라스미드를 사용하여 완전히 인간IgG1κ 또는 IgG4κ 항체를 발현할 수 있다. 본 발명의 완전 인간 및 키메라 항체는 IgG2, IgG3, IgE, IgA, IgM 및 IgD 항체를 포함한다. 다른 중쇄 이소타입의 발현 또는 람다 경쇄를 포함하는 항체의 발현을 위해 유사한 플라스미드를 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또다른 측면에서, 본 발명의 인간항-IL-15 항체의 구조적 측면 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4는 예컨대 IL-15에 결합하는 본 발명의 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 보유한 구조적으로 관련된 인간 항-IL-15 항체를 생산하기 위해 사용된다. 더 구체적으로, 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 하나 이상의 CDR 영역은 본 발명의 추가 재조합적으로-가공된 인간 항-IL-15 항체를 생산하기 위해 공지된 인간 골격 영역 및 CDR과 재조합적으로 합해질 수 있다.
따라서, 또다른 실시양태에서, 본 발명은 (1) 인간 중쇄 골격 영역 및 인간 중쇄 CDR (여기서, 하나 이상의 인간 중쇄 CDR는 도 2에 나타낸 CDR의 아미노산 서열 (또는 서열 번호 2 중의 상응하는 아미노산 잔기)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함함); 및 (2) 인간 경쇄 골격 영역 및 인간 경쇄 CDR (여기서, 하나 이상의 인간 중쇄 CDR은 도 3에 나타낸 CDR의 아미노산 서열 (또는 서열 번호 4 중의 상응하는 아미노산 잔기)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함함)을 포함하는 항체의 제조단계를 포함하는 항-IL-15 항체의 제조 방법을 제공하며, 여기서 항체는 IL-15에 대한 결합능을 보유한다. IL-15에 대한 항체의 결합능은 표준 결합 분석, 예컨대 실시예에 기재되는 것 (예컨대, ELISA)을 사용하여 측정할 수 있다.
항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 도메인이 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화성에서 특히 중요한 역할을 수행한다는 것이 당업계에 잘 공지되어 있기 때문에, 상술된 바와 같이 제조된 본 발명의 재조합 항체는 바람직하게는 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 중쇄 및 경쇄 CDR3을 포함한다. 항체는 추가로 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 CDR2를 포함할 수 있다. 항체는 추가로 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 CDR1을 포함할 수 있다. 항체는 추가로 CDR의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
따라서, 또다른 실시양태에서, 본 발명은 (1) 인간 중쇄 골격 영역, 인간 중쇄 CDR1 영역, 인간 중쇄 CDR2 영역 및 인간 중쇄 CDR3 영역 (여기서, 인간 중쇄 CDR3 영역은 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 CDR3, 예를 들면 도 2에 나타낸146B7의 인간 중쇄 CDR 영역 (또는 서열 번호 2 중의 상응하는 아미노산 잔기)으로부터 선택됨); 및 (2) 인간 경쇄 골격 영역, 인간 경쇄 CDR1 영역, 인간 경쇄 CDR2 영역 및 인간 경쇄 CDR3 영역 (여기서, 인간 경쇄 CDR3 영역은 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 CDR3, 예를 들면 도 3에 나타낸 146B7의 인간 경쇄 CDR 영역 (또는 서열 번호 4 중의 상응하는 아미노산 잔기)으로부터 선택됨)을 포함하는 항- IL-15 항체를 추가로 제공하며, 여기서 항체는 IL-15에 결합한다. 항체는 추가로 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 중쇄 CDR2 및(또는) 경쇄 CDR2를 포함한다. 항체는 추가로 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 중쇄 CDR1 및(또는) 경쇄 CDR1을 포함할 수 있다.
상술된 가공된 항체의 CDR1, 2, 및(또는) 3 영역은 본원에 개시된 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4와 같은 정확한 아미노산 서열(들)을 포함할 수 있다. 그러나, 당업자는 항체가 IL-15에 유효하게 결합하는 능력을 여전히 보유하며 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 정확한 CDR 서열로부터의 일부 일탈이 가능할 수 있다 (예컨대, 보존적 서열 변형)는 것을 인식할 것이다. 따라서, 또다른 실시양태에서, 가공된 항체는 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 하나 이상의 CDR에 예를 들면 90%, 95%, 98% 또는 99.5% 동일한 하나 이상의 CDR로 이루어질 수 있다.
단순한 IL-15 결합 이외에, 예컨대 상술된 가공 항체는 본 발명의 항체의 다른 기능적 특성, 예컨대:
(1) 인간 IL-15에 대한 결합 및 IL-15 유도된 전염증성 영향의 억제;
(2) IL-15 -유도 TNFα 생성 또는 T 세포 증식의 억제;
(3) 재조합 인간 IL-15를 분석물로 사용하고 항체를 리간드로서 사용하며 BIACORE3000 인스트루먼트의 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술로 측정하는 경우 해리 평형 상수 (KD) 약 10-7M 미만의 인간 IL-15에의 결합;
(4) 인간 IL-15의 β- 및(또는) γ-쇄 상호작용 도메인 상에 위치한 에피토프에 대한 결합;
(5) 인간 IL-15 수용체의 β-단위에 대한 인간 IL-15의 Asp8결합 및(또는) 인간 IL-15 수용체의 γ-단위에 대한 인간 IL-15의 Gln108의 결합의 간섭;
(6) 수용체-결합 인간 IL-15에 대한 결합;
(7) 인간 IL-15에 대한 결합 및 인간 IL-15의 이상각화증 유도능 억제;
(8) 인간 IL-15에 대한 결합 및 인간 IL-15의 표피 비후 유도능 억제;
(9) 인간 IL-15에 대한 결합 및 인간 IL-15의 각질세포 증식 유도능 억제; 및(또는)
(10) 인간 IL-15에 대한 결합 및 인간 IL-15의 활성화된 백혈구의 화학주성 유도능 억제하는 특성의 보유를 위해 선택될 수 있다.
IL-15에 대한 인간 모노클로날 항체의 특성화
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 다수의 공지된 기술을 사용하여 IL-15에 대한 결합에 대해 특성화될 수 있다. 일반적으로는, 항체는 ELISA에 의해 초기에 특성화된다. 간단하게는, 미세역가 플레이트를 PBS 중의 정제된 IL-15로 코팅하고, 이어서 PBS 중에 희석한 무관한 단백질, 예컨대 소 혈청 알부민 (BSA)으로 블로킹할 수 있다. IL-15-면역화 마우스로부터의 혈장 희석물을 각각의 웰에 첨가하고, 1 내지 2 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션한다. 플레이트를 PBS/트윈 20으로 세척하고, 이어서 알칼리 포스파타제에 접합된 염소-항-인간 IgG Fc-특이성 폴리클로날 시약과 1 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 세척 후에, 플레이트를 ABTS 기질로 현상시키고, OD 405에서 분석한다. 바람직하게는, 최고 역가를 나타내는 마우스를 융합에 사용할 것이다.
상술된 ELISA 분석을 사용하여 항체 및 IL-15 면역원과 양성의 반응성을 나타내는 항체를 생산하는 하이브리도마를 스크리닝할 수 있다. 바람직하게는 고 친화성으로 IL-15에 결합하는 하이브리도마를 이어서 서브클로닝하고, 추가로 특성화할 수 있다. 부모 세포의 반응성 (ELISA에 의해)을 보유하는 각각의 하이브리도마로부터의 하나의 클론은 이어서 세포 은행 제조용 및 항체 정제용으로 선택될 수 있다.
인간 항-IL-15 항체를 정제하기 위해, 선별된 하이브리도마를 롤러 병, 2-리터 스피너-플라스크 또는 다른 배양 시스템 중에서 성장시킬 수 있다. 상등액을 여과 농축하고, 단백질 A-세파로스 (Pharmacia, Piscataway, NJ)를 사용하며 친화 크로마토그래피로 단백질을 정제할 수 있다. 완충액을 PBS로 교환한 후에, 농도는 흡광 계수 1.43을 사용하며 OD280또는 바람직하게는 탁도계 분석으로 측정할 수 있다. IgG는 겔 전기영동 및 항원 특이성 방법으로 확인할 수 있다.
선별된 인간항-IL-15 모노클로날 항체가 특이 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 각각의 항체는 시판 입수가능 시약 (Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 비오틴 부착화될 수 있다. 비오틴 부착된 MAb 결합은 스트렙타비딘 표지된 프로브로 탐지될 수 있다. 정제된 항체의 이소타입을 결정하기 위해, 이소타입 ELISA는 당업계 인지된 기술을 사용하며 수행될 수 있다. 예를 들면, 미세역가 플레이트의 웰을 항-인간 Ig 10 ㎍/ml로 밤새 4 ℃에서 코팅할 수 있다. 5% BSA로 블로킹 한 후에, 플레이트를 모노클로날 항체 또는 정제된 이소타입 대조군 10 ㎍/ml와 주위 온도에서 2 시간 동안 반응시킨다. 웰은 이어서 인간 IgGl 또는 다른 인간 이소타입 특이 접합 프로브와 반응될 수 있다. 플레이트를 상술된 바와 같이 현상시키고 분석하였다.
IL-15를 발현하는 생존 세포에 대한 모노클로날 항체의 결합을 시험하기 위해, 유동 세포측정기를 사용하였다. 간단하게는, 세포주 및(또는) 인간 PBMC 발현 구성원-결합 IL-15 (표준 성장 조건하에 성장함)를 0.1% BSA 및 0.01% NaN3을 함유한 PBS 중의 모노클로날 항체의 다양한 농도와 4 ℃에서 1 시간 동안 혼합하였다. 세척 후에, 세포를 플루오레세인 (Fluorescein)-표지 항-인간 IgG 항체와 1차 항체 염색과 동일 조건 하에 반응시켰다. 샘플은 단일 세포가 통과하는데 광 및 측방 산란 특성을 사용하는 FACScan 인스트루먼트로 분석될 수 있고 표지된 항체의 결합이 측정된다. 형광 현미경을 사용하는 다른 분석은 유동 세포측정기 분석 (이외에 또는 대신에) 사용될 수 있다. 세포는 상술된 바와 같이 정확하게 염색되고 형광현미경으로 조사될 수 있다. 이 방법은 개개의 세포를 시각화시키지만 항원 밀도에 따른 민감도를 감소시킬 수 있다.
항-IL-15 인간 IgG는 웨스턴 블로팅으로 IL-15 항원과의 반응성에 대해 추가로 시험될 수 있다. 간단하게는, IL-15 발현 세포로부터의 세포 추출물을 제조하고, 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 한다. 전기영동 후에, 분리된 항원을 니트로셀룰로오스 막으로 이동시키고, 20% 마우스 혈청으로 블로킹하고, 시험되는 모노클로날 항체로 탐침한다. 인간 IgG 결합을 항-인간 IgG 알칼리 포스파타제를 사용하여 탐지하고, BCIP/NBT 기질 정제 (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)로 현상할 수 있다.
II.인간 모노클로날 항-IL-15 항체를 생성하는 트랜스제닉 및 염색체이전 비인간 동물의 생산
본 발명의 또다른 측면은 IL-15에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현할 수 있는 트랜스제닉 및 염색체이전 비-인간 동물, 예컨대 트랜스제닉 또는 염색체이전 마우스를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 마우스가 IL-15 항원 및(또는) IL-15 발현하는 세포로 면역화되는 경우 인간 항-IL-15 항체를 생산하도록 인간 중쇄 트랜스유전자를 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 또는 염색체이전 마우스를 제공한다. 인간 중쇄 트랜스유전자는 트랜스제닉, 예컨대 본원에 상세히 기재되고 실시되는 HuMAb 마우스에 대한 경우와 같이 마우스의 염색체 DNA 내로 통합될 수 있다. 달리, 인간 중쇄 트랜스유전자는 WO 02/43478 (2002년 6월 6일 공개됨)에 기재된 염색체이전 (예컨대, KM) 마우스의 경우에서와 같이 염색체외로 유지될 수 있다. 이러한 트랜스제닉 및 염색체이전 마우스는 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환의 발생으로 IL-15 (예컨대, IgG, IgA 및(또는) IgE)에 대한 인간 모노클로날 항체의 다중 이소타입을 생산할 수 있다. 이소타입 전환은 예컨대 전형적인 또는 비-전형적인 이소타입 전환에 의해 발생될 수 있다.
이종 항체 레퍼토리를 사용한 외래 항원 자극에 대해 반응하는 트랜스제닉 또는 염색체이전 비-인간 동물의 디자인은 트랜스제닉 동물 내에 함유된 이종 면역글로불린 트랜스유전자가 B-세포 발생의 경로를 걸쳐서 정확하게 작용하는 것을 요구한다. 이는 예를 들면 이종 중쇄 트랜스유전자의 이소타입 전환을 포함한다. 따라서, 트랜스유전자는 이소타입 전환 및 하나 이상의 하기 항체를 생산하도록 제조된다: (1) 고 수준 및 세포-유형 특이 발현, (2) 기능적인 유전자 재배열, (3) 대립유전자 배제의 활성화 및 반응, (4) 충분한 1차 레퍼토리의 발현, (5) 신호 전달, (6) 체세포 과돌연변이, 및 (7) 면역 반응 동안 트랜스유전자 항체 유전자좌의 우세.
상기 판단기준 모두가 부합될 필요는 없다. 예를 들면, 트랜스제닉 동물의 내인성 면역글로불린 유전자좌가 기능적으로 파괴되는 이들 실시양태에서 트랜스유전자는 대립유전자 배제를 활성화시킬 필요가 없다. 추가로, 트랜스유전자가 기능적으로 재배열된 중쇄 및(또는) 경쇄 면역글로불린 유전자를 포함하는 실시양태에서, 기능적인 유전자 재배열의 제2 판단기준은 적어도 이미 재배열된 트랜스유전자에 대해 불필요하다. 분자 면역학에 대한 예비 지식은 문헌 [Fundamental Immunology, 2nd edition (1989), Paul William E., ed. Raven Press, N. Y.]을 참고한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 데 사용되는 트랜스제닉 또는 염색체이전 비-인간 동물은 트랜스제닉 동물의 생식세포계열 중에 재배열되거나, 재배열되지 않거나 또는 재배열 및 재배열되지 않은 조합의 이종 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스유전자를 함유한다. 각각의 중쇄 트랜스유전자는 하나 이상의 CH유전자를 포함한다. 또한, 중쇄 트랜스유전자는 트랜스제닉 동물의 B-세포 중에 다중 CH유전자를 코딩하는 이종 트랜스유전자의 이소타입 전환을 지지할 수 있는 기능적인 이소타입 전환 서열을 함유할 수 있다. 이러한 전환 서열은 트랜스유전자 CH유전자의 공급원으로서 제공되는 종으로부터의 생식세포계열 면역글로불린 위치에서 천연 발생할 수 있는 것일 수 있거나, 또는 이러한 전환 서열은 트랜스유전자 구조물이 수취되는 종 (트랜스제닉 동물)에서 발생할 수 있는 것으로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 트랜스제닉 마우스를 생산하기 위해 사용되는 인간 트랜스유전자 구조물은 마우스 중쇄 유전자좌에서 천연 발생하는 것과 유사하게 전환 서열 내로 통합되는 경우 이소타입 전환 사건을 더 높은 빈도로 발생할 수 있는데, 이는 아마 마우스 전환 서열이 마우스 전환 리콤비나제 (recombinase) 효소 시스템에 기능하도록 최적화되는 반면 인간 전환 서열은 최적화되지 않기 때문일 것이다. 전환 서열을 단리하고 통상의 클로닝 방법으로 클로닝하거나, 또는 면역글로불린 전환 영역 서열에 관계된 공개된 서열 정보에 기초하여 디자인된 오버랩 합성 올리고뉴클레오티드로부터 새로이 합성될 수 있다 (Millset al., Nucl. Acids Res. 15: 7305-7316 (1991); Sideras et al., Intl. Immunol. 1: 631-642 (1989)). 상기 트랜스제닉 동물 각각의 경우에, 기능적으로 재배열된 이종 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 트랜스유전자는 트랜스제닉 동물의 B-세포의 유의한 분획에서 발견된다 (10% 이상).
본 발명의 트랜스제닉 동물을 생산하기 위해 사용되는 트랜스유전자는 하나 이상의 가변성 유전자 분절, 하나의 다양성 유전자 분절, 하나의 연결 유전자 분절 및 하나 이상의 불변성 영역 유전자 분절을 코딩하는 DNA를 포함하는 중쇄 트랜스유전자를 포함한다. 면역글로불린 경쇄 트랜스유전자는 하나 이상의 가변성 유전자 분절, 하나의 연결 유전자 분절 및 하나 이상의 불변성 영역 유전자 분절을 코딩하는 DNA를 포함한다. 경쇄 및 중쇄 유전자 분절을 코딩하는 유전자 분절는 트랜스제닉 비-인간 동물로 이루어지지 않는 종으로부터 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 분절을 코딩하는 DNA로부터 유도되거나 또는 상응하는 점에서 트랜스제닉 비-인간 동물에 대해 이종이다. 본 발명의 일 측면에서, 트랜스유전자는 개개의 유전자 분절이 재배열되지 않도록, 즉 기능적인 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 코딩하도록 재배열되지 않도록 제조된다. 이러한 재배열되지 않은 트랜스유전자는 IL-15 항원에 노출되는 경우 트랜스제닉 비-인간 동물 내의 생성된 재배열된 면역글로불린 중쇄 중의 V, D, 및 J 유전자 분절의 재조합 (기능적인 재배열) 및 바람직하게는 D 영역 유전자 분절 모두 또는 부분의 통합을 지지한다.
다른 실시양태에서, 트랜스유전자는 재배열되지 않은 "소-유전자좌 (mini-locus)"를 포함한다. 이러한 트랜스유전자는 전형적으로 C, D, 및 J 분절의 상당부위 뿐만 아니라 V 유전자 분절의 서브세트를 포함한다. 이러한 트랜스유전자 구조물에서, 각종 조절 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 분류 전환 영역, RNA 프로세싱에 대한 스플라이스-도너 (splice-donor) 및 스플라이스-어셉터 (acceptor) 서열, 재조합 신호 등은 이종 DNA로부터 유도되는 상응하는 서열을 포함한다. 이러한 조절 서열은 본 발명에 사용되는 비-인간 동물의 동일 또는 관련 종으로부터의 트랜스유전자 내로 통합될 수 있다. 예를 들면, 인간 면역글로불린 유전자 분절은 트랜스제닉 마우스 내에 사용하기 위한 설치류 면역글로불린 인핸서 서열을 갖는 트랜스유전자 중에서 조합될 수 있다. 달리, 합성 조절 서열은 트랜스유전자 내로 통합될 수 있으며, 여기서 이러한 합성 조절 서열은 포유류의 게놈에서 천연 발생하는 것으로 공지된 기능적인 DNA 서열과 일치하지 않는다. 합성 조절 서열은 일치 법칙 (consensus rules), 예컨대 스플라이스-어셉터 부위 또는 프로모터/인핸서 모티프의 허용가능 서열을 지정하는 것에 따라 디자인된다. 예를 들면, 유전자좌는 자연-발생 생식세포계열 Ig 위치에 비해 비-필수 DNA 부위 (예컨대, 개재 서열; 그의 인트론 또는 부위)의 하나 이상의 내부 (즉, 부위의 말단이 아님) 삭제를 갖는 게놈 면역글로불린 위치의 부위를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, IL-15에 대한 인간 항체를 생산하기 위해 사용되는 트랜스제닉 또는 염색체이전 동물은 WO 98/24884의 실시예 5, 6, 8, 또는 14에 기재된 경쇄 트랜스유전자의 단일 복제물을 함유한 동물에서 생성된 WO 98/24884 (예컨대, pHC1 또는 pHC2)의 실시예 12에 기재된 트랜스유전자의 하나 이상, 전형적으로 2 내지 10개, 때때로 25 내지 50개 이상의 복제물 및 WO 98/24884의 실시예 10에 기재된 JH삭제 동물에서 생성된 자식을 함유한다. 동물은 이들 3가지 특성 각각에 대해 동형접합성이 된다. 이러한 동물은 하기 유전자형을 가진다: 인간 중쇄 재배열되지 않은 소-위치 (WO 98/24884의 실시예 12에 기재됨)의 (염색체의 1 반수체 당) 단일 복제물, 재배열된 인간 κ경쇄 구조물 (WO 98/24884의 실시예 14에 기재됨)의 (염색체의 1 단수성 세트 당) 단일 복제물, 및 기능적인 JH분절 (WO 98/24884의 실시예 10에 기재됨) 모두를 제거한 각각의 내인성 마우스 중쇄 위치에서의 삭제. 이러한 동물은 JH삭제에 대해 동형접합성이고 인간 중쇄 및 경쇄 구조물에 대해 반접합성인 자손을 생산하기 위해 JH분절 (WO 98/24884의 실시예 10)의 삭제에 대해 동형접합성인 마우스와 교배된다. 생성된 동물에 항원을 주사하고, 이들 항원에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위해 상기 동물을 사용하였다.
이러한 동물로부터 단리된 B 세포는 각각의 유전자의 단지 단일 복제물을 함유하기 때문에 인간 중쇄 및 경쇄에 관해 단일특이적이다. 또한, 이들은 내인성 마우스 중쇄 유전자 복제물이 WO 98/24884의 실시예 9 및 12에 기재된 바와 같이 도입된 JH영역 횡단 삭제에 의해 비기능적이기 때문에 인간 또는 마우스 중쇄에 관해 단일특이적일 것이다. 또한, B 세포의 상당한 분획은 재배열된 인간 κ경쇄 유전자의 단일 복제물의 발현이 대립유전자형적으로 및 동종형적으로 B-세포의 유의한 분획 중의 내인성 마우스 κ및 람다 쇄 유전자의 재배열을 제외하기 때문에 인간 또는 마우스 경쇄에 관해 단일 특이적일 것이다.
본 발명에 사용되는 트랜스제닉 및 염색체이전 마우스는 천연 마우스와 이상적으로는 실질적으로 유사하게 유의한 레퍼토리 갖는 면역글로불린 생성을 나타낸다. 따라서, 예를 들면, 내인성 Ig 유전자가 불활성화되는 실시양태에서, 전체 면역글로불린 수준은 약 0.1 내지 10 mg/ml 혈청, 바람직하게는 0.5 내지 5 mg/ml 혈청, 이상적으로는 약 1.0 mg/ml 혈청 이상의 범위일 것이다. IgM으로부터 IgG로의 전환을 유효하게 할 수 있는 트랜스유전자가 트랜스제닉 마우스 내로 도입되는 경우, 성숙 마우스의 혈청 IgG 대 IgM 비율은 바람직하게는 약 10:1이다. IgG 대 IgM 비율은 비성숙 마우스에서 매우 더 낮을 것이다. 일반적으로는, 약 10% 초과, 바람직하게는 40 내지 80%의 비장 및 림프절 B 세포는 독점적으로 인간 IgG 단백질을 발현한다.
레퍼토리는 천연 마우스에 나타나는 것과 이상적으로는 유사할 것이며, 보통 약 10% 이상, 바람직하게는 25 내지 50% 이상일 것이다. 일반적으로는, 적어도 1000 종의 상이한 면역글로불린 (이상적으로는 IgG), 바람직하게는 104내지 106종 이상의 면역글로불린이 마우스 게놈 내에 삽입되는 다수의 상이한 V, J 및 D 영역에 주로 의존적으로 생산될 것이다. 이들 면역글로불린은 전형적으로 약 절반 이상의 높은 항원성 단백질, 예컨대 포도상구균 단백질 A를 인식할 것이다. 전형적으로, 면역글로불린은 예비선별된 항원에 대한 친화도 (KD)가 10-7M 미만, 예컨대10-8M 미만, 10-9M 또는 10-1M 미만 조차도 나타낼 것이다. 일부 실시양태에서, 예비결정된 항원 유형에 대한 항체 반응에 나타나는 V 유전자의 선별을 제한하기 위해 예비결정된 레퍼토리를 갖는 마우스를 생산하는 것이 바람직할 수 있다. 예비결정된 레퍼토리를 갖는 중쇄 트랜스유전자는 인간에서 예비결정된 항원 유형에 대한 항체 반응에 우선적으로 사용되는 예를 들면 인간 VH유전자를 포함할 수 있다. 달리, 일부 VH유전자는 각종 이유 (예컨대, 예비결정된 항원에 대한 고 친화성 V 영역의 낮은 코딩 가능성; 체세포 돌연변이 및 친화성 예리함 발생의 낮은 경향; 또는 특정 인간에 대한 면역원성)에 대한 정의된 레퍼토리로부터 배제될 수 있다. 따라서, 각종 중쇄 또는 경쇄 유전자 분절을 함유한 트랜스유전자의 재배열 전에, 이러한 유전자 분절은 트랜스제닉 동물 이외의 유기체 종으로부터 예컨대 혼성화 또는 DNA 서열분석에 의해 용이하게 동정될 수 있다.
상술된 트랜스제닉 및 염색체이전 마우스는 예를 들면 IL-15 항원의 정제 또는 부유 제조물 및(또는) IL-15 발현 세포로 면역화될 수 있다. 달리, 트랜스제닉 마우스는 인간 IL-15를 코딩하는 DNA로 면역화될 수 있다. 마우스는 이어서 내부트랜스유전자 전환 재조합 (cis-전환)을 통해 분류-전환이 일어나고 IL-15와 반응성인 면역글로불린을 발현하는 B 세포를 생산할 것이다. 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드가 체세포 돌연변이 및 V 영역 재조합 연결에 의해 유도된 서열 뿐만 아니라 생식세포계열-코딩 서열을 포함할 수 있는 인간 트랜스유전자 서열에 의해 코딩되는 인간 항체 ("인간 서열 항체"로서도 칭해짐)일 수 있는데; 이들 인간항체는 다른 비-생식세포계열 서열이 체세포 돌연변이 및 상이한 V-J 및 V-D-J 재조합 연결의 결과로서 존재할 수 있을지라도 인간 VL또는 VH유전자 분절 및 인간 JL또는 DH및 JH분절에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열에 실질적으로 동일한 것으로 칭해질 수 있다. 각각의 항체 쇄의 가변성 영역은 전형적으로 인간 생식세포계열 V, J, 및 중쇄의 경우에 D 유전자 분절에 의해 80% 이상 코딩되고; 종종 가변성 영역의 85% 이상이 트랜스유전자에 존재하는 인간 생식세포계열 서열에 의해 코딩되고; 종종 가변성 영역 서열의 90 또는 95% 이상이 트랜스유전자에 존재하는 인간 생식세포계열 서열에 의해 코딩된다. 그러나, 비-생식세포계열 서열이 체세포 돌연변이 및 VJ 및 VDJ 연결에 의해 도입되기 때문에, 인간 서열 항체는 마우스의 생식세포계열 중의 인간 트랜스유전자(들)에서 발견되는 인간 V, D 또는 J 유전자 분절에 의해 코딩되지 않은 일부 가변성 영역 서열 (및 덜 종종 불변성 영역 서열)을 종종 가질 것이다. 전형적으로, 이러한 비-생식세포계열 서열 (또는 개개의 뉴클레오티드 위치)은 CDR 중에 또는 주변에, 또는 체세포 돌연변이가 연속 발생 (cluster )되는 것으로 공지된 영역 중에 연속 발생될 것이다.
예비결정된 항원에 결합하는 인간 항체는 이소타입 전환으로부터 발생하여 인간 서열 γ쇄 (예컨대 γ1, γ2a, γ2B 또는 γ3) 및 인간 서열 경쇄 (예컨대, 카파)를 포함하는 인간 항체를 생산할 수 있다. 이러한 이소타입-전환된 인간 항체는 친화성 성숙 및 항원에 의한 B 세포의 선별, 특히 이어지는 2차 (또는 차후) 항원 접종의 결과로서 전형적으로 가변성 영역 중의 및 종종 CDR의 약 10 잔기 중의 또는 내에 하나 이상의 체세포 돌연변이(들)을 종종 함유한다. 이들 고 친화성 인간 항체는 10-7M 미만, 예컨대 10-8M 미만, 심지어 10-9M 또는 10-1M 이하의 결합 친화도 (KD)를 가질 수 있다.
본 발명의 또다른 측면은 본원에 상술된 트랜스제닉 또는 염색체이전 마우스로부터 유도된 B 세포를 포함한다. B 세포는 인간 IL-15에 대한 고 친화성 (예컨대, 10-7M 미만)으로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현하는 하이브리도마를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 또다른 실시양태에서, 본 발명은 인간 IL-15 결합에 대해 재조합 인간 IL-15를 분석물로서 사용하고 항체를 리간드로서 사용하며 BIACORE 3000 인스트루먼트 중의 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술로 측정하는 경우 10-7M 미만, 예컨대 10-8M 미만, 심지어 10-9M 또는 10-1M 이하의 친화도 (KD)를 갖는 인간 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공하며, 여기서 항체는
(1) 인간 VL유전자 분절 및 인간 JL분절에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열에 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변성 영역 및 (2) 인간 CL유전자 분절에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열에 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 불변성 영역으로 이루어진 인간 서열 경쇄; 및
(1) 인간 VH유전자 분절, 임의로 D 영역 및 인간 JH분절로 코딩되는 폴리펩티드 서열에 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변성 영역, 및(2) 인간 CH유전자 분절에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열에 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 불변성 영역으로 이루어진 인간 서열 중쇄로 이루어진다.
IL-15에 대한 고 친화성 인간 모노클로날 항체의 발생은 통합된 인간 면역글로불린 트랜스유전자를 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 마우스 중의 인간 가변성 영역 유전자 분절의 레퍼토리 확장 방법으로 촉진될 수 있으며, 상기 방법은 상기 통합된 인간 면역글로불린 트랜스유전자에 존재하지 않는 V 영역 유전자 분절을 포함하는 게놈 V 유전자 트랜스유전자 내로의 도입을 포함한다. 종종, V 영역 트랜스유전자는 인간 VH또는 VL(VK) 유전자 분절 정렬의 부위를 포함하는 효모 인공 염색체인데, 인간 게놈에서 천연 발생할 수 있거나 또는 재조합 방법으로 개별적으로 모두 스플라이싱되어 순서가 바뀌거나 또는 생략된 V 유전자 분절을 포함할 수 있다. 종종 5 개 이상의 기능적인 V 유전자 분절은 YAC 상에 함유된다. 이 변화에서, V 레퍼토리 확장 방법으로 생산된 트랜스제닉 마우스를 생산할 수 있으며, 여기서 마우스는 V 영역 트랜스유전자 상에 존재하는 V 영역 유전자 분절에 의해 코딩되는 가변성 영역 서열 및 인간 Ig 트랜스유전자 상에 코딩된 C 영역을 포함하는 면역글로불린 쇄를 발현한다. V 레퍼토리 확장 방법으로, 5 개 이상의 별개의 V 유전자를 갖는 트랜스제닉 마우스를 생산하고; 약 24 개 이상의 V 유전자를 함유한 마우스를 생산할 수도 있다. 일부 V 유전자 분절은 비-기능적인 (예컨대, 위유전자 등)일 수 있는데; 이들 분절은 필요한 경우 당업자에게 이용될 수 있는 재조합 방법으로 보유되거나 또는 선택적으로 삭제될 수 있다.
마우스 생식세포계열이 J 및 C 유전자 분절을 포함하는 인간 Ig 트랜스유전자에 실질적으로 존재하지 않는 확장된 V 분절 레파토리를 갖는 기능적 YAC를 포함하도록 조작되기만 하면, 이 형질을 증식시킬 수 있고, 확장된 V 분절 레파토리를 갖는 기능적 YAC가 상이한 인간 Ig 트랜스유전자를 갖는 마우스 생식세포계열로 육종하는 배경을 포함하여 다른 유전적 배경으로 육종할 수 있다. 확장된 V 분절 레파토리를 갖는 다수개의 기능적 YAC를 생식세포계열 내로 육종시켜 인간 Ig 트랜스유전자 (또는 다수개의 인간 Ig 트랜스유전자)와 함께 작동하게 할 수 있다. 본원에서는 YAC 트랜스유전자로 명명하지만, 이러한 트랜스유전자는 게놈으로 통합될 때 실질적으로 효모 서열, 예컨대 효모에서 자율적 복제에 요구되는 서열이 결핍하고, 이러한 서열은 효모의 복제가 더 이상 필수적이지 않게 된 후(즉, 마우스 ES 세포 또는 마우스 프로지고트(prozygote)로 도입하기 이전에)에 유전적 조작(예를 들어 제한 절단(restriction digestion) 및 펄스장(pulsed-field) 겔 전기영동 또는 다른 적합한 방법)에 의하여 임의적으로 제거될 수 있다. 인간 서열 면역글로불린 발현의 형질을 증식시키는 방법은 인간 Ig 트랜스유전자(들)을 갖는, 그리고 임의적으로 또한 확장 V 분절 레퍼토리를 갖는 기능적 YAC를 갖는 트랜스유전자 마우스를 육종하는 것을 포함한다. VH및 VL유전자 분절은 YAC 위에 존재할 수 있다. 트랜스유전자 마우스를 인간 Ig 트랜스유전자 및(또는) 다른 인간 림프구 단백질을 코딩하는 트랜스유전자를 포함하는 다른 인간 트랜스유전자를 하버링(harboring)하는 배경을 포함하는, 수행자가 바라는 임의의 배경으로 육종할수 있다. 본 발명은 또한 확장된 V 영역 레퍼토리 YAC 트랜스유전자를 갖는 트랜스유전자 마우스에 의하여 생산된 고친화성 인간 서열 면역글로불린을 제공한다. 앞에선 본 발명의 트랜스유전자 동물의 바람직한 양태를 기술하였지만, 다음의 4가지 카테고리 내에 분류되는 다른 양태를 고려할 수 있다.
I. 재배열되지 않은 무거운 및 재배열된 가벼운 면역글로불린 트랜스유전자를 포함하는 트랜스유전자 동물;
II. 재배열되지 않은 무거운 및 재배열되지 않는 가벼운 면역글로불린 트랜스유전자를 포함하는 트랜스유전자 동물;
III. 재배열된 무거운 및 재배열되지 않는 가벼운 면역글로불린 트랜스유전자를 포함하는 트랜스유전자 동물; 및
IV. 재배열된 무거운 및 재배열된 가벼운 면역글로불린 트랜스유전자를 포함하는 트랜스유전자 동물.
트랜스유전자 동물의 이들 분류 중에서, 바람직한 것을 순서로 나열하면 내인성 경쇄 유전자 (또는 적어도 K 유전자)가 상동 재조합(또는 다른 방법)에 의하여 유전자탈락(knock out)된 경우 II > I > III > IV의 순서이고, 내인성 경쇄 유전자 유전자 탈락되지 않고 대립유전자 형질배제로 지배되어야 하는 경우 I > II > III > IV의 순서이다.
III. 항체 접합체(Conjugate)/면역독소
다른 관점에서, 본 발명의 특징은 치료 성분, 예컨대 세포독소, 약제(예를 들어 면역억제제) 또는 방사성 동위원소와 접합한 인간 항-IL-15 모노클론성 항체이다. 세포독소와 접합시에, 이들 항체 접합체를 "면역독소"라고 부른다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 해로운(예를 들어 죽이는) 임의의 약품를 포함한다. 예로서 택솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시안트라신 디온, 미톡산트론, 미쓰라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라케인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 푸로마이신 및 이의 유사체와 동족체를 포함한다. 치료제는 항대사물질(예를 들어 메쏘트렉세이트, 6-머캅토푸린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로레싸민, 티오에파 클로람부실, 멜파란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로쏘스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 플래티넘(II)(DDP) 시스플라틴), 안쓰라시클린(예를 들어, 다우노루비신(이전에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미쓰라마이신, 및 안쓰라마이신(AMC), 및 항-유사분열제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 항체는 방사성 동위원소, 예를 들어 방사성 요오드와 접합되어 암과 같은 IL-15 관련 질환의 치료용 세포독성 방사성약물을 생성할 수 있다.
본 발명의 항체 접합체를 이용하여 주어진 생물학적 반응을 변형할 수 있다. 치료 부분은 전통적인 화학 치료제에만 한정되지 않는 것으로 추론된다. 예를 들면, 약물 부분은 원하는 생물적 활성을 갖는 단백질이거나 폴리펩티드일 수 있다.이러한 단백질은 예를 들어 효소적으로 활성인 독소, 또는 이들의 활성 단편, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 엑소톡신 또는 디프테리아 독소; 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ와 같은 단백질; 또는 생물 반응 변형제 예컨대 림포킨, 인터루킨-1("IL-1"), 인터루킨-2("IL-2"), 인터루킨-6("IL-6"), 과립백혈구 대식세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 과립백혈구 콜로니 자극 인자("G-CSF"), 또는 다른 시토킨 또는 성장 인자를 포함한다.
이러한 치료 부분을 항체에 접합하기 위한 기술은 공지되어 있고 예를 들어 문헌[Arnon et al.,"Monoclonal Antibodies ForImmunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy], 문헌[Reisfeld et al. (eds. ), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)]; 문헌[Hellstrom et al.,"Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.)], 문헌[Robinson et al. (eds. ), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)]; [Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies'84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985);"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy], 문헌[Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)], 및 문헌[Thorpe et al.,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. , 62: 119-58 (1982)]을 참조한다.
IV. 제약 조성물
다른 측면으로, 본 발명은 조성물, 예를 들어 제약적으로 허용되는 담체와 함께 제제화된 본 발명의 인간 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부의 하나 또는 조합을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 바람직한 태양으로, 이 조성물은 복수(예를 들어 2개 이상)의 단리된 본 발명의 인간 항체의 조합을 포함한다. 바람직하게는, 조성물의 항체 각각이 별개의, 먼저 선택된 IL-15의 에피토프에 결합한다.
본 발명의 제약 조성물은 다른 약품와 함께 하는 병행 치료로 투여될 수 있다. 예를 들어, 병행 치료는 적어도 본 발명의 조성물을 하나 이상의 추가의 치료제, 예컨대 항염증제, DMARD(질병 조절 항류마티스 약), 면역억제제, 화학요법제, 및 건선제와 함께 포함할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물을 방사선 요법과 결합하여 투여할 수 있다. 다른 항체, 예컨대 CD4 특이 항체 및 IL-2 특이 항체와 함께 하는 동시투여도 또한 본 발명에 포함된다. 이러한 CD4 특이 항체 또는 IL-2 특이 항체와의 결합은 특히 자기면역 질병 및 이식 거부반응을 치료하는데 유용하다고 여겨진다.
본원에서 사용되는 "제약적으로 허용되는 담체"란 생리학적으로 적합성인 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제, 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 상피 투여(예를 들어 주사 또는 주입)에 적합하다. 투여의 경로에 따라서 활성 화합물, 즉 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산의 작용으로부터 및 다른 천연 조건으로부터 화합물을 보호해 주는 물질로 피복될 수 있다.
"제약적으로 허용되는 염"이란 모체 화합물의 원하는 생물적 활성을 보유하고 임의의 바람직하지 않는 독성 효과를 주지 않는 염을 의미한다 (예를 들어 문헌 [Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19] 참조). 이들 염의 예로서 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 비독성 무기산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등 및 비독성 유기산, 예컨대 지방족 일카르복시 및 이카르복시산, 페닐 치환된 알칸산, 히드록시 알카노익산, 방향족산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유도된 것들을 포함한다. 염기 부가염으로 알칼리 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등 및 비독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유도된 것들을 포함한다.
본 발명의 조성물은 당업계에서 알려진 다양한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 당업자에게 잘 알려져 있듯이, 투여 경로 및(또는) 방식은 원하는 결과에 따라서 다양할 수 있다. 활성 화합물을 이 화합물이 급격하게 방출되는 것을 막아주는 담체, 예컨대 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 방출 조절 제제와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르쏘에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 폴리머를 사용할 수 있다. 이러한 제제를 제조하는 많은 방법이특허되었거나 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson,ed., Marcel Dekker, Inc. , New York, 1978]을 참조한다.
본 발명의 화합물을 어떤 투여 경로에 의하여 투여하기 위해서는, 불활성화를 막아주는 물질로 화합물을 피복하거나 그러한 물질과 화합물을 동시투여하는 것이 필요하다. 예를 들어, 본 화합물을 적당한 담체 예를 들어 리포솜, 또는 희석제 내에서 대상에게 투여할 수 있다. 제약적으로 허용되는 희석제는 염수 및 수성 완충용액을 포함한다. 리포솜은 통상적인 리포솜 뿐 아니라 물-오일-물(water-in-oil-in-water) CGF 유화액을 포함한다 (Strejan et al. (1984)J. Neuroimmunol. 7: 27).
제약적으로 허용되는 담체는 살균 수용액 또는 분산액 및 살균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 살균 분말을 포함한다. 제약적으로 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 약품의 용도는 당업계에서 공지되어 있다. 통상적인 매질 또는 약품이 활성 화합물과 상용되는 한, 본 발명의 제약 조성물에서 이들의 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물도 조성물에 혼입될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로 살균되어야 하고, 제조 및 보관 조건하에서 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로유화액, 리포솜 또는 고약물 농도에 적합한 다른 규칙적인 구조로 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 적합한 이들의 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어 레시틴과같은 피복을 사용하여, 분산의 경우 필요한 입자 크기를 유지하여, 및 계면활성제를 사용하여 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 많은 경우에서, 조성물 내에 등장제, 예를 들어 설탕, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직하다. 흡수를 늦추는 약품, 예를 들어 모노스테아레이트염 및 젤라틴을 조성물 내에 포함시킴으로써 주사용 조성물의 장시간 흡수를 유발할 수 있다.
활성 화합물의 필요양을 상기 열거한 성분의 하나 또는 조합과 함께 적합한 용매 내에 혼입하고 필요하다면 다음에 살균 마이크로여과함으로써 살균 주사용액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 활성 화합물을 기본 분산 매질 및 앞서 나열한 것들로부터의 요구되는 다른 성분들을 포함하는 살균 부형제에 혼입함으로써 분산액을 제조한다. 살균 주사용액의 제조에 사용되는 살균 분말의 경우, 앞서 살균-여과한 이들의 용액으로부터 임의의 추가 원하는 성분을 더한 활성 성분의 분말을 제공하는 진공 건조 및 냉동건조(동결건조)가 바람직한 제조 방법이다.
투여계획을 조절하여 최적의 소기의 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공한다. 예를 들어, 단일 환약을 투여할 수 있고, 여러개로 나눈 투여량을 시간마다 투여하거나 또는 투여량을 치료 상태의 사정에 따라 지시되는 바와 같이 비례적으로 줄이거나 증가할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 인간 항체를 피하 주사로써 일주에 한번 또는 두번 투여할 수 있거나, 피하 주사로 한달에 한번 또는 두번 투여할 수 있다. 투여의 용이함과 투여량의 균일을 위하여 비경구 조성물을 단위 투여형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서의 단위 투여형태란 치료받을대상에 대한 단일투여로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하고 각 단위는 필요한 제약학적 담체와 함께 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 단위 투여형태에 대한 조건은 (a) 활성 화합물의 특이한 특성 및 얻고자 하는 특별한 치료 효과 및 (b) 개체에 민감성을 치료하기위한 상기 활성 화합물을 컴파운딩하는 당업계의 고유의 제한에 의해 나타내거나 좌우된다.
제약적으로 허용되는 항산화제의 예로서 (1) 수용성 항산화제, 예를 들어 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 소듐 비술페이트, 소듐 메타비술파이트, 소듐 술파이트 등, (2) 오일가용성 항산화제, 예를 들어 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔(BHA), 부틸화 히드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등, 및 (3) 금속 킬레이팅제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
치료 조성물에 대하여, 본 발명의 제제는 경구, 비강, 국부(구강, 및 설하를 포함하여), 직장, 질 및(또는) 비경구 투여에 적합한 것들을 포함한다. 제제는 단위 투여 형태로 알맞게 제공될 수 있고 약업계에서 공지된 임의의 방법에 의하여 제조될 수 있다. 단위 투여 형태를 제조하기 위한 담체 재료와 합할 수 있는 활성 성분의 양은 치료하는 대상 및 특정한 투여하는 방식에 따라 변할 수 있다. 담체 재료와 합하여 단일 투여 형태를 제조할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 만드는 조성물의 양일 수 있다. 일반적으로, 100 퍼센트로 볼 때, 이 양은 약 0.001 퍼센트 내지 약 90 퍼센트의 활성 성분, 바람직하게는 약 0.005 퍼센트 내지 약 70 퍼센트, 아주 바람직하게는 약 0.01 퍼센트 내지 약 30 퍼센트 범위일 수 있다.
질 투여에 적합한 본 발명의 제제는 또한 당업계에서 적합한 것으로 공지된 바와 같은 상기 담체를 포함하는 질좌약, 탐폰, 크림, 젤, 패이스트, 포옴 또는 스프레이 제제를 포함한다. 본 발명의 조성물의 국소 또는 경피 투여용 투여 형태는 분말, 스프레이, 연고, 패이스트, 크림, 로션, 젤, 용액, 패치, 및 흡입제를 포함한다. 이 활성 화합물은 살균 조건에서 제약적 허용되는 담체와 및 요구될 수 있는 임의의 방부제, 완충제, 또는 포사제와 함께 혼합될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여되는"이란 장내 및 국부 투여 이외의 투여 방식, 보통 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 제한 없이 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피막내, 안와내, 심장내, 진피내, 복막내, 경기관(transracheal), 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지망막하, 척수내, 경막외, 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물로 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예로서 물, 에탄올, 폴리올(예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 적합한 이의 혼합물, 야채 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 예를 들어, 레시틴과 같은 피복 재료를 사용하는 것, 분산의 경우 요구되는 입자의 크기를 유지하는 것 및 계면활성제를 사용함으로써 적합한 유동성을 유지할 수 있다.
이들 조성물은 또한 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 미생물의 존재의 방지는 앞에서의 살균 과정에 의하여 및 여러가지 항박테리아 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 포함에 확실히 할 수 있다. 또한 등장제 예컨대 설탕, 염화나트륨 등을 조성물에 포함하게 하는 것이 바람직하다. 게다가 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 늦추는 약품의 포함에 의하여 주사가능한 제약 형태가 장시간 흡수될 수 있게 한다.
본 발명의 화합물이 제약으로 인간 및 동물에게 투여될 때, 단독으로 또는 예를 들어 0.001 내지 90%(더 바람직하게는, 0.01 내지 30%와 같이 0.005 내지 70%)의 활성성분을 제약적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물로서 제공할 수 있다.
선택하는 투여경로에 무관하게, 본 발명의 화합물은 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있고(거나) 본 발명의 제약 조성물을 당업자에게 공지된 통상의 방법에 의하여 제약적으로 허용가능한 투여 형태로 제제화된다.
본 발명의 제약 조성물내의 활성 성분의 실제 투여량은 환자에게 독성이 되지 않으면서 특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 얻기에 효과적인 활성 성분의 양을 얻도록 다양할 수 있다. 선택된 투여량은 사용되는 본 발명의 특정 조성물, 이들의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여시간, 사용되는 특정 화합물의 분비속도, 치료의 기간, 사용되는 특정 조성물과 함께 사용되는 다른 약, 화합물 및(또는) 물질, 치료받는 환자의 성별, 나이, 몸무게, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 병력 및 의약업계에서 잘 공지되어 있는 여러 인자들을 포함하는 다양한 약물 동태 인자에 의존할 수 있다. 당업계에서 통상의 기술을 갖고 있는 의사 또는 수의사는 필요한 제약 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 제약 조성물에 사용되는 본 발명의 화합물의 투여량을 원하는 치료 효과를 얻기 위해 요구되는 양보다 적은 양에서 시작하여 원하는 효과를 얻을 때까지 점차로 투여량을 증가할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적합한 일일 투여량은 치료 효과를 얻기에 효과적인 최소량인 화합물의 양일 수 있다. 이러한 유효량은 일반적으로 앞서 서술한 인자들에 의존한다. 투여가 정맥내로, 근육내, 복막내, 또는 피하로 투여되는 것, 바람직하게는 목표 위치에 인접하게 투여하는 것이 바람직하다. 원한다면, 치료 조성물의 일일 유효량은 임의적으로 단위 투여형태로 하루 종일 적당한 간격으로 별개로 투여되는 두번, 세번, 네번, 다섯번, 여섯번 또는 더많은 세분 투여량, 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물이 단독으로 투여될 수 있지만, 제약 제제(조성물)로 화합물을 투여하는 것이 바람직하다.
치료 조성물을 당업계에서 공지된 의료장비를 사용하여 투여할 수 있다. 예를 들면, 바람직한 태양으로, 본 발명의 치료 조성물을 무바늘 피하 주사 장비, 예컨대 미국 특허 제 5,399,163, 5,383,851, 5,312,335, 5,064,413, 4,941,880, 4,790,824, 또는 4,596,556호에 개시되어 있는 장비로 투여할 수 있다. 본 발명에 유용한 공지된 임플랜트 및 모듈의 예로 조절된 속도로 약물을 분배하기 위한 이식가능한 마이크로-주입 펌프를 개시하고 있는 미국 특허 제 4,487,603호; 피부를 통하여 약물을 투여하기 위한 치료 장치를 개시하고 있는 미국 특허 제 4,486,194호;약을 정확한 주입속도로 전달하기 위한 약물 주입 펌프를 개시하고 있는 미국 특허 제 4,447,233호; 연속적인 약물 전달을 위한 가변 유량 이식가능 주입 장치를 개시하고 있는 미국 특허 제 4,447,224호; 다중챔버 격실을 갖는 삼투적 약물 전달 체계를 개시하는 미국 특허 제 4,439,196호; 및 삼투적 약물 전달 체계를 개시하고 있는 미국 특허 제 4,475,196호를 포함한다. 상기 다른 임플랜트, 전달 체계 및 모듈의 다수가 당업자에게 공지되어 있다.
몇몇 태양에서는, 본 발명의 인간 모노클로날 항체를 제제화하여 생체내에서 적절한 분포를 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 혈관-뇌 문맥(BBB)는 많은 매우 친수성 화합물을 배제한다. 본 발명의 화합물이 (필요하다면) BBB를 통과하게 하기 위하여, 예를 들어 리포솜에서 제제화될 수 있다. 리포솜을 제조하는 방법으로, 예를 들어 미국 특허 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331을 참조한다. 리포솜은 선택적으로 특이적 세포 또는 기관으로 운반되는 하나 또는 그보다 많은 잔기를 포함할 수 있고, 따라서 목적으로 하는 약물 전달을 증대할 수 있다 (예를 들어 문헌[V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol.] 참조). 예시적인 표적 잔기로 엽산염 또는 바이오틴(예를 들어 로 등에게 허여된 미국 특허 5,416,016 참조); 만노시드(문헌[Umezawa etal., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038]); 항체(문헌[P. G. Bloemanet al. (1995)FEBS Lett. 357: 140; M. Owais etal. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180 29: 685]); 계면활성제 단백질 A 수용체 (이들의 다른 종들이 본 발명의 분자의 성분 뿐만 아니라 본 발명의 제제를 포함할 수 있다) (문헌[Briscoe et al. (1995)Am. J Physiol. 1233: 134)]; pl20 (문헌[Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090)을 들 수 있고; 또한 문헌[K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994)FEBSLett. 346: 123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994)Immunomethods 4: 273]을 참조할 수 있다. 본 발명의 한 태양에서는, 본 발명의 치료 화합물은 리포솜에서 제제화되고, 더욱 바람직한 태양에서는, 리포솜은 표적하는 잔기를 포함한다. 더욱 더 바람직한 태양에서는, 리포솜의 치료 화합물은 감염 또는 종양에 인접한 위치로 순간 주사에 의하여 전달될 수 있다. 조성물은 용이하게 주사할 수 있을 정도로 유체이어야 한다. 제조 및 저장의 조건하에서 안정해야 하고 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대하여 보존되어야 한다.
류마티스성 관절염에 대한 "치료 유효 투여량"은 바람직하게 환자에게 ACR20 예비 개선 정의(ACR20 Preliminary Definition of Improvement)를 야기하고, 더 바람직하게는 ACR50 예비 개선 정의를, 더욱 더 바람직하게는 ACR70 예비 개선 정의를 야기할 수 있다.
ACR20 예비 개선 정의란 압통 관절계수(Tender Joint Count, TCJ) 및 부종 관절 계수(Swollen Joint Count, SWJ)에서 ≥20%의 개선 및 다음의 5가지 평가 즉 환자의 고통 평가(Patient Pain Assessment)(VAS), 환자의 전반적 평가(Patient Global Assessment)(VAS), 의사의 전반적 평가(Physician Global Assessment)(VAS), 환자 자기-평가 장애(Patient Self-Assessed Disability)(HAQ), 급성기 반응물질(Acute Phase Reactant)(CRP 또는 ESR) 중 3가지에서 ≥20%의 개선으로 정의된다.
ACR50 및 ACR70은 각각 동일한 방식으로 ≥50% 및 ≥70%의 개선으로 정의된다. 더 추가적인 세부내용은 문헌 [Felson et al. in American College of Rheumatology Preliminary Definition of Improvement in Rheumatoid Arthritis; Arthritis Rheumatism (1995) 38: 727-735]을 참조한다.
본 발명의 화합물의 암을 억제하는 능력은 인간 종양 내에서 효능을 갖는 것으로 예측되는 동물 모델 시스템에서 사정될 수 있다. 별법으로, 조성물의 이러한 성질을 화합물의 억제하는 능력, 예를 들면 시험관 내 억제를 숙련된 실시자에게 공지된 분석으로 조사함으로 사정할 수 있다. 치료 화합물의 치료 유효량은 종양 크기를 감소할 수 있거나, 그렇지 않으면 대상의 징후를 완화할 수 있다. 당업자는 대상의 크기, 대상 징후의 심각도, 및 특정한 조성물 또는 선택된 투여 경로와 같은 인자에 근거하여 상기 양을 결정할 수 있을 것이다.
항체가 건선을 치료하거나 방지하는 능력도 당업계에서 잘 공지된 방법에 의하여 사정할 수 있다.
조성물은 살균되어야 하고, 조성물이 주사기에 의하여 전달가능한 정도로 유체여야 한다. 물 외에 또, 담체는 등장성 완충 염수용액, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적합한 혼합물일 수 있다. 예를 들어 레시틴과 같은 피복을 사용하여, 분산의 경우 필요한 입자 크기를 유지함으로, 및 계면활성제를 사용하여 적합한 유동성을 유지할 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 설탕, 폴리알콜 예컨대 만니톨 또는 소르비톨 및 염화나트륨을 조성물 내에 포함하는 것이 바람직하다. 주사가능 조성물의장기간 흡수는 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 약품을 조성물에 포함시킴으로써 발생하게 할 수 있다.
앞서 기술한 바와 같이 활성 화합물이 적합하게 보호될 경우, 화합물은 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체와 함께 경구로 투여될 수 있다.
V. 본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 IL-15에 대한 인간 항-IL-15 항체(항체의 유도체 및 접합체를 포함함) 및 항체를 포함하는 조성물을 다양한 생체내 및 생체외 진단 및 치료 분야에 사용할 수 있다.
한 태양으로서, 본 발명의 인간 항체를 T 세포 및(또는) 단핵구/대식세포에 의한 IL-15 유도 TNFα 생성을, 바람직하게는 IL-2와 같은 다른 사이토킨에 의해 유도되는 TNFα 생성을 억제하지 않으면서, 억제하는 데 사용한다. 항체를 IL-15로 접촉함으로써 (예를 들어 항체를 대상에 투여함으로써), IL-15 수용체를 통하여 신호전달하는 IL-15의 능력이 억제되고 따라서 T 세포 및(또는) 단핵구/대식세포에 의한 TNFα의 생성도 억제된다. 바람직한 항체는 IL-15에 특이적인 에피토프(예를 들어 특이한 서브유닛, 예컨대 감마 서브유닛)에 결합하고, 따라서 유리하게 IL-15 유도 TNFα 생성을 억제하나 구조적으로 관련된 사이토킨, 예컨대 IL-2에 의한 TNFα 생성은 방해하지 않는다.
다른 태양으로, 본 발명의 인간 항체는, 바람직하게는 IL-2와 같은 다른 구조적으로 관련된 사이토킨에 의해 유도되는 T 세포 증식을 억제하지 않고서, IL-15 유도 T 세포 점증 및(또는) 증식을 억제하는데 사용된다. TNFα 생성에서와 같이, 항체를 IL-15에 접촉시킴으로써(예를 들어 항체를 대상에 투여함으로써), IL-15 수용체를 통하여 신호전달하는(signaling) IL-15의 능력이 억제되고 따라서 IL-15에 의한 T 세포 자극이 억제된다.
따라서, 다른 태양으로서, 본 발명은 대상에게 본 발명의 인간 항체를 질환을 치료 또는 방지하는 유효량으로 투여함으로써 IL-15에 의하여 매개되는 질환(예를 들어, 자가면역 질환, 예컨대 건선, 류마티스성 관절염, 또는 염증성 장 질환, 또는 HIV와 같은 감염성 질환)을 치료 또는 방지하는 방법을 제공한다. 항체는 단독으로 또는 다른 치료제, 예를 들어 스테로이드 또는 비스테로이드 항염증제와 같은 항염증제, 또는 IL-15 매개 질환을 치료 또는 방지하는 항체와 함께 또는 상승작용적으로 작용하는 세포독소와 함께 투여될 수 있다.
특정 태양으로는, 본 발명의 인간 항체는 류마티스성 관절염(RA)를 치료 또는 방지하는데 사용된다. 이 항체는 IL-15가 RA와 같은 질병과 관련된 염증의 진행에 담당하는 역할을 제한시킨다. T 세포, 특히 CD4+ T-헬퍼(T-helper) 세포가 RA에서 염증성 진행의 개시 및 유지에 관련이 있다. TNF-α, 다른 사이토킨은 결국은 RA가 있는 환자의 관절의 파괴 및 무능력화로 이끄는 염증 경로에 관련이 있다. IL-15의 국소 합성은 T 세포의 활성화 및 점증 및 TNFα 및 다른 염증성 사이토킨의 유도 모두에서 중요한 역할을 담당한다. RA의 진행에서의 IL-15의 역할은 대식세포에 의하여 합성된 IL-15가 T세포 점증을 유도하는 과정과 관련이 있다. 다음에 활성화된 T 세포는 (1) 대식세포의 활성을 유지하고, (2) TNF-α 생성을 유도한다. 자극된 대식세포는 더많은 IL-15의 합성 및 T 세포 활성화를 촉진시키고,따라서 사이클이 계속된다. TNF-α 및 대식세포에 대한 영향 외에 또, IL-15는 또한 호중구를 활성화시키고 국소 B 세포 면역글로불린 분비, 특히 류마티스성 인자 합성에 영향을 준다.
따라서, 본 발명의 항-IL-15 항체를 사용하여 RA를 야기하는 앞선 IL-15의 효과를 방지 또는 차단할 수 있고 따라서 이들 질병을 방지 또는 치료하는 데 이용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-IL-15 항체는 염증을 억제하고(거나) RA에 연루된 활성화된 백혈구의 화학주성을 방지하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 인간 항체는 메토트렉세이트에 대한 부적합한 반응을 갖는 류마티스성 관절염을 겪는 환자의 구조적 손상의 진행을 억제하는 데 또는 징후와 증상을 감소하고 이전에 DMARD로 치료하여 실패하지 않는 환자를 포함하여 중간 내지 심각하게 활성인 류마티스 관절염에 걸린 환자의 구조적 손상을 지연하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 인간 항체는 또한 IL-15의 다른 효과를 억제하거나 차단하는데 사용될 수 있다. IL-15는 단핵구 및 대식세포, 섬유아세포, 수지상세포, 및 각질세포를 포함하는 다양한 세포 및 조직에서 발현된다. 각질세포는 점막 조직의 표피 및 상피 내면의 주요 구성성분이다. 각질세포 성장의 제어는 사이토킨 및 성장 인자의 복잡한 네트워크에 의하여 중개되고, 이들 일부는 각질세포 자체에 의하여 생성된다. 각질세포로부터 유도된 IL-15는 T 세포 축적, 증식, 및 건선 플라크에서의 생존에 기여한다. 각질세포의 수가 증가되고 이로 인해 관련된 질병 징후들의 일부의 원인인 표피 과다증식증으로 이르는 많은 질병이 알려져 있다. 이들 질병은 만성 질병 예컨대 건선 및 아토피성 피부염 및 만성 손 습진, 접촉 피부염, 바이러스성 사마귀(HPV 관련), 피부 T 세포 임파종, 손상된 상처 회복, 예컨대 당뇨병에 기인한 손상된 상처 회복과 같은 이상을 포함한다. 따라서 본 발명은 본 발명의 인간 항-IL-15 항체를 질환을 치료 또는 방지하는 유효량으로 환자에 투여함으로써 상기 질병을 치료 또는 방지하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 항-IL-15 항체를 건선의 이상각화증을 차단 또는 억제하고, 건선의 표피 두께를 감소하고 건선에서 각질세포의 증식을 감소하는 데 사용할 수 있다.
IL-15는 또한 장 상피 세포의 기능을 조절한다 (문헌[Reinecker, et al. (1996) Gastroenterology111 : 1706-13]). 구체적으로, IL-15는 점막 상피 세포 및 장 상피 세포주의 변형을 야기할 수 있고, 따라서 염증성 장 질환, 예를 들어 복강 질환의 병인과 연관이 있다. 상기 질병에서 IL-15의 역할은 복강 질환에 걸린 비치료 환자의 소장에서의 IL-15+ 세포의 선택적인 과-표현(over-presentation)에 의해서 보여진다 (WO 00/02582). 따라서, IL-15는 복강 질병의 개시 및 유지에 직접적으로 관련이 있다고 보여진다. 따라서, 다른 태양으로는, 본 발명의 항-IL-15 인간 항체(즉, IL-15의 염증을 향한 효과를 억제하는)를 질환을 치료 또는 방지하는 유효량으로 환자에게 항체를 투여함으로써, 복강 질병을 치료 및(또는) 방지하는데 사용할 수 있다.
게다가, 본 발명의 발명자는 IL-15가 또한 새로운 혈관의 형성, 즉 신혈관화 또는 혈관생성이라고 불리는 과정을 촉진한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 항체에 대한 또다른 용도는 신혈관화와 관련된 질병의 치료 또는 방지를 포함한다. 이들 질병은 염증 질병 외에 또 신혈관화로 특징되거나 또는 이에 의존하는 각종 암을 포함한다.
본 발명의 인간 항체는 또한 HIV와 같은 감염성 질병과 관련된 IL-15의 효과를 억제 또는 차단하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체의 다른 용도는 예를 들어 HIV-1과 같은 감염성 질병의 치료 또는 방지를 포함한다.
예를 들어, 항체는 생체 내에서 또는 시험관 내에서 IL-15에 의해 매개되는 다수의 질병을 진단하는 데 사용될 수 있다. 구체적으로, 항체를 사용하여 IL-15의 양, 또는 그들의 막표면에 있는 또는 그들의 수용체에 연결된 IL-15(수용체 결합된 인간 IL-15)를 포함하는 세포의 양을 검출할 수 있다. 상기 IL-15의 양의 검출은 일정 질병 징후와 상호관련될 수 있다. 별법으로는, 항체는 IL-15 기능을 억제 또는 차단하는데 사용할 수 있고, 이것은 다시 IL-15 기능에 의하여 야기되는 질병 징후를 방지 또는 완화할 수 있다.
앞서 기술하였듯이, 본 발명의 인간 항-IL-15 항체는 하나 이상의 치료제, 예를 들어 면역억제제 또는 항염증제와 동시투여되어 전반적인 항염증 효과를 증가시킬 수 있다. 항체가 이 약제에 결합될 수 있거나 (면역복합체로서) 또는 약제와 별도로 투여될 수 있다. 후자의 경우(별도 투여), 항체를 그 약제와 동시에, 이전에, 또는 이후에 투여할 수 있다. 적합한 치료제는 특히 항염증제, DMARD (질병 조절 항류마티스 약물), 면역억제제, 화합요법제, 및 건선제를 포함한다. 본 발명에 따른 인간 항체를 방사선 요법과 함께 투여할 수 있다.
다른 태양으로, 본 발명의 인간 항체를 다른 항체, 예컨대 CD4 특이적 항체및 IL-2 특이 항체와 함께 투여할 수 있다. 본 인간 항체와 CD4 특이적 항체 또는 IL-2 특이적 항체의 조합은 자기면역 질병 및 이식 거부반응을 치료하는 데 특히 유용하다고 여겨진다.
본 발명의 인간 항-IL-15 항체 및 임의로 사용 지침서를 포함하는 키트도 본 발명의 범위 내의 것이다. 키트는 추가로 하나 이상의 추가 약품, 예컨대 면역억제제 또는 하나 이상의 추가의 본 발명의 인간 항체(예를 들어 제 1 인간 항체와 구별되는 IL-15 항원 내의 에피토프와 결합하는 상보적 활성을 갖는 인간 항체)를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체로 치료된 환자에게 인간 항체의 치료 효과를 증대 또는 증강하는 다른 치료제, 예컨대 항염증제를 추가적으로 투여할 수 있다 (본 발명의 인간 항체의 투여 이전에, 동시에 또는 다음에).
또 다른 태양으로서, 본 발명의 인간 항체는 상기 화합물을 항체에 연결함으로써 세포 표면 예를 들어 세포막에 결합되거나 IL-15 수용체에 결합된 IL-15을 갖는 세포에 화합물(예를 들어, 치료제, 표지, 세포독소, 면역억제제 등)을 표적으로 하는데 사용할 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 또한 IL-15 및 IL-15 수용체를 발현하는 세포를 생체 내에서, 생체 외에서, 또는 시험관 내에서 국소화하는 방법을 제공한다 (예를 들어, 검출가능한 표지, 예컨대 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자로).
본 발명의 다른 태양은 다음의 실시예에서 기술한다.
본 발명은 추가로 다음의 실시예로 설명하나 이를 추가로 한정하는 것으로여겨서는 안된다. 서열 목록, 도면의 수록 및 본 출원에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 간행된 특허공보이 내용은 참고로 본원에 명백히 인용되어 있다.
실시예 1 : Cmu 표적화한 마우스의 생성
CMD 표적벡터의 제작
플라스미드 pICEmu는 Balb/C 게놈 람다 파지 라이브러리로부터 얻은 mu 유전자를 걸친(spanning) 쥐 Ig 중쇄 유전자좌의 EcoRI/XhoI 단편을 함유한다 (Marcuet al. Cell 22 : 187,1980). 이 게놈 단편을 플라스미드 pICEMI9H의 XhoI/EcoRI 위치 내로 서브클로닝하였다 (Marsh et al; Gene 32, 481-485,1984). pICEmu 내에 포함되어 있는 중쇄 서열들은 mu 인트론 인핸서의 바로 3' 에 위치한 EcoRI 위치의 하류를 mu 유전자의 마지막 막횡단 엑손의 대략 1kb 하류쪽에 위치한 XhoI 위치까지 확장된다. 그러나 mu 전환 반복 영역의 많은 부분이 이. 콜라이(E. coli) 내에서의 통과에 의해(passage) 삭제된다.
표적 벡터가 다음과 같이 구성된다. 1.3kb HindIII/SmaI 단편을 pICEmu으로부터 잘라내어 HindIII/SmaI 절단 pBluescript (스트라타진(Stratagene), 캘리포니아, 라졸라)내로 서브클로닝하였다 . 이 pICEmu 단편을 Cmu1의 5'의 대략 1 kb 위치한 HindIII 위치에서부터 Cmu1 내에 위치한 SmaI 위치까지 연장되어 있었다. 이로 얻은 플라스미드를 SmaI/SpeI로 절단시키고, Cmu1 3' 내의 Sma I 위치에서부터 마지막 Cmu 엑손의 바로 하류에 위치한 XbaI 위치까지 연장되는 pICEmu로부터의 약 4kb SmaI/XbaI 단편을 삽입하였다. 이로 얻어진 플라스미드, pTAR1을 SmaI 위치에서 선형화하고, 네오 발현 카셋(neo expression cassette)를 삽입하였다. 이 카셋은 마우스 포스포글리세레이트 키나제(pgk) 프로모터(XbaI/TaqI 단편; Adra et al. (1987) Gene 60: 65-74)의 전사 조절 하의 네오 유전자로 구성되어 있고 pgk 폴리아데닐화 위치(PvuII/HindIII 단편; Boer et al. (1990) Biochemical Genetics 28: 299-308)를 포함한다. 이 카셋은 플라스미드 pKJ1로부터 얻었고 (Tybulewicz et al. (1991) Gene 65: 1153-1163), 이로부터 네오 카셋을 EcoRI/HindIII 단편으로 잘라내어 EcoRI/HindIII 절단 pGEM-7Zf(+)로 서브클로닝하여 pGEM-7(KJ1)을 생성한다. 네오 카셋을 EcoRI/SalI 절단에 의하여 EpGEM-7(KJ1)로부터 잘라내고, 끝이 무디게 하고(blunt ended), 플라스미드 pTAR1의 SmaI 위치로 게놈 Cmu 서열이 반대 배향으로 서브클로닝하였다. 이로 얻은 플라스미드를 Not I로 선형화하고, 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제(tk) 카셋을 삽입하여 문헌[Mansour et al. (1988) Nature 336: 348-352] 등에 의하여 기술된 바와 같이 상동 재조합체를 갖는 ES 클론을 풍부하게 한다. 이 카셋은 문헌[Tybulewicz et al. (1991) Cell 65: 1153-1163]에 기술된 바와 같이, 마우스 pgk 프로모터 및 폴리아데닐화 위치로 브랙키트된(bracketed) tk 유전자의 코딩 서열로 구성되어 있다. 이로 얻어진 CMD 표적 벡터는 중쇄 유전자좌와 총 약 5.3kb의 상동성을 갖고, 첫번째 Cmu 엑손의 독특한 SmaI 위치의 네오 발현 카셋이 삽입된 돌연변이 mu 유전자를 생성하도록 계획된다. ES 세포 내로 전기 충격하기 이전에, 표적 벡터를 플라스미드 서열 내에서 절단하는 PvuI로 선형화한다.
표적 ES 세포의 발생 및 분석
AB-1 ES 세포(문헌[McMahon, A. P. and Bradley, A. , (1990) Cell 62: 1073-1085])를 실질적으로 문헌[Robertson, E. J. (1987) in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach (E. J. Robertson, ed. ) Oxford: IRL Press, p. 71-112])에서 기술한 바와 같이 유사분열적으로 불활성의 SNL76/7 세포 공급기 층(같은 책에)에서 성장시킨다. 선형 CMD 표적 벡터를 AB-1 세포 내로 전기충격시켜 넣었다 (문헌[Hasty, P. R. et al.(1991) Nature350 : 243-246]). 전기충격된 세포를 10mm 접시에 1-2×106세포/접시의 밀도로 평판배양하였다. 24시간 후에, G418(활성 성분 200 마이크로그램/ml) 및 FIAU(5×10-7M)를 배지에 첨가하고, 8-9일 동안 내약품성 클론이 발생하게 하였다. 클론을 꺼내고, 트립신처리하고, 2부분으로 나누고 추가로 확장하였다. 각 클론으로부터 유도한 세포의 반을 냉동하고, 다른 반은 벡터와 표적 서열 간의 상동 재조합에 대해 분석하였다.
서던 블럿 이종교배(Southern blot hybridization)에 의하여 DNA 분석을 행하였다. DNA를 문헌[Laird, P. W. etal., (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4293]에서 기술하는 바대로 클론으로부터 단리하였다. 단리된 게놈 DNA를 SpeI로 절단하고, 915 bp SacI 단편, 탐침 A로 탐침하였고(도 1 참조), 이를 mu 인트론 인핸서와 mu 전환 영역 사이의 서열에 혼성화시켰다. 탐침 A는 자연형 유전자좌로부터 9.9kb SpeI 단편을 및 CMD 표적 벡터로 상동 재조합한 mu 유전자좌로부터 특징적인 7.6kb 밴드를 감지한다 (네오 발현 카셋은 SpeI 위치를 함유한다). 서던 블럿 분석에 의해 스크리닝된 1132 G418 및 FIAU 내성 클론 중에, 3개는 mu 유전자좌에서상동 재조합을 나타내는 7.6 kb SpeI 밴드를 나타냈다. 이들 3 클론은 효소 BglI, BstXI, 및 EcoRI로 추가로 절단시켜 벡터가 상동적으로 mu 유전자에 통합되었음을 입증한다. 탐침 A로 혼성화된 경우, BglI, BstXI 또는 EcoRI로 절단된 야생형 DNA의 서던 블럿은 각각 15.7, 7.3, 및 12.5kb의 단편을 생성하고, 반면 표적 mu 대립유전자의 존재는 각각 7.7, 6.6 및 14.3kb의 단편에 의하여 알 수 있다. SpeI 절단에 의해 검출되는 모든 3개의 양성 클론은 네오 카셋의 Cmu1 엑손으로의 삽입 현상을 나타내는 예상된 BglI, BstXI 및 EcoRI 제한 단편을 보여준다.
돌연변이된 mu 유전자를 갖는 마우스의 생성
지정번호 264, 272 및 408인 세개의 표적 ES 클론을 해동하고 브래들리에 의해 기술된 바(문헌[(Bradley, A. (1987) in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach. (E. J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, p. 113-151])와 같이 C57BL/6J 미분화 세포 내로 주입하였다. 주입한 미분화세포를 가임신한 암컷의 자궁으로 이전하고 투입 ES 세포와 숙주 미분화세포로부터 유도된 세포의 혼합물을 나타내는 키메라 마우스를 생성하였다. 키메라에 ES 세포의 기여 정도는 검정 C57BL/6J 배경에 대해 ES 세포주로부터 유도된 아구터 외피 착색의 양으로써 시각적으로 추정할 수 있다. 클론 272 및 408은 단지 낮은 백분율의 키메라를 생성하였으나(즉, 낮은 백분율의 아구티 착색), 클론 264는 높은 백분율의 수컷 키메라를 생성하였다. 이들 키메라를 C57BL/6J 암컷과 교배하여 ES 세포 게놈의 생식세포계열 전달을 나타내는 아구티 자손을 생성하였다. 표적 mu 유전자에 대한 스크리닝을 꼬리 생검(tail biopsy)으로부터의 BglI 절단 DNA의 서던 블롯 분석으로 수행하였다 (ES 세포 DNA의 분석에 대해서는 상기 기술한 바와 같음). 아구티 자손의 약 50%가 15.7kb의 야생형 밴드외에 또한 7.7 kb의 혼성화 BglI 밴드를 나타내었는데 이는 표적 mu 세포의 생식세포계열 전달을 증명해 준다.
mu 유전자의 기능 불활성화에 대한 트랜스유전된 마우스의 분석
네오 카셋의 Cmu1로의 삽입이 Ig 중쇄 유전자를 불활성화하는지를 결정하기 위하여, 클론 264 키메라를 JH 유전자 분절의 결실의 결과 중쇄의 발현을 불활성화하는 JHD 돌연변이화를 위해 동형접합인 마우스와 교배하였다(Chen 등 (1993) Immunol, 5:647-656). 네개의 아구티 자손을 생성하였다. 1달 나이인 이들 동물로부터 혈청을 얻었고 쥐 IgM의 존재에 대해 ELISA로 분석하였다. 4 자손 중 2개가 완전히 IgM이 결핍되었다 (표 1 참조). BglI 절단 및 탐침 A로 혼성화 (도 1 참조) 및, StuI 절단 및 475 bp EcoRI/StuI 단편 (같은 곳 참조)으로 혼성화하여 꼬리 생검한 DNA를 서든 블롯 분석한 4 동물의 유전자형은 혈청 IgM를 발현하지 못한 동물들은 중쇄 유전자좌의 한 대립유전자가 JHD 돌연변이를 갖고 있고, 다른 대립유전자는 Cmu1 돌연변이를 갖고 있는 것임을 증명한다. JHD 돌연변이를 위해 이형접합된 마우스는 야생형 수준의 혈청 Ig를 보여준다. 이들 데이터는 Cmu1 돌연변이가 mu 유전자의 발현을 불활성화한다는 것을 증명해 준다.
마우스 혈청 IgM(마이크로그램/ml) Ig H 사슬 유전자형
42 < 0.002 CMD/JHD
43 196 +/JHD
44 < 0.002 CMD/JHD
45 174 +/JHD
129 x BL6 F1 153 +/+
JHD < 0.002 JHD/JHD
표 1은 CMD 및 JHD 변이 둘다를 갖는 쥐(CMD/JHD), JHD 변이에 대한 잡종의 쥐(+/JHD), 야생형(129Sv x C57BL/6J)F1 쥐(+/+), 및 JHD 변이에 대해 잡종의 B 세포 결핍 쥐(JHD/JHD)에 대해 ELISA에 의해 측정된 혈청 IgM의 수준을 나타낸다.
실시예 2 HCO12 트랜스제닉 쥐의 발생
HCO12 인간 중쇄 트랜스유전자
pHC2(Taylor et al., 1994, Int. Immunol., 6: 579-591)의 80kb 삽입체 및 pVx6의 25 kb의 삽입체의 공동주입에 의해 HCO12 트랜스유전자를 발생시켰다. 플라스미드 pVx6은 하기에 기술되는 바와 같이 제조하였다.
생식세포계열 인간 VH1-18(DP-14) 유전자와 함께 대략 2.5 kb의 5'플랭킹 및 5kb의 3' 플랭킹 게놈 서열을 포함하는 8.5kb HindIII/SalI DNA 단편을 플라스미드 벡터 pSP72(위스콘신주 메디슨 소재의 프로메가사 공급)으로 서브클로닝하여 플라스미드 p343.7.16을 발생시켰다. 생식세포계열 인간 VH5-51(DP-73) 유전자와 함께 대략 5kb의 5'플랭킹 및 1kb의 3'플랭킹 게놈 서열을 포함하는 7 kb BamHI/HindIII DNA 단편을 pBR322 기재의 플라스미드 클로닝 벡터 pGP1f(Taylor et al. 1992, Nucleic Acids Res. 20: 6287-6295)으로 클로닝하여 플라스미드 p251f를 발생시켰다. pGP1f, pGP1k(서열 번호:13)으로부터 얻은 새로운 클로닝 벡터를 EcoRV/BamHI을 이용하여 절단시키고, 생식세포계열 인간 VH3-23(DP47) 유전자와 함께 대략 4kb의 5'플랭킹 및 5kb의 3' 플랭킹 게놈 서열을 포함하는 10kb ECoRV/BamHI DNA 단편으로 결찰시켰다. 생성된 플라스미드, p112.2RR.7을BamHI/SalI으로 절단시키고, 7kb의 p251f의 정제된 BamHI/SalI 삽입체와 결찰시켰다. 생성된 플라스미드, pVx4를 XhoI으로 절단시키고, p343.7.16의 8.5 kb XhoI/SalI 삽입체와 결찰시켰다.
다른 2개의 V 유전자와 동일한 배향의 VH1-18 유전자를 이용하여 클론을 얻었다. 이어서, pVx6으로 지정된 상기 클론을 NotI을 이용하여 절단시키고, 정제된 26kb 삽입체를 - 1:1 몰비의 pHC2의 정제된 80 kb Not I 삽입체와 함께- 호간(Hogan) 등에 의해 기술된 바와 같은 1.5일 생 (C57BL/6JxDBA/2J)F2 배아의 전핵으로 공동주입시켰다 (B. Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, 2ndedition, 1994, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview NY). Vx6 및 HC2 둘다로부터의 서열을 포함하는 트랜스제닉 쥐의 3개의 독립 주를 주입시킨 배아로부터 발생시킨 쥐로부터 정착시켰다. 이들 주들을 (HCO12)14881, (HCO12)15083 및 (HCO12)15087으로 지정하였다. 이어서, 3개의 생식세포계열 각각을 실시예 1에 기술된 CMD 변이, JKD 변이(Chen et al.1993,EMBOJ.12:811-820) 및 (KCo5)9272 트랜스 유전자(Fishwild et al. 1996, Nature Biotechnology 14:845-851)를 포함하는 쥐를 이용하여 육종(breed)시켰다. 이렇게 발생된 쥐는 내인성 쥐 중쇄 및 카파 경쇄 유전자좌의 파괴에 대한 잡종 바탕하에서 인간의 중쇄 및 카파 경쇄 트랜스유전자를 발현시켰다.
실시예 3 IL-15에 대한 인간 모노클로날 항체의 생산
상기 기술된 바와 같이 발생시키고, 미국 캘리포니아주 산 조세(San Jose)메다렉스로부터 공급받은 HCo12 및 HCo7 트랜스제닉 쥐를 완전 프로인트 아쥬반트(Complete Freunds Adjuvant)(CFA, 로트 번호:121024LA; 미국 미시간주 디트로이트 디프코 래보라토리스 소재) 또는 불완전 프로인트 아주반트(Incomplete Freunds Adjuvant)(ICFA, 로트 번호:121195LA; 디프코)으로 보충시킨 인간 재조합 IL-15(hIL-15, 미국 시애틀 소재의 이뮤넥스 코프(Immunex corp.) 사 공급)로 피하로(SC), 복강내로(IP) 또는 정맥내로(IV) 면역화시켰다. 수개의 경우는 KLH와 결합된 hIL-15가 면역화에 이용되었다. 완전 또는 불완전 프레운즈 어쥬번트로 보충시킨 hIL-15를 이용하여 수회 부스트(boost)시킨 후, 쥐의 혈청을 IL-15에 대한 인간 항체의 존재에 대해 시험하였다.
최종 클론 146B7, 146H5, 404E4 및 404A8을 제공하는 트랜스제닉 쥐의 면역화 설계
쥐 번호 제146호(HCol2), ID 995-146, 암컷
170699 SC CFA 중의 hIL-15 12㎍ (디프코, 로트 번호: 121024LA)
010799 SC ICFA중의 hIL-15 12㎍ (디프코, 로트 번호: 121195LA)
150799 SC ICFA중의 hIL-15 12㎍
020899 SC ICFA 중의 hIL-15-KLH 12㎍
070999 SC ICFA 중의 hIL-15-KLH 12㎍
280999 SC CFA 중의 hIL-15-KLH 12㎍
111099 IV PBS 중의 hIL-15 30㎍
121099 IV PBS 중의 hIL-15 30㎍
151099 상기 쥐의 림프절과 스프린 셀과 SP2/0과의 접합
쥐 번호 제404호(HCo7), ID 997-404, 암컷
201099 IP CFA 중의 hIL-15-KLH 25㎍ (디프코, 로트번호:121024LA)
031199 IP ICFA 중의 hIL-15 12.5㎍, hIL-15-KLH 12.5㎍, 25㎍ (디프코, 로트번호: 121195LA)
101199 IV hIL-15 12.5㎍, hIL-15-KLH 12.5㎍
121199 IV hIL-15 12.5㎍, hIL-15-KLH 12.5㎍
191199 상기 쥐의 림프절과 스프린 셀과 SP2/0와의 접합
배양 배지(medium)
접합 파트너 배지(FPM):
이스코브 개질된 둘베코 배지를 100 IU/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신, 1mM Na-피루베이트(Pyruvate), 0.5mM β-메르캡토에탄올(스코틀랜드 페이슬리 소재의 라이프 테크놀로지사 공급) 및 10% 열-불활성화 소태아혈청(미국 유타주 소재의 하이클론(HyClone) 공급)으로 보충하였다.
접합 선택 배지(FSM):
FPM을 30ml의 오리겐 하이브리도마(Hybridoma) 클로닝 팩터(미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재의 IGEN사 공급), HAT(미국 미주리주 세인트 소재의 루이스 시그마 케미컬 코 공급; 제조자 추천 농도, 1 바이알) 및 0.5mg/ml 카나마이신(스코틀랜드 페이슬리 소재의 라이프 테크놀로지사 공급)으로 보충시켰다.
접합 클로닝 배지(FCM):
FPM을 20ml의 오리겐 하이브리도마 클로닝 팩터(미국 메릴랜드주 게이터버그소재의 IGEN사 공급), HT(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미컬 코. 공급; 제조자 추천 농도, 1 바이알) 및 0.5mg/ml 카나마이신(스코틀랜드 페이슬리 소재의 라이프 테크놀로지사 공급)으로 보충시켰다.
하이브리도마 제조: SP2/0 근세포와 비장 및 림프절 세포의 접합
하이브리도마를 얻기 위해, 비장, 서혜부 및 파라-대동맥 림프절을 쥐로부터 제거하였다. 비장 및 림프절 세포의 단일 세포 현탁액을 세포 비율 1:2 중의 SP2/0 근세포로 혼합시켰다. 세포를 분리시키고, 펠렛을 37℃에서 1ml 폴리에틸렌글리콜(PBS 중의 50% w/v; 영국 아이빈 시그마-알드리치) 중에서 온화하게 재현탁시켰다. 60초 동안 세포를 스월링시킨 후, 25ml FPM-2를 첨가시키고, 세포를 30 내지 60분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 세포를 FSM 중의 96-웰 플레이트 중의 웰(100㎕) 당 0.75 x 105세포의 세포 농도에서 배양시켰다. 3일 후, 100㎕의 FSM을 각 웰에 첨가시켰다.
hIL-15로 면역화시킨 HCo7 및 HCo12 쥐의 비장 및 림프절을 접합시켜 IL-15에 대한 항체를 제공하는 수 개의 하이브리도마를 발생시켰다. 완전 인간 항-IL-15 항체를 제공하는 하기 4개의 안정한 클론을 단리시켰다:(1) 146LyD7F7B7 개명: 146B7; (2)146DE2E12A3H5 개명: 146H5; (3)404CG11B7E4 개명: 404E4; 및 (4) 404FB12E7A8 개명: 404A8. 상기 클론은 모두 인간 IgG1/k 서브클래스이었다.
하이브리도마의 스크리닝
접합 후 7일 내지 11일 사이, 하기 ELISA를 이용하여 인간 항체의 존재에 대해 웰을 스크리닝하였다:
배양 상청액 중의 인간 IgG의 존재에 대해 스크리닝을 하기 위한 ELISA
인간 IgG 항체의 존재를 검사하는 ELISA를 수행하기 위해, 100㎕/웰의 0.9㎍/ml 래빗-α-k-경쇄 항체(덴마크 글로스트러프 소재의 DAKO)를 포스페이트 완충 염수(PBS) 중에 넝크 맥시소프 ELISA-플레이트(실온에서 밤새 인큐베이션)으로 첨가시켰다. 닭혈청(2%; 스코틀랜드 페이슬리 라이프테크놀로지) 및 트윈-20(0.05%;PBSTC)으로 보충시킨 PBS를 이용하여 플레이트를 블로킹시킨 후, 배양 상청액을 첨가시켰다. 1.5 시간 동안 인큐베이션 후, 플레이트를 세척하고, PBSTC 중에 희석시킨 호스 래디쉬 과산화효소(덴마크 글로스트러프 소재의 DAKO) 0.5㎍/ml와 접합시킨 래빗-α-인간 IgG(Fab2-단편)을 첨가시켰다. 1시간 동안 인큐베이션 후, 웰을 세척시키고, 기질, ABTS (2,2'-아지노비스-3-에틸벤즈티아졸린-술폰산, 독일 맨하임 소재의 로쉐 다이아그노스틱사 공급)을 제조자의 프로토콜을 따라 첨가시키고, 항체 결합을 EL808 ELISA-리더(미국 버몬트주 위누스키 소재의 바이오테크 인스트루먼트 사 공급) 중에 405nm에서 평가하였다.
IL-15 특이적 항체의 존재에 대해 스크리닝하는 ELISA
인간 IgG/k 항체를 포함하는 웰을 IL-15-특이적 ELISA 중의 인간 항-IL-15 항체의 존재에 대해 추가로 시험하였다. ELISA를 수행하기 위해, 100㎕/웰의 1㎍/ml IL-15를 포스페이트 완충 염수(PBS) 중에 넝크 맥시소프 ELISA-플레이트(실온에서 밤새 인큐베이션)으로 첨가시켰다. 닭혈청(2%; 스코틀랜드 페이슬리 소재의 라이프테크놀로지) 및 트윈-20(0.05%;PBSTC)으로 보충시킨 PBS를 이용하여 플레이트를 블로킹시킨 후, 배양 상청액을 첨가시켰다. 1.5시간 동안 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 세척하고, PBSTC 중에 희석시킨 호스 래디쉬 과산화효소(미국 펜실바니아 웨스트 그로브 소재의 잭슨 이뮤노 리서치사 공급)와 접합시킨 α-인간 IgG Fc를 첨가시켰다. 1시간 동안 인큐베이션 후, 웰을 세척하고, 기질, ABTS (2,2'-아지노비스-3-에틸벤즈티아졸린-술폰산, 독일 맨하임 소재의 로쉐 다이아그노스틱사 공급)을 제조자의 프로토콜을 따라 첨가시키고, 항체 결합을 EL808 ELISA-리더(미국 버몬트주 위누스키 소재의 바이오-테크 인스트루먼트사 공급) 중에 405nm에서 평가하였다.
하이브리도마의 서브클로닝
안정한 항-IL-15 세포주를 얻기 위해, 하이브리도마를 96-웰 플레이트 중의 세포의 제한 희석(0.5세포/웰)에 의해 서브클로닝하였다. 서브클론을 약 10일 후 상기 IL-15 ELISA를 이용하여 시험하였다. 수회의 서브클로닝 과정 동안 FSM이 FCM을 거쳐 FPM로 상이 변화되었다. 서브클론의 이소타입은 하기 ELISA에 의해 측정되었다.
ELISA에 의해 항-IL-15 항체의 이소타입 측정
이소타입 ELISA을 수행하기 위해 1㎍/㎕의 항-인간 Fc(잭슨 이뮤노 리서치) 100㎕/웰을 포스페이트 완충 염수(PBS)중에 넝크 맥시소프 ELISA-플레이트(실온에서 밤새 인큐베이션)로 첨가시켰다. 닭혈청(2%; 스코틀랜드 페이슬리 소재의 라이프테크놀로지사 공급) 및 트윈-20(0.05%;PBSTC)으로 보충시킨 PBS를 이용하여 플레이트를 블로킹시킨 후, 배양 상청액을 첨가시켰다. 1.5시간 동안 인큐베이션 후,플레이트를 세척하고, 알칼라인 포스페이트(자이메드(Zymed), 플라아츠, 랜드)와 접합시킨 쥐-α-HuIgG1 또는 호스 래디쉬 과산화효소(자이매드)와 접합시킨 쥐-α-HuIgG3를 첨가시켰다. 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 웰을 세척하고, 기질, ABTS (2,2'-아지노비스-3-에틸벤즈티아졸린-술폰산, 독일 맨하임 소재의 로쉐 다이아그노스틱사 공급)을 제조자의 프로토콜을 따라 첨가시켰다. 항체 결합을 EL808 ELISA-리더(미국 버몬트주 위누스키 바이오-테크 인스트루먼트) 중 405nm에서 평가하였다.
실시예 4 완전 항-IL-15 항체의 에피토프 특이성
치료적으로 작용하고, IL-15-유도 전-염증성 효과를 억제하도록 IL-15 특이적 항체가 IL-2Rβ-사슬 및(또는) IL-15 수용체의 γ-사슬과의 상호작용과 관련된 IL-15 에피토프를 인식하는 것이 필요하다.
변이 단백질(페티트 등이 기술)을 완전 인간 항-IL-15 항체, 146B7, 146H5, 404A8 및 404E4의 에피토프 특이성을 평가하기 위해 사용하였다. 사용된 IL-15 변이는 IL-15 변이 Q108S(잔기 108에서 Gln을 Ser로 치환; γ-사슬 상호작용 영역에서의 변이체) 및 변이 D8SQ108S(잔기 108에서 Gln을 Ser로 치환하고, 8위치의 Asp를 Ser로 치환하고; IL-15의 β 및 γ사슬 상호작용 모든 영역에서의 변이)를 포함한다.
hIL-15 특이적 항체, 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 hIL-15 및 변이 IL-15 단백질로의 결합을 측정하는 ELISA
ELISA을 수행하기 위해 포스페이트 완충 염수(PBS) 중에 100㎕의 1㎍/㎖ IL-15 또는 hIL-15 변이 단백질을 코팅을 위한 넝크 맥시소프 ELISA-플레이트로 첨가시켰다. 닭혈청(2%; 스코틀랜드 페이슬리 소재의 라이프테크놀로지 공급) 및 트윈-20(0.05%;PBSTC)으로 보충시킨 PBS를 이용하여 플레이트를 블로킹시킨 후, hIL-15 특이적 항체의 연속 희석액을 인큐베이션시켰다. 세척후 PBSTC 중에 1/5000로 희석시킨 과산화효소(미국 펜실바니아주 웨스트 그로브 소재의 잭슨 이뮤노 리서치사 공급)와 접합시킨 α-인간 IgG Fc를 첨가시켰다. 기질을 세척후, ABTS (2,2'-아지노비스-3-에틸벤즈티아졸린-술폰산, 독일 맨하임 소재의 로쉐 다이아그노스틱사 공급)을 제조자 프로토콜을 따라 첨가시키고, 항체 결합을 EL808 ELISA-리더(미국 버몬트주 위누스키 바이오-테크 인스트루먼트사 공급) 중에 405nm에서 평가하였다.
완전 인간 IL-15 특이적 항체 146B7, 146H5, 404A8 및 404E4의 hIL-15 및 IL-15 변이 단백질 Q108S 및 D8SQ108S로의 결합을 도1에 나타내었다. 146B7과 146H5 중 어느 것도 이들 변이 IL-15 단백질과 결합될 수 없었다. 이 두 변이체는 Q108S 변이체를 포함하기 때문에 146B7 및 146H5에 의해 인식되는 에피토프는 IL-15 수용체의 γ-사슬과 상호작용하는 IL-15의 결정적인 도메인 내에 있었다. 404A8 과 404E4는 둘다 변이 단백질과 결합할 수 있고, 따라서, 이들 항체는 IL-15의 β- 및 γ-사슬 상호작용 도메인의 외부의 에피토프를 인식하였다. 146B7 및 146H5는 둘다 IL-15 수용체의 γ-사슬과의 상호작용하는 영역에서 IL-15와 결합하였다. 이는 본 발명의 완전 인간 항-IL-15 항체를 이용하는 증식 분석으로부터 얻어진 데이타와 일치한다. 하기에 상술하는 바와 같이, 404A8과 404E4 중 어느 것도 CTLL-2 세포 및 인간 PBMC의 IL-15-유도된 증식을 억제할 수 없었다. 146B7 및 146H5는 둘다 IL-15-유도된 다산을 억제할 수 있었다. 또한, 다산의 억제는 IL-15 수용체의 γ-서브유닛과의 IL-15의 상호작용을 블로킹함에 의해 얻어졌다.
실시예 5 146B7의 V H 및 V L -영역 서열
146B7의 재배열된 VH및 VL-도메인 뉴클레오티드 및 유래된 아미노산 서열을 하기 방법을 이용하여 측정하였다. 이들 서열은 사용된 VH및 VL생식세포계열 족에 관한 정보를 제공하고, 이들 생식세포계열 서열에서 점 돌연변이는 동물의 면역화 동안 B-세포의 친화성 변이로 인한 것이다.
RNA 제조
전체 RNA를 제조자 프로토콜을 따라 RNA졸(영국 풀(Poole) 바이오지너시스)을 이용하여 5x106146B7 하이브리도마 세포로부터 제조하였다.
cDNA 제조
146B7으로부터의 RNA의 cDNA를 제조자 프로토콜을 따라 완충액을 갖는 AMV 리버스 트랜스크립타제(독일 맨하임 소재의 로쉐 다이아그노스틱스 게엠베하 공급), 올리고 d(T)15(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가 공급), dNTP(미국 보에링거 맨하임 코프사 공급) 및 RNAsin(프로메가)를 이용하여 3㎍ 전체 RNA로부터 제조하였다.
클로닝을 위해 V H 및 V L 영역를 증폭시키는데 사용되는 PCR 프라이머
사용되는 프라이머 쌍:
VH
FR1 5'프라이머
(1) AB62 CAg gTK CAg CTg gTg CAg TC
(2) AB63 SAg gTg CAg CTg KTg gAg TC
(3) AB65 gAg gTg CAg CTg gTg CAg TC
VH리더 5'프라이머
(4) AB85 ATg gAC Tgg ACC Tgg AgC ATC
(5) AB86 ATg gAA TTg ggg CTg AgC Tg
(6) AB87 ATg gAg TTT ggR CTg AgC Tg
(7) AB88 ATg AAA CAC CTg Tgg TTC TTC
(8) AB89 ATg ggg TCA ACC gCC ATC CT
VH3'프라이머
(9) AB90 TgC CAg ggg gAA gAC CgA Tgg
VK:
FR1 5' 프라이머
(1) AB8 RAC ATC CAg ATg AYC CAg TC
(2) AB9 gYC ATC YRg ATg ACC CAg TC
(3) AB10 gAT ATT gTg ATg ACC CAg AC
(4) AB11 gAA ATT gTg TTg ACR CAg TC
(5) AB12 gAA ATW gTR ATg ACA CAg TC
(6) AB13 gAT gTT gTg ATg ACA CAG TC
(7) AB14 gAA ATT gTg CTg ACT CAg TC
VK리더 5'프라이머
(8) AB123 CCC gCT Cag CTC CTg ggg CTC CTg
(9) AB124 CCC TgC TCA gCT CCT ggg gCT gC
(10) AB125 CCC AgC gCA gCT TCT CTT CCT CCT gC
(11) AB126 ATg gAA CCA Tgg AAg CCC CAg CAC AgC
VK 3' 프라이머
(12) AB16 Cgg gAA gAT gAA gAC AgA Tg
클로닝을 위한 V H 및 V L 영역를 증폭시키는데 사용되는 PCR 조건
PCR 반응은 진앰프 PCR 시스템 9700 (미국 캘리포니아주 포스터 시티에 소재하는 퍼킨 엘머 어플라이드 바이오시스템스사 공급) 상에서 앰플리타크(AmpliTaq) 폴리머라제(퍼킨 엘머)를 이용하여 수행하였다.
PCR 주기 프로토콜:
94°2'
11 주기 94°30"
65°30", 사이클 당 1°감소
72°30"
30 주기 94°30"
55°30"
72°30"
72°10'
4°로 냉각
pGEMT-벡터 시스템 I 중의 V H 및 V L 의 클로닝
아가로스 겔 상에서 PCR 생성물을 분석한 후, 생성물을 S-400 또는 S300 마이크로스핀 컬럼(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 파마시아 바이오테크 인크사 공급) 또는 QIAEX II 겔 추출 키트(독일 힐덴 퀴아겐 게엠베하)를 이용하여 정제하였다. 각 실험에 대해 제조자 프로토콜을 따라 각 VH및 VL영역의 FR1 또는 리더 프라이머를 이용하여 2개의 독립적으로 증폭시킨 PCR 생성물을 pGEMT-벡터 시스템 I 중에서 클로닝하였다.
이. 콜리DH5α에 대한 형질전환 후, 개개의 콜로니들을 T7 및 SP6 프라이머을 이용하는, 55°, 30주기의 콜로니 PCR에 의해 스크리닝 하였다. 각 개별 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 퀴아프레프 스핀 미니프레프 키트(Qiagen)을 이용하여 정제하였다. 추가 분석을 위해 Nco1/Not1(영국소재의 NE 바이오랩 및 다이아그노스틱사 공급) 절단를 수행하고, 아가로스 겔상에서 분석하였다.
시퀀싱
pGEMT-벡터 시스템 I 중에서 클로닝 후 V-영역를 시퀀싱하였다. T7 및 Sp6 프라이머(벨기에 루이크 소재의 유로젠테크사 공급)를 서열 키트: ABI 프리즘 빅다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 레디 리액션 키트(영국 워링톤 소재의 어플라이드 바이오시스템즈사 공급)와 혼합하여 프로토콜을 따라 사용하였다. 반응을 ABI 프리즘 377 시퀀서(PE 어플라이드 바이오시스템즈)상에서 수행하고, 서열을 프로그램 DNAStar, SeqmanII을 이용하여 분석하였다. 이어서, 서열을 VBASE 중의 생식세포계열 V-유전자 서열로 정렬시켰다(www. mrc-cpe. cam. ac. uk/imt-doc/public/intro. htm).
146B7의 V H 및 V L -영역의 클로닝 및 시퀀싱
하이브리도마 146B7으로부터 VH및 VL-영역를 PCR에 의해 증폭시키고,cDNA-서열을 측정하기 위해 pGEMT-벡터 시스템 I 중에서 클로닝하였다. 뉴클레오티드 및 대응 아미노산 서열을 도2(서열 번호 1 및 2) 및 도3(서열 번호 3 및 4)에 각각 나타내었다. 프레임워크(FR) 및 상보적인 측정 영역(CDR)가 또한 나타났다. V염기 중의 정렬에 따라 146B7의 VH-영역에 대한 생식세포계열 패밀리: VH5-51(VH5-서브그룹), D2-15/D2(DH-분절), JH4b(JH-분절). V염기 중의 정렬에 따른 146B7의 VL-영역에 대한 생식세포계열 패밀리: A27(VKIII-서브그룹) 및 JK2(JK-분절). VH및 VL영역에 관한 추가 정보는 캐뱃(Kabat) 데이타베이스(http ://immuno. bme. nwu. edu) 또는 V베이스(http://www. Vbase. com.)에서 제공한다.
실시예 6 146B7의 친화력 결합 성질
146B7의 친화력은 하기 방법을 따라 바이오분자 단백질 상호작용을 측정하는 BIACORE 3000 기구를 사용하여 표면 플라스몬 레조넌스(SPR) 기술에 의해 분석하였다. 바이오분자 결합에 의해 유발되는 표면층 상의 SPR 신호의 변화가 검측되었고, 표면 층에서 질량 농도의 변화가 확인되었다. 친화력은 하기 정의를 이용하여 표현된다: ka=결합속도상수(M-1초-1); kd=분리속도상소(초-1); KA=결합평형상수-ka/kd(M-1); 및 KD=분리평형상수=kd/ka(M).
다른 과정을 수행하여 인간 IL-15(hIL-15)에 대해 146B7의 친화력을 얻었다. 2개의 상이한 공급자(미국 시애틀 소재의 이뮤넥스 코프 및 미국 뉴저지주 로키 힐 소재의 페프로테크)로부터 인간 재조합 IL-15을 CM5-센서칩을 결합시켰다. 센서칩과 결합한 화합물을 리간드로 정의하였다. 다른 실험에서, 146B7은 리간드로서 사용되었다.
각 동적 분석에서, 분석물의 결합, 센서칩에 결합된 리간드에 적응시킨 hIL-15 또는 146B7을 표준 대조군 CM5 센서칩에의 결합과 비교하였다. 분석물의 일련의 희석액들을 테스트하였다(0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 ㎍/㎖). 결합 및 분리 커브를 모델 랭뮤어(Langmuer) 1:1에서 단량체 상호작용에 대해 핏팅하여 ka및 kd를 측정하고 KA및 KD를 계산하였다. 모든 데이터가 BIA-이밸류에이션 버젼 3.1을 이용하여 분석하였다. 2가 상호작용에 대해 모델 "2가 분석물"을 사용하였다. 모든 분석은 이동 기준선으로 수정되었다.
146B7의 항체 친화력을 측정하기 위해, 항체 146B7의 친화도를 BIACORE 3000에서 2개의 상이한 공급자, 임뮤넥스 및 페프로테크로부터 얻은 인간 재조합 IL-15에 대해 측정하였다. 리간드로서 146B7을 이용하고 분석물로서 hIL-15를 이용하여 1가 상호작용을 측정하였다(커브핏팅 랭뮤어 1:1)
IL-15(임뮤넥스 코프.)에 대한 146B7의 친화력을 하기와 같이 측정하였다:
결합 속도 상수 ka: 1.07(±0.17)×105M-1초-1
분리 속도 상수 kd: 6.56(±0.09)×10-3초-1
결합 평형 상수 KA: 1.55(±0.21)×107M-1
분리 평형 상수 KD: 6.56(±0.88)×10-8M
146B7의 결합력(avidity)을 측정하기 위해 IL-15(임뮤넥스 코프)를 리간드로서 사용하고, 146B7을 분석물로서 사용하였다. 얻어진 데이터를 랭뮤어(1:1) 커브 핏팅을 이용하여 분석한 경우 항체의 2가 상호작용이 발현되고, 항체의 결합력이 측정되었다.
IL-15(이뮤넥스 코프)에 대한 146B7의 결합력이 하기와 같이 측정되었다.
결합 속도 상수 ka: 7.03(±0.81)×105M-1초-1
분리 속도 상수 kd: 1.45(±2.05)×10-3초-1
결합 평형 상수 KA: 5.03(±3.40)×108M-1
분리 평형 상수 KD: 1.55(±1.24)×10-9M
페프로테크 제공 IL-15에 대한 146B7의 친화력 및 결합력도 또한 측정되었다. 2개의 공급원 IL-15에 대한 친화력 또는 결합력에서의 중요한 차이는 발견되지 않았다.
완전 인간 항-IL-15 항체에 의해 CTLL-2 세포 및 PBMC의 인간 인터루킨-15(hIL-15)-유도 증식의 억제에 대해 하기 예에 기재된 바에 따르면, [3H]-티미딘 혼입에 의해 측정된 바에 의해 146B7은 IL-15 유도된 증식을 복용량-의존 방식으로 억제하였다. 증식 억제 실험으로부터 IC50(50% 억제에서 농도, 친화력을 측정하는 더 기능적인 방식)을 계산하였다: 3.1±0.91nM. 상기 IC50을 146B7을 리간드로서 이용하고 재조합 인간 IL-15를 분석물로서 이용하여 BIACURE 3000(KD1.5nM)에 의해 측정된 결합력과 일치하고, 여기서 얻어진 친화력 및 결합력 측정을 확인하였다.
실시예 7 완전 인간 항-IL-15 항체에 의한 hIL-15-유도 TNF-α생산의 억제
IL-15-유도 TNF-α생산에서 완전 인간 항-IL-15 항체, 146B7, 146H5, 404E4 및 404A8의 효과는 하기 과정을 이용하여 건강한 자원자로부터 말초혈액단핵세포(PBMC)을 이용하여 연구하였다. IL-15에 대한 특이성을 평가하기위해 IL-2-매개 TNF-α 생산에서 이들 항체의 효과도 또한 측정되었다.
세포 배양
배양액을 2mM L-글루타민, 100IU/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신(스코트랜드 패이슬리 소재의 라이프 테크놀로지사로부터 얻은 것들) 및 10% 열-불활성화 소태아혈청(미국 유타 소재의 하이클론사 공급)을 갖는 RPMI-1640중에서 유지시켰다.
말초혈액단핵세포(PBMC)의 정제
동의를 얻은 건강한 자원자로부터 새로운 인간 혈액을 얻었고, 응고를 방지하기 위해 헤파린을 첨가하였다. 피콜(Ficoll)(스웨덴 우프잘라 소재의 파마시아사 공급)을 이용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 PBMC를 정제하였다.
시험 화합물
HIL-15, 로트 번호:6870-011(미국 워싱톤 시애틀 소재의 임뮤넥스 코프.사 공급)
hIL-2 (네덜란드 암스테르담 소재의 치론 베네룩스 BV(Chiron Benelux BV)
사용된 완전 인간 항체: 146B7(배치:070101) 및 146B7RDJW07, 404A8(배치: 030101) 및 404E4(배치:080101) 및 이소타입 대조항체로서 T1(97-2B11-2B12, 배치:190900)
항-IL-15 항체에 의해 PBMC에 의해 인간 IL-15(hIL-15) 또는 hIL-2-유도된 TNF-α생산의 억제
PBMC을 hIL-2 또는 hIL-15의 존재 또는 부재하에서 항-IL-15 항체가 존재 또는 부재하는 웰 당 1.5 x 105세포의 96-웰 평면-바닥 플레이트 중에 3개 또는 4개 세트로 배양하였다. 이소타입 대조군 항체(T1)를 음성 대조군으로서 포함시켰다. 콘카나발린 A(2.5㎍/㎖, 칼비오켐)을 증식에 대한 양성 대조군으로서 첨가시켰다. 세포를 37℃에서 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션시켰다. 상청액을 수확하여 ELISA에 의해 인간 TNF-α의 양을 측량하였다(네덜란드 우트레쉬트 소재의 유-시테크 사 제공).
PBMC에 의한 IL-15-매개 TNF-α생산에 대해 146B7 및 이소타입 대조군 항체의 효과를 시험하였다. 146B7은 복용량-의존 방식으로 hIL-15-매개 TNF-α생산을 억제한 반면, 이소타입 대조군 항체는 hIL-15-유도 TNF-α 생산을 억제하지 않았다(도 6). 2개의 건강한 자원자의 데이터가 제시된다. 404E4 및 404A8은 hIL-15-유도 TNF-α생산을 억제하지 못했다.
항-IL-15 항체의 특이성을 확인하기 위해 hIL-2-매개 TNF-α 생산에 대한 그의 효과를 평가하였다. IL-2-매개 TNF-α생산의 억제는 146B7에 의해 유도되지 않았다(도 7). 404E4 또는 404A8에 의한 복용-의존 억제는 hIL-2-매개 TNF-α생산에서는 나타나지 않았다.
hIL-15 매개 TNF-α생산의 복용량-의존 억제는 146B7에 의해서만 나타나고, 404E4 및 404A8에 의해서는 나타나지 않았다. 억제 효과는 hIL-15에 대해 특이적이었고; IL-2-매개 TNF-α생산은 억제되지 않았다.
실시예 8 완전 인간 항-IL-15 항체에 의해 CTLL-2 세포 및 PBMC의 인간인터루킨-15 (hIL-15)-유도 증식의 억제
항체 146B7, 146H5, 404E4 및 404A8을 하기 방법을 이용하여 CTLL-2세포(Gills et al., 1978) 및 말초혈액단핵세포(PBMC)를 이용하여 T-세포 증식을 억제하는 능력에 대해 시험하였다.
세포 배양
배양액을 2mM L-글루타민, 100IU/ml 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(스코틀랜드 페이슬리 소재의 라이프 테크놀로지사 공급) 및 10% 열-불활성화 소태아혈청(미국 유타주 소재의 하이클론 공급)을 갖는 RPMI-1640중에 유지시켰다. CTLL-2 세포(Gillis et al.,1978)을 36 유닛 hIL-2/ml(네덜란드 암스테르담 소재의 치론 베네룩스 BV)으로 보충시킨 상기 언급한 배지 중에 유지시키고, 실험시작 전 3-4 일 동안 hIL-2을 공급중단시켰다. CTLL-2 세포를 사용전 3회 세척하였다.
말초 단핵 세포(PBMC)의 정제
동의를 얻은 건강한 자원자로부터 새로운 인간 혈액을 채취하고, 응고가 방지하기 위해 헤파린을 첨가하였다. 피콜(Ficoll)(스웨덴 우프살라에 소재하는 파마시아)을 이용하여 밀도구배원심분리에 의해 PBMC를 정제하였다.
시험 화합물
HIL-15, 로트 번호:6870-011(미국 워싱톤 시애틀 소재의 임뮤넥스 코프사 공급)
hIL-2(네덜란드 암스테르담 소재의 치론 베네룩스 BV)
도8에 제시된 보고서에서 CTLL-2 분석을 위해 사용한 항-IL-15 항체: 146B7,146H5, 404A8, 404E4
PBMC 분석을 위해 사용된 항-IL-15 항체: 146B7(배치:070101), 404A8(배치:030101) 및 404E4(배치:080101).
항-IL-15 항체에 의해 인간 IL-15(hIL-15) 또는 hIL-2 유도 CTLL-2 다산의 억제
각 실험에서, 세포를 hIL-2 또는 hIL-15의 존재 또는 부재하에서 96-웰 플레이트, 웰 당 5x103세포 중에 3개 세트로 시딩하였다. 증식에 대한 효과를 평가하기 위해 4개의 항-IL-15 항체 각각을 첨가시켰다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 16시간 동안 인큐베이션시켰다. [3H] 티미딘(1 μCi/웰, 영국 버킨햄샤이어 리틀 챌폰트 소재의 아머샴 라이프 사이언스사 공급)을 수확 4시간 전에 첨가하였다(미국 오랜지 CT 톰테크의 하비스터 96).
도 8에 제시된 바와 같이, CTLL-2 세포의 IL-15 유도 증식은 감소된 [3H]-티미딘 혼입에 의해 반영된 바와 같이 146B7 및 146H5에 의해 복용량-의존 방식으로 감소되었다. 404 E4 및 404 A8은 CTLL-2 세포의 IL-15 유도 증식을 차단할 수 없었다.
hIL-15(hIL-15) 또는 hIL-2 유도된 PBMC 증식의 항-IL-15 항체에 의해 억제
PBMC를 hIL-2 또는 hIL-15 및 항-IL-15 항체의 존재 또는 부재하에서 96-웰 유-바닥 플레이트(넝크, 덴마크 날지 넝크 인터내쇼날), 웰 당 5x104세포 중에서 3개 세트로(in triplicate) 배양하였다. 콘카나발린 A(2.5㎍/㎖, 칼바이오켐)을 증식에 대한 양성 대조군으로서 첨가시켰다. 세포를 72시간 동안 37℃에서 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. [3H] 티미딘(1 μCi/웰, 영국 버킨햄샤이어 리틀 챌폰트 소재의 아머샴 라이프 사이언스사 공급)을 수확 16시간 전에 첨가하였다(미국 오랜지 CT 톰테크의 하비스터 96).
146B7은 IL-15 유도 [3H]-티미딘 혼입을 복용량-의존 방식으로 억제할 수 있었고, 증식이 억제되었다(IC50=3.1±0.91nM). 404E4 및 404A8 둘다는 hIL-15 유도 PBMC 증식을 블로킹할 수 없었다. 146H5는 상기 수행된 실험으로부터 얻어진 데이터를 따라 시험하지 않았다. IL-15에 대한 146B7, 404E4 및 404A8의 특이성을 확인하기 위해서, 이들 항체는 IL-2 매개 증식에 대한 이들의 효과에 대해 서로 평가하였다. 시험된 항-IL-15 항체는 IL-2 유도 증식에 대한 효과를 나타내지 않았다. (도 9)
실시예 9 인간 항-IL-15 항체 146B7을 인간 PBMC상에 존재하는 인간 IL-15에 결합함
시험 화합물
인간 PMBC를 동의를 얻은 건강한 자원자로부터 얻었다.
항체 146B7(배치 번호: MDX015)(미국 캘리포니아주 밀피타스 소재의 메다렉스 공급)
146B7 및 인간 IgG의 바이오티닐화
N-히드록시숙신이미도-바이오틴(시그마)를 먼저 DMSO 중에 희석시키고(최종희석: 100mg/ml), 이어서, 0.1M NaHCO3(최종 농도: 1mg/ml, 시그마) 중에 희석시켰다. 항체(1ml 중에 희석됨) 1mg 당 바이오틴 용액 600㎕를 첨가하였다(진함, 2시간, 실온). 항체-바이오틴 용액을 슬라이드-아-라이저(slide-a-lizer; 상표) 투석 카세트(10,000 MWCO, 네덜란드 퍼비오 사이온스 피어스 공급) 중에서 투석하여(밤새 4℃) 미표지된 바이오틴을 제거하였다. 다음 날, 바이오티닐화된 항체의 농도를 스펙트로포토메트리(울트라스펙 2100프로) OD 280nm에서 측정하였다.
말초혈액의 자극
IL-15를 유도하기 위해, 혈액을 건강한 자원자로부터 정맥천자에 의해 얻었다. PBMC를 최대 2일 동안(37℃) 페니실린(5U/ml), 스트렙토마이신(50㎍/ml), L-글루타민(2mM)(바이오위트테이커 유럽) 및 10% 소태아혈청(옵티멈 C241, 멀티셀, 위센트 인크)로 보충시킨 RPMI 1640(바이오휘트테이커 유럽)중에 배양시키고, 500 U/ml IFNγ(보에링거 잉겔하임)으로 자극시켰다.
유량 세포분석법
세포를 페니실린(5U/ml), 스트렙토마이신(50 ㎍/㎖), L-글루타민(2mM)(바이오휘트테이커 유럽) 및 10% 소태아혈청(옵티멈 C241, 멀티셀, 위센트 인크.)으로 보충시킨 RPMI 1640(바이오휘트테이커, 유럽) 중의 10% 인간 AB 세럼(네덜란드 암스테르담 소재의 CLB사 공급)으로 예비-인큐베이션시켰다. 투과성(20분, 4℃, 시토픽스/시토펌(상표) 키트내; 캘리포니아 샌디에고 소재의 벡톤 디킨슨사 공급) 및 펌/워쉬(Perm/Wash)(상표) 완충액(시토픽스/시토펌(상표) 키트) 중에서 세척한 후,PBMC를 IL-15 유량 세포분석법에 의해 IL-15을 염색시켰다. 염색 과정을 거쳐 펌/워시(상표) 완충액(시토픽스/시토펌(상표) 키트)을 이용하여 연속 침투성을 얻었다. 바이오티닐화 146B7 또는 바이오티닐화 hIgG1(20㎍/㎖, 30분, 4℃)를 이용하여 세포를 인큐베이션시키고, 펌/워시(상표) 완충액으로 세척한 후, 세포를 스트렙타비딘-피코에트린(DAKO)을 이용하여 30분 동안(40℃) 연속적으로 인큐베이션시켰다. 유량 세포분석법(벡톤 딕킨슨, FACS 칼리부르) 단핵구상의 게이팅에 의해 셀퀘스트 프로 소프트웨어를 사용하여 분석 후 샘플 당 5000개 이상의 세포의 형광 강도를 측정하였다. 데이타를 하기 식에 의해 계산된 자극 지수(S.I.)를 나타냈다:
S.I.=(평균 형광 양성 염색)/(평균 형광 배경 염색)
면역세포화학
인간 단핵구상에 존재하는 IL-15를 검측하기 위해, 사이토스핀 제제를 전체 혈액 샘플로 구성하였다. 슈퍼프로스트(등록상표)-플러스 현미경 슬라이드(멘젤) 상에 5x104세포(200㎕)를 스피닝 다운시킨 후, 슬라이드를 공기건조시키고(60분 미만), 2% 파라포름알데히드/PBS(8분, 4℃) 중에서 고정시키고, PBS를 이용하여 세척시키고, 다시 공기건조시켰다. 염색 전, 사이토스핀 제제는 염색 과정에 걸쳐 연속적으로 사용된 PBS(+0.1% 사포닌;PBSS) 중에서 투과화시켰다. 내인성 과산화효소 활성을 블로킹하기 위해, 사이토스핀 제제를 시트르산/포스페이트 완충액(pH 5.8, 20분, 실온) 중에 희석시킨 0.05%(v/v) 과산화수소(H2O2)으로 인큐베이션시켰다. PBSS으로 세척 후, 내인성 바이오틴 활성을 제조자의 지시(바이오틴 블로킹 키트, 벡터 랩, DAKO)에 따라 블로킹시켰다. PBSS을 이용하여 세척후, 비-특이적 결합 영역를 PBSS 중의 10%(v/v) 인간 풀 AB-세럼(CLB, 네덜란드 암스테르담)을 이용하여 사이토스핀 제조를 인큐베이션시킴으로써 블로킹하였다. 그 후, 사이토스핀 제제를 바이오티닐화 1차 항체(60분, 실온)로 인큐베이션시키고, PBSS으로 세척후, 바이오티닌화 호스 래디쉬 과산화효소(스트렙트AB컴플렉스/HRP, DAKO; PBS 중 1:100, 2% 인간 AB 혈청을 포함; 30분, 실온)으로 복합화시킨 스트렙타비딘으로 인큐베이션시켰다. PBSS 중에 세척후 사이토스핀 제제를 HRP 활성의 검측을 위해 10분 동안 소듐 아세테이트 완충액(50mM, pH 4.9) 중에서 3-아미노-9-에틸카르바졸(0.5mg/ml) 및 H2O2(0.01%)을 이용하여 인큐베이션시켰다. 사이토 사이토스핀을 5분 동안 흐르는 수도물로 세척하고, 해마톡실린(DAKO)를 이용하여 1분 동안 대조염색시키고, 다시 5분 동안 흐르는 수도물로 세척하고, 파라마운트(faramount) 또는 글리세롤(DAKO) 중에 함침시켰다.
유세포 분석
146B7의 IFNγ-자극된 인간 단핵세포에의 결합을 도 12에 나타내었다. 비오티닐화된 146B7은 비자극 세포 중에서 IL-15의 존재를 나타내는 비자극 단핵세포에 결합한다. 단핵세포를 IFNγ로 자극하면 146B7의 세포에 대한 결합이 증가하며 배양 제1일에 최대치에 도달한다. 대조군 항체인 hIgG1은 비자극 단핵세포에 거의 결합하지 않는다. IFNγ로 자극하면 단핵세포 상에 Fcγ 수용체의 증가된 발현을통해 hIgG1의 결합이 증가한다.
면역세포화학
도 13은 146B7로, 또는 대조군 항체인 hIgG1으로 인간 단핵세포를 염색한 것을 나타낸다. 146B7와 함께 세포를 배양한 후에는 세포질의 뚜렷한 적색 염색이 관찰되었으나, 대조군 항체의 경우에는 그렇지 않았다. 따라서, 146B7는 단핵세포 중에서 hIL-15에 결합하며 이러한 결합은 IFNγ에 의한 자극 후에 상향조절된다. 도 13은 IL-15 염색이 주로 세포내적이라는 것을 또한 보여준다.
실시예 10 인간 항-IL-15 항체 146B7은 면역조직화학에 의해 조직 중에서 IL-15에 결합한다
테스트 화합물
인간 건선 피부 조직 샘플을 정보를 주고 동의 하에 얻었다. 덴마크, 코펜하겐, 젠토프테 대학 병원, 피부과, 루이즈 빌라젠.
항체 146B7 (뱃치 번호 MDX015), 미국 캘리포니아, 밀피타스, 메다렉스
146B7 및 인간 IgG의 비오티닐화
N-히드록시숙신이미도-비오틴 (시그마)을 먼저 DMSO 중에 희석하고 (최종 희석: 100 mg/ml) 이어 0.1 M NaHC03중에 희석하였다 (최종 희석: 1 mg/ml, 시그마). 1 mg의 항체 (1 ml 중에 희석) 당, 600 ㎕의 비오틴 용액을 첨가하였다 (어두움, 2시간, 실온). 항체-비오틴 용액을 슬라이드-어-라이저(상표명) 투석 카세트 (10,000 MWCO, 네덜란드, 페르비오 사이언스, 피어스)(ON,4℃) 중에서 투석하여 표지되지 않은 비오틴을 제거하였다. 다음날, 분광광도계(Ultrospec 2100pro)로 OD 280 nm에서 비오티닐화된 항체의 농도를 측정하였다.
면역조직화학
조직을 검정시까지 -80℃에서 저장하였다. 해동 후, 조직 섹션을 아세톤 중에 고정시키고 (10 분, 실온) 공기 건조시켰다. 내생적인 퍼옥시다제 활성을 차단하기 위해, 섹션을 시트르산/포스페이트 완충액 (pH 5.8, 20 분, 실온) 중에 희석시킨 0.05% (v/v) 과산화수소(H2O2)와 함께 배양하였다. PBS-Tween 20 (PBST, 0.05% v/v)로 세척 후, 제조자의 지시(Biotin Blocking Kit, Vector Lab., DAKO)에 따라 내생적 비오틴 활성을 차단하였다. PBST로 세척 후, 조직 섹션을 10% (v/v) 인간 풀 AB-혈청 (CLB, 네덜란드, 암스테르담)과 함께 PBST 중에서 배양하여 (30 분) 비특이적 결합 부위를 차단하였다. 혈청을 제거하고, 2% 인간 AB 혈청을 함유하는 PBS 중에 희석된 비오티닐화 1차 항체 (146B7 또는 hIgG1)와 함께 섹션을 60분간 (실온) 후속적으로 배양하였다. 섹션을 PBST 중에서 세척하였다. PBST 중에서 세척 후, 모든 조직 섹션을 스트렙트ABComplex/HRP (DAKO; 2% 인간 AB 혈청을 함유하는 PBS 중에서 1:100 희석; 30 분, 실온)와 함께 배양하였다. PBST 중에서 세척 후, 소듐 아세테이트 완충액 (50 mM, pH 4.9) 중에서 섹션을 3-아미노-9-에틸카바졸 (0.5 mg/ml) 및 H2O2(0.01%)와 함께 10분간 (실온) 배양하여 HRP 활성을 검출하였다. 섹션을 흐르는 수돗물로 5분간 세척하고 해마톡실린 (DAKO)로 1분간 대비염색하고, 흐르는 수돗물로 다시 5분간 세척하고, 마지막으로파라마운트(faramount) 또는 글리세르겔 (DAKO) 중에 엠베딩하였다.
결과
조직 섹션을 146B7으로 염색한 후에는 건선 피부 중 각질형성세포의 뚜렷한 세포질 염색이 관찰되었으나, 대조군 항체의 경우에는 그렇지 않았다 (도 14; 146B7은 건선 플라크로부터 얻은 IL-15-양성 각질형성세포를 염색한다).
실시예 11 인간 항-IL-15 항체 146B7은 SCID 마우스-인간 조직 키메라 중의 IL-15를 차단한다; 관절염 및 건선 조직 모두의 염증의 상당한 억제
테스트 화합물
활액 조직 - 아동 류마티스성 관절염 환자로부터 정보를 주고 동의하에 얻었음; 미국, 오하이오, 신시내티, 아동 병원 메디칼 센터, 소아 류마티즘학과, 알렉시 그롬(Alexei Grom).
케라톰(keratome) 생체검사 - 정보를 주고 동의 하에 조직 샘플을 얻었음. 덴마크, 코펜하겐, 젠토프테 대학 병원, 피부과, 루이즈 빌라젠.
항체 146B7 (뱃치 번호 MDX015), 미국 캘리포니아, 밀피타스, 메다렉스, 인크., 건선 실험용.
항체 146B7 (뱃치 번호 15-00RDJW07), 미국 캘리포니아, 밀피타스, 메다렉스 인크., 류마티스성 관절염 실험용.
SCID 마우스-인간 활액분비 조직 키메라 중 IL-15의 차단
관절 대체 수술 후의 아동 류마티스성 관절염 환자로부터 신선한 활액분비 조직 샘플을 얻었다. 샘플을 멸균 조건 하에 수집하였다. 전체 활액분비 조직 샘플로부터의 잘게 썬 조직 단편을 완전히 혼합하여 각 제제의 균질성을 확보하였다. 잘게 썬 조직 (동물 당 2-4 그래프트; 한 부위당 100 mg)을 SCID/NOD 마우스의 등에 피하로 이식하였다 (잭슨 실험실). 각 동물은 그래프트 이식 당일, 및 이식 후 7, 14 및 21일에, 146B7 (500 μg, i. p.) 또는 PBS를 받았다. 이식 후 28일에 동물을 희생시켰다. 활액분비 그래프트를 절제하고 포르말린 상에 배치하여 H&E 염색을 하였다.
SCID 마우스-인간 활액분비 조직 키메라로부터의 조직의 H&E 염색의 정량 (Lehr et al., J. Histochem. Cytochem.1997,45, 1559로부터 변형)
X10 대물렌즈 (Zeiss microscope; Axiovision software)를 사용하여 SCID 마우스-인간 활액분비 조직 키메라로부터 얻은 조직의 디지탈 이미지(2600x2060, jpg)를 얻은 후에, 포토샵, 버젼 6.0 (Adobe Systems, 미국 캘리포니아 마운틴 뷰)을 사용하여 데이타를 컴퓨터 분석하고 1300x1300 픽셀로 바꾸었다. 전체 슬라이드 상의 조직의 전체 염색을 가장 잘 반영하기 위해 각각의 섹션 내에 여섯 개의 X10 필드를 선택하였다. 모든 염색된 핵을 선택한 후 (톨러런스 10으로 어두운 핵 상에 매직 완드), 선택된 영역의 광학 밀도 플롯을 생성시키고 평균 염색 강도를 기록하였다 (유사/이미지 히스토그램 코맨드 선택 후). 이어, 배경을 선택하고 염색을 정량화하였다 (톨러런스 10으로 배경 상에 매직 완드). 염색 강도를 핵 염색 및 배경 염색 사이의 차이로서 계산하였다. 이를 임의의 단위로 사이토케미칼 인덱스라 지정하였다. 데이타를 평균으로서 나타내었으며 s.e.m. 데이타를 학생 t-테스트에 의해 분석하였다.
SCID 마우스-인간 건선 조직 키메라 중 IL-15의 차단
두 환자의 건선 플라크로부터 케라톰 생검을 얻었으며 나누어 C.B-17 SCID (Jackson Laboratories) 마우스 상에 이식하였다. 이식 3주 후에 마우스는 15일간 이틀에 한번 꼴로 10 mg/kg이 용량으로 PBS (위약), CsA (시클로스포린 A) (산도스)를 받거나 또는 제1일에 20 mg/kg의 용량으로 그리고 제8일 및 제15일에 10 mg/kg의 용량으로 146B7을 받았다. 마지막 주입 후 1주일 후, 마우스를 희생시키고 각 이종이식편으로부터 4 mm 펀치 생검을 취하였다. 생검을 포르말린 중에 고정하여 파라핀에 묻고 H&E 중에서 Ki-67 핵 항원을 위해 염색하였다.
SCID 마우스-인간 건선 조직 키메라로부터의 조직의 면역조직화학 염색의 정량화
H&E로 염색된 섹션을 표피 두께(μm), 부전각화증 등급 (0-3으로 등급을 매김), 및 상부 진피의 염증성 단핵 세포의 수에 대해 평가하였다. Ki-67에 대해 염색된 섹션을 사이클링 각질형성세포의 수/mm2섹션에 대해 평가하였다. 각 치료 군에서 4 마우스에 대한 평균 값을 계산하고 각 환자로부터의 데이터를 평균 및 s.e.m.으로서 요약하였다.
SCID/RA 모델
섹션의 현미경 관찰에 의해 가장 어두운 염색된 핵이 침윤 세포에 속하는 것으로 나타났다. 따라서, 핵의 수(상대 표면적으로서 측정)가 침윤에 대한 척도로서 간주된다. 146B7의 주입은, 비히클 치료와 비교하여, 염증 활액분비 조직으로의 침윤 세포의 수를 감소시킨다 (도 15a, p<0.05). 도 15b는 이종이식된 활액분비 조직 내로의 세포의 침윤에 대한 146B7의 효과를 나타내며, 비히클 치료와 비교하여 어두운 핵을 가진 세포 수의 감소를 보인다.
SCID/건선 모델
도 16은 146B7으로 치료되거나 또는 대조군 치료의 SCID/건선 마우스를 나타낸다. 비히클, PBS와 비교하여, 146B7의 주입은, 각질층으로부터 레테 펙의 시작까지 측정했을 때, 표피 두께에 의해 평가된 건선의 심각도를 감소시켰다 (도 16A): PBS (177.8±42. 2 ㎛), CsA (91.0±15.2 ㎛), 146B7 (62.5±9.1 ㎛). 두께의 감소는 각질층으로부터 레테 펙의 가장 깊은 부분까지 측정했을 때도 역시 관찰되었다 (도 16B): PBS (433.8±32.1 ㎛), CsA (303.8±62.9 ㎛) 및 146B7 (208.0±33.8 ㎛). 또한, 부전각화증의 등급이 146B7 치료에 의해 감소되었다 (도 16C): PBS (1.6±0.4), CsA (1.3±0.3), 146B7 (0.5±0.3). 또한, 146B7은 상부 진피의 감염성 단핵 세포의 수를 감소시킨다 (도 16D): PBS (33.3±1.9 단핵 세포), CsA (19.4±8.5), 146B7 (16.4±0.1). 인간 Ki-67 단백질의 발현은 세포 증식과 엄격하게 연관된다. 간기 동안, 항원은 핵 내에서 배타적으로 검출될 수 있으며, 반면 유사분열시에는 대부분의 단백질이 크로모좀의 표면으로 재배치된다. Ki-67 단백질이 세포 사이클의 모든 활성 상(G(1), S, G(2)및 유사분열) 동안 존재하지만 휴지 세포(G(0))로부터는 부재한다는 사실은, 주어진 세포 집단의 소위 성장 분획을 결정하는 데 있어 탁월한 마커로 만든다. 146B7는 Ki-67+ 사이클링 각질형성세포의 수를 감소시킨다 (도 16E): PBS (247.9±77.0), CsA (116.0±24.1), 146B7 (73.8±9.9).
146B7에 의한 치료는 류마티스성 관절염에 대한 인간 SCID 모델 중의 염증 조직으로의 염증성 세포의 침윤을 억제하였다. 또한, 이식된 인간 건선 플라크를 가진 SCID 마우스에서, 146B7에 의한 치료는 CsA에 의한 치료와 비교하여 건선의 심각도를 감소시켰다. 실제, 146B7에 의한 치료에 의해, 감염, 상피 두께, 분열되는 각질형성세포의 수, 및 인간/SCID 마우스에서의 부전각화증의 심각도가 주로 감소되었다.
실시예 12 인간 항-IL-15 항체 146B7은 수용체에 결합된 IL-15를 인식한다
테스트 화합물
hIgG1 - 인간 대조군 항체 (시그마).
항체 146B7 - 메다렉스, 인크.(Medarex Inc.), MDX015.
IL-15Rα를 구성발현하는 라지(Raji) 세포 (영국 사우쓰햄프턴, 사우쓰햄프턴 일반 병원, 테노부스 리써치 래브러토리, 마틴 글레니).
146B7 및 인간 IgG의 비오티닐화
N-히드록시숙신이미도-비오틴 (시그마)를 먼저 DMSO 중에 (최종 희석: 100 mg/ml) 그리고 이어 0.1 M NaHC03중에 (최종 희석: 1 mg/ml, 시그마) 희석하였다.1 mg의 항체 (1 ml 중에 희석) 당, 600 ㎕의 비오틴 용액을 첨가하였다 (어두움, 2 시간, 실온). 항체-비오틴 용액을 슬라이드-어-라이져(상표명) 투석 카세트 (10,000 MWCO, 네덜란드, 페르비오 사이언스, 피어스) (4℃에서 철야)에서 투석하여 표지되지 않은 비오틴을 제거하였다. 다음날, 비오티닐화된 항체의 농도를 분광광도계 (Ultrospec 2100pro)로 OD 280 nm에서 측정하였다.
ELISA에 의한 146B7의 IL-15 - IL-15Rα 복합체에의 결합
바닥이 평평한 미세적정 플레이트(Greiner)를 IL-15Rα(R&D 시스템스, 미국 미네소타주 미네아폴리스)로 코팅한 후(실온에서 철야), 플레이트를 PBS 및 닭 혈청과 함께 배양하였다 (2%, 실온, 60분). PBS (+0.05% Tween 20: PBST) 중에서 세척 후, 비표지화된 IL-15(50 ㎕, 실온, 미국 시애틀 이뮤넥스)로 수 회 희석하며 플레이트를 후속적으로 배양하였다. 10분 후, 비오티닐화된 항체를 웰 (50 ㎕)에 다른 농도로 첨가하였다(실온에서 90분). PBST 중에서 세척 후, PBST-C (PBST 및 2% 닭 혈청) 중에서 1:10,000 희석된 스트렙트아비딘-폴리-호스래디쉬 퍼옥시다제 (네덜란드 암스테르담, CLB)과 함께 플레이트를 배양하였다 (실온에서 60분). 마지막으로, 플레이트를 세척하고 후속적으로 제조자의 프로토콜에 따라 ABTS 완충액 중의 ABTS(아지노비스-3-에틸벤즈티아졸린-술폰산, 독일 만하임 로슈 다이아그노스틱스)와 함께 배양하였다. 발색 반응을 2% 옥살산 (50㎕)으로 정지시켰다. EL808 ELISA-판독기(미국 버몬트 위누스키, 바이오-테크 인스트루먼츠)로 405 nm에서 결합을 측정하였다.
라지(Raji) 세포 상의 146B7의 IL-15 - IL-15R 복합체에의 결합
라지 세포를 FACS 완충액 (PBS, 0.05% BSA, 0.02%NaN03) 중의 10% 인간 풀 AB 혈청 (CLB, 네덜란드 암스테르담)과 함께 예비배양(4℃에서 20분)시킨다. 라지 세포(1-2*105세포/ml)를 웰에 넣고 50㎕의 비표지화된 IL-15를 수 가지의 농도로 첨가하였다 (10% 인간 AB 혈청으로 FACS 완충액 중에 희석). 세포를 30분간(4℃) 배양하고 FACS 완충액 중에서 2회 세척한 후, 50 ㎕의 비오티닐화 항체(146B7 또는 hIgG1)를 웰에 첨가하였다 (4℃에서 30분). FACS 완충액 중에서 2회 세척한 후, 50㎕의 스트렙트아비딘-피코에리스린을 각 웰에 첨가하였다 (4℃에서 30분). FACS 완충액 중에서 2회 세척한 후, 세포를 200 ㎕의 FACS 완충액 중에 취하고, 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어를 사용하여 유세포분석(FACS 캘리버, 벡턴 디킨슨)에 의해 분석 후 샘플당 5000 세포 이상의 형광 강도를 측정하였다. 데이타는 자극 인덱스(S.I.)를 나타내며 다음과 같이 계산되었다.
S.I. = (평균 형광 양성 염색)/(평균 형광 배경 염색)
ELISA
146B7의 IL-15/IL-15R 복합체에의 결합의 ELISA를 도 19에 나타내었다. 146B7의 결합은 수용체에 결합하는 IL-15의 농도가 증가함에 따라 증가한다. 대조군 항체의 IL-15 또는 IL-15R에의 결합의 효과는 관찰되지 않았다.
IL-15R-발현 라지(Raji) 세포에의 결합
라지 세포 상의 146B7의 IL-15/IL-15R 복합체에의 결합을 도 20에 나타내었다. 146B7은 용량-의존성 방식으로 IL-15/IL-15R 복합체에 결합한다. 라지 세포상의 IL-15/IL-15R 복합체에 대한 hIgG1의 결합은 관찰되지 않았다 (도 20).
146B7는 이 사이토카인이 그 수용체에 결합한 후에 IL-15에 결합할 수 있다. 146B7은 수용체에의 결합에 관여되지 않은 IL-15 상에서 에피토프에 결합한다.
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동등물
본 명세서에 기재된 발명의 구체적인 실시태양에 대한 많은 동등물을 당업자는 인식하거나 또는 일상적인 실험을 통해 확인할 수 있을 것이다. 그러한 동등물은 하기 특허청구범위에 포함되도록 의도되었다. 종속항에 개시된 실시태양의 임의의 조합도 본 발명의 범위 내에 속한 것으로 간주된다.
참고문헌으로서의 포함
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그 전체로서 참고로서 본 명세서에 포함된다.

Claims (70)

  1. 인간 IL-15에 특이적으로 결합하고 IL-15 유도된 염증후 효과를 억제하는 단리된 인간 모노클론성 항체.
  2. 제1항에 있어서, IL-15-유도된 TNFα 생산 또는 T 세포 증식을 억제하는 항체.
  3. 제2항에 있어서, 증식 억제 검정법으로 측정시 약 100 nM 미만의 IC50값으로 IL-15 유도된 T 세포 증식을 억제하는 항체.
  4. 제2항에 있어서, 증식 억제 검정법으로 측정시 약 10 nM 미만의 IC50값으로 IL-15 유도된 T 세포 증식을 억제하는 항체.
  5. 제1항에 있어서, 재조합 인간 IL-15를 분석물질로 사용하고 항체를 리간드로 사용하여 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기법으로 측정시 10-7M 미만의 해리 평형 상수 (KD)로 인간 IL-15에 결합하는 항체.
  6. 제1항에 있어서, 항체가 인간 IL-15의 β-쇄 또는 γ-쇄 상호작용 도메인에위치한 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 항체.
  7. 제6항에 있어서, 항체가 인간 IL-15의 γ-쇄 상호작용 도메인에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 항체.
  8. 제1항에 있어서, 항체가 인간 IL-15의 Asp8의 인간 IL-15 수용체의 β유닛에 대한 결합 또는 인간 IL-15의 Gln108의 인간 IL-15 수용체의 γ-유닛에 대한 결합과 간섭하는 것인 항체.
  9. 제1항에 있어서, 항체가 수용체에 결합된 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 것인 항체.
  10. 가변 영역에 도 2(서열 번호 :1) 및 도 3(서열 번호: 3)에 각각 개시된 뉴클레오티드 서열 및 그 보존적 서열 변형을 포함하는 인간 IgG 중쇄 및 인간 카파 경쇄 핵산에 의해 코딩되는 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클론성 항체.
  11. 도 2(서열 번호 :2) 및 도 3(서열 번호: 4)에 각각 나타낸 아미노산 서열 및 그 보존적 서열 변형을 포함하는 IgG 중쇄 및 인간 카파 경쇄 가변 영역을 가지는인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클론성 항체.
  12. (a) 도 2 (서열 번호 : 2) 및 도 3 (서열 번호: 4) 각각에 나타낸 아미노산 서열 CDR1 각각 및 그 보존적 서열 변형을 포함하는 CDR1 도메인,
    (b) 도 2 (서열 번호 : 2) 및 도 3 (서열 번호: 4) 각각에 나타낸 아미노산 서열 CDR2 및 그 보존적 서열 변형을 포함하는 CDR2 도메인
    (c) 도 2 (서열 번호 : 2) 및 도 3 (서열 번호: 4) 각각에 나타낸 아미노산 서열 CDR3 및 그 보존적 서열 변형을 포함하는 CDR3 도메인
    으로 구성된 군으로부터 선택되고 항체 프레임워크에 삽입되거나 또는 합성 링커에 의해 연결된 CDR 도메인을 포함하는 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클론성 항체.
  13. 제1항에 있어서, 항체가 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD 및 IgE 항체로 구성된 군으로부터 선택된 것인 항체.
  14. 제1항에 있어서, IgG1 중쇄를 포함하는 항체.
  15. 제1항에 있어서, 항체 단편 또는 단일 쇄 항체인 항체.
  16. 제1항에 있어서, 전체 항체(whole antibody)인 항체.
  17. 제1항에 있어서, 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스유전자 및 인간 경쇄 트랜스유전자를 포함하는 게놈을 가지는 트랜스제닉 비인간 동물로부터 얻어진 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된 항체.
  18. 인간 IL-15에 특이적으로 결합하고 수용체에 결합시 염증후 효과를 유도하는 IL-15의 능력을 억제하는 단리된 인간 모노클론성 항체.
  19. IL-15를 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클론성 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, T-세포 또는 단핵세포 중에서 IL-15 유도되고 IL-2 유도되지 않은 TNFα 생산을 억제하는 방법.
  20. IL-15를, T 세포의 존재 하에서 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클론성 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, IL-15 유도되고 IL-2 유도되지 않은 T 세포 증식을 억제하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, T 세포가 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 CTLL-2 세포인 방법.
  22. 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스유전자 및 경쇄 트랜스유전자를 포함하는 게놈을 가지는 형질 전환 비인간 동물로부터 얻어진 B 세포를 포함하며, 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 인간 모노클론성 항체를 생산하는 하이브리도마.
  23. 제22항에 있어서, 인간 IgG 중쇄 및 인간 카파 경쇄 핵산에 의해 코딩되는 인간 모노클론성 항체를 생산하는 하이브리도마.
  24. 가변 영역에 도 2(서열 번호 :1) 및 도 3(서열 번호: 3)에 각각 개시된 뉴클레오티드 서열 및 그 보존적 서열 변형을 포함하는 인간 IgG 중쇄 및 인간 카파 경쇄 핵산에 의해 코딩되는 인간 모노클론성 항체를 생산하는 하이브리도마.
  25. 도 2(서열 번호: 2) 및 도 3(서열 번호: 4)에 각각 개시된 아미노산 서열 및 그 보존적 서열 변형을 포함하는 IgG 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 가지는 인간 모노클론성을 생산하는 하이브리도마.
  26. 제1항에 있어서, 인간 중쇄 및 인간 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스펙토마에 의해 생산된 단리된 인간 항체.
  27. 인간 중쇄 및 인간 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하며 검출가능한 양의 제1항의 모노클론성 항체를 생산하는 트랜스펙토마.
  28. 제27항에 있어서, 서열 번호: 1 및 서열 번호: 3에 각각 개시된 뉴클레오티드 서열 또는 그 보존적 서열 변형을 가변 영역에 포함하는 인간 중쇄 및 인간 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스펙토마.
  29. 인간 중쇄 트랜스유전자 및 인간 경쇄 트랜스유전자를 포함하는 게놈을 가지며, 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 인간 모노클론성 항체를 발현하는 트랜스제닉 비인간 동물.
  30. 인간 중쇄 트랜스유전자 및 인간 경쇄 트랜스유전자를 포함하는 게놈을 가지는 트랜스제닉 비인간 동물을 인간 IL-15 또는 인간 IL-15를 발현하는 세포로 면역화시켜 동물의 B 세포에 의해 항체가 생성되도록 하는 단계;
    동물의 B 세포를 단리하는 단계;
    B 세포를 골수종 세포와 융합시켜, IL-15에 대해 특이적인 인간 모노클론성 항체를 분비하는 불멸 하이브리도마 세포를 형성하는 단계; 및
    하이브리도마의 배양 상청액으로부터 IL-15에 대해 특이적인 인간 모노클론성 항체를 단리하는 단계
    를 포함하는, 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 인간 모노클론성 항체를 생산하는 방법.
  31. 제1항에 따른 항체 및 치료제를 포함하는 면역접합체.
  32. 제31항에 있어서, 치료제가 면역억제제인 면역접합체.
  33. 제31항에 있어서, 치료제가 스테로이드성 항염증제, 비스테로이드성 항염증제 및 DMARD로 구성된 군으로부터 선택된 항염증제인 면역복합체.
  34. 제31항에 있어서, 치료제가 세포독성제인 면역접합체.
  35. 제1항에 따른 항체 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 치료 제제를 추가로 포함하는 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 제제가 면역억제제인 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 면역억제제가 시클로스포린인 조성물.
  39. 제36항에 있어서, 제제가 스테로이드성 항염증제 및 비스테로이드성 항염증제로 구성된 군으로부터 선택된 항염증제인 조성물.
  40. 제36항에 있어서, 제제가 메토트렉세이트, 에타너셉트 및 인플릭시맙으로 구성된 군으로부터 선택된 DMARD인 조성물.
  41. 제36항에 있어서, 제제가 독소루비신, 시스플라틴, 블레오마이신, 카르무스틴, 시클로포스파미드 및 클로르암부실로 구성된 군으로부터 선택된 화학치료제인 조성물.
  42. 제36항에 있어서, 제제가 건선 치료용 제제인 조성물.
  43. 제36항에 있어서, 제제가 항체인 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 항체가 CD4 특이적 항체 및 IL-2 특이적 항체로 구성된 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  45. 질병을 치료 또는 예방하기에 효과적인 양의 제1항의 항체를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 IL-15에 의해 매개되는 질병을 치료 또는 예방하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 질병이 건선, 관절염, 염증성 장 질환, 암, 이식 거부 및 감염성 질환으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 관절염이 류마티스성 관절염인 방법.
  48. 제45항에 있어서, 치료 제제의 공동 투여를 추가로 포함하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 제제가 면역억제제인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 면역억제제가 시클로스포린인 방법.
  51. 제48항에 있어서, 제제가 스테로이드성 항염증제 및 비스테로이드성 항염증제로 구성된 군으로부터 선택된 항염증제인 방법.
  52. 제48항에 있어서, 제제가 메토트렉세이트, 에타너셉트 및 인플릭시맙으로 구성된 군으로부터 선택된 DMARD인 방법.
  53. 제48항에 있어서, 제제가 독소루비신, 시스플라틴, 블레오마이신, 카르무스틴, 시클로포스파미드 및 클로르암부실로 구성된 군으로부터 선택된 화학치료제인 방법.
  54. 제48항에 있어서, 제제가 건선 치료용 제제인 방법.
  55. 제48항에 있어서, 제제가 항체인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 항체가 CD4 특이적 항체 및 IL-2 특이적 항체로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  57. 인간 IL-15에 특이적으로 결합하며 수용체에 결합시 염증후 효과를 유도하는 IL-15의 능력을 억제하는 단리된 인간 모노클론성 항체를 투여하는 것을 포함하는, 건선의 치료 또는 예방 방법.
  58. 제57항에 있어서, 항체가 IL-15의 부전각화증을 유도하는 능력을 억제하는 것인 방법.
  59. 제57항에 있어서, 항체가 IL-15의 표피 농화를 유도하는 능력을 억제하는 것인 방법.
  60. 제57항에 있어서, 항체가 IL-15의 케라틴생성세포의 증식을 유도하는 능력을 억제하는 것인 방법.
  61. 인간 IL-15에 특이적으로 결합하며 수용체에 결합시 염증후 효과를 유도하는 IL-15의 능력을 억제하는 단리된 인간 모노클론성 항체를 투여하는 것을 포함하는,류마티스성 관절염의 치료 또는 예방 방법.
  62. 제61항에 있어서, 항체가 IL-15의 활성화된 백혈구의 주화성 유도 능력을 억제하는 것인 방법.
  63. 항체 또는 그 일부와 IL-15 사이의 복합체 형성을 허용하는 조건 하에서, 샘플 및 대조군 샘플을 제1항의 인간 항체와 접촉시키는 단계; 및
    복합체의 형성을 검출하는 단계
    를 포함하며, 여기서 대조군 샘플에 비교한 샘플의 복합체 형성 차이가 샘플 중 IL-15의 존재를 나타내는 것인, 샘플 중에서 IL-15 항원 또는 IL-15 발현 세포의 존재의 검출에 의해 IL-15 매개 질병을 진단하는 방법.
  64. IL-15의 염증후 효과를 억제하는 인간 모노클론성 항체의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  65. 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 인간 모노클론성 항체의 가변 영역을 코딩하며 서열 번호: 1 및 서열 번호: 3 및 그 보존적 서열 변형으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  66. 인간 IL-15에 결합하는 인간 항체의 경쇄, 중쇄 또는 경쇄 및 중쇄 모두의가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  67. 제66항에 있어서, IL-15에 결합하는 인간 항체의 경쇄, 중쇄 또는 경쇄 및 중쇄 모두의 CDR 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 발현 벡터.
  68. 서열 번호: 2 및 서열 번호: 4에 각각 나타낸 아미노산 서열 및 그 보존적 서열 변형을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  69. 서열 번호: 2 및 서열 번호: 4에 각각 나타낸 아미노산 서열 및 그 보존적 변형을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  70. 제66항의 발현 벡터를 포함하는 트랜스펙토마.
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