PL217752B1 - Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wobec IL-15 lub jego fragment wiążący antygen i związane z nimi hybrydoma, kompozycja farmaceutyczna oraz zastosowania medyczne - Google Patents

Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wobec IL-15 lub jego fragment wiążący antygen i związane z nimi hybrydoma, kompozycja farmaceutyczna oraz zastosowania medyczne

Info

Publication number
PL217752B1
PL217752B1 PL371946A PL37194602A PL217752B1 PL 217752 B1 PL217752 B1 PL 217752B1 PL 371946 A PL371946 A PL 371946A PL 37194602 A PL37194602 A PL 37194602A PL 217752 B1 PL217752 B1 PL 217752B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
human
antibody
antibodies
antigen
binding fragment
Prior art date
Application number
PL371946A
Other languages
English (en)
Other versions
PL371946A1 (pl
Inventor
De Winkel Jan G.J. Van
Dijk Marcus Antonius Van
Janine Schuurman
Arnout F. Gerritsen
Ole Baadsgaard
Original Assignee
Genmab As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genmab As filed Critical Genmab As
Publication of PL371946A1 publication Critical patent/PL371946A1/pl
Publication of PL217752B1 publication Critical patent/PL217752B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wobec IL-15 lub jego fragment wiążący antygen, i związane z nimi hybrydoma, kompozycja farmaceutyczna oraz zastosowania medyczne.
Interleukina-15 (IL-15) jest prozapalną cytokiną, glikoproteiną o 14-15 kD. Istnieją doniesienia o jej konstytutywnej ekspresji w różnych komórkach i tkankach obejmujących monocyty i makrofagi, fibroblasty, keratynocyty oraz komórki dendrytyczne (Waldmann i Tagaya, 1999; Fehniger i Caligiuri, 2001). W stanach zapalnych ekspresja interleukiny-15 jest zwiększana, jak opisano dla monocytów stymulowanych IFN-γ i LPS lub przy infekcji wirusami, bakteriami lub pierwotniakami (Kirman i wsp., 1998; Waldmann i wsp., 1998; Waldmann i Tagaya, 1999; Fehniger i Caligiuri, 2001). Ponadto, w przewlekłych zapalnych chorobach, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, miejscowo wytwarzana IL-15 prawdopodobnie zwiększa zapalenie przez włączenie nowych i aktywację maziowych limfocytów T. Jak sugerowano to indukujące działanie IL-15, odgrywa zasadniczą rolę w patogenezie chorób (Kirman i wsp., 1998; McInnes i wsp., 1996; McInnes i wsp., 1997; McInnes i Liew, 1998; Fehniger i Caligiuri, 2001).
Badania in vitro wykazały, że IL-15 ma kilka biologicznych aktywności wspólnych z IL-2, ze względu na to, że mają wspólne składniki receptora. Receptor IL-15 obecny na limfocytach T obejmuje wyjątkowy łańcuch a, IL-15Ra, lecz ma wspólny z IL-2R łańcuch β i łańcuch γ. W konsekwencji, oba receptory wykorzystują te same elementy sygnałowe Jak/STAT. Jednakże, w oparciu o skomplikowaną regulację i zróżnicowaną ekspresję IL-2 i IL-15 i ich receptorów, zostały opisane istotne różnice w ich funkcjonowaniu in vivo (Kirman i wsp., 1998; Waldmann i Tagaya, 1999; Waldmann i wsp., 2001). Jest również ważne, aby zauważyć, niezbędną rolę IL-15 w rozwoju, przeżyciu, rozprzestrzenianiu się i funkcjonowaniu naturalnych białych krwinek o działaniu cytotoksycznym (NK, ang. natural killer cells), limfocytów T NK i limfocytów śródnabłonkowych (Kennedy i wsp., 2000; Liu i wsp., 2000).
McInnes i współpracownicy (Mclnnes i wsp., 1997; McInnes i Liew, 1998) opisywali indukcję wytwarzania TNF-α po stymulacji IL-15 w limfocytach T pochodzących od pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów. Ponadto pokazano, że limfocyty T z krwi obwodowej aktywowane przez IL-15, indukują znaczące wytwarzanie TNF-α przez makrofagi, przez mechanizm zależny od kontaktu z komórką. Ze względu na destrukcyjną rolę TNF-α w reumatoidalnym zapaleniu stawów, hamowanie tej cytokiny obniża aktywność choroby (Bathon i wsp., 2000; Klippel, 2000; Lovell i wsp., 2000; Maini i Taylor, 2000).
Twórcy wynalazku po raz pierwszy wytworzyli i wyizolowali w pełni ludzkie monoklonalne przeciwciała, które specyficznie wiążą się z ludzką IL-15 i hamują prozapalne działania indukowane przez IL-15, oraz scharakteryzowali te nowe przeciwciała i wykazali ich terapeutyczne wartości w leczeniu wielu różnych chorób, w których pośredniczy IL-15.
Wiążące IL-15 izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne według wynalazku, lub będący przedmiotem wynalazku jego fragment wiążący antygen, obejmuje (a) region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3, odpowiednio, jak przedstawiono jako reszty aminokwasowe 31-35, 50-66 oraz 100-107 SEK NR ID: 2; oraz (b) region zmienny łańcucha lekkiego zawierający sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3 odpowiednio, jak przedstawiono jako reszty aminokwasowe 24-35, 51-57 oraz 90-97 SEK NR ID: 4.
Korzystnie przeciwciało, lub jego fragment wiążący antygen, według wynalazku, obejmuje regiony zmienne ludzkiego łańcucha ciężkiego i ludzkiego łańcucha lekkiego zawierające sekwencje aminokwasowe przedstawione odpowiednio jako SEK NR ID: 2 i SEK NR ID: 4.
Jak opisano niniejszym, ludzkie przeciwciała hamują zarówno wytwarzanie TNF-a, jak i proliferację limfocytów T, przy czym oba te zjawiska są integralnie związane z zaburzeniami zapalnymi. Zgodnie z powyższym, ludzkie przeciwciała według wynalazku dostarczają ulepszonych środków do leczenia i zapobiegania takim zaburzeniom (i dowolnym innym zaburzeniom, w których pośredniczy IL-15), które mogą być przypisane w części ich wyjątkowej specyficzności (np., epitopowa i gatunkowa specyficzność), powinowactwu, strukturze, czynnościowej aktywności oraz faktowi, że są one w pełni ludzkie, co powoduje, że są one znacząco mniej immunogenne i bardziej terapeutycznie skuteczne i użyteczne, gdy podawane pacjentom będącym ludźmi, w porównaniu z innymi wcześniej wytwarzanymi przeciwciałami IL-15 (np., mysie i humanizowane przeciwciała). Niniejszym opisano nowe terapeutyczne zastosowania, obejmujące leczenie chorób zapalnych, takich jak reumatoidalne zapalenie
PL 217 752 B1 stawów, łuszczycę, odrzucenia przeszczepów i nowotwory, dla przeciwciał hamujących IL-15, takich jak ludzkie przeciwciała według wynalazku.
Izolowane ludzkie przeciwciała według wynalazku obejmują wiele różnych izotypów przeciwciał, takich jak izotypy IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD i IgE. Typowo, obejmują one izotypy IgG1 (np., IgG1k), IgG3 i IgM. Zatem korzystnie przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, według wynalazku, jest wybrane z grupy przeciwciał składającej się z IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD i IgE, a korzystniej stanowi przeciwciało IgG1. Przeciwciało może mieć pełną długość (np., przeciwciało IgG1 lub IgG3) lub może obejmować tylko fragment wiążący antygen (np., Fab, F(ab')2, Fv, jednołańcuchowy fragment Fv, izolowany region określający komplementarność (CDR, ang. complementarity determining region) lub połączenia dwóch lub więcej izolowanych CDR). W korzystnej postaci wykonania fragment wiążący antygen, według wynalazku, jest fragmentem Fab przeciwciała lub przeciwciałem jednołańcuchowym.
Ludzkie przeciwciała według wynalazku są rekombinowanymi przeciwciałami. W szczególnej postaci wykonania, ludzkie przeciwciało jest kodowane przez kwasy nukleinowe ludzkiego łańcucha ciężkiego IgG i ludzkiego łańcucha lekkiego kappa w ich zmiennych regionach, jak przedstawiono w SEK NR ID:1 i SEK NR ID:3, odpowiednio i ich konserwatywne modyfikacje sekwencji. W innej postaci wykonania, ludzkie przeciwciało obejmuje zmienne regiony ciężkiego łańcucha IgG i lekkiego łańcucha kappa, które zawierają sekwencje aminokwasowe przedstawione w SEK NR ID:2 i SEK NR ID:4, odpowiednio. Zatem najkorzystniej przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, według wynalazku, zawiera region zmienny z łańcucha ciężkiego IgG1 i region zmienny z łańcucha lekkiego kappa.
Ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą być wytwarzane rekombinacyjnie w komórce gospodarza, takiej jak transfektoma (np., transfektoma obejmująca unieśmiertelnione komórki CHO lub komórki limfocytowe), zawierającej kwasy nukleinowe kodujące ciężkie i lekkie łańcuchy przeciwciała, lub mogą być otrzymane bezpośrednio z hybrydoma, w której zachodzi ekspresja przeciwciała (np., która obejmuje limfocyt B otrzymany z transgenicznego, niebędącego człowiekiem, zwierzęcia, np., transgenicznej myszy, o genomie zawierającym transgen ludzkiego ciężkiego łańcucha i transgen ludzkiego lekkiego łańcucha, który koduje przeciwciało, sprzężone z unieśmiertelnioną komórką). Zatem przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, według wynalazku, jest korzystnie wytwarzane przez hybrydoma, która obejmuje limfocyt B otrzymany z transgenicznego, niebędącego człowiekiem zwierzęcia o genomie zawierającym transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego i transgen ludzkiego łańcucha lekkiego, połączony z unieśmiertelnioną komórką albo przez transfektomę zawierającą kwasy nukleinowe kodujące ludzki łańcuch ciężki i ludzki łańcuch lekki. Przeciwciała według wynalazku mogą być wytwarzane przez hybrydoma określane tutaj jako 146B7 lub przez transfektoma komórki gospodarza (np., komórka CHO) zawierające kwasy nukleinowe, które zawierają sekwencje nukleotydowe kodujące ludzki ciężki łańcuch i ludzki lekki łańcuch w ich zmiennych regionach, jak przedstawiono w SEK NR ID: 1 i 3 odpowiednio i ich modyfikacje konserwatywne. Niniejszym opisano również przeciwciała wytwarzane przez hybrydoma określane tutaj jako 146B7, 146H5, 404E4 i 404A8. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało specyficznie wiąże się z epitopem zlokalizowanym na łańcuchu β i/lub γ oddziałującej domeny IL-15. Tak więc korzystnie przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według wynalazku wiąże się z epitopem zlokalizowanym na łańcuchu β lub łańcuchu γ domeny oddziałującej ludzkiej IL-15, lub wiąże się z ludzką IL-15 związaną z receptorem.
Ludzkie przeciwciała według wynalazku specyficznie wiążą się z ludzką IL-15 i hamują zdolność IL-15 do indukowania prozapalnego działania, np., hamują produkcję TNFa i/lub hamują proliferację limfocytów T, takich jak limfocyty T PBMC lub CTLL-2, podczas wiązania IL-15 z receptorem IL-15. Zatem korzystnie przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według wynalazku, hamuje wywołane przez IL-15 skutki prozapalne oraz hamuje wywołane przez IL-15 wytwarzanie TNFa lub proliferację limfocytów T. Zazwyczaj, ludzkie przeciwciała wiążą się z IL-15 ze stałą równowagi dysocjacji (KD) mniejszą niż około 10-7 M, czyli mniejszą niż około 10-8 Μ, 10-9 M lub 10-10 M lub nawet niższych, jak określono techniką rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR, ang. surface plasmon resonance) stosując urządzenie BIACORE 3000 z zastosowaniem zrekombinowanej ludzkiej IL-15 jako analitu i przeciwciała jako ligandu. W szczególnej postaci wykonania, przeciwciało wiąże się z ludzką IL-15 ze stałą równowagi dysocjacji (KD) O wartości w przybliżeniu 6,5 x 10-8 M. Tak więc korzystnie przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według wynalazku, wiąże się z ludzką IL-15 ze stałą równowagi dysocjacji (KD) poniżej 10-7 M, jak określono techniką SPR z zastosowaniem rekombinowanej ludzkiej IL-15 jako analitu i przeciwciała jako ligandu.
PL 217 752 B1
Niniejszym ujawniono cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące przeciwciało, lub fragment wiążący antygen według wynalazku. Zgodnie z powyższym, rekombinowane wektory ekspresyjne, które obejmują kodujące przeciwciało kwasy nukleinowe i komórki gospodarza trasfekowane takimi wektorami, są również niniejszym opisane, tak jak i sposoby wytwarzania przeciwciał według wynalazku przez hodowlę tych komórek gospodarza.
Niniejszym opisano wektor ekspresyjny zawierający sekwencję nukleotydową kodującą ciężkie i lekkie zmienne regiony, które zawierają sekwencje aminokwasowe przedstawione w SEK NR ID:2 i SEK NR ID:4, odpowiednio i ich modyfikacje konserwatywne. Takie wektory ekspresyjne są dobrze znane w dziedzinie. Przykłady takich wektorów obejmują wektory transkrypcyjne/translacyjne in vitro wykorzystujące, na przykład, lizaty retikulocytów.
Niniejszym ujawniono również limfocyty B od transgenicznego, niebędącego człowiekiem, zwierzęcia, np., transgenicznej myszy, które są zdolne do prowadzenia ekspresji różnych izotypów (np., IgG, IgA i/lub IgM) ludzkich monoklonalnych przeciwciał, które specyficznie wiążą się z IL-15. Izolowane limfocyty B mogą być otrzymywane z transgenicznego, niebędącego człowiekiem, zwierzęcia, np., transgenicznej myszy, którą immunizowano oczyszczonym lub wzbogaconym preparatem antygenu IL-15 i/lub komórkami prowadzącymi ekspresję IL-15. Korzystnie, transgeniczne, niebędącego człowiekiem zwierzę, np., transgeniczna mysz, ma genom zawierający transgen ludzkiego ciężkiego łańcucha i transgen ludzkiego lekkiego łańcucha. Izolowane limfocyty B są następnie unieśmiertelnione, aby dostarczyć źródło (np., hybrydoma) ludzkich monoklonalnych przeciwciał przeciwko IL-15.
Zgodnie z powyższym, wynalazek również dostarcza hybrydoma zdolnej do wytwarzania ludzkiego monoklonalnego przeciwciała, które specyficznie wiąże się z IL-15. W jednym rozwiązaniu, hybrydoma obejmuje limfocyt B otrzymany z transgenicznego, niebędącego człowiekiem, zwierzęcia, np., transgenicznej myszy, o genomie zawierającym transgen ludzkiego ciężkiego łańcucha i transgen ludzkiego lekkiego łańcucha sprzężony z unieśmiertelnioną komórką. Transgeniczne, niebędące człowiekiem, zwierzę może być immunizowane oczyszczonym lub wzbogaconym preparatem antygenu IL-15 i/lub komórkami prowadzącymi ekspresję IL-15, aby wytworzyć hybrydoma wytwarzające przeciwciało. Zatem będące przedmiotem wynalazku hybrydoma wytwarzające przeciwciało według wynalazku lub jego fragment wiążący antygen według wynalazku, zawiera limfocyt B otrzymany z transgenicznego, niebędącego człowiekiem zwierzęcia o genomie zawierającym transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego i transgen łańcucha lekkiego, połączony z unieśmiertelnioną komórką. Szczególne ujawnione niniejszym hybrydoma obejmują 146B7, 146H5, 404E4 i 404A8.
Niniejszym opisano transgeniczne niebędące człowiekiem zwierzę, takie jak transgeniczna mysz, u której zachodzi ekspresja ludzkich monoklonalnych przeciwciał, które specyficznie wiążą się z IL-15. Transgeniczne niebędące człowiekiem zwierzę może być transgeniczną myszą o genomie zawierającym transgen ludzkiego ciężkiego łańcucha i transgen ludzkiego lekkiego łańcucha. Transgeniczne, niebędące człowiekiem zwierzę może być immunizowane oczyszczonym lub wzbogaconym preparatem antygenu IL-15 i/lub komórkami prowadzącymi ekspresję IL-15. Korzystnie, transgeniczne, niebędące człowiekiem zwierzę, np., transgeniczna mysz, jest zdolna do wytwarzania wielu izotypów ludzkich monoklonalnych przeciwciał przeciwko IL-15 (np., IgG, IgA i/lub IgM) w wyniku przejścia rekombinacji V-D-J i przełączania izotypów. Przełączanie izotypów może występować w wyniku, np. klasycznego lub nieklasycznego przełączania izotypów.
Ujawnione tutaj sposoby wytwarzania ludzkiego monoklonalnego przeciwciała, które specyficznie oddziałuje z IL-15 obejmują immunizację transgenicznego, niebędącego człowiekiem zwierzęcia, np., transgenicznej myszy, mającej genom zawierający transgen ludzkiego ciężkiego łańcucha i transgen ludzkiego lekkiego łańcucha, oczyszczonym lub wzbogaconym preparatem antygenu IL-15 i/lub komórkami prowadzącymi ekspresję IL-15. Limfocyty B (np., limfocyty B śledzony) takiego zwierzęcia są następnie uzyskiwane i sprzęgane z komórkami szpiczaka, aby utworzyć nieśmiertelne komórki hybrydoma, które wydzielają ludzkie monoklonalne przeciwciała przeciwko IL-15.
Ludzkie przeciwciało anty-IL-15 może być sprzężone z terapeutycznym ugrupowaniem cząsteczkowym, np., cytotoksycznym lekiem, enzymatycznie czynną toksyną, lub ich fragmentem, izotopem promieniotwórczym, lub małocząsteczkowym lekiem przeciwnowotworowym.
W innym aspekcie, wynalazek dostarcza kompozycji farmaceutycznej zawierającej farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i przynajmniej jedno ludzkie monoklonalne przeciwciało według wynalazku, które specyficznie wiąże się z IL-15. W korzystnej postaci wykonania kompozycja według wynalazku zawiera ponadto środek terapeutyczny. Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może ponadto obejmować inne środki terapeutyczne, takie jak inne środki immunosupresyjne, lub środki
PL 217 752 B1 chemoterapeutyczne. Korzystnie środkiem jest środek immunosupresyjny, a korzystniej cyklosporyna. Również korzystnie środkiem terapeutycznym jest środek przeciwzapalny wybrany spośród steroidowego środka przeciwzapalnego i niesteroidowego środka przeciwzapalnego. Ponadto korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera środek będący przeciwreumatycznym lekiem modyfikującym przebieg choroby (DMARD, ang. disease-modifying anti-rheumatic drug) wybranym spośród metotreksatu, etanerceptu i infliksymabu. Według wynalazku środek w kompozycji farmaceutycznej może być także środkiem chemoterapeutycznym wybranym z grupy składającej się z doksorubicyny, cisplatyny, bleomycyny, karmustyny, cyklofosfamidu i chlorambucylu, a alternatywnie jest środkiem do leczenia łuszczycy. Również korzystnie środek stanowi przeciwciało albo czynnik hamujący czynnik martwicy nowotworu-α (TNFa). Korzystniej przeciwciało jest wybrane z grupy składającej się z przeciwciała swoistego wobec CD4 i przeciwciała swoistego wobec IL-2.
Stanowiące przedmiot wynalazku rozwiązania umożliwiają hamowanie prozapalnego działania IL-15, takiego jak hamowanie wytwarzania TNFa i/lub proliferacji limfocytów T indukowanych przez IL-15, korzystnie bez hamowania aktywności (np., wytwarzania TNFa i/lub proliferacji limfocytów T) strukturalnie pokrewnych białek/cytokin (np., IL-2), na przykład przez zastosowanie jednego lub więcej ludzkich przeciwciał według wynalazku.
Ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą być użyte do leczenia i/lub zapobiegania wielu różnym chorobom, w których pośredniczy IL-15 przez podawanie przeciwciał pacjentom cierpiącym na takie choroby.
Przykładowe choroby, które mogą być leczone (np., łagodzone) lub którym można zapobiegać, stosując rozwiązania według wynalazku obejmują, lecz nie są ograniczone do, zaburzeń zapalnych, takich jak zapalenie stawów (np., artropatia łuszczycowa i reumatoidalne zapalenie stawów łącznie z aktywnym reumatoidalnym zapaleniem stawów i młodzieńczym reumatoidalnym zapaleniem stawów), zapalna choroba jelita. Na przykład, wykazano, że przeciwciała zmniejszają parakeratozę, obniżają grubość naskórka i obniżają proliferację keratynocytów przy łuszczycy. Wykazano również, że przeciwciała obniżają zapalenie i/lub zapobiegają chemotaksji aktywowanych leukocytów biorących udział w reumatoidalnym zapaleniu stawów. Przeciwciała również mogą być użyte do leczenia chorób zakaźnych, takich jak zakażenie HIV. Ponadto, przeciwciała mogą być użyte do leczenia odrzucenia przeszczepu. W kolejnej postaci wykonania, przeciwciała mogą być użyte do leczenia wielu różnych chorób, w których uczestniczy związane z IL-15 unaczynianie nowotworów, takich jak wzrost nowotworu i nowotwory, np. białaczka z limfocytów T. Przedmiotem wynalazku jest zatem lek zawierający izolowane ludzkie przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według wynalazku do leczenia zaburzenia zachodzącego za pośrednictwem ludzkiej IL-15, w szczególności zapalnej choroby jelit, łuszczycy, odrzucenia przeszczepu, nowotworu i choroby zakaźnej.
Ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą również być łączone z jednym lub więcej dodatkowymi środkami terapeutycznymi, takimi jak środki przeciwzapalne, DMARD (przeciwreumatyczne leki modyfikujące przebieg choroby), środki immunosupresyjne, chemoterapeutyczne i środki przeciwko łuszczycy.
W jednej postaci wykonania, osobnik może być dodatkowo leczony jednym lub więcej środkiem, który wzmacnia zachodzące dzięki przeciwciałom hamowanie działań prozapalnych, np., środkiem przeciwzapalnym, takim jak steroidowy lek lub NSAID (niesteroidowy lek przeciwzapalny, ang. nonsteroidal anti-inflammatory drug). Korzystne środki obejmują, na przykład, aspirynę i inne salicylany, inhibitory Cox-2, takie jak rofekoksyb (Vioxx) i celekoksyb (Celebrex), NSAID takie jak ibuprofen (Motrin, Advil), fenoprofen (Nalfon), naproksen (Naprosyn), sulindak (Clinoril), diklofenak (Voltaren), piroksykam (Feldene), ketoprofen (Orudis), diflunizal (Dolobid), nabumeton (Relafen), etodolak (Lodine), oksaprozyna (Daypro) i indometacynę (Indocin).
W innej postaci wykonania, ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą być podawane w kombinacji z jednym lub więcej DMARD, takim jak metotreksat (Rheumatrex), hydroksychlorochina (Plaquenil), sulfasalazyna (Asulfidine), inhibitory syntezy pirymidyny, np. Ieflunomid (Arava), czynniki blokujące receptor IL-1, np. anakinra (Kineret) i czynniki blokujące TNF-a, np. etanercept (Enbrel), infliksymab (Remicade) i adalimumab.
W innej postaci wykonania, ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą być podawane w kombinacji z jednym lub więcej środkami immunosupresyjnymi, takimi jak cyklosporyna (Sandimmune, Neoral) i azatiopryna (Imural).
W innej postaci wykonania, ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą być podawane w kombinacji z jednym lub więcej środkami chemoterapeutycznymi, takimi jak doksorubicyna (Adria6
PL 217 752 B1 mycin), cisplatyna (Platinol), bleomycyna (Blenoksane), karmustyna (Gliadel), cyklofosfamid (Cytoksan, Procytox, Neosar) i chlorambucyl (Leukeran). Ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą również być podawane w połączeniu z terapią promieniowaniem.
W innej postaci wykonania, ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą być podawane w kombinacji z jednym lub więcej środkami do leczenia łuszczycy, takimi jak leki do stosowania miejscowego zawierającymi smołę pogazową, witaminę A, kortyzon lub inne kortykosteroidy, doustnymi lub wstrzykiwanymi środkami medycznymi, takimi jak kortykosteroidy, metotreksat, retinoidy, np. acykretyna (Neogitason) lub cyklosporyna (Sandimmune, Neoral). Inne sposoby leczenia mogą obejmować wystawienie na promieniowanie słoneczne lub terapię światłem.
W innej postaci wykonania, ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą być podawane w kombinacji z innymi przeciwciałami, takimi jak specyficzne przeciwciała przeciwko CD4 i specyficzne przeciwciała przeciwko IL-2. Rozważane są kombinacje ludzkich przeciwciał według wynalazku ze specyficznymi przeciwciałami przeciwko CD4 lub specyficznymi przeciwciałami przeciwko IL-2, zwłaszcza gdy są użyteczne do leczenia autoimmunologicznych chorób i odrzuceń przeszczepów.
Niniejszym opisano także sposoby wykrywania in vitro lub in vivo obecności antygenu IL-15 w próbce, np., aby zdiagnozować choroby, w których pośredniczy IL-15. Sposób ten można realizować przez kontaktowanie próbki, która ma być badana, wraz z próbką kontrolną, z ludzkim monoklonalnym przeciwciałem według wynalazku, lub jego częścią wiążącą antygen, w warunkach, które umożliwiają tworzenie kompleksu pomiędzy przeciwciałem a IL-15. Tworzenie kompleksu następnie wykrywane jest (np., stosując test ELISA) w obu próbkach i każda statystycznie znacząca różnica w tworzeniu kompleksów pomiędzy próbkami stanowi wskaźnik obecności antygenu IL-15 w badanej próbce. Wynalazek dotyczy zatem czynnika diagnostycznego zawierającego izolowane ludzkie przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według wynalazku do diagnozowania choroby zachodzącej za pośrednictwem ludzkiej IL-15.
Inne właściwości i korzyści obecnego wynalazku będą widoczne na podstawie poniższego szczegółowego opisu i zastrzeżeń.
Krótki opis rysunków
Fig. 1 przedstawia wykresy wykazujące wiązanie ludzkich specyficznych przeciwciał przeciwko IL-15, 146B7, 147H5, 404A8 i 404E4, z ludzką IL-15 (hIL-15) i ze zmutowanymi białkami IL-15, Q108S i D8SQ108S. Kolejne rozcieńczenia przeciwciał badano pod kątem ich wiązania z hIL-15 lub ze zmutowanymi białkami IL-15 D8SQ108S i Q108S testem ELISA.
Fig. 2 i 3 przedstawiają aminokwasową (SEK NR ID: 2 i 4) i nukleotydową (SEK NR ID: 1 i 3) sekwencję regionów VH i VL, odpowiednio, z przeciwciała 146B7. Wskazano szkielet (FR) i regiony określające komplementarność (CDR).
Fig. 4 przedstawia wykresy wykazujące gatunkową reaktywność krzyżową przeciwciał 146B7, 146H5, 404A8 i 404E4. Kolejne rozcieńczenia w pełni ludzkich przeciwciał anty-IL15 badano pod kątem ich wiązania z ludzką, mysią i małpią (Zielona małpa afrykańska) zrekombinowaną IL-15 testem ELISA.
Fig. 4A-D przedstawiają wykresy wykazujące hamowanie wydzielania TNF-α, w którym pośredniczy IL-15, przez przeciwciało 146B7. Ludzkie PBMC inkubowano z hIL-15 (0, 50, 100 ng/ml) w połączeniu z przeciwciałem 146B7 lub z przeciwciałem kontrolującym izotyp (0,1; 1; 10 pg/ml) przez 72 godziny. Ilość uzyskiwanego TNF-α zmierzono testem ELISA. Przedstawiono dane od dwóch zdrowych ochotników.
Fig. 5 przedstawia wykres wykazujący wpływ przeciwciała 146B7 na wytwarzanie IL-2 lub TNF-α, w którym pośredniczy IL-15. Ludzkie PBMC inkubowano z hIL-15 (0, 50, 100 ng/ml) lub z hIL-2 (100 ng/ml) w połączeniu z 146B7 (0,1; 1; 10 μg/ml) przez 72 godzin. Ilość uzyskiwanego TNF-α zmierzono testem ELISA.
Fig. 6 przedstawia wykres wykazujący aktywność hamującą przeciwciał 146B7, 146H5, 404E4 i 404A8 na indukowaną hIL-15 proliferację CTLL-2.
Komórki CTLL-2, których pozbawiono hIL-2 inkubowano z hIL-15 (60 pg/ml) połączoną z kolej3 nymi rozcieńczeniami 146B7, 146H5, 404E4 i 404A8 przez 48 godzin. Wbudowanie [3H]-tymidyny zmierzono, aby określić proliferację (cpm). Wyniki przedstawiono jako wartości średnie.
Fig. 7-9 przedstawiają wykresy wykazujące aktywność hamującą przeciwciał 146B7 (Fig. 7), 404E4 (Fig. 8) i 404A8 (Fig. 9) na indukowaną IL-15 proliferację PBMC. Ludzkie PBMC inkubowano z hIL-15 (0, 25, 100 ng/ml; odpowiednio Fig. 7A, 8A i 9A) lub hIL-2 (0, 10, 100 ng/ml; odpowiednio
PL 217 752 B1
Fig. 7B, 8B i 9B) w połączeniu z 146B7 (Fig. 7), 404E4 (Fig. 8) lub 404A8 (Fig. 9) w 0,1; 1; 10 pg/ml 3 przez 72 godziny. Aby określić proliferację zmierzono wbudowanie [3H]-tymidyny (cpm).
Fig. 10 przedstawia wykres wykazujący wiązanie przeciwciała 146B7 z monocytami stymulowanymi IFNy. Ludzkie PBMC hodowano w obecności IFNy (500 U/ml) przez 2 dni (37°C). Natężenie fluorescencji o przynajmniej 5000 komórek na próbkę określono po analizie cytometrią przepływową i bramowaniu na monocytach. Dane przedstawiają współczynnik stymulacji (S.I. = (średnia z pozytywnych barwień fluorescencyjnych)/(średnia z podstawowego barwienia fluorescencyjnego)).
Fig. 11 przedstawia wiązanie ludzkich monocytów z przeciwciałem 146B7 (panel B) lub przeciwciałem kontrolującym izotyp (panel A). Ludzkie PBMC izolowano i preparaty z wirowanych komórek uzyskano po zakończeniu hodowli komórek z IFNy (500 U/ml). Komórki barwiono kontrastowo hematoksyliną.
Fig. 12 przedstawia wiązanie ludzkiej skóry łuszczycowej z 146B7 (panel B) lub przeciwciałem kontrolującym izotyp (hlgG1) (panel A). Ludzkie łuszczycowe płytki otrzymano od pacjentów po ich świadomej zgodzie i przechowywano w temp. -80°C do momentu badania. Tkanki barwiono biotynylowanymi przeciwciałami i uwidaczniano przez aktywację peroksydazą chrzanową.
Fig. 13A przedstawia wykres wykazujący procent komórek jądrzastych w reumatoidalnej tkance przy zapaleniu stawu po leczeniu myszy SCID stosując 146B7 lub nośnik. Tkanki barwiono hematoksyliną i eozyną (H&E) i analizowano programem Photo Shop wersja 6.0. Dane przedstawiono jako średnią i s.e.m. jądra (jako procent całkowitej powierzchni) myszy po traktowaniu 146B7 (n=4) lub traktowaniu nośnikiem (n=2). Fig. 13B wykazuje reprezentatywne barwienie H&E przeszczepionej między różnymi gatunkami tkance RA u myszy SCID, po leczeniu 146B7 (panel B) lub PBS (panel A).
Fig. 14 przedstawia wykresy wykazujące wpływ przeciwciała na leczenie 146B7 u myszy SCID/z łuszczycą. Biopsje utrwalono w formalinie w celu zanurzenia w parafinie i barwiono H&E oraz pod kątem antygenu jądrowego Ki-67. Fig. 14A przedstawia dotkliwość łuszczycy określoną przez grubość naskórka, którą zmierzono od warstwy rogowej do początku sopli naskórkowych (ang. rete pegs). Fig. 14B przedstawia grubość naskórka, którą zmierzono od warstwy rogowej do najgłębszej części sopli naskórkowych. Fig. 14C wykazuje stopień parakeratozy. Fig. 14D przedstawia liczbę zapalnych jednojądrzastych komórek w górnej warstwie skóry właściwej. Fig. 14E przedstawia liczbę krążących keratynocytów Ki-67+.
Fig. 15 przedstawia barwienie H&E ludzkiej skóry łuszczycowej wszczepionej myszy SCID, po leczeniu przeciwciałem 146B7 (panel C), CsA (panel B), lub traktowaniu nośnikiem (panel A). Trzy tygodnie po transplantacji myszy otrzymały PBS (placebo), CsA (cyklosporynę A) (Sandoz) w dawce 10 mg/kg co drugi dzień przez 15 dni, lub 146B7 w dawce 20 mg/kg w dniu 1 i 10 mg/kg w dniach 8 i 15. Jeden tydzień po ostatniej iniekcji, myszy uśmiercano i 4 mm biopsję pobierano sztancą z każdego heteroprzeszczepu. Biopsje utrwalono w formalinie w celu zanurzenia w parafinie i barwiono w H&E.
Fig. 16 przedstawia Ki-67 barwienia ludzkiego skóry łuszczycowej wszczepionej myszy SCID, po leczeniu 146B7 (panel C), CsA (panel B), lub traktowaniem nośnikiem (panel A). Trzy tygodnie po transplantacji myszy otrzymały PBS (placebo), CsA (cyklosporyna A) (Sandoz) w dawce 10 mg/kg co drugi dzień przez 15 dni, lub 146B7 w dawce 20 mg/kg w dniu 1 i 10 mg/kg w dniach 8 i 15. Jeden tydzień po ostatniej iniekcji, myszy uśmiercano i 4 mm biopsję pobierano sztancą z każdego heteroprzeszczepu. Biopsje utrwalono w formalinie w celu zanurzenia w parafinie i barwiono w celu oznaczenia jądrowego antygenu Ki-67 antygen.
Fig. 17 przedstawia wykres wykazujący wiązanie przeciwciała 146B7 ze związaną z receptorem IL-15. Szalki powlekano IL-15Ra i inkubowano z IL-15. Po 10 minutach, biotynylowaną 146B7 dodano do studzienek. Wiązanie 146B7 ze związaną z receptorem IL-15 określono przy 405 nm czytnikiem testu ELISA.
Fig. 18 przedstawia wykres wykazujący wiązanie przeciwciała 146B7 z IL-15, po wiązaniu IL-15 z jego receptorem ulegającym ekspresji w komórkach Raji. Po inkubacji komórek Raji prowadzących ekspresję IL-15R z IL-15, biotynylowaną 146B7 dodano do komórek po 10 minutach. Wiązanie 146B7 ze związaną z receptorem IL-15 określono analizą FACS.
Szczegółowy opis wynalazku
Oparte na przeciwciałach terapeutyczne rozwiązania według wynalazku umożliwiają działanie i diagnozowanie wielu różnych zaburzeń, w których pośredniczy IL-15 (to jest, zaburzenia powodowane przez prozapalne działania IL-15). Jak zastosowano tutaj, termin „prozapalne działania IL-15”
PL 217 752 B1 obejmuje dowolne humoralne lub zachodzące za pośrednictwem komórek odpowiedzi odpornościowe indukowane przez IL-15, takie jak wytwarzanie TNFa i innych zapalnych mediatorów i włączenie/proliferacja limfocytów T. Sposoby leczenia tu opisane wykorzystują izolowane ludzkie monoklonalne przeciwciała, które specyficznie wiążą się z epitopem obecnym na IL-15.
W jednej postaci wykonania, ludzkie przeciwciała są uzyskiwane od innych niż ludzie zwierząt transgenicznych, np., transgenicznej myszy, zdolnej do wytwarzania wielu izotypów ludzkich monoklonalnych przeciwciał przeciwko IL-15 (np., IgG, IgA i/lub IgE) w wyniku przejścia rekombinacji V-D-J i przełączania izotypów. Zgodnie z powyższym, różne aspekty wynalazku obejmują przeciwciała i ich farmaceutyczne kompozycje, jak i inne niż ludzie zwierzęta transgeniczne, limfocyty B, transfektoma i hybrydoma komórek gospodarza do wytwarzania takich monoklonalnych przeciwciał. Sposoby stosowania przeciwciał według wynalazku do wykrywania komórek, z którymi IL-15 jest związana, i/lub aby hamować funkcje, w których pośredniczy IL-15 zarówno in vitro jak i in vivo, są również niniejszym opisane. Twórcy wynalazku ujawnili także sposoby ukierunkowania czynników na komórki, z którymi IL-15 jest związana.
Aby obecny wynalazek mógł być łatwiej zrozumiały, niektóre terminy zostaną najpierw zdefiniowane. Dodatkowe definicje przedstawiono w całym poniższym szczegółowym opisie.
Określenia „IL-15,” „antygen IL-15” i “interleukina 15” stosowano tutaj wymiennie i obejmują dowolne odmiany lub izoformy, które są naturalnie wyrażane przez komórki.
Termin „przeciwciało” jak określono tutaj obejmuje całe przeciwciała i dowolny fragment wiążący antygen (to jest, „fragment wiążący antygen”) lub pojedynczy jego łańcuch. „Przeciwciało” odnosi się do glikoproteiny zawierającej przynajmniej dwa ciężkie (H) łańcuchy i dwa lekkie (L) łańcuchy połączone między sobą wiązaniami dwusiarczkowymi, lub ich fragment wiążący antygen. Każdy ciężki łańcuch jest złożony ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha (w skrócie określony jako VH) i stały region ciężkiego łańcucha. Stały region ciężkiego łańcucha jest złożony z trzech domen, CH1, CH2 i CH3. Każdy lekki łańcuch jest złożony ze zmiennego regionu lekkiego łańcucha (w skrócie określony jako VL) i stałego region lekkiego łańcucha. Stały region lekkiego łańcucha jest złożony z jednej domeny, CL. Regiony VH i VL mogą być ponadto dalej podzielone na regiony o hiperzmienności, określone mianem regionów określających komplementarność (CDR, ang. complementarity determining regions), rozdzielone od siebie regionami, które są bardziej konserwowane, określone mianem regionów szkieletowych (FR, ang. framework regions). Każdy VH i VL jest złożony z trzech regionów CDR i czterech FR, ustawionych od końca aminowego do końca karboksylowego w poniższej kolejności: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Zmienne regiony ciężkiego i lekkiego łańcucha zawierają domenę wiążącą, która oddziałuje z antygenem. Stałe regiony przeciwciał mogą pośredniczyć w wiązaniu immunoglobulin z tkankami lub czynnikami gospodarza, obejmującymi różne komórki układu odpornościowego (np., komórki efektorowe) i pierwszego składnika (Clq) klasycznego układu dopełniacza.
Termin „fragment wiążący antygen” przeciwciała (lub po prostu „część przeciwciała”), jak stosuje się tutaj, odnosi się do jednego lub więcej fragmentów przeciwciał, które zachowują zdolność do specyficznego wiązania się z antygenem (np., IL-15). Wykazano, że wiążąca antygen funkcja przeciwciała może być uzyskana przez fragmenty pełnej długości przeciwciała. Przykłady fragmentów wiążących objęte terminem „fragment wiążący antygen” przeciwciała obejmują (i) fragment Fab, jednowartościowy fragment obejmujący domeny VL, VH, CL i CH1; (ii) fragment F(ab')2, dwuwartościowy fragment zawierający dwa fragmenty Fab połączone mostkiem dwusiarczkowym w regionie przegubu; (iii) fragment Fd obejmujący domeny VH i CH1; (iv) fragment Fv obejmujący domeny VL i VH pojedynczego ramienia przeciwciała, (v) fragment dAb (Ward i wsp., (1989) Nature 341:544-546), który obejmuje domenę VH; i (vi) izolowany region określający komplementarność (CDR) lub (vii) połączenia dwóch lub więcej izolowanych regionów CDR, które ewentualnie mogą być połączone przez syntetyczny łącznik. Ponadto, pomimo, że dwie domeny fragmentu Fv, VL i VH, są kodowane przez oddzielne geny, mogą one być połączone, stosując sposoby rekombinacji, przez syntetyczny łącznik, który umożliwia ich połączenie w pojedynczy łańcuch białkowy, w którym regiony VL i VH ulegają sparowaniu z wytworzeniem jednowartościowej cząsteczki (znanej jako Fv (scFv) o pojedynczym łańcuchu; patrz np., Bird i wsp. (1988) Science 242:423-426: i Huston i wsp. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Takie jednołańcuchowe przeciwciała są również w zamiarze objęte terminem „fragment wiążący antygen” przeciwciała. Te fragmenty przeciwciał otrzymano stosując tradycyjne techniki znane specjalistom w dziedzinie i fragmenty przeszukiwano, pod kątem ich wykorzystania w ten sam sposób jak nienaruszone przeciwciała.
PL 217 752 B1
Termin „monoklonalne przeciwciało” w stosowanym tu znaczeniu, odnosi się do przeciwciała, które wykazuje specyficzność pojedynczego wiązania i powinowactwo do szczególnego epitopu. Zgodnie z powyższym, termin „ludzkie monoklonalne przeciwciało” odnosi się do przeciwciała, które wykazuje specyficzność pojedynczego wiązania i które ma zmienne i stałe regiony pochodzące z ludzkich sekwencji linii zarodkowej. W jednym rozwiązaniu, ludzkie monoklonalne przeciwciała są wytwarzane przez hybrydomę, która obejmuje limfocyt B otrzymany z transgenicznego, niebędącego człowiekiem, zwierzęcia, np., transgenicznej myszy, o genomie zawierającym transgen ludzkiego ciężkiego łańcucha i transgen lekkiego łańcucha sprzężony z unieśmiertelnioną komórką.
Termin „rekombinowane ludzkie przeciwciało”, w stosowanym tu znaczeniu, obejmuje wszystkie ludzkie przeciwciała, które wytworzono, wyrażano, stworzono lub izolowano środkami do rekombinacji, takie jak (a) przeciwciała izolowane od zwierzęcia (np., myszy), która jest transgeniczna lub transchromosomowa względem ludzkich genów kodujących immunoglobuliny lub z hybrydoma z nich wytworzonej (opisane ponadto w części I, poniżej), (b) przeciwciała izolowane z komórki gospodarza transformowanej, aby prowadziły ekspresję przeciwciała, np., z transfektomy, (c) przeciwciała izolowane ze zrekombinowanej, kombinatorycznej ludzkiej biblioteki przeciwciał i (d) przeciwciała wytworzone, wyrażane, stworzone lub izolowane dowolnymi innymi środkami obejmującymi składanie (ang. splicing) ludzkich sekwencji genów kodujących immunoglobuliny z innymi sekwencjami DNA. Takie zrekombinowane ludzkie przeciwciała mają zmienne i stałe regiony pochodzące z ludzkich sekwencji linii zarodkowych. W pewnych postaciach wykonania, jednakże, takie zrekombinowane ludzkie przeciwciała mogą być poddane mutagenezie in vitro (lub, gdy zwierzę transgeniczne względem ludzkich sekwencji kodujących Ig jest zastosowane, somatycznej mutagenezie in vivo), a zatem sekwencje aminokwasowe regionów VH i VL zrekombinowanych przeciwciał stanowią sekwencje które, podczas gdy pochodzące z i pokrewne z ludzkimi sekwencjami linii komórek zarodkowych VH i VL, mogą nie występować naturalnie w obrębie zestawu ludzkich linii zarodkowych przeciwciał in vivo.
W znaczeniu tu stosowanym, „heterogeniczne przeciwciało” zdefiniowano w odniesieniu do transgenicznego nieludzkiego organizmu wytwarzającego takie przeciwciało. Termin ten odnosi się do przeciwciała mającego aminokwasową sekwencję lub kodującego sekwencję kwasu nukleinowego odpowiadającą sekwencji stwierdzonej w organizmie, nie obejmując transgenicznego, niebędącego człowiekiem zwierzęcia i ogólnie z gatunków innych niż to transgeniczne, niebędące człowiekiem zwierzę.
„Izolowane przeciwciało”, w znaczeniu tu stosowanym, ma odnosić się do przeciwciała, które jest zasadniczo wolne od innych przeciwciał mających różne antygenowe specyficzności (np., izolowane przeciwciało, które specyficznie wiąże się z IL-15 jest zasadniczo wolne od przeciwciał, które specyficznie wiąże się z antygenami innymi niż IL-15). Izolowane przeciwciało, które specyficznie wiąże się z epitopem IL-15 może, jednakże, wykazywać reaktywność krzyżową z innymi pokrewnymi cytokinami lub z innymi białkami IL-15 z różnych gatunków. Jednakże, przeciwciało korzystnie zawsze wiąże się z ludzką IL-15. Ponadto, izolowane przeciwciało jest typowo zasadniczo wolne od innego komórkowego materiału i/lub środków chemicznych. W jednym korzystnym wykonaniu wynalazku, połączenia „izolowanych” monoklonalnych przeciwciał mających różne specyficzności wobec IL-15 są połączone w dobrze zdefiniowanej kompozycji.
W znaczeniu tu stosowanym, „specyficzne wiązanie odnosi się do wiązania przeciwciała z wstępnie określonym antygenem. Zazwyczaj, przeciwciało wiąże się z powinowactwem (KD) w przybliżeniu mniejszym niż 10-7 M, takim jak w przybliżeniu mniejszym niż 10-8 M, 10-9 M lub 10-10 M lub nawet mniejszym, gdy określono techniką rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR) przy użyciu urządzenia BIACORE 3000, stosując zrekombinowaną ludzką IL-15 jako analit i przeciwciało jako ligand i wiąże się ze wstępnie określonym antygenem z powinowactwem, które wynosi przynajmniej dwukrotnie więcej niż jego powinowactwo wiązania z niespecyficznym antygenem (np., BSA, kazeina) innym niż wstępnie określony antygen lub blisko spokrewniony antygen. Określenia „przeciwciało rozpoznające antygen” i „przeciwciało specyficzne względem antygenu” zastosowano tutaj wymiennie z terminem „przeciwciało, które wiąże się specyficznie z antygenem”.
Termin „KD”, w znaczeniu tu stosowanym, ma odnosić się do stałej równowagi dysocjacji danego oddziaływania przeciwciało-antygen.
W znaczeniu tu stosowanym, „izotyp” odnosi się do klasy przeciwciał (np., IgM lub IgG1), która jest kodowana przez geny stałego regionu ciężkiego łańcucha.
W znaczeniu tu stosowanym, „przełączenie izotypów” odnosi się do zjawiska, w wyniku którego klasa, lub izotyp przeciwciała zmienia się z jednej klasy Ig na inne Ig.
PL 217 752 B1
W znaczeniu tu stosowanym, „nieprzełączony izotyp” odnosi się do klasy izotypowej ciężkiego łańcucha, która jest uzyskiwana gdy nie miało miejsce przełączenie izotypów; gen CH kodujący nieprzełączony izotyp stanowi typowo pierwszy gen CH bezpośrednio w dół (ang. downstream) za funkcjonalnie przearanżowanym genem VDJ. Przełączenie izotypów zostało sklasyfikowane jako klasyczne lub nieklasyczne przełączenie izotypów. Klasyczne przełączenie izotypów występuje w wyniku rekombinacji, która obejmuje przynajmniej jeden region sekwencji przełączania w transgenie. Nieklasyczne przełączenie izotypów może występować w wyniku, na przykład, homologicznej rekombinacji pomiędzy ludzkim σμ a ludzkim Σμ (delecja związana z δ). Alternatywne nieklasyczne mechanizmy przełączania, takie jak intertransgen i/lub rekombinacja interchromosomowa, między innymi, może występować i wpływać na przełączenie izotypów.
W znaczeniu tu stosowanym, termin „sekwencje przełączania” odnosi się do tych sekwencji DNA odpowiedzialnych za rekombinację przełączania. Sekwencja „dawcy przełączania”, typowo region przełączania μ, będzie w kierunku 5' od (to jest, w górę od (ang. upstream)) regionu konstruktu, który będzie usunięty w czasie rekombinacji przełączania. Region „biorcy przełączania” będzie regionem pomiędzy regionem konstruktu, który ma być usunięty i zamiennym stałym regionem (np., γ, ε, itp.). Jako, że nie istnieje specyficzne miejsce, w którym rekombinacja zawsze występuje, końcowa sekwencja genu będzie typowo nieprzewidywalna na podstawie konstruktu.
W znaczeniu tu stosowanym, „wzór glikozylacji” zdefiniowano jako wzór jednostek węglowodanowych, które kowalencyjnie są przyłączone do białka, bardziej szczegółowo do białka immunoglobuliny. Wzór glikozylacji heterogenicznego przeciwciała może być scharakteryzowany jako będący zasadniczo podobny do wzorów glikozylacji, które występują naturalnie na przeciwciałach wytwarzanych przez gatunki niebędącego człowiekiem transgenicznego zwierzęcia, gdy osoba o przeciętnej wiedzy w dziedzinie może rozpoznać ten wzór glikozylacji heterogenicznego przeciwciała jako będący bardziej podobny do wzoru glikozylacji u gatunków niebędącego człowiekiem transgenicznego zwierzęcia, niż do gatunków, z których geny CH transgenu pochodzą.
Termin „naturalnie-występujący” w znaczeniu tu stosowanym w odniesieniu do przedmiotu odnosi się faktycznie do przedmiotu, który może być znaleziony w naturze. Na przykład, polipeptydowa lub polinukleotydowa sekwencja, która jest obecna w organizmie (obejmującym wirusy), która może być izolowana ze źródła naturalnego, a która nie została specjalnie zmodyfikowana przez człowieka w laboratorium, jest naturalnie występującą.
Termin „przearanżowany” w znaczeniu tu stosowanym odnosi się do konfiguracji locus ciężkiego łańcucha lub lekkiego łańcucha immunoglobulin, przy czym segment V jest umiejscowiony tuż po przylegającym segmencie D-J lub J w konformacjach kodujących zasadniczo pełną domenę VH lub VL, odpowiednio. Przearanżowany locus genu immunoglobulinowego może być zidentyfikowany przez porównanie z DNA linii zarodkowej; przearanżowany locus będzie miał przynajmniej jeden element homologii zrekombinowanego heptameru/nonameru.
Termin „nieprzearanżowany” lub „konfiguracja linii zarodkowej” w znaczeniu tu stosowanym w odniesieniu do segmentu V odnosi się do konfiguracji, w której segment V nie jest zrekombninowany, tak aby był przylegający bezpośrednio do segmentu D lub J.
Termin „kwasu nukleinowego cząsteczka”, w znaczeniu tu stosowanym, ma obejmować cząsteczki DNA i cząsteczki RNA. Cząsteczka kwasu nukleinowego może być jednoniciowa lub dwuniciowa, lecz korzystnie jest dwuniciowa DNA.
Termin „izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego” w znaczeniu tu stosowanym w odniesieniu do kwasów nukleinowych kodujących przeciwciała lub fragmenty przeciwciał (np., VH, VL, CDR3), które wiążą się z IL-15, ma odnosić się do cząsteczki kwasu nukleinowego, w której sekwencja nukleotydowa kodująca przeciwciało lub część przeciwciała jest wolna od innych sekwencji nukleotydowych kodujących przeciwciała lub fragmenty przeciwciał, które wiążą się z antygenami innymi niż IL-15, przy czym te inne sekwencje mogą naturalnie flankować kwas nukleinowy ludzkiego genomowego DNA. SEK NR ID: 1-4 odpowiadają nukleotydowym i aminokwasowym sekwencjom zawierającym zmienne regiony łańcucha ciężkiego (VH) i łańcucha lekkiego (VL) ludzkiego przeciwciała anty-IL-15 według wynalazku, 146B7. W szczególności, SEK NR ID: 1 i 2 odpowiadają VH przeciwciała 146B7, SEK NR ID: 3 i 4 odpowiadają VL przeciwciała 146B7.
W niniejszym zgłoszeniu Twórcy odnoszą się do „konserwatywnych modyfikacji sekwencji” przedstawionych jako SEK NR ID: 1-4, to jest, modyfikacji nukleotydowych i aminokwasowych sekwencji, które nie wpływają lub nie zmieniają znacząco charakterystyki wiązania przeciwciał kodowanych przez taką sekwencję nukleotydową lub zawierających takie sekwencje aminokwasowe. Takie
PL 217 752 B1 konserwatywne modyfikacje sekwencji obejmują nukleotydowe i aminokwasowe podstawienia, addycje i delecje. Modyfikacje mogą być wprowadzone do SEK NR ID: 1-4 standardowymi technikami znanymi w dziedzinie, takimi jak ukierunkowana mutageneza i mutageneza z zastosowaniem PCR. Konserwatywne aminokwasowe podstawienia obejmują te, w których aminokwasowa reszta została zastąpiona resztą aminokwasową mającą podobny łańcuch boczny. Rodziny reszt aminokwasowych mające podobne łańcuchy boczne zostały zdefiniowane w dziedzinie. Te rodziny obejmują aminokwasy o zasadowych łańcuchach bocznych (np., lizyna, arginina, histydyna), kwasowe łańcuchy boczne (np., kwas asparaginowy, kwas glutaminowy), nienaładowane polarne łańcuchy boczne (np., glicyna, asparagina, glutamina, seryna, treonina, tyrozyna, cysteina, tryptofan), niepolame łańcuchy boczne (np., alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina), beta-rozgałęzione łańcuchy boczne (np., treonina, walina, izoleucyna) i aromatyczne łańcuchy boczne (np., tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan, histydyna). Zatem, przewidywana nieistotna aminokwasowa reszta w ludzkim przeciwciele anty-IL-15 może być zastąpiona inną resztą aminokwasową z tej samej rodziny łańcuchów bocznych.
W innej postaci rozwiązania, mutacje mogą być wprowadzone losowo wzdłuż wszystkich lub części kodujących sekwencji przeciwciała anty-IL-15, takie jak w wyniku mutagenezy nasycen ia, a otrzymane zmodyfikowane przeciwciała anty-IL-15 mogą być przeszukiwane pod kątem aktywności wiązania.
Zgodnie z powyższym, przeciwciała kodowane przez sekwencje nukleotydowe (regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i lekkiego) ujawnione tutaj i/lub zawierające sekwencje aminokwasowe (regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i lekkiego) ujawnione tutaj (to jest, SEK NR ID: 1-4) obejmują zasadniczo podobne przeciwciała kodowane przez lub zawierające podobne sekwencje, które zostały konserwatywnie zmodyfikowane. Poniżej przedstawiono dalsze omówienie tego, jak takie zasadniczo podobne przeciwciała mogą być wytwarzane w oparciu o częściowe sekwencje (to jest, zmienne regiony łańcucha ciężkiego i lekkiego) ujawnione tutaj jako SEK NR ID:1-4.
W przypadku kwasów nukleinowych, termin „zasadnicza homologia” wskazuje, że dwa kwasy nukleinowe, lub oznaczone ich sekwencje, gdy zostały optymalnie przyrównanie i porównane, są identyczne, z odpowiednimi nukleotydowymi insercjami lub delecjami, w przynajmniej około 80% nukleotydów, zwykle przynajmniej w około 90% do 95% i korzystniej przynajmniej w około 98% do 99,5% nukleotydów. Alternatywnie, zasadnicza homologia występuje, gdy segmenty ulegają hybrydyzacji w selektywnych warunkach hybrydyzacji z komplementem nici.
Procent identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami jest funkcją liczby identycznych pozycji występujących w sekwencjach (to jest, % homologii = liczba identycznych pozycji /całkowitą liczbę pozycji x 100), przy uwzględnieniu liczby przerw i długości każdej z przerw, które trzeba było wprowadzić w celu najlepszego przyrównania dwóch sekwencji. Porównanie sekwencji i wyznaczanie procentowej identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami może być osiągnięte przez zastosowanie algorytmu matematycznego, jak opisano w nieograniczających zakresu wynalazku przykładach poniżej.
Procent identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami nukleotydowymi może być określony stosując program GAP w zestawie oprogramowania GCG (dostępny na stronie http://www.gcg.com), stosując macierz NWSgapdna.CMP i ciężar przerw 40, 50, 60, 70 lub 80 oraz ciężar długości 1,2, 3, 4, 5 lub 6. Procent identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami nukleotydowymi lub aminokwasowymi może również być określony stosując algorytm E. Meyersa i W. Millera (CABIOS, 4:11-17 (1989)), które włączono do programu ALIGN (wersja 2.0), stosując tablicę reszt ważonych PAM120, karę za długość przerwy 12 oraz karę za przerwy 4. Ponadto, procent identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami aminokwasowymi może być określony stosując algorytm Needleman i Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)), który włączono do programu GAP w zestawie do oprogramowania GCG (dostępny na stronie http://www.gcg.com), stosując albo macierz Blossum 62 albo macierz PAM250 oraz ciężar przerw 16, 14, 12, 10, 8, 6 lub 4 i ciężar długości 1,2, 3, 4, 5 lub 6.
Sekwencje kwasu nukleinowego i białko może ponadto być użyte jako „sekwencja zapytania” do przeprowadzenia przeszukiwania w ogólnie dostępnych bazach danych aby, na przykład, zidentyfikować sekwencje pokrewne. Takie przeszukiwania mogą być przeprowadzane z zastosowaniem programów NBLAST i XBLAST (wersja 2.0) według Altschul, i wsp. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Przeszukiwania nukleotydowe BLAST mogą być prowadzane z użyciem programu NBLAST, wynik = 100, długość słowa = 12, aby uzyskać sekwencje nukleotydowe homologiczne do cząsteczek kwasu nukleinowego ujawnionego niniejszym. Przeszukiwania białkowe BLAST mogą być prowadzane z użyciem programu XBLAST, wynik = 50, długość słowa = 3, aby uzyskać sekwencje aminokwasowe homolo12
PL 217 752 B1 giczne do cząsteczki białka według wynalazku. Aby uzyskać przyporządkowania z przerwami w celach porównania, można zastosować Gapped BLAST jak opisano w Altschul i wsp., (1997) Nucleic Acid
Res. 25(17):3389- 3402. W przypadku stosowania programów BLAST i Gapped BLAST, można wykorzystywać parametry domyślne odpowiednich programów (np., XBLAST i NBLAST). Patrz http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Kwasy nukleinowe mogą być obecne w całych komórkach, w lizatach komórkowych, lub w częściowo oczyszczonej lub zasadniczo czystej postaci. Kwas nukleinowy jest „izolowany” lub „uzyskany w postaci zasadniczo czystej” gdy został oczyszczony od innych komórkowych składników lub innych zanieczyszczeń, np., innych komórkowych kwasów nukleinowych lub białek, standardowymi technikami, obejmującym traktowanie związkami alkalicznymi/SDS, wiązanie CsCl, chromatografię kolumnową, elektroforezę w agarozowym żelu i inne dobrze znane w stanie techniki. Patrz, F. Ausubel, i wsp., red. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).
Kompozycje kwasu nukleinowego, podczas gdy często w postaci natywnej sekwencji (z wyjątkiem zmodyfikowanych miejsc restrykcyjnych i tym podobnych), zarówno z cDNA, genomowego lub ich mieszanin mogą być zmutowane, standardowymi technikami z dostarczeniem sekwencje genów. W przypadku sekwencji kodujących, mutacje te, mogą wpływać na sekwencję aminokwasową w sposób pożądany. W szczególności, rozważane są niniejszym sekwencje DNA zasadniczo homologiczne z lub pochodzące z natywnych V, D, J, stałych, przełączanych i innych, takich jak sekwencje opisane tutaj (przy czym „pochodząca z” wskazuje, że sekwencja jest identyczna do lub zmodyfikowana z innej sekwencji).
Kwas nukleinowy jest „funkcjonalnie połączony” gdy jest umieszczony w funkcjonalnym związku z innymi sekwencjami kwasu nukleinowego. Na przykład, promotor lub wzmacniacz (enchancer) jest funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą, jeśli wpływa na transkrypcyję sekwencji. W odniesieniu do sekwencji regulatorowych transkrypcji, funkcjonalnie połączony oznacza, że sekwencje DNA, które są połączone przylegają i, gdzie jest to konieczne aby połączyć dwa regiony kodujące białko, przylegają w ramce odczytu. W przypadku sekwencji przełączania, funkcjonalnie połączony wskazuje, że sekwencje są zdolne do uzyskania rekombinacji przełączania.
Określenie „wektor”, w znaczeniu tu stosowanym, ma odnosić się do cząsteczki kwasu nukleinowego zdolnej do przenoszenia innego kwasu nukleinowego, z którym ma być połączona. Jeden typ wektora stanowi „plazmid”, który odnosi się do kolistego dwuniciowego DNA, z którym dodatkowe segmenty DNA mogą być zligowane. Inne typy wektora stanowi wektor wirusowy, w którym dodatkowe segmenty DNA mogą być zligowane z wirusowym genomem. Pewne wektory są zdolne do autonomicznej replikacji w komórce gospodarza do której zostały one wprowadzone (np., bakteryjne wektory mające bakteryjne miejsce inicjacji replikacji i episomalne wektory ssacze). Inne wektory (np., nieepisomalne wektory ssacze) mogą być zintegrowane z genomem komórki gospodarza przy wprowadzeniu do komórki gospodarza, przez co ulegają one replikacji z genomem gospodarza. Ponadto, pewne wektory są zdolne do kierowania ekspresją genów, z którymi są one funkcjonalnie połączone. Takie wektory określane są tutaj jako „zrekombinowane wektory ekspresyjne” (lub po prostu, „wektory ekspresyjne”). Ogólnie, wektory ekspresyjne użyteczne w technikach rekombinowanego DNA są często w postaci plazmidów. W niniejszym opisie, „plazmid” i „wektor” mogą być stosowane wymiennie, jako że plazmid jest najczęściej stosowaną postacią wektora. Jednakże, opisane są także inne postaci wektorów ekspresyjnych, takie jak wirusowe wektory (np., o uszkodzonej replikacji retrowirusy, adenowirusy i wirusy związane z adenowirusami), które służą równoważnym funkcjom.
Termin „zrekombinowana komórka gospodarza” (lub po prostu „komórka gospodarza”), w znaczeniu tu stosowanym, ma odnosić się do komórki do której zrekombinowany wektor ekspresyjny został wprowadzony. Należy rozumieć, że takie określenia są przeznaczone, aby nie odnosić się tylko do szczególnej przedmiotowej komórki, lecz do potomstwa takiej komórki. Ponieważ pewne modyfikacje mogą występować w kolejnych pokoleniach ze względu zarówno na mutacje lub wpływy środowiskowe, takie potomne komórki nie mogą, w rzeczywistości, być identyczne z komórką rodzicielską, lecz są nadal objęte zakresem terminu „komórka gospodarza” w znaczeniu tu stosowanym.
W znaczeniu tu stosowanym, termin „osobnik” obejmuje dowolnego człowieka lub dowolne zwierzę niebędące człowiekiem. Na przykład, przeciwciała i kompozycje według wynalazku mogą być użyte do leczenia osobnika cierpiącego na choroby zapalne, takie jak zapalenie stawów, np., reumatoidalne zapalenie stawów. Termin „niebędące człowiekiem zwierzę” obejmuje wszystkie kręgowce, np., ssaki i nie-ssaki, takie jak naczelne oprócz ludzi, owce, psy, krowy, kurczaki, płazy, itp.
PL 217 752 B1
Różne aspekty wynalazku opisano w ponadto szczegółowo w poniższych podrozdziałach.
I. Wytwarzanie ludzkich przeciwciał przeciwko IL-15
Ludzkie monoklonalne przeciwciała według wynalazku mogą być wytwarzane stosując wiele różnych znanych technik, takich jak standardowa technika hybrydyzacji komórek somatycznych opisana przez Kohlera i Milsteina, Nature 256: 495 (1975). Pomimo, że procedury hybrydyzacji komórek somatycznych są korzystne, w zasadzie, inne techniki wytwarzania monoklonalnych przeciwciał również mogą być stosowane, np., wirusowe lub onkogenną transformację limfocytów B, technika prezentowania na fagu wykorzystująca bibliotekę genów kodujących ludzkie przeciwciała.
Korzystny układ zwierzęcy do wytwarzania hybrydoma, które wytwarzają ludzkie monoklonalne przeciwciała według wynalazku stanowi układ mysi. Wytwarzanie hybrydoma w myszy jest dobrze znane w dziedzinie, włączając protokoły immunizacji i techniki wyodrębnienia i fuzji immunizowanych splenocytów.
W jednej postaci wykonania, ludzkie monoklonalne przeciwciała skierowane przeciwko IL-15 wytworzono stosując transgeniczne lub transchromosomalne myszy niosące części ludzkiego układu odpornościowego zamiast układu mysiego. W jednej postaci wykonania, wykorzystywane są transgeniczne myszy, określane tutaj jako „myszy HuMAb”, które zawierają ludzki miniloci genu kodującego immunoglobuliny, które kodują nieprzearanżowane sekwencje ludzkiego ciężkiego (μ i γ) i lekkiego κ łańcucha immunoglobulin, razem z docelową mutacją, która inaktywuje endogenne Ioci łańcuchów μ i κ (Lonberg, N. i wsp. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Zgodnie z powyższym, myszy wykazują obniżoną ekspresję mysiej IgM lub κ i w odpowiedzi na immunizację, wprowadzone transgeny ludzkiego ciężkiego i lekkiego łańcucha przechodzą przełączanie klasy i mutację somatyczną, aby uzyskać ludzkie monoklonalne przeciwciała IgGK o wysokim powinowactwie (Lonberg, N. i wsp. (1994), supra; przegląd w Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. i Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93 i Harding, F. i Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546). Otrzymywanie myszy HuMAb opisano szczegółowo w rozdziale II poniżej i w pracy Taylora, L. i wsp. (1992) Nucleic Acid Research 20:6287-6295; Chen, J. i wsp. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon i wsp. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:3720-3724; Choi i wsp. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. i wsp. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon i wsp. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg i wsp., (1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. i wsp. (1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg, N. i Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol, tom 13: 65-93; Harding, F. i Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546; Fishwild, D. i wsp. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. Patrz ponadto, Patenty US o nr 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; i 5,770,429; wszystkie należące do Lonberg i Kay i GenPharm International; Patent US o nr 5,545,807 należący do Surani i wsp.; publikacja międzynarodowa o nr WO 98/24884, opublikowana 11 czerwca 1998; WO 94/25585, opublikowana 10 listopada 1994; WO 93/1227, opublikowana 24 czerwca 1993; WO 92/22645, opublikowana 23 grudnia 1992; WO 92/03918, opublikowana 19 marca 1992. Wytwarzanie transgenicznych myszy HuMAb HCO12, w szczególności, zostało opisane w przykładzie 2.
Immunizacje
Aby wytworzyć w pełni ludzkie monoklonalne przeciwciała przeciwko IL-15, transgeniczne lub transchromosomalne myszy zawierające ludzkie geny kodujące immunoglobuliny (np., myszy HCo12, HCo7 lub KM) mogą być immunizowane oczyszczonym lub wzbogaconym preparatem antygenu IL-15 i/lub komórkami wyrażającymi IL-15, jak opisano, na przykład, przez Lonberga i wsp. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwilda i wsp. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 i WO 98/24884. W innym rozwiązaniu, myszy mogą być immunizowane DNA kodującym ludzką IL-15. Korzystnie, myszy będą w wieku 6-16 tygodni w czasie pierwszego wlewu. Na przykład, oczyszczony lub wzbogacony preparat (5-50 μg) antygenu IL-15 może być użyty do immunizacji myszy HuMAb śródotrzewnowo. W przypadku, w którym immunizacje z zastosowaniem oczyszczonego lub wzbogaconego preparatu antygenu IL-15 nie prowadzą do uzyskania przeciwciał, myszy mogą również być immunizowane komórkami prowadzącymi ekspresję IL-15, np., linią komórkową, aby zapoczątkować i zwiększyć odpowiedzi odpornościowe.
Łączne doświadczenie z różnymi antygenami wykazało, że transgeniczne myszy HuMAb odpowiadają najlepiej gdy wstępnie immunizowano je śródotrzewnowo (IP) lub podskórnie (SC) antygenem w pełnym adiuwancie Freunda, a następnie co tydzień immunizacjami IP/SC (sumarycznie do 10)
PL 217 752 B1 antygenem w niepełnym adiuwancie Freunda. Odpowiedzi odpornościowe mogą być monitorowane w trakcie protokołu immunizacji przy użyciu próbek osocza otrzymanych w wyniku pozaoczodołowych krwawień. Osocze może być przeszukiwane testem ELISA (jak opisano poniżej) i myszy o wystarczającym mianie ludzkich immunoglobulin anty-IL-15 mogą być wykorzystane do fuzji. Myszy mogą otrzymać dawkę przypominającą antygenu dożylnie 3 dni przed zabiciem i usunięciem śledziony.
Wytwarzanie hybrydoma wytwarzających ludzkie monoklonalne przeciwciała przeciwko IL-15
Aby otrzymać hybrydoma wytwarzające ludzkie monoklonalne przeciwciała przeciwko IL-15, splenocyty i komórki węzła chłonnego od immunizowanych myszy mogą być izolowane i poddane fuzji z odpowiednią unieśmiertelnioną linią komórkową, taką jak mysia linia komórkowa szpiczaka. Otrzymane hybrydoma mogą następnie być przeszukiwane pod kątem wytwarzania przeciwciał specyficznych wobec antygenu. Na przykład, pojedyncza komórka zawiesiny limfocytów śledzony z immunizowanej myszy może być poddana fuzji z SP2/0-Ag8.653 niewydzielającą komórką mysiego szpiczaka (ATCC, CRL 1580) z 50% PEG (masa/obj.). Komórki mogą być wysiane na szalce w przybliżeniu 5 w ilości 1 x 105 na płaskodennej szalce mikrotitracyjnej, a następnie dwa tygodnie inkubacji w selekty wnej pożywce zawierającej oprócz zwykłych odczynników 10% płodową surowicę do klonowania, 5-10% czynnik origen do klonowania hybrydoma (IGEN) i 1X HAT (Sigma). Po około dwóch tygodniach, komórki mogły być hodowane w pożywce, w której HAT został zastąpiony HT. Osobne studzienki mogą być następnie przeszukane za pomocą ELISA pod kątem monoklonalnego ludzkiego przeciwciała IgM i IgG anty-IL-15. Gdy występuje zwiększony wzrost hybrydoma, pożywka może być obserwowana zwykle po 10-14 dniach. Hybrydoma wydzielające przeciwciała mogą być ponownie umieszczone na płytkach, przeszukane i jeśli nadal są pozytywne względem ludzkiego monoklonalnego przeciwciała IgG anty-IL-15, mogą być wklonowane przynajmniej dwukrotnie przez ograniczone rozcieńczenia. Stabilne klony mogą następnie być hodowane in vitro, aby wytwarzać przeciwciało w pożywce do hodowli tkankowych w celu określenia jego charakterystyki.
Wytwarzanie transfektom wytwarzających ludzkie monoklonalne przeciwciała przeciwko IL-15
Ludzkie przeciwciała według wynalazku również mogą być wytwarzane w komórce gospodarza transfektoma stosując, na przykład, połączenia technik rekombinacji DNA i sposobów transfekcji genowej, jak jest dobrze znane w dziedzinie (Morrizon, S. (1985) Science 229:1202).
Na przykład, w jednej postaci wykonania, gen(y) będący przedmiotem zainteresowania, np., gen kodujący ludzkie przeciwciało, może być ligowany do wektora ekspresyjnego, takiego jak eukariotyczny plazmidu ekspresyjny, przykładowo stosowany w układzie do ekspresji genowej GS ujawniony w WO 87/04462, WO 89/01036 i EP 338 841 lub innych układach ekspresji dobrze znanych w dziedzinie. Oczyszczony plazmid ze sklonowanym genem kodującym przeciwciało może być wprowadzony do eukariotycznej komórki gospodarza, takiej jak komórki CHO lub komórki NSO lub alternatywnie eukariotycznej komórki, takiej jak komórki pochodzące z roślin, grzybów lub komórek drożdży. Sposób zastosowany do wprowadzenia tych genów może być sposobem opisanym w dziedzinie, takim jak elektroporacja, lipofektyna, lipofektamina lub inne. Po wprowadzaniu tych genów kodujących przeciwciało do komórki gospodarza, komórki prowadzące ekspresję przeciwciała mogą być zidentyfikowane i wybrane. Te komórki stanowią transfektoma, które mogą następnie być amplifikowane pod kątem ich poziomu ekspresji, a skala wytwarzana zwiększona w celu uzyskania przeciwciał. Zrekombinowane przeciwciała mogą być izolowane i oczyszczone z supernatantów tych hodowli i/lub komórek.
Alternatywnie te sklonowane geny kodujące przeciwciało mogą być wyrażane w innych układach ekspresyjnych, takich jak E. coli lub w pełnych organizmach lub mogą być wyrażane syntetycznie.
Zastosowanie sekwencji częściowych przeciwciała do wyrażania nienaruszonych przeciwciał
Przeciwciała oddziaływują z docelowymi antygenami przeważająco poprzez aminokwasowe reszty, które są zlokalizowane w sześciu ciężkich i lekkich łańcuchach regionów określających komplementarność (CDR). Z tej przyczyny, sekwencje aminokwasowe w obrębie CDR są bardziej zróżnicowane pomiędzy poszczególnymi przeciwciałami niż sekwencje poza CDR. Ponieważ sekwencje CDR są odpowiedzialne za większość oddziaływań przeciwciało-antygen, możliwe jest prowadzenie ekspresji rekombinowanych przeciwciał, które naśladują właściwości specyficznych, naturalnie występujących przeciwciał, przez konstruowanie wektorów ekspresyjnych, które obejmują sekwencje CDR ze specyficznych, naturalnie występujących przeciwciał, wszczepionych do sekwencji szkieletowych z różnych przeciwciał o różnych właściwościach (patrz, np., Riechmann, L. i wsp., 1998, 332:323-327; Jones, P. i wsp., 1986, Nature 321:522- 525; i Queen, C. i wsp., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
PL 217 752 B1
86:10029-10033). Takie sekwencje szkieletowe mogą być otrzymane z ogólnie dostępnych baz danych DNA, które obejmują sekwencje genów przeciwciał linii zarodkowej. Te sekwencje linii zarodkowej różnią się od sekwencji genów dojrzałych przeciwciał, ponieważ nie będą obejmowały całkowicie zestawionych zmiennych genów, które są utworzone przez połączenie V(D)J w czasie dojrzewania limfocytów B. Sekwencje genowe linii zarodkowej będą również różniły się od sekwencji zestawu drugorzędowych przeciwciał o wysokim powinowactwie osobnika równomiernie w zmiennym regionie. Na przykład , somatyczne mutacje są stosunkowo rzadkie w aminokońcowej części regionu szkieletowego. Na przykład, somatyczne mutacje są stosunkowo rzadkie w aminokońcowej część regionu szkieletowego 1 i w karboksylokońcowej część regionu szkieletowego 4. Ponadto, wiele somatycznych mutacji nie zmienia znacząco właściwości wiązania przeciwciała. Z tej przyczyny, nie jest konieczne uzyskanie całej sekwencji DNA danego przeciwciała w celu odtworzenia nienaruszonego zrekombinowanego przeciwciała o właściwościach wiązania podobnych, jak te wyjściowych przeciwciał (patrz PCT/US99/05535 zgłoszone 12 marca 1999). Częściowa sekwencja ciężkiego i lekkiego łańcucha rozciągająca sią na regiony CDR jest typowo wystarczająca w tym celu. Częściowa sekwencja została zastosowana, aby określić, które segmenty zmiennych genów linii zarodkowej i genów łączących uczestniczyły w zrekombninowanych zmiennych genach przeciwciała. Sekwencja linii zarodkowej została następnie zastosowana do wypełnienia brakującej części zmiennych regionów. Sekwencje liderowe ciężkiego i lekkiego łańcucha są cięte w czasie dojrzewania białka i nie mają wkładu we właściwości końcowego przeciwciała. Aby dodać brakujące sekwencje, sklonowane sekwencje cDNA mogą być połączone z syntetycznymi oligonukleotydami przez ligację lub amplifikację metodą PCR. Alternatywnie cały zmienny region może być zsyntetyzowany jako zestaw krótkich, zachodzących na siebie, oligonukleotydów i połączonych przez amplifikację PCR, aby stworzyć całkowicie syntetyczny zmienny klon regionu. Proces ten ma pewne korzyści, takie jak usunięcie lub uwzględnienie szczególnych miejsc restrykcyjnych, lub optymalizacja szczególnych kodonów.
Sekwencje nukleotydowe transkryptów ciężkiego i lekkiego łańcucha z hybrydoma zastosowano do zaprojektowania zestawu zachodzących na siebie syntetycznych oligonukleotydów, aby utworzyć syntetyczne sekwencje V o zdolnościach kodowania aminokwasów identycznych do naturalnych sekwencji. Syntetyczne sekwencje łańcucha ciężkiego i kappa mogą różnić się od naturalnych sekwencji na trzy sposoby: ciągi powtórzonych nukleotydowych zasad są przerwane w celu ułatwienia syntezy oligonukleotydu i amplifikacji PCR; optymalne miejsca inicjacji translacji są włączone zgodnie z zasadami Kozaka (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266L19867019870) oraz miejsca HindIII są wstawione metodami inżynierii w górę od miejsca początku translacji.
Zarówno dla zmiennych regionów ciężkiego i lekkiego łańcucha, zoptymalizowane kodujące i odpowiednie niekodujące sekwencje nici są rozdzielane na 30 - 50 nukleotydowe, w przybliżeniu w punkcie środkowym odpowiadającego niekodującego oligonukleotydu. Zatem, dla każdego łańcucha, oligonukleotydy mogą być zestawione w zachodzących na siebie dwuniciowych grupach, które obejmują segmenty o 150 - 400 nukleotydach. Pule następnie zastosowano jako matryce do uzyskania produktów amplifikacji PCR 150 - 400 nukleotydów. Typowo, pojedynczy zmienny region oligonukleotydowego zbioru będzie podzielony na dwie pule, które są oddzielnie amplifikowane, aby wytworzyć dwa zachodzące na siebie produkty PCR. Te zachodzące na siebie produkty następnie połączono poprzez amplifikację metodą PCR, aby utworzyć pełny zmienny region. Może również być pożądane, aby objąć zachodzące na siebie fragmenty ciężkiego lub stałego regionu lekkiego łańcucha (obejmujące miejsce BbsI lekkiego łańcucha kappa lub miejsce AgeI ciężkiego łańcucha gamma) w amplifikacji metodą PCR, aby wytwarzać fragmenty, które mogą łatwo być wklonowane do konstruktów wektora ekspresyjnego.
Zrekonstruowane zmienne regiony ciężkiego i lekkiego łańcucha następnie połączone ze sklonowanym promotorem, sekwencją liderową, miejscem inicjacji translacji, sekwencją liderową, stałym regionem, 3' nie ulegającym translacji, sekwencjami poliadenylacji i terminacji transkrypcji, aby utworzyć konstrukty wektora ekspresyjnego. Ekspresyjne konstrukty ciężkiego i lekkiego łańcucha mogą być połączone w pojedynczy wektor, komórki gospodarza mogą być współ-trasfekowane, kolejno trasfekowane, lub oddzielnie transfekowane, a następnie poddane fuzji z wytworzeniem komórki gospodarza wyrażającej oba łańcuchy.
Plazmidy do zastosowania w konstrukcji wektorów ekspresyjnych ludzkiego IgGK opisano poniżej (Przykład 1). Plazmidy skonstruowano tak, że amplifikowane metodą PCR sekwencje cDNA kodujące ciężki V i lekki V łańcuch kappa, mogły być użyte do rekonstrukcji minigenów pełnego ciężkiego i lekkiego łańcucha. Te plazmidy mogą być użyte do prowadzenia ekspresji całkowicie ludzkich prze16
PL 217 752 B1 ciwciał IgGK lub IgG4K. W pełni ludzkie i chimeryczne przeciwciała również obejmują przeciwciała
IgG2, IgG3, IgE, IgA, IgM i IgD. Podobne plazmidy mogą być skonstruowane do ekspresji innych izotypów ciężkich łańcuchów, lub do ekspresji przeciwciał zawierających lekkie łańcuchy lambda.
Zatem, w innym aspekcie wynalazku strukturalne właściwości ludzkiego przeciwciała anty-IL-15 według wynalazku, 146B7, 147H5, 404A8 i 404E4, zastosowano aby otrzymać strukturalnie pokrewne ludzkie przeciwciała anty-IL-15, które zachowują przynajmniej jedną funkcjonalną właściwość przeciwciał według wynalazku, taką jak wiązanie z IL-15. Bardziej szczegółowo, jeden lub więcej regiony CDR z 146B7, 147H5, 404A8 i 404E4 może być połączony rekombinacyjnie ze znanymi ludzkimi regionami szkieletowymi i CDR, aby otrzymać dodatkowe, rekombinacyjnie-zaprojektowane, ludzkie przeciwciała anty-IL-15 według wynalazku.
Zgodnie z powyższym, niniejszym opisano sposób wytwarzania przeciwciał anty-IL-15 obejmujący: wytwarzanie przeciwciała zawierającego (1) regiony szkieletowe ludzkiego ciężkiego łańcucha i CDR ludzkiego ciężkiego łańcucha, przy czym przynajmniej jeden z CDR ludzkiego ciężkiego łańcucha zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z sekwencji aminokwasowych CDR przedstawionych na Fig 2 (lub odpowiadające reszty aminokwasowe z SEK NR ID: 2); i (2) regiony szkieletowe ludzkiego lekkiego łańcucha i CDR ludzkiego lekkiego łańcucha, przy czym przynajmniej jeden z CDR ludzkiego ciężkiego łańcucha zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z sekwencji aminokwasowych CDR przedstawionych na Fig. 3 (lub odpowiadające reszty aminokwasowe z SEK NR ID: 4); przy czym przeciwciało zachowuje zdolność do wiązania z IL-15.
Zdolność przeciwciała do wiązania z IL-15 może być określona stosując standardowe testy wiązania, takie jak te przedstawione w przykładach (np., test ELISA).
Ponieważ w dziedzinie powszechnie wiadomo, że domeny ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciała CDR3 odgrywają szczególnie ważną rolę w specyficzności/powinowactwie wiązania przeciwciała z antygenem, zrekombinowane przeciwciała według wynalazku wytworzone jak przedstawiono powyżej korzystnie zawierają ciężki i lekki łańcuch CDR3 z 146B7, 147H5, 404A8 i 404E4. Przeciwciała ponadto mogą zawierać CDR2 z 146B7, 147H5, 404A8 i 404E4. Przeciwciała ponadto mogą zawierać CDR1 z 146B7, 147H5, 404A8 i 404E4. Przeciwciała mogą ponadto zawierać dowolne kombinacje CDR.
Zgodnie z powyższym, niniejszym ujawniono przeciwciała anty-IL-15 zawierające: (1) regiony szkieletowe łańcucha ciężkiego, region CDR1 ludzkiego łańcucha ciężkiego, region CDR2 ludzkiego łańcucha ciężkiego i region CDR3 ludzkiego łańcucha ciężkiego, przy czym region CDR3 ludzkiego łańcucha ciężkiego wybrano spośród CDR3 z 146B7, 147H5, 404A8 i 404E4, na przykład, region CDR ludzkiego łańcucha ciężkiego z 146B7 jak wykazano na Fig. 2 (lub odpowiadające reszty aminokwasowe z SEK NR ID: 2); i (2) regiony szkieletowe ludzkiego łańcucha lekkiego, region CDR1 ludzkiego łańcucha lekkiego, region CDR2 ludzkiego łańcucha lekkiego i region CDR3 ludzkiego łańcucha lekkiego, przy czym region CDR3 ludzkiego łańcucha lekkiego wybrano spośród CDR3 z 146B7, 147H5, 404A8 i 404E4, na przykład, region CDR ludzkiego łańcucha lekkiego z 146B7 jak wykazano na Fig. 3 (lub odpowiadające reszty aminokwasowe z SEK NR ID: 4), przy czym przeciwciało wiąże się z IL-15. Przeciwciało może ponadto zawierać CDR2 łańcucha ciężkiego i/lub CDR2 łańcucha lekkiego z 146B7, 147H5, 404A8 i 404E4. Przeciwciało może ponadto zawierać ciężki łańcuch CDR1 i/lub lekki łańcuch CDR1 z 146B7, 147H5, 404A8 i 404E4.
Regiony CDR1, 2, i/lub 3 z inżynieryjnie opracowanych przeciwciał opisanych powyżej mogą zawierać dokładną(e) sekwencję(e) aminokwasową(e) jak ta(e) z 146B7, 147H5, 404A8 i 404E4 ujawnionych niniejszym. Jednakże, specjalista o zwykłych umiejętnościach doceni, że pewne odstępstwa od dokładnych sekwencji CDR z 146B7, 147H5, 404A8 i 404E4 może być możliwe nadal zachowując zdolność przeciwciała do skutecznego wiązania z IL-15 (np., modyfikacje sekwencji konserwatywnych). Zgodnie z powyższym, w innej postaci wykonania, opracowane inżynieryjnie przeciwciało może być złożone z jednego lub więcej CDR które są, na przykład, w 90%, 95%, 98% lub 99,5% identyczne z jednym lub więcej CDR z 146B7, 147H5, 404A8 i 404E4.
Oprócz prostego wiązania IL-15, inżynieryjnie opracowane przeciwciała, takie jak te opisane powyżej, mogą być wybrane pod względem zachowania przez nie innych funkcjonalnych właściwości przeciwciał według wynalazku, takich jak:
(1) wiązanie z ludzką IL-15 i hamowanie indukowanego IL-15 działania prozapalnego;
(2) hamowanie indukowanego przez IL-15 wytwarzania TNFa lub proliferacji limfocytów T;
PL 217 752 B1 (3) wiązanie z ludzką IL-15 ze stałą równowagi dysocjacji (KD) poniżej około 10-7 M, jak określono techniką rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR) stosując urządzenie BIACORE 3000 oraz zrekombinowaną ludzką IL-15 jako analit i przeciwciało jako ligand;
(4) wiązanie z epitopem zlokalizowanym na łańcuchu β i/lub γ oddziałującej domeny ludzkiej IL-15;
(5) oddziaływanie na wiązanie Asp8 ludzkiej IL-15 z jednostką β ludzkiego receptora IL-15 i/lub Gln108 ludzkiej IL-15 z jednostką γ ludzkiego receptora IL-15;
(6) wiązanie ze związaną z receptorem ludzką IL-15;
(7) wiązanie z ludzką IL-15 i hamowanie zdolności ludzkiej IL-15 do indukowania parakeratozy;
(8) wiązanie z ludzką IL-15 i hamowanie zdolności ludzkiej IL-15 do indukowania zgrubienia naskórka;
(9) wiązanie z ludzką IL-15 i hamowanie zdolności ludzkiej IL-15 do indukowania proliferacji keratynocytów; i/lub (10) wiązanie z ludzką IL-15 i hamowanie zdolności ludzkiej IL-15 do indukowania chemotaksji aktywowanych leukocytów.
Charakterystyka ludzkich monoklonalnych przeciwciał przeciwko IL-15
Ludzkie monoklonalne przeciwciała według wynalazku mogą być scharakteryzowane pod względem ich wiązania z IL-15 stosując wiele różnych znanych technik. Ogólnie, przeciwciała są wstępnie scharakteryzowane testem ELISA. Pokrótce, szalki mikrotitracyjne mogą być powlekane oczyszczoną IL-15 w PBS i następnie blokowane niespokrewionymi białkami, takimi jak bydlęca albumina z surowicy (BSA, ang. bovine serum albumin) rozcieńczona w PBS. Rozcieńczenia osocza z myszy immunizowanych IL-15 dodano do każdej studzienki i inkubowano przez 1-2 godziny w temp. 37°C. Szalki przemywano PBS/Tween 20, a następnie inkubowano z poliklonalnym odczynnikiem Fc-specyficznym kozią-anty-ludzką IgG sprzężonym z fosfatazą alkaliczną przez 1 godzinę w temp. 37°C. Po przemyciu, szalki wywoływano substratem ABTS i analizowano przy OD 405. Korzystnie, myszy które rozwinęły najwyższe miana zostaną użyte do fuzji.
Test ELISA, jak opisano powyżej, może być użyty do przeszukiwania przeciwciał a zatem, hybrydoma, które wytwarzają przeciwciała wykazujące pozytywną reaktywność z immunogenem IL-15. Hybrydoma, które wiążą się, korzystnie z wysokim powinowactwem, z IL-15 mogą następnie zostać wklonowane i dalej scharakteryzowane. Jeden klon z każdej hybrydoma, która zachowuje reaktywność komórki wyjściowej (test ELISA), może następnie zostać wybrany do wytwarzania banku komórek i do oczyszczania przeciwciała.
Aby oczyścić ludzkie przeciwciała anty-IL-15, wybrane hybrydoma mogą być hodowane w walcowatych butelkach, dwulitrowych obłych kolbach lub innych układach hodowlanych. Aby oczyścić białko supernatanty mogą być przesączane i zatężane przed chromatografią powinowactwa z białkiem A-sefarozą (Pharmacia, Piscataway, NJ). Po wymianie buforu na PBS, stężenie może być określone przez pomiar OD280 stosując 1,43 współczynnik ekstynkcji lub korzystnie analizą nefelometryczną. IgG może być sprawdzona stosując elektroforezę w żelu i metodą specyficznego antygenu.
Aby określić czy wybrane ludzkie monoklonalne przeciwciała anty-IL-15 wiążą się ze szczególnymi epitopami, każde przeciwciało może być biotynylowane stosując dostępne na rynku odczynniki (Pierce, Rockford, IL). Wiązanie biotynylowanego MAb może być wykrywane sondą znakowanej streptawidyny. Aby określić izotyp oczyszczonych przeciwciał, izotypowy test ELISA może być przeprowadzany z zastosowaniem techniki znanej w tej dziedzinie. Na przykład, studzienki szalek mikrotitracyjnych mogą być powlekane 10 μg/ml anty-ludzkiej Ig przez noc w temperaturze 4°C. Po blokowaniu 5% BSA, szalki poddano reakcji z 10 μg/ml monoklonalnych przeciwciał lub oczyszczonych izotypowych kontroli, w temperaturze otoczenia przez dwie godziny. Studzienki mogą następnie być poddane reakcji zarówno z ludzką IgG1 lub innymi sprzęganymi sondami specyficznymi wobec ludzkiego izotypu. Szalki wywołano i analizowano jak opisano powyżej.
Do zbadania wiązania monoklonalnych przeciwciał wobec żywych komórek prowadzących ekspresję IL-15, może być użyta cytometria przepływowa. Pokrótce, linie komórkowe i/lub ludzkie PBMC wyrażające związaną z błoną IL-15 (hodowane w standardowych warunkach hodowli) zmieszano z różnymi stężeniami monoklonalnych przeciwciał w PBS zawierającym 0,1% BSA i 0,01% NaN3 w temp. 4°C przez 1 godzinę. Po przemyciu, komórki poddano reakcji ze znakowanym fluoresceiną przeciwciałem przeciwko ludzkiej IgG w tych samych warunkach jak barwienie pierwszorzędowego
PL 217 752 B1 przeciwciała. Próbki mogą być analizowane aparatem FACScan z wykorzystaniem właściwości świetlnych i rozpraszania bocznego w celu bramkowania pojedynczych komórek i wyznaczane jest wiązanie znakowanych przeciwciał. Alternatywny test z zastosowaniem mikroskopii fluorescencyjnej, może być zastosowany (oprócz lub zamiast) analizy cytometrią przepływową. Komórki mogą być barwione dokładnie jak opisano powyżej i badane mikroskopią fluorescencyjną. Metoda ta pozwala na uwidocznienie osobnych komórek, lecz może mieć zmniejszoną czułość w zależności od gęstości antygenu.
Ludzkie anty-IL-15 IgG mogą być ponadto badane pod kątem ich reaktywności z antygenem IL-15 metodą Western blot. Pokrótce, ekstrakty komórkowe z komórek wyrażających IL-15 mogą być wytwarzane i poddane elektroforezie w żelu poliakrylamidowym z solą sodową siarczanu dodecylu. Po elektroforezie, rozdzielone antygeny zostaną przeniesione na błony nitrocelulozowe, blokowane 20% mysią surowicą i poddane badaniu sondami testowanych monoklonalnych przeciwciał. Wiązanie ludzkiej IgG może być wykrywane z zastosowaniem fosfatazy alkalicznej anty-ludzkiej IgG i wywołanie substratem w postaci tabletek BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).
II. Wytwarzanie transgenicznych i transchromosomalnych, niebędących ludźmi zwierząt, które wytwarzają ludzkie monoklonalne przeciwciała anty-IL-15
Niniejszym opisano transgeniczne i transchromosomalne, niebędące człowiekiem zwierzęta, takie jak transgeniczne lub transchromosomalne myszy, które są zdolne do wyrażania ludzkich monoklonalnych przeciwciał, które specyficznie wiążą się z IL-15. Ujawnione transgeniczne lub transchromosomalne myszy mają genom zawierający transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego, tak że mysz wytwarza ludzkie przeciwciała anty- IL-15, gdy jest immunizowana antygenem IL-15 i/lub komórkami wyrażającymi IL-15. Transgen ludzkiego ciężkiego łańcucha może być zintegrowany z chromosomalnym DNA myszy, jak to ma miejsce w przypadku transgenicznej myszy, np. HuMAb, jak niniejszym opisano szczegółowo i przedstawiono w przykładach. W innym rozwiązaniu, transgen ludzkiego ciężkiego łańcucha może być utrzymywany pozachromosomalnie, jak to ma miejsce w przypadku transchromosomalnej (np., KM) myszy jak opisano w WO 02/43478 (opublikowana 6 czerwca 2002). Takie transgeniczne i transchromosomalne myszy są zdolne do wytwarzania wielu izotypów ludzkich monoklonalnych przeciwciał przeciwko IL-15 (np., IgG, IgA i/lub IgE) w wyniku przechodzenia rekombinacji V-D-J i przełączania izotypów. Przełączanie izotypów może występować w wyniku, np., klasycznego lub nieklasycznego przełączania izotypów.
Opracowanie transgenicznego lub transchromsomalnego, niebędącego człowiekiem zwierzęcia, który odpowiada na obcą antygenową stymulację zestawem heterogenicznych przeciwciał wymaga, aby transgeny heterogenicznych immunoglobulin zawierały w obrębie funkcjonowania transgenicznego zwierzęcia prawidłowej całej ścieżki rozwoju limfocytów B. Obejmuje to, na przykład, przełączenie izotypów transgenu heterogenicznego ciężkiego łańcucha. Zgodnie z powyższym, transgeny są tak skonstruowane, aby uzyskać przełączenie izotypów i jedno lub więcej z poniższych przeciwciał: (1) wysoki poziom i ekspresja specyficzna dla typu komórki, (2) funkcjonalne przearanżowanie genowe, (3) aktywacja i odpowiedź na wyłączenie allelowe, (4) ekspresja wystarczającego pierwszorzędowego zbioru, (5) transdukcja sygnału, (6) somatyczna hipermutacja i (7) dominacja locus transgenu przeciwciała w czasie odpowiedzi odpornościowej.
Nie wszystkie z powyższych kryteriów muszą być spełnione. Na przykład, w tych rozwiązaniach, gdzie Ioci endogennych immunoglobulin transgenicznego zwierzęcia są funkcjonalnie przerwane, transgen nie musi aktywować wyłączenia allelowego. Ponadto, w tych rozwiązaniach, w których transgen zawiera funkcjonalnie przearanżowany gen kodujący ciężki i/lub lekki łańcuch immunoglobulin, drugie kryterium funkcjonalnego przearanżowania genu nie jest konieczne, przynajmniej dla tego transgenu, który jest już przearanżowany. Podstawy immunologii molekularnej przedstawiono w „Fundamental Immunology”, wydanie 2 (1989), Paul William E., red., Raven Press, N.Y.
W pewnych postaciach transgeniczne lub transchromosomalne, niebędące człowiekiem zwierzęta stosowane do wytwarzania ludzkich monoklonalnych przeciwciał według wynalazku zawierają przearanżowany, nieprzearanżowany lub kombinację przearanżowanych i nieprzearanżowanych transgenów heterogenicznych ciężkiego i lekkiego łańcucha immunoglobulin w linii zarodkowej transgenicznego zwierzęcia. Każdy z transgenów łańcucha ciężkiego zawiera przynajmniej jeden gen CH. Ponadto, transgeny ciężkiego łańcucha mogą zawierać funkcjonalne izotypowe sekwencje przełączania, które są zdolne do wspierania przełączania izotypów heterogenicznego transgenu kodującego wiele genów CH w limfocytach B transgenicznego zwierzęcia. Takie sekwencje przełączania mogą być tymi, które występują naturalnie w locus linii zarodkowej immunoglobulin od gatunków, które służą
PL 217 752 B1 jako źródło transgenu genów CH, lub takie sekwencje przełączania mogą pochodzić z tych, które występują u gatunków, u których ma być otrzymany konstrukt transgenowy (transgeniczne zwierzę). Na przykład, ludzki konstrukt transgenowy, który jest zastosowany do uzyskania transgenicznej myszy może uzyskać wyższą częstość przypadków przełączania izotypów, jeśli obejmuje on sekwencje przełączania podobne do tych, które występują naturalnie w locus łańcucha ciężkiego myszy, jako że przypuszczalnie mysie sekwencje przełączania są zoptymalizowany, aby funkcjonować z mysim układem enzymu rekombinazy przełączania, podczas gdy ludzkie sekwencje przełączania nie. Sekwencje przełączania mogą być izolowane i sklonowane tradycyjnymi sposobami klonowania, lub mogą być zsyntetyzowane de novo z zachodzących na siebie syntetycznych oligonukleotydów zaprojektowanych na podstawie opublikowanych informacji dotyczących sekwencji określających sekwencje immunoglobulinowego regionu przełączania (Mills i wsp., Nucl. Acids. Res. 15:7305-7316 (1991); Sideras i wsp., Intl. Immunol. 1:631-642 (1989)). Dla każdego z powyższych transgenicznych zwierząt, transgeny funkcjonalnie przearanżowanego heterogenicznego ciężkiego i lekkiego łańcucha immunoglobulinowego zostały stwierdzone w znaczącym ułamku limfocytów B transgenicznego zwierzęcia (przynajmniej 10 procent).
Transgeny stosowane do wytwarzania transgenicznych zwierząt obejmują transgen łańcucha ciężkiego zawierający DNA kodujący przynajmniej jeden zmienny segment genu, jeden segment genu różnorodności (ang. diversity gene), jeden segment genu łączącego i przynajmniej jeden segment genu regionu stałego. Immunoglobulinowy transgen łańcucha lekkiego zawiera DNA kodujący przynajmniej jeden segment genu zmiennego, jeden segment genu łączącego i przynajmniej jeden segment genu regionu stałego. Segmenty genów kodujących segmenty genów łańcucha lekkiego i ciężkiego są heterogeniczne względem transgenicznego, niebędącego człowiekiem zwierzęcia, w takim zakresie, że pochodzą z, lub odpowiadają, DNA kodującemu immunoglobulinowe segmenty genów łańcucha ciężkiego i lekkiego z gatunków nie obejmujących transgeniczne, niebędące człowiekiem zwierzęta. Transgen może być skonstruowany tak, że poszczególne segmenty genów są nieprzearanżowane, to jest, nie przearanżowane tak, aby kodować funkcjonalny immunoglobulinowy łańcuch lekki lub ciężki. Takie nieprzearanżowane transgeny wspierają rekombinację segmentów genów V, D i J (funkcjonalne przearanżowanie) i korzystnie wspierają wbudowanie wszystkich lub części segmentu genu kodującego region D w otrzymanym przearanżowanym immunoglobulinowym łańcuchu ciężkim, w obrębie transgenicznego, niebędącego człowiekiem zwierzęcia, gdy jest eksponowane na antygen IL-15.
Odmiennie, transgeny zawierają nieprzearanżowany „mini-locus. Takie transgeny typowo zawierają zasadniczą część segmentów C, D i J, jak i podzbiór segmentów genów V. W takich konstruktach transgenowych różne regulatorowe sekwencje, np. promotory, wzmacniacze, region przełączania klasy, sekwencje łącznik- donor i łącznik-akceptor do obróbki RNA, sygnały rekombinacji i tym podobne, zawierają odpowiadające im sekwencje pochodzące z heterogenicznego DNA. Takie regulatorowe sekwencje mogą być włączone do transgenu z tego samego lub pokrewnego gatunku niebędącego człowiekiem zastosowanego zwierzęcia. Na przykład, ludzkie immunoglobulinowe segmenty genów mogą być połączone w transgenie z immunoglobulinową wzmacniającą sekwencją gryzoni do zastosowania u transgenicznej myszy. W innym rozwiązaniu, syntetyczne regulatorowe sekwencje mogą być włączone do transgenu, w którym takie syntetyczne regulatorowe sekwencje nie są homologiczne z funkcjonalną sekwencją DNA, która jest znana, jako występująca naturalnie w genomach ssaków. Syntetyczne regulatorowe sekwencje zaprojektowano według reguł zgodności, takich jak, na przykład, te wyszczególnione dopuszczalne sekwencje miejsce łączn ika-akceptora lub motyw promotora/wzmacniacza. Na przykład, minilocus zawiera część genomowego immunoglobulinowego locus o przynajmniej jednej wewnętrznej (to jest, nie na końcu fragmentu) delecję nieistotnej części DNA (np., sekwencji przeszkadzającej; intronu lub jego części) w porównaniu do naturalnie występującego locus linii zarodkowej Ig.
Transgeniczne lub transchromosomalne zwierzę zastosowane, aby wytwarzać ludzkie przeciwciała przeciwko IL-15 zawiera przynajmniej jedną, typowo 2-10 i czasami 25-50 lub więcej kopii transgenu opisanych w przykładzie 12 z WO 98/24884 (np., pHC1 lub pHC2) hodowli ze zwierzęciem zawierającym pojedynczą kopię transgenu lekkiego łańcucha opisanego w przykładach 5, 6, 8 lub 14 z WO 98/24884 i w hodowli potomstwa, zwierzęcia pozbawionego JH, jak opisano w przykładzie 10 z WO 98/24884. Zwierzęta hodowano do homozygotyczności w każdej z tych trzech prób. Takie zwierzęta mają poniższy genotyp: pojedyncza kopia (na haploidalny zbiór chromosomów) nieprzearanżowanego mini-locus ludzkiego ciężkiego łańcucha (opisanego w przykładzie 12 z WO 98/24884), poje20
PL 217 752 B1 dyncza kopia (na haploidalny zbiór chromosomów) przearanżowanego ludzkiego konstruktu łańcucha lekkiego K (opisany w przykładzie 14 z WO 98/24884) i delecję w każdym locus endogennego mysiego ciężkiego łańcucha, która usuwa wszystkie funkcjonalne segmenty JH (opisane w przykładzie 10 z WO 98/24884). Takie zwierzęta hodowano z myszami, które są homozygotyczne pod względem delecji segmentów JH (przykłady 10 z WO 98/24884) do uzyskania potomstwa, które jest homozygotyczne pod względem delecji JH i hemizygotyczne pod względem konstruktów ludzkiego ciężkiego i lekkiego łańcucha. Otrzymanym zwierzętom wstrzykuje się antygeny i są one stosowane do wytwarzania ludzkich monoklonalnych przeciwciał przeciwko tym antygenom.
Limfocyty B izolowane od takiego zwierzęcia są monospecyficzne w odniesieniu do ludzkiego łańcucha ciężkiego i lekkiego, ponieważ zawierają tylko pojedynczą kopię każdego z genów. Ponadto, pozostaną one monospecyficzne w odniesieniu do ludzkich lub mysich łańcuchów ciężkich, ponieważ oba endogenne mysie kopie genów ciężkiego łańcucha nie są funkcjonalne w wyniku delecji łączącego regionu JH wprowadzonego, jak opisano w przykładach 9 i 12 z WO 98/24884. Ponadto, zasadnicza frakcja limfocytów B będzie monospecyficzna w odniesieniu do ludzkiego lub mysiego łańcucha lekkiego, ponieważ ekspresja pojedynczej kopii przearanżowanego ludzkiego genu kodującego łańcuch lekki κ będzie allelowo i izotypowo wyłączała przearanżowanie endogennych mysich genów kodujących łańcuch κ i lambda w znaczącym ułamku limfocytów B.
Transgeniczne i transchromsomalne myszy tu opisane wytwarzają immunoglobuliny ze znaczącym zbiorem, idealnie zasadniczo podobnym do tego myszy naturalnych. Zatem, na przykład, w rozwiązaniach gdzie endogenne geny Ig, które inaktywowano całkowite, poziomy immunoglobulin będą w zakresie od około 0,1 do 10 mg/ml surowicy, korzystnie 0,5 do 5 mg/ml, idealnie przynajmniej około 1,0 mg/ml. Gdy transgen zdolny do uzyskania przełączenia z IgG na IgM został wprowadzony do transgenicznej myszy, stosunek w surowicy dorosłej myszy IgG do IgM wynosi korzystnie około 10:1. Stosunek IgG do IgM będzie znacznie niższy u niedojrzałej myszy. Ogólnie, ponad około 10%, korzystnie 40 do 80% limfocytów B śledziony i węzłów chłonnych prowadzi ekspresję wyłącznie ludzkiego białka IgG.
W warunkach idealnych zbiór przeciwciał będzie zbliżony, do tego u myszy natywnej, zwykle przynajmniej w około 10%, korzystnie 25 do 50% lub więcej. Ogólnie, przynajmniej około tysiąca różnych immunoglobulin (idealnie IgG), korzystnie 104 do 106 lub więcej, będzie uzyskiwanych, w zależności od przede wszystkim liczby różnych regionów V, J i D wprowadzonych do genomu myszy. Te immunoglobuliny będą typowo rozpoznawały około połowę lub więcej wysoce antygenowych białek, np., białko A gronkowca. Typowo, immunoglobuliny będą wykazywać powinowactwo (KD) Z wcześniej wybranymi antygenami poniżej 10-7 M, na przykład 10-8 M, 10-9 M lub 10-10 M lub nawet niższe.
Korzystnie można wytwarzać myszy o wcześniej określonych zbiorach, aby ograniczyć selekcję genów V reprezentowanych w odpowiedzi przeciwciała na wstępnie określony typ antygenu. Transgen łańcucha ciężkiego o wcześniej określonym zbiorze może obejmować, na przykład, ludzkie geny VH, które są korzystne w zastosowaniu w odpowiedziach przeciwciała na wstępnie określony typ antygenu u ludzi. Alternatywnie niektóre geny VH mogą być wyłączone ze zdefiniowanego zbioru z różnych przyczyn (np., mają niskie prawdopodobieństwo kodowania regionów V o wysokim powinowactwie z wstępnie określonym antygenem; mają niską skłonność, aby przechodzić mutację somatyczną i zaostrzenie powinowactwa; lub są immunogenne u pewnych ludzi). Zatem, przed przearanżowaniem transgenu zawierającego różne segmenty genów łańcucha ciężkiego lub lekkiego, takie segmenty genów mogą być łatwo identyfikowane, np. przez hybrydyzację lub sekwencjonowanie DNA, gdyż są one z gatunku organizmu innego niż transgeniczne zwierzę.
Transgeniczne i transchromosomalne myszy, jak opisano powyżej mogą być immunizowane, na przykład, oczyszczonym lub wzbogaconym preparatem antygenu IL-15 i/lub komórkami wyrażającymi IL-15. W innym rozwiązaniu, transgeniczne myszy mogą być immunizowane DNA kodującym ludzką IL-15. Myszy będą następnie wytwarzały limfocyty B, które przechodzą przełączanie klasy przez intratransgenową rekombinację przełączania (przełączanie cis) i prowadzą ekspresję immunoglobulin reaktywnych z IL-15. Immunoglobuliny mogą być ludzkimi przeciwciałami (również określanymi jako „przeciwciała ludzkiej sekwencji”), przy czym polipeptydy łańcucha ciężkiego i lekkiego są kodowane przez ludzkie transgenowe sekwencje, które mogą obejmować sekwencje uzyskane przez mutację somatyczną i połączenia rekombinacyjne regionu V, jak i sekwencje kodowane przez linię zarodkową; te ludzkie przeciwciała mogą być określane jako zasadniczo identyczne z polipeptydową sekwencją kodowaną przez ludzki segment genowy VL lub VH i ludzki segment JL lub DH i JH, jednakże nawet inne sekwencje niż linii zarodkowej mogą być obecne w wyniku mutacji somatycznej i zróżnicowanej rePL 217 752 B1 kombinacji połączeń V-J i V-D-J. Zmienne regiony każdego z łańcucha przeciwciała są typowo przynajmniej w 80 procentach kodowane przez ludzką linię zarodkową V, J oraz, w przypadku ciężkich łańcuchów, D, segmenty genów; często przynajmniej 85 procent zmiennych regionów jest kodowanych przez ludzkie sekwencje linii zarodkowej obecne w transgenie; często 90 lub 95 procent lub więcej innych regionów jest kodowanych przez ludzkie sekwencje linii zarodkowej obecne w transgenie. Jednakże, ponieważ sekwencje inne niż linii zarodkowej są wprowadzone przez mutację somatyczną i łączenie VJ i VDJ, ludzka sekwencja przeciwciał będzie często mieć pewne sekwencje zmiennych regionów (i rzadziej sekwencje stałego regionu), które nie są kodowane przez ludzkie segmenty genów V, D, lub J, jak stwierdzono w ludzkim transgenie(ach) w linii zarodkowej myszy. Typowo, takie sekwencje inne niż linii zarodkowej (lub poszczególne nukleotydowe pozycje) będą tworzyć klaster w lub w pobliżu CDR, lub w regionach, o których wiadomo, że somatyczne mutacje tworzą klaster.
Ludzkie przeciwciała, które wiążą się z wstępnie określonym antygenem mogą być wynikiem przełączenia izotypów, tak że są uzyskiwane ludzkie przeciwciała zawierające ludzką sekwencję łańcucha γ (takiego jak γ1, γ2a, γ2Β, lub γ3) i ludzka sekwencja lekkiego łańcucha (takiego jak kappa). Takie ludzkie przeciwciała o przełączonym izotypie często zawierają jedną lub więcej mutację somatyczną(e), typowo w zmiennym regionie i często w lub w obrębie około 10 reszt z CDR w wyniku dojrzewania powinowactwa i selekcji limfocytów B przez antygen, zwłaszcza w następstwie prowokacji drugorzędowym (lub kolejnym) antygenem. Takie wysokie powinowactwo ludzkich przeciwciał może wykazywać powinowactwa wiązania (KD) poniżej 10-7 M, przykładowo poniżej 10-8 M,10-9 M lub 10-10 M lub nawet niższe.
Niniejszym ujawniono limfocyty B pochodzące z transgenicznej lub transchromosomalnej myszy jak opisano tutaj. Limfocyty B mogą być użyte do wytwarzania hybrydoma wyrażających ludzkie monoklonalne przeciwciała, które wiążą się z wysokim powinowactwem (np., niższym niż 10-7 M) z ludzką IL-15. Zatem, w innej postaci wykonania, wynalazek dostarcza hybrydoma, która wytwarza ludzkie przeciwciała o powinowactwie (Kd) poniżej 10-7 M, takim jak poniżej 10-8 M, 10-9 M lub 10-10 M lub nawet niższe, gdy określono techniką rezonansu plazmonów powierzch niowych (SPR) urządzeniem BIACORE 3000, stosując rekombinowaną ludzką IL-15 jako analit i przeciwciało jako ligand, przy czym przeciwciało zawiera:
ludzką sekwencję łańcucha lekkiego złożoną z (1) regionu zmiennego łańcucha lekkiego mającego polipeptydową sekwencję, która jest zasadniczo identyczna z polipeptydową sekwencją kodowaną przez ludzki segment genu VL i ludzki segment JL i (2) regionu stałego łańcucha lekkiego mającego polipeptydową sekwencję, która jest zasadniczo identyczna z polipeptydową sekwencją kodowaną przez ludzki segment genu CL oraz ludzką sekwencję łańcucha ciężkiego złożoną z (1) regionu zmiennego ciężkiego łańcucha mającego polipeptydową sekwencję, która jest zasadniczo identyczna z polipeptydową sekwencją kodowaną przez ludzki segment genu VH, ewentualnie region D ludzki segment JH i (2) regionu stałego mającego polipeptydową sekwencję, która jest zasadniczo identyczna z polipeptydową sekwencją kodowaną przez ludzki segment genu CH.
Opracowanie ludzkich monoklonalnych przeciwciał przeciwko IL-15 o wysokim powinowactwie, może być ułatwiony przez sposób rozprzestrzeniania zbioru segmentów genów ludzkiego zmiennego regionu u myszy transgenicznej mającej genom zawierający zintegrowany ludzki immunoglobulinowy transgen, przy czym sposób ten obejmuje wprowadzanie do genomu transgenu genu V zawierającego segmenty genów regionu V, które nie są obecne w tym zintegrowanym ludzkim immunoglobulinowym transgenie. Często, transgen regionu V jest sztucznym chromosomem drożdży zawierającym część ludzkiego szyku segmentu genowego VH lub VL (VK), jaki może naturalnie występować w ludzkim genomie lub jaki może być składany razem oddzielnie sposobami rekombinacji, które mogą obejmować zepsute lub pominięte segmenty genowe V. Często przynajmniej pięć lub więcej funkcjonalnych segmentów genowych V jest obecnych na YAC. W tej zmienności, jest możliwe otrzymanie transgenicznej myszy metodą rozprzestrzeniania się zbioru V, przy czym mysz wyraża immunoglobulinowy łańcuch zawierający sekwencję zmiennego regionu kodowaną przez segment genowy regionu V obecny w transgenie regionu V i regionu C kodowanych w obrębie ludzkiego transgenu Ig. Za pośrednictwem sposobu rozprzestrzeniania się zbioru V, mogą być wytworzone transgeniczne myszy o przynajmniej 5 odmiennych V genach; podobnie jak myszy zawierające przynajmniej około 24 lub więcej genów V. Niektóre segmenty genowe V mogą być niefunkcjonalne (np., pseudogeny i tym podobne); segmenty te mogą być zachowane lub mogą być selektywnie usunięte sposobami rekombinacji dostępnymi specjaliście w dziedzinie, jeśli jest to pożądane.
PL 217 752 B1
Gdy mysia linia zarodkowa została opracowana tak, aby zawierała funkcjonalne YAC o rozszerzonym zbiorze segmentów V, zasadniczo nieobecnych w ludzkim transgenie Ig zawierającym segmenty genów J i C, cecha może być namnażana i hodowana w innym genetycznym otoczeniu, obejmującym otoczenie, w którym funkcjonalne YAC mające rozszerzony zbiór segmentów V są hodowane w mysiej linii zarodkowej mającej odmienny ludzki transgen Ig. Wiele funkcjonalnych YAC mających rozszerzony zbiór segmentów V, może być przekazywane do linii zarodkowej, w celu współpracy z ludzkim transgenem Ig (lub wielokrotnymi ludzkimi transgenami Ig). Pomimo, że określane są tutaj jako transgeny YAC, transgeny takie gdy są zintegrowane z genomem mogą zasadniczo być pozbawione sekwencji drożdży, takich jak sekwencje wymagane do autonomicznej replikacji w komórkach drożdży; takie sekwencje mogą ewentualnie być usunięte metodami inżynierii genetycznej (np., trawienie restrykcyjne i elektroforeza w żelu z pulsującym polem, lub inna odpowiednia metoda) po replikacji w komórce drożdży nie jest to dalej konieczne (to jest, przed wprowadzeniem do mysich komórek ES lub mysiej prozygoty). Sposoby rozprzestrzeniania cechy ekspresji ludzkiej sekwencji immunoglobulin, obejmują hodowlę transgenicznej myszy mającej ludzki(e) transgen(y) Ig i ewentualnie również mającej funkcjonalne YAC o rozszerzonym zbiorze segmentów V. Oba segmenty VH i VL genów mogą być obecne na YAC. Transgeniczna mysz może być hodowana w dowolnym, pożądanym przez lekarza, otoczeniu, włącznie z otoczeniem zawierającym inne ludzkie transgeny, obejmujące ludzkie transgeny Ig i/lub transgeny kodujące inne białka ludzkiego limfocytu. Immunoglobuliny o wysokim powinowactwie do ludzkich sekwencji wytwarzane przez transgeniczną mysz mającą rozszerzony zbiór segmentów V transgenu YAC. Pomimo, że powyżej opisano korzystne transgeniczne zwierzęta, inne rozwiązania mogą być rozważane, które można sklasyfikować w czterech kategoriach:
I. Transgeniczne zwierzęta zawierające transgen nieprzearanżowany ciężkiej i przearanżowanej lekkiej immunoglobuliny;
II. Transgeniczne zwierzęta zawierające transgen nieprzearanżowany ciężkiej i nieprzearanżowany lekkiej immunoglobuliny;
III. Transgeniczne zwierzę zawierające transgen przearanżowanej ciężkiej i nieprzearanżowanej lekkiej immunoglobuliny oraz
IV. Transgeniczne zwierzęta zawierające transgeny przearanżowanej ciężkiej i przearanżowanej lekkiej immunoglobuliny.
Z tych kategorii transgenicznych zwierząt, porządek korzystnych rozwiązań jest następujący II > I > III > IV, gdy endogenne geny kodujące lekki łańcuch (lub przynajmniej gen K) zostały znokautowane w wyniku homologicznej rekombinacji (lub inną metodą) i I > II > III >IV, gdy endogenne geny kodujące lekki łańcuch nie zostały znokautowane i muszą być zdominowane przez wyłączenie allelowe.
III. Koniugaty przeciwciał / Immunotoksyny
Niniejszym ujawniono ludzkie monoklonalne przeciwciało anty-IL-15 sprzężone z terapeutycznym ugrupowaniem molekularnym, takim jak cytotoksyna, lek (np., środek immunosupresyjny) lub izotop promieniotwórczy. Gdy są sprzężone z cytotoksyną, takie koniugaty przeciwciał określane są jako „immunotoksyny.” Cytotoksyna lub środek cytotoksyczny obejmuje dowolny środek, który jest śmiertelny dla (np., zabija) komórki. Przykłady obejmują taksol, cytochalazynę B, gramicydynę D, bromek etydyny, emetyn, mitomycynę, etopozyd, tenopozyd, winkrystynę, winblastynę, kolchicynę, doksorubicynę, daunorubicynę, dihydroksy antracyno dion, mitoksantron, mitramycynę, aktynomycynę D, 1 -dehydrotestosteron, glukokortykoidy, prokainę, tetrakainę, lidokainę, propranolol i puromycynę i ich analogi lub homologi. Terapeutyczne środki obejmują, lecz nie są ograniczone do antymetabolitów (np., metotreksat, 6-merkaptopuryna, 6-tioguanina, cytarabina, 5-fluorouracylo dekarbazyna), czynników alkilujących (np., mechloretamina, tioepa chlorambucyl, melfalan, karmustyna (BSNU) i lomustyna (CCNU), cyklotosfamid, busulfan, dibromomannitol, streptozotocyna, mitomycyna C i cis-dichlorodiamino platyna (II) (DDP) cisplatyna), antracykliny (np., daunorubicyna (uprzednio daunomycyna) i doksorubicyna), antybiotyków (np., daktynomycynę (uprzednio aktynomycynę), bleomycynę, mitramycynę i antramycynę (AMC)) i czynniki przeciwmitotyczne (np., winkrystyna i winblastyna). Przeciwciało według wynalazku może być sprzęgane z radioizotopem, np., aktywnym promieniotwórczo jodem z wytworzeniem cytotoksycznych radiofarmaceutyków do leczenia pokrewnych zaburzeń IL-15, takich jak nowotwór.
Koniugaty przeciwciał według wynalazku mogą być użyte do modyfikacji danej biologicznej odpowiedzi. Terapeutyczne ugrupowanie molekularne nie ma być skonstruowane jako ograniczone do
PL 217 752 B1 klasycznych chemicznych terapeutycznych czynników. Na przykład, część leku może być białkiem lub polipeptydem mającym pożądaną biologiczną aktywność. Takie białka mogą obejmować, na przykład, enzymatycznie aktywną toksynę, lub aktywny jej fragment, taki jak abryna, rycyna A, egzotoksyna Pseudomonas, lub toksyna dyfterytu; białko takie jak czynnik martwicy nowotworu lub interferon-γ; lub środki modyfikujące biologiczną odpowiedź, takie jak, na przykład, limfokiny, interleukina-1 („IL-1”), interleukina-2 („IL-2”), interleukina-6 („IL-6”), czynnik stymulujący kolonię granulocytów makrofagów („GM-CSF”), czynnik stymulujący kolonię granulocytów („G-CSF”), lub inne cytokiny lub czynniki wzrostu.
Techniki sprzęgania takich terapeutycznych ugrupowań molekularnych z przeciwciałami są dobrze znane, patrz, np., Amon i wsp., „Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugis in Cancer Therapy”, w Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld i wsp. (red.), str. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); HeIlstrom i wsp., „Antibodies For Drug Delivery”, w Controlled Drug Delivery (wyd. 2), Robinson i wsp. (red.), str. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, „ Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, w Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera i wsp. (red.), str. 475-506 (1985); „Analysis, Results, and Future Prospective Of The Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, w Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin i wsp. (red.), str. 303-16 (Academic Press 1985) i Thorpe i wsp., „The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody - Toxin Conjugates”, Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
IV. Kompozycie farmaceutyczne
W innym aspekcie, obecny wynalazek dostarcza kompozycję, np., kompozycję farmaceutyczną, zawierającą jedno lub kombinację ludzkich monoklonalnych przeciwciał, lub ich fragmentów wiążących antygen(y), według wynalazku, przygotowaną razem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. W korzystnym wykonaniu, kompozycje obejmują połączenia wielu (np., dwa lub więcej) izolowanych ludzkich przeciwciał według wynalazku. Korzystnie, każde z przeciwciał z kompozycji wiąże się z innym, wcześniej wybranym epitopem IL-15.
Farmaceutyczne kompozycje według wynalazku również mogą być podawane w terapii skojarzonej, to jest, w połączeniu z innymi czynnikami. Na przykład, terapia skojarzona może obejmować kompozycję według wynalazku z przynajmniej jednym lub więcej dodatkowymi terapeutycznymi środkami, takimi jak środki przeciwzapalne, DMARD (przeciwreumatyczne leki modyfikujące przebieg choroby), środki immunosupresyjne, środki chemoterapeutyczne i środki przeciwko łuszczycy. Farmaceutyczne kompozycje według wynalazku mogą również być podawane w kombinacji z terapią promieniowaniem. Podawanie skojarzone z innymi przeciwciałami, takie jak przeciwciała specyficzne wobec CD4 i przeciwciała specyficzne wobec IL-2, są również objęte przez niniejszy wynalazek. Takie połączenia z przeciwciałami specyficznymi wobec CD4 lub przeciwciałami specyficznymi wobec IL-2 są rozważane zwłaszcza jako użyteczne do leczenia chorób autoimmunologicznych i odrzuceń przeszczepów.
W znaczeniu tu stosowanym, „farmaceutycznie dopuszczalny nośnik” obejmuje dowolny i wszystkie rozpuszczalniki, ośrodki dyspersyjne, powłoki, czynniki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybiczne, czynniki izotoniczne i opóźniające absorpcję i tym podobne, które są fizjologicznie kompatybilne. Korzystnie, nośnik jest odpowiedni do dożylnego, domięśniowego, podskórnego, pozajelitowego, dokręgosłupowego lub naskórkowego podawania (np., przez iniekcję lub wlew). W zależności od trybu podawania, aktywny związek, to jest, przeciwciało, bispecyficzna i multispecyficzna cząsteczka, może być powlekana przez materiał do ochrony związku przed działaniem kwasów i innych naturalnych czynników, które mogą inaktywować związek.
„Farmaceutycznie dopuszczalna sól” odnosi się do soli, która zachowuje pożądaną biologiczną aktywność wyjściowego związku i nie pogarsza żadnych niepożądanych toksycznych działań (patrz np., Berge, S.M., i wsp. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Przykłady takich soli obejmują sole addycyjne z kwasem i sole addycyjne z zasadą. Sole addycyjne z kwasem obejmują te otrzymane z nietoksycznych nieorganicznych kwasów, takich jak kwas chlorowodorowy, azotowy, fosforowy, siarkowy, bromowodorowy, jodowodorowy, fosforowy i tym podobne, jak i z nietoksycznych organicznych kwasów, takich jak alifatyczne mono- i dikarboksylowe kwasy, fenylopodstawione alkanowe kwasy, hydroksy alkanowe kwasy, kwasy aromatyczne, kwasy alifatyczne i aromatyczne kwasy sulfonowe i tym podobne. Sole addycyjne z zasadą obejmują te otrzymane z metali ziem alkalicznych, takich jak sód, potas, magnez, wapń i tym podobne, jak i z nietoksycznych organicznych amin, takich jak Ν,Ν'-di24
PL 217 752 B1 benzyloetylenodiamina, N-metyloglukamina, chloroprokaina, cholina, dietanolamina, etylenodiamina, prokaina i tym podobne.
Kompozycja według wynalazku może być podawana wieloma różnymi sposobami znanymi w dziedzinie. Jak zostanie to docenione przez specjalistę w dziedzinie, tryb i/lub sposób podawania będzie różny w zależności od pożądanego wyniku. Aktywne związki mogą być wprowadzone do preparatu z nośnikami, które zabezpieczą związek przed szybkim uwalnianiem, takiego jak preparat o kontrolowanym uwalnianiu, obejmujący wszczepy, plastry do podawania przezskómego i mikrokapsułkowane układy do podawania. Ulegające rozkładowi biologicznemu, biokomatybilne polimery mogą być użyte, takie jak winylooctan etylenu, polibezwodniki, kwas poliglikolowy, kolagen, poliortoestry i kwas polimlekowy. Wiele sposobów uzyskiwania preparatów opatentowano lub jest ogólnie znanych specjalistom w dziedzinie. Patrz, np., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, red., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Aby podać związek według wynalazku określonymi drogami podawania, może być konieczne powlekanie związku, lub współpodawanie związku z materiałem, aby zapobiegać jego inaktywacji. Na przykład, związek może być podawany osobnikowi w odpowiednim nośniku, na przykład, liposomach, lub rozcieńczalniku. Farmaceutycznie dopuszczalne rozcieńczalniki obejmują roztwór soli w wodzie i wodne roztwory buforów. Liposomy obejmują emulsje woda-w-oleju-w-wodzie CGF jak i tradycyjne liposomy (Strejan i wsp. (1984), J. Neuroimmunol. 7:27).
Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki obejmują sterylne wodne roztwory lub dyspersje i sterylne proszki do przygotowania bezpośrednio przed użyciem preparatu sterylnego roztworu lub dyspersji do wstrzykiwania. Zastosowanie takich ośrodków i czynników do farmaceutycznie aktywnych substancji jest znane w dziedzinie. Z wyjątkiem takiego zakresu, w jakim dowolny tradycyjny ośrodek lub czynnik jest niekomatybilny z aktywnym związkiem, zastosowanie ich w farmaceutycznych kompozycjach według wynalazku jest rozważane. Uzupełniające związki aktywne mogą również być włączone do kompozycji.
Terapeutyczne kompozycje typowo muszą być sterylne i stabilne w warunkach wytwarzania i przechowywania. Kompozycja może być spreparowana jako roztwór, mikroemulsja, liposom lub inaczej uporządkowana struktura odpowiednia do wysokiego stężenia leku. Nośnikiem może być rozpuszczalnik lub ośrodek dyspergujący zawierający, na przykład, wodę, etanol, poliol (na przykład, glicerol, glikol propylenowy i płynny glikol polietylenowy i tym podobne) i odpowiednie ich mieszaniny. Odpowiednia płynność może być utrzymywana, na przykład, przez zastosowanie powłoczek, na przykład lecytyny, przez utrzymywanie wymaganej wielkości cząstek w przypadku dyspersji i przez zastosowanie środków powierzchniowo czynnych. W wielu przypadkach, będzie korzystne zastosowanie czynników izotonicznych, na przykład, cukrów, polialkoholi, takich jak manitol, sorbitol, lub chlorek sodu w kompozycji. Przedłużona absorpcja kompozycji do iniekcji może być uzyskana przez włączenie do kompozycji środka, który opóźnia absorpcję, na przykład, soli monostearynianu i żelatyny.
Sterylne roztwory do iniekcji mogą być wytworzone przez włączenie aktywnego związku w wymaganej ilości do odpowiedniego rozpuszczalnika, z jednym lub z połączeniem składników wyliczonych powyżej, jak jest to konieczne, a następnie sterylizacji przez mikrofiltrację. Ogólnie, dyspersje wytworzono przez włączenie aktywnego związku do sterylnego nośnika, który zawiera podstawowy ośrodek dyspergujący i wymagane inne składniki z tych wyliczonych powyżej. W przypadku sterylnych proszków do wytwarzania preparatu w postaci sterylnych roztworów do iniekcji, preferowane sposoby wytwarzania preparatu są suszone w próżni i suszone sublimacyjnie (liofilizacja), co prowadzi do uzyskania proszku z aktywnym składnikiem plus dowolny dodatkowy pożądany składnik z jego wcześniej sterylizowanego przez sączenie roztworu.
Reżimy dawkowania są dostosowane, tak aby dostarczyć optimum pożądanej odpowiedzi (np., terapeutycznej odpowiedzi). Na przykład, pojedyncza dawka uderzeniowa może być podawana, kilka podzielonych dawek może być podawanych w czasie lub dawka może być stosunkowo obniżana lub zwiększana, jak wskazano przez wymagania sytuacji terapeutycznej. Na przykład, ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą być podawane raz lub dwa razy w tygodniu przez podskórną iniekcję lub raz lub dwa razy w miesiącu przez podskórną iniekcję.
Jest szczególnie korzystne formułowanie preparatu kompozycji pozajelitowych w jednostkowych postaciach dawkowania do łatwego podawania i jednolitości dawkowania. Jednostkowa postać dawkowania w znaczeniu tu stosowanym odnosi się do fizycznie oddzielnych jednostek odpowiednich jako jednostkowe dawkowanie dla osobników, którzy mają być leczeni; każda jednostka zawiera wcześniej określoną ilość aktywnego związku obliczoną tak, aby uzyskać pożądane terapeutyczne działanie
PL 217 752 B1 w połączeniu z wymaganym farmaceutycznie nośnikiem. Doprecyzowanie jednostkowych postaci dawkowania jest dyktowane przez i bezpośrednio zależne od (a) wyjątkowej charakterystyki aktywnego związku i szczególnego terapeutycznego działania, jakie ma być uzyskane i (b) ograniczeń występujących nieodłącznie w dziedzinie wytwarzania związków takich, jak aktywny związek do leczenia wrażliwości u osobników.
Przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych przeciwutleniaczy obejmują: (1) rozpuszczalne w wodzie przeciwutleniacze, takie jak kwas askorbinowy, chlorowodorek cysteiny, wodorosiarczan sodu, disiarczan sodu, siarczan sodu i tym podobne; (2) rozpuszczalne w oleju przeciwutleniacze, takie jak palmitynian askorbylu, butylowany hydroksyanizol (BHA), butylowany hydroksytoluen (BHT), lecytyna, galusan propylu, alfa-tokoferol i tym podobne; i (3) czynniki chelatujące metale, takie jak kwas cytrynowy, kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), sorbitol, kwas winowy, kwas fosforowy i tym podobne.
W przypadku terapeutycznych kompozycji, preparaty według obecnego wynalazku obejmują te odpowiednie do podawania doustnego, donosowego, miejscowego (obejmujące policzkowe i podjęzykowe), doodbytniczego, dopochwowego i/lub pozajelitowego. Preparaty mogą dogodnie być dostarczone w jednostkowej postaci dawkowania i mogą być wytwarzane w dowolny sposób znany w dziedzinie farmacji. Ilość aktywnego składnika, który może być połączony z materiałem nośnika w celu uzyskania pojedynczych postaci dawkowania będzie różna w zależności od osoby leczonej i szczególnego trybu podawania. Ilość aktywnego składnika, który może być połączony z materiałem nośnika w celu uzyskania pojedynczej postaci dawkowania będzie ogólnie taką ilością kompozycji, która powoduje działanie terapeutyczne. Ogólnie, ponad jedną setną procenta, ilość ta będzie w zakresie od około 0,001 procent do około dziewięćdziesiąt procent aktywnego składnika, korzystnie od około 0,005 procent do około 70 procent, najkorzystniej od około 0,01 procent do około 30 procent.
Preparaty według wynalazku, które są odpowiednie do podawania dopochwowego również obejmują krążki maciczne, tampony, kremy, żele, pasty, pianki lub preparaty aerozolowe zawierające takie nośniki jakie są znane w dziedzinie za odpowiednie. Postacie dawkowania do podawania miejscowego lub przezskórnego kompozycji według wynalazku obejmują proszki, rozpylacze, maści, pasty, kremy, lotiony, żele, roztwory, plastry i środki do inhalacji. Aktywny związek może być zmieszany w sterylnych warunkach z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i z dowolnymi konserwantami, buforami, lub gazami pędnymi, które mogą być konieczne.
Określenia „pozajelitowe podawanie” i „podawanych pozajelitowo” w znaczeniu tu stosowanym oznacza sposoby podawania inne niż podawanie jelitowe i miejscowe, zwykle przez iniekcję i obejmują, nieograniczająco, dożylne, domięśniowe, wewnątrztętnicze, dooponowe, wewnątrztorebkowe, wewnątrzoczodołowe, dosercowe, śródskórne, śródotrzewnowe, przeztchawicze, podskórne, podnaskórkowe, wewnątrzstawowe, podtorebkowe, podpajęczynówkowe, dokręgosłupowe, zewnątrzoponowe i wewnątrzmostkowe iniekcje i wlewy.
Przykłady odpowiednich wodnych i niewodnych nośników, które mogą być stosowane w farmaceutycznych kompozycjach według wynalazku obejmują wodę, etanol, poliole (takie jak glicerol, glikol propylenowy, glikol polietylenowy i tym podobne) i odpowiednie ich mieszaniny, oleje roślinne, takie jak oliwa z oliwek i organiczne estry do wstrzykiwania, takie jak oleinian etylu. Właściwa płynność może być utrzymywana, na przykład, przez zastosowanie materiałów powlekających, takich jak lecytyna, przez utrzymywan ie wymaganej wielkości cząstek w przypadku dyspersji i przez zastosowanie środków powierzchniowo czynnych.
Te kompozycje mogą również zawierać adiuwanty takie jak konserwanty, czynniki zwilżające, czynniki emulgujące i czynniki dyspergujące. Zapobieganie obecności mikroorganizmów może być zapewnione zarówno przez procedury sterylizacji, powyżej i przez włączenie różnych przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybiczych czynników, na przykład, takich jak paraben, chlorobutanol, kwas fenolosorbinowy i tym podobne. Może również być pożądane, aby włączyć środki izotoniczne, takie jak cukry, chlorek sodu i tym podobne do kompozycji. Ponadto, farmaceutyczna postać do iniekcji, o przedłużonej absorpcji, może być uzyskana przez włączenie czynników, które opóźniają absorpcję, takich jak monostearynian glinu i żelatyna.
Gdy związki według wynalazku są podawane jako środki farmaceutyczne, ludziom i zwierzętom, mogą one być podawane same lub jako kompozycja farmaceutyczna zawierająca, na przykład, 0,001 do 90% (korzystniej, 0,005 do 70%, czyli 0,01 to 30%) aktywnego składnika w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
PL 217 752 B1
Bez względu na wybrany tryb podawania, związki według wynalazku, które mogą być stosowane w odpowiedniej postaci uwodnionej, i/lub farmaceutyczne kompozycje według wynalazku, są przygotowane w farmaceutycznie dopuszczalnych postaciach dawkowania tradycyjnymi sposobami znanymi w dziedzinie.
Faktyczne poziomy dawkowania składników aktywnych w farmaceutycznych kompozycjach według wynalazku mogą być różne, tak aby uzyskać ilość aktywnego składnika, która jest skuteczna aby uzyskać pożądaną terapeutyczną odpowiedź u danego pacjenta, przy czym kompozycja i sposób podawania, nie może być toksyczny dla pacjenta. Wybrany poziom dawkowania będzie zależał od wielu różnych farmakokinetycznych czynników, obejmujących aktywność zastosowanej szczególnej kompozycji według wynalazku, lub jego estru, soli lub amidu, tryb podawania, czas podawania, szybkość wydalania danego związku, który zastosowano, czas trwania leczenia, inne leki, związki i/lub materiały zastosowane w połączeniu z zastosowaną, szczególną kompozycją, wiek, seks, masa, stan, zdrowie ogólne i uprzednia historia chorób leczonych u pacjenta i tym podobne czynniki dobrze znane w medycznym stanie techniki. Lekarz lub weterynarz mający zwykłą wiedzę w dziedzinie może łatwo określić i przepisać skuteczne ilości wymaganej kompozycji farmaceutycznej. Na przykład, lekarz lub weterynarz może rozpocząć dawki związków według wynalazku zastosowanych w kompozycji farmaceutycznej na poziomach niższych niż te wymagane, aby uzyskać pożądane terapeutyczne działanie i stopowo zwiększać dawkowanie do osiągnięcia pożądanego działania. Ogólnie, odpowiednie dzienne dawki kompozycji według wynalazku będą takie, że ilość związku która stanowi najniższą dawkę skuteczną do uzyskania terapeutycznego działania. Takie skuteczne dawki będą ogólnie zależeć od czynników opisanych powyżej. Jest preferowane, aby podawanie było dożylne, domięśniowe, śródotrzewnowe, lub podskórne, korzystnie podawane w bliskości miejsca docelowego. Jeśli jest to pożądane, skuteczna dzienna dawka terapeutycznej kompozycji może być podawany jako dwa, trzy, cztery, pięć, sześć lub więcej mniejszych dawek podawanych oddzielnie w odpowiednich przedziałach czasowych w ciągu dnia, ewentualnie, w jednostkowych postaciach dawkowania. Podczas gdy jest możliwe aby związek według obecnego wynalazku był podawany sam, jest korzystne jednak aby podawać związek jako preparat farmaceutyczny (kompozycja).
Terapeutyczne kompozycje mogą być podawane stosując urządzenia medyczne znane w stanie techniki. Na przykład, w korzystnym rozwiązaniu, terapeutyczna kompozycja według wynalazku może być podawana bezigłowymi urządzeniami do podskórnej iniekcji, takimi jak urządzenia ujawnione w patentach US o nr 5,399,163, 5,383,851, 5,312,335, 5,064,413, 4,941,880, 4,790,824, lub 4,596,556. Przykłady dobrze znanych implantów i cząsteczek użytecznych w obecnym wynalazku obejmują: patent US o nr 4,487,603, który opisuje możliwą do wszczepienia pompę do mikro-wlewu do uwalniania leku z kontrolowaną szybkością; Patent US o nr 4,486,194, który ujawnia terapeutyczne urządzenie do podawania środków medycznych poprzez skórę; patent US o nr 4,447,233, który ujawnia pompę do wlewu środków medycznych do dostarczenia leku z precyzyjną szybkością wlewu; Patent US o nr 4,447,224, który ujawnia nadające się do wszczepienia urządzenie do infuzji ze zmiennym przepływem do ciągłego dostarczania leku; patent US o nr 4,439,196, który ujawnia układ dostarczania leku mający wielokomorowe przedziały i Patent US o nr 4,475,196, który ujawnia osmotyczny układ do dostarczania leku. Wiele innych takich implantów, układów i cząsteczek do dostarczania jest znanych specjalistom w dziedzinie.
W pewnych rozwiązaniach, ludzkie monoklonalne przeciwciała według wynalazku mogą być utworzone, aby zapewnić właściwe rozmieszczenie in vivo. Na przykład, bariera krew-mózg (BBB) wyklucza wiele wysoce hydrofilowych związków. Aby zapewnić, że terapeutyczne związki według wynalazku przechodzą przez BBB (jeśli jest to pożądane), mogą one być przygotowane, na przykład, w liposomach. Sposoby wytwarzania liposomów, patrz, np., Patenty USA o nr 4,522,811; 5,374,548; i 5,399,331. Liposomy mogą zawierać jeden lub więcej części cząsteczek, które są selektywnie transportowane do specyficznych komórek lub organów, zatem zwiększyć docelowe dostarczanie leku (patrz, np., V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Przykładowe docelowe części cząsteczek obejmują folan lub biotynę (patrz, np., Patent U.S. 5,416,016 na rzecz Low i wsp.); manozydy (Umezawa i wsp., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); przeciwciała (P.G. Bloeman i wsp. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais i wsp. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); środek powierzchniowo czynny receptora białka A (Briscoe i wsp. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134), różne rodzaje których mogą zawierać preparaty według wynalazku, jak i składniki cząsteczek według wynalazku; p120 (Schreier i wsp. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); patrz również K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; JJ. Killion; U. Fidler (1994) Immunomethods 4:273. W jednej poPL 217 752 B1 staci wykonania, terapeutyczne związki według wynalazku są przygotowane w liposomach; w bardziej korzystnej postaci wykonania, liposomy obejmują docelową część cząsteczki. W najbardziej korzystnej postaci wykonania, terapeutyczne związki w liposomach są dostarczane przez iniekcję dawki uderzeniowej, w miejscu w bliskości do nowotworu lub infekcji. Kompozycja musi być płynna w takim zakresie, aby była łatwo wprowadzana do strzykawki. Musi ona być stabilna w warunkach wytwarzania i przechowywania, i musi być chroniona przeciwko zakażającym działaniom mikroorganizmów, takich jak bakterie i grzyby.
„Terapeutycznie skuteczne dawkowanie” w reumatoidalnym zapaleniu stawów korzystnie będzie prowadzić do Wstępnej Definicji Poprawy ACR20 u pacjentów, bardziej korzystnie do Wstępnej Definicji Poprawy ACR50 i jeszcze bardziej korzystnie do Wstępnej Definicji Poprawy ARCD70.
Wstępną Definicję Poprawy ACR20 zdefiniowano jako:
> 20% poprawa w: zliczeniu tkliwych stawów (TCJ) i zliczeniu opuchniętych stawów (SWJ) oraz > 20% poprawa w 3 z poniższych 5 oznaczeń: Określenie Bólu Pacjenta (VAS), Określenie Ogólne Pacjenta (VAS), Określenie Ogólne Lekarza (VAS), Samo-Testowanie Utraty Czynności przez Pacjenta (HAQ), Składnik Reakcji Ostrej Fazy (CRP lub ESR).
ACR50 i ACR70 zdefiniowano w ten sam sposób przy > 50% i > 70% poprawie, odpowiednio. W celu poznania dalszych szczegółów patrz Felson i wsp. w American College of Rheumatology Preliminary Definition of Improvement in Rheumatoid Arthritis; Arthritis Rheumatism (1995) 38: 727-735.
Zdolność związku do hamowania raka może być określona na układach modelowych u zwierzęcia przewidujących skuteczność w przypadku ludzkich nowotworów. W innym rozwiązaniu, ta właściwość kompozycji może być określona przez badanie zdolności związku do hamowania, takie hamowanie in vitro testami znanymi specjaliście w dziedzinie. Terapeutycznie skuteczne ilości terapeutycznego związku mogą zmniejszać wielkość nowotworu, lub w inny sposób łagodzić objawy u osobnika. Osoba o przeciętnej wiedzy w dziedzinie byłaby w stanie określić takie ilości w oparciu o takie czynniki jak wielkość osobnika, ciężkość objawów osobnika i wybrane szczególne kompozycje lub sposób podawania.
Zdolność przeciwciała do leczenia lub zapobiegania łuszczycy może również być określona sposobami dobrze znanymi w dziedzinie.
Kompozycja musi być sterylna i płynna w takim zakresie aby kompozycja mogła być dostarczana przez strzykawkę. Oprócz wody, nośnik może być izotonicznym zbuforowanym roztworem soli w wodzie, etanolem, poliolem (na przykład, glicerol, glikol propylenowy i płynny glikol polietylenowy i tym podobne) i odpowiednie ich mieszaniny. Właściwa płynność może być utrzymywana, na przykład, przez zastosowanie powlekania takiego jak lecytyną, przez utrzymanie wymaganej wielkości cząstek w przypadku dyspersji i przez zastosowanie środków powierzchniowo czynnych. W wielu przypadkach, jest korzystne, aby obejmować środki izotoniczne, na przykład, cukry, polialkohole takie jak mannitol lub sorbitol i chlorek sodu w kompozycji. Przedłużona absorpcja kompozycji do iniekcji może być uzyskana przez włączenie do kompozycji środka, który opóźnia absorpcję, na przykład, soli monostearynianu i żelatyny.
Gdy aktywny związek jest odpowiednio zabezpieczony, jak opisano powyżej, związek może być podawany doustnie, na przykład, z obojętnym rozcieńczalnikiem lub przyswajalnym jadalnym nośnikiem.
V. Zastosowania według wynalazku i sposoby
Ludzkie przeciwciała przeciwko IL-15 według wynalazku (obejmujące pochodne i koniugaty przeciwciał) i kompozycje zawierające przeciwciała mogą być użyte w wielu różnych diagnostycznych i terapeutycznych zastosowaniach in vitro i in vivo.
W jednym rozwiązaniu, ludzkie przeciwciała według wynalazku zastosowano do hamowania indukowanego IL-15 wytwarzania TNFa przez limfocyty T i/lub monocyty/makrofagi, korzystnie bez hamowania wytwarzania TNFa indukowanego przez inne cytokiny, takie jak IL-2. Przez kontaktowanie przeciwciała z IL-15 (np., przez podawanie przeciwciała osobnikowi), zdolność IL-15 do sygnalizacji poprzez receptor IL-15 jest hamowana i w ten sposób wytwarzanie TNFa przez limfocyty T i/lub monocyty/makrofagi jest również hamowane. Korzystnie przeciwciała wiążą się z epitopami (np., szczególne podjednostki, takie jak podjednostka gamma), które są specyficzne względem IL-15 i w ten sposób, korzystnie hamują indukowane IL-15 wytwarzanie TNFa, lecz nie przeszkadzają w wytwarzaniu TNFa przez strukturalnie pokrewne cytokiny, takie jak IL-2.
PL 217 752 B1
W innym rozwiązaniu, ludzkie przeciwciała według wynalazku zastosowano do hamowania indukowanego przez IL-15 włączenia nowych limfocytów T i/lub proliferacji, korzystnie bez hamowania proliferacji limfocytów T indukowanej przez inne strukturalnie pokrewne cytokiny, takie jak IL-2. Tak jak przy wytwarzaniu TNFa, przez kontaktowanie przeciwciała z IL-15 (np., przez podawanie przeciwciała osobnikowi), zdolność IL-15 do sygnalizowania poprzez receptor IL-15 jest hamowana i w ten sposób, stymulacja limfocytów T przez IL-15 jest hamowana.
Zgodnie z powyższym, w jeszcze innych rozwiązaniach, rozwiązania według wynalazku umożliwiają leczenie lub zapobiegania zaburzeniu, w którym pośredniczy IL-15 (np., autoimmunologiczne choroby, takie jak łuszczyca, reumatoidalne zapalenie stawów, lub zapalna choroba jelit, lub choroby zakaźne, takie jak HIV), przez podawanie osobnikowi ludzkiego przeciwciała według wynalazku w ilości skutecznej do leczenia lub zapobiegania zaburzeniom. Przeciwciało może być podawane samo lub wraz z innym środkiem terapeutycznym, takim jak środek przeciwzapalny, np., steroidowy lub niesteroidowy środek zapalny, lub cytotoksyna, która działa w połączeniu z lub synergistycznie z przeciwciałem do leczenia lub zapobiegania chorobom, w których pośredniczy IL-15.
W szczególnym rozwiązaniu, ludzkie przeciwciała według wynalazku zastosowano do leczenia lub do zapobiegania reumatoidalnemu zapaleniu stawów (RA). Przeciwciała ograniczają rolę, jaką IL-15 odgrywa w postępowaniu zapalenia związanego z chorobami takimi jak RA. Limfocyty T, zwłaszcza CD4+ komórki pomocnicze T, biorą udział w zapoczątkowaniu i utrzymaniu zapalnych procesów w RA. TNF-α, inna cytokina, również bierze udział w ścieżkach zapalnych, które w końcu wiodą do zniszczenia stawu i okaleczenia pacjenta z RA. Miejscowa synteza IL-15 odgrywa kluczową rolę zarówno w aktywacji jak i włączeniu nowych limfocytów T i na indukcji TNF-α i innych zapalnych cytokin. Rola IL-15 w progresji RA obejmuje sposób, w którym IL-15, która została zsyntetyzowana przez makrofagi, indukuje włączenie nowych limfocytów T. Aktywowane limfocyty T następnie: (1) utrzymują aktywację makrofaga; i (2) indukują produkcję TNF-α. Stymulowane makrofagi zwiększają dalej syntezę IL-15 i aktywację limfocytów T, zatem, kontynuację cyklu. Oprócz tego działania na TNF-α i makrofagi, IL-15 również aktywuje neutrofile i wpływa na miejscowe wydzielanie immunoglobulin limfocytów B, zwłaszcza przy syntezie czynnika reumatoidalnego.
Zgodnie z powyższym, przeciwciała anty-IL-15 według wynalazku mogą być użyte do zapobiegania lub blokowania powyższych działań IL-15, które powodują RA i w ten sposób, mogą być użyte do zapobiegania lub leczenia tej choroby. Na przykład, przeciwciała anty-IL-15 według wynalazku mogą być użyte do hamowania zapalenia i/lub zapobiegania chemotaksji aktywowanych leukocytów biorących udział w RA.
Ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane do hamowania postępu strukturalnego uszkodzenia u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawu lub stawów, które miały nieodpowiednią odpowiedź na metotreksat lub w celu zmniejszenia sygnałów i objawów, i opóźnienie strukturalnego uszkodzenia u pacjentów z łagodnym do znacznego aktywnego reumatoidalnego zapalenia stawów, obejmując tych, których wcześniej nie udało się wyleczyć stosując DMARD.
Ludzkie przeciwciała według wynalazku również mogą być użyte do blokowania lub hamowania innych działań IL-15. IL-15 ulega ekspresji w różnych komórkach i tkankach obejmujących monocyty i makrofagi, fibroblasty, komórki dendrytyczne i keratynocyty. Keratynocyty stanowią główny składnik naskórka i nabłonowej wyściółki tkanki śluzówek. W kontroli wzrostu keratynocytów pośredniczy skomplikowana sieć cytokin i czynników wzrostu, z których niektóre są wytwarzane przez same keratynocyty. Pochodząca z keratinocytów IL-15 przyczynia się do akumulacji limfocytów T, proliferacji i przeżycia w płytkach łuszczycowych. Wiele chorób jest znanych, w których liczba keratynocytów jest zwiększona, co prowadzi do naskórkowej hiperplazji, która jest odpowiedzialna za przynajmniej niektóre objawy związane z chorobą. Te choroby obejmują chroniczne choroby takie jak łuszczyca i atopowe zapalenie skóry, jak i stany typu chronicznej egzemy ręki, kontaktowe zapalenie skóry, wirusowe brodawki (związane z HPV), skórny chłoniak limfocytów T, osłabione zdrowienie ran, takie jak osłabione zdrowienie ran ze względu na cukrzycę. Zgodnie z powyższym, wynalazek dostarcza sposoby leczenia lub zapobiegania takiego zaburzenia przez podawanie pacjentom ludzkiego przeciwciała anty-IL-15 według wynalazku w ilości skutecznej do leczenia lub zapobiegania zaburzeniu. Na przykład, przeciwciała anty-IL-15 według wynalazku może być użyte do blokowania lub hamowania parakeratozy w łuszczycy, obniża naskórkową grubość w łuszczycy i obniża proliferację keratynocytów w łuszczycy.
IL-15 również moduluje funkcje jelitowych nabłonkowych komórek (Reinecker, i wsp. (1996) Gastroenterology 111:1706-13). Specyficznie, IL-15 może powodować modyfikacje w śluzówkowych
PL 217 752 B1 nabłonkowych komórkach i w jelitowych nabłonkowych liniach komórkowych i w ten sposób bierze udział w patogenezie zapalnych chorób jelita, np., chorób trzewnych. Rola IL-15 w takich chorobach jest przedstawiona przez selektywną nad-reprezentację komórek IL-15+ w jelicie cienkim nieleczonych pacjentów z chorobami trzewnymi (WO 00/02582). Zatem, wykazano że IL-15 jest bezpośrednio zaangażowane w inicjacji i utrzymaniu chorób trzewnych. Zgodnie z powyższym, w innym rozwiązaniu, ludzkie przeciwciała anty-IL-15 według obecnego wynalazku (to jest, które hamują prozapalne działania IL-15) mogą być użyte do leczenia i/lub zapobiegania chorób trzewnych przez podawanie przeciwciała pacjentowi w ilości skutecznej do leczenia lub zapobiegania zaburzeniu.
Ponadto, wynalazcy ujawnili, że według obecnego wynalazku, IL-15 również zwiększa tworzenie nowych naczyń krwi, sposób zwany unaczynienie nowotworów lub rozwoju naczyń. Zgodnie z powyższym, jeszcze inne zastosowanie przeciwciała według wynalazku obejmuje zapobieganie lub leczenie chorób obejmujących unaczynienie nowotworów. Choroby te obejmują wiele różnych nowotworów, które polegają na lub są scharakteryzowane przez unaczynienie nowotworów, oprócz zapalnych chorób.
Ludzkie przeciwciała według obecnego wynalazku również mogą być użyte do blokowania lub hamowania działania IL-15 związanego z chorobami zakaźnymi, takimi jak HIV. Zgodnie z powyższym, inne zastosowania przeciwciał według wynalazku obejmują zapobieganie lub leczenie chorób zakaźnych, np., HIV-1.
Na przykład, przeciwciała mogą być użyte in vitro lub in vivo do diagnozowania wielu różnych chorób, w których pośredniczy IL-15. Specyficznie, przeciwciała mogą być użyte do wykrywania poziomów IL-15, lub poziomów komórek, które obejmują IL-15 na powierzchni ich błon lub połączone z ich receptorami (ludzka IL-15 związana z receptorem). Detekcja takich poziomów IL-15 może następnie być skorelowane z objawami pewnych chorób. W innym rozwiązaniu, przeciwciała mogą być użyte do hamowania lub blokowania funkcji IL-15 które, z kolei, mogą zapobiegać lub łagodzić objawy chorób powodowanych przez funkcję IL-15.
Jak wcześniej opisano, ludzkie przeciwciała anty-IL-15 według wynalazku mogą być współpodawane z jednym lub więcej terapeutycznymi czynnikami, np., środkiem immunosupresyjnym lub środkiem przeciwzapalnym, aby zwiększyć całkowite przeciwzapalne działanie. Przeciwciało może być połączone ze środkiem (jak w immunokompleksie) lub może być podawane oddzielnie od środka. W ostatnim przypadku (oddzielne podawanie), przeciwciało może być podawane przed, po lub wspólnie ze środkiem. Odpowiednie terapeutyczne czynniki obejmują, między innymi, środki przeciwzapalne, DMARD (przeciwreumatyczne leki modyfikujące przebieg choroby), środki immunosupresyjne, środki chemoterapeutyczne i środki przeciwko łuszczycy. Ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą również być podawane w połączeniu z terapią promieniowaniem.
W innym rozwiązaniu, ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą być podawane w połączeniu z innymi przeciwciałami, takimi jak specyficzne przeciwciała CD4 i specyficzne przeciwciała IL-2. Połączenia obecnych ludzkich przeciwciał ze specyficznymi przeciwciałami CD4 lub specyficznymi przeciwciałami IL-2 są rozważane zwłaszcza jako użyteczne w leczeniu autoimmunologicznych chorób i odrzuceń przeszczepów.
Również w zakresie obecnego wynalazku są zestawy zawierające ludzkie przeciwciała anty-IL-15 według wynalazku i, ewentualnie, instrukcje do stosowania. Zestaw może ponadto zawierać jeden lub więcej dodatkowych odczynników, takich jak środek immunosupresyjny, lub jeden lub więcej dodatkowych ludzkich przeciwciał według wynalazku (np., ludzkie przeciwciało mające komplementarną aktywność, która wiąże się z epitopem w antygenie IL-15 odmiennym od pierwszego ludzkiego przeciwciała).
Zgodnie z powyższym, pacjenci leczeni przeciwciałami według wynalazku mogą być dodatkowo podawane (przed, równocześnie z, lub po podawaniu ludzkiego przeciwciała według wynalazku) z innym środkiem terapeutycznym, takim jak środek przeciwzapalny, który wzmacnia lub zwiększa terapeutyczny wpływ ludzkich przeciwciał.
W jeszcze innym rozwiązaniu, ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą być użyte do kierowania związków (np., terapeutyczne czynniki, znaczniki, cytotoksyny, środki immunosupresyjne itp.) do komórek, które mają IL-15 związaną z ich powierzchnią (np., związaną z błoną lub związaną z receptorem IL-15 przez połączenie takich związków z przeciwciałem. Zatem, wynalazek również dostarcza sposoby lokalizacji komórek ex vivo, in vivo lub in vitro prowadzących ekspresję IL-15 i receptor IL-15 (np., z wykrywalnym znacznikiem, takim jak radioizotop, fluorescencyjny związek, enzym, lub kofaktor enzymu).
PL 217 752 B1
Inne rozwiązania według obecnego wynalazku opisano w poniższych przykładach.
Obecny wynalazek został ponadto zilustrowany przez poniższe przykłady, które nie powinny być interpretowane jako dalej ograniczające. Zawartość Listy sekwencji, rysunku i wszystkich odnośników, patentów i opublikowanych zastosowań patentów cytowanych uprzednio w tym zgłoszeniu są wyraźnie włączone tutaj jako odnośnik.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1 Wytwarzanie docelowych myszy Cmu
Konstrukcja kierującego wektora CMD
Plazmid pICEmu zawiera fragment EcoRI/XhoI mysiego locus ciężkiego łańcucha Ig, łączącego się genu mu, który otrzymano z biblioteki fag genomowej Balb/C lambda (Marcu i wsp. Cell 22: 187, 1980). Ten genomowy fragment subklonowano w miejsce miejsca XhoI/EcoRI plazmidu pICEMI9H (Marsh i wsp.; Gene 32, 481-485, 1984). Sekwencje ciężkiego łańcucha są objęte w rozszerzeniu pICEmu w dół od miejsca EcoRI zlokalizowanego 3' tuż od intronowego enchancera mu, do miejsca XhoI zlokalizowanego w przybliżeniu 1 kilozasad w dół od ostatniego transmembranowego egzonu genu mu; jednakże, większość z regionu powtórzenia przełączenia mu usunięto przez przeniesienie do E. coli.
Kierujący wektor skonstruowany następująco. Fragment 1,3 kilozasad Hindlll/Smal wycięto z pICEmu i wklonowano w miejsce Hindlll/Smal trawione pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA). Ten fragment pICEmu rozciąga się od miejsca HindIII zlokalizowanego w przybliżeniu 1 kilozasad 5' Cmu1 do miejsca Smal zlokalizowanego w obrębie Cmu1. Otrzymany plazmid trawiono SmaI/SpeI i wprowadzono w przybliżeniu 4 kilozasad fragment Smal/Xbal z pICEmu, rozciągający się od miejsca SmaI w Cmul 3' do miejsca XbaI zlokalizowanego tuż w dół od ostatniego egzonu Cmu. Otrzymany plazmid, pTAR1, przeprowadzono w postać liniową w miejscu Smal i wprowadzono kasetę ekspresyjną neo. Ta kaseta obejmuje gen neo pod kontrolą transkrypcji fragmentu promotora mysiej kinazy fosfogliceranowej (pgk) (Xbal/TaqI; Adra i wsp. (1987) Gene 60: 65-74) i zawierajacego miejsce poliadenylacji pgk (fragment PvuII/HindIII; Boer i wsp. (1990) Biochemical Genetics 28: 299-308). Tę kasetę otrzymano z plazmidu pKJ1 (opisanego przez Tybulewicza i wsp. (1991) Cell 65: 1153-1163) z którego kasetę neo wycięto jako fragment EcoRI/Hindlll i wklonowano w miejsce trawione EcoRI/Hindlll pGEM-7Zf (+) aby wytworzyć pGEM-7 (KJ1). Kasetę neo wyciętą z pGEM-7 (KJ1) przez trawienie EcoRI/Sall, ścięto końce i wklonowano w miejsce Smal plazmidu pTAR1, w przeciwnej orientacji genomowych sekwencji Cmu. Otrzymany plazmid przeprowadzono w postać liniową trawiąc Not I i kasetę kinazy tymidyny (tk) wirusa opryszczki wprowadzono aby umożliwić wzbogacenie klonów ES niosących homologiczne rekombinanty, jak opisano przez Mansoura i wsp. (1988) Nature 336: 348-352. Ta kaseta obejmuje sekwencje kodujące genu tk objętego przez mysi promotor pgk i miejsce poliadenylacji, jak opisano w pracy Tybulewicza i wsp. (1991) Cell 65: 1153-1163. Otrzymany kierujący wektor CMD zawiera w sumie w przybliżeniu 5,3 kilozasad homologicznych z locus ciężkiego łańcucha i jest zaprojektowany tak, aby wytworzyć zmutowany gen mu, do którego wprowadzono kasetę ekspresyjną neo w jedyne miejsce Smal pierwszego egzonu Cmu. Kierujący wektor przeprowadzono w postać liniową trawiąc PvuI, który tnie w obrębie plazmidowych sekwencji, przed elektroporacją z komórkami ES.
Wytwarzanie i analiza docelowych komórek ES
Komórki AB-1 ES (McMahon, A. P. i Bradley, A., (1990) Cell 62: 1073-1085) hodowano w mitotycznie nieaktywnych warstwach pożywki komórkowej SNL76/7 (ibid.) zasadniczo jak opisano (Robertson, E. J. (1987) w Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach (E. J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, str. 71-112). Przeprowadzony w postać liniową kierujący wektor CMD elektroporowano z komórkami AB-1 sposobami opisanymi przez Hasty'ego i wsp. (Hasty, P. R. i wsp. (1991) Nature 350: 243-246). Elektroporowane komórki wysiano na szalkach w szalkach 100 mm przy gęstości 1-2 x 106 komórek/szalkę. Po 24 godzinach, G418 (200 mikrogramów/ml aktywnego składnika) i FIAU (5 x 10-7 M) dodano do pożywki i klony odporne na leki pozostawiono aby rozwijały się przez 8-9 dni. Klony wybrano, trypsynizowano, podzielono na dwie części i dalej namnażano. Połowa z komórek pochodzących z każdego klony następnie zamrożono a drugą połowę analizowano pod względem homologicznych rekombinacji pomiędzy wektorem a docelową sekwencją.
Analizę DNA przeprowadzono metodą hybrydyzacji Southern blot. DNA izolowano z klonów jak opisano przez Lairda i wsp. (Laird, P. W. i wsp., (1991) Nucleic Acid Res. 19 : 4293). Izolowany genomowy DNA trawiono SpeI i wprowadzano sondy o 915 parach zasad fragmentu SacI, sonda A (patrz Fig. 1), która hybrydyzuje z sekwencją pomiędzy intronowym enchancerem mu a regionem
PL 217 752 B1 przełączania mu. Sonda A wykrywa fragment SpeI o 9,9 kilozasadach z locus typu dzikiego i diagnostyczny prążek o 7,6 kilozasadach z locus mu, który został homologicznie zrekombninowany z kierującym wektorem CMD (kaseta ekspresyjna neo zawiera miejsce SpeI). Odporne klony z 1132 G418 i FIAU przeszukiwane analizą blotu Southerna, 3 wykazały prążek SpeI o 7,6 kilozasadach będący wskaźnikiem homologicznej rekombinacji w locus mu. Te 3 klony ponadto trawiono enzymami BglI, BstXI i EcoRI, aby sprawdzić, czy wektor uległ integracji homologicznej z genem mu. Gdy hybrydyzowano sondą A, bloty Southerna typu dzikiego DNA trawiono BglI, BstXI, lub EcoRI uzyskując fragmenty o 15,7; 7,3 i 12,5 kilozasad, odpowiednio, podczas gdy obecności docelowego allelu mu wskazano przez fragmenty odpowiednio o 7,7; 6,6 i 14,3 kilozasadach. Wszystkie 3 pozytywne klony wykryte przez trawienie SpeI wykazały spodziewane fragmenty restrykcyjne BglI, BstXI i EcoRI diagnostyczne insercji kasety neo do egzonu Cmu1.
Wytwarzanie myszy niosących zmutowany gen mu
Trzy docelowe klony ES, oznaczone liczbami 264, 272 i 408, rozmrożono i wstrzykiwany do blastocyst C57BL/6J jak opisano przez Bradley'a (Bradley, A. (1987) w Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach. (E. J. Robertson, red.) Oxford: IRL Press, str. 113-151). Wstrzykiwane blastocysty przenoszono do macicy nibyciężarnych samic aby wytworzyć chimeryczne myszy reprezentujące mieszaninę komórek pochodzących z wprowadzonych komórek ES i blastocysty gospodarza. Zakres udziału komórek ES w chimerze może być wzrokowo oszacowan y poprzez ilość przesianego wybarwienia futra, pochodzącego z linii komórkowej ES, na czarnym tle C57BL/6J. Klony 272 i 408 uzyskiwały tylko niski procent chimer (to jest niski procent wybarwienia przesianego) lecz klon 264 uzyskiwał wysoki procent męskich chimer. Te chimery hodowano z samicami C57BL/6J i wytworzono potomstwo o przesianym futrze, wskazują na przekazanie linii zarodkowej genomu komórek ES. Przeszukiwanie pod kątem docelowego genu mu przeprowadzono analizą blotu Southerna trawionego BglI DNA z biopsji z ogona (jak opisano powyżej dla analizy DNA komórek ES). W przybliżeniu 50% z potomstwa o przesianej sierści wykazało hybrydyzujący prążek BglI o 7,7 kilozasadach oprócz typu dzikiego prążka o 15,7 kilozasadach, wykazując przekazanie linii zarodkowej docelowego gen mu.
Analiza transgenicznych myszy pod kątem funkcjonalnej inaktywacii genu mu
Aby określić czy insercja kasety neo w Cmu1 ma inaktywować gen kodujący ciężki łańcuch Ig, klon chimery 264 hodowano z mysimi homozygotami pod kątem mutacji JHD, która inaktywowała ekspresję ciężkiego łańcucha w wyniku delecji segmentów genów JH (Chen i wsp., (1993) Immunol. 5: 647-656). Wytworzono cztery sztuki potomstwa o przesianej sierści. Surowicę otrzymano z tych zwierząt w wieku 1 miesiąca i badali testem ELISA pod kątem obecności mysiego IgM. Dwoje z czterech sztuk potomstwa całkowicie były pozbawione IgM (patrz Tabela 1). Genotypowanie czterech zwierząt analizą blotu Southerna DNA z biopsji ogona przez trawienie BglI i hybrydyzację z sondą A (patrz Fig. 1), i przez trawienie Stul i hybrydyzację z 475 parami zasad fragmentu EcoRI/StuI (ibid.) wykazując, że zwierzęta, które nie prowadzą ekspresji surowicy IgM są tymi, w których jeden alleli locusa ciężkiego łańcucha niosącego mutację JHD, inne allele mutacji Cmu1. Heterozygotyczne myszy pod względem mutacji JHD wykazują poziomy surowicy Ig typu dzikiego. Dane te wykazują, że mutacja Cmu1 inaktywuje ekspresję genu mu.
T a b e l a 1
Mysz Surowica IgM (mikrogramy/ml) genotyp łańcucha IgH
42 < 0,002 CMD/JHD
43 196 +/JHD
44 < 0,002 CMD/JHD
45 174 +/JHD
129 x BL6 Fl 153 +/+
JHD < 0,002 JHD/JHD
Tabela 1 przedstawia poziomy surowicy IgM, określone testem ELISA, dla myszy niosących zarówno mutację CMD jak i JHD (CMD/JHD), dla heterozygotycznych myszy pod kątem mutacji JHD
PL 217 752 B1 (+/JHD), dla typu dzikiego (129Sv x C57BL/6J)F1 myszy (+/+) i limfocytu B myszy pozbawione homozygot pod kątem mutacji JHD (JHD/JHD).
P r z y k ł a d 2 Wytwarzanie transgenicznej myszy HCO12
Ludzki transgen ciężkiego łańcucha HCO12
Transgen HCO12 wytworzono przez wspólną iniekcję insertu 80 kilozasad pHC2 (Taylor i wsp., 1994, Int. Immunol., 6: 579-591) i insertu 25 kilozasad pVx6. Plazmid pVx6 skonstruowano jak opisano poniżej.
Fragment Hindlll/Sall DNA o 8,5 kilozasadach, zawierające ludzki gen z linii zarodkowej VH 1-18 (DP-14) razem z, w przybliżeniu, 2,5 kilozasad 5' flankującej i 5 kilozasad z 3' flankującej genomowej sekwencji subklonowano w miejsce plazmidowego wektora pSP72 (Promega, Madizon, WI), aby wytworzyć plazmid p343.7.16. Fragment BamHI/Hindlll DNA o 7 kilozasadach, zawierający gen z linii zarodkowej ludzkiego VH 5-51 (DP-73) razem z, w przybliżeniu, 5 kilozasad 5' flankującej i 1 kilozasad 3' flankującej genomowej sekwencji, wklonowano do wektora pGP1f opartego na plazmidzie pBR322 (Taylor i wsp. 1992, Nucleic Acid Res. 20: 6287-6295), aby wytworzyć plazmid p251f. Nowo sklonowany wektor pochodzący z pGP1f, pGP1k (SEK NR ID:13), trawiono EcoRV/BamHI i ligowano z fragmentem EcoRV/BamHI DNA o 10 kilozasadach, zawierającym gen z linii zarodkowej ludzkiego VH 3-23 (DP47) razem z, w przybliżeniu, 4 kilozasad 5' flankującej i 5 kilozasad 3' flankującej genomowej sekwencji. Otrzymany plazmid, p112.2RR.7, trawiono BamHI/Sall i ligowano z oczyszczonym insertem o 7 kilozasadach BamHI/Sall z p251f. Otrzymany plazmid, pVx4, trawiono XhoI i ligowano z insertem o 8,5 kilozasadach Xhol/Sall z p343.7.16.
Klon otrzymano z genem VH 1-18 w tej samej orientacji jak inne dwa geny V. Klon ten, oznaczony pVx6, następnie trawiono NotI i oczyszczono insert 26 kilozasad wstrzykiwany razem z oczyszczonym insertem NotI o 80 kilozasadach z pHC2 w stosunku molowym 1:1 do przedjądrza półdniowych embrionów (C57BL/6J x DBA/2J)F2 jak opisano w pracy Hogana i wsp. (B. Hogan i wsp., Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, wyd. 2, 1994, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview NY). Trzy niezależne linie transgenicznych myszy zawierające sekwencje zarówno z Vx6 jak i HC2 założono od myszy które rozwinęły się ze wstrzykiwanych embrionów. Linie te oznaczono (HCO12)14881, (HCO12)15083 i (HCO12)15087. Każda z trzech linii następnie była hodowana z myszami niosącymi mutację CMD opisanymi w przykładzie 1, mutacja JKD (Chen i wsp. 1993, EMBO J. 12: 811-820) i transgen (KCo5)9272 (Fishwild i wsp. 1996, Nature Biotechnology 14: 845-851). Otrzymane myszy prowadzą ekspresję transgenów ludzkiego ciężkiego i lekkiego łańcucha kappa w podstawowych homozygotach do przerwania Ioci endogennego mysiego ciężkiego i lekkiego łańcucha kappa.
P r z y k ł a d 3 Wytwarzanie ludzkich monoklonalnych przeciwciał przeciwko IL-15
Transgeniczne myszy HCo12 i HCo7, wytworzone jak opisano powyżej i dostarczone z Medarex, San Jose, CA, USA, immunizowano ludzką zrekombinowaną IL- 5 (hIL-15, Immunex corp., Seattle, USA) uzupełnioną zarówno pełnym adiuwantem Freundsa (CFA, seria nr 121024LA, Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA) jak i niepełnym adiuwantem Freundsa (ICFA, seria nr 121195LA, Difco, podskórnie (SC) śródotrzewnowo (IP) lub dożylnie (IV). W kilku przypadkach hIL-15 sprzężoną z KLH zastosowano do immunizacji. Po kilku dawkach wspomagających hIL-15 uzupełnioną zarówno pełnym jak i niepełnym adiuwantem Freundsa, surowicę myszy badano pod kątem obecności ludzkich przeciwciał skierowanych przeciwko IL-15.
Schematy immunizacji transgenicznych myszy, które prowadziły do ostatecznych klonów
146B7, 146H5, 404E4 i 404A8
Mysz nr. 146 (HCo12), ID 995-146, Samice
170699 SC 12
010799 SC 12
150799 SC 12
020899 SC 12
070999 SC 12
280999 SC 12
111099 IV 30
μg hIL-15 w CFA (Difco, seria nr 121024LA) μg hIL-15 w ICFA (Difco, seria nr 121195LA) μβ hIL-15 w ICFA μg hIL-15-KLH w ICFA μg hIL-15-KLH w ICFA μg hIL-15-KLH w CFA μg hIL-15 w PBS
PL 217 752 B1
121099 IV 30 μg hIL-15 w PBS
151099 fuzja komórek węzła chłonnego i śledziony tej myszy z SP2/0
Mysz nr 404 (HCo7), ID 997-404, Samice
201099 IP
031199 IP
101199 IV
191199 IV
121199
μg hIL-15-KLH w CFA (Difco, seria nr 121024LA)
12,5 μg hIL-15, 12,5 μg hIL-15-KLH, 25 μg w ICFA (Difco, seria nr 121195LA)
12,5 μg hIL-15, 12,5 g hIL-15-KLH
12,5 μg hIL-15, 12,5 μg hIL-15-KLH fuzja komórek węzła chłonnego i śledziony tej myszy z SP2/0
Pożywki hodowlane
Wspólna pożywka do fuzji (FPM):
Zmodyfikowana wg. Iscove'a pożywka Dulbecco uzupełniona 100 IU/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 1 mM Na-Pirogronian, 0,5 mM β-merkaptoetanol (Life Technologies, Paisley, Szkocja) i 10% inaktywowana ciepłem płodowa surowica cielęca (HyClone, Utah, USA).
Selekcyjna pożywka do fuzji (FSM):
FPM uzupełnionej z 30 ml Origen Hybridoma Klonowanie Czynnik (IGEN, Gaithersburg, MD, USA), HAT (1 vial, wytwarzanie zalecane przez stężenie, Sigma Chemiczne Co., St. Louis, MO, USA) i 0,5 mg/ml kanamycin (Life Technologies, Paisley, Szkocja).
Klonująca pożywka do fuzji (FCM):
FPM uzupełniona 20 ml czynnika Origen Hybridomy do klonowania (IGEN, Gaithersburg, MD, USA), HT (1 fiolka, zgodnie z zalecanym stężeniem przez producenta, Sigma Chemiczne Co., St. Louis, MO, USA) i 0,5 mg/ml kanamycyny (Life Technologies, Paisley, Szkocja).
Wytwarzanie hybrydoma: fuzja komórek śledziony i węzła chłonnego z komórkami szpiczaka
SP2/0
Aby uzyskać hybrydoma, śledzionę, pachwinowe i przyaortowe węzły chłonne usunięto z myszy. Pojedyncze zawiesiny komórek śledziony i komórek węzła chłonnego zmieszano z komórkami szpiczaka SP2/0 w stosunku 1:2. Komórki wirowano i osad zawieszono ponownie łagodnie w 1 ml polietyleneglikolu (50% masa/obj. w PBS, Sigma-Aldrich, Irvine, UK) w temp. 37°C. Po wirowaniu komórek przez 60 sekund, 25 ml FPM-2 dodano i komórki inkubowano w temp. 37°C przez 30-60 5 minut. Po inkubacji, komórki hodowano do stężenia komórek 0,75 x 105 komórek na studzienkę (w 100 μΐ) w 96-studzienkowych szalkach w FSM. Po 3 dniach, 100 μΐ FSM dodano do każdej studzienki.
Fuzja śledziony i węzłów chłonnych z HCo7 i HCo12 myszy immunizowanych hIL-15 prowadziło do wytwarzania kilku hybrydom wytwarzających przeciwciała skierowanej przeciwko IL-15. Poniższe cztery stabilne klony wytwarzające w pełni ludzkie przeciwciała anty-IL-15 zostały izolowane: (1) 146LyD7F7B7 o zmienionej nazwie: 146B7; (2) 146DE2E12A3H5 o zmienionej nazwie: 146H5; (3) 404CG11B7E4 o zmienionej nazwie: 404E4; i (4) 404FB12E7A8 o zmienionej nazwie: 404A8. Klony te wszystkie pochodziły z ludzkiej podklasy IgG1/k.
Przeszukiwanie hybrydoma
Pomiędzy dniem 7 a 11 po fuzji, studzienki przeszukiwano pod kątem obecności ludzkiego przeciwciała stosując poniższe testy ELISA:
Test ELISA do przeszukiwania pod kątem obecności ludzkiego IgG w supernatantach hodowli
Aby przeprowadzić test ELISA do wykrywania obecności ludzkich przeciwciał IgG, 100 μΐ/studzienkę 0,9 μg/ml króliczych-a-k-lekkich łańcuchów przeciwciał (DAKO, Glostrup, Dania) dodano w zbuforowanym fosforanem roztworze soli w wodzie (PBS) do szalki do testu ELISA Nunc Maxizorp plate (inkubacja przez noc w temperaturze pokojowej). Po blokowaniu szalki PBS uzupełnionej surowicą kurczaka (2%; Life Technologies, Paisley, Szkocja) i Tween-20 (0,05%; PBSTC), supernatant hodowli dodano. Po inkubacji przez 1,5 godziny szalki przemywano i szczurzą -a-ludzką IgG (fragmenty Fab2) koniugowane z peroksydazą z rzodkiewki (DAKO, Glostrup, Dania) dodano rozcieńczony 0,5 μg/ml w PBSTC. Po inkubacji przez 1 godzinę, studzienki przemywano i substrat, ABTS (kwas 2,2'-Azynobis-3-etylobenzotiazolino-sulfonowy, Roche Diagnostics, Mannheim, Niemcy) dodano we34
PL 217 752 B1 dług protokołu wytwarzania i wiązanie przeciwciała określono przy 405 nm w czytniku do szalek ELISA
EL808 (Bio-tek Instruments, Winooski, VT, USA).
ELISA do przeszukiwania pod kątem obecności specyficznych przeciwciał przeciwko IL-15
Studzienki zawierające ludzkie przeciwciała IgG/k dalej badano pod kątem obecności ludzkiego przeciwciała anty-IL-15 w specyficznym wobec IL-15 teście ELISA. Przeprowadzono analizę metodą ELISA, 100 μl/studzienkę 1 μg/ml IL-15 dodano w zbuforowanym fosforanem roztworem soli w wodzie (PBS) na szalce Nunc Maxizorp ELISA (inkubacja przez noc w temperaturze pokojowej). Po blokowaniu szalki PBS uzupełnionym surowicą kurczaka (2%; Life Technologies, Paisley, Szkocja) i Tween-20 (0,05%; PBSTC), dodano supematanty hodowli. Po inkubacji przez 1,5 godziny szalki przemywano i dodano ludzką a-IgG sprzężoną Fc z peroksydazą chrzanową (Jackson Immunoresearch, West Grove, Pennsylvania, USA) 1/5000 rozcieńczoną w PBSTC. Po inkubacji przez 1 godzinę, studzienki przemywano i dodano substrat, ABTS (kwas 2,2'-Azynobis-3-etylobenzotiazolino-sulfonowy, Roche Diagnostics, Mannheim, Niemcy) według protokołu producenta i wiązanie przeciwciała określono przy 405 nm czytnikiem EL808 ELISA (Bio-tek Instruments, Winooski, VT, USA).
Subklonowanie hybrydoma
Aby uzyskać stabilne linie komórkowe anty-IL-15, hybrydoma wklonowano stosując ograniczone rozcieńczenia komórek (do 0,5 komórki/studzienkę) w 96-studzienkowych szalkach.
Klony badano po w przybliżeniu 10 dniach stosując powyżej wymieniony test IL-15 ELISA. W czasie kilku procedur wklonowania, FSM zmieniono w fazach poprzez FCM do FPM. Izotyp klonów określono stosując test ELISA opisany poniżej.
Wyznaczanie izotypów przeciwciał anty-IL-15 testem ELISA
Aby przeprowadzić oznaczanie izotypu ELISA, 100 μl/studzienkę 1 μg/ml anty-ludzkiego Fc (Jackson Immunoresearch) dodano w zbuforowanym fosforanem roztworze soli w wodzie (PBS) do szalki Nunc Maxizorp ELISA (inkubacja przez noc w temperaturze pokojowej). Po blokowaniu szalki PBS uzupełnionym surowicą kurczaka (2%; Life Technologies, Paisley, Szkocja) i Tween-20 (0,05%; PBSTC), dodano supernatanty hodowli. Po inkubacji przez 1,5 godziny szalki przemywano i dodano mysią -a-HuIgG1 sprzężoną z fosfatazą alkaliczną (Zymed, plaats, land), lub mysią-a-HuIgG3 sprzężoną z peroksydazą chrzanową (Zymed). Po inkubacji przez 1 godzinę studzienki przemywano i substrat, ABTS (kwas 2,2'-azynobis-3-etylobenzotiazolino-sulfonowy, Roche Diagnostics, Mannheim, Niemcy) dodano według protokołu producenta. Wiązania przeciwciała określono przy 405 nm czytnikiem EL808 ELISA (Bio-tek Instruments, Winooski, VT, USA.
P r z y k ł a d 4 Specyficzność epitopowa w pełni ludzkiego przeciwciała anty-IL-15
Aby uzyskać działanie terapeutyczne i hamowanie indukowanego IL-15 działania prozapalnego, specyficzne przeciwciała przeciwko IL-15 muszą rozpoznawać epitopy IL-15 biorące udział w oddziaływaniu z łańcuchem IL-2R3 i/lub łańcuchem γ receptora IL-15.
Zmutowane białka (opisane przez Pettita i wsp.) zastosowano do określenia specyficzności epitopu w pełni ludzkich przeciwciał anty-IL-15, 146B7, 146H5, 404A8 i 404E4. Zastosowane mutanty IL-15 obejmują mutant IL-15 Q108S (reszta Gln w pozycji 108 zastąpiona przez Ser; mutacja w miejscu oddziaływanie łańcucha γ) i mutant D8SQ108S (reszta Gln w pozycji 108 zastąpiona przez Ser i Asp w pozycji 8 podstawiono Ser; mutacje w obu miejscach oddziaływania łańuchach β i γ IL-15).
Test ELISA do określenia wiązania specyficznych przeciwciał hIL-15, 146B7, 147H5. 404A8 i 404E4. przeciwko hIL-15 i zmutowanemu białku IL-15
Aby przeprowadzić test ELISA, 100 μl 1 ąg/ml IL-15 lub zmutowane białko hlL-15, w zbuforowanym fosforanem roztworze soli w wodzie (PBS), dodano do szalki Nunc Maxizorp ELISA do powlekania. Po blokowaniu szalki PBS uzupełnionym surowicą kurczaka (2%; Life Technologies, Paisley, Szkocja) i Tween-20 (0,05%; PBSTC), inkubowano kolejne rozcieńczenia specyficznych przeciwciał przeciwko hIL-15. Po przemyciu, dodano ludzką a-IgG Fc sprzężoną z peroksydazą (Jackson Immunoresearch, West Grove, Pennsylvania, USA) 1/5000 rozcieńczoną PBSTC. Po przemyciu substratu, dodano ABTS (kwas 2,2'-azynobis-3-etylobenzotiazolino-sulfonowy, Roche Diagnostics, Mannheim, Niemcy) według protokołu producenta i wiązanie przeciwciała określono przy 405 nm czytnikiem EL808 ELISA (Bio-tek Instruments, Winooski, VT, USA).
Wiązanie z, w pełni ludzkimi specyficznym przeciwciałami IL-15 146B7, 146H5, 404A8 i 404E4 przeciwko hIL-15 i zmutowanym białkom IL-15, Q108S i D8SQ108S przedstawiono na Fig 1. Ani 146B7 ani 146H5 nie były zdolne do wiązania z zmutowanymi białkami IL-15. Ponieważ oba mutanty
PL 217 752 B1 niosą mutację Q108S, epitop rozpoznawany przez 146B7 i 146H5 jest w obrębie istotnej domeny IL-15, która oddziałuje z łańcuchem γ receptora IL-15. 404A8 i 404E4 oba były zdolne do wiązania zmutowanego białka, dlatego, te przeciwciała rozpoznawały epitop zewnętrznych domen oddziałujących łańcuchów β i γ IL-15. Oba 146B7 i 146H5 wiążą się z IL-15 w regionie, który oddziałuje z łańcuchem γ receptora IL-15. To jest zgodne z danymi otrzymanymi w testach proliferacji stosując w pełni ludzkie przeciwciała anty-IL-15 według obecnego wynalazku. Jak opisano szczegółowo poniżej, ani 404A8 ani 404E4 nie były zdolne do hamowania indukowanej IL-15 proliferacji komórek CTLL-2 i ludzkich PBMC. Oba 146B7 i 146H5 były zdolne do hamowania indukowanej IL-15 proliferacji. Ponadto, hamowanie proliferacji uzyskano przez blokowanie oddziaływania IL-15 z podjednostką γ receptora IL-15.
P r z y k ł a d 5 Sekwencje regionów VH i VL z 146B7
Nukleotydową i wywnioskowaną aminokwasową sekwencję przearanżowanych domen VH i VL 146B7 określono stosując poniższe procedury. Sekwencje te dostarczają informacji odnoszących się do zastosowania rodzin linii zarodkowej VH i VL; mutacje punktowe w tych sekwencjach z linii zarodkowej są spowodowane dojrzewaniem powinowactwa limfocytów B w czasie immunizacji zwierząt.
Przygotowanie RNA
Całkowite RNA przygotowano z 5 x 106 146B7 komórek hybrydoma z RNAzol (Biogenezis, Poole, Anglia) według protokołu producentów.
Przygotowanie cDNA cDNA z RNA z 146B7 uzyskano z 3 μg całkowitego RNA stosując odwrotną transkryptazę AMV z buforem (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy), oligo d(T)15 (Promega, Madizon, WI, USA), dNTP (Boehringer Mannheim corp., USA) i RNAzyną (Promega) według protokołu producenta.
Startery PCR zastosowane do amplifikacji regionów Vh i V_do klonowania:
Zastosowanie pary starterów:
VH:
(1) FR1 startery 5' AB62 CAggTKCAgCTggTgCAgTC
(2) AB63 SAg gTg CAg CTg KTg gAg TC
(3) AB65 gAg gTg CAg CTg gTg CAg TC
VH liderowe startery 5'
(4) AB85 ATg gAC Tgg ACC Tgg AgC ATC
(5) AB86 ATg gAA TTg ggg CTg AgC Tg
(6) AB87 ATg gAg TTT ggR CTg AgC Tg
(7) AB88 ATg AAA CAC CTg Tgg TTC TTC
(8) AB89 ATg ggg TCA ACC gCC ATC CT
(9) VK: VH starter 3' AB90 TgC CAg ggg gAA gAC CgA Tgg
FR1 starter 5's
(1) AB8 RAC ATC CAg ATg AYC CAg TC
(2) AB9 gYC ATC YRg ATg ACC CAg TC
(3) AB10 gAT ATT gTg ATg ACC CAg AC
(4) AB 11 gAA ATT gTg TTg ACR CAg TC
(5) AB12 gAA ATW gTR ATg ACA CAg TC
(6) AB13 gAT gTT gTg ATg ACA CAG TC
(7) AB14 gAA ATT gTg CTg ACT CAg TC
VK liderowe startery 5':
(8) AB123 CCC gCT Cag CTC CTg ggg CTC CTg
(9) AB124 CCC TgC TCA gCT CCT ggg gCT gC
(10) AB125 CCC AgC gCA gCT TCT CTT CCT CCT
PL 217 752 B1 (11) AB126 ATg gAA CCA Tgg AAg CCC CAg CAC AgC
VK starter 3' (12) AB16 Cgg gAA gAT gAA gAC AgA Tg
Zastosowane warunki PCR do amplifikacji regionów VH i VL do klonowania
Reakcje PCR przeprowadzano stosując polimerazę AmpliTaq (Perkin Elmer) w układzie GenAmp PCR 9700 (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
PCR protokół cyklu:
94° 2'
11 cykli 94° 30” 65° 30”, minus 1° na cykl 72° 30”
30 cykli 94° 30” 55° 30” 72° 30” 72° 10' schłodzenie do 4°
Klonowanie Vh i V_ w układzie I wektora pGEMT
Po analizowaniu produktów PCR w żelu agarozowym, produkty oczyszczono mikrowirówkowymi kolumnami S-400 lub S300 (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, USA), lub żelowym zestawem do ekstrakcji QIAEX II (Qiagen GmbH, Hilden, Niemcy). W każdym doświadczeniu 2 niezależnie amplifikowane produkty PCR, stosując FR1 lub startery liderowe, każdego z VH i VL regionów sklonowano w układzie I wektora pGEMT (Promega) według protokołu producentów.
Po transformowaniu E. coli DH5a, poszczególne kolonie przeszukiwano przez PCR kolonii stosując startery T7 i SP6, 30 cykli w temp. 55°. Plazmid DNA z każdej osobnej kolonii oczyszczano stosując zestaw Qiaprep Spin miniprep (Qiagen). W celu dalszej analizy przeprowadozno trawienie Nco1/Not1 (NE Biolabs, Wielka Brytania i Roche Diagnostics) i analizowano w żelu agarozowym.
Sekwencjonowanie
Regiony V sekwencjonowano po w klonowaniu do układu I wektora pGEMT. Startery T7 i SP6 (Eurogentec, Luik, Belgium) zastosowano w połączeniu z zestawem do sekwencjonowania: zestaw ABI Prism BigDye Terminator Cykl Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Warrington, Wielka Brytania) według protokołu. Reakcje przeprowadzano w sekwenserze ABI PRISM 377 (PE Applied Biosystems) i sekwencje analizowano programem DNAStar, SeqmanII. Sekwencje następnie zorientowano z sekwencjami genów V z linii zarodkowej stosując VBASE (www.mrc-cpe.cam. Ac.uk/imt-doc/public/intro.htm).
Klonowanie i sekwencionowanie regionu Vh i V_ Z 146B7
Regiony VH i VL z hybrydomy 146B7 amplifikowano metodą PCR i sklonowano układem I wektora pGEMT aby określić sekwencje cDNA. Nukleotydowe i odpowiadające im sekwencje aminokwasowe przedstawiono odpowiednio na Fig. 2 (SEK NR ID: 1 i 2) i Fig. 3 (SEK NR ID: 3 i 4). Regiony szkieletowe (FR) i określające komplementarność (CDR) są również wskazane. Rodzina linii zarodkowej regionu VH z 146B7 według przyporządkowania programem Vbase: VH5-51 (VH5-podgrupa), D2-15/D2 (DH-segment), JH4b (JH-segment). Rodzina linii zarodkowej regionu VL z 146B7 według przyporządkowania programem Vbase: A27 (VKIII-podgrupa) i JK2 (JK-segment). Więcej informacji odnośnie domen VH i VL przedstawiono w bazie danych Kabat http://immuno.bme.nwu.edu/ lub na http://www.Vbase.com.
P r z y k ł a d 6 Charakterystyka powinowactwa wiązania 146B7
Powinowactwo 146B7 analizowano techniką powierzchniowego rezonansu plazmonu(SPR) stosując urządzenie BIACORE, 3000 aby określić cząsteczkowe biologiczne oddziaływań białkowych według poniższych procedur. Wykrywano zmiany sygnału SPR na powierzchni warstwy wytwarzane przez wiązanie cząsteczki biologiczne i wyrażają zmianę stężenia wagowego w warstwie powierzchniowej. Powinowactwo jest wyrażane stosując poniższe definicje: ka= stała szybkości asocjacji
-1 -1 -1 -1 (M-1 sek-1); kd = stała szybkości dysocjacji (sek-1); KA = stała równowagi asocjacji = ka/kd (M-1); i KD = stałej równowagi dysocjacji = kd/ka (M).
Różne procedury przeprowadzano, aby uzyskać powinowactwo 146B7 wobec ludzkiej IL-15 (hIL-15). Ludzka zrekombinowana IL-15 z dwóch różnych źródeł (Immunex corp., Seattle, USA i PePL 217 752 B1 protech, Rocky Hill, NJ, USA) została sprzężona z chipem czujnika CM5. Związek sprzężony z chipem czujnika zdefiniowano jako ligand. W innych doświadczeniach jako ligand zastosowano 146B7.
W każdej kinetycznej analizie, wiązanie analitu, 146B7 lub hIL-15 przystosowane do ligandu sprzężonego z chipem czujnika, w porównaniu z wiązaniem z odnośnikową kontrolą chipem czujnika CM5. Badano kolejne rozcieńczenia analitu (0, 3,125; 6,25; 12,5; 25, 50 pg/ml). Krzywe asocjacji i dysocjacji dopasowano do monomerycznego oddziaływania w modelu Langmuira 1:1, aby określić ka i kd i aby obliczyć KA i KD. Wszystkie dane analizowano stosując BIA-Evaluation wersja 3.1. W przypadku dwuwartościowego oddziaływania zastosowano model „dwuwartościowego analitu”. Wszystkie analizy korygowano pod względem przesuwającej się linii podstawowej.
Aby określić powinowactwo przeciwciała 146B7, powinowactwo przeciwciała 146B7 zmierzono dla ludzkiej zrekombinowanej IL-15 pochodzącej z dwóch różnych źródeł, Immunex i Peprotech, w BIACORE 3000. Stosując 146B7 jako ligand i hIL-15 jako analit, jedno wartościowe oddziaływanie określono (dopasowanie krzywej według Langmuira 1:1).
Powinowactwo 146B7 z IL-15 (Immunex Corp.) zmierzono następująco:
Stała szybkości asocjacji ka: Stała szybkości dysocjacji kd: Stała równowagi asocjacji KA: Stałej równowagi dysocjacji KD:
1,07 (± 0,17) x 10 6,56 (± 0,09) x 10-3 sek- M -1 sek -1
-1
1,55 (± 0,21) x 107 M 6,59 (± 0,88) x 10-8 M
Aby określić zachłanność 146B7, IL-15 (Immunex Corp.) zastosowano jako ligand i 146B7 zastosowano jako analit. Gdy otrzymane dane analizowano stosując dopasowanie krzywej Langmuira (1:1) określono dwuwartościowe oddziaływania przeciwciała, wyznaczono zachłanność przeciwciała.
Zachłanność 146B7 wobec IL-15 (Immunex Corp.) zmierzono następująco:
Stała szybkości asocjacji ka: Stała szybkości dysocjacji kd: Stała równowagi asocjacji KA: Stałej równowagi dysocjacji KD:
7,30 (± 0,81) x 105 M-1 sek-1 1,45 (± 2,05) x 10-3 sek-1 5,03 (± 3,40) x 108 M-1 1,55 (± 1,24) x 10-9 M
Określono również powinowactwo i zachłanność 146B7 wobec pochodzącej z Peprotech IL-15. Żadnych większych różnic w powinowactwie lub zachłanności IL-15 z dwóch różnych źródeł nie obserwowano.
Jak opisano w przykładzie poniżej odnoszącym się do hamowania indukowanej ludzką interleukiną-15 (hIL-15) proliferacji komórek CTLL-2 i PBMC przez w pełni ludzkie przeciwciała anty-IL-15,
146B7 hamowało w sposób zależny od dawki indukowaną IL-15 proliferację jak zmierzono przez wbu3 dowanie [3H]-tymidyny. Stężenie IC50 przy 50% hamowania, bardziej funkcjonalny sposób aby określić powinowactwo na podstawie tych doświadczeń hamowania proliferacji obliczono: 3,1 ± 0,91 nM. To IC50 jest zgodne z zachłannością mierzoną przez BLACORE 3000 (KD 1,5 nM) stosując 146B7 jako ligand i zrekombinowaną ludzką IL-15 jako analit i potwierdziło pomiary powinowactwa i zachłanności otrzymane tutaj.
P r z y k ł a d 7 Hamowanie indukowanej hIL-15 produkcji TNF-α przez w pełni ludzkie przeciwciała anty-IL-15
Wpływ w pełni ludzkich przeciwciał anty-IL-15, 146B7, 146H5, 404E4 i 404A8, na indukowaną IL-15 produkcję TNF-a badano stosując pochodzące z krwi obwodowej jednojądrzaste komórki (PBMC) od zdrowych ochotników stosując poniższe procedury. Do określenia specyficzności wobec IL-15, również badano wpływ tych przeciwciał na produkcję TNF-a w której pośredniczy IL-2.
Hodowla komórkowa
Hodowle utrzymywano w RPMI-1640 z 2 mM L-glutaminą, 100 IU/ml penicyliną, 100 μg/ml streptomycyną (wszystkie pochodzące z Life Technologies, Paisley, Szkocja) i 10% inaktywowaną płodową surowicą cielęca (HyClone, Utah, USA).
Oczyszczanie komórek jednojądrzastych z krwi obwodowej (PBMC)
Świeżą ludzką krew pobrano od zdrowego ochotnika po świadomej zgodzie, aby zapobiec skrzepowi dodano heparynę. Oczyszczanie PBMC przeprowadzono przez wirowanie w gradiencie gęstości stosując Ficoll (Pharmacia, Uppsala, Szwecja).
Związek badany
HIL-15, seria nr: 6870-011, Immunex corp., Seattle, Washington, USA.
PL 217 752 B1 hIL-2, Chiron Benelux BV, Amsterdam, Holandia.
Zastosowano w pełni ludzkie przeciwciała: 146B7 (seria: 070101) i 146B7RDJW07, 404A8 (seria: 030101) i 404E4 (seria: 080101) i jako izotypowe przeciwciało kontrolne T1 (97-2B11-2B12, seria:
190900).
Hamowanie indukowanej ludzką IL-15 (hIL-15) lub hIL-2 produkcji TNF-a przez PBMC przez przeciwciała anty-IL-15
PBMC hodowano w trzech powtórzeniach lub czterech powtórzeniach w 96-studzienkowej pła5 skodennej szalce przy 1,5 x 105 komórek na studzienkę w obecności lub braku hIL-2 lub hIL-15 i z lub bez przeciwciał anty-IL-15. Izotypowe przeciwciało kontrolne (T1) włączono jako kontrola negatywna. Koncanawalinę A (2,5 μg/ml, Calbiochem) dodano jako pozytywną kontrolę proliferacji. Komórki inkubowano przez 72 godziny w temp. 37°C i 5% CO2. Supernatanty zebrano aby ocenić jakościowo ilość ludzkiego TNF-a testem ELISA (U-CyTech, Utrecht, Holandia).
Działanie 146B7 i izotypowego przeciwciała kontrolnego badano na produkcji TNF-a przez PBMC, w której pośredniczy IL-15. 146B7 hamowało produkcję TNF-a, w której pośredniczy hIL-15, w sposób zależny od dawki, podczas gdy izotypowe przeciwciało kontrolne nie hamowało indukowanej hIL-15 produkcji TNF-a (Fig. 6). Przedstawiono dane dwóch zdrowych ochotników. 404E4 i 404A8 były niezdolne do hamowania indukowanej hIL-15 produkcji TNF-a.
Aby zapewnić specyficzności przeciwciał anty-IL-15, określono ich wpływ na produkcję TNF-a, w której pośredniczy hIL-2. Nie stwierdzono indukcji hamowania produkcji TNF-a w której pośredniczy hIL-2 przez 146B7 (Fig. 7). Nie stwierdzono zależnego od dawki hamowania zarówno przez 404E4 jak i 404A8 w produkcji TNF-a w której pośredniczy hIL-2.
Zależne od dawki hamowanie produkcji TNF-a, w której pośredniczy hIL-15 obserwowano tylko przez 146B7 lecz nie przez 404E4 i 404A8. Hamujące działanie było specyficzne dla hIL-15; produkcji TNF-a w której pośredniczy IL-2.
P r z y k ł a d 8 Hamowanie indukowanej ludzką interleukiną-15 (hIL-15) proliferacji komórek CTLL-2 i PBMC przez w pełni ludzkie przeciwciała anty-IL-15
Przeciwciała 146B7, 146H5, 404E4 i 404A8 badano pod kątem ich zdolności do hamowania proliferacji limfocytów T, stosując komórki CTLL-2 (Gillis i wsp., 1978) i komórek jednojądrzastych we krwi obwodowej (PBMC) stosując poniższe procedury.
Hodowla komórkowa
Hodowlę utrzymywano w RPMI-1640 z 2 mM L-glutaminą, 100 IU/ml penicyliną, 100 μg/ml streptomycyną (wszystkie pochodzące z Life Technologies, Paisley, Szkocja) i 10% inaktywowaną płodową surowicą cielęca (HyClone, Utah, USA).
Komórki CTLL-2 (Gillis i wsp., 1978) utrzymywano w powyżej wymienionej pożywce uzupełnionej 36 jednostkami hIL-2/ml (Chiron Benelux BV, Amsterdam, Holandia) i które pozbawiono hIL-2 przez 3-4 dni przed rozpoczęciem doświadczenia. Komórki CTLL-2 przemywano trzy razy przed użyciem.
Oczyszczanie komórek iednoiadrzastych z krwi obwodowej (PBMC)
Świeżą ludzką krew pobrano od zdrowego ochotnika po świadomej zgodzie, aby zapobiec skrzepowi dodano heparynę. Oczyszczanie PBMC przeprowadzono przez wirowanie w gradiencie gęstości stosując Ficoll (Pharmacia, Uppsala, Szwecja).
Związek badany
HIL-15, seria nr: 6870-011, Immunex corp., Seattle, Washington, USA. hIL-2, Chiron Benelux BV, Amsterdam, Holandia.
przeciwciała anty-IL-15 zastosowane do badania CTLL-2 w tym opisie przedstawione na Fig. 8: 146B7, 146H5, 404A8, 404E4.
przeciwciała anty-IL-15 zastosowane do badań PBMC: 146B7 (seria: 070101), 404A8 (seria: 030101) i 404E4 (seria: 080101).
Hamowanie przez przeciwciała anty-IL-15 proliferacji CTLL-2 indukowanej ludzka IL-15 (hIL-15) lub hIL-2
W każdym doświadczeniu, komórki wysiewano w trzech powtórzeniach do 96-studzienkowej 3 szalki, 5x103 komórek na studzienkę w obecności lub braku obu hIL-2 lub hIL-15. W celu określenia działania na proliferację, dodano każde z czterech przeciwciał anty-IL-1. Komórki inkubowano przez
PL 217 752 B1 3 godzin w temp. 37°C i przy 5% CO2. Dodano [ H] Tymidynę (1 μCi/studzienkę, Amersham Life Sciences, Little Chalfont, Buckinhamshire, UK) 4 godziny przed zebraniem komórek (Harvester 96 Mach II M, Tomtec, Orange CT, USA).
Jak przedstawiono na Fig. 8, indukowana IL-15 proliferacja komórek CTLL-2 została obniżona w sposób zależny od dawki przez 146B7 i 146H5 jak to było widoczne poprzez obniżenie wbudowania 3
[3H]-tymidyny. Zarówno 404E4 jak i 404A8 były niezdolne do blokowania indukowanej IL-15 proliferacji komórek CTLL-2.
Hamowanie przez przeciwciała anty-IL-15 indukowanej hIL-15 (hIL-15) lub hIL-2 proliferacji
PBMC
PBMC hodowano w trzech powtórzeniach w 96-studzienkowych szalkach o dnie w kształcie litery U (Nunc, Nalge Nunc International, Dania), 5 x 104 komórki na studzienkę w obecności lub braku hIL-2 lub hIL-15 i przeciwciał anty-IL-15. Koncanawalina A (2,5 ąg/ml, Calbiochem) dodano jako pozytywną kontrolę do proliferacji. Komórki inkubowano przez 72 godziny w temp. 37°C i 5% CO2, dodano 3
[3H] tymidynę (1 ąCi/studzienkę, Amersham Life Sciences, Little Chalfont, Buckinhamshire, UK) godzin przed zebraniem komórek (Harvester 96, Tomtec, Orange CT, USA).
3
146B7 był zdolny do hamowania indukowanego IL-15 wbudowania [3H]-tymidyny zależnego od dawki i dlatego, hamował proliferację (IC50 = 3,1 ± 0,91 nM). Zarówno 404E4 jak i 404A8 były niezdolne do blokowania indukowania hIL-15 proliferacji PBMC. 146H5 nie było badane według danych otrzymanych z wcześniej przeprowadzanych doświadczeń. Aby upewnić się o specyficzności 146B7, 404E4 i 404A8 względem IL-15, przeciwciała te również zbadano pod kątem ich działania na proliferację, w której pośredniczy IL-2. Żadne z badanych przeciwciał anty-IL-15 nie wykazywało działania na indukowaną IL-2 proliferację (Fig. 9).
P r z y k ł a d 9 Ludzkie przeciwciała anty-IL-15o 146B7 wiążą się z ludzką IL-15 obecne w ludzkich PBMC
Badane związki
Ludzkie PBMC otrzymano od zdrowych ochotników po świadomej zgodzie.
Przeciwciało 146B7 (seria nr MDX015), Medarex Inc., Milpitas, CA, USA.
Biotynylacia 146B7 i ludzkiej IgG
N-hydroksysukcynimido-biotynę (Sigma) najpierw rozcieńczono w DMSO (końcowe rozcieńczenie: 100 mg/ml), a następnie w 0,1 M NaHCO3 (końcowe rozcieńczenie: 1 mg/ml, Sigma). Na 1 mg przeciwciała (rozcieńczonego w 1 ml), dodano 600 μl roztworu biotyny (w ciemności, 2 godziny, temperatura pokojowa). Roztwór przeciwciało biotyna dializowano w kasecie do dializy slide-a-lyzer™ (10,000 MWCO, Pierce, Perbio Science, Holandia) (przez noc w temp. 4°C) aby usunąć nieznakowaną biotynę. Następnego dnia, stężenie biotynylowanego przeciwciała określono spektrofotometrycznie (Ultrospec 2100pro) przy OD 280 nm.
Stymulacja krwi obwodowej
Do indukowania IL-15, krew otrzymano przez nakłucie żyły od zdrowych ochotników. PBMC hodowano w RPMI 1640 (Biowhittaker Europa) uzupełnionej penicyliną (5 U/ml), streptomycyną (50 μg/ml), L-glutaminą (2 mM) (Biowhittaker, Europa) i 10% płodową surowicą cielęcą (Optimum C241, Multicell, Wisent Inc.) przez maksymalnie 2 dni (37°C) i stymulowano 500 U/ml IFN-γ (Boehringer Ingelheim).
Cytometria przepływowa
Komórki wstępnie inkubowano z 10% ludzką surowicą AB (CLB, Amsterdam, Holandia) w RPMI 1640 (Biowhittaker Europa) uzupełnioną penicyliną (5 U/ml), streptomycyną (50 μg/ml), L-glutaminą (2 mM) (Biowhittaker Europa) i 10% płodową surowicą cielęcą (Optimum C241, Multicell, Wisent Inc.). Po uprzepuszczelnieniu (20 min, 4°C, w zestawie Cytofix/Cytoperm™, Becton Dickinson, San Diego, CA) i przemyciu w buforze Perm/Wash™ (Zestaw Cytofix/Cytoperm™), PBMC poddano barwieniu IL-15 cytometrią przepływową. Ciągłą przepuszczalność uzyskano stosując bufor Perm/Wash™ (Zestaw Cytofix/Cytoperm™) w procedurze barwienia. Po inkubacji komórek z biotynylowaną 146B7 lub z biotynylowaną hlgG1 (20 μg/ml, 30 min, 4°C) i przemyciu w buforze Perm/Wash™, komórki następnie inkubowano ze streptawidyną-fikoerytryną (DAKO) przez 30 minut (4°C). Natężenie fluorescencji przynajmniej 5000 komórek na próbkę określono po analizie cytometrią przepływową (FACS Calibur, Becton Dickinson) i bramowanie na monocytach, stosując oprogramowanie CellQuest Pro. Dane
PL 217 752 B1 przedstawiają współczynnik stymulacji (S.I.), który jest obliczony następująco: S.I. = (średnie pozytywne barwienie fluorescencyjne)/(średnie podstawowe barwienie fluorescencyjne).
Immunocytochemia
Do wykrywania IL-15 obecnego w ludzkich monocytach, preparaty z wirowanych komórek wykonano z całych próbek krwi. Po żwirowaniu 5 x 104 komórek (200 μθ na szkiełka mikroskopowe Superfrost®-Plus (Menzel), szkiełka wysuszono na powietrzu (< 60 min), utrwalono w 2% paraformaldehydzie/PBS (8 min, 4°C), przemywano PBS i wysuszono ponownie na powietrzu. Przed barwieniem, preparaty z wirowanych komórek uprzepuszczalniano w PBS (+ 0,1% saponina; PBSS), które następnie zastosowano w procedurze barwienia. Do blokowania aktywności endogennej peroksydazy, preparaty z wirowanych komórek inkubowano z 0,05% (obj./obj.) nadtlenkiem wodoru (H2O2) rozcieńczono w buforze kwasu cytrynowego/fosforanowego (pH 5,8, 20 min, temperatura pokojowa). Po przemyciu PBSS, endogenna aktywność biotyny była blokowana według instrukcji producenta (zestaw do blokowania biotyny, Wektor Lab., DAKO). Po przemyciu PBSS, miejsca niespecyficznego wiązania były blokowane przez inkubację preparatów z wirowanych komórek z 10% (obj./obj.) ludzką zebraną surowicą AB (CLB, Amsterdam, Holandia) (30 min) w PBSS. Następnie, preparaty z wirowanych komórek inkubowano z biotynylowanym pierwszorzędowym przeciwciałem (60 min, temperatura pokojowa) i po przemyciu PBSS, ze streptawidyną skompleksowaną z biotynylowaną peroksydazą chrzanową (streptABComplex/HRP, DAKO; 1:100 w PBSS, zawierająca 2% ludzkiej surowicy AB; 30 min, temperatura pokojowa). Po przemyciu w PBSS, preparaty z wirowanych komórek inkubowano z 3-amino-9-etylokarbazolem (0,5 mg/ml) i H2O2 (0.01%), w buforze octanie sodu (50 mM, pH 4.9) przez 10 minut (temperatura pokojowa), do detekcji aktywności HRP. Preparaty z wirowanych komórek przemywano bieżącą wodą wodociągową przez 5 minut, barwiono kontrastowo hematoksyliną (DAKO) przez jedną minutę, przemywano bieżącą wodą wodociągową przez kolejne 5 minut i zatapiano w faramount lub glycergel (DAKO).
Cytometrią przepływowa
Wiązanie 146B7 ze stymulowanymi IFN-γ ludzkimi monocytami przedstawiono na Fig. 12. Biotynylowany 146B7 wiąże się z monocytami niestymulowanymi wykazując obecności IL-15 w niestymulowanych komórkach. Stymulacja monocytów IFN-γ prowadzi do zwiększonego wiązania 146B7 z komórkami, przy maksimum osiągniętym w jednodniowej hodowli. Kontrolne przeciwciało, hlgG1 wykazuje małe wiązanie z niestymulowanymi monocytami. Stymulacja IFN-γ zwiększenia wiązania hlgG1 poprzez zwiększoną ekspresję receptorów Fcγ na monocytach.
Immunocytochemia
Fig. 13 przedstawia barwienie ludzkich monocytów 146B7, lub kontrolnym przeciwciałem, hlgG1. Wyraźne czerwone barwienie cytoplazmy obserwowano po inkubacji komórek z 146B7, lecz nie z kontrolnym przeciwciałem. Zgodnie z powyższym, 146B7 wiąże hIL-15 w monocytach i jego wiązanie jest regulowane w górę przez stymulację IFN;.'. Fig. 13 również wykazuje, że barwienie IL-15 jest początkowo wewnątrzkomórkowe.
P r z y k ł a d 10 Ludzkiego przeciwciała anty-IL-15o 146B7 wiążą IL-15 w tankach w wyniku immunohistochemii
Badane związki
Ludzka skóra łuszczycowa - próbki tkanki otrzymano po świadomej zgodzie. Louise Villadsen, Department of Dermatology, Gentofte University Hospital, Copenhagen, Dania.
Przeciwciało 146B7 (seria nr MDX015), Medarex, Milpitas, CA, USA
Biotynylacja 146B7 i ludzkiej IgG
N-hydroksysukcynimido-biotynę (Sigma) najpierw rozcieńczono w DMSO (końcowe rozcieńczenie: 100 mg/ml) a następnie w 0,1 M NaHCO3 (końcowe rozcieńczenie: 1 mg/ml, Sigma). Dodano na 1 mg przeciwciała (rozcieńczenie w 1 ml), 600 μl roztworu biotyny (w ciemności, 2 godziny, temperatura pokojowa). Roztwór przeciwciało-biotyna dializowano w kasecie do dializ slide-a-lyzer™ (10 000 MWCO, Pierce, Perbio Science, Holandia) (ON, 4°C) aby usunąć nieznakowaną biotynę. Następnego dnia, stężenie biotynylowanych przeciwciał określono spektrofotometrycznie (Ultrospec 2100 pro) przy OD 280 nm.
PL 217 752 B1
Immunohistochemia
Tkanki przechowywano w temp. -80°C do momentu badania. Po rozmrożeniu, skrawki tkanek utrwalono w acetonie (10 min, temperatura pokojowa) i wysuszono na powietrzu. Do blokowania endogennej aktywności peroksydazy, skrawki inkubowano z 0,05% (obj./obj.) nadtlenkiem wodoru (H2O2) rozcieńczonym w buforze kwas cytrynowy/fosforanowy (pH 5,8, 20 min, temperatura pokojowa). Po przemyciu PBS-Tween 20 (PBST, 0,05% obj./obj.), endogenną aktywność biotyny blokowano według instrukcji producenta (Biotin Blokowaniu Kit, Wektor Lab., DAKO). Po przemyciu PBST, miejsca niespecyficznego wiązania blokowano przez inkubację skrawków tkanek z 10% (obj./obj.) ludzkiej zebranej surowicy AB (CLB, Amsterdam, Holandia) (30 min) w PBST. Surowicę oddzielono i skrawki następnie inkubowano z biotynylowanym pierwszorzędowym przeciwciałem (146B7 lub hlgG1) rozcieńczonym w PBS zawierającym 2% ludzkiej surowicy AB przez 60 minut (temperatura pokojowa). Skrawki przemywano w PBST. Po przemyciu w PBST, wszystkie skrawki tkanek inkubowano ze streptABComplex/HRP (DAKO; 1:100 rozcieńczenie w PBS zawierającym 2% ludzkiej surowicy AB; 30 min, temperatura pokojowa). Po przemyciu w PBST, skrawki inkubowano z 3-amino-9-etylokarbazolem (0,5 mg/ml) i H2O2 (0,01%), w buforze octanu sodu (50 mM, pH 4,9) przez 10 minut (temperatura pokojowa), w celu detekcji aktywności HRP. Skrawki przemywano bieżącą wodą wodociągową przez 5 minut, barwiono kontrastowo hematoksyliną (DAKO) przez jedną minutę, przemywano bieżącą wodą wodociągową przez kolejne 5 minut i na koniec zatapiano w faramount lub glycergel (DAKO).
Wyniki
Wyraźne cytoplazmatyczne barwienie keratynocytów w skórze łuszczycowej obserwowano po barwieniu skrawków tkanek 146B7, lecz nie kontrolnym przeciwciałem (Fig. 14; 146B7 szczepy pozytywne wobec IL-15 keratynocytów otrzymanych z płytek łuszczycowych).
P r z y k ł a d 11 Ludzkiego przeciwciała anty-IL-15o 146B7 blocks IL-15 in SCID mouseludzkiego tissue chimeras: znaczący hamowania of zapalenie zarówno w tkance z zapaleniem stawu jak i tkance łuszczycowej.
Badane związki
Tkanka maziowa - otrzymana od pacjentów z młodzieńczym reumatoidalnym zapaleniem stawu lub stawów, po świadomej zgodzie; Alexei Grom, division of pediatrie rheumatology, Children's Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio, USA.
Biopsje keratomy - próbki tkanki otrzymano po świadomej zgodzie. Louise Villadsen, Department of Dermatology, Gentofte University Hospital, Copenhagen, Dania.
Przeciwciało 146B7 (seria nr MDX015), Medarex Inc., Milpitas, CA, USA do doświadczeń z łuszczycą.
Przeciwciało 146B7 (seria nr 15-00RDJW07) , Medarex Inc., Milpitas, CA, USA do doświadczeń z reumatoidalnym zapaleniem stawu lub stawów.
Blokowanie IL-15 w mysich - ludzkich chimerach SCID tkanki maziowej
Świeże próbki tkanki maziowej otrzymano od pacjentów z młodzieńczym reumatoidalnym zapaleniem po zabiegu zastąpienia stawu. Próbki pobrano w sterylnych warunkach. Rozdrobnione fragmenty tkanek z całej próbki tkanki maziowej całkowicie zmieszano, aby zapewnić homogeniczność każdego preparatu. Rozdrobnione tkanki (2-4 przeszczepy na zwierzę; 100 mg na jedno miejsce) wszczepiono podskórnie do grzbietu myszy SCID/NOD (Jackson Laboratories). Każde zwierzę otrzymało 146B7 (500 pg, i.p.) lub PBS w dniu wszczepienia przeszczepu i po wszczepieniu w dniach 7, 14 i 21. Zwierzęta uśmiercano w dniu 28 po wszczepieniu. Przeszczepy maziowe wycięto i umieszczono w formalinie w celu barwienia H&E.
Określenie ilościowe barwienia H&E mysich - ludzkich chimer SCID tkanki maziowej (Zmodyfikowane z Lehr i wsp., J. Histochem. Cytochem. 1997. 45. 1559.)
Po otrzymywaniu cyfrowych obrazów (2600x2060, jpg) skrawków otrzymanych z mysich - ludzkich chimer SCID tkanki maziowej stosując obiektyw X10 (mikroskop Zeiss; oprogramowanie Axiovision), dane analizowano komputerowo, stosując Photoshop, wersja 6.0 (Adobe Systems, Increasing view, CA) i obniżono rozdzielczość do 1300x1300 pikseli. W obrębie każdego skrawka sześć X10 pól wybrano tak, aby najlepiej oddać całkowite barwienie tkanki w całym preparacie histologicznym. Po selekcji wszystkich wybarwionych jąder (magiczna różdżka na ciemnych jądrach przy tolerancji 10), wykres optycznej gęstości wybranych powierzchni utworzono i średnią intensywność barwienia zapisano (po selekcji podobnych/komenda histogramu obrazu). Następnie, tło wybrano i barwienie określono ilościowo (magiczna różdżka na tło przy tolerancji 10). Intensywność barwienia obliczono jako
PL 217 752 B1 różnicę pomiędzy barwieniem jądrowym i barwieniem tła. To oznaczono jako cytochemiczny współczynnik z dobranymi jednostkami. Dane przedstawiono jako średnią i s.e.m. Dane analizowano testem t Studenta.
Blokowanie IL-15 w mysich - ludzkich chimerach SCID tkanki maziowej
Biopsje keratomy otrzymano z łuszczycowych płytek od dwóch pacjentów, podzielono i wszczepiono myszom C.B-17 SCID (Jackson Laboratories). Trzy tygodnie po transplantacji myszy otrzymały PBS (placebo), CsA (cyklosporynę A) (Sandoz) w dawce 10 mg/kg co drugi dzień przez 15 dni, lub 146B7 w dawce 20 mg/kg w dniu 1 i 10 mg/kg w dniach 8 i 15. Jeden tydzień po ostatniej iniekcji, myszy uśmiercano i 4 mm biopsje pobierano sztancą z każdego heteroprzeszczepu. Biopsje utrwalono w formalinie w celu zanurzenia w parafinie i barwiono w H&E i pod kątem jądrowego antygenu Ki-67.
Określenie ilościowe immunohistochemicznego barwienia tkanek z mysich - ludzkich chimer SCID tkanki maziowej
Skrawki barwione H&E określono dla grubości ^m) naskórka, stopień parakeratozy (w zakresie od 0-3) i liczba zapalnych jednojądrzastych komórek w górnej części skóry właściwej. Skrawki barwio2 ne pod kątem Ki-67 określono względem liczby krążących keratynocytów/mm2 skrawka. Średnie wartości dla 4 myszy w każdej grupie leczniczej obliczono i dane dla każdego pacjenta podsumowano jako średnią i s.e.m.
Model SCID/RA
Mikroskopowe obserwacje skrawków wykazały, że najciemniej barwione jądra należą do przenikających komórek. Dlatego, liczba jąder (mierzonych względem pola powierzchni) jest rozważana pomiar przenikania. Iniekcja 146B7 obniża liczbę przenikających komórek do będącej w stanie zapalnym tkanki maziowej, w porównaniu do traktowania nośnikiem (Fig. 15a, p<0,05). Fig. 15b przedstawia wpływ 146B7 na infiltrację komórek do heteroprzeszczepionej tkanki maziowej i wykazuje obniżenie liczby komórek o ciemnych jądrach, w porównaniu do traktowania nośnikiem.
Model SCID/łuszczycy
Fig. 16 przedstawia myszy SCID/łuszczycowe leczone 146B7 lub traktowane nośnikiem. W porównaniu do nośnika, PBS, iniekcja 146B7 obniżyła ciężkość łuszczycy określonej przez grubość naskórka, gdy zmierzono od warstwy rogowej do rozpoczynających się sopli naskórka (Fig. 16A)): PBS (177,8 ± 42,2 μm), CsA (91,0 ± 15,2 μm), 146Β7 (62,5 ± 9,1 μm). Zmniejszenie grubości również obserwowano gdy mierzono od warstwy rogowej do najgłębszej części sopli naskórka (Fig. 16B): PBS (433,8 ± 32,1 μm), CsA (303,8 ± 62,9 μm) i 146B7 (208,0 ± 33,8 μm). Również, stopień parakeratozy obniżono przez leczenie 146B7 (Fig. 16C): PBS (1,6 ± 0,4), CsA (1,3 ± 0,3), 146B7 (0,5 ± 0,3). Ponadto, 146B7 obniża liczbę zapalnych jednojądrzastych komórek w górnej części skóry właściwej (Fig. 16D): PBS (33,3 ± 1,9 jednojądrzastych komórek), CsA (19,4 ± 8,5), 146B7 (16,4 ± 0,1). Ekspresja ludzkiego białka Ki-67 jest bezpośrednio związana z proliferacją komórek. W czasie interfazy, antygen może być wyłącznie wykrywany w jądrze, podczas gdy w czasie mitozy większość białka jest przeniesiona na powierzchnię chromosomów. Fakt, że białko Ki-67 jest obecne w czasie wszystkich aktywnych faz cyklu komórkowego (G(1), S, G(2) i mitozy), lecz nie ma go w czasie spoczynkowym, faza (G(0)), czyni je doskonałym znacznikiem do określania tak zwanych frakcji wzrostu danej populacji komórek. 146B7 obniża liczbę Ki-67+ krążących keratynocytów (Fig. 16E): PBS (247,9 ± 77,0), CsA (116,0 ± 24,1), 146B7 (73,8 ± 9,9).
Leczenie 146B7 hamowało infiltrację zapalnych komórek do będącej w stanie zapalnym tkanki w ludzkich modelach SCID reumatoidalnego zapalenia stawu lub stawów. Ponadto, u myszy SCID z wszczepionymi ludzkimi łuszczycowymi płytkami, leczenie 146B7 obniżyło ciężkość łuszczycy, w porównaniu do leczenia CsA. Faktycznie, leczenie 146B7 prowadziło do głównego zmniejszenia zapalenia, grubości naskórka, liczby dzielących się keratynocytów i dotkliwości parakeratozy u myszy ludzki/SCID.
P r z y k ł a d 12 Ludzkie przeciwciało anty-IL-15o 146B7 rozpoznaje związaną z receptorem IL-15
Badane związki hlgG1 - ludzkie kontrolne przeciwciało (Sigma).
Przeciwciało 146B7 - Medarex Inc., MDX015.
Komórki Raji z konstytutywną ekspresją IL-15Ra (Martin Glennie, Tenovus Research Laboratory, Southampton General Hospital, Southampton, U.K.).
PL 217 752 B1
Biotynylacja 146B7 i ludzkiej IgG
N-hydroksysukcynimido-biotynę (Sigma) najpierw rozcieńczono w DMSO (końcowe rozcieńczenie: 100 mg/ml) a następnie w 0,1 M NaHCO3 (końcowe rozcieńczenie: 1 mg/ml, Sigma). Dodano na 1 mg przeciwciała (rozcieńczenie w 1 ml), 600 μl roztworu biotyny (w ciemności, 2 godziny, temperatura pokojowa). Roztwór przeciwciało-biotyna dializowano w kasecie do dializ slide-a-lyzer™ (10,000 MWCO, Pierce, Perbio Science, Holandia) (przez noc w temp. 4°C) aby usunąć nieznakowaną biotynę. Następnego dnia, stężenie biotynylowanych przeciwciał określono spektrofotometrycznie (Ultrospec 2100 pro) przy OD 280 nm.
Wiązanie 146B7 z kompleksem IL-15 - IL-15Ra badano testem ELISA
Po powlekaniu (przez noc w temperaturze pokojowej) szalki mikrotitracyjnej o płaskim dnie (Greiner) IL-15Ra (układy R&D, Minneapolis, MN, USA), szalki inkubowano z PBS i surowicę z kurczaka (2%, temperatura pokojowa, 60 min). Po przemyciu w PBS (+ 0.05% Tween 20: PBST), szalki następnie inkubowano z kilkoma rozcieńczeniami nieznakowanej IL-15 (50 pl, temperatura pokojowa, Immunex, Seattle, USA). Po 10 minutach, biotynylowane przeciwciała dodano do studzienek (50 pl) w różnych stężeniach (90 minut w temperaturze pokojowej). Po przemyciu w PBST, szalki inkubowano (60 minut w temperaturze pokojowej) ze streptawidyną-poli-peroksydazą chrzanową (CLB, Amsterdam, Holandia) rozcieńczoną 1:10,000 w PBST-C (PBST i 2% surowicę z kurczaka). Na koniec, szalki przemywano, a następnie inkubowano z ABTS (Kwas azynobis-3-etylobenzotiazolino-sulfonowy, Roche Diagnostics, Mannheim, Niemcy) w buforze ABTS według protokołu producenta. Reakcję barwną zatrzymano 2% kwasem szczawiowym (50 pl). Wiązanie określono przy 405 nm czytnikiem EL808 ELISA (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA).
Wiązanie 146B7 z kompleksem IL-15 - IL-15R w komórkach Raji
Komórki Raji wstępnie inkubowano (20 minut w temp. 4°C) z 10% ludzkiej zebranej surowicy
AB (CLB, Amsterdam, Holandia) w buforze FACS (PBS, 0,05% BSA, 0,02% NaNO3). Komórki Raji 5 (1-2*105 komórek/ml) wprowadzono do studzienek i dodano 50 pl nieznakowanej IL-15 w kilku stężeniach (rozcieńczenie w buforze FACS z 10% ludzką surowicą AB). Po inkubacji komórek przez 30 minut (4°C) i przemyciu dwukrotnym w buforze FACS, dodano do studzienek 50 pl biotynylowanych przeciwciał (146B7 lub hlgG1) (30 minut w temp. 4°C). Po przemyciu dwukrotnie w buforze FACS, 50 pl strepatawidyny-fikoerytryny dodano do każdej studzienki (30 minut w temp. 4°C). Po przemyciu dwukrotnie w buforze FACS, komórki roztworzono w 200 pl buforu FACS i natężenie fluorescencji przynajmniej 5000 komórek na próbkę określono po analizie cytometrią przepływową (FACS Calibur, Becton Dickinson) stosując oprogramowanie CellQuest. Dane przedstawiają współczynnik stymulacji (S.I.), który obliczono następująco:
S.I. = (średnia fluorescencyjnego barwienia pozytywnego)/(średnia fluorescencyjnego barwienia tła)
ELISA
Wiązanie 146B7 z kompleksem IL-15/IL-15R testem ELISA przedstawiono na Fig. 19. Wiązanie 146B7 zwiększa się ze zwiększeniem stężenia wiązania IL-15 z jej receptorem. Nie obserwowano wpływu wiązania kontrolnego przeciwciała z IL-15 lub z IL-15R.
Wiązanie z komórkami Raji wyrażającymi IL-15R
Wiązanie 146B7 z kompleksem IL-15/IL-15R na komórkach Raji przedstawiono na Fig. 20. 146B7 wiąże się z kompleksem IL-15/IL-15R w sposób zależny od dawki. Nie obserwowano wiązania hlgG1 z kompleksem IL-15/IL-15R na komórkach Raji (Fig. 20).
146B7 jest zdolne do wiązania IL-15 po związaniu tej cytokiny z jej receptorem.
146B7 wiąże się z epitopem na IL-15, który nie bierze udziału w wiązaniu z receptorem.
Literatura
Bathon J. M., Martin R. W., Fleischmann R. M., Tesser J. R., Schiff M. H., Keystone E. C., Genovese M. C., Wasko M. C., Moreland L. W., Weaver A. L., Markenson J. and Finek B. K. (2000) A comparison of etanercept and methotrexate in patients with early rheumatoid arthritis. N Engl J Med 343,1586-93.
Fehniger T. A. and Caligiuri M. A. (2001) Interleukin 15: biology and relevance to human disease. Blood 97: 14-28.
PL 217 752 B1
Fishwild D. M., O'Donnell S. L., Bengoechea T., Hudson D. V., Harding F., Bernhard S. L.,
Jones D., Kay R. M., Higgins K. M., Schramm S. R. and Lonberg N. (1996) High-avidity human IgGk monoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice. Nature biotechn. 14:845-51.
Gillis S.,Ferm M. M., Ou W. and Smith K. A. (1978) T cell growth factor: parameters of production and a quantitative microassay for activity. J Immunol 120,2027-32.
Kennedy Μ. K., etal. (2000) Reversible defects in natural killer and memory CD8 T cell lineages in IL-15 deficient mice. J. Exp. Med. 191: 771-80.
Kirman I., Vainer B. and Nielsen O. H. (1998) Interleukin-15 and its role in chronic inflammatory diseases. Inflamm Res 47,285-9.
Klippel J. H. (2000) Biologic therapy for rheumatoid arthritis. N Engl J Med 343,1640-1.
Kohler G. and Milstein C. (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495-7.
Liu C. C., Perussia B. and Young J. D. (2000) The emerging role of IL-15 inNK-cell development. Immunol Today 21,113-6.
Lovell D. J., Giannini E. H.,ReiffA., Cawkwell G. D., Silverman E. D., Nocton J. J., Stein L. D., Gedalia A., Ilowite N. T., Wallace C. A., Whitmore J. and Finck B. K. (2000) Etanercept in children with polyarticular juvenile rheumatoid arthritis. Pediatric Rheumatology Collaborative Study Group. N Engl J Med 342,763-9.
Maini R. N. and Taylor P. C. (2000) Anti-cytokine therapy for rheumatoid arthritis. Annu Rev Med 51,207-29.
McInnesI. B., al-Mughales J., Field M., Leung B. P., Huang F. P., Dixon R., Sturrock R. D., Wilkinson P.C. and Liew F. Y. (1996) The role of interleukin-15 in T-cell migration and activation in rheumatoid arthritis. Nat Med 2,175-82.
McInnes I. B., Leung B. P., Sturrock R. D., Field M. and Liew F. Y. (1997) Interleukin-15 mediates T cell-dependent regulation of tumor necrosis factor alpha production in rheumatoid arthritis. Nat Med 3,189-95.
McInnes I. B. and Liew F. Y. (1998) Interleukin 15: a proinflammatory role in rheumatoid arthritis synovitis. Immunol Today 19,75-9.
Oppenheimer-Marks,et al. (1997) J. Clin. Investig.101 : 1261-72.
Pettit D. K., Bonnert T. P.,Eisenman J., Srinivasan S., Paxton R., Beers C., Lynch D., Miller B., Yost J., Grabstein Κ. H. and Gombotz W. R. (1997) Structure function studies of interleukin 15 using site-specific mutagenesis, polyethylene glycol conjugation, and homology modeling. J Biol Chem 272, 2312-8.
Ruchatz,et al. (1998) J. Immunol. 160: 5654-60.
Waldmann T., Tagaya Y. and Bamford R. (1998) Interleukin-2, interleukin-15, and their receptors. Int Rev Immunol 16,205-26.
Waldmann T. A., Dubois S. and Tagaya Y. (2001) Contrasting Roles of IL-2 and IL-15 in the Life and Death of Lymphocytes. Implications for Immunotherapy. Immunity 14,105- 110.
Waldmann T. A. and Tagaya Y. (1999) The multifaceted regulation of interleukin-15 expression and the role of this cytokine in NK cell differentiation and host response to intracellular pathogens. Annu Rev Immunol 17,19-49.
PL 217 752 B1
LISTA SEKWENCJI <110> GenMab, Inc. et al.
<120> Ludzkie przeciwciała specyficzne wobec interleukiny 15 (IL-15) <130> GMI-O24PC <150> US 60/314,731 <151> 2001-08-23 <160> 4 <17O> wersja FastSEQ dla wersji Windows 4.0 <210> i <211> 390 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221 > CDS <222> (1)...(390) <400> 1
gag gtg cag ctg gtg cag Gin tct gga gca gag gtg aaa aag ccc ggg gag 43
Glu 1 Val Gin Leu Val 5 Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Glu
tct ctg aag atc tcc tgt aag gtt tct gga rac ttc ttt acc acc tac 96
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Phe Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
tgg atc gg<= tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tat atg 144
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met
35 40 45
ggg atc atc tat cct ggt gac tct gat acc aga tac agc ccg tcc ttc 192
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc agc acc gcc tac 240
Gin Gly Gin Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Jlla Tyr
65 70 75 80
ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288
Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga ggg ggt aac tgg aac tgc ttt gac tac tgg ggc cag gga acc 336
Ala Arg Gly Gly Asn Trp Asn Cys Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
ctg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc 384
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125 ctg gca 390
Leu Ala
130
PL 217 752 B1 <210> 2 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Phe Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gin Gly Gin Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asn Trp Asn Cys Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 ιισ
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala
130 <210> 3 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)...(357) <400> 3
gaa Glu 1 att gtg ttg acg cag tct cca ggc Pro Gly acc ctg tct ttg tct cca ggg 48
Ile Val Leu Thr 5 Gin Ser Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
10 15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc a_gc agc 96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
tac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc 144
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Giy Gin Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
atc tat ggt gca tcc cgc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt 192
Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr Giy Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag 240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
70 75 80 cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt cag cgg tat ggt agc tca cac 288
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Arg Tyr Gly Ser Ser His
PL 217 752 B1
90 95
act ttt ggc cag ggg Gly acc aag ctg gag ate agc ega act gtg get gca Ala 336
Thr Phe Gly Gin 100 Thr Lys Leu Glu 105 Ile Ser Arg Thr Val 110 Ala
cca tct gtc ttc ate ttc ccg 357
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
115
<210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4
Glu Ile 1 Val Leu Thr Gin 5 Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu 10 Ser Pro Gly 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Arg Tyr Gly Ser Ser His
85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Ser Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
115
Zastrzeżenia patentowe

Claims (28)

1. Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne, lub jego fragment wiążący antygen, które wiąże IL-15, obejmujące (a) region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3, odpowiednio, jak przedstawiono jako reszty aminokwasowe 31-35, 50-66 oraz 100-107 SEK NR ID: 2; oraz (b) region zmienny łańcucha lekkiego zawierający sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3 odpowiednio, jak przedstawiono jako reszty aminokwasowe 24-35, 51-57 oraz 90-97 SEK NR ID: 4.
2. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że obejmuje regiony zmienne ludzkiego łańcucha ciężkiego i ludzkiego łańcucha lekkiego zawierające sekwencje aminokwasowe przedstawione odpowiednio jako SEK NR ID: 2 i SEK NR ID: 4.
3. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że hamuje wywołane przez IL-15 skutki prozapalne.
4. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że hamuje wywołane przez IL-15 wytwarzanie TNFα lub proliferację limfocytów T.
5. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że wiąże się z ludzką IL-15 ze stałą równowagi dysocjacji (KD) poniżej 10-7 M, jak określono techniką
PL 217 752 B1 rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR) z zastosowaniem rekombinowanej ludzkiej IL-15 jako analitu i przeciwciała jako ligandu.
6. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że wiąże się z epitopem zlokalizowanym na łańcuchu β lub łańcuchu γ domeny oddziałującej ludzkiej IL-15.
7. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że wiąże się z ludzką IL-15 związaną z receptorem.
8. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że jest wybrane z grupy przeciwciał składającej się z IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD i IgE.
9. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 8, znamienne tym, że jest przeciwciałem IgG1.
10. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 9, znamienne tym, że zawiera region zmienny z łańcucha ciężkiego IgG1 i region zmienny z łańcucha lekkiego kappa.
11. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że jest fragmentem Fab przeciwciała lub przeciwciałem jednołańcuchowym.
12. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że jest wytwarzane przez hybrydoma, która obejmuje limfocyt B otrzymany z transgenicznego, niebędącego człowiekiem zwierzęcia o genomie zawierającym transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego i transgen ludzkiego łańcucha lekkiego, połączony z unieśmiertelnioną komórką.
13. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że jest wytwarzane przez transfektomę zawierającą kwasy nukleinowe kodujące ludzki łańcuch ciężki i ludzki łańcuch lekki.
14. Hybrydoma zawierająca limfocyt B otrzymany z transgenicznego, niebędącego człowiekiem zwierzęcia o genomie zawierającym transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego i transgen łańcucha lekkiego, połączony z unieśmiertelnioną komórką, przy czym hybrydoma wytwarza przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen określone w dowolnym z zastrz. 1 albo 2.
15. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen określone w jednym z zastrz. 1 albo 2 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
16. Kompozycja według zastrz. 15, znamienna tym, że zawiera ponadto środek terapeutyczny.
17. Kompozycja według zastrz. 16, znamienna tym, że środek jest środkiem immunosupresyjnym.
18. Kompozycja według zastrz. 17, znamienna tym, że środkiem immunosupresyjnym jest cyklosporyna.
19. Kompozycja według zastrz. 16, znamienna tym, że środek jest środkiem przeciwzapalnym wybranym spośród steroidowego środka przeciwzapalnego i niesteroidowego środka przeciwzapalnego.
20. Kompozycja według zastrz. 16, znamienna tym, że środek jest lekiem przeciwgośćcowym modyfikującym chorobę (DMARD) wybranym spośród metotreksatu, etanerceptu i infliksymabu.
21. Kompozycja według zastrz. 16, znamienna tym, że środek jest środkiem chemoterapeutycznym wybranym z grupy składającej się z doksorubicyny, cisplatyny, bleomycyny, karmustyny, cyklofosfamidu i chlorambucylu.
22. Kompozycja według zastrz. 16, znamienna tym, że środek jest środkiem do leczenia łuszczycy.
23. Kompozycja według zastrz. 16, znamienna tym, że środek jest przeciwciałem.
24. Kompozycja według zastrz. 16, znamienna tym, że środek jest przeciwciałem lub czynnikiem hamującym czynnik martwicy nowotworu-a (TNFa).
25. Kompozycja według zastrz. 24, znamienna tym, że przeciwciało jest wybrane z grupy składającej się z przeciwciała swoistego wobec CD4 i przeciwciała swoistego wobec IL-2.
26. Lek zawierający izolowane ludzkie przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen określone w zastrz. 1 lub 2 do leczenia zaburzenia zachodzącego za pośrednictwem ludzkiej IL-15.
27. Lek według zastrz. 26, znamienny tym, że zaburzenie jest wybrane z grupy składającej się z zapalnej choroby jelit, łuszczycy, odrzucenia przeszczepu, nowotworu i choroby zakaźnej.
28. Czynnik diagnostyczny zawierający izolowane ludzkie przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen określone w zastrz. 1 albo 2 do diagnozowania choroby zachodzącej za pośrednictwem ludzkiej IL-15.
PL371946A 2001-08-23 2002-08-23 Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wobec IL-15 lub jego fragment wiążący antygen i związane z nimi hybrydoma, kompozycja farmaceutyczna oraz zastosowania medyczne PL217752B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31473101P 2001-08-23 2001-08-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL371946A1 PL371946A1 (pl) 2005-07-11
PL217752B1 true PL217752B1 (pl) 2014-08-29

Family

ID=23221192

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL371946A PL217752B1 (pl) 2001-08-23 2002-08-23 Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wobec IL-15 lub jego fragment wiążący antygen i związane z nimi hybrydoma, kompozycja farmaceutyczna oraz zastosowania medyczne

Country Status (24)

Country Link
US (1) US7153507B2 (pl)
EP (1) EP1425389B1 (pl)
JP (2) JP4359503B2 (pl)
KR (1) KR100911951B1 (pl)
CN (1) CN100557018C (pl)
AT (1) ATE531390T1 (pl)
AU (1) AU2002332628B2 (pl)
BR (1) BR0212136A (pl)
CA (1) CA2456648C (pl)
CY (1) CY1112447T1 (pl)
DK (1) DK1425389T3 (pl)
EA (1) EA014802B1 (pl)
ES (1) ES2375271T3 (pl)
HU (1) HU229776B1 (pl)
IL (2) IL160358A0 (pl)
MX (1) MXPA04001486A (pl)
NO (1) NO333152B1 (pl)
NZ (1) NZ531211A (pl)
PL (1) PL217752B1 (pl)
PT (1) PT1425389E (pl)
RS (1) RS51829B (pl)
SI (1) SI1425389T1 (pl)
WO (1) WO2003017935A2 (pl)
ZA (1) ZA200401144B (pl)

Families Citing this family (287)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2385745C (en) 2001-06-08 2015-02-17 Abbott Laboratories (Bermuda) Ltd. Methods of administering anti-tnf.alpha. antibodies
US7247304B2 (en) 2001-08-23 2007-07-24 Genmab A/S Methods of treating using anti-IL-15 antibodies
WO2003017935A2 (en) 2001-08-23 2003-03-06 Genmab A/S Human antibodies specific for interleukin 15 (il-15)
US7329405B2 (en) 2001-08-23 2008-02-12 Genmab A/S Human antibodies specific for interleukin 15 (IL-15)
GB0208817D0 (en) * 2002-04-17 2002-05-29 European Molecular Biology Lab Embl Method for producing monoclonal antibodies
JP4892335B2 (ja) * 2003-02-26 2012-03-07 ゲンマブ エー／エス インターロイキン１５（ｉｌ−１５）に特異的なヒト抗体
NZ570709A (en) 2003-06-13 2010-04-30 Univ Pennsylvania Nucleic acid sequences encoding and compositions comprising IgE signal peptide and/or IL-15 and methods for using the same
US20050123542A1 (en) * 2003-11-06 2005-06-09 Genmab A/S Methods for treating disorders involving monocytes
CA2584211C (en) * 2004-10-22 2014-07-08 Amgen Inc. Methods for refolding of recombinant antibodies
MX2007006832A (es) * 2004-12-13 2007-08-07 Cytos Biotechnology Ag Arreglos de antigeno interleucina 15 y usos de los mismos.
JP5757495B2 (ja) 2005-05-16 2015-07-29 アッヴィ バイオテクノロジー リミテッド びらん性多発性関節炎の治療のためのｔｎｆ阻害剤の使用
WO2006138181A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 Amgen Inc. Self-buffering protein formulations
US20070190057A1 (en) 2006-01-23 2007-08-16 Jian Wu Methods for modulating mannose content of recombinant proteins
US9399061B2 (en) * 2006-04-10 2016-07-26 Abbvie Biotechnology Ltd Methods for determining efficacy of TNF-α inhibitors for treatment of rheumatoid arthritis
US9605064B2 (en) 2006-04-10 2017-03-28 Abbvie Biotechnology Ltd Methods and compositions for treatment of skin disorders
US20080131374A1 (en) * 2006-04-19 2008-06-05 Medich John R Uses and compositions for treatment of rheumatoid arthritis
PE20081760A1 (es) 2007-02-09 2009-01-01 Genentech Inc Anticuerpos anti-robo4 y sus usos
EP2171451A4 (en) 2007-06-11 2011-12-07 Abbott Biotech Ltd METHOD FOR TREATING JUVENILIAN IDIOPATHIC ARTHRITIS
US20110097318A1 (en) * 2007-08-31 2011-04-28 Amgen Inc. Solid-State Protein Formulation
JP5963341B2 (ja) * 2007-09-14 2016-08-10 アムジエン・インコーポレーテツド 均質な抗体集団
EP2205280B1 (en) 2007-09-27 2019-09-04 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
EP2219602A1 (en) 2007-11-15 2010-08-25 Amgen, Inc Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stablised by antioxidants for parenteral administration
TWI468417B (zh) 2007-11-30 2015-01-11 Genentech Inc 抗－ｖｅｇｆ抗體
EP2098536A1 (en) 2008-03-05 2009-09-09 4-Antibody AG Isolation and identification of antigen- or ligand-specific binding proteins
JP2011517672A (ja) * 2008-03-24 2011-06-16 アボツト・バイオテクノロジー・リミテツド 骨損失を治療するための方法及び組成物
CU23716A1 (es) 2008-09-30 2011-10-05 Ct Ingenieria Genetica Biotech Péptido antagonista de la actividad de la interleucina-15
UA109633C2 (uk) 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
AR077595A1 (es) 2009-07-27 2011-09-07 Genentech Inc Tratamientos de combinacion
US9321823B2 (en) 2009-09-02 2016-04-26 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
CA2778105C (en) 2009-10-23 2019-04-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
US8486397B2 (en) 2009-12-11 2013-07-16 Genentech, Inc. Anti-VEGF-C antibodies and methods using same
PL2515941T3 (pl) 2009-12-21 2020-04-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Preparat farmaceutyczny zawierający bewacyzumab
CA2800919C (en) 2010-06-07 2019-01-15 Amgen Inc. Drug delivery device
EP2580243B1 (en) 2010-06-09 2019-10-16 Genmab A/S Antibodies against human cd38
RS56599B1 (sr) 2010-06-15 2018-02-28 Genmab As Konjugati humanog antitela sa lekom protiv tkivnog faktora
DK2625197T3 (en) 2010-10-05 2016-10-03 Genentech Inc Smoothened MUTANT AND METHODS OF USING THE SAME
WO2012135315A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Amgen Inc. Vial adapter and system
AU2012245231B2 (en) 2011-04-20 2016-10-13 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
CN102250243B (zh) * 2011-07-01 2013-08-28 华绍炳 抗白细胞介素-15抗体
ES2682750T5 (en) * 2011-07-18 2025-02-04 Iba Lifesciences Gmbh Method of reversibly staining a target cell
EA030868B1 (ru) 2011-10-14 2018-10-31 Эмджен Инк. Инжектор и способ его сборки
EP3072548B1 (en) 2012-11-21 2019-03-06 Amgen, Inc Drug delivery device
EP2958941B1 (en) 2013-02-20 2019-04-10 Innate Pharma A compound that specifically binds to kir3dl2 for use in the treatment of peripheral t cell lymphoma
PT2968467T (pt) 2013-03-13 2020-07-28 Hoffmann La Roche Formulações de oxidação reduzida
RU2707092C2 (ru) 2013-03-13 2019-11-22 Дженентек, Инк. Составы со сниженным окислением
US20140314778A1 (en) 2013-03-13 2014-10-23 Genentech, Inc. Formulations with reduced oxidation
AR095399A1 (es) 2013-03-13 2015-10-14 Genentech Inc Formulaciones con oxidación reducida, método
WO2014160490A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Genetech, Inc. Antibody formulations
BR112015021993A8 (pt) 2013-03-15 2019-12-03 Genentech Inc polipeptídeo, métodos para sua produção, métodos para cultivo de uma célula, composição farmacêutica, kit, e meio de cultura celular
ES2973257T3 (es) 2013-03-15 2024-06-19 Amgen Inc Casete de fármaco, autoinyector y sistema de autoinyector
CN105142695B (zh) 2013-03-15 2020-06-02 安进公司 身体轮廓可调适的自动注射器装置
EP3593839A1 (en) 2013-03-15 2020-01-15 Amgen Inc. Drug cassette
CA2897825C (en) 2013-03-22 2022-05-24 Scott R. Gibson Injector and method of assembly
LT3049441T (lt) 2013-09-27 2020-02-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-pdl1 antikūnų kompozicija
US11097055B2 (en) 2013-10-24 2021-08-24 Amgen Inc. Injector and method of assembly
AU2014340174B2 (en) 2013-10-24 2019-09-12 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
MY189089A (en) 2013-12-17 2022-01-25 Genentech Inc Methods of treating cancers using pd-1 axis binding antagonists and taxanes
WO2015095410A1 (en) 2013-12-17 2015-06-25 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using pd-1 axis binding antagonists and an anti-cd20 antibody
AU2014364606A1 (en) 2013-12-17 2016-07-07 Genentech, Inc. Combination therapy comprising OX40 binding agonists and PD-1 axis binding antagonists
WO2015120075A2 (en) 2014-02-04 2015-08-13 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
MX2016012779A (es) 2014-03-31 2017-04-27 Genentech Inc Terapia de combinacion con agentes antiangiogénesis y agonistas de unión a ox40.
CA3193070A1 (en) 2014-05-07 2015-11-12 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
JP6817074B2 (ja) 2014-06-03 2021-01-20 アムジエン・インコーポレーテツド 制御可能な薬物送達システム及び使用方法
EP2963057A1 (en) 2014-07-02 2016-01-06 Calypso Biotech SA Antibodies to IL-15
US20160137727A1 (en) 2014-09-15 2016-05-19 Genentech, Inc. Antibody formulations
JP6766040B2 (ja) 2014-10-14 2020-10-07 アムジエン・インコーポレーテツド 視覚および可聴インジケータを備える薬剤注射装置
EP3209332B1 (en) 2014-10-23 2021-05-26 Amgen Inc. Reducing viscosity of pharmaceutical formulations
SG10201807625PA (en) 2014-11-17 2018-10-30 Genentech Inc Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
EP3848072A1 (en) 2014-12-19 2021-07-14 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
JP2017538512A (ja) 2014-12-19 2017-12-28 アムジエン・インコーポレーテツド ライブボタンまたはユーザインタフェースフィールドを含む薬物送達装置
EP3253784B1 (en) 2015-02-04 2020-05-06 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
WO2016133947A1 (en) 2015-02-17 2016-08-25 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
ES2905870T3 (es) 2015-02-27 2022-04-12 Amgen Inc Dispositivo de suministro de fármacos que tiene un mecanismo de protección de aguja con un umbral de resistencia ajustable al movimiento de la protección de aguja
CN116327953A (zh) 2015-06-17 2023-06-27 豪夫迈·罗氏有限公司 使用pd-1轴结合拮抗剂和紫杉烷治疗局部晚期或转移性乳腺癌的方法
JOP20200312A1 (ar) 2015-06-26 2017-06-16 Novartis Ag الأجسام المضادة للعامل xi وطرق الاستخدام
TW202440903A (zh) 2015-08-04 2024-10-16 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法（一）
WO2017027861A1 (en) 2015-08-13 2017-02-16 Amgen Inc. Charged depth filtration of antigen-binding proteins
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
EP3386573B1 (en) 2015-12-09 2019-10-02 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
BR112018010945A2 (pt) 2015-12-30 2018-12-04 Genentech Inc formulações com degradação de polissorbato reduzida
AU2016381694A1 (en) 2015-12-30 2018-07-05 Genentech, Inc. Use of tryptophan derivatives for protein formulations
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
KR20180097615A (ko) 2016-01-08 2018-08-31 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd-1 축 결합 길항물질 및 항-cea/항-cd3 이중특이성 항체를 사용하는 cea-양성 암의 치료 방법
EP3411396A1 (en) 2016-02-04 2018-12-12 Curis, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
US11200298B2 (en) 2016-03-15 2021-12-14 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
WO2017159699A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of treating cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-gpc3 antibodies
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
EP3455142B1 (en) 2016-05-13 2023-08-09 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
US11238150B2 (en) 2016-05-16 2022-02-01 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
TW201802121A (zh) 2016-05-25 2018-01-16 諾華公司 抗因子XI/XIa抗體之逆轉結合劑及其用途
WO2017209899A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
US20180002417A1 (en) * 2016-06-15 2018-01-04 Celimmune Llc Methods and Compositions for the Treatment of Celiac Disease, Non-Celiac Gluten Sensitivity, and Refractory Celiac Disease
WO2018004842A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
JP7250674B2 (ja) 2016-08-08 2023-04-03 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト がんの治療及び診断方法
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
US11459401B2 (en) 2016-10-06 2022-10-04 Amgen Inc. Reduced viscosity protein pharmaceutical formulations
US20180110856A1 (en) * 2016-10-21 2018-04-26 Amgen Inc. Pharmaceutical Formulations and Methods of Making the Same
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
AU2017382850B2 (en) * 2016-12-21 2024-11-21 Cephalon Llc Antibodies that specifically bind to human IL-15 and uses thereof
JP7139332B2 (ja) 2016-12-23 2022-09-20 ノバルティス アーゲー 第ｘｉ因子抗体および使用方法
MX2019008432A (es) 2017-01-17 2019-11-18 Amgen Inc Dispositivos de inyeccion y metodos relacionados de uso y ensamblaje.
EP3582825A1 (en) 2017-02-17 2019-12-25 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
CA3052204A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
JP7377596B2 (ja) 2017-02-22 2023-11-10 アムジエン・インコーポレーテツド 低粘度、高濃度エボロクマブ製剤及びそれらの製造方法
JP2020508803A (ja) 2017-03-06 2020-03-26 アムジエン・インコーポレーテツド 作動防止特徴部を備える薬物送達デバイス
AU2018230546B2 (en) 2017-03-07 2024-03-21 Amgen Inc. Needle insertion by overpressure
CA3052310A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
KR20240042212A (ko) 2017-03-28 2024-04-01 암겐 인코포레이티드 플런저 로드 및 주사기 조립 시스템 및 방법
AU2018257917B2 (en) 2017-04-24 2023-05-04 University Of Massachusetts Diagnosis and treatment of vitiligo
US12103979B2 (en) 2017-04-28 2024-10-01 Amgen Inc. N-acetylated and non-acetylated dipeptides containing arginine to reduce the viscosity of viscous compositions of therapeutic polypeptides
AU2018282077B2 (en) 2017-06-08 2023-11-23 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
WO2018226515A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
JP7195276B2 (ja) 2017-06-22 2022-12-23 アムジエン・インコーポレーテツド デバイス起動による衝突／衝撃の低減
EP3641861A1 (en) 2017-06-23 2020-04-29 Amgen Inc. Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly
WO2019014014A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 Amgen Inc. NEEDLE INSERTION-RETRACTING SYSTEM HAVING DOUBLE TORSION SPRING SYSTEM
IL271173B2 (en) 2017-07-21 2024-04-01 Amgen Inc Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly
EP4085942A1 (en) 2017-07-25 2022-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
MA49676A (fr) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament doté d'un système d'accès à un récipient et procédé d'assemblage associé
EP3662287B1 (en) 2017-08-01 2024-02-28 Amgen Inc. Systems and methods for real time preparation of a polypeptide sample for anaylsis with mass spectrometry
SG11202000785VA (en) 2017-08-01 2020-02-27 Amgen Inc Systems and methods for performing a real-time glycan assay of a sample
WO2019032482A2 (en) 2017-08-09 2019-02-14 Amgen Inc. HYDRAULIC-PNEUMATIC PRESSURE CHAMBER DELIVERY SYSTEM
WO2019036181A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Amgen Inc. BODY INJECTOR WITH STERILE ADHESIVE PATCH
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
EP3691717B1 (en) 2017-10-04 2023-02-08 Amgen Inc. Flow adapter for drug delivery device
EP3691716B1 (en) 2017-10-06 2023-11-29 Amgen Inc. Drug delivery device with interlock assembly and related method of assembly
EP3694578B1 (en) 2017-10-09 2025-09-24 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
EP3703779A1 (en) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc. Systems and approaches for sterilizing a drug delivery device
MA50569A (fr) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc Ensembles de remplissage-finition et procédés associés
US20200261648A1 (en) 2017-11-06 2020-08-20 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
EP3706826A1 (en) 2017-11-10 2020-09-16 Amgen Inc. Plungers for drug delivery devices
SG11202003004RA (en) 2017-11-16 2020-04-29 Amgen Inc Door latch mechanism for drug delivery device
MA50903A (fr) 2017-11-16 2021-05-12 Amgen Inc Auto-injecteur avec détection de décrochage et de point d'extrémité
WO2019143753A1 (en) 2018-01-17 2019-07-25 Amgen Inc. Drug delivery mechanism
MA52268A (fr) 2018-03-07 2021-01-13 Amgen Inc Seringue à distribution contrôlée
JP7747440B2 (ja) 2018-03-09 2025-10-01 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスの逆流防止機構
IL277106B2 (en) 2018-03-13 2024-03-01 Amgen Inc Sequential digestion of polypeptides for mass spectrometric analysis
EP4321870B1 (en) 2018-03-13 2025-07-30 Amgen Inc. Methods for the preparation of trypsin-resistant polypeptides for mass spectrometric analysis
SG11202007756XA (en) 2018-03-30 2020-09-29 Amgen Inc Camera-based drug container inspection
US11583633B2 (en) 2018-04-03 2023-02-21 Amgen Inc. Systems and methods for delayed drug delivery
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
SG11202012446UA (en) 2018-06-23 2021-01-28 Genentech Inc Methods of treating lung cancer with a pd-1 axis binding antagonist, a platinum agent, and a topoisomerase ii inhibitor
EP3823611A1 (en) 2018-07-18 2021-05-26 Genentech, Inc. Methods of treating lung cancer with a pd-1 axis binding antagonist, an antimetabolite, and a platinum agent
WO2020023451A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
US12303677B2 (en) 2018-07-24 2025-05-20 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with optional grip portion and related method of preparation
CA3103681A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
JP2021530243A (ja) 2018-07-25 2021-11-11 アスクジーン・ファーマ・インコーポレイテッドAskGene Pharma, Inc. 新規ｉｌ−２１プロドラッグおよびそれを使用する方法
CA3103105A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
EP3833389A1 (en) 2018-08-08 2021-06-16 Genentech, Inc. Use of tryptophan derivatives and l-methionine for protein formulation
SG11202013189WA (en) 2018-08-17 2021-01-28 Amgen Inc Activation mechanism for drug delivery device
AU2019342133B8 (en) 2018-09-21 2025-08-07 Genentech, Inc. Diagnostic methods for triple-negative breast cancer
WO2020068623A1 (en) 2018-09-24 2020-04-02 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
IL281469B2 (en) 2018-09-28 2024-08-01 Amgen Inc Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
JP2022503983A (ja) 2018-10-02 2022-01-12 アムジエン・インコーポレーテツド 内力伝達を伴う薬物送達用の注入システム
EP3860686A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
KR102848295B1 (ko) 2018-10-15 2025-08-20 암젠 인크 댐핑 메커니즘을 갖는 약물 전달 장치
EA202191038A1 (ru) 2018-10-15 2021-07-06 Эмджен Инк. Способ платформенной сборки для устройства доставки лекарственного средства
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
MA54057A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament à rétraction partielle d'élément d'administration de médicament
EP3873566B1 (en) 2018-11-01 2024-11-27 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
JP7769544B2 (ja) 2018-12-14 2025-11-13 アムジエン・インコーポレーテツド 勾配によるタンパク質濃度定量を伴う使用のためのシステム適合性方法
US11534547B2 (en) 2019-01-24 2022-12-27 Amgen Inc. Drug delivery systems and methods with pressure sensitive control
EP3914320A1 (en) 2019-01-24 2021-12-01 Amgen Inc. Drug delivery systems and methods with back pressure sensing
US20220087901A1 (en) 2019-02-12 2022-03-24 Amgen Inc. Systems and approaches for drug delivery device reconstitution
ES2997201T3 (en) 2019-02-12 2025-02-14 Amgen Inc Take-home drug delivery system
EP3924019A1 (en) 2019-02-12 2021-12-22 Amgen Inc. Continuous dosing systems and approaches
WO2020167704A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 Amgen Inc. Continuous dosing systems and approaches
US20220072224A1 (en) 2019-02-12 2022-03-10 Amgen Inc. Continuous dosing systems and approaches
US12329720B2 (en) 2019-02-12 2025-06-17 Amgen Inc. Dosing systems and approaches
JP7483731B2 (ja) 2019-02-14 2024-05-15 アムジエン・インコーポレーテツド 試料の調製及びその試料のリアルタイムアッセイの実施のためのシステム及び方法
JP7530376B2 (ja) 2019-02-20 2024-08-07 アムジエン・インコーポレーテツド タンパク質の安定性を決定する方法
MX2021010414A (es) 2019-03-04 2021-09-14 Amgen Inc Reversibilidad in vivo de especies de alto peso molecular.
AU2020245573B2 (en) 2019-03-27 2025-11-20 Amgen Inc. Methods of fingerprinting therapeutic proteins via a two-dimensional (2D) nuclear magnetic resonance technique at natural abundance for formulated biopharmaceutical products
US11464706B2 (en) 2019-04-08 2022-10-11 Amgen Inc. Automated drug delivery device and container
MX2021012233A (es) 2019-04-09 2021-11-03 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos con mango inteligente.
MX2021012476A (es) 2019-04-17 2021-11-12 Amgen Inc Cartucho para un autoinyector y metodos relacionados.
MX2021012557A (es) 2019-04-24 2021-11-12 Amgen Inc Conjuntos y metodos de verificacion de esterilizacion de jeringuillas.
EP3958925A1 (en) 2019-04-24 2022-03-02 Amgen Inc. Injector accessories
WO2020247790A1 (en) 2019-06-05 2020-12-10 Amgen Inc. Methods of identifying attributes of therapeutic proteins
WO2020252264A1 (en) 2019-06-12 2020-12-17 AskGene Pharma, Inc. Novel il-15 prodrugs and methods of use thereof
CA3137544A1 (en) 2019-06-20 2020-12-24 Amgen Inc. Wireless communication enabled drug delivery device and method
WO2021011716A1 (en) 2019-07-18 2021-01-21 Amgen Inc. Drug delivery device having pressurized vessel
WO2021011717A1 (en) 2019-07-18 2021-01-21 Amgen Inc. Sealing arrangement for drug delivery device
MX2022001112A (es) 2019-08-01 2022-02-16 Amgen Inc Dispositivo de suministro de farmacos con medicion de la temperatura y metodo relacionado.
EP4017560A2 (en) 2019-08-23 2022-06-29 Amgen, Inc Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
JP2022546082A (ja) 2019-09-03 2022-11-02 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達のための注入デバイス及び注入デバイスのためのパッケージ
CA3150480A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Amgen Inc. Activatable injection device for drug delivery
US20220362462A1 (en) 2019-09-12 2022-11-17 Amgen Inc. Backflow Prevention Mechanism for Drug Delivery Device
MX2022002980A (es) 2019-09-16 2022-04-06 Amgen Inc Metodo para la esterilizacion externa de un dispositivo de suministro de farmacos.
MX2022003802A (es) 2019-09-30 2022-04-29 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos.
FI4037735T3 (fi) 2019-09-30 2025-11-25 Amgen Inc Lääkeaineen annostelulaite
JP2022549349A (ja) 2019-09-30 2022-11-24 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイス
US20210093797A1 (en) 2019-09-30 2021-04-01 Amgen Inc. Drug delivery device
EP4037731A1 (en) 2019-09-30 2022-08-10 Amgen Inc. Drug delivery device and methods of delivering a drug
CN114450048B (zh) 2019-09-30 2025-02-18 美国安进公司 药物递送装置
EP4041649A1 (en) * 2019-10-07 2022-08-17 Amgen Inc. Packages for pharmaceutical products and methods of assembly
WO2021071763A1 (en) 2019-10-07 2021-04-15 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
WO2021071780A1 (en) 2019-10-07 2021-04-15 Amgen Inc. Drug delivery devices having light-activated ultrasonic fluid delivery
ES3049662T3 (en) 2019-10-07 2025-12-17 Amgen Inc Drug delivery device with fingerprint sensor
AU2020362062B2 (en) 2019-10-08 2025-07-10 Amgen Inc. Temperature indicator for drug delivery device
US20240100247A1 (en) 2019-10-08 2024-03-28 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
US20240082502A1 (en) 2019-10-08 2024-03-14 Amgen Inc. Drug delivery device
EP4041352A1 (en) 2019-10-08 2022-08-17 Amgen Inc. Cassette for an autoinjector and related methods
EP4044989A1 (en) 2019-10-18 2022-08-24 Amgen Inc. Systems and approaches for drug delivery device reconstitution
MX2022004483A (es) 2019-10-18 2022-05-06 Amgen Inc Sistemas y enfoques para reconstitucion en dispositivo de administracion de farmacos.
EP4045108A1 (en) 2019-10-18 2022-08-24 Amgen Inc. Drug delivery device and system
WO2021076826A2 (en) 2019-10-18 2021-04-22 Amgen Inc. Drug delivery device and system
US20220401643A1 (en) 2019-10-21 2022-12-22 Amgen Inc. Drug product container and drug delivery system
EP4048344A1 (en) 2019-10-24 2022-08-31 Amgen Inc. Drug delivery device
WO2021080822A1 (en) 2019-10-24 2021-04-29 Amgen Inc. Systems and methods for drug delivery
WO2021081321A1 (en) 2019-10-24 2021-04-29 Amgen Inc. Systems and approaches for drug delivery
WO2021081161A1 (en) 2019-10-24 2021-04-29 Amgen Inc. Systems and components for drug delivery and components for preparation of the same
EP4048345A1 (en) 2019-10-24 2022-08-31 Amgen, Inc Drug delivery device and system
US20220395635A1 (en) 2019-11-07 2022-12-15 Amgen Inc. Drug delivery system and method of use
WO2021113101A1 (en) 2019-12-02 2021-06-10 Amgen Inc. Lockout mechanism for drug delivery device
WO2021113070A1 (en) 2019-12-05 2021-06-10 Amgen Inc, Flow restrictor for drug delivery device
AU2021205981A1 (en) 2020-01-11 2022-07-14 AskGene Pharma, Inc. Novel masked cytokines and methods of use thereof
CN114901330A (zh) 2020-01-13 2022-08-12 美国安进公司 针头护罩移除器、药物递送装置、以及相关方法
AU2021226754A1 (en) 2020-02-24 2022-07-07 Amgen Inc. Containers and systems for use during external sterilization of drug delivery devices
CA3170639A1 (en) 2020-03-16 2021-09-23 Amgen Inc. Drug delivery member insertion sensing assemblies, drug delivery devices, and related methods
CN115209931B (zh) 2020-03-17 2025-05-13 美国安进公司 受控式分配注射器
EP4143811A1 (en) 2020-04-28 2023-03-08 Amgen Inc. Packaging label
MX2022014688A (es) 2020-05-22 2022-12-16 Amgen Inc Sistema de almacenamiento y metodo para almacenar y transportar medicamentos.
WO2021257503A1 (en) 2020-06-16 2021-12-23 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating triple-negative breast cancer
JP2023540484A (ja) 2020-09-02 2023-09-25 アムジエン・インコーポレーテツド 薬剤保管カートン用の簡易開封装置
EP4210805A1 (en) 2020-09-09 2023-07-19 Amgen Inc. Swallowable drug delivery devices
WO2022055761A1 (en) 2020-09-11 2022-03-17 Amgen Inc. Inline uv flow device for sterilizing flow cytometry sheath fluid
AU2021343495A1 (en) 2020-09-18 2023-04-27 Amgen Inc. Methods of processing a sample for peptide mapping analysis
CA3192737A1 (en) 2020-10-12 2022-04-21 Amgen Inc. Long-term medicament storage apparatus and methods
CA3196039A1 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Amgen Inc. Drug delivery device assembly and accessory for drug delivery device
JP7775312B2 (ja) 2020-11-04 2025-11-25 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスアセンブリ及び薬物送達デバイス用アクセサリ
US20230381423A1 (en) 2020-11-04 2023-11-30 Amgen Inc. Drug delivery device assembly and accessory for drug delivery device
US20230381426A1 (en) 2020-11-04 2023-11-30 Amgen Inc. Drug delivery device assembly and accessory for drug delivery device
US20240010672A1 (en) 2020-11-05 2024-01-11 Amgen Inc. Materials and methods for protein processing
US20240115462A1 (en) 2021-02-03 2024-04-11 Amgen Inc. High-throughput automated reconstitution of lyophilized drug product
CN116782993A (zh) 2021-02-03 2023-09-19 美国安进公司 用于药物加工的系统和方法
US20240082110A1 (en) 2021-02-03 2024-03-14 Amgen Inc. Coaxial needle adapter and guide bracket for robotic liquid handling platform
IL305213A (en) 2021-03-08 2023-10-01 Amgen Inc Manufacturing process for a hollow piston rod
US20220288326A1 (en) 2021-03-10 2022-09-15 Amgen Inc. Drug delivery device, subassembly for drug delivery device, syringe holder, and method of assembly
WO2022192311A1 (en) 2021-03-10 2022-09-15 Amgen Inc. Drug delivery device
WO2022192308A1 (en) 2021-03-10 2022-09-15 Amgen Inc. Drug delivery device having removable cap
MX2023011160A (es) 2021-03-25 2023-09-29 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos.
WO2022212227A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Amgen Inc. Sound-detection based injection time measurement system for drug delivery devices
WO2022225736A1 (en) 2021-04-22 2022-10-27 Amgen Inc. Methods and systems for automated syringe quality evaluation
EP4330974A1 (en) 2021-04-28 2024-03-06 Amgen Inc. Systems for out-patient treatment of a patient, and related methods
WO2022245574A1 (en) 2021-05-17 2022-11-24 Amgen Inc. Feedback system and method for a drug product
BR112023024278A2 (pt) 2021-05-21 2024-01-30 Amgen Inc Método de otimizar uma receita de enchimento para um recipiente de fármacos
EP4348141A1 (en) 2021-06-01 2024-04-10 Amgen Inc. Lyophilization system
JP2024521571A (ja) 2021-06-08 2024-06-03 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイス、フィンガーグリップ要素及び関連する方法
EP4355395A1 (en) 2021-06-17 2024-04-24 Amgen Inc. Drug delivery device having shock absorber
CA3224996A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Amgen Inc. Syringes, assemblies, and methods of manufacture
WO2023278125A1 (en) 2021-06-28 2023-01-05 Amgen Inc. Safety device for drug delivery system
EP4370087A1 (en) 2021-07-16 2024-05-22 Amgen Inc. Systems and approaches for drug processing single-use hardware
JP2024537009A (ja) 2021-09-29 2024-10-10 アムジエン・インコーポレーテツド 事前充填シリンジにおけるプランジャストッパの深さ測定用の装置、システム及び方法
EP4412682A1 (en) 2021-10-06 2024-08-14 Amgen Inc. Impact activated brake feature for drug delivery device
TW202327673A (zh) 2021-10-06 2023-07-16 美商安進公司 用於藥物遞送裝置的撞擊啟動式固位特徵
US20240408308A1 (en) 2021-10-11 2024-12-12 Amgen Inc. Characterization apparatus for drug delivery devices or subcomponents thereof
AU2022382741A1 (en) 2021-11-05 2024-04-04 Amgen Inc. Drug delivery devices, components for use within drug delivery devices
TW202325853A (zh) 2021-11-09 2023-07-01 美商安進公司 治療性蛋白之生產
TW202335693A (zh) 2021-11-29 2023-09-16 美商安進公司 活塞桿移除力方法及設備
US20250009976A1 (en) 2021-12-03 2025-01-09 Amgen Inc. Stopper placement in a syringe
CN118829460A (zh) 2022-03-11 2024-10-22 美国安进公司 可调节深度的自动注入器
EP4504295A1 (en) 2022-04-06 2025-02-12 Amgen Inc. Packaging for drug delivery device
WO2024028448A1 (en) 2022-08-04 2024-02-08 Calypso Biotech Sa Il-15 inhibitors useful for the treatment of atopic dermatitis
WO2024040020A1 (en) 2022-08-15 2024-02-22 Absci Corporation Quantitative affinity activity specific cell enrichment
CN119730894A (zh) 2022-08-18 2025-03-28 美国安进公司 用于注射器的针头护罩组件
IL318145A (en) 2022-08-18 2025-03-01 Amgen Inc Needle shield for syringe
AU2023333370A1 (en) 2022-08-30 2025-01-16 Amgen Inc. System and method of limiting subvisible particles in a syringe
WO2024228970A1 (en) 2023-05-01 2024-11-07 Amgen Inc. Configurable handheld biological analyzers for identification of biological products based on raman spectroscopy using artificial intelligence
CN118894934A (zh) 2023-05-05 2024-11-05 北京智仁美博生物科技有限公司 抗人il-15的抗体及其用途
WO2024259275A1 (en) 2023-06-14 2024-12-19 Bristol-Myers Squibb Company Near real time sialic acid quantitation of glycoproteins
WO2025019224A1 (en) 2023-07-14 2025-01-23 Amgen Inc. Monitoring systems and methods for injection devices
WO2025072072A1 (en) 2023-09-26 2025-04-03 Amgen Inc. Packaging systems for medical devices
WO2025101602A1 (en) 2023-11-07 2025-05-15 Amgen Inc. Methods of analyzing amino acid content of a therapeutic protein
CN117209605B (zh) * 2023-11-09 2024-01-30 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 特异性结合il-15的抗体及其应用
US20250171175A1 (en) 2023-11-28 2025-05-29 Amgen Inc. Automated systems and methods for foil packaging components
WO2025136894A1 (en) 2023-12-18 2025-06-26 Amgen Inc. Ampoule adapter and method of use
WO2025136766A1 (en) 2023-12-20 2025-06-26 Amgen Inc. Packaging for drug administration
WO2025144700A1 (en) 2023-12-27 2025-07-03 Absci Corporation Nanobody library screening using bacterial surface display
US20250269119A1 (en) 2024-02-28 2025-08-28 Amgen Inc. Drug delivery device
TW202535330A (zh) 2024-02-29 2025-09-16 美商安進公司 用於製藥用途的容器的可持續和模組化包裝系統
WO2025213011A1 (en) 2024-04-05 2025-10-09 Amgen Inc. Method of assessing stopper movement in a drug delivery device
WO2025222117A1 (en) 2024-04-19 2025-10-23 Amgen Inc. Drug delivery device
WO2025255028A1 (en) 2024-06-03 2025-12-11 Amgen Inc. High-throughput liquid chromatography-mass spectrometry-based peptide mapping

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE139258T1 (de) * 1990-01-12 1996-06-15 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6255458B1 (en) * 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5574138A (en) 1993-03-08 1996-11-12 Immunex Corporation Epithelium-derived T-cell factor
US5591630A (en) * 1994-05-06 1997-01-07 Immunex Corporation Monoclonal antibodies that bind interleukin-15 receptors
US5795966A (en) * 1995-02-22 1998-08-18 Immunex Corp Antagonists of interleukin-15
DE69622854T2 (de) 1995-04-02 2003-04-10 Chugai Seiyaku K.K., Tokio/Tokyo Arzneimittel zur Heilung von Thrombozytopenie
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US5660824A (en) 1995-05-24 1997-08-26 Grabstein; Kenneth H. Muscle trophic factor
CN1241944C (zh) * 1995-09-11 2006-02-15 协和发酵工业株式会社 抗人白介素－5受体α链的抗体
US6001973A (en) 1996-04-26 1999-12-14 Beth Israel Deaconess Medical Center Antagonists of interleukin-15
WO1998016254A1 (en) 1996-10-17 1998-04-23 Immunomedics, Inc. Non-antigenic toxin-conjugate and fusion protein of internalizing receptor system
DE69810091T2 (de) 1997-02-21 2003-10-09 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw., Zwijnaarde Verwendung von interleukin-15
JP4082740B2 (ja) * 1997-02-28 2008-04-30 キリンファーマ株式会社 内因性遺伝子が破壊されている分化多能性保持細胞
GB9814892D0 (en) 1998-07-10 1998-09-09 Kennedy Rheumatology Inst Treatment of celiac disease
WO2001002003A1 (en) 1999-07-06 2001-01-11 Bulfone Paus Silvia Method of treating psoriasis with il-15 antagonist
WO2003017935A2 (en) 2001-08-23 2003-03-06 Genmab A/S Human antibodies specific for interleukin 15 (il-15)

Also Published As

Publication number Publication date
EA200400345A1 (ru) 2004-12-30
PL371946A1 (pl) 2005-07-11
WO2003017935A2 (en) 2003-03-06
KR20040047796A (ko) 2004-06-05
JP4359503B2 (ja) 2009-11-04
EP1425389A4 (en) 2007-08-01
US7153507B2 (en) 2006-12-26
AU2002332628B2 (en) 2007-07-26
NO20040752L (no) 2004-04-24
KR100911951B1 (ko) 2009-08-13
MXPA04001486A (es) 2004-10-27
CA2456648C (en) 2011-08-16
WO2003017935A3 (en) 2003-08-14
CN100557018C (zh) 2009-11-04
HUP0402653A2 (hu) 2005-03-29
HU229776B1 (hu) 2014-07-28
CA2456648A1 (en) 2003-03-06
RS51829B (sr) 2012-02-29
CY1112447T1 (el) 2015-12-09
HUP0402653A3 (en) 2010-01-28
CN1571836A (zh) 2005-01-26
BR0212136A (pt) 2004-12-07
IL160358A0 (en) 2004-07-25
YU15104A (sh) 2006-08-17
EA014802B1 (ru) 2011-02-28
US20030138421A1 (en) 2003-07-24
HK1066828A1 (en) 2005-04-01
DK1425389T3 (da) 2012-01-30
JP2009256354A (ja) 2009-11-05
ATE531390T1 (de) 2011-11-15
EP1425389A2 (en) 2004-06-09
PT1425389E (pt) 2012-02-07
ZA200401144B (en) 2005-05-12
IL160358A (en) 2010-12-30
SI1425389T1 (sl) 2012-02-29
EP1425389B1 (en) 2011-11-02
ES2375271T3 (es) 2012-02-28
WO2003017935A9 (en) 2003-04-10
NZ531211A (en) 2007-04-27
JP2005503151A (ja) 2005-02-03
NO333152B1 (no) 2013-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100911951B1 (ko) 인터루킨 15 (ｉｌ-15)에 대하여 특이적인 인간 항체
AU2004215120B2 (en) Human antibodies specific for interleukin 15 (IL-15)
JP4606172B2 (ja) 上皮成長因子受容体（ｅｇｆｒ）に対するヒトモノクローナル抗体
AU2002332628A1 (en) Human antibodies specific for interleukin 15 (IL-15)
PL217296B1 (pl) Wyizolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne, wytwarzająca je hybrydoma, kodujący to przeciwciało wektor ekspresyjny i zawierająca je kompozycja farmaceutyczna, immunokoniugat, bispecyficzna lub multispecyficzna cząsteczka obejmująca kwasy nukleinowe kodujące ciężki i lekki łańcuch transfektoma, ich zastosowania, zwłaszcza w medycynie, obejmująca te kwasy ex vivo eukariotyczna lub prokariotyczna komórka gospodarza oraz nie będące człowiekiem zwierzę transgeniczne lub roślina, sposób in vitro hamowania wzrostu i/lub proliferacji komórek wyrażających CD25 lub eliminowania komórek wyrażających CD25, sposób wykrywania w próbce obecności antygenu CD25 lub komórki wyrażającej CD25, zestaw diagnostyczny do wykrywania w próbce obecności antygenu CD25 lub komórki wyrażającej CD25
JP4892335B2 (ja) インターロイキン１５（ｉｌ−１５）に特異的なヒト抗体
US7329405B2 (en) Human antibodies specific for interleukin 15 (IL-15)
HK1066828B (en) Human antibodies specific for interleukin 15 (il-15)