EA014802B1 - АНТИТЕЛА К ИНТЕРЛЕЙКИНУ 15 (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, ИММУНОКОНЪЮГАТ НА ИХ ОСНОВЕ, ГИБРИДОМА, ТРАНСФЕКТОМА, ТРАНСГЕННОЕ ЖИВОТНОЕ, ЭКСПРЕССИОННЫЙ ВЕКТОР (ВАРИАНТЫ) И НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА ДЛЯ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ОПОСРЕДОВАННЫХ ИЛ-15, СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ ИНДУЦИРОВАННОЙ ИЛ-15 ПРОДУКЦИИ TNF-α И СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ ИНДУЦИРОВАННОЙ ИЛ-15 ПРОЛИФЕРАЦИИ КЛЕТОК - Google Patents

Abstract

Описаны выделенные человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с ИЛ-15 (например, человеческим ИЛ-15), а также соответствующие композиции на основе этих антител и молекулы. Человеческие антитела могут быть получены в трансфектоме или отличном от человека трансгенном животном, например в трансгенной мыши, способной к образованию множества изотипов человеческих моноклональных антител путем рекомбинации V-D-J и переключения изотипов. Представлены также фармацевтические композиции, содержащие человеческие антитела, трансгенные животные, отличные от человека, и гибридомы, которые продуцируют человеческие антитела, а также способы терапии и диагностики с использованием человеческих антител.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к иммунологии и представляет собой новые лекарственные препараты на основе антител для лечения и диагностики ряда нарушений, опосредованных ИЛ-15 (т.е. нарушений, вызываемых провоспалительными эффектами ИЛ-15).

Предшествующий уровень техники

Интерлейкин-15 (ИЛ-15) представляет собой провоспалительный цитокин, гликопротеин молекулярной массы 14-15 кД. Отмечена конститутивная экспрессия в различных клетках и тканях, включая моноциты и макрофаги, фибробласты, кератиноциты и дендритные клетки (см. статьи \Уа1бтапп и Тадауа, 1999; Рейшдег и Сайдши, 2001). Положительная регуляция экспрессии происходит в условиях воспаления, как описано для моноцитов, стимулированных ΙΡΝ-γ (интерфероном-γ) и ЬР8 (липополисахаридами), или при инфекции вирусами, бактериями или простейшими (см. статьи К1гтап и соавт., 1998; \Уа1бтапп и соавт., 1998; \Уа1бтапп и Тадауа, 1999; Рейшдег и СаНдшп, 2001). Кроме того, при хронических воспалительных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит, местное образование ИЛ-15, вероятно, усиливает воспаление путем рекрутирования и активации синовиальных Т-клеток. Данный эффект, индуцируемый ИЛ-15, как предполагалось, играет центральную роль в патогенезе заболевания (см. статьи К1гтап и соавт., 1998; Мс1ппе§ и соавт., 1996; Мс1ппе§ и соавт., 1997; Мс1ппе§ и Ыете, 1998; Рейшдег и СаИдшп, 2001).

Исследования ш νίίτο показали, что ИЛ-15 имеет ряд общих биологических эффектов с ИЛ-2 в связи с наличием общих рецепторных компонентов. Рецептор ИЛ-15, присутствующий на Т-клетках, состоит из уникальной α-цепи, ИЛ-15Ра, но имеет такие же β-цепь и γ-цепь, как ИЛ-2Р. Вследствие этого, оба рецептора используют одинаковые элементы передачи сигнала 1ак/8ТАТ. Однако основываясь на системной регуляции и дифференцированной экспрессии ИЛ-2 и ИЛ-15 и их рецепторов были описаны важные различия данных функций ш νίνο (см. статьи Кйтап и соавт., 1998; \Уа1бтапп и Тадауа, 1999; \Уа1бтапп и соавт., 2001). Важно также отметить основную роль ИЛ-15 в развитии, жизнеспособности, экспансии и функции натуральной киллерной (ΝΚ) клетки, ΝΚ-Т-клетки и интраэпителиального лимфоцита (см. статьи Кеппебу и соавт., 2000; Ьщ и соавт., 2000).

Ме1ппе§ с коллегами (см. статью Мс1ппе§ и соавт., 1997; Ме1ппе§ и Ые\\\ 1998) описали индукцию продукции ΪΝΕ-α в Т-клетках, выделенных у больных ревматоидным артритом, после стимуляции с помощью ИЛ-15. Кроме того, было показано, что Т-клетки периферической крови, активированные ИЛ-15, индуцируют продукцию Т№-а макрофагами на значительном уровне посредством механизма, зависимого от контакта клеток. Вследствие деструктивной роли ΪΝΕ-α в развитии ревматоидного артрита ингибирование данного цитокина снижает активность заболевания (см. статьи Вабюп и соавт., 2000; Κΐίρре1, 2000; Йоге11 и соавт., 2000; Маш1 и Тау1ог, 2000).

Сущность изобретения

Данное изобретение основано на создании и выделении впервые полностью человеческих моноклональных антител, которые специфически связываются с человеческим ИЛ-15 и ингибируют провоспалительные эффекты, индуцируемые ИЛ-15, а также на характеризации данных новых антител и демонстрации их терапевтической ценности при лечении ряда ИЛ-15-опосредованных заболеваний. Например, как описано в данном контексте, было показано, что человеческие антитела ингибируют оба процесса, как продукцию ΊΝΡ-α, так и пролиферацию Т-клеток, которые полностью вовлечены в воспалительные нарушения. Согласно этому человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, представляют собой усовершенствованное средство для лечения и профилактики данных нарушений (и любого другого ИЛ-15-опосредованного нарушения). Это отчасти обусловлено их уникальной специфичностью (например, специфичностью в отношении эпитопа или вида), аффинностью, структурой, функциональной активностью и тем фактом, что они являются полностью человеческими, что делает их значительно менее иммуногенными и более терапевтически эффективными при введении пациенту-человеку, чем другие антитела против ИЛ-15, полученные ранее (например, мышиные и гуманизированные антитела). В основе данного изобретения лежит также разработка новых способов терапевтического применения антител, ингибирующих ИЛ-15, таких как человеческие антитела, описанные в данном контексте, в том числе для лечения воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, псориаз, отторжение трансплантатов и рак.

Выделенные человеческие антитела, соответствующие изобретению, включают множество изотипов антител, таких как 1дО1, 1дС2, 1дО3, 1дО4, 1дМ, ЮА1, 1дА2, 1дА§ес, 1дЭ и 1дЕ. Как правило, они включают изотипы 1дС1 (например, 1дО1к), 1дС3 и 1дМ. Антитела могут иметь полную длину (например, антитело 1дС1 или 1дС3) или включать только антигенсвязывающую часть (например, РаЬ, Р(аЬ')2, Ρν, фрагмент одноцепочечного Ρν, выделенный гипервариабельный участок (участок, определяющий комплементарность) (СИЯ) или комбинацию из двух или более выделенных СИР..

В одном из вариантов осуществления человеческие антитела представляют собой рекомбинантные антитела. В конкретном варианте осуществления человеческое антитело кодируется нуклеиновыми кислотами человеческой тяжелой цепи 1дО и человеческой каппа-легкой цепи, которые содержат в вариабельных областях нуклеотидные последовательности, приведенные в 8ЕО ΙΌ N0:1 и 3 соответственно, и

- 1 014802 консервативные модификации данных последовательностей. В другом варианте осуществления человеческое антитело включает вариабельные области тяжелой цепи 1дС и каппа-легкой цепи, которые содержат последовательности аминокислот, представленные в 8ЕО ΙΌ N0:2 и 4 соответственно, и консервативные модификации данных последовательностей.

Человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть получены рекомбинантным путем в клетке-хозяине, такой как трансфектома (например, трансфектома, состоящая из иммортализованных клеток СНО (яичников китайского хомячка) или лимфоцитарных клеток), содержащей нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелую и легкую цепи антитела, или могут быть получены непосредственно из гибридомы, которая экспрессирует антитело (например, гибридомы, которая включает В-клетку, выделенную из организма трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, геном которой содержит трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, кодирующие антитело, слитую с иммортализованной клеткой). В конкретном варианте осуществления продукция антител осуществляется гибридомой, обозначаемой в данном контексте 146В7, или трансфектомой на основе клетки-хозяина (например, клетки СНО), содержащей нуклеиновые кислоты человеческой тяжелой цепи и человеческой легкой цепи, которые содержат в вариабельных областях нуклеотидные последовательности, представленные в 8Е0 ΙΌ N0:1 и 3 соответственно, и их консервативные модификации. В конкретных вариантах осуществления продукция антител осуществляется гибридомами, обозначаемыми в данном контексте 146В7, 146Н5, 404Е4 и 404А8. В предпочтительном варианте осуществления антитело специфически связывает эпитоп, находящийся на домене ИЛ-15, который взаимодействует с β- и/или γ-цепью.

В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, специфически связываются с человеческим ИЛ-15 и подавляют способность ИЛ-15 индуцировать провоспалительные эффекты, например ингибируют продукцию ΤΝΕ-α и/или подавляют пролиферацию Т-клеток, таких как Т-клетки, представленные РВМС (мононуклеарными клетками периферической крови) или СТЬЬ-2, путем связывания ИЛ-15 с рецептором ИЛ-15. Как правило, человеческие антитела связываются с ИЛ-15 с константой равновесия диссоциации (КИ) меньше чем приблизительно 10^-7 М, например меньше чем приблизительно 10^-8 М, 10^-9 М или 10^-10 М или даже меньше по определению, с применением технологии поверхностного плазменного резонанса (8РК.) с помощью прибора В1АС0РЕ 3000, используя рекомбинантный человеческий ИЛ-15 в качестве аналита и антитело в качестве лиганда. В конкретном варианте осуществления антитело связывается с человеческим ИЛ-15 с константой равновесия диссоциации (КИ) приблизительно 6,5х 10^-8 М.

В другом аспекте в изобретении представлены молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела или антигенсвязывающие части, соответствующие изобретению. Согласно этому изобретение охватывает также рекомбинантные экспрессионные векторы, которые включают кодирующие антитело нуклеиновые кислоты, соответствующие изобретению, клетки-хозяева, трансфицированные данными векторами, а также способы получения антител, соответствующих изобретению, путем культивирования данных клеток-хозяев.

Изобретение касается также экспрессионного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой цепей, которые содержат аминокислотные последовательности, представленные в 8Е0 ΙΌ N0:2 и 4 соответственно, и их консервативные модификации. Данные экспрессионные векторы хорошо известны в области техники. Примеры векторов включают векторы для транскрипции/трансляции ίη νίίτο с использованием, например, лизатов ретикулоцитов.

В еще одном аспекте изобретение представляет выделенные В-клетки трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, которые способны экспрессировать различные изотипы (например, ΙβΟ. 1дА и/или 1дМ) человеческих моноклональных антител, которые специфически связываются с ИЛ-15. Предпочтительно, когда выделенные В-клетки получают у трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, которая была иммунизирована очищенным или обогащенным препаратом антигена ИЛ-15 и/или клеток, экспрессирующих ИЛ-15. Предпочтительно, когда геном трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, содержит трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи. Затем выделенные В-клетки иммортализуют с целью получения источника (например, гибридомы) человеческих антител против ИЛ-15.

Соответственно, данное изобретение представляет также гибридому, способную продуцировать человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с ИЛ-15. В одном из вариантов осуществления гибридома включает В-клетку, полученную от трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, с геномом, содержащим трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, кодирующие целое антитело, соответствующее изобретению, или его фрагмент, слитую с иммортализованной клеткой. Трансгенное животное, отличное от человека, может быть иммунизировано очищенным или обогащенным препаратом антигена ИЛ-15 и/или клеток, экспрессирующих ИЛ-15, с целью создания гибридом, продуцирующих антитело. Конкретные гибридомы,

- 2 014802 представленные в изобретении, включают 146В7, 146Н5, 404Е4 и 404А8.

В еще одном аспекте изобретение представляет трансгенное животное, отличное от человека, например трансгенную мышь, которая экспрессирует человеческие моноклональные антитела, специфически связывающиеся с ИЛ-15. В конкретном варианте осуществления трансгенное животное, отличное от человека, представлено трансгенной мышью, геном которой содержит трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи. Трансгенное животное, отличное от человека, может быть иммунизировано очищенным или обогащенным препаратом антигена ИЛ-15 и/или клеток, экспрессирующих ИЛ-15. Предпочтительно, когда трансгенное животное, отличное от человека, например трансгенная мышь, способно к образованию множества изотипов человеческих моноклональных антител к ИЛ-15 (например, 1дС. 1дА и/или 1дМ) путем рекомбинации У-И-1 и переключения изотипов. Переключение изотипов может осуществляться, например, путем классического и неклассического переключения изотипов.

В другом аспекте данное изобретение представляет способы получения человеческих моноклональных антител, которые специфически реагируют с ИЛ-15. В одном из вариантов осуществления способ включает иммунизацию трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, геном которой содержит трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, кодирующие целое антитело, очищенным или обогащенным препаратом антигена ИЛ-15 и/или клеток, экспрессирующих ИЛ-15. Затем получают В-клетки (например, В-клетки селезенки) животного и сливают их с клетками миеломы с образованием иммортализованных гибридомных клеток, которые секретируют человеческие моноклональные антитела против ИЛ-15.

В еще одном аспекте данного изобретения охарактеризованы человеческие антитела против ИЛ-15, конъюгированные с терапевтической молекулой, например цитотоксическим лекарственным веществом, токсином с ферментативной активностью или его фрагментом, радиоизотопом или маленькой молекулой противоопухолевого лекарственного вещества.

В другом аспекте данное изобретение представляет композиции, например фармацевтические и диагностические композиции, содержащие фармацевтически приемлемый носитель и по меньшей мере одно человеческое моноклональное антитело, соответствующее изобретению, которое специфически связывается с ИЛ-15. Кроме того, композиция может содержать другие терапевтические агенты, такие как другие иммунодепрессанты или химиотерапевтические агенты.

В еще одном аспекте в изобретении представлены способы ингибирования провоспалительных эффектов ИЛ-15, такие как ингибирование образования ΤΝΡ-α и/или пролиферации Т-клеток, индуцируемых ИЛ-15, предпочтительно без ингибирования активности (например, образования ΤΝΡ-α и/или пролиферации Т-клеток) структурно близких белков/цитокинов (например, ИЛ-2) с использованием одного или более человеческих антител, соответствующих изобретению.

Человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, можно использовать для лечения и/или профилактики ряда ИЛ-15-опосредованных заболеваний посредством введения антител пациентам, страдающим данными заболеваниями.

Примеры заболеваний, которые можно лечить (например, облегчить) или предупредить, используя способы и композиции, соответствующие изобретению, включают без ограничения перечисленным воспалительные заболевания, такие как артрит (например, псориатический артрит и ревматоидный артрит, в том числе активный ревматоидный артрит и ювенильный ревматоидный артрит (болезнь Стилла)) и воспалительное заболевание кишечника. Например, было показано, что антитела снижают паракератоз, уменьшают толщину эпидермиса и снижают пролиферацию кератиноцитов при псориазе. Показано также, что антитела уменьшают воспаление и/или препятствуют хемотаксису активированных лейкоцитов, участвующих в развитии ревматоидного артрита. Антитела можно также использовать для лечения инфекционных заболеваний, таких как ВИЧ-инфекция. Более того, антитела могут быть использованы для лечения отторжения трансплантата. Кроме того, антитела могут быть использованы для лечения ряда заболеваний, включающих ИЛ-15-опосредованную неоваскуляризацию, таких как рост опухолей и раковых новообразований, например Т-клеточного лейкоза.

Человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, могут быть также скомбинированы с одним или более дополнительными терапевтическими агентами, такими как противовоспалительные агенты, ИМАВИ (модифицирующие заболевание антиревматические лекарственные вещества), иммунодепрессанты, химиотерапевтические препараты и агенты для лечения псориаза.

В одном из вариантов осуществления субъекта могут дополнительно лечить одним или более агентом, которые усиливают подавление провоспалительного эффекта антител, например противовоспалительным агентом, таким как стероидное лекарственное средство или Ν8ΑΙΌ (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство). Предпочтительные агенты включают, например, аспирин и другие салицилаты, ингибиторы Сох-2, такие как рофекоксиб (Уюхх (Виокс)) и целекоксиб (Се1еЬгех (Целебрекс)), Ν8ΑΙΌ, такие как ибупрофен (Μοΐπη (Мотрин), Αάνίΐ (Адвил)), фенопрофен (Ναΐίοη (Налфон)), напроксен (ΝαρίΌδνη (Напросин)), сулиндак (Οίηοτίΐ (Клинорил)), диклофенак (УоИагеп (Вольтарен)), пироксикам (Ее1бепе (Фелден)), кетопрофен (Огибщ (Орудис)), дифлунисал (Ио1оЬ1б (Долобид)), набуме

- 3 014802 тон (Ве1аРеп (Релафен)), этодолак (Ьобше (Лодин)), оксапроцин (Ьаурго (Дайпро)) и индометацин (1пбосш (Индоцин)).

В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть введены в комбинации с одним или более ΌΜΑΒΌ, таких как метотрексат (ВЫеита1тех (Реуматркес)), гидроксихлороквин (ИациепИ (Плаквенил)), сульфасалазин (АкиШбше (Асульфидин)), ингибиторы синтеза пиримидина, например лефлуномид (Агата (Арава)), блокаторы рецептора ИЛ-1, например анакинра (Кшете! (Кинерет)) и блокатор ΤΝΡ-α, например этанерцепт (ЕпЬте1 (Энбрел)), инфликсимаб (Ветюабе (Ремикад)) и адалимумаб.

В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть введены в комбинации с одним или более иммунодепрессантом, таким как циклоспорин (8апб1ттипе (Сандиммун), №ога1 (Неорал)) и азатиоприн (1тига1 (Имурал)).

В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть введены в комбинации с одним или более химиотерапевтическим препаратом, таким как доксорубицин (Абпатусш (Адриамицин)), цисплатин (Р1а1шо1 (Платинол)), блеомицин (В1епохапе (Бленоксан)), кармустин (Сйабе1 (Глиадел)), циклофосфамид (Су1охап (Цитоксан), Ртосу1ох (Процитокс), №о§ат (Неосар)) и хлорамбуцил (Ьеикегап (Лейкеран)). Человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть также введены в сочетании с радиотерапией.

В следующем варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть введены в комбинации с одним или более агентом для лечения псориаза, таких как наружные лекарственные препараты, содержащие каменноугольный деготь, витамин А, кортизон или другие кортикостероиды, пероральные или инъекционные лекарственные препараты, такие как кортикостероиды, метотрексат, ретиноиды, например ацикретин (№одйа8оп (Неогистасон)) или циклоспорин (8апб1ттипе (Сандиммун), №ога1 (Неорал)). Другие способы лечения могут включать воздействие солнечного света или фототерапию.

В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть введены в комбинации с другими антителами, такими как СЭб-специфические антитела и ИЛ-2специфические антитела. Комбинацию данных человеческих антител с СЭб-специфическими антителами или ИЛ-2-специфическими антителами считают особенно эффективной для лечения аутоиммунных заболеваний и отторжения трансплантатов.

В еще одном аспекте данное изобретение представляет способ детекции ш уйто или ш у1уо присутствия антигена ИЛ-15 в образце, например, с целью диагностики ИЛ-15-опосредованных заболеваний. В одном из вариантов осуществления этого достигают посредством контактирования тестируемого образца параллельно с контрольным образцом с человеческим моноклональным антителом, соответствующим изобретению, или его антигенсвязывающей частью в условиях, которые дают возможность формирования комплекса антитела и ИЛ-15. Затем формирование комплекса определяют (например, с помощью ЕЫ8А (твердофазный иммуноферментный анализ)) в обоих образцах, и любая значимая разница в образовании комплексов между образцами указывает на присутствие антигена ИЛ-15 в тест-образце.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения очевидны из следующего детального описания и пунктов формулы изобретения.

Перечень чертежей и иных материалов

Фиг. 1 включает графики, отражающие связывание специфических в отношении человеческого ИЛ-15 антител 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4 с человеческим ИЛ-15 (ЫЬ-15) и мутантными белками ИЛ-15 01088 и Ό88Ο1088. Различные разведения антитела исследуют на связывание с ЫЬ-15 или мутантными белками ИЛ-15 Ό88Ο1088 и 01088 с помощью ЕЫ8А.

На фиг. 2 и 3 представлены аминокислотные (8Е0 ΙΌ N0:2 и 4) и нуклеотидные (8Е0 ΙΌ N0:1 и 3) последовательности У_Н- и Ар-областей, соответственно, из антитела 146В7. Указаны каркасный сегмент (ЕВ) и гипервариабельные участки (СОВ).

Фиг. 4А-Э включают графики, отражающие ингибирование ИЛ-15-опосредованного выхода ΤΝΡ-α антителом 146В7. Человеческие РВМС инкубировали с ЫЬ-15 (в концентрациях 0, 50, 100 нг/мл) в комбинации с антителом 146В7 или изотипическим контрольным антителом (в концентрации 0,1, 1, 10 мкг/мл) в течение 72 ч. Количество образованного ΤΝΡ-α измеряли с помощью ЕЬ18А. Приведены данные по двум здоровым добровольным участникам эксперимента.

На фиг. 5 представлен график, демонстрирующий эффект антитела 146В7 на ИЛ-2- или ИЛ-15опосредованную продукцию ΤΝΡ-α. Человеческие РВМС инкубировали с ЫЬ-15 (в концентрациях 0, 50, 100 нг/мл) или ЫЬ-2 (в концентрации 100 нг/мл) в комбинации с антителом 146В7 (в концентрации 0,1, 1, 10 мкг/мл) в течение 72 ч. Количество образованного ΤΝΡ-α измеряли с помощью ЕЬ18А.

На фиг. 6 - график, демонстрирующий ингибирующую активность антител 146В7, 146Н5, 404Е4 и 404А8 на индуцированную ЫЬ-15 пролиферацию СТЬБ^. Клетки СТЬЬ-2, испытывающие необходимость в ЫЬ-2, инкубировали с ЫЬ-15 (в концентрации 60 пг/мл) в сочетании с серийными разведениями 146В7, 146Н5, 404Е4 и 404А8 в течение 48 ч. С целью отображения пролиферации измеряли включение [³Н]-тимидина (число импульсов/мин). Результаты представлены как средние значения.

- 4 014802

Фиг. 7-9 включают графики, демонстрирующие ингибирующую активность антител 146В7 (см. фиг. 7), 404Е4 (см. фиг. 8) и 404А8 (см. фиг. 9) на индуцированную ЫЬ-15 пролиферацию РВМС. Человеческие РВМС инкубировали с ЫЬ-15 (в концентрации 0,25, 100 нг/мл; см. фиг. 7А, 8А и 9А соответственно) или ЫЬ-2 (в концентрации 0, 10, 100 нг/мл; см. фиг. 7В, 8В и 9В соответственно) в сочетании с 146В7 (см. фиг. 7), 404Е4 (см. фиг. 8) или 404А8 (см. фиг. 9) в концентрации 0,1, 1, 10 пг/мл в течение 72 ч. С целью отображения пролиферации измеряли включение [³Н]-тимидина (число импульсов/мин).

На фиг. 10 представлен график, демонстрирующий связывание антитела 146В7 с моноцитами, стимулированными ΙΕΝ-γ. Человеческие РВМС культивировали в присутствии ΙΕΝ-γ (500 ед./мл) сроком до 2 дней (при 37°С). Интенсивность флуоресценции по меньшей мере 5000 клеток/образец определяли после анализа с помощью проточной цитометрии при установке дискриминационного окна на моноциты. Данные показывают коэффициент стимуляции (8.Ι.) = (средняя флуоресценция положительного окрашивания)/(средняя флуоресценция фонового окрашивания)).

На фиг. 11 представлено связывание человеческих моноцитов с антителом 146В7 (панель В) или с изотипическим контрольным антителом (панель А). Выделяли человеческие РВМС и получали осадки в цитоцентрифуге после культивирования клеток с ΙΕΝ-γ (500 ед./мл). Клетки подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином.

На фиг. 12 представлено связывание человеческой пораженной псориазом кожи с 146В7 (панель В) или с изотипическим контрольным антителом (ЫдС1) (панель А). Человеческие псориатические бляшки получали от пациентов после согласия на основе полученной информации и хранили при -80°С до проведения анализа. Ткани окрашивали биотинилированными антителами и визуализировали после активации пероксидазой хрена.

На фиг. 13А представлен график, демонстрирующий процент ядерных клеток в ткани, пораженной ревматоидным артритом, после лечения мышей 8СШ с помощью 146В7 или носителем. Ткани окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е) и анализировали с использованием программы Р1юЮ 81юр. версия 6.0. Данные представлены как средние значения и 8.е.ш. (стандартная ошибка) для ядер (как процент от общей площади) у мышей после лечения 146В7 (п=4) или введения носителя (п=2). На фиг. 13В представлено репрезентативное окрашивание Н&Е ксенотрансплантированной ткани КА у мышей 8СШ после лечения 146В7 (панель В) или РВ8 (фосфатно-буферным раствором) (панель А).

Фиг. 14 включает графики, демонстрирующие эффекты лечения антителом 146В7 у мышей 8СШ/псориаз. Биоптаты фиксировали в формалине для заключения в парафин и окрашивали Н&Е и на ядерный антиген Κί-67. На фиг. 14А представлена степень тяжести псориаза, определенная по толщине кожи, которую измеряли от рогового слоя до начала сетчатого слоя. На фиг. 14В представлена толщина эпидермиса, которая измерена от рогового слоя до самой глубокой части сетчатого слоя. На фиг. 14С представлена степень паракератоза. На фиг. 14Ό представлено число воспалительных мононуклеарных клеток в верхнем слое дермиса. На фиг. 14Е представлено число циклирующих (митотически активных) кератиноцитов Κ1-67+.

На фиг. 15 представлено окрашивание Н&Е человеческой пораженной псориазом кожи, трансплантированной мышам 8СШ, после лечения антителом 146В7 (панель С), С§А (панель В) или введения носителя (панель А). Через три недели после трансплантации мыши получали РВ8 (плацебо), С§А (циклоспорин А) (8апФох) в дозе 10 мг/кг каждый второй день в течение 15 дней или 146В7 в дозе 20 мг/кг в день 1 и 10 мг/кг в дни 8 и 15. Через одну неделю после последней инъекции мышей умерщвляли и из каждого ксенотрансплантата брали пункционную биопсию размером 4 мм. Биоптаты фиксировали в формалине для заключения в парафин и окрашивали Н&Е.

На фиг. 16 представлено окрашивание Κί-67 человеческой пораженной псориазом кожи, трансплантированной мышам 8СШ, после лечения антителом 146В7 (панель С), С§А (панель В) или носителем (панель А). Через три недели после трансплантации мыши получали РВ8 (плацебо), С§А (циклоспорин А) (δαηάοζ) в дозе 10 мг/кг каждый второй день в течение 15 дней или 146В7 в дозе 20 мг/кг в день 1 и 10 мг/кг в дни 8 и 15. Через одну неделю после последней инъекции мышей умерщвляли и из каждого ксенотрансплантата брали пункционную биопсию размером 4 мм. Биоптаты фиксировали в формалине для заключения в парафин и окрашивали ядерным антигеном Κί-67.

На фиг. 17 представлен график, показывающий связывание антитела 146В7 с ИЛ-15, связанным с рецептором. Платы покрывают ИЛ-15Ка и инкубируют с ИЛ-15. Через 10 мин в лунки добавляют биотинилированное 146В7. Связывание 146В7 с ИЛ-15, связанным с рецептором, определяют при длине волны 405 нм с помощью ридера для ЕЫ8А.

На фиг. 18 представлен график, показывающий связывание антитела 146В7 с ИЛ-15 после связывания ИЛ-15 с его рецептором, экспрессированным на клетках Кар. После инкубирования в течение 10 мин клеток Кац, экспрессирующих ИЛ-15К, с ИЛ-15 к клеткам добавляли биотинилированное 146В7. Связывание 146В7 с ИЛ-15, связанным с рецептором, определяют посредством анализа с использованием ТАС8 (клеточный сортер с возбуждением флуоресценции).

- 5 014802

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В данном изобретении представлены новые лекарственные препараты на основе антител для лечения и диагностики ряда нарушений, опосредованных ИЛ-15 (т.е. нарушений, вызываемых провоспалительными эффектами ИЛ-15). Как используют в данном контексте, термин провоспалительные эффекты ИЛ-15 включает любой гуморальный или опосредованный клетками иммунный ответ, индуцируемый ИЛ-15, такой как продукция ΤΝΕ-α и других воспалительных медиаторов и рекрутирование/пролиферация Т-клеток. В лекарственных препаратах, соответствующих изобретению, используют выделенные человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с эпитопом, присутствующим на ИЛ-15.

В одном из вариантов осуществления человеческие антитела образуются в организме трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, способной продуцировать множество изотипов человеческих моноклональных антител к ИЛ-15 (например, 1дС, 1дА и/или 1дЕ) путем рекомбинации У-Э-1 и переключения изотипа. Соответственно, различные аспекты изобретения включают антитела и их фармацевтические композиции, а также трансгенных животных, отличных от человека, В-клетки, трансфектомы клетки-хозяина и гибридомы для получения данных моноклональных антител. Изобретение охватывает также способы с использованием антител, соответствующих изобретению, для детекции клеток, с которыми связан ИЛ-15, и/или для подавления функций, опосредованных ИЛ-15 либо ίη νίΐτο, либо ίη νίνο. Включены также способы создания направленности агентов на клетки, с которыми связан ИЛ-15.

Для того чтобы было легче понять данное изобретение, сначала даны определения некоторым терминам. Дополнительные определения представлены во всем тексте детального описания.

Термины ИЛ-15, антиген ИЛ-15 и интерлейкин-15 взаимозаменяемо используют в данном контексте, и они включают любые варианты и изоформы, которые в естественных условиях экспрессируются клетками.

Термин антитело, рассматриваемый в данном контексте, включает целые антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. антигенсвязывающую часть) или одну цепь антитела. Термин антитело относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (Ь) цепи, связанные между собой дисульфидными связями, или их антигенсвязывающую часть. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначаемой в данном контексте как ν_Η) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначаемой в данном контексте как νθ и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена СЬ. Области ν_Η и ν₂ могут далее подразделяться на участки гипервариабельности, называемые участками определения комплементарности (СЭЯ), которые перемежаются с участками, являющимися более консервативными, называемыми каркасными (скелетными) сегментами (ЕЯ). Каждая из ν_Η и VI, состоит из трех СИЯ и четырех ЕЯ, организованных в направлении от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: ЕЯ1, СИЯ1, ЕЯ2, СИЯ2, ЕЯ3, СИЯ3, ЕЯ4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включающими различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки), и первым компонентом (С1с|) классической системы комплемента.

Термин антигенсвязывающая часть антитела (или просто часть антитела), как используют в данном контексте, относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связывать антиген (например, ИЛ-15). Показано, что антигенсвязывающая функция антитела может быть осуществлена фрагментами антитела полной длины. Примеры связывающих фрагментов, охватываемые термином антигенсвязывающая часть антитела, включают (ί) фрагмент ЕаЬ - моновалентный фрагмент, состоящий из доменов ν^ ν_Η, СЬ и СН1; (ίί) фрагмент Е(аЬ')₂ - бивалентный фрагмент, содержащий два фрагмента ЕаЬ, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ίίί) фрагмент Еб, состоящий из доменов ν_Η и СН 1; (ίν) фрагмент Εν, состоящий из доменов ν и ν_Η одного плеча антитела; (ν) фрагмент бАЬ (см. статью \Уагб с1 а1., №Ш1гс. 341: 544-546, (1989)), который состоит из домена ν_Η; и (νί) выделенный гипервариабельный участок (СИЯ) или (νίί) комбинацию двух или более выделенных СИЯ, которые необязательно могут быть связаны с синтетическим линкером. Более того, хотя два домена фрагмента Εν, ν₂ и ν_Η, кодируются разными генами, они могут быть связаны с использованием рекомбинантных способов синтетическим линкером, который делает возможным получить их в виде одной белковой цепи, в которой области ν и ν_Η связывают попарно с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечные Εν (κοΕν); см., например, статьи Впб и соавт., 8с1епсе, 242:423-426, (1988) и ΗιΐδΙοη и соавт., Ргос. Ναΐ1. Асаб. 8с1. И8А, 85:5879-5883, (1988)). Предусматривается, что данные одноцепочечные антитела также охватываются термином антигенсвязывающая часть антитела. Данные фрагменты антитела получают с использованием принятых технологий, известных компетентным специалистам в области техники, и проводят скрининг фрагментов на возможность применения таким же образом, что интактные антитела.

Термин моноклональное антитело, как используют в данном контексте, относится к антителу, ко

- 6 014802 торое проявляет одну специфичность связывания и аффинность к конкретному эпитопу. Соответственно, термин человеческое моноклональное антитело относится к антителам, проявляющим одну связывающую специфичность, которые имеют вариабельную и константную области, выделенные из последовательностей иммуноглобулина человеческих зародышевых линий. В одном из воплощений изобретения человеческие моноклональные антитела продуцируются гибридомой, которая включает В-клетку, полученную от трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, геном которой содержит трансген человеческой тяжелой цепи и трансген легкой цепи, слитую с иммортализованной клеткой.

Термин рекомбинантное человеческое антитело, как используют в данном контексте, предусматривает включение всех человеческих антител, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными способами, таких как (а) антитела, выделенные у животного (например, мыши), которая является трансгенной или трансхромосомной по генам человеческого иммуноглобулина, или из гибридомы, полученной из него (описано далее в разделе I, ниже), (Ь) антитела, выделенные из клеткихозяина, трансформированной таким образом, чтобы она экспрессировала антитело, например, из трансфектомы, (с) антитела, выделенные из библиотеки рекомбинантных комбинаторных человеческих антител, и (б) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей гена человеческого иммуноглобулина с другими последовательностями ДНК. Данные рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельную и константную области, выделенные из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Однако в ряде вариантов осуществления такие рекомбинантные человеческие антитела могут подвергаться мутагенезу ίη νίΐτο (или при использовании животного, трансгенного по последовательностям человеческого 1д, соматическому мутагенезу ίη νίνο), и таким образом последовательности аминокислот областей Ун и У_ъ рекомбинантного антитела представляют собой последовательности, которые, хотя и выделены из последовательностей У_н и У_ъ человеческой зародышевой линии и близки им, могут не существовать в природных условиях в репертуаре человеческих антител зародышевой линии ίη νίνο.

Как используют в данном контексте, термин гетерологичное антитело определяют относительно трансгенного организма, отличного от человека, продуцирующего данное антитело. Термин относится к антителу, имеющему последовательность аминокислот или кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую последовательностям, обнаруженным в организме, который не является трансгенным животным, отличным от человека, и, как правило, выделенному у животного другого вида, чем трансгенное животное, отличное от человека.

Термин выделенное антитело, как используют в данном контексте, предназначен для определения антитела, которое практически не содержит другие антитела, имеющие отличные антигенные специфичности (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с ИЛ-15, практически не содержит антитела, которые специфически связываются с антигенами, отличными от ИЛ-15). Выделенное антитело, которое специфически связывается с эпитопом ИЛ-15, может, однако, обладать перекрестной реактивностью с другими подобными цитокинами или другими белками ИЛ-15, выделенными у других видов. Однако антитело всегда предпочтительно связывается с человеческим ИЛ-15. Кроме того, выделенное антитело, как правило, практически не содержит другой клеточный материал и/или химические вещества. В одном из вариантов осуществления изобретения комбинацию выделенных моноклональных антител с различными специфичностями в отношении ИЛ-15 смешивают в хорошо определенной композиции.

Как используют в данном контексте, термин специфическое связывание относится к связыванию антитела с заданным антигеном. Как правило, антитело связывается с аффинностью (ΚΌ) меньше чем приблизительно 10^-7 М, такой как меньше чем приблизительно 10^-8 М, 10^-9 М или 10^-10 М или даже ниже при определении, с применением технологии поверхностного плазменного резонанса (8РК) с помощью прибора В1АСОКЕ 3000, при использовании рекомбинантного человеческого ИЛ-15 в качестве аналита и антитела в качестве лиганда. При этом антитело связывается с заданным антигеном с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза превышает его аффинность связывания с неспецифическим антигеном (например, В 8 А, бычьим сывороточным альбумином, казеином), отличным от заданного антигена, или близкородственного антигена. Выражения антитело, распознающее антиген и антитело, специфическое в отношении антигена используют в данном контексте взаимозаменяемо с термином антитело, которое специфически связывается с антигеном.

Термин К_с, как используется в данном контексте, предназначен для определения константы диссоциации взаимодействия конкретного антитела и антигена.

Как используется в данном контексте, термин изотип относится к классу антител (например, 1дМ или 1дС1), кодируемых генами константной области тяжелой цепи.

Как используется в данном контексте, термин переключение изотипа относится к феномену, вследствие которого класс или изотип антитела переходит из одного класса в другие классы 1д.

Как используется в данном контексте, термин непереключенный изотип относится к изотипическому классу тяжелой цепи, который образуется, когда не происходит никакого переключения изотипа; ген СН, кодирующий непереключенный изотип, как правило, представляет собой первый ген СН, распо

- 7 014802 ложенный по ходу транскрипции сразу после функционального реаранжированного гена УЭТ Переключение изотипа классифицируют как классическое и неклассическое переключение изотипа. Классическое переключение изотипа происходит посредством рекомбинационных событий, которые затрагивают по меньшей мере один участок переключающей последовательности в трансгене. Неклассическое переключение изотипа может происходить, например, путем гомологичной рекомбинации между σ_μ человека и Σ_μ человека (δ-ассоциированная делеция). Возможно существование и осуществление переключения изотипа посредством альтернативных неклассических механизмов, таких как (среди прочих) интертрансгенная и/или интерхромосомная рекомбинация.

Как используется в данном контексте, термин переключающая последовательность относится к таким последовательностям ДНК, которые отвечают за переключающую рекомбинацию. Последовательность донора переключения, как правило μ-участок переключения, будет расположена 5' (т.е. выше по ходу транскрипции) участка конструкции, который должен подвергнуться делеции при переключающей рекомбинации. Участок акцептора переключения будет находиться между константной областью, которая должна быть подвергнута делеции, и замещающей константной областью (например, γ, ε и т.п.). В связи с отсутствием специфического сайта, в котором всегда происходит рекомбинация, конечную последовательность гена, как правило, нельзя будет предсказать исходя из конструкции.

Как используется в данном контексте, термин тип гликозилирования определяют как тип углеводных молекул, которые ковалентно связываются с белком, в частности с белком иммуноглобулина. Тип гликозилирования гетерологичного антитела может быть охарактеризован как в значительной степени близкий типам гликозилирования, которые существуют в естественных условиях на антителах, продуцируемых видами трансгенных животных, отличных от человека. При этом обычный компетентный специалист в данной области определил бы тип гликозилирования гетерологичного антитела как более близкий к указанному типу гликозилирования у видов трансгенного животного, отличного от человека, чем у видов организмов, из которых были выделены гены СН трансгена.

Термин природный, как используется в данном контексте применительно к объекту, относится к тому факту, что объект можно обнаружить в естественных условиях. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, которая присутствует в организме (включая вирусы), которая может быть выделена из природного источника и которая не была преднамеренно модифицирована человеком в лабораторных условиях, является природной.

Термин реаранжированный, как используется в данном контексте, относится к конфигурации локуса тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, где положение сегмента V находится в непосредственной близости к сегменту Ό-1 или 1 в конформации, кодирующей в основном полный домен У_н или У|, соответственно. Реаранжированный локус гена иммуноглобулина может быть идентифицирован путем сравнения с ДНК зародышевой линии, реаранжированный локус будет содержать по меньшей мере один подвергнувшийся рекомбинации гептамерный/нонамерный гомологичный элемент.

Термин нереаранжированный или конфигурация зародышевой линии, как используется в данном контексте в отношении сегмента V, относится к конфигурации, в которой сегмент V не подвергся рекомбинации, при которой он находился бы в непосредственной близости к сегменту Ό или 1.

Термин молекула нуклеиновой кислоты, как используется в данном контексте, предусматривает включение молекул ДНК и молекул РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть однонитевой или двунитевой, но предпочтительно представлена двунитевой ДНК.

Термин выделенная молекула нуклеиновой кислоты, как используют в данном контексте применительно к нуклеиновым кислотам, кодирующим антитела или части антител (например, У_н, У_ъ, СЭКЗ), которые связываются с ИЛ-15, предназначен для определения молекулы нуклеиновой кислоты, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело или часть антитела, не содержат другие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела или части антител, которые связываются с антигенами, отличными от ИЛ-15. При этом данные другие последовательности могут в естественных условиях фланкировать указанную нуклеиновую кислоту в геномной ДНК человека. 8ЕО ΙΌ N0:1-4 соответствуют нуклеотидным и аминокислотным последовательностям, содержащим вариабельные области тяжелой цепи (У_н) и легкой цепи (Уь) человеческого антитела 146В7 против ИЛ-15, соответствующего изобретению. В частности, 8Е0 ΙΌ N0:1 и 2 соответствуют У_н антитела 146В7, 8Е0 ΙΌ N0:3 и 4 соответствуют Уь антитела 146В7.

Данное изобретение охватывает также консервативные модификации последовательности, касающиеся последовательностей, представленных в 8Е0 ΙΌ N0:1-4, т.е. модификации нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, которые не оказывают существенного воздействия или не изменяют характеристик связывания антитела, кодируемого нуклеотидной последовательностью или содержащего аминокислотную последовательность. Данные консервативные модификации последовательности включают замены, добавления и делеции нуклеотидов и аминокислот. Модификации могут быть интродуцированы в 8Е0 ΙΌ N0:1-4 посредством стандартных технологий, известных в области техники, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР (полимеразная цепная реакция)-опосредованный мутагенез. Консервативные замены аминокислот включают замены, при которых остаток аминокислоты заме

- 8 014802 няют остатком аминокислоты, имеющим аналогичную боковую цепь. В области техники определены семейства остатков аминокислот, имеющих аналогичные боковые цепи. Данные семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), β-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, предсказанный остаток неосновной аминокислоты в человеческом антителе против ИЛ-15 предпочтительно заменяют другим остатком аминокислоты из того же семейства боковых цепей.

Альтернативно, в другом варианте осуществления возможна интродукция мутаций случайным образом на протяжении всей последовательности, кодирующей антитело против ИЛ-15, или ее части, в частности, путем насыщающего мутагенеза, и может быть проведен скрининг полученных в результате модифицированных антител против ИЛ-15 на активность связывания.

Соответственно, антитела, кодируемые нуклеотидными последовательностями (вариабельной области тяжелой и легкой цепи), описанными в данном контексте, и/или содержащие аминокислотные последовательности (вариабельной области тяжелой и легкой цепи), описанные в данном контексте (т.е. ЗЕО ΙΌ N0:1-4), включают практически аналогичные антитела, кодируемые близкими последовательностями или содержащие близкие последовательности, которые были консервативно модифицированы. Ниже приведено дальнейшее обсуждение, касающееся того, как можно получить практические аналогичные антитела на основе частичных последовательностей (т.е. вариабельных областей тяжелой и легкой цепей), представленных в данном контексте как ЗЕО ΙΌ N0:1-4.

Для нуклеиновых кислот термин существенная гомология показывает, что две нуклеиновые кислоты или их обозначенные последовательности при оптимальном выравнивании и сравнении являются идентичными (при наличии соответствующих инсерций или делеций нуклеотидов) по меньшей мере приблизительно на 80% нуклеотидов, обычно по меньшей мере приблизительно на 90-95% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 98-99,5% нуклеотидов. Альтернативно, имеется существенная гомология, когда сегменты гибридизуются в условиях селективной гибридизации с комплементом нити.

Процент идентичности двух последовательностей представляет собой функцию числа идентичных положений, общих для последовательностей (т.е. % гомологии = числу идентичных положений/общее число положений х 100), с учетом числа гэпов (двунитевых разрывов) и длины каждого гэпа, которые необходимо ввести для оптимального элайнмента (способа сравнения с использованием выравнивания последовательностей) двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности двух последовательностей можно осуществить с использованием математического алгоритма, как описано ниже в неограничивающих примерах.

Процент идентичности двух нуклеотидных последовательностей можно определить с помощью программы ОАР в пакете программного обеспечения ОСО (см. ййр://ет^ет.дсд.сот) при использовании матрицы ШУЗдарйпа.СМР и веса гэпа 40, 50, 60, 70 или 80 и веса длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процент идентичности двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей можно также определить с использованием алгоритма, предложенного Е. Меуегк и ^. МШет (см. САВ103, 4:11-17, (1988)), введенные в программу ΑΕΙΟΝ (версия 2.0), с использованием таблицы весов остатков РАМ 120, поправочного коэффициента длины гэпа 12 и поправочного коэффициента гэпа 4. Кроме того, можно определить процент идентичности двух аминокислотных последовательностей, используя алгоритм №еб1етап и ^ипксй (см. 1. Мо1. Вю1., 48:444-453, (1970)), введенный в программу ОАР в пакете программного обеспечения ОСО (см. 1Шр://\\л\л\'.8сд.со1п) при использовании либо матрицы В1оккит 62, либо матрицы РАМ250 и веса гэпа 40, 50, 60, 70 или 80 и веса длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Кроме того, последовательности нуклеиновых кислот и белков, соответствующие данному изобретению, могут быть использованы в качестве запрашивающей последовательности для проведения поиска в общедоступных базах данных, например, с целью идентификации близких последовательностей. Такой поиск может быть предпринят с использованием программ ΝΒΕΑ3Τ и ХВЬАЗТ (версия 2.0), представленных в работе Айксйи1 и соавт., 1. Мо1. Вю1., 215:403-10, (1990). Поиск нуклеотидов ВЬАЗТ может быть осуществлен с помощью программы ^№ЬАЗТ (сумма баллов = 100, длина слова = 12) с целью получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот, соответствующих изобретению. Поиск белка ВЬАЗТ можно выполнить с помощью программы ХВЬАЗТ (сумма баллов = 50, длина слова = 3) с целью получения аминокислотных последовательностей, гомологичных белковым молекулам, соответствующим изобретению. Для получения выровненных последовательностей с гэпами с целью проведения сравнения можно использовать Саррей ВЬАЗТ, как описано в статье Айксйи1 и соавт., Шс1ею Асйк Век., 25 (17):3389-3402, (1997). При использовании программ ВЬАЗТ и Саррей ВЬАЗТ могут быть использованы параметры умолчания соответствующих программ (например, ХВЬАЗТ и NΒ^Α3Τ). См. ййр://^тете.псЫ.п1т.п1й.доу.

- 9 014802

Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, в лизатах клеток или в частично очищенной или практически чистой форме. Нуклеиновая кислота считается выделенной или практически чистой, когда она очищена от других клеточных компонентов или иных примесей, например других клеточных нуклеиновых кислот или белков стандартными методиками, включая обработку щелочью/δΌδ (додецилсульфатом натрия), разделение при центрифугировании в градиенте СкС1, колоночную хроматографию, элетрофорез в агарозном геле и другие методики, хорошо известные в области техники. См. монографию под ред. Е. ЛикиЬе1 и соавт. Современные методы молекулярной биологии (Ситгеи! Рто1осок ίη Мо1еси1аг Βίοίοβν). Стееие РиЬНкЫид аиб ^11еу 1и1егкс1еисе, Ыете Уогк (1987).

Для получения последовательностей генов композиции нуклеиновых кислот, соответствующие данному изобретению, зачастую в нативной последовательности (за исключением модифицированных сайтов рестрикции и т.п.), из кДНК, геномной ДНК или их смесей, могут быть подвергнуты мутированию согласно стандартным методикам. В кодирующих последовательностях данные мутации могут, если это желательно, затрагивать аминокислотную последовательность. В частности, имеются в виду последовательности ДНК с существенной гомологией или выделенные из нативных последовательностей V, Ό, 1, константных, переключающих или других последовательностей, описанных в данном контексте (в данном случае выделенный означает, что последовательность является идентичной другой последовательности или ее модифицированной формой).

Нуклеиновая кислота считается функционально связанной, когда она находится в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер являются функционально связанными с кодирующей последовательностью, если они воздействуют на транскрипцию данной последовательности. Касательно последовательностей регуляции транскрипции термин функционально связанные означает, что последовательности ДНК, будучи связанными, прилегают друг к другу и при необходимости соединения двух участков, кодирующих белки, прилегают друг к другу и находятся в рамке считывания. Для переключающих последовательностей быть функционально связанными означает, что последовательности способны к осуществлению переключающей рекомбинации.

Термин вектор, как он использован в данном контексте, предназначен для определения молекулы нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой он связан. Одним из типов вектора является плазмида, что означает кольцевую петлю двунитевой ДНК, с которой можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Другой тип вектора представлен вирусным вектором, где дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в геном вируса. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они интродуцированы (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина посредством интродукции в клетку-хозяин и, таким образом, реплицироваться вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Данные векторы определяют в данном контексте как рекомбинантные экспрессионные векторы (или просто экспрессионные векторы). Как правило, экспрессионные векторы, используемые в технологиях рекомбинантной ДНК, часто представлены плазмидными формами. В данном описании термины плазмида и вектор могут использоваться взаимозаменяемо, поскольку плазмида представляет собой наиболее часто используемую форму вектора. Однако изобретение предусматривает включение других форм экспрессионных векторов, таких как вирусные векторы (например, репликационно-дефектные ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые осуществляют эквивалентные функции.

Термин рекомбинантная клетка-хозяин (или просто клетка-хозяин), как используют в данном контексте, предназначен для определения клетки, в которую интродуцирован рекомбинантный экспрессионный вектор. Следует понимать, что данные термины предназначены не только для определения данной конкретной клетки, но и потомства такой клетки. Поскольку в последующих поколениях могут произойти определенные модификации либо вследствие мутаций, либо под воздействием окружающей среды, данное потомство в действительности может не быть идентичным родительской клетке, но может еще быть включено в объем термина клетка-хозяин, как используют в данном контексте.

Как используют в данном контексте, термин субъект включает любого человека или отличное от человека животное. Например, способы и композиции, соответствующие данному изобретению, могут быть использованы для лечения субъекта с воспалительным заболеванием, таким как артрит, например ревматоидный артрит. Термин животное, отличное от человека включает всех позвоночных, например млекопитающих и немлекопитающих, таких как отличные от человека приматы, овца, собака, корова, курицы, амфибии, рептилии и т.п.

В последующих подразделах различные аспекты изобретения описаны более детально.

I. Получение человеческих антител к ИЛ-15.

Человеческие моноклональные антитела, соответствующие изобретению, можно получить с использованием множества известных технологий, таких как стандартная технология гибридизации соматических клеток КоЫет и МЙ81еш (см. ЫаШге, 256:495, (1975)). Хотя процедуры гибридизации соматиче

- 10 014802 ских клеток являются предпочтительными, в принципе могут быть использованы другие технологии получения моноклональных антител, например трансформация В-лимфоцитов вирусами или онкогенами, технология представления на фагах с использованием библиотек генов человеческих антител.

Предпочтительной системой получения гибридом, которые продуцируют человеческие моноклональные антитела, соответствующие изобретению, на основе является система на основе мышей или крыс. Получение гибридомы с использованием мышей хорошо известно в области техники, включая протоколы иммунизации и технологии выделения и слияния иммунизированных спленоцитов.

В одном из вариантов осуществления человеческие моноклональные антитела, направленные против ИЛ-15, получают с использованием трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих части человеческой иммунной системы, а не мышиной системы. В одном из вариантов осуществления в изобретении используют трансгенных мышей, обозначаемых в данном контексте как мыши НиМАЬ, которые содержат минилокусы гена человеческого иммуноглобулина, кодирующие переаранжированные последовательности тяжелой (μ и γ) и к (каппа)-легкой цепей иммуноглобулина, а также направленные мутации, которые инактивируют эндогенные локусы μ- и каппа-цепей (см. статью ЬоиЬегд и соавт., Иа1иге, 368 (6474):856-859, (1994)). Соответственно, у мышей проявляется пониженная экспрессия мышиного 1дМ или каппа, и в ответ на иммунизацию интродуцированные трансгены человеческой тяжелой и легкой цепей подвергаются переключению класса и соматической мутации с образованием высокоаффинных человеческих моноклональных антител 1дС-к (см. статью ЬоиЬегд N. и соавт., кирга, (1994); обзор в монографии ЬоиЬегд N. Справочник по экспериментальной фармакологии (НапбЬоок о! Е.хрептеп1а1 Рйагтасо1о§у) 113:49-101, (1994); статьи ЬопЬегд N. и Никхаг Ό., 1п1егп. Веу. 1ттипо1., уо1. 13:65-93, (1995) и Нагбшд Е. и ЬопЬегд N. Апп. N. Υ. Асаб. 8сЕ, 764:536-546, (1995)). Получение мышей НиМАЬ детально описано в разделе II ниже и в работах Тау1ог Ь. и соавт., ШсШс Аабк Векеагсй, 20:6287-6295, (1992); Сйеп 1. и соавт., 1п1егпайопа1 1ттипо1о§у, 5:647-656, (1993); ТиаШоп и соавт., Ргос. №И. Асаб. 8сЕ И8А, 90:3720-3724, (1993); СЬо1 и соавт., ХаИие Сепейск, 4:117-123, (1993); Сйеп 1. и соавт., ЕМВО 1., 12:821-830, (1993); ТиаШоп и соавт., 1. 1ттипо1., 152:2912-2920, (1994); ЬопЬегд и соавт., №1Шге. 368 (6474):856-859, (1994); ЬопЬегд К, Справочник по экспериментальной фармакологии (НапбЬоок о! Ехрептеп1а1 Рйагтасо1о§у), 113:49-101, (1994); Тау1ог Ь. и соавт., 1п1егпайопа1 1тшипо1о§у, 6:579-591, (1994); ЬопЬегд N. и Никхаг Ό., 1п1егп. Веу. 1ттипо1., уо1. 13:65-93, (1995); Нагбшд Е. и ЬопЬегд К, Апп. N. Υ. Асаб. 8сЕ, 764:536-546, (1995); ЕйШсПб Ό. и соавт., №1Шге Вю1есйпо1о§у, 14:845-851, (1996). Кроме того, см. патенты США №№ 5545806, 5569825, 5625126, 5633425, 5789650, 5877397, 5661016, 5814318, 5874299 и 5770429, все из которых выданы ЬопЬегд и Кау и СепРйагт 1п1егпайопа1, патент США № 5545807, выданный 8игаш и соавт.; международные публикация №№ XVО 98/24884, опубликованная 11 июня 1998 г., νθ 94/25585, опубликованная 10 ноября 1994 г., νθ 93/1227, опубликованная 24 июня 1993 г., νθ 92/22645, опубликованная 23 декабря 1992 г., νθ 92/03918, опубликованная 19 марта 1992 г. В частности, получение трансгенных мышей НиМаЬ НСО12 описано в примере 2.

Иммунизации.

Для генерации полностью человеческих моноклональных антител к ИЛ-15 трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих гены человеческого иммуноглобулина (например, мышей НСО12, НСО7 или КМ), можно иммунизировать очищенным или обогащенным препаратом антигена ИЛ-15 и/или клеток, экспрессирующих ИЛ-15, как описано, например, в статьях ЬопЬегд и соавт., Ха1иге, 368 (6474):856859, (1994); Е1кйетйб и соавт., №1Шге Вю1есйпо1о§у, 14:845-851, (1996) и в публикации νθ 98/24884. Альтернативно, мыши могут быть иммунизированы ДНК, кодирующей человеческий ИЛ-15. Предпочтительно, когда для первого вливания используют мышей в возрасте 6-16 недель. Например, очищенный или обогащенный препарат (5-50 мкг) антигена ИЛ-15 может быть использован для внутрибрюшинной иммунизации мышей НиМАЬ. В случае, когда иммунизации с использованием очищенного или обогащенного препарата антигена ИЛ-15 не приводят к образованию антител, мышей можно также иммунизировать клетками, экспрессирующими ИЛ-15, например клеточной линией, с целью стимуляции иммунных ответов. Обобщенный опыт работы с различными антигенами показывает, что трансгенные мыши НиМАЬ дают наилучший ответ при изначальной внутрибрюшинной (1Р) или подкожной (8С) иммунизации антигеном в полном адъюванте Фрейнда с последующими еженедельными 1Р/8С иммунизациями (в целом до 10 раз) антигеном в неполном адъюванте Фрейнда. Иммунный ответ можно мониторировать в ходе протокола иммунизации с использованием образцов плазмы, получаемых при отборе крови из ретроорбитальной вены. Проводят скрининг образцов плазы с помощью ЕЫ8А (как описано ниже) и мышей с достаточными титрами человеческого иммуноглобулина против ИЛ-15 используют для слияний. Мышам проводят бустерную иммунизацию путем внутривенного введения антигена за 3 дня до умерщвления и удаления селезенки.

Получение гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела к ИЛ-15

Для получения гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела к ИЛ-15, спленоциты и клетки лимфатических узлов иммунизированной мыши могут быть выделены и слиты с подходящей иммортализованной клеточной линией, такой как клеточная линия мышиной миеломы. Затем проводят скрининг полученных гибридом на продукцию антиген-специфических антител. Например,

- 11 014802 суспензии отдельных клеток лимфоцитов селезенки, полученных от иммунизированных мышей, сливают с несекретирующими клетками мышиной миеломы 8Р2/0-АС8.653 (АТСС (Американская коллекция типовых культур), СКЬ 1580) с использованием 50% РЕС (мас./об.). Клетки в концентрации приблизительно 1 х 10⁵ помещают в плоскодонные платы для микротитрования с последующим инкубированием в течение двух недель в селективной среде, содержащей кроме обычных реагентов 10% эмбриональной С1опе 8егит (сыворотки для клонирования), 5-10% фактора клонирования гибридом огфсп (1СЕЫ) и 1хНАТ (среда ГАТ, содержащая гипоксантин-аминоптерин-тимидин) (81дша). Приблизительно через две недели клетки можно культивировать в среде, где НАТ заменена НТ (среда ГТ, содержащая гипоксантин-тимидин). Затем проводят скрининг отдельных лунок с помощью ЕБ18А на человеческие моноклональные антитела 1дМ и 1дС против ИЛ-15. Как правило, после начала сильного роста гибридом среду исследуют через 10-14 дней. Гибридомы, секретирующие антитела, переносят на другие платы, снова проводят скрининг и, если они остаются положительными в отношении человеческих моноклональных антител 1дС против ИЛ-15, их субклонируют по меньшей мере дважды путем ограничивающего разведения. Затем стабильные субклоны культивируют ίη νίίτο в среде для культур тканей с целью получения антитела для характеризации.

Получение трансфектом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела к ИЛ-15

Человеческие антитела, соответствующие изобретению, также можно получить в трансфектоме клетки-хозяина при использовании, например, комбинации технологии рекомбинантной ДНК и способов трансфекции гена, как это хорошо известно в области техники (см. статью Моггбоп 8., 8с1епсе, 229:1202, (1985)).

Например, в одном из вариантов осуществления ген(ы), представляющий интерес, в частности гены человеческого антитела, может быть лигирован в экспрессионный вектор, такой как эукариотическая экспрессионная плазмида, такая как используют в системе экспрессии гена С8, описанной в публикациях \νϋ 87/04462, 89/01036 и ЕР 338841, или других экспрессионных системах, хорошо известных из уровня техники. Очищенную плазмиду с клонированными генами антитела интродуцируют в эукариотические клетки-хозяева, например клетки СНО или клетки N80, или, альтернативно, в другие эукариотические клетки, например клетки, выделенные из растений, грибов или дрожжей. Способ, используемый для интродукции данных генов, может быть представлен способами, описанными в области техники, такими как электропорация, использование липофектина, липофектамина или иными способами. После интродукции данных генов антител в клетки-хозяева можно идентифицировать и селектировать клетки, экспрессирующие антитело. Данные клетки представляют собой трансфектомы, которые затем могут быть размножены на основе уровня экспрессии и масштабированы для получения антител. Из супернатантов и/или клеток данных культур можно выделить и очистить рекомбинантные антитела.

Альтернативно, данные клонированные гены антител можно экспрессировать в других экспрессионных системах, таких как Е. со11 или целые организмы, или они могут быть экспрессированы синтетическим путем.

Использование частичной последовательности антитела для экспрессии интактных антител

Антитела взаимодействуют с антигенами-мишенями в основном посредством аминокислотных остатков, которые находятся в шести гипервариабельных участках (СИК) тяжелой и легкой цепей. По этой причине аминокислотные последовательности внутри СИК являются более разнообразными среди отдельных антител, чем последовательности вне СИК. Поскольку последовательности СИК отвечают за большинство взаимодействий антитела и антигена, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфических природных антител путем конструирования экспрессионных векторов, которые включают последовательности СИК из специфического природного антитела, привитые на каркасные последовательности из другого антитела с другими свойствами (см., например, статьи К1есйшапп Ь. и соавт., №1Шге. 332:323-327, (1998); 1опе8 Р. и соавт., №1иге, 321:522-525, (1986) и Оиееп С. и соавт., Ргос. №11. Асаб. 8с1. И.8.А., 86:10029-10033, (1989)). Данные каркасные последовательности могут быть получены из общедоступных баз данных ДНК, которые включают последовательности генов антител зародышевой линии. Данные последовательности зародышевой линии будут отличаться от последовательностей генов зрелого антитела, поскольку они не будут включать полностью собранные вариабельные гены, которые формируются путем связывания У(И)1 в процессе созревания В-клеток. Последовательности генов зародышевой линии также будут отличаться от последовательностей высокоаффинного антитела из вторичного репертуара характерным равномерным расположением в вариабельной области. Например, соматические мутации относительно редко встречаются в аминоконцевой части каркасного сегмента. В частности, соматические мутации относительно редко встречаются в аминоконцевой части каркасного сегмента 1 и в карбоксиконцевой части каркасного сегмента 4. Более того, многие соматические мутации не изменяют существенным образом связывающие свойства антитела. В связи с этим нет необходимости в получении полной последовательности ДНК конкретного антитела с целью воссоздания интактного рекомбинантного антитела, имеющего свойства связывания, аналогичные данным свойствам исходного антитела (см. публикацию РСТ/И8 99/05535, зарегистрированную 12 марта 1999 г.). Как правило, для этой цели является достаточным охват участков СИК частичных по

- 12 014802 следовательностей тяжелой и легкой цепей. Частичную последовательность используют для определения, какие вариабельные и связывающие сегменты генов зародышевой линии участвуют в образовании вариабельных генов рекомбинированного антитела. Кроме того, последовательность зародышевой линии используют для заполнения утраченных частей вариабельных областей. Лидерные последовательности тяжелой и легкой цепи расщепляются в процессе созревания белка и не вносят вклад в формирование свойств конечного антитела. Для восполнения утраченных последовательностей клонированные последовательности кДНК можно комбинировать с синтетическими олигонуклеотидами путем лигирования или ПЦР-амплификации. Альтернативно, целая вариабельная область может быть синтезирована как набор коротких перекрывающихся олигонуклеотидов и скомбинирована посредством ПЦР-амплификации с целью создания полностью синтетического клона вариабельной области. Данный процесс обладает рядом преимуществ, таких как элиминация или включение определенных сайтов рестрикции либо оптимизация определенных кодонов.

Нуклеотидные последовательности транскриптов тяжелой и легкой цепей из гибридом используют для конструирования перекрывающегося набора синтетических олигонуклеотидов с целью создания синтетических У-последовательностей со способностями кодирования аминокислот, идентичными способностям природных последовательностей. Синтетические последовательности тяжелой и каппа-цепи могут отличаться от природных последовательностей по трем направлениям: цепи повторяющихся нуклеотидных оснований прерывают для облегчения синтеза олигонуклеотидов и ПЦР-амплификации, инкорпорируют оптимальные сайты инициации трансляции согласно правилам Ко хак (см. статью Ко/ак. 1. ΒίοΙ. Сйет., 2б6Ь19867019870, (1991)) и конструируют сайты ΗίηάΙΙΙ, расположенные выше по ходу транскрипции относительно сайтов инициации трансляции.

Для оптимизированного кодирования и соответствующего некодирования вариабельных областей как тяжелой, так и легкой цепей последовательности цепей разбивают на фрагменты из 30-50 нуклеотидов примерно в середине соответствующего некодирующего олигонуклеотида. Таким образом, для каждой цепи можно собрать олигонуклеотиды в перекрывающиеся двунитевые наборы, которые заполняют сегменты из 150-400 нуклеотидов. Затем пулы используют как матрицы для получения продуктов ПЦР-амплификации из 150-400 нуклеотидов. Как правило, один набор олигонуклеотидов вариабельной области разбивают на два пула, которые раздельно амплифицируют с получением двух перекрывающихся продуктов ПЦР. Затем данные перекрывающиеся продукты комбинируют путем ПЦР-амплификации с образованием полной вариабельной области. Для создания фрагментов, легко клонируемых в конструкции экспрессионных векторов, может быть также желательным включение в ПЦР-амплификацию перекрывающегося фрагмента константной области тяжелой или легкой цепи (в том числе сайта ВЬН каппалегкой цепи или сайта Аде1 γ-тяжелой цепи).

Затем реконструированные вариабельные области тяжелой и легкой цепей смешивают с клонированными промотором, лидерной последовательностью, последовательностью инициации трансляции, лидерной последовательностью, последовательностями константной области, З'-нетранслируемого участка, участка полиаденилирования и терминации транскрипции с целью формирования конструкций экспрессионного вектора. Конструкции для экспрессии тяжелой и легкой цепей могут быть скомбинированы в одном векторе, котрансфицированы, серийно трансфицированы или раздельно трансфицированы в клетки-хозяева, которые затем сливают с образованием клетки-хозяина, экспрессирующей обе цепи.

Плазмиды, используемые в конструкциях экспрессионных векторов для человеческого 1дСк, описаны ниже (см. пример 1). Плазмиды сконструированы таким образом, чтобы ПЦР-амплифицированные последовательности кДНК У-тяжелой и У-каппа-легкой цепей можно было бы использовать для реконструкции минигенов полной тяжелой и легкой цепей. Данные плазмиды могут быть использованы для экспрессии полностью человеческих антител 1дС1к или 1дС4к. Полные человеческие и химерные антитела, соответствующие данному изобретению, включают также антитела 1дС2, 1дС3, 1дЕ, 1дА, 1дМ и Ι§Ό. Могут быть сконструированы подобные плазмиды для экспрессии других изотипов тяжелых цепей или для экспрессии антител, содержащие λ-легкие цепи.

Таким образом, в другом аспекте изобретения структурные свойства человеческих антител против ИЛ-15, соответствующих изобретению (146В7,147Н5, 404А8 и 404Е4), используют для создания структурно близких человеческих антител против ИЛ-15, которые сохраняют по меньшей мере одно функциональное свойство антител, соответствующих изобретению, такое как связывание с ИЛ-15. В частности, один или более участков СОВ 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4 могут быть скомбинированы рекомбинантным образом с известными человеческими каркасными сегментами и СЭВ для создания дополнительных, рекомбинантно-инжнерных человеческих антител против ИЛ-15, соответствующих изобретению.

Соответственно, в другом варианте осуществления изобретение представляет способ получения антитела против ИЛ-15, предусматривающий получение антитела, содержащего (1) каркасные сегменты человеческой тяжелой цепи и СЭВ человеческой тяжелой цепи, где по меньшей мере один из СЭВ человеческой тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей СЭВ, представленных на фиг. 2 (или соответствующих аминокислотных остатков в ЗЕС ΙΌ N0:2), и (2) каркасные сегменты человеческой легкой цепи и СЭВ человеческой тяжелой цепи,

- 13 014802 где по меньшей мере один из СЭЯ человеческой тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей СОЯ, представленных на фиг. 3 (или соответствующих аминокислотных остатков в 8ЕО Ш N0:4), где антитело сохраняет способность связываться с ИЛ-15. Способность антитела связывать ИЛ-15 можно установить с использованием стандартных анализов связывания, таких как приведенные в примерах (например, ЕЫ8А).

Поскольку в уровне техники хорошо известно, что домены СИКЗ тяжелой и легкой цепей антитела играют исключительно важную роль в специфичности связывания/аффиности антитела к антигену, рекомбинантные антитела, соответствующие изобретению, полученные как представлено выше, предпочтительно содержат СИКЗ тяжелой и легкой цепей 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4. Кроме того, антитела могут содержать СЭЯ2 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4. Далее антитела могут содержать СЭЯ1 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4. Кроме того, антитела могут содержать любые комбинации СИЯ.

Соответственно, в другом варианте осуществления изобретение далее представляет антитела против ИЛ-15, содержащие (1) каркасные сегменты человеческой тяжелой цепи, участок СЭЯ1 человеческой тяжелой цепи, участок СЭЯ2 человеческой тяжелой цепи и участок СЭЯЗ человеческой тяжелой цепи, где участок СИЯЗ человеческой тяжелой цепи выбран из СИЯЗ 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4, например представлен участком СИЯ человеческой тяжелой цепи 146В7, как показано на фиг. 2 (или соответствующими аминокислотными остатками в 8Е0 Ш N0:2), и (2) каркасные сегменты человеческой легкой цепи, участок СЭЯ 1 человеческой легкой цепи, участок СИЯ2 человеческой легкой цепи и участок СИЯЗ человеческой легкой цепи, где участок СЭЯЗ человеческой легкой цепи выбран из СИЯЗ 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4, например представлен участком СИЯ человеческой тяжелой цепи 146В7, как показано на фиг. З (или соответствующими аминокислотными остатками в 8Е0 Ш N0: 4). При этом антитело связывает ИЛ-15. Кроме того, антитело может содержать СЭЯ2 тяжелой цепи и/или СИЯ2 легкой цепи 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4. Далее антитело может содержать СИЯ1 тяжелой цепи и/или С0Я1 легкой цепи 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4.

Участки СЭЯ1, 2 и/или З вышеописанных инженерных антител содержат точно такую же аминокислотную последовательность(и), как у 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4, представленные в данном контексте. Однако обычный компетентный специалист примет во внимание возможность некоторого отклонения от точных последовательностей СИЯ 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4 при сохранении способности антитела эффективно связывать ИЛ-15 (например, консервативные модификации последовательностей). Соответственно, в другом варианте осуществления инженерное антитело может состоять из одного или более СИЯ, которые, например, на 90, 95, 98 или 99,5% идентичны одному или более СИЯ 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4. Кроме того, для простого связывания ИЛ-15 инженерные антитела, такие как описано выше, могут быть отобраны на основании их удерживания или других функциональных свойств антител, соответствующих изобретению, таких как:

(1) связывание с человеческим ИЛ-15 и ингибирование индуцированных ИЛ-15 провоспалительных эффектов;

(2) ингибирование индуцированной ИЛ-15 продукции ΤΝΕ-α или пролиферации Т-клеток;

(3) связывание человеческого ИЛ-15 с константой равновесия диссоциации (К_с) меньше чем приблизительно 10^-7 М при определении, с применением технологии поверхностного плазменного резонанса (8РЯ) с помощью прибора В1АС0ЯЕ З000 с использованием рекомбинантного человеческого ИЛ-15 в качестве аналита и антитела в качестве лиганда;

(4) связывание эпитопа, находящегося на домене ИЛ-15, взаимодействующем с β- и/или γ-цепью;

(5) нарушение связывания Акр⁸ человеческого ИЛ-15 с β-субъединицей рецептора человеческого ИЛ-15 и/или С1и¹⁰⁸ человеческого ИЛ-15 с γ-субъединицей рецептора человеческого ИЛ-15;

(6) связывание человеческого ИЛ-15, связанного с рецептором;

(7) связывание с человеческим ИЛ-15 и ингибирование способности человеческого ИЛ-15 индуцировать паракератоз;

(8) связывание с человеческим ИЛ-15 и ингибирование способности человеческого ИЛ-15 индуцировать утолщение эпидермиса;

(9) связывание с человеческим ИЛ-15 и ингибирование способности человеческого ИЛ-15 индуцировать пролиферацию кератиноцитов и/или (10) связывание с человеческим ИЛ-15 и ингибирование способности человеческого ИЛ-15 индуцировать хемотаксис активированных лейкоцитов.

Характеризация связывания человеческих моноклональных антител с ИЛ-15

Человеческие моноклональные антитела, соответствующие изобретению, могут быть охарактеризованы по связыванию с ИЛ-15 с использованием множества известных методик. Как правило, изначально антитела характеризуют с использованием ЕЬ18А. Вкратце, платы для микротитрования покрывают очищенным ИЛ-15 в РВ8 (фосфатно-буферном растворе), а затем блокируют несоответствующими белками, такими как бычий сывороточный альбумин (В8А), разведенными в РВ8. В каждую лунку вносят разведения плазмы мышей, иммунизированных ИЛ-15, и инкубируют в течение 1-2 ч при З7°С. Платы промывают РВ8/твином 20, а затем инкубируют с козьим Ре-специфическим поликлональным реагентом

- 14 014802 против человеческого 1§С. конъюгированным с щелочной фосфатазой, в течение 1 ч при 37°С. После отмывания платы проявляют с использованием субстрата АВТ8 и анализируют при ΘΌ (оптическая плотность) 405. Предпочтительно использование для слияний мышей. имеющих максимальные титры.

Способ ЕБ18А. как описано выше. также может быть использован для скрининга антител и. следовательно. гибридом. которые продуцируют антитела. проявляющие положительную реактивность с иммуногеном ИЛ-15. Гибридомы. которые (предпочтительно с высокой аффинностью) связываются с ИЛ-15. затем субклонируют и характеризуют дополнительно. Один клон каждой гибридомы. который сохраняет реактивность родительских клеток (по данным ЕБ18А). затем может быть выбран для создания банка клеток и очистки антитела.

Для очистки человеческих антител против ИЛ-15 отобранные гибридомы выращивают в роллерных флаконах. двухлитровых роллерных колбах или в других системах для культивирования. Перед проведением аффинной хроматографии с использованием белка А-сефарозы (РНагташа. Р18са1а^ау. N1) супернатанты могут быть отфильтрованы и сконцентрированы. После замены буферного раствора на РВ8 концентрацию можно определить при ОИ₂₈₀ с использованием коэффициента экстинкции 1.43 или. что предпочтительно. с помощью нефелометрического анализа. 1дС может быть проверен с помощью гельэлектрофореза и способом с использованием специфичности антител.

Чтобы определить. могут ли отобранные человеческие моноклональные антитела против ИЛ-15 связываться с уникальными эпитопами. каждое антитело биотинилируют с использованием имеющихся в продаже реагентов (Р1егсе. КоскГогб. 1Б). Связывание биотинилированных МаЬ (моноклональные антитела) может быть определено с использованием зонда. меченного стрептавидином. Для определения изотипа очищенных антител можно провести ЕБ18А изотипов с использованием известных в области техники методик. Например. лунки платы для микротитрования покрывают 10 мкг/мл 1д против человека в течение ночи при 4°С. После блокирования с помощью 5% В8А в платах проводят реакцию с 10 мг/мл моноклональных антител или контрольных очищенных изотипов при комнатной температуре в течение двух часов. Затем в лунках проводят реакцию либо с человеческим 1дС1. либо с зондами. конъюгированными с агентом. специфическим в отношении другого человеческого изотипа. Платы проявляют и анализируют. как описано выше.

Для демонстрации связывания моноклональных антител с живыми клетками. экспрессирующими ИЛ-15. можно использовать проточную цитометрию. Вкратце. клеточные линии и/или человеческие РВМС. экспрессирующие связанный с мембраной ИЛ-15 (выращенные в стандартных условиях роста). смешивают с различными концентрациями моноклональных антител в РВ8. содержащим 0.1% В8А и 0.01% NаN₃ при 4°С в течение 1 ч. После промывания проводят реакцию клеток с меченным флуоресцеином антителом против человеческого 1дС в тех же условиях. что окрашивание первичного антитела. Образцы анализируют с помощью устройства ЕАС8сал (клеточный сортер с возбуждением флуоресценции) с использованием характеристик света и бокового рассеяния дискриминационного окна для отдельных клеток. при этом определяют связывание меченых антител. В дополнение или вместо проточного цитометрического анализа может быть использован альтернативный способ анализа с использованием флуоресцентной микроскопии. Клетки окрашивают точно так. как описано выше. и исследуют с помощью флуоресцентной микроскопии. Данный способ позволяет визуализировать отдельные клетки. но он может иметь пониженную чувствительность в зависимости от плотности антигена.

Кроме того. человеческие 1дС против ИЛ-15 могут быть протестированы на реактивность с антигеном ИЛ-15 с помощью вестерн-блоттинга. Вкратце. получают экстракты из клеток. экспрессирующих ИЛ-15. и подвергают их электрофорезу в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия (8Ό8). После электрофореза разделенные антигены переносят на нитроцеллюлозные мембраны. блокируют 20% мышиной сывороткой и зондируют с помощью тестируемых моноклональных антител. Связывание человеческого 1дС можно определить с использованием 1дС против человека-щелочной фосфатазы и проявить таблетированным субстратом ВС'ЗР^ВТ (8щша СНет. Со.. 81. Бошк. МО).

II. Получение трансгенных и трансхромосомных животных. отличных от человека. которые образуют человеческие моноклональные антитела против ИЛ-15.

В еще одном аспекте изобретение представляет трансгенных или трансхромсомных животных. отличных от человека. таких как трансгенные или трансхромосомные мыши. которые способны к экспрессии человеческих моноклональных антител. специфически связывающихся с ИЛ-15. В конкретном варианте осуществления изобретение представляет трансгенную или трансхромосомную мышь с геномом. содержащим трансген тяжелой цепи человека. так что данная мышь продуцирует человеческие антитела против ИЛ-15 при иммунизации антигеном ИЛ-15 и/или клетками. экспрессирующимим ИЛ-15. Трансген тяжелой цепи человека может быть интегрирован в хромосомную ДНК мыши. как в случае трансгенной мыши. например мыши НиМАЬ. что детально описано в данном контексте и подкреплено примерами. Альтернативно. трансген тяжелой цепи человека может поддерживаться экстрахромосомно. как в случае трансхромосомной мыши (например. КМ). как описано в заявке XVО 02/43478 (опубликована 6 июня 2002 г.). Данные трансгенные и трансхромосомные мыши способны продуцировать множество изотипов человеческих моноклональных антител к ИЛ-15 (например. 1дС. 1дА и/или 1дЕ) путем рекомбинации Υ-Ο-Ι и переключения изотипов. Переключение изотипов может происходить. например. по

- 15 014802 средством классического или неклассического переключения изотипов.

Для конструирования трансгенного или трансхромосомного животного, отличного от человека, которое отвечает на стимуляцию чужеродным антигеном репертуаром гетерологичных антител, необходимо, чтобы трансгены гетерологичного иммуноглобулина, которые содержит трансгенное животное, функционировали нормально на всем пути развития В-клеток. Это включает, например, переключение изотипа трансгена гетерологичной тяжелой цепи. Соответственно, трансгены конструируют так, чтобы они осуществляли переключение изотипа и одну или более из следующих характеристик антител: (1) высокий уровень и экспрессия, специфическая для клеточного типа, (2) функциональная реаранжировка гена, (3) активация ответа на аллельное исключение, (4) экспрессия достаточного первичного репертуара, (5) сигнальная трансдукция, (6) соматическая гипермутация и (7) доминирование локуса трансгенного антитела в процессе иммунного ответа.

Не все из вышеперечисленных критериев должны быть представлены. Например, в тех вариантах осуществления, где локусы эндогенного иммуноглобулина трансгенного животного функционально разрушены, трансген может не активировать аллельное исключение. Кроме того, в тех вариантах осуществления, когда трансген содержит функционально реаранжированный ген тяжелой и/или легкой цепи иммуноглобулина, второй критерий функциональной реаранжировки гена не является необходимым, по меньшей мере, для трансгена, который уже реаранжирован. Основы молекулярной иммунологии см. в монографии Фундаментальная иммунология (Еипбатеп1а1 1ттипо1о§у) под ред. Раи1 ^1Шат Е., 2 изд., Κηνβη Ргезз, N. Υ., (1989).

В некоторых вариантах воплощения трансгенных или трансхромосомных животных, отличных от человека, используют для генерации человеческих моноклональных антител, соответствующих изобретению, которые содержат реаранжированные, неаранжированные или комбинацию реаранжированных и неаранжированных трансгенов гетерологичных тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина в зародышевой линии трансгенного животного. Каждый из трансгенов тяжелой цепи содержит по меньшей мере один ген С_н. Кроме того, трансген тяжелой цепи может содержать функциональные последовательности переключения изотипа, которые способны поддерживать переключение изотипа гетерологичного трансгена, кодирующего множество генов С_н в В-клетках трансгенного животного. Данные переключающие последовательности могут быть последовательностями, присутствующими в естественных условиях в локусе иммуноглобулина зародышевой линии вида, который служит источником трансгенных генов Сн, или данные переключающие последовательности могут быть выделены из имеющихся у видов, которые предназначены для получения трансгенной конструкции (трансгенного животного). Например, человеческая трансгенная конструкция, которую используют для получения трансгенной мыши, может давать повышенную частоту событий переключения изотипа, если она содержит переключающие последовательности, близкие существующим в естественных условиях в локусе тяжелой цепи мыши, поскольку переключающие последовательности мыши, в отличие от переключающих последовательностей человека, по-видимому, оптимизированы для функционирования с переключающей ферментной системой рекомбиназы мыши. Переключающие последовательности выделяют и клонируют принятыми способами клонирования, или они могут быть синтезированы бе ηονο из перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов, созданных на основе опубликованной информации о последовательностях, касающейся последовательностей области переключения иммуноглобулина (см. статьи МШз и соавт., Νιιοί. Ас1бз Кез., 15:7305-7316, (1991); §1бега8 и соавт., Ιηΐ1. Iттиηο1., 1:631-642, (1989). У каждого из вышеописанных трансгенных животных функционально реаранжированные трансгены гетерологичных тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина обнаруживают в значительной фракции В-клеток трансгенного животного (по меньшей мере 10%).

Трансгены, используемые для создания трансгенных животных, соответствующих изобретению, включают трансген тяжелой цепи, содержащий ДНК, которая кодирует по меньшей мере один сегмент вариабельного гена, один сегмент разнообразия, один сегмент связывающего гена и по меньшей мере один сегмент гена константной области. Трансген легкой цепи иммуноглобулина содержит ДНК, кодирующую по меньшей мере один сегмент вариабельного гена, один сегмент связывающего гена и по меньшей мере один сегмент гена константной области. Сегменты генов, кодирующих сегменты генов легкой и тяжелой цепей, являются гетерологичными для трансгенного животного, отличного от человека, поскольку они выделены из ДНК или соответствуют ДНК, кодирующей сегменты генов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, видов, не включающих трансгенное животное, отличное от человека. В одном из аспектов изобретения трансген конструируют таким образом, чтобы отдельные сегменты гена были переаранжированными, т. е. не были реаранжированы так, чтобы кодировать функциональные легкую и тяжелую цепи иммуноглобулина. Такие нереаранжированные трансгены поддерживают рекомбинацию сегментов генов У, Ό и ί (функциональную реаранжировку) и предпочтительно поддерживают инкорпорацию полного сегмента гена участка Ό или его части в полученную в результате реаранжированную тяжелую цепь иммуноглобулина у трансгенного животного, отличного от человека, при воздействии антигена ИЛ-15. В альтернативном варианте осуществления трансгены содержат нереаранжированный минилокус. Данные трансгены, как правило, содержат значительную часть сегментов С, Ό и ί. а также подгруппу сегментов гена У. В данных трансгенных конструкциях различные регуляторные по

- 16 014802 следовательности, например промоторы, энхансеры, участки переключения класса, сплайс-донорные и сплайс-акцепторные последовательности процессинга РНК, сигналы рекомбинации и т.п., содержат соответствующие последовательности, выделенные из гетерологичной ДНК. Такие регуляторные последовательности могут быть инкорпорированы в трансген от того же самого или близкого вида животного, отличного от человека, используемого в изобретении. Например, сегменты гена человеческого иммуноглобулина могут быть скомбинированы в трансгене с последовательностью энхансера иммуноглобулина грызунов для использования в трансгенной мыши. Альтернативно в трансген могут быть инкорпорированы синтетические регуляторные последовательности, где данные синтетические регуляторные последовательности негомологичны функциональной последовательности ДНК, которая, как известно, присутствует в естественных условиях в геномах млекопитающих. Синтетические регуляторные последовательности конструируют согласно правилам консенсуса, таким как, например, правила, определяющие допустимые последовательности сплайс-акцепторного сайта или мотива промотора/энхансера. Например, минилокус содержит часть геномного локуса иммуноглобулина по меньшей мере с одной внутренней (т. е. неконцевой части) делецией неосновной части ДНК (например, промежуточной последовательности, интрона или его фрагмента) по сравнению с природным локусом 1д зародышевой линии.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения трансгенное или трансхромосомное животное, используемое для генерации человеческих антител к ИЛ-15, которое содержит по меньшей мере одну, как правило, 2-10 и иногда 25-50 или более копий трансгена, описанного в примере 12 патентной заявки XV 0 98/24884 (например, рНС1 или рНС2), скрещивают с животным, содержащим одну копию трансгена легкой цепи, описанного в примерах 5, 6, 8 или 14 патентной заявки \У0 98/24884, и их потомство скрещивают с животным, несущим делецию 1_н, описанную в примере 10 патентной заявки \У0 98/24884. Животных скрещивают до получения гомозиготности по каждому из данных трех признаков. Такие животные имеют следующий генотип: одна копия (на гаплоидный набор хромосом) нереаранжированного минилокуса человеческой тяжелой цепи (описано в примере 12 заявки XV0 98/24884), одна копия (на гаплоидный набор хромосом) реаранжированной конструкции человеческой К-легкой цепи (описано в примере 14 патентной заявки ν0 98/24884) и делеция в каждом эндогенном локусе мышиной тяжелой цепи, которая элиминирует все функциональные сегменты 1_н (описано в примере 10 патентной заявки ν0 98/24884). Данных животных скрещивают с мышами, гомозиготными по делеции сегментов 1_н (примеры 10 патентной заявки ν0 98/24884), для получения потомства, гомозиготного по делеции 1_н и гемизиготного по конструкциям человеческих тяжелой и легкой цепей. Полученным в результате животным инъекционно вводят антигены и используют для продукции человеческих моноклональных антител против данных антигенов.

В-клетки, изолированные от такого животного, являются моноспецифическими относительно человеческих тяжелой и легкой цепей, поскольку они содержат только одну копию каждого гена. Более того, они будут моноспецифическими относительно человеческой и мышиной тяжелых цепей, потому что обе копии эндогенного гена мышиной тяжелой цепи нефункциональны вследствие делеции объема участка 1_н, интродуцированной, как описано в примерах 9 и 12 заявки ν0 98/24884. Более того, существенная фракция В-клеток будет моноспецифической относительно человеческой или мышиной легких цепей, поскольку экспрессия единственной копии реаранжированного гена человеческой каппа-легкой цепи будет аллельно и изотипически исключать реаранжировку эндогенных генов мышиных каппа- и λ-цепей в существенной фракции В-клеток.

Трансгенные и трансхромосомные мыши, используемые в данном изобретении, демонстрирует значительный репертуар продукции иммуноглобулина, в идеале практически аналогичном репертуару нативной мыши. Так, например, в вариантах осуществления с инактивацией эндогенных генов 1д уровни общего иммуноглобулина будут лежать в интервале от приблизительно 0,1 до 10 мг/мл сыворотки, предпочтительно от 0,5 до 5 мг/мл, в идеальном случае по меньшей мере приблизительно 1,0 мг/мл. Когда трансген, способный воздействовать на переключение с 1дМ на 1дС, интродуцирован трансгенной мыши, у взрослой мыши соотношение сывороточного ΙβΟ к 1дМ составляет предпочтительно приблизительно 10:1. У неполовозрелой мыши соотношение ΙβΟ к 1дМ будет значительно ниже. Как правило, больше приблизительно 10%, предпочтительно от 40 до 80% В-клеток селезенки и лимфатических узлов экспрессируют исключительно человеческий белок 1дС.

Репертуар будет идеально приближаться к показанному для нативной мыши, обыкновенно иметь величину по меньшей мере приблизительно 10%, предпочтительно 25-50% или больше. Как правило, будет продуцироваться по меньшей мере приблизительно тысяча различных иммуноглобулинов (в идеале 1§С), предпочтительно 10⁴-10⁶ или больше в зависимости, прежде всего, от числа различных участков V, 1 и Ό, интродуцированных в геном мыши. Данные иммуноглобулины, как правило, будут распознавать приблизительно половину или больше высокоантигенных белков, например белок А 81ар11у1ососси5. В типичном случае аффинность (К_с), которую проявляют иммуноглобулины в отношении заранее заданных антигенов, будет ниже 10^-7 М, например ниже 10^-8 М, 10^-9 М или 10^-10 М или даже ниже.

В ряде вариантов осуществления может быть предпочтительным получение мышей с заранее заданными репертуарами с целью ограничения отбора ν-генов, представленных в ответе антитела на заданный тип антигена. Трансген тяжелой цепи, имеющий заранее заданный репертуар, может содержать,

- 17 014802 например, гены ν_Η человека, которые преимущественно используются в ответах антител на заданный тип антигена у людей. Альтернативно, некоторые гены ν_Η могут быть исключены из определенного репертуара по разным соображениям (например, при низкой вероятности кодирования высокоаффинных ν-областей для заданного антигена, при высокой частоте соматических мутаций и сужения аффинности или при иммуногенности для некоторых людей). Таким образом, перед реаранжировкой трансгена, содержащего различные сегменты генов тяжелой и легкой цепей, данные сегменты генов можно легко идентифицировать, например, путем гибридизации или секвенирования ДНК, как происходящие из видов организма, отличного от трансгенного животного.

Как описано выше, трансгенные и трансхромосомные мыши могут быть иммунизированы, например, очищенным или обогащенным препаратом антигена ИЛ-15 и/или клетками, экспрессирующими ИЛ-15. Альтернативно, трансгенные мыши могут быть иммунизированы ДНК, кодирующей человеческий ИЛ-15. Тогда мыши будут продуцировать В-клетки, в которых переключение класса происходит путем внутритрансгенной переключающей рекомбинации (цис-переключения), и экспрессировать иммуноглобулины, реактивные с ИЛ-15. Иммуноглобулины могут быть представлены человеческими антителами (называемыми также антителами с человеческими последовательностями), где полипептиды тяжелой и легкой цепей кодируются человеческими трансгенными последовательностями, которые могут включать последовательности, полученные путем соматической мутации и рекомбинаторных связей ν-области, а также последовательностями, кодируемыми зародышевой линией. Данные человеческие антитела можно рассматривать, как имеющие существенную идентичность с полипептидной последовательностью, кодируемой сегментом гена человеческих V или ν_Η и сегментом человеческих к. или Ό_Η и 1_Н, хотя другие последовательности незародышевой линии могут присутствовать в качестве результата соматической мутации и дифференциальных рекомбинационных связей ν-1 и ν-Ό-1. Вариабельные области каждой цепи антитела, как правило, по меньшей мере на 80% кодируются сегментами генов человеческой зародышевой линии ν, 1 и в случае тяжелых цепей Ό; зачастую по меньшей мере 85% вариабельных областей кодируется последовательностями человеческой зародышевой линии, присутствующими в трансгене; часто 90 или 95% или больше последовательностей вариабельной области кодируется последовательностями человеческой зародышевой линии, присутствующими в трансгене. Однако, хотя последовательности незародышевой линии интродуцируют путем соматической мутации и связывания νί и νΟΙ, антитела с человеческими последовательностями зачастую будут иметь некоторые последовательности вариабельной области (и реже последовательности константной области), которые не кодируются сегментами генов человеческих ν, Ό или 1, как обнаружено в человеческом трансгене(ах) в зародышевой линии мышей. Обычно такие последовательности незародышевой линии (или отдельные положения нуклеотидов) будут образовывать кластеры в СОЯ или около них, или в областях, где, как известно, соматические мутации образуют кластер.

Человеческие антитела, которые связываются с заданным антигеном, можно получить в результате переключения изотипа, при этом происходит продукция человеческих антител, содержащих человеческую последовательность γ-цепи (такой как γ1, у2а, у2В или γ3) и человеческую последовательность легкой цепи (такой как каппа). Такие человеческие антитела с переключенным изотипом часто содержат одну или более соматических мутаций, как правило, в вариабельной области и часто в приблизительно 10 остатках СОЯ или около них, что является результатом созревания аффинности и отбора В-клеток с помощью антигена, в особенности после вторичного (или последующего) введения антигена. Данные высокоаффинные человеческие антитела могут иметь аффинности связывания (К_с) ниже 10^-7 М, такие как ниже 10^-8 М, 10^-9 М или 10^-10 М или даже ниже.

Другой аспект изобретения касается В-клеток, выделенных у трансгенных или трансхромосомных мышей, как описано в данном контексте. В-клетки могут быть использованы для генерации гибридом, экспрессирующих человеческие моноклональные антитела, которые связываются с человеческим ИЛ-15 с высокой аффинностью (например, ниже, чем 10^-7 М). Так в другом варианте осуществления изобретение представляет гибридому, которая продуцирует человеческое антитело, которое имеет аффинность (К_с) ниже 10^-7 М, такие как ниже 10^-8 М, 10^-9 М или 10^-10 М или даже ниже по определению, с применением технологии поверхностного плазменного резонанса (8РЯ) с помощью прибора В1АСОЯЕ 3000, используя рекомбинантный человеческий ИЛ-15 в качестве аналита и антитело в качестве лиганда для связывания человеческого ИЛ-15, где антитело содержит последовательность человеческой легкой цепи, состоящую из (1) вариабельной области легкой цепи, имеющей полипептидную последовательность, практически идентичную полипептидной последовательности, кодируемой сегментом человеческого гена ν и сегментом человеческого 1_Ь, и (2) константной области легкой цепи, имеющей полипептидную последовательность, практически идентичную полипептидной последовательности, кодируемой сегментом человеческого гена Сь, и последовательность человеческой тяжелой цепи, состоящую из (1) вариабельной области тяжелой цепи, имеющей полипептидную последовательность, практически идентичную полипептидной последовательности, кодируемой сегментом человеческого гена ν_Η, необязательно Ό-участком и сегментом человеческого 1_Η, и (2) константной области, имеющей полипептидную последовательность, практически идентичную полипептидной последовательности, кодируемой сегментом человеческого гена

- 18 014802

Созданию высокоаффинных человеческих моноклональных антител против ИЛ-15 способствует способ расширения репертуара сегментов человеческого гена вариабельной области у трансгенной мыши, которая имеет геном, содержащий интегрированный трансген человеческого иммуноглобулина. Данный способ предусматривает интродукцию в геном трансгена У-гена, содержащего сегменты гена У-области, которые не присутствуют в указанном интегрированном трансгене человеческого иммуноглобулина. Часто трансген У-области представляет собой искусственную хромосому дрожжей, содержащую часть последовательности сегмента человеческого гена У_н или У_ъ (У_к), так как она может находиться в естественных условиях в геноме человека или поскольку она может быть раздельно сплайсирована вместе рекомбинантными способами, которые могут включать нарушенные или пропущенные сегменты гена У. Часто УЛС (искусственная хромосома дрожжей) содержит по меньшей мере пять или более функциональных сегментов гена У. В данном варианте возможно создание трансгенной мыши, полученной способом расширения У-репертуара, где мышь экспрессирует цепь иммуноглобулина, содержащую последовательность вариабельной области, кодируемую сегментом гена У-области, присутствующим в трансгене У-области, и С-область, кодируемую трансгеном Ι§ человека. С помощью способа расширения У-репертуара могут быть получены трансгенные мыши по меньшей мере с 5 различными У-генами, а также мыши, несущие по меньшей мере приблизительно 24 У-гена или более. Некоторые сегменты У-гена могут быть нефункциональными (например, псевдогены и т.п.); если желательно, данные сегменты можно сохранять или избирательно элиминировать рекомбинантными способами, которые доступны компетентным исследователям.

После конструирования мышиной зародышевой линии, содержащей функциональную УЛС, имеющую расширенный репертуар У-сегментов, практически не присутствующий в трансгене человеческого Ι§. содержащем сегменты генов 1 и С, признак может быть размножен и введен путем скрещивания в другие генетические системы, включая системы, в которых функциональную УЛС с расширенным репертуаром У-сегментов вводят путем скрещивания в зародышевую линию мышей, несущую другой трансген человеческого Ιβ. Для функционирования с трансгеном человеческого Ιβ (или множеством трансгенов человеческого Ιβ) множество функциональных УЛС с расширенным репертуаром У-сегментов может быть путем скрещивания введено в зародышевую линию. Хотя и обозначаемые в данном контексте как трансгены УЛС, данные трансгены при интеграции в геном могут практически утрачивать дрожжевые последовательности, такие как последовательности, необходимые для автономной репликации в дрожжах, данные последовательности необязательно могут быть удалены способами геннной инженерии (например, рестрикционным расщеплением и гель-электрофорезом в пульсовом поле или другим подходящим способом) после репликации в дрожжах при отсутствии дальнейшей необходимости (т.е. перед интродукцией в мышиные клетки Е8 или прозиготу мыши). Способы размножения признака экспрессии последовательности человеческого иммуноглобулина включают скрещивание трансгенной мыши, имеющей трансген(ы) человеческого Ι§ и необязательно имеющей также функциональную УЛС с расширенным репертуаром У-сегмента. На УЛС могут присутствовать сегменты обоих генов У_н и У_ъ. Трансгенная мышь может быть скрещена с любой системой, желательной для исследователя, включая системы, несущие другие трансгены человека, в том числе трансгены Ι§ человека и/или трансгены, кодирующие другие белки лимфоцитов человека. Изобретение представляет также последовательность высокоаффинного человеческого иммуноглобулина, продуцируемую трансгенной мышью, несущей трансген УЛС расширенного репертуара У-области. Хотя вышеприведенное описывает предпочтительный вариант осуществления трансгенного животного, соответствующего изобретению, представлены другие варианты осуществления, которые разделены на четыре категории:

Ι) трансгенные животные, содержащие трансген иммуноглобулина с нереаранжированной тяжелой и реаранжированной легкой цепью;

ΙΙ) трансгенные животные, содержащие трансген иммуноглобулина с нереаранжированной тяжелой и нереаранжированной легкой цепью;

ΙΙΙ) трансгенные животное, содержащие трансген иммуноглобулина с реаранжированной тяжелой и нереаранжированной легкой цепью; и

ГУ) трансгенные животные, содержащие трансгены иммуноглобулина с реаранжированной тяжелой и реаранжированной легкой цепью.

Из данных категорий трансгенных животных предпочтительным порядком выбора является следующий: ΙΙ > Ι > ΙΙΙ > ΙΫ, где эндогенные гены легкой цепи (или по меньшей мере гена К) выбиты путем гомологичной рекомбинации (или другим способом), и Ι > ΙΙ > ΙΙΙ > РУ, где эндогенные гены легкой цепи не выбиты и должны доминировать посредством аллельного исключения.

ΙΙΙ. Конъюгаты антител/иммунотоксины.

В другом аспекте данное изобретение характеризует человеческое моноклональное антитело против ИЛ-15, конъюгированное с такой терапевтической молекулой, как цитотоксин, лекарственное средство (например, иммунодепрессант) или радиоизотоп. При конъюгировании с цитотоксином данные конъюгаты антител обозначают термином иммунотоксины. Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, который причиняет вред клетке (например, уничтожает ее). Примеры включают таксол, цитохалазин В, грамицидин Ό, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин,

- 19 014802 винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин Ό, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин, а также их аналоги или гомологи. Терапевтические агенты включают без ограничения перечисленным антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил, декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (ΒδΝυ) и ломустин (СС^и), циклофосфамид, бисульфан, дибромоманнит, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлордиаминплатину (II) ((ПИР)-цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (прежнее название дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (прежнее название актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)), а также антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин). Антитело, соответствующее данному изобретению, может быть конъюгировано с радиоизотопом, например радиоактивным йодом, с целью получения цитотоксических радиофармацевтических препаратов для лечения нарушения, связанного с ИЛ-15, такого как рак.

Конъюгаты антител, соответствующие изобретению, могут быть использованы для модификации заданного биологического ответа. Термин терапевтическая молекула не следует ограничивать рамками классических химических терапевтических агентов. Например, молекула лекарственного вещества может быть представлена белком или полипептидом, обладающими желательной биологической активностью. Данные белки могут включать, например, токсин с активностью фермента или его активный фрагмент, такой как абрин, рицин А, эндотоксин Ркеиботопак или дифтерийный токсин; белок, такой как фактор некроза опухолей или интерферон-γ, или модификаторы биологического ответа, такие как, например, лимфокины, интерлейкин-1 (ИЛ-1), интерлейкин-2 (ИЛ-2), интерлейкин-6 (ИЛ-6), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (СМ-С8Р), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (6-С8Р) и другие факторы роста.

Технологии конъюгирования такой терапевтической молекулы с антителами хорошо известны, см., например, раздел, написанный Агпоп и соавт. Моноклональные антитела для создания иммунонаправленности лекарственных веществ в терапии рака (Мопос1опа1 апРЬоб1ек Рог Гттипо1агдеРпд Οί Игидк Ιη СапсегТРегару), в монографии Моноклональные антитела и терапия рака (Мопос1опа1 апРЬоб1ек Апб Сапсег ТРегару) под ред. Ве1кГе1б и соавт., с. 243-56 (А1ап В. Ыкк, 1пс. 1985); раздел, написанный Не11к1гот и соавт. Антитела для доставки лекарственных веществ (АпРЬоб1ек Рог Игид Ое1Р^гегу) в монографии Контролируемая доставка лекарственных веществ (Соп1го11еб Эгид Пе1Вегу), 2-е изд., под ред. ВоЫпкоп и соавт., с. 623-53 (Магсе1 Иеккег, 1пс. 1987); обзор ТРогре Антитела-носители цитотоксических агентов в терапии рака (АпРЬобу Сатегк ОГ Су1оЮх1с Адеп1к 1п Сапсег ТРегару: А Яеν^е\ν. в сборнике Моноклональные антитела'84: биологическое и клиническое применение (Мопос1опа1 ап11Ьоб1ек'84: Вю1одюа1 Апб СИшса1 АррРсаРопк) под ред. РтсРега и соавт., с. 475-506, (1985); раздел Анализ, результаты и будущие перспективы терапевтического применения антител с радиоактивной меткой в терапии рака, Апа1ук1к, ВекиРк, Апб РиШге Р^οкресΐ^νе ОГ ТРе ТРегареиРс Ике ОГ Вабю1аЬе1еб АпРЬобу 1п Сапсег ТРегару, в монографии Моноклональные антитела для определения и терапии рака, Мопос1опа1 АпРЬоб1ек Рог Сапсег Ое1есРоп Апб ТРегару, под ред. Ва1б\\зп и соавт., с. 303-16 (Асабепис Ргекк 1985) и статью ТРогре и соавт. Получение и цитотоксические свойства конъюгатов антител и токсинов, ТРе РгерагаРоп Апб СуЮохю РгорегРек ОГ АпРЬобу-Тохш Соп)ида1ек, 1ттипо1. Веν., 62:119-58, (1982).

ГУ. Фармацевтические композиции.

В другом аспекте данное изобретение представляет композицию, например фармацевтическую композицию, содержащую одно или комбинацию человеческих моноклональных антител или их антигенсвязывающую часть(и), соответствующие данному изобретению, изготовленные вместе с фармацевтически приемлемым носителем. В предпочтительном варианте осуществления композиции включают комбинацию множества (двух или более) выделенных человеческих антител или их антигенсвязывающих фрагментов, соответствующих изобретению. Предпочтительно, когда каждое из антител, составляющих композицию, связывается с различными заранее выбранными эпитопами ИЛ-15.

Фармацевтические композиции, соответствующие изобретению, можно также применять в комбинированной терапии, т. е. в сочетании с другими агентами. Например, комбинированная терапия может включать композицию, соответствующую данному изобретению, по меньшей мере с одним или более дополнительных терапевтических агентов, таких как противовоспалительные агенты, ИМАВЭ (противоревматические лекарственные вещества, модифицирующие заболевание), иммунодепрессанты, химиотерапевтические агенты и агенты против псориаза. Фармацевтические композиции, соответствующие изобретению, могут также вводиться в сочетании с радиотерапией. Изобретение охватывает также совместное введение с другими антителами, такими как СП4-специфические антитела и ИЛ-2-специфические антитела. Полагают, что данные комбинации с СП4-специфическими антителами и ИЛ-2-специфическими антителами являются особенно эффективными для лечения аутоимунных заболеваний и отторжения трансплантатов.

Как используют в данном контексте, термин фармацевтически приемлемый носитель включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие всасывание агенты и т.п., которые являются физиологически

- 20 014802 совместимыми. Предпочтительно, когда носитель пригоден для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии). В зависимости от способа введения активное соединение, т.е. антитело, биспецифическая и мультиспецифическая молекула могут быть покрыты материалом для защиты соединения от действия кислот и других условий естественной среды, которые могут инактивировать соединение.

Термин фармацевтически приемлемая соль относится к соли, которая сохраняет желательную биологическую активность исходного соединения и не вносит никакие нежелательные токсикологические эффекты (см., например, Вегде δ.Μ. и соавт. 1. Рйагт. δα., 66:1-19, (1977)). Примеры данных солей включают соли, полученные при добавлении кислот, и соли, полученные при добавлении оснований. Соли, полученные при добавлении кислот, включают соли, полученные из нетоксичных неорганических кислот, таких как гидрохлорная, азотная, фосфорная, серная, бромисто-водородная, йодисто-водородная, фосфористая и т.п., а также из нетоксичных органических кислот, таких как алифатические моно- и дкарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и т.п. Соли, полученные при добавлении оснований, включают соли, полученные из щелочно-земельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и т.п., а также из нетоксичных органических аминов, таких как Ν-Ν'-дибензилэтилендиамин, Ν-метилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и т.п.

Композиция, соответствующая данному изобретению, может быть введена множеством способов, известных в области техники. Компетентный специалист примет во внимание, что путь и/или способ введения будут изменяться в зависимости от желательных результатов. Активные соединения могут быть приготовлены с носителями, которые будут предохранять соединение от быстрого выхода, как в препарате с контролируемым выходом, включая имплантаты, чрескожные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Возможно использование биодеградируемых биосовместимых полимеров, таких как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы приготовления данных препаратов запатентованы или в целом известны компетентным специалистам в данной области. См., например, монографию под ред. 1.Я. ЯоЬ1ηδοη Системы доставки лекарственных веществ с задержанным или контролируемым выходом (8и81атеб апб Сог11го11еб Яе1еазе Эгид ЭеКуегу 8у81етв), Магсе1 Эеккег, 1пс., Νο\ν Уогк, (1978).

Для введения соединения, соответствующего изобретению, определенными путями может быть необходимым покрыть соединения оболочкой или вводить соединения вместе с материалом, который предупреждает его инактивацию. Например, соединение может быть введено субъекту в подходящем носителе, например в липосомах или разбавителе. Фармацевтически приемлемые разбавители включают физиологический раствор и водные буферные растворы. Липосомы включают эмульсии СОЕ типа вода-вмасле-в-воде, а также обычные липосомы (см. статью δίΓοίηη и соавт., 1. Nеи^ο^ттиηο1., 7:27, (1984)).

Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий для немедленного применения. В области техники известно применение таких сред и агентов для фармацевтически активных субстанций. Таким образом, за исключением любых обычных сред и агентов, несовместимых с данным активным соединением, их применение предусматривается в фармацевтических композициях, соответствующих изобретению. В композиции могут быть также введены дополнительные активные соединения.

Терапевтические композиции, как правило, должны быть стерильными и стабильными в условиях изготовления и хранения. Композиция может быть приготовлена в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного вещества. Носитель может быть представлен растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий пропиленгликоль и т. п.), а также их подходящие смеси. Необходимую текучесть можно поддерживать, например, с помощью такого покрытия, как лецитин, поддержанием требующегося размера частиц в случае дисперсии и применения поверхностно-активных веществ. Во многих случаях будет предпочтительным включение в композицию изотонических агентов, например сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит и сорбит, или хлорида натрия. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций можно осуществить включением в композицию агента, который задерживает всасывание, например, солей моностеарата и желатина.

Стерильные инъекционные растворы могут быть приготовлены путем введения активного соединения в необходимом количестве в соответствующий растворитель с одним или комбинацией вышеперечисленных ингредиентов, как требуется, с последующей стерилизацией путем микрофильтрации. Как правило, дисперсии готовят введением активного соединения в стерильный носитель, который содержит базовую дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из вышеперечисленных. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и высушивание вымораживанием (лиофилизация), которые приводят к получению порошка активного ингредиента, содержащего любой дополнительный желательный ингредиент из его раствора, предварительно простерилизованного фильтрованием.

- 21 014802

Схемы дозирования подбирают так, чтобы получить оптимальный желательный ответ (например, терапевтический ответ). Например, может быть введен один болюс, за определенный период может быть введено несколько разделенных доз или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, как продиктовано терапевтической ситуацией. Например, человеческие антитела, соответствующие изобретению, можно вводить путем подкожной инъекции один или два раза в неделю или путем подкожной инъекции один или два раза в месяц. Особенно эффективным является приготовление парентеральных композиций в унифицированной лекарственной форме для простоты применения и унификации дозы. Термин унифицированная лекарственная форма, как используют в данном контексте, относится к физически дискретным единицам, соответствующим однократным дозам, предназначенным для субъектов, проходящих лечение. Каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения желательного терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Подробное определение унифицированных лекарственных форм, соответствующих изобретению, продиктовано и непосредственно зависит от (а) уникальных характеристик активного соединения и определенного терапевтического эффекта, который предусматривается достигнуть, и (Ь) ограничений, присущих области техники, связанной с составлением рецептур данного активного соединения для лечения чувствительности у субъектов.

Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, цистеина гидрохлорид, бисульфат натрия, метабисульфат натрия, сульфит натрия и т.п.; (2) антиоксиданты, растворимые в масле, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, α-токоферол и т.п. и (3) металл-хелатирующие агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ΕΌΊΆ), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и т.п.

Касательно терапевтических композиций препараты, соответствующие данному изобретению, включают пригодные для перорального, назального, наружного (в том числе защечного и подъязычного), ректального, вагинального и/или парентерального введения. Препараты могут быть удобно представлены в унифицированной лекарственной форме и могут быть приготовлены способами, известными в фармации. Количество активного ингредиента, которое может сочетаться с материалом носителя при получении лекарственной формы для однократного приема, будет варьировать в зависимости от субъекта, проходящего лечение и конкретного способа введения. Количество активного ингредиента, которое может сочетаться с материалом носителя для получения лекарственной формы для однократного приема, будет, как правило, составлять то количество композиции, которое обеспечивает терапевтический эффект. В общем, из ста процентов данное количество будет находиться в интервале от приблизительно 0,001 до приблизительно 90% активного ингредиента, предпочтительно от приблизительно 0,005 до приблизительно 70%, наиболее предпочтительно от приблизительно 0,01 до приблизительно 30%.

Препараты, соответствующие данному изобретению, которые пригодны для вагинального введения, включают также препараты в виде пессариев (маточных колец), тампонов, кремов, гелей, паст, пенок или спреев, содержащих такие носители, которые в области техники известны как приемлемые. Лекарственные формы для наружного или чрескожного применения композиций, соответствующих данному изобретению, включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и ингаляционные препараты. Активное соединение может быть смешано в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и любыми консервантами, буферами или пропеллентами, которые могут оказаться необходимыми. Выражения парентеральное введение и вводимый парентерально, как используют в данном контексте, означают способы введения, отличные от энтерального и наружного введения, обычно путем инъекции и включают без ограничения внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную (подоболочечную), внутрикапсульную, внутриглазничную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и внутригрудинную инъекции или вливание.

Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые могут быть использованы в фармацевтических композициях, соответствующих изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и пригодные для инъекционного введения органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, с помощью таких покрывающих материалов, как лецитин, поддержанием требующегося размера частиц в случае дисперсии и применения поверхностно-активных веществ.

Данные композиции могут также содержать вспомогательные компоненты, такие как консерванты, увлажняющие агенты, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Предупреждение появления микроорганизмов обеспечивают процедурами стерилизации, кирга, и введением различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Желательным может также оказаться введение в композиции изотонических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и т. п. Кроме того, пролонгированное всасывание инъекционной фармацевтической формы можно осуществить включением агентов, которые задерживают всасывание, таких как моностеарат алюминия и

- 22 014802 желатин.

При введении человеку и животным соединений, соответствующих данному изобретению, в виде фармацевтических препаратов их можно применять в виде монокомпонентов или как фармацевтическую композицию, содержащую, например, 0,001-90% (более предпочтительно 0,005-70%, например 0,0130%) активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

Независимо от выбранного способа введения соединения, соответствующие данному изобретению, которые могут быть использованы в подходящей гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции, соответствующие данному изобретению, готовят в виде фармацевтически приемлемых лекарственных форм обычными способами, известными компетентным специалистам в данной области техники.

Фактические уровни дозировок активных ингредиентов в фармацевтических композициях, соответствующих данному изобретению, могут варьировать, чтобы обеспечить количество активного ингредиента, эффективное для достижения желательного терапевтического ответа у конкретного пациента, состав и способ введения без токсического воздействия на пациента. Выбранный уровень дозы будет зависеть от ряда фармакокинетических факторов, включая активность используемых определенных композиций, соответствующих данному изобретению, или их сложных эфиров, солей или амидов, способа введения, времени введения, скорости выведения конкретного используемого соединения, продолжительности лечения, других лекарств, соединений и/или материалов, применяемых в комбинации с определенными композициями, которые используют, возраста, пола, массы тела, условий, общего состояния здоровья и истории болезни пациента, проходящего лечение, а также подобных факторов, хорошо известных в области медицины. Врач или ветеринар со средним уровнем компетентности в данной области легко может определить и прописать эффективное количество требующейся фармацевтической композиции. Например, врачу или ветеринару следовало бы начать с доз соединений, соответствующих изобретению, которые используют в фармацевтической композиции, на более низких уровнях, чем требуются для достижения желательного терапевтического эффекта, и постепенно повышать дозу, пока терапевтический эффект не будет достигнут. Как правило, подходящей суточной дозой композиций, соответствующих изобретению, будет такое количество соединения, которое в самой низкой дозе эффективно обеспечивает терапевтический эффект. В основном данная эффективная доза будет зависеть от вышеописанных факторов. Предпочтительным является внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное или подкожное введение, предпочтительно проведенное вблизи области мишени. Если желательно, эффективную суточную дозу терапевтической композиции можно вводить в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или более субдоз, которые вводят раздельно с определенными интервалами в течение дня, (необязательно) в унифицированных лекарственных формах. Хотя для соединения, соответствующего данному изобретению, допустимо введение в виде монокомпонента, предпочтительным является вводить соединение как фармацевтический препарат (композицию).

Терапевтические композиции можно вводить с помощью медицинских устройств, известных в данной области. Например, в предпочтительном варианте осуществления терапевтическая композиция, соответствующая изобретению, может быть введена с помощью безыгольного гиподермического инъекционного устройства, такого как устройства, описанные в патентах США №№ 5399163, 5383851, 5312335, 5064413, 4941880, 4790824 или 4596556. Примеры хорошо известных имплантатов и модулей, используемых в данном изобретении, включают патент США № 4487603, который раскрывает имплантируемый микроинфузионный насос для введения лекарственного препарата с контролируемой скоростью; патент США № 4486194, который раскрывает терапевтическое устройство для введения лекарственных препаратов через кожу; патент США № 4447233, в котором описан насос для инфузии лекарственного препарата, доставляющий лекарственный препарат с точной скоростью инфузии; патент США № 4447224, раскрывающий имплантируемое устройство для инфузии с изменением потока, служащее для непрерывной доставки лекарственного вещества; патент США № 4439196, в котором описана осмотическая система доставки лекарственного вещества, имеющая многокамерные отделения, и патент США № 4475196, раскрывающий осмотическую систему доставки лекарственного вещества. Компетентным специалистам в данной области известно много других подобных имплантатов, систем доставки и модулей. В ряде вариантов осуществления может быть получен препарат человеческих моноклональных антител, соответствующих изобретению, обеспечивающий надлежащее распределение ш νίνο. Например, гематоэнцефалический барьер (ВВВ) не пропускает многие соединения с высокой гидрофильностью. Чтобы обеспечить прохождение терапевтических соединений, соответствующих изобретению, через ВВВ (если это желательно), их можно приготовить, например, в липосомах. Относительно способов изготовления липосом см., например, патенты США 4522811, 5374548 и 5399331. Липосомы могут содержать одну или более молекул, которые селективно транспортируются в специфические клетки или органы, повышая таким образом направленную доставку лекарственного вещества (см., например, статью У.У. Капабе, ί. С11п. Рйагтасо1., 29:685, (1989)). Примеры направленных молекул включают фолат или биотин (см., например, патент США 5416016, выданный Ьоте и соавт.); маннозиды (см. статью итеха\\'а и соавт., Βίοсйет. Вюрйук. Кек. Сеттла, 153:1038, (1988)); антитела (см. статьи Р.6. Вкетап и соавт., РЕВ8 Ьеб., 357:140, (1995); М. 0\уак и соавт., АпбтюгоЬ. Адепй Сйетοίйе^., 39:180, (1995)); рецептор поверхност

- 23 014802 но-активного белка А (см. статью Впксое и соавт., Ат. 1. Рйукю1., 1233:134, (1995)), различные виды которого могут представлять препараты, соответствующие изобретениям, а также являться компонентами изобретенных молекул; р. 120 (см. Зсйге1ег и соавт., 1. Вю1. Сйет., 269:9090, (1994)); см. также статьи К. Кетапеп, М.Ь. Ьаиккапеп, ЕЕВЗ Ьей., 346:123, (1994); 1.1. К1Шоп, Ι.Ε Е1б1ег, 1ттипоте1йобк, 4:273, (1994). В одном из вариантов осуществления изобретения терапевтические соединения, соответствующие изобретению, приготовлены в липосомах; в более предпочтительном варианте осуществления липосомы содержат направленную структуру. В наиболее предпочтительном варианте осуществления терапевтические соединения в липосомах доставляют путем болюсной инъекции в область, расположенную вблизи опухоли или места инфекции. Композиция должна быть текучей до такой степени, чтобы ее можно было легко набрать в шприц. Она должна быть стабильной в условиях изготовления и хранения, и нобходимо принять меры для ее предохранения от загрязняющего действия таких микроорганизмов, как бактерии и грибы. Терапевтически эффективная доза для ревматоидного артрита предпочтительно выражается в предварительном определении улучшения АСВ20 у пациентов, более предпочтительно в предварительном определении улучшения АСВ50 и даже более предпочтительно в предварительном определении улучшения АСВ70.

Предварительное определение улучшения АСВ20 определяют как > 20% улучшение показателя болезненности сустава (ТС1) и показателя опухания сустава (З\УЛ) и 20% улучшение по 3 из 5 следующих критериев: оценка болезненных ощущений у пациента (УАЗ), оценка общего состояния пациента (УАЗ), самооценка нетрудоспособности пациента (НАО). реагент острой фазы (СВР или ЕЗВ).

АСВ50 и АСВ70 определяют аналогичным образом при улучшениях > 50 и > 70% соответственно. Более подробное описание см. в работе Ее1коп и соавт. Американская корпорация по Ревматологическому предварительному определению улучшения при ревматоидном артрите (Атепсап Со11еде ок Вйеита1о1о§у Ргейттагу Оейпйюп ок 1тргоуетеп1 ш Вйеита1о1б АййпИк); Аййпйк Вйеитайкт, 38: 727-735, (1995).

Способность соединения подавлять развитие рака можно оценить в системе модели на животных, предсказывающей эффективность в отношении опухолей человека. Альтернативно, данное свойство композиции можно оценить путем исследования подавляющей способности соединения, данное подавление т уйго определяют с помощью анализов, известных компетентным практическим исследователям. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может уменьшать размер опухоли или иным образом ослаблять симптомы у субъекта. Обычный специалист в данной области смог бы определить данные количества на основе таких факторов, как размер субъекта, тяжесть симптомов заболевания у субъекта, а также выбор конкретной композиции и способа введения.

Согласно способам, хорошо известным в области техники, может быть также определена способность антител лечить или предупреждать развитие псориаза.

Композиция должна быть стерильной и текучей до такой степени, чтобы композицию можно было доставлять с помощью шприца. Кроме воды, носитель может быть представлен изотоническим забуференным солевым раствором, этанолом, полиолом (например, глицерином, пропиленгликолем и жидким полиэтиленгликолем и т.п.), а также их подходящими смесями. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, с помощью таких покрывающих материалов, как лецитин, поддержанием требующегося размера частиц в случае дисперсии и применением поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительно введение в композицию изотонических агентов, например сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит и сорбит, или хлорида натрия. Длительное всасывание инъекционных композиций можно осуществить включением в композицию агента, который задерживает всасывание, например моностеарата алюминия или желатина.

При соответствующей защите активного соединения, как описано выше, соединение можно принимать перорально, например, с инертным разбавителем или ассимилируемым пищевым носителем.

V. Применения и способы, соответствующие изобретению.

Человеческие антитела против ИЛ-15, соответствующие данному изобретению, (включая производные и конъюгаты антител) и композиции, содержащие антитела, могут быть использованы в ряде диагностических и терапевтических способов применения ш уйго и ш у1уо.

В одном из вариантов осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, используют для ингибирования индуцируемой ИЛ-15 продукции ТКк-а Т-клетками и/или моноцитами/макрофагами, предпочтительно без ингибирования продукции Т№-а, индуцируемой другими цитокинами, такими как ИЛ-2. При контактировании антитела с ИЛ-15 (например, при введении антитела субъекту) происходит подавление способности ИЛ-15 к образованию сигнала посредством рецептора ИЛ-15 и таким образом осуществляется ингибирование продукции Т№-а Т-клетками и/или моноцитами/макрофагами. Предпочтительные антитела связываются с эпитопами (например, определенными субъединицами, такими как γ-субъединица), которые обладают специфичностью в отношении ИЛ-15, и таким образом эффективно ингибируют продукцию Т№-а, индуцируемую ИЛ-15, но не нарушают продукцию ΤNΕ-α, связанную с близкими цитокинами, такими как ИЛ-2.

В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, исполь

- 24 014802 зуют для подавления индуцируемых ИЛ-15 рекрутирования и/или пролиферации Т-клеток, предпочтительно без ингибирования пролиферации Т-клеток, индуцируемой другими структурно близкими цитокинами, такими как ИЛ-2. Что касается продукции ΤΝΕ-α, то при контактировании антитела с ИЛ-15 (например, при введении антитела субъекту) происходит подавление способности ИЛ-15 к образованию сигнала посредством рецептора ИЛ-15 и таким образом осуществляется ингибирование стимуляции Т-клеток под воздействием ИЛ-15.

Соответственно, в еще одном варианте осуществления данное изобретение представляет способ лечения или профилактики нарушения, опосредованного ИЛ-15 (например, аутоиммунного заболевания, такого как псориаз, ревматоидный артрит или воспалительное заболевание кишечника, или инфекционного заболевания, такого как ВИЧ), путем введения субъекту человеческого антитела, соответствующего изобретению, в количестве, эффективном для лечения или профилактики нарушения. Антитело может быть введено в виде монотерапии или вместе с другим терапевтическим агентом, таким как противовоспалительный агент, например стероидный или нестероидный противовоспалительный агент, или цитотоксин, который дает сочетанный или синергический эффект с антителом при лечении или профилактике заболевания, опосредованного ИЛ-15.

В конкретном варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, используют для лечения или профилактики ревматоидного артрита (ВА). Антитела ограничивают роль, которую ИЛ-15 играет в развитии воспаления, ассоциированного с заболеваниями, такими как ВА (ревматоидный артрит). Т-клетки, в особенности Т-хелперные клетки СЭ4+, участвуют в инициации и поддержании воспалительных процессов при ВА. ΤΝΕ-α, другой цитокин, также участвует в воспалительных путях, которые в конечном счета ведут к разрушению сустава и инвалидности пациента с ВА. Местный синтез ИЛ-15 играет ключевую роль как в активации, так и в рекрутировании Т-клеток и индукции ΤΝΕ-α и других воспалительных цитокинов. Роль ИЛ-15 в развитии ВА включает процесс, при котором ИЛ-15, синтезирующийся в макрофагах, индуцирует рекрутирование Т-клеток. Затем активированные Т-клетки (1) поддерживают активацию макрофагов и (2) индуцируют продукцию ΤΝΕ-α. Стимулированные макрофаги способствуют дальнейшему синтезу ИЛ-15 и активации Т-клеток, продолжая, таким образом, данный цикл. Кроме указанных эффектов в отношении ΤΝΕ-α и макрофагов, ИЛ-15 активирует также нейтрофилы и воздействует на локальную секрецию иммуноглобулина В-клетками, в частности на синтез ревматоидного фактора.

Согласно этому антитела против ИЛ-15, соответствующие изобретению, могут быть использованы для предупреждения или блокирования вышеперечисленных эффектов ИЛ-15, которые вызывают ВА, и таким образом могут быть использованы для лечения данного заболевания. Например, антитела против ИЛ-15, соответствующие изобретению, могут быть использованы для подавления воспаления и/или предупреждения хемотаксиса активированных лимфоцитов, участвующих в развитии ВА.

Человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, могут быть использованы для подавления развития структурных повреждений у пациентов с ревматоидным артритом, которые давали неадекватную реакцию на метотрексат, или для уменьшения признаков и симптомов, а также задержки появления структурных нарушений у пациентов со средним до тяжелого активным ревматоидным артритом, включая больных, которых ранее безуспешно лечили ОМАВО.

Человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, могут быть также использованы для блокирования или подавления других эффектов ИЛ-15. ИЛ-15 экспрессируется в различных клетках и тканях, включая моноциты и макрофаги, фибробласты, дендритные клетки и кератиноциты. Кератиноциты являются основным компонентом эпидермиса и эпителиальной выстилки слизистой ткани. Контроль роста кератиноцитов опосредуется сложным комплексом цитокинов и факторов роста, ряд которых продуцируют сами кератиноциты. ИЛ-15 из кератиноцитов участвует в процессах кумуляции, пролиферации и выживаемости Т-клеток в псориатических бляшках. Известно множество заболеваний, при которых повышается число кератиноцитов, что приводит к гиперплазии эпидермиса, обусловливающей, по меньшей мере, некоторые из симптомов, связанных с заболеванием. Данные заболевания включают такие хронические заболевания, как псориаз и атопический дерматит, а также патологические состояния, как, например, хроническая экзема кистей рук, контактный дерматит, вирусные бородавки (ассоциированные с НРУ (вирусом папилломы человека)), кожная Т-клеточная лимфома, нарушения заживления ран, такие как плохо заживающие раны при диабете. Соответственно, в изобретении представлены способы лечения или профилактики данных нарушений посредством введения пациентам человеческого антитела против ИЛ-15, соответствующего изобретению, в количестве, эффективном для лечения или профилактики нарушения. Например, антитела против ИЛ-15, соответствующие изобретению, могут быть использованы для блокирования или подавления паракератоза при псориазе, снижения толщины эпидермиса при псориазе и уменьшения пролиферации кератиноцитов при псориазе.

ИЛ-15 модулирует также функцию кишечных эпителиальных клеток (см. статью Ветескег и соавт., Са8(гоеп(его1о§у, 111:1706-13,(1996)). В частности, ИЛ-15 может вызывать модификации эпителиальных клеток слизистой оболочки и клеточных линий кишечного эпителия и, вследствие этого, участвует в патогенезе воспалительного заболевания кишечника, например заболевания брюшной полости. Роль ИЛ-15

- 25 014802 в данных заболеваниях показана на основании избирательной сверхпрезентации клеток ИЛ-15+ в тонкой кишке нелеченых пациентов с заболеванием органов брюшной полости (см. заявку XVО 00/02582). Так, показано, что ИЛ-15 непосредственно участвует в инициации и течение заболевания органов брюшной полости. Соответственно, в другом варианте осуществления человеческие антитела против ИЛ-15, соответствующие данному изобретению (т.е. ингибирующие провоспалительные эффекты ИЛ-15) могут быть использованы для лечения и/или профилактики заболевания брюшной полости посредством введения антитела пациенту в количестве, эффективном для лечения или профилактики нарушения.

Кроме того, авторами данного изобретения обнаружено, что ИЛ-15 способствует также образованию новых кровеносных сосудов, т.е. процессу, называемому неоваскуляризацией или ангиогенезом. Соответственно, еще одно применение антител, соответствующих изобретению, включает профилактику или лечение заболеваний, включающих неоваскуляризацию. Кроме воспалительных заболеваний данные заболевания включают многие формы рака, которые зависят от неоваскуляризации или характеризуются неоваскуляризацией.

Человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, могут быть также использованы для блокирования или ингибирования эффектов ИЛ-15, ассоциированных с инфекционными заболеваниями, таким как ВИЧ. Соответственно, другое применение антител, соответствующих изобретению, включает профилактику или лечение инфекционных заболеваний, например ВИЧ-1.

Например, антитела могут быть использованы ш ν 11го или ш у1уо для диагностики ряда заболеваний, опосредованных ИЛ-15. В частности, антитела могут быть использованы для детекции уровней ИЛ-15 или уровней клеток, которые на поверхности мембраны содержат ИЛ-15, или он связан с их рецепторами (связанный с рецептором человеческий ИЛ-15). Затем может быть установлена корреляция определения данных уровней ИЛ-15 с определенными симптомами заболевания. Альтернативно, антитела могут быть использованы для ингибирования или блокирования функции ИЛ-15, которая, в свою очередь, может препятствовать появлению или ослаблять симптомы заболевания, вызываемые функцией ИЛ-15.

Как описано ранее, человеческие антитела против ИЛ-15, соответствующие изобретению, могут быть введены с одним или более другим терапевтическим агентом, например иммунодепрессантом или противовоспалительным агентом, для усиления общего противовоспалительного эффекта. Антитело может быть связано с агентом (таким как иммунокомплекс) или может быть введено отдельно от агента. В последнем случае (раздельное введение), антитело может вводиться до, после или одновременно с агентом. Подходящие терапевтические агенты включают среди прочих противовоспалительные агенты, ΌΜΑΒΌ (противоревматические лекарственные препараты, модифицирующие заболевание), иммунодепрессанты, химиотерапевтические агенты и агенты для лечения псориаза. Человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть также введены в сочетании с радиотерапией.

В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть введены в комбинации с другими антителами, такими как СЭ4-специфические антитела и ИЛ-2специфические антитела. Считают, что комбинация данных человеческих антител с СЭ4-специфическими антителами или ИЛ-2-специфическими антителами особенно эффективна для лечения аутоиммунных заболеваний и отторжения трансплантатов.

В объем данного изобретения входят также наборы, содержащие человеческие антитела против ИЛ-15, соответствующие изобретению, и (необязательно) инструкции по применению. Кроме того, набор может содержать один или более дополнительных реагентов, таких как иммунодепрессанты, или одно или более дополнительных человеческих антител, соответствующих изобретению (например, человеческое антитело, обладающее комплементарной активностью, которое связывается с эпитопом на антигене ИЛ-15, отличном от эпитопа связывания первого человеческого антитела).

Соответственно, пациентам, леченным антителами, соответствующими изобретению, можно дополнительно ввести (до, одновременно или после введения человеческого антитела, соответствующего изобретению) другой терапевтический агент, такой как противовоспалительный агент, который усиливает или повышает терапевтический эффект человеческих антител.

В еще одном варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть использованы для того, чтобы направить соединения (например, терапевтические агенты, метки, цитотоксины, иммунодепрессанты и т.п.) на клетки, с поверхностью которых связан ИЛ-15 (например, связанный с мембраной или связанный с рецептором ИЛ-15) путем присоединения данных соединений к антителу. Таким образом, изобретение представляет также способы локализации ех \ко, ш νί\Ό или ш νίΙΐΌ клеток, экспрессирующих ИЛ-15 и рецептор ИЛ-15 (например, с определяемой меткой, такой как радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента).

Другие варианты осуществления изобретения описаны в последующих примерах.

Данное изобретение далее иллюстрируется последующими примерами, которые не следует истолковывать как дальнейшее ограничение. Содержание списка последовательностей, чертежей и всех ссылок, патентов и опубликованных патентных заявок, приведенных на протяжении данной заявки, специально введено в данном контексте в виде ссылки.

- 26 014802

Примеры

Пример 1. Создание Сти-направленных мышей.

Конструирование СМЛ-направленного вектора.

Плазмида р1СЕти содержит фрагмент Ε^ΡΙ/ΧΙιοΙ локуса тяжелой цепи мышиного 1д, охватывающий ген ти, который получен из геномной библиотеки Ва1Ь/С в фаге λ (см. статью Магси и соавт., Се11., 22:187, (1980)). Данный геномный фрагмент субклонируют в сайты ΧΙιοΙ/Ε^ΡΙ плазмиды р1СЕМ19Н (см. статью Магзй и соавт., Сене, 32:481-485, (1984)). Последовательности тяжелой цепи, включенные в р1СЕти, находятся ниже по ходу транскрипции сайта ЕтоК!, расположенного сразу 3' от интронного энхансера ти в сторону сайта ΧΙιοΙ, расположенного приблизительно через 1 т.п.н. вниз по ходу транскрипции от последнего трансмембранного экзона гена ти; однако большую часть участка повтора переключения ти подвергают делеции путем пассажа в Е. отН.

Направленный вектор конструируют следующим образом. Фрагмент Ηίη6ΙΙΙ/8ιηηΙ размером 1,3 т.п.н. вырезают из ρΚΈιηιι и субклонируют в рВШезспр!, разрезанный Н^ηбIII/8таI (8^313^^, Ьа ^Иа, СА). Данный фрагмент рГСЕти располагается от сайта Ηίη6ΙΙΙ, находящегося на расстоянии приблизительно 1 т.п.н. 5' от Сти1, до сайта 8та!, находящегося в Сти1. Полученную плазмиду разрезают с помощью 8таI/8реI и делают инсерцию фрагмента 8ιηηΙ/ΧΜ·ιΙ длиной приблизительно 4 т.п.н. из рГСЕти, располагающуюся 3' от сайта 8таI в Сти1 в направлении к сайту ХЬаЕ находящемуся по ходу транскрипции непосредственно после последнего экзона Сти. Полученную плазмиду рТАК1 линеаризуют по сайту 8таI и вводят экспрессионную кассету ικο. Данная кассета состоит из гена ικο под контролем транскрипции мышиного промотора фосфоглицераткиназы (рдк) (фрагмент ΧΜ-ιΙ/ΤηςΕ см. статью Абга и соавт., Севе, 60:65-74, (1987)) и содержит сайт полиаденилирования рдк (фрагмент РуиП/НтбИЕ см. статью Вοе^ и соавт., Вюскеш1са1 СеиеЕс^ 28:299-308, (1990)). Данную кассету получают из плазмиды рКЛ (описано в статье ТуЬи1е\\зс/ и соавт., Се11., 65:1153-1163, (1991)), из которой кассету ικο вырезают в виде фрагмента ЕсοКI/Η^ηбIII и субклонируют в рСЕМ-72Е (+), разрезанную ЕсοКI/Η^ηбIII с образованием рСЕМ-7 (КЛ). Кассету ικο вырезают из рСЕМ-7 (КЛ) с помощью Е^Ш^аЛ, делают тупые концы и субклонируют в сайт 8таI плазмиды рТАК1 в ориентации, противоположной геномным последовательностям Сти. Полученную плазмиду линеаризуют с помощью Νοΐ Ι и вводят кассету тимидинкиназы вируса простого герпеса (1к) для обеспечения обогащения клонами Е8, несущими гомологичные рекомбинанты, как описано в статье Маизюш и соавт. (см. №1иге, 336:348-352, (1988)). Данная кассета состоит из кодирующей последовательности гена 1к, фланкированного мышиным промотором рдк и сайтом полиаденилирования, как описано в статье ТуЬи1е\у|с/ и соавт. (см. Се11., 65:1153-1163, (1991)). Полученный в результате СМЛ-направленный вектор приблизительно на 5,3 т.п.н. гомологичен локусу тяжелой цепи и сконструирован для генерации мутантного гена ти с инсерцией экспрессионной кассеты ικο в уникальном сайте 8таI первого экзона Сти. Перед электропорацией в клетки Е8 направленный вектор линеаризуют с помощью ΡνυΙ, разрезающей плазмидные последовательности.

Генерация и анализ целевых клеток Е8.

Клетки Е8 АВ-1 (см. статью МсМайοη А.Р. и Вгаб1еу А., Се11., 62:1073-1085, (1990)) выращивают на фидерных слоях митотически неактивных клеток 8ΝΣ76/7 (1Ь1б.) в основном, как описано КοЬе^ι5οη ЕЛ. (см. монографию Тератокарциномы и эмбриональные стволовые клетки - практический подход (Тегаΐοса^с^ηοта8 аиб ЕтЬ^шс 81ет Се11з: а Ргасйса1 Арргоасй) под ред. ЕЛ. КοЬе^ι5οη. ОхЕцгб: ШЛ Ргезз, с. 71-112, (1987)). Линеаризованный СМЛ-направленный вектор электропорируют в клетки АВ-1 способом, описанным Найу и соавт. (см. статью НаЧу Р.К. и соавт., №1нге, 350:243-246, (1991)). Подвергшиеся электропорации клетки помещают на чашки диаметром 100 мм с густотой 1-2х10⁶ клеток/чашку. Через 24 ч в среду добавляют С418 (в концентрации 200 мкг/мл по активному компоненту) и НАЛ (5х10^-7 М) и позволяют развиваться клонам с лекарственной устойчивостью в течение 8-9 дней. Клоны отбирают, трипсинизируют, делят на две части и продолжают размножать. Затем половину клеток, полученных из каждого клона, замораживают, а другую половину анализируют на наличие гомологичной рекомбинации между вектором и последовательностями-мишенями.

Анализ ДНК проводят путем гибридизации саузерн-блоттингом. ДНК изолируют из клонов, как описано Ла1гб и соавт. (см. статью Лайб Р.^. и соавт., ШсШс Ас1бз Кез., 19:4293, (1991)). Выделенную геномную ДНК разрезают 8реI и зондируют фрагментом 8аб из 915 пар осн., зондом А (см. фиг. 1), который гибридизуется с последовательностью между интронным энхансером ти и участком переключения ти. Зонд А определяет фрагмент 8реI из 9,9 т.п.н. из локуса дикого типа и диагностическую полосу размером 7,6 т.п.н. из локуса ти, прошедшую гомологичную рекомбинацию с СМЛ-направленным вектором (экспрессионная кассета ικο содержит сайт 8реЦ. Из 1132 клонов, устойчивых к С418 и НАЛ, которые проверены саузерн-блоттингом, у 3 обнаруживают полосу 8реI размером 7,6 т.п.н., указывающую на гомологичную рекомбинацию в локусе ти. Данные 3 клона далее разрезают ферментами ВдП, ΕδίΧΙ и ЕтоК!, чтобы удостоверится, что вектор гомологично интегрирован в ген ти. Будучи гибридизованы с зондом А, полосы, полученные при саузерн-блоттинге ДНК дикого типа, при разрезании ВдИ, ΕκίΧΙ или Е^К! образуют фрагменты размером 15,7, 7,3 и 12,5 т.п.н. соответственно, тогда как присутствие целевого аллеля ти определяют по фрагментам размером 7,7, 6,6 и 14,3 т.п.н. соответственно. Все 3 положи

- 27 014802 тельных клона, выявленные по разрезанию 8ре1, демонстрируют присутствие ожидаемых рестрикционных фрагментов Вд11, ΒδΐΧΙ и ЕсоК1, диагностирующих инсерцию кассеты пео в экзон Сти1.

Получение мышей, несущих мутантный ген ти.

Три целевых клона Е8, обозначаемых номерами 264, 272 и 408, оттаивают и инъекцией вводят в бластоцисты С57ВЭ/66, как описано Вгаб1еу (см. раздел, написанный Вгаб1еу А. в монографии Тератокарциномы и эмбриональные стволовые клетки - практический подход (Тега1осагсшота8 апб ЕтЬгуотс 81ет Се11з: а Ргасйса1 АрргоасИ) под ред. ЕД. КоЬеНзоп, ОхТогб: 1КЬ Ргезз, с. 113-151, (1987)). Инъецированные бластоцисты переносят с матки псевдобеременных самок для получения химерных мышей, представляющих смесь клеток, происходящих из введенных клеток Е8 и бластоцисты хозяина. Степень участия клеток Е8 в создании химеры можно визуально определить по количеству окрашивания шерсти агути, ведущего начало из клеточной линии Е8, на черном фоне С57ВЭ/66. Клоны 272 и 408 приводят к образованию только низкопроцентных химер (т.е. низкого процента пигментации агути), но клон 264 приводит к образованию высокопроцентных химер-самцов. Данные химеры скрещивают с самками С57ВЭ/66 и получают потомство агути, указывающее на передачу генома клеток Е8 через зародышевую линию. Скрининг целевого гена ти проводят саузерн-блоттингом ДНК, разрезанной Вд11, из биоптатов хвоста (как описано выше для анализа ДНК клеток). Приблизительно 50% потомства агути показывает гибридизацию полосы Вд11 размером 7,7 т.п.н. в дополнение к полосе дикого типа размером 15,7 т.п.н., демонстрируя передачу целевого гена ти через зародышевую линию.

Анализ трансгенных мышей на функциональную инактивацию гена ти.

Для определения, инактивирует ли инсерция кассеты пео в Сти1 ген тяжелой цепи 1д, клон химеры 264 скрещивают с мышью, гомозиготной по мутации 6НО, которая инактивирует экспрессию тяжелой цепи в результате делеции сегментов гена ГН (см. статью СИеп и соавт., 1ттипо1., 5:647-656, (1993)). Получают четыре потомка агути. От данных животных в возрасте 1 месяца получают сыворотку и анализируют ее с использованием ЕЫ8А на присутствие мышиного 1дМ. У двух из четырех потомков 1дМ полностью отсутствует (см. табл. 1). Генотипирование четырех животных с помощью анализа саузернблоттингом ДНК из биоптатов хвоста путем разрезания Вд11 и гибридизации с зондом А (см. фиг. 1) и разрезания 81и1 и гибридизации с фрагментом ЕсоК1/81и1 размером 475 т.п.н. (1Ыб.) демонстрирует, что животные, не способные к экспрессии сывороточного 1дМ, являются животными, у которых один аллель локуса тяжелой цепи несет мутацию ГНО, а другой аллель - мутацию Сти1. Мыши, гетерозиготные по мутации ГНО, представляют уровни сывороточного 1д дикого типа. Данные результаты демонстрируют, что мутация Сти1 инактивирует экспрессию гена ти.

Таблица 1

Мышь	Сывороточный 1дМ (мкг/мл)	Генотип Н-цепи 1д
42	<0,002	СМО/бНО
43	196	+/6НЭ
44	<0,002	СМЭ/бНЭ
45	174	+/6НО
129 х В1_6 Г1	153	+/+
6НЭ	<0,002	6НЭ/6НЭ

В табл. 1 представлены уровни сывороточного 1дМ, определенные с помощью ЕЫ8А, у мышей, несущих обе мутации, СМЭ и ГНО, (СМЭ/бНЭ), у мышей, гетерозиготных по мутации 6НЭ (+/1НО), у мышей дикого типа (1298νхС57Β^/6^)Ρ1 (+/+) и у мышей с дефицитом В-клеток, гомозиготных по мутации .1110 (1НО-.1НО).

Пример 2. Получение трансгенных мышей НС012.

Трансген человеческой тяжелой цепи НС012.

Трансген НС012 генерируют совместной инъекцией инсерционного сегмента рНС2 размером 80 т.п.н. (см. статью Тау1ог и соавт., 1п1. 1ттипо1., 6:579-591, (1994)) и инсерционного сегмента рУх6 размером 25 т.п.н. Плазмиду рУх6 конструируют, как описано выше. Фрагмент ДНК НшбШ/8а11 размером 8,5 т.п.н., содержащий ген У_Н 1-18 (ЭР-14) зародышевой линии человека, вместе с 5'-фланкирующей

- 28 014802 последовательностью размером приблизительно 2,5 т.п.н. и 3'-фланкирующей геномной последовательностью размером 5 т.п.н. субклонируют в плазмидный вектор рЗР72 (Рготеда, Майкоп, νΙ) с целью генерации плазмиды р343.7.16. Фрагмент ДНК ВаШе/ИтйШ размером 7 т.п.н., содержащий ген У_н5-51 (ΌΡ-73) зародышевой линии человека вместе с 5'-фланкирующей последовательностью размером приблизительно 5 т. п.н. и 3'-фланкирующей геномной последовательностью размером 1 т. п. н. клонируют в вектор для клонирования на основе плазмиды рВВ322 р6Р1Р (см. статью Тау1ог и соавт., МкЭек АсЫк Век., 20:6287-6295, (1992)) с целью генерации плазмиды р251Г. Новый вектор для клонирования, полученный из р6Р1Г, р6Р1к (ЗЕО ΙΌ N0: 13), разрезают с помощью ЕсоВУ/ВатШ и лигируют во фрагмент ДНК ЕсоВУ/ВатШ размером 10 т.п.н., содержащий ген зародышевой линии человека У_н3-23 (ЭР47) вместе с 5'-фланкирующей последовательностью размером приблизительно 4 т.п.н. и 3'-фланкирующей геномной последовательностью размером 5 т.п.н. Полученную плазмиду р1112.2ВВ.7 разрезают с помощью ВатШ/ЗаП и лигируют с очищенным инсерционным сегментом ВатЫ/ЗаП размером 7 т.п.н. р251Г. Полученную плазмиду рУх4 разрезают с помощью Х1ю! и лигируют с инсерционным сегментом ХМ/ЗаП размером 8,5 т.п.н. р343.7.16.

Получают клон, содержащий ген У_н1-18 в той же ориентации, что два других гена У. Затем данный клон, обозначенный рУх6, разрезают с помощью №6 и очищенный инсерционный сегмент размером 26 т.п.н. инъецируют совместно с очищенным инсерционным сегментом рнС2 размером 80 т.п.н. в молярном соотношении 1:1 в пронуклеусы полудневных эмбрионов (С57ВЬ/61хПВА/2.1)Р2, как описано нодап и соавт. (см. монографию В. нодап и соавт. Лабораторное руководство по манипуляциям с мышиными эмбрионами (МашрЫайпд Ше Мойке ЕтЬгуо, А ЬаЬога1огу Мапиа1), 2-е изд., 1994, Со1й Зрппд нагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, Р1ат\зе\у NΥ). Из мышей, развивающихся из инъецированных эмбрионов, получают три независимые линии трансгенных мышей, содержащих последовательности как из Ух6, так и из НС2. Данные линии обозначают (НСО12)14881, (НСО12)15083 и (НСО12)15087. Затем каждую из трех линий скрещивают с мышами, содержащими мутацию СМЬ, описанную в примере 1, мутацию ЖЬ (см. статью СНеп и соавт., ЕМВ0 I., 12:811-820, (1993)) и трансген (КСо5)9272 (см. статью ИкЬ^йй и соавт., №1Шге Вю1есйпо1оду, 14:845-851, (1996)). Полученные в результате мыши экспрессируют трансгены тяжелой и каппа-легкой цепей человеческого иммуноглобулина на фоне, гомозиготном в плане разрушения эндогенных локусов мышиной тяжелой и каппа-легкой цепей.

Пример 3. Продукция человеческих моноклональных антител против ИЛ-15.

Трансгенных мышей НСО12 и НСО7, генерированных как описано выше и полученных из Мейагех, Зап .Токе, СА, ИЗА, иммунизируют подкожно (ЗС), внутрибрюшинно ЦР) или внутривенно (Ж) человеческим рекомбинантным ИЛ-15 (ЫЬ-15, Iттиηеx согр., ЗеаШе, ИЗА) с добавлением либо полного адъюванта Фрейнда (СРА, партия по. 121024ЬА, Ь|Гсо ЬаЬога1опек, Пе1гой, МюЫдап, ИЗА), либо неполного адъюванта Фрейнда (ЮРА, партия по. 121195ЬА, ЭГсо). В некоторых случаях для иммунизации используют ЫЬ-15, связанный с КЬн (гемоцианином из моллюска МедаШига сгепи1а!а (блюдечко)). После нескольких бустерных иммунизаций ЫЬ-15 с добавлением полного или неполного адъюванта Фрейнда сыворотку мышей тестируют на присутствие человеческих антител, направленных против ИЛ-15.

- 29 014802

Схемы иммунизации трансгенных мышей, приводящие к образованию конечных клонов 146В7, 146Н5, 404Е4 и 404А8.

70699

50799

020899

070999

Мышь по. 404 (НСо7), Ю 997-404, самка

099

Мышь по. 146 (Нсо12), Ю 995-146, самка мкг ИИ-15 в СРА (полный адъювант Фрейнда)(ОНсо,

Партия по. 121024ЙА

1ζ мкг ηίί_-15 в ЮРА (неполный адъювант шрейнда) (υίτοο

Партия по. 1211951-А слияние лимфатических узлов и клеток селезенки данной мыши с 8Р2/0 мкг ήΙΙ_-15-Κ1_Η в СРА ϋιΐοο, партия по. 1210241ЭХ слияние лимфатических узлов и клеток селезенки данной мыши с 8Р2/0

Среда для культивирования.

Среда для слияния партнеров (РРМ).

В среду Дульбекко в модификации (ксогек добавляют 100 ΐυ (международных единиц)/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1 мМ пирувата Να, 0,5 мМ β-меркаптоэтанола (ЬКе Тес11по1од1ек, РаЫеу, 8со11апб) и 10% инактивированной нагреванием сыворотки телячьих эмбрионов (НуС1опе, 1Ла11, ША).

Среда для селекции слияний (Р8М).

РРМ с добавлением З0 мл фактора клонирования гибридом Опдеп (ΙΟΕΝ, ОаййегкЪигд, МО, ША), НАТ (1 флакон, концентрация, рекомендуемая изготовителем, 81дша С11ет1са1 Со., 81. Ьошк, МО, ША) и 0,5 мг/мл канамицина (Ше Тес11по1од1ек, РаЫеу, 8со11апб).

Среда для клонирования слияний (РСМ).

РРМ с добавлением 20 мл фактора клонирования гибридом Опдеп (ΙΟΕΝ, ОаййегкЪигд, МО, и8А), НАТ (1 флакон, концентрация, рекомендуемая изготовителем, 81дша Сйет1са1 Со., 81. Ьошк, МО, и8А) и 0,5 мг/мл канамицина (Ше Тесйпо1од1ек, Ра1к1еу, 8со11апб).

- З0 014802

Получение гибридом: слияние клеток селезенки и лимфатических узлов с клетками миеломы 8Р2/0.

Для получения гибридом у мышей удаляют селезенку, паховые и парааортальные лимфатические узлы. Суспензии отдельных клеток селезенки и лимфатических узлов смешивают с клетками миеломы 8Р2/0 при соотношении клеток 1:2. Клетки центрифугируют и осадок осторожно ресуспендируют в 1 мл полиэтиленгликоля (50% мас./об. в РВ8 (фосфатно-буферного раствора), 8щта-А1бпск 1гуте, ИК) при 37°С. После взбалтывания клеток в течение 60 с добавляют 25 мл ЕРМ-2 и инкубируют клетки при 37°С в течение 30-60 мин. После инкубирования клетки культивируют при концентрации клеток 0,75х10⁵ клеток/лунку (в 100 мкл) в 96-луночных платах с Е8М. Через 3 дня в каждую лунку добавляют 100 мкл Е8М.

Слияние селезенки и лимфатических узлов мышей НСО7 и НСО12, иммунизированных ЫЬ-15, приводит к генерации нескольких гибридом, продуцирующих антитела, направленные против ИЛ-15. Выделяют следующие четыре стабильных клона, продуцирующих полностью человеческие антитела против ИЛ-15: (1) 146ЬуО7Е7В7 (название изменено на 146В7); (2) 146ΌΕ2Ε12Α3Η5 (название изменено на 146Н5); (3) 404СС11В7Е4 (название изменено на 404Е4) и (4) 404ЕВ12Е7А8 (название изменено на 404А8). Все данные клоны принадлежат к подклассу человеческого 1дС1/к.

Скрининг гибридом.

Между 7 и 11 днями после слияния проводят скрининг лунок на присутствие человеческих антител с использованием следующих вариантов ЕЬ18А.

ЕЬ18А для скрининга присутствия человеческих к|С в супернатантах культур.

Для проведения ЕЬ18А с целью детекции присутствия человеческих антител 1дС 100 мкл/лунку кроличьих антител против α-каппа-легких цепей (ПАКО, С1о81гир, Эеитагк) в концентрации 0,9 мкг/мл добавляют в фосфатно-буферном растворе (РВ8) в платы для проведения ЕЫ8А Миис МахНогр (инкубирование в течение ночи при комнатной температуре). После блокирования платы с помощью РВ8 с добавлением куриной сыворотки (2%; ЫГе Тескпокще^ Ра181еу, 8собаиб) и Твин-20 (0,05%; РВ8ТС) добавляют супернатанты культур. После инкубирования в течение 1,5 ч платы отмывают и добавляют кроличье антитело против α-цепи человеческого 1дС (фрагменты ЕаЬ2), конъюгированное с пероксидазой хрена (ЭАКО, 61о81гир, Оеитагк), в концентрации 0,5 мкг/мл, разведенное в РВ8ТС. После инкубирования в течение 1 ч лунки отмывают и добавляют субстрат АВТ8 (2,2'-азино-бис-3-этилбензтиазолинсульфокислоту, Яоске П1адио8бс8, Маиийе1т, Сегтаиу) согласно протоколу изготовителя и определяют связывание антитела при длине волны 405 нм с помощью ридера для ЕЬ18А ЕЬ808 (Вю-1ек 1и81гитеи18, ^тоозИ, ντ, ИЗА).

ЕЬ18А для скрининга присутствия ИЛ-15-специфических антител.

Лунки, содержащие человеческие антитела 1дС/к, далее тестируют на присутствие человеческих антител против ИЛ-15 с использованием ИЛ-15-специфического ЕЬ18А. Для проведения ЕЬ18А 100 мкл/лунку ИЛ-15 в концентрации 1 мкг/мл добавляют в фосфатно-буферном растворе (РВ8) в платы для проведения ЕЫ8А Миис МахЦогр (инкубирование в течение ночи при комнатной температуре). После блокирования платы с помощью РВ8 с добавлением куриной сыворотки (2%; Ь1Ге Теск-ю^ще^ Ра181еу, Зсобаиб) и Твин-20 (0,05%; РВ8ТС), вносят супернатанты культур. После инкубирования в течение 1,5 ч платы отмывают и добавляют Ес α-человеческого 1дС, конъюгированное с пероксидазой хрена (1аскзои 1ттиие гезеагск, \Уе81 Сгоуе, Реищукаша, И8А) в разведении 1/5000 в РВ8ТС. После инкубирования в течение 1 ч лунки отмывают и добавляют субстрат АВТ8 (2,2'-азино-бис-3-этилбензтиазолинсульфокислоту, Воске П1адио8бс8, Маткем, Сегтаиу) согласно протоколу изготовителя и определяют связывание антитела при длине волны 405 нм с помощью ридера для ЕЬ18А ЕЬ808 (Вю-1ек ШзбитеШз, №тоозк1, νΕ ИЗА).

Субклонирование гибридом.

Для получения стабильных клеточных линий против ИЛ-15 субклонируют гибридомы путем ограничивающего разведения клеток (до концентрации 0,5 клетки/лунку) в 96-луночных платах.

Субклоны тестируют через приблизительно 10 дней с помощью вышеописанного ЕЬ18А для ИЛ-15. Во время нескольких процедур субклонирования Е8М заменяют в фазах через ЕСМ на ЕРМ. Изотип субклонов определяют с помощью ЕЬ18А, как описано ниже.

Определение изотипа антитела против ИЛ-15 с помощью ЕЬ18А.

Для проведения ЕЬ18А изотипа 100 мкл/лунку Ес против человека в концентрации 1 мкг/мл (1аскзои 1ттиио гезеагск) добавляют в фосфатно-буферном растворе (РВ8) в платы для проведения ЕЫ8А №1пс Мах1зогр (инкубирование в течение ночи при комнатной температуре). После блокирования платы с помощью РВ8 с добавлением куриной сыворотки (2%; Ь1Ге Тескио^дхез, Ра1з1еу, Зсобаиб) и Твин-20 (0,05%; РВ8ТС) вносят супернатанты культур. После инкубирования в течение 1,5 ч платы отмывают и добавляют мышиное α-ΗυΙβΟ1, конъюгированное со щелочной фосфатазой (2утеб, р1аа!з, 1аиб), или мышиное α-ΗπΙ§Ο3, конъюгированное с пероксидазой хрена (2утеб). После инкубирования в течение 1 ч лунки отмывают и добавляют субстрат АВТ8 (2,2'-азино-бис-3-этилбензтиазолинсульфокислоту, Яоске П1адиозбсз, Маиикет, Сегтаиу) согласно протоколу изготовителя и определяют связывание антитела при длине волны 405 нм с помощью ридера для ЕЬ18А ЕЬ808 (Вю-1ек 1из1гитеи1з, ХУтоозкг νχ ИЗА).

- 31 014802

Пример 4. Специфичность полностью человеческих антител против ИЛ-15 в отношении эпитопов.

Для осуществления терапевтической функции или ингибирования индуцируемых ИЛ-15 провоспалительных эффектов ИЛ-15-специфические антитела должны распознавать эпитопы ИЛ-15, участвующие во взаимодействии с цепью ΗΠ-2Ββ и/или γ-цепью рецептора ИЛ-15.

С целью оценки специфичности в отношении эпитопов полностью человеческих антител против ИЛ-15 146В7, 146Н5, 404А8 апб 404Е4 используют мутантные белки (описанные в статье РсН11 и соавт.). Используемые мутанты ИЛ-15 включают мутант ИЛ-15 01088 (остаток О1п в положении 108 заменен 8ег; мутация в γ-цепи центра взаимодействия) и мутант 08801088 (остаток О1п в положении 108 заменен 8ег и Акр в положении 8 заменен 8ег; мутации в центрах взаимодействия ИЛ-15 обеих, β- и γ-цепей).

ЕЫ8А для определения связывания ЫЬ-15-специфических антител 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4 с ЫЬ-15 и мутантными белками ИЛ-15.

Для проведения ЕЫ8А 100 мкл ИЛ-15 или мутантного белка ИЛ-15 в концентрации 1 мкг/мл добавляют в фосфатно-буферном растворе (РВ8) в платы для проведения ЕЫ8А Шпс Махкогр для покрытия. После блокирования платы с помощью РВ8 с добавлением куриной сыворотки (2%; Ь1£е Тескпо1ощек, Ра1к1еу, 8со6апб) и Твин-20 (0,05%; РВ8ТС), инкубируют серийные разведения ЫЬ-15специфических антител. После отмывания добавляют Ес α-человеческого 1дС, конъюгированное с пероксидазой (Аасккоп 1ттипе гекеагск, '№еб Сго^'е, Реппкукаша, И8А) в разведении 1/5000 в РВ8ТС. После отмывания добавляют субстрат АВТ8 (2,2'-азино-бис-3-этилбензтиазолинсульфокислоту, Воске Όίадпоккск, Маппке1т, Оегтапу) согласно протоколу изготовителя и определяют связывание антитела при длине волны 405 нм с помощью ридера для ЕЫ8А ЕЬ808 (В1о-1ек 1пкРитепк, ’№тоокк1, УТ, И8А).

Связывание полностью человеческих специфических в отношении ИЛ-15 антител 146В7, 146Н5, 404А8 и 404Е4 с ЫЬ-15 и мутантными белками ИЛ-15 01088 и 08801088 представляют на фиг. 1. Ни 146В7, ни 146Н5 не способны связываться с данными мутантными белками ИЛ-15. Поскольку оба мутанта несут мутацию 01088, эпитоп, распознаваемый 146В7 и 146Н5, находится в важных доменах ИЛ-15, которые взаимодействуют с γ-цепью рецептора ИЛ-15. Оба, 404А8 и 404Е4, способны связывать мутантные белки, потому что данные антитела распознают эпитоп, находящийся вне доменов ИЛ-15, которые взаимодействуют с β- и γ-цепями. Оба, как 146В7, так и 146Н5, связываются с ИЛ-15 в области, которая взаимодействуете γ-цепью рецептора ИЛ-15. Это согласуется с данными, полученными в анализах пролиферации с использованием полностью человеческих антител против ИЛ-15, соответствующих данному изобретению. Как подробно описано ниже, ни 404А8, ни 404Е4 не способны к ингибированию индуцируемой ИЛ-15 пролиферации клеток СТЬЬ-2 и человеческих РВМС. Оба, 146В7 и 146Н5, могут ингибировать индуцируемую ИЛ-15 пролиферацию. Кроме того, ингибирование пролиферации достигают блокированием взаимодействия ИЛ-15 с γ-субъединицей рецептора ИЛ-15.

Пример 5. Последовательности ν^ и ν^ областей 146В7.

Нуклеотидную и рассчитанную аминокислотную последовательность реаранжированных Ун- и VI-доменов 146В7 определяют с использованием следующих процедур. Данные последовательности дают информацию, касающуюся использованных семейств зародышевых линий и ν₂; точечные мутации в данных последовательностях зародышевых линий обусловлены созреванием аффинности В-клеток во время иммунизации животного.

Получение РНК.

Тотальную РНК готовят из 5х10⁶ клеток гибридомы 146В7 с использованием РНКзола (Вюдепебк, Роо1е, Епд1апб) в соответствии с протоколом изготовителя.

Получение кДНК.

кДНК РНК из 146В7 готовят из 3 мкг тотальной РНК с использованием обратной транскриптазы АМV с буфером (Воске О1адпо811с8 Откн, Маппкет, Оегтапу), олиго-6(Т)15 (Рготеда, Майкоп, VI, И8А), άNΤР (дезоксинуклеозидтрифосфат) (Воекппдег Маппке1т согр., И8А) и РНКзина (Рготеда) в соответствии с протоколом изготовителя.

ПЦР-праймеры, используемые для амплификации Ун- и νι,-областей с целью клонирования.

- 32 014802

Используемые пары праймеров:

%

ЕР1 5’-праймеры

(1)	АВ62	САд	дТК	САд	СТд	дТд	САд	ТС
(2)	АВ 63	8Ад	дТд	САд	СТд	КТд	дАд	ТС
(3)	АВ65	дАд	дТд	САд	СТд	дТд	САд	ТС
	νΗ лидерные 5'-праймеры
(4)	АВ85	АТд	длс	Тдд	АСС	тдд	АдС	АТС
(5)	АВ86	АТд	дАА	ТТд	ддд	СТд	АдС	Тд
(6)	АВ87	АТд	дАд	ТТТ	ддн	СТд	АдС	Тд
(7)	АВ88	АТд	ААА	САС	СТд	Тдд	ттс	ТТС
(8)	АВ89	АТд	ддд	ТСА	АСС	дсс	АТС	СТ
	νΗ 3'-праймер
О)	АВ90	ТдС	САд	ддд	дАА	ддс	СдА	тдд
νΚ:
	ЕР1 5'-праймеры
(1)	АВ8	РАС	АТС	САд	АТд	АУС	САд	тс

(2)	АВ9	дУС АТС УРд АТд АСС САд ТС
(3)	АВ10	дАТ АТТ дТд АТд АСС САд АС
(4)	АВ11	дАА АТТ дТд ТТд АСР САд ТС
(5)	АВ12	дАА ΑΒΑ/ дТР АТд АСА САд ТС
(6)	АВ13	дАТ дТТ дТд АТд АСА САС ТС
(7)	ΑΒ14	дАА АТТ дТд СТд АСТ САд ТС
	Ук лидерные 5'-праймеры:
(8)	АВ 123	ССС дСТ Сад СТС СТд ддд СТС СТд
(9)	АВ 124	ССС ТдС ТСА дСТ ССТ ддд дСТ дС
(Ю)	АВ 125	ССС АдС дСА дСТ ТСТ СТТ ССТ ССТ дС
(11)	АВ 126	АТд дАА ССА Тдд ААд ССС САд САС АдС
	νκ З'-лидерный праймер
(12)	АВ16	Сдд дАА дАТ дАА дАС АдА Тд

Условия ПЦР (полимеразной цепной реакции), используемые для амплификации У_н- и У_ь-областей с целью клонирования.

ПЦР проводят с помощью полимеразы АтрНТад ро1утегазе (Регкт Е1тег) при использовании системы ПЦР ОепеАтр 9700 (Регкт Е1тег Аррйе^ В1О8у81етз, Роз1ег С11у, СА, Ц8А).

- 33 014802

Протокол цикла ПЦР:

94° 2’ циклов 94° 30

65° 30, минус 1°/цикп

72° 30 циклов 94° 30

55° 30

72° 30

72° 10' охлаждение до 4°

Клонирование ν_Η и Χ'ι. в системе вектора рОЕМТ I.

После анализа продуктов ПЦР на агарозном геле данные продукты очищают на колонках для микроцентрифуги 8-400 или 8300 (АшегзИаш Рйагтаща Вю1есй 1пс., Р18са1а'№ау, ΝΙ, и8А) или с помощью набора для гель-экстракции С)1АЕХ II (СЯадеи ОтЬН, НИСеи, Сейтану). Для каждого эксперимента 2 независимо амплифицированных с использованием ЕЯ1 или лидерных праймеров продукта ПЦР каждой ν_Η- и Хф-обдаети клонируют в систему I вектора рОЕМТ (Рготеда) в соответствии с протоколом изготовителя.

После трансформации в Е. сой ΏΗ5α проводят скрининг отдельных клонов путем ПЦР колоний с использованием праймеров Т7 и 8Р6, 30 циклов при 55°. Плазмидную ДНК из каждой отдельной колонии очищают с использованием минипрепаративного набора (фарге'р (ЕЕадечЕ). Для дальнейшего анализа проводят разрезание продукта с помощью \со1/\о11 (ΝΕ Вю1аЬ§, ит1еб Ктдбот и ЯосИе Оха^^з!^) и анализ на агарозном геле.

Секвенирование.

ν-области секвенируют после клонирования в систему I вектора рОЕМТ. Праймеры Т7 и 8р6 (ЕигодеШес, Ьшк, ВеЧдшт') используют в комбинации с набором последовательностей: готовый к употреблению реакционный набор для секвенирования с терминатором цикла (Тегшта1ог Сус1е δχχμιχ'ΐκίιψ Яеабу 1<е'асДо11 Κίί) АВI Рпзт В|дОуе (Аррйеб ВюзузХетз, ^а^^^ηдΐοη, ит1еб Ктдбот) согласно протоколу. Реакции проводят на секвенаторе АВI РК18М 377 (РЕ Аррйеб ВюзузХетз) и анализируют последовательности с помощью программы О\Л81аг, 8е^таη11. Затем последовательности сравнивают с помощью элайнмента с последовательностями ν-гена зародышевой линии в УВА8Е (\ν\ν\ν.ιιιΐΜсре.сат.ас.икЛтЕбос/риЬНс/тйо.Ыт).

Клонирование и секвенирование ν_Η- и νΕ-областн 146В7.

ν_Η- и νι^-области из гибридомы 146В7 амπлнфнцнруют с помощью ПЦР и клонируют в систему I вектора рОЕМТ с целью определения последовательности кДНК. Нуклеотидные и соответствующие аминокислотные последовательности представляют на фиг. 2 (8ЕР ГО ΝΟ:1 и 2) и фиг. 3 (8ЕР ГО ΝΟ:3 и 4) соответственно. Указаны также каркасный сегмент (ЕЯ) и гипервариабельные участки (СОЯ). Семейство зародышевой лнннн V_Η-областн 146В7 согласно данным элайнмента в ν-базе представлено: ν_Η5-51 (подгруппа ν_Η5), 02-15/02 (сегмент О_Н), 1Н4Ь (сегмент 1_Н). Семейство зародышевой лнннн Хф области 146В7 согласно данным элайнмента в ν-базе представлено: А27 (подгруппа Х'_кПЕ) и 1_К2 (сегмент 1_К). Дополнительная информация, касающаяся доменов ν_Η и ν^ представлена в базе данных КаЬа! 1Шр:/дтти11о.Ьте.11\уи.ес1и/ или йΐΐр://ννν.VЬа8е.сοт.

Пример 6. Характеристики аффинности связывания 146В7.

Аффинность 146В7 анализируют с применением технологии поверхностного плазменного резонанса (8РЯ) с помощью прибора ВЕАСОКЕ 3000 с целью определения биомолекулярных взаимодействий белков согласно следующим процедурам. Определяют изменения в сигнале 8РЯ на поверхностном слое, вызываемые биомолекулярным связыванием, и они означают изменения в концентрации массы в поверхностном слое. Аффинность выражают с помощью следующих определений: к_а = константа скорости ассоциации (М^-1 с^-1); кб = константа равновесия диссоциации (с^-1); КА = константа равновесия ассоциации = к_а/к_б (М^-1) и К_о = константа равновесия диссоциации = к_б/к_а (М).

Для получения значения аффинности 146В7 к человеческому ИЛ-15 (ЫЕ-15) проводят различные процедуры. Человеческий рекомбинантный ИЛ-15 от двух различных производителей (Итшилех Согр., 8еай1е, и8А аηб Рерго1есй, Яоску Ηΐ11, ΝΙ, и8А) связывают с сенсорным чипом СМ5. Соединение, связанное с сенсорным чипом, определяют как лиганд. В других экспериментах в качестве лиганда используют 146В7.

- 34 014802

В каждом варианте кинетического анализа связывание аналита, 146В7 или ЫЬ-15, адаптированного к лиганду, связанному с сенсорным чипом, сравнивают со связыванием с эталонным контрольным сенсорным чипом СМ5. Тестируют серийные разведения аналита (0, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 мкг/мл). Кривые ассоциации и диссоциации аппроксимируют для мономерного взаимодействия в соответствии с моделью Ьапдтшг 1:1 для определения к_а и к_б и для вычисления К_А и К_о. Все данные анализируют с использованием программы ΒIА-Еνа1иаΐ^οп, версия 3.1. Для бивалентного взаимодействия используют модель бивалентного аналита. Все анализы корректируют относительно смещающейся базовой линии.

Для определения аффинности антитела 146В7 данную аффинность антитела 146В7 измеряют относительно человеческого рекомбинантного ИЛ-15, полученного от двух производителей, 1ттипех и Рерго1еск на приборе В1АС0КЕ 3000. Моновалентное взаимодействие определяют с использованием 146В7 в качестве лиганда и ЫЬ-15 в качестве аналита (аппроксимация кривой Ьапдтшг 1:1).

Аффинность 146В7 к ИЛ-15 (1ттипех Согр.) измеряют следующим образом.

Константа скорости ассоциации к_а: 1,07 (± 0,17)х10⁵ М^-1 с^-1.

Константа скорости диссоциации к_б: 6,56 (± 0,09)х10^-3 с^-1.

Константа равновесия ассоциации К_А: 1,55 (± 0,21) х10⁷ М^-1.

Константа равновесия диссоциации К_с: 6,59 (± 0,88)х 10^-8 М.

Для определения авидности 146В7 в качестве лиганда используют ИЛ-15 (1ттипех Согр.) и в качестве аналита используют 146В7. При анализе полученных данных с использованием аппроксимации кривой Ьапдтшг (1:1), отражающей бивалентное взаимодействие антитела, определяют авидность антитела.

Авидность 146В7 в отношении ИЛ-15 (1ттипех Согр.) измеряют следующим образом.

Константа скорости ассоциации к_а: 7,30 (± 0,81)х10⁵ М^-1 с^-1.

Константа скорости диссоциации к_б: 1,45 (± 2,05)х10^-3 с^-1.

Константа равновесия ассоциации К_А: 5,03 (± 3,40)х10⁸ М^-1.

Константа равновесия диссоциации К_с: 1,55 (± 1,24)х10^-9 М.

Определяют также аффинность и авидность 146В7 в отношении ИЛ-15, полученного от Рерго)есй. Не обнаруживают никаких важных различий в аффинности или авидности ИЛ-15, полученного из разных источников.

Как описано в примере ниже, касающемся подавления индуцируемой человеческим интерлейкином-15 (ЫЬ-15) пролиферации клеток СТЬЬ-2 и РВМС полностью человеческим антителом против ИЛ-15, 146В7 подавляет дозазависимым образом индуцируемую ИЛ-15 пролиферацию, что измеряют по включению [³Н]-тимидина. 1С5₀-концентрация 50% ингибирования, как более функциональное определение аффинности, на основании данных экспериментов по подавлению пролиферации по расчетам составляет 3,1 ± 0,91 нМ. Данное значение 1С₅₀ согласуется с авидностью, измеряемой с помощью прибора В1АС0КЕ 3000 (КО 1,5 нМ) при использовании 146В7 в качестве лиганда и рекомбинантного человеческого ИЛ-15 в качестве аналита, и подтверждает значения аффинности и авидности, полученные в данной работе.

Пример 7. Ингибирование индуцируемой ЫЬ-15 продукции ΪΝΕ-α полностью человеческими антителами против ИЛ-15.

Эффект полностью человеческих антител против ИЛ-15 146В7, 146Н5, 404Е4 и 404А8 на индуцируемую ИЛ-15 продукцию ΪΝΤ-α изучают с использованием мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), выделенных от здоровых добровольных участников эксперимента с использованием следующих процедур. Для оценки специфичности ИЛ-15 исследуют также эффект данных антител на опосредуемую ИЛ-2 продукцию ТИР-а.

Культура клеток.

Культуры поддерживают в КРМ1-1640 с добавлением 2мМ Ь-глутамина, 100 Ιυ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (все вещества приобретают в фирме Ь1£е Тесйпо1од1ек, Ра1к1еу, 8со!1апб) и 10% инактивированной нагреванием сыворотке телячьих эмбрионов (НуС1опе, Шай, и8А).

Очистка мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС).

В свежую человеческую кровь, взятую у добровольных участников эксперимента после согласия на основе полученной информации, добавляют гепарин для предохранения от свертывания. Очистку РВМС осуществляют путем центрифугирования в градиенте плотности с использованием фиколла (РйагшаЫа, иррка1а, 8\\'ебеп).

Тест-соединение.

ЫЬ-15, партия по: 6870-011, 1ттипех согр., 8еай1е, ^акЫпд)оп, и8А.

ЫЬ-2, СЫгоп Вепе1их ВУ, Атйегбат, Тйе №!йег1апбк.

Используемые полностью человеческие антитела: 146В7 (серия: 070101), 146В7КО1^07, 404А8 (серия: 030101), 404Е4 (серия: 080101) и изотипическое контрольное антитело Т1 (97-2В11-2В12, серия: 190900).

Ингибирование индуцируемой человеческим ИЛ-15 (ЫЬ-15) или ЫЬ-2 продукции ΊΝΡ-α в РВМС с помощью антител против ИЛ-15.

РВМС культивируют в трех или четырех повторностях в 96-луночных плоскодонных платах в кон

- 35 014802 центрации 1.5 х 10⁵ клеток/лунку в присутствии и в отсутствие ЫЬ-2 или ЫЬ-15 и с добавлением или без добавления антитела против ИЛ-15. Изотипическое контрольное антитело (Т1) включают в качестве отрицательного контроля. Конканавалин А (в концентрации 2.5 мкг/мл. Са1ЫосНет) добавляют в качестве положительного контроля для пролиферации. Клетки инкубируют в течение 72 ч при 37°С и содержании 5% СО₂. Супернатанты собирают для определения количества человеческого ΤΝΕ-α с помощью ЕЫ8А (И-СуТесЬ. ЫгесНЕ ТНе №1Нег1апб8).

Эффекты 146В7 и изотипического контрольного антитела тестируют в отношении опосредованной ИЛ-15 продукции Т>-а в РВМС. 146В7 подавляет опосредованную ИЛ-15 продукцию Т№-а дозазависимым образом. тогда как изотипическое контрольное антитело не подавляет индуцированную ИЛ-15 продукцию Т№-а (см. фиг. 6). Представлены данные по двум здоровым добровольным участникам эксперимента. 404Е4 и 404А8 не способны подавлять индуцированную ИЛ-15 продукцию Т№-а.

Для того чтобы убедиться в специфичности антител против ИЛ-15. оценивают их эффект на опосредованную ЫЬ-2 продукцию Т№-а. 146В7 не индуцируют никакого ингибирования опосредованной ИЛ-2 продукции Т№-а (см. фиг. 7). Не обнаруживают никакого дозазависимого ингибирования опосредованной ЫЬ-2 продукции Т№-а ни со стороны 404Е4. ни со стороны 404А8.

Дозазависимое ингибирование опосредованной ЫЬ-15 продукции Т№-а отмечают только у 146В7. но не у 404Е4 и 404А8. Подавляющий эффект является специфическим для ЫЬ-15; не происходит ингибирование ИЛ-2-опосредованной продукции Т№-а.

Пример 8. Ингибирование индуцируемой человеческим интерлейкином-15 (ЫЬ-15) пролиферации клеток СТЬЬ-2 и РВМС полностью человеческими антителами против ИЛ-15.

Антитела 146В7. 146Н5. 404Е4 и 404А8 тестируют в отношении их способности подавлять пролиферацию Т-клеток с использованием клеток СТЬЬ-2 (см. статью 611118 и соавт.. 1978) и мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) с помощью следующих процедур.

Культура клеток.

Культуры поддерживают в КРМ1-1640 с добавлением 2мМ Ь-глутамина. 100 Ш/мл пенициллина. 100 мкг/мл стрептомицина (все вещества приобретают в фирме ЫГе ТесНпо1од1е8. Ра181еу. 8со11апб) и 10% инактивированной нагреванием сыворотке телячьих эмбрионов (НуС1опе. и1аН. и8А). Клетки СТЬЬ-2 (см. статью 611118 и соавт.. 1978) поддерживают в вышеупомянутой среде с добавлением 36 единиц ЫЬ-2/мл (СЫгоп Вепе1их ВУ. Ат81егбат. ТНе №1Ьег1апб8) при дефиците ЫЬ-2 в течение 3-4 дней до начала эксперимента. Клетки СТЬЬ-2 трижды промывают перед использованием.

Очистка мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС).

В свежую человеческую кровь. взятую у добровольных участников эксперимента после согласия на основе полученной информации. добавляют гепарин для предохранения от свертывания. Очистку РВМС осуществляют путем центрифугирования в градиенте плотности с использованием фиколла (РНагтаЫа. иррка1а. 8\уебеп).

Тест-соединение.

ЫЬ-15. партия по: 6870-011. Гттипех согр.. 8еаЫе. ’№а8Ыпд!оп. и8А.

ЫЬ-2. СЫгоп Вепе1их ВУ. Ат81егбат. ТНе №1Ьег1апб8.

Антитела против ИЛ-15. используемые для анализа СТЬЬ-2 в данной работе. представляют на фиг. 8: 146В7. 146Н5. 404А8. 404Е4.

Антитела против ИЛ-15. используемые для анализа РВМС: 146В7 (серия: 070101). 404А8 (серия: 030101) и 404Е4 (серия: 080101).

Ингибирование индуцируемой человеческим ИЛ-15 (ЫЬ-15) или ЫЬ-2 пролиферации СТЬЬ-2 антителами против ИЛ-15.

В каждом эксперименте клетки засевают в трех повторностях в 96-луночные платы по 5х10³ клеток/лунку в присутствии или в отсутствие ЫЬ-2 или ЫЬ-15. Для оценки эффекта на пролиферацию добавляют каждое из четырех антител против ИЛ-15. Клетки инкубируют в течение 16 ч при 37°С и при содержании 5% СО₂. За четыре часа до сбора (Нагуе81ег 96 МасН II М. ТОМТЕС. Огапде СТ. и8А) добавляют [³Н]-тимидин (1 мКи/лунку. Атег8Нат Ь1Ге 8аепсе8. ЬЫ1е СНа1Гоп1. Виск1пЬат8Ыге. иК).

Как представляют на фиг. 8. 146В7 и 146Н5 снижают пролиферацию клеток СТЬЬ-2. индуцируемую ИЛ-15. дозазависимым образом. что отражается в уменьшении включения [³Н]-тимидина. Оба. как 404Е4. так и 404А8. неспособны блокировать индуцируемую ИЛ-15 пролиферацию клеток СТЬЬ-2.

Ингибирование индуцируемой человеческим ИЛ-15 (ЫЬ-15) или ЫЬ-2 пролиферации РВМС антителами против ИЛ-15.

РВМС культивируют в трех повторностях в 96-луночных платах с υ-образным дном (Штс. №1[де М.1пс ШетаЕопаГ Эептагк). по 5х10⁴ клеток/лунку в присутствии или в отсутствие ЫЬ-2 или ЫЬ-15 и антител против ИЛ-15. Конканавалин А (2.5 2.5 мкг/мл. Са1ЬюсНет) добавляют в качестве положительного контроля для пролиферации. Клетки инкубируют в течение 72 ч при 37°С и содержании 5% СО2. За 16 ч до сбора (Нагуе81ег 96. ТОМТЕС. Огапде СТ. и8А) добавляют [³Н]-тимидин (1 мКи/лунку. Атег8Нат Ь1Ге 8аепсе8. ЬЫ1е СНа1Гоп1. Виск1пЬат8Ыге. иК).

146В7 обладает способностью ингибировать индуцируемое ИЛ-15 включение [³Н]-тимидина доза

- 36 014802 зависимым образом и, следовательно, ингибировать пролиферацию (1С₅₀ = 3,1 ± 0,91 нМ). Оба, как 404Е4, так и 404А8 неспособны блокировать пролиферацию РВМС, индуцируемую ЫЬ-15. 146Н5 не тестируют в соответствии с данными, полученными в предварительно проведенных экспериментах. Для того чтобы удостовериться в специфичности 146В7, 404Е4 и 404А8 в отношении ИЛ-15, данные антитела оценивают также по их эффектам в отношении 1Ь-2-опосредованной пролиферации. Ни одно из тестируемых антител против ИЛ-15 не обладает эффектом на пролиферацию, индуцируемую 1Ь-2 (см. фиг. 9).

Пример 9. Человеческое антитело против ИЛ-15 146В7 связывается с человеческим ИЛ-15, присутствующим на человеческих РВМС.

Тест-соединения.

Человеческие РВМС получают от здоровых добровольных участников эксперимента после согласия на основе полученной информации. Используют антитело 146В7 (серия по. ΜΌΧ015), Мебагех ГИС., Мйрйак, СА, И8А.

Биотинилирование 146В7 и человеческого 1с.|С.

№гидроксисукцинимидобиотин (8щта) сначала разводят в ДМСО (диметилсульфоксид) (конечная концентрация 100 мг/мл), а затем в 0,1 М NАНСОз (конечная концентрация 1 мг/мл, 8щта). На 1 мг антитела, разведенного в 1 мл, добавляют 600 мкл раствора биотина (в темноте, экспозиция 2 ч при комнатной температуре). Раствор антитела-биотина диализуют в кассете для диализа к11бе-а-1у/ег™ (10,000 М\\^;С'О, Р1егсе, РегЬю 8аепсе, №(йег1апбк) (в течение ночи при 4°С) для удаления несвязанного биотина. На следующий день проводят спектрофотометрическое определение концентрации биотинилированных антител (ИЙгокрес 2100рго) при ΟΌ (оптической плотности) 280 нм.

Стимуляция периферической крови.

Для индукции ИЛ-15 кровь берут из вены здоровых добровольных участников эксперимента. РВМС культивируют в ВРМ1 1640 (Вю\\'1Ш1акег Еигоре) с добавлением пенициллина (5 ед./мл), стрептомицина (50 мкг/мл), Ь-глутамина (2мМ) (Вю\\'1Ш1акег Еигоре) и 10% сыворотки телячьих эмбрионов (ОрΙίιηιιιη С241, МиШсей, νί^πΐ 1пс.) максимум в течение 2 дней (37°С) и проводят стимуляцию 500 ед./мл ΙΕ№γ (интерферона-γ) (Воейпдег 1пде1йе1т).

Проточная цитометрия.

Клетки предварительно инкубируют с 10% человеческой сывороткой АВ (СЬВ, Атк(егбат, №(йег1апбк) в ВРМ1 1640 (Вю\\'1Ш1акег Еигоре) с добавлением пенициллина (5 ед./мл), стрептомицина (50 мкг/мл), Ь-глутамина (2 мМ) (Вю\\'1Ш1акег Еигоре) и 10% сыворотки телячьих эмбрионов (Орйтит С241, Ми1йсе11, νί^πΐ 1пс.). После нарушения проницаемости клеточной мембраны (пермеабилизации) (20 мин, 4°С с использованием набора Су(ойх/Су1орегт™, ВесЮп Пккшкоп, 8ап П1едо, СА) и отмывания в буфере РегтЖакй (набор СуЮПх/СуЮрегт) в РВМС проявляют ИЛ-15 с помощью проточной цитометрии. Для достижения постоянной проницаемости используют буфер Регт^акй (набор СуЮПх/СуЮрегт) в течение всей процедуры проявления. Затем после инкубирования клеток с биотинилированным 146В7 или биотинилированным й1дС1 (20 мкг/мл, 30 мин, 4°С) и отмывания в буфере Регш^акй клетки инкубируют со стрептавидин-фикоэритрином (ОАКО) в течение 30 мин (4°С). После анализа с помощью проточной цитометрии (ЕАС8 СайЬиг, ВесЮп Оюкткоп) при установке дискриминационного окна на моноциты определяют интенсивность флуоресценции по меньшей мере 5000 клеток/образец с использованием программного обеспечения Се110иек1 Рго. Данные показывают коэффициент стимуляции (8.Ι.), который вычисляют следующим образом: 8.Ι. = (средняя флуоресценция положительного окрашивания)/(средняя флуоресценция фонового окрашивания).

Иммуноцитохимия.

Для детекции ИЛ-15, присутствующего в человеческих моноцитах, делают препараты образцов цельной крови с помощью цитоцентрифуги. После осаждения 5х10⁴ клеток (200 мкл) на покровные стекла для микроскопирования 8ирегГгок1®-Р1ик(Мепхе1), покровные стекла подсушивают на воздухе (< 60 мин), фиксируют в 2% параформальдегиде/РВ8 (8 мин, 4°С), промывают в РВ8 и снова подсушивают на воздухе. Перед окрашиванием у препаратов, полученных с помощью цитоцентрифуги, нарушают клеточную мембрану в РВ8 с добавление 0,1% сапонина (РВ88), который впоследствии используют во всей процедуре окрашивания. Для блокирования активности эндогенной пероксидазы препараты, полученные с помощью цитоцентрифуги, инкубируют с 0,05% (об./об.) пероксидом водорода (Н₂О₂), разведенным в цитратно-фосфатном буфере (рН 5,8, 20 мин, при комнатной температуре). После отмывания в РВ88 активность эндогенного биотина блокируют в соответствии с инструкциями изготовителя (набор для блокирования биотина, УесЮг ЬаЬ., ОАКО). После отмывания с помощью РВ88 центры неспецифического связывания блокируют посредством инкубирования препаратов, полученных с помощью цитоцентрифуги, с 10% (об./об.) человеческой объединенной сывороткой АВ (СЬВ, Атйегбат, №(йег1аибк) (30 мин) в РВ88. После этого препараты, полученные с помощью цитоцентрифуги, инкубируют с биотинилированным первичным антителом (60 мин при комнатной температуре) и (после отмывания в РВ88) со стрептавидином, комплексированным с биотинилированной пероксидазой хрена (к1гер(АВСотр1ех/НВР, ОАКО; разведение 1:100 в РВ88, содержащим 2% человеческой сыворотки АВ, в течение 30 мин при комнатной

- 37 014802 температуре). После отмывания в РВ88 препараты, полученные с помощью цитоцентрифуги, инкубируют с З-амино-9-этилкарбазолом (0,5 мг/мл) и Н₂0₂ (0,01%) в буфере на основе цитрата натрия (50 мМ, рН 4,9) в течение 10 мин (при комнатной температуре) с целью детекции активности НВР (пероксидазы хрена). Препараты, полученные с помощью цитоцентрифуги, отмывают под струей водопроводной воды в течение 5 мин, проводят контрастное окрашивание гематоксилином (ΌΛΚΟ) в течение одной минуты, отмывают под струей водопроводной воды в течение еще 5 мин и заключают в фарамаунт или глицергель (БАКО).

Проточная цитометрия.

Связывание 146В7 со стимулированными ΙΕΝ-γ человеческими моноцитами представлено на фиг. 12. Биотинилированное 146В7 связывается с нестимулированными моноцитами, демонстрируя присутствие ИЛ-15 в нестимулированных клетках. Стимуляция моноцитов с помощью ΙΕΝ-γ приводит к повышению связывания 146В7 с клетками при достижении максимума на первый день культивирования. Контрольное антитело ЫдС1 демонстрирует слабое связывание с нестимулированными моноцитами. Стимуляция с помощью ΙΕΝ-γ повышает связывание ЫдС1, обусловленное повышенной экспрессией рецепторов Εсγ на моноцитах.

Иммуноцитохимия.

На фиг. 13 представляют окрашивание человеческих моноцитов 146В7 или контрольным антителом ЫдС1. Прозрачное красное окрашивание цитоплазмы наблюдают после инкубирования клеток с 146В7, но не с контрольным антителом. Соответственно, 146В7 связывает ЫЬ-15 в моноцитах, и данное связывание возрастает после стимуляции ΙΕΝ-γ. На фиг. 13 показывают также, что окрашивание ИЛ-15 в основном является внутриклеточным.

Пример 10. Человеческое антитело против ИЛ-15 146В7 связывает ИЛ-15 в тканях по данным иммуногистохимии.

Тест-соединения.

Образцы ткани человеческой пораженной псориазом кожи получают после согласия на основе полученной информации. Бошке УШабкеп, Отделение дерматологии, Университетская больница Сеп(ойе, Сорепйадеп, Бептагк.

Антитело 146В7 (серия по. МБХ015), Мебагех, Мбрйак, СА, И8А.

Биотинилирование 146В7 и человеческого к|С.

Ν-гидроксисукцинимидобиотин (81дта) сначала разводят в ДМСО (конечная концентрация 100 мг/мл), а затем в 0,1 М NАΗСОз (конечная концентрация 1 мг/мл, 81дта). На 1 мг антитела, разведенного в 1 мл, добавляют 600 мкл раствора биотина (в темноте, экспозиция 2 ч при комнатной температуре). Раствор антитела-биотина диализуют в кассете для диализа ккбе-а-йхег™ (10,000 М^СО, Р1егсе, РегЫо 8с1епсе, №Лег1апбк) (в течение ночи при 4°С) для удаления несвязанного биотина. На следующий день проводят спектрофотометрическое определение концентрации биотинилированных антител (ИЙтокрес 2100рго) при ОБ 280 нм.

Иммуногистохимия.

Ткани хранят при -80°С до проведения анализа. После оттаивания срезы тканей фиксируют в ацетоне (10 мин при комнатной температуре) и подсушивают на воздухе. Для блокирования активности эндогенной пероксидазы срезы инкубируют с 0,05% (об./об.) пероксидом водорода (Н₂О₂), разведенным в цитратно-фосфатном буфере (рН 5,8, 20 мин, при комнатной температуре). После отмывания в РВЗ-Твин 20 (РВЗТ, 0,05% об./об.) активность эндогенного биотина блокируют в соответствии с инструкциями изготовителя (набор для блокирования биотина, Уес(ог ЬаЬ., БАКО). После отмывания с помощью РВЗТ центры неспецифического связывания блокируют посредством инкубирования срезов с 10% (об./об.) человеческой объединенной сывороткой АВ (СЬВ, Атйегбат, №Шег1апбк) (30 мин) в РВЗТ. Сыворотку удаляют промоканием, а затем инкубируют срезы с биотинилированным первичным антителом (146В7 или ЫдС1), разведенным в РВЗ, содержащем 2% человеческой сыворотки АВ, в течение 60 мин при комнатной температуре. Срезы отмывают в РВЗТ. После отмывания в РВЗТ все срезы тканей инкубируют со к!гер(АВСотр1ех/НВР (БАКО; 1:100, разведенном в РВЗ, содержащем 2% человеческой сыворотки АВ в течение 30 мин при комнатной температуре). После отмывания в РВЗТ срезы инкубируют с З-амино-9-этилкарбазолом (0,5мг/мл) и Н₂О₂ (0,01%) в буфере на основе цитрата натрия (50 мМ, рН 4,9) в течение 10 мин (при комнатной температуре) с целью детекции активности НВР. Срезы отмывают под струей водопроводной воды в течение 5 мин, проводят контрастное окрашивание гематоксилином (БАКО) в течение одной минуты, отмывают под струей водопроводной воды в течение еще 5 мин и заключают в ГагатошЦ или глицергель (БАКО).

Результаты.

Прозрачное окрашивание цитоплазмы кератиноцитов в пораженной псориазом коже наблюдают после окрашивания срезов тканей 146В7, но не контрольным антителом (см. фиг. 14; 146В7 окрашивает ИЛ-15-положительные кератиноциты, полученные из псориазных бляшек).

Пример 11. Человеческое антитело против ИЛ-15.

146В7 блокирует ИЛ-15 в химерных тканях типа мышь 8СШ-человек, что приводит к значительно

- 38 014802 му подавлению воспаления как в тканях, пораженных псориазом, так и в тканях, пораженных артритом.

Тест-соединения.

Синовиальная ткань получена от пациентов с ювенильным ревматоидным артритом после согласия на основе полученной информации; А1ехе1 Сгот, Отделение детской ревматологии, Медицинский центр детской больницы, Сшсшпаб, ОЫо, И8А.

Биоптаты кератом - образцы ткани получены после согласия на основе полученной информации. Ьошке УШабкеп, Отделение дерматологии, Университетская больница СегИоПе. СорепЫадеп, Эепшагк.

Антитело 146В7 (серия по. ΜΌΧ015), Мебагех 1пс., Мбркак, СА, И8А для экспериментов с целью исследования псориаза.

Антитело 146В7 (серия по. 15-00ΒΌΐν07), Мебагех 1пс., Мбрйак, СА, И8А для экспериментов с целью исследования ревматоидного артрита.

Блокирование ИЛ-15 в химерных синовиальных тканях типа мышь 8СШ-человек.

Образцы свежей синовиальной ткани получают от пациентов с ювенильным ревматоидным артритом после хирургических операций по замене сустава. Образцы отбирают в стерильных условиях. Измельченные фрагменты ткани из целого образца синовиальной ткани тщательно перемешивают, добиваясь гомогенности каждого препарата. Измельченные ткани (2-4 трансплантата/животное; 100 мг/один участок) трансплантируют подкожно в области спины мышей 8ΟΙΌ/Ν0Ό (басккоп ЬаЬогаЮпек). Каждое животное получает 146В7 (500 мкг, внтурибрюшинно (1.р.)) или РВ8 в день имплантации трансплантата и в дни 7, 14 и 21 после имплантации. Животных умерщвляют в день 28 после имплантации. Синовиальные трансплантаты вырезают и помещают в формалин для окрашивания Н&Е (гематоксилином/эозином).

Количественная оценка окрашивания Н&Е тканей, полученных из химерных синовиальных тканей типа мышь 8СШ-человек (модификация методики, предложенной в статье Ьейг и соавт., 1. НШосйет. СуЮсйет., 1997, 45:1559).

После получения цифровых изображений (2600x2060, )р§) срезов химерных синовиальных тканей типа мышь 8СШ-человек с использованием объектива Х10 (2е1кк тюгоксоре; программа АхюуШоп), данные анализируют с помощью компьютера, используя программу РйоЮкйор, версия 6.0 (АбоЬе 8ук1ешк, Моип1аш У1ете, СА) и уменьшают разрешние до 1300x1300 пиксел.

В каждом срезе выбирают 6x10 полей для наилучшего отражения общего окрашивания ткани на целом предметном стекле. После отбора всех окрашенных ядер (волшебная палочка на темном ядре при допуске 10) строят график оптической плотности выбранной площади и регистрируют среднюю интенсивность окрашивания (после выбора команды гистограммы аналогичного изображения). Затем выбирают фон и проводят количественную оценку окрашивания (волшебная палочка на фоне при допуске 10). Интенсивность окрашивания рассчитывают как разницу между окрашиванием ядер и окрашиванием фона. Это определяет цитохимический коэффициент в произвольных единицах. Данные представляют как среднее значение и к.е.т. (стандартная ошибка). Данные анализируют с использованием критерия Стьюдента.

Блокирование ИЛ-15 в химерных пораженных псориазом тканях типа мышь 8СШ-человек.

Биоптаты кератом получают из псориазных бляшек двух пациентов, делят и трансплантируют мышам С.В-17 8СЮ (басккоп ЬаЬогаЮпек). Через три недели после трансплантации мыши получают РВ8 (плацебо), СкА (циклоспорин А) (8апбох) в дозе 10 мг/кг на каждый второй день в течение 15 дней или 146В7 в дозе 20 мг/кг в день 1 и 10 мг/кг в дни 8 и 15. Через одну неделю после последней инъекции мышей умерщвляют и из каждого ксенотрансплантата берут пункционную биопсию 4 мм. Биоптаты фиксируют в формалине для заключения в парафин и окрашивают Н&Е и на ядерный антиген Κί-67.

Количественная оценка иммуногистохимического окрашивания тканей из химерных пораженных псориазом тканей типа мышь 8СШ-человек.

Окрашенные Н&Е срезы оценивают по толщине эпидермиса (М), степени паракератоза (от 0 до 3) и числу воспалительных мононуклеарных клеток в верхнем слое эпидермиса. Срезы, окрашенные на Κί-67, оценивают по числу циклирующих (митотически активных) кератиноцитов/мм² среза. Вычисляют средние значения для 4 мышей в каждой группе лечения и суммируют данные по каждому пациенту как среднее значение и к.е.т.

Модель 8СШ/ВА.

Микроскопическое исследование срезов показывает, что наиболее темноокрашенные ядра находятся в инфильтрующихся клетках. Вследствие этого число ядер (измеренное как относительная площадь поверхности) считают мерой инфильтрации. Инъекция 146В7 уменьшает число клеток, инфильтрующихся в воспаленную синовиальную ткань, по сравнению с введением носителя (см. фиг. 15а, р<0,05). На фиг. 15Ь проиллюстрированы эффекты 146В7 на инфильтрацию клеток в ксенотрансплантат синовиальной ткани и показано уменьшение числа клеток с темными ядрами по сравнению с введением носителя.

Модель 8СШ/псориаз.

На фиг. 16 представляют мышей 8СШ/псориаз, леченных 146В7 или контрольным препаратом. По

- 39 014802 сравнению с носителем (РВ8) инъекции 146В7 снижают тяжесть псориаза, определенную по толщине эпидермиса, который измеряют от рогового слоя до начала ограничивающей сети (см. фиг. 16А): РВ8 (177,8 ± 42,2 мкм), СкА (91,0 ± 15,2 мкм), 146В7 (62,5 ± 9,1 мкм). Уменьшение толщины наблюдают также при измерении от рогового слоя до самой глубокой части ограничивающей сети (см. фиг. 16В): РВ8 (433,8 ± 32,1 мкм), СкА (303,8 ± 62,9 мкм) и 146В7 (208,0 ± 33,8 мкм). Степень паракератоза также снижается при лечении 146В7 (см. фиг. 16С): РВ8 (1,6 ± 0,4), СкА (1,3 ± 0,3), 146В7 (0,5 ± 0,3). Более того, 146В7 снижает число воспалительных мононуклеарных клеток в верхнем слое дермы (см. фиг. 16Ό): РВ8 (33,3 ± 1,9 мононуклеарных клеток), СкА (19,4 ± 8,5), 146В7 (16,4 ± 0,1). Экспрессия человеческого белка Κί-67 жестко связана с пролиферацией клеток. В период интерфазы антиген может быть обнаружен исключительно в ядре, тогда как во время митоза большая часть белка переходит на поверхность хромосом. Тот факт, что белок Κί-67 присутствует на всех активных фазах клеточного цикла (С(1), 8, 0(2) и митоза), но отсутствует в покоящихся клетках (С(0)), делает его хорошим маркером для определения так называемой фракции роста данной популяции клеток. 146В7 снижает число циклирующих кератиноцитов Κ1-67+ (см. фиг. 16Е): РВ8 (247,9 ± 77,0), СкА (116,0 ± 24,1), 146В7 (73,8 ± 9,9).

Воздействие 146В7 подавляет инфильтрацию воспалительных клеток в воспаленную ткань на человеческих моделях ревматоидного артрита на 8СШ. Более того, у мышей 8СШ с имплантированными человеческими псориазными бляшками лечение с помощью 146В7 снижает тяжесть псориаза по сравнению с лечением СкА. Действительно, лечение 146В7 приводит к сильному снижению воспаления, толщины эпидермиса, числа делящихся кератиноцитов и тяжести паракератоза у человека/мышей 8СШ.

Пример 12. Человеческое антитело против ИЛ-15 146В7 распознает связанный с рецептором ИЛ-15. Тест-соединения.

РГдО1 - человеческое контрольное антитело (81дта).

Антитело 146В7-Мебагех Гпс., МЭХ015.

Клетки Ва_ц с конститутивной экспрессией ИЛ-15Ва (Майш О1епте, Τеηονик ВекеагсР ЬаЬогаЮгу, 8ои1Ратр1оп Оепега1 Нокр11а1, 8ои1Ратр1оп, υ.Κ.). Биотинилирование 146В7 и человеческого Ρ|Ο Ν-гидроксисукцинимидобиотин (81дта) сначала разводят в ДМСО (конечное разведение 100 мг/мл), а затем в 0,1 М NΑНСΟз (конечное разведение 1 мг/мл, 81дта). На 1 мг антитела, разведенного в 1 мл, добавляют 600 мкл раствора биотина (в темноте, экспозиция 2 ч при комнатной температуре). Раствор антитела-биотина диализуют в кассете для диализа кИбе-а-1ухег^|Л1 (10000 М^СО, Р1егсе, РегЬю 8с1епсе, №111ег1апбк) (в течение ночи при 4°С) для удаления несвязанного биотина. На следующий день проводят спектрофотометрическое определение концентрации биотинилированных антител ШРгокрес 2100рго) при ОЭ 280 нм.

Связывание 146В7 с комплексом ИЛ-15-ИЛ-15Ва в ЕЫ8А.

После покрытия (в течение ночи при комнатной температуре) плоскодонных планшетов для микротитрования (Огетег) с ИЛ-15Ва (В&Э кук1етк, М1ппеаро11к, М^ и8А) платы инкубируют с РВ8 и куриной сывороткой (2%, при комнатной температуре, 60 мин). Затем после отмывания в РВ8 (с добавлением 0,05% Твин 20: РВ8Т) платы инкубируют с различными разведениями немеченого ИЛ-15 (50 мкл, при комнатной температуре, Гттипех, 8еа111е, и8А). Через 10 мин в лунки добавляют биотинилированные антитела (50 мкл) в различных концентрациях (экспозиция 90 мин при комнатной температуре). После отмывания в РВ8Т платы инкубируют (60 мин при комнатной температуре) со стрептавидин-полипероксидаза хрена (СЬВ, Атйегбат, №1Рег1апбк), разведенным 1:10000 в РВ8Т-С (РВ8Т и 2% куриная сыворотка). Наконец, платы отмывают, а затем инкубируют с АВТ8 (азино-бис-3-этилбензтиазолинсульфокислотой, ВосРе Э1адпокРск, МаппРеш, Оегтапу) в буфере АВТ8 согласно протоколу изготовителя. Цветную реакцию останавливают 2% щавелевой кислотой (50 мкл). Связывание определяют при длине волны 405 нм с помощью ридера для ЕЬГ8А ЕЬ808 (Вю-Тек ШкРитеШк, ХУтооккк УТ, и8А).

Связывание 146В7 с комплексом ИЛ-15-ИЛ-15В на клетках Ва_ц.

Клетки Ва_р предварительно инкубируют (20 мин при 4°С) с 10% человеческой объединенной сывороткой АВ (СЬВ, Атйегбат, №1Рег1апбк) в буфере РАС8 (РВ8, 0,05% В8А, 0,02% NΑNΟз). Клетки Ва_р (в концентрации 1-2х10₅ клеток/мл) помещают в лунки и добавляют 50 мкл немеченого ИЛ-15 в нескольких концентрациях (разведенного в буфере РАС8 с 10% человеческой сывороткой АВ). После инкубирования клеток в течение 30 мин (при 4°С) и двукратного промывания в буфере РАС8 в лунки добавляют 50 мкл биотинилированного антитела (146В7 или ЫдО1) (экспозиция 30 мин при 4°С). После двукратного отмывания в буфере РАС8 в каждую лунку добавляют 50 мкл стрептавидин-фикоэритрина (экспозиция 30 мин при 4°С). После двукратного отмывания в буфере РАС8 клетки отбирают в 200 мл буфера РАС8 и определяют интенсивность флуоресценции по меньшей мере 5000 клеток/образец после анализа с помощью проточной цитометрии (РАС8 СаРЬиг, ВесЮп Эюкткоп) с использованием программного обеспечения Серией. Данные представляют коэффициент стимуляции (8.Ι.), который вычисляют следующим образом: 8.Ι. = (средняя флуоресценция положительного окрашивания)/(средняя флуоресценция фонового окрашивания).

ЕЫ8А.

Связывание 146В7 с комплексом ИЛ-15-ИЛ-15В в ЕЫ8А представляют на фиг. 19. Связывание

- 40 014802

146В7 усиливается при повышении концентраций ИЛ-15, связывающегося со своим рецептором. Не обнаруживают никакие эффекты связывания контрольного антитела с ИЛ-15 или ИЛ-15В.

Связывание с клетками Ва_ц, экспрессирующими ИЛ-15В.

Связывание 146В7 с комплексом ИЛ-15-ИЛ-15В на клетках Ва_ц представляют на фиг. 20. 146В7 связывается с комплексом ИЛ-15-ИЛ-15В дозазависимым образом. Не обнаруживают никакого связывания к1дО1 с комплексом ИЛ-15-ИЛ-15В на клетках Ва_р (см. фиг. 20).

146В7 способно связывать ИЛ-15 после связывания данного цитокина с его рецептором. 146В7 связывается с эпитопом на ИЛ-15, который не участвует в связывании с рецептором.

Приведенные ссылки.

ВаЛоп 1.М., Магйп В.У., Е1е1ксктапп В.М., Теккег кВ., ЗсНГГ М.Н., КеукГопе Е.С., Оепоуеке М.С., Уакко М.С., Моге1апб б.У., Уеауег А.Ь, Магкепкоп 1. и Етск В.К. Сравнение эффекта этанерцепта и метотрексата у пациентов с ранней стадией ревматоидного артрита (А сотрапкоп ок еГапегсерГ апб теЛоГгехаГе т рабепГк тебк еаг1у гкеита!о1б агЛпбк), Ν. Епд1. 1. Меб., 343:1586-93, (2000).

Еектдег Т.А. и Сабдшп М.А. Интерлейкин-15 - биология и участие в развитии заболеваний человека (1пГег1еикт 15: Ью1оду апб ге1еуапсе Ю китап б1кеаке), В1ооб, 97:14-28, (2001).

Е1кктебб О.М., О'Ооппе11 З.Ь., Вепдоескеа Т., Нибкоп Ό.ν., Нагбтд Е., Вегпкагб З.Ь, 1опек Ό., Кау В.М., Шддтк К.М., Зскгатт З.В. и ЬопЬегд Ν. Высокоавидные человеческие моноклональные антитела 1дОк из нового клона трансгенных мышей, несущих минилокус (Н1дк-ау1ббу Нитап 1дОк топос1опа1 апбЬоб1ек кгот а поуе1 к1гат ок Ш1ш1осик йапкдешс тке), Кйиге Ьюкскп., 14:845-51, (1996).

О1Шк З., Еегт М.М., Ои У. и Зтбк К.А. Фактор роста Т-клеток, параметры образования и количественный микроанализ активности (Т се11 дготеЛ ГасЮг: рагатеГегк ок ргобисбоп апб а диапШабуе ткгоаккау ког асбубу), 1. 1ттипо1., 120:2027-32, (1978).

Кеппебу М.К. и соавт. Обратимые дефекты Т-клеточных линий натуральных киллеров и клеток памяти СЭ8 у мышей с дефицитом ИЛ-15 (Веуегк1Ь1е бекесГк ш па1ига1 кб1ег апб тетогу СЭ8 Т се11 Нпеадек т Ι6-15 бекккпГ тке), 1. Ехр. Меб., 191:771-80, (2000).

К1гтап I., Уатег В. и №е1кеп О.Н. Интерлейкин-15 и его роль в хронических воспалительных заболеваниях (1пГег1еикт 15 апб бк го1е ш скгошс шйаттаФгу бкеакек), 1пк1атт. Век., 47:285-9, (1998).

Кбрре1 кН. Биотерапия ревматоидного артрита (Вю1одк Легару ког гкеитаЮ1б агЛпбк), Ν. Епд1. 1. Меб., 343:1640-1, (2000).

КоН1ег О. и М11к1ет С. Непрерывные культуры слитых клеток, секретирующих антитело заданной специфичности (Сопбпиоик сибигек ок кикеб се11к кесгебпд апбЬобу ок ргебеПпеб кресккбу), Книге, 256:495-7, (1975).

Ь1и С.С., Регикк1а В. и Уоипд Ю. Выявление роли ИЛ-15 в развитии НК-клеток (Тке етегдтд го1е ок Ι6-15 т ΝΕ-сеН беуе1ортепГ), 1ттипо1. Тобау, 21:113-6, (2000).

Ьоуе11 Ό.Ε, О1аптш Е.Н., Векк А., Сатектее11 О.О., Зкуегтап Е.Э., №с1оп кк, З1ет Ε.Ό., Оебака А., Потеке КТ., Уа11асе С.А., Укбтоге 1. и Етск В.К. Применение этанерцепта у детей с многосуставным ювенильным ревматоидным артритом (ЕГапегсер! ш сккбгеп текк ро1уагбси1аг Цуепке гкеита1о1б агЛпбк), Объединенная группа для проведения исследований в области детской ревматологии (Реб1а1гк ВкеитаГо1оду Со11аЬогабуе ЗГибу Огоир), Ν. Епд1. 1. Меб., 342:763-9, (2000).

Ма1ш В.К и Тау1ог Р.С. Антицитокиновая терапия ревматоидного артрита (Апб-су1окте Легару ког гкеита1о1б агЛгЛк), Аппи. Веу. Меб., 51:207-29, (2000).

Мс1ппек 1.В., а1-Мидка1ек 1., Е1е1б М., Ьеипд В.Р., Ниапд Е.Р., Э1хоп В., ЗЛггоск В.О., Уккшкоп Р.С. и Лете Ε.Υ. Роль интерлейкина-15 в миграции и активации Т-клеток при ревматоидном артрите (Тке го1е ок ЛкйеикЛ 15 т Т-се11 тдгабоп апб асбуабоп ш гкеита!о1б агЛгЛк), №11. Меб., 2:175-82, (1996).

Мс1ппек 1.В., Ьеипд В.Р., ЗГштоск В.Э.. Е1е1б М. и Лете Ε.Υ. Интерлейкин-15 опосредует зависимую от Т-клеток регуляцию продукции фактора некроза опухолей-α при ревматоидном артрите (1пГег1еикт-15 теб1а1ек Т се11-берепбепГ геди1абоп ок Гитог песгок1к касГог-а1рка ргобисбоп ш гкеитаЮ1б агЛгЛк), К-И. Меб., 3:189-95, (1997).

Мс1ппек 1.В. и Лете Ε.Υ. Провоспалительная роль интерлейкина-15 в развитии синовита при ревматоидном артрите (1пГег1еикт 15: а рго1пйатта1огу го1е ш ЛеитаЮ1б агЛгЛк купоуЛк), 1ттипо1. Тобау, 19:75-9, (1998).

Оррепке1тег-Магкк и соавт., 1. С1т. Луекбд., 101:1261-72, (1997).

Ребб О.К., Воппеб Т.Р., Ебептап 1., Зптуакап З., РахГоп В., Веегк С., Ьупск Ό., МШег В., Υокΐ 1., ОгаЬкГет К.Н. и СотЬо1х У.В. Исследование зависимости структуры-функции интерлейкина-15 с использованием сайт-специфического мутагеназа, конъюгирования с полиэтиленгликолем и моделирования на основе гомологии (ЗбисГиге-кипсбоп к1иб1ек ок 1пГег1еикш-15 иктд кбе-кресбтс тиГадепекк, ро1уеЛу1епе д1усо1 сопщдабоп, апб кото1оду тобекпд), 1. Вю1. Скет., 272:2312-8, (1997).

Вискак и соавт., 1. 1ттипо1., 160:5654-60, (1998).

Уа1бтапп Т., Тадауа Υ. и Ваткогб В. Интерлейкин-2, интерлейкин-15 и их рецепторы (1пГег1еикш-2, 1пГег1еикш-15, апб Лей гесерГогк), 1пГ. Веу. 1ттипо1., 16:205-26, (1998).

Уа1бтапп Т.А., Эикок З. и Тадауа Υ. Противоположные роли ИЛ-2 и ИЛ-15 в существовании и гибели лимфоцитов. Возможности применения в химиотерапии (СопГгакбпд Во1ек ок 1Ь-2 апб 1Ь-15 ш Ле

- 41 014802

1,1Ге апй 1)еа1к оГ Ьутркосу1е8, ИпрНсаИопк Гог !ттипо1кегару), ΙιηιηιιπιΙν, 14:105-110, (2001).

Vа1йтаππ Т.А. и Тадауа Υ. Многоаспектная регуляция экспрессии интерлейкина-15 и роль данного цитокина в дифференцировке НК-клеток и реакции хозяина на внутриклеточных патогенах (ТЬе тиШГасе!ей геди1айоп оГ ЫГеПеикт-^ ехргеззюп апй 1Не го1е оГ 1Ыз су!окте ίπ NК се11 сШТегепИаИоп апй Боз! гезропзе !о т1гасе11и1аг раШодепз), Аппи. Веу. ^типоР, 17:19-49, (1999).

Эквивалентные решения

Компетентные специалисты в данной области признают или имеют возможность установить при использовании не более чем рутинных экспериментов множество эквивалентных решений конкретных вариантов осуществления изобретения, описанных в данном контексте. Предусматривается, что данные эквивалентные решения охватываются следующей формулой изобретения. Предполагается, что любая комбинация вариантов осуществления, раскрываемых в зависимых пунктах формулы, входит в объем изобретения.

Включение посредством ссылки

Все публикации, патенты и находящиеся на стадии рассмотрения патентные заявки, приведенные в данном контексте, таким образом включены в виде ссылки во всей их полноте.

Перечень последовательностей < 110> Генмаб А/С <120> Человеческие моноклональные антитела к интерлейкину 15 (ИЛ-15), способ их получения и их использование, гибридома, трансфектома, экспрессионный вектор (варианты) <130> ОМ1-024РС <150> из 60/314,731 <151> 2001-08-23 <160> 4 <170> РазЙЕф Гог АУшйоууз Уегзюп 4.0 <210> 1 <211> 390 <212> ϋΝΑ <213> Ното заргепз <220>

<221> СОЗ <222> (1)...(390) <400> 1

дад

дед

сад

сед

дед

сад

есе

дда

дса

дад

дБд

ааа

аад

ссс

ддд

дад

48

01и

Уа1

ΘΙη

Ьеи

Уа1

ΘΙη

Зег

С1у

А1а

61и

Уа1

Ьуз

Ьуз

Рго

С1у

О1и

1

5

10

15

есе

сед

аад

аес

есс

еде

аад

дее

есе

дда

еас

еес

еее

асе

асе

Ьас

96

Зег

Ьеи

Ьуз

Не

Зег

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

С1у

Туг

РЬе

РЬе

ТЬг

ТЬг

Туг

20

25

30

сдд

аес

ддс

Рдд

дед

сдс

сад

аед

ссс

ддд

ааа

ддс

сед

дад

еае

аед

144

Тгр

Не

О1у

Тгр

Уа1

Агд

ΘΙη

Мее

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

Туг

Мее

35

40

45

ддд

аес

аес

СаЬ

ссе

ддс

дас

есе

дае

асе

ада

еас

аде

ссд

есс

еес

192

О1у

Не

Не

Туг

Рго

С1у

Азр

Зег

Азр

ТЬг

Агд

Туг

Зег

Рго

Зег

РЬе

50

55

60

саа

ддс

сад

дес

асе

аес

еса

дсс

дас

аад

есс

аес

аде

асе

дсс

еас

240

ΘΙη

О1у

ΘΙη

Уа1

ТЬг

Не

Зег

А1а

Азр

Ьуз

Зег

Не

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Сиу

сдд

> хм

4— х-^*4—

ООО

к-ссу

ау и

ау С

и. у

а.ау

У

ииу

у<аи

у и-ки.

иу

ьеи.

ьаь

'-'У и

0ОО

Ьеи

ΘΙη

Тгр

Зег

Зег

Ьеи

Ьуз

А1а

Зег

Азр

ТЬг

А1а

Мее

Туг

Туг

Суз

85

90

95

дед

ада

ддд

ддс

аас

сдд

аас

еде

еее

дас

еас

сдд

ддс

сад

дда

асе

336

А1а

Агд

С1у

О1у

Азп

Тгр

Азп

Суз

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

С1п

61у

ТЬг

100

105

110

сед

дес

асе

дес

есс

еса

дсс

есс

асе

аад

ддс

сса

Ссд

дес

еес

ссс

384

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

ТНг

Ьуз

С1у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Рго

115

120

125

сед дса 390

Ьеи А1а

Ί О Г\ <210> 2 <211> 130 <212> РКТ <213> Ното 8ар1еп8 <400> 2 <31и Уа1 ΘΙη Ьеи Уа1 ΘΙη Зег С1у А1а О1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у С1и

- 42 014802

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Ьуз

Ые

Зег

Суз

Ьуз

УаЬ

Зег

СЬу

Туг

РЬе

РЬе

ТЬг

ТЬг

Туг

20

25

30

Тгр

Ые

С1у

Тгр

УаЬ

Агд

СЬп

Мер

Рго

СЬу

Ьуз

О1у

Ьеи

СЬи

Туг

МеЬ

35

40

45

С1у

Ые

Ые

Туг

Рго

С1у

Азр

Зег

Азр

ТЬг

Агд

Туг

Зег

Рго

Зег

РЬе

50

55

60

СЬп

С1у

СЬп

УаЬ

ТЬг

Ые

Зег

А1а

Азр

Ьуз

Зег

Не

Зег

ТЬг

АЬа

Туг

65

70

75

80

Ьеи

СЬп

Тгр

Зег

Зег

Ьеи

Ьуз

А1а

Зег

Азр

ТЬг

А1а

Ме!

Туг

Туг

Суз

85

90

95

АЬа

Агд

ОЬу

СЬу

Азп

Тгр

Азп

Суз

РЬе

Азр

Туг

Тгр

СЬу

СЬп

СЬу

ТЬг

100

105

110

Ьеи

УаЬ

ТЬг

УаЬ

Зег

Зег

АЬа

Зег

ТЬг

Ьуз

ОЬу

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Рго

115

120

125

Ьеи

АЬа

130

<210> 3 <211> 357 <212> ϋΝΑ <213> Ното 8ар1епз <220>

<221> СО8 <222> (1)...(357) <400> 3

даа

аЬЬ

дьд

!!д

асд

сад

ЬсЬ

сса

ддс

асе

сСд

ЬсЬ

!!д

ЬсЬ

сса

ддд

48

СЬи

11е

УаЬ

Ьеи

ТЬг

СЬп

Зег

Рго

ОЬу

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

1

5

10

15

даа

ада

дсс

асе

сРс

Есе

Сдс

адд

дсс

ад!

сад

ад!

дС!

аде

аде

аде

96

СЬи

Агд

АЬа

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Агд

АЬа

Зег

СЬп

Зег

УаЬ

Зег

Зег

Зег

20

25

30

Бас

ЬЬа

дсс

!дд

Ьас

сад

сад

ааа

ссЬ

ддс

сад

дсЬ

ссс

адд

сЬс

сЬс

144

Туг

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

СЬп

СЬп

Ьуз

Рго

СЬу

СЬп

АЬа

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

35

40

45

аЕс

ЬаЕ

дд!

дса

Ьсс

сдс

адд

дсс

асЬ

ддс

а£с

сса

дас

адд

!Ьс

ад!

192

Ые

Туг

СЬу

АЬа

Зег

Агд

Агд

АЬа

ТЬг

СЬу

Ые

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

50

55

60

ддс

адЬ

ддд

ЬсЬ

ддд

аса

дас

ЬЬс

асЬ

сРс

асе

аЕс

аде

ада

сРд

дад

240

СЬу

Зег

СЬу

Зег

СЬу

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ые

Зег

Агд

Ьеи

СЬи

65

70

75

80

ССЬ

даа

даЬ

ЬЬЬ

дса

дьд

!аЬ

Сас

Ьд!

сад

сдд

ЬаЬ

ддс

аде

Сса

сас

288

Рго

СЬи

Азр

РЬе

АЬа

УаЬ

Туг

Туг

Суз

СЬп

Агд

Туг

СЬу

Зег

Зег

ΗΪ3

85

90

95

асЬ

ддс

сад

ддд

асе

аад

сЬд

дад

аЬс

аде

еда

асЬ

дьд

дсЬ

дса

336

ТЬг

РЬе

СЬу

СЬп

СЬу

ТЬг

Ьуз

Ьеи

СЬи

Ые

Зег

Агд

ТЬг

УаЬ

АЬа

АЬа

100

105

110

сса

ЬсС

д!с

ЕЬс

аЬс

РРс

ссд

357

Рго

Зег

УаЬ

РЬе

Ые

РЬе

Рго

115

<210> 4 <211> 119 <212> РКТ <213> Ното 8ар1еп8 <400> 4

СЬи 1

Ые

УаЬ

Ьеи

ТЬг 5

СЬп

Зег

Рго

СЬу

ТЬг 10

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго 15

СЬу

СЬи

Агд

АЬа

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Агд

АЬа

Зег

СЬп

Зег

УаЬ

Зег

Зег

Зег

20

25

30

Туг

Ьеи АЬа 35

Тгр

Туг СЬп СЬп

Ьуз 40

Рго ОЬу СЬп

АЬа

Рго Агд 45

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

ОЬу

АЬа

Зег

Агд

Агд

АЬа

ТЬг

ОЬу

1Ье

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

50

55

60

СЬу

Зег

СЬу

Зег

ОЬу

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Агд

Ьеи

СЬи

65

70

75

80

Рго

СЬи

Азр

РЬе

АЬа

УаЬ

Туг

Туг

Суз

СЬп

Агд

Туг

СЬу

Зег

Зег

НЬз

85

90

95

ТЬг

РЬе

ОЬу

СЬп

СЬу

ТЬг

Ьуз

Ьеи

СЬи

Ые

Зег

Агд

ТЬг

УаЬ

АЬа

АЬа

100

105

110

Рго

Зег

УаЬ

РЬе

Ые

РЬе

Рго

115

- 4З 014802

Claims (29)

1. Выделенное человеческое моноклональное антитело, которое связывается с человеческим ИЛ-15 и проявляет по крайней мере одно из следующих свойств: а) ингибирует индуцируемую ИЛ-15 продукцию Т№-а или пролиферацию Т-клеток; б) ингибирует индуцируемую ИЛ-15 пролиферацию Т-клеток при значении 1С₅₀ меньше чем приблизительно 100 нМ, как определено при анализе ингибирования пролиферации; в) ингибирует индуцируемую ИЛ-15 пролиферацию Т-клеток при значении 1С₅₀ меньше чем приблизительно 10 нМ, как определено при анализе ингибирования пролиферации; г) связывается с человеческим ИЛ-15 с константой равновесия диссоциации (К_с) ниже 10^-7 М, как определено с применением технологии поверхностного плазменного резонанса (8РК) при использовании рекомбинантного человеческого ИЛ-15 в качестве аналита и антитела в качестве лиганда; или д) связывается с эпитопом, находящимся на домене человеческого ИЛ-15, взаимодействующем β-цепью или γ-цепью, или его фрагмент.

2. Антитело по п.1, которое связывается с эпитопом, находящимся на домене человеческого ИЛ-15, взаимодействующем с γ-цепью.

3. Антитело по п.1, которое нарушает связывание Акр⁸ человеческого ИЛ-15 с β-субъединицей рецептора человеческого ИЛ-15 или связывание С1п¹⁰⁸ человеческого ИЛ-15 с γ-субъединицей рецептора человеческого ИЛ-15.

4. Антитело по любому из пп.1-3, содержащее вариабельную область тяжелой цепи антитела человека, имеющую 8ЕО ΙΌ Ν0:2, включающую последовательности СОК1, СЭК2 и СОК3, и вариабельную область легкой цепи антитела человека, имеющую 8ЕО ΙΌ Ν0:4, включающую последовательности СЭКЕ СЭК2 и СОК3, где СЭК3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 2, или указанную последовательность с консервативными модификациями; а ί.ΌΚ3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 3, или указанную последовательность с консервативными модификациями.

5. Антитело по п.4, в котором СЭК2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 2, или указанную последовательность с консервативными модификациями; а ί.ΌΚ2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 3, или указанную последовательность с консервативными модификациями.

6. Антитело по п.4, в котором ί.ΌΚ1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 2, или указанную последовательность с консервативными модификациями, а ί.ΌΚ1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 3, или указанную последовательность с консервативными модификациями.

7. Антитело по любому из пп.4-6, в котором СЭК3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 2, или указанную последовательность с консервативными модификациями; СЭК3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 3, или указанную последовательность с консервативными модификациями; ί.ΌΚ2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 2, или указанную последовательность с консервативными модификациями; СЭК2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 3, или указанную последовательность с консервативными модификациями; ί.ΌΚ1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 2, или указанную последовательность с консервативными модификациями; и ί.ΌΚ1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность СЭКЕ представленную на фиг. 3, или указанную последовательность с консервативными модификациями.

8. Антитело по любому из пп.1-7, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, происходящую из гена У_Н5-51 зародышевой линии человека, и вариабельную область легкой цепи, происходящую из гена У_КА27 зародышевой линии человека.

9. Антитело по любому из пп.1-8, способное связываться с комплексом человеческого ИЛ-15 и рецептора ИЛ-15.

10. Антитело по любому из пп.1-9, содержащее тяжелую цепь человеческого Ιβ6 и легкую каппацепь человеческого Ιβ6, включающее вариабельные области, кодируемые нуклеотидными последовательностями, представленными на фиг. 2 (8ЕО ΙΌ Ν0:1) и на фиг. 3 (8ЕО ΙΌ Ν0:3) соответственно, или нуклеотидными последовательностями, которые по крайней мере на 80% идентичны 8ЕО ΙΌ Ν0:1 или 3.

11. Антитело по любому из пп.1-9, содержащее вариабельные области тяжелой цепи и каппа-легкой цепи ΙβΟ, которые имеют аминокислотные последовательности, представленные на фиг. 2 (8ЕО ΙΌ Ν0:2) и на фиг. 3 (8ЕО ΙΌ Ν0:4) соответственно, или указанные последовательности с консервативными модификациями.

12. Антитело по любому из пп.1-9, содержащее вариабельные области тяжелой цепи и каппа-легкой цепи ΙβΟ, которые имеют аминокислотные последовательности, представленные на фиг. 2 (8ЕО ΙΌ Ν0:2) и на фиг. 3 (8ЕО ΙΌ Ν0:4) соответственно, или аминокислотные последовательности, которые по крайней мере на 80% идентичны 8ЕО ΙΌ Ν0:2 или 4.

13. Антитело по любому из пп.1-12, которое представляет собой одноцепочечное антитело.

- 44 014802

14. Антитело, способное связываться с человеческим ИЛ-15, характеризующееся тем, что оно состоит из одной полипептидной цепи, которая содержит по меньшей мере два домена СОК, связанных посредством синтетического линкера, причем указанная полипептидная цепь получена рекомбинантным методом, а упомянутые домены СОК выбраны из группы, состоящей из домена СОК1, содержащего аминокислотную последовательность СОК1, представленную на фиг. 2 (8ЕЦ ΙΌ N0:2) и на фиг. 3 (8ЕЦ ΙΌ N0:4) соответственно, или указанные последовательности с консервативными модификациями домена СОК2, содержащего аминокислотную последовательность СОК2, представленную на фиг. 2 (8ЕЦ ΙΌ N0:2) и на фиг. 3 (8ЕЦ ΙΌ N0:4) соответственно, или указанные последовательности с консервативными модификациями, а также домена СОК3, содержащего аминокислотную последовательность СОК3, представленную на фиг. 2 (8ЕЦ ΙΌ N0:2) и фиг. 3 (8ЕЦ ΙΌ N0:4) соответственно, или указанные последовательности с консервативными модификациями, причем указанное антитело обладает по меньшей мере одним из свойств, указанных в п.1.

15. Антитело по любому из пп.1-14, выбранное из группы, состоящей из Ι§Ο1, ЦС2, [дС3, ЦС4, ЦМ, ЦА1, ΙβΛ2, ЦАкес, Ι§ϋ и ЦЕ.

16. Антитело по любому из пп.1-14, которое содержит тяжелую цепь IдС1.

17. Антитело по любому из пп.1-16, продуцируемое гибридомой, которая включает В-клетку, полученную от трансгенного животного, отличного от человека, с геномом, содержащим трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, слитую с иммортализованной клеткой, где трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи кодируют тяжелую и легкую цепи антитела соответственно.

18. Способ ингибирования индуцируемой ИЛ-15, но не индуцируемой ИЛ-2 продукции ТЫЕ-а в Тклетках или моноцитах, в котором обеспечивают контактирование ИЛ-15 с антителом по любому из пп.1-17.

19. Способ ингибирования индуцируемой ИЛ-15, но не индуцируемой ИЛ-2 пролиферации Т-клеток, в котором обеспечивают контактирование указанных Т-клеток с антителом по любому из пп.1-17.

20. Способ по п.19, отличающийся тем, что Т-клетки представлены мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС) или клетками СТЬЬ-2.

21. Гибридома, содержащая В-клетку, полученную от трансгенного животного, отличного от человека, с геномом, содержащим трансген тяжелой цепи и трансген легкой цепи человека, слитую с иммортализованной клеткой, продуцирующая антитело по любому из пп.1-17, где трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи кодируют тяжелую и легкую цепи антитела соответственно.

22. Гибридома по п.21, которая продуцирует антитело, содержащее тяжелую цепь и легкую каппа-цепь человеческого ЦС.

23. Гибридома по любому из пп.21, 22, которая продуцирует антитело, содержащее тяжелую цепь человеческого ЦС и легкую каппа-цепь человеческого ЦС, включающее вариабельные области, кодируемые нуклеотидными последовательностями, представленными на фиг. 2 (8ЕЦ ΙΌ N0:1) и на фиг. 3 (8ЕЦ ΙΌ N0:3) соответственно, или нуклеотидными последовательностями, которые по крайней мере на 80% идентичны 8ЕЦ ΙΌ N0:1 или 3.

24. Гибридома по любому из пп.21-23 которая продуцирует антитело, содержащее вариабельные области тяжелой цепи и каппа-легкой цепи ЦС, которые имеют аминокислотные последовательности, представленные на фиг. 2 (8ЕЦ ΙΌ N0:2) и на фиг. 3 (8ЕЦ ΙΌ N0:4) соответственно, или указанные последовательности с консервативными модификациями.

25. Антитело по любому из пп.1-17, продуцируемое трансфектомой, содержащей нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь антитела человека.

26. Трансфектома, содержащая нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь антитела человека, которая продуцирует определяемое количество антитела по любому из пп.1-17.

27. Трансфектома по п.26, содержащая нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи антитела человека, имеющие нуклеотидные последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:1 и 8ЕЦ ΙΌ N0:3 соответственно, или нуклеотидные последовательности, которые по крайней мере на 80% идентичны 8ЕЦ ΙΌ N0:1 или 3.

28. Трансгенное животное, отличное от человека, продуцирующее антитело по любому из пп.1-17, имеющее геном, содержащий трансген тяжелой цепи и трансген легкой цепи антитела человека, где трансген тяжелой цепи и трансген легкой цепи кодируют тяжелую и легкую цепи антитела соответственно.

29. Способ получения антитела по любому из пп.1-12 или 14-17, отличающийся тем, что иммунизируют отличное от человека трансгенное животное, геном которого содержит трансген тяжелой цепи и трансген легкой цепи антитела человека, ИЛ-15 человека или клеткой, экспрессирующей человеческий ИЛ-15, вызывая продукцию антител в В-клетках животного, где трансген тяжелой цепи и трансген легкой цепи кодируют тяжелую и легкую цепи антитела соответственно, выделяют В-клетки животного, проводят слияние В-клеток с клетками миеломы с образованием бессмертных (иммортализованных) клеток гибридомы, секретирующих человеческие моноклональные антитела, специфические в отношении ИЛ-15, и выделяют человеческие.