ES2949173T3

ES2949173T3 - Formulaciones de anticuerpo

Info

Publication number: ES2949173T3
Application number: ES15772124T
Authority: ES
Inventors: Lan Le; Brian Connolly
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2014-09-15
Filing date: 2015-09-15
Publication date: 2023-09-26
Anticipated expiration: 2035-09-15
Also published as: US11370833B2; WO2016044334A1; CN106794247A; BR112017004393A2; CN106794247B; JP7072384B2; ZA201701461B; EP3193932A1; AU2015318001B2; JP2017528480A; KR20170057339A; JP2022084590A; EP3193932B1; IL250731A0; IL250731B; US20190161541A1; CA2959545A1; SG11201701821QA; RU2017112703A3; RU2017112703A

Abstract

La invención proporciona formulaciones farmacéuticas acuosas estables que comprenden un anticuerpo terapéutico, trehalosa, un tampón y un tensioactivo opcional, y que tienen un pH en el intervalo de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,0. La invención también proporciona métodos para preparar dichas formulaciones y métodos para usar dichas formulaciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones de anticuerpo

Campo de la invención

La presente invención se refiere a formulaciones farmacéuticas acuosas estables que comprenden anticuerpos.

Antecedentes de la invención

En los últimos años, los avances en biotecnología han hecho posible producir una variedad de proteínas para aplicaciones farmacéuticas usando técnicas de ADN recombinante. Debido a que las proteínas son más grandes y más complejas que los fármacos orgánicos e inorgánicos tradicionales (por ejemplo, poseen múltiples grupos funcionales además de estructuras tridimensionales complejas), la formulación de dichas proteínas plantea problemas especiales. Para que una proteína permanezca biológicamente activa, una formulación debe conservar intacta la integridad conformacional de al menos una secuencia central de los aminoácidos de la proteína mientras al mismo tiempo proteger los múltiples grupos funcionales de la proteína de la degradación. Las vías de degradación de las proteínas pueden implicar inestabilidad química (por ejemplo, cualquier proceso que implique la modificación de la proteína por la formación o escisión de enlaces que dé como resultado una nueva entidad química) o inestabilidad física (por ejemplo, cambios en la estructura de orden superior de la proteína). La inestabilidad química puede ser el resultado de la desamidación, racemización, hidrólisis, oxidación, eliminación beta o intercambio de disulfuros. La inestabilidad física puede ser el resultado de la desnaturalización, agregación, precipitación o adsorción, por ejemplo. Las tres vías de degradación de proteínas más comunes son la agregación de proteínas, la desamidación y la oxidación. Cleland et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377 (1993).

En las proteínas usadas para aplicaciones farmacéuticas se incluyen anticuerpos. Se han desarrollado formulaciones acuosas estables para anticuerpos farmacéuticos. Véase, por ejemplo, el documento WO 2011/084750. El documento WO2013/063510 se refiere a la estabilización de preparaciones de anticuerpos y divulga soluciones acuosas estables que comprenden bevacizumab y trehalosa en las que la proporción de anticuerpo con respecto a trehalosa es de 0,417. Todavía existe una necesidad en la técnica de una formulación farmacéutica acuosa estable que comprenda un anticuerpo, tal como un anticuerpo anti-VEGF y un anticuerpo anti-CD20, que mitigue la formación de dímeros, los agregados solubles y las partículas.

Sumario

En un aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas acuosas estables que comprenden (a) un anticuerpo monoclonal en una cantidad de 25 mg/ml a 100 mg/ml; (b) trehalosa en una cantidad de 45 mM a 634 mM; y (c) fosfato de sodio en una cantidad de 35 mM a 100 mM, en las que dicha formulación tiene un pH de 5,5 a 7,0, en las que la proporción en peso de dicho anticuerpo monoclonal con respecto a dicha trehalosa en la formulación es de 0,49 a 1,47, en las que dicha formulación es estable cuando se almacena a -20 °C o -40 °C durante al menos 6 meses, en las que el anticuerpo monoclonal es bevacizumab, y un tensioactivo opcional. En algunos modos de realización, la proporción en peso del anticuerpo monoclonal con respecto a la trehalosa es de 0,73 a 1,47. En algunos modos de realización, la proporción en peso del anticuerpo monoclonal con respecto a la trehalosa es cualquiera de 0,50, 0,55, 0,60, 0,65, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 1,00, 1,05, 1,10, 1,15, 1,20, 1,25, 1,30, 1,35, 1,40 y 1,45, incluyendo todos los valores entre estos números.

En algunos modos de realización, la formulación es para administración subcutánea. En algunos modos de realización, la formulación es para administración intraocular. En algunos modos de realización, la formulación es isotónica. En algunos modos de realización, la formulación tiene una osmolalidad de más de aproximadamente 240 mOsm/kg.

En algunos modos de realización, la formulación es para administración intravenosa.

En algunos modos de realización, el anticuerpo monoclonal en la formulación descrita en el presente documento está en una cantidad de aproximadamente 30 mg/ml a aproximadamente 90 mg/ml, de aproximadamente 35 mg/ml a aproximadamente 85 mg/ml, de aproximadamente 35 mg/ml a 75 mg/ml, de aproximadamente 40 mg/ml a aproximadamente 80 mg/ml, de aproximadamente 45 mg/ml a aproximadamente 70 mg/ml o de aproximadamente 45 mg/ml a aproximadamente 55 mg/ml. En algunos modos de realización, el anticuerpo monoclonal en la formulación es de 25 mg/ml, aproximadamente 30 mg/ml, aproximadamente 35 mg/ml, aproximadamente 40 mg/ml, aproximadamente 45 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 55 mg/ml, aproximadamente 60 mg/ml, aproximadamente 65 mg/ml, aproximadamente 70 mg/ml, aproximadamente 75 mg/ml, aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 85 mg/ml, aproximadamente 90 mg/ml, aproximadamente 95 mg/ml o 100 mg/ml, incluyendo todos los valores entre estos números. En algunos modos de realización, el anticuerpo monoclonal en la formulación es de aproximadamente 45 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml o aproximadamente 55 mg/ml.

En algunos modos de realización, la formulación descrita en el presente documento comprende la trehalosa en de 45 mM a aproximadamente 600 mM, de 45 mM a aproximadamente 550 mM, de 45 mM a aproximadamente 500 mM, de 45 mM a aproximadamente 450 mM, de 45 mM a aproximadamente 400 mM, de 45 mM a aproximadamente 350 mM, de 45 mM a aproximadamente 300 mM, de 45 mM a aproximadamente 250 mM, de 45 mM a aproximadamente 200 mM, de 45 mM a aproximadamente 180 mM, de 45 mM a aproximadamente 150 mM, de 45 mM a aproximadamente 140 mM, de 45 mM a aproximadamente 135 mM, de 45 mM a aproximadamente 130 mM, de 45 mM a aproximadamente 120 mM, de 45 mM a aproximadamente 110 mM, de 45 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 180 mM a 634 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 600 mM o de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 400 mM. En algunos modos de realización, la trehalosa en la formulación es aproximadamente 45 mM, aproximadamente 50 mM, aproximadamente 60 mM, aproximadamente 70 mM, aproximadamente 80 mM, aproximadamente 90 mM, aproximadamente 100 mM, aproximadamente 110 mM, aproximadamente 120 mM, aproximadamente 130 mM, aproximadamente 135 mM, aproximadamente 140 mM, aproximadamente 150 mM, aproximadamente 180 mM, aproximadamente 200 mM, aproximadamente 250 mM, aproximadamente 300 mM, aproximadamente 350 mM, aproximadamente 400 mM, aproximadamente 450 mM, aproximadamente 500 mM, aproximadamente 550 mM, aproximadamente 600 mM, aproximadamente 610 mM, aproximadamente 620 mM, aproximadamente 630 mM o 634 mM, incluyendo todos los valores entre estos números. En algunos modos de realización, la formulación comprende fosfato de sodio como tampón. En algunos modos de realización, el fosfato de sodio en la formulación es de 35 mM a 100 mM, de aproximadamente 40 mM a 100 mM, de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 90 mM o de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 75 mM. En algunos modos de realización, el fosfato de sodio en la formulación es aproximadamente 35 mM, aproximadamente 36 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 45 mM, aproximadamente 50 mM, aproximadamente 51 mM, aproximadamente 55 mM, aproximadamente 60 mM, aproximadamente 65 mM, aproximadamente 70 mM, aproximadamente 75 mM, aproximadamente 80 mM, aproximadamente 85 mM, aproximadamente 90 mM, aproximadamente 95 mM o 100 mM, incluyendo todos los valores entres estos números.

En algunos modos de realización, la formulación descrita en el presente documento comprende además un tensioactivo. En algunos modos de realización, el tensioactivo es polisorbato (tal como polisorbato 20) o poloxámero (tal como poloxámero 188). En algunos modos de realización, la concentración de tensioactivo es de un 0,01 % a un 0,1 %, de un 0,01 % a aproximadamente un 0,05 % o de aproximadamente un 0,02 % a aproximadamente un 0,04 %. En algunos modos de realización, la concentración de tensioactivo es de un 0,01 %, aproximadamente un 0,02 %, aproximadamente un 0,03 %, aproximadamente un 0,04 %, aproximadamente un 0,05 % o un 0,1 %, incluyendo todos los valores entre estos números.

En algunos modos de realización, la formulación descrita en el presente documento tiene un pH de 5,5 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 5,8 a aproximadamente 6,8, de aproximadamente 5,9 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,4 o de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,2. En algunos modos de realización, la formulación tiene un pH de aproximadamente 5,6, aproximadamente 5,8, aproximadamente 5,9, aproximadamente 6,0, aproximadamente 6,2, aproximadamente 6,4, aproximadamente 6,5, aproximadamente 6,8 o 7,0, incluyendo todos los valores entre estos números.

En algunos modos de realización, el anticuerpo monoclonal en la formulación descrita en el presente documento no se somete a liofilización anterior. En algunos modos de realización, el anticuerpo es bevacizumab. En algunos modos de realización, el anticuerpo monoclonal es susceptible de agregación.

En algunos modos de realización, la formulación descrita en el presente documento es estable a -20 °C durante al menos aproximadamente 6 meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 15 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 19 meses, al menos aproximadamente 20 meses o al menos aproximadamente 2 años. En algunos modos de realización, la formulación es estéril. En algunos modos de realización, la formulación es para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, la formulación es para administración intravenosa (i.v.), subcutánea (s.c.), intraocular (i.o.) o intramuscular (i.m.).

En otro aspecto, la invención proporciona artículos de fabricación que comprenden un recipiente que contiene una formulación farmacéutica acuosa estable descrita en el presente documento.

En algunos modos de realización, el recipiente es un vial con un tapón perforable por una jeringuilla, en el que el vial comprende una cualquiera de las formulaciones descritas en el presente documento. En algunos modos de realización, el vial se almacena a aproximadamente 2-8 °C. En algunos modos de realización, el vial se almacena a aproximadamente -20 °C. En algunos modos de realización, el vial es un vial de 3 ml, 20 ml o 50 ml.

En otro aspecto, la divulgación proporciona depósitos de acero inoxidable que comprenden una cualquiera de las formulaciones descritas en el presente documento en el interior del depósito. En algunos modos de realización, la formulación está congelada.

En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos de reducción de la agregación de un anticuerpo monoclonal terapéutico.

En otro aspecto, la divulgación proporciona procedimientos de preparación de una formulación farmacéutica que comprenden: (a) preparar una cualquiera de las formulaciones descritas en el presente documento; y (b) evaluar la estabilidad física, la estabilidad química o la actividad biológica del anticuerpo en la formulación. En algunos modos de realización, la estabilidad física, la estabilidad química o la actividad biológica del anticuerpo en la formulación se evalúa aproximadamente a los 6 meses, aproximadamente a los 12 meses, aproximadamente a los 18 meses o aproximadamente a los 24 meses después de almacenar la formulación (por ejemplo, a -20 °C o -40 °C).

En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos de tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto, que comprenden administrar una cualquiera de las formulaciones descritas en el presente documento a un sujeto en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o trastorno. En algunos modos de realización, el anticuerpo es bevacizumab. En algunos modos de realización, la enfermedad es cáncer. En algunos modos de realización, el cáncer se selecciona de cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer renal y glioblastoma.

Breve descripción de los dibujos

Las FIGS. 1A, 1B, 1C y 1D muestran la cristalización de trehalosa visual después de la nucleación inducida en la superficie de muestras congeladas con concentraciones farmacéuticamente pertinentes de trehalosa de (FIG. 1A) trehalosa al 0,0 % (p/v), (FIG. 1B) trehalosa al 2,0 % (p/v), (FIG. 1C) trehalosa al 4,0 % (p/v) y (FIG. 1D) trehalosa al 8,0 % (p/v).

La FIG. 2A muestra la solubilidad de sacarosa (1), trehalosa (2) y manitol (3) en función de la temperatura, como está marcado. La FIG.2B representa el porcentaje de especies de alto peso molecular de bevacizumab en diversas formulaciones crioprotectoras antes y después de la congelación y la nucleación inducida durante 28 días a -20 °C como se determina por HP-SEC, como está marcado.

Las FIGS. 3A, 3B y 3C muestran el incremento dependiente del tiempo en la agregación de muestras congeladas rápidamente de mAb1 (FIG. 3A), bevacizumab (FiG. 3B) y mAb3 (FiG. 3C) almacenadas congeladas a -20 °C (1), -14 °C (2) y -8 °C (3), como está marcado.

Las FIGS. 4A y 4B muestran cromatogramas de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) representativos de monómero, dímero y especies de alto peso molecular (HMWS) de mAb3. (FIG. 4A) Efecto de la tasa de congelación. Muestras de mAb3 congeladas a tasas de congelación lenta (1), normal (2) y rápida (3) (como está marcado) y almacenadas a -20 °C durante 12 meses. Se muestra el control del estudio (almacenado a -70 °C) para comparación. (FIG. 4B) Efecto de la temperatura de almacenamiento. Muestras de mAb3 congeladas a la tasa de congelación rápida y almacenadas a -20 °C (3), -14 °C (2) y -8 °C (1) durante 12 meses, como está marcado. Se muestra el control del estudio (almacenado a -70 °C) para comparación.

La FIG. 5 muestra los espectros NIR normalizados de las tres formas de trehalosa analizadas en este estudio: trehalosa amorfa (1), trehalosa anhidra (cristalina) (2) y dihidrato de trehalosa (cristalina) (3), como está marcado.

Las FIGS. 6A1-FIG. 6C3 muestran espectros NIR normalizados de muestras congeladas de (FIGS. 6A1, 6A2 y 6A3) mAb1, (FIGS. 6B1, 6B2 y 6B3) bevacizumab y (FIGS. 6C1, 6C2 y 6C3) mAb3 usando (FIGS. 6A1, 6B1 y 6C1) congelación lenta, (FIGS. 6A2, 6B2 y 6C2) congelación normal y (3) tasas de congelación rápida después de 12 meses de almacenamiento a -20 °C, -14 °C y -8 °C.

Las FIGS. 7A, 7B y 7C muestran las concentraciones de trehalosa amorfa (1) y cristalizada (2) en formulaciones con (FIG. 7A) 0 mg/ml de bevacizumab, (FIG. 7B) 25 mg/ml de bevacizumab y (FIG. 7C) 100 mg/ml de bevacizumab después de 12 meses de almacenamiento a -20 °C. Las FIG. 7D y 7E muestran diagramas de cajas que presentan el porcentaje de especies de alto peso molecular para formulaciones de trehalosa con (FIG. 7d ) 25 mg/ml de bevacizumab y (FIG. 7E) 100 mg/ml de bevacizumab después de 12 meses de almacenamiento a -20 °C.

Las FIGURAS. 8A y 8B muestran el porcentaje de dihidrato de trehalosa cristalizada (FIG. 8A) y el porcentaje de especies de alto peso molecular (FIG. 8B) en función de la proporción trehalosa:mAb total (p/p). Las especies de alto peso molecular se midieron usando HP-SEC y la concentración de dihidrato de trehalosa se determinó usando FT-NIR.

Descripción detallada

I. Definiciones.

Antes de describir la invención en detalle, se ha de entender que la presente invención no se limita a composiciones o sistemas biológicos particulares, que, por supuesto, pueden variar. También se ha de entender que la terminología usada en el presente documento es para el propósito de describir solo modos de realización particulares y no se pretende que sea limitante. Como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno/a" y "el/la" incluyen las referencias al plural a menos que el contenido lo indique claramente de otro modo. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una molécula" incluye opcionalmente una combinación de dos o más de dichas moléculas, y similares.

El término "aproximadamente" como se usa en el presente documento se refiere al intervalo de error normal para el valor respectivo fácilmente conocido para el experto en la técnica en este campo técnico. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) modos de realización que se refieren a ese valor o parámetro per se.

Se entiende que los aspectos y modos de realización de la invención descrita en el presente documento incluyen "que comprende", "que consiste en" y "que consiste esencialmente en" aspectos y modos de realización.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica del ingrediente activo sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación. Dichas formulaciones son estériles. Los excipientes (vehículos, aditivos) "farmacéuticamente aceptables" son los que se pueden administrar razonablemente a un sujeto mamífero para proporcionar una dosis eficaz del ingrediente activo empleado.

Una formulación "estéril" es aséptica o está libre o esencialmente libre de todos los microorganismos vivos y sus esporas.

Una formulación "congelada" es una que está a una temperatura inferior a 0 °C. En general, la formulación congelada no está liofilizada ni se somete a liofilización anterior o posterior. En determinados modos de realización, la formulación congelada comprende una sustancia farmacéutica congelada para almacenamiento (en un depósito de acero inoxidable) o un producto farmacéutico congelado (en la configuración del vial final).

Una formulación "estable" es una en la que la proteína en la misma conserva esencialmente su estabilidad física y/o estabilidad química y/o actividad biológica tras el almacenamiento. Preferentemente, la formulación conserva esencialmente su estabilidad física y química, así como su actividad biológica tras el almacenamiento. El período de almacenamiento se selecciona, en general, en base a la vida útil prevista de la formulación. Diversas técnicas analíticas para medir la estabilidad de las proteínas están disponibles en la técnica y se revisan en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., Pubs. (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90 (1993), por ejemplo. La estabilidad se puede medir a una temperatura seleccionada durante un período de tiempo seleccionado. En determinados modos de realización, la formulación es estable a aproximadamente 40 °C durante al menos aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21,28 o más días. En determinados modos de realización, la formulación es estable a aproximadamente 40 °C durante al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más semanas. En determinados modos de realización, la formulación es estable a aproximadamente 25 °C durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o más meses. En determinados modos de realización, la formulación es estable a aproximadamente 5 °C durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20, 21, 22, 23, 24 o más meses. En determinados modos de realización, la formulación es estable a aproximadamente -20 °C durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o más meses. En determinados modos de realización, la formulación es estable a 5 °C o -20 °C durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o más meses. Además, la formulación es estable preferentemente después de congelar (por ejemplo, a -20 °C, -40 °C o -70 °C) y descongelar la formulación, por ejemplo, después de 1,2, 3, 4 o 5 ciclos de congelación y descongelación. La estabilidad se puede evaluar cualitativa y/o cuantitativamente en una variedad de formas diferentes, incluyendo la evaluación de la formación de agregados (por ejemplo, usando cromatografía de exclusión por tamaño, midiendo la turbidez y/o por inspección visual); valorando la heterogeneidad de carga usando cromatografía de intercambio catiónico, enfoque isoeléctrico capilar de imagen (icIEF) o electroforesis de zona capilar; análisis de secuencia aminoterminal o carboxiterminal; análisis espectrométrico de masas; análisis SDS-PAGE para comparar el anticuerpo reducido y el intacto; análisis por cartografía peptídica (por ejemplo, tripsínico o LYS-C); evaluar la actividad biológica o función de unión a antígeno del anticuerpo; etc. La inestabilidad puede implicar uno cualquiera o más de: agregación, desamidación (por ejemplo, desamidación de Asn), oxidación (por ejemplo, oxidación de Met), isomerización (por ejemplo, isomerización de Asp), recorte/hidrólisis/fragmentación (por ejemplo, fragmentación de región bisagra), formación de succinimida, cisteína(s) desemparejada(s), extensión N terminal, procesamiento C terminal, diferencias de glucosilación, etc.

Una proteína "conserva su estabilidad física" en una formulación farmacéutica si no muestra signos o muestra muy pocos signos de agregación, precipitación y/o desnaturalización tras el examen visual del color y/o la claridad, o como se mide por dispersión de luz UV o por cromatografía de exclusión por tamaño.

Una proteína "conserva su estabilidad química" en una formulación farmacéutica, si la estabilidad química en un momento dado es de modo que se considera que la proteína todavía conserva su actividad biológica como se define a continuación. La estabilidad química se puede valorar detectando y cuantificando formas químicamente alteradas de la proteína. La alteración química puede implicar la modificación del tamaño (por ejemplo, recorte) que se puede evaluar usando cromatografía de exclusión por tamaño, SDS-PAGE y/o espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz/tiempo de vuelo (EM MALDI/TOF), por ejemplo. Otros tipos de alteración química incluyen la alteración de carga (por ejemplo, que se produce como resultado de la desamidación), que se puede evaluar por cromatografía de intercambio iónico o icIEF, por ejemplo.

Un anticuerpo "conserva su actividad biológica" en una formulación farmacéutica, si la actividad biológica del anticuerpo en un momento dado está dentro de aproximadamente un 10 % (dentro de los errores del ensayo) de la actividad biológica presentada en el momento en que se preparó la formulación farmacéutica, como se determina en un ensayo de unión a antígeno, por ejemplo. A continuación en el presente documento se elaboran otros ensayos de "actividad biológica" para anticuerpos.

Como se usa en el presente documento, "actividad biológica" de un anticuerpo monoclonal se refiere a la capacidad del anticuerpo de unirse a un antígeno. Puede incluir además la unión del anticuerpo al antígeno y dar como resultado una respuesta biológica mensurable que se puede medir in vitro o in vivo. Dicha actividad puede ser antagonista o agonista.

Un anticuerpo monoclonal "desamidado" en el presente documento es uno en el que uno o más residuos de asparagina del mismo se han derivatizado, por ejemplo, a un ácido aspártico o un ácido isoaspártico.

Un anticuerpo que es "susceptible de desamidación" es uno que comprende uno o más residuos que se ha descubierto que son propensos a desamidar.

Un anticuerpo que es "susceptible de agregación" es uno que se ha descubierto que se agrega con otra(s) molécula(s) de anticuerpo, especialmente tras su congelación y/o agitación.

Un anticuerpo que es "susceptible de fragmentación" es uno que se ha descubierto que se escinde en dos o más fragmentos, por ejemplo en una región bisagra del mismo.

Por "reducir la desamidación, agregación o fragmentación" se pretende evitar o disminuir la cantidad de desamidación, agregación o fragmentación en relación con el anticuerpo monoclonal formulado en una formulación diferente.

El anticuerpo que se formula preferentemente es esencialmente puro y de forma deseable esencialmente homogéneo (es decir, libre de proteínas contaminantes, etc.). Anticuerpo "esencialmente puro" quiere decir una composición que comprende al menos aproximadamente un 90 % en peso del anticuerpo, en base al peso total de la composición, preferentemente al menos aproximadamente un 95 % en peso. Anticuerpo "esencialmente homogéneo" quiere decir una composición que comprende al menos aproximadamente un 99 % en peso del anticuerpo, en base al peso total de la composición.

Por "isotónico" se quiere decir que la formulación de interés tiene esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Las formulaciones isotónicas tendrán en general una presión osmótica de aproximadamente 250 a 350 mOsm. La isotonicidad se puede medir usando un osmómetro de tipo presión de vapor o congelación de hielo, por ejemplo. En algunos modos de realización, la formulación tiene una osmolalidad de más de aproximadamente 240 mOsm/kg.

Como se usa en el presente documento, "tampón" se refiere a una solución tamponada que resiste los cambios en el pH por la acción de sus componentes conjugados ácido-base. El tampón de la presente divulgación tiene preferentemente un pH en el intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,0, preferentemente de aproximadamente 5,6 a aproximadamente 7,0, por ejemplo de 5,6 a 6,9, de 5,7 a 6,8, de 5,8 a 6,7, de 5,9 a 6,6, de 5,9 a 6,5, de 6,0, de 6,0 a 6,4 o de 6,1 a 6,3. En un modo de realización, el tampón tiene un pH de 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 o 7,0. Por ejemplo, el fosfato de sodio es un ejemplo de tampones que controlarán el pH en este intervalo.

Como se usa en el presente documento, un "tensioactivo" se refiere a un agente activo en la superficie, preferentemente un tensioactivo no iónico. Los ejemplos de tensioactivos en el presente documento incluyen polisorbato (por ejemplo, polisorbato 20 y polisorbato 80); poloxámero (por ejemplo, poloxámero 188); Tritón; dodecilsulfato de sodio (SDS); laurilsulfato de sodio; octil-glucósido de sodio; lauril-, miristil-, linoleil- o estearilsulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- o cetil-betaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropil-betaína (por ejemplo, lauroamidopropilo); miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil-taurato de sodio o metil oleil-taurato de disodio; y la serie MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.); polietilglicol, polipropilglicol y copolímeros de etilen- y propilenglicol (por ejemplo, Pluronics, PF68, etc.); etc. En un modo de realización, el tensioactivo en el presente documento es polisorbato 20.

En un sentido farmacológico, en el contexto de la divulgación, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un anticuerpo se refiere a una cantidad eficaz en la prevención o el tratamiento de un trastorno para el tratamiento del que el anticuerpo es eficaz. Un "trastorno" es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con el anticuerpo. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas, incluyendo las afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión.

Un "conservante" es un compuesto que se puede incluir opcionalmente en la formulación para reducir esencialmente la acción bacteriana en la misma, facilitando, por tanto, la producción de una formulación de múltiples usos, por ejemplo. Los ejemplos de conservantes potenciales incluyen cloruro de octadecildimetilbencilamonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en los que los grupos alquilo son compuestos de cadena larga) y cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservantes incluyen alcoholes aromáticos tales como fenol, alcohol butílico y bencílico, alquilparabenos tales como metil o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol. En un modo de realización, el conservante en el presente documento es alcohol bencílico.

El término "VEGF" o "VEGF-A" como se usa en el presente documento se refiere al factor de crecimiento de células endoteliales vasculares humano del aminoácido 165 y los factores de crecimiento de células endoteliales vasculares humanos de los aminoácidos 121, 189 y 206 relacionados, como se describe por Leung et al. (1989) Science 246:1306, y Houck et al. (1991) Mol. Endocrin., 5:1806, conjuntamente con las formas alélicas naturales y procesadas de los mismos. El término "VEGF" también se refiere a VEGF de especies no humanas, tales como ratón, rata o primate. A veces, el VEGF de una especie específica se indica por términos tales como hVEGF para VEGF humano, mVEGF para VEGF murino y etc. El término "VEGF" también se usa para referirse a formas truncadas del polipéptido que comprende los aminoácidos de 8 a 109 o de 1 a 109 del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares humano del aminoácido 165. Se puede identificar la referencia a cualquiera de dichas formas de VEGF en la presente solicitud, por ejemplo, por "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" o "VEGFW . Las posiciones aminoacídicas para un VEGF natural "truncado" se numeran como se indica en la secuencia de VEGF natural. Por ejemplo, la posición aminoacídica 17 (metionina) en VEGF natural truncado también es la posición 17 (metionina) en VEGF natural. El VEGF natural truncado tiene afinidad de unión por los receptores KDR y Flt-1 comparable al VEGF natural.

La "actividad biológica de VEGF" incluye la unión a cualquier receptor de VEGF o cualquier actividad de señalización de VEGF, tal como la regulación de la angiogénesis y la vasculogénesis tanto normales como anómalas (Ferrara y Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18:4-25; Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77:527-543); promover la vasculogénesis y la angiogénesis embrionarias (Carmeliet et al. (1996) Nature 380:435-439; Ferrara et al. (1996) Nature 380:439-442); y modular la proliferación de vasos sanguíneos cíclica en el aparato reproductor femenino y para el crecimiento óseo y la formación de cartílago (Ferrara et al. (1998) Nature Med. 4:336-340; Gerber et al. (1999) Nature Med. 5:623-628). Además de ser un factor angiogénico en la angiogénesis y la vasculogénesis, el VEGF, como factor de crecimiento pleótropo, presenta múltiples efectos biológicos en otros procesos fisiológicos, tales como la supervivencia de las células endoteliales, la permeabilidad de los vasos y la vasodilatación, la quimiotaxia de monocitos y la entrada de calcio (Ferrara y Davis-Smyth (1997), supra y Cebe-Suarez et al. Cell. Mol. Life Sci. 63:601-615 (2006)). Además, estudios recientes han informado de efectos mitógenos del VEGF en unos pocos tipos de células no endoteliales, tales como células del epitelio pigmentario de la retina, células del conducto pancreático y células de Schwann. Guerrin et al. (1995) J. Cell Physiol. 164:385-394; Oberg-Welsh et al. (1997) Mol. Cell. Endocrinol. 126:125-132; Sondell et al. (1999) J. Neurosci. 19:5731-5740.

Un "antagonista de VEGF" o "antagonista específico de VEGF" se refiere a una molécula que se puede unir a VEGF, reducir los niveles de expresión de VEGF o neutralizar, bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir en las actividades biológicas de VEGF, incluyendo, pero sin limitarse a, la unión de VEGF a uno o más receptores de VEGF y la angiogénesis y la supervivencia o la proliferación de células endoteliales mediadas por VEGf . Como antagonistas específicos de VEG^fútiles en los procedimientos de la divulgación se incluyen polipéptidos que se unen específicamente a VEGF, anticuerpos anti-VEGF y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, moléculas receptoras y derivados que se unen específicamente a VEGF secuestrando de este modo su unión a uno o más receptores, proteínas de fusión (por ejemplo, VEGF-Trap (Regeneron)) y VEGF121-gelonina (Peregrine). Los antagonistas específicos de VEGF también incluyen variantes antagonistas de polipéptidos de VEGF, oligómeros de nucleobases de antisentido dirigidos a VEGF, moléculas de ARN pequeñas dirigidas a VEGF, aptámeros de ARN, pepticuerpos y ribocimas frente a VEGF. Los antagonistas específicos de VEGF también incluyen moléculas pequeñas no peptídicas que se unen a VEGF y pueden bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir en las actividades biológicas de VEGF. Por tanto, el término "actividades de VEGF" incluye específicamente actividades biológicas mediadas por VEGF de VEGF. En determinados modos de realización, el antagonista de VEGF reduce o inhibe, en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más, el nivel de expresión o la actividad biológica de VEGF.

Un "anticuerpo anti-VEGF" es un anticuerpo que se une a VEGF con suficiente afinidad y especificidad. En determinados modos de realización, el anticuerpo seleccionado normalmente tendrá una afinidad de unión suficiente por VEGF, por ejemplo, el anticuerpo se puede unir a hVEGF con un valor de Kd de entre 100 nM-1 μM. Las afinidades de los anticuerpos se pueden determinar por un ensayo basado en resonancia de plasmón superficial (tal como el ensayo BIAcore como se describe en la publicación de solicitud PCT n.° WO2005/012359); un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA); y ensayos de competencia (por ejemplo, RIA), por ejemplo.

En determinado modo de realización, el anticuerpo anti-VEGF se puede usar como un agente terapéutico en la selección como diana e interferencia en enfermedades o afecciones en las que está implicada la actividad de VEGF. Además, el anticuerpo se puede someter a otros ensayos de actividad biológica, por ejemplo, para evaluar su eficacia como agente terapéutico. Dichos ensayos son conocidos en la técnica y dependen del antígeno diana y del uso previsto para el anticuerpo. Los ejemplos incluyen el ensayo de inhibición con HUVEC; ensayos de inhibición del crecimiento de células tumorales (como se describe en el documento WO 89/06692, por ejemplo); ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad mediada por el complemento (CDC) (pat. de EE. UU. n.° 5.500.362); y ensayos de actividad agonista o hematopoyesis (véase el documento WO 95/27062). Un anticuerpo anti-VEGF normalmente no se unirá a otros homólogos de VEGF, tales como VEGF-B o VEGF-C, ni a otros factores de crecimiento, tales como P1GF, PDGF o bFGF. En un modo de realización, el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo monoclonal que se une al mismo epítopo que el anticuerpo anti-VEGF monoclonal A4.6.1 producido por el hibridoma ATCC HB 10709. En otro modo de realización, el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con Presta et al. (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599, incluyendo pero sin limitarse al anticuerpo conocido como bevacizumab (BV; AVASTIN®).

El anticuerpo anti-VEGF "bevacizumab (BV)", también conocido como "rhuMAb VEGF" o "AVASTIN®", es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con Presta et al. (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599. Comprende regiones estructurales de IgG1 humana mutadas y regiones determinantes de la complementariedad de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF murino A.4.6.1 que bloquea la unión del VEGF humano a sus receptores. Aproximadamente un 93 % de la secuencia de aminoácidos de bevacizumab, incluyendo la mayoría de las regiones estructurales, se deriva de la IgG1 humana, y aproximadamente un 7 % de la secuencia se deriva del anticuerpo murino A4.6.1. Bevacizumab tiene una masa molecular de aproximadamente 149.000 daltons y está glucosilado. Bevacizumab y otros anticuerpos anti-VEGF humanizados se describen además en la pat. de E^e. UU. n.° 6.884.879 publicada el 26 de febrero de 2005.

El término "polipéptido de la serie B20", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido, que incluye un anticuerpo que se une a VEGF. Los polipéptidos de la serie B20 incluyen, pero sin limitarse a, anticuerpos derivados de una secuencia del anticuerpo B20 o un anticuerpo derivado de B20 descrito en la publicación de EE. UU. n.° 20060280747, la publicación de EE. UU. n.° 20070141065 y/o la publicación de EE. UU. n.° 20070020267. En un modo de realización, el polipéptido de la serie B20 es B20-4.1 como se describe en la publicación de EE. UU. n.° 20060280747, la publicación de EE. UU. n.° 20070141065 y/o la publicación de EE. UU. n.° 20070020267. En otro modo de realización, el polipéptido de la serie B20 es B20-4.1.1 descrito en la patente de EE. UU. n.° 7.910.098.

El término "polipéptido de la serie G6", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido, que incluye un anticuerpo que se une a VEGF. Los polipéptidos de la serie G6 incluyen, pero sin limitarse a, anticuerpos derivados de una secuencia del anticuerpo G6 o un anticuerpo derivado de G6 descrito en la publicación de EE. UU. n.° 20060280747, la publicación de EE. UU. n.° 20070141065 y/o la publicación de EE. UU. n.° 20070020267. Los polipéptidos de la serie G6, como se describe en la publicación de EE. UU. n.° 20060280747, la publicación de EE. Uu . n.° 20070141065 y/o la publicación de EE. UU. n.° 20070020267 incluyen, pero sin limitarse a, G6-8, G6-23 y G6-31.

Para anticuerpos adicionales, véanse las pat. de EE. UU. n.os 7.060.269, 6.582.959, 6.703.020; 6.054.297; los documentos WO98/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP0666868B1; las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. n.os 2006009360, 20050186208, 20030206899, 20030190317, 20030203409 y 20050112126; y Popkov et al., Journalof Immunological Methods 288:149-164 (2004). En determinados modos de realización, otros anticuerpos incluyen los que se unen a un epítopo funcional en el VEGF humano que comprende los residuos F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, I91, K101, E103 y C104 o, de forma alternativa, que comprende los residuos F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 y Q89.

También son conocidos otros anticuerpos anti-VEGF, y se describen, por ejemplo, en Liang et al., J Biol Chem 281, 951-961 (2006).

"CD20" como se usa en el presente documento se refiere al antígeno de linfocitos B humano CD20 (también conocido como CD20, antígeno de superficie B1, Leu-16, Bp35, BM5 y LF5 de linfocitos B; la secuencia se caracteriza en la entrada P11836 de la base de datos SwissProt) es una proteína transmembrana hidrófoba con un peso molecular de aproximadamente 35 kD localizada en linfocitos pre-B y B maduros. (Valentine, M.A., et al., J. Biol. Chem. 264(19) (1989 11282-11287; Tedder, T.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85 (1988) 208-12; Stamenkovic, I., et al., J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-80; Einfeld, D.A., et al., EMBO J. 7 (1988) 711-7; Tedder, T.F., et al., J. Immunol. 142 (1989) 2560-8). El gen humano correspondiente es el miembro 1, subfamilia A, de 4 dominios que abarcan la membrana, también conocido como MS4A1. Este gen codifica un miembro de la familia de genes 4^aque abarcan la membrana. Los miembros de esta familia de proteínas nacientes se caracterizan por rasgos característicos estructurales comunes y límites de empalme entre intrones/exones similares y presentan patrones de expresión únicos entre células hematopoyéticas y tejidos no linfáticos. Este gen codifica la molécula de superficie de linfocitos B que desempeña un papel en el desarrollo y diferenciación de linfocitos B en células plasmáticas. Este miembro de la familia se localiza en 11q12, entre un grupo de miembros de la familia. El empalme alternativo de este gen da como resultado dos variantes de transcripción que codifican la misma proteína.

Los términos "CD20" y "antígeno CD20" se usan de manera intercambiable en el presente documento e incluyen cualquier variante, isoforma y homólogo de especie del CD20 humano que se expresen de forma natural por células o se expresen en células transfectadas con el gen CD20. La unión de un anticuerpo de la divulgación al antígeno CD20 media en la destrucción de células que expresan CD20 (por ejemplo, una célula tumoral), inactivando el CD20. La destrucción de las células que expresan CD20 se puede producir por uno o más de los siguientes mecanismos: inducción de muerte celular/apoptosis, ADCC y CDC.

Los sinónimos de CD20, como se reconoce en la técnica, incluyen el antígeno CD20 de linfocitos B, el antígeno de superficie B1, Leu-16, Bp35, BM5 y LF5 de linfocitos B.

El término "anticuerpo anti-CD20" de acuerdo con la divulgación es un anticuerpo que se une específicamente al antígeno CD20. Dependiendo de las propiedades de unión y las actividades biológicas de los anticuerpos anti-CD20 con respecto al antígeno CD20, se pueden distinguir dos tipos de anticuerpos anti-CD20 (anticuerpos anti-CD20 de tipo I y tipo II) de acuerdo con Cragg, M.S., et al., Blood 103 (2004) 2738-2743; y Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052, véase la tabla 1.

Tabla 1: propiedades de anticuerpos anti-CD20 de tipo I y tipo II

Los ejemplos de anticuerpos anti-CD20 de tipo II incluyen, por ejemplo, anticuerpo IgG1 B-Ly1 humanizado (un anticuerpo IgG1 humanizado quimérico como se divulga en el documento WO 2005/044859), IgG1 11B8 (como se divulga en el documento WO 2004/035607) e IgG1 AT80. Típicamente, los anticuerpos anti-CD20 de tipo II del isotipo IgG1 muestran propiedades de CDC características. Los anticuerpos anti-CD20 de tipo II tienen una CDC disminuida (si es isotipo IgG1) en comparación con anticuerpos de tipo I del isotipo IgG1.

Los ejemplos de anticuerpos anti-CD20 de tipo I incluyen, por ejemplo, rituximab, IgG3 HI47 (ECACC, hibridoma), IgG1 2C6 (como se divulga en el documento WO 2005/103081), IgG1 2F2 (como se divulga en los documentos WO 2004/035607 y WO 2005/103081) e IgG1 2H7 (como se divulga en el documento WO 2004/056312).

Los anticuerpos anti-CD20 afucosilados de acuerdo con la divulgación son preferentemente anticuerpos anti-CD20 de tipo II, más preferentemente un anticuerpo B-Ly1 humanizado afucosilado como se describe en los documentos WO 2005/044859 y WO 2007/031875.

El anticuerpo "rituximab" (anticuerpo de referencia; ejemplo de un anticuerpo anti-CD20 de tipo I) es un dominio constante murino gamma 1 humano quimérico genomanipulado que contiene un anticuerpo monoclonal dirigido frente al antígeno CD20 humano. Sin embargo, este anticuerpo no se glucomanipula ni se afocusila y, por tanto, tiene una cantidad de fucosa de al menos un 85 %. Este anticuerpo quimérico contiene dominios constantes gamma 1 humanos y se identifica por el nombre "C2B8" en el documento US 5.736.137 (Anderson et. al.) publicado el 17 de abril de 1998, cedido a iDe C Pharmaceuticals Corporation. Rituximab está aprobado para el tratamiento de pacientes con linfoma no hodgkiniano de linfocitos B, positivo para CD20, de escasa malignidad o folicular recidivante o resistente al tratamiento. Los estudios del mecanismo de acción in vitro han demostrado que rituximab presenta citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) humano (Reff, M.E., et. al., Blood 83(2) (1994) 435 445). Adicionalmente, presenta actividad en ensayos que miden la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

El término "anticuerpo B-Ly1 humanizado" se refiere a un anticuerpo B-Ly1 humanizado, como se divulga en los documentos WO 2005/044859 y WO 2007/031875, que se obtuvo a partir del anticuerpo anti-CD20 monoclonal murino B-Ly1 (región variable de la cadena pesada (VH) murina: SEQ ID NO: 1; región variable de la cadena ligera murina (VL): SEQ ID NO:2, (véase Poppema, S. y Visser, L., Biotest Bulletin 3 (1987) 131-139) por quimerización con un dominio constante humano de IgG1 y seguido de humanización (véanse los documentos WO 2005/044859 y WO 2007/031875). Estos "anticuerpos B-Ly1 humanizados" se divulgan en detalle en los documentos WO 2005/044859 y WO 2007/031875.

En un modo de realización, el "anticuerpo B-Ly1 humanizado" tiene la región variable de la cadena pesada (VH) seleccionada del grupo de SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO:19 (de B-HH₂a B-HH9 y de B-HL8 a B-HL17 de los documentos WO 2005/044859 y WO 2007/031875). En un modo de realización específico, dicho dominio variable se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID No . 3, 4, 7, 9, 11, 13 y 15 (B-HH₂, BHH-3, B-HH6, B-HH8, B-HL8, B-HL11 y B-HL13 de los documentos WO 2005/044859 y WO 2007/031875). En un modo de realización específico, el "anticuerpo B-Ly1 humanizado" tiene la región variable de la cadena ligera (VL) de SEQ ID NO. 20 (B-KV1 de los documentos W^o2005/044859 y WO 2007/031875). En un modo de realización específico, el "anticuerpo B-Ly1 humanizado" tiene una región variable de la cadena pesada (VH) de SEQ ID NO. 7 (B-HH6 de los documentos WO 2005/044859 y WO 2007/031875) y una región variable de la cadena ligera (VL) de SEQ ID NO. 20 (B-KV1 de los documentos WO 2005/044859 y W ^o2007/031875). Además en un modo de realización, el anticuerpo B-Ly1 humanizado es un anticuerpo IgG1. De acuerdo con la divulgación, dichos anticuerpos B-Ly1 humanizados afucosilados se glucomanipulan (GE) en la región Fc de acuerdo con los procedimientos descritos en los documentos WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, Umana, P. et al., Nature Biotechnol.

17 (1999) 176-180 y el documento WO 99/154342. En un modo de realización, el B-Ly1 humanizado glucomanipulado afucosilado es B-HH6-B-KV1 GE. En un modo de realización, el anticuerpo anti-CD20 es obinutuzumab (DCI recomendada, WHO Drug Information, vol. 26, n.° 4, 2012, p.453). Como se usa en el presente documento, obinutuzumab es sinónimo de GA101 o RO5072759. Esto reemplaza todas las versiones previas (por ejemplo, vol. 25, n.° 1, 2011, p. 75-76) y es conocido anteriormente como afutuzumab (DCI recomendada, WHO Drug Information, vol. 23, n.° 2, 2009, p. 176; vol. 22, n.° 2, 2008, p. 124). En algunos modos de realización, el anticuerpo B-Ly1 humanizado es un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos modos de realización, el anticuerpo B-Ly1 humanizado comprende una región variable de la cadena pesada que comprende las tres CDR de la cadena pesada de SEQ ID NO: 21 y una región variable de la cadena ligera que comprende las tres CDR de la cadena ligera de SEQ ID NO: 22.

Cadena pesada (SEQ ID NO: 21)

Cadena ligera (SEQ ID NO: 22)

En algunos modos de realización, el anticuerpo B-Ly1 humanizado es un B-Ly1 humanizado glucomanipulado afucosilado. Dichos anticuerpos B-Ly1 humanizados glucomanipulados tienen un patrón alterado de glucosilación en la región Fc, tienen preferentemente un nivel reducido de restos de fucosa. Preferentemente, la cantidad de fucosa es un 60 % o menos de la cantidad total de oligosacáridos en Asn297 (en un modo de realización, la cantidad de fucosa está entre un 40 % y un 60 %, en otro modo de realización, la cantidad de fucosa es de un 50 % o menos, y todavía en otro modo de realización, la cantidad de fucosa es de un 30 % o menos). Además, los oligosacáridos de la región Fc están preferentemente bisecados. Estos anticuerpos B-Ly1 humanizados glucomanipulados tienen una ADCC incrementada.

El componente oligosacárido puede afectar significativamente a las propiedades pertinentes para la eficacia de una glucoproteína terapéutica, incluyendo la estabilidad física, resistencia al ataque por proteasas, interacciones con el sistema inmunitario, farmacocinética y actividad biológica específica. Dichas propiedades pueden depender no solo de la presencia o ausencia, sino también de las estructuras específicas, de los oligosacáridos. Se pueden realizar algunas generalizaciones entre la estructura de oligosacárido y la función de la glucoproteína. Por ejemplo, determinadas estructuras de oligosacárido median en el rápido aclaramiento de la glucoproteína de la circulación sanguínea a través de las interacciones con proteínas de unión a carbohidratos específicos, mientras que otras se pueden unir a anticuerpos y desencadenar reacciones inmunitarias no deseadas. (Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-81).

Las células de mamífero son los huéspedes preferentes para la producción de glucoproteínas terapéuticas, debido a su capacidad para glucosilar proteínas en la forma más compatible para su aplicación en seres humanos. (Cumming, D.A., et al., Glycobiology 1 (1991) 115-30; Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol 14 (1996) 975-81). Las bacterias casi nunca glucosilan proteínas y, como otros tipos de huéspedes comunes, tales como levaduras, hongos filamentosos, células vegetales y de insecto, proporcionan patrones de glucosilación asociados con el aclaramiento rápido de la circulación sanguínea, interacciones inmunitarias no deseables y, en algunos casos específicos, una actividad biológica reducida. Entre las células de mamífero, se han usado más comúnmente células de ovario de hámster chino (CHO) durante las últimas dos décadas. Además de dar patrones de glucosilación adecuados, estas células permiten la generación consecuente de líneas celulares clonales altamente productivas, genéticamente estables. Se pueden cultivar a densidades altas en biorreactores simples usando medios sin suero y permiten el desarrollo de bioprocedimientos seguros y reproducibles. Otras células animales comúnmente usadas incluyen células de riñón de cría de hámster (BHK), células de mieloma de ratón NS0 y SP2/0. Más recientemente se ha sometido a prueba también la producción a partir de animales transgénicos. (Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981).

Todos los anticuerpos contienen estructuras de carbohidrato en posiciones conservadas en las regiones constantes de la cadena pesada, en las que cada isotipo posee un ordenamiento distinto de estructuras de carbohidratos unidos a N, que afecta de modo variable el ensamblaje, la secreción o la actividad funcional de la proteína. (Wright, A. y Morrison, S.L., Trends Biotech. 15 (1997) 26-32). La estructura del carbohidrato unido a N fijado varía de forma considerable, dependiendo del grado de procesamiento y puede incluir oligosacáridos de alto contenido en manosa, con ramificaciones múltiples, así como biantenarios complejos. (Wright, A. y Morrison, S.L., Trends Biotech. 15 (1997) 26-32). Típicamente, existe un procesamiento heterogéneo de las estructuras de oligosacáridos centrales fijados en un sitio de glucosilación particular, de modo que incluso los anticuerpos monoclonales existen como glucoformas múltiples. Asimismo, se ha demostrado que se producen diferencias importantes en la glucosilación de anticuerpos entre líneas celulares e incluso se observan diferencias menores en una línea celular dada cultivada en condiciones de cultivo diferentes. (Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5(8) (1995) 813-22).

Una forma de obtener grandes incrementos de potencia, mientras se mantiene un procedimiento de producción simple y se evitan potencialmente efectos secundarios no deseables significativos, es potenciar las funciones efectoras naturales mediadas por células de los anticuerpos monoclonales genomanipulando su componente oligosacárido como se describe en Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 y el documento US 6.602.684. Los anticuerpos de tipo IgG1, los anticuerpos más comúnmente usados en la inmunoterapia contra el cáncer, son glucoproteínas que tienen un sitio de glucosilación unido a N conservado en Asn297 en cada dominio CH₂. Los dos oligosacáridos biantenarios complejos fijados a Asn297 están ocultos entre los dominios CH₂, formando contactos extensos con la cadena principal polipeptídica, y su presencia es esencial para que el anticuerpo medie en las funciones efectoras tales como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A. y Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32).

Se ha demostrado previamente que la sobreexpresión en células de ovario de hámster chino (CHO) de p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III ("GnTIM"), una glucosiltransferasa que cataliza la formación de oligosacáridos bisecados incrementa significativamente la actividad ADCC in vitro de un anticuerpo monoclonal quimérico antineuroblastoma (chCE7) producido por las células CHO genomanipuladas. (Véase Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; y el documento WO 99/154342). El anticuerpo chCE7 pertenece a una gran clase de anticuerpos monoclonales no conjugados que tienen afinidad y especificidad tumorales altas, pero tienen muy poca potencia para ser útiles clínicamente cuando se producen en líneas celulares industriales estándar que carecen de la enzima GnTIII (Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180). Este estudio fue el primero en mostrar que se podían obtener incrementos grandes de actividad ADCC genomanipulando las células productoras de anticuerpos para expresar GnTIII, lo que también dio lugar a un incremento en la proporción de oligosacáridos bisecados asociados a la región constante (Fc), incluyendo oligosacáridos no fucosilados bisecados, por encima de los niveles encontrados en anticuerpos naturales.

"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Los que necesitan tratamiento incluyen los que ya tienen el trastorno, así como en los que se va a evitar el trastorno.

Un "trastorno" es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento, incluyendo, pero sin limitarse a, trastornos o enfermedades crónicas y agudas, incluyendo las afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los trastornos incluyen trastornos angiogénicos. "Trastorno angiogénico", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier afección que implica angiogénesis anómala o fuga o permeabilidad vascular anómala. Los ejemplos no limitantes de trastornos angiogénicos que se van a tratar en el presente documento incluyen tumores malignos y benignos; neoplasias malignas distintas de leucemias y linfáticas; y, en particular, metástasis tumoral (cáncer).

Se produce "angiogénesis anómala" cuando los vasos sanguíneos nuevos crecen excesivamente o bien de otro modo inapropiadamente (por ejemplo, la localización, el momento, el grado o la aparición de la angiogénesis que no se desea desde un punto de vista médico) en un estado patológico o de modo que provoca un estado patológico. En algunos casos, se produce una angiogénesis excesiva, descontrolada o de otro modo inapropiada cuando hay crecimiento de vasos sanguíneos nuevos que contribuye al empeoramiento del estado patológico o la causa de un estado patológico. Los vasos sanguíneos nuevos pueden alimentar a los tejidos afectados, destruir tejidos normales y, en el caso del cáncer, los vasos nuevos pueden permitir que las células tumorales lleguen a la circulación y se alojen en otros órganos (metástasis tumorales). Los ejemplos de trastornos que implican una angiogénesis anómala incluyen, pero no se limitan a cáncer, especialmente tumores sólidos vascularizados y tumores metastásicos (incluyendo cáncer de colon, pulmón (especialmente carcinoma de pulmón microcítico) o cáncer de próstata), enfermedades provocadas por neovascularización ocular, especialmente ceguera diabética, retinopatías, principalmente retinopatía diabética o degeneración macular senil, neovascularización coroidea (NVC), edema macular diabético, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, oclusión venosa central de la retina (OVCR), neovascularización corneal, neovascularización retiniana y rubeosis; psoriasis, artritis psoriásica, hemangioblastoma tal como hemangioma; enfermedades renales inflamatorias, tales como glomerulonefritis, especialmente glomerulonefritis mesangioproliferativa, síndrome urémico hemolítico, nefropatía diabética o nefroesclerosis hipertensiva; diversas enfermedades inflamatorias, tales como artritis, especialmente artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, sarcoidosis, arterioesclerosis arterial y enfermedades que se producen después de trasplantes, endometriosis o asma crónica y otras afecciones.

Se produce "permeabilidad vascular anómala" cuando el flujo de líquidos, moléculas (por ejemplo, iones y nutrientes) y células (por ejemplo, linfocitos) entre los compartimentos vascular y extravascular es excesivo o de otro modo inapropiado (por ejemplo, la localización, el momento, el grado o el inicio de la permeabilidad vascular no se desea desde un punto de vista médico) en un estado patológico o de modo que provoca un estado patológico. Una permeabilidad vascular anómala puede dar lugar a una "fuga" excesiva o de otro modo inapropiada de iones, agua, nutrientes o células a través de la vasculatura. En algunos casos, la permeabilidad vascular o la fuga vascular excesiva, descontrolada o de otro modo inapropiada exacerba o induce enfermedades que incluyen, por ejemplo, edema asociado con tumores, incluyendo, por ejemplo, tumores cerebrales; ascitis asociada con neoplasias malignas; síndrome de Meigs; inflamación pulmonar; síndrome nefrótico; derrame pericárdico; derrame pleural; permeabilidad asociada con enfermedades cardiovasculares tales como la afección que sigue a infartos de miocardio y apoplejías y similares. La presente divulgación contempla el tratamiento de los pacientes que han desarrollado o corren el riesgo de desarrollar las enfermedades y trastornos asociados con permeabilidad o fuga vascular anómala.

Los términos "trastorno proliferativo celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que se asocian con algún grado de proliferación celular anómala. En un modo de realización, el trastorno proliferativo celular es cáncer. En un modo de realización, el trastorno proliferativo celular es un tumor.

"Tumor", como se usa en el presente documento, se refiere a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sea maligno o benigno, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso", "trastorno proliferativo celular", "trastorno proliferativo" y "tumor" no son mutuamente excluyentes como se hace referencia en el presente documento.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o neoplasias malignas linfáticas. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen, pero no se limitan a, cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón incluyendo carcinoma de pulmón microcítico, carcinoma de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma pulmonar de células escamosas, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago incluyendo cáncer gastrointestinal y cáncer estromal gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de las vías urinarias, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, melanoma, melanoma de extensión superficial, melanoma sobre lentigo maligno, melanomas lentiginosos acros, melanomas nodulares, mieloma múltiple y linfoma de linfocitos B (incluyendo linfoma no hodgkiniano (LNH) folicular/de escasa malignidad; LNH linfocítico pequeño (LP); LNH folicular/de malignidad intermedia; LNH difuso de malignidad intermedia; LNH inmunoblástico de gran malignidad; LNH linfoblástico de gran malignidad; LNH de células pequeñas no escindidas de gran malignidad; LNH con gran masa tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crónica (LLC); leucemia linfocítica aguda (LLA); tricoleucemia; leucemia mielógena crónica; y trastorno linfoproliferativo postrasplante (TLPT), así como proliferación vascular anómala asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales), síndrome de Meigs, cáncer cerebral, así como de cabeza y cuello, y metástasis asociadas. En determinados modos de realización, los cánceres que son tributarios de tratamiento por los anticuerpos de la divulgación incluyen cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer rectal, carcinoma de pulmón no microcítico, glioblastoma, linfoma no hodgkiniano (NHL), cáncer de células renales, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer pancreático, sarcoma de partes blandas, sarcoma de Kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, cáncer ovárico, mesotelioma y mieloma múltiple. En algunos modos de realización, el cáncer se selecciona de: carcinoma de pulmón microcítico, gliblastoma, neuroblastomas, melanoma, carcinoma de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal (CCR) y carcinoma hepatocelular. Aún, en algunos modos de realización, el cáncer se selecciona de: carcinoma de pulmón no microcítico, cáncer colorrectal, glioblastoma y carcinoma de mama, incluyendo las formas metastásicas de esos cánceres.

El término "tratamiento antineoplásico" se refiere a un tratamiento útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes terapéuticos antineoplásicos incluyen, pero se limitan a, por ejemplo, agentes quimioterápicos, agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotóxicos, agentes usados en radioterapia, agentes antiangiogénicos, agentes apoptóticos, agentes antitubulina y otros agentes para tratar el cáncer, tales como anticuerpos anti-HER2, anticuerpos anti-CD20, un antagonista del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (por ejemplo, un inhibidor de tirosina-cinasas), inhibidor de HER1/EGFR (por ejemplo, erlotinib (Tarceva™), inhibidores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (por ejemplo, Gleevec™ (mesilato de imatinib)), un inhibidor de la COX-2 (por ejemplo, celecoxib), interferones, citocinas, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que se unen a una o más de las siguientes dianas ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BlyS, APRIL, BCMA o receptor(es) de VEGF, TRAIL/Apo2 y otros agentes químicos bioactivos y orgánicos, etc. También se incluyen en la divulgación combinaciones de los mismos.

Un "factor o agente angiogénico" es un factor de crecimiento o su receptor que está implicado en estimular el desarrollo de vasos sanguíneos, por ejemplo, promover la angiogénesis, el crecimiento de células endoteliales, la estabilidad de los vasos sanguíneos y/o la vasculogénesis, etc. Por ejemplo, los factores angiogénicos incluyen, pero no se limitan a, VEGF y miembros de la familia de VEGF y sus receptores (VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGFR1, VEGFR2 y VEGFR3), P1GF, familia de PDGF, familia de factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), ligandos TIE (angiopoyetinas, An GPTI, ANGPT2), TIE1, TIE2, efrinas, Bv8, ligando similar a delta 4 (DLL4), Del-1, factores de crecimiento de fibroblastos: ácidos (aFGF) y básicos (bFGF), FGF4, FGF9, BMp9, b Mp 10, folistatina, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), GM-CSF, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor de dispersión (SF), interleucina 8 (IL-8), CXCL12, leptina, midkina, neuropilinas, NRP1, NRp2, factor de crecimiento placentario, factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas (PD-ECGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas, especialmente PDGF-BB, PDGFR alfa o PDGFR beta, pleiotrofina (PTN), progranulina, proliferina, factor de crecimiento y transformación alfa (TGF alfa), factor de crecimiento y transformación beta (TGF-beta), factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa), Alk1, CXCR4, Notchl, Notch4, Sema3A, Sema3C, Sema3F, Robo4, etc. Incluiría además factores que promueven la angiogénesis, tales como ESM1 y perlecán. También incluiría factores que aceleran la cicatrización, tales como la hormona del crecimiento, el factor de crecimiento insulínico I (IGF-I), VIGF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), dominio similar a EGF, múltiple 7 (EGFL7), CTGF y miembros de su familia, y TGF alfa y TGF beta. Véanse, por ejemplo, Klagsbrun y D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39; Streit y Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179; Ferrara y Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12): 1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (por ejemplo, la tabla 1 enumera factores angiogénicos conocidos); y Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206.

Un "agente antiangiogénico" o "inhibidor angiogénico" se refiere a una sustancia de bajo peso molecular, un polinucleótido (incluyendo, por ejemplo, un ARN inhibidor (ARNi o ARNip)), un polipéptido, una proteína aislada, una proteína recombinante, un anticuerpo, o conjugados o proteínas de fusión de los mismos, que inhibe la angiogénesis, la vasculogénesis o la permeabilidad vascular indeseable, ya sea directa o indirectamente. Se debe entender que el agente antiangiogénico incluye los agentes que se unen y bloquean la actividad angiogénica del factor angiogénico o su receptor. Por ejemplo, un agente antiangiogénico es un anticuerpo u otro antagonista frente a un agente angiogénico como se define anteriormente, por ejemplo, anticuerpos frente a VEGF-A o frente al receptor de VEGF-A (por ejemplo, receptor KDR o receptor Flt-1), inhibidores anti-PDGFR, moléculas pequeñas que bloquean la señalización del receptor de VEGF (por ejemplo, PTK787/ZK₂284, SU6668, SUTENT®/SU11248 (malato de sunitinib), AMG706, o los descritos, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 2004/113304). Los agentes antiangiogénicos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes agentes: inhibidores de VEGF tales como un antagonista específico de VEGf , inhibidor de EGF, inhibidores de EGFR, Erbitux® (cetuximab, ImClone Systems, Inc., Branchburg, N.J.), Vectibix® (panitumumab, Amgen, Thousand Oaks, Calif.), inhibidores de TIE2, inhibidores de IGF1R, inhibidores de COX-II (ciclooxigenasa II), inhibidores de MMP-2 (metaloproteinasa de la matriz 2) e inhibidores de MMP-9 (metaloproteinasa de la matriz 9), CP-547.632 (Pfizer Inc., NY, EE. UU.), axitinib (Pfizer Inc.; AG-013736), ZD-6474 (AstraZeneca), AEE788 (Novartis), AZD-2171), VEGF Trap (Regeneron/Aventis), Vatalanib (también conocido como PTK-787, ZK-222584: Novartis & Schering AG), Macugen (pegaptanib octasódico, NX-1838, EYE-001, Pfizer Inc./Gilead/Eyetech), IM862 (Cytran Inc. de Kirkland, Wash., Ee . UU.); y angiozima, una ribocima sintética de Ribozyme (Boulder, Colo.) y Chiron (Emeryville, Calif.), y combinaciones de los mismos. Otros inhibidores de la angiogénesis incluyen trombospondina 1, trombospondina 2, colágeno IV y colágeno XVIII. Se divulgan inhibidores de VEGF en las pat. de EE. UU. n.os 6.534.524 y 6.235.764. Los agentes antiangiogénicos también incluyen inhibidores de la angiogénesis naturales, por ejemplo, angiostatina, endostatina, etc. Véanse, por ejemplo, Klagsbrun y D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39; Streit y Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179 (por ejemplo, la tabla 3 que enumera el tratamiento antiangiogénico en el melanoma maligno); Ferrara y Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12): 1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (por ejemplo, la tabla 2 que enumera los factores antiangiogénicos conocidos); y Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206 (por ejemplo, la tabla 1 que enumera los agentes antiangiogénicos usados en ensayos clínicos).

El término "tratamiento antiangiogénico" se refiere a un tratamiento útil para inhibir la angiogénesis, que comprende la administración de un agente antiangiogénico.

El término "cáncer que expresa CD20" como se usa en el presente documento se refiere a todos los cánceres en los que las células cancerosas muestran una expresión del antígeno CD20. Preferentemente, cáncer que expresa CD20 como se usa en el presente documento se refiere a linfomas (preferentemente linfomas no hodgkinianos (LNH) de linfocitos B) y leucemias linfocíticas. Dichos linfomas y leucemias linfocíticas incluyen, por ejemplo, a) linfomas foliculares, b) linfomas de células pequeñas no escindidas/linfoma de Burkitt (incluyendo linfoma de Burkitt endémico, linfoma de Burkitt esporádico y linfoma distinto de Burkitt), c) linfomas de la zona marginal (incluyendo linfoma de linfocitos B de la zona marginal extraganglionar (linfomas de tejidos linfáticos asociados a mucosas, TLAM), linfoma de linfocitos B de la zona marginal ganglionar y linfoma de la zona marginal esplénico), d) linfoma de células del manto (LCM), e) linfoma de células grandes (incluyendo linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG), linfoma difuso de células mixtas, linfoma inmunoblástico, linfoma de linfocitos B mediastínico primario, linfoma angiocéntrico-linfoma pulmonar de linfocitos B), f) tricoleucemia, g) linfoma linfocítico, macroglobulinemia de Waldenstrom, h) leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC)/linfoma linfocítico pequeño (LLP), leucemia prolinfocítica de linfocitos B, i) neoplasias de células plasmáticas, mieloma de células plasmáticas, mieloma múltiple, plasmocitoma j) enfermedad de Hodgkin.

Más preferentemente, el cáncer que expresa CD20 es un linfoma no hodgkiniano (LNH) de linfocitos B. Especialmente, el cáncer que expresa CD20 es un linfoma de células del manto (LCM), leucemia linfocítica aguda (l La ), leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG), linfoma de Burkitt, tricoleucemia, linfoma folicular, mieloma múltiple, linfoma de la zona marginal, trastorno linfoproliferativo posterior al trasplante (TLPT), linfoma asociado al VIH, macroglobulinemia de Waldenstrom o linfoma del SNC primario.

El término "agente citotóxico" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o evita una función celular y/o provoca la muerte o destrucción celular. El término pretende incluir isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 y los isótopos radiactivos de Lu); agentes quimioterápicos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de los mismos tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos, y los diversos agentes antitumorales o antineoplásicos divulgados a continuación. Otros agentes citotóxicos se describen a continuación. Un agente tumoricida provoca la destrucción de células tumorales.

Una "toxina" es cualquier sustancia que puede tener un efecto perjudicial sobre el crecimiento o la proliferación de una célula.

Un "agente quimioterápico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN®); alquilsulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colquicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecán, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (en particular criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiína; espongistatina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafacina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos de enediína (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma II y caliqueamicina omega ll (véase, por ejemplo, Nicolaou et al. Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); CDP323, un inhibidor de alfa-4 integrina oral; dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; así como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos antibióticos de cromoproteína enediína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluyendo ADRIAMYCIN®, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolinodoxorrubicina, inyección liposomal de doxorrubicina HCl (DOXIL®), doxorrubicina liposomal TLC D-99 (MYOCET®), doxorrubicina liposomal pegilada (CAELYX®) y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), una epotilona y 5-fluorouracilo (5-FU); combretastatina; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reponedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etilhidracida; procarbacina; complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofurano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbacina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("citarabina"); tiotepa; taxoide, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), formulación de nanopartículas genomanipuladas con albúmina de paclitaxel (ABRAXANE™) y docetaxel (TAXOTERE®, Rhome-Poulene Rorer, Antony, Francia); cloranbucilo; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes de platino tales como cisplatino, oxaliplatino (por ejemplo, ELOXATIN®) y carboplatino; vincas, que evitan que la polimerización de tubulina forme microtúbulos, incluyendo vinblastina (VELBAN®), vincristina (ONCOVIN®), vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) y vinorelbina (NAVELBINE®); etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; leucovorina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de la topoisomerasa RFS2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico, incluyendo bexaroteno (TARGRETIN®); bisfosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®) o risedronato (ACTONEL®); troxacitabina (un análogo de 1,3-dioxolano nucleósido de citosina); oligonucleótidos antisentido, en particular los que inhiben la expresión de genes en vías de señalización implicadas en proliferación celular anómala, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) (por ejemplo, erlotinib (Tarceva™)); y VEGF-A que reducen la proliferación celular; vacunas tales como vacuna THER^{a t}O^pE® y vacunas de tratamientos génicos, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®); rmRH (por ejemplo, ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (sunitinib, SUTENT®, Pfizer); perifosina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo celecoxib o etoricoxib), inhibidor de proteosomas (por ejemplo, PS341); bortezomib (VELCADE®); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; inhibidor de Bcl-2 tal como oblimersen sódico (GENASENSE®); pixantrona; inhibidores de EGFR; inhibidores de tirosina cinasa; inhibidores de serina-treonina cinasa tales como rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®); inhibidores de farnesiltransferasa tales como lonafarnib (SCH 6636, SARASAR™); y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura para una politerapia de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona; y FOLFOX, una abreviatura de una pauta de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovorina, y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores.

Los agentes quimioterápicos como se define en el presente documento incluyen "agentes antihormonales" o "tratamientos endocrinos" que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de las hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer. Pueden ser hormonas en sí mismas, incluyendo, pero sin limitarse a: antiestrógenos y moduladores selectivos de los receptores de estrógenos (MSRE), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno FARESTON; inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestania, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA® y anastrozol ARIMIDEX®; y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprorelina y goserelina; así como troxacitabina (un análogo de nucleósido citosina de 1,3-dioxolano); oligonucleótidos antisentido, en particular los que inhiben la expresión de genes en las vías de señalización implicadas en la proliferación celular anómala, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf y H-Ras; ribocimas, tales como un inhibidor de la expresión de VEGF (por ejemplo, ribocima ANGIOZYME®) y un inhibidor de la expresión de HER2; vacunas, tales como vacunas de tratamiento génico, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; vinorelbina y esperamicinas (véase la pat. de EE. UU. n.° 4.675.187) y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores.

Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, in vitro o bien in vivo. En un modo de realización, el agente inhibidor del crecimiento es un anticuerpo inhibidor del crecimiento que evita o reduce la proliferación de una célula que expresa un antígeno al que se une el anticuerpo. En otro modo de realización, el agente inhibidor del crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de células en fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar distinto de la fase S), tales como agentes que inducen la interrupción de G1 y la interrupción de la fase M. Los bloqueantes de fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), taxanos e inhibidores de topoisomerasa II tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido y bleomicina. Los agentes que interrumpen G1 también actúan sobre la interrupción de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbacina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y citarabina. Se puede encontrar información adicional en MendeIsohn and Israel, eds. The Molecular Basis of Cancer, capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs", por Murakami et al. (W.B. Saunders, Filadelfia, 1995), por ejemplo, p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos antineoplásicos derivados ambos del árbol del tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamblaje de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos evitando la despolimerización, lo que da como resultado la inhibición de mitosis en células.

Por "radioterapia" se quiere decir el uso de rayos beta o rayos gamma dirigidos para inducir suficiente daño a una célula para limitar su capacidad de funcionar normalmente o para destruir la célula por completo. Se apreciará que existen muchas formas conocidas en la técnica para determinar la dosificación y duración del tratamiento. Los tratamientos típicos se dan como una administración en una sola dosis y las dosificaciones típicas varían de 10 a 200 unidades (grays) por día.

Un "sujeto" o un "individuo" para propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja y animales de zoológico, para la práctica de deportes o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, ganado bovino, etc. Preferentemente, el mamífero es un ser humano.

El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo, siempre que presenten la actividad biológica deseada.

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos de investigación, de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En algunos modos de realización, un anticuerpo se purifica (1) hasta más de un 95 % en peso de anticuerpo como se determina, por ejemplo, por el procedimiento de Lowry, y en algunos modos de realización, hasta más de un 99 % en peso; (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N terminal o interna por el uso, por ejemplo, de un secuenciador de vaso giratorio o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando, por ejemplo, tinción con azul de Coomassie o plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, puesto que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Habitualmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.

Los "anticuerpos naturales" son normalmente glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se une a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, aunque el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de isotipos de inmunoglobulina diferentes. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V_H) seguido de una serie de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (V_L) en un extremo y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos aminoacídicos particulares forman una interfase entre los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada.

El término "dominio constante" se refiere a la porción de una molécula de inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos más conservada en relación con la otra porción de la inmunoglobulina, el dominio variable, que contiene el sitio de unión a antígeno. El dominio constante contiene los dominios C^h1, C^h2 y C^h3 (conjuntamente, CH) de la cadena pesada y el dominio CHL (o CL) de la cadena ligera.

La "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios aminoterminales de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada se puede denominar "V_H.". El dominio variable de la cadena ligera se puede denominar "V_L". Estos dominios son, en general, las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de unión a antígeno.

El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente por los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables (HVR), en los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se llaman regiones estructurales (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera naturales comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina beta, conectadas por tres HVR, que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de lámina beta. Las HVR en cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las HVR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos.

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de mamífero se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa ("k") y lambda ("A"), en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

El término "isotipo" o "subclase" de IgG, como se usa en el presente documento, quiere decir cualquiera de las subclases de inmunoglobulinas definidas por las características químicas y antigénicas de sus regiones constantes.

Dependiendo de las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) se pueden asignar a clases diferentes. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGⁱ, IgG², IgG³, IgG⁴, IgAⁱe IgA². Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, y, £, Y, y M, respectivamente. Las estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas y se describen, en general en, por ejemplo, Abbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 4.a ed. (W.B. Saunders, Co., 2000). Un anticuerpo puede ser parte de una molécula de fusión más grande, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo con una o más de otras proteínas o péptidos.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, no a fragmentos de anticuerpo como se define a continuación. Las expresiones se refieren en particular a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen una región Fc.

Un "anticuerpo no marcado" para los propósitos en el presente documento es un anticuerpo que no está conjugado con un resto citotóxico o radiomarcador.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferentemente la región de unión a antígeno del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')₂y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento "Fc" residual, con un nombre que refleja su capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina proporciona un fragmento F(ab')₂que tiene dos sitios de combinación con antígeno y todavía se puede reticular con el antígeno.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión a antígeno completo. En un modo de realización, una especie de Fv bicatenario consiste en un dímero de un dominio variable de la cadena pesada y uno de la ligera en asociación estrecha, no covalente. En una especie de Fv monocatenario (scFv), un dominio variable de la cadena pesada y uno de la ligera se pueden unir covalentemente por un conector peptídico flexible de modo que las cadenas ligera y pesada se puedan asociar en una estructura "dimérica" análoga a la de una especie de Fv bicatenario. Es en esta configuración en la que las tres HVR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Conjuntamente, las seis HVR confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres HVR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab contiene los dominios variables de la cadena pesada y ligera y también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxílico del dominio CH1 de la cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra de anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para un Fab' en el que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')₂se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También son conocidos otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv monocatenarios" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. En general, el polipéptido scFv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios VH y VL lo que posibilita que el scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de scFv, véase, por ejemplo, Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York, 1994), pp. 269-315.

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Usando un conector que sea demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se obliga a que los dominios se emparejen con los dominios complementarios de otra cadena y creen dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos. Los diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003) .

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones naturales, que pueden estar presentes en cantidades menores. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo no es una mezcla de distintos anticuerpos. En determinados modos de realización, un anticuerpo monoclonal de este tipo incluye típicamente un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une a una diana, en el que la secuencia polipeptídica de unión a diana se obtuvo por un procedimiento que incluye la selección de una única secuencia polipeptídica de unión a diana de una pluralidad de secuencias polipeptídicas. Por ejemplo, el procedimiento de selección puede ser la selección de un clon único de una pluralidad de clones, tal como un grupo de clones de hibridoma, clones de fago o clones de ADN recombinante. Se debe entender que una secuencia de unión a diana seleccionada se puede alterar además, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar la secuencia de unión a diana, para mejorar su producción en un cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de unión a diana alterada es también un anticuerpo monoclonal de la presente divulgación. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige frente a un determinante único en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales son ventajosas en cuanto a que típicamente no están contaminadas por otras inmunoglobulinas.

El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se ha de interpretar como que requiere la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la divulgación se pueden preparar por una variedad de técnicas, que incluyen, por ejemplo, el procedimiento de hibridoma (por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.a ed. 1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la pat. de EE. UU. n.° 4.816.567), tecnologías de presentación en fagos (véanse, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol.

222:581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004) ; Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004) y tecnologías para producir anticuerpos humanos o humanizados en animales que tienen partes o la totalidad de los locus de inmunoglobulina humana o genes que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (véanse, por ejemplo, los documentos WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); las pat. de EE. UU. n.os 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (véanse, por ejemplo, la pat. de EE. UU. n.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos incluyen anticuerpos PRIMATIZED® en los que la región de unión a antígeno del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido, por ejemplo, inmunizando macacos con el antígeno de interés.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En un modo de realización, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la que los residuos de una HVR del receptor se remplazan por residuos de una HVR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas. En algunos casos, se reemplazan residuos de FR de la inmunoglobulina humana por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se pueden realizar para refinar más el rendimiento del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente comprenderá también al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véanse, por ejemplo, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Véanse también, por ejemplo, Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris,Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); y las pat. de EE. UU. n.os 6.982.321 y 7.087.409.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha preparado usando cualquiera de las técnicas para preparar anticuerpos humanos como se divulga en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo colecciones de presentación en fagos. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). También están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos los procedimientos descritos en Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Véase también van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5:368-74 (2001). Los anticuerpos humanos se pueden preparar administrando el antígeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir dichos anticuerpos en respuesta a la exposición antigénica, pero con locus endógenos que se han desactivado, por ejemplo, xenorratones inmunizados (véanse, por ejemplo, las pat. de EE. UU. n.° 6.075.181 y 6.150.584 con respecto a la tecnología XENOMOUSE™). Véase también, por ejemplo, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) con respecto a los anticuerpos humanos generados por medio de una tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos.

Un "anticuerpo dependiente de la especie" es uno que tiene una afinidad de unión más fuerte por un antígeno de una primera especie de mamífero que la que tiene por un homólogo de ese antígeno de una segunda especie de mamífero. Normalmente, el anticuerpo dependiente de la especie se "une específicamente" a un antígeno humano (por ejemplo, tiene un valor de afinidad de unión (Kd) de no más de aproximadamente 1x10'7 M, preferentemente de no más de aproximadamente 1x10'8 M y preferentemente no más de aproximadamente 1x10^-9M) pero tiene una afinidad de unión por un homólogo del antígeno de una segunda especie de mamífero no humano que es al menos aproximadamente 50 veces, o al menos aproximadamente 500 veces, o al menos aproximadamente 1000 veces, más débil que su afinidad de unión por el antígeno humano. El anticuerpo dependiente de la especie puede ser cualquiera de los diversos tipos de anticuerpos como se define anteriormente, pero preferentemente es un anticuerpo humanizado o humano.

La expresión "región hipervariable", "HVR" o "HV", cuando se usa en el presente documento, se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son de secuencia hipervariable y/o forman bucles estructuralmente definidos. En general, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H₂, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). En anticuerpos naturales, H3 y L3 presentan la mayor diversidad de las seis HVR, y se cree que H3 en particular desempeña un papel único al conferir una especificidad precisa a los anticuerpos. Véanse, por ejemplo, Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson y Wu, en Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003). De hecho, los anticuerpos de camélido naturales que consisten solo en una cadena pesada son funcionales y estables en ausencia de cadena ligera. Véanse, por ejemplo, HamersCasterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

Una serie de delimitaciones de HVR están en uso y se engloban en el presente documento. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de Kabat se basan en la variabilidad de secuencia y son las usadas más comúnmente (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Chothia se refiere, en cambio, a la localización de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las HVR de AbM representan un término medio entre las HVR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y se usan por el programa informático de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las HVR de "contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los residuos de cada una de estas HVR se indican a continuación.

Las HVR pueden comprender "HVR extendidas" como sigue: 24-36 o 24-34 (L1), 46-56 o 50-56 (L2) y 89-97 o 89 96 (L3) en el VL y 26-35 (H1), 50-65 o 49-65 (H₂) y 93-102, 94-102, o 95-102 (H3) en el VH. Los residuos del dominio variable se enumeran de acuerdo con Kabat et al., supra, para cada una de estas definiciones.

Los residuos "estructurales" o "FR" son aquellos residuos del dominio variable distintos de los residuos de HVR, como se definen en el presente documento.

El término "numeración de residuos del dominio variable según Kabat" o "numeración de posición de aminoácidos según Kabat", y las variaciones del mismo, se refieren al sistema de numeración usado para dominios variables de la cadena pesada o dominios variables de la cadena ligera de la recopilación de anticuerpos en Kabat et al., supra. Usando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o adicionales correspondientes a un acortamiento de, o inserción en, una FR o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada puede incluir una única inserción aminoacídica (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del residuo 82 de la FR de la cadena pesada. La numeración de residuos de Kabat se puede determinar para un anticuerpo dado por alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada según Kabat "estándar".

El sistema de numeración de Kabat se usa, en general, cuando se hace referencia a un residuo en el dominio variable (aproximadamente los residuos 1-107 de la cadena ligera y los residuos 1-113 de la cadena pesada) (por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). El "sistema de numeración EU" o "índice EU" se usa, en general, cuando se hace referencia a un residuo en una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, el índice EU que se informa en Kabat et al., supra). El "índice EU según Kabat" se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo humano IgG1 EU.

La expresión "anticuerpos lineales" se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al., (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062). En resumen, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, conjuntamente con polipéptidos de la cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

II. Formulaciones y preparación de anticuerpos

La divulgación en el presente documento se refiere a formulaciones acuosas estables que comprenden un anticuerpo. En algunos modos de realización, la formulación comprende un anticuerpo monoclonal, trehalosa, y un tampón, en la que la proporción en peso del anticuerpo monoclonal con respecto a la trehalosa en la formulación es mayor que o igual a 0,41 y menor que 1,65, en la que la formulación tiene un pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,0. En algunos modos de realización, la formulación comprende además un tampón (tal como fosfato de sodio o histidina). En algunos modos de realización, la formulación comprende (a) un anticuerpo monoclonal en una cantidad de aproximadamente 25 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml; (b) trehalosa en una cantidad de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 634 mM; y (c) fosfato de sodio en una cantidad de más de 35 mM a aproximadamente 100 mM, en la que dicha formulación tiene un pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,0, y en la que la proporción en peso de dicho anticuerpo monoclonal con respecto a dicha trehalosa en la formulación es mayor que o igual a aproximadamente 0,41 y menor que 1,65. En algunos modos de realización, el anticuerpo en la formulación es estable a -20 °C durante al menos aproximadamente 6 meses, al menos aproximadamente 12 meses o al menos aproximadamente 18 meses. En algunos modos de realización, la trehalosa se puede sustituir por un poliol distinto de trehalosa. En algunos modos de realización, el anticuerpo se une a VEGF.

A. Preparación de anticuerpos

El anticuerpo en la formulación se prepara usando técnicas disponibles en la técnica para generar anticuerpos, de los que se describen procedimientos ejemplares con más detalle en las siguientes secciones.

El anticuerpo se dirige frente a un antígeno de interés. Preferentemente, el antígeno es un polipéptido biológicamente importante y la administración del anticuerpo a un mamífero que padece un trastorno puede dar como resultado un beneficio terapéutico en dicho mamífero. Sin embargo, también se contemplan anticuerpos dirigidos frente a antígenos distintos de polipéptido.

Si el antígeno es un polipéptido, puede ser una molécula transmembranaria (por ejemplo, receptor) o ligando, tal como un factor de crecimiento. Los antígenos ejemplares incluyen moléculas tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); CD20; ox-LDL; ox-ApoB100; renina; una hormona del crecimiento, incluyendo hormona del crecimiento humana y hormona del crecimiento bovina; factor liberador de la hormona del crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona foliculoestimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación, tales como factor VIIIC, factor IX, tromboplastina tisular y factor de Von Willebrand; factores anticoagulación, tales como proteína C; péptido natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador del plasminógeno, tal como urocinasa u orina humana o activador tisular del plasminógeno (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (regulación por activación normalmente expresada y secretada por los linfocitos T); proteína inflamatoria de macrófagos (MIP-1-alfa) humana; una seroalbúmina, tal como seroalbúmina humana; hormona antimülleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropinas de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; DNasa; IgE; un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA), tal como CTLA-4; inhibina; activina; receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoideos; un factor neurotrófico, tal como el factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT4, NT-5 o NT-6) o un factor de crecimiento nervioso, tal como NGF-p; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos, tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento y transformación (TGF), tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-P1, TGF-P2, TGF-P3, TGF-p4 o TGF-p5; factor de crecimiento insulínico I y II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de unión al factor de crecimiento insulínico; proteínas CD, tales como CD3, CD4, CD8, CD19 y CD20; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón, tal como interferón alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, de IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de linfocitos T; proteínas de membrana de superficie; factor de aceleración del decaimiento; antígeno vírico, tal como, por ejemplo, una porción de la envoltura del sida; proteínas de transporte; receptores de migración dirigida; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas, tales como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, una ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado a tumor, tal como el receptor HER2, HER3 o HER4; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos enumerados anteriormente.

En determinados modos de realización de la divulgación, las dianas moleculares para anticuerpos englobados por la divulgación incluyen VEGF y CD20. En algunos modos de realización, el anticuerpo en el presente documento es uno que se une a VEGF humano. En algunos modos de realización, el anticuerpo en el presente documento es uno que se une a CD20 humano.

(i) Preparación de antígenos

Se pueden usar antígenos o fragmentos de los mismos solubles, opcionalmente conjugados con otras moléculas, como inmunógenos para generar anticuerpos. Para moléculas transmembranarias, tales como receptores, se pueden usar fragmentos de estos (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor) como inmunógeno. De forma alternativa, se pueden usar células que expresan la molécula transmembranaria como inmunógeno. Dichas células se pueden derivar de una fuente natural (por ejemplo, líneas celulares cancerosas) o pueden ser células que se han transformado por técnicas recombinantes para expresar la molécula transmembranaria. Otros antígenos y formas de los mismos útiles para preparar anticuerpos serán evidentes para los expertos en la técnica.

(ii) Determinados procedimientos basados en anticuerpos

Los anticuerpos policlonales se generan preferentemente en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (s.c.) o intraperitoneales (i.p.) del antígeno pertinente y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno pertinente con una proteína que es inmunógena en la especie que se va a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, seroalbúmina, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja, usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster maleimidobenzoilsulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl₂o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados combinando, por ejemplo, 100 |jg o 5 |jg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes después, se administra una dosis de refuerzo a los animales con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días después se extrae sangre de los animales y el suero se somete a ensayo para determinar el valor de anticuerpos. Se administra una dosis de refuerzo a los animales hasta alcanzar una meseta del valor. Preferentemente, se administra una dosis de refuerzo al animal con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. También se pueden preparar conjugados en cultivo de células recombinantes como fusiones de proteínas. También se usan adecuadamente agentes de agregación, tales como alumbre, para potenciar la respuesta inmunitaria.

Los anticuerpos monoclonales de la divulgación se pueden preparar usando el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), y descrito además, por ejemplo, en Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253- 260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.a ed. 1988); Hammerling et al., en: MonoclonalAntibodies and T-CellHybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) con respecto a hibridomas humanos-humanos. Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la pat. de EE. UU. n.° 7.189.826 con respecto a la producción de anticuerpos IgM naturales humanos monoclonales a partir de líneas celulares de hibridoma. La tecnología de hibridoma humano (tecnología de trioma) se describe en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).

Para diversas otras técnicas de hibridoma, véanse, por ejemplo, los documentos US 2006/258841; US 2006/183887 (anticuerpos completamente humanos), US 2006/059575; US 2005/287149; US 2005/100546; US 2005/026229; y las pat. de EE. UU. n.os 7.078.492 y 7.153.507. Un protocolo ejemplar para producir anticuerpos monoclonales usando el procedimiento de hibridoma se describe como sigue. En un modo de realización, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, se inmuniza para obtener linfocitos que producen o pueden producir anticuerpos que se unen específicamente a la proteína usada para la inmunización. Los anticuerpos se generan en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (s.c.) o intraperitoneales (i.p.) de un polipéptido de la divulgación o un fragmento del mismo, y un adyuvante, tal como monofosforil lípido A (MPL)/dicrinomicolato de trehalosa (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, Mont.). Se puede preparar un polipéptido de la divulgación (por ejemplo, antígeno) o un fragmento del mismo usando procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como procedimientos recombinantes, de los que algunos se describen además en el presente documento. El suero de animales inmunizados se somete a ensayo para determinar anticuerpos anti-antígeno, y se administran opcionalmente inmunizaciones de refuerzo. Se aíslan los linfocitos de animales que producen anticuerpos antiantígeno. De forma alternativa, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro.

A continuación, se fusionan los linfocitos con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma. Véase, por ejemplo, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986). Se pueden usar células de mieloma que se fusionan eficazmente, soportan una producción de alto nivel estable de anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Las células de mieloma ejemplares incluyen, pero no se limitan a, líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif., EE. UU., y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de American Type Culture Collection, Rockville, Md., EE. UU. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).

Se siembran las células de hibridoma así preparadas y se cultivan en un medio de cultivo adecuado, por ejemplo, un medio que contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma originales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que evitan el crecimiento de células carentes de HGPRT. Preferentemente, se usan procedimientos de cultivo celular de hibridoma sin suero para reducir el uso de suero derivado de animal tal como suero fetal bovino, como se describe, por ejemplo, en Even et al., Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006).

Los oligopéptidos como herramientas para mejorar la productividad de cultivos celulares de hibridoma se describen en Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005). Específicamente, se enriquecen los medios de cultivo estándar con determinados aminoácidos (alanina, serina, asparagina, prolina) o con fracciones de hidrolizado de proteínas, y se puede suprimir significativamente la apoptosis por oligopéptidos sintéticos, constituidos por de tres a seis residuos aminoacídicos. Los péptidos están presentes en concentraciones milimolares o mayores.

El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma se puede someter a ensayo para la producción de anticuerpos monoclonales que se unen a un anticuerpo de la divulgación. La especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se puede determinar por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoanálisis (RIA) o enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA). La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, por análisis de Scatchard. Véase, por ejemplo, Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Después de que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar por procedimientos de dilución limitante y cultivar por procedimientos estándar. Véase, por ejemplo, Goding, supra. Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, se pueden cultivar in vivo células de hibridoma como tumores ascíticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, líquido ascítico o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales, tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. Un procedimiento para el aislamiento de proteínas de células de hibridoma se describe en el documento US 2005/176122 y la pat. de EE. UU. n.° 6.919.436. El procedimiento incluye el uso de sales mínimas, tales como sales liotrópicas, en el procedimiento de unión y preferentemente también el uso de pequeñas cantidades de disolventes orgánicos en el procedimiento de elución.

(iii) Determinados procedimientos de cribado de colecciones

Los anticuerpos de la divulgación se pueden preparar usando colecciones combinatorias para cribar para determinar los anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, una variedad de procedimientos son conocidos en la técnica para generar colecciones de presentación en fagos y cribar dichas colecciones para determinar los anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Dichos procedimientos se describen, en general, en Hoogenboom et al., en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001). Por ejemplo, un procedimiento de generación de anticuerpos de interés es a través del uso de una colección de anticuerpos en fagos como se describe en Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93.

En principio, los clones de anticuerpos sintéticos se seleccionan cribando colecciones de fagos que contienen fagos que presentan diversos fragmentos de la región variable (Fv) del anticuerpo fusionada a la proteína de la cubierta del fago. Dichas colecciones de fagos se analizan por cromatografía de afinidad frente al antígeno deseado. Los clones que expresan fragmentos Fv que se pueden unir al antígeno deseado se adsorben en el antígeno y, por tanto, se separan de los clones de no unión en la colección. A continuación, los clones de unión se eluyen del antígeno, y se pueden enriquecer además por ciclos adicionales de adsorción/elución de antígeno. Cualquiera de los anticuerpos de la divulgación se puede obtener diseñando un procedimiento de cribado de antígenos adecuado para seleccionar el clon de fago de interés seguido de la construcción de un clon de anticuerpo de longitud completa usando las secuencias de Fv del clon de fago de interés y secuencias de la región constante (Fc) adecuadas descritas en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Publicación del NIH 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3.

En determinados modos de realización, el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo se forma a partir de dos regiones variables (V) de aproximadamente 110 aminoácidos, cada una de las cadenas ligera (VL) y pesada (VH), presentando ambas tres bucles hipervariables (HVR) o regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Los dominios variables se pueden presentar funcionalmente en fagos, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) en los que VH y VL están unidos covalentemente a través de un péptido flexible corto, o bien como fragmentos Fab en los que están fusionados cada uno a un dominio constante e interaccionan no covalentemente, como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 (1994). Como se usa en el presente documento, los clones de fago que codifican scFv y los clones de fago que codifican Fab se denominan conjuntamente "clones de fago para Fv" o "clones para Fv".

Los repertorios de genes de VH y VL se pueden clonar por separado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y recombinar aleatoriamente en colecciones de fagos, que, a continuación, se pueden consultar para determinar los clones de unión a antígeno como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Las colecciones de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad con respecto al inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. De forma alternativa, se puede clonar el repertorio sin exposición previa para proporcionar una única fuente de anticuerpos humanos para una amplia gama de antígenos no propios y también propios sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, también se pueden preparar sintéticamente colecciones sin exposición previa clonando los segmentos génicos V no reordenados a partir de células madre y usando cebadores de PCR que contienen secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para lograr el reordenamiento in vitro, como se describe por Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 221: 381-388 (1992).

En determinados modos de realización, el fago filamentoso se usa para presentar fragmentos de anticuerpo por fusión a la proteína de la cubierta menor μlll. Los fragmentos de anticuerpo se pueden presentar como fragmentos Fv monocatenarios, en los que los dominios VH y VL están conectados en la misma cadena polipeptídica por un espaciador polipeptídico flexible, por ejemplo, como se describe por Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), o como fragmentos Fab, en los que una cadena se fusiona a pIII y la otra se secreta en el periplasma de la célula huésped bacteriana, donde el ensamblaje de una estructura de Fab-proteína de la cubierta se presenta en la superficie del fago desplazando algunas de las proteínas de la cubierta naturales, por ejemplo, como se describe en Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991).

En general, los ácidos nucleicos que codifican fragmentos de genes de anticuerpos se obtienen de células inmunitarias obtenidas de seres humanos o animales. Si se desea una colección sesgada en favor de clones antiantígeno, se inmuniza al sujeto con antígeno para generar una respuesta de anticuerpos, y se recuperan las células del bazo y/o linfocitos B en circulación u otros linfocitos de sangre periférica (LSP) para la construcción de colecciones. En un modo de realización se obtiene una colección de fragmentos de genes de anticuerpos humanos sesgada en favor de los clones anti-antígeno generando una respuesta de anticuerpos anti-antígeno en ratones transgénicos que portan una micromatriz genética de inmunoglobulina humana funcional (y que carecen de un sistema de producción de anticuerpos endógenos funcionales), de modo que la inmunización con antígeno dé lugar a linfocitos B que producen anticuerpos humanos frente al antígeno. La generación de ratones transgénicos que producen anticuerpos humanos se describe a continuación.

Se puede obtener un enriquecimiento adicional en cuanto a las poblaciones celulares reactivas anti-antígeno usando un procedimiento de cribado adecuado para aislar linfocitos B que expresan un anticuerpo unido a membrana específico de antígeno, por ejemplo, por separación celular usando cromatografía de afinidad por antígeno o adsorción de células sobre antígeno marcado con fluorocromo seguida de separación celular activada por flujo (FACS).

De forma alternativa, el uso de células del bazo y/o linfocitos B u otros LSP de un donante no inmunizado proporciona una mejor representación del posible repertorio de anticuerpos, y también permite la construcción de una colección de anticuerpos usando cualquier especie animal (humana o no humana) en la que el antígeno no es antigénico. Para colecciones que incorporan una construcción de genes de anticuerpos in vitro, se obtienen células madre del sujeto para proporcionar ácidos nucleicos que codifiquen segmentos de genes de anticuerpos no reordenados. Las células inmunitarias de interés se pueden obtener a partir de una variedad de especies animales, tales como las especies humana, de ratón, de rata, lagomorfa, lupina, canina, felina, porcina, bovina, equina y aviar, etc.

Los segmentos de genes variables de anticuerpos que codifican ácidos nucleicos (incluyendo los segmentos de VH y VL) se recuperan de las células de interés y se amplifican. En el caso de las colecciones de genes de VH y VL reordenados, se puede obtener el ADN deseado aislando ADN genómico o ARNm de linfocitos, seguido de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores que coinciden con los extremos 5' y 3' de genes de VH y VL reordenados como se describe en Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE. UU.), 86: 3833-3837 (1989), preparando de este modo diversos repertorios de genes V para expresión. Los genes V se pueden amplificar a partir de ADNc y ADN genómico, con los cebadores inversos en el extremo 5' del exón que codifica el dominio V maduro y los cebadores directos basadosdentro del segmento J como se describe en Orlandi et al. (1989) y en Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989). Sin embargo, para amplificar a partir de ADNc, los cebadores inversos también se pueden basar en el exón líder como se describe en Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991), y los cebadores directos dentro de la región constante como se describe en Sastry et al., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE. UU.), 86: 5728-5732 (1989). Para maximizar la complementariedad, se puede incorporar redundancia en los cebadores como se describe en Orlandi et al. (1989) o Sastry et al. (1989). En determinados modos de realización, la diversidad de las colecciones se maximiza usando cebadores de PCR dirigidos a cada familia de genes V para amplificar todas las disposiciones de VH y VL disponibles presentes en la muestra de ácido nucleico de células inmunitarias, por ejemplo, como se describe en el procedimiento de Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) o como se describe en el procedimiento de Orum et al., Nucleic Acids Res. 21: 4491-4498 (1993). Para la clonación del ADN amplificado en vectores de expresión se pueden introducir sitios de restricción infrecuentes dentro del cebador de PCR como una marca en un extremo como se describe en Orlandi et al. (1989), o por amplificación por PCR adicional con un cebador marcado como se describe en Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991).

Los repertorios de genes V reordenados sintéticamente se pueden derivar in vitro de segmentos de genes V. La mayoría de los segmentos de genes VH humanos se han clonado y secuenciado (informado en Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)), y cartografiado (informado en Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993); estos segmentos clonados (incluyendo todas las conformaciones principales de los bucles H1 y H₂) se pueden usar para generar diversos repertorios de genes VH con cebadores de PCR que codifican bucles H3 de secuencia y longitud diversas como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). También se pueden preparar repertorios de VH con toda la diversidad de secuencia enfocada en un bucle H3 largo de una única longitud como se describe en Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992). Los segmentos V^ky VA humanos se han clonado y secuenciado (informado en Williams y Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) y se pueden usar para preparar repertorios de cadena ligera sintéticos. Los repertorios de genes V sintéticos, basados en una gama de pliegues VH y VL, y longitudes L3 y H3, codificarán anticuerpos de considerable diversidad estructural. Después de la amplificación de los ADN que codifican genes V, se pueden reordenar in vitro segmentos de genes V de la estirpe germinal de acuerdo con los procedimientos de Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).

Los repertorios de fragmentos de anticuerpo se pueden construir combinando los repertorios de genes VH y VL conjuntamente de varias formas. Cada repertorio se puede crear en vectores diferentes y los vectores se pueden recombinar in vitro, por ejemplo, como se describe en Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993), o in vivo por infección combinatoria, por ejemplo, el sistema loxP descrito en Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265 2266 (1993). El enfoque de recombinación in vivo aprovecha la naturaleza bicatenaria de fragmentos Fab para superar el límite del tamaño de la colección impuesto por la eficacia de transformación de E. coli. Los repertorios de VH y VL sin exposición previa se clonan por separado, uno en un fagémido y el otro en un vector de fago. A continuación, se combinan las dos colecciones por infección por fagos de bacterias que contienen fagémidos, de modo que cada célula contenga una combinación diferente y el tamaño de la colección esté limitado solo por el número de células presentes (aproximadamente 10¹²clones). Ambos vectores contienen señales de recombinación in vivo de modo que los genes VH y VL se recombinen en un único replicón y se empaqueten conjuntamente en viriones de fago. Estas inmensas colecciones proporcionan grandes cantidades de diversos anticuerpos con buena afinidad (K_d ^-1de aproximadamente 10^-8M).

De forma alternativa, los repertorios se pueden clonar secuencialmente en el mismo vector, por ejemplo, como se describe en Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991), o ensamblar conjuntamente por PCR y a continuación clonar, por ejemplo, como se describe en Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). También se puede usar ensamblaje por p Cr para unir los ADN de VH y VL con ADN que codifica un espaciador peptídico flexible para formar repertorios de Fv monocatenarios (scFv). Aún en otra técnica, se usa "ensamblaje por PCR en célula" para combinar genes de VH y VL en linfocitos por PCR y, a continuación, clonar repertorios de genes unidos como se describe en Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992).

Los anticuerpos producidos por las colecciones sin exposición previa (naturales o bien sintéticas) pueden ser de afinidad moderada (K^d-1de aproximadamente 10⁶a 10⁷M^{' 1}), pero la maduración de la afinidad también se puede imitar in vitro construyendo y reseleccionando a partir de colecciones secundarias como se describe en Winter et al. (1994), supra. Por ejemplo, la mutación se puede introducir al azar in vitro usando polimerasa propensa a errores (informada en Leung et al., Techniquel: 11-15 (1989)) en el procedimiento de Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992) o en el procedimiento de Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992). Adicionalmente, la maduración de la afinidad se puede realizar mutando aleatoriamente una o más CDR, por ejemplo, usando PCR con cebadores que portan secuencias aleatorias que abarcan la CDR de interés, en clones Fv individuales seleccionados y cribando para determinar clones de mayor afinidad. El documento WO 9607754 (publicado el 14 de marzo de 1996) describió un procedimiento para inducir mutagénesis en una región determinante de la complementariedad de una cadena ligera de inmunoglobulina para crear una colección de genes de la cadena ligera. Otro enfoque eficaz es recombinar los dominios VH o VL seleccionados por presentación en fagos con repertorios de variantes de dominios V naturales obtenidas a partir de donantes no inmunizados y cribar para determinar la mayor afinidad en varias tandas de rebarajado de cadenas como se describe en Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo con afinidades de aproximadamente 10^-9M o menos.

El cribado de las colecciones se puede lograr por diversas técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, el antígeno se puede usar para recubrir los pocillos de las placas de adsorción, expresar en células huésped fijadas a placas de adsorción o usar en la separación celular, o conjugar con biotina para la captura con microesferas recubiertas con estreptavidina, o usar en cualquier otro procedimiento para explorar colecciones de presentación en fagos.

Las muestras de las colecciones en fagos se ponen en contacto con el antígeno inmovilizado en condiciones adecuadas para la unión de al menos una porción de las partículas de fago con el adsorbente. Normalmente, las condiciones, que incluyen pH, fuerza iónica, temperatura y similares, se seleccionan para imitar condiciones fisiológicas. Los fagos unidos a la fase sólida se lavan y a continuación se eluyen con ácido, por ejemplo, como se describe en Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991), o con álcali, por ejemplo, como se describe en Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), o por competencia antigénica, por ejemplo, en un procedimiento similar al procedimiento de competencia antigénica de Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). Los fagos se pueden enriquecer 20-1000 veces en una única tanda de selección. Además, se pueden cultivar los fagos enriquecidos en cultivos bacterianos y someterse a tandas de selección adicionales.

La eficacia de la selección depende de muchos factores, incluyendo la cinética de disociación durante el lavado, y si múltiples fragmentos de anticuerpo en un único fago pueden interactuar simultáneamente con el antígeno. Los anticuerpos con cinética de disociación rápida (y afinidades de unión débiles) se pueden conservar por el uso de lavados cortos, presentación en fagos multivalente y alta densidad de recubrimiento de antígeno en fase sólida. La alta densidad no solo estabiliza el fago a través de interacciones multivalentes, sino que favorece que el fago que se ha disociado se vuelva a unir. La selección de anticuerpos con cinética de disociación lenta (y buenas afinidades de unión) se puede promover por el uso de lavados largos y presentación en fagos monovalente como se describe en Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) y en el documento WO 92/09690, y una baja densidad de recubrimiento de antígeno como se describe en Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992).

Es posible seleccionar entre anticuerpos en fagos de diferentes afinidades, incluso con afinidades que difieran ligeramente, por el antígeno. Sin embargo, es probable que la mutación aleatoria de un anticuerpo seleccionado (por ejemplo, como se realiza en algunas técnicas de maduración de la afinidad) dé lugar a muchos mutantes, uniéndose la mayor parte al antígeno, y unos pocos con mayor afinidad. Con antígeno limitante, el fago de alta afinidad infrecuente podría quedar fuera. Para conservar todos los mutantes de mayor afinidad, los fagos se pueden incubar con un exceso de antígeno biotinilado, pero con el antígeno biotinilado a una concentración de molaridad menor que la constante de afinidad molar diana por el antígeno. A continuación, los fagos de alta afinidad de unión se pueden capturar por microesferas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina. Dicha "captura en equilibrio" permite que se seleccionen los anticuerpos de acuerdo con sus afinidades de unión, con una sensibilidad que permita el aislamiento de clones mutantes con una afinidad tan solo dos veces mayor a partir de un gran exceso de fagos con afinidad menor. Las condiciones usadas en el lavado de fagos unidos a una fase sólida también se pueden manipular para discriminar en base a la cinética de disociación.

Los clones anti-antígeno se pueden seleccionar en base a la actividad. En determinados modos de realización, la divulgación proporciona anticuerpos anti-antígeno que se unen a células vivas que expresan naturalmente el antígeno o se unen al antígeno flotante libre o al antígeno fijado a otras estructuras celulares. Los clones Fv correspondientes a dichos anticuerpos anti-antígeno se pueden seleccionar (1) aislando clones anti-antígeno a partir de una colección de fagos como se describe anteriormente, y opcionalmente, amplificando la población aislada de clones de fago cultivando la población en un huésped bacteriano adecuado; (2) seleccionando el antígeno y una segunda proteína frente a la que se desea actividad de bloqueo y de no bloqueo, respectivamente; (3) adsorbiendo los clones de fago anti-antígeno sobre el antígeno inmovilizado; (4) usando un exceso de la segunda proteína para eluir cualquier clon no deseado que reconozca determinantes de unión a antígeno que se solapan o se comparten con los determinantes de unión de la segunda proteína; y (5) eluyendo los clones que permanecen adsorbidos después de la etapa (4). Opcionalmente, los clones con las propiedades de bloqueo/no bloqueo deseadas se pueden enriquecer además repitiendo una o más veces los procedimientos de selección descritos en el presente documento.

El ADN que codifica anticuerpos monoclonales derivados de hibridoma o los clones Fv de presentación en fagos de la divulgación se aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando cebadores oligonucleotídicos diseñados para amplificar específicamente las regiones codificantes de la cadena pesada y ligera de interés a partir de un molde de ADN de fago o hibridoma). Una vez aislado, el ADN se puede disponer en vectores de expresión, que, a continuación, se transfectan en células huésped tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma, que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales deseados en las células huésped recombinantes. Los artículos de revisión sobre expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol., 5: 256 (1993) y Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992).

El ADN que codifica los clones Fv de la divulgación se puede combinar con secuencias de ADN conocidas que codifican regiones constantes de la cadena pesada y/o la cadena ligera (por ejemplo, las secuencias de ADN apropiadas se pueden obtener de Kabat et al., supra) para formar clones que codifiquen las cadenas pesada y/o ligera de longitud parcial o completa. Se apreciará que se pueden usar regiones constantes de cualquier isotipo para este propósito, incluyendo las regiones constantes de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, y que dichas regiones constantes se pueden obtener a partir de cualquier especie humana o animal. Un clon Fv derivado del ADN del dominio variable de una especie animal (tal como humana) y, a continuación, fusionado a ADN de la región constante de otra especie animal para formar secuencia(s) codificante(s) para la cadena pesada y/o la cadena ligera de longitud completa "híbrida" se incluye en la definición de anticuerpo "quimérico" e "híbrido" como se usa en el presente documento. En determinados modos de realización, un clon Fv derivado de ADN variable humano se fusiona a ADN de la región constante humana para formar secuencia(s) codificante(s) para las cadenas pesada y/o ligera humanas de longitud parcial o completa.

También se puede modificar ADN que codifica anticuerpos anti-antígeno derivados de un hibridoma de la divulgación, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para dominios constantes de la cadena pesada y ligera humanos en lugar de secuencias murinas homólogas derivadas del clon de hibridoma (por ejemplo, como en el procedimiento de Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Se puede modificar además ADN que codifica un anticuerpo o fragmento derivado de clon Fv o hibridoma por unión covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido distinto de inmunoglobulina. De esta manera, se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tienen la especificidad de unión de los anticuerpos derivados de clon Fv o hibridoma de la divulgación.

(iv) Anticuerpos humanizados y humanos

Son conocidos en la técnica diversos procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoacídicos introducidos en el mismo desde una fuente que no es humana. Estos residuos aminoacídicos no humanos a menudo se denominan residuos de "importación", que típicamente se toman de un dominio variable de "importación". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano por las CDR o secuencias de CDR de roedor. En consecuencia, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (pat. de EE. UU. n.° 4.816.567) en los que se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR están sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se van a usar en la preparación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el llamado procedimiento de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a toda la colección de secuencias del dominio variable humanas conocidas. A continuación, se acepta la secuencia humana que es la más cercana a la del roedor como la región estructural (FR) humana para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). otro procedimiento usa una región estructural particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de las cadenas ligera o pesada. Se puede usar la misma región estructural para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

Es importante además que los anticuerpos se humanicen con conservación de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con un modo de realización del procedimiento, los anticuerpos humanizados se preparan por un procedimiento de análisis de las secuencias originales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están disponibles comúnmente y son consabidos para los expertos en la técnica. Están disponibles programas informáticos que ilustran y presentan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos de FR se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias receptoras y de importación de modo que se logre la característica de anticuerpo deseada, tal como una afinidad incrementada por el/los antígeno(s) diana. En general, los residuos de la región hipervariable están directamente y lo más sustancialmente implicados en influir en la unión a antígeno.

Los anticuerpos humanos de la divulgación se pueden construir combinando secuencia(s) del dominio variable de clones Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de seres humanos con secuencia(s) de dominio constante humanas conocidas como se describe anteriormente. De forma alternativa, se pueden preparar anticuerpos monoclonales humanos de la divulgación por el procedimiento de hibridoma. Las líneas celulares de heteromieloma ratón-humano y mieloma humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos se han descrito, por ejemplo, por Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).

Es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que, tras la inmunización, pueden producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión a la cadena pesada de anticuerpo (J^h) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da como resultado una inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz génica de inmunoglobulina de línea germinal humana a dichos ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición a antígeno. Véanse, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Yearin Immuno., 7:33 (1993); y Duchosal et al., Nature 355:258 (1992).

También se puede usar el barajado de genes para derivar anticuerpos humanos a partir de anticuerpos no humanos, por ejemplo, de roedor, donde el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares al anticuerpo no humano de partida. De acuerdo con este procedimiento, que también se llama "sellado de epítopo", la región variable de la cadena pesada o bien ligera de un fragmento de anticuerpo no humano obtenido por técnicas de presentación en fagos como se describe en el presente documento se reemplaza por un repertorio de genes de dominio V humanos, creando una población de quimeras de scFv o Fab de cadena humana/cadena no humana. La selección con antígeno da como resultado el aislamiento de un scFv o Fab quimérico de cadena humana/cadena no humana, en el que la cadena humana restablece el sitio de unión a antígeno destruido tras la retirada de la cadena no humana correspondiente en el clon de presentación en fagos principal, es decir, el epítopo regula (sella) la elección del ligando de cadena humana. Cuando se repite el proceso para reemplazar la cadena no humana restante, se obtiene un anticuerpo humano (véase la publicación PCT WO 93/06213 publicada el 1 de abril de 1993). A diferencia de la humanización tradicional de anticuerpos no humanos por injerto de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos, que no tienen residuos de FR o CDR de origen no humano.

(v) Fragmentos de anticuerpo

Se pueden generar fragmentos de anticuerpo por medios tradicionales, tales como digestión enzimática, o por técnicas recombinantes. En determinadas circunstancias, existen ventajas del uso de fragmentos de anticuerpo, en lugar de anticuerpos completos. El tamaño más pequeño de los fragmentos permite un aclaramiento rápido y puede dar lugar a un acceso mejorado a tumores sólidos. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134.

Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron por medio de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véanse, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se pueden producir ahora directamente por células huésped recombinantes. Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y ScFv se pueden expresar todos en y secretar de E. coli, permitiendo, por tanto, la fácil producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Se pueden aislar fragmentos de anticuerpo de las colecciones de fagos de anticuerpos analizadas anteriormente. De forma alternativa, los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')₂(Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, se pueden aislar fragmentos F(ab')₂directamente del cultivo de células huésped recombinantes. Los fragmentos Fab y F(ab')₂con semivida in vivo incrementada que comprenden residuos de epítopo de unión a receptor de rescate se describen en la pat. de EE. UU. n.° 5.869.046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el profesional experto. En determinados modos de realización, un anticuerpo es un fragmento Fv monocatenario (scFv). Véanse el documento WO 93/16185; las pat. de EE. UU. n.os 5.571.894 y 5.587.458. Fv y scFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que carecen de regiones constantes; por tanto, pueden ser adecuados para una unión inespecífica reducida durante su uso in vivo. Se pueden construir proteínas de fusión de scFv para proporcionar la fusión de una proteína efectora en el extremo amínico o bien carboxílico de un scFv. Véase Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la pat. de EE. UU. n.° 5.641.870, por ejemplo. Dichos anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.

(vi) Anticuerpos multiespecíficos

Los anticuerpos multiespecíficos tienen especificidades de unión por al menos dos epítopos diferentes, donde los epítopos son normalmente de diferentes antígenos. Si bien dichas moléculas normalmente solo se unirán a dos epítopos diferentes (es decir, anticuerpos biespecíficos, BsAb), los anticuerpos con especificidades adicionales tales como anticuerpos triespecíficos se engloban por esta expresión cuando se usan en el presente documento. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')₂).

En la técnica son conocidos procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las que solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se realiza normalmente por etapas de cromatografía de afinidad, es bastante engorrosa y los rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares se divulgan en el documento WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

De acuerdo con un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH₂y CH3. Es típico que la primera región constante de la cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la unión a la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones con la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad al ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en modos de realización en los que proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no son de particular importancia.

En un modo de realización de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se descubrió que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma de separación fácil. Este enfoque se divulga en el documento WO 94/04690. Para más detalles de la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acuerdo con otro enfoque descrito en el documento WO96/27011, se puede genomanipular la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. Una interfase comprende al menos una parte del dominio C^h3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena(s) lateral(es) grande(s) en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando las cadenas laterales de aminoácidos grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero frente a otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, se puede acoplar uno de los anticuerpos en el heteroconjugado a avidina, el otro a biotina. Por ejemplo, se han propuesto dichos anticuerpos para dirigir células del sistema inmunitario a células no deseadas (pat. de e E. UU. n.° 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089). Se pueden preparar anticuerpos heteroconjugados usando cualquier procedimiento de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica y se divulgan en la pat. de EE. UU. n.° 4.676.980, junto con una serie de técnicas de reticulación.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos usando un enlace químico. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que los anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')₂. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente de formación de complejos con ditiol arsenito de sodio para estabilizar los ditioles vecinos y evitar la formación de disulfuro intermolecular. A continuación, los fragmentos Fab' generados se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). A continuación, uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte en Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Los recientes avances han facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli, que se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula F(ab')₂de anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se secretó por separado de E. co liy se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico.

También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar directamente fragmentos de anticuerpo biespecífico del cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucinas. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos de las cremalleras de leucinas de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y a continuación se volvieron a oxidar para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este procedimiento también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (V_H) conectado a un dominio variable de la cadena ligera ( V_L) por un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, se obliga a que los dominios V_Hy V_Lde un fragmento se emparejen con los dominios V_Ly V_Hcomplementarios de otro fragmento, formando de este modo dos sitios de unión a antígeno. También se ha informado de otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico por el uso de dímeros de Fv monocatenario (sFv). Véase Gruber et al, J. Immunol, 152:5368 (1994).

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tuft et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

(vii) Anticuerpos de dominio único

En algunos modos de realización, un anticuerpo de la divulgación es un anticuerpo de dominio único. Un anticuerpo de dominio único es una cadena polipeptídica única que comprende todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados modos de realización, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, Mass.; véase, por ejemplo, la pat. de EE. UU. n.° 6.248.516 B1). En un modo de realización, un anticuerpo de dominio único consiste en todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo.

(viii) Variantes de anticuerpo

En algunos modos de realización, se contempla(n) una modificación/modificaciones en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo introduciendo cambios apropiados en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede preparar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Las alteraciones de aminoácidos se pueden introducir en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo objeto en el momento en el que se prepara la secuencia.

(ix) Derivados de anticuerpo

Los anticuerpos de la divulgación se pueden modificar además para contener restos no proteicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. En determinados modos de realización, los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo son polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o bien copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)/polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicol-propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros fijados al anticuerpo puede variar y, si se fija más de un polímero, pueden ser las mismas moléculas o diferentes. En general, se puede determinar el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización en base a consideraciones que incluyen, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se van a mejorar, si el derivado de anticuerpo se usará en un tratamiento en condiciones definidas, etc.

(x) Vectores, células huésped y procedimientos recombinantes

Los anticuerpos también se pueden producir usando procedimientos recombinantes. Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-antígeno, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo se aísla y se inserta en un vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica el anticuerpo se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que se pueden unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Están disponibles muchos vectores. Los componentes del vector en general incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia finalizadora de la transcripción.

(a) Componente de secuencia señal

Un anticuerpo de la divulgación se puede producir de forma recombinante no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferentemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína o polipéptido maduro. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferentemente es una que se reconoce y se procesa (por ejemplo, se escinde por una peptidasa señal) por la célula huésped. Para las células huésped procariotas que no reconocen y procesan una secuencia señal de anticuerpo natural, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de las secuencias líder de fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o enterotoxina II termoestable. Para la secreción en levadura, la secuencia señal natural se puede sustituir, por ejemplo, por la secuencia líder de invertasa de levadura, una secuencia líder de factor (incluyendo las secuencias líder de factor a de Saccharomyces y Kluyveromyces) o secuencia líder de fosfatasa ácida, secuencia líder de glucoamilasa de C. albicans o la señal descrita en el documento WO 90/13646. En la expresión de células de mamífero, están disponibles secuencias señal de mamífero así como secuencias líder secretoras víricas, por ejemplo, la señal gD del herpes simple.

(b) Origen de replicación

Tanto los vectores de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que posibilita que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. En general, en vectores de clonación esta secuencia es una que posibilita que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Dichas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias gramnegativas, el origen del plásmido 2|j es adecuado para levaduras, y diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. En general, el componente de origen de replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamífero (el origen de SV40 se puede usar típicamente solo porque contiene el promotor temprano).

(c) Componente del gen de selección

Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan carencias auxotróficas o (c) suministran nutrientes cruciales no disponibles en medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa de bacilos.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Las células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a fármaco y, por tanto, sobreviven a la pauta de selección. Los ejemplos de dicha selección dominante usan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son los que posibilitan la identificación de células competentes para captar ácido nucleico que codifica anticuerpos, tal como DHFR, glutamina sintetasa (GS), timidina cinasa, metalotioneína I y II, preferentemente genes de metalotioneína de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, se identifican células transformadas con el gen DHFR cultivando los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. En estas condiciones, se amplifica el gen DHFR junto con cualquier otro ácido nucleico cotransformado. Se puede usar una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) carente de actividad de DHFR endógena (por ejemplo, ATCC CRL-9096).

De forma alternativa, las células transformadas con el gen GS se identifican cultivando los transformantes en un medio de cultivo que contiene L-metionina sulfoximina (Msx), un inhibidor de GS. En estas condiciones, se amplifica el gen GS junto con cualquier otro ácido nucleico cotransformado. El sistema de selección/amplificación de Gs se puede usar en combinación con el sistema de selección/amplificación de DHFR descrito anteriormente.

De forma alternativa, se pueden seleccionar células huésped (en particular huéspedes naturales que contienen DHFR endógena) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de interés, el gen DHFR natural y otro marcador seleccionable tal como aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (APH) por crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglucosídico, por ejemplo, canamicina, neomicina o G418. Véase la pat. de EE. UU. n.° 4.965.199.

Un gen de selección adecuado para su uso en levaduras es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC n.° 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). La presencia de la lesión de trpl en el genoma de célula huésped de levadura proporciona a continuación un entorno eficaz para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano. De forma similar, las cepas de levadura carentes de Leu2 (ATCC 20.622 o 38.626) se complementan con plásmidos conocidos que portan el gen Leu2.

Además, se pueden usar vectores derivados del plásmido circular de 1,6 jm pKD1 para la transformación de levaduras Kluyveromyces. De forma alternativa, se ha informado de un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina bovina recombinante para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). También se han divulgado vectores de expresión de múltiples

humana recombinante madura por cepas industriales de Kluyveromyces. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991).

(d) Componente de promotor

Los vectores de expresión y clonación contienen, en general, un promotor que se reconoce por el organismo huésped y se une de forma funcional al ácido nucleico que codifica un anticuerpo. Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen el promotor de phoA, los sistemas promotores de p-lactamasa y lactosa, el promotor de fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para su uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (SD) unida de forma funcional al ADN que codifica un anticuerpo.

Las secuencias promotoras son conocidas para los eucariotas. Prácticamente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente de 25 a 30 bases en dirección 5' del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada de 70 a 80 bases en dirección 5' del comienzo de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT, donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas hay una secuencia AATAAa que puede ser la señal para la adición de la cola poli A en el extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan de forma adecuada en vectores de expresión eucariotas.

Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucolíticas, tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa.

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión de levaduras se describen además en el documento EP 73.657. Los potenciadores de levadura también se usan de forma ventajosa con promotores de levadura.

La transcripción del anticuerpo a partir de vectores en células huésped de mamífero se puede controlar, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis-B, virus de simio 40 (SV40), o de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación vírico de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción de HindlII E. Un sistema para expresar ADN en huéspedes mamíferos usando el virus del papiloma bovino como vector se divulga en la pat. de EE. UU. n.° 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la pat. de EE. UU. n.° 4.601.978. Véase también Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) sobre la expresión del ADNc de p-interferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple. De forma alternativa, la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous se puede usar como promotor.

(e) Componente de elemento potenciador

La transcripción de un ADN que codifica un anticuerpo de la presente divulgación por eucariotas superiores se incrementa a menudo por la inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Muchas secuencias potenciadoras son conocidas ahora a partir de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un potenciador de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el promotor/potenciador temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas. El potenciador se puede empalmar en el vector en una posición 5' o 3' para la secuencia codificante de anticuerpo, pero se localiza preferentemente en un sitio 5' del promotor.

(f) Componente finalizador de la transcripción

Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (células de levadura, hongo, insecto, vegetal, animal, humana o nucleadas de otros organismos multicelulares) contendrán también secuencias necesarias para la finalización de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están comúnmente disponibles de regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente, 3' de ADN o ADNc eucariotas o víricos. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica el anticuerpo. Un componente finalizador de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Véase el documento WO94/11026 y el vector de expresión divulgado en el mismo.

(g) Selección y transformación de células huésped

Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores en el presente documento son las células procariotas, de levadura o eucariotas superiores descritas anteriormente. Las procariotas adecuadas para este propósito incluyen eubacterias, tales como organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo, enterobacteriáceas tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella, así como bacilos tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P divulgado en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), seudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces. Un huésped de clonación de E. coli preferente es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) y E. co liW3110 (ATCC 27.325) son adecuadas. Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes.

Los anticuerpos de longitud completa, proteínas de fusión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo se pueden producir en bacterias, en particular cuando no se necesitan la glucosilación y la función efectora de Fc, tal como cuando el anticuerpo terapéutico se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, una toxina) que por sí mismo muestra eficacia en la destrucción de células tumorales. Los anticuerpos de longitud completa tienen mayor semivida en circulación. La producción en E. coli es más rápida y más rentable. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, la pat. de EE. UU. n.° 5.648.237 (Carter et al.), pat. de EE. UU. n.° 5.789.199 (Joly et al.), pat. de EE. UU. n.° 5.840.523 (Simmons et al.), que describen la región de inicio de la traducción (TIR) y las secuencias señal para optimizar la expresión y la secreción. Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245 254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli. Después de la expresión, el anticuerpo se puede aislar de la pasta celular de E. coli en una fracción soluble y se puede purificar a través de, por ejemplo, una columna de proteína A o G dependiendo del isotipo. La purificación final se puede llevar a cabo de forma similar al procedimiento para purificar el anticuerpo expresado, por ejemplo, en células CHO.

Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores codificantes de anticuerpos. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadería común, es la más usada entre los microorganismos huésped eucariotas inferiores. Sin embargo, una serie de otros géneros, especies y cepas están comúnmente disponibles y son útiles en el presente documento, tales como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes de Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (documento EP 402.226); Pichia pastoris (documento EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (documento EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y huéspedes de Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger. Para una revisión que analiza el uso de levaduras y hongos filamentosos para la producción de proteínas terapéuticas, véase, por ejemplo, Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004).

Se pueden seleccionar determinadas cepas de hongos y levaduras en las que las vías de glucosilación se han "humanizado", dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véase, por ejemplo, Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) (que describe la humanización de la vía de glucosilación en Pichia pastoris); y Gemgross et al., supra.

Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glucosilado también derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovíricas y las correspondientes células huésped de insecto permisivas de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Están públicamente disponibles una variedad de cepas víricas para transfección, por ejemplo, la variante L-1 de NPV de Autographa californica y la cepa Bm-5 de ⁿP^vde Bombyx mori, y dichos virus se pueden usar como el virus en el presente documento de acuerdo con la divulgación, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate, lenteja de agua (Leninaceae), alfalfa (M. truncatula) y tabaco también se pueden utilizar como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las pat. de EE. UU. n.os 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en vegetales transgénicos).

Las células de vertebrado se pueden usar como huéspedes, y la propagación de células de vertebrado en cultivo (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento habitual. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de hámster neonato (BHK, ATCC CCL 10); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, At CC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR-(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma, tales como NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268.

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o de clonación descritos anteriormente para la producción de anticuerpos y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

(h) Cultivo de las células huésped

Las células huésped usadas para producir un anticuerpo de la presente divulgación se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente tales como F10 de Ham (Sigma), medio esencial mínimo (MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio Eagle modificado de Dulbecco ((Dm Em ), Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), pat. de EE. UU. n.os 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; documentos WO 90/03430; WO 87/00195; o re. pat. de EE. UU. 30.985 se pueden usar como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios se puede complementar según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos presentes normalmente en concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro complemento necesario también se puede incluir en concentraciones apropiadas que serían conocidas para los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las usadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto en la técnica.

(xi) Purificación de anticuerpo

Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo se puede producir intracelularmente, en el espacio periplásmico, o se puede secretar directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, los restos de partículas, células huésped o bien fragmentos lisados, se retiran, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. En resumen, se descongela la pasta de células en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los restos celulares se pueden retirar por centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión, en general, se concentran en primer lugar usando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes accidentales.

La composición de anticuerpo preparada a partir de las células se puede purificar usando, por ejemplo, cromatografía con hidroxilapatita, cromatografía de interacción hidrófoba, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad una de las etapas de purificación típicamente preferentes. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y del isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. Se puede usar proteína A para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas y1, y2 o y4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para y3 humana (Guss et al., EMBO J.

5:15671575 (1986)). La matriz a la que se fija el ligando de afinidad es muy a menudo agarosa, pero están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio C^h3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, la precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina-SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna con poli(ácido aspártico)), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo que se va a recuperar.

En general, diversas metodologías para preparar anticuerpos para su uso en investigación, pruebas y clínica están bien establecidas en la técnica, consecuente con las metodologías descritas anteriormente y/o como se considere apropiado por un experto en la técnica para un anticuerpo de interés particular.

B. Selección de anticuerpos biológicamente activos

Los anticuerpos producidos como se describe anteriormente se pueden someter a uno o más ensayos de "actividad biológica" para seleccionar un anticuerpo con propiedades beneficiosas desde una perspectiva terapéutica. El anticuerpo se puede cribar por su capacidad de unirse al antígeno frente al que se generó. Por ejemplo, para un anticuerpo anti-VEGF, las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo se pueden evaluar en un ensayo que detecta la capacidad de unión a VEGF. En otro ejemplo, para un anticuerpo anti-CD20, las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo se pueden evaluar en un ensayo que detecta la capacidad de unión a CD20.

En otro modo de realización, la afinidad del anticuerpo se puede determinar por unión por saturación; ELISA; y/o ensayos de competencia (por ejemplo, RIA), por ejemplo.

Además, el anticuerpo se puede someter a otros ensayos de actividad biológica, por ejemplo, para evaluar su eficacia como agente terapéutico. Dichos ensayos son conocidos en la técnica y dependen del antígeno diana y del uso previsto para el anticuerpo.

Para cribar anticuerpos que se unen a un epítopo particular en el antígeno de interés (por ejemplo, los que bloquean la unión del anticuerpo anti-VEGF del ejemplo a VEGF), se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado habitual como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). De forma alternativa, se puede realizar una cartografía de epítopos, por ejemplo, como se describe en Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995), para determinar si el anticuerpo se une a un epítopo de interés.

El término "expresión del antígeno CD20" pretende indicar un nivel de expresión significativo del antígeno CD20 en una célula, preferentemente en la superficie celular de un linfocito T o B, más preferentemente un linfocito B, de un tumor o cáncer, respectivamente, preferentemente una neoplasia hematológica. Los pacientes que tienen un "cáncer que expresa c D20" se pueden determinar por ensayos estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, la expresión del antígeno CD20 se mide usando detección inmunohistoquímica (IHQ), FACS o por medio de detección basada en PCR del ARNm correspondiente.

C. Preparación de las formulaciones

Después de la preparación del anticuerpo de interés (por ejemplo, las técnicas para producir anticuerpos que se pueden formular como se divulga en el presente documento se elaborarán a continuación y son conocidas en la técnica), se prepara la formulación farmacéutica que lo comprende. En determinados modos de realización, el anticuerpo que se va a formular no se ha sometido a liofilización anterior y la formulación de interés en el presente documento es una formulación acuosa. En determinados modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa. En un modo de realización, el anticuerpo en la formulación es un fragmento de anticuerpo, tal como un F(ab')₂, en este caso puede ser necesario abordar los problemas que es posible que no se produzcan para el anticuerpo de longitud completa (tal como el recorte del anticuerpo en Fab). La cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo presente en la formulación se determina teniendo en cuenta los volúmenes de dosis y el/los modo(s) de administración deseados, por ejemplo. De aproximadamente 25 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, o de aproximadamente 30 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml o de aproximadamente 45 mg/ml a aproximadamente 55 mg/ml es una concentración de anticuerpo ejemplar en la formulación.

Se prepara una formulación acuosa que comprende el anticuerpo en una solución de pH tamponado. El tampón de la presente divulgación tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,0. En determinados modos de realización, el pH está en el intervalo de pH de 5,5 a 6,5, en el intervalo de pH de 5,7 a 6,8, en el intervalo de pH de 5,8 a 6,5, en el intervalo de pH de 5,9 a 6,5, en el intervalo de pH de 6,0 a 6,5 o en el intervalo de pH 6,2 a 6,5. En determinados modos de realización de la divulgación, la formulación tiene un pH de 6,2 o aproximadamente 6,2. En determinados modos de realización de la divulgación, la formulación tiene un pH de 6,0 o aproximadamente 6,0. Los ejemplos de tampones que controlarán el pH dentro de este intervalo incluyen fosfato de sodio e histidina (tal como L-histidina). Como se usa en el presente documento, las referencias a "histidina" en una formulación o tampón se pueden referir a cualquier forma de histidina conocida en la técnica, incluyendo, sin limitación, histidina-HCl o cloruro de histidina, acetato de histidina, fosfato de histidina, sulfato de histidina y similares.

En algunos modos de realización, el tampón contiene fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio) en una concentración de más de 35 mM a menos de o igual a aproximadamente 100 mM. En algunos modos de realización, el tampón contiene fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio) en una concentración de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 100 mM. En determinados modos de realización de la divulgación, el tampón contiene fosfato de sodio en una concentración de aproximadamente 15 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 22 mM, aproximadamente 25 mM, aproximadamente 28 mM, aproximadamente 30 mM, aproximadamente 35 mM, aproximadamente 36 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 45 mM, aproximadamente 50 mM, aproximadamente 51 mM, aproximadamente 55 mM, aproximadamente 60 mM, aproximadamente 65 mM, aproximadamente 70 mM, aproximadamente 75 mM, aproximadamente 80 mM, aproximadamente 85 mM, aproximadamente 90 mM, aproximadamente 95 mM o aproximadamente 100 mM. En algunos modos de realización, el tampón contiene fosfato de sodio en una concentración menor que aproximadamente cualquiera de las siguientes concentraciones: 100 mM, 95 mM, 90 mM, 85 mM, 80 mM, 75 mM, 70 mM, 65 mM, 60 mM, 55 mM, 51 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM, 36 mM, 35 mM, 30 mM, 28 mM, 25 mM, 22 mM o 20 mM. En algunos modos de realización, el tampón contiene fosfato de sodio en una concentración mayor que aproximadamente cualquiera de las siguientes concentraciones: 15 mM, 20 mM, 22 mM, 25 mM, 28 mM, 30 mM, 35 mM, 36 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 51 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM o 95 mM. Es decir, la concentración de fosfato de sodio en el tampón puede ser cualquiera de un intervalo de concentraciones que tiene un límite superior de aproximadamente 100 mM, 95 mM, 90 mM, 85 mM, 80 mM, 75 mM, 70 mM, 65 mM, 60 mM, 55 mM, 51 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM, 36 mM, 35 mM, 30 mM, 28 mM, 25 mM, 22 mM o 20 mM y un límite inferior seleccionado independientemente de aproximadamente 15 mM, 20 mM, 22 mM, 25 mM, 28 mM, 30 mM, 35 mM, 36 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 51 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM o 95 mM, en el que el límite inferior es menor que el límite superior.

En determinados modos de realización, el tampón contiene histidina en una concentración de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 100 mM. En determinados modos de realización, el tampón contiene histidina en una concentración de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 100 mM. En determinados modos de realización de la divulgación, el tampón contiene histidina en una concentración de aproximadamente 15 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 22 mM, aproximadamente 25 mM, aproximadamente 28 mM, aproximadamente 30 mM, aproximadamente 35 mM, aproximadamente 36 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 45 mM, aproximadamente 50 mM, aproximadamente 51 mM, aproximadamente 55 mM, aproximadamente 60 mM, aproximadamente 65 mM, aproximadamente 70 mM, aproximadamente 75 mM, aproximadamente 80 mM, aproximadamente 85 mM, aproximadamente 90 mM, aproximadamente 95 mM o aproximadamente 100 mM. En algunos modos de realización, el tampón contiene histidina en una concentración menor que aproximadamente cualquiera de las siguientes concentraciones: 100 mM, 95 mM, 90 mM, 85 mM, 80 mM, 75 mM, 70 mM, 65 mM, 60 mM, 55 mM, 51 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM, 36 mM, 35 mM, 30 mM, 28 mM, 25 mM, 22 mM o 20 mM. En algunos modos de realización, el tampón contiene histidina en una concentración mayor que aproximadamente cualquiera de las siguientes concentraciones: 15 mM, 20 mM, 22 mM, 25 mM, 28 mM, 30 mM, 35 mM, 36 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 51 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM o 95 mM. Es decir, la concentración de histidina en el tampón puede ser cualquiera de un intervalo de concentraciones que tiene un límite superior de aproximadamente 100 mM, 95 mM, 90 mM, 85 mM, 80 mM, 75 mM, 70 mM, 65 mM, 60 mM, 55 mM, 51 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM, 36 mM, 35 mM, 30 mM, 28 mM, 25 mM, 22 mM o 20 mM y un límite inferior seleccionado independientemente de aproximadamente 15 mM, 20 mM, 22 mM, 25 mM, 28 mM, 30 mM, 35 mM, 36 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 51 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM o 95 mM, en el que el límite inferior es menor que el límite superior.

La formulación comprende además trehalosa en una cantidad de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 634 mM, aproximadamente 50 mM a aproximadamente 600 mM o aproximadamente 150 mM a aproximadamente 400 mM. En algunos modos de realización, la trehalosa en la formulación es de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 600 mM, de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 550 mM, de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 450 mM, de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 400 mM, de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 350 mM, de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 300 mM, de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 250 mM, de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 180 mM, de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 150 mM, de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 140 mM, de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 135 mM, de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 130 mM, de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 120 mM, de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 110 mM, de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 180 mM a aproximadamente 634 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 600 mM o de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 400 mM. En algunos modos de realización, la trehalosa en la formulación es aproximadamente 45 mM, aproximadamente 50 mM, aproximadamente 60 mM, aproximadamente 70 mM, aproximadamente 80 mM, aproximadamente 90 mM, aproximadamente 100 mM, aproximadamente 110 mM, aproximadamente 120 mM, aproximadamente 130 mM, aproximadamente 135 mM, aproximadamente 140 mM, aproximadamente 150 mM, aproximadamente 180 mM, aproximadamente 200 mM, aproximadamente 250 mM, aproximadamente 300 mM, aproximadamente 350 mM, aproximadamente 400 mM, aproximadamente 450 mM, aproximadamente 500 mM, aproximadamente 550 mM, aproximadamente 600 mM, aproximadamente 610 mM, aproximadamente 620 mM, aproximadamente 630 mM o aproximadamente 634 mM. En algunos modos de realización, la formulación contiene trehalosa en una concentración menor que aproximadamente cualquiera de las siguientes concentraciones: 634 mM, 630 mM, 620 mM, 610 mM, 600 mM, 550 mM, 500 mM, 450 mM, 400 mM, 350 mM, 300 mM, 250 mM, 200 mM, 180 mM, 150 mM, 140 mM, 135 mM, 130 mM, 120 mM, 110 mM, 100 mM, 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM o 50 mM. En algunos modos de realización, la formulación contiene trehalosa en una concentración mayor que aproximadamente cualquiera de las siguientes concentraciones: 45 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 135 mM, 140 mM, 150 mM, 180 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 610 mM, 620 mM o 630 mM. Es decir, la concentración de trehalosa en la formulación puede ser cualquiera de un intervalo de concentraciones que tiene un límite superior de aproximadamente 634 mM, 630 mM, 620 mM, 610 mM, 600 mM, 550 mM, 500 mM, 450 mM, 400 mM, 350 mM, 300 mM, 250 mM, 200 mM, 180 mM, 150 mM, 140 mM, 135 mM, 130 mM, 120 mM, 110 mM, 100 mM, 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM o 50 mM y un límite inferior seleccionado independientemente de aproximadamente 45 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 135 mM, 140 mM, 150 mM, 180 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 610 mM, 620 mM o 630 mM, en el que el límite inferior es menor que el límite superior.

En algunos modos de realización, la proporción en peso del anticuerpo monoclonal con respecto a la trehalosa en la formulación es mayor que o igual a 0,41 y menor que 1,65. En algunos modos de realización, la proporción en peso del anticuerpo monoclonal con respecto a la trehalosa en la formulación es de 0,41 a 0,73. En algunos modos de realización, la proporción en peso del anticuerpo monoclonal con respecto a la trehalosa es de 0,73 a 1,47. En algunos modos de realización, la proporción en peso del anticuerpo monoclonal con respecto a la trehalosa es de 0,49 a 1,47. En algunos modos de realización, la proporción en peso del anticuerpo monoclonal con respecto a la trehalosa es cualquiera de 0,41, 0,45, 0,50, 0,55, 0,60, 0,65, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 1,00, 1,05, 1,10, 1,15, 1,20, 1,25, 1,30, 1,35, 1,40, 1,45, 1,50, 1,55, 1,60 y 1,64, incluyendo todos los valores entre estos números. Como se usa en el presente documento, el peso de trehalosa en la formulación para calcular la proporción en peso del anticuerpo con respecto a la trehalosa se basa en la cantidad de dihidrato de trehalosa (PM 378,33). Si se usan otras formas de trehalosa (por ejemplo, trehalosa anhidra), el peso de la trehalosa en la formulación se debe convertir al peso de trehalosa dihidrato con la misma concentración molar.

En algunos modos de realización, la trehalosa se puede sustituir por un poliol distinto de trehalosa. Por ejemplo, la trehalosa se puede sustituir por sacarosa, manitol, lactosa, glicerol y/o propilenglicol. Por lo tanto, en cualquier referencia a la trehalosa en una formulación de anticuerpo descrita en el presente documento, dicha trehalosa se puede sustituir opcionalmente por un poliol distinto de trehalosa (por ejemplo, los enumerados anteriormente).

Opcionalmente, se puede añadir un tensioactivo a la formulación de anticuerpo. Los tensioactivos ejemplares incluyen tensioactivos no iónicos tales como polisorbatos (por ejemplo, polisorbatos 20, 80, etc.) o poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188, etc.). La cantidad de tensioactivo añadido es de modo que reduce la agregación del anticuerpo formulado y/o minimiza la formación de partículas en la formulación y/o reduce la adsorción. Por ejemplo, el tensioactivo puede estar presente en la formulación en una cantidad de aproximadamente un 0,001 % a aproximadamente un 0,5 %, de aproximadamente un 0,005 % a aproximadamente un 0,2 %, de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 0,1 % o de aproximadamente un 0,02 % a aproximadamente un 0,06 %, o de aproximadamente un 0,03 % a aproximadamente un 0,05 %. En determinados modos de realización, el tensioactivo está presente en la formulación en una cantidad de un 0,04 % o de aproximadamente un 0,04 %. En determinados modos de realización, el tensioactivo está presente en la formulación en una cantidad de un 0,02 % o de aproximadamente un 0,02 %. En un modo de realización, la formulación no comprende un tensioactivo.

En un modo de realización, la formulación contiene los agentes identificados anteriormente (por ejemplo, anticuerpo, tampón, trehalosa y/o tensioactivo) y está esencialmente libre de uno o más conservantes, tales como alcohol bencílico, fenol, m-cresol, clorobutanol y cloruro de bencetonio. En otro modo de realización se puede incluir un conservante en la formulación, en particular cuando la formulación es una formulación multidosis. La concentración de conservante puede estar en el intervalo de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 2 %, preferentemente de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 1 %. Uno o más vehículos, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables tales como los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. Ed. (1980) se puede incluir en la formulación siempre que no afecten de forma adversa las características deseadas de la formulación. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen; agentes tamponadores adicionales; codisolventes; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; agentes quelantes tales como EDTA; complejos de metal (por ejemplo, complejos Zn-proteína); polímeros biodegradables tales como poliésteres; y/o contraiones formadores de sales. Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además agentes de dispersión intersticial de fármacos, tales como glucoproteínas de hialuronidasa activa a pH neutro soluble (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas de hialuronidasa PH-20 soluble humana, tales como rHuPH20 (Hy LENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patente de e E. UU. n.os 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales tales como condroitinasas.

Si bien las diversas descripciones de quelantes en el presente documento a menudo se centran en EDTA, se apreciará que otros quelantes de iones metálicos también están englobados dentro de la divulgación. Los quelantes de iones metálicos son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan necesariamente a aminopolicarboxilatos, EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), EGTA (ácido etilenglicol-bis(beta-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetraacético), NTA (ácido nitrilotriacético), EDDS (disuccinato de etilendiamina), PDTA (ácido 1,3-propilendiaminotetraacético), DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético), ADA (ácido beta-alaninadiacético), MGCA (ácido metilglicinadiacético), etc. Adicionalmente, algunos modos de realización en el presente documento comprenden quelantes de fosfonatos/ácido fosfónico.

La formulación en el presente documento también puede contener más de una proteína según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellas con actividades complementarias que no afecten de forma adversa a la otra proteína. Por ejemplo, cuando el anticuerpo es anti-VEGF, se puede combinar con otro agente (por ejemplo, un agente quimioterápico y un agente antineoplásico).

En algunos modos de realización se evalúa o mide la estabilidad física, la estabilidad química o la actividad biológica del anticuerpo en la formulación. Se puede usar cualquier procedimiento conocido en la técnica para evaluar la estabilidad y la actividad biológica. En algunos modos de realización, el anticuerpo en la formulación es estable a -20 °C durante al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 21 meses o al menos aproximadamente 24 meses (o al menos aproximadamente 52 semanas). En algunos modos de realización, la estabilidad se mide por la formación de especies de alto peso molecular (HMWS) en la formulación después del almacenamiento. En algunos modos de realización, el porcentaje de HMWS en la formulación es menor que cualquiera de aproximadamente un 0,8 %, aproximadamente un 0,9 % o aproximadamente un 1 % después del almacenamiento a -20 °C durante al menos aproximadamente 6 meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos unos 18 meses o al menos aproximadamente 24 meses. En algunos modos de realización, los agregados totales en la formulación son menos de cualquiera de aproximadamente un 2,5 % o aproximadamente un 3 % después del almacenamiento a -20 °C durante al menos aproximadamente 6 meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses o al menos aproximadamente 24 meses.

Las formulaciones que se van a usar para su administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles, antes de o después de la preparación de la formulación.

MI. Adm inistración de formulaciones de anticuerpo

En algunos modos de realización, una formulación como se describe en el presente documento es para administración a un sujeto. La formulación se puede administrar a un mamífero que necesita tratamiento con el anticuerpo, preferentemente un ser humano, de acuerdo con procedimientos conocidos, tales como administración intravenosa como una inyección intravenosa rápida o por infusión continua durante un período de tiempo, por vías intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraocular, intrarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. En un modo de realización, la formulación se administra al mamífero por administración intravenosa. Para dichos propósitos, la formulación se puede inyectar usando una jeringuilla o por medio de una vía i.v., por ejemplo. En un modo de realización, la formulación se administra al mamífero por administración subcutánea.

La dosificación apropiada ("cantidad terapéuticamente eficaz") del anticuerpo dependerá, por ejemplo, de la afección que se vaya a tratar, de la gravedad y evolución de la afección, de si el anticuerpo se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, del tratamiento previo, de la anamnesis y respuesta del paciente al anticuerpo, del tipo de anticuerpo usado y del criterio del médico especialista. El anticuerpo se administra de forma adecuada al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos y se puede administrar al paciente en cualquier momento desde el diagnóstico en adelante. El anticuerpo se puede administrar como el tratamiento único o junto con otros fármacos o tratamientos útiles en el tratamiento de la afección en cuestión.

Como una proposición general, la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo administrado estará en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal del paciente ya sea por una o más administraciones, siendo el intervalo típico de anticuerpo usado de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 20 mg/kg, preferentemente de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 15 mg/kg, administrados diariamente, por ejemplo. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas posológicas. En un modo de realización, el antagonista es un anticuerpo anti-VEGF que se administra a una dosis de aproximadamente 100 o 400 mg cada 1, 2, 3 o 4 semanas o se administra una dosis de aproximadamente 1, 3, 5, 7,5, 10, 15 o 20 mg/kg cada 1,2, 3 o 4 semanas. La dosis se puede administrar como una dosis única o como dosis múltiples (por ejemplo, 2 o 3 dosis), tal como infusiones. El curso de este tratamiento se supervisa fácilmente por técnicas convencionales.

IV. Artículos de fabricación

En otro modo de realización de la divulgación se proporciona un artículo de fabricación que comprende un recipiente que contiene la formulación farmacéutica acuosa de la divulgación y opcionalmente proporciona instrucciones para su uso. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales y jeringuillas. El recipiente se puede formar a partir de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. Un recipiente ejemplar es un vial de vidrio de un único uso de 3-20 ml. De forma alternativa, para una formulación multidosis, el recipiente puede ser un vial de vidrio de 3-100 ml. El recipiente contiene la formulación y la etiqueta sobre, o asociada con, el recipiente puede indicar instrucciones de uso. El artículo de fabricación puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas y prospectos del envase con instrucciones para su uso.

Ejemplos

La invención se entenderá más completamente por referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, no se deben interpretar como limitantes del alcance de la invención. Se entiende que los ejemplos y modos de realización descritos en el presente documento son solo para propósitos ilustrativos.

Ejemplo 1: efectos de la solubilidad del excipiente sobre la estabilidad de mAb en formulaciones de trehalosa congeladas

Este estudio se diseñó para valorar los efectos de la tasa de congelación, la temperatura de almacenamiento y la composición de la formulación sobre la distribución de fases de trehalosa y la estabilidad de la proteína en soluciones congeladas. Además de dilucidar la distribución de fases de la cristalización de trehalosa en soluciones congeladas, los resultados de este estudio tienen numerosas implicaciones prácticas. Presumiblemente, la eficacia de la trehalosa como estabilizador de proteínas depende de la distribución de fases de la trehalosa en solución. Por tanto, entender la distribución de fases de la trehalosa que resulta de diferentes composiciones, tasas de congelación y temperaturas de almacenamiento informa del desarrollo de formulaciones sólidas y procedimientos de congelación.

Materiales y procedimientos

Materiales y preparación de muestras

Se clonaron tres anticuerpos monoclonales de longitud completa IgG1 (mAb1, bevacizumab y mAb3) con un peso molecular aproximado de 145 kilodaltons, expresados en líneas celulares de ovario de hámster chino, y se purificaron.

Para los estudios de temperatura de almacenamiento y tasa de congelación, se formuló el mAb1 a 25 mg/ml en trehalosa al 2,1 % (p/v), clorhidrato de histidina 5 mM, a pH 6,0 con polisorbato 20 al 0,01 % (p/v) y agua para inyectables, USP; se formuló bevacizumab a 25 mg/ml en trehalosa al 5,4 % (p/v), fosfato de sodio 51 mM, a pH 6.2 con polisorbato 20 al 0,04 % (p/v) y agua para inyectables, USP; y se formuló el mAb3 a 20 mg/ml en trehalosa al 8,2 % (p/v), acetato de histidina 20 mM, a pH 6,2 con polisorbato 20 al 0,02 % (p/v) y agua para inyectables, USP.

Para el estudio de solubilidad de excipiente, se formuló bevacizumab a 25 mg/ml en fosfato de sodio 51 mM, a pH 6.2 con polisorbato 20 al 0,04 % (p/v), agua para inyectables, USP (muestra de control) con 6,0 % (p/v) de sacarosa, trehalosa o bien manitol.

Para los estudios de formulación, se evaluó bevacizumab en tres concentraciones de mAb (0, 25 y 100 mg/ml) en clorhidrato de histidina 20 mM a pH 6,0 con cantidades variables de trehalosa (0 %, 1,7 %, 3,4 %, 5,1 %, 6,8 %, 8,6 %, 10,3 %, 12,0 %, 13,7 %, 15,4 %, 17,1 %, 20,5 %, 24,0 %, 27,4 %, 30,8 % y 34,2 % p/v) con y sin polisorbato 20 al 0,04 %. Estas 64 formulaciones diferentes, así como 32 blancos de vehículo que contenían 0 mg/ml de bevacizumab, se formularon en una microplaca Greiner de 96 pocillos.

Se prepararon soluciones adicionales con trehalosa al 0,0, 2,0, 4,0 y 8,0 % (p/v) en acetato de histidina 20 mM, a pH 5,5, y agua para inyectables. Se dosificaron cincuenta microlitros de tinte indicador de pH pHydrion (intervalo de pH: 0-7) (Micro Essential Laboratory, NY) en un vial de vidrio de 10 ml y se dejó evaporar. Se añadieron al vial aproximadamente cuatro mililitros de las diversas formulaciones de trehalosa y se dejó que el tinte se disolviera en la solución. Se obtuvieron fotografías de soluciones de trehalosa congeladas usando una cámara digital Olympus Stylus 770SW (Olympus America Inc., NJ) en modo supermacro.

Los tampones de formulación para todas las muestras se prepararon con productos químicos de calidad farmacopeica (USP, NP, EP) y se purificó agua desionizada usando el sistema de purificación de agua Elga PURELAb Ultra (Celle, Alemania). Las muestras del estudio de formulación se dializaron exhaustivamente en tampones de formulación usando casetes de diálisis Pierce Slide-A-Lyzer o tubos de centrifugación (10 kD MWCO) Amicon Ultra de Millipore (Billerica, MA) y se verificó el pH de la solución madre de mAb para cada muestra dializada. Después de la diálisis, las muestras se concentraron por ultrafiltración usando dispositivos de filtración centrífuga Amicon Ultra (10 kD MWCO).

Congelación controlada

Para preparar las muestras para la congelación lenta y normal, se dosificaron alícuotas de muestra de dos mililitros en viales de vidrio de 5 ml esterilizados en autoclave y sellados con Lyo-Stoppers de 20 mm usando una técnica aséptica en una campana de bioseguridad ventilada con flujo de aire laminar. La congelación lenta se logró colocando los viales de muestra en un liofilizador en estantes enfriados previamente y mantenidos entre -1 °C y -3 °C durante 24 horas. Para controlar el sobreenfriamiento, se nucleó hielo aplicando CO2 congelado al lado de cada vial hasta que se formaba hielo y, a continuación, la temperatura se disminuyó linealmente hasta -40 °C durante 144 horas a una tasa de aproximadamente -0,3 °C/min.

La congelación normal se logró colocando los viales de muestra en un congelador a -20 °C hasta que las muestras estuvieran completamente congeladas. Para controlar el sobreenfriamiento, se nucleó hielo aplicando CO₂congelado al lado de cada vial hasta que se formaba hielo.

La congelación rápida se logró enfriando por enfriamiento rápido alícuotas de muestra de cincuenta microlitros gota a gota en nitrógeno líquido. El criterio de valoración de congelación se determinó por la opacidad incrementada y el hundimiento de la esfera desde la superficie en una cesta de recogida de malla de acero inoxidable. Después de la congelación, se retiraron del nitrógeno líquido alícuotas de un mililitro de gránulos congelados de fármaco y se transfirieron a viales de vidrio de 5 ml estériles, previamente enfriados. A continuación, los viales se almacenaron en CO2 congelado y se sellaron con Lyo-Stoppers de 20 mm. Las muestras de cribado de formulación se congelaron rápidamente en microplacas de 96 pocillos usando nitrógeno líquido. Inmediatamente después de congelar las microplacas, las muestras se nuclearon raspando la superficie del hielo con agujas de calibre 24 (BD, Franklin Lakes, NJ).

Mantenimiento isotérmico

Las muestras congeladas a las tres tasas de congelación (lenta, normal y rápida) por los procedimientos descritos se transfirieron a tres unidades de congelación con puntos de ajuste de -20 °C, -14 °C y -8 °C con un intervalo de ±2 °C para almacenamiento congelado. La temperatura del congelador se supervisó usando un sistema de supervisión de temperatura Yokogawa (Yokogawa Meters and Instruments Corporation, Tokio, Japón). Los viales de muestra se extrajeron después de 0, 1, 2, 3, 6, 9 y 12 meses de almacenamiento congelado isotérmico y se colocaron en la mesa del laboratorio en condiciones ambientales (aproximadamente 22 °C) y se dejaron descongelar antes del análisis.

Las microplacas de muestra de cribado de formulación se almacenaron a dos temperaturas (-20±2 °C y -40±2 °C). La temperatura del congelador se supervisó usando un sistema de supervisión de temperatura Yokogawa (Yokogawa Meters and Instruments Corporation, Tokio, Japón).

Las microplacas de muestra para el análisis SEC se almacenaron isotérmicamente durante un máximo de 365 días. Después del almacenamiento congelado, las microplacas se descongelaron en la mesa del laboratorio en condiciones ambientales (aproximadamente 22 °C) antes del análisis. Las muestras de control (día 0) se descongelaron inmediatamente después de completar el procedimiento de congelación. Las microplacas de vidrio de muestra para el análisis FTIR se extrajeron después de 365 días de almacenamiento congelado isotérmico y se liofilizaron para realizar el análisis de cristalización de trehalosa. Las muestras de control (0 meses) se liofilizaron inmediatamente después de completar el procedimiento de congelación.

Liofilización

Las muestras previstas para la determinación de la cristalización de trehalosa se liofilizaron en primer lugar usando una unidad liofilizadora LyoStar II controlada por el programa informático LyoManager II (FTS Systems, Stone Ridge, NY). Las muestras congeladas se colocaron en un estante enfriado previamente y se mantuvieron a -35 °C durante 7 horas antes del secado principal. El secado principal se logró bajo una presión del sistema de 150 |jm Hg incrementando linealmente la temperatura del estante a 20 °C a una tasa de 0,2 °C/min, seguido de un mantenimiento de 40 horas a 20 °C. El secado secundario se realizó incrementando linealmente la temperatura del estante a 30 °C a 0,2 °C/min, seguido de un mantenimiento de 8 horas a 30 °C. Se colocaron termopares en diversos viales de muestra para supervisar la temperatura durante la liofilización. Después del secado secundario, los viales de muestra se taparon mientras que estaban todavía a vacío para evitar que las muestras se hidrataran antes del análisis. Se liofilizaron muestras de cribado de formulación de bajo volumen (300 microlitros) en placas de vidrio de 96 pocillos (Zinsser, Alemania) usando el mismo procedimiento de liofilización.

Cromatografía de exclusión por tamaño

Para medir la distribución del tamaño molecular de las tres sustancias farmacéuticas, se implementó el análisis HPSEC (cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento) usando una columna TosohHaas TSKgel G3000 SWx1 (7,8 mm x 30 cm, tamaño de poro de 250 A, tamaño de partícula de 5 jm ) en el sistema de HPLC Agilent 1200 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) o equivalente usando una solución de fase móvil de fosfato de potasio 0,2 M, cloruro de potasio 0,25 M, pH 6,2. El caudal fue de 0,5 ml/min y el tiempo de desarrollo fue de 30 minutos. La temperatura de la cámara de muestra fue de 5 °C y la masa de inyección fue de 100 microgramos. La señal de salida de la columna se supervisó con un detector de matriz de diodos que midió la absorbancia a 280 nm usando 360 nm como señal de referencia. A continuación, se realizó el análisis de datos y la integración de los picos UV usando el programa informático Chromeleon (Dionex, Sunnyvale, CA) para cuantificar el porcentaje de agregado molecular, monómero y fragmento presente en cada muestra. Las muestras de cribado de formulación de bajo volumen se analizaron en microplacas de polipropileno de 96 pocilios Greiner (GREINER INFO, CITY) usando el procedimiento SEC descrito con un caudal de 1,0 ml/min y un tiempo de desarrollo de 15 minutos. Antes del análisis SEC, las muestras de bevacizumab se diluyeron en clorhidrato de histidina 20 mM, pH 6,0, y se mantuvieron a 30 °C durante 24 horas para resolver los agregados disociables antes del análisis SEC. La temperatura de la cámara de muestra fue de 30 °C y la masa de inyección fue de 100 microgramos.

Medición de concentración

Se midió la absorbancia UV de cada muestra registrando la absorbancia a 279 nm y 320 nm en una cubeta de cuarzo con un camino óptico de 1 cm en un espectrofotómetro Agilent 8453 usando el programa informático Chemstation (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). La determinación de la concentración UV se calculó usando las absortividades de 1,50, 1,70 y 1,45 (mg/ml)-1cm-1 para mAb1, bevacizumab y mAb3, respectivamente. Se estableció el blanco de las mediciones frente a los tampones apropiados.

Análisis de turbidez

Se midió la turbidez de las muestras registrando la absorbancia promedio de 340-360 nm en una cubeta de cuarzo con un camino óptico de 1 cm (Eckhardt, B.M., et al. (1991) Pharm. Res. 8:1360-4) en un espectrofotómetro HP8453 usando el programa informático Chemstation (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Se usó agua para inyectables estéril para establecer el blanco en el instrumento antes de los análisis. El análisis de turbidez de las muestras de cribado de formulación se realizó en una microplaca de 96 pocillos, Corning de media área, transparente a UV, usando el instrumento Spectramax M2 (Molecular Devices, Sunnyvale). Se midió la turbidez frente a un blanco de agua para inyectables estéril y se midió el valor de turbidez registrando el promedio de la absorbancia de 340-360 nm.

Espectroscopia FT-NIR

El porcentaje de cristalización de trehalosa se determinó usando espectroscopia de reflectancia difusa en el infrarrojo cercano. Los procedimientos de recogida, calibración y análisis de datos usados en este estudio se adaptaron de trabajos previos centrados en caracterizar las diferencias espectrales entre los polimorfos de trehalosa amorfa y trehalosa cristalina (Connolly, B., et al. (2010) Anal. Biochem. 399(1):48-57). Usando estos procedimientos, se registraron espectros NIR de muestras de 10.000 - 4000 cm-1 usando 32 barridos promediados con una resolución de 4 cm -1 en un analizador FT-IR cercano Nicolet Antaris equipado con un módulo de esfera integradora (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). El porcentaje de cristalización de trehalosa se calculó usando proporciones de bandas de intensidad máxima normalizadas a 4306 cm-1 y 4291 cm-1 (Connolly, B., et al. (2010) Anal. Biochem. 399(1):48-57). El análisis de datos se llevó a cabo usando un análisis de regresión lineal con MATLAB (R2007a, The MathWorks, Natick, Massachussetts) (Connolly, B., et al. (2010) Anal. Biochem. 399(1):48-57). Se liofilizaron muestras de cribado de formulación de bajo volumen (300 microlitros) y, a continuación, se analizó el porcentaje de cristalización de trehalosa usando el mismo procedimiento.

Resultados

Es de gran interés entender si la cristalización de trehalosa afecta la estabilidad de la proteína en concentraciones farmacéuticamente pertinentes (<10 % p/v). Para evaluar el impacto de la concentración de trehalosa nominal en la cristalización del excipiente, se prepararon soluciones con dihidrato de trehalosa al 0,0, 2,0, 4,0 y 8,0 % (p/v) en presencia de tinte indicador de pH para visualizar mejor la cristalización. Las muestras se congelaron usando la tasa de congelación normal y se almacenaron a -20 °C durante 6 días. Después de la nucleación inducida, se observó visualmente la cristalización de trehalosa en todas las soluciones de trehalosa congeladas (FIG. 1). La inspección visual de las soluciones congeladas indica que el grado de cristalización se incrementa proporcionalmente con la concentración de trehalosa nominal. Por ejemplo, la concentración de trehalosa nominal más alta evaluada (FIG. 1D: 8,0 % p/v) dio como resultado sustancialmente más cristalización en comparación con las soluciones que contenían trehalosa al 0,0 % (FIG. 1A), 2,0 % (FIG. 1B) y 4,0 % (FIG. 1C) (p/v).

Aunque las concentraciones de trehalosa farmacéuticamente pertinentes (<10 % p/v) están muy por debajo del límite de solubilidad en soluciones no congeladas (FIG. 2A), durante el procedimiento de congelación, la trehalosa se concentra sustancialmente y, a menores temperaturas, la solubilidad de la trehalosa es significativamente menor (Miller, D.P., et al. (1997) Pharm. Res. 14:578-90). La mayor concentración que comenzó a temperatura ambiente ciertamente excede la solubilidad a la temperatura de almacenamiento congelado. Con la trehalosa por encima de su límite de solubilidad en el concentrado congelado, solo se requeriría un acontecimiento de nucleación para iniciar la cristalización.

Ejemplo 2: efectos de la cristalización de excipiente sobre la estabilidad de mAb en formulaciones de trehalosa congelada

Se ha demostrado que la cristalización de carbohidratos durante la congelación, la liofilización y el almacenamiento congelado afecta la estabilidad física de los fármacos proteicos. Por ejemplo, se ha demostrado que el manitol cristaliza durante la liofilización y da como resultado cambios conformacionales, agregación y pérdida de actividad para diversas proteínas (Sharma, V.K. y Kalonia, D.S. (2004) AAPS PharmSciTech. 5:E10; Cavatur, R.K., et al. (2002) Pharm. Res. 19:894-900); Izutsu, K., et al. (1994) Chem. Pharm. Bull. (Tokio) 42:5-8); e Izutsu, K., et al. (1993) Pharm. Res. 10:1232-7). Aunque a <40 °C la trehalosa es más soluble que el manitol, es significativamente menos soluble que la sacarosa, que, en general, se considera un excipiente no cristalizante (FIG. 2A).

Para evaluar los efectos de la solubilidad del excipiente sobre la estabilidad de la proteína en soluciones congeladas, se prepararon soluciones de bevacizumab con concentraciones equivalentes de sacarosa, trehalosa y manitol. Las muestras se congelaron a la tasa de congelación normal, se indujo la nucleación y se almacenaron congeladas a -20 °C durante 28 días. Los datos de SEC demuestran que después del almacenamiento congelado no se observó ningún incremento en la agregación en la formulación de sacarosa; se observó un pequeño incremento (~1 %) en la agregación en la formulación de trehalosa; y se observó un gran incremento (~3 %) en la agregación en la formulación de manitol (FIG. 2B).

Estos resultados establecen una correlación de orden de posición entre la solubilidad del excipiente y la agregación de proteínas. Como se esperaba, los carbohidratos con menor solubilidad a -20 °C dan como resultado mayores incrementos en la agregación (FIG. 2B). Específicamente de interés, los resultados sugieren que la solubilidad de la trehalosa a -20 °C es lo suficientemente baja como para que pueda cristalizar y dar como resultado la agregación de proteínas en concentraciones farmacéuticamente pertinentes (2-10 % p/v).

Ejemplo 3: efectos de la tasa de congelación sobre la estabilidad de mAb en formulaciones de trehalosa congelada

Los datos de SEC para las tres formulaciones de mAb demostraron que la tasa de congelación sí afecta la estabilidad de la proteína (véase la tabla 1 a continuación).

Tabla 1 - Resumen de las fases de trehalosa después de 12 meses de almacenamiento congelado

En general, los anticuerpos monoclonales se agregaron después de la congelación a tasa rápida (> 100 °C/min) y no se agregaron a tasas de congelación más lentas (< 1 °C/min). Se observó que no se midió una agregación significativa en ninguna de las tres sustancias farmacéuticas (mAb1, bevacizumab y mAb3) congeladas a tasas de congelación más lentas (< 1 °C/min), independientemente de la temperatura de almacenamiento a largo plazo (tabla 1). Sin embargo, todas las muestras de bevacizumab y mAb3 congeladas a la tasa de congelación más rápida (> 100 °C/min) mostraron incrementos significativos en la agregación con el tiempo (tabla 1). Incluso mAb1 congelado rápidamente, incluido como control negativo, mostró incrementos menores en la agregación durante el transcurso del estudio (tabla 1). Para todas las muestras congeladas rápidamente, la mayor parte de la agregación observada durante el almacenamiento parece producirse dentro de los primeros seis meses (FIG. 3). Posteriormente, la tasa de agregación disminuye significativamente entre seis y doce meses; los cambios son lo suficientemente pequeños durante este período de modo que la agregación medida se puede atribuir potencialmente a la variabilidad de la muestra y/o del ensayo.

Sin quedar vinculado a ninguna teoría, se cree que la congelación a la tasa rápida representa una condición de tensión para la estabilidad del anticuerpo. Por ejemplo, tras la congelación a la tasa rápida, se observaron cambios en la agregación en las formulaciones de anticuerpo después de un mes, mientras que en condiciones de congelación y almacenamiento comerciales, la agregación puede permanecer constante durante 9 meses o más. Se cree que la congelación rápida representa una condición de tensión bajo la que las formulaciones de anticuerpo experimentan agregación mucho más rápido que las condiciones de congelación y almacenamiento comerciales. Como resultado, esta condición de tensión se puede usar para evaluar la susceptibilidad de una formulación de anticuerpo a la agregación, independientemente de la cantidad de tiempo que se almacene la formulación.

La superposición SEC de muestras de mAb3 congeladas a las tres tasas de congelación y almacenadas a -20 °C durante 12 meses demuestra que hubo un incremento observable en las especies agregadas (dímero y alto peso molecular) en la muestra de mAb3 congelada rápidamente (FIG. 4A). Por el contrario, las muestras congeladas a tasas de congelación lenta y normal no mostraron incrementos significativos en el porcentaje agregado y los datos se superponen estrechamente en comparación con el control del estudio (FIG. 4A). Además, las muestras de bevacizumab congeladas rápidamente mostraron incrementos en el agregado soluble (tabla 1) y la formación de precipitados como se determina por análisis de turbidez e inspección visual. Estos precipitados se han caracterizado previamente como relacionados con proteínas y tienen disminuciones simultáneas en la absorbancia UV después de la retirada por filtración usando un filtro de PVDF de 0,2 micrómetros.

La aplicación de un procedimiento de espectroscopia de reflectancia difusa en el infrarrojo cercano usado en combinación con un modelo de regresión lineal demostró que podía cuantificar cantidades relativas de trehalosa amorfa y cristalina en presencia de proteína aprovechando la clara diferencia en la región espectral previamente caracterizada entre 4000-4500 cm-1 (Connolly, B., et al. (2010) Anal. Biochem. 399(1):48-57). Los espectros de FT-NIR de muestras puras de las tres fases de trehalosa conocidas ilustraron las diferencias espectrales clave entre el anhidro cristalino y el dihidrato cristalino amorfos (FIG. 5). El análisis de las muestras de 12 meses por espectroscopia FT-NIR demuestra que había cantidades mensurables de cristalización de trehalosa en las muestras de congelación rápida para mAb1 (FIG. 6A3), bevacizumab (FIG. 6B3) y mAb3 (FIG. 6C3) (tabla 1), no había cantidades mensurables de cristalización de trehalosa en las muestras de congelación lenta y normal para mAb1 (FIGS. 6A1-2), bevacizumab (FIGS. 6B1-2) o mAb3 (FIGS. 6C1-2). Los espectros de muestras de congelación rápida obtenidos después de doce meses de almacenamiento congelado a las diversas temperaturas de almacenamiento presentan cambios de pico bruscos en regiones espectrales clave asociadas con dihidrato de trehalosa (FIGS. 6^b3 y 6C3) y contienen entre 30 y 70 por ciento (de 1,6 % a 5,7 % p/v) de dihidrato de trehalosa cristalina, conservando > 2,5 % (p/v) de trehalosa amorfa en la solución congelada.

Curiosamente, los incrementos observados en la agregación de proteínas se asociaron con incrementos en la cristalización de trehalosa. Por ejemplo, se encontró que las muestras de mAb1 congeladas rápidamente almacenadas a -20 °C durante 12 meses tenían un 0,2 % (p/v) de dihidrato de trehalosa cristalina y un incremento en la agregación de un 0,1 %, mientras que se encontró que las muestras de bevacizumab y las de mAb3 congeladas rápidamente y almacenadas a-20 °C durante 12 meses tenían un 2,5 % y un 5,1 % (p/v) de dihidrato de trehalosa cristalina y un incremento en la agregación de un 1,7 % y un 3,1 %, respectivamente (tabla 1). Esta correlación de orden de posición del porcentaje de dihidrato de trehalosa y la agregación de mAb sugiere que la concentración de trehalosa cristalizada afectó la estabilidad de la proteína.

Como control, las muestras se congelaron rápidamente y se analizaron de inmediato por SEC y FT-NIR para evaluar el impacto inmediato del enfriamiento rápido y la liofilización en la formación de cristales y la agregación de proteínas. No se observó ningún cambio en la agregación de proteínas (datos no mostrados). Adicionalmente, los espectros de FT-NIR obtenidos para el conjunto de muestras congeladas rápidamente T0 revelan que el glúcido era predominantemente de carácter amorfo y contenía menos de un cinco por ciento de dihidrato de trehalosa cristalina, que está cerca de los límites de detección del procedimiento. Estos resultados demuestran que no hay un impacto inmediato sobre la agregación de proteínas o la distribución de fases de trehalosa después de la congelación rápida. Por tanto, los incrementos medidos en la cristalización de trehalosa y la agregación de proteínas durante este estudio representan cambios que se producen de manera dependiente del tiempo durante el almacenamiento.

Los resultados de los estudios de tasa de congelación proporcionan información sobre los efectos de la tasa de congelación tanto en la cristalización de trehalosa como en la agregación de mAb. Como se analiza previamente, la congelación rápida incrementa el área de superficie interfacial de los cristales de hielo y proporciona sitios de nucleación adicionales. Sin quedar vinculado a ninguna teoría, se cree que estos sitios de nucleación adicionales formados en muestras congeladas rápidamente incrementan la probabilidad de que se produzca un acontecimiento de nucleación. Por el contrario, los cristales de hielo más grandes formados en las muestras congeladas a tasas de congelación lenta y normal tienen un área de superficie menor, lo que se cree que disminuye la probabilidad de un acontecimiento de nucleación.

Ejemplo 4: efectos de la temperatura de almacenamiento sobre la estabilidad de mAb en formulaciones de trehalosa congeladas

Los datos de agregación de doce meses demuestran que la temperatura de almacenamiento sí afecta la estabilidad de la proteína (FIG. 3). En general, las muestras de mAb3 congeladas rápidamente y almacenadas durante doce meses a -20 °C se agregaron en el mayor grado (FIG. 3C). Curiosamente, la tasa inicial de agregación de bevacizumab y mAb3 fue más rápida en muestras congeladas rápidamente almacenadas a -14 °C disminuyendo antes la tasa de agregación que en las almacenadas a -20 °C (FIG. 3), lo que se puede deber a la naturaleza caótica de los acontecimientos de nucleación. Las muestras congeladas rápidamente y almacenadas a -8 °C, la temperatura de almacenamiento más cálida, en general mostraron tanto la tasa como el grado de agregación más bajos a lo largo del transcurso del estudio (FIG. 3). La superposición de cromatograma en la FIG. 4B muestra las diferencias observadas en los perfiles SEC para muestras de mAb3 congeladas rápidamente almacenadas durante doce meses a las tres temperaturas de almacenamiento respectivas. Las muestras de congelación rápida almacenadas a mayores temperaturas (por ejemplo, -8 °C) se agregaron en menor grado; y, por el contrario, las muestras almacenadas a menores temperaturas (por ejemplo, -20 °C) se agregaron en mayor grado para bevacizumab y mAb3.

La dependencia de la temperatura de almacenamiento de la agregación de proteínas en este estudio da información adicional sobre el mecanismo de agregación de proteínas en la solución congelada. Curiosamente, la temperatura de almacenamiento determina la dependencia entre la agregación de proteínas y la cristalización de trehalosa (tabla 1). En general, las muestras congeladas rápidamente y almacenadas a -8 °C, -14 °C y -20 °C no mostraron diferencias significativas en el grado de cristalización de trehalosa, aunque las muestras almacenadas a la menor temperatura (-20 °C) se agregaron a mayores grados que las almacenadas a mayores temperaturas (-14 °C y -8 °C, respectivamente) (FIG. 3). Por ejemplo, aunque las muestras de mAb3 congeladas rápidamente almacenadas durante 12 meses tenían entre un 61 % - 69 % de trehalosa cristalizada para todas las temperaturas de almacenamiento, la cantidad de agregación se incrementó a temperaturas de almacenamiento más negativas. Por ejemplo, las muestras congeladas agregaron un 0,3 %, un 2,1 % y un 3,1 % después de 12 meses de almacenamiento a -8 °C, -14 °C y -20 °C, respectivamente (tabla 1). Esta tendencia demuestra que una cantidad comparable de cristalización de trehalosa en dos muestras puede dar como resultado más agregación de proteínas con el almacenamiento a menores temperaturas (-20 °C) que a mayores temperaturas (-14 °C y -8 °C, respectivamente).

Estas tendencias dependientes de la temperatura sugieren que la movilidad molecular y las propiedades físicas (es decir, la morfología del hielo) del entorno congelado pueden desempeñar funciones críticas en la agregación de proteínas inducida por la cristalización de trehalosa. El intervalo de temperaturas de almacenamiento estudiado (-20 °C, -14 °C y -8 °C) están por encima de las temperaturas de transición vítrea para estas soluciones (intervalo de Tv': de -29,5 a -32 °C) y, por tanto, se espera cierta movilidad. Todas las muestras congeladas rápidamente se congelan de la misma manera, por tanto, presumiblemente, las muestras con la misma composición tienen morfologías de hielo y distribuciones de solutos similares inmediatamente después de la congelación. Sin embargo, después de la congelación, la temperatura de almacenamiento dicta la concentración de soluto a largo plazo y las tasas de difusión de las moléculas de trehalosa y proteína en el concentrado congelado. Debido a la diferencia de tamaño entre la trehalosa (342 Da) y la IgG1 (>145.000 Da), se puede suponer que las moléculas de trehalosa se difunden mucho más rápidamente a través del concentrado congelado que las proteínas globulares grandes. Estudios adicionales demuestran que la cristalización de trehalosa alcanza una meseta dentro de las 2 semanas de almacenamiento congelado (datos no mostrados). Puesto que la cristalización de trehalosa se produce temprano y los datos muestran la cinética de agregación con el tiempo a diversas temperaturas de almacenamiento, esto puede sugerir que la movilidad molecular dicta la tasa y el grado de reorganización de los medios congelados y, de este modo, dicta la tasa y el grado de agregación de los anticuerpos monoclonales IgG1. Después de la congelación rápida, las muestras de mAb3 almacenadas a -14 °C comienzan a agregarse temprano pero alcanzan una meseta entre 3 y 6 meses, mientras que las muestras almacenadas a -20 °C comienzan a agregarse poco después de esto, pero se continúan agregando de manera dependiente del tiempo y alcanzan una meseta entre de 6 a 12 meses (FIG. 3C). Presumiblemente, las muestras a mayores temperaturas (-14 °C y -8 °C) tienen más movilidad molecular, por lo que las proteínas inicialmente difunden conjuntamente y forman agregados. Sin embargo, a medida que los componentes de la solución separados en fases (es decir, trehalosa) se redistribuyen, las proteínas se estabilizan por interacciones con moléculas de trehalosa amorfa colocalizadas.

Ejemplo 5: efectos de la composición de la formulación sobre la estabilidad de mAb en formulaciones de trehalosa congeladas

Para determinar los efectos de la composición de la formulación sobre la cristalización de trehalosa y la agregación de mAb durante el almacenamiento congelado, se evaluó bevacizumab en un intervalo de concentración de trehalosa (intervalo de [trehalosa]: de un 0 a un 34,2 % (p/v) y concentraciones de bevacizumab (intervalo de [bevacizumab]: 0, 25 y 100 mg/ml). Las muestras se congelaron rápidamente durante 12 meses a temperaturas por encima (-20 °C) y por debajo (-40 °C) de la temperatura de transición vítrea y se analizaron para determinar la cristalización de trehalosa y la agregación de proteínas usando FT-NIR y SEC, respectivamente.

Los resultados de este estudio demostraron que después de la congelación rápida, la trehalosa cristaliza en soluciones congeladas almacenadas a -20 °C durante 12 meses (FIG.7). Sin embargo, no se observó cristalización de trehalosa ni agregación de mAb en soluciones congeladas almacenadas a -40 °C durante 12 meses. Inmediatamente después de la congelación rápida y el raspado, hay una cantidad mínima de trehalosa cristalizada (<10 % p/v). Sin embargo, después de 12 meses de almacenamiento congelado a -20 °C, la cristalización de trehalosa se incrementa significativamente (FIGS. 7A-C).

En general, los resultados demuestran que incrementar la concentración de trehalosa da como resultado mayores porcentajes de trehalosa cristalizada. Por ejemplo, el porcentaje de trehalosa cristalizada se incrementa de un 47 % a un 86 % ([bevacizumab] = 0 mg/ml), de un 22 % a un 61 % ([bevacizumab] = 25 mg/ml) y de un 10 % a un 47 % ([bevacizumab] = 100 mg/ml) a medida que la concentración de trehalosa se incrementa de un 1,7 % a un 34,2 % (p/v) (FIG.7). De forma similar, la agregación de bevacizumab también se incrementó después de 12 meses de almacenamiento congelado a -20 °C (FIGS. 7D-E). En general, los resultados muestran que hay un intervalo óptimo de trehalosa que estabiliza las soluciones de bevacizumab durante el almacenamiento congelado a largo plazo. De forma alternativa, las proporciones de trehalosa:mAb por encima del intervalo óptimo dan como resultado la cristalización de trehalosa y la agregación de proteínas (FlGs. 7D-E). En proporciones de trehalosa:mAb por debajo del intervalo óptimo, hay un incremento en la agregación de proteínas pero no un incremento en la cristalización de trehalosa, presumiblemente debido a otro mecanismo (por ejemplo, crioprotector insuficiente).

Los datos indican que el porcentaje de trehalosa cristalizada formada depende de las concentraciones tanto de proteína como de trehalosa. Curiosamente, una mayor concentración de bevacizumab da como resultado menores cantidades de cristalización de trehalosa. Por ejemplo, a una concentración fija de trehalosa (1,7 % p/v), incrementar la concentración de bevacizumab de 0 mg/ml a 100 mg/ml, disminuye el porcentaje de trehalosa cristalizada de un 53 % a un 9 %.

La FIG. 8 demuestra la importancia de la proporción de trehalosa con respecto a mAb (p/p) en la cristalización de trehalosa (FIG. 8A) y la agregación de bevacizumab (FIG. 8B). Como se muestra en las FlGS. 8A y B, el análisis de la estabilidad física de bevacizumab demostró que se requiere suficiente trehalosa:mAb (>0,2:1 p/p) para estabilizar las soluciones de bevacizumab durante la congelación a largo plazo; sin embargo, el exceso de trehalosa:mAb (>2,4:1 p/p) da como resultado mayores proporciones de dihidrato de trehalosa cristalizada e incrementos significativos en la agregación de bevacizumab. Presumiblemente, incrementar trehalosa:mAb da como resultado una sobresaturación de trehalosa en soluciones congeladas y da como resultado la cristalización de trehalosa y la agregación de mAb. Estos resultados identifican un intervalo óptimo de trehalosa:mAb (>0,2:1 y <2,4:1 p/p) requerido para la estabilización física de las formulaciones de bevacizumab por trehalosa durante el almacenamiento congelado a largo plazo.

Dicho de otra forma, estos resultados identifican un intervalo óptimo de mAb:trehalosa (>0,417:1 y <5,0:1 p/p) requerido para la estabilización física de las formulaciones de bevacizumab por trehalosa durante el almacenamiento congelado a largo plazo. Por ejemplo, como se muestra en la FIG. 7D, usando 25 mg/ml de bevacizumab, los intervalos de mAb:trehalosa entre 0,49 y 1,47 mostraron baja agregación de proteínas y baja variación de la muestra. Como otro ejemplo, como se muestra en la FIG. 7E, usando 100 mg/ml de bevacizumab, los intervalos de mAb:trehalosa entre 0,41 y 1,47 mostraron baja agregación de proteínas y baja variación de la muestra.

Curiosamente, el polisorbato no afectó la estabilidad de la proteína ni la distribución de fases de la trehalosa en ninguna de las formulaciones de bevacizumab congeladas. Para muestras con composiciones equivalentes, la adición de polisorbato (0,04 % p/v) no dio como resultado ningún cambio mesurable en la cristalización de trehalosa o la agregación de proteínas.

Los resultados del estudio de composición de la formulación indican que incrementar la concentración de proteína disminuye la aparición y el grado de cristalización de trehalosa en muestras congeladas. Estos resultados demuestran que las proporciones de trehalosa:mAb excesivamente altas (>2,4 p/p) dan como resultado la cristalización de trehalosa y la agregación de proteínas, pero las proporciones de trehalosa:mAb excesivamente bajas (<0,2 p/p) no proporcionaron la crioprotección adecuada para concentraciones de bevacizumab de hasta 100 mg/ml. Los resultados identifican un intervalo óptimo de proporción de trehalosa:bevacizumab (p/p), 0,2-2,4, que puede estabilizar físicamente las formulaciones de bevacizumab durante el almacenamiento congelado a largo plazo, incluso para formulaciones congeladas rápidamente (>100 °C/min). Dicho de otra forma, estos resultados identifican un intervalo óptimo de bevacizumab:trehalosa (>0,417:1 y <5,0:1 p/p) requerido para la estabilización física de las formulaciones de bevacizumab por trehalosa durante el almacenamiento congelado a largo plazo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una formulación farmacéutica acuosa estable, que comprende:

(a) un anticuerpo monoclonal en una cantidad de 25 mg/ml a 100 mg/ml, de 35 mg/ml a 85 mg/ml, de 45 mg/ml a 55 mg/ml o 50 mg/ml;

(b) trehalosa en una cantidad de 45 mM a 634 mM, de 45 mM a 135 mM, de 180 mM a 634 mM o 60 mM; y

(c) fosfato de sodio en una cantidad de 35 mM a 100 mM, de 45 mM a 90 mM, de 50 mM a 75 mM o 51 mM;

en la que dicha formulación tiene un pH de 5,5 a 7,0, de 5,9 a 6,5, 6,2 o 6,0;

en la que la proporción en peso de dicho anticuerpo monoclonal con respecto a dicha trehalosa en la formulación es de 0,49 a 1,47, de 0,49 a 0,73 o de 0,73 a 1,47, en la que la proporción en peso de dicho anticuerpo monoclonal con respecto a dicha trehalosa en la formulación no es de 0,83,

en la que dicha formulación es estable cuando se almacena a -20 °C o -40 °C durante al menos 6 meses,

en la que el anticuerpo monoclonal es bevacizumab, y

en la que el peso de trehalosa en la formulación para calcular la proporción en peso del anticuerpo con respecto a la trehalosa se basa en el PM de dihidrato de trehalosa, en la que el PM es de 378,33.

2. La formulación de la reivindicación 1, que comprende además un tensioactivo.

3. La formulación de la reivindicación 2, en la que dicho tensioactivo es polisorbato, opcionalmente polisorbato

20, o poloxámero, opcionalmente poloxámero 188.

4. La formulación de la reivindicación 2 o 3, en la que dicha concentración de tensioactivo es de un 0,01 % a un

0,1 %, de un 0,01 % a un 0,05 % o de un 0,04 %.

5. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicho anticuerpo monoclonal no se somete a liofilización anterior.

6. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la formulación es estable a -20 °C durante al menos 12 meses.

7. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que es para administración intravenosa (i.v.), subcutánea (s.c.), intraocular (i.o.) o intramuscular (i.m.).

8. Un artículo de fabricación que comprende un recipiente que contiene la formulación farmacéutica acuosa estable de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Un procedimiento de reducción de la agregación de un anticuerpo monoclonal terapéutico, que comprende formular dicho anticuerpo monoclonal en una formulación que comprende trehalosa en una cantidad de 45 mM a

634 mM, de 45 mM a 135 mM, de 180 mM a 634 mM o 60 mM;

fosfato de sodio en una cantidad de 35 mM a 100 mM, de 50 mM a 75 mM o 51 mM, y

teniendo dicha formulación un pH de 5,5 a 7,0, de 5,9 a 6,5, de 6,2 o de 6,0,

en el que dicho anticuerpo monoclonal se formula en una cantidad de 25 mg/ml a 100 mg/ml, de 35 mg/ml a

85 mg/ml, de 45 mg/ml a 55 mg/ml o de 50 mg/ml en la formulación,

en el que la proporción en peso de dicho anticuerpo monoclonal con respecto a dicha trehalosa en la formulación es de 0,49 a 1,47, de 0,49 a 0,73 o de 0,73 a 1,47, o cualquiera

e 0,49, 0,58, 0,65, 0,73, 0,74, 0,97, 1,16 y 1,47, en el que la proporción en peso de dicho anticuerpo monoclonal con respecto a dicha trehalosa en la formulación no es de 0,83,

en el que la formulación es estable cuando se almacena a -20 °C o -40 °C durante al menos 6 meses,

en el que el anticuerpo monoclonal es bevacizumab, y

en el que el peso de trehalosa en la formulación para calcular la proporción en peso del anticuerpo con respecto a la trehalosa se basa en el PM de dihidrato de trehalosa, en el que el PM es de 378,33.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha formulación comprende además un tensioactivo.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho tensioactivo es polisorbato, opcionalmente polisorbato 20, o poloxámero, opcionalmente poloxámero 188.

12. El procedimiento de la reivindicación 10 u 11, en el que dicha concentración de tensioactivo es de un 0,01 % a un 0,1 %, de un 0,01 % a un 0,05 % o de un 0,04 %.

13. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto.