KR20170057339A - 항체 제형 - Google Patents

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KR20170057339A
KR20170057339A KR1020177010007A KR20177010007A KR20170057339A KR 20170057339 A KR20170057339 A KR 20170057339A KR 1020177010007 A KR1020177010007 A KR 1020177010007A KR 20177010007 A KR20177010007 A KR 20177010007A KR 20170057339 A KR20170057339 A KR 20170057339A
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trehalose
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Prior art date
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KR1020177010007A
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란 레
브라이언 코놀리
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 치료적 항체, 트레할로오스, 버퍼, 및 선택적인 계면활성제를 포함하고 약 5.5 내지 약 7.0 범위의 pH를 갖는, 안정한 수성 약제학적 제형을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 제형을 제조하는 방법 및 상기 제형을 사용하는 방법을 제공한다.

Description

항체 제형{ANTIBODY FORMULATIONS}
관련 출원들에 대한 교차참조
본원은 미국 가출원 시리즈 제62/050,739호 (2014년 9월 15일 출원)의 우선권 이익을 주장하고, 이는 그 전체가 참고로 본원에 편입되어 있다.
ASCII 텍스트 파일의 서열 목록의 제출
ASCII 텍스트 파일에 대한 하기 제출 내용은 그 전체가 참고로 본원에 편입되어 있다: 서열목록의 컴퓨터 판독가능한 형태 (CRF) (파일명: 146392028240SEQLIST.txt, 기록일: 2015년 9월 3일, 크기: 29 KB).
발명의 분야
본 발명은 항체를 포함하는 안정한 수성 약제학적 제형에 관한 것이다.
지난 수년간 생명공학의 발전으로 재조합 DNA 기법을 이용하여 약제학적 적용을 위한 다양한 단백질을 생산할 수 있게 되었다. 단백질은 전통적인 유기 및 무기 약물보다 크고 더 복잡하기 때문에 (예를 들면, 복잡한 3차원 구조 외에도 다수의 작용기를 보유함), 이러한 단백질의 제형은 특별한 문제를 야기한다. 단백질이 생물학적 활성을 유지하기 위해서는, 제형은 단백질의 아미노산의 적어도 핵심 서열의 온전한 형태적 완전성을 유지해야 하며 동시에 단백질의 다수의 작용기가 분해되는 것을 방지해야 한다. 단백질에 대한 분해 경로는 화학적 불안정성 (예를 들면, 새로운 화학 독립체를 야기하는 결합 형성 또는 절단에 의한 단백질의 변형을 포함하는 임의의 공정) 또는 물리적 불안정성 (예를 들면, 단백질의 고차 구조의 변화)을 수반할 수 있다. 화학적 불안정성은 탈아미드화, 라세미화, 가수분해, 산화, 베타 제거 또는 디설파이드 교환으로부터 비롯될 수 있다. 물리적 불안정성은, 예를 들면, 변성, 응집, 침전 또는 흡착으로부터 비롯될 수 있다. 가장 일반적인 3가지 단백질 분해 경로는 단백질 응집, 탈아미드화 및 산화이다. Cleland 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377 (1993).
약제학적 적용을 위해 사용되는 단백질에는 항체가 포함된다. 안정한 수성 제형이 약제학적 항체를 위해 개발되었다. 예를 들면, WO 제2011/084750호를 참고한다. 이량체, 가용성 응집물, 및 미립자의 형성을 완화시키는 항-VEGF 항체 및 항-CD20 항체와 같은 항체를 포함하는 안정한 수성 약제학적 제형이 당업계에 여전히 필요하다.
요약
일 측면에서, 본 발명은 단클론성 항체, 트레할로오스 및 버퍼를 포함하는 안정한 수성 약제학적 제형을 제공하며, 상기 제형에서 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 0.41 이상 내지 1.65 미만이고, 상기 제형은 약 5.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 0.49 내지 1.47이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 약 0.41 내지 0.73이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 약 0.73 내지 1.47이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 0.41, 0.45, 0.50, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.95, 1.00, 1.05, 1.10, 1.15, 1.20, 1.25, 1.30, 1.35, 1.40, 1.45, 1.50, 1.55, 1.60, 및 1.64 중 어느 것(이들 숫자 사이의 모든 값을 포함함)이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 단클론성 항체는 약 25 mg/mL 내지 약 100 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 단클론성 항체는 약 45 mg/mL 내지 약 55 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 단클론성 항체는 약 35 mg/mL 내지 약 75 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 트레할로오스는 약 45 mM 내지 약 634 mM이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 트레할로오스는 약 50 mM 내지 약 600 mM이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 트레할로오스는 약 150 mM 내지 약 400 mM이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 트레할로오스는 약 45 mM 내지 약 135 mM이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 트레할로오스는 약 180 mM 내지 약 634 mM이다. 일부 구현예에서, 버퍼는 약 15 mM 내지 약 100 mM의 양이다. 일부 구현예에서, 버퍼는 35 mM 초과 내지 약 100 mM의 양이다. 일부 구현예에서, 버퍼는 히스티딘 (예를 들면, 히스티딘 아세테이트, 히스티딘 하이드로클로라이드) 또는 포스페이트 (예를 들면, 인산나트륨)를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 약 25 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 양의 단클론성 항체; (b) 약 45 mM 내지 약 634 mM의 양의 트레할로오스; 및 (c) 35 mM 초과 내지 약 100 mM의 양의 인산나트륨, 및 임의의 계면활성제를 포함하는 안정한 수성 약제학적 제형을 제공하며, 상기 제형은 약 5.5 내지 약 7.0의 pH를 갖고, 제형 내의 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비는 0.41 이상 내지 1.65 미만이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 0.41 내지 0.73이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 0.73 내지 1.47이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 0.49 내지 1.47이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 0.41, 0.45, 0.50, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.95, 1.00, 1.05, 1.10, 1.15, 1.20, 1.25, 1.30, 1.35, 1.40, 1.45, 1.50, 1.55, 1.60, 및 1.64 중 어느 것(이들 숫자 사이의 모든 값을 포함함)이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 안정한 수성 약제학적 제형을 제공하며, 상기 제형은 (a) 약 100 mg/mL 이하의 양의 항체 (예를 들면, 단클론성 항체); 및 (b) 약 150 mM 내지 약 400 mM의 양의 트레할로오스를 포함하고, 상기 제형은 약 5.5 내지 약 7.0의 pH를 갖고, 제형 내의 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비는 0.41 이상 내지 1.65 미만이다. 일부 구현예에서, 제형은 피하 투여용이다. 일부 구현예에서, 제형은 안구내 투여용이다. 일부 구현예에서, 제형은 등장성이다. 일부 구현예에서, 제형은 약 240 mOsm/kg을 초과하는 오스몰농도를 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 안정한 수성 약제학적 제형을 제공하며, 상기 제형은 (a) 약 100 mg/mL 이하의 양의 항체 (예를 들면, 단클론성 항체); 및 (b) 약 50 mM 내지 약 600 mM의 양의 트레할로오스를 포함하고, 상기 제형은 약 5.5 내지 약 7.0의 pH를 가지며, 제형 내의 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비는 0.41 초과 내지 1.65 미만이다. 일부 구현예에서, 제형은 정맥내 투여용이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 제형 내의 단클론성 항체는 약 30 mg/mL 내지 약 90 mg/mL, 약 35 mg/mL 내지 약 85 mg/mL, 약 35 mg/mL 내지 75 mg/mL, 약 40 mg/mL 내지 약 80 mg/mL, 약 45 mg/mL 내지 약 70 mg/mL, 또는 약 45 mg/mL 내지 약 55 mg/mL의 양이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 단클론성 항체는 약 25 mg/mL, 약 30 mg/mL, 약 35 mg/mL, 약 40 mg/mL, 약 45 mg/mL, 약 50 mg/mL, 약 55 mg/mL, 약 60 mg/mL, 약 65 mg/mL, 약 70 mg/mL, 약 75 mg/mL, 약 80 mg/mL, 약 85 mg/mL, 약 90 mg/mL, 약 95 mg/mL, 또는 약 100 mg/mL (이들 숫자 사이의 모든 값을 포함함)이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 단클론성 항체는 약 45 mg/mL, 약 50 mg/mL, 또는 약 55 mg/mL이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 제형은 약 45 mM 내지 약 600 mM, 약 45 mM 내지 약 550 mM, 약 45 mM 내지 약 500 mM, 약 45 mM 내지 약 450 mM, 약 45 mM 내지 약 400 mM, 약 45 mM 내지 약 350 mM, 약 45 mM 내지 약 300 mM, 약 45 mM 내지 약 250 mM, 약 45 mM 내지 약 200 mM, 약 45 mM 내지 약 180 mM, 약 45 mM 내지 약 150 mM, 약 45 mM 내지 약 140 mM, 약 45 mM 내지 약 135 mM, 약 45 mM 내지 약 130 mM, 약 45 mM 내지 약 120 mM, 약 45 mM 내지 약 110 mM, 약 45 mM 내지 약 100 mM, 약 180 mM 내지 약 634 mM, 약 50 mM 내지 약 600 mM, 또는 약 150 mM 내지 약 400 mM의 트레할로오스를 포함한다. 일부 구현예에서, 제형 내의 트레할로오스는 약 45 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 약 135 mM, 약 140 mM, 약 150 mM, 약 180 mM, 약 200 mM, 약 250 mM, 약 300 mM, 약 350 mM, 약 400 mM, 약 450 mM, 약 500 mM, 약 550 mM, 약 600 mM, 약 610 mM, 약 620 mM, 약 630 mM, 또는 약 634 mM (이들 숫자 사이의 모든 값을 포함함)이다. 일부 구현예에서, 제형은 버퍼로서 포스페이트 (예를 들면, 인산나트륨)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제형 내의 포스페이트 버퍼 (예를 들면, 인산나트륨)는 약 15 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 30 mM, 약 22 mM 내지 약 28 mM, 35 mM 초과 내지 약 100 mM, 약 40 mM 내지 약 100 mM, 약 45 mM 내지 약 90 mM, 약 50 mM 내지 약 75 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 100 mM이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 포스페이트 (예를 들면, 인산나트륨)는 약 15 mM, 약 20 mM, 약 22 mM, 약 25 mM, 약 28 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 36 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 51 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 또는 약 100 mM (이들 숫자 사이의 모든 값을 포함함)이다. 일부 구현예에서, 제형은 버퍼로서 히스티딘 (예컨대 L-히스티딘)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제형 내의 히스티딘은 약 15 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 30 mM, 약 22 mM 내지 약 28 mM, 35 mM 초과 내지 약 100 mM, 약 40 mM 내지 약 100 mM, 약 45 mM 내지 약 90 mM, 약 50 mM 내지 약 75 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 100 mM이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 히스티딘은 약 15 mM, 약 20 mM, 약 22 mM, 약 25 mM, 약 28 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 36 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 51 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 또는 약 100 mM (이들 숫자 사이의 모든 값을 포함함)이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 제형은 계면활성제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 (예컨대 폴리소르베이트 20) 또는 폴록사머 (예컨대 폴록사머 188)이다. 일부 구현예에서, 계면활성제 농도는 약 0.01% 내지 약 0.1%, 약 0.01% 내지 약 0.05%, 또는 약 0.02% 내지 약 0.04%이다. 일부 구현예에서, 계면활성제 농도는 약 0.01%, 약 0.02%, 약 0.03%, 약 0.04%, 약 0.05%, 또는 약 0.1% (이들 숫자 사이의 모든 값을 포함함)이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 제형은 약 5.5 내지 약 6.5, 약 5.8 내지 약 6.8, 약 5.9 내지 약 6.5, 약 6.0 내지 약 6.5, 약 6.0 내지 약 6.4, 또는 약 6.0 내지 약 6.2의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제형은 약 5.6, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.2, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.8, 또는 약 7.0 (이들 숫자 사이의 모든 값을 포함함)의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 제형 내의 단클론성 항체는 사전에 동결건조되지 않는다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 전장 항체이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 IgGl, IgG2, 또는 IgG4 항체이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 인간화 항체, 키메라성 항체 또는 인간 항체이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 항원-결합 영역을 포함하는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 Fab 또는 F(ab')2 단편이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 VEGF에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 베바시주맙이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 응집에 민감하다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 제형 내의 단클론성 항체는 사전에 동결건조되지 않는다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 전장 항체이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 IgGl, IgG2, 또는 IgG4 항체이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 인간화 항체, 키메라성 항체 또는 인간 항체이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 항원-결합 영역을 포함하는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 Fab 또는 F(ab')2 단편이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 CD20에 결합한다. 일부 구현예에서, CD20에 결합하는 항체는 본원에 기재된 인간화된 B-Ly1 항체이다. 일부 구현예에서, CD20에 결합하는 항체는 서열번호: 3 내지 서열번호: 19로부터 선택된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호: 20의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 오비누투주맙이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 응집에 민감하다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 제형은 적어도 약 6개월, 적어도 약 12개월, 적어도 약 15개월, 적어도 약 18개월, 적어도 약 19개월, 적어도 약 20개월, 또는 적어도 약 2년 동안 -20 ℃에서 안정하다. 일부 구현예에서, 제형은 멸균이다. 일부 구현예에서, 제형은 대상체 투여용이다. 일부 구현예에서, 제형은 정맥내 (IV), 피하 (SQ), 안구내 (IO), 또는 근육내 (IM) 투여용이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 안정한 수성 약제학적 제형을 보유하는 용기를 포함하는 제조 물품을 제공한다. 일부 구현예에서, 제형은 단클론성 항체, 트레할로오스, 및 버퍼를 포함하고, 제형 내의 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비는 0.41 이상 내지 1.65 미만이고, 상기 제형은 약 5.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제형은 (a) 약 25 내지 약 100 mg/mL의 양의 단클론성 항체; (b) 약 45 mM 내지 약 634 mM의 양의 트레할로오스; 및 (c) 35 mM 초과 내지 약 100 mM의 양의 인산나트륨, 및 임의의 계면활성제를 포함하며, 상기 제형은 약 5.5 내지 약 7.0의 pH를 갖고, 제형 내의 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비는 0.41 이상 및 1.6 미만이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 0.41 내지 0.73이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 0.73 내지 1.47이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 0.49 내지 1.47이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 0.41, 0.45, 0.50, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.95, 1.00, 1.05, 1.10, 1.15, 1.20, 1.25, 1.30, 1.35, 1.40, 1.45, 1.50, 1.55, 1.60, 및 1.64 중 어느 것 (이들 숫자 사이의 모든 값을 포함함) 이다.
일부 구현예에서, 제형 내의 단클론성 항체는 약 30 mg/mL 내지 약 90 mg/mL, 약 35 mg/mL 내지 약 85 mg/mL, 약 35 mg/mL 내지 약 75 mg/mL, 약 40 mg/mL 내지 약 80 mg/mL, 약 45 mg/mL 내지 약 70 mg/mL, 또는 약 45 mg/mL 내지 약 55 mg/mL의 양이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 단클론성 항체는 약 25 mg/mL, 약 30 mg/mL, 약 35 mg/mL, 약 40 mg/mL, 약 45 mg/mL, 약 50 mg/mL, 약 55 mg/mL, 약 60 mg/mL, 약 65 mg/mL, 약 70 mg/mL, 약 75 mg/mL, 약 80 mg/mL, 약 85 mg/mL, 약 90 mg/mL, 약 95 mg/mL, 또는 약 100 mg/mL (이들 숫자 사이의 모든 값을 포함함)이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 단클론성 항체는 약 45 mg/mL, 약 50 mg/mL, 또는 약 55 mg/mL이다.
일부 구현예에서, 제형은 약 45 mM 내지 약 600 mM, 약 45 mM 내지 약 550 mM, 약 45 mM 내지 약 500 mM, 약 45 mM 내지 약 450 mM, 약 45 mM 내지 약 400 mM, 약 45 mM 내지 약 350 mM, 약 45 mM 내지 약 300 mM, 약 45 mM 내지 약 250 mM, 약 45 mM 내지 약 200 mM, 약 45 mM 내지 약 180 mM, 약 45 mM 내지 약 150 mM, 약 45 mM 내지 약 140 mM, 약 45 mM 내지 약 135 mM, 약 45 mM 내지 약 130 mM, 약 45 mM 내지 약 120 mM, 약 45 mM 내지 약 110 mM, 약 45 mM 내지 약 100 mM, 약 180 mM 내지 약 634 mM, 약 50 mM 내지 약 600 mM, 또는 약 150 mM 내지 약 400 mM의 트레할로스를 포함한다. 일부 구현예에서, 제형 내의 트레할로오스는 약 45 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 약 135 mM, 약 140 mM, 약 150 mM, 약 180 mM, 약 200 mM, 약 250 mM, 약 300 mM, 약 350 mM, 약 400 mM, 약 450 mM, 약 500 mM, 약 550 mM, 약 600 mM, 약 610 mM, 약 620 mM, 약 630 mM, 또는 약 634 mM (이들 숫자 사이의 모든 값을 포함함)이다. 일부 구현예에서, 제형은 버퍼로서 인산나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제형 내의 인산나트륨은 약 15 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 30 mM, 약 22 mM 내지 약 28 mM, 35 mM 초과 내지 약 100 mM, 약 40 mM 내지 약 100 mM, 약 45 mM 내지 약 90 mM, 약 50 mM 내지 약 75 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 100 mM이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 인산나트륨은 약 15 mM, 약 20 mM, 약 22 mM, 약 25 mM, 약 28 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 36 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 51 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 또는 약 100 mM (이들 숫자 사이의 모든 값을 포함함)이다. 일부 구현예에서, 제형은 버퍼로서 히스티딘 (예컨대 L-히스티딘)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제형 내의 히스티딘은 약 15 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 30 mM, 약 22 mM 내지 약 28 mM, 35 mM 초과 내지 약 100 mM, 약 40 mM 내지 약 100 mM, 약 45 mM 내지 약 90 mM, 약 50 mM 내지 약 75 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 100 mM이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 히스티딘은 약 15 mM, 약 20 mM, 약 22 mM, 약 25 mM, 약 28 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 36 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 51 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 또는 약 100 mM (이들 숫자 사이의 모든 값을 포함함)이다.
일부 구현예에서, 제형은 계면활성제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 (예컨대 폴리소르베이트 20) 또는 폴록사머 (예컨대 폴록사머 188)이다. 일부 구현예에서, 계면활성제 농도는 약 0.01% 내지 약 0.1%, 약 0.01% 내지 약 0.05%, 또는 약 0.02% 내지 약 0.04%이다. 일부 구현예에서, 계면활성제 농도는 약 0.01%, 약 0.02%, 약 0.03%, 약 0.04%, 약 0.05%, 또는 약 0.1% (이들 숫자 사이의 모든 값을 포함함)이다.
일부 구현예에서, 제형은 약 5.5 내지 약 6.5, 약 5.8 내지 약 6.8, 약 5.9 내지 약 6.5, 약 6.0 내지 약 6.5, 약 6.0 내지 약 6.4, 또는 약 6.0 내지 약 6.2의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제형은 약 5.6, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.2, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.8, 또는 약 7.0 (이들 숫자 사이의 모든 값을 포함함)의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 단클론성 항체는 사전에 동결건조되지 않는다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 전장 항체이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 IgGl, IgG2, 또는 IgG4 항체이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 인간화 항체, 키메라성 항체 또는 인간 항체이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 항원-결합 영역을 포함하는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 Fab 또는 F(ab')2 단편이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 VEGF에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 베바시주맙이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 응집에 민감하다.
일부 구현예에서, 단클론성 항체는 사전에 동결건조되지 않는다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 전장 항체이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 IgGl, IgG2, 또는 IgG4 항체이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 인간화 항체, 키메라성 항체 또는 인간 항체이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 항원-결합 영역을 포함하는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 Fab 또는 F(ab')2 단편이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 CD20에 결합한다. 일부 구현예에서, CD20에 결합하는 항체는 본원에 기재된 인간화된 B-Ly1 항체이다. 일부 구현예에서, CD20에 결합하는 항체는 서열번호: 3 내지 서열번호: 19로부터 선택된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호: 20의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 오비누투주맙이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 응집에 민감하다.
일부 구현예에서, 제형은 적어도 약 6개월, 적어도 약 12개월, 적어도 약 15개월, 적어도 약 18개월, 적어도 약 19개월, 적어도 약 20개월, 또는 적어도 약 2년 동안 -20 ℃에서 안정하다. 일부 구현예에서, 제형은 멸균이다. 일부 구현예에서, 제형은 대상체 투여용이다. 일부 구현예에서, 제형은 정맥내 (IV), 피하 (SQ), 안구내 (IO), 또는 근육내 (IM) 투여용이다.
일부 구현예에서, 용기는 주사기에 의해 뚫릴 수 있는 마개가 있는 바이알이며, 상기 바이알은 본원에 기재된 제형 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이알은 약 2-8ºC에서 보관된다. 일부 구현예에서, 바이알은 약 -20 ℃에서 보관된다. 일부 구현예에서, 바이알은 3 cc, 20 cc 또는 50 cc 바이알이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 탱크 내에 본원에 기재된 제형 중 어느 하나를 포함하는 스테인레스강 탱크를 제공한다. 일부 구현예에서, 제형은 동결된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료용 단클론성 항체의 응집을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 단클론성 항체를 트레할로오스 및 버퍼를 포함하는 제형에서 제형화하는 것을 포함하고, 제형 내의 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 0.41 이상 내지 1.65 미만이고, 상기 제형은 약 5.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 항체를 약 45 mM 내지 약 634 mM, 약 50 mM 내지 약 600 mM, 또는 약 150 mM 내지 약 400 mM의 양의 트레할로오스 및 35 mM 초과 내지 약 100 mM의 양의 인산나트륨을 포함하는 제형에서 제형화하는 것을 포함하고, 상기 제형은 약 5.5 내지 약 7.0의 pH를 갖고, 상기 단클론성 항체는 제형 내에 약 25 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 양으로 제형화되고, 제형 내의 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비는 0.41 이상 내지 1.65 미만이다.
본원에 기재된 방법의 일부 구현예에서, 제형 내의 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비는 0.41 이상 내지 1.65 미만이다. 본 명세서에서 기재된 방법의 일부 구현예에서, 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 0.73 내지 1.47이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 0.49 내지 1.47이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 0.41, 0.45, 0.50, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.95, 1.00, 1.05, 1.10, 1.15, 1.20, 1.25, 1.30, 1.35, 1.40, 1.45, 1.50, 1.55, 1.60, 및 1.64 중 어느 것(이들 숫자 사이의 모든 값을 포함함)이다.
일부 구현예에서, 제형 내의 단클론성 항체는 약 30 mg/mL 내지 약 90 mg/mL, 약 35 mg/mL 내지 약 85 mg/mL, 약 35 mg/mL 내지 약 75 mg/mL, 약 40 mg/mL 내지 약 80 mg/mL, 약 45 mg/mL 내지 약 70 mg/mL, 또는 약 45 mg/mL 내지 약 55 mg/mL의 양이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 단클론성 항체는 약 25 mg/mL, 약 30 mg/mL, 약 40 mg/mL, 약 45 mg/mL, 약 50 mg/mL, 약 55 mg/mL, 약 60 mg/mL, 약 65 mg/mL, 약 70 mg/mL, 약 75 mg/mL, 약 80 mg/mL, 약 85 mg/mL, 약 90 mg/mL, 약 95 mg/mL, 또는 약 100 mg/mL (이들 숫자 사이의 모든 값을 포함함)이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 단클론성 항체는 약 45 mg/mL, 약 50 mg/mL, 또는 약 55 mg/mL이다.
일부 구현예에서, 제형은 약 45 mM 내지 약 600 mM, 약 45 mM 내지 약 550 mM, 약 45 mM 내지 약 500 mM, 약 45 mM 내지 약 450 mM, 약 45 mM 내지 약 400 mM, 약 45 mM 내지 약 350 mM, 약 45 mM 내지 약 300 mM, 약 45 mM 내지 약 250 mM, 약 45 mM 내지 약 200 mM, 약 45 mM 내지 약 180 mM, 약 45 mM 내지 약 150 mM, 약 45 mM 내지 약 140 mM, 약 45 mM 내지 약 135 mM, 약 45 mM 내지 약 130 mM, 약 45 mM 내지 약 120 mM, 약 45 mM 내지 약 110 mM, 약 45 mM 내지 약 100 mM, 약 180 mM 내지 약 634 mM, 약 50 mM 내지 약 600 mM, 또는 약 150 mM 내지 약 400 mM의 트레할로스를 포함한다. 일부 구현예에서, 제형 내의 트레할로오스는 약 45 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 약 135 mM, 약 140 mM, 약 150 mM, 약 180 mM, 약 200 mM, 약 250 mM, 약 300 mM, 약 350 mM, 약 400 mM, 약 450 mM, 약 500 mM, 약 550 mM, 약 600 mM, 약 610 mM, 약 620 mM, 약 630 mM, 또는 약 634 mM이다. 일부 구현예에서, 제형은 버퍼로서 인산나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제형 내의 인산나트륨은 약 15 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 30 mM, 약 22 mM 내지 약 28 mM, 35 mM 초과 내지 약 100 mM, 약 40 mM 내지 약 100 mM, 약 45 mM 내지 약 90 mM, 약 50 mM 내지 약 75 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 100 mM이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 인산나트륨은 약 15 mM, 약 20 mM, 약 22 mM, 약 25 mM, 약 28 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 36 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 51 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 또는 약 100 mM (이들 숫자 사이의 모든 값을 포함함)이다. 일부 구현예에서, 제형은 버퍼로서 히스티딘 (예컨대 L-히스티딘)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제형 내의 히스티딘은 약 15 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 30 mM, 약 22 mM 내지 약 28 mM, 35 mM 초과 내지 약 100 mM, 약 40 mM 내지 약 100 mM, 약 45 mM 내지 약 90 mM, 약 50 mM 내지 약 75 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 100 mM이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 히스티딘은 약 15 mM, 약 20 mM, 약 22 mM, 약 25 mM, 약 28 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 36 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 51 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 또는 약 100 mM (이들 숫자 사이의 모든 값을 포함함)이다.
일부 구현예에서, 제형은 계면활성제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 (예컨대 폴리소르베이트 20) 또는 폴록사머 (예컨대 폴록사머 188)이다. 일부 구현예에서, 계면활성제 농도는 약 0.01% 내지 약 0.1%, 약 0.01% 내지 약 0.05%, 또는 약 0.02% 내지 약 0.04%이다. 일부 구현예에서, 계면활성제 농도는 약 0.01%, 약 0.02%, 약 0.03%, 약 0.04%, 약 0.05%, 또는 약 0.1% (이들 숫자 사이의 모든 값을 포함함)이다.
일부 구현예에서, 제형은 약 5.5 내지 약 6.5, 약 5.8 내지 약 6.8, 약 5.9 내지 약 6.5, 약 6.0 내지 약 6.5, 약 6.0 내지 약 6.4, 또는 약 6.0 내지 약 6.2의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제형은 약 5.6, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.2, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.8, 또는 약 7.0 (이들 숫자 사이의 모든 값을 포함함)의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 단클론성 항체는 사전에 동결건조되지 않는다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 전장 항체이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 IgGl, IgG2, 또는 IgG4 항체이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 인간화 항체, 키메라성 항체 또는 인간 항체이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 항원-결합 영역을 포함하는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 Fab 또는 F(ab')2 단편이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 VEGF에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 베바시주맙이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 응집에 민감하다.
일부 구현예에서, 단클론성 항체는 사전에 동결건조되지 않는다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 전장 항체이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 IgGl, IgG2, 또는 IgG4 항체이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 인간화 항체, 키메라성 항체 또는 인간 항체이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 항원-결합 영역을 포함하는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 Fab 또는 F(ab')2 단편이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 CD20에 결합한다. 일부 구현예에서, CD20에 결합하는 항체는 본원에 기재된 인간화된 B-Ly1 항체이다. 일부 구현예에서, CD20에 결합하는 항체는 서열번호: 3 내지 서열번호: 19로부터 선택된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호: 20의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 오비누투주맙이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 응집에 민감하다.
일부 구현예에서, 제형은 적어도 약 6개월, 적어도 약 12개월, 적어도 약 15개월, 적어도 약 18개월, 적어도 약 19개월, 적어도 약 20개월, 또는 적어도 약 2년 동안 -20 ℃에서 안정하다. 일부 구현예에서, 제형은 멸균이다. 일부 구현예에서, 제형은 대상체 투여용이다. 일부 구현예에서, 제형은 정맥내 (IV), 피하 (SQ), 안구내 (IO), 또는 근육내 (IM) 투여용이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 약제학적 제형을 제조하는 방법을 제공한다: (a) 본원에 기재된 제형 중 어느 하나를 제조하는 단계; 및 (b) 제형 내의 항체의 물리적 안정성, 화학적 안정성, 또는 생물학적 활성을 평가하는 단계.일부 구현예에서, 제형 내의 항체의 물리적 안정성, 화학적 안정성, 또는 생물학적 활성은 제형이 보관된 후 (예를 들면, -20 ℃ 또는 -40 ℃에서) 약 6개월, 약 12개월, 약 18개월, 또는 약 24개월에 평가된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 제형 중 어느 하나를 질환 또는 장애를 치료하는데 유효한 양으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 제형은 VEGF에 결합하는 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 베바시주맙이다. 일부 구현예에서, 질환은 암이다. 일부 구현예에서, 상기 암은 결장직장암, 폐암, 유방암, 신장 암, 및 교모세포종으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 제형 중 어느 하나를 질환 또는 장애를 치료하는데 유효한 양으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 제형은 CD20에 결합하는 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 오비누투주맙이다. 일부 구현예에서, 질환은 암이다. 일부 구현예에서, 상기 암은 CD20 발현 암, 예를 들면, 림프종, 림프구성 백혈병, 및 다발성 골수종이다.
본원에 기재된 다양한 구현예의 특징 중 하나, 일부, 또는 모두는 조합되어 본 발명의 다른 구현예를 형성할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 이들 및 다른 측면은 당해 분야의 숙련가에게 명백해질 것이다. 본 발명의 이들 및 다른 구현예는 이하의 상세한 설명에 의해 더 설명된다.
도면의 간단한 설명
도1A , 1B, 1C 및 1D는 하기 트레할로오스의 약제학적으로 관련된 농도를 갖는 동결된 샘플의 표면 상의 유도된 핵생성 후의 시각적 트레할로오스 결정화를 나타낸다: (도1A) 0.0% (wt/v) 트레할로오스, (도1B) 2.0% (wt/v) 트레할로오스, (도1C) 4.0% (wt/v) 트레할로오스, 및 (도1D) 8.0% (wt/v) 트레할로오스.
도 2A는 표지된 바와 같이, 온도의 함수로서 수크로오스 (1), 트레할로오스 (2), 및 만니톨 (3)의 용해도를 나타낸다. 도 2B는 표지된 바와 같이, HP-SEC에 의해 결정된 바와 같은 -20 ℃에서 28일 동안 동결 및 유도된 핵생성 전후의 다양한 동결보호제 제형에서의 베바시주맙의 퍼센트 고분자량 종을 나타낸다.
도 3A , 3B 및 3C는 표지된 바와 같이 -20 ℃ (1), -14 ℃ (2), 및 -8 ℃ (3)에서 동결 보관된 mAb1 (도 3A), 베바시주맙 (도 3B), 및 mAb3 (도 3C) 급속 동결 샘플의 시간 의존적 응집 증가를 나타낸다.
도 4A 및 4B는 mAb3 단량체, 이량체, 및 고분자량 종 (HMWS)의 대표적인 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 크로마토그램을 나타낸다. (도 4A) 동결 속도의 효과. 느린 (1), 정상 (2), 및 빠른 (3) 동결 속도로 동결되고 (표지된 바와 같음) -20 ℃에서 12개월 동안 보관된 mAb3.비교를 위해 나타낸 연구 대조군 (-70 ℃에서 보관됨). (도 4B) 보관 온도의 효과. 빠른 동결 속도로 동결되고 표지된 바와 같이 12개월 동안 -20 ℃ (3), -14 ℃ (2), 및 -8 ℃ (1) 에서 보관된 mAb3 샘플.비교를 위해 나타낸 연구 대조군 (-70 ℃에서 보관됨).
도5는 본 연구에서 논의된 3가지 트레할로오스 형태의 정규화된 NIR 스펙트럼을 나타낸다: 표지된 바와 같이, 무정형 트레할로오스 (1), 트레할로오스 안하이드레이트 (결정성) (2), 및 트레할로오스 디히드레이트 (결정성) (3).
도 6 A1 -도 6 C3은 하기의 정규화된 NIR 스펙트럼을 나타낸다: (도 6 A1 , 6A2 및 6A3) mAb1, (도 6 B1 , 6B2 , 및 6B3) 베바시주맙, 및 (도 6 C1 , 6C2 , 및 6C3) mAb3 샘플로서, 상기 샘플은 -20 ℃, -14°C, 및 -8°C. -20 ℃, -14°C, 및 -8°C에서 12개월 보관 후 (도 6 A1 , 6B1 , 및 6C1) 느린 동결, (도 6 A2 , 6B2 , 및 6C2) 정상 동결, 및 (3) 빠른 동결 속도를 이용하여 동결됨.
도 7A , 7B 및 7C는 하기를 갖는 제형에서 무정형 (1) 및 결정화된 트레할로오스 (2)의 농도를 나타낸다: (도 7A) 0 mg/mL 베바시주맙, (도 7B) 25 mg/mL 베바시주맙, 및 (도 7C) 100 mg/mL 베바시주맙, -20 ℃에서 12개월 후도 7D 및 7E는 하기를 갖는 트레할로오스 제형의 퍼센트 고분자량 종을 나타내는 박스 플롯을 나타낸다: -20 ℃에서 12개월 보관 후 (도 7D) 25 mg/mL 베바시주맙, 및 (도 7E) 100 mg/mL 베바시주맙.
도 8A 및 8B는 총 트레할로오스: mAb 비 (wt/wt)의 함수로서 결정화된 트레할로오스 탈수화물 (도 8A), 및 퍼센트 고분자량 종 (도 8B)의 퍼센트를 나타낸다. 고분자량 종은 HP-SEC를 이용하여 측정하였고 트레할로오스 디히드레이트 농도는 FT-NIR을 이용하여 결정하였다.
상세한 설명
I. 정의.
본 발명을 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 특정 조성물 또는 생물학적 시스템에 한정되지 않으며, 이는 당연히 다양할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기술하기 위한 것이며, 제한하고자 하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 달리 명확히 언급하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "하나의 분자"에 대한 언급은 임의로 2개 이상의 상기 분자의 조합 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 “약”은 본 기술 분야의 숙련가에게 쉽게 공지된 각각의 값에 대한 일반적인 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 “약” 값 또는 파라미터에 대한 언급은 상기 값 또는 파라미터 자체에 관한 구현예를 포함한다 (및 기술한다).
본원에 기재된 본 발명의 측면 및 구현예는 측면 및 구현예를 “포함하는,” “이루어지는,” 및 “본질적으로 이루어지는” 것을 포함하는 것으로 이해된다.
용어 "약제학적 제형"은 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이게 하는 형태이며, 제형이 투여될 대상체가 받아들이기 어려울 정도로 독성인 부가적인 성분을 함유하지 않은 제제를 지칭한다. 그러한 제형은 멸균된다. "약제학적으로 허용가능한" 부형제 (비히클, 첨가제)는 대상 포유류에게 합리적으로 투여되어 이용된 활성 성분의 유효량을 제공할 수 있는 부형제이다.
"멸균된" 제형은 무균이거나 살아있는 모든 미생물 및 이들의 포자가 없거나 본질적으로 없다.
"동결된" 제형은 0 ℃ 미만의 온도에 있는 제형이다. 일반적으로, 동결된 제형은 동결-건조되지 않으며, 사전 또는 사후 동결건조되지 않는다. 특정 구현예에서, 동결된 제형은 보관용 동결 약물 물질 (스테인레스강 탱크에서) 또는 동결된 의약품 (최종 바이알 형태로)을 포함한다.
"안정한" 제형은 내부 단백질이 보관시 그의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 유지하는 제형이다. 바람직하게는, 제형은 보관시 그의 물리적 및 화학적 안정성, 뿐만 아니라 그의 생물학적 활성을 본질적으로 유지한다. 보관 기간은 일반적으로 제형의 의도된 저장수명에 기초하여 선택된다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석적 기술이 당해 기술에서 이용가능하며, 예를 들면 하기 문헌에서 검토된다: Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.,Pubs.(1991) and Jones, A. Adv . Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). 안정성은 선택된 기간 동안 선택된 온도에서 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 제형은 약 40 ℃에서 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 28일 이상 동안 안정하다. 특정 구현예에서, 제형은 약 40 ℃에서 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 이상 동안 안정하다. 특정 구현예에서, 제형은 적어도 약 25ºC에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24개월 이상 동안 안정하다. 특정 구현예에서, 제형은 약 5ºC에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 개월 이상 동안 안정하다. 특정 구현예에서, 제형은 약 -20 ℃에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48개월 이상 동안 안정하다. 특정 구현예에서, 제형은 5ºC 또는 -20 ℃에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48개월 동안 안정하다. 더욱이, 제형은 바람직하게는 제형의 동결 (예를 들면, -20 ℃, -40 ℃ 또는 -70 ℃로) 및 해동 후, 예를 들면 동결 및 해동의 1, 2 3, 4, 또는 5 사이클 후 안정하다. 안정성은 응집물 형성의 평가 (예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여, 탁도를 측정함으로써, 및/또는 육안 검사에 의해); 양이온 교환 크로마토그래피, 이미지 모세관 등전점 포커싱 (icIEF) 또는 모세관 구역 전기영동을 이용하여 전하 이종성을 평가함으로써; 아미노-말단 또는 카복시-말단 서열 분석; 질량 분광분석 분석; 감소된 온전한 항체를 비교하는 SDS-PAGE 분석; 펩타이드 맵 (예를 들면 트립신 또는 LYS-C) 분석; 항체의 생물학적 활성 또는 항원 결합 기능을 평가하는 것; 등을 포함하는 다양한 상이한 방식으로 정성적으로 및/또는 정량적으로 평가될 수 있다. 불안정성은 하기 중 어느 하나 이상을 수반할 수 있다: 응집, 탈아미드화 (예를 들면Asn 탈아미드화), 산화 (예를 들면Met 산화), 이성질체화 (예를 들면Asp 이성질체화), 클리핑/가수분해/단편화 (예를 들면 힌지 영역 단편화), 석신이미드 형성, 쌍을 형성하지 않은 시스테인(들), N-말단 연장, C-말단 처리, 당화 차이, 등.
단백질이 색 및/또는 투명도의 육안 조사시, 또는 UV 광 산란에 의해 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된 바와 같이, 응집, 침전 및/또는 변성의 징후를 나타내지 않거나 거의 나타내지 않으면, 단백질은 약제학적 제형에서 "그의 물리적 안정성을 유지한다".
주어진 시간에서의 화학적 안정성이 단백질이 아래에서 정의된 바와 같이 그의 생물학적 활성을 여전히 유지하는 것으로 여겨지는 정도이면, 단백질은 약제학적 제형에서 "그의 화학적 안정성을 유지한다". 화학적 안정성은 단백질의 화학적으로 변경된 형태를 검출하고 정량화함으로써 평가될 수 있다. 화학적 변경은, 예를 들면 크기 배제 크로마토그래피, SDS-PAGE 및/또는 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화/비행시간형 질량 분광분석법 (MALDI/TOF MS)을 이용하여 평가될 수 있는 크기 변형 (예를 들면 클리핑)을 포함할 수 있다. 화학적 변경의 다른 유형은, 예를 들면 이온교환 크로마토그래피 또는 icIEF에 의해 평가될 수 있는 전하 변경 (예를 들면 탈아미드화의 결과로서 발생하는)을 포함한다.
주어진 시간에서의 항체의 생물학적 활성이, 예를 들면 항원 결합 분석에서 결정된 바와 같이, 약제학적 제형이 제조될 때 나타낸 생물학적 활성의 약 10% (분석의 오차 이내) 이내이면, 항체는 약제학적 제형에서 "그의 생물학적 활성을 유지한다". 항체에 대한 다른 "생물학적 활성" 분석이 본원의 하기에 상세히 설명된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단클론성 항체의 "생물학적 활성"은 항체가 항원에 결합하는 능력을 지칭한다. 그것은 항체의 항원에의 결합 및 시험관내 또는 생체내에서 측정될 수 있는 측정가능한 생물학적 반응을 야기하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 활성은 길항적 또는 작용적일 수 있다.
본원에서 "탈아미드화된" 단클론성 항체는 이의 하나 이상의 아스파라긴 잔기가, 예를 들면 아스파르트산 또는 이소-아스파르트산으로 유도체화된 항체이다.
"탈아미드화에 민감한" 항체는 탈아미드화하는 경향이 있는 것으로 확인된 하나 이상의 잔기를 포함하는 항체이다.
"응집에 민감한" 항체는, 특히 동결 및/또는 진탕시, 다른 항체 분자(들)과 응집하는 것으로 확인된 항체이다.
"단편화에 민감한" 항체는, 예를 들면 이의 힌지 영역에서, 2 이상의 단편으로 절단되는 것으로 확인된 항체이다
"탈아미드화, 응집, 또는 단편화를 감소시키는 것"은 상이한 제형으로 제형화된 항체와 비교하여 탈아미드화, 응집, 또는 단편화의 양을 막거나 감소시키고자 하는 것이다.
제형화된 항체는 바람직하게는 본질적으로 순수하고 바람직하게는 본질적으로 균질(예를 들면, 오염 단백질 등이 없음)하다. "본질적으로 순수한" 항체는 조성물의 총 중량을 기준으로, 적어도 약 90중량 %, 바람직하게는 적어도 약 95중량 %의 항체를 포함하는 조성물을 의미한다. "본질적으로 균질한" 항체는 조성물의 총 중량을 기준으로, 적어도 약 99중량 %의 항체를 포함하는 조성물을 의미한다.
"등장성"은 관심있는 제형이 인간 혈액과 본질적으로 동일한 삼투압을 갖는다는 것을 의미한다. 등장성 제형은 일반적으로 삼투압 약 250 내지 350 mOsm을 가질 것이다. 등장성은, 예를 들면 증기압 또는 얼음-동결형 삼투압계를 이용하여 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 제형은 약 240 mOsm/kg을 초과하는 오스몰농도를 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "버퍼"는 그의 산-염기 접합체 성분의 작용에 의해 pH 변화를 저항하는 완충된 용액을 지칭한다. 본 발명의 버퍼는 바람직하게는 약 4.5 내지 약 7.0, 바람직하게는 약 5.6 내지 약 7.0, 예를 들면 5.6 내지 6.9, 5.7 내지 6.8, 5.8 내지 6.7, 5.9 내지 6.6, 5.9 내지 6.5, 6.0, 6.0 내지 6.4, 또는 6.1 내지 6.3 범위의 pH를 갖는다. 일 구현예에서 버퍼는 pH 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 또는 7.0을 갖는다. 예를 들면, 인산나트륨은 pH를 이 범위로 제어할 버퍼의 예이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "계면활성제"는 표면활성제, 바람직하게는 비이온성 계면활성제를 지칭한다. 본원의 계면활성제의 예는 폴리소르베이트 (예를 들면, 폴리소르베이트 20 및, 폴리소르베이트 80); 폴록사머 (예를 들면 폴록사머 188); 트리톤; 나트륨 도데실 설페이트 (SDS); 나트륨 라우릴 설페이트; 나트륨 옥틸 글리코사이드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-설포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미토프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인 (예를 들면 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미토프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 나트륨 메틸 코코일-, 또는 디나트륨 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQUATTM 시리즈 (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.); 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 공중합체 (예를 들면플루로닉스, PF68 등); 등을 포함한다일 구현예에서, 본원의 계면활성제는 폴리소르베이트 20이다.
약리학적 관점에서, 본 발명의 맥락에서, 항체의 "치료적 유효량"은 항체가 효과적인 치료를 위한 장애의 예방 또는 치료에 효과적인 양을 지칭한다. "장애"는 항체 치료로부터 유익할 임의의 병태이다. 이것은 포유동물을 문제되는 장애에 취약하게 만드는 병태를 포함하는 만성적 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다.
"보존제"는 내부 박테리아 작용을 본질적으로 감소시켜, 예를 들면 다용도 제형의 생산을 용이하게 하기 위해, 제형에 선택적으로 포함될 수 있는 화합물이다. 잠재적인 보존제의 예는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드 (알킬기가 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물), 및 벤즈에토늄 클로라이드를 포함한다. 보존제의 다른 유형은 방향족 알코올, 예컨대 페놀, 부틸 및 벤질 알코올, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥산올, 3-펜타놀, 및 m-크레졸을 포함한다. 일 구현예에서, 본원의 보존제는 벤질 알코올이다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "VEGF" 또는 "VEGF-A"는 하기 문헌에 기재된 바와 같이, 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자 및 관련된 121-, 189-, 및 206-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자 (이의 자연발생 대립 형태 및 가공된 형태와 함께)를 지칭한다: Leung 등(1989) Science 246: 1306, 및 Houck 등(1991) Mol . Endocrin 5: 1806. 용어 "VEGF"는 또한 마우스, 랫트 또는 영장류와 같은 비-인간 종으로부터의 VEGF를 지칭한다. 때때로 특정 종으로부터의 VEGF는 인간 VEGF의 경우 hVEGF, 쥣과 VEGF의 경우 mVEGF 등과 같은 용어로 표시된다. 용어 "VEGF"는 또한 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자의 아미노산 8 내지 109 또는 1 내지 109를 포함하는 절단된 형태의 폴리펩타이드를 지칭하기 위해 사용된다. 임의의 상기 형태의 VEGF의 언급은, 예를 들면, "VEGF (8-109), " "VEGF (1-109)" 또는 "VEGF165"에 의해 본원에서 확인될 수 있다. "절단된" 천연 VEGF에 대한 아미노산 위치는 천연 VEGF 서열에서 표시된 바와 같이 번호가 매겨진다. 예를 들면, 절단된 천연 VEGF에서의 아미노산 위치 17 (메티오닌)은 천연 VEGF에서 위치 17 (메티오닌)이다. 절단된 천연 VEGF는 천연 VEGF와 대등한 KDR 및 Flt-1 수용체에 대한 결합 친화도를 갖는다.
"VEGF 생물학적 활성"은 하기를 포함한다: 정상 및 비정상 혈관신생 및 맥관형성 모두의 조절과 같은 임의의 VEGF 수용체 또는 임의의 VEGF 신호전달 활성에 결합하는 것 (Ferrara 및 Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18: 4-25; Ferrara (1999) J. Mol. Med . 77: 527-543)); 배아 맥관형성 및 혈관신생을 촉진하는 것 (Carmeliet 등(1996) Nature 380: 435-439; Ferrara 등(1996) Nature 380: 439-442); 및 여성 생식기에서 그리고 골 성장 및 연골 형성을 위해 주기적인 혈관증식을 조절하는 것 (Ferrara 등(1998) Nature Med . 4: 336-340; Gerber 등(1999) Nature Med . 5: 623-628). 혈관신생 및 맥관형성에서 혈관신생 인자인 것 외에도, 다면발현성 성장 인자로서 VEGF는 내피 세포 생존, 혈관 투과성 및 혈관확장, 단핵구 화학주성 및 칼슘 유입과 같이, 다른 생리적 과정에서 다수의 생물학적 효과를 나타낸다 (전술한 Ferrara 및 Davis-Smyth (1997), 및 Cebe-Suarez 등 Cell. Mol . Life Sci . 63: 601-615 (2006)). 또한, 최근 연구는 몇 가지 비-내피 세포 유형, 예컨대 망막 색소 상피 세포, 췌관 세포, 및 슈반 세포에 대한 VEGF의 유사분열 효과를 보고하였다. Guerrin 등(1995) J. Cell Physiol . 164: 385-394; Oberg-Welsh 등(1997) Mol . Cell. Endocrinol . 126: 125-132; Sondell 등(1999) J. NeuroSci. 19: 5731-5740.
"VEGF 길항제" 또는 "VEGF-특이적 길항제"는 VEGF에 결합할 수 있고, VEGF 발현 수준을 감소시킬 수 있거나, 또는 비제한적으로 하나 이상의 VEGF 수용체에 대한 VEGF 결합 및 VEGF 매개된 혈관신생 및 내피 세포 생존 또는 증식을 포함하는 VEGF 생물학적 활성을 중화, 차단, 억제, 폐지, 감소, 또는 방해할 수 있는 분자를 지칭한다. 본 발명의 방법에서 유용한 VEGF-특이적 길항제로서 VEGF, 항-VEGF 항체 및 이의 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드, VEGF에 특이적으로 결합하여 하나 이상의 수용체, 융합 단백질 (예를 들면, VEGF-Trap (Regeneron)), 및 VEGF121-젤로닌 (Peregrine)에 대한 그의 결합을 격리하는 수용체 분자 및 유도체가 포함된다. VEGF-특이적 길항제는 또한 VEGF 폴리펩타이드의 길항제 변이체, VEGF에 대한 안티센스 핵염기 올리고머, VEGF에 대한 작은 RNA 분자, RNA 압타머, 펩티바디, 및 VEGF에 대한 리보자임을 포함한다. VEGF-특이적 길항제는 또한 VEGF에 결합하고 VEGF 생물학적 활성을 차단, 억제, 폐지, 감소, 또는 방해할 수 있는 비펩타이드 소분자를 포함한다. 따라서, 용어 "VEGF 활성"은 특히 VEGF의 VEGF 매개된 생물학적 활성을 포함한다. 특정 구현예에서, VEGF 길항제는 VEGF의 발현 수준 또는 생물학적 활성을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 감소시키거나 억제한다.
"항-VEGF 항체"는 충분한 친화도 및 특이성으로 VEGF에 결합하는 항체이다. 특정 구현예에서, 선택된 항체는 일반적으로 VEGF에 대해 충분한 결합 친화도를 가질 것이며, 예를 들면, 항체는 100 nM-1 pM 사이의 Kd 값으로 hVEGF에 결합할 수 있다. 항체 친화도는 하기에 의해 결정될 수 있다: 예를 들면 표면 플라즈몬 공명 기반 분석 (예컨대 PCT 출원 공개 제WO2005/012359호에 기재된 바와 같은 BIAcore 분석); 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA); 및 경쟁 분석 (예를 들면RIA)에 의해 결정될 수 있다.
특정 구현예에서, 항-VEGF 항체는 VEGF 활성이 관여된 질환 또는 병태를 표적화하고 방해하는 치료제로서 사용될 수 있다. 또한, 항체는, 예를 들면, 치료제로서 그의 유효성을 평가하기 위해 다른 생물학적 활성 분석이 수행될 수 있다. 그러한 분석은 당해 기술에 공지되어 있고 항체에 대한 표적 항원 및 의도한 용도에 좌우된다. 그 예는 HUVEC 억제 분석; 종양 세포 성장 억제 분석 (예를 들면, WO 제89/06692호에 기재된 바와 같음); 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 및 보체-매개된 세포독성 (CDC) 분석 (U.S. 특허 제5,500,362호); 및 작용적 활성 또는 조혈 분석 (WO 제95/27062호 참고)을 포함한다. 항-VEGF 항체는 일반적으로 VEGF-B 또는 VEGF-C와 같은 다른 VEGF 동족체, 또는 P1GF, PDGF 또는 bFGF와 같은 다른 성장 인자에 결합하지 않을 것이다. 일 구현예에서, 항-VEGF 항체는 하이브리도마 ATCC HB 10709에 의해 생산된 단클론성 항-VEGF 항체 A4.6.1과 동일한 에피토프에 결합하는 단클론성 항체이다. 또 다른 구현예에서, 항-VEGF 항체는 하기 문헌에 따라 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 단클론성 항체이다: Presta 등(1997) Cancer Res. 57: 4593-4599 (비제한적으로 베바시주맙 (BV; 아바스틴®으로서 공지된 항체를 포함함).
"rhuMAb VEGF" 또는 "AVASTIN®"로도 공지된 항-VEGF 항체 "베바시주맙 (BV)"은 하기 문헌에 따라 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 단클론성 항체이다: Presta 등(1997) Cancer Res.57: 4593-4599. 그것은 돌연변이된 인간 IgG1 프레임워크 영역 및 인간 VEGF가 그의 수용체에 결합하는 것을 차단하는 쥣과 항-hVEGF 단클론성 항체 A.4.6.1로부터의 항원-결합 상보성-결정 영역을 포함한다. 대부분의 프레임워크 영역을 포함하는, 베바시주맙의 아미노산 서열의 대략 93%는 인간 IgG1로부터 유래되고, 상기 서열의 약 7%는 쥣과 항체 A4.6.1로부터 유래된다. 베바시주맙은 약 149,000 달톤의 분자량을 가지며, 당화된다. 베바시주맙 및 다른 인간화된 항-VEGF 항체는 U.S. 특허 제6,884,879호 (2005년 2월 26일에 발행됨)에 추가로 기재되어 있고, 그 전체 개시내용은 본원에 참고로 명확히 편입되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "B20 시리즈 폴리펩타이드"는 VEGF에 결합하는 항체를 포함하는 폴레펩타이드를 지칭한다. B20 시리즈 폴리펩타이드는, 비제한적으로, B20 항체의 서열로부터 유래된 항체 또는 하기에 기재된 B20 유래의 항체를 포함한다: US 공개 제20060280747호, US 공개 제20070141065호 및/또는 US 공개 제20070020267호 (이들 특허 출원의 내용은 참고로 본원에 명확히 편입되어 있음). 일 구현예에서, B20 시리즈 폴리펩타이드는 하기에 기재된 바와 같은 B20-4.1이다: US 공개 제20060280747호, US 공개 제20070141065호 및/또는 US 공개 제20070020267호. 또 다른 구현예에서, B20 시리즈 폴리펩타이드는 하기에 기재된 B20-4.1.1이다: U.S. 특허 제7,910,098호 (그 전체 개시내용이 본원에 참고로 명확히 편입되어 있음).
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "G6 시리즈 폴리펩타이드"는 VEGF에 결합하는 항체를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. G6 시리즈 폴리펩타이드는, 비제한적으로, G6 항체의 서열로부터 유래된 항체 또는 하기에 기재된 G6 유래의 항체를 포함한다: US 공개 제20060280747호, US 공개 제20070141065호 및/또는 US 공개 제20070020267호.G6 시리즈 폴리펩타이드, 하기에서 기재됨: US 공개 제20060280747호, US 공개 제20070141065호 및/또는 US 공개 제20070020267호는, 비제한적으로, G6-8, G6-23 및 G6-31을 포함한다.
추가의 항체를 위해, 하기를 참고한다: U.S. 특허 제7,060,269호, 제6,582,959호, 제6,703,020호; 제6,054,297호; WO 제98/45332호; WO 제96/30046호; WO 제94/10202호; EP 제0666868호B1; U.S. 특허 출원 공개 제2006009360호, 제20050186208호, 제20030206899호, 제20030190317호, 제20030203409호, 및 제20050112126호; 및 Popkov 등, Journal of Immunological Methods 288: 149-164 (2004). 특정 구현예에서, 다른 항체는 잔기 F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, I91, K101, E103, 및 C104를 포함하거나, 대안적으로, 잔기 F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 및 Q89를 포함하는 인간 VEGF 상의 기능적 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
다른 항-VEGF 항체가 또한 공지되어 있으며, 이는 예를 들면, 하기에 기재되어 있다: Liang 등, J Biol Chem 281, 951-961 (2006).
본원에서 사용된 바와 같이 “CD20”은 인간 B-림프구 항원 CD20 (CD20, B-림프구 표면 항원 B1, Leu-16, Bp35, BM5, 및 LF5로도 공지됨; SwissProt 데이터베이스 입력 P11836을 특징으로 하는 서열)이 전구-B 및 성숙한 B 림프구 상에 위치한 약 35 kD의 분자량을 갖는 소수성 막통과 단백질임을 지칭한다. (Valentine, M.A., 등, J. Biol. Chem.264(19) (1989 11282-11287; Tedder, T.F., 등, Proc. Natl. Acad . Sci . U. S. A. 85 (1988) 208-12; Stamenkovic, I., 등, J.Exp.Med.167 (1988) 1975-80; Einfeld, D.A., 등, EMBO J.7 (1988) 711-7; Tedder, T.F., 등, J. Immunol. 142 (1989) 2560-8). 상응하는 인간 유전자는 MS4A1로도 공지된 막-스패닝 4-도메인, 서브패밀리 A, 구성원 1이다. 이 유전자는 막-스패닝 4A 유전자 패밀리의 구성원을 인코딩한다. 이 초기 (nascent) 단백질 패밀리의 구성원은 공통의 구조적 특징 및 유사한 인트론/엑손 스플라이스 경계를 특징으로 하며 조혈 세포와 비림프양 조직 간에 독특한 발현 패턴을 나타낸다. 이 유전자는 B-세포를 형질 세포로 발달시키고 분화시키는 역할을 하는 B-림프구 표면 분자를 인코딩한다. 이 패밀리 구성원은 패밀리 구성원의 클러스터 중 11q12에 국재화된다. 이 유전자의 선택적 스플라이싱 (alternative splicing)은 동일한 단백질을 인코딩하는 2개의 전사 변이체를 야기한다.
용어 "CD20" 및 "CD20 항원"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 세포에 의해 자연적으로 발현되거나 CD20 유전자로 형질감염된 세포 상에서 발현되는 임의의 변이체, 동형체 및 종 동족체를 포함한다. 본 발명의 항체와 CD20 항원과의 결합은 CD20을 불활성화시킴으로써 CD20을 발현하는 세포 (예를 들면, 종양 세포)의 사멸을 매개한다. CD20을 발현하는 세포의 사멸은 하기 기전 중 하나 이상에 의해 일어날 수 있다: 세포 사멸/세포자멸사 유도, ADCC 및 CDC.
당해 기술분야에서 인정되는 CD20의 동의어는 B-림프구 항원 CD20, B-림프구 표면 항원 B1, Leu-16, Bp35, BM5, 및 LF5를 포함한다.
본 발명에 따른 용어 “항-CD20 항체”는 CD20 항원에 특이적으로 결합하는 항체이다. CD20 항원에 대한 항-CD20 항체의 결합 특성 및 생물학적 활성에 좌우되어, 2가지 유형의 항-CD20 항체 (유형 I 및 유형 II 항-CD20 항체)가 하기 문헌에 따라 구별될 수 있다: Cragg, M.S., 등, Blood 103 (2004) 2738-2743; 및 Cragg, M.S., 등, Blood 101 (2003) 1045-1052 (표 1 참고).
표 1: 유형 I 및 유형 II 항-CD20 항체의 특성
Figure pct00001
유형 II 항-CD20 항체의 예는, 예를 들면 인간화 B-Ly1 항체 IgG1 (WO 제2005/044859호에 개시된 바와 같은 키메라성 인간화 IgG1 항체), 11B8 IgG1 (WO 제2004/035607호에 개시된 바와 같음), 및 AT80 IgG1을 포함한다. 전형적으로 IgG1 아이소타입의 유형 II 항-CD20 항체는 특징적인 CDC 특성을 나타낸다. 유형 II 항-CD20 항체는 IgG1 아이소타입의 유형 I 항체와 비교하여 감소된 CDC 를 갖는다 (IgG1 아이소타입인 경우).
유형 I 항-CD20 항체의 예는, 예를 들면 리툭시맙, HI47 IgG3 (ECACC, 하이브리도마), 2C6 IgG1 (WO 제2005/103081호에 개시된 바와 같음), 2F2 IgG1 (WO 제2004/035607호 및 WO 제2005/103081호에 개시된 바와 같음) 및 2H7 IgG1 (WO 제2004/056312호에 개시된 바와 같음)을 포함한다.
본 발명에 따른 탈푸코실화된 항-CD20 항체는 바람직하게는 유형 II 항-CD20 항체, 더 바람직하게는 WO 제2005/044859호 및 WO 제2007/031875호에 기재된 바와 같은 탈푸코실화된 인간화 B-Ly1 항체이다.
“리툭시맙” 항체 (참조 항체; 유형 I 항-CD20 항체의 예)는 인간 CD20 항원에 대항하는, 유전적으로 조작된 키메라성 인간 감마 1 쥣과 불변 도메인을 함유하는 단클론성 항체이다. 그러나 이 항체는 당조작되지 않고 탈푸코실화되지 않으므로, 적어도 85 %의 푸코스 양을 갖는다. 이 키메라성 항체는 인간 감마 1 불변 도메인을 함유하고 IDEC 제약사에게 양도된, 1998년 4월 17일에 발행된 US 제5,736,137호 (Andersen, 등)에서 명칭 “C2B8"로 확인된다. 리툭시맙은 재발하거나 난치성의 저등급 또는 여포성, CD20 양성, B 세포 비-호지킨 림프종 환자의 치료용으로 승인되어 있다. 시험관내 작용 기전 연구는 리툭시맙이 인간 보체-의존적 세포독성 (CDC)을 나타낸다는 것을 보여왔다 (Reff, M.E., et. al, Blood 83(2) (1994) 435-445). 또한, 그것은 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 측정하는 분석에서 활성을 나타낸다.
용어 “인간화 B-Ly1 항체”는 IgG1으로부터의 인간 불변 도메인을 이용항 키메라화 및 이후의 인간화 (WO 제2005/044859호 및 WO 제2007/031875호 참고)에 의해 쥣과 단클론성 항-CD20 항체 B-Ly1로부터 수득된, WO 제2005/044859호 및 WO 제2007/031875호에 개시된 바와 같은 인간화 B-Ly1 항체를 지칭한다 (쥣과 중쇄 (VH)의 가변 영역: 서열번호: 1; 쥣과 경쇄 (VL)의 가변 영역: 서열번호: 2- Poppema, S. 및 Visser, L., Biotest Bulletin 3 (1987) 131-139 참고). 이들 “인간화 B-Ly1 항체”는 WO 제2005/044859호 및 WO 제2007/031875호에 상세히 개시되어 있다.
일 구현예에서, “인간화 B-Ly1 항체”는 서열번호3 내지 서열번호19 (WO 제2005/044859호 및 WO 제2007/031875호의 B-HH2 내지 B-HH9 및 B-HL8 내지 B-HL17)의 군으로부터 선택된 중쇄 (VH)의 가변 영역을 갖는다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 가변 도메인은 서열번호3, 4, 7, 9, 11, 13 및 15 (WO 제2005/044859호 및 WO 제2007/031875호의 B-HH2, BHH-3, B-HH6, B-HH8, B-HL8, B-HL11 및 B-HL13)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 특정 구현예에서, “인간화 B-Ly1 항체”는 서열번호20 (WO 제2005/044859호 및 WO 제2007/031875호의 B-KV1)의 경쇄 (VL)의 가변 영역을 갖는다. 하나의 특정 구현예에서, “인간화 B-Ly1 항체”는 서열번호7 (WO 제2005/044859호 및 WO 제2007/031875호의 B-HH6)의 중쇄 (VH)의 가변 영역 및 서열번호20 (WO 제2005/044859호 및 WO 제2007/031875호의 B-KV1)의 경쇄 (VL)의 가변 영역을 갖는다. 더욱이, 일 구현예에서, 인간화 B-Ly1 항체는 IgG1 항체이다. 본 발명에 따르면 상기 탈푸코실화된 인간화 B-Ly1 항체는 하기에 기재된 절차에 따라 Fc 영역에서 당조작된다 (GE): WO 제2005/044859호, WO 제2004/065540호, WO 제2007/031875호, Umana, P. 등, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 및 WO 제99/154342호.일 구현예에서, 탈푸코실화된 당조작된 인간화 B-Ly1은 B-HH6-B-KV1 GE이다. 일 구현예에서, 항-CD20 항체는 오비누투주맙이다 (권고된 INN, WHO Drug Information, Vol. 26, No.4, 2012, p.453). 본원에서 사용된 바와 같이, 오비누투주맙은 GA101 또는 RO5072759와 동의어이다. 이는 모든 이전의 버전 (예를 들면Vol. 25, No.1, 2011, p.75-76)을 대체하며, 이전에는 아푸투무맙으로 공지되어 있다 (권고된 INN, WHO Drug Information, Vol. 23, No.2, 2009, p. 176; Vol. 22, No. 2, 2008, p. 124). 일부 구현예에서, 인간화 B-Ly1 항체는 서열번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체이다. 일부 구현예에서, 인간화 B-Ly1 항체는 서열번호: 21의 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 22의 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
중쇄 (서열번호: 21)
Figure pct00002
경쇄 (서열번호: 22)
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일부 구현예에서, 인간화 B-Ly1 항체는 탈푸코실화된 당조작된 인간화된 B-Ly1이다. 이러한 당조작된 인간화 B-Ly1 항체는 Fc 영역에서 당화의 변경된 패턴을 가지며, 바람직하게는 감소된 수준의 푸코스 잔기를 갖는다. 바람직하게는 푸코스의 양은 Asn297에서 올리고당의 총량의 60% 이하이다 (일 구현예에서 푸코스의 양은 40 % 내지 60 %이고, 또 다른 구현예에서 푸코스의 양은 50 % 이하이며, 또 다른 구현예에서 푸코스의 양은 30 % 이하임). 더욱이, Fc 영역의 올리고당은 바람직하게는 이등분된다. 이러한 당조작된 인간화 B-Ly1 항체는 증가된 ADCC를 갖는다.
올리고당 성분은 물리적 안정성, 프로테아제 공격에 대한 내성, 면역계와의 상호작용, 약동학, 및 특정 생물학적 활성을 포함하는 치료용 당단백질의 효능과 관련된 특성에 유의미하게 영향을 미칠 수 있다. 그러한 특성은 올리고당의 존재 또는 부재뿐만 아니라 올리고당의 특정 구조에 의존할 수 있다. 올리고당 구조와 당단백질 기능 사이에 일부 일반화가 이뤄질 수 있다. 예를 들면, 특정 올리고당 구조는 특정 탄수화물 결합 단백질과의 상호작용을 통해 혈류에서 당단백질의 신속한 제거를 매개하는 반면, 다른 것은 항체에 의해 결합되어 원치않는 면역 반응을 유발할 수 있다. (Jenkins, N., 등, Nature Biotechnol.14 (1996) 975-81).
포유동물 세포는 단백질을 인간 적용을 위한 가장 양립가능한 형태로 당화하는 능력 때문에 치료용 당단백질의 생산을 위한 바람직한 숙주이다. (Cumming, D.A., 등, Glycobiology 1 (1991) 115-30; Jenkins, N., 등, Nature Biotechnol . 14 (1996) 975-81). 박테리아는 단백질을 매우 드물게 당화하며, 효모, 사상균, 곤충 및 식물 세포와 같은 다른 유형의 일반적인 숙주와 마찬가지로, 혈류로부터의 신속한 제거, 바람직하지 않은 면역 상호작용, 및 일부 특정한 경우, 감소된 생물학적 활성과 연과된 당화 패턴을 생성한다 포유동물 세포 중에서, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포가 최근 20년 동안 가장 흔하게 사용되어 왔다. 적합한 당화 패턴을 제공하는 것 외에도, 이들 세포는 유전적으로 안정하고 매우 생산적인 클론 세포주의 일관된 생성을 가능하게 한다. 이들은 무혈청 배지를 사용하여 간단한 생물반응기에서 고밀도로 배양될 수 있고, 안전하고 재생가능한 생물공정의 개발을 가능하게 한다. 다른 통상적으로 사용되는 동물 세포는 어린 햄스터 신장 (BHK) 세포, NSO- 및 SP2/0-마우스 골수종 세포를 포함한다. 보다 최근에는, 형질전환 동물로부터의 생산이 또한 시험되어 왔다. (Jenkins, N., 등, Nature Biotechnol .14 (1996) 975-981).
모든 항체는 중쇄 불변 영역 내의 보존된 위치에 탄수화물 구조를 함유하고, 각 아이소타입은 단백질 어셈블리, 분비 또는 기능적 활성에 다양하게 영향을 미치는 N-연결된 탄수화물 구조의 별개의 배열을 보유한다. (Wright, A., and Morrison, S.L., Trends Biotech. 15 (1997) 26-32). 부착된 N-연결된 탄수화물의 구조는 가공 정도에 따라 상당히 다양하며, 고-만노스, 다중-분지형 뿐만 아니라 바이안테너리 (biantennary) 복합 올리고당을 포함할 수 있다. (Wright, A., and Morrison, S.L., Trends Biotech. 15 (1997) 26-32). 전형적으로, 특정 당화 부위에 부착된 코어 올리고당 구조의 이종 가공이 있어서 단클론성 항체조차도 다중 글리코형으로 존재한다. 마찬가지로, 항체 당화의 주요 차이가 세포주 간에서 발생하고, 훨씬 사소한 차이가 상이한 배양 조건 하에 성장한 주어진 세포에서 보여지는 것으로 나타났다. (Lifely, M.R., 등, Glycobiology 5(8) (1995) 813-22).
간단한 생산 공정을 유지하고 유의미한 바람직하지 않은 부작용을 잠재적으로 피하면서 효능을 크게 증가시키는 한 가지 방법은, 하기 문헌에 기재된 바와 같이 그의 올리고당 성분을 조작함으로써 단클론성 항체의 천연, 세포-매개된 효과기 기능을 향상시키는 것이다: Umana, P., 등, Nature Biotechnol .17 (1999) 176-180 및 US 제6,602,684호.암 면역요법에서 가장 일반적으로 사용되는 항체인 IgG1 유형 항체는, 각 CH2 도메인 내의 Asn297에 보존된 N-연결된 당화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297에 부착된 2개의 복합 바이안테너리 올리고당은 CH2 도메인 사이에 묻혀 있어서, 폴리펩타이드 골격과의 광범위한 접촉을 형성하며, 그들의 존재는 항체가 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)과 같은 효과기 기능을 매개하는데 필수적이다 (Lifely, M.R., 등, Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R., 등, Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A., 및 Morrison, S.L., Trends Biotechnol.15 (1997) 26-32).
앞서, 이등분된 올리고당의 형성을 촉매하는 글리코실전달효소인 ß(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐전달효소 I11 ("GnTII17y)의 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서의 과발현은 조작된 CHO 세포에 의해 생산된 항신경교세포종 키메라성 단클론성 항체 (chCE7)의 시험관내 ADCC 활성을 유의미하게 증가시키는 것으로 나타났다. (Umana, P., 등, Nature Biotechnol . 17 (1999) 176-180; 및 WO 제99/154342호 참고, 이들의 전체 내용은 본원에 참고로 편입됨). 항체 chCE7은 높은 종양 친화도 및 특이성을 갖는 비접합된 단클론성 항체의 큰 부류에 속하지만, GnTIII 효소가 결여된 표준 산업 세포주에서 생산될 때 임상적으로 유용한 효력이 거의 없다 (Umana, P., 등, Nature Biotechnol . 17 (1999) 176-180). 상기 연구는 항체 생산 세포를 GnTIII을 발현하도록 조작함으로써 ADCC 활성의 큰 증가가 얻어질 수 있음을 최초로 보여주었고, 이는 또한 자연 발생 항체에서 발견되는 수준을 초과하는, 이등분된 비-푸코실화된 올리고당을 포함하는 불변 영역 (Fc)-관련된, 이등분된 올리고당의 비율 증가를 야기하였다.
“치료”는 치료적 처치 및 예방 또는 방지적 조치를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 대상은 이미 장애가 있는 대상뿐만 아니라 장애가 예방되어야 하는 대상을 포함한다.
"장애"는 포유동물이 문제되는 장애에 취약하게 하는 병리학적 상태를 포함하는 만성적 및 급성 장애 또는 질환을 비제한적으로 포함하는, 치료로부터 유익할 임의의 병태이다. 장애는 혈관신생 장애를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이 "혈관신생 장애"는 비정상적인 혈관신생 또는 비정상적인 혈관 투과성 또는 누출을 수반하는 임의의 병태를 지칭한다. 본원에서 치료될 혈관신생 장애의 비-제한적인 예는 악성 및 양성 종양; 비-백혈병 및 림프양 악성종양; 및, 특히, 종양 (암) 전이를 포함한다.
"비정상적 혈관신생"은 새로운 혈관이 질환 상태에서 또는 질환 상태를 유발할 정도로 과도하게 또는 부적절하게 (예를 들면, 혈관신생의 위치, 타이밍, 정도, 또는 발병이 의학적 관점에서 바람직하지 않음) 성장할 때 발생한다. 일부 경우에서, 과도하거나, 제어되지 않거나, 또는 부적절한 혈관신생은 질환 상태의 악화 또는 질환 상태의 유발에 기여하는 새로운 혈관 성장이 있을 때 발생한다. 새로운 혈관은 병든 조직에 영양을 공급하고, 정상 조직을 파괴할 수 있으며, 암의 경우에, 새로운 혈관은 종양 세포가 순환으로 빠져 나가 다른 기관에 머무르게 할 수 있다 (종양 전이). 비정상 혈관신생을 포함하는 장애의 예는, 비제한적으로 암, 특히 혈관화된 고형 종양 및 전이성 종양 (결장, 폐암 (특히 소세포 폐암), 또는 전립선암 포함), 안구 신생혈관에 의해 야기된 질환, 특히 당뇨병성 실명, 망막병증, 주로 당뇨병성 망막병증 또는 연령 관련 황반 변성, 맥락막 신생혈관형성 (CNV), 당뇨병성 황반 부종, 병리적 근시, 폰 히펠-린다우병, 눈의 히스토플라스마증, 중심 망막 정맥 폐색 (CRVO), 각막 신생혈관형성, 망막 신생혈관형성 및 조홍; 건선, 건선성 관절염, 혈관종과 같은 혈관모세포종; 염증성 신장 질환, 예컨대 사구체신염, 특히 메산지움 증식성 사구체신염, 용혈성 요독증증후군, 당뇨병성 신병증 또는 고혈압 신장경화증; 다양한 염증성 질환, 예컨대 관절염, 특히 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 건선, 유육종증, 동맥 동맥경화증 및 이식 후 발생하는 질환, 자궁내막증 또는 만성 천식 및 다른 병태를 포함한다.
"비정상적 혈관 투과성"은 혈관 및 혈관외 구획 사이의 체액, 분자 (예를 들면, 이온 및 영양소) 및 세포 (예를 들면, 림프구)의 흐름이 질환 상태에서 또는 질환 상태를 유발할 정도로 과도하거나 부적절 (예를 들면, 혈관 투과성의 위치, 타이밍, 정도, 또는 발병이 의학적 관점에서 바람직하지 않음)할 때 발생한다. 비정상적인 혈관 투과성은 맥관구조를 통해 이온, 물, 영양소, 또는 세포의 과도하거나 부적절한 "누출"을 야기할 수 있다. 일부 경우, 과도하거나, 제어되지 않거나, 또는 부적절한 혈관 투과성 또는 혈관 누출은, 예를 들면, 뇌종양을 포함하는 종양과 관련된 부종; 악성종양과 관련된 복수; 메이그스 증후군; 폐 염증; 신장 증후군; 심낭 삼출; 늑막 삼출; 심근경색증 및 뇌졸중 후의 병태와 같은 심혈관 질환과 관련된 투과성 등을 포함하는 질환 상태를 악화시키거나 유도한다. 본 발명은 비정상적인 혈관 투과성 또는 누출과 관련된 질환 및 장애가 생기거나 생길 위험이 있는 환자를 치료하는 것을 고려한다.
용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 어느 정도의 비정상적인 세포 증식과 관련된 장애를 지칭한다. 일 구현예에서, 세포 증식성 장애는 암이다. 일 구현예에서, 세포 증식성 장애는 종양이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "종양"은 악성 또는 양성이든 간에 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전-암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 본원에서 언급된 바와 같이 상호 배타적이지 않다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리적 상태를 지칭하거나 기술한다. 암의 예는 비제한적으로, 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프양 악성종양을 포함한다. 상기 암의 보다 구체적인 예는, 비제한적으로, 편평 세포 암 (예를 들면, 상피성 편평 세포 암), 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평상피 암종을 포함하는 폐암, 복막의 암, 간세포 암, 위장 암 및 위장 간질 암을 포함하는 위 또는 위암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요로의 암, 간종양, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액샘 암종, 신장 또는 신장 암, 전립선암, 외음부 암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 흑색종, 표재 확장성 흑색종, 악성 흑자 흑색종, 선단 흑자성 흑색종, 결절성 흑색종, 다발성 골수종 및 B-세포 림프종 (저등급/여포성 비-호지킨 림프종 (NHL); 작은 림프구 (SL) NHL; 중간 등급/여포성 NHL; 중간 등급 확산 NHL; 높은 등급 면역아세포성 NHL; 높은 등급 림프아구성 NHL; 높은 등급 작은 비-절단된 세포 NHL; 거대종양 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련된 림프종; 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증 포함); 만성적 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프아구성 백혈병 (모든); 모발 세포 백혈병; 만성적 골수아세포 백혈병; 및 이식후 림프증식성 장애 (PTLD), 뿐만 아니라 모반증, 부종 (예컨대 뇌종양과 관련된 것), 메이그스 증후군, 뇌와 관련된 비정상적 혈관 증식, 뿐만 아니라 두경부 암, 및 관련된 전이를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체에 의해 치료될 수 있는 암은 유방암, 결장직장암, 직장암, 비소세포 폐암, 교모세포종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 신장 세포 암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연조직 육종, 카포시 육종, 카르시노이드 암종, 두경부 암, 난소암, 중피종, 및 다발성 골수종을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 암은 하기로부터 선택된다: 소세포 폐암, 교모세포종, 신경교세포종, 흑색종, 유방 암종, 위암, 결장직장암 (CRC), 및 간세포 암종. 또한, 일부 구현예에서, 상기 암은 하기로부터 선택된다: 비소세포 폐암, 결장직장암, 교모세포종 및 유방 암종 (상기 암의 전이성 형태 포함).
용어 "항암 요법"은 암을 치료하는데 유용한 요법을 지칭한다. 항암 치료제의 예는, 비제한적으로, 예를 들면, 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 요법에 사용되는 제제, 항-혈관형성제, 세포자멸제, 항-튜불린제, 및 암을 치료하기 위한 다른 제제, 예컨대 항-HER-2 항체, 항-CD20 항체, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 길항제 (예를 들면, 티로신 키나제 저해제), HER1/EGFR 저해제 (예를 들면, 에를로티닙 (타르세바TM), 혈소판 유도된 성장 인자 저해제 (예를 들면, 글리벡TM (이마티닙 메실레이트)), COX-2 저해제 (예를 들면, 셀레콕십), 인터페론, 사이토카인, 하기 타겟 ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-베타, BlyS, APRIL, BCMA 또는 VEGF 수용체(들) 중 하나 이상에 결합하는 길항제 (예를 들면, 중화 항체), TRAIL/Apo2, 및 다른 생물활성 및 유기 화학 제제 등을 포함한다. 이들의 조합 역시 본 발명에 포함된다.
"혈관신생 인자 또는 제제"는 혈관의 성장을 자극하는데 관여하는, 예를 들면, 혈관신생, 내피 세포 성장, 혈관의 안정성, 및/또는 맥관형성, 등을 촉진하는 성장 인자 또는 그의 수용체이다. 예를 들면, 혈관신생 인자는, 비제한적으로, 예를 들면, VEGF 및 VEGF 패밀리의 구성원 및 그의 수용체 (VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGFR1, VEGFR2 및 VEGFR3), P1GF, PDGF 패밀리, 섬유아세포 성장 인자 패밀리 (FGF), TIE 리간드 (안지오포이에틴, ANGPT1, ANGPT2), TIE1, TIE2, 에프린, Bv8, 델타-유사 리간드 4 (DLL4), Del-1, 섬유아세포 성장 인자: 산성 (aFGF) 및 염기성 (bFGF), FGF4, FGF9, BMP9, BMP10, 폴리스타틴, 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), GM-CSF, 간세포 성장 인자 (HGF)/산란 인자 (SF), 인터류킨-8 (IL-8), CXCL12, 렙틴, 미드카인, 뉴로필린, NRP1, NRP2, 태반 성장 인자, 혈소판-유도된 내피 세포 성장 인자 (PD-ECGF), 혈소판-유도된 성장 인자, 특히 PDGF-BB, PDGFR-알파, 또는 PDGFR-베타, 플레이오트로핀 (PTN), 프로그라눌린, 프롤리페린, 형질전환 성장 인자-알파 (TGF-알파), 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-베타), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파), Alk1, CXCR4, Notch1, Notch4, Sema3A, Sema3C, Sema3F, Robo4, 등을 포함한다. 그것은 혈관신생을 촉진하는 인자, 예컨대 ESM1 및 퍼레칸을 추가로 포함한다. 그것은 또한 상처 치유를 가속화시키는 인자, 예컨대 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-I (IGF-I), VIGF, 표피 성장 인자 (EGF), EGF-유사 도메인, 다중 7 (EGFL7), CTGF 및 그의 패밀리의 구성원, 및 TGF-알파 및 TGF-베타를 포함할 것이다. 예를 들면, 하기를 참고한다: Klagsbrun and D'Amore (1991) Annu.Rev.Physiol. 53: 217-39; Streit and Detmar (2003) Oncogene 22: 3172-3179; Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12): 1359-1364; Tonini 등(2003) Oncogene 22: 6549-6556 (예를 들면, 공지된 혈관신생 인자를 열거하는 표 1); 및, Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol.8: 200-206을 참고한다.
"항-혈관형성제" 또는 "혈관신생 저해제"는 혈관신생, 맥관형성, 또는 바람직하지 않은 혈관 투과성을 직접 또는 간접적으로 억제하는, 작은 분자량 물질, 폴리뉴클레오타이드 (예를 들면, 억제성 RNA (RNAi 또는 siRNA) 포함), 폴리펩타이드, 단리된 단백질, 재조합 단백질, 항체, 또는 이의 접합체 또는 융합 단백질을 지칭한다. 항-혈관형성제는 혈관신생 인자 또는 그의 수용체에 결합하고 그의 혈관신생 활성을 차단하는 제제들을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 항-혈관형성제는 상기에서 정의된 바와 같은 혈관형성제에 대한 항체 또는 다른 길항제, 예를 들면 VEGF-A 또는 VEGF-A 수용체 (예를 들면, KDR 수용체 또는 Flt-1 수용체)에 대한 항체, 항-PDGFR 저해제, VEGF 수용체 신호전달을 차단하는 소분자 (예를 들면, PTK787/ZK2284, SU6668, SUTENT®/SU11248 (수니티닙 말레이트), AMG706, 또는 예를 들면, 국제 특허 출원 WO 제2004/113304호에 기재된 것)이다. 항-혈관형성제는 비제한적으로, 하기 제제를 포함한다: VEGF 억제제, 예컨대 VEGF-특이적 길항제, EGF 억제제, EGFR 억제제, Erbitux® (세툭시맙, ImClone Systems, Inc., Branchburg, N.J.), Vectibix® (파니투무맙, Amgen, Thousand Oaks, Calif.), TIE2 억제제, IGF1R 억제제, COX-II (사이클로옥시게나제 II) 억제제, MMP-2 (매트릭스-메탈로프로테이나제 2) 억제제, 및 MMP-9 (매트릭스-메탈로프로테이나제 9) 억제제, CP-547,632 (Pfizer Inc., NY, USA), 악시티닙 (Pfizer Inc.;AG-013736), ZD-6474 (AstraZeneca), AEE788 (Novartis), AZD-2171), VEGF Trap (Regeneron/Aventis), 바탈라닙 (PTK-787, ZK-222584로도 공지됨: Novartis & Schering A G), 마쿠젠 (페갑타닙 옥타소디움, NX-1838, EYE-001, Pfizer Inc./Gilead/Eyetech), IM862 (Cytran Inc. of Kirkland, Wash.,USA); 및 Ribozyme (Boulder, Colo.) 및 Chiron (Emeryville, Calif.)으로부터의 합성 리보자임인 안지오자임 및 이들의 조합.다른 혈관신생 저해제는 트롬보스폰딘1, 트롬보스폰딘2, 콜라겐 IV 및 콜라겐 XVIII을 포함한다. VEGF 저해제는 하기에 개시되어 있다: U.S. 특허 제6,534,524호 및 제6,235,764호 (이 둘 모두는 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 편입되어 있음). 항-혈관형성제는 또한 천연 혈관신생 저해제, 예를 들면, 안지오스타틴, 엔도스타틴 등을 포함한다. 예를 들면, 하기를 참고한다: Klagsbrun and D'Amore (1991) Annu.Rev.Physiol. 53: 217-39; Streit and Detmar (2003) Oncogene 22: 3172-3179 (예를 들면, 악성 흑색종에서의 항-혈관신생 요법을 열거하는 표 3); Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12): 1359-1364; Tonini 등(2003) Oncogene 22: 6549-6556 (예를 들면, 공지된 항혈관신생 인자를 열거하는 표 2); 및, Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol .8: 200-206 (예를 들면, 임상시험에서 사용된 항-혈관형성제를 열거하는 표 1)을 참고한다.
용어 "항-혈관신생 요법"은 항-혈관형성제의 투여를 포함하는 혈관신생을 억제하는데 유용한 요법을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 “CD20 발현 암”은 암 세포가 CD20 항원의 발현을 나타내는 모든 암을 지칭한다. 바람직하게는 본원에서 사용된 바와 같이 CD20 발현 암은 림프종 (바람직하게는 B-세포 비-호지킨 림프종 (NHL)) 및 림프구성 백혈병을 지칭한다. 그러한 림프종 및 림프구성 백혈병은, 예를 들면 a) 여포성 림프종, b) 작은 비-절단된 세포 림프종/ 버킷 림프종 (풍토병성 버킷 림프종, 산발적 버킷 림프종 및 비-버킷 림프종 포함) c) 변연부 림프종 (결절외 변연부 B 세포 림프종 (점막-관련된 림프 조직 림프종, 맥아), 결절 변연부 B 세포 림프종 및 비장 변연부 림프종 포함), d) 맨틀 세포 림프종 (MCL), e) 대세포 림프종 (B-세포 미만성 대세포 림프종 (DLCL), 확산 혼합된 세포 림프종, 면역아세포성 림프종, 원발성 종격동 B-세포 림프종, 혈관중심성 림프종-폐 B-세포 림프종 포함) f) 모발 세포 백혈병, g) 림프구 림프종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, h) 급성 림프구성 백혈병 (모든), 만성적 림프구성 백혈병 (CLL)/ 작은 림프구 림프종 (SLL), B-세포 전림프구성 백혈병, i) 형질 세포 신생물, 형질 세포 골수종, 다발성 골수종, 형질세포종 j) 호지킨 질환을 포함한다.
더 바람직하게는 CD20 발현 암은 B-세포 비-호지킨 림프종 (NHL)이다. 특히 CD20 발현 암은 맨틀 세포 림프종 (MCL), 급성 림프구성 백혈병 (모든), 만성적 림프구성 백혈병 (CLL), B-세포 미만성 대세포 림프종 (DLCL), 버킷 림프종, 모발 세포 백혈병, 여포성 림프종, 다발성 골수종, 변연부 림프종, 이식후 림프증식성 장애 (PTLD), HIV 관련된 림프종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 또는 1차 CNS 림프종이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "세포독성제"는 세포성 기능을 억제하거나 방지하고/거나 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들면, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학치료제 (예를 들면, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알카로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로르암부실, 다우노루비신 또는 다른 개재 약물, 효소 및 그의 단편, 예컨대 핵산분해 효소, 항생제, 및 독소, 예컨대 소분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, (이의 단편 및/또는 변이체 포함), 및 하기에 개시된 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하는 것으로 의도된다. 다른 세포독성 약물은 하기에 기재되어 있다. 종양파괴성 제제는 종양 세포의 파괴를 유발한다.
"독소"는 세포의 성장 또는 증식에 해로운 영향을 미칠 수 있는 임의의 물질이다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로스포스파마이드 (사이톡산®); 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸로멜라민을 포함하는 메틸아멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라하이드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀®); 베타-라파콘; 라파콘; 콜히친; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (하이캄틴®), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 바이젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드 예컨대 클로르암부실, 클로르나파진, 클로로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님무스틴; 항생제, 예컨대 엔디인 항생제 (예를 들면, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마1I 및 칼리키아마이신 오메가Il (예를 들면, Nicolaou 등, Angew.Chem Intl. Ed. Engl .,33: 183-186 (1994) 참고); CDP323, 경구 알파-4 인테그린 저해제; 다이네마이신 A를 포함하는 다이네마이신; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색소단백질 엔디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (ADRIAMYCIN®, 모폴리노-독소루비신, 시아노모폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포좀 주사 (DOXIL®), 리포좀 독소루비신 TLC D-99 (MYOCET®), 페길화된 리포좀 독소루비신 (CAELYX®), 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피머, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물, 예컨대 메토트렉세이트, 젬시타빈 (GEMZAR®), 테가푸르 (UFTORAL®), 카페시타빈 (XELODA®), 에포틸론, 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 콤브레타스타틴; 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레벌린산; 에닐루라실; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소크산트론; 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK® 다당류 복합체 (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산; 라이족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아진산; 트리아지쿠온; 2,2',2'-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (ELDISINE®, FILDESIN®); 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들면, 파클리탁셀 (탁솔®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형 (아브락산TM), 및 도세탁셀 (탁소테르®, Rhome-Poulene Rorer, Antony, France); 클로란부실; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 제제, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 (예를 들면, 엘록사틴®), 및 카보플라틴; 빈블라스틴 (벨반®), 빈크리스틴 (온코빈®), 빈데신 (ELDISINE®, FILDESIN®), 및 비노렐빈 (나벨빈®)를 포함하는, 튜불린 중합이 미세소관을 형성하는 것을 막는 빈카; 에토포시드 (VP-16); 이포스파마이드; 미톡산트론; 류코보린; 노반트론; 데다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 저해제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 벡사로텐 (타르그레틴®)을 포함하는 레티노산; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트 (예를 들면, BONEFOS® 또는 OSTAC®), 에티드로네이트 (DIDROCAL®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (조메타®), 알렌드로네이트 (FOSAMAX®), 팔미드로네이트 (아레디아®), 틸루드로네이트 (SKELID®), 또는 리센드로네이트 (ACTONEL®); 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오사이드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 특히 비정상적인 세포 증식에 연루된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예컨대, 예를 들면, PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R) (예를 들면, 에를로티닙 (타르세바TM)); 및 세포 증식을 감소시키는 VEGF-A; 백신 예컨대 THERATOPE® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들면, ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신, 및 VAXID® 백신; 토포이소머라제 1 저해제 (예를 들면, 루르토테칸®); rmRH (예를 들면, 아바렐릭스®); BAY439006 (소라페닙; Bayer); SU-11248 (수니티닙, 수텐트®, Pfizer); 페리포신, COX-2 저해제 (예를 들면 셀레콕십 또는 에토리콕십), 프로테오좀 억제제 (예를 들면PS341); 보르테조밉 (벨케이드®); CCI-779; 티피파르닙 (R11577); 오라페닙, ABT510; Bcl-2 억제제, 예컨대 오블리메르센 나트륨 (GENASENSE®); 픽산트론; EGFR 저해제; 티로신 키나제 저해제; 세린-트레오닌 키나제 억제제, 예컨대 라파마이신 (시롤리무스, RAPAMUNE®); 파르네실전달효소 억제제, 예컨대 로나파르닙 (SCH 6636, SARASARTM); 및 상기 중 어느 것의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 중 둘 이상의 조합, 예컨대 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니솔론의 병용 요법에 대한 약어인 CHOP; 및 5-FU 및 류코보린과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴TM)을 갖는 치료 요법에 대한 약어인 폴폭스, 및 상기 중 어느 것의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 중 둘 이상의 조합을 포함한다.
본 명세서에서 정의된 바와 같이 화학요법제는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단, 또는 억제하는 작용을 하는 "항-호르몬제" 또는 "내분비 치료제"를 포함한다. 이들은 비제한적으로 하기를 포함하는 호르몬 자체일 수 있다: 예를 들면, 타목시펜 (놀바덱스® 타목시펜 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케녹시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 파레스톤.cndot.토레미펜을 포함하는, 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절물질 (SERM); 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예컨대, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, MEGASE® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신® 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, RIVISOR® 보로졸, 페마라® 레트로졸, 및 아리미덱스® 아나스트로졸; 및 항-안드로겐 예컨대 플루타미드, 닐루타마이드, 바이칼루타마이드, 류프롤라이드, 및 고세렐린; 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오사이드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 특히 비정상 세포 증식에 연루된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예컨대, 예를 들면, PKC-알파, Raf 및 H-Ras; 리보자임 예컨대 VEGF 발현 저해제 (예를 들면, 안지오자임® 리보자임) 및 HER2 발현 저해제; 백신, 예컨대 유전자 요법 백신, 예를 들면, ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신, 및 VAXID® 백신; 프롤류킨® rIL-2; 루르토테칸® 토포이소머라제 1 저해제; 아바렐릭스® rmRH; 비노렐빈 및 에스페라마이신 (U.S. 특허 제4,675,187호 참고), 및 상기 중 어느 것의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 중 둘 이상의 조합.
본원에서 사용될 때 "성장 억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 일 구현예에서, 성장 억제제는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포의 증식을 막거나 감소시키는 성장 억제성 항체이다. 또 다른 구현예에서, 성장 억제제는 S기에 있는 세포의 백분율을 유의미하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행을 차단하는 제제 (S기 이외의 장소에서), 예컨대 G1 정지 및 M-기 정지를 유도하는 제제를 포함한다. 고전적인 M-기 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 토포이소머라제 II 저해제, 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드, 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 제제, 예를 들면, DNA 알킬화제, 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 및 ara-C는 또한 S-기 정지로 넘친다. 추가 정보는 하기에서 발견될 수 있다: Mendelsohn and Israel, eds.,The Molecular Basis of Cancer, Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami 등(W.B.Saunders, Philadelphia, 1995), e.g., p.13.탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 주목나무 (yew tree)로부터 유래된 항암 약물이다. 유럽 주목나무로부터 유래된 도세탁셀 (탁소테르®, Rhone-Poulenc Rorer)은 파클리탁셀 (탁솔®, Bristol-Myers Squibb)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터 미세소관의 조립을 촉진하며 탈중합을 막아 미세소관을 안정화시켜, 세포의 유사분열을 억제한다.
"방사선 요법"은 정상적으로 기능하는 세포의 능력을 제한하거나 세포 전체를 파괴하기 위해 세포에게 충분한 손상을 유도하는 지향된 감마선 또는 베타선의 사용을 의미한다. 복용량 및 치료 지속시간을 결정하는 당해 기술에 공지된 많은 방법이 있을 것임이 인식될 것이다. 전형적인 치료는 1회 투여로서 제공되며 전형적인 투여량은 하루당 10 내지 200 단위 (Grays)의 범위이다.
치료 목적을 위한 “대상체” 또는 “개인”은 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는 포유동물로서 분류된 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 구체적으로 단클론성 항체 (전장 단클론성 항체 포함), 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함한다.
"단리된" 항체는 확인되고 그의 자연 환경의 성분으로부터로부터 분리 및/또는 회수된 항체이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이며, 이는 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 (1) 예를 들면, 라우리 (Lowry) 방법에 의해 결정된 바와 같이 95 중량%를 초과하는 항체, 및 일부 구현예에서, 99 중량%를 초과하는 항체로 정제되거나; (2) 예를 들면, 스피닝 컵 서열분석장치의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열 중 적어도 15개 잔기를 얻는데 충분한 정도까지 정제되거나, 또는 (3) 예를 들면, 쿠마씨 블루 또는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 균질한 정도까지 정제된다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경 중 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에, 재조합 세포 내에서 원위치에 있는 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"천연 항체"는 보통 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 1개의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되는 한편, 디설파이드 연결의 수는 상이한 면역글로불린 아이소타입의 중쇄 간에 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 디설파이드 브릿지를 갖는다. 각 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인 (VH)을 가지고 그 다음에 많은 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인 (VL) 및 그의 다른 말단에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에 접점을 형성하는 것으로 여겨진다.
용어 "불변 도메인"은 항원 결합 부위를 함유하는 가변 도메인인 면역글로불린의 다른 부위에 비해 더 보존된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분자의 부위를 지칭한다. 불변 도메인은 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인 (종합적으로, CH) 및 경쇄의 CHL (또는 CL) 도메인을 함유한다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이며 항원-결합 부위를 함유한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부위가 항체 간에 서열이 광범위하게 상이하고 그의 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 고르게 분포되어 있지 않다. 그것은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 내의 초가변 영역 (HVR)이라 불리는 3개의 분절에 집중되어 있다. 가변 도메인 중 더 고도로 보존된 부위는 프레임워크 영역 (FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 베타-시트 구조를 연결하고 일부 경우 베타-시트 구조의 일부를 형성하는, 3개의 HVR에 의해 연결된, 주로 베타-시트 배열을 채택하는, 4개의 FR 영역을 포함한다. 각 사슬 내의 HVR은 FR 영역에 의해 매우 근접하여 결합되고, 다른 사슬로부터의 HVR과 함께, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md.(1991)). 불변 도메인은 항체와 항원의 결합에 직접 관여하지는 않지만, 항체-의존적 세포성 독성에서 항체의 참여와 같은, 다양한 효과기 기능을 나타낸다.
임의의 포유동물 종으로부터의 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (“κ”) 및 람다 (“λ”)로 불리는 2개의 명확히 구별되는 유형 중 하나로 배정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 IgG "아이소타입” 또는 "서브클래스"는 그들의 불변 영역의 화학적 및 항원성 특징에 의해 정의된 면역글로불린의 서브클래스 중 어느 것을 의미한다.
그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (면역글로불린)는 상이한 부류로 배정될 수 있다. 면역글로불린에는 5개의 주요 부류인IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM가 있고, 이들 중 몇 가지는 서브클래스 (아이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, γ, ε, γ, 및 μ로 불린다. 면역글로불린의 상이한 부류의 서브유닛 구조 및 3차원 배열은 잘 알려져 있으며 일반적으로 하기에 기재되어 있다: 예를 들면, Abbas 등 Cellular and Mol . Immunology, 4th ed.(W.B.Saunders, Co.,2000). 항체는 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드과 항체의 공유 또는 비-공유 결합에 의해 형성된 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "전장 항체," "온전한 항체" 및 "전체 항체"는 하기에서 정의된 바와 같은 항체 단편이 아닌 실질적으로 온전한 형태의 항체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
본원의 목적을 위한 "네이키드 (naked) 항체"는 세포독성 모이어티 또는 방사선표지에 접합되지 않은 항체이다.
"항체 단편"은, 바람직하게는 이의 항원 결합 영역을 포함하는, 온전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편 (각각 단일 항원-결합 부위를 가짐), 및 나머지 "Fc" 단편 (이 명칭은 쉽게 결정화화는 능력을 반영함)을 생산한다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 가지며 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 일 구현예에서, 2쇄 Fv 종은 견고한 비-공유 결합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 단일-사슬 Fv (scFv) 종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 가요성 펩타이드 링커에 의해 공유결합될 수 있으며 이로써 경쇄 및 중쇄는 2쇄 Fv 종과 비슷한 "이량체성" 구조로 결합할 수 있다. 각 가변 도메인의 3개의 HVR이 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 정의하기 위해 상호작용하는 것이 이 배열 내에 있다. 종합적으로, 6개의 HVR은 항체에게 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 HVR만을 포함하는 Fv의 절반)조차도, 전체 결합 부위보다 낮은 친화도이긴 하지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하며, 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 몇 개의 잔기를 부가함으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 자유 티올 그룹을 갖는 Fab'에 대한 본원의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링 역시 공지되어 있다.
"단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩타이드는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함하고, 이는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다. scFv의 검토를 위해, 예를 들면, Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315를 참고한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭하며, 상기 단편은 동일한 폴리펩타이드 사슬에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH) (VH-VL)을 포함한다. 동일한 사슬 상에서 2개의 도메인 사이에 쌍을 형성하도록 하기에 너무 짧은 링커를 이용함으로써, 상기 도메인은 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 강제로 쌍을 형성하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는 하기에 더 자세히 기재되어 있다: 예를 들면, EP 제404,097호; WO 제1993/01161호; Hudson 등, Nat. Med. 9: 129-134 (2003); 및 Hollinger 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 6444-6448 (1993). 트리아바디 및 테트라바디 역시 하기에 기재되어 있다: Hudson 등, Nat. Med. 9: 129-134 (2003).
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 예를 들면, 상기 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들면, 자연 발생 돌연변이를 제외하면 동일하다. 따라서, 수식어 "단클론성"은 별개의 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특성을 가리킨다. 특정 구현예에서, 이러한 단클론성 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 여기서 상기 표적 결합 폴리펩타이드 서열은 복수의 폴리펩타이드 서열로부터 단일 표적에 결합하는 폴리펩타이드 서열의 선택을 포함하는 공정에 의해 수득되었다. 예를 들면, 선택 공정은 복수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파아지 클론, 또는 재조합 DNA 클론의 집단으로부터의 독특한 클론을 선택하는 것일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은, 예를 들면, 표적에 대한 친화도를 개선하기 위해, 표적 결합 서열을 인간화하기 위해, 세포 배양시 그의 생산을 개선하기 위해, 생체내에서 그의 면역원성을 감소시키기 위해, 다중특이적 항체를 생성하기 위해, 등을 위해 추가로 변경될 수 있는 것으로 이해되어야 하고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체 역시 본 발명의 단클론성 항체인 것으로 이해되어야 한다. 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체와 달리, 단클론성 항체 조제물의 각 단클론성 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대한 것이다. 그의 특이성 외에도, 단클론성 항체 조제물은 이들이 전형적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되어 있지 않는다는 점에서 유리하다.
수식어 "단클론성"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체의 특성을 가리키며, 이는 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 단클론성 항체는 하기를 포함하는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다: 예를 들면, 하이브리도마 방법 (예컨대, Kohler 및 Milstein, Nature, 256: 495-97 (1975); Hongo 등, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow 등, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling 등, in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), 재조합 DNA 방법 (예를 들면, U.S. 특허 제4,816,567호 참고), 파아지-디스플레이 기술 (예를 들면, Clackson 등, Nature, 352: 624-628 (1991); Marks 등, J. Mol. Biol .222: 581-597 (1992); Sidhu 등, J. Mol . Biol . 338(2): 299-310 (2004); Lee 등, J. Mol. Biol . 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee 등, J. Immunol . Methods 284(1-2): 119-132 (2004) 참고), 및 인간 면역글로불린 유전자좌 또는 인간 면역글로불린 서열을 인코딩하는 유전자 중 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하는 기술 (예를 들면, WO 제1998/24893호; WO 제1996/34096호; WO 제1996/33735호; WO 제1991/10741호; Jakobovits 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 2551 (1993); Jakobovits 등, Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann 등, Year in Immunol . 7: 33 (1993); U.S. 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호; Marks 등, Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg 등, Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild 등, Nature Biotechnol . 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol . 14: 826 (1996); 및 Lonberg 및 Huszar, Intern.Rev. Immunol . 13: 65-93 (1995) 참고).
본원에서 단클론성 항체는 특히 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동인 반면, 상기 사슬(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 항체, 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 상기 항체의 단편에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동인 "키메라성" 항체를 포함한다 (예를 들면, U.S. 특허 제4,816,567호; 및 Morrison 등, Proc. Natl . Acad . Sci . USA 81: 6851-6855 (1984) 참고). 키메라성 항체는 항체의 항원-결합 영역이, 예를 들면 짧은 꼬리 원숭이를 관심있는 항원으로 면역화함으로써 생산된 항체로부터 유래된 PRIMATTZED® 항체를 포함한다.
비-인간 (예를 들면, 쥣과) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라성 항체이다. 일 구현예에서, 인간화 항체는 수령체의 HVR로부터의 잔기가 비-인간 종 (공여체 항체), 예컨대 원하는 특이성, 친화도, 및/또는 수용력을 갖는 마우스, 랫트, 토끼, 또는 비인간 영장류의 HVR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수령체 항체)이다. 일부 경우, 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 더욱이, 인간화 항체는 수령체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더 개선하기 위해 이뤄질 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 모든 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 임의로 또한 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 추가 세부사항을 위해, 예를 들면, Jones 등, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann 등, Nature 332: 323-329 (1988); 및 Presta, Curr . Op. Struct . Biol . 2: 593-596 (1992)를 참고한다. 또한 예를 들면, Vaswani 및 Hamilton, Ann.Allergy, Asthma & Immunol . 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem . Soc . Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle 및 Gross, Curr .Op.Biotech.5: 428-433 (1994); 및 U.S. 특허 제6,982,321호 및 제7,087,409호를 참고한다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 아미노산을 갖고/거나 본원에서 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하는 기술 중 어느 것을 이용하여 제조된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 특히 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다. 인간 항체는 파아지-디스플레이 라이브러리를 포함하는, 당해 기술에서 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol ., 227: 381 (1991); Marks 등, J. Mol. Biol.,222: 581 (1991). 또한 하기에 기재된 방법이 인간 단클론성 항체의 제조를 위해 이용가능하다: Cole 등, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, p. 77 (1985); Boerner 등, J. Immunol.,147(1): 86-95 (1991). 또한 하기를 참조한다: van Dijk 및 van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol ., 5: 368-74 (2001). 인간 항체는 항원 공격에 반응하여 상기 항체를 생산하도록 변형되었으나 그의 내인성 유전자좌가 무력화된 형질전환 동물, 예를 들면, 면역화된 제노마우스 (xenomice)에게 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다 (예를 들면, U.S. 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호 (XENOMOUSETM 기술 관련). 또한 하기를 참조한다: 예를 들면, Li 등, Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 103: 3557-3562 (2006) (인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체 관련).
"종-의존적 항체"는 제2 포유동물 종로부터의 상기 항체의 동족체에 대해 갖는 결합 친화도보다 제1 포유동물 종으로부터의 항체에 대해 더 강한 결합 친화도를 갖는 항체이다. 일반적으로, 종-의존적 항체는 인간 항원에 "특이적으로 결합"하지만 (예를 들면, 약 1x10-7 M 이내, 바람직하게는 약 1x10-8 M 이내 및 바람직하게는 약 1x10-9 M 이내의 결합 친화도 (Kd) 값를 가짐), 인간 항원에 대한 그의 결합 친화도보다 적어도 약 50 배, 또는 적어도 약 500 배, 또는 적어도 약 1000 배 더 약한 제2 비인간 포유동물 종로부터의 항체의 동족체에 대한 결합 친화도를 갖는다. 종-의존적 항체는 상기 정의된 바와 같은 다양한 유형의 항체 중 어느 것일 수 있지만, 바람직하게는 인간화 또는 인간 항체이다.
본원에서 사용될 때, 용어 "초가변 영역," "HVR," 또는 "HV"은 서열이 초가변성이고/거나 구조적으로 정의된 루프를 형성하는, 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH에 3개 (H1, H2, H3), 및 VL에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR의 대부분의 다양성을 나타내며, 특히 H3은 항체에게 우수한 특이성을 부여하는 독특한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 예를 들면, 하기를 참고한다: Xu 등, Immunity 13: 37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248: 1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003)을 참고한다. 사실상, 중쇄로만 이루어지는 자연 발생 낙타과 항체는 경쇄의 부재시 기능적이고 안정하다. 예를 들면, 하기를 참고한다: Hamers-Casterman 등, Nature 363: 446-448 (1993); Sheriff 등, Nature Struct.Biol.3: 733-736 (1996).
많은 HVR 표기가 사용되고 있으며 이는 본원에 포함되어 있다. 카밧 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성에 기초하며 가장 통상적으로 사용된다 (Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)). 초티아는 대신에 구조적 루프의 위치를 나타낸다 (Chothia and Lesk J. Mol. Biol . 196: 901-917 (1987)). AbM HVR은 카밧 HVR 및 초티아 구조적 루프 사이의 절충안을 나타내며, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" HVR은 이용가능한 복잡한 결정 구조의 분석을 기반으로 한다. 각각의 이들 HVR로부터의 잔기가 하기에 언급되어 있다.
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HVR은 하기와 같이 "확장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3) 및 VH에서 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 상기 가변 도메인 잔기는 이들 정의 각각에 대해, 전술한 카밧 등에 따라 번호가 매겨진다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같은 HVR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
용어 "카밧에서와 같은 가변 도메인 잔기 번호매기기" 또는 "카밧에서와 같은 아미노산 위치 번호매기기," 및 이의 변형은 전술한 카밧 등에서 항체의 편집물의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인을 위해 사용된 번호매기기 체계를 지칭한다. 이 번호매기기 체계를 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축, 또는 가변 도메인의 FR 또는 HVR 내로의 삽입에 상응하는 더 적거나 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 이후에 단일 아미노산 삽입 (카밧에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 이후에 삽입된 잔기 (예를 들면 카밧에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c, 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카밧 번호매기기는 항체의 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카밧 번호가 매겨진 서열과 정렬함으로써 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.
카밧 번호매기기 체계는 일반적으로 가변 도메인 내의 잔기 (경쇄의 대략 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 지칭할 때 사용된다 (예를 들면, Kabat 등, Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)). "EU 번호매기기 체계" 또는 "EU 지수"는 일반적으로 면역글로불린 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 언급할 때 사용된다 (예를 들면, 전술한 카밧 등에서 보고된 EU 지수). "카밧에서와 같은 EU 지수"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 번호를 지칭한다.
표현 “선형 항체"는 하기에 기재된 항체를 지칭한다: Zapata 등(1995 Protein Eng, 8(10): 1057-1062). 간략하게, 이들 항체는 한 쌍의 탠덤 Fd 분절 (VH-CH1-VH-CH1)를 포함하고, 이는 상보적 경쇄 폴리펩타이드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
II. 항체 제형 및 제조
본 발명은 항체를 포함하는 안정한 수성 제형에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 제형은 단클론성 항체, 트레할로오스, 및 버퍼를 포함하고, 제형 내의 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 0.41 이상 내지 1.65 미만이며, 상기 제형은 약 5.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제형은 버퍼 (예컨대 인산나트륨 또는 히스티딘)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제형은 (a) 약 25 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 양의 단클론성 항체; (b) 약 45 mM 내지 약 634 mM의 양의 트레할로오스; 및 (c) 35 mM 초과 내지 약 100 mM의 양의 인산나트륨을 포함하며, 상기 제형은 약 5.5 내지 약 7.0의 pH를 갖고, 제형 내의 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비는 약 0.41 이상 내지 1.65 미만이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 항체는 -20 ℃에서 적어도 약 6개월, 적어도 약 12개월, 또는 적어도 약 18개월 동안 안정하다. 일부 구현예에서, 트레할로오스는 비-트레할로오스 폴리올로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 VEGF에 결합한다.
A. 항체 제조
제형 내의 항체는 항체를 생성하기 위해 당해 기술에서 이용가능한 기술을 이용하여 제조되며, 이의 예시적인 방법은 하기 섹션에서 보다 상세히 기술된다.
항체는 관심있는 항원에 대한 것이다. 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩타이드이며 장애로 고통받고 있는 포유동물에게 항체의 투여는 상기 포유동물에서 치료적 이점을 야기할 수 있다. 그러나, 비폴리펩타이드 항원에 대한 항체가 또한 고려된다.
항원이 폴리펩타이드인 경우, 그것은 막통과 분자 (예를 들면, 수용체) 또는 리간드, 예컨대 성장 인자일 수 있다. 예시적인 항원은 분자, 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); CD20; ox-LDL; ox-ApoB100; 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 포함하는 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 여포자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰빌레브란트 인자; 항-응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방나트륨 이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제, 예컨대 우로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (regulated on activation normally T-cell expressed and secreted); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러관 억제 물질; 릴락신 A-사슬; 릴락신 B-사슬; 프로릴락신; 마우스 성선자극호르몬-관련된 펩타이드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련된 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스성 인자; 신경영양성 인자, 예컨대 골 유래 신경영양성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5를 포함하는 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des (1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 골유도성 인자; 면역독소; 골 형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 집락 자극 인자 (CSF), 예를 들면, M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터류킨 (IL), 예를 들면, IL-1 내지 IL-10; 슈퍼옥사이드 디스무타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예컨대, AIDS 피막의 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 아드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련된 항원, 예컨대 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 상기-열거된 폴리펩타이드 중 어느 것의 단편과 같은 분자를 포함한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명에 포함되는 항체에 대한 분자 표적은 VEGF 및 CD20을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 항체는 인간 VEGF에 결합하는 항체이다. 일부 구현예에서, 본원에서 항체는 인간 CD20에 결합하는 항체이다.
(i) 항원 제조
다른 분자에 임의로 접합된 가용성 항원 또는 그의 단편은 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 수용체와 같은 막통과 분자의 경우, 이들의 단편 (예를 들면 수용체의 세포외 도메인)이 면역원으로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 막통과 분자를 발현하는 세포가 면역원으로서 사용될 수 있다. 그러한 세포는 천연 공급원 (예를 들면 암 세포주)으로부터 유래될 수 있거나 또는 막통과 분자를 발현하도록 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포일 수 있다. 항체를 제조하는데 유용한 다른 항원 및 이의 형태는 당해 기술의 숙련가에게 명백할 것이다.
(ii) 특정 항체-기반 방법
다클론성 항체는 바람직하게는 관련된 항원 및 보조제의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 증가된다. 관련된 항원을 이작용성 또는 유도화제, 예를 들면, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시석신이미드 (라이신 잔기를 통함), 글루타르알데하이드, 석신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기서 R 및 R1은 상이한 알킬 그룹임)을 이용하여 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들면 열쇠구멍 삿갓조개헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제에 접합시키는 것이 유용할 수 있다.
동물은, 예를 들면, 100 μg 또는 5 μg의 단백질 또는 접합체 (각각 토끼 또는 마우스의 경우)를 3 부피의 프로인트 완전 보조제와 조합하고 상기 용액을 다중 부위에 피내 주사함으로써 항원, 면역원성 접합체, 또는 유도체에 대해 면역화된다. 1개월 후, 동물은 다중 부위에서 피하 주사에 의해 프로인트 완전 보조제 중의 펩타이드 또는 접합체의 원래의 양의 1/5 내지 1/10를 이용하여 증강된다. 7 내지 14일 후, 동물을 출혈시키고 혈청을 항체 역가에 대해 분석한다. 동물은 역가가 안정 수준에 달할 때까지 증강된다. 바람직하게는, 동물은 동일한 항원의 접합체이지만, 상이한 단백질에 접합되고/거나 상이한 가교결합 시약을 통해 접합된 동일한 항원의 접합체로 증강된다. 접합체는 또한 단백질 융합으로서 재조합 세포 배양에서 제조될 수 있다. 또한, 명반 (alum)과 같은 응집제가 면역 반응을 향상시키기 위해 적합하게 사용된다.
본 발명의 단클론성 항체는 Kohler 등, Nature, 256: 495 (1975)에 의해 처음 기재되고, 예를 들면, Hongo 등, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow 등, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling 등, in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4): 265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마 관련)에 추가로 기재된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 추가의 방법은, 예를 들면, 하기에 기재된 것을 포함한다: U.S. 특허 제7,189,826호 (하이브리도마 세포주로부터 단클론성 인간 천연 IgM 항체의 생산 관련). 인간 하이브리도마 기술 (트리오마 기술)은 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3): 927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005)에 기재되어 있다.
다양한 다른 하이브리도마 기술을 위해, 예를 들면, US 제2006/258841호; US 제2006/183887호 (완전 인간 항체), US 제2006/059575호; US 제2005/287149호; US 제2005/100546호; US 제2005/026229호; 및 U.S. 특허 제7,078,492호 및 제7,153,507호를 참고한다. 하이브리도마 방법을 사용하여 단클론성 항체를 생산하기 위한 예시적인 프로토콜은 하기와 같이 기술된다. 일 구현예에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터는 면역화를 위해 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하도록 면역화된다. 항체는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 및 보조제, 예컨대 모노포스포릴 지질 A (MPL)/트레할로오스 디크리노미콜레이트 (TDM) (Ribi Immunochem.Research, Inc., Hamilton, Mont.)의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 증가된다. 본 발명의 폴리펩타이드 (예를 들면, 항원) 또는 이의 단편은 당해 기술에서 잘 알려진 방법, 예컨대 재조합 방법을 이용하여 제조될 수 있고, 이의 일부는 본원에 추가로 기재되어 있다. 면역화된 동물의 혈청을 항-항원 항체에 대해 분석하고, 증강 면역을 선택적으로 투여한다. 항-항원 항체를 생산하는 동물의 림프구가 단리된다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다.
그리고 나서, 림프구는 적합한 융합 제제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다. 예를 들면, 하기를 참고한다: Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)을 참고한다. 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 생산을 지원하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 골수종 세포가 사용될 수 있다. 예시적인 골수종 세포는, 비제한적으로, 쥣과 골수종 세포주, 예컨대 Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif.USA로부터 이용가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 세포, 및 미국 종균 협회, Rockville, Md.USA로부터 이용가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포를 포함한다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 또한 인간 단클론성 항체의 생산을 위해 기재되었다 (Kozbor, J. Immunol ., 133: 3001 (1984); Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
이렇게 제조된 하이브리도마는 적합한 배양 배지, 예를 들면, 융합되지 않은 친계 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 배지에접종되고 성장한다. 예를 들면, 친계 골수종 세포가 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 전달효소 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린, 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이고, 이 물질은 HGPRT-결핍된 세포의 성장을 억제한다. 바람직하게는, 무혈청 하이브리도마 세포 배양 방법이 예컨대 하기 문헌에 기재된 바와 같은 우태아 혈청과 같은 동물 유래 혈청의 사용을 감소시키기 위해 사용된다: Even 등, Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006).
하이브리도마 세포 배양물의 생산성을 향상시키기 위한 도구로서 올리고펩타이드는 Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005)에 기재되어 있다. 구체적으로, 표준 배양 배지는 특정 아미노산 (알라닌, 세린, 아스파라긴, 프롤린)이 풍부하거나, 또는 단백질 가수분해물 분획이 풍부하며, 세포자멸사가 3개 내지 6개의 아미노산 잔기로 구성된 합성 올리고펩타이드에 의해 유의미하게 억제될 수 있다. 상기 펩타이드는 밀리몰 이상의 농도로 존재한다.
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 본 발명의 항체에 결합하는 단클론성 항체의 생산에 대해 분석될 수 있다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단클론성 항체의 결합 특이성은 면역침강에 의해 또는 시험관내 결합 분석, 예컨대 방사선면역분석 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 결정될 수 있다. 단클론성 항체의 결합 친화도는, 예를 들면, 스캐차드 (Scatchard) 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 하기를 참고한다: Munson 등, Anal. Biochem ., 107: 220 (1980).
원하는 특이성, 친화도, 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다. 예를 들면, 하기를 참고한다: 전술한 Goding을 참고한다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들면, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 (ascites) 종양으로서 생체내에서 성장될 수 있다. 서브클론에 의해 분비된 단클론성 항체는, 예를 들면, 단백질 A-세파로오스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 종래의 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지, 복수 유체, 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다. 하이브리도마 세포로부터 단백질을 단리하기 위한 한 가지 절차가 US 제2005/176122호 및 U.S. 특허 제6,919,436호에 기재되어 있다. 이 방법은 결합 과정에서 친액성 (lyotropic) 염과 같은 최소 염을 사용하는 것 및 바람직하게는 또한 용출 공정에서 소량의 유기 용매를 사용하는 것을 포함한다.
(iii) 특정 라이브러리 스크리닝 방법
본 발명의 항체는 원하는 활성 또는 활성을 갖는 항체를 스크리닝하기 위해 조합 라이브러리를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 파아지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 원하는 결합 특징을 갖는 항체를 위해 상기 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 당해 기술에 공지되어 있다. 그러한 방법은 일반적으로 하기 문헌에 기재되어 있다: Hoogenboom 등 (Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien 등, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001)). 예를 들면, 관심있는 항체를 생성하는 한 가지 방법은 하기 문헌에 기재된 바와 같은 파아지 항체 라이브러리를 사용하는 것이다: Lee 등, J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93.
원칙적으로, 합성 항체 클론은 파아지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 영역 (Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파아지를 함유하는 파아지 라이브러리를 스크리닝함으로써 선택된다. 그러한 파아지 라이브러리는 원하는 항원에 대한 친화성 크로마토그래피에 의해 패닝 (panning)된다. 원하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론은 항원에 흡착되어 라이브러리 내의 비-결합 클론으로부터 분리된다. 그리고 나서, 결합 클론은 항원으로부터 용출되고, 항원 흡착/용출의 추가의 사이클에 의해 추가로 농축될 수 있다. 본 발명의 임의의 항체는 관심있는 파아지 클론을 선택하기 위한 적합한 항원 스크리닝 절차를 설계한 다음, 관심있는 파아지 클론으로부터의 Fv 서열 및 하기에 기재된 적합한 불변 영역 (Fc) 서열을 이용하여 전장 항체 클론을 제작함으로써 수득될 수 있다: Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md.(1991), vols. 1-3.
특정 구현예에서, 항체의 항원-결합 도메인은 모두 3개의 초가변 루프 (HVR) 또는 상보성-결정 영역 (CDR)을 제시하는, 각각 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)로부터의, 약 110개 아미노산의 2개의 가변 (V) 영역으로부터 형성된다. 가변 도메인은 VH 및 VL이 짧은 가요성 펩타이드를 통해 공유 결합된 단일-사슬 Fv (scFv) 단편으로서, 또는 이들 각각이 불변 도메인에 융합되고 하기 문헌에 기재된 바와 같이 비공유적으로 상호작용하는 Fab 단편으로서, 파아지 상에 기능적으로 디스플레이될 수 있다: Winter 등, Ann. Rev. Immunol ., 12: 433-455 (1994). 본원에 사용된 바와 같이, scFv 인코딩 파아지 클론 및 Fab 인코딩 파아지 클론은 총칭하여 "Fv 파아지 클론" 또는 "Fv 클론"으로 불린다.
VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 개별적으로 클로닝되고 파아지 라이브러리에 무작위로 재조합될 수 있고, 이후 이는 하기 문헌에 기재된 바와 같이 항원-결합 클론에 대해 검색될 수 있다: Winter 등, Ann. Rev. Immunol.,12: 433-455 (1994). 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 제작할 필요 없이 면역원에 대한 고친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 (naive) 레퍼토리는 하기 문헌에 기재된 바와 같은 임의의 면역화없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 대한 인간 항체의 단일 공급원을 제공하기 위해 클로닝될 수 있다: Griffiths 등, EMBO J, 12: 725-734 (1993). 마지막으로, 나이브 라이브러리는 또한 줄기세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, 매우 가변적인 CDR3 영역을 인코딩하기 위해 그리고 하기 문헌에 기재된 바와 같이 시험관내에서 재배열을 달성하기 위해 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 합성적으로 제조될 수 있다: Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).
특정 구현예에서, 섬유상 파아지가 소수 코트 단백질 pIII에 융합함으로써 항체 단편을 디스플레이하는데 사용된다. 항체 단편은, 예를 들면, 하기 문헌에 의해 기재된 같이, VH 및 VL 도메인이 가요성 폴리펩타이드 스페이서에 의해 동일한 폴리펩타이드 사슬 상에서 연결된 단일 사슬 Fv 단편으로서(Marks 등, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)), 또는 하기 문헌에 기재된 바와 같이 하나의 사슬이 pIII에 융합되고 다른 사슬은 박테리아 숙주 세포 주변세포질 내로 분비되는 Fab 단편으로서 디스플레이될 수 있으며, 여기서 Fab-코트 단백질 구조의 어셈블리는 야생형 코트 단백질의 일부를 대체함으로써 파아지 표면 상에 표시되게 된다: Hoogenboom 등, Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991).
일반적으로, 항체 유전자 단편을 인코딩하는 핵산은 인간 또는 동물로부터 수확된 면역 세포로부터 수득된다. 항-항원 클론에 대해 우호적으로 편향된 라이브러리를 원하는 경우, 대상체는 항원으로 면역화되어 항체 반응을 생성하며, 비장 세포 및/또는 순환하는 B 세포 또는 다른 말초 혈액 림프구 (PBL)가 라이브러리 제작을 위해 회수된다. 일 구현예에서, 항-항원 클론에 대해 우호적으로 편향된 인간 항체 유전자 단편 라이브러리는 기능적 인간 면역글로불린 유전자 어레이를 갖는 (그리고 기능적 내인성 항체 생산 시스템이 결여된) 형질전환 마우스에서 항-항원 항체 반응을 생성하여 항원 면역화가 항원에 대한 인간 항체를 야기하게 함으로써 수득된다. 인간 항체를 생산하는 형질전환 마우스의 생성은 하기에 기재되어있다.
항-항원 반응성 세포 집단에 대한 추가 농축은 항원-특이적 막 결합된 항체를 발현하는 B 세포를 단리하는 적합한 스크리닝 절차에 의해, 예를 들면, 항원 친화성 크로마토그래피를 사용한 세포 분리 또는 형광색소-표지된 항원에 세포를 흡착한 후 유동-활성화된 세포 분류 (FACS)를 사용하여, 수득될 수 있다.
대안적으로, 비면역화된 공여체로부터의 비장 세포 및/또는 B 세포 또는 다른 PBL의 사용은 가능한 항체 레퍼토리의 더 나은 표현을 제공하고, 또한 항원이 항원성이 아닌 임의의 동물 (인간 또는 비-인간) 종을 이용하여 항체 라이브러리의 제작을 허용한다. 시험관내 항체 유전자 제작을 구체화하는 라이브러리의 경우, 재배열되지 않은 항체 유전자 분절을 인코딩하는 핵산을 제공하기 위해 대상체로부터 줄기 세포가 수확된다. 관심있는 면역 세포는 다양한 동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 랫트, 토끼목, 류프린, 갯과, 고양이, 돼지, 소, 말, 및 조류 종 등으로부터 수득될 수 있다.
항체 가변 유전자 분절 (VH 및 VL 분절을 포함)을 인코딩하는 핵산은 관심있는 세포로부터 회수되어 증폭된다. 재배열된 VH 및 VL 유전자 라이브러리의 경우, 원하는 DNA는 림프구로부터 게놈 DNA 또는 mRNA를 단리한 다음, 하기 문헌에 기재된 바와 같은 재배열된 VH 및 VL 유전자의 5' 및 3' 말단에 일치하는 프라이머를 이용한 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 수득될 수 있고 (Orlandi 등, Proc . Natl . Acad. Sci . (USA), 86: 3833-3837 (1989)), 이로써 발현을 위해 다양한 V 유전자 레퍼토리를 만들 수 있다. V 유전자는 성숙한 V-도메인을 인코딩하는 엑손의 5' 말단의 역방향 프라이머 및 하기에 기재된 바와 같은 J-분절을 기초로 한 정방향 프라미어를 이용하여, cDNA 및 게놈 DNA로부터 증폭될 수 있다: Orlandi 등(1989) 및 Ward 등, Nature, 341: 544-546 (1989). 그러나, cDNA로부터의 증폭을 위해, 역방향 프라이머는 또한 하기 문헌에 기재된 바와 같은 리더 엑손에 기초할 수 있고 (Jones 등, Biotechnol ., 9: 88-89 (1991)), 정방향 프라이머는 하기 문헌에 기재된 불변 영역에 기초할 수 있다 (Sastry 등, Proc . Natl . Acad . Sci . (USA), 86: 5728-5732 (1989)). 상보성을 최대화하기 위해, 축퇴성이 하기 문헌에 기재된 바와 같이 프라이머 내에 혼입될 수 있다: Orlandi 등(1989) 또는 Sastry 등(1989). 특정 구현예에서, 라이브러리 다양성은, 예를 들면, 하기 문헌의 방법에 기재된 바와 같이, 면역 세포 핵산 샘플에 존재하는 모든 이용가능한 VH 및 VL 배열을 증폭시키기 위해 각 V-유전자 패밀리에 표적화된 PCR 프라이머를 이용하여 최대화된다: Marks 등, J. Mol . Biol ., 222: 581-597 (1991) 또는 Orum 등, Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993). 증폭된 DNA를 발현 벡터 내로 클로닝하기 위해, 희박한 제한 부위가 하기에 기재된 바와 같이 한쪽 말단에 태그로서 PCR 프라이머 내에 도입될 수 있거나 (Orlandi 등(1989)), 또는 하기에 기재된 바와 같은 태그된 프라이머를 이용하여 추가 PCR 증폭에 의해 도입될 수 있다 (Clackson 등, Nature, 352: 624-628 (1991).
합성으로 재배열된 V 유전자의 레퍼토리는 V 유전자 분절로부터 시험관내에서 유래될 수 있다. 대부분의 인간 VH-유전자 분절이 클로닝되고 서열분석되었고 (Tomlinson 등, J. Mol . Biol ., 227: 776-798 (1992)에서 보고됨), 맵핑되었으며 (Matsuda 등, Nature Genet., 3: 88-94 (1993)에서 보고됨); 이들 클로닝된 분절 (H1 및 H2 루프의 모든 주요 형태를 포함)이 하기 문헌에 기재된 바와 같이 다양한 서열 및 길이의 H3 루프를 인코딩하는 PCR 프라이머를 이용하여 다양한 VH 유전자 레퍼토리를 생성하는데 사용될 수 있다: Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol.,227: 381-388 (1992). VH 레퍼토리는 또한 하기 문헌에 기재된 바와 같이 단일 길이의 긴 H3 루프에 집중된 모든 서열 다양성으로 제조될 수 있다: Barbas 등, Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 89: 4457-4461 (1992). 인간 Vκ 및 Vλ 분절은 클로닝 및 서열분석되었고 (Williams 및 Winter, Eur. J. Immunol.,23: 1456-1461 (1993)에서 보고됨), 합성 경쇄 레퍼토리를 제조하는데 사용될 수 있다. VH 및 VL 폴드, 및 L3 및 H3 길이의 범위에 기초한 합성 V 유전자 레퍼토리는 상당한 구조적 다양성을 갖는 항체를 인코딩할 것이다. V-유전자를 인코딩하는 DNA의 증폭 후, 생식계열 V-유전자 분절은 하기 문헌의 방법에 따라 시험관내에서 재배열될 수 있다: Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).
항체 단편의 레퍼토리는 몇 가지 방식으로 VH 및 VL 유전자 레퍼토리를 함께 조합함으로써 제작될 수 있다. 각 레퍼토리는 상이한 벡터에서 생성될 수 있고, 벡터는 예를 들면, 하기에 기재된 바와 같이 시험관내에서 (Hogrefe 등, Gene, 128: 119-126 (1993)), 또는 조합 감염에 의해 생체내에서 재조합될 수 있으며, 예를 들면, Waterhouse 등, Nucl . Acids Res., 21: 2265-2266 (1993)에 기재된 loxP 시스템을 들 수 있다. 생체내 재조합 접근법은 E. 콜리 형질전환 효율에 의해 정해진 라이브러리 크기의 한계를 극복하기 위하여 Fab 단편의 2-쇄 성질을 이용한다. 나이브 VH 및 VL 레퍼토리는 별도로 클로닝되며, 하나는 파아지미드로 클로닝되고 다른 것은 파아지 벡터 내로 클로닝된다. 그리고 나서, 각 세포가 상이한 조합을 함유하도록 상기 2개의 라이브러리는 파아지미드-함유 박테리아의 파아지 감염에 의해 조합되고, 라이브러리 크기는 존재하는 세포의 수 (약 1012 클론)에 의해서만 제한된다. 두 벡터는 VH 및 VL 유전자가 단일 레플리콘으로 재조합되고 파아지 비리온 내로 함께 패키징되도록 생체내 재조합 신호를 함유한다. 이들 거대한 라이브러리는 양호한 친화도 (약 10-8 M의 Kd-1)를 갖는 많은 다양한 항체를 제공한다.
대안적으로, 레퍼토리는, 예를 들면 하기에 기재된 바와 같이, 동일한 벡터 내로 순차적으로 클로닝될 수 있거나 (Barbas 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 88: 7978-7982 (1991)), 또는 예를 들면 하기에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 함께 조립된 다음 클로닝될 수 있다 (Clackson 등, Nature, 352: 624-628 (1991). PCR 어셈블리는 또한 가요성 펩타이드 스페이서를 인코딩하는 DNA로 VH 및 VL DNA를 연결하여 단일 사슬 Fv (scFv) 레퍼토리를 형성하는데 사용될 수 있다. 또 다른 기술에서, "인 셀 PCR 어셈블리 (in cell PCR assembly)"는 하기에 기재된 비와 같이, PCR에 의해 림프구 내의 VH 및 VL 유전자를 조합한 다음 연결된 유전자의 레퍼토리를 클로닝하는데 사용된다: Embleton 등, Nucl . Acids Res., 20: 3831-3837 (1992).
나이브 라이브러리 (천연 또는 합성)에 의해 생산된 항체는 중간 정도의 친화도 (약 106 내지 107 M-1의 Kd-1)를 가질 수 있지만, 또한 하기 문헌에 기재된 바와 같이 2차 라이브러리로부터 제작하고 재선택함으로써 친화도 성숙이 시험관내에서 모방될 수 있다: 전술한 Winter 등(1994). 예를 들면, 돌연변이가 오류유발 폴리머라제를 이용하여 시험관내에서 무작위로 도입될 수 있다 (Leung 등, Technique 1: 11-15 (1989))에서 보고됨, Hawkins 등, J. Mol . Biol ., 226: 889-896 (1992)의 방법에서 또는 Gram 등, Proc . Natl . Acad . Sci USA, 89: 3576-3580 (1992)의 방법에서). 추가로, 친화도 성숙은 선택된 개별적인 Fv 클론에서 관심있는 CDR을 포괄하는 무작위 서열을 갖는 프라이머를 사용한 PCR을 이용하여, 하나 이상의 CDR을 무작위로 돌연변이하고, 더 높은 친화도 클론을 스크리닝함으로써 수행될 수 있다. WO 제9607754호 (1996년 3월 14일 공개)는 면역글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역에서 돌연변이생성을 유도하여 경쇄 유전자의 라이브러리를 생성하는 방법을 기재하고 있다. 또 다른 효과적인 접근법은 하기 문헌에 기재된 바와 같이 비면역화된 공여체로부터 수득된 천연 발생 V 도메인 변이체의 레퍼토리를 이용한 파아지 디스플레이에 의해 선택된 VH 또는 VL 도메인을 재조합하고 몇 차례의 사슬 재셔플링에서 더 높은 친환도에 대해 스크리닝하는 것이다: Marks 등, Biotechnol., 10: 779-783 (1992). 이 기술은 약 10-9 M 이하의 친화도를 갖는 항체 및 항체 단편의 생산을 허용한다.
라이브러리의 스크리닝은 당해 기술에 공지된 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 항원은 흡착 플레이트에 부착된 숙주 세포 상에 발현된, 흡착 플레이트의 웰을 코팅하는데 사용될 수 있거나 또는 세포 분류에서 사용될 수 있거나, 또는 스트렙타비딘-코팅된 비드로 포획하기 위해 바이오틴에 접합될 수 있거나, 또는 파아지 디스플레이 라이브러리를 패닝하기 위한 임의의 다른 방법에서 사용될 수 있다.
파아지 라이브러리 샘플은 파아지 입자의 적어도 일부를 흡착제와 결합시키는데 적합한 조건 하에 고정된 항원과 접촉된다. 일반적으로, pH, 이온 강도, 온도 등을 포함하는 조건이 생리 조건을 모방하도록 선택된다. 고상에 결합된 파아지는 세정된 다음, 예를 들면 Barbas 등, Proc . Natl . Acad . Sci USA, 88: 7978-7982 (1991)에 기재된 바와 같이 산에 의해, 또는, 예를 들면 Marks 등, J. Mol. Biol ., 222: 581-597 (1991)에 기재된 바와 같이 알칼리에 의해, 또는 예를 들면, 하기 문헌의 항원 경쟁 방법과 유사한 절차에서 항원 경쟁에 의해 용출된다: Clackson 등, Nature, 352: 624-628 (1991). 파아지는 1회의 선택으로 20-1,000배 농축될 수 있다. 더욱이, 농축된 파아지는 박테리아 배양에서 성장될 수 있고 추가 횟수의 선택을받을 수 있다.
선택의 효율은 세정 동안의 해리의 동력학, 및 단일 파아지 상의 다중 항체 단편이 동시에 항원과 결합할 수 있는지 여부를 포함하는 많은 인자에 좌우된다. 빠른 해리 동력학 (및 약한 결합 친화도)은 짧은 세정, 다가 파아지 디스플레이 및 고상에서 높은 코팅 밀도의 항원의 사용에 의해 유지될 수 있다. 고밀도는 다가 상호작용을 통해 파아지를 안정화시킬 뿐만 아니라, 해리된 파아지의 재결합을 선호한다. 느린 해리 동력학 (및 양호한 결합 친화도)를 갖는 항체의 선택은 하기 문헌에 기재된 바와 같이 긴 세정 및 1가 파아지 디스플레이의 사용 (Bass 등, Protein, 8: 309-314 (1990) 및 WO 92/09690), 및 하기 문헌에 기재된 바와 같이 낮은 코팅 밀도의 항원의 사용에 의해 촉진될 수 있다 (Marks 등, Biotechnol ., 10: 779-783 (1992).
항원에 대해 상이한 친화도를 갖는 파아지 항체, 심지어 항원에 대해 약간 상이한 친화도를 갖는 파아지 항체 사이에서 선택할 수 있다. 그러나, 선택된 항체의 랜덤 돌연변이 (예를 들면 일부 친화도 성숙 기술에서 수행된 바와 같음)는 대부분은 항원에 결합하고 일부는 더 높은 친화도로 결합하는 많은 돌연변이체를 야기할 가능성이 있다. 항원을 제한함으로써, 희귀한 높은 친화도 파아지가 경쟁될 수 있다. 모든 더 높은 친화도 돌연변이체를 보유하기 위해, 파아지는 과잉의 바이오티닐화된 항원과 함께 배양될 수 있지만, 항원에 대해 일정한 표적 몰 친화도보다 더 낮은 몰농도의 농도에서 바이오티닐화된 항원과 함께 배양될 수 있다. 그리고 나서, 높은 친화도-결합 파아지는 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드에 의해 포획될 수 있다. 그러한 "평형 포획"은, 더 낮은 친화도를 갖는 매우 과잉의 파아지로부터 2배 정도 더 높은 친화도를 갖는 돌연변이체 클론의 단리를 허용하는 민감도로, 항체가 그의 결합 친화도에 따라 선택될 수 있게 한다. 고상에 결합된 파아지를 세정하는데 사용되는 조건은 또한 해리 동력학에 기초하여 분별하도록 조작될 수 있다.
항-항원 클론은 활성에 기초하여 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 항원을 자연적으로 발현하는 살아있는 세포에 결합하거나 자유 부유 항원 또는 다른 세포 구조에 부착된 항원에 결합하는 항-항원 항체를 제공한다. 이러한 항-항원 항체에 상응하는 Fv 클론은 (1) 상기에서 기재된 바와 같이 파아지 라이브러리로부터 항-항원 클론을 단리하고, 임의로 적합한 박테리아 숙주에서 집단을 성장시킴으로써 파아지 클론의 단리된 집단을 증폭시키는 단계; (2) 차단 및 비-차단 활성을 각각 원하는 항원 및 제2 단백질을 선택하는 단계; (3) 항-항원 파아지 클론을 고정된 항원에 흡착시키는 단계; (4) 과잉의 제2 단백질을 이용하여 제2 단백질의 결합 결정인자와 중첩되거나 공유되는 항원-결합 결정인자를 인식하는 임의의 원하지 않는 클론을 용출시키는 단계; 및 (5) 단계 (4) 후 흡착된 상태로 남아있는 클론을 용출시키는 단계에 의해 선택될 수 있다. 선택적으로, 원하는 차단/비-차단 특성을 갖는 클론은 본원에 기재된 선택 절차를 1회 이상 반복함으로써 추가로 농축될 수 있다.
본 발명의 하이브리도마-유도된 단클론성 항체 또는 파아지 디스플레이 Fv 클론을 인코딩하는 DNA는 종래의 절차를 이용하여 (예를 들면 하이브리도마 또는 파아지 DNA 주형으로부터 관심있는 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용함으로써) 쉽게 단리되고 서열분석된다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터로 들어갈 수 있고, 이는 이후에 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주세포, 예컨대 E. 콜리 세포, 유인원 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포 내로 형질감염되어 재조합 숙주세포에서 원하는 단클론성 항체의 합성을 얻을 수 있다. 항체-인코딩 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 관한 검토 문헌은 하기를 포함한다: Skerra 등, Curr . Opinion in Immunol ., 5: 256 (1993) 및 Pluckthun, Immunol . Revs, 130: 151 (1992).
본 발명의 Fv 클론을 인코딩하는 DNA는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 공지된 DNA 서열과 조합되어 (예를 들면 적절한 DNA 서열이 전술한 카밧 등으로부터 수득될 수 있음) 전체 또는 부분 길이 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 클론을 형성할 수 있다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함하는 임의의 아이소타입의 불변 영역이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있으며, 상기 불변 영역이 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있음이 인정될 것이다. 하나의 동물 (예컨대 인간) 종으로부터 유래된 다음 또 다른 동물 종의 불변 영역 DNA에 융합되어 "하이브리드" 전장 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성하는 Fv 클론이 본원에서 사용된 바와 같은 "키메라성" 및 "하이브리드" 항체의 정의에 포함된다. 특정 구현예에서, 인간 가변 DNA로부터 유래된 Fv 클론은 인간 불변 영역 DNA에 융합되어 전체- 또는 부분-길이 인간 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성한다.
본 발명의 하이브리도마로부터 유래된 항-항원 항체를 인코딩하는 DNA는 또한, 예를 들면, 하이브리도마 클론으로부터 유래된 상동성 쥣과 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 대체함으로써 변형될 수 있다 (예를 들면 하기에서의 방법과 같음: Morrison 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81: 6851-6855 (1984)). 하이브리도마- 또는 Fv 클론-유래된 항체 또는 단편을 인코딩하는 DNA는 비-면역글로불린 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합함으로써 추가로 변형될 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 Fv 클론 또는 하이브리도마 클론-유래된 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라성" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.
(iv) 인간화 및 인간 항체
비-인간 항체를 인간화하기 위한 다양한 방법이 당해 기술에 공지되어 있다. 예를 들면, 인간화 항체는 비-인간인 공급원으로부터 그 안에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기이다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "도입(import)" 잔기로 지칭되며, 이는 전형적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 본질적으로 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 대체함으로써, Winter와 동료의 방법에 따라 수행될 수 있다 (Jones 등, Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann 등, Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen 등, Science, 239: 1534-1536 (1988)). 따라서, 그러한 "인간화" 항체는 키메라성 항체 (U.S. 특허 제4,816,567호)이며, 이는 실질적으로 온전하지 않은 인간 가변 도메인이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환되었다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체 내의 유사한 부위의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체를 제조하는데 사용되는 경쇄 및 중쇄의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "최적화" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 그 다음, 설치류와 가장 가까운 인간 서열이 인간화 항체를 위한 인간 프레임워크 (FR)로서 받아들여진다 (Sims 등, J. Immunol ., 151: 2296 (1993); Chothia 등, J. Mol . Biol ., 196: 901 (1987)). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 하위그룹의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크가 몇 가지 상이한 인간화 항체에 사용될 수 있다 (Carter 등, Proc . Natl . Acad Sci . USA, 89: 4285 (1992); Presta 등, J. Immunol., 151: 2623 (1993)).
항체가 항원에 대해 높은 친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 유지하면서 인간화되는 것이 더 중요하다. 이 목표를 달성하기 위해, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 인간화 항체는 친계 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 친계 서열 및 다양한 개념적인 인간화 생성물을 분석하는 공정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델이 일반적으로 이용가능하며, 이는 당해 분야의 숙련가에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태적 구조를 예시하고 표시하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 표시의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉, 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 원하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 수령체 및 도입 서열로부터 선택 및 조합될 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적으로 그리고 가장 실질적으로 관여한다.
본 발명의 인간 항체는 인간 유래의 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 상기에서 기재된 바와 같은 공지된 인간 불변 도메인 서열(들)과 조합함으로써 제작될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 인간 단클론성 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단클론성 항체를 생산하기 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주는, 예를 들면 하기 문헌에 기재되었다: Kozbor J. Immunol ., 133: 3001 (1984); Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner 등, J. Immunol., 147: 86 (1991).
면역화시, 내인성 면역글로불린 생산의 부재하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 형질전환 동물 (예를 들면, 마우스)을 생산할 수 있다. 예를 들면, 키메라성 및 생식계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동종접합성 결실이 내인성 항체 생산의 완전한 억제를 야기한다고 기재되었다. 그러한 생식계열 돌연변이 마우스에서 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 투여시 인간 항체의 생산을 야기할 것이다. 예를 들면, 하기를 참고한다: Jakobovits 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits 등, Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann 등, Year in Immuno ., 7: 33 (1993); 및 Duchosal 등 Nature 355: 258 (1992).
인간 항체가 출발하는 비-인간 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 갖는 경우, 유전자 셔플링 (gene shuffling)이 또한 비-인간, 예를 들면 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하는데 사용될 수 있다. "에피토프 각인 (epitope imprinting)"으로도 불리는 이 방법에 따르면, 파아지 디스플레이 기술 본원에서 기재된 바와 같은 파아지 디스플레이 기술에 의해 수득된 비-인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 중 어느 하나는 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어, 비-인간 사슬/인간 사슬 scFv 또는 Fab 키메라의 집단을 생성한다. 항원을 이용한 선택은 비-인간 사슬/인간 사슬 키메라성 scFv 또는 Fab의 단리를 야기하며, 여기서 상기 인간 사슬은 일차 파아지 디스플레이 클론 내의 상응하는 비-인간 사슬의 제거시 파괴된 항원 결합 부위를 회복시키며, 즉 에피토프는 인간 사슬 파트너의 선택을 지배 (각인)한다. 남아있는 비-인간 사슬을 대체하기 위해 상기 공정이 반복되는 경우, 인간 항체가 수득된다 (PCT WO 제93/06213호 (1993년 4월 1일 공개) 참고). CDR 이식에 의한 비-인간 항체의 전통적 인간화와 달리, 이 기술은 비-인간 기원의 FR 또는 CDR 잔기를 갖지 않는 완전한 인간 항체를 제공한다.
(v) 항체 단편
항체 단편은 전통적 수단, 예컨대 효소 소화에 의해, 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 어떤 경우, 전체의 항체보다 항체 단편을 이용하는 이점이 있다. 더 작은 크기의 단편은 빠른 소거가 가능하며, 고형 종양에 대한 개선된 접근을 야기할 수 있다. 어떤 항체 단편의 검토를 위해, 하기를 참고한다: Hudson 등(2003) Nat. Med. 9: 129-134.
항체 단편의 생산을 위해 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백분해 소화를 통해 유래되었다 (예를 들면, Morimoto 등, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); 및 Brennan 등, Science, 229: 81 (1985) 참고). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 대장균에서 발현되어 분비될 수 있으므로, 다량의 이들 단편의 손쉬운 생산을 가능하게 한다. 항체 단편은 상기 논의된 항체 파아지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 대장균으로부터 직접 회수될 수 있고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (Carter 등, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). 또 다른 접근법에 따르면, F(ab') 2 단편은 재조합 숙주 세포 배양으로부터 직접 단리될 수 있다. 구제 (salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab') 2 단편이 하기에 기재되어 있다: U.S. 특허 제5,869,046호. 항체 단편을 생산하기 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 특정 구현예에서, 항체는 단일 사슬 Fv 단편 (scFv)이다. WO 제93/16185호; U.S. 특허 제5,571,894호; 및 제5,587,458호를 참고한다. Fv 및 scFv는 불변 영역이 없는 온전한 결합 부위를 갖는 유일한 종이며; 따라서, 이들은 생체내 사용 동안 감소된 비특이적 결합에 적합할 수 있다. scFv 융합 단백질은 scFv의 아미노 또는 카복시 말단에서 효과기 단백질의 융합을 생성하도록 제작될 수 있다. 하기를 참고한다: Antibody Engineering, ed. Borrebaeck. 하기 항체 단편은 또한, 예를 들면, 하기에 기재된 "선형 항체"일 수 있다: U.S. 특허 제5,641,870호. 그러한 선형 항체는 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
(vi) 다중특이적 항체
다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 가지며, 여기서 상기 에피토프는 일반적으로 상이한 항원 유래이다. 그러한 분자는 일반적으로 2개의 상이한 에피토프 (즉 이중특이적 항체, BsAb)에만 결합하지만, 부가적인 특이성을 갖는 항체, 예컨대 삼중특이적 항체가 본원에서 사용될 때 이 표현에 포함된다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들면F(ab')2 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (상기 2개의 사슬은 상이한 특이성을 가짐)의 공동발현에 기초한다 (Millstein 등, Nature, 305: 537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 배열 때문에, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하며, 이들 중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 일반적으로 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 번거로우며 생성물 수율은 낮다. 유사한 절차가 하기에 개시되어 있다: WO 제93/08829호, 및 Traunecker 등, EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).
상이한 접근법에 따르면, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 적어도 하나의 융합 내에 존재하는 것이 전형적이다. 면역글로불린 중쇄 융합 및, 원한다면, 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 DNA는 별개의 발현 벡터에 삽입되고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동-형질감염된다. 이는 제작시 사용된 3개의 폴리펩타이드 사슬의 동일하지 않은 비가 최적의 수율을 제공할 때 구현예에서 3개의 폴리펩타이드 단편의 상호 비율을 조절하는데 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비의 적어도 2개의 폴리펩타이드 사슬의 발현이 높은 수율을 야기할 때 또는 상기 비가 특별한 유의성이 없을 때 하나의 발현 벡터 내에 2개 도는 3개의 폴리펩타이드 사슬에 대한 코딩 서열을 삽입할 수 있다.
이 접근법의 일 구현예에서, 이중특이적 항체는 하나의 팔 (arm) 내에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 팔 내에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이러한 비대칭 구조가 원치않는 면역글로불린 사슬 조합으로부터 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 한다는 것이 밝혀졌는데, 이중특이적 분자의 단지 절반 내에 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 손쉬운 분리 방식을 제공하기 때문이다. 이러한 접근법은 WO 제94/04690호에 개시되어 있다. 이중특이적 항체 생성의 추가의 세부사항의 경우, 예를 들면, 하기를 참고한다: Suresh 등, Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)을 참고한다.
WO제96/27011호에 기재된 또 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 접점은 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 이종이량체의 배분율을 최대화하도록 조작될 수 있다. 한 가지 접점은 항체 불변 도메인의 CH 3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 접점으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 더 큰 측쇄 (예를 들면 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄 (예를 들면 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 항체 분자의 접점 상에 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기의 보상성 "공동 (cavity)"이 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치않는 최종 생성물보다 이종이량체의 수율을 증가시키는 기전을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교결합된 항체 또는 "이종접합" 항체를 포함한다. 예를 들면, 이종접합체 내의 항체 중 하나는 아비딘에 결합되고, 다른 하나는 바이오틴에 결합될 수 있다. 그러한 항체는, 예를 들면, 면역계 세포를 원치않는 세포에 표적화시키고 (U.S. 특허 제4,676,980호), HIV 감염을 위해 (WO 제91/00360호, WO 제92/200373호, 및 EP 제03089호) 제안되어 왔다. 이종접합 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교결합제는 당해 기술에서 잘 알려져 있으며, 많은 가교결합 기술과 함께, 하기에 개시되어 있다: U.S. 특허 제4,676,980호.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술 역시 문헌에 기재되어 왔다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 화학 연결을 이용하여 제조될 수 있다. Brennan 등, Science, 229: 81 (1985)은 온전한 항체가 단백분해적으로 절단되어 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 기술한다. 이들 단편은 디티올 착화제 나트륨 아르세나이트 존재하에 환원되어 인접한 디티올을 안정화시키고 분자간 디설파이드 형성을 방지한다. 이후, 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. 이후, Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민을 이용한 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환되고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 제제로서 사용될 수 있다.
최근의 진보는 대장균으로부터 Fab'-SH 단편의 직접적인 회수를 용이하게 하였으며, 이는 화학적으로 결합되어 이중특이적 항체를 형성할 수 있다. Shalaby 등, J.Exp.Med., 175: 217-225 (1992)는 완전 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 기술한다. 각 Fab' 단편은 대장균으로부터 개별적으로 분비되어 시험관내에서 유도 화학 결합되어 이중특이적 항체를 형성하였다.
재조합 세포 배양으로부터 직접 이중특이적 항체를 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기재되었다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 이용하여 생산되었다. Kostelny 등, J. Immunol ., 148(5): 1547-1553 (1992). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩타이드는 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부위에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성한 다음 재산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 이 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산에 이용될 수 있다. Hollinger 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90: 6444-6448 (1993)에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대안적인 기전을 제공하였다. 상기 단편은 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이에 쌍을 형성하기에 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍을 형성하게 되어, 2개의 항원-결합 부위를 형성한다. 단일-사슬 Fv (sFv) 이량체를 사용함으로써 이중특이적 항체 단편을 제조하는 또 다른 전략이 또한 보고되었다. Gruber 등, J. Immunol, 152: 5368 (1994)를 참고한다.
2개를 초과하는 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들면, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다. Tuft 등 J. Immunol.147: 60 (1991).
(vii) 단일-도메인 항체
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 단일-도메인 항체이다. 단일-도메인 항체는 중쇄 가변 도메인의 모두 또는 일부 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 모두 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, Mass.; 예를 들면, U.S. 특허 제6,248,516호 B1 참고). 일 구현예에서, 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 모두 또는 일부로 이루어진다.
(viii) 항체 변이체
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 적절한 변화를 도입함으로써, 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 그러한 변형은, 예를 들면, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 작제물이 원하는 특징을 보유하는 한, 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 이뤄져 최종 작제물에 도달할 수 있다. 아미노산 변경이 서열이 만들어지는 시점에 대상 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.
(ix) 항체 유도체
본 발명의 항체는 당해 기술에 공지되어 있고 쉽게 이용가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비-제한적인 예는, 비제한적으로, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들면, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물에서의 안정성으로 인해 제조시 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 1개를 초과하는 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일하거나 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 비제한적으로 개선될 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 정의된 조건 하에 요법에서 사용될지 여부 등을 포함하는 고려사항에 기초하여 결정될 수 있다.
(x) 벡터, 숙주세포, 및 재조합 방법
항체는 또한, 재조합 방법을 이용하여 생산될 수 있다. 항-항원 항체의 재조합 생산을 위해, 항체를 인코딩하는 핵산이 단리되고 추가 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입된다. 항체를 인코딩하는 DNA는 종래의 절차를 이용하여 (예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용하여) 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로, 비제한적으로, 하기 중 하나 이상을 포함한다: 신호 서열, 복제 원점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
(a) 신호 서열 성분
본 발명의 항체는 직접적으로뿐만 아니라 바람직하게는 성숙한 단백질 또는 폴리펩타이드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩타이드인 이종성 폴리펩타이드와의 융합 폴리펩타이드로서 재조합적으로 생산될 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 바람직하게는 숙주세포에 의해 인식되고 가공되는 (예를 들면, 신호 펩티다아제에 의해 절단되는) 것이다. 천연 항체 신호 서열을 인식 및 가공하지 않는 원핵 숙주세포의 경우, 신호 서열은, 예를 들면, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열안정성 장독소 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵 신호 서열에 의해 치환된다. 효모 분비를 위해, 천연 신호 서열은, 예를 들면, 효모 인버타제 리더, 인자 리더 (사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더 포함), 또는 산 포스파타제 리더, C. 알비칸스 글루코아밀라아제 리더, 또는 WO 제90/13646호에 기재된 신호에 의해 치환될 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들면, 단순 포진 gD 신호가 이용가능하다.
(b) 복제 원점
발현 및 클로닝 벡터는 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 벡터가 복제될 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서, 이 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있게 하는 것이며, 복제 원점 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 그러한 서열은 다양한 박테리아, 효모, 및 바이러스에 대해 잘 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 원점은 대부분의 그램-음성 박테리아에 적합하고, 2μ 플라스미드 원점은 효모에 적합하며, 다양한 바이러스 원점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 원점 성분은 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다 (SV40 원점은 전형적으로 초기 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있음).
(c) 선별 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선별 마커로도 불리는 선별 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들면, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에게 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보충하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용불가능한 중요 영양소, 예를 들면, 바실러스의 경우 D-알라닌 라세마제를 인코딩하는 유전자를 공급하는 단백질을 인코딩한다.
선별 계획의 한 가지 예는 숙주세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하므로 선별 요법에서 살아남는다. 그러한 우성 선별의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 사용한다.
포유동물 세포를 위한 적합한 선별 마커의 또 다른 예는 항체-인코딩 핵산, 예컨대 DHFR, 글루타민 합성효소 (GS), 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 탈탄산효소, 등을 소비하는데 능숙한 세포의 확인을 가능하게 하는 것이다.
예를 들면, DHFR 유전자로 형질전환된 세포는 상기 형질전환체를 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 배양함으로써 확인된다. 이들 조건 하에, DHFR 유전자는 임의의 다른 공동-형질전환된 핵산과 함께 증폭된다. 내인성 DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예를 들면, ATCC CRL-9096)이 사용될 수 있다.
대안적으로, GS 유전자로 형질전환된 세포는 상기 형질전환체를 GS의 억제제인 L-메티오닌 설폭시민 (Msx)을 함유하는 배양 배지에서 배양함으로써 확인된다. 이들 조건 하에, GS 유전자는 임의의 다른 공동-형질전환된 핵산과 함께 증폭된다. GS 선별/증폭 시스템은 상기 기재된 DHFR 선별/증폭 시스템과 함께 사용될 수 있다.
대안적으로, 관심있는 항체를 인코딩하는 DNA 서열, 야생형 DHFR 유전자, 및 또 다른 선별 마커, 예컨대 아미노글리코시드 3'-인산전달효소 (APH)로 형질전환되거나 공동-형질전환된 숙주세포 (특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 아미노글리코시드 항생제, 예를 들면, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418와 같은 선별 마커에 대한 선별제를 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선별될 수 있다. U.S. 특허 제4,965,199호를 참고한다.
효모에서 사용하는데 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (Stinchcomb 등, Nature, 282: 39 (1979)). trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이 균주, 예를 들면, ATCC 번호44076 또는 PEP4-1에 대한 선별 마커를 제공한다. Jones, Genetics, 85: 12 (1977). 그리고 나서, 효모 숙주세포 게놈 내에 trp1 병변의 존재는 트립토판의 부재시 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍된 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 갖는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.
또한, 1.6 μm 원형 플라스미드 pKD1으로부터 유래된 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 대안적으로, 재조합 송아지 카이모신의 대규모 생산을 위한 발현 시스템이 K. 락티스에 대해 보고되었다. (Van den Berg, Bio/Technology, 8: 135 (1990)). 또한 클루이베로마이세스의 산업적 균주에 의해 성숙한 재조합 인간 혈청 알부민을 분비하기 위한 안정적인 다중-카피 발현 벡터가 개시되었다. Fleer 등, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991).
(d) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주에 사용하는데 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토오스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제 프로모터, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지된 박테리아 프로모터도 적합하다. 박테리아 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 또한 항체를 인코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.
프로모터 서열은 진핵생물에 대해 공지되어 있다. 실제로 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 약 25 내지 30 염기 상류에 위치한 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 시작으로부터 70 내지 80 염기 상류에서 발견되는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역 (여기서, N은 임의의 뉴클레오타이드일 수 있음)이다. 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단에는 AATAAA 서열이 있으며, 이는 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 테일을 부가하기 위한 신호일 수 있다. 이들 서열 모두는 진핵 발현 벡터에 적합하게 삽입된다.
효모 숙주와 함께 사용하기 위한 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예컨대 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소, 헥소키나제, 피루베이트 탈탄산효소, 포스포프럭토키나제, 글루코오스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코오스 이소머라제, 및 글루코키나제를 위한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 제어된 전사의 추가 이점을 갖는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터는, 알코올 탈수소효소 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소, 및 말토오스 및 갈락토오스 이용을 담당하는 효소를 위한 프로모터 영역이다. 효모 발현에서 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터가 EP 제73,657호에 추가로 기재되어 있다. 효모 인핸서가 또한 효모 프로모터와 함께 유익하게 사용된다.
포유동물 숙주세포에서 벡터로부터의 항체 전사는, 프로모터가 숙주 세포 시스템과 양립하면, 예를 들면, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 유인원 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득된 프로모터에 의해, 또는 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들면, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터, 열-충격 프로모터로부터 수득된 프로모터에 의해 제어될 수 있다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 원점을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 (immediate early) 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로서 이용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 U.S. 특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 이 시스템의 변형은 U.S. 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 또한 단순 포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어 하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 대해 하기를 참조한다: Reyes 등, Nature 297: 598-601 (1982). 대안적으로, 루 육종 바이러스 긴 말단 반복이 프로모터로서 사용될 수 있다.
(e) 인핸서 요소 성분
고등 진핵생물에 의한 본 발명의 항체를 인코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백, 및 인슐린)로부터 알려져 있다. 그러나, 전형적으로, 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 예는 복제 원점의 말단 부분 (bp 100-270)의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 원점의 말단 부분의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소에 대해 하기를 참조한다: Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982). 인핸서는 항체-인코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터에 접합될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
(f) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 또한 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 그러한 서열은 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및, 가끔 3', 비번역 영역으로부터 일반적으로 이용가능하다. 이들 영역은 항체를 인코딩하는 mRNA의 비번역 부분에 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 분절을 함유한다. 한 가지 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO제94/11026호 및 상기 문헌에 개시된 발현 벡터를 참고한다.
(g) 숙주세포의 선택 및 형질전환
본원에서 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 발현하기 위한 적합한 숙주세포는 상기 기재된 원핵, 효모, 또는 고등 진핵 세포이다. 이러한 목적을 위한 적합한 원핵생물은 진균, 예컨대 그램-음성 또는 그램-양성 유기체, 예를 들면, 엔테로박테리아세애, 예컨대 에스케리치아, 예를 들면, E. 콜리, 엔테로박터, 어위니아, 클렙시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 예를 들면, 살모넬라 타이피뮤리움, 세라티아, 예를 들면, 세라티아 마르체칸스, 및 시겔라, 뿐만 아니라 바실러스 예컨대 B. 서브틸리스 및 B. 리케니포르미스 (예를 들면, 1989년 4월 12일에 공개된 DD 266,710에 개시된 B. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 예컨대 P. 에어루기노사, 및 스트렙토마이세스를 포함한다. 대장균 B, 대장균 X1776 (ATCC 31,537), 및 대장균 W3110 (ATCC 27,325)가 적합하지만, 한 가지 바람직한 대장균 클로닝 숙주는 대장균 294 (ATCC 31,446)이다. 이들 예는 제한적이라기보다는 예시적이다.
전장 항체, 항체 융합 단백질, 및 항체 단편은, 특히 당화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않을 때, 예컨대 그 자체로 종양 세포 파괴 효과를 나타내는 세포독성 약물 (예를 들면, 독소)에 치료 항체가 접합될 때, 박테리아에서 생산될 수 있다. 전장 항체는 순환에서 더 큰 반감기를 갖는다. 대장균에서의 생산은 더 빠르고 더 비용 효율적이다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩타이드의 발현을 위해, 예를 들면, U.S. 특허 제5,648,237호 (Carter 등), U.S. 특허 제5,789,199호 (Joly 등), U.S. 특허 제5,840,523호 (Simmons 등) (발현 및 분비를 최적화하기 위한 번역 개시 영역 (TIR) 및 신호 서열을 기재)를 참고한다. 또한 하기를 참조한다: Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254 (대장균에서 항체 단편의 발현을 기재). 발현 후, 항체는 가용성 분획 내의 대장균 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 아이소타입에 따라, 예컨대 단백질 A 또는 G 칼럼을 통해 정제될 수 있다. 최종 정제는 예를 들면, CHO 세포에서 발현된 항체를 정제하는 공정과 유사하게 수행될 수 있다.
원핵생물 외에도, 사상균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 항체-인코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애, 또는 일반적인 빵 효모가 하등 진핵 숙주 미생물 가운데 가장 통상적으로 사용되는 것이다. 그러나, 수많은 다른 속, 종, 및 균주, 예컨대 쉬조사카로마이세스 폼베; 클루이베로마이세스 숙주, 예를 들면, K. 락티스, K. 프라길리스 (ATCC 12,424), K. 불가리쿠스 (ATCC 16,045), K. 위케라미 (ATCC 24,178), K. 왈티이 (ATCC 56,500), K. 드로소필라룸 (ATCC 36,906), K. 써모톨레란스, 및 K. 마르시아누스; 야로위아 (EP 402,226); 피치아 패스토리스 (EP 183,070); 칸디다; 트리코데르마 레에시아 (EP 244,234); 뉴로스포라 크라싸; 쉬완니오마이세스, 예컨대 쉬완니오마이세스 옥시덴탈리스; 및 사상균, 예를 들면, 뉴로스포라, 페니실리움, 톨리포클라디움, 및 아스페르길루스 숙주, 예컨대 A. 니둘란스 및 A. 니제르가 일반적으로 이용가능하며 본원에서 유용하다. 치료 단백질의 생산을 위해 효모 및 사상균의 사용을 논의하는 검토를 위해, 예를 들면, Gerngross, Nat.Biotech.22: 1409-1414 (2004)를 참고한다.
당화 경로가 "인간화"되어, 부분적 또는 완전 인간 당화 패턴을 갖는 항체의 생산을 야기하는, 특정한 진균 및 효모 균주가 선택될 수 있다. 예를 들면, 하기를 참고한다: Li 등, Nat.Biotech.24: 210-215 (2006) (피치아 패스토리스에서 당화 경로의 인간화를 기재); 및 전술한 Gerngross 등.
당화된 항체의 발현에 적합한 숙주세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 스포도프테라 프루지페르다 (유충), 아에데스 아에집티 (모기), 아에데스 알보픽투스 (모기), 드로소필라 멜라노가스테르 (초파리), 및 봄빅스 모리와 같은 숙주로부터의 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 상응하는 허용된 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들면, 오토그라파 칼리포르니카 NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공중에게 이용가능하며, 그러한 바이러스는, 특히 스포도프테라 프루지페르다 세포의 형질감염을 위해, 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로서 사용될 수 있다.
면, 옥수수, 감자, 대두, 피튜니아, 토마토, 개구리밥 (duckweed) (레니나세애), 알팔파 (M. 트룬카툴라), 및 담배의 식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들면, 하기를 참고한다: U.S. 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호, 및 제6,417,429호 (형질전환 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 기재).
척추동물 세포는 숙주로서 사용될 수 있고, 배양 (조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식이 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 세포 또는 현탁 배양에서 성장하기 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham 등, J. Gen Virol . 36: 59 (1977)); 어린 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol . Reprod . 23: 243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 갯과 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather 등, Annals N.Y . Acad . Sci . 383: 44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 세포주 (Hep G2)이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예컨대 DHFR- CHO 세포 (Urlaub 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77: 4216 (1980)); 및 골수종 세포주, 예컨대 NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 어떤 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들면, 하기를 참고한다: Yazaki 및 Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268.
숙주세포는 항체 생산을 위해 전술한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 또는 원하는 서열을 인코딩하는 유전자를 증폭하는데 적합한 변형된 종래의 영양소 배지에서 배양된다.
(h) 숙주세포 배양
본 발명의 항체를 생산하기 위해 사용된 숙주세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대 Ham's F10 (시그마), 최소 필수 배지 ((MEM), (시그마), RPMI-1640 (시그마), 및 둘베코 변형된 이글 배지 ((DMEM), 시그마)가 숙주세포를 배양하는데 적합하다. 또한, 문헌[Ham 등, Meth . Enz . 58: 44 (1979), Barnes 등, Anal. Biochem . 102: 255 (1980), U.S. 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 제90/03430호; WO 제87/00195호; 또는 U.S. 특허 Re. 30,985에 기재된 배지 중 어느 것이 숙주세포를 위한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지 중 어느 것은 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 버퍼 (예컨대 HEPES), 뉴클레오타이드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 겐타마이신TM 약물), 미량 원소 (일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코오스 또는 동등한 에너지원이 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물이 또한, 당해 분야의 숙련가에게 공지될 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH, 등은, 발현을 위해 선택된 숙주세포와 함께 앞서 사용된 것이며, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
(xi) 항체의 정제
재조합 기술을 사용할 때, 항체는 주변세포질 공간에서 세포내에서 생산될 수 있거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서, 미립자 잔해인 숙주세포 또는 용해된 단편이, 예를 들면, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. Carter 등, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)은 대장균의 주변세포질 공간으로 분비된 항체를 단리시키는 절차를 기술한다. 요약하면, 세포 페이스트는 약 30분간 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 해동된다. 세포 잔해는 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 항체가 배지내로 분비되는 경우, 그러한 발현 시스템으로부터의 상청액은 일반적으로 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들면, 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Pellicon) 한외여과 유닛을 이용하여 먼저 농축된다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제가 단백질 분해를 억제하기 위해 전술한 단계 중 임의의 단계에 포함될 수 있고, 항생제가 우발적인 오염물의 성장을 막기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들면, 하이드록아파타이트 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있고, 친화성 크로마토그래피는 형적으로 바람직한 정제 단계 중 하나이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 아이소타입에 좌우된다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제하는데 사용될 수 있다 (Lindmark 등, J. Immunol . Meth . 62: 1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 아이소타입 및 인간 γ3에 대해 권고된다 (Guss 등, EMBO J. 5: 15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔히 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 제어된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드 (Bakerbond) ABXTM 수지 (J.T.Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온교환 칼럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 세파로오스TM 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온교환수지 (예컨대 폴리아스파르트산 칼럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 암모늄 설페이트 침전이 회수될 항체에 따라 또한 이용가능하다.
일반적으로, 전술한 방법론과 일치하고/거나 관심있는 특정한 항체에 대해 당해 분야의 숙련가에 의해 적절한 것으로 간주된 바와 같은, 연구, 시험, 및 임상에서 사용하기 위한 항체를 제조하는 다양한 방법론이 당해 기술에서 잘 확립되어 있다.
B. 생물학적 활성 항체의 선택
상기에서 기재된 바와 같이 생산된 항체는 치료적 관점에서 유익한 특성을 갖는 항체를 선택하기 위해 하나 이상의 "생물학적 활성" 분석이 수행될 수 있다. 항체는 항원에 결합하는 그의 상승된 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들면, 항-VEGF 항체의 경우, 항체의 항원 결합 특성은 VEGF에 결합하는 능력을 검출하는 분석에서 평가될 수 있다. 또 다른 예에서, 항-CD20 항체의 경우, 항체의 항원 결합 특성은 CD20에 결합하는 능력을 검출하는 분석에서 평가될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 항체의 친화도는 예를 들면, 포화 결합; ELISA; 및/또는 경쟁 분석 (예를 들면RIA)에 의해 결정될 수 있다.
또한, 항체는, 예를 들면, 치료제로서 그의 유효성을 평가하기 위해 다른 생물학적 활성 분석이 수행될 수 있다. 그러한 분석은 당해 기술에 공지되어 있고 항체에 대한 표적 항원 및 의도한 용도에 좌우된다.
관심있는 항원 상의 특정 에피토프에 결합하는 항체 (예를 들면, 예시의 항-VEGF 항체가 VEGF에 결합하는 것을 차단하는 항체)를 스크리닝하기 위해, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)에 기재된 것과 같은 일상적인 교차-차단 분석이 수행될 수 있다. 대안적으로, Champe 등, J. Biol. Chem .270: 1388-1394 (1995)에서 기재된 바와 같은 에피토프 맵핑이, 항체가 관심있는 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해 수행될 수 있다.
용어 "CD20 항원의 발현”은 각각 종양 또는 암, 바람직하게는 비-고형 종양으로부터, 세포에서의, 바람직하게는 T- 또는 B- 세포, 더 바람직하게는 B-세포의 표면 상에서의 CD20 항원의 유의미한 발현 수준을 가리키고자 하는 것이다. “CD20 발현 암”을 갖는 환자는 당해 기술에서 공지된 표준 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, CD20 항원 발현은 면역조직화학적 (IHC) 검출, FACS 또는 상응하는 mRNA의 PCR-기반 검출을 통해 측정된다.
C. 제형의 제조
관심있는 항체의 제조 후 (예를 들면, 본원에 개시된 바와 같이 제형화될 수 있는 항체를 생산하는 기술은 하기에 상술될 것이고 당해 기술에 공지되어 있음), 이를 포함하는 약제학적 제형이 제조된다. 특정 구현예에서, 제형화될 항체는 사전에 동결건조되지 않았으며 본원에서 관심있는 제형은 수성 제형이다. 특정 구현예에서, 항체는 전장 항체이다. 일 구현예에서, 제형 내의 항체는 F(ab')2와 같은 항체 단편이며, 이 경우에 전장 항체에 대해 발생할 수 없는 문제점 (예컨대 Fab에 대한 항체의 클립핑 (clipping))이 해결될 필요가 있을 수 있다. 제형에 존재하는 치료적 유효량의 항체는 예를 들면, 원하는 용량 부피 및 투여 방식(들)을 고려하여 결정된다. 약 25 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 또는 약 30 mg/mL 내지 약 100 mg/mL 또는 약 45 mg/mL 내지 약 55 mg/mL이 제형 내의 예시적인 항체 농도이다.
pH-완충 용액 중에 항체를 포함하는 수성 제형이 제조된다. 본 발명의 버퍼는 약 5.5 내지 약 7.0 범위의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 pH는 pH 5.5 내지 6.5의 범위, pH 5.7 내지 6.8의 범위, pH 5.8 내지 6.5의 범위, pH 5.9 내지 6.5의 범위, pH 6.0 내지 6.5의 범위, 또는 pH 6.2 내지 6.5의 범위이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 제형은 6.2 또는 약 6.2의 pH를 갖는다. 본 발명의 특정 구현예에서, 제형은 6.0 또는 약 6.0의 pH를 갖는다. pH를 이 범위 내로 제어할 버퍼의 예는 인산나트륨 및 히스티딘 (예컨대 L-히스티딘)을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 제형 또는 버퍼 중의 “히스티딘”에 대한 언급은 당해 기술에 공지된 히스티딘의 임의의 형태를 지칭할 수 있으며, 이는 비제한적으로 히스티딘-HCl 또는 히스티딘 클로라이드, 히스티딘 아세테이트, 히스티딘 포스페이트, 히스티딘 설페이트 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 버퍼는 35 mM 초과 내지 약 100 mM 이하의 농도의 포스페이트 (예를 들면, 인산나트륨)를 함유한다. 일부 구현예에서, 버퍼는 약 15 mM 내지 약 100 mM의 농도의 포스페이트 (예를 들면, 인산나트륨)를 함유한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 버퍼는 약 15 mM, 약 20 mM, 약 22 mM, 약 25 mM, 약 28 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 36 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 51 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 또는 약 100 mM의 농도의 인산나트륨을 함유한다. 일부 구현예에서, 버퍼는 하기 농도 중 대략 어느 것 미만의 농도의 인산나트륨을 함유한다: 100 mM, 95 mM, 90 mM, 85 mM, 80 mM, 75 mM, 70 mM, 65 mM, 60 mM, 55 mM, 51 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM, 36 mM, 35 mM, 30 mM, 28 mM, 25 mM, 22 mM, 또는 20 mM.일부 구현예에서, 버퍼는 하기 농도 중 대략 어느 것 미만의 농도의 인산나트륨을 함유한다: 15 mM, 20 mM, 22 mM, 25 mM, 28 mM, 30 mM, 35 mM, 36 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 51 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 또는 95 mM.즉, 버퍼 내의 인산나트륨의 농도는 약 100 mM, 95 mM, 90 mM, 85 mM, 80 mM, 75 mM, 70 mM, 65 mM, 60 mM, 55 mM, 51 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM, 36 mM, 35 mM, 30 mM, 28 mM, 25 mM, 22 mM, 또는 20 mM의 상한 및 약 15 mM, 20 mM, 22 mM, 25 mM, 28 mM, 30 mM, 35 mM, 36 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 51 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 또는 95 mM의 독립적으로 선택된 하한을 갖는 농도 범위 중 어느 것일 수 있으며, 여기서 하한은 상한 미만이다.
특정 구현예에서, 버퍼는 약 40 mM 내지 약 100 mM의 농도의 히스티딘을 함유한다. 특정 구현예에서, 버퍼는 약 15 mM 내지 약 100 mM의 농도의 히스티딘을 함유한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 버퍼는 약 15 mM, 약 20 mM, 약 22 mM, 약 25 mM, 약 28 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 36 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 51 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 또는 약 100 mM의 농도의 히스티딘을 함유한다. 일부 구현예에서, 버퍼는 하기 농도 중 대략 어느 것 미만의 농도의 히스티딘을 함유한다: 100 mM, 95 mM, 90 mM, 85 mM, 80 mM, 75 mM, 70 mM, 65 mM, 60 mM, 55 mM, 51 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM, 36 mM, 35 mM, 30 mM, 28 mM, 25 mM, 22 mM, 또는 20 mM.일부 구현예에서, 버퍼는 하기 농도 중 대략 어느 것 미만의 농도의 히스티딘을 함유한다: 15 mM, 20 mM, 22 mM, 25 mM, 28 mM, 30 mM, 35 mM, 36 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 51 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 또는 95 mM.즉, 버퍼 내의 히스티딘의 농도는 약 100 mM, 95 mM, 90 mM, 85 mM, 80 mM, 75 mM, 70 mM, 65 mM, 60 mM, 55 mM, 51 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM, 36 mM, 35 mM, 30 mM, 28 mM, 25 mM, 22 mM, 또는 20 mM의 상한 및 약 15 mM, 20 mM, 22 mM, 25 mM, 28 mM, 30 mM, 35 mM, 36 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 51 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 또는 95 mM의 독립적으로 선택된 하한을 갖는 농도의 범위 중 어느 것일 수 있고, 여기서 하한은 상한 미만이다.
제형은 약 45 mM 내지 약 634 mM, 약 50 mM 내지 약 600 mM, 또는 약 150 mM 내지 약 400 mM의 양의 트레할로오스를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제형 내의 트레할로오스는 약 45 mM 내지 약 600 mM, 약 45 mM 내지 약 550 mM, 약 45 mM 내지 약 500 mM, 약 45 mM 내지 약 450 mM, 약 45 mM 내지 약 400 mM, 약 45 mM 내지 약 350 mM, 약 45 mM 내지 약 300 mM, 약 45 mM 내지 약 250 mM, 약 45 mM 내지 약 200 mM, 약 45 mM 내지 약 180 mM, 약 45 mM 내지 약 150 mM, 약 45 mM 내지 약 140 mM, 약 45 mM 내지 약 135 mM, 약 45 mM 내지 약 130 mM, 약 45 mM 내지 약 120 mM, 약 45 mM 내지 약 110 mM, 약 45 mM 내지 약 100 mM, 약 180 mM 내지 약 634 mM, 약 50 mM 내지 약 600 mM, 또는 약 150 mM 내지 약 400 mM이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 트레할로오스는 약 45 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 약 135 mM, 약 140 mM, 약 150 mM, 약 180 mM, 약 200 mM, 약 250 mM, 약 300 mM, 약 350 mM, 약 400 mM, 약 450 mM, 약 500 mM, 약 550 mM, 약 600 mM, 약 610 mM, 약 620 mM, 약 630 mM, 또는 약 634 mM이다. 일부 구현예에서, 제형은 하기 농도 중 대략 어느 것 미만의 농도의 트레할로오스를 함유한다: 634 mM, 630 mM, 620 mM, 610 mM, 600 mM, 550 mM, 500 mM, 450 mM, 400 mM, 350 mM, 300 mM, 250 mM, 200 mM, 180 mM, 150 mM, 140 mM, 135 mM, 130 mM, 120 mM, 110 mM, 100 mM, 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 또는 50 mM.일부 구현예에서, 제형은 하기 농도 중 대략 어느 것 초과의 농도의 트레할로오스를 함유한다: 45 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 135 mM, 140 mM, 150 mM, 180 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 610 mM, 620 mM, 또는 630 mM.즉, 제형 내의 트레할로오스의 농도는 약 634 mM, 630 mM, 620 mM, 610 mM, 600 mM, 550 mM, 500 mM, 450 mM, 400 mM, 350 mM, 300 mM, 250 mM, 200 mM, 180 mM, 150 mM, 140 mM, 135 mM, 130 mM, 120 mM, 110 mM, 100 mM, 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 또는 50 mM의 상한 및 약 45 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 135 mM, 140 mM, 150 mM, 180 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 610 mM, 620 mM, 또는 630 mM의 독립적으로 선택된 하한을 갖는 농도의 범위 중 어느 것일 수 있고, 여기서 하한은 상한 미만이다.
일부 구현예에서, 제형 내의 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 0.41 이상 내지 1.65 미만이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 0.41 내지 0.73이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 0.73 내지 1.47이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 0.49 내지 1.47이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체 대 트레할로오스의 중량비는 0.41, 0.45, 0.50, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.95, 1.00, 1.05, 1.10, 1.15, 1.20, 1.25, 1.30, 1.35, 1.40, 1.45, 1.50, 1.55, 1.60, 및 1.64 중 어느 것(이들 숫자 사이의 모든 값을 포함함)이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항체 대 트레할로오스의 중량비를 계산하기 위한 제형 내의 트레할로오스의 중량은 트레할로오스 디히드레이트 (MW 378.33)의 양에 기초한다. 다른 형태의 트레할로오스 (예를 들면, 무수 트레할로오스)가 사용되는 경우, 제형 내의 트레할로오스의 중량은 동일한 몰 농도를 갖는 트레할로오스 디히드레이트의 중량으로 전환되어야 한다.
일부 구현예에서, 트레할로오스 이외의 폴리올이 트레할로오스를 대체할 수 있다. 예를 들면, 수크로오스, 만니톨, 락토오스, 글리세롤, 및/또는 프로필렌 글리콜이 트레할로오스를 대체할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 항체 제형 내의 트레할로오스에 대한 어떤 언급에서, 상기 트레할로오스는 트레할로오스 이외의 폴리올 (예를 들면, 상기 열거된 것)로 대체될 수 있다.
계면활성제가 항체 제형에 임의로 첨가될 수 있다. 예시적인 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (예를 들면 폴리소르베이트 20, 80 등) 또는 폴록사머 (예를 들면 폴록사머 188 등)를 포함한다. 첨가된 계면활성제의 양은 제형화된 항체의 응집을 감소시키고/거나 제형에서 미립자의 형성을 최소화하고/거나 흡착을 감소시키기 위한 양이다. 예를 들면, 계면활성제는 약 0.001% 내지 약 0.5%, 약 0.005% 내지 약 0.2%, 약 0.01% 내지 약 0.1%, 또는 약 0.02% 내지 약 0.06%, 또는 약 0.03% 내지 약 0.05%의 양으로 제형 내에 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 계면활성제는 0.04% 또는 약 0.04%의 양으로 제형 내에 존재한다. 특정 구현예에서, 계면활성제는 0.02% 또는 약 0.02%의 양으로 제형 내에 존재한다. 일 구현예에서, 제형은 계면활성제를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 제형은 상기-확인된 제제 (예를 들면, 항체, 버퍼, 트레할로오스, 및/또는 계면활성제)를 함유하고 하나 이상의 보존제, 예컨대 벤질 알코올, 페놀, m-크레졸, 클로로부탄올 및 벤즈에토늄 Cl이 본질적으로 없다. 또 다른 구현예에서, 특히 제형이 다회용량 제형인 경우, 보존제가 제형 내에 포함될 수 있다. 보존제의 농도는 약 0.1% 내지 약 2%, 바람직하게는 약 0.5% 내지 약 1%의 범위일 수 있다. 제형의 원하는 특징에 부정적으로 영향을 미치지 않는 한, 하나 이상의 다른 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제, 예컨대 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.Ed.(1980)에 기재된 것이 제형 내에 포함될 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 이용된 복용량 및 농도에서 수령체에게 비독성이며, 추가의 완충제; 공용매; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; EDTA와 같은 킬레이트제; 금속 착물 (예를 들면Zn-단백질 복합체); 폴리에스테르와 같은 생분해성 중합체; 및/또는 염 형성 반대이온을 포함한다. 본원에서 예시적인 약제학적으로 허용가능한 담체는 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)와 같은 기관내 약물 분산제를 추가로 포함한다. 특정 예시적인 sHASEGP 및 rHuPH20을 포함하는 사용 방법이 하기에 기재되어 있다: US 특허 공개 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호.일 측면에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
본원의 킬레이트제의 다양한 설명이 종종 EDTA에 집중되어 있지만, 다른 금속 이온 킬레이트제 역시 본 발명에 포함된다는 것이 인정될 것이다. 금속 이온 킬레이트제는 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있으나, 아미노폴리카복실레이트, EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산), EGTA (에틸렌 글리콜-비스(베타-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산), NTA (니트릴로트리아세트산), EDDS (에틸렌 디아민 디석시네이트), PDTA (1,3-프로필렌디아민테트라아세트산), DTPA (디에틸렌트리아민펜타아세트산), ADA (베타-알라닌디아세트산), MGCA (메틸글리신디아세트산) 등에 반드시 제한되는 것은 아니다. 추가로, 본원의 일부 구현예는 포스포네이트/포스폰산 킬레이트제를 포함한다.
본원의 제형은 또한 치료될 특정 징후에 필요한 하나를 초과하는 단백질, 바람직하게는 다른 단백질에 부정적으로 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 단백질을 함유할 수 있다. 예를 들면, 항체가 항-VEGF인 경우, 그것은 또 다른 제제 (예를 들면, 화학치료제, 및 항-신생물성 제제)와 조합될 수 있다.
일부 구현예에서, 제형 내의 항체의 물리적 안정성, 화학 안정성, 또는 생물학적 활성이 평가되거나 측정된다. 본 기술분야에 공지된 임의의 방법이 안정성 및 생물학적 활성을 평가하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제형 내의 항체는 -20 ℃에서 적어도 약 12개월, 적어도 약 18개월, 적어도 약 21개월, 또는 적어도 약 24개월 (또는 적어도 약 52주) 동안 안정하다. 일부 구현예에서, 안정성은 보관 후 제형에서 고분자량 종 (HMWS)의 형성에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 제형 내의 HMWS의 퍼센트는 -20 ℃에서 적어도 약 6개월, 적어도 약 12개월, 적어도 약 18개월, 또는 적어도 약 24개월 동안 보관 후 약 0.8%, 약 0.9%, 또는 약 1% 중 어느 것 미만이다. 일부 구현예에서, 제형 내의 총 응집물은 -20 ℃에서 적어도 약 6개월, 적어도 약 12개월, 적어도 약 18개월, 또는 적어도 약 24개월 동안 보관 후 약 2.5%, 또는 약 3% 중 어느 것 미만이다.
생체내 투여를 위해 사용되는 제형은 멸균이어야 한다. 이것은 제형의 제조 전 또는 후에, 멸균된 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
III. 항체 제형의 투여
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 바와 같은 제형은 대상체 투여용이다. 제형은 공지된 방법에 따라, 예컨대 볼러스로서 정맥내 투여 또는 일정 기간 동안 연속적인 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 안구내, 관절내, 활막내, 척추강내, 경구, 국소, 또는 흡입 경로에 의해, 항체 치료르르 필요로 하는 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 제형은 정맥내 투여에 의해 포유동물에게 투여된다. 이러한 목적을 위해, 제형은, 예를 들면 주사기를 이용하여 또는 IV 라인을 통해 주사될 수 있다. 일 구현예에서, 제형은 피하투여에 의해 포유동물에게 투여된다.
항체의 적절한 투여량 ("치료적 유효량")은, 예를 들면, 치료될 병태, 병태의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적을 위해 투여되는지 여부, 이전의 요법, 항체에 대한 환자의 임상 이력 및 반응, 사용된 항체의 유형, 및 주치의의 재량에 좌우될 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료 동안 환자에게 적합하게 투여되며, 진단 이후부터 임의의 시간에 환자에게 투여될 수 있다. 항체는 단일 치료로서 투여되거나, 문제의 병태를 치료하는데 유용한 다른 약물 또는 요법과 함께 투여될 수 있다.
일반적인 제의로서, 투여된 항체의 치료적 유효량은 하나 이상의 투여에 관계없이 환자 체중의 약 0.1 내지 약 50 mg/kg의 범위일 것이며, 사용된 항체의 전형적인 범위는, 예를 들어, 매일 투여는, 약 0.3 내지 약 20 mg/kg, 바람직하게는 약 0.3 내지 약 15 mg/kg이다. 그러나, 다른 복용량 요법이 유용할 수 있다. 일 구현예에서, 길항제는 1, 2, 3, 또는 4주마다 약 100 또는 400 mg의 용량으로 투여되거나 또는 1, 2, 3, 또는 4주마다 약 1, 3, 5, 7.5, 10, 15, 또는 20 mg/kg의 용량으로 투여되는 항-VEGF 항체이다. 용량은 단회 용량으로서 또는 다중 용량 (예를 들면, 2 또는 3 용량), 예컨대 주입으로서 투여될 수 있다. 이 요법의 진행은 종래의 기술에 의해 쉽게 모니터링된다.
IV.제조 물품
본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 수성 약제학적 제형을 보유하고 선택적으로 그의 사용 설명서를 제공하는 용기를 포함하는 제조 물품이 제공된다. 적합한 용기는, 예를 들면, 병, 바이알 및 주사기를 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 예시적인 용기는 3-20 cc 1회용 유리 바이알이다. 대안적으로, 다회용량 제형의 경우, 용기는 3-100 cc 유리 바이알일 수 있다. 용기는 제형을 보유하고, 용기 상의, 또는 용기에 결합된 라벨은 사용 지침을 나타낼 수 있다. 제조 물품은 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 설명서를 갖는 포장 삽입물을 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서는 당해 분야의 숙련가가 본 발명을 실시하는데 충분한 것으로 간주된다. 본원에 나타나고 기재된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명으로부터 당해 분야의 숙련가에게 명백해질 것이며 첨부된 청구항들의 범위에 속할 것이다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 본원에 편입되어 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참고하여 보다 완전하게 이해될 것이다. 그러나, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 설명을 위한 것이고, 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당해 분야의 숙련가에게 제안될 것이며 이는 본원의 사상 및 범위 및 첨부된 청구항들의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다.
실시예 1: 동결된 트레할로오스 제형에서 mAb 안정성에 대한 부형제 용해도의 영향
이 연구는 동결된 용액에서 트레할로오스 상 분포 및 단백질 안정성에 대한 동결 속도, 보관 온도, 및 제형 조성물의 효과를 평가하기 위해 설계되었다. 동결된 용액에서 트레할로오스 결정화의 상 분포를 밝히는 것 이외에도, 이 연구의 결과는 많은 실제적인 함축성을 갖는다. 아마도, 단백질의 안정제로서 트레할로오스의 효과는 용액에서 트레할로오스의 상 분포에 좌우된다. 따라서, 상이한 조성물, 동결 속도, 및 보관 온도로부터 비롯되는 트레할로오스의 상 분포를 이해하는 것은 강력한 제형 및 동결 공정의 개발에 영향을 미친다.
물질 및 방법
물질 및 샘플 제조
145 킬로달톤의 근사 분자량을 갖는 3개의 IgG1 전장 단클론성 항체 (mAb1, 베바시주맙, 및 mAb3)를 클로닝하고, 차이니즈 햄스터 난소 세포주에서 발현시키고, 정제하였다.
보관 온도, 및 동결 속도 연구를 위해, mAb1을 2.1% (wt/v) 트레할로오스, 0.01% 폴리소르베이트 20 (wt/v)을 갖는 5 mM 히스티딘-하이드로클로라이드 (pH 6.0), 및 주사용수, USP에서 25 mg/mL로 제형화하고; 베바시주맙을 5.4% (wt/v) 트레할로오스, 0.04% 폴리소르베이트 20 (wt/v)을 갖는 51 mM 인산나트륨 (pH 6.2), 및 주사용수, USP에서 25 mg/mL로 제형화하며; mAb3을 8.2% (wt/v) 트레할로오스, 0.02% 폴리소르베이트 20 (wt/v)을 갖는 20 mM 히스티딘-아세테이트 (pH 6.2), 및 주사용수, USP에서 20 mg/mL로 제형화하였다.
부형제 용해도 연구를 위해, 베바시주맙을 6.0% (wt/v)의 수크로오스, 트레할로오스, 또는 만니톨 중 어느 하나를 갖는, 0.04% 폴리소르베이트 20 (wt/v)을 갖는 51 mM 인산나트륨 (pH 6.2), 주사용수, USP (대조군 샘플)에서 25 mg/mL로 제형화하였다.
제형 연구를 위해, 베바시주맙을 0.04% 폴리소르베이트 20을 갖거나 갖지 않는, 다양한 양의 트레할로오스 (0%, 1.7%, 3.4%, 5.1%, 6.8%, 8.6%, 10.3%, 12.0%, 13.7%, 15.4%, 17.1%, 20.5%, 24.0%, 27.4%, 30.8%, 및 34.2% wt/v)를 갖는 20mM 히스티딘-하이드로클로라이드 (pH 6.0)에서 3개의 mAb 농도 (0, 25, 및 100 mg/mL)에서 평가하였다. 이들 64개의 상이한 제형뿐만 아니라 0 mg/mL의 베바시주맙을 함유하는 32개의 비히클 블랭크를 96-웰 그레이너 (Greiner) 마이크로플레이트에서 제형화하였다.
20 mM 히스티딘-아세테이트 (pH 5.5), 및 주사용 물 중에서 0.0, 2.0, 4.0, 및 8.0 % (wt/v) 트레할로오스를 사용하여 추가의 용액을 제조하였다. 50 마이크로리터의 pHydrion (pH Range: 0-7) pH-지시 염료 (Micro Essential Laboratory, NY)를 10cc 유리 바이알에 분주하고 증발시켰다. 대략 4 밀리리터의 다양한 트레할로오스 제형을 바이알에 부가하고 상기 염료를 상기 용액에 용해시켰다. 동결된 트레할로오스 용액의 사진을 슈퍼매크로 모드에서 Olympus Stylus 770SW 디지털 카메라 (Olympus America Inc., NJ)를 사용하여 얻었다.
모든 샘플에 대한 제형 버퍼를 약전수재 등급 (USP, NP, EP) 화학물질, 및 Elga PURELAB Ultra (Celle, Germany) 정수 시스템을 이용하여 정제된 탈이온수를 이용하여 제조하였다. 제형 연구 샘플을 Pierce Slide-A-Lyzer 투석 카세트 또는 밀리포어 (Billerica, MA) Amicon Ultra 원심분리 튜브 (10 kD MWCO)를 이용하여 제형 버퍼로 철저히 투석하고 mAb 스톡 용액 pH를 각 투석된 샘플에 대해 확인하였다. 투석 후, 샘플을 Amicon Ultra 원심 여과 장치 (10 kD MWCO)를 이용하여 한외여과에 의해 농축시켰다.
제어된 동결
느린 동결 및 정상 동결을 위한 샘플을 제조하기 위해, 2 밀리리터 샘플 분취액을 오토클레이브된 5 cc 유리 바이알에 분주하고 층류 공기 흐름을 갖는 환기된 생물안전성 후드에서 무균 기술을 사용하여 20 mm Lyo-Stopper로 밀봉하였다. 샘플 바이알을 미리 냉각된 선반 위의 동결 건조기에 넣고 -1 ℃ 내지 -3 ℃에서 24시간 동안 유지시킴으로써 느린 동결을 달성하였다. 과냉각을 제어하기 위해, 얼음 형성 때까지 동결된 CO2를 각 바이알의 측면에 가하여 얼음을 생성한 다음, 온도를 대략 -0.3 ℃ /분의 속도로 144시간 동안 -40 ℃로 선형적으로 감소시켰다.
정상 동결은 샘플이 완전히 동결될 때까지 샘플 바이알을 -20 ℃ 냉동고에 넣음으로써 달성하였다. 과냉각을 제어하기 위해, 얼음 형성 때까지 동결된 CO2를 각 바이알의 측면에 가하여 얼음을 생성하였다.
빠른 동결은 50 마이크로리터 샘플 분취액을 액체 질소에 적가하여 급속 냉각함으로써 달성하였다. 동결 종료점을 증가된 불투명도 및 표면으로부터 스테인레스강 메쉬 수집 바스켓 안으로 구형체의 침강에 의해 결정하였다. 동결 후, 벌크 약물 동결된 펠렛의 1 밀리리터 분취액을 액체 질소에서 꺼내어 멸균된, 미리 냉각된 5 cc 유리 바이알로 옮겼다. 그리고 나서, 바이알을 냉동된 CO2에 보관하고, 20 mm Lyo-Stopper로 밀봉하였다. 제형 스크린 샘플을 액체 질소를 이용하여 96-웰 마이크로플레이트에서 급속 동결시켰다. 마이크로플레이트가 동결된 직후, 얼음 표면을 24 게이지 바늘 (BD, Franklin Lakes, NJ)로 긁어 샘플에 핵을 형성시켰다.
등온 유지
기재된 방법에 의해 3가지 동결 속도 (느린, 정상, 및 빠른)로 동결된 샘플을 동결된 보관을 위해 ±2 ℃의 범위로 -20 ℃, -14 ℃, 및 -8 ℃ 의 설정값을 갖는 3개의 냉동 유닛으로 옮겼다. 냉동고 온도를 요코가와 (Yokogawa) 온도 모니터링 시스템 (Yokogawa Meters and Instruments Corporation, Tokyo, Japan)을 이용하여 모니터링하였다. 샘플 바이알을 0, 1, 2, 3, 6, 9 및 12개월의 등온, 동결 보관 후 꺼내어 주변 조건 (대략 22 ℃) 하에 실험실 계수기 벤치에 넣고 분석 전에 해동시켰다.
제형 스크린 샘플 마이크로플레이트를 2가지 온도 (-20±2 ℃, 및 -40±2 ℃)에서 보관하였다. 냉동고 온도를 요코가와 (Yokogawa) 온도 모니터링 시스템 (Yokogawa Meters and Instruments Corporation, Tokyo, Japan)을 이용하여 모니터링하였다.
SEC 분석을 위한 샘플 마이크로플레이트를 최대 365일간 등온에서 보관하였다. 동결 보관 후, 마이크로플레이트를 분석 전에 주변 조건 (대략 22 ℃) 하에 실험실 계수기 벤치 상에서 해동시켰다. 동결 공정의 완료 즉시 대조군 (0일) 샘플을 해동시켰다. FTIR 분석을 위한 샘플 유리 마이크로플레이트를 365일의 등온, 동결 보관 후 꺼내어 트레할로오스 결정화 분석을 위해 동결건조하였다. 대조군 (0개월) 샘플을 동결 공정의 완료 즉시 동결건조하였다.
동결건조
트레할로오스 결정화 결정을 위한 샘플을 LyoManager II 소프트웨어 (FTS Systems, Stone Ridge, NY)에 의해 제어된 LyoStar II 동결건조기를 사용하여 먼저 동결건조시켰다. 동결된 샘플을 미리 냉각된 선반에 놓고 1차 건조 전에 -35 ℃에서 7시간 동안 유지시켰다. 1차 건조는 선반 온도를 0.2 ℃/분의 속도로 20 ℃까지 선형으로 증가시킨 다음, 20 ℃에서 40시간 동안 유지시킴으로써 150 μm Hg의 시스템 압력 하에 달성하였다. 2차 건조는 선반 온도를 0.2 ℃/분으로 30 ℃까지 선형으로 증가시킨 다음 30 ℃에서 8시간 동안 유지시킴으로써 수행되었다. 열전쌍을 다양한 샘플 바이알에 넣어 동결-건조 동안 온도를 모니터링하였다. 2차 건조 후, 분석 전에 샘플이 수화되는 것을 막기 위해 여전히 진공 하에서 샘플 바이알의 마개를 막았다. 저부피 (300 마이크로리터), 제형 스크린 샘플을 동일한 동결건조 방법을 사용하여 96-웰 유리판 (Zinsser, Germany)에서 동결건조시켰다.
크기 배제 크로마토그래피
3가지 약물 물질의 분자 크기 분포를 측정하기 위해, HPSEC (고성능 크기 배제 크로마토그래피) 분석을 0.2 M 인산칼륨, 0.25 M 칼륨 클로라이드, pH 6.2 이동상 용액을 사용하여 Agilent 1200 HPLC 시스템 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) 상에서 TosohHaas TSKgel G3000 SWxl (7.8 mm × 30 cm, 250 ÅA 기공 크기, 5 μm 입자 크기) 칼럼 또는 동등물을 사용하여 수행하였다. 유속은 0.5 mL/분이었고, 작동 시간은 30분이었다. 샘플 챔버 온도는 5 ℃였고 주사 질량은 100 마이크로그램이었다. 칼럼 출구 신호를 참조 신호로서 360 nm를 이용하여 280 nm에서 흡광도를 측정하는 다이오드 어레이 검출기로 모니터링하였다. 그리고 나서, 크롬레온 소프트웨어 (Dionex, Sunnyvale, CA)를 사용하여 데이터 분석 및 UV 피크 통합을 수행하여 각 샘플에 존재하는 분자 응집물, 단량체 및 단편의 퍼센트를 정량하였다. 저부피, 제형 스크린 샘플을 1.0 mL/분의 유속 및 15분의 작동 시간으로 기재된 SEC 방법을 이용하여 그레이너 (GREINER INFO, CITY), 96-웰 폴리프로필렌 마이크로플레이트에서 분석하였다. SEC 분석에 앞서, 베바시주맙 샘플을 20mM 히스티딘-하이드로클로라이드 pH 6.0으로 희석하고 30 ℃에서 24시간 동안 유지시켜 SEC 분석 전에 분리할 수 있는 응집물을 분해하였다. 샘플 챔버 온도는 30 ℃였고 주사 질량은 100 마이크로그램이었다.
농도 측정
각 샘플의 UV 흡광도를 켐스테이션 (Chemstation) 소프트웨어 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)를 이용하여 Agilent 8453 분광측정기 상에서 1-cm 경로 길이를 갖는 석영 큐벳에서 279 nm 및 320 nm에서 흡광도를 기록함으로써 측정하였다. UV 농도 결정을 mAb1, 베바시주맙 및 mAb3에 대해 각각 1.50, 1.70, 및 1.45 (mg/ml) - 1 cm -1의 흡수도를 사용하여 계산하였다. 측정을 적절한 버퍼에 대해 블랭킹하였다.
탁도 분석
샘플의 탁도를 소프트웨어 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)를 이용하여 HP8453 분광측정기 상에서 1-cm 경로 길이를 갖는 석영 큐벳에서 340-360 nm로부터 평균 흡광도를 기록함으로써 측정하였다 (Eckhardt, B.M., 등(1991) Pharm .Res.8: 1360-4). 분석에 앞서, 주사용 멸균수를 사용하여 기기를 블랭킹하였다. 제형 스크린 샘플의 탁도 분석을 Spectramax M2 기기 (Molecular Devices, Sunnyvale)를 이용하여 UV 투과성 코닝 절반 영역, 96-웰 마이크로플레이트 상에서 수행하였다. 탁도를 주사용 멸균수 블랭크에 대해 측정하였고 탁도 값을 340-360nm로부터의 흡광도의 평균을 기록함으로써 측정하였다.
FT-NIR 분광법
퍼센트 트레할로오스 결정화를 근적외선 확산 반사 분광법을 사용하여 결정하였다. 이 연구에서 사용된 데이터 수집, 보정, 및 분석 방법은 무정형 트레할로오스 및 결정성 트레할로오스 다형체 간의 스펙트럼 차이를 규명하는데 집중된 이전의 작업으로부터 변경되었다 (Connolly, B., 등(2010) Anal. Biochem . 399(1): 48-57). 이들 방법을 이용하여, 적분구 (integrating sphere) 모듈이 장착된 Nicolet Antaris FT-Near IR 분석기 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 상에서 4 cm-1 해상도로 32 평균 스캔을 이용하여 10,000 - 4,000 cm-1로부터 샘플 NIR 스펙트럼을 기록하였다퍼센트 트레할로오스 결정화를 4306 cm-1 및 4291 cm-1 에서 밴드의 정규화된 피크 세기 비를 사용하여 계산하였다(Connolly, B., 등(2010) Anal. Biochem . 399(1): 48-57). 데이터 분석을 MATLAB (R2007a, The MathWorks, Natick, Massachussetts)를 갖는 선형회귀 분석을 이용하여 수행하였다 (Connolly, B., 등(2010) Anal. Biochem . 399(1): 48-57). 저부피 (300 마이크로리터) 제형 스크린 샘플을 동결건조한 다음, 동일한 방법을 이용하여 퍼센트 트레할로오스 결정화에 대해 분석하였다.
결과
트레할로오스 결정화가 약제학적으로 관련된 (≤10% wt/v) 농도에서 단백질 안정성에 영향을 미치는지 이해하는 것은 상당히 흥미롭다. 부형제 결정화에 대한 근소한 트레할로오스 농도의 영향을 평가하기 위해, 결정화를 더 잘 시각화하는 pH 지시 염료의 존재 하에 0.0, 2.0, 4.0 및 8.0% (wt/v) 트레할로오스 디히드레이트로 용액을 제조하였다. 샘플을 정상 동결 속도를 이용하여 동결시키고 -20 ℃에서 6일간 보관하였다. 유도된 핵생성 후, 트레할로오스 결정화를 모든 동결된 트레할로오스 용액에서 육안으로 관찰하였다 (도1). 동결된 용액의 육안 검사는 결정화의 정도가 근소한 트레할로오스 농도에 비례하여 증가한다는 것을 나타낸다. 예를 들면, 평가된 최고 근소한 트레할로오스 농도 (도1D: 8.0% wt/v)는 하기를 함유한 용액과 비교하여 실질적으로 더 많은 결정화를 야기하였다: 0.0% (도1A), 2.0% (도1B), 및 4.0% (도1C) 트레할로오스 (wt/v).
약제학적으로 적절한 트레할로오스 농도 (≤10% wt/v)가 동결되지 않은 용액에서의 용해도 한계보다 훨씬 낮지만 (도 2A), 동결 공정 동안, 트레할로오스는 실질적으로 농축되고, 더 낮은 온도에서, 트레할로오스의 용해도는 유의미하게 더 낮다 (Miller, D.P., 등(1997) Pharm .Res.14: 578-90). 주변 온도에서 시작된 더 높은 농도는 확실히 동결 보관 온도에서의 용해도를 초과한다. 동결 농축물에서 그의 용해도 한계를 초과하는 트레할로오스에 대해, 결정화를 개시하는 핵생성 사건만이 필요할 것이다.
실시예 2: 동결된 트레할로오스 제형에서 mAb 안정성에 대한 부형제 결정화의 영향
동결, 동결-건조, 및 동결 보관 동안, 탄수화물의 결정화는 단백질 약물의 물리적 안정성에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 예를 들면, 만니톨은 동결-건조 동안 결정화하고 다양한 단백질의 형태적 변화, 응집, 및 활성의 손실을 야기하는 것으로 나타났다 (Sharma, V.K. and Kalonia, D.S.(2004) AAPS PharmSciTech .5: E10; Cavatur, R.K., 등(2002) Pharm .Res.19: 894-900); Izutsu, K., 등(1994) Chem.Pharm.Bull.(Tokyo) 42: 5-8); 및 Izutsu, K., 등(1993) Pharm .Res.10: 1232-7). <40 ℃에서 트레할로오스가 만니톨보다 더 가용성임에도 불구하고, 그것은 일반적으로 결정화하지 않는 부형제로서 여겨지는 수크로오스보다 유의미하게 덜 가용성이다 (도 2A).
동결된 용액에서 단백질 안정성에 대한 부형제 용해도의 효과를 평가하기 위해, 동등한 농도의 수크로오스, 트레할로오스, 및 만니톨을 이용하여 베바시주맙 용액을 제조하였다. 샘플을 정상 동결 속도로 동결시키고, 핵생성을 유도하고, -20 ℃에서 28일간 동결 보관하였다. SEC 데이터는 동결 보관 후 수크로오스 제형에서 응집 증가가 관찰되지 않았고; 트레할로오스 제형에서 응집의 작은 증가 (~1%)가 관찰되었고; 만니톨 제형에서 응집의 큰 증가 (~3%)가 관찰되었음을 입증하였다 (도 2B).
이들 결과는 부형제 용해도 및 단백질 응집 간의 등위 (rank-order) 상관관계를 확립한다. 예상대로, -20 ℃에서 더 낮은 용해도를 갖는 탄수화물은 더 큰 응집 증가를 야기한다 (도 2B). 특히 흥미롭게도, 상기 결과는 -20 ℃에서 트레할로오스의 용해도가 충분히 낮아서 약제학적으로 적절한 농도 (2-10% wt/v)에서 결정화하여 단백질 응집을 야기할 수 있음을 제시한다.
실시예 3: 동결된 트레할로오스 제형에서 mAb 안정성에 대한 동결 속도의 영향
3가지 mAb 제형에 대한 SEC 데이터는 동결 속도가 단백질 안정성에 영향을 미친다는 것을 입증하였다 (하기 표 1 참고).
표 1 - 12개월 동결 보관 후 트레할로오스 상의 요약
Figure pct00005
일반적으로, 단클론성 항체는 빠른 속도 (> 100 ℃/분)로 동결 후 응집되었고 더 느린 동결 속도 (< 1 ℃/분)에서 응집되지 않았다. 장기간 보관 온도에 관계없이 더 느린 동결 속도 (< 1 ℃/분)로 동결된 3가지 약물 물질 (mAb1, 베바시주맙 및 mAb3) 중 어느 것에서도 유의미한 응집이 측정되지 않았음이 관찰되었다 (표 1). 그러나, 더 빠른 동결 속도 (> 100 ℃/분)로 동결된 모든 베바시주맙 및 mAb3 샘플은 시간이 지남에 따라 유의미한 응집 증가를 나타내었다 (표 1). 음성 대조군으로서 포함된 훨씬 더 빠른 동결된 mAb1은 연구 과정 동안 작은 응집 증가를 나타내었다 (표 1). 모든 빠른 동결된 샘플의 경우, 보관 동안 관찰된 대부분의 응집은 처음 6개월 내에 일어나는 것으로 보인다 (도 3). 그 후, 응집 속도는 6개월 및 12개월 사이에 유의미하게 감소하며, 이 기간 동안의 변화는 충분히 작아 측정된 응집은 잠재적으로 샘플 및/또는 분석 변동성에 기인할 수 있다.
이론에 의해 구속되기를 바라지 않지만, 빠른 속도로 동결시키는 것이 항체 안정성에 대한 스트레스 조건에 해당하는 것으로 여겨진다. 예를 들면, 빠른 속도로 동결시, 항체 제형의 응집 변화가 1개월 후에 관찰된 반면, 상업적 동결 및 보관 상태 하에서는 응집이 9개월 이상 일정하게 유지될 수 있다. 빠른 동결은 항체 제형이 상업적 동결 및 보관 상태보다 훨씬 더 빠르게 응집되는 스트레스 상태에 해당한다고 여겨진다. 그 결과, 이 스트레스 상태는, 제형이 보관되는 시간의 양에 독립적으로, 응집에 대한 항체 제형의 감수성을 평가하는데 사용될 수 있다.
3가지 동결 속도로 동결되고 -20 ℃에서 12개월 동안 보관된 mAb3 샘플의 SEC 오버레이는 빠른 동결된 mAb3 샘플에서 응집된 종 (이량체 및 고분자량)의 관찰가능한 증가가 있었음을 입증한다 (도 4A). 반대로 느린 동결 속도 및 정상 동결 속도로 동결된 샘플은 연구 대조군과 비교하여 퍼센트 응집물의 유의미한 증가 및 데이터 오버레이 나타내지 않았다 (도 4A). 또한, 빠른 동결 베바시주맙 샘플은 탁도 분석 및 육안 검사에 의해 결정된 바와 같이 가용성 응집물의 증가 (표 1) 및 침전물의 형성을 나타내었다. 이러한 침전물은 이전에 단백질과 관련된 것으로 규명되었고, 0.2 마이크론 PVDF 필터를 이용한 여과에 의한 제거한 후에 UV 흡광도의 동반 감소를 갖는다.
선형회귀 모델과 조합하여 사용된 근적외선 확산 반사 분광법의 적용은 4000-4500 cm-1 사이의 이전에 규명된 스펙트럼 영역의 명확한 차이를 이용함으로써 단백질의 존재시 무정형 및 결정성 트레할로오스의 상대적인 양을 정량할 수 있음을 입증하였다 (Connolly, B., 등(2010) Anal. Biochem . 399(1): 48-57). 3가지 공지된 트레할로오스 상의 순수한 샘플의 FT-NIR 스펙트럼은 무정형, 결정성 무수물과 결정성 이수화물 사이의 핵심적인 스펙트럼 차이를 보여주었다 (도5). FT-NIR 분광법에 의한 12개월 샘플의 분석은 mAb1 (도 6 A3), 베바시주맙, (도 6 B3), 및 mAb3 (도 6 C3)에 대한 빠른 동결 샘플에서 트레할로오스 결정화의 측정가능한 양이있었고 (표 1), mAb1 (도 6 A1 -2), 베바시주맙 (도 6 B1 -2), 또는 mAb3 (도 6 C1 - 2)에 대한 느린 및 정상 동결 샘플에서 트레할로오스 결정화의 측정가능한 양이 없었음을 입증하였다. 다양한 보관 온도에서 12개월 동결 보관 후 얻은 빠른 동결 샘플 스펙트럼은 트레할로오스 이수화물과 관련된 핵심 스펙트럼 영역에서 날카로운 피크 이동을 보여주며 (도 6 B3 및 6C3), 동결된 용액 내에 ≥ 2.5% (wt/v) 무정형 트레할로오스를 보유하는, 30 내지 70 퍼센트 (1.6% 내지 5.7% wt/v) 결정성 트레할로오스 이수화물을 함유한다.
흥미롭게도, 관찰된 단백질 응집 증가는 트레할로오스 결정화 증가와 관련되었다. 예를 들면, -20 ℃에서 12개월간 보관된 빠른 동결된 mAb1 샘플은 0.2% (wt/v) 결정성 트레할로오스 이수화물 및 0.1% 응집 증가율을 갖는 것으로 나타난 반면, -20 ℃에서 12개월 동안 보관된 빠른 동결된 베바시주맙 및 mAb3 샘플은 각각 2.5% 및 5.1% (wt/v) 결정성 트레할로오스 이수화물 및 1.7% 및 3.1% 응집 증가를 갖는 것으로 나타났다 (표 1). 퍼센트 트레할로오스 이수화물 및 mAb 응집의 이러한 등위 상관관계는 결정화된 트레할로오스의 농도가 단백질 안정성에 영향을 미쳤음을 제시한다.
대조군으로서, 샘플을 빠르게 동결시키고 SEC 및 FT-NIR에 의해 즉시 분석하여 결정 형성 및 단백질 응집에 대한 급속 냉각 및 동결-건조의 즉각적인 영향을 평가하였다. 단백질 응집 변화가 관찰되지 않았다 (데이터 도시되지 않음). 또한, 빠른 동결된 T0 샘플 세트에 대해 수득한 FT-NIR 스펙트럼은 당이 특성상 주로 무정형이었고, 방법의 검출 한계 근처인 5 퍼센트 미만의 결정성 트레할로오스 이수화물을 함유한다는 것을 보여준다. 이들 결과는 빠른 동결 후 단백질 응집 또는 트레할로오스 상 분포에 즉각적인 영향을 없음을 입증한다. 따라서, 이 연구 동안 트레할로오스 결정화 및 단백질 응집의 측정된 증가는 보관 동안 시간-의존적 방식으로 일어나는 변화를 나타낸다.
동결 속도 연구 결과는 트레할로오스 결정화 및 mAb 응집 모두에 대한 동결 속도의 영향에 대한 통찰력을 제공한다. 이전에 논의된 바와 같이, 빠른 동결은 얼음 결정의 계면 표면적을 증가시키고 추가의 핵생성 부위를 제공한다. 이론에 의해 구속되기를 바라지 않지만, 빠른 동결 샘플에서 형성된 이들 추가의 핵생성 부위는 핵생성 사건이 발생할 수 있는 가능성을 증가시키는 것으로 여겨진다. 반대로, 느린 동결 속도 및 정상 동결 속도로 동결된 샘플에서 형성된 더 큰 얼음 결정은 더 적은 표면적을 가지며, 이는 핵생성의 가능성을 감소시키는 것으로 여겨진다.
실시예 4: 동결된 트레할로오스 제형에서 mAb 안정성에 대한 보관 온도의 영향
12개월 응집 데이터는 보관 온도가 단백질 안정성에 영향을 미친다는 것을 입증한다 (도 3). 일반적으로, 빠르게 동결되고 -20 ℃에서 12개월 동안 보관된 mAb3 샘플은 가장 많이 응집되었다 (도 3C). 흥미롭게도, 베바시주맙 및 mAb3의 초기 응집 속도는 -14 ℃에서 보관된 빠른 동결된 샘플에서 더 빨랐으며, 응집 속도는 -20 ℃에서 보관된 것보다 더 조기에 감소하였고 (도 3), 이는 핵생성 사건의 무질서한 특성 때문일 수 있다. 빠르게 동결되고 가장 따뜻한 보관 온도인 -8 ℃에서 보관된 샘플은 일반적으로 연구 과정 전반에 걸쳐 가장 낮은 속도 및 응집 정도를 나타내었다 (도 3). 도 4B의 크로마토그램 오버레이는 3가지 각 보관 온도에서 12개월 보관된 빠른 동결된 mAb3 샘플에 대해 SEC 프로파일에서 관찰된 차이를 나타낸다. 더 높은 온도 (예를 들면, -8 ℃)에서 보관된 빠른 동결 샘플은 적은 정도로 응집되었고; 반대로 더 낮은 온도 (예를 들면, -20 ℃)에서 보관된 샘플은 베바시주맙 및 mAb3에 대해 더 큰 정도로 응집되었다.
이 연구에서 단백질 응집의 보관 온도 의존성은 동결된 용액에서 단백질 응집의 기전에 대한 추가적인 통찰력을 제공한다. 흥미롭게도, 보관 온도는 단백질 응집 및 트레할로오스 결정화 사이의 의존성을 결정한다 (표 1). 일반적으로, 빠르게 동결되고 -8 ℃, -14 ℃ 및 -20 ℃에서 보관된 샘플은 트레할로오스 결정화의 정도에서 유의한 차이를 나타내지 않았지만, 저온 (-20 ℃)에서 보관된 샘플은 더 높은 온도 (각각 -14 ℃ 및 -8 ℃)에서 보관된 샘플보다 더 큰 정도로 응집되었다 (도 3). 예를 들면, 12개월 동안 보관된 빠른 동결된 mAb3 샘플은 모든 보관 온도에 대해 61% - 69% 사이의 결정화된 트레할로오스를 가지고 있었음에도 불구하고, 응집 양은 더 낮은 음의 보관 온도에서 증가하였다. 예를 들면, 동결된 샘플은 8 ℃, -14 ℃, 및 -20 ℃에서 12개월 보관 후 각각 0.3%, 2.1%, 및 3.1% 응집되었다 (표 1). 이 추세는 2개의 샘플에서 비슷한 양의 트레할로오스 결정화가 더 높은 온도 (각각 -14 ℃ 및 -8 ℃)보다 더 낮은 온도 (-20 ℃)에서 보관시 더 많은 단백질 응집을 야기할 수 있음을 입증한다.
이로한 온도 의존적 추세는 동결 환경의 분자 이동도 및 물리적 특성 (즉, 얼음 형태학)이 트레할로오스-결정화 유도된 단백질 응집에서 결정적인 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다. 조사된 보관 온도의 범위 (-20 ℃, -14 ℃ 및 -8 ℃)는 이들 용액에 대한 유리 전이 온도 (Tg 범위: -29.5 내지 -32 ℃)보다 높으므로, 약간의 이동도가 예상된다. 모든 빠른 동결된 샘플은 동일한 방식으로 동결되므로, 짐작컨대, 동일한 조성을 갖는 샘플은 동결 직후 유사한 얼음 형태학 및 용질 분포를 갖는다. 그러나, 동결 후, 보관 온도는 동결 농축물에서 트레할로오스 및 단백질 분자의 장기간 용질 농도 및 확산 속도를 영향을 미친다. 트레할로오스 (342 Da) 및 IgG1 (≥145,000 Da) 사이의 크기 차이 때문에, 트레할로오스 분자가 큰 구상 단백질보다 동결 농축물에 훨씬 더 빠르게 확산하는 것으로 가정할 수 있다. 추가의 연구는 트레할로오스 결정화가 동결된 보관 2주 이내에 안정기에 도달한다는 것을 입증한다 (데이터 도시되지 않음). 트레할로오스 결정화는 초기에 일어나며 데이터가 다양한 보관 온도에서 시간 경과에 따른 응집 동력학을 나타내므로, 이는 분자 이동도가 동결된 매질의 재배열 속도 및 정도에 영향을 미쳐 IgG1 단클론성 항체의 응집 속도 및 정도에 영향을 미친다는 것을 제시할 수 있다. 빠른 동결 후, -14 ℃에서 보관된 mAb3 샘플은 초기에 응집하기 시작하지만 3 내지 6개월에 안정기에 도달하는 반면, -20 ℃에 보관된 샘플은 그 후에 곧바로 응집하기 시작하지만, 시간 의존적 방식으로 계속 응집하여 6 내지 12개월에 안정기에 도달한다 (도 3C). 짐작컨대, 더 높은 온도 (-14 ℃ 및 -8 ℃)에서의 샘플은 더 분자 이동도를 가지므로 단백질이 초기에 함께 확산하여 응집물을 형성한다. 그러나, 상 분리된 용액 성분 (즉, 트레할로오스)가 재분배됨에 따라, 단백질은 공동-국재화된 무정형 트레할로오스 분자와의 상호작용에 의해 안정화된다.
실시예 5: 동결된 트레할로오스 제형에서 mAb 안정성에 대한 제형 조성물의 영향
동결된 보관 동안 트레할로오스 결정화 및 mAb 응집에 대한 제형 조성물의 영향을 결정하기 위해, 베바시주맙을 트레할로오스 농도의 범위 ([트레할로오스] 범위: 0 내지 34.2% (wt/v) 및 베바시주맙 농도 ([베바시주맙] 범위: 0, 25, 및 100 mg/mL)에서 평가하였다. 샘플을 유리전이 온도보다 높은 (-20 ℃) 그리고 낮은 (-40 ℃) 온도에서 12개월 동안 빠르게 동결시키고 FT-NIR 및 SEC를 이용하여 각각 트레할로오스 결정화 및 단백질 응집에 대해 분석하였다.
이 연구로부터의 결과는 빠른 동결 후, 트레할로오스가 -20 ℃에서 12개월 동안 보관된 동결 용액에서 결정화한다는 것을 입증하였다 (도 7). 그러나, -40 ℃에서 12개월 동안 보관된 동결 용액에서는 트레할로오스 결정화 또는 mAb 응집이 관찰되지 않았다. 빠른 동결 및 긁기 직후에는, 최소 양의 결정화된 트레할로오스 (<10% wt/v)가 있다. 그러나, -20 ℃에서 12개월 동결 보관 후, 트레할로오스 결정화는 유의미하게 증가한다(도 7A-C).
일반적으로, 상기 결과는 트레할로오스를 증가시키는 것이 결정화된 트레할로오스의 더 높은 백분율을 야기한다는 것을 입증한다. 예를 들면, 퍼센트 결정화된 트레할로오스는 트레할로오스 농도가 1.7%에서 34.2% (wt/v)로 증가함에 따라 47%에서 86% ([베바시주맙] = 0 mg/mL), 22%에서 61% ([베바시주맙] = 25 mg/mL), 및 10%에서 47% ([베바시주맙] = 100 mg/mL)로 증가한다 (도 7). 또한, 유사하게, -20 ℃에서 12개월 동결된 보관 후 베바시주맙 응집이 증가하였다 (도 7D -E). 일반적으로, 이 결과는 장기간 동결 보관 동안 베바시주맙 용액을 안정화시키는 트레할로오스의 최적 범위가 있음을 보여준다. 대안적으로, 최적 범위를 초과하는 트레할로오스: mAb 비는 트레할로오스 결정화 및 단백질 응집을 야기한다 (도 7D -E). 최적 범위 미만의 트레할로오스: mAb 비에서, 단백질 응집 증가가 있으나, 짐작컨대 또 다른 기전 (예를 들면, 불충분한 동결보호제)로 인해, 트레할로오스 결정화 증가는 없다.
상기 데이터는 형성된 결정화된 트레할로오스의 퍼센트가 단백질 및 트레할로오스 모두의 농도에 좌우된다는 것을 나타낸다. 흥미롭게도, 더 높은 베바시주맙 농도는 더 낮은 양의 트레할로오스 결정화를 야기한다. 예를 들면, 고정된 트레할로오스 농도 (1.7% wt/v)에서, 베바시주맙 농도를 0 mg/mL에서 100 mg/mL으로 증가시키는 것은 결정화된 트레할로오스의 퍼센트를 53%에서 9%로 감소시킨다.
도 8은 트레할로오스 결정화 (도 8A) 및 베바시주맙 응집 (도 8B)에 대한 트레할로오스 대 mAb 비 (wt/wt)의 중요성을 입증한다. 도 8A 및 B에 나타난 바와 같이, 베바시주맙 물리적 안정성이 분석이 장기간 동결 동안 베바시주맙을 안정화시키기 위해 충분한 트레할로오스: mAb (≥0.2: 1 wt/wt)가 필요하다는 것을 입증하였지만, 과도한 트레할로오스: mAb (≥2.4: 1 wt/wt)는 결정화된 트레할로오스 이수화물의 더 높은 비율 및 베바시주맙 응집의 유의미한 증가를 야기한다. 짐작컨대, 트레할로오스: mAb를 증가시키는 것은 동결된 용액에서 트레할로오스의 과포화를 야기하여 트레할로오스 결정화 및 mAb 응집을 야기한다. 이들 결과는 장기간 동결된 보관 동안 트레할로오스에 의한 베바시주맙 제형의 물리적 안정화에 필요한 트레할로오스: mAb의 최적 범위 (>0.2: 1 및 <2.4: 1 wt/wt)를 확인한다.
달리 표현하면, 이들 결과는 장기간 동결된 보관 동안 트레할로오스에 의한 베바시주맙 제형의 물리적 안정화에 필요한 mAb: 트레할로오스의 최적 범위 (>0.417: 1 및 <5.0: 1 wt/wt)를 확인한다. 예를 들면, 도 7D에 나타낸 바와 같이, 25 mg/mL 베바시주맙을 이용하여, 0.49 내지 1.47의 mAb: 트레할로오스의 범위는 낮은 단백질 응집 및 적은 샘플 변화를 나타내었다. 또 다른 예로서, 도 7E에 나타낸 바와 같이, 100 mg/mL 베바시주맙을 이용하여, 0.41 내지 1.47의 mAb: 트레할로오스의 범위는 낮은 단백질 응집 및 적은 샘플 변화를 나타내었다.
흥미롭게도, 폴리소르베이트는 동결된 베바시주맙 제형 중 어느 것에서도 단백질 안정성 또는 트레할로오스의 상 분포에 영향을 미치지 않았다. 동등한 조성을 가진 샘플의 경우, 폴리소르베이트 (0.04% wt/v)의 첨가는 트레할로오스 결정화 또는 단백질 응집에서 어느 측정가능한 변화를 야기하지 않았다.
제형 조성물 연구 결과는 단백질 농도 증가가 동결 샘플에서 트레할로오스 결정화의 발생 및 정도를 감소시킨다는 것을 나타낸다. 이들 결과는 과도하게 높은 트레할로오스: mAb 비 (≥2.4 wt/wt)는 트레할로오스 결정화 및 단백질 응집을 야기하지만, 과도하게 낮은 트레할로오스: mAb 비 (≤0.2 wt/wt)는 최대 100mg/mL의 베바시주맙 농도에 대해 충분한 동결보호를 제공하지 않았음을 입증한다. 상기 결과는 장기간 동결 보관 동안 (심지어 빠른 동결된 (>100 ℃/min) 제형의 경우에도) 베바시주맙 제형을 물리적으로 안정화할 수 있는, 트레할로오스: 베바시주맙 (wt/wt) 비의 최적 범위인 0.2-2.4를 확인한다. 달리 표현하면, 이들 결과는 장기간 동결 보관 동안 트레할로오스에 의한 베바시주맙 제형의 물리적 안정화에 필요한 베바시주맙: 트레할로오스의 최적 범위 (>0.417: 1 및 <5.0: 1 wt/wt)를 확인한다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 문서, 및 논문은 그 전체가 참고로 본원에 편입되어 있다.
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Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences of variable region of the heavy chain (VH) of humanized B-Ly1 antibody (B-HL13) <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 119 <212> PRT 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Claims (78)

  1. 단클론성 항체, 트레할로오스, 및 버퍼를 포함하는 안정한 수성 약제학적 제형으로서, 제형 내의 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비는 0.41 이상 내지 1.65 미만이고, 상기 제형은 약 5.5 내지 약 7.0의 pH를 가지며, 상기 단클론성 항체는 VEGF에 결합하는 제형.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비가 0.49 내지 1.47인 제형.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비가 0.41 내지 0.73인 제형.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비가 0.73 내지 1.47인 제형.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제형 내의 상기 단클론성 항체가 약 25 mg/mL 내지 약 100 mg/mL인 제형.
  6. 제5항에 있어서, 제형 내의 상기 단클론성 항체가 약 45 mg/mL 내지 약 55 mg/mL인 제형.
  7. 제5항에 있어서, 제형 내의 상기 단클론성 항체가 약 35 mg/mL 내지 약 75 mg/mL인 제형.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제형 내의 상기 트레할로오스가 약 45 mM 내지 약 634 mM, 약 50 mM 내지 약 600 mM, 또는 약 150 mM 내지 약 400 mM인 제형.
  9. 제8항에 있어서, 제형 내의 상기 트레할로오스가 약 45 mM 내지 약 135 mM인 제형.
  10. 제8항에 있어서, 제형 내의 상기 트레할로오스가 약 180 mM 내지 약 634 mM인 제형.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼가 35 mM 초과 내지 약 100 mM의 양인 제형.
  12. 제11항에 있어서, 상기 버퍼가 히스티딘을 포함하는 제형.
  13. 제11항에 있어서, 상기 버퍼가 인산나트륨을 포함하는 제형.
  14. (a) 약 25 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 양의 단클론성 항체; (b) 약 45 mM 내지 약 634 mM의 양의 트레할로오스; 및 (c) 35 mM 초과 내지 약 100 mM의 인산나트륨을 포함하는 안정한 수성 약제학적 제형으로서, 상기 제형은 약 5.5 내지 약 7.0의 pH를 갖고, 제형 내의 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비는 0.41 이상 내지 1.65 미만이며, 상기 단클론성 항체는 VEGF에 결합하는 제형.
  15. 제14항에 있어서, 제형 내의 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비가 0.41 내지 0.73인 제형.
  16. 제14항에 있어서, 제형 내의 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비가 0.73 내지 1.47인 제형.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체가 약 35 mg/mL 내지 약 85 mg/mL의 양인 제형.
  18. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체가 약 45 mg/mL 내지 약 55 mg/mL의 양인 제형.
  19. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체가 약 50 mg/mL의 양인 제형.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트레할로오스가 약 45 mM 내지 약 135 mM의 양인 제형.
  21. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트레할로오스가 약 180 mM 내지 약 634 mM의 양인 제형.
  22. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트레할로오스가 약 60 mM의 양인 제형.
  23. 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인산나트륨이 약 45 mM 내지 약 90 mM의 양인 제형.
  24. 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인산나트륨이 약 50 mM 내지 약 75 mM의 양인 제형.
  25. 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인산나트륨이 약 51 mM의 양인 제형.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제를 추가로 포함하는 제형.
  27. 제26항에 있어서, 상기 계면활성제가 폴리소르베이트 또는 폴록사머인 제형.
  28. 제27항에 있어서, 상기 폴리소르베이트가 폴리소르베이트 20인 제형.
  29. 제27항에 있어서, 상기 폴록사머가 폴록사머 188인 제형.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제 농도가 약 0.01% 내지 약 0.1%인 제형.
  31. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제 농도가 약 0.01% 내지 약 0.05%인 제형.
  32. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제 농도가 약 0.04%인 제형.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 약 5.9 내지 약 6.5의 pH를 갖는 제형.
  34. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 약 6.2 또는 약 6.0의 pH를 갖는 제형.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체가 사전에 동결되지 않은 제형.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체가 전장 항체인 제형.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체가 IgGl 항체인 제형.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체가 인간화 항체인 제형.
  39. 제1항 내지 제35항, 제37항 및 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체가 항원-결합 영역을 포함하는 항체 단편인 제형.
  40. 제39항에 있어서, 상기 항체 단편이 Fab 또는 F(ab')2 단편인 제형.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 베바시주맙인 제형.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체가 응집에 민감한 제형.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 -20 ℃에서 적어도 12개월, 적어도 18개월 또는 적어도 24개월 동안 안정한 제형.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 멸균된 제형.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 대상체 투여용인 제형.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 정맥내 (IV), 피하 (SQ), 안구내 (IO), 또는 근육내 (IM) 투여용인 제형.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항의 안정한 수성 약제학적 제형을 보유하는 용기를 포함하는 제조 물품.
  48. 상기 항체를 약 45 mM 내지 약 634 mM의 양의 트레할로오스 및 35 mM 초과 내지 약 100 mM의 양의 인산나트륨을 포함하는 제형에서 제형화하는 것을 포함하는 치료적 단클론성 항체의 응집을 감소시키는 방법으로서, 상기 제형은 약 5.5 내지 약 7.0의 pH를 갖고, 상기 단클론성 항체는 제형 내에 약 25 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 양으로 제형화되고, 제형 내의 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비는 0.41 이상 내지 1.65 미만이며, 상기 단클론성 항체는 VEGF에 결합하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 제형 내의 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비가 0.41 내지 0.73인 방법.
  50. 제48항에 있어서, 제형 내의 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비가 0.73 내지 1.47인 방법.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인산나트륨이 약 50 mM 내지 약 75 mM의 양인 방법.
  52. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인산나트륨이 약 51 mM의 양인 방법.
  53. 상기 항체를 트레할로오스 및 버퍼를 포함하는 제형에서 제형화하는 것을 포함하는 치료적 단클론성 항체의 응집을 감소시키는 방법으로서, 제형 내의 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비는 0.41 이상 내지 1.65 미만이고, 상기 제형은 약 5.5 내지 약 7.0의 pH를 가지며, 상기 단클론성 항체는 VEGF에 결합하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 제형 내의 상기 단클론성 상체 대 상기 트레할로오스의 중량비가 0.41, 0.49, 0.58, 0.65, 0.73, 0.74, 0.83, 0.97, 1.16, 및 1.47 중 어느 것인 방법.
  55. 제53항에 있어서, 제형 내의 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비가 0.49 내지 1.47인 방법.
  56. 제53항에 있어서, 제형 내의 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비가 0.41 내지 0.73인 방법.
  57. 제53항에 있어서, 제형 내의 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비가 0.73 내지 1.47인 방법.
  58. 제48항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체가 약 45 mg/mL 내지 약 55 mg/mL의 양인 방법.
  59. 제48항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체가 약 50 mg/mL의 양인 방법.
  60. 제48항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체가 약 35 mg/mL 내지 약 75 mg/mL의 양인 방법.
  61. 제48항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트레할로오스가 약 45 mM 내지 약 135 mM의 양인 방법.
  62. 제48항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트레할로오스가 약 60 mM의 양인 방법.
  63. 제48항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트레할로오스가 약 180 mM 내지 약 634 mM인 방법.
  64. 제48항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 계면활성제를 추가로 포함하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 계면활성제가 폴리소르베이트 또는 폴록사머인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 폴리소르베이트가 폴리소르베이트 20인 방법.
  67. 제65항에 있어서, 상기 폴록사머가 폴록사머 188인 방법.
  68. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제 농도가 약 0.01% 내지 약 0.1%인 방법.
  69. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제 농도가 약 0.01% 내지 약 0.05%인 방법.
  70. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제 농도가 약 0.04%인 방법.
  71. 제48항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 약 5.9 내지 약 6.5의 pH를 갖는 방법.
  72. 제48항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 약 6.2 또는 6.0의 pH를 갖는 방법.
  73. 제53항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼가 35 mM 초과 내지 약 100 mM의 양의 인산나트륨을 포함하는 방법.
  74. 제48항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 베바시주맙인 방법.
  75. 하기를 포함하는 약제학적 제형을 제조하는 방법:
    (a) 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항의 제형을 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 제형 내의 항체의 물리적 안정성, 화학적 안정성, 또는 생물학적 활성을 평가하는 단계.
  76. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항의 제형을 질환 또는 장애를 치료하는데 유효한 양으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
  77. (a) 약 100 mg/mL 이하의 양의 단클론성 항체; 및 (b) 약 50 mM 내지 약 600 mM의 양의 트레할로오스를 포함하는, 정맥내 투여용 안정한 수성 약제학적 제형으로서, 상기 제형은 약 5.5 내지 약 7.0의 pH를 갖고, 제형 내의 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비는 0.41 이상 내지 1.65 미만인 제형.
  78. (a) 약 100 mg/mL 이하의 양의 단클론성 항체; 및 (b) 약 150 mM 내지 약 400 mM의 양의 트레할로오스를 포함하는, 피하 또는 안구내 투여용 안정한 수성 약제학적 제형으로서, 상기 제형은 약 5.5 내지 약 7.0의 pH를 갖고, 제형 내의 상기 단클론성 항체 대 상기 트레할로오스의 중량비는 0.41 이상 내지 1.65 미만인 제형.
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