PT2234600E - Formulação de anticorpos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "FORMULAÇÃO DE ANTICORPOS" A invenção presente diz respeito a uma formulação de um anticorpo monoclonal anti-CD20, a um processo para a preparação da referida formulação e às utilizações da formulação.

Estado da Técnica Anterior A molécula CD20 (também denominada Bp35 ou antigénio de diferenciação restrito ao linfócito B humano) é uma proteína transmembranar hidrofóbica com uma massa molecular de cerca de 35 kD localizada nos linfócitos pré-B e B maduros (Valentine et al. (1989) J. Biol. Chem. 264 (19): 11282-11287; e Einfield et al. (1988) EMBO J. 7(3): 711-717). A CD20 está localizada à superfície de mais do que 90 % das células B do sangue periférico ou de órgãos linfóides e é expressa durante a fase inicial do desenvolvimento das células pré-B, permanecendo até à diferenciação das células do plasma. A CD20 está presente tanto em células B normais como em células B malignas. Em especial, a CD20 está expressa em mais do que 90 % dos linfomas não Hodgkin (NHL) das células B (Anderson et al. (1984) Blood 63(6): 1424-1433)) mas não se encontra nas 2 células estaminais hematopoiéticas, nas células pro-B, nas células normais do plasma, nem noutros tecidos normais (Tedder et al. (1985) J. Immunol. 135(2): 973- 979). A região do terminal carboxilo com 85 aminoácidos da proteína CD20 está localizada dentro do citoplasma. 0 comprimento desta região contrasta com o de outras estruturas superficiais específicas das células B tais como as cadeias pesadas IgM, IgD, e IgG ou os antigénios de histocompatibilidade das cadeias a ou β das cadeias de classe II, que têm regiões intracitoplásmicas relativamente curtas respectivamente com 3, 3, 28, 15, e 16 aminoácidos, (Komaromy et al. (1983) NAR 11: 6775-6785). Dos últimos 61 aminoácidos do terminal carboxilo, 21 têm resíduos ácidos, enquanto só 2 os têm básicos, indicando que esta região tem uma forte carga líquida negativa. 0 N° de Acessão no GenBank é NP-690605. Crê-se que a CD20 possa estar envolvida na regulação de um ou mais passos iniciais no processo de activação e diferenciação das células B (Tedder et al. (1986) Eur. J. Immunol. 25(16): 881-887) e poderia funcionar como canal do ião cálcio (Tedder et al. (1990) J. Cell. Biochem. 14D: 195).

Existem dois tipos diferentes de anticorpos anti-CD20 que diferem significativamente no seu modo de ligação ao CD20 e nas suas actividades biológicas (Cragg, M.S., et al., Blood, 103 (2004) 2738-2743; e Cragg, M. S., et al., Blood, 101 (2003) 1045-1051). Os anticorpos do tipo I, tais 3 como o Rituximab, são potentes na citotoxicidade por complemento, enquanto os anticorpos do tipo II, tais como o Tositumomab (Bexxar®, Bl), 11B8 e AT80, iniciam efectivamente a morte das células alvo por apoptose independente da caspase, com uma exposição concomitante da fosfatidilserina.

Resumem-se as caracteristicas partilhadas dos anticorpos anti-CD20 do tipo I e do tipo II na Tabela 1.

Tabela 1: Propriedades dos anticorpos anti-CD20 do tipo I e

do tipo II anticorpos anti-CD20 do tipo 1 anticorpos anti-CD20 do tipo II epítopo de CD20 do tipo 1 epítopo de CD20 do tipo II Localizam a CD20 em jangadas lipídicas Não localizam a CD20 em jangadas lipídicas Maior CDC (se do isotipo lgG1) Menor CDC (se do isotipo lgG1) Actividade de ADCC (se do isotipo lgG1) Actividade de ADCC (se do isotipo lgG1) Capacidade de ligação completa Menor capacidade de ligação Agregação homotípica Agregação homotípica mais forte Indução da apoptose por ligações cruzadas Indução forte da morte celular sem ligações cruzadas

Descrição Pormenorizada da Invenção 0 termo "anticorpo" inclui as diversas formas de anticorpo incluindo mas não se limitando a anticorpos inteiros, anticorpos humanos, anticorpos humanizados e 4 anticorpos geneticamente modificados tais como anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos ou anticorpos recombinantes bem como fragmentos desses anticorpos desde que as propriedades caracteristicas de acordo com a invenção sejam mantidas. "Fragmentos de anticorpo" incluem uma porção do comprimento inteiro do anticorpo, em geral pelo menos uma porção de anticorpo que se liga ao antigénio ou a sua região variável. Incluem-se nos exemplos de fragmentos de anticorpo os diacorpos, moléculas de anticorpo de cadeia singela, imunotoxinas, e anticorpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Além disto, incluem-se nos fragmentos de anticorpo polipéptidos de cadeia singela com as caracteristicas de uma cadeia VH, nomeadamente sendo capazes de se montar em conjunto com uma cadeia VL ou com um fragmento de uma cadeia VL que se ligue ao antigénio CD20, nomeadamente sendo capazes de montar em conjunto com uma cadeia VH, uma bolsa funcional de ligação ao antigénio. "Fragmentos de anticorpo" também inclui desses fragmentos que, por si próprios, não sejam capazes de proporcionar funções efectivadora (ADCC/CDC) mas que proporcionam esta função de um modo de acordo com a invenção depois de serem combinados com um ou mais domínios constantes de anticorpo. 5

Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpos monoclonais", tal como se utilizam neste documento, referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo com uma única composição em aminoácidos. Portanto, o termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos exibindo uma única especificidade de ligação e que possuam regiões variáveis e constantes derivadas das sequências de imunoglobulinas da linha de gérmen humano. Numa concretização, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal transgénico não humano, por exemplo um murganho transgénico, com um genoma que inclua um transgene com uma cadeia pesada humana e um transgene com uma cadeia leve humana, fundidos a uma célula imortalizada. 0 termo "anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo monoclonal incluindo uma região variável, isto é, uma região de ligação, proveniente de uma fonte ou espécie, e pelo menos uma porção de uma região constante derivada de uma fonte ou espécie diferente, preparado em geral por técnicas de ADN recombinante. São especialmente preferidos os anticorpos quiméricos que incluam uma região variável murina e uma região constante humana. Estes anticorpos quiméricos murino/humanos são produto de genes de imunoglobulina expressos que incluem segmentos de ADN codificando para regiões variáveis de imunoglobulina murina e segmentos de ADN codificando para regiões constantes de imunoglobulina humana. Outras formas de "anticorpos 6 quiméricos" incluídas na invenção presente são aquelas cuja classe ou subclasse tenha sido modificada ou alterada da do anticorpo original. Estes anticorpos "quiméricos" são também referidos como "anticorpos de classe alterada". Os métodos para produzir anticorpos quiméricos envolvem as metodologias convencionais de ADN recombinante e de transfecção genéticas, hoje em dia bem conhecidas na técnica. Veja-se, por exemplo, Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 6851-6855; Patentes US 5.202.238 e US 5.204.244. O termo "anticorpo humanizado" refere-se a anticorpos nos quais o quadro ou "as regiões determinantes da complementaridade" (CDR) tenham sido modificadas para incluir as CDR de uma imunoglobulina com uma especificidade diferente, quando comparada com a da imunoglobulina original. Numa concretização preferida, enxerta-se uma CDR murina na região do quadro de um anticorpo humano para preparar o "anticorpo humanizado". Veja-se, por exemplo, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; e Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. São especialmente preferidas as CDR correspondendo às que representam sequências que reconhecem os antigénios anotados acima para anticorpos quiméricos e bifuncionais. O termo "anticorpo humano", tal como se utiliza neste documento, pretende incluir anticorpos possuindo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de 7 imunoglobulina da linha gérmen humana. Os anticorpos humanos são bem conhecidos no estado da técnica (van Dijk, M.A., e van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374). Com base nesta tecnologia, podem produzir-se anticorpos humanos contra uma grande variedade de alvos. São descritos exemplos de anticorpos humanos, por exemplo em Kellermann, S. A., et ai., Curr. Opin. Biotechnol. 13 (2002) 593-597. O termo "anticorpo recombinante humano", tal como se utiliza neste documento, pretende incluir todos os anticorpos humanos que sejam preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tal como anticorpos isolados de uma células hospedeiras tais como células NSO ou CHO ou da de um animal (por exemplo um murganho) que seja transgénico para os genes de imunoglobulina humana ou para os anticorpos expressos utilizando um vector de expressão recombinante transfectados numa célula hospedeira. Estes anticorpos recombinantes humanos possuem regiões variáveis e constantes derivadas das sequências das imunoglobulinas da linha de gérmen humana numa forma assumindo uma nova disposição. Os anticorpos recombinantes humanos consoante a invenção foram submetidos a uma hipermutação somática in vivo. Deste modo, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas com as das regiões VH e VL da linha de gérmen humana, podem não existir na natureza adentro do reportório de anticorpos da linha de gérmen humana in vivo.

Tal como se utiliza neste documento, "ligando-se especificamente" ou "que se liga especificamente a" refere-se a um anticorpo se ligar especificamente ao antigénio CD20. Preferivelmente a afinidade de ligação apresenta um valor de KD de 1CT9 mol/L ou menor (por exemplo IO”10 mol/L) , preferivelmente um valor de KD de 1CT10 mol/L ou menor (por exemplo 1CT12 mol/L). Determina-se a afinidade de ligação utilizando um ensaio de ligação normalizado, tal como a técnica de ressonância do plasmão superficial (Biacore®) . 0 termo "molécula de ácido nucleico", tal como se utiliza neste documento, pretende incluir moléculas de ADN e moléculas de ARN. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de cadeia singela ou de dupla cadeia, mas é preferivelmente ADN de dupla cadeia.

Os "domínios constantes" não estão directamente envolvida na ligação do anticorpo a um antigénio mas estão envolvidos nas funções efectivadores (ADCC, ligação ao complementos, e CDC). A "região variável" (região variável de uma cadeia leve (VL), região variável de uma cadeia pesada (VH)) , tal como se utiliza neste documento, denota ambos os membros de um par de cadeias, leve e pesada, que está 9 directamente envolvido na ligação entre o anticorpo e o antigénio . Os domínios das cadeias variável leve humana e variável pesada humana possuem a mesma estrutura geral e cada um deles inclui quatro regiões de enquadramento (FR) cujas sequências são largamente conservadas, ligadas por três "regiões hipervariáveis" (ou regiões de determinação da complementaridade, CDR) . As regiões de enquadramento adoptam uma conformação de folha b e as CDR podem formar ansas ligando a estrutura das folhas b. As CDR de cada cadeia são mantidas na sua estrutura tridimensional pelas regiões de enquadramento e formam em conjunto com as CDR da outra cadeia o local de ligação ao antigénio. As regiões CDR3 das cadeias pesada e leve desempenham um papel especialmente importante na especificidade e afinidade da ligação dos anticorpos consoante a invenção, e constituem portanto mais um objecto adicional da invenção.

Os termos "região hipervariável" ou "porção de um anticorpo que se liga ao antigénio", quando utilizados neste documento, referem-se à sequência de resíduos de aminoácido de um anticorpo que é responsável pela ligação ao antigénio. A região hipervariável inclui resíduos de aminoácidos das "regiões determinantes da complementaridade" ou "CDR". As regiões de "enquadramento" ou "FR" são as regiões do domínio variável para além dos resíduos da região hipervariável tal como se definem neste documento. Portanto, a cadeia leve e a pesada de um anticorpo incluem, do terminal N para o C, os domínios FR1, 10 CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, e FR4. Em especial, a CDR3 da cadeia pesada é a região que mais contribui para a ligação ao antigénio. As regiões CDR e FR são determinadas consoante a definição padrão de Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou os resíduos de uma "ansa hipervariável".

Os termos "CD20" e "antigénio CD20" são utilizados intercambiavelmente neste documento, e incluem quaisquer variantes, isoformas e espécies homólogas da CD20 humana que são naturalmente expressas por células ou que são expressas em células transfectadas com o gene de CD20. A ligação de um anticorpo da invenção ao antigénio CD20 media a liquidação das células que expressam a CD20 (por exemplo, uma célula tumoral) através da inactivação de CD20. A liquidação das células que expressam CD20 pode ocorrer por um ou mais dos mecanismos seguintes:

Incluem-se nos sinónimos de CD20, tal como reconhecidos na técnica, antigénio CD-20 de linfócito B, antigénio BI superficial de linfócito B, Leu-16, Bp35, BM5, e LF5. O termo "anticorpo anti-CD20" consoante a invenção é um anticorpo que se liga especificamente ao antigénio CD20. Consoante as propriedades de ligação e as actividades biológicas dos anticorpos anti-CD20 ao 11 antigénio CD20, podem distinguir-se dois tipos de anticorpos anti-CD20 (anticorpos anti-CD20 de tipo I e de tipo II), de acordo com Cragg, M.S., et al. , Blood 103 (2004) 2738-2743; e com Cragg, M.S., et al . Blood 101 (2003) 1045-1051, Veja-se a Tabela 2.

Tabela 2: Propriedades de anticorpos anti-CD20 de tipo I e

de tipo II

anticorpos anti-CD20 de tipo I

anticorpos anti-CD20 de tipo II iepitopo de tipo I de CD20 \ epitopo de tipo II de CD20 Localiza CD20 em jangadas lipidicas 1 Não localiza CD20 em jangadas 1 lipidicas i CDC aumentada (se for do isotipo IgGl) 1 CDC diminuída (se for do \ isotipo IgGl) ij actividade ADCC (se for do isotipo IgGl) \ actividade ADCC (se for do 1 isotipo IgGl) Capacidade de ligação completa jCapacidade de ligação diminuída Agregação homotípica jAgregação homotípica mais forte

Indução de apoptose quando se estabelecem ligações cruzadas

Indução forte de morte celular sem ligações cruzadas

Uma propriedade essencial dos anticorpos anti-CD-20 de tipo I e de tipo II é o seu modo de ligação. Assim, os anticorpos anti-CD-20 de tipo I e de tipo II pode ser classificados através da razão das capacidades de ligação a CD20 em células Raji (ATCC-No. CCL-86) do anticorpo anti-CD20 referido, em comparação com a do rituximab. 12

Tal como se utiliza neste documento, "anticorpo anti-CD20" poder ser quer um anticorpo do tipo I, quer do tipo II. Preferivelmente, será um anticorpo do tipo II.

Os anticorpos anti-CD-20 de tipo I apresentam uma razão de capacidades de ligação a CD20 em células Raji (ATCC-No. CCL-86) do referido anticorpo anti-CD20 em comparação com a do rituximab de entre 0,8 e 1,2, preferivelmente de entre 0,9 e 1,1. Incluem-se como exemplos destes anticorpos anti-CD20 de tipo I, por exemplo, rituximab, (W 094/11.026), 1F5 IgG2a (ECACC, hibridoma; Press et al., Blood 69/2: 584-591 (1987)), HI47 IgG3 (ECACC, hibridoma) , 2C6 IgGl (tal como se descreve no WO 2005/103.081), 2F2 IgGl (tal como se descreve no WO 2004/035.607 e no WO 2005/103.081) e 2H7 IgGl (tal como se descreve no WO 2004/056.312). Preferivelmente o referido anticorpo anti-CD20 de tipo I é um anticorpo monoclonal que se liga ao mesmo epítopo que o rituximab. Os anticorpos anti-CD20 de tipo apresentam uma razão de capacidades de ligação a CD20 em células Raji (ATCC-No. CCL-86) desse anticorpo anti-CD20 em comparação com a do rituximab, de entre 0,3 e 0,6, preferivelmente de entre 0,35 e 0,55, mais preferivelmente de entre 0,4 e 0,5. Incluem-se nos exemplos destes anticorpos anti-CD20 de tipo II, por exemplo, tositumomab (BI IgG2a), anticorpo IgGl humanizado B-Lyl (um anticorpo IgGl quimérico humanizado descrito no WO 2005/044.859), o IgGl 11B8 (tal como descrito no WO 2004/035.607), e o IgGl AT80. Preferivelmente o referido 13 anticorpo anti-CD20 de tipo II é um anticorpo monoclonal que se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo humanizado B-Lyl (tal como descrito no WO 2005/044.859). A "razão entre as capacidades de ligação a CD20 em células Raji (ATCC-No. CCL-86) dos anticorpos anti-CD20 em comparação com a do rituximab" é determinada por medição directa de imunofluorescência (medem-se as intensidades fluorescentes directas (MFI)) utilizando o referido anticorpo anti-CD20 conjugado com Cy5 e o rituximab conjugado com Cy5 num Conjunto FACS (FACSArray) (Becton Dickinson) com células Raji (ATCC-No. CCL-86), tal como se descreve no Exemplo N° 2, e calcula-se como se segue:

Razão entre as capacidades de ligação a CD20 em células Raji (ATCC-N0 CCL-86) = MFI(Cv5-anticorpo anti-CD20) x Cv5-razão de marcacão(Cv5-rituximab . MFI(Cy5-rituximab) Cy5-razão de marcação(Cy5-anticorpo anti-CD20) MFI é a intensidade fluorescente média. A "Cy5-razão de marcação", tal como se utiliza neste documento significa o número de moléculas de marcador Cy5por molécula de anticorpo. O referido anticorpo anti-CD20 de tipo I apresenta tipicamente uma razão entre a sua capacidade de ligação a CD20 em células Raji (ATCC-No. CCL-86) em comparação com a do rituximab de entre 0,8 e 1,2, preferivelmente de entre 0,9 e 1,1. 14 0 referido anticorpo anti-CD20 de tipo II apresenta tipicamente uma razão entre a sua capacidade de ligação a CD20 em células Raji (ATCC-No. CCL-86) em comparação com a do rituximab de entre 0,3 e 0,6, preferivelmente de entre 0,35 e 0,55, mais preferivelmente de 0,4 a 0,5.

Numa concretização preferida, o referido anticorpo anti-CD20 de tipo II, preferivelmente um anticorpo B-Lyl humanizado, apresenta uma maior citotoxicidade dependente do anticorpo (ADCC).

Por "anticorpo com uma maior citotoxicidade dependente do anticorpo (ADCC)" significa-se um anticorpo, tal como este termo é definido neste documento, com uma maior ADCC tal como determinada por qualquer método adequado conhecido pelos indivíduos com conhecimentos médios na técnica. Um ensaio de ADCC aceite in vitro é como se segue: 1) o ensaio utiliza células alvo que se sabe expressarem o antigénio alvo reconhecido pela região do anticorpo de ligação ao antigénio; 2) o ensaio recorre a células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC), isoladas o sangue de um doador saudável escolhido 15 aleatoriamente, a título de células efectivadoras; 3) leva-se a cabo o ensaio seguindo o protocolo que se segue: i) isolam-se as PBMC utilizando processos padrão de centrifugação por densidade e suspendem-se a 5 X 106 células/mL em meio de cultura de células RPMI; ii) cultivam-se as células alvo pelos métodos habituais de cultura de tecidos, colhem-se na fase crescimento exponencial com uma viabilidade superior a 90 %, lavam-se com meio RPMI de cultura de células, marcam-se com 100 micro-Curie de "Cl-, lavam-se por duas vezes com meio de cultura de células, e voltam a suspender-se em meio de cultura de células a uma densidade de 1 0' células/mL; iii) transferem-se 100 microlitros da suspensão final de células alvo para cada um dos poços de uma placa de microtitulação com 96 poços; iv) dilui-se o anticorpo em série a partir de 4.000 ng/mL e até 0,04 ng/mL em meio de 16 cultura de células, e adicionam-se 50 microlitros das soluções de anticorpo resultantes às células alvo na placa de microtitulação com 96 poços, testando-se em triplicado diversas concentrações em anticorpo cobrindo toda a gama de concentrações acima; v) para os controlos com libertação máxima (MR) , colocam-se em 3 poços adicionais contendo as células alvo marcadas, 50 microlitros de uma solução aquosa a 2 % (VN) de um detergente não iónico (Nonidet, Sigma, St. Louis), em vez da solução de anticorpo (ponto iv acima); vi) para os controlos de libertação espontânea (SR), colocam-se em 3 poços adicionais na placa contendo as células alvo marcadas, 50 microlitros de meio RPMI de cultura de células em vez da solução de anticorpo (ponto iv acima); vii) centrifuga-se então a placa de microtitulação com 96 poços a 50 x g durante 1 minuto e incuba-se durante 1 hora a 4°C; viii) adicionam-se 50 microlitros da suspensão de PBMC (ponto i acima) a cada poço para se 17 obter uma razão entre efectivador:célula alvo de 25:1 e colocam-se as placas numa incubadora sob uma atmosfera com 5 % de CO2 e a 37°C durante 4 horas; ix) recolhe-se o sobrenadante isento de células de cada poço e quantifica-se a radioactividade experimentalmente libertada (ER) utilizando um contador gama; x) calcula-se a percentagem de lise especifica para cada concentração em anticorpo recorrendo à fórmula (ER-MR)/(MR-SR) x 100, em que ER é a média da radioactividade quantificada (veja-se o ponto ix acima) para a concentração em anticorpo respectiva, MR é a radioactividade média quantificada (veja-se o ponto ix acima) para os controlos MR (veja-se o ponto V acima) , e SR é a radioactividade média quantificada (veja-se o ponto ix acima) para os controlos SR (veja-se o ponto vi acima); 4) "uma maior ADCC" é definida como ou um aumento da percentagem máxima de lise específica observada adentro da gama de concentração testada acima, e/ou uma diminuição da concentração em anticorpo necessária parasse conseguir metade da percentagem máxima de lise 18 específica observada adentro da gama de concentrações testada acima. 0 aumento da ADCC é relativo à ADCC quantificada com o ensaio acima, mediada pelo mesmo anticorpo, produzido no mesmo tipo de células hospedeiras, utilizando o mesmo protocolo de produção, purificação, formulação e de armazenagem, métodos que são conhecidos dos especialistas da técnica, mas que não tenha sido produzido por células hospedeiras geneticamente transformadas de modo a sobre-expressarem GnTIII.

Pode obter-se a referida "ADCC aumentada" por glicoengenharia dos anticorpos referidos, o que significa aumentar as respectivas funções naturais, mediadas por células efectivadoras dos anticorpos monoclonais por engenharia da sua componente oligossacaridica tal como se descreve em Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999) e na Pat. U.S. N° 6.602.684. O termo "citotoxicidade dependente do complemento (CDC)" refere-se à lise de células alvo de tumor humano pelo anticorpo consoante a invenção na presença de complemento. Quantifica-se a CDC preferivelmente por tratamento de uma preparação de células que expressem CD20 com um anticorpo anti-CD20 consoante a invenção na presença de complemento. Observa-se CDC quando o anticorpo induziu a uma concentração de 100 nM a lise (morte celular) de 20 % 19 ou mais das células de tumor ao fim de 4 horas. Leva-se a cabo o ensaio preferivelmente com células de tumor marcadas com 51Cr ou com Eu e quantificando o 51Cr ou o Eu libertados. Os controlos incluem a incubação das células alvo de tumor com complemento, mas sem anticorpo.

Os anticorpos anti-CD20 de Tipo I e de Tipo II denotam tipicamente propriedades CDC caracteristicas. Os anticorpos anti-CD20 de Tipo I apresentam uma CDC aumentada (quando são do isotipo IgGl) e os anticorpos anti-CD20 de Tipo II denotam uma CDC diminuída (quando são do isotipo IgGl) em comparação uns com os outros. Preferivelmente tanto os anticorpos anti-CD20 de Tipo I como os de Tipo II são anticorpos do isotipo IgGl. 0 anticorpo "rituximab" é um anticorpo monoclonal quimérico humano obtido por engenharia genética do dominio gama 1 murino, dirigido contra o antigénio CD20 humano. Este anticorpo quimérico contém domínios constantes gama 1 humanos e é identificado pelo nome "C2B8" no WO 94/11.026 (Anderson et al.). O rituximab está aprovado para o tratamento de pacientes de linfoma não Hodgkin de células B positivos para CD20, de recaída ou refractários de baixo grau ou foliculares. Demonstrou-se por estudos do mecanismo de actuação in vitro que o rituximab exibe uma citotoxicidade dependente do complemento humano (CDC) (Reff et al., Blood 83(2): 435-445 (1994)). Além disto, ele exibe uma actividade significativa em ensaios nos quais se 20 determina a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) . O termo "anticorpo B-Lyl humanizado" refere-se ao anticorpo B-Lyl humanizado tal como descrito no WO 2005/044.859, obtido a partir do anticorpo monoclonal B-Lyl murino anti-CD20 (região variável da cadeia pesada murina (VH) : SEQ ID NO: 1; região variável da cadeia leve murina (VL) : SEQ ID NO: 2 veja-se Poppema, S. e Visser, L., Biotest Bulletin 3: 131-139 (1987);) por quimerização com um domínio constante humano do IgGl e da humanização que se segue (veja-se WO 2005/044.859). Estes "anticorpos humanizados B-Lyl" estão descritos em pormenor no WO 2005/044.859.

Além disto, o anticorpo humanizado B-Lyl é preferivelmente um anticorpo IgGl. Preferivelmente estes anticorpos humanizados B-Lyl são glicomodifiçados (GE) na região Fc de acordo com o processo descrito no WO 2005/044.859, no WO 2004/065.540, em Umana, P. et al. , Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999) e no WO 99/154.342. A maior parte dos anticorpos glicomodifiçados humanizados B-Lyl apresentam um perfil de glicosilação alterado na região Fc, preferivelmente apresentando um teor diminuído em resíduos fucose. Preferivelmente pelo menos 40 % ou mais (numa concretização entre 40 % e 60 %, noutra concretização pelo menos 50 %, e ainda noutra concretização pelo menos 70 % ou mais) dos oligossacáridos da região Fc são não 21 fucosilados. Além disto os oligossacáridos da região Fc são preferivelmente bissectados. 0 "anticorpo humanizado B-Lyl" inclui B-HH6 de VH e B-KV1 de VL do WO 2005/044.859. Tal como se utiliza neste documento, o anticorpo referido também é mencionado como "HuMab<CD20>". Noutra concretização mais preferida de todas, o referido anticorpo apresenta um teor diminuído em resíduos fucose tal como se definiu acima e/ou os oligossacáridos da região Fc são de preferência bissectados. Em mais uma concretização mais preferida de todas, o referido anticorpo apresenta uma ADCC tal como se definiu neste documento. A componente oligossacarídica pode afectar significativamente propriedades relevantes para a eficácia de uma glicoproteína terapêutica, incluindo a estabilidade física, a resistência a ataque por proteases, as interacções com o sistema imunológico, a farmacocinética, e a actividade biológica específica. Estas propriedades podem depender não apenas da presença ou da ausência, mas também das estruturas específicas, dos oligossacáridos. Podem fazer-se algumas generalizações entre a estrutura de oligossacáridos e a função de glicoproteínas. Por exemplo, determinadas estruturas de oligossacáridos mediam uma eliminação rápida da glicoproteína na corrente sanguínea, por interacções com proteínas específicas de ligação a hidratos de carbono, enquanto outras podem ligar-se a anticorpos e despoletar reacções imunológicas indesejáveis (Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14: 975-81 (1996)). 22

As células de mamíferos são as hospedeiras preferidas para a produção de glicoproteínas terapêuticas, devido à sua capacidade de glicosilar proteínas do modo mais compatível para aplicações humanas (Cumming et al., Glycobiology 1: 115-30 (1991); Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14: 975-81 (1996)). As bactérias apenas gl icosilam proteínas em casos muito raros, e tal como nos outros tipos de hospedeiros habituais, tais como leveduras, fungos filamentosos, células de insectos e de plantas, originam perfis de glicosilação associados a eliminações rápidas da corrente sanguínea, interacções imunológicas indesejáveis, e em alguns casos específicos, uma actividade biológica diminuída. De entre as células de mamíferos, as células de ovário de hamster Chinês (CHO) têm sido as mais habitualmente utilizadas durante os últimos vinte anos. Para além de originarem perfis de glicosilação adequados, estas células permitem gerar de modo consistente linha de células geneticamente estáveis clonais altamente produtivas. Elas podem ser cultivadas até densidades elevadas em biorreactores simples utilizando meios isentos de soro, e permitem o desenvolvimento de bioprocessos seguros e reprodutíveis. Incluem-se em outras células habitualmente utilizadas as células de rim de hamster bebé (BHK), as células de mieloma murino NSO e SP2/0. Mais recentemente, a produção a partir de animais transgénicos foi também testada. (Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14: 975-981 (1996) . 23

Todos os anticorpos contém estruturas de hidratos de carbono em posições conservadas nas regiões constantes da cadeia pesada, cada isotipo possuindo um conjunto diferente de estruturas de hidratos de carbono ligadas a N, que afectam de modo variável a montagem de proteínas, a secreção ou a actividade funcional. (Wright, A., e Monison, S. L. , Trends Biotech. 15: 26-32 (1997)). A estrutura do hidrato de carbono presente por ligação a N varia consideravelmente, dependendo do grau de processamento, e pode incluir oligossacáridos com altos teores em manose, com múltiplas ramificações, bem como complexos com duas antenas. (Wright, A., e Morrison, S. L., Trends Biotech. 15: 26-32 (1997)). Tipicamente, existe um processamento heterogéneo as estruturas oligossacarídicas nucleares ligadas a um local de glicosilação específico, de tal modo que mesmo os anticorpos monoclonais existem sob diversas gl icoformas. De igual modo, mostrou-se que ocorrem diferenças muito importantes na glicosilação de anticorpos entre linhas de células, e observam-se até diferenças menos importantes para uma mesma linha de células cultivada sob condições de cultura diferentes. (Lifely, M. R. et al., Glycobiology 5(8): 813-22 (1995)).

Uma maneira de se obterem grandes aumentos de potência, enquanto se mantém um processo de produção simples e se evitam potencialmente efeitos colaterais significativos e indesejáveis, é aumentar as funções efectivadoras naturais, mediadas por células, dos anticorpos monoclonais através da modificação da sua componente oligossacaridica tal como se descreve em Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999) e na Pat. U.S. N° 6.602.684. Os anticorpos de tipo IgGl, anticorpos mais habitualmente utilizados na imunoterapia do cancro, são glicoproteinas que possuem um local de glicosilação ligada por N conservado no Asn297 em cada domínio CH2. Os dois oligossacáridos complexos biantenários ligados a Asn297 estão enterrados dentro dos domínios CH2, formando contactos extensivos com o esqueleto polipeptídico, e a sua presença é essencial para que o anticorpo medeie funções efectivadoras tais como a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) (Lifely, M. R., et al., Glycobiology 5: 813-822 (1995); Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163: 59-76 (1998); Wright, A. e Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 15: 26-32 (1997)). cujos conteúdos Já foi demonstrada a sobre-expressão, em células de ovário de hamster Chinês (CHO) de β(1,4)-Ν-acetilglucosaminil-transferase 111 ("GnTII17y), uma glicosil-transferase catalisando a formação de oligossacáridos bissectados, que aumenta de modo significativo a actividade ADCC in vitro de um anticorpo monoclonal quimérico antineuroblastoma (chCE7) produzido pelas células CHO geneticamente modificadas. (Veja-se Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999); e o WO 99/154.342, cujos conteúdos são integralmente 25 incorporados neste documento, por citação). 0 anticorpo chCE7 pertence a uma grande classe de anticorpos monoclonais não conjugados que têm elevada afinidade e especificidade tumorais, mas que têm uma potência pequena demais para serem clinicamente úteis quando são produzidos em linhas de células industriais habituais que não possuem o enzima GnTIII (Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999)). Aquele estudo foi o primeiro a demonstrar que se podiam obter grandes aumentos de actividade ADCC modificando geneticamente as células produtoras de anticorpos para expressarem GnTIII, o que também levava a um aumento da proporção de oligossacáridos da região constante associados com Fc, bissectados, incluindo oligossacáridos bissectados, não fucosilados, acima dos teores habitualmente encontrados em anticorpos com ocorrência natural. O termo "expressão do antigénio CD20" pretende indicar um teor significativo de expressão do antigénio CD20 numa célula, preferivelmente á superfície de uma célula T ou B, mais preferivelmente uma célula B, de um tumor ou de um cancro, respectivamente, preferivelmente um tumor não sólido. Podem determinar-se quais os pacientes com um "cancro expressando CD20" recorrendo a ensaios conhecidos na técnica. A "expressão do antigénio CD20" também pretende sobretudo indicar um teor significativo da expressão do antigénio CD20 numa célula, preferivelmente à superfície da célula de uma célula T ou B, mais 26 preferivelmente uma célula B, numa doença auto-imune. Por exemplo mede-se a expressão do antigénio CD20 utilizando uma detecção imunohistoquimica (IHC), FACS ou por detecção baseada em PCR do mARN correspondente. 0 termo "cancro expressando CD20", tal como se utiliza neste documento, refere-se preferivelmente a linfomas (preferivelmente linfomas não Hodgkin de células B (NHL)) e leucemias linfociticas. Incluem-se nestes linfomas e leucemias linfocíticas exemplo a) linfomas foliculares, b) Linfomas Celulares Pequenos Não Clivados/linforna de Burkitt (incluindo linfoma de Burkitt endémico, linfoma de Burkitt esporádico e linfoma não de Burkitt) c) linfoma de zona marginal (incluindo linfoma de células B de zona marginal extranodal (linfomas de tecido linfático associados a mucosas, MALT), linfoma de células B de zona marginal nodal e linfoma de zona marginal do baço), d) Linfoma de células do Manto (MCL), e) Linfoma de Células Grandes (incluindo linfoma de células grandes difuso de células B (DLCL), Linfoma Difuso de Células Mistas, Linfoma Imunoblástico, Linfoma Primário de Células B do Mediastino, Linfoma Angiocêntrico-Linforna Pulmonar de Células B f) leucemia de células pilosas, g) linfoma linfocitico, macroglobulinemia de Waldenstrom, h) leucemia linfocitica aguda (ALL), leucemia linfocitica crónica (CLL)/linforna de células pequenas (SLL), leucemia prolinfocitica de células B, i) neoplasmas de células do plasma, mieloma de células 27 do plasma, mieloma múltiplo, plasmacitoma j) doença de Hodgkin.

Preferivelmente o cancro expressando CD20 é um linfoma de Células B Não de Hodgkin (NHL). Em particular o cancro expressando CD20 pode ser um linfoma de células do Manto (MCL), uma leucemia linfocitica aguda (ALL), uma leucemia linfocitica crónica (CLL), um linfoma de células grandes difusas de células B (DLCL), um linfoma de Burkitt, uma leucemia de células pilosas, um linfoma folicular, um mieloma múltiplo, um linfoma de zona marginal, patologia linfoproliferativa após o transplante (PTLD), linfoma associado ao VIH, macroglobulinemia de Waldenstrom, ou linfoma primário do SNC.

Tal como se utiliza neste documento, "doença auto-imune" relaciona-se com uma doença ou patologia proveniente de e dirigida contra os próprios tecidos de um indivíduo. Incluem-se nos exemplos de doenças ou patologias auto-imunes sem que elas se limitem a estas, artrite (artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, osteoartrite, artrite psoriática), psoríase, dermatite, polimiosite/dermatomiosite, necrólise epidérmica tóxica, escleroderma sistémico e esclerose, reacções associadas a doença inflamatória dos intestinos, doença de Crohn, colite ulcerosa, síndrome de insuficiência respiratória, síndrome de insuficiência respiratória do adulto (ARDS), meningite, encefalite, uveíte, colite, glomerulonefrite, estados 28 alérgicos, eczema, asma, estados envolvendo infiltração de células T e reacções inflamatórias crónicas, aterosclerose, miocardite auto-imune, deficiência de adesão de leucócitos, lúpus eritematoso sistémico (SLE), diabetes com inicio juvenil, esclerose múltipla, encefalomielite alérgica, reacções imunológicas associadas a hipersensibilidade aguda e a termo mediadas por citoquinas e linfócitos T, tuberculose, sarcoidose, granulomatose incluindo granulomatose de Wegener, agranulocitose, vasculite (incluindo ANCA), anemia aplásica, anemia Diamond Blackfan, anemia hemolítica imune incluindo anemia hemolitica auto-imune (AIHA), anemia perniciosa, aplasia de células vermelhas pura (PRCA), deficiência em Factor VIII, hemofilia A, neutropenia auto-imune, pancitopenia, leucopenia, doenças envolvendo diapedese de leucócitos, patologias inflamatórias do sistema nervoso central (SNC) patologias inflamatórias, sindrome de lesões em múltiplos órgãos, miastenia grave, doenças mediadas por um complexo de anticorpo-antigénio, doença da membrana de base anti-glomerular, sindrome de anticorpo anti-fosfolipido, neurite alérgica, doença de Bechet, sindrome de Castleman, sindrome de Goodpasture, Sindrome Miasténica de Lambert-Eaton, sindrome de Reynaud, sindrome de Sjorgen, sindrome de Stevens Johnson, bolhose penfigóide, pênfigo, poliendocrinopatias auto-imunes, s nefropatia, polineuropatias a IgM ou neuropatia mediada por IgM, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombótica trombocitopénica (TTP), trombocitopenia auto- 29 imune, doença auto-imune do testículo e do ovário incluindo orquite auto-imune e ooforite auto-imune, hipotiroidismo primário; doenças auto-imunes endócrinas incluindo tiroidite auto-imune, tiroidite crónica (Tiroidite de Hashimoto), tiroidite subaguda, hipotiroidismo idiopático, doença de Addison, doença de Grave, síndromes poliglandulares auto-imunes (ou síndromes de endocrinopatia poliglandular I), diabetes de Tipo I também referida como diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM) e síndrome de Sheehan; hepatite auto-imune, penumonite intersticial linfóide (VIH), bronquiolite obliterante (não de transplantes) em relação a NSIP, síndrome de Guillain-Barre, vasculite de vasos grandes (incluindo polimialgia reumática e arterite de células gigantes (de Takayasu)), vasculite de vasos médios (incluindo doença de Kawasaki e poliarterite nodosa), espondilite anquilosante, doença de Berger (nefropatia a IgA), glomerulonefrite rapidamente progressiva, cirrose biliar primária, doença celíaca (enteropatia ao glúten), crioglobulinemia, esclerose lateral amiotrófica (ALS), doença das artérias coronárias, etc.

Preparam-se para armazenagem as formulações terapêuticas dos anticorpos utilizados de acordo com a invenção presente misturando um anticorpo que tenha o grau de pureza pretendido com veículos, excipientes ou estabilizadores opcionais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a 30 edição, Osol, A. Editor (1980)), sob a forma de formulações liofilizadas ou de soluções aquosas. Os veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos para os destinatários nas dosagens e concentrações empregues. O termo "tensioactivo", tal como se utiliza neste documento, denota um agente tensioactivo aceitável do ponto de vista farmacêutico. Na formulação da invenção, a quantidade de tensioactivo é descrita como uma percentagem expressa em peso/volume. A unidade de peso/volume mais utilizada é mg/mL. Incluem-se nos tensioactivos adequados aceitáveis do ponto de vista farmacêutico mas não se limitam a estes, os tensioactivos não iónicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG). Para além disto, também se incluem sem que se limitem a estes, ésteres com polietileno-sorbitan de ácidos gordos, polietileno-polipropilenoglicóis, estearatos de polioxietileno e dodecilsulfatos de sódio. Os derivados de polietileno-sorbitan preferidos são os ésteres de polietileno(20)-sorbitan (sinónimo de polissorbato 20, comercializado sob a marca registada Tween 20™) e o mono-oleato de polioxietileno(20)-sorbitan (sinónimo de polissorbato 80, comercializado sob a marca registada Tween 80™). Os polietileno-polipropilenoglicóis preferidos são os comercializados sob as marcas registadas Pluronic® F68 ou Poloxamer 188™. O mais preferido é o Poloxamer 188™. Os estearatos de polioxietileno preferidos são os 31 comercializados sob a marca registada Myrj™. Os ésteres mono polioxietilenolaurilicos preferidos são os comercializados sob a marca registada Brij™. Quando se utilizam ésteres de polietileno-sorbitan-polietileno(20) -sorbitan (Tween 20™) e de mono-oleato de polioxietileno (20) sorbitan (Tween 80™) eles são em geral utilizados numa quantidade de entre cerca de 0,001 e cerca de 1 %, preferivelmente entre cerca de 0,005 e cerca de 0,1 % e ainda mais preferivelmente entre cerca de 0,01 % e cerca de 0,04 %, em peso/volume. O termo "tampão", tal como se utiliza neste documento, denota um tampão aceitável do ponto de vista farmacêutico. Incluem-se nos tampões aceitáveis do ponto de vista farmacêutico mas sem que se limitem a, tampões de histidina, tampões citrato, tampões succinato, tampões acetato e tampões fosfato. Incluem-se nos tampões preferidos L-histidina ou misturas de L-histidina com cloridrato de L-histidina com agentes de isotonicidade e potencialmente ajusta-se ode pH com um ácido ou com uma base conhecidos na técnica. O mais preferido é a L- histidina. Utilizam-se em geral os tampões de histidina mencionados acima numa quantidade de entre 1 mM e cerca de 100 mM, preferivelmente de entre cerca de 5 mM e cerca de 50 mM e ainda mais preferivelmente de cerca de 20 mM. Independentemente do tampão que se utiliza, ajusta-se o pH a um valor de entre cerca de 4,5 e cerca de 7,0 e preferivelmente de entre cerca de 5,5 e cerca de 6,5 e 32 ainda mais preferivelmente de cerca de 6,0 por ajustamento com um ácido ou com uma base conhecidos na técnica utilizando misturas adequadas de um dos componentes do tampão ou ambos. O termo "agentes de isotonicidade", tal como se utiliza neste documento, denota agentes de isotonicidade aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. Utilizam-se os agentes de isotonicidade para proporcionarem uma formulação isotónica. Uma formulação isotónica é liquida, ou um liquido reconstituído a partir de uma forma sólida, por exemplo uma forma liofilizada, e denota uma solução possuindo a mesma tonicidade de outra solução com qual seja comparada, tal como uma solução salina fisiológica com o soro de sangue. Incluem-se nos agentes de isotonicidade adequados sem que se limitem a estes, sais, incluindo mas não se limitando a cloreto de sódio (NaCl) ou cloreto de potássio, açúcares incluindo mas não se limitando a glucose, sacarose, trehalose ou glicerina e qualquer componente do conjunto dos aminácidos, açúcares, sais e as suas combinações. Utilizam-se em geral os agentes de isotonicidade numa quantidade total de entre cerca de 5 mM e cerca de 350 mM. O termo "líquido", tal como se utiliza neste documento em ligação à formulação consoante a invenção, denota uma formulação eu seja líquida a uma temperatura de pelo menos entre cerca de 2 e cerca de 8°C. 33 0 termo "liofilizada", tal como se utiliza neste documento em ligação à formulação consoante a invenção, denota uma formulação que é seca por congelação da formulação e subsequentemente sublimando o gelo a partir do conteúdo congelado por quaisquer métodos se liofilização conhecidos na técnica, por exemplo com dispositivos liofilizadores comercialmente disponíveis. 0 termo "sais", tal como se utiliza neste documento, denota um sal numa quantidade de entre cerca de 1 mM e cerca de 500 mM. Incluem-se nos exemplos não limitativos de sais os sais de quaisquer combinações dos catiões sódio, potássio, cálcio e magnésio com os aniões cloreto, fosfato, citrato, succinato, sulfato ou com misturas destes. O termo "aminoácido", tal como se utiliza neste documento, denota um aminoácido numa quantidade de entre cerca de 1 e cerca de 100 mg/mL, incluindo mas não se limitando a arginina, glicina, ornitina, glutamina, asparagina, lisina, histidina, ácido glutâmico, ácido asparágico, isoleucina, leucina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptofano, metionina, serina, prolina. O termo "açúcar", tal como se utiliza neste documento, denota açúcares aceitáveis do ponto de vista farmacêutico utilizados numa quantidade de entre cerca de 34 25 mM e cerca de 500 mM. Prefere-se 100 a 300 mM. Mais preferido é 220 a 260 mM. De preferência utiliza-se 240 mM. Incluem-se nos açúcares adequados sem que se limitem, os monossacáridos e os dissacáridos. Incluem-se nos exemplos não limitativos de açúcares consoante a invenção a trehalose, a sacarose, o manitol, o sorbitol, a lactose, a glucose, a manose, a maltose, a galactose, a frutose, a sorbose, a rafinose, a glucosamina, a N-metilglucosamina (denominada em geral "meglumina"), a galactosamina e o ácido neuraminico, bem como combinações de quaisquer destes. O mais preferido é a trehalose. O termo "estabilizador" refere-se a estabilizadores aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, tais como por exemplo mas não se limitando a aminoácidos e açúcares tal como descritos nas secções acima bem como dextranas comercialmente disponíveis de qualquer tipo e massa molecular, tal como conhecidas na técnica. 0 termo "antioxidante" denota um antioxidante aceitável do ponto de vista farmacêutico. Isto pode incluir excipientes tais como metionina, álcool benzílico ou qualquer outro excipiente utilizado para minimizar a oxidação. 0 termo "um método de tratar" ou um seu equivalente, quando aplicado a, por exemplo, o cancro, refere-se a um processo ou conjunto de actuações que sejam 35 concebidos para diminuir ou para eliminar o número de células cancerosas num paciente, ou para aliviar os sintomas de um cancro. " Um método de tratar" cancro ou outra patologia proliferativa não significa necessariamente que as células do cancro ou da outra patologia venham a ser, de facto, eliminadas, que o número de células ou a patologia sejam, de facto, diminuídos, ou que os sintomas de um cancro ou de outra patologia sejam, de facto, aliviados. Amiúde, um método de tratar cancro será levado a cabo mesmo com uma pequena probabilidade de sucesso, desde que, atento o historial médico e a sobrevivência expectável de um paciente, se creia no entanto ele possa induzir um decurso de actuações que seja globalmente benéfico. A formulação de acordo com a invenção pode assumir uma forma líquida, uma forma liofilizada ou a forma de um líquido reconstituído a partir de uma forma liofilizada.

Numa concretização a formulação de acordo com a invenção é uma formulação liofilizada. A formulação liofilizada de acordo com a invenção tem a vantagem de ter uma melhor estabilidade quando envolvida na formação de particulados e de agregados com maior massa molecular o que é em geral difícil de conseguir com formulações líquidas com a mesma concentração descrita de anticorpo anti-CD20. 36 A formulação de acordo com a invenção pode ser administrada por via endovenosa (i.v.), subcutânea (s.c.) ou por qualquer outro meio de administração parentérico, tal como os conhecidos na técnica farmacêutica.

Além disto, uma formulação de acordo com a invenção pode incluir conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; fenol, álcool butilico ou benzílico; alquilparabenos tais como metilparabeno ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixa massa molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina, ou imunoglobulinas; agentes quelantes tais como EDTA; contra-iões formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo complexos de Zn-proteína).

Também se podem armadilhar os ingredientes activos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, respectivamente microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli-(metacrilato de metilo) , em sistemas coloidais de veiculação de fármacos (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nano-partícuias e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Descrevem-se estas 37 técnicas no Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A., Editor (1980).

Podem preparar-se preparações para libertação prolongada. Incluem-se nos exemplos adequados de preparações para libertação prolongada matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, matrizes estas que assumam a forma de artigos enformados, por exemplo películas, ou microcápsulas. Incluem-se nos exemplos de matrizes com libertação prolongada poliésteres, hidrogeles (por exemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), ou poli(álcool vinílico)), polilactidos (US 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico como L-glutamato de gama-etilo, copolímero de etileno-acetato de vinilo não degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico com ácido glicólico tais como LUPRON DEPOT™ (microesferas injectáveis constituídas por copolímero de ácido láctico com ácido glicólico e acetato de leuprolido), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

As formulações a utilizar para administração in vivo têm que ser estéreis. Isto consegue-se facilmente por filtração através de membranas de filtração estéreis.

Preferivelmente, a formulação da invenção inclui um ou mais agentes de isotonicidade numa quantidade de 38 entre cerca de 5 mM e cerca de 350 mM, tal como se definiu acima neste documento.

Preferivelmente, a formulação da invenção inclui uma quantidade de um açúcar de entre cerca de 25 mM e cerca de 500 mM, tal como se definiu acima neste documento.

Também preferivelmente, a formulação da invenção também inclui um ou mais dos seguintes ingredientes: antioxidantes, ácido ascórbico, glutationa, conservantes, por exemplo, m-cresol, fenol, álcool benzilico, metilparabeno, propilparabeno, clorobutanol, tiomersal, cloreto de benzalcónio, polietilenoglicol, por exemplo PEG 3.000, 3.350, 4.000, 6.000, albumina, albumina de soro humano (HSA), albumina de soro de bovino (BSA), álcoois polihidricos, glicerol, etanol, manitol, sais, sais acetato (por exemplo acetato de sódio), cloreto de magnésio, cloreto de cálcio, trometamina, EDTA, (por exemplo Na-EDTA).

Também preferivelmente, a formulação da invenção também contém um ou mais estabilizadores tal como se definiram acima neste documento e ingredientes também conhecidos na técnica como "lioprotectores" tais como açúcares, álcoois de açúcares, aminoácidos e dextranas, tal como se sabe na técnica. 39 São descritas as seguintes formulações, quer em formas liquidas, liofilizadas, ou como líquidos reconstituídos a partir de formas liofilizadas: ou 10 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,01 % de polissorbato 20 em peso/volume, 20 mM em L-histidina, e 140 mM em cloreto de sódio, a pH 6,0; ou 15 mg/mL de HuMab<CD20>,

Opcionalmente 0,001 a 1 % em peso/volume de um tensioactivo, 20 mM em L-histidina, a pH 6,0; ou 10 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,02 % de polissorbato 20 em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 240 mM em trehalose, a pH 6,0; 40 ou 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,02 % de polissorbato 20 em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 240 mM em trehalose, a pH 6,0; ou 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,02 % em Poloxamer 188™ em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 240 mM em trehalose, a pH 6,0; ou 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,01 % de Poloxamer 188™ em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 240 mM em trehalose, a pH 6,0; ou 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,1 % de Poloxamer 188™ em peso por volume, 41 20 mM em L-histidina, e 240 mM em trehalose, a pH 6,0; ou 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,02 % de Polissorbato 80 em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 240 mM em trehalose, a pH 6,0; ou 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,1 % de Polissorbato 80 em peso por volume, 20 mM em Acetato, e 240 mM em trehalose, a pH 5,5; ou 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,1 % de Polissorbato 80 em peso/volume, 20 mM em Acetato, e 14 OmM em cloreto de sódio, a pH 5,5; 42 ou 30 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,01 % de Poloxamer 188™ em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 200 mM em trehalose, a pH 6,5;

As formulações da invenção estão descritas nas reivindicações. Numa concretização preferida da formulação consoante a invenção, a formulação assume uma forma liofilizada e inclui após reconstituição com a quantidade adequada de água para injecção: 10 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,02 % de polissorbato 20 em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 240 mM em trehalose, a pH 6,0;

Esta formulação exibe uma boa estabilidade na armazenagem a 2-8°C e a 25° apresentando uma estabilidade adequada no que toca aos pontos de transição física tais como os de agregação, bem como aos pontos de transição química, tal como o de fragmentação. 43

Numa concretização preferida da formulação consoante a invenção, a formulação assume uma forma liquida: 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,02 % de Poloxamer 188™ em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 240 mM em trehalose, a pH 6,0;

Numa concretização preferida, a formulação é útil para evitar ou diminuir metástases ou mais disseminações num paciente que sofra de um cancro que expresse CD20. A formulação é útil para aumentar a duração da sobrevivência de um tal paciente, aumentando a sobrevivência isenta de progressão de um tal paciente, aumentando a duração da reacção, resultando numa melhoria estatisticamente significativa e com significado clinico do paciente tratado, tal como se possa medir pela duração da sobrevivência, da sobrevivência isenta de progressão, da taxa de reacção ou da duração da reacção. Numa concretização preferida, a formulação é útil para aumentar a taxa de reacção num grupo de pacientes.

No contexto desta invenção, podem utilizar-se outros agentes citotóxicos, quimioterapêuticos ou contra o cancro, em combinação com a formulação de anticorpo anti-CD20 consoante a invenção. 44

Incluem-se nestes agentes, por exemplo: agentes alquilantes ou agentes com uma acção alquilante, tais como ciclofosfamida (CTX; por exemplo cytoxan®) , clorambucil (CHL; por exemplo leukeran®) , cis-platina (CisP; por exemplo platinol®) , bussulfan (por exemplo myleran®) , melfalan, carmustina (BCNU), estreptozotocina, trietilenomelamina (TEM), mitomicina C, e outros semelhantes; anti-metabolitos, tais como metotrexato (MTX), etoposido (VP16; por exemplo vepesid®) , 6-mercaptopurina (6MP), 6-tioguanina (6TG), citarabina (Ara-C), 5-fluorouracilo (5-FU), capecitabina (por exemplo Xeloda®) , dacarbazina (DTIC), e outros semelhantes; antibióticos, tais como actinomicina D, doxorrubicina (DXR; por exemplo adriamicina®) daunorrubician (daunomicina), bleomicina, mitramicina e outras semelhantes; alcaloides, tais como alcaloides de vinca como a vincristina (VCR), a vinblastina, e outros semelhantes; e outros agentes antitumorais, tais como paclitaxel (por exemplo taxol®) e derivados de paclitaxel, os agentes citostáticos, glucocorticóides tais como dexametasona (DEX ; por exemplo decadron®) e corticosteróides tais como prednisona, nucleósidos inibidores de enzimas tais como hidroxiureia, enzimas que eliminem aminoácidos tais como asparaginase, meclorenamina leucovorina e outros derivados de ácido fólico, e diversos agentes antitumorais semelhantes. Também se podem utilizar os agentes seguintes como agentes adicionais: arnifostina (por exemplo ethyol®) , dactinomicina, 45 (mostarda de azoto), estreptozocina, ciclofosfamida, lomustina (CCNU), doxorrubicina lipo (por exemplo doxil®) , gemcitabina (por exemplo gemzar®) , daunorrubicina lipo (por exemplo daunoxome®) , procarbazina, mitomicina, docetaxel (por exemplo taxotere®) , aldesleuquina, carboplatina, oxaliplatina, cladribina, camptotecina, CPT 11 (irinotecana) , 10-hidroxi-7-etil-camptotecina (SN38), floxuridina, fludarabina, ifosfamida, idarrubicina, mesna, interferão beta, interferão alfa, mitoxantrona, topotecana, leuprolido, megestrol, melfalan, mercaptopurina, plicamicina, mitotano, pegaspargase, pentostatina, pipobromana, plicamicina, tamoxifene, teniposido, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostarda de uracilo, vinorrelbina, clorambucil. Preferivelmente o tratamento de combinação com anticorpo anti-CD20 é utilizado sem estes agentes adicionais. A utilização de agentes citotóxicos e anti-cancro descrita acima bem como a de um fármaco anti-cancro antiproliferativo especifico para um alvo, tal como inibidores de proteína quinases em regimes quimioterapêuticos é em geral bem caracterizada nas técnicas de terapia do cancro, e a sua utilização neste documento recai sob as mesmas considerações para a monitorização da tolerância e da eficácia e sob as de controlo de vias e dosagens de administração, com alguns ajustamentos. Por exemplo, as dosagens actuais dos agentes citotóxicos podem variar consoante a reacção do paciente em 46 culturas de células, determinada por métodos de histocultura. Em geral, a dosagem será menor em comparação com a guantidade utilizada na ausência de outros agentes adicionais.

As dosagens típicas de um agente citostático eficaz podem estar na gama recomendada pelo fabricante, e quando tal seja indicado pelas reacções in vitro ou em modelos em animais, podem ser diminuídas em até cerca de uma ordem de grandeza, em concentração ou em quantidade. Deste modo, a dosagem real dependerá da opinião do médico, do estado do paciente, e da eficácia do método terapêutico baseada na reactividade in vitro das células malignas primárias cultivadas ou de amostras de tecido em histocultura, ou das reacções observadas nos modelos em animais que sejam apropriados.

No contexto desta invenção, pode aplicar-se uma quantidade eficaz de radiação ionizante e/ou um produto radiofarmacêutico, para além da formulação de anticorpos anti-CD20 consoante a invenção. A fonte da radiação pode ser quer externa, quer interna, em relação ao paciente que se estiver a tratar. Quando a fonte for externa ao paciente, a terapia é conhecida como terapia de irradiação com um feixe externo (EBRT). Quando a fonte for interna ao paciente, a terapia é conhecida como braquiterapia (BT) . Podem seleccionar-se átomos radioactivos no contexto desta invenção a partir do conjunto constituído por, mas que não se limita a, rádio, césio-137, irídio-192, americio-241, ouro-198, cobalto-57, cobre-67, tecnécio-99, iodo-123, iodo-131, e indio-111. Também é possível marcar o anticorpo com estes isótopos radioactivos. Preferivelmente utiliza-se a formulação de anticorpos anti-CD20 consoante a invenção sem esta radiação ionizante. A terapia de radiação é um tratamento habitual para controlar tumores não ressecáveis ou inoperáveis e/ou metástases tumorais. Observaram-se melhores resultados quando se combinou a terapia de radiação com a quimioterapia. A terapia de radiação baseia-se no princípio de que a radiação de alta energia absorvida numa área alvo resultará na morte das células que se reproduzem, tanto no tumor como nos tecidos normais. 0 regime de dosagem da radiação é em geral definido em termos de dose de radiação absorvida (Gy), duração e fraccionamento, e tem que ser cuidadosamente definido pelo oncologista. A quantidade de radiação que um paciente recebe dependerá de diversos factores, sendo os dois mais importantes a localização do tumor em relação a outras estruturas ou órgãos críticos do corpo, e a extensão do desenvolvimento do tumor. Um decurso típico de tratamento para um paciente que receba terapia de radiação envolverá um calendário de tratamentos ao longo de um período de entre 1 a 6 semanas, com uma dose total de entre 10 e 80 Gy administrada ao paciente em fracções diárias únicas de cerca de 1,8 a 2,0 Gy, 5 dias por semana. Numa concretização preferida desta invenção existe sinergia 48 quando os tumores dos pacientes humanos são tratados com a formulação consoante a invenção e com radiação. Por outras palavras, a inibição do crescimento de tumores por intermédio dos agentes que incluam uma combinação da invenção é maior quando é combinada com radiação, opcionalmente com agentes quimioterapêuticos ou anti-cancro adicionais. Podem ver-se parâmetros das terapias de radiação adjuvantes, por exemplo, no WO 99/60.023.

Administra-se a formulação de anticorpos a um paciente de acordo com métodos conhecidos, por administração endovenosa sob a forma de um bolus ou por infusão continua ao longo de um período de tempo, pela via intramuscular, intraperitoneal, intracerobroespinal, subcutânea, intra-articular, intrassinovial, ou intratecal. Prefere-se a administração dos anticorpos por via endovenosa ou subcutânea. A invenção também inclui um estojo caracterizado por incluir um contentor, uma composição dentro do contentor que inclua a formulação referida do anticorpo anti-CD20, e uma documentação inserida na embalagem, que instrua o utilizador da formulação como administrar a referida formulação de anticorpo anti-CD20 a um paciente que sofra de um cancro que expresse CD20. O termo "documento inserido na embalagem" refere-se a instruções habitualmente incluídas nas embalagens 49 comerciais dos produtos terapêuticos, que podem incluir informação acerca das indicações, utilização, dosagem, administração, contra-indicações e/ou avisos acerca da utilização destes produtos terapêuticos.

Numa concretização preferida, o artigo dos contentores manufacturados pode também incluir um veiculo aceitável do ponto de vista farmacêutico. 0 artigo dos contentores manufacturados também pode incluir um diluente estéril, que se armazena preferivelmente num contentor adicional, em separado.

Tal como se utiliza neste documento, um "veiculo aceitável do ponto de vista farmacêutico" pretende incluir todo e qualquer material compatível com a administração farmacêutica, incluindo solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de isotonicidade e de atraso da absorção, e outros materiais e compostos compatíveis com a administração farmacêutica. Excepto na medida em que qualquer agente ou meio convencional seja incompatível com o composto activo, a sua utilização nas composições da invenção está contemplada. Também se podem incorporar agentes activos suplementares nas composições.

Em mais uma concretização da invenção, a formulação consoante a invenção inclui um anticorpo anti-CD20 de tipo I que seja co-administrado em conjunto com um 50 anticorpo anti-CD20 de tipo II consoante a invenção. As formulações consoante a invenção podem ser duas formulações em separado, uma para cada um dos anticorpos anti-CD20. Em alternativa, a formulação neste documento também pode conter ambos os anticorpos numa mesma formulação.

Noutra concretização ainda da invenção, a formulação consoante a invenção inclui um anticorpo anti-CD20 na medida em que o referido anticorpo anti-CD20 é co-administrado com um agente activo anti-Bcl-2. O termo "Bcl-2", tal como se utiliza neste documento, refere-se à proteína Bcl-2 (Swiss Prot ID N° P10415), um membro da família de proteínas Bcl-2. O termo "agente activo anti-Bcl-2" inclui "nucleótidos de sentido reverso anti-Bcl-2" e "inibidores de Bcl-2". Os "nucleótidos de sentido reverso anti-Bcl-2" regulam em baixa os teores de mARN de Bcl-2 e diminuem a expressão da proteína Bcl-2. Incluem-se nos exemplos destes nucleótidos de sentido reverso anti-Bcl-2 o Oblimersen e o SPC-2996. ABT-737, tal como se utiliza neste documento, significa N-[4-[4-(4'-clorobifenil-2- ilmetill)piperazin-l-il]benzoíl]-3-[3-(dimetilamino)-1(R)-(fenilsulfanilmetil)propilamino]-4-nitrobenzenosulfonamida; a 4-[4-(4'-clorobifenil-2-ilmetil)piperazin-l-il]-N- [3 —[3 — (dimetilamino)-1(R)-(fenilsulfanilmetil)propilamino]-4-nitrofenilsulfonil]benzamida, um inibidor de Bcl-2, que se encontra descrita no WO 2006/099.667 ou em Corey, S., et al.r Câncer Cell (2005) 5-6. BT-263, tal como se utiliza neste documento, significa um inibidor de Bcl-2, que se 51 encontra descrito no US 2007/027.135. Preferivelmente selecciona-se o agente activo anti-Bcl-2 de entre Oblimersen, SPC-2996, TA-402, Gossipol, AT-101, mesilato de Obatoclax, A-371191, A-385358, A-438744, ABT-737, AT-101, BL-11, BL-193, GX-15-003, 2-metoxiantimicina A3, HA-14-1, KF-67544, Purpurogalina, TP-TW-37, YC-137 e Z-24. Preferivelmente o agente activo anti-Bcl-2 é um inibidor proteico de Bcl-2 ligante com um IC50 para a sua actividade inibidora anti-Bcl-2 de 5 μΜ ou menos. Um tal inibidor ligante da proteína Bcl-2 é seleccionado de preferência de entre Gossipol, AT-101, mesilato de Obatoclax, ABT-263 e ABT-737, mais preferivelmente de entre ABT-263 ou ABT-737.

Noutra concretização ainda da invenção, a formulação consoante a invenção inclui um anticorpo anti-CD20 na medida em que o referido anticorpo anti-CD20 é co-administrado com um inibidor do proteassoma. O termo "inibidor do proteassoma", tal como se utiliza neste documento, refere-se a agentes que inibam a actividade do proteassoma 26S. Incluem-se nestes inibidores do proteassoma entre outros, por exemplo, derivados peptídicos tais como aldeídos peptídicos (por exemplo MG132, MG115, CEP-1615, PSI, ou o inibidor específico do imunoproteassoma IPSI-001 (Cbz-LnL-CHO = N-carbobenziloxi-leucil-norleucinal, veja-se o US 2006/0.241.056), boronatos peptídicos (por exemplo bortezomib (PS-341) ou DFLB), epoxicetonas peptídicas (por exemplo epoxomicina, dihidroeponemicina, ou o derivado de epoxomicina 52 carfilzomib (PR-171)), ou vinilsulfonas peptídicas (por exemplo NLVS) e derivados não peptídicos tais como a salinosporamida A (NPI-0052), derivados de salinosporamida A, lactacistina ou derivados de lactacistina (por exemplo clasto-lactacistina-L-lactona (omuralido) ou PS-519). Os diferentes tipos e estruturas dos referidos inibidores do proteassoma estão descritos por exemplo em Kisselev, A.L., et al., Chem. Biol. (2001) 739-758, WO 2004/004.749 e em Joazeiro, C., et al., Res. 66(16) (2006) 7840-7842), Kanagasabaphy, et al., Curr. Opin. Investig. Drugs 8 (2007) 447-51, Adams, J., Nat. Ver. Câncer 4 (2004) 349-360 e no US 2006/0.241.056.

Preferivelmente o referido inibidor do proteassoma é seleccionado de entre aldeídos peptídicos (preferivelmente N-carbobenziloxi-leucil-norleucinal (IPSI-001)), boronatos peptídicos (preferivelmente bortezomib (PS-341)), epoxicetonas peptídicas (preferivelmente o derivado de epoxomicina, carfilzomib (PR-171)), ou salinosporamida A (NPI-0052). Mais preferivelmente o referido inibidor do proteassoma é seleccionado de entre bortezomib (PS-341), carfilzomib (PR-171), salinosporamida A (NPI-0052) ou N-carbobenziloxi-leucil-norleucinal (IPSI-001) .

Numa concretização preferida o inibidor do proteassoma é um derivado peptídico seleccionado de entre aldeídos peptídicos (preferivelmente N-carbobenziloxi- 53 leucil-norleucinal (IPSI-001)), boronatos peptídicos (preferivelmente bortezomib (PS-34)) ou epoxicetonas peptídicas. Noutra concretização preferida o inibidor do proteassoma é um boronato peptídico (preferivelmente bortezomib (PS-341); veja-se, por exemplo, Adams, Cur. Opin. Chem. Biol. 6 (2002) 493-500 e a US 5.780.454)).

Preferivelmente o inibidor de proteassoma apresenta um valor de IC50 para a sua actividade inibidora anti-proteassoma de 5 μΜ ou menos, mais preferivelmente de 1 μΜ ou menos. Um Ensaio Baseado em Células para identificar os referidos inibidores do proteassoma e para a determinação do valor de IC5o para a actividade inibidora anti-proteassoma (recorrendo a uma diluição em série e a cálculos utilizando o ajuste de uma curva não linear (programa XLfit (ID Business Solution Ltd., Guilford, Surrey, UK)) estão descritos em Moravec, et al., Cell Notes 15 (2006) 4-7, utilizando o Reagente para Ensaios Baseados em Células Proteasome-Glo™ da Promega com células U266 (de mieloma do plasma humano). Este ensaio de "adicionar-misturar-quantificar" mede a actividade como protéase semelhante à de quimotripsina associada ao proteassoma, em células em cultura.

Para além do IPSI-001 (Cbz-LnL-CHO = N-carbobenziloxi-leucil-norleucinal), também são inibidores preferidos do proteassoma os seguintes derivados peptídicos do US 2006/0.241.056: N-carbobenziloxi-homofenilalanil- 54 fenilalanilal, N-carbobenziloxi-leucil-fenilalanilal, N-carbobenziloxi-alanil-fenilalanilai, N-carbobenziloxi- glicil-prolil-alanil-fenilalanilal, N-carbobenziloxi- glicil-prolil-fenilalanil-fenilalanilal, N-carbobenziloxi-glicil-fenilalanil-fenilalanilal, ácido N-carbobenziloxi-leucil-norleucinaborónico, ácido N-carbobenziloxi- fenilalanil-fenilalaninaborónico, ácido N-carbobenziloxi-homofenilalanil-fenilalaninaborónico, ácido N- carbobenziloxi-leucil-fenilalaninaborónico, ácido N- carbobenziloxi-glicil-prolil-alanilfenilalaninaborónico, ácido N-carbobenziloxi-glicil-prolil-fenilalanil- fenilalaninaborónico, ácido N-carbobenziloxi-leucil-leucil-fenilalaninaborónico, ácido N-carbobenziloxi-glicil- fenilalanil-fenilalaninaborónico, N-carbobenziloxi-leucil-norleucina-metilvinilsulfona, N-carbobenziloxi-fenilalanil-fenilalanina-metilvinilsulfona, N-carbobenziloxi- homofenilalanil-fenilalanina-metilvinilsulfona, N- carbobenziloxi-leucil-fenitalanina-metilvinilsulfona, N-carbobenziloxi-alanil-fenilalanina-metilvinilsulfona, N-carbobenziloxi-glicil-prolil-alanil-fenilalanina-metilvinilsulfona, N-carbobenziloxi-glicil-prolil- fenilalanil-fenilalanina-meti1vinilsulfona, N- carbobenz iloxi-leucil-leucil-fenilalanina- metilvinilsulfona, N-carbobenziloxi-glicil-fenilalanil- fenilalanina-metilvinilsulfona, N-carbobenziloxi-leucil-norleucina-epoxicetona, N-carbobenziloxi-fenilalanil- fenilalanina-epoxicetona, N-carbobenziloxi-homofenilalanil-fenilalanina-epoxicetona, N-carbobenziloxi-leucil- 55 fenilalanina-epoxicetona, N-carbobenziloxi-alanil-fenilalanina-epoxicetona, N-carbobenziloxi-glicil-prolil-alanil-fenilalanina-epoxicetona, N-carbobenziloxi-glicil-prolil-fenilalanil-fenilalanina-epoxicetona, n-carbobenziloxi-leucil-leucil-fenilalanina-epoxicetona, e N-carbobenziloxi—glicil—fenilalanil—fenilalanina-epoxicetona·

Os exemplos e figuras que se seguem são proporcionados para ajudar na compreensão da invenção presente, cujo âmbito real se encontra nas reivindicações apensas. Entende-se que poderão ser feitas modificações nos processos incluídos sem afastamento em relação ao espírito da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Prepararam-se as seguintes formulações, quer na forma líquida, liofilizada ou na de um líquido reconstituído a partir de uma forma liofilizada: 15 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,01 % polissorbato 20 em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 140 mM em cloreto de sódio, a pH 6,0; 56 10 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,01 % de polissorbato 20 em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 140 mM em cloreto de sódio, a pH 6,0; 15 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM em L-histidina, a pH 6,0; 10 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,02 % de polissorbato 20 em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 240 mM em trehalose, a pH 6,0; 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,02 % de polissorbato 20 em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 240 mM em trehalose, a pH 6,0.

Também se preparou uma forma liofilizada que incluía após reconstituição com a quantidade apropriada de água para injecção: 10 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,02 % de polissorbato 20 em peso por volume, 57 20 mM em L-histidina, e 240 mM em trehalose, a pH 6,0.

Esta formulação denota uma boa estabilidade sob armazenagem a 2-8°C e a 25° com uma estabilidade adequada em relação aos pontos de viragem físicos tais como a agregação e aos pontos de viragem químicos tais como a fragmentação.

Desenvolveram-se conforme se segue formulações líquidas e liofilizadas do produto farmacológico para administração parenteral consoante a invenção:

Preparação de formulações líquidas.

Prepararam-se formulações líquidas de HuMab<CD20> por homogeneização de soluções de HuMab<CD20> no tampão da sua produção (por exemplo tampão 20 mM de histidina a um pH de cerca de 6,0 ou tampão 20 mM de histidina a um pH de cerca de 6,0 contendo 140 mM de cloreto de sódio e 0,01 % (em peso por volume) de polissorbato 20) . Também se podem preparar formulações de HuMab<CD20> ajustando a concentração proteica ao valor pretendido por diluição com tampão. Adicionaram-se excipientes para estabilizar a proteína e para ajustar a tonicidade tal como era necessário e que podem ser adicionados sob uma forma dissolvida ou em alternativa como sólidos. Adicionou-se 58 tensioactivo às formulações sob a forma de uma solução de reserva, consoante necessário. Todas as formulações foram esterilizadas por filtração através de filtros de 0,22 pm e distribuídas em alíquotas por frascos estéreis em vidro fechados com rolhas de borracha e pinças alucrimp. Armazenaram-se estas formulações a diferentes temperaturas e durante diferentes intervalos de tempo e removeram-se para análise nas alturas indicadas nos parágrafos individuais. Analisaram-se as formulações 1) por espectrofotometria no UV, 2) por Cromatografia de Exclusão de Dimensões (SEC), 3) para encontrar partículas visíveis e subvisíveis, 4) por cromatografia de permuta iónica (IEC) e 5) por turbidez da solução.

Preparação de formulações liofilizadas.

Prepararam-se soluções de HuMab<CD20> tal como se descreveu acima para as formulações liquidas, ou fabricaram-se homogeneizando soluções de HuMab<CD20> em tampão de histidina 20 mM a um pH de cerca de 6,0, contendo um açúcar e um tensioactivo. Todas as formulações foram esterilizadas por filtração através de filtros de 0,22 pm e distribuídas em alíquotas por frascos estéreis em vidro. Fecharam-se parcialmente os frascos com rolhas de borracha adequadas para utilização em processos de liofilização e transferiram-se para a câmara de secagem do liofilizador. Pretende-se que todos os métodos de liofilização conhecidos na técnica se encontrem adentro do âmbito da invenção. Por 59 59 Dimensões (SEC) 4) exemplo, o processo de liofilização utilizado para este estudo incluía o arrefecimento da formulação desde a temperatura ambiente até cerca de 5°C (pré-arrefecimento), seguindo-se uma congelação a -40°C (Freeze I) a uma velocidade linear de entre cerca de l°C/min e 5°C/min. O primeiro passo de secagem pode ocorrer a uma taxa linear de entre 0,3 e 0,5°C/min desde -40°C até -30°C mantendo depois a -30°C durante pelo menos 50 horas a uma pressão na câmara de entre cerca de 75 e 80 mTorr. Pode ocorrer um segundo passo de secagem a uma velocidade linear de entre 0,1 e 0,3°C/min desde -30°C a 25°C, mantendo-se a 25°C durante pelo menos 5 horas a uma pressão da câmara de entre cerca de 50 e 80 mTorr (a calendarização da secagem aplicada está na Tabela 1). Verificou-se que as formulações de HuMab<CD20> que foram secas utilizando os processos de liofilização descritos apresentavam períodos de reconstituição convenientemente rápidos, de cerca de 2-3 minutos. Todos os bolos de liofilização deste estudo apresentavam um conteúdo residual em água de cerca de 0,1 a 1,0 %, tal como determinados pelo método de Karl-Fischer. Armazenaram-se os frascos liofilizados a diferentes temperaturas durante períodos de tempo diferentes. Reconstituíram-se as formulações liofilizadas com o volume de água para injecção (WFI) respectivo antes de 1) se analisar por espectrofotometria UV, 2) determinação do período de tempo de reconstituição, 3) análise por Cromatografia de Exclusão de 60 cromatografia de permuta iónica (IEC), 5) determinação de partículas subvisíveis e visíveis e 6) turbidez da solução.

Levou-se a cabo a cromatografia de exclusão de dimensões (SEC) para detectar espécies solúveis com elevada massa molecular (agregados) (HMW) e produtos de hidrólise com pequena massa molecular (LMW) nas formulações. O método recorreu a um instrumento de HPLC adequado equipado com um detector no UV (comprimento de onda de detecção de 280 nm) e uma coluna Zorbax GF-250 (9,4 x 250 mm, Agilent); o método utilizava como fase móvel fosfato de sódio 200 mM a pH 7,0.

Levou-se a cabo a Cromatografia de Permuta Iónica (IEC) para detectar produtos de degradação química alterando a carga líquida do HuMab<CD20> nas formulações. O método recorreu a um instrumento de HPLC adequado equipado com um detector no UV (comprimentos de onda de detecção de 220 e 280 nm) e uma coluna Dionex ProPac WCX-10 (4 mm x 250 mm). Utilizaram-se respectivamente a título de fases móveis A e B tampão de fosfato de sódio 10 mM a pH 6,0 em H2O e tampão de fosfato de sódio 10 mM a pH 6,0 + NaCl 0,75 M, e um caudal de 1,0 mL/min. A espectroscopia no UV para determinação da concentração proteica foi levada a cabo num espectrofotómetro Varian Cary Bio UV a 280 nm. 61

Para a determinação da turbidez, mediu-se a opalescência em FTU (unidades de turbidez) utilizando um turbidimetro HACH 2100AN à temperatura ambiente.

Analisaram-se as amostras quanto à presença de partículas subvisíveis utilizando um HIAC Royco PharmaSpec (HRLD-150), e a presença de partículas visíveis utilizando um instrumento Seidenader V90-T de inspecção visual.

Passo

Tabela 1 Ciclo de Liofilizaçao jTaxa linear de j alteração de \ temperatura |(°C/min) | Temperatura ida prateleira I(°C)

Período de manutenção |min) | Valor da | pressão em ! vazio l(mTorr)

Antes dojgoQ arrefecimento j |o,o 60 j- Congelação 1 |-40°C h,o 120 j- Secagem Ln<>r Primária j 0,5 3.720 O oo Secagem j Secundária j ! 0,2 300 80

Dados de estabilidade das formulações liquidas do produto farmacológico HuMab<CD20> consoante esta invenção 62 Formulação 15 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM em L-histidina, pH 6,0,

Condições de Armazenagem ; Período desn . , SEC » s Proteína .. Armazenagem s. , .. Monomero I (meses) |(mg/mL) (%) SEC | IEC | HMW{Turbidez {Alterações (%) | Significativas;

Partículas { Partículas i Visíveis jSubvisíveis i

Inicial

2-8°C

25°C

40°C

20°C

80°C 14.5 14.7 15.5 14.2 14.8 15.0 14.6 14.8 15.1 14.8 15.1 14.3 ,15,0 Í1Í9 98,4 98,1 97,9 97.7 98.0 97.8 97.3 97.6 96.1 98.4 98.1 97.7 |98~2 {98,4 1.6 |5,9 {Não | Passou | Passou 1.8 |5,9 |Não | Passou | Passou 2.0 |6,1 {Não | Passou | Passou 2.1 15,7 {Não {Passou {Passou 1.7 {5,7 {Não {Passou {Passou 1.8 {5,8 {Não {Passou {Passou 1.9 {6,1 {Sim {Falhou {Passou 1.6 {5,8 {Não {Passou {Passou 1.9 {6,2 {Sim {Passou {Passou 1.6 {6,3 {n/d {Falhou {Passou 1.8 {6,2 {Não {Falhou {Passou 2,3 {6,1 {Não {Falhou {Passou 1.6 {5,8 {Não {Falhou {Passou 1.6 {5,7 {Não {Falhou iPassou n/d: não determinado Passou: livre a essencialmente livre de partículas visíveis, no máximo 6,000 partículas >10 μιτι/contentor, no máximo 600 partículas >25 μιτι/contentor 63

Formulação 10 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM em L-histidina, 240 mM em trehalose, 0,02 % em peso por volume de

Polissorbato 20, pH 6,0, Condições de Armazenagem | Período de jprotefna |SEC jSEC \ ÍIEC ; Armazenagem L . .. i Monómero ; HMW : Turbidez ; Alterações ! (meses) | (mg/mL) |(%) ;(%) | | Significativas l Partículas | Partículas \ Visíveis iSubvisíveis Inicial (11,0 [98,4 (1,6 |3,9 ] Não jPassou |Passou h hi,i Í98,3 11,6 |4,0 I Não j Falhou j Passou 2-8°C |3 111,3 |98,2 |1,7 ; 6,6 I Não [Falhou [Passou Í6 Ho,8 198,1 |1,7 18,3 I Não [Falhou !Passou h hi,o ]98,3 h,4 j 6,4 I Não \ Falhou ! Passou 25°C I3 111,3 ]98,2 |1,5 [6,7 ! Não [Falhou [Passou Í6 Hl,2 !98,8 |1,4 |6,7 ISim [Falhou !Passou h hi,i :98,0 11,3 !7,5 I Não [Falhou [Passou 40°C 4________________________________ |3 111,2 |96,7 II ,5 14,9 ISim [Falhou [Passou h |ϊι,ο |98,5 h,5 |3,4 | Não [Passou [Passou -20°C I3 ! 11,2 :98,3 ! 1,6 [4,0 I Não [Passou [Passou |6 jn/d jn/d jn/d jn/d :j n/d jn/d jn/d ΟΛΟΛ |3 H1,2 Í98,3 Í1,6 3,7 I Não [Passou [Passou -OU \j |6 h 1,0 í 98,5 ji',5 3,8 | Não |Passou |Passou n/d: não determinado

Passou: livre a essencialmente livre de partículas visíveis, no máximo 6,000 partículas >10 μιτι/contentor, no máximo 600 partículas >25 μm/contentor

Dados de estabilidade de formulações do produto farmacológico liofilizado huMAb<CD20> consoante esta invenção

Formulação: 10 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM em L-histidina 240 mM em trehalose, com 0,02 % em peso por volume de Polissorbato 20, pH 6,0, - 64 - i Condições de iArmazenage im 5eríodo de Armazenage m (meses) Proteín a (mg/mL) jsEC Monómer |o(%) SEC i HM jTurbide W z (%) | IEC I Alterações i Significativa Is í Partícula ; Partículas ! js Visíveis iSubvisívei ! ! |s \ Inicial 10,4 ;98,9 1,1 2,9 154,8 (Passou (Passou | 10,5 Í98,9 1,1 2,9 I n/d ]Passou |Passou | 3 10,4 ]98,9 1,1 2,9 |n/d I Passou |Passou j 2-8°C 6 10,4 98,9 1,1 13,4 153,1 í Passou \Passou | 12 10,4 |98,9 1,1 (3,1 ί 56,6 lPassou |Passou j 24 10,3 (98,9 1,1 13,1 (55,6 iPassou \Passou | 1 10,2 (98,9 1,1 2,9 j n/d i Passou |Passou j 25°C 3 6 105 10,4 |98,9 (98,9 1.1 2,9 1.1 |3,3 (n/d [52,9 (Passou (Passou j (Passou |Passou j 12 10,4 |98,8 1,2 3,1 (56,9 (Passou (Passou ( 1 10,5 (98,9 1,1 13,0 |n/d (Passou |Passou j 40°C 3 10,4 |98,9 1,1 13,0 (n/d (Passou (Passou ( (6 10,5 (98,9 ϊ,ϊ ! 3,4 (50,9 (Passou (Passou ( n/d: não determinado j

Passou: livre a essencialmente livre de partículas visíveis, no máximo 6,000 partículas >10 j pm/contentor, no máximo 600 partículas >25 μιτι/contentor j

Exemplo 2

Prepararam-se as formulações seguintes, quer sob forma líquida, quer liofilizada, quer ainda sob forma líquida reconstituída a partir de uma forma liofilizada: 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,02 % de Poloxamer 188™ em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 240 mM em trehalose, a pH 6,0; 65 ou 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,01 % de Poloxamer 188™ em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 240 mM em trehalose, a pH 6,0; ou 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,1 % de Poloxamer 188™ em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 240 mM em trehalose, a pH 6,0; ou 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,02 % de Polissorbato 80 em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 240 mM em trehalose, a pH 6,0; ou 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 66 0,1 % de Polissorbato 80 em peso por volume, 20 mM em Acetato, e 240 mM em trehalose, a pH 5,5; ou 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,1 % de Polissorbato 80 em peso por volume, 20 mM em Acetato, e 140 mM em cloreto de sódio, a pH 5,5; ou 30 mg/mL de HuMab<CD20>, 0,01 % de Poloxamer 188™ em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 200 mM em trehalose, a pH 6,5.

Prepararam-se tal como se segue formulações do produto farmacológico liquidas e liofilizadas para administração parenteral:

Preparação de formulações líquidas. 67

Prepararam-se formulações de HuMab<CD20> por homogeneização de soluções de HuMab<CD20> no tampão da sua produção (por exemplo tampão 20 mM de histidina a um pH de cerca de 6,0 contendo trehalose 240 mM e 0,02 % (em peso por volume) de Poloxamer 18 8™) . Também se podem preparar formulações de HuMab<CD20> por diafiltração de soluções com cerca de 10-40 mg/mL de HuMab<CD20> no tampão de produção (por exemplo tampão de histidina 20 mM a um pH de cerca de 6,0) por filtração com caudal tangencial (TFF) para aumentar a concentração proteica acima da concentração proteica alvo e para permutar o tampão. Também se podem preparar formulações de HuMab<CD20> ajustando a concentração proteica ao valor pretendido por diluição com tampão. Adicionaram-se excipientes para estabilizar a proteína e para ajustar a tonicidade tal como era necessário e que podem ser adicionados sob uma forma dissolvida ou em alternativa como sólidos. Adicionou-se tensioactivo às formulações sob a forma de uma solução de reserva, consoante necessário. Todas as formulações foram esterilizadas por filtração através de filtros de 0,22 pm e distribuídas em alíquotas por frascos estéreis em vidro fechados com rolhas de borracha e pinças alucrimp. Armazenaram-se estas formulações a diferentes temperaturas e durante diferentes intervalos de tempo e removeram-se para análise nas alturas indicadas nos parágrafos individuais. Analisaram-se as formulações 1) por espectrofotometria no UV, 2) por Cromatografia de Exclusão de Dimensões (SEC), 3) para encontrar partículas visíveis e 68 subvisíveis, 4) por cromatografia de permuta iónica (IEC) e 5) por turbidez da solução.

Preparação de formulações liofilizadas.

Prepararam-se soluções de HuMab<CD20> tal como se descreveu acima para as formulações liquidas. Todas as formulações foram esterilizadas por filtração através de filtros de 0,22 pm e distribuídas em alíquotas por frascos estéreis em vidro. Fecharam-se parcialmente os frascos com rolhas de borracha adequadas para utilização em processos de liofilização e transferiram-se para a câmara de secagem do liofilizador. Pretende-se que todos os métodos de liofilização conhecidos na técnica se encontrem adentro do âmbito da invenção. Por exemplo, o processo de liofilização utilizado para este estudo incluía o arrefecimento da formulação desde a temperatura ambiente até cerca de 5°C (pré-arrefecimento), seguindo-se uma congelação a -40°C (Freeze I) a uma velocidade linear de entre cerca de l°C/min e 5°C/min. 0 primeiro passo de secagem pode ocorrer a uma taxa linear de entre 0,3 e 0,5°C/min desde -40°C até -30°C mantendo depois a -30°C durante pelo menos 50 horas a uma pressão na câmara de entre cerca de 75 e 80 mTorr. Pode ocorrer um segundo passo de secagem a uma velocidade linear de entre 0,1 e 0,3°C/min desde -30°C a 25°C, mantendo-se a 25°C durante pelo menos 5 horas a uma pressão da câmara de entre cerca de 50 e 80 mTorr (a calendarização da secagem aplicada está na Tabela 1). Todos os bolos de liofilização 69 deste estudo apresentavam um conteúdo residual em água de cerca de 0,1 a 1,0 %, tal como determinados pelo método de Karl-Fischer. Armazenaram-se os frascos liofilizados a diferentes temperaturas durante períodos de tempo diferentes. Reconstituíram-se as formulações liofilizadas com o volume de água para injecção (WFI) respectivo antes de 1) se analisar por espectrofotometria UV, 2) análise por Cromatografia de Exclusão de Dimensões (SEC), 3) cromatografia de permuta iónica (IEC), 4) determinação de partículas subvisíveis e visíveis e 5) turbidez da solução.

Levou-se a cabo a cromatografia de exclusão de dimensões (SEC) para detectar espécies solúveis com elevada massa molecular (agregados) (HMW) e produtos de hidrólise com pequena massa molecular (LMW) nas formulações. O método recorreu a um instrumento de HPLC adequado equipado com um detector no UV (comprimento de onda de detecção de 280 nm) e uma coluna Zorbax GF-250 (9,4 x 250 mm, Agilent) ou uma TSKgel G3000 SWXL (7, 8 x 300 mm); o método utilizava como fase móvel quer fosfato de sódio 200 mM a pH 7,0, quer cloreto de potássio 250 mM em fosfato de potássio 200 mM a pH 7,0.

Levou-se a cabo a Cromatografia de Permuta Iónica (IEC) para detectar produtos de degradação química alterando a carga líquida do HuMab<CD20> nas formulações. O método recorreu a um instrumento de HPLC adequado equipado com um detector no UV (comprimentos de onda de detecção de 70 220 e 280 nm) e uma coluna Dionex ProPac WCX-10 (4 mm x 250 mm). Utilizaram-se respectivamente a titulo de fases móveis A e B tampão de fosfato de sódio 10 mM a pH 6,0 em H2O e tampão de fosfato de sódio 10 mM a pH 6,0 + NaCl 0,75 M, e um caudal de 1,0 mL/min. A espectroscopia no UV para determinação da concentração proteica foi levada a cabo num espectrof otómetro Varian Cary Bio UV a 280 nm ou num espectrofotómetro Perkin Elmer UV a 280 nm.

Para a determinação da turbidez, mediu-se a opalescência em FTU (unidades de turbidez) utilizando um turbidímetro HACH 2100AN à temperatura ambiente.

Analisaram-se as amostras quanto à presença de partículas subvisíveis utilizando um HIAC Royco PharmaSpec (HRLD-150) , e a presença de partículas visíveis utilizando um instrumento Seidenader V90-T de inspecção visual.

Tabela 1 Ciclo de Liofilização L . ITaxa linear de s Temperatura . pass° |da Prateleira |tem^°kira e 1' ](°C/min) Antes doLo« jnn arrefecimento \ \ Congelação 1 |-40°C |1,0 _ , . . sValor da Período de; . - pressão em manutenção ζ <mm> (mTorr) 60 |-120 |- Secagem | |0,5 Primaria \ \ 3.720 |β0 - 71 - Passo

Temperatura |da prateleira

|+25°C

Taxa linear alteração temperatura (°C/min) de de

Período de manutenção (min) | Valor da | pressão em | vazio j(mTorr)

Secagem Secundária 0,2 300 [80

Dados de estabilidade de formulações liquidas do produto farmacológico huMAb<CD20> consoante esta invenção

Formulação: 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM em L-histidina, 240 mM em trehalose, com 0,02 % em peso por volume de Poloxamer 188™, pH 6,0. „ .. . . Período de Condiçoes de\. . ; Armazenagem Armazenagem ° § (meses) | Proteína | (mg/mL) ISEC iMonómero [(%) SEC | HMW Turbidez (%) I IEC Alterações Significativas Partículas Visíveis Partículas Subvisíveis ! Inicial 25,7 198,7 1,3 16,4 61,6 Passou Passou | 2-8°C ]1 25,6 j 98,7 1,3 16,0 62,0 Passou Passou | |3 '26,1 í 98,6 1,3 [5,9 61 ,Ò Passou Passou | 25°C H 25,7 198,5 1,4 |6,5 62,0 Passou Passou | |3 26,0 [97,9 1,5 [5,9 58,5 Passou Passou j 40°C |1 25,7 ! 97,9 1,6 6,6 52,6 Passou Passou j I3 25,7 ! 91,0 2,4 j6,7 33,6 Passou Passou | -80°C I3 [25,6 [98,7 1,3 6,2 60,9 Passou Passou | 20°C |3 |25,5 [98,7 1,3 i 6,3 60,8 Passou Passou | n/d: não determinado j i Passou: livre a essencialmente livre de partículas visíveis, no máximo 6,000 partículas >10j | μιτι/contentor, no máximo 600 partículas £25 μιτι/contentor j

Formulação: 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM em L-histidina, 240 mM em trehalose, com 0,01 % em peso por volume de Poloxamer 188™, pH 6,0. - 72 -

Condições de Armazenagem \ Período | Armazenagem | (meses) i Proteína | (mg/mL) SEC Monómero (%) :sec HMW |(%) | ÍEC Alterações ÍTurbidez | Significativas : Partículas i Visíveis | Partículas Subvisíveis ; Inicial j26,4 [99,6 [0,4 [5,5 [72,2 j Passou |Passou h (26,4 [99,7 |0,3 [5,7 | n/a I Passou | Passou I2 (26,3 [99,5 |0,5 j 5,7 [72,0 |Passou | Passou 2-8°C I3 (26,3 |99,5 [0,5 [6,3 |72,6 iPassou [Passou | |9 Í26,2 [99,4 [θ,6 [6,0 [70,8 |Passou |Passou I12 [26,4 ]99,5 (0,5 [6,5 [70,1 |Passou |Passou b l n/a [99,6 [0,4 [5,2 |n/a íPassou [Passou I I2 I n/a [99,4 |0,6 [5,7 [70,6 |Passou [Passou 25°C i3 I n/a [99,4 )0,6 [6,1 |66,5 |Passou [Passou I9 |26,4 (95,7 j0,8 [5,9 [58,2 jPassou |Passou |12 Í26,5 |95,5 Í0,7 |6,1 154,9 iiPassou |Passou b I n/a [98,2 Í0,3 Í 5,4 [58,6 |Passou [Passou 40°C |2 ] n/a [97,4 (0,8 [5,7 [50,4 jPassou | Passou i3 ! n/a [96,7 [1,0 [6,3 |n/a j Passou [Passou 80°C |9 j 25,7 [99,5 i0,5 j 5,9 |72,3 |Passou [Passou n/a: não analisado j

Passou: livre a essencialmente livre de partículas visíveis, no máximo 6,000 partículas >10 μιτι/contentor, no j máximo 600 partículas £25 μιτι/contentor 73

Formulação: 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM em L-histidina, 240 mM em trehalose, com 0,1 % em peso por volume de Poloxamer 188™, pH 6,0.

Condições de Armazenagem ΐ Período \ Armazenagem ΐ (meses) j Proteína | (mg/mL) SEC Monómero (%) SEC HMW %) HEC Alterações Turbidez \ Significativas Partículas Visíveis | Partículas Subvisíveis ; Inicial :26,4 99,6 0,4 5,5 ! 71,5 3assou |Passou i h 126,7 99,7 0,3 6,2 jn/a Passou |Passou |2 ! 26,5 99,5 0,5 5,4 173,0 Passou |Passou 2-8°C Í3 ! 26,4 99,5 0,5 6,3 70,9 Passou |Passou i |9 |26,5 99,4 0,6 6,4 ! 71,8 Passou |Passou | (12 ] 26,6 99,5 0,5 5,8 170,0 3assou |Passou | [1 in/a 99,6 0,4 5,2 jn/a Passou |Passou I2 jn/a 99,4 0,6 5,7 70,7 Passou |Passou 25°C 3 í n/a 99,4 0,6 6,2 i 67,4 ^assou !Passou v, v, v, v, v, v, v, v, v, V, V, V, V, V, V, V, V, I9 j 26,6 95,7 0,8 6,2 ! 58,6 3assou |Passou 12 |26,6 95,4 0,7 6,0 54,9 Passou | Passou b \nla [98,0 0,5 5,3 |59,3 Passou | Passou 40°C 2 \nla 197,4 0,8 5,8 [51,8 Passou | Passou I3 \nla 96,6 ΙΓ 7,0 \nla Passou |Passou -80°C |9 Í26,1 í 99,5 0,5 5,9 |71,0 Passou jPassou n/a: não analisado

Passou: livre a essencialmente livre de partículas visíveis, no máximo 6,000 partículas ^10 pm/contentor, no j máximo 600 partículas >25 μιτι/contentor 74

Formulação 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM em Acetato, 240 mM em trehalose, com 0.1 % em peso por volume de Polissorbato 80, pH 5,5. „ .. - . Período de Condiçoes de\. . y Armazenagem Armazenagem . 3 9 s (meses) | Proteína | (mg/mL) SEC Monómero (%) SEC HMW (%) Turbidez IEC Alterações Significativas i Partículas | Visíveis Partículas Subvisíveis j Inicial [24,6 99.6 0,4 (8,2 71,9 |Passou Passou | 2-8°C |1 24,8 99,7 0,3 (4,9 ....... n/a !Passou 3assou | |2 24,5 99,4 0,6 ! 5,2 72,6 !Passou 3assou | I3 Í24,3 99,4 0,6 ! 7,0 66,2 !Passou Passou i 25°C j1 | n/a 99,6 0,4 |6,7 n/a !Passou Passou \ |2 n/a 99,3 0,7 7,0 71,9 !Passou Passou | I3 n/a 99,2 0,8 7,3 65,1 !Passou Passou j 40°C |1 n/a 97,5 1,0 26,8 52,9 iPassou Passou | I2 n/a 96,0 2,1 27,8 42,1 !Passou 3assou | |3 n/a 94,4 3,2 26,8 n/a !Passou 3assou | i n/a: não analisado j

Passou: livre a essencialmente livre de partículas visíveis, no máximo 6,000 partículas >101 μιτι/contentor, no máximo 600 partículas >25 μιτι/contentor j 75

Formulação 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM em Acetato, 140 mM em cloreto de sódio, com 0,1 % em peso por volume de

Polissorbato 80, pH 5,5. n j- ~ j ^Período de ·., . . Condiçoes de:. -Proteína . Armazenagem ·, . .. Armazenagem ^ ^ 3 · (mg/mL) [SEC [SEC [ [IEC [Partículas [Monómero [HMW [Turbidez Alterações [Visíveis [(%) [(%) |Significativas j [ Partículas [ [Subvisíveis j Inicial [23,7 |99,5 [0,5 [11,4 170,9 [Passou [Passou [ 2-8°C |1 124,4 |99,6 jo,4 |11,4 l n/a [Passou [Passou | Í2 ! 24,2 |99,4 |0,6 110,5 171,5 [Passou [Passou [ Í3 124,2 [99,3 IO,7 Ϊ 12,5 [71,3 [Passou [Passou [ 25°C |1 j n/a [99,5 (0,5 [12,0 l n/a [Passou [Passou | |2 | n/a 199,1 [0,9 [013,0 [68,2 [Passou [Passou [ Í3 I n/a |99,1 |0,9 [13,2 [64,6 [Passou [Passou [ 40°C [1 ] n/a |96,9 [1,2 [26,8 [54,0 [Passou [Passou | |2 [n/a Í95,0 |2,9 Í26,5 Í46,1 [Passou 1 Passou | I3 [n/a [93,1 [4,2 [26,1 l n/a [Passou [Passou | n/a: não analisado $ Passou: livre a essencialmente livre de partículas visíveis, no máximo 6,000 partículas >101 μιτι/contentor, no máximo 600 partículas >25 μιτι/contentor | 76

Formulação: 30 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM em L-histidina, 200 mM em trehalose, com 0,01 % em peso por volume de

Poloxamer 18 8™, pH 6,5. «... . Período de = _ . , Condiçoes de . : Proteína A r Armazenagem s. , .. Armazenagem |(meses) M | (mg/mL) jSEC SEC | MEC jMonómero |HMW |Turbidez j Alterações i(%) (%) | ! Significativas | Partículas Partículas i Visíveis jSubvisíveis nicial 132,0 |98,4 |1,6 ! 6,4 |61,0 |Passou |Passou 2-8°C jl ! 32,2 Í98,3 !1,6 6,6 |62,3 |Passou |Passou I3 j 32,9 |98,ϊ M,7 5,7 :60,5 |Passou |Passou 25°C |1 j 32,2 |98,1 1,8 6,2 160,9 |Passou |Passou l3 132,1 |97,6 2,0 6,2 156,5 |Passou |Passou 40°C |1 ]32,0 |97,3 ,2,1 |6,3 150,9 |Passou |Passou I3 ! 32,3 )89,9 ! 3,0 j 7,2 )31,1 |Passou |Passou 80°C I3 ! 31,8 98,3 ! 1,6 |6,2 |61,0 |Passou |Passou 20°C I3 " 102,1 |98,3 1,6 |6,6 ) 60,7 |Passou |Passou 3assou: livre a essencialmente livre de partículas visíveis, no máximo 6,000 partículas £10 μιτι/contentor, no máximo 600 partículas £25 μιτι/contentor

Dados de estabilidade de formulações liofilizadas do produto farmacológico huMAb<CD20> consoante esta invenção 77

Formulação: 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM em L-histidina, 240 mM em trehalose, com 0,02 % em peso por volume de

Poloxamer 188™

Condições de Armazenagem Inicial 2-8°C Período de Armazenagem (meses) Μ n . , Isec Proteína, „ /m„/mi\;Monomero (mg/mL) ^ 25,5 198,9 25,2 199,0 ;SEC | HMW iTurbidez m [ [t0 [6,2.......... |1,0 |5,8 IEC Alterações Significativas 61,2 63,1 Partículas í Partículas ! Visíveis :Subvisíveis! Passou i Passou ! Passou ^Passou | I3 25,3 199,0 Π,Ο |6,1 60,4 Passou j Passou | 25°C h 25,4 198,9 |1,0 [6,0 62,9 Passou | Passou | Í3 25,6 198,5 ll,1 Í6.1 60,2 Passou ! Passou \ 40°C ]1 25,3 ] 98,9 j1,1 6,3 60,6 Passou ^Passou | Í3 25,9 |98,5 í 1,3 |5,9 56,9 Passou i Passou \ -80°C \3 25,3 198,9 j 1,0 |6,3 61,2 Passou passou \ -20°C Í3 25,4 Í 98,9 Í1,0 Í6,7 60,6 Passou passou |

Passou: livre a essencialmente livre de partículas visíveis, no máximo 6,000 partículas >10j | μιτι/contentor, no máximo 600 partículas ^25 μιτι/contentor j 78

Formulação 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM em L-histidina, 240 mM em trehalose, com 0,02 % em peso por volume de Polissorbato 80, pH 6,0. i Condições de | Armazenagem Período de Armazenagem (meses) 3roteína [mg/mL) jSEC § Monómero !(%) jSEC ÍHMW K%) IEC Turbidez j Alterações \ Significativas s Partículas | Visíveis Partículas Subvisíveis |Inicial 27,2 |99,6 |0,4 6,0 [72,3 [Passou Passou 1 27,1 [99,7 [0,3 6,1 [ n/a [Passou Passou 2-8°C 2 27,0 [99,5 |0,5 5,8 [74,0 [Passou [Passou 3 27,0 [99,5 |θ,5 6,2 [69,8 [Passou Passou 25°C 1 n/a §99,7 i0,4 6,2 ! n/a [Passou [Passou 2 n/a [99,5 [0,5 5,4 [66,2 [Passou [Passou 3 n/a Í99,5 lo,5 5,9 [68,6 [Passou [Passou 40°C 1 n/a [99,6 [0,4 5,4 |70,6 [Passou [Passou 2 n/a [99,4 [0,6 5,4 [70,1 [Passou [Passou 3 n/a [99,3 |0,7 6,3 I n/a [Passou [Passou n/a: não analisado \

Passou: livre a essencialmente livre de partículas visíveis, no máximo 6,000 partículas ^10[ μιτι/contentor, no máximo 600 partículas ^25 μιτι/contentor j

Lisboa, 19 de Setembro de 2014.

Claims (5)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma formulação, que esteja sob uma forma liofilizada e inclua: 10 mg/mL do anticorpo humanizado B-Ly 1 incluindo a B-HH6 da VH e a B-KVl da VL do WO 2005/044.859, 0,02 % de polissorbato 20 em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 240 mM em trehalose, a pH 6,0.

2. Uma formulação, a qual contenha: 25 mg/mL do anticorpo humanizado B-Ly 1 incluindo a B-HH6 da VH e a B-KVl da VL do WO 2005/044.859, 0,02 % de Poloxamer 188™ em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 240 mM em trehalose, a pH 6,0; ou 25 mg/mL do anticorpo humanizado B-Ly 1 incluindo a B-HH6 da VH e a B-KVl da VL do WO 2005/044.859 2 0,01 % de Poloxamer 188™ em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 240 mM em trehalose, a pH 6,0; ou 25 mg/mL do anticorpo humanizado B-Ly 1 incluindo a B-HH6 da VH e a B-KV1 da VL do WO 2005/044.859, 0,1 % de Poloxamer 188™ em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 240 mM em trehalose, a pH 6,0; ou 25 mg/mL do anticorpo humanizado B-Ly 1 incluindo a B-HH6 da VH e a B-KV1 da VL do WO 2005/044.859, 0,02 % de Polissorbato 80 em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 240 mM em trehalose, a pH 6,0; ou 3 30 mg/mL do anticorpo humanizado B-Ly incluindo a B-HH6 da VH e a B-KV1 da VL do WO 2005/044.859, 0,01 % de Poloxamer 188™ em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 200 mM em trehalose, a pH 6,5.

3. A formulação consoante a reivindicação 2a qual esteja sob forma liquida e contenha: 25 mg/mL do anticorpo humanizado B-Ly 1 incluindo a B-HH6 da VH e a B-KV1 da VL do WO 2005/044.859, 0,02 % de Poloxamer 188™ em peso por volume, 20 mM em L-histidina, e 240 mM em trehalose, a pH 6,0.

4. A utilização de uma formulação consoante qualquer uma das reivindicações 1 a 3 para a preparação de um medicamento útil para tratar doenças relacionadas com o CD2 0 .

5. A utilização de acordo com a reivindicação 4, em que a doença seja seleccionada de entre o conjunto constituído por Linfomas Não Hodgkin de Células B (NHL), Linfoma de células do Manto (MCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma difuso com células grandes de Células B (DLCL), linfoma de Burkitt, leucemia de células pilosas, linfoma folicular, mieloma múltiplo, linfoma da zona marginal, patologia linfoproliferativa pós-transplante (PTLD), linfoma associado ao VIH, macroglobulinemia de Waldenstrom e linfoma primário do SNC. Lisboa, 19 de Setembro de 2014.