KR101247418B1 - 항체 제형 - Google Patents

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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 항-CD20 인간 단일클론성 항체 제형, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

항체 제형{ANTIBODY FORMULATION}
본 발명은 항-CD20 인간 단일클론성 항체 제형, 상기 제형의 제조 방법 및 상기 제형의 용도에 관한 것이다.
CD20 분자(또한 인간 B-임파구-제한된 분화 항원 또는 Bp35로 지칭됨)는 프리-B 및 성숙한 B 임파구에 위치한 약 35 kD의 분자량을 갖는 소수성 막관통 단백질이다(문헌[Valentine et al. (1989) J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287; and Einfield et al. (1988) EMBO J. 7(3):711-717]). CD20은 말초 혈액 또는 임파액으로부터의 B-세포의 90 % 초과의 표면상에서 발견되고, 초기 프리-B-세포 발생 동안 발현되고, 혈장 세포 분화 전까지 유지된다. CD20은 정상 B-세포 및 악성 B-세포 둘다에 존재한다. 특히, CD20은 B-세포 비-호지킨 임파종의 90 % 초과에서 발현되지만(문헌[Anderson et al. (1984) Blood 63(6): 1424-1433]), 조혈 줄기 세포, 프로-B-세포, 정상 혈장 세포 또는 다른 정상 조직상에서 발견되지 않는다(문헌[Tedder et al. (1985) J, Immunol. 135(2):973- 979]).
CD20 단백질의 85 아미노산 카복실-말단 영역은 세포질내에 위치된다. 이러한 영역의 길이는 다른 B-세포-특이적인 표면 구조, 예컨대 IgM, IgD, IgG 중쇄 또는 조직적합성 항원 부류 I1 a 또는 β 쇄(이들은 각각 3, 3, 28, 15 및 16 아미노산의 비교적 짧은 세포질내 영역을 가짐)의 길이와 대조된다(문헌[Komaromy et al. (1983) NAR 11:6775-6785]). 마지막 61 카복실-말단 아미노산중 21은 산성 잔기인 반면에 단지 2만이 염기성이고, 이는 이러한 영역이 강한 순 음성 전하를 가짐을 나타낸다. 젠뱅크(GenBank) 기탁 번호는 NP-690605이다. CD20이 B-세포의 활성화 및 분화 과정의 초기 단계를 조절하는데 관여될 수 있고(문헌[Tedder et al. (1986) Eur. J. Immunol. 25 16:881-887]), 칼슘 이온 채널로서 작용할 수 있음(문헌[Tedder et al. (1990) J. Cell. Biochem. 14D: 195])이 교시된다.
CD20 결합 방식 및 생물학적 활성에서 상당히 구별되는 2개의 상이한 유형의 항-CD20 항체가 존재한다(문헌[Cragg, M.S., et al, Blood, 103 (2004) 2738-2743; and Cragg, M.S., et al, Blood, 101 (2003) 1045-1051]). 유형 I 항체, 즉 리툭시맙(Rituximab)은 보체 매개 세포 독성에 영향을 미치는 반면에, 유형 II 항체, 즉 토시투모맙(Tositumomab)(벡사르(Bexxar, 등록상표), B1), 11B8 및 AT80은 수반되는 포스파티딜세린 노출과 함께 카스파제-독립적인 세포사멸을 통한 표적 세포 사망을 효과적으로 개시한다.
유형 I 및 유형 II 항-CD20 항체의 분류된 일반적인 특징이 하기 표 1에 요약된다.
유형 I 및 유형 II 항-CD20 항체의 특성
유형 I 항-CD20 항체 유형 II 항-CD20 항체
유형 I CD20 에피토프 유형 II CD20 에피토프
CD20을 지질 라프트에 배치함 CD20을 지질 라프트에 배치하지 않음
증가된 CDC(IgG1 이소타입인 경우) 감소된 CDC(IgG1 이소타입인 경우)
ADCC 활성(IgG1 이소타입인 경우) ADCC 활성(IgG1 이소타입인 경우)
완전한 결합 능력 감소된 결합 능력
동종형 응집 보다 강한 동종형 응집
가교결합시 세포사멸 유도 가교결합 없이 강한 세포 사망 유도
한 양상에서, 본 발명은 1 내지 150 mg/㎖의 항-CD20 항체, 1 내지 100 mM의 완충액; 선택적으로 0.001 내지 1 %의 계면활성제; 및 선택적으로 1 내지 800 mM의 등장화제를 4.5 내지 7.0의 pH로 포함하는 약학 제형에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 항-CD20 항체는 유형 II 항체이다. 보다 바람직하게는, 상기 항-CD20 항체는 인간화된 B-Ly1 항체이다.
용어 "항체"는 다양한 형태의 항체, 예컨대 비제한적으로 전체 항체, 인간 항체, 인간화된 항체 및 유전학적으로 가공된 항체, 예컨대 단일클론성 항체, 키메라 항체 또는 재조합 항체, 및 (본 발명의 특징적인 특성이 유지되는 한) 상기 항체의 단편을 포함한다.
"항체 단편"은 전체 길이 항체의 부분, 일반적으로 적어도 항원 결합 부분 또는 이의 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 다이어보디(diabody), 단쇄 항체 분자, 항체독소 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특성 항체를 포함한다. 또한, 항체 단편은 VH 쇄의 특징을 갖는, 즉 VL 쇄와 함께 어셈블링될 수 있거나, 또는 CD20 항원에 결합하는 VL 쇄의 특징을 갖는, 즉 작용성 항원 결합 포켓에 VH 쇄와 함께 어셈블링될 수 있는 단쇄 폴리펩티드를 포함한다.
"항체 단편"은 또한 본래 작동자 기능(ADCC/CDC)을 제공할 수 없지만, 적절한 항체 불변 도메인과 조합된 후 본 발명에 따른 방식으로 상기 기능을 제공하는 단편을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "단일클론성 항체" 또는 "단일클론성 항체 조성물"은 단일 아미노산 조성물인 항체 분자의 제제를 지칭한다. 따라서, 용어 "인간 단일클론성 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 한 양태에서, 인간 단일클론성 항체는 부동화된 세포에 융합된 인간 경쇄 이식유전자 및 인간 중쇄 이식유전자를 포함하는 게놈을 갖는 이식 비-인간 동물, 예를 들어 유전자이식 쥐로부터 수득한 B-세포를 포함한다.
용어 "키메라 항체"는 하나의 공급원 또는 종으로부터의 가변 영역, 즉 결합 영역, 및 상이한 공급원 또는 종으로부터 유도된 적어도 일부분의 불변 영역을 포함하고, 통상적으로 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 단일클론성 항체를 지칭한다. 쥐과 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체가 특히 바람직하다. 이러한 쥐과/인간 키메라 항체는 쥐과 면역글로불린 가변 영역을 코딩하는 DNA 분절, 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 코딩하는 DNA 분절을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 생성물이다. 본 발명에 의해 포괄되는 다른 형태의 "키메라 항체"는 클래스 또는 서브클래스가 원래 항체의 클래스 또는 서브클래스로부터 개질되거나 변화된 형태이다. 이러한 "키메라" 항체는 또한 "클래스-스위칭된 항체"로서 지칭된다. 키메라 항체의 제조 방법은 현재 당해 분야에 널리 공지된 통상적인 재조합 DNA 및 유전자 형질감염을 포함한다(예를 들어, 문헌[Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855]; 미국특허 제5,202,238호 및 제5,204,244호 참고).
용어 "인간화된 항체"는 모 면역글로불린과 비교하여 상이한 특이성을 갖는 면역글로불린의 "상보적 결정 영역(CDR)"을 포함하도록 개질된 CDR 또는 뼈대를 갖는 항체를 지칭한다. 바람직한 양태에서, 쥐과 CDR을 인간 항체의 뼈대 영역으로 이식하여 "인간화된 항체"를 제조한다(예를 들어, 문헌[Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; and Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270] 참고). 특히 바람직한 CDR은 키메라 및 이작용성 항체에 대한, 상기 항원을 인식하는 서열을 나타내는 CDR이다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 인간 항체는 당해 분야에 널리 공지되어 있다(문헌[van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374]). 이러한 기술을 기초로 하여, 매우 다양한 표적에 대한 인간 항체가 제조될 수 있다. 인간 항체의 예는, 예를 들어 문헌[Kellermann, S. A., et al., Curr Opin Biotechnol. 13 (2002) 593-597]에 기술되어 있다.
본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 숙주 세포, 예컨대 NSo 또는 CHO 세포로부터 단리된 항체, 또는 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자이식된 동물(예컨대, 쥐)로부터 단리된 항체, 또는 숙주 세포내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체를 포함하도록 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 재배열된 형태인 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 생체내 체세포 과돌연변이(somatic hypermutation)를 거쳤다. 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유도되고 이와 관련되지만, 생체내 인간 항체 생식계열 레퍼토리내에 자연적으로 존재할 수 없다.
본원에 사용된 "특이적으로 결합하는" 또는 "~에 특이적으로 결합하는"은 CD20 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 바람직하게는, 결합 친화도는 10-9 mol/ℓ 이하(예컨대, 10-10 mol/ℓ)의 KD-값, 바람직하게는 10-10 mol/ℓ 이하(예컨대, 10-12 mol/ℓ)의 KD-값이다. 결합 친화도는 표준 결합 분석법, 예컨대 표면 플라즈몬 공명 기술(바이아코어(Biacore, 등록상표))로 측정된다.
본원에 사용된 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있지만, 이중-가닥 DNA가 바람직하다.
"불변 도메인"은 항체를 항원에 결합하는데 직접 관여하지는 않고, 작동자 기능(ADCC, 상보적 결합, 및 CDC)에 관여한다.
본원에 사용된 "가변 영역"(경쇄의 가변 영역(VL), 중쇄의 가변 영역(VH))은 항원으로의 항체의 결합에 직접 관여하는 경쇄 및 중쇄의 쌍 각각을 나타낸다. 가변 인간 경쇄 및 중쇄의 도메인은 동일한 일반적인 구조를 가지고, 각각의 도메인은 이의 서열이 3개의 "초가변 영역"(또는 상보적 결정 영역, CDR)에 의해 광범위하게 보존되고 연결된 4개의 뼈대(FR)를 포함한다. 뼈대 영역은 b-시트 형상을 채용하고, CDR은 b-시트 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각각의 쇄내의 CDR은 뼈대 영역에 의해 이의 3차원 구조에 의해 유지되고, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화도에서 특히 중요한 역할을 하고, 이에 따라 본 발명의 추가의 목적을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "항체의 항원-결합 부분"은 항원-결합을 야기하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보적 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "뼈대" 또는 "FR" 영역은 본원에 정의된 초가변 영역 외의 가변 도메인 영역이다. 따라서, 항체의 경쇄 또는 중쇄는 N- 또는 C-말단으로부터 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3은 대부분 항원 결합에 공헌하는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]의 표준 정의에 따라 결정되고/되거나 "초가변 루프"로부터의 잔기이다.
용어 "CD20" 및 "CD20 항원"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 세포에 의해 천연적으로 발현되거나, CD20 유전자에 의해 형질감염된 세포상에 발현되는 인간 CD20의 임의의 변종, 이소폼 및 종 동족체를 포함한다. CD20으로의 본 발명의 항체의 결합은 CD20을 불활성화시킴으로서 CD20을 발현하는 세포(예컨대, 종양 세포)의 사멸을 매개한다. CD20을 발현하는 세포의 사멸은 하나 이상의 하기 기제에 의해 발생할 수 있다: 당해 분야에서 인정되는 바와 같은 CD20의 동의어는 B-임파구 항원 CD20, B-임파구 표면 항원 B1, Leu-16, Bp35 및 LF5를 포함한다.
본 발명에 따른 용어 "항-CD20 항체"는 CD20 항원에 특이적으로 결합하는 항원이다. CD20 항원에 대한 항-CD20 항체의 결합 특성 및 생물학적 활성에 따라서, 2개 유형의 항-CD20 항체(유형 I 및 유형 II 항-CD20 항체)가 문헌[Cragg, M.S., et al , Blood 103 (2004) 2738-2743; and Cragg, M.S., et al Blood 101 (2003) 1045-1051]에 따라 구별될 수 있다(하기 표 2 참고).
유형 I 및 유형 II 항-CD20 항체의 특성
유형 I 항-CD20 항체 유형 II 항-CD20 항체
유형 I CD20 에피토프 유형 II CD20 에피토프
CD20을 지질 라프트에 배치함 CD20을 지질 라프트에 배치하지 않음
증가된 CDC(IgG1 이소타입인 경우) 감소된 CDC(IgG1 이소타입인 경우)
ADCC 활성(IgG1 이소타입인 경우) ADCC 활성(IgG1 이소타입인 경우)
완전한 결합 능력 감소된 결합 능력
동종형 응집 보다 강한 동종형 응집
가교결합시 세포사멸 유도 가교결합 없이 강한 세포 사망 유도
유형 I 및 유형 II 항-CD20 항체의 하나의 본질적인 특성은 이의 결합 방식이다. 따라서, 유형 I 및 유형 II 항-CD20 항체는 리툭시맙과 비교되는 상기 항-CD20 항체의 라지(Raji) 세포(ATCC-No. CCL-86)상 CD20에 대한 결합 능력의 비에 의해 분류될 수 있다.
본원에 사용된 "항-CD20 항체"는 유형 I 또는 유형 II 항체일 수 있다. 바람직하게는, 유형 II 항체이다.
리툭시맙과 비교되는 유형 I 항-CD20 항체의 라지 세포(ATCC-No. CCL-86)상 CD20에 대한 결합 능력의 비는 0.8 내지 1.2, 바람직하게는 0.9 내지 1.1이다. 이러한 유형 I 항-CD20 항체의 예는, 예를 들어 리툭시맙(국제특허공개공보 제WO 94/11026호), 1F5 IgG2a(ECACC, 하이브리도마; 문헌[Press et al., Blood 69/2:584-591 (1987)]), HI47 IgG3(ECACC, 하이브리도마), 2C6 IgG1(제WO 2005/103081호에 개시됨), 2F2 IgG1(제WO 2004/035607호 및 제WO 2005/103081호에 개시됨) 및 2H7 IgG1(제WO 2004/056312호에 개시됨)을 포함한다. 바람직하게는, 상기 유형 I 항-CD20 항체는 리툭시맙과 동일한 에피토프에 결합하는 단일클론성 항체이다. 리툭시맙과 비교되는 유형 II 항-CD20 항체의 라지 세포(ATCC-No. CCL-86)상 CD20에 대한 결합 능력의 비는 0.3 내지 0.6, 바람직하게는 0.35 내지 0.55, 더욱 바람직하게는 0.4 내지 0.5이다. 이러한 유형 II 항-CD20 항체의 예는, 예를 들어 토시투모맙(B1 IgG2a), 인간화된 B-Ly1 항체 IgG1(제WO 2005/044859호에 개시된 키메라 인간화된 IgG1 항체), 11B8 IgG1(제WO 2004/035607호에 개시됨) 및 AT80 IgG1을 포함한다. 바람직하게는, 상기 유형 II 항-CD20 항체는 인간화된 B-Ly1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 단일클론성 항체이다(제WO 2005/044859호에 개시됨).
"리툭시맙과 비교되는 항-CD20 항체의 라지 세포(ATCC-No. CCL-86)상 CD20에 대한 결합 능력의 비"는 실시예 2에 기술된 바와 같이, 라지 세포를 사용하는 파크스어레이(FACSArray)(벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson))에서 Cy5와 접합된 항-CD20 항체 및 Cy5와 접합된 리툭시맙을 사용하는, 직접적인 면역형광 측정(평균 형광 강도(MFI)가 측정됨)에 의해 측정되고, 하기 수학식 1과 같이 계산된다:
[수학식 1]
라지 세포(ATCC-No. CCL-86)상 CD20에 대한 결합 능력의 비 =
Figure 112010039280513-pct00001
MFI는 평균 형광 강도이다. 본원에 사용된 "Cy5-표지 비"는 항체 분자 당 Cy5-표지 분자의 평균 개수를 의미한다.
전형적으로, 유형 I 항-CD20 항체는 0.8 내지 1.2, 바람직하게는 0.9 내지 1.1의 리툭시맙과 비교되는 제 1 항-CD20 항체의 라지 세포(ATCC-No. CCL-86)상 CD20에 대한 결합 능력의 비를 갖는다.
전형적으로, 유형 II 항-CD20 항체는 0.3 내지 0.6, 바람직하게는 0.35 내지 0.55, 더욱 바람직하게는 0.4 내지 0.5의 리툭시맙과 비교되는 제 2 항-CD20 항체의 라지 세포(ATCC-No. CCL-86)상 CD20에 대한 결합 능력의 비를 갖는다.
바람직한 양태에서, 상기 유형 II 항-CD20 항체, 바람직하게는 인간화된 B-Ly1 항체는 증가된 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC)을 갖는다.
"증가된 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC)을 갖는 항체"는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 측정된 증가된 ADCC를 갖는, 본원에 정의된 바와 같은 항체를 의미한다. 시험관내 ADCC 어세이에서 허용되는 것은 다음과 같다:
(1) 상기 어세이는 항체의 항원-결합 영역에 의해 인식되는 표적 항원을 발현하는 것으로 공지된 표적 세포이고;
(2) 상기 어세이는 작동자 세포로서, 무작위로 선택된 건강한 공여자의 혈액으로부터 단리된, 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용하고;
(3) 어세이는 하기 프로토콜에 따라 수행되고:
[(i) PBMC를 표준 밀도 원심분리 과정을 사용하여 단리하고, RPMI 세포 배양 배지중에 5 x 106 세포/㎖로 현탁하고;
(ii) 표준 조직 배양 방법에 의해 표적 세포를 성장시키고, 90 % 초과의 생존율을 갖는 기하급수적인 성장 상태로부터 수확하고, RPMI 세포 배양 배지에서 세척하고, 100 μCi의 "CI-로 표지하고, 세포 배양 배지로 2회 세척하고, 1 0' 세포/㎖의 밀도로 세포 배양 배지에 재현탁하고;
(iii) 100 ㎕의 상기 최종 표적 세포 현탁액을 96-웰 마이크로티터 플레이트의 각각의 웰에 옮기고;
(iv) 항체를 세포 배양 배지에서 4,000 ng/㎖로부터 0.04 ng/㎖까지 순차적으로 희석하고, 50 ㎕의 생성된 항체 용액을 96-웰 마이크로티터 플레이트의 표적 세포에 첨가하고, 상기 전체 농도 범위에 걸친 다양한 항체 농도를 3회 시험하고;
(v) 최대 방출(MR) 대조군의 경우, 표지된 표적 세포를 함유하는 플레이트내의 3개의 부가적인 웰은 항체 용액(상기 단계 (iv)) 대신에 비-이온성 세정제의 2 % (VN) 수용액 50 ㎕(노니데트(Nonidet), 미국 세인트루이스 소재 시그마(Sigma))를 수용하고;
(vi) 자발적인 방출(SR) 대조군의 경우, 표지된 표적 세포를 함유하는 플레이트내의 3개의 부가적인 웰은 항체 용액(상기 단계 (iv)) 대신에 50 ㎕의 RPMI 세포 배양 배지를 수용하고;
(vii) 이어서, 96-웰 마이크로티터 플레이트를 1 분 동안 50 x g로 원심분리하고, 4 ℃에서 1 시간 동안 배양하고;
(viii) 50 ㎕의 PBMC 현탁액(상기 (i) 단계)을 각각의 웰에 첨가하여 25:1의 작동자:표적 세포 비를 수득하고, 플레이트를 5 % CO2 대기하에 37 ℃에서 4 시간 동안 인큐베이터에 위치시키고;
(ix) 각각의 웰로부터의 세포-부재 상청액을 수확하고, 실험적으로 방출된 방사능(ER)을 감마 계수기를 사용하여 정량화하고;
(x) 특이적인 분해의 백분율을 하기 수학식 2에 따라 각각의 항체 농도에 대해 계산한다:
[수학식 2]
(ER - MR)/(MR - SR) x 100
상기 식에서,
ER은 항체 농도에 대해 정량화된 평균 방사능(상기 단계 (ix) 참고)이고;
MR은 MR 대조군(상기 단계 (v) 참고)에 대해 정량화된 평균 방사능(상기 단계 (ix) 참고)이고;
SR은 SR 대조군(상기 단계 (vi) 참고)에 대해 정량화된 평균 방사능(상기 단계 (ix) 참고)이다];
(4) "증가된 ADCC"는 상기 시험된 항체 농도 범위내에서 관찰된 특이적인 분해의 최대 백분율의 증가, 및/또는 상기 시험된 항체 농도 범위내에서 관찰된 특이적인 분해의 최대 백분율의 절반을 달성하는데 필요한 항체의 농도의 감소로서 정의된다. ADCC의 증가는 ADCC에 비례하고, 상기 어세이에 의해 측정되고, 동일한 항체에 의해 매개되고, 당업자에게 공지된 바와 동일한 표준 제조, 정제, 제형화 및 저장 방법을 사용하여 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 제조되지만, GnTIII를 과발현하도록 가공된 숙주 세포에 의해 제조되지 않는다.
상기 "증가된 ADCC"는 상기 항체의 당공학에 의해 수득될 수 있고, 문헌[Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999) and U.S. Pat. No. 6,602,684]에 기술된 이의 올리고당 성분을 가공함으로써 단일클론성 항체의 상기 천연적인 세포-매개된 작동자 기능을 강화시킴을 의미한다.
용어 "보체-의존적 세포독성(CDC)"은 보체의 존재하에서 본 발명에 따른 항체에 의한 인간 종양 표적 세포의 분해를 지칭한다. CDC는 바람직하게는 보체의 존재하에서 본 발명에 따른 항-CD20 항체를 사용하는 CD20 발현 세포의 제조 처리에 의해 측정된다. CDC는 항체가 4 시간 후 20 % 이상의 종양 세포의 분해(세포 사망)를 100 nM의 농도로 유도하는 경우에 발견된다. 어세이는 바람직하게는 51Cr 또는 Eu 표지된 종양 세포 및 방출된 51Cr 또는 Eu의 측정에 의해 수행된다. 대조군은 보체를 갖지만 항체가 없는 종양 표적 세포의 배양을 포함한다.
전형적으로, IgG1 이소타입의 유형 I 및 유형 II 항-CD20 항체는 특징적인 CDC 특성을 나타낸다. 유형 I 항-CD20 항체는 증가된 CDC(IgG1 이소타입의 경우)를 가지고, 유형 II 항-CD20 항체는 서로 비교하여 감소된 CDC(IgG1 이소타입의 경우)를 갖는다. 바람직하게는, 유형 I 및 유형 II 항-CD20 항체 둘다는 IgG1 이소타입 항체이다.
"리툭시맙" 항체는 인간 CD20 항원을 지향하는 단일클론성 항체를 함유하는 유전적으로 가공된 키메라 인간 감마 1 쥐과 불변 영역이다. 이러한 키메라 항체는 인간 감마 1 불변 영역을 함유하고, 국제특허공개공보 제WO 94/11026호(앤더슨(Anderson) 등)에서 명칭 "C2B8"에 의해 동정된다. 리툭시맙은 저-등급 또는 여포성, CD20 양성, B-세포 비-호지킨 임파종을 갖는 환자의 치료에 대해 승인된다. 활성 연구의 시험관내 기전은 리툭시맙이 인간 보체-의존적 세포독성(CDC)을 나타냄을 밝혀냈다(문헌[Reff et. al, Blood 83(2): 435-445 (1994)]). 또한, 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC)을 측정하는 어세이에서 상당한 활성을 나타냈다.
용어 "인간화된 B-Ly1 항체"는 국제특허공개공보 제WO 2005/044859호에 개시된 인간화된 B-Ly1 항체를 지칭하고, 이는 IgG1로부터의 인간 불변 영역을 사용한 키메라화 및 하기 인간화(제WO 2005/044859호 참고)에 의해 쥐과 단일클론성 항-CD20 항체 B-Ly1(쥐과 중쇄의 가변 영역(VH): 서열식별번호: 1번; 쥐과 경쇄의 가변 영역(VL): 서열식별번호: 2번; 문헌[Poppema, S. and Visser, L., Biotest Bulletin 3: 131-139 (1987)] 참고)로부터 수득된다. 이러한 "인간화된 B-Ly1 항체"는 제WO 2005/044859호에 개시된다.
바람직하게는, "인간화된 B-Ly1 항체"는 서열식별번호 3번 내지 서열식별번호 20번의 군으로부터 선택된 중쇄의 가변 영역(VH)을 갖는다(제WO 2005/044859호의 B-HH2 내지 B-HH9 및 B-HL8 내지 B-HL17). 서열식별번호 3번, 4번, 7번, 9번, 11번, 13번 및 15번이 특히 바람직하다(제WO 2005/044859호의 B-HH2, BHH-3, B-HH6, B-HH8, B-HL8, B-HL11 및 B-HL13). 가장 바람직하게는, 상기 VH는 BHH6이다. 바람직하게는, "인간화된 B-Ly1 항체"는 제WO 2005/044859호의 서열식별번호 20번(B-KV1)의 경쇄의 가변 영역(VL)을 갖는다. 또한, 인간화된 B-Ly1 항체는 바람직하게는 IgG1 항체이다. 바람직하게는, 이러한 인간화된 B-Ly1 항체는 제WO 2005/044859호, 제WO 2004/065540호, 문헌[Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)] 및 제WO 99/154342호에 기술된 과정에 따라 Fc 영역에서 글리코엔지니어링(GE)된다. 대부분의 글리코엔지니어링된 인간화된 B-Ly1 항체는 Fc 영역내의 글리코실화의 변경된 패턴을 갖고, 바람직하게는 감소된 수준의 푸코스 잔기를 갖는다. 바람직하게는, Fc 영역의 올리고당의 적어도 40 % 이상(한 양태에서 40 내지 60 %, 다른 양태에서 50 % 이상, 또 다른 양태에서 적어도 70 % 이상)은 푸코실화되지 않는다. 또한, Fc 영역의 올리고당은 바람직하게는 이등분된다. 가장 바람직하게는, "인간화된 B-Ly1 항체"는 제WO 2005/044859호의 VH B-HH6 및 VL B-KV1을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 항체는 또한 "HuMab<CD20>"으로서 지칭된다. 다른 가장 바람직한 양태에서, 상기 항체는 상기 정의된 바와 같은 감소된 수준의 푸코스 잔기를 가지고/가지거나 Fc 영역의 올리고당은 가장 바람직하게 이등분된다. 또 다른 가장 바람직한 양태에서, 상기 항체는 상기 정의된 바와 같은 증가된 ADCC를 나타낸다.
올리고당 성분은 치료적 당단백질의 효능과 관련된 특성, 예컨대 물리적인 안정성, 프로테아제 공격에 대한 내성, 면역계와의 상호작용, 약동학 및 특이적인 생물학적 활성에 상당한 영향을 줄 수 있다. 이러한 특성은 올리고당의 존재 또는 부재뿐만 아니라 올리고당의 특이적인 구조에 의존할 수 있다. 올리고당 구조 및 당단백질 기능 사이에 일부 일반화가 만들어 질 수 있다. 예를 들어, 특정 올리고당 구조는 특이적인 탄수화물 결합 단백질과의 상호작용을 통한 혈류로부터의 당단백질의 신속한 제거를 매개하는 반면, 다른 것은 항체를 통해 결합되어 원치 않는 면역 반응을 유발할 수 있다(문헌[Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)]).
포유동물 세포는, 인간 적용을 위한 가장 상용적인 형태로 단백질을 글리코실화하는 이의 능력에 기인하여, 치료적 당단백질의 제조를 위한 바람직한 숙주이다(문헌[Cumming et al., Glycobiology 1:115-30 (1991); Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)]). 박테리아는 매우 드물게 단백질을 글리코실화하고, 다른 유형의 일반적인 숙주, 예컨대 효모, 곰팡이, 곤충 및 식물 세포와 마찬가지로 혈류로부터의 신속한 제거와 관련된 글리코실화 패턴, 원치 않는 면역 상호작용, 및 일부 특정 경우에 감소된 생물학적 활성을 나타낸다. 포유동물 세포중에서, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포는 최근 20년 동안 가장 통상적으로 사용되었다. 적합한 글리코실화 패턴을 제공하는 것 외에, 이러한 세포는 유전적으로 안정하고, 고도로 생산적인 클론성 세포주의 일관된 발생을 가능하게 한다. 이들은 혈청부재 배지를 사용하는 단순한 생물반응기에서 고밀도로 배양될 수 있고, 안정하고 재생가능한 생물공정의 개발을 가능하게 한다. 다른 통상적으로 사용되는 동물 세포는 갓난 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, NSO- 및 SP2/0-쥐 골수종 세포를 포함한다. 더욱 최근에는, 유전자이식 동물로부터의 생산이 또한 시험되었다(문헌[Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14: 975-981 (1996)]).
모든 항체는 중쇄 불변 영역내의 보존 위치에서 탄수화물 구조를 함유하고, 각각의 이소타입은 N-연결된 탄수화물 구조의 별개의 배열을 갖고, 이는 단백질 어셈블리, 분비 또는 기능적인 활성에 가변적으로 영향을 준다(문헌[Wright, A., and Monison, S. L., Trends Biotech. 15: 26-32 (1997)]). 부착된 N-연결된 탄수화물의 구조는 가공도에 따라서 상당히 변하고, 하이만노스(highmannose), 다중-분지된 바이안테너리(biantennary) 착물 올리고당을 포함할 수 있다(문헌[Wright, A., and Morrison, S. L., Trends Biotech. 15: 26-32 (1997)]). 전형적으로, 심지어 단일클론성 항체가 다중 글리코폼(glycoform)으로 존재하도록 특정 글리코실화 부위에 부착된 코어 올리고당의 불균질한 가공이 존재한다. 또한, 항체 글리코실화의 주요한 차이가 세포주 사이에서 발생하고, 심지어 사소한 차이가 상이한 배양 조건하에 성장한 소정 세포주에 대해 보여짐이 나타났다(문헌[Lifely, M. R. et al., Glycobiology 5(8):813-22 (1995)]).
단순한 제조 방법을 유지하면서, 상당한 원치 않는 부작용을 가능한 피하면서, 효능의 큰 증가를 수득하는 하나의 방법은 문헌[Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)] 및 미국특허 제6,602,684호에 기술된 바와 같이 올리고당 성분을 가공함으로써 단일클론성 항체의 천연적인 세포-매개된 작동자 기능을 강화시키는 것이다. 암 면역요법에 가장 통상적으로 사용되는 항체인 IgG1 유형 항체는 각각의 CH2 도메인내의 Asn297에서 보존된 N-연결된 글리코실화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297에 부착된 2개의 착물 바이안테너리 올리고당은 CH2 도메인 사이에 묻혀 폴리펩티드 골격과의 광범위한 접촉을 형성하고, 이의 존재는 작동자 기능, 예컨대 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC)을 매개하는 항체에 필수적이다(문헌[Lifely, M. R., et al., Glycobiology 5: 813-822 (1995); Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163: 59-76 (1998); Wright, A. and Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 15: 26-32 (1997)]).
β(1,4)-N-아세틸글루코스아민일전이효소 I11("GnTII17y)(이등분된 올리고당의 형성을 촉매화하는 글리코실전이효소)의 중국 햄스터 난소(CHO) 세포의 과발현이 가공된 CHO 세포에 의해 제조된 항신경아세포종 키메라 단일클론성 항체(chCE7)의 시험관내 ADCC 활성을 상당히 증가시킴이 종래에 밝혀졌다(문헌[Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999)]; 및 국제특허공개공보 제WO 99/154342호, 이의 전체 내용은 참고로서 본원에 혼입됨). 항체 chCE7은 높은 종양 친화도 및 특이성을 갖지만, 효능이 너무 적어서 GnTIII 효소가 결핍된 표준 산업용 세포주로 제조되는 경우 임상적으로 유용하지 않는, 접합되지 않은 단일클론성 항체의 대부류에 속한다(문헌[Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999)]). 이러한 연구는 먼저, ADCC 활성의 큰 증가가 항체 생성 세포를 GnTIII 세포를 발현하도록 가공함으로써 수득될 수 있고, 이는 또한 불변 영역(Fc)-결합된 이등분된 올리고당, 예컨대 이등분된 푸코실화되지 않은 올리고당의 비율을 천연-발생 항체에서 발견되는 수준보다 높게 상승시킴을 나타냈다.
용어 "CD20 항원의 발현"은 세포내의, 바람직하게는 각각 종양 또는 암, 바람직하게는 비-고체 종양으로부터의 T- 또는 B-세포, 더욱 바람직하게는 B-세포의 세포 표면상의 상당한 수준의 CD20 항원의 발현을 나타내도록 의도된다. "CD20 발현 암"을 갖는 환자는 당해 분야에 공지된 표준 어세이에 의해 결정될 수 있다. "CD20 항원의 발현"은 또한 바람직하게는 세포내의, 바람직하게는 자가면역 질병에서, T- 또는 B-세포, 더욱 바람직하게는 B-세포의 세포 표면상의 상당한 수준의 CD20 항원의 발현을 나타내도록 의도된다. 예를 들어, CD20 항원 발현은 면역조직화학적(IHC) 검출, FACS, 또는 상응하는 mRNA의 PCR-계 검출을 사용하여 측정된다.
본원에 사용된 용어 "CD20 발현 암"은 바람직하게는 임파종(바람직하게는 B-세포 비-호지킨 임파종(NHL)) 및 임파구성 백혈병을 지칭한다. 이러한 임파종 및 임파구성 백형병은, 예를 들어 (a) 여포성 임파종, (b) 소 비균열 세포 임파종/버킷 임파종(예컨대, 풍토성 버킷 임파종, 산발성 버킷 임파종 및 비-버킷 임파종), (c) 변연부 임파종(예컨대, 결절외 변연부 B-세포 임파종(점막-결합된 임파 조직 임파종, MALT), 결절 변연부 B-세포 임파종 및 비장 변연부 임파종), (d) 맨틀 세포 임파종(MCL), (e) 거대 세포 임파종(예컨대, B-세포 확산성 거대 세포 임파종(DLCL), 확산성 혼합 세포(Diffuse Mixed Cell) 임파종, 면역아구성 임파종, 원발성 종격 B-세포(Primary Mediastinal B-Cell) 임파종, 혈관중심성 임파종-폐 B-세포 임파종), (f) 모양 세포성 백혈병, (g) 임파구성 임파종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, (h) 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소 림프구성 임파종(SLL), B-세포 전임파구성 백혈병, (i) 혈장 세포 신생물, 혈장 세포 골수종, 다발성 골수종, 형질세포종, (j) 호지킨병을 포함한다.
바람직하게는, CD20 발현 암은 B-세포 비-호지킨 임파종(NHL)이다. 특히, CD20 발현 암은 맨틀 세포 임파종(MCL), 급성 임파구성 백혈병(ALL), 만성 임파구성 백혈병(CLL), B-세포 확산성 거대 세포 임파종(DLCL), 버킷 임파종, 모양 세포성 백혈병, 여포성 임파종, 다발성 골수종, 변연부 임파종, 이식 후 임파구 증식성 질환(PTLD), HIV 관련된 임파종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 또는 원발성 CNS 임파종이다.
본원에 사용된 "자가면역 질병"은 개인 스스로의 조직으로부터 발생하거나, 이러한 조직을 지향하는 질병 또는 질환에 관한 것이다. 자가면역 질병 또는 질환의 예는 비제한적으로 관절염(류마티스성 관절염, 청소년 류마티스성 관절염, 골 관절염, 건선 관절염), 건선, 피부염, 다발성 근염/피부 근염, 독성 표피 융해, 전신 경피증 및 경화증, 1 5 염증성 장 질환과 관련된 반응, 크론병, 궤양성 대장염, 호흡 곤란 증후군, 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS), 뇌막염, 뇌염, 포도막염, 대장염, 사구체 신염, 알러지성 병태, 습진, 천식, T-세포의 침입 및 만성 염증성 반응을 비롯한 병태, 죽상 경화증, 자가면역 심근염, 백혈구 유착 결핍증, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 청소년 발병 당뇨병, 다발성 경화증, 알러지성 뇌척수염, 사이토카인 및 T-임파구에 의해 매개되는 급성 및 지연된 과민증과 관련된 면역 반응, 결핵, 유육종증, 육아종증, 예컨대 베게너 육아종증, 과립 세포 감소증, 맥관염(예컨대, ANCA), 무형성 빈혈, 다이아몬드 블랙팬 빈혈, 면역 용혈성 빈혈, 예컨대 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), 악성 빈혈, 진성 적혈구 무형성증(PRCA), 인자 VIII 결핍증, 혈우병 A, 자가면역 호중구 감소증, 범혈구 감소증, 백혈구 감소증, 백혈구 누출증을 수반하는 질병, 중추신경계(CNS) 염증성 질환, 다중 기관 손상 증후군, 중증 근무력증, 항원-항체 착물 매개된 질병, 항사구체 기저막 질병, 항인지질 항체 증후군, 알러지성 신경염, 베체트병, 캐슬맨 증후군, 굿파스처 증후군, 람버트-이튼 근육무력 증후군, 레이노드 증후군, 쇼르겐 증후군, 스티븐스 존슨 증후군, 수포성 유천포창, 수포창, 자가면역 다내분비성 증후군, 신증, IgM 다발신경병증 또는 IgM 매개된 신경병증, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 혈전성 혈소판 감소성 자반증(TTP), 자가면역 혈소판 감소증, 정소 및 난소의 자가면역 질병, 예컨대 자가면역 고환염 및 난소염, 원발성 갑상선 기능저하증; 자가면역 내분비선 질병, 예컨대 자가면역 갑상선염, 만성 갑상선염(하시모토 갑상선염), 아급성 갑상선염, 특발성 갑상선 기능저하증, 아디슨병, 그레이브병, 자가면역 다선성 증후군(또는 다선성 I 내분비선 증후군), 인슐린-의존적 진성 I 당뇨병(IDDM)으로도 지칭되는 유형 I 당뇨병 및 시이한 증후군; 자가면역 간염, 림프 간질성 폐렴(HIV), 폐색성 세기관지염(비-이식) vs NSIP, 길리안-바레 증후군, 거대 혈관 혈관염(예컨대, 류마티스성 다발성 근육통 및 거대 세포(다카야수) 동맥염), 중간 혈관 혈관염(예컨대, 가와사키병 및 결절 다발성 동맥염), 강직성 척추염, 버거병(IgA 신증), 급속 진행성 사구체신염, 원발성 담즙성 간경변, 복강 스프루(글루텐 장 병증), 한랭 글로불린혈증, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 관상 동맥 질병 등을 포함한다.
저장을 위해 목적하는 순도를 갖는 항체를 선택적인 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 함께 혼합함으로써, 본 발명에 따라 사용된 항체의 치료 제형을 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조하였다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용체에 대해 비독성이다.
본원에 사용된 용어 "계면활성제"는 약학적으로 허용되는 표면-활성제를 나타낸다. 본 발명의 제형에서, 계면활성제의 양은 중량/부피로 표현되는 백분율로 기술된다. 가장 통상적으로 사용되는 중량/부피 단위는 mg/㎖이다. 적합한 약학적으로 허용되는 계면활성제는 비제한적으로 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN, 상표), 플루로닉스(PLURONICS, 상표) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 또한, 비제한적으로 폴리에틸렌-소르비탄-지방산 에스터, 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌-스테아레이트 및 나트륨 도데실 설페이트를 포함한다. 바람직한 폴리에틸렌-소르비탄은 폴리에틸렌(20)-소르비탄-에스터(폴리소르베이트 20의 동의어, 상표명 트윈 20으로 시판중) 및 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄모노올리에이트(폴리소르베이트 80의 동의어, 상표명 트윈 80으로 시판중)이다. 바람직한 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜은 플루로닉(등록상표) F68 또는 폴록사머(Poloxamer) 188(상표)로 시판중인 것이다. 폴록사머 188(상표)이 가장 바람직하다. 바람직한 폴리옥시에틸렌-스테아레이트는 상표명 Myrj로 시판중인 것이다. 바람직한 폴리옥시에틸렌 모노로릴 에터는 상표명 Brij로 시판중인 것이다. 폴리에틸렌-소르비탄-폴리에틸렌(20)-소르비탄-에스터(트윈 20(상표)) 및 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄모노올리에이트(트윈 80)가 사용되는 경우, 이들은 일반적으로 약 0.001 내지 약 1 %, 바람직하게는 약 0.005 내지 약 0.1 %, 더욱 바람직하게는 약 0.01 내지 약 0.04 % w/v의 양으로 사용된다.
본원에 사용된 용어 "완충액"은 약학적으로 허용되는 완충액을 나타낸다. 적합한 약학적으로 허용되는 완충액은 비제한적으로 히스티딘-완충액, 시트레이트-완충액, 숙신에이트-완충액, 아세테이트-완충액 및 포스페이트-완충액을 포함한다. 바람직한 완충액은 L-히스티딘, 또는 L-히스티딘과 L-히스티딘 하이드로클로라이드의 혼합물을 등장화제 및 당해 분야에 공지된 산 또는 염기를 사용한 잠재적인 pH 조정과 함께 포함한다. L-히스티딘이 가장 바람직하다. 상기 히스티딘-완충액은 약 1 내지 약 100 mM, 바람직하게는 약 5 내지 50 mM, 더욱 더 바람직하게는 약 20 mM의 양으로 사용된다. 사용된 완충액과는 독립적으로, 당해 분야에 공지된 산 또는 염기를 사용하여 조정하거나, 완충액 성분의 적절한 혼합물을 사용하거나, 또는 둘다에 의해, pH는 약 4.5 내지 약 7.0, 바람직하게는 약 5.5 내지 약 6.5, 더욱 바람직하게는 약 6.0의 값으로 조정된다.
본원에 사용된 용어 "등장화제"는 약학적으로 허용되는 등장화제를 나타낸다. 등장화제는 등장성 제형을 제공하기 위하여 사용된다. 등장성 제형은 액체, 또는 고체 형태, 예를 들어 동결건조된 형태로부터 재구성된 액체이고, 비교되는 일부 다른 용액, 예컨대 생리적인 염 용액 및 혈청과 동일한 장력을 갖는 용액을 나타낸다. 적합한 등장화제는 비제한적으로 염, 예컨대 비제한적으로 나트륨 클로라이드(NaCl) 또는 칼륨 클로라이드, 당, 예컨대 비제한적으로 글루코스, 수크로스, 트레할로스 또는 글리세린, 및 아미노산, 당, 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터의 임의의 성분을 포함한다. 등장화제는 일반적으로 약 5 내지 350 mM의 총 양으로 사용된다.
본 발명에 따른 제형과 함께 본원에 사용되는 용어 "액체"는 적어도 약 2 내지 8℃의 온도에서 액체인 제형을 나타낸다.
본 발명에 따른 제형과 함께 본원에 사용되는 용어 "동결건조된"은 제형을 동결하고, 이어서 당해 분야에 공지된 임의의 동결-건조 방법, 예를 들어 시판중인 동결-건조 장치에 의해 동결된 내용물로부터 얼음을 승화시킴으로써 건조되는 제형을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "염"은 약 1 내지 약 500 mM의 양인 염을 나타낸다. 염의 비제한적인 예는 양이온 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘과 음이온 클로라이드, 포스페이트, 시트레이트, 숙신에이트, 설페이트 또는 이들의 혼합물의 임의의 조합의 염을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "아미노산"은 비제한적으로 아르기닌, 글리신, 오르니틴, 글루타민, 아스파라긴, 리신, 히스티딘, 글루탐산, 아스파라그산, 이소류신, 류신, 알라닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 세린, 프롤린을 포함하는, 약 1 내지 약 100 mg/㎖의 양의 아미노산을 나타낸다.
본원에 사용된 "당"은 약 25 내지 약 500 mM의 양으로 사용된 약학적으로 허용되는 당을 나타낸다. 100 내지 300 mM이 바람직하다. 220 내지 260 mM이 더욱 바람직하다. 240 mM이 가장 바람직하다. 적합한 당은 비제한적으로 단당류 및 이당류를 포함한다. 본 발명에 따른 당의 비제한적인 예는 트레할로스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 락토스, 글루코스, 만노스, 말토스, 갈락토스, 프룩토스, 소르보스, 라피노스, 글루코스아민, N-메틸글루코스아민(소위 "메글루민(Meglumine)"), 갈락토스아민 및 뉴라민산 및 이들의 조합을 포함한다. 트레할로스가 가장 바람직하다.
용어 "안정화제"는 약학적으로 허용되는 안정화제, 예를 들어 비제한적으로 상기한 바와 같은 아미노산 및 당, 및 당해 분야에 공지된 임의의 종류 및 분자량의 시판중인 엑스트란을 지칭한다.
용어 "산화방지제"는 약학적으로 허용되는 산화방지제를 나타낸다. 이들은 부형제, 예컨대 메티오닌, 벤질알콜, 또는 산화를 최소화시키기 위해 사용되는 임의의 다른 부형제를 포함할 수 있다.
예를 들어, 암에 적용되는 경우, 용어 "치료 방법"은 환자의 암 세포의 개수를 경감시키거나 제거하거나, 암의 증상을 완화시키도록 고안된 작용의 과정 또는 경로를 지칭한다. 암 또는 다른 증식성 질환의 "치료 방법"은 암 세포 또는 다른 질환이 실제로 제거되거나, 세포의 개수 또는 질환이 실제로 경감하거나, 암 또는 다른 질환의 증상이 실제로 완화됨을 필수적으로 의미하지는 않는다. 종종, 암의 치료 방법은 낮은 성공 가능성으로 수행되지만, 그럼에도 불구하고, 환자의 의학 병력 및 평가된 생존 기대는 전반적으로 이로운 작용 경로를 유도하는 것으로 여겨진다.
한 양상에서, 본 발명은 약 1 내지 약 150 mg/㎖ 항-CD20 항체, 약 0.001 내지 약 1 %의 하나 이상의 계면활성제, 및 약 1 내지 약 100 mM의 완충액을 약 4.5 내지 약 7.0의 pH로 포함하는 항-CD20 항체 제형에 관한 것이다.
더욱 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 제형은 약 1 내지 약 150 mg/㎖ 항-CD20 항체, 약 0.005 내지 약 0.05 %의 하나 이상의 계면활성제, 및 약 1 내지 약 100 mM의 완충액을 약 4.5 내지 약 7.0의 pH로 포함한다.
바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 제형은 약 10 내지 약 30 mg/㎖의 유형 II 항-CD20 항체, 20 mM의 L-히스티딘, 240 mM의 트레할로스, 및 0.02 % w/v의 폴리소르베이트 20을 약 6의 pH로 포함한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 제형은 약 10 내지 약 30 mg/㎖의 유형 II 항-CD20 항체, 0.02 % w/v의 폴록사머 188(상표), 20 mM의 L-히스티딘, 및 240 mM의 트레할로스를 약 6의 pH로 포함한다.
바람직하게는, 항-CD20 항체는 유형 I 항체이다. 더욱 바람직하게는, 항-CD20 항체는 유형 II 항체이다. 더욱 더 바람직하게는 항-CD20 항체는 제WO 2005/044859호에 상세히 개시된 바와 같은 "인간화된 B-Ly1 항체"이다. 가장 바람직하게는, 항체는 HuMab<CD20>이다. 제형은 1 내지 약 150 mg/㎖의 상기 항체, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 100 mg/㎖의 상기 항체, 더욱 더 바람직하게는 약 10 내지 약 30 mg/㎖의 상기 항체, 약 5, 10, 15, 20, 25 및 30 mg/㎖로 이루어진 군으로부터 선택된 상기 항체, 및 가장 바람직하게는 25 mg/㎖의 상기 항체를 포함한다.
본 발명에 따른 제형은 액체 형태, 동결건조된 형태, 또는 동결건조된 형태로부터 재구성된 액체 형태일 수 있다.
한 양태에서, 본 발명에 따른 제형은 동결건조된 제형이다. 본 발명에 따른 동결건조된 제형은 상기 항-CD20 항체와 동일한 농도의 액체 제형으로는 달성되기가 통상적으로 어려운 보다 높은 분자량의 응집체 및 미립자의 형성에 관해 개선된 안정성의 이점을 갖는다.
본 발명에 따른 제형은 정맥내(i.v.)로, 피하(s.c.)로, 임의의 다른 비경구 투여 수단, 예컨대 약학 분야에 공지된 수단으로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 제형은 보존제(예컨대, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 염-형성 대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물(예컨대, Zn-단백질 착물)을 포함할 수 있다.
활성 성분은 또한, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 인터레이셜(interracial) 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메트아크릴레이트) 마이크로캡슐 각각에 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼으로 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
서방형 제제가 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이때 매트릭스는 형상화된 제품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방형 매트릭스의 예는 폴리에스터, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메트아크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락타이드(미국특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 분해할 수 없는 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해가능한-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 디포(LUPRON DEPOT, 상표)(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프로라이드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 미세구), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통과시킴으로써 용이하게 달성된다.
바람직하게는, 본 발명의 제형은 상기한 바와 같은 하나 이상의 등장화제를 약 5 내지 약 350 mM의 양으로 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 제형은 상기한 바와 같은 당을 약 25 내지 약 500 mM의 양으로 포함한다.
또한, 바람직하게는, 본 발명의 제형은 하나 이상의 하기 성분을 추가로 포함한다: 산화방지제, 아스코르브산, 글루타티온(Glutathion), 보존제, 예컨대 m-크레솔, 페놀, 벤질알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르부탄올, 티오머살, 벤즈알코늄 클로라이드, 폴리글리콜, 예컨대 PEG 3000, 3350, 4000, 6000, 알부민, 인간 혈청 알부민(HSA), 소 혈청 알부민(BSA), 다가 알콜, 글리세롤, 에탄올, 만니톨, 염, 아세테이트 염(예컨대, 나트륨 아세테이트), 마그네슘클로라이드, 칼슘클로라이드, 트로메트아민, EDTA(예컨대 Na-EDTA).
또한, 바람직하게는, 본 발명의 제형은 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 안정화제, 및 "라이오프로텍턴트(lyoprotectant)"로서도 당해 분야에 공지된 성분, 예컨대 당해 분야에 공지된 덱스트란, 당, 당 알콜 및 아미노산을 추가로 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명의 제형은 액체 형태, 동결건조된 형태, 또는 동결건조된 형태로부터 재구성된 액체 형태인 하기 제형을 포함한다:
15 mg/㎖의 유형 II 항-CD20 항체, 바람직하게는 인간화된 B-Ly1 항체, 가장 바람직하게는 HuMab<CD20>, 0.01 % w/v의 폴리소르베이트 20, 20 mM의 L-히스티딘, 및 140 mM의 나트륨 클로라이드를 pH 6.0으로 포함하는 제형;
10 mg/㎖의 유형 II 항-CD20 항체, 바람직하게는 인간화된 B-Ly1 항체, 가장 바람직하게는 HuMab<CD20>, 0.01 % w/v의 폴리소르베이트 20, 20 mM의 L-히스티딘, 및 140 mM의 나트륨 클로라이드를 pH 6.0으로 포함하는 제형;
15 mg/㎖의 유형 II 항-CD20 항체, 바람직하게는 인간화된 B-Ly1 항체, 가장 바람직하게는 HuMab<CD20>, 선택적으로 0.001 내지 1 % w/v의 계면활성제, 20 mM의 L-히스티딘을 pH 6.0으로 포함하는 제형;
10 mg/㎖의 유형 II 항-CD20 항체, 바람직하게는 인간화된 B-Ly1 항체, 가장 바람직하게는 HuMab<CD20>, 0.02 % w/v의 폴리소르베이트 20, 20 mM의 L-히스티딘, 및 240 mM의 트레할로스를 pH 6.0으로 포함하는 제형;
25 mg/㎖의 유형 II 항-CD20 항체, 바람직하게는 인간화된 B-Ly1 항체, 가장 바람직하게는 HuMab<CD20>, 0.02 % w/v의 폴리소르베이트 20, 20 mM의 L-히스티딘, 및 240 mM의 트레할로스를 pH 6.0으로 포함하는 제형;
25 mg/㎖의 유형 II 항-CD20 항체, 바람직하게는 인간화된 B-Ly1 항체, 가장 바람직하게는 HuMab<CD20>, 0.02 % w/v의 폴록사머 188(상표), 20 mM의 L-히스티딘, 및 240 mM의 트레할로스를 pH 6.0으로 포함하는 제형;
25 mg/㎖의 유형 II 항-CD20 항체, 바람직하게는 인간화된 B-Ly1 항체, 가장 바람직하게는 HuMab<CD20>, 0.01 % w/v의 폴록사머 188(상표), 20 mM의 L-히스티딘, 및 240 mM의 트레할로스를 pH 6.0으로 포함하는 제형;
25 mg/㎖의 유형 II 항-CD20 항체, 바람직하게는 인간화된 B-Ly1 항체, 가장 바람직하게는 HuMab<CD20>, 0.1 % w/v의 폴록사머 188(상표), 20 mM의 L-히스티딘, 및 240 mM의 트레할로스를 pH 6.0으로 포함하는 제형;
25 mg/㎖의 유형 II 항-CD20 항체, 바람직하게는 인간화된 B-Ly1 항체, 가장 바람직하게는 HuMab<CD20>, 0.02 % w/v의 폴리소르베이트 80, 20 mM의 L-히스티딘, 및 240 mM의 트레할로스를 pH 6.0으로 포함하는 제형;
25 mg/㎖의 유형 II 항-CD20 항체, 바람직하게는 인간화된 B-Ly1 항체, 가장 바람직하게는 HuMab<CD20>, 0.1 % w/v의 폴리소르베이트 80, 20 mM의 아세테이트, 및 240 mM의 트레할로스를 pH 5.5로 포함하는 제형;
25 mg/㎖의 유형 II 항-CD20 항체, 바람직하게는 인간화된 B-Ly1 항체, 가장 바람직하게는 HuMab<CD20>, 0.1 % w/v의 폴리소르베이트 80, 20 mM의 아세테이트, 및 140 mM의 나트륨 클로라이드를 pH 5.5로 포함하는 제형;
30 mg/㎖의 유형 II 항-CD20 항체, 바람직하게는 인간화된 B-Ly1 항체, 가장 바람직하게는 HuMab<CD20>, 0.01 % w/v의 폴록사머 188(상표), 20 mM의 L-히스티딘, 및 200 mM의 트레할로스를 pH 6.5로 포함하는 제형;
본 발명에 따른 제형의 바람직한 양태에서, 제형은 동결건조된 형태이고, 적절한 양의 주사용 물로 재구성된 후 10 mg/㎖의 유형 II 항-CD20 항체, 바람직하게는 인간화된 B-Ly1 항체, 가장 바람직하게는 HuMab<CD20>, 0.02 % w/v의 폴리소르베이트 20, 20 mM의 L-히스티딘, 및 240 mM의 트레할로스를 pH 6.0으로 포함한다.
상기 제형은 응집과 같은 물리적인 종말점 및 분열과 같은 화학적인 종말점에 관한 적절한 안정성과 함께 2 내지 8℃ 및 25°에서 저장시 양호한 안정성을 나타낸다.
본 발명에 따른 제형의 바람직한 양태에서, 제형은 액체 형태이고, 25 mg/㎖의 유형 II 항-CD20 항체, 바람직하게는 인간화된 B-Ly1 항체, 가장 바람직하게는 HuMab<CD20>, 0.02 % w/v의 폴록사머 188(상표), 20 mM의 L-히스티딘, 및 240 mM의 트레할로스를 pH 6.0으로 포함한다.
바람직한 양태에서, 제형은 CD20 발현 암으로 고통받는 환자의 전이의 예방 또는 경감, 또는 추가 파종에 유용하다. 제형은 상기 환자의 생존 기간의 증가, 상기 환자의 진행 없는 생존, 반응 기간의 증가에 유용하고, 생존 기간, 진행 없는 생존, 반응 속도 또는 반응 기간에 의해 측정된, 치료되는 환자의 통계학적으로 유의하고 임상적으로 의미있는 개선을 야기한다. 바람직한 양태에서, 제형은 환자의 군의 반응 속도의 증가에 유용하다.
본 발명의 문맥에서, 부가적인 다른 세포독성제, 화학요법제 또는 항암제, 또는 상기 약품의 효과를 강화시키는 화합물이 본 발명에 따른 항-CD20 항체 제형과 조합되어 사용될 수 있다.
이러한 약품은, 예를 들어 알킬화제 또는 알킬화 작용을 갖는 약품, 예컨대 사이클로포스파미드(CTX; 예컨대, 사이톡산(cytoxan, 등록상표)), 클로르암부실(CHL; 예컨대 류케란(leukeran, 등록상표)), 시스플라틴(CisP; 예컨대 플라티놀(platinol, 등록상표)), 부설판(예컨대 마일레란(myleran, 등록상표)), 멜팔란, 카르무스틴(BCNU), 스트렙토조토신, 트라이에틸렌멜라민(TEM), 미토마이신 C 등; 대사길항제, 예컨대 네토트렉세이트(MTX), 에토포사이드(VP16; 예컨대 베페시드(vepesid, 등록상표)), 6-머캡토푸린(6MP), 6-티옥구아닌(6TG), 사이타라빈(Ara-C), 5-플루오로우라실(5-FU), 카페시타빈(예컨대 젤로다(Xeloda, 등록상표)), 다카바진(DTIC) 등; 항생제, 예컨대 악티노마이신 D, 독소루비신(DXR; 예컨대 아드리아마이신(adriamycin, 등록상표)), 다우노루비신(다우노마이신), 블레오마이신, 니트라마이신 등; 알카로이드, 예컨대 빈카 알카로이드, 예컨대 빈크리스틴(VCR), 빈블라스틴 등; 및 다른 항종양제, 예컨대 파클리탁셀(예컨대 탁솔(taxol, 등록상표)) 및 파클리탁셀 유도체, 세포성장 억제제, 글루코코르티코이드, 예컨대 덱사메타손(DEX; 예컨대 데카드론(decadron, 등록상표)) 및 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손, 뉴클레오사이드 효소 억제제, 예컨대 하이드록시우레아, 아미노산 고갈 효소, 예컨대 아스파라기나제, 류코보린 및 다른 엽산 유도체, 및 유사한 다른 항종양제를 포함한다. 하기 약품이 또한 첨가제로서 사용될 수 있다: 아르니포스틴(예컨대 에티올(ethyol, 등록상표)), 닥티노마이신, 메클로레타민(질소 머스타드), 스트렙토조신, 사이클로포스파미드, 로무스틴(CCNU), 독소루비신 리포(예컨대 독실(doxil, 등록상표)), 젬시타빈(예컨대 젬자르(gemzar, 등록상표)), 다우노루비신 리포(예컨대 다우녹솜(daunoxome, 등록상표)), 프로카바진, 미토마이신, 도세탁셀(예컨대 탁소테레(taxotere, 등록상표)), 알데스류킨, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 클라드리빈, 캄프토테신, CPT 11(이리노테칸), 10-하이드록시 7-에틸-캄프토테신(SN38), 플록수리딘, 플루다라빈, 이포스파미드, 이다루비신, 메스나, 인터페론 베타, 인터페론 알파, 미톡산트론, 토포테칸, 류프로라이드, 메게스트롤, 멜팔란, 머캡토푸린, 플리카마이신, 미토탄, 페가스파르가제, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 타목시펜, 테니포사이드, 테스토락톤, 티오구아닌, 티오테파, 우라실 머스타드, 비노렐빈, 클로람부실. 바람직하게는, 항-CD20 항체 조합 치료가 상기 첨가제 없이 사용된다.
화학치료 요법에서의 상기 세포독성제 및 항암제, 및 항증식성 표적-특이적 항암 약물, 예컨대 단백질 키나제 억제제의 사용은 일반적으로 암 치료 분야에서 잘 특성화되어 있고, 본원에서 이의 사용은 일부 조정과 함께 내성 및 효능의 모니터링, 및 투여 경로 및 투여량의 제어를 위해 동일하게 고려된다. 예를 들어, 세포독성제의 실제 투여량은 조직배양(histoculture) 방법을 사용하여 측정된 환자의 배양된 세포 반응에 따라 변할 수 있다. 일반적으로, 투여량은 다른 첨가제의 부재하에 사용된 양에 비해 감소될 것이다.
효과적인 세포독성제의 전형적인 투여량은 제조자에 의해 추천된 범위내에 있을 수 있고, 시험관내 반응 또는 동물 모델내의 반응에 의해 지시되는 경우, 약 하나의 자릿수 이하만큼 감소될 수 있다. 따라서, 실제 투여량은 의사의 판단, 환상의 상태, 및 1차 배양된 악성 세포 또는 조직배양된 조직 샘플의 시험관내 반응성에 기초한 치료 방법의 효능, 또는 적절한 동물 모델에서 관찰된 반응에 따라 변할 것이다.
본 발명의 문맥에서, 효과량의 이온화 방사가 수행될 수 있고/있거나 본 발명에 따른 항-CD20 항체 제형 외에 방사성 약품이 사용될 수 있다. 방사선의 공급원은 치료되는 환자의 외부 또는 내부에 존재할 수 있다. 공급원이 환자의 외부에 존재하는 경우, 치료법은 외부 빔 방사선 치료법(EBRT)으로서 공지되어 있다. 방사선의 공급원이 환자의 내부에 존재하는 경우, 치료법은 근접치료법(BT)으로 지칭된다. 본 발명의 문맥에 사용하기 위한 방사성 원자는 비제한적으로 라듐, 세슘-137, 이리듐-192, 아메리슘-241, 금-198, 코발트-57, 구리-67, 테크네튬-99, 요오드-123, 요오드-131 및 인듐-111로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 방사성 동위원소를 사용하여 항체를 표지하는 것이 또한 가능하다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항-CD20 항체 제형이 상기 이온화 방사선 없이 사용된다.
방사선 치료법은 제거불가능한 또는 수술불가능한 종양 및/또는 종양 전이의 제어를 위한 표준 치료법이다. 방사선 치료법의 화학요법과 합해진 경우에, 개선된 결과가 보여진다. 방사선 치료법은 표적 구역에 전달된 고-선량의 방사선이 종양 및 정상 조직 둘다에서 생식 세포의 사멸을 야기하는 원리를 기초로 한다. 방사선 투여 요법은 일반적으로 방사선 흡수 선량(Gy), 시간 및 분류에 의해 한정되고, 종양학 의사에 의해 조심스럽게 한정되어야 한다. 환자가 수용하는 방사선의 양은 다양한 고려 사항에 의존하지만, 가장 중요한 2개의 사항은 신체의 다른 중요한 구조 또는 기관에 대한 종양의 위치, 및 종양이 퍼진 정도이다. 방사선 치료를 받는 환자의 전형적인 치료 코스는 주 당 5 일 약 1.8 내지 2.0 Gy의 단일 일일 분량으로 환자에게 투여된 총 10 내지 80 Gy의 총 선량을 사용하는, 1 내지 6 주의 기간에 걸친 치료 계획이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 인간 환자의 종양이 본 발명에 따른 제형 및 방사선으로 치료되는 경우 상승효과를 나타낸다. 즉, 본발명의 조합을 포함하는 약품에 의한 종양 성장의 억제는 선택적으로 부가적인 화학요법제 또는 항암제와 함께 방사선과 조합되는 경우 강화된다. 보조적인 방사선 치료법의 변수는, 예를 들어 제WO 99/60023호에 포함되어 있다.
항체 제형은 볼루스로서 정맥내 투여에 의해, 또는 소정 기간에 걸친 연속적인 주입에 의해, 근육내, 복막내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내 또는 협막내 경로에 의해 공지된 방법에 따라 환자에게 투여된다. 정맥내 또는 피하 투여가 바람직하다.
본 발명은 용기, 상기 항-CD20 항체를 포함하는 용기내의 조성물, 및 CD20 발현 암을 앓고 있는 환자에게 상기 항-CD20 항체의 제형을 투여하는 방법은 제형의 사용자에게 설명하는 패키지 인서트(package insert)를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트를 추가로 포함한다.
용어 "패키지 인서트"는 치료 제품의 시판중인 포장에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하고, 지시사항, 용법, 투여량, 투여법, 금기사항 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 경고를 포함할 수 있다.
바람직한 양태에서, 제조 용기의 제품은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 제조 제품은 멸균 희석액을 추가로 포함할 수 있고, 바람직하게는 별개의 추가 용기에 저장된다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용되는 담체"는 약학적인 투여물과 상용가능한 임의의 물질 및 모든 물질, 예컨대 용매, 분산 매질, 코팅, 살균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 및 약학적인 투여물과 상용가능한 다른 물질 및 화합물을 포함하는 것으로 의도된다. 임의의 통상적인 매질 또는 약품이 활성 화합물과 불상용성인 것을 제외하고는, 본 발명의 조성물내의 이의 사용이 고려된다. 보충적인 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 제형은 본 발명에 따른 유형 II 항-CD20 항체와 병용-투여되는 유형 I 항-CD20 항체를 포함한다. 본 발명에 따른 제형은 각각의 항-CD20 항체를 위한 별개의 2개 제형일 수 있다. 선택적으로, 로, 본원의 제형은 또한 하나의 제형에 항체 둘다를 함유할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 제형은 항-Bcl-2 활성제와 병용-투여되는 항-CD20 항체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "Bcl-2"는 Bcl-2 계열의 단백질의 구성원인 Bcl-2 단백질(스위스 프로트 식별번호(Swiss Prot ID No.) P10415)을 지칭한다. 용어 "항-Bcl-2 활성제"는 "항-Bcl-2 안티센스 뉴클레오타이드" 및 "Bcl-2 억제제"를 포함한다. "항-Bcl-2 안티센스 뉴클레오타이드"는 Bcl-2 mRNA 수준을 하향조절하고, Bcl-2 단백질 발현을 감소시킨다. 이러한 항-Bcl-2 안티센스 뉴클레오타이드의 예는 오블리머센(Oblimersen) 및 SPC-2996을 포함한다. 본원에 사용된 ABT-737은 N-[4-[4-(4'-클로로바이페닐-2-일메틸)피페라진-1-일]벤조일]-3-[3-(다이메틸아미노)-1(R)-(페닐설판일메틸)프로필아미노]-4-나이트로벤젠설폰아미드; 4-[4-(4'-클로로바이페닐-2-일메틸)피페라진-1-일]-N-[3-[3-(다이메틸아미노)-1(R)-(페닐설판일메틸)프로필아미노]-4-나이트로페닐설폰일]벤즈아미드, Bcl-2 억제제이고, 제WO 2006/099667호 또는 문헌[Corey, S., et al., Cancer Cell (2005) 5-6]에 기술되어 있다. 본원에 사용된 BT-263은 Bcl-2 억제제를 의미하고, 미국특허공개공보 제2007027135호에 기술되어 있다. 바람직하게는, 항-Bcl-2 활성제는 오블리머센, SPC-2996, TA-402, 고시폴(Gossypol), AT-101, 오바토클락스(Obatoclax) 메실레이트, A-371191, A-385358, A-438744, ABT-737, AT-101, BL-11, BL-193, GX-15-003, 2-메톡시안티마이신 A3, HA-14-1, KF-67544, 푸르푸로갈린(Purpurogallin), TP-TW-37, YC-137 및 Z-24로부터 선택된다. 바람직하게는, 항-Bcl-2 활성제는 5 μM 이하의 항-Bcl-2 억제 활성의 IC50을 갖는 Bcl-2 단백질 결합 억제제이다. 이러한 Bcl-2 단백질 결합 억제제는 바람직하게는 고시폴, AT-101, 오바토클락스 메실레이트, ABT-263 및 ABT-737이고, 더욱 바람직하게는 ABT-263 또는 ABT-737이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 제형은 프로테아좀 억제제와 병용-투여되는 항-CD20 항체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "프로테아좀 억제제"는 26S 프로테아좀의 활성을 억제하는 약품을 지칭한다. 이러한 프로테아좀 억제제는 특히, 예컨대 펩티드 유도체, 예컨대 펩티드 알데하이드(예컨대, MG132, MG115, CEP-1615, PSI, 또는 면역프로테아좀 특이적 억제제 IPSI-001(Cbz-LnL-CHO = N-카보벤질옥시-류실-노르류시날, 미국특허공개공보 제20060241056호 참고), 펩티드 보론에이트(예컨대, 보르테조밉(PS-341) 또는 DFLB), 펩티드 에폭시케톤(예컨대, 에폭소미신, 다이하이드로에포네마이신 또는 에폭소미신 유도체 카필조밉(PR-171)), 또는 펩티드 비닐 설폰(예컨대, NLVS) 및 비-펩티드 유도체, 예컨대 살리노스포라미드 A(NPI-0052), 살리노스포라미드 A 유도체, 락타시스틴 또는 락타시스틴 유도체(예컨대, 클라스토-락타시스틴-L-락톤(오무랄라이드) 또는 PS-519)을 포함한다. 상기 프로테아좀 억제제의 상이한 유형 및 구조는, 예컨대 문헌[Kisselev, A.L., et al., Chem Biol (2001) 739-758], 제WO 2004/004749호 및 문헌[Joazeiro, C., et al., Res 66(16) (2006) 7840-7842, Kanagasabaphy, et al., Curr Opin Investig Drugs 8 (2007) 447-51, Adams, J., Nat Rev Cancer 4 (2004) 349-360] 및 미국특허공개공보 제20060241056호에 기술되어 있다.
바람직하게는, 상기 프로테아좀 억제제는 펩티드 알데하이드(바람직하게는 N-카보벤질옥시-류실-노르류신알(IPSI-001)), 펩티드 보론에이트(바람직하게는 보르테조밉(PS-341)), 펩티드 에폭시케톤(바람직하게는 에폭소미신 유도체 카르필조밉(PR-171)) 및 살리노스포라미드 A(NPI-0052)로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는 상기 프로테아좀 억제제는 보르테조밉(PS-341), 카르필조밉(PR-171), 살리노스포라미드 A(NPI-0052) 및 N-카보벤질옥시-류실-노르류신알(IPSI-001)로부터 선택된다.
바람직한 양태에서, 프로테아좀 억제제는 펩티드 알데하이드(바람직하게는 N-카보벤질옥시-류실-노르류신알(IPSI-001)), 펩티드 보론에이트(바람직하게는 보르테조밉(PS-341)) 및 펩티드 에폭시케톤으로부터 선택된다. 다른 바람직한 양태에서, 프로테아좀 억제제는 펩티드 보론에이트(바람직하게는 보르테조밉(PS-341); 예컨대, 문헌[Adams, Cur. Opin. Chem Biol. 6 (2002) 493-500] 및 미국특허 제5,780,454호 참고)이다.
바람직하게는, 프로테아좀 억제제는 5 μM 이하, 바람직하게는 1 μM 이하의 항-프로테아좀 억제 활성의 IC50을 갖는다. 상기 프로테아좀 억제제를 동정하고, 항-프로테아좀 억제 활성의 IC50을 측정하기 위한 세포-계 어세이(비-선형 곡선 피트(XLfit 소프트웨어(영국 서레이 길포드 소재 아이디 비즈니스 솔루션 리미티드(ID Business Solution Ltd.)))를 사용하는 연속적인 희석 및 계산을 통함)는 프로메가(Promega)로부터의 U266 세포(인간 혈장 골수종)를 갖는 프로테아좀-글로(Glo, 상표) 세포-계 어세이 시약를 사용하는 문헌[Moravec, et al., Cell Notes 15 (2006) 4-7]에 기술되어 있다. 이러한 "애드-믹스-메저(add-mix-measure)" 어세이는 배양된 세포내의 프로테아좀과 관련된 키모트립신-형 프로테아제 활성을 측정한다.
IPSI-001(Cbz-LnL-CHO = N-카보벤질옥시-류실-노르류신알) 외에, 미국특허공개공보 제20060241056호의 하기 펩티드 유도체가 또한 바람직한 프로테아좀 억제제이다: N-카보벤질옥시-호모페닐알란일-페닐알란일알, N-카보벤질옥시-류실-페닐알란일알, N-카보벤질옥시-알란일-페닐알란일알, N-카보벤질옥시-글리실-프롤릴-알란일-페닐알란일알, N-카보벤질옥시-글리실-프롤릴-페닐알란일-페닐알란일알, N-카보벤질옥시-글리실-페닐알란일-페닐알란일알, N-카보벤질옥시-류실-노르류신 보론산, N-카보벤질옥시-페닐알란일-페닐알라닌 보론산, N-카보벤질옥시-호모페닐알란일-페닐알라닌 보론산, N-카보벤질옥시-류실-페닐알라닌 보론산, N-카보벤질옥시-글리실-프롤릴-알란일-페닐알라닌 보론산, N-카보벤질옥시-글리실-프롤릴-페닐알란일-페닐알라닌 보론산, N-카보벤질옥시-류실-류실-페닐알라닌 보론산, N-카보벤질옥시-글리실-페닐알란일-페닐알라닌 보론산, N-카보벤질옥시-류실-노르류신 메틸 비닐 설폰, N-카보벤질옥시-페닐알란일-페닐알라닌 메틸 비닐 설폰, N-카보벤질옥시-호모페닐알란일-페닐알라닌 메틸 비닐 설폰, N-카보벤질옥시-류실-페닐알라닌 메틸 비닐 설폰, N-카보벤질옥시-알란일-페닐알라닌 메틸 비닐 설폰, N-카보벤질옥시-글리실-프롤릴-알란일-페닐알라닌 메틸 비닐 설폰, N-카보벤질옥시-글리실-프롤릴-페닐알란일-페닐알라닌 메틸 비닐 설폰, N-카보벤질옥시-류실-류실-페닐알라닌 메틸 비닐 설폰, N-카보벤질옥시-글리실-페닐알란일-페닐알라닌 메틸 비닐 설폰, N-카보벤질옥시-류실-노르류신 에폭시 케톤, N-카보벤질옥시-페닐알란일-페닐알라닌 에폭시 케톤, N-카보벤질옥시-호모페닐알란일-페닐알라닌 에폭시 케톤, N-카보벤질옥시-류실-페닐알라닌 에폭시 케톤, N-카보벤질옥시-알란일-페닐알라닌 에폭시 케톤, N-카보벤질옥시-글리실-프롤릴-알란일-페닐알라닌 에폭시 케톤, N-카보벤질옥시-글리실-프롤릴-페닐알란일-페닐알라닌 에폭시 케톤, N-카보벤질옥시-류실-류실-페닐알라닌 에폭시 케톤, 및 N-카보벤질옥시-글리실-페닐알란일-페닐알라닌 에폭시 케톤.
하기 실시예 및 숫자는 본 발명의 이해에 도움을 주기 위하여 제공되고, 이의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 설명된다. 본 발명의 사상으로부터 벗어남이 없이 설명된 과정에서 개질이 수행될 수 있음이 이해된다.
실시예
실시예 1
액체 형태, 동결건조된 형태, 또는 동결건조된 형태로부터 재구성된 액체 형태인 하기 제형을 제조하였다:
15 mg/㎖의 HuMab<CD20>, 0.01 % w/v의 폴리소르베이트 20, 20 mM의 L-히스티딘, 및 140 mM의 나트륨 클로라이드를 pH 6.0으로 포함하는 제형;
10 mg/㎖의 HuMab<CD20>, 0.01 % w/v의 폴리소르베이트 20, 20 mM의 L-히스티딘, 및 140 mM의 나트륨 클로라이드를 pH 6.0으로 포함하는 제형;
15 mg/㎖의 HuMab<CD20>, 및 20 mM의 L-히스티딘을 pH 6.0으로 포함하는 제형;
10 mg/㎖의 HuMab<CD20>, 0.02 % w/v의 폴리소르베이트 20, 20 mM의 L-히스티딘, 및 240 mM의 트레할로스를 pH 6.0으로 포함하는 제형; 및
25 mg/㎖의 HuMab<CD20>, 0.02 % w/v의 폴리소르베이트 20, 20 mM의 L-히스티딘, 및 240 mM의 트레할로스를 pH 6.0으로 포함하는 제형.
적절한 양의 주사용 물로 재구성한 후, 10 mg/㎖의 HuMab<CD20>, 0.02 % w/v의 폴리소르베이트 20, 20 mM의 L-히스티딘, 및 240 mM의 트레할로스를 pH 6.0으로 포함하는 동결건조된 형태를 또한 제조하였다.
상기 제형은 응집과 같은 물리적 종말점 및 분열과 같은 화학적인 종말점에 관한 적절한 안정성과 함께 2 내지 8℃ 및 25°에서 저장시 양호한 안정성을 나타낸다.
본 발명에 따른 비경구 투여를 위한 액체 및 동결건조된 약물 제품 제형이 다음과 같이 개발되었다:
액체 제형의 제조
제조 완충액(예컨대, 140 mM의 나트륨 클로라이드 및 0.01 % w/v의 폴리소르베이트 20을 함유하는 약 6.0의 pH의 20 mM 히스티딘 완충액, 또는 약 6.0의 pH의 20 mM 히스티딘 완충액)중에 HuMab<CD20>의 용액을 균질화함으로써, HuMab<CD20>의 제형을 제조하였다. 완충액을 사용한 희석에 의해 단백질 농도를 목적 농도로 조정함으로써 HuMab<CD20>의 제형을 제조할 수 있다. 단백질을 안정화시키고, 장력 조정을 위한 부형제를 필요에 따라 첨가하고, 용해된 형태 또는 선택적으로 고체로서 첨가할 수 있다. 계면활성제를 필요에 따라 저장 용액인 제형에 첨가하였다. 모든 제형을 0.22 ㎛ 필터를 통해 멸균 여과하고, 멸균 유리 바이알에 무균적으로 분취하고, 고무 마개 및 알루크림프 캡(alucrimp cap)으로 밀폐하였다. 이러한 제형을 상기한 시간 동안 상이한 온도에서 저장하고, 개별적인 문단에서 지시된 시점에 분석을 위해 제거하였다. 제형을 (1) 자외선 분광광도법에 의해, (2) 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해, (3) 가시적인 입자 및 비가시적인(subvisible) 입자에 대해, (4) 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의해, 그리고 (5) 용액의 탁도에 의해 분석하였다.
동결건조된 제형의 제조
HuMab<CD20>의 용액을 액체 제형에 관해 상기한 바와 같이 제조하거나, 또는 당 및 계면활성제를 함유하는 약 6.0의 pH의 20 mM 히스티딘 완충액중 HuMab<CD20>의 HuMab<CD20> 용액을 균질화함으로써 제조하였다. 모든 제형을 0.22 ㎛ 필터를 통해 멸균 여과하고, 멸균 유리 바이알로 무균적으로 분취하였다. 바이알을 동결건조 공정에 사용하기에 적합한 고무 마개로 부분적으로 밀폐하고, 동결건조기의 건조 챔버로 옮겼다. 당해 분야에 공지된 임의의 동결건조 방법은 본 발명의 범위에 속하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 본 연구에 사용된 동결건조 공정은 실온으로부터 약 5 ℃까지의 제형의 냉각(예비-냉각), 및 약 1 내지 약 5 ℃/분의 램핑 속도(ramping rate)로 -40 ℃에서의 동결(동결 I)을 포함하였다. 제 1 건조 단계는 -40 ℃부터 -30 ℃까지 0.3 내지 0.5 ℃/분의 램핑 속도로 수행될 수 있고, 이어서, 약 75 내지 80 mTorr의 챔버 압력하에 -30 ℃에서 50 시간 이상 유지될 수 있다. 제 2 건조 단계는 -30 ℃부터 25 ℃까지 0.1 내지 0.3 ℃/분의 램핑 속도로 수행될 수 있고, 이어서, 약 50 내지 80 mTorr의 챔버 압력하에 25 ℃에서 5 시간 이상 유지될 수 있다(적용된 건조 계획은 표 3에 제공된다). 상기 동결건조 공정을 사용하여 건조된 HuMab<CD20> 제형은 약 2 내지 3 분의 적절히 빠른 재구성 시간을 갖는 것으로 밝혀졌다. 본 연구에서 모든 동결건조된 케이크는 칼-피셔(Karl-Fischer) 방법에 의해 측정된 약 0.1 내지 1.0 %의 잔류수 함량을 가졌다. 동결건조된 바이알을 상이한 시간 동안 상이한 온도에서 저장하였다. 동결건조된 제형을 (1) 자외선 분광광도법에 의한 분석, (2) 재구성 시간의 측정, (3) 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 분석, (4) 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의한 분석, (5) 비가시적인 입자 및 가시적인 입자의 측정, 및 (6) 용액의 탁도에 의한 분석 전에 각각의 부피의 주사용 물(WFI)로 재구성하였다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 수행하여 제형내의 가용성 고분자량 종(응집체) 및 저분자량 가수분해 산물을 검출하였다. 상기 방법은 자외선 검출기(검출 파장 280 nm) 및 조르박스(Zorbax) GF-250 컬럼(9.4 x 250 mm, 아질런트(Agilent))이 장착된 적합한 HPLC 기기를 사용하였고, 상기 방법은 이동상으로서 200 mM의 나트륨 포스페이트 pH 7.0을 사용하였다.
이온 교환 크로마토그래피(IEC)를 수행하여 제형내의 HuMab<CD20>의 순 전하를 변경하는 화학적인 분해 산물을 검출하였다. 상기 방법은 자외선 검출기(검출 파장 220 및 280 nm) 및 다이오넥스 프로팩(Dionex ProPac) WCX-10 컬럼(4 mm x 250 mm)이 장착된 적합한 HPLC 기기를 사용하였다. H20중 10 mM의 나트륨 포스페이트 완충액 pH 6.0, 및 10 mM의 나트륨 포스페이트 완충액 pH 6.0 + 0.75 M NaCl을 1.0 ㎖/분의 유속으로 각각 이동상 A 및 B로서 사용하였다.
단백질 농도의 측정을 위한 자외선 스펙트로스코피를 280 nm에서 바리안 케리 바이오(Varian Cary Bio) 자외선 분광광도계에서 수행하였다.
탁도의 측정을 위하여, 실온에서 HACH 2100AN 탁도계를 사용하여 FTU(탁도 단위)로 유백광을 측정하였다.
비가시적인 입자에 대해 HIAC 로이코 파마스펙(Royco PharmaSpec)(HRLD-150)을 사용하고, 가시적인 입자에 대해 사이데나더(Seidenader) V90-T 외관 검사 기기를 사용하여 샘플을 분석하였다.
Figure 112010039280513-pct00002
n/d: 검출되지 않음
통과: 가시적인 입자의 부재 내지 본질적인 부재, 최대 6000 입자 ≥ 10 ㎛/용기, 최대 600 입자 ≥ 25 ㎛/용기
제형 10 mg/㎖의 HuMab<CD20>, 20 mM의 L-히스티딘, 240 mM의 트레할로스, 0.02 % w/v의 폴리소르베이트 20, pH 6.0
Figure 112010039280513-pct00003
n/d: 검출되지 않음
통과: 가시적인 입자의 부재 내지 본질적인 부재, 최대 6000 입자 ≥ 10 ㎛/용기, 최대 600 입자 ≥ 25 ㎛/용기
본 발명에 따른 동결건조된 HuMab<CD20> 약물 제품 제형의 안정성 데이터
제형 10 mg/㎖의 HuMab<CD20>, 20 mM의 L-히스티딘, 240 mM의 트레할로스, 0.02 % w/v의 폴리소르베이트 20, pH 6.0
Figure 112010039280513-pct00004
n/d: 검출되지 않음
통과: 가시적인 입자의 부재 내지 본질적인 부재, 최대 6000 입자 ≥ 10 ㎛/용기, 최대 600 입자 ≥ 25 ㎛/용기
실시예 2
액체 형태, 동결건조된 형태, 또는 동결건조된 형태로부터 재구성된 액체 형태인 하기 제형을 제조하였다:
25 mg/㎖의 HuMab<CD20>, 0.02 % w/v의 폴록사머 188(상표), 20 mM의 L-히스티딘, 및 240 mM의 트레할로스를 pH 6.0으로 포함하는 제형;
25 mg/㎖의 HuMab<CD20>, 0.01 % w/v의 폴록사머 188(상표), 20 mM의 L-히스티딘, 및 240 mM의 트레할로스를 pH 6.0으로 포함하는 제형;
25 mg/㎖의 HuMab<CD20>, 0.1 % w/v의 폴록사머 188(상표), 20 mM의 L-히스티딘, 및 240 mM의 트레할로스를 pH 6.0으로 포함하는 제형;
25 mg/㎖의 HuMab<CD20>, 0.02 % w/v의 폴리소르베이트 80, 20 mM의 L-히스티딘, 및 240 mM의 트레할로스를 pH 6.0으로 포함하는 제형;
25 mg/㎖의 HuMab<CD20>, 0.1 % w/v의 폴리소르베이트 80, 20 mM의 아세테이트, 및 240 mM의 트레할로스를 pH 5.5로 포함하는 제형;
25 mg/㎖의 HuMab<CD20>, 0.1 % w/v의 폴리소르베이트 80, 20 mM의 아세테이트, 및 140 mM의 나트륨 클로라이드를 pH 5.5로 포함하는 제형; 및
30 mg/㎖의 HuMab<CD20>, 0.01 % w/v의 폴록사머 188(상표), 20 mM의 L-히스티딘, 및 200 mM의 트레할로스를 pH 6.5로 포함하는 제형.
비경구 투여를 위한 액체 및 동결건조된 약물 제품 제형을 다음과 같이 제조하였다:
액체 제형의 제조
제조 완충액(예컨대, 240 mM의 트레할로스 및 0.02 % w/v의 폴록사머 188(상표)을 함유하는 약 6.0의 pH의 20 mM 히스티딘 완충액)에서 HuMab<CD20>의 용액을 균질화함으로써 HuMab<CD20>의 제형을 제조하였다. 단백질 농도를 상기 표적 단백질 농도로 증가시키고 완충액을 교환하기 위한 접선 유동 여과(TFF)에 의해 제조 완충액(예컨대, 약 6.0의 pH의 20 mM 히스티딘 완충액)중 약 10 내지 40 mg/㎖의 HuMab<CD20>의 용액을 투석 여과함으로써 HuMab<CD20>의 제형을 또한 제공할 수 있다. 완충액으로 희석하여 단백질 농도를 목적 농도로 조정함으로써 HuMab<CD20>의 제형을 또한 제조할 수 있다. 단백질을 안정화시키고, 장력 조정을 위한 부형제를 용해된 형태 또는 선택적으로 고체로서 첨가할 수 있다. 계면활성제를 필요에 따라 저장 용액인 제형에 첨가하였다. 모든 제형을 0.22 ㎛ 필터를 통해 멸균 여과하고, 멸균 유리 바이알에 무균적으로 분취하고, 고무 마개 및 알루크림프 캡(alucrimp cap)으로 밀폐하였다. 이러한 제형을 상기한 시간 동안 상이한 온도에서 저장하고, 개별적인 문단에서 지시된 시점에 분석을 위해 제거하였다. 제형을 (1) 자외선 분광광도법에 의해, (2) 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해, (3) 가시적인 입자 및 비가시적인 입자에 대해, (4) 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의해, 그리고 (5) 용액의 탁도에 의해 분석하였다.
동결건조된 제형의 제조
HuMab<CD20>의 용액을 액체 제형에 관해 상기한 바와 같이 제조하였다. 모든 제형을 0.22 ㎛ 필터를 통해 멸균 여과하고, 멸균 유리 바이알로 무균적으로 분취하였다. 바이알을 동결건조 공정에 사용하기에 적합한 고무 마개로 부분적으로 밀폐하고, 동결건조기의 건조 챔버로 옮겼다. 당해 분야에 공지된 임의의 동결건조 방법은 본 발명의 범위에 속하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 본 연구에 사용된 동결건조 공정은 실온으로부터 약 5 ℃까지의 제형의 냉각(예비-냉각), 및 약 1 내지 약 5 ℃/분의 램핑 속도로 -40 ℃에서의 동결(동결 I)을 포함하였다. 제 1 건조 단계는 -40 ℃부터 -30 ℃까지 0.3 내지 0.5 ℃/분의 램핑 속도로 수행될 수 있고, 이어서, 약 75 내지 80 mTorr의 챔버 압력하에 -30 ℃에서 50 시간 이상 유지될 수 있다. 제 2 건조 단계는 -30 ℃부터 25 ℃까지 0.1 내지 0.3 ℃/분의 램핑 속도로 수행될 수 있고, 이어서, 약 50 내지 80 mTorr의 챔버 압력하에 25 ℃에서 5 시간 이상 유지될 수 있다(적용된 건조 계획은 표 4에 제공된다). 상기 동결건조 공정을 사용하여 건조된 HuMab<CD20> 제형은 칼-피셔 방법에 의해 측정된 약 0.1 내지 1.0 %의 잔류수 함량을 갖는 것으로 밝혀졌다. 동결건조된 바이알을 상이한 시간 동안 상이한 온도에서 저장하였다. 동결건조된 제형을 (1) 자외선 분광광도법에 의한 분석, (2) 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 분석, (3) 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의한 분석, (4) 비가시적인 입자 및 가시적인 입자의 측정, 및 (5) 용액의 탁도에 의한 분석 전에 각각의 부피의 주사용 물(WFI)로 재구성하였다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 수행하여 제형내의 가용성 고분자량 종(응집체) 및 저분자량 가수분해 산물을 검출하였다. 상기 방법은 자외선 검출기(검출 파장 280 nm) 및 조르박스 GF-250 컬럼(9.4 x 250 mm, 아질런트) 또는 TSKgel G3000 SWXL(7.8 x 300 mm)이 장착된 적합한 HPLC 기기를 사용하였고, 상기 방법은 이동상으로서 200 mM의 나트륨 포스페이트 pH 7.0, 또는 200 mM 칼륨 포스페이트 pH 7.0중 250 mM 칼륨 클로라이드를 사용하였다.
이온 교환 크로마토그래피(IEC)를 수행하여 제형내의 HuMab<CD20>의 순 전하를 변경하는 화학적인 분해 산물을 검출하였다. 상기 방법은 자외선 검출기(검출 파장 220 및 280 nm) 및 다이오넥스 프로팩 WCX-10 컬럼(4 mm x 250 mm)이 장착된 적합한 HPLC 기기를 사용하였다. H20중 10 mM의 나트륨 포스페이트 완충액 pH 6.0, 및 10 mM의 나트륨 포스페이트 완충액 pH 6.0 + 0.75 M NaCl을 1.0 ㎖/분의 유속으로 각각 이동상 A 및 B로서 사용하였다.
단백질 농도의 측정을 위한 자외선 스펙트로스코피를 280 nm에서 바리안 케리 바이오 또는 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 자외선 분광광도계에서 수행하였다.
탁도의 측정을 위하여, 실온에서 HACH 2100AN 탁도계를 사용하여 FTU(탁도 단위)로 유백광을 측정하였다.
비가시적인 입자에 대해 HIAC 로이코 파마스펙(HRLD-150)을 사용하고, 가시적인 입자에 대해 사이데나더 V90-T 외관 검사 기기를 사용하여 샘플을 분석하였다.
Figure 112010039280513-pct00005
통과: 가시적인 입자의 부재 내지 본질적인 부재, 최대 6000 입자 ≥ 10 ㎛/용기, 최대 600 입자 ≥ 25㎛/용기
제형 25 mg/㎖의 HuMab<CD20>, 20 mM의 L-히스티딘, 240 mM의 트레할로스, 0.01 % w/v의 폴록사머 188(상표), pH 6.0
Figure 112010039280513-pct00006
n/a: 분석되지 않음
통과: 가시적인 입자의 부재 내지 본질적인 부재, 최대 6000 입자 ≥ 10 ㎛/용기, 최대 600 입자 ≥ 25 ㎛/용기
제형 25 mg/㎖의 HuMab<CD20>, 20 mM의 L-히스티딘, 240 mM의 트레할로스, 0.1 % w/v의 폴록사머 188(상표), pH 6.0
Figure 112010039280513-pct00007
n/a: 분석되지 않음
통과: 가시적인 입자의 부재 내지 본질적인 부재, 최대 6000 입자 ≥ 10 ㎛/용기, 최대 600 입자 ≥ 25 ㎛/용기
제형 25 mg/㎖의 HuMab<CD20>, 20 mM의 아세테이트, 240 mM의 트레할로스, 0.1 % w/v의 폴리소르베이트 80, pH 5.5
Figure 112010039280513-pct00008
n/a: 분석되지 않음
통과: 가시적인 입자의 부재 내지 본질적인 부재, 최대 6000 입자 ≥ 10 ㎛/용기, 최대 600 입자 ≥ 25 ㎛/용기
제형 25 mg/㎖의 HuMab<CD20>, 20 mM의 아세테이트, 140 mM의 나트륨 클로라이드, 0.1 % w/v의 폴리소르베이트 80, pH 5.5
Figure 112010039280513-pct00009
n/a: 분석되지 않음
통과: 가시적인 입자의 부재 내지 본질적인 부재, 최대 6000 입자 ≥ 10 ㎛/용기, 최대 600 입자 ≥ 25 ㎛/용기
제형 30 mg/㎖의 HuMab<CD20>, 20 mM의 L-히스티딘, 200 mM의 트레할로스, 0.01 % w/v의 폴록사머 188(상표), pH 6.5
Figure 112010039280513-pct00010
통과: 가시적인 입자의 부재 내지 본질적인 부재, 최대 6000 입자 ≥ 10 ㎛/용기, 최대 600 입자 ≥ 25 ㎛/용기
동결건조된 huMAb<CD20> 약물 제품 제형의 안정성 데이터
제형 25 mg/㎖의 HuMab<CD20>, 20 mM의 L-히스티딘, 240 mM의 트레할로스, 0.02 % w/v의 폴록사머 188(상표)
Figure 112010039280513-pct00011
통과: 가시적인 입자의 부재 내지 본질적인 부재, 최대 6000 입자 ≥ 10 ㎛/용기, 최대 600 입자 ≥ 25 ㎛/용기
제형 25 mg/㎖의 HuMab<CD20>, 20 mM의 L-히스티딘, 240 mM의 트레할로스, 0.02 % w/v의 폴리소르베이트 80, pH 6.0
Figure 112010039280513-pct00012
n/a: 분석되지 않음
통과: 가시적인 입자의 부재 내지 본질적인 부재, 최대 6000 입자 ≥ 10 ㎛/용기, 최대 600 입자 ≥ 25 ㎛/용기

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  13. 10 mg/㎖의 인간화된 B-Ly1 항체,
    0.02 % w/v의 폴리소르베이트 20,
    20 mM의 L-히스티딘, 및
    240 mM의 트레할로스
    를 pH 6.0으로 포함하는 제형.
  14. 25 mg/㎖의 인간화된 B-Ly1 항체,
    0.02 % w/v의 폴록사머 188(상표),
    20 mM의 L-히스티딘, 및
    240 mM의 트레할로스
    를 pH 6.0으로 포함하거나;
    25 mg/㎖의 인간화된 B-Ly1 항체,
    0.01 % w/v의 폴록사머 188(상표),
    20 mM의 L-히스티딘, 및
    240 mM의 트레할로스
    를 pH 6.0으로 포함하거나;
    25 mg/㎖의 인간화된 B-Ly1 항체,
    0.1 % w/v의 폴록사머 188(상표),
    20 mM의 L-히스티딘, 및
    240 mM의 트레할로스
    를 pH 6.0으로 포함하거나;
    25 mg/㎖의 인간화된 B-Ly1 항체,
    0.02 % w/v의 폴리소르베이트 80,
    20 mM의 L-히스티딘, 및
    240 mM의 트레할로스
    를 pH 6.0으로 포함하거나;
    30 mg/㎖의 인간화된 B-Ly1 항체,
    0.01 % w/v의 폴록사머 188(상표),
    20 mM의 L-히스티딘, 및
    200 mM의 트레할로스
    를 pH 6.5로 포함하는
    제형.
  15. 제 14 항에 있어서,
    25 mg/㎖의 인간화된 B-Ly1 항체,
    0.02 % w/v의 폴록사머 188(상표),
    20 mM의 L-히스티딘, 및
    240 mM의 트레할로스
    를 pH 6.0으로 포함하는, 액체 형태의 제형.
  16. 제 13 항 내지 제 15 항중 어느 한 항에 따른 제형을 포함하는, CD20-관련 질병을 치료하기 위한 약제.
  17. 제 16 항에 있어서,
    질병이 B-세포 비-호지킨 임파종(NHL), 맨틀 세포 임파종(MCL), 급성 임파구성 백혈병(ALL), 만성 임파구성 백혈병(CLL), B-세포 확산성 거대 세포 임파종(DLCL), 버킷 임파종, 모양 세포성 백혈병, 여포성 임파종, 다발성 골수종, 변연부 임파종, 이식 후 임파구 증식성 질환(PTLD), HIV 관련된 임파종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증 및 원발성 중추신경계(CNS) 임파종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제.
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