ES2744526T3 - Anticuerpos anti-MCAM y métodos de uso asociados - Google Patents

Anticuerpos anti-MCAM y métodos de uso asociados Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo humanizado que inhibe la unión de MCAM a laminina-α4 que comprende: (a) una región variable madura de la cadena pesada que comprende tres CDRs de Kabat de SEQ ID Nºs: 66-68 respectivamente, y que es al menos un 97% idéntica a la SEQ ID Nº: 156; y (b) una región variable madura de la cadena ligera que comprende tres CDRs de Kabat de SEQ ID Nºs: 61-63 respectivamente, y que es al menos un 97% idéntica a la SEQ ID Nº: 160.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-MCAM y métodos de uso asociados
Referencias cruzadas a las solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica prioridad de la Solicitud Provisional de EE. UU. N° 61/952.123, presentada el 12 de marzo de 2014, la Solicitud Provisional de EE. UU. N° 62/023.698, presentada el 11 de julio de 2014 y la Solicitud Provisional de e E. UU. N° 62/068.438, presentada el 24 de octubre de 2014.
Referencia a un listado de secuencias, una tabla, o una lista de programas informáticos
El Listado de Secuencias escrito en el archivo 459014SEQLIST.txt, creado el 4 de marzo de 2015, para "ANTICUERPOS ANTI-MCAM Y MÉTODOS DE USO ASOCIADOS" tiene 148 kilobytes.
Antecedentes
Un subconjunto de células T CD4+, denominadas células TH17 (células T auxiliares 17), se ha implicado en la patogénesis de varias enfermedades autoinmunes, en particular las afecciones neuroinflamatorias que involucran la infiltración en el SNC de células T, como la esclerosis múltiple y el modelo animal, encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Se ha informado que las células TH17 secretan una serie de citocinas seleccionadas que incluyen IL-17 e IL-22. Se ha informado que las células TH17 experimentan un reclutamiento específico e infiltración del tejido. Se ha informado que MCAM se expresa en las células TH17 y se une a laminina alfa-4 como ligando.
Flanagan, et al. (2012) PLoS ONE 7 (7): e40443 y el documento WO 2012/170071 A1 informan de la unión de MCAM humana a laminina alfa 4 y proporcionan el clon 17 como anticuerpo que se une a MCAM humana e inhibe su interacción con laminina alfa 4.
Zhang et al. (2008) Hybridoma 27 (5): 345-352 analiza varios anticuerpos contra la MCAM humana, ninguno de los cuales se describe como inhibidor de la interacción entre la MCAM humana y la laminina alfa4.
Resumen de la invención reivindicada
La invención proporciona anticuerpos humanizados que comprenden una región variable madura de la cadena pesada que comprende tres CDRs de Kabat de SEQ ID N°s: 66-68 respectivamente, y que son al menos un 97% idénticas a la SEQ ID N°: 156, y una región variable madura de la cadena ligera que comprende tres CDRs de Kabat de SEQ ID N°s: 61-63, respectivamente, y que son al menos un 97% idénticas a la SEQ ID N°: 160. En algunos anticuerpos, la región variable madura de la cadena pesada es al menos un 98% o 99% idéntica a la SEQ ID N°: 156, y la región variable madura de la cadena ligera es al menos un 98% o 99% idéntica a la SEQ ID N°: 160. En algunos anticuerpos, la región variable madura de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 156 y la región variable madura de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 160. En algunos anticuerpos, la posición 93 (numeración de Kabat) de la región variable madura de la cadena pesada está ocupada por T; la posición 42 (numeración de Kabat) de la región variable madura de la cadena pesada está ocupada por E; la posición 43 (numeración de Kabat) de la región variable madura de la cadena ligera está ocupada por S; la posición 9 (numeración de Kabat) de la región variable madura de la cadena pesada ligera está ocupada por S; la posición 19 (numeración de Kabat) de la región variable madura de la cadena pesada ligera está ocupada por V. En algunos anticuerpos, la posición 93 (numeración de Kabat) de la región variable madura de la cadena pesada está ocupada por T ; la posición 42 (numeración de Kabat) de la región variable madura de la cadena pesada está ocupada por E; la posición 3 (numeración de Kabat) de la región variable madura de la cadena pesada está ocupada por K, la posición 43 (numeración de Kabat) de la región variable madura de la cadena ligera está ocupada por S; la posición 9 (numeración de Kabat) de la región variable madura de la cadena pesada ligera está ocupada por S; la posición 19 (numeración de Kabat) de la región variable madura de la cadena pesada ligera está ocupada por V.
La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente.
La invención proporciona además los anticuerpos mencionados anteriormente para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio caracterizado por infiltración de células que expresan MCAM en un sitio de inflamación en el cuerpo. Dicho trastorno inflamatorio puede ser un trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC) caracterizado por la infiltración de células que expresan MCAM en el SNC.
La invención proporciona además los anticuerpos mencionados anteriormente para su uso en el tratamiento de la esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, dermatitis de contacto alérgica, psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide, sarcoidosis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn o cáncer (por ejemplo, tumores sólidos o hematológicos), como el melanoma.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 representa la identificación de clones críticos. Se representa el valor de unión medio de 1749.1.3 en función de su valor medio de expresión en la superficie (rombos grises). Se aplicaron umbrales de <30% de reactividad de anticuerpos monoclonales y >50% de unión de sueros de ratón para identificar los clones (rombos negros) que fueron negativos para la unión del anticuerpo, pero positivos para la expresión en la superficie.
La FIG. 2 representa un modelo de homología de MCAM humana, que indica la ubicación de cinco residuos identificados como sitios de unión potencialmente críticos para 1749.1.3, incluidos C272, Y318, C320, V340 y W377. La FIG. 3A representa una alineación de las secuencias de aminoácidos de 1749.1.3 con las regiones variables maduras de la cadena ligera de 1749 humanizado. ABA71407.1 y CAI99800.1 son la secuencia Vl aceptora humana. Las regiones CDR según la definición de Kabat se resaltan en gris.
La FIG. 3B representa una alineación de las secuencias de aminoácidos de 1749.1.3 con las regiones variables maduras de la cadena pesada de 1749 humanizado. AAX82494.1 y ADX65676.1 son la secuencia Vh aceptora humana. Las regiones CDR según la definición de Kabat se resaltan en gris.
Breve descripción de las secuencias
La SEQ ID N°: 1 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable madura de la cadena ligera del clon de anticuerpo 17.
La SEQ ID N°: 2 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena ligera del clon de anticuerpo 17. La SEQ ID N°: 3 es la secuencia de aminoácidos de CDRL1 del clon de anticuerpo 17.
La SEQ ID N°: 4 es la secuencia de aminoácidos de CDRL2 del clon de anticuerpo 17.
La SEQ ID N°: 5 es la secuencia de aminoácidos de CDRL3 del clon de anticuerpo 17.
La SEQ ID N°: 6 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable madura de la cadena pesada del clon de anticuerpo 17.
La SEQ ID N°: 7 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del clon de anticuerpo 17.
La SEQ ID N°: 8 es la secuencia de aminoácidos de CDRH1 del clon de anticuerpo 17.
La SEQ ID N°: 9 es la secuencia de aminoácidos de CDRH2 del clon de anticuerpo 17.
La SEQ ID N°: 10 es la secuencia de aminoácidos de CDRH3 del clon de anticuerpo 17.
La SEQ ID N°: 11 es la secuencia de aminoácidos de la MCAM humana, N° de acceso CAA48332.
La SEQ ID N°: 12 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable madura de la cadena ligera del clon de anticuerpo 15.
La SEQ ID N°: 13 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena ligera del clon de anticuerpo 15.
La SEQ ID N°: 14 es la secuencia de aminoácidos de CDRL1 del clon de anticuerpo 15.
La SEQ ID N°: 15 es la secuencia de aminoácidos de CDRL2 del clon de anticuerpo 15.
La SEQ ID N°: 16 es la secuencia de aminoácidos de CDRL3 del clon de anticuerpo 15.
La SEQ ID N°: 17 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable madura de la cadena pesada del clon de anticuerpo 15.
La SEQ ID N°: 18 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del clon de anticuerpo 15.
La SEQ ID N°: 19 es la secuencia de aminoácidos de CDRH1 del clon de anticuerpo 15.
La SEQ ID N°: 20 es la secuencia de aminoácidos de CDRH2 del clon de anticuerpo 15.
La SEQ ID N°: 21 es la secuencia de aminoácidos de CDRH3 del clon de anticuerpo 15.
La SEQ ID N°: 22 es la secuencia de aminoácidos del dominio 1 de MCAM humana (residuos 19-129).
La SEQ ID N°: 23 es la secuencia de aminoácidos del dominio 2 de MCAM humana (residuos 139-242).
La SEQ ID N°: 24 es la secuencia de aminoácidos del dominio 3 de MCAM humana (residuos 244-321).
La SEQ ID N°: 25 es la secuencia de aminoácidos del dominio 4 de MCAM humana (residuos 355-424).
La SEQ ID N°: 26 es la secuencia de aminoácidos del dominio 5 de MCAM humana (residuos 430-510).
La SEQ ID N°: 27 es la secuencia de aminoácidos de una isoforma de la cadena a4 de la laminina 411 humana (N° de acceso NP001098676).
La SEQ ID N°: 28 es la secuencia de aminoácidos de una isoforma de la cadena a4 de la laminina 411 humana (N° de acceso CAA48332).
La SEQ ID N°: 29 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo 1174.1.3.
La SEQ ID N°: 30 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo 1174.1.3.
La SEQ ID N°: 31 es la secuencia de aminoácidos de CDRL1 del anticuerpo 1174.1.3.
La SEQ ID N°: 32 es la secuencia de aminoácidos de CDRL2 del anticuerpo 1174.1.3.
La SEQ ID N°: 33 es la secuencia de aminoácidos de CDRL3 del anticuerpo 1174.1.3.
La SEQ ID N°: 34 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo 1174.1.3.
La SEQ ID N°: 35 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo 1174.1.3.
La SEQ ID N°: 36 es la secuencia de aminoácidos de CDRH1 del anticuerpo 1174.1.3.
La SEQ ID N°: 37 es la secuencia de aminoácidos de CDRH2 del anticuerpo 1174.1.3.
La SEQ ID N°: 38 es la secuencia de aminoácidos de CDRH3 del anticuerpo 1174.1.3.
La SEQ ID N°: 39 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo 1414.1.2.
La SEQ ID N°: 40 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo 1414.1.2.
La SEQ ID N°: 41 es la secuencia de aminoácidos de CDRL1 del anticuerpo 1414.1.2.
La SEQ ID N°: 42 es la secuencia de aminoácidos de CDRL2 del anticuerpo 1414.1.2.
La SEQ ID N°: 43 es la secuencia de aminoácidos de CDRL3 del anticuerpo 1414.1.2.
La SEQ ID N°: 44 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo 1414.1.2.
La SEQ ID N°: 45 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo 1414.1.2.
La SEQ ID N°: 46 es la secuencia de aminoácidos de CDRH1 del anticuerpo 1414.1.2.
La SEQ ID N°: 47 es la secuencia de aminoácidos de CDRH2 del anticuerpo 1414.1.2.
La SEQ ID N°: 48 es la secuencia de aminoácidos de CDRH3 del anticuerpo 1414.1.2.
La SEQ ID N°: 49 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo 1415.1.1.
La SEQ ID N°: 50 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo 1415.1.1.
La SEQ ID N°: 51 es la secuencia de aminoácidos de CDRL1 del anticuerpo 1415.1.1.
La SEQ ID N°: 52 es la secuencia de aminoácidos de CDRL2 del anticuerpo 1415.1.1.
La SEQ ID N°: 53 es la secuencia de aminoácidos de CDRL3 del anticuerpo 1415.1.1.
La SEQ ID N°: 54 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo 1415.1.1.
La SEQ ID N°: 55 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo 1415.1.1.
La SEQ ID N°: 56 es la secuencia de aminoácidos de CDRH1 del anticuerpo 1415.1.1.
La SEQ ID N°: 57 es la secuencia de aminoácidos de CDRH2 del anticuerpo 1415.1.1.
La SEQ ID N°: 58 es la secuencia de aminoácidos de CDRH3 del anticuerpo 1415.1.1.
La SEQ ID N°: 59 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo 1749.1.3.
La SEQ ID N°: 60 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo 1749.1.3.
La SEQ ID N°: 61 es la secuencia de aminoácidos de CDRL1 del anticuerpo 1749.1.3.
La SEQ ID N°: 62 es la secuencia de aminoácidos de CDRL2 del anticuerpo 1749.1.3.
La SEQ ID N°: 63 es la secuencia de aminoácidos de CDRL3 del anticuerpo 1749.1.3.
La SEQ ID N°: 64 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo 1749.1.3.
La SEQ ID N°: 65 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo 1749.1.3.
La SEQ ID N°: 66 es la secuencia de aminoácidos de CDRH1 del anticuerpo 1749.1.3.
La SEQ ID N°: 67 es la secuencia de aminoácidos de CDRH2 del anticuerpo 1749.1.3.
La SEQ ID N°: 68 es la secuencia de aminoácidos de CDRH3 del anticuerpo 1749.1.3.
La SEQ ID N°: 69 es la secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo 2120.4.19.
La SEQ ID N°: 70 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo 2120.4.19 expuesta en la SEQ ID N°: 69.
La SEQ ID N°: 71 es la secuencia de aminoácidos de una región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo 2120.4.19.
La SEQ ID N°: 72 es la secuencia de aminoácidos de una región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo 2120.4.19.
La SEQ ID N°: 73 es la secuencia
Figure imgf000005_0001
de aminoácidos de
Figure imgf000005_0002
L1 del anticuerpo 2120.4.19.
La SEQ ID N°: 74 es la secuencia
Figure imgf000005_0003
de aminoácidos de
Figure imgf000005_0004
L2 del anticuerpo 2120.4.19.
La SEQ ID N°: 75 es la secuencia
Figure imgf000005_0005
de aminoácidos de
Figure imgf000005_0006
L3 del anticuerpo 2120.4.19.
La SEQ ID N°: 76 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo 2120.4.19.
La SEQ ID N°: 77 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo 2120.4.19.
La SEQ ID N°: 78 es la secuencia
Figure imgf000005_0007
de aminoácidos de
Figure imgf000005_0008
H1 del anticuerpo 2120.4.19.
La SEQ ID N°: 79 es la secuencia
Figure imgf000005_0009
de aminoácidos de
Figure imgf000005_0010
H2 del anticuerpo 2120.4.19.
La SEQ ID N°: 80 es la secuencia
Figure imgf000005_0011
de aminoácidos de
Figure imgf000005_0012
H3 del anticuerpo 2120.4.19.
La SEQ ID N°: 81 es una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo 2107.4.10.
La SEQ ID N°: 82 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo 2107.4.10 expuesta en la SEQ ID N°: 81.
La SEQ ID N°: 83 es una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo 2107.4.10.
La SEQ ID N°: 84 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo 2107.4.10 expuesta en la SEQ ID N°: 83.
La SEQ ID N°: 85 es la secuencia de aminoácidos de CDRL1 del anticuerpo 2107.4.10.
La SEQ ID N°: 86 es la secuencia de aminoácidos de CDRL2 del anticuerpo 2107.4.10.
La SEQ ID N°: 87 es la secuencia de aminoácidos de CDRL3 del anticuerpo 2107.4.10.
La SEQ ID N°: 88 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo 2107.4.10.
La SEQ ID N°: 89 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo 2107.4.10.
La SEQ ID N°: 90 es la secuencia de aminoácidos de CDRH1 del anticuerpo 2107.4.10.
La SEQ ID N°: 91 es la secuencia de aminoácidos de CDRH2 del anticuerpo 2107.4.10.
La SEQ ID N°: 92 es la secuencia de aminoácidos de CDRH3 del anticuerpo 2107.4.10.
La SEQ ID N°: 93 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo 1749.1.3.
La SEQ ID N°: 94 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo humanizado 1749 versión 1 (VH1).
La SEQ ID N°: 95 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo humanizado 1749 versión 2 (VH2).
La SEQ ID N°: 96 es la secuencia de aminoácidos del donante de la región estructural variable de la cadena pesada U96282_VH.
La SEQ ID N°: 97 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo 1749.1.3.
La SEQ ID N°: 98 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo humanizado 1749 versión 1 (VL1).
La SEQ ID N°: 99 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo humanizado 1749 versión 2 (VL2).
La SEQ ID N°: 100 es la secuencia de aminoácidos del donante de la región estructural variable de la cadena ligera X02990_VL.
La SEQ ID N°: 101 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo 2107.4.10.18.
La SEQ ID N°: 102 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo humanizado 2107 versión 1 (VH1).
La SEQ ID N°: 103 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo humanizado 2107 versión 2 (VH2).
La SEQ ID N°: 104 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo humanizado 2107 versión 3 (VH3).
La SEQ ID N°: 105 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo humanizado 2107 versión 4A (VH4A).
La SEQ ID N°: 106 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo humanizado 2107 versión 5A (VH5A).
La SEQ ID N°: 107 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo humanizado 2107 versión 6 (VH6).
La SEQ ID N°: 108 es la secuencia de aminoácidos del donante de la región estructural variable de la cadena pesada AF062133_VH.
La SEQ ID N°: 109 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo 2107.4.10.18.
La SEQ ID N°: 110 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo humanizado 2107 versión 1 (VL1).
La SEQ ID N°: 111 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo humanizado 2107 versión 2 (VL2).
La SEQ ID N°: 112 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo humanizado 2107 versión 3 (VL3).
La SEQ ID N°: 113 es la secuencia de aminoácidos del donante de la región estructural variable de la cadena ligera U86803.
La SEQ ID N°: 114 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo 2120.4.19.6.
La SEQ ID N°: 115 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo humanizado 2120 versión 1 (VH1).
La SEQ ID N°: 116 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo humanizado 2120 versión 2 (VH2).
La SEQ ID N°: 117 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo humanizado 2120 versión 3 (VH3).
La SEQ ID N°: 118 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo humanizado 2120 versión 4 (VH4).
La SEQ ID N°: 119 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo humanizado 2120 versión 5 (VH5).
La SEQ ID N°: 120 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo 2120.4.19.6.
La SEQ ID N°: 121 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo humanizado 2120 versión 1 (VL1).
La SEQ ID N°: 122 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo humanizado 2120 versión 2 (VL2).
La SEQ ID N°: 123 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo humanizado 2120 versión 3 (VL3).
La SEQ ID N°: 124 es la secuencia de aminoácidos del donante de la región estructural variable de la cadena ligera X84343_VL.
La SEQ ID N°: 125 es la secuencia de aminoácidos de una región estructur laal d ceadena pesada humanizada. La SEQ ID N°: 126 es la secuencia de aminoácidos de una región estructur laal d ceadena pesada humanizada. La SEQ ID N°: 127 es la secuencia de aminoácidos de una región estructura lal d ceadena pesada humanizada. La SEQ ID N°: 128 es la secuencia de aminoácidos de una región estructural de la cadena pesada/cadena ligera humanizada.
La SEQ ID N°: 129 es la secuencia de aminoácidos de una región estructura lal d ceadena ligera humanizada. La SEQ ID N°: 130 es la secuencia de aminoácidos de una región estructura lal d ceadena ligera humanizada. La SEQ ID N°: 131 es la secuencia de aminoácidos de una región estructura lal d ceadena ligera humanizada. La SEQ ID N°: 132 es la secuencia de aminoácidos de una región estructura lal d ceadena ligera humanizada. La SEQ ID N°: 133 es la secuencia de aminoácidos de una región estructura lal d ceadena pesada humanizada. La SEQ ID N°: 134 es la secuencia de aminoácidos de una región estructura lal d ceadena pesada humanizada.
La SEQ ID N2: 135 es la secuencia de aminoácidos de
Figure imgf000008_0001
La SEQ ID N2: 136 es la secuencia de aminoácidos de
Figure imgf000008_0002
La SEQ ID N2: 137 es la secuencia de aminoácidos de
Figure imgf000008_0003
La SEQ ID N2: 138 es la secuencia de aminoácidos de
Figure imgf000008_0004
La SEQ ID N2: 139 es la secuencia de aminoácidos de
Figure imgf000008_0005
La SEQ ID N2: 140 es la secuencia de aminoácidos de
Figure imgf000008_0006
La SEQ ID N2: 141 es la secuencia de aminoácidos de
Figure imgf000008_0007
La SEQ ID N2: 142 es la secuencia de aminoácidos de
Figure imgf000008_0008
ligera humanizada. La SEQ ID N2: 143 es la secuencia de aminoácidos de
Figure imgf000008_0009
ligera humanizada. La SEQ ID N2: 144 es la secuencia de aminoácidos de
Figure imgf000008_0010
ligera humanizada. La SEQ ID N2: 145 es la secuencia de aminoácidos de
Figure imgf000008_0011
ligera humanizada. La SEQ ID N2: 146 es la secuencia de aminoácidos de
Figure imgf000008_0012
ligera humanizada. La SEQ ID N2: 147 es la secuencia de aminoácidos de
Figure imgf000008_0013
ligera humanizada. La SEQ ID N2: 148 es la secuencia de aminoácidos de
Figure imgf000008_0014
ligera humanizada. La SEQ ID N2: 149 es la secuencia de aminoácidos de
Figure imgf000008_0015
ligera humanizada. La SEQ ID N2: 150 es la secuencia de aminoácidos de
Figure imgf000008_0016
ligera humanizada. La SEQ ID N2: 151 es la secuencia de aminoácidos de
Figure imgf000008_0017
La SEQ ID N2: 152 es la secuencia de aminoácidos de
Figure imgf000008_0018
La SEQ ID N°: 153 es la secuencia de aminoácidos de CDRH3 del anticuerpo humanizado 2120 versión 1-5 (VH1-VH5). La SEQ ID N2: 154 es a secuencia de aminoácidos de una región estructural de la cadena ligera humanizada. La SEQ ID N2: 155 es a secuencia de aminoácidos de una región estructural de la cadena pesada humanizada. La SEQ ID N2: 156 es a secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo humanizado 1749 versión 3 (VH3).
La SEQ ID N°: 157 es la secuencia de aminoácidos de la plantilla de la estructura de la región variable de la cadena pesada de ratón PBD#1HILVH.
La SEQ ID N°: 158 es la secuencia de aminoácidos de la región estructural aceptora variable de la cadena pesada ACC#AAX82494.1.
La SEQ ID N°: 159 es la secuencia de aminoácidos de la región estructural aceptora variable de la cadena pesada ACC#ADX65676.1.
La SEQ ID N°: 160 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena ligera del anticuerpo humanizado 1749 versión 3 (VL3).
La SEQ ID N°: 161 es la secuencia de aminoácidos de la plantilla de la estructura de la región variable de la cadena ligera de ratón PDB#2LTQVL.
La SEQ ID N°: 162 es la secuencia de aminoácidos de la región estructural aceptora variable de la cadena ligera ACC#ABA71407.1.
La SEQ ID N°: 163 es la secuencia de aminoácidos de la región estructural aceptora variable de la cadena ligera CAI99800.1.
La SEQ ID N°: 164 es la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal ejemplar que puede fusionarse a una región variable madura de la cadena pesada o de la cadena ligera.
La SEQ ID N°: 165 es la secuencia de aminoácidos del péptido señal ejemplar codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID N°: 164.
La SEQ ID N°: 166 es la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal ejemplar que se puede fusionar a una región variable madura de la cadena pesada o de la cadena ligera.
La SEQ ID N°: 167 es la secuencia de aminoácidos del péptido señal ejemplar codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID N°: 166.
La SEQ ID N°: 168 es la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal ejemplar que se puede fusionar a una región variable madura de la cadena pesada o de la cadena ligera.
La SEQ ID N°: 169 es la secuencia de aminoácidos del péptido señal ejemplar codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID N°: 168.
La SEQ ID N°: 170 es la secuencia de aminoácidos de una región constante de la cadena ligera de 1749 humanizado, con Arginina en el extremo N-terminal.
La SEQ ID N°: 171 es la secuencia de aminoácidos de una región constante de la cadena ligera de 1749 humanizado, sin arginina en el extremo N-terminal.
La SEQ ID N°: 172 es la secuencia de aminoácidos de una región constante de la cadena pesada de 1749 humanizado. La SEQ ID N°: 173 es la secuencia de aminoácidos de una región constante del alotipo G1m3 de la cadena pesada de la versión BIP.
La SEQ ID N°: 174 es la secuencia de aminoácidos de una región constante del alotipo G1m3 de la cadena pesada de la versión BIP.
La SEQ ID N°: 175 es la secuencia de aminoácidos de una región de la cadena ligera madura del anticuerpo humanizado 1749 versión 3
(VL3 región constante de la cadena ligera).
La SEQ ID N°: 176 es la secuencia de aminoácidos de una región de la cadena pesada madura del anticuerpo humanizado 1749 versión 3 (región constante de alotipo G1m3 de la cadena pesada de la versión VH3 BIP). La SEQ ID N°: 177 es la secuencia de aminoácidos de una región de la cadena pesada madura del anticuerpo humanizado 1749 versión 3 (región constante de alotipo G1m3 de la cadena pesada de la versión VH3 BIP). La SEQ ID N°: 178 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo humanizado 2107 versión 4B (VH4B).
La SEQ ID N°: 179 es la secuencia de aminoácidos de la región variable madura de la cadena pesada del anticuerpo humanizado 2107 versión 5B (VH5B).
Definiciones
Los anticuerpos monoclonales se proporcionan típicamente en forma aislada. Esto significa que un anticuerpo suele estar al menos un 50% p/p puro de proteínas y otras macromoléculas que surgen de su producción o purificación, pero no excluye la posibilidad de que el anticuerpo monoclonal se combine con un exceso de vehículo(s) farmacéutico(s) aceptable(s) u otro vehículo destinado a facilitar su uso. A veces, los anticuerpos monoclonales están al menos un 60%, 70%, 80%, 90%, 95 o 99% p/p puros de proteínas y otras macromoléculas de la producción o purificación. La unión específica de un anticuerpo monoclonal a su antígeno objetivo significa una afinidad de al menos 106, 107, 108, 109 o 1010 M-1. La unión específica es detectable con una mayor magnitud, y es distinguible de la unión inespecífica que se produce en al menos un objetivo no relacionado. La unión específica puede ser el resultado de la formación de enlaces entre grupos funcionales particulares o una disposición espacial particular (por ejemplo, tipo de cerradura y llave), mientras que la unión inespecífica suele ser el resultado de las fuerzas de van der Waals. Sin embargo, la unión específica no implica necesariamente que un anticuerpo monoclonal se una a un solo objetivo.
La unidad estructural del anticuerpo básico es un tetrámero de subunidades. Cada tetrámero incluye dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, y cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsable del reconocimiento del antígeno. Esta región variable se expresa inicialmente vinculada a un péptido señal escindible. La región variable sin el péptido señal se denomina a veces región variable madura. Así, por ejemplo, una región variable madura de la cadena ligera significa una región variable de la cadena ligera sin el péptido señal de la cadena ligera. La parte carboxiterminal de cada cadena define una región constante que es la principal responsable de la función efectora.
Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, y la cadena pesada también incluye una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. (Véase, en general, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, NY, 1989, Cap. 7).
Las regiones variables maduras de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo. Por lo tanto, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en los anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son iguales. Todas las cadenas exhiben la misma estructura general de regiones estructurales relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de la complementariedad o CDRs. Las CDRs de las dos cadenas de cada par están alineadas mediante las regiones estructurales, permitiendo la unión a un epítopo específico. Desde el extremo N-terminal al C-terminal, tanto la cadena ligera como la pesada comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 y 1991), o Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901 - 917 (1987); Chothia et al., Nature 342: 878-883 (1989). Kabat también proporciona una convención de numeración ampliamente utilizada (numeración de Kabat) en la que a los residuos correspondientes entre diferentes cadenas pesadas o entre diferentes cadenas ligeras se les asigna el mismo número (por ejemplo, H83 significa la posición 83 mediante la numeración de Kabat en la región variable madura de la cadena pesada; igualmente, la posición L36 significa la posición 36 mediante la numeración de Kabat en la región variable madura de la cadena ligera). La numeración de Kabat se utiliza en todo momento para referirse a las posiciones en la región variable de un anticuerpo, a menos que se indique explícitamente lo contrario.
El término "anticuerpo" incluye anticuerpos intactos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos. Típicamente, los fragmentos compiten con el anticuerpo intacto del cual derivaron por la unión específica al objetivo, incluidas cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras, Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, diacuerpos, Dabs, nanocuerpos, y Fv. Los fragmentos pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante separación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.
El término "anticuerpo" también incluye un anticuerpo biespecífico, y/o un anticuerpo quimérico, y/o un anticuerpo humanizado. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesadas/ligeras diferentes y dos sitios de unión diferentes (véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547 - 53 (1992)). En algunos anticuerpos biespecíficos, los dos pares de cadena pesada/ligera diferentes pueden incluir un par de cadena pesada/cadena ligera humanizado y un par de cadena pesada/cadena ligera específico de un epítopo diferente.
En algunos anticuerpos biespecíficos, un par de cadena pesada/cadena ligera es un anticuerpo humanizado como se describe más adelante, y el par de cadena pesada/ligera proviene de un anticuerpo que se une a un receptor expresado en la barrera hematoencefálica, como un receptor de insulina, un receptor de factor de crecimiento similar a insulina (IGF), un receptor de leptina o un receptor de lipoproteínas, o un receptor de transferrina (Friden et al., PNAS 88: 4771-4775, 1991; Friden et al., Science 259: 373-377, 1993). Dicho anticuerpo biespecífico puede transferirse a través de la barrera hematoencefálica por medio de la transcitosis mediada por receptor. La captación cerebral del anticuerpo biespecífico puede mejorarse aún más modificando el anticuerpo biespecífico para reducir su afinidad al receptor de la barrera hematoencefálica. La afinidad reducida por el receptor dio lugar a una distribución más amplia en el cerebro (véase, por ejemplo, Atwal et al. Sci. Trans. Med. 3, 84ra43, 2011; Yu et al. Sci. Trans. Med. 3, 84ra44, 2011).
Los anticuerpos biespecíficos ejemplares también pueden ser (1) un anticuerpo de dominio variable doble (DVD-Ig), donde cada cadena ligera y pesada contiene dos dominios variables en tándem a través de un enlace peptídico corto (Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, en: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (2) un Tandab, que es una fusión de dos diacuerpos de cadena simple que dan como resultado un anticuerpo biespecífico tetravalente que tiene dos sitios de unión para cada uno de los antígenos objetivo; (3) un flexicuerpo, que es una combinación de scFvs con un diacuerpo que da como resultado una molécula multivalente; (4) una molécula denominada molécula de "acoplamiento y cierre", basada en el "dominio de dimerización y acoplamiento" de la proteína quinasa A, que, cuando se aplica a los Fab, puede producir una proteína de unión biespecífica trivalente que consiste en dos fragmentos Fab idénticos unidos a un fragmento Fab diferente; (5) una denominada molécula escorpión, que comprende, por ejemplo, dos scFv fusionados a ambos extremos de una región Fc humana. Los ejemplos de plataformas útiles para preparar anticuerpos biespecíficos incluyen, entre otros, BiTE (Micromet), DART (MacroGenics), Fcab y Mab2 (F-Star), IgG 1 con Fc modificado (Xencor) o DuoBody (basado en el intercambio del brazo Fab, Genmab).
El término "epítopo" se refiere a un sitio en un antígeno al que se une un anticuerpo. Un epítopo puede formarse a partir de aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una o más proteínas. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos se retienen típicamente en la exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por el plegamiento terciario se pierden típicamente en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo típicamente incluye al menos 3, y más generalmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar la conformación espacial de epítopos incluyen, por ejemplo, la cristalografía de rayos X y la resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, en Methods in Molecular Biology, vol. 66, Glenn E.
Morris, Ed. (1996).
Un anticuerpo "antagonista" u otro agente de unión es uno que inhibe una actividad biológica del antígeno al que se une. Dichos anticuerpos pueden inhibir sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno.
Los términos "actividad biológica" y "biológicamente activo", con respecto a MCAM, se refieren a su capacidad de unirse específicamente a su ligando (una cadena de laminina a4, por ejemplo, la cadena a4 de laminina 411) y/o de facilitar la infiltración de células que expresan MCAM, por ejemplo, células TH17, en el SNC.
"Inhibir" significa que un agente disminuye la actividad biológica de al menos un objetivo, por ejemplo, MCAM. Dicho inhibidor inhibe la actividad de al menos un objetivo en al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 35%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 45%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 95% o al menos aproximadamente el 100%.
Un "sujeto" incluye un sujeto humano u otro mamífero que recibe un tratamiento profiláctico o terapéutico.
Para los fines de clasificar las sustituciones de aminoácidos como conservativas o no conservativas, los aminoácidos se agrupan de la siguiente manera: Grupo I (cadenas laterales hidrófobas): met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrófilas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (residuos que influyen en la orientación de la cadena): gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromáticas): trp, tyr, phe. Las sustituciones conservativas implican sustituciones entre aminoácidos de la misma clase. Las sustituciones no conservativas constituyen el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra.
El porcentaje de identidades de secuencia se determina con secuencias de anticuerpos alineadas al máximo mediante la convención de numeración de Kabat. Después de la alineación, si una región del anticuerpo en cuestión (por ejemplo, la región variable madura completa de una cadena pesada o ligera) se compara con la misma región de un anticuerpo de referencia, el porcentaje de identidad de secuencia entre las regiones del anticuerpo en cuestión y de referencia es el número de posiciones ocupadas por el mismo aminoácido tanto en la región del anticuerpo de referencia como en la del anticuerpo en cuestión dividido por el número total de posiciones alineadas de las dos regiones, sin contabilizar los huecos, multiplicado por 100 para convertirlo en un porcentaje.
Las composiciones o métodos que comprenden uno o más elementos enumerados pueden incluir otros elementos no enumerados específicamente. Por ejemplo, una composición que comprende un anticuerpo puede contener el anticuerpo solo o en combinación con otros ingredientes.
La designación de un intervalo de valores incluye todos los números enteros dentro o que definen el intervalo, y todos los subintervalos definidos por números enteros dentro del intervalo.
A menos que sea evidente de otra manera por el contexto, el término "aproximadamente" abarca valores dentro de un margen estándar de error de medición (SEM) de un valor establecido.
La significación estadística significa p<0,05.
Descripción detallada
I. GENERAL
Los anticuerpos con la propiedad útil de inhibir la unión de MCAM a la cadena a4 de laminina 411 se describen en los documentos WO/2012/170071 y PCT/US2013/058773. La presente solicitud, entre otras cosas, (a) proporciona nuevas formas humanizadas del anticuerpo 1749.1.3, (b) cartografía los epítopos a los que se une el anticuerpo 1749.1.3, y (c) proporciona anticuerpos que se unen al mismo epítopo.
Los términos anticuerpo "1749.1.3", "m1749" o "1749 de ratón" se refieren a un clon de anticuerpo monoclonal derivado de ratón que tiene una cadena pesada variable madura que corresponde a la SEQ ID N°: 93 y una cadena ligera variable madura que corresponde a la SEQ ID NO: 97. "1749 humanizado" o "hu1749" se refiere a las variantes humanizadas del clon 1749.1.3. La variante humanizada de 1749 que tiene una región variable madura de la cadena pesada correspondiente a la SEQ ID N°: 156 y una región variable madura de la cadena ligera correspondiente a la SEQ ID N°: 160 se denomina en la presente memoria "hu1749VH3VL3".
II. MOLÉCULAS OBJETIVO
La MCAM humana de tipo natural (molécula de adhesión a células de melanoma, también conocida como CD146 y MUC18) es un péptido de 646 aminoácidos que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: MGLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEKRTLIFRVR QGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPLGIPVNSKE PEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYCELNYRLPSG NHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKEGDRVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTNDNGVLVLEP ARKEHSGRYECQAWNLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQWLREETDQVL ERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVKLAIFGPPWMAFKERKVWVKENMVLNLSCEASGHPRPTIS WNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTGLSTSTASPHTR ANSTSTERKLPEPESRGWIVAVIVCILVLAVLGAVLYFLYKKGKLPCRRSGKQEITLPPSRKTELVVEVKSDKLPEEMGL LQGSSGDKRAPGDQGEKYIDLRH (SEQ ID N2: 11).
(Base de datos GenBank con el Número de Acceso AAA20922.1 (CAA48332). La MCAM es una glicoproteína de la superficie celular que pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas involucrada en la adhesión celular y en la cohesión de la monocapa endotelial en las uniones intercelulares en el tejido vascular. También promueve la progresión tumoral de muchos cánceres, como los tumores sólidos, que incluyen el melanoma y el cáncer de próstata. Se sabe que interactúa de una manera homotípica/homofílica y también puede unirse a otros ligandos. La MCAM humana incluye cinco dominios de inmunoglobulina (1: residuos de aminoácidos 19-129; 2: residuos de aminoácidos 139-242; 3: residuos de aminoácidos 244-321; 4: residuos de aminoácidos 335-424; y 5: residuos de aminoácidos 430-510), que se muestran como SEQ ID N°s: 22-26.
A menos que sea evidente de otra manera por el contexto, la referencia a MCAM o sus fragmentos incluye las secuencias de aminoácidos humanas de tipo natural indicadas anteriormente y sus variantes alélicas humanas.
La laminina a4 se refiere a una de las cadenas polipeptídicas encontradas en las moléculas de laminina, que se expresan en la lámina basal (de la membrana basal), una base de red de proteínas para la mayoría de las células y órganos. Se sabe que las lamininas se unen a las membranas celulares a través de las moléculas de la membrana plasmática y contribuyen a la unión celular. La cadena a4 de laminina forma típicamente un complejo con una cadena p de laminina y una cadena y de laminina. La cadena a4 de laminina se encuentra en numerosas moléculas de laminina, incluida la laminina 411 (laminina 8 o a4p1 y1); laminina 421 (laminina 9 o a4p2Y1), y laminina 423 (laminina 14 o a4p2Y3). Hay dos isoformas principales de la cadena a4 de laminina humana: los números de acceso de GenBank NP001098676 y CAA48332 (SeQ ID N°s: 27 y 28). "Laminina 411" se refiere a un complejo polipeptídico trimérico formado por tres subunidades o cadenas polipeptídicas: cadena a4, una cadena p1 y una cadena y1.
Los antagonistas contra MCAM incluyen anticuerpos, proteínas de fusión de receptores o ligandos a una región constante de IgG, otras moléculas de unión biológica y moléculas pequeñas. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Los anticuerpos pueden ser no humanos, como de ratón o rata, primates no humanos, o pueden ser humanos. Los anticuerpos pueden ser quiméricos, recubiertos, humanizados, primatizados y similares.
Un antagonista de MCAM se refiere a un antagonista que inhibe total o parcialmente la capacidad de MCAM de (i) unirse específicamente a su ligando: una cadena a4 de laminina, por ejemplo, la cadena a4 de laminina 411; y/o (ii) facilitar que una célula que expresa MCAM, por ejemplo, una célula TH17, se infiltre o migre hacia el tejido de un sujeto. Los antagonistas de MCAM incluyen anticuerpos u otros antagonistas que se unen a MCAM o a su ligando laminina alfa 4.
III. Anticuerpos
A. Formas humanizadas del anticuerpo anti-MCAM 1749
Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo modificado genéticamente en el que las CDRs de un anticuerpo "donante" no humano se injertan en secuencias de anticuerpos "aceptores" humanos (véase, por ejemplo, Queen et al., documentos US 5.530.101 y 5.585.089; Winter et al., documento US 5.225.539; Carter, documento US 6.407.213; Adair, documentos US 5.859.205 y 6.881.557; y Foote, documento US 6.881.557). Las secuencias del anticuerpo aceptor pueden ser, por ejemplo, una secuencia de región variable madura de un anticuerpo humano, un compuesto de tales secuencias, una secuencia consenso de secuencias de regiones variables de un anticuerpo humano (por ejemplo, secuencias consenso de regiones variables de la cadena ligera y pesada de Kabat, 1991, anteriormente mencionado), o una secuencia de región variable de la línea germinal.
Los ejemplos de una secuencia aceptora para la cadena pesada son las regiones variables de la cadena pesada maduras humanas con códigos de acceso NCBI AAX82494.1 (GI: 62421461) y/o ADX65676.1 (GI: 323432073). Preferiblemente, se usa un compuesto de estos aceptores, como es el caso en los presentes ejemplos. Estas secuencias aceptoras incluyen dos CDRs que tienen la misma forma canónica y una CDR-H3 de la misma longitud con una base retorcida como la cadena pesada de m1749, y AAX82494.1 tiene una identidad de secuencia del 91% y ADX65676.1 tiene una identidad de secuencia del 83% en la región estructural de la región variable de la cadena pesada. Para la cadena ligera, los ejemplos de una secuencia aceptora son las regiones variables maduras de la cadena ligera con los códigos de acceso NCBI ABA71407.1 (GI: 77379502) y/o CAI99800.1 (GI: 98956324). Preferiblemente, se usa un compuesto de estas secuencias, como es el caso en los presentes ejemplos. Estas secuencias aceptoras incluyen tres CDR que tienen la misma forma canónica que una cadena ligera de m1749, y ABA71407.1 tiene una identidad de secuencia del 85% y CAI99800.1 tiene una identidad de secuencia del 83% en la región estructural de la región variable de la cadena ligera.
La invención proporciona anticuerpos humanizados que tienen tres CDRs de la cadena ligera y tres de la cadena pesada, como se define según Kabat completamente o sustancialmente del anticuerpo m1749 donante, y las secuencias estructurales de la región variable madura y las regiones constantes, si están presentes, completamente o sustancialmente de secuencias de anticuerpos humanos. Del mismo modo, una cadena pesada humanizada es una cadena pesada que tiene tres CDRs de la cadena pesada, como se define según Kabat, completamente o sustancialmente de la cadena pesada del anticuerpo m1749, y una secuencia variable de la cadena pesada madura y una secuencia de la región constante de la cadena pesada, si están presentes, completamente o sustancialmente de una secuencia de la cadena pesada de un anticuerpo humano. Del mismo modo, una cadena ligera humanizada es una cadena ligera que tiene tres CDRs de la cadena ligera, como se define según Kabat, completamente o sustancialmente de la cadena ligera del anticuerpo m1749, y una secuencia variable madura de la cadena ligera y una secuencia de la región constante de la cadena ligera, si están presentes, completamente o sustancialmente de una secuencia de la cadena ligera de un anticuerpo humano. Algunos anticuerpos comprenden una cadena pesada humanizada que comprende la CDR1 de Kabat de SEQ ID N°: 66; SYIMS; CDR2 de Kabat de SEQ ID N°: 67: TISSGGSSTYYPDSVKG; CDR3 de Kabat de SEQ ID N°: 68: DDDYDVKVFAY. Algunos anticuerpos comprenden una cadena ligera humanizada que comprende la CDR1 de Kabat de SEQ ID N°: 61: KSSRSLLNs RiRKNYLA; CDR2 de Kabat de SEQ ID N2: 62: WASTRES; CDR3 de Kabat de SEQ ID N2: 63: KQSYN-LLT. Algunos anticuerpos comprenden una cadena pesada humanizada que comprende las tres CDRs de Kabat de las SEQ ID N°: 66, 67 y 68, y una cadena ligera humanizada que comprende las tres CDRs de Kabat de las SEQ ID N°: 61,62 y 63. Una CDR es sustancialmente de m1749 si al menos un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los residuos son idénticos a los residuos correspondientes en la CDR correspondiente de m1749, excepto por las posiciones de Kabat 60-65 de CHRH2 que pueden estar sustituidas. Las secuencias estructurales de la región variable madura de una cadena de anticuerpo o la secuencia de la región constante de una cadena de anticuerpo son sustancialmente de una secuencia estructural de una región variable madura humana o una secuencia de una región constante humana, respectivamente, cuando al menos un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los residuos correspondientes definidos por Kabat son idénticos.
Ciertos aminoácidos de los residuos estructurales de la región variable madura humana pueden seleccionarse para la sustitución en función de su posible influencia en la conformación de las CDRs y/o la unión al antígeno, la mediación en la interacción entre las cadenas pesadas y ligeras, la interacción con la región constante, ser un sitio para una modificación postraduccional deseada o no deseada, ser un residuo inusual por su posición en una secuencia de una región variable humana y, por lo tanto, potencialmente inmunógeno, entre otras razones. Las siguientes seis posiciones de la región estructural de la región variable se consideraron candidatas para las sustituciones por una o más de estas razones, como se especifica en los Ejemplos (D9S, A19V, P43S, Q3K, G42E, A93T).
Aquí como en cualquier otro lugar, el primer residuo mencionado es el residuo de un anticuerpo humanizado formado injertando CDRs de Kabat en una región estructural aceptora humana, y el segundo residuo mencionado es un residuo que se considera que reemplaza a dicho residuo. Por lo tanto, en las regiones estructurales de las regiones variables, el primer residuo mencionado es humano y dentro de las CDRs, el primer residuo mencionado es de ratón (por ejemplo, C97S).
Las sustituciones de aminoácidos se pueden hacer en las CDRs. Una posible variación es sustituir ciertos residuos en las CDRs del anticuerpo m1749 con residuos correspondientes de secuencias de CDRs humanas, típicamente de las CDRs de las secuencias aceptoras humanas usadas en el diseño de los anticuerpos humanizados ejemplificados. En algunos anticuerpos, solo una parte de las CDRs, es decir, el subconjunto de residuos de CDR necesarios para la unión, denominados SDRs, son necesarios para retener la unión en un anticuerpo humanizado. Los residuos de la CDR que no entran en contacto con el antígeno y que no están en las SDRs pueden identificarse basándose en estudios previos (por ejemplo, los residuos H60-H65 de la CDR H2 a menudo no son necesarios), de regiones de CDRs de Kabat que se encuentran fuera de los bucles hipervariables de Chothia (Chothia, J. Mol. Biol. 196: 901, 1987), mediante modelización molecular y/o empíricamente, o como se describe en Gonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863, 2004. En dichos anticuerpos humanizados en posiciones en las que uno o más residuos de CDR del donante están ausentes o en los que se omite una CDR del donante, el aminoácido que ocupa la posición puede ser un aminoácido que ocupa la posición correspondiente (por la numeración de Kabat) en la secuencia del anticuerpo aceptor. El número de tales sustituciones de aminoácidos a incluir del aceptor por el donante en las CDRs refleja un equilibrio de consideraciones en competencia. Dichas sustituciones son potencialmente ventajosas para disminuir el número de aminoácidos de ratón en un anticuerpo humanizado y, en consecuencia, disminuir la inmunogenicidad potencial. Sin embargo, las sustituciones también pueden causar cambios de afinidad, y preferiblemente se evitan reducciones significativas en la afinidad. Las posiciones para la sustitución dentro de las CDRs y los aminoácidos a sustituir también pueden seleccionarse empíricamente.
Una razón para realizar una sustitución dentro de una CDR es que un residuo de ratón es un sitio de modificación postraduccional que puede interferir con la expresión o el ensamblaje de un anticuerpo.
La invención proporciona variantes del anticuerpo 1749 humanizado en las que la región variable madura de la cadena pesada humanizada muestra al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la SEQ ID N°: 156, y la región variable madura de la cadena ligera humanizada muestra al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 160. Algunos de estos anticuerpos humanizados incluyen tres CDRs de la cadena pesada y tres de la ligera, total o sustancialmente idénticas a las regiones CDR de hu1749, que son las mismas que las del anticuerpo donante de ratón. Las regiones CDR pueden definirse mediante cualquier definición convencional (por ejemplo, de Chothia), pero son preferiblemente como se define mediante Kabat.
El anticuerpo 1749 humanizado en el que la región variable madura de la cadena pesada humanizada es la SEQ ID N°: 156 y la región variable madura de la cadena ligera humanizada es la SEQ ID N°: 160 se denomina 1749VH3VL3. Algunas variantes del anticuerpo 1749VH3VL3 humanizado retienen algunas o todas las retromutaciones en hu1749VH3VL3. En otras palabras, al menos 1,2, 3, 4, 5, o preferiblemente las 6 siguientes están presentes: H3 está ocupado por K, H42 está ocupado por E, H93 está ocupado por T, L9 está ocupado por S, L19 está ocupado por V, y L43 está ocupado por S.
Además de retener al menos 1,2, 3, 4, 5, o preferiblemente las 6 retromutaciones de hu1749VH3VL3, los anticuerpos 1749 humanizados también pueden contener retromutaciones adicionales en las regiones estructurales de las regiones variables. Los ejemplos de tales retromutaciones secundarias incluyen H1 ocupado por D, H10 ocupado por D, H13 ocupado por K, H19 ocupado por K, H113 ocupado por A, L5 ocupado por S, L15 ocupado por A, L18 ocupado por K, L21 ocupado por M, L63 ocupado por T, L78 ocupado por V, L83 ocupado por L, L100 ocupado por A, L104 ocupado por L, y/o L106 ocupado por L. Para la selección de retromutaciones para un producto terapéutico o diagnóstico, se debe tener en cuenta el grado en que, en general, no mejoran la afinidad, y el grado en que la introducción de más residuos de ratón puede aumentar el riesgo de inmunogenicidad.
En cualquiera de los anticuerpos anteriores, se pueden hacer otras sustituciones de aminoácidos en la región estructural de la región variable madura, por ejemplo, en residuos que no están en contacto con las CDRs. A menudo, los reemplazos realizados en la variante de secuencias humanizadas son conservativos con respecto a los aminoácidos reemplazados.
B. Selección de la región constante
Las regiones variables de la cadena pesada y ligera de anticuerpos quiméricos, recubiertos o humanizados pueden unirse a al menos una porción de una región constante humana. La elección de la región constante depende, en parte, de si se desea la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos y/o la citotoxicidad dependiente del complemento. Por ejemplo, los isotipos humanos IgG1 e IgG3 tienen citotoxicidad dependiente del complemento, y los isotipos humanos IgG2 e IgG4 no la tienen. Las IgG1 e IgG3 humanas también inducen funciones efectoras mediadas por células más fuertes que las IgG2 e IgG4 humanas. Las regiones constantes de la cadena ligera pueden ser lambda o kappa.
Uno o varios aminoácidos del extremo aminoterminal o carboxiterminal de la cadena ligera y/o pesada, como la lisina C-terminal de la cadena pesada, pueden faltar o derivatizarse en una proporción o en todas las moléculas. Se pueden hacer sustituciones en las regiones constantes para reducir o aumentar la función efectora, como la citotoxicidad mediada por el complemento o ADCC (véase, por ejemplo, Winter et al., Patente de EE. UU. N° 5.624.821; Tso et al., Patente de EE. UU. N° 5.834.597; y Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 4005, 2006), o para prolongar la vida media en humanos (véase, por ejemplo, Hinton et al., J. Biol. Chem. 279: 6213, 2004). Las sustituciones ejemplares incluyen una Gln en la posición 250 y/o una Leu en la posición 428 (se usa la numeración EU en este párrafo para la región constante) para aumentar la vida media de un anticuerpo. La sustitución en cualquiera o en todas las posiciones 234, 235, 236 y/o 237 reduce la afinidad por los receptores Fcy, particularmente el receptor FcyRI (véase, por ejemplo, el documento US 6.624.821). Se puede usar una sustitución de alanina en las posiciones 234, 235 y 237 de la IgG1 humana para reducir las funciones efectoras. Algunos anticuerpos tienen una sustitución de alanina en las posiciones 234, 235 y 237 de la IgG1 humana para reducir las funciones efectoras. Opcionalmente, las posiciones 234, 236 y/o 237 en IgG2 humana están sustituidas con alanina, y la posición 235 con glutamina (véase, por ejemplo, el documento US 5.624.821). En algunos anticuerpos, se utiliza una mutación en una o más de las posiciones 241, 264, 265, 270, 296, 297, 322, 329 y 331 por la numeración EU de IgG1 humana. En algunos anticuerpos, se utiliza una mutación en una o más de las posiciones 318, 320 y 322 por la numeración EU de IgG1 humana. En algunos anticuerpos, las posiciones 234 y/o 235 están sustituidas con alanina y/o la posición 329 está sustituida con glicina. En algunos anticuerpos, las posiciones 234 y 235 están sustituidas con alanina, como en la SEQ ID N°: 174. En algunos anticuerpos, el isotipo es IgG2 o IgG4 humano. Una región constante kappa de la cadena ligera humana ejemplar tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 170. La arginina N-terminal de la SEQ ID N°: 170 se puede omitir, en cuyo caso la región constante kappa de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 171. Una región constante de la cadena pesada de IgG1 humana ejemplar tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 172 (con o sin la lisina C-terminal). Los anticuerpos pueden expresarse como tetrámeros que contienen dos cadenas ligeras y dos pesadas, como cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras, como Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, o como anticuerpos de cadena simple en los que los dominios variables maduros de las cadenas pesada y ligera están unidos a través de un espaciador.
Las regiones constantes humanas muestran una variación alotípica y una variación isoalotípica entre diferentes individuos, es decir, las regiones constantes pueden diferir en diferentes individuos en una o más posiciones polimórficas. Los isoalotipos difieren de los alotipos en que los sueros que reconocen un isoalotipo se unen a una región no polimórfica de uno o más isotipos diferentes. Así, por ejemplo, otra región constante de la cadena pesada es del alotipo IgG1 G1m3 y tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 173. Otra región constante de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 173, excepto porque carece de la lisina C-terminal. Otra región constante de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 174. Otra región constante de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 174, excepto porque carece de la lisina C-terminal.
La descripción proporciona además ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las regiones constantes anteriores. Opcionalmente, dichos ácidos nucleicos codifican además un péptido señal y pueden expresarse con el péptido señal unido a la región constante.
C. Expresión de anticuerpos recombinantes
Los anticuerpos pueden producirse mediante expresión recombinante. En los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos pueden optimizarse los codones para la expresión en el tipo de célula deseado (por ejemplo, CHO o Sp2/0). Las construcciones de ácidos nucleicos recombinantes típicamente incluyen una secuencia de control de la expresión unida de forma operable a las secuencias codificantes de las cadenas de anticuerpos, incluidas las regiones promotoras asociadas de forma natural o heterólogas. Las secuencias de control de la expresión pueden ser sistemas promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucariotas. Una vez que el vector se ha incorporado en el huésped apropiado, el huésped se mantiene en condiciones adecuadas para la expresión a alto nivel de las secuencias de nucleótidos, y la recolección y purificación de los anticuerpos de reacción cruzada. El vector o vectores que codifican las cadenas de anticuerpos también pueden contener un gen seleccionable, tal como la dihidrofolato reductasa, para permitir la amplificación del número de copias de los ácidos nucleicos que codifican las cadenas de anticuerpos.
E. coli es un huésped procariota particularmente útil para expresar anticuerpos, particularmente fragmentos de anticuerpos. Los microbios, como la levadura, también son útiles para la expresión. Saccharomyces es un ejemplo de un huésped de levadura, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de la expresión, un origen de replicación, secuencias de terminación y similares, según se desee. Los promotores típicos incluyen la 3-fosfoglicerato quinasa y otras enzimas glicolíticas. Los promotores de levadura inducibles incluyen, entre otros, promotores de alcohol deshidrogenasa, isocitocromo C y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa.
Las células de mamífero se pueden usar para expresar segmentos de nucleótidos que codifican inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas. Véase Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). Se han desarrollado varias líneas celulares huésped adecuadas capaces de secretar proteínas heterólogas intactas, e incluyen líneas celulares CHO, varias líneas celulares COS, células HeLa, células HEK293, células L y mielomas que no producen anticuerpos, que incluyen Sp2/0 y NS0. Puede ser ventajoso utilizar células no humanas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, un potenciador (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), y los sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de corte y empalme del ARN, sitios de poliadenilación y secuencias de terminación transcripcional. Las secuencias de control de la expresión adecuadas son promotores derivados de genes endógenos, citomegalovirus, SV40, adenovirus, papilomavirus bovino y similares. Véase Co et al., J. Immunol. 148: 1149 (1992).
Habiendo introducido el/los vector(es) que codifica(n) cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos en cultivos celulares, se pueden analizar grupos de células para determinar la productividad del cultivo y la calidad del producto en medios sin suero. Los grupos de células que producen los mejores productos pueden someterse luego a una clonación de una sola célula basada en FACS para generar líneas monoclonales. Pueden ser ventajosas productividades específicas por encima de 50 pg o 100 pg por célula por día, que corresponden a títulos de productos de más de 7,5 g/L de cultivo. Los anticuerpos producidos por clones de células individuales también se pueden ensayar para determinar la turbidez, las propiedades de filtración, PAGE, IEF, barrido UV, HP-SEC, cartografía de carbohidratosoligosacáridos, espectrometría de masas y ensayos de unión, como ELISA o Biacore. Un clon seleccionado puede almacenarse después en múltiples viales y almacenarlo congelado para su uso posterior.
Una vez expresados, los anticuerpos pueden purificarse de acuerdo con los procedimientos convencionales de la técnica, que incluyen la captura con proteína A, cromatografía en columna (por ejemplo, interacción hidrófoba o intercambio iónico), bajo pH para inactivación viral y similares (véase, en general, Scopes, Protein Purification Springer-Verlag, NY, 1982)).
Metodología para la producción comercial de anticuerpos que incluye la optimización de codones, selección de promotores, elementos de transcripción y terminadores, clonación de células individuales sin suero, bancos de células, uso de marcadores de selección para la amplificación del número de copias, terminador de CHO, clonación de células individuales sin suero, mejora de los títulos de proteínas (véanse, por ejemplo, los documentos US 5.786.464, US 5.888.809, US 6.063.598, US 6.114.148, US 7.569.339, WO2004/050884, WO2005/019442, WO2008/012142, WO2008/012142, WO2008/107388, y WO2008/012142).
D. Ácidos nucleicos
La descripción proporciona además ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las cadenas pesadas y ligeras descritas anteriormente. Típicamente, los ácidos nucleicos también codifican un péptido señal fusionado con las cadenas pesadas y ligeras maduras (por ejemplo, péptidos señal que tienen secuencias de aminoácidos de SEQ ID N°s: 165, 167 y 169 que pueden codificarse mediante las SEQ ID N°s: 164, 166, y 168). Las secuencias de codificación en ácidos nucleicos pueden estar en una unión operable con secuencias reguladoras para asegurar la expresión de las secuencias de codificación, tales como un promotor, potenciador, sitio de unión al ribosoma, señal de terminación de la transcripción y similares. Los ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesadas y ligeras pueden aparecer en forma aislada o pueden clonarse en uno o más vectores. Los ácidos nucleicos pueden sintetizarse, por ejemplo, mediante síntesis en estado sólido o PCR de oligonucleótidos solapantes. Los ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesadas y ligeras pueden unirse como un ácido nucleico contiguo, por ejemplo, dentro de un vector de expresión, o pueden estar separados, por ejemplo, cada uno clonado en su propio vector de expresión.
E. Caracterización de los epítopos de MCAM para la unión de anticuerpos y producción de anticuerpos que se unen a los mismos
1. Epítopos de MCAM para la unión de anticuerpos
La invención proporciona anticuerpos monoclonales que se unen a epítopos específicos dentro de la proteína MCAM humana. Algunos anticuerpos de la invención se unen al mismo epítopo o a uno solapante, como el anticuerpo designado 1749.1.3 (m1749).
La invención proporciona anticuerpos que se unen al mismo epítopo o a uno solapante, como el anticuerpo designado m1749. Las mutaciones en los residuos 272, 318, 320, 340 y 377 de MCAM interrumpen la unión específica de m1749 (por ejemplo, <30% de unión a MCAM mutante en comparación con una MCAM de tipo natural de control positivo como se describe en los ejemplos). Debido a que relativamente pocos residuos afectan a la unión, y los residuos están espaciados más ampliamente que un epítopo lineal típico (por ejemplo, 3-20 aminoácidos contiguos), estos resultados proporcionan una indicación de que m1749 se une a un epítopo conformacional. Alternativamente, uno o más de los residuos que afectan a la unión pueden hacerlo de forma alostérica sin contacto directo con el anticuerpo.
Los anticuerpos que se unen a un epítopo que incluye uno o más de los residuos 272, 318, 320, 324, 326, 340 y 377 de MCAM, y en particular a un epítopo que incluye uno o más de los residuos 318, 324 y 326, es probable que compartan propiedades inhibitorias útiles con m1749. Por lo tanto, los anticuerpos cuya unión específica es inhibida por la mutagénesis de uno o más de los residuos 318, 324 y 326, y particularmente el residuo 318 de MCAM, es probable que compartan propiedades similares a m1749. Algunos de estos anticuerpos se unen a un epítopo que incluye o que consiste en el residuo 318, 324 y/o 326 de MCAM. El epítopo puede ser lineal, como un epítopo (por ejemplo, 2-5, 3-5, 3-10, 3-15, 3-20, 5-10, 5-15, 5-20, 5-30, 5-40, 5-50, 5-60 o 5-70 aminoácidos contiguos) que incluye 1,2 o 3 de los aminoácidos especificados (318, 324 y 326) o puede ser conformacional, que incluye o consiste en 1, 2, o 3 de los aminoácidos especificados.
2. La generación de anticuerpos que se unen a epítopos de MCAM específicos
Algunos anticuerpos de la invención se unen al mismo epítopo o a uno solapante al del anticuerpo m1749. La producción de otros anticuerpos monoclonales no humanos, por ejemplo, murinos, cobayas, primates, conejos o ratas, contra la MCAM humana se puede lograr, por ejemplo, inmunizando al animal con la MCAM humana o un fragmento peptídico de la misma que incluya el epítopo deseado (el "inmunógeno"), y el cribado de los anticuerpos resultantes en función de la unión a MCAM, opcionalmente en competencia con m1749 (véase Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988)). Opcionalmente, el inmunógeno se conjuga con una molécula portadora. Opcionalmente, el inmunógeno se administra con un adyuvante. Se pueden usar varios tipos de adyuvantes como se describe a continuación. Se prefiere el adyuvante completo de Freund seguido del adyuvante incompleto para la inmunización de animales de laboratorio. Normalmente se utilizan conejos o conejillos de Indias para hacer anticuerpos policlonales. Los ratones se utilizan típicamente para hacer anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos se criban para determinar la unión específica a un epítopo deseado dentro de MCAM.
La descripción proporciona fragmentos peptídicos de MCAM que se usan para crear anticuerpos dirigidos a los epítopos descritos anteriormente. Los ejemplos de tales péptidos incluyen un péptido que tiene una longitud de 2-5, 3-5, 3-10, 3-15, 3-20, 5-10, 5-15, 5-20, 5-30, 5-40, 5-50, 5-60, o 5-70 aminoácidos contiguos e incluye al menos uno de los residuos de aminoácidos 318, 324 y 326 de MCAM. En algunos de estos péptidos, el péptido incluye los tres residuos de aminoácidos 318, 324 y 326.
Los inmunógenos pueden conjugarse con moléculas portadoras, típicamente un polipéptido portador, y así ayudan a provocar una respuesta inmunitaria contra el fragmento conjugado con el portador. Un solo agente puede unirse a un solo portador, varias copias de un agente pueden unirse a múltiples copias de un portador, que a su vez están unidas entre sí, varias copias de un agente pueden unirse a una sola copia de un portador, o una sola copia de un agente puede unirse a múltiples copias de un portador, o diferentes portadores. Los vehículos adecuados incluyen albúminas de suero, hemocianina de lapa californiana, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovoalbúmina, toxoide tetánico o un toxoide de otras bacterias patógenas, como la difteria (p. ej., CRM197), E. coli, cólera o H. pylori, o un derivado atenuado de toxina.
Los inmunógenos a menudo se administran con adyuvantes farmacéuticamente aceptables. El adyuvante aumenta el título de los anticuerpos inducidos y/o la afinidad de unión de los anticuerpos inducidos respecto de la situación si el péptido se usara solo. Se puede usar una variedad de adyuvantes en combinación con un fragmento inmunógeno de MCAM para provocar una respuesta inmunitaria. Los adyuvantes preferidos aumentan la respuesta intrínseca a un inmunógeno sin causar cambios conformacionales en el inmunógeno que afecten a la forma cualitativa de la respuesta. Los adyuvantes preferidos incluyen hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (MPL™) (véase el documento Gb 2220211 (RIBI Immuno-Chem Research Inc., Hamilton, Montana, ahora parte de Corixa). Stimulon™ QS-21 es un glucósido triterpénico o saponina aislado de la corteza del árbol Quillaja Saponaria Molina hallado en América del Sur (véase Kensil et al., en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); documento US 5.057.540), (Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA; ahora Antigenics, Inc., Nueva York, NY). Otros adyuvantes son emulsiones de aceite en agua (como el escualeno o el aceite de cacahuete), opcionalmente en combinación con estimulantes inmunitarios, como el monofosforil lípido A (véase Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)), polímeros de tipo Pluronic, y micobacterias muertas. Otro adyuvante es CpG (documento WO 98/40100). Los adyuvantes pueden administrarse como un componente de una composición terapéutica con un agente activo, o pueden administrarse por separado, antes, simultáneamente o después de la administración del agente terapéutico.
3. Tipos de anticuerpos
Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Los anticuerpos pueden ser no humanos, como de ratón o rata, primates no humanos, o pueden ser humanos. Los anticuerpos pueden ser quiméricos, recubiertos, humanizados, primatizados y similares.
Los anticuerpos monoclonales se humanizan utilizando los métodos descritos anteriormente y los métodos descritos en Queen, documentos US 5.530.101 y 5.585.089; Winter, documento US 5.225.539, Carter, documento US 6.407.213, Adair, documentos US 5.859.205 y 6.881.557, Foote, documento US 6.881.557.
La invención proporciona además formas quiméricas y recubiertas de anticuerpos no humanos que se unen específicamente a los epítopos de MCAM descritos anteriormente.
Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo en el que las regiones variables maduras de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo no humano (por ejemplo, de ratón) se combinan con las regiones constantes de las cadenas ligeras y pesadas humanas. Dichos anticuerpos conservan sustancial o totalmente la especificidad de unión del anticuerpo de ratón, y tienen aproximadamente dos tercios de la secuencia humana.
Un anticuerpo recubierto es un tipo de anticuerpo humanizado que retiene algunas y generalmente todas las CDRs y algunos de los residuos de la región estructural de la región variable no humana de un anticuerpo no humano, pero reemplaza otros residuos de la región estructural de la región variable que pueden contribuir a los epítopos de células B o T, por ejemplo, residuos expuestos con residuos de las posiciones correspondientes de una secuencia de anticuerpo humano (Padlan, Mol. Immunol. 28: 489, 1991). El resultado es un anticuerpo en el que las CDRs son total o sustancialmente de un anticuerpo no humano, y las regiones estructurales de las regiones variables del anticuerpo no humano se hacen más parecidas a las humanas por las sustituciones.
Los anticuerpos humanos contra MCAM se proporcionan mediante una variedad de técnicas que se describen a continuación. Algunos anticuerpos humanos se seleccionan mediante experimentos de unión competitiva, mediante el método de presentación en fagos de Winter, anteriormente mencionado, o de otra manera, para tener la misma especificidad hacia el epítopo que un anticuerpo de ratón particular, como uno de los anticuerpos monoclonales de ratón descritos en los ejemplos. Los anticuerpos humanos también pueden analizarse para determinar la especificidad hacia un epítopo particular utilizando solo un fragmento de MCAM como antígeno objetivo, y/o cribando anticuerpos contra una colección de mutantes por deleción de MCAM.
Los métodos para producir anticuerpos humanos incluyen el método de trioma de Oestberg et al., Hybridoma 2: 361­ 367 (1983); Oestberg, patente de e E.UU. n° 4.634.664; y Engleman et al., Patente de EE. UU. n° 4.634.666, el uso de ratones transgénicos que incluyen genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Lonberg et al., documento WO93/12227 (1993); documentos US 5.661.016, US 5.633.425, US 5.625.126, US 5.569.825, US 5.545.806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, documento WO 91/10741 (1991) y los métodos de expresión en fagos (véase, por ejemplo, Dower et al., documento WO 91/17271 y McCafferty et al., documentos WO 92/01047, US 5.877.218, US 5.871.907, US 5.858.657, US 5.837.242, US 5.733.743 y US 5.565.332.
Los anticuerpos quiméricos, humanizados (incluyendo los recubiertos) y humanos se producen típicamente mediante expresión recombinante como se describió anteriormente.
La descripción proporciona además moléculas de unión que no son anticuerpos. Las moléculas de unión que no son anticuerpos incluyen, por ejemplo, anticalinas, que se basan en el armazón de lipocalina, una estructura proteica caracterizada por un barril beta rígido que soporta cuatro bucles hipervariables que forman el sitio de unión al ligando. Las nuevas especificidades de unión están diseñadas mediante mutagénesis aleatoria dirigida en las regiones de los bucles, en combinación con la expresión funcional y la selección guiada (Skerra (2008) FEBS J. 275: 2677-2683). Otros armazones adecuados pueden incluir, por ejemplo, adnectinas o monocuerpos, basados en el décimo dominio extracelular de la fibronectina III humana (Koide y Koide (2007) Methods Mol. Biol. 352: 95-109); aficuerpos, basados en el dominio Z de la proteína A estafilocócica (Nygren et al. (2008) FEBS J. 275: 2668-2676)); DARPins, basados en proteínas de repetición de anquirina (Stumpp et al. (2008) Drug. Discov. Today 13: 695-701); finómeros, basados en el dominio SH3 de la proteína quinasa Fyn humana (Grabulovski et al. (2007) J. Biol. Chem. 282: 3196-3204); afitinas, basadas en Sac7d de Sulfolobus acidolarius (Krehenbrink et al. (2008) J. Mol. Biol. 383: 1058-1068); afilinas, basadas en la cristalina y-B humana (Ebersbach et al. (2007) J. Mol. Biol. 372: 172-185); avímeros, basados en los dominios A de las proteínas receptoras de membrana (Silverman et al. (2005) Biotechnol. 23: 1556-1561); péptidos de knottina ricos en cisteína (Kolmar (2008) FEBS J. 275: 2684-2690); e inhibidores de tipo Kunitz (Nixon y Wood (2006) Curr. Opin. Drug. Discov. Dev. 9: 261-268). Para una revisión, véase Gebauer y Skerra (2009) Curr. Opin. Chem. Biol. 13: 245-255.
En algunos de estos anticuerpos, el anticuerpo no es uno cualquiera de los anticuerpos o anticuerpos que incluyen CDRs (según lo definido por Kabat, Chothia o una combinación de los mismos) completamente o sustancialmente de los anticuerpos descritos en los documentos WO/2012/170071 y PCT/US2013/058773, particularmente los anticuerpos denominados clon 15 (definidos por SEQ ID N°s: 12-21) y clon 17 (definidos por SEQ ID N°s: 1 -10) en el documento WO/2012/170071 y los clones monoclonales anti-MCAM humana de ratón denominados 1174.1.3, 1414.1.2, 1415.1.1 y 1749.1.3, y los clones de anticuerpo monoclonal anti-MCAM humana de rata denominados 2120.4.19 y 2107.4.10 descritos en el documento PCT/US2013/058773.
4. Métodos de cribado de anticuerpos en función de la actividad
La actividad inhibitoria de los anticuerpos hacia MCAM descritos en la presente memoria puede analizarse mediante cualquier método conocido en la técnica, incluidos los ensayos de unión competitiva con anticuerpos que se unen al mismo epítopo o uno similar (por ejemplo, m1749) y el bloqueo de la unión de MCAM con su ligando, la cadena a4 de laminina 411.
Por ejemplo, la actividad de los anticuerpos hacia MCAM de bloquear la interacción entre MCAM y la cadena a4 de laminina 411 se puede analizar de la siguiente manera. Las células que expresan MCAM (a) se incuban con un polipéptido recombinante que comprende una cadena a4 de laminina, por ejemplo, una cadena a4 de laminina 411, en presencia o ausencia de un anticuerpo candidato; (b) se controla el nivel de unión de la laminina a4 a las células, por ejemplo, mediante microscopía de fluorescencia o citometría de flujo; y (c) se identifica dicho anticuerpo candidato como un inhibidor de la interacción MCAM/laminina a4 si el nivel de unión de la laminina a4 es menor en presencia que en ausencia del anticuerpo candidato. Un protocolo de cribado alternativo implica el uso de una población de células que expresan una cadena a4 de laminina, que se puede incubar con MCAM, en presencia y ausencia de un anticuerpo candidato, y la unión de MCAM a la población celular monitorizada. Si la unión de MCAM a la población celular en presencia del anticuerpo candidato es menor que en su ausencia, el anticuerpo candidato es un antagonista de MCAM.
Otros métodos de monitorización incluyen la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
Los antagonistas de MCAM identificados en función de su capacidad de inhibir la unión de MCAM a su ligando, por ejemplo, una cadena a4 de laminina, son candidatos para el tratamiento de afecciones inflamatorias caracterizadas por la infiltración de células que expresan MCAM.
La actividad inhibitoria de un anticuerpo hacia MCAM también puede evaluarse in vivo. Un ejemplo de una metodología para evaluar la actividad inhibitoria de un anticuerpo hacia MCAM es con un modelo experimental de encefalomielitis autoinmune (EAE). EAE es una enfermedad que se genera en animales de laboratorio para producir síntomas similares a los de la esclerosis múltiple (EM) en humanos. Véase, por ejemplo, Bauer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 106: 1920-1925 (2009). La EAE generalmente se produce inyectando a los animales diferentes proteínas del sistema nervioso central de otros animales, por ejemplo, extractos de proteína básica de mielina y tejido de la médula espinal o cerebro completo, o con células T que reaccionan específicamente a la mielina. La EAE se usa comúnmente para seguir el curso de las recaídas o formas progresivas de la EM. EAE ha servido como modelo animal adecuado tanto para desarrollar agentes terapéuticos para la EM como para estudiar los procesos de la enfermedad específica de la EM. Véase, por ejemplo, Gold et al., Brain 129: 1953-1971 (2006); véase también Steinman et al., Ann. Neurol. 60, 12-21 (2006).
Los efectos del bloqueo de MCAM sobre la progresión de la enfermedad se pueden examinar en un modelo terapéutico de EAE en el que la polarización de TH17 se produce in vivo. Los ratones se inmunizan con el péptido 139-151 de PLP para inducir EAE. Después de la aparición de la enfermedad, los ratones se tratan por vía intraperitoneal con un anticuerpo anti-MCAM candidato o un control de isotipo, y todos los días a partir de entonces. Los ratones se monitorizan diariamente y se puntúan con enmascaramiento, y los pesos corporales se obtienen cada 2-3 días. Un retraso en la recaída y una reducción significativa en la gravedad de los síntomas en los ratones tratados con un anticuerpo hacia MCAM candidato es indicativo de un anticuerpo candidato eficaz.
F. Anticuerpos conjugados
Los anticuerpos conjugados que se unen específicamente a MCAM pueden ser útiles para seleccionar como objetivo el cáncer o las células tumorales para su destrucción, o para seleccionar como objetivo las células involucradas en enfermedades autoinmunes o enfermedades neuroinflamatorias. Dichos anticuerpos también pueden ser útiles para seleccionar como objetivo cualquier enfermedad mediada, al menos en parte, por la expresión de MCAM. Por ejemplo, tales anticuerpos pueden conjugarse con otros agentes terapéuticos, otras proteínas, otros anticuerpos y/o marcadores detectables. Véanse los documentos WO 03/057838; US 8.455.622. Dichos agentes terapéuticos pueden ser cualquier agente que pueda usarse para tratar, combatir, recuperar, prevenir o mejorar una afección o enfermedad indeseada en un paciente, como una enfermedad autoinmune, una enfermedad neuroinflamatoria o un cáncer. Los agentes terapéuticos pueden incluir agentes citotóxicos, agentes citostáticos, agentes radioterapéuticos, inmunomoduladores o cualquier agente biológicamente activo que facilite o aumente la actividad del anticuerpo. Un agente citotóxico puede ser cualquier agente tóxico para una célula. Un agente citostático puede ser cualquier agente que inhiba la proliferación celular. Un inmunomodulador puede ser cualquier agente que estimule o inhiba el desarrollo o el mantenimiento de una respuesta inmunológica. Un agente radioterapéutico puede ser cualquier molécula o compuesto que emita radiación. Si dichos agentes terapéuticos se acoplan a un anticuerpo específico hacia MCAM, como los anticuerpos descritos en la presente memoria, los agentes terapéuticos acoplados tendrán una afinidad específica por las células que expresan MCAM (por ejemplo, células inmunitarias, como las células que expresan TH17 o células cancerosas, como los melanocitos malignos) respecto de otras células. En consecuencia, la administración de los anticuerpos conjugados selecciona como objetivo directamente las células que expresan MCAM con efectos mínimos en otras células y tejidos circundantes. Esto puede ser particularmente útil para los agentes terapéuticos que son demasiado tóxicos para administrarlos solos. Además, se pueden usar cantidades más pequeñas de los agentes terapéuticos.
Los anticuerpos se pueden modificar para que actúen como inmunotoxinas. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 5.194.594. Por ejemplo, la ricina, una toxina celular derivada de plantas, se puede acoplar a los anticuerpos usando los reactivos bifuncionales anhídrido S-acetilmercapto-succínico para el anticuerpo y 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidilo para ricina. Véase Pietersz et al., Cancer Res. 48 (16): 4469-4476 (1998). El acoplamiento da como resultado la pérdida de la actividad de unión a la cadena B de la ricina, mientras que no afecta ni al potencial tóxico de la cadena A de la ricina ni a la actividad del anticuerpo. De manera similar, la saporina, un inhibidor del ensamblaje ribosómico, se puede acoplar a los anticuerpos a través de un enlace disulfuro entre grupos sulfhidrilo insertados químicamente. Véase Polito et al., Leukemia 18: 1215-1222 (2004).
Los radioisótopos también pueden unirse a los anticuerpos. Los radioisótopos preferidos incluyen itrio90 (90Y), indio111 (111 In), 131I, 99mTc, radioplata-111, radiooro-199 y bismuto213. La unión de radioisótopos a los anticuerpos puede realizarse con quelatos bifuncionales convencionales. Para unir radioplata-111 y radiooro-199, se pueden usar enlazadores basados en azufre. Véase Hazra et al., Cell Biophys. 24-25: 1-7 (1994). La unión de los radioisótopos de plata puede implicar la reducción de la inmunoglobulina con ácido ascórbico. Para los radioisótopos como 111In y 90Y, se puede usar ibritumomab tiuxetan, y reaccionará con dichos isótopos para formar 1111n-ibritumomab tiuxetan y 90Y-ibritumomab tiuxetan, respectivamente. Véase Witzig, Cancer Chemother. Pharmacol., 48 Supl. 1: S91-S95 (2001).
También se pueden unir otros agentes terapéuticos a anticuerpos. Los agentes terapéuticos suelen ser citotóxicos o citostáticos. Por ejemplo, los anticuerpos pueden conjugarse con fármacos quimioterapéuticos tóxicos como la maitansina, geldanamicina, inhibidores de tubulina, como auristatinas, o agentes de unión al surco menor, como caliqueamicina. Otros agentes terapéuticos representativos incluyen agentes que se sabe que son útiles para el tratamiento, manejo o mejora de una enfermedad autoinmune, una enfermedad neuroinflamatoria o un cáncer, o los síntomas de una enfermedad autoinmune, una enfermedad neuroinflamatoria o un cáncer. Los ejemplos de dichos agentes terapéuticos se describen en otra parte en la presente memoria.
Los anticuerpos también se pueden acoplar con otras proteínas. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden acoplar con finómeros. Los finómeros son pequeñas proteínas de unión (por ejemplo, 7 kDa) derivadas del dominio SH3 de Fyn humano. Pueden ser estables y solubles, y pueden carecer de residuos de cisteína y enlaces disulfuro. Los finómeros pueden diseñarse para unirse a las moléculas objetivo con la misma afinidad y especificidad que los anticuerpos. Son adecuados para crear proteínas de fusión multiespecíficas basadas en anticuerpos. Por ejemplo, los finómeros pueden fusionarse a los extremos N-terminal y/o C-terminal de los anticuerpos para crear FinomAbs bi y tri-específicos con diferentes arquitecturas. Los finómeros pueden seleccionarse utilizando bibliotecas de finómeros a través de tecnologías de detección que utilizan FACS, Biacore y ensayos basados en células que permiten una selección eficiente de los finómeros con propiedades óptimas. Se describen ejemplos de finómeros en Grabulovski et al., J. Biol. Chem. 282: 3196-3204 (2007); Bertschinger et al., Protein Eng. Des. Sel. 20:57-68 (2007); Schlatter et al., MAbs. 4: 497-508 (2011); Banner et al., Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 69 (Pt6): 1124-1137 (2013); y Brack et al., Mol. Cancer Ther. 13: 2030-2039 (2014).
Los anticuerpos descritos en la presente memoria también pueden acoplarse o conjugarse con uno o más anticuerpos diferentes (por ejemplo, para formar heteroconjugados de anticuerpos). Tales otros anticuerpos pueden unirse a diferentes epítopos dentro de la MCAM o pueden unirse a un antígeno objetivo diferente.
Los anticuerpos también se pueden acoplar con una etiqueta detectable. Dichos anticuerpos pueden usarse, por ejemplo, para diagnosticar una enfermedad autoinmune, una enfermedad neuroinflamatoria o un cáncer, para monitorizar la progresión de una enfermedad autoinmune, una enfermedad neuroinflamatoria o un cáncer, y/o para evaluar la eficacia del tratamiento. Dichos anticuerpos pueden ser útiles para realizar tales determinaciones en sujetos que tienen o son susceptibles a una enfermedad autoinmune, una enfermedad neuroinflamatoria o un cáncer, o en muestras biológicas apropiadas obtenidas de tales sujetos. Los marcadores detectables representativos que se pueden acoplar o unir a un anticuerpo incluyen diversas enzimas, tales como peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos, como estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotri-azinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, como luminol; materiales bioluminiscentes, tales como luciferasa, luciferina y aecuorina; materiales radioactivos, como radioplata-111, radiooro-199, bismuto213, yodo (131I, 125I, 123I, 121I), carbono (14C), azufre (5S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In, 111In,), tecnecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn y 117estaño; metales emisores de positrones que se utilizan en diversas tomografías de emisión de positrones; iones metálicos paramagnéticos no radiactivos; y moléculas que están radiomarcadas o conjugadas a radioisótopos específicos.
Los agentes terapéuticos, otras proteínas, otros anticuerpos y/o marcadores detectables se pueden acoplar o conjugar, directa o indirectamente, a través de un intermedio (por ejemplo, un enlazador), a un anticuerpo murino, quimérico, recubierto o humanizado usando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Arnon et al., ''Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies for Drug Delivery'', en Controlled Drug Delivery (2a ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985); y Thorpe et al., Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982). Los enlazadores adecuados incluyen, por ejemplo, enlazadores escindibles y no escindibles. Se pueden emplear diferentes enlazadores que liberan los fármacos en condiciones ácidas o reductoras o al exponerlos a proteasas específicas. Asimismo, se pueden emplear diferentes enlazadores que liberan los agentes terapéuticos, proteínas, anticuerpos y/o marcadores detectables acoplados en condiciones ácidas o reductoras, o al exponerlos a proteasas específicas o en otras condiciones definidas.
IV. MÉTODOS DE TRATAMIENTO Y COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS
Los anticuerpos u otros antagonistas descritos pueden usarse para tratar o llevar a cabo la profilaxis de sujetos que tienen (por ejemplo, que cumplen los criterios reconocidos en la técnica, como los del DSM-IV-TR o DSM-V) o con riesgo elevado con respecto a la población general de una enfermedad autoinmune, neuroinflamatoria y cáncer, entre otras. El riesgo elevado puede evaluarse a partir de la presencia de uno o más marcadores genéticos o bioquímicos asociados a la enfermedad, o uno o más síntomas compatibles con la enfermedad pero insuficientes para permitir un diagnóstico definitivo. Las categorías o enfermedades mencionadas anteriormente no son necesariamente excluyentes entre sí; por ejemplo, la esclerosis múltiple se puede clasificar como neuroinflamatoria o autoinmune. Algunas enfermedades ejemplares específicas que se pueden tratar con los métodos actuales incluyen la esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, dermatitis alérgica de contacto, psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide, sarcoidosis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn y cáncer, particularmente tumores sólidos, como el melanoma. Aunque la práctica de los métodos no depende de la comprensión del mecanismo, se cree que en algunos métodos los anticuerpos u otros antagonistas funcionan al menos en parte inhibiendo la interacción de la MCAM expresada en las células T (por ejemplo, células TH17) y la cadena a4 de laminina, por ejemplo, una cadena a4 de laminina 411 expresada en la superficie de una célula endotelial. Los conjugados anticuerpo-fármaco pueden tener mecanismos de acción adicionales, que incluyen el efecto citotóxico o citostático del agente unido, típicamente después de la absorción dentro de la célula objetivo. Los conjugados anticuerpo-fármaco también pueden inducir toxicidad por los macrófagos asociados a tumores.
Las afecciones neuroinflamatorias se caracterizan por inflamación del SNC y/o daño celular/tisular. Los signos pueden incluir un aumento de la activación glial, un aumento de los niveles de citocinas/quimiocinas proinflamatorias (por ejemplo, TNFa, INFy, IL-1 p), un aumento de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica y/o un aumento del reclutamiento/invasión de células inmunitarias (por ejemplo, leucocitos) en el SNC. La neuroinflamación es a menudo crónica, asociada a la activación crónica de las células del sistema inmunitario (es decir, neuroinflamación asociada a autoinmunidad), pero puede tener episodios agudos alternativos o adicionales.
La esclerosis múltiple es una enfermedad preferida para el tratamiento en cualquiera de sus al menos cuatro subtipos. La EM recurrente-remitente (EM-RR) es la forma más común de EM, y se caracteriza por exacerbaciones/recaídas claramente definidas (ataques agudos) seguidas de una recuperación parcial o completa. No hay progresión de la enfermedad entre los periodos de recaída. Inicialmente (en el momento del diagnóstico), la EM-RR representa aproximadamente el 85% de todos los sujetos recién diagnosticados. La definición de recaída requiere que el nuevo síntoma o signo esté presente durante al menos 24 horas, que no esté asociado a fiebre o enfermedad intercurrente (como la "gripe" o una infección del tracto urinario), porque una temperatura corporal elevada puede desenmascarar lesiones asintomáticas o antiguas.
La progresiva primaria (EM-PP) es continua desde el principio, sin recaídas claras. Puede haber mesetas (períodos de estabilización). El 10-15% de todos los sujetos con EM están en este grupo, y tiende a ocurrir en individuos de edad avanzada. La proporción entre mujeres y hombres es igual en este grupo, a diferencia de otras formas donde las mujeres predominan en aproximadamente 2:1. Además, la EM-PP tiende a presentarse con menos cambios en la IRM cerebral y más cambios relacionados con la mielopatía/médula espinal.
Una forma secundaria progresiva (EM-SP) comienza como una EM-RR y luego se produce una progresión constante con o sin recaídas. Aproximadamente el 50% de los sujetos con EM recurrente-remitente avanzan a la forma secundaria progresiva.
Una forma de recaída progresiva (EM-RP), que ocurre en aproximadamente el 5% de los individuos, es progresiva desde el inicio con recaídas superpuestas (con o sin recuperación).
El diagnóstico de la EM generalmente se basa en un historial médico, un examen neurológico y varias pruebas, incluidas las imágenes de resonancia magnética (IRM), los potenciales evocados (PE) y el análisis del líquido cefalorraquídeo. Un diagnóstico definitivo de EM requiere evidencias de daños en al menos dos áreas separadas del sistema nervioso central (SNC), que incluyen el cerebro, la médula espinal y los nervios ópticos, y evidencias de que los daños ocurrieron con una diferencia de al menos un mes, y la exclusión de todos los demás posibles diagnósticos. Además de tratar terapéuticamente a los sujetos que tienen un diagnóstico de EM según criterios reconocidos en la técnica, los métodos actuales también se pueden usar de manera profiláctica para tratar a individuos que tienen al menos un signo o síntoma de EM, lo que los coloca en un mayor riesgo de progresión a EM en comparación con la población general de individuos sanos. Por ejemplo, los métodos pueden usarse para tratar a los individuos que han tenido un ataque (también llamado recaída o exacerbación) de síntomas similares a la EM, conocidos como síndrome clínicamente aislado (SCA), que pueden o no continuar para desarrollar EM. Los individuos con riesgo de desarrollar EM también pueden identificarse por la presencia de un anticuerpo contra la proteína KIR4.1 en su suero, entre otros métodos.
La enfermedad neuroinflamatoria también incluye la enfermedad de Parkinson. Los síntomas de la enfermedad de Parkinson incluyen temblor (p. ej., temblor en las manos, brazos, piernas, mandíbula y cara); rigidez de las extremidades y del tronco; bradicinesia o lentitud de movimientos; inestabilidad postural o alteración del equilibrio y la coordinación; depresión y otros cambios emocionales; dificultad para tragar, masticar y hablar; problemas urinarios o estreñimiento; problemas de la piel; trastornos del sueño. La enfermedad de Parkinson se puede diagnosticar a partir de estos síntomas y/o escáneres cerebrales y/u otras pruebas para descartar otras enfermedades.
Los presentes métodos pueden usarse para inhibir el crecimiento o la metástasis del cáncer. Los cánceres pueden ser tumores malignos hematopoyéticos o tumores sólidos, es decir, masas de células que resultan de un crecimiento o proliferación celular excesivo, ya sea benigno o maligno, lo que incluye las lesiones precancerosas. Los cánceres pueden ser benignos, malignos o metastásicos. El cáncer metastásico se refiere a un cáncer que se diseminó desde el lugar donde comenzó a otro lugar en el cuerpo. Los tumores formados por células cancerosas metastásicas se denominan tumor metastásico o metástasis, un término que también se usa para referirse al proceso mediante el cual las células cancerosas se propagan a otras partes del cuerpo. En general, el cáncer metastásico tiene el mismo nombre y el mismo tipo de células cancerosas que el cáncer original o primario. Los ejemplos de cáncer incluyen tumores sólidos, como melanoma, carcinoma, blastoma y sarcoma. Los cánceres también incluyen tumores malignos hematológicos, como leucemia o tumores malignos linfoides, como el linfoma. Los ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioma, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, cáncer endometrial o carcinoma uterino, cáncer de glándula salival, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, así como cáncer de cabeza y cuello.
Las enfermedades autoinmunes incluyen enfermedades autoinmunes sistémicas, enfermedades autoinmunes específicas de órganos o tejidos, y enfermedades que exhiben expresiones de tipo autoinmune. En estas enfermedades, el cuerpo desarrolla una respuesta inmune celular y/o humoral contra uno de sus propios antígenos, lo que lleva a la destrucción de ese antígeno y puede causar consecuencias graves y/o fatales. La respuesta celular, si está presente, puede ser de células B o de células T, o ambas. Se ha informado que las células TH17, células auxiliares de linaje T caracterizadas por la producción de interleucina (IL)-17 e IL-22, entran en los tejidos para facilitar las respuestas autoinmunes patógenas, incluida la esclerosis múltiple en humanos y la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratones. Véase, por ejemplo, Cua et al., Nature 421: 744-748 (2003); Ivonov et al., Cell 126: 1121-1133 (2006). Las células TH17 pueden iniciar o propagar una respuesta inflamatoria por su reclutamiento específico e infiltración del tejido.
Los ejemplos de enfermedades autoinmunes incluyen la enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, el síndrome poliglandular autoinmune, diabetes mellitus dependiente de insulina (diabetes tipo 1), diabetes mellitus resistente a la insulina (diabetes tipo 2), infertilidad mediada por el sistema inmunitario, enfermedad de Addison autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, dermatitis herpetiforme, alopecia autoinmune, vitíligo, anemia hemolítica autoinmune, púrpura trombocitopénica idiopática, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, anemia perniciosa, miastenia grave, síndrome de Guillain-Barre, síndrome de la persona rígida, fiebre reumática aguda, oftalmia simpática, síndrome de Goodpasture, uveítis autoinmune, arteritis temporal, enfermedad de Behcet, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, cirrosis biliar primaria, hepatitis autoinmune, ooforitis autoinmune, fibromialgia, polimiositis, dermatomiositis, espondilitis anquilosante, arteritis de Takayashu, paniculitis, penfigoide, vasculitis de origen desconocido, vasculitis ANCA-negativa, vasculitis ANCA-positiva, lupus eritematoso sistémico, artritis psoriásica, artritis reumatoide, esclerodermia, vasculitis necrosante sistémica, granulomatosis de Wegener, síndrome CREST, síndrome antifosfolipídico, síndrome de Sjogren, gastroenteritis eosinofílica, dermatitis tópica atípica, cardiomiopatía, síndromes post-infecciosos, endomiocarditis postinfecciosa, enfermedad celíaca, esclerosis múltiple, sarcoidosis y psoriasis.
Los anticuerpos u otros antagonistas se administran en un régimen efectivo que significa una dosis, una vía de administración y una frecuencia de administración que retrasa la aparición, reduce la gravedad, inhibe un mayor deterioro y/o mejora al menos un signo o síntoma de una enfermedad que se está tratando (por ejemplo, cáncer). Si un paciente ya sufre un trastorno, el régimen se puede denominar régimen terapéuticamente eficaz. Si el paciente tiene un riesgo elevado de padecer el trastorno respecto de la población general, pero aún no tiene síntomas, el régimen puede considerarse un régimen profilácticamente eficaz. En algunos casos, la eficacia terapéutica o profiláctica se puede observar en un paciente individual respecto de los controles históricos o la experiencia pasada en el mismo paciente. En otros casos, la eficacia terapéutica o profiláctica puede demostrarse en un ensayo clínico o preclínico en una población de pacientes tratados respecto de una población de control de pacientes sin tratar.
Las dosis ejemplares para un anticuerpo son 0,1-20, o 0,5-5 mg/kg de peso corporal (por ejemplo, 0,5, 1, 2, 3, 4 o 5 mg/kg) o 10-1500 mg como una dosis fija. La dosis depende del estado del paciente y de la respuesta al tratamiento anterior, si lo hay, si el tratamiento es profiláctico o terapéutico y si el trastorno es agudo o crónico, entre otros factores.
La administración puede ser parenteral, intravenosa, oral, subcutánea, intraarterial, intracraneal, intratecal, intraperitoneal, tópica, intranasal o intramuscular. Se prefiere la administración en la circulación sistémica mediante administración intravenosa o subcutánea. La administración intravenosa puede ser, por ejemplo, por infusión durante un período de 30-90 minutos.
La frecuencia de administración depende de la vida media del anticuerpo en la circulación, el estado del paciente y la vía de administración, entre otros factores. La frecuencia puede ser diaria, semanal, mensual, trimestral o a intervalos irregulares en respuesta a los cambios en el estado del paciente o la progresión del trastorno que se está tratando. Una frecuencia ejemplar para la administración intravenosa es entre semanal y trimestral a lo largo de un curso continuo de tratamiento, aunque también es posible una dosificación más o menos frecuente. Para la administración subcutánea, una frecuencia de dosificación ejemplar es de diaria a mensual, aunque también es posible una dosificación más o menos frecuente.
El número de dosis administradas depende de si el trastorno es agudo o crónico, y de la respuesta del trastorno al tratamiento. Para los trastornos agudos o las exacerbaciones agudas de un trastorno crónico, a menudo son suficientes entre 1 y 10 dosis. A veces, una única dosis en inyección rápida, opcionalmente en forma dividida, es suficiente para un trastorno agudo o la exacerbación aguda de un trastorno crónico. El tratamiento puede repetirse para la recurrencia de un trastorno agudo o la exacerbación aguda. Para los trastornos crónicos, puede administrarse un anticuerpo a intervalos regulares, por ejemplo, semanalmente, quincenalmente, mensualmente, trimestralmente, cada seis meses durante al menos 1,5 o 10 años, o la vida del paciente.
Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral son preferiblemente estériles y sustancialmente isotónicas, y se fabrican en condiciones GMP. Las composiciones farmacéuticas se pueden proporcionar en forma de dosis unitaria (es decir, la dosis para una administración única). Las composiciones farmacéuticas pueden formularse utilizando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o auxiliares fisiológicamente y farmacéuticamente aceptables. La formulación depende de la vía de administración elegida. Para la inyección, los anticuerpos pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles, como la solución de Hank, la solución de Ringer o solución salina fisiológica o tampón acetato (para reducir las molestias en el lugar de la inyección). La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Alternativamente, los anticuerpos pueden estar en forma liofilizada para su reconstitución con un vehículo adecuado, p. ej., agua estéril apirógena, antes del uso.
El tratamiento con los anticuerpos de la invención se puede combinar con otros tratamientos efectivos contra el trastorno que se está tratando. Los tratamientos de combinación se pueden formular para administrarse por separado. Los agentes terapéuticos adicionales para el tratamiento de la esclerosis múltiple incluyen uno o más de los siguientes: teriflunomida, interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, fingolimod y mitoxantrona, o un corticosteroide, como prednisona, metilprednisolona o dexametasona.
Los agentes terapéuticos adicionales para el cáncer incluyen agentes alquilantes tales como carmustina, clorambucilo, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, procarbazina y ciclofosfamida; antimetabolitos tales como fluorouracilo, floxuridina, fludarabina, gemcitabina, metotrexato e hidroxiurea; productos naturales que incluyen alcaloides de plantas y antibióticos como bleomicina, doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina, etopósido, mitomicina, mitoxantrona, vinblastina, vincristina y Taxol (paclitaxel) o compuestos relacionados tales como Taxotere®; el inhibidor de la topoisomerasa 1 irinotecán; temozolomida y Gliadel®, carmustina; e inhibidores de las tirosina quinasas, tales como Gleevec®, Sutent®. (sunitinib malato), Nexavar® (sorafenib) y Tarceva® (erlotinib) o Iressa® (gefitinib); inhibidores de la angiogénesis; y anticuerpos monoclonales, incluido Herceptin® contra el antígeno HER2; Avastin® contra VEGF; o anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) como Erbitux® (cetuximab) y Vectibix® (panitumumab).
Los agentes adicionales para tratar la enfermedad de Parkinson incluyen levodopa, benzaserida, carbidopa, agonistas de dopamina, agonistas de dopamina distintos de ergot, inhibidores de catecol-O-metilo ("COMT") como, por ejemplo, entacona o tolcopona, inhibidores de monoamina oxidasa ("MAO"), como, por ejemplo, rasagalina, amantadina o agentes anticolinérgicos.
V. KITS
La descripción proporciona además kits (por ejemplo, recipientes) que comprenden los anticuerpos MCAM u otros antagonistas de la invención y materiales relacionados, tales como instrucciones de uso (por ejemplo, un prospecto). Las instrucciones de uso pueden contener, por ejemplo, instrucciones para la administración de los antagonistas de MCAM y opcionalmente uno o más agentes adicionales. Los recipientes de antagonista(s) de MCAM pueden ser dosis unitarias, paquetes a granel (por ejemplo, paquetes de dosis múltiples) o dosis en subunidades.
El prospecto se refiere a las instrucciones habitualmente incluidas en los paquetes comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, el uso, la dosificación, la administración, las contraindicaciones y/o las advertencias sobre el uso de dichos productos terapéuticos.
Los kits también pueden incluir un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, como agua para inyección bacteriostática (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. También puede incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluidos otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
Si se asocian diferentes versiones de una secuencia con un número de acceso en diferentes momentos, se entiende la versión asociada con el número de acceso en la fecha de presentación efectiva de esta solicitud. La fecha de presentación efectiva se refiere a la fecha de presentación anterior de la fecha de presentación concreta o la fecha de presentación de una solicitud de prioridad que se refiere al número de acceso, si es aplicable. Del mismo modo, si se publican diferentes versiones de una publicación, sitio web o similares en diferentes momentos, se entiende la versión más recientemente publicada en la fecha de presentación efectiva de la solicitud, a menos que se indique lo contrario. Cualquier característica, etapa, elemento, realización o aspecto de la invención se puede usar en combinación con cualquier otro a menos que se indique específicamente lo contrario. Aunque la presente invención se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y de ejemplo con fines de claridad y comprensión, será evidente que pueden ponerse en práctica ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Materiales y métodos
Generación/caracterización de anticuerpos
Para la generación de anticuerpos capaces de unirse a MCAM murina, se generó MCAM-Fc fusionando el dominio extracelular de MCAM murina a IgG humana, y se produjo en células CHO utilizando técnicas convencionales. Se inmunizaron ratas Lou/M con 100 gg de proteína MCAM-Fc en CFA (volumen 1: 1). Las ratas se reforzaron dos veces a intervalos de dos semanas con proteína MCAM-Fc en adyuvante incompleto de Freund (IFA) (volumen 1: 1). Se generaron hibridomas a partir de las ratas inmunizadas utilizando protocolos convencionales, y los clones se seleccionaron mediante Clonepix. Las células CHO se transfectaron con el gen MCAM murino de longitud completa y se seleccionaron para la expresión estable utilizando neomicina y técnicas convencionales. Las células CHO originales (negativas para MCAM) se marcaron de manera fluorescente con succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE) usando técnicas convencionales y se mezclaron en una proporción 1:1 con células CHO transfectadas con MCAM sin marcar. Los sobrenadantes de hibridoma se incubaron con esta mezcla de células durante 30 minutos y se detectó la unión de posibles anticuerpos específicos hacia MCAM con un anticuerpo secundario anti-rata marcado de forma fluorescente (Jackson Immuno) mediante citometría de flujo.
Los sobrenadantes de hibridomas que fueron positivos para los anticuerpos específicos hacia MCAM se incubaron previamente con proteína MCAM-Fc de ratón marcada con fluorescencia (5 gg/mL) durante 30 minutos antes de la adición a la línea celular WM2664 que expresaba laminina a4, y se determinó la neutralización de la unión de la proteína MCAM-Fc a la línea celular mediante citometría de flujo.
Para la generación de anticuerpos de rata capaces de unirse a MCAM humana, se generó hMCAM-Fc fusionando el dominio extracelular de MCAM humana a IgG humana, y se produjo en células CHO usando técnicas convencionales. Se inmunizaron ratas Lou/M con 250 gg de proteína hMCAM-Fc en CFA (volumen 1:1). Las ratas se reforzaron dos veces a intervalos de dos semanas con la proteína hMCAM-Fc en adyuvante incompleto de Freund (IFA) (volumen 1:1). Se generaron hibridomas a partir de las ratas inmunizadas utilizando protocolos convencionales, y los clones se seleccionaron mediante Clonepix. Las células CHO se transfectaron con el gen MCAM humano de longitud completa y se seleccionaron para la expresión estable utilizando neomicina y técnicas convencionales. Las células CHO originales (negativas para MCAM) se marcaron de forma fluorescente con succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE) usando técnicas convencionales, y se mezclaron en una proporción 1:1 con células CHO transfectadas con MCAM humana sin marcar. Los sobrenadantes de hibridoma se incubaron con esta mezcla de células durante 30 minutos y se detectó la unión de los anticuerpos específicos potenciales hacia MCAM humana con un anticuerpo secundario anti-rata marcado con fluorescencia (Jackson Immuno) mediante citometría de flujo.
Para la generación de anticuerpos de ratón capaces de unirse a MCAM humana, se generó hMCAM-Fc fusionando el dominio extracelular de MCAM humana con IgG humana, y se produjo en células CHO usando técnicas convencionales. Se inmunizaron ratones Balb/c con 50 pg de proteína hMCAM-Fc en CFA (volumen 1:1). Los ratones se reforzaron dos veces a intervalos de dos semanas con la proteína hMCAM-Fc en adyuvante incompleto de Freund (IFA) (volumen 1:1). Se generaron hibridomas a partir de ratones inmunizados utilizando protocolos convencionales, y los clones se seleccionaron mediante Clonepix. Las células CHO se transfectaron con el gen MCAM humano de longitud completa y se seleccionaron para la expresión estable utilizando neomicina y técnicas convencionales. Las células CHO originales (negativas para MCAM) se marcaron de forma fluorescente con succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE) usando técnicas convencionales, y se mezclaron en una proporción 1:1 con células CHO transfectadas con MCAM humana sin marcar. Los sobrenadantes de hibridoma se incubaron con esta mezcla de células durante 30 minutos y se detectó la unión de anticuerpos específicos potenciales hacia MCAM humana con un anticuerpo secundario anti-ratón marcado con fluorescencia (Jackson Immuno) mediante citometría de flujo.
Los sobrenadantes de hibridomas que dieron positivo para anticuerpos humanos específicos hacia MCAM se incubaron previamente con proteína hMCAM-Fc marcada con fluorescencia (5 pg/mL) durante 30 minutos antes de la adición a la línea celular WM2664 que expresaba laminina a4, y se determinó la neutralización de la unión de la proteína hMCAM-Fc a la línea celular mediante citometría de flujo.
Manipulación de ácidos nucleicos y proteínas
Para la determinación de las CDRs, se aisló el ARN total de las células de hibridoma usando el kit RNAquous-4PCR (Ambion), y se usó para la síntesis de ADNc. La primera y segunda cadenas de ADNc se sintetizaron utilizando métodos modificados de la amplificación de ADNc de Marathon (Clontech) con el adaptador de ADNc ligado al extremo 5' del ADNdsc obtenido. El cebador específico inverso se diseñó en función de la secuencia de la región constante del isotipo del anticuerpo específico para cadenas tanto pesadas como ligeras, y se usó junto con el cebador adaptador en la amplificación mediante PCR de los fragmentos VL y VH utilizando la a Dn polimerasa Pfu Ultra (Stratagene). El producto de PCR amplificado se clonó en pCR-Blunt-TOPO (Invitrogen) y se determinó la secuencia de nucleótidos. Las secuencias de los clones identificados se compararon para determinar el porcentaje de identidad en las secuencias VL y VH.
Para la determinación de las concentraciones de IL-17 en el sobrenadante, se realizó un ELISA utilizando un kit comercial (R&D Systems).
Ejemplo 1. Generación de anticuerpos monoclonales anti-MCAM
Los anticuerpos monoclonales de ratón y rata dirigidos contra la proteína MCAM humana se generaron como se describe en los Materiales y Métodos anteriormente. La unión específica entre el anticuerpo monoclonal y la MCAM humana se confirmó evaluando la capacidad del anticuerpo monoclonal de unirse a las células transfectadas con la MCAM humana. Para esto, las células sin transfectar se marcaron con succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE) y se mezclaron con células transfectadas con MCAM humana sin marcar. Por lo tanto, se pudieron distinguir las células sin transfectar.
Usando estas técnicas, se aislaron 823 clones de fusiones de ratón independientes, y se mostró que expresaban un anticuerpo capaz de unirse a la MCAM humana. Además, se aislaron 152 clones de fusiones de rata independientes, y se demostró que expresaban un anticuerpo capaz de unirse a la MCAM humana.
A continuación, se usaron los anticuerpos monoclonales anti-MCAM humana para ensayar su capacidad de bloquear la unión de MCAM humana a su ligando. La proteína MCAM-Fc humana (5 pg/ml) se incubó previamente con un anticuerpo de control de isotipo, o 10 pg/ml del anticuerpo monoclonal de ensayo durante 30 minutos en PBS. La mezcla se añadió a cortes de tejido de médula espinal sana y posteriormente se caracterizó mediante microscopía de fluorescencia como se describió en Materiales y métodos anteriormente. Además, las células CHO parentales (CHOK1) o las células CHO transfectadas con un gen MCAM humano se preincubaron con medios de cultivo de CHO (DMEM), laminina 411 recombinante (10 pg/ml) o laminina 511 recombinante (es decir, laminina 10 (a5p1Y1)) (10 pg/ml) a 37 °C durante 45 minutos. Se lavaron las células y se detectó la unión específica de la laminina 411, pero no de la laminina 511, a MCAM con un anticuerpo hacia pan-laminina mediante citometría de flujo. La preincubación de las células CHO transfectadas con MCAM humana con el anticuerpo anti-MCAM (a 20 pg/ml), antes de la incubación con laminina, suprimió la unión de MCAM humana a laminina 411.
Utilizando esta técnica, se demostró que 87 de los 823 clones de fusión de ratón independientes y 26 de los 152 clones de fusión de rata independientes descritos anteriormente expresaban un anticuerpo que era capaz de bloquear la interacción entre la proteína MCAM humana y su ligando, la cadena a-4 de laminina.
Ejemplo 2. Caracterización adicional de anticuerpos monoclonales anti-MCAM
Los 87 clones de fusión de ratón independientes y los 26 clones de fusión de rata independientes descritos en el Ejemplo 1 anterior, capaces de (i) unirse a MCAM humana, y (ii) bloquear la interacción entre MCAM humana y la cadena a-4 de laminina, se caracterizaron adicionalmente como sigue. En primer lugar, se determinó la cuantificación de CI50 por la capacidad del anticuerpo monoclonal de bloquear la unión de MCAM humana a la cadena a-4 de la laminina de la siguiente manera. Las células CHO que expresan MCAM humana se incubaron con un anticuerpo anti-MCAM humana (a diversas concentraciones) durante 30 minutos a 4 grados centígrados. Se lavó el anticuerpo sin unir y las células se incubaron con laminina 411 humana recombinante a 20 pg/ml durante 45 minutos a 37 grados centígrados. La laminina sin unir se eliminó mediante lavado, y la laminina unida a la superficie de las células se detectó con anticuerpos anti-laminina marcados con fluorescencia. Después del lavado, la cantidad de laminina unida a la superficie se detectó mediante citometría de flujo, y las CI50s se calcularon en función de la intensidad fluorescente media.
Utilizando el ensayo descrito anteriormente, se identificaron seis clones de anticuerpos monoclonales anti-MCAM humana con unión a MCAM humana y que tenían la mayor capacidad de bloquear la interacción entre la MCAM humana expresada en la superficie de las células y su ligando de unión, laminina humana 411. Estos seis clones de anticuerpos monoclonales anti-MCAM se mencionan aquí como (i) los clones monoclonales anti-MCAM humana de ratón 1174.1.3, 1414.1.2, 1415.1.1, y 1749.1.3, y (ii) los clones de anticuerpos monoclonales anti-MCAM humana de rata 2120.4.19 y 2107.4.10. Las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de las cadenas pesada y ligera de estos anticuerpos, y sus regiones hipervariables, se proporcionan en las SEQ ID N°: 29-92. Más específicamente, en el ensayo anterior, se determinó que las CI50s para los clones de anticuerpos monoclonales 1174.1.3, 1414.1.2, 1415.1.1, 1749.1.3, 2120.4.19 y 2107.4.10 son 0,469 pg/ml, 0,431 pg/ml, 0,307 pg/ml, 0,545 pg/ml, 0,888 pg/ml y 0. 290.pg/ml, respectivamente. Además, los experimentos realizados para determinar la afinidad de unión específica de cada anticuerpo monoclonal demostraron que cada uno fue capaz de unirse a la proteína MCAM humana con alta afinidad (datos no mostrados). Como tales, cada uno de estos anticuerpos monoclonales específicos fue muy capaz de unirse a la MCAM humana e inhibir la interacción de la MCAM humana expresada en células con su ligando de unión a laminina a-4. En contraste, dos anticuerpos de control, un anticuerpo IgG1 humano inespecífico y un anticuerpo anti-MCAM completamente humano descrito anteriormente denominado ABX-MA1 (por ejemplo, véase Mills et al., Cancer Res. 62: 5106 (2002), y las patentes de EE. UU. N°s 6.924.360, 7.067.131 y 7.090.844) fueron incapaces de bloquear la interacción de la unión entre la MCAM humana y su molécula de unión, laminina 411.
Como tales, los seis anticuerpos monoclonales específicos identificados anteriormente poseen la nueva capacidad de (i) unirse con alta afinidad a MCAM humana en la superficie de las células vivas, y (ii) bloquear la interacción de MCAM humana expresada en las células con una proteína de laminina que comprende una cadena polipeptídica de laminina a-4.
Ejemplo 3. Análisis de la unión de dominios para los anticuerpos monoclonales anti-MCAM
Se empleó el análisis de ForteBio para determinar la ubicación del epítopo del antígeno en la proteína MCAM humana que reconocen y a la que se unen los clones de anticuerpos monoclonales 1174.1.3, 1414.1.2, 1415.1.1, 1749.1.3, 2120.4.19 y 2107.4.10. Se usó el siguiente protocolo: se utilizaron biosensores de ForteBio de Fc anti-IgG humana para inmovilizar varios dominios de MCAMhFc, incluida la proteína MCAMhFc de longitud completa en la superficie del biosensor. Estos sensores se sumergieron en los anticuerpos específicos de MCAM 1174.1.3, 1414.1.2, 1415.1.1, 1749.1.3, 2120.4.19 o 2107.4.10 para la detección de la unión a estos dominios o a la proteína de longitud completa. Después de cargar estas muestras en una placa negra de 96 pocillos, el Octet Red se programó de la siguiente manera: 60 segundos para el valor inicial n° 1; 180 segundos para cargar varios dominios; 60 segundos para el valor inicial n° 2; 180 segundos para la asociación del anticuerpo al dominio; y 240 segundos para la disociación del anticuerpo del dominio.
Reactivos y suministros utilizados:
1. Concentración final de MCAMhFc a 5 pg/ml
2. clones de anticuerpos 1174.1.3, 1414.1.2, 1415.1.1, 1749.1.3, 2120.4.19 y 2107.4.10 a 5 pg/ml
3. Biosensores de captura de Fc anti-IgG humana (AHC) de ForteBio para experimentos de cinética, n° de cat.
18-5060
4. Bloque de placas de 96 pocillos de Greiner Bio-one, n° de cat. 655209
5. Aparato ForteBio Octet Red
6. Se usó un medio de cultivo de tejidos fresco, DMEM con 20% de FCS, como tampón para la dilución
Los resultados de estos análisis son los siguientes.
Se demostró que todos los clones de anticuerpos monoclonales 1174.1.3, 1414.1.2, 1415.1.1 y 1749.1.3 se unen a un epítopo antigénico hallado en el dominio 3 de la proteína MCAM humana, definido específicamente por los aminoácidos 244-321 (SEQ ID N°: 24) de la proteína MCAM humana. Estos anticuerpos monoclonales no fueron capaces de unirse al dominio 1 de MCAM humana (concretamente, los aminoácidos 19-129, SEQ ID N°: 22), el dominio 2 (concretamente, los aminoácidos 139-242, SEQ ID N°: 23), o la combinación de dominios 1 y 2 (concretamente, los aminoácidos 19-242). Por lo tanto, los clones de anticuerpos monoclonales 1174.1.3, 1414.1.2, 1415.1.1 y 1749.1.3 definen un nuevo epítopo antigénico localizado dentro del dominio 3 de la proteína MCAM humana.
Se demostró que los clones de anticuerpos monoclonales 2120.4.19 y 2107.4.10 se unen a un epítopo antigénico definido por la combinación de los dominios 1 de MCAM humana (concretamente, los aminoácidos 19-129, SEQ ID N°: 22), y el dominio 2 (concretamente, los aminoácidos 139-242, SEQ ID N°: 23). Ninguno de estos dos anticuerpos monoclonales se unió al dominio 1 de MCAM humana por sí mismo. Por lo tanto, los clones de anticuerpos monoclonales 2120.4.19 y 2107.4.10 definen un nuevo epítopo antigénico determinado por la presencia de ambos dominios 1 y 2 de la proteína MCAM humana.
En contraste con lo anterior, el anticuerpo ABX-MA1 anti-MCAM completamente humano descrito previamente se une a un epítopo antigénico diferente de los descritos anteriormente, concretamente, un epítopo antigénico que está completamente definido y abarcado solamente dentro del dominio 1 de MCAM humana.
Dados estos resultados, debido a que cada uno de los clones de anticuerpos monoclonales 1174.1.3, 1414.1.2, 1415.1.1, 1749.1.3, 2120.4.19 y 2107.4.10 son capaces de (i) unirse a la MCAM humana, y (ii) bloquear la interacción entre la MCAM humana y una proteína que contiene laminina a-4, mientras que el anticuerpo ABX-MA1 es capaz de unirse solo a la MCAM humana, pero no bloquear la interacción entre la MCAM humana y una proteína que contiene laminina a-4, estos resultados demuestran que el dominio 2 de MCAM humana, el dominio 3 de MCAM humana y su combinación desempeñan un papel en la interacción de unión con la cadena de laminina a-4. Teniendo en cuenta esto, está claro que los anticuerpos que se unen al dominio 2 de MCAM humana, el dominio 3 de MCAM humana y/o la combinación de los mismos tendrán utilidad como agentes capaces de bloquear la interacción entre la MCAM humana y la laminina a-4 y, por lo tanto, tendrán utilidad para inhibir las diversas consecuencias descritas en la presente memoria que resultan de esa interacción. En contraste, los anticuerpos que se unen a un epítopo antigénico definido únicamente por el dominio 1 de MCAM humana (como el anticuerpo ABX-MA1 descrito en la presente memoria) no son útiles para bloquear la interacción MCAM/laminina a-4 y sus diversas consecuencias biológicas posteriores.
Ejemplo 4. Cartografía de epítopos mediante mutagénesis aleatoria
Se identificaron varios residuos de aminoácidos de interés para la unión del anticuerpo anti-MCAM utilizando mutagénesis aleatoria y tecnología de expresión celular de alto rendimiento que permite la expresión y el análisis de grandes bibliotecas de proteínas objetivo mutadas dentro de células eucarióticas. Cada residuo de la proteína MCAM humana se mutó individualmente a una alanina, u otro residuo específico, para analizar los cambios en la función. Las proteínas se expresaron en líneas celulares de mamífero habituales.
La Tabla 1 muestra un resumen de los reactivos y métodos utilizados para generar la biblioteca de mutagénesis aleatoria.
Tabla 1
Figure imgf000026_0001
La MCAM humana de longitud completa se sometió a optimización de codones, se sintetizó y se subclonó con éxito en un vector de alta expresión en mamíferos. En esta construcción original se verificó después la secuencia y se validó para la expresión en células mamíferas mediante métodos de inmunodetección.
La detección del anticuerpo 1749.1.3 y los sueros de ratón que se unieron a MCAM mediante inmunofluorescencia se optimizó con éxito para el formato de alto rendimiento de mutagénesis aleatoria. Las diluciones en serie de cada anticuerpo primario se ensayaron con una sola dilución de anticuerpo secundario en un formato de 384 pocillos. Los anticuerpos se ensayaron con respecto a la detección de células 293T y BHK que expresaban MCAM humana. Se seleccionaron las condiciones de ensayo óptimas para cribar la biblioteca de mutación completa.
Se creó la biblioteca de mutaciones de MCAM y se verificó la secuencia, que consistió en 545 clones (528/536 mutantes de alanina y 17/17 mutantes mediante mutagénesis dirigida), cada uno de los cuales tenía una única sustitución de residuo por alanina (los residuos de alanina se sustituyen por serina) o un residuo especificado. Los residuos 35, 66, 161, 261, 342, 380, 414 y 435 no están representados en la biblioteca. La biblioteca de mutaciones se cribó por triplicado mediante inmunodetección en función de la unión a sueros de ratón. Esto valida la expresión en la superficie celular para cada clon mutante.
Se realizaron múltiples rondas de optimización para determinar las condiciones que son adecuadas para la cartografía. Se evaluaron las siguientes variables: múltiples concentraciones de laminina y concentraciones de anticuerpos secundarios anti-laminina, varios tampones de bloqueo para reducir la unión inespecífica, múltiples tipos de células y múltiples etapas de lavado.
La biblioteca de mutaciones se cribó por triplicado mediante inmunodetección en función de la unión al anticuerpo 1749.1.3. Se cuantificó la reactividad para cada mutante para identificar los mutantes puntuales que exhiben una pérdida de unión.
El anticuerpo monoclonal y la reactividad de los sueros se cuantificaron para cada clon mutante para identificar los mutantes puntuales que exhiben una pérdida de unión sin afectar a la expresión en la superficie. Se identificaron los residuos críticos para cada anticuerpo mediante la comparación del perfil de unión del anticuerpo monoclonal con el perfil de unión de los sueros de cada clon mutante.
Las células BHK se transfectaron con MCAM de tipo natural (TN) o vector solo en un formato de 384 pocillos, seguido de inmunodetección. Se analizaron diluciones en serie de cada anticuerpo (comenzando con 4 pg/ml) para determinar la inmunorreactividad contra TN o vector solo (Tabla 2). Cada punto representa el promedio de cuatro repeticiones.
Tabla 2
Figure imgf000027_0001
Se determinaron las condiciones de cribado óptimas para la inmunodetección y la cartografía de epítopos de 1749.1.3 y sueros de EM. Usando estas condiciones, cada anticuerpo demostró una señal robusta, valores altos de señal respecto del fondo, y una baja variabilidad entre duplicados. Estos datos indican que estas condiciones son adecuadas para la cartografía de epítopos de alto rendimiento eficaz. Se usaron concentraciones finales de cribado de 0,5 pg/mL para 1749.1.3 y una dilución 1:800 de los sueros de EM. Se utilizaron anticuerpos secundarios de Jackson ImmunoResearch a 1:400 para la detección de MAb y sueros. La Tabla 3 muestra los parámetros experimentales optimizados para la inmunodetección de alto rendimiento.
Tabla 3
Figure imgf000028_0001
La biblioteca de mutaciones se analizó para determinar la expresión en la superficie (unión de los sueros de ratón) y la unión del anticuerpo monoclonal, por triplicado. A cada punto de datos en bruto se le restó el fondo y se normalizó respecto de los valores de reactividad de MCAM de tipo natural. Los resultados se muestran en la Fig. 1. El valor medio de unión del anticuerpo monoclonal para cada clon se representa en función de su valor medio de expresión en la superficie (Fig. 1, rombos grises). Se aplicaron umbrales de <30% de reactividad de anticuerpos monoclonales y >50% de unión de sueros de ratón para identificar los clones (Fig. 1, rombos negros) que fueron negativos para la unión de anticuerpos monoclonales, pero positivos para la expresión en la superficie.
Los residuos críticos para 1749.1.3 se identificaron mediante la evaluación de la reactividad media de los anticuerpos monoclonales de cada clon en comparación con su expresión total en la superficie (reactividad media del suero). Los residuos involucrados en la unión del anticuerpo se identificaron como aquellos que fueron negativos para la unión del anticuerpo monoclonal (<30% TN), pero positivos para la expresión en la superficie (> 50% TN) (Tabla 4). Se determinó la reactividad media (y la desviación estándar) para cada residuo crítico.
Tabla 4.
Figure imgf000028_0002
Los aminoácidos críticos identificados mediante la cartografía de mutagénesis aleatoria sugieren los sitios de unión para el anticuerpo 1749.1.3. Los datos indican que 1749.1.3 se une a un epítopo conformacionalmente complejo en el tercer dominio de Ig de MCAM.
Los residuos críticos parecen depender en gran medida de la estabilización estructural aportada por los enlaces disulfuro del segundo y/o tercer dominios de Ig. La mutación en la cisteína 272 o 320 anula la unión del anticuerpo, lo que sugiere que el enlace disulfuro compartido del tercer dominio de Ig juega un papel importante en la estabilización del epítopo.
Ejemplo 5 Cartografía confirmatoria de epítopos de MCAM para la unión a anticuerpos y laminina
Para identificar los sitios de unión de 1749.1.3 en MCAM humana, se construyó un modelo de homología de Ig3 de MCAM humana en pdb 3KVQ A, 3V2A_R, 2IEP_A y 2YD1_A usando el programa Schrodinger Maestro (Fig. 2). Se diseñaron y generaron veinte mutantes puntuales basados en la información de la estructura y la información de la mutagénesis aleatoria. Estos mutantes se expresaron en células mamíferas, y se usó FACS para ensayar la unión de 1749.1.3 y laminina a-4 a los mutantes de MCAM. Tres mutantes únicos de MCAM, I141A, D216A e Y318A, demostraron una pérdida completa de la unión a laminina a-4. El mutante Y318A demostró una pérdida completa de la unión a 1749.1.3.
Para confirmar aún más los datos, se generaron líneas celulares estables que expresaban I141A, P145V, D216A e Y318A, respectivamente. Los ensayos de ForteBio se realizaron con las proteínas purificadas como se describió anteriormente. El anticuerpo ABX-MA1 de control se unió a MCAM de tipo natural y a los mutantes de MCAM. El anticuerpo 1749.1.3 no mostró una unión significativa al mutante Y318A de MCAM.
Ejemplo 6. Humanización de anticuerpos 1749.1.3.
El punto de partida o anticuerpo donante para la humanización es el anticuerpo de ratón 1749 producido mediante un hibridoma descrito en los documentos w O/2012/170071 y PCT/US2013/058773. Las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de la región variable madura de la cadena pesada de m1749 se proporcionan como SEQ ID N°s: 93 y 64, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de la región variable madura de la cadena ligera de m1749 maduro se proporcionan como SEQ ID N°s: 97 y 59, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y c DR3 de la cadena pesada se proporcionan como SEQ ID N°s: 66, 67 y 68, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera se proporcionan como SEQ ID N°s: 61, 62 y 63, respectivamente. En este Ejemplo se utiliza la numeración de Kabat.
La región variable kappa (Vk) de m1749 pertenece al subgrupo 1 de Kabat de ratón, que corresponde al subgrupo 4 de Kabat humano. La región variable pesada (Vh) de m1749 pertenece al subgrupo 3d de Kabat de ratón, que corresponde al subgrupo 3 de Kabat humano (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición). Publicación del NIH N° 91 -3242, 1991). La CDR-L1 de 17 residuos pertenece a la clase canónica 3, la CDR-L2 de 7 residuos pertenece a la clase canónica 1, la CDR-L3 de 8 residuos pertenece a la clase canónica 3 de Vk (Martin y Thornton, J Mol Biol. 263: 800- 15, 1996). La CDR-H1 de 5 residuos pertenece a la clase canónica 1, la CDR-H2 de 17 residuos pertenece a la clase canónica 1 o 3 (Martin y Thornton, J Mol Biol. 263: 800-15, 1996). La CDR-H3 no tiene clases canónicas, pero el bucle de 11 residuos probablemente tiene una base retorcida de acuerdo con las reglas de Shirai et al., FEbS Lett. 455: 188-97 (1999).
Los residuos en la interfase entre los dominios Vk y Vh son los que se encuentran comúnmente. Se realizó una búsqueda a lo largo de las secuencias de proteínas en la base de datos de PDB (Deshpande et al., Nucleic Acids Res.
33: D233-7, 2005) para encontrar estructuras que proporcionasen un modelo estructural aproximado de 1749. El anticuerpo contra la proteína de membrana integral DsbB en E. coli, debido a que posee una buena similitud de secuencia global con Vk de m1749, conserva las mismas estructuras canónicas para los bucles. La estructura cristalina de rayos X del anticuerpo anti-DsbB (código pdb 2LTQ; Tang et al., J. Mol. Biol. 425: 1670-82, 2013; SEQ ID N°: 161) se usó para la estructura Vk en la modelización. El anticuerpo dirigido contra un inmunógeno peptídico de la hemaglutinina del virus de la gripe tiene una buena similitud de secuencia global con la estructura de Vh de 1749. También tiene una CDR-H3 de una longitud similar con una base retorcida. La estructura del anticuerpo dirigido contra un inmunógeno peptídico de la hemaglutinina del virus de la gripe (1HIL; Rini et al., Science 255: 959-65, 1992; SEQ ID N°: 157) tiene una resolución razonable (2.0 A), y se usó para la estructura de Vh en la modelización. Además, las CDRs-Hl y H2 de 1H1L tienen las mismas estructuras canónicas para CDR-H1 y CDR-H2 que las de Vh de 1749. Se utilizó BioLuminate® para modelizar una estructura aproximada de 1749Fv.
Una búsqueda en la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes del NCBI permitió la selección de estructuras humanas adecuadas en las que injertar las CDRs murinas. Para Vk, se eligieron dos cadenas ligeras kappa humanas, la primera con el código de acceso NCBI ABA71407.1 (GI: 77379502; SEQ ID N°: 162) (Manske et al., Clin. J. Immunol. 120: 106-20, 2006) y la segunda con el código de acceso NCBI CAI99800.1 (GI: 98956324; SEQ ID N°: 163) (Su et al., J. Immunol. 181: 1264-71,2008). Esto tiene las mismas clases canónicas para CDR-L1, L2 y L3. ABA71407.1 tiene una identidad de secuencia del 85% en la región estructural de la región variable de la cadena ligera respecto de la cadena ligera de 1749 murino. CAI99800.1 tiene una identidad de secuencia del 83% en la región estructural de la región variable de la cadena ligera respecto de la cadena ligera de 1749 murino.
Para Vh, se eligieron dos cadenas pesadas de Ig humana, la primera con el código de acceso NCBI AAX82494.1 (GI: 62421461; SEQ ID N°: 158) (Lundquist, Infect. Immun. 74: 3222-31, 2006) y la segunda con el código de acceso de NCBI ADX65676.1 (GI: 323432073; SEQ ID N°: 159) (sin publicar). Comparte la forma canónica de CDR-H1 y H2 de 1749, y H3 tiene una longitud de 11 residuos con una base retorcida predicha. AAX82494.1 tiene una identidad de secuencia del 91% en la región estructural de la región variable respecto de la cadena pesada de 1749 murino. ADX65676.1 tiene una identidad de secuencia del 83% en la región estructural de la región variable respecto de la cadena pesada de 1749 murino.
Se construyó una variante de la región variable de la cadena ligera humanizada y una variante de la región variable de la cadena pesada humanizada que contenían las sustituciones anteriores (Hu1749VHv3; SEQ ID N°: 156 y Hu1749VLv3; SeQ ID N°: 160) (Figs. 3A y B). Los aminoácidos en H3, H42, H93, L9, L19, L43 de Hu1749VHv3 y Hu1749VLv3 se enumeran en la Tabla 5.
Tabla 5
Numeración de Kabat de algunos residuos estructurales para la retromutación en anticuerpos 1749 humanizados
Figure imgf000030_0001
Las razones para la selección de las posiciones anteriores como candidatos para la sustitución son las siguientes. Q3K (aquí como en cualquier otra parte de la presente memoria para las retromutaciones de la región estructural, el primer residuo mencionado es el residuo humano y el segundo el residuo de ratón): K entra en contacto con Y102 en CDRH3. Por lo tanto, debería mantenerse en la región estructural.
G42E: E tiene una cadena lateral similar a D en el aceptor humano AAX82494.1. E es más frecuente que D en humanos. Esta retromutación contribuye a la estabilidad de la proteína.
A93T: Esta posición es un residuo de la interfase Vk/Vh.
D9S: este residuo no entra en contacto ni afecta a las CDRs y/o la interfase. La frecuencia de S es mayor que D en las regiones estructurales humanas.
A19V: La frecuencia de V y A son similares en las regiones estructurales humanas.
P43S: S entra en contacto con dos residuos de la interfase en VH: Y91 y W103. Por lo tanto, es crucial, y debería mantenerse en la región estructural.
> Hu1749VHv3
EVKLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMSWVROTPEKRLEWVATISSGGSSTY YPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCTRDDDYDVKVFAYWGOGTLV TVSS
> Hu1749VLv3
DIVMTOSPSSLAVSLGERVTINCKSSRSLLNSRIRKNYLAWYOOKPGOSPKLLIYWAST RESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCKQSYNLLTFGOGTKVEIKR
Ejemplo 7. Caracterización de la variante del anticuerpo 1749H3L3 humanizado
Se ha caracterizado la cinética de unión del anticuerpo 1749 humanizado que comprende la cadena pesada Hu1749VHv3 y la cadena ligera Hu1749VLv3.
La cinética de unión de los anticuerpos 1749 humanizados se midió mediante interferometría de biocapa (BLI) utilizando un instrumento ForteBio Octet QK (ForteBio, Menlo Park, CA). Se determinaron los parámetros cinéticos de unión detallados (velocidad de asociación, ka aparente, velocidad de disociación, kd aparente y constante de afinidad, KD aparente) para los anticuerpos 1749 quimérico y 1749 humanizado (Tabla 6). La ka aparente, kd aparente y Kd aparente son parámetros cinéticos de unión obtenidos utilizando los formatos de ensayo de ForteBio.
Se descubrió que la variante hu1749H3L3 da la constante de disociación más baja (la constante de asociación más alta), lo mismo que 1749.1.3 dentro del EEM.
Tabla 6
Figure imgf000031_0001
Además, el análisis con dispersión dinámica de luz (DLS) muestra un nivel de polidispersidad (% PD) del anticuerpo h1749H3L3 similar al del anticuerpo m1749 original (Tabla 7). Las medidas de dispersión dinámica de luz se tomaron en un instrumento de dispersión dinámica de luz Wyatt DynaPro Nanostar, en volúmenes de 10 microlitros en una cubeta de cuarzo. Todas las mediciones se obtuvieron a 37 °C, y cada medición tuvo 10 adquisiciones con un tiempo de adquisición de 5 segundos. La regularización se realizó mediante el programa informático Wyatt Technology Dynamics 7.0 utilizando un modelo de esferas de Rayleigh.
Tabla 7
Figure imgf000031_0002
Sequence listing
<110> LIU, Yue
<120> ANTICUERPOS ANTI-MCAM Y MÉTODOS DE USO ASOCIADOS
<130> 057450/459014
<150> US 61/952,123
<151 > 12-03-2014
<150> US 62/023,698
<151 > 11-07-2014
<150> US 62/068,438
<151 > 24-10-2014
<160> 179
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
<210> 1
<211> 428
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 1
atgagggtcc agattcagtt tctggggctc cttctgctct ggacatcagt tgtccagtgt 60 gatgtccaga tgacccagtc tccatcttat cttgctacgt ctcctggaga gagtgtttcc 120 atcagttgca aggcaagtaa aaacattgac acatacttag cctggtatca ggagaaacct 180 gggaaaacga ataagcttct tatctactct gggtcaactt tgcaatctgg aactccatcg 240 agattcagtg gcagtggatc tggtacagat ttcacgctca ccatcagaaa cctggagtct 300 gaagattttg cagtctacta ctgtcaacag cataatgaat acccgctcac gttcggttct 360 gggaccaagc tggagatcaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tcctcgga 428
<210 > 2
<211> 142
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 2
Met Arg Val Gln lie Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Thr Ser 1 5 10 15
Val Val Gln Cys Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala 20 25 30 Thr Ser Pro Gly Glu Ser Val Ser lie Ser Cys Lys Ala Ser Lys Asn 35 40 45
lie Asp Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn 50 55 60
Lys Leu Leu lie Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly_ Thr Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Arg 85 90 95
Asn Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn 100 105 110 Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 115 120 125
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser lie Phe Pro Pro Ser Ser
130 135 140
<210 > 3
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintético
<400>3
Lys Ala Ser Lys Asn lie Asp Thr Tyr Leu Ala
1 5 10
<210 > 4
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintético
<400>4
Ser Gly Ser Thr Leu
1 5
<210 > 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintético
<400>5
Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210>6
<211 > 480
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 6
atggacacca ggctctgctt ggttttcctt gtccttttca taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg tggaggctta gtgcagcctg gaaggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct caggattcac tttcagtaac tattacatgg cctgggtccg ccaggctcca 180 acgaagggtc tggagtgggt cgcatccatt agttttgagg gtaatagaaa tcactatgga 240 gactccgtga agggccgaat cactatctcc agagataatg caaaaagcac cctatacctg 300 caaatgacca gtctgaggcc tgaggacacg gcctattatt gtgcaagaca tcgggggtat 360 agtacgaatt tttatcacga cgttttggat gcctggggtc aaggagcttt agtcactgtc 420
tcctcagctg aaacaacagc cccatctgtc tatccactgg ctcctggaac tgctctcaaa 480
<210 > 7
<211> 161
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintetizado
Figure imgf000033_0001
<210 > 8
<211 > 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintético
<400>8
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Tyr Met Ala
1 5 10
<210 > 9
<211 > 16
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial quence
<220>
<223> Sintético
<400>9
Ser lie Ser Phe Glu Gly Asn Arg Asn His Tyr Gly Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
<210> 10
<211 > 19
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 10
His Arg Gly Tyr Ser Thr Asn Phe Tyr His Asp Val Leu Asp Ala Trp 1 5 10 15
Gly Gln Gly
<210> 11
<211> 646
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Met Gly Leu Pro Arg Leu Val Cys Ala Phe Leu Leu Ala Ala Cys Cys 1 5 10 15
Cys Cys Pro Arg Val Ala Gly Val Pro Gly Glu Ala Glu Gln Pro Ala 20 25 30
Pro Glu Leu Val Glu Val Glu Val Gly Ser Thr Ala Leu Leu Lys Cys 35 40 45
Gly Leu Ser Gln Ser Gln Gly Asn Leu Ser His Val Asp Trp Phe Ser 50 55 60
Val His Lys Glu Lys Arg Thr Leu lie Phe Arg Val Arg Gln Gly Gln 65 70 75 80 Gly Gln Ser Glu Pro Gly Glu Tyr Glu Gln Arg Leu Ser Leu Gln Asp 85 90 95
Arg Gly Ala Thr Leu Ala Leu Thr Gln Val Thr Pro Gln Asp Glu Arg 100 105 110
lie Phe Leu Cys Gln Gly Lys Arg Pro Arg Ser Gln Glu Tyr Arg lie 115 120 125
Gln Leu Arg Val Tyr Lys Ala Pro Glu Glu Pro Asn lie Gln Val Asn 130 135 140
Pro Leu Gly lie Pro Val Asn Ser Lys Glu Pro Glu Glu Val Ala Thr 145 150 155 160 Cys Val Gly Arg Asn Gly Tyr Pro lie Pro Gln Val lie Trp Tyr Lys 165 170 175
Asn Gly Arg Pro Leu Lys Glu Glu Lys Asn Arg Val His lie Gln Ser 180 185 190
Ser Gln Thr Val Glu Ser Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Gln Ser lie Leu 195 200 205
Lys Ala Gln Leu Val Lys Glu Asp Lys Asp Ala Gln Phe Tyr Cys Glu 210 215 220
Leu Asn Tyr Arg Leu Pro Ser Gly Asn His Met Lys Glu Ser Arg Glu 225 230 235 240 Val Thr Val Pro Val Phe Tyr Pro Thr Glu Lys Val Trp Leu Glu Val 245 250 255
Glu Pro Val Gly Met Leu Lys Glu Gly Asp Arg Val Glu lie Arg Cys 260 265 270
Leu Ala Asp Gly Asn Pro Pro Pro His Phe Ser lie Ser Lys Gln Asn 275 280 285
Pro Ser Thr Arg Glu Ala Glu Glu Glu Thr Thr Asn Asp Asn Gly Val 290 295 300
Leu Val Leu Glu Pro Ala Arg Lys Glu His Ser Gly Arg Tyr Glu Cys 305 310 315 320 Gln Ala Trp Asn Leu Asp Thr Met lie Ser Leu Leu Ser Glu Pro Gln 325 330 335
Glu Leu Leu Val Asn Tyr Val Ser Asp Val Arg Val Ser Pro Ala Ala 340 345 350 Pro Glu Arg Gln Glu Gly Ser Ser Leu Thr Leu Thr Cys Glu Ala Glu 355 360 365
Ser Ser Gln Asp Leu Glu Phe Gln Trp Leu Arg Glu Glu Thr Asp Gln 370 375 380
Val Leu Glu Arg Gly Pro Val Leu Gln Leu His Asp Leu Lys Arg Glu 385 390 395 400 Ala Gly Gly Gly Tyr Arg Cys Val Ala Ser Val Pro Ser lie Pro Gly 405 410 415
Leu Asn Arg Thr Gln Leu Val Lys Leu Ala lie Phe Gly Pro Pro Trp 420 425 430 Met Ala Phe Lys Glu Arg Lys Val Trp Val Lys Glu Asn Met Val Leu 435 440 445
Asn Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly His Pro Arg Pro Thr lie Ser Trp 450 455 460
Asn Val Asn Gly Thr Ala Ser Glu Gln Asp Gln Asp Pro Gln Arg Val 465 470 475 480 Leu Ser Thr Leu Asn Val Leu Val Thr Pro Glu Leu Leu Glu Thr Gly 485 490 495
Val Glu Cys Thr Ala Ser Asn Asp Leu Gly Lys Asn Thr Ser lie Leu 500 505 510 Phe Leu Glu Leu Val Asn Leu Thr Thr Leu Thr Pro Asp Ser Asn Thr 515 520 525
Thr Thr Gly Leu Ser Thr Ser Thr Ala Ser Pro His Thr Arg Ala Asn 530 535 540
Ser Thr Ser Thr Glu Arg Lys Leu Pro Glu Pro Glu Ser Arg Gly Val 545 550 555 560 Val lie Val Ala Val lie Val Cys lie Leu Val Leu Ala Val Leu Gly 565 570 575
Ala Val Leu Tyr Phe Leu Tyr Lys Lys Gly Lys Leu Pro Cys Arg Arg 580 585 590 Ser Gly Lys Gln Glu lie Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys Thr Glu Leu 595 600 605
Val Val Glu Val Lys Ser Asp Lys Leu Pro Glu Glu Met Gly Leu Leu 610 615 620
Gln Gly Ser Ser Gly Asp Lys Arg Ala Pro Gly Asp Gln Gly Glu Lys 625 630 635 640 Tyr lie Asp Leu Arg His
645
<210> 12
<211> 474
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 12
atggaatcac agacccaggt cctcatgtcc ctgctgctct ggatttctgg tacctgtggg 60 gacattgtga tgacccagtc tccatcctct ctggctgtgt cagctgggga gacggtctct 120 atacactgca agtccagtca gagtctttta tacagtggaa cccaaaagaa ctacttggcc 180 tggttccagc agaaaccagg acagtctcct aaactgctga tcttctgggc atctactagg 240 cagtctggtg tccctgatcg cttcataggc cgtggatctg ggacagactt cactctgacc 300 atcagcggtg tgcaggcaga agatctggca atttattact gtcaacaata ttatgatact 360 ctcacggaca cgtttggagc ggggaccaag ctggaactga aacgggctga tgctgcacca 420 actgtateta tcttcccacc atccacggaa cagttagcaa ctggaggtgc ctca 474
<210> 13
<211 > 158
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintetizado
<400> 13
Figure imgf000036_0001
<210> 14
<211 > 17
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 14
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Gly Thr Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala
<210> 15
<211>7
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 15
Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser
1 5
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 16
Gln Gln Tyr Tyr Asp Thr Leu Thr Asp Thr
1 5 10
<210 > 17
<211 > 469
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 17
atggacatca ggctcagctt ggctttcctg gtccttttca taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcggctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gaaagtccat gaaactctcc 120 tgtgtagcct cgggattcaa attcagtaac tattacatgt cctgggtccg ccaggctcca 180 gcgaagggtc tggagtgggt cgcatccatt agtgatggtg gtggtgacac tttctgtcga 240 gacttggtga agggccgatt cactatctcc agagataatg caaaaagtac cctttacctg 300 caaatggaca gtctgaggcc tgaggacacg gccacttatt actgtgcaag acggggagca 360 gctatggggg gtgttatgga tgcctggggt caaggaactt cagtcactgt ctcctcagct 420 gaaacaacag ccccatctgt ctatccactg gctcctggaa ctgctctca 469
<210> 18
<211> 156
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintetizado
<400> 18
Met Asp lie Arg Leu Ser Leu Ala Phe Leu Val Leu Phe lie Lys Gly 1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Arg Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Lys Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Lys Phe 35 40 45
Ser Asn Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Ala Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Val Ala Ser lie Ser Asp Gly Gly Gly Asp Thr Phe Cys Arg 65 70 75 80 Asp Leu Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser 85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Ala Ala Met Gly Gly Val Met Asp Ala 115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Glu Thr Thr Ala 130 135 140
Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala Leu
145 150 155
<210> 19
<211 > 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 19
Gly Phe Lys Phe Ser Asn Tyr Tyr Met Ser
Figure imgf000037_0001
<210> 20
<211 > 17
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 20
Ser lie Ser Asp Gly Gly Gly Asp Thr Phe Cys Arg Asp Leu Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 21
<211 > 15
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 21
Arg Gly Ala Ala Met Gly Gly Val Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly 1 5 10 15
<210> 22
<211 > 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Pro Arg Val Ala Gly Val Pro Gly Glu Ala Glu Gln Pro Ala Pro Glu 1 5 10 15 Leu Val Glu Val Glu Val Gly Ser Thr Ala Leu Leu Lys Cys Gly Leu 20 25 30
Ser Gln Ser Gln Gly Asn Leu Ser His Val Asp Trp Phe Ser Val His 35 40 45
Lys Glu Lys Arg Thr Leu lie Phe Arg Val Arg Gln Gly Gln Gly Gln 50 55 60
Ser Glu Pro Gly Glu Tyr Glu Gln Arg Leu Ser Leu Gln Asp Arg Gly 65 70 75 80 Ala Thr Leu Ala Leu Thr Gln Val Thr Pro Gln Asp Glu Arg lie Phe 85 90 95 Leu Cys Gln Gly Lys Arg Pro Arg Ser Gln Glu Tyr Arg lie Gln 100 105 110
<210> 23
<211> 104
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Pro Asn lie Gln Val Asn Pro Leu Gly lie Pro Val Asn Ser Lys Glu 1 5 10 15 Pro Glu Glu Val Ala Thr Cys Val Gly Arg Asn Gly Tyr Pro lie Pro 20 25 30
Gln Val lie Trp Tyr Lys Asn Gly Arg Pro Leu Lys Glu Glu Lys Asn 35 40 45
Arg Val His lie Gln Ser Ser Gln Thr Val Glu Ser Ser Gly Leu Tyr 50 55 60
Thr Leu Gln Ser lie Leu Lys Ala Gln Leu Val Lys Glu Asp Lys Asp 65 70 75 80 Ala Gln Phe Tyr Cys Glu Leu Asn Tyr Arg Leu Pro Ser Gly Asn His 85 90 95 Met Lys Glu Ser Arg Glu Val Thr
100
<210> 24
<211> 78
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Pro Val Phe Tyr Pro Thr Glu Lys Val Trp Leu Glu Val Glu Pro Val 1 5 10 15 Gly Met Leu Lys Glu Gly Asp Arg Val Glu lie Arg Cys Leu Ala Asp 20 25 30
Gly Asn Pro Pro Pro His Phe Ser lie Ser Lys Gln Asn Pro Ser Thr 35 40 45
Arg Glu Ala Glu Glu Glu Thr Thr Asn Asp Asn Gly Val Leu Val Leu 50 55 60
Glu Pro Ala Arg Lys Glu His Ser Gly Arg Tyr Glu Cys Gln 65 70 75
<210> 25
<211> 90
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Pro Gln Glu Leu Leu Val Asn Tyr Val Ser Asp Val Arg Val Ser Pro 1 5 10 15
Ala Ala Pro Glu Arg Gln Glu Gly Ser Ser Leu Thr Leu Thr Cys Glu 20 25 30
Ala Glu Ser Ser Gln Asp Leu Glu Phe Gln Trp Leu Arg Glu Glu Thr 35 40 45
Asp Gln Val Leu Glu Arg Gly Pro Val Leu Gln Leu His Asp Leu Lys 50 55 60
Arg Glu Ala Gly Gly Gly Tyr Arg Cys Val Ala Ser Val Pro Ser lie 65 70 75 80 Pro Gly Leu Asn Arg Thr Gln Leu Val Lys
85 90
<210> 26
<211> 81
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Pro Pro Trp Met Ala Phe Lys Glu Arg Lys Val Trp Val Lys Glu Asn 1 5 10 15
Met Val Leu Asn Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly His Pro Arg Pro Thr 20 25 30
lie Ser Trp Asn Val Asn Gly Thr Ala Ser Glu Gln Asp Gln Asp Pro 35 40 45
Gln Arg Val Leu Ser Thr Leu Asn Val Leu Val Thr Pro Glu Leu Leu
50 55 60
Glu Thr Gly Val Glu Cys Thr Ala Ser Asn Asp Leu Gly Lys Asn Thr 65 70 75 80 Ser
<210> 27
<211> 1823
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo humanizado que inhibe la unión de MCAM a laminina-a4 que comprende:
(a) una región variable madura de la cadena pesada que comprende tres CDRs de Kabat de SEQ ID N°s: 66-68 respectivamente, y que es al menos un 97% idéntica a la SEQ ID N°: 156; y
(b) una región variable madura de la cadena ligera que comprende tres CDRs de Kabat de SEQ ID N°s: 61 -63 respectivamente, y que es al menos un 97% idéntica a la SEQ ID N°: 160.
2. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1, en el que la región variable madura de la cadena pesada es al menos un 98% idéntica a la SEQ ID N°: 156 y la región variable madura de la cadena ligera es al menos un 97% idéntica a la SEQ ID N°: 160, o en la que la región variable madura de la cadena pesada es al menos un 99% idéntica a la SEQ ID N°: 156 y la región variable madura de la cadena ligera es al menos un 97% idéntica a la SEQ ID N°: 160, o en la que la región variable madura de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 156 y la región variable madura de la cadena ligera es un 97% idéntica a la SEQ ID N°: 160, o en la que la región variable madura de la cadena pesada es al menos un 97% idéntica a la SEQ ID N°: 156 y la región variable madura de la cadena ligera es al menos un 98% idéntica a SEQ ID N°: 160, o en la que la región variable madura de la cadena pesada es al menos un 97% idéntica a la SEQ ID N°: 156 y la región variable madura de la cadena ligera es al menos un 99% idéntica a la SEQ ID N°: 160, o en la que la región variable madura de la cadena pesada es al menos un 97% idéntica a la SEQ ID N°: 156 y la región variable madura de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 160, o en la que la región variable madura de la cadena pesada es al menos un 98% idéntica a la SEQ ID N°: 156 y la región variable madura de la cadena ligera es al menos un 98% idéntica a SEQ ID N°: 160, o en la que la región variable madura de la cadena pesada es al menos un 99% idéntica a la SEQ ID N°: 156 y la región variable madura de la cadena ligera es al menos un 99% idéntica a la SEQ ID N°: 160.
3. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1, en el que la región variable madura de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 156 y la región variable madura de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 160.
4. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 3, con tal de que además la posición 3 (numeración de Kabat) de la región variable madura de la cadena pesada esté ocupada por K y/o la posición 93 (numeración de Kabat) de la región variable madura de la cadena pesada esté ocupada por T y/o la posición 42 (numeración de Kabat) de la región variable madura de la cadena pesada esté ocupada por E y/o la posición 43 (numeración de Kabat) de la región variable madura de la cadena ligera esté ocupada por S y/o la posición 9 (numeración de Kabat) de la región variable madura de la cadena pesada ligera esté ocupada por S y/o la posición 19 (numeración de Kabat) de la región variable madura de la cadena pesada ligera esté ocupada por V.
5. El anticuerpo humanizado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que es un fragmento de unión al antígeno.
6. El anticuerpo humanizado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que es un anticuerpo intacto.
7. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humanizado de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
8. Un anticuerpo humanizado de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para el uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio en un sujeto mamífero, caracterizado por la infiltración de células que expresan MCAM en un sitio de inflamación en el cuerpo.
9. Un anticuerpo humanizado de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para el uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC) en un sujeto mamífero, caracterizado por la infiltración de células que expresan MCAM en el SNC.
10. Un anticuerpo humanizado de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para el uso en el tratamiento de esclerosis múltiple, psoriasis, un tumor sólido, tal como melanoma, sarcoidosis, artritis psoriásica, enfermedad de Parkinson, dermatitis de contacto alérgica, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, o enfermedad de Crohn en un sujeto mamífero.
FIG. 1
Figure imgf000094_0001
Figure imgf000095_0001
FIG. 2 Figura 3A
Figure imgf000096_0001
Decoración 'Decoración n° 1': Residuos de caja que difieren del consenso.
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