CN107843730B - 使靶细胞可逆染色的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使靶细胞可逆染色的方法。本发明还涉及分离靶细胞或由存在至少一个共同特异性受体分子定义的靶细胞群的方法。本发明还提供了可用于实施本发明所述方法的试剂盒。
Description
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求于2011年7月18日向美国专利和商标局提交的美国临时专利申请61/508,943的“Method of Reversibly Staining a Target Cell”的优先权的权益，该申请以引用的方式全文并入本文。
发明领域
本发明涉及使靶细胞可逆染色的方法。本发明还涉及分离由存在至少一种共同特异性受体分子定义的靶细胞或靶细胞群的方法。本发明还提供了可用于实施本发明的方法的试剂盒。
发明背景
细胞疗法对许多疾病的治疗是高效的已经得到证明。例如，原发性免疫缺陷可以通过造血干细胞移植(HSCT)治愈，某些白血病可以通过异体HSCT和供者淋巴细胞输注(DLI)的组合得到完全缓解(Kolb,H.J.等,Donor leukocyte transfusions fortreatment of recurrent chronic myelogenous leukemia in marrow transplantpatients.Blood 76(12),2462-2465(1990))。在一些临床环境中，病毒特异性T细胞的过继转移对重建免疫功能低下患者对抗由巨细胞病毒(CMV)造成的威胁生命的并发症(Riddell,S.R.等,Restoration of viral immunity in immunodeficient humans bythe adoptive transfer of T cell clones.Science 257(5067),238-241(1992))或由Epstein-Barr-病毒(EBV)介导的淋巴组织增生性疾病(Rooney,C.M.等,Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to control Epstein-Barr-virus-relatedlymphoproliferation.Lancet 345(8941),9-13(1995))非常有效。同样，无论是源自自身肿瘤浸润性淋巴细胞还是培养或体外设计的肿瘤抗原定向T细胞都是对改进疗法有前景的候选项。
无论这些有趣的临床观察结果如何，细胞疗法更广泛转移到临床应用仍然需要等待。这主要是由于这样的事实，用于产生免疫治疗的细胞制备物的多数程序是非常费时、费力并且昂贵的。此外，已知的用于调节临床疗效的细胞群通常需要被富集到很高的纯度，因为“不需要的”细胞的污染可能会介导有害的且有时危及生命的副作用(如移植物抗宿主病(GvHD)是由异种反应性T细胞在同种异基因干细胞移植和/或DLI治疗中介导的)。已有研究表明，极少量过继转移T细胞可以促进有益的临床疗效，同样的规则也适用于细胞群介导的负面影响。因此，提供适用于治疗的定义明确的高纯度细胞制备物成为使这些有前景的疗法更有效和可预测并且降低潜在副作用风险的关键。
目前表面标记物介导的临床细胞纯化的方法通常依赖于单一的参数(如，CD34，MHC多聚体)。但是，对于多数细胞群—无论直接是源自离体的还是在体外细胞培养后的—不同表面标记物的组合是必须的，以便从其它细胞中真正将这些细胞分隔出来。例如，天然存在的调节性T细胞(Treg)代表一类有前景的细胞亚群，其能预防基于同种异基因HSCT 4的急性GvHD或自身免疫疾病的发展(Riley,J.L.,June,C.H.,&Blazar,B.R.,Human Tregulatory cell therapy:take a billion or so and call me in themorning.Immunity 30(5),656-665(2009),Randolph,D.A.&Fathman,C.G.,Cd4+Cd25+regulatory T cells and their therapeutic potential.Annu Rev Med 57,381-402(2006))。
除了由大量细胞共有的CD4的表达，其它的标记物如其组成型表达的高亲和性IL-2受体α链(CD25)需要进一步减少异质性。然而，CD25也表达于很大部分的非调节性细胞上，所述细胞包括最近活化的效应细胞和记忆T细胞。因此，已建议使用组合的染色模式，如CD4、CD25、CD127和CD45RA的组合(Miyara,M.等,Functional delineation anddifferentiation dynamics of human CD4+ T cells expressing theFoxP3transcription factor.Immunity 30(6),899-911(2009),Hoffmann,P.等,Only theCD45RA+subpopulation of CD4+CD25high T cells gives rise to homogeneousregulatory T-cell lines upon in vitro expansion.Blood 108(13),4260-4267(2006))来更精确地鉴定此与临床相关的T细胞亚群。
目前所有可用的基于临床标记物的细胞分离技术采用顺磁性珠子，所述珠子将标记的细胞群保留在磁场内。由此，使用直接标记的靶细胞群的积极富集策略得到最高纯度。但是，经由几种不同标记物的组合的纯化仍然很难达到，尽管分离具有最高纯度的不同细胞群是必需的。另外，阳性筛选后，标记和珠子通常保留在细胞产物中，潜在地操纵分离的细胞群或负面地影响其功能/生活力如通过受体阻滞。特别是在临床细胞分选中，保留的细胞标记会导致细胞产品在患者中的重大适用性调节障碍。为了规避阳性筛选的问题，许多临床细胞处理程序已经变为耗竭设置。不幸的是，靶细胞的纯度往往很低并且耗竭法常需要不同抗体的复杂混合物，这就使得其生产和应用费力且价格昂贵。
因此，仍然需要提供一种用于细胞纯化或分离的方法，该方法例如在细胞分选后允许从纯化的细胞群中释放且完全除去受体结合的所有组分和染色剂。
发明概述
本发明一方面提供一种使用可检测标记使靶细胞可逆染色的方法，所述靶细胞包含在其表面上的受体分子，所述方法包括：
使包含所述靶细胞的细胞混合物与下述物质接触：
(i)受体结合试剂，所述受体结合试剂包含至少一个(任意)结合位点B，其中结合位点B特异性结合至所述受体分子，其中所述受体结合试剂经由结合位点B和所述受体分子之间的结合的解离速率常数(Koff)的值为约0.5×10-4sec-1或更大，所述受体结合试剂进一步包含至少一个结合配偶体C，其中所述结合配偶体C能够(可逆)连接到多聚化试剂的结合位点Z，
(ii)多聚化试剂，所述多聚化试剂包含用于受体结合试剂的结合配偶体C的可逆结合的至少两个结合位点Z，其中受体结合试剂(i)和多聚化试剂(ii)形成结合至所述靶细胞的(多个)多价结合复合物，每个多价结合复合物包含结合至一个所述多聚化试剂的至少两个所述受体结合试剂，所述多价结合复合物相对于所述受体结合试剂提供增加的亲合力；和
(iii)结合至所述多价结合复合物的所述可检测标记，
其中所述靶细胞通过所述多价结合复合物与所述靶细胞的结合染色，并且基于所述受体结合试剂的所述结合配偶体C与所述多聚化试剂的所述结合位点Z之间的结合的破裂，所述靶细胞的染色是可逆的。
本发明的第二个方面提供此染色法用于分离由存在(至少一种共同特异性)受体分子定义的靶细胞群的用途。
本发明另一方面提供用于使用可检测标记使靶细胞可逆染色(分离)的试剂盒，所述靶细胞包含在其表面的受体分子。此试剂盒包括：
(i)至少一种受体结合试剂，所述至少一种受体结合试剂包含特异性结合至所述受体分子的(任意)结合位点B，其中所述受体结合试剂经由结合位点B和所述受体结合分子之间的结合的解离速率常数(Koff)的值为约0.5×10-4sec-1或更大，并且所述受体结合试剂进一步包含至少一个结合配偶体C，其中所述结合配偶体C能够被多聚化试剂的结合位点Z(可逆)结合，
(ii)至少一种多聚化试剂，所述至少一种多聚化试剂包含用于受体结合试剂的所述结合配偶体C的至少两个结合位点Z，其中结合配偶体C与所述多聚化试剂的结合位点Z能够形成可逆键合，
(iii)可检测标记，所述可检测标记结合至或能够结合至受体结合试剂(i)和/或多聚化试剂(ii)。
本发明的再一方面提供一种特异性结合至受体分子的受体结合试剂在使靶细胞可逆染色的方法中的用途，所述受体结合试剂包含至少一个结合位点B，其中所述结合位点B特异性结合至所述受体分子，其中所述受体结合试剂经由结合位点B和所述受体分子之间的结合的解离速率常数(Koff)的值为约0.5×10-4sec-1或更大。
本发明的又一个方面提供一种使用可检测标记使靶细胞可逆染色的方法，所述靶细胞包含在其表面的(至少一种)受体分子，所述方法包括：
使包含所述靶细胞的细胞混合物与下述物质的接触：
(i)至少两种受体结合试剂，每种受体结合试剂包含至少一个结合位点B，其中每种受体结合试剂的结合位点B特异性结合至所述受体分子，其中每种所述受体结合试剂经由结合位点B和所述受体分子之间的结合的解离速率常数(Koff)的值为约0.5×10-4sec-1或更大，每种所述受体结合试剂进一步包含至少一个结合配偶体C，其中每种受体结合试剂的结合配偶体C能够(可逆)结合至多聚化试剂的结合位点Z，
(ii)多聚化试剂，所述多聚化试剂包含用于每种受体结合试剂的结合配偶体C的可逆结合的至少一个结合位点Z，
其中所述至少两种受体结合试剂(i)和多聚化试剂(ii)形成结合至所述靶细胞的(多个)多价结合复合物，每个多价结合复合物包含结合至一个所述多聚化试剂的每种受体结合试剂中的至少一个，所述多价结合复合物相对于每种所述受体结合试剂提供增加的亲合力；和
(iii)结合至所述多价结合复合物的所述可检测标记，
其中所述靶细胞通过所述多价结合复合物与所述靶细胞的结合染色，并且其中基于每种所述受体结合试剂的所述结合配偶体C与所述多聚化试剂的所述结合位点Z之间的结合的分裂，所述靶细胞的染色是可逆的。
本发明另一方面提供用于使用可检测标记使靶细胞可逆染色(或分离)的试剂盒，所述靶细胞包含在其表面上的受体分子，所述试剂盒包括：
(i)至少两种受体结合试剂，所述至少两种受体结合试剂包含特异性结合至所述受体分子的结合位点B，其中每种所述受体结合试剂经由结合位点B和所述受体结合分子之间的结合的解离速率常数(Koff)的值为约0.5×10-4sec-1或更大，并且每种所述受体结合试剂进一步包含至少一个结合配偶体C，其中每种受体结合试剂的结合配偶体C能够被多聚化试剂的结合位点Z(可逆)结合，
(ii)至少一种多聚化试剂，所述至少一种多聚化试剂包含用于每种受体结合试剂的所述结合配偶体C的的至少一个结合位点Z，其中每种结合试剂的结合配偶体C与所述多聚化试剂的所述结合位点Z能够形成可逆键合，
(iii)可检测标记，所述可检测标记结合至或能够结合至受体结合试剂(i)和/或多聚化试剂(ii)。
附图简述
将非限制性实施例与附图结合考虑并参照发明详述将会更好的理解本发明，其中：
图1示出使用Fab片段作为(至少一个)受体结合试剂(就Fab片段而言且也通常在本发明的一个实施例中，受体结合试剂可含有用于受体分子的单个结合位点)的可逆染色法的原理。图1a示出Fab片段用作受体结合试剂的说明性示例，其中链霉亲和素结合肽即
为受体结合试剂的结合配偶体C。在这一实施例中，链霉亲和素结合肽融合或缀合到Fab片段从而形成受体结合试剂。在图1a所示实例中，多聚化试剂是链霉亲和素突变蛋白(
)，其包含用于所述至少一个结合配偶体C的至少两个结合位点Z。在图1a所示实例中，多聚化试剂带有荧光标记如藻红蛋白。在图1b的实例中，再次一起示出了Fab片段和缀合到作为标记的磁珠上的多聚化试剂。采用链霉亲和素突变蛋白与Fab片段之间经由链霉亲和素结合肽的多价结合复合物形成的可逆染色法在本文中也称作“Fab-多聚体染色”。图1c示出这种可逆Fab-多聚体染色法的示意图概况。在这一实例中，从存在于血液样品中的细胞混合物中染色/分离靶细胞。用于结合至存在于靶细胞上的细胞受体、Koff速率为约0.5×10-4sec-1或更大的Fab片段通过
复合物形成可逆多聚化。靶细胞被多价结合复合物(通过如图1c步骤a)中所示使细胞与多聚化试剂和受体结合试剂接触)染色并可选地与缺乏同源性细胞表面受体分子的其它细胞分离，例如，利用荧光活化细胞分选术(图1c步骤b)中标记为商标“FACSTM”)。用与
肽竞争的
配体D-生物素后续处理分离染色的靶细胞导致Fab片段从多聚化试剂上移位，由此导致多聚化试剂(
复合物)的从靶细胞中释放(如图1c步骤c)所示)。保留的Fab片段，与
未复合，由于其高Koff速率将在合理的时间窗(自发地)解离，并且可以通过洗涤完全从靶细胞表面移除(如图1c步骤d)所示)。洗涤可以在这样一个体积下进行，所述体积在每个洗涤步骤期间将Fab片段稀释至至少等于Fab片段与同源细胞表面受体分子之间的结合的亲和性解离常数(Kd)的浓度。图1d示出与图1c类似的染色过程，其中多聚化试剂缀合到磁珠上并且其中染色/分离步骤包括经由其上结合染色细胞的磁柱将染色细胞从未染色细胞中分离。
图2示出Fab多聚体可逆染色所需的结合特性。图2示出用不同抗-CD4Fab突变体染色的抗-CD4 Fab多聚体的FACS分析，所述不同抗-CD4Fab突变体对于Fab片段与作为受体分子的CD4的结合具有增加的Koff-速率(Fab片段的结合动力学的总结列于表1)。外周血单核细胞(PBMC)用融合至两个顺序排列的
序列(市售商品名为“One-STrEP-tag”；结合配偶体C)的抗-CD4Fab片段(受体结合试剂)染色并用藻红蛋白标记的
(Strep-Tactin PE；IBA GmbH,
德国；包含用于结合配偶体C的至少2个结合位点Z的多聚化试剂)多聚化，然后在用D-生物素处理之前(第二列)或之后(第三列)进行分析。然后在仅用Strep-Tactin PE(未结合Fab片段)(第四列)移除Fab-单体的洗涤步骤后，检测靶细胞表面上保留的Fab-单体(即用作受体结合试剂的Fab片段)。在上述细胞可逆染色后再次进行Fab多聚体的染色(第五列)，来控制生物素移除的完成，否则该生物素将会妨碍如第四列所示的保留Fab-单体仅用Strep-Tactin PE(未结合Fab片段)的染色，从而导致错误的实验结论。或者，细胞用单体Fab片段培养、洗涤并在用Strep-Tactin
(第一，即最左边的列)染色后进行分析。示出了活的CD3+ T细胞。点图中的数字表示门内细胞的百分比。
图3示出图2的FACS分析的备选方案，即Fab多聚体染色可逆性的蛋白质印迹分析。CD4 Fab多聚体利用列于表1并进一步如图2具体说明的不同抗-CD4 Fab-突变体和
PE(IBA GmbH,
德国)生成。PBMC与不同CD4 Fab多聚体一起孵育，且每个样品中的一致的细胞染色用流式细胞仪检测(与浅色直方图对比，实线代表未染色细胞)。然后，细胞用D-生物素处理并随后洗涤。最后，经洗涤的细胞裂解，并用高特异性的抗
抗体(StrepMAB-Classic Horse Radish Peroxidase(HRP)缀合物；IBAGmbH,
德国)分析溶解(S)和未溶解(I)级分的保留Fab-单体。为了控制一致量的不溶细胞物质的应用，同时用来自兔的针对β-肌动蛋白的第一抗体(Santa CruzBiotechnology Inc.,Santa Cruz,USA)和缀合到HRP的针对兔Ig(免疫球蛋白)的第二抗体(Sigma,St.Louis,USA0来检测β-肌动蛋白。
发明详述
本发明提供一种使在细胞表面具有受体分子的靶细胞或靶细胞群可逆染色的方法。对照于描述于美国专利7,776,562或国际专利申请WO 02/054065的方法，本发明是基于这样的发现，在该方法中，受体结合试剂与靶细胞表面上的受体分子的低亲和性结合并不是可逆性必须的。相反，本发明已经发现不考虑结合强度，意味着无论受体结合试剂和受体分子之间结合的解离常数(Kd)是否具有低亲和性，例如在Kd为约10-3到10-7M的范围内，或是否具有高亲和性，例如在Kd为约10-7到10-10M的范围内，靶细胞都能被可逆染色，只要受体结合试剂经由结合位点B与受体分子的结合的解离发生得足够快。以Koff速率(也称为受体结合试剂(经由结合位点B)与受体分子之间的结合的解离速率常数)表示，Koff速率为约0.5×10-4sec-1或更大，约1×10-4sec-1或更大，约2×10-4sec-1或更大，约3×10-4sec-1或更大，约4×10-4sec-1或更大，约5×10-4sec-1或更大，约1×10-3sec-1或更大，约1.5×10-3sec-1或更大，约2×10-3sec-1或更大，约3×10-3sec-1或更大，约4×10-3sec-1或更大，约5×10-3sec-1或更大，约1×10-2sec-1或更大，或约5×10-1sec-1或更大。本文关于Koff速率、kon速率或Kd时所用术语“约”是指包含±0.1％、±0.2％、±0.3％、±0.4％、±0.5％、±0.7％、±0.9％、±1.0％、±1.2％、±1.4％、±1.6％、±1.8％、±2.0％、±2.2％、±2.4％、±2.6％、±2.8％、±3.0％、±3.5％、±4.0.％、±4.5％、±5.0％、±6.0％、±7.0％、±8.0％、±9.0％、±10.0％、±15.0％或±20.0％的误差容限。
在本文中，值得注意的是受体结合试剂L与其受体P(例如细胞表面受体分子)之间复合物(C)的形成可以描述为著名的两状态过程
相应的解离常数Kd定义为
其中[P]、[L]、和[C]是在给定的温度和压力下受体、受体结合试剂(配体)和相应的复合物的平衡摩尔浓度。解离常数Kd也可表述为复合物结合/形成的速度即正反应速度(on-rate)常数(kon)(也称为结合速率常数)和复合物解离即逆反应速度(off-rate)常数(koff)(也称为解离速率常数)的比率
Kd＝koff/kon
在本发明的应用中，热力学和动力学常数Kd、Ka、kon和koff的值是指其“标准条件”下的测定值，所述“标准条件”即温度为25℃，大气压力为1.013bar。
在本发明中，如上述提到的，已发现受体结合试剂与受体分子经由其特异性结合位点B的结合的koff速率[s-1]决定了通过进一步含有结合配偶体C的相应的受体结合试剂的靶细胞染色的可逆性，其中结合配偶体C能够被本文定义的多聚化试剂结合。koff的范围可以基于，例如，要被染色和任选地被纯化的靶细胞及相应的实验条件在范围内进行选择。考虑到受体结合试剂L与受体分子P之间的复合物(C)的半衰期T1/2可表述为ln2/koff＝0.693/koff且koff为0.5×10-4sec-1，受体结合试剂与受体分子之间的复合物的浓度降低一半消耗13860秒或231分钟或3.85小时，其中假定稀释是充分的从而解离的受体结合试剂与受体分子的重新结合可以忽略不计。为了实现复合物浓度的相同降低，当koff为1.0×10-4sec-1时消耗6390秒(或仅106.5分钟或1.775小时)，koff为2.0×10-4sec-1时消耗3465秒(或57分钟，即小于1小时)，koff为4.0×10-4sec-1时消耗1732秒(或大约28分钟)。因此，对于在染色靶细胞从样品中其他细胞分离出来后和在多聚化试剂和受体结合试剂之间形成的多价复合物的破裂后进行的洗涤步骤，可以基于要染色细胞对外部影响的敏感性选择细胞受体结合试剂。例如，对于相当敏感的细胞，可以使用具有相当高的koff速率、如大于4.0×10-4sec-1的受体结合试剂，使得在多价结合复合物破裂后，多数受体结合试剂可以在1小时内被移除(如上述，复合物的浓度在56分钟内降至最初浓度的25％，其中假定由于充分稀释重新结合作用可以忽略不计)。对于更强壮的细胞，可以使用具有较低koff速率、如1.0×10-4sec-1的受体结合试剂，相应地其解离需要更多的时间(在这种情况下，需要212分钟或大约3.5小时来解离和移除75％的受体分子结合试剂)。多聚化试剂解离后(例如，通过能够扰乱结合配偶体C和多聚化试剂之间可逆键合的竞争者)，洗涤也可以在一定缓冲液体积中恒定温和搅拌至少两倍半衰期T1/2下进行，所述缓冲液体积将所用的受体结合试剂稀释至浓度为解离常数(Kd)以下至少10倍。然后移除解离的受体结合试剂，例如，通过靶细胞沉降，并弃去上清液。在一个可选的实施例中，可以重复上述洗涤一次或两次或多次来移除受体结合试剂从而接近完全去除。在本文中，需要注意的是，当提及染色的靶细胞时所用术语“洗涤”是指使染色的靶细胞(伴随有多价体结合复合物的破裂或在多价体结合复合物的破裂后)与足量的洗涤缓冲液接触，用洗涤缓冲液孵育适宜的一段时间以使受体结合试剂从受体分子上解离且然后通过适当的程序从洗涤缓冲液(其由此消除了解离的受体结合试剂)中分离，例如靶细胞的沉降和上清液的去除，或例如洗涤缓冲液的过滤。洗涤通常在对将要染色或分离的细胞的生活力或状态没有不利影响的缓冲液中进行，即，洗涤在生理可接受条件下进行(如生理可接受缓冲液、适宜的温度，例如，在4℃、15℃或25℃(即，室温)下等)。适于实验的洗涤条件可以很容易地由本领域普通技术人员经验确定。例如，如果koff有一个接近5.0×10-4sec-1的相对较高的值，且染色的细胞对高温不敏感(相对的)，则洗涤可以在室温下进行，从而使得受体结合试剂从染色细胞上更快解离。可选地，如果染色的细胞对较高温度相对的敏感，则洗涤可在4℃下进行，使得受体结合试剂的解离/移除消耗较长时间，但细胞的功能状态或生活力将不会受到影响。在一些实施例中，温度为4℃或至少15℃以下是优选的从而防止靶细胞生理状态的任何改变。
在本文中，需要注意的是受体结合试剂既可以含有特异性结合受体分子的(任意)单一结合位点B，受体结合试剂也可以含有两个或更多个此结合位点B，只要受体分子经由(每个)结合位点B的结合的koff的总值为约0.5×10-4sec-1或更大。因此，受体结合试剂可以是单价的(例如，单价的抗体片段或单价的人工结合分子(蛋白性的或其他)，如基于脂质运载蛋白家族的多肽的突变蛋白(也被称为
)，或是二价的分子如抗体或其中两个结合位点都被保留的片段如F(ab’)2片段。受体结合试剂还可以是五聚体IgM分子，条件是全部IgM分子的koff速率为0.5×10-4sec-1或更大。
受体结合试剂与受体分子的koff-速率和当然的kon速率也可以通过标准的方法测定，如表面等离子共振(SPR)，例如，使用BIAcore技术(SPR；Jonsson,U.等.(1991)Biotechniques,11,620–627)。这一测定方法在本领域技术人员一般知识范围内。通常，这一测定在25℃下通过表面等离子共振分析进行，在适当的受体结合试剂浓度下受体分子固定在相应的传感器芯片表面上。配体(即，受体结合试剂)，例如，以不同浓度(通常接近从最初表征测定的估计的Kd值)施用于芯片的Fab片段，使用的流速在μl/min范围内。
作为一个说明性的例子，本文提到CD4(作为受体分子)与源自单克隆抗体13B8.2的Fab片段结合的koff速率测定。如描述于美国专利7,482,000或Bes,C.,等.J Biol Chem278,14265-14273(2003)中，koff速率与其他动力学参数可采用BIAcore 2000仪器(BIAcoreAB,乌普萨拉,瑞典)通过表面等离子共振在25℃下测定。重组的CD4可以使用根据制造商说明书使用胺耦合法共价固定于CM5传感器芯片表面。对照基准表面(control referencesurface)可采用相同的化学处理未注入CD4的流动池表面来制备。然后在包含10mM Hepes(pH7.4)、3mM EDTA、150mm NaCl和0.005％的非离子表面活性剂P20(BIAcore AB)的缓冲溶液中的重组Fab突变体可以5到20μg/ml的浓度注入到流动池上，且解离阶段在用5mM HCl溶液的再生步骤之后。流动速率可以设定为30μl/min。所有的传感图可以通过从对照基准表面中减去信号来校正。数据可以利用BIAevaluation Version 3.2软件全面拟合至1:1Langmuir等温结合曲线。
作为另一个说明性的例子，本文提到抗-CD30Fab对于重组CD30A抗原片段的koff速率的测定可通过Schlapschy,M.,等.“Functional humanization of an anti-CD30 Fabfragment for the immunotherapy of Hodgkin's lymphoma using an in vitroevolution approach”Protein Eng Des Sel 17,847-860(2004)的表面等离子体共振测量。该测定在BIAcore X系统(BIAcore,乌普萨拉,瑞典)中进行。通过凝胶过滤将缓冲液交换为pH3.85的10mM醋酸钠后，纯化的CD30A稀释至50μg/ml并采用胺耦合试剂盒(BIAcore)固定于“研究级”的CM5传感器芯片上，产生1700个固定的响应单元(RU)。以一系列合适浓度将纯化的重组Fab片段应用于PBS/P(包含0.005％的表面活性剂P-20的PBS；BIAcore)。在连续的5μl/min的缓冲流作用下观察到复合物的形成。传感图通过减去对照空白道测得的相应信号进行校正，该对照空白到也在线使用。芯片通过施加流速为25μl/min 1mM NaOH的2ml脉冲，然后通过用PBS/P平衡而再生。动力学参数可再次用BIAevalution软件V 3.0(BIAcore)通过基线漂移的1:1(Langmuir)结合模型测定。
重回本发明所述的方法，如上述提到的，受体结合试剂对细胞表面受体分子的亲和性不必是低亲和性。相反地(另见实验部分)，所述受体结合试剂与所述受体分子之间的结合的解离常数(kd)的范围可为约10-2M至约10-8M，或约10-2M至约10-9M，或约10-2M至约0.8×10-9M，或约10-2M至约0.6×10-9M，或约10-2M至约0.4×10-9M，或约10-2M至约0.3×10-9M，或约10-2M至约0.2×10-9，或约10-2M至约0.15×10-9M，或约10-2M至约10-10，只要在多价结合复合物的破裂后，在一个时间窗内且在对将要染色或分离的细胞可接受的洗涤条件下，koff允许受体结合试剂的移除。在一个实施例中，所述受体结合试剂与所述受体分子之间的结合的解离常数(Kd)的范围可为约10-7M至约10-10M，或约10-7M至约0.8×10-9M，或约10-7M至约0.6×10-9M，或约10-7M至约0.3×10-9M，或约1.1×10-7M至约10-10M，或约1.1×10-7M至约0.15×10-9M，或约1.1×10-7M至约0.3×10-9M，或约1.1×10-7M至约0.6×10-9M，或约1.1×10-7M至约0.8×10-9M。在本文中应当注意的是对于免疫球蛋白类如抗体或Fab-片段与其相应的抗原的结合，已知kon-速率最多为约5×106M-1s-1(见，例如，Lee等，Mol.Biol.(2004)340,1073–1093，其中图4示出Fab片段G6-23的kon-速率为5.6×106M-1s-1或，例如，Kwong等J.Mol.Biol.2008December 31；384(5):1143–1156或国际专利申请WO 2010/017103中报道了抗-人NKG2D单克隆抗体的Fab片段和作为抗体的IgG1(见Kwong等,上文，表1)的kon值为1×105M-1s-1到1.4×106M-1s-1)。因此，假设受体结合试剂如Fab片段有与受体分子的结合的kon值为5×106M-1s-1且Kd为1x10-10，koff为5x10-4M，使得这种抗体分子(或一般的受体结合试剂)将非常适于用于本发明所述的可逆染色法(当koff为5x10-4sec-1时受体结合试剂和受体分子之间复合物的浓度降低一半仅消耗1386秒或23分钟，尽管亲和性Kd为1x10-10M)。同样地，作为更进一步的示例，如果受体结合试剂与受体分子的结合的kon值为5×105M-1s-1且Kd为1x10-9，koff也为5x10-4M，结果也导致了在多价结合复合物破裂后，受体结合试剂从靶细胞上的相当快的解离。在这种情况下，其可以，例如，通过使用进化法(evolutionarymethod)如噬菌体展示，来有意筛选受体结合试剂如抗体片段或例如脂质运载蛋白突变蛋白(也对照Lee等，上文的这方面)。因此，如果需要，具有理想动力学性质的受体结合试剂可以通过这种进化法从已知氨基酸序列的起始分子得到。也可以使用本文描述的方法中对受体分子具有低亲和性的受体结合试剂，从而受体结合试剂与受体分子之间的结合的解离常数(Kd)值的范围为10-2至10-7M。
所述染色法进一步包括从样品/细胞混合物中存在的非靶细胞分离染色细胞。所述分离可以如美国专利7,776,562或国际专利申请WO 02/054065中描述地进行，且可以进一步包括通过破裂受体结合试剂的结合配偶体C与多聚化试剂的结合位点Z之间的结合从所述细胞去除所述染色。这种键合应是可逆的，即，该键合在适于实施要求保护的方法的条件下能够被破裂。所述结合配偶体C与所述结合位点Z之间的结合的解离常数(Kd)可以，例如，在为约10-2M至约10-13M的范围内。因此，这种可逆的键合可以，例如，具有的Kd为约10-2M至约10-13M，或约10-5M至约10-13M，或约10-6M至约10-10M，或约10-3M至约10-12M，或约10-4M至约10-11M，或约10-5M至约10-10M。这种键合的Kd值也可以通过任意合适的方法测定，例如，通过荧光滴定、平衡透析或如上述与受体结合试剂和受体分子之间形成的键合的Koff速率测定结合解释的表面等离子共振。染色的多聚化试剂从细胞的解离/移除导致了解离的受体结合试剂、和因此包含可检测标记的整个多价结合复合物从预先染色的细胞移除。为了促进受体结合试剂的移除，使用一定体积的相应洗涤缓冲液从而使添加的受体结合试剂的浓度显著低于其与同源受体分子相互作应的Kd。或者，洗涤可以用较少体积重复几次，而温和搅拌可有利于阻止立即重新结合。在一个实施例中，用一定体积的洗涤缓冲液降低受体结合试剂浓度低于Kd或甚至更优选地浓度低于Kd的1/10，使得90％以上的受体结合试剂以解离的形式(即未结合至受体分子)存在或甚至更优选地浓度低于Kd的1/100，使得99％以上的受体结合试剂以解离的形式存在或甚至更优选地浓度低于Kd的1/1000Kd，使得99.9％以上的受体结合试剂以解离的形式存在。
在本发明的一些实施例中，选择受体结合试剂，使得其包含至少一个结合配偶体C，而多聚化试剂包含用于所述结合配偶体C的至少两个结合位点Z、至少三个或至少四个结合位点Z。在可选的实施例中，可以使用两个不同(种类)的受体结合试剂。这两个受体结合试剂中的每一个通过相同或不同的结合位点B(对于后一种情况，两个受体结合试剂识别并从而结合相同受体分子的不同表位)结合相同的受体分子。另外，两个受体结合试剂中的每一个具有至少一个结合配偶体C，而多聚化试剂具有至少一个结合位点Z，以用于两个不同受体结合试剂中的每一个的结合配偶体C。例如，可以使用两个不同的受体结合试剂，其都经由相同的结合位点B结合相同的受体分子，但是其具有不同的结合配偶体C1和C2。例如，一个受体结合试剂可具有结合配偶体C1如六-组氨酸标签，而另一个受体结合试剂具有结合配偶体C2如FLAG标签。在这种情况下，多聚化试剂可包含用于结合配偶体C1的仅一个结合位点(Z1)和用于结合配偶体C2的的仅一个结合位点。由于多聚化试剂中总共存在两个结合位点，亲和性效果仍能达到。这种多聚化试剂可以是，例如，生物相容性聚合物(例如，右旋糖苷或其它多糖)，抗-FLAG抗体的Fab片段和抗-六组氨酸标签抗体的一个Fab片段缀合到所述生物相容性聚合物(多聚化试剂的详细讨论见下文)。无论是否含仅一个或两个或更多个结合配偶体C的一个或两个受体结合试剂用于本发明，结合配偶体C和多聚化试剂的任意结合都可被选出，只要结合配偶体C和多聚化试剂的结合位点Z在(多价)复合物中能可逆地多聚化从而引发亲和性效果，如美国专利7,776,562或国际专利申请WO 02/054065中所述。
在一些说明性性实施例中，配偶体可选自以下：
(a)结合配偶体C包含生物素，而多聚化试剂包含可逆结合至生物素的链霉亲和素类似物或抗生物素蛋白类似物。
(b)结合配偶体C包含可逆结合至链霉亲和素或抗生物素蛋白的生物素类似物，而多聚化试剂包含可逆结合至所述生物素类似物的链霉亲和素、抗生物素蛋白、链霉亲和素类似物、或抗生物素蛋白类似物，或
(c)结合配偶体C包含链霉亲和素或抗生物素蛋白结合肽，而多聚化试剂包含可逆结合至所述链霉亲和素或抗生物素蛋白结合肽的链霉亲和素、抗生物素蛋白、链霉亲和素类似物、或抗生物素蛋白类似物。在这些实施例中的一些实施例中，结合配偶体可包含链霉亲和素结合肽Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys，而所述多聚化试剂包含链霉亲和素类似物Va144-Thr45-Ala46-Arg47或链霉亲和素类似物Ile44-Gly45-Ala46-Arg47，这两种多聚化试剂例如描述于美国专利6,103,493，市售商标为
链霉亲和素结合肽可以是，例如，单一肽，如描述于美国专利5,506,121的
，例如，或具有如国际专利申请WO 02/077018所述的顺序排列的两个或更多个单个结合分子的链霉亲和素结合肽。
在另一些实施例中，仅使用了一个结合配偶体C，其中结合配偶体C与所述多聚化试剂的所述至少2个结合位点Z之间的结合在二价阳离子存在下发生。在这种实施例的一个说明性实例中，结合配偶体C包含钙调蛋白结合肽，而多聚化试剂包含例如如美国专利5,985,658中描述的多聚体钙调蛋白。或者，结合配偶体C可包含FLAG肽，而所述多聚化试剂可包含结合至FLAG肽的抗体，如FLAG，其结合至如美国专利4,851,341中所描述的单克隆抗体4E11。在另一个说明性实例中，结合配偶体包含寡聚组氨酸标签，而多聚化试剂包含结合至寡聚组氨酸标签的抗体或过渡金属离子。所有这些结合复合物的破裂可通过金属离子螯合来完成，如钙螯合，如通过添加EDTA或EGTA。钙调蛋白，抗体如4E11或螯合的金属离子或游离的螯合剂可通过常规方法被多聚化，如通过生物素化和与链霉亲和素或抗生物素蛋白或其多聚体或通过将羧酸残基导入多糖中，所述多糖如葡聚糖，基本上如Noguchi,A.,Takahashi,T.,Yamaguchi,T.,Kitamura,K.,Takakura,Y.,Hashida,M.&Sezaki,H.(1992).“Preparation and properties of the immunoconjugate composed of anti-humancolon cancer monoclonal antibody and mitomycin C dextranconjugate.Bioconjugate Chemistry 3,132-137”中第一步所描述并且使用第二步中常规的碳二亚胺化学使钙调蛋白或抗体或螯合金属离子或游离螯合剂经由伯胺基与多糖如葡聚糖主链上的羧基耦合。
在这种实施例中，所述结合配偶体C与所述多聚化试剂的所述至少两个结合位点Z之间的结合可以通过金属离子螯合破裂。金属离子螯合可以通过例如添加EDTA来完成。
本发明所述方法中，多聚化试剂也可以是链霉亲和素或抗生物素蛋白或者链霉亲和素或抗生物素蛋白的任意类似物的低聚物或聚合物。该低聚物或聚合物可以通过多糖交联。在一个实施例中，链霉亲和素或抗生物素蛋白或者链霉亲和素或抗生物素蛋白的类似物的低聚物或聚合物通过将羧基残基导入多糖如葡聚糖中来制备，基本上如“Noguchi,A.,Takahashi,T.,Yamaguchi,T.,Kitamura,K.,Takakura,Y.,Hashida,M.&Sezaki,H.(1992).“Preparation and properties of the immunoconjugate composed of anti-humancolon cancer monoclonal antibody and mitomycin C dextranconjugate.Bioconjugate Chemistry 3,132-137”中第一步所描述。然后使用第二步中常规的碳二亚胺化学使链霉亲和素或抗生物素或其类似物经由内部赖氨酸残基和/或游离N-末端的伯胺基耦合到葡聚糖主链的羧基上。但是，链霉亲和素或抗生物素蛋白或者链霉亲和素或抗生物素蛋白的任意类似物的交联的低聚物或聚合物也可通过经由双官能团连接物如戊二醛(glutardialdehyde)或通过文献中描述的其他方法交联获得。
在本发明所述染色法的另一个实施例中，结合配偶体C包含抗原，而多聚化试剂包含针对所述抗原的抗体或抗体片段。这种抗原可以是，例如，表位标签。合适的表位标签的实例包括，但不限于，Myc-标签(序列：EQKLISEEDL)、HA-标签(序列：YPYDVPDYA)、VSV-G-标签(序列：YTDIEMNRLGK)、HSV-标签(序列：QPELAPEDPED)、V5-标签(序列：GKPIPNPLLGLDST)或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，仅仅列举几个。在另一个实施例中，结合配偶体C包含麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)或硫氧还蛋白作为抗原。在这些情况下，多聚化试剂(抗体)的所述至少两个结合位点Z与抗原之间形成的复合物可通过添加游离抗原即如Myc-标签或HA-标签(表位标签)的游离肽或游离蛋白(如MBP或CBP)来破坏。在本文中，需要注意的是在FLAG-标签(序列：DYKDDDDK)用作结合配偶体而多聚化试剂包含结合FLAG标签的抗体或抗体片段的情况下，也可通过添加游离FLAG肽来破坏这一可逆键合。
在本发明所述方法中，特异性地结合至所述受体分子的受体结合试剂的所述至少一个结合位点B可以是例如抗体或二价抗体片段如(Fab)2’-片段、二价单链Fv片段。其也可以是二价蛋白质性人工结合分子，如又被称为“duocalin”的二聚体脂质运载蛋白突变蛋白。在其它实施例中，受体结合试剂可具有单个结合位点B，即为单价的。单价受体结合试剂的实例包括，但不限于，单价抗体片段、具有抗体样结合特性的蛋白质性结合分子或MHC分子。
单价抗体片段的实例包括，但不限于Fab片段、Fv片段、和单链Fv片段(scFv)。
特异性结合受体分子的可用作受体结合试剂的具有抗体样结合特性的蛋白质性结合分子的实例包括，但不限于，适配体、基于脂质运载蛋白家族的多肽的突变蛋白、重组蛋白(glubody)、基于锚蛋白支架的蛋白、基于结晶支架的蛋白、adnectin、高亲和性多聚体(avimer)、EGF-样结构域、三环结构域(Kringle-domain)、纤连蛋白Ⅰ型结构域、纤连蛋白Ⅱ型结构域、纤连蛋白Ⅲ型结构域、PAN结构域、G1a结构域、SRCR结构域、库尼茨(Kunitz)/牛胰蛋白酶抑制剂结构域、淀粉酶抑肽(tendamistat)、Kazal-型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域、三叶(P-型)结构域、血管性血友病因子C型结构域、过敏毒素样结构域、CUB结构域、甲状腺球蛋白Ⅰ型重复序列、LDL受体A类结构域、Sushi结构域、Link结构域、凝血酶敏感蛋白Ⅰ型结构域、免疫球蛋白结构域或免疫球蛋白样结构域(例如，结构域抗体或骆驼重链抗体)、C型凝集素结构域、MAM结构域、血管性血友病A型结构域、生长调节素B结构域、WAP型四二硫化物核心结构域、F5/8C型结构域、血红素结合蛋白结构域、SH2结构域、SH3结构域、层粘连蛋白型EGF样结构域、C2结构域、“Kappabodies”(Ill.等."Design and construction of ahybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chainvariable regions"Protein Eng 10:949-57(1997))、“微抗体”(Martin等."Theaffinity-selection of a minibody polypeptide inhibitor of human interleukin-6"EMBO J 13:5303-9(1994)),"Janusins"(Traunecker等."Bispecific single chainmolecules(Janusins)target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells"EMBO J10:3655-3659(1991)和Traunecker等."Janusin:new molecular design for bispecificreagents"Int J Cancer Suppl 7:51-52(1992))、纳米抗体、adnectin、四连接素、微体(microbody)、affilin、亲和体或锚蛋白、晶状体蛋白、knottin、泛素、锌指蛋白、自体荧光蛋白、锚蛋白或锚蛋白重复蛋白或富含亮氨酸重复蛋白、avimer(Silverman,Lu Q,BakkerA,To W,Duguay A,Alba BM,Smith R,Rivas A,Li P,Le H,Whitehorn E,Moore KW,Swimmer C,Perlroth V,Vogt M,Kolkman J,Stemmer WP 2005,Nat Biotech,Dec；23(12):1556-61,E-Publication in Nat Biotech.2005Nov 20edition)；以及通过人受体结构域家族的外显子穿梭进化来的多价avimer蛋白，如还描述于Silverman J,Lu Q,Bakker A,ToW,Duguay A,Alba BM,Smith R,Rivas A,Li P,Le H,Whitehorn E,Moore KW,Swimmer C,Perlroth V,Vogt M,Kolkman J,Stemmer WP,Nat Biotech,Dec；23(12):1556-61,E-Publication in Nat.Biotechnology.2005Nov 20版。
在本发明所述方法中，使包含靶细胞的混合物与受体结合试剂和多聚化试剂接触可在任一合适的温度下进行，例如如美国专利7,776,562或国际申请专利WO 02/054065中描述。通常情况下，使包含靶细胞的混合物与受体结合试剂和多聚化试剂接触和之后所述试剂的移除可在这样的温度下进行，在该温度下，在T细胞将被染色或分离的情况下，基本上没有可能导致靶细胞如T细胞表型改变的活化和/或信号事件发生。在一些更优选的实施例中，接触在温度≤15℃或≤4℃下进行。
在发明所述方法中，几乎任一所述具有至少一个用于染色或分离靶细胞的共同受体分子的靶细胞都可使用。为了达到亲和性效力，受体分子通常于靶细胞表面上以两个或更多个拷贝存在。在典型的实施例中，靶细胞是哺乳动物细胞或真核或原核细胞。同样，定义靶细胞群的所述至少一个相同(特异性)受体可以是针对如上述可被靶向的受体结合试剂的任一受体。例如，受体可为定义细胞群或亚群的抗原，如血细胞群或亚群，如淋巴细胞(如T细胞、T辅助细胞，例如，CD4+T辅助细胞、B细胞或自然杀伤细胞)、单核细胞或干细胞，如CD34阳性外周血干细胞或Nanog或Oct-4的表达干细胞。T细胞的实例包括如CMV特异性CD8+ T淋巴细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞和调节性T细胞(Treg)。Treg的一个说明性实例是CD4+CD25+CD45RA Treg细胞，而记忆T细胞的一个说明性实例是CD62L+CD8+特异性中心记忆T细胞。受体也可是肿瘤细胞的标记物。在本文中，需要注意的是，本文所用术语“靶细胞”包括所有生物实体/囊泡，其中膜(也可以使脂质双层)将内部与外部环境隔开并且包含在生物实体表面上的特异性受体分子。这种实体的实例包括，但不限于，病毒、脂质体和细胞器如线粒体、叶绿体、细胞核或溶酶体。
一旦被分离，则靶细胞群的特征在于受体结合试剂已经从所述受体上基本完全移除(通常低于检测限，例如用FACS检测到的)。受体结合试剂的完全移除是通过使用如上所述具有高koff速率的可逆多聚化受体结合试剂完成的。通过这样做，可以提供没有被纯化方法改变的具有功能状态的个靶细胞群(由具有共同特异性受体定义)。
靶细胞群或其中膜(也可以是脂质双层)将内部与外部环境隔开且进一步表征为在表面包含共同特异性受体分子的任意其他生物实体群可以在之后移除使用的任何纯化试剂(受体结合试剂；多聚化试剂；标记物)的情况下通过本发明所述方法纯化这一事实提供了下述监管优势(超出了如果目标是细胞或细胞器，其生理状态不会被改变的优势)，即在这种经纯化的生物实体作为药物时，纯化试剂不会给药到患者。在这种情况下，监管当局如FDA(美国)或EMEA(欧洲)比将纯化试剂与为细胞或脂质体的药物一起给药的情况下需要就所述纯化试剂的生产过程需要较低的成本限制。因此，明确的技术优势也存在于本发明所述实体纯化的方法，该实体的生理状态无法像对于例如脂质体那样处理，如果这种脂质体必须纯化并用作药物的话。
用于染色细胞检测的标记可以是用于诊断和分析方法中的任意标记。优选的标记对要染色或分离的细胞的性质没有负面影响。标记的实例有荧光标记(例如，藻红蛋白、藻蓝蛋白、香豆素或罗丹明，仅仅列举几个)、磁性标记、有色标记(chromophoric label)、适用于电子自旋共振/电子顺磁共振(EPR)的自旋标记物(spin label)或放射性标记。标记可以结合至受体结合试剂和/或多聚化试剂。标记可以是直接标记，即结合至如上指定的多价结合复合物成员中的一个。在这种情况下，所述标记可以，例如，共价偶联(缀合)至或者受体结合试剂或者多聚化试剂(参照携带荧光标记的多聚化试剂如图1所示的藻红蛋白)。可选地，标记可以是间接标记，即标记与其它试剂结合，该试剂反过来能结合至如上指定的多价结合复合物成员中的一个。这种标记可在多价结合复合物形成之前、之中或之后添加。这种间接标记物的实例是包含荧光染料的二、三或四-NTA，如Lata等.Am.Chem.Soc.2005,127,10205-10215或Huang等,Bioconjugate Chem.2006,17,1592-1600所描述。所述标记能非共价结合(经由金属螯合)至寡聚组氨酸标签。因此，在这一实例中，受体结合试剂和/或多聚化试剂可以携带寡聚组氨酸标签(例如，作为受体结合试剂的Fab片段，其具有寡聚组氨酸标签，如融合到CH1或CL-结构域C-末端的六组氨酸标签或链霉亲和素突变蛋白如作为多聚化试剂的
其具有融合到其一个可用亚基的N-或C-末端)，由此被用于非共价结合Lata等上文或Huang等上文描述的基于NTA的荧光染料化合物。这种非共价结合标记不一定需要在多价结合复合物形成前结合至其靶标(受体结合试剂和/或多聚化试剂)，但是也能够在多价结合复合物形成时或多价结合复合物已经形成后添加至样品中。这种非共价结合标记也可在多价结合复合物结合至靶细胞后添加。除了包含NTA的荧光染料:以上描述的寡聚组氨酸结合对，或其他任意特异性结合对如，例如，携带可用于间接标记的荧光或其它标记的地高辛(digoxigenin)和抗地高辛抗体或抗体片段。在这种情况下，受体结合试剂和/或多聚化试剂缀合到地高辛或携带所选的结合至(经由地高辛)多聚化试剂或受体结合试剂的标记的抗地高辛抗体或抗体片段/与前述物质结合。
在本发明所述方法的实施例中，靶细胞被染色并任选地通过至少两个不同(预先选择的)受体分子的组将其分离。代表超过一个共同受体的靶细胞的分离可以通过以顺序方式实施本发明所述方法进行，其中每个循环中使用相应的受体结合试剂。在这种情况下，相同的标记可用于每个循环。或者，当不同标记用于每个受体分子时，靶细胞的同时标记是可能的。这样的顺序细胞富集和/或(同时)多参数染色使用两种不同的受体结合试剂，每种受体结合试剂包含特异性结合至至少两个不同受体分子的组中的预选受体分子的至少一个结合位点B。示例地说，所述至少两个不同受体分子可以是不同的CD标记物，如CD4+CD25+调节性T细胞或CD62L+CD8+特异性中央记忆T细胞。细胞可以是，例如，抗原特异性T细胞如CMV-特异性CD8+T细胞，其能通过首先选择CD8+T细胞、随后通过第二步染色和分离CMV-特异性靶群如HLA-B8/IE1K199-207-特异性CD8+T细胞而被分离。
在这种实施例中，结合至至少两个不同受体分子的组的第二或任一其它受体分子的受体结合试剂可以进一步包含至少一个结合配偶体C。
对于第二受体分子的染色，经由结合位点B特异性结合的受体结合试剂与所述第二或任一其它受体分子之间的结合的解离速率常数(koff)也具有0.5×10-4sec-1或更大的koff速率。备选地，根据美国专利7,776,562或国际专利申请WO 02/054065中的方法，所述第二或任一其它受体分子与特异性结合所述第二或任一其它受体分子的所述受体结合试剂之间的结合的解离常数(Kd)范围可以为10-2至10-7M。
如上述讨论，本发明所述染色方法可用于由存在至少一种共同特异性受体分子定义的细胞群的分离。由存在至少一种共同特异性受体分子定义的细胞群可以是，例如，T细胞群，包括如抗原特异性T细胞群。这些纯化的细胞群可以用于例如过继转移或免疫疗法。
本发明所述方法也可用于T细胞群的功能状态的测定，或T细胞群的纯化以用于体外扩增。
更详细的和根据美国专利7,776,562的公开，本发明所述方法允许靶细胞群如T细胞群的基于可逆染色过程的功能性分离。靶细胞如T细胞的最初功能状态可以在识别和纯化后基本保持。因此，本发明所述方法对基础研究和临床应用具有广泛益处。
优选的应用实例如下：
基础研究
淋巴细胞如包括如抗原特异性T细胞群的T细胞的功能状态的直接离体研究。提出在体外T细胞群的功能状态为高度多样化且依赖于特定的体内条件，但是由于缺乏合适的检测工具，这些方面仅是稍微了解。例如，如此处描述，使用Fab多聚体可以对表位特异性T细胞群独立于其功能状态进行鉴定并纯化。然而，不可逆试剂的结合干扰了随后的功能测定。可逆的T细胞染色如采用配备链霉亲和素结合肽/
试剂的Fab片段，是一种允许不变的多样化T细胞群的直接功能离体研究的技术。
T细胞群的纯化以用于体外高效扩增。离体得到的T细胞群的表征常需要进一步在体外扩增到T细胞系或T细胞克隆。
采用Fab多聚体技术，可分离单细胞或不同T细胞群中的不同表型的亚群，但是所述试剂与TCR的结合干扰了体外扩增效率。这一实验难题通过使用本发明所述试剂进行可逆T细胞染色来解决，所述试剂如，
试剂。这种Fab片段可携带如国际专利申请公开WO 02/077018中描述的作为结合配偶体的具有顺序排列的两个或更多个单个结合组件的链霉亲和素结合肽。
T细胞群的纯化以用于过继转移实验。在免疫学研究中许多体内实验需要将纯化的T细胞过继转移至受体动物中。转移的T细胞群的纯度和发生在分离过程中的细胞中可能的改变都是在这些实验系统中关注的。细胞群的最高纯度通过正相选择法得到，但是用于鉴定的标记物(通常为抗体)很难从分离的细胞表面移除并且可能干扰随后的体内实验结果。
采用本发明试剂如
试剂的可逆T细胞染色允许正相选择法与随后的筛选标记物的移除组合使用并且可以大大提高过继转移实验。
临床应用
T细胞群的纯化以用于高效体外扩增。人T细胞系或克隆的产生(如病原体/肿瘤特异性或自身反应性T细胞)在临床研究、诊断和免疫治疗的许多领域是必须的。体外培养常常被用于抗原特异性刺激的条件标准化的难题所限制。对T细胞群纯化的改进策略可以大大增加体外扩增效率，从而允许使用抗原-非依赖性刺激如促细胞分裂剂和抗-CD3。采用本发明，如用
或
试剂(作为受体结合试剂)和
多聚化试剂，T细胞群可以直接离体分离并在试剂离解后体内扩增。这种方法预期比使用例如常规的不可逆MHC多聚化试剂更高效，因为试剂的结合会负面的干扰体外T细胞扩增的效率。
T细胞群从体外扩增细胞系或克隆体中的纯化，以用于更进一步的功能分析或治疗。T细胞的体外扩增需要向培养物中添加抗原呈递细胞或饲养细胞。对于进一步的功能分析，尤其是对于治疗应用(如过继转移)，其可有助于移除这些污染的细胞。对于正相选择程序(通常结果是最高程度的纯度)，筛选标记物应当从T细胞表面移除，因为其会干扰功能测定或过继转移。如果T细胞用于体内应用，筛选标记物如包含能够引起临床并发症如过敏反应的物质则必须被进一步移除。如使用
或
试剂/
试剂的可逆T细胞染色满足全部这些标准。
用于“直接过继免疫治疗”的T细胞群的离体纯化。T细胞群直接离体分离后立即将细胞转移至受体中(没有任何更进一步的体外繁殖)具有特殊的临床价值。预期直接分离的细胞群比用于体内用途的培养的细胞更有效。需要极高数量的体外扩增T细胞进行有效的过继转移，这一现象最可能是由于T细胞对体外培养条件的适应性造成的。这一过程的一个重要的临床应用实例是EBV和/或CMV-特异性T细胞群在[否则]消耗T细胞(T cell-depleted)的干细胞移植中的平行纯化和过继转移，这是一个可能显著减少在移植患者中EBV和CMV-相关恶性肿瘤发生率的程序。如使用
或
作为受体结合试剂和
作为多聚化试剂的可逆T细胞染色和分离是用于这些临床用途非常合适的方法。例如，MHCⅠ分子(融合至链霉亲和素结合肽)允许从供体血液白细胞得到的高纯度CMV特异性CD8+T细胞的分离；然后这种纯化细胞直接转移至患有危及生命的CMV疾病的免疫功能低下的患者中(如经同种异基因干细胞移植)。参见Schmitt等,(2011)TRANSFUSION,Volume 51,pp.591-599中关于这方面的内容。其它的实例包括用于过继转移的纯化的Treg细胞群，以用于治疗自身免疫疾病如移植物抗宿主病(GvHD)或移植物排斥或Ⅰ型糖尿病、肠炎或过敏症。用于这些目的的Treg靶细胞群可以是CD4+CD25+CD45RA+Treg细胞，这些细胞被使用三个受体结合试剂如特异性结合CD4受体分子、CD25受体分子或CD45RA受体分子的Fab片段以顺序方式染色/分离。其它的实例包括自然杀伤性细胞经由CD56受体分子(也被称为神经细胞粘附分子(NCAM))或造血干细胞如CD34+、CD59+、Thy1/CD90+、CD38lo/-、CD133+或Ckit/CD117+造血干细胞经由相应细胞表面受体分子的分离。
功能性T细胞诊断
MHC多聚体技术允许抗原特异性T细胞直接地离体定量和表型表征。但是，多聚化试剂与TCR的结合使得在功能测定时(如慢性病毒感染[HIV、CMV、EBV、HBV、HCV]、肿瘤特异性T细胞群)纯化细胞的使用复杂化。
如使用
试剂的可逆T细胞染色和分离打开了在许多临床情况中有力地评价这种T细胞状态的大门。
通过以下的实验实例本发明将得到进一步证明。
实施例
材料和方法
血液样品
从外周血或血沉棕黄层中在Biocoll分离液中通过离心得到新鲜PBMC。外周血是从医学微生物学、免疫学和卫生学研究所(慕尼黑工业大学)处的健康成人供者得到的，而血沉棕黄层是从慕尼黑德国心脏中心(巴伐利亚州和慕尼黑工业大学)的麻醉学研究所处的自体献血供者得到的。从供者处得到了签署的知情同意书，且血样的使用根据国家法律已由当地机构审查委员会(Ethikkommission der Medizinischen
derTechnischen
)批准。
作为受体结合试剂的Fab片段的产生(克隆、表达、纯化)
源自单克隆抗CD4抗体13B8.2的可变结构域使用美国专利7,482,000和Bes,C.,等J Biol Chem 278,14265-14273(2003)中描述的序列通过基因合成得到。之后得到的可变序列与编码人恒定区Ch1型1重链和kappa轻链的序列连接，并且重链在羧基末端与顺序排列的两个链霉亲和素结合模件(SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK)融合，所述模件作为One-STrEP-标签亲和标签从德国IBA GmbH,
商购得到。所有的克隆通过使用
克隆系统(IBA GmbH,
德国)和适于所述Fab表达的融合载体进行。PCR诱变应用于引入氨基酸置换。克隆后，Fab-One-STrEP-标签融合蛋白在大肠杆菌菌株JM83中表达(
A.&Skerra,A.Expression of functional antibody Fv and Fabfragments in Escherichia coli.Methods Enzymol 178,497-515(1989))。周质表达后，Fab片段经由
超流柱(IBA)通过One-STrEP-标签/
亲和色谱法纯化(Schmidt,T.G.&Skerra,A.The
system for one-step purificationand high-affinity detection or capturing of proteins.Nat Protoc 2,1528-1535(2007))，从用于通过渗析从柱中洗脱相应Fab的脱硫生物素中释放，且由此转移至PBSpH7.4缓冲液中并于4℃下或冰冻下(-20℃)储存于PBS pH7.4。
多聚化、染色和FACS分析
对于CD4受体分子特异性靶细胞群在细胞混合物中的染色，采用标记有作为荧光标记的藻红蛋白的
(IBA GmbH,
德国)与如下所述的抗体13B8.2变体的单体CD4结合Fab-One-STrEP片段一起用作多聚化试剂。对于FACS分析，使5×106个PBMC与作为受体结合试剂的Fab多聚体和作为多聚化试剂的0.7μg
PE(IBAGmbH,
德国)使用下述方案一起孵育，所述Fab多聚体由0.2μg Fab-片段(包含结合位点B)与配有的One-STrEP-标签(结合配偶体C)组成。另外，在FACS分离后，每个染色细胞的部分中的多价复合物通过如下所述添加生物素被破裂。对照抗体染色通过相应抗体的伴随应用进行：抗-CD4(OKT4)(来自eBiosciences公司，San Diego,CA,美国)。在本发明的染色过程后，细胞随后用碘化丙碇染色从而识别活的/死的细胞。
5×106个细胞用受体结合试剂和多聚化试剂染色的实验方案
1.用0.2μg单体CD4结合Fab-One-STrEP片段在黑暗中4℃下孵育0.75μg Strep-Tactin PE 30分钟。
2.5×106个预先冷却的细胞用10ml缓冲液IS(在pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中0.5％BSA(w/v)，其中PBS＝0.86mM Na2HPO4 1.47mM KH2PO4,137mM NaCl)在15ml反应试管中洗涤来移除潜在的成分，如例如，会干扰随后程序的D-生物素。
3.细胞重新悬浮在50μl缓冲液IS中并转移至适于染色的反应容器中，如96孔圆底微量滴定板。
4.将从步骤1得到的预先孵育的Fab-Streptamer制剂加入到细胞中并通过温和抽吸充分混合。
5.混合液在黑暗中4℃下培养20分钟。
6.细胞通过离心法(400xg,2min)在200μl缓冲液IS中洗涤三次。
7.现在细胞已经处理好并用于FACS分析或FACS分选，FACS分析在CyAn ADP Lx(Beckman Coulter)上进行并且用FlowJo软件(TreeStar)分析。
多价体复合物的解离和随后的受体结合试剂用D-生物素从5×106个细胞中移除
的实验方案
1.通过离心(400xg)收集5×106个染色的细胞(见上文)并重新悬浮于包含1mM D-生物素的3ml缓冲液IS中并在4℃下孵育10分钟。
2.通过离心沉降细胞并弃去上清液。
3.重复步骤1和步骤2。
4.将细胞重新悬浮于10ml缓冲液IS中并在25℃下孵育养10分钟(对于用作受体结合试剂的CD4结合Fab片段的解离)。
5.通过离心沉降细胞并弃去上清液。
6.步骤4和步骤5重复3次。
结果
可逆的Fab-多聚体染色的原理
本发明的基础来自这一令人惊奇的发现，即受体结合试剂，如对细胞受体具有Kd<10-7低至10-10的高亲和性的单体Fab分子，需要通过多聚化试剂被多聚化从而稳定地结合到靶细胞，并能经配偶体C与多聚化试剂的结合位点Z之间相互作用的靶向破裂从细胞表面完全移除(图1)。更进一步的发现是，这种可逆染色的关键分子基础不是细胞表面受体分子与受体结合试剂上的结合位点B之间相互作用的亲和性常数Kd，而是受体结合试剂从受体分子解离的逆反应速率(off rate)。逆反应速率应为0.5×10-4sec-1或更高从而受体分子结合试剂能够在合理的时间窗内完全从靶细胞移除。
为了证明是逆反应速率而不是亲和性是用于实施可逆Fab多聚体染色的必需参数这一关键发现，生成了下述针对细胞表面受体分子CD4的重组Fab片段(作为受体结合试剂)：
1)由CD4结合鼠抗体13B8.2的可变结构域和一个恒定结构域组成的Fab片段，其中恒定结构域由gamma1型人重链恒定CH1结构域和kappa型人轻链恒定结构域组成，如描述于美国专利7,482,000。所述Fab在下文表示为13.B8.2Fab片段。
2)突变体13B8.2Fab片段，其中重链100位的Phe残基突变为Ala(本文也称为CD4突变体1(F100A)和参照美国专利7,482,000表Ⅱ，名称为F100K-H)
3)突变体13B8.2Fab片段，其中轻链92位的Tyr残基突变为Ala(本文也称为CD4突变体2(Y92A)和参照美国专利7,482,000表Ⅲ，名称为Y92L)
4)突变体13B8.2Fab片段，其中重链35位的His残基突变为Ala(本文也称为CD4突变体3(H35A)和参照美国专利7,482,000表Ⅱ，名称为H35-H)
5)突变体13B8.2Fab片段，其中轻链91位的His残基突变为Ala(本文也称为CD4突变体4(H91A)和参照美国专利7,482,000表Ⅲ，名称为H91-L)
这些Fab片段具有广谱亲和性(Kd值的范围从12.5nM至16.9μM)和增加的Koff-速率；通过BIAcore测定的结合动力学总结列于下表1中。
1)所列值是Bes等人给出的3次测量的算术平均值。
2)Bes等人给出单次测量值。
3)所列值是Bes等人给出的2次测量的算术平均值。
为了引入结合配偶体C，CD4结合Fab片段的重链基因融合至串联排列的两个
II序列(SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK，作为OneSTrEP-标签序列从德国IBA GmbH,
商购得到)，并且两条链都同时在大肠杆菌周质中表达。作为受体结合试剂的功能化组装的Fab片段随后通过亲和色谱法在
树脂上纯化，且在经透析移除脱硫生物素后，在水溶性的藻红蛋白标记的
(
PE，作为多聚化试剂，为One-STrEP-标签序列提供至少2个(大约12个)结合位点Z，其中藻红蛋白作为(荧光)标记)存在下进行多聚化。经添加D-生物素(或其衍生物，如例如二氨基生物素或脱硫生物素)作为竞争配体后，链霉亲和素结合肽与链霉亲和素突变蛋白
之间的相互作用是可逆的。
对于染色和解离实验，5×106个PBMC用相应的抗-CD4 Fab-多聚体-
PE复合物或用相应的Fab-单体(后者不与
PE复合)孵育。13B8.2野生型(wt)Fab片段和所有突变体多聚化后都表现出基本上同等出色的染色信号，而只有具有较慢Koff速率(1.11x10-4s-1和4.75x10-4s-1)的13B8.2 wt Fab片段和突变体1能够以单体状态结合到它们的抗原(图2，第一列和第二列)。在D-生物素介导的多聚复合物(图2，第三列)破裂和随后的洗涤后，通过添加单独的
PE(不结合Fab)(图2，第四列)来探测残留的表面结合的Fab片段。正如单体染色实验所预期，突变体2、3和4没有能检测到残留的Fab单体，而在野生型和突变体1变体中观察到大量残留的细胞表面结合的Fab。对于突变体2、3和4，细胞可以使用Fab-多聚体标记(图2，第五列)有效地二次再染色，从而证明在细胞表面残留的Fab片段检测过程中一致的生物素移除。
除了基于流式细胞术的分析(图2)，Fab多聚体的完全移除也可通过独立的其他分析方法评估，即蛋白质印迹分析(图3)。确证了示于表2的高度敏感的FACS结果，在突变体2、3和4细胞裂解后无论是在可溶性还是不溶性细胞部分都没有检测到Fab片段，而在可溶性部分能容易地检测到野生型Fab片段。由于这一实验也可检测可能无法由FACS检测到的内化的Fab片段，在染色和释放过程中表面结合的受体结合试剂的任意显著内化都可被排除，从而确证示于图2的解释正确。与证明在所用洗涤条件下突变体1为非完全移除的FACS实验相反，蛋白质印迹实验中在类似处理的细胞中没有检测到残留的突变体1，推测是由于蛋白质印迹法的灵敏度较低。
主要令人惊奇的结果如下：由于其低亲和性(Kd为约6.2μM和16μM)Fab突变体3和4在相应的Fab片段和
PE作为多聚化试剂的多价复合物的破裂之后完全释放与美国专利7,776,562或国际专利申请WO02/054065中的教导一致，与单体野生型Fab分子(类似于突变体3和4Fab片段)相反，突变体2Fab片段的完全释放是完全无法预测的，因为突变体2的亲和性(Kd＝14.75±2.25nM)确定为明显高于野生型(Kd＝29.17±3.27nM)和所有其它突变体。但是突变体2比野生型Fab片段和Fab突变体1具有快得多的逆反应速率(koff＝10.80±1.91x10-4s-1；也见表1)特征，表明是解离速率而不是亲和性常数在表面结合的单体Fab片段的结合稳定性中具有主导作用。根据这一解释，所有的完全可逆Fab片段(突变体2-4)(在本文定义为受体结合试剂)共有一个大于0.5×10-4s-1的快逆反应速率。但是，仍需要注意的是，在多价结合复合物的破裂时，用包含D-生物素的溶液洗涤/孵育较长时间，则野生型Fab片段和Fab突变体1(两者Koff速率都大于0.5×10-4s-1)在合理的时间窗内的完全移除是有可能的，并因此根据本发明可用作受体结合试剂。
总之，这些数据表明与受体分子经由结合位点B结合的koff速率大于0.5×10-4s-1的多聚化受体结合试剂(例如Fab-片段)可用于以稳定的方式染色细胞并且这些试剂在生理条件下可以完全从标记细胞的表面分离和移除。
本文说明性地描述的本发明可以适于在缺少本文未具体公开的任一要素或元素、一种或多种限制条件下实施。因此，例如，术语“包含”“包括”“含有”等应当被宽泛且非限制性的理解。另外，本文所采用的术语和表达是描述性的而不是限制条件，且没有使用这种术语和表达排除任何显示和描述或其部分特征的等价物的意图，但是需要认识到多种修饰可能包含在本发明要求保护的范围内。因此，应当理解尽管本发明已经通过示例性实施例和可选的特征具体公开，技术人员可以寻求体现于本文的本发明的修饰和变化，这些修饰和变异被认为包含在本发明的范围内。
本文已经广泛地且属类地描述了发明。每一个较窄的种类和落入一般公开范围亚属组都构成本发明的一部分。这包括用附加条件或从该属中除去任何主题的负面限制的本发明的一般描述，无论去除的材料是否是本发明具体描述的一部分。
其它实施例在以下权利要求内。此外，本发明的特征或方面是以马库什组的方式描述的，本领域技术人员将认识到本发明还能以马库什组的任何单个成员或成员亚组的形式来描述。
Claims (72)
1.一种使用可检测标记使靶细胞可逆染色的方法，所述靶细胞包含在其表面上的受体分子，所述方法包括：
使包含所述靶细胞的细胞混合物与下述接触：
(i)受体结合试剂，所述受体结合试剂包含至少一个结合位点B，其中所述结合位点B特异性结合至所述受体分子，其中所述受体结合试剂经由所述结合位点B和所述受体分子之间的结合的解离速率常数(koff)的值为1×10-3sec-1或更大，所述受体结合试剂进一步包含至少一个结合配偶体C，其中所述结合配偶体C能够可逆结合至多聚化试剂的结合位点Z；
(ii)多聚化试剂，所述多聚化试剂包含用于所述受体结合试剂的结合配偶体C的可逆结合的至少两个结合位点Z，
其中所述受体结合试剂和所述多聚化试剂形成结合至所述靶细胞的多价结合复合物，每个多价结合复合物包含结合至一个所述多聚化试剂的至少两个所述受体结合试剂，所述多价结合复合物相对于所述受体结合试剂提供增加的亲合力；和
(iii)所述可检测标记，所述可检测标记结合至或能够结合至所述多价结合复合物，
其中所述靶细胞通过所述多价结合复合物与所述靶细胞的结合染色，并且其中经所述受体结合试剂的所述结合配偶体C与所述多聚化试剂的所述结合位点Z之间的结合的破裂，所述靶细胞的染色是可逆的。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结合位点Z与所述配偶体C的可逆结合的解离常数(Kd)在10-2M到10-13M的范围内。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述受体结合试剂与所述受体分子之间的结合的解离速率常数(koff)的值为1.5×10-3sec-1或更大。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述受体结合试剂与所述受体分子之间的结合的解离速率常数(koff)的值为2×10-3sec-1或更大。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述受体结合试剂与所述受体分子之间的结合的解离速率常数(koff)的值为3×10-3sec-1或更大。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述受体结合试剂与所述受体分子之间的结合的解离速率常数(koff)的值为4×10-3sec-1或更大。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述受体结合试剂与所述受体分子之间的结合的解离速率常数(koff)的值为5×10-3sec-1或更大。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述受体结合试剂与所述受体分子之间的结合的解离速率常数(koff)的值为1×10-2sec-1或更大。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述受体结合试剂与所述受体分子之间的结合的解离常数(Kd)在10-2M到10-10M的范围内。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述受体结合试剂与所述受体分子之间的结合的解离常数(Kd)在10-7M至10-10M的范围内。
11.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括从存在于所述细胞混合物中的非靶细胞分离所述染色的细胞。
12.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括通过破裂所述受体结合试剂的所述结合配偶体C与所述多聚化试剂的所述结合位点Z之间的结合从所述靶细胞中移除所述染色。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述多聚化试剂的移除导致所述受体结合试剂从所述染色的细胞的解离。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其特征在于，
(a)所述结合配偶体C包含生物素，所述多聚化试剂包含可逆结合至生物素的链霉亲和素类似物或抗生物素蛋白类似物；
(b)所述结合配偶体C包含可逆结合至链霉亲和素或抗生物素蛋白的生物素类似物，所述多聚化试剂包含可逆结合至所述生物素类似物的链霉亲和素、抗生物素蛋白、链霉亲和素类似物、或抗生物素蛋白类似物，或
(c)所述结合配偶体C包含链霉亲和素或抗生物素蛋白结合肽，所述多聚化试剂包含可逆结合至所述链霉亲和素或抗生物素蛋白结合肽的链霉亲和素、抗生物素蛋白、链霉亲和素类似物、或抗生物素蛋白类似物。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述结合配偶体C包含链霉亲和素-结合肽Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys，所述多聚化试剂包含链霉亲和素类似物Va144-Thr45-Ala46-Arg47或链霉亲和素类似物Ile44-Gly45-Ala46-Arg47。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结合配偶体C与所述多聚化试剂的所述结合位点Z之间的结合在二价阳离子存在下进行。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述结合配偶体C包含钙调蛋白结合肽，所述多聚化试剂包含钙调蛋白，或
其特征在于，所述结合配偶体C包含FLAG肽，所述多聚化试剂包含能结合所述FLAG肽的抗体，或
其特征在于，所述结合配偶体C包含寡聚组氨酸标签，所述多聚化试剂包含结合所述寡聚组氨酸标签的抗体。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其特征在于，所述结合配偶体C与所述多聚化试剂的所述结合位点Z之间的结合通过金属离子螯合破裂。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述金属螯合通过添加EDTA或EGTA完成。
20.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多聚化试剂是链霉亲和素或抗生物素蛋白或者链霉亲和素或抗生物素蛋白的任意类似物的聚合物。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述多聚化试剂是链霉亲和素或抗生物素蛋白或者链霉亲和素或抗生物素蛋白的任意类似物的低聚物。
22.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述聚合物通过多糖交联。
23.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述低聚物通过多糖交联。
24.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结合配偶体C包含抗原，所述多聚化试剂包含针对所述抗原的抗体。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述抗原是表位标签。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述表位标签选自序列EQKLISEEDL所示的Myc-标签、序列YPYDVPDYA所示的HA-标签、序列YTDIEMNRLGK所示的VSV-G-标签、序列QPELAPEDPED所示的HSV-标签、序列GKPIPNPLLGLDST所示的V5-标签和谷胱甘肽-S-转移酶中的一种。
27.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述抗原包含蛋白质。
28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述蛋白质选自麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)或硫氧还蛋白中的一种。
29.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，特异性结合至所述受体分子的所述受体结合试剂选自具有抗体样结合特性的蛋白质性结合分子和MHC分子中的一种。
30.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，特异性结合至所述受体分子的所述受体结合试剂选自抗体、二价抗体片段和单价抗体片段中的一种。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，所述二价抗体片段是(Fab)2’-片段或二价单链Fv片段。
32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述单价抗体片段选自Fab片段、Fv片段和单链Fv片段(scFv)中的一种。
33.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述具有抗体样结合特性的蛋白质性结合分子选自适配体、基于脂质运载蛋白家族的多肽的突变蛋白、重组蛋白、基于锚蛋白支架的蛋白、基于结晶支架的蛋白、纤连蛋白、和高亲和性多聚体中的一种。
34.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接触在温度≤15℃下进行。
35.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，所述接触在温度≤4℃下进行。
36.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是哺乳动物细胞。
37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞是淋巴细胞或干细胞。
38.根据权利要求37所述的方法，其特征在于，所述淋巴细胞是T细胞、T辅助细胞、B细胞或自然杀伤细胞。
39.根据权利要求38所述的方法，其特征在于，所述T细胞选自CMV-特异性CD8+T淋巴细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞和调节性T细胞中的一种。
40.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可检测标记是荧光染料或磁性标记。
41.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，靶细胞通过一组至少两种不同受体分子的方式顺序染色和分离，其中采用至少两种不同受体结合试剂，每种受体结合试剂包含特异性结合至所述至少两种不同受体分子的组中的预选受体分子的结合位点B。
42.根据权利要求41所述的方法，其特征在于，结合至所述至少两种不同受体分子的组的第二或任何其它受体分子的受体结合试剂进一步包含能够被多聚化试剂的结合位点Z结合的至少一个结合配偶体C。
43.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，所述受体结合试剂经由所述结合位点B与所述第二受体分子特异性结合之间的结合的解离速率常数(koff)的值为2×10-4sec-1或更大。
44.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，所述第二或任何其它受体分子与特异性结合所述第二或任何其它受体分子的所述受体结合试剂之间的结合的解离常数(Kd)在10-2至10-7M的范围内。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的方法在由存在至少一种共同特异性受体定义的细胞群的分离中的用途。
46.根据权利要求45所述的用途，其特征在于，所述由存在共同特异性受体定义的细胞群是淋巴细胞群或干细胞群。
47.根据权利要求46所述的用途，其特征在于，所述淋巴细胞群是抗原特异性T细胞群、T辅助细胞群、B细胞群或自然杀伤细胞群。
48.根据权利要求47所述的用途，其特征在于，所述T细胞选自CMV特异性CD8+T淋巴细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞和调节性T细胞中的一种。
49.根据权利要求46所述的用途，其用于所述淋巴细胞群或所述干细胞群的功能状态的测定。
50.根据权利要求46所述的用途，其用于淋巴细胞群的纯化以用于体外扩增。
51.根据权利要求46所述的用途，其用于干细胞群的纯化，所述干细胞群用于再生治疗。
52.根据权利要求51所述的用途，其特征在于，所述干细胞群是CD34+特异性群或Nanog+群。
53.根据权利要求46所述的用途，其特征在于，所述细胞群为用于调节免疫应答的CD4+T辅助细胞。
54.根据权利要求46所述的用途，其用于淋巴细胞群的纯化，所述淋巴细胞群用于过继转移、癌症治疗、细菌感染治疗、病毒感染治疗或免疫疗法。
55.根据权利要求54所述的用途，其特征在于，经纯化的细胞群是对相关抗原特异性的CD8+T细胞，对白血病相关抗原特异性的CD8+T细胞，对黑色素瘤相关抗原特异性的CD8+T细胞，或对病毒抗原特异性的CD8+T细胞。
56.根据权利要求55所述的用途，其特征在于，所述对病毒抗原特异性的CD8+T细胞为巨细胞病毒(CMV)磷蛋白65-特异性CD8+T细胞或EB病毒-EBNA抗原-特异性CD8+T细胞。
57.根据权利要求54所述的用途，其特征在于，经纯化的细胞群是用于自身免疫疾病、Ⅰ型糖尿病、肠炎、或过敏治疗的Treg细胞。
58.根据权利要求57所述的用途，其特征在于，所述自身免疫疾病是移植物抗宿主病(GvHD)或移植物排斥反应。
59.根据权利要求57所述的用途，其特征在于，所述Treg细胞群是CD4+CD25+CD45RA+Treg细胞。
60.根据权利要求54所述的用途，其特征在于，经纯化的细胞群是CD62L+CD8+特异性中央记忆T细胞。
61.一种用于使用可检测标记使靶细胞可逆染色的试剂盒，所述靶细胞包含在其表面上的受体分子，所述试剂盒包含：
(i)至少一种受体结合试剂，所述至少一种受体结合试剂包含特异性结合至所述受体分子的结合位点B，其中所述受体结合试剂经由所述结合位点B和所述受体结合分子之间的结合的解离速率常数(koff)的值为1×10-3sec-1或更大，并且所述受体结合试剂进一步包含至少一个结合配偶体C，其中所述结合配偶体能够被多聚化试剂的结合位点Z可逆结合；
(ii)至少一种多聚化试剂，所述至少一种多聚化试剂包含用于所述受体结合试剂的所述结合配偶体C的至少两个结合位点Z，其中所述结合配偶体C与所述多聚化试剂的所述结合位点Z能够形成可逆键合；
(iii)可检测标记，所述可检测标记结合至或能够结合至所述受体结合试剂和/或所述多聚化试剂。
62.根据权利要求61所述的试剂盒，其特征在于，所述结合配偶体C与所述结合位点Z之间的结合的解离常数(Kd)在10-2至10-13M的范围内。
63.特异性结合至受体分子的受体结合试剂在根据权利要求1-44中任一项所述的使靶细胞可逆染色的方法中的用途，所述受体结合试剂包含至少一个结合位点B，其中所述结合位点B特异性结合至所述受体分子，其中所述受体结合试剂经由所述结合位点B与所述受体分子之间的结合的解离速率常数(koff)的值为1×10-3sec-1或更大。
64.根据权利要求63所述的用途，其特征在于，所述受体结合试剂选自具有抗体样结合性质的蛋白质性结合分子和MHC分子中的一种。
65.根据权利要求64所述的用途，其特征在于，所述受体结合试剂选自抗体、二价抗体片段和单价抗体片段中的一种。
66.根据权利要求65所述的用途，其特征在于，所述二价抗体片段是(Fab)2’-片段、二价单链Fv片段或双特异抗体。
67.根据权利要求66所述的用途，其特征在于，所述单价抗体片段选自Fab片段、Fv片段、和单链Fv片段(scFv)中的一种。
68.根据权利要求64所述的用途，其特征在于，所述具有抗体样结合性质的蛋白质性结合分子选自适配体、基于脂质运载蛋白家族的多肽的突变蛋白、重组蛋白、基于锚蛋白支架的蛋白、基于结晶支架的蛋白、纤连蛋白、和高亲和性多聚体中的一种。
69.一种使用可检测标记使靶细胞可逆染色的方法，所述靶细胞包含在其表面上的受体分子，所述方法包括：
使包含所述靶细胞的细胞物与下述接触：
(i)至少两种受体结合试剂，每种所述受体结合试剂包含至少一个结合位点B，其中每种受体结合试剂的所述结合位点B特异性结合至所述受体分子，其中每种所述受体结合试剂经由所述结合位点B和所述受体分子之间的结合的解离速率常数(koff)的值为1×10- 3sec-1或更大，每种所述受体结合试剂进一步包含至少一个结合配偶体C，其中每种受体结合试剂的结合配偶体C能够可逆结合至多聚化试剂的结合位点Z；
(ii)多聚化试剂，所述多聚化试剂包含用于每种所述受体结合试剂的结合配偶体C的可逆结合的至少一个结合位点Z，
其中所述至少两种受体结合试剂和所述多聚化试剂形成结合至所述靶细胞的多价结合复合物，每个多价结合复合物包含结合至一个所述多聚化试剂的每种受体结合试剂中的至少一种，所述多价结合复合物相对于每种所述受体结合试剂提供增强的亲合力；和
(iii)所述可检测标记，所述可检测标记结合至或能够结合至所述多价结合复合物，
其中所述靶细胞通过所述多价结合复合物与所述靶细胞的结合染色，并且其中经每种所述受体结合试剂的所述结合配偶体C与所述多聚化试剂的所述结合位点Z之间的结合的破裂，所述靶细胞的染色是可逆的。
70.根据权利要求69所述的方法，其特征在于，所述结合位点Z与每种受体结合试剂的所述配偶体C之间的结合的解离常数(Kd)在10-2至10-3M的范围内。
71.一种用于使用可检测标记使靶细胞可逆染色的试剂盒，所述靶细胞包含在其表面上的受体分子，所述试剂盒包含：
(i)至少两种受体结合试剂，所述至少两种受体结合试剂包含特异性结合至所述受体分子的结合位点B，其中每种所述受体结合试剂经由所述结合位点B和所述受体结合分子之间的结合的解离速率常数(koff)的值为1×10-3sec-1或更大，并且每种所述受体结合试剂进一步包含至少一个结合配偶体C，其中每种所述受体结合试剂的结合配偶体能够被多聚化试剂的结合位点Z结合，
(ii)至少一种多聚化试剂，所述至少一种多聚化试剂包含用于每种所述受体结合试剂的所述结合配偶体C的至少一个结合位点Z，其中每种结合试剂的结合配偶体C与所述多聚化试剂的所述结合位点Z能够形成可逆键合，
(iii)可检测标记，所述可检测标记结合至或能够结合至所述受体结合试剂和/或所述多聚化试剂。
72.根据权利要求71所述的试剂盒，其特征在于，所述结合位点Z与每种受体结合试剂的所述配偶体C之间的结合的解离常数(Kd)在10-2至10-3M的范围内。
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