CN116148467A - 检测翻译后修饰蛋白质与其配体间相互作用的成套试剂 - Google Patents

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CN116148467A CN202211223519.7A CN202211223519A CN116148467A CN 116148467 A CN116148467 A CN 116148467A CN 202211223519 A CN202211223519 A CN 202211223519A CN 116148467 A CN116148467 A CN 116148467A
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Abstract

本发明公开了检测翻译后修饰蛋白质与其配体间相互作用的成套试剂。本发明的成套试剂，由A、B、C和D四种试剂组成；A由名称为R的生物分子和名称为X的蛋白质连接而成；B含有名称为L的生物分子；R与L相同或不同且二者间具有相互作用，R与L相互作用后发生相变；C为由C单体形成的多聚体，C单体由名称为mc的单体、名称为甲的报告基团和名称为YC的生物分子连接得到的分子，大于等于两个的mc能形成多聚体；D由名称为XL的带有修饰的蛋白质和名称为YD的生物分子连接而成；YC与YD间具有相互作用。本发明实现了互作蛋白和配体在相变液滴中的高度富集，将弱互作信号放大，使之易于检测。

Description

检测翻译后修饰蛋白质与其配体间相互作用的成套试剂
本申请是申请日为2018年5月14日、发明名称为“检测翻译后修饰蛋白质与其配体间相互作用的成套试剂”的中国发明专利申请201810455238.1的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，检测翻译后修饰蛋白质与其配体间相互作用的成套试剂。
背景技术
“相变”作为物质的一种特性在物理界及日常生活中早已广为人知，近几年科学家们逐渐发现相变(或相分离)机制也广泛存在于生物细胞中，且在细胞生命周期的时空调控等方面行使重要的生物学功能。
目前的研究发现，当溶液中的多价的大分子与其多价配体互作时，容易产生更大的复合物，后者的溶解度一般会降低，从而从普通溶液相分离出来，形成一个复合物富集的独立的液态相，这个转变过程被称为“液-液分离相变”。其中，多价的价数是指大分子或其配体中含有的可与对方互作的结合区的数量。对蛋白互作而言，多价蛋白和它们的多价配体在体外也会发生“液-液分离相变”(简称为“相变”)现象，即可以产生一个正常的溶液相和一个蛋白富集的粘稠的液体相。在显微镜下可见蛋白富集的液体相内含有大量小液滴(即相变液滴)，液滴直径可达微米级甚至更大。如多价SH3(SRC homology 3domain)与其多价配体PRM(proline-rich motif)在一定浓度下就可以发生相变，而与SH3有更高亲和力的PRMH则可与SH3发生更强烈的相变。
在生物体内，蛋白与其配体间的相互作用是蛋白质行使其功能的主要方式。在生理条件下，蛋白之间的互作以一种动态平衡的形式存在，解离常数(Kd)通常被用来表征蛋白质相互作用的强度。根据Kd值的不同，蛋白质相互作用通常分为稳态相互作用(StableInteraction)和瞬态相互作用(Transient Interaction)，前者对应的Kd值介于皮摩尔到微摩尔之间，后者对应的Kd值大于1微摩尔。而基本上蛋白质之间瞬态相互作用即可以认为是弱蛋白质相互作用。经过修饰(包括甲基化/去甲基化、乙酰化/去乙酰化、磷酸化/去磷酸化、泛素化/去泛素化、糖基化/去糖基化等)的蛋白与其配体间的相互作用多为弱相互作用。这种弱相互作用在细胞信号转导、细胞周期调控等方面发挥重要作用。如磷酸化修饰的蛋白与其配体的弱互作可实现信号通路中磷酸基团的传递，甲基化修饰的组蛋白与其配体的弱互作可调控基因的表达等。可见，研究蛋白间的弱相互作用有助于理解重要的细胞学过程。然而目前蛋白间的弱相互作用仍然难以检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测蛋白质间的弱相互作用，尤其是经翻译后修饰的蛋白质与其配体间的相互作用，翻译后修饰是指蛋白质翻译完成后，发生在蛋白质的特定氨基酸残基上的共价修饰过程。目前已经发现300多种翻译后修饰，常见的有甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、糖基化修饰等，与蛋白质翻译后修饰相反的修饰过程为蛋白质去修饰，如去甲基化、去乙酰化、去磷酸化、去泛素化、去糖基化等。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种用于检测名称为X的蛋白质与名称为XL的带有修饰的蛋白质间是否具有相互作用的成套试剂，记为成套试剂1，所述成套试剂1由名称分别为A、B、C和D的四种试剂组成；
所述A由名称为R的生物分子和所述X连接而成；
所述B含有名称为L的生物分子；
所述R与所述L相同或不同且二者间具有相互作用，所述R与所述L相互作用后发生相变；
所述C为由C单体形成的多聚体，所述C单体为下述c1)或c2)：
c1)由名称为mc的单体、名称为甲的报告基团和名称为YC的生物分子连接得到的分子，大于等于两个的所述mc能形成多聚体；
c2)在c1)上连接标签得到的分子；
所述D由所述XL和名称为YD的生物分子连接而成；
所述YC与所述YD间具有相互作用。
上述成套试剂1中，所述YC与所述YD均可为蛋白质。
上述成套试剂1中，所述YC可为Y11)、Y12)或Y13)：
Y11)氨基酸序列是序列7的第362-465位所示的蛋白质；
Y12)将序列表中序列7的第362-465位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
Y13)在Y11)或Y12)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
所述YD可为Y21)、Y22)或Y23)：
Y21)氨基酸序列是序列11的第22-29位所示的蛋白质；
Y22)将序列表中序列11的第22-29位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
Y23)在Y21)或Y22)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
其中，序列11的第22-29位所示的KKETPV与序列7的第362-465位所示的PDZ具有相互作用。
上述成套试剂1中，所述R含有名称为结合区1的结合区；所述L含有名称为结合区2的结合区；所述R与所述L间的相互作用可通过所述结合区1和所述结合区2进行，所述R中所述结合区1和所述L中所述结合区2的个数均可大于等于2。
其中，所述结合区1和所述结合区2均为结合区，结合区是指生物分子间通过非共价键相互作用的最小单元。当所述R与所述L间有大于等于2个结合区时，如所述R中的结合区不完全相同，所述结合区1为所述R中的各结合区的统称，如所述L中的结合区不完全相同，所述结合区2为所述L中的各结合区的统称。
所述R和所述L均为多价分子。其中，多价的价数是指分子与分子间互作时一个分子中所含有的可与另一分子结合的结合区的个数，对于所述R来说，所述R的价数即为所述结合区1的个数，对于所述L来说，所述L的价数即为所述结合区2的个数。
所述R与所述L通过多价相互作用发生相变。
上述成套试剂1中，所述R可为蛋白质、核酸或多糖。所述L可为蛋白质、核酸或多糖。
上述成套试剂1中，所述A中还可连接有名称为乙的报告基团。
所述B中还可连接有名称为丙的报告基团。
上述成套试剂1中，所述乙和所述丙可相同或不同。
所述甲可不同于所述乙和所述丙。
上述成套试剂1中，所述甲、所述乙和所述丙均可为荧光报告基团。
进一步，所述甲、所述乙和所述丙均可为荧光蛋白质。
上述成套试剂1中，所述A中所述X和所述R的个数比可为大于等于1的整数。
所述C单体中所述mc、所述甲和所述YC的摩尔比可为1:1:1。
所述C单体中，所述mc、所述甲和所述YC可通过连接区或化学键相连。所述甲具体可为mCherry。
上述成套试剂1中，所述R可为由R单体形成的多聚体，所述R单体均含有名称为mr的单体，大于等于两个的所述mr能形成多聚体。
所述L可为由L单体形成的多聚体，所述L单体均含有名称为ml的单体，大于等于两个的所述ml能形成多聚体。
所述mc、所述mr与所述ml相同或至少两个相同或彼此间均不同。
上述成套试剂1中，所述R中可至少有一个单体含有所述结合区1。
所述L中可至少有一个单体含有所述结合区2。
当所述R中只有一个单体含有所述结合区1时，该单体中至少含有两个所述结合区1，当所述R中有两个或两个以上单体含有所述结合区1时，每个单体中含有所述结合区1的个数均至少为1个。
当所述L中只有一个单体含有所述结合区2时，该单体中至少含有两个所述结合区2，当所述L中有两个或两个以上单体含有所述结合区2时，每个单体中含有所述结合区2的个数均至少为1个。
所述R的含有所述结合区1的单体中，所述结合区1可连接在所述mr上。
所述L的含有所述结合区2的单体中，所述结合区2可连接在所述ml上。
所述mr与所述ml相同或不同。
上述成套试剂1中，所述R单体均可含有所述mr和所述结合区1。
所述L单体均可含有所述ml和所述结合区2。
上述成套试剂1中，所述R单体中，所述mr与所述结合区1或含有所述结合区1的生物分子可通过所述连接区或化学键相连。
所述L单体中，所述ml与所述结合区2或含有所述结合区1的生物分子可通过所述连接区或化学键相连。
所述R单体中，所述结合区1的个数至少为一个。
所述L单体中，所述结合区2的个数至少为一个。
所述R和所述L单体中，无论各部分(即所述mr或所述ml、所述结合区1或所述结合区2、所述乙或丙)的数量为1个还是多个，彼此间的连接顺序没有要求，只要能满足大于等于两个所述R单体能形成多聚体、大于等于两个所述L单体能形成多聚体，且这两种多聚体能发生相互作用且能引起相变即可。
上文中，所述连接区没有特殊要求，所述连接区只要满足可以连接所述R和所述L的每个单体中的相连两个部分且不影响二者的功能即可。所述连接区可以为多肽。所述R单体中，所述mr、所述乙与所述结合区1或含有所述结合区1的生物分子可通过所述连接区或化学键依次相连。
所述L单体中，所述ml、所述丙与所述结合区2或含有所述结合区2的生物分子可通过所述连接区或化学键依次相连。
所述R单体均至少连接一个所述X。
在本发明的一个实施例中，所述R单体的C端均通过所述连接区与所述X的N端相连。
上述成套试剂1中，所述R单体还均可含有所述乙。
所述L单体还均可含有所述丙。
上述成套试剂1中，所述R单体中，所述mr、所述乙与所述结合区1或含有所述结合区1的生物分子可通过所述连接区或化学键相连。
所述L单体中，所述ml、所述丙与所述结合区2或含有所述结合区2的生物分子可通过所述连接区或化学键相连。
上述成套试剂1中，所述R单体均可相同，所述L单体均可相同，所述C单体均可相同。
所述mr与所述ml均可为酵母蛋白SmF。酵母蛋白SmF是核糖核蛋白复合体的核心组分，其晶体结构显示它是以同源十四聚体的形式存在的。因而以SmF为载体可以实现靶蛋白的多聚化。
所述mc可为枯草芽孢杆菌蛋白Hfq。枯草芽孢杆菌蛋白Hfq以同源六聚体的形式存在，因而以Hfq为载体可以实现靶蛋白的多聚化。
所述结合区1可为序列1的第364-431位所示的SH3中与序列5的第366-380位所示的PRMH结合的区域；所述结合区2可为序列5的第366-380位所示的PRMH中与序列1的第364-431位所示的SH3结合的区域。
所述连接区可为(Gly-Gly-Ser)n或含有(Gly-Gly-Ser)n的多肽，n为大于等于2的自然数。n具体可为4或2。
所述甲可为红色荧光蛋白，如mCherry。所述乙和所述丙均可为绿色荧光蛋白，如GFP。
上述成套试剂1中，所述mr与所述ml均可为序列1的第17-102位所示的酵母SmF。
所述mc可为序列7的第17-94位所示的Hfq。
所述含有所述结合区1的生物分子可为序列1的第364-431位所示的SH3。
所述含有所述结合区2的生物分子可为序列5的第366-380位所示的PRMH。
上述成套试剂1中，所述R单体可为H1)或H2)或H3)：
H1)氨基酸序列是序列1的第17-431位所示的蛋白质；
H2)将序列表中序列1的第17-431位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
H3)在H1)或H2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
所述L单体可为I1)或I2)或I3)：
I1)氨基酸序列是序列5的第17-380位所示的蛋白质；
I2)将序列表中序列5的第17-380位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
I3)在I1)或I2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
所述C单体可为J1)或J2)或J3)：
J1)氨基酸序列是序列7的第17-465位所示的蛋白质；
J2)将序列表中序列7的第17-465位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
J3)在J1)或J2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
为了使H1)或I1)或J1)中的蛋白质便于纯化，可在H1)或I1)或J1)的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述H2)或I2)或J2)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述H2)或I2)或J2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述H2)或I2)或J2)中的蛋白质的编码基因可通过将本发明中编码所述R单体的DNA序列或编码所述L单体的DNA序列或编码所述C单体的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
本发明还提供了用于检测所述X与所述XL间是否具有相互作用的成套试剂，记为成套试剂2，所述成套试剂2由下述X1)、X2)、X3)和X4)组成：
X1)与所述R单体相关的生物材料，为下述X11)至X14)中的任一种：
X11)编码所述R单体的核酸分子；
X12)含有X11)所述核酸分子的表达盒；
X13)含有X11)所述核酸分子的重组载体、或含有X12)所述表达盒的重组载体；
X14)含有X11)所述核酸分子的重组微生物、或含有X12)所述表达盒的重组微生物、或含有X13)所述重组载体的重组微生物；
X2)与所述L单体相关的生物材料，为下述X21)至X24)中的任一种：
X21)编码所述L单体的核酸分子；
X22)含有X21)所述核酸分子的表达盒；
X23)含有X21)所述核酸分子的重组载体、或含有X22)所述表达盒的重组载体；
X24)含有X21)所述核酸分子的重组微生物、或含有X22)所述表达盒的重组微生物、或含有X23)所述重组载体的重组微生物；
X3)与所述C单体相关的生物材料，为下述X31)至X34)中的任一种：
X31)编码所述C单体的核酸分子；
X32)含有X31)所述核酸分子的表达盒；
X33)含有X31)所述核酸分子的重组载体、或含有X32)所述表达盒的重组载体；
X34)含有X31)所述核酸分子的重组微生物、或含有X32)所述表达盒的重组微生物、或含有X33)所述重组载体的重组微生物；
X4)与所述YD相关的生物材料，为下述X41)至X44)中的任一种：
X41)编码所述YD的核酸分子；
X42)含有X41)所述核酸分子的表达盒；
X43)含有X41)所述核酸分子的重组载体、或含有X42)所述表达盒的重组载体；
X44)含有X41)所述核酸分子的重组微生物、或含有X42)所述表达盒的重组微生物、或含有X43)所述重组载体的重组微生物。
上述成套试剂2中，X11)所述核酸分子可为如下x11)或x12)或x13)：
x11)编码序列是序列表中序列2的第62-1306位的cDNA分子或DNA分子；
x12)与x11)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述R单体的cDNA分子或基因组DNA分子；
x13)在严格条件下与x11)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述R单体的cDNA分子或基因组DNA分子。
X21)所述核酸分子可为如下x21)或x22)或x23)：
x21)编码序列是序列表中序列6的第62-1153位的cDNA分子或DNA分子；
x22)与x21)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述L单体的cDNA分子或基因组DNA分子；
x23)在严格条件下与x21)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述L单体的cDNA分子或基因组DNA分子。
X31)所述核酸分子可为如下x31)或x32)或x33)：
x31)编码序列是序列表中序列8的第51-1400位的cDNA分子或DNA分子；
x32)与x31)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述C单体的cDNA分子或基因组DNA分子；
x33)在严格条件下与x31)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述C单体的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
X12)所述的含有编码所述R单体的核酸分子的表达盒(R单体基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达所述R单体的DNA，该DNA不但可包括启动所述R单体基因转录的启动子，还可包括终止所述R单体基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
X22)所述的含有编码所述L单体的核酸分子的表达盒(L单体基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达所述L单体的DNA，该DNA不但可包括启动所述L单体基因转录的启动子，还可包括终止所述L单体基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
X32)所述的含有编码所述C单体的核酸分子的表达盒(C单体基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达所述C单体的DNA，该DNA不但可包括启动所述C单体基因转录的启动子，还可包括终止所述C单体基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的载体构建含有所述R单体基因表达盒或所述L单体基因表达盒或所述C单体基因表达盒的重组载体。所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pRSFDuet-1载体。
X13)所述重组载体具体可为pRSFDuet-1-SGS，所述pRSFDuet-1-SGS为将pRSFDuet-1载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列2的第12-1360位所示的DNA分子得到的重组载体。所述pRSFDuet-1-SGS能表达序列1所示的所述R单体与His-tag的融合蛋白质。
X23)所述重组载体具体可为pRSFDuet-1-SGP，所述pRSFDuet-1-SGP为将pRSFDuet-1载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列6的第12-1162位所示的DNA分子得到的重组载体。所述pRSFDuet-1-SGP能表达序列5所示的所述L单体与His-tag的融合蛋白质。
X33)所述重组载体具体可为pRSFDuet-1-Hfq-mCherry-PDZ，所述pRSFDuet-1-Hfq-mCherry-PDZ为将pRSFDuet-1载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列8所示的DNA分子得到的重组载体。所述pRSFDuet-1-Hfq-mCherry-PDZ能表达序列7所示的Hfq、mCherry、PDZ与His-tag形成的融合蛋白质。
所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，所述细菌可为大肠杆菌。
上述成套试剂1和成套试剂2中，所述修饰可为蛋白质翻译后修饰或蛋白质翻译后修饰的去修饰。所述蛋白质翻译后修饰可为甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化或糖基化修饰。所述蛋白质翻译后修饰的去修饰可为去甲基化、去乙酰化、去磷酸化、去泛素化或去糖基化。
本发明还提供了检测生物分子间是否具有相互作用的方法，所述生物分子为名称分别为X与XL的两种生物分子，所述XL为带有修饰的蛋白质，所述X为蛋白质，所述方法包括：
将溶液A、溶液B、溶液C和溶液D混合，得到待测液，所述溶液A为含有所述A的溶液；所述溶液B为含有所述B的溶液；所述溶液C为含有所述C的溶液；所述溶液D为含有所述D的溶液；所述待测液中所述A中的R与所述B中的L互作发生相变产生相变液滴；根据所述待测液中相变液滴中是否含有所述甲的信号确定所述X与所述XL间是否具有相互作用：如所述待测液中相变液滴中含有所述甲的信号，所述X与所述XL间具有或候选具有相互作用；如所述待测液中相变液滴中不含有所述甲的信号，所述X与所述XL间不具有或候选不具有相互作用。
其中，所述待测液中相变液滴中是否具有所述甲的信号是指所述待测液中所述甲的信号是否在相变液滴中得到了富集，以使相变液滴中所述甲的信号高于所述待测液中非相变液滴部分。具体的，所述根据所述待测液中相变液滴中是否具有所述甲的信号确定所述X与所述XL间是否具有相互作用可包括：如所述待测液中相变液滴中所述甲的信号得到了富集，所述X与所述XL间具有或候选具有相互作用；如所述待测液中相变液滴中所述甲的信号没有得到富集，所述X与所述XL间不具有或候选不具有相互作用。
所述溶液A可由所述A与溶剂组成，所述溶液B可由所述B与所述溶剂组成，所述溶液C可由所述C与所述溶剂组成，所述溶液D可由所述D与所述溶剂组成，所述溶剂能溶解所述A、所述B、所述C和所述D。
在本发明的一个实施例中，所述溶剂为KMEI buffer，KMEI buffer由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为：150mM KCl,1mM MgCl2,1mM EGTA,10mM imidazole,1mM DTT，pH＝7。
在本发明的一个实施例中，采用将蛋白质与已知的多价酵母蛋白SmF或枯草芽孢杆菌蛋白Hfq进行融合表达实现蛋白质的多聚化，即试剂A、试剂B和试剂C的多价化。所述R单体为SGS(SGS为融合蛋白SmF-GFP-SH3的缩写)，所述L单体为SGP(SGP为融合蛋白SmF-GFP-PRMH的缩写)，SH3和PRMH互作引起多价蛋白SGS和SGP的互作进而发生相变产生相变液滴。
上述方法中，所述修饰可为蛋白质翻译后修饰或蛋白质翻译后修饰的去修饰。所述蛋白质翻译后修饰可为甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化或糖基化修饰。所述蛋白质翻译后修饰的去修饰可为去甲基化、去乙酰化、去磷酸化、去泛素化或去糖基化。
本发明还提供了所述成套试剂1或所述成套试剂2的下述任一应用：
Z1)在检测或辅助检测带有修饰的蛋白质与其他生物分子间是否具有相互作用中的应用；
Z2)在筛选带有修饰的蛋白质与其他生物分子间相互作用调控因子中的应用；
Z3)在鉴定或辅助鉴定带有修饰的蛋白质与其他生物分子相互作用调控因子中的应用；
Z4)在检测物质对带有修饰的蛋白质与其他生物分子间相互作用的影响中的应用；
Z5)在检测蛋白质是否具有参与蛋白质翻译后修饰的酶活中的应用；
Z6)在制备检测带有修饰的蛋白质与其他生物分子间是否具有相互作用产品中的应用；
Z7)在制备筛选带有修饰的蛋白质与其他生物分子间相互作用调控因子产品中的应用；
Z8)在制备鉴定带有修饰的蛋白质与其他生物分子间相互作用调控因子产品中的应用；
Z9)在制备检测蛋白质是否具有参与蛋白质翻译后修饰的酶活产品中的应用。
上述应用中，所述其他生物分子可为蛋白质。
上述应用中，所述修饰可为蛋白质翻译后修饰或蛋白质翻译后修饰的去修饰。所述蛋白质翻译后修饰可为甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化或糖基化修饰。所述蛋白质翻译后修饰的去修饰可为去甲基化、去乙酰化、去磷酸化、去泛素化或去糖基化。
本发明的检测经翻译后修饰的蛋白质与其配体间的相互作用的成套试剂及基于该成套试剂创建的多价招募系统利用相变机制实现了互作蛋白和配体在相变液滴中的高度富集，将原本较弱的互作信号强烈放大，使易于检测。本发明的成套试剂及多价招募系统可用于检测蛋白和其配体间相互作用，尤其是弱相互作用，还可以鉴定一种蛋白是否具有某种参与蛋白质翻译后修饰的酶活，比如，磷酸化修饰对应的激酶活性、甲基化修饰对应的甲基转移酶活性等，也可以鉴定可以调控上述酶活性的调控物。
附图说明
图1H3K9me3与CD相互作用的检测体系1-8实验结果分析。A为体系3的相变液滴形态观察，右图为左图框选区域的放大图像。B为体系1-8的激光共聚焦高内涵显微成像分析。标尺＝100μm。
图2为H3K9me3与CD相互作用的检测体系9-20实验结果分析。A为体系9-20的激光共聚焦高内涵显微成像分析。标尺＝100μm。B为A图相变液滴中的mCherry荧光强度的量化分析。H3K9me3和H3K9分别表示H3K9me3-KKETPV和H3K9-KKETPV；0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0分别表示H3K9me3-KKETPV在H3K9me3-KKETPV和H3K9-KKETPV的混合物中所占的比例。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本发明提供了用于检测生物分子X与XL间相互作用的成套试剂，该成套试剂由名称分别为A、B、C和D的四种试剂组成；
A由名称为R的生物分子和名称为X的蛋白质连接而成，R为由R单体形成的多聚体，R单体均相同，每个单体均含有mr、名称为乙的荧光报告基团、结合区1或含有结合区1的生物分子、蛋白质X，每个单体各部分之间通过连接区或化学键相连，其中，大于等于2个的mr能形成多聚体；
B含有名称为L的生物分子，L为由L单体形成的多聚体，L单体均相同，每个单体均含有ml、名称为丙的荧光报告基团、结合区2或含有结合区2的生物分子，每个单体各部分之间通过连接区或化学键相连，其中，大于等于2个的ml能形成多聚体；
R与L相同或不同且二者间具有相互作用，R与L间的相互作用通过R的结合区1和L的结合区2进行，R中结合区1和L中结合区2的个数均大于等于2，R与L相互作用后发生相变；
C为由C单体形成的多聚体，C单体由名称为mc的单体、名称为甲的报告基团和名称为YC的生物分子连接而成，大于等于两个的mc能形成多聚体；
D由名称为XL的带有翻译后修饰的蛋白质和名称为YD的生物分子连接而成；
YC与YD间具有相互作用。
下面以R与L均为蛋白质为例来阐述本发明的成套试剂在检测含有翻译后甲基化修饰的蛋白质与其配体间的相互作用，具体的，mr和ml均为SmF，荧光报告基团乙和荧光报告基团丙均为GFP，含有结合区1的生物分子为SH3，含有结合区2的生物分子为PRMH，将SmF、GFP和SH3的融合蛋白质记为SGS(即R单体)，将SmF、GFP和PRMH的融合蛋白质记为SGP(即L单体)；mc为Hfq，荧光报告基团甲为mCherry，YC为序列7的第362-465位所示的PDZ，Hfq、mCherry与PDZ融合即得到C单体；YD为KKETPV(序列11的第22-29位)。
实施例1、H3K9me3与CD相互作用的验证
本实施例中，XL为H3K9me3，X为CD，H3K9me3与CD具有相互作用。
一、重组载体的制备
1、表达SGS与CD的融合蛋白的重组载体
将pRSFDuet-1载体(Merck公司旗下Novagen产品)的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列2的第12-1360位所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-SGS，pRSFDuet-1-SGS能表达序列1所示的蛋白质(SGS融合His-tag，即R单体，记为His-SGS)。
其中，序列2的第14-1354位所示的DNA分子编码序列1所示的His-SGS，序列2的第1344-1349位和第1355-1360位分别为NcoI和XhoI的识别序列，序列1的第3-8位为His-tag的氨基酸序列，序列1的第17-102位为SmF的氨基酸序列，序列1的第109-349位为GFP的氨基酸序列，序列1的第364-431位为SH3的氨基酸序列，序列1的第103-108位、第350-363位和第432-444位为连接区的氨基酸序列。His-SGS能通过SmF的作用形成十四聚体。
将pRSFDuet-1-SGS的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列4的第1-212位所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-SGS-CD，pRSFDuet-1-SGS-CD表达序列表中序列1所示的His-SGS与序列3所示的CD的融合蛋白(记为SGS-CD)。
其中，序列4的第9-203位编码序列3所示的CD。SGS-CD能通过SmF的作用形成十四聚体。
2、表达SGP的重组载体
将pRSFDuet-1载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列6的第12-1162位所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-SGP，pRSFDuet-1-SGP能表达序列5所示的蛋白质(SGP融合His-tag，记为His-SGP，也即L单体)。
其中，序列6的第14-1156位所示的DNA分子编码序列5所示的His-SGP，序列5的第3-8位为His-tag的氨基酸序列，序列5的第17-102位为SmF的氨基酸序列，序列5的第109-349位为GFP的氨基酸序列，序列5的第366-380位为PRMH的氨基酸序列，序列5的第103-108位和第350-365位为连接区的氨基酸序列。
His-SGP能通过SmF的作用形成十四聚体。
3、表达C单体(Hfq-mCherry-PDZ)的重组载体
将pRSFDuet-1载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列8所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-Hfq-mCherry-PDZ，pRSFDuet-1-Hfq-mCherry-PDZ能表达序列7所示的蛋白质(Hfq、mCherry、PDZ与His-tag形成的融合蛋白质，记为Hfq-mCherry-PDZ)。
其中，序列8的第3-1397位所示的DNA分子编码序列7所示的Hfq-mCherry-PDZ，序列7的第3-8位为His-tag的氨基酸序列，序列7的第17-94位为Hfq的氨基酸序列，序列7的第101-340位为mCherry的氨基酸序列，序列7的第362-465位为PDZ的氨基酸序列，序列7的第95-100位和第341-361位为连接区的氨基酸序列。
Hfq-mCherry-PDZ能通过Hfq的作用形成六聚体。
制备表达不含有Hfq融合蛋白质的重组载体：将pRSFDuet-1载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列10的第11-1143位所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-mCherry-PDZ，pRSFDuet-1-mCherry-PDZ能表达序列9所示的蛋白质(mCherry、PDZ与His-tag形成的融合蛋白质，记为mCherry-PDZ，以下作为对照)。
其中，序列10的第13-1134位所示的DNA分子编码序列9所示的mCherry-PDZ，序列9的第3-8位为His-tag的氨基酸序列，序列9的第17-256位为mCherry的氨基酸序列，序列9的第271-374位为PDZ的氨基酸序列，序列9的第257-270位为连接区的氨基酸序列。
4、试剂D的制备
化学合成XL连接YD的试剂D，试剂D为在序列表中序列11所示的H3K9-KKETPV的第4位的赖氨酸进行三甲基化得到的带有甲基化修饰的蛋白质，将其记为H3K9me3-KKETPV，H3K9me3-KKETPV序列如下：ARTK(Me)3QTARGGSGGSGGSWGGSKKETPVAV。
二、融合蛋白表达与纯化
将步骤一的pRSFDuet-1-SGS、pRSFDuet-1-SGS-CD、pRSFDuet-1-SGP、pRSFDuet-1-Hfq-mCherry-PDZ和pRSFDuet-1-mCherry-PDZ分别导入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)(天根生化科技(北京)有限公司)，得到重组菌株BL21-pRSFDuet-1-SGS、BL21-pRSFDuet-1-SGS-CD、BL21-pRSFDuet-1-SGP、BL21-pRSFDuet-1-Hfq-mCherry-PDZ和BL21-pRSFDuet-1-mCherry-PDZ。
按照下述方法，对重组菌株BL21-pRSFDuet-1-SGS、BL21-pRSFDuet-1-SGS-CD、BL21-pRSFDuet-1-SGP、BL21-pRSFDuet-1-Hfq-mCherry-PDZ和BL21-pRSFDuet-1-mCherry-PDZ表达的含有His标签的融合蛋白进行纯化：
(1)细菌培养和蛋白诱导表达：将上述重组菌株接种到1L LB培养基中。37℃，200rpm培养至OD600约0.8-1(约8-9hr)。将菌液转移至18℃降温1hr，加IPTG至终浓度为0.5mM诱导蛋白表达过夜(16hr左右)，得到培养液。
(2)菌体重悬与破碎：将步骤(1)得到的培养液离心，弃上清液，用40mL bindingbuffer(40mM Tris-Cl，500mM NaCl,pH 8.0或7.4)重悬菌体沉淀并进行超声破碎，将破碎产物超速离心20000rpm，1hr，收集上清液(含有目的融合蛋白)。
(3)Ni柱纯化：预先准备好Ni柱，并用binding buffer平衡。将步骤(2)得到的上清液倒入Ni柱。待液体快流干时，加入wash buffer洗2-3个柱体积，然后加入elution buffer进行目的融合蛋白的洗脱，收集流出液。
wash buffer：40mM Tris-HCl,500mM NaCl,40mM咪唑，pH同binding buffer。
elution buffer：40mM Tris-HCl,500mM NaCl,500mM咪唑，pH同binding buffer。
(4)离子交换纯化：根据蛋白的等电点，选择合适的离子交换柱。用40mM的Tris-Cl缓冲液稀释步骤(3)的流出液以降低离子浓度，得到蛋白稀释液。安装离子交换柱至ATKA蛋白质纯化系统(GE公司)并完成蛋白稀释液的上样。采用逐步提高盐离子浓度的方式对结合在柱子上的蛋白进行洗脱并收集目的融合蛋白。洗脱所用洗脱液由A液和B液组成，二者间的配比根据具体情况调整：A液：40mM Tris-Cl，pH同binding buffer；B液：40mM Tris-Cl，2M NaCl，pH同binding buffer。
(5)凝胶过滤纯化：将步骤(4)得到的目的融合蛋白超滤浓缩后，用预设的分子筛程序对其进行分离纯化，得到进一步纯化的目的融合蛋白。
柱平衡及洗脱所用KMEI buffer由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为：150mM KCl,1mM MgCl2,1mM EGTA,10mM imidazole,1mM DTT，pH＝7。
(6)检测并保存纯化的蛋白：利用SDS-PAGE对上述步骤纯化得到的BL21-pRSFDuet-1-SGS表达的His-SGS、BL21-pRSFDuet-1-SGS-CD表达的SGS-CD、BL21-pRSFDuet-1-SGP表达的His-SGP、BL21-pRSFDuet-1-Hfq-mCherry-PDZ表达的Hfq-mCherry-PDZ和BL21-pRSFDuet-1-mCherry-PDZ表达的mCherry-PDZ进行检测，在确定上述融合蛋白大小均符合预期后将蛋白浓缩冻存于-80℃备用。
三、H3K9me3与CD相互作用的检测
将步骤二得到的His-SGS、SGS-CD、His-SGP、Hfq-mCherry-PDZ、mCherry-PDZ(作为对照)、H3K9me3-KKETPV和H3K9-KKETPV(作为对照)的溶液(溶剂均为KMEI buffer)分别按照如表2所示体系分装于384微孔板中，每孔一种体系，体系中SGS-CD、His-SGP、Hfq-mCherry-PDZ、mCherry-PDZ以及H3K9me3-KKETPV与H3K9-KKETPV的混合物在相应体系中的浓度均为1μM：
表2、H3K9me3与CD相互作用的检测体系
Figure BDA0003878990990000111
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Figure BDA0003878990990000121
表2中，“+”表示含有该种物质；“-”表示不含有该种物质；“*”表示H3K9me3-KKETPV和H3K9-KKETPV的混合物，体系9-14中H3K9me3-KKETPV占H3K9me3-KKETPV和H3K9-KKETPV的混合物的摩尔百分比分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0，体系15-20中H3K9me3-KKETPV占H3K9me3-KKETPV和H3K9-KKETPV的混合物的摩尔百分比分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0。
将上述各体系于4℃静置孵育直至发生相变的体系中的相变液滴完全沉降到孔板底部，用激光共聚焦高内涵成像显微镜进行图像采集，结果(图1中B)显示，体系1和体系2中溶液均未发生变化，未发现荧光信号聚集区域；体系3和体系4中均产生相变液滴，绿色荧光信号(GFP发出的荧光信号)聚集于相变液滴中，且其信号强度远远高于溶液中的信号强度(图1中A)；体系5和体系6中溶液均未发生变化，未发现荧光信号聚集区域；体系7和体系8中均产生相变液滴，绿色荧光信号聚集于相变液滴中，且其信号强度远远高于溶液中的信号强度，同时并未发现液滴中有红色荧光信号聚集；体系9-14产生相变液滴，绿色荧光信号聚集于相变液滴中，且其信号强度远远高于溶液中的信号强度，同时并未发现液滴中有明显红色荧光信号聚集(图2)；体系15-20产生相变液滴，绿色荧光信号聚集于相变液滴中，且其信号强度远远高于溶液中的信号强度；同时发现当混合物完全由H3K9-KKETPV组成时(即H3K9me3-KKETPV在混合物中的摩尔百分比为0时)，相变液滴中无明显红色荧光(mCherry发出的荧光信号)聚集；而随着H3K9me3在H3K9me3和H3K9的混合物中所占比例的提高，相变液滴中的红色荧光信号强度也随之增加；至混合物完全由H3K9me3-KKETPV组成时(即H3K9me3-KKETPV在混合物中的摩尔百分比为1.0时)，相变液滴中的红色荧光信号强度达到最高(图2)。
说明，SGS可以与SGP结合产生相变液滴，该相变液滴可以用GFP发出的荧光信号来标示。在mCherry-PDZ存在Hfq-mCherry-PDZ不存在的体系中，无论该体系是否含有H3K9me3-KKETPV或H3K9-KKETPV，该体系的相变液滴中均不能富集红色荧光信号，在mCherry-PDZ不存在Hfq-mCherry-PDZ存在的体系中，H3K9me3的含量与相变液滴中红色荧光信号的富集程度呈正相关。表明，SGS-CD中的CD可通过CD与H3K9me3的相互作用将H3K9me3-KKETPV招募至相变液滴中，而H3K9me3-KKETPV中的KKETPV则可进一步将发出红色荧光信号的Hfq-mCherry-PDZ招募至相变液滴中，进而使相变液滴发出富集的红色荧光信号；如将Hfq-mCherry-PDZ替换为mCherry-PDZ，相变液滴中的红色荧光信号不明显，表明，Hfq-mCherry-PDZ通过Hfq形成六价态(即六聚体)后的比单价的mCherry-PDZ更适于检测CD与H3K9me3之间的互作。
综上，本发明的基于相变的成套试剂与多价招募体系具有放大互作信号、提高H3K9me3与CD相互作用检测灵敏度的特点，为检测含有翻译后修饰蛋白质与其配体间较弱的相互作用提供了一种简便易行的新方法。

Claims (21)

1.成套试剂，由名称分别为A、B、C和D的四种试剂组成；
所述A由名称为R的生物分子和名称为X的蛋白质连接而成；
所述B含有名称为L的生物分子；
所述R与所述L相同或不同且二者间具有相互作用，所述R与所述L相互作用后发生相变；
所述C为由C单体形成的多聚体，所述C单体为下述c1)或c2)：
c1)由名称为mc的单体、名称为甲的报告基团和名称为YC的生物分子连接得到的分子，大于等于两个的所述mc能形成多聚体；
c2)在c1)上连接标签得到的分子；
所述D由名称为XL的带有修饰的蛋白质和名称为YD的生物分子连接而成；
所述YC与所述YD间具有相互作用，
所述YC与所述YD均为蛋白质,其中，
所述YC为Y12)或Y13)：
Y12)将序列表中序列7的第362-465位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
Y13)在Y12)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
和/或，所述YD为Y22)或Y23)：
Y22)将序列表中序列11的第22-29位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
Y23)在Y22)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述R含有名称为结合区1的结合区；所述L含有名称为结合区2的结合区；所述R与所述L间的相互作用通过所述结合区1和所述结合区2进行，所述R中所述结合区1和所述L中所述结合区2的个数均大于等于2。
3.根据权利要求1或2所述的成套试剂，其特征在于：所述R为蛋白质、核酸或多糖；和/或，所述L为蛋白质、核酸或多糖。
4.根据权利要求1或2所述的成套试剂，其特征在于：所述A中还连接有名称为乙的报告基团；
和/或，所述B中还连接有名称为丙的报告基团。
5.根据权利要求4所述的成套试剂，其特征在于：所述乙和所述丙相同或不同；
和/或，所述甲不同于所述乙和所述丙。
6.根据权利要求5所述的成套试剂，其特征在于：所述甲、所述乙和所述丙均为荧光报告基团。
7.根据权利要求6所述的成套试剂，其特征在于：所述荧光报告基团为荧光蛋白质。
8.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述A中所述X和所述R的个数比为大于等于1的整数。
9.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述R为由R单体形成的多聚体，所述R单体均含有名称为mr的单体，大于等于两个的所述mr能形成多聚体；
和/或，所述L为由L单体形成的多聚体，所述L单体均含有名称为ml的单体，大于等于两个的所述ml能形成多聚体；
所述mc、所述mr与所述ml相同或至少两个相同或彼此间均不同。
10.根据权利要求9所述的成套试剂，其特征在于：
所述R中至少有一个单体含有所述结合区1；
和/或，所述L中至少有一个单体含有所述结合区2。
11.根据权利要求9所述的成套试剂，其特征在于：所述R单体均含有所述mr和结合区1；
和/或，所述L单体均含有所述ml和结合区2。
12.根据权利要求11所述的成套试剂，其特征在于：所述R单体中，所述mr与所述结合区1或含有所述结合区1的生物分子通过所述连接区或化学键相连；
和/或，所述L单体中，所述ml与所述结合区2或含有所述结合区2的生物分子通过所述连接区或化学键相连。
13.根据权利要求11或12所述的成套试剂，其特征在于：所述R单体均还含有名称为乙的报告基团；
和/或，所述L单体均还含有名称为丙的报告基团。
14.根据权利要求13所述的成套试剂，其特征在于：所述R单体中，所述mr、所述乙与所述结合区1或含有所述结合区1的生物分子通过连接区或化学键相连；
和/或，所述L单体中，所述ml、所述丙与所述结合区2或含有所述结合区2的生物分子通过连接区或化学键相连。
15.根据权利要求14所述的成套试剂，其特征在于：所述R单体均相同，所述L单体均相同，所述C单体均相同；
和/或，所述mr与所述ml均为酵母蛋白SmF；和/或，所述mc为枯草芽孢杆菌蛋白Hfq；
和/或，所述结合区1为序列1的第364-431位所示的SH3中与序列5的第366-380位所示的PRMH结合的区域；所述结合区2为序列5的第366-380位所示的PRMH中与序列1的第364-431位所示的SH3结合的区域；
和/或，所述连接区为(Gly-Gly-Ser)n或含有(Gly-Gly-Ser)n的多肽，n为大于等于2的自然数；
和/或，所述甲为红色荧光蛋白；
和/或，所述乙和所述丙均为绿色荧光蛋白。
16.根据权利要求12所述的成套试剂，其特征在于：所述mr与所述ml均为序列1的第17-102位所示的酵母SmF；
和/或，所述mc为序列7的第17-94位所示的Hfq；
和/或，所述含有所述结合区1的生物分子为序列1的第364-431位所示的SH3；
和/或，所述含有所述结合区2的生物分子为序列5的第366-380位所示的PRMH。
17.根据权利要求9所述的成套试剂，其特征在于：所述R单体为H2)或H3)：
H2)将序列表中序列1的第17-431位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
H3)在H2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
和/或，所述L单体为I2)或I3)：
I2)将序列表中序列5的第17-380位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
I3)在I2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
和/或，所述C单体为J2)或J3)：
J2)将序列表中序列7的第17-465位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
J3)在J2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
18.成套试剂，由下述X1)、X2)、X3)和X4)组成：
X1)为下述X11)至X14)中的任一种：
X11)编码R单体的核酸分子；
X12)含有X11)所述核酸分子的表达盒；
X13)含有X11)所述核酸分子的重组载体、或含有X12)所述表达盒的重组载体；
X14)含有X11)所述核酸分子的重组微生物、或含有X12)所述表达盒的重组微生物、或含有X13)所述重组载体的重组微生物；
X2)为下述X21)至X24)中的任一种：
X21)编码L单体的核酸分子；
X22)含有X21)所述核酸分子的表达盒；
X23)含有X21)所述核酸分子的重组载体、或含有X22)所述表达盒的重组载体；
X24)含有X21)所述核酸分子的重组微生物、或含有X22)所述表达盒的重组微生物、或含有X23)所述重组载体的重组微生物；
X3)为下述X31)至X34)中的任一种：
X31)编码C单体的核酸分子；
X32)含有X31)所述核酸分子的表达盒；
X33)含有X31)所述核酸分子的重组载体、或含有X32)所述表达盒的重组载体；
X34)含有X31)所述核酸分子的重组微生物、或含有X32)所述表达盒的重组微生物、或含有X33)所述重组载体的重组微生物；
X4)为下述X41)至X44)中的任一种：
X41)编码YD的核酸分子；
X42)含有X41)所述核酸分子的表达盒；
X43)含有X41)所述核酸分子的重组载体、或含有X42)所述表达盒的重组载体；
X44)含有X41)所述核酸分子的重组微生物、或含有X42)所述表达盒的重组微生物、或含有X43)所述重组载体的重组微生物，
其中，
所述R单体均含有名称为mr的单体和名称为乙的报告基团，大于等于两个的所述mr能形成多聚体，至少一个所述R单体含有结合区1或含有结合区1的生物分子，所述mr、所述乙与所述结合区1或含有所述结合区1的生物分子通过连接区或化学键相连，
所述L单体均含有名称为ml的单体和名称为丙的报告基团，大于等于两个的所述ml能形成多聚体，至少一个所述L单体含有结合区2或含有结合区2的生物分子，所述ml、所述丙与所述结合区2或含有所述结合区2的生物分子通过连接区或化学键相连，
所述mr与所述ml相同或至少两个相同或彼此间均不同，所述结合区1或所述含有所述结合区1的生物分子与所述结合区2或含有所述结合区2的生物分子之间能够相互作用从而引起X1)和X2)的表达产物发生相变；
所述C单体为下述c1)或c2)：
c1)由名称为mc的单体、名称为甲的报告基团和名称为YC的生物分子连接得到的分子，大于等于两个的所述mc能形成多聚体；
c2)在c1)上连接标签得到的分子；
所述YD为与所述YC之间具有相互作用的生物分子。
19.根据权利要求18所述的成套试剂，其特征在于：
X11)所述核酸分子为如下x11)或x12)或x13)：
x11)编码序列是序列表中序列2的第62-1306位的cDNA分子或DNA分子；
x12)与x11)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求9～17所述R单体的cDNA分子或基因组DNA分子；
x13)在严格条件下与x11)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求9～17所述R单体的cDNA分子或基因组DNA分子；
和/或，X21)所述核酸分子为如下x21)或x22)或x23)：
x21)编码序列是序列表中序列6的第62-1153位的cDNA分子或DNA分子；
x22)与x21)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求9～17所述L单体的cDNA分子或基因组DNA分子；
x23)在严格条件下与x21)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求9～17所述L单体的cDNA分子或基因组DNA分子；
和/或，X31)所述核酸分子为如下x31)或x32)或x33)：
x31)编码序列是序列表中序列8的第51-1400位的cDNA分子或DNA分子；
x32)与x31)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求15～17所述C单体的cDNA分子或基因组DNA分子；
x33)在严格条件下与x31)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求15～17所述C单体的cDNA分子或基因组DNA分子。
20.根据权利要求1-19中任一所述的成套试剂，其特征在于：所述修饰为蛋白质翻译后修饰或蛋白质翻译后修饰的去修饰；
进一步，
所述蛋白质翻译后修饰为甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化或糖基化修饰；
所述蛋白质翻译后修饰的去修饰为去甲基化、去乙酰化、去磷酸化、去泛素化或去糖基化。
21.权利要求1-19中任一所述成套试剂的下述任一应用：
Z1)在检测或辅助检测带有修饰的蛋白质与其他生物分子间是否具有相互作用中的应用；
Z2)在筛选带有修饰的蛋白质与其他生物分子间相互作用调控因子中的应用；
Z3)在鉴定或辅助鉴定带有修饰的蛋白质与其他生物分子相互作用调控因子中的应用；
Z4)在检测物质对带有修饰的蛋白质与其他生物分子间相互作用的影响中的应用；
Z5)在检测蛋白质是否具有参与蛋白质翻译后修饰的酶活中的应用；
Z6)在制备检测带有修饰的蛋白质与其他生物分子间是否具有相互作用产品中的应用；
Z7)在制备筛选带有修饰的蛋白质与其他生物分子间相互作用调控因子产品中的应用；
Z8)在制备鉴定带有修饰的蛋白质与其他生物分子间相互作用调控因子产品中的应用；
Z9)在制备检测蛋白质是否具有参与蛋白质翻译后修饰的酶活产品中的应用。
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