CN110853712B - 鉴定多对生物分子间相互作用调控因子的方法 - Google Patents

鉴定多对生物分子间相互作用调控因子的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110853712B
CN110853712B CN201810865132.9A CN201810865132A CN110853712B CN 110853712 B CN110853712 B CN 110853712B CN 201810865132 A CN201810865132 A CN 201810865132A CN 110853712 B CN110853712 B CN 110853712B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
contain
gly
interaction
detected
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810865132.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110853712A (zh
Inventor
李丕龙
李维平
周敏
王亮
吴荣波
王静
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tsinghua University
Original Assignee
Tsinghua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tsinghua University filed Critical Tsinghua University
Priority to CN201810865132.9A priority Critical patent/CN110853712B/zh
Publication of CN110853712A publication Critical patent/CN110853712A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110853712B publication Critical patent/CN110853712B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了鉴定多对生物分子间相互作用调控因子的方法。本发明运用多价互作大分子建立相变体系，并将每对互作生物分子中的一个生物分子与形成相变的多价大分子之一进行共价连接，使其聚集于相变液滴中；同时将每个生物分子的互作配体分别与不同报告基团相连，创建一系列重组生物分子，这些重组生物分子可与相变液滴中的相应生物分子形成生物分子对而发生相互作用进而聚集于相变液滴中，可通过检测不同报告基团的信号以确定相应生物分子对间是否具有相互作用。在此基础上，通过向体系中加入生物分子互作抑制剂，并通过检测相变液滴中不同报告基团信号强度的变化实现多靶点生物分子互作抑制剂的同步高通量筛选。

Description

鉴定多对生物分子间相互作用调控因子的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，鉴定多对生物分子间相互作用调控因子的方法。
背景技术
“相变”作为物质的一种特性在物理界及日常生活中早已广为人知，近几年科学家们逐渐发现相变(或相分离)机制也广泛存在于生物细胞中，且在细胞生命活动中行使重要的生物学功能。
目前的研究发现，当溶液中的多价的大分子与其多价配体互作时，往往会产生更大的复合物，后者的溶解度通常会降低，从而从普通溶液相分离出来，形成一个复合物富集的独立的液态相，这个转变过程被称为“液-液分离相变”。其中，多价的价数是指大分子或其配体中含有的可与对方互作的结合区的数量。对蛋白互作而言，多价蛋白和它们的多价配体在体外也会发生“液-液分离相变”(简称为“相变”)现象，即可以产生一个正常的溶液相和一个蛋白富集的粘稠的液体相。在显微镜下可见蛋白富集的液体相内含有大量小液滴(即相变液滴)，液滴直径可达微米级甚至更大。如多价SH3(SRC homology 3domain)与其多价配体PRM(proline-rich motif)在一定浓度下就可以发生相变，而与SH3有更高亲和力的PRMH则可与SH3发生更强烈的相变。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定多对生物分子间的调控因子。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了鉴定或辅助鉴定p对生物分子间互作(即相互作用)调控因子的方法，将该方法记为方法1，p为大于等于2的自然数，p对生物分子的名称分别为X1～Xp以及XL1～XLp，X1与XL1间、X2与XL2间、……、Xp与XLp间均具有相互作用，所述方法1包括U1)～U3)：
U1)将名称分别为溶液A1～Ap的p种溶液、名称为溶液B的溶液与名称分别为溶液C1～Cp的p种溶液混合，得到混合液；
所述溶液A1为含有A1的溶液，所述A1由名称为R的生物分子和X1连接而成；
所述溶液A2为含有A2的溶液，所述A2由所述R和X2连接而成；
所述溶液A3为含有A3的溶液，所述A3由所述R和X3连接而成；
以此类推，……，所述溶液Ap为含有Ap的溶液，所述Ap由所述R和Xp连接而成；
所述溶液B为含有B的溶液，所述B含有名称为L的生物分子；
所述R与所述L相同或不同且二者间具有相互作用，所述R与所述L相互作用后发生相变产生相变液滴；
所述溶液C1为含有C1的溶液，所述C1由名称为E1的报告基团与XL1连接而成；所述溶液C2为含有C2的溶液，所述C2由名称为E2的报告基团与XL2连接而成；所述溶液C3为含有C3的溶液，所述C3由名称为E3的报告基团与XL3连接而成；以此类推，……，所述溶液Cp为含有Cp的溶液，所述Cp由名称为Ep的报告基团与XLp连接而成；E1～Ep的p种报告基团均不相同；
X1与Xp为蛋白质、核酸或多糖；XL1与XLp为蛋白质、核酸或多糖；
U2)向所述混合液中加入q种待测调控因子，得到待测液，q为大于等于1的自然数；
U3)检测所述待测液和所述混合液的相变液滴中E1～Ep的信号强度确定所述q种待测调控因子中是否含有p对生物分子间相互作用的调控因子：如所述待测液相变液滴中E1的信号等于所述对照液，所述q种待测调控因子中不含或候选不含X1与XL1间发生相互作用的调控因子；如所述待测液相变液滴中E1的信号不等于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X1与XL1间发生相互作用的调控因子；
如所述待测液相变液滴中E2的信号等于所述对照液，所述q种待测调控因子中不含或候选不含X2与XL2间发生相互作用的调控因子；如所述待测液相变液滴中E2的信号不等于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X2与XL2间发生相互作用的调控因子；
以此类推，……，如所述待测液相变液滴中Ep的信号等于所述对照液，所述q种待测调控因子中不含或候选不含Xp与XLp间发生相互作用的调控因子；如所述待测液相变液滴中Ep的信号不等于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有Xp与XLp间发生相互作用的调控因子。
上述方法中，如所述待测液相变液滴中E1的信号不等于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X1与XL1间发生相互作用的调控因子，包括：如所述待测液相变液滴中E1的信号高于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X1与XL1间发生相互作用的促进因子；如所述待测液相变液滴中E1的信号低于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X1与XL1间发生相互作用的抑制剂；
如所述待测液相变液滴中E2的信号不等于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X2与XL2间发生相互作用的调控因子，包括：如所述待测液相变液滴中E2的信号高于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X2与XL2间发生相互作用的促进因子；如所述待测液相变液滴中E2的信号低于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X2与XL2间发生相互作用的抑制剂；
以此类推，……，如所述待测液相变液滴中Ep的信号不等于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有Xp与XLp间发生相互作用的调控因子，包括：如所述待测液相变液滴中Ep的信号高于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有Xp与XLp间发生相互作用的促进因子；如所述待测液相变液滴中Ep的信号低于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有Xp与XLp间发生相互作用的抑制剂。
本发明还提供了鉴定或辅助鉴定p+s对生物分子间互作抑制剂的方法，将该方法记为方法2，p为大于等于2的自然数，s为大于等于2的自然数，p+s对生物分子的名称分别为X1～Xp与Xp+1～Xp+s以及XL1～XLp与XLp+1～XLp+s，X1与XL1间、X2与XL2间、……、Xp与XLp间、Xp+1与XLp+1间、Xp+2与XLp+2间、……、Xp+s与XLp+s间均具有相互作用，所述方法2包括V1)～V3)：
V1)将名称分别为溶液A1～Ap、Ap+1～Ap+s+1的p+s+1种溶液、名称为溶液B的溶液与名称分别为溶液C1～Cp的p种溶液混合，得到混合液；
所述溶液A1为含有A1的溶液，所述A1由所述R和X1连接而成；
所述溶液A2为含有A2的溶液，所述A2由所述R和X2连接而成；
所述溶液A3为含有A3的溶液，所述A3由所述R和X3连接而成；
以此类推，……，所述溶液Ap为含有Ap的溶液，所述Ap由所述R和Xp连接而成；
所述溶液Ap+1为含有Ap+1的溶液，所述Ap+1由所述R和Xp+1连接而成；
所述溶液Ap+2为含有Ap+2的溶液，所述Ap+2由XLp+1与Xp+2连接而成；
所述溶液Ap+3为含有Ap+3的溶液，所述Ap+3由XLp+2与Xp+3连接而成；
以此类推，……，所述溶液Ap+s为含有Ap+s的溶液，所述Ap+s由XLp+s-1与Xp+s连接而成；
所述溶液Ap+s+1为含有Ap+s+1的溶液，所述Ap+s+1由XLp+s与名称为甲的报告基团连接而成；
所述溶液B为含有B的溶液，所述B含有名称为L的生物分子；
所述R与所述L相同或不同且二者间具有相互作用，所述R与所述L相互作用后发生相变产生相变液滴；
所述溶液C1为含有C1的溶液，所述C1由名称为E1的报告基团与XL1连接而成；所述溶液C2为含有C2的溶液，所述C2由名称为E2的报告基团与XL2连接而成；所述溶液C3为含有C3的溶液，所述C3由名称为E3的报告基团与XL3连接而成；以此类推，……，所述溶液Cp为含有Cp的溶液，所述Cp由名称为Ep的报告基团与XLp连接而成；E1～Ep的p种报告基团均不相同，且均不同于所述甲；
X1～Xp与Xp+1～Xp+s为蛋白质、核酸或多糖；XL1～XLp与XLp+1～XLp+s为蛋白质、核酸或多糖；
V2)向所述混合液中加入q种待测调控因子，得到待测液，q为大于等于1的自然数；
V3)检测所述待测液相变液滴中E1～Ep以及所述甲的信号确定所述q种待测调控因子中是否含有p+s对生物分子间相互作用的抑制剂：如所述待测液中不含有E1的信号，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X1与XL1间发生相互作用的抑制剂；如所述待测液中含有E1的信号，所述q种待测调控因子中不含或候选不含X1与XL1间发生相互作用的抑制剂；如所述待测液中不含有E2的信号，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X2与XL2间发生相互作用的抑制剂；如所述待测液中含有E2的信号，所述q种待测调控因子中不含或候选不含X2与XL2间发生相互作用的抑制剂；以此类推，……，如所述待测液中不含有Ep的信号，所述q种待测调控因子中含有或候选含有Xp与XLp间发生相互作用的抑制剂；如所述待测液中含有Ep的信号，所述q种待测调控因子中不含或候选不含Xp与XLp间发生相互作用的抑制剂；如所述待测液中不含有所述甲的信号，所述q种待测调控因子中含有或候选含有Xp+1与XLp+1至Xp+s与XLp+s的s对生物分子中至少1对的相互作用抑制剂；如所述待测液中含有所述甲的信号，所述q种待测调控因子中不含或候选不含Xp+1与XLp+1至Xp+s与XLp+s的s对生物分子中任一对相互作用的抑制剂。
上文中，所述R含有名称为结合区1的结合区；所述L含有名称为结合区2的结合区；所述R与所述L间的相互作用可通过所述结合区1和所述结合区2进行，所述R中所述结合区1和所述L中所述结合区2的个数均大于等于2。
其中，所述结合区1和所述结合区2均为结合区，结合区是指生物分子间通过非共价键相互作用的最小单元。当所述R与所述L间有大于等于2个结合区时，如所述R中的结合区不完全相同，所述结合区1为所述R中的各结合区的统称，如所述L中的结合区不完全相同，所述结合区2为所述L中的各结合区的统称。
所述R和所述L均为多价分子。其中，多价的价数是指分子与分子间互作时一个分子中所含有的可与另一分子结合的结合区的个数，对于所述R来说，所述R的价数即为所述结合区1的个数，对于所述L来说，所述L的价数即为所述结合区2的个数。
所述R与所述L通过多价相互作用发生相变。
上文中，所述R可为蛋白质、核酸或多糖。
所述L可为蛋白质、核酸或多糖。
上文中，E1～Ep可为p种荧光报告基团。
所述甲可为荧光报告基团。
上文中，E1～Ep可为p种荧光蛋白质。
所述甲可为荧光蛋白质。
上文中，所述A1中X1和所述R的个数比、所述Ap中Xp和所述R的个数比以及所述Ap+1中Xp+1和所述R的个数比均可为大于等于1的整数。
上文中，所述R为由R单体形成的多聚体，所述R单体均含有名称为mr的单体，大于等于两个的所述mr能形成多聚体。
所述L为由L单体形成的多聚体，所述L单体均含有名称为ml的单体，大于等于两个的所述ml能形成多聚体。
所述mr与所述ml相同或不同。
上文中，所述R中可至少有一个单体含有所述结合区1。
所述L中可至少有一个单体含有所述结合区2。
当所述R中只有一个单体含有所述结合区1时，该单体中至少含有两个所述结合区1，当所述R中有两个或两个以上单体含有所述结合区1时，每个单体中含有所述结合区1的个数均至少为1个。
当所述L中只有一个单体含有所述结合区2时，该单体中至少含有两个所述结合区2，当所述L中有两个或两个以上单体含有所述结合区2时，每个单体中含有所述结合区2的个数均至少为1个。
所述R的含有所述结合区1的单体中，所述结合区1可连接在所述mr上。
所述L的含有所述结合区2的单体中，所述结合区2可连接在所述ml上。
上文中，所述R单体均可含有所述mr和所述结合区1。
所述L单体均可含有所述ml和所述结合区2。
上文中，所述R单体中，所述mr与所述结合区1或含有所述结合区1的生物分子可通过连接区或化学键相连。
所述L单体中，所述ml与所述结合区2或含有所述结合区2的生物分子可通过所述连接区或化学键相连。
所述R单体还均可含有名称为乙的报告基团。所述L单体还均可含有名称为丙的报告基团。
所述R单体中，所述mr、所述乙与所述结合区1或含有所述结合区1的生物分子可通过所述连接区或化学键相连。所述L单体中，所述ml、所述丙与所述结合区2或含有所述结合区2的生物分子可通过所述连接区或化学键相连。
所述乙和所述丙相同或不同。所述甲与E1～Ep可均不同于所述乙和所述丙。
所述R单体中，所述结合区1的个数至少为一个。
所述L单体中，所述结合区2的个数至少为一个。
所述R和所述L单体中，无论各部分(即所述mr或所述ml、所述结合区1或所述结合区2、所述乙或丙)的数量为1个还是多个，彼此间的连接顺序没有要求，只要能满足大于等于两个所述R单体能形成多聚体、大于等于两个所述L单体能形成多聚体，且这两种多聚体能发生相互作用且能引起相变即可。
上文中，所述连接区没有特殊要求，所述连接区只要满足可以连接所述R和所述L的每个单体中的相连两个部分且不影响二者的功能即可。所述连接区可以为多肽。所述R单体中，所述mr与所述结合区1或含有所述结合区1的生物分子可通过所述连接区或化学键依次相连。
所述L单体中，所述ml与所述结合区2或含有所述结合区2的生物分子可通过所述连接区或化学键依次相连。
所述R单体均至少连接一个X1或Xp或Xp+1。
在本发明的一个实施例中，所述R单体的C端均通过所述连接区与X1或Xp或Xp+1的N端相连。
上文中，所述R单体均可相同。
所述L单体可均相同。
所述mr与所述ml均可为酵母SmF。酵母SmF蛋白是核糖核蛋白复合体的核心组分，其晶体结构显示它是以同源十四聚体的形式存在的。因而以SmF为载体可以实现靶蛋白的多聚化。
所述结合区1可为序列1的第364-431位所示的SH3中与序列5的第366-380位所示的PRMH结合的区域；所述结合区2可为序列5的第366-380位所示的PRMH中与序列1的第364-431位所示的SH3结合的区域。
所述连接区可为(Gly-Gly-Ser)n或含有(Gly-Gly-Ser)n的多肽，n为大于等于2的自然数。
n具体可为4或2。
上文中，所述mr与所述ml均可为序列1的第17-102位所示的酵母SmF。
所述含有所述结合区1的生物分子可为序列1的第364-431位所示的SH3。
所述含有所述结合区2的生物分子可为序列5的第366-380位所示的PRMH。
上文中，所述R单体可为H1)或H2)或H3)：
H1)氨基酸序列是序列17的第1-170位所示的蛋白质；
H2)将序列表中序列17的第1-170位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
H3)在H1)或H2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
所述L单体可为I1)或I2)或I3)：
I1)氨基酸序列是序列15的蛋白质；
I2)将序列表中序列15的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
I3)在I1)或I2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
为了使H1)或I1)中的蛋白质便于纯化，可在H1)或I1)的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述H2)或I2)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述H2)或I2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述H2)或I2)中的蛋白质的编码基因可通过将编码所述R单体的DNA序列或编码所述L单体的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上文中，p可为下述a1)或a2)或a3)：
a1)小于等于10的整数；
a2)小于等于5的整数；
a3)3。
q可为下述b1)或b2)或b3)：
b1)小于等于10的整数；
b2)小于等于5的整数；
b3)3。
s为可下述c1)或c2)或c3)：
c1)小于等于10的整数；
c2)小于等于5的整数；
c3)小于等于3的整数。
在本发明的一个实施例中，p为3。q为3。X1为p53，XL1为MDM2，X2为多肽KKETPV，XL2为PDZ，X3为BIR3，XL3为多肽AVPF。E1为绿色荧光蛋白GFP，E2为蓝色荧光蛋白BFP，E3为红色荧光蛋白mCherry。所述q种待测调控因子分别为MI-773、KKETAV和GDC0152。
所述溶液A1可由A1与溶剂组成，所述溶液A2可由A2与所述溶剂组成，所述溶液A3可由A3与所述溶剂组成，……，所述溶液Ap可由Ap与所述溶剂组成，所述溶液Ap+1可由Ap+1与所述溶剂组成，所述溶液Ap+2可由Ap+2与所述溶剂组成，……，所述溶液Ap+s可由Ap+s与所述溶剂组成，所述溶液Ap+s+1可由Ap+s+1与所述溶剂组成，所述溶液B可由所述B与所述溶剂组成，所述溶液C1可由所述C1与所述溶剂组成,所述溶液C2可由所述C2与所述溶剂组成,……，所述溶液Cp可由所述Cp与所述溶剂组成,所述溶剂能溶解A1～Ap、Ap+1～Ap+s、Ap+s+1、所述B以及C1～Cp。
在本发明的一个实施例中，所述溶剂为KMEI buffer，KMEI buffer由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为：150mM KCl,1mM MgCl2,1mM EGTA,10mM imidazole,1mM DTT，pH＝7。
在本发明的一个实施例中，采用将蛋白质与已知的多价蛋白酵母SmF进行融合表达实现靶蛋白的多聚化，即A1～Ap、Ap+1和所述B的多价化。所述R单体为SS(SS为融合蛋白SmF-SH3的缩写)，所述L单体为SP(SP为融合蛋白SmF-PRMH的缩写)，SH3和PRMH互作引起多价蛋白SS和SP的互作进而发生相变产生相变液滴。
上述方法2中，所述待测液相变液滴中是否含有E1～Ep以及所述甲的信号是指所述待测液中E1～Ep以及所述甲的信号是否在相变液滴中得到了富集，以使相变液滴中E1～Ep以及所述甲的信号高于所述待测液中非相变液滴部分。具体的，所述根据所述待测液中E1～Ep以及所述甲的信号确定所述q种待测调控因子中是否含有p+s对生物分子间相互作用的抑制剂可包括：如所述待测液的相变液滴中E1的信号没有得到富集，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X1与XL1间发生相互作用的抑制剂；如所述待测液的相变液滴中E1的信号得到了富集，所述q种待测调控因子中不含或候选不含X1与XL1间发生相互作用的抑制剂；如所述待测液的相变液滴中E2的信号没有得到富集，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X2与XL2间发生相互作用的抑制剂；如所述待测液的相变液滴中E2的信号得到了富集，所述q种待测调控因子中不含或候选不含X2与XL2间发生相互作用的抑制剂；……，如所述待测液的相变液滴中Ep的信号没有得到富集，所述q种待测调控因子中含有或候选含有Xp与XLp间发生相互作用的抑制剂；如所述待测液的相变液滴中Ep的信号得到了富集，所述q种待测调控因子中不含或候选不含Xp与XLp间发生相互作用的抑制剂；如所述待测液的相变液滴中所述甲的信号没有得到富集，所述q种待测调控因子中含有或候选含有Xp+1与XLp+1至Xp+s与XLp+s的s对生物分子中至少1对的相互作用抑制剂；如所述待测液的相变液滴中所述甲的信号得到了富集，所述q种待测调控因子中不含或候选不含Xp+1与XLp+1至Xp+s与XLp+s的s对生物分子中任一对相互作用的抑制剂。
上述方法2中，还可进一步设置对照液，通过比较对照液与所述待测液相变液滴中所述荧光信号的高低确定所述q种待测调控因子中是否含有p+s对生物分子间相互作用的抑制剂：如所述待测液相变液滴中所述E1的信号低于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X1与XL1间发生相互作用的抑制剂；如所述待测液相变液滴中E1的信号高于或等于所述对照液，所述q种待测调控因子中不含或候选不含X1与XL1间发生相互作用的抑制剂；如所述待测液相变液滴中所述E2的信号低于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X2与XL2间发生相互作用的抑制剂；如所述待测液相变液滴中E2的信号高于或等于所述对照液，所述q种待测调控因子中不含或候选不含X2与XL2间发生相互作用的抑制剂；……，如所述待测液相变液滴中所述Ep的信号低于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有Xp与XLp间发生相互作用的抑制剂；如所述待测液相变液滴中Ep的信号高于或等于所述对照液，所述q种待测调控因子中不含或候选不含Xp与XLp间发生相互作用的抑制剂；如所述待测液相变液滴中所述甲的信号低于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有Xp+1与XLp+1至Xp+s与XLp+s的s对生物分子中至少1对的相互作用抑制剂；如所述待测液相变液滴中所述甲的信号高于或等于所述对照液，所述q种待测调控因子中不含或候选不含Xp+1与XLp+1至Xp+s与XLp+s的s对生物分子中任一对相互作用的抑制剂。所述对照液具体可为将所述待测液中所述q种待测调控因子去除得到的溶液。所述q种待测调控因子中不含有所述R与所述L相互作用的抑制剂。
上述方法的下述任一应用：
Z1)在筛选生物分子间相互作用调控因子中的应用；
Z2)在筛选多对生物分子间相互作用调控因子中的应用；
Z3)在筛选多对生物分子间与生物分子互作链的调控因子中的应用；
Z4)在检测物质对生物分子间相互作用的调控中的应用；
Z5)在检测物质对多对生物分子间相互作用调控中的应用；
Z6)在检测物质对多对生物分子间与生物分子互作链的调控中的应用。
本发明中，所述筛选生物分子间相互作用调控因子可进行高通量筛选。所述鉴定生物分子间互作调控因子或抑制剂也可进行高通量鉴定。
本发明鉴定p对生物分子间互作调控因子的方法，首先运用多价互作大分子建立相变体系，并将每对互作生物分子中的一个生物分子与形成相变的多价大分子之一进行共价连接，使其聚集于相变液滴中；同时将每个生物分子的互作配体分别与不同报告基团相连，创建一系列重组生物分子，这些重组生物分子可与相变液滴中的相应生物分子形成生物分子对而发生相互作用进而聚集于相变液滴中，可通过检测不同报告基团的信号以确定相应生物分子对间是否具有相互作用。本发明还结合重组生物分子链，重组生物分子链间各分子通过环环相扣的相互作用聚集于相变液滴中，可通过将链末端生物分子进行报告基团的标记并检测相变液滴中是否有相应报告基团的信号的聚集来确定上述生物分子对以及重组生物分子链的上下游分子间形成的生物分子对之间是否有相互作用。在此基础上，通过向体系中加入生物分子互作调控因子(如抑制剂)，并通过检测相变液滴中不同报告基团信号强度的变化实现多靶点生物分子互作调控因子(如抑制剂)的同步高通量筛选。在进行生物分子互作调控物的高通量筛选时，该方法还可直接确定调控物具体对哪一对生物分子的互作进行了调控。
本发明采用基于相变的策略，利用标记互作生物分子的荧光基团的不同，通过一次高通量实验，可实现多靶点生物分子互作调控因子(如抑制剂)的同时筛选。该方法的显著优势是将一系列互作生物分子的调控因子的筛选从传统的逐一筛选变为同时筛选，极大的提高了筛选效率。该方法操作简便、灵敏度高、成本低廉、适用性广，尤其适用于进行信号通路调控物的筛选，为高通量同步筛选多对生物分子调控因子提供了一个新思路。
本发明通过将微观的生物分子互作及其调控等生化过程转化为直观的荧光信号强度变化，具有极强的可视性；操作过程简单易行且成本低廉；由于相变液滴中生物分子的浓度接近体内生物分子浓度，因而可很好地模拟真实生命环境。
附图说明
图1为实施例1的结果。A为荧光信号检测结果，B为相变液滴中红色荧光信号的量化分析。
图2为实施例2中部分体系的荧光强度检测结果。
图3为实施例2中部分体系的荧光强度检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
实施例1、抑制剂对多靶点蛋白间互作影响的检测
一、重组载体的制备
1、表达SGS的重组载体
将pRSFDuet-1载体(Merck公司旗下Novagen产品)的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列2的第12-1360位所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-SGS，pRSFDuet-1-SGS能表达序列1所示的蛋白质(SGS融合His-tag，即R单体，记为His-SGS)。
其中，序列2的第14-1354位所示的DNA分子编码序列1所示的His-SGS，序列2的第1344-1349位和第1355-1360位分别为NcoI和XhoI的识别序列，序列1的第3-8位为His-tag的氨基酸序列，序列1的第17-102位为SmF的氨基酸序列，序列1的第109-349位为GFP的氨基酸序列，序列1的第364-431位为SH3的氨基酸序列，序列1的第103-108位、第350-363位和第432-444位为连接区的氨基酸序列。His-SGS能通过SmF的作用形成十四聚体。
2、表达SGS与P53的融合蛋白的重组载体
将pRSFDuet-1-SGS的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列4的第5-66位所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-SGS-P53，pRSFDuet-1-SGS-P53表达序列表中序列1所示的His-SGS与序列3所示的P53的融合蛋白(记为SGS-P53)。
其中，序列4的第13-60位编码序列3所示的P53。SGS-P53能通过SmF的作用形成十四聚体。
3、表达SGP的重组载体
将pRSFDuet-1载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列6的第12-1162位所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-SGP，pRSFDuet-1-SGP能表达序列5所示的蛋白质(SGP融合His-tag，记为His-SGP，也即L单体)。
其中，序列6的第14-1156位所示的DNA分子编码序列5所示的His-SGP，序列5的第3-8位为His-tag的氨基酸序列，序列5的第17-102位为SmF的氨基酸序列，序列5的第109-349位为GFP的氨基酸序列，序列5的第366-380位为PRMH的氨基酸序列，序列5的第103-108位和第350-365位为连接区的氨基酸序列。His-SGP能通过SmF的作用形成十四聚体。
4、表达MDM2与KKETPV的融合蛋白的重组载体
将pRSFDuet-1载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列8的第11-432位所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-MDM2-KKETPV，pRSFDuet-1-MDM2-KKETPV能表达序列7所示的蛋白质(即MDM2与KKETPV的融合蛋白，记为MDM2-KKETPV)。
其中，序列8的第13-426位所示的DNA分子编码序列7所示的MDM2-KKETPV，序列7的第3-9位为His-tag的氨基酸序列，序列7的第18-114位为MDM2的氨基酸序列，序列7的第132-137位为KKETPV的氨基酸序列，序列7的第115-131位为连接区的氨基酸序列。
5、表达PDZ与BIR3的融合蛋白的重组载体
将pRSFDuet-1载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列10的第11-813位所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-PDZ-BIR3，pRSFDuet-1-PDZ-BIR3能表达序列9所示的蛋白质(即PDZ与BIR3的融合蛋白，记为PDZ-BIR3)。
其中，序列10的第13-807位所示的DNA分子编码序列9所示的PDZ-BIR3，序列9的第3-9位为His-tag的氨基酸序列，序列9的第18-125位为PDZ的氨基酸序列，序列9的第150-264位为BIR3的氨基酸序列，序列9的第126-149位为连接区的氨基酸序列。
6、表达MBP-SUMO-AVPF-mCherry的融合蛋白的重组载体
将pRSFDuet-1载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列12所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-MBP-SUMO-AVPF-mCherry，pRSFDuet-1-MBP-SUMO-AVPF-mCherry能表达序列11所示的蛋白质。
其中，序列12的第9-2228位所示的DNA分子编码序列11所示的MBP-SUMO-AVPF-mCherry，序列11的第1-6位为His-tag的氨基酸序列，序列11的第14-380位为MBP的氨基酸序列，序列11的第387-482位为SUMO的氨基酸序列，序列11的第483-486位为AVPF的氨基酸序列，序列11的第502-739位为mCherry的氨基酸序列，序列11的第487-501位为连接区的氨基酸序列。
二、融合蛋白表达与纯化
将步骤一的pRSFDuet-1-SGS、pRSFDuet-1-SGS-P53、pRSFDuet-1-SGP、pRSFDuet-1-MDM2-KKETPV、pRSFDuet-1-PDZ-BIR3和pRSFDuet-1-MBP-SUMO-AVPF-mCherry载体分别导入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)(天根生化科技(北京)有限公司)，得到重组菌株BL21-pRSFDuet-1-SGS、BL21-pRSFDuet-1-SGS-P53、BL21-pRSFDuet-1-SGP、BL21-pRSFDuet-1-MDM2-KKETPV、BL21-pRSFDuet-1-PDZ-BIR3和BL21-pRSFDuet-1-MBP-SUMO-AVPF-mCherry。
按照下述方法，对重组菌株BL21-pRSFDuet-1-SGS、BL21-pRSFDuet-1-SGS-P53、BL21-pRSFDuet-1-SGP、BL21-pRSFDuet-1-MDM2-KKETPV、BL21-pRSFDuet-1-PDZ-BIR3和BL21-pRSFDuet-1-MBP-SUMO-AVPF-mCherry表达的含有His标签的融合蛋白进行纯化：
(1)细菌培养和蛋白诱导表达：将上述重组菌株接种到1L LB培养基中。37℃，200rpm培养至OD600约0.8-1(约8-9hr)。将菌液转移至18℃降温1hr，加IPTG至终浓度为0.5mM诱导蛋白表达过夜(16hr左右)，得到培养液。
(2)菌体重悬与破碎：将步骤(1)得到的培养液离心，弃上清液，用40mLbindingbuffer(40mM Tris-Cl，500mM NaCl,pH 8.0或7.4)重悬菌体沉淀并进行超声破碎，将破碎产物超速离心20000rpm，1hr，收集上清液(含有目的融合蛋白)。
(3)Ni柱纯化：预先准备好Ni柱，并用binding buffer平衡。将步骤(2)得到的上清液倒入Ni柱。待液体快流干时，加入wash buffer洗2-3个柱体积，然后加入elution buffer进行目的融合蛋白的洗脱，收集流出液。
wash buffer：40mM Tris-HCl,500mM NaCl,40mM咪唑，pH同binding buffer。
elution buffer：40mM Tris-HCl,500mM NaCl,500mM咪唑，pH同binding buffer。
(4)离子交换纯化：根据蛋白的等电点，选择合适的离子交换柱。用40mM的Tris-Cl缓冲液稀释步骤(3)的流出液以降低离子浓度，得到蛋白稀释液。安装离子交换柱至ATKA蛋白质纯化系统(GE公司)并完成蛋白稀释液的上样。采用逐步提高盐离子浓度的方式对结合在柱子上的蛋白进行洗脱并收集目的融合蛋白。洗脱所用洗脱液由A液和B液组成，二者间的配比根据具体情况调整：A液：40mM Tris-Cl，pH同binding buffer；B液：40mM Tris-Cl，2M NaCl，pH同binding buffer。
(5)凝胶过滤纯化：将步骤(4)得到的目的融合蛋白超滤浓缩后，用预设的分子筛程序对其进行分离纯化，得到进一步纯化的目的融合蛋白。
柱平衡及洗脱所用KMEI buffer由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为：150mM KCl,1mM MgCl2,1mM EGTA,10mM imidazole,1mM DTT，pH＝7。
(6)检测并保存纯化的蛋白：利用SDS-PAGE对上述步骤纯化得到的BL21-pRSFDuet-1-SGS表达的His-SGS、BL21-pRSFDuet-1-SGS-P53表达的SGS-P53、BL21-pRSFDuet-1-SGP表达的His-SGP、BL21-pRSFDuet-1-MDM2-KKETPV表达的MDM2-KKETPV、BL21-pRSFDuet-1-PDZ-BIR3表达的PDZ-BIR3和BL21-pRSFDuet-1-MBP-SUMO-AVPF-mCherry表达的MBP-SUMO-AVPF-mCherry进行检测，在确定上述融合蛋白大小均符合预期后将除MBP-SUMO-AVPF-mCherry外的蛋白浓缩冻存于-80℃备用。
(7)将步骤(6)所得的MBP-SUMO-AVPF-mCherry蛋白用SUMO蛋白酶Ulp1(DennisKuo etal.,SUMO as a Solubility Tag and In Vivo Cleavage of SUMO FusionProteins with Ulp1)酶切过夜，得到酶切溶液。
(8)将步骤(7)所得的酶切溶液进行串联的Ni柱-MBP柱纯化，除去杂蛋白。
(9)将步骤(8)所得的流穿溶液浓缩后按照步骤(5)的凝胶过滤纯化方法纯化，得到纯化的AVPF-mCherry蛋白，将得到的纯化的AVPF-mCherry蛋白并冻存于-80℃备用。
三、抑制剂对多靶点蛋白互作的抑制效果验证
将步骤二得到的His-SGS、SGS-P53、His-SGP、MDM2-KKETPV、PDZ-BIR3和AVPF-mCherry的溶液(溶剂均为KMEI buffer)以及P53与MDM2的互作抑制剂MI-773、KKETPV与PDZ的互作拮抗物KKETAV(短肽KKETAV可与KKETPV竞争性结合PDZ，且前者与PDZ的亲和力更强，故可将KKETAV看作KKETPV与PDZ的竞争性互作抑制剂)、BIR3与AVPF的互作抑制剂GDC0152分别按照如下体系分装于384微孔板中，每孔一种体系，每孔液体体积为20μl。体系中His-SGS(下述体系中简称为SGS)、His-SGP(下述体系中简称为SGP)和SGS-P53在相应体系中的浓度均为1μM；MDM2-KKETPV、PDZ-BIR3和AVPF-mCherry在相应体系中的浓度均为2μM；MI-773和GDC0152在相应体系中的浓度均为5μM；KKETAV在相应体系中的浓度分别为2μM、10μM或50μM。各体系中所含物质具体如下：
体系A：SGS；
体系B：SGP；
体系C：SGS+SGP；
体系D：SGS-P53；
体系E：SGS-P53+SGP；
体系F：SGS-P53+SGP+MDM2-KKETPV+PDZ-BIR3+AVPF-mCherry+DMSO；
体系G：SGS-P53+SGP+MDM2-KKETPV+AVPF-mCherry；
体系H：SGS-P53+SGP+PDZ-BIR3+AVPF-mCherry；
体系I：SGS-P53+SGP+AVPF-mCherry；
体系J：AVPF-mCherry；
体系K：SGS-P53+SGP+MDM2-KKETPV+PDZ-BIR3+AVPF-mCherry+MI-773；
体系L-1：SGS-P53+SGP+MDM2-KKETPV+PDZ-BIR3+AVPF-mCherry+KKETAV，该体系中KKETAV的浓度为2μM；
体系L-2：SGS-P53+SGP+MDM2-KKETPV+PDZ-BIR3+AVPF-mCherry+KKETAV，该体系中KKETAV的浓度为10μM；
体系L-3：SGS-P53+SGP+MDM2-KKETPV+PDZ-BIR3+AVPF-mCherry+KKETAV，该体系中KKETAV的浓度为50μM；
体系M：SGS-P53+SGP+MDM2-KKETPV+PDZ-BIR3+AVPF-mCherry+GDC0152；
体系N：SGS-P53+SGP+MDM2-KKETPV+PDZ-BIR3+AVPF-mCherry。
将上述各体系于4℃静置孵育直至发生相变的体系中的相变液滴完全沉降到孔板底部，用激光共聚焦高内涵成像显微镜进行荧光图像采集，结果(图1中A)显示，体系A、B、D和J中溶液均未发生变化，未检测到荧光信号聚集区域；体系C、E、G、H和I中溶液产生相变液滴，相变液滴中检测到绿色荧光信号(GFP发出的荧光信号)的聚集且其信号强度远远高于溶液中的信号强度；体系F溶液产生相变液滴，相变液滴中可检测到绿色荧光信号和红色荧光信号(mCherry发出的荧光信号)的聚集且其信号强度均远远高于溶液中的信号强度；体系K和M溶液产生相变液滴，相变液滴中检测到绿色荧光信号的聚集且其信号强度远远高于溶液中的信号强度，还检测到相变液滴中红色荧光信号强度明显低于体系F(加DMSO的对照体系)相变液滴中红色荧光信号强度(图1中A和B)；体系L-1～3溶液均产生相变液滴，相变液滴中检测到绿色荧光信号的聚集且其信号强度远远高于溶液中的信号强度，还检测到相变液滴中红色荧光信号强度随着KKETAV浓度的增加而降低(图1中A和B)；体系N中溶液产生相变液滴，相变液滴中可检测到绿色荧光信号和红色荧光信号的聚集且其信号强度均远远高于溶液中的信号强度，与体系F无明显区别。
以上结果说明，SGS可以与SGP结合产生相变液滴，该相变液滴可以用GFP发出的荧光来标示，当相变液滴中含有MDM2的互作蛋白P53时，P53可通过其与MDM2的互作将MDM2-KKETPV招募至相变液滴中，KKETPV则可通过其与PDZ的互作将PDZ-BIR3也招募至相变液滴中，BIR3通过其与AVPF的互作将AVPF-mCherry也招募至相变液滴中，即形成了一个环环相扣的蛋白互作链。正是通过这样环环相扣的蛋白相互作用，实现了红色荧光信号在相变液滴中的聚集。而上述体系中任一组分的缺失或加入任一对蛋白的互作抑制剂(MI-773、KKETAV或GDC0152)均导致蛋白互作链的断裂，从而抑制蛋白互作链末端的红色荧光信号在相变液滴中的聚集。表明利用His-SGP、SGS-P53、MDM2-KKETPV、PDZ-BIR3与AVPF-mCherry组成的体系可以同时对P53/MDM2、KKETPV/PDZ和BIR3/AVPF这3对蛋白之间的互作抑制剂进行检测。
实施例2、抑制剂对多靶点蛋白间互作影响的检测
一、重组载体的制备
1、表达MBP-SUMO与SP的融合蛋白的重组载体
将pRSFDuet-1载体(Merck公司旗下Novagen产品)的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列14所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-MBP-SUMO，pRSFDuet-1-MBP-SUMO能表达序列13所示的蛋白质(记为MBP-SUMO)。
其中，序列14的第9-1466位所示的DNA分子编码序列13所示的MBP-SUMO，序列14的第1456-1461位和第1467-1472位分别为NcoI和XhoI的识别序列，序列13的第1-6位为His-tag的氨基酸序列，序列13的第14-380位为MBP的氨基酸序列，序列13的第387-482位为SUMO的氨基酸序列。
将pRSFDuet-1-MBP-SUMO载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列16所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SP，pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SP能表达序列13所示的MBP-SUMO与序列15所示的SP的融合蛋白质(记为MBP-SUMO-SP，其中SP为L单体)。
其中，序列16的第9-350位所示的DNA分子编码序列15所示的SP，序列15的第1-86位为SmF的氨基酸序列，序列15的第99-113位为PRMH的氨基酸序列，序列15的第87-98位为连接区的氨基酸序列。MBP-SUMO-SP能通过SmF的作用形成十四聚体。
2、表达MBP-SUMO与SS与P53的融合蛋白的重组载体
将pRSFDuet-1-MBP-SUMO的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列18所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SS，pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SS表达序列表中序列13所示的MBP-SUMO与序列17所示的SS的融合蛋白(记为MBP-SUMO-SS)。
其中，序列18的第9-566位所示的DNA分子编码序列17所示的SS，序列18的第556-561位和第567-572位分别为NcoI和XhoI的识别序列，序列17的第1-86位为SmF的氨基酸序列，序列17的第105-170位为SH3的氨基酸序列，序列17的第87-104位、第171-183位为连接区的氨基酸序列。MBP-SUMO-SS蛋白能通过SmF的作用形成十四聚体。
将pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SS的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列4的第5-66位所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SS-P53，pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SS-P53表达序列表中序列13所示的MBP-SUMO与序列17所示的SS与序列3所示的P53的融合蛋白(记为MBP-SUMO-SS-P53，其中SS为R单体)。
其中，序列4的第13-60位编码序列3所示的P53。MBP-SUMO-SS-P53能通过SmF的作用形成十四聚体。
3、表达MBP-SUMO与SS与BIR3的融合蛋白的重组载体
将pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SS的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列20所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SS-BIR3，pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SS-BIR3表达序列表中序列13所示的MBP-SUMO与序列17所示的SS与序列19所示的BIR3的融合蛋白(记为MBP-SUMO-SS-BIR3)。
其中，序列20的第9-356位编码序列19所示的BIR3。MBP-SUMO-SS-BIR3能通过SmF的作用形成十四聚体。
4、表达MBP-SUMO与SS与KKETPV的融合蛋白的重组载体
将pRSFDuet-1-MBP-SUMO的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列22所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SS-KKETPV，pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SS-KKETPV表达序列表中序列13所示的MBP-SUMO与序列21所示的SS-KKETPV的融合蛋白(记为MBP-SUMO-SS-KKETPV)。
其中，序列22的第9-575位所示的DNA分子编码序列21所示的Smf-SH3-KKETPV，序列21的第1-86位为SmF的氨基酸序列，序列21的第105-170位为SH3的氨基酸序列，序列21的第183-188位为KKETPV的氨基酸序列，序列21的第87-104位、第171-182位为连接区的氨基酸序列。MBP-SUMO-SS-KKETPV蛋白能通过SmF的作用形成十四聚体。
5、表达MBP-SUMO-AVPF-mCherry的融合蛋白的重组载体
同实施例1中步骤一步骤6。
6、表达BFP与PDZ的融合蛋白的重组载体
将pRSFDuet-1载体(Merck公司旗下Novagen产品)的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列24所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-BFP-PDZ，pRSFDuet-1-BFP-PDZ能表达序列23所示的蛋白质(记为BFP-PDZ)。
其中，序列24的第9-1160位所示的DNA分子编码序列23所示的BFP-PDZ，序列24的第835-840位和第1161-1166位分别为NcoI和XhoI的识别序列，序列23的第1-7位为His-tag的氨基酸序列，序列23的第16-262位为BFP的氨基酸序列，序列23的第277-383位为PDZ的氨基酸序列，序列23的第263-276位为连接区的氨基酸序列。
7、表达GFP与MDM2的融合蛋白的重组载体
将pRSFDuet-1载体(Merck公司旗下Novagen产品)的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列26所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-GFP-MDM2，pRSFDuet-1-GFP-MDM2能表达序列25所示的蛋白质(记为GFP-MDM2)。
其中，序列26的第9-1133位所示的DNA分子编码序列25所示的GFP-MDM2，序列26的第814-819位和第1134-1139位分别为NcoI和XhoI的识别序列，序列25的第1-6位为His-tag的氨基酸序列，序列25的第15-255位为GFP的氨基酸序列，序列25的第270-374位为MDM2的氨基酸序列，序列25的第256-269位为连接区的氨基酸序列。
二、融合蛋白表达与纯化
将步骤一的pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SP、pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SS-P53、pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SS-BIR3、pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SS-KKETPV、pRSFDuet-1-MBP-SUMO-AVPF-mCherry、pRSFDuet-1-BFP-PDZ、pRSFDuet-1-GFP-MDM2载体分别导入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)(天根生化科技(北京)有限公司)，得到重组菌株BL21-pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SP、BL21-pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SS-P53、BL21-pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SS-BIR3、BL21-pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SS-KKETPV、BL21-pRSFDuet-1-MBP-SUMO-AVPF-mCherry、BL21-pRSFDuet-1-BFP-PDZ、BL21-pRSFDuet-1-GFP-MDM2。按照实施例1中步骤二的(1)-(5)的方法，对重组菌株BL21-pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SP、BL21-pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SS-P53、BL21-pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SS-BIR3、BL21-pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SS-KKETPV、BL21-pRSFDuet-1-MBP-SUMO-AVPF-mCherry、BL21-pRSFDuet-1-BFP-PDZ和BL21-pRSFDuet-1-GFP-MDM2表达的含有His标签的融合蛋白进行纯化。
然后利用SDS-PAGE对纯化得到的BL21-pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SP表达的MBP-SUMO-SP、BL21-pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SS-P53表达的MBP-SUMO-SS-P53、BL21-pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SS-BIR3表达的MBP-SUMO-SS-BIR3、BL21-pRSFDuet-1-MBP-SUMO-SS-KKETPV表达的MBP-SUMO-SS-KKETPV、BL21-pRSFDuet-1-MBP-SUMO-AVPF-mCherry表达的MBP-SUMO-AVPF-mCherry、BL21-pRSFDuet-1-BFP-PDZ表达的BFP-PDZ和BL21-pRSFDuet-1-GFP-MDM2表达的GFP-MDM2进行检测，在确定上述融合蛋白大小均符合预期后将BFP-PDZ和GFP-MDM2浓缩冻存于-80℃备用。将所得的MBP-SUMO-SP、MBP-SUMO-SS-P53、MBP-SUMO-SS-BIR3、MBP-SUMO-SS-KKETPV、MBP-SUMO-AVPF-mCherry蛋白分别用SUMO蛋白酶Ulp1酶切过夜；然后将所得酶切溶液进行串联的Ni柱-MBP柱纯化，除去杂蛋白，收集流穿溶液；将所得流穿溶液浓缩后按照实施例1中步骤二中(5)的凝胶过滤纯化方法纯化，获得纯化后的SP、SS-P53、SS-BIR3、SS-KKETPV和AVPF-mCherry蛋白并冻存于-80℃备用，所得纯化后的SP的序列为序列表中序列15，所得纯化后的SS-P53为序列表中序列17所示的SS与序列3所示的P53的融合蛋白，所得纯化后的SS-BIR3为序列17所示的SS与序列19所示的BIR3的融合蛋白，所得纯化后的SS-KKETPV为序列21所示的蛋白质，所得纯化后的AVPF-mCherry为序列表中序列11的第483-739位所示的蛋白质。
三、抑制剂对多靶点蛋白互作的抑制效果验证
将步骤二得到的SP、SS-P53、GFP-MDM2、SS-KKETPV、BFP-PDZ、SS-BIR3和AVPF-mCherry的溶液(溶剂均为KMEI buffer)以及P53与MDM2的互作抑制剂MI-773、KKETPV与PDZ的互作拮抗物KKETAV、BIR3与AVPF的互作抑制剂GDC0152分别按照如下体系分装于384微孔板中，每孔一种体系，每孔液体体积为20μl。体系中SP在相应体系中的浓度均为3μM、SS-P53、SS-KKETPV和SS-BIR3在相应体系中的浓度均为1μM；GFP-MDM2、BFP-PDZ和AVPF-mCherry在相应体系中的浓度均为2μM；MI-773和GDC0152在相应体系中的浓度均为5μM；KKETAV在相应体系中的浓度分别为2μM、10μM和50μM。各体系中所含物质具体如下：
体系1：SP；
体系2：SS-P53；
体系3：SP+SS-P53；
体系4：GFP-MDM2；
体系5：SP+SS-P53+GFP-MDM2；
体系6：SP+SS-P53+GFP-MDM2+MI-773；
体系7：SP+SS-KKETPV；
体系8：BFP-PDZ；
体系9：SP+SS-KKETPV+BFP-PDZ；
体系10-1：SP+SS-KKETPV+BFP-PDZ+KKETAV，该体系中KKETAV的浓度为2μM；
体系10-2：SP+SS-KKETPV+BFP-PDZ+KKETAV，该体系中KKETAV的浓度为10μM；
体系10-3：SP+SS-KKETPV+BFP-PDZ+KKETAV，该体系中KKETAV的浓度为50μM；
体系11：SP+SS-BIR3；
体系12：AVPF-mCherry；
体系13：SP+SS-BIR3+AVPF-mCherry；
体系14：SP+SS-BIR3+AVPF-mCherry+GDC0152；
体系15：SP+SS-P53+GFP-MDM2+SS-KKETPV+BFP-PDZ+SS-BIR3+AVPF-mCherry+DMSO；
体系16：SP+SS-P53+GFP-MDM2+SS-KKETPV+BFP-PDZ+SS-BIR3+AVPF-mCherry+MI-773；
体系17-1：SP+SS-P53+GFP-MDM2+SS-KKETPV+BFP-PDZ+SS-BIR3+AVPF-mCherry+KKETAV，该体系中KKETAV的浓度为2μM；
体系17-2：SP+SS-P53+GFP-MDM2+SS-KKETPV+BFP-PDZ+SS-BIR3+AVPF-mCherry+KKETAV，该体系中KKETAV的浓度为10μM；
体系17-3：SP+SS-P53+GFP-MDM2+SS-KKETPV+BFP-PDZ+SS-BIR3+AVPF-mCherry+KKETAV，该体系中KKETAV的浓度为50μM；
体系18：SP+SS-P53+GFP-MDM2+SS-KKETPV+BFP-PDZ+SS-BIR3+AVPF-mCherry+GDC0152；
体系19：SP+SS-P53+GFP-MDM2+SS-KKETPV+BFP-PDZ+SS-BIR3+AVPF-mCherry。
将上述各体系于4℃静置孵育直至发生相变的体系中的相变液滴完全沉降到孔板底部，用激光共聚焦高内涵成像显微镜进行荧光图像采集，结果(图2和3)显示，体系1、2、4、8和12中溶液均未发生变化，未检测到荧光信号聚集区域；体系3、7和11中溶液均产生相变液滴(利用显微镜的相差(PH)模式观察，在图中液滴处添加紫色伪彩以便于识别液滴，即图中的相变液滴行的结果)，相变液滴中未检测到荧光信号聚集；体系5中溶液产生相变液滴，相变液滴中检测到绿色荧光信号(GFP发出的荧光信号)的聚集且其信号强度远远高于溶液中的信号强度；体系6中溶液产生相变液滴，相变液滴中未检测到明显荧光信号聚集；体系9中溶液产生相变液滴，相变液滴中检测到蓝色荧光信号(BFP发出的荧光信号)的聚集且其信号强度远远高于溶液中的信号强度；体系10-1～3中溶液均产生相变液滴，且检测到相变液滴中聚集的蓝色荧光信号强度随着KKETAV浓度的升高而降低；体系13中溶液产生相变液滴，相变液滴中检测到红色荧光信号(mCherry发出的荧光信号)的聚集且其信号强度远远高于溶液中的信号强度；体系14中溶液产生相变液滴，相变液滴中未检测到明显荧光信号聚集；体系15中溶液产生相变液滴，相变液滴中可检测到绿色荧光信号、蓝色荧光信号和红色荧光信号的聚集且其信号强度均远远高于溶液中的信号强度；体系16溶液产生相变液滴，相变液滴中可检测到蓝色荧光信号和红色荧光信号的聚集且其信号强度均远远高于溶液中的信号强度，相变液滴中未检测到绿色荧光信号聚集；体系17-1～3中溶液均产生相变液滴，相变液滴中均可检测到绿色荧光信号和红色荧光信号的聚集且其信号强度均远远高于溶液中的信号强度，检测到相变液滴中的蓝色荧光信号强度随着KKETAV浓度的升高而降低；体系18溶液中产生相变液滴，相变液滴中可检测到绿色荧光信号和蓝色荧光信号的聚集且其信号强度均远远高于溶液中的信号强度，相变液滴中未检测到红色荧光信号聚集；体系19中溶液产生相变液滴，相变液滴中可检测到绿色荧光信号、蓝色荧光信号和红色荧光信号的聚集且其信号强度均远远高于溶液中的信号强度，该体系与体系15无明显区别。
以上结果说明，SP可以与SS-P53结合产生相变液滴，P53可通过其与MDM2的互作将GFP-MDM2招募至相变液滴中，从而使绿色荧光信号聚集于相变液滴中，该体系中任一组分的缺失或加入P53与MDM2的互作抑制剂MI-773均会抑制绿色荧光信号在相变液滴中的聚集；SP可以与SS-KKETPV结合产生相变液滴，KKETPV可通过其与PDZ的互作将BFP-PDZ招募至相变液滴中，从而使蓝色荧光信号聚集于相变液滴中，该体系中任一组分的缺失或加入KKETPV与PDZ的互作拮抗剂KKETAV均会抑制蓝色荧光信号在相变液滴中的聚集；SP可以与SS-BIR3结合产生相变液滴，BIR3可通过其与AVPF的互作将AVPF-mCherry招募至相变液滴中，从而使红色荧光信号聚集于相变液滴中，该体系中任一组分的缺失或加入BIR3与AVPF的互作抑制剂GDC0152均会抑制红色荧光信号在相变液滴中的聚集。在SP、SS-P53、GFP-MDM2、SS-KKETPV、BFP-PDZ、SS-BIR3和AVPF-mCherry都存在的情况下，SP可以与SS-P53、SS-KKETPV、SS-BIR3结合产生复合相变液滴(即该相变液滴由SP与SS-P53形成的相变液滴、SP与SS-KKETPV形成的相变液滴、SP与SS-BIR3形成的相变液滴复合而成)，P53可通过其与MDM2的互作将GFP-MDM2招募至复合相变液滴中，KKETPV可通过其与PDZ的互作将BFP-PDZ招募至复合相变液滴中，BIR3可通过其与AVPF的互作将AVPF-mCherry招募至复合相变液滴中，从而使复合相变液滴中可检测到绿色荧光信号、蓝色荧光信号和红色荧光信号的聚集；在此基础上，当加入各自的互作抑制剂，则检测到相变液滴中相应荧光信号的聚集受抑制，但并不影响其它两种荧光信号在相变液滴中的聚集。
表明利用SP、SS-P53、GFP-MDM2、SS-KKETPV、BFP-PDZ、SS-BIR3和AVPF-mCherry组成的体系可以同时筛选P53/MDM2、KKETPV/PDZ和BIR3/AVPF这3对蛋白互作的抑制剂，且可通过相变液滴中聚集的荧光信号的强度变化直接确定抑制剂具体抑制了哪一对蛋白的互作。
<110> 清华大学
<120> 鉴定多对生物分子间相互作用调控因子的方法
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Lys His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly
1 5 10 15
Met Ser Glu Ser Ser Asp Ile Ser Ala Met Gln Pro Val Asn Pro Lys
20 25 30
Pro Phe Leu Lys Gly Leu Val Asn His Arg Val Gly Val Lys Leu Lys
35 40 45
Phe Asn Ser Thr Glu Tyr Arg Gly Thr Leu Val Ser Thr Asp Asn Tyr
50 55 60
Phe Asn Leu Gln Leu Asn Glu Ala Glu Glu Phe Val Ala Gly Val Ser
65 70 75 80
His Gly Thr Leu Gly Glu Ile Phe Ile Arg Ser Asn Asn Val Leu Tyr
85 90 95
Ile Arg Glu Leu Pro Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met Lys Val Ser
100 105 110
Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu
115 120 125
Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu
130 135 140
Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr
145 150 155 160
Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr
165 170 175
Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp Tyr Met Lys Gln His Asp
180 185 190
Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile
195 200 205
Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe
210 215 220
Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe
225 230 235 240
Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Phe Asn
245 250 255
Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys
260 265 270
Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu
275 280 285
Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu
290 295 300
Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp
305 310 315 320
Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala
325 330 335
Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Thr Met Lys Gly
340 345 350
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met Ser Gly His Met
355 360 365
Asp Leu Asn Met Pro Ala Tyr Val Lys Phe Asn Tyr Met Ala Glu Arg
370 375 380
Glu Asp Glu Leu Ser Leu Ile Lys Gly Thr Lys Val Ile Val Met Glu
385 390 395 400
Lys Ser Ser Asp Gly Trp Trp Arg Gly Ser Tyr Asn Gly Gln Val Gly
405 410 415
Trp Phe Pro Ser Asn Tyr Val Thr Glu Glu Gly Asp Ser Pro Leu Gly
420 425 430
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Met Gly
435 440 445
<210> 2
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaggagatat accatgaaac atcatcatca tcatcacgaa aacctgtatt ttcagggcgg 60
catgagcgaa agcagcgata ttagcgcgat gcagccggtg aacccgaaac cgtttctgaa 120
aggcctggtg aaccatcgcg tgggcgtgaa actgaaattt aacagcaccg aatatcgcgg 180
caccctggtg agcaccgata actattttaa cctgcaactg aacgaagcgg aagaatttgt 240
ggcgggcgtg agccacggca ccctgggcga aatttttatt cgcagcaaca acgtgctgta 300
tattcgcgaa ctgccgaacg gcggttccgg cggttccatg aaagtgagca agggcgagga 360
gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa 420
gttcagcgtg cgcggcgagg gcgagggcga tgccaccaac ggcaagctga ccctgaagtt 480
catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta 540
cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ctacatgaag cagcacgact tcttcaagtc 600
cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatctcc ttcaaggacg acggcaccta 660
caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa 720
gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaacttcaa 780
cagccacaac gtctatatca cggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg cgaacttcaa 840
gatccgccac aacgtcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac 900
ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccaa 960
gctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc 1020
cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagacc atgaaaggcg gtagcggtgg 1080
cagcggtggt agcggcggct ccatgagcgg ccatatggac ctcaacatgc ccgcttatgt 1140
gaaatttaac tacatggctg agagagagga tgaattatca ttgataaagg ggacaaaggt 1200
gatcgtcatg gagaaaagca gtgatgggtg gtggcgtggt agctacaatg gacaagttgg 1260
atggttccct tcaaactatg taactgaaga aggtgacagt cctttgggtg gcagtggcgg 1320
tagcggtggc agcggtggca gctccatggg ctaactcgag tctggtaaag aaac 1374
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn
1 5 10 15
<210> 4
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggaaccatgg gcagccagga aacctttagc gatctgtgga aactgctgcc ggaaaactaa 60
ctcgagaagg 70
<210> 5
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Lys His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly
1 5 10 15
Met Ser Glu Ser Ser Asp Ile Ser Ala Met Gln Pro Val Asn Pro Lys
20 25 30
Pro Phe Leu Lys Gly Leu Val Asn His Arg Val Gly Val Lys Leu Lys
35 40 45
Phe Asn Ser Thr Glu Tyr Arg Gly Thr Leu Val Ser Thr Asp Asn Tyr
50 55 60
Phe Asn Leu Gln Leu Asn Glu Ala Glu Glu Phe Val Ala Gly Val Ser
65 70 75 80
His Gly Thr Leu Gly Glu Ile Phe Ile Arg Ser Asn Asn Val Leu Tyr
85 90 95
Ile Arg Glu Leu Pro Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met Lys Val Ser
100 105 110
Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu
115 120 125
Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu
130 135 140
Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr
145 150 155 160
Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr
165 170 175
Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp Tyr Met Lys Gln His Asp
180 185 190
Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile
195 200 205
Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe
210 215 220
Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe
225 230 235 240
Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Phe Asn
245 250 255
Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys
260 265 270
Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu
275 280 285
Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu
290 295 300
Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp
305 310 315 320
Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala
325 330 335
Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Thr Met Lys Gly
340 345 350
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met Ser Ser Lys Lys
355 360 365
Thr Pro Pro Pro Val Pro Pro Arg Thr Thr Ser Lys
370 375 380
<210> 6
<211> 1183
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaggagatat accatgaaac atcatcatca tcatcacgaa aacctgtatt ttcagggcgg 60
catgagcgaa agcagcgata ttagcgcgat gcagccggtg aacccgaaac cgtttctgaa 120
aggcctggtg aaccatcgcg tgggcgtgaa actgaaattt aacagcaccg aatatcgcgg 180
caccctggtg agcaccgata actattttaa cctgcaactg aacgaagcgg aagaatttgt 240
ggcgggcgtg agccacggca ccctgggcga aatttttatt cgcagcaaca acgtgctgta 300
tattcgcgaa ctgccgaacg gcggttccgg cggttccatg aaagtgagca agggcgagga 360
gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa 420
gttcagcgtg cgcggcgagg gcgagggcga tgccaccaac ggcaagctga ccctgaagtt 480
catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta 540
cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ctacatgaag cagcacgact tcttcaagtc 600
cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatctcc ttcaaggacg acggcaccta 660
caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa 720
gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaacttcaa 780
cagccacaac gtctatatca cggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg cgaacttcaa 840
gatccgccac aacgtcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac 900
ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccaa 960
gctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc 1020
cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagacc atgaaaggcg gtagcggtgg 1080
cagcggtggt agcggcggct ccatgagcag caaaaaaacc ccgccgccgg tgccgccgcg 1140
caccaccagc aaataactcg agtctggtaa agaaaccgct gct 1183
<210> 7
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Met Lys His His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5 10 15
Ala Met Lys Ser Gln Ile Pro Ala Ser Glu Gln Glu Thr Leu Val Arg
20 25 30
Pro Lys Pro Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser Val Gly Ala Gln Lys
35 40 45
Asp Thr Tyr Thr Met Lys Glu Val Leu Phe Tyr Leu Gly Gln Tyr Ile
50 55 60
Met Thr Lys Arg Leu Tyr Asp Glu Lys Gln Gln His Ile Val Tyr Cys
65 70 75 80
Ser Asn Asp Leu Leu Gly Asp Leu Phe Gly Val Pro Ser Phe Ser Val
85 90 95
Lys Glu His Arg Lys Ile Tyr Thr Met Ile Tyr Arg Asn Leu Val Val
100 105 110
Val Asn Ser Met Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Ser Met Gly Lys Lys Glu Thr Pro Val
130 135
<210> 8
<211> 432
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aggagatata ccatgaaaca tcatcatcat catcatcatg aaaacctgta ttttcagggc 60
gccatgaaaa gccagattcc ggcgagcgaa caggaaaccc tggtgcgccc gaaaccgctg 120
ctgctgaaac tgctgaaaag cgtgggcgcg cagaaagata cctataccat gaaagaagtg 180
ctgttttatc tgggccagta tattatgacc aaacgcctgt atgatgaaaa acagcagcat 240
attgtgtatt gcagcaacga tctgctgggc gatctgtttg gcgtgccgag ctttagcgtg 300
aaagaacatc gcaaaattta taccatgatt tatcgcaacc tggtggtggt gaactccatg 360
aaaggcggta gcggtggcag cggtggtagc ggcggctcca tgggcaagaa agaaaccccg 420
gtgtaactcg ag 432
<210> 9
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Met Lys His His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5 10 15
Ala Met Lys Gly Ser Pro Glu Phe Leu Gly Glu Glu Asp Ile Pro Arg
20 25 30
Glu Pro Arg Arg Ile Val Ile His Arg Gly Ser Thr Gly Leu Gly Phe
35 40 45
Asn Ile Val Gly Gly Glu Asp Gly Glu Gly Ile Phe Ile Ser Phe Ile
50 55 60
Leu Ala Gly Gly Pro Ala Asp Leu Ser Gly Glu Leu Arg Lys Gly Asp
65 70 75 80
Gln Ile Leu Ser Val Asn Gly Val Asp Leu Arg Asn Ala Ser His Glu
85 90 95
Gln Ala Ala Ile Ala Leu Lys Asn Ala Gly Gln Thr Val Thr Ile Ile
100 105 110
Ala Gln Tyr Lys Pro Glu Glu Tyr Ser Arg Phe Glu Ala Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Met Glu Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Val Ser Ser Asp Arg Asn Phe Pro Asn
145 150 155 160
Ser Thr Asn Leu Pro Arg Asn Pro Ser Met Ala Asp Tyr Glu Ala Arg
165 170 175
Ile Phe Thr Phe Gly Thr Trp Ile Tyr Ser Val Asn Lys Glu Gln Leu
180 185 190
Ala Arg Ala Gly Phe Tyr Ala Leu Gly Glu Gly Asp Lys Val Lys Cys
195 200 205
Phe His Cys Gly Gly Gly Leu Thr Asp Trp Lys Pro Ser Glu Asp Pro
210 215 220
Trp Glu Gln His Ala Lys Trp Tyr Pro Gly Cys Lys Tyr Leu Leu Glu
225 230 235 240
Gln Lys Gly Gln Glu Tyr Ile Asn Asn Ile His Leu Thr His Ser Leu
245 250 255
Glu Glu Cys Leu Val Arg Thr Thr
260
<210> 10
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aggagatata ccatgaaaca tcatcatcat catcatcatg aaaacctgta ttttcagggc 60
gccatgaaag gatccccgga attcctgggg gaggaagaca ttccccggga accaaggcgg 120
atcgtgatcc atcggggctc caccggcctg ggcttcaaca ttgtgggcgg cgaggatggt 180
gaaggcatct tcatctcctt catccttgct gggggtccag ccgacctcag tggggagcta 240
cggaaggggg accagatcct gtcggtcaat ggtgttgacc tccgcaatgc cagtcacgaa 300
caggctgcca ttgccctgaa gaatgcgggt cagacggtca cgatcatcgc tcagtataaa 360
ccagaagagt atagtcgatt cgaggcgggc ggttcaggtg gctcaggtgg cagcggcggt 420
agcgccatgg aaggtggcag cggcggtagc ggtggcagcg atgcggtgag cagcgatcgc 480
aactttccga acagcaccaa cctgccgcgc aacccgagca tggcggatta tgaagcgcgc 540
atttttacct ttggcacctg gatttatagc gtgaacaaag aacagctggc gcgcgcgggc 600
ttttatgcgc tgggcgaagg cgataaagtg aaatgctttc attgcggcgg cggcctgacc 660
gattggaaac cgagcgaaga tccgtgggaa cagcatgcga aatggtatcc gggctgcaaa 720
tatctgctgg aacagaaagg ccaggaatat attaacaaca ttcatctgac ccatagcctg 780
gaagaatgcc tggtgcgcac cacctaactc gag 813
<210> 11
<211> 739
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Lys Ile Glu
1 5 10 15
Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly
20 25 30
Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val
35 40 45
Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala
50 55 60
Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe
65 70 75 80
Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys
85 90 95
Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr
100 105 110
Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu
115 120 125
Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu
130 135 140
Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu
145 150 155 160
Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala
165 170 175
Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys
180 185 190
Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu
195 200 205
Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser
210 215 220
Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn
225 230 235 240
Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly
245 250 255
Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val
260 265 270
Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu
275 280 285
Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu
290 295 300
Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr
305 310 315 320
Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn
325 330 335
Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe
340 345 350
Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln
355 360 365
Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn Ala Ala Ala Ala
370 375 380
Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro
385 390 395 400
Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser
405 410 415
Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu
420 425 430
Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg
435 440 445
Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp
450 455 460
Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile
465 470 475 480
Gly Gly Ala Val Pro Phe Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Trp Gly
485 490 495
Gly Ser Ser Met Gly Met Lys Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met
500 505 510
Ala Ile Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser
515 520 525
Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro
530 535 540
Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro
545 550 555 560
Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser
565 570 575
Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu
580 585 590
Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp
595 600 605
Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu
610 615 620
Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly
625 630 635 640
Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg
645 650 655
Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu
660 665 670
Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr
675 680 685
Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile
690 695 700
Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln
705 710 715 720
Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu
725 730 735
Tyr Lys Thr
<210> 12
<211> 2234
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccatgagcca tcatcatcat catcacgaaa acctgtattt tcagggcaaa atcgaagaag 60
gtaaactggt aatctggatt aacggcgata aaggctataa cggtctcgct gaagtcggta 120
agaaattcga gaaagatacc ggaattaaag tcaccgttga gcatccggat aaactggaag 180
agaaattccc acaggttgcg gcaactggcg atggccctga cattatcttc tgggcacacg 240
accgctttgg tggctacgct caatctggcc tgttggctga aatcaccccg gacaaagcgt 300
tccaggacaa gctgtatccg tttacctggg atgccgtacg ttacaacggc aagctgattg 360
cttacccgat cgctgttgaa gcgttatcgc tgatttataa caaagatctg ctgccgaacc 420
cgccaaaaac ctgggaagag atcccggcgc tggataaaga actgaaagcg aaaggtaaga 480
gcgcgctgat gttcaacctg caagaaccgt acttcacctg gccgctgatt gctgctgacg 540
ggggttatgc gttcaagtat gaaaacggca agtacgacat taaagacgtg ggcgtggata 600
acgctggcgc gaaagcgggt ctgaccttcc tggttgacct gattaaaaac aaacacatga 660
atgcagacac cgattactcc atcgcagaag ctgcctttaa taaaggcgaa acagcgatga 720
ccatcaacgg cccgtgggca tggtccaaca tcgacaccag caaagtgaat tatggtgtaa 780
cggtactgcc gaccttcaag ggtcaaccat ccaaaccgtt cgttggcgtg ctgagcgcag 840
gtattaacgc cgccagtccg aacaaagagc tggcgaaaga gttcctcgaa aactatctgc 900
tgactgatga aggtctggaa gcggttaata aagacaaacc gctgggtgcc gtagcgctga 960
agtcttacga ggaagagttg gcgaaagatc cacgtattgc cgccacgatg gaaaacgccc 1020
agaaaggtga aatcatgccg aacatcccgc agatgtccgc tttctggtat gccgtgcgta 1080
ctgcggtgat caacgcggcg agcggtcgcc agaccgtgga tgaagcgctg aaagatgcgc 1140
agaccaacgc ggcagcggcc atgagcgact cagaagtcaa tcaagaagct aagccagagg 1200
tcaagccaga agtcaagcct gagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat ggatcttcag 1260
agatcttctt caagatcaaa aagaccactc ctttaagaag gctgatggaa gcgttcgcta 1320
aaagacaggg taaggaaatg gactccttaa gattcttgta cgacggtatt agaatccaag 1380
ctgatcagac ccctgaagat ttggacatgg aggataacga tattattgag gctcacagag 1440
aacagattgg tggagcggtg ccgtttggtt caggtggctc aggtggcagc tggggcggta 1500
gctccatggg catgaaagtg agcaagggcg aggaggataa catggccatc atcaaggagt 1560
tcatgcgctt caaggtgcac atggagggct ccgtgaacgg ccacgagttc gagatcgagg 1620
gcgagggcga gggccgcccc tacgagggca cccagaccgc caagctgaag gtgaccaagg 1680
gtggccccct gcccttcgcc tgggacatcc tgtcccctca gttcatgtac ggctccaagg 1740
cctacgtgaa gcaccccgcc gacatccccg actacttgaa gctgtccttc cccgagggct 1800
tcaagtggga gcgcgtgatg aacttcgagg acggcggcgt ggtgaccgtg acccaggact 1860
cctccctcca ggacggcgag ttcatctaca aggtgaagct gcgtggcacc aacttcccct 1920
ccgacggccc cgtaatgcag aagaagacaa tgggctggga ggcctcctcc gagcggatgt 1980
accccgagga cggcgccctg aagggcgaga tcaagcagag gctgaagctg aaggacggcg 2040
gccactacga cgctgaggtc aagaccacct acaaggccaa gaagcccgtg cagctgcccg 2100
gcgcctacaa cgtcaacatc aagttggaca tcacctccca caacgaggac tacaccatcg 2160
tggaacagta cgaacgcgcc gagggccgcc actccaccgg cggcatggac gagctgtaca 2220
agacctaact cgag 2234
<210> 13
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Lys Ile Glu
1 5 10 15
Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly
20 25 30
Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val
35 40 45
Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala
50 55 60
Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe
65 70 75 80
Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys
85 90 95
Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr
100 105 110
Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu
115 120 125
Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu
130 135 140
Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu
145 150 155 160
Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala
165 170 175
Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys
180 185 190
Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu
195 200 205
Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser
210 215 220
Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn
225 230 235 240
Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly
245 250 255
Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val
260 265 270
Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu
275 280 285
Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu
290 295 300
Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr
305 310 315 320
Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn
325 330 335
Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe
340 345 350
Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln
355 360 365
Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn Ala Ala Ala Ala
370 375 380
Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro
385 390 395 400
Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser
405 410 415
Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu
420 425 430
Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg
435 440 445
Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp
450 455 460
Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile
465 470 475 480
Gly Gly Ser Met Gly
485
<210> 14
<211> 1472
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ccatgagcca tcatcatcat catcacgaaa acctgtattt tcagggcaaa atcgaagaag 60
gtaaactggt aatctggatt aacggcgata aaggctataa cggtctcgct gaagtcggta 120
agaaattcga gaaagatacc ggaattaaag tcaccgttga gcatccggat aaactggaag 180
agaaattccc acaggttgcg gcaactggcg atggccctga cattatcttc tgggcacacg 240
accgctttgg tggctacgct caatctggcc tgttggctga aatcaccccg gacaaagcgt 300
tccaggacaa gctgtatccg tttacctggg atgccgtacg ttacaacggc aagctgattg 360
cttacccgat cgctgttgaa gcgttatcgc tgatttataa caaagatctg ctgccgaacc 420
cgccaaaaac ctgggaagag atcccggcgc tggataaaga actgaaagcg aaaggtaaga 480
gcgcgctgat gttcaacctg caagaaccgt acttcacctg gccgctgatt gctgctgacg 540
ggggttatgc gttcaagtat gaaaacggca agtacgacat taaagacgtg ggcgtggata 600
acgctggcgc gaaagcgggt ctgaccttcc tggttgacct gattaaaaac aaacacatga 660
atgcagacac cgattactcc atcgcagaag ctgcctttaa taaaggcgaa acagcgatga 720
ccatcaacgg cccgtgggca tggtccaaca tcgacaccag caaagtgaat tatggtgtaa 780
cggtactgcc gaccttcaag ggtcaaccat ccaaaccgtt cgttggcgtg ctgagcgcag 840
gtattaacgc cgccagtccg aacaaagagc tggcgaaaga gttcctcgaa aactatctgc 900
tgactgatga aggtctggaa gcggttaata aagacaaacc gctgggtgcc gtagcgctga 960
agtcttacga ggaagagttg gcgaaagatc cacgtattgc cgccacgatg gaaaacgccc 1020
agaaaggtga aatcatgccg aacatcccgc agatgtccgc tttctggtat gccgtgcgta 1080
ctgcggtgat caacgcggcg agcggtcgcc agaccgtgga tgaagcgctg aaagatgcgc 1140
agaccaacgc ggcagcggcc atgagcgact cagaagtcaa tcaagaagct aagccagagg 1200
tcaagccaga agtcaagcct gagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat ggatcttcag 1260
agatcttctt caagatcaaa aagaccactc ctttaagaag gctgatggaa gcgttcgcta 1320
aaagacaggg taaggaaatg gactccttaa gattcttgta cgacggtatt agaatccaag 1380
ctgatcagac ccctgaagat ttggacatgg aggataacga tattattgag gctcacagag 1440
aacagattgg tggatccatg ggctaactcg ag 1472
<210> 15
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Met Ser Glu Ser Ser Asp Ile Ser Ala Met Gln Pro Val Asn Pro Lys
1 5 10 15
Pro Phe Leu Lys Gly Leu Val Asn His Arg Val Gly Val Lys Leu Lys
20 25 30
Phe Asn Ser Thr Glu Tyr Arg Gly Thr Leu Val Ser Thr Asp Asn Tyr
35 40 45
Phe Asn Leu Gln Leu Asn Glu Ala Glu Glu Phe Val Ala Gly Val Ser
50 55 60
His Gly Thr Leu Gly Glu Ile Phe Ile Arg Ser Asn Asn Val Leu Tyr
65 70 75 80
Ile Arg Glu Leu Pro Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Ser Ser Lys Lys Thr Pro Pro Pro Val Pro Pro Arg Thr Thr Ser
100 105 110
Lys
<210> 16
<211> 356
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ccatgggcat gagcgaaagc agcgatatta gcgcgatgca gccggtgaac ccgaaaccgt 60
ttctgaaagg cctggtgaac catcgcgtgg gcgtgaaact gaaatttaac agcaccgaat 120
atcgcggcac cctggtgagc accgataact attttaacct gcaactgaac gaagcggaag 180
aatttgtggc gggcgtgagc cacggcaccc tgggcgaaat ttttattcgc agcaacaacg 240
tgctgtatat tcgcgaactg ccgaacggcg gtagcggcgg ctccggtggc tcgggcggtt 300
cgagcaaaaa aaccccgccg ccggtgccgc cgcgcaccac cagcaaataa ctcgag 356
<210> 17
<211> 185
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Met Ser Glu Ser Ser Asp Ile Ser Ala Met Gln Pro Val Asn Pro Lys
1 5 10 15
Pro Phe Leu Lys Gly Leu Val Asn His Arg Val Gly Val Lys Leu Lys
20 25 30
Phe Asn Ser Thr Glu Tyr Arg Gly Thr Leu Val Ser Thr Asp Asn Tyr
35 40 45
Phe Asn Leu Gln Leu Asn Glu Ala Glu Glu Phe Val Ala Gly Val Ser
50 55 60
His Gly Thr Leu Gly Glu Ile Phe Ile Arg Ser Asn Asn Val Leu Tyr
65 70 75 80
Ile Arg Glu Leu Pro Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly His Met Asp Leu Asn Met Pro
100 105 110
Ala Tyr Val Lys Phe Asn Tyr Met Ala Glu Arg Glu Asp Glu Leu Ser
115 120 125
Leu Ile Lys Gly Thr Lys Val Ile Val Met Glu Lys Ser Ser Asp Gly
130 135 140
Trp Trp Arg Gly Ser Tyr Asn Gly Gln Val Gly Trp Phe Pro Ser Asn
145 150 155 160
Tyr Val Thr Glu Glu Gly Asp Ser Pro Leu Gly Ser Gly Gly Ser Gly
165 170 175
Gly Ser Trp Gly Gly Ser Ser Met Gly
180 185
<210> 18
<211> 572
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ccatgagcat gagcgaaagc agcgatatta gcgcgatgca gccggtgaac ccgaaaccgt 60
ttctgaaagg cctggtgaac catcgcgtgg gcgtgaaact gaaatttaac agcaccgaat 120
atcgcggcac cctggtgagc accgataact attttaacct gcaactgaac gaagcggaag 180
aatttgtggc gggcgtgagc cacggcaccc tgggcgaaat ttttattcgc agcaacaacg 240
tgctgtatat tcgcgaactg ccgaacggcg gttcaggtgg cagcggtggt agtggcggct 300
ccggtggctc gggcggttcg ggccatatgg acctcaacat gcccgcttat gtgaaattta 360
actacatggc tgagagagag gatgaattat cattgataaa ggggacaaag gtgatcgtca 420
tggagaaaag cagtgatggg tggtggcgtg gtagctacaa tggacaagtt ggatggttcc 480
cttcaaacta tgtaactgaa gaaggtgaca gtcctttggg ttcaggtggc tcaggtggca 540
gctggggcgg tagctccatg ggctaactcg ag 572
<210> 19
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
Asp Ala Val Ser Ser Asp Arg Asn Phe Pro Asn Ser Thr Asn Leu Pro
1 5 10 15
Arg Asn Pro Ser Met Ala Asp Tyr Glu Ala Arg Ile Phe Thr Phe Gly
20 25 30
Thr Trp Ile Tyr Ser Val Asn Lys Glu Gln Leu Ala Arg Ala Gly Phe
35 40 45
Tyr Ala Leu Gly Glu Gly Asp Lys Val Lys Cys Phe His Cys Gly Gly
50 55 60
Gly Leu Thr Asp Trp Lys Pro Ser Glu Asp Pro Trp Glu Gln His Ala
65 70 75 80
Lys Trp Tyr Pro Gly Cys Lys Tyr Leu Leu Glu Gln Lys Gly Gln Glu
85 90 95
Tyr Ile Asn Asn Ile His Leu Thr His Ser Leu Glu Glu Cys Leu Val
100 105 110
Arg Thr Thr
115
<210> 20
<211> 362
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ccatgggcga tgcggtgagc agcgatcgca actttccgaa cagcaccaac ctgccgcgca 60
acccgagcat ggcggattat gaagcgcgca tttttacctt tggcacctgg atttatagcg 120
tgaacaaaga acagctggcg cgcgcgggct tttatgcgct gggcgaaggc gataaagtga 180
aatgctttca ttgcggcggc ggcctgaccg attggaaacc gagcgaagat ccgtgggaac 240
agcatgcgaa atggtatccg ggctgcaaat atctgctgga acagaaaggc caggaatata 300
ttaacaacat tcatctgacc catagcctgg aagaatgcct ggtgcgcacc acctaactcg 360
ag 362
<210> 21
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 21
Met Ser Glu Ser Ser Asp Ile Ser Ala Met Gln Pro Val Asn Pro Lys
1 5 10 15
Pro Phe Leu Lys Gly Leu Val Asn His Arg Val Gly Val Lys Leu Lys
20 25 30
Phe Asn Ser Thr Glu Tyr Arg Gly Thr Leu Val Ser Thr Asp Asn Tyr
35 40 45
Phe Asn Leu Gln Leu Asn Glu Ala Glu Glu Phe Val Ala Gly Val Ser
50 55 60
His Gly Thr Leu Gly Glu Ile Phe Ile Arg Ser Asn Asn Val Leu Tyr
65 70 75 80
Ile Arg Glu Leu Pro Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly His Met Asp Leu Asn Met Pro
100 105 110
Ala Tyr Val Lys Phe Asn Tyr Met Ala Glu Arg Glu Asp Glu Leu Ser
115 120 125
Leu Ile Lys Gly Thr Lys Val Ile Val Met Glu Lys Ser Ser Asp Gly
130 135 140
Trp Trp Arg Gly Ser Tyr Asn Gly Gln Val Gly Trp Phe Pro Ser Asn
145 150 155 160
Tyr Val Thr Glu Glu Gly Asp Ser Pro Leu Gly Ser Gly Gly Ser Gly
165 170 175
Gly Ser Trp Gly Gly Ser Lys Lys Glu Thr Pro Val
180 185
<210> 22
<211> 581
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ccatgagcat gagcgaaagc agcgatatta gcgcgatgca gccggtgaac ccgaaaccgt 60
ttctgaaagg cctggtgaac catcgcgtgg gcgtgaaact gaaatttaac agcaccgaat 120
atcgcggcac cctggtgagc accgataact attttaacct gcaactgaac gaagcggaag 180
aatttgtggc gggcgtgagc cacggcaccc tgggcgaaat ttttattcgc agcaacaacg 240
tgctgtatat tcgcgaactg ccgaacggcg gttcaggtgg cagcggtggt agtggcggct 300
ccggtggctc gggcggttcg ggccatatgg acctcaacat gcccgcttat gtgaaattta 360
actacatggc tgagagagag gatgaattat cattgataaa ggggacaaag gtgatcgtca 420
tggagaaaag cagtgatggg tggtggcgtg gtagctacaa tggacaagtt ggatggttcc 480
cttcaaacta tgtaactgaa gaaggtgaca gtcctttggg ttcaggtggc tcaggtggca 540
gctggggcgg tagcaagaaa gaaaccccgg tgtaactcga g 581
<210> 23
<211> 383
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 23
His His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met
1 5 10 15
Ser Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met His Met
20 25 30
Lys Leu Tyr Met Glu Gly Thr Val Asp Asn His His Phe Lys Cys Thr
35 40 45
Ser Glu Gly Glu Gly Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Met Arg Ile
50 55 60
Lys Val Val Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala
65 70 75 80
Thr Ser Phe Leu Tyr Gly Ser Lys Thr Phe Ile Asn His Thr Gln Gly
85 90 95
Ile Pro Asp Phe Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu
100 105 110
Arg Val Thr Thr Tyr Glu Asp Gly Gly Val Leu Thr Ala Thr Gln Asp
115 120 125
Thr Ser Leu Gln Asp Gly Cys Leu Ile Tyr Asn Val Lys Ile Arg Gly
130 135 140
Val Asn Phe Thr Ser Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Gly
145 150 155 160
Trp Glu Ala Phe Thr Glu Thr Leu Tyr Pro Ala Asp Gly Gly Leu Glu
165 170 175
Gly Arg Asn Asp Met Ala Leu Lys Leu Val Gly Gly Ser His Leu Ile
180 185 190
Ala Asn Ala Lys Thr Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Pro Ala Lys Asn Leu
195 200 205
Lys Met Pro Gly Val Tyr Tyr Val Asp Tyr Arg Leu Glu Arg Ile Lys
210 215 220
Glu Ala Asn Asn Glu Thr Tyr Val Glu Gln His Glu Val Ala Val Ala
225 230 235 240
Arg Tyr Cys Asp Leu Pro Ser Lys Leu Gly His Lys Leu Asn Pro Lys
245 250 255
Lys Lys Arg Lys Val Ala Met Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
260 265 270
Ser Gly Gly Ser Met Gly Ser Pro Glu Phe Leu Gly Glu Glu Asp Ile
275 280 285
Pro Arg Glu Pro Arg Arg Ile Val Ile His Arg Gly Ser Thr Gly Leu
290 295 300
Gly Phe Asn Ile Val Gly Gly Glu Asp Gly Glu Gly Ile Phe Ile Ser
305 310 315 320
Phe Ile Leu Ala Gly Gly Pro Ala Asp Leu Ser Gly Glu Leu Arg Lys
325 330 335
Gly Asp Gln Ile Leu Ser Val Asn Gly Val Asp Leu Arg Asn Ala Ser
340 345 350
His Glu Gln Ala Ala Ile Ala Leu Lys Asn Ala Gly Gln Thr Val Thr
355 360 365
Ile Ile Ala Gln Tyr Lys Pro Glu Glu Tyr Ser Arg Phe Glu Ala
370 375 380
<210> 24
<211> 1166
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ccatgaaaca tcatcatcat catcatcatg aaaacctgta ttttcagggc gccatgagca 60
tggtgtctaa gggcgaagag ctgattaagg agaacatgca catgaagctg tacatggagg 120
gcaccgtgga caaccatcac ttcaagtgca catccgaggg cgaaggcaag ccctacgagg 180
gcacccagac catgagaatc aaggtggtcg agggcggccc tctccccttc gccttcgaca 240
tcctggctac tagcttcctc tacggcagca agaccttcat caaccacacc cagggcatcc 300
ccgacttctt caagcagtcc ttccctgagg gcttcacatg ggagagagtc accacatacg 360
aagacggggg cgtgctgacc gctacccagg acaccagcct ccaggacggc tgcctcatct 420
acaacgtcaa gatcagaggg gtgaacttca catccaacgg ccctgtgatg cagaagaaaa 480
cactcggctg ggaggccttc accgagacgc tgtaccccgc tgacggcggc ctggaaggca 540
gaaacgacat ggccctgaag ctcgtgggcg ggagccatct gatcgcaaac gccaagacca 600
catatagatc caagaaaccc gctaagaacc tcaagatgcc tggcgtctac tatgtggact 660
acagactgga aagaatcaag gaggccaaca acgaaaccta cgtcgagcag cacgaggtgg 720
cagtggccag atactgcgac ctccctagca aactggggca caagcttaat ccaaaaaaga 780
agagaaaggt agccatgaaa ggcggtagcg gtggcagcgg tggtagcggc ggctccatgg 840
gatccccgga attcctgggg gaggaagaca ttccccggga accaaggcgg atcgtgatcc 900
atcggggctc caccggcctg ggcttcaaca ttgtgggcgg cgaggatggt gaaggcatct 960
tcatctcctt catccttgct gggggtccag ccgacctcag tggggagcta cggaaggggg 1020
accagatcct gtcggtcaat ggtgttgacc tccgcaatgc cagtcacgaa caggctgcca 1080
ttgccctgaa gaatgcgggt cagacggtca cgatcatcgc tcagtataaa ccagaagagt 1140
atagtcgatt cgaggcgtaa ctcgag 1166
<210> 25
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 25
His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Lys
1 5 10 15
Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val
20 25 30
Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu
35 40 45
Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys
50 55 60
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu
65 70 75 80
Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp Tyr Met Lys Gln
85 90 95
His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg
100 105 110
Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val
115 120 125
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile
130 135 140
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn
145 150 155 160
Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly
165 170 175
Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val
180 185 190
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro
195 200 205
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu Ser
210 215 220
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
225 230 235 240
Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Thr Met
245 250 255
Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met Gly Met
260 265 270
Thr Asp Gly Ala Val Thr Thr Ser Gln Ile Pro Ala Ser Glu Gln Glu
275 280 285
Thr Leu Val Arg Pro Lys Pro Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser Val
290 295 300
Gly Ala Gln Lys Asp Thr Tyr Thr Met Lys Glu Val Leu Phe Tyr Leu
305 310 315 320
Gly Gln Tyr Ile Met Thr Lys Arg Leu Tyr Asp Glu Lys Gln Gln His
325 330 335
Ile Val Tyr Cys Ser Asn Asp Leu Leu Gly Asp Leu Phe Gly Val Pro
340 345 350
Ser Phe Ser Val Lys Glu His Arg Lys Ile Tyr Thr Met Ile Tyr Arg
355 360 365
Asn Leu Val Val Val Asn
370
<210> 26
<211> 1139
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ccatgaaaca tcatcatcat catcacgaaa acctgtattt tcagggcgcc atgaaagtga 60
gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg 120
taaacggcca caagttcagc gtgcgcggcg agggcgaggg cgatgccacc aacggcaagc 180
tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga 240
ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgactacatg aagcagcacg 300
acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc tccttcaagg 360
acgacggcac ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc 420
gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg 480
agtacaactt caacagccac aacgtctata tcacggccga caagcagaag aacggcatca 540
aggcgaactt caagatccgc cacaacgtcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact 600
accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga 660
gcacccagtc caagctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg 720
agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag accatgaaag 780
gcggtagcgg tggcagcggt ggtagcggcg gctccatggg catgactgat ggtgctgtaa 840
ccaccagcca gattccggcg agcgaacagg aaaccctggt gcgcccgaaa ccgctgctgc 900
tgaaactgct gaaaagcgtg ggcgcgcaga aagataccta taccatgaaa gaagtgctgt 960
tttatctggg ccagtatatt atgaccaaac gcctgtatga tgaaaaacag cagcatattg 1020
tgtattgcag caacgatctg ctgggcgatc tgtttggcgt gccgagcttt agcgtgaaag 1080
aacatcgcaa aatttatacc atgatttatc gcaacctggt ggtggtgaac taactcgag 1139

Claims (17)

1.鉴定p对生物分子间互作调控因子的方法，p为2或3，p对生物分子的名称分别为X1～Xp以及XL1～XLp，X1与XL1间、X2与XL2间、……、Xp与XLp间均具有相互作用，所述方法包括U1）～U3）：
U1）将名称分别为溶液A1～Ap的p种溶液、名称为溶液B的溶液与名称分别为溶液C1～Cp的p种溶液混合，得到混合液；
所述溶液A1为含有A1的溶液，所述A1由名称为R的生物分子和X1连接而成；
所述溶液A2为含有A2的溶液，所述A2由所述R和X2连接而成；
所述溶液A3为含有A3的溶液，所述A3由所述R和X3连接而成；
以此类推，……，所述溶液Ap为含有Ap的溶液，所述Ap由所述R和Xp连接而成；
所述溶液B为含有B的溶液，所述B含有名称为L的生物分子；
所述R与所述L相同或不同且二者间具有相互作用，所述R与所述L相互作用后发生相变产生相变液滴；
所述溶液C1为含有C1的溶液，所述C1由名称为E1的报告基团与XL1连接而成；所述溶液C2为含有C2的溶液，所述C2由名称为E2的报告基团与XL2连接而成；所述溶液C3为含有C3的溶液，所述C3由名称为E3的报告基团与XL3连接而成；以此类推，……，所述溶液Cp为含有Cp的溶液，所述Cp由名称为Ep的报告基团与XLp连接而成；E1～Ep的p种报告基团均不相同；
X1与Xp为蛋白质、核酸或多糖；XL1与XLp为蛋白质、核酸或多糖；
U2）向所述混合液中加入q种待测调控因子，得到待测液，q为大于等于1的自然数；
U3）检测所述待测液和所述混合液的相变液滴中E1～Ep的信号强度确定所述q种待测调控因子中是否含有p对生物分子间相互作用的调控因子：如所述待测液相变液滴中E1的信号等于对照液，所述对照液为所述混合液，所述q种待测调控因子中不含或候选不含X1与XL1间发生相互作用的调控因子；如所述待测液相变液滴中E1的信号不等于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X1与XL1间发生相互作用的调控因子；
如所述待测液相变液滴中E2的信号等于所述对照液，所述q种待测调控因子中不含或候选不含X2与XL2间发生相互作用的调控因子；如所述待测液相变液滴中E2的信号不等于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X2与XL2间发生相互作用的调控因子；
以此类推，……，如所述待测液相变液滴中Ep的信号等于所述对照液，所述q种待测调控因子中不含或候选不含Xp与XLp间发生相互作用的调控因子；如所述待测液相变液滴中Ep的信号不等于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有Xp与XLp间发生相互作用的调控因子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：如所述待测液相变液滴中E1的信号不等于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X1与XL1间发生相互作用的调控因子，包括：如所述待测液相变液滴中E1的信号高于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X1与XL1间发生相互作用的促进因子；如所述待测液相变液滴中E1的信号低于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X1与XL1间发生相互作用的抑制剂；
如所述待测液相变液滴中E2的信号不等于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X2与XL2间发生相互作用的调控因子，包括：如所述待测液相变液滴中E2的信号高于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X2与XL2间发生相互作用的促进因子；如所述待测液相变液滴中E2的信号低于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X2与XL2间发生相互作用的抑制剂；
以此类推，……，如所述待测液相变液滴中Ep的信号不等于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有Xp与XLp间发生相互作用的调控因子，包括：如所述待测液相变液滴中Ep的信号高于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有Xp与XLp间发生相互作用的促进因子；如所述待测液相变液滴中Ep的信号低于所述对照液，所述q种待测调控因子中含有或候选含有Xp与XLp间发生相互作用的抑制剂。
3.鉴定p+s对生物分子间互作抑制剂的方法，p为2或3，s为2或3，p+s对生物分子的名称分别为X1～Xp与Xp+1～Xp+s以及XL1～XLp与XLp+1～XLp+s，X1与XL1间、X2与XL2间、……、Xp与XLp间、Xp+1与XLp+1间、Xp+2与XLp+2间、……、Xp+s与XLp+s间均具有相互作用，所述方法包括V1）～V3）：
V1）将名称分别为溶液A1～Ap、Ap+1～Ap+s+1的p+s+1种溶液、名称为溶液B的溶液与名称分别为溶液C1～Cp的p种溶液混合，得到混合液；
所述溶液A1为含有A1的溶液，所述A1由权利要求1中所述R和X1连接而成；
所述溶液A2为含有A2的溶液，所述A2由所述R和X2连接而成；
所述溶液A3为含有A3的溶液，所述A3由所述R和X3连接而成；
以此类推，……，所述溶液Ap为含有Ap的溶液，所述Ap由所述R和Xp连接而成；
所述溶液Ap+1为含有Ap+1的溶液，所述Ap+1由所述R和Xp+1连接而成；
所述溶液Ap+2为含有Ap+2的溶液，所述Ap+2由XLp+1与Xp+2连接而成；
所述溶液Ap+3为含有Ap+3的溶液，所述Ap+3由XLp+2与Xp+3连接而成；
以此类推，……，所述溶液Ap+s为含有Ap+s的溶液，所述Ap+s由XLp+s-1与Xp+s连接而成；
所述溶液Ap+s+1为含有Ap+s+1的溶液，所述Ap+s+1由XLp+s与名称为甲的报告基团连接而成；
所述溶液B为含有B的溶液，所述B含有名称为L的生物分子；
所述R与所述L相同或不同且二者间具有相互作用，所述R与所述L相互作用后发生相变；
所述溶液C1为含有C1的溶液，所述C1由名称为E1的报告基团与XL1连接而成；所述溶液C2为含有C2的溶液，所述C2由名称为E2的报告基团与XL2连接而成；所述溶液C3为含有C3的溶液，所述C3由名称为E3的报告基团与XL3连接而成；以此类推，……，所述溶液Cp为含有Cp的溶液，所述Cp由名称为Ep的报告基团与XLp连接而成；E1～Ep的p种报告基团均不相同，且均不同于所述甲；
X1～Xp与Xp+1～Xp+s为蛋白质、核酸或多糖；XL1～XLp与XLp+1～XLp+s为蛋白质、核酸或多糖；
V2）向所述混合液中加入q种待测调控因子，得到待测液，q为大于等于1的自然数；
V3）检测所述待测液相变液滴中E1～Ep以及所述甲的信号确定所述q种待测调控因子中是否含有p+s对生物分子间相互作用的抑制剂：如所述待测液中不含有E1的信号，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X1与XL1间发生相互作用的抑制剂；如所述待测液中含有E1的信号，所述q种待测调控因子中不含或候选不含X1与XL1间发生相互作用的抑制剂；如所述待测液中不含有E2的信号，所述q种待测调控因子中含有或候选含有X2与XL2间发生相互作用的抑制剂；如所述待测液中含有E2的信号，所述q种待测调控因子中不含或候选不含X2与XL2间发生相互作用的抑制剂；以此类推，……，如所述待测液中不含有Ep的信号，所述q种待测调控因子中含有或候选含有Xp与XLp间发生相互作用的抑制剂；如所述待测液中含有Ep的信号，所述q种待测调控因子中不含或候选不含Xp与XLp间发生相互作用的抑制剂；如所述待测液中不含有所述甲的信号，所述q种待测调控因子中含有或候选含有Xp+1与XLp+1至Xp+s与XLp+s的s对生物分子中至少1对的相互作用抑制剂；如所述待测液中含有所述甲的信号，所述q种待测调控因子中不含或候选不含Xp+1与XLp+1至Xp+s与XLp+s的s对生物分子中任一对相互作用的抑制剂。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述R含有名称为结合区1的结合区；所述L含有名称为结合区2的结合区；所述R与所述L间的相互作用通过所述结合区1和所述结合区2进行，所述R中所述结合区1和所述L中所述结合区2的个数均大于等于2。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述R为蛋白质、核酸或多糖；和/或，所述L为蛋白质、核酸或多糖。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：E1～Ep为p种荧光报告基团。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述甲为荧光报告基团。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：E1～Ep为p种荧光蛋白质；和/或，所述甲为荧光蛋白质。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述A1中X1和所述R的个数比、所述Ap中Xp和所述R的个数比以及所述Ap+1中Xp+1和所述R的个数比均为大于等于1的整数。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述R为由R单体形成的多聚体，所述R单体均含有名称为mr的单体，大于等于两个的所述mr能形成多聚体；
和/或，所述L为由L单体形成的多聚体，所述L单体均含有名称为ml的单体，大于等于两个的所述ml能形成多聚体；
所述mr与所述ml相同或不同。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：
所述R中至少有一个单体含有所述结合区1；
和/或，所述L中至少有一个单体含有所述结合区2。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述R单体均含有所述mr和所述结合区1；
和/或，所述L单体均含有所述ml和所述结合区2。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述R单体中，所述mr与所述结合区1或含有所述结合区1的生物分子通过连接区或化学键相连；
和/或，所述L单体中，所述ml与所述结合区2或含有所述结合区2的生物分子通过所述连接区或化学键相连。
14.根据权利要求10-13中任一所述的方法，其特征在于：所述R单体均相同，所述L单体均相同；
和/或，所述mr与所述ml均为酵母SmF；
和/或，所述结合区1为序列1的第364-431位所示的SH3中与序列5的第366-380位所示的PRMH结合的区域；所述结合区2为序列5的第366-380位所示的PRMH中与序列1的第364-431位所示的SH3结合的区域；
和/或，所述连接区为（Gly-Gly-Ser）n或含有（Gly-Gly-Ser）n的多肽，n为大于等于2的自然数。
15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述mr与所述ml均为序列1的第17-102位所示的酵母SmF；
和/或，所述含有所述结合区1的生物分子为序列1的第364-431位所示的SH3；
和/或，所述含有所述结合区2的生物分子为序列5的第366-380位所示的PRMH。
16.根据权利要求10-13中任一所述的方法，其特征在于：所述R单体为H1）或H2）或H3）：
H1）氨基酸序列是序列17的第1-170位所示的蛋白质；
H2）将序列表中序列17的第1-170位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
H3）在H1）或H2）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
和/或，所述L单体为I1）或I2）或I3）：
I1）氨基酸序列是序列15的蛋白质；
I2）将序列表中序列15的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
I3）在I1）或I2）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
17.权利要求1-16中任一所述方法的下述任一应用：
Z1）在筛选生物分子间相互作用调控因子中的应用；
Z2）在筛选多对生物分子间相互作用调控因子中的应用；
Z3）在筛选多对生物分子间与生物分子互作链的调控因子中的应用；
Z4）在检测物质对生物分子间相互作用的调控中的应用；
Z5）在检测物质对多对生物分子间相互作用调控中的应用；
Z6）在检测物质对多对生物分子间与生物分子互作链的调控中的应用。
CN201810865132.9A 2018-08-01 2018-08-01 鉴定多对生物分子间相互作用调控因子的方法 Active CN110853712B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810865132.9A CN110853712B (zh) 2018-08-01 2018-08-01 鉴定多对生物分子间相互作用调控因子的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810865132.9A CN110853712B (zh) 2018-08-01 2018-08-01 鉴定多对生物分子间相互作用调控因子的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110853712A CN110853712A (zh) 2020-02-28
CN110853712B true CN110853712B (zh) 2022-06-07

Family

ID=69594464

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810865132.9A Active CN110853712B (zh) 2018-08-01 2018-08-01 鉴定多对生物分子间相互作用调控因子的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110853712B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117285644A (zh) * 2022-06-16 2023-12-26 清华大学 一种相变调节元件及其用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1894581A (zh) * 2003-07-09 2007-01-10 森蒂金生物科学公司 检测蛋白－蛋白相互作用的方法
CN101620233A (zh) * 2009-05-27 2010-01-06 华中科技大学 一种蛋白质相互作用的检测方法
CN106370831A (zh) * 2016-08-29 2017-02-01 苏州奥普特克自动化科技有限公司 用于生物分子相互作用动态检测的检测芯片及制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0131014D0 (en) * 2001-12-28 2002-02-13 James Peter Method for molecule-mlecule analysis

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1894581A (zh) * 2003-07-09 2007-01-10 森蒂金生物科学公司 检测蛋白－蛋白相互作用的方法
CN101620233A (zh) * 2009-05-27 2010-01-06 华中科技大学 一种蛋白质相互作用的检测方法
CN106370831A (zh) * 2016-08-29 2017-02-01 苏州奥普特克自动化科技有限公司 用于生物分子相互作用动态检测的检测芯片及制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
生物分子相互作用技术检测黄曲霉毒素B1;许艳丽 等;《检验检疫学刊》;20170420;第27卷(第2期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110853712A (zh) 2020-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11390653B2 (en) Amino acid-specific binder and selectively identifying an amino acid
US20160146786A1 (en) Method of monitoring cellular trafficking of peptides
CN111856024B (zh) 检测生物膜蛋白质间相互作用的方法及所用成套试剂
CN110853712B (zh) 鉴定多对生物分子间相互作用调控因子的方法
CN109752557B (zh) 检测生物分子间相互作用及其调控因子的成套试剂与应用
CN109554433B (zh) 一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法
CN110794141B (zh) 鉴定生物分子链中多对生物分子间相互作用调控因子的方法
JP5182671B2 (ja) コイルドコイルを利用した膜タンパク質標識方法
CN109917120B (zh) 检测翻译后修饰蛋白质与其配体间相互作用的成套试剂
Lee et al. Bimolecular fluorescence complementation for imaging protein interactions in plant hosts of microbial pathogens
CN110684115A (zh) 用于凋亡细胞识别和标记的融合蛋白及其制备方法和应用
EP3530670B1 (en) Method for producing endotoxin detecting agent comprising recombinant limulus factor c and use thereof
US20160229899A1 (en) LUCIGEN YELLOW (LucY), A YELLOW FLUORESCENT PROTEIN
KR20210072021A (ko) 생물학 분석에 적합한 복수의 폴리펩티드 변이체의 생산 방법
CN110794129B (zh) 细胞内检测生物分子间相互作用及其调控因子的方法与所用试剂
WO2019085958A1 (zh) 检测生物分子间相互作用及其调控因子的成套试剂与应用
KR101101986B1 (ko) 새로운 리포터와 분자 탐침자로서 빠르고 강한 형광이 유도되는 적색 형광 단백질 ＦｍＲｅｄ
CN106632687B (zh) 一种用于筛选弱MdmX抑制剂或测试弱MdmX抑制剂的抑制活性的融合蛋白
CN111269976A (zh) 检测MeCP2突变的物质在检测MeCP2突变是否为致病突变以及筛选药物中的应用
JP2009112282A (ja) 極微小タンパク質およびその結晶
US20080161199A1 (en) Fusion Proteins and Methods for Determining Protein-Protein-Interactions in Living Cells and Cell Lysates, Nucleic Acids Encoding these Fusion Proteins, as well as Vectors and Kits Containing These
JP2010071744A (ja) 化合物のスクリーニング方法、並びに、スクリーニング用キット
EP4421166A1 (en) Improved split halotags
Berglund Analyzing binding motifs for WW, MATH, and MAGE domains using Proteomic Peptide Phage Display
CN114057893A (zh) 一种编码线粒体定位的豆蔻酰化多肽及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant