HU230586B1 - Anti-ErbB antitest/maytansinoid konjugátumok alkalmazása rákos betegségek kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására - Google Patents

Anti-ErbB antitest/maytansinoid konjugátumok alkalmazása rákos betegségek kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU230586B1
HU230586B1 HU0201616A HUP0201616A HU230586B1 HU 230586 B1 HU230586 B1 HU 230586B1 HU 0201616 A HU0201616 A HU 0201616A HU P0201616 A HUP0201616 A HU P0201616A HU 230586 B1 HU230586 B1 HU 230586B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cancer
antibody
antibodies
cells
cell
Prior art date
Application number
HU0201616A
Other languages
English (en)
Inventor
Sharon Erickson
Ralph Schwall
Mark X. Sliwkowski
Original Assignee
Genentech, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26838985&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU230586(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech, Inc. filed Critical Genentech, Inc.
Publication of HUP0201616A2 publication Critical patent/HUP0201616A2/hu
Publication of HUP0201616A3 publication Critical patent/HUP0201616A3/hu
Publication of HU230586B1 publication Critical patent/HU230586B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

A találmány tárgya azditest-maytanainold kenj egálon, amelyben az entitást a hobAb4D5~8 vagy a hobAb4DS-8 antigénhez kötődő fragmense,, vagy ilyen kenj ugátumot tartalmazd gyógyászat1 készítmény ErbBéreceptort túlzott mennyiségben termelő tumor emberben történő kezelésére történő alkalmazásra.
á maytansint elsőkánt egy Kelet-Afrikéban élő cserééből,. a Maytenus serrete-ből izolálták (Xd. 3 896 111 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírási. Ezt követően felismerték, hogy bizonyos mikrobák szinten termeinek maytansin-szerö vegyeleteket fán. maytansinoidokaz), pl, meytanslnolt és C~3 mayfcansl.no.1 -észtereket <4 151 042 számé egyesült államokbeli szabadalmi leírás), A szintetíküs maytansinol és msytan~ o.-an, égek leírását illetően lek pl. a következő számú egyesült államokbeli szabadalma le-
1 rést kát: 4 . 137 233; 4 248 37 0; 4 . 256 746; 4260 608;
4 2 6 b élét 4 234 73?; 4 30:7 016; 4 308 263; 4 308 262;
4 309 425; 4 313 516; 4 Ö 00 0 < V S f 4 317 321; 4 322 34 8;
4 331 338; 4: 361 650; 4 364 866; 424 219; 4 4 50 254;
4 3 SS 6 3 5 és 4 371 533 mely: eket telj ;em teryeőeámékö en a
15586 KB
kitanitás részének tekintünk.
A maytansin és a maytanslnoidok
A mayfansin és maytansinoidok rendkívül citetORikasuk, rákzerápiaban veié klinikai .alkalmazásúkát azonban nagymértékben korlátozzák, súlyos szisztémás mellékhatásaik, amelyek elsősorban tumorokra vonatkozó gyenge szeioktlvitásuknak tulajdoníthatok, A maytansinnal végzett klinikai kísérleteket a központi idegrendszerre és gyomor-bélrendszerre gyakorolt súlyos mellékhatásaik miatt felfüggesztették [Issei és mtsai,: Cső. űreaimént Rév. 1 iái <1973)}.
A reoeptor firozln kinázok űrök-családia és enti-r-rbB antitestek
A receptor tirosio kinézek űrbB-csaiádjának tagjai a sej tszaporodás, ditferáncráció és -túlélés fontos mediátoral. A receptorcsalád négy tagbői áll, melyek a kővetkezők:; epidermáiie növekedési faktor receptor (EGER vagy BröBfj ; HEK.2 (BrbSB vagy piSda&;b ; HERE iErb.Sé) ; és EŰRi (Erőé vagy tyrol;.
k plS5fl&a-t eredetileg vegyszeresen kezeit patkányok nearoblasztomáibél származó transzformáló gének termékeként azonosatották. A reu proto-onkogén aktivált alakja a ködeiét p rot e1n t r aaszmernbrán-regiói aban bakó ve t ke ze t1 pórimat átlő úvalin-tglut amin sav) eredménye. A non humán homológjának sokszorozödását megfigyelték emlőrákokban és petefészekrákokban, és ez rossz prognózissal volt összefutgésben (Siamon és misai.: Science 225, 17? (1987} ; Piarca és misai.Science 244.# 707 {1937} ? és 4 963 303 számú mmmlt áir '•s.c-51 - - )0.7.:: míres'. Ή; eszmém ,n„me:.
temcrokben e ren prct o~oneocénben lévőhöz hasonló psntmLtaci.órdi nőm ssámoltek be, r ErbEa túlzott mértéké termelődését (amely -gyakran, de nem egységesen, génewiif ikeciő eredménye} más carcinomák esetében is megfigyelték, többek kötött a gyomor, endometrinm, nyáImirigy,
tüdő, vese, vastagbél, p se j r ami r i gy, ha snyáimi r: igy és hegy-
hólyag sereinőméiben (id , pl. Ring és misei.: 3cien.ce 229,
974 (1935} ; Yokoia se mt sál., : Le ecet, I, 765 7.98 6);
Enkeshigi és mtsai,: hol . Gall.. Siói, 6, 955 {1 936); Gaúrin
és misei.: Qncogene Rés , 3, 21 (1938} ; Cohen és mtsaí.,:
Onoogene 4, 81 {1989}; fonémára és misai,: Cancer Rés. 51,
1034 (1991}; Sorát és misei, : Gyessel.. Onool. 38, 364
{19 9 07 ; kei ser és mtsai. : Cancer Rés, 50, 421 (1990} ; Rém
és mtsai.: Cancer Rés. 50, 5184 (1990); Park és mtsai,:
Cancer Rés, 49, 6305 {1980}; Oh au és mtsaí.: Női. Cammog. 3, été (19907; hasi and és mtsaí. : Sr. 7, Cancer 57, 355
7.938}; Williams és mrsaz.: Pathotá.oicgy 59- <16 í 19511 ; és WcCann és mtsai,: Cancer 65, 88 {1990} ] „ Ar Erb32~receptor prosstatadeganetokoar. tátrait mértékben termelődhet (Gr és mtsai,: Cancer Lett. 99, 185 {1995}; Roas és misei.: Ham.
Patboi. 28, 827 {1997}; Ross és misei.: Cancer 7 9, 2162 {1997}; és Sadasivan és misei.; J. Utol. 150, 126 (1992)}. ér ere 6 2 on bogén ÍVsp)ioea” alakját, amely konstitutív· módon tirozin-foszfcrilált SrbS2~-receptort kódol, a WC 00729576 számú nemretköri köttététel! iratban 71171, április 13.1
Írták le. ,á spircs’' váltósat által kódolt erbB2-profeznre IS aminosavas, leolvasási fázison, belüli teledé jellemző (CvDléCKGCRAEQRAS) , melyek közül kettő konzervált cisztáin.
Korábban patkányeredetű pl 85^ és humán ErbBzgroteinek elleni, antitesteket is fe:. ráossz. Drebin és mtsai, a patkáüyeredatn neu-gánsermek, a pl.85* elleni antitesteket hoztak létra fid. pl. decin és mosd.; Gall 41, 11 ílelőj ; nyers és mtsai.. : Meth. Enzym, lép, 277 (1911) ; ts ?t d d td , -'tmte <·. ^„dddd *. Drebin és mtsai, [Cncogene 2, 273 (1583)] beszámoltak arról, hogy a p!85asu kei kőién régiójával reaktív antitestek elegye szinergíkns tumoréizenes hatást fejtett ki a csipesz egerekbe ültetett - nec-génnei transzformált - RÍH-3T3sejtekre pld. még 5 824 311 számé egyesült államokbeli szabadalmi leírás)
Egyéb, knlöobezé talajdooságö anti-ErbBl antitesteket is feltártak (id, pl, Caglíabüe és mtsai,; J. Center 47, 133 (1331); Kckenzie és mtsai.: Oncogene 1, 54:3 (1589);
lelet és mtsai.: Cancer les. 5 1, 5361 illái:; Saras és mtsai,: Cdecdar Carcinogeneois 3, 350 illat); Btancovski és mtsai,: 71.12 (üSé) 83, 6631 (1331); Baoas és mtsai,:
Cancer Research 52:, 25 80 (1312); Ka és mtsai,: int. J.
Cancer 53, 401 (1393); Wö 94/0Ö136 számú nemzetközi közzétételi irat; Kasprzyr és mtsai.:: Cancer Research 57, 2771 (1132); Hancock ás mtsai,; Cancer Research 51, 4535 (:1331),: Shaover és mtsai.; Cancer Research 54, 1353 (1134); Arteaga ás mtsai.: Cancer Research 51, 3758 (1:334); Haroerth és mtsai. : 3. Bioi. Chem. 257, 151.60 i 1132) ;
7:(3 136 számú egyesült', áiiamokbei.i. szabadalmi leírás; Klapper és mtsai, : Oneegene 1«, 2099 (1997) 1 ,
Hoc z lak és mtsai, [Mól. Cel.l, Bioi, 91;, 1165 (1989) j anti-BrbB2 antitestek sorozatának létrehozását Írták le, mely antitesteket az SK-BR-3 hamsa emlőtnmor-sejt vonal. alkalmazásával karakzerizálták. át ΒΚ-3η·-·3 sejtek - antitestekkel történő érintkoztetés ntáni - relatív proiiterációját az egyrétegű sejtienyészetek 72 óra elteltével végzett. kristályibolya festésével határozták meg. E vizsgálati eljárásban a maximális gátlást a 4Ώ5-antitesttel kapták, amely a sejtek proliferácíögá.t 56 %-ban gátolta, A szobán forgó antitest-sorozat egyéb tagjai e vizsgálati eljárásban kisebb mértékben gázolták a sej torol iterációt» hegéilapították továbbá, hogy a (Do-antitest az £.rbS2-t tűizott mértékben termelő emlotomor-sejtvonaiakat szerzitizáija a IbF citctosikos hatásaira, fid. még: 5 677 171 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás). A Hoczíak és mtsaí. által leírt anti-ErfcBf antitestek további karakterÍtélését illetően iá. Fenoly és mtsai,: Cancer Research 50, 155Q (1990); Kotta es másai. : In Olt no 26(35, 5 9A (1990); harap és mtsai,: Gronáh Reguláción 1, 72 (1991); Shepard és mtsai,: őt Clin. Immun ol. 11:5), 117 (1991); Kuma. r és mtsai.:: hol. Coll. Bioi, II (2), 979 (1991) ; remis és másai,: Cancer
Ir&munol. Xmmonother. 37, 255 (1993); rietras és mtsai.:
............... ~~~~
Oncogene 9, 1329 (19945; Vitatta és mtsai.; Cancer Research oá, 5301 (1994); iliwkowski és mtsai,: 31 Bioi, ebem,
269 (20), 14661 (1.994)? Beolt és mtsai. : o, Bioi. Chem. 266, 1.4 300 (1921); ír Bonra és mtsaí..; 3roc. (lati. Acad. Sói. 91,
7292 0.900); Lee is és mtsai,.: Gáncsr Eesearch 55, 1457 :0 395: ; Sohoefer és mtsai.: Onoooene 15, 13SS Ο.29Ό .
' ........ ............. ·- —“· ...........
A2 egéreredetű anti-HSRS monokiónális antitest gátolj a a 325.2-t 2+ és 2 a mértékben táltermelő ezé órák-sej tvonalak szaporodását, a H252-Í kisebb asunyőségben termelő sejtekre azonban nincs ilyen hatása. {Lewis és mássd,.: Cancer Immunoi, Immanether. 0.983.0, S megfigyelés alapján a 4DSar.ti testet humani tárták jid. Cár tar és mtsaz.: Prcc. ka ti. Acad, On 851 5 0 4235 0.232}]. A HEECS8TIE® elnevezésé, humanizált változatot :ChoWah4D5~8, rhtmAb HERE; Id. 5 821 337 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás} olyan emlőrákon betegekben tesztelték, akikben a HER2 túlzott mértékben termelődött, de nagyomanyos kemoterápiát követően a betegség súlyosbodásé volt megfigyeinetö iBaselga és mtsaí,: J, Cián, dacol. 2.0 737 0.9960 Gabiéig:; és mtsaí, : ,0 Ciin. Cnooi. 17, 2839 0939}], Az e kísérletbe bevont, páciensek többsége a HRR2~t S*· szinten, néhanyuk 2-t szinten termelte. A HEPCEEIOO' a páciensek 15 %-ában indakait klinikai reakciókat íd E-aknái teljes reakciók, 11 %üknél részleges reakciók}, és a reakciók átlagos időtartama 3,1 hónap volt. A nSKCuPTIfO kereskedelmi forgalmazását a Food and Drog Administratíon 1999 szeptember 25~én engedélyezte olyan metasztázisós emlőrákban szenvedő páciensek kezelésére, akik emlőtumora túlzott mértékben termeli az
ErbE2-proteint.
Homolőgia-szűrásssi az ErbB-receptorcsalád két másik tagiát is azonosították; EroSO (5 133 884 és 5 488 358 számé egyesült államokbeli szabadalmi leírás; valamint ormos és mtsai, ;
PÁAS (ÜSA) yp 9193 (1989)1 és £rbS4 (529 274 számú európai szabadalmi. bejelentés; Plozmán és másai.,; Proc. Natl, Acad, Sói. 1JSA 90, 174 6 (1923);· és Plosman és mtsai.: Natasa 366, 4Ί3 (1993)}, S két receptor - legalább nénány emlorák-sejtvonalban ··- fokozott mértékű tsrmaiddést matat:,
MaytansInold/a n t i tea é __ kenj aga f ástok
Terápiás indexűk javítása érdekében a maytansint és a maytansínoíookat tumorsajt~antigenekhez spécii'ikusan kötődő antitestekhez kon j ágálták, A nayiansinoidokat tartalmazó immunkonjugátnmokat, példáséi az 5 löt 020 és 5 ilé 06á számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban és az £2 0425235 SÍ számú európai szabadalmi leírásban tárték fel (melyeket teljes terjedelmükben a kitanítás részének tekintünk) . kin és mtsai, (Proc. Kati, Acad. Sói. USA 9 3, 3613 (1996)} olyan immunkenj agátnmet Írtak le, amely DPI elnevezésű maytansinoídot tartalmaz, mely hwán vastagvégdéIrakén speoírlkns 2212 monokionáiis antitesthez van kapcsolva. 1 kopjugátum rendkívül speei.fikasnak bizonyolt a tenyészetben tartott vastagbélzák-sagtekre, és in vivő tamornövekedésí tesztben 1 tmorel.1 enes aktivitást matatott.
Cheri és mtsai, (Cancer Besearch 52, 127 (1992) 1 olyan immenkonjugátumoket Írtak le, amelyekben a maytansizord di~ szalfidkbtéssel - n-„ , tzee - ) OU.sk' tttígénre specifikus - egéreredetű A7-antitesthez vagy (i-i£P~ 2/mer onkogént megkötő) egéreredetü ΤΑ.1 monokionáiis antitesthez van konjugálva, A GA,i-raytansiuoad kon inga vömet in vitrű - sej teaként 3 x IC' ABR-S felületi antigént termelő
- humán SK-3P-3 eniőrék~sejtvonalon teszteltük- A drogkon j agát um a szabad axá-ytensinoiddal elérhetőhöz hasonló mértékű cieotoxicitást eredményezett, ami a maytansinoidzcieknltk antitest-moíeknlákhoz viszonyított számának nővelégével fokozható. Az A7~msytanslnoid kom.jngátóm szisztémás citotoxieitása. egerekben alacsony mólt.
Sár a «ERGEPTid® áttörést jelent az előzetes ráktérápián átesett, ErbBz-t túltermeiő emlörákos páciensek kezelésében, az ilyen betegek hozzávetőleg 8 b %-a általában nem
- vagy csak alig - reagál t KERCE3Tiib-es kezelésre, és a kereskedelmi forgalomba helyezés engedélyezését megelőző klinikai kísérletben a betegség progressziójáig élőéit idő
- az összes kezelt páciensre - átlagosan mindössze 3,1 hónap volt. ilyenformán, nagy szükség van újabb RER2specifikus rákterápiák kifejlesztésére azon páciensek esetében, akik HEEx-'t túlzott mennyiségbén termelő tomoroktól vagy egyéb, HEF2-termeiödéssel összefüggő betegségekben szenvednek, melyek nem vagy csak alig reagálnak a HERCER TÍR®- e s kézolás re >
A találmány szerinti megoldás azon a váratlan kísérleti relrszesésen aiapzi, hogy a HERCEPTICb-naytansinoid kenjegáturok rgen hatásosak a 3ER2-t (SrbSz-t) túlzott mér♦c-cr --ο » t o m melyek á HERCEPTIE^-ee kezelésre nett vagy csak alig reagálnak.
A találmány egyik szénporé)a értőimében anti-ErbS antitest/maytansinoid: konjngátum gyógyászati lap hatásos menynyiségenek alkalmazását tárjak fel ErbB-reosgtort túlzott mennyiségben termelő - és monoklonális anti~ErfoB· antitestbel végzett kezelésre nem vagy csak alig reagáló - tumor en_c -u-n , \\1Λ' v: t se re cec.u-n? >. v tessz az el \a 1 -1 n>a~ v- .-:¾ v
A találmány szerinti alkalmazás egyik előnyös megvaiősiráei módja szerint az anti-Erbb antitest/maytar.srnoid konjugátumot ember kezelésére szolgáié gyógyszer előállítására alkalmazzuk. Egy másik előnyös negvaiósítási mód szerint. az antí-BxfeS ént1test/maytansincid konjugátumot humán Erdői-receptort. (HlRi; túlzott mennyiségben termelő tumor kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására alkalmazzuk. é találmány szerinti megoldás szempontjából az alkalmazott anti-ErbB antitest hatásmechanizmusa nem korlátozó jeliegS; például, az antí-ErbB· antitest lehet sejtszaporodást gátló hatású és/vagy indukálhat sejthalált és/vagy apoptózist, á találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint az. antí-ErbB antitast/maytaosínoid konjugátumot emlőrák, petefészekrák, gyomorrák, endometriumrák, mu.r t rí ryrá tüdőrák, veserák, vastagbélrák, vastag-végbeIrak, pajzsmirígyrák, hasnyálmirigy-rák, prosztatarák és nogyhőlyagrák kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására alkalmazzuk. Még előnyösebben, az ant 1-ErbB antitest/maytanslnord korjugétumot emlőrák, közelebbről, EroBz-reoeptort 2+ vagy nagyobb, még előnyösebben 3-t vagy nagyobb mértékben túlterhelő emlőrák kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására alkalmazzuk, á találmány szerinti koejugáium antitestként előnyösen a IDŐ monokiónális antitest biológiai sajátságaivai bíró antitestet vagy olyan antitestet tartalmaz, amely lényegében ugyanazon epítóphoz kötődik/, mint a 4Sö monokiónál is antitest, Különösen előnyös az egéreredetö 4P5 monoklonális antitest (A1CC Col 10463) humanizált alakja.
A t a 1 a 1 τη á n y s z e r 1 n t í ko n j ugá t sn ma y t a n s 1 no tokén t maytansint vagy - előnyösen - maytarsleolt vagy maytansinol-észtert tartalmaz, Az antitest és a maytarsioníd btspécitikos kémiát kapttolómöle kólával köntösé iható egymáshoz, például, d-szurciri.tl ári--- ;?-ptridí1tio) -propanoé t (SPDlö vagy k-szűkein!midi 1-4- ;2-pirióiltio;-pentánéit (SPő) alkalmazásával, áz antitest és maytansinotd közöIfi kapósétőt söpört, például, diszulfzd~ csoport, tiostercsopört, savbomlézony csoport, lénnyel hasítható csoport, peptidázzal hastthaté csoport vagy észterázzal hasítható csoport lehat.
A találmány egy következő szempontja értelmében feltárunk egy terméket, amely egy tartályból és az abban lévő auiz-Srbl antitest/maytansinotd konjogátomot tartalmazó készítményből áll, tartalmaz továbbá egy tájékoztatót vagy címkét, amelyen fel van tüntetve, hogy a készítmény KrbSreoeptor tdiiermelőőésével (előnyösen 2a vagy nagyest szintű túltermeiöő.ésévei; jellemezhető rákos betegség kezelésére alkaIma zha tő.
A következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjók.
Az 1. ábrán a Dóst elnevezésű maytansinoid szerkezetét műta tjük be,
A 2, ábrán a HE 1CEP1Ib®/őbl-konjngátam szerkezetét mutatjuk be.
A 3, ábrám a nEpbEEidhakdhi-ko:njug.átum Sephaeryl bubi géiszűrő oszlopon végzett tisztításának elkelts profilja látható,
A h, ábrán egy EERz-transzgént hordozó plazmidkonatrnkció fi., azomositószáma szekvencia} - amely transzgenikus egerek tejmirigyében a natív humán HER2 ÍErb.82) termalögését vezérli - nukieotidszekvepciáját matatjuk be, faitüntetve a EER2 ;ErbS2; cuhS--inszert )2. azonositószámű szekvencia) ntkieotiőazekvenczáját, valamint az abból laszármázta torz aminosav-szekvenoíát (3, azonosítószámú szekvencia), a szignáiszekvenciával együtt. A 3, azonosítószámú szekvenciában a kb, 22, pozíciótól a tán, pozícióig elhelyezkedő aminosavak a HEE2 (ErbRi) extracelluláris dóménjót ai kot jákr .< S. ábrán a HlACEPTld®/Dbl. -kord nos tűm HSE2t rans zgane s t urnér o kr a gy a korο11 ha t a sár se ami élt e fe j ü k. EIM?V-hüR2-rrsoszgéres tűrnötök 2 mzi-as darabjait EVE-egerek emlő-zsírpárnájába ültettük be. kantán a tumorok 25Q msk-es méretet értek e.l; egyenként nyolc egérből álló csoportokat ót egymást követő napon intravénásán BBRCEPTIE'V'Dfelkonjogátómmal oltottuk. Az egerek két másik csoportját intraperltoneállsan hetente kétszer 10 mgíkg HSRCEPlikt-nel vagy RrivXAti-nai oltottuk.
A 6. ábrán a humanizált antí~HBR2 2Cá-an.titest nehéz lánca variábilis régiójának szekvenciajár mutatjuk be.
A ?„ ábrán a humanizált anti-EEE2 2C4-antitest könnyű lánca variábilis régiójának szekvenciáját mutatjuk ba,
Ha másképp nem. jelezzük, a technikai és tudományos kifedezéseket szakember számára jól, ismert, szokványos jelentéseknek. megfelelően használjak iöingleton és mtsai>: ” sieti onary of Míozobiology and boi.eoolar Bio légy fí, 1- kiadás, a, dzisy & oons, bee York, EY (lázi)1. Szakember számára könnyem felismerhető számos, az általunk feltártakhoz hasonló vagy azokkal egyezer iára anyag és eljárás., melyek alkalmasak lehetnek a találmány gyakorlata megvalósítására. Valójában a találmány szerinti magoláss nem koriétoződík az itt leírt eljárásokra ás anyagokra, A találmány céljaira néhány krfejezóst az alábbiakban definiálunk..
Az ErbB-reeeptor*' vagy Erős kifejezésen olyan tirozin kinéz receptor-proteint értünk, amely az ErtB reeepzorcsaiádba tartozik. Az ErbS-reoepzorok közé tartoznak a következők: Erőül fEGEEi, ErbBz ( HEEz j , ErbEl (HEE3; és Erbős (HEE4) , valamint e család még azonosításra váró tagjai. A szóban forgó kifejezés knionösen vonatkozik: azon Σ; cE termo, - amelyeket a megfelelő erbE-onkogének összeillesztett ísplioed1 alakjai kódolnak, ideértve, többek között, az BrbBz dslécíös változatát, amelyet a EO
00/20319 számó nemzetközi közzétételi iratban tártak fel. áz ErbB-reeeptor általában a következő komponensekből áll: extracel.iuiár is dómén, amely Erbü-ligandumhoz kötődhet?
i p o f i. 1 t r an s zmenb r á n domb n ? ko n z e r v á 11 1 n t. r a c e 11 a I á r 1 s tirozin kinéz dómén; és C-termínáiis szígnáldomén, amely több fosztor Hálható tírozínfc tartalmaz. Az ErbB-receptor natív szekvenciája ErbS-reoeptor vagy annak funkcionális származéka ipl, aminosav-szokvanota-változata; lehet. Az 3 r ioB -receptor előnyösen nat iv s zak vénei á j ó hómén E rbB -- 15 receptor,
Az '’ErbElw, '’epidermáiis nőve kedés I lektor rezes tor” és ’dsGFp” kifejezések - melyek egymás szinoniméiként alkalmazhatók - a natív szekvenoiajá EGFR-re vonatkoznak (mely-
nek leírását lo. pl., Carpenter és mtsai,; Ann. Rév,
Bioebem, 5y, 5 51 fi 937} j , ideértve ezek termesz etben eio-
forduld mutáns a la; cjait [pldele oiós mutáns EGER; id,
Knmpbrey és mtsai. ENAS iü5A) 37, 2257 /1395} 1 valamani
funkcionális szárrsazákalkst, pl, aminosav-szekvuncia változataiké'. Az erfBl kifejezés az EGFB-proteint kódodé gént jelent 1,
Az wE.rbS.2” és *’RE'R2” kifejezések - melyeket egymás szinonimáiként alkalmazunk - a natív szekvenoiájó barnán KEE2-proteinre vonatkoznak [melynek leírását id, pl, Semba és mtsai,,: 2FG-.3 {55A} 32, 6497 01335} és iamamoto és mtsai,: dature 513, 23ö 11386); GenBank nyilvántartási számz 103363} , válaiiíni funkcionális származékaira, például, aminosav-szekvencia változataira. Az er.dBl5' kifejezés a dumán HBR2~f kódoló: gént jelenti, mig a '‘reá” kifejezés a patkányé retet ü pl 8téfe:i~t kódoló génre vonatkozik. Az előnyös KIRÍ a natív szekvenciája dumán RE52, A HEHz-t megkötő önti testek példái közé tartozik a 425 .monoklonális antitest {ATCC Cél 10463), 2C4 monoklonális antitest (ATCC 2B12697), '723 monoklonális antitest (ATCC KE-12216; és ?C2 monoklónál is antitest {ATCC KB 12215;; Id. 5 712 997 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás, dC 93/77797 számú nemzetközi közzétételi irat és 5 310 525 számé egyesült államokbeli szabadalmi leírás, mely eket teljes terjedelmükben.
a l._t,Ui..zúc i 1 nt.uz.·,, ?. '..«v?',/1? ^.nt' S'-'R'' antitestek közé tartósnak a következők: huAAbibS-l, nudAbáDS2, huM.áfci7S-3, hüMAbáDö-i, hnéAb«D5-S, bu.MAb4 D3-6, hsbéb4Db~7 és huAAbiD5~8 (.HEACEFTlb®; id, n 5 821 337 szárt egyesúlt áliamokbeii szabadalmi leírás 3. táblázatéban,, naivet teljes terjedelmében a kítanítás részének tokintönk) , valamint humanizált 52OC9 (Wö 93/21319 orvul nemzetközt közzétételi irat; . A barnán anti-EEAl antitestek leírását illetően lé. 5 772 997 szárú egyeseit államokbeli szabadalmi leírás (1998, öt, 30·.} és 10 97/09271 számú nemzetközi közzétételi irat (1997, öl, 03.}.
Az wEr.b83” és ”1213” kifejezés recepter-poilpeptidre fid, 5 183 884 és 5 480 968 szárú egyesült államokbeli szabadalmi leírás, valamint Írass és mtsai.i EMAS (USA) 9 6,
9193 (1511(1, továbbá iunkctonáiis származékaira vonatkozik, ideértve amlnosav-szekvenola változatait, A HE33-st regkötő antitestek példáit az 5 111 SÍI számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (Akita és Siiiiovski? tárták fel; ilyen. pl. a 819-antitest (ATCC RB 12079} vagy burán1z á11 változata,
Az ErbBi és lllinr; kifejezés receptör-poiipeptidre fid, pl. 599 274 szárú európai szabadalmi bejelentés;
ormán és rtsai.: eroc. lati. Arad. Sói. 33é 99, 1746 (1993); Flovran és misei,: bátoré 360, 473 (1993)}, valamint funkcionális származékaira vonatkozik, köztük aminosav-szekvencia változataira, mint: pl. a lö 99/19488 számú nemzetközi közzétételi iratban feltart H1R1-1zoalakok.
A natív” vagy ”natlv szekvenciáiú EGER-, HER2-,
KÉRI- vagy HESá-poüpöptld lehet természetből izeiéit r~ η ül - > r \ - c· :i m, , - ütött pci ipeptid; kémi-ai szintézissel előállított poiípeptrd; vagy ilyen és hasonló^ eljárások kombinálásával el tál Ütött poüpept id.
A funkcionális származékok kifejezésen egy natív polipeptíd aminosav-szekvencia változatait ás kovalens változatait ártják, melyek megtartják a tagfelölő natív poiipepfio kvalitatív biológiai aktivitását. Az aminosavszekvencia változatok általában a natív anlnosav-szekvsnciu tsfcsrőieges pozíciójában ipczicioitao? egy vagy több aminosavat érintő szaksat üöcicoan, deled óban és/vagy lőszereiében térnek el a nat.lv szekvencia tőd A deleciós változatok közé tartoznak a natív pcüpeptidek fragmensei és az h- és/vagy CdsrmináÜson ieröviditett változatok. Az aminesav-szekvenoía változatok általában legalább kb. 70 tkan., előnyösen legalább kb. 00 t-can, bég előnyösebben iegalabö kb. ?C l-ban homológok a natív poüoeptidded á ütne Itala % definíciója szerint, ez aminosavszekvencia változat azon aminosavainak százalékos aránya, amelyek a vonatke aratási szekvenciával végzett egymás alá rendezés <üligámért) - ás szekvenciákban a manimáüs századacc tcücd elérése céljából hézagok beiktatása után á vonatkoztatási szekvencia megfelelő ard.no savaival azonosnak bizonyulnak. A szekvenciák egymás alá rendezéséhez alkalmas eljárások és számítógépes programok szakember számára jói Ismertek. Az egyik ilyen számítógépes program az Üllőn 2 dünectech, lmod>· amelyet felhasználói dókamentán lóval. egyyát e,z Egyesült Államok Jogvédő Hivatalánál (Ba· őt ingó on DC 20558} 1981, december IS---én nettek nyilvántartásba .
Az ErbB-iiganduríl* kifejezésen olyan poiipepiiöet értőnk, amely ErbB-receptorhoz kötődik és/vagy aktiválja art, A találmány szerinti megoldás szempontiából különösen telantőz ErnB-liganáumok a natív szekvenciáié hután ErbBligandumok, ránt pl. az epiderrnáiis növekedési faktor [2GF; Savage és zásai. : J. Siói. Cher.. 217, 701.2 (1972)); transzformáié növekedésé faktor-a fllil-a; Marquardf és mtsei,: Söience 223, 137 5 (1934)1; az.phireqclin, más néven sccanoma vagy keratinod is aatokrin növekedési faktor (Shoyaö és rtsad: Science 24 3, 1074 11989} 1; Károsra és zásai.: Nettre 543, 257 (1990); Cook és zásai.: Hol. Coll, Bioi. 11, 2547 (1981)1; betácsitúlin (Snrng és zásai, : Science 259, 1.504 (1923); Sasada és zásai.: Biochem. Bíophys. Bes. Cérnán. 190, 117 3 (1923)]; hepaninkötő epiderzíális növekedési faktor cö-2“; átesroc’í v í ” sor : Science fáé, 939 (.1991; 1; epéreguiin (Toycda és zásai. : 51 Siói. Cnem. 27.0,
495 (1995); Komuraeski és zásai.: Onoooene 15, 2841 *· —...v .19?·]; heregulín (lé. késődé); neéreguiín-2 (MHC—2; CaXraway és zásai.: Kataré 387, 51,2 (1997)]; nearsguiio-3
5880-3; inang és írásai.: Proc. Kati. Acad. Ser. 94, 9552 (1997)1 vagy érintő (GR-i; Kannan és zásar.; é. Bioi. Chere 272 (5), 3332 (1997) („ Az EGFB-t megkötő ErbB-iigandozák közé tartozik az ECF, TSF-a, amperregeiin, detacellaiin, KBEGF és epireguéin; a 9EP3~ho~ kötődő ErbB-iigandnmok a hereguéinok; zág a BEM megkötésére képes troB-lrgandnmok a következők.: betaceliuizn, epitegoiin. ΗΒ-ill, bBG-2, bibés a heragulinók.
Ahogy itt hasznáijok, a íf heregoiin jüRG) olyan peptidet. jelent, amely aktiválja az RrbS2~GrbB3 ée BrbB2~ ExbBi protein kon.pl ezeket (vagyrs a komplexhez: kötődve a komplexben lévő tirozinck fosztorilációját indukálja) . A különféle heregoiin-polrpeptidek leírását Illetően id. pl. Holmes és pisai.: Science 236, 1205 11992:; G0: 92/2079S számú nemzetközi közzétételi irat; Wen és mtsai..: hol. Celi. ölel. Iá (3 ) 1909 (1291); ba.r ebi enni és mtsai.;
Natúré 962, 312 (1993). A hereguirn kifejezés jelentése kiterjed a természetben eiöfc-rdoió HRG-poiipeptid biológiailag aktív rragmenseire és/vagy változataira is, pl. EGBszepű dómén fragmer:sörre (ΗΑΟβ;-?γ.
Az ErbB ieterc-oiágoner’1 kifejezés egy nem kovalens kötesse! kapcsolt oligomer, amely legalább két különböze ErbB-reoeptort tartalmaz. Az ilyen komplexek akkor jönnek létre., ha két vagy több SrbB-receptcrt termelő sejtet ErbBliganeonnal éri étkeztetünk, majd izmiorrcrec ipát átlóval Izolál ha tok és SDS-BAGE vizsgálati eljárással analizálhatok [Id, pl., Sirokonakz és mtsai.: ob Siói. Ghem. 169 (20) f 14661 (1991)). Az ilyen BrpB betero-oiigomerek példái a következők: EGBR-RSR2, HER2~üE'R3 as HER3-BSR4. Ezen túlmenően, az ErbB zetero-oligomer két vagy több üERz-receptort is tartalmazhat, melyek különböző ErbB-tecepfcorokkal (HE.R3, b\4 ve,au Ε1ΓΚ' .ehen.o\ λ., törne. va. 9 νη : •'-.„itereme,:
más protein, például, citokin-receptor alegység (pl. gp!3ö) is jelen lehet.
A üEAz-váltótatok {pl. EEPf-i ragmeneak) vonatkozásában a natív némán HbB2 biológiai aktivitásával bíró” kifejezés e fragmensek azon. kvalitatív képességére atal, hogy egy találmány szerinti (transzgenikas vagy vv; transzgénikos; állatmodeiiben túlzott mennyrségben termelődve tumornövő kodé :s t 1 n baka inak.
Ahogy itt használjuk, a tumor kifejezésen neopláziás ímalignáns vagy jóindulaté) sejtnövekedést és proiizeráerőt, valamint rákos állapot előtti és rákos sajtó két és szövetekot értőnk.
A rák” és rákos kriejezések emlősök olyan fiziológiai állapotára vonatkoznak, amelyek szabályozatlan sejtszaporodással jellemeztetek. A. rákok példái köze tartoznak, többek között, a cártiromák, iimfomák, blastomák, ss mamák, leukémiák, valamint a leukémiák és a limford malignáns betegségek. A rakok konkrét példái közé tartozik a pikkelysejtes rak (ni. eoitholiaiis pikkeiysejtos rák), a tüdőrák {kis sejtes és non kis sajtot tüdőrák, tudő-adonokarcinoma és t \k«, y.-t tus tüdő-karoinoms), ka s.hár iparát, hepatoceiiuiár.is rák, gyomor vagy hasi rákok, pl. gastrointostinalis rák, hasayáimirigy-rák, giioriastoma, méhnyakrák, petefészekrák, máj rák, húgyhőd.y aurák, hepa torna, emlőrák, vas tagnál rák, végbél rák, vastag- és végbél.rák, endometrium- vagy néh-ksrsd.noma, nyáimirzgyrák, veaarák, prosztatarák,. tzemóremtest-rák, paj zsmirigyrák, májkarcinoma, végbél-kareinoma, peéiskáfcinöma, valamint fogás nyakról.
Az Erők-receptorz túlzott nettekben termedé rák kiλ υ.
fejszésen olyan rákot értünk, amely egy ErbB-reoeptőrt (pl. uőR2-t) lényegesen nagyobb mennyiségben termel, sünt az ugyanazon szövettípus nem rákos sejtjei. Az ilyen túlzott mértékű termelődést génsokszorozőo.ác vagy tokozott mértékű transzkripció vagy transzláció okozhatja. Az ErbS-receptor túlzott mértékű termelődése diagnosztikai vagy prognosztizáló teszttel, az ErbB-receptor sejtíelűletsn jelenlévő fokozott szintjének meghatározásával. értékelhető (pl. irmmznhísztokémiai f'IBC; teszt teli . Más módon - -agy nmeilett - meghatározhatjuk a sejtben lévő, ErbB-t kódoló nukIsltaav mennyiségét is, például, fluoreszcens in siló hibridizációval (FISH; ld. dó 98/4S4Ó9 számú nemzetközi közzétételi irat), Sonthern-blot technikávai vagy poiimerázlánoreakciős (ECB.; technikával., pl. valós idejű u'reai tírse’ü kvantitatív BCB (RT-PCB) alkalmazásával. Az ErbBreceptor túlzott mértékű termelődése biológiai mintába (pl. vérsavóba; kibocsátott antigén (pl. ErbH axtracellaláris dómén) mennyiségének mézesével is meghatározható fid, pl.
533 234 számú: egyesült államokbeli szabadalmi leírás; ÜO 91/65264 .számú nemzetközi közzétételi irat; 5 401 638 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Elás és mtsai.; J. Immunoi., Methods 132, 73 (1990) ) . A fonti tesztek mellett számos in vivő vizsgálati eljárás is a szakember rendelkezésére áll. Például, a páciens testében lévő sejteket adott esetben dotektáIható jsl.ölőanyaggsl, pl. radioaktív izotóppal jelölt - antitesttel érintkeztethefjók, és az antitest .sejtekhez történő kötődése, pálcául, a radioakti.vitás külsődleges pásztázásával vagy a páciensből vett biopszia vizsgálatával határozható meg.
A HiR2~t túlzott mértékben termelő tumorok irmunk!aztokámrai pontszámokkal értékelhetek, mely pontszamok a termelődött HkRé-molekuiák sejtenkénti számának fezeinek meg, ami biokémiai úton határozható meg: ú - 010000 HERz-molekula/sejt; 1+ ~ legalább kb. 200 000 HSR2molekula sejtenként; 2+ - legalább kb, 500 Ö00 EER2molekule/sejt.; 3+ - legalább kb. 2 000 000 HER2molakula/se j t. A EER2 3+ szintű túitermelödése - ami a. tirozin kané z 1iganóum-fűggetlen a ktiváiásához vezet [Hudztak és mtsai,; Oroz, heti, Acad. Eoi.. üSA 84, 7159 (19871 ] - az emlőrákok kb. 30: %-árnál fordul elő, és ezekben a betegekben a kiújulás-mentes túlélés és az összesített túlélés csökkent szintű (Álamon és mtsai.; Science 214, 707 (198:00; Aramon és mtsai.: Science 233, 17? <1937)1,
Ezzel szemben, az a rák, amelyre nem jellemző az SrbB-receptor túlzott mértékű termelődése:, olyan rák., amely diagnoszta kai tesztben (az ugyanazon szövettípus nem rákos sejtjeivel összehasonlítva? normálisnál nem. nagyobb mennyi, a égben termel ErbB-receptort,
A 'mormontügyetlen rák kifejezésen olyan rákot értünk, amelyben a rákos sejtek proliieráelőja nem függ a rákos sejtek által termelt receptorhoz kötődő hormon jelenlététől.. Az ilyen rákok -· a hormon koncentrációját a tumorban vagy annak közelében csökkentő - gyógyszeres kezelés vagy sebészeti beavatkozás hatására nem: mutatnak klinikai regressziót. A hormonfüggetlen rákok jellemző példái közé tartozik az androgénhormen-független pros ztaterák, az őszt regén független emlőrák, erdőmet x iumrák és petefészekrák. Az ilyen rákok hozmorfüggő tumorokként kezdődhetnek, és tuti-hormonéiis terápiát követően hormonézennfttv stádiumból hormonnal nehezen kezeinető tenorokká alakulnak.
A találmány leírásában az antitest kifejezést legtágabb érteimében használjuk, s jelentése kiterjed az ép monoklonális antitestekre, polikionális antitestekre, a legalább két ép antitestből álló multispacífikus antitestekre (pl. bispecifikus antitestek}, valamint az aniitestfragmensekre, .teltévé,, hogy azok rendelkeznek a kivént biológiai aktivitással. Ahogy itt használjuk, a monoklonális antitest'’ kifejezésen lényegében. homogén antitestpopulációból származó antitestet ártunk, azaz a populációt alkotó egyes antitestek - az esetlegesen kis mennyiségben előforduló természetes mutáciőktöl eltekintve - azonosak. A monoklonális antitestek rendkívül specifikusak; egyetlen antigénes hely ellen irányulnak. Ezen túlmenően, ellentétben a polikionális antitestek készítményeivel, amelyek különböző determinánsok hapitöpokj elleni különböző antitesteket tartalmaznak, minden, egyes monoklonális antitest az antigén egyetlen determinánsa ellen irányul. A monoklonális antitestek - spécifitásukon túlmenően - azért is előnyösek, mert más antitestektől mentesen szintetizálhatők. A monoklonális” jelző az antitest azon sajátságát jelenti, hogy antitestek lényegében homogén populációjából nyerhető, és nem utal arra, hogy az antitest bármilyen konkrét eljárással lenne elöálliinaió. Például, a: találmány szerinti megoldás értelmében alkalmazandó monoklonális antitestek az elsőként Kohlét és msed. (ütőre 256,, 455 (1375)] által
Idd hibridőma-d járással vagy rekombináns CN$~zechnikák (Id. cl. 4: 31.6 567 egyesült államokbeli szabadalmi leírás) alkalmazásával állíthatók elő, A monok.lonális antitestek tág artÍzest-könyvtárakból is darálhatok, példád, a Clacksor és mtsai. [ütőre 352, 521 (1991)] és tarts és mtsai. (d. tol. Bioi. 222, 581 (1951)) által leid teohnikákai kaImamásává1.
A monoklonális aráit estek konkrét példái közé tartoznak a kimérd antitestek, amelyekben a nehéz és/vagy kányává lánc egy résre azonos vagy homológ egy adott rajból származó - vagy egy adott antitest-osztályhoz vagy -alosztályhoz tartozó - antitestek megfeleld szekvenciálvai, mig a lánc(ck) többi része azonos vagy homológ egy másik fajból származó - vagy egy másik antitest-osztályba vagy -alosztályba tartozó ·· antitestek megfeleld szekvenciáival. A monoklonális antitestek közé tartoznak az ilyen kiméta antitestek fragmenser, feltéve, hogy képesek a kiΟ*' h m , d’itat ' -,.Ό. (- t <· -·„a?w emesült államokbeli szabadalmi leírás? Morrison és mtsai,:: Proc. Kati. Agad. Sói. öSA 81, Sári (1584)]: , A szóban forgó kimére antitestek közé tartoznak az ún. tfósmiósltett antitestek, amelyek nem humán főemlősből (pl. óvilági majomból, emberszabású majomból; származó variábilis dómén antigénkötő szekvenciát és barnán konstans régid szekvenciákat tartalmaznak.
Az. dntitest-fragmens'1’ egy ép antitest része, amely előnyösen tartalmazza annak antigérkdfö vagy variábilis te„ 7 Ζ C.· glőj az. Az antitest-fragmensek példái közé tartoznak a következők: Fab~, Bab'-, Fiaik ?.>- és Fv-ftanmentek; diatestek'; lineáris antitestek; egyianou antitest-moiekulák; és antitest-iregnens (ek) bői álló. mnitíspecifikus antitestek.
Az ét antitest sntigénkttő variábilis régiekéi, továbbá könnyű lánc konstans doménbcl (CJ és nehéz lánc konstans doménskböl iCs=l, Cti és >CK3) áll. A konstans bőmének natív etekvéntiá jó Konstans derének (pl. némán natív szekvenciája konstans doméneki vagy ezek aminesavszekvenoia változatai lehetnek. Az ét antitest előnyösen egy vagy több ebiektor funkcióval bír.
A nem humán (pl, rágcsáiőeiedetű) antitestek humanizált alakjel olyan kimára antitestek, amelyek minimális mennyiségű nem humán 1 mm unni ebül inból, szármezé szekvenciát tartalmaznak. A humanizált antitestek többnyire olyan numán immunglobulinok (reoipiens antitest;, amelyekben a recípiens antitest hipervaríábiiia régiójának aminesavai egy nem humán fajból (pl, egértől, patkányból, nyűiből vagy nem humán .főemlősből) szármázó antitest (donor antitest) h í pe r v a r i á b i11s rég i öj án a k am1ηosa va 1v a1 vaηn a k he1yet1 esitve. Néhány esetben a humán Immunglobulin vázregzőjának (Fű) amlnosavai nem humán ivmunglobuiln megfelelő aminosavaiveí vannak helyettesítve, Ezenfelül, a humanizált antitestek Olyan aminosavaket is tartalmazhatnék, amelyek nem taiáihatök meg a reoipiens antitestben vagy a donor antitestben. ezek a módosítások az antitest további finomítása céljából hajthatok végre. A tumsnizált antitest általában egy - jellemzően két - variábilis dómén lényegében egészét tartalmazza, me leiek;ben a bipervariáhiiis hurkok mindegyike vagy lényagában mindegyike megfelei egy nem humán immunciobuiinénak, és a vázrégiók mindegyike vagy lényegében mindegyike barnán immungioouiin-szekvencrábői származik. A humanizált antitest, adott esetben, egy immunglobulin {jellemzően agy barnán Ínmnínglohnlin) kent tana régiójának legalább egy részét is tartalmazza. További részieteket illetően id. Jones és mtsai.: Natúré 321, 522 (1386); P.iechmann és mtsai,: bátoré 332, 323 (198S)öresta; Curry Op.
Sűrűét.. ott..., 2, 2 33 (iaőzi,
A humanizált asti~Erb£2 antitestek közé tartoznak a következők; nubafd 13-1, tuAAöiu5-2, nubAölDS-3, bubáid DS-s, bnbAbáSd-S, hohhOiD5-t, huMAbáDS-J és holiAidDő-3 /HhuCEPTIb®/ id. az 5 321 337 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás 3. táblázatában, melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének tekintünk; valamint humanizált 52OCá-antítesi (WO 93/21319 számú nemzetközi közzétételi' irat) és a humanizált 227-antitestek (ld, 3. ábra/.
Az antitestek í!ef rektor tor kőiéi” olyan biológián aktivitások, amelyek egy antitest Fo-régiőjának {natív székvéneiéjó Fe-régíö vagy annak aminosev-szakvencia változata; toiajdoni-hatót. Az antitest etfaktor funkciók közé tartoznak a következők; Clg-kötés; komplement-decsnoens citótozicitás; Fc-receptor megkötése; antirest-dependeus sej tközvetitette citoz.icités (ADCC;; fagocitőzis; sejtfelölati receptorok (pl. F-scjt-reoepfor, SCF; gátláza, sth.
Az ép antitestek - nehéz láncaik konstans coménjének amincsav-szekvenciájátöl függően - különböző osztályokba” sorolhatók. Az ép antitestek öt tő osztálya létezik: igA, igb, IgE, löt és igái, aslyek kötni több korábbi ''alosztályokra” (izotóposokra' osztható, pl, IgGl, lgG2; loGl, lgG4f loA és ig.A2. A különböző antitest-osztályoknak megfelelő nehéz lánc konstans tömének einevezése a következő; cg. 5, t, yf illetve μ. A kólónkéit Ig-osztályok alegységszer Kezet a és háromdimenziós kentigarációja sza karóét szánéra jói lséért, .Az !,sntitesz~cepenőens sejt közvetítette eltetoxioltás és ”ADCCn kife3esés olyan sejikervetsiette reakciót jelent, amelynek során Fc-receptorokat (FcF) termelő, nem specifikus citotoxi.kas: sejtek (pl, természetes killer (FFj sejtek, neatrofilek vagy makrofágok] egy célsejten lévő, kötött antitestet ismernek fel, és ezt követően a célsejt izzásét okozzák. Az ÁDOC-t. közvetítő elsődleges sejtek., az FE-aejcek, csak Fcyklil-at termelnek, óig a monocilák az FoyRl-et, FcgRIl-t és FcyRIIl-at egyaránt termelik. A vérképzési sejtek FcR-termeléséc illetően id, Rávetek és Kinet cikkének [Anno.. Rév, zmmnnol. 9, <57 (1991}} ..3, táblázatát. Egy adott oolekola ADCG-aktívItásának értékelésére .in vátro AbCG-teszt alkalmazbatő (id. pl. 5 500 362 és 0 821 537 szárú egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Az ilyen vizsgálati eljárásokban alkalmazhatő effaktor sejtek közé tartoznak a perifériás vér egymagaű sejtjei Vilii és a természetes kil let -sejtek. Más módön - vagy ezen túlmenően - egy adott nőiskola AaCC-aktivitása in vivő is tesztelhető, példáéi állatmodell alkalmazásával {.Id. Clynes és mtsai,: FFAS (GSA) 95, 652 (1993)}, olyan leukocifáV; amelyek
A ez faktor sejtek egy vagy több Fc-reoéptörh termeltet és effektor-funkeiét töltenek be, A sejtek előnyöset legalább az FctRllI-at termelik, és ADCC efrektor™funkciót töltetek be. Az ADCC-t közvetítő humán ieukociták példái közé tartoznak a perifériás ver egymagvö sejt jel frSMc), a természetes: fcílier (AK)-sejtek, a monooiták, a eitetoxíkus T-sejtek és a ssutroíálek, melyek közöl a találmány szerinti megoldás szempontjából a kökC-k és az NK-sejtek előnyösek. Az effektor-seitek természetes: forrásukból (pl, vetbk vagy perifériás vér egymagvű sejtjei közűi) izolálhatok.
Az Το--· receptor vagy 8FoR:?í kire j őzt«:a~ olyan receptort értőnk, amely egy antitest: re-régiójához képes kötődni. Az Fc-reeeptor előnyösen natív szekvenciája humán lek, Ezenfelül, a találmány szerinti megoldás szempontjából előnyös Fc-receptor IgG-sntitest. megkötésére képes (vagyis yreoeptor;, mint pl. az Fcyul, FozRlI és FégRTI! alosztályok tagjai, ideértve ezek 5 A iv.ut.'bu: és alternatlv spiieing' események következtében létrejött alakjait. Az. FcyRÍl-receptorok közé tartozik az FeyRllA k’akfciváiö: receptor) , és az foyPilB tj”gátló receptorü , melyek hasonló aminosav-szekvenciát tartalmaznak - elsősorban cíto-·· pzazmikus dóménjükben tétnek el egymástól. Az aktiváló FcyRiTA-receptor oitoplazmikus dóménjénen ímmunreceptor ti romín-a ragu aktiváló motívumot IrTAM):, míg a gátié F'eyRiIS-receptor e i t oplazmí kas dómén j ében immun receptor tízopím-zlaoű gátid motívumot ízílM) tartalmaz láftékintést Id, Paéron; Anno. Rév. Immunoi, IS. 2íz :)1927)1:, Az; Fereceptorok áttekintő leírását illetően in. Ravetch es Kínét:: Anno, Rév. húzz, 9, 457 (1991;; Capei és mtsaí.:
lmm.u:nos:ethod.s 4, 77 (1994); és de Haas es mtsai.: ü, hab.
Clin, Med. 126, 330 (3995}}. Az: Fc“receptor kifejezés magában foglalja az: egyéb Fc-receptorokat ;ideértve a még azonosításra váró Fc-receptorokat, valamint az új szidottkor2 Fc~receptőrt [FoRn, amely az anyai igG-molekólák magzatba történő átviteléért felelős; in, Gnysr es mtsai,: J. Immunoi. 117537 7.976); és Kim és misai.: J. Immunod 24,
249 (12 9 437.
A í!komplement-dependens oítotoxioltás vagy wC0n” kifejezés egy molekula célsejtet - komplement jeleniétében ü zálő képességére véna t ke z i k. á komplement-akti válási, reakcióntat a komplement-rendszer első komponensének (Clq) egy közős eredetű antigénnel komplexált molekulakor (pl. ahtitesthed történő kötődése indítja be. A komplementaktiválás vizsgálatára CDC-teszret [in, Gazzano-Santoro és mtsai,: d Immunod Kethods 202, 163 (1996)} végezhetőnk.
á natív antitestek rendszerint kb, 2 50 0:20 Sálion mclekolatamegű heterofcetramar giikoprotéinek,, amelyek két azonos könnyű (L) láncbői és két azonos nehéz (ü) láncból állnak, Mindkét könnyű lánc egy kovalens díszulfid híddal kapcsolódik a nehéz lánchoz, mig a különböző immunglobulinizotipusokoan a nehéz láncok között eltérő számú öu.szulfidkőtés található. A nehéz és könnyű láncokban, egymástól szabályos távolságokra, láncon belüli diszolfib-kötésék helyezkednek el. Mindkét nehéz lánc egyik végén variábilis dómén dd tsiálbafő, melyet számos konstans dómén kövez, á könnyű láncok egyik végén, variábilis dómén íblj , másik végén. konstans dómén helyezkedik el; a. könnyű lenn konstans dóménge a nehéz lánc első konstans dóméngévei, még a könnyű lánc variábilis dórén je a nehéz lánc variábilis dómért ével illeszkedik, Úgy tartják, hogy a nehéz és a könnyű lánc variábilis doménjeí között bizonyon amínosavafc határfelületet képeznek.
éz antitestekkel összefüggésben hasznait variábilis kifejezés arra vonatkozik, hogy a variábilis dómén bizonyos rés zeinek sminosav-szefcvenciája az egyes antitestekben nagymértékben eltér egymás t öl, azok a sza\aszo\ rá Ízlések az adott antitest adott antigénre vonatkozó spéciiírásáért. mindazonáltal, a variabilitás az antitest variábilis dóménjelben nem: egyenletesen oszlik meg, hanem bárom szakaszra koncentrálódik: ezek ez úgynevezett hipervariábiits régiok, amelyek a. könnyű lánc és a nehéz lánc variábilis doménjeiben egyaránt megtalálhatok. Λ variábilis dómén konzervá1tabb szakaszait vázrégióknak íFAj nevezzük. A natív antitestek nehéz és könnyű ráncainak variábilis dcménger egyenként négy vézrégiót tartalmaznak melyet többnyire β-redös konfigurációt vesznek fel), és ezeket három, komplementaritást meghatározó régió (CDFű köti össze, melyek hurkokat képeznek, és ezek a hurkok kötik Össze a B-redős struktúrát (és néhány esetben annak részét is képezik:. Az. egyse láncokban a vázréciök szorosan összerántják a komplementaritást .meghatározó régiókat, melyek a másik láncban lévő komplementaritást meghatározó régiókkal együtt - az antitest antigénkctd helyeinek létrehozásébar játszanak szerepet fid. babét és misei,; Seguences of Proteins of Immunoiogi oal Interest/', 5, kiadás, Public Health Service, National Insfátütés of Health, Bethesda, döfi 39.1)1, A konstans bőmének közvetlenül nem játszanak közre az antitest antigénhez történd kötődésében,· azonban Különféle effektor-fuukciókar töltenek be - pl. az antitest részvétele az éntitest-dependsns celluláris citotoxieitásbán (.13/11 ,
Ahogy a találmány leírásában tastnáljek, a hipezvariábilis régid kifejezésen egy antitest artigén-kötésért felelős aminosaválból álló régiót értünk, A hipervariábiirs régié általában komplementaritást meghatározd régióból ” (ÜDR) szármázd aminösavakat tartalmaz - pl, a könnyű, lánc variábilis doménjének 29-33. aminosavait fii), 50-36. amisósavért (L2) és 39-37, aminosavait (13), valamint a nehéz ránc variábilis doménjének 31-35. aminosavait ÍH1), 53-65. aminosavait (H2j és 35-152. ásd. nos avart (113) (lő. Kabar és mtsai.: Seguences of Proteins of Immunoiogioal interest, ö. kiadás, .Public Health Service, National insfitttes of Health, Betheede, HD (1991)1 -, és/vagy hipervarlabilis hurokból származó aminösavakat [pl, a könnyű lánc variábilis doménjének .2 6-32, aminosavait (Lil), 50-52, aminosavait (L23 és 91-96, ami no savait (h3),· valamint a nehéz l-áu-c va-
r z á 0 z 11 s dóm énje n e k 2.6-321 aminosavait (Hl), 53-51 (. amino-
savait (H2) es 36-1 9.1. aminosavait (H3 ) ; Cnothia és Lesk;
a, bői. Bioi, zbh, 3 öl. (13 S7j i tattáImái z. A váz rég·. löt al'ko-
tő aminos&vak a var labilis nemén azon aminosavai, emelysk
uén a aipervariábiiís régió részét képezik.
Az izolált antitest kifejezésen egy ~ természetes körny ez etében megtalálnatő - z c 1. ni szísz, és/vagy elkülönített antitestet értünk, A természetes környezetben megtalálható szennyező komponensek az antitest diagnosztikai vagy gyógyászati óelkaaznáiását akadályoznák;
' \ o rn m'k, orí’-o-'-'k egyéb - proteinszerü vagy nem proteinszert · oldott anyagok, A találmány előnyös megvalósítási módjai érteimében az antitest tisztításénak mértére a kővetkező.; hl) a Lovryeijárással végzett meghatározás szerint $5 m/ml-nál nagyobb, legelörvösebben iá m/mi-nál nagyobb; (2> forgácsészés (spinning nap) szekvenátor alkalmazásával legalább 15 amrn?s-.\ $s vug> ; e n-nn, sav-s -όe-u1 s kinyeréséhez szükséges tisztaság; vagy )3) redukáló vagy nem redukáló feltételekkel végzett SDS-sAGf-analizissel (Coomassie-kék vagy előnyösen: ezüstfestés alkalmazásával) homogenitásnak megfelelő tisztaság. Az izolált antitest kifejezés jelentése kiterjed a rokomblnans sejtekben in sitt megtalálható antitestre, mivel az ilyen sejtekben az antitest termeszeket környezeténen legalább egy komponense hiányzik. Mindazonáltal, az izolált antitesteket aItalárán '' _ ~t «„ H^,.η·' xan~ i
A kérdéses antigént {pl. ErbBr-antigent) megkötő antitesten olyan antitestet értünk, amely az antigént kellő affinitással képes megkötni, miáltal diagnosztikai és/vagy terápiás hattanyánként alkalmazható az antigént termeid sejt nercéizására és/vagy óitotorikos vagy egyéb kenőterápi.aás h < \ nyag (pl, maytansínoid) óéiba·« juttatására. Amennyiben az antitest Eréül~recetterhez képes tétetni, rendszerint elsősorban az ErbBz-receptort fogja megkötni (szemben más BrbB-receptorokkaif, és előfordulhat, hogy más proteinekkel (pl. EGER, Érből vagy SrbB4) jelentős mértékben nem lép keresztreakelőba. Az ilyen megvaiősltási módokban ez antitest nem ErbBl-proteinekhez történő kötődésének (pl, endogén receptorhoz történő sejtfaluiét! kötődés) mértéke - fluoreszcencia aktiválta sej-osztályozási (kACS) analízissel vagy raözoimmunpracipítácibvai (RIA; meghatározva - 1.0: á-nél kisebb lesz. Bizonyos esetekben az anfi-SrbBl antitest nem lép jelentős mértékű keresztreakcióba a patkányeredetű neo-proteinnel (id. pl. Scheoter és mtsai.: Natúré Biz, 513 (1984); Dtebin és mtsai,:: Natúré
311, 545 11984)}.
Ha másképpen nem jelezzük, a éüő monoklonális antitest kifejezés olyan antitestre vonatkozik, amely egéreredetű ébS-antitestből származó ahtlgéhkotö aminosavakat tartalmaz, léidéül, a 4B5 monokionáiis: antitest egérersdetű IDŐ monoklonális antitest (AiCC CRL 13163) vagy annak változata lehet (például humanizált IDo-antitest), amely az egéreredetű 4Do monoklonális antitest antigénkötö aminosavart tartalmazza, A jellemző humanizált iD5~anfitestek példái a következők: huMAbiDS-l, hahAb<Bo-2:, huőAo4D5-5, huMAbákS-s, huzAblES-ő, hohAbiD3-3, hubAbáDS-1 és huMAbéDŐS (HEKCSőTIN®) , Id. 5 Bűi 337 számú egyesült áiiamcköeit szabadalmi 1 sir ás., melyek: közül a- hnOhlűt-ű (küBőErűéb^) az eOőnyds humanizált 4DS~aniite»t.
Egy adott antitest (pl. 4B5: monokionáiis antitest) ''bioiograi taxajdonságávsi” bitó antitest kifejezésen olyan antitestet étiünk, amely n adott antitest bioiégi sí tulajdonságai közei eggyel vagy többel bit, ami megkülönbözteti az ugyanazon antigénhez föl. ErbBi-recspiorhoz; kötődő egyéb antitestektől. Pólóéul, a áDö-antitest biológiai tulajdonságával bíró antitest Ernők-t tűitéremlő sejtekre az Erb.Br: ekpressziós szintjétől függő - szaporoóásgátió hatást fejthet ki és/vagy az Erboz extracelluláris dóménjében ugyanazt az epxtőpot kötheti meg, mini a IDö-antitesi (pl. amely gátolja a 4Dó nonokionáiis antitest ErbBi-höz történő kötődését.
Ahogy itt használjuk, a sejtszeporodáso gátié hatéanyag” kifejezés olyan vágyóiéira vagy készítményre vonatkozik, amely in viz.ro· vagy in vivő gátolja egy sejt - elsősorban ErbB-receptort termeid ráksejt - szaporodását. Ilyenformán, a szaporodást gátló hatóanyag jelentés mértékben csökkentheti az S-fázrsbsn lévő EroB-termeiŐ sejtek százalékos arányát. A szaporodást gátló hatóanyagok jellemző példái kkőzé tartoznak a sejtoíklus elSrehalaéását (az S—fázistól eltérd ponton· blokkoló hatóanyagok, például, a él-fázisban vagy az d-f ázásban történő megrekedést indukáló anyagok, A klasszikus M-fázis blokkolók közé tartoznak a vinca-vegyületek (pl. oínoristín és vinbiasiinl, a taxának és zopo-TI-inhibitorok, pl. doxorubiein, apirubicrn, naunoruoioin, etoposid és ileornycin. b Gl~f ázást fai tartóztató hatóanyagok S-fázisban történő blokkolásba is átnyúlhatnak, mint pl. a DkS-aikilezo szerek (pl.. tamozífen, prednison, daoárbazin, msehiorethamin, oi spiati n, mechozrexat, „ ......., < a--1 \~
Illetően ld.!> The Moiezmiar Sa-sis of Cancer”, szerit,: decdesohn és tersei, 1. fejezet, deretami és mtsai.: “teli oycle regolation, onoogenes, and antineopiastic drogé” IWB Saunders; Philadelphia,, 1395) különös tekintettel a 13, oldalra,
A sejtszaporobást gátló” antitestek jellemző példái azok, amelyek kötődnek az ErbBr-receptorhoz, és gátolják az ErbBz-t túlzott mértekben termeid ráksejtek szaporodásét. .3 találmány szerinti megoldás szempontjábol előnyös, sejtszaporodást gátló enti~ErbS2 antitestek eejttenyészetben, kb. 0,5-32 ng/mi. koncentrációban 20 %-nál nagyobb mértékben, előnyösen 50 %-nái nagyobb mértékben ;kb. 50-100 %-ban; gátolják az SK-BB-3 emlőtumor-sejtek szaporodását (a szaporodás-gátlást az SK-BE-3 sejtek antitesttel történő érintkeztetése után hat nappal meghatározva; id, 5 67? 171 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Az SK-SR-3 sejtek szapörodáegátiási tesztjének részletes leírását lg, a.2 5 277 171 számú egyesült allamokbeim. szabadalmi leírásban és az alábbiakban. Az előnyös szaporodásgátfő antitest a 425 mcnoeionáiis antitest, pl, humanizált 2őS-antítest.
A sejthalált” indukált molekula (pl, antitest) olyan ?mlo\a)^, um-m c)<-..-.,uvs -d e. <o; . ólat - ? :m5.. A szóban forgó sejt általában Erb32-reoeptort termalő sejt, elsősorban ErbBr-receptort túlzott mértékben termelő sejt. A szóban forgó: sejt előnyösen ráksejt, pl., emlőrák, petefészekrák, gyomorrák, eüdometriumrák, nyáinirigyrák, tüdőrák, veserák, vastagbélrek, pajzsmirigyrák, nasnyáimirigyráe,
Ζ,ί prosztatarák vagy hagybólyagrák-sejt. Jn varró a sejt 1KBR-3, BT474, Calu3, MDA-MB-453, MDA~MB~361 vagy SKOV3 sejt lehet, in vitro a sejthalál - az ont1test-dspendens sejtközvetitette oltotaxiéitás (ADCCi és a komplementdependens olterózióitás (CoC) által indukált sejthalál megköd. önbe zt été se érdekében - komplement és immro-er rektor sejtek hiányában tatarozhat© meg, Ilyenformán, a sejthalál kimutatási tesztje hővel inaktivált szérum alkalmazásával (vagyis komplement hiányában! és immun-effaktor sejtek hiányában hajtható végre. Annak megái lapozása céljából, hogy a molekula képes-e sejthalált indukálni, a sejtmembrán épségének - propidium-jodid (kik, trypan-kék (Iá. honra és mtsai.: Cytorechnology 17, 1 (1995)) ’ragy 7&&.D felvétele alapján meghatározott - károsodása a. kezeletlen sejtekéhez viszonyítva értékelhető. Az előnyös sejthalált indukál6 antitestek azok, amelyek fl-feivéteii teszt során BT474sej fékben ál-felvételt képesék indukálni. A sejthalált indukáló antitestek példái a 1C2 és 7F3 anri-Ernlz antitest (id. Kű 98/17797 szarni nemzetközi közzétételi irat, melyet teljes terjedelmében a kitanitás részének tekintünk;:, ideértve ezek humanizált és/vagy affinitás-fejlesztett változatai t .
Az '’apoptózist inoukáió molekula (pl. antitest; olyan, molekula, amely programozott sejthalált indukál, amely standard apcpfázás-tesztekkel - pl. annexin-v megkötése, DÓS fragmentáoiő, sejt zsugorodás, enoop.latmaf ikus retikuium tágulása, sejt feldarafeolédás és/vagy nemóránvezrkúrák (un. apoptorisos testek) képződése alapján - hatorozható meg. A ν\ szóban tcrgő sejt általában ErbBz-receptőrt termelő- sejc, elsősorban ErbBl-receptort túlzott, mértékben termelő sejt. A erőben forgó sejt előnyosan ráksejt, pl. emlőrák, petefészekrák, gyomorrák, andometríumrák, nyálmirigyrák, tüdőrák, veserák, vastagbéirák, pajzsmirigyrák, hasnyálmirigyrák, prosztatarák vagy húgyhólyagrák-sejt, In vitro a sejt SKB.R-3, Blévé, dalai, bDA-MS-453, MDA~M3-3S1 vagy SKOV3 sejt lehet. Az apoptőzással kapcsolatos cellaláris események értékelésére különféle eljárások állnak rendelkezésre, Például, ánnemin-köfés alapján foszfatidíl-szérin háSj transzlokáciő mérhető; ChS-látrázás alapján DdS-fragmentáctó; és hipobiplöid sejtek száménak nővekezese alapján DKSfragmentáclóval együttes sejtmag/kromatin kondenzáció értékelhető. Az apoptőzlst indukáló molekula előnyösen olyan molekula, amely BT474-sejtek alkalmazásával végzett artézin-kötesd tesztben - a kezeletlen sejtekhez viszonyítva - kb.. 2-50-szer-s. előnyösen kb. S-Sö-szeres, legelőnyösebben kb:. Iv-SQ-szeres annexin-indukciót eredményez. Bizonyos esetekben a prc-apcptózrsos molekula olyan molekula, amely gátolja egy Eröá-reoeptor BrbB-iigandum általi aktiválását. Más esetekben az ilyen molekula nem blokkolja jelentős mértékben egy E.röB-reeeptor SrbB-lrgandum általi aktiválását. Ezen túlmenően, a molekula anélkül is indukálhat apoptőzlstf: hogy az S~fázisban lévő sejtek százalékos arányának nagymértékű csökkenését okozná ípl. δ2 ilyen sejtek százalékos a \ csak 0—10 á-kai csökkentő molekula) . Az apoptőzlst indukáló:· antitestek közé tartozik a. 7pg és< agg arér-Ethál antitest: jld, dl 23/177-93 számú nemzetközi közzétételi izet, mélyet teljes terjedelmiben a kitanitás részének tekintünk), ideértve ezek humanizált és/vagy affinitás-fejlesztett változatait, ét BlaB-reeaptöt ligandum általi akti válását wbiokkoló antitest kifejezésen olyan antitestet: értőnk., amely csökkenti vagy gátolja a szóban főt go (fentebb leirtj aktiválást, azzal, hogy az antitest lényegesen hatékonyabban képes gátolni az ErbB-reoeptor iigandnm általi aktiválását, eint a <Dé monoklonális antitest ipi, kb. olyan hatékonysággal, mint a át vagy 2C4 monoklonális antitest, vagy ezek ?ac-ft-gn nsor, és < um.yo·^:. '-e. c_\a 'a* e'mn, rn, mint a 2C4 monoklonális antitest vagy iáb-f ragmensej ... Példáéi, az EroB·· receptor iigandom: általi aktiválását gátló antitest olyan antitest, amely egy ErbB heterooligomer képződését 50-100 %-kal hatékonyabban blokkolja, mint a 015-antiiest·.Egy ErbB-receptor iigandom általi aktiválásának, gátlása tetszőleges módón blokkolhutc, például, a irgsudum EtbBreoeptorhoz történő kótoeésener megakadályozásával; az örbS-kompiek kialakul á sansz gátlásával; egy ErbB-komplexben lévő ErbB-recapror tirozih kinéz aktivitásának gér lázával; és/vagy ErbB-reoept orban lévő tiroziníok; foszforiláoldásnak gátlásával. Az SrhB-rseeptorok Iigandom általi aktiválását gátlő antitestek példái közé tartoznak a kővetkezők: £Ci és 7 Bő monoklonális antitest (melyek az
ErbBl/SrbBŐ r3 y · jj/ErbSá serero-olizomerek EEG általi aktiválását, valamint az EGFn./BrhBz hetero-ollgomer möF, TGEcg. amphiregulin, HS-EeF és/vagy epiregulln általi aktiválását blokkolják); továbbá az 126-, L96- és 1282-antitest [Klapper és mtsai.: Oncogene. 14, 2199 (1997)), melyek az fGE és EDE ~ EGF9~t, ArbB2~t, ErbB3~af és ErbBá-et termeié - ii?D-sej tekh&z történő kötődését gátolják.. A szóban forgó kifejezés jelentése kiterjed a felsorolt és egyéb antitestek humanizált és/vagy affinitás-fejiesztett változataira is.
Az epitóp kifejezésen monoklonális vagy poliklonális antitestek - protein-antigéneken lévő - kötőhelyeit értjük.
Az adott epitépkor kötődő antitesteket epizőptérképezéssel/’ azonosíthatjuk. A. proteineken lévő epitőpok elhelyezkedésének térképezésére és karakterizalására számos eljárás ismeretes; ilyenek pl, az antitest-antigén komplex kristályszerkezetének megfejtése; kompétisi ős tészták; génfragmens-expresszibs tesztek; szintetikus pepiiden alapuló vizsgálati eljárások [id. pl, Barlox és lane: being Antibodies, A Laboratory Hanuai”, 11, fejezet, Cold Spr.ing Harbor Laboratory Éress, Cold Spring Harbor, Lee York (19991), A kompetíciós teszteket a későbbiekben ismertetjak. A gánfragmans-ezpressziős tesztekben a proteint kódoló nyitott leolvasási fázist véletlenezerően vagy specifikus genetikai konstrukciók szerint fragmentáijak, és megáiiaplcmn' a n'unirdtE; í 't- 'A uőAí n’ ixo.... ,v titesttel megfigyelt reaktivitását. A génfragmensefc, például, poiimeráz-láncreakoiórai állíthatok elő, majd in vifro transzkripció és transzláció útján - radioaktív aminosavak jeieni.étéően - rΆ Ά- ..iacrnil. Az ra,mta\~ tivan jelzett proteínszekaszokhoz történő kötődését rrnmunprecipi tár lovai és géieiektroforézissel mutattuk ki.
Bizonyos epitópok fágrészecakék feiülshén. megjelenített randctf peptídszekvenciák nagyméretű kény-v tárainak .(fágkdnyvtárak) aikaima zásával is azonosiszakák. Más nádon, átfedő peptidfragmensefc meghatározott könyvtárát egyszerű kötési vizsgálati eljárásokban a vizsgálni kívánt antitestház történő kötődésre tesztelhetjak. Ez utóbbi módszer kb. 5-15 aminosavas lineáris epitópok meghatározására alkalmas.
agy vonatkoztatási antitesttel összehasonlítva ^lényegéten azonos epitophoz kötődő” antitest kifejezés azt jelenti, hogy a kát antitest azonos vagy térbelilég átfedő epitőpokaf ismer fel. Az antitestek ilyen azonos vagy átfedő epltőpokat felismerő tulajdonságának légéi tál,áros abban alkalmazott gyors eljárásai a kompetíciós tesztek, melyek számos különféle formátomban, jelölt antigén vagy jelölt antitest alkalmazásával hajthatók végre. Az antigént rendszerint 9 c öregö tálcán ímmobilízáljok, és radioaktív vagy ehZlmés jelöld alkalmazásával meghatározzak a jelöletlen antitestek jelölt antitestek kötődését blokkoló képességét.
A ”áb5--epí.tőc” az Er.b.8z ezt rács Ián iáris dómén j ének azon régiója, amelyhez a iD5-antitsst (A1CC CR1. 104 63; kötődni képes. Ez az égitőt közei van az SrbSz transzmembrán dóménjéhez; a kb. 5:19. aminosavtől a kb. 6:35, amínosavig terjed, ami az ErbBl eztr aceiiuiárís dómén szekvenciáján fid. 4. ábra, 3. azonosítószámú szekvencia) beiül helyezkedik el. A áDS-epitőphoz kötődő antitestek azonosítása céljából szokványos: keresztbiokkciási tesztét végezhetünk üld. ρί. Harlem és tané, id, fentebb). Más módon, epizőptérképezést végezhetünk annak meghatározása céljából, hegy az antitest kcioöik-e az ErbB2 405-eoitopjához ipl, a 3, azonos itős tárná szekvencia kb. 522. eminozavá tói kb. 625, amincsávázó serjebő régióban agy vagy több ami no savhoz} .
A ahá-epitöp” n ErbBz eztraosi itiaris doménjének azon régiója, amelyhez a rná-antitest kötődni képes, Ez az epitőp az ErbB2 extraoelinláris doménj a amino?savszefcvenciájinak kb, 541-S39, aminosavait foglalja magában (ló, 4, ábra, 3. azonosítótzámű szekvencia),
A 7C2/0'.0epitóp!; az ErbSz extraoeilniáris dom.énje 2terminálisának azon régiója., amelyhez a 722- es /vagy 7Elánt i test (mindkettő 3.2 ATeC-néi rátétbe helyezve, 1«. lentebb} kötődni képes. A 722/7 E3~eg.itdphos kötőöní képes antitestek azonosítása céljából szokványon keresztblokkolási tesztet végezhetünk (Id. pl. karion és Lane, id. fentebb). Más módon, apicóp-tarfcépezást végezhetőnk annak meghatározása céljából, hogy az antitest kötődik-e az ErbBz 7C2/7F3enitapjához (pl. az ErbBz kb, 22, aminosavétói kb, 53, aminosavaig terjedő régióban (Id. 3, azonosítószámú szekvencia; 4. ábra} egy vagy több aminosavhoz0
Az olyan tumor, ameiy anti-ErbB antitesttel végzett kezelésre nem. vagy csak alig reagál”, elismert áliatmodelibsn vagy humán klinikai kísérletben, az anti.-S.rbB; antitesttel végzett kezelés hatására - a kezelés nélküli állapothoz vagy a pia;ebóval végzett kezeléshez viszonyítva - nem matat statisztikailag szignifikáns javálást, vagy más módon, az: anti-ErbB antitestekkel végzett kezdeti kezelésre reagál, de a kezelés folytatása során növekszik. Az anti-BrhB antitestek hatékonyságának tesztelésére különösen alkalmas sllatmodell á 3, példában bemotatásra kerüld transzgenlkns állétmódéi!.
A kezelés kifejezése;', terápiás eéld, elletve megelőzési célú (prof ilaktlkus) kezelést értőnk. A kezelésre szerűié páciensek közé tartoznak azok, akik nem kívánatos fiziológiai változás vagy rendellenesség (pl. rák kifejlődésének vagy terjedésének) megelőzésére vagy enyhítésére van szükség. A találmány céljaira a jótékony vagy kívánatos klinikai eredmények köze tartoznak, többek között, a következők; tünetek enyhitése; a betegség mértékének csökkentése; stabilizált (azaz nem rosszabbodó) állapot; a betegség progresszióiának késleltetése vagy lassítása; a betegség százasának javítása vagy átmeneti enyhítése; remísszió |részleges vagy terjes), akár detektálható, akár nem, A kezelés” kifejezés a páciens túlélési Idejének - kezelés nélkül várható tűiéléshez viszonyított - meghosszabbítását is jelenti. A kezelésre szórniő páciensek közé tartoznak a rendellenességtől mát szenvedők, az arra hajlamosak, illetve azok,· akiknél a rendellenesség ki fejlodésének megelőzésére van szükség,
A ''rendellenesség kifejezés olyan állapotot, jelent, amelyre a találmány szerinti kezelés jótékony hatású. Az ilyen rendellenességek közé krónikás és akut rendellenességek vagy betegségek tartoznak, ideértve azon koros állapotokat is, amelyek az emlőst hajlamossá teszik a szóban forgó rendel.letessen kisiskolására.. A találmány szerinti megoldás érteimében kezelhető rendellenességek példái közé tartoznak, többek között, a kővetkezők: jőindoiató és maiignáns tumorok; leukézisok és maiignáns iymphoid betegs,~o+>\, <' r -00:-., az emlőrák, petefészekrák, gyomorrák, erdőmetriumrák, nyálmirigyrák, tüdőrák, veserek, vastagbélrák, pa. j zsmirigyrák, hasnyálmirígyrák, prosztatarák és húgyhólyagnál A találmány szerinti megoldás értelmében előnyösen kezelhető rendellenesség a maiignáns tumor, pl, emlőrák, amely túlzott mennyiségben termel SrbS-receptort (pl. ErbSz-receptőrt vagy EGER-t) , és nem vagy csak alig reagál a túlzott mennyiségben termelt receptor(ok) elleni antitesttel, végzett kezelésre, A találmány szerinti megoldás értelmében különösen előnyösen kecelhető rendellenesség az Érből túltermelésével jellemezhető emlőrák, amely nem vagy gyengén reagál a hREGiSRlih®-terápiára.
A terápiás szemponthoz hatásos mennyiség kifejezésen egy hatóanyag azon mennyiségét: értjük, amely hatásos egy adott betegség vagy rendellenesség emlősben történő kezelésére. Rákos betegség esetén a ha főanyag terápiás szempontbői hatásos mennyisége: csökkenti a ránca sejtek számát; csökkentheti a tumor méretét; gátolja, (azaz bizonyos mértékben lassítja, előnyösen blokkolja; a. rákos sejt perifériás szervekbe történő int üt rációját; gátolja (azaz bizonyos mértékben luesztje, előnyösen blokkolja) a tumor mezasztázisát; gátolja (bizonyos mértékben) a tumor növekedését; és/vagy bizonyos mértétben enyhíti a ráztál összefüggő egy vagy több tünetet. A hatóanyagnak a létező ráksejtek növekedésének gátlására és/vagy pusztításéra kifejtett hatásának mértéke oitosztatIkes és/vagy citotoxikus letet. Rákterápia esetében a hatékonyság, például, a betegség progressziói; zoejánsk (TTF) mérésével és/vagy a reakció ráta (R.R) mérésé vei has érő zható meg.
Ahogy a leírásban használ jak, a ezretori kés hatóanyag” kifejezésen olyan anyagot értünk, amely gátolja a sejtek működését és/vagy azok elpusztítását oredmányezi, A oitoioxikts hatóanyagok kozó tartoznak a radioaktív Izotópok (pl. ét2;b r3i i12\ y9s, ae-sy s®1^, £i‘;t íz és a La radioaktív izotópjáig; a kemoterápiás hatóanyagok; valamint a toxinok, pl. a kis molekulájú: toxinok és. az enzimátikusan aktív taxinak, melyek bakteriális, o mr .-,· növényi vagy állati eredetnek lehetnek (Ideértve az ilyen toxinok fragmeuseit és/vagy változatait} ,
A kemoterápiás hatóanyag kifejezésen rák kezelésére alkalmas vegyi letet értünk. A kemoterápiás hatóanyagok példái közé tartoznak a következők: alkiiezöszerek, pl. thiotepa és cikiofosxfamid (CYTOXAN-'·}; slklisznlfonéxok, pl, buszulfán, improsxuifén és plposztlián; azirléinek, pl. óenzodoos, carboqaon, mettrezora és urabomé; etilénIminek és maiálaméiaminek, pl. aléralamin, trietilénmeiamin, t r í e t i1énfo s z fo ramid, t ri e111én-1 i o f cs z χ oram id és orzme trió lese laton.; nitrogén-mustárok, ni. kiörambaoii, kldrnsfszin, choiofoazfamid, esziramnsztin, rfoszfamié, mek io rét amin, maki örét amzn-oz id-h i dra k iot id, meiphelan, novembinhi n, phene s t e r in, pr vonzz, n s z t in. trófea zf amid, úracii-mustár; nztrosnreák, pl. oarmmsiin, oh.l örmzpt ooin, f ödémást in, lemos tin, nimnsiin, ranimust ing astibiof iktmöfk, ml. aclacinomicinek, actl.nomicin, anthramicin, azaszexiu, b1somion nek, oa c11 nőni cin, oai ioheami cin, ca rab ioin.
kp ίΛ £' íiv.h í:i kPZd .h .t í í y aonornbicrn, doxorabicin, e a r z I no Ilii n, de borebi cin,
..cin,.
c n r omomr cinek, da c t i on lm i o In
- d i a 2 e - 5 - ox o - L -η o r 1 e u o i n e sο rebic1n, íd a reblein marcél Tomiéin, mi tömi cinek, mikofenolsav, nogslantéin o kiverni cinek, gneiemiein, tubexeibin, peylomicig,, potfiromicin, peremi cin, streptozooin, rotíoruhi c in, st rept οn i gr i n, nbenimen, zinosistin, zömei cm; antímárából i tor, pi< methetrexat és 5-finomraoii (ó-Fb); fólsav-anslógck, pl. tíenopierin, methotrexát, pteropterin, trióéérexát; perin-analógok, pl. fiooarabra, 6-merkaptoporin, tramiprin, t iogeanm; pirimidin-analógok, pl. ancizabin, azaoitiom, 5~azaeridin, carmofer, c.y t a rab i n, di de z ox i n r 1 d in d o x i i i e r r d 1 n, en oo it eb i n, oal.es taron, népitrostán, i iozemoin, ö-FS; androgensk, pi.
oronos t ano ion -- prop rónáé, api t ács tané 1., ma tora lton; mellék vese-hozmon elleni hatóanyagok, pl. aminoglutatimid, mitotan, trilostrn; fór sav·· ki egész izék, pi, irolinsav; aoeglaton; aldoiosefamid-giikorío; amrnoieveilnsev; ameaorin; bestrabnoil; bisentren; edatraxát; detoxamin; áemeoolorn; diaziguon; elfornztin;
eiriptinem-acetét; etoglucid; gallium-nitrát.; nidroxi-karbamid; leninan; lonidamin; mizoguazon; miéoxsntron; mo ρ i damo1; ni t ra c r i n; pent o st a11n; ph enama t; óirarabi cin; pedofiliánsav; 2~etirhádrazid; erőkarbatán; FSF; razoxán;
sizofiran; api regermaoium; tenua zóna av; tria zrg e ο n; 2,5',5''·· trikiór-trieiriamm; nretán; vindszio; dacarbazin; mannomustin; mitobronifol; miétlattól; prpobromán; gaoitozin; arsbinozrd ÍAra~Ct; ciklofőszfámád; tiotapa;
taxoiook, pl. paoll.taxei ÍTAXOi®, Bristol-dyors Squibb Onoology, HHcetcn, hl, USA} és doxatazol klAAbi'FRlH, Khone-Povísno Forer, Antony, Franciaország}; cnlorarbucii; gsmcitnbin; SHHguanin; markaptoparín; methotraxát; platána-analógok, pl. císplatzn és ca uq'l-k ’ n; v zuo^aszt a a : platina; etoposld (VP-1S:; ifoszfaraid; ? -,-.-.:::.--1mitoxantron; vincristi.n; vínorélőin; nevelőin; romántron; toniposi.d; óannomicin; amínopterin; xeloda; ibandronát; CPT-II; topod romárát inhibitor FFS 2000; dirluormatiiornltin (FMFOl; rstinasav; esne ram. cd rak; empeod. tahin; valamint a felsorolt vegyi letek gyógyászati szempontból elfogadható sói, savai és származékai, A kemoterápiás hatói-'vaíív ko„t ; te fusk a’ -η:ηηά'ΐν t Πsomlyek a hormonok tumorokra kifejtett hatását szabályozzák vagy gátolják; ilyenek pl. az anti-ösztrögének, pl, a tamoxifen, raloxifen, arcnatiz-gaíiá á í 5}-imida.zoi.ok, thidroxitamoxifen, triomifén, keoxzfén, 1.1117210, onapristor és toremifén (Faroston}; és anti-endrogérrek, pl... fiutsraid, ni.'intaraid, bioalutamid, ieuproiid és goserelin; valamint a felsoroltak gyógyászati, szempontból elfogadható sói, savai ο;.·.· .-,:.re,zo.r,,-.·, .
Ahogy a találmány leírásában használjuk, a pro-drog arc'?' e~ r\ ν ct b-* p Π ' vagy származékát ártják, amely a zomorsejíekre ez eredeti hatóanyagnál :drognál} kevésbé cl t okoz ikus, és onzim.aii.-~ kosán a nagyobb- akízvitási eredeti alakká aktiválható·, illetve alakítható kieb pl. Wiiman; Mochemicai. Sooiety
Pransaotions H, 375 (193 3} ; és ate
Ha ás mtsai.
Xűrodrogs; A Chemical Approach to kergeted Drog üeilvery, a Direoted Drog Delivery” cimü kiadvány (tzerk,: Borcherdr és másai., Humán a árassá 247--2 6. oldalain (1920)), A találmány szerinti pro-drogok közé tartoznak, többek között, a kővetkezők: fosszéttarts Ind pro-drogok, fiofoszfát-tartalmú pro-drogok, szulfát tartalmú pro-drogok, p ep t i átártslm ú p r o - d r ogok, u- ami no s a vva 1 mó d i fi ké lt pro drogok, glíkoziiáit pro-drogok, β-iakzám-tertalmú prodrogok, adott esetben szubszzítusét fenoni-ecetamidtartalmú pro-drogok, adott esetben eznbsztifcuáit feniiaoeramld-fartaimú pro-drogok, ö-fluorcitozin és egyéb 5f1u o r o r. 1 d 1 η ρ r o - d r o g o k, a m e 1 y e k n a gy óbb a k t i v i t á s ú, s z a bab oitotoxikos drogokká alakíthatok, A. találmány szerinti felhasználás céljából pro-drog alakká derivatizálhatő oítotoxikus drogok példái köze tartoznak, többek kozott, a fentebb említett kemoterápiás hatóanyagok.
A. nukleínsav” kifejezésen polinokleötldokat, pl. dezcxirzbcnorieznsavat (Dhu) és - alkalmas esetben - ribonukleinsavat (AHS) értőnk. A nnkieinsav kifejezés jelentése kiterjed a nnkl.einsav-anaiőgokfcoi készülő Dión- vagy RHSekvlvaiensekre és --analógokra, valamint az egyszázé (szensz vagy antiszensz) és kettős szálú poiinukleotidokra< Az izolált'· no k lei n sav :~mo f e ka la cl y a n no k 1 eins a v -mo 1 eke 1 a, amely legalább egy, természetes forrásában megtalálható szennyező nukieinsav-molekulátói el van különítve. Az izolált nutleintsv-molekula nem azonos a természetben megtalálható aiajávai. Ilyenformán., az izolált nokleinsavmoiekulák megkülönböztethetők a természetes sejtekben létesói baki élhsa y-möle kei éktől, Mindézónái ta I, Indiáid nukl sin-sav-moiekuia az is, a»ly az antitested rendesen termelő sojzban, de a természetes sejtektől eltérő kromoszenélős helyen található meg.
Ahogy a leírásban használjuk, a vektor kifejezésen olyan nukleinsav-molekulát értünk, amely egy másik, hozná kapcsolt nnkleinsav szállá tárára képes. Az expresszién rektor kifejezés olyan olaznldc kre, kománkra és dánokra vonatkozik, melyek alkalmasak a vektor által, hordozott rekombináns gén által kódolt Hlxi-proreár termeltetésére. A találmány szerinti megoldás szempontjadói azok az előnyös vektorok, amelyek önálló replikáciőra ás az általuk hordozott nuklsinsavak expressziItatására képesek. A leírásban a plaznia és vektor kifejezéseket felcserélhető nődön, egymás szinonimáiként használj ok, mivel a plazraid a vektor légéitalánossóban alkalmazott alakja.
Ahogy a leírásban használjuk, a iránszkripciós szabáiyozoslen.sk és transzkripciós szaőáiyczészekesnciák kifejezéseken (melyeket egymás szinonimáiként alkalmazunk; olyan nukieinsav-szekvenolákat (pl. DNS-szokvenciáratΪ értünk, amelyek egy adott organizmusban szükségesek egy működőképesen kapcsolt fcödolőszekvencia expresssélfcatásához'. A prokarióta gazdasej fék számára megfelelő szabályozőszekvencia, például, a premőter, adott esetben az operátorszokvencra, valamint a riboszöma-kötőhely. Eukariöta sejtekről ismeretes, hogy premőtereket, erősltőszakvenciákst, í!splioing,!-szig.náiokat és poliadeniiácrös szignálokat alkalmaznak. ü kifejezések ragukban foglalják valamennyi, transzkripciót elősegítő és szztáiy'czó elemet, ideértve a promőfereket, c RhS-pciimeráz és transzkripciós faktorok alapvető interakciój okoz szükséges ezre-elemeket, apstrearő elemeket, erósitoszekvenciák.ut és reagáló • :,response) elemeket (Lenin; Genes V'% Oxford oniversity Press, Oxford, 847-873. old.). Egy gén vagy gáncsaién transzkripcióé szabályozóelemei kézé tartozik a természetben előforduló transzkripciós szabályozóelemek esésre vagy azok egy ép régiója, illetve a gén vagy géncsoport transzkripciós szaraiyozőeleneinek mődositett alakja, Az ilyen módosított alakok közé tartoznak a bizonyos elemek átrendeződésével, bizonyos elemek vagy külső szekvenciák deiéelőjávai, illetve heteroióg elemek inszerciőjáva.i létrejött alakok. Az ilyen módosításokat, a transzkripciós szabályozóé lenek moduláris természete, és bizonyos szabályozóelemek (pl. erősitőszekvenciék) funkciójának pozíciófüggetlensége teszi .lehetővé.. A gének szanál yotóéi ereinek kivágására számos technika all rendelkezésre, melyek lehetővé teszik a szabályozóelemek elhelyezkedésének és fankoio o. \.ó. c '· η·.-y Az ilyen információk, kívánt esetben, felhasználhatok ez elemek módosítására. Mindazonáltal, előnyős a gén transzkripciós szabályozóelemei, ép régröjánax f e Iha s z ná I á s a.
A szövetspecifikus promóter” kifejesésen promőterként szolgáló nukieotIdszekvenciat értünk, amely vezérli a hozzá működőképesen képcsőit DM3-szekvencia expresszióját, és amely a szóban forgó DNS-szekvencia expresssióját egy szövet specifikus sejtjeiben (pl, pl. nyélmirigy sejtjeiben) teszi lehetővé. Az egyik jellemző megvalósítási mód szerint a ny á imx r i gy - spe oi f 1 ku s pr omó t er e ke t a 1 ka 1 ma zó g én kοns t r u.kerők a H1E2-protein vagy fregmense expresszié jót elsősorban a nyálmirigy-zzövetben teszik lehetővé.
Egy nukleinsav akkor működőképesen kapcsolt, he egy másik nullái nsav-szekvencráva1 funkcionális kapcsolatban van, ééidáol, egy pre-szekvenoia vagy szekréciós vezetőszekvoncis öhE-e akkor van működőképesen egy polípeptídet kódoló űES-hez kapcsolva, ha olyan pre~ proteinként expresszálőőik, amely részt vesz a polipeptid szekréciójában. Egy cromőter vagy egy erősítöezekven.cia akkor van működőképesen agy köteleszakvenolthoz kapcsolva, ha hatással van a szekvencia transzkripciójára. Egy rihessömakőtöhely akkor van működőképesen egy kődoiossekvenciához kapcsolva, ha elősegíti a transzlációt, A működőképesen kapcsolt kifejezés általában azt jelenti, hogy az összekapcsolt DlE-szekvetciák egymással határosak, és - szekréciós vezetöszekvencia esetében - egymással határosak és azonos leolvasási fázisban vannak, ugyanakkor, az erösitőszekveneiáfc esetében nem követelmény, hogy összeértek legyenek. Az összekapcsolás szokványos restrikciós helyeknél liyáiássai valósítható meg. Ha ilyen helyek nem léteznek, az általános gyakorlatnak megfelelően szintetikus oligonakieo11 d - adapterek vagy kapósο1cszekvenciák alkaima z hátok.
A franszfekelő kifejezésen egy nukieinsav (pl, expreesziös vektor) reoiplehs sejtbe - hakleínszvközvetítette génbejuttatássál végzett - bevitelét értjük. Ahogy a leírásban használjuk, a trsnszzoxmaciö” kifejezés olyan eljárást jelent, melynek serén egy sejt genotípusát erősén DNS vagy RNS coli elérts felvétele révén - megváltoztatjuk, miáltal a transzformáit sejt, például, a KER2 rskomb1n ána alakját teme1í: >:
Ahogy Itt használjuk, a transzgén kifejezés olyan rrokleineav-szekvenciára vonatkozik, amely részben vagy egészben heterolög (azaz idegen} árrá á transzgenikus állatra vagy sejtre nézve, amelybe bejuttatásra került, vagy homológ a szóban forgó f.ranszgenikus állat vagy sejt egy endogén génjével, be az állat gemmába úgy van beinszertálva, hogy a sejt genomjár (amelybe bejuttatásra került} módosítsa (például, a természetes génétől eltérő helyre van inszertálve, vagy leszerelőja knock-out mutációt: okoz ·. A transzgének egy vagy több transzkripciós szabályozészekvenciához és egyéb, tetszőleges - a kiválasztott, nukieinsav optimális expresszáltatásához; szükséges - outiéinsavakhoz (pl, intronokbozj lehetnek működőképesen kapcsolva.
A fermreknek megfelelően, a transzgén-konztrvkeró kifejezés olyan nokisinsavra vonatkozik, amely transzgént és - adott esetben - további oukieinsav-szekvenoiáket tartalmaz, Így például, transzkripciós szabályozészekvenoiát, polizderiiáciés helyet, repllkáeiős kezdőbe ivet, markergént és hasonlókat, melyek a transzgén gazdaorganizmus-genomba történő inszetciőja céljából végzett általános manipuláció szempont iából hasznosak lehatnék.,
A találmány leirásában a transzgenikus vagy transzgénes kifejezést egy állat, vagy konstrukció transzgént hordozó sajátságát leírd jelzőként használjuk* Például, ahogy Itt használjuk, egy transzgéni kun organizmus” olyan állat, előnyösen nem humán emlős, amelynek egy vagy több sejtje - emberi beavatkozás eredményeként, pl. szakember számára jói ismert transzgenikus technikák alkalmazásának eredményeként - idegen (heterológ) nukieinsavai tartalmaz. A nukieiusav többféle módón juttatható be a sejtbe, például, szándékos genetikai manipulációval (pl. mikroinjektáiással vagy rekomnináns vírussal végzett infekcióval) közvetlenül a sejtbe, vagy közvetve a sejt prekurzorába. A genetikai manipuláció” kifejezés rekombtnáns Dh'S-molekuia sejtekbe történő bejuttatására ve''a*·''.!·, «s te . u.tosv ' zn >} 'bi-ínJus ker-^s . »~ zésre és in vitro f ertilízáoíöra. A. sejtekbe bejuttatni kívánt rekombináns öhS kromoszómába Integraiható, ne lehet extrakromoszomálrsan replíkálódé ÜSS is. A leírásban ismertetett, tipikus· transzgenikus állatokban a transzgén azt eredményezi, hogy a sejtek a találmány szerinti HEP2proteinek re kenőináns alakját termelik vagy tóit emelik, Az alapító vonal” és sírnisv illat” kifejezések olyan állatokra .vonatkoznak, amelyek azokból az embriókból származnak, amelyekbe a transzgént bejuttattuk, vagyis olyan állatok, amelyek azon embriókból származnak, amelyekbe a DNS-t inSzertáituk, és amelyeket egy vagy több pótgazdába
Íme lantéi tünk..
Az: utód és transzgení káé ál lát utódja” kifej a zés ek az eredetileg transzformált emlősökből származó valamennyi generáció ieszármazottaira vonatkoznak, A ”nem humán emlős” kifejezésen az. emlősök osztályának tetszőleges; tagját ártják, az ember kivételével.. Az emlős” kifejezésen az emlősök osztályába sorolt állatokat értünk, ideértve az embert, a háziállatokat és gazdasági haszónáilatokat, állatkerti állatokat, sportolási, ÜL kedvtelési célból tartott állatokat, Így ni. kutyákat, lovakat, macskákat, szarvasmarhákat és főemlősöket.
A ieizásban a sejt, sejtvonal.” és sejttenyészet” kifejezéseket egymás szinonimáiként alkalmazzuk, és maismennyi ilyen megjelölés magéban foglalja az utódokat is, ilyenformán, a transzrormáns és tránézformált sejt” kifejezések jelentése kiterjed az elsődleges, eredeti sejtre és a belőle származó tenyészetekre /függetlenül az átoítások számától).. Természetesen az: otbdok bhS-tartalmukban nem pontosan egyformák, ami a szándékos vagy ve let let szeri mutációk következménye. A funkciójuk és biológiai aktivitásuk tekintetében azonos mutáns utódok szintén e kifejezés jelentésköréfce tartoznak. Az ettől eltérő megjelölések a szöveg ossz e függés bői ny 11 v á n vau d k 1 es z ne k.
k ” i~:,n s ? z kife jezésen kisméretű vezikulát értünk, amely különféle típusú iipidekből, foszfoiigtoekbői és/vagy felületaktív anyagokból áll, és hatóanyagok /pl. találmány szerinti enfi.-SrbBr antitestek és, adott esetben, kemoterápiás hatóanyag) emlősnek történő adagolására alkalmazhatok.
A liposzőma komponensei rendszerint kettős réteg formátumban vannak elrendeződve (hasonlóan a biológiai méisbránok 11pice1renő ezÖőéséhez) .
A termékismertető kifejezésen gyógyászati termékekház általánosan mellékelt Útmutatót értünk, amely a gyágyas zakó termák alkalmazására vonatkozó ,·.ηα1 rációkat, a gyógyszer dozirozásat, aoagoiász médiát, ellen javallatait és/vagy figyelmeztetéseket tartalmaz.
A karöioprotektána kifejezésen olyan vegyöletet vagy készítményt ártunk, amely gátolja vagy csökkenti egy hatóanyag - pl.. snii-BrhB antitest vagy annak maytansinoidkonjugátuma - páciensnek történő adagolásával összefüggő szivizon-ölstfunkcrőt fszivizömbentalom és/vagy pangásos sziveiénte fenség) . A x&rdioprotektáns, például, blokkolja vagy csökkenti a szabad gyökök közvetítette kardiotozikus hatásokat és/vagy megakadályozza vagy csökkenti az oxldat.lv stresaz sérülést. Az Így definiált kardioprotektánsok példái közé tartoznak a következők: cas-kelátképzd őexrazován.
nCRF-lS”; Stefiért és mtsai,: The Annals of
Pharmacotnerapy 28, 1063 (1994); lipzdszint-csdhkentö hatóanyag és/vagy antioxidáno, pl. probuecd FSingal és mtsai.:
J. Mai, Coli Cardiol. 27, lóit (1335}}; amifostlu (amino.....
tlol-2- ((3-amino-propII) -amino} - szán -f ioi-dihldrogén·-főszfát észter, más néven WR-2751, valamint ennek defoszíoriiéit - sejt által felvett - alakja, a WR-Iömo) és 3-3- (3-meti1-emino-prepei-amino) -propil-foszfortiosav (RR~ 151327}; Id. Green és mtsai.: Cancer Research 54., 738 (139«); digozin (Srlstow: Btug-lnduoed Heart Bisease, szem.: Bristov, Uez York, Elsevier, 131-215. old.. (1930)1; ^-blokkolók, pl. nakoptölel (Bjalmarson és mtsai.; Drugs 47 (SuppI. 4;, 31. (1994)}; Bhaddy es mtsai.: Am, Koart 1. 129, 197 <1935; j R-vztamín; aszkorfoinsav «C-vitamin); sza0.5 őadgyök-megkötők, pl. oleanolsav, ursolsav és Eaoetilcisztein (EAC)y spin trapping vegyülitek, pl. <xfenri-t-butil-nitrón [PSM; Paracobini és mtsai.: Antioanoer Rés. 13, 1607 (1993);? szerves szeiénvegytletek, pl.». P2Ő1 {Slessen) ; és has οn.1 ö k.
A találmány szerinti megoldás egy új RER2-iranszgénes tumormodailban kapott eredményeken alapul, mely modellben a HEACEP'llN* (Illetve az agéreredeta éDb-antiteet, amelyből a HSRCSPTTN'® származik) minimális hatást gyakorolt a. tumornövekedésre.. A HARCÉIlii' és a HBRCEPClH*/maytanainőid konjugátomok tesztelésére ezt a modellt alkalmazva váratlanul azt találtuk, hogy míg az ilyen transzaenikus egerekből származó rranszplantaiz tumor gyengén reagált a HERCSFCCEAes kezelésre, a HERCHRCüA/may tansinoio kenj ugat rmok igen hatásosnak bizonyultak.
Ennek megzelelöed, a találmány szerinti megoldás antíErbB antitest/maytanárnőid kon;; ugat umok ErbB-receptort túlzott mértekben termelő - és az anti-ErbB antitesttel és/vagy maytaneinoiddai végzett kezelésre alig reagáló tumorok kezelésére történő alkalmazásán alapul..
A)Anti-Srb8 antitestek e1őálIrtása
A következőkben a találmány szerinti megoldás értelmében alkalmazott antitestek jellemző előállítási módszereit ismertetjük, Az antitestek előállítását az anki-ErbRi antitestek vonatkozásában szemléltetjük, azonban szakejzoer számára kézenfekvő, hogy az ErbE-reoeptorosalád egyéb tagjai el leni ahf.ífesfek ha s om ig módon állíthatok aló ás mőhasit hatok*
Az antitestek előállítására alkalmazandó SrbBzantigén, például, az h.m...ji - kívánt epítöpot tartalmazó extracelluláris dóménjónak vagy annak egy részének szolubilie alakja, lehet, más nődön, az antitestek előállítására sejtfeltlétükén ErbBz-t torkelő sejtek (pl. ErbB2 túltermelése céljából transzfermáit hsH-3T3~sejtek vagy karcinoma-sejtvonal, pl. SK-Bh-3-sejtek; Id. Stáncözeki és mtsía.: BBAS (ÜSA) 83, 8691 (1991)1 alkalmazhatók. Az ErhB2 - antitestek létrehozására uiosimas - egyéb alakjai szakember számára jól ismertek.
(1) rollklonálís antitestek
A políklonális antitesteket előnyösen állatokban, a megfelelő: antigén és adjwáns: többszöri szgbkután lse) vagy intraperitöneális (ipj injektálásával termeltetjük* A releváns: antigént előnybe lehet olyan proteinhez kenjagaImi, amely az immunizál.ni kívánt fajban lazsunogén hatású. Az ilyen proteinek példái, a keyhoie llmpet” hemocianín, a széruma fbumln, a szsrvasmarha-erecetl thyroglobul In és a szójabab tripszin-inhibitor. A konjugálás bifunkoios vagy dérivatizáló ágens alkalmazásával történhet, például, ital éimibobenzpi 1-s ági fos zgheínisbb~áh zley (kenj nyáláé óla z~ tele e ken kére s z t u 1) , 3 -- h ?. d n ·; n u < o i .m. r 13. (kenj u g á 1 ás lizineken keresztül), gitfáraldehid, borostyánkösavanhidbid,:: Bődig vagy (amelyben A és: ηΛ jelentése:
egymásról eltérd aikilcsoporf) alkalmazásával.
&z állatokat az antigén, az ímmnnogén konjugátamok vagy származótok ellen ágy inneni sál jak, hogy s protein vágy a konjugátam, például, 1Ö0 ug-ját inyulak esetében), illetve 5 μο-ját (egerek eset ében) háromszoros térfogatú Frennd-féie komplett adjuvánssal elegyítjük, és az oldatot inéradermálísan az állat testének több pontjába injektáljuk. ügy hónap elteltével az állatoknak - több helyre adott szubkután injekcióval ~ a peptid vagy konjugátum eredeti mennyiségének 1/5-lylö-éveI (Freund-fáie komplett adjutánsban; emiékeztetooitász adunk, 7-14 nappal később az állatokból vért veszünk, és a véresvőben meghatározzuk az ennitesz-titort, Az esd élezterooltásozat addig i smételjük, mig az antitest-titer platót nem ér el. Az állatoknak az emlékeztetőolrást előnyösen azonos antigén (de eltérő proteinnel és/vagy eltérő keresztkötő reagenssel képzett) kenjugaturnával végezzük. A koujugátumok rekombináns sejttenyészetben, fúziós proteinekként is előállíttétek. Az lmmunreakoi.ó serkentésére aggregáoiot elősegítő nafőanyagok •pl. al ami ni. nm-bi drőzre, din1': is alkalmazna tők.
(ilj Monoklonális antitestek
A monokiénélis antitestek lényegében homogén antitestek pcptláciőtáoől származnak, vagyis a populációt alkotó egyes antitestek egymással azonosak (a minimális mennyiségben esetlegesen előforduló természetes mutációktól eltekintve) , Ilyenformán, a ''monokionáiis jelző az antitestek
-ίο.- t, - j, ·> .f. κ ο ν. \ θ' ο - η\ ' nerc tek eiegyeként léteznek.
A monokionális antitestek az el sokén t Kókler és mtsai.
(hature 256, 495 (1975)1 által leírt hibrídőma-el.járással, valamint rekembináns Ddő-technikák (4 Síé 567 számú egyesült államokbeli szabadalmi, leírás) alkalmazásával állíthatók elő.
A hibridőma-eljárás során egeret vagy egyéb alkalmas gazdaállatot (pl. hörcsögöt) a lentebb leírtak szerint immunizálunk, hogy olyan iim-iociták termelődését váltsak ki, amelyek az immunt rá lássa alkalmazott proteinhez specifikusan kötődő antitesteket termelnek (Illetve azok termelésére képesek/. Más módon, a limrocitákat in vitro immunizálhatjak, Ezt követően a limftortákat megfelelő fűzioné Itató ágens (pl. polletzien-glikoi.) alkalmazásával myeiomasejvekhez fuzionáljuk, miáltal hibriőőmasejteket kapunk bioöiag; ko.uoci.cnai. Antibodies; Prí.nciples and Practice, 59-153, old. , Academic Press ¢1:966/] ,
Az Így létrehozott hibrfö.dmase j teret megfelelő - előnyösen a ruzionálatlan kiindulási mye roma sej: tek szaporodását ás tóiélését gátló egy vagy több anyagot zártáimázd tenyésztő tápközegben .szaporítjuk. Például, ha. a kiindulási myelcmasejtekbői hiányzik a hiponanihin guanón foszforibozii transzferáz enzim: (döfEl vagy HPET;, a habridőmák tenyésztésére rendszerint hiporánthint, amlnopterint és timldlni tartalmazó tápközeget (HATtápközeg/ alkalmazunk, amely gátolja a HGPP?-cefteless sejté k s z apó r oda s á t.
A fuzionáieatáara előnyösen olyan myelomasejteket alkalmasunk, amelyek hatékonyan fuzionálbafők; elősegít.ik a kiválasztott anti test-torosto sajtok stabil és nagymértékű anfitesr-termelésát; és valamely tápközegre (pl. HATdg. közegre' croedenyek. Erők ko.'ül előnyösen egérersdetű ryd.omasejtokot alkalmazunk; ilyenek példád, a A09C-21 és APC-li egér tumorokból származó rajtvonalak (ősik institute Cel.1 Dtetrifoution Center, San Diego, Kalifornia, ISA) és az 32-2 vagy X23--Agt~SS3 sejtek (Ameríoan Tyue Culture Col lett tea., Rogkvílie, Maryiand, HSA; . Humán monoklonális antitestek termelésére humán m.ye lomase j tok es egér/humán heteromyeiomaaejtok alkalmazását is leírták (XcL Kézbőr; d kord. 223, 3002 (2984); Brodeur és mtsai.; Monodona.1
Antibody Produetion Taohniuues and Appü tat ions'k 51-22. old,. Maróéi Dekkery Inc., Ken York (1982)),
A tenyésztő tápközeget (amelyben, a hiba időnasej teker szaporítottuk! az antigén elleni monöklönaiis antitestek termelécesére vizsgáljuk. A hlbridémaaejtök által termelt monoklonális antitestek kötési speoifitását. előnyösen i:mm.;nprseipiéáoiöval vagy in dtro kötődési tesztül - pl. r adí oimmun- rés zt t el (RXAi vagy enzimkötöt t .immnns torbens vizsgálati eljárással (&LTS&) ~ határozzuk meg.
A. mono ki ónál is antitest kötési affinitása, például, a o^nztn mosat. --dk Irood. d , Itt, :.d ~d„l _e irt Scatohard-anaiisissel határozható meg,
A kívánt spesifitása, affínitásű és/vagy aktivitású antitesteket termelő hibridőmasejtek azonosítása után a kiőnokat limitáló higitáasal sztori ónozhatjak és szokványos eljárásokká;. szaporíthatjuk fid. éodíng; ^donoolonal Amtíhodiea; kelne teles and Braotioe”, 52-103. old.
(Academio Press:, 1986}), Az e célra alkalmas tenyésztő tápközegek példái közé tartozik a D-HSM és az A9M1-1640 tápközeg, Más módón,, a hibridőmasejtek hasári tűzerőkként állatokban in vivő is szaporíthatok.
A szufcklónok által kiválasztott .monokionális antitesteket előnyösen hagyományos: izavunglobuiin-tlsztitási teon* fpl:.
ni kék proteln-A Sepharose, nidroxiiapatítkromatográfia, géieiektroforézis, dialízis vágy affínitási kromatográfia} alkalmazásával választjuk el a tenyésztő tápkőzegtöi, hasűrí folyadéktői vagy vérsavőtői.
A monokionális antitesteket kbdolö DNS-ek szokványos eljárásokkal egyszerűen izoiáibatők és szekvenáihatőfc (pl. spécitikusan az egéreredetű antitestek nehéz, ill, könnyű láncát kódoló génekhez hieridízálö Glíeonnkleötid-próbák alkalmazásával) . Áz ilyen EPS-ek előnyös forrásául öibridőmasejtek szolgálnak. Izolálás után a DKS-t empresszlós vektorokba iaszertálkal. juk, és a vektorokkal gazdase j keket - pl. A. coli sejteket.,, majorneredetö COSsejteket, kínai hörcsög petefészek (CHO) sejteket vagy m ye 1 oma s e j t e ke t (melyek e gy eb kén t imm un gi obul in ~p ro t e í n t nem termeinek) - transzfektálhatunk, miáltal a rekombináns gsadassjlekben monokionális antitestek termelődnek. Az antitestet kődolő: DNS baktériumokban rekombináno módszerekre! történd el oáIlitásót illetően id, pl, Sfcerra. és miaui % Curr, Ovineon in Immunoi, 3, 258 (1993); Pláokthun:
immunoi. leve. 130, 151 (1992) .
A találmány egyéb megvalósítási módjainak, a? .antitestek vagy ant itest ~f iragmensek a McCalf&rty és mtsai. (hature 346, SS2 (1990)1 által leírt technikák alkalma sása v a 1 1 é a r e h o zott a n t i t e s t - f a g kőn y vt á r a kbő 1 izei á .1 ~ hatók. Clarkson és mtsai. [hature 352, 62« (1997)1 és tarka és mtsai. )J. tol. Bioi, 222, SSi (1991)) egéreredetu., illetve humán antitestek tagkönyvtárak alkalmazásával történő izolálásét Írták le. Később ismertették a nagy InM nagyságrendű) affinitása humán antitestek láng-kombinálással l'ehtzn-shnf fiing!í) történő előállítását kid. tarka és mtsai.: Bio/feohnol.ogy 11, 779 (1992)). Szén túlmenően, a kombínatorikas infekciót és in vivő rekombinációt., mint a nagyon, nagyméretű t ágkönyvtárak előállításának s t rá t égiáját Írták 1« íketerhouse és mtsai.,; duci. Aciős Rés. 21, 2265
...—.-I· .....· (1393)). ilyenformán, ezek a technikák a monoklonális antitestek izolálásának hagyományos hlbriőoma-technikáinak. működőképes aiternativái,
Az antitestet kódold Dbc, például, ügy módosázható, hogy a humán nehéz és n lánc entt? dóménjelnek kőd c 1 ó szak v e η o i á j á ve. 1 e g é r e r ede t ü an t i t e s t e k homo lóg szekvenciáit helyettesitjók (9 Síé 567 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Morrison és masai,; hroc. háti. Acad, Sói. OS A 81, 6851 >1984) ], vagy az immunglobulin kődőlŐstelvenótájához kovalens kötéssel egy nem immunglóba1 i.n-ροΐ ipeptid kodciszekvenoiá járnak . t.. .. v. ·. j · részét kapcsolj uk.
Az ilyen nem iízmungiobulzn-pollpeptidekkei rendszerint az antitestek konstans deméngeit helyettesítjük, vagy más megfelelően módon, egy antitest egy antigén-kombináicdási helyének variábilis dóménleit helyettesitjak velük, hogy olyan bivalene kimera antitestet hoztunk létre, amely egy bizonyos antigénre specifikus antigén~kori,ináióöási helyet, valantint egy másik antigénre specifikus antlgén-kombinélátási helyet tartalmaz..
jítií.....Humanizált antitestek
A nem: humán antitestek humanitálssi eljárásainak. Ιοί mása az ide vonat kosé szakirodalomban megtalálható. A humanizált antitest, előnyösen egy vagy több, nem humán forrásból származó amlnosavat tartalmaz, Izeket a nem humán anihosavafcat gyakran import ami.nosavaknak nevezzük, melyek rendszerint egy ampert variábilis doménböi szármáznák. Az antitestek humanizálását lényegében Winter és mtsai, eljárásával hajtjuk végre ílőcse és mtsai,; bátoré 321, 522
0986: ; Hiechmann és mtsai.: Kataré 332, 323 0938); Verhoyen és mtsai.: Science 111, 1534 {1958)), oly módon, hogy egy humán antitest megfelelő szekvenciáit hipervariábiiis szekvenciákkal helyettesítjük, Ennek megfelelően, az ilyen humanizált antitestek kimére antitestek {id, á 316 567 számú egyesült államokbeli szabadalma leírás), amelyekben az antitest - teljes humán variábilis dcménnél lényegesen kisebb - része van helyettesítve egy nem humán faj; bél szar manó, megf éle ió^ szekvenciával. A gyakorlatban a humanizált antitestek rendszerint olyan humán antitestek, amelyekben a hiperysriábilis régié néhány aminosava - és esetleg a vázrégit (FR) néhány amincsava ~ rágcsálőeredetu antitestek analóg géziéióiból származó szánósavakkal tan helyettesítve.
Az ant.igen.it ás csökkentése szempont iából nagy jelentősége van a humanizált antitestek létrehozására alkalmazandó (nehéz és könnyé láncból származó) humán variábilis derének rvhacnlxKU ... Az ugym \ < z ztt . ό,; Ήη w/arss-' m'OSzar szerint agy rágesálóeredetű antitest variábilis dóménjének szekvenciáját ismert, dumán variábilis dóménak szekvenciáit tartalmazó teljes könyvtárral hasosiitgak Össze. A rágoeáloeredetá szekvenciával legközelebbi egyezést mutató humán szekvenciát a humanizált antitest humán vázrégiójának (FPj ragadjak el (Sima és mtsai.: u. immunoi, 111, Ilii (illír; Chothia és mtsai.. : öl bel. Bioi. 196, 101 (1987)1. Fgy másik módszer szerint az összes - egy bizonyos alcsoportba tartozó könnyű és nehéz láncot tartalmazó - humán antitest köb szén zus - s z a kvenoiág ából s zá rmasö· vá z r ég r ó t a 1 ka Ima zunk, Különböze humanizált antitestek esetében ugyanaz a vázrégió .használható (Cárfez és mtsai.: Proc. Kati. bead. Fez. 9SA
99, 428 5 (1992); Prést a és mtsai.: J. Immunoi. 151, 2 €2 8 (1993) 1.
lényeges továbbá, hogy az antitestek a humanizálást kővetően is megtartsák az antigénre vonatkozó azftoitásukac és egyéb kedvező: biológiai tulajdonságaikat, Ennek érdekében, az <- . ' < .:0--0 . tm a humanizált antitesteket a kiindulási szekvenciák és a különböző lehetséges humanizált termékek - háromdimenziós modellek felhasználásával végzett - analiza^tsat követően állltjuk elő. Az lm η ϊ_..t J ” - ί η ν _ ζ' η > ι e ο . η» en ό . , ~ . + , · - X ·* \ ' ί c Ο ~. ' _SOC ' ·\ . _ Ά Ο^Ρ“.
programok állnak rendelkezésre a kiválasztott lehetséges i mmenglobnlin-s zekvet.c iák valószínű táronó ínén z iós konformációs sttoétűráinsk íllösztrálátása és megjerősítésére, Az igy megjelenitett struktúrák tanulmányozása elősegíti az egyse aminosavaknak a lehetséges immangiobulin-szekvencia működésében betöltött szerepének vizsgálatát, azaz a lehetvac- n'-mky'U i η u' n c \ ' tor; j · >ló aminosavak vizsgálatát- Ezen s módon kiválaszthatók a vázrégió amlnosavai, ás a recipiens és import szekvenciákból úgy kombínálhatók, hogy a kívánt antitestt u 1 aj dón eág o k a t ·( p I.. a c é 1 a n t i g é n (e k > r e v ο n a t ko z ó r o k ο z o 11 affinitásj kapjuk. A komplementáritást meghsrározó régié eminosavai általában közvetlenül és jelentős mértékben játszanak szerepet az entígénfcötés befolyásolásában.
Az 1. példában egy jellemző humanizált anti-.ErbB2 antitest előállítását mutatjuk be. A humanizált antitest, például - humán variábilis nehéz lánc coménbe foglalva nem humán hipervariábilis régióból származó amínosavakat tartalmazhat , továbbá a váz rég lóban - a &1H,< 71.H és 71.H pozíciók kezűi kiválasztott pozícióban ja variábilis bőmének Eabat-féle számozása szerint; ló, Rabat és mtsai.: Segueuees of Proteiné of Immunologieal interest”, 5. kiadás, 'Public Eeaith Service, bationai iostitutes of Health, Herhesda, MD (1991H - szubsztitúciókat is hordozhat. Az egyik megvalósítási mód széfint a humanizált antitest a búb, 71. A és 7111 poci ciok közül, keit eben vagy mindharombah t a r t a 1ma z FR-s zab a zt it üoió t.
A találmány szerinti megoldás érteimében a humanizált antitestek különféle alakjait alkalmazzuk> Például, a konj ngátnmokban humanizált antite s t ként unt 1 t ea t- ira ómen st ,· pl. Fab-fraomenst, vagy más módén, teljes antitestet, pl., teljes igát·· and i te s let a 1 ke Ima zhat u n k.
,. ,i„\? átfess:Az antitestek huna.nlzáiesának alternatíváját jelenti a humán antitestek létrehozása. Például, lehetőség van olyan transzgenikus állatok (pl. egerek) létrehozására amelyek immunizálást követően - endogén immunglobulin“termelődés nélkül - képesek a hunén antitestek teljes repertoáriának termelésére. Például, leírfák, hogy kínéra és osiravonaimutáns egerekben az antitest nehéz lánc kapcsolódási, régiójának (ŰH) génjében bekövetkezett homozigóta deléoió az endogén énéitest-termelődés teljes gátlását eredményezi. A humán osiravonal-eredetu. immuno lobul, in- gének ilyen csira vonal-mutáns egetekbe történő bejuttatása - antigén-stimuius hatására - humán antitestek termeiddését eredményezi fid, pl. áakobövite és másai. ; ?roo. hat). Arad, Sri. USA: őt, 25Ü (1393); Jakobovits és mtsai.: öazure 362, 255 (1393);
Rruggormarn és mtsai.:: lear in Immuné. 7, 33 (1:333); és
591 669; 5 539 369 és 5 545 557 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás),
Más lehetőség szerint, humán antitestek és antitestfragmensek - immun izéiét len donorokból, s ό .'ezé immunglobulln variábilis ívj dómén gének g:én?~re:per?t.o árjából tó ni éné in vitro előállítására a tágon való 'megjelenítési (phageóisplay”) technika (McOafrerty és mtsai.: Natúré 34 8, 532 (1990)5 is siaalnatieto, p módszer szerint az antitest Vdóménjét kódoló géneket fonalas bakteriofág (pl, Ml3 vagy tói nagy vagy kis burokprotein géniével azonos leolvasási fázisban klónozzuk, és a zágrészeoske felületén funkcionális antitest-nragmensekként jelenítjük meg. Mivel a fonalas részecske a fáé genomjának egyszáiú DdS-kopiáját tartalmazza, az antitest funkcionális tulajdonságain a napú tó szelektálás az ilyen fuisjbánságokkal bíró antitestet kódoló gén kiválasztását eredményezi, Ilyenformán, a rág a B-sejt bizonyos sajátságait utánozza, é tágon való megjelenítés különböző forrná turnékban valósitkstő meg; esek. összefoglaló áttekintését id. pl, Johnson ás mtsai.: Current Opinion in Streetarai Bioiogy 3, 554 (1993) 5 . a tágon való megjelenitésre a V -gén-szakaszók különféle forrásai alkaima zhatok, Cineken és mtsai. (Natúré 352, 624 (.13915} immunizált egerek luc ér.származó: V-gének kisméretű rundom kombinatorikus könyvtárából anti-ozazolon antitestek dlverz sorozatát izolálták. Maris: és mtsai. (J, Hol. midi. 222, 581 (1:9915 ] és 1-rif fiit és mtsai. (35130 J, 12, 72 S (1933)] által leint eljárásokkal nt 1 t.~. , 'nn származó V-gének repertoárja hozható létre, és antigének drverz sorozata (beleértve a sajátantigéneket is) elleni antitestek izolálhatók (ló, még 5 585 332 és S 573 905 számi egyesült államokbeli szabadalmi (leírások) ,
A humán antitestek in vntra aktivált B~sejtekkel is
275 számú, egyesült termel tét séták (lő, 5 56 7 ele és 5 22á államokbeli soábadélmi lelt ás} .
A humán antl-EtbBz: antitestek leírását 11 ínteán id. 5 771 997 számú egyeseit államokbeli szabadalmi leírás és hó 97/0Ú271 számú nemzetközi közzétételi irat.
(v) hati_test-£ragmeesek
Az sntitest-fragmensek előállítására különféle technikákat reilesztettek ki. Izek a fragmensek hagyományosan Intakt antitestek proteoiltikus emésztésével hozhatók létre (ló.. Horimöto és mtsai.: Journal of r' onm,. 3 , Flophysicai Hethods 24, 107 (19910; és Bronzán és mtsai.í ocience 229, 81 0.925}j, azonban ezek a fragmensek rekombrnáns gazda.sejtek alkalmazásával közvetlenül Is előáll irha lók, Példád, az antitest~fragmeraek a fentebb leírt antitest íáy~könyvtárakból izolálhatok, Hás módon, a Fabz~ SH fragmensek A. coli-bél közvetlenül kinyerhetők, és kémiai kapcsolással F (art d-£ragmeneekké alakíthatók (Carter és mtsai,; Big/Technology 10, 167 Fii díj. így másik lehetőség szerint az F(ad d-fragmensek közvetlenül rekombinárs gazda sejt-tenyészetből 1 adélhat ők. Az art it est -- fragmensek előállításának egyéb technikái szakember számára jői ismertek. Hás megvalósítási módokban a kiválasztott antitest egylánoú Fv-fragmens (seFvd Id, hó 95/1718 5 számú nemzetközi közzétételi irat; valamint 5 ö7l 391 és 5 537 553 száma egyesült államokbeli szabadalmi leírás. Az antitestfragmens lehet lineáris antitest” is (id.., pl. 5 35 1 870 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás;, A lineáris antitest-íragmensek monospeoi.f i kásák vagy bispeeitikosak letetnek„ <yi| Elapad fika s ...a n fc i t estek.
A bispecifikus antitestek olyan antitestek, amelyek legalább kát különböző epifőpra specifikusak, A jellemző bispeciflkom antitestek az ErbBo-prolein két különböző epltópjához képesek kötődni, kiás bispecifikus antitestekben 32 ERPB2 kötőhelyet SSFR-t, Ero33-af és/vagy Erb34~et megkötő kötőhellyel van kombinálva. Eás módon, egy Eresz-1 megkötő kar olyan antitest-karral kombinálható, amely lenkocitán lévő tngger-molekulához - pl. T-sejt-receptor molekulához (pl. öli vagy oE3j vagy IgG Fc-receptorához tEeyRl , pl. ΕογΕ.1 ;2Β64;, ΕογΒΙΙ (CB32; és ReyRIU (CDI 6). kötődik, miáltal a teliülát.Is védekező mechanizmus az ErbB2~t termelő: sejtre összpontosithatő. A nispecifirus antitestek arra is aikálmazhatók, hogy a oitotoxikus hatóanyagokat az ErbB2-f termeld sejtekre lokalizáljuk. A 'WO 96/16673 számú nemzetközi közzététéli iratban bispecifikus anti.-RPbR2/anti-EcyRlll antitestet, az S 337 234 számú egyeseit államokbeli szabadalmi leírásban bispecifikus ancz-SroBz/antl-Fc/Bl antitestet tártak fel. A bispecifikus atti-EröBz/Fo antitestet a dó 96/02463 számú nemzetközi közzétételi u.mca 3' , < , k. . dl ' mám de államokbeli szabadalmi leírásban bispecifikus antiűrből/anti-CDd antitestet tártak fel.
A bispecj *r anti testek előáll itásl. eljár! sah szakember szamára jól ismertek. A teljes hosszúságú hisgecifikus . z> + z~.~< V - -v v immunglobulin nehéz láne/könnyű lánc pár együttes eépresszáitatásán alapul (a két lánc különböző speolfitású; biiistein és mtsai.: betűre 305, 51? (1983)). Az immunglobulin nehéz és könnyű láncainak véletlenszerű választéka miatt e héfcriöőmák (kvebrömákj potenciálisan tíz különböző antitest-molekuia elegyet termelik, melyek közül csupán egy rendelkezi κ a: megfelelő hispéci zikus szerkezei tel. A negíelelő· molekula - általában aífinítási krcmatugráriával végzett - tisztítása igen munkaigényes, és a kitermelési százaléka alacsony. Hasonló eljárások leírását Illetően 14, a WO 93/08829 számú nemzetközi közzétételi iratot, valamint
Trauneokér és mtsai.: EbSö ő. 10, 3355 illái).
Egy másik lehetőség szerint az antitestek kívánt kötési speolfitású variábilis doménjeít (antitest-antigén kombináléuési helyek) Immunglobulin konstans dómén szekvenciáihoz fuzionáljuk. A fúziót előnyösen egy immunglobulin nehéz lánc konstans doménjével valósítjuk meg, amely legalább a csukló- (’lhlnge’lí, CH2- és CH3~régíö részét tartalmazza. Előnyös, ha a konstans dómén tartalmazza - a könnyű lánchoz történő kötődéshez szükséges helyet magában foglaló - első nehéz lánc konstans régiöt jöHlb. Az lim:vunglebuiiu nehéz lánc fúziókat; - és kívánt esetben az immunglobulin nehéz láncot - kódoló DdS-eket külön enpressziős vektorokba ínszertáljuk, es \é ut - e /'sn-musha transzfektáljuk. Ez nagy rugalmasságot biztosít a hés' .-Λ rom poüpeptid relatív arányának beáll! fásában «· szón meg'valósítási módokban, ahol az oprimáils hozam elérése érdekében a konstrukcióban a három, különböző polipeptld-iánoot nem azonos erényekben azkaÍrattuk, Mzndssoaáifcal, lehetőség van arra is, hogy két vagy mindhárom pclípeptid-iáno köde lösze kvenciá ját egyazon expressz 1ős vektorba iuszertáljuk (olyan esetekben, ha legalább két poiipaptlolánc azonos aranyban történő expressztej a eredményezi a nagy hozamot vagy ha a láncok relatív arányának nincs külön b s ebb jele n t ö s é g e.
B megoldás egy előnyös megvalósítási módja értelmében a brspécit!kas antitestek - az egyik karon - hibrid immunglobulin nehéz láncból (első kötő~specititás) és - a. másik karon - egy hibrid immanglohul in nehéz láno/könnyű lánc párból (második kötö-specifitást biztosiévá) állnak. Azt találtuk, hogy ez az ásszá.metrikus struktúra elősegíti a kivént bispecilikas VéyyÜlet nem kívánatos immunglobuliniánckombinécrőktcl történd elválasztását, mivel az immung lob.,1 in könnyű láncnak, a bispecifikus zíólekuie csupán egyik felében való jelenléte egyszerű elkülönítése, tesz iehetővé. ΰ megoldás leírását id. a bő dl/11ISI számú nemzetközi közzétételi iratot. A bisneciflkuz antitestek előállításénak további részleteit illetően iö, pi. Sorosa és mtsai.: kethoös in Szzymoiogy 121, 210 (1986;.
Agy másik megoldás (lob 5 731 163 számú egyesült államokbeli szabadalmi iairás) szerint a reköhblnáns sejttenyészetből. kinyerhető heterodimerek százalékos arányának maximalizálása érdekében antitest-molekula pár közötti határiéiüiet alakítható ki. Az előnyős határfelület egy antitest konstans dóménje Ckl-domén j ének legalább egy részét tartalmazza. Az eljárás során az első antitest-molekula határfelületéből egy vagy több kisméretű aminosav-oldailáncot nagyobb oldal lánooa.i (pl. társz in vagy triptofán) helyettesitünk, A második antitest-molekula határfelületén a nagy oldaláncíok)éval azonos vagy hasonló méretű kompenzáló
“üregeket hozhatunk létre, oly módon. hogy a nagyobb ami -
nosav-oldalláncúzen kisebbekre (pl alaninrs vagy
t remin sej cseréljük. bz a mechanizmus a hét erőd mer jobb
ho zenét b i z t o altja < a nem kívánatos végtermé kelhez, pl.
lomod Ímer a kh e z v í s z ony I1 va) .:
A blspecilikus antitestek antiteet-fraomensekből tör.....
fenő előállításának technikái a szakirodalomból szintén jól ismertek, beidéül, a bispecitikus antitestek előállíthatok kémiai kapcsolás alkalmazásával, Brennan és mtsal. (Science .223, 31 (iaűöh] eljárásában az intakt antitesteket proftelitikusan emésztve F(abd 2~fragmenseket hoznak tétre, majd ezeket a Iragmenseket - a vicinális dirroiok stabilizálása és az intarmolekulárie dlszuiízd-kepzőöés megakadályozása érdekében ditiol. komoiexalő ágens (natriam-arzenit} jelenlétében redukálják. Az Így kapott Fab'-r ragmen.se két tio-nitrobensoát (TbS) származékokká alakítják, majd az Fab-The s zá rmazékok egyikét mer kap f o- e 11..1 aminnal vég z e 1t redukcióval visszaiakl.t jak Fab-' -tioilá, és azt a másik Fsb'-TüB származék ekvimoláris mennyiségével elegyítik, miáltal, a blspecilikus antitesthez j utnak. Az íny létrehozott bispecirikos antitestek enzimek szelektív immobilizslásara a 1. ka 1 ma z n a tő k.
Az utóbbi években lehetővé vált a Fan’-SÍ fragmensok A, ítéli sejtekből történő közvetlen kinyerése. 1 fragmensok kémiai kapcsolásával bispecif ikus: antitestek koztatok létre. Sha 1 aby és mtsai, tik Ext, led, 115, 217 {1992)i téltesén humanizált bispecif iksas antitest ltfl molekula előáliisását tárták tel , Mindként Fabf-íragmenst küicn-küiön A. coli-var termeltették, és a bispeoiiikus antitestet irányított in emu kémiai, kapcsolásra'1 hocták létre. Az általuk elosIlihóit bi specif ikus: antilést BphSá-receptőrt túlzott zéunyi esőben termeié ségtekhex és normál humán 1Séjtékhez képes kötődni, és képes kiváltani a humán cltotoxikns limfooiták humán emlötumor sejtek elleni
111ékes aktivíleset,
A bispeoi íikus; antitestek fragmenseinek közvetlenül rekcmbínáns sejttényészétékben történő előállítására ép izolálására különzelé eljárásokét tártak fel. Például, Kcstelcy és mtsai. (<J. Immunoi. 149 (5), 1547 elhull e ső im -ϊ! ο 1 p z á. r a k * a 1 ka. imá t Isi va i Pá s p e c1f i ku s aa 111 e a t e k e t
-1,..-, ' A oe '. mm -> . . ír , acipzár peptideket génfűzió alkalmazásával k-át különböző antitest. Fatl -fragmenséhsz kapcsolták. Az antitestközműi ne re kéz a csukló-régiónál redukálva monomereket kaptak, majd ezekét visszaoxidálva antitest-héterodimereket hoztak létre. Ez az eljárás antitest-ho.modimerek előállítására is alkalmazható, A holdingét és mtsai. ftroo. háti. Acad, Sói, ISA 90, 6444 )1993)] ádtal feltárt diatest t-»- ii j x. ^spoo-t mm . zst rrasm . „„,η t - - .
alternatív mechanizmusát reprezentálja, Az ilyen fragmensek egy nehéz lánc variábilis domént (¾) egy könnyű lánc variábilis doménhez (¾) kapcsolva tartalmaznak, olyan kapcsalöszekvencián keresztül, amely túl rövid ahhoz, hogy az ugyanazon láncon levő két dómén között psrosooás következzen he.. Ennek megfelelően, az egyik fragmens V5Í~ és ¥v~ doménje kényszerítve van, hogy a másik fraomensen lévő komplementer νδ- es VH~áomenu.ei alkosson párt, miáltal két antigénkötő: hely képződik. A bispeci tikos antitestfragmensek előállításának egy másik, egyiéhoú Ev-őimersk alkalmazásén alapuló módszerét őruöer és mtsai. tárták fel p. Immunoi. 152, 51Ő3 {1914)1.
A kettőnél, több értékű antitestek szintén a relé leány tárgyához tartoznak, Például, előáliithatők zrispecifikns antitestek is fid. luft és mtsai.:' J, Immunoi. 14 7 # 6ö {1221}) .
(vili Egyéb aminosav-szekvenci.a módosítások
A következőkben a találmány szerinti anti-brbBz antitestek amlnomav-szekvencia módosításait ismertetjük.. Például, kívánatos lehet az antitest kötési affinitásának és/vagy egyéb biológiai tulajdonsága znak javítása. Az antiErdői antitest aminosav-szekvencia változatait úgy hozhatjuk létre, hogy az anti-ErőSi antitestet kódoló nukleinsavha megfelelő nekleotid-mődositésokat iktatunk be, vagy más módon, peptidszinfézist hajtunk végre. Az ilyen módosítások, közé tartoznak az anti-Erbüz antitest aminosavszekvenciáját érintő deléciők éshvrgy ínszerciók és/vagy szubsztitúciók. A végső konstrukoié létrehozásé céljából a délászok, ínszerei.ók és szebsztitácíók bármely kombinációja alkalmazhat6, feltéve. Hogy a végtermék, a kívánt tulajdonságokkal brr. Az aminosav-válfozatatásók módosíthatjak az anir~ErbB2 antitest poszt--transzlációs érési folyamatait is ipi. a giikoziiáoios helyek számának vagy pozíciójának változtatásával ) <
Az anti~ErbB2 antitest - mutagenezis heiyszineként előnyös - amlnosavai. vagy régiói, azonosításának egyik hasznos eljárása az: ”ale.ni.n~pásztázási. mutagenezis néven ismert te<lc k.„ (Cunningham és Wells: Science 244, 1081 (1989)j. Ezen eljárás szerint azonosítunk egy aninosavst vagy céiamincsavak csoportját (pl, töltéssel bíró ami.nosavek, ti. Arg, Asp, His, lys és Glu), és ez(ekeit semleges vagy negatív töltésű aminossvval (legelőnyösebben alanínnal vagy polialaninnal) helyettesítjök, abból a óéiból, hogy befolyásoljuk az aminosavak és az ErbB2-antigén közötti kölcsönhatást. A szubsztitúcióra: futkerónál is érzékenységet matató amínosav-poziélők meghatározását ezután úgy finomíthatjuk, hogy a szubsztitúció helyén vagy annak közelében újabb vagy egyéb mutációkat hozunk létre. Ilyenformán, bár az amínosav-módősitások helye előre meghatározott, a mutáció természete -önmagában nem előre meghatározott. Például, az adott helyen végrehajtott mutáció eredményének vizsgálata céljából a célkodonnái vagy cé.lrég lóban élanihpásztázási vagy ráncom mutage.cezisc végeink, és ez szeresseki1 anti-Erbbz antitest-változatokat a kívánt akti.vitásra szelektáljuk.
Az aminosav-szekvemcia inszeroíói lehatnék 1- és/vagy C-terminális fúziók, amelyek egy amlnossvtöi száz vagy még több amá.nosav hosszúságig terjedő poiibeptid amímoaavssérvénóiénoz történő hozzákapcsolását jelem tik, illetve egy vagy több amincsavas, szekvenciám belüli inszerciék lehetnek. A terminális luszeroiák példái közé tartoznak az N~ terminális met.zonínt tartalmszö antí-lrból antitestek, -a citotomíkns polipeptidhez. fuzionált antitestek, továbbá az anti-Erbll antitest h~ víz C~terminálisának enzimhez (pl, ADI/uh vagy olyan polipeptidhez történő fuzionáltatása, amely fokozza az anzagonisra vérsavóban mérhető felezési idei ét,
Az amihosav-szekvemcia változatok egy másik típusát reprezentálják az amimosav-szubsztitúcibs változatok, amelyek az snfi-ErfoBl antitest-molekula .Legalább egy arninosava helyett m «.c íj . / tc-i.'' 'Ά ''v szubsztitúción mutagénezisének legnagyobb jelentőségű pontjai a üipervariábilis régiók, de a vázrégióban végrehajtott szubsztttúctők is jelentős hatásúak lehetnek. A. konzervatív szubsztitúciókat az '1. táblázat előnyős szubsztitúciók” oszlopában mutatjuk be. ha ezek a helyettesítések a biológiai aktivitás megváltozását sreőményezlk. Így további, jelentősebb szunsztitúeiós módosításokat végezhetőnk, melyeket az 1. táblázat ”lehetséges szubsztitúciók oszlopéban {illetve, később, az aminostvak csoportosítása kapcsán; matatunk be, és az így .létrehozott változatokat széleit áljuk.
1. táblázat
Eredeti amínosav bobot séges a zabon ti tód ók Előnyös szubsztitúciók
in ·,Α; Fal, Len, He Fal.
Azg jő) bys, Gin, Aon bys
Asn it} Sin, Hzs, Asp, iys, Arg G.i A
Asg Írj Ha, asm Cin
Cos (Ci Sor, Aia Sor
G.Í.A (G / Asn, Sla Asn
fis i'jj Ásó,, eln Asp
a Ív H? Alá -ÁM
Hia inj ,ΑίόΠ. ? bt Lys < Arg
He jij boa. Fal, Met, Ara, Ebe. sörteóoia Lep :
len fij borioacin, Ho, Fai, bet, Alá, Ebe He
Eys (Ej Arg, Cin, Asm Arg
Bt íMj tea, éhe, rio iiSS
Fhe (F) Lén, Fai, He, Aie, lyr Tyr
Arc (Íj Alá Aie
Sor IS} tor Túr
ctr m Ser Se r
7rp (bí Tyr, Fho Tyr
lyr m Trg, Ebe, Fht, Ser E'.ne
Fal (F) 1 He, ben, bet, tóé, Alá, norieucin .. <£· -
Az antitestek biológiai tulajdonságai szempont jóból lényeges módosítások úgy valósíthatók meg, hogy kiválaszttok azokat a szubsztitúciókat, amelyek a következők tekintetében jelentős mértékben különböznek az eredeti aminosavtöt:: (aj a szubsztitúció kőtelében a pol.icepzio-váz szerkezetének fenntartásában (pl. redős vagy helikálie konformáció); (b; a molekula óéibeiyen a töltés és hicrofébirás fenntartásában; vagy (o) az oldallánc fizikai kitérj ebesének fenntartásában. A természetben előforduló aminosavakat
- cldaiiáttaik tulajdonságai alapján - a következő escportokra soroljuk;
(Íj h.idrofőb: hőt.lécben, bek, Alá., Wif ken, Xle?
(2) semleges, hidrofil; Cys, Ser, l'hr;
(3; savas: A.sp, Gin;
(éj baziscs: Asz, Gin, His, Lys, Arg;
(5j lánoorientáelőt befolyásoló amínosevak; Gly, Pro;
(S# aromás: Trp, Tyr, Phe.
A nem. konzervatív szubsztitúció azt jelenti, hogy az egyik csoportba tartozó aminosav egy másik csoportba, tartozó aminosavval van helyettesítve.
Az anti-Xrb.8 antitest pontos konformációjának fenntartásában szerepet nem játszó tiszteinek szintén helyettesíthetők (éitaiáoan szarinnel) , am.i növeli a. molekula oxidativ stabiietását, es megakadályozza a rendel lenes keresztkötésképzést, Ezzel szemben, az antitest stabilitásának nevelése érdekében (különösen olyan esetekben, ha az antagonista egy antitest-fragmens, pl. Fv-fragmehsi oisttein-kcfesek iktathatök be,
A szabszhí tudós váltótárok egy különösen előnyös tipasa: az eredeti antitest hipervariábiiis régiója egy vagy több aminosavánsk szubsztitúcióját foglalják magukban. A további javífáéra kiválasztott váltósat<ok) az eredeti ácsi testhez képest j avított biológiai tc.l újdonságának) leszdnek) . Az ilyen szubsztitúcíös változatok létrehozásának egyik alkalmas módja a fágfeluleten történő megjelenitestei végzett affinitás-fejlesztés. Röviden összefoglalva; a hípervariábiiis régió több helyén (pl. 6-7 helyen) mát «genezist', végzünk, hogy mindegyik helyen valamennyi lehetséges amlnosav-szubszts.thóiét iétréhozzuk. Az így kapott antitest-változatokat külön.....külön f fonalas fágrészeos keket az H13 - fágrészecskékbe osomag'öit - XII. géntermékével képzett fúzióé proteinekként jelenítjük meg. A tágon megjelenített változatokat biológiai aktivitásukra (pl. kötési altinitásukra) teszteljük, A hipervariábíiis régió módosításra alkalmas helyeinek azonosítása téijábői aiauínpásztázási matagenezist végezhetünk, amellyel meghatárazható, hogy a hipervaríábiii.s régió mely aninesavei járulnak hozza az antigénkötéshez, hás módon, vagy e mellett, az antitest és az antigén közötti érintkezési pontok azonosítása céljából előnyös lehet ez antigén-antitest kompién kristályszerkezetének vizsgálata. Az. ilyen érintkezési (kontakt) aminosavak és ez ezekkel szomszédos aminosavak a szóban forgó technokéval végzett szcbsztltúcióra kiszemelt az ......?s« ·*η,. no.Az ilyen változatok létrehosása után a változatos sorozatút az itt ismertetett módon azkrineijük, és további fejlesztésre az egy vagy több releváns tesztben: kimagasló iulajógnaágsnak bigonyalö antikétleket választ tok, ki .
Ά találmány szerinti antitestet effektor-fankciója voaat sózáséban is modosithatjuk, pl, antigén-dependess sejtközvetifette citotnxiclkásának (ADCC; és/vagy kompiément--depót, cens citctoxioltásának (CSC) növelése céljából, F. ,.Ο' %’> az ant>agonista antitest Fo~ régiójába egy vagy több aminosav-szubsztitócíőt iktatónk be. Más módon., vagy ezen felül, az In-régióba tisztein (ek) építhető(k) ne, ami e régióban lehetővé teszi, a láncok kő;rrv e tts. ο ” — antitest javított internálizácies képességű és/vagy fokozott mértékű komplement --'közvetítette sej tpusztatást és antitsst-bependens ceiialáris öltötozicitást (AöCC; fejt ki [Id. Cáron és mtsai.; 1. Exp. Mao. 176, 1191 (1992); és Sbopes; öl Immunoi. 143, 2213 11992)1. bolti é.e mtsai. [Canoer kesearoh 53, 2SSÖ (1933)1 leírása szerint, hetefödifankoiós keresztkőtésk :rrők alkalmazásával, megnövelt tamorellenes aktivitásó homodimer antitestek is előállíthatok. Más módon, kifejiészt (ml luk olyan antitestet, amely két Fo—régiót tartalmaz, ezáltal fokozott mértékű komplement l.Izlst és AbCC-akt ivitást matat [id. Stevenson. és mtsai,; .énti-Cánoertbrhg: Design 3, 212 ()1939)]..
Az antitest vérsavöban mért felezési idegének növelése céljából az antitestbe (előnyösen antitest-fragnensbe) mentoreceptor-kötő epitopot (Fsalvage receptor minding epitope; Id. í. „ g ::c,._z c- sza babalmi leírás; iktathatunk be, A mertöreoepfor-kötő epitóp kifejezésen egy Igd-molekula (pl, Igtó, igib, rgGy
- tg vagy igö-a? Ec-régiOjának olyan epitopjat értjük, amely az IgG-moleku.is in vivő felezési idejének neveléséért felelős.
(vili) Gllfcozliáölös„változatok
Az antitestek konstans régióik konzervált pozícióiban vannak ciikozilálva [Jefferis és Lund: Chem. Immunoi. 65 El (1997); tSright és forr1som TibTECH 15, 26 (1997)}. imm un g l óé n 1 1 no k ο I lg e s za oka r id - o I da 11 á ne a 1 be f o .1 y á so 1 i á k a protein működését (Boyd és mtsai.: Moi, immunoi. 32, 1311 (1996); El ét ve és üouardi: Biochem. 29, 9175 (1990)1 és a giikoprotein egyes részel közötti intramolekuláris interakciókat, ami hatással van a giikoprotein konformációiára és háromdimenziós felszínére ÍHefferis és lnne, id, fentebb; Nyes és Wghet; Eurrent Epin. Biotsok. 7, été ilSBöjfh. á.z oiigoszachariook - specifikus felismerési struktúrák réven - egy adott grikoptötein bizonyos more aulákhoz történő eólbajuttacasát is szolgálhatták. iáidéul, beszámoltak arról, hogy ga lakt.ozí iáié t lan IgG-mole kul ában az ollgoszacharid-gyök kiugrik a EE-kozi térből, és a terminális N~acelii~gIükÖzamio gyökök hozzáférhet övé válnak a mannözkötö proteinhez történő kapcsolódásra [Maihotra és mtsai.; Natúré Med. lf 237 (1995hk. Ά kínai hörcsög petefészek-ssj tekben (CHO-sejtek) termeltetett CAMEATh-lHmolekulából (amely a humán limtooiták EEu52-antigénjét felismerő rekombináns, humanizált egéreredetű monokionáiis IgGl-antitesti az oitgoszaoharidok giikopeptidázzal végzett eltávolítása a komplement-közveti. tét te lisls (CbCij tettes gátlását eredményezte (Boyd és mtsai.: Mól, Immunoi. 32,
1311 (1936) ), zúg a sziáisav-gycköK neuram.inidázzal végzett szelektív eifévűirtása a cMCL-ben nem okozott csökkenést.
Leírták továbbáf hogy az antitestek giikcziiációja hatással van az antlv.es t-dependens oeilcléris citotoxi olt ásva (ADCC) < Közelebbről, bmana és mtsai. (Matere Biotech. 17, 176 (1999)) leírták, hegy azok a CKO-sejtek, amelyekben a ί (1,4) -h-acetii-giükózamínii-transzferáz~lll (SnTXII, amely az elágazd GIcKAc képződéséi katalizáló glikoziltransztaráz) tatraorki ín-vezéreite termelődése figyelhető meg, javított ADCC-aktivatássál bírnak.
A poiipeptidek g.li közi rációja jellemzően K- vagy 0kdtésü lehet. Az X-kötésű, girkoziláoio azt jelenti, hogy a szénhidrát-gyök egy aszparagin oldalláncúhoz kötődik, A sző n hl d r á t - gy ö k a s zpa r ági n - o l.dal Ián c he z tő r t é n ő e n z ima ti k u a kapcsolásának felismerési helyéül az a.szparagin-X-szerin és a s z p a r a g in -X -1 neon in t r i pop t 1 d- s z e kvenc 1 á k (emel vekben X jelentése: tetszőleges smincsav, a prolin kivételével) szolgálnak. Ilyenformán, a polipeptidekben az ilyen tripeptid—szekvenciák jelenléte potenciái is glikoziiáeiős helyet teremt. Az O-köfésn gliköziiácíő azt jelenti, hogy az N-aoetii-galaktőzamin, gaiaktőz vagy xilcz valamelyike nidrrx ·<:? rvel/ yre a. -v , Λη vagy treonrnhez) kötődik, Pár 5-hidroxiproiin vagy 5-hidrorliizln is alkalmazható.
Az antitestek giikoziióciős változatai olyan változatok, amelyek g). i kozz lóerős mintázata módosítva van, A módosításon az antitest egy vagy több szénhidrát-gyökének eitáAö volitását, egy vagy több szénhidrát-gyök beiktatását, a glákövilácids mintázat megváltoztatásáé, a gliköziiáitság mértékének megváltoztatását és hasonlókat értünk.
A giikoziiáciős helyek artagonistába történő beiktatása oly módon hajtható végre, hogy ~ A-kötésü giikoziiáolő eseten - a polinézeid a fenti tripeptid-szekvenciák közül egyet vagy többet tartalmazzon, illetve ~ O-kdtésü gilkozilaciő eseten - a giikoziiáciős helyek egy vagy több szerin vagy treonin addicióiávai vagy beheiyettesivesével hozhatók létre, fíasonioan, a ölikoziláoiős helyek eltávolítása az antitest natív giikoziiáciős helyein belüli aminos av -mődo sírással hajtható: végre.
Az amlnosav-szekvencíákat rendszerint az azokat kódoló nukleinéav-szekvenciák megváltóétapásával módosítjuk. Az anti-Erőit antitest amisósav-szetvencla változatait kóaoic n _c * ---- , \ Λ tz r < < /láthatók elő. Az ilyen eljárások köré tervezik, többek között, a természetes forrásból történő izolálás (természetben előforduló amlnesav-szekvenöia változat esetében), valamint az anti-ErőBO antitest korábban előállított változatának - vagy változatnak nem minősithető a la <” svak óligonokleot id~közvetít ette (vagy helyspécifikus} műtagenezisével, BCB-mmtagenezisével vagy kezezza-nntay-, el végzett e1Ős11it a s.
Az antitestek glikozíláctöia [ideértve a giikoziiáciős miniázatotí az aminoaav-szekvencia vagy az azt kódoló nuki/éőfiddteivenoíá mőőösltása séiköl is menmáltöitathatő:.: A glikovriáoíö nagymértékben függ az anr.iv.est termeltetésére alkalmazott gazöasejttői. Mivel a rekombi·<áus ciikoprsteinek (pl. antitestek), mint potenciális gyógyszerek termeltetésére használt, sejttípus ritkán azonos a natív sejttel, az antitestek q 1 lkot i iáit sági mintázatáoan jelentős változások várhatók (ld. pl. őse és mtsai, : 31 Siói. Chem. 272, 3362 (1997)) . Az antitestek, glikűziiáodöját a rekombináns technikák alkalmazásával végzett termeltetés során befolyásoló tényezők közé tartozik - a gazdaeejtek kiválasztásán túl - a sej iszapotitás módja, a tápközeg őszszótáraié, a tenyészet sejtsürúsége, önígéneiiátottsága, pü-ja, továbbá a tisztítási sémák és hasonlók. Agy adott gazdaszervezetben megvaiőenlo glikozt._s 'k? mintázat módosítására különböző eljárásokat dolgoztak ki; ilyen módszer, például, az oiigoszacharíd-termeiésben szerepet játszó bizonyos enzimek bejuttatása vagy túltermelése Cid, 5 041 335; 5 510 261 és 5 216 239 számé egyesült államokbeli szabadalmi ieirásokb- A giíkoproteinek giiköziláltsága (vagy bizonyos típusú glikoriiáitsága; enzimazíkus ütőn pl, endogii kosidáz-H (Endo-üj alkalmazd savai - megszüntethető, Más módon, a rekombináns gazdasejt genetikailag úgy manipulálható, hogy bizonyos típusú poiiszacharidok feldolgozáséban (proeessing-jében) defektust hordozzon. Az ilyen és hasonló technikák szakember számára jól Ismertek.
Az antitestek giikozirániba struktúrája szokványos v t.mn.r.b.-mtv.t'ní mo Ss <r'%. 1 (pl. iektin--kromatográfia,f MMA, tomegspektromstría, HALC, GrC, monoszam; .z-össz ttetel analízis, szekvenciális enzimatikus emésztés és HL-AEC-PAl, melynek során az ollgoszaoharÍrnokok töltés szerinti elválasztására nagy ohjé: ani.oncssréiő kromafográfiát alkalmazunk. Az ο 1 i g os z a ch a r í.do k a na 1 i t.1. ka .·. cé 1 r a t ö rt έnd f el s zaba.d.í ta a i technikái szintén jól ismertek, így például, többek között, az anzimatikus kezelés (szokváryosan peptid-b-glíkozidázF/endo-ú-gaiaktozíoáz alkainazásával végrehajtva); az erősen lúgos feltételek alkalmazáséval végzett elimináció (többnyire ö-kőtésű struktúrák felszabadóhasára); valamint vízmentes hidrazin alkalmazásával végzett kémiai módszerek (K~ és 0-kötésű oiígoszacharidok felszabadítására).
(íz) Kívánt tulajdonságú antitestek szelektálása.
áz antitestek előállítási módszerélet a fentiekben tárgyaltuk. Kivárt esetben az antitesteket bizonyos ciciίρι <:oi tulajdórSágokra szeloltálhaíjuk.
zéidáui, a sejtszaporodást gátló anti~Ero32 artátestek azonosítása cetjéből olyan antitesteket szelektálhatunk, amelyek az BrbB2~receptort túlzott mértékben termelő ráksejtek szaporodását gátolják. Az egyik megvalósítási mód szerint a. kiválasztott, sejíszaoorodást gátló antitest sej tzc-yeszstoen, kb. ö,5-30 ug/ml koncentrációnál kb. ΙΟΙ öö %-bar, előnyösen ko. 5(1-110 i-ban gátolja az SK-BR-3sejtek szaporodását... Az ilyen antitestek azonosítására az 5 6117· 111 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban < . Ot E~ Zí. i -.\>a· η. Π-2Κ
3-sejt.eket - 1,0 % magzati borjúszérummal, gíutaminrai és penicillinnel, sztreptomocinnei kiegészített - 1:1 arányú
Elz/oMEM-táoközegben tenyésztjük, majd a sejteket 35 mn-es sejttenyésztö csészébe széieaztjük (20 000 sejt,/? ml) , A csészéhez 0,5-30 μο antf-Erb52 antitestet adunk, majd hat nap elteltével a sejtek számét - a kezeletlen sejtek számához viszonyítva - elektronikus COülTEE sejtszámláiéval határozzuk meg. Az SK-8E-3-sejfcek szaporodását kfo. 20-100 íben vagy kb. 50-100 5-ban gátoló antitesteket szaporodászó4· ' = a ’ ' n' 'tt''·': .
A. sejthalált indokaié antitestek szelektálása céljából a sejtmembrán épségének csökkenését - propidium-jodid (Pl; , trypan-kék vagy 7AAD felvétele alapján - kontroll sejtekéhez viszonyítva értékeljük, Előnyösen S247 4-sej tel alkalmazásával végzett 21-felveteii tesztet végzünk. S teszt során 37474-sejteker (American Type Culture Coliection, Eockvilie, hűl üulbecco-féle módosított Ságle-tápközeg ;DAEib és Ham-iéle fiz-tápközeg 1:1 arányi - 15 % 'hőina kt Ívéit magzati bor jászé rummal (IBS. Kyoione) és 2 mM h-glutaminnal kiegészített; eiegyében tenyésztjük (Így a fesztet komplement és iamun-effektor sejtek hiányéban végezzük) . A 37474-sejkeket 100 z 30 mm-es csészékben, csészén ként 3 x Ízű sejt mennyiségben helyezzük el, és egy éjszakán át hagyjuk letapadni, Ezután a tápkőzegef eltávolítjuk és friss tápk.Ozeggei vagy a megfelelő monoklonális antitest 10 g/mi-ét tartalmazó tápkdzeggel helyettesrejuk. h sejteket három, napig inkubáljuk. Az egyes kezelések után az egyrétegű sej ttenyészeteket foszfátpuffereit sóoidatlal (PBS/ mossuk és tripszines kezeléssel leválasztjuk a csészék faláról, Ezt kővetően a sejteket 4 ®ú-o.n 1200;-as peroenkéntí fordulatszámmal 5 percig centrifugáljuk, a sédül adókat 3 mi jéghideg Ca''’-kötö pufférben (iö mM iE/iti pH ~ 7,4; 140 ti bail; 2,5 cl Cail;?; újraszuszpendáijuk, és a sejtcsomók eltávolítása érdekében 35 mm-es szűrővel lezárt 12 x 75-ös kémcsövekbe szórt orozzak (kémcsövenként 1 ml; kezelési csuportónként 3 kémcső;. A kémcsövekbe ezután propidinm-jetidet IPX; 10 g/mi) adunk. A mintákat BACSCAh áramlási cltométor és FACSCOhVöRT oell.Quest szoftver (Becton pickinson) alkalmazásával vizsgáljuk, A Pi-fezvélel alapján statisztikailag szignifikáns szintű sejthalált indukáló antitesteket sejthalál/ indukáló antitestekként azonosítjuk.
Az apoptózist indukáló antitestek szelektálása céljából. - BT4?é-sejtek alkalmazásával - annexin-kötési tesztet végezhetünk. A 3T474-sejteket az előző bakazdesben leírtak szerint tenyésztjük és oltjuk csészékbe, A tápkozeget ezután eltávolítjuk, majd friss' /ápköreggei vagy a megfelelő monoklonális antitest 10 g/ml-ét tartalmazó tápkozeggei helyettesit júr, Három napos inkubáiás után az egyrétegű sejttenyészeteket foszfátpuffarait sóoldattal (PBS) mossuk és tripszinss kezeléssel leválasztjuk a csészék faláról. Ezt követően a sejteket centrifugáljuk, Ca:-köcő pafzerben újraszuszpendáijukz és a fentebb leírtak szerint kémcsövekbe szortírozzuk. A kémcsövekbe ezután jelölt anneklnt (pl, annexen V-FTiC; 1 ug/mll adunk, A mintákat PACSCAd áramlási cl tómé tér és AACSCöWőBl CeiiQuest szoftver ; Bestén Diokinson) alkalmazásával vizsgáljuk. A kontrolihoz képest statisztikailag szignifikáns szintű annexin-kbtődést inda- ti káló antitestekei apoptbzlst indukáló antitestekként azonosítjuk.
Az annexln-kötési teszten kívül B?á?l-sejtek alkalmazásával végzett EdS-testésí tesztek Is végezhetünk,. g; teszthez az előző két bekezdésében leírtak szerint a kérdéses antitesttel kezelt BT474-sejteket .9 pg/ml HOECHST 33342-vel 37 cC-en két óra hosszat kezeltük, majd BB1CB ILIIÉ áramlási citométerrel. bioultér Corporation), MÓDÉIT 1T szoftver íVerity Software House) alkalmazásával analizáltuk. B teszt aikaimazásávai az apopfözísgs sejtek százalékos arányában - a kezeletlen sejtekhez képest - kétszeres vagy nagyobb (előnyösen háromszoros vagy nagyobb) változást (az apoptözisos sejtek egészen 1B0 %-áíg) indukáló ad ' esteket pro-apoptózisos antítestekként azonosátj uk.
Az SrbB-rsoeptor iigandum: általi aktiválását blokkold antitestek azonosítása céljából az antitestek azon képességét értékeljük, hogy blokkoljak-e az ErbB-ligandum - BrbBreeepéort (pl, egy másik ErbS-receytorrai konjugatva, amely a kérdéses BrdB-reoeptorral ErbB hetero-cl.lgomert képez) termelő - sejtekhez történő kötődését. Például, az ErbB betero-oll.gomer ErbB-receptorait eredetileg is termelő vagy annak termelése céljából transzfektáit - sejteket az antitesttel Inkuhálunt. majd jeléit SrbB-lroandumraal érintkezeztünk, miáltal értékelhető az anti-ErbB antitest azon képessége, hogy gátolja a Iigandom - ErbB heteroolicomerben lévő - ErbB-receptorhoz történő kötődését.
Például, a HBG-poiipeptid MCF7 emlőznmor-sejtekhez történő kötődésének anti-SrbBÍ antitestek általi gátlása 24 üregű tálca formátumban, légen, készített egyrétegű MŰFŰtenyészetek alkalmazásával, lényegében az 1. példában leírtak szerint hajtható -.-'égre. A tálca mindegyik üregébe antiErbBz antitesteket adunk, majd 10 perces inkubaiás után az üregeknez ‘'l-izctőtpai jelölt rHÁűii??,.2om'Pöi iyeptidet (25 pm} adunk, és az inkubálást 4-16 ára hosszat folytatjuk, bázis-reakció: görbéket készíthetünk,, és a - rudasén antitestre kiszámíthatjuk az ICgo-értékst. Az er t megvalósítási mód szerint az ErbB-reeeptor ligandnm általi aktiválásét biolkoió antitestnek a tesztben - a HÍG MCF7-sejtekhez történő kötődésére vonatkozó - ICgo-értéke 50 nH vagy kisebb, előnyösebben 10 nM vagy kisebb. Amennyiben az antitest egy antitest-fragmens, pl, Fan-fragmens, e tesztben a HmG-poIipeptid hiOF?-se j t ehhez történő kötődésére vonat kozó - ICso-értéke kin I v 1 » ryy 'mseon. mos bt zvaselrv-n
Su: nM vagy kisebb.
Mas módon (vagy ezen túlmenően; az acti-Frbku antitestnek egy ArbS hetero-oligomerben lévő űrbB-recepter BrbB-iígandure által stimulált tirozin-foszforiláciöját blokkold képességét értékelhetjók, keidéül, az ErbBreceptort endogén módon 'Υό.'· -<r v c' a receptort termeltetése érdekében transzfefctált sejteket} az antitesttel lakúnáljak, majd foszfotirozin elleni monoklónális antitest ; amely adott esetben detektálható jelölővel konjugálható) alkalmazásával vizsgáljuk az ErbBiigenben depencenz tirozin-foszforrláoiős aktivitást. Az 5 7 56 $65 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, feltárt ktnaz-recepfcr aktiválási teszt szintén alkalmas az
ErbB-receptor aktiválásának - és ezen aktivitás antitest általi blokkolásának - meghatározására.
A. találmány egyik megvalósítási módja szerint olyan antitest azoppsitására végzünk szelektálást, amely AGF'?~ sejtekben gátolja a pliO-protein cfrozin-fosz forr ládájának K8G-polipepdd általi stimulációját, Például, az MGF7ssjteket 24 üregű tálcákra szélesztjük, majd mindegyik üreghez Erb32 elleni antitesteket adunk, ás a taicátat szobahőmérsékleten 30 percig inkubáijnk, Ezt követően mindegyik üreghez - 0,2 nA végkcncentrációban - rHEGl :77..744poiipaptidet adunk, és az inkuoáiást S percig folytatjuk. A tápfcözeget mindegyik ütegből leszívjuk, és a reakciókat 100 pl OOS-rc nrape.frer (5% ODS, 25 mb OTT és 25 mb 7ris~üCl, pH •::: 6,8) hozzáadásával leállítjuk. Valamennyi mintát (25 pl) 4-1.2 8-os gradiens-gélen láovex) eiekrroforizáijur, majd elekerozorai!kas aη ρο 1 Ív i η 111 dán. - d I fiporí d mernérónra násorjel. Anti-foazfotirozih II ug/ml-nél) Immunbiotokat hívunk old, ás a fo reaktív csík fi80 000 D molekulatömegnél) intenzitását reflexió óenzizomerriávai határozzuk meg.. A kiszelektált antitest e tesztben, előnyös esetben, jelentős mértékben gátolja a pl30 tírozin-foszforilációjának HEG általi stimulációját (a kontrolihoz viszonyítva kb, 0-25 %? . A plóO tirodn-foszforíiáoiőja HEG általi s tize; iá szójának reflexió denzitometriával meghatározott gátlására dózisreakció görbét készíthetünk, és annak alapján kiszámíthatjuk a kérdéses antitest ICs^-értékát. Az egyik megvalósítási mód szerint az ErbB-receptor ifgancum általi aktiválását blokkoló antitestnek a plóö firozin-főszlóriiadójának liRG — 3 b — általi stimulációjára vonatkozó 1Cgö-értéke ke. 50 nM vagy kisebb, meg előnyösebben lö ab vagy kisebb. Amennyiben az antitest egy antiteet-frsgmsns, pl, Fab-fragmena, e tesztben - a plBö tirozin-foszforiiáoiőjának HRá általi stemulációjára vonatkozó ~ TCj^-érteke kb< löö nő vagy kisebb, meg előnyösebben 10 nA vagy kisebb.
A fentiekén túlmenően, elvégezhetjük az antitest őóAHB-i7ó-sejtekre gyakorolt szaporodásgátiő hatásainak vizsgálatát is, például, a Schaefer és mtsai. [Oncogene 15, ''t aif;_ „ xrt -1 - t-t » ~ stt».a - járás szériát az MDÁ~RB-17S~sejdeket négy napig anti-ErbSi monoklonális auzrtesttel ciO g/mi) kezeljük és tristáiyibolyával festjük. Az anti-ErbB antitesttel végzett inkubaiás a sejt vonalra - a BEA monokínnális anti. test által muta tótéhoz hasonló - szaporodásgátló hatást gyakorol. Egy másik megvalósítási mód szerint exogén. eredetű HBS-poIipeptid nem képes jelentős mértékben visszaforőitani a gátlást. Az antitest előnyösen - exogén EBE jel&niétéoen és hiányában egyaránt - nagyobb mértékben gátolja az dDA~dB-17Ö-sejtek prolifaráéitját, mint a ióz monokionéira antitest (és adott esetben, nagyobb mértékben, mint a 7F3 monoklonális antitest) ,
Az egyik megvalősitási mód érteimében a szóban forgó anti-ErbSz antitest MCE?- és SK-BR-3-sejtekben (koímmanpreclpitácíos kísérletben meghatározva) egyaránt képes blokkolni az ErbB SthBő-mai történő - heregtlin-dependens asszociációját (és előnyősön sokkal hatékonyabban, mint a ?Bő möeoklooalis antitest. ),
9 ·**
Sgy szóhah forgó antitest által megkötött ErbHlantigén esitopj óhoz kötődő antitestet kiszeleItalosa céljabél rutinszerű teresztbiokkoiásl kísérletet végezhetünk (id. Antihősies, A Laboratory bánnál”, lóid Sprint tarost Laboratory, szerkó; Harlem és tané náSSfj , Aás módon, vagy ezen túlmenően, szakember számára jól ismert eljárások alkalmazásával eeitóptérlécezést végezhetünk Üd. i/A és i/3 ábra}
A fentebb leirt. sej fa lapu tesztekkel kapott eredményeket állatokban (pl. égérmodéilekben} és humán klinikai kiserietekben terjeszthetjük kl,: Közelebbről, ErbBz-rozeptcrt túltermelő tumorok kezelését illetően agy antitest alkalmatlanságát vagy korlátozott alkalmasságát a példákban később ismertetésre kerülő transzgenikus egérmodeilfoen vizsgálta tg uk.
S) Ant1-Erb3________antitest/maytansinoid konjugátnraok (imraunkonjagátumok)
Az: a n t Ί - S r b β a n t i test / ma y t a n s i η o i d ko n j u gát nme k a z antz-ErbS antitest maytansíngld-moiefcuiához történd kémiai kapcsolásával állíthatók elé, anélkül, hogy csökkentenénk az antitest vagy a maytansinoid-molekula biológiai, aktivitását. A maytansinoádok szakember számára jói ismertek, és ismert technikák alkalmazásával szintet!zálhatók, illetve természetes forrásokból izolálhatok. A találmány szerinti megoldás értelmében alkalmas maytansinoidokat, például, az 5 208 Olt számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban.
valamint egyéb, fentebb említett szabadalmi iratokban és máé pacit kéziokban Írták. Is, A találmány szarinti a.egoidás szempontiából előnyös maytansInnidók közé tartozik a maytansinol és - az aromás gyűrűben vagy a maytansinormolekula egyéb pozícióiban módosított - maya ansrnoianaiögok, pl. különbőzé maytanainol-észterek.
Az antitest/maytansinold. kon j aga turnék előállítására az idevonatkozó szakirodalomból számos kapcsolóosoport ismeretes fid, pl. á 101 020 számú egyesült államokbeli szabadalmi leirés; 0 425 235 B1 számú európai szabadalmi leírás; Cheri és mtsai.u Cancer Research 52, 127 (1202)] . A képcsőlöcsoportok közé tartoznak a díszülfiá-ösoportok, tioéterc s oportok, s arcom1ékeny cs op ortok, fény1ab11: i s c s ορo ztok, peptidázzal hasítható csoportok és eszterázzal hasizható csoportok kid. a fentebb említett szabadalmi iratokat), melyek közül a diszulfld- és a fioátsr-csgportok előnyösek.
Az antitestlmaytansinoid konjngátumok különféle dl funkciós: prűteinkapesoió-ágensek alkalmazásával állíthatók elő, melyek példái a következőt: b-ezukcinlmidil-3-(2piridil-dltio)-propionát íSPüP) , szukoinimidri-4- (hma i ormi do-meti1)~oikiobexán-u -kartoxiiát, ímlnotiolán (121, ímidoészterek dilunkciős származékai (pl. cimaziiadipimioát-kü.l) , aktív észterek (pl. disznkcini.mid.iiszuberát), aldehidek (pl. gintáraldehid), bísx-azídovegyületek [pi. hisz (p-azido-benzoii'·-hexándiaminj, hiszdiazonrnm-származékok (pl. hisz(p-drazonzum-benzoi i)etiléndiaminl, diizodanátok (pl. toiién-l, 6-diizocianát) , és kétszeresen, aktív fluor in származékot (pl, 1, 5-cl fluor2, i-dliiitrobenzol:] . A kapcsolóágensek közül különösen előnyös ez d-szükcinimidí1-3-(2-piridii-dltio)-propionáfc fSPÖ?; Cár Issen és mtsa.·..: üiocúem. ül 173, 723 (1373)] és ez N-ezukzi.nimidl.1-4-(z-piridii-tio)-pentaroáf ;$??), melyek diszuifidkötések létrehozására alkalmasak.
A kapcsolóágens ~ a létrehozni kívánt kötés típusától függően - kdlönbözo pozíciókban kapcsolható^ a mayéansinoidmolekulához. Például, szokványos kapcsolási technikák alkalmazásával észterkötés alakítható ki a hidroxilesepertet tartalmazd C-3 pozíciónál, a hidrcxl-meitiosoporttal módosított C-14 pozíciónál, a hidroxilosoporttal mödositott C15 pozícionál és a hidroxilesoportot tartalmazó C-20 pozícionál , Az egyik előnyös megvalósítási móc szerint a kötést, a maytanslnol vagy a maytansimo1-s.nalég C-3 oozictójánál alakítjuk ki.
C) Gyógyászati készítmények
A találmány szerinti megoldás értelmében alkalmazott antitest/maytansinoíd korjugar úrnőkből oly módon készíthetünk tárolásra alkalmas gyógyászati készítményeket, hogy kívánt tisztaságú antitestet ét - adott esetben - fiziológiai szempontból elfogadható hordozókat, kötőanyagokat és stabilizálóazereket [ló. Pamingfconfs üharmaoeutioal Sciences, 15, kiadás, szert. : Osol -(193Ö)] elegyítünk (Iiofiiizátum vagy vizes oldat alakjában;. Az erre a célra alkalmas hordozók, kötőanyagok és stabliizáiőszsrek az alkalmazott dózisokban és koncentrációkban nem lehetnek texiknsak a páciensre. Az ilyen, anyagok a következők; pufferek (pi. foszfát, extrát és egyéb szerves savak); antioxidánsok (pl. o ktadeciI-dimstiI~benzIx-snnöniám-klório, kexa ~
-e. -n , , :m- m•'r dkxr. m~' z_xd, be . “\kii3, fenti, vádi- vagy henzllaikohol, alkiiparebenek (pl. matti- vagy propiiparabén), eaeetchol, rezorexnoi, dkdhexand, 3-pentanol és m-kreoölj ; kis nclekalatömega (legfeljebb kd Ív amdosavas) poiipepd.dek; proteinek (piszérumeibumin, zselatin vagy immuno lobé idők; ; dórod. 1 po~ iimarek ;pi. pd dxddl trolidon; ; amdossvak (pl. glictn, glutamin, assparagin, hisztrdin, arginin vagy lizín); monoszacnardok, dzsxachardok ás egyéb szénhidrátok ipl. glukóz, mannóz vagy áextdnek); keiátképzők (pl. SDTA) ; cukrok (pl , szacharóz, masnitól, trehaiőz vagy szerbitől); soképzo el iaa ion ok (pl. n á t r i om).; f ép kompi eme k (ρ 1. 2 η - p r o t a 1 n komplexek); és/vagy nemionos felületaktív anyagok {pl, Tkeerd, Fluronied vagy políetilénglikpl (BÉG)j. A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyös iiofilizálf 'omártOi _b - st - m-sr .. u ::.u: í A'/ulf'l szaru nemzetközi. közzétételi iratban tárták fel (melyet teljes terjedelmében a kitanifás részének tekintünk) .
A szóban forgó gyógyászati készítmény - az adod indikációtól függően ~ egynél több (előnyösen egymás hatását károsan nem befolyásoló, komplementer aktivitása) hatóanyagot is tartalmazhat. Például, az ilyen készítmény tartalma zhat o,l van ant itesteket vagy art i te s t /maytané inoid kod ugaturnokat is, amelyek képesek megkötni a2 EGFB-t, ErhBz-t (pl. az ErbFx egy másik api topját;, ErOB3-af,
EZb84~-et. vagy vas skaláris endotheilaiis faktort (vEGEs . Más módon., vagy ezen túlmenően, a készítmény tartalmazhat cltorovi kas hatóanyagot, kameratápiát hatóanyagot, oltoklnt, seitszaporodást gátló hatóanyagot, antihormonáiis hatóanyagot és/vagy kardioprotektánst is. Az ilyen molekulák, alkalmas módon, a kívánt cél eléréshez megfeleld kombinációban és mennyiségben lehetnek leien a készít m é n y b e n.
Az aktív összetevők mikrok&pszulába is foglalhatók, amely, például, koacervácibs technikával (hidrorimetlleeilulöz vagy zselatin mikrokapszul.a) vagy határfelületi polimazizáciövsi állítható élő [pofi ínétil~ metskrdlár) -mi krokapszr la]... Más módon, az aktív összetevők k* . le n.l s * -I λ, un-'v''.tv pl. I.iposzőmák, alOumic-mikrogömbök, mikroemolziők, nanoszemcsék és tartkapszulaki vagy maktoemuiziékba foglalhatók,. Az ilyen technikák leírását ló. : Aemington7s Pherm&ceutioai öciencsa, In, kiadás, szerk. : Oisoi U9dö/j.
A találmány szerinti, megoldás érteimében tértős hatóanyag-kibocsátású zeszirményes is előállíthatok. Az ilyen készítmények jellemző példái közé tartoznak az antitestet tartalmazó, szilárd hidrofor polimerekből készített féligáteresztő ágyazóanyagok, amelyek pl. filmek vagy mikrofcaps~v * > formájában állíthatók aló. A tartós 'hatóanyag-fel szabadulást biztosító^ ágyazőanyagok példái e következők: poliészterek; hiőrogéiek {pl, puli{2~hidrönieiiz~ mefa kr iuá t l vagy poiivínil el kenő i ]; go Ili ad tinók /3 7 73 él é: számú egyeséit államokbeli szabadalmi leírás/; Agiutavinsav és γ-etdd-s-giutamát kopoiimerel; lebonthátatlan okirén-viniracetái köpoli.métek; lebonrhatc tejsavgixkolsav köpöd ámenek (pl, 1.UPROK DEROd^t amely te j sav.i._. χ χΟΊχ e- < p„...c t .1 . , w tárható zmkrogcmb készítmény 0 és poI0D~{~/~3~ hrdroxivajsav.
Aa in w adagolásra sránt készítményeknek sterileknek kell lennrak, ami steril szürőmombránck alkalmazásával végzett szűréssel egyszerűen biztosítható.
Abtl-rrb520 nt r testtmaytazi 1 no id kouingátumokkal végzéft ke teles
A találmány szerinti megoldás értelmében az anti-SrbBz antítestymaytansinoid konj agatusok különféle betegségek vagy rendellenességek kezelésére alkalmazhatok, melyek jellemző példái közé tartótnak a következők; jóinduratő. és malignáns tumorok; leokozdsok és iiváodd mad ionéns betegséget; valamint egyéb rendellenességek, mént ni. ioegsejt-, giiasej t ··, asxtrociía-, hipotalamusz-, mirigy-, makrcfág-, epithex.se jt~, síromé-, btssztocői'-, gyulladásos, anglog?én és xmmuno1ögrai r ende11enessége k.
A találmány szerinti megoldás értelmében kezelhető betegség vagy rendellenesség általában rákos betegség, melyek példái, közé tartozik, többek között, a karcirama, ixmfoma, blastoma, sarcomé, leokőzis és malignáns Irmíoid rendellenességek, A rákbetegségek konkrét példái köré tartoznak a következők: pikkelyséjtss rák (pl. epitheiialis plkkelysejfces rák),, a tüdőrák (kis sejtes és nem kis sejtes tüdőrák) ,< tüdő -uuerour;· c:: neme és pikkelyse j tes tüdő-karóimama, hashártyarák, hepatocelluláris rák, gyomot vagy hasi rákok, pl. gastrolntestinalis rák, hasnyálmirigy-rák, giioblastoma, méhnyakrák, petefészekrák, májrák, hugyhőlyagrák, hepatoma, emlőrák, vastagbáirák, véybélrák, vastagvágna Irak, enőometrium vagy méh karoinoma, nyálmirigyrák, vas e rá k, prosztatarák, s z e mé r a m t est- r á k, pa j z smi r i g y rá k, májkaroinoma, végből-karcicoma, paniskaroinoma, valamint fej- és nyakrák.
A szobán forgó rakok ErbS-receptort termelő - és általában túlzott mértékben termeid - sejteket tartalmaznak, így az anti-ErbS antitestéé képesek a tumorhoz kötődni. A találmány egyik előnyös megválóéitási módja szerint a rák ErbBz-receptőrt termel©: sejteket, még előnyösebben, SrbBzreoeptort túlzott mértékben termelő sejteket tartalmaz, A rákban az ErbE-rsceptor (pl. az ErbSz-receptor) termelődésének meghatározására különféle diagnosztikai és prognosztizáló tesztek állnak rendelkezésre. Az egyik megvalósítási mőd értelmében az ErbBB tűi termelődését IRC-vei, például, EEECBPTESE* (Dako) alkalmazáséval teszteljük. Az 1BCtes z tb e n t umo r «fel ορ s z 1 á bő .1 s z á rma z ő, pa r a f £ 1 nba á g y a z ott szövetmetszsteket vizsgálunk, és a szöveteket a ErfoBBprotein fsstődési intenzitása alapján értékeljük, a következők szerint:
::: fed tödén nem tapasztalható, vagy a tumorsejtek kevesebb, mint 10 b-ában figyelhető meg membránfestődés;
It a. tumoraejbek több, mint 10 %-ában gyenge, alig észrevehető metótánfestődés: detektálható;
tó ~ a tumorsejtók több, mint 10 %-ában enyhén/mérsékeltea komplett, .membtámrémrődéő figyelhető: meg;
tó - a tORO-r.sejtek több, mint 10 tóéban mérsekelten/erősen komplett membránfestödés figyelhető meg,
A tó!” vagy la ErbSl-tüitermelöoési pontsaimmal értékeit tumorok az SrbBtót nem túltórmei© tumorként jellemezhetők, mig a tót” és tót pontszámú tumorok az ErbStót túlt e rm a 1 Ők é nt a somosa.1 fe a t ők.
Sás módon, vagy ezen túlmenően, tormáiinnal rimáitó paraffinba ágyazott tumorszövet felhasználásával, a tursor Erzsi-tűitermeiése tértekének (ha kimutatható egyáltalán) meghatározására 'FÍSb-teszteket - például, IhECEA (bontana., Arizona; vagy SATHVrőlOh tesztet [bysis, Illinois) végezhetünk .
A találmány egyik megvalósítási módja szerint a rák Bötó.-i termel (esetleg túlzott, mértékben) . Az EGFA-t terme<«. Itó*’ tót-'-' I η Ί r m , ' u';' ^~tó ' iu a következők: pikkelyesjtós rák (pl... epithelia.lis pikkelysejtes rák), tüdőrák (kis sejtes tüdőrák, nem kis sejtes tüdőrák, tüdő-adenokaróinoma és pikkelyrejtes tüdőkarcrnoma;, hashártyarak, hepatocoiluiáris rák, gyomor vagy hasi rákok, pl. gasfrointestinaiis rák, hasnyáimirigy-rák, gliobiastoma, méhnyakrák, petefészekrák, máj rák, húgyhóiysgrák, hépatoma, emlőrák, vastagbél rák, végbéirák, vastag- és végbéirák, éhdódetrloír. vagy tón karé in óma, nyáltórigyrék, veserák, prosztatarák, szeméremtest-rák, pajz«mirigy rák, mg j karol, nőm a, végbél kazeinomé, pont s kar einoma, va•V lámint fej- és nyakrák,
A taiblvény szerinti iramunkon jUgátumokat és/vagy az ErbB-t (pl, ErbB2 vagy EGFR), amelyhez kötődnek, a. sejt internalizái ja, ami az immuTíkonjugátum torozott terápiás hatékonyságát eredményezi azon rákos sejtek e1pusztításába n, amelyhez kötődni képesek. Az egyik előnyös megvalósítási mód szerint a cltotorikus hatóanyag (maytansinoid) a rákos sejtben lévő nnkieinsavat célozza reg vagy gátolja azt.
A találmány szerinti megoldás érteimében végzett kezeléssel BrbB-t túltervező tumorok célozhatok meg, amelyek a nem konjugáit anti-ErPB: antitesttel végzett kezelésre nem vagy csak alig reagálnak. Az Ilyen rákos betegségektől o ne c - <r\o η -η·> ~ maytansinoidhoz nem konjugáit - anfi-lrfcB antitestre! végzett kezelésen, amely .nem eredményezett jelentős .mértékű javulást vagy csak átmeneti enyhüléshez vezetett, Mindazonáltal, a konjugáláslan anti-ErbS antitesttel végzett előzetes kezelés nem előfeltétele a páciensek - találmány szerinti megoldás értelmében anti-BroB antitast/mas-'tanslnoid konjugátummal végzendő - kezelés kiszemeltjelként történő azonositásánák, Általánosan hozzáférhető klinikai adatok és saját tapasztalat alapján szakember számára nem okoz gondot azon páciensek azonosítása, akik várhatóan előnyt élvezhetnek a találmány szerinti lmunkonjugéturnékkal végzett kezelésből, Az emlősök, és különösen az emberek - (könjugálatianj anti-Erbb antitesttel végzett előzetes kezeléssel vagy anélkül történő - kezelése a islátvány oltalmi körébe tartozik.,
Az a n.t 1 - £ r b 3 antitest / ma y t a n s í η o i d k on. j u g át umo k a t 1 s ~ mert módszerekkel, például, rntravénás (pl. bűius injekcióval vagy folyamatos infúzióval) , intramuszknlárie, 1 n t rács ri toneá i is , in t ra ccz etrospr nai 1 s, s z ubkn cár, intráértrcaiazis, intrasyncvialls, intrathecalls, orális, topíkus vagy ínhalációs adagolással adjak be az emlősöknek (előnyösen embereknek), mely adagolási módok közül az Intravénás és a arubkután adagolást reszeslrjür előnyben.
Az aufl-EroS antitest/maytansinoid konjugátamok adagolásával egyéb terápiás adagolási sémák is kombinéihatok. á kombinált adagolás lehet együttes adagolás: (külön készítmények vagy egyetlen gyógyászati készítmény alkalmazásával) , továbbá lehet egymás utáni adagolás (bármely sorrendben), melynek során megfelelő időtartamot bizioslznnk arra, hogy mindkét (vagy valamennyi) aktív hatóanyag kifejthesse biológiai aktivitását.
ez egyik előnyös megvalösitésl mód szerint a. pácienst két vagy több eltérő sntl-ErbP antitesttel kezeljük, melyek legalább egyike maytansinaiddal van konjugáiva. Például, a páciens kezelésére egy első anti-Srbel antitest /maytansinoid konjugáfumot (amely se jf szaporodást. gátié antitestet, pl. HERGEAT TÜ-t tartalmaz), és egy második anti-Erbsz antitest/immunkor jvgátomot [pl. egy ErbBreceptor ligandnm általi aktiválását gátló antitest (pb. zöi-autÍzest és/vagy affinitás-fej lesztett változata) vagy SrbS-f túlzott mértékben termelő sejt apoptezisáf indukáló antitest (pl. 7C2, 711 vagy humanizált változataik) mayransiuslcoal alkotott, konjugáturnét) alkalmazzuk. A tuiád.mány egy további megvalósítási mólja szerint a kezelés során két. vagy több különböző Ebb.8-receptort (pl, ErbSzreoeptort és bGE'R-re Gépiért) specifikusan megkötő antitesteket adagolunk, melyek közti legalább az egyik anti-Erbő antitestet maytansinoid-konjugátumként alkalmazzuk. Az ilyen kombinált terápia előnyösen szinergikns hatást eredményez.
Előnyös leket az anti-ErtE ant itest/may tana ined.d kong ugatunok adagolását más - nem az ErbB-rsoeptcrcsaládba tartózd - tumorasszociáit antigén elleni antitest adageiásavai kombinálni. Ilyen esetben a másik antitest, például, vasoularis encotueiíelis növekedési faktorhoz (vegü) kötődhet, és taytansinőid-vonjagátun vagy más immunkonjugátum a1a kj ában a1kaIma z ha t ő,
A találmány egyik megvalósítási mőoga szerint a kezelést egy anti-ErbEz ant Ítész ima ytansinoid kenj ugat un: (vagy keniugátumok) és egy vagy több kemoterápiás hatóanyag vagy sejtszaporodást gátló hatóanyag kombinált adagolásával végezzük (Ideértve a különböző kemoterápiás hatóanyagok keverékeinek együttse adagolását is). A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyös kemoterápiás: hatóanyagok közé tartoznak a tanárok (pl. paeiitaxel és doxetamel) és/vagy az anthraoyolin antibiotikumok. Az ilyen kemoterápiás hatóanyagok eiokészitését és dósirozását a gyártó útmutatásai szerint végezhetjük, illetve a kezelőorvos kísérleti ütőn h a t á r o z h a t j a m e g, A k emo t. e r á p i á s h a 16 a n y a g o k e 1 ő k é s z i t. é s é t a< dozírozását. illetően Id, : 3^: toe, szert,: M<C, Eerry, dili isme és Rüh kiás, Bal timore, MD
Μί
Az antitest/mayt ansHoid kenj ugatunok hormonéi lenes vegyülettel is kombi ne ihatok, íny pi, ·· az ilyen molekulákra ismert oőzisokoan - ősztrogénelienes vegyülettel (pl. oanoxz fe-b ; eregessveronai lenes vegyi let tel (pl.
o „j. j_? « 7' H>* s a-z'-' ' i „n-rJ c-r-'.s.
vegyülettel ·pl. fiútemid). Amennyiben a kezelni kívánt rák he rmon fügéét len, a pácienst előzőleg hormeneilen.es terápiának vethetjük, alá, és - miután a rák hormontaggétlenne válik, megkezdhetjük az anti-Erőül antitest (és adott esetben a fentebb leirt egyéb hetdenyégok) adagolását.
Bizonyos esetekben előnyős lehet karőicprosektánst (a. terápiával összefüggő szívizom—károsodás megelőzése vagy csökkentése érdekesen.; vagy egy vagy több cirokért adagolni. A fenti, terápiás sémákon, kívül a pácienst - a rákos sejtek eltávolitása céljából - sebészeti beavatkozásnak és/vagy sugárkezelésnek vethetjük alá.
A fentebb felsorolt, együttesen adagolható hatóanyagok dózisait a gyógyászati gyakorlatban jelenleg alkalmazott dózisoknak megfelelően állapítjuk meg, illetve., az adott hatóanyag és az anti~SrdB2 antitest kombinált (szinergikus; hatásának függvényében csökkentett dózisokat alkalmazhatunk .,
Egy betegség megelőzése vagy kezelése céljából az antitest/maytansinoid kenjagátumok megfelelő adagolása a kezelni. kívánt betegség típusától, a betegség súlyosságától vagy lefolyásának menetétűi, a kezelés profHektikus vagy terápiás természetétől, a korábban végzeté gyógykezelésektol, a páciens kiisikéi tőit éneié tői ér astiiesfie adóét; reakciójától, valamint a kezelőorvos saját megítélésétől függően natároshafó meg. Az antitest/maytansinoid kor i agat űme t, alkalmas módon, egy elkelómmal vagy kezeléssorozat során adagoljak. Az antitest/maytansinoid kenj agát orvat ~ a betegség típusától és súlyosságától függően - ko. 1 pg/kg-től 15 mg/kg-tg terjedő kezdődőtissen (pl. ¢,1-2/ mg/kg) adagoljuk, függetlenül attól, hogy egy vagy több alkalommal végtett beadást vagy folyamatos infúziós adagolást végzünk. A jellemző napi dózis - a fenti tényezőktől függően - kb. 1 pg/kg-tói lőö mg/kg-ig vagy még tovább terjedhet. A totó napon keresztül vagy még hosszabb ideig végzett, ismételt adagolás esetén a kezelést - az adott állapottői függően - addig folytatjuk, míg a betegség tüneteinek kiránt mérséklődése nem. következnek be. Az anti™
Srb32 érti test/mayiansÍróid kooiugátum előnyös adagolási sémája során kb, 4 mg/kg-os kezdő dózist el kaima zunk, majd kfe. 2 mg/kg-os heti fenntartó dózist adagolunk, Mindazonáltal, egyéb adagolási sémák is hasznosak lehetnek. A terápia folyamata hagyományos technikák és tesztek alkalmazáséval eoyszerue; nyer ?r ktvet-mtr
E; Termékek
A találmány egy következő megvalósítási módja értelme; i ' .< ni. ' . Ad ; . t z se a ' s.s tat'-'' eoi\-\’í; < lésére alkalmas anyagokat tartalmazó terméket tárunk fel. A. találmány szerinti termék tartályból és az azon levő ózagy
- lük ~ ahhoz mellékelt; címkéből vagy rermékismísrtefőbői áll, Az ilyen osztályok, például, palackok, fiolák, fecskendők és hasonlók ietetnek, és különféle anyagokból (pl. üvegből vagy műanyagból; készülhetnek, A rarfáiy en adott betegség kezelésére hatásos készítményt tartalmaz, és steril nyílással lehet ellátva (pl. szubkután injekciós tűvel átszúrható dugóval lezárt intravénás oldat-sasak vagy fiola), A lészítmény legalább egy aktív hatóanyagként anti-ErbB antitest/máytansindid kon)ugatomol tartalmaz, A címke vagy ter~ t e>\ r . ' ·, ., i ' h r x „ u<. * ö -, h<\ \ c ·· .. li\ milyen betegség (pl. rák) kezelésére alkalmazható. Az egyik megvalósítási, mód szerint a címke vagy termekismertető arról ad felvilágosítást, hogy az ErbBz-receptort megkötő antitestet tartalmazó készítmény ErbS-receptor [epidermálíe növekedési faktor receptor (EGEF; , Erb32, SrbB‘3 vagy ErbB4, előnyösen BSEBJ termelésével jellemezhető rák. kezelésére alkalmazható, A címke vagy termékismertető tartalmazhatja azt is, hogy a készítmény egy ErbS-receptor (EGER, irrli, EröEi vagy ErhBi) túlzott mértékű aktiválásával, jellemezhető rák kezelésére alkalmazható. Például, a rák a receptorokat túlzott mértékben termelő rák vagy agy úrbB-iigendnmot (pl.. TGE-on túlzott mértékben termelő rák lehet. Mindezeken falúi, a címke vagy termékismertető felvilágosítást nyújthat arról is, hogy a készítmény olyan rák kezelésére szolgál, amelyre nem jellemző az ErbBf-receptor túlzott mértékű termelődése, Például, mig a HERCEFUlh termékismertetőjén az áll, hogy az antitest metssztszisos emlőrákban szenvedő paciensek kezelésére szolgál, mely páciensek tumora túlzott
- 1« mértékben termeli az ErcBi-prezeirr, a találmány szerinti termék termékismertefdje arról ad tájékoztatást, hogy az antitest vagy készítmény elven rák kezelésére alkalmazható, amely a BERCI BT IB®-nei végzett kezelésre nem - vagy csak alig - reagál, A találmány más megvalósítási módjai érzelmébe a t e rmé ki smer t efő azt jelzi, hegy az antitest/maytans inaid kom jnyátom vagy a készítmény hermonfüggetlen rák, prosztatarák, vastagbélrák vagy vastag” és végnélrák kezelésére is alkalmazható. Ezen túlmenően, a találmány szerinti termék tartalmazhat (a) egy első tartályt, amely egy - ErbSz-receptorz megkötő és ErPBz-t túlzott mértékbe:; termelő rákos sejtek szaporodását gátló - első antitest m.ay tanárnőiddel alkotott kon Ingáz mát tartalmazó készitményt foglal magéban; és (b) tartalmazhat egy második tartályt is, amely egy második - BrbBz-receptcrt megkötő és egy ErbB-reoeptor irgandom általi aktiválását gátló - antitestet (vagy ezen antitest maytansinoiddal. alkotott konjugáttmát) tartalmazó készítményt foglal magában, a, találmány e megvalósítási módja szerinti termék termékismertetőt is tartalmazhat, amely arról ad felvilágosítást, hogy az első és a második készítmény rák kezelésére alkaimazható. has módon - vagy ezen túlmenően - a találmány szerinti termák tartalmazhat egy második (vagy harmadik} tartályt is, amely gyógyászati szempontból elfogadható hordozót (pl. bakteríosztatikns· injektálható vizet iBMFl}, foszfátpnfferelt sóoidatot, Binger-oldatot vagy dezzroz-ddatoti tartalmaz. A termék egyéb, ke re eke de lati és felhasználói szempontból hasznos anyagokat is tartalmazhat, Így pl. további
104 puffereket, diiuendomokat, szűrőket, tűket és fecskendőket. A tafálmáj'íy szerinti megoldást a továbbiakban kisérleti példák bemutatásán keresstűi szemléltetjük.
1.
A 4D5 énti-1 r olt monoklonálls ént 1t est eIdd111tás a,.....karoktar 1 zá 1 ása és humanizálása
Az egárersdetü 4D5 monoklonális antiteste/ (amely specifikusan kötődik az ErbBr eztraoelinlária ómenjéhez) a Fendiy és mtsai. fCanoer Reaaarzu 50, 1550 (1.990) 1 által leírt ei járással á.ilitotzuk ele. Röviden összefoglalva: Hunniák és mtsai, (Proo. Heti, Aoad. Bei, USA §4, 7158 01907)1 által leírt, mádon élőál irtott dIH:-3l‘3thFB-2“3^r/ sejteket (melyek sej tónkén/ hozzávetőleg 1 o ICO ErbBrmolekulát termeinek) 25 ok EBTA-t tartalmazó foszfátpuf terelt sőoldatoan (IBS) összegyűjtettünk, és az Így kapott se j tszcs zcenziötal BAlB/c-egereke/ immunizáltunk., Az egereknek a 0,, 2., 5. és 71 bében intraperitonsdlis (i.p,) laiekiáXássgl ö,S ml kBF-feen rkf sejtet adagol tón ku .A 3c?izotöppal jelölt ErbBl-receptort ímmunprácipitáló antiszérumot termeld egereket a ű. és 13. héten iréraperíton sális an - b úz a o s íra -a gg1utín1n/5epharo sa (WGA) gy ant án tisztított - ErbBr membránkivonattal oltottak. Ez/ követően az egereknek intravénásán 0,1 mi ErbBr-készitményt adtunk be, és: a iépsejtsket ·szplenooitákat) égé/eredetű X63Auc.6/3 mysioma-sejtvenslial fuzionállattok. A hibriddmafelülűs zőkat Eli 3A-fesz11 eI és rabi oimmunprecipita oldva1
SrbB2-kötődésre
Ep1tép-1ér .<épezas és -k5r.a.<ter i zélés
A 4D5 monoklonális antitest éltei magkötött ErbBzapitopot kompefotÍv kötési analízissel azonosítóttok [Fendiy és mtsai.; Canoer Research 50, 1552 (1905)j, Sértetlen se j tokkal végzet t direkt fluoreszceneia alapién (a t ino ros zoe η o i a kva n t i t a 11 v me gh a t á r. o z á s á r a PAP' D EXTÍ< S c r e e n daohine készüléket alkalmaz vaj kereszt'-blokkolási kísérleteket végeztünk, A monoklonális antitestet - ismert eljárások ai ka ima zásával fid. bofsy és mis la. : 'iSeiected Xetkoos in Ceiluiar irrtonology, szerk.: Misnél és Schii.gr, 287, old., San Francisco, W.l, Freeman Co. (1985)} ;Ílnores:Zícedn..-i:zoti.oo.iá.há:t:S:OV: nEIlüj kon jógái. tok.. A M7Hlil/KEa-z-l.ioo sejtek kontinens egy rétegű tenyészetét tripszennel kezeltük, egyszer lemostok, majd - 0,5 % szarvasmarha-szérumalbumint (BSAí és 0,1 % MaiM-oc tartalmazó - hideg roszráípurfereit sóoldatban 1,75 x Iüte sejt/ral sejtsűrüséghen ójraszoszpendáituk. A RAMDEln* tálca membránjai eltőmööésének csökkentése érdekében a sejtsznszpenzióhoz 1 % végkonoentrációban iaéex-szemoséket {TDC, Porzland, OP.) adtunk. A PANDEH tálca üregeibe 20 μΐ sejtszuazpenziót és tisztított monoklonális antitestek 20 pl térfogata oldatát <100 pg/rrl-fől 0,1 ug/ml-ig terjedő koncentrációban) adton k, és jégen 30 percig inkubaitok. Ezután mindegyik üreghez FlXC-vel jelölt monoklonális antitest előre meghatározott hígításait adtuk (25 ül térfogatban>, majd 35 perces inkubálás: ás az: azt követő mesés utón a fl.noresZcenoláa
PANDEXM1 készülék alkalmazásával kvantif ative mégha távoztuk, A pengklónálfs anbit salakot alkon fair Intőt fűk közös epitápot felismerőnek, na mindegyik legalább 50 %-ban gá~ tolta a másak kötődéséi (i.rreleváns: bont roll .monok! ónál! a antitesttel Összehasonlítva) , E kísérletben azt találtok, högy a 4D5 monoklonális antitest az irtuk extraaeiluiáris doménjében lévő (kfo. 52.9, aminösavtól a. kfo. 625. aminosavig terjedő; Id. 3. azonositőszámó. szekvencia) l epitópot ismeri fal..
A 4D5 monoklonális antitest ss;fszaporodást gátló tulajdonságát 5K-BB-5 emlőtömön;-sejivónál alkalmazásával érteke ltok [Id, Sodziak és mtsai.: hol. Cs.ii, Bioi. 9 (3) , 1165 .(1351}], Röviden összefoglalva: az SK-BR-5-sejteket
3,25 bit %: f <140 színigIdái. al kelme zásával leválasztott ok a tálcák faláról, és i z 13 sejtírni sejtsöröséggel kompiéit tápkeiegbén eaüeipéndáifok:, 96 üregii mikzobitee-tálcáit üregeibe 133 p! iéffogatü aiikvofokát /4 x 13* sejti helyezbünk, a sejteket hagytuk az üregek falához tapadni, majd az üregekhez: 13:3 pl tápközegeh (önmagában} vagy szintén 133 pl, de meooklönális antitestet (5 ug/ml vegkoncentráoiőban} is tartalmazd tápközeget abfan-fc. 72 óra elteltével a tálcákat foszfáfpoftereit sdoldetiai (pR = 7,5} iedbiitetidk, kristályibolyával (0,5 %-os metanolos oldat) megfestettük, majd Sagarmah és mtsai. /Sc.ience 2311, lék /I9l5i:i leírása: szejrint relatív sej t proli f er áci őrá ieziiaifnin A 435 mono: kínnál is antitest az Im-BR-l-ssjtek relatív se;tpr?1 z*e' ar ’ ái <t. 53 %-ban gátolta
- sl F 7' - se j:1 e t telj e s
- i dő A 4D5 monoklonális antitestet sejtes iszátomábői származó, ISO 000 D mólekeiatömegtartományba tartozó - proteinek HRG-stlmniáita tz rozstfoszforilációiát gátló képességére is teszteltük (leolt és mtsai.: Canoer Research SS, 14 57 (1926) j. Az MCB7-sej Lekről leírták, hogy termeli valamennyi. ismert ErbR-reoeptort, de viszonylag alacsony szinten. Mivel az ErbEz, ErbBü és FrbEé moiekeiatömege csaknem azonos, a teljes sejtes iizátrmok Pestem-biot analízisével nem lehet megéllapítani, hogy melyik protein. rs rozst-fost tor liaoi.őja következik be, azonban ezek a sejtek ideálisak a HRG ti rozín-.f eszi orlláclő» tesztek végrehajtásához, mivel az alkalmazott vizsgálati feltételek mellett - exogén HRG hiányában - kis vagy kimutattarétién koncentrációban tartalmazzák a 181 Q9ö~es molekulatömeg- is r tenányba tartozó ti rozsn-iősziorziáit proteineket.
Az MCF7~sejtokát 21 Üregű tálcákra szél.eszreitük, majd mindegyik üreghez SrhBz elleni, antíteatekef adtunk, és a tálcákat szobahőmérsékleten 30 percig inkubáltuk, őzt követően mindegyik: üreghez - 0,2 nM végkoncent rációban rBRGÚÍ3,-?7_:24íi~poIipeptidet adtunk, és az Inknbálást S percig foiytartna. A táokozeget óvatosan mindegyik üregből leszívtuk, és a reakciókat 100 ai SSS-mintapoffér (5% BBS, 25 mM DTT én 25 mk Tri.s-HCl, pH - 6,0) hozzáadásával leáll! róttuk. Valamennyi mintát (25 pl) 4-12. t-os gradiens-gélen (üovex) elefctrcforizéltük, maja eiektroforstiknsan porivini iidén-dif1 uor i d membránra má aol tu k. Anti -fos z f ot i.roeí n ííGlöo az EBI terméke; I ug/nu. konoent rációban alkalmazva) immunbiotekat hívtunk ele, as a fő reaktív esik (ISO 000 D
-\m molekulatömegnéi ( intenzitását határoztuk mag [Iá, Holmes és mtsai. : Science 111, 1205
01.992;; Sí i konok 1 és mtsai,: u, Bioi. Chem. 259, 14651
09990],
A 11 monokionálís antitest e tesztben jelentés mértékben gátolta a 195 57'~er molekulatömegnél jelentkező, HRG-indnfcália tirozin-foazroríláoiés jel keletkezését. HPG hiányában at ant i tet t nem: volt kéme s st imulálni a 113 999es molekulatömeg-tartományba tartozó proteinek tározónfoszforiláeiöját. Ezenfelül, ez az antitest nem lép keresztreakcióba az HGPH-rel íkenőiy és másai.: dánost Research 55, 15 50 (1996)]:, uz árba3-mai és az HrbB4-gyeI. A
495 monokionális antitest a tirozin-foszforiiáció HRG általi stimulációját 50 %-ban képes gátolni.
A 405 monokionálís antitest duA-MB-175-sejtekre és SKΒΒ-3-sejtekre - exogén rHRGf$l jelenlétében, vagy hiányában gyakorolt szaporodásaitÁó hatását is megvizsgáltuk fid. Sokáéisr és mtsai,; Oncogene 15, 1395 (199?;]. M9A-MB-1lőréitekben az ErbBz-koncentráció 4-6-szór nagyobb, mint a normális emlő-epizlsireg sexben, és az ErbBl-BroSl receptor boA-bB-175-sejtemen konstitutív trrozi-fosztoriiácáot mutat. A 495 monokionálís ancítest az ADA-AB-l?5-sejtek proliiérációját - exogén H9G jelenlétében és hiányában egyaránt - képes gátolni , A 495-antitest sej toroliterációt gátló hatása az Ernái: termelődésének szintjétől függ [Leois ér murai.: Center Immunoi, Immnnothsr. 97, 255 (1995;]. SKΒΗ-3-sejtekben 66 5-os maximálás gátlást detektáltunk, azonban ez a határ szögén HHG-vei leküzdhető.
renzí t emet r1ava1
1® Humanizálás
Az egeresedet 5 4 £>5 monokionális sutit estei az 5 821 337 száma egyesült áiiumckoeii szabadalmi, leírásom (melyet teljes terjedelmében s kitanítás részének tekintünk; leírt ” gén kenve redős műt a gén,ez i.s stratégia alkalmazásával humanizáltuk. A következő kísérletekben alkalmazott, humanizált 4D5 monoklónális antitestet y'n.uMAb4D5-5!> néven azonosítjuk, Sz az antitest IgGi-izetipusé.
HBECB ATIb^--ndi kon j ugátumok
1) A HHAGEHTltd tusttatása
A HEdCEHTlM® ;nzöAfciD5™3, rzzödt Hidd); Ő uzl 337 számú egyesalf áliamorheli szabadalmi leírás) egy fiolányi menynyiménél (440 mg antitest: SO ml MES-pnfferben (25 mb ABS, oő mM hadi, pH - o,tj oldottak, majd a mintát - előzetesen MHG-puffezben skvilábráit - kátioncserélő oszlopra (sephazose S; 15 x 1,7 cm) töltöttük. Az oszlopot ezután ugyanezen paffét ötszörös oszloptérfogatával mostuk, majd a HERCEEGz®-t a puffét kaCi-koncentráoióiának 2G0 mb-rz történő növelésével előéltük, Az antitestét tartalmazd írakoöókat összeöntettök, .10 mg/ml-re hígítottuk, majd 5S mM kálium-foszfát, 50' cd ősül és 2 ni) BÉTA (pH - €, 5? összetételt puff erre 1 szemben diaii.záltnk.
£) A HEBGőBTIK®; módosítása. EoF-vel
A tisztított HEhCEPuIE^-antít estet ~ ditropírföilcsoportok létrehozása érdekében - N-szukoinimidil-á- (£~ pírtól1-tle)-pertsötéttel (3PP) módifikáitok. Az tetitestet (37t,Q mg; 3 mg/mlj 14,7 ml 5b tál kálium-ámszfát pufferben (pH ~ 5,5} - amely 50 mtí daCI-ot és 1 mik EDTA-t tartalmazott - SPF-vel (2,.3 mi ataoolPan 5,3 möl-egyeuérték SAP) keceltük. Szobahőmérsékleten 90 percig argongáz alatt végzett inkabálás arám a reakolóelegyet - 35 mb nátriumcifrát, lóé rh hadi és 2 mM EDTA Összetételű pufforral ekei 1ábráit - Sephaóex G2 3 oszlopon gélszartót. Az antitestet tartalmazó f rakodókat beszétütöttük és tesz tel. tűk. Az antitest módosításánok mértékét a fentebb leírtak szerint határoztuk meg. A módosított antitest (HERCEPTRŰ-SPP-Py} hozama 337 mg volt (89,7 %} (antitestenként 4,5 felszahadí.thatö z-tiopiridin-csopert.
3) HSRCEaTihg“SPP-Py konjugálása DHi-gyel
A módosított art trés tat (237,ü mg; 9,5 intői. félszobadithaté 2-tiopizddin-csoport) a fenti 35 mM nátrium-cifrát paff őrben (pH - 6,5) 2,5 mg/ml végkoncértrációra h lg), róttak. Az antitest-oldathoz 3,0 mf óimétil~acatamídban (DMA;
a rázolóéi egyben 3 V/7 1 végkoncénzráció; hdi-at adtunk (szerkezetét Id, az 1, ábrán; 1,7 agyenerték, 16,1 μηοΐ.) . A reakciót argongáz alatt, környezeti hőmérsékleten £0 óra hosszat folytattuk. A HkhCnPflh^-DHl koniugétumok szerkezetét a 2, ábrán, mutatjuk be.
*
- 117 s>
A reakcióélegyet Sephaocyl Sóöö gázszűrő oszlopra (5,0 cm x 90,0 cm; 1.,77 liter; töltöttük, melyet előzőleg 35 xü nátrzum-cit ráz. ás 154 mM haCl (pH - 6,5) összetételt mutterre 1 ekviiibráltunk. Az átfolyási sebességet 5,0 ml/percre állítottuk be, és 65 - egyenként .2.0,.6 ml térfogatú - frakciókét, gyűjtöttünk. A fc csúcs centruma a 47. frakció körűi volt (lel 3. ábra). A fő csaesöt a monomer üERCrrTIi)*-- Dúl alkotja. A 41-51,. frakciókat összeömiöl tűk és analizáltuk, Az egyes antitest-molekulákhoz kapcsolódó DM1-drogmolekólák számát az eb szőrben cl a 252 m és 280 nm hullámhossznál végzett mérésével, határoztuk meg, és azt találtuk, hogy tntrf esz-mc .f-ku),Inként r,7 drogmolekula kapcsolódik.
3, példa
Transzgenlkas állatok
A üEEClPTlir klinikai aktivitásának javítása céljából ttahszgenikus uEBu-egermodelif fejlesztettünk ki, amelyben elvégezhetek a HEAz-aiatú terápiák preklinikai fesztjei:, A cet-gén (amely a HER2 catkenyeredetü homológja) mutációval aktivált alakját empresszáió: transzgeníkus egerekben kónynyen keletkeznek tumorok, de az emlőrákokban túlzott mértékben termelt HZR2 nincs mutagenizáiva, és a tutor képződés sokkal kevésbé kifejezett azon transzgenikus egerekben, amelyek nem mutagenizáit H'SB.2~t termeinek túlzott mértékben (debster és mtsai,; Sémin. Canoer Siói. 5, 69 61994]]. A turné .rkép<Z:©dée műt agenlzá la titán 313 2 - ve 1. tör térni
CX.'V *·
3.11 érdékében transzgémikus egeremben egy stratégiát alkalmaztunk a mutagenizálatian HER2 tűitermeiődésének további tokozására .
A feltárt, konstrukciókban bármely promóter alkalmazható, amely elősegíti a HEH egér tejmirigyben lévő eoitbeisejtellen történd expressziöját. özémos tajproteingén transzkripcióia olyan promőterek és erősitőszekveneiák ('!en.hancs.rw-ek) szabályozása alatt következik be. melyek specifikusan az tejminigyekben aktinak, A tejproietn-gének köze tartoznak a. Kazeineket (y-lh őé β; , β-laktogioóuiint α-iakiainunint és savas tét savó proteineket kódoló gének. Az ovin β-iaktobiobulin promóter részletesen karakterézált es széles körben alkalmazott promóter íöhiteiav és mtsai,: Bioohem. 1, 23ő, 31 (1392)], ugyanakkor, egyéb fájókból származó, ha.aonlő promóter iNS~fragmensek is alkalmazhatok. Az egyik előnyős promóter az egér emlőtumor vírus (hlATb) hosszt terminális ismétlőmé seb ŐI (LTR): származó promóter. A találmány szerinti HE.R2 transzgén-konstrukolót az MM7V-LT.Rpromóter alkalmazásával hoztuk. létre.
A mutageni zálat lan 3BR2-vei bekövetkező tumorképződés javítása érdekében - HER2 oRES-plazmid alkalmazásával transzgenikus egereket hoztunk lésre, mely p3.azmi.dban az 52-végi. ATG bázishármast eiz.ávolitattuk, hogy megskadálv...zzuk a transzláció ilyen 5'-végi ATG kőbánoknál be köve* terű inioiáclóját, ami egyébként csökkentené a KIRÓ eredeti 31végi kezdökodonja általi transzlációs iuioiáciő gyakoriságát (id. pl. Chilid és mtsai,: 1. Bioi. Chem, 2 7 4, 21335 (1993)] . Ezen. tulmenőau:, a cSNB 5' -végéhez kimérIkus
113 intront ainunk, amely szinté;; fokoz hatja &z expresszlő szintjét (ahogy azt korábban leírták, pl. Nenberger és Williams:: Nucleíc Acids les. 16, 6716 (19386 3 ; Baobmam és Berg; Moi, leli. Bioi. 6, 1396 (1983); Brinster és mtsai,: Brcc. háti. Acad, Sói, USA 6 5, 936 (1933)j, A kiméri kas vektor a iromega által forgalmazott pCl-neo emlős expresszfős vektorból származik (890:-1022, oázispár;. A cBNS 3J-régét a humán növekedés 1 hormon 4, és 5. exonja, valamint poiladenilációs szekvenciák szegélyezik. Az egérmodell létrehozására vVB-egereket alkalmaztunk, mivel ez a törzs fogékonyabb a tumorképzöoésre. Az hMik-LTB-ből származó promotert a HB22 te(mirigyben bekövetkező szevetspscifikus expressziójának biztosítása céljából használtok. Az
állatokén A IN jelt diétán tart o f t. u k, hogy fokozzak a.
t um o r k é ρ z Ö d é s i hajlamot ; 3 ao e s mtsai,: Breast Canoer Rés.
and Freanment 45, 7 4 5 (19971), A létrehozott transzgénés
plazmidkonstrukoió nukleotidszekvenoiáját (1. azonos!tiszámú szekvencia) a 4. ábrán mutatjuk be.
A transzgenikus kisérietekre alkalmas állatok kereskedelmi forrásokból beszerezhetők (pl. Taconic; Gernantoon, K.Y.). Számos törzs felhasználható, azonban - nagyobb cororképződési haj(emuk miatt - a nőstény FVB-egerek alkalmazása. előnyös. A ham BVB-egereket péroztatásra, aig a vasectomizaiz CD, 1 ármezen álterhesség kralokolásának stfmulálásáre használtok. A vasectomizáit egerek kereskedelmi, forgalomban beszerezhetőkAz alapitő állatokat Főiegerekkel vagy I29/BL6 x FVB por heterozigóca egerekkel tenyessiettok kereszteztük, A pS3~alIáira heterozigőts egerekel a tumorképződós lehetőségének növelése céljából a lkaimáztuk, azonban ez szükségtelennek bizonyult. Ennek megfelelően, bizonyos Fi tumorok kevert törzsből valók. Az alapító állatok tumorjai tisztán EVB-vonslnak, hat alapitó állatot kaptunk, melyeklen (utődok kihordása nélkül) némi t umo r kép zödé s ve i t tap as z tat be t ó,
HERz-transzgénes egér, mint a Ö£E2-aiapú terápiák tanulnán y o z ae á.na k t umo rmod e l 1 j e
A 3, példában ieirtak szerint létrehozott, kt. két hónapos alapító transzgenikus egerek tejmirigyelbői vett biopsriáfcban - irtmunhisztokém.iaí festéssel - a HER2 3e mértékű termelődését mutattuk ki, A HŰRE ertraceiiulárís doménjének (ECS) vérsavóba került mennyiségét meghatározva ko. 1,2 ng/ml értéket mértünk (huang és mtsai., iá. fentebb) . Ebben az egérben - öt hónapos korban, négy alom ellése után - emlőtumor alakúit ki. A tumort aszeptikus feltételek mellett sebészetileg eltávolítorruk, maid apró, 2 mmt-es darabokra vagdaltuk, és ezeket vad típusú nőstény FVE-egetek emlő-zsirpárnáiha. t.rsrszplantáltuk„ 31 reoipiens egér közül - bt hetes iappangáéi idő után - 22-ben fejlődtek ki tumorok, A későből átültetéseket követően a tumorok rdvídebb iappangásl idővel fejlődtek kis, gyorsabban növekedtek, és a tumorok a recípiemsek több, mint /5 %-ánál fordultak elő, A HER2-termelődés immunhisztokémlai festéssor maghatározott szintje 3t volt, amely a primer tumorban
:.>· heterogénnek bizonyult, de az első átültetés után egységesen 1+ szent volt klmatatusbő..
A tumort hordoze egerek HBEGBFTlh*-ueÍ. vagy 405antitesttel (egéreredetű antitest, amelyből a humanizált nEkilFTLN® származik; végzett kezelése csak mérsékelt hatást gyakorolt a transsplantáit tumorok növekedésére (id., 5. ábra), A üeRCbeTld-nei. vagy IDr-antitesttel végzett kezelés során a növekvő tumorokban a HEK2-termelődés őt szintű volt,· ami azt jelzi, hogy KEPz-uegatÍv tumorok nem voltak. Ezenfelül, a tumort hordozó egerekbe történő injektálás után a tumotsejteken oyo-hEPCEFTll'-t detektáltunk, ami azt mutatja, hogy a babáé nem amiazt maradt el, hogy az aht_t< vt -A - : n i hút 3 dmu;.
A HEF.2 folyamatos termelődése és e tamormodsilben a HeECEPTilá'-re adott reakció: hiánya miatt egy áj megközelítési módot teszteltünk, melynek során DM1 mayransineidhoz konjugált BEECBFlld®-t (Id. 5- példa) alkalmaztunk. Az 5. ábrán látható, hogy a HSRCERTld-DMI konjugátum e modellben rendkívüli tumor ellenes aktivitást .felt ki. E ki séri etekben negatív kontrolIkont a BllűMAE®-! alkalmaztuk, amely egy CD20 elleni, nem rokon monokiorális antitest, A kontroll RI?l'XAM's'~hoz keresi a HEDCEPTTtl-re reakciói alig tapasztaltunk, a HEBCEETTkl mogtansinoid-honjugátuma azonban erőteljes tumoréilenes aktivitást mutatott. Ahogy az 5. ábrán látható:,: a hERCEFllb^-mayfszzsinoid koajAgátnmmal késéit: egerek .mindegyikében a tumorok egyértelmű zsugorodása volt megfigyelhető, azonban a: tumorok egyike sem tűnt el. hozzávető lég négy hét elteltével: a tumorok ismét növekedni, kezdSs.
- 116 fék, Ekkor Öt állatot leoltunk, se ezek tumorairól megállapítottuk, hogy a HEHz-t 3t szinten. termelik. Ilyenformán, a HEA2-negatív tumorokra nem volt szelekció. S megfigyelés alapján a maradék három egeret a HERGEáTIim-maytansinoid kenj ugatummal öt egymást kévető napon kezeltük, és a tumorok a kezelés hatására lemét visszafejlődtek.
A taiálmánv leírásában említett valamennyi hivazkezást teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni.
Az alábbi bib.r idoma-sejtvonalakat az .American lype
Golfűré Collégiion-nél (AIGCy 3.0813. no. i var sí t. y Bonle várd, bánás sas, CA 20112-2219, FSA) helyeztük letétbe;:
Antitest elnevezése AI1C ny1rv.azám betétbe helyezés dátuma
712 ATCC HB-liziő 1996, ott. 17,
7F3 ATCC EB-32216 1996. ott. 17,
idő ATCC CR1 10563 1930. május 25
2C4 ATCC nS-12697 1999, ápr, S.
A sejtvonalakat a Budapesti Szerződésnek megfelelően helyezték letétbe, Ez nizfősitja az életképes tenyészetek letétbe helyezés dátumától számitott 30 évig történd fenntartását. A letérne helyezett organizmusoknak - a Budapesti
Szerződés rendelkezésein.ek és a Genentech Inc. és az ATCC közötti megállapodásnak megfelelően [amely a vonatkozó egyesült államokbeli szabadalom megadása vagy az egyesült államokbeli vagy más országbeli szabadalmi bejelentés közzekét ele után (akármelyik, is történjék korábban) a tényéτη szerek utódsejtéinek folyamatos és korlátlan hozzáférhatóságéi biztosítja a köz számára, valamint az ö.S. Connzssicnsr of Patents and Traoemarks szerint (a ói oSC is2. paragrafus, valamint a vonatkozó törvények alapján, ideértve a 37 1FR 1.12 paragrafust. különös tekintettel a S3€ 01 633~ra: arra jogosultak számára] - az ATCC-néi hozzáférhetöknek keli lenniük.
A jelen találmány jogosultja megállapodást kötött, hogy amennyiben a letétbe helyezett tenyészetek megfelelő feltételez mellemz végzett tenyésztés során elpusztulnának, elvesznének vagy megsemmisülnének, bejelentés alapján azonos tenyészet életképes mintáival azonnal pótlásra kerülnek. A letétbe helyezett törzsek hozzáférhetősége nsas tekinthető arra vonatkozó engedélyként, hogy a. találmány szerinti megoldás gyakorlati kivitelezése a szabadalmi törvényes biztosította jogok megsértésével végrehajtható legyen.
Á találmány leírását elégségesnek tártjuk arra:, hogy a találmány szerinti megoldás szakember számára kivitelezhető legyen. A találmány oltalmi köre nem korlátozódik a letétbe helyezett konstrukciókra, mivel azok a találmány bizonyos szempontjainak szemléltetését szolgálják, és valamennyi, funkcionálisan egyenértékű konstrukció a találmány igényeit, oltalmi körébe tartozik. A fentebb említett anyagok, letétbe helyezése nem jelenti, annak elismerését, hogy a találmány leírása elégtelen a találmány szerinti megoldás bármely szempontja gyakorlati kivitelezéséhez (ideértve azok legjobb megvalósitúsz módjalt isi, Illetve nem jelentik az Igénypontok spéci ti kus megvalós ít ési. módokra történő kor iá- 118 *
hozásáé. A találmány leírása alapján szakember számára kézenfekvő, hogy a találmány szerinél megoldásban, különféle módoeitáeok hajthatók végre aséiknl, hogy eltérnénk a találmányi gondolattól. Az ilyen megoldások az igényelt óllá lmi: kömön belül maradnak..
Az igénypontokban említett valamennyi anyag és el;árás elvárható mennyiségű kísérleti munkával elöáliittató, il~ 1etve megvalősi tnatő,

Claims (8)

  1. Szaladelmí igénypontok
    1. Anzizesz-raytansinoid kon joga som, amelyben az antitest a huMAfoiD5-3 vagy a iuMAfo4D5-3 antigénhez kötődő íragmense, vagy ilyen koniagátamot tartalmazd gyógyászati készítmény irtóz-receptort tál zott menirpíségben termelő tasor emberben történő keselésére történő: alkalmazásra.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti kon jégáron vagy gyógyászat - mn.·. a..ol 5 ür’ tűn 'on-'_ \ 5 r; ad: roa:a, a hoki Ab 4 0 5 - 8 a n 111 e s 11 e 1 t ő r t én ő k e z e 1 ő s re.
  3. 3. Az I. vagy 2. tóonvtc -omtó \c\O'oom vssy gyógyászati készitmény, ahol. a maytansizoíd maytansinoi, raytansinoi-észter vagy bői.
  4. 4. A z 1. ~ 3. 1 g é n y p ο n t o k b á nse I y i k e s z e r ί n 11 k ο n j u g a t um vagy gyógyászati készítmény, ahol (ló a konjagátam vagy gyógyászati készítmény kemoterápiás szerrel egvatt történő alkalmazásra szolgál, különálló gyógyászati készítmények vagy egyetlen gyógyászati készítmény felhasználásával; vagy (11; a konjogáhum vagy gyógyászati készítmény kemoterápiás szerrel egymása kővetően történő alkalmazásra szolgái bármilyen adagolási sorrend mellett.
  5. 5. A. 4, igénypont szerinti konjugatom. vagy gyógyászati készítmény, ahol a kemoterápiás szer taxán.
  6. 6. Az 1.-3. igénypontok bármelyike szerinti konjrgátom vagy gyógyászati készítmény, amely egy második anti-Er.b.32- 120 ant átestiül törteed egy üttes: kezed ég és. ezoigái:.
  7. 7, A ő> igénypont szerinti konjugátum vagy gyógyászati készítmény, ahol a második anti-ErbBz-antítest hiokkoija az ErbS2 Ugandám álcái; aktiválását.
    3, A 7. igénypont szerinti konj ágálsz vagy gyógyászati készítmény, ahol a második ant v-lztii- anti test humanizált
    2Cá (A2C2 BB-12O7) ,
    S. Az 1. vagy 2, igénypont szerinti kon jogé tűz vagy gyógyászati készítmény, ahol a tumor a következők valamelyike: plkkelysejtes rák, epítheiiaiis pikkelysegtes rák, tüdőrák, kissejtes tüdőrák, nem kissejtes tüdőrák, tüdőadenokarctnoma, a plkkelysejtes tüdőkaróinoma, hashártya ráki májsejtrák, emésztőszervi rák, gyomorrát, gyomorbélrendszer rákja, hasoyálmárigyrák, girobiastoma, méhnyakrák, petefészekrák, májrák, hőiyagrák, hepatorna, emlőrák, vastagbélrák, végfoelrák, vastag- és végbélrák, endometriális: rák, méhrgk, nyáimirigyrák, veserák, vesesejtes rák, prosztatarák, szeméremtesti rák, pgjzsmirigyrák, máj ka re i ma, végbe!kareiroma, pániszkarcinoma, valamint fej.....és nyakrák.
  8. 12. A 9. Igénypont szerinti konjugátum vagy gyógyászati készítmény, ahol a tumor emlőrák.
HU0201616A 1999-06-25 2000-06-23 Anti-ErbB antitest/maytansinoid konjugátumok alkalmazása rákos betegségek kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására HU230586B1 (hu)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14131699P 1999-06-25 1999-06-25
US60/141,316 1999-06-25
US18984400P 2000-03-16 2000-03-16
US60/189,844 2000-03-16
PCT/US2000/017229 WO2001000244A2 (en) 1999-06-25 2000-06-23 METHODS OF TREATMENT USING ANTI-ErbB ANTIBODY-MAYTANSINOID CONJUGATES

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0201616A2 HUP0201616A2 (en) 2002-08-28
HUP0201616A3 HUP0201616A3 (en) 2004-11-29
HU230586B1 true HU230586B1 (hu) 2017-02-28

Family

ID=26838985

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0201616A HU230586B1 (hu) 1999-06-25 2000-06-23 Anti-ErbB antitest/maytansinoid konjugátumok alkalmazása rákos betegségek kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására

Country Status (20)

Country Link
EP (5) EP2283866B1 (hu)
JP (3) JP4780633B2 (hu)
KR (1) KR20020012292A (hu)
CN (1) CN100482281C (hu)
AU (1) AU784157B2 (hu)
BR (3) BRPI0012196B8 (hu)
CA (1) CA2370466C (hu)
CY (1) CY1120070T1 (hu)
DK (3) DK2283866T3 (hu)
ES (3) ES2466715T3 (hu)
HK (5) HK1133600A1 (hu)
HU (1) HU230586B1 (hu)
IL (2) IL147241A0 (hu)
LT (1) LT2803367T (hu)
MX (1) MXPA01013240A (hu)
NZ (1) NZ515975A (hu)
PL (1) PL213213B1 (hu)
PT (3) PT2803367T (hu)
SI (1) SI2803367T1 (hu)
WO (1) WO2001000244A2 (hu)

Families Citing this family (183)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6949245B1 (en) 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
BRPI0012196B8 (pt) * 1999-06-25 2021-05-25 Genentech Inc artigo industrializado
HU226742B1 (en) * 1999-06-25 2009-08-28 Genentech Inc Humanized anti-erbb2 antibodies and treatment with anti-erbb2 antibodies
US7303749B1 (en) 1999-10-01 2007-12-04 Immunogen Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
CA2385528C (en) * 1999-10-01 2013-12-10 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
EP1231944A2 (en) * 1999-11-15 2002-08-21 University Of Southern California Targeted delivery of therapeutic and diagnostic moieties
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
KR20030007640A (ko) 2000-05-19 2003-01-23 제넨테크, 인크. ＥｒｂＢ 길항제에 의한 암 치료요법에 대한 효과적인반응의 가능성을 개선시키기 위한 유전자 검출 분석
WO2002081649A2 (en) 2001-04-06 2002-10-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania ErbB INTERFACE PEPTIDOMIMETICS AND METHODS OF USE THEREOF
US20030103985A1 (en) 2001-05-18 2003-06-05 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates
EP1258255A1 (en) * 2001-05-18 2002-11-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Conjugates of an antibody to CD44 and a maytansinoid
US6441163B1 (en) * 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
AU2003226065B2 (en) * 2002-04-12 2009-02-26 Ludwig Institute For Cancer Research, Ltd Recombinant anti-interleukin-9 antibodies
DE60334452D1 (de) 2002-05-23 2010-11-18 Univ Pennsylvania Fas peptid-mimetika und ihre verwendungszwecke
DK1585966T3 (da) * 2002-07-15 2012-02-20 Hoffmann La Roche Behandling af cancer med anti-ErbB2-antistoffet rhuMab 2C4
KR100555211B1 (ko) * 2002-07-16 2006-03-03 주식회사 팬제노믹스 항암효과를 갖는 Ｈｅｒ-２/ｎｅｕ ＤＮＡ 백신
EP1391213A1 (en) * 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
CA2525553C (en) * 2003-05-14 2011-07-05 Immunogen, Inc. Maytansinoid-antibody conjugate compositions
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
MXPA05014152A (es) * 2003-06-27 2006-05-25 Abgenix Inc Anticuerpos dirigidos a los mutantes de delecion de receptor de factor de crecimiento epidermico y sus usos.
ES2579836T3 (es) 2003-11-06 2016-08-17 Seattle Genetics, Inc. Compuestos de monometilvalina capaces de conjugación con ligandos
MXPA06006009A (es) * 2003-11-28 2006-09-04 Mitra Medical Technology Ab Direccionamiento de antigenos erb.
US7662936B2 (en) * 2004-04-07 2010-02-16 Genentech, Inc. Mass spectrometry of antibody conjugates
CN102614521A (zh) * 2004-05-14 2012-08-01 阿布拉西斯生物科学公司 利用白蛋白-结合蛋白作为靶标的治疗方法
AU2005249490B2 (en) 2004-06-01 2010-07-29 Genentech, Inc. Antibody drug conjugates and methods
CA2580141C (en) 2004-09-23 2013-12-10 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
HUE025449T2 (hu) 2004-12-09 2016-04-28 Janssen Biotech Inc Integrin elleni immunkonjugátumok, eljárás elõállításukra és alkalmazásuk
JP2008528486A (ja) 2005-01-21 2008-07-31 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｈｅｒ抗体の一定投薬
BRPI0606542A8 (pt) 2005-02-23 2018-03-20 Genentech Inc métodos para aumentar o tempo de progressão de uma doença (ttp)
CN100398558C (zh) * 2005-05-10 2008-07-02 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段及其编码基因与应用
JP2006316040A (ja) * 2005-05-13 2006-11-24 Genentech Inc Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）補助療法
WO2007019232A2 (en) 2005-08-03 2007-02-15 Immunogen, Inc. Immunoconjugate formulations
US8080534B2 (en) 2005-10-14 2011-12-20 Phigenix, Inc Targeting PAX2 for the treatment of breast cancer
KR20090115980A (ko) 2007-03-02 2009-11-10 제넨테크, 인크. 낮은 ｈｅｒ３ 발현을 기초로 한 ｈｅｒ 이량체화 억제제에 대한 반응 예측
US9551033B2 (en) 2007-06-08 2017-01-24 Genentech, Inc. Gene expression markers of tumor resistance to HER2 inhibitor treatment
EP2171090B1 (en) 2007-06-08 2013-04-03 Genentech, Inc. Gene expression markers of tumor resistance to her2 inhibitor treatment
BRPI0906049A8 (pt) 2008-03-14 2018-06-26 Genentech Inc método para determinar se um câncer em um paciente é resistente ao tratamento com um agente antimitótico, método para tratar um paciente com câncer que é resistente ao agente antimitótico e método de tratamento
DK2644194T3 (en) 2008-03-18 2017-07-03 Genentech Inc Combinations of an anti-HER2 antibody-drug conjugate and docetaxel
EP2282769A4 (en) 2008-04-29 2012-04-25 Abbott Lab DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND ITS USES
WO2009149189A2 (en) 2008-06-03 2009-12-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
NZ589436A (en) 2008-06-03 2012-12-21 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
BRPI0812682A2 (pt) 2008-06-16 2010-06-22 Genentech Inc tratamento de cáncer de mama metastático
JP5674654B2 (ja) 2008-07-08 2015-02-25 アッヴィ・インコーポレイテッド プロスタグランジンｅ２二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
AU2010203353B2 (en) 2009-01-12 2016-06-16 Cytomx Therapeutics, Inc Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
SG10201402742YA (en) 2009-03-20 2014-08-28 Genentech Inc Bispecific anti-her antibodies
SG10201507044PA (en) 2009-05-29 2015-10-29 Hoffmann La Roche Modulators for her2 signaling in her2 expressing patients with gastric cancer
NZ598929A (en) 2009-09-01 2014-05-30 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
JP2013504585A (ja) 2009-09-09 2013-02-07 セントローズ， エルエルシー 細胞外標的化薬物複合体
AU2010306677B2 (en) 2009-10-15 2013-05-23 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
RU2587619C2 (ru) 2010-02-18 2016-06-20 Дженентек, Инк. Антагонисты неурегулина и применение их в лечении злокачественного новообразования
MX2012011901A (es) 2010-04-15 2012-11-29 Spirogen Sarl Pirrolobenzodiacepinas y conjugados de las mismas.
WO2011146568A1 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Genentech, Inc. Predicting response to a her inhibitor
EP2576621B1 (en) 2010-05-27 2019-04-10 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2
EP2575880B1 (en) 2010-05-27 2019-01-16 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2 epitope
CA3220104A1 (en) 2010-06-08 2011-12-15 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
WO2012018790A2 (en) 2010-08-03 2012-02-09 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
MX2013002270A (es) 2010-08-26 2013-05-14 Abbvie Inc Inmonoglubinas de dominio variable doble y usos de las mismas.
TW201302793A (zh) 2010-09-03 2013-01-16 Glaxo Group Ltd 新穎之抗原結合蛋白
CN103313990B (zh) 2010-11-17 2016-07-20 基因泰克公司 丙氨酰美登醇抗体偶联物
EP2643353A1 (en) 2010-11-24 2013-10-02 Novartis AG Multispecific molecules
WO2012085111A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
WO2012100346A1 (en) 2011-01-24 2012-08-02 Ym Biosciences Inc. Antibodies selective for cells presenting egfr at high density
US20140170149A1 (en) 2011-04-20 2014-06-19 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2 and cd3
EP2707723B1 (en) 2011-05-12 2016-02-10 Genentech, Inc. Multiple reaction monitoring lc-ms/ms method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature pepides
US20140363438A1 (en) 2011-08-17 2014-12-11 Genentech, Inc. Neuregulin antibodies and uses thereof
US9055757B2 (en) 2011-10-05 2015-06-16 Fmc Corporation Stabilizer composition of co-attrited microcrystalline cellulose and carboxymethylcellulose, method for making, and uses
EP2764046B1 (en) 2011-10-05 2021-04-21 DuPont Nutrition USA, Inc. Stabilizer composition of microcrystalline cellulose and carboxymethylcellulose, method for making, and uses
MX350152B (es) 2011-10-14 2017-08-29 Medimmune Ltd Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de las mismas.
US9327023B2 (en) 2011-10-25 2016-05-03 The Regents Of The University Of Michigan HER2 targeting agent treatment in non-HER2-amplified cancers having HER2 expressing cancer stem cells
KR20140098834A (ko) 2011-11-30 2014-08-08 제넨테크, 인크. 암에서의 erbb3 돌연변이
WO2013083810A1 (en) 2011-12-09 2013-06-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Identification of non-responders to her2 inhibitors
EP2787836A4 (en) 2011-12-09 2015-05-27 Fmc Corp Inc TOGETHER DECOMMINATED STABILIZER COMPOSITION WITH INCREASED STRENGTH
WO2013102042A2 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against il-13 and/or il-17
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
CN104220457A (zh) 2012-03-27 2014-12-17 霍夫曼-拉罗奇有限公司 涉及her3抑制剂的诊断和治疗
CN103566377A (zh) * 2012-07-18 2014-02-12 上海博笛生物科技有限公司 癌症的靶向免疫治疗
CA2887897C (en) 2012-10-12 2020-02-18 Adc Therapeutics Sarl Pyrrolobenzodiazepine-anti-cd25 antibody conjugates
US9931414B2 (en) 2012-10-12 2018-04-03 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
ES2680153T3 (es) 2012-10-12 2018-09-04 Adc Therapeutics Sa Conjugados de anticuerpos anti-PSMA-pirrolobenzodiazepinas
PL2839860T3 (pl) 2012-10-12 2019-10-31 Medimmune Ltd Pirolobenzodiazepiny i ich koniugaty
US10751346B2 (en) 2012-10-12 2020-08-25 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine—anti-PSMA antibody conjugates
EP2906297B1 (en) 2012-10-12 2017-12-06 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
HUE035694T2 (hu) 2012-10-12 2018-05-28 Adc Therapeutics Sa Pirrolobenzodiazepin-anti-CD22 antitest konjugátumok
TWI601745B (zh) 2012-11-01 2017-10-11 艾伯維有限公司 抗－ｖｅｇｆ／ｄｌｌ４雙重可變區域免疫球蛋白及其用途
RU2692773C2 (ru) 2012-11-30 2019-06-27 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Идентификация пациентов, нуждающихся в совместной терапии с использованием ингибитора pd-l1
US9562049B2 (en) 2012-12-21 2017-02-07 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN105246894A (zh) 2012-12-21 2016-01-13 斯皮罗根有限公司 用于治疗增殖性和自身免疫疾病的非对称吡咯并苯并二氮杂卓二聚物
SG11201507214SA (en) 2013-03-13 2015-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CA2904044C (en) 2013-03-13 2020-03-31 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
BR112015023333A8 (pt) 2013-03-13 2018-04-17 Medimmune Ltd pirrolbenzodiazepinas e conjugados dos mesmos
US9062108B2 (en) 2013-03-15 2015-06-23 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against IL-1 and/or IL-17
MX2016001862A (es) 2013-08-12 2016-08-03 Genentech Inc Compuestos de conjugado anticuerpo-farmaco dimerico de 1-(clorometil)-2,3-dihidro-1h-benzo[e]indol, y metodos de uso y tratamiento.
WO2015052532A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US9950078B2 (en) 2013-10-11 2018-04-24 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2015052535A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3480215B8 (en) 2013-11-19 2021-07-28 RemeGen Co., Ltd. Anti-her2 antibody and conjugate thereof
MX2016007578A (es) 2013-12-16 2016-10-03 Genentech Inc Compuestos de conjugado anticuerpo-farmaco dimerico de 1-(clorometil)-2,3-dihidro-1h-benzo [e] indol, y metodos de uso y tratamiento.
EP3082874A2 (en) 2013-12-16 2016-10-26 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
CR20160271A (es) 2013-12-16 2016-12-02 Genentech Inc Compuestos peptidométicos y sus conjugados de anticuerpo-fármaco
JP6130517B2 (ja) 2013-12-25 2017-05-17 第一三共株式会社 抗ｔｒｏｐ２抗体−薬物コンジュゲート
JP6957154B2 (ja) 2014-01-10 2021-11-02 バーディー バイオファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 免疫療法のための化合物及び組成物
SI3466976T1 (sl) 2014-01-31 2021-12-31 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-her2 konjugat protitelesa-zdravila
ES2754348T3 (es) 2014-04-10 2020-04-17 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugado de (anticuerpo anti-HER2)-fármaco
US10124070B2 (en) 2014-06-06 2018-11-13 Redwood Bioscience, Inc. Anti-HER2 antibody-maytansine conjugates and methods of use thereof
CN105440135A (zh) 2014-09-01 2016-03-30 博笛生物科技有限公司 用于治疗肿瘤的抗-pd-l1结合物
CA2954446A1 (en) 2014-07-09 2016-01-14 Shanghai Birdie Biotech, Inc. Anti-pd-l1 combinations for treating tumors
JP6531166B2 (ja) 2014-09-10 2019-06-12 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピン及びそのコンジュゲート
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN106714844B (zh) 2014-09-12 2022-08-05 基因泰克公司 蒽环类二硫化物中间体、抗体-药物缀合物和方法
BR112017003236A2 (pt) 2014-09-12 2017-11-28 Genentech Inc anticorpos elaborados com cisteína, conjugados de droga e anticorpos, método de preparação de conjugado de droga e anticorpo e composição farmacêutica
AU2015317653A1 (en) 2014-09-17 2017-04-06 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and antibody disulfide conjugates thereof
EP3206717B1 (en) 2014-10-17 2020-11-25 Novartis AG Combination of ceritinib with an egfr inhibitor
CN107148285B (zh) 2014-11-25 2022-01-04 Adc治疗股份有限公司 吡咯并苯并二氮杂䓬-抗体缀合物
MX2017007169A (es) 2014-12-03 2018-05-02 Genentech Inc Compuestos de amina cuaternaria y conjugados de anticuerpofármaco de los mismos.
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
BR112017021688A2 (pt) 2015-04-17 2018-08-14 Bristol-Myers Squibb Company composições compreendendo uma combinação de um anticorpo anti-pd-1 e outro anticorpo
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
JP6787890B2 (ja) 2015-06-29 2020-11-18 第一三共株式会社 抗体−薬物コンジュゲートの選択的製造方法
AU2016290065B2 (en) 2015-07-07 2022-08-11 Genentech, Inc. Combination therapy with an anti-HER2 antibody-drug conjugate and a Bcl-2 inhibitor
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
CN106943597A (zh) 2016-01-07 2017-07-14 博笛生物科技（北京）有限公司 用于治疗肿瘤的抗-egfr组合
CN115554406A (zh) 2016-01-07 2023-01-03 博笛生物科技有限公司 用于治疗肿瘤的抗-cd20组合
CN115350279A (zh) 2016-01-07 2022-11-18 博笛生物科技有限公司 用于治疗肿瘤的抗-her2组合
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
EP3433621A1 (en) 2016-03-25 2019-01-30 H. Hoffnabb-La Roche Ag Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
WO2017194554A1 (en) 2016-05-10 2017-11-16 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Combinations therapies for the treatment of cancer
CA3025019A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Biohaven Pharmaceutical Holding Company Ltd. Use of glutamate modulating agents with immunotherapies to treat cancer
EP3458101B1 (en) 2016-05-20 2020-12-30 H. Hoffnabb-La Roche Ag Protac antibody conjugates and methods of use
WO2017205741A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Genentech, Inc. Bioanalytical method for the characterization of site-specific antibody-drug conjugates
EP3464280B1 (en) 2016-06-06 2021-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
CN109689111B (zh) 2016-08-11 2024-04-05 基因泰克公司 吡咯并苯并二氮杂䓬前药及其抗体缀合物
WO2018060833A1 (en) 2016-09-27 2018-04-05 Novartis Ag Dosage regimen for alpha-isoform selective phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor alpelisib
CN110139674B (zh) 2016-10-05 2023-05-16 豪夫迈·罗氏有限公司 制备抗体药物缀合物的方法
AU2017341000A1 (en) 2016-10-07 2019-04-11 Daiichi Sankyo Company, Limited Therapy for drug-resistant cancer by administration of anti-HER2 antibody/drug conjugate
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
TW201828993A (zh) 2016-12-12 2018-08-16 日商第一三共股份有限公司 抗體－藥物結合物與免疫檢查點抑制劑之組合
KR102537651B1 (ko) 2017-01-17 2023-05-26 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 gpr20 항체 및 항 gpr20 항체-약물 콘쥬게이트
DK3544636T3 (da) 2017-02-08 2021-05-10 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepin-antistof-konjugater
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
TW201834649A (zh) 2017-03-02 2018-10-01 新加坡商亞獅康私人有限公司 癌症療法
US20210330801A1 (en) 2017-03-02 2021-10-28 Cadila Healthcare Limited Novel protein drug conjugate formulation
CA3058175A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
DK3612537T3 (da) 2017-04-18 2022-08-08 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepinkonjugater
PL3612234T3 (pl) 2017-04-20 2024-09-02 Adc Therapeutics Sa Terapia skojarzona z koniugatem anty-AXL przeciwciało-lek
CN118515666A (zh) 2017-04-27 2024-08-20 博笛生物科技有限公司 2-氨基-喹啉衍生物
TWI794230B (zh) 2017-05-15 2023-03-01 日商第一三共股份有限公司 抗ｃｄｈ６抗體及抗ｃｄｈ６抗體-藥物結合物、以及其製造方法
WO2018222135A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Aslan Pharmaceuticals Pte Ltd Cancer therapy
EP3638373B1 (en) 2017-06-14 2024-09-04 ADC Therapeutics SA Dosage regimes for the administration of an anti-cd19 adc
AU2017419352B2 (en) 2017-06-23 2024-05-30 Birdie Biopharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions
ES2906965T3 (es) 2017-08-18 2022-04-21 Medimmune Ltd Conjugados de pirrolobenzodiazepina
CN111051330A (zh) 2017-08-31 2020-04-21 第一三共株式会社 抗体-药物缀合物的改进制备方法
CN117865839A (zh) 2017-08-31 2024-04-12 第一三共株式会社 制备抗体-药物缀合物的新方法
EP3684773A1 (en) 2017-09-20 2020-07-29 pH Pharma Co., Ltd. Thailanstatin analogs
WO2019075468A1 (en) 2017-10-15 2019-04-18 Bristol-Myers Squibb Company TUMOR TREATMENT METHODS
WO2019150985A1 (ja) * 2018-01-31 2019-08-08 国立大学法人東京大学 抗体薬物複合体及びそれを含む医薬組成物
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
TW202003565A (zh) 2018-03-23 2020-01-16 美商必治妥美雅史谷比公司 抗mica及/或micb抗體及其用途
KR20200139724A (ko) 2018-03-30 2020-12-14 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 종양을 치료하는 방법
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP4257611A3 (en) 2018-05-18 2024-03-06 Glycotope GmbH Anti-muc1 antibody
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
EP3870235A1 (en) 2018-10-24 2021-09-01 F. Hoffmann-La Roche AG Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use
CN113227119A (zh) 2018-12-10 2021-08-06 基因泰克公司 用于与含Fc的蛋白质进行位点特异性缀合的光交联肽
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
CN110396130B (zh) * 2019-08-23 2020-06-30 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种鼠抗人ErbB2单克隆抗体10A6、编码基因及其制备方法和应用
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
AU2021416156A1 (en) 2020-12-28 2023-06-22 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumors
MX2023007734A (es) 2020-12-28 2023-08-21 Bristol Myers Squibb Co Composiciones de anticuerpos y metodos de uso de las mismas.
EP4314068A1 (en) 2021-04-02 2024-02-07 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
TW202334238A (zh) 2021-11-30 2023-09-01 日商第一三共股份有限公司 蛋白酶分解性遮蔽抗體
IL314707A (en) 2022-02-09 2024-10-01 Daiichi Sankyo Company Ltd Environmentally reactive masked antibody and its use
WO2023235847A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
WO2024138128A2 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Genentech, Inc. Cereblon degrader conjugates, and uses thereof

Family Cites Families (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6034997A (ja) 1983-05-09 1985-02-22 ジヨージ、ジヨセフ、トダロ 生物学的活性ポリペプチド類
ATE97498T1 (de) 1984-01-30 1993-12-15 Imp Cancer Res Tech Verbesserungen an wachstumsfaktoren.
US5401638A (en) 1986-06-04 1995-03-28 Oncogene Science, Inc. Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US4968603A (en) 1986-12-31 1990-11-06 The Regents Of The University Of California Determination of status in neoplastic disease
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JPH0775478B2 (ja) 1987-05-20 1995-08-09 三菱電機株式会社 交流エレベ−タ制御装置
US5824311A (en) 1987-11-30 1998-10-20 Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of tumors with monoclonal antibodies against oncogene antigens
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5047335A (en) 1988-12-21 1991-09-10 The Regents Of The University Of Calif. Process for controlling intracellular glycosylation of proteins
WO1991005264A1 (en) 1989-09-29 1991-04-18 Oncogenetics Partners Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5183884A (en) 1989-12-01 1993-02-02 United States Of America Dna segment encoding a gene for a receptor related to the epidermal growth factor receptor
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US5278299A (en) 1991-03-18 1994-01-11 Scripps Clinic And Research Foundation Method and composition for synthesizing sialylated glycosyl compounds
IL101943A0 (en) 1991-05-24 1992-12-30 Genentech Inc Structure,production and use of heregulin
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
AU3144193A (en) 1991-11-21 1993-06-15 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Controlling degradation of glycoprotein oligosaccharides by extracellular glycosisases
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
CA2128862C (en) 1992-02-11 2008-05-20 Jonathan G. Seidman Homogenotization of gene-targeting events
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
WO1993021319A1 (en) 1992-04-08 1993-10-28 Cetus Oncology Corporation HUMANIZED C-erbB-2 SPECIFIC ANTIBODIES
JPH08504172A (ja) 1992-06-30 1996-05-07 オンコロジクス，インコーポレイティド 抗−ｅｒｂＢ−２モノクロナール抗体の組み合わせ物及び使用方法
WO1994004690A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
CA2103323A1 (en) 1992-11-24 1994-05-25 Gregory D. Plowman Her4 human receptor tyrosine kinase
DK0616812T3 (da) 1993-03-24 2000-04-25 Berlex Biosciences Kombination af antihormonforbindelser og bindingsmolekyler til behandling af cancer
AU6527894A (en) 1993-03-30 1994-10-24 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Prevention of tumors with monoclonal antibodies against (neu)
WO1995014776A1 (en) 1993-11-23 1995-06-01 Genentech, Inc. PROTEIN TYROSINE KINASES NAMED Rse
AU4289496A (en) 1994-12-02 1996-06-19 Chiron Corporation Method of promoting an immune response with a bispecific antibody
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5837234A (en) 1995-06-07 1998-11-17 Cytotherapeutics, Inc. Bioartificial organ containing cells encapsulated in a permselective polyether suflfone membrane
ATE483733T1 (de) 1995-06-14 2010-10-15 Univ California Hochaffine humane antikörper gegen tumorantigene
CN102416176A (zh) 1995-07-27 2012-04-18 基因技术股份有限公司 稳定等渗的冻干蛋白质制剂
US5783186A (en) 1995-12-05 1998-07-21 Amgen Inc. Antibody-induced apoptosis
US5968511A (en) 1996-03-27 1999-10-19 Genentech, Inc. ErbB3 antibodies
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
AU4982097A (en) 1996-10-18 1998-05-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-erbb2 antibodies
US5994071A (en) 1997-04-04 1999-11-30 Albany Medical College Assessment of prostate cancer
WO1999019488A1 (en) 1997-10-15 1999-04-22 Children's Medical Center Corporation Novel human egf receptors and use thereof
ZA9811162B (en) * 1997-12-12 2000-06-07 Genentech Inc Treatment with anti-ERBB2 antibodies.
AU5963699A (en) 1998-10-02 2000-04-26 Mcmaster University Spliced form of (erb)b-2/neu oncogene
CA2374085C (en) * 1999-05-14 2015-12-29 Genentech, Inc. Tumour treatment with anti-erbb2 antibodies
KR100754049B1 (ko) * 1999-06-25 2007-08-31 제넨테크, 인크. 전립선암을 치료하기 위한 약제 제조에 사용되는 항-ErbB2 항체 및 조성물
BRPI0012196B8 (pt) * 1999-06-25 2021-05-25 Genentech Inc artigo industrializado
HU226742B1 (en) * 1999-06-25 2009-08-28 Genentech Inc Humanized anti-erbb2 antibodies and treatment with anti-erbb2 antibodies
PL202369B1 (pl) 1999-08-27 2009-06-30 Genentech Inc Zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2, zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB oraz zestaw zawierający to przeciwciało

Also Published As

Publication number Publication date
EP2283866A3 (en) 2012-01-25
ES2662581T3 (es) 2018-04-09
DK2803367T3 (en) 2018-04-16
JP2011105755A (ja) 2011-06-02
HK1133600A1 (zh) 2010-04-01
JP2003503365A (ja) 2003-01-28
CA2370466A1 (en) 2001-01-04
CA2370466C (en) 2011-02-08
CN100482281C (zh) 2009-04-29
JP4778101B2 (ja) 2011-09-21
EP2283866A2 (en) 2011-02-16
IL147241A0 (en) 2002-08-14
BRPI0017590B1 (pt) 2020-02-04
AU5632900A (en) 2001-01-31
HK1152479A1 (en) 2012-03-02
BRPI0017590B8 (pt) 2021-05-25
WO2001000244A2 (en) 2001-01-04
BRPI0012196B8 (pt) 2021-05-25
EP2803367B1 (en) 2018-01-31
EP1191944A2 (en) 2002-04-03
AU784157B2 (en) 2006-02-16
ES2536676T3 (es) 2015-05-27
BR0012196A (pt) 2002-03-19
DK2283866T3 (en) 2015-05-18
HUP0201616A2 (en) 2002-08-28
PL352678A1 (en) 2003-09-08
DK2283867T3 (da) 2014-06-10
JP4780633B2 (ja) 2011-09-28
EP2283867B1 (en) 2014-05-21
PT2283867E (pt) 2014-08-29
BRPI0012196B1 (pt) 2018-09-25
PL213213B1 (pl) 2013-01-31
HUP0201616A3 (en) 2004-11-29
CY1120070T1 (el) 2018-12-12
ES2466715T3 (es) 2014-06-11
KR20020012292A (ko) 2002-02-15
EP2283867A2 (en) 2011-02-16
JP2010270129A (ja) 2010-12-02
PT2803367T (pt) 2018-03-29
NZ515975A (en) 2004-01-30
EP2283867A3 (en) 2012-01-25
SI2803367T1 (en) 2018-04-30
IL147241A (en) 2006-12-10
EP2977063A1 (en) 2016-01-27
HK1153151A1 (en) 2012-03-23
HK1202446A1 (en) 2015-10-02
PT2283866E (pt) 2015-07-20
CN1387444A (zh) 2002-12-25
MXPA01013240A (es) 2002-06-21
EP2283866B1 (en) 2015-02-25
WO2001000244A3 (en) 2001-10-04
HK1220897A1 (zh) 2017-05-19
EP2803367A1 (en) 2014-11-19
LT2803367T (lt) 2018-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU230586B1 (hu) Anti-ErbB antitest/maytansinoid konjugátumok alkalmazása rákos betegségek kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására
US11312787B2 (en) Antibodies and vaccines for use in treating ROR1 cancers and inhibiting metastasis
JP7316862B2 (ja) 小細胞肺癌に対する標的療法
CN101155830B (zh) 结合epha2的抗体及其使用方法
JP4620808B2 (ja) 突然変異上皮成長因子受容体を標的とする試薬および方法
KR101960004B1 (ko) Cldn6 생체내 표적-지향된 항체를 이용하는 암 치료법
CN101090729B (zh) 前列腺干细胞抗原(psca)变体及其序列
US9988431B2 (en) Dendritic cell marker and uses thereof
CN105017420B (zh) 针对整联蛋白αvβ6的抗体和使用该抗体治疗癌症
KR101818741B1 (ko) 암 치료용 모노클로날 항체
JP4854912B2 (ja) 癌に対する抗体
CN107849132A (zh) 人源化的和亲和力成熟的针对FcRH5的抗体和使用方法
EA028744B1 (ru) Антитела против мезотелина и иммуноконъюгаты
HU229776B1 (hu) Interleukin 15-re (IL-15-re) specifikus emberi antitestek
CN107108740A (zh) 抗fgfr2/3抗体及其使用方法
CN107667120A (zh) 抗muc16抗体及其应用
CN107787331A (zh) 抗her2抗体和使用方法
EA014870B1 (ru) Антитела к белку steap-1 и их применение
CN106104273A (zh) 新型抗dpep3抗体和使用方法
UA98762C2 (uk) Моноклональне антитіло, яке зв&#39;язується з tat226, та імунокон&#39;югат
EA028220B1 (ru) Иммуноконъюгат на основе белка, связывающегося с bcma (cd269/tnfrsf17), его медицинское применение и фармацевтическая композиция
JP2001521520A (ja) 抗α▲下ｖ▼β▲下３▼インテグリン抗体アンタゴニスト
EA030182B1 (ru) Антитела, специфические для кадгерина-17
CN103755809B (zh) 治疗和诊断表达slc34a2(tat211=seqid2)的肿瘤的抗体
CN101679485B (zh) 骨桥蛋白的功能表位、针对该单位的单克隆抗体及它们的应用