CN107667120A - 抗muc16抗体及其应用 - Google Patents

抗muc16抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107667120A
CN107667120A CN201680028517.9A CN201680028517A CN107667120A CN 107667120 A CN107667120 A CN 107667120A CN 201680028517 A CN201680028517 A CN 201680028517A CN 107667120 A CN107667120 A CN 107667120A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
acid sequence
amino acid
antibody
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201680028517.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107667120B (zh
Inventor
大卫·斯普里格斯
阿尔贝托·费尔南德斯-特哈达
达尔马络·萨皮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Original Assignee
Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Memorial Sloan Kettering Cancer Center filed Critical Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority to CN202210174122.7A priority Critical patent/CN115368460A/zh
Publication of CN107667120A publication Critical patent/CN107667120A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107667120B publication Critical patent/CN107667120B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
    • A61K39/00117—Mucins, e.g. MUC-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4727—Mucins, e.g. human intestinal mucin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
    • A01K2217/203—Animal model comprising inducible/conditional expression system, e.g. hormones, tet
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Abstract

本文提供了涉及免疫特异性结合糖基化形式的MUC16(一种拴粘蛋白)的抗体的组合物、方法和用途。本文还提供了用于管理、治疗或预防疾病例如癌症的用途和方法。

Description

抗MUC16抗体及其应用
本申请要求2015年3月17日提交的美国临时申请号62/134,402的权益，其在此全文引入作为参考。
本申请参考引入了作为文本文件与申请一同提交的名称为“序列_Listing_13542-016-228.txt”的序列表，其创建于2016年3月14日，大小375Kb。
1.技术领域
本文提供了涉及抗体的组合物、方法和用途，所述抗体免疫特异性结合MUC16(一种拴粘蛋白(tethered mucin protein))并调节MUC16的表达和/或活性用于管理、治疗或预防疾病，例如癌症。
2.背景
粘蛋白是用于细胞稳态和保护上皮表面的重要生物分子。卵巢癌中粘蛋白表达的变化可能被用于诊断，预后和治疗(Singh AP等，Lancet Oncol 2008；9(11)：1076-85)。MUC16是一种在大多数卵巢癌中过表达的粘蛋白，是用于卵巢癌检测和进展的已知替代血清标志物(CA-125)(Badgwell D等，Dis Markers 2007；23(5-6)：397410；Bast RC，Jr等，Int JGynecol Cancer 2005；15 Suppl 3：274-81；Fritsche HA等，Clin Chem 1998；44(7)：1379-80和Krivak TC等，Gynecol Oncol 2009；115(1)：81-5)。MUC16是由大的切割和释放结构域组成的高度糖基化的粘蛋白，称为CA-125，由多个重复序列和一个保留结构域(MUC-CD)组成，后者包括残留的非重复细胞外片段、跨膜结构域和细胞质尾(O'Brien TJ等，Tumor Biol 2001；22(6)：348-66)。由于抗原只能在子宫、子宫内膜、输卵管、卵巢和腹腔和胸腔的浆膜中以低水平表达，因此MUC16是基于免疫的治疗的潜在吸引力的靶标。
然而，MUC16的大多数细胞外结构域被切割和分泌的事实限制了MUC16作为靶向抗原在卵巢癌中的应用。事实上，迄今为止，大多数报道的MUC16单克隆抗体结合存在于糖蛋白的大分泌型CA-125部分上的表位，没有已知与抗原的保留的细胞外部分(MUC-CD)结合(Bellone S，Am J Obstet Gynecol 2009；200(1)：75el-10，Berek JS，Expert Opin BiolTher 2004；4(7)：1159-65；O'Brien TJ等，Int J Biol Markers 1998；13(4)：188-95)。因此，诊断和治疗方法需要产生针对MUC16的非脱落区域的新抗体。
3.概述
本文提供了抗体及其抗原结合片段和包括该抗体或抗原结合片段的多肽，例如融合蛋白、缀合物、和/或嵌合抗原受体，以及表达其的细胞。抗体和抗原结合片段中是那些特异性结合MUC16蛋白表位的。该抗体在本文中称为“MUC16糖基化抗体”。该表位典型的是位于或基本位于MUC16分子胞外部分之内的表位，在一些实施方案中，表位不在MUC16串联重复区域和/或分泌形式的MUC16之内，或抗体或片段不结合MUC16串联重复区域和/或分泌形式的MUC16。在一些实施方案中，表位位于MUC16c114之内或包括MUC16c114之内的残基并典型的包括其中的一个或多个糖基化残基或糖基化位点。在一些实施方案中，表位包括一个或多个糖基化位点，例如N-糖基化位点。在一些方面，该表位包括对应如SEQ ID NO:150所示的MUC16序列(和/或其糖基化形式)的Asn1806或Asn1800的天冬酰胺残基；在一些方面，表位包括对应SEQ ID NO:150的Asn1806天冬酰胺残基，但不包括对应SEQ ID NO:150的Asn1800天冬酰胺残基，在一些方面，表位包括对应SEQ ID NO:150的Asn1800天冬酰胺残基，但不包括对应SEQ ID NO:150的Asn1806天冬酰胺残基。在一些任何一种这些实施方案中，该一个或多个天冬酰胺是糖基化的，例如N-糖基化的。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段结合SEQ ID NO:131之内的表位或包括SEQ ID NO:131之内的残基的表位；结合SEQ ID NO:130之内的表位或包括SEQ ID NO:130之内的残基的表位，或其组合；在一些实施方案中，抗体或片段不免疫特异性结合对应SEQ ID NO:168的MUC16区域内或SEQ ID NO:168的残基2-19内。
在一些实施方案中，提供的抗体或抗原结合片段包括对应抗体序列的重链和/或轻链的CDR的一个或多个互补决定区(CDR)，例如本文描述的靶向MUC16-糖基化位点的抗体序列，例如抗体18C6的，抗体10C6的，和/或抗体19C11的。在一些实施方案中，抗体或片段具有重链CDR3(HCDR3)，其具有对应本文提供的重链序列之一的HCDR3的序列，例如命名为18C6的抗体、命名为10C6的抗体、命名为19C11的抗体和/或命名为7B12的抗体的重链序列。在一些方面，HCDR3具有选自下述的序列：IGTAQATDALDY(SEQ ID NO:105)；GTAQATDALD(SEQ IDNO:111)；X18RIGTAQATDALDY(SEQ ID NO:117)，其中X18是T，A或S；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:31，51，71和91；SEQ ID NO:17；SEQ ID ON：37；SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:97。
在一些实施方案中，提供的抗体或抗原结合片段具有重链CDR1(HCDR1)，其具有对应本文提供的重链序列之一的HCDR1的序列，例如命名为18C6的抗体、命名为10C6的抗体、命名为19C11的抗体和/或命名为7B12的抗体的重链序列。在一些方面，HCDR1具有选自下述的序列：TX1GMGVG(SEQ ID NO:103)，其中X1为L或V；序列GFSLX8TX9GM(SEQ ID NO:109)，其中X8为N或S，且其中X9为L或V；GFSLX15TX16GMG(SEQ ID NO:115)，其中X15为N或S，且X16为V或L；以及SEQ ID NO:3所示的序列；SEQ ID NO:9所示的序列；SEQ ID NO:15所示的序列；SEQ IDNOs：23，43，63，83任一所示的序列；SEQ ID NOs：29，49，69和89任一所示的序列；SEQ IDNOs：35，55，75和95任一所示的序列。
在一些实施方案中，提供的抗体或抗原结合片段具有重链CDR2(HCDR2)，其具有对应本文提供的重链序列之一的HCDR1的序列，例如命名为18C6的抗体、命名为10C6的抗体、命名为19C11的抗体和/或命名为7B12的抗体的重链序列。在一些方面，HCDR2具有选自下述的序列：HIWWDDX2DKYYX3PALKS(SEQ ID NO:104)，其中X2是E或不存在且X3是Y或N；WDDX10(SEQ IDNO:110)，其中X10是E或不存在；IWWDDX17DK(SEQ ID NO:116)，其中X17是E或不存在；SEQ IDNO:4所示的序列；SEQ ID NO:10所示的序列；SEQ ID NO:16所示的序列；SEQ ID NOs：24，44，64，84任一所示的序列；SEQ ID NOs：30，50，70，90任一所示的序列；SEQ ID NOs：36，56，76，96任一所示的序列。
在一些实施方案中，包括任一前述实施方案，提供的抗体或抗原结合片段包括，例如，进一步包括，具有对应本文提供的轻链序列之一的LCDR3的序列的轻链CDR3(LCDR3)，例如命名为18C6的抗体、命名为10C6的抗体、命名为19C11的抗体和/或命名为7B12的抗体的轻链序列。在一些方面，LCDR3具有选自下述的序列：MQX6LEX7PLT(SEQ ID NO:108)，其中X6是G或S且其中X7是H或Y；X13LEX14PL(SEQ ID NO:114)，其中X13是G或S且其中X14是H或Y；MQSLEYPLT(SEQ ID NO:120)，选自下述的序列：SEQ ID NOs：8，28，48，68和88；选自下述的序列：SEQ ID NOs：14，34，54，74和94和选自下述的序列：SEQ ID NOs：20，4，60，80和100。
在一些实施方案中，包括任一前述实施方案，提供的抗体或抗原结合片段包括，例如，进一步包括，具有对应本文提供的轻链序列之一的LCDR1的序列的轻链CDR1(LCDR1)，例如命名为18C6的抗体、命名为10C6的抗体、命名为19C11的抗体和/或命名为7B12的抗体的轻链序列。在一些方面，LCDR1具有选自下述的序列：RSSKSLX4X5SNGNTYLY(SEQ ID NO:106)；SKSLX11X12SNGNTY(SEQ ID NO:112)，其中X11是L或R且其中X12是H或K；KSLX19X20SNGNTY(SEQID NO:118)，其中X19是V或L且其中X20是H或K；选自下述的序列：SEQ ID NOs：6，26，46，66和86；选自下述的序列：SEQ ID NOs：12，32，52，72和92和选自下述的序列：SEQ ID NOs：18，38，58，78和98。
在一些实施方案中，包括任一前述实施方案，提供的抗体或抗原结合片段包括，例如，进一步包括，具有对应本文提供的轻链序列之一的LCDR2的序列的轻链CDR2(LCDR2)，例如命名为18C6的抗体、命名为10C6的抗体、命名为19C11的抗体和/或命名为7B12的抗体的轻链序列。在一些方面，LCDR2具有选自下述的序列：YMSNLAS(SEQ ID NO:107)；YMS(SEQ IDNO:113)和SEQ ID NOs：7，27，47，67，87，13，33，53，73，93，19，39，59，79，99，119任一所示的序列。
在任意实施方案中的抗体和抗原结合片段是那些具有：(a)VH互补决定区(CDR)1，包含氨基酸序列TX1GMGVG(SEQ ID NO:103)，其中X1是L或V；(b)VH CDR2，包含氨基酸序列HIWWDDX2DKYYX3PALKS(SEQ ID NO:104)，其中X2是E或不存在且X3是Y或N；和(c)VH CDR3，包含氨基酸序列IGTAQATDALDY(SEQ ID NO:105)。
在任意实施方案中的抗体和抗原结合片段是那些具有：(a)VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX8TX9GM(SEQ ID NO:109)，其中X8是N或S且其中X9是L或V；(b)VH CDR2，包含氨基酸序列WDDX10(SEQ ID NO:110)，其中X10是E或不存在；和(c)VH CDR3，包含氨基酸序列GTAQATDALD(SEQ ID NO:111)。
在任意实施方案中的抗体和抗原结合片段是那些具有：(a)VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX15TX16GMG(SEQ ID NO:115)，其中X15是N或S且X16是V或L；(b)VH CDR2，包含氨基酸序列IWWDDX17DK(SEQ ID NO:116)，其中X17是E或不存在；和(c)VH CDR3，包含氨基酸序列X18RIGTAQATDALDY(SEQ ID NO:117)，其中X18是T，A或S。
在任意实施方案中的抗体和抗原结合片段是那些具有：VH CDR1，包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；VH CDR1，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；VH CDR1，包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；VH CDR1，包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；VH CDR1，包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；VH CDR1，包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；VH CDR1，包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；VH CDR1，包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQID NO:64的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；VH CDR1，包含SEQID NO:69的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQID NO:71的氨基酸序列；VH CDR1，包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ IDNO:76的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；VH CDR1，包含SEQ IDNO:83的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:85的氨基酸序列；VH CDR1，包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列；包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列。
在任意实施方案中的抗体和抗原结合片段是那些具有：(a)VL CDR1，包含氨基酸序列RSSKSLX4X5SNGNTYLY(SEQ ID NO:106)，其中X4是R或L且X5是K或H；(b)VL CDR2，包含氨基酸序列YMSNLAS(SEQ ID NO:107)；和(c)VL CDR3，包含氨基酸序列MQX6LEX7PLT(SEQ ID NO:108)，其中X6是G或S且X7是H或Y。
在任意实施方案中的抗体和抗原结合片段是那些具有：(a)VL CDR1，包含氨基酸序列KSLX11X12SNGNTY(SEQ ID NO:112)，其中X11是L或R且X12是H或K；(b)VL CDR2，包含氨基酸序列YMS(SEQ ID NO:113)；和(c)VL CDR3，包含氨基酸序列X13LEX14PL(SEQ ID NO:114)，其中X13是G或S且X14是H或Y。
在任意实施方案中的抗体和抗原结合片段是那些具有：VL CDR1，包含氨基酸序列KSLX19X20SNGNTY(SEQ ID NO:118)，其中X19是V或L且X20是H或K；(b)VL CDR2，包含氨基酸序列YMS(SEQ ID NO:119)；和(c)VL CDR3，包含氨基酸序列MQSLEYPLT(SEQ ID NO:120)。
在任意实施方案中的抗体和抗原结合片段是那些具有：VL CDR1，包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；或VL CDR1，包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或VL CDR1，包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；或VL CDR1，包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；或VL CDR1，包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；或VL CDR1，包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；或VL CDR1，包含SEQ IDNO:86的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ IDNO:88的氨基酸序列；或VL CDR1，包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ IDNO:93的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列；或VL CDR1，包含SEQ IDNO:98的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ IDNO:100的氨基酸序列；或VL CDR1，包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；或VL CDR1，包含SEQ IDNO:12的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列；或VL CDR1，包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ IDNO:19的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；或VL CDR1，包含SEQ IDNO:66的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ IDNO:68的氨基酸序列；或VL CDR1，包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ IDNO:73的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列；或VL CDR1，包含SEQ IDNO:78的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列。
在任意实施方案中的抗体和抗原结合片段是那些具有：(a)(i)包含下述的VH：VHCDR1，包含氨基酸序列TX1GMGVG(SEQ ID NO:103)，其中X1是L或V，VH CDR2，包含氨基酸序列HIWWDDX2DKYYX3PALKS(SEQ ID NO:104)，其中X2是E或不存在且X3是Y或N，和VH CDR3，包含氨基酸序列IGTAQATDALDY(SEQ ID NO:105)；和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含氨基酸序列RSSKSLX4X5SNGNTYLY(SEQ ID NO:106)，其中X4是R或L且X5是K或H，VL CDR2，包含氨基酸序列YMSNLAS(SEQ ID NO:107)和VL CDR3，包含氨基酸序列MQX6LEX7PLT(SEQ ID NO:108)，其中X6是G或S且X7是H或Y；或(b)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX8TX9GM(SEQ ID NO:109)，其中X8是N或S且其中X9是L或V，VH CDR2，包含氨基酸序列WDDX10(SEQ IDNO:110)，其中X10是E或不存在和VH CDR3，包含氨基酸序列GTAQATDALD(SEQ ID NO:111)；和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含氨基酸序列KSLX11X12SNGNTY(SEQ ID NO:112)，其中X11是L或R且X12是H或K，VL CDR2，包含氨基酸序列YMS(SEQ ID NO:113)和VL CDR3，包含氨基酸序列X13LEX14PL(SEQ ID NO:114)，其中X13是G或S且X14是H或Y；或(c)(i)VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX15TX16GMG(SEQ ID NO:115)，其中X15是N或S且X16是V或L，VH CDR2，包含氨基酸序列IWWDDX17DK(SEQ ID NO:116)，其中X17是E或不存在和VH CDR3，包含氨基酸序列X18RIGTAQATDALDY(SEQ ID NO:117)，其中X18是T，A或S；和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含氨基酸序列KSLX19X20SNGNTY(SEQ ID NO:118)，其中X19是V或L且X20是H或K，VL CDR2，包含氨基酸序列YMS(SEQ ID NO:119)和VL CDR3，包含氨基酸序列MQSLEYPLT(SEQ ID NO:120)；或(d)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；或(e)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:31的氨基酸序列；和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，VLCDR2，包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或(f)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；或(g)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:45的氨基酸序列；和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，VLCDR2，包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；或(h)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ IDNO:50的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；或(i)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:55的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:57的氨基酸序列；和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，VLCDR2，包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；或(j)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ IDNO:84的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列；和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列；或(k)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:89的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:91的氨基酸序列；和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列，VLCDR2，包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列；或(l)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ IDNO:96的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列；或(m)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；或(n)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或(o)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；或(p)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；或(q)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列；或(r)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列，VL CDR2，包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列，和VL CDR3，包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
在任意实施方案中的抗体和抗原结合片段是那些具有：(a)(i)包含下述氨基酸序列的VH：QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIWWDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS(SEQ IDNO:101)，其中X21是T或N，X22是I或K，X23是N或S，X24是V或L，X25是S或I，X26是P或S，X27是E或不存在，X28是N或Y，X29是K或R，X30是A或D，X31是T或S，X32是V或A，X33是G或D，X34是T，I或S且X35是T，S或A；和(ii)包含下述氨基酸序列的VL：DIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:102)，其中X36是I或V，X37是P或S，X38是R或L，X39是K或H，X40是R或K，X41是E或G，X42是S或G且X43是Y或H；或(b)(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH；和(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL；或(c)(i)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH；和(ii)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL；或(d)(i)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VH；和(ii)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL；或(e)(i)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VH；和(ii)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的VL；或(f)(i)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH；和(ii)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VL。
在提供的抗体或抗原结合片段中还包括具有与任何该抗体和/或任何表1和2中所示的抗体的VH和/或VL序列至少90，95，96，97，98，99或100％同一性的那些抗体或抗原结合片段。在提供的抗体及其片段中还包括与任何该抗体竞争结合MUC16和/或其表位的那些抗体及其片段。
本文还提供了融合蛋白，例如嵌合分子，和/或缀合物，其包括任何抗体，例如包含该抗体或片段的嵌合抗原受体(CAR)和表达该分子的细胞。本文还提供了任何该抗体的人源化版本。
在一些实施方案中，本文提供了抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体(a)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(b)不能(lack of)免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；且(c)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。在某些实施方案中，(i)重组表达第一形式的MUC16的细胞是SKOV3细胞；(ii)重组表达第二形式的MUC16的细胞是SKOV3细胞；且(iii)步骤(c)中的细胞是SKOV3细胞。在具体实施方案中，抗体不能免疫特异性结合重组表达第三形式的MUC16的细胞，该第三形式是糖基化的，且其中第三形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139。在某些实施方案中，(i)重组表达第一形式的MUC16的细胞是SKOV3细胞；(ii)重组表达第二形式的MUC16的细胞是SKOV3细胞；且(iii)步骤(c)中的细胞是SKOV3细胞。在某些实施方案中，(i)重组表达第一形式的MUC16的细胞是SKOV3细胞；(ii)重组表达第二形式的MUC16的细胞是SKOV3细胞；(iii)重组表达第三形式的MUC16的细胞是SKOV3细胞；且(iv)步骤(c)中的细胞是SKOV3细胞。
本文还提供了抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体(a)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ IDNO:133；(b)不能免疫特异性结合重组表达第三形式的MUC16的细胞，该第三形式是糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；且(c)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。在某些实施方案中，(i)重组表达第一形式的MUC16的细胞是SKOV3细胞；(ii)重组表达第三形式的MUC16的细胞是SKOV3细胞；且(iii)步骤(c)中的细胞是SKOV3细胞。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段免疫特异性结合包含N-糖基化的SEQ IDNO:150的天冬酰胺1806的表位。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段免疫特异性结合氨基酸序列CTRNGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:130)，其中CTRNGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:130)的4号氨基酸残基(N4)和10号氨基酸残基(N10)是糖基化的。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段免疫特异性结合氨基酸序列CGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:131)，其中CGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:131)的7号氨基酸残基(N7)是糖基化的。在某些实施方案中，糖基化包含N连接的壳二糖。
在某些实施方案中，通过使细胞接触抗体或抗原结合片段将抗体或其抗原结合片段内化至表达第一形式的MUC16的细胞中。在某些实施方案中，细胞是重组表达第一形式的MUC16的SKOV3细胞。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段抑制表达糖基化形式的MUC16的肿瘤的生长。
在某些实施方案中，抗体是单克隆抗体。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)，其包含(a)VH互补决定区(CDR)1，包含氨基酸序列TX1GMGVG(SEQ ID NO:103)，其中X1是L或V；(b)VH CDR2，包含氨基酸序列HIWWDDX2DKYYX3PALKS(SEQ ID NO:104)，其中X2是E或不存在且X3是Y或N；和(c)VH CDR3，包含氨基酸序列IGTAQATDALDY(SEQ ID NO:105)。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VH：(a)VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX8TX9GM(SEQ ID NO:109)，其中X8是N或S且其中X9是L或V；(b)VH CDR2，包含氨基酸序列WDDX10(SEQ ID NO:110)，其中X10是E或不存在；和(c)VH CDR3，包含氨基酸序列GTAQATDALD(SEQ ID NO:111)。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VH：(a)VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX15TX16GMG(SEQ ID NO:115)，其中X15是N或S且X16是V或L；(b)VH CDR2，包含氨基酸序列IWWDDX17DK(SEQ ID NO:116)，其中X17是E或不存在；和(c)VH CDR3，包含氨基酸序列X18RIGTAQATDALDY(SEQ ID NO:117)，其中X18是T，A或S。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:11的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:17的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:31的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:45的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:49的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:51的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:55的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:57的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:63的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:65的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:69的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:71的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:75的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:77的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VH CDR1，包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:89的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:91的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:95的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:97的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含下述氨基酸序列：QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIWWDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:101)，其中X21是T或N，X22是I或K，X23是N或S，X24是V或L，X25是S或I，X26是P或S，X27是E或不存在，X28是N或Y，X29是K或R，X30是A或D，X31是T或S，X32是V或A，X33是G或D，X34是T，I或S且X35是T，S或A。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，其包含(a)VL CDR1，包含氨基酸序列RSSKSLX4X5SNGNTYLY(SEQ ID NO:106)，其中X4是R或L且X5是K或H；(b)VLCDR2，包含氨基酸序列YMSNLAS(SEQ ID NO:107)；和(c)VL CDR3，包含氨基酸序列MQX6LEX7PLT(SEQ ID NO:108)，其中X6是G或S且X7是H或Y。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VL：(a)VL CDR1，包含氨基酸序列KSLX11X12SNGNTY(SEQ ID NO:112)，其中X11是L或R且X12是H或K；(b)VL CDR2，包含氨基酸序列YMS(SEQ ID NO:113)；和(c)VL CDR3，包含氨基酸序列X13LEX14PL(SEQ ID NO:114)，其中X13是G或S且X14是H或Y。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VL：(a)VL CDR1，包含氨基酸序列KSLX19X20SNGNTY(SEQ ID NO:118)，其中X19是V或L且X20是H或K；(b)VL CDR2，包含氨基酸序列YMS(SEQ ID NO:119)；和(c)VL CDR3，包含氨基酸序列MQSLEYPLT(SEQ ID NO:120)。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，其包含VL CDR1，包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:34的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:38的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:40的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:46的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:48的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:54的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:58的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:60的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:86的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:88的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:92的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:94的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:98的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:100的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:12的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:66的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:68的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:72的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:74的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:78的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含下述氨基酸序列：
DIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVG VYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:102)，其中X36是I或V，X37是P或S，X38是R或L，X39是K或H，X40是R或K，X41是E或G，X42是S或G且X43是Y或H。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体包含人源的重链和轻链恒定区。在某些实施方案中，重链恒定区具有选自γ1，γ2，γ3和γ4的同种型。在某些实施方案中，轻链恒定区具有选自κ和λ的同种型。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是人源化的。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是人源化的形式的啮齿类抗体。
在某些实施方案中，抗体是包含两条相同重链和两条相同轻链的免疫球蛋白。在某些实施方案中，免疫球蛋白是IgG。
本文还提供了包含缀合至试剂的本文提供的抗体或其抗原结合片段的抗体缀合物。在某些实施方案中，试剂是显影剂或细胞毒性剂。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是双特异性抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体免疫特异性结合CD3。在某些实施方案中，双特异性抗体包含免疫特异性结合MUC16的免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链通过肽接头缀合至免疫特异性结合CD3的单链可变区片段(scFv)。本文还提供了包含缀合至试剂的本文提供的双特异性抗体的双特异性抗体缀合物。在某些实施方案中，试剂是显影剂或细胞毒性剂。
在某些实施方案中，其抗原结合片段是单链可变区片段(scFv)。本文还提供了包含缀合至试剂的本文提供的scFv的scFv缀合物。在某些实施方案中，试剂是显影剂或细胞毒性剂。
本文还提供了包含抗体和抗原结合片段的融合蛋白、嵌合分子和缀合物。本文提供了包括一个或多个任一提供的抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体(CAR)，例如包含任一本文提供的scFv或本文提供的scFv缀合物的CAR，和/或包含与之竞争结合MUC16的抗原结合域的CAR。
本文还提供了抗体重链或其抗原结合部分。在提供的抗体及其抗原结合片段中包括具有重链和/或其抗原结合部分(例如其VH区)的抗体及其抗原结合片段，本文还提供了该重链及其抗原结合部分。在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的VH：(a)VH CDR1，包含氨基酸序列TX1GMGVG(SEQ ID NO:103)，其中X1是L或V；(b)VH CDR2，包含氨基酸序列HIWWDDX2DKYYX3PALKS(SEQ ID NO:104)，其中X2是E或不存在且X3是Y或N；和(c)VHCDR3，包含氨基酸序列IGTAQATDALDY(SEQ ID NO:105)；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的VH：(a)VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX8TX9GM(SEQ ID NO:109)，其中X8是N或S且X9是L或V；(b)VH CDR2，包含氨基酸序列WDDX10(SEQ ID NO:110)，其中X10是E或不存在；和(c)VH CDR3，包含氨基酸序列GTAQATDALD(SEQ ID NO:111)；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ IDNO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的VH：(a)VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX15TX16GMG(SEQ ID NO:115)，其中X15是N或S且X16是V或L；(b)VH CDR2，包含氨基酸序列IWWDDX17DK(SEQ ID NO:116)，其中X17是E或不存在；和(c)VH CDR3，包含氨基酸序列X18RIGTAQATDALDY(SEQ ID NO:117)，其中X18是T，A或S；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:11的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:17的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:31的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:45的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:49的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:51的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:55的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:57的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:63的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:65的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:69的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:71的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:75的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:77的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:83的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:85的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:89的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:91的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ IDNO:95的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ IDNO:97的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分包含VH，其包含下述氨基酸序列：QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIWWDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:101)，其中X21是T或N，X22是I或K，X23是N或S，X24是V或L，X25是S或I，X26是P或S，X27是E或不存在，X28是N或Y，X29是K或R，X30是A或D，X31是T或S，X32是V或A，X33是G或D，X34是T，I或S且X35是T，S或A；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分包含VH，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分包含VH，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分包含VH，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分包含VH，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分包含VH，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在某些实施方案中，抗体重链或其抗原结合部分包含人源的重链恒定区。在某些实施方案中，重链恒定区具有选自γ1，γ2，γ3和γ4的同种型。在某些实施方案中，抗体重链是人源化的。在某些实施方案中，抗体重链是人源化的形式的啮齿类重链。
本文还提供了包含本文提供的抗体重链的抗体重链缀合物，其中所述抗体重链缀合试剂。在某些实施方案中，试剂是显影剂或细胞毒性剂。
在提供的抗体及其抗原结合片段中包括具有轻链和/或其部分例如其VL区的抗体及其抗原结合片段，本文还提供了该轻链及其抗原结合部分。在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的VL：(a)VLCDR1，包含氨基酸序列RSSKSLX4X5SNGNTYLY(SEQ ID NO:106)，其中X4是R或L且X5是K或H；(b)VL CDR2，包含氨基酸序列YMSNLAS(SEQ ID NO:107)；和(c)VL CDR3，包含氨基酸序列MQX6LEX7PLT(SEQ ID NO:108)，其中X6是G或S且X7是H或Y；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的VL：(a)VL CDR1，包含氨基酸序列KSLX11X12SNGNTY(SEQ ID NO:112)，其中X11是L或R且X12是H或K；(b)VL CDR2，包含氨基酸序列YMS(SEQ ID NO:113)；和(c)VL CDR3，包含氨基酸序列X13LEX14PL(SEQ ID NO:114)，其中X13是G或S且X14是H或Y；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的VL：(a)VL CDR1，包含氨基酸序列KSLX19X20SNGNTY(SEQ ID NO:118)，其中X19是V或L且X20是H或K；(b)VL CDR2，包含氨基酸序列YMS(SEQ ID NO:119)；和(c)VL CDR3，包含氨基酸序列MQSLEYPLT(SEQ ID NO:120)；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:12的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:28的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:34的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:38的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:40的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:46的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:48的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:54的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:58的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:60的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:66的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:68的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:72的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:74的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:78的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:86的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:88的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:92的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:94的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ IDNO:98的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ IDNO:100的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分包含VL，其包含下述氨基酸序列：DIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:102)，其中X36是I或V，X37是P或S，X38是R或L，X39是K或H，X40是R或K，X41是E或G，X42是S或G且X43是Y或H；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ IDNO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分包含VL，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分包含VL，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分包含VL，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分包含VL，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分包含VL，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
在某些实施方案中，抗体轻链或其抗原结合部分包含人源的轻链恒定区。在某些实施方案中，轻链恒定区具有选自κ和λ的同种型。在某些实施方案中，抗体轻链是人源化的。在某些实施方案中，抗体轻链是人源化的形式的啮齿类抗体。
本文还提供了包含缀合至试剂的本文提供的抗体轻链的抗体轻链缀合物。在某些实施方案中，试剂是显影剂或细胞毒性剂。
本文还提供了融合蛋白，包含通过肽接头缀合至scFv的本文提供的抗体轻链缀合物。在某些实施方案中，scFv结合CD3。
本文还提供了细胞，例如免疫细胞，例如T细胞，其重组表达一个或多个本文提供的分子，例如本文提供的CAR。
本文还提供了一种多核苷酸，其包含编码本文提供的scFv的核酸序列。本文还提供了一种多核苷酸，其包含编码本文提供的scFv或其缀合物的核酸序列。本文还提供了一种多核苷酸，其包含编码本文提供的CAR的核酸序列。本文还提供了一种多核苷酸，其包含编码本文提供的抗体重链或其抗原结合部分的核酸序列。本文还提供了一种多核苷酸，其包含编码本文提供的抗体重链缀合物的核酸序列。本文还提供了一种多核苷酸，其包含编码本文提供的抗体轻链或其抗原结合部分的核酸序列。本文还提供了一种多核苷酸，其包含编码本文提供的抗体轻链缀合物的核酸序列。本文还提供了一种多核苷酸，其包含编码本文提供的融合蛋白的核酸序列。一种多核苷酸，其包含编码下述的核酸序列：(a)本文提供的抗体重链或其抗原结合部分或本文提供的抗体重链缀合物；和(b)本文提供的抗体轻链或其抗原结合部分，本文提供的抗体轻链缀合物或本文提供的融合蛋白。
本文还提供了包含可操作地连接启动子的本文提供的多核苷酸的载体。本文还提供了载体，其包含(a)可操作地连接第一启动子的本文提供的第一多核苷酸和(b)可操作地连接第二启动子的本文提供的第二多核苷酸。
本文还提供了包含可操作地连接启动子的本文提供的多核苷酸的离体细胞。本文还提供了包含可操作地连接启动子的本文提供的多核苷酸的离体细胞。本文还提供了包含本文提供的载体的离体细胞。本文还提供了包含可操作地连接启动子的一种或多种编码本文提供的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的离体细胞。
本文还提供了产生抗体重链或其抗原结合部分的方法，包括在细胞表达多核苷酸的条件下培养本文提供的细胞以产生多核苷酸编码的抗体重链或其抗原结合部分或抗体重链缀合物。
本文还提供了产生抗体轻链或其抗原结合部分的方法，包括在细胞表达多核苷酸的条件下培养本文提供的细胞以产生抗体轻链或其抗原结合部分，抗体轻链缀合物或融合蛋白多核苷酸编码的。
本文还提供了产生抗体或其抗原结合片段的方法，包括在细胞表达可操作地连接第一启动子的多核苷酸和可操作地连接第二启动子的多核苷酸的条件下离体培养本文提供的细胞以产生(i)多核苷酸编码的抗体重链或抗体重链缀合物和(ii)多核苷酸编码的抗体轻链、抗体轻链缀合物或融合蛋白。
本文还提供了药物组合物，包含：治疗有效量的本文提供的抗体或其抗原结合片段，本文提供的抗体缀合物，本文提供的双特异性抗体，本文提供的双特异性抗体缀合物，本文提供的scFv，scFv缀合物，本文提供的CAR，本文提供的抗体重链或其抗原结合部分，本文提供的抗体重链缀合物，本文提供的抗体轻链或其抗原结合部分，本文提供的抗体轻链缀合物，本文提供的融合蛋白或本文提供的T细胞和药学上可接受的载体。
本文还提供了在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括对所述患者给药本文提供的药物组合物。在某些实施方案中，癌症是肺癌，胰腺癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌或原发性腹膜癌。在某些实施方案中，癌症是卵巢癌。在某些实施方案中，患者是人患者。在具体的实施方案中，该方法是联合治疗方法，进一步包括对患者给药治疗有效量的另一治疗剂。
在联合治疗方法的一个具体实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的本文描述的抗体或其抗原结合片段的第一抗体，其中抗体或其抗原结合片段识别MUC16中的表位，所述表位包含N-糖基化的SEQ ID NO:150的Asn1806，但不包含N-糖基化的SEQ ID NO:150的Asn1800，其中另外的治疗剂是第二抗体或其抗原结合片段，其中第二抗体或其抗原结合片段识别MUC16中的表位，所述表位包含N-糖基化的SEQ ID NO:150的Asn1806，也包含N-糖基化的SEQ ID NO:150的Asn1800。在具体实施方案中，第一抗体或其抗原结合片段通过下述进行鉴定：(i)其免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞的能力，其第一形式的MUC16是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)其不能免疫特异性结合重组表达第三形式的MUC16的细胞，该第三形式是糖基化的，其中第三形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；和(iii)其免疫特异性结合重组表达第四形式的MUC16的细胞的能力，其第四形式是糖基化的，且其中第四形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:152；且其中重组表达第一形式的MUC16的细胞、重组表达第三形式的MUC16的细胞和重组表达第四形式的MUC16的细胞是相同细胞类型；且其中第二抗体或其抗原结合片段通过下述进行鉴定：(i)其免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞的能力，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；和(ii)其不能免疫特异性结合重组表达第五形式的MUC16的细胞，其第五形式是糖基化的，且其中第五形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:172，其中重组表达第一形式的MUC16的细胞与重组表达第五形式的MUC16的细胞是相同细胞类型。
在联合治疗方法的一个具体实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的第一抗体或其抗原结合片段，其是本文描述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段识别MUC16中的表位，所述表位包含N-糖基化的SEQ ID NO:150的Asn1806但不包含N-糖基化的SEQ ID NO:150的Asn1800，其中另外的治疗剂是治疗有效量的第二抗体或其抗原结合片段，其中第二抗体或其抗原结合片段识别MUC16中的表位，所述表位包含N-糖基化的SEQID NO:150的Asn1800但不包含N-糖基化的SEQ ID NO:150的Asn1806。在具体实施方案中，第一抗体或其抗原结合片段通过下述进行鉴定：(i)其免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞的能力，其第一形式的MUC16是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)其不能免疫特异性结合重组表达第三形式的MUC16的细胞，该第三形式是糖基化的，且其中第三形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；和(iii)其免疫特异性结合重组表达第四形式的MUC16的细胞的能力，其第四形式是糖基化的，且其中第四形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:152，其中重组表达第一形式的MUC16的细胞、重组表达第三形式的MUC16的细胞和重组表达第四形式的MUC16的细胞是相同细胞类型；且其中第二抗体或其抗原结合片段通过下述进行鉴定：(i)其免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞的能力，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)其免疫特异性结合重组表达第三形式的MUC16的细胞的能力，该第三形式的MUC16是糖基化的，且其中第三形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；和(iii)其不能免疫特异性结合重组表达第四形式的MUC16的细胞，其中第四形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:152，且，其中重组表达第一形式的MUC16的细胞、重组表达第三形式的MUC16的细胞和重组表达第四形式的MUC16的细胞是相同类型的细胞。
本文还提供了包括一个或多个糖基化位点的免疫原性糖肽，其中(i)免疫原性糖肽是10-60个氨基酸残基、10-30个氨基酸残基、15-25个氨基酸残基、15-20个氨基酸残基或15-18个氨基酸残基长和(ii)该一个或多个糖基化位点的至少一个连接碳水化合物。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含1、2或3个糖基化位点。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含连接碳水化合物的糖基化位点。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含两个分别连接碳水化合物的糖基化位点。在某些实施方案中，碳水化合物是N-或O连接的碳水化合物。在某些实施方案中，碳水化合物是单糖、二糖、三糖、四糖或五糖。在某些实施方案中，碳水化合物是二糖。在某些实施方案中，二糖是壳二糖。
在某些实施方案中，免疫原性糖肽的N端是乙酰化的。在某些实施方案中，糖肽的C端是N-甲基甲酰胺衍生物的形式。在某些实施方案中，免疫原性糖肽缀合免疫原性载体蛋白。在某些实施方案中，免疫原性载体蛋白是钥孔戚血蓝素。
在某些实施方案中，免疫原性糖肽是15-18个氨基酸残基长。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含连接壳二糖的糖基化位点。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含分别连接壳二糖的两个糖基化位点。
在某些实施方案中，免疫原性糖肽是18个氨基酸残基长。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含分别连接壳二糖的两个糖基化位点。
在某些实施方案中，免疫原性糖肽是15个氨基酸残基长。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含连接壳二糖的糖基化位点。
在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的至少10个氨基酸部分，其中该一个或多个糖基化位点的至少一个位于所述氨基酸序列部分之内。
在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列。
在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含位于SEQ ID NO:129第30个残基(Asn)的糖基化位点，其连接壳二糖。
在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含位于SEQ ID NO:129第30个残基(Asn)的糖基化位点，其连接Man3GlcNAc2部分。
在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含位于SEQ ID NO:130第4个残基(Asn)和第10个残基(Asn)的两个糖基化位点，其分别连接壳二糖。
在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含位于SEQ ID NO:131第7个残基(Asn)的糖基化位点，其连接壳二糖。
本文还提供了产生特异性结合糖蛋白的抗体或其抗原结合片段的方法，包括用包含一个或多个糖基化位点的免疫原性糖肽来免疫对象，其中(i)免疫原性糖肽是10-60个氨基酸残基、10-30个氨基酸残基、15-25个氨基酸残基、15-20个氨基酸残基或15-18个氨基酸残基长，(ii)免疫原性糖肽包含糖蛋白氨基酸序列的至少10个氨基酸的部分，(iii)该一个或多个糖基化位点的至少一个连接碳水化合物，和(iv)该一个或多个糖基化位点的至少一个位于所述氨基酸序列部分之内。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段不能特异性结合非糖基化形式的糖蛋白。在某些实施方案中，对象是山羊、绵羊、驴、鸡、豚鼠、大鼠、兔或小鼠。在某些实施方案中，对象是大鼠、兔或小鼠。在某些实施方案中，对象是小鼠。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含1、2或3个糖基化位点。权利要求190-195任一项的方法，其中免疫原性糖肽包含连接碳水化合物的糖基化位点。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含两个分别连接碳水化合物的糖基化位点。在某些实施方案中，碳水化合物是N-或O连接的碳水化合物。在某些实施方案中，碳水化合物是单糖、二糖、三糖、四糖或五糖。在某些实施方案中，碳水化合物是二糖。在某些实施方案中，二糖是壳二糖。在某些实施方案中，免疫原性糖肽的N端是乙酰化的。在某些实施方案中，糖肽的C端是N-甲基甲酰胺衍生物的形式。在某些实施方案中，免疫原性糖肽缀合免疫原性载体蛋白。在某些实施方案中，免疫原性载体蛋白是钥孔戚血蓝素。在某些实施方案中，免疫原性糖肽是15-18个氨基酸残基长。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含连接壳二糖的糖基化位点。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含分别连接壳二糖的两个糖基化位点。在某些实施方案中，免疫原性糖肽是18个氨基酸残基长。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含分别连接壳二糖的两个糖基化位点。在某些实施方案中，免疫原性糖肽是15个氨基酸残基长。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含连接壳二糖的糖基化位点。在某些实施方案中，糖蛋白包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含位于SEQ ID NO:129第30个残基(Asn)的糖基化位点，其连接壳二糖。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含位于SEQ ID NO:129第30个残基(Asn)的糖基化位点，其连接Man3GlcNAc2部分。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含位于SEQ ID NO:130第4个残基(Asn)和第10个残基(Asn)的两个糖基化位点，其分别连接壳二糖。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含SEQID NO:131的氨基酸序列。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含位于SEQ ID NO:131第7个残基(Asn)的糖基化位点，其连接壳二糖。
本文还提供了抗体及其抗原结合片段，其免疫特异性结合MUC16且其具有本文描述的抗体(例如，10C6、7B12、19C11、16C5或18C6)的VH，VL，VH CDR，和/或VL CDR序列，及其缀合物(例如，缀合显影剂或细胞毒性剂试剂)。
4.附图简述
图1A-图1I。MUC16构建体。图1A：MUC16的示意图。图1B：顶部：MUC16c344的示意图。底部：截短的MUC16c344构建体的线性表示。第一串联重复的N端氨基酸序列如SEQ ID NO:155所示。第一串联重复的C端氨基酸序列如SEQ ID NO:156所示。胞外域N端的氨基酸序列如SEQID NO:157所示。胞外域C端的氨基酸序列如SEQ ID NO:158所示。图1C：顶部：MUC16c114的示意图。底部：MUC16c114的线性表示。胞外域的氨基酸序列如SEQ ID NO:161所示。跨膜域的氨基酸序列如SEQ ID NO:159所示。胞质尾区的氨基酸序列如SEQ ID NO:160所示。图1D：顶部：MUC16c80的示意图。底部：MUC16c80的线性表示。胞外域的氨基酸序列如SEQ ID NO:162所示。跨膜域的氨基酸序列如SEQ ID NO:159所示。胞质尾区的氨基酸序列如SEQ ID NO:159所示。图1E：顶部：MUC16c86的示意图。底部：MUC16c86的线性表示。胞外域的氨基酸序列如SEQID NO:163所示。跨膜域的氨基酸序列如SEQ NO：164所示。胞浆区的氨基酸序列是SEQ IDNO:165。图1F：MUC16c114-N123的线性表示。3(N→A)突变的胞外域58aa的氨基酸序列如SEQ IDNO:166所示。跨膜域的氨基酸序列如SEQ ID NO:159所示。胞浆区的氨基酸序列如SEQ IDNO:160所示。图1G，图1H和图1I描述了通过4H11由FACS分析检测的细胞百分比，其中细胞系表达指出的MUC16构建体。
图2A-图2C。MUC16转染子的体外生长曲线。图2A描述了与3T3细胞中的对照细胞系(phrGFP)相比较的MUC16c114和MUC16c344细胞系的体外生长曲线。图2B描述了与A2780细胞中的对照细胞系(phrGFP)相比较的MUC16c114和MUC16c344细胞系的体外生长曲线。图2C描述了与3T3细胞中的对照细胞系(phrGFP)相比较的MUC16c114，MUC16c80和MUC16c86细胞系的体外生长曲线。
图3A-图3E。MUC16在3T3细胞中的作用。图3A描绘了在60mm培养皿中3T3转染子的软琼脂生长。14天后，对菌落进行计数和绘制。表中所示的数据表示与表达phrGFP对照载体的细胞的软琼脂生长相比的三个相似实验中的一个(***p<0.0001)。图3B描述了用phrGFP对照载体或用MUC16c114或MUC16c344羧基末端构建体稳定转染后3T3细胞系的基质胶侵袭测定。每次测定采用三个平行进行两次或多次，并人工计数。与侵袭表达phrGFP载体对照的细胞相比，MUC16c114和MUC16c344细胞系的侵袭性明显更高(***p<0.0001)，MUC16c344细胞系的结果与MUC16c114细胞系显著不同((#p＝0.0354)。图3C描述了MUC16c114和MUC16c344表达诱导的转移和侵袭基因的表达。针对MUC16构建体阳性和仅载体细胞系检测了80个侵袭/转移基因转录物的超阵列。在3T3MUC16c114或3T3-MUC16c344细胞系中测量选定的趋化性，粘附和侵袭转录物的表达(三个平行分别测试两次，并与通过卡方检验的phr仅载体对照比较)。表中显示了经调整适于重复检测的每个转录物的p值。包括了p<0.05或更低水平变化的所有基因。图3D：检测了转染的3T3细胞ERK/AKT信号通路的激活与仅载体对照的比较。与phr载体的表达相比，MUC16c114和MUC16c344构建体表达后，ERK1/2(pT202/Y204)和AKT(S473)的磷酸化增加。在每个细胞系中都观察到两种途径的活化。β-肌动蛋白归一化光密度测定值如下图所示每个western印迹显示。图3E描绘了无胸腺裸鼠中MUC16构建体阳性的肿瘤生长。将两百万个肿瘤细胞引入15只nu/nu小鼠的侧腹，观察小鼠的肿瘤形成。每周两次由卡尺测量肿瘤。携带MUC16构建体阳性肿瘤的小鼠平均肿瘤体积的差异显著更大(与表达phrGFP对照载体的细胞相比，两个细胞系的p<0.0001)。
图4A-图4C.MUC16片段的致癌性质。图4A描述了转染phrGFP对照载体或MUC16羧基末端表达载体MUC16c114或MUC16c344的A2780细胞系的基质胶侵袭测定。每次测定采用三个平行进行两次或多次，并人工计数。将结果与表达phrGFP对照载体或MUC16c114的细胞的基质胶侵袭进行比较。MUC16c114或MUC16c34细胞系相对于phrGFP载体对照显示出显著的基质胶侵袭，MUC16c344细胞系的结果与MUC16c114细胞系的结果显著不同(##p＝0.0018)。图4B描述了MUC16表达对ERK/AKT信号传导的影响。检测了A2780细胞的ERK/AKT信号通路的激活。每个MUC16表达构建体的表达后，ERK1/2(pT202/Y204)和AKT(S473)的磷酸化增加。在每个细胞系中激活两种途径。β-肌动蛋白归一化光密度测定值如下图所示每个western印迹显示。图4C描绘了无胸腺裸鼠中MUC16-构建体阳性的肿瘤生长。将两百万个肿瘤细胞引入15只nu/nu小鼠的侧腹，观察小鼠的肿瘤形成。每周两次由卡尺测量肿瘤。如图所示，在第28天，携带任何MUC16c114-或MUC16c344-阳性肿瘤的小鼠的平均肿瘤体积的差异显著更大。
图5A-图5D：截短的MUC16c114变体的影响。图5A：软琼脂生长。将表达MUC16c114的内部或外部域部分的3T3转染子铺在软琼脂上，如6.1.2节所述。对菌落进行计数和绘制。显示的数据代表三个实验之一。MUC16c80和MUC16c86的软琼脂生长速率与MUC16c114的生长速度显着不同(分别为#p＝0.0111和##p＝0.0258)，而与MUC1686转染子的生长速率相比，MUC1680转染子的生长速率更高(###p<0.0001)。图5B描述了转染phrGFP对照载体或用MUC16羧基末端构建体转染的3T3细胞系的基质胶侵袭测定。每次测定采用三个平行进行两次或多次，并人工计数。与MUC16c114细胞系侵袭相比，侵袭MUC16c80转染细胞是显著的(#p＝0.0172)。图5C描述了MUC16表达对ERK/AKT信号传导的影响。检测了转染的3T3细胞的ERK/AKT信号通路的激活。MUC16c114后ERK1/2(pT202/Y204)和AKT(S473)的磷酸化增加，然而，在用MUC16c80或MUC16c86构建体转染的细胞中信号较低。β-肌动蛋白归一化光密度测定值如下图所示每个western印迹显示。图5D描绘了无胸腺裸鼠中MUC16构建阳性的肿瘤生长。将两百万个肿瘤细胞导入20只nu/nu小鼠的侧腹，观察小鼠的肿瘤形成。每周两次由卡尺测量肿瘤。携带MUC16+肿瘤的小鼠的平均肿瘤体积的差异显著更大。3T3MUC16c114和3T3MUC16c86转染子与MUC16c80转染子相比有显著差异(###p<0.0001)。
图6A-图6B。MUC16c114(氨基酸残基1777-1890(SEQ ID NO:133)，图6A)和MUC16c344(氨基酸残基1547-1890(SEQ ID NO:132)，图6B)的氨基酸序列。N-和O-糖基化位点高亮显示，跨膜域(氨基酸残基1835-1859)带有下划线并标明“跨膜域”。氨基酸残基1857-1884表示MUC16c86构建体中存在的28个氨基酸的内域缺失(参见，图1)。氨基酸残基1798-1831表示MUC16c80构建体中存在的34个氨基酸的胞外域缺失(参见，图1)。
图7A-图7H。N-糖基化对MUC16转化的影响。图7A描述了转染phrGFP对照载体或MUC16c114或MUC16c114-N123和MUC16c114并用0.1μg/mL衣霉素处理的3T3细胞系的基质胶侵袭分析。MUC16c114细胞系的结果与phrGFP载体对照细胞系的结果显著不同(###p<0.0001)。MUC16c114-N123细胞系的结果与phrGFP载体对照细胞系的结果显著不同(**p＝0.007)。用N-糖基化抑制剂衣霉素处理与未处理的MUC16c114相比显著抑制基质胶侵袭(p＝0.004)。图7B描述了与phrGFP对照载体相比的的3T3转染的细胞系基质胶侵袭分析。用MUC16c114转染的3T3细胞使用单独的培养基处理或用5μg/mL的对照pFUSE hIgG1-Fc2融合蛋白或用5μg/mL的MUC16c57-c114-pFUSE hIgG1-Fc2融合蛋白或用5μg/mL的117-244LGALS3-pFUSE hIgG1-Fc2融合蛋白处理，如图8详述。MUC16c114细胞系比表达phrGFP载体对照的对照3T3细胞的侵袭性更强(***p<0.0001)，且其不受暴露于仅pFUSE载体蛋白的影响。相反，用MUC16c57-c114-pFUSEhIgG1-Fc2融合蛋白或117-244LGALS3-pFUSE hIgG1-Fc2融合蛋白处理的MUC16c114细胞系与MUC16c114对照细胞相比显示了显著的基质胶侵袭抑制。图7C描述了MUC16表达对ERK/AKT信号传导的影响。还检测了转染的3T3细胞对ERK/AKT信号通路的激活。用MUC16c114转染的3T3中ERK1/2(pT202/Y204)和AKT(S473)的磷酸化增强，然而，在用MUC16c114-N123载体转染的3T3细胞中该作用消失(“MUC16c114-N123”和“MUC163(N-->A)c114”在本文中可交换使用)。虽然将3个天冬酰胺突变为丙氨酸突变，用抗MUC16抗体(4H11mAb)进行western印迹显示了比phrGFP载体对照或原始MUC16c114-转染细胞更强的信号，表明转染的3T3细胞中表达高水平的MUC163(N-->A)c114蛋白。如本文使用的，“4H11”表示Rao等，Appl.Immunohistochem MolMorphol，2010，18(5):462-72和国际专利申请公开号WO 2011/119979中的4H11单克隆抗MUC16抗体。图7D描述了无胸腺裸鼠中MUC16-构建体-阳性的肿瘤生长。将两百万个肿瘤细胞导入20只nu/nu小鼠侧腹并观察小鼠的肿瘤形成。每种两次用卡尺测量肿瘤。携带MUC16c114肿瘤的小鼠的平均肿瘤体积差异显著(p<0.0001)。3T3-MUC16c114转染子的结果与phrGFP对照载体细胞系的结果相比而言高度显著(***p<0.0001)。然而，MUC16c114-N123 3T3转染子未显示相对phrGFP载体对照3T3细胞的任何显著性，显示N-糖基化的突变显著降低肿瘤生长和侵袭。图7E描述了MUC16c57-114-pFUSE-人-IgG1-Fc2构建体的线性表示。胞外域的氨基酸序列如SEQ ID NO:161所示。图7F描述了由指示的抗体测定的蛋白水平的MUC16c57-114-pFUSE-人-IgG1-Fc2构建体。图7G描述了117-244LGALS3-pFUSE-人-IgG1-Fc2构建体的线性表示。糖结合域的氨基酸序列如SEQ ID NO:167所示。图7H描述了由指示的抗体测定的蛋白水平的17-244LGALS3-pFUSE-人-IgG1-Fc2构建体。
图8.插入pFUSE-hIgG1-Fc2载体以构建作为假(sham)受体的MUC16c57-c114pFUSE的胞外域-MUC16c57->c114(SEQ ID NO:161，MUC16氨基酸残基1777-1834)的氨基酸序列和插入pFUSE-hIgG1-Fc2获得作为受体的117-244LGALS3pFUSE载体的117-244LGALS3氨基酸序列(SEQID NO:167)的顺序。
图9A-图9E.MUC16c354转基因小鼠。图9A描述了MUC16c354条件构建的策略。使用CMV早期增强子加上鸡β肌动蛋白启动子(CAG)来驱动两个loxP和下游MUC16c354序列之间的hrGFP的转录。图9B：Southern印迹显示在显微注射程序后99只动物中有12名候选的MUC16c354阳性建立者(founder)。图9C：使用抗MUC16抗体4H11的Western印迹来鉴定MUC16c354小鼠集落发育的建立者9(50拷贝)和36(10拷贝)；A5是来自稳定转染MUC16c354的SKOV3的阳性对照。图9D：来自双MUC16c354:p53+/-转基因小鼠的肿瘤的组织学分析。在双MUC16c354:p53+/-转基因小鼠中鉴定了多个肉瘤和淋巴瘤。切片用苏木精和伊红(H&E)染色。肿瘤包括子宫(I，比例尺：100μm)、肝脏(II，比例尺：50μm)、卵巢(III，比例尺：50μm)和骨髓(IV，比例尺：50μm)中的组织细胞肉瘤以及卵巢(V，比例尺：50μm)、肾脏(VI，比例尺：50μm)和肺(VII，比例尺：50μm)中的淋巴瘤与肺癌(VIII，比例尺：50μm)。图9E：转基因小鼠癌特异性Kaplan-Meier存活曲线：MUC16c354小鼠在前18个月没有显示出与野生型(WT)类似的自发性肿瘤发展。然而，当MUC16c354小鼠与p53+/-小鼠交叉时，与p53+/-小鼠(p<0.014)或MUC16c354小鼠相比，双重转基因MUC16c354：p53+/-小鼠由于自发性肿瘤发展而显示出显著更差的总生存期。
图10。12个月大的雄性和雌性MUC16c354转基因小鼠的代表性组织学结果。组织切片用苏木精和伊红染色(H&E，比例尺：50μm)。观察到子宫内膜增生，两种基因型具有相似的发病率和严重程度(此处仅显示于转基因动物中)。转基因动物的卵巢、肺、结肠和肝脏(Tg)与亲本系(野生型，WT)相似。
图11A-图11C。MUC16对人卵巢癌的影响。图11A描述了MUC16转录本数。图11B：与Kaplan-Meier分析中与MUC16表达较低的患者相比，具有最高MUC16表达的患者的五分之一与18例确定的MUC16突变的患者具有显著更差(p＝0.02117)的生存期。图11C描述了MUC16遗传改变与卵巢癌中PI3K突变事件的关系。
图12A-图12C。MUC16基质胶侵袭的糖基化需求。图12A描述了SKOV3转染的细胞系的基质胶侵袭分析。phrGFP表示表达对照载体的SKOV3细胞。MUC16c114表示表达MUC16c114的SKOV3细胞。N3表示表达MUC16c114-N3的SKOV3细胞。N1-2表示表达MUC16c114-N12的SKOV3细胞。N1-2-3表示表达MUC16c114-N123的SKOV3细胞。MUC16c114-shControl表示表达MUC16c114和对照shRNA的SKOV-3细胞。phrGFP shRNA MGAT群#4表示表达对照载体和针对MGAT5的shRNA的SKOV3细胞。phrGFP shRNA LGALS3群#15表示表达对照载体和针对LGALS3的shRNA的SKOV3细胞。MUC16c114-shMGAT5表示表达MUC16c114和针对MGAT5的shRNA的SKOV3细胞。MUC16c114-shLGALS3表示表达MUC16c114和针对LGALS3的shRNA的SKOV3细胞。图12B描述了表达对照载体、phrGFP或指示的MUC16c114构建体的3T3细胞的基质胶侵袭分析。图12C描述了移植有表达指示的构建体的SKOV3细胞的无胸腺裸鼠中按照肿瘤体积测定的肿瘤生长。
图13A-图13D。MUC16糖基化模式和肽。图13A描述了表达MUC16c114-N12的SKOV3细胞的N连接的谱。三角形表示岩藻糖。方块代表N-乙酰氨基葡萄糖。灰色圆圈表示甘露糖。白色圆圈表示半乳糖。菱形表示N-乙酰基甲酰胺酸。图13B描述了55-mer(SEQ ID NO:129)的抗原。图13C描述了15-mer(SEQ ID NO:131)的抗原。图13D描述了18-mer(SEQ ID NO:130)的抗原。
图14提供了包含用糖基化和未糖基化抗原的MUC16糖基化抗体的生物反应性上清液的相对反应性的详细ELISA分析，其中使用15mer和18mer作为免疫原和筛选抗原靶标。
图15A-图15B。MUC16糖基化抗体抑制基质胶侵袭。图15A描述了在存在或不存在来自产生MUC16糖基化抗体的生物反应性上清液下表达phrGFP对照载体或MUC16c114的SKOV3细胞的基质胶侵袭。该细胞系是相对数200的参照系。图15B描述了在存在或不存在纯化的MUC16糖基化抗体下表达phrGFP对照载体或MUC16c114的SKOV3细胞的基质胶侵袭。该细胞系是相对数90的参照系。
图16A-图16E。MUC16糖基化抗体抑制基质胶侵袭。图16A描述了表达phrGFP对照载体或指示的MUC16c114构建体的SKOV3细胞的基质胶侵袭，其中存在：(i)对照抗体，(ii)4H11或(iii)MUC16糖基化抗体克隆10C6.E4。图16B描述了使用4H11进行第三轮FACs分选后稳定表达phrGFP对照载体或指示的MUC16c344构建体的SKOV3细胞的基质胶侵袭，其中存在：(i)对照抗体，(ii)4H11或(iii)MUC16糖基化抗体克隆10C6.E4。图16C描述了表达phrGFP对照载体或指示的MUC16c114构建体的3T3细胞的基质胶侵袭，其中存在：(i)对照抗体，(ii)4H11或(iii)MUC16糖基化抗体克隆10C6.E4。图16D描述了移植有表达MUC16c344和用模拟物(MUC16c344)处理的或用MUC16糖基化抗体10C6.E4(MUC16c344+10C6.E4)处理的SKOV3细胞的无胸腺裸鼠中如肿瘤体积所示的肿瘤生长。箭头指示给药100μg的MUC16糖基化抗体的天数。图16E描述了用指示的抗体染色的人卵巢肿瘤样品。
图17描述了在指示的温度和时间点下内化标记的MUC16糖基化抗体的细胞的百分比。
图18A描述了MUC16转染子的体外生长曲线。在96孔平底板中用phrGFP载体对照、表达MUC16c114(SEQ ID NO:133)的phrGFP载体或表达MUC16c344(SEQ ID NO:132)的phrGFP载体培养1000SKOV3细胞/孔，并在37℃下5％CO2中孵育5天。每天用Alamar Blue染色一块板，并在37℃下5％CO2中孵育4小时。在CytoFluor Fluorescent读板器中读板。曲线中未发现统计差异。图18B描述了SKOV3 phrGFP细胞、SKOV3MUC16c114-GFP细胞或SKOV3-MUC16c344-GFP细胞的基质胶侵袭分析。每次测定采用三个平行进行两次或多次，并人工计数。结果表达为侵袭细胞的相对数。c114和c344与phrGFP相比统计学上显著。图18C描述了无胸腺雌性裸鼠中SKOV3转染子的肿瘤生长。将两百万个肿瘤细胞引入10只nu/nu小鼠侧腹并观察小鼠的肿瘤形成。每周两次用卡尺测量肿瘤。与phrGFP肿瘤相比，携带MUC16c344肿瘤(p<0.0001)和MUC16c114肿瘤(p＝0.002)的小鼠的平均肿瘤体积差异在统计学上显著较大。图18A-FIG.18C的缩写：“SKOV3 phrGFP”和“phrGFP”表示表达对照phrGFP载体的SKOV3细胞，“SKOV3MUC16c114-GFP”和“c114”表示表达MUC16c114(SEQ ID NO:133)的SKOV3细胞，“SKOV3MUC16c344-GFP”和“c344”表示表达MUC16c344(SEQ ID NO:132)的SKOV3细胞。
图19A-图19F描述了MUC16表达对SKOV3卵巢癌细胞的影响。图19A描绘了用或不用以下处理的表达对照phrGFP对照载体(“phrGFP”)或表达MUC16c114(SEQ ID NO:133；“c114”)的phrGFP载体的SKOV3细胞的基质胶侵袭分析：(1)5μg/mL衣霉素；(2)5μg/mL的对照pFUSE蛋白；(3)5μg/mL的MUC16c57-114-pFUSE融合蛋白；或(4)5μg/mL的117-244LGALS3-pFUSE融合蛋白。结果表达为治疗后48小时的侵袭细胞数。c114细胞比phrGFP细胞侵袭性更强(p<0.0001)。c114细胞的侵袭性不受使用仅pFUSE载体蛋白处理的影响。用衣霉素(N-糖基化抑制剂)处理降低了c114细胞的侵袭性。用MUC16c57-114-pFUSE融合蛋白或117-244LGALS3-pFUSE处理降低了c114细胞的侵袭性(p<0.0001)。图19B描绘了在存在或不存在薄层(lamelli)对照shRNA、MGAT5特异性shRNA或LGALS3特异性shRNA的情况下用phrGFP载体对照(“phrGFP”)或表达MUC16c114(SEQ ID NO:133)(“c114”)的phrGFP载体转染的SKOV3细胞的基质胶侵袭分析。与用shRNA处理的phrGFP细胞相比，用MGAT5特异性shRNA或LGALS3特异性shRNA处理的c114细胞侵袭减少。对照shRNA对c114细胞侵袭无影响。每次测定采用三个平行进行两次或多次，并人工计数。图19C描述了SKOV3-MUC16c114基质胶侵袭的糖基化依赖性。用phrGFP对照载体或表达以下MUC16突变体的phrGFP载体转染SKOV3细胞：c114(SEQ ID NO:133)，N1mut c114(SEQ ID NO:151)，N24MUC c114(SEQ ID NO:152)，N30mut c114(SEQ ID NO:139)，N1-N24mut c114(SEQ ID NO:153)，N1-N24-N30mut c114(SEQ ID NO:154)。与对照phrGFP细胞相比，表达c114的细胞显示增加的侵袭。表达c114的细胞的增加的侵袭性依赖于MUC16c114(SEQ ID NO:133)的氨基酸位点24和30处天冬酰胺的N-糖基化。虽然N24和N30都是重要的，但对该作用而言N30位点似乎比N24位点更为重要。每次测定采用三个平行进行两次或多次，并人工计数。结果表示为与phrGFP载体对照相比的％。图19D描述了SKOV3-MUC16c344基质胶侵袭的糖基化依赖性。用phrGFP对照载体或表达以下MUC16突变体的phrGFP载体转染SKOV3细胞：c344(SEQ ID NO:132)，N24 mut c344(SEQ ID NO:173)，N30mut c344(SEQ IDNO:174)或N24-N30 mut c344(SEQ ID NO:175)。与对照的phrGFP细胞相比，表达c344的细胞显示增加的侵袭。表达c344的细胞的增加的侵袭性依赖于对应于MUC16c114(SEQ ID NO:133)的氨基酸位点24和30的天冬酰胺的N-糖基化。每次测定采用三个平行进行两次或多次，并人工计数。图19E描述了MUC16表达对所选信号通路的影响。用或不用对照shRNA(“sh薄层”)或针对MGAT5(“shMGAT5”)或LGALS3(“shLGALLS3”)的shRNA处理MUC16c114(SEQ IDNO:133)转染的SKOV3细胞，并与转染phrGFP载体对照(“phrGFP”)或表达MUC16c114-N30mut(SEQID NO:139)(“N30mut”)的phrGFP载体的SKOV3细胞进行对比，并检测细胞的pAKT，pERK1/2，pSRC和pEGF受体(pEGFR)信号通路的活化。MUC16c114细胞中AKT(S473)和ERK1/2(pT202/Y204)的磷酸化增加。敲低MGAT5(shMGAT5)，敲低半乳糖凝集素-3(shLGALLS3)和N30A突变均降低了MUC16c114诱导的SKOV3细胞系中的癌基因激活。图19F描绘了无胸腺雌性裸鼠中的SKOV3转染肿瘤生长。对于每种情况，将200万个肿瘤(如下所述)细胞引入10只nu/nu小鼠的侧翼，观察小鼠肿瘤形成。每周两次用卡尺测量肿瘤。与phrGFP肿瘤细胞相比，c114肿瘤细胞的体内生长更具侵略性(p<0.0001)。与phrGFP诱导细胞相比，N1-N24-N30-mut c114，c114-sh-MGAT5和c114-sh-LGALS3肿瘤细胞不显示生长增强。肿瘤细胞的描述：“phrGFP”表示用phrGFP载体对照转染的SKOV3细胞，“c114”表示用表达MUC16c114(SEQ ID NO:133)的phrGFP载体转染的SKOV3细胞，“N1-N24-N30-mut c114”表示用表达MUC16c114-N1-N24-N30-mut(SEQ ID NO:154)的phrGFP载体转染的SKOV3细胞，“c114-sh-MGAT5”表示用表达MUC16c114(SEQ ID NO:133)的phrGFP载体转染并用针对MGAT5的shRNA处理的SKOV3细胞，“c114-sh-LGALS3”表示用表达MUC16c114(SEQ ID NO:133)的phrGFP载体转染并用针对LGALS3的shRNA处理的SKOV3细胞。
图20A描述了MUC16表达对EGFR表面表达的影响。在存在或不存在放线菌酮(CHX)处理下24小时检测SKOV3-phrGFP和SKOV3-MUC16c114转染子。显示了基底和CHX处理后水平下EGFR和MUC16表达的几何平均荧光。SKOV3-phrGFP样品中的EGFR在用CHX处理24小时后降低至未处理水平的58％。在这些细胞中没有显著的MUC16表达。相比之下，在SKOV3-MUC16c114细胞中，EGFR几何平均荧光增加约25％、降低至CHX暴露后对照的83％。MUC16c114平均荧光没有被CHX显著降低。图20B描绘了来自总细胞EGFR的Western印迹的EGFR/β-肌动蛋白比例的光密度测定，说明在用CHX处理的SKOV3-phrGFP细胞中EGFR随时间变化的稳定损失。相比之下，SKOV3-MUC16c114细胞中EGFR的总水平得以保持，显示与MUC16(–)对照细胞系(“phrGFP(-)”)相比EGFR更稳定。图20C描述了用phrGFP对照载体(“稳定phrGFP”)转染的SKOV3细胞、SKOV3-MUC16c114和SKOV3-MUC16c114(tet)四环素诱导型细胞系的基质胶侵袭分析，其表达为对照细胞侵袭的分数。SKOV3-MUC16c114(tet)细胞的四环素诱导导致与稳定的SKOV3-MUC16c114(SKOV3c114)相似的侵袭性表型，而未诱导的细胞与MUC16-phrGFP对照细胞匹配。这种MUC16诱导的基质胶侵袭的增加完全依赖于EGFR。当在SKOV3细胞中引入EGFR(shEGFR)发夹RNA敲低时，四环素诱导MUC16(蛋白质印迹中的4H11阳性蛋白)的表达，但不增加基质胶侵袭。每个测定进行三个平行，并手工计数。图20D：MUC16c114(+)和MUC16c114(–)细胞细胞中的EGFR稳定性。用CHX处理24小时并探测总细胞EGFR的未诱导或四环素诱导的SKOV3-MUC16c114(tet)细胞系的细胞提取物表示为光密度比，并用β-肌动蛋白标准化。四环素诱导的SKOV3-MUC16c114细胞的EGFR下降斜率与MUC16c114(–)相比，复制了MUC16c114表达的EGFR稳定作用。其结果类似于上述图20B所示的稳定转染的效果。
图21描述了用放线菌酮处理24小时的未诱导或四环素诱导的SKOV3c114细胞系(分别为“未诱导的MUC16c114”和“Tet诱导的MUC16c114”)的细胞提取物的印迹分析的光密度测定。对蛋白质印迹探测了pEGFR，并将蛋白质水平标准化为β-肌动蛋白水平。与未诱导的SKOV3c114细胞系相比，四环素诱导的SKOV3c114pEGFR信号的斜率显示出稳定的pEGFR。
图22A-图22C描述了MUC16胞外域N-糖基化种类的鉴定和化学合成。图22A：用表达N1-N24突变的MUC16c114(SEQ ID NO:SEQ ID NO:153)的phrGFP转染的SKOV3细胞的N-聚糖谱图。在佐治亚大学复合碳水化合物研究中心(Complex Carbohydrate Research Center,University of Georgia)，通过总离子作图检测和鉴定了聚糖。三角形：岩藻糖；方块：N-乙酰葡萄糖胺；圆圈，深色填充：甘露糖；圆圈，浅色填充：半乳糖；菱形：N-乙酰神经氨酸。图22B描述了在N30位点具有单壳二糖(GlcNAc2)聚糖的55-merMUC16抗原的示意结构。该N-糖肽抗原用于免疫小鼠以产生抗体。氨基酸序列如SEQ ID NO：129所示。方块代表N-乙酰葡糖胺；圆圈表示甘露糖。图22C分别描绘了在N30位点用壳二糖单糖基化的KLH-缀合的15-merMUC16抗原和在N24和N30位点用两个壳二糖单元双糖基化的KLH-缀合的18-merMUC16抗原的示意结构。随后将这些N-糖肽-KLH构建体用于免疫小鼠以产生针对MUC16胞外域内的GlcNAc2-肽表位的单克隆抗体。还包括了MUC16无关糖肽和非糖基化的MUC16肽2以得到4H11单克隆抗体的序列。KLH-15-mer(壳二糖)[C-G25-V38]的氨基酸序列如SEQ ID NO：131所示。KLH-18-mer(壳二糖)2[C-T22-V38]的氨基酸序列如SEQ ID NO：130所示。MUC16非糖基化肽2的氨基酸序列如SEQ ID NO：168所示。MUC16无关肽18mer和MUC16无关肽18mer+GlcNAc2的氨基酸序列如SEQ ID NO：169所示。方块表示N-乙酰葡糖胺。
图23A-图23H描述了MUC16糖基化抗体的表征。图23A描绘了4H11和四种先导GlcNAc2-MUC16-胞外域单体抗体(MUC16糖基化抗体)通过夹心ELISA对各种MUC16和GlcNAc2-糖基化肽的反应性。对非糖基化的MUC16肽2(SEQ ID NO：168)或任何一种无关肽(SEQ ID NO：169)没有观察到聚糖-MUC16胞外域交叉反应性。类似地，4H11对MUC16 15-mer(SEQ ID NO:131)或(GlcNAc2)2-18-mer(SEQ ID NO:130)N-糖肽基本上没有亲和力。方块代表N-乙酰谷氨酰胺；三角形表示岩藻糖；圆圈表示甘露糖。图23B、23C、23D描述了MUC16糖基化抗体对MUC16增强的基质胶侵袭的影响。结果表示为与对照相比的％。用表达MUC16c114(SEQ ID NO:133)的phrGFP转染的SKOV3细胞(图23B)，CAOV3细胞(图23C)和OVCA-433细胞(图23D)的基质胶分析，含有或不含(对照)纯化的4H11或5μg/mL的四聚糖-MUC16-胞外域抗体18C6、10C6、19C22或7B12。四种抗聚糖-MUC16-胞外域抗体(MUC16糖基化抗体)中的每一种都抑制三种不同的MUC16(+)卵巢癌细胞系(CAOV3和OVCA-433)的侵袭，而4H11对SKOV3-MUC16c114细胞侵袭的抑制作用较小。图23E描述了通过MUC16糖基化抗体单克隆抗体(“MAB”)10C6抑制EGFR稳定。来自未诱导的SKOV3-MUC16c114(tet)、四环素诱导的SKOV3-MUC16c114(tet)或单克隆MUC16糖基化抗体10C6处理的四环素诱导的SKOV3-MUC16c114(tet)细胞系的细胞提取物的western印迹分析的光密度测定，对所述细胞系用CHX处理，然后在用环己酮处理后的指定时间(小时)检测总EGFR。如图20A所示，光密度曲线的斜率表明MUC16c114在细胞表面的存在稳定了EGFR。MUC16糖基化抗体10C6消除了总EGFR蛋白的MUC16c114稳定，使其类似于MUC16(–)未诱导的对照。图23F描绘了用4H11、OC125(商业化的)或单克隆MUC16糖基化抗体(10C6和19C11)染色的人卵巢组织微阵列。MUC16在浆液性卵巢癌中的表达是一致的，与OC125和4H11重叠。图23G、23H描述了MUC16糖基化抗体对无胸腺雌性裸鼠肿瘤生长的影响。将二百万个肿瘤细胞(用phrGFP载体(“phrGFP”)或表达MUC16c344(SEQ ID NO：132；“c344”)的phrGFP载体转染的SKOV3细胞)导入20只nu/nu小鼠的侧腹。用纯化的单克隆MUC16糖基化抗体10C6以100μg/小鼠自第0天起静脉内处理10只小鼠，每周两次，持续4周。观察所有小鼠的肿瘤形成。每周两次用卡尺测量肿瘤。图23G显示了在存在和不存在10μg/mL纯化的单克隆MUC16糖基化抗体10C6下对相同细胞进行的基质胶侵袭分析。图23H显示，与未处理的MUC16c344肿瘤相比，单克隆MUC16糖基化抗体10C6处理的携带MUC16c344肿瘤的小鼠的平均肿瘤体积差异显著降低(p＝0.0004)，表明保护免受MUC16对肿瘤生长的影响。
图24A-FIG.24D描述了半乳糖凝集素介导的MUC16蛋白-蛋白相互作用。图24A描述了三种糖基化的蛋白(EGFR DDK-His，MUC16c57-114-pFUSE和LGALS3Myc-DDK)的免疫印迹(IB)和免疫沉淀(IP)。将MUC16c57-114-pFUSE糖基化的蛋白混合LGALS3蛋白(0.13μg)和EGFR(0.13μg)，然后在4℃下旋转1小时。加入预封闭的蛋白A/G PLUS琼脂糖珠，然后在4℃下旋转过夜。对IP小球进行冲洗，在上载缓冲液中煮沸并通过10％SDS-PAGE凝胶电泳进行分离，然后转移至硝酸纤维膜上。用抗EGFR-v3、抗4H11-HRP或多克隆抗LGALS3抗体对膜进行检测。如图所示，4H11结合显示MUC16c57-114-pFUSE一直存在。LGALS3结合在MUC16c57-114-pFUSE阳性泳道中，但是EGFR仅在LGALS3和MUC16c57-114-pFUSE均存在时检测到。单克隆MUC16糖基化抗体18C6的存在防止了这些LGALS3，EGFR和MUC16蛋白复合体的形成(右侧泳道)。图24B描述了MUC16和EGFR蛋白共定位。野生型OVCAR3细胞或用表达MUC16c344(SEQ ID NO:132，“SKOV3c344”)的phrGFP或用表达MUC16c114(SEQ ID NO:133，“SKOV3c114”)的phrGFP转染的SKOV3细胞的免疫荧光染色，EGFR-A647和4H11-PE用于MUC16或两种试剂EGFR-A647和4H11-PE组合用于MUC16。显微图像(50μm比例尺)表明所有三种细胞系中EGFR和MUC16c114的共定位(参见箭头)。图24C描述了三种糖基化的蛋白(整联蛋白β1Myc-DDK，MUC16c57-114-pFUSE和LGALS3Myc-DDK)的免疫印迹(IB)和免疫沉淀(IP)。使用与图24A中大致相同的方法。免疫印迹的Western印迹分析和所有免疫沉淀的样品在10％SDS-PAGE凝胶上运行，转移至硝酸纤维膜上并用抗4C5-DDK检测整联蛋白β1或用抗4H11-HRP或抗4C5-DDK检测LGALS3抗体。对于EGFR，需要所有三种蛋白来共沉淀整联蛋白β1蛋白。MUC16糖基化抗体18C6也阻断MUC16、LGALS3和整联蛋白β1的组合，如三条右侧的泳道所示。图24D描述了MUC16和整联蛋白β1蛋白的共定位。野生型OVCAR3细胞或用表达MUC16c344(SEQ ID NO:132，“SKOV3c344”)的phrGFP或用表达MUC16c114(SEQ ID NO:133，“SKOV3c114”)的phrGFP转染的SKOV3细胞的免疫荧光染色，整联蛋白β1-A647或4H11-PE用于MUC16或两种试剂整联蛋白β1-A647或4H11-PE的组合用于MUC16。显微图像(50μm比例尺)表明OVCAR3，SKOV3c344和SKOV3c114细胞中整联蛋白β1和MUC16的共定位(参见箭头)。
图25A描述了野生型OVCAR3细胞或用表达MUC16c344(SEQ ID NO:132，“SKOV3c344”)的phrGFP或表达MUC16c114(SEQ ID NO:133，“SKOV3c114”)的phrGFP转染的SKOV3细胞或SKOV3c344或SKOV3c114细胞系的免疫荧光染色，EGFR-A647或4H11-PE或两种试剂的组合用于MUC16。显微图像(比例尺100μm)清晰表明了EGFR和MUC16的共定位(参见箭头)。图25B：野生型OVCAR3或SKOV3c344或具有整联蛋白β1-A647或4H11-PE用于MUC16的细胞系或两种试剂的组合的免疫荧光染色。显微图像(比例尺100μm)清晰表明了整联蛋白β1和MUC16的共定位(参见箭头)。
图26A-图26D描述了MUC16肿瘤促进的模型。图26A描述了EGFR-LGALS3-MUC16和LGALS3-整联蛋白β1-MUC16的关系图。通过EGFR的SRC/ERK/AKT信号传导或通过整联蛋白β1的SRC/FAK信号传导依赖于MUC16和与LGALS3五聚体的信号-分子相互作用。图26B描述了糖基化缺失的模型：在shMGAT5-转染的细胞系中，MUC16，EGFR和整联蛋白β1上的位点的N-糖基化由于四触角(tetra-antennary)结构的缺失而降低，导致不结合LGALS3。图26C描述了半乳糖凝集素-3缺失的模型：在shLGALS3转染的细胞系中，虽然MUC16上存在N-糖基化位点，但是与LGALS3结合的缺失导致不能MUC16/EGFR或MUC16/整联蛋白β1关联，并减少了由内向外的信号。图26D描述了MUC16/LGALS3相互作用的潜在抑制剂的模型。暴露于MUC16糖基化抗体或“假的”模拟受体(抗MUC16c57-114pFUSE或117-244LGALS3-pFUSE)的MUC16(+)细胞不能结合LGALS3凝胶，并随之不能结合EGFR或整联蛋白β1。
图27A描述了侧链保护的N-乙酰化的55-mer肽酰胺(SEQ ID NO:129)。图27B描述了糖肽p55-mer[N1-S55]来自UPLC分析的ESI-MS和UV示踪(trace)。计算值C486H760N84O111S8，9812.25(平均同位素)[M+5H]5+m/z 1963.45，测试值(found)1963.20，[M+6H]6+m/z1636.38，测试值1636.24，[M+7H]7+m/z 1402.75，测试值1402.74。BEH C4柱，梯度：80-99％乙腈/水超过6分钟，流速0.3mL/min。
图28A描述了携带壳二糖的55-mer糖肽：“55-mer(壳二糖)[N1-S55]”(GlcNAc2-55-mer)(SEQ ID NO:129)。图28B描述了糖肽“55mer(壳二糖)[N1-S55]”(GlcNAc2-55-mer)来自UPLC分析的ESI-MS和UV示踪。计算值C291H463N87O97S，6764.38(平均同位素)[M+4H]4+m/z1692.10，测试值1692.01，[M+5H]5+m/z 1353.88，测试值1353.86，[M+6H]6+m/z 1128.40，测试值1128.41，[M+7H]7+m/z 967.34，测试值967.45，[M+8H]8+m/z 846.55，测试值846.27。BEH C4柱，梯度：20-40％乙腈/水超过6分钟，流速0.3mL/min。
图29A描述了携Man3GlcNAc2的55-mer糖肽：“55-mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]”(Man3GlcNAc2-55-mer)(SEQ ID NO:129)。图29B描述了糖肽“55mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]”(Man3GlcNAc2-55-mer)来自分析级HPLC分析的ESI-MS和UV示踪。计算值C309H493N87O112S，7250.80(平均同位素)[M+4H]4+m/z 1813.70，测试值1813.52，[M+5H]5+m/z1451.16，测试值1451.02，[M+6H]6+m/z 1209.47，测试值1209.33，[M+7H]7+m/z 1036.83，测试值1036.74。Waters X-Bridge C18柱，梯度：25-35％乙腈/水超过30分钟，流速0.2mL/min。
图30A描述了侧链保护的15-mer肽(p15-mer[C-G25-V38])(SEQ ID NO:131)。图30B描述了壳二糖-单糖基化的15-mer糖肽：15-mer(壳二糖)[C-G25-V38](GlcNAc2-15-mer)(SEQID NO:132)。图30C描述了糖肽“15mer(壳二糖)[C-G25-V38]”(GlcNAc2-15-mer)来自分析级HPLC分析的的ESI-MS和UV示踪。计算值C87H142N24O35S，2116.26(平均同位素)[2M+3H]3+m/z1411.84，测试值1412.02，[M+2H]2+m/z 1059.13，测试值1059.15，[M+3H]3+m/z 706.42，测试值706.46。Varian Microsorb 300-5 C18柱，梯度：15-30％乙腈/水超过30分钟，流速0.2mL/min。
图31A描述了侧链保护的18-mer肽(p18-mer[C-G22-V38])(AF-I-165)(SEQ ID NO:130)。图31B描述了壳二糖-双糖基化的18-mer糖肽：“18-mer(壳二糖)2[C-T22-V38]”[(GlcNAc2)2-18-mer](SEQ ID NO:130)。图31C描述了来自糖肽“18mer(壳二糖)2[C-T22-V38]”[(GlcNAc2)2-18-mer]的分析级HPLC分析的ESI-MS和UV示踪。计算值C117H193N33O50S，2894.04(平均同位素)[2M+3H]3+m/z 1930.36，测试值1930.22，[M+2H]2+m/z 1448.02，测试值1447.65，[M+3H]3+m/z 965.68，测试值965.25。Varian Microsorb 300-5C8柱，梯度：15-30％乙腈/水over 30minute，流速0.2mL/min。
图32A描述了糖肽“15-mer(壳二糖)[C-G25-V38]”，缀合至KLH(SEQ ID NO:131)。图32B描述了糖肽“18-mer(壳二糖)2[C-T22-V38]”，缀合至KLH(SEQ ID NO:130)。
5.发明详述
本文提供了抗体及其抗原结合片段和包括该抗体或片段的多肽，例如融合蛋白，缀合物，和/或嵌合抗原受体，以及表达其的细胞。抗体和片段中是那些特异性结合MUC16蛋白表位的。该抗体在本文中称为“MUC16糖基化抗体”。该表位通常是位于表位MUC16分子胞外部分或基本位于其胞外部分之内的，通常为非脱落(shed)形式的MUC16，在一些实施方案中，表位不位于MUC16的串联重复区域和/或分泌形式的MUC16之内，或抗体或片段不结合MUC16的串联重复区域和/或分泌形式的MUC16。在一些实施方案中，表位位于MUC16c114之内或包括MUC16c114之内的残基，并典型的包括其中的一个或多个糖基化的残基或糖基化位点。在一些实施方案中，表位包括一个或多个糖基化位点，例如用于N-糖基化的位点。在一些方面，该表位包括对应如SEQ ID NO:150所示的MUC16序列(和/或其糖基化形式)的Asn1806或Asn1800的天冬酰胺残基；在一些方面，在一些方面，表位包括对应SEQ ID NO:150的Asn1806天冬酰胺残基，但不包括对应SEQ ID NO:150的Asn1800天冬酰胺残基，在一些方面，表位包括对应SEQ ID NO:150的Asn1800天冬酰胺残基，但不包括对应SEQ ID NO:150的Asn1806天冬酰胺残基。在一些该实施方案的任何一个，该一个或多个天冬酰胺是糖基化的，例如N-糖基化的。在一些实施方案中，抗体或片段结合SEQ ID NO:131之内的表位或包括SEQ ID NO:131之内的残基的表位，结合SEQ ID NO:130之内的表位或包括SEQ ID NO:130之内的残基的表位，或其组合，在一些实施方案中，抗体或片段不免疫特异性结合对应SEQ ID NO:168的MUC16区域内或SEQ ID NO:168的残基2-19内。
在一个方面，本文提供了抗体(例如，单克隆抗体)和其抗原结合片段，其(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139和(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。在另一方面，本文提供了抗体(例如，单克隆抗体)和其抗原结合片段，其(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第三形式的MUC16的细胞，该第三形式是糖基化的，且其中第三形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139和(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。在一个优选实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体及其抗原结合片段免疫特异性结合包含SEQ ID NO:150的氨基酸残基1806(Asn1806)的表位，其中Asn1806是N-糖基化的(本文中称为“Asn1806糖基化”)。如本文第6节的实施例所示，Asn1806糖基化对于MUC16介导的侵袭和肿瘤细胞生长是必须的。从而，本文描述的MUC16糖基化抗体及其抗原结合片段能够结合封闭该侵袭和肿瘤细胞生长。
在一个实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段除了N-糖基化的Asn1806外还需要N-糖基化的Asn1800以结合MUC16(即，两种N-糖基化位点都是MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段所识别的表位的一部分)。“Asn1800”表示SEQ ID NO:150的氨基酸残基1800。该MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段可通过下述进行鉴定：(i)其免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞的能力，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133和(ii)其不能免疫特异性结合重组表达第五形式的MUC16的细胞，其第五形式是糖基化的，且其中第五形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:172，其中重组表达第一形式的MUC16的细胞与重组表达第五形式的MUC16的细胞是相同细胞类型。
在一个实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段需要N-糖基化的Asn1806但不需要N-糖基化的Asn1800以结合MUC16(即，N-糖基化的Asn1806是MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段所识别表位的一部分，但N-糖基化的Asn1800不是MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段所识别表位的一部分)。该MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段可通过下述进行鉴定：(i)其免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞的能力，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)其不能免疫特异性结合重组表达第三形式的MUC16的细胞，该第三形式是糖基化的，且其中第三形式的氨基酸序列是SEQ IDNO:139；和(iii)其免疫特异性结合重组表达第四形式的MUC16的细胞的能力，其第四形式是糖基化的，且其中第四形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:152和(iii)其中重组表达第一形式的MUC16的细胞、重组表达第三形式的MUC16的细胞和重组表达第四形式的MUC16的细胞是相同细胞类型。
由SEQ ID NO:133的氨基酸序列编码的蛋白在本文中也称为MUC16c114，其由成熟MUC16的C端114个氨基酸残基(SEQ ID NO:150为成熟MUC16的序列)组成。MUC16c114能够在SEQ IDNO:133的天冬酰胺氨基酸残基位点1，24和30被N-糖基化(对应于氨基酸位点SEQ ID NO:150的Asn1777，Asn1800和Asn1806)。
由SEQ ID NO:139的氨基酸序列编码的蛋白在本文中也称为MUC16c114-N3。MUC16c114-N3由成熟MUC16的C端114个氨基酸残基(SEQ ID NO:150为成熟MUC16的序列)组成，除了氨基酸位点30的天冬酰胺(对应SEQ ID NO:150的氨基酸位点1806)被突变为丙氨酸。从而，MUC16c114-N3不能在SEQ ID NO:139的氨基酸位点30被N-糖基化(对应氨基酸位点SEQ IDNO:150的Asn1806)。
由SEQ ID NO:152的氨基酸序列编码的蛋白在本文中也称为MUC16c114-N2。MUC16c114-N2由成熟MUC16的C端114个氨基酸残基(SEQ ID NO:150为成熟MUC16的序列)组成，除了氨基酸位点24的天冬酰胺(对应氨基酸位点SEQ ID NO:150的Asn1800)被突变为丙氨酸。从而，MUC16c114-N2不能在SEQ ID NO:152的氨基酸位点24被N-糖基化(对应氨基酸位点SEQ IDNO:150的Asn1800)。
由SEQ ID NO:172的氨基酸序列编码的蛋白在本文中也称为MUC16c114-N23。MUC16c114-N23由成熟MUC16的C端114个氨基酸残基(SEQ ID NO:150为成熟MUC16的序列)组成，除了氨基酸位点24和30的天冬酰胺(对应于SEQ ID NO:150的氨基酸位点Asn1800和Asn1806)被突变为丙氨酸。从而，MUC16c114-N23不能在SEQ ID NO:157的氨基酸位点24和30被N-糖基化(对应于SEQ ID NO:150的氨基酸位点Asn1800和Asn1806)。
本文还提供了重链和轻链，其中包含所述重链和轻链的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段：(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。本文还提供了包含核酸序列(例如，互补DNA(cDNA))的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)，其编码该抗体及其抗原结合片段，重链或轻链。进一步的，本文提供了载体(例如，表达载体)和细胞(例如，分离的细胞或离体细胞)包含含有核酸序列(例如，互补DNA(cDNA))的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)，所述核酸序列编码该抗体及其抗原结合片段，重链或轻链。本文还提供了制备该抗体，其抗原结合片段，重链，轻链，载体和细胞的方法。在其它方面，本文提供了用于MUC16活性和/或MUC16-驱动的肿瘤生长或治疗或管理某些本文描述的病况或疾病的方法和用途，例如治疗和管理癌症。还提供了相关组合物(例如，药物组合物)，试剂盒和诊断方法。
如本文使用的术语“MUC16”或“MUC16多肽”或“MUC16肽”表示Yin BW和Lloyd KO，2001，J Biol Chem.276(29):27371-5中所述的MUC16拴粘蛋白。GenBankTM登录号NM_024690.2(SEQ ID NO:137)提供了示例性的人MUC16核酸序列。GenBankTM登录号NP_078966.2(SEQ IDNO:136)提供了示例性的人MUC16氨基酸序列。原始MUC16包含胞内域，跨膜域，邻近推测的裂解位点的胞外域和大的、高度糖基化的12-20重复区，每区156个氨基酸长(图1A)。“不成熟的”MUC16指SEQ ID NO:136，其包含MUC16信号序列(SEQ ID NO:136的氨基酸残基1-60)。“成熟MUC16”表示如细胞表面上表达的原始MUC16，即，其中信号序列已被细胞加工所去除，例如，SEQ ID NO:150，其中SEQ ID NO:136的前60个氨基酸残基被去除(即，SEQ ID NO:136是“不成熟”形式的MUC16)。
对于抗体命名，(i)18C6和18C6.D12可交换使用，(ii)10C6和10C6.E4可交换使用，(iii)19C11和19C11.H6可交换使用，(iv)7B12和7B12.B3可交换使用。抗体亚克隆(即，18C6.D12，10C6.E4，19C11.H6和7B12.B3)被用于第6节中描述的实验。
5.1抗体
MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段可以包括，例如，单克隆抗体、多克隆抗体、重组产生的抗体、特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两个重链和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链抗体重链对、体内抗体、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链可变片段(scFv)、骆驼化抗体、亲和体和二硫键连接的Fv(dsFv)或其片段。这样的抗体可以通过本领域已知的方法制备。
多特异性抗体或其片段是指可以同时结合至少两个不同结构的靶的抗体或其片段，例如两个不同的抗原，相同抗原或半抗原和抗原或表位上的两个不同的表位。一种特异性可以是例如B细胞、T细胞、骨髓样细胞、血浆样细胞或肥大细胞抗原或表位，例如CD3。另一特异性可以是相同或不同细胞类型上的不同抗原，例如MUC16。多特异性多价抗体是具有多于一个结合位点的构建体，并且结合位点具有不同的特异性，例如双特异性双抗体，其中一个结合位点与一个抗原反应，另一个与另一个抗原反应。
双特异性抗体是可以同时结合两个具有不同结构的靶的抗体。双特异性抗体(bsAb)和双特异性抗体片段(bsFab)具有至少一个免疫特异性结合至第一靶标的臂，例如MUC16，以及至少一个其他免疫特异性结合第二靶标的其它臂，例如CD3。可以使用分子工程生产各种双特异性融合蛋白。在一种形式中，双特异性融合蛋白是二价的，由例如(i)具有一个抗原的单一结合位点的scFv和(ii)具有针对第二抗原的单个结合位点的抗体或Fab片段组成。在另一种形式中，双特异性融合蛋白是四价的，由例如具有两个针对一个抗原的结合位点和两个针对第二抗原的相同scFv的IgG组成。参见例如国际公开号WO 2011/1160119，其全部内容通过引用并入本文。
最近用于产生双特异性单克隆抗体的方法包括使用工程重组单克隆抗体，其具有额外的半胱氨酸残基，使得它们比更常见的免疫球蛋白同种型交联更强。参见例如FitzGerald等人，Protein Eng.10(10):1221-1225，1997。另一种方法是设计连接具有所需双重特异性的两种或多种不同单链抗体或抗体片段区段(segment)的重组融合蛋白。参见例如Coloma等，Nature Biotech.15:159-163，1997。可以使用分子工程生产各种双特异性融合蛋白。
连接两个或多个不同单链抗体或抗体片段的双特异性融合蛋白可以以相似的方式制备。重组方法可用于产生多种融合蛋白。在某些方面，柔性接头将scFv(例如靶向CD3的scFv)连接到单克隆抗体(例如，本文所述的MUC16糖基化抗体，参见5.1)的轻链恒定区。通过PCR反应将重链Fc与scFv的框内连接所需的合适的接头序列引入VL和Vκ域。然后将编码scFv的DNA片段连接到含有编码CHI结构域的DNA序列的分段(staging)载体中。将所得构建体切下并连接到含有编码抗体(例如，MUC16糖基化抗体)VH区的DNA序列的载体中。所得到的载体可用于转染合适的宿主细胞，例如用于表达双特异性融合蛋白的哺乳动物细胞。
在某些实施方案中，本文所述的MUC16糖基化抗体(见第5.1节)及其片段也可用于制备也称为双抗体的功能性双特异性单链抗体(bscAb)，并且可以使用重组方法在哺乳动物细胞中产生。参见，例如，Mack等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，92：7021-7025，1995，通过引用并入本文。例如，可以通过使用重组方法通过甘氨酸-丝氨酸接头连接两个单链Fv片段来产生bscAb。使用本领域已知的标准PCR方法分离两种感兴趣的抗体的VL和VH结构域。双特异性单链抗体和双特异性融合蛋白包括在本发明的范围内。
在某些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段表示scFv。ScFv是本领域公认的术语。scFv包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白，其中该融合蛋白保留与完整免疫球蛋白相同的抗原特异性。VH通过肽接头融合到VL。在某些实施方案中，肽接头为5-25、5-15、10-20、10-15或15-25个氨基酸残基长。在某些实施方案中，scFv肽接头显示适合作为本领域技术人员已知的肽接头的一个或多个特征。在某些实施方案中，scFv肽接头包含允许scFv肽接头可溶性的氨基酸，例如，例如，丝氨酸和苏氨酸。在某些实施方案中，scFv肽接头包含允许scFv肽接头柔性的氨基酸，例如，例如，甘氨酸。在某些实施方案中，scFv肽接头将VH的N端连接至的VL C端。在某些实施方案中，scFv肽接头可以将VH的C端连接至VL的N端。
在某些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段表示嵌合抗原受体(CAR)。CAR是本领域公认的术语。CAR可以靶向肿瘤相关抗原(例如，MUC16)。本文提供的CAR通常包含来源于MUC16糖基化抗体的scFv；跨膜域，其在一些实施方案中为T细胞共刺激分子来源的跨膜域(例如来源于CD28、CD8、CD38、OX-40或4-1BB的跨膜域)；和初级信号域，例如T细胞受体(TCR)ζ链胞质信号域。在一些实施方案中，CAR还包括一个或多个另外的区域或结构域，例如一个或多个间隔区(spacer)或接头，包括细胞外间隔区，例如来源于抗体或其它细胞表面分子的间隔区，例如包含一个或多个抗体CH2、CH3和/或铰链区的间隔区，或来源于CD28分子或CD8分子的间隔区或其它间隔区。本文还提供了细胞，例如工程化以表达该CAR的T细胞，例如重组表达该CAR的T细胞。表达CAR的T细胞在识别表达MUC16的肿瘤时，优选诱导这种肿瘤的细胞的T细胞活化、增殖和/或裂解。
MUC16糖基化抗体可以是任何类型(type)(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类别(class)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或任何亚类(subclass)(例如，IgG2a或IgG2b)的免疫球蛋白分子。在某些实施方案中，本文描述的抗体是IgG抗体或其一个类别或亚类。在某些实施方案中，本文描述的抗体是IgG1抗体。在某些实施方案中，本文描述的抗体是IgG2抗体。在某些实施方案中，本文描述的抗体是IgG2a抗体。在某些实施方案中，本文描述的抗体是IgG2b抗体。在某些实施方案中，本文描述的抗体是IgG2a和IgG2b抗体的混合物。在具体实施方案中，抗体是人源化形式的啮齿类单克隆抗体。
在具体实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段所结合的抗原是一种形式的糖基化MUC16，例如，其中该形式的MUC16的氨基酸序列是SEQ ID NO:133。由SEQ ID NO:133的氨基酸序列编码的蛋白在本文中也称为MUC16c114，其由成熟MUC16C末端114个氨基酸残基组成。MUC16c114能够在SEQ ID NO:133的位点1、24和30的天冬酰胺氨基酸(对应于SEQ IDNO:150的氨基酸位点Asn1777，Asn1800和Asn1806)处N-糖基化。成熟MUC16(SEQ ID NO:150)表示全长MUC16，其中信号序列被去除且其中信号序列由SEQ ID NO:136的前60个氨基酸残基组成(即，SEQ ID NO:136是“不成熟的”形式的MUC16)。
MUC16糖基化抗体的抗原结合片段可以是Fab片段、F(ab’)2片段或MUC16糖基化抗体的一部分，其包含赋予MUC16糖基化抗体其抗原特异性的氨基酸残基(例如，互补决定区(CDR))。MUC16糖基化抗体可来自任何动物品种，例如啮齿类(例如，小鼠，大鼠或仓鼠)和人。
如本文使用的，术语“可变区”或“可变域”可交换使用，并是本领域常规的。可变区通常表示抗体的一部分，一般为轻链或重链的一部分，通常是成熟重链氨基末端约110-120个氨基酸和成熟轻链氨基末端约90-100个氨基酸，其序列在不同抗体中显著不同，并被用于特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性。序列中的变化在称为互补决定区(CDR)的那些区域内集中，可变区中更为高度保守的区域称为框架区(FR)。CDR的两侧是FR。一般，CDR和FR的N末端到C末端方向的空间定位如下：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。不希望受任何特定机理或理论的约束，我们相信轻链和重链CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在某些实施方案中，可变区是啮齿类(例如，小鼠或大鼠)可变区。在某些实施方案中，可变区是人可变区。在某些实施方案中，可变区包含啮齿类(例如，小鼠或大鼠)CDR和人框架区(FR)。在具体实施方案中，可变区是灵长类(例如，非人灵长类)可变区。在某些实施方案中，可变区包含啮齿类或鼠类CDR和灵长类(例如，非人灵长类)框架区(FR)。
CDR在本领域以多种方式定义，包括Kabat、Chothia和IMGT和示例定义。Kabat定义基于序列可变性(Kabat，Elvin A.等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest.Bethesda:National Institutes of Health,1983)。对于Kabat编号系统，(i)VHCDR1通常位于重链氨基酸位点31-35，其可选的可包括氨基酸位点35之后一个或两个另外的氨基酸(在Kabat编号方案中指35A和35B)，(ii)VH CDR2通常位于重链氨基酸位点50-65，(iii)VH CDR2通常位于重链氨基酸位点95-102(Kabat，Elvin A.等，Sequences ofProteins of Immunological Interest.Bethesda:National Institutes of Health,1983)。对于Kabat编号系统，(i)VL CDR1通常位于轻链氨基酸位点24-34，(ii)VL CDR2通常位于轻链氨基酸位点50-56，(iii)VL CDR3通常位于轻链氨基酸位点89-97(Kabat，ElvinA.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest.Bethesda:NationalInstitutes of Health,1983)。如本领域技术人员熟知的，使用Kabat编号系统，由于FR和/或CDR的缩短和延长，抗体可变区的实际线性氨基酸序列可以包含更少或额外的氨基酸，从而，氨基酸的Kabat编号不必与其线性氨基酸编号相同。
Chothia定义是基于结构性环区域的位置(Chothia等，(1987)J Mol Biol 196：901-917和美国专利号7,709,226)。术语“Chothia CDR”和相似术语是本领域认可的，表示根据Chothia和Lesk，1987，J.Mol.Biol.，196:901-917的方法确定的抗体CDR序列，其在本文中称为“Chothia CDR”(也参见，例如，美国专利号7,709,226和Kontermann和Dübel编写的Antibody Engineering，第31章，pp.422-439，Springer-Verlag，Berlin(2001)中的Martin，A.，“Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody VariableDomains”。对于Chothia编号系统，使用对VH区氨基酸残基进行编号的Kabat编号系统，(i)VH CDR1通常位于重链氨基酸位点26-32，(ii)VH CDR2通常位于重链氨基酸位点53-55，(iii)VH CDR3通常位于重链氨基酸位点96-101。在具体实施方案中，对于Chothia编号系统，使用对VH区氨基酸残基进行编号的Kabat编号系统，(i)VH CDR1通常位于重链氨基酸位点26-32或34，(ii)VH CDR2通常位于重链氨基酸位点52-56(在一个实施方案中，CDR2位于位点52A-56，其中52A在位点52后)，(iii)VH CDR3通常位于重链氨基酸位点95-102(在一个实施方案中，位点编号96-100处没有氨基酸)。对于Chothia编号系统，使用对VL区氨基酸残基进行编号的Kabat编号系统，(i)VL CDR1通常位于轻链氨基酸位点26-33，(ii)VL CDR2通常位于轻链氨基酸位点50-52，(iii)VL CDR3通常位于轻链氨基酸位点91-96。在具体实施方案中，对于Chothia编号系统，使用对VL区氨基酸残基进行编号的Kabat编号系统，(i)VLCDR1通常位于轻链氨基酸位点24-34，(ii)VL CDR2通常位于轻链氨基酸位点50-56和(iii)VL CDR3通常位于轻链氨基酸位点89-97(在一个实施方案中，位点编号96-100处没有氨基酸)。这些Chothia CDR位点可根据抗体不同发生变化，并可根据本领域已知的方法确定。
IMGT定义来自于IMGT("国际ImMunoGeneTics网址imgt.org，建立者和主管：Marie-Paule Lefranc，Montpellier，France，参见，例如，Lefranc，M.-P.，1999，The Immunologist，7:132-136和Lefranc，M.-P.等，1999，Nucleic Res.，27:209-212，其均在此全文引入作为参考)。对于IMGT编号系统，(i)VH CDR1通常位于重链氨基酸位点25-35，(ii)VH CDR2通常位于重链氨基酸位点51-57，(iii)VH CDR2通常位于重链氨基酸位点93-102。对于IMGT编号系统，(i)VL CDR1通常位于轻链氨基酸位点27-32，(ii)VL CDR2通常位于轻链氨基酸位点50-52，(iii)VL CDR3通常位于轻链氨基酸位点89-97。
5.1.1序列和结构
在某些实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其包含本文提供的MUC16糖基化抗体的任何VH CDR，例如，如表1、3和5所示。在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含MUC16糖基化抗体VH CDR1，如表1、3或5所示。在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含MUC16糖基化抗体VHCDR2，如表1、3或5所示。在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含MUC16糖基化抗体VH CDR3，如表1、3或5所示。在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含1个、2个或全部3个的MUC16糖基化抗体VH CDR，如表1、3或5所示(例如，表1第2行的VL CDR，例如，抗体10C6的所有VH CDR)。
在某些实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其包含本文提供的抗MUC16抗体的任何VL CDR，例如，如表2、4和6所示。在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含MUC16糖基化抗体VH CDR1，如表2、4或6所示。在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含MUC16糖基化抗体VHCDR2，如表2、4或6所示。在某些实施方案中，本文提供的抗MUC16抗体或其抗原结合片段包含MUC16糖基化抗体VH CDR3，如表2、4或6所示。在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含表2、4或6中1个、2个或全部3个的MUC16糖基化抗体VL CDR(例如，表2第2行的VL CDR，例如，抗体10C6的所有VH CDR)。
表1.VH CDR氨基酸序列(Kabat).
表2.VL CDR氨基酸序列(Kabat).
表3.VH CDR氨基酸序列(Chothia).
表4.VL CDR氨基酸序列(Chothia).
表5.VH CDR氨基酸序列(IMGT).
表6.VL CDR氨基酸序列(IMGT).
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：
(a)VH CDR1，包含氨基酸序列TX1GMGVG(SEQ ID NO:103)，其中X1是L或V，
(b)VH CDR2，包含氨基酸序列HIWWDDX2DKYYX3PALKS(SEQ ID NO:104)，其中X2是E或不存在且X3是Y或N，和
(c)VH CDR3，包含氨基酸序列IGTAQATDALDY(SEQ ID NO:105)。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：
(d)VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX8TX9GM(SEQ ID NO:109)，其中X8是N或S且X9是L或V，
(e)VH CDR2，包含氨基酸序列WDDX10(SEQ ID NO:110)，其中X10是E或不存在，和
(f)VH CDR3，包含氨基酸序列GTAQATDALD(SEQ ID NO:111)。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：
(g)VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX15TX16GMG(SEQ ID NO:115)，其中X15是N或S且X16是V或L，
(h)VH CDR2，包含氨基酸序列IWWDDX17DK(SEQ ID NO:116)，其中X17是E或不存在，和
(i)VH CDR3，包含氨基酸序列X18RIGTAQATDALDY(SEQ ID NO:117)，其中X18是T，A或S。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和VHCDR3，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQID NO:15的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQID NO:17的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列。在具体实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ IDNO:70的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQID NO:89的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQID NO:91的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：
(j)VL CDR1，包含氨基酸序列RSSKSLX4X5SNGNTYLY(SEQ ID NO:106)，其中X4是R或L且X5是K或H，
(k)VL CDR2，包含氨基酸序列YMSNLAS(SEQ ID NO:107)，和
(l)VL CDR3，包含氨基酸序列MQX6LEX7PLT(SEQ ID NO:108)，其中X6是G或S且X7是H或Y。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：
(m)VL CDR1，包含氨基酸序列KSLX11X12SNGNTY(SEQ ID NO:112)，其中X11是L或R且X12是H或K，
(n)VL CDR2，包含氨基酸序列YMS(SEQ ID NO:113)，和
(o)VL CDR3，包含氨基酸序列X13LEX14PL(SEQ ID NO:114)，
其中X13是G或S且X14是H或Y。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：
(p)VL互补决定区(CDR)1，包含氨基酸序列KSLX19X20SNGNTY(SEQ ID NO:118)，其中X19是V或L且X20是H或K，
(q)VL CDR2，包含氨基酸序列YMS(SEQ ID NO:119)，和
(r)VL CDR3，包含氨基酸序列MQSLEYPLT(SEQ ID NO:120)。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和VLCDR3，包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：
(i)VH，其包含：
(a)VH CDR1，包含氨基酸序列TX1GMGVG(SEQ ID NO:103)，其中X1是L或V，
(b)VH CDR2，包含氨基酸序列HIWWDDX2DKYYX3PALKS(SEQ ID NO:104)，其中X2是E或不存在且其中X3是Y或N，和(c)VH CDR3，包含氨基酸序列IGTAQATDALDY(SEQ ID NO:105)，和
(ii)VL，其包含：
(d)VL CDR1，包含氨基酸序列RSSKSLX4X5SNGNTYLY(SEQ ID NO:106)，其中X4是R或L且其中X5是K或H，
(e)VL CDR2，包含氨基酸序列YMSNLAS(SEQ ID NO:107)，和
(f)VL CDR3，包含氨基酸序列MQX6LEX7PLT(SEQ ID NO:108)，其中X6是G或S且其中X7是H或Y。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含
(i)VH，其包含：
(g)VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX8TX9GM(SEQ ID NO:109)，其中X8是N或S且其中X9是L或V，
(h)VH CDR2，包含氨基酸序列WDDX10(SEQ ID NO:110)，其中X10是E或不存在，和
(i)VH CDR3，包含氨基酸序列GTAQATDALD(SEQ ID NO:111)和
(ii)VL，其包含：
(j)VL CDR1，包含氨基酸序列KSLX11X12SNGNTY(SEQ ID NO:112)，其中X11是L或R且其中X12是H或K，
(k)VL CDR2，包含氨基酸序列YMS(SEQ ID NO:113)，和
(l)VL CDR3，包含氨基酸序列X13LEX14PL(SEQ ID NO:114)，其中X13是G或S且其中X14是H或Y。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含
(i)VH，其包含：
(m)VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX15TX16GMG(SEQ ID NO:115)，其中X15是N或S且其中X16是V或L，
(n)VH CDR2，包含氨基酸序列IWWDDX17DK(SEQ ID NO:116)，其中X17是E或不存在，和
(o)VH CDR3，包含氨基酸序列X18RIGTAQATDALDY(SEQ ID NO:117)，其中X18是T，A或S，和
(ii)VL，其包含：
(p)VL CDR1，包含氨基酸序列KSLX19X20SNGNTY(SEQ ID NO:118)，其中X19是V或L且其中X20是H或K，
(q)VL CDR2，包含氨基酸序列YMS(SEQ ID NO:119)，和
(r)VL CDR3，包含氨基酸序列MQSLEYPLT(SEQ ID NO:120)。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：
(i)VH，其包含：
(s)VH CDR1，包含氨基酸序列TX1GMGVG(SEQ ID NO:103)，其中X1是L或V，
(t)VH CDR2，包含氨基酸序列HIWWDDX2DKYYX3PALKS(SEQ ID NO:104)，其中X2是E或不存在且其中X3是Y或N，和
(u)VH CDR3，包含氨基酸序列IGTAQATDALDY(SEQ ID NO:105)，和
(ii)VL，其包含：
(v)VL CDR1，包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，
(w)VL CDR2，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，和
(x)VL CDR3，包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含
(i)VH，其包含：
(y)VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX8TX9GM(SEQ ID NO:109)，其中X8是N或S且其中X9是L或V，
(z)VH CDR2，包含氨基酸序列WDDX10(SEQ ID NO:110)，其中X10是E或不存在，和
(aa)VH CDR3，包含氨基酸序列GTAQATDALD(SEQ ID NO:111)和
(ii)VL，其包含：
(bb)VL CDR1，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，
(cc)VL CDR2，包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和
(dd)VL CDR3，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：
(ee)VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX15TX16GMG(SEQ ID NO:115)，其中X15是N或S且其中X16是V或L，
(ff)VH CDR2，包含氨基酸序列IWWDDX17DK(SEQ ID NO:116)，其中X17是E或不存在，和
(gg)VH CDR3，包含氨基酸序列X18RIGTAQATDALDY(SEQ ID NO:117)，其中X18是T，A或S和
(ii)VL，其包含：
(hh)VL CDR1，包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，
(ii)VL CDR2，包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，和
(jj)VL CDR3，包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含
(i)VH，其包含：
(kk)VH CDR1，包含氨基酸序列TX1GMGVG(SEQ ID NO:103)，其中X1是L或V，
(ll)VH CDR2，包含氨基酸序列HIWWDDX2DKYYX3PALKS(SEQ ID NO:104)，其中X2是E或不存在且其中X3是Y或N，和(mm)VH CDR3，包含氨基酸序列IGTAQATDALDY(SEQ ID NO:105)，和
(ii)VL，其包含：
(nn)VL CDR1，包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，
(oo)VL CDR2，包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，和
(pp)VL CDR3，包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：
(i)VH，其包含：
(qq)VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX8TX9GM(SEQ ID NO:109)，其中X8是N或S且其中X9是L或V，
(rr)VH CDR2，包含氨基酸序列WDDX10(SEQ ID NO:110)，其中X10是E或不存在，和
(ss)VH CDR3，包含氨基酸序列GTAQATDALD(SEQ ID NO:111)，和
(ii)VL，其包含：
(tt)VL CDR1，包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，
(uu)VL CDR2，包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，和
(vv)VL CDR3，包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：
(i)VH，其包含：
(ww)VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX15TX16GMG(SEQ ID NO:115)，其中X15是N或S且其中X16是V或L，
(xx)VH CDR2，包含氨基酸序列IWWDDX17DK(SEQ ID NO:116)，其中X17是E或不存在，和
(yy)VH CDR3，包含氨基酸序列X18RIGTAQATDALDY(SEQ ID NO:117)，其中X18是T，A或S，和
(ii)VL，其包含：
(zz)VL CDR1，包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，
(aaa)VL CDR2，包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，和
(bbb)VL CDR3，包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和(b)VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(b)VL CDR1，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；和(b)VL CDR1，包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；和(b)VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和(b)VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；和(b)VL CDR1，包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；和(b)VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；和(b)VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；和(b)VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；和(b)VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和(b)VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；和(b)VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列；和(b)VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列；和(b)VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；和(b)VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列。
表7.VH区氨基酸序列
表8.VL区氨基酸序列
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH区，其包含：
QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIWWDDX27DKYYX2 8PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS(SEQ IDNO:101)，其中X21是T或N，X22是I或K，X23是N或S，X24是V或L，X25是S或I，X26是P或S，X27是E或不存在，X28是N或Y，X29是K或R，X30是A或D，X31是T或S，X32是V或A，X33是G或D，X34是T，I或S且X35是T，S或A。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VL区，其包含：
DIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:102)，其中X36是I或V，X37是P或S，X38是R或L，X39是K或H，X40是R或K，X41是E或G，X42是S或G且X43是Y或H。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含
(ccc)VH区，其包含
QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIWWDDX27DKYYX2 8PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS(SEQ IDNO:101)，其中X21是T或N，X22是I或K，X23是N或S，X24是V或L，X25是S或I，X26是P或S，X27是E或不存在，X28是N或Y，X29是K或R，X30是A或D，X31是T或S，X32是V或A，X33是G或D，X34是T，I或S且X35是T，S或A，和
(ddd)VL区，其包含
DIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:102)，其中X36是I或V，X37是P或S，X38是R或L，X39是K或H，X40是R或K，X41是E或G，X42是S或G且X43是Y或H。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含
(eee)VH区，其包含
QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIWWDDX27DKYYX2 8PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS(SEQ IDNO:101)，其中X21是T或N，X22是I或K，X23是N或S，X24是V或L，X25是S或I，X26是P或S，X27是E或不存在，X28是N或Y，X29是K或R，X30是A或D，X31是T或S，X32是V或A，X33是G或D，X34是T，I或S且X35是T，S或A，和
(fff)VL区，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含
(ggg)VH区，其包含
QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIWWDDX27DKYYX2 8PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS(SEQ IDNO:101)，其中X21是T或N，X22是I或K，X23是N或S，X24是V或L，X25是S或I，X26是P或S，X27是E或不存在，X28是N或Y，X29是K或R，X30是A或D，X31是T或S，X32是V或A，X33是G或D，X34是T，I或S且X35是T，S或A，和
(hhh)VL区，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含如表7所示的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含重链可变区序列，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(表7)(例如，抗体10C6的VH)。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含重链可变区序列，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列(表7)(例如，抗体7B12的VH)。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含重链可变区序列，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列(表7)(例如，抗体19C11的VH)。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含重链可变区序列，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列(表7)(例如，抗体16C5的VH)。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含重链可变区序列，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列(表7)(例如，抗体18C6的VH)。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含如表8所示的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区序列，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列(表8)(例如，抗体10C6的VL)。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区序列，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列(表8)(例如，抗体7B12的VL)。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区序列，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列(表8)(例如，抗体19C11的VL)。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区序列，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列(表8)(例如，抗体16C5的VL)。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区序列，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列(表8)(例如，抗体18C6的VL)。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含(a)包含如表7所示氨基酸序列的VH；和(b)包含如表8所示氨基酸序列的VL。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含(a)重链可变区序列，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(表7)(例如，抗体10C6的VH)和(b)轻链可变区序列，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列(表8)(例如，抗体10C6的VL)。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含(a)重链可变区序列，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列(表7)(例如，抗体7B12的VH)和(b)轻链可变区序列，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列(表8)(例如，抗体7B12的VL)。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含(a)重链可变区序列，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列(表7)(例如，抗体19C11的VH)和(b)轻链可变区序列，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列(表8)(例如，抗体19C11的VL)。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含(a)重链可变区序列，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列(表7)(例如，抗体16C5的VH)和(b)轻链可变区序列，其包含SEQID NO:62的氨基酸序列(表8)(例如，抗体16C5的VL)。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含(a)重链可变区序列，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列(表7)(例如，抗体18C6的VH)和(b)轻链可变区序列，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列(表8)(例如，抗体18C6的VL)。
在某些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：具有如表7所示氨基酸序列的VH的VH CDR(例如，如表1、3或5所示)，和具有如表8所示氨基酸序列的VL的VL CDR(例如，如表2，4或6所示)。
在某些实施方案中，本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段可以通过其VH结构域单独或其VL域单独或其三个VH CDR单独或其三个VL CDR单独描述。参见例如Rader C等人(1998)PNAS 95：8910-8915，其通过引用整体并入本文，其描述了通过分别从人轻链或重链文库鉴定互补轻链或重链来对小鼠抗αvβ3抗体进行人源化，得到具有相当或高于原始抗体亲和力的亲和力的人源化抗体变体。还参见Clackson T等(1991)Nature 352：624-628，其全部内容通过引用并入本文，描述了通过使用特异性VH区(或VL区)产生结合特异性抗原的抗体，并针对互补可变区进行筛选的方法。另见Kim SJ&Hong HJ，(2007)JMicrobiol 45：572-577，其全部内容通过引用并入本文，描述了通过使用特异性VH区和筛选文库(例如，人VL文库)中的互补VL区来产生结合特异性抗原的抗体的方法；选择的VL结构域可继而用于指导另外的互补(例如，人)VH区的选择。
在某些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段可以是人源化抗体，例如，人源化形式的啮齿类抗体。人源化抗体可使用本领域已知的多种技术进行生产，包括但不限于，CDR-移植(欧洲专利号EP 239,400，国际公开号WO 91/09967和美国专利号5,225,539，5,530,101和5,585,089)、链更替(美国专利号5,565,332)、嵌合(veneering)或重修饰(resurfacing)(欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596，Padlan，1991，MolecularImmunology 28(4/5):489-498，Studnicka等，1994，Protein Engineering 7(6):805-814和Roguska等，1994，PNAS 91:969-973)，以及下述文件中描述的技术，例如，美国专利号6,407,213，美国专利号5,766,886，WO 9317105，Sandhu JS，Gene 150(2):409-10(1994)，Pedersen等，J.Mol.Biol.235(3):959-73(1994)，Couto等，Cancer Res.55(8):1717-22(1995)，Roguska等，Protein Eng.9(10):895 904(1996)，Baca等，J.Biol.Chem.272(16):10678-84(1997)，Couto等，Cancer Res.55(23Supp):5973s-5977s(1995)，Caldas等，Protein Eng.13(5):353-60(2000)，Morea等，Methods 20(3):267 79(2000)和Tan等，J.Immunol.169:1119 25(2002)。还参见美国专利公开号US 2005/0042664A1(2005年2月24日)，其分别全文引入作为参考。
在某些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段可以是复合人抗体。复合人抗体可以通过下述方式产生，例如，以避开T细胞表位的方式从多个人抗体可变区序列片段设计可变区序列，从而最小化得到的抗体的免疫原性(参见，例如，Baker等，2010，Self Nonself.，1(4):314-322，Bryson等，2010，BioDrugs，24(1):1-8和Jones等，2009，Methods Mol Biol.，525:405-23)。该抗体可包含人恒定区序列，例如，人轻链和/或重链恒定区。
在某些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段可以是去免疫化(deimmunized)抗体。去免疫化抗体是其中T细胞表位已被去除的抗体。制备去免疫化抗体的方法已有描述。参见，例如，Jones等，Methods Mol Biol.2009；525:405-23，xiv和DeGroot等，Cell.Immunol.244:148-153(2006))。
在具体的实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段是人源化的免疫球蛋白，其包含表1，表2和表3和表4，表5和表6各自中的任何抗体的3个VH CDR和3个VLCDR(即，VH CDR1、VH CDR2，VH CDR3，VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)，人源的框架区和人源的恒定区。非限制性示例的人框架区在本领域已有描述，例如，参见Kabat等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生及公共服务部，NIH出版号91-3242)。在某些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含人框架区或源自人框架区的框架区(例如，VL区和/或VH区的框架区)。在某些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含灵长类(例如，非人灵长类)框架区或源自灵长类(例如，非人灵长类)框架区的框架区(例如，VL区和/或VH区的框架区)。例如，抗原特异性非人抗体的CDR，通常为啮齿类来源的(例如，小鼠或大鼠)，被植入同源的人或非人灵长类(例如，旧大陆猿(Old World apes)，例如黑猩猩(Pan troglodytes)，倭黑猩猩(Panpaniscus)或大猩猩(Gorilla gorilla)，黑猩猩(Pan troglodytes)，旧大陆猴(Old Worldmonkeys)，例如来自猕猴属(Macaca)或食蟹猴猕猴属(cynomolgus monkey Macacacynomolgus)。非人灵长类框架序列描述于美国专利申请公开号US 2005/0208625。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的VH CDR1、VHCDR2，和/或VH CDR3在VH区中的位置和/或VL CDR1、VL CDR2，和/或VL CDR2在VL区中的位置可以变化1、2、3、4、5、6或更多个氨基酸位点，只要(i)保持免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)保持不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；和(iii)保持抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭(例如，基本保持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在另一实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的VH CDR1、VH CDR2，和/或VH CDR3在VH区中的长度和/或VL CDR1、VLCDR2，和/或VL CDR2在VL区中的长度可以变化(例如，更短或更长)1、2、3、4、5、6或更多个氨基酸，只要(i)保持免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)保持不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139，和(iii)保持抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭(例如，基本保持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在另一实施方案中，与一个或多个本文描述的CDR相比，本文描述的VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3、VL CDR1、VL CDR2、和/或VL CDR3的氨基端和/或羧基端可延伸或截短1、2、3、4、5、6或更多个氨基酸，只要(i)保持免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)保持不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；和(iii)保持抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭(例如，基本保持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。如本文使用的，术语“免疫特异性结合”、“免疫特异性识别”、“特异性结合”和“特异性识别”在抗体的语境下是类似术语，表示抗体及其抗原结合片段通过如本领域技术人员所理解的抗原结合位点结合抗原(例如，表位或免疫复合物)，且不排除抗体或抗原结合片段与其它抗原的交叉反应性。本领域已知的任何方法都可用于确认是否：(i)保持免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)保持不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；和(iii)保持抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭，例如，ELISA结合分析或FACs分析，如下第6节所述。
在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其包含抗体重链和/或轻链，例如，单独的重链，单独的轻链或重链和轻链。对于重链，在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的重链可以是α、δ、ε、γ或μ重链。在另一具体实施方案中，所述MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的重链可以包含人α、δ、ε、γ或μ重链。
在具体实施方案中，(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭的本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含重链，其中重链可变区的氨基酸序列包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:105；分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111；或分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:117；且其中重链恒定区是人α、δ、ε、γ或μ重链恒定区。如本文使用的术语“恒定区”或“恒定域”是可互相替换的，具有其在本领域的常规含义。恒定区是抗体的部分，例如，轻链和/或重链的羧端部分，其不直接涉及抗体与抗原的结合，但能够表现出多种效应物功能，例如与Fc受体的相互作用。免疫球蛋白分子的恒定区一般具有相对免疫球蛋白可变区而言更为保守的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含重链，其中重链可变区的氨基酸序列包含抗体10C6、7B12、19C11、16C5或18C6(即，列于表1、表3或表5的抗体)的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，且其中重链恒定区是人α、δ、ε、γ或μ重链恒定区。
在另一具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化的抗体或其抗原结合片段包含重链，其中重链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列，且其中重链恒定区是人α、δ、ε、γ或μ重链恒定区。在另一具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化的抗体或其抗原结合片段包含重链，其中重链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21、SEQID NO:41、SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:81的氨基酸序列，且其中重链恒定区是人α、δ、ε、γ或μ重链恒定区。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化的抗体或其抗原结合片段包含重链，其中重链可变区的氨基酸序列包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其分别具有氨基酸序列SEQ IDNO:103、SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:105；或分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:109、SEQ IDNO:110或SEQ ID NO:111；或分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116或SEQ IDNO:117，且其中重链恒定区是人重链恒定区。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化的抗体或其抗原结合片段包含重链，其中重链可变区的氨基酸序列包含抗体10C6、7B12、19C11、16C5或18C6VH CDR(即，列于表1、表3和表5的那些)的任何VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，且其中重链恒定区是人重链恒定区。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化的抗体或其抗原结合片段包含重链，其中重链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列，且其中重链恒定区是人重链恒定区。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化的抗体或其抗原结合片段包含重链，其中重链可变区的氨基酸序列包含抗体10C6、7B12、19C11、16C5或18C6的VH CDR(即，列于表7的那些)的任一的氨基酸序列，且其中重链恒定区是人重链恒定区。非限制性示例的人恒定区序列在本领域已有描述，例如，参见Kabat EA等，(1991)，同上。
对于轻链，在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的轻链是κ轻链。在另一具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的轻链是λ轻链。在又一具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的轻链是人κ轻链或人λ轻链。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含轻链，其中轻链可变区氨基酸序列包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其分别具有抗体氨基酸序列SEQ IDNO:106、SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108，或分别具有SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113和SEQ ID NO:114，或分别具有SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:120，且其中轻链恒定区是κ或λ轻链恒定区。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含轻链，其中轻链可变区氨基酸序列包含抗体10C6、7B12、19C11、16C5或18C6(即，列于表2、表4或表6的那些)的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，且其中轻链恒定区是κ或λ轻链恒定区。
在另一具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化的抗体或其抗原结合片段包含轻链，其中轻链可变区氨基酸序列包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列，且其中轻链恒定区是κ或λ轻链恒定区。在另一具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化的抗体或其抗原结合片段包含轻链，其中轻链可变区氨基酸序列包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:42、SEQID NO:62或SEQ ID NO:82的氨基酸序列，且其中轻链恒定区是κ或λ轻链恒定区。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化的抗体或其抗原结合片段包含轻链，其中轻链可变区氨基酸序列包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其分别具有氨基酸序列SEQ IDNO:106、SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108，或分别具有SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113和SEQ ID NO:114，或分别具有SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:120，且其中轻链恒定区包含人轻链恒定区的氨基酸。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化的抗体或其抗原结合片段包含轻链，其中轻链可变区氨基酸序列包含具有抗体10C6、7B12、19C11、16C5或18C6的VL CDR(即，列于表2、表4和表6的那些)任一的氨基酸序列的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3，且其中轻链恒定区是人轻链恒定区。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化的抗体或其抗原结合片段包含轻链，其中轻链可变区氨基酸序列包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列，且其中轻链恒定区是人轻链恒定区。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化的抗体或其抗原结合片段包含轻链，其中轻链可变区氨基酸序列包含抗体10C6、7B12、19C11、16C5或18C6的VL CDR(即，列于表8的那些)任一的氨基酸序列，且其中轻链恒定区是人轻链恒定区。非限制性示例的人恒定区序列在本领域已有描述，例如，参见Kabat EA等，(1991)，同上。
在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含如本文描述的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，且其中恒定区是IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子或人IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子中的类型。在另一具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，其包含本文描述的任何氨基酸序列，且其中恒定区是IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子，任何类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a和IgG2b)of免疫球蛋白分子中的类型。在具体实施方案中，恒定区是人IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子，免疫球蛋白分子任何类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a和IgG2b)中的类型。
在另一具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含重链和/或轻链，其中(i)重链包含(a)可变区，包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:105；分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111；或分别具有SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116和SEQID NO:117，且(b)包含重链恒定区，其是人IgG重链恒定区，和/或(ii)轻链包含(a)可变区，包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108，或分别具有SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113和SEQ ID NO:114，或分别具有SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:120；和(b)轻链恒定区，其是人IgG恒定区。在另一具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含重链和/或轻链，其中(i)重链包含(a)可变区，包含具有抗体10C6、7B12、19C11、16C5或18C6的VH CDR(即，列于表1、表3和表5的那些)任一的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3且(b)包含重链恒定区，其是人IgG重链恒定区，和/或(ii)轻链包含(a)可变区，包含具有抗体10C6、7B12、19C11、16C5或18C6的VL CDR(即，列于表2、表4和表6的那些)任一氨基酸序列的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，和(b)轻链恒定区，其是人IgG的恒定区。
在另一具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含重链和/或轻链，其中(i)重链包含(a)可变区，包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列；和(b)重链恒定区，其是人IgG恒定区，和/或(ii)轻链包含(a)可变区，包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列；和(b)轻链恒定区，其是人κ轻链恒定区。在另一具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含重链和/或轻链，其中(i)重链包含(a)可变区，包含下述：抗体10C6、7B12、19C11、16C5或18C6(即，列于表7的那些)任一的VH的氨基酸序列和(b)重链恒定区，其是人IgG恒定区，和/或(ii)轻链包含(a)可变区，包含下述氨基酸序列：抗体10C6、7B12、19C11、16C5或18C6(即，列于表8的那些)任一的VL，和(b)轻链恒定区，其是人κ轻链恒定区。
在某些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段或其抗原结合片段包含相对于任何的SEQ ID NOs:1-100具有下述百分比同一性的氨基酸序列。数学算法可用于确定两条序列(例如，氨基酸序列或核酸序列)之间的同一性百分比。用于比较两个序列的数学算法的优选的非限制性示例是Karlin和Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:22642268，于Karlin和Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873 5877中优化。该算法被并入Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程序中。可以使用NBLAST核苷酸程序参数设置进行BLAST核苷酸检索，例如，设定score＝100，wordlength＝12，以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。可以使用XBLAST程序参数设置进行BLAST蛋白质检索，例如设定score50，wordlength＝3以获得与本文所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。可以按照Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res.25：3389 3402中的描述进行缺口BLAST，以获得用于比较目的的缺口比对。可选的，可以通过PSI BLAST(Id.)来执行检测分子之间远缘关系的迭代检索。当使用BLAST，Gapped BLAST和PSI Blast程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数(例如，参见例如，国家生物技术信息中心(NCBI)，万维网ncbi.nlm.nih.gov)。用于比较序列的数学算法的另一个优选的非限制性实例是Myers和Miller，1988，CABIOS 4:11 17的算法。这样的算法被并入ALIGN程序(版本2.0)中，其是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。此外，可以使用与上述类似的技术来确定两个序列之间的百分比同一性，允许或不允许缺口。通常，计算百分比同一性时，只计算完全匹配。
在某些实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:101的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的VH。在某些实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含具有与抗体10C6、7B12、19C11、16C5或1B5(即，列于表7的那些)的任一VH的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的VH。在某些实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH区，其具有与SEQ ID NO:101的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性，其中抗体或抗原结合片段包含与表1、表2、表3、表4、表5或表6中所示CDR(例如，VH CDR和/或VL CDR)相同的CDR(例如，VH CDR和/或VL CDR)。在某些实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VH区，其具有与抗体10C6、7B12、19C11、16C5或18C6(即，列于表7的那些)的任一VH的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性，其中抗体或抗原结合片段包含与表1、表2、表3、表4、表5或表6中所示CDR(例如，VH CDR和/或VL CDR)相同的CDR(例如，VH CDR和/或VL CDR)。
在某些实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:102的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的VL。在某些实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含具有与任一抗体10C6、7B12、19C11、16C5或1B5(即，列于表8的那些)的VL氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的VL。在某些实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VL区，其具有与SEQ ID NO:102的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性，其中抗体或抗原结合片段包含与表1、表2、表3、表4、表5或表6中所示CDR(例如，VH CDR和/或VL CDR)相同的CDR(例如，VH CDR和/或VL CDR)。在某些实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含VL区，其具有与任一抗体10C6、7B12、19C11、16C5或18C6(即，列于表7的那些)的VL氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性，其中抗体或抗原结合片段包含与表1、表2、表3、表4、表5或表6中所示CDR(例如，VH CDR和/或VL CDR)相同的CDR(例如，VH CDR和/或VL CDR)。
在某些实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(i)VH区，其具有与SEQID NO:101的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性和(ii)VL区，其具有与SEQ ID NO:102的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性。在某些实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段分别包含：(i)VH区，其具有与任一抗体10C6、7B12、19C11、16C5或18C6的VH氨基酸序列(即，列于表8的那些)至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性和(ii)VL区，其具有与任一抗体10C6、7B12、19C11、16C5或18C6的VL氨基酸序列(即，列于表7的那些)至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性。在某些实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(i)VH区，其具有与SEQ ID NO:101的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性和(ii)VL区，其具有与SEQ IDNO:102的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性，其中抗体或抗原结合片段包含与表1、表2、表3、表4、表5或表6中所示CDR(例如，VH CDR和/或VL CDR)相同的CDR(例如，VH CDR和/或VL CDR)。在某些实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段分别包含：(i)VH区，其具有与任一抗体10C6、7B12、19C11、16C5或18C6的VH氨基酸序列(即，列于表8的那些)至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性和(ii)VL区，其具有与任一抗体10C6、7B12、19C11、16C5或18C6的VL氨基酸序列(即，列于表7的那些)至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性，其中抗体或抗原结合片段包含与表1、表2、表3、表4、表5或表6中所示CDR(例如，VH CDR和/或VL CDR)相同的CDR(例如，VH CDR和/或VL CDR)。
在另一方面，本文提供了结合本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(例如，10C6、7B12、19C11、16C5和/或16C5)的相同或重叠表位的抗体。如本文所用，“表位”是本领域中的术语，并且可以指抗体可以免疫特异性结合的抗原局部区域。表位可以是例如多肽的连续氨基酸(线性或连续表位)，或表位可以例如一起来自一种多肽或多种多肽的两个或多个非连续区域(构象、非线性、不连续或非连续表位)。在某些实施方案中，抗体的表位可以通过例如NMR谱、X射线衍射晶体学研究、ELISA测定、与质谱联用的氢/氘反应(例如，MALDI质谱)、基于阵列的寡肽扫描测定和/或诱变作图(例如，定点诱变作图)进行确定。对于X射线晶体学，可以使用本领域中任何已知方法(例如，Giegé R等，(1994)ActaCrystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4)：339-350，McPherson A(1990)Eur JBiochem 189：1-23，Chayen NE(1997)Structure 5：1269-1274，McPherson A(1976)J BiolChem 251：6300-6303)。抗体：抗原晶体可使用熟知的X射线衍射技术进行研究，并可使用计算机软件拟合(refine)，例如X-PLOR(Yale University，1992，由Molecular Simulations，Inc.分配，参见例如Meth Enzymol(1985)第114&115卷，Wyckoff HW等编，美国专利申请号2004/0014194)和BUSTER(Bricogne G(1993)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1)：37-60，Bricogne G(1997)Meth Enzymol 276A：361-423，Carter CW，Roversi P等编，(2000)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10)：1316-1323)。可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行诱变作图。参见，例如，Champe M等，(1995)和Cunningham BC&Wells JA(1989)对于诱变技术的描述，包括丙氨酸扫描诱变技术。此外，可以使用常规技术例如免疫测定来鉴定识别和结合相同或重叠的表位的抗体，例如通过显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原的结合的能力，即竞争性结合测定。竞争结合测定法也可用于确定两种抗体是否对表位具有相似的结合特异性。可以在其中被测免疫球蛋白抑制参考抗体与共同抗原的免疫特异性结合的测定中确定竞争性结合。许多类型的竞争结合测定法是已知的，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)，固相直接或间接酶免疫测定(EIA)，三明治竞争测定(参见Stahli C等，(1983)Methods Enzymol 9：242-253)，固相直接生物素-亲和素EIA(参见Kirkland TN等，(1986)J Immunol 137：3614-9)，固相直接标记分析，固相直接标记夹心分析(参见Harlow E&Lane D，(1988)Antibodies:A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press)，使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel GA等，(1988)Mol Immunol 25(1)：7-15)，固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung RC等，(1990)Virology 176：546-52)和直接标记RIA(Moldenhauer G等，(1990)Scand J Immunol 32：77-82)。通常，这种测定涉及使用与固体表面结合的纯化抗原或携带其任一的细胞，未标记的测试免疫球蛋白和标记的参比免疫球蛋白。可以通过测定在测试免疫球蛋白存在下与固体表面或细胞结合的标记物的量来测量竞争性抑制。通常测试的免疫球蛋白过量存在。通常，当竞争抗体过量存在时，其将至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或者更多地抑制参比抗体与共同抗原的免疫特异性结合。竞争结合测定可以使用标记的抗原或标记的抗体以大量不同的形式进行设计。在该测定的通用形式中，将抗原固定在96孔板上。然后使用放射性或酶标记测量未标记抗体阻断标记抗体与抗原结合的能力。更详细的内容参见，例如，Wagener C等，(1983)J Immunol 130：2308-2315，Wagener C等，(1984)J ImmunolMethods 68：269-274，Kuroki M等，(1990)Cancer Res 50：4872-4879，Kuroki M等，(1992)Immunol Invest 21：523-538，Kuroki M等，(1992)Hybridoma 11：391-407和Antibodies:ALaboratory Manual，Harlow E&Lane D编，同上，pp.386-389。
在某些方面，竞争结合测定法可用于确定在竞争结合测定法(例如竞争性ELISA测定)中，当两种抗体识别相同或空间重叠的表位时，一种抗体是否以例如剂量依赖的方式被另一种抗体(例如，作为参比抗体，其基本上结合相同的表位或重叠的表位的抗体)竞争性阻断，所述测定法可以使用标记的抗原或标记的抗体配置为不同形式的所有数量。在具体实施方案中，抗体可以在本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的竞争结合测定中进行测试(例如，含有10C6、7B12、19C11、16C5或16C5可变区的鼠IgG抗体)。
在另一方面，本文提供了使用本领域技术人员已知的或本文描述的测定法(例如，ELISA)确定的能够与本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(例如，含有10C6、7B12、19C11、16C5或16C5可变区的鼠IgG抗体)竞争(例如，以剂量依赖的形式)结合MUC16的抗体。在另一方面，本文提供了使用本领域技术人员已知的或本文描述的测定法(例如，ELISA)确定的能够竞争性抑制(例如，以剂量依赖的形式)本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(例如，含有10C6、7B12、19C11、16C5或16C5可变区的鼠IgG抗体)与MUC16的结合的抗体。
在某些实施方案中，本文提供了与本文描述的抗体竞争性结合MUC16的抗体，所述抗体以与本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段自我竞争结合MUC16相同的程度结合MUC16。在某些实施方案中，本文提供了第一抗体，其与本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争结合MUC16，其中该竞争表现为将第一抗体与表位的结合降低超过80％(例如，85％、90％、95％或98％或80％-85％、80％-90％、85％-90％或85％-95％)。
在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：VH，其包含具有表1、表3或表5所示氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2，和/或VH CDR3。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含10C6的VHCDR的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16(参见，表1、表3和表5)。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含7B12的VH CDR的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16(参见，表1、表3和表5)。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含19C11的VH CDR的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16(参见，表1、表3和表5)。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含16C5的VH CDR的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16(参见，表1、表3和表5)。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含18C6的VH CDR的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16(参见，表1、表3和表5)。
在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：VL，包含具有表2、表4或表6所示氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2，和/或VL CDR3。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含10C6的VL CDR(参见，表2、表4和表6)的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含7B12的VL CDR(参见，表2、表4和表6)的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含19C11的VL CDR(参见，表2、表4和表6)的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含16C5的VL CDR(参见，表2、表4和表6)的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含18C6的VL CDR(参见，表2、表4和表6)的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16。
在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：(a)包含下述的VH：具有表1、表3或表5所示氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2，和/或VHCDR3；和(b)包含下述的VL：具有表2、表4或表6所示氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2，和/或VL CDR3。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：(a)10C6的VH CDR(参见，表1、表3和表5)和(b)10C6的VL CDR(参见，表2、表4和表6)。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：(a)7B12的VH CDR(参见，表1、表3和表5)和(b)7B12的VL CDR(参见，表2、表4和表6)。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：(a)19C11的VH CDR(参见，表1、表3和表5)和(b)19C11的VL CDR(参见，表2、表4和表6)。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：(a)16C5的VH CDR(参见，表1、表3和表5)和(b)16C5的VL CDR(参见，表2、表4和表6)。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：(a)18C6的VH CDR(参见，表1、表3和表5)和(b)18C6的VL CDR(参见，表2、表4和表6)。
在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：VH区，其具有表7所示的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：VH区，其具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：VH区，其具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：VH区，其具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：VH区，其具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：VH区，其具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列。
在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：VL区，其具有表8所示的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：VL区，其具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：VL区，其具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：VL区，其具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：VL区，其具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：VL区，其具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列。
在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：(a)VH区，其具有表7所示的氨基酸序列和(b)VL区，其具有表8所示的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：(a)VH区，其具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列和(b)VL区，其具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：(a)VH区，其具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列和(b)VL区，其具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：(a)VH区，其具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列和(b)VL区，其具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：(a)VH区，其具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列和(b)VL区，其具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：(a)VH区，其具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列和(b)VL区，其具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列。
在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含VH，其包含具有表1、表3或表5所示氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2，和/或VH CDR3。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含10C6的VH CDR(参见，表1、表3和表5)。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含7B12的VH CDR(参见，表1、表3和表5)。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合MUC16：19C11的VH CDR(参见，表1、表3和表5)。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含16C5的VH CDR(参见，表1、表3和表5)。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含18C6的VH CDR(参见，表1、表3和表5)。
在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或或其抗原结合片段结合抗体的相同或重叠表位，所述抗体包含VL，其包含具有表2、表4或表6所示氨基酸序列的VL CDR1、VLCDR2，和/或VL CDR3。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含10C6的VL CDR(参见，表2、表4和表6)。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含7B12的VL CDR(参见，表2、表4和表6)。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含19C11的VL CDR(参见，表2、表4和表6)。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含16C5的VL CDR(参见，表2、表4和表6)。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含18C6的VL CDR(参见，表2、表4和表6)。
在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含(a)VH，其包含具有表1、表3或表5所示氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2，和/或VH CDR3和(b)VL，其包含具有表2、表4或表6所示氨基酸序列的VL CDR1、VLCDR2，和/或VL CDR3。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含(a)10C6的VH CDR(参见，表1、表3和表5)和(b)10C6的VL CDR(参见，表2、表4和表6)。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含(a)7B12的VH CDR(参见，表1、表3和表5)和(b)7B12的VL CDR(参见，表2、表4和表6)。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含(a)19C11的VH CDR(参见，表1、表3和表5)和(b)19C11的VL CDR(参见，表2、表4和表6)。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含(a)16C5的VH CDR(参见，表1、表3和表5)和(b)16C5的VL CDR(参见，表2、表4和表6)。在具体实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含(a)18C6的VH CDR(参见，表1、表3和表5)和(b)18C6的VL CDR(参见，表2、表4和表6)。
在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含VH区，其具有表7所示的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含VH区，其具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含VH区，其具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含VH区，其具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含VH区，其具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含VH区，其具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列。
在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含VL区，其具有表8所示的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含VL区，其具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含VL区，其具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含VL区，其具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含VL区，其具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含VL区，其具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列。
在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含(a)VH区，其具有表7所示的氨基酸序列和(b)VL区，其具有表8所示的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含(a)VH区，其具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列和(b)VL区，其具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含(a)VH区，其具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列和(b)VL区，其具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含(a)VH区，其具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列和(b)VL区，其具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含(a)VH区，其具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列和(b)VL区，其具有SEQ IDNO:62的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含(a)VH区，其具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列和(b)VL区，其具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列。
可以使用本领域技术人员已知的或本文描述的测定法(例如，X-射线晶体学，ELISA分析等)确定两种抗体是否结合相同表位。可以使用多种本领域已知方式测量和/或表达亲和力，包括但不限于平衡解离常数(KD)和平衡缔合常数(KA)。可以通过本领域技术人员已知的技术测定KD，例如生物层干涉法。
在某些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的表位被用作免疫原来产生抗体。参见，例如，第5.3节和第6.2节的产生抗体的方法。
5.1.2功能特征
在某些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以低于0.5x10-3/s、1x10-3/s、1.5x10-3/s、2x10-3/s、2.5x10-3/s、3x10-3/s、4x10-3/s、5x10-3/s、6x10-3/s、7x10-3/s、8x10-3/s、9x10-3/s、1x10-4/s、2x10-4/s、3x10-4/s、4x10-4/s、5x10-4/s、6x10-4/s、7x10-4/s或8x10-4/s的kd结合MUC16。在一些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约0.5x10-3/s、1x10-3/s、1.5x10-3/s、2x10-3/s、2.5x10-3/s、3x10-3/s、4x10-3/s、5x10-3/s、6x10-3/s、7x10-3/s、8x10-3/s、9x10-3/s、1x10-4/s、2x10-4/s、3x10-4/s、4x10-4/s、5x10-4/s、6x10-4/s、7x10-4/s或8x10-4/s的kd结合MUC16。在一些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约0.5x10-3/s-8x10-4/s的kd结合MUC16。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约1x10-3/s的kd结合MUC16。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约1.5x10-3/s的kd结合MUC16。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约2x10-3/s的kd结合MUC16。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约2x10-4/s的kd结合MUC16。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约7x10-4/s的kd结合MUC16。
在某些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以至少2.5x104/s、3x104/s、3.5x104/s、4x104/s、4.5x104/s、5x104/s、5.5x104/s、6x104/s、6.5x104/s、7x104/s、7.5x104/s、8x104/s、9x104/s或9x105/s的ka结合MUC16。在一些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约2.5x104/s、3x104/s、3.5x104/s、4x104/s、4.5x104/s、5x104/s、5.5x104/s、6x104/s、6.5x104/s、7x104/s、7.5x104/s、8x104/s、9x104/s或9x105/s的ka结合MUC16。在一些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约4x104/s的ka结合MUC16。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约6x104/s的ka结合MUC16。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约7.5x104/s的ka结合MUC16。
在某些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以低于1000nM、500nM、100nM、50nM、25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.1nM或0.05nM的KD结合MUC16。在一些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约1000nM、500nM、100nM、50nM、25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.1nM或0.05nM的KD结合MUC16。在一些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约500nM-1000nM的KD结合MUC16。在一些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约5nM-75nM的KD结合MUC16。在具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约7nM的KD结合MUC16。在另一具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约10pM的KD结合MUC16。在另一具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约15pM的KD结合MUC16。在另一具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约20pM的KD结合MUC16。在另一具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约25pM的KD结合MUC16。在另一具体实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约65pM的KD结合MUC16。如本文使用的，当用于修饰数值或数值范围时，术语“约”表示数值或数值范围的5％-10％以上和5％-10％以下偏差保留在引用数值或范围的所期望的含义内。
在某些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ IDNO:133。在某些实施方案中，细胞是癌细胞(例如，卵巢癌细胞，肺癌细胞，胰腺癌细胞，乳腺癌细胞，输卵管癌细胞，子宫(例如，子宫内膜)癌细胞或原发性腹膜癌细胞)。在某些实施方案中，细胞是卵巢癌细胞。在某些实施方案中，细胞是肺癌细胞。在某些实施方案中，细胞是胰腺癌细胞。在某些实施方案中，细胞是乳腺癌细胞。在某些实施方案中，细胞是子宫(例如，子宫内膜)癌细胞。在某些实施方案中，细胞是输卵管癌细胞。在某些实施方案中，细胞是原发性腹膜癌细胞。在某些实施方案中，细胞是SKOV3细胞。在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133，其结合至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、250、500或1000倍高于同种型对照抗体结合细胞。同种型对照抗体是本领域公认的术语。在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133，其结合约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、250、500或1000倍高于同种型对照抗体结合细胞。在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133，其结合10-50、50-100、100-250、250-500或500-1000倍高于同种型对照抗体结合细胞。
由SEQ ID NO:133的氨基酸序列编码的蛋白在本文中也称为MUC16c114，其由成熟MUC16的C端114个氨基酸残基(SEQ ID NO:150为成熟MUC16的序列)组成。MUC16c114能够在SEQ IDNO:133位点1、24和30的天冬酰胺氨基酸处N-糖基化(对应于SEQ ID NO:150的氨基酸位点Asn1777，Asn1800和Asn1806)。
在某些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139。在某些实施方案中，细胞是卵巢癌细胞。在某些实施方案中，细胞是肺癌细胞。在某些实施方案中，细胞是胰腺癌细胞。在某些实施方案中，细胞是乳腺癌细胞。在某些实施方案中，细胞是子宫(例如，子宫内膜)癌细胞。在某些实施方案中，细胞是输卵管癌细胞。在某些实施方案中，细胞是原发性腹膜癌细胞。在某些实施方案中，细胞是SKOV3细胞。在某些实施方案中，第二形式的MUC16融合至可检测蛋白，例如，如，绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139，其结合至多1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4或5倍高于同种型对照抗体结合细胞。在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139，其结合约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4或5倍高于同种型对照抗体结合细胞。在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ IDNO:139，其结合0-1.1，1.1-1.5，1.5-3或3-5倍高于同种型对照抗体结合细胞。
由SEQ ID NO:139的氨基酸序列编码的蛋白在本文中也称为MUC16c114-N3。MUC16c114-N3由成熟MUC16的C端114个氨基酸残基(SEQ ID NO:150为成熟MUC16的序列)组成，除了氨基酸位点30的天冬酰胺(对应SEQ ID NO:150氨基酸位点1806)被突变为丙氨酸。从而，MUC16c114-N3不能在SEQ ID NO:139氨基酸位点30(对应SEQ ID NO:150的氨基酸位点Asn1806)被N-糖基化。
在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ IDNO:139，其结合至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30或40倍低于4H11结合细胞。在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139，其结合约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30或40倍低于4H11结合细胞。在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139，其结合3-5、5-10、10-20或20-40倍低于4H11结合细胞。
用于确定本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段与细胞的结合的测定法，例如，如，FACs，是本领域技术人员已知的。参见，例如，第6.2节描述的方法。
如本文使用的，“4H11”表示Rao等，Appl.Immunohistochem Mol Morphol，2010、18(5):462-72和国际专利申请公开号WO 2011/119979中的单克隆抗MUC16抗体4H11。
在某些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段结合一种肽，所述肽包含氨基酸序列CTRNGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:130)，其中CTRNGTQLQNFTLDRSSV(SEQID NO:130)的4号氨基酸残基(N4)和10号氨基酸残基(N10)是糖基化的。在某些实施方案中，所述肽由氨基酸序列CTRNGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:130)组成，其中CTRNGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:130)的4号氨基酸残基(N4)和10号氨基酸残基(N10)是糖基化的。在某些实施方案中，糖基化包含N连接的壳二糖。在某些实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段结合一种肽，所述肽由氨基酸序列CGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:131)组成，其中CGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:131)的7号氨基酸残基(N7)是糖基化的。在某些实施方案中，所述肽包含氨基酸序列CGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:131)，其中CGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:131)的7号氨基酸残基(N7)是糖基化的。在某些实施方案中，糖基化包含N连接的壳二糖。在某些实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段结合肽混合物，其中肽混合物包含(a)第一肽，其包含氨基酸序列CTRNGTQLQNFTLDRSSV(SEQ IDNO:130)，其中CTRNGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:130)的4号氨基酸残基(N4)和10号氨基酸残基(N10)是糖基化的和(b)第二肽，其包含氨基酸序列CGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:131)，其中CGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:131)的7号氨基酸残基(N7)是糖基化的。在某些实施方案中，第一肽由氨基酸序列CTRNGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:130)组成，其中CTRNGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:130)的4号氨基酸残基(N4)和10号氨基酸残基(N10)是糖基化的。在某些实施方案中，第二肽由氨基酸序列CGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:131)组成，其中CGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:131)的7号氨基酸残基(N7)是糖基化的。在某些实施方案中，糖基化包含N连接的壳二糖。
测定本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段与细胞的结合的测定法，例如，如，ELISA，是本领域技术人员已知的。参见，例如，第6.2节描述的方法。在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以相对于抗MUC16单克隆抗体4H11与肽结合的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或30倍之多结合所述肽。在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以相对于抗MUC16单克隆抗体4H11与肽结合的约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或30倍之多结合所述肽。
在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以低于0.5x10-3/s、1x10-3/s、1.5x10-3/s、2x10-3/s、2.5x10-3/s、3x10-3/s、4x10-3/s、5x10-3/s、6x10-3/s、7x10-3/s、8x10-3/s、9x10-3/s、1x10-4/s、2x10-4/s、3x10-4/s、4x10-4/s、5x10-4/s、6x10-4/s、7x10-4/s或8x10-4/s的kd结合所述肽。在一些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约0.5x10-3/s、1x10-3/s、1.5x10-3/s、2x10-3/s、2.5x10-3/s、3x10-3/s、4x10-3/s、5x10-3/s、6x10-3/s、7x10-3/s、8x10-3/s、9x10-3/s、1x10-4/s、2x10-4/s、3x10-4/s、4x10-4/s、5x10-4/s、6x10-4/s、7x10-4/s或8x10-4/s的kd结合所述肽。在一些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约0.5x10-3/s-8x10-4/s的kd结合所述肽。
在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以至少2.5x104/s、3x104/s、3.5x104/s、4x104/s、4.5x104/s、5x104/s、5.5x104/s、6x104/s、6.5x104/s、7x104/s、7.5x104/s、8x104/s、9x104/s或9x105/s的ka结合所述肽。在一些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约2.5x104/s、3x104/s、3.5x104/s、4x104/s、4.5x104/s、5x104/s、5.5x104/s、6x104/s、6.5x104/s、7x104/s、7.5x104/s、8x104/s、9x104/s或9x105/s的ka结合所述肽of。在一些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约2.5x104/s-9x105/s的ka结合所述肽。
在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以低于1000nM、500nM、100nM、50nM、25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.1nM或0.05nM的kD结合所述肽。在一些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约1000nM、500nM、100nM、50nM、25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.1nM或0.05nM的kD结合所述肽。在一些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以约500nM-1000nM的kD结合所述肽。
在某些实施方案中，MUC16糖基化抗体或抗原结合片段不能免疫特异性结合氨基酸序列CTRNGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:130)，其中CTRNGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:130)的4号氨基酸残基(N4)和10号氨基酸残基(N10)不是糖基化的。在某些实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段不能免疫特异性结合氨基酸序列CGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:131)，其中CGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:131)的7号氨基酸残基(N7)是糖基化的。在某些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，不能免疫特异性结合肽混合物，其中所述肽混合物包含(a)第一肽，包含氨基酸序列CTRNGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:130)，其中CTRNGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:130)的4号氨基酸残基(N4)和10号氨基酸残基(N10)是糖基化的；和(b)第二肽，包含氨基酸序列CGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:131)，其中CGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:131)的7号氨基酸残基(N7)是糖基化的。
在某些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段抑制重组表达一种形式的MUC16的体外基质胶侵袭细胞，该形式的MUC16是糖基化的，且其氨基酸序列是SEQID NO:133(MUC16c114)。在某些实施方案中，重组表达糖基化的MUC16c114的细胞是SKOV3细胞。在某些实施方案中，糖基化形式的MUC16c114是N-糖基化的。在某些实施方案中，糖基化形式的MUC16c114在氨基酸残基Asn30(对应成熟MUC16(SEQ ID NO:150)的Asn1806)处是N-糖基化的。在某些实施方案中，糖基化形式的MUC16c114在氨基酸残基Asn 24和Asn30(分别对应成熟MUC16(SEQ ID NO:150)的Asn1800和Asn1806)处是N-糖基化的。在某些实施方案中，糖基化形式的MUC16c114在氨基酸残基Asn1，Asn24和Asn30(分别对应成熟MUC16(SEQ IDNO:150)的Asn1777，Asn1800和Asn1806)处是N-糖基化的。在某些实施方案中，糖基化包含N连接的壳二糖。在某些实施方案中，糖基化由N连接的壳二糖组成。在某些实施方案中，与用对照抗体(例如，不靶向MUC16的抗体)或4H11处理的细胞的体外基质胶侵袭相比，基质胶侵袭被抑制至少1.25、1.5、1.75、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在某些实施方案中，与用对照抗体(例如，不靶向MUC16的抗体)或4H11处理的细胞的体外基质胶侵袭相比，基质胶侵袭被抑制约1.25、1.5、1.75、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
测定MUC16糖基化抗体或抗原结合片段介导的基质胶侵袭的抑制的测定法是本领域技术人员已知的。参见例如第6.2节中描述的方法。例如，可以从BD Biosciences，MA购买BDBioCoatTMMatrigelTM侵袭插入物或室(24孔板中，目录#354480)和对照插入物(24孔板中，目录#354578)。基质胶侵袭分析可以按照制造商的方案进行。简言之，允许24孔板(-20℃储存)和对照插入物(4℃储存)的基质胶室达到室温。在24孔板的内部(insert)以及外部孔中将两种插入物用0.5mL无血清培养基在37℃5％CO2加湿培养箱中再水化2小时。培养的SKOV3细胞被胰蛋白酶化并用培养基洗涤。将一百万个细胞分离至另一离心管并用无血清培养基洗涤3次。稍后调整这些细胞以在0.5mL无血清培养基中得到5,000个细胞。去除再水化插入物中的培养基，并将插入物转移到新的24孔板中，所述24孔板在孔中含有0.75mL的含10％胎牛血清(FBS)培养基，该培养基用作化学引诱剂。立即将0.5mL无血清培养基中的细胞(5,000个细胞)加入到插入物中。要适当注意，没有气泡被困在插入物和外部的孔中。将24孔板在37℃5％CO2加湿培养箱中孵育48小时。孵育后，通过将棉花尖棉签插入基质胶或对照插入物中并轻轻地施加压力，同时将棉签的尖端移动到膜表面上，通过“擦洗”从膜的上表面去除非侵袭细胞。用浸有培养基的第二个棉签重复擦洗过程。然后将插入物在含有0.5％结晶紫染色剂的0.5mL蒸馏水中的新24孔板中染色30分钟。染色后，将插入物在3个蒸馏水烧瓶中冲洗以除去多余的染色剂。在新的24孔板中将插入物风干。在倒置显微镜下以200倍放大倍率手工计数侵袭细胞。计数三个平行膜的几个领域，并记录在图中。
在某些实施方案中，本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段能够在小鼠模型研究中抑制或减少转移，抑制肿瘤生长或诱导肿瘤退化。例如，可以将肿瘤细胞系导入无胸腺裸鼠，并且可以对无胸腺小鼠施用本文所述的MUC16糖基化抗体一次或多次，并且可以在几周和/或几个月内监测注射的肿瘤细胞的肿瘤进展。在一些情况下，将MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段给予无胸腺裸鼠可以在引入肿瘤细胞系之前进行。在某个实施方案中，表达MUC16c114的SKOV3细胞被用于本文所述的小鼠异种移植模型。参见例如第6.2节和第6.3节。
在具体的实施方案中，按照本文描述的或本领域技术人员已知的方法进行评价，与模拟物处理的小鼠相比，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段在小鼠模型中抑制肿瘤生长或诱导肿瘤退化至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％。在具体的实施方案中，按照本文描述的或本领域技术人员已知的方法进行评价，与模拟物处理的小鼠相比，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段在小鼠模型中抑制肿瘤生长或诱导肿瘤退化至少约25％或35％、可选的约75％。在具体的实施方案中，按照本文描述的或本领域技术人员已知的方法进行评价，与模拟物处理的小鼠相比，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段在小鼠模型中抑制肿瘤生长或诱导肿瘤退化至少约1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。模拟物处理的小鼠可使用磷酸盐缓冲盐水或对照(例如，抗IgG抗体)进行处理。
可以例如通过在一段时间内监测肿瘤大小，例如通过可触诊肿瘤的物理测量或其它视觉检测方法来评估确定肿瘤生长抑制或肿瘤退化。例如，可以产生肿瘤细胞系以重组表达例如绿色荧光蛋白(GFP)或荧光素酶等可视化试剂，然后可以通过显微镜进行GFP的体内可视化，以及可以通过向异种移植小鼠施用荧光素酶底物并检测由荧光素酶处理荧光素酶底物引起的发光进行荧光素酶的体内可视化。GFP或荧光素酶的检测程度或水平与异种移植小鼠中肿瘤的大小有关。
在某些实施方案中，与模拟物处理的小鼠相比，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段能够增加肿瘤异种移植模型中动物的存活率。在具体的实施方案中，按照本文描述的或本领域技术人员已知的方法进行评价，与模拟物处理的小鼠相比，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段使肿瘤异种移植模型中动物的存活率增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在具体的实施方案中，按照本文描述的或本领域技术人员已知的方法进行评价，与模拟物处理的小鼠相比，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段使肿瘤异种移植模型中动物的存活率增加至少约25％或35％、可选的约75％。在具体的实施方案中，按照本文描述的或本领域技术人员已知的方法进行评价，与模拟物处理的小鼠相比，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段使肿瘤异种移植模型中动物的存活率增加至少约1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。可以通过例如在肿瘤细胞系注射后相对于时间(例如，天数或周数)标绘存活小鼠数量的存活曲线来测定存活率。模拟物处理的小鼠可使用磷酸盐缓冲盐水或对照(例如，抗IgG抗体)进行处理。
在某些实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段在细胞与MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段接触时被内化入表达一种形式的MUC16的细胞，所述形式的MUC16是糖基化的，且其氨基酸序列是SEQ ID NO:133(MUC16c114)。当指向一种被细胞内化的分子时，“内化的”或“内化”表示该与细胞膜的胞外表面接触的分子穿过细胞膜到达细胞膜的胞内表面和/或进入细胞质。在某些实施方案中，重组表达糖基化MUC16c114的细胞是SKOV3细胞。在某些实施方案中，糖基化形式的MUC16c114是N-糖基化的。在某些实施方案中，糖基化形式的MUC16c114在氨基酸残基Asn30(对应成熟MUC16(SEQ ID NO:150)的Asn1806)处N-糖基化。在某些实施方案中，糖基化形式的MUC16c114在氨基酸残基Asn 24和Asn30(分别对应成熟MUC16(SEQ ID NO:150)的Asn1800和Asn1806)处N-糖基化。在某些实施方案中，糖基化形式的MUC16c114在氨基酸残基Asn1，Asn24和Asn30(分别对应成熟MUC16(SEQ IDNO:150)的Asn1777，Asn1800和Asn1806)处N-糖基化。在某些实施方案中，糖基化包含N连接的壳二糖。在某些实施方案中，糖基化由N连接的壳二糖组成。
确定本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段内化至细胞的测定法，例如，如使用放射性标记抗体是本领域技术人员已知的。参见例如第6.2节中描述的方法。例如，可以在表达MUC16c114的SKOV3细胞上研究89Zr标记的抗体的内化。简言之，将约1×105个细胞接种在12孔板中，并在37℃5％CO2培养箱中温育过夜。向每个孔中加入一体积的放射性标记的蛋白质，并将板在37℃和4℃下孵育1，5，12和24小时。在每个孵育期后，收集培养基，并用1mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗细胞。通过在4℃下用1mL的含100mM甘氨酸(1:1，pH3.5)的100mM乙酸中洗涤细胞来收集表面结合的活性。然后将粘附的细胞用1mL的1M NaOH裂解。收集每次的洗涤液并进行活性计数。使用最终洗涤液的活性与所有洗涤液的总活性的比例来确定内化的％。在某些实施方案中，测定在37℃下进行。在某些实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段在至少百分之1、2、3、5、6、7、8、9或10的与MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段一起孵育的细胞中内化。在某些实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段在约百分之1、2、3、5、6、7、8、9或10的与MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段一起孵育的细胞中内化。在某些实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段在细胞与MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段接触的1、2、3、4、8、12、16、20或24小时中内化。
5.2抗体缀合物
在优选的实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第Error！Reference source not found.节)不缀合至任何其它分子，例如有机部分，可检测标记或同位素。在可选实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节Error！Reference source not found.)缀合至一个或多个有机部分。在可选实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段缀合至一个或多个可检测标记。在可选实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段缀合至一个或多个同位素。
5.2.1可检测标记和同位素
在某些实施方案中，本文提供了MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节Error！Reference source not found.)缀合物，其中所述MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段缀合至一种或多种试剂，例如，显影剂或细胞毒性剂。本文还提供了双特异性抗体缀合物，其中所述双特异性抗体缀合至一种或多种试剂，例如，显影剂或细胞毒性剂。本文还提供了抗体重链缀合物，其中所述抗体重链缀合至一种或多种试剂，例如，显影剂或细胞毒性剂。本文还提供了抗体轻链缀合物，其中所述抗体轻链缀合至一种或多种试剂，例如，显影剂或细胞毒性剂。本文还提供了融合蛋白缀合物，其中所述融合蛋白缀合一种试剂，例如，显影剂或细胞毒性剂。在某些实施方案中，试剂共价或非共价缀合。
在某些实施方案中，成像剂是可检测标记，例如显色剂、酶剂、放射性同位素剂、同位素剂、荧光剂、毒性剂、化学发光剂、核磁共振造影剂或其它标记。
合适的显色标记的非限制性实例包括二氨基联苯胺和4-羟基偶氮苯-2-羧酸。
合适的酶标记的非限制性实例包括苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
合适的放射性同位素的非限制性实例包括3H、111In、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、223Ra、223Ra、89Zr、177Lu和109Pd。在某些实施方案中，111In是用于体内成像的优选同位素，因为它避免了125I或131I标记的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段在肝脏中脱卤的问题。此外，111In具有更有利的成像伽马发射能(Perkins等人，Eur.J.Nucl.Med.70:296-301(1985)；Carasquillo等，J.Nucl.Med.25:281-287(1987))。例如，与具有1-(P-异硫氰酸苄基)-DPTA的单克隆抗体偶联的111In在非肿瘤组织，特别是肝脏中几乎没有摄取，因此增强了肿瘤定位的特异性(Esteban等，J.Nucl.Med.28:861-870(1987))。
合适的非放射性同位素标记的非限制性实例包括157Gd、55Mn、162Dy、52Tr和56Fe。
合适的荧光标记的非限制性实例包括152Eu标记、荧光素标记、异硫氰酸酯标记、罗丹明标记、藻红蛋白标记、藻蓝蛋白标记、别藻蓝蛋白标记、绿色荧光蛋白(GFP)标记、邻苯二甲醛标记和荧光胺标记。
化学发光标记的非限制性实例包括鲁米诺标记、异亮氨酸标记、芳族吖啶酯标记、咪唑标记、吖啶盐标记、草酸酯标记、萤光素标记、荧光素酶标记和水母发光蛋白标记。
核磁共振对比剂的非限制性实例包括重金属核，例如Gd、Mn和铁。
本领域普通技术人员已知的用于将上述标记与所述MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链和融合蛋白缀合的技术描述于例如，Kennedy等，Clin.CMm.Acta 70:1-31(1976)和Schurs等，Clin.CMm.Acta 81:1-40(1977)。后者所述的偶联技术是戊二醛法、高碘酸盐法、二马来酰亚胺法、间马来酰亚胺基苄基-N-羟基-琥珀酰亚胺酯法，所有这些方法均通过引用并入本文。
细胞毒性剂的非限制性实例包括细胞抑制剂或杀细胞剂、放射性金属离子、例如α-发射体和毒素、例如假单胞菌外毒素、相思豆毒素、霍乱毒素、蓖麻毒蛋白A和白喉毒素。
在某些实施方案中，所述试剂是诊断试剂。诊断试剂是通过定位含有抗原的细胞来诊断或检测疾病的试剂。有用的诊断剂包括但不限于放射性同位素、染料(例如具有生物素-链霉亲和素复合物)、对比剂、荧光化合物或分子以及用于磁共振成像(MRI)的增强剂(例如顺磁离子)。美国专利号6,331,175描述了MRI技术和与MRI增强剂缀合的抗体的制备，并通过引用整体并入本文。优选地，诊断剂选自放射性同位素，用于磁共振成像的增强剂和荧光化合物。为了用放射性金属或顺磁性离子负载MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，可能需要将其与具有长尾巴的试剂反应，后者附着多个螯合基团以结合离子。这样的尾巴可以是聚合物，例如聚赖氨酸，多糖或具有侧基的其它衍生化或可衍生的链，所述侧基可以结合螯合基团，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、聚胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟基等已知可用于该目的的基团。螯合剂使用标准化学与抗体偶联。螯合剂通常通过能够与分子形成键的基团与抗体连接，其具有最小的免疫反应性损失和最小聚集和/或内部交联，螯合剂与抗体缀合的其它更为不寻常的方法和试剂公开于1989年4月25日授权的题为“Antibody Conjugates”的Hawthorne的美国专利号4,824,659，其公开内容通过引用整体并入本文。特别有用的金属螯合剂组合包括2-苄基-DTPA及其单甲基和环己基类似物，与用于放射成像的诊断同位素一起使用。当与本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段一起使用时，当与非放射性金属如锰，铁和钆络合时，相同的螯合剂可用于MRI。大环螯合剂如NOTA，DOTA和TETA可分别用于各种金属和放射性金属，尤其是镓，钇和铜的放射性核素。通过将环尺寸调整(tailoring)适合感兴趣的金属，可以使这种金属-螯合剂复合物非常稳定。本文还包括用于稳定结合核素的其它环型螯合剂如大环聚醚如用于RAIT的223Ra。
在某些实施方案中，试剂是有机试剂。该有机试剂可以产生具有改善的药代动力学性质(例如体内血清半衰期增加)的缀合物。有机部分可以是亲水性聚合物基团，脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。如本文所用，术语“脂肪酸”包括单羧酸和二羧酸。如本文所用，“亲水性聚合物基团”是指在水中比在辛烷中更可溶的有机聚合物，例如聚赖氨酸。适用于改性本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的亲水性聚合物可以是直链或支链的，包括例如聚链烷二醇(例如聚乙二醇、(PEG)、单甲氧基-聚乙二醇和聚丙二醇)、碳水化合物(例如葡聚糖、纤维素、寡糖和多糖)、亲水氨基酸的聚合物(例如聚赖氨酸、聚精氨酸和聚天冬氨酸)、聚烷氧化物(例如聚乙烯氧化物和聚丙烯氧化物)和聚乙烯吡咯烷酮。在某些实施方案中，修饰本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，双特异性抗体，抗体重链，抗体轻链或融合蛋白的亲水性聚合物作为一个单独的分子实体具有约800至约150,000道尔顿的分子量。例如可以使用PEG5000和PEG20,000、其中下标是道尔顿中聚合物的平均分子量。亲水性聚合基团可以被一至六个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基团取代。用脂肪酸或脂肪酸酯基取代的亲水性聚合物可以通过采用合适的方法制备。例如，包含胺基的聚合物可以与脂肪酸或脂肪酸酯的羧酸酯偶合，脂肪酸或脂肪酸酯上的活化的羧酸酯(例如，用N，N-羰基二咪唑活化)可以与聚合物上的羟基偶联。
适于修饰本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，双特异性抗体，抗体重链，抗体轻链或融合蛋白的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的或可以含有一种或更多的不饱和单位。适于修饰本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，双特异性抗体，抗体重链，抗体轻链或融合蛋白的脂肪酸包括例如正十二烷酸盐、正十四烷酸盐、正十六烷酸盐、正二十烷酸盐、正二十烷酸盐、正三酸甘油酸盐、正四十烷酸盐、顺-δ-9-十八烷酸盐、所有顺式-δ-5,8,11,14-二十碳五烯酸酯、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等。合适的脂肪酸酯包括含有直链或支链低级烷基的二羧酸单酯。低级烷基可包含1至约12个，优选1至约6个碳原子。
本文提供的缀合物可以使用合适的方法制备，例如通过与一种或多种改性剂反应。如本文所用，“活化基团”是化学部分或官能团，其在适当条件下可与第二化学基团反应，从而在改性剂和第二化学基团之间形成共价键。例如，胺反应活化基团包括亲电子基团，例如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、卤素(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等。可以与硫醇反应的活化基团包括例如马来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯酰基、吡啶基二硫化物、5-硫醇-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等。醛官能团可以与含胺或酰肼的分子偶联，并且叠氮基可以与三价磷基反应形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺键。将活化基团引入分子的合适方法是本领域已知的(参见例如Hernanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press：San Diego，Calif.(1996))。可以将活化基团直接键合到有机基团(例如亲水性聚合物，脂肪酸，脂肪酸酯)上或通过接头部分例如二价C1-C12基团键合，其中一个或多个碳原子可以被诸如氧，氮或硫的杂原子取代。合适的接头部分包括例如四甘醇，(CH2)3和NH。包含接头部分的修饰剂可以例如通过在1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺(EDC)的存在下使单Boc-烷基二胺(例如单Boc-乙二胺或单Boc-二氨基己烷)与脂肪酸反应来制备，以形成游离胺和脂肪酸羧酸酯之间的酰胺键。可以通过用三氟乙酸(TFA)处理将Boc保护基从产物中除去，以暴露可以如所述偶联至另一羧酸酯的伯胺，或者可以与马来酸酐反应，并将所得产物环化以产生活化的马来酰亚胺脂肪酸的衍生物。(参见例如Thompson等人，WO 92/16221，其全部教导通过引用并入本文)。
“改性剂”可以指包含活化基团的合适的有机基团(例如亲水聚合物，脂肪酸和脂肪酸酯)。例如，有机部分可以通过使用胺反应性改性剂，例如PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯，以非位点特异性方式与MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段结合。修饰的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段也可以通过将MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，双特异性抗体，抗体重链，抗体轻链或融合蛋白的二硫键(例如，链内二硫键)还原进行制备。然后可以将还原的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，双特异性抗体，抗体重链，抗体轻链或融合蛋白与硫醇反应性改性剂反应，以产生本文提供的缀合物。包含与本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的特定位点结合的有机部分的缀合物可以使用合适的方法制备，例如反向蛋白水解(Fisch等人，Bioconjugate Chem.，3：147-153(1992)；Werlen等人，BioconjugateChem.，5：411-417(1994)；Kumaran等人，Protein Sci.6(10)：2233-2241(1997)；Itoh等人，Bioorg.Chem.，24(1)：59-68(1996)；Capellas等人，Biotechnol.Bioeng.，56(4)：456-463(1997))和Hermanson，GT，Bioconjugate Techniques，Academic Press：San Diego，Calif(1996)。
5.3抗体生产
5.3.1生产和筛选抗体
在另一方面，本文提供了生产MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的方法(参见第Error！Reference source not found.节和第5.2节)。
本文所述的抗体或其抗原结合片段可以通过本领域已知的用于合成抗体的任何方法来产生，例如通过化学合成或通过重组表达技术。除非另有说明，否则本文所述的方法在分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交和相关领域中均采用本领域的常规技术。这些技术描述于例如本文引用的参考文献中，并在文献中得到充分解释。参见，例如，Maniatis T等，(1982)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Sambrook J等，(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Sambrook J等，(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，Ausubel FM等，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley&Sons(1987年，每年更新)，Current Protocols inImmunology，John Wiley&Sons(1987年，每年更新)Gait(编)(1984)OligonucleotideSynthesis：A Practical Approach，IRL Press，Eckstein(编)(1991)Oligonucleotides和Analogues：A Practical Approach，IRL Press，Birren B等，(编)(1999)GenomeAnalysis：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press。
在具体实施方案中，本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段是通过任何方式制备，表达，产生或分离的抗体(例如，重组抗体)，其涉及创建，例如通过合成，DNA序列遗传工程。在某些实施方案中，此类抗体包含由在动物或哺乳动物(例如人)体内的抗体种系谱中非天然存在的DNA序列编码的序列。在具体实施方案中，本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段通过包括使用糖基化形式的SEQ ID NO：129，SEQ ID NO：130和/或SEQ IDNO：131的方法制备。在具体实施方案中，SEQ ID NO：129，SEQ ID NO：130和/或SEQ ID NO：131的糖基化形式用一个或多个壳二糖进行糖基化。有关如何产生本文所述的抗体的详细描述参见第6.2节、第6.3节和第6.4节。
在某一方面，本文提供了包含一个或多个糖基化位点的免疫原性糖肽，其中(i)免疫原性糖肽是10-60个氨基酸残基、10-30个氨基酸残基、15-25个氨基酸残基、15-20个氨基酸残基或15-18个氨基酸残基长和(ii)该一个或多个糖基化位点的至少一个连接碳水化合物。
在一些实施方案中，免疫原性糖肽包含1、2或3个糖基化位点。在具体实施方案中，免疫原性糖肽包含一个糖基化位点。在另一具体实施方案中，免疫原性糖肽包含两个糖基化位点。
在具体的实施方案中，免疫原性糖肽包含一个连接碳水化合物的糖基化位点。在具体的实施方案中，免疫原性糖肽包含两个分别连接碳水化合物的糖基化位点。
与免疫原性糖肽的一个或多个糖基化位点连接的碳水化合物可以是N-连接的碳水化合物，O-连接的碳水化合物或C-连接的碳水化合物。N-连接的碳水化合物与天冬酰胺残基相连，是自然界中最常见的形式。大多数N-连接的碳水化合物与GlcNAc-β-Asn形式的肽连接。O-连接的碳水化合物连接到氨基酸羟基侧链(通常来自丝氨酸或苏氨酸)。大多数O-连接的碳水化合物与GlcNAc-β-Ser/Thr或GlcNAc-α-Ser/Thr形式的肽连接。C-连接的碳水化合物是指与色氨酸残基相连的甘露糖，是自然界中最少见的形式。在一个实施方案中，免疫原性糖肽中的碳水化合物是N-或O-连接的碳水化合物。在具体实施方案中，免疫原性糖肽中的碳水化合物是N-连接的碳水化合物。
与免疫原性糖肽的一个或多个糖基化位点连接的碳水化合物可以是单糖、二糖、寡糖(例如三糖、四糖或五糖)或多糖。在某些实施方案中，碳水化合物是单糖、二糖、三糖、四糖或五糖。在具体实施方案中，碳水化合物是二糖。在具体实施方案中，二糖是壳二糖。在另一具体实施方案中，碳水化合物是Man3GlcNAc2。在具体的实施方案中，免疫原性糖肽的N端是乙酰化的。在具体的实施方案中，免疫原性糖肽的C端是N-甲基甲酰胺衍生物的形式。
在某些实施方案中，免疫原性糖肽与免疫原性载体蛋白缀合。在大多数情况下，小抗原(例如短肽或小型半抗原)不足够复杂，不能诱导产生抗体。免疫原性载体蛋白由于其大的尺寸和复杂的结构，可赋予缀合的小抗原免疫原性，导致针对小抗原和免疫原性载体蛋白上的表位产生抗体。因此，小抗原总是与免疫原性载体蛋白化学偶联，以加强免疫应答从而成功产生抗体。通常使用的免疫原性载体蛋白包括但不限于匙孔血蓝蛋白(KLH)，小脑泡藻血蓝蛋白(CCH)，牛血清白蛋白(BSA)和卵白蛋白(OVA)。在具体实施方案中，免疫原性糖肽与KLH缀合。KLH是属于一组称为血蓝蛋白的非血红蛋白的含铜多肽，它们在节肢动物和软体动物中被发现。KLH分离自锁孔帽贝(Megathura crenulata)。由于其与哺乳动物的进化距离，高分子量，复杂结构以及含有提供伯胺作为缀合目标的数百个赖氨酸基团的大表面，KLH是哺乳动物中具有极大免疫原性的和有效的载体蛋白。
在某些实施方案中，免疫原性糖肽是10-60个氨基酸残基长。在一些实施方案中，免疫原性糖肽是10-30个氨基酸残基长。在一些实施方案中，免疫原性糖肽是15-25个氨基酸残基长。在一些实施方案中，免疫原性糖肽是15-20个氨基酸残基长。在具体的实施方案中，免疫原性糖肽是15-18个氨基酸残基长。在该具体实施方案的一个特定方面，其中免疫原性糖肽是15-18个氨基酸残基长，免疫原性糖肽包含连接壳二糖的糖基化位点。在该具体实施方案的另一特定方面，其中免疫原性糖肽是15-18个氨基酸残基长，免疫原性糖肽包含分别连接壳二糖的两个糖基化位点。在具体实施方案中，免疫原性糖肽是55个氨基酸残基长。在该具体实施方案的一个特定方面，其中免疫原性糖肽是55个氨基酸残基长，免疫原性糖肽包含连接壳二糖的糖基化位点。在具体实施方案中，免疫原性糖肽是18个氨基酸残基长。在该具体实施方案的一个特定方面，其中免疫原性糖肽是18个氨基酸残基长，免疫原性糖肽包含分别连接壳二糖的两个糖基化位点。在另一具体实施方案中，免疫原性糖肽是15个氨基酸残基长。在该具体实施方案的一个特定方面，其中免疫原性糖肽是15个氨基酸残基长，免疫原性糖肽包含连接壳二糖的糖基化位点。
在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的至少10个氨基酸部分，且该一个或多个糖基化位点的至少一个免疫原性糖肽位于所述氨基序列部分内。在某些其它实施方案中，免疫原性糖肽包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的至少15、20、25或30个氨基酸部分，且该一个或多个糖基化位点的至少一个免疫原性糖肽位于所述氨基序列部分内。在具体的实施方案中，免疫原性糖肽是15-18个氨基酸残基长。在具体的实施方案中，免疫原性糖肽是55个氨基酸残基长。在具体的实施方案中，免疫原性糖肽包含SEQ IDNO:129的氨基酸序列。在具体实施方案中，免疫原性糖肽是55个氨基酸残基长并包含SEQID NO:129的氨基酸序列。在具体实施方案中，包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的免疫原性糖肽在第30位残基(Asn)包含连接壳二糖的糖基化位点。在另一具体实施方案中，包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的免疫原性糖肽在SEQ ID NO:129第30位残基(Asn)包含连接Man3GlcNAc2部分的糖基化位点。在具体的实施方案中，免疫原性糖肽是18个氨基酸残基长。在具体的实施方案中，免疫原性糖肽包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列。在具体实施方案中，免疫原性糖肽是18个氨基酸残基长并包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列。在具体实施方案中，包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的免疫原性糖肽在第4位残基(Asn)和第10位残基(Asn)包含两个糖基化位点，其分别连接壳二糖。在具体的实施方案中，免疫原性糖肽是15个氨基酸残基长。在具体的实施方案中，免疫原性糖肽包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列。在具体实施方案中，免疫原性糖肽是15个氨基酸残基长并包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列。在具体实施方案中，包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的免疫原性糖肽在第7位残基(Asn)包含连接壳二糖的糖基化位点。
在另一方面，本文提供了产生特异性结合糖蛋白的抗体或其抗原结合片段的方法，包括用包含如上所述一个或多个糖基化位点的免疫原性糖肽来免疫对象。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含糖蛋白氨基酸序列的至少10个氨基酸的部分且免疫原性糖肽的一个或多个糖基化位点的至少一个位于所述氨基酸序列部分之内。在其它某些实施方案中，免疫原性糖肽包含糖蛋白的至少15、20、25或30个氨基酸部分的氨基酸序列，且免疫原性糖肽的一个或多个糖基化位点的至少一个位于所述氨基酸序列部分之内。在具体实施方案中，糖蛋白包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列。在具体实施方案中，抗体或其抗原结合片段不能特异性结合非糖基化形式的糖蛋白。按照本文描述的方法免疫的对象可以是，但不限于，山羊、绵羊、驴、鸡、豚鼠、大鼠、兔或小鼠。在一些实施方案中，按照本文描述的方法免疫的对象是大鼠、兔或小鼠。在具体实施方案中，按照本文描述的方法免疫的对象是小鼠。对对象的免疫可以使用任何本领域已知方法进行，例如，通过对对象给予免疫原性糖肽和佐剂，如实施例2和实施例3所述(参见第6.2节和第6.3节)。
在另一方面，本文还提供了制备本文所述的免疫原性糖肽的方法。在某些实施方案中，制备免疫原性糖肽的方法包括将本文所述的免疫原性糖肽的一个或多个糖基化位点与碳水化合物(例如，壳二糖)连接。在某些实施方案中，制备免疫原性糖肽的方法还包括合成肽部分。免疫原性糖肽的肽部分可以通过本领域已知的任何方法合成，例如通过如实施例2中所述的Fmoc固相肽合成(参见第6.2节)。在某些实施方案中，在合成免疫原性糖肽期间，一个或多个糖基化位点处的氨基酸(例如天冬酰胺)被保护基团保护。在一个具体的实施方案中，肽部分的仅一个天冬酰胺残基与碳水化合物(例如壳二糖)连接，天冬酰胺上的保护基是烯丙基。在另一具体实施方案中，肽部分的多于一个(例如两个)天冬酰胺残基各自与碳水化合物(例如，壳二糖)连接，天冬酰胺残基上的保护基是O-2-苯基异丙基酯(O-2-PhiPr，OPp)。连接步骤可以通过本领域已知的任何方法进行。在优选的实施方案中，碳水化合物部分与肽部分连接，使用如实施例2所述的单烧瓶天冬氨酰化/去保护程序(参见第6.2.2.1节)。
产生MUC16糖基化的方法本文所述的抗体或其抗原结合片段是本领域普通技术人员已知的，例如通过化学合成，通过从生物来源纯化，或通过重组表达技术，包括例如，来自哺乳动物细胞或转基因制剂。除非另有说明，否则本文所述的方法在分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交和相关领域中均采用本领域常规技术。这些技术例如在本文引用的参考文献中有描述，并在文献中得到充分解释。参见，例如，Maniatis等(1982)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Sambrook等(1989)，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Sambrook等(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons(1987年，每年更新)，Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons(1987年，每年更新)Gait(编)(1984)Oligonucleotide Synthesis：A PracticalApproach，IRL Press，Eckstein(编)(1991)Oligonucleotides和Analogues：A PracticalApproach，IRL Press，Birren等(编)(1999)Genome Analysis：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press。
本领域中存在用于产生本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的多种方法(参见第5.1节和第5.2节)。例如，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段可以通过重组DNA方法制备，例如美国专利号4,816,567中描述的方法。编码本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的一种或多种DNA可以容易地用常规方法分离和测序(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链或来自人、人源化或其它来源的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将其转化入宿主细胞如NS0细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、酵母细胞、藻类细胞、卵或骨髓瘤细胞中，其不会产生免疫球蛋白，以获得重组宿主细胞中MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的合成。也可以通过将编码所需物种的重链和轻链恒定区的序列替换为同源人序列(美国专利号4,816,567；Morrison等，同上)或通过将免疫球蛋白编码序列共价连接到全部或部分非免疫球蛋白多肽的编码序列来对DNA进行修饰。该非免疫球蛋白多肽可以替换为本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的恒定区。在某些实施方案中，DNA如第5.3.2节所述。
还可以使用至少一种MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段编码多核苷酸来制备本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，以提供转基因动物或哺乳动物，例如山羊，牛，马，羊等，在其乳汁中产生这样的抗体。可以使用已知方法提供这样的动物。参见，例如，但不限于，美国专利号5,827,690、5,849,992、4,873,316、5,849,992、5,994,616、5,565,362、5,304,489等，其各自全文引入作为参考。
在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段可另外使用编码本文提供的至少一种MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的多核苷酸进行制备，所述多核苷酸用于提供转基因植物，培养植物细胞(例如但不限于烟草和玉米)，其在植物部分或在其中培养的细胞中产生此类抗体、特定部分或变体。作为非限制性实例，表达重组蛋白的转基因烟草叶已经成功地用于提供大量的重组蛋白，例如使用诱导型启动子。参见，例如，Curr.Top.Microbol.Immunol.240:95-118(1999)及其中引用的参考文献。此外，转基因玉米已被用于以商业生产水平表达哺乳动物蛋白质，其生物活性与其它重组体系中产生的或者从天然来源纯化的生物活性相当。参见例如Hood等，Adv.Exp.Med.Biol.464:127-147(1999)及其中引用的参考文献。抗体还大量产生自包括抗体片段如scFv的转基因植物种子，包括烟草种子和马铃薯块茎。参见，例如，Conrad等，Plant Mol.Biol.38:101-109(1998)及其中引用的参考文献。因此，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段也可以使用转基因植物根据已知方法产生。另见，例如，Fischer等，Biotechnol.Appl.Biochem.30:99-108(1999年10月)，Ma等，Trends Biotechnol.13:522-7(1995)，Ma等，Plant Physiol.109:341-6(1995)，Whitelam等，Biochem Soc.Trans.22:940-944(1994)及其中引用的参考文献。上述各参考文献全部并入本文作为参考。
在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段可以使用本文提供的至少一种编码MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的多核苷酸来制备，以提供产生此类MUC16糖基化抗体或抗原结合片段的细菌。作为非限制性实例，表达重组蛋白的大肠杆菌已经成功地用于提供大量的重组蛋白。参见例如Verma等人，1998，216(1-2)：165-181及其中引用的参考文献。
制备多特异性(例如，双特异性抗体)的方法已有描述，参见，例如，美国专利号7,951,917、7,183,076、8,227,577、5,837,242、5,989,830、5,869,620、6,132,992和8,586,713。
在某些实施方案中，本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)被用于产生双特异性抗体。可以通过融合两个杂交瘤以产生具有两个结合位点的杂合免疫球蛋白分子来制备双特异性抗体。双特异性抗体不仅将肿瘤移植(handcuff)至T细胞，它们还交联T细胞上的CD3并启动激活级联。这样，基于T细胞受体的细胞毒性被重定向到绕过MHC限制的期望的肿瘤靶标。用抗CD3-抗-MUC16双特异性结合分子装入多克隆活化的T细胞(ATC)，组合了MUC16糖基化抗体的靶向特异性和T细胞的非MHC限制性穿孔素/颗粒酶介导的细胞毒性。双特异性结合分子BsAb或BiTE可以在输注到患者体内之前装备体外扩增的活化的T细胞。这种策略将每个ATC转换成特定的CTL(Thakur和Lum，2010，Curr OpinMol Ther 12,340-349；Grabert等人，2006，Clin Cancer Res 12,569-576)。
双特异性结合分子可以由MUC16糖基化抗体组成，其中MUC16糖基化抗体是免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的每个轻链是融合蛋白，其中融合蛋白由免疫球蛋白轻链通过肽接头连接到靶向CD3的scFv。CH2结构域中的N297A突变导致糖基化，导致不存在FcR或Clq结合。
MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段可用于产生CAR。CAR最通常包括单链可变区片段长度抗体(scFv)(例如来源于靶向给定肿瘤相关抗原和/或其变体的单克隆抗体的一种)，跨膜域(例如来源于T细胞表面分子，例如共刺激分子如CD8，CD28，OX-40和4-1BB的跨膜域)，TCR复合物的信号传导部分(例如TCRζ链的胞内结构域和/或附加部分，例如其细胞质信号结构域)。在具体实施方案中，本文所述的单克隆MUC16糖基化抗体的重链和轻链可变区从产生单克隆MUC16糖基化抗体的杂交瘤细胞系中分离。例如，从杂交瘤细胞系提取RNA，通过逆转录PCR从RNA产生cDNA。利用可变区特异性引物通过标准PCR克隆VH和VL链可变区。将得到的VH和VL片段亚克隆到穿梭载体，例如TopoTA PCR 2.1克隆载体(Invitrogen)中并进行测序。随后将VH和VL片段连接到(Gly4Ser)3间隔区，产生MUC16糖基化抗体scFv并通过重叠PCR与人CD8前导肽(CD8L)(CD8L-MUC16糖基化抗体scFv)融合(参见例如，Maher J等，Nat Biotechnol 2002；20(1)：70-5；和Gong MC等人，Neoplasia 1999；1(2)：123-7)。将CD8L-MUC16糖基化抗体scFv编码区融合到人CD8铰链和跨膜域，或者可选的与CD28跨膜和细胞质信号结构域融合，与T细胞受体CD3-ζ信号结构域融合(参见例如Maher J等，NatBiotechnol 2002；20(1):70-5.，Brentjens RJ等，Nat Med 2003；9(3):279-86和Brentjens RJ等，Clin Cancer Res 2007；13(18Pt 1):5426-35)。
本文还提供了表达本文所述的CAR的T细胞。用于产生表达CAR的T细胞的方法是本领域已知的。例如，CAR构建体可以亚克隆到经修饰的MMLV逆转录病毒载体SFG(参见，例如，Riviere I等，Proc Natl Acad Sci USA 1995；92(15):6733-7)或其它合适的逆转录病毒载体中。在一些实施方案中，逆转录病毒载体是慢病毒载体，例如基于HIV的载体。来源于转导的gpg29成纤维细胞的VSV-G假型逆转录病毒上清液可用于构建稳定的PG13长臂猿白血病病毒(GaLV)包封假型逆转录病毒产生细胞系(参见例如Gong MC等，Neoplasia 1999；1(2):123-7)。分离的健康供体外周血单核细胞(PBMC)可以以2μg/m1(Sigma，St.Louis，MO)的植物凝集素(PHA)活化，并在纤连蛋白包被的非组织培养板上逆转录病毒转导(Quintas-Cardama A等，Hum Gene Ther 2007；18(12):1253-60)以产生重组表达CAR的T细胞。可以通过FACS评估CAR进入T细胞的基因转移。
单域抗体，例如，缺乏轻链的抗体，可以通过本领域熟知的方法产生。参见RiechmannL&Muyldermans S(1999)J Immunol 231：25-38，Nuttall SD等，(2000)Curr PharmBiotechnol 1(3)：253-263，Muyldermans S，(2001)J Biotechnol 74(4)：277-302，美国专利号6,005,079和国际公开号WO 94/04678、WO 94/25591和WO 01/44301。
在具体实施方案中，本文所述的结合与本文所述的MUC16糖基化抗体相同或重叠的表位的本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段是人MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，竞争性阻断(例如，以剂量依赖的方式)本文所述的任何一种抗体与MUC16结合的本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段是人MUC16糖基化抗体或抗原其结合片段。可以使用本领域已知的任何方法制备人抗体。例如，可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。特别地，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机引入或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。可选的，除人类重链和轻链基因之外，还可以将人可变区，恒定区和多样性区引入小鼠胚胎干细胞。小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可以通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座而分开或同时进行非功能化。特别地，JH区域的纯合缺失可防止内源性抗体产生。将修饰的胚胎干细胞扩增并显微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合后代。转基因小鼠以正常方式用选定的抗原(例如全部或部分抗原)进行免疫。针对抗原的单克隆抗体可以使用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠获得。由转基因小鼠携带(harbored)的人类免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，随后进行类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术可以产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于用于生产人抗体的该技术的概述，参见例如Lonberg N&Huszar D(1995)Int Rev Immunol 13:65-93。关于用于产生人抗体和人单克隆抗体的该技术的详细讨论和用于产生此类抗体的方案，参见例如国际公开号WO 98/24893、WO 96/34096和WO 96/33735和美国专利号5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598。能够产生人抗体的小鼠的实例包括XenomouseTM(Abgenix，Inc.，美国专利号6,075,181和6,150,184)、HuAb-MouseTM(Mederex，Inc./Gen Pharm，美国专利号5,545,806和5,569,825)、Trans ChromoMouseTM(Kirin)和KM MouseTM(Medarex/Kirin)。
免疫特异性结合MUC16的人抗体可以通过本领域已知的多种方法制备，包括使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库所述的噬菌体展示方法。另见美国专利号4,444,887、4,716,111和5,885,793和国际公开号WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741。
在一些实施方案中，可以使用小鼠-人杂交瘤产生人抗体。例如，用Epstein-Barr病毒(EBV)转化的人外周血淋巴细胞可以与小鼠骨髓瘤细胞融合以产生分泌人单克隆抗体的小鼠-人杂交瘤，并且可筛选这些小鼠-人杂交瘤以确定分泌免疫特异性结合靶抗原的人单克隆抗体的那些。这些方法是已知的并且在本领域中描述，参见例如Shinmoto H等，(2004)Cytotechnology 46：19-23；Naganawa Y等，(2005)Human Antibodies 14：27-31。
在具体的实施方案中，产生免疫特异性结合MUC16的抗体或其抗原结合片段的方法描述于第6.2节，如下所示。
在具体的实施方案中，筛选和选择免疫特异性结合MUC16的抗体或其抗原结合片段的方法描述于第6.2节，如下所示。
一旦已经产生了本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，则可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法纯化，例如通过色谱法(例如，离子交换，亲和层析，特别是通过蛋白A和尺寸排阻柱色谱法后对特异性抗原的亲和层析)，离心，差异溶解或通过任何其他用于纯化蛋白质的标准技术。此外，本文所述的抗体可以融合到本文所述的或本领域已知的异源多肽序列以促进纯化。
在具体的实施方案中，本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段是分离的或纯化的。通常，分离的抗体是基本上不含与所分离的抗体具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体。例如，在具体实施方案中，本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的制备基本上不含细胞材料和/或化学前体。“基本上不含细胞材料”的语言包括MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的制剂，其中将抗体与分离或重组产生所述抗体的细胞的细胞组分进行分离。因此，基本上不含细胞材料的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段包括具有小于约30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(以干重计)的异源蛋白(本文也称为“污染性蛋白质”)和/或MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的变体(例如MUC16糖基化抗体或抗原结合片段的不同翻译后修饰形式或其它不同形式的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(例如，抗体片段))的抗体制剂。当重组产生抗体时，其通常也基本上不含培养基，即培养基代表小于蛋白质制剂体积的约20％、10％、2％、1％、0.5％或0.1％。当通过化学合成制备抗体时，其通常基本上不含化学前体或其它化学物质，即它与参与合成蛋白质的化学前体或其它化学物质分离。因此，抗体的这种制剂具有小于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的除感兴趣的抗体之外的化学前体或化合物。在具体实施方案中，本文描述的抗体是分离的或纯化的。
5.3.2多核苷酸
在某些实施方案中，本文提供了包含编码MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的多核苷酸(参见第5.1节和第5.2节)。本文还提供了包含这种多核苷酸的载体(参见第5.3.3节)。本文还提供编码本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的抗原的多核苷酸(参见第5.1节和第5.2节)。本文还提供了在严格或较低严格杂交条件下与编码本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的多核苷酸杂交的多核苷酸。
语言“纯化的”包括具有小于约15％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(特别是小于约10％)的其他材料的多核苷酸或核酸分子的制剂，例如细胞材料，培养基，其他核酸分子，化学前体和/或其它化学品。在具体实施方案中，编码本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第Error！Reference source not found.节和第5.2节)的核酸分子是分离的或纯化的。
本文提供的核酸分子可以是RNA的形式，例如mRNA，hnRNA，tRNA或任何其它形式，或以DNA的形式，包括但不限于通过克隆或合成生产或其任何组合获得的cDNA和基因组DNA。DNA可以是三链，双链或单链，或其任何组合。DNA或RNA的至少一条链的任何部分可以是编码链，也称为有义链，或者它可以是非编码链，也称为反义链。
在某些实施方案中，本文提供了一种多核苷酸，其包含编码本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第Error！Reference source not found.节和第5.2节)的核苷酸序列。
在特定方面，本文还提供了包含编码MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)的核苷酸序列的多核苷酸，其免疫特异性结合MUC16，并且包含本文描述的氨基酸序列，以及与该MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争结合MUC16的抗体，或者其与这些抗体结合相同的表位。
本文提供的多核苷酸可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，如果编码本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(见第5.1节和第5.2节)的核苷酸序列是已知的，则编码MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的多核苷酸可以由化学合成的寡核苷酸(例如，如Kutmeier等人，BioTechniques 17：242(1994)中所述)进行组装，其简要地涉及包含编码抗体的序列的部分的重叠寡核苷酸的合成，退火和那些寡核苷酸的连接，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
可选的，编码MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的多核苷酸(参见第5.1节和第5.2节)可以从合适来源的核酸产生。如果含有编码特定MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的核酸的克隆不可得，但MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的序列是已知的，则编码MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的核酸可以通过化学合成获得或从合适的来源获得(例如，表达抗体的任何组织或细胞，例如选择用于表达本文提供的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的杂交瘤细胞，所产生的抗体cDNA文库或cDNA文库，或从表达抗体的任何组织或细胞中分离的核酸，优选的poly A+RNA)，其中通过使用与序列的3'和5'末端杂交的合成引物进行PCR扩增或通过使用对特定基因序列特异性的寡核苷酸探针进行克隆，以鉴别例如来自编码抗体的cDNA文库的cDNA克隆。然后可以使用本领域熟知的任何方法将通过PCR产生的扩增的核酸克隆到可复制的克隆载体中(参见例如第5.3.3节)。
在这样的实施方案中，编码这种MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的多核苷酸可以使用本领域熟知的用于操作核苷酸序列的方法进行操作，例如重组DNA技术，定点诱变，PCR，等等(参见例如Sambrook等人，1990、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel等编，1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.，中描述的技术，其全部内容通过引用并入本文)，以产生具有不同氨基酸序列的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，例如，以产生氨基酸取代，缺失和/或插入。例如，可以进行这种操作以使编码的氨基酸被糖基化，或破坏抗体结合C1q、Fc受体或激活补体系统的能力。
本文提供的分离的核酸分子可包括包含开放阅读框(ORF)的核酸分子，任选具有一个或多个内含子，例如但不限于至少一个互补决定区(CDR)的至少一个特定部分，作为至少一个重链或轻链的CDR1，CDR2和/或CDR3；包含MUC16糖基化抗体或可变区的编码序列的核酸分子；和包含与上述基本上不同的核苷酸序列，但由于遗传密码的简并性，仍然编码如本文所述的至少一种MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
本文还提供了在选择性杂交条件下与本文公开的多核苷酸杂交的分离的核酸。因此，该实施方案的多核苷酸可用于分离，检测和/或定量包含此类多核苷酸的核酸。例如，本文提供的多核苷酸可用于鉴定，分离或扩增保藏的文库中的部分或全长克隆。在一些实施方案中，所述多核苷酸是与人或哺乳动物核酸文库的cDNA分离或以其它方式互补的基因组或cDNA序列。
除了本文提供的多核苷酸之外，核酸可以方便地包括序列。例如，可以将包含一个或多个内切核酸酶限制性位点的多克隆位点插入到核酸中以有助于分离多核苷酸。此外，可插入可翻译序列以帮助分离本文提供的翻译的多核苷酸。例如，六组氨酸标记序列提供了纯化本文提供的多肽的方便手段。本文提供的核酸(不包括编码序列)任选的用于克隆和/或表达本文提供的多核苷酸的载体，适配子或接头。
另外的序列也可以加入到这样的克隆和/或表达序列中以优化它们在克隆和/或表达中的功能，以帮助分离多核苷酸，或改进将多核苷酸引入细胞。克隆载体，表达载体，适配子和接头的使用是本领域公知的。(参见例如Ausubel，同上；或Sambrook，同上)。
在具体实施方案中，使用常规的重组DNA技术，本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的一个或多个CDR可以插入已知的框架区域内。框架区可以是天然存在的或共有的框架区，优选人框架区(参见例如Chothia等人，J.Mol.Biol.278：457-479(1998)的人框架区列表)。优选地，通过框架区和CDR的组合产生的多核苷酸编码免疫特异性结合MUC16的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段。可以在框架区内进行一个或多个氨基酸取代，优选地，氨基酸取代改善抗体与其抗原的结合。此外，这些方法可用于进行参与链内二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基的氨基酸取代或缺失，以产生缺少一个或多个链内二硫键的抗体分子。在本文中并且在本领域的技术范围内提供了对多核苷酸的其它改变。
在某些实施方案中，分离或纯化的核酸分子或其片段在与另一个核酸分子连接时可以编码融合蛋白。融合蛋白的产生在本领域的普通技术范围内，并且可以涉及使用限制酶或重组克隆技术(参见例如Gateway.TM..(Invitrogen))。另见美国专利号5,314,995。
在某些实施方案中，本文提供的多核苷酸是如第5.3.3节所述的载体(例如，表达载体)的形式。
在某些方面，本文提供了包含编码本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段或其抗原结合片段(例如，可变轻链区和/或可变重链区)的核苷酸序列的多核苷酸，其免疫特异性结合MUC16和载体，例如包含这样的多核苷酸的载体，用于在宿主细胞(例如，大肠杆菌和哺乳动物细胞)中有效表达。在一些实施方案中，多核苷酸是分离的或纯化的。
如本文所用，“分离的”多核苷酸或核酸分子是与核酸分子的天然来源(例如，在小鼠或人中)存在的其它核酸分子分离的。此外，当通过重组技术产生时，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，可基本上不含其它细胞材料或培养基；或当采用化学合成时，其基本上不含化学前体或其它化学物质。例如，语言“基本上不含”包括具有小于约15％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％的其他材料的多核苷酸或核酸分子的制剂，例如细胞材料，培养基，其他核酸分子，化学前体和/或其它化学物质。
在特定方面，本文提供了包含编码MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的多核苷酸，并且包含本文所述的氨基酸序列，以及与此类抗体竞争结合MUC16的抗体(例如，以剂量依赖的方式)，或者结合与该抗体相同或重叠表位的抗体。
在某些方面，本文提供了包含编码本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的轻链或重链的核酸序列的多核苷酸。多核苷酸可以包含编码包含本文所述的VH CDR的重链的核苷酸序列(参见例如表1，表3和表5)。多核苷酸可以包含编码包含本文所述VL CDR的轻链的核苷酸序列(参见例如表2、表4和表6)。
在具体实施方案中，本文提供了多核苷酸，其包含编码含有3个VH CDR的MUC16糖基化抗体的核苷酸序列，例如，含有如表1、表3或表5中所述的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在具体的实施方案中，本文描述的多核苷酸编码10C6、7B12、19C11、16C5和18C6共同序列VH CDR的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(即，分别为SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:105，或分别为SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111，或SEQ ID NO:115、SEQ IDNO:116和SEQ ID NO:117)。在具体的实施方案中，本文描述的多核苷酸编码10C6的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3(即，分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，或分别为SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，或分别为SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQID NO:17)。在具体的实施方案中，本文描述的多核苷酸编码7B12的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3(即，分别为SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25，或分别为SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31，或分别为SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37)。在具体的实施方案中，本文描述的多核苷酸编码19C11的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(即，分别为SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45，或分别为SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51，或分别为SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57)。在具体的实施方案中，本文描述的多核苷酸编码16C5的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(即，分别为SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65，或分别为SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70和SEQ IDNO:71，或分别为SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:77)。在具体的实施方案中，本文描述18C6的多核苷酸编码的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(即，分别为SEQ ID NO:83、SEQID NO:84和SEQ ID NO:85，或分别为SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:91，或分别为SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97)。
在具体的实施方案中，本文提供了包含编码MUC16糖基化抗体的核苷酸序列的多核苷酸，所述MUC16糖基化抗体包含(a)3个VH CDR，例如，含有如表1、表3或表5中所述的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3和(b)3个VL链CDR，例如，含有如表2、表4或表6所述的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3。在具体的实施方案中，本文描述的多核苷酸编码(a)10C6、7B12、19C11、16C5和18C6共同序列VH CDR的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(即，分别为SEQ ID NO:103、SEQID NO:104和SEQ ID NO:105，或分别为SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111，或SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:117)和(b)10C6、7B12、19C11、16C5和18C6共同序列VL CDR的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(即，分别为SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108，或分别为SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113和SEQ ID NO:114，或SEQ IDNO:118、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:120)。在具体的实施方案中，本文描述的多核苷酸编码(a)10C6的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(即，分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5，或分别为SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，或分别为SEQ ID NO:15、SEQID NO:16和SEQ ID NO:17)和(b)10C6的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(即，分别为SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，或分别为SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14，或分别为SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20)。在具体的实施方案中，本文描述的多核苷酸编码(a)7B12的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(即，分别为SEQ ID NO:23、SEQID NO:24和SEQ ID NO:25，或分别为SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31，或分别为SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37)和(b)7B12的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(即，分别为SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28，或分别为SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33和SEQ ID NO:34，或分别为SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40)。在具体的实施方案中，本文描述的多核苷酸编码(a)19C11的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(即，分别为SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45，或分别为SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51，或分别为SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57)和(b)19C11的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3(即，分别为SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48，或分别为SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54，或分别为SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60)。在具体的实施方案中，本文描述的多核苷酸编码(a)16C5的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3(即，分别为SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65，或分别为SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:71，或分别为SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76和SEQ IDNO:77)和(b)16C5的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(即，分别为SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68，或分别为SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74，或分别为SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80)。在具体的实施方案中，本文描述的多核苷酸编码(a)18C6的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(即，分别为SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84和SEQ IDNO:85，或分别为SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:91，或分别为SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97)和(b)18C6的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(即，分别为SEQID NO:86、SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88，或分别为SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93和SEQ IDNO:94，或分别为SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100)。
在某些实施方案中，本文描述的多核苷酸包含编码本文描述的MUC16糖基化抗体的核苷酸序列，所述MUC16糖基化抗体包含含有本文描述的氨基酸序列的重链可变区(例如，SEQID NO:1、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:101)，其中抗体免疫特异性结合MUC16。
在某些实施方案中，本文描述的多核苷酸包含编码本文描述的MUC16糖基化抗体的核苷酸序列，所述MUC16糖基化抗体包含含有本文描述的氨基酸序列的轻链可变区(例如，SEQID NO:2、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:102)，其中抗体免疫特异性结合MUC16。
在某些实施方案中，本文描述的多核苷酸包含编码本文描述的MUC16糖基化抗体的核苷酸序列，所述MUC16糖基化抗体包含重链可变区，其包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文描述的多核苷酸包含编码本文描述的MUC16糖基化抗体的核苷酸序列，所述MUC16糖基化抗体包含重链可变区，其包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文描述的多核苷酸包含编码本文描述的MUC16糖基化抗体的核苷酸序列，所述MUC16糖基化抗体包含重链可变区，其包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文描述的多核苷酸包含编码本文描述的MUC16糖基化抗体的核苷酸序列，所述MUC16糖基化抗体包含重链可变区，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文描述的多核苷酸包含编码本文描述的MUC16糖基化抗体的核苷酸序列，所述MUC16糖基化抗体包含重链可变区，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文描述的多核苷酸包含编码本文描述的MUC16糖基化抗体的核苷酸序列，所述MUC16糖基化抗体包含重链可变区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文描述的多核苷酸包含编码本文描述的MUC16糖基化抗体的核苷酸序列，所述MUC16糖基化抗体包含重链可变区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文描述的多核苷酸包含编码本文描述的MUC16糖基化抗体的核苷酸序列，所述MUC16糖基化抗体包含重链可变区，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本文描述的多核苷酸编码VH，后者包含SEQ ID NO:140、SEQ IDNO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146或SEQ ID NO:148的核酸序列。在某些实施方案中，本文描述的多核苷酸编码VL，后者包含SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147或SEQ ID NO:149的核酸序列。在具体实施方案中，本文描述的多核苷酸编码具有核酸序列SEQ ID NO:140的VH和具有核酸序列SEQ ID NO:141的VL(例如，10C6)。在具体实施方案中，本文描述的多核苷酸编码具有核酸序列SEQ ID NO:142的VH和具有核酸序列SEQ ID NO:143的VL(例如，7B12)。在具体实施方案中，本文描述的多核苷酸编码具有核酸序列SEQ ID NO:144的VH和具有核酸序列SEQ ID NO:145的VL(例如，19C11)。在具体实施方案中，本文描述的多核苷酸编码具有核酸序列SEQ ID NO:146的VH和具有核酸序列SEQID NO:147的VL(例如，16C5)。在具体实施方案中，本文描述的多核苷酸编码具有核酸序列SEQ ID NO:148的VH和具有核酸序列SEQ ID NO:149的VL(例如，18C6)。
在具体的方面，本文提供了一种多核苷酸，其包含编码包含轻链和重链的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，例如，单独的轻链和重链。对于重链，在具体实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码γ(例如，γ1，γ2，γ3或γ4)重链的核苷酸序列。在具体实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，其中抗体包含重链，且其中重链可变区的氨基酸序列可包含任何SEQID NO:1、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:101的氨基酸序列，且其中重链恒定区是人γ重链恒定区。
对于轻链，在具体实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码κ轻链的核苷酸序列。在另一具体实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码λ轻链的核苷酸序列。在又一具体实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码本文描述的包含人κ轻链或人λ轻链的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。在具体实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，其中抗体包含轻链，且其中轻链可变区氨基酸序列可包含任何SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:102的氨基酸序列，且其中轻链恒定区是人κ轻链恒定区。在另一具体实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，其中抗体包含轻链，其中轻链可变区氨基酸序列可包含任何SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:102的氨基酸序列，且其中轻链恒定区是人λ轻链恒定区。
对于产生本文描述的MUC16糖基化抗体的详细实施例，参见第6.2节和第6.3节。
5.3.3细胞和载体
在某些实施方案中，本文提供了表达(例如，重组表达)一个或多个MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第Error！Reference source not found.节和第5.2节)的细胞(例如，离体细胞)。本文还提供了包含编码本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列(参见，例如，第Error！Reference source not found.节)的载体(例如，表达载体)，用于在宿主细胞中重组表达，优选在哺乳动物细胞中重组表达。本文还提供了包含该载体或核苷酸序列的细胞(例如，离体细胞)，用于重组表达本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段。本文还提供了用于生产本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的方法，包括从细胞(例如，离体细胞)中表达该MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段。在一个优选实施方案中，细胞是离体细胞。
载体(例如，表达载体)是包含在细胞(例如离体细胞)中表达的基因的DNA分子。通常，将基因表达置于某些调节元件的控制下，包括组成型或诱导型启动子，组织特异性调节元件和增强子。将这样的基因称为与调节元件例如启动子“可操作地连接”。重组宿主可以是含有克隆载体或表达载体的任何原核或真核细胞。该术语还包括原核或真核细胞以及转基因动物，其被遗传工程化以在宿主细胞或宿主细胞(例如，离体细胞)的细胞的染色体或基因组中含有克隆的基因。在一个实施方案中，启动子是CMV启动子。
在某些实施方案中，本文提供了包含如第5.3.2节所述的一种或多种多核苷酸的载体。在某些实施方案中，可以将第5.3.2节所述的多核苷酸克隆到合适的载体中，并可用于转化或转染任何合适的宿主。用于构建此类载体的载体和方法是本领域普通技术人员已知的，并且在一般技术参考文献中有所描述(参见，一般参见“Recombinant DNA Part D，”Methods in Enzymology，Vol.153，Wu和Grossman编，Academic Press(1987))。在某些实施方案中，载体包含调节序列，例如转录和翻译起始和终止密码子，其特异于待引入载体的宿主(例如细菌，真菌，植物，昆虫或哺乳动物)的类型，酌情考虑载体是DNA还是RNA。在某些实施方案中，载体包含特异于宿主属的调节序列。在某些实施方案中，载体包含特异于宿主种的调节序列。
在某些实施方案中，载体包含一个或多个标记基因，其允许选择转化或转染的宿主。标记基因的非限制性实例包括杀生物剂抗性，例如抗生素，重金属等的抗性，营养缺陷型宿主中的互补以提供原养型等。在优选的实施方案中，载体包含氨苄青霉素和潮霉素选择标记。
在某些实施方案中，表达载体可以包含与第5.3.2节所述的多核苷酸可操作地连接的天然或规范性启动子。启动子的选择，例如强，弱，可诱导，组织特异性和发育特异性，均在本领域技能范围内。类似地，如上所述的核酸分子或其片段与启动子的组合也在本领域的技能范围内。
合适的载体的非限制性实例包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或两者的那些。例如，克隆载体可以选自pUC系列，pBluescript系列(Stratagene，LaJolla，Calif.)，pET系列(Novagen，Madison，Wis.)，pGEX系列(Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)和pEX系列(Clontech，Palo Alto，Calif.)。还可以使用噬菌体载体，如λ-GT10、λ-GT11，λ-ZapII(Stratagene)，λ-EMBL4和λ-NM1149。植物表达载体的非限制性实例包括pBI110、pBI101.2，pBI101.3，pBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的非限制性实例包括pEUK-C1，pMAM和pMAMneo(Clontech)。也可以根据制造商的建议使用TOPO克隆系统(Invitrogen，Carlsbad，Calif)。
在某些实施方案中，载体是哺乳动物载体。在某些实施方案中，哺乳动物载体含有至少一个启动子元件，其介导mRNA，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的编码序列，以及转录终止和转录多聚腺苷酸化所需的信号的转录起始。在某些实施方案中，哺乳动物载体包含另外的元件，例如增强子，Kozak序列和两侧为用于RNA剪接的供体和受体位点的插入序列。在某些实施方案中，可以使用例如来自SV40的早期和晚期启动子，来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTRS)例如RSV、HTLVI，HIVI和巨细胞病毒(CMV)的早期启动子达到高效转录。然而，也可以使用细胞元件(例如，人肌动蛋白启动子)。哺乳动物表达载体的非限制性实例包括载体，例如pIRESlneo，pRetro-Off，pRetro-On，PLXSN或pLNCX(Clonetech Labs，PaloAlto，Calif.)，pcDNA3.1(+/-)，pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen)，PSVL和PMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，pRSVcat(ATCC37152)，pSV2dhfr(ATCC 37146)和pBC12MI(ATCC 67109)。可以与这些哺乳动物载体组合使用的哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括人Hela 293，H9和Jurkat细胞，小鼠NIH3T3和C127细胞，Cos 1，Cos 7和CV 1，鹌鹑QC1-3细胞，小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在某些实施方案中，载体是病毒载体，例如逆转录病毒载体，基于细小病毒的载体，例如基于腺相关病毒(AAV)的载体，AAV-腺病毒嵌合载体和基于腺病毒的载体，和慢病毒载体，例如基于单纯疱疹(HSV)的载体。在某些实施方案中，操纵病毒载体以使病毒复制缺陷。在某些实施方案中，操作病毒载体以消除对宿主的毒性。这些病毒载体可以使用例如Sambrook等人，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；和Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates和John Wiley&Sons，New York，N.Y.(1994)中所述的标准重组DNA技术来制备。
在某些实施方案中，本文所述的载体或多核苷酸可以通过常规技术转移至细胞(例如，离体细胞)，并且所得细胞可以通过常规技术培养以产生MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段。因此，本文提供的是包含编码MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其重链或轻链或其轻链融合多肽的多核苷酸的细胞，其可操作地连接到用于在宿主细胞中表达此类序列的启动子。在某些实施方案中，编码可操作地连接到启动子的重链的载体和编码可操作地连接到启动子的轻链的载体可以在细胞中共表达，用于表达整个MUC16糖基化抗体。在某些实施方案中，编码可操作地连接到启动子的重链的载体和编码可操作地连接到启动子的轻链融合多肽的载体可以在细胞中共表达以表达整个双特异性结合分子。在某些实施方案中，细胞包含载体，其包含编码与启动子可操作地连接的本文所述的MUC16糖基化抗体的重链和轻链多肽的多核苷酸。在某些实施方案中，细胞包含载体，所述载体包含编码与启动子可操作地连接的本文描述的双特异性结合分子的重链和轻链融合多肽的多核苷酸。在某些实施方案中，细胞包含两种不同的载体，包含编码与启动子可操作地连接的重链的多核苷酸的第一载体，和包含编码与启动子可操作地连接的轻链多肽的多核苷酸的第二载体。在某些实施方案中，细胞包含两种不同的载体，包含编码与启动子可操作地连接的重链的多核苷酸的第一载体，和包含编码与启动子可操作地连接的轻链融合多肽的多核苷酸的第二载体。在某些实施方案中，第一细胞包含第一载体，其包含编码本文所述的MUC16糖基化抗体的重链的多核苷酸，第二细胞包含第二载体，其包含编码本文所述的MUC16糖基化抗体的轻链多肽的多核苷酸。在某些实施方案中，本文提供了包含该第一细胞和该第二细胞的细胞混合物。在某些实施方案中，第一细胞包含第一载体，其包含编码本文所述的双特异性结合分子的重链的多核苷酸，第二细胞包含第二载体，其包含编码本文所述的双特异性结合分子的轻链融合多肽的多核苷酸。在某些实施方案中，本文提供了包含该第一细胞和该第二细胞的细胞混合物。在优选的实施方案中，细胞表达载体或载体，使得寡核苷酸被细胞有效转录和翻译。
在实施方案中，细胞表达载体，从而寡核苷酸或其片段被细胞有效转录和翻译。
在某些实施方案中，细胞存在于宿主中，宿主可以是动物，例如哺乳动物。细胞的实例包括但不限于人细胞、人细胞系、大肠杆菌(例如大肠杆菌TB-1、TG-2、DH5a、XL-Blue MRF'(Stratagene)、SA2821和Y1090)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、铜绿假单胞菌(P.aerugenosa)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、粗糙脉孢菌(N.crassa)、昆虫细胞(例如Sf9、Ea4)下文所述的其它细胞。在优选的实施方案中，细胞是CHO细胞。在特别优选的实施方案中，细胞是CHO-S细胞。
在某些实施方案中，本文所述的多核苷酸可以通过将多核苷酸引入细胞而在包含整合到染色体中的多核苷酸的稳定细胞系中表达。在某些实施方案中，通过例如电穿孔将多核苷酸引入细胞。在某些实施方案中，通过例如将包含多核苷酸的载体转染到细胞中将多核苷酸引入细胞。在某些实施方案中，载体用选择性标记如DHFR，GPT，新霉素或潮霉素共转染，以允许鉴定和分离转染的细胞。在某些实施方案中，也可以扩增所转染的多核苷酸以表达大量的编码的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段。例如，DHFR(二氢叶酸还原酶)标记可用于开发携带数百或甚至数千拷贝目标多核苷酸的细胞系。选择标记的另一个实例是酶谷氨酰胺合成酶(GS)(Murphy等，Biochem.J.227:277-279(1991)，Bebbington等，Bio/Technology10:169-175(1992))。使用这些标记物，细胞在选择性培养基中生长，并选出具有最高抗性的细胞。这些细胞系含有整合到染色体中的扩增基因。中国仓鼠卵巢(CHO)和NSO细胞常用于生产抗体。
在一个实施方案中，载体包含(i)编码结合MUC16的免疫球蛋白轻链的第一多核苷酸序列，其可操作地连接到第一启动子和(ii)编码结合MUC16的免疫球蛋白重链的第二多核苷酸，其可操作地连接到第二启动子。在某些实施方案中，载体是病毒载体。
在一个实施方案中，载体包含(i)可操作地连接到第一启动子的编码轻链融合多肽的第一多核苷酸序列，其包含通过肽接头与scFv融合的免疫球蛋白轻链，其中轻链结合MUC16，其中scFv结合CD3，和(ii)可操作地连接到第二启动子的编码结合MUC16的免疫球蛋白重链的第二多核苷酸。在某些实施方案中，载体是病毒载体。
5.4药物组合物
在某些实施方案中，本文提供了包含药学有效量的一种或多种MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)的组合物(例如药物组合物)和试剂盒。在某些实施方案中，药物组合物包含免疫细胞，例如T细胞，其重组表达本文所述的抗体、其抗原结合片段和/或CAR。组合物可用于制备单个单一剂量形式。本文提供的组合物可以配制用于胃肠外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、Ommaya内、眼内、玻璃体内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸廓内、子宫内、膀胱内、大丸、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内、囊内、脑心室内、脑薄壁组织内或透皮给药。在优选的实施方案中，将组合物配制成肠胃外给药。在特别优选的实施方案中，将组合物配制用于静脉内给药。在优选的实施方案中，将组合物配制用于腹膜内给药。在具体实施方案中，将组合物配制用于腹膜内给药以治疗腹膜转移。在优选的实施方案中，将组合物配制用于鞘内给药。在具体实施方案中，将组合物配制用于鞘内施用以治疗脑转移。参见例如Kramer等，2010、97：409-418。在优选的实施方案中，将组合物配制用于脑部脑室内给药。在具体实施方案中，将组合物配制用于心室内给药以治疗脑转移。参见例如Kramer等，2010,97：409-418。在优选的实施方案中，将组合物配制成用于脑内实施内给药。在具体实施方案中，将组合物配制用于薄壁组织内施用以治疗脑肿瘤或脑肿瘤转移。参见例如Luther等人，2014，Neuro Oncol，16：800-806和Clinical Trial ID NO NCT01502917。
在具体实施方案中，将组合物配制用于腹膜内给药用于腹膜转移。
在某些实施方案中，本文提供了包含一种或多种包含编码本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的多核苷酸的组合物。在某些实施方案中，本文提供了包含细胞的组合物，其中所述细胞包含一种或多种包含编码本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的多核苷酸。在某些实施方案中，本文提供了包含载体的组合物，其中所述载体包含一种或多种包含编码本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的多核苷酸。在某些实施方案中，本文提供的是包含细胞的组合物，其中所述细胞包含载体，其中所述载体包含一种或多种包含本文所述的编码MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的多核苷酸。
在某些实施方案中，本文所述的组合物是稳定或保存的制剂。在某些实施方案中，稳定的制剂包含具有盐水或选择的盐的磷酸盐缓冲液。在某些实施方案中，所描述的组合物是适用于药物或兽医用途的多用途保藏制剂。在某些实施方案中，本文所述的组合物包含防腐剂。本领域普通技术人员已知防腐剂。防腐剂的非限制性实例包括苯酚，间甲酚，对甲酚，邻甲酚，氯甲酚，苄醇，亚硝酸苯汞，苯氧基乙醇，甲醛，氯丁醇，氯化镁(例如六水合物)，对羟基苯甲酸烷基酯(甲基，乙基，丙基，丁基等)，苯扎氯铵，苄索氯铵和脱氢乙酸钠和硫柳汞，或它们在水性稀释剂中的混合物。可以使用本领域已知的任何合适的浓度或混合物，例如0.001-5％或其中的任何范围或值，例如但不限于0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或其中的任何范围或值。非限制性示例包括，无防腐剂、0.1-2％间甲酚(例如0.2、0.3.0.4、0.5、0.9、1.0％)、0.1-3％苯甲醇(例如0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5％)、0.001-0.5％硫柳汞(例如0.005、0.01)、0.001-2.0％苯酚(例如0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0％)、0.0005-1.0％对羟基苯甲酸烷基酯(例如0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0％)等。
有时可能期望将本文提供的组合物长时间地递送到对象，例如从单次给药递送一周至一年或更长时间。可以使用各种缓释、贮存(depot)或植入剂型。例如，剂型可以含有在体液中具有低溶解度的化合物的药学上可接受的无毒盐，例如(a)与多元酸如磷酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、丹宁酸、双羟萘酸、藻酸、聚谷氨酸、萘单磺酸或二磺酸、聚半乳糖醛酸等的酸加成盐；(b)与多价金属阳离子如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等的盐，或与有机阳离子例如N，N'-二苄基乙二胺或乙二胺的盐；或(c)(a)和(b)的组合，例如单宁酸锌盐。此外，本文提供的组合物，优选相对不溶性的盐，例如刚刚描述的那些，可以配制成凝胶，例如适用于注射的具有例如芝麻油的单硬脂酸铝凝胶。特别优选的盐是锌盐、单宁酸锌盐、双羟萘酸盐等。用于注射的另一种类型的缓释贮存制剂将含有分散用于包封在缓慢降解，无毒，非抗原性聚合物如聚乳酸/聚乙醇酸聚合物中的化合物或盐，例如美国专利号3,773,919中描述的。化合物或优选的相对不溶性的盐，如上述那些，也可以配制在胆固醇基质硅橡胶微丸中，特别是用于动物。文献(美国专利号5,770,222和"Sustained and Controlled ReleaseDrug Delivery Systems"，J.R.Robinson编，Marcel Dekker，Inc.，N.Y.，1978)中已知另外的缓释、贮存或植入组合物，例如气体或液体脂质体。
本文提供的至少一种MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段组合物(参见第5.1节和第5.2节)的范围包括在重构时产生的量，如果在湿/干系统中，浓度为约1.0微克/毫升至约1000毫克/毫升，尽管较低和较高的浓度是可操作的并且取决于预期的递送载体，例如，溶液制剂将不同于透皮贴剂、肺、经粘膜或渗透或微泵方法。
在某些实施方案中，本文提供的组合物包含任何合适的辅助剂，例如但不限于稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等中的至少一种。在某些实施方案中，优选药学上可接受的助剂。制备这种无菌溶液的非限制性实例和方法是本领域公知的，例如但不限于，Gennaro编，Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，MackPublishing Co.(Easton，Pa.)。可以常规选择适合本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的施用方式，溶解度和/或稳定性的药学上可接受的载体。
在某些实施方案中，本文提供的组合物含有一种或多种药物赋形剂和/或添加剂。药物赋形剂和添加剂的非限制性实例是蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如，糖、包括单糖、二、三、四和寡糖；衍生糖如糖醇、醛糖酸、酯化糖等；和多糖或糖聚合物)，其可以单独或组合存在，包含单独或组合的1-99.99％的重量或体积。蛋白质赋形剂的非限制性实例包括血清白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。氨基酸/抗体组分也可以起缓冲作用的非限制性实例包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。在某些实施方案中，氨基酸是甘氨酸。碳水化合物赋形剂的非限制性实例包括单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精，葡聚糖、淀粉等；和糖醇，如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨醇(葡萄糖醇)、肌醇等。在某些实施方案中，碳水化合物赋形剂是甘露糖醇、海藻糖或棉子糖。
在某些实施方案中，本文提供的组合物包括一种或多种缓冲液或pH调节剂；通常，缓冲液是由有机酸或碱制备的盐。缓冲剂的非限制性实例包括有机酸盐，例如柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐；Tris，氨丁三醇盐酸盐或磷酸盐缓冲液。在某些实施方案中，缓冲液是有机酸盐，例如柠檬酸盐。其它赋形剂，例如等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、防腐增强剂，可以任选和优选加入到稀释剂中。通常在已知浓度下使用等渗剂如甘油。优选加入生理上耐受的缓冲液以提供改善的pH控制。组合物可以覆盖宽范围的pH，例如约pH 4至约pH 10、优选范围为约pH 5至约pH 9，最优选范围为约6.0至约8.0。优选地，本文提供的组合物的pH在约6.8和约7.8之间。优选的缓冲液包括磷酸盐缓冲液，最优选磷酸钠，特别是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在某些实施方案中，本文提供的组合物包括一种或多种聚合物赋形剂/添加剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、多糖(聚合糖)、糊精(例如环糊精，例如2-羟基丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如聚山梨酸酯如“TWEEN20”和“TWEEN 80”)、脂质(例如磷脂、脂肪酸)、类固醇、胆固醇)和/或螯合剂(例如EDTA)。
其它添加剂，例如药学上可接受的助溶剂如吐温20(聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯)、吐温40(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)、吐温80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)、Pluronic F68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)和PEG(聚乙二醇)或非离子表面活性剂如聚山梨醇酯20或80或泊洛沙姆184或188、Pluronic.RTM.聚醚，其它嵌段共聚物和螯合剂如EDTA和EGTA可以任选加入到组合物中以减少聚集。如果使用泵或塑料容器来施用组合物，这些添加剂是特别有用的。药学上可接受的表面活性剂的存在减轻了蛋白质聚集的倾向。
适用于本文提供的组合物的另外的药物赋形剂和/或添加剂是本领域技术人员已知的，并且参考例如“Remington：The Science&Practice of Pharmacy”，第19版，Williams&Williams，(1995)和“Physician's Desk Reference”，第52版，Medical Economics，Montvale，N.J.(1998)，其全部内容通过引用并入本文。在某些优选实施方案中，载体或赋形剂材料是碳水化合物(例如糖和糖醇)和缓冲液(例如柠檬酸盐)或聚合物。
优选地，水性稀释剂任选地还包含药学上可接受的防腐剂。优选的防腐剂包括选自苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(甲基、乙基、丙基、丁基等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱水乙酸酯和硫柳汞、或其混合物的那些。组合物中使用的防腐剂的浓度是足以产生抗微生物作用的浓度。这样的浓度取决于所选择的防腐剂，并且是本领域技术人员容易确定的。
本文提供的组合物可以通过包括在水性稀释剂中混合本文所述的至少一种MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)和选自以下的防腐剂的方法制备：苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(甲基、乙基、丙基、丁基等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或其混合物。使用常规的溶解和混合程序将本文所述的至少一种MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段与水性稀释剂中的防腐剂混合。为了制备合适的组合物，例如，将缓冲溶液中实测量的至少一种本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段与缓冲溶液中的所需防腐剂组合，其量足以提供本文所述的MUC16糖基化抗体或抗原结合片段和所需浓度的防腐剂。本文提供的组合物可以通过包括混合本文所述的至少一种MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段和选择的缓冲液，优选含有盐水或选择的盐的磷酸盐缓冲液的方法来制备。使用常规溶解和混合程序将本文所述的至少一种MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段与水性稀释液中的缓冲液混合。为了制备合适的组合物，例如将在水或缓冲液中实测量的至少一种本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段与所需的缓冲剂水溶液合并，其量足以提供蛋白质和缓冲液所需浓度。这些方法的变化将由本领域普通技术人员认识到。例如，添加组分的顺序，是否使用其他添加剂，制备组合物的温度和pH都是可以针对所用浓度和给药方式进行优化的因素。
5.4.1肠胃外剂型
在某些实施方案中，本文提供的组合物被配制用于肠胃外可注射给药。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、血管内、肌内、皮内、皮下和眼内。对于肠胃外给药，组合物可以配制成溶液、悬浮液、乳剂或冻干粉末，其与药学上可接受的肠胃外载体联合或者单独提供。这种载体的非限制性实例是水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、甘油、乙醇和1-10％人血清白蛋白。还可以使用脂质体和非水性载体如固定油。载体或冻干粉末可以含有保持等渗性(例如氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(例如缓冲剂和防腐剂)的添加剂。制剂通过已知或合适的技术灭菌。
在本领域的标准参考文献的最新版本的Remington's Pharmaceutical Sciences，A.Osol中描述了合适的药物载体。
用于肠胃外给药的制剂可以含有作为常规赋形剂的无菌水或盐水、聚亚烷基二醇如聚乙二醇、植物来源的油、氢化萘等。用于注射的水性或油性悬浮液可以根据已知方法使用合适的乳化剂或润湿剂和悬浮剂来制备。注射剂可以是无毒的，非口服给药的稀释剂，例如水溶液或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液。作为可用的载体或溶剂，允许使用水，林格氏溶液，等渗盐水等；作为普通溶剂或悬浮溶剂，可以使用无菌非挥发性油。为了这些目的，可以使用任何种类的非挥发油和脂肪酸，包括天然或合成或半合成脂肪油或脂肪酸；天然的或合成的或半合成的甘油单酯或甘油三酯。亲本(Parental)施用是本领域已知的，并且包括但不限于常规的注射方法、美国专利号5,851,198中所述的气压无针注射装置和美国专利号5,839,446所述的激光穿孔装置，其通过引用整体并入本文。
5.4.2肺部剂型
在某些实施方案中，包含本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的组合物(参见第5.1节和第5.2节)被配制用于肺部给药。对于肺部给药，组合物以有效用于到达肺或窦的下呼吸道的粒径递送。用于肺部给药的组合物可以通过本领域已知的各种吸入或鼻部装置通过吸入施用治疗剂来递送。能够在患者鼻腔或肺泡中沉积雾化制剂的这些装置包括计量吸入器、雾化器、干粉发生器、喷雾器等。适用于引导本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的肺或鼻施用的其它装置也是本领域已知的。所有这些装置都使用适合于在气溶胶中分配本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的施用的制剂。这种气溶胶可以由溶液(水溶液和非水溶液)或固体颗粒组成。计量吸入器，如计量吸入器，通常使用推进气体，并且在吸气期间需要驱动(参见例如WO 94/16970、WO 98/35888)。干粉吸入器，如TurbuhalerTM(Astra)，(Glaxo)，(Glaxo)，由InhaleTherapeutics销售的装置，仅举几例，使用混合粉末的呼吸驱动(美国专利号4,668,218Astra，EP 237507Astra，WO 97/25086Glaxo，WO 94/08552Dura，美国专利号5,458,135Inhale，WO 94/06498Fisons，通过引用完全并入本文)。雾化器如雾化器(Mallinckrodt)和雾化器(Marquest Medical Products)(美国专利号5,404,871Aradigm，WO 97/22376)，以上参考文献全部并入本文作为参考，从溶液中产生气溶胶，而计量吸入器，干粉吸入器等产生小颗粒气溶胶。商业上可获得的吸入装置的这些实例是非限制性实施例，并不意在限制范围。
在某些实施方案中，可以通过使得至少一种MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的悬浮液或溶液在压力下穿过喷嘴来制备包含本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)的喷雾剂。可以选择喷嘴的尺寸和构型，施加的压力和液体进料速率来实现所需的输出和粒度。电喷雾可以例如通过与毛细管或喷嘴进料结合的电场来产生。有利地，由喷雾器递送的包含至少一种本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的组合物的颗粒具有小于约10μm的粒度，优选在约1μm至约5μm的范围内，并且最多优选约2μm至约3μm。
适合与喷雾器一起使用的本文所述的至少一种MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(见第5.1节和第5.2节)的组合物的制剂通常包括至少一种MUC16糖基化抗体或抗原水溶液，其浓度为约0.1mg至约100mg/ml溶液或mg/gm，或其中的任何范围或值，例如但不限于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/ml或mg/gm。制剂可以包括诸如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂、和优选锌的试剂。制剂还可以包括用于稳定MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段组合物的赋形剂或试剂，如缓冲剂、还原剂、散装(bulk)蛋白质或碳水化合物。用于配制这种组合物的散装蛋白包括白蛋白、鱼精蛋白等。用于配制抗体组合物蛋白质的典型碳水化合物包括蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。组合物还可以包括表面活性剂，其可以减少或防止由形成气溶胶时的溶液雾化引起的组合物的表面诱导聚集。可以使用各种常规的表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，以及聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。其用量通常为制剂重量的0.001至14％。优选的表面活性剂是聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯，聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。
在某些实施方案中，组合物通过雾化器，例如喷射雾化器或超声雾化器施用。通常，在喷射雾化器中，压缩空气源被用于通过孔口产生高速空气射流。当气体扩张超过喷嘴时，产生低压区域，其通过连接到液体储存器的毛细管吸引抗体组合物蛋白质的溶液。来自毛细管的液体流在离开管时被剪切成不稳定的细丝和液滴，产生气溶胶。可以使用一系列配置，流速和挡板类型来实现来自给定喷射雾化器的所需性能特征。在超声波雾化器中，高频电能被用于产生振动、机械能，通常采用压电换能器。该能量直接或通过偶联流体传递给抗体组合物蛋白质的制剂，产生包含抗体组合物蛋白质的气溶胶。有利地，由雾化器递送的抗体组合物蛋白颗粒具有小于约10μm的粒度，优选在约1μm至约5μm的范围内，最优选约2μm至约3μm。
在某些实施方案中，组合物经由计量吸入器(MDI)施用，其中推进剂，至少一种本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)，和任意赋形剂或其它添加剂作为包括液化压缩气体的混合物盛放于罐中。计量阀的致动将混合物(diemixture)释放为气溶胶，优选含有尺寸范围小于约10μm，优选约1μm至约5μm，最优选约2μm至约3μm的颗粒。可以通过使用包括喷射研磨，喷雾干燥，临界点冷凝等本领域技术人员已知的各种方法产生的抗体组合物蛋白质的制剂，来获得所需的气溶胶粒度。优选的计量吸入器包括由3M或Glaxo制造并使用氢氟烃推进剂的那些。
用于计量吸入器装置的本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)的制剂通常包括细碎粉末，其含有至少一种抗-IL-6抗体作为非水介质中的悬浮液，例如借助表面活性剂悬浮在推进剂中。推进剂可以是用于此目的的任何常规材料，例如氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或烃、包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1,1,1,2-四氟乙烷、HFA-134a(氢氟烷烃-134a)、HFA-227(氢氟烷-227)等。优选地，推进剂是氢氟烃。可以选择表面活性剂以将本文所述的至少一种MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段稳定化为推进剂中的悬浮液，以保护活性剂免于化学降解等。合适的表面活性剂包括脱水山梨醇三油酸酯、大豆卵磷脂、油酸等。在某些情况下，优选使用溶剂如乙醇制备溶液气溶胶。本领域已知的用于制备蛋白质的其它试剂也可以包括在制剂中。
5.4.3口服剂型
在某些实施方案中，本文提供的组合物被配制用于口服给药。在某些实施方案中，对于口服给药，施用至少一种本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的组合物和方法依赖于佐剂的共同给药，例如间苯二酚和非离子表面活性剂如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚，以人工增加肠壁的渗透性，以及共同给药酶抑制剂，例如胰蛋白酶抑制剂，二异丙基氟磷酸盐(DFF)和特斯乐，以抑制酶降解。用于口服给药的固体型剂型的活性构成化合物可以与至少一种添加剂混合，所述添加剂包括蔗糖、乳糖、纤维素、甘露糖醇、海藻糖、棉子糖、麦芽糖醇、葡聚糖、淀粉、琼脂、精氨酸、壳多糖、壳聚糖、果胶、黄蓍胶、阿拉伯树胶、明胶、胶原蛋白、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物和甘油酯。这些剂型还可以含有其它类型的添加剂，例如无活性稀释剂；润滑剂如硬脂酸镁、对羟基苯甲酸酯；防腐剂如山梨酸、抗坏血酸、α-生育酚；抗氧化剂如半胱氨酸；崩解剂；粘合剂；增稠剂；缓冲剂；甜味剂；调味剂；芳香剂等。
在某些实施方案中，用于口服给药的片剂和丸剂可以进一步加工成肠溶衣制剂。在某些实施方案中，用于口服给药的液体制剂包括例如可用于医疗用途的乳剂、糖浆、酏剂、悬浮液和溶液制剂。这些制剂可以含有通常用于所述领域的无活性稀释剂，例如水。脂质体制剂可用于口服给药制剂，例如，如用于胰岛素和肝素所述(美国专利号4,239,754)。此外，混合氨基酸(类蛋白质)的人造聚合物的微球可以用于药物的口服给药，例如，如美国专利号4,925,673所述。此外，载体化合物，例如美国专利号5,879,681和美国专利号5,871,753所述的，被用于口服给药生物活性剂。
5.4.4粘膜剂型
在某些实施方案中，本文提供的组合物被配制用于通过粘膜表面吸收。在某些实施方案中，为了通过粘膜表面进行吸收，施用本文所述至少一种MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)的组合物和方法包括含有多个亚微米颗粒，粘膜粘附性大分子，生物活性肽和水性连续相的乳剂，其通过实现乳剂颗粒的粘膜粘附而促进通过粘膜表面的吸收(美国专利号5,514,670)。适用于本文提供的乳剂的粘膜表面可包括例如角膜、结膜、颊、舌下、鼻、阴道、肺、胃、肠和直肠给药途径。用于阴道或直肠给药的制剂，例如栓剂，可以含有赋形剂，例如聚亚烷基二醇、凡士林、可可脂等。用于鼻内给药的制剂可以是固体的并且含有赋形剂，例如乳糖、或者可以是含水或油性的滴鼻溶液。对于口腔含化给药，赋形剂包括例如糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预凝胶淀粉等(美国专利号5,849,695)。
5.4.5透皮剂型
在某些实施方案中，本文提供的组合物被配制用于透皮给药。在某些实施方案中，为了透皮给药，包含至少一种MUC16糖基化抗体或本文所述的其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)的组合物被包封在递送装置中，例如脂质体或聚合物纳米颗粒，微粒，微胶囊或微球(除非另有说明，否则统称为微粒)。已知多种合适的透皮给药装置，包括由合成聚合物如聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物等多羟基酸、聚原酸酯、聚酐和聚磷腈等合成聚合物，以及天然聚合物如胶原、聚氨基酸、白蛋白和其他蛋白质、藻酸盐和其他多糖、及其组合制成的微粒(美国专利号5,814,599)。
5.4.6试剂盒
本文还提供了包含本文所述的一种或多种抗体或其抗原结合片段或其缀合物的试剂盒。在具体实施方案中，本文提供了药物包装或试剂盒，其包含一个或多个填充有本文所述药物组合物的一种或多种成分的容器，例如本文所述的一种或多种抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，试剂盒含有本文所述的药物组合物和预防或治疗剂。
任选地与这种容器相关联的可以是由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，剂型和/或使用说明书。在某些实施方案中，试剂盒中包含的说明书提供关于用于药物组合物给药的剂量和/或给药方案的指导。
药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶子、小包、小药囊、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器以及适用于选择的药物组合物和期望的给药和治疗方式的任何包装材料。
本文提供的试剂盒可进一步包括用于施用活性成分的装置。这种装置的实例包括但不限于注射器、无针注射器、滴灌袋、贴剂和吸入器。
本文提供的试剂盒可以进一步包括可用于施用成分的药学上可接受的载体。例如，如果成分以固体形式提供，必须重新配制用于肠胃外给药，试剂盒可以包含合适载体的密封容器，其中可以将成分溶解以形成无颗粒的无菌溶液，其适用于肠胃外给药或可以重构为口服给药的悬浮液。药学上可接受的载体的实例包括但不限于：水性载体，包括但不限于注射用水USP、氯化钠注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液以及乳酸林格注射液；水混溶性载体，包括但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；和非水性载体，包括但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
5.5用途和方法
5.5.1治疗用途和方法
在某些实施方案中，本文提供了用于治疗对象的癌症，特别是对象中MUC16阳性癌症的方法，其包括向有需要的对象施用治疗有效量的MUC16糖基化抗体或抗原其结合片段(参见第5.1节和第5.2节)。在具体实施方案中，对象是如第5.5.5节所述的对象。在具体实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段以5.5.3节所述的剂量施用。在具体实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段根据5.5节所述的方法给药。在具体实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段与一种或多种另外的药物活性剂组合施用，如第5.5.4节所述。
为了在特定物种的对象中使用MUC16糖基化抗体或其片段，使用与该特定物种的MUC16结合的MUC16糖基化抗体或其片段。例如，为了治疗人，使用与人MUC16结合的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段是免疫球蛋白。
此外，为了在特定物种的对象中使用MUC16糖基化抗体或其片段，MUC16糖基化抗体，优选MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的恒定区源自该特定物种。例如，为了治疗人，MUC16糖基化抗体或其片段可以包含作为免疫球蛋白的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白包含人恒定区。在具体实施方案中，对象是人。
在具体实施方案中，MUC16-阳性癌症是卵巢癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫(例如，子宫内膜)癌、原发性腹膜癌或表达MUC16受体的任何其他组织的癌症。
在具体实施方案中，治疗可以是实现有益或期望的临床结果，包括但不限于症状的减轻，疾病程度的减小，疾病状态的稳定(即不恶化)，延迟或减缓疾病进展，改善或缓解疾病状态，以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。在具体实施方案中，与不接受治疗的预期生存期相比，“治疗”还可以延长生存期。在一个具体实施方案中，将本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段或本文所述的药物组合物施用于患有癌症的对象(例如，卵巢癌，肺癌，胰腺癌，乳腺癌，输卵管癌，子宫(例如，子宫内膜)癌或原发性腹膜癌，或表达MUC16受体的任何其他组织的癌症)达到以下效果中的至少一种，两种，三种，四种或更多种：(i)减少或改善一种或多种癌症症状的严重程度；(ii)减少与癌症相关的一种或多种症状的持续时间；(iii)预防与癌症相关的症状复发；(iv)对象的住院治疗减少；(v)减少住院时间；(vi)对象生存期增加；(vii)增强或改善另一疗法的治疗效果；(viii)抑制与癌症相关的一种或多种症状的发展或发作；(ix)与癌症相关的症状数量减少；(x)通过本领域熟知的方法评估的生活质量的改善；(x)抑制肿瘤的复发；(xi)肿瘤和/或与之相关的一种或多种症状的消退；(xii)抑制肿瘤和/或与之相关的一种或多种症状的进展；(xiii)肿瘤生长减少；(xiv)肿瘤大小的减小(例如体积或直径)；(xv)新形成的肿瘤的形成减少；(xvi)预防，根除，清除或控制原发性，局部性和/或转移性肿瘤；(xvii)转移的数量或大小减少；(xviii)降低死亡率；(xix)无复发生存率的增加；(xx)维持肿瘤的大小，并且肿瘤的大小不增加或增加的量小于在给予标准治疗之后的肿瘤的增加，所述大小如本领域技术人员可获得的常规方法进行测量，例如磁共振成像(MRI)、动态对比增强MRI(DCE-MRI)、X射线和计算机断层(CT)扫描或正电子发射断层(PET)扫描；和/或(xxi)患者缓解长度增加。治疗可以实现前述的一个或多个。
5.5.2诊断用途
在某些实施方案中，本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)可用于诊断目的以检测，诊断或监测本文所述的病症(例如，涉及MUC16阳性癌细胞的病症)。在某些实施方案中，用于诊断目的的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段如第5.2节所述进行标记。
在某些实施方案中，本文提供了用于检测本文描述的病症的方法，其包括(a)使用一种或多种本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段来测定对象的细胞或组织样品中MUC16或其片段的表达；和(b)将MUC16或其片段的表达水平与对照水平进行比较，例如，在正常组织样品中的水平(例如，来自不具有本文所述病症的对象或来自相同患者的病症发作前)，由此与MUC16或其片段表达的对照水平相比，MUC16的测定水平或其片段表达的增加或减少是本文所述的病症的指标。
本文所述的抗体可用于使用本文所述的或本领域技术人员已知的常规免疫组织学方法来测定生物样品中MUC16或其片段的水平(例如参见Jalkanen等，1985，J.Cell.Biol.101:976-985和Jalkanen等，1987，J.Cell.Biol.105:3087-3096)。用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域已知的，并且包括酶标记，例如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(121In)和锝(99Tc)；发光标签，如鲁米诺；和荧光标记，如荧光素和罗丹明，以及生物素。
在某些实施方案中，通过在初次诊断后一段时间重复诊断的方法来进行本文所述的病症(例如，MUC16阳性癌症)的监测。
可以使用本领域已知的用于体内扫描的方法在对象中检测标记分子的存在。技术人员将能够确定检测特定标签的适当方法。可用于本发明的诊断方法的方法和装置包括但不限于计算机断层扫描(CT)，全身扫描如位置发射断层扫描(PET)，磁共振成像(MRI)和超声检查。
5.5.3剂量和给药方案
本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)或组合物(参见第5.4节)或表达抗体或其抗原结合片段的细胞可以通过各种途径递送给对象。这些包括但不限于胃肠外、鼻内、气管内、口服、皮内、局部、肌肉内、腹膜内、透皮、静脉内、肿瘤内、结膜和皮下途径。也可以使用肺部给药，例如通过使用吸入器或雾化器，以及用作为喷雾剂的雾化剂的制剂。在一个实施方案中，将本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段或组合物肠胃外施用于对象(例如，如第5.5.5节所述的对象)。在一个具体实施方案中，所述肠胃外给药是静脉内，肌内或皮下。
MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段或其在治疗和/或预防病症中有效的组合物的量将取决于疾病的性质，并且可以通过标准临床技术来确定。
在组合物中使用的精确剂量还将取决于施用途径和癌症的类型，并且应根据从业者的判断和每个对象的情况来决定。例如，有效剂量还可以根据给药方式、目标部位、患者的生理状态(包括年龄、体重和健康状况)、患者是人类还是动物、其他药物施用、或治疗是预防性的还是治疗性的来发生变化。治疗剂量被最佳滴定以优化安全性和功效。
在某些实施方案中，使用体外测定来帮助鉴定最佳剂量范围。可以从源自体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线推断有效剂量。
对于MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，剂量可以为约0.0001至100mg/kg的患者体重，更通常为0.01至15mg/kg。例如，剂量可以是1mg/kg体重，10mg/kg体重或1-10mg/kg的范围，或换句话说，针对70kg的患者，分别为70mg或700mg或在70-700mg范围内。通常，由于对外来多肽的免疫应答，人抗体在人体内的半衰期比其他物种的抗体更长。因此，较低剂量的人抗体和较不频繁的施用通常是可能的。
在某些实施方案中，例如在施用表达抗体或其抗原结合片段或CAR的工程细胞时，将对象在约百万至约1000亿个细胞的范围内施用于对象，例如，如100万至500亿细胞(例如约500万细胞、约2500万细胞、约5亿细胞、约10亿细胞、约50亿细胞、约200亿细胞、约300亿细胞、约4百亿细胞或由任意前述两个值定义的范围)，例如约1千万至约1千亿细胞(例如，约2千万细胞、约3千万细胞、约4千万细胞、约6千万细胞、约7千万细胞、约8千万细胞、约9千万细胞、约1百亿细胞、约250亿细胞、约5百亿细胞、约750亿细胞、约9百亿细胞或由任意前述两个值定义的范围)和在一些情况下约1亿细胞至约5百亿细胞(例如，约1.2亿细胞、约2.5亿细胞、约3.5亿细胞、约4.5亿细胞、约6.5亿细胞、约8亿细胞、约9亿细胞、约30亿细胞、约3百亿细胞、约450亿细胞)或这些范围之间的任何值。在一些实施方案中，总细胞的剂量和/或个体的亚群细胞的剂量在约104至约109细胞/千克(kg)体重范围内，例如105至106细胞/kg体重，例如，约1x105细胞/kg、1.5x105细胞/kg、2x105细胞/kg或1x106细胞/kg、2x106细胞/kg、5x106细胞/kg或10x106细胞/kg体重。例如，在一些实施方案中，施用细胞的剂量在误差为约104至约109个T细胞/千克(kg)体重，例如105至107个T细胞/kg体重的某个范围内。
MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段可以多次施用。单剂量之间的间隔可以是1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年或2年。
5.5.4联合治疗
在一个具体实施方案中，本文提供的用于治疗对象的癌症(例如，卵巢癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫(例如子宫内膜)癌或原发性腹膜癌)的方法包括向有需要的对象施用包含本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段的药物组合物(参见第5.1节和第5.2节)，还包括向对象施用一种或多种另外的治疗剂。在一个具体实施方案中，另外的治疗剂用于治疗对象的癌症(例如卵巢癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫(例如子宫内膜)癌和原发性腹膜癌)。在一个具体实施方案中，另外的治疗剂用于治疗用本文所述的MUC16糖基化抗体或抗原结合片段治疗的任何副作用(参见第5.1节和第5.2节)。
在一个实施方案中，施用第一MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其识别MUC16中的表位，所述表位包含N-糖基化的Asn1806但不包含N-糖基化的Asn1800(即，其结合MUC16需要N-糖基化的Asn1806，而非N-糖基化的Asn1800)，并联合第二MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其识别MUC16中的表位，所述表位包含N-糖基化的Asn1806，也包含N-糖基化的Asn1800(即，两个N-糖基化位点均为MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段所识别的表位的一部分)。该第一MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段可通过下述进行鉴定：(i)其免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞的能力，其第一形式的MUC16是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)其不能免疫特异性结合重组表达第三形式的MUC16的细胞，该第三形式是糖基化的，且其中第三形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；和(iii)其免疫特异性结合重组表达第四形式的MUC16的细胞的能力，其第四形式是糖基化的，且其中第四形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:152，其中重组表达第一形式的MUC16的细胞、重组表达第三形式的MUC16的细胞和重组表达第四形式的MUC16的细胞是相同细胞类型。该第二MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段可通过下述进行鉴定：(i)其免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞的能力，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133和(ii)其不能免疫特异性结合重组表达第五形式的MUC16的细胞，其第五形式是糖基化的，且其中第五形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:172，其中重组表达第一形式的MUC16的细胞与重组表达第五形式的MUC16的细胞是相同细胞类型。由SEQ IDNO:172的氨基酸序列编码的蛋白在本文中也称为MUC16c114-N23。MUC16c114-N23由成熟MUC16的C端114个氨基酸残基(SEQ ID NO:150为成熟MUC16的序列)组成，除了氨基酸位点24和30的天冬酰胺(对应于SEQ ID NO:150的氨基酸位点Asn1800和Asn1806)被突变为丙氨酸。从而，MUC16c114-N23不能在SEQ ID NO:172氨基酸位点24和30(对应于SEQ ID NO:150的氨基酸位点Asn1800和Asn1806)被N-糖基化。
在一个实施方案中，施用第一MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段，其识别MUC16中的表位，所述表位包含N-糖基化的Asn1806但不包含N-糖基化的Asn1800(即，其结合MUC16需要N-糖基化的Asn1806，而非N-糖基化的Asn1800)，并联合第二抗体或其抗原结合片段，其识别MUC16中的表位，所述表位包含N-糖基化的Asn1800但不包含N-糖基化的Asn1806(即，其结合MUC16需要N-糖基化的Asn1800、而非N-糖基化的Asn1806)。该第一MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段可通过下述进行鉴定：(i)其免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞的能力，其第一形式的MUC16是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ IDNO:133；(ii)其不能免疫特异性结合重组表达第三形式的MUC16的细胞，该第三形式是糖基化的，且其中第三形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；和(iii)其免疫特异性结合重组表达第四形式的MUC16的细胞的能力，其第四形式是糖基化的，且其中第四形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:152，其中重组表达第一形式的MUC16的细胞、重组表达第三形式的MUC16的细胞和重组表达第四形式的MUC16的细胞是相同细胞类型。该第二抗体或其抗原结合片段可通过下述进行鉴定：(i)其免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞的能力，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)其免疫特异性结合重组表达第三形式的MUC16的细胞的能力，该第三形式是糖基化的，且其中第三形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；和(iii)其不能免疫特异性结合重组表达第四形式的MUC16的细胞，其第四形式是糖基化的，其中第四形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:152，其中重组表达第一形式的MUC16的细胞、重组表达第三形式的MUC16的细胞和重组表达第四形式的MUC16的细胞是相同类型的细胞。
在具体的实施方案中，另外的试剂是用于治疗卵巢癌的试剂。在具体的实施方案中，另外的试剂是用于治疗胰腺癌的试剂。在具体的实施方案中，另外的试剂是用于治疗肺癌的试剂。在具体的实施方案中，另外的试剂是用于治疗乳腺癌的试剂。在具体的实施方案中，另外的试剂是用于治疗输卵管癌的试剂。在具体的实施方案中，另外的试剂是用于治疗子宫(例如，子宫内膜)癌的试剂。在具体的实施方案中，另外的试剂是用于治疗原发性腹膜癌的试剂。
本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)可以同时或顺序(之前和/或之后)与另外的治疗剂一起施用。抗体或其抗原结合片段和另外的治疗剂可以以相同或不同的组合物和相同或不同的施用途径施用。针对患有癌症的对象(例如，卵巢癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫(例如子宫内膜)癌和原发性腹膜癌)，可以在施用第二次治疗(本文所述的MUC16糖基化抗体或抗原结合片段(参见本文所述的第5.1节和第5.2节)或其他治疗剂)之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、同时或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)施用第一疗法(其是本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)或另外的治疗剂)。在某些实施方案中，与本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(见第5.1节和第5.2节)组合给予对象的另外的治疗剂以相同的组合物(药物组合物)给药。在其它实施方案中，与本文所述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)组合施用的另外的治疗剂以与本文描述的MUC16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第Error！Reference source not found.节和第5.2节)不同的组合物对对象施用(例如，使用两种或更多种药物组合物)。
5.5.5患者群
根据本文提供的方法治疗的对象可以是任何哺乳动物，例如啮齿动物、猫、犬、马、牛、猪、猴、灵长类动物或人等。在优选的实施方案中，对象是人。在另一优选实施方案中，对象是犬。如本文所使用的，术语“对象”和“患者”可互换使用。
在某些实施方案中，根据本文提供的方法治疗的对象已被诊断患有MUC16阳性癌症，包括但不限于卵巢癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌或原发性腹膜癌、或表达MUC16的任何其他组织的癌症。
通过说明而非限制的方式提供以下实施例。
6.实施例
6.1实施例1：MUC16/CA125羧末端部分的表达诱导转化和肿瘤侵袭
6.1.1介绍
自20世纪80年代初以来，血清CA125抗原(MUC16的抗原性片段)一直是卵巢癌评估和管理的支柱，但其对卵巢癌表现的生物学和贡献了解甚少(参见参考文献1-3，如下文第6.1.5节所述)。2001年实现的CA125的克隆首先将MUC16鉴定为具有小胞内域、跨膜域、靠近推测的切割位点的胞外域、以及各自为156个氨基酸长的12-20个串联重复的大的重度糖基化区域的拴粘蛋白(图1A)(参见下文第6.1.5节所述的参考文献4-6)。卵巢、输卵管和子宫的浆液性癌症通常表达大量的MUC16，异常的MUC16表达可以在其他几种恶性肿瘤中发现，包括肺癌、胰腺癌和乳腺癌。其他拴粘蛋白的表达是上皮器官的常见特征，并且它们通常在恶性肿瘤中过度表达。两个突出的例子是在许多乳腺和卵巢癌中过度表达的MUC1和在胰腺和胃肠癌中特征性的丰富的MUC4(参见下文第6.1.5节所述的参考文献7)。这两种粘蛋白都被鉴定为具有转化性质(参见下文第6.1.5节所述的参考文献8和9)。转化机制不同，不完全清楚。MUC1具有β-连环蛋白同源性区域，已显示其转位至细胞核并作为转录因子(参见下文第6.1.5节所述的参考文献10和11)。相比之下，MUC4在其跨膜域内具有HER结合域，并且至少部分地通过HER家族激酶起作用(参见下文第6.1.5节中所述的参考文献12和13)。MUC16与这些域中的任一个缺乏同源区，并且似乎已经独立进化(参见下文第6.1.5节所述的参考文献12)。与MUC1和MUC4两者相比，MUC16的表达受到更多的限制，通常几乎专一性地表达于苗勒带(Müllerian tract)和眼上皮(参见下文第6.1.5节所述的参考文献14-16)。MUC16分子的串联重复区似乎作为与间皮素和其他基质蛋白的关键相互作用蛋白起作用(参见下文第6.1.5节所述的参考文献17)。这些相互作用可能是卵巢癌的浆膜传播的经典模式的原因。在临床环境中，来自编码CA125抗原的MUC16的高水平循环元素与不良临床结果相关，与阶段、等级和其他传统临床因素无关(参见如下第6.1.5节所述的参考文献18)。其他人已鉴定得到MUC16的C末端在侵袭和生长中是重要的，但是负责转化的近端MUC16序列的特定区域尚未被描述(参见例如，Therialt等，Gynecol Oncol 2011，121(3):434-443和Giannakouros等Int.J.Oncol.2015，41(1):91-98)。已经在癌症基因组图谱(TCGA)卵巢癌项目中观察到在卵巢癌DNA中编码MUC16的基因组区域的扩增和MUC16 mRNA的过度表达，并且与更差的结果相关(参见如下第6.1.5节所述参考文献19)。小鼠中MUC16的缺失与不同的表型不相关，但持续或异常的MUC16表达的作用是未知的(参见下文第6.1.5节所述的参考文献20)。本实施例中的数据显示MUC16的114个C-末端氨基酸残基(MUC16c114，SEQ ID NO：133)的表达，以及特别的，MUC16c114的残基Asn30(对应于成熟MUC16(SEQ ID NO：NO：150)的Asn1806)的糖基化，与信号转导、基因表达和侵袭性生物学行为的特异性改变相关。
6.1.2材料和方法
6.1.2.1MUC16羧端(MUC16c114)和MUC16-CA125域(MUC16c344)DNA构建体和糖基化的融合蛋白的合成
产生了编码截短形式的MUC16(命名为MUC16c344，MUC16c114，MUC16c80和MUC16c86，图1B和图1C)的DNA构建体。使用phrGFP II-C载体(phrGFP)(Stratagene，LaJolla，CA)的EcoRV和NotI多克隆位点引入MUC16c114，MUC16c80、MUC16c86和MUC16c344DNA以产生GFP融合构建体，其中在截短的MUC16融合蛋白羧端上存在GFP蛋白。使用pBK-CMV-MUC16-B53DNA作为模板产生MUC16片段(MUC16c344，MUC16c114，MUC16c80和MUC16c86)的PCR产物(Yin BWT等人，2002，98(5):737-740)，PCR产物在1％琼脂糖凝胶中纯化，测序，并插入到phrGFP II-C载体(phrGFP)的EcoRV和NotI多克隆位点。pFUSE-hIgG1-Fc2载体购自InvivoGen(San Diego，CA)。针对胞外域MUC16c57-114(SEQ ID NO：150的位点1777至1834)设计聚合酶链反应(PCR)引物，或合成117-244LGALS3DNA序列的糖结合域(Sigma-Genosys，The Woodlands，TX)，使用限制性内切酶位点EcoRV作为正向引物，限制性内切酶位点NcoI作为反向引物。使用pBK-CMV-MUC16-B53DNA作为模板产生MUC16c57-114片段的PCR产物，使用来自ATCC(Manassas，VA)的LGALS3cDNA克隆(MGC:2058 IMAGE:3050135GenBank：AAH01120.1；DBSource登录号BC001120.2)作为DNA模板合成LGALS3PCR产物的糖结合域。PCR产物在1％琼脂糖凝胶中纯化，测序，并插入pFUSE-hIgG1-Fc2载体中。
6.1.2.2引物和PCR
MUC16-胞浆区(MUC16c114，羧端114aa)正向和反向引物(5’-CCATGCGATATCGCCACCATGGTGAACTTCTCGCCACTGGCT-3’和5’-TACGGCGGCCGCTTGCAGATCCTCCAGGTCTAGG-3’，SEQ ID NO:121和SEQ ID NO:122)。MUC16c344(一个仅具有一个半胱氨酸环的串联重复，344aa)(5’-CCATGCGATATCGCCACCATGGTGACAGGCCCTGGGCTGGACAG A-3’和5’-TACGGCGGCCGCTTGCAGATCCTCCAGGTCTAGG-3’，SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:124)在正向引物中具有EcoRV和KOZAK，在反向引物中具有NotI。使用MUC16c114–GFP DNA构建体通过快变(quick change)引物产生MUC16c80和MUC16c86构建体。MUC16c57-114pFUSE-hIgG1-Fc2载体的正向和反向引物(5'-CCATGCGATATCAAACTTCTCGCCACTGGCT-3’和5’-AGATCTAACCATGGGAAGGTCAGAATTCCCAGT-3’，SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126)，pFUSE-hIgG1-Fc2载体117-244LGALS3的糖结合域的正向和反向引物(5’-CATGCGATATCACCTTATAACCTGCCTTTG-3’和5’-AGATCTAACCATGGTATATGAAGCACTGGT-3’，SEQID NO:127和SEQ ID NO:128)，在正向引物中具有EcoRV，在反向引物中具有NcoI。所有上述引物由Sigma Genosys，The Woodlands，TX合成。
通过以下方法实现PCR条件：将DNA在95℃下解链5分钟以实现变性。进行30个重复循环的97℃加热30秒、60℃退火1分钟、72℃延伸1分钟。随后将生成的PCR产物链在72℃延伸5分钟，然后在4℃下冷却过夜。
phrGFP II-C载体DNA，MUC16c114、MUC16c80、MUC16c86、MUC16c344和MUC16c678凝胶纯化的DNA用EcoRV和NotI(New England Biolabs，Beverly，MA)限制性内切酶在37℃水浴中分别消化过夜。pFUSE-hIgG1-Fc2载体DNA，MUC16c57-114和117-244GALS3凝胶纯化的DNA用EcoRV和NcoI(New England Biolabs，Beverly，MA)限制性内切酶在37℃的水浴中分别消化过夜。对MUC16c114和phrGFP，MUC16c344和phrGFP或MUC16c678和phrGFP限制性消化的DNA进行凝胶纯化，并使用T4连接酶(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)连接过夜。类似地，对MUC16c57-114和pFUSE-hIgG1-Fc2，117-244LGALS3和pFUSE-hIgG1-Fc2限制性消化的DNA进行凝胶纯化，并使用T4连接酶(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)连接过夜。根据制造商的方案将连接的DNA转化到XL-1Blue超感受态细胞(Stratagene，LaJolla，CA)中，并将它们铺在含有卡那霉素(50μg/mL，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的LB培养基的琼脂平板上(对于phrGFP载体)或含有25μg/ml Zeocin(Invitrogen，CA)的LB培养基的琼脂平板上。在第二天选择克隆，并使用Wizard Plus Miniprep DNA纯化系统(Promega Corporation，Madison，WI)提取Miniprep DNA。对选择的克隆DNA在MSKCC DNA测序核心实验室上使用MUC16和phrGFP的正向和反向引物进行测序，以证实序列中存在MUC16和phrGFP作为融合构建体或MUC16c57-114和pFUSE-hIgG1-Fc2或117-244LGALS3和pFUSE-hIgG1-Fc2。通过使用Wizard Plus Megaprep DNA纯化系统(Promega Corporation，Madison，WI)制备来自该克隆的Megaprep DNA，其也被证实在其序列中存在MUC16和phrGFP或MUC16c57 -114和pFUSE-hIgG1-Fc2或117-244LGALS3和pFUSE-hIgG1-Fc2作为融合构建体。
6.1.2.3荧光活化细胞分选(FACS)
将转染的细胞进行胰蛋白酶消化，洗涤并通过血细胞计数器计数。将细胞分散在多个eppendorf管中，至少0.5-1×106/管。用含有1％FCS和0.025％叠氮化钠(FACS缓冲液)的PBS洗涤细胞。对于表面FACS染色，将细胞在不含(用于第二抗体对照)或含有1μg/管的MUC16-羧基末端单克隆(4H11.2.5)的生物反应性上清液、小鼠抗人OC125(M3519)(DakoCytomation，Dako North A-merica Inc.，Carpinteria，CA)中在冰上孵育30分钟。eppendorf管中的细胞还用1μg/管的非特异性同种型匹配的对照小鼠抗体(IgG1为13C4，IgG2b单克隆为4E11，从MSKCC单克隆核心实验室获得)进行表面染色(数据未显示)，并在冰上孵育30分钟。所有细胞用FACS缓冲液洗涤3次。将细胞与1μg/管的第二抗体山羊抗小鼠IgG1-PE或IgG2b-PE在冰上孵育30分钟，然后用FACS缓冲液洗涤3次。细胞用FACS Calibur分析。
6.1.2.4细胞培养
从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)获得NIH/3T3(3T3)细胞(成纤维细胞)，A2780细胞是人卵巢癌细胞系(参见下文第6.1.5节中所述的参考文献28)。根据公布的条件维持两种细胞系。通过转染MUC16表达载体(phrGFP-MUC16c344、phrGFP-MUC16c114、phrGFP-MUC16c80和phrGFP-MUC16c86)并在其各自培养物中使用遗传霉素(G418，Invitrogen，Grand Island，NY)进行选择，并基于绿色荧光蛋白(GFP)的表达进行分离，产生稳定的MUC16阳性细胞系。MUC16c114转染子具有从推定的切割位点到羧基末端(SEQ IDNO：150的氨基酸1777至1890)的MUC16蛋白的细胞表面表达(参见下文第6.1.5节中所述的参考文献5)。以类似的方式制备具有较长MUC16片段的细胞系，包括具有MUC16c344-GFP载体表达的细胞系，其具有作为延伸至MUC16羧基端的344个氨基酸片段(氨基酸1547至1890)的MUC16蛋白的细胞表面表达(参见下文第6.1.5节所述的参考文献5)。
6.1.2.5转染
使用制造商的方案，使用DOTAP(Roche Diagnostics，Indianapolis Corporation，IN)将所有构建体引入NIH/3T3(3T3)和A2780细胞。在各自的培养基中用400μg/mL的G418选择3T3和A2780细胞的稳定转染子。在MSKCC流式细胞计数核心实验室(FCCF)上对细胞进行两次GFP表达的细胞分选，选择的细胞作为细胞系生长至多达15代。通过FACS分析进行常规监测，以确认这些细胞系的GFP阳性。使用抗hrGFP(Stratagene，La Jolla，CA)和抗-MUC16-羧基末端单克隆抗体通过Western印迹分析这些细胞系的蛋白质提取物(参见下文第6.1.5节中所述的参考文献5和14)。
6.1.2.6生长曲线
将1000稳定转染的细胞/孔接种在200μL培养基/孔中的多个96孔平底板中，并在37℃和5％CO2下孵育5天。每天用25μL/孔的Alamar Blue(ABD Serotec Co.UK)发展三个平行的培养板，并在37℃和5％CO2下孵育4小时。在PerSeptive Biosystems CytoFluorMultiwell荧光板读数器型号#4000上读取板，530nM激发和620nM发射。记录4天以上的生长曲线，并相应地绘制三个平行平板的平均值。
6.1.2.7软琼脂分析
将稳定转染的细胞置于琼脂糖悬浮液中并铺在薄的琼脂糖层上，并分析其形成不依赖贴壁的集落的能力。每块板铺10mL培养基-琼脂糖悬浮液1-5百万个细胞，并在37℃和5％CO2下孵育。监测板上的集落形成。每4-5天覆盖额外的培养基。培养11-14天后，计算了集落数并对集落进行拍照。
6.1.2.8转染至真核表达载体
分别将MUC16c57-114-pFUSE-hIgG1-Fc2和117-244LGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2构建体转染到人胚胎肾(HEK)FreeStyle293F细胞(Invitrogen，CA)中，其表达并分泌融合蛋白到血清培养基中。用5μg/道的来自携带pFUSE-hIgG1-Fc2对照空载体、MUC16c57-114-pFUSE-hIgG1-Fc2载体和LGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2载体的瞬时转染的HEK 293F细胞的融合蛋白上清液进行3个10％SDS-PAGE凝胶。根据制造商的方案，一个凝胶用Gelcode试剂直接染色。将来自两个凝胶的蛋白质转移到两个硝酸纤维素膜上，所述两个硝酸纤维素膜在室温下的振荡器上用含有0.1％Tween-20(PBST)的5％无脂奶-磷酸盐缓冲盐水封闭1小时。用5％无脂奶PBST中以1:5000稀释的抗人IgG1-Fc-HRP(γ1链特异性)(Southern Biotech Inc.，CA)、5％无脂奶PBST中以1:2000稀释的4H11-HRP mAb(参见下文第6.1.5节所述的参考文献14)和5％无脂奶PBST中以1：200稀释的抗人GAL3mAb(Santa Cruz Biotechnology，CA)在振荡器上4℃标记(probe)膜过夜。将GAL3膜用PBST洗涤三次，并用抗小鼠IgG-HRP第二抗体以1:3,000稀释度在5％的无脂奶PBST中室温下振荡器上标记1小时。膜用PBST洗涤三次，然后用ECL试剂(Perkin El-mer，NY)化学发光底物处理5分钟，并将照射的信号捕获在X射线胶片上。
6.1.2.9侵袭
在基质胶侵袭室(BD Biosciences，Bedford，MA)中测定基底膜侵袭。在48孔时测量三个平行孔中的基质胶迁移，与phrGFP载体对照进行比较，并表达为％phrGFP对照基质胶侵袭。测定了0.1μg/mL的衣霉素(Sigma-Aldrich，St.Louis MO cat#T7765)或5μg/mL的MUC16c57-c114-pFUSE-hIgG1-Fc2或5μg/mL的117-244LGALS3 pFUSE-hIgG1-Fc2融合蛋白处理的稳定细胞系的48小时后基质胶迁移并表达为％phrGFP对照基质胶侵袭。
BD BioCoatTMMatrigelTM侵袭插入物或室(24孔板中的目录#354480)和对照插入物(24孔板中的目录#354578)购自BD Biosciences，MA。按照制造商的方案进行基质胶侵袭测定。简言之，将24孔板(储存在-20℃)和对照插入物(储存在4℃)中的基质胶体室进入室温。将两种插入物用插入物以及24孔板的外孔中的0.5mL无血清培养基在37℃5％CO2加湿培养箱中再水合2小时。将培养的3T3或A2780细胞进行胰蛋白酶化，并用培养基洗涤。将一百万个细胞分离至另一离心管中并用无血清培养基洗涤3次。随后调节这些细胞，以在0.5mL无血清培养基中得到10,000个细胞。除去再水合的插入物中的培养基，并将插入物转移到含有0.75mL含10％胎牛血清(FBS)的培养基的新24孔板中，该培养基用作化学引诱剂。立即将0.5mL无血清培养基中的细胞(10,000个细胞)加入到插入物中。适当注意插入物和外孔中没有困住气泡。将24孔板在37℃5％CO2加湿培养箱中孵育48小时。孵育后，通过将棉花尖棉签插入基质胶或对照插入物中并轻轻地施加压力，同时将棉签的尖端移动到膜表面上，通过“擦洗”从膜的上表面去除非侵袭细胞。用浸有培养基的第二个棉签重复擦洗过程。然后将插入物在含有0.5％结晶紫染色剂的0.5mL蒸馏水中的新24孔板中染色30分钟。染色后，将插入物在3个蒸馏水烧瓶中冲洗以除去多余的染色剂。在新的24孔板中将插入物风干。在倒置显微镜下以200倍放大倍率手工计数侵袭细胞。计数三个平行膜的几个领域，并记录在图中。
6.1.2.10实时聚合酶链反应
通过遵循RiboPure试剂盒(Ambion，Austin，TX)方案制备RNA分离物。如前所述(参见下文第6.1.5节所述的参考文献29)，使用RT2 Profiler PCR Array系统(Super Array，Frederick，MD)进行一组转移和胞外区域(extracellular domain)基质蛋白基因的RTPCR。
6.1.2.11无胸腺裸鼠中的肿瘤生长
将转染的细胞系和适当的对照细胞系引入无胸腺裸鼠的侧腹或腹膜腔，并且由MSKCC抗肿瘤评估核心实验室提供常规动物护理。对于肿瘤生长评估实验，将来自每个肿瘤细胞系的2百万个细胞分别植入5-15个无胸腺裸鼠中。每周进行两次肿瘤测量，根据MSKCC RARC指南，肿瘤生长记录为最大尺寸1500mm3。
6.1.2.12 Western印迹分析
将稳定的细胞系在其各自培养基中的10cm培养皿中培养，并在37℃和5％CO2下孵育3天。然后将它们用冰冷的PBS洗涤两次，并用1-2mL冰冷的PBS刮洗并离心。将沉淀的细胞用0.2mL改良的Ripa裂解缓冲液(20mM Tris-HCL，pH 7.4；150mM NaCl；1％NP-40；1mMNa3VO4；1mM PMSF；1mM DTT；具有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(来自Roche Diagnostics，IN的cat#11836170001))在冰上裂解30分钟，并在4℃离心10分钟。使用Bio-Rad蛋白测定(BioRaD Laboratories，Hercules，CA)测量上清液的蛋白浓度。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离等量的蛋白，并在4℃下使用BioRad转移装置转移到PVDF膜。用3％牛血清白蛋白(BSA)或5％非脂乳在含有0.1％Tween-20(PBST)的PBS中4℃将膜封闭过夜。用多种一抗(Cell Signaling，MA：Akt cat#9272，Phospho-Akt(Ser473)(193H12)cat#4058，p44/43MAPK(Erk1/2)cat#9102，Phospho-p44/43MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)cat#9101)，(Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，MO：β-肌动蛋白cat#A5441)，(Southern BioTech，Birmingham，AL：抗人-Fc-IgG1-HRP cat#9054-05和Abgent，San Diego，CA：多克隆LGALS3抗体cat#AP11938b)在4℃使膜显影过夜。将膜用PBST洗涤三次，并用HRP缀合的抗小鼠或抗兔抗体(GE Healthcare，UK)(1:5000稀释)在室温下显影1小时。然后将膜用PBS-T洗涤三次，并在室温下用Western Lightning Chemiluminescence试剂(ECL，Perkin El-mer)显影1-5分钟，并将信号在HyBlot CL膜(Denville Scientific Inc.Metuchen，NJ)上显影。
6.1.2.13 MUC16的TCGA表达分析
作为TCGA项目(tcga.cancer.gov)的一部分，可获得316个浆液性卵巢癌样品的综合基因组数据。基因水平的DNA拷贝数呼叫(calls)是使用GISTIC从CBS分段的Agilent 1M微阵列数据得到的。使用三种不同的平台(Agilent 244K全基因组表达阵列，Affymetrix HT-HG-U133A和Affymetrix Exon 1.0阵列)测量MUC16 mRNA表达，并且如先前所述导出基因表达值(参见如下文第6.1.5节的参考文献30)。确定了MUC16的体细胞突变，全部外显子组捕获，然后进行下一代测序(SOLiD或Illumina)。所有TCGA数据均从cBio癌症基因组学门户网站(www.cbioportal.org)下载。然后将mRNA表达值与相应的DNA拷贝数类别(纯合缺失、半合子缺失、二倍体、增益、高水平扩增)进行关联，并将体细胞突变覆盖所有样品，并使用统计框架R(www.R-project.org)绘制箱形图，如前所述(参见下文第6.1.5节所述的参考文献31)。临床数据来自TCGA数据门户(tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)。
6.1.2.14 MUC16c354转基因小鼠
使用载体phrGFP II-C(Stratagene，La Jolla，CA)制备条件羧基末端354氨基酸(MUC16c354)转基因构建体，并用来自载体pCAG-CreERT2(Addgene，Cambridge，MA)的CAG启动子替代CMV启动子。通过PCR从Yin BW等人制备的构建体B53扩增MUC16c354片段(参见下文第6.1.5节中所述的参考文献5和6)。MUC16c354条件构建体包含以下单元：pCAG，5’loxP，hrGFP，BGHpA，3’loxP，MUC16c354，HA和SV40pA。
使用上述MUC16c354条件转基因构建体，MSKCC小鼠遗传学核心实验室在B6CBAF1/J小鼠上进行显微注射程序。通过Southern印迹从99只小鼠中鉴定出12只MUC16c354条件转基因小鼠。所有12只前-建立者(pro-founder)均与B6.FVB-Tg(EIIa-cre)C5379Lmgd/J小鼠(TheJackson Laboratory，Bar Harbor，MI)交配，以除去位于两个loxP之间的hrGFP。解剖每个建立者的MUC16c354PCR阳性雌性小鼠。将来自这些解剖的小鼠的器官(脑，结肠，心脏，肾脏，肝脏，肺，卵巢和脾脏)切碎并匀浆化。通过Western印迹分析蛋白样品，以鉴定高表达MUC16c354的建立者。将得到的转基因小鼠保持在混合背景上。
将转基因MUC16c354小鼠的两只建立者与p53杂合小鼠(B6.129S2-Trp53tm1Tyj/J)(TheJackson Laboratory，Bar Harbor，MI)杂交以产生双转基因MUC16c354:p53+/-。将得到的转基因小鼠保持在混合背景上。使用提取的脚趾或尾DNA通过PCR对所有小鼠进行基因分型。所有实验动物均按照MSKCC制度化动物保护和使用委员会和研究动物资源中心(MSKCCInstitutional Animal Care and Use Committee and Research Animal ResourceCenter)以及NIH“实验动物护理和使用指南”批准的指南进行维护。
6.1.2.15组织学分析
处死12个月龄的小鼠并进行尸检。经肉眼检查，将解剖组织样品在10％中性缓冲福尔马林中固定24小时，然后在醇和二甲苯中处理，包埋在石蜡中，切片厚度5μm，用苏木精和伊红(H&E)染色。组织由兽医病理学家(SM)检查，根据公布的啮齿动物病理学命名指南诊断肿瘤和非肿瘤性病变。
6.1.2.16统计分析
使用学生双侧配对t检验比较体外生长、侵袭和软琼脂生长潜力的研究组。根据提供的软件(SuperArray)，使用卡方检验分析RT-PCR数据的显著性。使用每个动物随着时间的总肿瘤体积曲线下面积评估进行肿瘤体积的比较。基于两组中所有动物均存活的最后一天进行肿瘤体积评估。使用级别的无参数检验(Wilcoxon双样本测试)来测试组之间的分布差异。在动物生存研究中，进行时间对事件的分析，事件定义为肿瘤体积超过1,500mm3或溃烂的时间。对肿瘤体积小于1,500mm3的动物跟踪多达60天，然后进行检查。使用Kaplan-Meier方法估计存活分布(参见下文第6.1.5节所述的参考文献32)。
6.1.3结果
在MUC16蛋白的串联重复区的明显切割和释放之后，蛋白质的羧基末端的大约114个氨基酸(c114)被认为保留在细胞表面上，并且该分子部分的潜在功能是未知的。分析了MUC16蛋白最接近部分在3T3成纤维细胞和卵巢癌细胞系恶性转化和行为中的作用。为了测试接近切割位点的残留c114氨基酸元件的作用，设计了两个载体：(1)MUC16c114-GFP载体，和(2)截短的MUC16c344-GFP载体(图1)和这些载体和phrGFP对照载体，独立转染入3T3成纤维细胞。选择表达MUC16c114-和MUC16c344的细胞系，并用G418维持，使用识别MUC16羧基末端的独特氨基酸序列的单克隆抗体通过FACS分析证实MUC16c114和MUC16c344的稳定表达(参见下文6.1.5节引用的参考文献14)。表达来自MUC16(SEQ ID NO:132)蛋白的344个氨基酸的细胞系(MUC16c344-GFP细胞系)具有典型的CA125表位，其通过FACS分析在细胞表面上被OC125抗体识别，CA125被释放到细胞培养上清液中。OC125不识别MUC16c114-GFP细胞。然而，所有转染的细胞系都是MUC16c114胞外序列(SEQ ID NO：133)细胞表面阳性的，所述序列靠近推测的切割位点并被MUC16胞外域特异性4H11抗体识别(参见下文6.1.5节引用的参考文献14，图1)。
6.1.3.1 3T3细胞
为了研究由MUC16的残留的切割后元件赋予的转化特性，分析了3T3MUC16c114-GFP和3T3MUC16c344-GFP细胞系的特征，并将这两个最小的MUC16元件的效果与载体对照进行比较。MUC16序列的最接近的114个氨基酸(MUC16c114)或近端344个氨基酸(MUC16c344)的表达对于任何转染细胞系的体外生长速率相对于亲本细胞系图2A的表达而言没有显著影响。然而，MUC16蛋白相同元件的表达在软琼脂克隆中显著改变了3T3的贴壁依赖性生长。与仅载体对照相比，最小c114片段和c344片段都显著增加了软琼脂菌落的数量(图3A)。与用phrGFP载体对照转染的3T3细胞相比，MUC16蛋白表达的近端部分还增强了经典基质胶侵袭测定中的MUC16+3T3细胞迁移(p<0.0001)(图3B)。在检测表达各种MUC16蛋白片段的3T3细胞表达所选择的转移和侵袭基因转录物时，存在多种侵袭基因上调，包括趋化因子配体12(CXCL12)、钙粘蛋白11(CDH11)和基质金属蛋白酶MMP2和MMP9(图3C)。包括纤连蛋白(FN1)和神经纤维蛋白(NF2)在内的其他转录物一直在减少。MUC16可能以类似于MUC1和MUC4的作用的方式通过规范信号通路起作用，因为MUC16改变体内肿瘤生长并增加携带MUC16蛋白的细胞的侵袭性质。之前已经将相互作用的ERK和AKT途径鉴定为卵巢癌和肿瘤细胞侵袭调节因子中的重要信号机制(参见下文第6.1.5节所述的参考文献21和22)。如图3D所示，存在由pAKT(S473)和pERK(T202/Y204)的增加证明的两种途径的活化。
致癌转化的最明确的标志是促进免疫缺陷小鼠生长的能力。为了测量MUC16对肿瘤生长速度的影响，采用侧腹部肿瘤模型来促进常规肿瘤测量。如图3E所示，当将表达MUC16的3T3细胞系(载体phrGFP、MUC16c114-GFP和MUC16c344-GFP)植入无胸腺裸鼠的侧腹时，与仅载体对照相比，MUC16c114-GFP和MUC16c344-GFP都在4周时形成更大的肿瘤。表达MUC16c114-GFP和MUC16c344-GFP蛋白的细胞系(图3E)之间没有统计学差异，表明MUC16表达的致癌作用与分子的最近端部分相关。在肿瘤的整个生长期间都观察到该肿瘤生长速度的增加，并且与高水平的MUC16表达(作为血清CA125)和较差的存活率之间的临床联系一致(参见下文第6.1.5节所述的参考文献18)。
6.1.3.2 A2780人卵巢癌细胞
虽然3T3细胞中MUC16蛋白的表达与转化的标志明显相关，但是当培养时，一些完全转化的卵巢癌细胞系缺乏MUC16表达。为了探索MUC16对人卵巢癌细胞行为的贡献，用MUC16c114-GFP或MUC16c344-GFP转染A2780细胞(不表达MUC16的人卵巢癌细胞系)。通过G418选择表达MUC16的细胞，并进行FACS用于MUC16和GFP表达。由于这些细胞在没有MUC16表达的情况下在软琼脂中生长良好，因此分析了MUC16c344和MUC16c114对基质胶侵袭的影响。如图4A所示，MUC16c344和MUC16c114表达明显促进了A2780细胞中的基质胶侵袭。同样，MUC16c344和MUC16c114对ERK和AKT途径的激活的作用与3T3细胞中的相似，增加pAKT(S473)和pERK(T202/Y204)的基础水平(图4B)。因此，即使在恶性卵巢细胞系中，MUC16羧基末端元件的表达增加也与增加的侵袭和癌基因激活有关。此外，分析了MUC16c114和MUC16c344转染的A2780系的体内肿瘤生长(图4C)。在两种背景下，MUC16c114细胞系和MUC16c344细胞系比仅载体对照生长更快。在这种人癌症模型中，载体对照确实以足够的速度生长，最终杀死动物。
6.1.3.3糖基化研究
为了确定负责转化的MUC16c114的特定部分，构建了两个另外的MUC16片段：(1)MUC16c80，其中缺失了来自MUC16c114的胞外域的34个氨基酸序列(如原始出版中编号的1798至1831位)(图1D；SEQ ID NO：135)(参见下文第6.1.5节所述的参考文献5)；(2)MUC16c86，其中MUC16c114构建体保留了MUC16的整个胞外域，但从细胞质域的推定的Ezrin域，潜在的酪氨酸磷酸化位点和SH2域(位点1857到1884)去除了28个氨基酸的序列(图1D；SEQ ID NO：134)。将这些构建体引入3T3细胞中，并通过FACS选择剩余的MUC16c80和MUCc86序列的细胞表面表达。然后检查这两个额外的细胞群体MUC16c80和MUCc86的依赖性变化。MUC16c86构建体(具有完整的胞外域的构建体)与MUC16c80构建体(具有完整的胞质域的构建体)(图5A)相比，保留了更大的软琼脂集落形成能力。基质胶侵袭的能力也是如此(图5B)。表达MUC16c80的3T3细胞具有与phrGFP载体对照组无统计学差异的侵袭率。相比之下，表达MUC16c86的3T3细胞保留了更为侵袭性的表型，与完整的MUC16c114和MUC16c344细胞相似。当检测AKT和ERK途径的激活时，结果与软琼脂菌落和基质胶侵袭研究一致(图5C)。MUC16c80片段(没有全部的完整胞外域)的表达没有激活ERK和AKT，与phrGFP载体对照相似；相比之下，表达MUC16c86(具有完整的胞外域)的3T3细胞与表达完整MUC16c114的3T3细胞在激活ERK和AKT方面相似。最后，在异种移植肿瘤模型中证实了完整胞外域的重要性。
与MUC16c114对照相比，完整MUC16胞外域的丧失(3T3MUC16c80)导致MUC16c114依赖性3T3生长增强的丧失，而表达MUC16c86的3T3细胞具有适度的生长延迟，但与表达MUC16c114的3T3细胞具有相似的总效果(图5D)。因此，MUC16c114片段的细胞外部分负责MUC16在3T3细胞中的转化效应。为了进一步研究MUC16c114胞外片段的作用，使用一组MUC16靶向抗体用表达MUC16c114的3T3细胞进行共沉淀研究(参见下文第6.1.5节所述的参考文献14)。通过银染法鉴定没有共同沉淀的单条带，EGFR、整合素和HER3的特异性Western印迹为阴性。然而，MUC16c114序列的分析表明，胞外域中的三个潜在的N-糖基化位点(Asn1777、Asn1800和Asn1806(图6，SEQ ID NO：132和SEQ ID NO：133))可能起作用。分析了这些N-糖基化位点的作用。使用位点特异性点突变，将所有三个天冬酰胺改为丙氨酸。将该修饰的MUC16c114构建体(命名为MUC16c114-N123)导入3T3细胞，通过FACS和4H11胞外域抗体分离表达MUC16c114-N123的细胞。如图7A所示，这些天冬酰胺向丙氨酸的突变完全消除了对3T3细胞中亲本MUC16c114表达载体观察到的MUC16c114诱导的基质胶侵袭增强。为了证实N-糖基化的作用，用糖基化抑制剂衣霉素(0.1μg/mL)处理3T3细胞，并注意到基质胶侵袭的显著降低。还测试了两种合成蛋白抑制剂，以进一步探索MUC16c114胞外序列的作用。将MUC16外部序列(如下文第6.1.5节所述的参考文献5中所编号的位点1777至1834)连接到人Fc骨架pFUSE(MUC16c57- c114pFUSE)上以提供“虚拟”受体。将该构建体与MUC16c114侵袭和pFUSE载体对照进行比较。如图7B所示，“虚拟”受体构建体降低了MUC16c114表达载体对基质胶侵袭的总体作用(图7)。推测凝集素与糖基化的MUC16c114蛋白的作用相关，将LGALS3的糖结合域(氨基酸117至244；图7和图8)(参见6.1.5节引用的参考文献23)连接到相同pFUSE骨架(117-244LGALS3pFUSE)构建了第二抑制剂。与衣霉素相同，这两种蛋白质抑制剂都会干扰MUC16c114与其他细胞表面蛋白质的相互作用，而单独的pFUSE载体没有作用(图7B)。与其他干预相同，当去除N-糖基化位点时，对pAKT表达和pERK的作用减少，其平行于基质胶侵袭的丧失，如图7C所示。然而，MUC16c114-N123构建体具有高水平的MUC16c114-N123蛋白的表达，如4H11(MUC16胞外域特异性)结合所证明的。在nu/nu小鼠中转染的3T3细胞的生长减少同样证实了N-糖基化损失的影响，如图7D所示。
6.1.3.4转基因小鼠
研究了羧基末端MUC16元件在转基因小鼠中表达的作用和自发肿瘤形成速率。产生了表达MUC16c354(完整的c114序列和最近的携带CA125的串联重复)的条件转基因小鼠。使用CMV早期增强子加鸡β肌动蛋白启动子(CAG)来强制所有鼠组织中的大量MUC16c354表达。选择这种策略是因为人类卵巢的生理学与鼠生殖系统非常不同，组织特异性卵巢启动子在转基因系统中一直很弱，相对难于使用。这些小鼠的策略如图9A所示。
通过Southern印迹法选择条件转基因动物，如图9B所示，并与EIIa-Cre小鼠交叉产生MUC16c354转基因建立者(founder)。如图9C所示，选择了两个建立者，并产生了MUC16c354转基因小鼠的集落(colony)。两个建立者在许多器官中高度表达MUC16c354，例如脑，结肠，心脏，肾脏，肝脏，肺，卵巢和脾脏。这些小鼠对MUC16c354的广泛异位表达没有影响，具有正常雄性:雌性后代比例，正常生育率和表观正常寿命，超过2年。对来自对照群体的两只表观健康的动物(一只雄性和一只雌性)和MUC16c354转基因小鼠在3个月间隔至1年进行尸检仅在较老的雌性小鼠的轻度/中度子宫内膜增生中显著，但发病率和严重程度与野生型对照无显著性差异。选定的组织如图10所示。在超过100只动物观察2年或以上的集落中，仅观察到一个自发的软组织肿瘤(肉瘤)。
基于该结果，我们猜测潜在地需要“第二次命中(second hit)”。值得注意的是，BRCA1突变的鼠模型也需要第二次命中，p53的缺失显著增加了肿瘤的发生频率。将MUC16c354小鼠与The Jackson Laboratory的p53+/-小鼠杂交。早期效果有限。然而，大约6个月后，具有p53+/-的MUC16c354小鼠以比正常对照动物高的速度开始发展软组织和淋巴瘤的自发性肉瘤样肿瘤。选定的肿瘤显示在图9D的面板插图中。这些小鼠的Kaplan-Meier存活率示于图9E。MUC16c354：p53+/-小鼠由于自发性肿瘤发展而显示出显著差的总生存期(p<0.014)。每组观察到的肿瘤总数为：p53+/-小鼠，20/107只小鼠；MUC16c354和p53+/-小鼠，34/91只小鼠；MUC16c354小鼠，1/72只小鼠；野生型小鼠，0/91只小鼠。当检测8个收集的肿瘤的p53基因组测序时，所有自发性肿瘤均缺失了p53正常等位基因，表明MUC16依赖性肿瘤发生也需要丧失正常的p53功能。
6.1.3.5卵巢TCGA
基于在实验模型中的MUC16片段的转化和肿瘤侵袭性，检查了MUC16的遗传改变与卵巢癌的结果之间的联系。TCGA卵巢癌项目是一项经过充分研究的收集，包含316例浆液性卵巢癌，具有完整数据，包括临床结果数据。由于MUC16蛋白表达是癌症行为的重要推动因素，分析了MUC16拷贝数对MUC16 mRNA表达的影响。MUC16转录本表达通常与MUC16基因拷贝数相关，尽管在所有检查组中MUC16转录本表达存在广泛的变化(当然，MUC16的稀有纯合缺失除外)。在大多数情况下，MUC16mRNA表达聚集在比包括作为对照的正常输卵管样品更高的转录本数量。基因拷贝数是可能改变MUC16蛋白表达的几个变量之一，但很明显，浆液性卵巢癌中MUC16 mRNA表达(当然也是MUC16蛋白)通常增加。还研究了MUC16过表达或突变对TCGA数据集中临床结果的综合影响。当TCGA数据集分为MUC16表达五分位数时，20％的MUC16表达最高的患者的生存期明显低于MUC16表达较低的患者(p＝0.02969)。如图11A所示，当MUC16突变的18例患者被包括在高MUC16表达组(p＝0.02117)时，这一关系进一步加强。总之，这一分析表明MUC16表达对卵巢癌患者的生存有不利影响，并证实了我们临床前模型中鉴定的MUC16表达的负面生物学效应。
卵巢癌常常表现出PI3K途径的激活。这些激活主要通过扩增和过表达而不是点突变事件发生，因为卵巢癌通常以拷贝数的改变为特征。基于PI3K/AKT通路在我们的细胞系模型中的激活，检测了MUC16与PI3K通路中其他激活基因改变的关系。如图11B所示，与MUC16相关的过表达和突变事件通常与其他途径事件互补(如PTEN缺失，AKT1、AKT2或PI3KCA的扩增)。这种MUC16驱动的AKT激活的机制仍然是未知的。此外，检查了ERK激活的作用，但没有确定MUC16表达和ERK通路突变之间的联系。
6.1.4讨论
编码CA125抗原的MUC16在许多卵巢癌患者的血浆中循环(参见下文第6.1.5节所述的参考文献1)。MUC16因其在苗勒组织之外的有限表达在拴粘蛋白中是独一无二的(参见下文第6.1.5节中所述的参考文献2和14)。虽然越来越多地被视为不依赖于肿瘤体积的不利预后因素，但是其负面影响的生物学机制尚未得到充分的了解(参见下文第6.1.5节所述的参考文献18)。该分子的NH2部分含有编码CA125抗原的多个串联重复，并且似乎用作间皮素和某些半乳糖凝集素的重要粘附伴侣(图1A)(参见如下文第6.1.5节所述参考文献5、17和24-26)。虽然这些粘附功能已经被认为在MUC16相关的不良结局中至关重要，但是这些研究并没有解释卵巢癌细胞行为的所有观察到的变化。MUC16糖蛋白的克隆提供了关于MUC16基因产物的基本结构信息(参见下文第6.1.5节所述的参考文献4和5)。在该实施例中呈现的数据是第一份数据，显示MUC16可以介导从环境进入癌细胞的信号传导，特别的，本实施例中呈现的数据表明糖基化的MUC16胞外域对于MUC16癌细胞行为的改变至关重要。
该实施例证明，来自MUC16的羧基末端的114个氨基酸足以转化NIH/3T3(3T3)细胞，支持增加的软琼脂生长和增加的基质胶侵袭。虽然其他人已经将MUC16的膜最近端C末端部分确定为MUC16诱导的行为的关键因素，但是我们将这些行为与保留的MUC16胞外域中的N-糖基化位点相关联。这些变化与MMP2、MMP9、CXCL12和CDH11等关键的侵袭基因的改变的基因表达谱和增加的表达有关。虽然较长的元件可以诱导更强的行为，但是即使靠近推定切割位点的残留114个氨基酸在3T3细胞中足以诱导侵袭基因表达的相同变化。此外，MUC16c114的Asn30(对应于成熟MUC16(SEQ ID NO：150)的Asn1806)的糖基化对于MUC16c114致癌性质是必需的，不受任何特定理论的束缚，这些发现与通过蛋白最近端部分(包括跟随跨膜域和胞质尾区的残余胞外区域(extracellular domain))的“外向内”信号转导最相符。不同于Theriault(Therialt等，Gynecol Oncol 2011，121(3):434-443)和Giannakouros(Giannakouros等，Int.J.Oncol.2015，41(1):91-98)，细胞内胞质域缺失比糖基化胞外域缺失的影响小，这些差异可能反映出选择的具体突变和方法学减少表达。“内向外”信号似乎激活了在软琼脂和裸鼠中促进表达MUC16的细胞的植入和生长的基因程序的转录。当检测转染的细胞对常见的致瘤途径的激活时，AKT和ERK通路似乎都被MUC16的组成型表达激活。MUC16增加AKT/ERK磷酸化的机制尚不清楚，需要进一步研究。共沉淀受体的缺失表明也可能涉及其他机制。虽然MUC16序列是非常不同的，但是其他拴粘蛋白(包括MUC1和MUC4)已被证明在3T3细胞和大鼠成纤维细胞中起到信号-产生癌基因的作用(参见下文第6.1.5节所述的参考文献8和9)。粘蛋白对癌细胞表面的作用可能通过仍待定义的机制起重要作用。
基于3T3细胞中的发现，MUC16转基因小鼠实验的结果是高度支持性的。本身，相同的MUC16近端354序列可以容易地在几乎所有的鼠组织中表达，在转基因小鼠中没有不利影响。这些小鼠自发性肿瘤形成率非常低，生殖功能似乎没有受到影响。然而，像其他鼠卵巢癌模型一样，p53功能的丧失似乎在MUC16依赖性肿瘤形成中起着很强的许可性作用(参见下文第6.1.5节所述的参考文献27)。这些结果当然与均一的p53失活一致，其表征TCGA数据集中的卵巢癌。
这些发现描述了细胞行为和基因转录中的MUC16相关变化。体外和体内模型与浆液性卵巢癌MUC16表达水平的不良反应一致，促进了对于MUC16作为卵巢癌行为的致病因子的理解。增加CA125表达的不利影响与MUC16(+)3T3转染子的增加的体内肿瘤生长和致死率一致(参见下文第6.1.5节所述的参考文献18)。
6.1.5实施例1引用的参考文献
1.Bast RC Jr，Klug TL，St John E，Jenison E，Niloff JM等，(1983)Aradioimmunoassay using a monoclonal antibody to monitor the course ofepithelial ovarian cancer.N Engl J Med 309:883-887.
2.Kabawat SE，Bast RC Jr，Bhan AK，Welch WR，Knapp RC等，(1983)Tissuedistribution of a coelomic-epithelium-related antigen recognized by themonoclonal antibody OC125.Int J Gynecol Pathol 2:275-285.
3.Bast RC Jr，Badgwell D，Lu Z，Marquez R，Rosen D等，(2005)New tumor markers:CA125 and beyond.Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-281.
4.O'Brien TJ，Beard JB，Underwood LJ，Dennis RA，Santin AD等，(2001)The CA 125gene:an extracellular superstructure dominated by repeat sequences.TumourBiol 22:348-366.
5.Yin BW，Lloyd KO(2001)Molecular cloning of the CA125 ovarian cancerantigen:identification as a new mucin，MUC16.J Biol Chem 276:27371-27375.
6.Yin BW，Dnistrian A，Lloyd KO(2002)Ovarian cancer antigen CA125 isencoded by the MUC16 mucin gene.Int J Cancer 98:737-740.
7.Hollingsworth MA，Swanson BJ(2004)Mucins in cancer:protection andcontrol of the cell surface.Nat Rev Cancer 4:45-60.
8.Li Y，Liu D，Chen D，Kharbanda S，Kufe D(2003)Human DF3/MUC1 carcinoma-associated protein functions as an oncogene.Oncogene 22:6107-6110.
9.Bafna S，Singh AP，Moniaux N，Eudy JD，Meza JL等，(2008)MUC4，amultifunctional transmembrane glycoprotein，induces oncogenic transformationof NIH3T3 mouse fibroblast cells.Cancer Res 68:9231-9238.
10.Huang L，Chen D，Liu D，Yin L，Kharbanda S等，(2005)MUC1 oncoprotein blocksglycogen synthase kinase 3beta-mediated phosphorylation and degradation ofbeta-catenin.Cancer Res 65:10413-10422.
11.Li Q，Ren J，Kufe D(2004)Interaction of human MUC1 and beta-catenin isregulated by Lck and ZAP-70 in activated Jurkat T cells.Biochem Biophys ResCommun 315:471-476.
12.Duraisamy S，Ramasamy S，Kharbanda S，Kufe D(2006)Distinct evolution ofthe human carcinoma-associated transmembrane mucins，MUC1，MUC4 AND MUC16.Gene373:28-34.
13.Ramsauer VP，Carraway CA，Salas PJ，Carraway KL(2003)Muc4/sialomucincomplex，the intramembrane ErbB2 ligand，translocates ErbB2 to the apicalsurface in polarized epithelial cells.J Biol Chem 278:30142-30147.
14.Dharma Rao T，Park KJ，Smith-Jones P，Iasonos A，Linkov I等，(2010)NovelMonoclonal Antibodies Against the Proximal(Carboxy-Terminal)Portions ofMUC16.Appl Immunohistochem Mol Morphol 18:462-72.
15.Corrales RM，Galarreta D，Herreras JM，Saez V，Arranz I等，(2009)Conjunctival mucin mRNA expression in contact lens wear.Optom Vis Sci 86:1051-1058.
16.Govindarajan B，Gipson IK(2010)Membrane-tethered mucins have multiplefunctions on the ocular surface.Exp Eye Res 90:655-663.
17.Kaneko O，Gong L，Zhang J，Hansen JK，Hassan R等，(2009)A binding domain onmesothelin for CA125/MUC16.J Biol Chem 284:3739-3749.
18.Zorn KK，Tian C，McGuire WP，Hoskins WJ，Markman M等，(2009)The prognosticvalue of pretreatment CA 125 in patients with advanced ovarian carcinoma:aGynecologic Oncology Group study.Cancer 115:1028-1035.
19.The Cancer Genome Atlas.Available from:http://cancergenome.nih.gov/.
20.Cheon DJ，Wang Y，Deng JM，Lu Z，Xiao L等，(2009)CA125/MUC16 is dispensablefor mouse development and reproduction.PLoS One 4:e4675.
21.Mazzoletti M，Broggini M(2010)PI3K/AKT/mTOR Inhibitors In OvarianCancer.Curr Med Chem 17:4433-4447.
22.Ventura AP，Radhakrishnan S，Green A，Rajaram SK，Allen AN等，(2010)Activation of the MEK-S6 pathway in high-grade ovarian cancers.ApplImmunohistochem Mol Morphol 18:499-508.
23.Strausberg RL，Feingold EA，Grouse LH，Derge JG，Klausner RD等，(2002)Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human andmouse cDNA sequences.Proc Natl Acad Sci USA 99:16899-16903.
24.Seelenmeyer C，Wegehingel S，Lechner J，Nickel W(2003)The cancer antigenCA125 represents a novel counter receptor for galectin-1.J Cell Sci.116(Pt7):1305-1318.
25.Lloyd KO，Yin BW(2001)Synthesis and secretion of the ovarian cancerantigen CA 125 by the human cancer cell line NIH:OVCAR-3.Tumour Biol 22:77-82.
26.Liu J，Yang G，Thompson-Lanza JA，Glassman A，Hayes K等，(2004)Agenetically defined model for human ovarian cancer.Cancer Res 64:1655-1663.
27.Xing D，Orsulic S(2006)A mouse model for the molecular characterizationof brca1-associated ovarian carcinoma.Cancer Res 66:8949-8953.
28.Rao TD，Rosales N，Spriggs DR(2011)Dual-fluorescence isogenic high-content screening for MUC16/CA125 selective agents.Mol Cancer Ther 10:1939-1948.
29.Shinoda Y，Ogata N，Higashikawa A，Manabe I，Shindo T等，(2008)Kruppel-likefactor 5 causes cartilage degradation through transactivation of matrixmetalloproteinase 9.J Biol Chem 283:24682-24689.
30.TCGA(2008)Comprehensive genomic characterization defines humanglioblastoma genes and core pathways.Nature 455:1061-1068.
31.Taylor BS，Schultz N，Hieronymus H，Gopalan A，Xiao Y等，(2010)Integrativegenomic profiling of human prostate cancer.Cancer Cell 18:11-22.
32.Heller G，Vendatraman E(1996)Resampling procedures to compare twosurvival distributions in the presence of right censored data.Biometrics 52:1204-1213.
6.2实施例2：MUC16糖基化抗体
6.2.1介绍
被OC125抗体识别的CA125抗原(参见下文第6.2.5节所述的参考文献1)是在来自MUC16糖蛋白的胞外部分的串联重复结构域中表达的重度糖基化抗原(参见参考文献2和3，如下文第6.2.5节所述)。这种循环抗原主要来源于良性或恶性苗勒组织，并被FDA批准作为人类卵巢癌的肿瘤标志物，但其在致癌过程中的功能和作用尚不清楚(参见如下第6.2.5节所述的参考文献4-6)。MUC16属于复杂的拴粘蛋白家族，其由大的重度糖基化的胞外区域、膜与推测的切割位点之间的小的胞外域、疏水性跨膜域和胞内短尾组成(见图1)(参见如下文第6.2.5节所述参考文献7和8)。大多数MUC16蛋白在切割后释放到周围空间，胞外域保留在细胞表面。OC125和大多数其他MUC16反应性单克隆抗体(mAb)与仅存在于分子切割部分的串联重复区中的抗原反应。由于这些表位可能在循环中发现，所以现有的mAb不能用于追踪剩余的MUC16蛋白片段的命运，并且可能不能准确地反映MUC16表达的真实分布(参见下文第6.2.5节中所述的参考文献9)。其他人已经显示，糖基化表面蛋白质可以通过基于半乳糖凝集素3与酪氨酸激酶受体(如EGFR，PDGFR等)的N-糖基化位点的相互作用来调节细胞增殖和分化(KS Lau Cell 129：123，2007)。如实施例1(参见第6.1节)所示，MUC16的近端部分(少至114个氨基酸)可以转化永生化的3T3细胞，并且这种作用看起来被衣霉素消除。
本实施例显示了介导这些作用的精确糖基化位点和半乳糖凝集素3在MUC16依赖性转化中的强制作用。因此，开发了能够以糖基化特异性方式结合近端肽序列(例如，MUC16c114)的抗体以抑制关键的MUC16介导的癌症功能，例如粘附和侵袭。通过使用定义的合成N-糖肽抗原作为关键表位模拟物，产生了针对MUC16胞外域内关键N-糖基化位点的单克隆抗体。这些抗体通过降低MUC16驱动的基质胶侵袭、癌基因激活和肿瘤生长来抑制MUC16的致癌生物学，这与其他非糖基化蛋白质导向的mAb相反，后者没有效果。这些抗体证明了粘蛋白转化的机制，并为MUC16阳性肿瘤的诊断和治疗应用提供了有用的工具。
6.2.2材料和方法
6.2.2.1糖肽的合成
使用合成的糖肽作为关键表位模拟物产生了针对MUC16的55个氨基酸序列(MUC16c55：NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNS(SEQ ID NO:129)的第三糖基化位点(Asn30，类似于MUC16的Asn1806)的特异性抗体，所述模拟物在MUC16c55(SEQ IDNO:129，图13)的Asn30上引入定义明确的壳二糖(GlcNAc2)。均质的N-糖肽的合成是高度收敛的，涉及部分保护的全长肽(MUC16c55、SEQ ID NO:129)与壳二糖胺在Lansbury天冬氨酰化条件下的偶联(参见下文第6.2.5节所述的参考文献11)。MUC16c55(SEQ ID NO:129)获得自微波辅助的Fmoc固相肽合成(SPPS)，然后进行树脂上N-乙酰化(Ac2O，DIEA)，Asp30(Pd(PPh3)4，PhSiH3)去烯丙基化(deallyation)和随后的树脂裂解(1-2％TFA/CH2Cl2)。使用单烧瓶(one-flask)天冬氨酰化/去保护流程(如下文第6.2.5节引用的参考文献12所述)，将Asn30位置的游离羧酸侧链与壳二糖胺偶联(如下文第6.2.5节引用的参考文献13所述)，随后用TFA处理(混合物R：90％TFA，5％硫代苯甲醚，3％乙二硫醇，2％茴香醚)，以提供糖肽GlcNAc2-55-mer。伪脯氨酸基序的存在有助于减轻天冬氨酰化期间不希望的天冬酰胺酰亚胺形成。
此外，含有Man3GlcNAc2的肽以类似的单烧瓶顺序制备。
制备了包含MUC16c55(SEQ ID NO：129)的Asn30和Asn24(分别类似于MUC16的Asn1800和Asn1806)的较短的糖肽(1)18-mer：CTRNGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO：130)和(2)15-mer：CGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO：131)。将18-mer和15-mer糖肽与血红素血蓝蛋白(KLH)缀合。15-mer(SEQ ID NO：131)在Asn7(类似于MUC16的Asn1806)引入壳二糖。以类似于55-mer糖肽合成的方式合成了15-mer糖肽。
18-mer(SEQ ID NO：130)在Asn4和Asn10(分别类似于MUC16的Asn1800和Asn1806)引入壳二糖。18-mer的Asn4和Asn10(类似于MUC16的Asn1800和Asn1806)的烯丙基保护导致显著的天冬酰胺酰亚胺形成。因此，在SPPS中使用较受阻碍的O-2-苯基异丙基酯(O-2-PhiPr，OPp)以在N-乙酰化和同时进行的树脂切割/OPp去除(1-2％TFA/CH2Cl2)后提供具有18-mer的游离Asn4和Asn10侧链(分别类似于MUC16的Asn1800和Asn1806)的部分保护的肽。通过双重Lansbury天冬氨酰化，然后进行全局的酸脱保护，进行了两个壳二糖单元的高度收敛的安装(installation)以产生双糖基化的18-mer肽(HPLC纯化后27％)。
18-mer和15-mer糖肽的N-末端半胱氨酸残基与马来酰亚胺衍生的载体蛋白的最终偶联提供了用于小鼠免疫的KLH缀合的构建体。
6.2.2.2小鼠免疫方案
在用于免疫小鼠的25μL的Titermax佐剂存在下，每三周三次用55-mer糖肽(见6.2.2.1节)免疫5只BALB/c和5只Swiss Webster小鼠。三周后，用单糖基化的15-mer(SEQ ID NO：131)和双糖基化的18-mer(SEQ ID NO：130)KLH缀合的构建体的混合物免疫小鼠。分析血清对55-mer GlcNAc2-糖基化和不缀合KLH的较短的糖肽的反应性。将未糖基化的55-mer、15-mer和18-mer肽与两个MUC16无关的含壳二糖的肽一起用作筛选的阴性对照。进一步每三周用15-mer和18-mer KLH缀合物另外两次免疫小鼠，每次免疫后通过ELISA分析反应。
6.2.2.3侵袭
参见6.1.2.9节。对于shRNA实验，从BD Biosciences，MA购买BD BioCoatTM MatrigelTM侵袭插入物或室(24孔板中的目录#354480)和对照插入物(24孔板中的目录#354578)。按照制造商的方案进行基质胶侵袭测定。简言之，允许24孔板(-20℃储存)和对照插入物(4℃储存)的基质胶室达到室温。在24孔板的内部(insert)以及外部孔中将两种插入物用0.5mL无血清培养基在37℃5％CO2加湿培养箱中再水化2小时。培养的SKOV3细胞被胰蛋白酶化并用培养基洗涤。将一百万个细胞分离至另一离心管并用无血清培养基洗涤3次。稍后调整这些细胞以在0.5mL无血清培养基中得到5,000个细胞。去除再水化插入物中的培养基，并将插入物转移到新的24孔板中，所述24孔板在孔中含有0.75mL的含10％胎牛血清(FBS)培养基，该培养基用作化学引诱剂。立即将0.5mL无血清培养基中的细胞(5,000个细胞)加入到插入物中。要适当注意，没有气泡被困在插入物和外部的孔中。将24孔板在37℃5％CO2加湿培养箱中孵育48小时。孵育后，通过将棉花尖棉签插入基质胶或对照插入物中并轻轻地施加压力，同时将棉签的尖端移动到膜表面上，通过“擦洗”从膜的上表面去除非侵袭细胞。用浸有培养基的第二个棉签重复擦洗过程。然后将插入物在含有0.5％结晶紫染色剂的0.5mL蒸馏水中的新24孔板中染色30分钟。染色后，将插入物在3个蒸馏水烧瓶中冲洗以除去多余的染色剂。在新的24孔板中将插入物风干。在倒置显微镜下以200倍放大倍率手工计数侵袭细胞。计数三个平行膜的几个领域，并记录在图中。
6.2.2.4无胸腺裸鼠中的肿瘤生长
参见第6.1.2.11节6.1.2.11。
6.2.2.5生物素化糖肽的结合分析
使用ForeBio Octet QK测定结合亲和力。将5μg/mL生物素化的壳二糖缀合的18-mer糖肽加载到链霉亲和素生物传感器上。洗去过量抗原后，分别用10μg/mL的小鼠抗体进行结合和解离步骤的检测。使用1：1结合位点模型计算结合参数，部分拟合。
6.2.2.6组织微阵列的免疫组织化学
预先存在的石蜡包埋组织的核心针活检从所谓的供体块获得，然后通过使用Kononen等人的技术被重新定位到受体石蜡排列的“主”块中。(参见Kononen J等，Nat Med 1998；4(7)：8447)，随后通过Hedvat等人修饰(参见Hedvat CV等人Hum Pathol 2002；33(10)：968-74)。使用来自Beecher Instruments Inc.(Sun Prairie，WI)的手动组织阵列MTA-1用于产生直径为0.6至1.0mm的样品圆形斑点(芯)。芯彼此间隔0.3至0.4毫米进行排列。策略性地将一层对照组织置于实际组织微阵列周围，以避免边界效应。下面描述了每种组织微阵列的具体组成。通过从福尔马林固定的石蜡包埋组织切割4um切片来制备用于卵巢癌或对照组织的组织微阵列的玻片。
在组织微阵列标准OC125(Ventana，Tuscon，AZ)、4H11(参见Rao等Appl.Immunohistochem Mol Morphol，2010，18(5):462-72)和19C11单克隆抗体上进行免疫组织化学。将组织微阵列的切片切成4微米，置于Superfrost/Plus显微镜载玻片(Fisher品牌)上，并在60°烘箱中烘烤至少60分钟。然后将载玻片脱蜡并水合至蒸馏水，在pH 6.00的柠檬酸盐缓冲液中于97℃浸泡30分钟，在流水中洗涤2-5分钟，在蒸馏水中稀释的3％过氧化氢中孵育5分钟。将载玻片在蒸馏水中洗涤1分钟，转移到pH7.2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)浴中，进行两次变化，每次5分钟，并置于用PBS稀释的0.05％BSA中至少1分钟。在围绕组织切片干燥后，以1:20稀释度在2％BSA/PBS中施用正常血清，并在室温下在湿度室中孵育至少10分钟。然后吸出血清，而不允许切片干燥，将约150λ的新抗体以1:1000稀释度置于组织上。将载玻片在4℃在湿度室中孵育过夜(约15-18小时)。使用三个变化的PBS洗涤一抗，每次10分钟。在1％BSA/PBS中以1:500的稀释度施用来自Vector实验室(Burlingame，Ca)的二抗，生物素化的α小鼠，并在室温下在湿度室中温育45-60分钟。如上所述再次使用三个变化的PBS洗脱抗体。然后将玻片转移到二氨基联苯胺(DAB)浴中，在PBS中稀释5-15分钟。然后将玻片在自来水中洗涤1分钟，使用Harris修饰的苏木精(Fisher)对染色，用1％酸性醇和氨水中的蓝(blue)脱色，用95％乙醇，100％乙醇和二甲苯的3个变化各脱水2分钟，盖上永久封固剂。
6.2.2.7内化分析
在表达MUC16c114的SKOV3细胞上研究89Zr-19C11的内化。将大约1×105个细胞接种在12孔板中，并在37℃5％CO2培养箱中温育过夜。将一体积的放射性标记蛋白加入各孔中，将板在37℃和4℃下孵育1、5、12和24小时。在每个孵育期后，收集培养基，并用1mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗细胞。通过在4℃下用含100mM甘氨酸(1:1，pH3.5)的1mL的100mM乙酸中洗涤细胞来收集表面结合的活性。然后将粘附的细胞用1mL的1M NaOH裂解。收集每次洗涤并计数活性。使用最终洗涤的活性与所有洗涤物的总活性的比率来确定内化的百分比。
6.2.3结果
6.2.3.1 MUC16病理生物学依赖于MUC16胞外域C端的N-糖基化。
实施例1(参见第6.1节)表明MUC16c114的表达导致3T3小鼠成纤维细胞的体外/体内行为更具侵袭性，导致MUC16c114驱动的基质胶侵袭显著增加，并且更迅速的体内肿瘤生长。因此，检测了SKOV-3细胞系(MUC16表达缺失的人类卵巢细胞系)的MUC16c114依赖性质的影响。MUC16c114表达导致细胞表面表达，并且基质胶侵袭增加近3倍(图12A的泳道1和2)。侵袭的这种增加取决于MUC16c114的氨基酸位点1(Asn1)、24(Asn24)和30(Asn 30)(分别对应成熟MUC16(SEQ ID NO：150)的Asn1777、Asn1800和Asn1806；MUC16c114-N123)的天冬酰胺的N-糖基化，因为Asn30突变为丙氨酸(MUC16c114-N3，图12A，泳道3)，Asn1和Asn24突变为丙氨酸(MUC16c114-N12，图12A，泳道4)和Asn1、Asn24和Asn30突变为丙氨酸(MUC16c114-N123，图12A，泳道4)，去除了基质胶侵袭。还参见图12B。此外，MUC16c114诱导的增加的基质胶侵袭依赖于MGAT5(涉及N-糖基化反应的第一个酶)和/或LGALS3(在许多高级浆液性癌症中扩增的酶)，因为降低的MGAT5或LGALS3表达的敲低shRNA实验具有与N-糖基化位点处的MUC16c114突变相似的作用，并且将侵袭降低到接近基础水平(图12A，泳道6-10)。
致癌转化的最明确的标志是促进免疫缺陷小鼠生长的能力。为了测量MUC16N-糖基化、MGAT5和LGALS2对肿瘤生长速度的影响，采用了侧腹部肿瘤模型来便于常规肿瘤测量。如图12C所示，当将表达载体(phrGFP)、MUC16c114、MUC16c114-N123、MUC16c114和抗MGAT5shRNA(MUC16c114-shMGAT5)或MUC16c114和抗LGALS3shRNA(MUC16c114-shLGALS3)的3T3细胞系植入到无胸腺裸鼠侧腹时，与仅载体对照组相比，只有MUC16c114 3T3细胞在24天形成较大的肿瘤。这些数据证实了体外分析，表明MUC16N-糖基化、MGAT5和LGALS3是肿瘤生长所必需的。
6.2.3.2作为mAb开发的关键表位模拟物的均匀N-糖肽的合成
由于MUC16c114的Asn30位点(对应于成熟MUC16(SEQ ID NO：150)的Asn 1806；MUC16c114 -N3))的N-糖基化被确定为MUC16致癌作用的中心要求，因此进行了SKOV3细胞中表达的MUC16c114-N12的聚糖谱分析，因为MUC16c114-N12保留在Asn30(对应于成熟MUC16(SEQ ID NO：150)的Asn1806)被N-糖基化的能力。该糖组分析显示该C末端MUC16片段具有高度多样化的N-糖基化模式，其中关键的壳二糖(GlcNAc2)干作为附着各种甘露糖部分的最小重复单元(图13A)。
因此，产生糖基化导向的mAb以努力抑制MUC16对转移和侵袭的糖基化依赖性作用。将这些抗体设计成靶向在MUC16胞外域(MUC16C55；SEQ ID NO：129)中较短的55个氨基酸序列上含有至关重要的第三糖基化位点(MUC16c114的Asn30)的N-糖肽表位。关于用作免疫原的糖肽的合成的描述参见第6.2.2.1节和图13B，13C，13D。有关免疫过程的描述参见第6.2.2.2节。
使用在对应于MUC16c114的Asn24和/或Asn30的氨基酸残基(分别对应成熟MUC16(SEQID NO:150)的Asn1800和Asn1806)处包含壳二糖的短(55-mer，18-mer和15-mer)MUC16糖肽通过免疫产生抗体。除了作为较大N聚糖共有的最小基序之外，壳二糖还可以使潜在的MUC16衍生肽更好地暴露以诱导抗体，所述抗体不仅显示出对聚糖的依赖性，而且还显示肽特异性。与正常细胞相比，这种低糖基化是肿瘤细胞表面粘糖蛋白的一个常见的区别性特征。
6.2.3.3用合成糖肽/糖缀合物进行小鼠免疫接种及血清学分析
根据6.2.2.2节中描述的方案进行小鼠免疫接种和血清采集。在用GlcNAc2-55-mer进行三次免疫后(图13B)，用KLH缀合的构建体的混合物(单糖基化的15-mer(SEQ ID NO：131；图13C)和双糖基化的18-mer(SEQ ID NO：130；图13D))进一步免疫小鼠，10只小鼠中的2只显示了针对两种55-mer(具有和不具有GlcNAc2)的阳性ELISA信号，但是反应通常较弱，表明小鼠未完全被55-mer免疫接种致敏。使用KLH缀合物(GlcNAc2-15-mer(图13C)；和(GlcNAc2)2-18-mer(图13D))进行两次额外免疫，导致针对较短的15-mer和18-mer糖肽的IgG免疫应答增强，特别是在两只老鼠(小鼠7和小鼠8)中。然而，通过ELISA测定，这些抗体没有显示与55-mer-glyco-肽的任何可检测的反应性，这表明在该特定分析中，该大片段中的表位是不可接近的或构象上不同的。响应两种55-mer(含壳二糖的和/或非糖基化的肽)的小鼠5对Man3GlcNAc2衍生的55-mer是阴性的。毫不奇怪，针对非糖基化肽骨架的4H11mAb(Rao等Appl.Immunohistochem Mol Morphol，2010，18(5):462-72)没有显示出与未缀合的15/18-mer糖肽的结合，表明可获得表位可能存在一些差异。参见图14。
6.2.3.4糖基化依赖性单克隆抗体的开发和体外生物测定——MUC16驱动的基质胶侵袭
选择10只小鼠中的一只(小鼠7)，其血清与非糖基化糖肽相比显示与短糖肽的最高的反应性比例，因此显示出对糖的存在的一些偏好。收获小鼠7的脾脏，标准杂交瘤培养技术提供了产生IgG的杂交瘤细胞系。脾细胞与杂交瘤融合伴侣融合，得到非常高的融合效率(平均>5.5个菌落/孔，>30,000个杂交瘤)。选择上清液并通过ELISA筛选针对各个糖肽的反应性。针对15-mer-壳二糖肽和18-mer-壳二糖肽(在同一个孔中组合)的融合试验板的初步ELISA分析显示一些阳性信号，其指示存在抗肽抗体，尽管在此刻其糖基化依赖性不能被充分评估。参见图14。然而，与非糖基化的相比，观察到更高比例的具有有利阳性的抗体，因此对于壳二糖糖基化的抗原具有更高特异性。在培养稀释后，获得在每个孔中生长的单个克隆(1:1比例以上)，初步筛选显示由这些杂交瘤产生的抗体不识别接近非糖基化的15-/18-mer的4H11表位。参见图14。在更高稀释度下完成单克隆抗体筛选之后，获得了表现出糖肽表位优先的抗体。因此，该方法提供了36种壳二糖依赖性原代mAb，其被测试对MUC16的反应性。在这些中，通过用SKOV3-MUC16c114转染子的基质胶测定法评估了15个mAb(与4H11平行)对侵袭的作用(图15A)。MUC16糖基化抗体1B5、10C6、13A7、18C6、19C11、16C5、6H10、21F8、7B12显示抑制基质胶侵袭，而4H11对该特性没有影响，表明针对MUC16c114的Asn30(对应于成熟MUC16(SEQ ID NO：150)的Asn1806)的抗体抑制MUC16的生物学。MUC16糖基化抗体随后被亚克隆并纯化。确定某些MUC16糖基化抗体的结合参数(参见表9)。
表9.MUC16糖基化抗体的结合参数
抗体 kd(1/s) kd的误差(1/s) ka(1/s) KD(nM)
10C6.E4 * - ** >1000
19C11.H6 2.42x10-3 2.35x10-4 3.80x104 63.7
13A7.C8 * - ** >1000
16C5.C1 1.72x10-3 1.20x10-4 6.68x104 25.7
7B12.B3 1.04x10-3 1.09x10-4 7.50x104 13.8
18C6.D12 6.78x10-4 1.83x10-4 6.14x104 11.1
1B5.A7 1.49x10-3 1.12x10-4 7.35x104 20.2
4H11 - - - -
*＝低计算置信度；未拟合解离率
**＝ka对于关联率测定而言过低
最后，与4H11或OC125进行的免疫组织化学(图16E)相比，用MUC16糖基化抗体10C6进行的人卵巢组织样品的免疫组织化学显示改善的MUC16检测。
6.2.3.5 MUC16糖基化抗体对MUC16糖基化具有特异性。
为了研究MUC16糖基化抗体的特异性，对(i)表达天然(成熟)MUC16的细胞(OVCA-433细胞)；(ii)缺失MUC16表达，表达对照载体(SKOV3 phrGFP细胞)的SKOV3细胞；(iii)表达MUC16c114的SKOV3细胞(SKOV3 MUC16c114)；(iv)表达MUC16c114-N1的SKOV3细胞(SKOV3MUC16c114-N1)，(v)表达MUC16c114-N3的SKOV3细胞(SKOV3 MUC16c114-N3)，或(vi)在存在或不存在MUC16糖基化抗体(18C6、19C11、10C、1B5或13A7)或单克隆抗MUC16抗体4H11(表10)的情况下表达SKOV3 MUC16c114-N123的SKOV3细胞(SKOV3 MUC16c114-N123)进行FAC分析。抗体4H11、18C6、19C11、10C6、1B5和13A7显示与OVCA-433细胞的结合(表10；比较ID NO：3-8和阴性对照，ID NO：1和2)。相比之下，如基于研究的设计和抗体的产生所预期的，抗体4H11、18C6、19C11、10C6、1B5和13A7均未结合SKOV3phrGFP细胞(表10，ID NO：11-16，与阴性对照ID NO：9和10相比)。抗体4H11，18C6，19C11，10C6，1B5和13A7结合SKOV3 MUC16c114(表10，ID NO：19-24，与阴性对照ID NO：17和18相比)。MUC16c114的Asn1(对应于成熟MUC16(SEQ ID NO：150)的Asn1777)的突变不抑制抗体与SKOV3 MUC16c114-N1细胞的结合(表10，ID NO：27-32，与阴性对照ID NO：25和26相比)。然而，MUC16c114的Asn30(对应于成熟MUC16(SEQ ID NO：150)的Asn1806)的突变消除MUC16糖基化抗体18C6，19C11，10C6，1B5和13A7的结合(表10，ID NO：36-40，与阴性对照ID NO：33和34相比)。此外，MUC16c114(对应于成熟MUC16(SEQ IDNO：150)的Asn1806)的Asn30的突变没有消除抗体4H11的结合，后者不是MUC16糖基化抗体(表10，ID NO：35，与阴性对照ID NOs：33和34相比)。此外，Asn1、Asn24和Asn30(分别对应于成熟MUC16(SEQ ID NO：150)的Asn1777、Asn1800和Asn1806)上的天冬酰胺至丙氨酸突变消除了MUC16糖基化抗体18C6，19C11，10C6和1B5的结合(表10、ID NOs：44-47，与阴性对照IDNOs：41和42相比)，而4H11的结合没有被消除。注意，13A7维持与SKOV3 MUC16c114-N123细胞的结合。这些数据表明MUC16糖基化抗体以糖基化依赖的方式结合MUC16c114。
表10.用OVCA-433或SKOV3转染细胞进行MUC16糖基化抗体的FAC分析
*表示没有观察到结合。
6.2.3.6 MUC16糖基化抗体抑制基质胶侵袭。
鉴于MUC16糖基化抗体的糖基化特异性(表9)，评估了MUC16糖基化抗体生物反应性上清液以糖基化特异性方式抑制基质胶侵袭的能力。因此，在存在(图15A，泳道3-18)或不存在(图15A，泳道1和2)MUC16糖基化抗体生物反应性上清液的情况下，用表达phrGFP(图15A，泳道1)或phr-GFP-MUC16c114(MUC16c114；图15A，泳道2-18)的SKOV3卵巢癌稳定细胞系进行基质胶侵袭测定。MUC16单克隆抗体4H11(图15A，泳道3)被用作MUC16糖基化抗体生物活性上清液的对照(图15A，泳道4-18)，以评估基质胶侵袭中的糖基化依赖性。单独存在或在4H11存在下(图15A，泳道2和3)MUC16c114的表达导致基质胶侵袭活性的增加。相比之下，与MUC16糖基化抗体(图15A，泳道4-18)的温育降低了表达MUC16c114的卵巢癌细胞的基质胶侵袭。
接下来，评估了纯化的MUC16糖基化抗体抑制基质胶侵袭的能力。为此，将表达MUC16c114的SKOV3细胞在存在和不存在MUC16抗体4H11或纯化的MUC16糖基化抗体(图15B)下孵育。MUC16糖基化抗体7B12、19C11、18C6和10C6抑制MUC16c114诱导的基质胶侵袭(图15B，比较泳道3-6和阴性对照，泳道2)。相比之下，单克隆抗MUC16抗体4H11不抑制MUC16c114诱导的基质胶侵袭(图15B，比较泳道2和阴性对照，泳道1)。这些数据表明，与单克隆抗体4H11相反，MUC16糖基化抗体(例如7B12、19C11、18C6和10C6)阻断基质胶侵袭。
在MUC16c114N-糖基化突变体的背景中测定了MUC16糖基化抗体抑制基质胶侵袭的能力(图16A)。为此，对SKOV3phrGFP细胞，SKOV3MUC16c114细胞，SKOV3MUC16c114-N1细胞，SKOV3MUC16c114-N2细胞或SKOV3 MUC16c114-N3细胞(图16A，分别为泳道1-5)进行基质胶侵袭测定，其中存在：(i)对照抗体；(ii)4H11抗体；或(iii)MUC16糖基化抗体10C6。MUC16c114诱导的基质胶侵袭在SKOV3 MUC16c114-N3细胞中被抑制，因为MUC16c114的Asn30对MUC16c114基质胶侵袭是必需的。此外，在存在和不存在MUC16单克隆抗体4H11的情况下，在SKOV3 MUC16c114细胞，SKOV3 MUC16c114-N1细胞和SKOV3 MUC16c114-N2细胞中诱导基质胶侵袭。相比之下，这些细胞与MUC16糖基化抗体10C6的温育消除了基质胶侵袭(图16A)。这些数据也在图16B和表达MUC16c344突变体的3T3细胞(图16C)中得到证实。
总之，这些数据表明，与单克隆抗MUC16抗体4H11相反，MUC16糖基化抗体能够以糖基化依赖性方式抑制基质胶侵袭。
6.2.3.7 MUC16糖基化抗体19C11被内化。
最后，评价了靶向MUC16c114的Asn30的MUC16糖基化抗体被内化的能力。将表达MUC16c114的SKOV3细胞与89Zr-DFO-标记的19C11抗体一起孵育并通过放射性示踪剂测定内化(图17)。这些数据表明，早在用抗体处理1小时后，当在37℃孵育下与表达MUC16c114的SKOV3细胞一起孵育时，标记的19C11抗体被内化。标记抗体的细胞摄取在4℃下降低。
6.2.4讨论
MUC16/CA125抗原——与MUC1具有实质同源性的粘蛋白家族成员——长期以来与妇科恶性肿瘤关联(参见下文第6.2.5节所述的参考文献4)。尽管作为一般筛选工具没有足够的敏感性或特异性，CA125测量经常用于通过基于抗体的检测方法监测卵巢癌患者。绝大多数的MUC16反应性抗体，例如OC125，是针对分子切割部分中发现的糖基化依赖性表位，并且不能用作检测切割后的MUC16的近端部分的筛选工具。因此，缺乏对剩余的MUC16蛋白片段的生物学研究。实施例1(第6.1节)中的数据证明近端MUC16区域的114个氨基酸序列(MUC16C114)足以增加几个卵巢癌细胞系的侵袭和肿瘤生长。本文中惊人的发现，该C末端胞外域的N-糖基化，特别是在第三Asn位点(Asn30，对应于成熟MUC16(SEQ ID NO：150)的Asn1806))，对于MUC16致癌作用至关重要，这表明MUC16新的作用，其可以被认为不仅是疾病的被动标志物，而且还被认为是病原分子。基于这一前提，针对这些MUC16保留部分的单克隆抗体的开发似乎是探索这种粘蛋白的病理生物学和创造MUC16靶向治疗药物的有力工具。
以前的研究确定了针对MUC16的非切割的C-末端区域的mAb，尽管与现有抗体相反，它们被引导至非糖基化肽骨架而不是复合糖蛋白表位。特别地，4H11表现出与MUC16胞外域的高亲和力结合，并且由于表位的邻近位置而比OC125更有效地被卵巢癌细胞内化。该发现表明，糖蛋白的近端区域具有远离推测切割位点的MUC16的脱落部分的独立生物学。然而，由于4H11不识别MUC16致病作用所必需的胞外域内的关键糖基化位点，因此其在靶向治疗中未来研究的潜力是有限的。
通过使用KLH缀合的合成糖肽模拟物与杂交瘤技术结合，开发了针对MUC16胞外域中关键糖肽表位的一组糖基化依赖性单克隆抗体。该方法优于多克隆抗体产生，因为在多克隆阶段，糖肽特异性不完全，并且还检测到与非糖基化MUC16肽片段的一些结合。为了获得MUC16糖基化抗体，单克隆抗体产生的主要选择是基于与糖存在的某种程度的偏好相关的多克隆培养物中糖基化依赖性的较高比例。已经通过研究它们对MUC16驱动的基质胶侵袭的影响来证明新的单克隆抗体的功能及其对糖肽表位的更高的特异性。这些MUC16糖基化抗体能够抑制基质胶体测定中的侵袭，而针对非糖基化的4H11则不能。基于发现在Asn30N糖基化对于MUC16作用是必需的，这些结果证实新产生的抗体特异性靶向MUC16胞外域的关键糖肽表位，这导致MUC16病理生物学的抑制。重要的是，MUC16糖基化抗体10C6在植入表达MUC16c114的卵巢癌细胞的无胸腺裸鼠模型中显著延迟MUC16阳性肿瘤生长，证明这些单克隆抗体作为优化临床应用中有希望的治疗工具的潜力。
6.2.5引用的参考文献
1.Bast,R.C.Jr.等，Reactivity of a monoclonal antibody with human ovariancarcinoma.J.Clin.Invest.68,1331–1337(1981).
2.Yin,B.W.&Lloyd,K.O.Molecular cloning of the CA125 ovarian cancerantigen:identification as a new mucin,MUC16.J.Biol.Chem.276,27371-27375(2001).
3.O'Brien,T.J.等，The CA 125 gene:an extracellular superstructuredominated by repeat sequences.Tumor Biol.22,348-366(2001).
4.Bast,R.C.Jr.等，CA125:the past and the future.Int.J.Biol.Markers 13,179187(1998).
5.Rustin,G.J.S.Use of CA-125 in clinical trial evaluation of newtherapeutic drugs for ovarian cancer.Clin.Cancer Res.10,3919–3926(2004).
6.Scholler,N.&Urban,N.CA125 in ovarian cancer.Biomark.Med.1,513–523(2007).
7.Yin,B.W.,Dnistrian,A.&Lloyd,K.O.Ovarian cancer antigen CA125 is encodedby the MUC16 mucin gene.Int.J.Cancer 2002,98,737-740.
8.O'Brien,T.J.,Beard,J.B.,Underwood,L.J.&Shigemasa,K.The CA 125 gene:anewly discovered extension of the glycosylated N-terminal domain doubles thesize of this extracellular superstructure.Tumor Biol.23,154-169(2002).
9.Nap,M.等，Immunohistochemical characterization of 22 monoclonalantibodies against the CA125 antigen:2nd report from the ISOBM TD-1workshop.Tumor Biol.17,325-331(1996).
10.Rao,T.D.等，Novel monoclonal antibodies against the proximal(carboxy-terminal)portions of MUC16.Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol.18,462-472(2010).
11.Cohen-Anisfeld,S.T.,Lansbury,P.T.A practical,convergent method forglycopeptide synthesis.J.Am.Chem.Soc.115,10531-10537(1993).
12.Wang,P.,Aussedat,B.,Vohra,Y.&Danishefsky,S.J.An advance in thechemical synthesis of homogeneous N-linked glycopolypeptides by convergentaspartylation.Angew.Chem.Int.Ed.51,11571-11575(2012).
13.Likhosherstov,L.M.,Novikova,O.S.,Derevitskaja,V.&Kochetkov,N.K.A newsimple synthesis of amino sugarβ-d-glycosylamines.Carbohydr.Res.146,C1-C5(1986).
14.Nakada,H.等，Epitopic structure of Tn glycophorin A for an anti-Tnantibody(MLS 128).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,2495–2499(1993).
15.Osinaga,E.等，Analysis of the fine specificity of Tn-binding proteinsusing synthetic glycopeptide epitopes and a biosensor based on surfaceplasmon resonance spectroscopy.FEBS Lett.469,24-28(2000).
16.Mazal,D.等，Monoclonal antibodies toward different Tn-amino acidbackbones display distinct recognition patterns on human cancercells.Implications for effective immuno-targeting of cancer.CancerImmunol.Immunother.62,1107–1122(2013).
17.Rosen,D.G.等，Potential markers that complement expression of CA125inepithelial ovarian cancer.Gynecol Oncol.99,267–277(2005).
18.Moore,R.G.,Maclaughlan,S.&Bast,R.C.Jr.Current state of biomarkerdevelopment for clinical application in epithelial ovarian cancer.GynecolOncol.116,240–245(2010).
6.3实施例3：MUC16的肿瘤促进作用需要与半乳糖凝集素-3和细胞表面受体的相互作用
该实施例提供(a)实施例2(第6.2节)中描述的某些实验的更详细的描述；和(b)与实施例2(第6.2节)相比的另外的实验。
6.3.1介绍
MUC16/CA125的过度表达在浆液性卵巢癌中是常见的，并且升高的血清CA125水平与存活率降低相关。OC125抗体识别的CA125抗原是来自MUC16糖蛋白胞外部分的串联重复结构域内表达的重度糖基化抗原(参见下文第6.3.13节中的参考文献3和22)。该抗原主要由良性或恶性的苗勒组织表达，但其在癌发生中的功能和作用目前尚未完全了解(参见下文第6.3.13节中的参考文献4)。MUC16是一种高度复杂的拴粘蛋白，其由大的非均匀糖基化胞外区域、细胞膜与推测切割位点之间的58个氨基酸的胞外域、疏水性跨膜区和细胞内短尾组成(见下文第6.3.13节参考文献21)。OC125和大多数其他MUC16反应性单克隆抗体(mAb)识别分子切割部分中存在的免疫原性156个氨基酸串联重复区。更新的胞外域特异性抗体(例如4H11和4A5)识别MUC16的切割后保留部分中的肽表位(参见下文第6.3.13节中的参考文献6)。已经证明MUC16的C-末端部分(MUC16c114)能够通过转化永生化的3T3细胞，如通过增加的锚定非依赖生长、AKT和ERK途径的激活、增加的基质胶侵袭和增强的裸鼠异种移植物的生长测量得到的(参见第6.1节和下文第6.3.13节中的参考文献19)。这些效应依赖于MUC16的胞外域，而31个氨基酸的胞质尾巴的缺失对这些性质影响不大。胞外域促进致癌行为的机制尚未完全了解(参见下文第6.3.13节中的参考文献19)。虽然不存在共有的蛋白质结合结构域，但MUC16胞外域的58个氨基酸序列包括三个N-糖基化位点，其代表MUC16与其它细胞表面分子的潜在相互作用/调节位点。
酪氨酸激酶受体如表皮生长因子受体(EGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)及其它等的N-糖基化位点似乎与细胞凝集素如半乳糖凝集素-3相互作用以调节表面驻留、信号强度和细胞行为(见下文第6.3.13节参考文献12)。N-糖基化的影响取决于生长增强受体上N-糖基化位点的数量和半乳糖凝集素-3对复合N-糖基化种类的亲和力。来自细胞表面分子如转化生长因子-β(TGF-β)受体的反补体抑制信号的N-糖基化位点较少。这些受体对生长因子相关的高营养通量敏感，并在正常情况下提供抑制功能。然而，癌症相关糖蛋白与经典受体酪氨酸激酶相互作用的机制尚不清楚。MUC1、MUC4和MUC16都是重度糖基化的拴糖蛋白，其特征在于跨膜域的存在并在上皮癌中过表达(参见下文第6.3.13节中的参考文献10)。
该实施例(第6.3节)表明，MUC16的糖基化通过介导复合细胞表面相互作用在粘蛋白相关转化中起关键作用。
MUC16的C末端部分促进癌基因激活、基质胶侵袭和肿瘤生长。这些作用依赖于保留58个氨基酸的MUC16胞外域中两个近端N糖基化位点的MGAT5依赖性糖基化。更远端的MUC16串联重复区域中的N-和O-糖基化位点都不能在功能上替代这两个位点。MUC16糖基化的模式是多种多样的，但是壳二糖干表征了所有N-糖基化种类的基础。抗近端含壳二糖的MUC16糖肽的抗体阻断半乳糖凝集素3介导的与细胞表面信号受体的结合并抑制MUC16的肿瘤促进作用。
使用了MUC16糖肽的系统性改变以直接考察聚糖结构与MUC16表达所起肿瘤促进作用之间的关系。这些作用，包括共定位、癌基因激活、基质胶原侵袭和肿瘤异种生物生长，都由半乳糖凝集素-3介导的MUC16的保留的、非循环的部分上的N-糖基化序列和细胞表面分子如表皮生长因子受体(EGFR)和整合素β1的结合所表现。细胞外的、粘蛋白驱动的肿瘤促进是由本文提出的发现和数据所支持的机制，其可以被N-糖基化位点定向抗体成功靶向。
如本实施例所示：(1)MUC16的细胞外糖基化状态驱动卵巢浆液性癌症行为；(2)侵袭和MUC16+异种移植物生长取决于具体的MUC16N-糖基化位点；(3)MUC16与半乳糖凝集素-3和EGFR或整合素β1形成异三聚体复合物；和(4)抗糖基化位点抗体阻断胞外MUC16对肿瘤的促进。
6.3.2材料和方法
6.3.2.1 MUC16羧基末端(MUC16c114)、MUC16-CA125域(MUC16c344)和糖基化融合蛋白DNA构建体的合成
关于MUC16C-末端构建体的描述，参见第6.1.2和6.2.2节和下述第6.3.13节中的参考文献19。pFUSE-huMan IgG1-Fc2载体(pFUSE)购自InvivoGen(San Diego，CA)，嵌合蛋白MUC16c57-114-pFUSE和117-244LGALS3-pFUSE的构建也描述于6.1.2节和6.2.2节和下文第6.3.13节中的参考文献19。
6.3.2.2细胞培养，转染和细胞系表征
如第6.1.2节和第6.2.2节和下文第6.3.13节的参考文献19所述获得和维持SKOV3、CAOV3和OVCAR3细胞系。详见6.3.6节。
6.3.2.3糖肽的合成
关于MUC16糖肽合成的详细描述，参见第6.4节。
6.3.2.4基质胶侵袭
在基质胶侵袭室(BD Biosciences，Bedford，MA)中测定基底膜侵袭。用5μg/mL衣霉素(Sigma-Aldrich，St.Louis MO cat#T7765)或5μg/mL MUC16c57-c114-pFUSE或5μg/mL 117- 244LGALS3-pFUSE融合蛋白(5μg/mL)处理稳定的细胞系；然后在一式三份的孔中测量48小时后的基质胶迁移，并与phrGFP载体对照和MUC16c114转染子进行比较。另见第6.1.2和6.2.2节以及下文第6.3.13节中的参考文献19。
6.3.2.5无胸腺裸鼠的肿瘤生长
将转染的细胞系和适当的对照细胞系引入无胸腺雌性裸鼠的侧腹，并由纪念斯隆凯特琳癌症中心抗肿瘤评估核心实验室提供常规的动物护理。每周进行两次肿瘤测量，按照纪念斯隆凯特琳癌症中心研究动物资源中心指南，肿瘤生长记录至最大尺寸为1,500mm3。另见第6.1.2和6.2.2节以及下文第6.3.13节中的参考文献19。
6.3.2.6单克隆抗体制备；小鼠免疫方案
免疫方案开始于含壳二糖的55-mer MUC16糖肽(GlcNAc2-55-mer；SEQ ID NO：129)，其对5只BALB/c和5只瑞士韦伯斯特小鼠在佐剂存在下每3周施用三次。第四次免疫用KLH缀合的单糖基化的15-mer(GlcNAc2-15-mer-KLH；SEQ ID NO：131)和双糖基化的18-mer([GlcNAc2]2-18-mer-KLH；SEQ ID NO：130)MUC16构建体的混合物。分析血清对GlcNAc2-55-mer(SEQ ID NO：129)和未缀合的携带壳二糖的15/18-mer糖肽(分别为SEQ ID NO：131和SEQ ID NO：130)的反应性。此外，非糖基化的55-mer(SEQ ID NO：129)、15-mer(SEQ ID NO：131)和18-mer肽(SEQ ID NO：130)，以及两个MUC16无关的含壳二糖肽用作阴性对照进行筛选(SEQ ID NO：168和169)。每3周用更短的KLH缀合物(SEQ ID NO：130和SEQ ID NO：131)进一步免疫小鼠两次以上，每次免疫后通过ELISA分析响应。另见第6.2.2节。
6.3.2.7 ELISA
根据用于ELISA测定的常规核心实验室方案，进行三明治ELISA以评估抗体对个体(二醇)肽的阳性。另见第6.2.2节。
6.3.2.8 Western印迹分析
通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离等量的蛋白质，并使用BioRad转移装置在4℃下转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)或硝酸纤维素膜上。用3％牛血清白蛋白(BSA)或5％非脂肪乳在含有0.1％Tween-20(PBST)的PBS中在室温下封闭膜1小时。膜用多种一抗[CellSignaling，MA：Akt cat#9272，Phospho-Akt(Ser473)(193H12)cat#4058，p44/43 MAPK(Erk1/2)cat#9102，Phospho-p44/43 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)cat#9101，Src cat#2109S，Phospho-Src cat#2101L，EGFR cat#2237L，Phospho-EGFR(Y1068)(D7A5)XP(R)cat#3777S]，(Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，MO：β肌动蛋白cat#A5441)，(Southern BioTech，Birmingham，AL：抗人-Fc-IgG1-HRP cat#9054-05)，(Abgent，San Diego，CA：多克隆LGALS3抗体cat#AP11938b)和(Origene，Rockville，MD：小鼠单克隆抗EGFR v3克隆OTI3H2 cat#TA506224，小鼠单克隆抗DDK克隆4C5 cat#TA50011-100)在4℃下过夜显影。将膜用PBS-T洗涤三次，并在室温下用HRP缀合的抗小鼠或抗兔抗体(GE Healthcare，UK)(1:5000稀释)显影1小时。然后将膜用PBS-T洗涤三次，并在室温下用Western LightningChemiluminescence试剂(ECL，Perkin El-mer)显影1-5分钟，并将信号在HyBlot CL膜(Denville Scientific Inc.Metuchen，NJ)上显影。
关于Western印迹分析方案的描述，还参见6.1.2和6.2.2节和下述第6.3.13节中的参考文献6。
6.3.3组织微阵列免疫组织化学(TMA)
如前所述进行人TMA筛选的免疫组织化学(参见下文第6.3.13节中的参考文献6)。
6.3.4 OVCAR3、SKOV3-MUC16C344和SKOV3-MUC16C114的免疫荧光染色
将50,000个细胞分别接种在Delta TPG 0.17mm培养皿中，并在各自的培养基中于37℃在5％CO2中培养过夜。用含1％胎牛血清(FCS)和0.025％叠氮化钠(FACS缓冲液)的PBS洗涤粘附的细胞两次。细胞以1:50稀释后用EGFR(R-1)-Alexa Fluor 647nm(Santa CruzBiotechnology，CA，cat#sc-101AF647)和4H11或整联蛋白β1(4B7R)-Alexa Fluor 647nm(Santa Cruz Biotechnology，CA，cat#sc-9970 AF647)和4H11在4℃下染色30分钟。细胞用FACS缓冲液洗涤三次，然后用山羊抗小鼠IgG2b-PE(Santa Cruz Biotechnology，CA，cat#sc-3766-PE)在4℃下标记30分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤三次，并使用ZEN2采集软件在具有20x/0.8NA空气镜和63x/1.4NA油镜的Zeiss Axio Observer Z1上拍摄图像。
6.3.5统计分析
为了比较在生长和侵袭的体外和体内研究中评估的组，使用GraphPad Prism软件(SanDiego，CA)的双尾学生t检验分析数据的统计学显著性。
6.3.6细胞培养，转染和细胞系表征
参见6.3.13节关于OVCA-433细胞系的参考文献3。pLenti四环素可诱导系统购自Invitrogen，CA(cat#K4925-00)，并用于产生pLenti-SKOV3c114。通过纪念斯隆凯特林癌症中心高通量筛选(HTS)核心实验室获得了EGFR表达病毒质粒的shRNA发夹敲除；从HEK293细胞收集转染的HEK293细胞和病毒上清液以感染pLenti-SKOV3c114-shEGFR细胞系。MUC16c114转染子具有从推测切割位点到羧基末端(SEQ ID NO：150的氨基酸1777至1890)的MUC16蛋白的细胞表面表达(参见下文第6.3.13节中的参考文献21)。以类似的方式制备具有较长MUC16片段的细胞系，包括具有MUC16c344-GFP载体表达的细胞系，其具有作为延伸至MUC16羧基端的344个氨基酸片段的MUC16蛋白的细胞表面表达(SEQ ID NO：150的氨基酸1547至1890)(参见下文第6.3.13节中的参考文献19和22)。
6.3.7转染
根据制造商的方案，使用DOTAP(Roche Diagnostics，Indianapolis Corporation，IN)将DNA构建体引入SKOV3细胞。在其培养基中用800μg/mL的G418选择SKOV3细胞的稳定转染子。它们被细胞分选两次用于GFP表达，选择的细胞以多达15代的细胞系生长。进行FACS分析的常规监测，以确认这些细胞系的GFP阳性。通过使用抗hrGFP(Stratagene，La Jolla，CA)和抗-MUC16-羧基末端单克隆抗体的Western印迹分析这些细胞系的蛋白提取物(参见下文第6.3.13节中的参考文献19)。如6.1节所述，根据制造商的方案，将MUC16c57-114-pFUSE-hIgG1-Fc2和117-244LGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2构建体分别转染到的人胚胎肾(HEK)FreeStyle 293F细胞(Invitrogen，CA)中，其表达融合蛋白并分泌至无血清培养基中(见第6.1节和下文第6.3.13节中的参考文献19)。纯化分泌的融合蛋白并使用抗人IgG1-Fc-HRP(γ1链特异性)(Southern Biotech Inc.，Birmingham，AL)或4H11-HRP或多克隆抗人LGALS3抗体(Abgent，San Diego，CA)的Western印迹分析进行表征。在HEK293细胞中表达的EGFRDDK-HIS(cat#TP700043)、LGALS3Myc-DDK(cat#TP308785)和整联蛋白-β1Myc-DDK(cat#TP303818)纯化的蛋白购自Origene，Rockville，MD。
6.3.8通过FACS分析的免疫荧光染色
如第6.1节和下文第6.3.13节中的参考文献6所述进行MUC16表达FACS分析。
6.3.9生长曲线
如第6.1节和第6.2节以及下文第6.3.13节中的参考文献18和19中所述进行生长曲线。
6.3.10命名
如实施例3(第6.3节)所用，“N1”是指SEQ ID NO：150的位点1777的天冬酰胺，也称为“Asn1777”。如实施例3(6.3节)所用，“N24”是指SEQ ID NO：150的位点1800的天冬酰胺，也称为“Asn1800”。如实施例3(6.3节)所用，“N30”是指SEQ ID NO：150的位点1806的天冬酰胺，也称为“Asn1806”。
6.3.11结果
6.3.11.1 MUC16病理生物学依赖于C端MUC16胞外域的N-糖基化
C-末端MUC16胞外域(MUC16c114)的最近端114个氨基酸的表达导致3T3小鼠成纤维细胞的更积极的体外/体内行为，包括MUC16驱动的基质胶侵袭的显著增加和更快速的肿瘤体内增长(见第6.1节和下文第6.3.13节参考文献19)。为了考察MUC16的作用及其在人卵巢细胞中的糖基化作用，检测了MUC16阴性SKOV3人卵巢细胞系的MUC16表达的影响(图18A-18C)。用MUC16c114稳定表达载体转染SKOV3细胞导致高水平的细胞表面MUC16表达，大于基质胶侵袭中的两倍增加，如图19A所示。细胞暴露于N-糖基化抑制剂衣霉素24小时显著地降低了SKOV3-MUC16c114细胞的侵袭性，但对SKOV3-phrGFP仅载体转染细胞的基质胶侵袭几乎没有影响(图19A)。
凝集素在之前已经涉及糖基化作用的介导(参见下文第6.3.13节中的参考文献17)，并且由于半乳糖凝集素-3通常在人类卵巢癌中过表达，因此通过将半乳糖凝集素-3的糖结合域(117-244LGALS3)与缺少可变结合域的截短的pFUSE-人IgG1-Fc2序列(pFUSE)(参见下文6.3.13节中的参考文献1)进行组合产生了凝集素阻断构建体(“117-244LGALS3-pFUSE”)。该嵌合分子结合半乳糖凝集素-3配体，但缺乏形成半乳糖凝集素-3五聚体的能力。如图19A所示，当将该半乳糖凝集素阻断构建体导入细胞时，其对对照SKOV3-phrGFP细胞的基质胶侵袭影响不大，但SKOV3-MUC16c114侵袭显著降低。缺少半乳糖凝集素-3糖结合域的对照pFUSE载体没有作用。还通过将相同的pFUSE载体与MUC16胞外域的58个氨基酸连接而构建产生了可溶性MUC16胞外域(“MUC16c57-114-pFUSE”)。与半乳糖凝集素-3-pFUSE(117-244LGALS3-pFUSE)阻断构建体相同，MUC16c57-114-pFUSE构建体也显著降低SKOV3-MUC16c114细胞的侵袭，而不是SKOV3-phrGFP细胞的侵袭。MGAT5是催化形成具有对半乳糖凝集素-3结合的最高亲和力的四触角N-聚糖的糖基化酶(参见下文第6.3.13节参考文献9)。MGAT5敲除小鼠对肿瘤生长有抗性(参见下文第6.3.13节参考文献8)。不受任何特定理论的约束，假设MUC16的作用将依赖于半乳糖凝集素-3和MGAT5的表达。如图19B所示，减少MGAT5或半乳糖凝集素-3(LGALS3)的shRNA显著降低SKOV3-MUC16c114侵袭，而阴性对照敲低薄层(Lamelli)shRNA无效果。
引入突变至MUC16胞外域N-糖基化位点(MUC16c114胞外域的N1，N24和N30位置的天冬酰胺残基)降低观察到的MUC16-糖基化依赖性变化。如图19C所示，与切割位点相邻的最远端的天冬酰胺(N1)的天冬酰胺至丙氨酸的突变对侵袭没有负面影响。相比之下，任何更近端的天门冬酰胺(N24或N30)的天冬酰胺至丙氨酸突变都不利地影响了侵袭。特别地，最靠近膜表面(N30)的天冬酰胺的保存对于增强侵袭是最关键的，并且通过额外的其他天冬酰胺残基的天冬酰胺至丙氨酸的突变没有显著增加这种作用。还检测了来自MUC16C-末端(MUC16c344)的具有344个氨基酸的更大的MUC16构建体。当将在MUC16c344的N30或MUC16c344的N24和N30携带MUC16突变的表达载体转染到SKOV3细胞系中时，基质胶侵袭显著降低(图19D)。尽管这个更大的构建体在切割位点的远端具有另外七个N-糖基化位点，但突变关键的近端N24和N30位点仍然降低了基质胶侵袭，如图19D所示，正如那些突变改变了SKOV3-MUC16c114的侵袭一样。
已经证明了3T3细胞的MUC16c114转化中的ERK和PI3K/AKT途径的下游激活(参见第6.1节和下文第6.3.13节中的参考文献19)。在图19E，可以看出用MUC16c114转染SKOV3细胞激活多种致癌基因，包括pERK1/2，pSRC和EGFR的磷酸化。图19E证实，以下每种条件均影响MUC16c114诱导的致癌基因激活：敲低MGAT5(shMGAT5)，敲低半乳糖凝集素-3(shLGALS3)，将N30的天冬酰胺突变为丙氨酸。这些数据与在MUC16c114表达相关的基质胶侵袭中观察到的降低一致。
在裸小鼠的异种移植肿瘤生长中检测了敲低MGAT5或LGALS3或MUC16c114胞外域N-糖基化位点突变的作用。如图19F所示，用任何这些N-糖基化定向干预均完全消除了MUC16c114诱导的肿瘤生长。还研究了MUC16c114对受体稳定性的影响。N-糖基化和连接到半乳糖凝集素晶格的存在已经与EGFR在细胞表面的稳定相关联(参见下文第6.3.13节参考文献11)。不受任何特定理论的约束，我们推测MUC16的增加的存在稳定了细胞表面的半乳糖凝集素晶格，从而使EGFR在细胞表面上稳定。如图20A所示，当使用FACS分析将稳定的SKOV3-MUC16c114转染子与仅载体对照相比时，SKOV3细胞的细胞表面上EGFR的存在增加。此外，在放线菌酮(CHX)处理以抑制新的EGFR合成后，与phrGFP载体对照相比，MUC16c114表达在细胞表面上几乎使EGFR翻倍。CHX处理后MUC16c114胞外域(4H11阳性)的稳定性不变。在稳定的SKOV3-MUC16c114和用CHX处理24小时的SKOV3-phrGFP细胞中通过Western印迹比较总EGFR相对时间，并将EGFR与β-肌动蛋白进行比较。光密度曲线(图20B)表明，与phrGFP载体对照相比，细胞表面MUC16c114的存在使EGFR稳定。为了排除这种影响与SKOV3稳定的MUC16c114克隆的选择有关的可能性，使用了四环素诱导型MUC16c114系统。如图20C所示，四环素暴露24小时对于用空phrGFP载体或稳定的CMV驱动的MUC16c114表达载体转染的对照SKOV3细胞的基质胶侵袭没有影响。在MUC16c114四环素诱导系统中，四环素暴露诱导的MUC16c114依赖性基质胶侵袭类似于稳定转染子，无论是对照还是MUC16c114。通过导入SKOV3细胞的降低EGFR表达的shRNA构建体(shEGFR)的稳定表达来检测EGFR的需求。shEGFR转染细胞的两种单细胞克隆都显示出明显降低的基质胶侵袭。与SKOV3-MUC16c114细胞系相比，四环素诱导的这两种shEGFR细胞系中MUC16c114的表达对基质胶侵袭的影响最小，证实SKOV3-MUC16c114诱导的基质胶侵袭与EGFR的表达相互依赖。通过Western印迹法研究了用四环素诱导的CHX处理的SKOV3-MUC16c114的EGFR稳定性，并与β-肌动蛋白进行比较。如图20D所示，CHX暴露24小时导致未诱导的MUC16(-)SKOV3细胞中总EGFR蛋白的稳定下降。当在SKOV3-MUC16c114(tet)细胞四环素诱导后进行相同的实验时，CHX诱导的EGFR损失率降低。MUC16不仅稳定了细胞的EGFR含量，而且与未诱导的SKOV3-MUC16c114(tet)细胞相比，其还稳定了四环素诱导的SKOV3-MUC16c114(tet)细胞中pEGFR表达水平(图21)。
6.3.11.2作为单克隆抗体(mAb)开发的表位模拟物的均质N-糖肽的合成
在将MUC16c114的N24和N30位点上的N-糖基化鉴定为MUC16作用的核心需要后，分析了从SKOV3-MUC16c114细胞系纯化的在N1和N24含有丙氨酸至天冬酰胺突变的MUC16c114突变糖肽的聚糖谱(图22)。因此，这种纯化的糖肽含有用于N-糖基化的单个天冬酰胺残基(N30)。纯化糖肽的糖组分析如图22A所示。其特征在于主要由截短的糖基化种类组成的多种N-糖基化模式，其共享附着岩藻糖和各种甘露糖残基的作为最小重复单元的常见的近端壳二糖(GlcNAc2)二糖(图22A)。
假设针对包含关键的N30糖基化位点的MUC-16-胞外域表位的抗体可能抑制MUC16与半乳糖凝集素晶格的相互作用，减少MUC16表达的不良反应，包括肿瘤生长和侵袭。因此，设计了在该N30位点用壳二糖糖基化的MUC16胞外域内各种长度的合成肽抗原(即分别为55、18和15个氨基酸长，分别为SEQ ID NO：129、131和130)。除了作为更大、更复杂的N-聚糖的共同最小基序之外，壳二糖也应该能够更好地暴露下面的肽以引发保留肽特异性的聚糖导向的抗体。
55-mer MUC16-胞外域N-糖肽(GlcNAc2-55-mer；SEQ ID NO：129)的合成是高度收敛的，并涉及方便保护的全长肽(55-mer)和壳二糖胺之间的偶联，然后使用我们的单烧瓶天冬氨酰基化/脱保护程序进行酸全局脱保护(参见第6.2节和第6.4节以及下文第6.3.13节中的参考文献7和20)。按照类似的方法，还通过收敛的天冬氨酰化制备了具有末端三聚甘露糖聚糖的更精细的Man3GlcNAc2-55-mer糖肽。
为了集中针对相关糖基化位点周围的较小尺寸表位的免疫应答，还合成了分别具有一个(N30)和两个壳二糖聚糖(N24和N30)的较短的15-和18-mer糖肽(图22C；分别为SEQ IDNO：131和130)，后者通过类似于Tn抗原(GalNAc-α-O-Ser/Thr)的簇显示，其已被证明是结合到一些mAbs所必须的(参见第6.2节和第6.4节以及下文第6.3.13节中的参考文献14-16)。然后通过N-末端半胱氨酸将这些糖肽与KLH载体蛋白缀合以产生相应的免疫原用于小鼠接种。
6.3.11.3用合成糖肽/糖缀合物进行小鼠接种和血清学分析
根据6.2和6.4节中描述的方案进行小鼠接种和血清采集。在用GlcNAc2-55-mer糖肽(SEQ ID NO：129，图22B)进行3次免疫后，随后用含有壳二糖的KLH缀合的构建体(单糖基化的15-mer(SEQ ID NO：131)和双糖基化的18-mer(SEQ ID NO：130))免疫，10只小鼠中只有2只显示出对两种55-mer(含和不含GlcNAc2(SEQ ID NO：129))的弱阳性ELISA信号，表明小鼠对55-mer免疫接种的免疫应答有限。用两种KLH缀合物(GlcNAc2-15-mer(SEQ ID NO:131)；和(GlcNAc2)2-18-mer(SEQ ID NO:130))的两次加强免疫接种导致针对较短糖肽的增强的免疫应答(IgG型)，特别是在两只小鼠(小鼠7和小鼠8)中。针对MUC16肽骨架的不同的、非糖基化的部分的4H11mAb显示出与15-mer/18-mer糖肽没有结合，表明与小鼠血清阳性分离的不同的识别表位。
通过ELISA进一步表征来自小鼠7的多克隆血清，并通过FACS在具有和不具有MUC16c114表达的几种细胞系中筛选。这些细胞分选研究证实了针对SKOV3-MUC16c114细胞和OVCAR3细胞的阳性信号，类似于抗MUC16 4H11抗体对照(参见下文第6.3.13节参考文献6)。缺乏MUC16的SKOV3-phrGFP对照细胞与小鼠7血清的结合是阴性的。
6.3.11.4糖基化导向的mAb的选择
收获小鼠7的脾脏，并将脾细胞与具有高融合效率的杂交瘤融合伴侣融合。选择上清液并通过ELISA筛选针对各个糖肽的反应性(图22C)。虽然多个上清液与GlcNAc2-15-mer和(GlcNAc2)2-18--mer糖肽具有反应性，但是筛选的杂交瘤上清液中没有一种在ELISA筛选中显示出对非糖基化肽的糖基化的高度选择性。MUC16特异性被保持，并且没有阳性上清液与壳二糖糖基化的不相关肽反应。4H11mAb识别的肽序列未见重叠。
在连续亚克隆之后，该方法提供了多个壳二糖-指导的初级mAb，其与MUC16-糖基化表位和同源非糖基化序列反应，而不与作为阴性对照的含有壳二糖的无关肽反应。在该池中，选择四种高亲和力抗体并进一步纯化用于表征。
6.3.11.5抗MUC16N30糖基化靶向/定向mAbs的表征
图23A中的ELISA显示了四种代表性抗体的验证性表征研究的结果。评估了候选抗体与各种合成肽的结合，并与识别MUC16-胞外域肽骨架的4H11抗体的结合进行比较。不相关的壳二糖连接的肽显示与所选择的任何抗聚糖-MUC16抗体都没有显著的结合。所有候选抗体对两种MUC16衍生的15-mer(即，非糖基化肽和相应的壳二糖糖肽)显示出相似的结合亲和力。携带替代糖部分(包括单GlcNAc、末端三聚甘露糖-壳二糖(Man3GlcNAc2)和岩藻糖基化壳二糖(GlcNAc2Fuc))的另外的合成糖肽基本上不改变抗体对用于免疫接种的壳二糖连接的MUC16肽的反应性。
还在表达差异糖基化的MUC16肽的细胞系的扩展组中测试了每种抗体的聚糖-MUC16c114和聚糖-MUC16c344特异性(表11)。在这些研究中，将SKOV3-phrGFP转染子与SKOV3-MUC16c114(全N-糖基化)、SKOV3-MUC16N24c114突变体(无N24糖基化位点)、SKOV3-MUC16N30c114(无N30糖基化位点)和SKOV3-MUC16N1-N24-N30c114(无N1、N24或N30糖基化位点)进行了对比。SKOV3-MUC16c114是指表达截短形式的MUC16的SKOV3细胞，其能够在N1、N24和N30进行N-糖基化。SKOV3-MUC16N24c114是指表达截短突变形式的MUC16的SKOV3细胞，其中对应于SEQ IDNO：150的Asn1800的氨基酸位置包含天冬酰胺至丙氨酸突变，因此在该位置不能进行N-糖基化位置。SKOV3-MUC16N30c114是指表达截短突变形式的MUC16的SKOV3细胞，其中对应于SEQID NO：150的Asn1806的氨基酸位置包含天冬酰胺至丙氨酸突变，因此在此不能进行N-糖基化位置。SKOV3-MUC16N1-N24-N30c114是指表达截短突变形式的MUC16的SKOV3细胞，其中对应于SEQ ID NO：150的Asn1777、Asn1800和Asn1806的氨基酸位置包含天冬酰胺至丙氨酸突变，因此不是能够在这些位置被N-糖基化。与ELISA数据一致，结果表明存在MUC16特异性靶向。
然而，与ELISA数据相反，MUC16胞外域中N24和N30糖基化位点的缺失降低了糖基化靶向的抗体反应性，而保留了对4H11抗体的反应性，从而证实了细胞表面SKOV3-MUC16c114的存在。具有延伸至344个氨基酸的MUC16C-末端链的细胞(例如SKOV3-MUC16c344)对N24或N30糖基化也具有相似的要求(表11)。此外，与针对聚糖-MUC16胞外域的抗体的反应性没有受到MGAT5的下调而减弱(表11)，证实N24/N30位点的壳二糖有助于抗体与全细胞的结合，而不管更复杂的分支(branching)。
表11.表11提供了4H11和四个GlcNAc2-MUC16胞外域单克隆抗体对N-糖基化位点修饰转染的SKOV3-MUC16的几何平均藻红蛋白(PE)荧光。4H11保留与所有细胞系(除了不表达MUC16的SKOV3-phrGFP系之外)的结合，而不管糖基化修饰，从而证实了细胞表面上的MUC16蛋白。当糖基化的N24和N30位点都失去时，MUC16c114和MUC16c344转染子的聚糖-MUC16抗体结合减少。MGAT5敲低细胞系的有限的反应性丧失证实，壳二糖对于每种GlcNAc2-MUC16胞外域抗体是必需的，而更广泛的支链具有有限的作用。
“G抗M”表示山羊抗小鼠。“PE”表示藻红蛋白.
评估了表征的四种代表性的MUC16糖基化抗体(18C6，10C6，19C11，7B12)和4H11的结合亲和力(表12)及其通过基质胶测定对SKOV3-MUC16c114转染子的侵袭的影响。如图23B-23D，新开发的抗体显示对基质胶侵袭的广泛抑制，而4H11的特征在于其不能阻断SKOV3-MUC16c114介导的侵袭，表明这些靶向MUC16胞外域中糖基化肽表位的抗体抑制了一些MUC16的关键生物学特性，其优于针对紧邻表位的抗体。所有MUC16糖基化抗体在表达天然全长MUC16的卵巢癌细胞(如CAOV3和OVCA-433细胞)中是抑制性的。这表明N24/N30糖基化位点对于MUC16的增强的侵袭性质是关键的，而其它MUC16N-和O-糖基化位点的存在不足以克服(overcome)阻断该关键表位的MUC16糖基化抗体。不受任何特定理论的束缚，我们预测抗体对半乳糖凝集素-3与MUC16的N24/30结合的抑制也会削弱EGFR的细胞表面稳定性。图23B-23D证实，当将这些抗体中的一种(10C6)引入细胞培养物时，四环素诱导的SKOV3-MUC16c114 (tet)的EGFR稳定作用被克服，并且暴露于CHX的细胞中EGFR损失速率与没有MUC16c114表达的未诱导的SKOV3-MUC16c114(tet)细胞系的相似。还在卵巢癌组织芯片中检测了抗体的免疫组织化学染色。如图23E所示，每个聚糖导向的MUC16胞外域抗体与石蜡固定的组织中的浆液性卵巢癌细胞结合，与其他基质组织的相互作用有限，类似于4H11的行为。最后，测试了10C6抗体对免疫受损小鼠中SKOV3-MUC16344生长的影响。使用SKOV3-MUC16c344细胞代替SKOV3-MUC16c114细胞作为具有多个N-和O-糖基化位点的MUC16阳性肿瘤细胞中抗体效应的更严格的测试。10C6抗体降低了MUC16c344细胞的基质胶侵袭(图23F)，并且当每周两次施用至荷瘤小鼠时，小鼠侧腹中SKOV3-MUC16c344肿瘤细胞的生长显著降低(图23G)。
表12.
*低计算置信度，未拟合解离率
**ka对于结合率测定而言过低
6.3.11.6 MUC16和其他细胞表面蛋白的半乳凝素依赖性共定位
MUC16稳定的EGFR似乎是卵巢癌细胞侵袭的重要驱动因素，并且这种相互作用取决于EGFR、适当的N-糖基化的MUC16蛋白胞外域和半乳糖凝集素-3的存在。用纯化的蛋白质评估这种相互作用，以建立这三种蛋白质之间必需/足够的三向相互作用。为此，使用了纯化的MUC16c57-114-pFUSE(在人胚胎肾[HEK]FreeStyle 293F细胞中产生)(作为相互作用的MUC16部分)，纯化的EGFR(由HEK293细胞产生)和纯化的半乳糖凝集素-3(LGALS3；使用HEK293细胞产生)蛋白。因为这些蛋白质是在人类细胞中产生的，所以它们被期望具有典型的天然糖基化种类。不受任何特定理论的约束，我们假设三种蛋白质将形成可通过免疫共沉淀鉴定的异聚体。图24A示出了这种免疫共沉淀的结果，其中检测的三种蛋白中的每一种都显示在左侧三个泳道的直接免疫印迹中。使用琼脂糖蛋白A/G PLUS珠，可以看出MUC16c57-114-pFUSE蛋白与蛋白A/G PLUS缀合的珠结合，并在SDS-PAGE凝胶上分离时存在于洗脱液中。EGFR仅存在于半乳糖凝集素-3(LGALS3)也存在时的与MUC16c57-114-pFUSE组合的洗脱液中。抗体18C6通过阻断半乳糖凝集素-3的N-糖基化结合位点而消除EGFR-MUC16相互作用(参见图24A)。直接分子双重免疫荧光成像也用于确认EGFR和MUC16在活细胞中的共定位。如图24B和25A所示，EGFR和MUC16紧密共定位在OVCAR3、SKOV3-MUC16c344和SKOV3-MUC16c114细胞中(参见图24B和25A中的箭头)。这些研究强烈证实MUC16组合半乳糖凝集素-3以与MUC16阳性卵巢癌细胞表面的EGFR结合。不受任何特定理论的约束，由于许多生长增强受体是糖基化的，我们推测，凝集素依赖性MUC16细胞表面效应可能包括其他N-糖基化蛋白，而不限于EGFR。整联蛋白经常在癌症中发生改变，并参与由间质-上皮相互作用启动的“外向内”信号，引发SRC磷酸化和其他下游作用。图24C描述了MUC16与整联蛋白β1的相互作用，整联蛋白β1是与癌症发展和进展频繁相关的整联蛋白成分。在EGFR的情况下，纯化的MUC16c57-114-pFUSE以半乳糖凝集素-3依赖性方式结合整联蛋白β1，并且该异源三聚相互作用需要所有3种蛋白质。与EGFR相同，该相互作用被抗MUC16c114糖基化位点阻断抗体18C6完全阻断。MUC16和整联蛋白β1的共定位也通过在几种卵巢癌细胞系中的双重免疫荧光证实(图24D和图25B)。因此，MUC16-胞外域表位的关键位点的N-糖基化以凝集素特异性方式介导与细胞表面蛋白受体的相互作用，以产生恶性行为的特征，包括基质胶侵袭、PI3K/ERK和SRC途径的活化，以及在免疫受损小鼠中增强的MUC16阳性肿瘤生长。
不受任何特定机制的约束，癌症相关粘蛋白MUC16的机理模型及其对卵巢癌细胞行为的影响如图26所示。在图26A中，MUC16通过半乳糖凝集素-3结合EGFR和整联蛋白β1，以增强能促进生长和侵袭的稳定性和“内向外”信号。当MUC16胞外域N-糖基化位点被突变或MGAT5活性被抑制时(图26B)，结合被阻止，并降低了EGFR/整联蛋白信号。类似地，如果半乳糖凝集素-3蛋白质表达被抑制(图26C)，则分子缔合丧失，信号和侵袭减少。最后，当MUC16-胞外域嵌合抗体或嵌合“TRAP”LGALS3分子阻止分子相互作用时，癌细胞缺少观察到的MUC16肿瘤促进特性(图26D)。
6.3.12讨论
MUC16和其他栓粘蛋白例如MUC1和MUC4可以转化3T3细胞并与不良结果相关。癌症中异常表达的粘蛋白的机制是复杂和多样的。我们很好地描述了N-糖基化模式在响应局部环境的细胞生长中起重要作用。糖蛋白模式的多样性受到通过基于高尔基体糖基化的环境依赖性己糖胺通量的影响。常见的生长因子受体如EGFR、胰岛素样生长因子受体(IGF1R)和PDGFR优选首先以营养依赖的方式糖基化，并且那些重度糖基化受体优先递送到细胞表面。相比之下，抑制性受体如TGF-β具有较少的N-糖基化位点，并且稍后呈现在细胞表面，从而导致生长程序的抑制(参见下文第6.3.13节参考文献12)。在卵巢癌中，EGFR表达与侵袭行为相关，EGFR信号传导依赖于受体的糖基化状态和N-糖基化种类对凝集素的亲和力(参见下文第6.3.13节中的参考文献2)。酶MGAT5似乎对于合成对半乳糖凝集素-3具有最高亲和力的四触角支链N-聚糖是重要的，所述半乳糖凝集素-3是一种在癌细胞中过表达的重要凝集素(参见下文第6.3.13节参考文献17)。
本实施例提供了证据，证明与MUC16表达相关的行为是通过这些方法在MUC16相对于细胞表面的最近端的胞外域上的特定N-糖基化位点介导的。与半乳糖凝集素-3和细胞表面蛋白的高亲和力相互作用需要MGAT5依赖的N-糖基化模式，以促进免疫受损小鼠的侵袭、癌基因激活和增加的肿瘤生长。特别地，切割后MUC16的保留的胞外域上最近端的N-糖基化对于这种相互作用至关重要。去除这些N-糖基化位点的干预、用模拟受体阻断位点或干扰其完全N-糖基化都会损害MUC16的转化作用。这些转化作用似乎不仅取决于单独的MUC16，还取决于N-糖基化的MUC16与半乳凝素-3和其他细胞表面蛋白在近端N-糖基化位点的相互作用。与亲本SKOV3phrGFP细胞相比，MUC16胞外域表达显示出能够稳定EGFR(一种生长和侵袭的介导物)并延长其在SKOV3-MUC16c114细胞表面的驻留。即使在仅保留一个N-糖基化位点的简化的MUC16糖肽模型中，糖基化的随机性质导致各种N-聚糖的存在，所有N-聚糖都通过共有的壳二糖干与MUC16蛋白骨架相连。因此，针对壳二糖连接(在N24/N30位点)的MUC16胞外域的MUC16c114聚糖肽表位制备抗体。这些新抗体(MUC16糖基化抗体)阻断MUC16增强的侵袭、癌基因激活和体内肿瘤生长。重要的是，这些MUC16糖基化抗体抑制具有全长MUC16表达以及具有较短的MUC16 C-末端表达的测试性截短的构建体的细胞中的MUC16相关性质。MUC16糖基化抗体在CHX存在下干扰了卵巢癌细胞表面的EGFR稳定性，并在裸小鼠中损伤了移植生长。此外，MUC16糖基化抗体的作用也阻止了纯化的MUC16与纯化的EGFR或整联蛋白β1在重组半乳糖凝集素-3存在下的相互作用。
本实施例揭示了粘蛋白过表达在癌症中的作用的见解。通过形成凝集素介导的低亲和力多分子复合物，MUC16能够以糖基化依赖的方式增强“外向内”信号转导。负责最大作用的特异性N-糖基化位点是独特的并且靠近细胞表面，而其他更远端的N-糖基化位点可能不那么重要。在临床开发中存在半乳糖凝集素-3抑制剂，但是模拟受体“半乳糖凝集素-3-TRAP”构建体或截短的“MUC16-TRAP”分子在本实施例的体外模型中具有相似的效果。本实施例中鉴定的MUC16糖基化抗体抑制MUC16的转化作用。
6.3.13参考文献
1.Ahmad,N.,Gabius,H.J.,Andre,S.,Kaltner,H.,Sabesan,S.,Roy,R.,Liu,B.,Macaluso,F.和Brewer,C.F.(2004).Galectin-3 precipitates as a penta-mer withsynthetic multivalent carbohydrates and forms heterogeneous cross-linkedcomplexes.J Biol Chem 279,10841-10847.
2.Alper,O.,Bergmann-Leitner,E.S.,Bennett,T.A.,Hacker,N.F.,Stromberg,K.和Stetler-Stevenson,W.G.(2001).Epidermal growth factor receptor signaling andthe invasive phenotype of ovarian carcinoma cells.J Natl Cancer Inst 93,1375-1384.
3.Bast,R.C.,Jr.,Feeney,M.,Lazarus,H.,Nadler,L.M.,Colvin,R.B.和Knapp,R.C.(1981).Reactivity of a monoclonal antibody with human ovarian carcinoma.TheJournal of clinical investigation 68,1331-1337.
4.Burton,D.R.和Mascola,J.R.(2015).Antibody responses to envelopeglycoproteins in HIV-1infection.Nat Immunol 16,571-576.
5.Dharma Rao,T.,Park,K.J.,Smith-Jones,P.,Iasonos,A.,Linkov,I.,Soslow,R.A.和Spriggs,D.R.(2010).Novel monoclonal antibodies against the proximal(carboxy-terminal)portions of MUC16.Appl Immunohistochem Mol Morphol 18,462-472.
6.Fernandez-Tejada,A.,Vadola,P.A.和Danishefsky,S.J.(2014).Chemicalsynthesis of the β-subunit of human luteinizing(hLH)and chorionicgonadotropin(hCG)glycoprotein hormones.J Am Chem Soc 136,8450-8458.
7.Granovsky,M.,Fata,J.,Pawling,J.,Muller,W.J.,Khokha,R.和Dennis,J.W.(2000).Suppression of tumor growth and metastasis in Mgat5-deficient mice.NatMed 6,306-312.
8.Hirabayashi,J.,Hashidate,T.,Arata,Y.,Nishi,N.,Nakamura,T.,Hirashima,M.,Urashima,T.,Oka,T.,Futai,M.,Muller,W.E.等，(2002).Oligosaccharide specificityof galectins:a search by frontal affinity chromatography.Biochim Biophys Acta1572,232-254.
9.Hollingsworth,M.A.和Swanson,B.J.(2004).Mucins in cancer:protection andcontrol of the cell surface.Nat Rev Cancer 4,45-60.
10.Lajoie,P.,Partridge,E.A.,Guay,G.,Goetz,J.G.,Pawling,J.,Lagana,A.,Joshi,B.,Dennis,J.W.和Nabi,I.R.(2007).Plasma membrane domain organizationregulates EGFR signaling in tumor cells.J Cell Biol 179,341-356.
11.Lau,K.S.,Partridge,E.A.,Grigorian,A.,Silvescu,C.I.,Reinhold,V.N.,Demetriou,M.和Dennis,J.W.(2007).Complex N-glycan number and degree ofbranching cooperate to regulate cell proliferation and differentiation.Cell129,123-134.
12.Mascola,J.R.和Haynes,B.F.(2013).HIV-1 neutralizing antibodies:understanding nature's pathways.Immunol Rev 254,225-244.
13.Mazal,D.,Lo-Man,R.,Bay,S.,Pritsch,O.,Deriaud,E.,Ganneau,C.,Medeiros,A.,Ubillos,L.,Obal,G.,Berois,N.等，(2013).Monoclonal antibodies towarddifferent Tn-amino acid backbones display distinct recognition patterns onhuman cancer cells.Implications for effective immuno-targeting ofcancer.Cancer Immunol Immunother 62,1107-1122.
14.Nakada,H.,Inoue,M.,Numata,Y.,Tanaka,N.,Funakoshi,I.,Fukui,S.,Mellors,A.和Yamashina,I.(1993).Epitopic structure of Tn glycophorin-a for an anti-Tnantibody(Mls-128).Proc Natl Acad Sci USA 90,2495-2499.
15.Osinaga,E.,Bay,S.,Tello,D.,Babino,A.,Pritsch,O.,Assemat,K.,Cantacuzene,D.,Nakada,H.和Alzari,P.(2000).Analysis of the fine specificity ofTn-binding proteins using synthetic glycopeptide epitopes and a biosensorbased on surface plasmon resonance spectroscopy.FEBS Lett 469,24-28.
16.Partridge,E.A.,Le Roy,C.,Di Guglielmo,G.M.,Pawling,J.,Cheung,P.,Granovsky,M.,Nabi,I.R.,Wrana,J.L.和Dennis,J.W.(2004).Regulation of cytokinereceptors by Golgi N-glycan processing and endocytosis.Science 306,120-124.
17.Rao,T.D.,Rosales,N.和Spriggs,D.R.(2011).Dual-fluorescence isogenichigh-content screening for MUC16/CA125 selective agents.Mol Cancer Ther 10,1939-1948.
18.Rao,T.D.,Tian,H.,Ma,X.,Yan,X.,Thapi,S.,Schultz,N.,Rosales,N.,Monette,S.,Wang,A.,Hyman,D.M.等，(2015).Expression of the carboxy-terminal portion ofMUC16/CA125 induces transformation and tumor invasion.PLoS One 10,e0126633.
19.Strausberg,R.L.,Feingold,E.A.,Grouse,L.H.,Derge,J.G.,Klausner,R.D.,Collins,F.S.,Wagner,L.,Shenmen,C.M.,Schuler,G.D.,Altschul,S.F.等，(2002).Generation and initial analysis of more than 15,000full-length human andmouse cDNA sequences.Proc Natl Acad Sci USA 99,16899-16903.
20.Wang,P.,Aussedat,B.,Vohra,Y.和Danishefsky,S.J.(2012).An advance in thechemical synthesis of homogeneous N-linked glycopolypeptides by convergentaspartylation.Angew Chem Int Edit 51,11571-11575.
21.Yin,B.W.,Dnistrian,A.和Lloyd,K.O.(2002).Ovarian cancer antigen CA125is encoded by the MUC16 mucin gene.Int J Cancer 98,737-740.
22.Yin,B.W.和Lloyd,K.O.(2001).Molecular cloning of the CA125 ovariancancer antigen:identification as a new mucin,MUC16.J Biol Chem 276,27371-27375.
6.4实施例4：补充化学信息
该实施例提供(a)实施例2和3(第6.2和6.3节)中描述的某些使用的方法和实验的更详细描述；和(b)与实施例2和3(第6.2和6.3节)相比的附加信息。
6.4.1一般材料和方法
使用所有可商购的材料(Aldrich，Fluka，Novabiochem)，无需进一步纯化。N-α-Fmoc保护的氨基酸，伪脯氨酸二肽，Oxyma Pure和NovaSyn TG Sieber树脂购自Novabiochem。1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐(HATU)购自Genscript。(7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyAOP)购自OakwoodProducts，Inc。壳二糖八醋酸酯购自Carbosynth Limited。TCEP溶液(0.5M，中性pH)和异双功能接头磺基-GMBS购自Pierce，ThermoScientific。所有其他试剂，包括血蓝蛋白(KLH)购自Aldrich。所有溶剂均为试剂级或HPLC级(Fisher Scientific)。无水四氢呋喃，乙醚，二氯甲烷，甲苯和苯由干溶剂体系(在氩气氛下通过中性氧化铝柱)得到，不经进一步干燥使用。
反应在预纯化的干燥氩气气氛下进行。空气和湿气敏感的液体和溶液通过注射器转移。通过用甲苯共沸除去水来干燥合适的碳水化合物试剂。分子筛在350℃下活化，并在使用前立即破碎，然后在真空下进行火焰干燥。通过在30℃以下的旋转蒸发将有机溶液减压浓缩。在Bruker Advance DRX-600MHz光谱仪上记录NMR光谱(1H和13C)，以TMS或残余溶剂为参考。使用JOEL JMS-DX-303-HF质谱仪或Waters Micromass ZQ质谱仪进行低分辨率质谱分析。在E.-merck硅胶60F254板上进行分析TLC，并在UV光(254nm)下或通过用钼酸铈铵(CAM)或5％硫酸在甲醇中染色显色。在E.-merck 230-400目硅胶60上进行二氧化硅快速柱层析。
6.4.1.1 UPLC/LC-MS分析和RP-HPLC纯化。
所有反相色谱分离都涉及由在水中的0.05％三氟乙酸(TFA)(v/v)和在乙腈中的0.04％TFA组成的流动相。在具有光电二极管检测器和单四极杆质谱检测器的WatersAcquityTM Ultra Preformance液相色谱系统的UPLC-MS分析中监测反应进程，该检测器装备有Acquity UPLC BEH C18/C8/C4柱(1.7μm，2.1×100mm)，流速为0.3mL/min。使用VarianMicrosorb C18柱(150×2.0mm)、Varian Microsorb C8/C4柱(250×2.0mm)或Waters X-Bridge C18柱(150×2.1mm)在具有Waters 2996光电二极管阵列检测器的Waters 2695分离模块上进行分析LC-MS分析，流速为0.2mL/min。使用Agilent Dynamax反相HPLCMicrosorb C18/C8/C4柱(250×21.4mm)或Waters X-Bridge C18柱(150×19.0mm)，在装有Rainin UV-1检测器的Ranin HPLC溶剂输送系统上进行制备级HPLC纯化，流速为16.0mL/min。
6.4.2实验流程
6.4.2.1基于Fmoc的固相肽合成(SPPS)
在CEM Liberty微波肽合成仪上进行自动肽合成。在NovaSyn TG Sieber树脂上用标准Fmoc方案合成肽。解块(deblock)混合物由Oxyma Pure(0.1M)的20％哌啶/DMF溶液组成。使用来自Novabiochem的以下Fmoc氨基酸：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Dmcp)-OH、Fmoc-Asp(OMpe)-OH、Fmoc-Asp(OPp)-OH、Fmoc-Asp(OAllyl)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Dmcp)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH。使用以下Dmb(2,4-二甲氧基苄基)和伪脯氨酸二肽(Novabiochem)：Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH、Fmoc-Gly-Thr(ψMe,MePro)-OH、Fmoc-Phe-Thr(ψMe,MePro)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(ψMe,MePro)-OH。
6.4.2.2肽树脂的N末端乙酰化
当以0.1mmol的规模自动合成完成时，将肽树脂用DMF(2mL)洗涤到肽合成容器中，并用乙酸酐(188μL，2mmol)和DIEA(384μL，2.2mmol)的DMF(2mL)溶液处理。将混合物通过温和的氮气鼓泡振荡1小时，然后用DMF和CH2Cl2洗涤，然后进行脱烯丙基化。
6.4.2.3天冬氨酸侧链的树脂上脱烯丙基化，Asp(OAllyl)
用Pd(PPh3)4(7.5mg，6.5μmol)和苯基硅烷(75μL，0.6mmol)在DMF/CH2Cl2(4mL，1:1)中处理N-乙酰化树脂结合的肽(0.1mol)。在轻微的氮气鼓泡20分钟后，重复Pd(PPh3)4/苯基硅烷处理两次。然后用DMF、CH2Cl2和甲醇洗涤肽-树脂，并在真空下干燥。
6.4.2.4从树脂切割[和同时的Asp(O-2-PhiPr)侧链脱保护，在适用情况下]
干燥后，将肽-树脂用裂解混合物(1％TFA/CH2Cl2，4mL)处理5个循环×5分钟，该过程重复四次。另外的裂解顺序包括用1.5％TFA/CH2Cl2(4mL 5循环×5分钟)和2％TFA/CH2Cl2(4mL 5循环×5分钟)处理。裂解溶液的各部分分别收集在冰冷的Et2O中并浓缩。将相应的油状残余物重新悬浮于最少量的三氟乙醇中，并用水沉淀。立即将所得混合物冻干，得到带有C末端酰胺的粗制受保护的肽。
6.4.2.5部分保护的全长肽(55-mer)与聚糖胺通过Lansbury天冬氨酰化偶联，随后用混合物R去除酸不稳定保护基
将部分保护的全长肽(1.0当量)和聚糖胺(壳二糖：4.0当量；Man3GlcNAc2 1.6当量)合并并溶解在无水DMSO中。向该混合物中加入新鲜制备的PyAOP(4.0当量)的DMSO溶液，然后加入DIEA(6.0当量)。将反应混合物搅拌3小时，并加入1mL冰冷的水(0.05％TFA)淬火。通过离心分离形成的沉淀物，重悬于水/CH3CN(1：1，0.05％TFA)中，并立即冻干。
然后通过用混合物R(90％TFA，5％硫代苯甲醚，3％乙二硫醇，2％苯甲醚)(1mL)处理2小时，将受保护的糖肽进行全局酸脱保护。残余物用冰冷的Et2O(12mL)沉淀，将所得悬浮液离心，得到白色沉淀。将上清液倾析，并将沉淀用冰冷的乙醚(12mL)研磨。该过程总共重复三次，所得沉淀溶解于水/CH3CN(1:1，5％TFA)中并冻干。通过RP-HPLC纯化相应的粗糖肽。
6.4.2.6通过Lansbury/双Lansbury天冬氨酰化将部分保护的小型肽(15-和18-mer)与壳二糖胺偶联，随后除去酸不稳定保护基
将部分保护的肽(1.0当量)和壳二糖胺(3.0当量/对于双Lansbury天冬氨酰化为7.0当量)合并并溶解在无水DMSO中。向该混合物中加入新鲜制备的PyAOP(4当量/后一种情况下为6当量)的DMSO溶液，然后加入DIEA(分别为6当量/8当量)。将反应混合物搅拌2.5小时，并加入1mL冰冷的水(0.05％TFA)淬火。通过离心分离形成的沉淀物，重悬于水/CH3CN(1:1，0.05％TFA)中，并立即冻干。
然后通过用TFA混合物(94％TFA，2.5％H2O，2.5％EDT，1％TIPSH)(1mL)处理2小时，将受保护的糖肽进行全局酸脱保护。残余物用冰冷的Et2O(12mL)沉淀，将悬浮液离心，得到白色沉淀。将上清液倾析，并将沉淀用冰冷的乙醚(12mL)研磨。该过程总共重复三次，将所得沉淀物溶于水/CH3CN(1:1，0.05％TFA)中并冻干。通过RP-HPLC纯化相应的粗糖肽。
6.4.2.7 15/18-mer糖肽的KLH-缀合
首先将KLH与异双功能交联剂磺基-GGBS)在pH7磷酸盐缓冲盐水(PBS)中孵育2小时。通过尺寸排阻色谱法(分别通过Bio-Gel P-10细柱)除去未结合的交联剂，然后获得马来酰亚胺活化的KLH。将带有末端硫醇官能团的新鲜去保护的(糖)肽与含有马来酰亚胺的KLH在pH7PBS中混合，并在室温下温育6小时。此后，使用Amicon Ultra-4离心过滤器(50 000截留分子量)除去未反应的(糖)肽。最后，获得作为PBS溶液的相应的KLH缀合物。
6.4.3全长MUC16糖肽(55-MER)的合成
6.4.3.1含有壳二糖的全长糖肽的合成
根据6.4.2.1的方法完成自动合成后，将肽树脂进行N-乙酰化和脱烯丙基化(分别参见6.4.2.2和6.4.2.3节)，以提供在树脂切割后(见第6.4.2.4节)，在Asp30侧链上具有游离羧酸的部分保护的肽p55-mer[N1-S55]。通过硅胶柱色谱法纯化该粗肽的一部分，用5→12％MeOH/CH2Cl2洗脱，冷冻干燥后得到作为白色固体的肽p55-mer[N1-S55](70mg)。图27A描绘了侧链保护的N-乙酰化的55-mer肽酰胺。图27B描绘了来自用于糖肽p55-mer[N1-S55]的UPLC分析的ESI-MS和UV示踪。
根据6.4.2.6节，将肽p55-mer[N1-S55](20mg，2.0μmol)和壳二糖(GlcNAc2)端基异构胺(3.5mg，8.1μmol)合并并溶于无水DMSO(100μL)。然后加入PyAOP(4.3mg，8.1μmol)的DMSO(30μL)溶液，然后加入DIEA(2.0μL，12.2μmol)。将金黄色混合物搅拌3小时，加入1mL冰冷水(0.05％TFA)淬火，冷冻干燥。
然后将保护的糖肽用混合物R(1.0mL)处理2小时，用冰冷的Et2O沉淀，离心，重新悬浮并如第6.4.2.6节所述冻干。将粗肽溶解在25％乙腈/水(0.05％TFA)(2mL)中，并通过HPLC在X-Bridge C18柱上纯化，使用25-35％乙腈水溶液(0.05％TFA)的线性梯度30分钟。收集含有20分钟洗脱的所需产物的级分并冻干，得到糖肽“55-mer(壳二糖)[N1-S55]”(GlcNAc2-55-mer)(3.0mg，22％产率)，为白色固体(图28A)。图28B提供来自UPLC分析的糖肽“55-mer(壳二糖)[N1-S55]”(GlcNAc2-55-mer)的ESI-MS和UV示踪。
6.4.3.2含有五糖的全长糖肽的合成
根据6.4.2.6节，将肽p55-mer[N1-S55](10mg，1.0μmol)和五糖Man3GlcNAc2端基异构胺(1.5mg，1.6μmol)合并并溶解在无水DMSO(30μL)中。然后加入PyAOP(2.1mg，4.1μmol)的DMSO(5μL)溶液，然后加入DIEA(1.0μL，6.1μmol)。将金黄色混合物搅拌3小时，加入1mL冰冷水(0.05％TFA)淬火，冷冻干燥。
然后将保护的糖肽经受用混合物R(1.0mL)处理2小时，用冰冷的Et2O沉淀，离心，重新悬浮并如第6.4.2.6节所述冻干。将粗肽溶解在25％乙腈/水(0.05％TFA)(2mL)中，并通过HPLC在X-Bridge C18柱上纯化，使用25-35％乙腈水溶液(0.05％TFA)的线性梯度30分钟。收集含有18分钟洗脱的所需产物的级分并冻干，得到糖肽“55-mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]”(Man3GlcNAc2-55-mer)(1.5mg，20％产率)，为白色固体。图29A描绘了携带有Man3GlcNAc2的55-mer糖肽：“55-mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]”(Man3GlcNAc2-55-mer)。图29B描绘了对于糖肽“55-mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]”(Man3GlcNAc2-55-mer)的分析级HPLC分析的ESI-MS和UV示踪。
6.4.4小尺寸糖肽(15-MER和18-MER)的合成
6.4.4.1壳二糖-单糖基化15-mer的合成
根据6.4.2.1节完成自动合成后，将肽树脂进行N-乙酰化和脱烯丙基化(分别见第6.4.2.2节和第6.4.2.3节)，以提供从树脂裂解(参见第6.4.2.4节)后的在Asp30(对应于SEQ ID NO：150的Asn1806)侧链上具有游离羧酸的部分保护的肽p15-mer[C-G25-V38]。图30A。该肽不经进一步纯化用于下一步骤。
将肽p15-mer[C-G25-V38](10mg，3.8μmol)和壳二糖(GlcNAc2)端基异构胺(4.8mg，11.3μmol)合并并溶解在无水DMSO(80μL)中。加入PyAOP(5.9mg，11.3μmol)的DMSO(20μL)溶液，然后加入DIEA(2.6μL，15μmol)，将金黄色混合物搅拌2.5小时，冷冻并冻干。然后将受保护的糖肽用TFA混合物(1mL)处理2小时，用冰冷的乙醚沉淀，离心，重悬浮并根据第6.4.2.6节冻干。将粗肽溶于15％乙腈/水(0.05％TFA)(2mL)中，并在C18柱上使用15-35％乙腈水溶液(0.05％TFA)的线性梯度在30分钟内纯化。收集含有17分钟洗脱的所需产物的级分并冻干，得到糖肽“15-mer(壳二糖)[C-G25-V38]”(GlcNAc2-15-mer)(2.0mg，25％产率)，为白色固体。壳二糖-单糖基化的15-mer糖肽：15-mer(壳二糖)[C-G25-V38](GlcNAc2-15-mer)参见图30B。图30C描绘了用于糖肽“15-mer(壳二糖)[C-G25-V38]”(GlcNAc2-15-mer)的分析级HPLC分析的ESI-MS和UV示踪。
6.4.4.2壳二糖-双糖基化的18-mer的合成
根据6.4.2.1节完成自动化合成后，将肽-树脂进行N-乙酰化(见6.4.2.2)。然后，按照6.4.2.4节所述的方法，进行从树脂中切下并伴随去除OPp保护基，得到在Asp24和Asp30(分别对应于SEQ ID NO：150的Asn1800和Asn1806)侧链上带有游离羧酸的部分保护的肽p18-mer[C-T22-V38]。该肽不经进一步纯化用于下一步骤。参见图32A。
将肽p18-mer[C-T22-V38](30mg，9.1μmol)和壳二糖(GlcNAc2)端基异构胺(27mg，63.4μmol)合并并溶解在无水DMSO(150μL)中。然后将PyAOP(28.5mg，54.6μmol)加入到DMSO(50μL)中，然后加入DIEA(2.6μL，15μmol)，并将金黄色混合物搅拌2.5小时，冷冻并冻干。然后将受保护的糖肽用TFA混合物(1mL)处理2小时，用冰冷的乙醚沉淀，离心，重悬浮并根据第6.4.2.6节冻干。将粗肽溶解在15％乙腈/水(0.05％TFA)(6mL)中，并通过HPLC在C8柱上纯化，使用15-27％乙腈水溶液(0.05％TFA)的线性梯度在30分钟内纯化。收集含有15分钟洗脱的所需产物的级分并冻干，得到糖肽“18-mer(壳二糖)2[C-T22-V38]”[(GlcNAc2)2-18-mer](6.5mg，25％收率)，为白色固体。参见图32B。图32C描绘了用于糖肽“18-mer(壳二糖)2[C-T22-V38]”[(GlcNAc2)2-18-mer]的分析级HPLC分析的ESI-MS和UV示踪。
6.5 15-MER和18-MER MUC16糖肽的KLH缀合
糖肽“15-mer(壳二糖)[C-G25-V38]”和“18-mer(壳二糖)2[C-T22-V38]”被按照第6.4.2.7节所示流程缀合至KLH以提供对应的KLH缀合物，分别为GlcNAc2-15-mer-KLH和(GlcNAc2)2-18-mer-KLH。参见图33A和图33B。
7.序列表
表13.序列表.
8.等同
在本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指示通过引用并入。虽然为了清楚理解的目的，已经通过说明和示例的方式对前述发明进行了一些详细的描述，但是根据本发明的教导，对于本领域的普通技术人员将显而易见的是，可以在不脱离所附权利要求书的精神或范围的情况下做出对其的某些改变和修改。
序列表
<110> 纪念斯隆-凯特林癌症中心
<120> 抗MUC16抗体及其应用
<130> 13542-016-228
<150> 62/134,402
<151> 2015-03-17
<160> 175
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6 VH
<400> 1
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr Leu
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ala Asn Val Asp Thr Ala Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ser Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6 VL
<400> 2
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys Asn
100 105
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6 HCDR1 (KABAT)
<400> 3
Thr Leu Gly Met Gly Val Gly
1 5
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6 HCDR2 (KABAT)
<400> 4
His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6 HCDR3 (KABAT)
<400> 5
Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6 LCDR1 (KABAT)
<400> 6
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6 LCDR2 (KABAT)
<400> 7
Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6 LCDR3 (KABAT)
<400> 8
Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6 HCDR1 (CHOTHIA)
<400> 9
Gly Phe Ser Leu Asn Thr Leu Gly Met
1 5
<210> 10
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6 HCDR2 (CHOTHIA)
<400> 10
Trp Asp Asp
1
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6 HCDR3 (CHOTHIA)
<400> 11
Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6 LCDR1 (CHOTHIA)
<400> 12
Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6 LCDR2 (CHOTHIA)
<400> 13
Leu Val Ser
1
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6 LCDR3 (CHOTHIA)
<400> 14
Ile Arg Glu Leu Thr Arg
1 5
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6 HCDR1 (IMGT)
<400> 15
Gly Phe Ser Leu Asn Thr Leu Gly Met Gly
1 5 10
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6 HCDR2 (IMGT)
<400> 16
Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 17
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6 HCDR3 (IMGT)
<400> 17
Ser Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6 LCDR1 (IMGT)
<400> 18
Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr
1 5 10
<210> 19
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6 LCDR2 (IMGT)
<400> 19
Leu Val Ser
1
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6 LCDR3 (IMGT)
<400> 20
Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser
1 5
<210> 21
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12 VH
<400> 21
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ser Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro
50 55 60
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln
65 70 75 80
Val Phe Leu Lys Ile Ala Asn Val Asp Thr Ala Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12 VL
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Arg Lys Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Lys Ile Lys
100 105 110
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12 HCDR1 (KABAT)
<400> 23
Thr Val Gly Met Gly Val Gly
1 5
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12 HCDR2 (KABAT)
<400> 24
His Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12 HCDR3 (KABAT)
<400> 25
Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12 LCDR1 (KABAT)
<400> 26
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Arg Lys Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12 LCDR2 (KABAT)
<400> 27
Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12 LCDR3 (KABAT)
<400> 28
Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12 HCDR1 (CHOTHIA)
<400> 29
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val Gly Met
1 5
<210> 30
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12 HCDR2 (CHOTHIA)
<400> 30
Trp Asp Asp Glu
1
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12 HCDR3 (CHOTHIA)
<400> 31
Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp
1 5 10
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12 LCDR1 (CHOTHIA)
<400> 32
Ser Lys Ser Leu Arg Lys Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 33
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12 LCDR2 (CHOTHIA)
<400> 33
Tyr Met Ser
1
<210> 34
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12 LCDR3 (CHOTHIA)
<400> 34
Ser Leu Glu Tyr Pro Leu
1 5
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12 HCDR1 (IMGT)
<400> 35
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val Gly Met Gly
1 5 10
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12 HCDR2 (IMGT)
<400> 36
Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys
1 5
<210> 37
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12 HCDR3 (IMGT)
<400> 37
Thr Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12 LCDR1 (IMGT)
<400> 38
Lys Ser Leu Arg Lys Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 39
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12 LCDR2 (IMGT)
<400> 39
Tyr Met Ser
1
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12 LCDR3 (IMGT)
<400> 40
Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 41
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 19C11 VH
<400> 41
Gln Val Asn Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Lys Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Leu
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Ala Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Val Asn Val Gly Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 19C11 VL
<400> 42
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Leu Glu His Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 19C11 HCDR1 (KABAT)
<400> 43
Thr Leu Gly Met Gly Val Gly
1 5
<210> 44
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 19C11 HCDR2 (KABAT)
<400> 44
His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 45
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 19C11 HCDR3 (KABAT)
<400> 45
Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 46
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 19C11 LCDR1 (KABAT)
<400> 46
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 19C11 LCDR2 (KABAT)
<400> 47
Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 19C11 LCDR3 (KABAT)
<400> 48
Met Gln Gly Leu Glu His Pro Leu Thr
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 19C11 HCDR1 (CHOTHIA)
<400> 49
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Leu Gly Met
1 5
<210> 50
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 19C11 HCDR2 (CHOTHIA)
<400> 50
Trp Asp Asp
1
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 19C11 HCDR3 (CHOTHIA)
<400> 51
Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp
1 5 10
<210> 52
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 19C11 LCDR1 (CHOTHIA)
<400> 52
Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 53
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 19C11 LCDR2 (CHOTHIA)
<400> 53
Tyr Met Ser
1
<210> 54
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 19C11 LCDR3 (CHOTHIA)
<400> 54
Gly Leu Glu His Pro Leu
1 5
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 19C11 HCDR1 (IMGT)
<400> 55
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Leu Gly Met Gly
1 5 10
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 19C11 HCDR2 (IMGT)
<400> 56
Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 57
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 19C11 HCDR3 (IMGT)
<400> 57
Ala Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 19C11 LCDR1 (IMGT)
<400> 58
Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 59
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 19C11 LCDR2 (IMGT)
<400> 59
Tyr Met Ser
1
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 19C11 LCDR3 (IMGT)
<400> 60
Met Gln Gly Leu Glu His Pro Leu Thr
1 5
<210> 61
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16C5 VH
<400> 61
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr Leu
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ala Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 62
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16C5 VL
<400> 62
Glu Leu Asp Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Arg Ile Arg Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly
20 25 30
Ile Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ser Tyr Ser Ser
85 90 95
Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16C5 HCDR1 (KABAT)
<400> 63
Thr Leu Gly Met Gly Val Gly
1 5
<210> 64
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16C5 HCDR2 (KABAT)
<400> 64
His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 65
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16C5 HCDR3 (KABAT)
<400> 65
Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16C5 LCDR1 (KABAT)
<400> 66
Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly Ile Ser
1 5 10
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16C5 LCDR2 (KABAT)
<400> 67
Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16C5 LCDR3 (KABAT)
<400> 68
Leu Gly Gly Tyr Ser Tyr Ser Ser Thr Leu Thr
1 5 10
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16C5 HCDR1 (CHOTHIA)
<400> 69
Gly Phe Ser Leu Asn Thr Leu Gly Met
1 5
<210> 70
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16C5 HCDR2 (CHOTHIA)
<400> 70
Trp Asp Asp
1
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16C5 HCDR3 (CHOTHIA)
<400> 71
Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp
1 5 10
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16C5 LCDR1 (CHOTHIA)
<400> 72
Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly
1 5
<210> 73
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16C5 LCDR2 (CHOTHIA)
<400> 73
Gly Ala Ser
1
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16C5 LCDR3 (CHOTHIA)
<400> 74
Gly Tyr Ser Tyr Ser Ser Thr Leu
1 5
<210> 75
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16C5 HCDR1 (IMGT)
<400> 75
Gly Phe Ser Leu Asn Thr Leu Gly Met Gly
1 5 10
<210> 76
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16C5 HCDR2 (IMGT)
<400> 76
Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 77
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16C5 HCDR3 (IMGT)
<400> 77
Ala Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 78
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16C5 LCDR1 (IMGT)
<400> 78
Glu Asp Ile Tyr Ser Gly
1 5
<210> 79
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16C5 LCDR2 (IMGT)
<400> 79
Gly Ala Ser
1
<210> 80
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16C5 LCDR3 (IMGT)
<400> 80
Leu Gly Gly Tyr Ser Tyr Ser Ser Thr Leu Thr
1 5 10
<210> 81
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18C6 VH
<400> 81
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ser Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro
50 55 60
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln
65 70 75 80
Val Phe Leu Lys Ile Ala Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 82
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18C6 VL
<400> 82
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18C6 HCDR1 (KABAT)
<400> 83
Thr Val Gly Met Gly Val Gly
1 5
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18C6 HCDR2 (KABAT)
<400> 84
His Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 85
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18C6 HCDR3 (KABAT)
<400> 85
Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 86
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18C6 LCDR1 (KABAT)
<400> 86
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18C6 LCDR2 (KABAT)
<400> 87
Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18C6 LCDR3 (KABAT)
<400> 88
Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18C6 HCDR1 (CHOTHIA)
<400> 89
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val Gly Met
1 5
<210> 90
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18C6 HCDR2 (CHOTHIA)
<400> 90
Trp Asp Asp Glu
1
<210> 91
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18C6 HCDR3 (CHOTHIA)
<400> 91
Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp
1 5 10
<210> 92
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18C6 LCDR1 (CHOTHIA)
<400> 92
Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 93
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18C6 LCDR2 (CHOTHIA)
<400> 93
Tyr Met Ser
1
<210> 94
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18C6 LCDR3 (CHOTHIA)
<400> 94
Ser Leu Glu Tyr Pro Leu
1 5
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18C6 HCDR1 (IMGT)
<400> 95
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val Gly Met Gly
1 5 10
<210> 96
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18C6 HCDR2 (IMGT)
<400> 96
Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys
1 5
<210> 97
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18C6 HCDR3 (IMGT)
<400> 97
Thr Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 98
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18C6 LCDR1 (IMGT)
<400> 98
Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 99
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18C6 LCDR2 (IMGT)
<400> 99
Tyr Met Ser
1
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18C6 LCDR3 (IMGT)
<400> 100
Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 101
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6-18C6 VH共同序列
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> Xaa = Thr或Asn
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> Xaa = Ile或Lys
<220>
<221> 变体
<222> 30
<223> Xaa = Asn或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 32
<223> Xaa = Val或Leu
<220>
<221> 变体
<222> 39
<223> Xaa = Ser或Ile
<220>
<221> 变体
<222> 42
<223> Xaa = Pro或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 58
<223> Xaa = Glu或不存在
<220>
<221> 变体
<222> 63
<223> Xaa = Asn或Tyr
<220>
<221> 变体
<222> 74
<223> Xaa = Lys或Arg
<220>
<221> 变体
<222> 75
<223> Xaa = Ala或Asp
<220>
<221> 变体
<222> 76
<223> Xaa = Thr或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 86
<223> Xaa = Val或Ala
<220>
<221> 变体
<222> 89
<223> Xaa = Gly或Asp
<220>
<221> 变体
<222> 93
<223> Xaa = Thr, Ile或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 99
<223> Xaa = Thr, Ser或Ala
<400> 101
Gln Val Xaa Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Xaa Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Xaa Thr Xaa
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Xaa Arg Gln Xaa Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Xaa Asp Lys Tyr Tyr Xaa Pro
50 55 60
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Xaa Xaa Xaa Ser Lys Asn Gln
65 70 75 80
Val Phe Leu Lys Ile Xaa Asn Val Xaa Thr Ala Asp Xaa Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Xaa Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 102
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 VL共同序列
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> Xaa = Ile或Val
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> Xaa = Pro或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 30
<223> Xaa = Arg或Leu
<220>
<221> 变体
<222> 31
<223> Xaa = Lys或His
<220>
<221> 变体
<222> 79
<223> Xaa = Arg或Lys
<220>
<221> 变体
<222> 86
<223> Xaa = Glu或Gly
<220>
<221> 变体
<222> 96
<223> Xaa = Ser或Gly
<220>
<221> 变体
<222> 99
<223> Xaa = Tyr或His
<400> 102
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Xaa Xaa Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Xaa Xaa Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Xaa Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Xaa Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Xaa
85 90 95
Leu Glu Xaa Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR1 KABAT共同序列
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> Xaa = Lue或Val
<400> 103
Thr Xaa Gly Met Gly Val Gly
1 5
<210> 104
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR2 KABAT共同序列
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> Xaa = Glu或不存在
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> Xaa = Tyr或Asn
<400> 104
His Ile Trp Trp Asp Asp Xaa Asp Lys Tyr Tyr Xaa Pro Ala Leu Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 105
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR3 KABAT共同序列
<400> 105
Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 106
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR2 KABAT共同序列
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> Xaa = Arg或Leu
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> Xaa = Lys或His
<400> 106
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Xaa Xaa Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR2 KABAT共同序列
<400> 107
Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR3 KABAT共同序列
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> Xaa = Gly或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> Xaa = His或Tyr
<400> 108
Met Gln Xaa Leu Glu Xaa Pro Leu Thr
1 5
<210> 109
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6-18C6 HCDR1 CHOTHIA共同序列
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> Xaa = Asn或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> Xaa = Leu或Val
<400> 109
Gly Phe Ser Leu Xaa Thr Xaa Gly Met
1 5
<210> 110
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6-18C6 HCDR2 CHOTHIA共同序列
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> Xaa = Glu或不存在
<400> 110
Trp Asp Asp Xaa
1
<210> 111
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6-18C6 HCDR3 CHOTHIA共同序列
<400> 111
Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp
1 5 10
<210> 112
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR1 CHOTHIA共同序列
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> Xaa = Leu或Arg
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> Xaa = His或Lys
<400> 112
Ser Lys Ser Leu Xaa Xaa Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 113
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR2 CHOTHIA共同序列
<400> 113
Tyr Met Ser
1
<210> 114
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR3 CHOTHIA共同序列
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = Gly或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> Xaa = His或Tyr
<400> 114
Xaa Leu Glu Xaa Pro Leu
1 5
<210> 115
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6-18C6 HCDR1 IMGT共同序列
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> Xaa = Asn或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> Xaa = Val或Leu
<400> 115
Gly Phe Ser Leu Xaa Thr Xaa Gly Met Gly
1 5 10
<210> 116
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6-18C6 HCDR2 IMGT共同序列
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> Xaa = Glu或不存在
<400> 116
Ile Trp Trp Asp Asp Xaa Asp Lys
1 5
<210> 117
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6-18C6 HCDR3 IMGT共同序列
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = Thr, Ala或Ser
<400> 117
Xaa Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 118
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR1 IMGT共同序列
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> Xaa = Val或Leu
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> Xaa = His或Lys
<400> 118
Lys Ser Leu Xaa Xaa Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 119
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR2 IMGT共同序列
<400> 119
Tyr Met Ser
1
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR3 IMGT共同序列
<400> 120
Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 121
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c114 F引物
<400> 121
Cys Cys Ala Thr Gly Cys Gly Ala Thr Ala Thr Cys Gly Cys Cys Ala
1 5 10 15
Cys Cys Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Cys Thr Thr Cys Thr Cys
20 25 30
Gly Cys Cys Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr
35 40
<210> 122
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c114 R引物
<400> 122
Thr Ala Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys Gly Cys Thr Thr Gly Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ala Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Thr Cys Thr Ala
20 25 30
Gly Gly
<210> 123
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c344 F引物
<400> 123
Cys Cys Ala Thr Gly Cys Gly Ala Thr Ala Thr Cys Gly Cys Cys Ala
1 5 10 15
Cys Cys Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys
20 25 30
Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala
35 40 45
<210> 124
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c344 R引物
<400> 124
Thr Ala Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys Gly Cys Thr Thr Gly Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ala Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Thr Cys Thr Ala
20 25 30
Gly Gly
<210> 125
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c57-114 F引物
<400> 125
Cys Cys Ala Thr Gly Cys Gly Ala Thr Ala Thr Cys Ala Ala Ala Cys
1 5 10 15
Thr Thr Cys Thr Cys Gly Cys Cys Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr
20 25 30
<210> 126
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c57-114 R引物
<400> 126
Ala Gly Ala Thr Cys Thr Ala Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly Gly Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Thr Cys Ala Gly Ala Ala Thr Thr Cys Cys Cys Ala Gly
20 25 30
Thr
<210> 127
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 117-244LGALS3 F引物
<400> 127
Cys Cys Ala Thr Gly Cys Gly Ala Thr Ala Thr Cys Ala Cys Cys Thr
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ala Ala Cys Cys Thr Gly Cys Cys Thr Thr Thr Gly
20 25 30
<210> 128
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 117-244LGALS3 R引物
<400> 128
Ala Gly Ala Thr Cys Thr Ala Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly Thr Ala
1 5 10 15
Thr Ala Thr Gly Ala Ala Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Thr
20 25 30
<210> 129
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 55mer免疫肽
<400> 129
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser
50 55
<210> 130
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18mer免疫肽
<400> 130
Cys Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser
1 5 10 15
Ser Val
<210> 131
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 15mer免疫肽
<400> 131
Cys Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val
1 5 10 15
<210> 132
<211> 344
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c344
<400> 132
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Val Thr Gln Leu Gly Phe Tyr
1 5 10 15
Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Ala Pro Gln Asn
20 25 30
Leu Ser Ile Arg Gly Glu Tyr Gln Ile Asn Phe His Ile Val Asn Gln
35 40 45
Asn Leu Ser Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr Ile Thr Leu Leu
50 55 60
Arg Asp Ile Gln Asp Lys Val Thr Thr Leu Tyr Lys Gly Ser Gln Leu
65 70 75 80
His Asp Thr Phe Arg Phe Cys Leu Val Thr Asn Leu Thr Met Asp Ser
85 90 95
Val Leu Val Thr Val Lys Ala Leu Phe Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser
100 105 110
Leu Val Glu Gln Val Phe Leu Asp Lys Thr Leu Asn Ala Ser Phe His
115 120 125
Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Gln Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met
130 135 140
Glu Ser Ser Val Tyr Gln Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe
145 150 155 160
Tyr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Lys Ala
165 170 175
Gln Pro Gly Thr Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu Asp
180 185 190
Ala Leu Asn Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser Tyr Phe Ser
195 200 205
Asp Cys Gln Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn Arg His His Thr
210 215 220
Gly Val Asp Ser Leu Cys Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp
225 230 235 240
Arg Val Ala Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr
245 250 255
Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly
260 265 270
Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
275 280 285
Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile
290 295 300
Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys
305 310 315 320
Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser
325 330 335
His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
340
<210> 133
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c114
<400> 133
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50 55 60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65 70 75 80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85 90 95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100 105 110
Leu Gln
<210> 134
<211> 80
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c86
<400> 134
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly
20 25 30
Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu
35 40 45
Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln
50 55 60
Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
65 70 75 80
<210> 135
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c80
<400> 135
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50 55 60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65 70 75 80
Asp Leu Glu Asp Leu Gln
85
<210> 136
<211> 14507
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 不成熟的人MUC16氨基酸序列 (NP_078966.2)
<400> 136
Met Leu Lys Pro Ser Gly Leu Pro Gly Ser Ser Ser Pro Thr Arg Ser
1 5 10 15
Leu Met Thr Gly Ser Arg Ser Thr Lys Ala Thr Pro Glu Met Asp Ser
20 25 30
Gly Leu Thr Gly Ala Thr Leu Ser Pro Lys Thr Ser Thr Gly Ala Ile
35 40 45
Val Val Thr Glu His Thr Leu Pro Phe Thr Ser Pro Asp Lys Thr Leu
50 55 60
Ala Ser Pro Thr Ser Ser Val Val Gly Arg Thr Thr Gln Ser Leu Gly
65 70 75 80
Val Met Ser Ser Ala Leu Pro Glu Ser Thr Ser Arg Gly Met Thr His
85 90 95
Ser Glu Gln Arg Thr Ser Pro Ser Leu Ser Pro Gln Val Asn Gly Thr
100 105 110
Pro Ser Arg Asn Tyr Pro Ala Thr Ser Met Val Ser Gly Leu Ser Ser
115 120 125
Pro Arg Thr Arg Thr Ser Ser Thr Glu Gly Asn Phe Thr Lys Glu Ala
130 135 140
Ser Thr Tyr Thr Leu Thr Val Glu Thr Thr Ser Gly Pro Val Thr Glu
145 150 155 160
Lys Tyr Thr Val Pro Thr Glu Thr Ser Thr Thr Glu Gly Asp Ser Thr
165 170 175
Glu Thr Pro Trp Asp Thr Arg Tyr Ile Pro Val Lys Ile Thr Ser Pro
180 185 190
Met Lys Thr Phe Ala Asp Ser Thr Ala Ser Lys Glu Asn Ala Pro Val
195 200 205
Ser Met Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val Thr Asp Ser His Thr Pro Gly
210 215 220
Arg Thr Asn Pro Ser Phe Gly Thr Leu Tyr Ser Ser Phe Leu Asp Leu
225 230 235 240
Ser Pro Lys Gly Thr Pro Asn Ser Arg Gly Glu Thr Ser Leu Glu Leu
245 250 255
Ile Leu Ser Thr Thr Gly Tyr Pro Phe Ser Ser Pro Glu Pro Gly Ser
260 265 270
Ala Gly His Ser Arg Ile Ser Thr Ser Ala Pro Leu Ser Ser Ser Ala
275 280 285
Ser Val Leu Asp Asn Lys Ile Ser Glu Thr Ser Ile Phe Ser Gly Gln
290 295 300
Ser Leu Thr Ser Pro Leu Ser Pro Gly Val Pro Glu Ala Arg Ala Ser
305 310 315 320
Thr Met Pro Asn Ser Ala Ile Pro Phe Ser Met Thr Leu Ser Asn Ala
325 330 335
Glu Thr Ser Ala Glu Arg Val Arg Ser Thr Ile Ser Ser Leu Gly Thr
340 345 350
Pro Ser Ile Ser Thr Lys Gln Thr Ala Glu Thr Ile Leu Thr Phe His
355 360 365
Ala Phe Ala Glu Thr Met Asp Ile Pro Ser Thr His Ile Ala Lys Thr
370 375 380
Leu Ala Ser Glu Trp Leu Gly Ser Pro Gly Thr Leu Gly Gly Thr Ser
385 390 395 400
Thr Ser Ala Leu Thr Thr Thr Ser Pro Ser Thr Thr Leu Val Ser Glu
405 410 415
Glu Thr Asn Thr His His Ser Thr Ser Gly Lys Glu Thr Glu Gly Thr
420 425 430
Leu Asn Thr Ser Met Thr Pro Leu Glu Thr Ser Ala Pro Gly Glu Glu
435 440 445
Ser Glu Met Thr Ala Thr Leu Val Pro Thr Leu Gly Phe Thr Thr Leu
450 455 460
Asp Ser Lys Ile Arg Ser Pro Ser Gln Val Ser Ser Ser His Pro Thr
465 470 475 480
Arg Glu Leu Arg Thr Thr Gly Ser Thr Ser Gly Arg Gln Ser Ser Ser
485 490 495
Thr Ala Ala His Gly Ser Ser Asp Ile Leu Arg Ala Thr Thr Ser Ser
500 505 510
Thr Ser Lys Ala Ser Ser Trp Thr Ser Glu Ser Thr Ala Gln Gln Phe
515 520 525
Ser Glu Pro Gln His Thr Gln Trp Val Glu Thr Ser Pro Ser Met Lys
530 535 540
Thr Glu Arg Pro Pro Ala Ser Thr Ser Val Ala Ala Pro Ile Thr Thr
545 550 555 560
Ser Val Pro Ser Val Val Ser Gly Phe Thr Thr Leu Lys Thr Ser Ser
565 570 575
Thr Lys Gly Ile Trp Leu Glu Glu Thr Ser Ala Asp Thr Leu Ile Gly
580 585 590
Glu Ser Thr Ala Gly Pro Thr Thr His Gln Phe Ala Val Pro Thr Gly
595 600 605
Ile Ser Met Thr Gly Gly Ser Ser Thr Arg Gly Ser Gln Gly Thr Thr
610 615 620
His Leu Leu Thr Arg Ala Thr Ala Ser Ser Glu Thr Ser Ala Asp Leu
625 630 635 640
Thr Leu Ala Thr Asn Gly Val Pro Val Ser Val Ser Pro Ala Val Ser
645 650 655
Lys Thr Ala Ala Gly Ser Ser Pro Pro Gly Gly Thr Lys Pro Ser Tyr
660 665 670
Thr Met Val Ser Ser Val Ile Pro Glu Thr Ser Ser Leu Gln Ser Ser
675 680 685
Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ser Leu Gly Leu Thr Pro Leu Asn Thr Arg
690 695 700
His Pro Phe Ser Ser Pro Glu Pro Asp Ser Ala Gly His Thr Lys Ile
705 710 715 720
Ser Thr Ser Ile Pro Leu Leu Ser Ser Ala Ser Val Leu Glu Asp Lys
725 730 735
Val Ser Ala Thr Ser Thr Phe Ser His His Lys Ala Thr Ser Ser Ile
740 745 750
Thr Thr Gly Thr Pro Glu Ile Ser Thr Lys Thr Lys Pro Ser Ser Ala
755 760 765
Val Leu Ser Ser Met Thr Leu Ser Asn Ala Ala Thr Ser Pro Glu Arg
770 775 780
Val Arg Asn Ala Thr Ser Pro Leu Thr His Pro Ser Pro Ser Gly Glu
785 790 795 800
Glu Thr Ala Gly Ser Val Leu Thr Leu Ser Thr Ser Ala Glu Thr Thr
805 810 815
Asp Ser Pro Asn Ile His Pro Thr Gly Thr Leu Thr Ser Glu Ser Ser
820 825 830
Glu Ser Pro Ser Thr Leu Ser Leu Pro Ser Val Ser Gly Val Lys Thr
835 840 845
Thr Phe Ser Ser Ser Thr Pro Ser Thr His Leu Phe Thr Ser Gly Glu
850 855 860
Glu Thr Glu Glu Thr Ser Asn Pro Ser Val Ser Gln Pro Glu Thr Ser
865 870 875 880
Val Ser Arg Val Arg Thr Thr Leu Ala Ser Thr Ser Val Pro Thr Pro
885 890 895
Val Phe Pro Thr Met Asp Thr Trp Pro Thr Arg Ser Ala Gln Phe Ser
900 905 910
Ser Ser His Leu Val Ser Glu Leu Arg Ala Thr Ser Ser Thr Ser Val
915 920 925
Thr Asn Ser Thr Gly Ser Ala Leu Pro Lys Ile Ser His Leu Thr Gly
930 935 940
Thr Ala Thr Met Ser Gln Thr Asn Arg Asp Thr Phe Asn Asp Ser Ala
945 950 955 960
Ala Pro Gln Ser Thr Thr Trp Pro Glu Thr Ser Pro Arg Phe Lys Thr
965 970 975
Gly Leu Pro Ser Ala Thr Thr Thr Val Ser Thr Ser Ala Thr Ser Leu
980 985 990
Ser Ala Thr Val Met Val Ser Lys Phe Thr Ser Pro Ala Thr Ser Ser
995 1000 1005
Met Glu Ala Thr Ser Ile Arg Glu Pro Ser Thr Thr Ile Leu Thr
1010 1015 1020
Thr Glu Thr Thr Asn Gly Pro Gly Ser Met Ala Val Ala Ser Thr
1025 1030 1035
Asn Ile Pro Ile Gly Lys Gly Tyr Ile Thr Glu Gly Arg Leu Asp
1040 1045 1050
Thr Ser His Leu Pro Ile Gly Thr Thr Ala Ser Ser Glu Thr Ser
1055 1060 1065
Met Asp Phe Thr Met Ala Lys Glu Ser Val Ser Met Ser Val Ser
1070 1075 1080
Pro Ser Gln Ser Met Asp Ala Ala Gly Ser Ser Thr Pro Gly Arg
1085 1090 1095
Thr Ser Gln Phe Val Asp Thr Phe Ser Asp Asp Val Tyr His Leu
1100 1105 1110
Thr Ser Arg Glu Ile Thr Ile Pro Arg Asp Gly Thr Ser Ser Ala
1115 1120 1125
Leu Thr Pro Gln Met Thr Ala Thr His Pro Pro Ser Pro Asp Pro
1130 1135 1140
Gly Ser Ala Arg Ser Thr Trp Leu Gly Ile Leu Ser Ser Ser Pro
1145 1150 1155
Ser Ser Pro Thr Pro Lys Val Thr Met Ser Ser Thr Phe Ser Thr
1160 1165 1170
Gln Arg Val Thr Thr Ser Met Ile Met Asp Thr Val Glu Thr Ser
1175 1180 1185
Arg Trp Asn Met Pro Asn Leu Pro Ser Thr Thr Ser Leu Thr Pro
1190 1195 1200
Ser Asn Ile Pro Thr Ser Gly Ala Ile Gly Lys Ser Thr Leu Val
1205 1210 1215
Pro Leu Asp Thr Pro Ser Pro Ala Thr Ser Leu Glu Ala Ser Glu
1220 1225 1230
Gly Gly Leu Pro Thr Leu Ser Thr Tyr Pro Glu Ser Thr Asn Thr
1235 1240 1245
Pro Ser Ile His Leu Gly Ala His Ala Ser Ser Glu Ser Pro Ser
1250 1255 1260
Thr Ile Lys Leu Thr Met Ala Ser Val Val Lys Pro Gly Ser Tyr
1265 1270 1275
Thr Pro Leu Thr Phe Pro Ser Ile Glu Thr His Ile His Val Ser
1280 1285 1290
Thr Ala Arg Met Ala Tyr Ser Ser Gly Ser Ser Pro Glu Met Thr
1295 1300 1305
Ala Pro Gly Glu Thr Asn Thr Gly Ser Thr Trp Asp Pro Thr Thr
1310 1315 1320
Tyr Ile Thr Thr Thr Asp Pro Lys Asp Thr Ser Ser Ala Gln Val
1325 1330 1335
Ser Thr Pro His Ser Val Arg Thr Leu Arg Thr Thr Glu Asn His
1340 1345 1350
Pro Lys Thr Glu Ser Ala Thr Pro Ala Ala Tyr Ser Gly Ser Pro
1355 1360 1365
Lys Ile Ser Ser Ser Pro Asn Leu Thr Ser Pro Ala Thr Lys Ala
1370 1375 1380
Trp Thr Ile Thr Asp Thr Thr Glu His Ser Thr Gln Leu His Tyr
1385 1390 1395
Thr Lys Leu Ala Glu Lys Ser Ser Gly Phe Glu Thr Gln Ser Ala
1400 1405 1410
Pro Gly Pro Val Ser Val Val Ile Pro Thr Ser Pro Thr Ile Gly
1415 1420 1425
Ser Ser Thr Leu Glu Leu Thr Ser Asp Val Pro Gly Glu Pro Leu
1430 1435 1440
Val Leu Ala Pro Ser Glu Gln Thr Thr Ile Thr Leu Pro Met Ala
1445 1450 1455
Thr Trp Leu Ser Thr Ser Leu Thr Glu Glu Met Ala Ser Thr Asp
1460 1465 1470
Leu Asp Ile Ser Ser Pro Ser Ser Pro Met Ser Thr Phe Ala Ile
1475 1480 1485
Phe Pro Pro Met Ser Thr Pro Ser His Glu Leu Ser Lys Ser Glu
1490 1495 1500
Ala Asp Thr Ser Ala Ile Arg Asn Thr Asp Ser Thr Thr Leu Asp
1505 1510 1515
Gln His Leu Gly Ile Arg Ser Leu Gly Arg Thr Gly Asp Leu Thr
1520 1525 1530
Thr Val Pro Ile Thr Pro Leu Thr Thr Thr Trp Thr Ser Val Ile
1535 1540 1545
Glu His Ser Thr Gln Ala Gln Asp Thr Leu Ser Ala Thr Met Ser
1550 1555 1560
Pro Thr His Val Thr Gln Ser Leu Lys Asp Gln Thr Ser Ile Pro
1565 1570 1575
Ala Ser Ala Ser Pro Ser His Leu Thr Glu Val Tyr Pro Glu Leu
1580 1585 1590
Gly Thr Gln Gly Arg Ser Ser Ser Glu Ala Thr Thr Phe Trp Lys
1595 1600 1605
Pro Ser Thr Asp Thr Leu Ser Arg Glu Ile Glu Thr Gly Pro Thr
1610 1615 1620
Asn Ile Gln Ser Thr Pro Pro Met Asp Asn Thr Thr Thr Gly Ser
1625 1630 1635
Ser Ser Ser Gly Val Thr Leu Gly Ile Ala His Leu Pro Ile Gly
1640 1645 1650
Thr Ser Ser Pro Ala Glu Thr Ser Thr Asn Met Ala Leu Glu Arg
1655 1660 1665
Arg Ser Ser Thr Ala Thr Val Ser Met Ala Gly Thr Met Gly Leu
1670 1675 1680
Leu Val Thr Ser Ala Pro Gly Arg Ser Ile Ser Gln Ser Leu Gly
1685 1690 1695
Arg Val Ser Ser Val Leu Ser Glu Ser Thr Thr Glu Gly Val Thr
1700 1705 1710
Asp Ser Ser Lys Gly Ser Ser Pro Arg Leu Asn Thr Gln Gly Asn
1715 1720 1725
Thr Ala Leu Ser Ser Ser Leu Glu Pro Ser Tyr Ala Glu Gly Ser
1730 1735 1740
Gln Met Ser Thr Ser Ile Pro Leu Thr Ser Ser Pro Thr Thr Pro
1745 1750 1755
Asp Val Glu Phe Ile Gly Gly Ser Thr Phe Trp Thr Lys Glu Val
1760 1765 1770
Thr Thr Val Met Thr Ser Asp Ile Ser Lys Ser Ser Ala Arg Thr
1775 1780 1785
Glu Ser Ser Ser Ala Thr Leu Met Ser Thr Ala Leu Gly Ser Thr
1790 1795 1800
Glu Asn Thr Gly Lys Glu Lys Leu Arg Thr Ala Ser Met Asp Leu
1805 1810 1815
Pro Ser Pro Thr Pro Ser Met Glu Val Thr Pro Trp Ile Ser Leu
1820 1825 1830
Thr Leu Ser Asn Ala Pro Asn Thr Thr Asp Ser Leu Asp Leu Ser
1835 1840 1845
His Gly Val His Thr Ser Ser Ala Gly Thr Leu Ala Thr Asp Arg
1850 1855 1860
Ser Leu Asn Thr Gly Val Thr Arg Ala Ser Arg Leu Glu Asn Gly
1865 1870 1875
Ser Asp Thr Ser Ser Lys Ser Leu Ser Met Gly Asn Ser Thr His
1880 1885 1890
Thr Ser Met Thr Tyr Thr Glu Lys Ser Glu Val Ser Ser Ser Ile
1895 1900 1905
His Pro Arg Pro Glu Thr Ser Ala Pro Gly Ala Glu Thr Thr Leu
1910 1915 1920
Thr Ser Thr Pro Gly Asn Arg Ala Ile Ser Leu Thr Leu Pro Phe
1925 1930 1935
Ser Ser Ile Pro Val Glu Glu Val Ile Ser Thr Gly Ile Thr Ser
1940 1945 1950
Gly Pro Asp Ile Asn Ser Ala Pro Met Thr His Ser Pro Ile Thr
1955 1960 1965
Pro Pro Thr Ile Val Trp Thr Ser Thr Gly Thr Ile Glu Gln Ser
1970 1975 1980
Thr Gln Pro Leu His Ala Val Ser Ser Glu Lys Val Ser Val Gln
1985 1990 1995
Thr Gln Ser Thr Pro Tyr Val Asn Ser Val Ala Val Ser Ala Ser
2000 2005 2010
Pro Thr His Glu Asn Ser Val Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ser Ser
2015 2020 2025
Pro Tyr Ser Ser Ala Ser Leu Glu Ser Leu Asp Ser Thr Ile Ser
2030 2035 2040
Arg Arg Asn Ala Ile Thr Ser Trp Leu Trp Asp Leu Thr Thr Ser
2045 2050 2055
Leu Pro Thr Thr Thr Trp Pro Ser Thr Ser Leu Ser Glu Ala Leu
2060 2065 2070
Ser Ser Gly His Ser Gly Val Ser Asn Pro Ser Ser Thr Thr Thr
2075 2080 2085
Glu Phe Pro Leu Phe Ser Ala Ala Ser Thr Ser Ala Ala Lys Gln
2090 2095 2100
Arg Asn Pro Glu Thr Glu Thr His Gly Pro Gln Asn Thr Ala Ala
2105 2110 2115
Ser Thr Leu Asn Thr Asp Ala Ser Ser Val Thr Gly Leu Ser Glu
2120 2125 2130
Thr Pro Val Gly Ala Ser Ile Ser Ser Glu Val Pro Leu Pro Met
2135 2140 2145
Ala Ile Thr Ser Arg Ser Asp Val Ser Gly Leu Thr Ser Glu Ser
2150 2155 2160
Thr Ala Asn Pro Ser Leu Gly Thr Ala Ser Ser Ala Gly Thr Lys
2165 2170 2175
Leu Thr Arg Thr Ile Ser Leu Pro Thr Ser Glu Ser Leu Val Ser
2180 2185 2190
Phe Arg Met Asn Lys Asp Pro Trp Thr Val Ser Ile Pro Leu Gly
2195 2200 2205
Ser His Pro Thr Thr Asn Thr Glu Thr Ser Ile Pro Val Asn Ser
2210 2215 2220
Ala Gly Pro Pro Gly Leu Ser Thr Val Ala Ser Asp Val Ile Asp
2225 2230 2235
Thr Pro Ser Asp Gly Ala Glu Ser Ile Pro Thr Val Ser Phe Ser
2240 2245 2250
Pro Ser Pro Asp Thr Glu Val Thr Thr Ile Ser His Phe Pro Glu
2255 2260 2265
Lys Thr Thr His Ser Phe Arg Thr Ile Ser Ser Leu Thr His Glu
2270 2275 2280
Leu Thr Ser Arg Val Thr Pro Ile Pro Gly Asp Trp Met Ser Ser
2285 2290 2295
Ala Met Ser Thr Lys Pro Thr Gly Ala Ser Pro Ser Ile Thr Leu
2300 2305 2310
Gly Glu Arg Arg Thr Ile Thr Ser Ala Ala Pro Thr Thr Ser Pro
2315 2320 2325
Ile Val Leu Thr Ala Ser Phe Thr Glu Thr Ser Thr Val Ser Leu
2330 2335 2340
Asp Asn Glu Thr Thr Val Lys Thr Ser Asp Ile Leu Asp Ala Arg
2345 2350 2355
Lys Thr Asn Glu Leu Pro Ser Asp Ser Ser Ser Ser Ser Asp Leu
2360 2365 2370
Ile Asn Thr Ser Ile Ala Ser Ser Thr Met Asp Val Thr Lys Thr
2375 2380 2385
Ala Ser Ile Ser Pro Thr Ser Ile Ser Gly Met Thr Ala Ser Ser
2390 2395 2400
Ser Pro Ser Leu Phe Ser Ser Asp Arg Pro Gln Val Pro Thr Ser
2405 2410 2415
Thr Thr Glu Thr Asn Thr Ala Thr Ser Pro Ser Val Ser Ser Asn
2420 2425 2430
Thr Tyr Ser Leu Asp Gly Gly Ser Asn Val Gly Gly Thr Pro Ser
2435 2440 2445
Thr Leu Pro Pro Phe Thr Ile Thr His Pro Val Glu Thr Ser Ser
2450 2455 2460
Ala Leu Leu Ala Trp Ser Arg Pro Val Arg Thr Phe Ser Thr Met
2465 2470 2475
Val Ser Thr Asp Thr Ala Ser Gly Glu Asn Pro Thr Ser Ser Asn
2480 2485 2490
Ser Val Val Thr Ser Val Pro Ala Pro Gly Thr Trp Thr Ser Val
2495 2500 2505
Gly Ser Thr Thr Asp Leu Pro Ala Met Gly Phe Leu Lys Thr Ser
2510 2515 2520
Pro Ala Gly Glu Ala His Ser Leu Leu Ala Ser Thr Ile Glu Pro
2525 2530 2535
Ala Thr Ala Phe Thr Pro His Leu Ser Ala Ala Val Val Thr Gly
2540 2545 2550
Ser Ser Ala Thr Ser Glu Ala Ser Leu Leu Thr Thr Ser Glu Ser
2555 2560 2565
Lys Ala Ile His Ser Ser Pro Gln Thr Pro Thr Thr Pro Thr Ser
2570 2575 2580
Gly Ala Asn Trp Glu Thr Ser Ala Thr Pro Glu Ser Leu Leu Val
2585 2590 2595
Val Thr Glu Thr Ser Asp Thr Thr Leu Thr Ser Lys Ile Leu Val
2600 2605 2610
Thr Asp Thr Ile Leu Phe Ser Thr Val Ser Thr Pro Pro Ser Lys
2615 2620 2625
Phe Pro Ser Thr Gly Thr Leu Ser Gly Ala Ser Phe Pro Thr Leu
2630 2635 2640
Leu Pro Asp Thr Pro Ala Ile Pro Leu Thr Ala Thr Glu Pro Thr
2645 2650 2655
Ser Ser Leu Ala Thr Ser Phe Asp Ser Thr Pro Leu Val Thr Ile
2660 2665 2670
Ala Ser Asp Ser Leu Gly Thr Val Pro Glu Thr Thr Leu Thr Met
2675 2680 2685
Ser Glu Thr Ser Asn Gly Asp Ala Leu Val Leu Lys Thr Val Ser
2690 2695 2700
Asn Pro Asp Arg Ser Ile Pro Gly Ile Thr Ile Gln Gly Val Thr
2705 2710 2715
Glu Ser Pro Leu His Pro Ser Ser Thr Ser Pro Ser Lys Ile Val
2720 2725 2730
Ala Pro Arg Asn Thr Thr Tyr Glu Gly Ser Ile Thr Val Ala Leu
2735 2740 2745
Ser Thr Leu Pro Ala Gly Thr Thr Gly Ser Leu Val Phe Ser Gln
2750 2755 2760
Ser Ser Glu Asn Ser Glu Thr Thr Ala Leu Val Asp Ser Ser Ala
2765 2770 2775
Gly Leu Glu Arg Ala Ser Val Met Pro Leu Thr Thr Gly Ser Gln
2780 2785 2790
Gly Met Ala Ser Ser Gly Gly Ile Arg Ser Gly Ser Thr His Ser
2795 2800 2805
Thr Gly Thr Lys Thr Phe Ser Ser Leu Pro Leu Thr Met Asn Pro
2810 2815 2820
Gly Glu Val Thr Ala Met Ser Glu Ile Thr Thr Asn Arg Leu Thr
2825 2830 2835
Ala Thr Gln Ser Thr Ala Pro Lys Gly Ile Pro Val Lys Pro Thr
2840 2845 2850
Ser Ala Glu Ser Gly Leu Leu Thr Pro Val Ser Ala Ser Ser Ser
2855 2860 2865
Pro Ser Lys Ala Phe Ala Ser Leu Thr Thr Ala Pro Pro Thr Trp
2870 2875 2880
Gly Ile Pro Gln Ser Thr Leu Thr Phe Glu Phe Ser Glu Val Pro
2885 2890 2895
Ser Leu Asp Thr Lys Ser Ala Ser Leu Pro Thr Pro Gly Gln Ser
2900 2905 2910
Leu Asn Thr Ile Pro Asp Ser Asp Ala Ser Thr Ala Ser Ser Ser
2915 2920 2925
Leu Ser Lys Ser Pro Glu Lys Asn Pro Arg Ala Arg Met Met Thr
2930 2935 2940
Ser Thr Lys Ala Ile Ser Ala Ser Ser Phe Gln Ser Thr Gly Phe
2945 2950 2955
Thr Glu Thr Pro Glu Gly Ser Ala Ser Pro Ser Met Ala Gly His
2960 2965 2970
Glu Pro Arg Val Pro Thr Ser Gly Thr Gly Asp Pro Arg Tyr Ala
2975 2980 2985
Ser Glu Ser Met Ser Tyr Pro Asp Pro Ser Lys Ala Ser Ser Ala
2990 2995 3000
Met Thr Ser Thr Ser Leu Ala Ser Lys Leu Thr Thr Leu Phe Ser
3005 3010 3015
Thr Gly Gln Ala Ala Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser Pro Ile Ser
3020 3025 3030
Leu Ser Thr Glu Lys Glu Thr Ser Phe Leu Ser Pro Thr Ala Ser
3035 3040 3045
Thr Ser Arg Lys Thr Ser Leu Phe Leu Gly Pro Ser Met Ala Arg
3050 3055 3060
Gln Pro Asn Ile Leu Val His Leu Gln Thr Ser Ala Leu Thr Leu
3065 3070 3075
Ser Pro Thr Ser Thr Leu Asn Met Ser Gln Glu Glu Pro Pro Glu
3080 3085 3090
Leu Thr Ser Ser Gln Thr Ile Ala Glu Glu Glu Gly Thr Thr Ala
3095 3100 3105
Glu Thr Gln Thr Leu Thr Phe Thr Pro Ser Glu Thr Pro Thr Ser
3110 3115 3120
Leu Leu Pro Val Ser Ser Pro Thr Glu Pro Thr Ala Arg Arg Lys
3125 3130 3135
Ser Ser Pro Glu Thr Trp Ala Ser Ser Ile Ser Val Pro Ala Lys
3140 3145 3150
Thr Ser Leu Val Glu Thr Thr Asp Gly Thr Leu Val Thr Thr Ile
3155 3160 3165
Lys Met Ser Ser Gln Ala Ala Gln Gly Asn Ser Thr Trp Pro Ala
3170 3175 3180
Pro Ala Glu Glu Thr Gly Ser Ser Pro Ala Gly Thr Ser Pro Gly
3185 3190 3195
Ser Pro Glu Met Ser Thr Thr Leu Lys Ile Met Ser Ser Lys Glu
3200 3205 3210
Pro Ser Ile Ser Pro Glu Ile Arg Ser Thr Val Arg Asn Ser Pro
3215 3220 3225
Trp Lys Thr Pro Glu Thr Thr Val Pro Met Glu Thr Thr Val Glu
3230 3235 3240
Pro Val Thr Leu Gln Ser Thr Ala Leu Gly Ser Gly Ser Thr Ser
3245 3250 3255
Ile Ser His Leu Pro Thr Gly Thr Thr Ser Pro Thr Lys Ser Pro
3260 3265 3270
Thr Glu Asn Met Leu Ala Thr Glu Arg Val Ser Leu Ser Pro Ser
3275 3280 3285
Pro Pro Glu Ala Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Gly Thr Pro Gly Gly
3290 3295 3300
Thr Arg Gln Ser Leu Ala Thr Met Ser Ser Val Ser Leu Glu Ser
3305 3310 3315
Pro Thr Ala Arg Ser Ile Thr Gly Thr Gly Gln Gln Ser Ser Pro
3320 3325 3330
Glu Leu Val Ser Lys Thr Thr Gly Met Glu Phe Ser Met Trp His
3335 3340 3345
Gly Ser Thr Gly Gly Thr Thr Gly Asp Thr His Val Ser Leu Ser
3350 3355 3360
Thr Ser Ser Asn Ile Leu Glu Asp Pro Val Thr Ser Pro Asn Ser
3365 3370 3375
Val Ser Ser Leu Thr Asp Lys Ser Lys His Lys Thr Glu Thr Trp
3380 3385 3390
Val Ser Thr Thr Ala Ile Pro Ser Thr Val Leu Asn Asn Lys Ile
3395 3400 3405
Met Ala Ala Glu Gln Gln Thr Ser Arg Ser Val Asp Glu Ala Tyr
3410 3415 3420
Ser Ser Thr Ser Ser Trp Ser Asp Gln Thr Ser Gly Ser Asp Ile
3425 3430 3435
Thr Leu Gly Ala Ser Pro Asp Val Thr Asn Thr Leu Tyr Ile Thr
3440 3445 3450
Ser Thr Ala Gln Thr Thr Ser Leu Val Ser Leu Pro Ser Gly Asp
3455 3460 3465
Gln Gly Ile Thr Ser Leu Thr Asn Pro Ser Gly Gly Lys Thr Ser
3470 3475 3480
Ser Ala Ser Ser Val Thr Ser Pro Ser Ile Gly Leu Glu Thr Leu
3485 3490 3495
Arg Ala Asn Val Ser Ala Val Lys Ser Asp Ile Ala Pro Thr Ala
3500 3505 3510
Gly His Leu Ser Gln Thr Ser Ser Pro Ala Glu Val Ser Ile Leu
3515 3520 3525
Asp Val Thr Thr Ala Pro Thr Pro Gly Ile Ser Thr Thr Ile Thr
3530 3535 3540
Thr Met Gly Thr Asn Ser Ile Ser Thr Thr Thr Pro Asn Pro Glu
3545 3550 3555
Val Gly Met Ser Thr Met Asp Ser Thr Pro Ala Thr Glu Arg Arg
3560 3565 3570
Thr Thr Ser Thr Glu His Pro Ser Thr Trp Ser Ser Thr Ala Ala
3575 3580 3585
Ser Asp Ser Trp Thr Val Thr Asp Met Thr Ser Asn Leu Lys Val
3590 3595 3600
Ala Arg Ser Pro Gly Thr Ile Ser Thr Met His Thr Thr Ser Phe
3605 3610 3615
Leu Ala Ser Ser Thr Glu Leu Asp Ser Met Ser Thr Pro His Gly
3620 3625 3630
Arg Ile Thr Val Ile Gly Thr Ser Leu Val Thr Pro Ser Ser Asp
3635 3640 3645
Ala Ser Ala Val Lys Thr Glu Thr Ser Thr Ser Glu Arg Thr Leu
3650 3655 3660
Ser Pro Ser Asp Thr Thr Ala Ser Thr Pro Ile Ser Thr Phe Ser
3665 3670 3675
Arg Val Gln Arg Met Ser Ile Ser Val Pro Asp Ile Leu Ser Thr
3680 3685 3690
Ser Trp Thr Pro Ser Ser Thr Glu Ala Glu Asp Val Pro Val Ser
3695 3700 3705
Met Val Ser Thr Asp His Ala Ser Thr Lys Thr Asp Pro Asn Thr
3710 3715 3720
Pro Leu Ser Thr Phe Leu Phe Asp Ser Leu Ser Thr Leu Asp Trp
3725 3730 3735
Asp Thr Gly Arg Ser Leu Ser Ser Ala Thr Ala Thr Thr Ser Ala
3740 3745 3750
Pro Gln Gly Ala Thr Thr Pro Gln Glu Leu Thr Leu Glu Thr Met
3755 3760 3765
Ile Ser Pro Ala Thr Ser Gln Leu Pro Phe Ser Ile Gly His Ile
3770 3775 3780
Thr Ser Ala Val Thr Pro Ala Ala Met Ala Arg Ser Ser Gly Val
3785 3790 3795
Thr Phe Ser Arg Pro Asp Pro Thr Ser Lys Lys Ala Glu Gln Thr
3800 3805 3810
Ser Thr Gln Leu Pro Thr Thr Thr Ser Ala His Pro Gly Gln Val
3815 3820 3825
Pro Arg Ser Ala Ala Thr Thr Leu Asp Val Ile Pro His Thr Ala
3830 3835 3840
Lys Thr Pro Asp Ala Thr Phe Gln Arg Gln Gly Gln Thr Ala Leu
3845 3850 3855
Thr Thr Glu Ala Arg Ala Thr Ser Asp Ser Trp Asn Glu Lys Glu
3860 3865 3870
Lys Ser Thr Pro Ser Ala Pro Trp Ile Thr Glu Met Met Asn Ser
3875 3880 3885
Val Ser Glu Asp Thr Ile Lys Glu Val Thr Ser Ser Ser Ser Val
3890 3895 3900
Leu Arg Thr Leu Asn Thr Leu Asp Ile Asn Leu Glu Ser Gly Thr
3905 3910 3915
Thr Ser Ser Pro Ser Trp Lys Ser Ser Pro Tyr Glu Arg Ile Ala
3920 3925 3930
Pro Ser Glu Ser Thr Thr Asp Lys Glu Ala Ile His Pro Ser Thr
3935 3940 3945
Asn Thr Val Glu Thr Thr Gly Trp Val Thr Ser Ser Glu His Ala
3950 3955 3960
Ser His Ser Thr Ile Pro Ala His Ser Ala Ser Ser Lys Leu Thr
3965 3970 3975
Ser Pro Val Val Thr Thr Ser Thr Arg Glu Gln Ala Ile Val Ser
3980 3985 3990
Met Ser Thr Thr Thr Trp Pro Glu Ser Thr Arg Ala Arg Thr Glu
3995 4000 4005
Pro Asn Ser Phe Leu Thr Ile Glu Leu Arg Asp Val Ser Pro Tyr
4010 4015 4020
Met Asp Thr Ser Ser Thr Thr Gln Thr Ser Ile Ile Ser Ser Pro
4025 4030 4035
Gly Ser Thr Ala Ile Thr Lys Gly Pro Arg Thr Glu Ile Thr Ser
4040 4045 4050
Ser Lys Arg Ile Ser Ser Ser Phe Leu Ala Gln Ser Met Arg Ser
4055 4060 4065
Ser Asp Ser Pro Ser Glu Ala Ile Thr Arg Leu Ser Asn Phe Pro
4070 4075 4080
Ala Met Thr Glu Ser Gly Gly Met Ile Leu Ala Met Gln Thr Ser
4085 4090 4095
Pro Pro Gly Ala Thr Ser Leu Ser Ala Pro Thr Leu Asp Thr Ser
4100 4105 4110
Ala Thr Ala Ser Trp Thr Gly Thr Pro Leu Ala Thr Thr Gln Arg
4115 4120 4125
Phe Thr Tyr Ser Glu Lys Thr Thr Leu Phe Ser Lys Gly Pro Glu
4130 4135 4140
Asp Thr Ser Gln Pro Ser Pro Pro Ser Val Glu Glu Thr Ser Ser
4145 4150 4155
Ser Ser Ser Leu Val Pro Ile His Ala Thr Thr Ser Pro Ser Asn
4160 4165 4170
Ile Leu Leu Thr Ser Gln Gly His Ser Pro Ser Ser Thr Pro Pro
4175 4180 4185
Val Thr Ser Val Phe Leu Ser Glu Thr Ser Gly Leu Gly Lys Thr
4190 4195 4200
Thr Asp Met Ser Arg Ile Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ser Leu Pro
4205 4210 4215
Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ala Gly Glu Ala Leu Ser Thr Tyr Glu
4220 4225 4230
Ala Ser Arg Asp Thr Lys Ala Ile His His Ser Ala Asp Thr Ala
4235 4240 4245
Val Thr Asn Met Glu Ala Thr Ser Ser Glu Tyr Ser Pro Ile Pro
4250 4255 4260
Gly His Thr Lys Pro Ser Lys Ala Thr Ser Pro Leu Val Thr Ser
4265 4270 4275
His Ile Met Gly Asp Ile Thr Ser Ser Thr Ser Val Phe Gly Ser
4280 4285 4290
Ser Glu Thr Thr Glu Ile Glu Thr Val Ser Ser Val Asn Gln Gly
4295 4300 4305
Leu Gln Glu Arg Ser Thr Ser Gln Val Ala Ser Ser Ala Thr Glu
4310 4315 4320
Thr Ser Thr Val Ile Thr His Val Ser Ser Gly Asp Ala Thr Thr
4325 4330 4335
His Val Thr Lys Thr Gln Ala Thr Phe Ser Ser Gly Thr Ser Ile
4340 4345 4350
Ser Ser Pro His Gln Phe Ile Thr Ser Thr Asn Thr Phe Thr Asp
4355 4360 4365
Val Ser Thr Asn Pro Ser Thr Ser Leu Ile Met Thr Glu Ser Ser
4370 4375 4380
Gly Val Thr Ile Thr Thr Gln Thr Gly Pro Thr Gly Ala Ala Thr
4385 4390 4395
Gln Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Thr Met Pro Tyr Leu Thr
4400 4405 4410
Glu Thr Pro Leu Ala Val Thr Pro Asp Phe Met Gln Ser Glu Lys
4415 4420 4425
Thr Thr Leu Ile Ser Lys Gly Pro Lys Asp Val Ser Trp Thr Ser
4430 4435 4440
Pro Pro Ser Val Ala Glu Thr Ser Tyr Pro Ser Ser Leu Thr Pro
4445 4450 4455
Phe Leu Val Thr Thr Ile Pro Pro Ala Thr Ser Thr Leu Gln Gly
4460 4465 4470
Gln His Thr Ser Ser Pro Val Ser Ala Thr Ser Val Leu Thr Ser
4475 4480 4485
Gly Leu Val Lys Thr Thr Asp Met Leu Asn Thr Ser Met Glu Pro
4490 4495 4500
Val Thr Asn Ser Pro Gln Asn Leu Asn Asn Pro Ser Asn Glu Ile
4505 4510 4515
Leu Ala Thr Leu Ala Ala Thr Thr Asp Ile Glu Thr Ile His Pro
4520 4525 4530
Ser Ile Asn Lys Ala Val Thr Asn Met Gly Thr Ala Ser Ser Ala
4535 4540 4545
His Val Leu His Ser Thr Leu Pro Val Ser Ser Glu Pro Ser Thr
4550 4555 4560
Ala Thr Ser Pro Met Val Pro Ala Ser Ser Met Gly Asp Ala Leu
4565 4570 4575
Ala Ser Ile Ser Ile Pro Gly Ser Glu Thr Thr Asp Ile Glu Gly
4580 4585 4590
Glu Pro Thr Ser Ser Leu Thr Ala Gly Arg Lys Glu Asn Ser Thr
4595 4600 4605
Leu Gln Glu Met Asn Ser Thr Thr Glu Ser Asn Ile Ile Leu Ser
4610 4615 4620
Asn Val Ser Val Gly Ala Ile Thr Glu Ala Thr Lys Met Glu Val
4625 4630 4635
Pro Ser Phe Asp Ala Thr Phe Ile Pro Thr Pro Ala Gln Ser Thr
4640 4645 4650
Lys Phe Pro Asp Ile Phe Ser Val Ala Ser Ser Arg Leu Ser Asn
4655 4660 4665
Ser Pro Pro Met Thr Ile Ser Thr His Met Thr Thr Thr Gln Thr
4670 4675 4680
Gly Ser Ser Gly Ala Thr Ser Lys Ile Pro Leu Ala Leu Asp Thr
4685 4690 4695
Ser Thr Leu Glu Thr Ser Ala Gly Thr Pro Ser Val Val Thr Glu
4700 4705 4710
Gly Phe Ala His Ser Lys Ile Thr Thr Ala Met Asn Asn Asp Val
4715 4720 4725
Lys Asp Val Ser Gln Thr Asn Pro Pro Phe Gln Asp Glu Ala Ser
4730 4735 4740
Ser Pro Ser Ser Gln Ala Pro Val Leu Val Thr Thr Leu Pro Ser
4745 4750 4755
Ser Val Ala Phe Thr Pro Gln Trp His Ser Thr Ser Ser Pro Val
4760 4765 4770
Ser Met Ser Ser Val Leu Thr Ser Ser Leu Val Lys Thr Ala Gly
4775 4780 4785
Lys Val Asp Thr Ser Leu Glu Thr Val Thr Ser Ser Pro Gln Ser
4790 4795 4800
Met Ser Asn Thr Leu Asp Asp Ile Ser Val Thr Ser Ala Ala Thr
4805 4810 4815
Thr Asp Ile Glu Thr Thr His Pro Ser Ile Asn Thr Val Val Thr
4820 4825 4830
Asn Val Gly Thr Thr Gly Ser Ala Phe Glu Ser His Ser Thr Val
4835 4840 4845
Ser Ala Tyr Pro Glu Pro Ser Lys Val Thr Ser Pro Asn Val Thr
4850 4855 4860
Thr Ser Thr Met Glu Asp Thr Thr Ile Ser Arg Ser Ile Pro Lys
4865 4870 4875
Ser Ser Lys Thr Thr Arg Thr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Ser Leu
4880 4885 4890
Thr Pro Lys Leu Arg Glu Thr Ser Ile Ser Gln Glu Ile Thr Ser
4895 4900 4905
Ser Thr Glu Thr Ser Thr Val Pro Tyr Lys Glu Leu Thr Gly Ala
4910 4915 4920
Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Asp Val Thr Ser Ser Ser Ser Thr
4925 4930 4935
Ser Phe Pro Gly Pro Asp Gln Ser Thr Val Ser Leu Asp Ile Ser
4940 4945 4950
Thr Glu Thr Asn Thr Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Met Thr Glu
4955 4960 4965
Ser Ala Glu Ile Thr Ile Thr Thr Gln Thr Gly Pro His Gly Ala
4970 4975 4980
Thr Ser Gln Asp Thr Phe Thr Met Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro
4985 4990 4995
Gln Ala Gly Ile His Ser Ala Met Thr His Gly Phe Ser Gln Leu
5000 5005 5010
Asp Val Thr Thr Leu Met Ser Arg Ile Pro Gln Asp Val Ser Trp
5015 5020 5025
Thr Ser Pro Pro Ser Val Asp Lys Thr Ser Ser Pro Ser Ser Phe
5030 5035 5040
Leu Ser Ser Pro Ala Met Thr Thr Pro Ser Leu Ile Ser Ser Thr
5045 5050 5055
Leu Pro Glu Asp Lys Leu Ser Ser Pro Met Thr Ser Leu Leu Thr
5060 5065 5070
Ser Gly Leu Val Lys Ile Thr Asp Ile Leu Arg Thr Arg Leu Glu
5075 5080 5085
Pro Val Thr Ser Ser Leu Pro Asn Phe Ser Ser Thr Ser Asp Lys
5090 5095 5100
Ile Leu Ala Thr Ser Lys Asp Ser Lys Asp Thr Lys Glu Ile Phe
5105 5110 5115
Pro Ser Ile Asn Thr Glu Glu Thr Asn Val Lys Ala Asn Asn Ser
5120 5125 5130
Gly His Glu Ser His Ser Pro Ala Leu Ala Asp Ser Glu Thr Pro
5135 5140 5145
Lys Ala Thr Thr Gln Met Val Ile Thr Thr Thr Val Gly Asp Pro
5150 5155 5160
Ala Pro Ser Thr Ser Met Pro Val His Gly Ser Ser Glu Thr Thr
5165 5170 5175
Asn Ile Lys Arg Glu Pro Thr Tyr Phe Leu Thr Pro Arg Leu Arg
5180 5185 5190
Glu Thr Ser Thr Ser Gln Glu Ser Ser Phe Pro Thr Asp Thr Ser
5195 5200 5205
Phe Leu Leu Ser Lys Val Pro Thr Gly Thr Ile Thr Glu Val Ser
5210 5215 5220
Ser Thr Gly Val Asn Ser Ser Ser Lys Ile Ser Thr Pro Asp His
5225 5230 5235
Asp Lys Ser Thr Val Pro Pro Asp Thr Phe Thr Gly Glu Ile Pro
5240 5245 5250
Arg Val Phe Thr Ser Ser Ile Lys Thr Lys Ser Ala Glu Met Thr
5255 5260 5265
Ile Thr Thr Gln Ala Ser Pro Pro Glu Ser Ala Ser His Ser Thr
5270 5275 5280
Leu Pro Leu Asp Thr Ser Thr Thr Leu Ser Gln Gly Gly Thr His
5285 5290 5295
Ser Thr Val Thr Gln Gly Phe Pro Tyr Ser Glu Val Thr Thr Leu
5300 5305 5310
Met Gly Met Gly Pro Gly Asn Val Ser Trp Met Thr Thr Pro Pro
5315 5320 5325
Val Glu Glu Thr Ser Ser Val Ser Ser Leu Met Ser Ser Pro Ala
5330 5335 5340
Met Thr Ser Pro Ser Pro Val Ser Ser Thr Ser Pro Gln Ser Ile
5345 5350 5355
Pro Ser Ser Pro Leu Pro Val Thr Ala Leu Pro Thr Ser Val Leu
5360 5365 5370
Val Thr Thr Thr Asp Val Leu Gly Thr Thr Ser Pro Glu Ser Val
5375 5380 5385
Thr Ser Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Ile Thr His Glu Arg Pro
5390 5395 5400
Ala Thr Tyr Lys Asp Thr Ala His Thr Glu Ala Ala Met His His
5405 5410 5415
Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Asn Val Gly Thr Ser Gly Ser Gly
5420 5425 5430
His Lys Ser Gln Ser Ser Val Leu Ala Asp Ser Glu Thr Ser Lys
5435 5440 5445
Ala Thr Pro Leu Met Ser Thr Thr Ser Thr Leu Gly Asp Thr Ser
5450 5455 5460
Val Ser Thr Ser Thr Pro Asn Ile Ser Gln Thr Asn Gln Ile Gln
5465 5470 5475
Thr Glu Pro Thr Ala Ser Leu Ser Pro Arg Leu Arg Glu Ser Ser
5480 5485 5490
Thr Ser Glu Lys Thr Ser Ser Thr Thr Glu Thr Asn Thr Ala Phe
5495 5500 5505
Ser Tyr Val Pro Thr Gly Ala Ile Thr Gln Ala Ser Arg Thr Glu
5510 5515 5520
Ile Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile Ser Asp Leu Asp Arg Pro Thr
5525 5530 5535
Ile Ala Pro Asp Ile Ser Thr Gly Met Ile Thr Arg Leu Phe Thr
5540 5545 5550
Ser Pro Ile Met Thr Lys Ser Ala Glu Met Thr Val Thr Thr Gln
5555 5560 5565
Thr Thr Thr Pro Gly Ala Thr Ser Gln Gly Ile Leu Pro Trp Asp
5570 5575 5580
Thr Ser Thr Thr Leu Phe Gln Gly Gly Thr His Ser Thr Val Ser
5585 5590 5595
Gln Gly Phe Pro His Ser Glu Ile Thr Thr Leu Arg Ser Arg Thr
5600 5605 5610
Pro Gly Asp Val Ser Trp Met Thr Thr Pro Pro Val Glu Glu Thr
5615 5620 5625
Ser Ser Gly Phe Ser Leu Met Ser Pro Ser Met Thr Ser Pro Ser
5630 5635 5640
Pro Val Ser Ser Thr Ser Pro Glu Ser Ile Pro Ser Ser Pro Leu
5645 5650 5655
Pro Val Thr Ala Leu Leu Thr Ser Val Leu Val Thr Thr Thr Asn
5660 5665 5670
Val Leu Gly Thr Thr Ser Pro Glu Pro Val Thr Ser Ser Pro Pro
5675 5680 5685
Asn Leu Ser Ser Pro Thr Gln Glu Arg Leu Thr Thr Tyr Lys Asp
5690 5695 5700
Thr Ala His Thr Glu Ala Met His Ala Ser Met His Thr Asn Thr
5705 5710 5715
Ala Val Ala Asn Val Gly Thr Ser Ile Ser Gly His Glu Ser Gln
5720 5725 5730
Ser Ser Val Pro Ala Asp Ser His Thr Ser Lys Ala Thr Ser Pro
5735 5740 5745
Met Gly Ile Thr Phe Ala Met Gly Asp Thr Ser Val Ser Thr Ser
5750 5755 5760
Thr Pro Ala Phe Phe Glu Thr Arg Ile Gln Thr Glu Ser Thr Ser
5765 5770 5775
Ser Leu Ile Pro Gly Leu Arg Asp Thr Arg Thr Ser Glu Glu Ile
5780 5785 5790
Asn Thr Val Thr Glu Thr Ser Thr Val Leu Ser Glu Val Pro Thr
5795 5800 5805
Thr Thr Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu Val Ile Thr Ser Ser
5810 5815 5820
Arg Thr Thr Ile Ser Gly Pro Asp His Ser Lys Met Ser Pro Tyr
5825 5830 5835
Ile Ser Thr Glu Thr Ile Thr Arg Leu Ser Thr Phe Pro Phe Val
5840 5845 5850
Thr Gly Ser Thr Glu Met Ala Ile Thr Asn Gln Thr Gly Pro Ile
5855 5860 5865
Gly Thr Ile Ser Gln Ala Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Ser Thr
5870 5875 5880
Ala Ser Trp Glu Gly Thr His Ser Pro Val Thr Gln Arg Phe Pro
5885 5890 5895
His Ser Glu Glu Thr Thr Thr Met Ser Arg Ser Thr Lys Gly Val
5900 5905 5910
Ser Trp Gln Ser Pro Pro Ser Val Glu Glu Thr Ser Ser Pro Ser
5915 5920 5925
Ser Pro Val Pro Leu Pro Ala Ile Thr Ser His Ser Ser Leu Tyr
5930 5935 5940
Ser Ala Val Ser Gly Ser Ser Pro Thr Ser Ala Leu Pro Val Thr
5945 5950 5955
Ser Leu Leu Thr Ser Gly Arg Arg Lys Thr Ile Asp Met Leu Asp
5960 5965 5970
Thr His Ser Glu Leu Val Thr Ser Ser Leu Pro Ser Ala Ser Ser
5975 5980 5985
Phe Ser Gly Glu Ile Leu Thr Ser Glu Ala Ser Thr Asn Thr Glu
5990 5995 6000
Thr Ile His Phe Ser Glu Asn Thr Ala Glu Thr Asn Met Gly Thr
6005 6010 6015
Thr Asn Ser Met His Lys Leu His Ser Ser Val Ser Ile His Ser
6020 6025 6030
Gln Pro Ser Gly His Thr Pro Pro Lys Val Thr Gly Ser Met Met
6035 6040 6045
Glu Asp Ala Ile Val Ser Thr Ser Thr Pro Gly Ser Pro Glu Thr
6050 6055 6060
Lys Asn Val Asp Arg Asp Ser Thr Ser Pro Leu Thr Pro Glu Leu
6065 6070 6075
Lys Glu Asp Ser Thr Ala Leu Val Met Asn Ser Thr Thr Glu Ser
6080 6085 6090
Asn Thr Val Phe Ser Ser Val Ser Leu Asp Ala Ala Thr Glu Val
6095 6100 6105
Ser Arg Ala Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Pro Thr Phe Met Pro Ala
6110 6115 6120
Ser Ala Gln Ser Thr Lys Ser Pro Asp Ile Ser Pro Glu Ala Ser
6125 6130 6135
Ser Ser His Ser Asn Ser Pro Pro Leu Thr Ile Ser Thr His Lys
6140 6145 6150
Thr Ile Ala Thr Gln Thr Gly Pro Ser Gly Val Thr Ser Leu Gly
6155 6160 6165
Gln Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ile Ala Thr Ser Ala Gly Thr
6170 6175 6180
Pro Ser Ala Arg Thr Gln Asp Phe Val Asp Ser Glu Thr Thr Ser
6185 6190 6195
Val Met Asn Asn Asp Leu Asn Asp Val Leu Lys Thr Ser Pro Phe
6200 6205 6210
Ser Ala Glu Glu Ala Asn Ser Leu Ser Ser Gln Ala Pro Leu Leu
6215 6220 6225
Val Thr Thr Ser Pro Ser Pro Val Thr Ser Thr Leu Gln Glu His
6230 6235 6240
Ser Thr Ser Ser Leu Val Ser Val Thr Ser Val Pro Thr Pro Thr
6245 6250 6255
Leu Ala Lys Ile Thr Asp Met Asp Thr Asn Leu Glu Pro Val Thr
6260 6265 6270
Arg Ser Pro Gln Asn Leu Arg Asn Thr Leu Ala Thr Ser Glu Ala
6275 6280 6285
Thr Thr Asp Thr His Thr Met His Pro Ser Ile Asn Thr Ala Val
6290 6295 6300
Ala Asn Val Gly Thr Thr Ser Ser Pro Asn Glu Phe Tyr Phe Thr
6305 6310 6315
Val Ser Pro Asp Ser Asp Pro Tyr Lys Ala Thr Ser Ala Val Val
6320 6325 6330
Ile Thr Ser Thr Ser Gly Asp Ser Ile Val Ser Thr Ser Met Pro
6335 6340 6345
Arg Ser Ser Ala Met Lys Lys Ile Glu Ser Glu Thr Thr Phe Ser
6350 6355 6360
Leu Ile Phe Arg Leu Arg Glu Thr Ser Thr Ser Gln Lys Ile Gly
6365 6370 6375
Ser Ser Ser Asp Thr Ser Thr Val Phe Asp Lys Ala Phe Thr Ala
6380 6385 6390
Ala Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu Leu Thr Ser Ser Ser Arg
6395 6400 6405
Thr Ser Ile Gln Gly Thr Glu Lys Pro Thr Met Ser Pro Asp Thr
6410 6415 6420
Ser Thr Arg Ser Val Thr Met Leu Ser Thr Phe Ala Gly Leu Thr
6425 6430 6435
Lys Ser Glu Glu Arg Thr Ile Ala Thr Gln Thr Gly Pro His Arg
6440 6445 6450
Ala Thr Ser Gln Gly Thr Leu Thr Trp Asp Thr Ser Ile Thr Thr
6455 6460 6465
Ser Gln Ala Gly Thr His Ser Ala Met Thr His Gly Phe Ser Gln
6470 6475 6480
Leu Asp Leu Ser Thr Leu Thr Ser Arg Val Pro Glu Tyr Ile Ser
6485 6490 6495
Gly Thr Ser Pro Pro Ser Val Glu Lys Thr Ser Ser Ser Ser Ser
6500 6505 6510
Leu Leu Ser Leu Pro Ala Ile Thr Ser Pro Ser Pro Val Pro Thr
6515 6520 6525
Thr Leu Pro Glu Ser Arg Pro Ser Ser Pro Val His Leu Thr Ser
6530 6535 6540
Leu Pro Thr Ser Gly Leu Val Lys Thr Thr Asp Met Leu Ala Ser
6545 6550 6555
Val Ala Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gly Ser Thr Ser His Lys Ile
6560 6565 6570
Pro Thr Thr Ser Glu Asp Ile Lys Asp Thr Glu Lys Met Tyr Pro
6575 6580 6585
Ser Thr Asn Ile Ala Val Thr Asn Val Gly Thr Thr Thr Ser Glu
6590 6595 6600
Lys Glu Ser Tyr Ser Ser Val Pro Ala Tyr Ser Glu Pro Pro Lys
6605 6610 6615
Val Thr Ser Pro Met Val Thr Ser Phe Asn Ile Arg Asp Thr Ile
6620 6625 6630
Val Ser Thr Ser Met Pro Gly Ser Ser Glu Ile Thr Arg Ile Glu
6635 6640 6645
Met Glu Ser Thr Phe Ser Leu Ala His Gly Leu Lys Gly Thr Ser
6650 6655 6660
Thr Ser Gln Asp Pro Ile Val Ser Thr Glu Lys Ser Ala Val Leu
6665 6670 6675
His Lys Leu Thr Thr Gly Ala Thr Glu Thr Ser Arg Thr Glu Val
6680 6685 6690
Ala Ser Ser Arg Arg Thr Ser Ile Pro Gly Pro Asp His Ser Thr
6695 6700 6705
Glu Ser Pro Asp Ile Ser Thr Glu Val Ile Pro Ser Leu Pro Ile
6710 6715 6720
Ser Leu Gly Ile Thr Glu Ser Ser Asn Met Thr Ile Ile Thr Arg
6725 6730 6735
Thr Gly Pro Pro Leu Gly Ser Thr Ser Gln Gly Thr Phe Thr Leu
6740 6745 6750
Asp Thr Pro Thr Thr Ser Ser Arg Ala Gly Thr His Ser Met Ala
6755 6760 6765
Thr Gln Glu Phe Pro His Ser Glu Met Thr Thr Val Met Asn Lys
6770 6775 6780
Asp Pro Glu Ile Leu Ser Trp Thr Ile Pro Pro Ser Ile Glu Lys
6785 6790 6795
Thr Ser Phe Ser Ser Ser Leu Met Pro Ser Pro Ala Met Thr Ser
6800 6805 6810
Pro Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Lys Thr Ile His Thr Thr Pro
6815 6820 6825
Ser Pro Met Thr Ser Leu Leu Thr Pro Ser Leu Val Met Thr Thr
6830 6835 6840
Asp Thr Leu Gly Thr Ser Pro Glu Pro Thr Thr Ser Ser Pro Pro
6845 6850 6855
Asn Leu Ser Ser Thr Ser His Glu Ile Leu Thr Thr Asp Glu Asp
6860 6865 6870
Thr Thr Ala Ile Glu Ala Met His Pro Ser Thr Ser Thr Ala Ala
6875 6880 6885
Thr Asn Val Glu Thr Thr Ser Ser Gly His Gly Ser Gln Ser Ser
6890 6895 6900
Val Leu Ala Asp Ser Glu Lys Thr Lys Ala Thr Ala Pro Met Asp
6905 6910 6915
Thr Thr Ser Thr Met Gly His Thr Thr Val Ser Thr Ser Met Ser
6920 6925 6930
Val Ser Ser Glu Thr Thr Lys Ile Lys Arg Glu Ser Thr Tyr Ser
6935 6940 6945
Leu Thr Pro Gly Leu Arg Glu Thr Ser Ile Ser Gln Asn Ala Ser
6950 6955 6960
Phe Ser Thr Asp Thr Ser Ile Val Leu Ser Glu Val Pro Thr Gly
6965 6970 6975
Thr Thr Ala Glu Val Ser Arg Thr Glu Val Thr Ser Ser Gly Arg
6980 6985 6990
Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ser Gln Ser Thr Val Leu Pro Glu Ile
6995 7000 7005
Ser Thr Arg Thr Met Thr Arg Leu Phe Ala Ser Pro Thr Met Thr
7010 7015 7020
Glu Ser Ala Glu Met Thr Ile Pro Thr Gln Thr Gly Pro Ser Gly
7025 7030 7035
Ser Thr Ser Gln Asp Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Lys
7040 7045 7050
Ser Gln Ala Lys Thr His Ser Thr Leu Thr Gln Arg Phe Pro His
7055 7060 7065
Ser Glu Met Thr Thr Leu Met Ser Arg Gly Pro Gly Asp Met Ser
7070 7075 7080
Trp Gln Ser Ser Pro Ser Leu Glu Asn Pro Ser Ser Leu Pro Ser
7085 7090 7095
Leu Leu Ser Leu Pro Ala Thr Thr Ser Pro Pro Pro Ile Ser Ser
7100 7105 7110
Thr Leu Pro Val Thr Ile Ser Ser Ser Pro Leu Pro Val Thr Ser
7115 7120 7125
Leu Leu Thr Ser Ser Pro Val Thr Thr Thr Asp Met Leu His Thr
7130 7135 7140
Ser Pro Glu Leu Val Thr Ser Ser Pro Pro Lys Leu Ser His Thr
7145 7150 7155
Ser Asp Glu Arg Leu Thr Thr Gly Lys Asp Thr Thr Asn Thr Glu
7160 7165 7170
Ala Val His Pro Ser Thr Asn Thr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ile
7175 7180 7185
Pro Ser Ser Gly His Glu Ser Pro Ser Ser Ala Leu Ala Asp Ser
7190 7195 7200
Glu Thr Ser Lys Ala Thr Ser Pro Met Phe Ile Thr Ser Thr Gln
7205 7210 7215
Glu Asp Thr Thr Val Ala Ile Ser Thr Pro His Phe Leu Glu Thr
7220 7225 7230
Ser Arg Ile Gln Lys Glu Ser Ile Ser Ser Leu Ser Pro Lys Leu
7235 7240 7245
Arg Glu Thr Gly Ser Ser Val Glu Thr Ser Ser Ala Ile Glu Thr
7250 7255 7260
Ser Ala Val Leu Ser Glu Val Ser Ile Gly Ala Thr Thr Glu Ile
7265 7270 7275
Ser Arg Thr Glu Val Thr Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile Ser Gly
7280 7285 7290
Ser Ala Glu Ser Thr Met Leu Pro Glu Ile Ser Thr Thr Arg Lys
7295 7300 7305
Ile Ile Lys Phe Pro Thr Ser Pro Ile Leu Ala Glu Ser Ser Glu
7310 7315 7320
Met Thr Ile Lys Thr Gln Thr Ser Pro Pro Gly Ser Thr Ser Glu
7325 7330 7335
Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Pro Ser Leu Val Ile
7340 7345 7350
Thr His Ser Thr Met Thr Gln Arg Leu Pro His Ser Glu Ile Thr
7355 7360 7365
Thr Leu Val Ser Arg Gly Ala Gly Asp Val Pro Arg Pro Ser Ser
7370 7375 7380
Leu Pro Val Glu Glu Thr Ser Pro Pro Ser Ser Gln Leu Ser Leu
7385 7390 7395
Ser Ala Met Ile Ser Pro Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Ala
7400 7405 7410
Ser Ser His Ser Ser Ser Ala Ser Val Thr Ser Leu Leu Thr Pro
7415 7420 7425
Gly Gln Val Lys Thr Thr Glu Val Leu Asp Ala Ser Ala Glu Pro
7430 7435 7440
Glu Thr Ser Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ser Thr Ser Val Glu Ile
7445 7450 7455
Leu Ala Thr Ser Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu Lys Ile His Pro
7460 7465 7470
Phe Ser Asn Thr Ala Val Thr Lys Val Gly Thr Ser Ser Ser Gly
7475 7480 7485
His Glu Ser Pro Ser Ser Val Leu Pro Asp Ser Glu Thr Thr Lys
7490 7495 7500
Ala Thr Ser Ala Met Gly Thr Ile Ser Ile Met Gly Asp Thr Ser
7505 7510 7515
Val Ser Thr Leu Thr Pro Ala Leu Ser Asn Thr Arg Lys Ile Gln
7520 7525 7530
Ser Glu Pro Ala Ser Ser Leu Thr Thr Arg Leu Arg Glu Thr Ser
7535 7540 7545
Thr Ser Glu Glu Thr Ser Leu Ala Thr Glu Ala Asn Thr Val Leu
7550 7555 7560
Ser Lys Val Ser Thr Gly Ala Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu
7565 7570 7575
Ala Ile Ser Phe Ser Arg Thr Ser Met Ser Gly Pro Glu Gln Ser
7580 7585 7590
Thr Met Ser Gln Asp Ile Ser Ile Gly Thr Ile Pro Arg Ile Ser
7595 7600 7605
Ala Ser Ser Val Leu Thr Glu Ser Ala Lys Met Thr Ile Thr Thr
7610 7615 7620
Gln Thr Gly Pro Ser Glu Ser Thr Leu Glu Ser Thr Leu Asn Leu
7625 7630 7635
Asn Thr Ala Thr Thr Pro Ser Trp Val Glu Thr His Ser Ile Val
7640 7645 7650
Ile Gln Gly Phe Pro His Pro Glu Met Thr Thr Ser Met Gly Arg
7655 7660 7665
Gly Pro Gly Gly Val Ser Trp Pro Ser Pro Pro Phe Val Lys Glu
7670 7675 7680
Thr Ser Pro Pro Ser Ser Pro Leu Ser Leu Pro Ala Val Thr Ser
7685 7690 7695
Pro His Pro Val Ser Thr Thr Phe Leu Ala His Ile Pro Pro Ser
7700 7705 7710
Pro Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Pro Ala Thr Thr
7715 7720 7725
Thr Asp Ile Leu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Gly Thr Ser Ser Ser
7730 7735 7740
Ser Ser Leu Ser Thr Thr Ser His Glu Arg Leu Thr Thr Tyr Lys
7745 7750 7755
Asp Thr Ala His Thr Glu Ala Val His Pro Ser Thr Asn Thr Gly
7760 7765 7770
Gly Thr Asn Val Ala Thr Thr Ser Ser Gly Tyr Lys Ser Gln Ser
7775 7780 7785
Ser Val Leu Ala Asp Ser Ser Pro Met Cys Thr Thr Ser Thr Met
7790 7795 7800
Gly Asp Thr Ser Val Leu Thr Ser Thr Pro Ala Phe Leu Glu Thr
7805 7810 7815
Arg Arg Ile Gln Thr Glu Leu Ala Ser Ser Leu Thr Pro Gly Leu
7820 7825 7830
Arg Glu Ser Ser Gly Ser Glu Gly Thr Ser Ser Gly Thr Lys Met
7835 7840 7845
Ser Thr Val Leu Ser Lys Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Glu Ile
7850 7855 7860
Ser Lys Glu Asp Val Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ala Gln Ser Thr
7865 7870 7875
Ile Ser Pro Asp Ile Ser Thr Arg Thr Val Ser Trp Phe Ser Thr
7880 7885 7890
Ser Pro Val Met Thr Glu Ser Ala Glu Ile Thr Met Asn Thr His
7895 7900 7905
Thr Ser Pro Leu Gly Ala Thr Thr Gln Gly Thr Ser Thr Leu Asp
7910 7915 7920
Thr Ser Ser Thr Thr Ser Leu Thr Met Thr His Ser Thr Ile Ser
7925 7930 7935
Gln Gly Phe Ser His Ser Gln Met Ser Thr Leu Met Arg Arg Gly
7940 7945 7950
Pro Glu Asp Val Ser Trp Met Ser Pro Pro Leu Leu Glu Lys Thr
7955 7960 7965
Arg Pro Ser Phe Ser Leu Met Ser Ser Pro Ala Thr Thr Ser Pro
7970 7975 7980
Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Glu Ser Ile Ser Ser Ser Pro
7985 7990 7995
Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Leu Ala Lys Thr Thr
8000 8005 8010
Asp Met Leu His Lys Ser Ser Glu Pro Val Thr Asn Ser Pro Ala
8015 8020 8025
Asn Leu Ser Ser Thr Ser Val Glu Ile Leu Ala Thr Ser Glu Val
8030 8035 8040
Thr Thr Asp Thr Glu Lys Thr His Pro Ser Ser Asn Arg Thr Val
8045 8050 8055
Thr Asp Val Gly Thr Ser Ser Ser Gly His Glu Ser Thr Ser Phe
8060 8065 8070
Val Leu Ala Asp Ser Gln Thr Ser Lys Val Thr Ser Pro Met Val
8075 8080 8085
Ile Thr Ser Thr Met Glu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ser Thr Pro
8090 8095 8100
Gly Phe Phe Glu Thr Ser Arg Ile Gln Thr Glu Pro Thr Ser Ser
8105 8110 8115
Leu Thr Leu Gly Leu Arg Lys Thr Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ser
8120 8125 8130
Leu Ala Thr Glu Met Ser Thr Val Leu Ser Gly Val Pro Thr Gly
8135 8140 8145
Ala Thr Ala Glu Val Ser Arg Thr Glu Val Thr Ser Ser Ser Arg
8150 8155 8160
Thr Ser Ile Ser Gly Phe Ala Gln Leu Thr Val Ser Pro Glu Thr
8165 8170 8175
Ser Thr Glu Thr Ile Thr Arg Leu Pro Thr Ser Ser Ile Met Thr
8180 8185 8190
Glu Ser Ala Glu Met Met Ile Lys Thr Gln Thr Asp Pro Pro Gly
8195 8200 8205
Ser Thr Pro Glu Ser Thr His Thr Val Asp Ile Ser Thr Thr Pro
8210 8215 8220
Asn Trp Val Glu Thr His Ser Thr Val Thr Gln Arg Phe Ser His
8225 8230 8235
Ser Glu Met Thr Thr Leu Val Ser Arg Ser Pro Gly Asp Met Leu
8240 8245 8250
Trp Pro Ser Gln Ser Ser Val Glu Glu Thr Ser Ser Ala Ser Ser
8255 8260 8265
Leu Leu Ser Leu Pro Ala Thr Thr Ser Pro Ser Pro Val Ser Ser
8270 8275 8280
Thr Leu Val Glu Asp Phe Pro Ser Ala Ser Leu Pro Val Thr Ser
8285 8290 8295
Leu Leu Asn Pro Gly Leu Val Ile Thr Thr Asp Arg Met Gly Ile
8300 8305 8310
Ser Arg Glu Pro Gly Thr Ser Ser Thr Ser Asn Leu Ser Ser Thr
8315 8320 8325
Ser His Glu Arg Leu Thr Thr Leu Glu Asp Thr Val Asp Thr Glu
8330 8335 8340
Asp Met Gln Pro Ser Thr His Thr Ala Val Thr Asn Val Arg Thr
8345 8350 8355
Ser Ile Ser Gly His Glu Ser Gln Ser Ser Val Leu Ser Asp Ser
8360 8365 8370
Glu Thr Pro Lys Ala Thr Ser Pro Met Gly Thr Thr Tyr Thr Met
8375 8380 8385
Gly Glu Thr Ser Val Ser Ile Ser Thr Ser Asp Phe Phe Glu Thr
8390 8395 8400
Ser Arg Ile Gln Ile Glu Pro Thr Ser Ser Leu Thr Ser Gly Leu
8405 8410 8415
Arg Glu Thr Ser Ser Ser Glu Arg Ile Ser Ser Ala Thr Glu Gly
8420 8425 8430
Ser Thr Val Leu Ser Glu Val Pro Ser Gly Ala Thr Thr Glu Val
8435 8440 8445
Ser Arg Thr Glu Val Ile Ser Ser Arg Gly Thr Ser Met Ser Gly
8450 8455 8460
Pro Asp Gln Phe Thr Ile Ser Pro Asp Ile Ser Thr Glu Ala Ile
8465 8470 8475
Thr Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Met Thr Glu Ser Ala Glu Ser
8480 8485 8490
Ala Ile Thr Ile Glu Thr Gly Ser Pro Gly Ala Thr Ser Glu Gly
8495 8500 8505
Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Thr Phe Trp Ser Gly Thr
8510 8515 8520
His Ser Thr Ala Ser Pro Gly Phe Ser His Ser Glu Met Thr Thr
8525 8530 8535
Leu Met Ser Arg Thr Pro Gly Asp Val Pro Trp Pro Ser Leu Pro
8540 8545 8550
Ser Val Glu Glu Ala Ser Ser Val Ser Ser Ser Leu Ser Ser Pro
8555 8560 8565
Ala Met Thr Ser Thr Ser Phe Phe Ser Thr Leu Pro Glu Ser Ile
8570 8575 8580
Ser Ser Ser Pro His Pro Val Thr Ala Leu Leu Thr Leu Gly Pro
8585 8590 8595
Val Lys Thr Thr Asp Met Leu Arg Thr Ser Ser Glu Pro Glu Thr
8600 8605 8610
Ser Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Ala Glu Ile Leu Ala
8615 8620 8625
Thr Ser Glu Val Thr Lys Asp Arg Glu Lys Ile His Pro Ser Ser
8630 8635 8640
Asn Thr Pro Val Val Asn Val Gly Thr Val Ile Tyr Lys His Leu
8645 8650 8655
Ser Pro Ser Ser Val Leu Ala Asp Leu Val Thr Thr Lys Pro Thr
8660 8665 8670
Ser Pro Met Ala Thr Thr Ser Thr Leu Gly Asn Thr Ser Val Ser
8675 8680 8685
Thr Ser Thr Pro Ala Phe Pro Glu Thr Met Met Thr Gln Pro Thr
8690 8695 8700
Ser Ser Leu Thr Ser Gly Leu Arg Glu Ile Ser Thr Ser Gln Glu
8705 8710 8715
Thr Ser Ser Ala Thr Glu Arg Ser Ala Ser Leu Ser Gly Met Pro
8720 8725 8730
Thr Gly Ala Thr Thr Lys Val Ser Arg Thr Glu Ala Leu Ser Leu
8735 8740 8745
Gly Arg Thr Ser Thr Pro Gly Pro Ala Gln Ser Thr Ile Ser Pro
8750 8755 8760
Glu Ile Ser Thr Glu Thr Ile Thr Arg Ile Ser Thr Pro Leu Thr
8765 8770 8775
Thr Thr Gly Ser Ala Glu Met Thr Ile Thr Pro Lys Thr Gly His
8780 8785 8790
Ser Gly Ala Ser Ser Gln Gly Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Ser
8795 8800 8805
Arg Ala Ser Trp Pro Gly Thr His Ser Ala Ala Thr His Arg Ser
8810 8815 8820
Pro His Ser Gly Met Thr Thr Pro Met Ser Arg Gly Pro Glu Asp
8825 8830 8835
Val Ser Trp Pro Ser Arg Pro Ser Val Glu Lys Thr Ser Pro Pro
8840 8845 8850
Ser Ser Leu Val Ser Leu Ser Ala Val Thr Ser Pro Ser Pro Leu
8855 8860 8865
Tyr Ser Thr Pro Ser Glu Ser Ser His Ser Ser Pro Leu Arg Val
8870 8875 8880
Thr Ser Leu Phe Thr Pro Val Met Met Lys Thr Thr Asp Met Leu
8885 8890 8895
Asp Thr Ser Leu Glu Pro Val Thr Thr Ser Pro Pro Ser Met Asn
8900 8905 8910
Ile Thr Ser Asp Glu Ser Leu Ala Thr Ser Lys Ala Thr Met Glu
8915 8920 8925
Thr Glu Ala Ile Gln Leu Ser Glu Asn Thr Ala Val Thr Gln Met
8930 8935 8940
Gly Thr Ile Ser Ala Arg Gln Glu Phe Tyr Ser Ser Tyr Pro Gly
8945 8950 8955
Leu Pro Glu Pro Ser Lys Val Thr Ser Pro Val Val Thr Ser Ser
8960 8965 8970
Thr Ile Lys Asp Ile Val Ser Thr Thr Ile Pro Ala Ser Ser Glu
8975 8980 8985
Ile Thr Arg Ile Glu Met Glu Ser Thr Ser Thr Leu Thr Pro Thr
8990 8995 9000
Pro Arg Glu Thr Ser Thr Ser Gln Glu Ile His Ser Ala Thr Lys
9005 9010 9015
Pro Ser Thr Val Pro Tyr Lys Ala Leu Thr Ser Ala Thr Ile Glu
9020 9025 9030
Asp Ser Met Thr Gln Val Met Ser Ser Ser Arg Gly Pro Ser Pro
9035 9040 9045
Asp Gln Ser Thr Met Ser Gln Asp Ile Ser Thr Glu Val Ile Thr
9050 9055 9060
Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Lys Thr Glu Ser Thr Glu Met Thr
9065 9070 9075
Ile Thr Thr Gln Thr Gly Ser Pro Gly Ala Thr Ser Arg Gly Thr
9080 9085 9090
Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Phe Met Ser Gly Thr His Ser
9095 9100 9105
Thr Ala Ser Gln Gly Phe Ser His Ser Gln Met Thr Ala Leu Met
9110 9115 9120
Ser Arg Thr Pro Gly Asp Val Pro Trp Leu Ser His Pro Ser Val
9125 9130 9135
Glu Glu Ala Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Ser Ser Pro Val Met
9140 9145 9150
Thr Ser Ser Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Asp Ser Ile His
9155 9160 9165
Ser Ser Ser Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Leu Val
9170 9175 9180
Lys Thr Thr Glu Leu Leu Gly Thr Ser Ser Glu Pro Glu Thr Ser
9185 9190 9195
Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Ala Glu Ile Leu Ala Ile
9200 9205 9210
Thr Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu Lys Leu Glu Met Thr Asn Val
9215 9220 9225
Val Thr Ser Gly Tyr Thr His Glu Ser Pro Ser Ser Val Leu Ala
9230 9235 9240
Asp Ser Val Thr Thr Lys Ala Thr Ser Ser Met Gly Ile Thr Tyr
9245 9250 9255
Pro Thr Gly Asp Thr Asn Val Leu Thr Ser Thr Pro Ala Phe Ser
9260 9265 9270
Asp Thr Ser Arg Ile Gln Thr Lys Ser Lys Leu Ser Leu Thr Pro
9275 9280 9285
Gly Leu Met Glu Thr Ser Ile Ser Glu Glu Thr Ser Ser Ala Thr
9290 9295 9300
Glu Lys Ser Thr Val Leu Ser Ser Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr
9305 9310 9315
Glu Val Ser Arg Thr Glu Ala Ile Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile
9320 9325 9330
Pro Gly Pro Ala Gln Ser Thr Met Ser Ser Asp Thr Ser Met Glu
9335 9340 9345
Thr Ile Thr Arg Ile Ser Thr Pro Leu Thr Arg Lys Glu Ser Thr
9350 9355 9360
Asp Met Ala Ile Thr Pro Lys Thr Gly Pro Ser Gly Ala Thr Ser
9365 9370 9375
Gln Gly Thr Phe Thr Leu Asp Ser Ser Ser Thr Ala Ser Trp Pro
9380 9385 9390
Gly Thr His Ser Ala Thr Thr Gln Arg Phe Pro Gln Ser Val Val
9395 9400 9405
Thr Thr Pro Met Ser Arg Gly Pro Glu Asp Val Ser Trp Pro Ser
9410 9415 9420
Pro Leu Ser Val Glu Lys Asn Ser Pro Pro Ser Ser Leu Val Ser
9425 9430 9435
Ser Ser Ser Val Thr Ser Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Thr Pro Ser
9440 9445 9450
Gly Ser Ser His Ser Ser Pro Val Pro Val Thr Ser Leu Phe Thr
9455 9460 9465
Ser Ile Met Met Lys Ala Thr Asp Met Leu Asp Ala Ser Leu Glu
9470 9475 9480
Pro Glu Thr Thr Ser Ala Pro Asn Met Asn Ile Thr Ser Asp Glu
9485 9490 9495
Ser Leu Ala Ala Ser Lys Ala Thr Thr Glu Thr Glu Ala Ile His
9500 9505 9510
Val Phe Glu Asn Thr Ala Ala Ser His Val Glu Thr Thr Ser Ala
9515 9520 9525
Thr Glu Glu Leu Tyr Ser Ser Ser Pro Gly Phe Ser Glu Pro Thr
9530 9535 9540
Lys Val Ile Ser Pro Val Val Thr Ser Ser Ser Ile Arg Asp Asn
9545 9550 9555
Met Val Ser Thr Thr Met Pro Gly Ser Ser Gly Ile Thr Arg Ile
9560 9565 9570
Glu Ile Glu Ser Met Ser Ser Leu Thr Pro Gly Leu Arg Glu Thr
9575 9580 9585
Arg Thr Ser Gln Asp Ile Thr Ser Ser Thr Glu Thr Ser Thr Val
9590 9595 9600
Leu Tyr Lys Met Pro Ser Gly Ala Thr Pro Glu Val Ser Arg Thr
9605 9610 9615
Glu Val Met Pro Ser Ser Arg Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ala Gln
9620 9625 9630
Ser Thr Met Ser Leu Asp Ile Ser Asp Glu Val Val Thr Arg Leu
9635 9640 9645
Ser Thr Ser Pro Ile Met Thr Glu Ser Ala Glu Ile Thr Ile Thr
9650 9655 9660
Thr Gln Thr Gly Tyr Ser Leu Ala Thr Ser Gln Val Thr Leu Pro
9665 9670 9675
Leu Gly Thr Ser Met Thr Phe Leu Ser Gly Thr His Ser Thr Met
9680 9685 9690
Ser Gln Gly Leu Ser His Ser Glu Met Thr Asn Leu Met Ser Arg
9695 9700 9705
Gly Pro Glu Ser Leu Ser Trp Thr Ser Pro Arg Phe Val Glu Thr
9710 9715 9720
Thr Arg Ser Ser Ser Ser Leu Thr Ser Leu Pro Leu Thr Thr Ser
9725 9730 9735
Leu Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Leu Asp Ser Ser Pro Ser Ser
9740 9745 9750
Pro Leu Pro Val Thr Ser Leu Ile Leu Pro Gly Leu Val Lys Thr
9755 9760 9765
Thr Glu Val Leu Asp Thr Ser Ser Glu Pro Lys Thr Ser Ser Ser
9770 9775 9780
Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Val Glu Ile Pro Ala Thr Ser Glu
9785 9790 9795
Ile Met Thr Asp Thr Glu Lys Ile His Pro Ser Ser Asn Thr Ala
9800 9805 9810
Val Ala Lys Val Arg Thr Ser Ser Ser Val His Glu Ser His Ser
9815 9820 9825
Ser Val Leu Ala Asp Ser Glu Thr Thr Ile Thr Ile Pro Ser Met
9830 9835 9840
Gly Ile Thr Ser Ala Val Asp Asp Thr Thr Val Phe Thr Ser Asn
9845 9850 9855
Pro Ala Phe Ser Glu Thr Arg Arg Ile Pro Thr Glu Pro Thr Phe
9860 9865 9870
Ser Leu Thr Pro Gly Phe Arg Glu Thr Ser Thr Ser Glu Glu Thr
9875 9880 9885
Thr Ser Ile Thr Glu Thr Ser Ala Val Leu Tyr Gly Val Pro Thr
9890 9895 9900
Ser Ala Thr Thr Glu Val Ser Met Thr Glu Ile Met Ser Ser Asn
9905 9910 9915
Arg Ile His Ile Pro Asp Ser Asp Gln Ser Thr Met Ser Pro Asp
9920 9925 9930
Ile Ile Thr Glu Val Ile Thr Arg Leu Ser Ser Ser Ser Met Met
9935 9940 9945
Ser Glu Ser Thr Gln Met Thr Ile Thr Thr Gln Lys Ser Ser Pro
9950 9955 9960
Gly Ala Thr Ala Gln Ser Thr Leu Thr Leu Ala Thr Thr Thr Ala
9965 9970 9975
Pro Leu Ala Arg Thr His Ser Thr Val Pro Pro Arg Phe Leu His
9980 9985 9990
Ser Glu Met Thr Thr Leu Met Ser Arg Ser Pro Glu Asn Pro Ser
9995 10000 10005
Trp Lys Ser Ser Leu Phe Val Glu Lys Thr Ser Ser Ser Ser Ser
10010 10015 10020
Leu Leu Ser Leu Pro Val Thr Thr Ser Pro Ser Val Ser Ser Thr
10025 10030 10035
Leu Pro Gln Ser Ile Pro Ser Ser Ser Phe Ser Val Thr Ser Leu
10040 10045 10050
Leu Thr Pro Gly Met Val Lys Thr Thr Asp Thr Ser Thr Glu Pro
10055 10060 10065
Gly Thr Ser Leu Ser Pro Asn Leu Ser Gly Thr Ser Val Glu Ile
10070 10075 10080
Leu Ala Ala Ser Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu Lys Ile His Pro
10085 10090 10095
Ser Ser Ser Met Ala Val Thr Asn Val Gly Thr Thr Ser Ser Gly
10100 10105 10110
His Glu Leu Tyr Ser Ser Val Ser Ile His Ser Glu Pro Ser Lys
10115 10120 10125
Ala Thr Tyr Pro Val Gly Thr Pro Ser Ser Met Ala Glu Thr Ser
10130 10135 10140
Ile Ser Thr Ser Met Pro Ala Asn Phe Glu Thr Thr Gly Phe Glu
10145 10150 10155
Ala Glu Pro Phe Ser His Leu Thr Ser Gly Phe Arg Lys Thr Asn
10160 10165 10170
Met Ser Leu Asp Thr Ser Ser Val Thr Pro Thr Asn Thr Pro Ser
10175 10180 10185
Ser Pro Gly Ser Thr His Leu Leu Gln Ser Ser Lys Thr Asp Phe
10190 10195 10200
Thr Ser Ser Ala Lys Thr Ser Ser Pro Asp Trp Pro Pro Ala Ser
10205 10210 10215
Gln Tyr Thr Glu Ile Pro Val Asp Ile Ile Thr Pro Phe Asn Ala
10220 10225 10230
Ser Pro Ser Ile Thr Glu Ser Thr Gly Ile Thr Ser Phe Pro Glu
10235 10240 10245
Ser Arg Phe Thr Met Ser Val Thr Glu Ser Thr His His Leu Ser
10250 10255 10260
Thr Asp Leu Leu Pro Ser Ala Glu Thr Ile Ser Thr Gly Thr Val
10265 10270 10275
Met Pro Ser Leu Ser Glu Ala Met Thr Ser Phe Ala Thr Thr Gly
10280 10285 10290
Val Pro Arg Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ser Pro Phe Ser Arg Thr
10295 10300 10305
Glu Ser Gly Pro Gly Asp Ala Thr Leu Ser Thr Ile Ala Glu Ser
10310 10315 10320
Leu Pro Ser Ser Thr Pro Val Pro Phe Ser Ser Ser Thr Phe Thr
10325 10330 10335
Thr Thr Asp Ser Ser Thr Ile Pro Ala Leu His Glu Ile Thr Ser
10340 10345 10350
Ser Ser Ala Thr Pro Tyr Arg Val Asp Thr Ser Leu Gly Thr Glu
10355 10360 10365
Ser Ser Thr Thr Glu Gly Arg Leu Val Met Val Ser Thr Leu Asp
10370 10375 10380
Thr Ser Ser Gln Pro Gly Arg Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Asp
10385 10390 10395
Thr Arg Met Thr Glu Ser Val Glu Leu Gly Thr Val Thr Ser Ala
10400 10405 10410
Tyr Gln Val Pro Ser Leu Ser Thr Arg Leu Thr Arg Thr Asp Gly
10415 10420 10425
Ile Met Glu His Ile Thr Lys Ile Pro Asn Glu Ala Ala His Arg
10430 10435 10440
Gly Thr Ile Arg Pro Val Lys Gly Pro Gln Thr Ser Thr Ser Pro
10445 10450 10455
Ala Ser Pro Lys Gly Leu His Thr Gly Gly Thr Lys Arg Met Glu
10460 10465 10470
Thr Thr Thr Thr Ala Leu Lys Thr Thr Thr Thr Ala Leu Lys Thr
10475 10480 10485
Thr Ser Arg Ala Thr Leu Thr Thr Ser Val Tyr Thr Pro Thr Leu
10490 10495 10500
Gly Thr Leu Thr Pro Leu Asn Ala Ser Met Gln Met Ala Ser Thr
10505 10510 10515
Ile Pro Thr Glu Met Met Ile Thr Thr Pro Tyr Val Phe Pro Asp
10520 10525 10530
Val Pro Glu Thr Thr Ser Ser Leu Ala Thr Ser Leu Gly Ala Glu
10535 10540 10545
Thr Ser Thr Ala Leu Pro Arg Thr Thr Pro Ser Val Phe Asn Arg
10550 10555 10560
Glu Ser Glu Thr Thr Ala Ser Leu Val Ser Arg Ser Gly Ala Glu
10565 10570 10575
Arg Ser Pro Val Ile Gln Thr Leu Asp Val Ser Ser Ser Glu Pro
10580 10585 10590
Asp Thr Thr Ala Ser Trp Val Ile His Pro Ala Glu Thr Ile Pro
10595 10600 10605
Thr Val Ser Lys Thr Thr Pro Asn Phe Phe His Ser Glu Leu Asp
10610 10615 10620
Thr Val Ser Ser Thr Ala Thr Ser His Gly Ala Asp Val Ser Ser
10625 10630 10635
Ala Ile Pro Thr Asn Ile Ser Pro Ser Glu Leu Asp Ala Leu Thr
10640 10645 10650
Pro Leu Val Thr Ile Ser Gly Thr Asp Thr Ser Thr Thr Phe Pro
10655 10660 10665
Thr Leu Thr Lys Ser Pro His Glu Thr Glu Thr Arg Thr Thr Trp
10670 10675 10680
Leu Thr His Pro Ala Glu Thr Ser Ser Thr Ile Pro Arg Thr Ile
10685 10690 10695
Pro Asn Phe Ser His His Glu Ser Asp Ala Thr Pro Ser Ile Ala
10700 10705 10710
Thr Ser Pro Gly Ala Glu Thr Ser Ser Ala Ile Pro Ile Met Thr
10715 10720 10725
Val Ser Pro Gly Ala Glu Asp Leu Val Thr Ser Gln Val Thr Ser
10730 10735 10740
Ser Gly Thr Asp Arg Asn Met Thr Ile Pro Thr Leu Thr Leu Ser
10745 10750 10755
Pro Gly Glu Pro Lys Thr Ile Ala Ser Leu Val Thr His Pro Glu
10760 10765 10770
Ala Gln Thr Ser Ser Ala Ile Pro Thr Ser Thr Ile Ser Pro Ala
10775 10780 10785
Val Ser Arg Leu Val Thr Ser Met Val Thr Ser Leu Ala Ala Lys
10790 10795 10800
Thr Ser Thr Thr Asn Arg Ala Leu Thr Asn Ser Pro Gly Glu Pro
10805 10810 10815
Ala Thr Thr Val Ser Leu Val Thr His Pro Ala Gln Thr Ser Pro
10820 10825 10830
Thr Val Pro Trp Thr Thr Ser Ile Phe Phe His Ser Lys Ser Asp
10835 10840 10845
Thr Thr Pro Ser Met Thr Thr Ser His Gly Ala Glu Ser Ser Ser
10850 10855 10860
Ala Val Pro Thr Pro Thr Val Ser Thr Glu Val Pro Gly Val Val
10865 10870 10875
Thr Pro Leu Val Thr Ser Ser Arg Ala Val Ile Ser Thr Thr Ile
10880 10885 10890
Pro Ile Leu Thr Leu Ser Pro Gly Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser
10895 10900 10905
Met Ala Thr Ser His Gly Glu Glu Ala Ser Ser Ala Ile Pro Thr
10910 10915 10920
Pro Thr Val Ser Pro Gly Val Pro Gly Val Val Thr Ser Leu Val
10925 10930 10935
Thr Ser Ser Arg Ala Val Thr Ser Thr Thr Ile Pro Ile Leu Thr
10940 10945 10950
Phe Ser Leu Gly Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser
10955 10960 10965
His Gly Thr Glu Ala Gly Ser Ala Val Pro Thr Val Leu Pro Glu
10970 10975 10980
Val Pro Gly Met Val Thr Ser Leu Val Ala Ser Ser Arg Ala Val
10985 10990 10995
Thr Ser Thr Thr Leu Pro Thr Leu Thr Leu Ser Pro Gly Glu Pro
11000 11005 11010
Glu Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser His Gly Ala Glu Ala Ser
11015 11020 11025
Ser Thr Val Pro Thr Val Ser Pro Glu Val Pro Gly Val Val Thr
11030 11035 11040
Ser Leu Val Thr Ser Ser Ser Gly Val Asn Ser Thr Ser Ile Pro
11045 11050 11055
Thr Leu Ile Leu Ser Pro Gly Glu Leu Glu Thr Thr Pro Ser Met
11060 11065 11070
Ala Thr Ser His Gly Ala Glu Ala Ser Ser Ala Val Pro Thr Pro
11075 11080 11085
Thr Val Ser Pro Gly Val Ser Gly Val Val Thr Pro Leu Val Thr
11090 11095 11100
Ser Ser Arg Ala Val Thr Ser Thr Thr Ile Pro Ile Leu Thr Leu
11105 11110 11115
Ser Ser Ser Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser His
11120 11125 11130
Gly Val Glu Ala Ser Ser Ala Val Leu Thr Val Ser Pro Glu Val
11135 11140 11145
Pro Gly Met Val Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Arg Ala Val Thr
11150 11155 11160
Ser Thr Thr Ile Pro Thr Leu Thr Ile Ser Ser Asp Glu Pro Glu
11165 11170 11175
Thr Thr Thr Ser Leu Val Thr His Ser Glu Ala Lys Met Ile Ser
11180 11185 11190
Ala Ile Pro Thr Leu Ala Val Ser Pro Thr Val Gln Gly Leu Val
11195 11200 11205
Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Gly Ser Glu Thr Ser Ala Phe Ser
11210 11215 11220
Asn Leu Thr Val Ala Ser Ser Gln Pro Glu Thr Ile Asp Ser Trp
11225 11230 11235
Val Ala His Pro Gly Thr Glu Ala Ser Ser Val Val Pro Thr Leu
11240 11245 11250
Thr Val Ser Thr Gly Glu Pro Phe Thr Asn Ile Ser Leu Val Thr
11255 11260 11265
His Pro Ala Glu Ser Ser Ser Thr Leu Pro Arg Thr Thr Ser Arg
11270 11275 11280
Phe Ser His Ser Glu Leu Asp Thr Met Pro Ser Thr Val Thr Ser
11285 11290 11295
Pro Glu Ala Glu Ser Ser Ser Ala Ile Ser Thr Thr Ile Ser Pro
11300 11305 11310
Gly Ile Pro Gly Val Leu Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Gly Arg
11315 11320 11325
Asp Ile Ser Ala Thr Phe Pro Thr Val Pro Glu Ser Pro His Glu
11330 11335 11340
Ser Glu Ala Thr Ala Ser Trp Val Thr His Pro Ala Val Thr Ser
11345 11350 11355
Thr Thr Val Pro Arg Thr Thr Pro Asn Tyr Ser His Ser Glu Pro
11360 11365 11370
Asp Thr Thr Pro Ser Ile Ala Thr Ser Pro Gly Ala Glu Ala Thr
11375 11380 11385
Ser Asp Phe Pro Thr Ile Thr Val Ser Pro Asp Val Pro Asp Met
11390 11395 11400
Val Thr Ser Gln Val Thr Ser Ser Gly Thr Asp Thr Ser Ile Thr
11405 11410 11415
Ile Pro Thr Leu Thr Leu Ser Ser Gly Glu Pro Glu Thr Thr Thr
11420 11425 11430
Ser Phe Ile Thr Tyr Ser Glu Thr His Thr Ser Ser Ala Ile Pro
11435 11440 11445
Thr Leu Pro Val Ser Pro Gly Ala Ser Lys Met Leu Thr Ser Leu
11450 11455 11460
Val Ile Ser Ser Gly Thr Asp Ser Thr Thr Thr Phe Pro Thr Leu
11465 11470 11475
Thr Glu Thr Pro Tyr Glu Pro Glu Thr Thr Ala Ile Gln Leu Ile
11480 11485 11490
His Pro Ala Glu Thr Asn Thr Met Val Pro Arg Thr Thr Pro Lys
11495 11500 11505
Phe Ser His Ser Lys Ser Asp Thr Thr Leu Pro Val Ala Ile Thr
11510 11515 11520
Ser Pro Gly Pro Glu Ala Ser Ser Ala Val Ser Thr Thr Thr Ile
11525 11530 11535
Ser Pro Asp Met Ser Asp Leu Val Thr Ser Leu Val Pro Ser Ser
11540 11545 11550
Gly Thr Asp Thr Ser Thr Thr Phe Pro Thr Leu Ser Glu Thr Pro
11555 11560 11565
Tyr Glu Pro Glu Thr Thr Ala Thr Trp Leu Thr His Pro Ala Glu
11570 11575 11580
Thr Ser Thr Thr Val Ser Gly Thr Ile Pro Asn Phe Ser His Arg
11585 11590 11595
Gly Ser Asp Thr Ala Pro Ser Met Val Thr Ser Pro Gly Val Asp
11600 11605 11610
Thr Arg Ser Gly Val Pro Thr Thr Thr Ile Pro Pro Ser Ile Pro
11615 11620 11625
Gly Val Val Thr Ser Gln Val Thr Ser Ser Ala Thr Asp Thr Ser
11630 11635 11640
Thr Ala Ile Pro Thr Leu Thr Pro Ser Pro Gly Glu Pro Glu Thr
11645 11650 11655
Thr Ala Ser Ser Ala Thr His Pro Gly Thr Gln Thr Gly Phe Thr
11660 11665 11670
Val Pro Ile Arg Thr Val Pro Ser Ser Glu Pro Asp Thr Met Ala
11675 11680 11685
Ser Trp Val Thr His Pro Pro Gln Thr Ser Thr Pro Val Ser Arg
11690 11695 11700
Thr Thr Ser Ser Phe Ser His Ser Ser Pro Asp Ala Thr Pro Val
11705 11710 11715
Met Ala Thr Ser Pro Arg Thr Glu Ala Ser Ser Ala Val Leu Thr
11720 11725 11730
Thr Ile Ser Pro Gly Ala Pro Glu Met Val Thr Ser Gln Ile Thr
11735 11740 11745
Ser Ser Gly Ala Ala Thr Ser Thr Thr Val Pro Thr Leu Thr His
11750 11755 11760
Ser Pro Gly Met Pro Glu Thr Thr Ala Leu Leu Ser Thr His Pro
11765 11770 11775
Arg Thr Glu Thr Ser Lys Thr Phe Pro Ala Ser Thr Val Phe Pro
11780 11785 11790
Gln Val Ser Glu Thr Thr Ala Ser Leu Thr Ile Arg Pro Gly Ala
11795 11800 11805
Glu Thr Ser Thr Ala Leu Pro Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Phe
11810 11815 11820
Thr Leu Leu Val Thr Gly Thr Ser Arg Val Asp Leu Ser Pro Thr
11825 11830 11835
Ala Ser Pro Gly Val Ser Ala Lys Thr Ala Pro Leu Ser Thr His
11840 11845 11850
Pro Gly Thr Glu Thr Ser Thr Met Ile Pro Thr Ser Thr Leu Ser
11855 11860 11865
Leu Gly Leu Leu Glu Thr Thr Gly Leu Leu Ala Thr Ser Ser Ser
11870 11875 11880
Ala Glu Thr Ser Thr Ser Thr Leu Thr Leu Thr Val Ser Pro Ala
11885 11890 11895
Val Ser Gly Leu Ser Ser Ala Ser Ile Thr Thr Asp Lys Pro Gln
11900 11905 11910
Thr Val Thr Ser Trp Asn Thr Glu Thr Ser Pro Ser Val Thr Ser
11915 11920 11925
Val Gly Pro Pro Glu Phe Ser Arg Thr Val Thr Gly Thr Thr Met
11930 11935 11940
Thr Leu Ile Pro Ser Glu Met Pro Thr Pro Pro Lys Thr Ser His
11945 11950 11955
Gly Glu Gly Val Ser Pro Thr Thr Ile Leu Arg Thr Thr Met Val
11960 11965 11970
Glu Ala Thr Asn Leu Ala Thr Thr Gly Ser Ser Pro Thr Val Ala
11975 11980 11985
Lys Thr Thr Thr Thr Phe Asn Thr Leu Ala Gly Ser Leu Phe Thr
11990 11995 12000
Pro Leu Thr Thr Pro Gly Met Ser Thr Leu Ala Ser Glu Ser Val
12005 12010 12015
Thr Ser Arg Thr Ser Tyr Asn His Arg Ser Trp Ile Ser Thr Thr
12020 12025 12030
Ser Ser Tyr Asn Arg Arg Tyr Trp Thr Pro Ala Thr Ser Thr Pro
12035 12040 12045
Val Thr Ser Thr Phe Ser Pro Gly Ile Ser Thr Ser Ser Ile Pro
12050 12055 12060
Ser Ser Thr Ala Ala Thr Val Pro Phe Met Val Pro Phe Thr Leu
12065 12070 12075
Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met Arg His
12080 12085 12090
Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Ala Thr Glu Arg Glu Leu Gln Gly
12095 12100 12105
Leu Leu Lys Pro Leu Phe Arg Asn Ser Ser Leu Glu Tyr Leu Tyr
12110 12115 12120
Ser Gly Cys Arg Leu Ala Ser Leu Arg Pro Glu Lys Asp Ser Ser
12125 12130 12135
Ala Thr Ala Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Pro Asp Pro Glu
12140 12145 12150
Asp Leu Gly Leu Asp Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Asn
12155 12160 12165
Leu Thr Asn Gly Ile Gln Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg
12170 12175 12180
Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Met Pro
12185 12190 12195
Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Val Gly Thr Ser
12200 12205 12210
Gly Thr Pro Ser Ser Ser Pro Ser Pro Thr Thr Ala Gly Pro Leu
12215 12220 12225
Leu Met Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr
12230 12235 12240
Glu Glu Asp Met Arg Arg Thr Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Met
12245 12250 12255
Glu Ser Val Leu Gln Gly Leu Leu Lys Pro Leu Phe Lys Asn Thr
12260 12265 12270
Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg
12275 12280 12285
Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr
12290 12295 12300
His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asn Arg Glu Gln Leu
12305 12310 12315
Tyr Trp Glu Leu Ser Lys Leu Thr Asn Asp Ile Glu Glu Leu Gly
12320 12325 12330
Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr
12335 12340 12345
His Gln Ser Ser Val Ser Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr
12350 12355 12360
Val Asp Leu Arg Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ser Pro
12365 12370 12375
Thr Ile Met Ala Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn
12380 12385 12390
Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Gly Glu Asp Met Gly His Pro
12395 12400 12405
Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu
12410 12415 12420
Leu Gly Pro Ile Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser
12425 12430 12435
Gly Cys Arg Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala
12440 12445 12450
Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Ile His His Leu Asp Pro Lys Ser
12455 12460 12465
Pro Gly Leu Asn Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu
12470 12475 12480
Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn
12485 12490 12495
Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Thr Ser Val Pro Thr
12500 12505 12510
Ser Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly
12515 12520 12525
Thr Pro Phe Ser Leu Pro Ser Pro Ala Thr Ala Gly Pro Leu Leu
12530 12535 12540
Val Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Lys Tyr Glu
12545 12550 12555
Glu Asp Met His Arg Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu
12560 12565 12570
Arg Val Leu Gln Thr Leu Leu Gly Pro Met Phe Lys Asn Thr Ser
12575 12580 12585
Val Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Ser
12590 12595 12600
Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His
12605 12610 12615
Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Val Asp Arg Glu Gln Leu Tyr
12620 12625 12630
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro
12635 12640 12645
Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His
12650 12655 12660
Trp Ile Pro Val Pro Thr Ser Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val
12665 12670 12675
Asp Leu Gly Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Thr Thr
12680 12685 12690
Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr
12695 12700 12705
Asn Leu Lys Tyr Glu Glu Asp Met His Cys Pro Gly Ser Arg Lys
12710 12715 12720
Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Ser Leu Leu Gly Pro Met
12725 12730 12735
Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu
12740 12745 12750
Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp
12755 12760 12765
Ala Ile Cys Thr His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Val Asp
12770 12775 12780
Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Gly Ile
12785 12790 12795
Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val
12800 12805 12810
Asn Gly Phe Thr His Gln Thr Ser Ala Pro Asn Thr Ser Thr Pro
12815 12820 12825
Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser
12830 12835 12840
Leu Pro Ser Pro Thr Ser Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr
12845 12850 12855
Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met His
12860 12865 12870
His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln
12875 12880 12885
Gly Leu Leu Gly Pro Met Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Leu Leu
12890 12895 12900
Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asn Gly
12905 12910 12915
Ala Ala Thr Gly Met Asp Ala Ile Cys Ser His Arg Leu Asp Pro
12920 12925 12930
Lys Ser Pro Gly Leu Asn Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser
12935 12940 12945
Gln Leu Thr His Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp
12950 12955 12960
Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Val
12965 12970 12975
Ala Pro Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr
12980 12985 12990
Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Thr Thr Ala Val Pro
12995 13000 13005
Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln
13010 13015 13020
Tyr Gly Glu Asp Met Arg His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr
13025 13030 13035
Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Gly Pro Leu Phe Lys Asn
13040 13045 13050
Ser Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Ile Ser Leu
13055 13060 13065
Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys
13070 13075 13080
Thr His His Leu Asn Pro Gln Ser Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln
13085 13090 13095
Leu Tyr Trp Gln Leu Ser Gln Met Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu
13100 13105 13110
Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe
13115 13120 13125
Thr His Arg Ser Ser Gly Leu Thr Thr Ser Thr Pro Trp Thr Ser
13130 13135 13140
Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Ser Pro Val Pro Ser
13145 13150 13155
Pro Thr Thr Thr Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe
13160 13165 13170
Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asn Met Gly His Pro Gly
13175 13180 13185
Ser Arg Lys Phe Asn Ile Thr Glu Ser Val Leu Gln Gly Leu Leu
13190 13195 13200
Lys Pro Leu Phe Lys Ser Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly
13205 13210 13215
Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Val Ala Thr
13220 13225 13230
Arg Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Pro Asp Pro Lys Ile Pro
13235 13240 13245
Gly Leu Asp Arg Gln Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr
13250 13255 13260
His Ser Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser
13265 13270 13275
Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr
13280 13285 13290
Ser Thr Pro Gly Thr Phe Thr Val Gln Pro Glu Thr Ser Glu Thr
13295 13300 13305
Pro Ser Ser Leu Pro Gly Pro Thr Ala Thr Gly Pro Val Leu Leu
13310 13315 13320
Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu
13325 13330 13335
Asp Met Arg Arg Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg
13340 13345 13350
Val Leu Gln Gly Leu Leu Met Pro Leu Phe Lys Asn Thr Ser Val
13355 13360 13365
Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu
13370 13375 13380
Lys Asp Gly Ala Ala Thr Arg Val Asp Ala Val Cys Thr His Arg
13385 13390 13395
Pro Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asp Arg Glu Arg Leu Tyr Trp
13400 13405 13410
Lys Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr
13415 13420 13425
Thr Leu Asp Arg His Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Gln
13430 13435 13440
Ser Ser Met Thr Thr Thr Arg Thr Pro Asp Thr Ser Thr Met His
13445 13450 13455
Leu Ala Thr Ser Arg Thr Pro Ala Ser Leu Ser Gly Pro Met Thr
13460 13465 13470
Ala Ser Pro Leu Leu Val Leu Phe Thr Ile Asn Phe Thr Ile Thr
13475 13480 13485
Asn Leu Arg Tyr Glu Glu Asn Met His His Pro Gly Ser Arg Lys
13490 13495 13500
Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Arg Pro Val
13505 13510 13515
Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu
13520 13525 13530
Thr Leu Leu Arg Pro Lys Lys Asp Gly Ala Ala Thr Lys Val Asp
13535 13540 13545
Ala Ile Cys Thr Tyr Arg Pro Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asp
13550 13555 13560
Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Ser Ile
13565 13570 13575
Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val
13580 13585 13590
Asn Gly Phe Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Ile Pro
13595 13600 13605
Gly Thr Pro Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Val Ser
13610 13615 13620
Lys Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ser Pro Leu Leu Val Leu Phe Thr
13625 13630 13635
Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Arg Tyr Glu Glu Asn Met Gln
13640 13645 13650
His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln
13655 13660 13665
Gly Leu Leu Arg Ser Leu Phe Lys Ser Thr Ser Val Gly Pro Leu
13670 13675 13680
Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly
13685 13690 13695
Thr Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His His Pro Asp Pro
13700 13705 13710
Lys Ser Pro Arg Leu Asp Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser
13715 13720 13725
Gln Leu Thr His Asn Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Ala Leu Asp
13730 13735 13740
Asn Asp Ser Leu Phe Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Val
13745 13750 13755
Ser Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Pro Thr Val Tyr Leu Gly Ala
13760 13765 13770
Ser Lys Thr Pro Ala Ser Ile Phe Gly Pro Ser Ala Ala Ser His
13775 13780 13785
Leu Leu Ile Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Arg
13790 13795 13800
Tyr Glu Glu Asn Met Trp Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr
13805 13810 13815
Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Arg Pro Leu Phe Lys Asn Thr
13820 13825 13830
Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg
13835 13840 13845
Pro Glu Lys Asp Gly Glu Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr
13850 13855 13860
His Arg Pro Asp Pro Thr Gly Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln Leu
13865 13870 13875
Tyr Leu Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Ser Ile Thr Glu Leu Gly
13880 13885 13890
Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr
13895 13900 13905
His Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Gly Val Val Ser Glu
13910 13915 13920
Glu Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Asn Asn Leu Arg Tyr Met
13925 13930 13935
Ala Asp Met Gly Gln Pro Gly Ser Leu Lys Phe Asn Ile Thr Asp
13940 13945 13950
Asn Val Met Gln His Leu Leu Ser Pro Leu Phe Gln Arg Ser Ser
13955 13960 13965
Leu Gly Ala Arg Tyr Thr Gly Cys Arg Val Ile Ala Leu Arg Ser
13970 13975 13980
Val Lys Asn Gly Ala Glu Thr Arg Val Asp Leu Leu Cys Thr Tyr
13985 13990 13995
Leu Gln Pro Leu Ser Gly Pro Gly Leu Pro Ile Lys Gln Val Phe
14000 14005 14010
His Glu Leu Ser Gln Gln Thr His Gly Ile Thr Arg Leu Gly Pro
14015 14020 14025
Tyr Ser Leu Asp Lys Asp Ser Leu Tyr Leu Asn Gly Tyr Asn Glu
14030 14035 14040
Pro Gly Pro Asp Glu Pro Pro Thr Thr Pro Lys Pro Ala Thr Thr
14045 14050 14055
Phe Leu Pro Pro Leu Ser Glu Ala Thr Thr Ala Met Gly Tyr His
14060 14065 14070
Leu Lys Thr Leu Thr Leu Asn Phe Thr Ile Ser Asn Leu Gln Tyr
14075 14080 14085
Ser Pro Asp Met Gly Lys Gly Ser Ala Thr Phe Asn Ser Thr Glu
14090 14095 14100
Gly Val Leu Gln His Leu Leu Arg Pro Leu Phe Gln Lys Ser Ser
14105 14110 14115
Met Gly Pro Phe Tyr Leu Gly Cys Gln Leu Ile Ser Leu Arg Pro
14120 14125 14130
Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Thr Thr Cys Thr Tyr
14135 14140 14145
His Pro Asp Pro Val Gly Pro Gly Leu Asp Ile Gln Gln Leu Tyr
14150 14155 14160
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Val Thr Gln Leu Gly Phe
14165 14170 14175
Tyr Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Ala Pro
14180 14185 14190
Gln Asn Leu Ser Ile Arg Gly Glu Tyr Gln Ile Asn Phe His Ile
14195 14200 14205
Val Asn Trp Asn Leu Ser Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr
14210 14215 14220
Ile Thr Leu Leu Arg Asp Ile Gln Asp Lys Val Thr Thr Leu Tyr
14225 14230 14235
Lys Gly Ser Gln Leu His Asp Thr Phe Arg Phe Cys Leu Val Thr
14240 14245 14250
Asn Leu Thr Met Asp Ser Val Leu Val Thr Val Lys Ala Leu Phe
14255 14260 14265
Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser Leu Val Glu Gln Val Phe Leu Asp
14270 14275 14280
Lys Thr Leu Asn Ala Ser Phe His Trp Leu Gly Ser Thr Tyr Gln
14285 14290 14295
Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met Glu Ser Ser Val Tyr Gln
14300 14305 14310
Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe Tyr Leu Asn Phe Thr
14315 14320 14325
Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Lys Ala Gln Pro Gly Thr
14330 14335 14340
Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu Asp Ala Leu Asn
14345 14350 14355
Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser Tyr Phe Ser Asp Cys
14360 14365 14370
Gln Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn Arg His His Thr Gly
14375 14380 14385
Val Asp Ser Leu Cys Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp
14390 14395 14400
Arg Val Ala Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly
14405 14410 14415
Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val
14420 14425 14430
Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser
14435 14440 14445
Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu
14450 14455 14460
Leu Gly Val Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu Val Thr Thr
14465 14470 14475
Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln Gln Cys
14480 14485 14490
Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
14495 14500 14505
<210> 137
<211> 43815
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 不成熟的人MUC16核酸序列 (NM_024690.2)
<400> 137
agcgttgcac aattccccca acctccatac atacggcagc tcttctagac acaggttttc 60
ccaggtcaaa tgcggggacc ccagccatat ctcccaccct gagaaatttt ggagtttcag 120
ggagctcaga agctctgcag aggccaccct ctctgagggg attcttctta gacctccatc 180
cagaggcaaa tgttgacctg tccatgctga aaccctcagg ccttcctggg tcatcttctc 240
ccacccgctc cttgatgaca gggagcagga gcactaaagc cacaccagaa atggattcag 300
gactgacagg agccaccttg tcacctaaga catctacagg tgcaatcgtg gtgacagaac 360
atactctgcc ctttacttcc ccagataaga ccttggccag tcctacatct tcggttgtgg 420
gaagaaccac ccagtctttg ggggtgatgt cctctgctct ccctgagtca acctctagag 480
gaatgacaca ctccgagcaa agaaccagcc catcgctgag tccccaggtc aatggaactc 540
cctctaggaa ctaccctgct acaagcatgg tttcaggatt gagttcccca aggaccagga 600
ccagttccac agaaggaaat tttaccaaag aagcatctac atacacactc actgtagaga 660
ccacaagtgg cccagtcact gagaagtaca cagtccccac tgagacctca acaactgaag 720
gtgacagcac agagaccccc tgggacacaa gatatattcc tgtaaaaatc acatctccaa 780
tgaaaacatt tgcagattca actgcatcca aggaaaatgc cccagtgtct atgactccag 840
ctgagaccac agttactgac tcacatactc caggaaggac aaacccatca tttgggacac 900
tttattcttc cttccttgac ctatcaccta aagggacccc aaattccaga ggtgaaacaa 960
gcctggaact gattctatca accactggat atcccttctc ctctcctgaa cctggctctg 1020
caggacacag cagaataagt accagtgcgc ctttgtcatc atctgcttca gttctcgata 1080
ataaaatatc agagaccagc atattctcag gccagagtct cacctcccct ctgtctcctg 1140
gggtgcccga ggccagagcc agcacaatgc ccaactcagc tatccctttt tccatgacac 1200
taagcaatgc agaaacaagt gccgaaaggg tcagaagcac aatttcctct ctggggactc 1260
catcaatatc cacaaagcag acagcagaga ctatccttac cttccatgcc ttcgctgaga 1320
ccatggatat acccagcacc cacatagcca agactttggc ttcagaatgg ttgggaagtc 1380
caggtaccct tggtggcacc agcacttcag cgctgacaac cacatctcca tctaccactt 1440
tagtctcaga ggagaccaac acccatcact ccacgagtgg aaaggaaaca gaaggaactt 1500
tgaatacatc tatgactcca cttgagacct ctgctcctgg agaagagtcc gaaatgactg 1560
ccaccttggt ccccactcta ggttttacaa ctcttgacag caagatcaga agtccatctc 1620
aggtctcttc atcccaccca acaagagagc tcagaaccac aggcagcacc tctgggaggc 1680
agagttccag cacagctgcc cacgggagct ctgacatcct gagggcaacc acttccagca 1740
cctcaaaagc atcatcatgg accagtgaaa gcacagctca gcaatttagt gaaccccagc 1800
acacacagtg ggtggagaca agtcctagca tgaaaacaga gagaccccca gcatcaacca 1860
gtgtggcagc ccctatcacc acttctgttc cctcagtggt ctctggcttc accaccctga 1920
agaccagctc cacaaaaggg atttggcttg aagaaacatc tgcagacaca ctcatcggag 1980
aatccacagc tggcccaacc acccatcagt ttgctgttcc cactgggatt tcaatgacag 2040
gaggcagcag caccagggga agccagggca caacccacct actcaccaga gccacagcat 2100
catctgagac atccgcagat ttgactctgg ccacgaacgg tgtcccagtc tccgtgtctc 2160
cagcagtgag caagacggct gctggctcaa gtcctccagg agggacaaag ccatcatata 2220
caatggtttc ttctgtcatc cctgagacat catctctaca gtcctcagct ttcagggaag 2280
gaaccagcct gggactgact ccattaaaca ctagacatcc cttctcttcc cctgaaccag 2340
actctgcagg acacaccaag ataagcacca gcattcctct gttgtcatct gcttcagttc 2400
ttgaggataa agtgtcagcg accagcacat tctcacacca caaagccacc tcatctatta 2460
ccacagggac tcctgaaatc tcaacaaaga caaagcccag ctcagccgtt ctttcctcca 2520
tgaccctaag caatgcagca acaagtcctg aaagagtcag aaatgcaact tcccctctga 2580
ctcatccatc tccatcaggg gaagagacag cagggagtgt cctcactctc agcacctctg 2640
ctgagactac agactcacct aacatccacc caactgggac actgacttca gaatcgtcag 2700
agagtcctag cactctcagc ctcccaagtg tctctggagt caaaaccaca ttttcttcat 2760
ctactccttc cactcatcta tttactagtg gagaagaaac agaggaaact tcgaatccat 2820
ctgtgtctca acctgagact tctgtttcca gagtaaggac caccttggcc agcacctctg 2880
tccctacccc agtattcccc accatggaca cctggcctac acgttcagct cagttctctt 2940
catcccacct agtgagtgag ctcagagcta cgagcagtac ctcagttaca aactcaactg 3000
gttcagctct tcctaaaata tctcacctca ctgggacggc aacaatgtca cagaccaata 3060
gagacacgtt taatgactct gctgcacccc aaagcacaac ttggccagag actagtccca 3120
gattcaagac agggttacct tcagcaacaa ccactgtttc aacctctgcc acttctctct 3180
ctgctactgt aatggtctct aaattcactt ctccagcaac tagttccatg gaagcaactt 3240
ctatcaggga accatcaaca accatcctca caacagagac cacgaatggc ccaggctcta 3300
tggctgtggc ttctaccaac atcccaattg gaaagggcta cattactgaa ggaagattgg 3360
acacaagcca tctgcccatt ggaaccacag cttcctctga gacatctatg gattttacca 3420
tggccaaaga aagtgtctca atgtcagtat ctccatctca gtccatggat gctgctggct 3480
caagcactcc aggaaggaca agccaattcg ttgacacatt ttctgatgat gtctatcatt 3540
taacatccag agaaattaca atacctagag atggaacaag ctcagctctg actccacaaa 3600
tgactgcaac tcaccctcca tctcctgatc ctggctctgc tagaagcacc tggcttggca 3660
tcttgtcctc atctccttct tctcctactc ccaaagtcac aatgagctcc acattttcaa 3720
ctcagagagt caccacaagc atgataatgg acacagttga aactagtcgg tggaacatgc 3780
ccaacttacc ttccacgact tccttgacac caagtaatat tccaacaagt ggtgccatag 3840
gaaaaagcac cctggttccc ttggacactc catctccagc cacatcattg gaggcatcag 3900
aagggggact tccaaccctc agcacctacc ctgaatcaac aaacacaccc agcatccacc 3960
tcggagcaca cgctagttca gaaagtccaa gcaccatcaa acttaccatg gcttcagtag 4020
taaaacctgg ctcttacaca cctctcacct tcccctcaat agagacccac attcatgtat 4080
caacagccag aatggcttac tcttctgggt cttcacctga gatgacagct cctggagaga 4140
ctaacactgg tagtacctgg gaccccacca cctacatcac cactacggat cctaaggata 4200
caagttcagc tcaggtctct acaccccact cagtgaggac actcagaacc acagaaaacc 4260
atccaaagac agagtccgcc accccagctg cttactctgg aagtcctaaa atctcaagtt 4320
cacccaatct caccagtccg gccacaaaag catggaccat cacagacaca actgaacact 4380
ccactcaatt acattacaca aaattggcag aaaaatcatc tggatttgag acacagtcag 4440
ctccaggacc tgtctctgta gtaatcccta cctcccctac cattggaagc agcacattgg 4500
aactaacttc tgatgtccca ggggaacccc tggtccttgc tcccagtgag cagaccacaa 4560
tcactctccc catggcaaca tggctgagta ccagtttgac agaggaaatg gcttcaacag 4620
accttgatat ttcaagtcca agttcaccca tgagtacatt tgctattttt ccacctatgt 4680
ccacaccttc tcatgaactt tcaaagtcag aggcagatac cagtgccatt agaaatacag 4740
attcaacaac gttggatcag cacctaggaa tcaggagttt gggcagaact ggggacttaa 4800
caactgttcc tatcacccca ctgacaacca cgtggaccag tgtgattgaa cactcaacac 4860
aagcacagga caccctttct gcaacgatga gtcctactca cgtgacacag tcactcaaag 4920
atcaaacatc tataccagcc tcagcatccc cttcccatct tactgaagtc taccctgagc 4980
tcgggacaca agggagaagc tcctctgagg caaccacttt ttggaaacca tctacagaca 5040
cactgtccag agagattgag actggcccaa caaacattca atccactcca cccatggaca 5100
acacaacaac agggagcagt agtagtggag tcaccctggg catagcccac cttcccatag 5160
gaacatcctc cccagctgag acatccacaa acatggcact ggaaagaaga agttctacag 5220
ccactgtctc tatggctggg acaatgggac tccttgttac tagtgctcca ggaagaagca 5280
tcagccagtc attaggaaga gtttcctctg tcctttctga gtcaactact gaaggagtca 5340
cagattctag taagggaagc agcccaaggc tgaacacaca gggaaataca gctctctcct 5400
cctctcttga acccagctat gctgaaggaa gccagatgag cacaagcatc cctctaacct 5460
catctcctac aactcctgat gtggaattca tagggggcag cacattttgg accaaggagg 5520
tcaccacagt tatgacctca gacatctcca agtcttcagc aaggacagag tccagctcag 5580
ctacccttat gtccacagct ttgggaagca ctgaaaatac aggaaaagaa aaactcagaa 5640
ctgcctctat ggatcttcca tctccaactc catcaatgga ggtgacacca tggatttctc 5700
tcactctcag taatgccccc aataccacag attcacttga cctcagccat ggggtgcaca 5760
ccagctctgc agggactttg gccactgaca ggtcattgaa tactggtgtc actagagcct 5820
ccagattgga aaacggctct gatacctctt ctaagtccct gtctatggga aacagcactc 5880
acacttccat gacttacaca gagaagagtg aagtgtcttc ttcaatccat ccccgacctg 5940
agacctcagc tcctggagca gagaccactt tgacttccac tcctggaaac agggccataa 6000
gcttaacatt gcctttttca tccattccag tggaagaagt catttctaca ggcataacct 6060
caggaccaga catcaactca gcacccatga cacattctcc catcacccca ccaacaattg 6120
tatggaccag tacaggcaca attgaacagt ccactcaacc actacatgca gtttcttcag 6180
aaaaagtttc tgtgcagaca cagtcaactc catatgtcaa ctctgtggca gtgtctgctt 6240
cccctaccca tgagaattca gtctcttctg gaagcagcac atcctctcca tattcctcag 6300
cctcacttga atccttggat tccacaatca gtaggaggaa tgcaatcact tcctggctat 6360
gggacctcac tacatctctc cccactacaa cttggccaag tactagttta tctgaggcac 6420
tgtcctcagg ccattctggg gtttcaaacc caagttcaac tacgactgaa tttccactct 6480
tttcagctgc atccacatct gctgctaagc aaagaaatcc agaaacagag acccatggtc 6540
cccagaatac agccgcgagt actttgaaca ctgatgcatc ctcggtcaca ggtctttctg 6600
agactcctgt gggggcaagt atcagctctg aagtccctct tccaatggcc ataacttcta 6660
gatcagatgt ttctggcctt acatctgaga gtactgctaa cccgagttta ggcacagcct 6720
cttcagcagg gaccaaatta actaggacaa tatccctgcc cacttcagag tctttggttt 6780
cctttagaat gaacaaggat ccatggacag tgtcaatccc tttggggtcc catccaacta 6840
ctaatacaga aacaagcatc ccagtaaaca gcgcaggtcc acctggcttg tccacagtag 6900
catcagatgt aattgacaca ccttcagatg gggctgagag tattcccact gtctcctttt 6960
ccccctcccc tgatactgaa gtgacaacta tctcacattt cccagaaaag acaactcatt 7020
catttagaac catttcatct ctcactcatg agttgacttc aagagtgaca cctattcctg 7080
gggattggat gagttcagct atgtctacaa agcccacagg agccagtccc tccattacac 7140
tgggagagag aaggacaatc acctctgctg ctccaaccac ttcccccata gttctcactg 7200
ctagtttcac agagaccagc acagtttcac tggataatga aactacagta aaaacctcag 7260
atatccttga cgcacggaaa acaaatgagc tcccctcaga tagcagttct tcttctgatc 7320
tgatcaacac ctccatagct tcttcaacta tggatgtcac taaaacagcc tccatcagtc 7380
ccactagcat ctcaggaatg acagcaagtt cctccccatc tctcttctct tcagatagac 7440
cccaggttcc cacatctaca acagagacaa atacagccac ctctccatct gtttccagta 7500
acacctattc tcttgatggg ggctccaatg tgggtggcac tccatccact ttaccaccct 7560
ttacaatcac ccaccctgtc gagacaagct cggccctatt agcctggtct agaccagtaa 7620
gaactttcag caccatggtc agcactgaca ctgcctccgg agaaaatcct acctctagca 7680
attctgtggt gacttctgtt ccagcaccag gtacatggac cagtgtaggc agtactactg 7740
acttacctgc catgggcttt ctcaagacaa gtcctgcagg agaggcacac tcacttctag 7800
catcaactat tgaaccagcc actgccttca ctccccatct ctcagcagca gtggtcactg 7860
gatccagtgc tacatcagaa gccagtcttc tcactacgag tgaaagcaaa gccattcatt 7920
cttcaccaca gaccccaact acacccacct ctggagcaaa ctgggaaact tcagctactc 7980
ctgagagcct tttggtagtc actgagactt cagacacaac acttacctca aagattttgg 8040
tcacagatac catcttgttt tcaactgtgt ccacgccacc ttctaaattt ccaagtacgg 8100
ggactctgtc tggagcttcc ttccctactt tactcccgga cactccagcc atccctctca 8160
ctgccactga gccaacaagt tcattagcta catcctttga ttccacccca ctggtgacta 8220
tagcttcgga tagtcttggc acagtcccag agactaccct gaccatgtca gagacctcaa 8280
atggtgatgc actggttctt aagacagtaa gtaacccaga taggagcatc cctggaatca 8340
ctatccaagg agtaacagaa agtccactcc atccttcttc cacttccccc tctaagattg 8400
ttgctccacg gaatacaacc tatgaaggtt cgatcacagt ggcactttct actttgcctg 8460
cgggaactac tggttccctt gtattcagtc agagttctga aaactcagag acaacggctt 8520
tggtagactc atcagctggg cttgagaggg catctgtgat gccactaacc acaggaagcc 8580
agggtatggc tagctctgga ggaatcagaa gtgggtccac tcactcaact ggaaccaaaa 8640
cattttcttc tctccctctg accatgaacc caggtgaggt tacagccatg tctgaaatca 8700
ccacgaacag actgacagct actcaatcaa cagcacccaa agggatacct gtgaagccca 8760
ccagtgctga gtcaggcctc ctaacacctg tctctgcctc ctcaagccca tcaaaggcct 8820
ttgcctcact gactacagct cccccaactt gggggatccc acagtctacc ttgacatttg 8880
agttttctga ggtcccaagt ttggatacta agtccgcttc tttaccaact cctggacagt 8940
ccctgaacac cattccagac tcagatgcaa gcacagcatc ttcctcactg tccaagtctc 9000
cagaaaaaaa cccaagggca aggatgatga cttccacaaa ggccataagt gcaagctcat 9060
ttcaatcaac aggttttact gaaacccctg agggatctgc ctccccttct atggcagggc 9120
atgaacccag agtccccact tcaggaacag gggaccctag atatgcctca gagagcatgt 9180
cttatccaga cccaagcaag gcatcatcag ctatgacatc gacctctctt gcatcaaaac 9240
tcacaactct cttcagcaca ggtcaagcag caaggtctgg ttctagttcc tctcccataa 9300
gcctatccac tgagaaagaa acaagcttcc tttcccccac tgcatccacc tccagaaaga 9360
cttcactatt tcttgggcct tccatggcaa ggcagcccaa catattggtg catcttcaga 9420
cttcagctct gacactttct ccaacatcca ctctaaatat gtcccaggag gagcctcctg 9480
agttaacctc aagccagacc attgcagaag aagagggaac aacagctgaa acacagacgt 9540
taaccttcac accatctgag accccaacat ccttgttacc tgtctcttct cccacagaac 9600
ccacagccag aagaaagagt tctccagaaa catgggcaag ctctatttca gttcctgcca 9660
agacctcctt ggttgaaaca actgatggaa cgctagtgac caccataaag atgtcaagcc 9720
aggcagcaca aggaaattcc acgtggcctg ccccagcaga ggagacgggg agcagtccag 9780
caggcacatc cccaggaagc ccagaaatgt ctaccactct caaaatcatg agctccaagg 9840
aacccagcat cagcccagag atcaggtcca ctgtgagaaa ttctccttgg aagactccag 9900
aaacaactgt tcccatggag accacagtgg aaccagtcac ccttcagtcc acagccctag 9960
gaagtggcag caccagcatc tctcacctgc ccacaggaac cacatcacca accaagtcac 10020
caacagaaaa tatgttggct acagaaaggg tctccctctc cccatcccca cctgaggctt 10080
ggaccaacct ttattctgga actccaggag ggaccaggca gtcactggcc acaatgtcct 10140
ctgtctccct agagtcacca actgctagaa gcatcacagg gactggtcag caaagcagtc 10200
cagaactggt ttcaaagaca actggaatgg aattctctat gtggcatggc tctactggag 10260
ggaccacagg ggacacacat gtctctctga gcacatcttc caatatcctt gaagaccctg 10320
taaccagccc aaactctgtg agctcattga cagataaatc caaacataaa accgagacat 10380
gggtaagcac cacagccatt ccctccactg tcctgaataa taagataatg gcagctgaac 10440
aacagacaag tcgatctgtg gatgaggctt attcatcaac tagttcttgg tcagatcaga 10500
catctgggag tgacatcacc cttggtgcat ctcctgatgt cacaaacaca ttatacatca 10560
cctccacagc acaaaccacc tcactagtgt ctctgccctc tggagaccaa ggcattacaa 10620
gcctcaccaa tccctcagga ggaaaaacaa gctctgcgtc atctgtcaca tctccttcaa 10680
tagggcttga gactctgagg gccaatgtaa gtgcagtgaa aagtgacatt gcccctactg 10740
ctgggcatct atctcagact tcatctcctg cggaagtgag catcctggac gtaaccacag 10800
ctcctactcc aggtatctcc accaccatca ccaccatggg aaccaactca atctcaacta 10860
ccacacccaa cccagaagtg ggtatgagta ccatggacag caccccggcc acagagaggc 10920
gcacaacttc tacagaacac ccttccacct ggtcttccac agctgcatca gattcctgga 10980
ctgtcacaga catgacttca aacttgaaag ttgcaagatc tcctggaaca atttccacaa 11040
tgcatacaac ttcattctta gcctcaagca ctgaattaga ctccatgtct actccccatg 11100
gccgtataac tgtcattgga accagcctgg tcactccatc ctctgatgct tcagctgtaa 11160
agacagagac cagtacaagt gaaagaacat tgagtccttc agacacaact gcatctactc 11220
ccatctcaac tttttctcgt gtccagagga tgagcatctc agttcctgac attttaagta 11280
caagttggac tcccagtagt acagaagcag aagatgtgcc tgtttcaatg gtttctacag 11340
atcatgctag tacaaagact gacccaaata cgcccctgtc cacttttctg tttgattctc 11400
tgtccactct tgactgggac actgggagat ctctgtcatc agccacagcc actacctcag 11460
ctcctcaggg ggccacaact ccccaggaac tcactttgga aaccatgatc agcccagcta 11520
cctcacagtt gcccttctct atagggcaca ttacaagtgc agtcacacca gctgcaatgg 11580
caaggagctc tggagttact ttttcaagac cagatcccac aagcaaaaag gcagagcaga 11640
cttccactca gcttcccacc accacttctg cacatccagg gcaggtgccc agatcagcag 11700
caacaactct ggatgtgatc ccacacacag caaaaactcc agatgcaact tttcagagac 11760
aagggcagac agctcttaca acagaggcaa gagctacatc tgactcctgg aatgagaaag 11820
aaaaatcaac cccaagtgca ccttggatca ctgagatgat gaattctgtc tcagaagata 11880
ccatcaagga ggttaccagc tcctccagtg tattaaggac cctgaatacg ctggacataa 11940
acttggaatc tgggacgact tcatccccaa gttggaaaag cagcccatat gagagaattg 12000
ccccttctga gtccaccaca gacaaagagg caattcaccc ttctacaaac acagtagaga 12060
ccacaggctg ggtcacaagt tccgaacatg cttctcattc cactatccca gcccactcag 12120
cgtcatccaa actcacatct ccagtggtta caacctccac cagggaacaa gcaatagttt 12180
ctatgtcaac aaccacatgg ccagagtcta caagggctag aacagagcct aattccttct 12240
tgactattga actgagggac gtcagccctt acatggacac cagctcaacc acacaaacaa 12300
gtattatctc ttccccaggt tccactgcga tcaccaaggg gcctagaaca gaaattacct 12360
cctctaagag aatatccagc tcattccttg cccagtctat gaggtcgtca gacagcccct 12420
cagaagccat caccaggctg tctaactttc ctgccatgac agaatctgga ggaatgatcc 12480
ttgctatgca aacaagtcca cctggcgcta catcactaag tgcacctact ttggatacat 12540
cagccacagc ctcctggaca gggactccac tggctacgac tcagagattt acatactcag 12600
agaagaccac tctctttagc aaaggtcctg aggatacatc acagccaagc cctccctctg 12660
tggaagaaac cagctcttcc tcttccctgg tacctatcca tgctacaacc tcgccttcca 12720
atattttgtt gacatcacaa gggcacagtc cctcctctac tccacctgtg acctcagttt 12780
tcttgtctga gacctctggc ctggggaaga ccacagacat gtcgaggata agcttggaac 12840
ctggcacaag tttacctccc aatttgagca gtacagcagg tgaggcgtta tccacttatg 12900
aagcctccag agatacaaag gcaattcatc attctgcaga cacagcagtg acgaatatgg 12960
aggcaaccag ttctgaatat tctcctatcc caggccatac aaagccatcc aaagccacat 13020
ctccattggt tacctcccac atcatggggg acatcacttc ttccacatca gtatttggct 13080
cctccgagac cacagagatt gagacagtgt cctctgtgaa ccagggactt caggagagaa 13140
gcacatccca ggtggccagc tctgctacag agacaagcac tgtcattacc catgtgtcta 13200
gtggtgatgc tactactcat gtcaccaaga cacaagccac tttctctagc ggaacatcca 13260
tctcaagccc tcatcagttt ataacttcta ccaacacatt tacagatgtg agcaccaacc 13320
cctccacctc tctgataatg acagaatctt caggagtgac catcaccacc caaacaggtc 13380
ctactggagc tgcaacacag ggtccatatc tcttggacac atcaaccatg ccttacttga 13440
cagagactcc attagctgtg actccagatt ttatgcaatc agagaagacc actctcataa 13500
gcaaaggtcc caaggatgtg tcctggacaa gccctccctc tgtggcagaa accagctatc 13560
cctcttccct gacacctttc ttggtcacaa ccatacctcc tgccacttcc acgttacaag 13620
ggcaacatac atcctctcct gtttctgcga cttcagttct tacctctgga ctggtgaaga 13680
ccacagatat gttgaacaca agcatggaac ctgtgaccaa ttcacctcaa aatttgaaca 13740
atccatcaaa tgagatactg gccactttgg cagccaccac agatatagag actattcatc 13800
cttccataaa caaagcagtg accaatatgg ggactgccag ttcagcacat gtactgcatt 13860
ccactctccc agtcagctca gaaccatcta cagccacatc tccaatggtt cctgcctcca 13920
gcatggggga cgctcttgct tctatatcaa tacctggttc tgagaccaca gacattgagg 13980
gagagccaac atcctccctg actgctggac gaaaagagaa cagcaccctc caggagatga 14040
actcaactac agagtcaaac atcatcctct ccaatgtgtc tgtgggggct attactgaag 14100
ccacaaaaat ggaagtcccc tcttttgatg caacattcat accaactcct gctcagtcaa 14160
caaagttccc agatattttc tcagtagcca gcagtagact ttcaaactct cctcccatga 14220
caatatctac ccacatgacc accacccaga cagggtcttc tggagctaca tcaaagattc 14280
cacttgcctt agacacatca accttggaaa cctcagcagg gactccatca gtggtgactg 14340
aggggtttgc ccactcaaaa ataaccactg caatgaacaa tgatgtcaag gacgtgtcac 14400
agacaaaccc tccctttcag gatgaagcca gctctccctc ttctcaagca cctgtccttg 14460
tcacaacctt accttcttct gttgctttca caccgcaatg gcacagtacc tcctctcctg 14520
tttctatgtc ctcagttctt acttcttcac tggtaaagac cgcaggcaag gtggatacaa 14580
gcttagaaac agtgaccagt tcacctcaaa gtatgagcaa cactttggat gacatatcgg 14640
tcacttcagc agccaccaca gatatagaga caacgcatcc ttccataaac acagtagtta 14700
ccaatgtggg gaccaccggt tcagcatttg aatcacattc tactgtctca gcttacccag 14760
agccatctaa agtcacatct ccaaatgtta ccacctccac catggaagac accacaattt 14820
ccagatcaat acctaaatcc tctaagacta caagaactga gactgagaca acttcctccc 14880
tgactcctaa actgagggag accagcatct cccaggagat cacctcgtcc acagagacaa 14940
gcactgttcc ttacaaagag ctcactggtg ccactaccga ggtatccagg acagatgtca 15000
cttcctctag cagtacatcc ttccctggcc ctgatcagtc cacagtgtca ctagacatct 15060
ccacagaaac caacaccagg ctgtctacct ccccaataat gacagaatct gcagaaataa 15120
ccatcaccac ccaaacaggt cctcatgggg ctacatcaca ggatactttt accatggacc 15180
catcaaatac aaccccccag gcagggatcc actcagctat gactcatgga ttttcacaat 15240
tggatgtgac cactcttatg agcagaattc cacaggatgt atcatggaca agtcctccct 15300
ctgtggataa aaccagctcc ccctcttcct ttctgtcctc acctgcaatg accacacctt 15360
ccctgatttc ttctacctta ccagaggata agctctcctc tcctatgact tcacttctca 15420
cctctggcct agtgaagatt acagacatat tacgtacacg cttggaacct gtgaccagct 15480
cacttccaaa tttcagcagc acctcagata agatactggc cacttctaaa gacagtaaag 15540
acacaaagga aatttttcct tctataaaca cagaagagac caatgtgaaa gccaacaact 15600
ctggacatga atcccattcc cctgcactgg ctgactcaga gacacccaaa gccacaactc 15660
aaatggttat caccaccact gtgggagatc cagctccttc cacatcaatg ccagtgcatg 15720
gttcctctga gactacaaac attaagagag agccaacata tttcttgact cctagactga 15780
gagagaccag tacctctcag gagtccagct ttcccacgga cacaagtttt ctactttcca 15840
aagtccccac tggtactatt actgaggtct ccagtacagg ggtcaactct tctagcaaaa 15900
tttccacccc agaccatgat aagtccacag tgccacctga caccttcaca ggagagatcc 15960
ccagggtctt cacctcctct attaagacaa aatctgcaga aatgacgatc accacccaag 16020
caagtcctcc tgagtctgca tcgcacagta cccttccctt ggacacatca accacacttt 16080
cccagggagg gactcattca actgtgactc agggattccc atactcagag gtgaccactc 16140
tcatgggcat gggtcctggg aatgtgtcat ggatgacaac tccccctgtg gaagaaacca 16200
gctctgtgtc ttccctgatg tcttcacctg ccatgacatc cccttctcct gtttcctcca 16260
catcaccaca gagcatcccc tcctctcctc ttcctgtgac tgcacttcct acttctgttc 16320
tggtgacaac cacagatgtg ttgggcacaa caagcccaga gtctgtaacc agttcacctc 16380
caaatttgag cagcatcact catgagagac cggccactta caaagacact gcacacacag 16440
aagccgccat gcatcattcc acaaacaccg cagtgaccaa tgtagggact tccgggtctg 16500
gacataaatc acaatcctct gtcctagctg actcagagac atcgaaagcc acacctctga 16560
tgagtaccac ctccaccctg ggggacacaa gtgtttccac atcaactcct aatatctctc 16620
agactaacca aattcaaaca gagccaacag catccctgag ccctagactg agggagagca 16680
gcacgtctga gaagaccagc tcaacaacag agacaaatac tgccttttct tatgtgccca 16740
caggtgctat tactcaggcc tccagaacag aaatctcctc tagcagaaca tccatctcag 16800
accttgatcg gcccacaata gcacccgaca tctccacagg aatgatcacc aggctcttca 16860
cctcccccat catgacaaaa tctgcagaaa tgaccgtcac cactcaaaca actactcctg 16920
gggctacatc acagggtatc cttccctggg acacatcaac cacacttttc cagggaggga 16980
ctcattcaac cgtgtctcag ggattcccac actcagagat aaccactctt cggagcagaa 17040
cccctggaga tgtgtcatgg atgacaactc cccctgtgga agaaaccagc tctgggtttt 17100
ccctgatgtc accttccatg acatcccctt ctcctgtttc ctccacatca ccagagagca 17160
tcccctcctc tcctctccct gtgactgcac ttcttacttc tgttctggtg acaaccacaa 17220
atgtattggg cacaacaagc ccagagcccg taacgagttc acctccaaat ttaagcagcc 17280
ccacacagga gagactgacc acttacaaag acactgcgca cacagaagcc atgcatgctt 17340
ccatgcatac aaacactgca gtggccaacg tggggacctc catttctgga catgaatcac 17400
aatcttctgt cccagctgat tcacacacat ccaaagccac atctccaatg ggtatcacct 17460
tcgccatggg ggatacaagt gtttctacat caactcctgc cttctttgag actagaattc 17520
agactgaatc aacatcctct ttgattcctg gattaaggga caccaggacg tctgaggaga 17580
tcaacactgt gacagagacc agcactgtcc tttcagaagt gcccactact actactactg 17640
aggtctccag gacagaagtt atcacttcca gcagaacaac catctcaggg cctgatcatt 17700
ccaaaatgtc accctacatc tccacagaaa ccatcaccag gctctccact tttccttttg 17760
taacaggatc cacagaaatg gccatcacca accaaacagg tcctataggg actatctcac 17820
aggctaccct taccctggac acatcaagca cagcttcctg ggaagggact cactcacctg 17880
tgactcagag atttccacac tcagaggaga ccactactat gagcagaagt actaagggcg 17940
tgtcatggca aagccctccc tctgtggaag aaaccagttc tccttcttcc ccagtgcctt 18000
tacctgcaat aacctcacat tcatctcttt attccgcagt atcaggaagt agccccactt 18060
ctgctctccc tgtgacttcc cttctcacct ctggcaggag gaagaccata gacatgttgg 18120
acacacactc agaacttgtg accagctcct taccaagtgc aagtagcttc tcaggtgaga 18180
tactcacttc tgaagcctcc acaaatacag agacaattca cttttcagag aacacagcag 18240
aaaccaatat ggggaccacc aattctatgc ataaactaca ttcctctgtc tcaatccact 18300
cccagccatc cggacacaca cctccaaagg ttactggatc tatgatggag gacgctattg 18360
tttccacatc aacacctggt tctcctgaga ctaaaaatgt tgacagagac tcaacatccc 18420
ctctgactcc tgaactgaaa gaggacagca ccgccctggt gatgaactca actacagagt 18480
caaacactgt tttctccagt gtgtccctgg atgctgctac tgaggtctcc agggcagaag 18540
tcacctacta tgatcctaca ttcatgccag cttctgctca gtcaacaaag tccccagaca 18600
tttcacctga agccagcagc agtcattcta actctcctcc cttgacaata tctacacaca 18660
agaccatcgc cacacaaaca ggtccttctg gggtgacatc tcttggccaa ctgaccctgg 18720
acacatcaac catagccacc tcagcaggaa ctccatcagc cagaactcag gattttgtag 18780
attcagaaac aaccagtgtc atgaacaatg atctcaatga tgtgttgaag acaagccctt 18840
tctctgcaga agaagccaac tctctctctt ctcaggcacc tctccttgtg acaacctcac 18900
cttctcctgt aacttccaca ttgcaagagc acagtacctc ctctcttgtt tctgtgacct 18960
cagtacccac ccctacactg gcgaagatca cagacatgga cacaaactta gaacctgtga 19020
ctcgttcacc tcaaaattta aggaacacct tggccacttc agaagccacc acagatacac 19080
acacaatgca tccttctata aacacagcag tggccaatgt ggggaccacc agttcaccaa 19140
atgaattcta ttttactgtc tcacctgact cagacccata taaagccaca tccgcagtag 19200
ttatcacttc cacctcgggg gactcaatag tttccacatc aatgcctaga tcctctgcga 19260
tgaaaaagat tgagtctgag acaactttct ccctgatatt tagactgagg gagactagca 19320
cctcccagaa aattggctca tcctcagaca caagcacggt ctttgacaaa gcattcactg 19380
ctgctactac tgaggtctcc agaacagaac tcacctcctc tagcagaaca tccatccaag 19440
gcactgaaaa gcccacaatg tcaccggaca cctccacaag atctgtcacc atgctttcta 19500
cttttgctgg cctgacaaaa tccgaagaaa ggaccattgc cacccaaaca ggtcctcata 19560
gggcgacatc acagggtacc cttacctggg acacatcaat cacaacctca caggcaggga 19620
cccactcagc tatgactcat ggattttcac aattagattt gtccactctt acgagtagag 19680
ttcctgagta catatcaggg acaagcccac cctctgtgga aaaaaccagc tcttcctctt 19740
cccttctgtc tttaccagca ataacctcac cgtcccctgt acctactaca ttaccagaaa 19800
gtaggccgtc ttctcctgtt catctgactt cactccccac ctctggccta gtgaagacca 19860
cagatatgct ggcatctgtg gccagtttac ctccaaactt gggcagcacc tcacataaga 19920
taccgactac ttcagaagac attaaagata cagagaaaat gtatccttcc acaaacatag 19980
cagtaaccaa tgtggggacc accacttctg aaaaggaatc ttattcgtct gtcccagcct 20040
actcagaacc acccaaagtc acctctccaa tggttacctc tttcaacata agggacacca 20100
ttgtttccac atccatgcct ggctcctctg agattacaag gattgagatg gagtcaacat 20160
tctccctggc tcatgggctg aagggaacca gcacctccca ggaccccatc gtatccacag 20220
agaaaagtgc tgtccttcac aagttgacca ctggtgctac tgagacctct aggacagaag 20280
ttgcctcttc tagaagaaca tccattccag gccctgatca ttccacagag tcaccagaca 20340
tctccactga agtgatcccc agcctgccta tctcccttgg cattacagaa tcttcaaata 20400
tgaccatcat cactcgaaca ggtcctcctc ttggctctac atcacagggc acatttacct 20460
tggacacacc aactacatcc tccagggcag gaacacactc gatggcgact caggaatttc 20520
cacactcaga aatgaccact gtcatgaaca aggaccctga gattctatca tggacaatcc 20580
ctccttctat agagaaaacc agcttctcct cttccctgat gccttcacca gccatgactt 20640
cacctcctgt ttcctcaaca ttaccaaaga ccattcacac cactccttct cctatgacct 20700
cactgctcac ccctagccta gtgatgacca cagacacatt gggcacaagc ccagaaccta 20760
caaccagttc acctccaaat ttgagcagta cctcacatga gatactgaca acagatgaag 20820
acaccacagc tatagaagcc atgcatcctt ccacaagcac agcagcgact aatgtggaaa 20880
ccaccagttc tggacatggg tcacaatcct ctgtcctagc tgactcagaa aaaaccaagg 20940
ccacagctcc aatggatacc acctccacca tggggcatac aactgtttcc acatcaatgt 21000
ctgtttcctc tgagactaca aaaattaaga gagagtcaac atattccttg actcctggac 21060
tgagagagac cagcatttcc caaaatgcca gcttttccac tgacacaagt attgttcttt 21120
cagaagtccc cactggtact actgctgagg tctccaggac agaagtcacc tcctctggta 21180
gaacatccat ccctggccct tctcagtcca cagttttgcc agaaatatcc acaagaacaa 21240
tgacaaggct ctttgcctcg cccaccatga cagaatcagc agaaatgacc atccccactc 21300
aaacaggtcc ttctgggtct acctcacagg atacccttac cttggacaca tccaccacaa 21360
agtcccaggc aaagactcat tcaactttga ctcagagatt tccacactca gagatgacca 21420
ctctcatgag cagaggtcct ggagatatgt catggcaaag ctctccctct ctggaaaatc 21480
ccagctctct cccttccctg ctgtctttac ctgccacaac ctcacctcct cccatttcct 21540
ccacattacc agtgactatc tcctcctctc ctcttcctgt gacttcactt ctcacctcta 21600
gcccggtaac gaccacagac atgttacaca caagcccaga acttgtaacc agttcacctc 21660
caaagctgag ccacacttca gatgagagac tgaccactgg caaggacacc acaaatacag 21720
aagctgtgca tccttccaca aacacagcag cgtccaatgt ggagattccc agctctggac 21780
atgaatcccc ttcctctgcc ttagctgact cagagacatc caaagccaca tcaccaatgt 21840
ttattacctc cacccaggag gatacaactg ttgccatatc aacccctcac ttcttggaga 21900
ctagcagaat tcagaaagag tcaatttcct ccctgagccc taaattgagg gagacaggca 21960
gttctgtgga gacaagctca gccatagaga caagtgctgt cctttctgaa gtgtccattg 22020
gtgctactac tgagatctcc aggacagaag tcacctcctc tagcagaaca tccatctctg 22080
gttctgctga gtccacaatg ttgccagaaa tatccaccac aagaaaaatc attaagttcc 22140
ctacttcccc catcctggca gaatcatcag aaatgaccat caagacccaa acaagtcctc 22200
ctgggtctac atcagagagt acctttacat tagacacatc aaccactccc tccttggtaa 22260
taacccattc gactatgact cagagattgc cacactcaga gataaccact cttgtgagta 22320
gaggtgctgg ggatgtgcca cggcccagct ctctccctgt ggaagaaaca agccctccat 22380
cttcccagct gtctttatct gccatgatct caccttctcc tgtttcttcc acattaccag 22440
caagtagcca ctcctcttct gcttctgtga cttcacttct cacaccaggc caagtgaaga 22500
ctactgaggt gttggacgca agtgcagaac ctgaaaccag ttcacctcca agtttgagca 22560
gcacctcagt tgaaatactg gccacctctg aagtcaccac agatacggag aaaattcatc 22620
ctttctcaaa cacggcagta accaaagttg gaacttccag ttctggacat gaatcccctt 22680
cctctgtcct acctgactca gagacaacca aagccacatc ggcaatgggt accatctcca 22740
ttatggggga tacaagtgtt tctacattaa ctcctgcctt atctaacact aggaaaattc 22800
agtcagagcc agcttcctca ctgaccacca gattgaggga gaccagcacc tctgaagaga 22860
ccagcttagc cacagaagca aacactgttc tttctaaagt gtccactggt gctactactg 22920
aggtctccag gacagaagcc atctccttta gcagaacatc catgtcaggc cctgagcagt 22980
ccacaatgtc acaagacatc tccataggaa ccatccccag gatttctgcc tcctctgtcc 23040
tgacagaatc tgcaaaaatg accatcacaa cccaaacagg tccttcggag tctacactag 23100
aaagtaccct taatttgaac acagcaacca caccctcttg ggtggaaacc cactctatag 23160
taattcaggg atttccacac ccagagatga ccacttccat gggcagaggt cctggaggtg 23220
tgtcatggcc tagccctccc tttgtgaaag aaaccagccc tccatcctcc ccgctgtctt 23280
tacctgccgt gacctcacct catcctgttt ccaccacatt cctagcacat atccccccct 23340
ctccccttcc tgtgacttca cttctcacct ctggcccggc gacaaccaca gatatcttgg 23400
gtacaagcac agaacctgga accagttcat cttcaagttt gagcaccacc tcccatgaga 23460
gactgaccac ttacaaagac actgcacata cagaagccgt gcatccttcc acaaacacag 23520
gagggaccaa tgtggcaacc accagctctg gatataaatc acagtcctct gtcctagctg 23580
actcatctcc aatgtgtacc acctccacca tgggggatac aagtgttctc acatcaactc 23640
ctgccttcct tgagactagg aggattcaga cagagctagc ttcctccctg acccctggat 23700
tgagggagtc cagcggctct gaagggacca gctcaggcac caagatgagc actgtcctct 23760
ctaaagtgcc cactggtgct actactgaga tctccaagga agacgtcacc tccatcccag 23820
gtcccgctca atccacaata tcaccagaca tctccacaag aaccgtcagc tggttctcta 23880
catcccctgt catgacagaa tcagcagaaa taaccatgaa cacccataca agtcctttag 23940
gggccacaac acaaggcacc agtactttgg acacgtcaag cacaacctct ttgacaatga 24000
cacactcaac tatatctcaa ggattttcac actcacagat gagcactctt atgaggaggg 24060
gtcctgagga tgtatcatgg atgagccctc cccttctgga aaaaactaga ccttcctttt 24120
ctctgatgtc ttcaccagcc acaacttcac cttctcctgt ttcctccaca ttaccagaga 24180
gcatctcttc ctctcctctt cctgtgactt cactcctcac gtctggcttg gcaaaaacta 24240
cagatatgtt gcacaaaagc tcagaacctg taaccaactc acctgcaaat ttgagcagca 24300
cctcagttga aatactggcc acctctgaag tcaccacaga tacagagaaa actcatcctt 24360
cttcaaacag aacagtgacc gatgtgggga cctccagttc tggacatgaa tccacttcct 24420
ttgtcctagc tgactcacag acatccaaag tcacatctcc aatggttatt acctccacca 24480
tggaggatac gagtgtctcc acatcaactc ctggcttttt tgagactagc agaattcaga 24540
cagaaccaac atcctccctg acccttggac tgagaaagac cagcagctct gaggggacca 24600
gcttagccac agagatgagc actgtccttt ctggagtgcc cactggtgcc actgctgaag 24660
tctccaggac agaagtcacc tcctctagca gaacatccat ctcaggcttt gctcagctca 24720
cagtgtcacc agagacttcc acagaaacca tcaccagact ccctacctcc agcataatga 24780
cagaatcagc agaaatgatg atcaagacac aaacagatcc tcctgggtct acaccagaga 24840
gtactcatac tgtggacata tcaacaacac ccaactgggt agaaacccac tcgactgtga 24900
ctcagagatt ttcacactca gagatgacca ctcttgtgag cagaagccct ggtgatatgt 24960
tatggcctag tcaatcctct gtggaagaaa ccagctctgc ctcttccctg ctgtctctgc 25020
ctgccacgac ctcaccttct cctgtttcct ctacattagt agaggatttc ccttccgctt 25080
ctcttcctgt gacttctctt ctcaaccctg gcctggtgat aaccacagac aggatgggca 25140
taagcagaga acctggaacc agttccactt caaatttgag cagcacctcc catgagagac 25200
tgaccacttt ggaagacact gtagatacag aagacatgca gccttccaca cacacagcag 25260
tgaccaacgt gaggacctcc atttctggac atgaatcaca atcttctgtc ctatctgact 25320
cagagacacc caaagccaca tctccaatgg gtaccaccta caccatgggg gaaacgagtg 25380
tttccatatc cacttctgac ttctttgaga ccagcagaat tcagatagaa ccaacatcct 25440
ccctgacttc tggattgagg gagaccagca gctctgagag gatcagctca gccacagagg 25500
gaagcactgt cctttctgaa gtgcccagtg gtgctaccac tgaggtctcc aggacagaag 25560
tgatatcctc taggggaaca tccatgtcag ggcctgatca gttcaccata tcaccagaca 25620
tctctactga agcgatcacc aggctttcta cttcccccat tatgacagaa tcagcagaaa 25680
gtgccatcac tattgagaca ggttctcctg gggctacatc agagggtacc ctcaccttgg 25740
acacctcaac aacaaccttt tggtcaggga cccactcaac tgcatctcca ggattttcac 25800
actcagagat gaccactctt atgagtagaa ctcctggaga tgtgccatgg ccgagccttc 25860
cctctgtgga agaagccagc tctgtctctt cctcactgtc ttcacctgcc atgacctcaa 25920
cttctttttt ctccacatta ccagagagca tctcctcctc tcctcatcct gtgactgcac 25980
ttctcaccct tggcccagtg aagaccacag acatgttgcg cacaagctca gaacctgaaa 26040
ccagttcacc tccaaatttg agcagcacct cagctgaaat attagccacg tctgaagtca 26100
ccaaagatag agagaaaatt catccctcct caaacacacc tgtagtcaat gtagggactg 26160
tgatttataa acatctatcc ccttcctctg ttttggctga cttagtgaca acaaaaccca 26220
catctccaat ggctaccacc tccactctgg ggaatacaag tgtttccaca tcaactcctg 26280
ccttcccaga aactatgatg acacagccaa cttcctccct gacttctgga ttaagggaga 26340
tcagtacctc tcaagagacc agctcagcaa cagagagaag tgcttctctt tctggaatgc 26400
ccactggtgc tactactaag gtctccagaa cagaagccct ctccttaggc agaacatcca 26460
ccccaggtcc tgctcaatcc acaatatcac cagaaatctc cacggaaacc atcactagaa 26520
tttctactcc cctcaccacg acaggatcag cagaaatgac catcaccccc aaaacaggtc 26580
attctggggc atcctcacaa ggtaccttta ccttggacac atcaagcaga gcctcctggc 26640
caggaactca ctcagctgca actcacagat ctccacactc agggatgacc actcctatga 26700
gcagaggtcc tgaggatgtg tcatggccaa gccgcccatc agtggaaaaa actagccctc 26760
catcttccct ggtgtcttta tctgcagtaa cctcaccttc gccactttat tccacaccat 26820
ctgagagtag ccactcatct cctctccggg tgacttctct tttcacccct gtcatgatga 26880
agaccacaga catgttggac acaagcttgg aacctgtgac cacttcacct cccagtatga 26940
atatcacctc agatgagagt ctggccactt ctaaagccac catggagaca gaggcaattc 27000
agctttcaga aaacacagct gtgactcaga tgggcaccat cagcgctaga caagaattct 27060
attcctctta tccaggcctc ccagagccat ccaaagtgac atctccagtg gtcacctctt 27120
ccaccataaa agacattgtt tctacaacca tacctgcttc ctctgagata acaagaattg 27180
agatggagtc aacatccacc ctgaccccca caccaaggga gaccagcacc tcccaggaga 27240
tccactcagc cacaaagcca agcactgttc cttacaaggc actcactagt gccacgattg 27300
aggactccat gacacaagtc atgtcctcta gcagaggacc tagccctgat cagtccacaa 27360
tgtcacaaga catatccact gaagtgatca ccaggctctc tacctccccc atcaagacag 27420
aatctacaga aatgaccatt accacccaaa caggttctcc tggggctaca tcaaggggta 27480
cccttacctt ggacacttca acaactttta tgtcagggac ccactcaact gcatctcaag 27540
gattttcaca ctcacagatg accgctctta tgagtagaac tcctggagat gtgccatggc 27600
taagccatcc ctctgtggaa gaagccagct ctgcctcttt ctcactgtct tcacctgtca 27660
tgacctcatc ttctcccgtt tcttccacat taccagacag catccactct tcttcgcttc 27720
ctgtgacatc acttctcacc tcagggctgg tgaagaccac agagctgttg ggcacaagct 27780
cagaacctga aaccagttca cccccaaatt tgagcagcac ctcagctgaa atactggcca 27840
tcactgaagt cactacagat acagagaaac tggagatgac caatgtggta acctcaggtt 27900
atacacatga atctccttcc tctgtcctag ctgactcagt gacaacaaag gccacatctt 27960
caatgggtat cacctacccc acaggagata caaatgttct cacatcaacc cctgccttct 28020
ctgacaccag taggattcaa acaaagtcaa agctctcact gactcctggg ttgatggaga 28080
ccagcatctc tgaagagacc agctctgcca cagaaaaaag cactgtcctt tctagtgtgc 28140
ccactggtgc tactactgag gtctccagga cagaagccat ctcttctagc agaacatcca 28200
tcccaggccc tgctcaatcc acaatgtcat cagacacctc catggaaacc atcactagaa 28260
tttctacccc cctcacaagg aaagaatcaa cagacatggc catcaccccc aaaacaggtc 28320
cttctggggc tacctcgcag ggtaccttta ccttggactc atcaagcaca gcctcctggc 28380
caggaactca ctcagctaca actcagagat ttccacagtc agtggtgaca actcctatga 28440
gcagaggtcc tgaggatgtg tcatggccaa gcccgctgtc tgtggaaaaa aacagccctc 28500
catcttccct ggtatcttca tcttcagtaa cctcaccttc gccactttat tccacaccat 28560
ctgggagtag ccactcctct cctgtccctg tcacttctct tttcacctct atcatgatga 28620
aggccacaga catgttggat gcaagtttgg aacctgagac cacttcagct cccaatatga 28680
atatcacctc agatgagagt ctggccgctt ctaaagccac cacggagaca gaggcaattc 28740
acgtttttga aaatacagca gcgtcccatg tggaaaccac cagtgctaca gaggaactct 28800
attcctcttc cccaggcttc tcagagccaa caaaagtgat atctccagtg gtcacctctt 28860
cctctataag agacaacatg gtttccacaa caatgcctgg ctcctctggc attacaagga 28920
ttgagataga gtcaatgtca tctctgaccc ctggactgag ggagaccaga acctcccagg 28980
acatcacctc atccacagag acaagcactg tcctttacaa gatgccctct ggtgccactc 29040
ctgaggtctc caggacagaa gttatgccct ctagcagaac atccattcct ggccctgctc 29100
agtccacaat gtcactagac atctccgatg aagttgtcac caggctgtct acctctccca 29160
tcatgacaga atctgcagaa ataaccatca ccacccaaac aggttattct ctggctacat 29220
cccaggttac ccttcccttg ggcacctcaa tgaccttttt gtcagggacc cactcaacta 29280
tgtctcaagg actttcacac tcagagatga ccaatcttat gagcaggggt cctgaaagtc 29340
tgtcatggac gagccctcgc tttgtggaaa caactagatc ttcctcttct ctgacatcat 29400
tacctctcac gacctcactt tctcctgtgt cctccacatt actagacagt agcccctcct 29460
ctcctcttcc tgtgacttca cttatcctcc caggcctggt gaagactaca gaagtgttgg 29520
atacaagctc agagcctaaa accagttcat ctccaaattt gagcagcacc tcagttgaaa 29580
taccggccac ctctgaaatc atgacagata cagagaaaat tcatccttcc tcaaacacag 29640
cggtggccaa agtgaggacc tccagttctg ttcatgaatc tcattcctct gtcctagctg 29700
actcagaaac aaccataacc ataccttcaa tgggtatcac ctccgctgtg gacgatacca 29760
ctgttttcac atcaaatcct gccttctctg agactaggag gattccgaca gagccaacat 29820
tctcattgac tcctggattc agggagacta gcacctctga agagaccacc tcaatcacag 29880
aaacaagtgc agtcctttat ggagtgccca ctagtgctac tactgaagtc tccatgacag 29940
aaatcatgtc ctctaataga atacacatcc ctgactctga tcagtccacg atgtctccag 30000
acatcatcac tgaagtgatc accaggctct cttcctcatc catgatgtca gaatcaacac 30060
aaatgaccat caccacccaa aaaagttctc ctggggctac agcacagagt actcttacct 30120
tggccacaac aacagccccc ttggcaagga cccactcaac tgttcctcct agatttttac 30180
actcagagat gacaactctt atgagtagga gtcctgaaaa tccatcatgg aagagctctc 30240
tctttgtgga aaaaactagc tcttcatctt ctctgttgtc cttacctgtc acgacctcac 30300
cttctgtttc ttccacatta ccgcagagta tcccttcctc ctctttttct gtgacttcac 30360
tcctcacccc aggcatggtg aagactacag acacaagcac agaacctgga accagtttat 30420
ctccaaatct gagtggcacc tcagttgaaa tactggctgc ctctgaagtc accacagata 30480
cagagaaaat tcatccttct tcaagcatgg cagtgaccaa tgtgggaacc accagttctg 30540
gacatgaact atattcctct gtttcaatcc actcggagcc atccaaggct acatacccag 30600
tgggtactcc ctcttccatg gctgaaacct ctatttccac atcaatgcct gctaattttg 30660
agaccacagg atttgaggct gagccatttt ctcatttgac ttctggattt aggaagacaa 30720
acatgtccct ggacaccagc tcagtcacac caacaaatac accttcttct cctgggtcca 30780
ctcacctttt acagagttcc aagactgatt tcacctcttc tgcaaaaaca tcatccccag 30840
actggcctcc agcctcacag tatactgaaa ttccagtgga cataatcacc ccctttaatg 30900
cttctccatc tattacggag tccactggga taacctcctt cccagaatcc aggtttacta 30960
tgtctgtaac agaaagtact catcatctga gtacagattt gctgccttca gctgagacta 31020
tttccactgg cacagtgatg ccttctctat cagaggccat gacttcattt gccaccactg 31080
gagttccacg agccatctca ggttcaggta gtccattctc taggacagag tcaggccctg 31140
gggatgctac tctgtccacc attgcagaga gcctgccttc atccactcct gtgccattct 31200
cctcttcaac cttcactacc actgattctt caaccatccc agccctccat gagataactt 31260
cctcttcagc taccccatat agagtggaca ccagtcttgg gacagagagc agcactactg 31320
aaggacgctt ggttatggtc agtactttgg acacttcaag ccaaccaggc aggacatctt 31380
catcacccat tttggatacc agaatgacag agagcgttga gctgggaaca gtgacaagtg 31440
cttatcaagt tccttcactc tcaacacggt tgacaagaac tgatggcatt atggaacaca 31500
tcacaaaaat acccaatgaa gcagcacaca gaggtaccat aagaccagtc aaaggccctc 31560
agacatccac ttcgcctgcc agtcctaaag gactacacac aggagggaca aaaagaatgg 31620
agaccaccac cacagctctg aagaccacca ccacagctct gaagaccact tccagagcca 31680
ccttgaccac cagtgtctat actcccactt tgggaacact gactcccctc aatgcatcaa 31740
tgcaaatggc cagcacaatc cccacagaaa tgatgatcac aaccccatat gttttccctg 31800
atgttccaga aacgacatcc tcattggcta ccagcctggg agcagaaacc agcacagctc 31860
ttcccaggac aaccccatct gttttcaata gagaatcaga gaccacagcc tcactggtct 31920
ctcgttctgg ggcagagaga agtccggtta ttcaaactct agatgtttct tctagtgagc 31980
cagatacaac agcttcatgg gttatccatc ctgcagagac catcccaact gtttccaaga 32040
caacccccaa ttttttccac agtgaattag acactgtatc ttccacagcc accagtcatg 32100
gggcagacgt cagctcagcc attccaacaa atatctcacc tagtgaacta gatgcactga 32160
ccccactggt cactatttcg gggacagata ctagtacaac attcccaaca ctgactaagt 32220
ccccacatga aacagagaca agaaccacat ggctcactca tcctgcagag accagctcaa 32280
ctattcccag aacaatcccc aatttttctc atcatgaatc agatgccaca ccttcaatag 32340
ccaccagtcc tggggcagaa accagttcag ctattccaat tatgactgtc tcacctggtg 32400
cagaagatct ggtgacctca caggtcacta gttctgggac agacagaaat atgactattc 32460
caactttgac tctttctcct ggtgaaccaa agacgatagc ctcattagtc acccatcctg 32520
aagcacagac aagttcggcc attccaactt caactatctc gcctgctgta tcacggttgg 32580
tgacctcaat ggtcaccagt ttggcggcaa agacaagtac aactaatcga gctctgacaa 32640
actcccctgg tgaaccagct acaacagttt cattggtcac gcatcctgca cagaccagcc 32700
caacagttcc ctggacaact tccatttttt tccatagtaa atcagacacc acaccttcaa 32760
tgaccaccag tcatggggca gaatccagtt cagctgttcc aactccaact gtttcaactg 32820
aggtaccagg agtagtgacc cctttggtca ccagttctag ggcagtgatc agtacaacta 32880
ttccaattct gactctttct cctggtgaac cagagaccac accttcaatg gccaccagtc 32940
atggggaaga agccagttct gctattccaa ctccaactgt ttcacctggg gtaccaggag 33000
tggtgacctc tctggtcact agttctaggg cagtgactag tacaactatt ccaattctga 33060
ctttttctct tggtgaacca gagaccacac cttcaatggc caccagtcat gggacagaag 33120
ctggctcagc tgttccaact gttttacctg aggtaccagg aatggtgacc tctctggttg 33180
ctagttctag ggcagtaacc agtacaactc ttccaactct gactctttct cctggtgaac 33240
cagagaccac accttcaatg gccaccagtc atggggcaga agccagctca actgttccaa 33300
ctgtttcacc tgaggtacca ggagtggtga cctctctggt cactagttct agtggagtaa 33360
acagtacaag tattccaact ctgattcttt ctcctggtga actagaaacc acaccttcaa 33420
tggccaccag tcatggggca gaagccagct cagctgttcc aactccaact gtttcacctg 33480
gggtatcagg agtggtgacc cctctggtca ctagttccag ggcagtgacc agtacaacta 33540
ttccaattct aactctttct tctagtgagc cagagaccac accttcaatg gccaccagtc 33600
atggggtaga agccagctca gctgttctaa ctgtttcacc tgaggtacca ggaatggtga 33660
cctctctggt cactagttct agagcagtaa ccagtacaac tattccaact ctgactattt 33720
cttctgatga accagagacc acaacttcat tggtcaccca ttctgaggca aagatgattt 33780
cagccattcc aactttagct gtctccccta ctgtacaagg gctggtgact tcactggtca 33840
ctagttctgg gtcagagacc agtgcgtttt caaatctaac tgttgcctca agtcaaccag 33900
agaccataga ctcatgggtc gctcatcctg ggacagaagc aagttctgtt gttccaactt 33960
tgactgtctc cactggtgag ccgtttacaa atatctcatt ggtcacccat cctgcagaga 34020
gtagctcaac tcttcccagg acaacctcaa ggttttccca cagtgaatta gacactatgc 34080
cttctacagt caccagtcct gaggcagaat ccagctcagc catttcaaca actatttcac 34140
ctggtatacc aggtgtgctg acatcactgg tcactagctc tgggagagac atcagtgcaa 34200
cttttccaac agtgcctgag tccccacatg aatcagaggc aacagcctca tgggttactc 34260
atcctgcagt caccagcaca acagttccca ggacaacccc taattattct catagtgaac 34320
cagacaccac accatcaata gccaccagtc ctggggcaga agccacttca gattttccaa 34380
caataactgt ctcacctgat gtaccagata tggtaacctc acaggtcact agttctggga 34440
cagacaccag tataactatt ccaactctga ctctttcttc tggtgagcca gagaccacaa 34500
cctcatttat cacctattct gagacacaca caagttcagc cattccaact ctccctgtct 34560
cccctggtgc atcaaagatg ctgacctcac tggtcatcag ttctgggaca gacagcacta 34620
caactttccc aacactgacg gagaccccat atgaaccaga gacaacagcc atacagctca 34680
ttcatcctgc agagaccaac acaatggttc ccaggacaac tcccaagttt tcccatagta 34740
agtcagacac cacactccca gtagccatca ccagtcctgg gccagaagcc agttcagctg 34800
tttcaacgac aactatctca cctgatatgt cagatctggt gacctcactg gtccctagtt 34860
ctgggacaga caccagtaca accttcccaa cattgagtga gaccccatat gaaccagaga 34920
ctacagccac gtggctcact catcctgcag aaaccagcac aacggtttct gggacaattc 34980
ccaacttttc ccatagggga tcagacactg caccctcaat ggtcaccagt cctggagtag 35040
acacgaggtc aggtgttcca actacaacca tcccacccag tataccaggg gtagtgacct 35100
cacaggtcac tagttctgca acagacacta gtacagctat tccaactttg actccttctc 35160
ctggtgaacc agagaccaca gcctcatcag ctacccatcc tgggacacag actggcttca 35220
ctgttccaat tcggactgtt ccctctagtg agccagatac aatggcttcc tgggtcactc 35280
atcctccaca gaccagcaca cctgtttcca gaacaacctc cagtttttcc catagtagtc 35340
cagatgccac acctgtaatg gccaccagtc ctaggacaga agccagttca gctgtactga 35400
caacaatctc acctggtgca ccagagatgg tgacttcaca gatcactagt tctggggcag 35460
caaccagtac aactgttcca actttgactc attctcctgg tatgccagag accacagcct 35520
tattgagcac ccatcccaga acagagacaa gtaaaacatt tcctgcttca actgtgtttc 35580
ctcaagtatc agagaccaca gcctcactca ccattagacc tggtgcagag actagcacag 35640
ctctcccaac tcagacaaca tcctctctct tcaccctact tgtaactgga accagcagag 35700
ttgatctaag tccaactgct tcacctggtg tttctgcaaa aacagcccca ctttccaccc 35760
atccagggac agaaaccagc acaatgattc caacttcaac tctttccctt ggtttactag 35820
agactacagg cttactggcc accagctctt cagcagagac cagcacgagt actctaactc 35880
tgactgtttc ccctgctgtc tctgggcttt ccagtgcctc tataacaact gataagcccc 35940
aaactgtgac ctcctggaac acagaaacct caccatctgt aacttcagtt ggacccccag 36000
aattttccag gactgtcaca ggcaccacta tgaccttgat accatcagag atgccaacac 36060
cacctaaaac cagtcatgga gaaggagtga gtccaaccac tatcttgaga actacaatgg 36120
ttgaagccac taatttagct accacaggtt ccagtcccac tgtggccaag acaacaacca 36180
ccttcaatac actggctgga agcctcttta ctcctctgac cacacctggg atgtccacct 36240
tggcctctga gagtgtgacc tcaagaacaa gttataacca tcggtcctgg atctccacca 36300
ccagcagtta taaccgtcgg tactggaccc ctgccaccag cactccagtg acttctacat 36360
tctccccagg gatttccaca tcctccatcc ccagctccac agcagccaca gtcccattca 36420
tggtgccatt caccctcaac ttcaccatca ccaacctgca gtacgaggag gacatgcggc 36480
accctggttc caggaagttc aacgccacag agagagaact gcagggtctg ctcaaaccct 36540
tgttcaggaa tagcagtctg gaatacctct attcaggctg cagactagcc tcactcaggc 36600
cagagaagga tagctcagcc acggcagtgg atgccatctg cacacatcgc cctgaccctg 36660
aagacctcgg actggacaga gagcgactgt actgggagct gagcaatctg acaaatggca 36720
tccaggagct gggcccctac accctggacc ggaacagtct ctatgtcaat ggtttcaccc 36780
atcgaagctc tatgcccacc accagcactc ctgggacctc cacagtggat gtgggaacct 36840
cagggactcc atcctccagc cccagcccca cgactgctgg ccctctcctg atgccgttca 36900
ccctcaactt caccatcacc aacctgcagt acgaggagga catgcgtcgc actggctcca 36960
ggaagttcaa caccatggag agtgtcctgc agggtctgct caagcccttg ttcaagaaca 37020
ccagtgttgg ccctctgtac tctggctgca gattgacctt gctcaggccc gagaaagatg 37080
gggcagccac tggagtggat gccatctgca cccaccgcct tgaccccaaa agccctggac 37140
tcaacaggga gcagctgtac tgggagctaa gcaaactgac caatgacatt gaagagctgg 37200
gcccctacac cctggacagg aacagtctct atgtcaatgg tttcacccat cagagctctg 37260
tgtccaccac cagcactcct gggacctcca cagtggatct cagaacctca gggactccat 37320
cctccctctc cagccccaca attatggctg ctggccctct cctggtacca ttcaccctca 37380
acttcaccat caccaacctg cagtatgggg aggacatggg tcaccctggc tccaggaagt 37440
tcaacaccac agagagggtc ctgcagggtc tgcttggtcc catattcaag aacaccagtg 37500
ttggccctct gtactctggc tgcagactga cctctctcag gtctgagaag gatggagcag 37560
ccactggagt ggatgccatc tgcatccatc atcttgaccc caaaagccct ggactcaaca 37620
gagagcggct gtactgggag ctgagccaac tgaccaatgg catcaaagag ctgggcccct 37680
acaccctgga caggaacagt ctctatgtca atggtttcac ccatcggacc tctgtgccca 37740
ccagcagcac tcctgggacc tccacagtgg accttggaac ctcagggact ccattctccc 37800
tcccaagccc cgcaactgct ggccctctcc tggtgctgtt caccctcaac ttcaccatca 37860
ccaacctgaa gtatgaggag gacatgcatc gccctggctc caggaagttc aacaccactg 37920
agagggtcct gcagactctg cttggtccta tgttcaagaa caccagtgtt ggccttctgt 37980
actctggctg cagactgacc ttgctcaggt ccgagaagga tggagcagcc actggagtgg 38040
atgccatctg cacccaccgt cttgacccca aaagccctgg agtggacagg gagcagctat 38100
actgggagct gagccagctg accaatggca tcaaagagct gggcccctac accctggaca 38160
ggaacagtct ctatgtcaat ggtttcaccc attggatccc tgtgcccacc agcagcactc 38220
ctgggacctc cacagtggac cttgggtcag ggactccatc ctccctcccc agccccacaa 38280
ctgctggccc tctcctggtg ccgttcaccc tcaacttcac catcaccaac ctgaagtacg 38340
aggaggacat gcattgccct ggctccagga agttcaacac cacagagaga gtcctgcaga 38400
gtctgcttgg tcccatgttc aagaacacca gtgttggccc tctgtactct ggctgcagac 38460
tgaccttgct caggtccgag aaggatggag cagccactgg agtggatgcc atctgcaccc 38520
accgtcttga ccccaaaagc cctggagtgg acagggagca gctatactgg gagctgagcc 38580
agctgaccaa tggcatcaaa gagctgggtc cctacaccct ggacagaaac agtctctatg 38640
tcaatggttt cacccatcag acctctgcgc ccaacaccag cactcctggg acctccacag 38700
tggaccttgg gacctcaggg actccatcct ccctccccag ccctacatct gctggccctc 38760
tcctggtgcc attcaccctc aacttcacca tcaccaacct gcagtacgag gaggacatgc 38820
atcacccagg ctccaggaag ttcaacacca cggagcgggt cctgcagggt ctgcttggtc 38880
ccatgttcaa gaacaccagt gtcggccttc tgtactctgg ctgcagactg accttgctca 38940
ggcctgagaa gaatggggca gccactggaa tggatgccat ctgcagccac cgtcttgacc 39000
ccaaaagccc tggactcaac agagagcagc tgtactggga gctgagccag ctgacccatg 39060
gcatcaaaga gctgggcccc tacaccctgg acaggaacag tctctatgtc aatggtttca 39120
cccatcggag ctctgtggcc cccaccagca ctcctgggac ctccacagtg gaccttggga 39180
cctcagggac tccatcctcc ctccccagcc ccacaacagc tgttcctctc ctggtgccgt 39240
tcaccctcaa ctttaccatc accaatctgc agtatgggga ggacatgcgt caccctggct 39300
ccaggaagtt caacaccaca gagagggtcc tgcagggtct gcttggtccc ttgttcaaga 39360
actccagtgt cggccctctg tactctggct gcagactgat ctctctcagg tctgagaagg 39420
atggggcagc cactggagtg gatgccatct gcacccacca ccttaaccct caaagccctg 39480
gactggacag ggagcagctg tactggcagc tgagccagat gaccaatggc atcaaagagc 39540
tgggccccta caccctggac cggaacagtc tctacgtcaa tggtttcacc catcggagct 39600
ctgggctcac caccagcact ccttggactt ccacagttga ccttggaacc tcagggactc 39660
catcccccgt ccccagcccc acaaccaccg gccctctcct ggtgccattc acactcaact 39720
tcaccatcac taacctacag tatgaggaga acatgggtca ccctggctcc aggaagttca 39780
acatcacgga gagtgttctg cagggtctgc tcaagccctt gttcaagagc accagtgttg 39840
gccctctgta ttctggctgc agactgacct tgctcaggcc tgagaaggat ggagtagcca 39900
ccagagtgga cgccatctgc acccaccgcc ctgaccccaa aatccctggg ctagacagac 39960
agcagctata ctgggagctg agccagctga cccacagcat cactgagctg ggaccctaca 40020
ccctggatag ggacagtctc tatgtcaatg gtttcaccca gcggagctct gtgcccacca 40080
ccagcactcc tgggactttc acagtacagc cggaaacctc tgagactcca tcatccctcc 40140
ctggccccac agccactggc cctgtcctgc tgccattcac cctcaatttt accatcacta 40200
acctgcagta tgaggaggac atgcgtcgcc ctggctccag gaagttcaac accacggaga 40260
gggtccttca gggtctgctt atgcccttgt tcaagaacac cagtgtcagc tctctgtact 40320
ctggttgcag actgaccttg ctcaggcctg agaaggatgg ggcagccacc agagtggatg 40380
ctgtctgcac ccatcgtcct gaccccaaaa gccctggact ggacagagag cggctgtact 40440
ggaagctgag ccagctgacc cacggcatca ctgagctggg cccctacacc ctggacaggc 40500
acagtctcta tgtcaatggt ttcacccatc agagctctat gacgaccacc agaactcctg 40560
atacctccac aatgcacctg gcaacctcga gaactccagc ctccctgtct ggacccatga 40620
ccgccagccc tctcctggtg ctattcacaa ttaacttcac catcactaac ctgcggtatg 40680
aggagaacat gcatcaccct ggctctagaa agtttaacac cacggagaga gtccttcagg 40740
gtctgctcag gcctgtgttc aagaacacca gtgttggccc tctgtactct ggctgcagac 40800
tgaccttgct caggcccaag aaggatgggg cagccaccaa agtggatgcc atctgcacct 40860
accgccctga tcccaaaagc cctggactgg acagagagca gctatactgg gagctgagcc 40920
agctgaccca cagcatcact gagctgggcc cctacaccct ggacagggac agtctctatg 40980
tcaatggttt cacacagcgg agctctgtgc ccaccactag cattcctggg acccccacag 41040
tggacctggg aacatctggg actccagttt ctaaacctgg tccctcggct gccagccctc 41100
tcctggtgct attcactctc aacttcacca tcaccaacct gcggtatgag gagaacatgc 41160
agcaccctgg ctccaggaag ttcaacacca cggagagggt ccttcagggc ctgctcaggt 41220
ccctgttcaa gagcaccagt gttggccctc tgtactctgg ctgcagactg actttgctca 41280
ggcctgaaaa ggatgggaca gccactggag tggatgccat ctgcacccac caccctgacc 41340
ccaaaagccc taggctggac agagagcagc tgtattggga gctgagccag ctgacccaca 41400
atatcactga gctgggcccc tatgccctgg acaacgacag cctctttgtc aatggtttca 41460
ctcatcggag ctctgtgtcc accaccagca ctcctgggac ccccacagtg tatctgggag 41520
catctaagac tccagcctcg atatttggcc cttcagctgc cagccatctc ctgatactat 41580
tcaccctcaa cttcaccatc actaacctgc ggtatgagga gaacatgtgg cctggctcca 41640
ggaagttcaa cactacagag agggtccttc agggcctgct aaggcccttg ttcaagaaca 41700
ccagtgttgg ccctctgtac tctggctgca ggctgacctt gctcaggcca gagaaagatg 41760
gggaagccac cggagtggat gccatctgca cccaccgccc tgaccccaca ggccctgggc 41820
tggacagaga gcagctgtat ttggagctga gccagctgac ccacagcatc actgagctgg 41880
gcccctacac actggacagg gacagtctct atgtcaatgg tttcacccat cggagctctg 41940
tacccaccac cagcaccggg gtggtcagcg aggagccatt cacactgaac ttcaccatca 42000
acaacctgcg ctacatggcg gacatgggcc aacccggctc cctcaagttc aacatcacag 42060
acaacgtcat gcagcacctg ctcagtcctt tgttccagag gagcagcctg ggtgcacggt 42120
acacaggctg cagggtcatc gcactaaggt ctgtgaagaa cggtgctgag acacgggtgg 42180
acctcctctg cacctacctg cagcccctca gcggcccagg tctgcctatc aagcaggtgt 42240
tccatgagct gagccagcag acccatggca tcacccggct gggcccctac tctctggaca 42300
aagacagcct ctaccttaac ggttacaatg aacctggtcc agatgagcct cctacaactc 42360
ccaagccagc caccacattc ctgcctcctc tgtcagaagc cacaacagcc atggggtacc 42420
acctgaagac cctcacactc aacttcacca tctccaatct ccagtattca ccagatatgg 42480
gcaagggctc agctacattc aactccaccg agggggtcct tcagcacctg ctcagaccct 42540
tgttccagaa gagcagcatg ggccccttct acttgggttg ccaactgatc tccctcaggc 42600
ctgagaagga tggggcagcc actggtgtgg acaccacctg cacctaccac cctgaccctg 42660
tgggccccgg gctggacata cagcagcttt actgggagct gagtcagctg acccatggtg 42720
tcacccaact gggcttctat gtcctggaca gggatagcct cttcatcaat ggctatgcac 42780
cccagaattt atcaatccgg ggcgagtacc agataaattt ccacattgtc aactggaacc 42840
tcagtaatcc agaccccaca tcctcagagt acatcaccct gctgagggac atccaggaca 42900
aggtcaccac actctacaaa ggcagtcaac tacatgacac attccgcttc tgcctggtca 42960
ccaacttgac gatggactcc gtgttggtca ctgtcaaggc attgttctcc tccaatttgg 43020
accccagcct ggtggagcaa gtctttctag ataagaccct gaatgcctca ttccattggc 43080
tgggctccac ctaccagttg gtggacatcc atgtgacaga aatggagtca tcagtttatc 43140
aaccaacaag cagctccagc acccagcact tctacctgaa tttcaccatc accaacctac 43200
catattccca ggacaaagcc cagccaggca ccaccaatta ccagaggaac aaaaggaata 43260
ttgaggatgc gctcaaccaa ctcttccgaa acagcagcat caagagttat ttttctgact 43320
gtcaagtttc aacattcagg tctgtcccca acaggcacca caccggggtg gactccctgt 43380
gtaacttctc gccactggct cggagagtag acagagttgc catctatgag gaatttctgc 43440
ggatgacccg gaatggtacc cagctgcaga acttcaccct ggacaggagc agtgtccttg 43500
tggatgggta ttctcccaac agaaatgagc ccttaactgg gaattctgac cttcccttct 43560
gggctgtcat cctcatcggc ttggcaggac tcctgggagt catcacatgc ctgatctgcg 43620
gtgtcctggt gaccacccgc cggcggaaga aggaaggaga atacaacgtc cagcaacagt 43680
gcccaggcta ctaccagtca cacctagacc tggaggatct gcaatgactg gaacttgccg 43740
gtgcctgggg tgcctttccc ccagccaggg tccaaagaag cttggctggg gcagaaataa 43800
accatattgg tcgga 43815
<210> 138
<211> 518
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 双特异性
<400> 138
Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Phe Gly
85 90 95
Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
100 105 110
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
115 120 125
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
130 135 140
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
145 150 155 160
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
180 185 190
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
195 200 205
Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
210 215 220
Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
225 230 235 240
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
245 250 255
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val
275 280 285
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
290 295 300
Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
305 310 315 320
Cys Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn
325 330 335
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
340 345 350
Lys Asn Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
355 360 365
Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp
370 375 380
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
385 390 395 400
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
405 410 415
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
420 425 430
Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln
435 440 445
Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu
450 455 460
Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
465 470 475 480
Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr
485 490 495
Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr
500 505 510
Lys Leu Gln Ile Thr Arg
515
<210> 139
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c114-N3
<400> 139
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Ala Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50 55 60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65 70 75 80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85 90 95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100 105 110
Leu Gln
<210> 140
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6 VH核酸
<400> 140
caggtaactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgaac actcttggta tgggtgtagg ctggattcgg 120
cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgataagtac 180
tataacccag ccctgaagag tcggctcaca atctccaagg attcctccaa aaaccaggtt 240
ttcctcaaga tcgccaatgt ggacactgca gatattgcca catactactg ttctcgaatc 300
gggacagctc aggctacgga tgctctggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 141
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 10C6 VL核酸
<400> 141
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60
atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120
caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300
tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac 330
<210> 142
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12 VH核酸
<400> 142
caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc actgttggta tgggtgtagg ctggagtcgt 120
cagccctcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacatct ggtgggatga tgaagataag 180
tattataatc cagccctgaa gagtcggctc acaatctcca aggatacctc caaaaaccag 240
gtcttcctca agatcgccaa tgtggacact gcagatagtg ccacatacta ctgtactcga 300
atcgggacag ctcaggctac ggatgctttg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 143
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B12 VL核酸
<400> 143
gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtatctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtcttcgg aaaagtaatg gcaacactta cttgtattgg 120
ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag cgcctgatat attatatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcaga gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240
agtagagtgg aggctgaaga tgtgggtgtt tattactgta tgcaaagtct agaatatcct 300
ctcacgttcg gaggggggac taagctaaaa ataaaa 336
<210> 144
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19C11 VH核酸
<400> 144
caggttaatc tgaaagagtc tggccctggg aaattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc actcttggta tgggtgtagg ttggattcgt 120
cagtcttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgataagtac 180
tataacccag ccctgaagag tcggctcaca atctccaggg ctacctccaa aaaccaggtt 240
ttcctcaaga tcgtcaatgt gggcactgca gatactgcca catattactg tgctcgaatc 300
gggacagctc aggctacgga tgctttggac tattggggtc agggaacctc agtcaccgtt 360
tcctca 366
<210> 145
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19C11 VL核酸
<400> 145
gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct atccctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtcttctg catagtaatg gcaacactta tttgtattgg 120
ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag cgcctgatat attatatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcaga gggtcaggaa ctgatttcac actgaaaatc 240
agtagagtgg aggctgggga tgtgggtgtt tattactgta tgcagggtct agagcatcct 300
ctcacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 146
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16C5 VH核酸
<400> 146
caggttactc tgaaagagtc tggccctgga atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgaac actcttggta tgggtgtagg ctggattcgt 120
cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgataagtac 180
tattacccag ccctgaagag tcggctcaca atctccaggg atacctccaa aaaccaggta 240
ttcctcaaga tcgccaatgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcgaatc 300
gggacagctc aggctacgga tgctctggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 147
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16C5 VL核酸
<400> 147
gagctcgata tgacccagac tccaccctcc ctgtctgcat ctgtgggaga aactgtcagg 60
attaggtgcc tggccagtga ggacatttat agtggtatat cctggtatca acagaagcca 120
gggaaacctc ctacactcct gatctatggt gcatccaatt tagaatctgg ggtcccacca 180
cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat tacaccctca ccattggcgg cgtgcaggct 240
gaagatgctg ccacctacta ctgtctaggc ggttatagtt atagtagtac cttgactttt 300
ggagctggca ccaatgtgga aatcaaa 327
<210> 148
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18C6 VH核酸
<400> 148
caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc actgttggta tgggtgtagg ctggagtcgt 120
cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgaggataag 180
tattataacc cagccctgaa gagtcggctc acaatctcca aggatacctc caaaaaccag 240
gtattcctca agatcgccaa tgtggacact gcagatactg ccacatacta ctgtactcga 300
atcgggacag ctcaggctac ggatgctttg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 149
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18C6 VL核酸
<400> 149
gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtcttctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 120
ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag cgcctgatat attatatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcaga gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240
agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaaagtct agaatatcct 300
ctcacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 150
<211> 14447
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 成熟人MUC16氨基酸序列
<400> 150
Asp Lys Thr Leu Ala Ser Pro Thr Ser Ser Val Val Gly Arg Thr Thr
1 5 10 15
Gln Ser Leu Gly Val Met Ser Ser Ala Leu Pro Glu Ser Thr Ser Arg
20 25 30
Gly Met Thr His Ser Glu Gln Arg Thr Ser Pro Ser Leu Ser Pro Gln
35 40 45
Val Asn Gly Thr Pro Ser Arg Asn Tyr Pro Ala Thr Ser Met Val Ser
50 55 60
Gly Leu Ser Ser Pro Arg Thr Arg Thr Ser Ser Thr Glu Gly Asn Phe
65 70 75 80
Thr Lys Glu Ala Ser Thr Tyr Thr Leu Thr Val Glu Thr Thr Ser Gly
85 90 95
Pro Val Thr Glu Lys Tyr Thr Val Pro Thr Glu Thr Ser Thr Thr Glu
100 105 110
Gly Asp Ser Thr Glu Thr Pro Trp Asp Thr Arg Tyr Ile Pro Val Lys
115 120 125
Ile Thr Ser Pro Met Lys Thr Phe Ala Asp Ser Thr Ala Ser Lys Glu
130 135 140
Asn Ala Pro Val Ser Met Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val Thr Asp Ser
145 150 155 160
His Thr Pro Gly Arg Thr Asn Pro Ser Phe Gly Thr Leu Tyr Ser Ser
165 170 175
Phe Leu Asp Leu Ser Pro Lys Gly Thr Pro Asn Ser Arg Gly Glu Thr
180 185 190
Ser Leu Glu Leu Ile Leu Ser Thr Thr Gly Tyr Pro Phe Ser Ser Pro
195 200 205
Glu Pro Gly Ser Ala Gly His Ser Arg Ile Ser Thr Ser Ala Pro Leu
210 215 220
Ser Ser Ser Ala Ser Val Leu Asp Asn Lys Ile Ser Glu Thr Ser Ile
225 230 235 240
Phe Ser Gly Gln Ser Leu Thr Ser Pro Leu Ser Pro Gly Val Pro Glu
245 250 255
Ala Arg Ala Ser Thr Met Pro Asn Ser Ala Ile Pro Phe Ser Met Thr
260 265 270
Leu Ser Asn Ala Glu Thr Ser Ala Glu Arg Val Arg Ser Thr Ile Ser
275 280 285
Ser Leu Gly Thr Pro Ser Ile Ser Thr Lys Gln Thr Ala Glu Thr Ile
290 295 300
Leu Thr Phe His Ala Phe Ala Glu Thr Met Asp Ile Pro Ser Thr His
305 310 315 320
Ile Ala Lys Thr Leu Ala Ser Glu Trp Leu Gly Ser Pro Gly Thr Leu
325 330 335
Gly Gly Thr Ser Thr Ser Ala Leu Thr Thr Thr Ser Pro Ser Thr Thr
340 345 350
Leu Val Ser Glu Glu Thr Asn Thr His His Ser Thr Ser Gly Lys Glu
355 360 365
Thr Glu Gly Thr Leu Asn Thr Ser Met Thr Pro Leu Glu Thr Ser Ala
370 375 380
Pro Gly Glu Glu Ser Glu Met Thr Ala Thr Leu Val Pro Thr Leu Gly
385 390 395 400
Phe Thr Thr Leu Asp Ser Lys Ile Arg Ser Pro Ser Gln Val Ser Ser
405 410 415
Ser His Pro Thr Arg Glu Leu Arg Thr Thr Gly Ser Thr Ser Gly Arg
420 425 430
Gln Ser Ser Ser Thr Ala Ala His Gly Ser Ser Asp Ile Leu Arg Ala
435 440 445
Thr Thr Ser Ser Thr Ser Lys Ala Ser Ser Trp Thr Ser Glu Ser Thr
450 455 460
Ala Gln Gln Phe Ser Glu Pro Gln His Thr Gln Trp Val Glu Thr Ser
465 470 475 480
Pro Ser Met Lys Thr Glu Arg Pro Pro Ala Ser Thr Ser Val Ala Ala
485 490 495
Pro Ile Thr Thr Ser Val Pro Ser Val Val Ser Gly Phe Thr Thr Leu
500 505 510
Lys Thr Ser Ser Thr Lys Gly Ile Trp Leu Glu Glu Thr Ser Ala Asp
515 520 525
Thr Leu Ile Gly Glu Ser Thr Ala Gly Pro Thr Thr His Gln Phe Ala
530 535 540
Val Pro Thr Gly Ile Ser Met Thr Gly Gly Ser Ser Thr Arg Gly Ser
545 550 555 560
Gln Gly Thr Thr His Leu Leu Thr Arg Ala Thr Ala Ser Ser Glu Thr
565 570 575
Ser Ala Asp Leu Thr Leu Ala Thr Asn Gly Val Pro Val Ser Val Ser
580 585 590
Pro Ala Val Ser Lys Thr Ala Ala Gly Ser Ser Pro Pro Gly Gly Thr
595 600 605
Lys Pro Ser Tyr Thr Met Val Ser Ser Val Ile Pro Glu Thr Ser Ser
610 615 620
Leu Gln Ser Ser Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ser Leu Gly Leu Thr Pro
625 630 635 640
Leu Asn Thr Arg His Pro Phe Ser Ser Pro Glu Pro Asp Ser Ala Gly
645 650 655
His Thr Lys Ile Ser Thr Ser Ile Pro Leu Leu Ser Ser Ala Ser Val
660 665 670
Leu Glu Asp Lys Val Ser Ala Thr Ser Thr Phe Ser His His Lys Ala
675 680 685
Thr Ser Ser Ile Thr Thr Gly Thr Pro Glu Ile Ser Thr Lys Thr Lys
690 695 700
Pro Ser Ser Ala Val Leu Ser Ser Met Thr Leu Ser Asn Ala Ala Thr
705 710 715 720
Ser Pro Glu Arg Val Arg Asn Ala Thr Ser Pro Leu Thr His Pro Ser
725 730 735
Pro Ser Gly Glu Glu Thr Ala Gly Ser Val Leu Thr Leu Ser Thr Ser
740 745 750
Ala Glu Thr Thr Asp Ser Pro Asn Ile His Pro Thr Gly Thr Leu Thr
755 760 765
Ser Glu Ser Ser Glu Ser Pro Ser Thr Leu Ser Leu Pro Ser Val Ser
770 775 780
Gly Val Lys Thr Thr Phe Ser Ser Ser Thr Pro Ser Thr His Leu Phe
785 790 795 800
Thr Ser Gly Glu Glu Thr Glu Glu Thr Ser Asn Pro Ser Val Ser Gln
805 810 815
Pro Glu Thr Ser Val Ser Arg Val Arg Thr Thr Leu Ala Ser Thr Ser
820 825 830
Val Pro Thr Pro Val Phe Pro Thr Met Asp Thr Trp Pro Thr Arg Ser
835 840 845
Ala Gln Phe Ser Ser Ser His Leu Val Ser Glu Leu Arg Ala Thr Ser
850 855 860
Ser Thr Ser Val Thr Asn Ser Thr Gly Ser Ala Leu Pro Lys Ile Ser
865 870 875 880
His Leu Thr Gly Thr Ala Thr Met Ser Gln Thr Asn Arg Asp Thr Phe
885 890 895
Asn Asp Ser Ala Ala Pro Gln Ser Thr Thr Trp Pro Glu Thr Ser Pro
900 905 910
Arg Phe Lys Thr Gly Leu Pro Ser Ala Thr Thr Thr Val Ser Thr Ser
915 920 925
Ala Thr Ser Leu Ser Ala Thr Val Met Val Ser Lys Phe Thr Ser Pro
930 935 940
Ala Thr Ser Ser Met Glu Ala Thr Ser Ile Arg Glu Pro Ser Thr Thr
945 950 955 960
Ile Leu Thr Thr Glu Thr Thr Asn Gly Pro Gly Ser Met Ala Val Ala
965 970 975
Ser Thr Asn Ile Pro Ile Gly Lys Gly Tyr Ile Thr Glu Gly Arg Leu
980 985 990
Asp Thr Ser His Leu Pro Ile Gly Thr Thr Ala Ser Ser Glu Thr Ser
995 1000 1005
Met Asp Phe Thr Met Ala Lys Glu Ser Val Ser Met Ser Val Ser
1010 1015 1020
Pro Ser Gln Ser Met Asp Ala Ala Gly Ser Ser Thr Pro Gly Arg
1025 1030 1035
Thr Ser Gln Phe Val Asp Thr Phe Ser Asp Asp Val Tyr His Leu
1040 1045 1050
Thr Ser Arg Glu Ile Thr Ile Pro Arg Asp Gly Thr Ser Ser Ala
1055 1060 1065
Leu Thr Pro Gln Met Thr Ala Thr His Pro Pro Ser Pro Asp Pro
1070 1075 1080
Gly Ser Ala Arg Ser Thr Trp Leu Gly Ile Leu Ser Ser Ser Pro
1085 1090 1095
Ser Ser Pro Thr Pro Lys Val Thr Met Ser Ser Thr Phe Ser Thr
1100 1105 1110
Gln Arg Val Thr Thr Ser Met Ile Met Asp Thr Val Glu Thr Ser
1115 1120 1125
Arg Trp Asn Met Pro Asn Leu Pro Ser Thr Thr Ser Leu Thr Pro
1130 1135 1140
Ser Asn Ile Pro Thr Ser Gly Ala Ile Gly Lys Ser Thr Leu Val
1145 1150 1155
Pro Leu Asp Thr Pro Ser Pro Ala Thr Ser Leu Glu Ala Ser Glu
1160 1165 1170
Gly Gly Leu Pro Thr Leu Ser Thr Tyr Pro Glu Ser Thr Asn Thr
1175 1180 1185
Pro Ser Ile His Leu Gly Ala His Ala Ser Ser Glu Ser Pro Ser
1190 1195 1200
Thr Ile Lys Leu Thr Met Ala Ser Val Val Lys Pro Gly Ser Tyr
1205 1210 1215
Thr Pro Leu Thr Phe Pro Ser Ile Glu Thr His Ile His Val Ser
1220 1225 1230
Thr Ala Arg Met Ala Tyr Ser Ser Gly Ser Ser Pro Glu Met Thr
1235 1240 1245
Ala Pro Gly Glu Thr Asn Thr Gly Ser Thr Trp Asp Pro Thr Thr
1250 1255 1260
Tyr Ile Thr Thr Thr Asp Pro Lys Asp Thr Ser Ser Ala Gln Val
1265 1270 1275
Ser Thr Pro His Ser Val Arg Thr Leu Arg Thr Thr Glu Asn His
1280 1285 1290
Pro Lys Thr Glu Ser Ala Thr Pro Ala Ala Tyr Ser Gly Ser Pro
1295 1300 1305
Lys Ile Ser Ser Ser Pro Asn Leu Thr Ser Pro Ala Thr Lys Ala
1310 1315 1320
Trp Thr Ile Thr Asp Thr Thr Glu His Ser Thr Gln Leu His Tyr
1325 1330 1335
Thr Lys Leu Ala Glu Lys Ser Ser Gly Phe Glu Thr Gln Ser Ala
1340 1345 1350
Pro Gly Pro Val Ser Val Val Ile Pro Thr Ser Pro Thr Ile Gly
1355 1360 1365
Ser Ser Thr Leu Glu Leu Thr Ser Asp Val Pro Gly Glu Pro Leu
1370 1375 1380
Val Leu Ala Pro Ser Glu Gln Thr Thr Ile Thr Leu Pro Met Ala
1385 1390 1395
Thr Trp Leu Ser Thr Ser Leu Thr Glu Glu Met Ala Ser Thr Asp
1400 1405 1410
Leu Asp Ile Ser Ser Pro Ser Ser Pro Met Ser Thr Phe Ala Ile
1415 1420 1425
Phe Pro Pro Met Ser Thr Pro Ser His Glu Leu Ser Lys Ser Glu
1430 1435 1440
Ala Asp Thr Ser Ala Ile Arg Asn Thr Asp Ser Thr Thr Leu Asp
1445 1450 1455
Gln His Leu Gly Ile Arg Ser Leu Gly Arg Thr Gly Asp Leu Thr
1460 1465 1470
Thr Val Pro Ile Thr Pro Leu Thr Thr Thr Trp Thr Ser Val Ile
1475 1480 1485
Glu His Ser Thr Gln Ala Gln Asp Thr Leu Ser Ala Thr Met Ser
1490 1495 1500
Pro Thr His Val Thr Gln Ser Leu Lys Asp Gln Thr Ser Ile Pro
1505 1510 1515
Ala Ser Ala Ser Pro Ser His Leu Thr Glu Val Tyr Pro Glu Leu
1520 1525 1530
Gly Thr Gln Gly Arg Ser Ser Ser Glu Ala Thr Thr Phe Trp Lys
1535 1540 1545
Pro Ser Thr Asp Thr Leu Ser Arg Glu Ile Glu Thr Gly Pro Thr
1550 1555 1560
Asn Ile Gln Ser Thr Pro Pro Met Asp Asn Thr Thr Thr Gly Ser
1565 1570 1575
Ser Ser Ser Gly Val Thr Leu Gly Ile Ala His Leu Pro Ile Gly
1580 1585 1590
Thr Ser Ser Pro Ala Glu Thr Ser Thr Asn Met Ala Leu Glu Arg
1595 1600 1605
Arg Ser Ser Thr Ala Thr Val Ser Met Ala Gly Thr Met Gly Leu
1610 1615 1620
Leu Val Thr Ser Ala Pro Gly Arg Ser Ile Ser Gln Ser Leu Gly
1625 1630 1635
Arg Val Ser Ser Val Leu Ser Glu Ser Thr Thr Glu Gly Val Thr
1640 1645 1650
Asp Ser Ser Lys Gly Ser Ser Pro Arg Leu Asn Thr Gln Gly Asn
1655 1660 1665
Thr Ala Leu Ser Ser Ser Leu Glu Pro Ser Tyr Ala Glu Gly Ser
1670 1675 1680
Gln Met Ser Thr Ser Ile Pro Leu Thr Ser Ser Pro Thr Thr Pro
1685 1690 1695
Asp Val Glu Phe Ile Gly Gly Ser Thr Phe Trp Thr Lys Glu Val
1700 1705 1710
Thr Thr Val Met Thr Ser Asp Ile Ser Lys Ser Ser Ala Arg Thr
1715 1720 1725
Glu Ser Ser Ser Ala Thr Leu Met Ser Thr Ala Leu Gly Ser Thr
1730 1735 1740
Glu Asn Thr Gly Lys Glu Lys Leu Arg Thr Ala Ser Met Asp Leu
1745 1750 1755
Pro Ser Pro Thr Pro Ser Met Glu Val Thr Pro Trp Ile Ser Leu
1760 1765 1770
Thr Leu Ser Asn Ala Pro Asn Thr Thr Asp Ser Leu Asp Leu Ser
1775 1780 1785
His Gly Val His Thr Ser Ser Ala Gly Thr Leu Ala Thr Asp Arg
1790 1795 1800
Ser Leu Asn Thr Gly Val Thr Arg Ala Ser Arg Leu Glu Asn Gly
1805 1810 1815
Ser Asp Thr Ser Ser Lys Ser Leu Ser Met Gly Asn Ser Thr His
1820 1825 1830
Thr Ser Met Thr Tyr Thr Glu Lys Ser Glu Val Ser Ser Ser Ile
1835 1840 1845
His Pro Arg Pro Glu Thr Ser Ala Pro Gly Ala Glu Thr Thr Leu
1850 1855 1860
Thr Ser Thr Pro Gly Asn Arg Ala Ile Ser Leu Thr Leu Pro Phe
1865 1870 1875
Ser Ser Ile Pro Val Glu Glu Val Ile Ser Thr Gly Ile Thr Ser
1880 1885 1890
Gly Pro Asp Ile Asn Ser Ala Pro Met Thr His Ser Pro Ile Thr
1895 1900 1905
Pro Pro Thr Ile Val Trp Thr Ser Thr Gly Thr Ile Glu Gln Ser
1910 1915 1920
Thr Gln Pro Leu His Ala Val Ser Ser Glu Lys Val Ser Val Gln
1925 1930 1935
Thr Gln Ser Thr Pro Tyr Val Asn Ser Val Ala Val Ser Ala Ser
1940 1945 1950
Pro Thr His Glu Asn Ser Val Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ser Ser
1955 1960 1965
Pro Tyr Ser Ser Ala Ser Leu Glu Ser Leu Asp Ser Thr Ile Ser
1970 1975 1980
Arg Arg Asn Ala Ile Thr Ser Trp Leu Trp Asp Leu Thr Thr Ser
1985 1990 1995
Leu Pro Thr Thr Thr Trp Pro Ser Thr Ser Leu Ser Glu Ala Leu
2000 2005 2010
Ser Ser Gly His Ser Gly Val Ser Asn Pro Ser Ser Thr Thr Thr
2015 2020 2025
Glu Phe Pro Leu Phe Ser Ala Ala Ser Thr Ser Ala Ala Lys Gln
2030 2035 2040
Arg Asn Pro Glu Thr Glu Thr His Gly Pro Gln Asn Thr Ala Ala
2045 2050 2055
Ser Thr Leu Asn Thr Asp Ala Ser Ser Val Thr Gly Leu Ser Glu
2060 2065 2070
Thr Pro Val Gly Ala Ser Ile Ser Ser Glu Val Pro Leu Pro Met
2075 2080 2085
Ala Ile Thr Ser Arg Ser Asp Val Ser Gly Leu Thr Ser Glu Ser
2090 2095 2100
Thr Ala Asn Pro Ser Leu Gly Thr Ala Ser Ser Ala Gly Thr Lys
2105 2110 2115
Leu Thr Arg Thr Ile Ser Leu Pro Thr Ser Glu Ser Leu Val Ser
2120 2125 2130
Phe Arg Met Asn Lys Asp Pro Trp Thr Val Ser Ile Pro Leu Gly
2135 2140 2145
Ser His Pro Thr Thr Asn Thr Glu Thr Ser Ile Pro Val Asn Ser
2150 2155 2160
Ala Gly Pro Pro Gly Leu Ser Thr Val Ala Ser Asp Val Ile Asp
2165 2170 2175
Thr Pro Ser Asp Gly Ala Glu Ser Ile Pro Thr Val Ser Phe Ser
2180 2185 2190
Pro Ser Pro Asp Thr Glu Val Thr Thr Ile Ser His Phe Pro Glu
2195 2200 2205
Lys Thr Thr His Ser Phe Arg Thr Ile Ser Ser Leu Thr His Glu
2210 2215 2220
Leu Thr Ser Arg Val Thr Pro Ile Pro Gly Asp Trp Met Ser Ser
2225 2230 2235
Ala Met Ser Thr Lys Pro Thr Gly Ala Ser Pro Ser Ile Thr Leu
2240 2245 2250
Gly Glu Arg Arg Thr Ile Thr Ser Ala Ala Pro Thr Thr Ser Pro
2255 2260 2265
Ile Val Leu Thr Ala Ser Phe Thr Glu Thr Ser Thr Val Ser Leu
2270 2275 2280
Asp Asn Glu Thr Thr Val Lys Thr Ser Asp Ile Leu Asp Ala Arg
2285 2290 2295
Lys Thr Asn Glu Leu Pro Ser Asp Ser Ser Ser Ser Ser Asp Leu
2300 2305 2310
Ile Asn Thr Ser Ile Ala Ser Ser Thr Met Asp Val Thr Lys Thr
2315 2320 2325
Ala Ser Ile Ser Pro Thr Ser Ile Ser Gly Met Thr Ala Ser Ser
2330 2335 2340
Ser Pro Ser Leu Phe Ser Ser Asp Arg Pro Gln Val Pro Thr Ser
2345 2350 2355
Thr Thr Glu Thr Asn Thr Ala Thr Ser Pro Ser Val Ser Ser Asn
2360 2365 2370
Thr Tyr Ser Leu Asp Gly Gly Ser Asn Val Gly Gly Thr Pro Ser
2375 2380 2385
Thr Leu Pro Pro Phe Thr Ile Thr His Pro Val Glu Thr Ser Ser
2390 2395 2400
Ala Leu Leu Ala Trp Ser Arg Pro Val Arg Thr Phe Ser Thr Met
2405 2410 2415
Val Ser Thr Asp Thr Ala Ser Gly Glu Asn Pro Thr Ser Ser Asn
2420 2425 2430
Ser Val Val Thr Ser Val Pro Ala Pro Gly Thr Trp Thr Ser Val
2435 2440 2445
Gly Ser Thr Thr Asp Leu Pro Ala Met Gly Phe Leu Lys Thr Ser
2450 2455 2460
Pro Ala Gly Glu Ala His Ser Leu Leu Ala Ser Thr Ile Glu Pro
2465 2470 2475
Ala Thr Ala Phe Thr Pro His Leu Ser Ala Ala Val Val Thr Gly
2480 2485 2490
Ser Ser Ala Thr Ser Glu Ala Ser Leu Leu Thr Thr Ser Glu Ser
2495 2500 2505
Lys Ala Ile His Ser Ser Pro Gln Thr Pro Thr Thr Pro Thr Ser
2510 2515 2520
Gly Ala Asn Trp Glu Thr Ser Ala Thr Pro Glu Ser Leu Leu Val
2525 2530 2535
Val Thr Glu Thr Ser Asp Thr Thr Leu Thr Ser Lys Ile Leu Val
2540 2545 2550
Thr Asp Thr Ile Leu Phe Ser Thr Val Ser Thr Pro Pro Ser Lys
2555 2560 2565
Phe Pro Ser Thr Gly Thr Leu Ser Gly Ala Ser Phe Pro Thr Leu
2570 2575 2580
Leu Pro Asp Thr Pro Ala Ile Pro Leu Thr Ala Thr Glu Pro Thr
2585 2590 2595
Ser Ser Leu Ala Thr Ser Phe Asp Ser Thr Pro Leu Val Thr Ile
2600 2605 2610
Ala Ser Asp Ser Leu Gly Thr Val Pro Glu Thr Thr Leu Thr Met
2615 2620 2625
Ser Glu Thr Ser Asn Gly Asp Ala Leu Val Leu Lys Thr Val Ser
2630 2635 2640
Asn Pro Asp Arg Ser Ile Pro Gly Ile Thr Ile Gln Gly Val Thr
2645 2650 2655
Glu Ser Pro Leu His Pro Ser Ser Thr Ser Pro Ser Lys Ile Val
2660 2665 2670
Ala Pro Arg Asn Thr Thr Tyr Glu Gly Ser Ile Thr Val Ala Leu
2675 2680 2685
Ser Thr Leu Pro Ala Gly Thr Thr Gly Ser Leu Val Phe Ser Gln
2690 2695 2700
Ser Ser Glu Asn Ser Glu Thr Thr Ala Leu Val Asp Ser Ser Ala
2705 2710 2715
Gly Leu Glu Arg Ala Ser Val Met Pro Leu Thr Thr Gly Ser Gln
2720 2725 2730
Gly Met Ala Ser Ser Gly Gly Ile Arg Ser Gly Ser Thr His Ser
2735 2740 2745
Thr Gly Thr Lys Thr Phe Ser Ser Leu Pro Leu Thr Met Asn Pro
2750 2755 2760
Gly Glu Val Thr Ala Met Ser Glu Ile Thr Thr Asn Arg Leu Thr
2765 2770 2775
Ala Thr Gln Ser Thr Ala Pro Lys Gly Ile Pro Val Lys Pro Thr
2780 2785 2790
Ser Ala Glu Ser Gly Leu Leu Thr Pro Val Ser Ala Ser Ser Ser
2795 2800 2805
Pro Ser Lys Ala Phe Ala Ser Leu Thr Thr Ala Pro Pro Thr Trp
2810 2815 2820
Gly Ile Pro Gln Ser Thr Leu Thr Phe Glu Phe Ser Glu Val Pro
2825 2830 2835
Ser Leu Asp Thr Lys Ser Ala Ser Leu Pro Thr Pro Gly Gln Ser
2840 2845 2850
Leu Asn Thr Ile Pro Asp Ser Asp Ala Ser Thr Ala Ser Ser Ser
2855 2860 2865
Leu Ser Lys Ser Pro Glu Lys Asn Pro Arg Ala Arg Met Met Thr
2870 2875 2880
Ser Thr Lys Ala Ile Ser Ala Ser Ser Phe Gln Ser Thr Gly Phe
2885 2890 2895
Thr Glu Thr Pro Glu Gly Ser Ala Ser Pro Ser Met Ala Gly His
2900 2905 2910
Glu Pro Arg Val Pro Thr Ser Gly Thr Gly Asp Pro Arg Tyr Ala
2915 2920 2925
Ser Glu Ser Met Ser Tyr Pro Asp Pro Ser Lys Ala Ser Ser Ala
2930 2935 2940
Met Thr Ser Thr Ser Leu Ala Ser Lys Leu Thr Thr Leu Phe Ser
2945 2950 2955
Thr Gly Gln Ala Ala Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser Pro Ile Ser
2960 2965 2970
Leu Ser Thr Glu Lys Glu Thr Ser Phe Leu Ser Pro Thr Ala Ser
2975 2980 2985
Thr Ser Arg Lys Thr Ser Leu Phe Leu Gly Pro Ser Met Ala Arg
2990 2995 3000
Gln Pro Asn Ile Leu Val His Leu Gln Thr Ser Ala Leu Thr Leu
3005 3010 3015
Ser Pro Thr Ser Thr Leu Asn Met Ser Gln Glu Glu Pro Pro Glu
3020 3025 3030
Leu Thr Ser Ser Gln Thr Ile Ala Glu Glu Glu Gly Thr Thr Ala
3035 3040 3045
Glu Thr Gln Thr Leu Thr Phe Thr Pro Ser Glu Thr Pro Thr Ser
3050 3055 3060
Leu Leu Pro Val Ser Ser Pro Thr Glu Pro Thr Ala Arg Arg Lys
3065 3070 3075
Ser Ser Pro Glu Thr Trp Ala Ser Ser Ile Ser Val Pro Ala Lys
3080 3085 3090
Thr Ser Leu Val Glu Thr Thr Asp Gly Thr Leu Val Thr Thr Ile
3095 3100 3105
Lys Met Ser Ser Gln Ala Ala Gln Gly Asn Ser Thr Trp Pro Ala
3110 3115 3120
Pro Ala Glu Glu Thr Gly Ser Ser Pro Ala Gly Thr Ser Pro Gly
3125 3130 3135
Ser Pro Glu Met Ser Thr Thr Leu Lys Ile Met Ser Ser Lys Glu
3140 3145 3150
Pro Ser Ile Ser Pro Glu Ile Arg Ser Thr Val Arg Asn Ser Pro
3155 3160 3165
Trp Lys Thr Pro Glu Thr Thr Val Pro Met Glu Thr Thr Val Glu
3170 3175 3180
Pro Val Thr Leu Gln Ser Thr Ala Leu Gly Ser Gly Ser Thr Ser
3185 3190 3195
Ile Ser His Leu Pro Thr Gly Thr Thr Ser Pro Thr Lys Ser Pro
3200 3205 3210
Thr Glu Asn Met Leu Ala Thr Glu Arg Val Ser Leu Ser Pro Ser
3215 3220 3225
Pro Pro Glu Ala Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Gly Thr Pro Gly Gly
3230 3235 3240
Thr Arg Gln Ser Leu Ala Thr Met Ser Ser Val Ser Leu Glu Ser
3245 3250 3255
Pro Thr Ala Arg Ser Ile Thr Gly Thr Gly Gln Gln Ser Ser Pro
3260 3265 3270
Glu Leu Val Ser Lys Thr Thr Gly Met Glu Phe Ser Met Trp His
3275 3280 3285
Gly Ser Thr Gly Gly Thr Thr Gly Asp Thr His Val Ser Leu Ser
3290 3295 3300
Thr Ser Ser Asn Ile Leu Glu Asp Pro Val Thr Ser Pro Asn Ser
3305 3310 3315
Val Ser Ser Leu Thr Asp Lys Ser Lys His Lys Thr Glu Thr Trp
3320 3325 3330
Val Ser Thr Thr Ala Ile Pro Ser Thr Val Leu Asn Asn Lys Ile
3335 3340 3345
Met Ala Ala Glu Gln Gln Thr Ser Arg Ser Val Asp Glu Ala Tyr
3350 3355 3360
Ser Ser Thr Ser Ser Trp Ser Asp Gln Thr Ser Gly Ser Asp Ile
3365 3370 3375
Thr Leu Gly Ala Ser Pro Asp Val Thr Asn Thr Leu Tyr Ile Thr
3380 3385 3390
Ser Thr Ala Gln Thr Thr Ser Leu Val Ser Leu Pro Ser Gly Asp
3395 3400 3405
Gln Gly Ile Thr Ser Leu Thr Asn Pro Ser Gly Gly Lys Thr Ser
3410 3415 3420
Ser Ala Ser Ser Val Thr Ser Pro Ser Ile Gly Leu Glu Thr Leu
3425 3430 3435
Arg Ala Asn Val Ser Ala Val Lys Ser Asp Ile Ala Pro Thr Ala
3440 3445 3450
Gly His Leu Ser Gln Thr Ser Ser Pro Ala Glu Val Ser Ile Leu
3455 3460 3465
Asp Val Thr Thr Ala Pro Thr Pro Gly Ile Ser Thr Thr Ile Thr
3470 3475 3480
Thr Met Gly Thr Asn Ser Ile Ser Thr Thr Thr Pro Asn Pro Glu
3485 3490 3495
Val Gly Met Ser Thr Met Asp Ser Thr Pro Ala Thr Glu Arg Arg
3500 3505 3510
Thr Thr Ser Thr Glu His Pro Ser Thr Trp Ser Ser Thr Ala Ala
3515 3520 3525
Ser Asp Ser Trp Thr Val Thr Asp Met Thr Ser Asn Leu Lys Val
3530 3535 3540
Ala Arg Ser Pro Gly Thr Ile Ser Thr Met His Thr Thr Ser Phe
3545 3550 3555
Leu Ala Ser Ser Thr Glu Leu Asp Ser Met Ser Thr Pro His Gly
3560 3565 3570
Arg Ile Thr Val Ile Gly Thr Ser Leu Val Thr Pro Ser Ser Asp
3575 3580 3585
Ala Ser Ala Val Lys Thr Glu Thr Ser Thr Ser Glu Arg Thr Leu
3590 3595 3600
Ser Pro Ser Asp Thr Thr Ala Ser Thr Pro Ile Ser Thr Phe Ser
3605 3610 3615
Arg Val Gln Arg Met Ser Ile Ser Val Pro Asp Ile Leu Ser Thr
3620 3625 3630
Ser Trp Thr Pro Ser Ser Thr Glu Ala Glu Asp Val Pro Val Ser
3635 3640 3645
Met Val Ser Thr Asp His Ala Ser Thr Lys Thr Asp Pro Asn Thr
3650 3655 3660
Pro Leu Ser Thr Phe Leu Phe Asp Ser Leu Ser Thr Leu Asp Trp
3665 3670 3675
Asp Thr Gly Arg Ser Leu Ser Ser Ala Thr Ala Thr Thr Ser Ala
3680 3685 3690
Pro Gln Gly Ala Thr Thr Pro Gln Glu Leu Thr Leu Glu Thr Met
3695 3700 3705
Ile Ser Pro Ala Thr Ser Gln Leu Pro Phe Ser Ile Gly His Ile
3710 3715 3720
Thr Ser Ala Val Thr Pro Ala Ala Met Ala Arg Ser Ser Gly Val
3725 3730 3735
Thr Phe Ser Arg Pro Asp Pro Thr Ser Lys Lys Ala Glu Gln Thr
3740 3745 3750
Ser Thr Gln Leu Pro Thr Thr Thr Ser Ala His Pro Gly Gln Val
3755 3760 3765
Pro Arg Ser Ala Ala Thr Thr Leu Asp Val Ile Pro His Thr Ala
3770 3775 3780
Lys Thr Pro Asp Ala Thr Phe Gln Arg Gln Gly Gln Thr Ala Leu
3785 3790 3795
Thr Thr Glu Ala Arg Ala Thr Ser Asp Ser Trp Asn Glu Lys Glu
3800 3805 3810
Lys Ser Thr Pro Ser Ala Pro Trp Ile Thr Glu Met Met Asn Ser
3815 3820 3825
Val Ser Glu Asp Thr Ile Lys Glu Val Thr Ser Ser Ser Ser Val
3830 3835 3840
Leu Arg Thr Leu Asn Thr Leu Asp Ile Asn Leu Glu Ser Gly Thr
3845 3850 3855
Thr Ser Ser Pro Ser Trp Lys Ser Ser Pro Tyr Glu Arg Ile Ala
3860 3865 3870
Pro Ser Glu Ser Thr Thr Asp Lys Glu Ala Ile His Pro Ser Thr
3875 3880 3885
Asn Thr Val Glu Thr Thr Gly Trp Val Thr Ser Ser Glu His Ala
3890 3895 3900
Ser His Ser Thr Ile Pro Ala His Ser Ala Ser Ser Lys Leu Thr
3905 3910 3915
Ser Pro Val Val Thr Thr Ser Thr Arg Glu Gln Ala Ile Val Ser
3920 3925 3930
Met Ser Thr Thr Thr Trp Pro Glu Ser Thr Arg Ala Arg Thr Glu
3935 3940 3945
Pro Asn Ser Phe Leu Thr Ile Glu Leu Arg Asp Val Ser Pro Tyr
3950 3955 3960
Met Asp Thr Ser Ser Thr Thr Gln Thr Ser Ile Ile Ser Ser Pro
3965 3970 3975
Gly Ser Thr Ala Ile Thr Lys Gly Pro Arg Thr Glu Ile Thr Ser
3980 3985 3990
Ser Lys Arg Ile Ser Ser Ser Phe Leu Ala Gln Ser Met Arg Ser
3995 4000 4005
Ser Asp Ser Pro Ser Glu Ala Ile Thr Arg Leu Ser Asn Phe Pro
4010 4015 4020
Ala Met Thr Glu Ser Gly Gly Met Ile Leu Ala Met Gln Thr Ser
4025 4030 4035
Pro Pro Gly Ala Thr Ser Leu Ser Ala Pro Thr Leu Asp Thr Ser
4040 4045 4050
Ala Thr Ala Ser Trp Thr Gly Thr Pro Leu Ala Thr Thr Gln Arg
4055 4060 4065
Phe Thr Tyr Ser Glu Lys Thr Thr Leu Phe Ser Lys Gly Pro Glu
4070 4075 4080
Asp Thr Ser Gln Pro Ser Pro Pro Ser Val Glu Glu Thr Ser Ser
4085 4090 4095
Ser Ser Ser Leu Val Pro Ile His Ala Thr Thr Ser Pro Ser Asn
4100 4105 4110
Ile Leu Leu Thr Ser Gln Gly His Ser Pro Ser Ser Thr Pro Pro
4115 4120 4125
Val Thr Ser Val Phe Leu Ser Glu Thr Ser Gly Leu Gly Lys Thr
4130 4135 4140
Thr Asp Met Ser Arg Ile Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ser Leu Pro
4145 4150 4155
Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ala Gly Glu Ala Leu Ser Thr Tyr Glu
4160 4165 4170
Ala Ser Arg Asp Thr Lys Ala Ile His His Ser Ala Asp Thr Ala
4175 4180 4185
Val Thr Asn Met Glu Ala Thr Ser Ser Glu Tyr Ser Pro Ile Pro
4190 4195 4200
Gly His Thr Lys Pro Ser Lys Ala Thr Ser Pro Leu Val Thr Ser
4205 4210 4215
His Ile Met Gly Asp Ile Thr Ser Ser Thr Ser Val Phe Gly Ser
4220 4225 4230
Ser Glu Thr Thr Glu Ile Glu Thr Val Ser Ser Val Asn Gln Gly
4235 4240 4245
Leu Gln Glu Arg Ser Thr Ser Gln Val Ala Ser Ser Ala Thr Glu
4250 4255 4260
Thr Ser Thr Val Ile Thr His Val Ser Ser Gly Asp Ala Thr Thr
4265 4270 4275
His Val Thr Lys Thr Gln Ala Thr Phe Ser Ser Gly Thr Ser Ile
4280 4285 4290
Ser Ser Pro His Gln Phe Ile Thr Ser Thr Asn Thr Phe Thr Asp
4295 4300 4305
Val Ser Thr Asn Pro Ser Thr Ser Leu Ile Met Thr Glu Ser Ser
4310 4315 4320
Gly Val Thr Ile Thr Thr Gln Thr Gly Pro Thr Gly Ala Ala Thr
4325 4330 4335
Gln Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Thr Met Pro Tyr Leu Thr
4340 4345 4350
Glu Thr Pro Leu Ala Val Thr Pro Asp Phe Met Gln Ser Glu Lys
4355 4360 4365
Thr Thr Leu Ile Ser Lys Gly Pro Lys Asp Val Ser Trp Thr Ser
4370 4375 4380
Pro Pro Ser Val Ala Glu Thr Ser Tyr Pro Ser Ser Leu Thr Pro
4385 4390 4395
Phe Leu Val Thr Thr Ile Pro Pro Ala Thr Ser Thr Leu Gln Gly
4400 4405 4410
Gln His Thr Ser Ser Pro Val Ser Ala Thr Ser Val Leu Thr Ser
4415 4420 4425
Gly Leu Val Lys Thr Thr Asp Met Leu Asn Thr Ser Met Glu Pro
4430 4435 4440
Val Thr Asn Ser Pro Gln Asn Leu Asn Asn Pro Ser Asn Glu Ile
4445 4450 4455
Leu Ala Thr Leu Ala Ala Thr Thr Asp Ile Glu Thr Ile His Pro
4460 4465 4470
Ser Ile Asn Lys Ala Val Thr Asn Met Gly Thr Ala Ser Ser Ala
4475 4480 4485
His Val Leu His Ser Thr Leu Pro Val Ser Ser Glu Pro Ser Thr
4490 4495 4500
Ala Thr Ser Pro Met Val Pro Ala Ser Ser Met Gly Asp Ala Leu
4505 4510 4515
Ala Ser Ile Ser Ile Pro Gly Ser Glu Thr Thr Asp Ile Glu Gly
4520 4525 4530
Glu Pro Thr Ser Ser Leu Thr Ala Gly Arg Lys Glu Asn Ser Thr
4535 4540 4545
Leu Gln Glu Met Asn Ser Thr Thr Glu Ser Asn Ile Ile Leu Ser
4550 4555 4560
Asn Val Ser Val Gly Ala Ile Thr Glu Ala Thr Lys Met Glu Val
4565 4570 4575
Pro Ser Phe Asp Ala Thr Phe Ile Pro Thr Pro Ala Gln Ser Thr
4580 4585 4590
Lys Phe Pro Asp Ile Phe Ser Val Ala Ser Ser Arg Leu Ser Asn
4595 4600 4605
Ser Pro Pro Met Thr Ile Ser Thr His Met Thr Thr Thr Gln Thr
4610 4615 4620
Gly Ser Ser Gly Ala Thr Ser Lys Ile Pro Leu Ala Leu Asp Thr
4625 4630 4635
Ser Thr Leu Glu Thr Ser Ala Gly Thr Pro Ser Val Val Thr Glu
4640 4645 4650
Gly Phe Ala His Ser Lys Ile Thr Thr Ala Met Asn Asn Asp Val
4655 4660 4665
Lys Asp Val Ser Gln Thr Asn Pro Pro Phe Gln Asp Glu Ala Ser
4670 4675 4680
Ser Pro Ser Ser Gln Ala Pro Val Leu Val Thr Thr Leu Pro Ser
4685 4690 4695
Ser Val Ala Phe Thr Pro Gln Trp His Ser Thr Ser Ser Pro Val
4700 4705 4710
Ser Met Ser Ser Val Leu Thr Ser Ser Leu Val Lys Thr Ala Gly
4715 4720 4725
Lys Val Asp Thr Ser Leu Glu Thr Val Thr Ser Ser Pro Gln Ser
4730 4735 4740
Met Ser Asn Thr Leu Asp Asp Ile Ser Val Thr Ser Ala Ala Thr
4745 4750 4755
Thr Asp Ile Glu Thr Thr His Pro Ser Ile Asn Thr Val Val Thr
4760 4765 4770
Asn Val Gly Thr Thr Gly Ser Ala Phe Glu Ser His Ser Thr Val
4775 4780 4785
Ser Ala Tyr Pro Glu Pro Ser Lys Val Thr Ser Pro Asn Val Thr
4790 4795 4800
Thr Ser Thr Met Glu Asp Thr Thr Ile Ser Arg Ser Ile Pro Lys
4805 4810 4815
Ser Ser Lys Thr Thr Arg Thr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Ser Leu
4820 4825 4830
Thr Pro Lys Leu Arg Glu Thr Ser Ile Ser Gln Glu Ile Thr Ser
4835 4840 4845
Ser Thr Glu Thr Ser Thr Val Pro Tyr Lys Glu Leu Thr Gly Ala
4850 4855 4860
Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Asp Val Thr Ser Ser Ser Ser Thr
4865 4870 4875
Ser Phe Pro Gly Pro Asp Gln Ser Thr Val Ser Leu Asp Ile Ser
4880 4885 4890
Thr Glu Thr Asn Thr Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Met Thr Glu
4895 4900 4905
Ser Ala Glu Ile Thr Ile Thr Thr Gln Thr Gly Pro His Gly Ala
4910 4915 4920
Thr Ser Gln Asp Thr Phe Thr Met Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro
4925 4930 4935
Gln Ala Gly Ile His Ser Ala Met Thr His Gly Phe Ser Gln Leu
4940 4945 4950
Asp Val Thr Thr Leu Met Ser Arg Ile Pro Gln Asp Val Ser Trp
4955 4960 4965
Thr Ser Pro Pro Ser Val Asp Lys Thr Ser Ser Pro Ser Ser Phe
4970 4975 4980
Leu Ser Ser Pro Ala Met Thr Thr Pro Ser Leu Ile Ser Ser Thr
4985 4990 4995
Leu Pro Glu Asp Lys Leu Ser Ser Pro Met Thr Ser Leu Leu Thr
5000 5005 5010
Ser Gly Leu Val Lys Ile Thr Asp Ile Leu Arg Thr Arg Leu Glu
5015 5020 5025
Pro Val Thr Ser Ser Leu Pro Asn Phe Ser Ser Thr Ser Asp Lys
5030 5035 5040
Ile Leu Ala Thr Ser Lys Asp Ser Lys Asp Thr Lys Glu Ile Phe
5045 5050 5055
Pro Ser Ile Asn Thr Glu Glu Thr Asn Val Lys Ala Asn Asn Ser
5060 5065 5070
Gly His Glu Ser His Ser Pro Ala Leu Ala Asp Ser Glu Thr Pro
5075 5080 5085
Lys Ala Thr Thr Gln Met Val Ile Thr Thr Thr Val Gly Asp Pro
5090 5095 5100
Ala Pro Ser Thr Ser Met Pro Val His Gly Ser Ser Glu Thr Thr
5105 5110 5115
Asn Ile Lys Arg Glu Pro Thr Tyr Phe Leu Thr Pro Arg Leu Arg
5120 5125 5130
Glu Thr Ser Thr Ser Gln Glu Ser Ser Phe Pro Thr Asp Thr Ser
5135 5140 5145
Phe Leu Leu Ser Lys Val Pro Thr Gly Thr Ile Thr Glu Val Ser
5150 5155 5160
Ser Thr Gly Val Asn Ser Ser Ser Lys Ile Ser Thr Pro Asp His
5165 5170 5175
Asp Lys Ser Thr Val Pro Pro Asp Thr Phe Thr Gly Glu Ile Pro
5180 5185 5190
Arg Val Phe Thr Ser Ser Ile Lys Thr Lys Ser Ala Glu Met Thr
5195 5200 5205
Ile Thr Thr Gln Ala Ser Pro Pro Glu Ser Ala Ser His Ser Thr
5210 5215 5220
Leu Pro Leu Asp Thr Ser Thr Thr Leu Ser Gln Gly Gly Thr His
5225 5230 5235
Ser Thr Val Thr Gln Gly Phe Pro Tyr Ser Glu Val Thr Thr Leu
5240 5245 5250
Met Gly Met Gly Pro Gly Asn Val Ser Trp Met Thr Thr Pro Pro
5255 5260 5265
Val Glu Glu Thr Ser Ser Val Ser Ser Leu Met Ser Ser Pro Ala
5270 5275 5280
Met Thr Ser Pro Ser Pro Val Ser Ser Thr Ser Pro Gln Ser Ile
5285 5290 5295
Pro Ser Ser Pro Leu Pro Val Thr Ala Leu Pro Thr Ser Val Leu
5300 5305 5310
Val Thr Thr Thr Asp Val Leu Gly Thr Thr Ser Pro Glu Ser Val
5315 5320 5325
Thr Ser Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Ile Thr His Glu Arg Pro
5330 5335 5340
Ala Thr Tyr Lys Asp Thr Ala His Thr Glu Ala Ala Met His His
5345 5350 5355
Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Asn Val Gly Thr Ser Gly Ser Gly
5360 5365 5370
His Lys Ser Gln Ser Ser Val Leu Ala Asp Ser Glu Thr Ser Lys
5375 5380 5385
Ala Thr Pro Leu Met Ser Thr Thr Ser Thr Leu Gly Asp Thr Ser
5390 5395 5400
Val Ser Thr Ser Thr Pro Asn Ile Ser Gln Thr Asn Gln Ile Gln
5405 5410 5415
Thr Glu Pro Thr Ala Ser Leu Ser Pro Arg Leu Arg Glu Ser Ser
5420 5425 5430
Thr Ser Glu Lys Thr Ser Ser Thr Thr Glu Thr Asn Thr Ala Phe
5435 5440 5445
Ser Tyr Val Pro Thr Gly Ala Ile Thr Gln Ala Ser Arg Thr Glu
5450 5455 5460
Ile Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile Ser Asp Leu Asp Arg Pro Thr
5465 5470 5475
Ile Ala Pro Asp Ile Ser Thr Gly Met Ile Thr Arg Leu Phe Thr
5480 5485 5490
Ser Pro Ile Met Thr Lys Ser Ala Glu Met Thr Val Thr Thr Gln
5495 5500 5505
Thr Thr Thr Pro Gly Ala Thr Ser Gln Gly Ile Leu Pro Trp Asp
5510 5515 5520
Thr Ser Thr Thr Leu Phe Gln Gly Gly Thr His Ser Thr Val Ser
5525 5530 5535
Gln Gly Phe Pro His Ser Glu Ile Thr Thr Leu Arg Ser Arg Thr
5540 5545 5550
Pro Gly Asp Val Ser Trp Met Thr Thr Pro Pro Val Glu Glu Thr
5555 5560 5565
Ser Ser Gly Phe Ser Leu Met Ser Pro Ser Met Thr Ser Pro Ser
5570 5575 5580
Pro Val Ser Ser Thr Ser Pro Glu Ser Ile Pro Ser Ser Pro Leu
5585 5590 5595
Pro Val Thr Ala Leu Leu Thr Ser Val Leu Val Thr Thr Thr Asn
5600 5605 5610
Val Leu Gly Thr Thr Ser Pro Glu Pro Val Thr Ser Ser Pro Pro
5615 5620 5625
Asn Leu Ser Ser Pro Thr Gln Glu Arg Leu Thr Thr Tyr Lys Asp
5630 5635 5640
Thr Ala His Thr Glu Ala Met His Ala Ser Met His Thr Asn Thr
5645 5650 5655
Ala Val Ala Asn Val Gly Thr Ser Ile Ser Gly His Glu Ser Gln
5660 5665 5670
Ser Ser Val Pro Ala Asp Ser His Thr Ser Lys Ala Thr Ser Pro
5675 5680 5685
Met Gly Ile Thr Phe Ala Met Gly Asp Thr Ser Val Ser Thr Ser
5690 5695 5700
Thr Pro Ala Phe Phe Glu Thr Arg Ile Gln Thr Glu Ser Thr Ser
5705 5710 5715
Ser Leu Ile Pro Gly Leu Arg Asp Thr Arg Thr Ser Glu Glu Ile
5720 5725 5730
Asn Thr Val Thr Glu Thr Ser Thr Val Leu Ser Glu Val Pro Thr
5735 5740 5745
Thr Thr Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu Val Ile Thr Ser Ser
5750 5755 5760
Arg Thr Thr Ile Ser Gly Pro Asp His Ser Lys Met Ser Pro Tyr
5765 5770 5775
Ile Ser Thr Glu Thr Ile Thr Arg Leu Ser Thr Phe Pro Phe Val
5780 5785 5790
Thr Gly Ser Thr Glu Met Ala Ile Thr Asn Gln Thr Gly Pro Ile
5795 5800 5805
Gly Thr Ile Ser Gln Ala Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Ser Thr
5810 5815 5820
Ala Ser Trp Glu Gly Thr His Ser Pro Val Thr Gln Arg Phe Pro
5825 5830 5835
His Ser Glu Glu Thr Thr Thr Met Ser Arg Ser Thr Lys Gly Val
5840 5845 5850
Ser Trp Gln Ser Pro Pro Ser Val Glu Glu Thr Ser Ser Pro Ser
5855 5860 5865
Ser Pro Val Pro Leu Pro Ala Ile Thr Ser His Ser Ser Leu Tyr
5870 5875 5880
Ser Ala Val Ser Gly Ser Ser Pro Thr Ser Ala Leu Pro Val Thr
5885 5890 5895
Ser Leu Leu Thr Ser Gly Arg Arg Lys Thr Ile Asp Met Leu Asp
5900 5905 5910
Thr His Ser Glu Leu Val Thr Ser Ser Leu Pro Ser Ala Ser Ser
5915 5920 5925
Phe Ser Gly Glu Ile Leu Thr Ser Glu Ala Ser Thr Asn Thr Glu
5930 5935 5940
Thr Ile His Phe Ser Glu Asn Thr Ala Glu Thr Asn Met Gly Thr
5945 5950 5955
Thr Asn Ser Met His Lys Leu His Ser Ser Val Ser Ile His Ser
5960 5965 5970
Gln Pro Ser Gly His Thr Pro Pro Lys Val Thr Gly Ser Met Met
5975 5980 5985
Glu Asp Ala Ile Val Ser Thr Ser Thr Pro Gly Ser Pro Glu Thr
5990 5995 6000
Lys Asn Val Asp Arg Asp Ser Thr Ser Pro Leu Thr Pro Glu Leu
6005 6010 6015
Lys Glu Asp Ser Thr Ala Leu Val Met Asn Ser Thr Thr Glu Ser
6020 6025 6030
Asn Thr Val Phe Ser Ser Val Ser Leu Asp Ala Ala Thr Glu Val
6035 6040 6045
Ser Arg Ala Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Pro Thr Phe Met Pro Ala
6050 6055 6060
Ser Ala Gln Ser Thr Lys Ser Pro Asp Ile Ser Pro Glu Ala Ser
6065 6070 6075
Ser Ser His Ser Asn Ser Pro Pro Leu Thr Ile Ser Thr His Lys
6080 6085 6090
Thr Ile Ala Thr Gln Thr Gly Pro Ser Gly Val Thr Ser Leu Gly
6095 6100 6105
Gln Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ile Ala Thr Ser Ala Gly Thr
6110 6115 6120
Pro Ser Ala Arg Thr Gln Asp Phe Val Asp Ser Glu Thr Thr Ser
6125 6130 6135
Val Met Asn Asn Asp Leu Asn Asp Val Leu Lys Thr Ser Pro Phe
6140 6145 6150
Ser Ala Glu Glu Ala Asn Ser Leu Ser Ser Gln Ala Pro Leu Leu
6155 6160 6165
Val Thr Thr Ser Pro Ser Pro Val Thr Ser Thr Leu Gln Glu His
6170 6175 6180
Ser Thr Ser Ser Leu Val Ser Val Thr Ser Val Pro Thr Pro Thr
6185 6190 6195
Leu Ala Lys Ile Thr Asp Met Asp Thr Asn Leu Glu Pro Val Thr
6200 6205 6210
Arg Ser Pro Gln Asn Leu Arg Asn Thr Leu Ala Thr Ser Glu Ala
6215 6220 6225
Thr Thr Asp Thr His Thr Met His Pro Ser Ile Asn Thr Ala Val
6230 6235 6240
Ala Asn Val Gly Thr Thr Ser Ser Pro Asn Glu Phe Tyr Phe Thr
6245 6250 6255
Val Ser Pro Asp Ser Asp Pro Tyr Lys Ala Thr Ser Ala Val Val
6260 6265 6270
Ile Thr Ser Thr Ser Gly Asp Ser Ile Val Ser Thr Ser Met Pro
6275 6280 6285
Arg Ser Ser Ala Met Lys Lys Ile Glu Ser Glu Thr Thr Phe Ser
6290 6295 6300
Leu Ile Phe Arg Leu Arg Glu Thr Ser Thr Ser Gln Lys Ile Gly
6305 6310 6315
Ser Ser Ser Asp Thr Ser Thr Val Phe Asp Lys Ala Phe Thr Ala
6320 6325 6330
Ala Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu Leu Thr Ser Ser Ser Arg
6335 6340 6345
Thr Ser Ile Gln Gly Thr Glu Lys Pro Thr Met Ser Pro Asp Thr
6350 6355 6360
Ser Thr Arg Ser Val Thr Met Leu Ser Thr Phe Ala Gly Leu Thr
6365 6370 6375
Lys Ser Glu Glu Arg Thr Ile Ala Thr Gln Thr Gly Pro His Arg
6380 6385 6390
Ala Thr Ser Gln Gly Thr Leu Thr Trp Asp Thr Ser Ile Thr Thr
6395 6400 6405
Ser Gln Ala Gly Thr His Ser Ala Met Thr His Gly Phe Ser Gln
6410 6415 6420
Leu Asp Leu Ser Thr Leu Thr Ser Arg Val Pro Glu Tyr Ile Ser
6425 6430 6435
Gly Thr Ser Pro Pro Ser Val Glu Lys Thr Ser Ser Ser Ser Ser
6440 6445 6450
Leu Leu Ser Leu Pro Ala Ile Thr Ser Pro Ser Pro Val Pro Thr
6455 6460 6465
Thr Leu Pro Glu Ser Arg Pro Ser Ser Pro Val His Leu Thr Ser
6470 6475 6480
Leu Pro Thr Ser Gly Leu Val Lys Thr Thr Asp Met Leu Ala Ser
6485 6490 6495
Val Ala Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gly Ser Thr Ser His Lys Ile
6500 6505 6510
Pro Thr Thr Ser Glu Asp Ile Lys Asp Thr Glu Lys Met Tyr Pro
6515 6520 6525
Ser Thr Asn Ile Ala Val Thr Asn Val Gly Thr Thr Thr Ser Glu
6530 6535 6540
Lys Glu Ser Tyr Ser Ser Val Pro Ala Tyr Ser Glu Pro Pro Lys
6545 6550 6555
Val Thr Ser Pro Met Val Thr Ser Phe Asn Ile Arg Asp Thr Ile
6560 6565 6570
Val Ser Thr Ser Met Pro Gly Ser Ser Glu Ile Thr Arg Ile Glu
6575 6580 6585
Met Glu Ser Thr Phe Ser Leu Ala His Gly Leu Lys Gly Thr Ser
6590 6595 6600
Thr Ser Gln Asp Pro Ile Val Ser Thr Glu Lys Ser Ala Val Leu
6605 6610 6615
His Lys Leu Thr Thr Gly Ala Thr Glu Thr Ser Arg Thr Glu Val
6620 6625 6630
Ala Ser Ser Arg Arg Thr Ser Ile Pro Gly Pro Asp His Ser Thr
6635 6640 6645
Glu Ser Pro Asp Ile Ser Thr Glu Val Ile Pro Ser Leu Pro Ile
6650 6655 6660
Ser Leu Gly Ile Thr Glu Ser Ser Asn Met Thr Ile Ile Thr Arg
6665 6670 6675
Thr Gly Pro Pro Leu Gly Ser Thr Ser Gln Gly Thr Phe Thr Leu
6680 6685 6690
Asp Thr Pro Thr Thr Ser Ser Arg Ala Gly Thr His Ser Met Ala
6695 6700 6705
Thr Gln Glu Phe Pro His Ser Glu Met Thr Thr Val Met Asn Lys
6710 6715 6720
Asp Pro Glu Ile Leu Ser Trp Thr Ile Pro Pro Ser Ile Glu Lys
6725 6730 6735
Thr Ser Phe Ser Ser Ser Leu Met Pro Ser Pro Ala Met Thr Ser
6740 6745 6750
Pro Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Lys Thr Ile His Thr Thr Pro
6755 6760 6765
Ser Pro Met Thr Ser Leu Leu Thr Pro Ser Leu Val Met Thr Thr
6770 6775 6780
Asp Thr Leu Gly Thr Ser Pro Glu Pro Thr Thr Ser Ser Pro Pro
6785 6790 6795
Asn Leu Ser Ser Thr Ser His Glu Ile Leu Thr Thr Asp Glu Asp
6800 6805 6810
Thr Thr Ala Ile Glu Ala Met His Pro Ser Thr Ser Thr Ala Ala
6815 6820 6825
Thr Asn Val Glu Thr Thr Ser Ser Gly His Gly Ser Gln Ser Ser
6830 6835 6840
Val Leu Ala Asp Ser Glu Lys Thr Lys Ala Thr Ala Pro Met Asp
6845 6850 6855
Thr Thr Ser Thr Met Gly His Thr Thr Val Ser Thr Ser Met Ser
6860 6865 6870
Val Ser Ser Glu Thr Thr Lys Ile Lys Arg Glu Ser Thr Tyr Ser
6875 6880 6885
Leu Thr Pro Gly Leu Arg Glu Thr Ser Ile Ser Gln Asn Ala Ser
6890 6895 6900
Phe Ser Thr Asp Thr Ser Ile Val Leu Ser Glu Val Pro Thr Gly
6905 6910 6915
Thr Thr Ala Glu Val Ser Arg Thr Glu Val Thr Ser Ser Gly Arg
6920 6925 6930
Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ser Gln Ser Thr Val Leu Pro Glu Ile
6935 6940 6945
Ser Thr Arg Thr Met Thr Arg Leu Phe Ala Ser Pro Thr Met Thr
6950 6955 6960
Glu Ser Ala Glu Met Thr Ile Pro Thr Gln Thr Gly Pro Ser Gly
6965 6970 6975
Ser Thr Ser Gln Asp Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Lys
6980 6985 6990
Ser Gln Ala Lys Thr His Ser Thr Leu Thr Gln Arg Phe Pro His
6995 7000 7005
Ser Glu Met Thr Thr Leu Met Ser Arg Gly Pro Gly Asp Met Ser
7010 7015 7020
Trp Gln Ser Ser Pro Ser Leu Glu Asn Pro Ser Ser Leu Pro Ser
7025 7030 7035
Leu Leu Ser Leu Pro Ala Thr Thr Ser Pro Pro Pro Ile Ser Ser
7040 7045 7050
Thr Leu Pro Val Thr Ile Ser Ser Ser Pro Leu Pro Val Thr Ser
7055 7060 7065
Leu Leu Thr Ser Ser Pro Val Thr Thr Thr Asp Met Leu His Thr
7070 7075 7080
Ser Pro Glu Leu Val Thr Ser Ser Pro Pro Lys Leu Ser His Thr
7085 7090 7095
Ser Asp Glu Arg Leu Thr Thr Gly Lys Asp Thr Thr Asn Thr Glu
7100 7105 7110
Ala Val His Pro Ser Thr Asn Thr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ile
7115 7120 7125
Pro Ser Ser Gly His Glu Ser Pro Ser Ser Ala Leu Ala Asp Ser
7130 7135 7140
Glu Thr Ser Lys Ala Thr Ser Pro Met Phe Ile Thr Ser Thr Gln
7145 7150 7155
Glu Asp Thr Thr Val Ala Ile Ser Thr Pro His Phe Leu Glu Thr
7160 7165 7170
Ser Arg Ile Gln Lys Glu Ser Ile Ser Ser Leu Ser Pro Lys Leu
7175 7180 7185
Arg Glu Thr Gly Ser Ser Val Glu Thr Ser Ser Ala Ile Glu Thr
7190 7195 7200
Ser Ala Val Leu Ser Glu Val Ser Ile Gly Ala Thr Thr Glu Ile
7205 7210 7215
Ser Arg Thr Glu Val Thr Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile Ser Gly
7220 7225 7230
Ser Ala Glu Ser Thr Met Leu Pro Glu Ile Ser Thr Thr Arg Lys
7235 7240 7245
Ile Ile Lys Phe Pro Thr Ser Pro Ile Leu Ala Glu Ser Ser Glu
7250 7255 7260
Met Thr Ile Lys Thr Gln Thr Ser Pro Pro Gly Ser Thr Ser Glu
7265 7270 7275
Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Pro Ser Leu Val Ile
7280 7285 7290
Thr His Ser Thr Met Thr Gln Arg Leu Pro His Ser Glu Ile Thr
7295 7300 7305
Thr Leu Val Ser Arg Gly Ala Gly Asp Val Pro Arg Pro Ser Ser
7310 7315 7320
Leu Pro Val Glu Glu Thr Ser Pro Pro Ser Ser Gln Leu Ser Leu
7325 7330 7335
Ser Ala Met Ile Ser Pro Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Ala
7340 7345 7350
Ser Ser His Ser Ser Ser Ala Ser Val Thr Ser Leu Leu Thr Pro
7355 7360 7365
Gly Gln Val Lys Thr Thr Glu Val Leu Asp Ala Ser Ala Glu Pro
7370 7375 7380
Glu Thr Ser Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ser Thr Ser Val Glu Ile
7385 7390 7395
Leu Ala Thr Ser Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu Lys Ile His Pro
7400 7405 7410
Phe Ser Asn Thr Ala Val Thr Lys Val Gly Thr Ser Ser Ser Gly
7415 7420 7425
His Glu Ser Pro Ser Ser Val Leu Pro Asp Ser Glu Thr Thr Lys
7430 7435 7440
Ala Thr Ser Ala Met Gly Thr Ile Ser Ile Met Gly Asp Thr Ser
7445 7450 7455
Val Ser Thr Leu Thr Pro Ala Leu Ser Asn Thr Arg Lys Ile Gln
7460 7465 7470
Ser Glu Pro Ala Ser Ser Leu Thr Thr Arg Leu Arg Glu Thr Ser
7475 7480 7485
Thr Ser Glu Glu Thr Ser Leu Ala Thr Glu Ala Asn Thr Val Leu
7490 7495 7500
Ser Lys Val Ser Thr Gly Ala Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu
7505 7510 7515
Ala Ile Ser Phe Ser Arg Thr Ser Met Ser Gly Pro Glu Gln Ser
7520 7525 7530
Thr Met Ser Gln Asp Ile Ser Ile Gly Thr Ile Pro Arg Ile Ser
7535 7540 7545
Ala Ser Ser Val Leu Thr Glu Ser Ala Lys Met Thr Ile Thr Thr
7550 7555 7560
Gln Thr Gly Pro Ser Glu Ser Thr Leu Glu Ser Thr Leu Asn Leu
7565 7570 7575
Asn Thr Ala Thr Thr Pro Ser Trp Val Glu Thr His Ser Ile Val
7580 7585 7590
Ile Gln Gly Phe Pro His Pro Glu Met Thr Thr Ser Met Gly Arg
7595 7600 7605
Gly Pro Gly Gly Val Ser Trp Pro Ser Pro Pro Phe Val Lys Glu
7610 7615 7620
Thr Ser Pro Pro Ser Ser Pro Leu Ser Leu Pro Ala Val Thr Ser
7625 7630 7635
Pro His Pro Val Ser Thr Thr Phe Leu Ala His Ile Pro Pro Ser
7640 7645 7650
Pro Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Pro Ala Thr Thr
7655 7660 7665
Thr Asp Ile Leu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Gly Thr Ser Ser Ser
7670 7675 7680
Ser Ser Leu Ser Thr Thr Ser His Glu Arg Leu Thr Thr Tyr Lys
7685 7690 7695
Asp Thr Ala His Thr Glu Ala Val His Pro Ser Thr Asn Thr Gly
7700 7705 7710
Gly Thr Asn Val Ala Thr Thr Ser Ser Gly Tyr Lys Ser Gln Ser
7715 7720 7725
Ser Val Leu Ala Asp Ser Ser Pro Met Cys Thr Thr Ser Thr Met
7730 7735 7740
Gly Asp Thr Ser Val Leu Thr Ser Thr Pro Ala Phe Leu Glu Thr
7745 7750 7755
Arg Arg Ile Gln Thr Glu Leu Ala Ser Ser Leu Thr Pro Gly Leu
7760 7765 7770
Arg Glu Ser Ser Gly Ser Glu Gly Thr Ser Ser Gly Thr Lys Met
7775 7780 7785
Ser Thr Val Leu Ser Lys Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Glu Ile
7790 7795 7800
Ser Lys Glu Asp Val Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ala Gln Ser Thr
7805 7810 7815
Ile Ser Pro Asp Ile Ser Thr Arg Thr Val Ser Trp Phe Ser Thr
7820 7825 7830
Ser Pro Val Met Thr Glu Ser Ala Glu Ile Thr Met Asn Thr His
7835 7840 7845
Thr Ser Pro Leu Gly Ala Thr Thr Gln Gly Thr Ser Thr Leu Asp
7850 7855 7860
Thr Ser Ser Thr Thr Ser Leu Thr Met Thr His Ser Thr Ile Ser
7865 7870 7875
Gln Gly Phe Ser His Ser Gln Met Ser Thr Leu Met Arg Arg Gly
7880 7885 7890
Pro Glu Asp Val Ser Trp Met Ser Pro Pro Leu Leu Glu Lys Thr
7895 7900 7905
Arg Pro Ser Phe Ser Leu Met Ser Ser Pro Ala Thr Thr Ser Pro
7910 7915 7920
Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Glu Ser Ile Ser Ser Ser Pro
7925 7930 7935
Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Leu Ala Lys Thr Thr
7940 7945 7950
Asp Met Leu His Lys Ser Ser Glu Pro Val Thr Asn Ser Pro Ala
7955 7960 7965
Asn Leu Ser Ser Thr Ser Val Glu Ile Leu Ala Thr Ser Glu Val
7970 7975 7980
Thr Thr Asp Thr Glu Lys Thr His Pro Ser Ser Asn Arg Thr Val
7985 7990 7995
Thr Asp Val Gly Thr Ser Ser Ser Gly His Glu Ser Thr Ser Phe
8000 8005 8010
Val Leu Ala Asp Ser Gln Thr Ser Lys Val Thr Ser Pro Met Val
8015 8020 8025
Ile Thr Ser Thr Met Glu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ser Thr Pro
8030 8035 8040
Gly Phe Phe Glu Thr Ser Arg Ile Gln Thr Glu Pro Thr Ser Ser
8045 8050 8055
Leu Thr Leu Gly Leu Arg Lys Thr Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ser
8060 8065 8070
Leu Ala Thr Glu Met Ser Thr Val Leu Ser Gly Val Pro Thr Gly
8075 8080 8085
Ala Thr Ala Glu Val Ser Arg Thr Glu Val Thr Ser Ser Ser Arg
8090 8095 8100
Thr Ser Ile Ser Gly Phe Ala Gln Leu Thr Val Ser Pro Glu Thr
8105 8110 8115
Ser Thr Glu Thr Ile Thr Arg Leu Pro Thr Ser Ser Ile Met Thr
8120 8125 8130
Glu Ser Ala Glu Met Met Ile Lys Thr Gln Thr Asp Pro Pro Gly
8135 8140 8145
Ser Thr Pro Glu Ser Thr His Thr Val Asp Ile Ser Thr Thr Pro
8150 8155 8160
Asn Trp Val Glu Thr His Ser Thr Val Thr Gln Arg Phe Ser His
8165 8170 8175
Ser Glu Met Thr Thr Leu Val Ser Arg Ser Pro Gly Asp Met Leu
8180 8185 8190
Trp Pro Ser Gln Ser Ser Val Glu Glu Thr Ser Ser Ala Ser Ser
8195 8200 8205
Leu Leu Ser Leu Pro Ala Thr Thr Ser Pro Ser Pro Val Ser Ser
8210 8215 8220
Thr Leu Val Glu Asp Phe Pro Ser Ala Ser Leu Pro Val Thr Ser
8225 8230 8235
Leu Leu Asn Pro Gly Leu Val Ile Thr Thr Asp Arg Met Gly Ile
8240 8245 8250
Ser Arg Glu Pro Gly Thr Ser Ser Thr Ser Asn Leu Ser Ser Thr
8255 8260 8265
Ser His Glu Arg Leu Thr Thr Leu Glu Asp Thr Val Asp Thr Glu
8270 8275 8280
Asp Met Gln Pro Ser Thr His Thr Ala Val Thr Asn Val Arg Thr
8285 8290 8295
Ser Ile Ser Gly His Glu Ser Gln Ser Ser Val Leu Ser Asp Ser
8300 8305 8310
Glu Thr Pro Lys Ala Thr Ser Pro Met Gly Thr Thr Tyr Thr Met
8315 8320 8325
Gly Glu Thr Ser Val Ser Ile Ser Thr Ser Asp Phe Phe Glu Thr
8330 8335 8340
Ser Arg Ile Gln Ile Glu Pro Thr Ser Ser Leu Thr Ser Gly Leu
8345 8350 8355
Arg Glu Thr Ser Ser Ser Glu Arg Ile Ser Ser Ala Thr Glu Gly
8360 8365 8370
Ser Thr Val Leu Ser Glu Val Pro Ser Gly Ala Thr Thr Glu Val
8375 8380 8385
Ser Arg Thr Glu Val Ile Ser Ser Arg Gly Thr Ser Met Ser Gly
8390 8395 8400
Pro Asp Gln Phe Thr Ile Ser Pro Asp Ile Ser Thr Glu Ala Ile
8405 8410 8415
Thr Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Met Thr Glu Ser Ala Glu Ser
8420 8425 8430
Ala Ile Thr Ile Glu Thr Gly Ser Pro Gly Ala Thr Ser Glu Gly
8435 8440 8445
Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Thr Phe Trp Ser Gly Thr
8450 8455 8460
His Ser Thr Ala Ser Pro Gly Phe Ser His Ser Glu Met Thr Thr
8465 8470 8475
Leu Met Ser Arg Thr Pro Gly Asp Val Pro Trp Pro Ser Leu Pro
8480 8485 8490
Ser Val Glu Glu Ala Ser Ser Val Ser Ser Ser Leu Ser Ser Pro
8495 8500 8505
Ala Met Thr Ser Thr Ser Phe Phe Ser Thr Leu Pro Glu Ser Ile
8510 8515 8520
Ser Ser Ser Pro His Pro Val Thr Ala Leu Leu Thr Leu Gly Pro
8525 8530 8535
Val Lys Thr Thr Asp Met Leu Arg Thr Ser Ser Glu Pro Glu Thr
8540 8545 8550
Ser Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Ala Glu Ile Leu Ala
8555 8560 8565
Thr Ser Glu Val Thr Lys Asp Arg Glu Lys Ile His Pro Ser Ser
8570 8575 8580
Asn Thr Pro Val Val Asn Val Gly Thr Val Ile Tyr Lys His Leu
8585 8590 8595
Ser Pro Ser Ser Val Leu Ala Asp Leu Val Thr Thr Lys Pro Thr
8600 8605 8610
Ser Pro Met Ala Thr Thr Ser Thr Leu Gly Asn Thr Ser Val Ser
8615 8620 8625
Thr Ser Thr Pro Ala Phe Pro Glu Thr Met Met Thr Gln Pro Thr
8630 8635 8640
Ser Ser Leu Thr Ser Gly Leu Arg Glu Ile Ser Thr Ser Gln Glu
8645 8650 8655
Thr Ser Ser Ala Thr Glu Arg Ser Ala Ser Leu Ser Gly Met Pro
8660 8665 8670
Thr Gly Ala Thr Thr Lys Val Ser Arg Thr Glu Ala Leu Ser Leu
8675 8680 8685
Gly Arg Thr Ser Thr Pro Gly Pro Ala Gln Ser Thr Ile Ser Pro
8690 8695 8700
Glu Ile Ser Thr Glu Thr Ile Thr Arg Ile Ser Thr Pro Leu Thr
8705 8710 8715
Thr Thr Gly Ser Ala Glu Met Thr Ile Thr Pro Lys Thr Gly His
8720 8725 8730
Ser Gly Ala Ser Ser Gln Gly Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Ser
8735 8740 8745
Arg Ala Ser Trp Pro Gly Thr His Ser Ala Ala Thr His Arg Ser
8750 8755 8760
Pro His Ser Gly Met Thr Thr Pro Met Ser Arg Gly Pro Glu Asp
8765 8770 8775
Val Ser Trp Pro Ser Arg Pro Ser Val Glu Lys Thr Ser Pro Pro
8780 8785 8790
Ser Ser Leu Val Ser Leu Ser Ala Val Thr Ser Pro Ser Pro Leu
8795 8800 8805
Tyr Ser Thr Pro Ser Glu Ser Ser His Ser Ser Pro Leu Arg Val
8810 8815 8820
Thr Ser Leu Phe Thr Pro Val Met Met Lys Thr Thr Asp Met Leu
8825 8830 8835
Asp Thr Ser Leu Glu Pro Val Thr Thr Ser Pro Pro Ser Met Asn
8840 8845 8850
Ile Thr Ser Asp Glu Ser Leu Ala Thr Ser Lys Ala Thr Met Glu
8855 8860 8865
Thr Glu Ala Ile Gln Leu Ser Glu Asn Thr Ala Val Thr Gln Met
8870 8875 8880
Gly Thr Ile Ser Ala Arg Gln Glu Phe Tyr Ser Ser Tyr Pro Gly
8885 8890 8895
Leu Pro Glu Pro Ser Lys Val Thr Ser Pro Val Val Thr Ser Ser
8900 8905 8910
Thr Ile Lys Asp Ile Val Ser Thr Thr Ile Pro Ala Ser Ser Glu
8915 8920 8925
Ile Thr Arg Ile Glu Met Glu Ser Thr Ser Thr Leu Thr Pro Thr
8930 8935 8940
Pro Arg Glu Thr Ser Thr Ser Gln Glu Ile His Ser Ala Thr Lys
8945 8950 8955
Pro Ser Thr Val Pro Tyr Lys Ala Leu Thr Ser Ala Thr Ile Glu
8960 8965 8970
Asp Ser Met Thr Gln Val Met Ser Ser Ser Arg Gly Pro Ser Pro
8975 8980 8985
Asp Gln Ser Thr Met Ser Gln Asp Ile Ser Thr Glu Val Ile Thr
8990 8995 9000
Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Lys Thr Glu Ser Thr Glu Met Thr
9005 9010 9015
Ile Thr Thr Gln Thr Gly Ser Pro Gly Ala Thr Ser Arg Gly Thr
9020 9025 9030
Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Phe Met Ser Gly Thr His Ser
9035 9040 9045
Thr Ala Ser Gln Gly Phe Ser His Ser Gln Met Thr Ala Leu Met
9050 9055 9060
Ser Arg Thr Pro Gly Asp Val Pro Trp Leu Ser His Pro Ser Val
9065 9070 9075
Glu Glu Ala Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Ser Ser Pro Val Met
9080 9085 9090
Thr Ser Ser Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Asp Ser Ile His
9095 9100 9105
Ser Ser Ser Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Leu Val
9110 9115 9120
Lys Thr Thr Glu Leu Leu Gly Thr Ser Ser Glu Pro Glu Thr Ser
9125 9130 9135
Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Ala Glu Ile Leu Ala Ile
9140 9145 9150
Thr Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu Lys Leu Glu Met Thr Asn Val
9155 9160 9165
Val Thr Ser Gly Tyr Thr His Glu Ser Pro Ser Ser Val Leu Ala
9170 9175 9180
Asp Ser Val Thr Thr Lys Ala Thr Ser Ser Met Gly Ile Thr Tyr
9185 9190 9195
Pro Thr Gly Asp Thr Asn Val Leu Thr Ser Thr Pro Ala Phe Ser
9200 9205 9210
Asp Thr Ser Arg Ile Gln Thr Lys Ser Lys Leu Ser Leu Thr Pro
9215 9220 9225
Gly Leu Met Glu Thr Ser Ile Ser Glu Glu Thr Ser Ser Ala Thr
9230 9235 9240
Glu Lys Ser Thr Val Leu Ser Ser Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr
9245 9250 9255
Glu Val Ser Arg Thr Glu Ala Ile Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile
9260 9265 9270
Pro Gly Pro Ala Gln Ser Thr Met Ser Ser Asp Thr Ser Met Glu
9275 9280 9285
Thr Ile Thr Arg Ile Ser Thr Pro Leu Thr Arg Lys Glu Ser Thr
9290 9295 9300
Asp Met Ala Ile Thr Pro Lys Thr Gly Pro Ser Gly Ala Thr Ser
9305 9310 9315
Gln Gly Thr Phe Thr Leu Asp Ser Ser Ser Thr Ala Ser Trp Pro
9320 9325 9330
Gly Thr His Ser Ala Thr Thr Gln Arg Phe Pro Gln Ser Val Val
9335 9340 9345
Thr Thr Pro Met Ser Arg Gly Pro Glu Asp Val Ser Trp Pro Ser
9350 9355 9360
Pro Leu Ser Val Glu Lys Asn Ser Pro Pro Ser Ser Leu Val Ser
9365 9370 9375
Ser Ser Ser Val Thr Ser Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Thr Pro Ser
9380 9385 9390
Gly Ser Ser His Ser Ser Pro Val Pro Val Thr Ser Leu Phe Thr
9395 9400 9405
Ser Ile Met Met Lys Ala Thr Asp Met Leu Asp Ala Ser Leu Glu
9410 9415 9420
Pro Glu Thr Thr Ser Ala Pro Asn Met Asn Ile Thr Ser Asp Glu
9425 9430 9435
Ser Leu Ala Ala Ser Lys Ala Thr Thr Glu Thr Glu Ala Ile His
9440 9445 9450
Val Phe Glu Asn Thr Ala Ala Ser His Val Glu Thr Thr Ser Ala
9455 9460 9465
Thr Glu Glu Leu Tyr Ser Ser Ser Pro Gly Phe Ser Glu Pro Thr
9470 9475 9480
Lys Val Ile Ser Pro Val Val Thr Ser Ser Ser Ile Arg Asp Asn
9485 9490 9495
Met Val Ser Thr Thr Met Pro Gly Ser Ser Gly Ile Thr Arg Ile
9500 9505 9510
Glu Ile Glu Ser Met Ser Ser Leu Thr Pro Gly Leu Arg Glu Thr
9515 9520 9525
Arg Thr Ser Gln Asp Ile Thr Ser Ser Thr Glu Thr Ser Thr Val
9530 9535 9540
Leu Tyr Lys Met Pro Ser Gly Ala Thr Pro Glu Val Ser Arg Thr
9545 9550 9555
Glu Val Met Pro Ser Ser Arg Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ala Gln
9560 9565 9570
Ser Thr Met Ser Leu Asp Ile Ser Asp Glu Val Val Thr Arg Leu
9575 9580 9585
Ser Thr Ser Pro Ile Met Thr Glu Ser Ala Glu Ile Thr Ile Thr
9590 9595 9600
Thr Gln Thr Gly Tyr Ser Leu Ala Thr Ser Gln Val Thr Leu Pro
9605 9610 9615
Leu Gly Thr Ser Met Thr Phe Leu Ser Gly Thr His Ser Thr Met
9620 9625 9630
Ser Gln Gly Leu Ser His Ser Glu Met Thr Asn Leu Met Ser Arg
9635 9640 9645
Gly Pro Glu Ser Leu Ser Trp Thr Ser Pro Arg Phe Val Glu Thr
9650 9655 9660
Thr Arg Ser Ser Ser Ser Leu Thr Ser Leu Pro Leu Thr Thr Ser
9665 9670 9675
Leu Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Leu Asp Ser Ser Pro Ser Ser
9680 9685 9690
Pro Leu Pro Val Thr Ser Leu Ile Leu Pro Gly Leu Val Lys Thr
9695 9700 9705
Thr Glu Val Leu Asp Thr Ser Ser Glu Pro Lys Thr Ser Ser Ser
9710 9715 9720
Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Val Glu Ile Pro Ala Thr Ser Glu
9725 9730 9735
Ile Met Thr Asp Thr Glu Lys Ile His Pro Ser Ser Asn Thr Ala
9740 9745 9750
Val Ala Lys Val Arg Thr Ser Ser Ser Val His Glu Ser His Ser
9755 9760 9765
Ser Val Leu Ala Asp Ser Glu Thr Thr Ile Thr Ile Pro Ser Met
9770 9775 9780
Gly Ile Thr Ser Ala Val Asp Asp Thr Thr Val Phe Thr Ser Asn
9785 9790 9795
Pro Ala Phe Ser Glu Thr Arg Arg Ile Pro Thr Glu Pro Thr Phe
9800 9805 9810
Ser Leu Thr Pro Gly Phe Arg Glu Thr Ser Thr Ser Glu Glu Thr
9815 9820 9825
Thr Ser Ile Thr Glu Thr Ser Ala Val Leu Tyr Gly Val Pro Thr
9830 9835 9840
Ser Ala Thr Thr Glu Val Ser Met Thr Glu Ile Met Ser Ser Asn
9845 9850 9855
Arg Ile His Ile Pro Asp Ser Asp Gln Ser Thr Met Ser Pro Asp
9860 9865 9870
Ile Ile Thr Glu Val Ile Thr Arg Leu Ser Ser Ser Ser Met Met
9875 9880 9885
Ser Glu Ser Thr Gln Met Thr Ile Thr Thr Gln Lys Ser Ser Pro
9890 9895 9900
Gly Ala Thr Ala Gln Ser Thr Leu Thr Leu Ala Thr Thr Thr Ala
9905 9910 9915
Pro Leu Ala Arg Thr His Ser Thr Val Pro Pro Arg Phe Leu His
9920 9925 9930
Ser Glu Met Thr Thr Leu Met Ser Arg Ser Pro Glu Asn Pro Ser
9935 9940 9945
Trp Lys Ser Ser Leu Phe Val Glu Lys Thr Ser Ser Ser Ser Ser
9950 9955 9960
Leu Leu Ser Leu Pro Val Thr Thr Ser Pro Ser Val Ser Ser Thr
9965 9970 9975
Leu Pro Gln Ser Ile Pro Ser Ser Ser Phe Ser Val Thr Ser Leu
9980 9985 9990
Leu Thr Pro Gly Met Val Lys Thr Thr Asp Thr Ser Thr Glu Pro
9995 10000 10005
Gly Thr Ser Leu Ser Pro Asn Leu Ser Gly Thr Ser Val Glu Ile
10010 10015 10020
Leu Ala Ala Ser Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu Lys Ile His Pro
10025 10030 10035
Ser Ser Ser Met Ala Val Thr Asn Val Gly Thr Thr Ser Ser Gly
10040 10045 10050
His Glu Leu Tyr Ser Ser Val Ser Ile His Ser Glu Pro Ser Lys
10055 10060 10065
Ala Thr Tyr Pro Val Gly Thr Pro Ser Ser Met Ala Glu Thr Ser
10070 10075 10080
Ile Ser Thr Ser Met Pro Ala Asn Phe Glu Thr Thr Gly Phe Glu
10085 10090 10095
Ala Glu Pro Phe Ser His Leu Thr Ser Gly Phe Arg Lys Thr Asn
10100 10105 10110
Met Ser Leu Asp Thr Ser Ser Val Thr Pro Thr Asn Thr Pro Ser
10115 10120 10125
Ser Pro Gly Ser Thr His Leu Leu Gln Ser Ser Lys Thr Asp Phe
10130 10135 10140
Thr Ser Ser Ala Lys Thr Ser Ser Pro Asp Trp Pro Pro Ala Ser
10145 10150 10155
Gln Tyr Thr Glu Ile Pro Val Asp Ile Ile Thr Pro Phe Asn Ala
10160 10165 10170
Ser Pro Ser Ile Thr Glu Ser Thr Gly Ile Thr Ser Phe Pro Glu
10175 10180 10185
Ser Arg Phe Thr Met Ser Val Thr Glu Ser Thr His His Leu Ser
10190 10195 10200
Thr Asp Leu Leu Pro Ser Ala Glu Thr Ile Ser Thr Gly Thr Val
10205 10210 10215
Met Pro Ser Leu Ser Glu Ala Met Thr Ser Phe Ala Thr Thr Gly
10220 10225 10230
Val Pro Arg Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ser Pro Phe Ser Arg Thr
10235 10240 10245
Glu Ser Gly Pro Gly Asp Ala Thr Leu Ser Thr Ile Ala Glu Ser
10250 10255 10260
Leu Pro Ser Ser Thr Pro Val Pro Phe Ser Ser Ser Thr Phe Thr
10265 10270 10275
Thr Thr Asp Ser Ser Thr Ile Pro Ala Leu His Glu Ile Thr Ser
10280 10285 10290
Ser Ser Ala Thr Pro Tyr Arg Val Asp Thr Ser Leu Gly Thr Glu
10295 10300 10305
Ser Ser Thr Thr Glu Gly Arg Leu Val Met Val Ser Thr Leu Asp
10310 10315 10320
Thr Ser Ser Gln Pro Gly Arg Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Asp
10325 10330 10335
Thr Arg Met Thr Glu Ser Val Glu Leu Gly Thr Val Thr Ser Ala
10340 10345 10350
Tyr Gln Val Pro Ser Leu Ser Thr Arg Leu Thr Arg Thr Asp Gly
10355 10360 10365
Ile Met Glu His Ile Thr Lys Ile Pro Asn Glu Ala Ala His Arg
10370 10375 10380
Gly Thr Ile Arg Pro Val Lys Gly Pro Gln Thr Ser Thr Ser Pro
10385 10390 10395
Ala Ser Pro Lys Gly Leu His Thr Gly Gly Thr Lys Arg Met Glu
10400 10405 10410
Thr Thr Thr Thr Ala Leu Lys Thr Thr Thr Thr Ala Leu Lys Thr
10415 10420 10425
Thr Ser Arg Ala Thr Leu Thr Thr Ser Val Tyr Thr Pro Thr Leu
10430 10435 10440
Gly Thr Leu Thr Pro Leu Asn Ala Ser Met Gln Met Ala Ser Thr
10445 10450 10455
Ile Pro Thr Glu Met Met Ile Thr Thr Pro Tyr Val Phe Pro Asp
10460 10465 10470
Val Pro Glu Thr Thr Ser Ser Leu Ala Thr Ser Leu Gly Ala Glu
10475 10480 10485
Thr Ser Thr Ala Leu Pro Arg Thr Thr Pro Ser Val Phe Asn Arg
10490 10495 10500
Glu Ser Glu Thr Thr Ala Ser Leu Val Ser Arg Ser Gly Ala Glu
10505 10510 10515
Arg Ser Pro Val Ile Gln Thr Leu Asp Val Ser Ser Ser Glu Pro
10520 10525 10530
Asp Thr Thr Ala Ser Trp Val Ile His Pro Ala Glu Thr Ile Pro
10535 10540 10545
Thr Val Ser Lys Thr Thr Pro Asn Phe Phe His Ser Glu Leu Asp
10550 10555 10560
Thr Val Ser Ser Thr Ala Thr Ser His Gly Ala Asp Val Ser Ser
10565 10570 10575
Ala Ile Pro Thr Asn Ile Ser Pro Ser Glu Leu Asp Ala Leu Thr
10580 10585 10590
Pro Leu Val Thr Ile Ser Gly Thr Asp Thr Ser Thr Thr Phe Pro
10595 10600 10605
Thr Leu Thr Lys Ser Pro His Glu Thr Glu Thr Arg Thr Thr Trp
10610 10615 10620
Leu Thr His Pro Ala Glu Thr Ser Ser Thr Ile Pro Arg Thr Ile
10625 10630 10635
Pro Asn Phe Ser His His Glu Ser Asp Ala Thr Pro Ser Ile Ala
10640 10645 10650
Thr Ser Pro Gly Ala Glu Thr Ser Ser Ala Ile Pro Ile Met Thr
10655 10660 10665
Val Ser Pro Gly Ala Glu Asp Leu Val Thr Ser Gln Val Thr Ser
10670 10675 10680
Ser Gly Thr Asp Arg Asn Met Thr Ile Pro Thr Leu Thr Leu Ser
10685 10690 10695
Pro Gly Glu Pro Lys Thr Ile Ala Ser Leu Val Thr His Pro Glu
10700 10705 10710
Ala Gln Thr Ser Ser Ala Ile Pro Thr Ser Thr Ile Ser Pro Ala
10715 10720 10725
Val Ser Arg Leu Val Thr Ser Met Val Thr Ser Leu Ala Ala Lys
10730 10735 10740
Thr Ser Thr Thr Asn Arg Ala Leu Thr Asn Ser Pro Gly Glu Pro
10745 10750 10755
Ala Thr Thr Val Ser Leu Val Thr His Pro Ala Gln Thr Ser Pro
10760 10765 10770
Thr Val Pro Trp Thr Thr Ser Ile Phe Phe His Ser Lys Ser Asp
10775 10780 10785
Thr Thr Pro Ser Met Thr Thr Ser His Gly Ala Glu Ser Ser Ser
10790 10795 10800
Ala Val Pro Thr Pro Thr Val Ser Thr Glu Val Pro Gly Val Val
10805 10810 10815
Thr Pro Leu Val Thr Ser Ser Arg Ala Val Ile Ser Thr Thr Ile
10820 10825 10830
Pro Ile Leu Thr Leu Ser Pro Gly Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser
10835 10840 10845
Met Ala Thr Ser His Gly Glu Glu Ala Ser Ser Ala Ile Pro Thr
10850 10855 10860
Pro Thr Val Ser Pro Gly Val Pro Gly Val Val Thr Ser Leu Val
10865 10870 10875
Thr Ser Ser Arg Ala Val Thr Ser Thr Thr Ile Pro Ile Leu Thr
10880 10885 10890
Phe Ser Leu Gly Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser
10895 10900 10905
His Gly Thr Glu Ala Gly Ser Ala Val Pro Thr Val Leu Pro Glu
10910 10915 10920
Val Pro Gly Met Val Thr Ser Leu Val Ala Ser Ser Arg Ala Val
10925 10930 10935
Thr Ser Thr Thr Leu Pro Thr Leu Thr Leu Ser Pro Gly Glu Pro
10940 10945 10950
Glu Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser His Gly Ala Glu Ala Ser
10955 10960 10965
Ser Thr Val Pro Thr Val Ser Pro Glu Val Pro Gly Val Val Thr
10970 10975 10980
Ser Leu Val Thr Ser Ser Ser Gly Val Asn Ser Thr Ser Ile Pro
10985 10990 10995
Thr Leu Ile Leu Ser Pro Gly Glu Leu Glu Thr Thr Pro Ser Met
11000 11005 11010
Ala Thr Ser His Gly Ala Glu Ala Ser Ser Ala Val Pro Thr Pro
11015 11020 11025
Thr Val Ser Pro Gly Val Ser Gly Val Val Thr Pro Leu Val Thr
11030 11035 11040
Ser Ser Arg Ala Val Thr Ser Thr Thr Ile Pro Ile Leu Thr Leu
11045 11050 11055
Ser Ser Ser Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser His
11060 11065 11070
Gly Val Glu Ala Ser Ser Ala Val Leu Thr Val Ser Pro Glu Val
11075 11080 11085
Pro Gly Met Val Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Arg Ala Val Thr
11090 11095 11100
Ser Thr Thr Ile Pro Thr Leu Thr Ile Ser Ser Asp Glu Pro Glu
11105 11110 11115
Thr Thr Thr Ser Leu Val Thr His Ser Glu Ala Lys Met Ile Ser
11120 11125 11130
Ala Ile Pro Thr Leu Ala Val Ser Pro Thr Val Gln Gly Leu Val
11135 11140 11145
Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Gly Ser Glu Thr Ser Ala Phe Ser
11150 11155 11160
Asn Leu Thr Val Ala Ser Ser Gln Pro Glu Thr Ile Asp Ser Trp
11165 11170 11175
Val Ala His Pro Gly Thr Glu Ala Ser Ser Val Val Pro Thr Leu
11180 11185 11190
Thr Val Ser Thr Gly Glu Pro Phe Thr Asn Ile Ser Leu Val Thr
11195 11200 11205
His Pro Ala Glu Ser Ser Ser Thr Leu Pro Arg Thr Thr Ser Arg
11210 11215 11220
Phe Ser His Ser Glu Leu Asp Thr Met Pro Ser Thr Val Thr Ser
11225 11230 11235
Pro Glu Ala Glu Ser Ser Ser Ala Ile Ser Thr Thr Ile Ser Pro
11240 11245 11250
Gly Ile Pro Gly Val Leu Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Gly Arg
11255 11260 11265
Asp Ile Ser Ala Thr Phe Pro Thr Val Pro Glu Ser Pro His Glu
11270 11275 11280
Ser Glu Ala Thr Ala Ser Trp Val Thr His Pro Ala Val Thr Ser
11285 11290 11295
Thr Thr Val Pro Arg Thr Thr Pro Asn Tyr Ser His Ser Glu Pro
11300 11305 11310
Asp Thr Thr Pro Ser Ile Ala Thr Ser Pro Gly Ala Glu Ala Thr
11315 11320 11325
Ser Asp Phe Pro Thr Ile Thr Val Ser Pro Asp Val Pro Asp Met
11330 11335 11340
Val Thr Ser Gln Val Thr Ser Ser Gly Thr Asp Thr Ser Ile Thr
11345 11350 11355
Ile Pro Thr Leu Thr Leu Ser Ser Gly Glu Pro Glu Thr Thr Thr
11360 11365 11370
Ser Phe Ile Thr Tyr Ser Glu Thr His Thr Ser Ser Ala Ile Pro
11375 11380 11385
Thr Leu Pro Val Ser Pro Gly Ala Ser Lys Met Leu Thr Ser Leu
11390 11395 11400
Val Ile Ser Ser Gly Thr Asp Ser Thr Thr Thr Phe Pro Thr Leu
11405 11410 11415
Thr Glu Thr Pro Tyr Glu Pro Glu Thr Thr Ala Ile Gln Leu Ile
11420 11425 11430
His Pro Ala Glu Thr Asn Thr Met Val Pro Arg Thr Thr Pro Lys
11435 11440 11445
Phe Ser His Ser Lys Ser Asp Thr Thr Leu Pro Val Ala Ile Thr
11450 11455 11460
Ser Pro Gly Pro Glu Ala Ser Ser Ala Val Ser Thr Thr Thr Ile
11465 11470 11475
Ser Pro Asp Met Ser Asp Leu Val Thr Ser Leu Val Pro Ser Ser
11480 11485 11490
Gly Thr Asp Thr Ser Thr Thr Phe Pro Thr Leu Ser Glu Thr Pro
11495 11500 11505
Tyr Glu Pro Glu Thr Thr Ala Thr Trp Leu Thr His Pro Ala Glu
11510 11515 11520
Thr Ser Thr Thr Val Ser Gly Thr Ile Pro Asn Phe Ser His Arg
11525 11530 11535
Gly Ser Asp Thr Ala Pro Ser Met Val Thr Ser Pro Gly Val Asp
11540 11545 11550
Thr Arg Ser Gly Val Pro Thr Thr Thr Ile Pro Pro Ser Ile Pro
11555 11560 11565
Gly Val Val Thr Ser Gln Val Thr Ser Ser Ala Thr Asp Thr Ser
11570 11575 11580
Thr Ala Ile Pro Thr Leu Thr Pro Ser Pro Gly Glu Pro Glu Thr
11585 11590 11595
Thr Ala Ser Ser Ala Thr His Pro Gly Thr Gln Thr Gly Phe Thr
11600 11605 11610
Val Pro Ile Arg Thr Val Pro Ser Ser Glu Pro Asp Thr Met Ala
11615 11620 11625
Ser Trp Val Thr His Pro Pro Gln Thr Ser Thr Pro Val Ser Arg
11630 11635 11640
Thr Thr Ser Ser Phe Ser His Ser Ser Pro Asp Ala Thr Pro Val
11645 11650 11655
Met Ala Thr Ser Pro Arg Thr Glu Ala Ser Ser Ala Val Leu Thr
11660 11665 11670
Thr Ile Ser Pro Gly Ala Pro Glu Met Val Thr Ser Gln Ile Thr
11675 11680 11685
Ser Ser Gly Ala Ala Thr Ser Thr Thr Val Pro Thr Leu Thr His
11690 11695 11700
Ser Pro Gly Met Pro Glu Thr Thr Ala Leu Leu Ser Thr His Pro
11705 11710 11715
Arg Thr Glu Thr Ser Lys Thr Phe Pro Ala Ser Thr Val Phe Pro
11720 11725 11730
Gln Val Ser Glu Thr Thr Ala Ser Leu Thr Ile Arg Pro Gly Ala
11735 11740 11745
Glu Thr Ser Thr Ala Leu Pro Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Phe
11750 11755 11760
Thr Leu Leu Val Thr Gly Thr Ser Arg Val Asp Leu Ser Pro Thr
11765 11770 11775
Ala Ser Pro Gly Val Ser Ala Lys Thr Ala Pro Leu Ser Thr His
11780 11785 11790
Pro Gly Thr Glu Thr Ser Thr Met Ile Pro Thr Ser Thr Leu Ser
11795 11800 11805
Leu Gly Leu Leu Glu Thr Thr Gly Leu Leu Ala Thr Ser Ser Ser
11810 11815 11820
Ala Glu Thr Ser Thr Ser Thr Leu Thr Leu Thr Val Ser Pro Ala
11825 11830 11835
Val Ser Gly Leu Ser Ser Ala Ser Ile Thr Thr Asp Lys Pro Gln
11840 11845 11850
Thr Val Thr Ser Trp Asn Thr Glu Thr Ser Pro Ser Val Thr Ser
11855 11860 11865
Val Gly Pro Pro Glu Phe Ser Arg Thr Val Thr Gly Thr Thr Met
11870 11875 11880
Thr Leu Ile Pro Ser Glu Met Pro Thr Pro Pro Lys Thr Ser His
11885 11890 11895
Gly Glu Gly Val Ser Pro Thr Thr Ile Leu Arg Thr Thr Met Val
11900 11905 11910
Glu Ala Thr Asn Leu Ala Thr Thr Gly Ser Ser Pro Thr Val Ala
11915 11920 11925
Lys Thr Thr Thr Thr Phe Asn Thr Leu Ala Gly Ser Leu Phe Thr
11930 11935 11940
Pro Leu Thr Thr Pro Gly Met Ser Thr Leu Ala Ser Glu Ser Val
11945 11950 11955
Thr Ser Arg Thr Ser Tyr Asn His Arg Ser Trp Ile Ser Thr Thr
11960 11965 11970
Ser Ser Tyr Asn Arg Arg Tyr Trp Thr Pro Ala Thr Ser Thr Pro
11975 11980 11985
Val Thr Ser Thr Phe Ser Pro Gly Ile Ser Thr Ser Ser Ile Pro
11990 11995 12000
Ser Ser Thr Ala Ala Thr Val Pro Phe Met Val Pro Phe Thr Leu
12005 12010 12015
Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met Arg His
12020 12025 12030
Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Ala Thr Glu Arg Glu Leu Gln Gly
12035 12040 12045
Leu Leu Lys Pro Leu Phe Arg Asn Ser Ser Leu Glu Tyr Leu Tyr
12050 12055 12060
Ser Gly Cys Arg Leu Ala Ser Leu Arg Pro Glu Lys Asp Ser Ser
12065 12070 12075
Ala Thr Ala Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Pro Asp Pro Glu
12080 12085 12090
Asp Leu Gly Leu Asp Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Asn
12095 12100 12105
Leu Thr Asn Gly Ile Gln Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg
12110 12115 12120
Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Met Pro
12125 12130 12135
Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Val Gly Thr Ser
12140 12145 12150
Gly Thr Pro Ser Ser Ser Pro Ser Pro Thr Thr Ala Gly Pro Leu
12155 12160 12165
Leu Met Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr
12170 12175 12180
Glu Glu Asp Met Arg Arg Thr Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Met
12185 12190 12195
Glu Ser Val Leu Gln Gly Leu Leu Lys Pro Leu Phe Lys Asn Thr
12200 12205 12210
Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg
12215 12220 12225
Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr
12230 12235 12240
His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asn Arg Glu Gln Leu
12245 12250 12255
Tyr Trp Glu Leu Ser Lys Leu Thr Asn Asp Ile Glu Glu Leu Gly
12260 12265 12270
Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr
12275 12280 12285
His Gln Ser Ser Val Ser Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr
12290 12295 12300
Val Asp Leu Arg Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ser Pro
12305 12310 12315
Thr Ile Met Ala Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn
12320 12325 12330
Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Gly Glu Asp Met Gly His Pro
12335 12340 12345
Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu
12350 12355 12360
Leu Gly Pro Ile Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser
12365 12370 12375
Gly Cys Arg Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala
12380 12385 12390
Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Ile His His Leu Asp Pro Lys Ser
12395 12400 12405
Pro Gly Leu Asn Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu
12410 12415 12420
Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn
12425 12430 12435
Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Thr Ser Val Pro Thr
12440 12445 12450
Ser Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly
12455 12460 12465
Thr Pro Phe Ser Leu Pro Ser Pro Ala Thr Ala Gly Pro Leu Leu
12470 12475 12480
Val Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Lys Tyr Glu
12485 12490 12495
Glu Asp Met His Arg Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu
12500 12505 12510
Arg Val Leu Gln Thr Leu Leu Gly Pro Met Phe Lys Asn Thr Ser
12515 12520 12525
Val Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Ser
12530 12535 12540
Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His
12545 12550 12555
Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Val Asp Arg Glu Gln Leu Tyr
12560 12565 12570
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro
12575 12580 12585
Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His
12590 12595 12600
Trp Ile Pro Val Pro Thr Ser Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val
12605 12610 12615
Asp Leu Gly Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Thr Thr
12620 12625 12630
Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr
12635 12640 12645
Asn Leu Lys Tyr Glu Glu Asp Met His Cys Pro Gly Ser Arg Lys
12650 12655 12660
Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Ser Leu Leu Gly Pro Met
12665 12670 12675
Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu
12680 12685 12690
Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp
12695 12700 12705
Ala Ile Cys Thr His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Val Asp
12710 12715 12720
Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Gly Ile
12725 12730 12735
Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val
12740 12745 12750
Asn Gly Phe Thr His Gln Thr Ser Ala Pro Asn Thr Ser Thr Pro
12755 12760 12765
Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser
12770 12775 12780
Leu Pro Ser Pro Thr Ser Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr
12785 12790 12795
Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met His
12800 12805 12810
His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln
12815 12820 12825
Gly Leu Leu Gly Pro Met Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Leu Leu
12830 12835 12840
Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asn Gly
12845 12850 12855
Ala Ala Thr Gly Met Asp Ala Ile Cys Ser His Arg Leu Asp Pro
12860 12865 12870
Lys Ser Pro Gly Leu Asn Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser
12875 12880 12885
Gln Leu Thr His Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp
12890 12895 12900
Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Val
12905 12910 12915
Ala Pro Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr
12920 12925 12930
Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Thr Thr Ala Val Pro
12935 12940 12945
Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln
12950 12955 12960
Tyr Gly Glu Asp Met Arg His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr
12965 12970 12975
Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Gly Pro Leu Phe Lys Asn
12980 12985 12990
Ser Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Ile Ser Leu
12995 13000 13005
Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys
13010 13015 13020
Thr His His Leu Asn Pro Gln Ser Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln
13025 13030 13035
Leu Tyr Trp Gln Leu Ser Gln Met Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu
13040 13045 13050
Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe
13055 13060 13065
Thr His Arg Ser Ser Gly Leu Thr Thr Ser Thr Pro Trp Thr Ser
13070 13075 13080
Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Ser Pro Val Pro Ser
13085 13090 13095
Pro Thr Thr Thr Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe
13100 13105 13110
Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asn Met Gly His Pro Gly
13115 13120 13125
Ser Arg Lys Phe Asn Ile Thr Glu Ser Val Leu Gln Gly Leu Leu
13130 13135 13140
Lys Pro Leu Phe Lys Ser Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly
13145 13150 13155
Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Val Ala Thr
13160 13165 13170
Arg Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Pro Asp Pro Lys Ile Pro
13175 13180 13185
Gly Leu Asp Arg Gln Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr
13190 13195 13200
His Ser Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser
13205 13210 13215
Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr
13220 13225 13230
Ser Thr Pro Gly Thr Phe Thr Val Gln Pro Glu Thr Ser Glu Thr
13235 13240 13245
Pro Ser Ser Leu Pro Gly Pro Thr Ala Thr Gly Pro Val Leu Leu
13250 13255 13260
Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu
13265 13270 13275
Asp Met Arg Arg Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg
13280 13285 13290
Val Leu Gln Gly Leu Leu Met Pro Leu Phe Lys Asn Thr Ser Val
13295 13300 13305
Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu
13310 13315 13320
Lys Asp Gly Ala Ala Thr Arg Val Asp Ala Val Cys Thr His Arg
13325 13330 13335
Pro Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asp Arg Glu Arg Leu Tyr Trp
13340 13345 13350
Lys Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr
13355 13360 13365
Thr Leu Asp Arg His Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Gln
13370 13375 13380
Ser Ser Met Thr Thr Thr Arg Thr Pro Asp Thr Ser Thr Met His
13385 13390 13395
Leu Ala Thr Ser Arg Thr Pro Ala Ser Leu Ser Gly Pro Met Thr
13400 13405 13410
Ala Ser Pro Leu Leu Val Leu Phe Thr Ile Asn Phe Thr Ile Thr
13415 13420 13425
Asn Leu Arg Tyr Glu Glu Asn Met His His Pro Gly Ser Arg Lys
13430 13435 13440
Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Arg Pro Val
13445 13450 13455
Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu
13460 13465 13470
Thr Leu Leu Arg Pro Lys Lys Asp Gly Ala Ala Thr Lys Val Asp
13475 13480 13485
Ala Ile Cys Thr Tyr Arg Pro Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asp
13490 13495 13500
Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Ser Ile
13505 13510 13515
Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val
13520 13525 13530
Asn Gly Phe Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Ile Pro
13535 13540 13545
Gly Thr Pro Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Val Ser
13550 13555 13560
Lys Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ser Pro Leu Leu Val Leu Phe Thr
13565 13570 13575
Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Arg Tyr Glu Glu Asn Met Gln
13580 13585 13590
His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln
13595 13600 13605
Gly Leu Leu Arg Ser Leu Phe Lys Ser Thr Ser Val Gly Pro Leu
13610 13615 13620
Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly
13625 13630 13635
Thr Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His His Pro Asp Pro
13640 13645 13650
Lys Ser Pro Arg Leu Asp Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser
13655 13660 13665
Gln Leu Thr His Asn Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Ala Leu Asp
13670 13675 13680
Asn Asp Ser Leu Phe Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Val
13685 13690 13695
Ser Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Pro Thr Val Tyr Leu Gly Ala
13700 13705 13710
Ser Lys Thr Pro Ala Ser Ile Phe Gly Pro Ser Ala Ala Ser His
13715 13720 13725
Leu Leu Ile Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Arg
13730 13735 13740
Tyr Glu Glu Asn Met Trp Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr
13745 13750 13755
Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Arg Pro Leu Phe Lys Asn Thr
13760 13765 13770
Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg
13775 13780 13785
Pro Glu Lys Asp Gly Glu Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr
13790 13795 13800
His Arg Pro Asp Pro Thr Gly Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln Leu
13805 13810 13815
Tyr Leu Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Ser Ile Thr Glu Leu Gly
13820 13825 13830
Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr
13835 13840 13845
His Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Gly Val Val Ser Glu
13850 13855 13860
Glu Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Asn Asn Leu Arg Tyr Met
13865 13870 13875
Ala Asp Met Gly Gln Pro Gly Ser Leu Lys Phe Asn Ile Thr Asp
13880 13885 13890
Asn Val Met Gln His Leu Leu Ser Pro Leu Phe Gln Arg Ser Ser
13895 13900 13905
Leu Gly Ala Arg Tyr Thr Gly Cys Arg Val Ile Ala Leu Arg Ser
13910 13915 13920
Val Lys Asn Gly Ala Glu Thr Arg Val Asp Leu Leu Cys Thr Tyr
13925 13930 13935
Leu Gln Pro Leu Ser Gly Pro Gly Leu Pro Ile Lys Gln Val Phe
13940 13945 13950
His Glu Leu Ser Gln Gln Thr His Gly Ile Thr Arg Leu Gly Pro
13955 13960 13965
Tyr Ser Leu Asp Lys Asp Ser Leu Tyr Leu Asn Gly Tyr Asn Glu
13970 13975 13980
Pro Gly Pro Asp Glu Pro Pro Thr Thr Pro Lys Pro Ala Thr Thr
13985 13990 13995
Phe Leu Pro Pro Leu Ser Glu Ala Thr Thr Ala Met Gly Tyr His
14000 14005 14010
Leu Lys Thr Leu Thr Leu Asn Phe Thr Ile Ser Asn Leu Gln Tyr
14015 14020 14025
Ser Pro Asp Met Gly Lys Gly Ser Ala Thr Phe Asn Ser Thr Glu
14030 14035 14040
Gly Val Leu Gln His Leu Leu Arg Pro Leu Phe Gln Lys Ser Ser
14045 14050 14055
Met Gly Pro Phe Tyr Leu Gly Cys Gln Leu Ile Ser Leu Arg Pro
14060 14065 14070
Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Thr Thr Cys Thr Tyr
14075 14080 14085
His Pro Asp Pro Val Gly Pro Gly Leu Asp Ile Gln Gln Leu Tyr
14090 14095 14100
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Val Thr Gln Leu Gly Phe
14105 14110 14115
Tyr Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Ala Pro
14120 14125 14130
Gln Asn Leu Ser Ile Arg Gly Glu Tyr Gln Ile Asn Phe His Ile
14135 14140 14145
Val Asn Trp Asn Leu Ser Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr
14150 14155 14160
Ile Thr Leu Leu Arg Asp Ile Gln Asp Lys Val Thr Thr Leu Tyr
14165 14170 14175
Lys Gly Ser Gln Leu His Asp Thr Phe Arg Phe Cys Leu Val Thr
14180 14185 14190
Asn Leu Thr Met Asp Ser Val Leu Val Thr Val Lys Ala Leu Phe
14195 14200 14205
Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser Leu Val Glu Gln Val Phe Leu Asp
14210 14215 14220
Lys Thr Leu Asn Ala Ser Phe His Trp Leu Gly Ser Thr Tyr Gln
14225 14230 14235
Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met Glu Ser Ser Val Tyr Gln
14240 14245 14250
Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe Tyr Leu Asn Phe Thr
14255 14260 14265
Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Lys Ala Gln Pro Gly Thr
14270 14275 14280
Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu Asp Ala Leu Asn
14285 14290 14295
Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser Tyr Phe Ser Asp Cys
14300 14305 14310
Gln Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn Arg His His Thr Gly
14315 14320 14325
Val Asp Ser Leu Cys Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp
14330 14335 14340
Arg Val Ala Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly
14345 14350 14355
Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val
14360 14365 14370
Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser
14375 14380 14385
Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu
14390 14395 14400
Leu Gly Val Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu Val Thr Thr
14405 14410 14415
Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln Gln Cys
14420 14425 14430
Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
14435 14440 14445
<210> 151
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c114-N1
<400> 151
Ala Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50 55 60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65 70 75 80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85 90 95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100 105 110
Leu Gln
<210> 152
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c114-N2
<400> 152
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50 55 60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65 70 75 80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85 90 95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100 105 110
Leu Gln
<210> 153
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c114-N12
<400> 153
Ala Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50 55 60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65 70 75 80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85 90 95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100 105 110
Leu Gln
<210> 154
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c114-N123
<400> 154
Ala Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr Gln Leu Gln Ala Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50 55 60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65 70 75 80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85 90 95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100 105 110
Leu Gln
<210> 155
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c344第一串联重复的N端
<400> 155
Trp Glu Leu Ser Gln Leu
1 5
<210> 156
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c344第一串联重复的C端
<400> 156
Thr Gly Val Asp Ser Leu Cys
1 5
<210> 157
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c344胞外域N端
<400> 157
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg
1 5
<210> 158
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c344胞外域C端
<400> 158
Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
1 5
<210> 159
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 跨膜
<400> 159
Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile
1 5 10 15
Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu Val
20 25
<210> 160
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胞质尾区
<400> 160
Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln Gln
1 5 10 15
Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
20 25 30
<210> 161
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c114胞外域
<400> 161
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
50 55
<210> 162
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c80胞外域
<400> 162
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Asp Leu Pro
20
<210> 163
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c86胞外域
<400> 163
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
50 55
<210> 164
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c86跨膜
<400> 164
Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile
1 5 10 15
Thr Cys Leu Ile Cys Gly
20
<210> 165
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c86胞质
<400> 165
Asp Leu Glu Asp Leu Gln
1 5
<210> 166
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16 3(N to A)c114胞外域
<400> 166
Ala Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr Gln Leu Gln Ala Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
50 55
<210> 167
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LGALS3糖结合域
<400> 167
Pro Tyr Asn Leu Pro Leu Pro Gly Gly Val Val Pro Arg Met Leu Ile
1 5 10 15
Thr Ile Leu Gly Thr Val Lys Pro Asn Ala Asn Arg Ile Ala Leu Asp
20 25 30
Phe Gln Arg Gly Asn Asp Val Ala Phe His Phe Asn Pro Arg Phe Asn
35 40 45
Glu Asn Asn Arg Arg Val Ile Val Cys Asn Thr Lys Leu Asp Asn Asn
50 55 60
Trp Gly Arg Glu Glu Arg Gln Ser Val Phe Pro Phe Glu Ser Gly Lys
65 70 75 80
Pro Phe Lys Ile Gln Val Leu Val Glu Pro Asp His Phe Lys Val Ala
85 90 95
Val Asn Asp Ala His Leu Leu Gln Tyr Asn His Arg Val Lys Lys Leu
100 105 110
Asn Glu Ile Ser Lys Leu Gly Ile Ser Gly Asp Ile Asp Leu Thr Ser
115 120 125
<210> 168
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16非糖基化的肽2
<400> 168
Cys Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn
1 5 10 15
Arg Asn Glu
<210> 169
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16无关肽18mer
<400> 169
Gly Ala Val Pro Arg Ser Ala Thr Ile Asn Val Ser Arg Ile Ala Thr
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 170
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18mer (无C)
<400> 170
Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser
1 5 10 15
Val
<210> 171
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 15mer (无C)
<400> 171
Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val
1 5 10
<210> 172
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC16c114-N23
<400> 172
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr Gln Leu Gln Ala Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50 55 60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65 70 75 80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85 90 95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100 105 110
Leu Gln
<210> 173
<211> 344
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N24 mut c344
<400> 173
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Val Thr Gln Leu Gly Phe Tyr
1 5 10 15
Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Ala Pro Gln Asn
20 25 30
Leu Ser Ile Arg Gly Glu Tyr Gln Ile Asn Phe His Ile Val Asn Gln
35 40 45
Asn Leu Ser Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr Ile Thr Leu Leu
50 55 60
Arg Asp Ile Gln Asp Lys Val Thr Thr Leu Tyr Lys Gly Ser Gln Leu
65 70 75 80
His Asp Thr Phe Arg Phe Cys Leu Val Thr Asn Leu Thr Met Asp Ser
85 90 95
Val Leu Val Thr Val Lys Ala Leu Phe Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser
100 105 110
Leu Val Glu Gln Val Phe Leu Asp Lys Thr Leu Asn Ala Ser Phe His
115 120 125
Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Gln Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met
130 135 140
Glu Ser Ser Val Tyr Gln Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe
145 150 155 160
Tyr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Lys Ala
165 170 175
Gln Pro Gly Thr Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu Asp
180 185 190
Ala Leu Asn Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser Tyr Phe Ser
195 200 205
Asp Cys Gln Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn Arg His His Thr
210 215 220
Gly Val Asp Ser Leu Cys Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp
225 230 235 240
Arg Val Ala Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr
245 250 255
Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly
260 265 270
Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
275 280 285
Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile
290 295 300
Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys
305 310 315 320
Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser
325 330 335
His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
340
<210> 174
<211> 344
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N30 mut c344
<400> 174
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Val Thr Gln Leu Gly Phe Tyr
1 5 10 15
Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Ala Pro Gln Asn
20 25 30
Leu Ser Ile Arg Gly Glu Tyr Gln Ile Asn Phe His Ile Val Asn Gln
35 40 45
Asn Leu Ser Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr Ile Thr Leu Leu
50 55 60
Arg Asp Ile Gln Asp Lys Val Thr Thr Leu Tyr Lys Gly Ser Gln Leu
65 70 75 80
His Asp Thr Phe Arg Phe Cys Leu Val Thr Asn Leu Thr Met Asp Ser
85 90 95
Val Leu Val Thr Val Lys Ala Leu Phe Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser
100 105 110
Leu Val Glu Gln Val Phe Leu Asp Lys Thr Leu Asn Ala Ser Phe His
115 120 125
Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Gln Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met
130 135 140
Glu Ser Ser Val Tyr Gln Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe
145 150 155 160
Tyr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Lys Ala
165 170 175
Gln Pro Gly Thr Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu Asp
180 185 190
Ala Leu Asn Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser Tyr Phe Ser
195 200 205
Asp Cys Gln Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn Arg His His Thr
210 215 220
Gly Val Asp Ser Leu Cys Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp
225 230 235 240
Arg Val Ala Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr
245 250 255
Gln Leu Gln Ala Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly
260 265 270
Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
275 280 285
Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile
290 295 300
Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys
305 310 315 320
Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser
325 330 335
His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
340
<210> 175
<211> 344
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N24-N30 mut c344
<400> 175
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Val Thr Gln Leu Gly Phe Tyr
1 5 10 15
Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Ala Pro Gln Asn
20 25 30
Leu Ser Ile Arg Gly Glu Tyr Gln Ile Asn Phe His Ile Val Asn Gln
35 40 45
Asn Leu Ser Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr Ile Thr Leu Leu
50 55 60
Arg Asp Ile Gln Asp Lys Val Thr Thr Leu Tyr Lys Gly Ser Gln Leu
65 70 75 80
His Asp Thr Phe Arg Phe Cys Leu Val Thr Asn Leu Thr Met Asp Ser
85 90 95
Val Leu Val Thr Val Lys Ala Leu Phe Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser
100 105 110
Leu Val Glu Gln Val Phe Leu Asp Lys Thr Leu Asn Ala Ser Phe His
115 120 125
Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Gln Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met
130 135 140
Glu Ser Ser Val Tyr Gln Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe
145 150 155 160
Tyr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Lys Ala
165 170 175
Gln Pro Gly Thr Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu Asp
180 185 190
Ala Leu Asn Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser Tyr Phe Ser
195 200 205
Asp Cys Gln Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn Arg His His Thr
210 215 220
Gly Val Asp Ser Leu Cys Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp
225 230 235 240
Arg Val Ala Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr
245 250 255
Gln Leu Gln Ala Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly
260 265 270
Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
275 280 285
Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile
290 295 300
Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys
305 310 315 320
Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser
325 330 335
His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
340

Claims (190)

1.抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体
(a)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133，
(b)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139，和
(c)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中抗体不能免疫特异性结合重组表达第三形式的MUC16的细胞，该第三形式是糖基化的，且其中第三形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139。
3.抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体
(a)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133,
(b)不能免疫特异性结合重组表达第三形式的MUC16的细胞，该第三形式是糖基化的，且其中第三形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139，和
(c)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中(i)重组表达第一形式的MUC16的细胞是SKOV3细胞；(ii)重组表达第二形式的MUC16的细胞是SKOV3细胞；且(iii)步骤(c)中的细胞是SKOV3细胞。
4.权利要求3的抗体或其抗原结合片段，其中(i)重组表达第一形式的MUC16的细胞是SKOV3细胞；(ii)重组表达第三形式的MUC16的细胞是SKOV3细胞；且(iii)步骤(c)中的细胞是SKOV3细胞。
5.权利要求2的抗体或其抗原结合片段，其中(i)重组表达第一形式的MUC16的细胞是SKOV3细胞；(ii)重组表达第二形式的MUC16的细胞是SKOV3细胞；(iii)重组表达第三形式的MUC16的细胞是SKOV3细胞；且(iv)步骤(c)中的细胞是SKOV3细胞。
6.权利要求1-5任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段免疫特异性结合氨基酸序列CTRNGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:130)，其中CTRNGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:130)的4号氨基酸残基(N4)和10号氨基酸残基(N10)是糖基化的。
7.权利要求1-6任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段免疫特异性结合包含N-糖基化的SEQ ID NO:150天冬酰胺1806的表位。
8.权利要求1-7任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段免疫特异性结合氨基酸序列CGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:131)，其中CGTQLQNFTLDRSSV(SEQ IDNO:131)的7号氨基酸残基(N7)是糖基化的。
9.权利要求6-8任一项的抗体或其抗原结合片段，其中糖基化包含N连接的壳二糖。
10.权利要求1-9任一项的抗体或其抗原结合片段，其中当表达第一形式的MUC16的细胞接触抗体或抗原结合片段时，抗体或其抗原结合片段内化入细胞。
11.权利要求10的抗体或其抗原结合片段，其中细胞是重组表达第一形式的MUC16的SKOV3细胞。
12.权利要求1-11任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体抑制表达糖基化形式的MUC16的肿瘤生长。
13.权利要求1-12任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体是单克隆抗体。
14.权利要求1-13任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)，其包含
(a)VH互补决定区(CDR)1，包含氨基酸序列TX1GMGVG(SEQ ID NO:103)，其中X1是L或V，
(b)VH CDR2，包含氨基酸序列HIWWDDX2DKYYX3PALKS(SEQ ID NO:104)，其中X2是E或不存在且X3是Y或N，和
(c)VH CDR3，包含氨基酸序列IGTAQATDALDY(SEQ ID NO:105)。
15.权利要求1-13任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：
(a)VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX8TX9GM(SEQ ID NO:109)，其中X8是N或S且其中X9是L或V，
(b)VH CDR2，包含氨基酸序列WDDX10(SEQ ID NO:110)，其中X10是E或不存在，和
(c)VH CDR3，包含氨基酸序列GTAQATDALD(SEQ ID NO:111)。
16.权利要求1-13任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：
(a)VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX15TX16GMG(SEQ ID NO:115)，其中X15是N或S且X16是V或L，
(b)VH CDR2，包含氨基酸序列IWWDDX17DK(SEQ ID NO:116)，其中X17是E或不存在，和
(c)VH CDR3，包含氨基酸序列X18RIGTAQATDALDY(SEQ ID NO:117)，其中X18是T，A或S。
17.权利要求1-14任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
18.权利要求1-13或15任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
19.权利要求1-13或16任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
20.权利要求1-14任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
21.权利要求1-13或15任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
22.权利要求1-13或16任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
23.权利要求1-14任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
24.权利要求1-13或15任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
25.权利要求1-13或16任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
26.权利要求1-14任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列。
27.权利要求1-13或15任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。
28.权利要求1-13或16任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。
29.权利要求1-14任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体具有包含下述的VH：VHCDR1，包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；和VHCDR3，包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。
30.权利要求1-13或15任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列。
31.权利要求1-13或16任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含：VH CDR1，包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列。
32.权利要求1-31任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含下述氨基酸序列：
QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIWWDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS(SEQ IDNO:101)，其中X21是T或N，X22是I或K，X23是N或S，X24是V或L，X25是S或I，X26是P或S，X27是E或不存在，X28是N或Y，X29是K或R，X30是A或D，X31是T或S，X32是V或A，X33是G或D，X34是T，I或S且X35是T，S或A。
33.权利要求1-19或32任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
34.权利要求1-16、20-22或32任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
35.权利要求1-16、23-25或32任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。
36.权利要求1-16、26-28或32任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
37.权利要求1-16或29-32任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列。
38.权利要求1-37任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，其包含
(a)VL CDR1，包含氨基酸序列RSSKSLX4X5SNGNTYLY(SEQ ID NO:106)，其中X4是R或L且X5是K或H，
(b)VL CDR2，包含氨基酸序列YMSNLAS(SEQ ID NO:107)，和
(c)VL CDR3，包含氨基酸序列MQX6LEX7PLT(SEQ ID NO:108)，其中X6是G或S且X7是H或Y。
39.权利要求1-37任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：
(a)VL CDR1，包含氨基酸序列KSLX11X12SNGNTY(SEQ ID NO:112)，其中X11是L或R且X12是H或K，
(b)VL CDR2，包含氨基酸序列YMS(SEQ ID NO:113)，和
(c)VL CDR3，包含氨基酸序列X13LEX14PL(SEQ ID NO:114)，其中X13是G或S且X14是H或Y。
40.权利要求1-37任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：
(a)VL CDR1，包含氨基酸序列KSLX19X20SNGNTY(SEQ ID NO:118)，其中X19是V或L且X20是H或K，
(b)VL CDR2，包含氨基酸序列YMS(SEQ ID NO:119)，和
(c)VL CDR3，包含氨基酸序列MQSLEYPLT(SEQ ID NO:120)。
41.权利要求1-38任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，其包含VL CDR1，包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
42.权利要求1-37或39的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
43.权利要求1-37或40的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
44.权利要求1-38任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，其包含VL CDR1，包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ IDNO:47的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
45.权利要求1-37或39的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
46.权利要求1-37或40的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。
47.权利要求1-38任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，其包含VL CDR1，包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ IDNO:87的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。
48.权利要求1-37或39的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列。
49.权利要求1-37或40的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列。
50.权利要求1-37任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，其包含VL CDR1，包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
51.权利要求1-37的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
52.权利要求1-37的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
53.权利要求1-37任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，其包含VL CDR1，包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ IDNO:67的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列。
54.权利要求1-37的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
55.权利要求1-37的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含：VL CDR1，包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
56.权利要求1-49任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含下述氨基酸序列：
DIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:102)，其中X36是I或V，X37是P或S，X38是R或L，X39是K或H，X40是R或K，X41是E或G，X42是S或G且X43是Y或H。
57.权利要求1-43任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
58.权利要求1-40或44-46任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
59.权利要求1-40或47-49任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列。
60.权利要求1-37或50-52任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
61.权利要求1-37或53-55任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
62.免疫特异性结合MUC16的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VH，其VH包含：
(a)VH CDR1，包含氨基酸序列TX1GMGVG(SEQ ID NO:103)，其中X1是L或V；VH CDR2，包含氨基酸序列HIWWDDX2DKYYX3PALKS(SEQ ID NO:104)，其中X2是E或不存在且X3是Y或N；和VHCDR3，包含氨基酸序列IGTAQATDALDY(SEQ ID NO:105)，或
(b)VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX8TX9GM(SEQ ID NO:109)，其中X8是N或S且其中X9是L或V；VH CDR2，包含氨基酸序列WDDX10(SEQ ID NO:110)，其中X10是E或不存在；和VH CDR3，包含氨基酸序列GTAQATDALD(SEQ ID NO:111)，或
(c)VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX15TX16GMG(SEQ ID NO:115)，其中X15是N或S且X16是V或L；VH CDR2，包含氨基酸序列IWWDDX17DK(SEQ ID NO:116)，其中X17是E或不存在；和VHCDR3，包含氨基酸序列X18RIGTAQATDALDY(SEQ ID NO:117)，其中X18是T，A或S，或
(d)VH CDR1，包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或
(e)VH CDR1，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，或
(f)VH CDR1，包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，或
(g)VH CDR1，包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，或
(h)VH CDR1，包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，或
(i)VH CDR1，包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，或
(j)VH CDR1，包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，或
(k)VH CDR1，包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，或
(l)VH CDR1，包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，或
(m)VH CDR1，包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，或
(n)VH CDR1，包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列，或
(o)VH CDR1，包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列，或
(p)VH CDR1，包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列，或
(q)VH CDR1，包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列，或
(r)VH CDR1，包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列。
63.免疫特异性结合MUC16的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含VL，其VL包含：
(a)VL CDR1，包含氨基酸序列RSSKSLX4X5SNGNTYLY(SEQ ID NO:106)，其中X4是R或L且X5是K或H；VL CDR2，包含氨基酸序列YMSNLAS(SEQ ID NO:107)；和VL CDR3，包含氨基酸序列MQX6LEX7PLT(SEQ ID NO:108)，其中X6是G或S且X7是H或Y，或
(b)VL CDR1，包含氨基酸序列KSLX11X12SNGNTY(SEQ ID NO:112)，其中X11是L或R且X12是H或K；VL CDR2，包含氨基酸序列YMS(SEQ ID NO:113)；和VL CDR3，包含氨基酸序列X13LEX14PL(SEQ ID NO:114)，其中X13是G或S且X14是H或Y，或
(c)VL CDR1，包含氨基酸序列KSLX19X20SNGNTY(SEQ ID NO:118)，其中X19是V或L且X20是H或K；VL CDR2，包含氨基酸序列YMS(SEQ ID NO:119)；和VL CDR3，包含氨基酸序列MQSLEYPLT(SEQ ID NO:120)，或
(d)VL CDR1，包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，或
(e)VL CDR1，包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，或
(f)VL CDR1，包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，或
(g)VL CDR1，包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，或
(h)VL CDR1，包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，或
(i)VL CDR1，包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，或
(j)VL CDR1，包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列，或
(k)VL CDR1，包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列，或
(l)VL CDR1，包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列，或
(m)VL CDR1，包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或
(n)VL CDR1，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，或
(o)VL CDR1，包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，或
(p)VL CDR1，包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，或
(q)VL CDR1，包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列，或
(r)VL CDR1，包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
64.免疫特异性结合MUC16的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含：
(a)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含氨基酸序列TX1GMGVG(SEQ ID NO:103)，其中X1是L或V；VH CDR2，包含氨基酸序列HIWWDDX2DKYYX3PALKS(SEQ ID NO:104)，其中X2是E或不存在且X3是Y或N；和VH CDR3，包含氨基酸序列IGTAQATDALDY(SEQ ID NO:105)，和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含氨基酸序列RSSKSLX4X5SNGNTYLY(SEQ ID NO:106)，其中X4是R或L且X5是K或H；VL CDR2，包含氨基酸序列YMSNLAS(SEQ ID NO:107)；和VL CDR3，包含氨基酸序列MQX6LEX7PLT(SEQ ID NO:108)，其中X6是G或S且X7是H或Y或
(b)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX8TX9GM(SEQ ID NO:109)，其中X8是N或S且其中X9是L或V；VH CDR2，包含氨基酸序列WDDX10(SEQ ID NO:110)，其中X10是E或不存在；和VH CDR3，包含氨基酸序列GTAQATDALD(SEQ ID NO:111)，和(ii)包含下述的VL：VLCDR1，包含氨基酸序列KSLX11X12SNGNTY(SEQ ID NO:112)，其中X11是L或R且X12是H或K；VLCDR2，包含氨基酸序列YMS(SEQ ID NO:113)；和VL CDR3，包含氨基酸序列X13LEX14PL(SEQID NO:114)，其中X13是G或S且X14是H或Y，或
(c)(i)VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX15TX16GMG(SEQ ID NO:115)，其中X15是N或S且X16是V或L；VH CDR2，包含氨基酸序列IWWDDX17DK(SEQ ID NO:116)，其中X17是E或不存在；和VHCDR3，包含氨基酸序列X18RIGTAQATDALDY(SEQ ID NO:117)，其中X18是T，A或S，和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含氨基酸序列KSLX19X20SNGNTY(SEQ ID NO:118)，其中X19是V或L且X20是H或K；VL CDR2，包含氨基酸序列YMS(SEQ ID NO:119)；和VL CDR3，包含氨基酸序列MQSLEYPLT(SEQ ID NO:120)，或
(d)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQID NO:24的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，或
(e)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQID NO:30的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，或
(f)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQID NO:36的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，或
(g)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQID NO:44的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，或
(h)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQID NO:50的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，或
(i)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQID NO:56的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，或
(j)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQID NO:84的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列，和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列，或
(k)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQID NO:90的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列，和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列，或
(l)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQID NO:96的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列，或
(m)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和(ii)包含下述的VL：VLCDR1，包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和VLCDR3，包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或
(n)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，或
(o)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQID NO:16的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，或
(p)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQID NO:64的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，或
(q)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQID NO:70的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列，和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列，或
(r)(i)包含下述的VH：VH CDR1，包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQID NO:76的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列，和(ii)包含下述的VL：VL CDR1，包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
65.免疫特异性结合MUC16的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含：
(a)(i)包含下述氨基酸序列的VH：
QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIWWDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS(SEQ IDNO:101)，其中X21是T或N，X22是I或K，X23是N或S，X24是V或L，X25是S或I，X26是P或S，X27是E或不存在，X28是N或Y，X29是K或R，X30是A或D，X31是T或S，X32是V或A，X33是G或D，X34是T，I或S且X35是T，S或A，和(ii)包含下述氨基酸序列的VL：
DIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:102)，其中X36是I或V，X37是P或S，X38是R或L，X39是K或H，X40是R或K，X41是E或G，X42是S或G且X43是Y或H，或
(b)(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH，和(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL，
(c)(i)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH，和(ii)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL，或
(d)(i)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VH，和(ii)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL，或
(e)(i)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VH，和(ii)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的VL，或
(f)(i)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH，和(ii)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VL。
66.权利要求14-65任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含人源的重链和轻链恒定区。
67.权利要求66的抗体或其抗原结合片段，其中重链恒定区具有选自γ1、γ2、γ3和γ4的同种型。
68.权利要求66或67的抗体或其抗原结合片段，其中轻链恒定区具有选自κ和λ的同种型。
69.权利要求1-31、38-55或62-64任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段是人源化的。
70.权利要求69的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段是人源化形式的啮齿类抗体。
71.权利要求1-70任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体是包含两条相同重链和两条相同轻链的免疫球蛋白。
72.权利要求71的抗体或其抗原结合片段，其中免疫球蛋白是IgG。
73.抗体缀合物，包含缀合至试剂的权利要求1-72任一项的抗体或其抗原结合片段。
74.权利要求73的抗体缀合物，其中试剂是显影剂或细胞毒性剂。
75.权利要求1-70任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段是双特异性抗体。
76.权利要求75的双特异性抗体，其中双特异性抗体免疫特异性结合CD3。
77.权利要求75或76的双特异性抗体，其中双特异性抗体包含免疫特异性结合MUC16的免疫球蛋白，其中免疫球蛋白轻链通过肽接头缀合至免疫特异性结合CD3的单链可变区片段(scFv)。
78.双特异性抗体缀合物，包含缀合至试剂的权利要求75-77任一项的双特异性抗体。
79.权利要求78的双特异性抗体缀合物，其中试剂是显影剂或细胞毒性剂。
80.权利要求1-70任一项的抗体或其抗原结合片段，其中其抗原结合片段是scFv。
81.ScFv缀合物，包含缀合至试剂的权利要求80的scFv。
82.权利要求81的ScFv缀合物，其中试剂是显影剂或细胞毒性剂。
83.嵌合抗原受体(CAR)，包含权利要求1-72任一项的抗体或抗原结合片段，或权利要求80的scFv，或权利要求81或82的scFv缀合物。
84.抗体重链或其抗原结合部分，其中重链或其抗原结合部分包含VH，其VH包含：
(I)(a)VH互补决定区(CDR)1，包含氨基酸序列TX1GMGVG(SEQ ID NO:103)，其中X1是L或V，
(b)VH CDR2，包含氨基酸序列HIWWDDX2DKYYX3PALKS(SEQ ID NO:104)，其中X2是E或不存在且X3是Y或N，和
(c)VH CDR3，包含氨基酸序列IGTAQATDALDY(SEQ ID NO:105)；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(II)(a)VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX8TX9GM(SEQ ID NO:109)，
其中X8是N或S且X9是L或V，
(b)VH CDR2，包含氨基酸序列WDDX10(SEQ ID NO:110)，其中X10是E或不存在，和
(c)VH CDR3，包含氨基酸序列GTAQATDALD(SEQ ID NO:111)，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(III)(a)VH CDR1，包含氨基酸序列GFSLX15TX16GMG(SEQ ID NO:115)，其中X15是N或S且X16是V或L，
(b)VH CDR2，包含氨基酸序列IWWDDX17DK(SEQ ID NO:116)，其中X17是E或不存在，和
(c)VH CDR3，包含氨基酸序列X18RIGTAQATDALDY(SEQ ID NO:117)，其中X18是T，A或S，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(IV)VH CDR1，包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(V)VH CDR1，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭，
或
(VI)VH CDR1，包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭，
或
(VII)VH CDR1，包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(VIII)VH CDR1，包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(IX)VH CDR1，包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(X)VH CDR1，包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(XI)VH CDR1，包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(XII)VH CDR1，包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(XIII)VH CDR1，包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(XIV)VH CDR1，包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(XV)VH CDR1，包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(XVI)VH CDR1，包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭，
或
(XVII)VH CDR1，包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(XVIII)VH CDR1，包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列；VH CDR2，包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；和VH CDR3，包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
85.抗体重链或其抗原结合部分，其中重链或其抗原结合部分包含VH，其包含：
(I)氨基酸序列
QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIWWDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS(SEQ IDNO:101)，其中X21是T或N，X22是I或K，X23是N或S，X24是V或L，X25是S或I，X26是P或S，X27是E或不存在，X28是N或Y，X29是K或R，X30是A或D，X31是T或S，X32是V或A，X33是G或D，X34是T，I或S且X35是T，S或A，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(II)SEQ ID NO:1的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭，
或
(III)SEQ ID NO:21的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(IV)SEQ ID NO:41的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(V)SEQ ID NO:61的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭，
或
(VI)SEQ ID NO:81的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
86.权利要求84或85的抗体重链或其抗原结合部分，其中抗体重链或其抗原结合部分包含人源的重链恒定区。
87.权利要求86的抗体重链或其抗原结合部分，其中重链或其抗原结合部分恒定区具有选自γ1、γ2、γ3和γ4的同种型。
88.权利要求85的抗体重链或其抗原结合部分，其中所述抗体重链或其抗原结合部分是人源化的。
89.权利要求88的抗体重链或其抗原结合部分，其中所述抗体重链或其抗原结合部分是人源化的形式的啮齿类重链。
90.抗体重链缀合物，包含权利要求84-89任一项的抗体重链或其抗原结合部分，其中所述抗体重链或其抗原结合部分缀合试剂。
91.权利要求90的抗体重链缀合物，其中试剂是显影剂或细胞毒性剂。
92.抗体轻链或其抗原结合部分，其中轻链或其抗原结合部分包含VL，其包含：
(I)(a)VL CDR1，包含氨基酸序列RSSKSLX4X5SNGNTYLY(SEQ ID NO:106)，其中X4是R或L且X5是K或H，
(b)VL CDR2，包含氨基酸序列YMSNLAS(SEQ ID NO:107)，和
(c)VL CDR3，包含氨基酸序列MQX6LEX7PLT(SEQ ID NO:108)，其中X6是G或S且X7是H或Y，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(II)(a)VL CDR1，包含氨基酸序列KSLX11X12SNGNTY(SEQ ID NO:112)，其中X11是L或R且X12是H或K，
(b)VL CDR2，包含氨基酸序列YMS(SEQ ID NO:113)，和
(c)VL CDR3，包含氨基酸序列X13LEX14PL(SEQ ID NO:114)，其中X13是G或S且X14是H或Y，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭，
或
(III)(a)VL CDR1，包含氨基酸序列KSLX19X20SNGNTY(SEQ ID NO:118)，其中X19是V或L且X20是H或K，
(b)VL CDR2，包含氨基酸序列YMS(SEQ ID NO:119)，和
(c)VL CDR3，包含氨基酸序列MQSLEYPLT(SEQ ID NO:120)，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(IV)VL CDR1，包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(V)VL CDR1，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(VI)VL CDR1，包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭，
或
(VII)VL CDR1，包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(VIII)VL CDR1，包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭，
或
(VIX)VL CDR1，包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭，
或
(X)VL CDR1，包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(XI)VL CDR1，包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(XII)VL CDR1，包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(XIII)VL CDR1，包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(XIV)VL CDR1，包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(XV)VL CDR1，包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(XVI)VL CDR1，包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(XVII)VL CDR1，包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭，
或
(XVIII)VL CDR1，包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列；VL CDR2，包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列；和VL CDR3，包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
93.抗体轻链，其中轻链包含VL，其包含：
(I)氨基酸序列
DIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:102)，其中X36是I或V，X37是P或S，X38是R或L，X39是K或H，X40是R或K，X41是E或G，X42是S或G且X43是Y或H，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(II)SEQ ID NO:2的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(III)SEQ ID NO:22的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(IV)SEQ ID NO:42的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(V)SEQ ID NO:62的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭；
或
(VI)SEQ ID NO:82的氨基酸序列，
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的MUC16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的MUC16的细胞的体外基质胶侵袭。
94.权利要求92或93的抗体轻链或其抗原结合部分，其中抗体轻链或其抗原结合部分包含人源的轻链恒定区。
95.权利要求94的抗体轻链或其抗原结合部分，其中轻链或其抗原结合部分恒定区具有选自κ和λ的同种型。
96.权利要求92的抗体轻链或其抗原结合部分，其中所述抗体轻链或其抗原结合部分是人源化的。
97.权利要求96的抗体轻链或其抗原结合部分，其中所述抗体轻链或其抗原结合部分是人源化的形式的啮齿类抗体。
98.抗体轻链缀合物，包含缀合至试剂的权利要求92-97任一项的抗体轻链或其抗原结合部分。
99.权利要求98的抗体轻链缀合物，其中试剂是显影剂或细胞毒性剂。
100.融合蛋白，包含通过肽接头缀合至scFv的权利要求92-99任一项的抗体轻链。
101.权利要求100的融合蛋白，其中scFv结合CD3。
102.重组表达权利要求83的CAR的T细胞。
103.一种多核苷酸，其包含编码权利要求80的scFv的核酸序列。
104.一种多核苷酸，其包含编码权利要求81或82的scFv缀合物的核酸序列。
105.一种多核苷酸，其包含编码权利要求83的CAR的核酸序列。
106.一种多核苷酸，其包含编码权利要求84-89任一项的抗体重链的核酸序列。
107.一种多核苷酸，其包含编码权利要求90或91的抗体重链缀合物的核酸序列。
108.一种多核苷酸，其包含编码权利要求92-97任一项的抗体轻链的核酸序列。
109.一种多核苷酸，其包含编码权利要求98或99的抗体轻链缀合物的核酸序列。
110.一种多核苷酸，其包含编码权利要求100或101的融合蛋白的核酸序列。
111.一种多核苷酸，其包含编码(a)权利要求84-89任一项的抗体重链或权利要求90或91的抗体重链缀合物；和(b)权利要求92-97任一项的抗体轻链，权利要求98或99的抗体轻链缀合物或权利要求100或101的融合蛋白的核酸序列。
112.载体，其包含可操作地连接启动子的权利要求103-110任一项的多核苷酸。
113.载体，其包含(a)可操作地连接第一启动子的权利要求106或107的多核苷酸和(b)可操作地连接第二启动子的权利要求108-110任一项的多核苷酸。
114.离体细胞，包含可操作地连接启动子的权利要求103-105任一项的多核苷酸。
115.离体细胞，包含可操作地连接启动子的权利要求106或107的多核苷酸。
116.离体细胞，包含可操作地连接启动子的权利要求108-110任一项的多核苷酸。
117.离体细胞，包含权利要求112的载体。
118.离体细胞，包含权利要求113的载体。
119.离体细胞，包含可操作地连接启动子的一种或多种编码权利要求1-72任一项的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
120.一种生产抗体重链的方法，包括在细胞表达多核苷酸以产生多核苷酸编码的抗体重链或抗体重链缀合物的条件下培养权利要求115的细胞。
121.一种生产抗体轻链的方法，包括在细胞表达多核苷酸以产生多核苷酸编码的抗体轻链，抗体轻链缀合物或融合蛋白的条件下培养权利要求116的细胞。
122.一种生产抗体或其抗原结合片段的方法，包括在细胞表达可操作地连接第一启动子的多核苷酸和可操作地连接第二启动子的多核苷酸以产生(i)多核苷酸编码的抗体重链或抗体重链缀合物和(ii)多核苷酸编码的抗体轻链、抗体轻链缀合物或融合蛋白的条件下培养权利要求118的离体细胞。
123.药物组合物，包含：治疗有效量的权利要求1-72任一项的抗体或其抗原结合片段，权利要求73或74的抗体缀合物，权利要求75-77任一项的双特异性抗体，权利要求78或79的双特异性抗体缀合物，权利要求80的scFv，权利要求81或82的scFv缀合物，权利要求83的CAR，权利要求84-89任一项的抗体重链，权利要求90或91的抗体重链缀合物，权利要求92-97任一项的抗体轻链，权利要求98或99的抗体轻链缀合物，权利要求100或101的融合蛋白或权利要求102的T细胞；和药学上可接受的载体。
124.在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括对所述患者施用权利要求123的药物组合物。
125.权利要求124的方法，其中所述癌症是肺癌，胰腺癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌或原发性腹膜癌的癌症。
126.权利要求124或125的方法，其中所述癌症是卵巢癌。
127.权利要求124-126任一项的方法，其中所述患者是人患者。
128.权利要求124-127任一项的方法，其中该方法进一步包括对患者施用治疗有效量的另外的治疗剂。
129.权利要求128的方法，其中药物组合物包含治疗有效量的第一抗体，所述第一抗体是权利要求1-72任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段识别MUC16中的表位，所述表位包含N-糖基化的SEQ ID NO:150的Asn1806但不包含N-糖基化的SEQ IDNO:150的Asn1800，其中另外的治疗剂是第二抗体或其抗原结合片段，其中第二抗体或其抗原结合片段识别MUC16中的表位，所述表位包含N-糖基化的SEQ ID NO:150的Asn1806，也包含N-糖基化的SEQ ID NO:150的Asn1800。
130.权利要求129的方法，其中第一抗体或其抗原结合片段通过下述进行鉴定：(i)其免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞的能力，其第一形式的MUC16是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)其不能免疫特异性结合重组表达第三形式的MUC16的细胞，该第三形式是糖基化的，其中第三形式的氨基酸序列是SEQ IDNO:139；和(iii)其免疫特异性结合重组表达第四形式的MUC16的细胞的能力，其第四形式是糖基化的，且其中第四形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:152且其中重组表达第一形式的MUC16的细胞、重组表达第三形式的MUC16的细胞和重组表达第四形式的MUC16的细胞是相同细胞类型和
其中第二抗体或其抗原结合片段通过下述进行鉴定：(i)其免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞的能力，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133和(ii)其不能免疫特异性结合重组表达第五形式的MUC16的细胞，其第五形式是糖基化的，且其中第五形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:172，其中重组表达第一形式的MUC16的细胞与重组表达第五形式的MUC16的细胞是相同细胞类型。
131.权利要求128的方法，其中药物组合物包含治疗有效量的第一抗体或其抗原结合片段，其是权利要求1-72任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段识别MUC16中的表位，所述表位包含N-糖基化的SEQ ID NO:150的Asn1806但不包含N-糖基化的SEQ ID NO:150的Asn1800、其中另外的治疗剂是治疗有效量的第二抗体或其抗原结合片段，其中第二抗体或其抗原结合片段识别MUC16中的表位，所述表位包含N-糖基化的SEQ IDNO:150的Asn1800但不包含N-糖基化的SEQ ID NO:150的Asn1806。
132.权利要求131的方法，其中第一抗体或其抗原结合片段通过下述进行鉴定：(i)其免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞的能力，其第一形式的MUC16是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)其不能免疫特异性结合重组表达第三形式的MUC16的细胞，该第三形式是糖基化的，且其中第三形式的氨基酸序列是SEQ IDNO:139；和(iii)其免疫特异性结合重组表达第四形式的MUC16的细胞的能力，其第四形式是糖基化的，且其中第四形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:152，其中重组表达第一形式的MUC16的细胞、重组表达第三形式的MUC16的细胞和重组表达第四形式的MUC16的细胞是相同细胞类型，和
其中第二抗体或其抗原结合片段通过下述进行鉴定：(i)其免疫特异性结合重组表达第一形式的MUC16的细胞的能力，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:133；(ii)其免疫特异性结合重组表达第三形式的MUC16的细胞的能力，该第三形式的MUC16是糖基化的，且其中第三形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:139；和(iii)其不能免疫特异性结合重组表达第四形式的MUC16的细胞，其第四形式是糖基化的，且其中第四形式的氨基酸序列是SEQ ID NO:152且其中重组表达第一形式的MUC16的细胞、重组表达第三形式的MUC16的细胞和重组表达第四形式的MUC16的细胞是相同类型的细胞。
133.免疫原性糖肽，包含一个或多个糖基化位点，其中(i)免疫原性糖肽是10-60个氨基酸残基、10-30个氨基酸残基、15-25个氨基酸残基、15-20个氨基酸残基或15-18个氨基酸残基长；且(ii)该一个或多个糖基化位点的至少一个连接碳水化合物。
134.权利要求133的免疫原性糖肽，其包含1、2或3个糖基化位点。
135.权利要求133的免疫原性糖肽，其包含连接碳水化合物的糖基化位点。
136.权利要求133的免疫原性糖肽，其包含两个分别连接碳水化合物的糖基化位点。
137.权利要求133-136任一项的免疫原性糖肽，其中碳水化合物是N或O连接的碳水化合物。
138.权利要求133-137任一项的免疫原性糖肽，其中碳水化合物是单糖、二糖、三糖、四糖或五糖。
139.权利要求133-137任一项的免疫原性糖肽，其中碳水化合物是二糖。
140.权利要求139的免疫原性糖肽，其中二糖是壳二糖。
141.权利要求133-140任一项的免疫原性糖肽，其中免疫原性糖肽的N端是乙酰化的。
142.权利要求133-141任一项的免疫原性糖肽，其中糖肽的C端是N-甲基甲酰胺衍生物的形式。
143.权利要求133-142任一项的免疫原性糖肽，其缀合免疫原性载体蛋白。
144.权利要求143的免疫原性糖肽，其中免疫原性载体蛋白是钥孔戚血蓝素。
145.权利要求133-144任一项的免疫原性糖肽，其是15-18个氨基酸残基长。
146.权利要求145的免疫原性糖肽，其包含连接壳二糖的糖基化位点。
147.权利要求145的免疫原性糖肽，其包含分别连接壳二糖的两个糖基化位点。
148.权利要求133-144任一项的免疫原性糖肽，其是18个氨基酸残基长。
149.权利要求148的免疫原性糖肽，其包含分别连接壳二糖的两个糖基化位点。
150.权利要求133-144任一项的免疫原性糖肽，其是15个氨基酸残基长。
151.权利要求150的免疫原性糖肽，其包含连接壳二糖的糖基化位点。
152.权利要求133-151任一项的免疫原性糖肽，其包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的至少10个氨基酸的部分，其中该一个或多个糖基化位点的至少一个位于所述氨基酸序列部分之内。
153.权利要求152的免疫原性糖肽，其包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列。
154.权利要求153的免疫原性糖肽，其包含位于SEQ ID NO:129第30个残基(Asn)的糖基化位点，其连接壳二糖。
155.权利要求153的免疫原性糖肽，其包含位于SEQ ID NO:129第30个残基(Asn)的糖基化位点，其连接Man3GlcNAc2部分。
156.权利要求152的免疫原性糖肽，其包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列。
157.权利要求156的免疫原性糖肽，其包含位于SEQ ID NO:130第4个残基(Asn)和第10个残基(Asn)的两个糖基化位点，其分别连接壳二糖。
158.权利要求152的免疫原性糖肽，其包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列。
159.权利要求158的免疫原性糖肽，其包含位于SEQ ID NO:131第7个残基(Asn)的糖基化位点，其连接壳二糖。
160.产生特异性结合糖蛋白的抗体或其抗原结合片段的方法，包括用包含一个或多个糖基化位点的免疫原性糖肽来免疫对象，其中(i)免疫原性糖肽是10-60个氨基酸残基、10-30个氨基酸残基、15-25个氨基酸残基、15-20个氨基酸残基或15-18个氨基酸残基长，(ii)免疫原性糖肽包含糖蛋白氨基酸序列的至少10个氨基酸的部分，(iii)该一个或多个糖基化位点的至少一个连接碳水化合物，且(iv)该一个或多个糖基化位点的至少一个位于所述氨基酸序列部分之内。
161.权利要求160的方法，其中抗体或其抗原结合片段不能特异性结合非糖基化形式的糖蛋白。
162.权利要求160或161任一项的方法，其中对象是山羊、绵羊、驴、鸡、豚鼠、大鼠、兔或小鼠。
163.权利要求160或161任一项的方法，其中对象是大鼠、兔或小鼠。
164.权利要求160或161任一项的方法，其中对象是小鼠。
165.权利要求160-164任一项的方法，其中免疫原性糖肽包含1、2或3个糖基化位点。
166.权利要求160-164任一项的方法，其中免疫原性糖肽包含连接碳水化合物的糖基化位点。
167.权利要求160-164任一项的方法，其中免疫原性糖肽包含两个分别连接碳水化合物的糖基化位点。
168.权利要求160-167任一项的方法，其中碳水化合物是N或O连接的碳水化合物。
169.权利要求160-168任一项的方法，其中碳水化合物是单糖、二糖、三糖、四糖或五糖。
170.权利要求160-168任一项的方法，其中碳水化合物是二糖。
171.权利要求170的方法，其中二糖是壳二糖。
172.权利要求160-171任一项的方法，其中免疫原性糖肽的N端是乙酰化的。
173.权利要求160-172任一项的方法，其中糖肽的C端是N-甲基甲酰胺衍生物的形式。
174.权利要求160-173任一项的方法，其缀合免疫原性载体蛋白。
175.权利要求174的方法，其中免疫原性载体蛋白是钥孔戚血蓝素。
176.权利要求160-175任一项的方法，其中免疫原性糖肽是15-18个氨基酸残基长。
177.权利要求176的方法，其中免疫原性糖肽包含连接壳二糖的糖基化位点。
178.权利要求176的方法，其中免疫原性糖肽包含分别连接壳二糖的两个糖基化位点。
179.权利要求160-175任一项的方法，其中免疫原性糖肽是18个氨基酸残基长。
180.权利要求179的方法，其中免疫原性糖肽包含分别连接壳二糖的两个糖基化位点。
181.权利要求160-175任一项的方法，其中免疫原性糖肽是15个氨基酸残基长。
182.权利要求181的方法，其中免疫原性糖肽包含连接壳二糖的糖基化位点。
183.权利要求160-182任一项的方法，其中糖蛋白包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列。
184.权利要求183的方法，其中免疫原性糖肽包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列。
185.权利要求184的方法，其中免疫原性糖肽包含位于SEQ ID NO:129第30个残基(Asn)的糖基化位点，其连接壳二糖。
186.权利要求184的方法，其中免疫原性糖肽包含位于SEQ ID NO:129第30个残基(Asn)的糖基化位点，其连接Man3GlcNAc2部分。
187.权利要求183的方法，其中免疫原性糖肽包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列。
188.权利要求187的方法，其中免疫原性糖肽包含位于SEQ ID NO:130第4个残基(Asn)和第10个残基(Asn)的两个糖基化位点，其分别连接壳二糖。
189.权利要求183的方法，其中免疫原性糖肽包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列。
190.权利要求189的方法，其中免疫原性糖肽包含位于SEQ ID NO:131第7个残基(Asn)的糖基化位点，其连接壳二糖。
CN201680028517.9A 2015-03-17 2016-03-16 抗muc16抗体及其应用 Active CN107667120B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210174122.7A CN115368460A (zh) 2015-03-17 2016-03-16 抗muc16抗体及其应用

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562134402P 2015-03-17 2015-03-17
US62/134,402 2015-03-17
PCT/US2016/022643 WO2016149368A1 (en) 2015-03-17 2016-03-16 Anti-muc16 antibodies and uses thereof

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210174122.7A Division CN115368460A (zh) 2015-03-17 2016-03-16 抗muc16抗体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107667120A true CN107667120A (zh) 2018-02-06
CN107667120B CN107667120B (zh) 2022-03-08

Family

ID=55755670

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680028517.9A Active CN107667120B (zh) 2015-03-17 2016-03-16 抗muc16抗体及其应用
CN202210174122.7A Pending CN115368460A (zh) 2015-03-17 2016-03-16 抗muc16抗体及其应用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210174122.7A Pending CN115368460A (zh) 2015-03-17 2016-03-16 抗muc16抗体及其应用

Country Status (15)

Country Link
US (2) US11066480B2 (zh)
EP (2) EP3271398B1 (zh)
JP (3) JP6968698B2 (zh)
KR (1) KR102618312B1 (zh)
CN (2) CN107667120B (zh)
AU (2) AU2016233309B2 (zh)
BR (1) BR112017019978A2 (zh)
CA (1) CA2979976A1 (zh)
ES (1) ES2929614T3 (zh)
HK (1) HK1249911A1 (zh)
IL (3) IL296062A (zh)
MX (2) MX2017011822A (zh)
RU (1) RU2758113C2 (zh)
SG (1) SG11201707538XA (zh)
WO (1) WO2016149368A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113061186A (zh) * 2021-04-09 2021-07-02 福州迈新生物技术开发有限公司 抗ca125蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN113366022A (zh) * 2018-11-16 2021-09-07 纪念斯隆凯特琳癌症中心 针对粘蛋白-16的抗体及其使用方法
CN114127116A (zh) * 2019-05-08 2022-03-01 纪念斯隆凯特琳癌症中心 针对黏蛋白-16的人源化抗体及其使用方法
CN114269791A (zh) * 2019-08-08 2022-04-01 纳夫罗根公司 用于治疗体液免疫抑制疾病的体液免疫抑制拮抗剂的组合物和用途
CN114835805A (zh) * 2022-06-10 2022-08-02 郑州大学 抗SARS-CoV-2 spike蛋白的单克隆抗体及应用

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3222632A1 (en) 2010-03-26 2017-09-27 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Antibodies to muc16 and methods of use thereof
CA2967595A1 (en) 2014-11-12 2016-05-19 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
CN107667120B (zh) 2015-03-17 2022-03-08 纪念斯隆-凯特林癌症中心 抗muc16抗体及其应用
IL258768B2 (en) 2015-11-12 2023-11-01 Siamab Therapeutics Inc Compounds interacting with glycans and methods of use
IL265369B2 (en) * 2016-09-23 2024-03-01 Regeneron Pharma Antibodies against (MUCIN 16) MUC16
US11401330B2 (en) 2016-11-17 2022-08-02 Seagen Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
WO2018160909A1 (en) 2017-03-03 2018-09-07 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
IL310182A (en) 2017-04-26 2024-03-01 Eureka Therapeutics Inc ׂ A Delaware Corp Structures of chimeric antibody/T-cell receptor and uses thereof
EA039842B1 (ru) * 2017-09-14 2022-03-18 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Биспецифичные анти-muc16-cd3 антитела и конъюгаты анти-muc16-лекарственное средство
CA3089988A1 (en) * 2018-02-01 2019-08-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antibodies to galectin-3 and methods of use thereof
CN112119095A (zh) * 2018-05-09 2020-12-22 奎斯特制药科技公司 Muc16单克隆抗体及其用途
CN110526977A (zh) * 2018-05-25 2019-12-03 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向muc1的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN110526974A (zh) * 2018-05-25 2019-12-03 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向muc16的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN110527667A (zh) * 2018-05-25 2019-12-03 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向muc16的嵌合抗原受体和嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN110526988A (zh) * 2018-05-25 2019-12-03 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向muc1的嵌合抗原受体和嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
WO2022003061A1 (en) * 2020-06-30 2022-01-06 Universiteit Antwerpen Mucins and isoforms thereof in diseases characterized by barrier dysfunction
WO2022133169A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor systems with adaptable receptor specificity
JP2024500189A (ja) 2020-12-21 2024-01-04 アロジーン セラピューティクス，インコーポレイテッド プロテアーゼ活性化ｃｄ４５ゲートｃａｒ
CA3204417A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Allogene Therapeutics, Inc. Knockdown or knockout of one or more of tap2, nlrc5, ?2m, trac, rfx5, rfxap and rfxank to mitigate t cell recognition of allogeneic cell products
WO2022204249A1 (en) * 2021-03-24 2022-09-29 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Variants of humanized anti-muc16 ectodomain antibodies for treatment of muc16 overexpressing tumors
WO2024026445A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Allogene Therapeutics Inc. Engineered cells with reduced gene expression to mitigate immune cell recognition

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011119979A2 (en) * 2010-03-26 2011-09-29 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Antibodies to muc16 and methods of use thereof

Family Cites Families (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
FR2374910A1 (fr) 1976-10-23 1978-07-21 Choay Sa Preparation a base d'heparine, comprenant des liposomes, procede pour l'obtenir et medicaments contenant de telles preparations
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
SE448277B (sv) 1985-04-12 1987-02-09 Draco Ab Indikeringsanordning vid en doseringsanordning for lekemedel
US4824659A (en) 1985-06-07 1989-04-25 Immunomedics, Inc. Antibody conjugates
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
SE453566B (sv) 1986-03-07 1988-02-15 Draco Ab Anordning vid pulverinhalatorer
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
CH671155A5 (zh) 1986-08-18 1989-08-15 Clinical Technologies Ass
US5869620A (en) 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
EP0279582A3 (en) 1987-02-17 1989-10-18 Pharming B.V. Dna sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US4978745A (en) 1987-11-23 1990-12-18 Centocor, Inc. Immunoreactive heterochain antibodies
US4975369A (en) 1988-04-21 1990-12-04 Eli Lilly And Company Recombinant and chimeric KS1/4 antibodies directed against a human adenocarcinoma antigen
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
AU5554190A (en) 1989-05-08 1990-11-29 Mark I. Farber Process and apparatus for the recovery of precious metals from slag, tailings and other materials
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
ES2087997T3 (es) 1990-01-12 1996-08-01 Cell Genesys Inc Generacion de anticuerpos xenogenicos.
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
EP0546073B1 (en) 1990-08-29 1997-09-10 GenPharm International, Inc. production and use of transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5404871A (en) 1991-03-05 1995-04-11 Aradigm Delivery of aerosol medications for inspiration
CA2288429C (en) 1991-03-15 2006-04-25 Synergen, Inc. Pegylation of polypeptides
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
AU662919B2 (en) 1991-07-02 1995-09-21 Inhale, Inc. Method and device for delivering aerosolized medicaments
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
ATE408012T1 (de) 1991-12-02 2008-09-15 Medical Res Council Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
DE69233204T2 (de) 1991-12-13 2004-07-15 Xoma Corp., Berkeley Verfahren und materialien zur herstellung von modifizierten variablen antikörperdomänen und ihre therapeutische verwendung
US5976818A (en) 1991-12-16 1999-11-02 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Monoclonal antibodies which identify the glycoprotein carrying the CA 125 epitope
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
ES2149768T3 (es) 1992-03-25 2000-11-16 Immunogen Inc Conjugados de agentes enlazantes de celulas derivados de cc-1065.
EP2192131A1 (en) 1992-08-21 2010-06-02 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
AU4829593A (en) 1992-09-23 1994-04-12 Fisons Plc Inhalation device
RO113214B1 (ro) 1992-10-19 1998-05-29 Dura Pharma Inc Inhalator de pulbere uscata
US5643252A (en) 1992-10-28 1997-07-01 Venisect, Inc. Laser perforator
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
ATE199392T1 (de) 1992-12-04 2001-03-15 Medical Res Council Multivalente und multispezifische bindungsproteine, deren herstellung und verwendung
US5849695A (en) 1993-01-13 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Parathyroid hormone analogues useful for treatment of osteoporosis and disorders of calcium meatabolism in mammals
AU5883694A (en) 1993-01-19 1994-08-15 Glaxo Group Limited Device
EP0804561B1 (en) 1993-02-12 2009-12-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Regulated transcription of targeted genes and other biological events
DK0698097T3 (da) 1993-04-29 2001-10-08 Unilever Nv Produktion af antistoffer eller (funktionaliserede) fragmenter deraf afledt af Camelidae-immunoglobuliner med tung kæde
US5514670A (en) 1993-08-13 1996-05-07 Pharmos Corporation Submicron emulsions for delivery of peptides
US5814599A (en) 1995-08-04 1998-09-29 Massachusetts Insitiute Of Technology Transdermal delivery of encapsulated drugs
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
ATE390933T1 (de) 1995-04-27 2008-04-15 Amgen Fremont Inc Aus immunisierten xenomäusen stammende menschliche antikörper gegen il-8
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
BR9606706A (pt) 1995-10-16 1999-04-06 Unilever Nv Análogo de fragmento de anticorpo biespecífico ou bivalente uso processo para produzir o mesmo
GB9526100D0 (en) 1995-12-20 1996-02-21 Intersurgical Ltd Nebulizer
WO1997025086A2 (en) 1996-01-03 1997-07-17 Glaxo Group Limited Inhalation device
US6107090A (en) 1996-05-06 2000-08-22 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of prostate cancer with antibodies to extracellur PSMA domains
US6027947A (en) 1996-08-20 2000-02-22 Ramtron International Corporation Partially or completely encapsulated top electrode of a ferroelectric capacitor
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
PT942968E (pt) 1996-12-03 2008-03-27 Amgen Fremont Inc Anticorpos totalmente humanos que se ligam ao egfr
US5879681A (en) 1997-02-07 1999-03-09 Emisphere Technolgies Inc. Compounds and compositions for delivering active agents
US5921447A (en) 1997-02-13 1999-07-13 Glaxo Wellcome Inc. Flow-through metered aerosol dispensing apparatus and method of use thereof
AU742045B2 (en) 1997-04-14 2001-12-13 Amgen Research (Munich) Gmbh Novel method for the production of anti-human antigen receptors and uses thereof
US20030148463A1 (en) 1997-04-14 2003-08-07 Micromet Ag Novel method for the production of anti-human antigen receptors and uses thereof
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US7951917B1 (en) 1997-05-02 2011-05-31 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
CU22731A1 (es) 1998-02-05 2002-02-28 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpo monoclonal que reconoce el oligosacárido ácido siálico n´glicolilado-galactosa-glucosa (ngcneu-gal-glu) en tumores malignos y composiciones farmacéuticas que los contienen
CA2327505A1 (en) 1998-04-28 1999-11-04 Smithkline Beecham Corporation Monoclonal antibodies with reduced immunogenicity
US6849425B1 (en) 1999-10-14 2005-02-01 Ixsys, Inc. Methods of optimizing antibody variable region binding affinity
AU765588C (en) 1999-11-24 2004-12-16 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising taxanes and their therapeutic use
AU2161501A (en) 1999-11-29 2001-06-25 Unilever Plc Immobilized single domain antigen-binding molecules
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
MXPA03009510A (es) * 2001-04-17 2005-04-29 Univ Arkansas Secuencias de repeticion del gen ca125 y su uso para intervenciones de diagnosticos y terapeuticas.
ITRM20010408A1 (it) 2001-07-10 2003-01-10 Univ Napoli Federico Ii Mini-anticorpo umano citotossico per cellule tumorali che esprimono il recettore erbb2.
CA2491864C (en) 2001-07-12 2012-09-11 Jefferson Foote Super humanized antibodies
US20040014194A1 (en) 2002-03-27 2004-01-22 Schering Corporation Beta-secretase crystals and methods for preparing and using the same
JP2006502110A (ja) 2002-07-03 2006-01-19 イミュノジェン・インコーポレーテッド 非放出Ｍｕｃ１およびＭｕｃ１６に対する抗体、およびその使用
GB2395270B (en) 2002-11-14 2006-08-16 Univ Nottingham Tumour marker proteins and uses thereof
ATE472338T1 (de) 2003-02-20 2010-07-15 Seattle Genetics Inc Anti-cd70 antikörper-arzneimittelkonjugate und ihre verwendung zur behandlung von krebs
US20050042664A1 (en) 2003-08-22 2005-02-24 Medimmune, Inc. Humanization of antibodies
CA2559809A1 (en) 2004-03-12 2005-11-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against human g-protein chemokine receptor (ccr5) hdgnr10
JP2007536938A (ja) 2004-05-14 2007-12-20 ザ・レジェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア 抗Ｗｎｔ２モノクローナル抗体およびｓｉＲＮＡを使用して癌を治療するための方法
US7521541B2 (en) 2004-09-23 2009-04-21 Genetech Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
CN101687037B (zh) 2007-05-08 2013-07-10 健泰科生物技术公司 半胱氨酸改造的抗muc16抗体和抗体药物偶联物
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
KR101904065B1 (ko) 2009-06-26 2018-10-04 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
JP6029581B2 (ja) 2010-06-19 2016-11-24 メモリアル スローン−ケタリング キャンサー センター 抗ｇｄ２抗体
US10023652B2 (en) * 2013-07-09 2018-07-17 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Method of targeting glycoproteins to treat cancer
CN107667120B (zh) 2015-03-17 2022-03-08 纪念斯隆-凯特林癌症中心 抗muc16抗体及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011119979A2 (en) * 2010-03-26 2011-09-29 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Antibodies to muc16 and methods of use thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DE´BAT H. ET AL: "Overpassing an aberrant Vk gene to sequence an antiidiotypic abzyme with b-lactamase-like activity that could have a linkage with autoimmune diseases", 《FASEB》 *
LOLLI F. ET AL: "The glycopeptide CSF114(Glc) detects serum antibodies in multiple sclerosis", 《JOURNAL OF NEUROIMMUNOLOGY》 *
SORENSEN A. ET AL: "Chemoenzymatically synthesized multimeric Tn/STn MUC1 glycopeptides elicit cancer-specific anti-MUC1 antibody response and override tolerance", 《GLYCOBIOLOGY》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113366022A (zh) * 2018-11-16 2021-09-07 纪念斯隆凯特琳癌症中心 针对粘蛋白-16的抗体及其使用方法
CN114127116A (zh) * 2019-05-08 2022-03-01 纪念斯隆凯特琳癌症中心 针对黏蛋白-16的人源化抗体及其使用方法
CN114269791A (zh) * 2019-08-08 2022-04-01 纳夫罗根公司 用于治疗体液免疫抑制疾病的体液免疫抑制拮抗剂的组合物和用途
CN113061186A (zh) * 2021-04-09 2021-07-02 福州迈新生物技术开发有限公司 抗ca125蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN114835805A (zh) * 2022-06-10 2022-08-02 郑州大学 抗SARS-CoV-2 spike蛋白的单克隆抗体及应用
CN114835805B (zh) * 2022-06-10 2023-06-06 郑州大学 抗SARS-CoV-2 spike蛋白的单克隆抗体及应用

Also Published As

Publication number Publication date
IL283321A (en) 2021-07-29
JP6968698B2 (ja) 2021-11-24
CN107667120B (zh) 2022-03-08
US20180112008A1 (en) 2018-04-26
KR102618312B1 (ko) 2023-12-28
RU2017134592A (ru) 2019-04-05
IL254517A0 (en) 2017-11-30
IL296062A (en) 2022-10-01
ES2929614T3 (es) 2022-11-30
WO2016149368A1 (en) 2016-09-22
JP2022116314A (ja) 2022-08-09
CA2979976A1 (en) 2016-09-22
EP4190817A1 (en) 2023-06-07
MX2017011822A (es) 2017-12-07
IL254517B (en) 2021-05-31
RU2017134592A3 (zh) 2020-01-23
US11066480B2 (en) 2021-07-20
CN115368460A (zh) 2022-11-22
SG11201707538XA (en) 2017-10-30
KR20170128525A (ko) 2017-11-22
AU2016233309B2 (en) 2021-11-18
BR112017019978A2 (pt) 2018-06-19
AU2022200931A1 (en) 2022-03-03
JP2018509907A (ja) 2018-04-12
RU2758113C2 (ru) 2021-10-26
AU2016233309A1 (en) 2017-10-12
JP2021000132A (ja) 2021-01-07
EP3271398B1 (en) 2022-08-31
EP3271398A1 (en) 2018-01-24
MX2022003891A (es) 2022-04-19
US20230026100A1 (en) 2023-01-26
HK1249911A1 (zh) 2018-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107667120A (zh) 抗muc16抗体及其应用
US20230032624A1 (en) Colon and pancreas cancer specific antigens and antibodies
ES2927090T3 (es) Anticuerpo anti-TROP-2 humano que muestra actividad antitumoral in vivo
KR101624381B1 (ko) in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항인간 TROP-2 항체
CN102827287B (zh) 用于诊断和治疗癌症的组合物和方法
CN108350067A (zh) 抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其用途
TW200804424A (en) Anti-5T4 antibodies and uses thereof
CN104072614A (zh) 抗-αvβ6 抗体及其用途
JP7003071B2 (ja) 結腸癌及び膵臓癌の診断ならびに治療のための、ヒト化モノクローナル抗体及び使用方法
JP2021046417A (ja) 抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体、ＣＬＥＣ−２との結合に必要なＡｇｇｒｕｓの領域、及びＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤のスクリーニング方法
WO2021251459A1 (ja) ヒト化抗ｇｐｃ－１抗体
WO2021251460A1 (ja) Ｃａｆを有するがんを処置するための組成物
CN101356679A (zh) 用于诊断和治疗癌症的组合物和方法
CA3027417C (en) Anti-human trop-2 antibody having an antitumor activity in vivo
TW202400651A (zh) 抗cd200r1抗體

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant