JP2021000132A - 抗muc16抗体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
米国仮特許出願第62/134,402号の恩典を主張する。
ing_13542-016-228.txt」というタイトルのテキストファイルとして本出願とともに提出
された配列表を引用により組み込んでいる。
本明細書に提供されるのは、癌などの障害を管理、治療、又は予防するための、繋留型
ムチンタンパク質であるMUC16に免疫特異的に結合し、かつMUC16の発現及び/又は活性を
調節する抗体に関する組成物、方法、及び使用である。
ムチンは、細胞の恒常性及び上皮表面の保護にとって重要な生体分子である。卵巣癌に
おけるムチンの発現の変化は、診断、予後判定、及び治療において利用することができる
(Singh APらの文献、LancetOncol 2008;9(11):1076-85)。MUC16は、ほとんどの卵巣癌で
過剰発現される1つのそのようなムチンであり、卵巣癌の検出及び進行の確立された代用
血清マーカー(CA-125)である(BadgwellDらの文献、Dis Markers 2007;23(5-6):397410;
Bast RC, Jrらの文献、IntJ Gynecol Cancer 2005;15 Suppl 3:274-81; Fritsche HAら
の文献、ClinChem 1998;44(7):1379-80;及びKrivak TCらの文献、Gynecol Oncol 2009;1
15(1):81-5)。MUC16は、多数のリピート配列からなる、CA-125と呼ばれる、切断され、放
出される大ドメインと、残りの非反復細胞外断片、膜貫通ドメイン、及び細胞質テールを
含む保持ドメイン(MUC-CD)とから構成される高度にグリコシル化されたムチンである(O'B
rien TJらの文献、TumourBiol 2001;22(6):348-66)。この抗原は、それ以外の場合は、
子宮、子宮内膜、卵管、卵巣、並びに腹腔及び胸腔の漿膜で低レベルで発現されるのみで
あるので、MUC16は、免疫ベースの療法の潜在的に魅力のある標的である。
より、卵巣癌上の標的抗原としてのMUC16の有用性は制限される。実際、今日まで、報告
されているほとんどのMUC16モノクローナル抗体は、この糖タンパク質の大きい分泌CA-12
5画分に存在するエピトープに結合し、この抗原の保持される細胞外画分(MUC-CD)に結合
することが知られているものはない(Bellone Sの文献、Am J Obstet Gynecol 2009;200(1
):75 el-10、BerekJSの文献、Expert Opin Biol Ther 2004;4(7):1159-65; O'Brien TJ
らの文献、IntJ Biol Markers 1998;13(4):188-95)。したがって、MUC16の非放出領域に
対する新たな抗体の作製が診断的及び治療的アプローチに必要とされる。
提供されるのは、抗体及びその抗原結合断片、並びにそのような抗体又は抗原結合断片
を含むポリペプチド、例えば、融合タンパク質、コンジュゲート、及び/又はキメラ抗原
受容体、並びにこれらを発現する細胞である。該抗体及び抗原結合断片の中に、MUC16タ
ンパク質のエピトープに特異的に結合するものがある。そのような抗体は、本明細書にお
いて「MUC16グリコシル化抗体」と呼ばれる。そのようなエピトープは、典型的には、MUC
16分子、通常、MUC16の非放出形態の細胞外部分の内部又は実質的に内部のエピトープで
あり;いくつかの実施態様において、該エピトープは、MUC16及び/もしくはMUC16の分泌形
態のタンデムリピート領域内になく、又は該抗体もしくは断片は、MUC16及び/もしくはMU
C16の分泌形態のタンデムリピート領域に結合しない。いくつかの実施態様において、該
エピトープは、MUC16c114の内部にあるか、又はMUC16c114の内部の残基を含み、典型的に
は、その中の1以上のグリコシル化残基又はグリコシル化部位を含む。いくつかの実施態
様において、該エピトープは、1以上のグリコシル化部位、例えば、N-グリコシル化の部
位を含む。いくつかの態様において、該エピトープは、配列番号150に示されるMUC16配列
(及び/又はそのグリコシル化形態)のAsn1806又はAsn1800に対応するアスパラギン残基を
含み;いくつかの態様において、該エピトープは、配列番号150のAsn1806に対応するアス
パラギン残基を含むが、配列番号150のAsn1800に対応するアスパラギン残基を含まず;い
くつかの態様において、該エピトープは、配列番号150のAsn1800に対応するアスパラギン
残基を含むが、配列番号150のAsn1806に対応するアスパラギン残基を含まない。そのよう
な実施態様のいずれかのいくつかにおいて、そのような1以上のアスパラギンは、グリコ
シル化、例えば、N-グリコシル化されている。いくつかの実施態様において、該抗体又は
抗原結合断片は、配列番号131の内部のエピトープもしくは配列番号131の内部の残基を含
むエピトープに結合し;配列番号130の内部のエピトープもしくは配列番号130の内部の残
基を含むエピトープに結合するか、又はこれらの組合せであり;いくつかの実施態様にお
いて、該抗体又は断片は、配列番号168に対応するMUC16の領域内でも、配列番号168の残
基2〜19の内部でも免疫特異的に結合しない。
れる抗体配列、例えば、MUC16-グリコシル化部位標的化抗体配列、例えば、18C6と表記さ
れる抗体、10C6と表記される抗体、及び/又は19C11と表記される抗体の重鎖及び/又は軽
鎖のCDRに対応する1以上の相補性決定領域(CDR)を含む。いくつかの実施態様において、
該抗体又は断片は、本明細書に提供される重鎖配列のうちの1つ、例えば、18C6と表記さ
れる抗体、10C6と表記される抗体、19C11と表記される抗体、及び/又は7B12と表記される
抗体の重鎖配列のHCDR3に対応する配列を有する重鎖CDR3(HCDR3)を有する。いくつかの態
様において、該HCDR3は、
(ここで、X18は、T、A、又はSである);配列番号5;配列番号25;配列番号45;配列番号65;及
び配列番号85;配列番号31、51、71、及び91;配列番号17;配列番号37;配列番号57;配列番
号77;並びに配列番号97の中から選択される配列を有する。
れる重鎖配列のうちの1つ、例えば、18C6と表記される抗体、10C6と表記される抗体、19C
11と表記される抗体、及び/又は7B12と表記される抗体の重鎖配列のCDR1(HCDR1)に対応す
る配列を有する重鎖HCDR1を含む。いくつかの態様において、該HCDR1は、
(ここで、X1は、L又はVである)、配列
(ここで、X8は、N又はSであり、かつX9は、L又はVである)、
(ここで、X15は、N又はSであり、かつX16は、V又はLである)、並びに配列番号3として示
されている配列;並びに配列番号9として示されている配列;並びに配列番号15として示さ
れている配列;並びに配列番号23、43、63、83のうちのいずれかに示されている配列;並び
に配列番号29、49、69、及び89のうちのいずれかに示されている配列;並びに配列番号35
、55、75、及び95のうちのいずれかに示されている配列の中から選択される配列を有する
。
れる重鎖配列のうちの1つ、例えば、18C6と表記される抗体、10C6と表記される抗体、19C
11と表記される抗体、及び/又は7B12と表記される抗体の重鎖配列のCDR2(HCDR2)に対応す
る配列を有する重鎖HCDR2を含む。いくつかの態様において、該HCDR2は、
(ここで、X2は、E又は非存在であり、かつX3は、Y又はNである);
(ここで、X10は、E又は非存在である);
(ここで、X17は、E又は非存在である);配列番号4として示されている配列;配列番号10と
して示されている配列;及び配列番号16として示されている配列;及び配列番号24、44、64
、84のうちのいずれかに示されている配列;及び配列番号30、50、70、90のうちのいずれ
かに示されている配列;及び配列番号36、56、76、96のうちのいずれかに示されている配
列の中から選択される配列を有する。
抗原結合断片は、本明細書に提供される軽鎖配列のうちの1つ、例えば、18C6と表記され
る抗体、10C6と表記される抗体、19C11と表記される抗体、及び/又7B12と表記される抗体
の軽鎖配列のCDR3(LCDR3)に対応する配列を有する軽鎖LCDR3を含む、例えば、さらに含む
。いくつかの態様において、該LCDR3は、
(ここで、X6は、G又はSであり、かつX7は、H又はYである);
(ここで、X13は、G又はSであり、かつX14は、H又はYである);及び
;配列番号8、28、48、68、及び88の中から選択される配列;配列番号14、34、54、74、及
び94の中から選択される配列;並びに配列番号20、4、60、80、及び100の中から選択され
る配列の中から選択される配列を有する。
抗原結合断片は、本明細書に提供される軽鎖配列のうちの1つ、例えば、18C6と表記され
る抗体、10C6と表記される抗体、19C11と表記される抗体、及び/又7B12と表記される抗体
の軽鎖配列のCDR1(LCDR1)に対応する配列を有する軽鎖LCDR1を含む、例えば、さらに含む
。いくつかの態様において、該LCDR1は、
(ここで、X11は、L又はRであり、かつX12は、H又はKである);
(ここで、X19は、V又はLであり、かつX20は、H又はKである);配列番号6、26、46、66、及
び86の中から選択される配列;配列番号12、32、52、72、及び92の中から選択される配列;
並びに配列番号18、38、58、78、及び98の中から選択される配列の中から選択される配列
を有する。
抗原結合断片は、例えば、本明細書に提供される軽鎖配列のうちの1つ、例えば、18C6と
表記される抗体、10C6と表記される抗体、19C11と表記される抗体、及び/又7B12と表記さ
れる抗体の軽鎖配列のCDR2(LCDR2)に対応する配列を有する軽鎖LCDR2を含む、例えば、さ
らに含む。いくつかの態様において、該LCDR2は、
;及び配列番号7、27、47、67、87;13、33、53、73、93、19、39、59、79、99、119のう
ちのいずれかに示されている配列の中から選択される配列を有する。
(ここで、X1は、L又はVである)を含むVH相補性決定領域(CDR)1;(b)アミノ酸配列
(ここで、X2は、E又は非存在であり、かつX3は、Y又はNである)を含むVHCDR2;及び(c)ア
ミノ酸配列
を含むVHCDR3を有するものがある。
(ここで、X8は、N又はSであり、かつX9は、L又はVである)を含むVHCDR1;(b)アミノ酸配
列
(ここで、X10は、E又は非存在である)を含むVHCDR2;及び(c)アミノ酸配列
を含むVHCDR3を有するものがある。
(ここで、X15は、N又はSであり、かつX16は、V又はLである)を含むVHCDR1;(b)アミノ酸
配列
(ここで、X17は、E又は非存在である)を含むVHCDR2;及び(c)アミノ酸配列
(ここで、X18は、T、A、又はSである)を含むVHCDR3を有するものがある。
むVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含
むVH CDR3;配列番号9のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVH
CDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVHCDR3;配列番号15のアミノ酸配列を含むV
H CDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含
むVH CDR3;配列番号23のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号24のアミノ酸配列を含むV
H CDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVHCDR3;配列番号29のアミノ酸配列を含む
VH CDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号31のアミノ酸配列を含
むVH CDR3;配列番号35のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むV
H CDR2、及び配列番号37のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVH;配列番号43のアミノ酸配
列を含むVHCDR1、配列番号44のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号45のアミノ酸
配列を含むVHCDR3;配列番号49のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号50のアミノ酸配
列を含むVHCDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;配列番号55の
アミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号56のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号57
のアミノ酸配列を含むVH CDR3;配列番号63のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号64の
アミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVH CDR3;配列番号69
のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号
71のアミノ酸配列を含むVHCDR3;配列番号75のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号76
のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列を含むVH CDR3;配列番号8
3のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号84のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番
号85のアミノ酸配列を含むVHCDR3;配列番号89のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号9
0のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列を含むVH CDR3;配列番号
95のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号96のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番
号97のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVHを有するものがある。
(ここで、X4は、R又はLであり、かつX5は、K又はHである)を含むVLCDR1;(b)アミノ酸配
列
を含むVLCDR2;及び(c)アミノ酸配列
(ここで、X6は、G又はSであり、かつX7は、H又はYである)を含むVLCDR3
を有するものがある。
(ここで、X11は、L又はRであり、かつX12は、H又はKである)を含むVLCDR1;(b)アミノ酸
配列YMS (配列番号:113)を含むVLCDR2;及び(c)アミノ酸配列
(ここで、X13は、G又はSであり、かつX14は、H又はYである)を含むVLCDR3を有するもの
がある。
(ここで、X19は、V又はLであり、かつX20は、H又はKである)を含むVLCDR1;(b)アミノ酸
配列YMS (配列番号:119)を含むVLCDR2;及び(c)アミノ酸配列
を含むVLCDR3を有するものがある。
むVL CDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号28のアミノ酸配列を
含むVLCDR3;又は配列番号32のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号33のアミノ酸配列
を含むVLCDR2、及び配列番号34のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は配列番号38のアミノ
酸配列を含むVLCDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号40のアミ
ノ酸配列を含むVLCDR3;又は配列番号46のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号47のア
ミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は配列番号5
2のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番
号54のアミノ酸配列を含むVLCDR3;又は配列番号58のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列
番号59のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又
は配列番号86のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含むVL CDR2、
及び配列番号88のアミノ酸配列を含むVLCDR3;又は配列番号92のアミノ酸配列を含むVL C
DR1、配列番号93のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列を含むVL
CDR3;又は配列番号98のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号99のアミノ酸配列を含むV
L CDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列を含むVLCDR3;又は配列番号6のアミノ酸配列を
含むVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を
含むVLCDR3;又は配列番号12のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号13のアミノ酸配列
を含むVLCDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は配列番号18のアミノ
酸配列を含むVLCDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号20のアミ
ノ酸配列を含むVLCDR3;又は配列番号66のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号67のア
ミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号68のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は配列番号7
2のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番
号74のアミノ酸配列を含むVLCDR3;又は配列番号78のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列
番号79のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号80のアミノ酸配列を含むVL CDR3を有
するものがある。
(ここで、X1は、LもしくはVである)を含むVHCDR1;アミノ酸配列
(ここで、X2は、Eもしくは非存在であり、かつX3は、YもしくはNである)を含むVHCDR2;
及びアミノ酸配列
を含むVHCDR3を含むVH;並びに(ii)アミノ酸配列
(ここで、X4は、RもしくはLであり、かつX5は、KもしくはHである)を含むVLCDR1;アミノ
酸配列
を含むVLCDR2;及びアミノ酸配列
(ここで、X6は、GもしくはSであり、かつX7は、HもしくはYである)を含むVLCDR3を含むV
L;又は(b)(i)アミノ酸配列
(ここで、X8は、NもしくはSであり、かつX9は、LもしくはVである)を含むVHCDR1;アミノ
酸配列
(ここで、X10は、Eもしくは非存在である)を含むVHCDR2;及びアミノ酸配列
を含むVHCDR3を含むVH;並びに(ii)アミノ酸配列
(ここで、X11は、LもしくはRであり、かつX12は、HもしくはKである)を含むVLCDR1;アミ
ノ酸配列YMS (配列番号:113)を含むVLCDR2;及びアミノ酸配列
(ここで、X13は、GもしくはSであり、かつX14は、HもしくはYである)を含むVLCDR3を含
むVL;又は(c)(i)アミノ酸配列
(ここで、X15は、NもしくはSであり、かつX16は、VもしくはLである)を含むVHCDR1;アミ
ノ酸配列
(ここで、X17は、Eもしくは非存在である)を含むVHCDR2;及びアミノ酸配列
(ここで、X18は、T、A、もしくはSである)を含むVHCDR3;並びに(ii)アミノ酸配列
(ここで、X19は、VもしくはLであり、かつX20は、HもしくはKである)を含むVLCDR1;アミ
ノ酸配列YMS (配列番号:119)を含むVLCDR2;及びアミノ酸配列
を含むVLCDR3を含むVL;又は(d)(i)配列番号23のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号2
4のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;
及び(ii)配列番号26のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含むVL
CDR2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVL;又は(e)(i)配列番号29のア
ミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号31の
アミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVH;及び(ii)配列番号32のアミノ酸配列を含むVL CDR1
、配列番号33のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号34のアミノ酸配列を含むVL CD
R3を含むVL;又は(f)(i)配列番号35のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号36のアミノ酸
配列を含むVHCDR2、及び配列番号37のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配
列番号38のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び
配列番号40のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVL;又は(g)(i)配列番号43のアミノ酸配列
を含むVHCDR1、配列番号44のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号45のアミノ酸配
列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号4
7のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;
又は(h)(i)配列番号49のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号50のアミノ酸配列を含むV
H CDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVH;及び(ii)配列番号52のア
ミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号54の
アミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVL;又は(i)(i)配列番号55のアミノ酸配列を含むVH CDR
1、配列番号56のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVH C
DR3を含むVH;及び(ii)配列番号58のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号59のアミノ酸
配列を含むVLCDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は(j)(i)
配列番号83のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号84のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及
び配列番号85のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVH;及び(ii)配列番号86のアミノ酸配列
を含むVLCDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号88のアミノ酸配
列を含むVLCDR3を含むVL;又は(k)(i)配列番号89のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番
号90のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含む
VH;及び(ii)配列番号92のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号93のアミノ酸配列を含む
VL CDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVL;又は(l)(i)配列番号95
のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号
97のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVH及び(ii)配列番号98のアミノ酸配列を含むVL CD
R1、配列番号99のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列を含むVL
CDR3を含むVL;又は(m)(i)配列番号3のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号4のアミノ
酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配
列番号6のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配
列番号8のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVL;又は(n)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含
むVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列を
含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号12のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号13の
アミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又
は(o)(i)配列番号15のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含むVH
CDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVH;及び(ii)配列番号18のアミ
ノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号20のア
ミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVL;又は(p)(i)配列番号63のアミノ酸配列を含むVH CDR1
、配列番号64のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVH CD
R3を含むVH;及び(ii)配列番号66のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号67のアミノ酸配
列を含むVLCDR2、及び配列番号68のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は(q)(i)配
列番号69のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び
配列番号71のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVH;及び(ii)配列番号72のアミノ酸配列を
含むVL CDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号74のアミノ酸配列
を含むVLCDR3を含むVL;又は(r)(i)配列番号75のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号7
6のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;
及び(ii)配列番号78のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号79のアミノ酸配列を含むVL
CDR2、及び配列番号80のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVLを有するものがある。
(ここで、X21は、TもしくはNであり、X22は、IもしくはKであり、X23は、NもしくはSであ
り、X24は、VもしくはLであり、X25は、SもしくはIであり、X26は、PもしくはSであり、X
27は、Eもしくは非存在であり、X28は、NもしくはYであり、X29は、KもしくはRであり、X
30は、AもしくはDであり、X31は、TもしくはSであり、X32は、VもしくはAであり、X33は
、GもしくはDであり、X34は、T、I、もしくはSであり、かつX35は、T、S、もしくはAであ
る)というアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)
(ここで、X36は、IもしくはVであり、X37は、PもしくはSであり、X38は、RもしくはLであ
り、X39は、KもしくはHであり、X40は、RもしくはKであり、X41は、EもしくはGであり、X
42は、SもしくはGであり、かつX43は、YもしくはHである)というアミノ酸配列を含むVL;
又は(b)(i)配列番号1のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号2のアミノ酸配列を含むV
L;又は(c)(i)配列番号21のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号22のアミノ酸配列を
含むVL;又は(d)(i)配列番号41のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号42のアミノ酸配
列を含むVL;又は(e)(i)配列番号61のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号62のアミノ
酸配列を含むVL;又は(f)(i)配列番号81のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号82のア
ミノ酸配列を含むVL:を有するものがある。
及び2に示される抗体のいずれかのVH及び/又はVL配列と少なくとも90、95、96、97、98、
99、又は100%の同一性を有するものがある。また、提供される抗体又はその断片の中に
、MUC16及び/又はそのエピトープに対する結合をそのような抗体のいずれかと競合するも
のがある。
び/又はコンジュゲート、例えば、そのような抗体又は断片を含有するキメラ抗原受容体(
CAR)、並びにそのような分子を発現する細胞である。また提供されるのは、任意のそのよ
うな抗体のヒト化バージョンである。
であり、ここで、該抗体は、(a)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化され
ており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細
胞に免疫特異的に結合し;(b)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されてお
らず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞
に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(c)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のイ
ンビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。ある実施態様において、(i)MUC16の該第一の形
態を組換え発現する細胞はSKOV3細胞であり;(ii)MUC16の該第二の形態を組換え発現する
細胞はSKOV3細胞であり;かつ(iii)工程(c)の細胞はSKOV3細胞である。具体的な実施態様
において、該抗体は、MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、こ
こで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する
免疫特異的結合を欠く。ある実施態様において、(i)MUC16の該第一の形態を組換え発現す
る細胞はSKOV3細胞であり;(ii)MUC16の該第二の形態を組換え発現する細胞はSKOV3細胞で
あり;かつ(iii)工程(c)の細胞はSKOV3細胞である。ある実施態様において、(i)MUC16の該
第一の形態を組換え発現する細胞はSKOV3細胞であり;(ii)MUC16の該第二の形態を組換え
発現する細胞はSKOV3細胞であり;(iii)MUC16の該第三の形態を組換え発現する細胞はSKOV
3細胞であり;かつ(iv)工程(c)の細胞はSKOV3細胞である。
、(a)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の
形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(
b)MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第二の形態
のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠
き;かつ(c)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤
を阻害する。ある実施態様において、(i)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞はSK
OV3細胞であり;(ii)MUC16の該第三の形態を組換え発現する細胞はSKOV3細胞であり;かつ(
iii)工程(c)の細胞はSKOV3細胞である。
化アスパラギン1806を含むエピトープに免疫特異的に結合する。
(ここで、
のアミノ酸残基番号4(N4)及びアミノ酸残基番号10(N10)はグリコシル化されている)に免
疫特異的に結合する。ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸
配列
(ここで、
のアミノ酸残基番号7(N7)はグリコシル化されている)に免疫特異的に結合する。ある実施
態様において、該グリコシル化は、N-結合型キトビオースからなる。
る細胞を該抗体又は抗原結合断片と接触させたとき、該細胞に内在化される。ある実施態
様において、該細胞は、MUC16の該第一の形態を組換え発現するSKOV3細胞である。
発現する腫瘍の成長を阻害する。
(ここで、X1は、L又はVである)を含むVH相補性決定領域(CDR)1;(b)アミノ酸配列
(ここで、X2は、E又は非存在であり、かつX3は、Y又はNである)を含むVHCDR2;及び(c)ア
ミノ酸配列
を含むVHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)を含む。
(ここで、X8は、N又はSであり、かつX9は、L又はVである)を含むVHCDR1;(b)アミノ酸配
列
(ここで、X10は、E又は非存在である)を含むVHCDR2;及び(c)アミノ酸配列
を含むVHCDR3を含む、VHを含む。
(ここで、X15は、N又はSであり、かつX16は、V又はLである)を含むVHCDR1;(b)アミノ酸
配列
(ここで、X17は、E又は非存在である)を含むVHCDR2;及び(c)アミノ酸配列
(ここで、X18は、T、A、又はSである)を含むVHCDR3を含む、VHを含む。
含むVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を
含むVH CDR3を含むVHを含む。
含むVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列
を含むVHCDR3を含むVHを含む。
含むVH CDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列
を含むVHCDR3を含むVHを含む。
含むVH CDR1、配列番号24のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列
を含むVHCDR3を含むVHを含む。
含むVH CDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号31のアミノ酸配列
を含むVHCDR3を含むVHを含む。
含むVH CDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号37のアミノ酸配列
を含むVHCDR3を含むVHを含む。
含むVH CDR1、配列番号44のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列
を含むVHCDR3を含むVHを含む。
含むVH CDR1、配列番号50のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列
を含むVHCDR3を含むVHを含む。
含むVH CDR1、配列番号56のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列
を含むVHCDR3を含むVHを含む。
含むVH CDR1、配列番号64のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列
を含むVHCDR3を含むVHを含む。
含むVH CDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号71のアミノ酸配列
を含むVHCDR3を含むVHを含む。
含むVH CDR1、配列番号76のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列
を含むVHCDR3を含むVHを含む。
含むVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列
を含むVHCDR3を含む。
含むVH CDR1、配列番号90のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列
を含むVHCDR3を含むVHを含む。
含むVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列
を含むVHCDR3を含むVHを含む。
(ここで、X21は、T又はNであり、X22は、I又はKであり、X23は、N又はSであり、X24は、V
又はLであり、X25は、S又はIであり、X26は、P又はSであり、X27は、E又は非存在であり
、X28は、N又はYであり、X29は、K又はRであり、X30は、A又はDであり、X31は、T又はSで
あり、X32は、V又はAであり、X33は、G又はDであり、X34は、T、I、又はSであり、かつX3
5は、T、S、又はAである)というアミノ酸配列を含むVHを含む。
含むVHを含む。
含むVHを含む。
含むVHを含む。
含むVHを含む。
含むVHを含む。
(ここで、X4は、R又はLであり、かつX5は、K又はHである)を含むVLCDR1;(b)アミノ酸配
列
を含むVLCDR2;及び(c)アミノ酸配列
(ここで、X6は、G又はSであり、かつX7は、H又はYである)を含むVLCDR3を含む、軽鎖可
変領域(VL)を含む。
(ここで、X11は、L又はRであり、かつX12は、H又はKである)を含むVLCDR1;(b)アミノ酸
配列YMS (配列番号:113)を含むVLCDR2;及び(c)アミノ酸配列
(ここで、X13は、G又はSであり、かつX14は、H又はYである)を含むVLCDR3を含む、VLを
含む。
(ここで、X19は、V又はLであり、かつX20は、H又はKである)を含むVLCDR1;(b)アミノ酸
配列YMS (配列番号:119)を含むVLCDR2;及び(c)アミノ酸配列
を含むVLCDR3を含む、VLを含む。
含むVL CDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号28のアミノ酸配列
を含むVLCDR3を含む、軽鎖可変領域(VL)を含む。
含むVL CDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号34のアミノ酸配列
を含むVLCDR3を含む、VLを含む。
含むVL CDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列
を含むVLCDR3を含む、VLを含む。
含むVL CDR1、配列番号47のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列
を含むVLCDR3を含む、VLを含む。
含むVL CDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列
を含むVLCDR3を含む、VLを含む。
含むVL CDR1、配列番号59のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列
を含むVLCDR3を含む、VLを含む。
含むVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列
を含むVLCDR3を含む、VLを含む。
含むVL CDR1、配列番号93のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列
を含むVLCDR3を含む、VLを含む。
含むVL CDR1、配列番号99のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号100のアミノ酸配
列を含むVLCDR3を含む、VLを含む。
含むVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を
含むVL CDR3を含む、VLを含む。
含むVL CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列
を含むVLCDR3を含む、VLを含む。
含むVL CDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号20のアミノ酸配列
を含むVLCDR3を含む、VLを含む。
含むVL CDR1、配列番号67のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号68のアミノ酸配列
を含むVLCDR3を含む、VLを含む。
含むVL CDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号74のアミノ酸配列
を含むVLCDR3を含む、VLを含む。
含むVL CDR1、配列番号79のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号80のアミノ酸配列
を含むVLCDR3を含む、VLを含む。
(ここで、X36は、I又はVであり、X37は、P又はSであり、X38は、R又はLであり、X39は、K
又はHであり、X40は、R又はKであり、X41は、E又はGであり、X42は、S又はGであり、かつ
X43は、Y又はHである)というアミノ酸配列を含むVLを含む。
含むVLを含む。
含むVLを含む。
含むVLを含む。
含むVLを含む。
含むVLを含む。
様において、該重鎖定常領域は、ガンマ1、ガンマ2、ガンマ3、及びガンマ4からなる群か
ら選択されるアイソタイプを有する。ある実施態様において、該軽鎖定常領域は、カッパ
及びラムダからなる群から選択されるアイソタイプを有する。
態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、齧歯類抗体のヒト化形態である。
ロブリンである。ある実施態様において、該免疫グロブリンは、IgGである。
体又はその抗原結合断片を含む抗体コンジュゲートである。ある実施態様において、該薬
剤は、イメージング剤又は細胞毒性剤である。
実施態様において、該二重特異性抗体は、CD3に免疫特異的に結合する。ある実施態様に
おいて、該二重特異性抗体は、MUC16に免疫特異的に結合する免疫グロブリンを含み、こ
こで、該免疫グロブリンの軽鎖は、ペプチドリンカーを介して、CD3に免疫特異的に結合
する単鎖可変断片(scFv)にコンジュゲートされている。また本明細書に提供されるのは、
薬剤にコンジュゲートされた本明細書に提供される二重特異性抗体を含む二重特異性抗体
コンジュゲートである。ある実施態様において、該薬剤は、イメージング剤又は細胞毒性
剤である。
細書に提供されるのは、薬剤にコンジュゲートされた本明細書に提供されるscFvを含むsc
Fvコンジュゲートである。ある実施態様において、該薬剤は、イメージング剤又は細胞毒
性剤である。
ラ分子、及びコンジュゲートである。提供される抗体又はその抗原結合断片のいずれかの
うちの1つ又は複数を含むキメラ抗原受容体(CAR)、例えば、本明細書に提供されるscFvも
しくは本明細書に提供されるscFvコンジュゲートのいずれかを含むCAR;及び/又はMUC16に
対する結合をそれと競合する抗原結合ドメインを含むCARが提供される。
体及びその抗原結合断片の中に、重鎖及び/又はその抗原結合部分、例えば、そのVH領域
を有するものがあり;そのような重鎖及びその抗原結合部分も提供される。いくつかの実
施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、(a)アミノ酸配列
(ここで、X1は、L又はVである)を含むVHCDR1;(b)アミノ酸配列
(ここで、X2は、E又は非存在であり、かつX3は、Y又はNである)を含むVHCDR2;及び(c)ア
ミノ酸配列
を含むVHCDR3を含む、VHを含み;ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含
む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化
されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現す
る細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化さ
れておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現す
る細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する
細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
(ここで、X8は、N又はSであり、かつX9は、L又はVである)を含むVHCDR1;(b)アミノ酸配
列
(ここで、X10は、E又は非存在である)を含むVHCDR2;及び(c)アミノ酸配列
を含むVHCDR3を含む、VHを含み;ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含
む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化
されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現す
る細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化さ
れておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現す
る細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する
細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
(ここで、X15は、N又はSであり、かつX16は、V又はLである)を含むVHCDR1;(b)アミノ酸
配列
(ここで、X17は、E又は非存在である)を含むVHCDR2;及び(c)アミノ酸配列
(ここで、X18は、T、A、又はSである)を含むVHCDR3を含む、VHを含み;ここで、任意に、
該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の
形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列
は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形
態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列
は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MU
C16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVHCDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号5のアミノ酸
配列を含むVHCDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分
を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシ
ル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発
現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル
化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発
現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現
する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVHCDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号11のアミノ
酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部
分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコ
シル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え
発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシ
ル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え
発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発
現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVHCDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号17のアミノ
酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部
分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコ
シル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え
発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシ
ル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え
発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発
現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVHCDR1、配列番号24のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号25のアミノ
酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部
分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコ
シル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え
発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシ
ル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え
発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発
現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVHCDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号31のアミノ
酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部
分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコ
シル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え
発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシ
ル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え
発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発
現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVHCDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号37のアミノ
酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部
分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコ
シル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え
発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシ
ル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え
発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発
現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVHCDR1、配列番号44のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号45のアミノ
酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部
分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコ
シル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え
発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシ
ル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え
発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発
現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVH CDR1、配列番号50のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号51のアミノ
酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部
分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコ
シル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え
発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシ
ル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え
発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発
現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVHCDR1、配列番号56のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号57のアミノ
酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部
分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコ
シル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え
発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシ
ル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え
発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発
現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVHCDR1、配列番号64のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号65のアミノ
酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部
分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコ
シル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え
発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシ
ル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え
発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発
現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVHCDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号71のアミノ
酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部
分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコ
シル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え
発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシ
ル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え
発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発
現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVHCDR1、配列番号76のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号77のアミノ
酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部
分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコ
シル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え
発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシ
ル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え
発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発
現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVHCDR1、配列番号84のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号85のアミノ
酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部
分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコ
シル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え
発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシ
ル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え
発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発
現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVHCDR1、配列番号90のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号91のアミノ
酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部
分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコ
シル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え
発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシ
ル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え
発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発
現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号97のアミノ
酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部
分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコ
シル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え
発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシ
ル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え
発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発
現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
(ここで、X21は、T又はNであり、X22は、I又はKであり、X23は、N又はSであり、X24は、V
又はLであり、X25は、S又はIであり、X26は、P又はSであり、X27は、E又は非存在であり
、X28は、N又はYであり、X29は、K又はRであり、X30は、A又はDであり、X31は、T又はSで
あり、X32は、V又はAであり、X33は、G又はDであり、X34は、T、I、又はSであり、かつX3
5は、T、S、又はAである)というアミノ酸配列を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体
重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(
この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列
番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(こ
の第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列
番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の
該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又は
その抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており
、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免
疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず
、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対
する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のイン
ビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又は
その抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており
、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免
疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず
、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対
する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のイン
ビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又は
その抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており
、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免
疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず
、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対
する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のイン
ビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又は
その抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており
、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免
疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず
、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対
する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のイン
ビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又は
その抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており
、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免
疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず
、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対
する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のイン
ビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
含む。ある実施態様において、該重鎖定常領域は、ガンマ1、ガンマ2、ガンマ3、及びガ
ンマ4からなる群から選択されるアイソタイプを有する。ある実施態様において、該抗体
重鎖は、ヒト化されている。ある実施態様において、該抗体重鎖は、齧歯類重鎖のヒト化
形態である。
ュゲートであり、ここで、該抗体重鎖は、薬剤にコンジュゲートされている。ある実施態
様において、該薬剤は、イメージング剤又は細胞毒性剤である。
L領域を有するものがあり;そのような軽鎖及びその抗原結合部分も提供される。いくつか
の実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、(a)アミノ酸配列
(ここで、X4は、R又はLであり、かつX5は、K又はHである)を含むVLCDR1;(b)アミノ酸配
列
を含むVLCDR2;及び(c)アミノ酸配列
(ここで、X6は、G又はSであり、かつX7は、H又はYである)を含むVLCDR3を含む、VLを含
み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片
は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一
の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し
;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二
の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結
合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリ
ゲル浸潤を阻害する。
(ここで、X11は、L又はRであり、かつX12は、H又はKである)を含むVLCDR1;(b)アミノ酸
配列YMS (配列番号:113)を含むVLCDR2;及び(c)アミノ酸配列
(ここで、X13は、G又はSであり、かつX14は、H又はYである)を含むVLCDR3を含む、VLを
含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断
片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第
一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合
し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第
二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的
結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマト
リゲル浸潤を阻害する。
(ここで、X19は、V又はLであり、かつX20は、H又はKである)を含むVLCDR1;(b)アミノ酸
配列YMS (配列番号:119)を含むVLCDR2;及び(c)アミノ酸配列
を含むVLCDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を
含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル
化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現
する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化
されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現
する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現す
る細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVLCDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号8のアミノ酸
配列を含むVLCDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部
分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコ
シル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え
発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシ
ル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え
発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発
現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVL CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号14のアミノ
酸配列を含むVLCDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合
部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリ
コシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換
え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコ
シル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換
え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え
発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVLCDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号20のアミノ
酸配列を含むVLCDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合
部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリ
コシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換
え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコ
シル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換
え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え
発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVLCDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号28のアミノ
酸配列を含むVLCDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合
部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリ
コシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換
え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコ
シル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換
え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え
発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVLCDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号34のアミノ
酸配列を含むVLCDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合
部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリ
コシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換
え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコ
シル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換
え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え
発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVLCDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号40のアミノ
酸配列を含むVLCDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合
部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリ
コシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換
え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコ
シル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換
え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え
発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVL CDR1、配列番号47のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号48のアミノ
酸配列を含むVLCDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合
部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリ
コシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換
え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコ
シル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換
え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え
発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVLCDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号54のアミノ
酸配列を含むVLCDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合
部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリ
コシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換
え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコ
シル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換
え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え
発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVLCDR1、配列番号59のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号60のアミノ
酸配列を含むVLCDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合
部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリ
コシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換
え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコ
シル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換
え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え
発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVLCDR1、配列番号67のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号68のアミノ
酸配列を含むVLCDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合
部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリ
コシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換
え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコ
シル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換
え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え
発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVLCDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号74のアミノ
酸配列を含むVLCDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合
部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリ
コシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換
え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコ
シル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換
え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え
発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVLCDR1、配列番号79のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号80のアミノ
酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合
部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリ
コシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換
え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコ
シル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換
え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え
発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVLCDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号88のアミノ
酸配列を含むVLCDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合
部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリ
コシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換
え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコ
シル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換
え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え
発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVLCDR1、配列番号93のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号94のアミノ
酸配列を含むVLCDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合
部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリ
コシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換
え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコ
シル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換
え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え
発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVLCDR1、配列番号99のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号100のアミ
ノ酸配列を含むVLCDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結
合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグ
リコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組
換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリ
コシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組
換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換
え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
(ここで、X36は、I又はVであり、X37は、P又はSであり、X38は、R又はLであり、X39は、K
又はHであり、X40は、R又はKであり、X41は、E又はGであり、X42は、S又はGであり、かつ
X43は、Y又はHである)というアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖
又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この
第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号
133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第
二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号
139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第
一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又は
その抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており
、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免
疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず
、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対
する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のイン
ビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又は
その抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており
、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免
疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず
、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対
する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のイン
ビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又は
その抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており
、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免
疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず
、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対
する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のイン
ビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又は
その抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており
、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免
疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず
、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対
する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のイン
ビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
配列を含むVLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又は
その抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており
、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免
疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず
、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対
する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のイン
ビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
含む。ある実施態様において、該軽鎖定常領域は、カッパ及びラムダからなる群から選択
されるアイソタイプを有する。ある実施態様において、該抗体軽鎖は、ヒト化されている
。ある実施態様において、該抗体軽鎖は、齧歯類抗体のヒト化形態である。
体軽鎖を含む抗体軽鎖コンジュゲートである。ある実施態様において、該薬剤は、イメー
ジング剤又は細胞毒性剤である。
た本明細書に提供される抗体軽鎖を含む融合タンパク質である。ある実施態様において、
scFvは、CD3に結合する。
えば、本明細書に提供されるCARを組換え発現する、細胞、例えば、免疫細胞、例えば、T
細胞である。
むポリヌクレオチドである。また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供されるscFv
又はそのコンジュゲートをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドである。また本明
細書に提供されるのは、本明細書に提供されるCARをコードする核酸配列を含むポリヌク
レオチドである。また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される抗体重鎖又はそ
の抗原結合部分をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドである。また本明細書に提
供されるのは、本明細書に提供される抗体重鎖コンジュゲートをコードする核酸配列を含
むポリヌクレオチドである。また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される抗体
軽鎖又はその抗原結合部分をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドである。また本
明細書に提供されるのは、本明細書に提供される抗体軽鎖コンジュゲートをコードする核
酸配列を含むポリヌクレオチドである。また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供
される融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドである。(a)本明細
書に提供される抗体重鎖もしくはその抗原結合部分又は本明細書に提供される抗体重鎖コ
ンジュゲート;及び(b)本明細書に提供される抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分、本明細
書に提供される抗体軽鎖コンジュゲート、又は本明細書に提供される融合タンパク質をコ
ードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
されるポリヌクレオチドを含むベクターである。また本明細書に提供されるのは、(a)第
一のプロモーターに動作可能に連結された本明細書に提供される第一のポリヌクレオチド
;及び(b)第二のプロモーターに動作可能に連結された本明細書に提供される第二のポリヌ
クレオチドを含むベクターである。
されるポリヌクレオチドを含むエクスビボ細胞である。また本明細書に提供されるのは、
プロモーターに動作可能に連結された本明細書に提供されるポリヌクレオチドを含むエク
スビボ細胞である。また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供されるベクターを含
むエクスビボ細胞である。また本明細書に提供されるのは、プロモーターに動作可能に連
結された本明細書に提供される抗体又はその抗原結合断片をコードする1以上のポリヌク
レオチドを含むエクスビボ細胞である。
て、本明細書に提供される細胞を、ポリヌクレオチドが該細胞によって発現されて、該ポ
リヌクレオチドによってコードされる該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分又は抗体重鎖
コンジュゲートを産生するような条件下で培養することを含む、方法である。
て、本明細書に提供される細胞を、ポリヌクレオチドが該細胞によって発現されて、該ポ
リヌクレオチドによってコードされる該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分、抗体軽鎖コ
ンジュゲート、又は融合タンパク質を産生するような条件下で培養することを含む、方法
である。
本明細書に提供されるエクスビボ細胞を、第一のプロモーターに動作可能に連結されたポ
リヌクレオチド及び第二のプロモーターに動作可能に連結されたポリヌクレオチドが該細
胞によって発現されて、(i)該ポリヌクレオチドによってコードされる抗体重鎖又は抗体
重鎖コンジュゲート;及び(ii)該ポリヌクレオチドによってコードされる抗体軽鎖、抗体
軽鎖コンジュゲート、又は融合タンパク質を産生するような条件下で培養することを含む
、方法である。
明細書に提供される抗体コンジュゲート、本明細書に提供される二重特異性抗体、本明細
書に提供される二重特異性抗体コンジュゲート、scFv、本明細書に提供されるscFvコンジ
ュゲート、本明細書に提供されるCAR、本明細書に提供される抗体重鎖もしくはその抗原
結合部分、本明細書に提供される抗体重鎖コンジュゲート、本明細書に提供される抗体軽
鎖もしくはその抗原結合部分、本明細書に提供される抗体軽鎖コンジュゲート、本明細書
に提供される融合タンパク質、又は本明細書に提供されるT細胞の治療有効量;及び医薬と
して許容し得る担体:を含む医薬組成物である。
て、該患者に、本明細書に提供される医薬組成物を投与することを含む、方法である。あ
る実施態様において、癌は、肺、膵臓、乳房、子宮、卵管、又は原発性腹膜の癌である。
ある実施態様において、癌は、卵巣の癌である。ある実施態様において、患者は、ヒト患
者である。具体的な実施態様において、該方法は、追加の治療剤の治療有効量を患者に投
与することをさらに含む、組合せ治療法である。
体又はその抗原結合断片である第一の抗体の治療有効量を含み、ここで、該抗体又はその
抗原結合断片は、配列番号150のN-グリコシル化Asn1806を含むが、配列番号150のN-グリ
コシル化Asn1800を含まないMUC16中のエピトープを認識し、ここで、該追加の治療剤は、
第二の抗体又はその抗原結合断片であり、ここで、該第二の抗体又はその抗原結合断片は
、配列番号150のN-グリコシル化Asn1806を含み、かつ配列番号150のN-グリコシル化Asn18
00も含むMUC16中のエピトープを認識する。具体的な実施態様において、該第一の抗体又
はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(このMUC16の第一の形態はグリコシル化さ
れており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する
細胞に免疫特異的に結合するその能力;(ii)MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコ
シル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え
発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如;及び(iii)MUC16の第四の形態(この第四
の形態はグリコシル化されており、ここで、該第四の形態のアミノ酸配列は配列番号152
である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力によって同定され、ここ
で、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞、MUC16の該第三の形態を組換え発現する
細胞、及びMUC16の該第四の形態を組換え発現する細胞は同じ細胞型のものであり、かつ
該第二の抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコ
シル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え
発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;及び(ii)MUC16の第五の形態(この第五の
形態はグリコシル化されており、ここで、該第五の形態のアミノ酸配列は配列番号172で
ある)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如によって同定され、ここ
で、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞はMUC16の該第五の形態を組換え発現する
細胞と同じ型の細胞である。
体又はその抗原結合断片である第一の抗体又はその抗原結合断片の治療有効量を含み、こ
こで、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号150のN-グリコシル化Asn1806を含むが、
配列番号150のN-グリコシル化Asn1800を含まないMUC16中のエピトープを認識し、ここで
、該追加の治療剤は、第二の抗体又はその抗原結合断片の治療有効量であり、ここで、該
第二の抗体又はその抗原結合断片は、配列番号150のN-グリコシル化Asn1800を含むが、配
列番号150のN-グリコシル化Asn1806を含まないMUC16中のエピトープを認識する。具体的
な実施態様において、該第一の抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(こ
のMUC16の第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列
は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;(ii)MUC16
の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミ
ノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如
;及び(iii)MUC16の第四の形態(この第四の形態はグリコシル化されており、ここで、該第
四の形態のアミノ酸配列は配列番号152である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合
するその能力によって同定され、ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞、M
UC16の該第三の形態を組換え発現する細胞、及びMUC16の該第四の形態を組換え発現する
細胞は同じ細胞型のものであり、かつ該第二の抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の
第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ
酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;(ii
)MUC16の第三の形態(MUC16のこの第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三
の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合す
るその能力;及び(iii)MUC16の第四の形態(該第四の形態のアミノ酸配列は配列番号152で
ある)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如によって同定され;ここで
、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞、MUC16の該第三の形態を組換え発現する細
胞、及びMUC16の該第四の形態を組換え発現する細胞は同じ細胞型のものである。
であり、ここで、(i)該免疫原性糖ペプチドは、10〜60アミノ酸残基、10〜30アミノ酸残
基、15〜25アミノ酸残基、15〜20アミノ酸残基、又は15〜18アミノ酸残基の長さであり、
かつ(ii)該1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つは、炭水化物と結合している
。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、1つ、2つ、又は3つのグリコシル化
部位を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、炭水化物と結合している
グリコシル化部位を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、炭水化物と
各々結合している2つのグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、該炭水化物は
、N-又はO-結合型炭水化物である。ある実施態様において、該炭水化物は、単糖、二糖、
三糖、四糖、又は五糖である。ある実施態様において、該炭水化物は、二糖である。ある
実施態様において、該二糖は、キトビオースである。
る実施態様において、該糖ペプチドのC末端は、N-メチルカルボキサミド誘導体の形態で
ある。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、免疫原性キャリアタンパク質に
コンジュゲートされている。ある実施態様において、該免疫原性キャリアタンパク質は、
キーホールリンペットヘモシアニンである。
ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと結合しているグリコシ
ル化部位を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと各々
結合している2つのグリコシル化部位を含む。
実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと各々結合している2つのグ
リコシル化部位を含む。
実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと結合しているグリコシル化
部位を含む。
くとも10アミノ酸部分を含み、ここで、該1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1
つは、該アミノ酸配列の部分にある。
。
号129の30番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む。
列番号129の30番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む。
。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと各々結合している配
列番号130の4番目の残基(Asn)及び10番目の残基(Asn)における2つのグリコシル化部位を
含む。
。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと結合している配列番
号131の7番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む。
その抗原結合断片を作製する方法であって、対象を、1以上のグリコシル化部位を含む免
疫原性糖ペプチドで免疫することを含み、ここで、(i)該免疫原性糖ペプチドが、10〜60
アミノ酸残基、10〜30アミノ酸残基、15〜25アミノ酸残基、15〜20アミノ酸残基、又は15
〜18アミノ酸残基の長さであり、(ii)該免疫原性糖ペプチドが該糖タンパク質のアミノ酸
配列の少なくとも10アミノ酸部分を含み、(iii)該1以上のグリコシル化部位のうちの少な
くとも1つが炭水化物と結合しており、かつ(iv)該1以上のグリコシル化部位のうちの少な
くとも1つが該アミノ酸配列の部分にある、方法である。ある実施態様において、該抗体
又はその抗原結合断片は、糖タンパク質の非グリコシル化形態に対する特異的結合を欠い
ている。ある実施態様において、対象は、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ニワトリ、モルモット、
ラット、ウサギ、又はマウスである。ある実施態様において、対象は、ラット、ウサギ、
又はマウスである。ある実施態様において、対象は、マウスである。ある実施態様におい
て、該免疫原性糖ペプチドは、1つ、2つ、又は3つのグリコシル化部位を含む。該免疫原
性糖ペプチドが、炭水化物と結合しているグリコシル化部位を含む、請求項190〜195のい
ずれか一項記載の方法。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、炭水化物と各
々結合している2つのグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、該炭水化物は、N
-又はO-結合型炭水化物である。ある実施態様において、該炭水化物は、単糖、二糖、三
糖、四糖、又は五糖である。ある実施態様において、該炭水化物は、二糖である。ある実
施態様において、該二糖は、キトビオースである。ある実施態様において、該免疫原性糖
ペプチドのN末端は、アセチル化されている。ある実施態様において、該糖ペプチドのC末
端は、N-メチルカルボキサミド誘導体の形態である。ある実施態様において、該免疫原性
糖ペプチドは、免疫原性キャリアタンパク質にコンジュゲートされている。ある実施態様
において、該免疫原性キャリアタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニンである
。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、15〜18アミノ酸残基の長さである。
ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと結合しているグリコシ
ル化部位を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと各々
結合している2つのグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプ
チドは、18アミノ酸残基の長さである。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは
、キトビオースと各々結合している2つのグリコシル化部位を含む。ある実施態様におい
て、該免疫原性糖ペプチドは、15アミノ酸残基の長さである。ある実施態様において、該
免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと結合しているグリコシル化部位を含む。ある実施
態様において、該糖タンパク質は、配列番号150のアミノ酸配列を含む。ある実施態様に
おいて、該免疫原性糖ペプチドは、配列番号129のアミノ酸配列を含む。ある実施態様に
おいて、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと結合している配列番号129の30番目の
残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプ
チドは、Man3GlcNAc2部分と結合している配列番号129の30番目の残基(Asn)におけるグリ
コシル化部位を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、配列番号130の
アミノ酸配列を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと
各々結合している配列番号130の4番目の残基(Asn)及び10番目の残基(Asn)における2つの
グリコシル化部位を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、配列番号13
1のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオー
スと結合している配列番号131の7番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む。
断片であって、本明細書に記載される抗体(例えば、10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6
)のVH、VL、VH CDR、及び/又はVLCDR配列を有するもの、並びにその(例えば、イメージ
ング剤又は細胞毒性剤との)コンジュゲートである。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体が、
(a)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の
形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し、
(b)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二
の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ
(c)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する、
前記抗体又はその抗原結合断片。
(項目2)
前記抗体が、MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠く、項目1記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目3)
抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体が、
(a)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の
形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し、
(b)MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の
形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ
(c)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する、
前記抗体又はその抗原結合断片であり、
(i)MUC16の前記第一の形態を組換え発現する細胞がSKOV3細胞であり;(ii)MUC16の前記
第二の形態を組換え発現する細胞がSKOV3細胞であり;かつ(iii)工程(c)の前記細胞がSKOV3細胞である、項目1記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目4)
(i)MUC16の前記第一の形態を組換え発現する細胞がSKOV3細胞であり;(ii)MUC16の前記
第三の形態を組換え発現する細胞がSKOV3細胞であり;かつ(iii)工程(c)の該細胞がSKOV3
細胞である、項目3記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目5)
(i)MUC16の前記第一の形態を組換え発現する細胞がSKOV3細胞であり;(ii)MUC16の前記
第二の形態を組換え発現する細胞がSKOV3細胞であり;(iii)MUC16の前記第三の形態を組換え発現する細胞がSKOV3細胞であり;かつ(iv)工程(c)の前記細胞がSKOV3細胞である、項目2記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目6)
前記抗体又はその抗原結合断片が、アミノ酸配列
に免疫特異的に結合し、ここで、
のアミノ酸残基番号4(N4)及びアミノ酸残基番号10(N10)がグリコシル化されている、項目1〜5のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目7)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号150のN-グリコシル化アスパラギン1806を
含むエピトープに免疫特異的に結合する、項目1〜6のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目8)
前記抗体又はその抗原結合断片が、アミノ酸配列
に免疫特異的に結合し、ここで、
のアミノ酸残基番号7(N7)がグリコシル化されている、項目1〜7のいずれか一項記載の抗
体又はその抗原結合断片。
(項目9)
前記グリコシル化がN-結合型キトビオースからなる、項目6〜8のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目10)
前記抗体又はその抗原結合断片が、MUC16の前記第一の形態を発現する細胞を該抗体又
は抗原結合断片と接触させたとき、該細胞に内在化される、項目1〜9のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目11)
前記細胞がMUC16の前記第一の形態を組換え発現するSKOV3細胞である、項目10記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目12)
前記抗体が、MUC16のグリコシル化形態を発現する腫瘍の成長を阻害する、項目1〜11のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目13)
前記抗体がモノクローナル抗体である、項目1〜12のいずれか一項記載の抗体又はその
抗原結合断片。
(項目14)
前記抗体又はその抗原結合断片が、
(a)アミノ酸配列
(ここで、X1は、L又はVである)を含むVH相補性決定領域(CDR)1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X2は、E又は非存在であり、かつX3は、Y又はNである)を含むVHCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含む、重鎖可変領域(VH)を含む、項目1〜13のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結
合断片。
(項目15)
前記抗体又はその抗原結合断片が、
(a)アミノ酸配列
(ここで、X8は、N又はSであり、かつX9は、L又はVである)を含むVHCDR1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X10は、E又は非存在である)を含むVHCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含むVH CDR3
を含む、VHを含む、項目1〜13のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目16)
前記抗体又はその抗原結合断片が、
(a)アミノ酸配列
(ここで、X15は、N又はSであり、かつX16は、V又はLである)を含むVHCDR1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X17は、E又は非存在である)を含むVHCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
(ここで、X18は、T、A、又はSである)を含むVHCDR3
を含むVHを含む、項目1〜13のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目17)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号3のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVHを
含む、項目1〜14のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目18)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号9のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVH
を含む、項目1〜13又は15のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目19)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号15のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番
号16のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜13又は16のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目20)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号23のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番
号24のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜14のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目21)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号29のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番
号30のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号31のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜13又は15のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目22)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号35のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番
号36のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号37のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜13又は16のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目23)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号43のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番
号44のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜14のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目24)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号49のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番
号50のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜13又は15のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目25)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号55のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番
号56のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜13又は16のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目26)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号63のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番
号64のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜14のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目27)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号69のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番
号70のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号71のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜13又は15のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目28)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号75のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番
号76のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜13又は16のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目29)
前記抗体が、配列番号83のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列を
含むVHCDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜14のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目30)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号89のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番
号90のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜13又は15のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目31)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号95のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番
号96のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜13又は16のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目32)
前記抗体又はその抗原結合断片が、
(ここで、X21は、T又はNであり、X22は、I又はKであり、X23は、N又はSであり、X24は、V又はLであり、X25は、S又はIであり、X26は、P又はSであり、X27は、E又は非存在であり
、X28は、N又はYであり、X29は、K又はRであり、X30は、A又はDであり、X31は、T又はSであり、X32は、V又はAであり、X33は、G又はDであり、X34は、T、I、又はSであり、かつX35は、T、S、又はAである)というアミノ酸配列を含むVHを含む、項目1〜31のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目33)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号1のアミノ酸配列を含むVHを含む、項目1〜19、又は32のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目34)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号21のアミノ酸配列を含むVHを含む、項目1
〜16、20〜22、又は32のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目35)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号41のアミノ酸配列を含むVHを含む、項目1
〜16、23〜25、又は32のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目36)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号61のアミノ酸配列を含むVHを含む、項目1
〜16、26〜28、又は32のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目37)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号81のアミノ酸配列を含むVHを含む、項目1
〜16又は29〜32のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目38)
前記抗体又はその抗原結合断片が、
(a)アミノ酸配列
(ここで、X4は、R又はLであり、かつX5は、K又はHである)を含むVLCDR1;
(b)アミノ酸配列
を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
(ここで、X6は、G又はSであり、かつX7は、H又はYである)を含むVLCDR3
を含む、軽鎖可変領域(VL)を含む、項目1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目39)
前記抗体又はその抗原結合断片が、
(a)アミノ酸配列
(ここで、X11は、L又はRであり、かつX12は、H又はKである)を含むVLCDR1;
(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:113)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
(ここで、X13は、G又はSであり、かつX14は、H又はYである)を含むVLCDR3
を含む、VLを含む、項目1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目40)
前記抗体又はその抗原結合断片が、
(a)アミノ酸配列
(ここで、X19は、V又はLであり、かつX20は、H又はKである)を含むVLCDR1;
(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:119)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含むVL CDR3
を含む、VLを含む、項目1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目41)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号26のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番
号27のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む
、軽鎖可変領域(VL)を含む、項目1〜38のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片
。
(項目42)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号32のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番
号33のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号34のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む
、VLを含む、項目1〜37又は39のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目43)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号38のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番
号39のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む
、VLを含む、項目1〜37又は40のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目44)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号46のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番
号47のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む
、軽鎖可変領域(VL)を含む、項目1〜38のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片
。
(項目45)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号52のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含む
、VLを含む、項目1〜37又は39のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目46)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号58のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番
号59のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む
、VLを含む、項目1〜37又は40のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目47)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号86のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番
号87のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む
、軽鎖可変領域(VL)を含む、項目1〜38のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片
。
(項目48)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号92のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番
号93のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む
、VLを含む、項目1〜37又は39のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目49)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号98のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番
号99のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む、項目1〜37又は40のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目50)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号6のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含む、軽
鎖可変領域(VL)を含む、項目1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目51)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号12のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番
号13のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む
、VLを含む、項目1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目52)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号18のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番
号19のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む
、VLを含む、項目1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目53)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号66のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番
号67のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号68のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む
、軽鎖可変領域(VL)を含む、項目1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片
。
(項目54)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号72のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番
号73のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号74のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む
、VLを含む、項目1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目55)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号78のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番
号79のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号80のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む
、VLを含む、項目1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目56)
前記抗体又はその抗原結合断片が、
(ここで、X36は、I又はVであり、X37は、P又はSであり、X38は、R又はLであり、X39は、K又はHであり、X40は、R又はKであり、X41は、E又はGであり、X42は、S又はGであり、かつX43は、Y又はHである)というアミノ酸配列を含むVLを含む、項目1〜49のいずれか一項記
載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目57)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号22のアミノ酸配列を含むVLを含む、項目1
〜43のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目58)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号42のアミノ酸配列を含むVLを含む、項目1
〜40、又は44〜46のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目59)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号82のアミノ酸配列を含むVLを含む、項目1
〜40、又は47〜49のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目60)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号2のアミノ酸配列を含むVLを含む、項目1〜37、又は50〜52のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目61)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号62のアミノ酸配列を含むVLを含む、項目1
〜37、又は53〜55のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目62)
MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体又はその抗
原結合断片がVHを含み、このVHが:
(a)アミノ酸配列
(ここで、X1は、LもしくはVである)を含むVHCDR1;アミノ酸配列
(ここで、X2は、Eもしくは非存在であり、かつX3は、YもしくはNである)を含むVHCDR2;
及びアミノ酸配列
を含むVH CDR3;又は
(b)アミノ酸配列
(ここで、X8は、NもしくはSであり、かつX9は、LもしくはVである)を含むVHCDR1;アミノ
酸配列
(ここで、X10は、Eもしくは非存在である)を含むVHCDR2;及びアミノ酸配列
を含むVH CDR3;又は
(c)アミノ酸配列
(ここで、X15は、NもしくはSであり、かつX16は、VもしくはLである)を含むVHCDR1;アミ
ノ酸配列
(ここで、X17は、Eもしくは非存在である)を含むVHCDR2;及びアミノ酸配列
(ここで、X18は、T、A、もしくはSである)を含むVHCDR3;又は
(d)配列番号3のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(e)配列番号9のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVHCDR2
、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(f)配列番号15のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(g)配列番号23のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号24のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(h)配列番号29のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号31のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(i)配列番号35のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号37のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(j)配列番号43のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号44のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(k)配列番号49のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号50のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(l)配列番号55のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号56のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(m)配列番号63のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号64のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(n)配列番号69のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号71のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(o)配列番号75のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号76のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(p)配列番号83のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(q)配列番号89のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号90のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(r)配列番号95のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列を含むVH CDR3
を含む、前記MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片。
(項目63)
MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体又はその抗
原結合断片がVLを含み、このVLが:
(a)アミノ酸配列
(ここで、X4は、RもしくはLであり、かつX5は、KもしくはHである)を含むVLCDR1;アミノ
酸配列
を含むVL CDR2;及びアミノ酸配列
(ここで、X6は、GもしくはSであり、かつX7は、HもしくはYである)を含むVLCDR3;又は
(b)アミノ酸配列
(ここで、X11は、LもしくはRであり、かつX12は、HもしくはKである)を含むVLCDR1;アミ
ノ酸配列YMS (配列番号:113)を含むVL CDR2;及びアミノ酸配列
(ここで、X13は、GもしくはSであり、かつX14は、HもしくはYである)を含むVLCDR3;又は
(c)アミノ酸配列
(ここで、X19は、VもしくはLであり、かつX20は、HもしくはKである)を含むVLCDR1;アミ
ノ酸配列YMS (配列番号:119)を含むVL CDR2;及びアミノ酸配列
を含むVL CDR3;又は
(d)配列番号26のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(e)配列番号32のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号34のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(f)配列番号38のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(g)配列番号46のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号47のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(h)配列番号52のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(i)配列番号58のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号59のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(j)配列番号86のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(k)配列番号92のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号93のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(l)配列番号98のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号99のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(m)配列番号6のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(n)配列番号12のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(o)配列番号18のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(p)配列番号66のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号67のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号68のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(q)配列番号72のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号74のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(r)配列番号78のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号79のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号80のアミノ酸配列を含むVL CDR3
を含む、前記MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片。
(項目64)
MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体又はその抗
原結合断片が:
(a)(i)アミノ酸配列
(ここで、X1は、LもしくはVである)を含むVHCDR1;アミノ酸配列
(ここで、X2は、Eもしくは非存在であり、かつX3は、YもしくはNである)を含むVHCDR2;
及びアミノ酸配列
を含むVH CDR3を含むVH;並びに(ii)アミノ酸配列
(ここで、X4は、RもしくはLであり、かつX5は、KもしくはHである)を含むVLCDR1;アミノ
酸配列
を含むVL CDR2;及びアミノ酸配列
(ここで、X6は、GもしくはSであり、かつX7は、HもしくはYである)を含むVLCDR3
を含むVL;又は
(b)(i)アミノ酸配列
(ここで、X8は、NもしくはSであり、かつX9は、LもしくはVである)を含むVHCDR1;アミノ
酸配列
(ここで、X10は、Eもしくは非存在である)を含むVHCDR2;及びアミノ酸配列
を含むVH CDR3
を含むVH;並びに(ii)アミノ酸配列
(ここで、X11は、LもしくはRであり、かつX12は、HもしくはKである)を含むVLCDR1;アミ
ノ酸配列YMS (配列番号:113)を含むVLCDR2;及びアミノ酸配列
(ここで、X13は、GもしくはSであり、かつX14は、HもしくはYである)を含むVLCDR3を含むVL;又は
(c)(i)アミノ酸配列
(ここで、X15は、NもしくはSであり、かつX16は、VもしくはLである)を含むVHCDR1;アミ
ノ酸配列
(ここで、X17は、Eもしくは非存在である)を含むVHCDR2;及びアミノ酸配列
(ここで、X18は、T、A、もしくはSである)を含むVHCDR3;並びに(ii)アミノ酸配列
(ここで、X19は、VもしくはLであり、かつX20は、HもしくはKである)を含むVLCDR1;アミノ酸配列YMS(配列番号:119)を含むVL CDR2;及びアミノ酸配列
を含むVL CDR3
を含むVL;又は
(d)(i)配列番号23のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号24のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号26のアミ
ノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号28のア
ミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(e)(i)配列番号29のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号31のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号32のアミ
ノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号34のア
ミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(f)(i)配列番号35のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号37のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号38のアミ
ノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号40のア
ミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(g)(i)配列番号43のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号44のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号46のアミ
ノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号47のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号48のア
ミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(h)(i)配列番号49のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号50のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号52のアミ
ノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号54のア
ミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(i)(i)配列番号55のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号56のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号58のアミ
ノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号59のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号60のア
ミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(j)(i)配列番号83のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号86のアミ
ノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号88のア
ミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(k)(i)配列番号89のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号90のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号92のアミ
ノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号93のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号94のア
ミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(l)(i)配列番号95のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH、及び(ii)配列番号98のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号99のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(m)(i)配列番号3のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号6のアミノ酸
配列を含むVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号8のアミノ酸
配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(n)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号12のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号14のアミ
ノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(o)(i)配列番号15のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号18のアミ
ノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号20のア
ミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(p)(i)配列番号63のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号64のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号66のアミ
ノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号67のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号68のア
ミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(q)(i)配列番号69のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号71のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号72のアミ
ノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号74のア
ミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(r)(i)配列番号75のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号76のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号78のアミ
ノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号79のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号80のア
ミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL
を含む、前記MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片。
(項目65)
MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体又はその抗
原結合断片が:
(a)(i)
(ここで、X21は、TもしくはNであり、X22は、IもしくはKであり、X23は、NもしくはSであり、X24は、VもしくはLであり、X25は、SもしくはIであり、X26は、PもしくはSであり、X27は、Eもしくは非存在であり、X28は、NもしくはYであり、X29は、KもしくはRであり、X30は、AもしくはDであり、X31は、TもしくはSであり、X32は、VもしくはAであり、X33は
、GもしくはDであり、X34は、T、I、もしくはSであり、かつX35は、T、S、もしくはAである)というアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)
(ここで、X36は、IもしくはVであり、X37は、PもしくはSであり、X38は、RもしくはLであり、X39は、KもしくはHであり、X40は、RもしくはKであり、X41は、EもしくはGであり、X42は、SもしくはGであり、かつX43は、YもしくはHである)というアミノ酸配列を含むVL;
又は
(b)(i)配列番号1のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号2のアミノ酸配列を含むVL;
(c)(i)配列番号21のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号22のアミノ酸配列を含むVL;又は
(d)(i)配列番号41のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号42のアミノ酸配列を含むVL;又は
(e)(i)配列番号61のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号62のアミノ酸配列を含むVL;又は
(f)(i)配列番号81のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号82のアミノ酸配列を含むVL
を含む、前記MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片。
(項目66)
前記抗体がヒト由来重鎖及び軽鎖定常領域を含む、項目14〜65のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目67)
前記重鎖定常領域が、ガンマ1、ガンマ2、ガンマ3、及びガンマ4からなる群から選択されるアイソタイプを有する、項目66記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目68)
前記軽鎖定常領域が、カッパ及びラムダからなる群から選択されるアイソタイプを有する、項目66又は67記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目69)
前記抗体又はその抗原結合断片がヒト化されている、項目1〜31、38〜55、又は62〜64
のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目70)
前記抗体又はその抗原結合断片が齧歯類抗体のヒト化形態である、項目69記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目71)
前記抗体が、2つの同一の重鎖及び2つの同一の軽鎖を含む免疫グロブリンである、項目1〜70のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目72)
前記免疫グロブリンがIgGである、項目71記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目73)
薬剤にコンジュゲートされている、項目1〜72のいずれか一項記載の抗体又はその抗原
結合断片を含む抗体コンジュゲート。
(項目74)
前記薬剤が、イメージング剤又は細胞毒性剤である、項目73記載の抗体コンジュゲート。
(項目75)
前記抗体又はその抗原結合断片が二重特異性抗体である、項目1〜70のいずれか一項記
載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目76)
前記二重特異性抗体がCD3に免疫特異的に結合する、項目75記載の二重特異性抗体。
(項目77)
前記二重特異性抗体が、MUC16に免疫特異的に結合する免疫グロブリンを含み、ここで
、該免疫グロブリンの軽鎖が、ペプチドリンカーを介して、CD3に免疫特異的に結合する
単鎖可変断片(scFv)にコンジュゲートされている、項目75又は76記載の二重特異性抗体。(項目78)
薬剤にコンジュゲートされた、項目75〜77のいずれか一項記載の二重特異性抗体を含む二重特異性抗体コンジュゲート。
(項目79)
前記薬剤が、イメージング剤又は細胞毒性剤である、項目78記載の二重特異性抗体コンジュゲート。
(項目80)
前記その抗原結合断片がscFvである、項目1〜70のいずれか一項記載の抗体又はその抗
原結合断片。
(項目81)
薬剤にコンジュゲートされた、項目80記載のscFvを含むscFvコンジュゲート。
(項目82)
前記薬剤が、イメージング剤又は細胞毒性剤である、項目81記載のscFvコンジュゲート。
(項目83)
項目1〜72のいずれか一項記載の抗体もしくは抗原結合断片;又は項目80記載のscFv又は項目81もしくは82記載のscFvコンジュゲートを含む、キメラ抗原受容体(CAR)。
(項目84)
抗体重鎖もしくはその抗原結合部分であって、該重鎖もしくはその抗原結合部分がVHを含み、このVHが:
(I)(a)アミノ酸配列
(ここで、X1は、LもしくはVである)を含むVH相補性決定領域(CDR)1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X2は、Eもしくは非存在であり、かつX3は、YもしくはNである)を含むVHCDR2;
及び
(c)アミノ酸配列
を含むVH CDR3;ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されてお
り、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておら
ず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のイ
ンビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する;
又は
(II)(a)アミノ酸配列
(ここで、X8は、NもしくはSであり、かつX9は、LもしくはVである)を含むVHCDR1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X10は、Eもしくは非存在である)を含むVHCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
り、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておら
ず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のイ
ンビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する;
又は
(III)(a)アミノ酸配列
(ここで、X15は、NもしくはSであり、かつX16は、VもしくはLである)を含むVHCDR1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X17は、Eもしくは非存在である)を含むVHCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
(ここで、X18は、T、A、もしくはSである)を含むVHCDR3;ここで、任意に、該抗体重鎖も
しくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配
列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(
この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16
の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する;
又は
(IV)配列番号3のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVHCDR2、
及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその
抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一
の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133
である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139
である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(V)配列番号9のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVHCDR2、
及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一
の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133
である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139
である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VI)配列番号15のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第
一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二
の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一
の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VII)配列番号23のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号24のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第
一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二
の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一
の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VIII)配列番号29のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号31のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくは
その抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この
第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第
二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第
一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(IX)配列番号35のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むVHCDR2
、及び配列番号37のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第
一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二
の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一
の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(X)配列番号43のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号44のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一
の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133
である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139
である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XI)配列番号49のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号50のアミノ酸配列を含むVHCDR2
、及び配列番号51のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第
一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二
の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一
の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XII)配列番号55のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号56のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第
一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二
の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一
の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XIII)配列番号63のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号64のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくは
その抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この
第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第
二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第
一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XIV)配列番号69のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号71のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第
一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二
の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一
の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XV)配列番号75のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号76のアミノ酸配列を含むVHCDR2
、及び配列番号77のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第
一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二
の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一
の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XVI)配列番号83のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第
一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二
の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一
の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XVII)配列番号89のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号90のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この
第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第
二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第
一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XVIII)配列番号95のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列を含むVHCDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この
第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第
二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第
一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する)
を含む、前記抗体重鎖もしくはその抗原結合部分。
(項目85)
抗体重鎖又はその抗原結合部分であって、該重鎖又はその抗原結合部分が:
(I)
(ここで、X21は、TもしくはNであり、X22は、IもしくはKであり、X23は、NもしくはSであり、X24は、VもしくはLであり、X25は、SもしくはIであり、X26は、PもしくはSであり、X27は、Eもしくは非存在であり、X28は、NもしくはYであり、X29は、KもしくはRであり、X30は、AもしくはDであり、X31は、TもしくはSであり、X32は、VもしくはAであり、X33は
、GもしくはDであり、X34は、T、I、もしくはSであり、かつX35は、T、S、もしくはAである)というアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化
されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化さ
れておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する
細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(II)配列番号1のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコ
シル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシ
ル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発
現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(III)配列番号21のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリ
コシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコ
シル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え
発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(IV)配列番号41のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分
を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリ
コシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコ
シル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え
発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(V)配列番号61のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコ
シル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシ
ル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発
現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VI)配列番号81のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分
を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリ
コシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコ
シル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え
発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する)
を含むVHを含む、前記抗体重鎖もしくはその抗原結合部分。
(項目86)
前記抗体重鎖又はその抗原結合部分がヒト由来重鎖定常領域を含む、項目84又は85記載の抗体重鎖又はその抗原結合部分。
(項目87)
前記重鎖又はその抗原結合部分の定常領域が、ガンマ1、ガンマ2、ガンマ3、及びガン
マ4からなる群から選択されるアイソタイプを有する、項目86記載の抗体重鎖又はその抗
原結合部分。
(項目88)
前記抗体重鎖又はその抗原結合部分がヒト化されている、項目85記載の抗体重鎖又はその抗原結合部分。
(項目89)
前記抗体重鎖又はその抗原結合部分が齧歯類重鎖のヒト化形態である、項目88記載の抗体重鎖又はその抗原結合部分。
(項目90)
項目84〜89のいずれか一項記載の抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体重鎖コンジュゲートであって、該抗体重鎖又はその抗原結合部分が薬剤にコンジュゲートされている、前記抗体重鎖コンジュゲート。
(項目91)
前記薬剤が、イメージング剤又は細胞毒性剤である、項目90記載の抗体重鎖コンジュゲート。
(項目92)
抗体軽鎖又はその抗原結合部分であって、該軽鎖又はその抗原結合部分が:
(I)(a)アミノ酸配列
(ここで、X4は、RもしくはLであり、かつX5は、KもしくはHである)を含むVLCDR1;
(b)アミノ酸配列
を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
(ここで、X6は、GもしくはSであり、かつX7は、HもしくはYである)を含むVLCDR3(ここで
、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の
形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の
形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲ
ル浸潤を阻害する);
又は
(II)(a)アミノ酸配列
(ここで、X11は、LもしくはRであり、かつX12は、HもしくはKである)を含むVLCDR1;
(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:113)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
(ここで、X13は、GもしくはSであり、かつX14は、HもしくはYである)を含むVLCDR3(ここ
で、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一
の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二
の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリ
ゲル浸潤を阻害する);
又は
(III)(a)アミノ酸配列
(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:119)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されてお
り、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておら
ず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のイ
ンビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(IV)配列番号6のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVLCDR2、
及び配列番号8のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその
抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一
の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133
である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139
である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(V)配列番号12のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一
の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133
である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139
である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VI)配列番号18のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVLCDR2
、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第
一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二
の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一
の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VII)配列番号26のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第
一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二
の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一
の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VIII)配列番号32のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号34のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくは
その抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この
第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第
二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第
一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VIX)配列番号38のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第
一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二
の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一
の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(X)配列番号46のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号47のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一
の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133
である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139
である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XI)配列番号52のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVLCDR2
、及び配列番号54のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第
一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二
の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一
の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XII)配列番号58のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号59のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第
一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二
の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一
の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XIII)配列番号66のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号67のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号68のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくは
その抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この
第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第
二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第
一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XIV)配列番号72のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号74のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第
一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二
の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一
の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XV)配列番号78のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号79のアミノ酸配列を含むVLCDR2
、及び配列番号80のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第
一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二
の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一
の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XVI)配列番号86のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第
一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二
の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一
の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XVII)配列番号92のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号93のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくは
その抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この
第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第
二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第
一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XVIII)配列番号98のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号99のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列を含むVLCDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしく
はその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(こ
の第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この
第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該
第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する)
を含む、VLを含む、前記抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分。
(項目93)
抗体軽鎖であって、該軽鎖が:
(I)
(ここで、X36は、IもしくはVであり、X37は、PもしくはSであり、X38は、RもしくはLであり、X39は、KもしくはHであり、X40は、RもしくはKであり、X41は、EもしくはGであり、X42は、SもしくはGであり、かつX43は、YもしくはHである)というアミノ酸配列(ここで、
任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形
態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形
態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル
浸潤を阻害する);
又は
(II)配列番号2のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコ
シル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシ
ル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発
現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(III)配列番号22のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリ
コシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコ
シル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え
発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(IV)配列番号42のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分
を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリ
コシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコ
シル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え
発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(V)配列番号62のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコ
シル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシ
ル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VI)配列番号82のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分
を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリ
コシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコ
シル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え
発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する)
を含むVLを含む、前記抗体軽鎖。
(項目94)
前記抗体軽鎖又はその抗原結合部分がヒト由来軽鎖定常領域を含む、項目92又は93記載の抗体軽鎖又はその抗原結合部分。
(項目95)
前記軽鎖又はその抗原結合部分の定常領域が、カッパ及びラムダからなる群から選択されるアイソタイプを有する、項目94記載の抗体軽鎖又はその抗原結合部分。
(項目96)
前記抗体軽鎖又はその抗原結合部分がヒト化されている、項目92記載の抗体軽鎖又はその抗原結合部分。
(項目97)
前記抗体軽鎖又はその抗原結合部分が齧歯類抗体のヒト化形態である、項目96記載の抗体軽鎖又はその抗原結合部分。
(項目98)
薬剤にコンジュゲートされた、項目92〜97のいずれか一項記載の抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体軽鎖コンジュゲート。
(項目99)
前記薬剤が、イメージング剤又は細胞毒性剤である、項目98記載の抗体軽鎖コンジュゲート。
(項目100)
ペプチドリンカーを介してscFvにコンジュゲートされた、項目92〜99のいずれか一項記載の抗体軽鎖を含む融合タンパク質。
(項目101)
前記scFvがCD3に結合する、項目100記載の融合タンパク質。
(項目102)
項目83記載のCARを組換え発現するT細胞。
(項目103)
項目80記載のscFvをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
(項目104)
項目81もしくは82記載のscFvコンジュゲートをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
(項目105)
項目83記載のCARをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
(項目106)
項目84〜89のいずれか一項記載の抗体重鎖をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
(項目107)
項目90又は91記載の抗体重鎖コンジュゲートをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
(項目108)
項目92〜97のいずれか一項記載の抗体軽鎖をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
(項目109)
項目98又は99記載の抗体軽鎖コンジュゲートをコードする核酸配列を含むポリヌクレ
オチド。
(項目110)
項目100又は101記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。(項目111)
(a)項目84〜89のいずれか一項記載の抗体重鎖又は項目90もしくは91記載の抗体重鎖コ
ンジュゲート;及び(b)項目92〜97のいずれか一項記載の抗体軽鎖、項目98もしくは99記載の抗体軽鎖コンジュゲート、又は項目100もしくは101記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
(項目112)
プロモーターに動作可能に連結された項目103〜110のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
(項目113)
(a)第一のプロモーターに動作可能に連結された項目106又は107記載のポリヌクレオチ
ド;及び(b)第二のプロモーターに動作可能に連結された項目108〜110のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
(項目114)
プロモーターに動作可能に連結された項目103〜105のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含むエクスビボ細胞。
(項目115)
プロモーターに動作可能に連結された項目106又は107記載のポリヌクレオチドを含むエクスビボ細胞。
(項目116)
プロモーターに動作可能に連結された項目108〜110のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含むエクスビボ細胞。
(項目117)
項目112記載のベクターを含むエクスビボ細胞。
(項目118)
項目113記載のベクターを含むエクスビボ細胞。
(項目119)
プロモーターに動作可能に連結された項目1〜72のいずれか一項記載の抗体又はその抗
原結合断片をコードする1以上のポリヌクレオチドを含むエクスビボ細胞。
(項目120)
抗体重鎖を産生する方法であって、項目115記載の細胞を、前記ポリヌクレオチドが該
細胞によって発現されて、該ポリヌクレオチドによってコードされる該抗体重鎖又は抗体重鎖コンジュゲートを産生するような条件下で培養することを含む、前記方法。
(項目121)
抗体軽鎖を産生する方法であって、項目116記載の細胞を、前記ポリヌクレオチドが該
細胞によって発現されて、該ポリヌクレオチドによってコードされる前記抗体軽鎖、抗体軽鎖コンジュゲート、又は融合タンパク質を産生するような条件下で培養することを含む、前記方法。
(項目122)
抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、項目118記載のエクスビボ細胞を
、前記第一のプロモーターに動作可能に連結されたポリヌクレオチド及び前記第二のプロモーターに動作可能に連結されたポリヌクレオチドが該細胞によって発現されて、(i)該
ポリヌクレオチドによってコードされる前記抗体重鎖又は前記抗体重鎖コンジュゲート;
及び(ii)該ポリヌクレオチドによってコードされる前記抗体軽鎖、前記抗体軽鎖コンジュゲート、又は前記融合タンパク質を産生するような条件下で培養することを含む、前記方法。
(項目123)
項目1〜72のいずれか一項記載の抗体もしくはその抗原結合断片、項目73もしくは74記
載の抗体コンジュゲート、項目75〜77のいずれか一項記載の二重特異性抗体、項目78もしくは79記載の二重特異性抗体コンジュゲート、項目80記載のscFv、項目81もしくは82記載のscFvコンジュゲート、項目83記載のCAR、項目84〜89のいずれか一項記載の抗体重鎖、
項目90もしくは91記載の抗体重鎖コンジュゲート、項目92〜97のいずれか一項記載の抗体軽鎖、項目98もしくは99記載の抗体軽鎖コンジュゲート、項目100もしくは101記載の融合タンパク質、又は項目102記載のT細胞の治療有効量;及び医薬として許容し得る担体:を含む医薬組成物。
(項目124)
それを必要としている患者の癌を治療する方法であって、該患者に項目123記載の医薬
組成物を投与することを含む、前記方法。
(項目125)
前記癌が、肺、膵臓、乳房、子宮、卵管、又は原発性腹膜の癌である、項目124記載の
方法。
(項目126)
前記癌が卵巣の癌である、項目124又は125記載の方法。
(項目127)
前記患者がヒト患者である、項目124〜126のいずれか一項記載の方法。
(項目128)
前記方法が、追加の治療剤の治療有効量を前記患者に投与することをさらに含む、項目124〜127のいずれか一項記載の方法。
(項目129)
前記医薬組成物が、項目1〜72のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片である
第一の抗体の治療有効量を含み、ここで、該抗体又はその抗原結合断片が、配列番号150
のN-グリコシル化Asn1806を含むが、配列番号150のN-グリコシル化Asn1800を含まないMUC16中のエピトープを認識し;ここで、前記追加の治療剤が、第二の抗体又はその抗原結合
断片であり、ここで、該第二の抗体又はその抗原結合断片が、配列番号150のN-グリコシ
ル化Asn1806を含み、かつ配列番号150のN-グリコシル化Asn1800も含むMUC16中のエピトープを認識する、項目128記載の方法。
(項目130)
前記第一の抗体又はその抗原結合断片が、(i)MUC16の第一の形態(このMUC16の第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133であ
る)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;(ii)MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如;及び(iii)MUC16の
第四の形態(この第四の形態はグリコシル化されており、ここで、該第四の形態のアミノ
酸配列は配列番号152である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力によって同定され;ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞、MUC16の該第三の形
態を組換え発現する細胞、及びMUC16の該第四の形態を組換え発現する細胞が同じ細胞型
のものであり、かつ
前記第二の抗体又はその抗原結合断片が、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグ
リコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;及び(ii)MUC16の第五の形態(この第
五の形態はグリコシル化されており、ここで、該第五の形態のアミノ酸配列は配列番号172である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如によって同定され、ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞がMUC16の該第五の形態を組換え発現する細胞と同じ型の細胞である、項目129記載の方法。
(項目131)
前記医薬組成物が、項目1〜72のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片である
第一の抗体又はその抗原結合断片の治療有効量を含み、ここで、該抗体又はその抗原結合断片が、配列番号150のN-グリコシル化Asn1806を含むが、配列番号150のN-グリコシル化Asn1800を含まないMUC16中のエピトープを認識し;ここで、前記追加の治療剤が、第二の抗体又はその抗原結合断片の治療有効量であり、ここで、該第二の抗体又はその抗原結合断片が、配列番号150のN-グリコシル化Asn1800を含むが配列番号150のN-グリコシル化Asn1806を含まないMUC16中のエピトープを認識する、項目128記載の方法。
(項目132)
前記第一の抗体又はその抗原結合断片が、(i)MUC16の第一の形態(このMUC16の第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133であ
る)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;(ii)MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如;及び(iii)MUC16の
第四の形態(この第四の形態はグリコシル化されており、ここで、該第四の形態のアミノ
酸配列は配列番号152である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力によって同定され、ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞、MUC16の該第三の形態を組換え発現する細胞、及びMUC16の該第四の形態を組換え発現する細胞が同じ細胞型
のものであり、かつ
前記第二の抗体又はその抗原結合断片が、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグ
リコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;(ii)MUC16の第三の形態(MUC16のこの第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;及び(iii)MUC16の第
四の形態(この第四の形態はグリコシル化されており、ここで、該第四の形態のアミノ酸
配列は配列番号152である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如によって同定され;ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞、MUC16の該第三の形
態を組換え発現する細胞、及びMUC16の該第四の形態を組換え発現する細胞が同じ細胞型
のものである、項目131記載の方法。
(項目133)
1以上のグリコシル化部位を含む免疫原性糖ペプチドであって、(i)該免疫原性糖ペプチドが、10〜60アミノ酸残基、10〜30アミノ酸残基、15〜25アミノ酸残基、15〜20アミノ酸残基、又は15〜18アミノ酸残基の長さであり、かつ(ii)該1以上のグリコシル化部位のう
ちの少なくとも1つが炭水化物と結合している、前記免疫原性糖ペプチド。
(項目134)
1つ、2つ、又は3つのグリコシル化部位を含む、項目133記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目135)
炭水化物と結合しているグリコシル化部位を含む、項目133記載の免疫原性糖ペプチド
。
(項目136)
炭水化物と各々結合している2つのグリコシル化部位を含む、項目133記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目137)
前記炭水化物がN-又はO-結合型炭水化物である、項目133〜136のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目138)
前記炭水化物が、単糖、二糖、三糖、四糖、又は五糖である、項目133〜137のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目139)
前記炭水化物が二糖である、項目133〜137のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目140)
前記二糖がキトビオースである、項目139記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目141)
前記免疫原性糖ペプチドのN末端がアセチル化されている、項目133〜140のいずれか一
項記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目142)
前記糖ペプチドのC末端がN-メチルカルボキサミド誘導体の形態である、項目133〜141
のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目143)
免疫原性キャリアタンパク質にコンジュゲートされている、項目133〜142のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目144)
前記免疫原性キャリアタンパク質がキーホールリンペットヘモシアニンである、項目143記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目145)
15〜18アミノ酸残基の長さである、項目133〜144のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目146)
キトビオースと結合しているグリコシル化部位を含む、項目145記載の免疫原性糖ペプ
チド。
(項目147)
キトビオースと各々結合している2つのグリコシル化部位を含む、項目145記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目148)
18アミノ酸残基の長さである、項目133〜144のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目149)
キトビオースと各々結合している2つのグリコシル化部位を含む、項目148記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目150)
15アミノ酸残基の長さである、項目133〜144のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目151)
キトビオースと結合しているグリコシル化部位を含む、項目150記載の免疫原性糖ペプ
チド。
(項目152)
配列番号150のアミノ酸配列の少なくとも10アミノ酸部分を含み、ここで、前記1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つが該アミノ酸配列の部分にある、項目133〜151
のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目153)
配列番号129のアミノ酸配列を含む、項目152記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目154)
キトビオースと結合している配列番号129の30番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む、項目153記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目155)
Man3GlcNAc2部分と結合している配列番号129の30番目の残基(Asn)におけるグリコシル
化部位を含む、項目153記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目156)
配列番号130のアミノ酸配列を含む、項目152記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目157)
キトビオースと各々結合している配列番号130の4番目の残基(Asn)及び10番目の残基(Asn)における2つのグリコシル化部位を含む、項目156記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目158)
配列番号131のアミノ酸配列を含む、項目152記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目159)
キトビオースと結合している配列番号131の7番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部
位を含む、項目158記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目160)
糖タンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、対象を、1以上のグリコシル化部位を含む免疫原性糖ペプチドで免疫することを含み、こ
こで、(i)該免疫原性糖ペプチドが、10〜60アミノ酸残基、10〜30アミノ酸残基、15〜25
アミノ酸残基、15〜20アミノ酸残基、又は15〜18アミノ酸残基の長さであり;(ii)該免疫
原性糖ペプチドが、該糖タンパク質アミノ酸配列の少なくとも10アミノ酸部分を含み;(iii)該1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つが炭水化物と結合しており;かつ(iv)該1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つが該アミノ酸配列の部分にある、前
記方法。
(項目161)
前記抗体又はその抗原結合断片が、前記糖タンパク質の非グリコシル化形態に対する特異的結合を欠いている、項目160記載の方法。
(項目162)
前記対象が、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ニワトリ、モルモット、ラット、ウサギ、又はマウスである、項目160又は161のいずれか一項記載の方法。
(項目163)
前記対象が、ラット、ウサギ、又はマウスである、項目160又は161のいずれか一項記載の方法。
(項目164)
前記対象がマウスである、項目160又は161のいずれか一項記載の方法。
(項目165)
前記免疫原性糖ペプチドが、1つ、2つ、又は3つのグリコシル化部位を含む、項目160〜164のいずれか一項記載の方法。
(項目166)
前記免疫原性糖ペプチドが、炭水化物と結合しているグリコシル化部位を含む、項目160〜164のいずれか一項記載の方法。
(項目167)
前記免疫原性糖ペプチドが、炭水化物と各々結合している2つのグリコシル化部位を含
む、項目160〜164のいずれか一項記載の方法。
(項目168)
前記炭水化物がN-又はO-結合型炭水化物である、項目160〜167のいずれか一項記載の方法。
(項目169)
前記炭水化物が、単糖、二糖、三糖、四糖、又は五糖である、項目160〜168のいずれか一項記載の方法。
(項目170)
前記炭水化物が二糖である、項目160〜168のいずれか一項記載の方法。
(項目171)
前記二糖がキトビオースである、項目170記載の方法。
(項目172)
前記免疫原性糖ペプチドのN末端がアセチル化されている、項目160〜171のいずれか一
項記載の方法。
(項目173)
前記糖ペプチドのC末端がN-メチルカルボキサミド誘導体の形態である、項目160〜172のいずれか一項記載の方法。
(項目174)
免疫原性キャリアタンパク質にコンジュゲートされている、項目160〜173のいずれか一項記載の方法。
(項目175)
前記免疫原性キャリアタンパク質がキーホールリンペットヘモシアニンである、項目174記載の方法。
(項目176)
前記免疫原性糖ペプチドが、15〜18アミノ酸残基の長さである、項目160〜175のいずれか一項記載の方法。
(項目177)
前記免疫原性糖ペプチドが、キトビオースと結合しているグリコシル化部位を含む、項目176記載の方法。
(項目178)
前記免疫原性糖ペプチドが、キトビオースと各々結合している2つのグリコシル化部位
を含む、項目176記載の方法。
(項目179)
前記免疫原性糖ペプチドが18アミノ酸残基の長さである、項目160〜175のいずれか一項記載の方法。
(項目180)
前記免疫原性糖ペプチドが、キトビオースと各々結合している2つのグリコシル化部位
を含む、項目179記載の方法。
(項目181)
前記免疫原性糖ペプチドが15アミノ酸残基の長さである、項目160〜175のいずれか一項記載の方法。
(項目182)
前記免疫原性糖ペプチドが、キトビオースと結合しているグリコシル化部位を含む、項目181記載の方法。
(項目183)
前記糖タンパク質が配列番号150のアミノ酸配列を含む、項目160〜182のいずれか一項
記載の方法。
(項目184)
前記免疫原性糖ペプチドが配列番号129のアミノ酸配列を含む、項目183記載の方法。
(項目185)
前記免疫原性糖ペプチドが、キトビオースと結合している配列番号129の30番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む、項目184記載の方法。
(項目186)
前記免疫原性糖ペプチドが、Man3GlcNAc2部分と結合している配列番号129の30番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む、項目184記載の方法。
(項目187)
前記免疫原性糖ペプチドが配列番号130のアミノ酸配列を含む、項目183記載の方法。
(項目188)
前記免疫原性糖ペプチドが、キトビオースと各々結合している配列番号130の4番目の残基(Asn)及び10番目の残基(Asn)における2つのグリコシル化部位を含む、項目187記載の方法。
(項目189)
前記免疫原性糖ペプチドが配列番号131のアミノ酸配列を含む、項目183記載の方法。
(項目190)
前記免疫原性糖ペプチドが、キトビオースと結合している配列番号131の7番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む、項目189記載の方法。
提供されるのは、抗体及びその抗原結合断片、並びにそのような抗体もしくは断片を含
むポリペプチド、例えば、融合タンパク質、コンジュゲート、及び/又はキメラ抗原受容
体、並びにこれら発現する細胞である。該抗体及び断片の中に、MUC16タンパク質のエピ
トープに特異的に結合するものがある。そのような抗体は、本明細書において、「MUC16
グリコシル化抗体」と呼ばれる。そのようなエピトープは、典型的には、MUC16分子、通
常、MUC16の非放出形態の細胞外部分の内部又は実質的に内部にあるエピトープであり;い
くつかの実施態様において、該エピトープは、MUC16のタンデムリピート領域及び/もしく
はMUC16の分泌形態の内部にあることも、該抗体もしくは断片が、MUC16のタンデムリピー
ト領域及び/もしくはMUC16の分泌形態に結合することもない。いくつかの実施態様におい
て、該エピトープは、MUC16c114の内部にあるか、又はMUC16c114の内部の残基を含み、典
型的には、その中に1以上のグリコシル化残基又はグリコシル化部位を含む。いくつかの
実施態様において、該エピトープは、1以上のグリコシル化部位、例えば、N-グリコシル
化の部位を含む。いくつかの態様において、該エピトープは、配列番号150に示されるMUC
16配列(及び/又はそのグリコシル化形態)のAsn1806又はAsn1800に対応するアスパラギン
残基を含み;いくつかの態様において、該エピトープは、配列番号150のAsn1806に対応す
るアスパラギン残基を含むが、配列番号150のAsn1800に対応するアスパラギン残基を含ま
ず;いくつかの態様において、該エピトープは、配列番号150のAsn1800に対応するアスパ
ラギン残基を含むが、配列番号150のAsn1806に対応するアスパラギン残基を含まない。そ
のような実施態様のいずれかのいくつかにおいて、そのような1以上のアスパラギンは、
グリコシル化されており、例えば、N-グリコシル化されている。いくつかの実施態様にお
いて、該抗体又は断片は、配列番号131の内部のエピトープもしくは配列番号131の内部の
残基を含むエピトープに結合するか;配列番号130の内部のエピトープもしくは配列番号13
0の内部の残基を含むエピトープに結合するか、又はこれらの組合せであり;いくつかの実
施態様において、該抗体又は断片は、配列番号168に対応するMUC16の領域内でも、配列番
号168の残基2〜19の内部にあるMUC16の領域内でも免疫特異的に結合しない。
はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)
を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態は
グリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)
を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を
組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する抗体(例えば、モノクロ
ーナル抗体)及びその抗原結合断片である。別の態様において、本明細書に提供されるの
は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一
の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し
;(ii)MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の
形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合
を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲ
ル浸潤を阻害する抗体(例えば、モノクローナル抗体)及びその抗原結合断片である。好ま
しい実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体及びその抗原結合
断片は、配列番号150のアミノ酸残基1806(Asn1806)を含むエピトープに免疫特異的に結合
し、ここで、Asn1806はN-グリコシル化されている(本明細書において「Asn1806グリコシ
ル化」と呼ばれる)。本明細書の第6節の実施例で示されているように、Asn1806グリコシ
ル化は、MUC16によって媒介される腫瘍細胞の浸潤及び成長にとって不可欠である。した
がって、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体及びその抗原結合断片は、そのよ
うな腫瘍細胞の浸潤及び成長を結合遮断することができる。
るのに、N-グリコシル化Asn1806の他に、N-グリコシル化Asn1800を必要とする(すなわち
、両方のN-グリコシル化部位は、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片によって
認識されるエピトープの一部である)。「Asn1800」は、配列番号150のアミノ酸残基1800
を指す。そのようなMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の
形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列
は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;及び(ii)M
UC16の第五の形態(この第五の形態はグリコシル化されており、ここで、該第五の形態の
アミノ酸配列は配列番号172である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の
欠如によって同定されることができ、ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細
胞は、MUC16の該第五の形態を組換え発現する細胞と同じ細胞型である。
るのに、N-グリコシル化Asn1806を必要とするが、N-グリコシル化Asn1800を必要としない
(すなわち、N-グリコシル化Asn1806は、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片に
よって認識されるエピトープの一部であるが、N-グリコシル化Asn1800は、MUC16グリコシ
ル化抗体又はその抗原結合断片によって認識されるエピトープの一部ではない)。そのよ
うなMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の
形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133で
ある)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;(ii)MUC16の第三の形態(こ
の第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番
号139である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如;及び(iii)MUC16
の第四の形態(この第四の形態はグリコシル化されており、ここで、該第四の形態のアミ
ノ酸配列は配列番号152である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力に
よって同定されることができ;かつ(iii)ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する
細胞、MUC16の該第三の形態を組換え発現する細胞、及びMUC16の該第四の形態を組換え発
現する細胞は、同じ細胞型のものである。
16c114とも呼ばれ、成熟MUC16のC末端の114アミノ酸残基からなる(配列番号150は成熟MUC
16の配列である)。MUC16c114は、配列番号133の位置1、24、及び30のアスパラギンアミノ
酸残基(配列番号150のアミノ酸位置Asn1777、Asn1800、及びAsn1806に対応する)でN-グリ
コシル化されることができる。
16c114-N3とも呼ばれる。MUC16c114-N3は、アミノ酸位置30のアスパラギン(配列番号150
のアミノ酸位置1806に対応する)がアラニンに突然変異させられていることを除いて、成
熟MUC16(配列番号150は成熟MUC16の配列である)のC末端の114アミノ酸残基からなる。し
たがって、MUC16c114-N3は、配列番号139のアミノ酸位置30(配列番号150のアミノ酸位置A
sn1806に対応する)でN-グリコシル化されることができない。
16c114-N2とも呼ばれる。MUC16c114-N2は、アミノ酸位置24のアスパラギン(配列番号150
のアミノ酸位置Asn1800に対応する)がアラニンに突然変異させられていることを除いて、
成熟MUC16(配列番号150は成熟MUC16の配列である)のC末端の114アミノ酸残基からなる。
したがって、MUC16c114-N2は、配列番号152のアミノ酸位置24(配列番号150のアミノ酸位
置Asn1800に対応する)でN-グリコシル化されることができない。
16c114-N23とも呼ばれる。MUC16c114-N23は、アミノ酸位置24及び30のアスパラギン(配列
番号150のアミノ酸位置Asn1800及びAsn1806に対応する)がアラニンに突然変異させられて
いることを除いて、成熟MUC16(配列番号150は成熟MUC16の配列である)のC末端の114アミ
ノ酸残基からなる。したがって、MUC16c114-N23は、配列番号157のアミノ酸位置24及び30
(配列番号150のアミノ酸位置Asn1800及びAsn1806に対応する)でN-グリコシル化されるこ
とができない。
MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態
はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)
を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態は
グリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)
を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を
組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。また本明細書に提供さ
れるのは、そのような抗体及びその抗原結合断片、重鎖、又は軽鎖をコードする核酸配列
(例えば、相補的DNA(cDNA))を含むポリヌクレオチド(例えば、単離されたポリヌクレオチ
ド)である。さらに提供されるのは、そのような抗体及びその抗原結合断片、重鎖、又は
軽鎖をコードする核酸配列(例えば、相補的DNA(cDNA))を含むポリヌクレオチド(例えば、
単離されたポリヌクレオチド)を含むベクター(例えば、発現ベクター)及び細胞(例えば、
単離された細胞又はエクスビボ細胞)である。また提供されるのは、そのような抗体、そ
の抗原結合断片、重鎖、軽鎖、ベクター、及び細胞を作製する方法である。他の態様にお
いて、本明細書に提供されるのは、MUC16活性及び/もしくはMUC16駆動性腫瘍成長のため
の、又は本明細書に記載される特定の疾病もしくは障害を治療もしくは管理する、例えば
、癌を治療もしくは管理するための方法及び使用である。関連組成物(例えば、医薬組成
物)、キット、及び診断方法も提供される。
ド」という用語は、YinBW及びLloyd KOの文献、2001, J Biol Chem. 276(29):27371-5に
記載されているようなMUC16繋留型ムチンタンパク質を指す。GenBank(商標)アクセッショ
ン番号NM_024690.2(配列番号137)は、例示的なヒトMUC16核酸配列を提供している。GenBa
nk(商標)アクセッション番号NP_078966.2(配列番号136)は、例示的なヒトMUC16アミノ酸
配列を提供している。ネイティブのMUC16は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、推定切
断部位の近位にあるエクトドメイン、及び各々156アミノ酸長の12〜20回反復する大きい
高度グリコシル化領域を含む(図1A)。「未成熟」MUC16は、配列番号136を指し、これは、
MUC16シグナル配列(配列番号136のアミノ酸残基1〜60)を含む。「成熟MUC16」は、細胞表
面に発現される、すなわち、シグナル配列が細胞プロセシングによって除去されている、
ネイティブのMUC16、例えば、配列番号150を指し、この場合、配列番号136の最初の60ア
ミノ酸残基は除去されている(すなわち、配列番号136はMUC16の「未成熟」形態である)。
に使用され、(iii)19C11と19C11.H6は互換的に使用され、(iv)7B12と7B12.B3は互換的に
使用される。抗体サブクローン(すなわち、18C6.D12、10C6.E4、19C11.H6、及び7B12.B3)
は、第6節に記載される実験で使用された。
MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片としては、例えば、モノクローナル抗体
、ポリクローナル抗体、組換え産生抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体(二重特異性
抗体を含む)、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、2つの重
鎖分子と2つの軽鎖分子を含む四量体抗体、抗体軽鎖単量体、抗体重鎖単量体、抗体軽鎖
二量体、抗体重鎖二量体、抗体軽鎖−抗体重鎖対、イントラボディ、単一ドメイン抗体、
一価抗体、単鎖抗体もしくは単鎖可変断片(scFv)、ラクダ化抗体、アフィボディ、及びジ
スルフィド連結Fv(dsFv)、又はこれらの断片を挙げることができる。そのような抗体は、
当技術分野で公知の方法によって作製することができる。
ば、2つの異なる抗原、同じ抗原上の2つの異なるエピトープ、又はハプテンと抗原もしく
はエピトープに同時に結合することができる抗体又はその断片を指す。1つの特異性は、
例えば、B細胞、T細胞、骨髄細胞、形質細胞、又は肥満細胞の抗原又はエピトープ、例え
ば、CD3などに対するものであり得る。別の特異性は、同じ又は異なる細胞型上の異なる
抗原、例えば、MUC16などに対するものであり得る。多重特異性多価抗体は、複数の結合
部位を有するコンストラクトであり、これらの結合部位は異なる特異性のものであり、こ
れには、例えば、一方の結合部位が1つの抗原と反応し、他方が別の抗原と反応する二重
特異性ダイアボディがある。
抗体である。二重特異性抗体(bsAb)及び二重特異性抗体断片(bsFab)は、第一の標的、例
えば、MUC16に免疫特異的に結合する少なくとも1つのアームと、第二の標的、例えば、CD
3などに免疫特異的に結合する少なくとも1つの他のアームを有する。種々の二重特異性融
合タンパク質を、分子工学を用いて産生することができる。1つの形態において、二重特
異性融合タンパク質は二価であり、例えば、(i)1つの抗原に対する単一の結合部位を有す
るscFv及び(ii)第二の抗原に対する単一の結合部位を有する抗体又はFab断片からなる。
別の形態において、二重特異性融合タンパク質は四価であり、例えば、1つの抗原に対す
る2つの結合部位を有するIgG及び第二の抗原に対する2つの同一のscFvからなる。例えば
、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、国際公開WO 2011/1160119号を参照され
たい。
アイソタイプよりも強く架橋するように、追加のシステイン残基を有する人為的に作製さ
れた組換えモノクローナル抗体の使用を含む。例えば、FitzGeraldらの文献、Protein En
g.10(10):1221-1225, 1997を参照されたい。別の手法は、必要とされる二重特異性を有
する2以上の異なる単鎖抗体又は抗体断片セグメントを連結している組換え融合タンパク
質を人為的に作製することである。例えば、Colomaらの文献、Nature Biotech. 15:159-1
63, 1997を参照されたい。種々の二重特異性融合タンパク質を、分子工学を用いて産生す
ることができる。
の方法で産生することができる。組換え法を用いて、種々の融合タンパク質を産生するこ
とができる。ある態様において、柔軟なリンカーは、scFv(例えば、CD3を標的とするscFv
)をモノクローナル抗体(例えば、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体;第5.1節
を参照)の軽鎖の定常領域に接続する。重鎖FcとscFvとのインフレーム接続に必要な適当
なリンカー配列をPCR反応を介してVL及びVカッパドメインに導入する。その後、scFvをコ
ードするDNA断片を、CHIドメインをコードするDNA配列を含むステージングベクターにラ
イゲーションする。得られるコンストラクトを切り出し、抗体(例えば、MUC16グリコシル
化抗体)のVH領域をコードするDNA配列を含むベクターにライゲーションする。得られるベ
クターを用いて、二重特異性融合タンパク質の発現のための適当な宿主細胞、例えば、哺
乳動物細胞をトランスフェクトすることができる。
及びその断片を用いて、ダイアボディとも呼ばれる機能的な二重特異性単鎖抗体(bscAb)
を調製することもでき、かつ組換え法を用いて哺乳動物細胞で産生することができる。例
えば、引用により本明細書中に組み込まれる、Mackらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci.,
92: 7021-7025,1995を参照されたい。例えば、bscAbは、組換え法を用いてグリシン-セ
リンリンカーを介して2つの単鎖Fv断片を繋げることにより産生することができる。対象
となる2つの抗体のVL及びVHドメインは、当技術分野で公知の標準的なPCR法を用いて単離
される。二重特異性単鎖抗体及び二重特異性融合タンパク質は、本発明の範囲内に含まれ
る。
合断片はscFvを指す。scFvは、当技術分野で認められている用語である。scFvは、免疫グ
ロブリンの重鎖の可変領域(VH)及び軽鎖の可変領域(VL)の融合タンパク質を含み、ここで
、該融合タンパク質は、全免疫グロブリンと同じ抗原特異性を保持している。VHは、ペプ
チドリンカーを介してVLに融合している。ある実施態様において、ペプチドリンカーは、
5〜25、5〜15、10〜20、10〜15、又は15〜25アミノ酸残基の長さである。ある実施態様に
おいて、scFvペプチドリンカーは、当業者に公知のペプチドリンカーに好適な1以上の特
徴を示す。ある実施態様において、scFvペプチドリンカーは、該scFvペプチドリンカーの
可溶性を可能にする、例えば、セリン及びトレオニンなどのアミノ酸を含む。ある実施態
様において、scFvペプチドリンカーは、該scFvペプチドリンカーの柔軟性を可能にする、
例えば、グリシンなどのアミノ酸を含む。ある実施態様において、scFvペプチドリンカー
は、VHのN末端をVLのC末端に接続する。ある実施態様において、scFvペプチドリンカーは
、VHのC末端をVLのN末端に接続することができる。
合断片は、キメラ抗原受容体(CAR)を指す。CARは、当技術分野で認められている用語であ
る。CARは、腫瘍関連抗原(例えば、MUC16)を標的とすることができる。本明細書に提供さ
れるCARは、典型的には、MUC16グリコシル化抗体に由来するscFv、いくつかの実施態様に
おいて、T細胞共刺激分子由来膜貫通ドメイン(例えば、CD28、CD8、CD38、OX-40、又は4-
1BBに由来する膜貫通ドメイン)である膜貫通ドメイン、及び一次シグナル伝達ドメイン、
例えば、T細胞受容体(TCR)ゼータ(ζ)鎖の細胞質シグナル伝達ドメインから構成される。
いくつかの実施態様において、CARは、1以上の追加の領域又はドメイン、例えば、1以上
のスペーサー又はリンカーをさらに含み、これには、細胞外スペーサー、例えば、抗体又
は他の細胞表面分子に由来するスペーサー、例えば、抗体のCH2、CH3、及び/もしくはヒ
ンジ領域のうちの1つもしくは複数を含有するスペーサー、又はCD28分子もしくはCD8分子
に由来するスペーサー、又は他のスペーサーが含まれる。また本明細書に提供されるのは
、細胞、例えば、そのようなCARを発現するように改変されたT細胞、例えば、そのような
CARを組換え発現するものである。CARを発現するT細胞は、MUC16発現腫瘍を認識したとき
、好ましくは、T細胞の活性化、増殖、及び/又はそのような腫瘍の細胞の溶解を誘導する
。
M、IgD、IgA、もしくはIgY)、任意のクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、も
しくはIgA2)、又は任意のサブクラス(例えば、IgG2aもしくはIgG2b)のものであることが
できる。ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、IgG抗体又はそのクラス
もしくはサブクラスである。ある実施態様において、本明細書に記載される抗体はIgG1抗
体である。ある実施態様において、本明細書に記載される抗体はIgG2抗体である。ある実
施態様において、本明細書に記載される抗体はIgG2a抗体である。ある実施態様において
、本明細書に記載される抗体はIgG2b抗体である。ある実施態様において、本明細書に記
載される抗体は、IgG2a抗体とIgG2b抗体の混合物である。具体的な実施態様において、該
抗体は、齧歯類モノクローナル抗体のヒト化形態である。
抗原は、グリコシル化されているMUC16の形態であり、例えば、ここで、MUC16の該形態の
アミノ酸配列は配列番号133である。配列番号133のアミノ酸配列によってコードされるタ
ンパク質は、本明細書において、MUC16c114とも呼ばれ、成熟MUC16のC末端の114アミノ酸
残基からなる。MUC16c114は、配列番号133の位置1、24、及び30のアスパラギンアミノ酸(
配列番号150のアミノ酸位置Asn1777、Asn1800、及びAsn1806に対応する)でN-グリコシル
化されることができる。成熟MUC16(配列番号150)は、シグナル配列が除去されており、か
つ該シグナル配列が配列番号136の最初の60アミノ酸残基からなる全長MUC16を指す(すな
わち、配列番号136はMUC16の「未成熟」形態である)。
その特異性をMUC16グリコシル化抗体に付与するアミノ酸残基(例えば、相補性決定領域(C
DR))を含むMUC16グリコシル化抗体の部分であることができる。MUC16グリコシル化抗体は
、任意の動物種、例えば、齧歯類(例えば、マウス、ラット、又はハムスター)及びヒトに
由来することができる。
使用され、かつ当技術分野で一般的である。可変領域は、典型的には、抗体間で配列が広
範囲にわたって異なり、かつその特定の抗原に対する特定の抗体の結合及び特異性におい
て使用される、抗体の部分、通常、軽鎖又は重鎖の部分、典型的には、成熟重鎖のほぼア
ミノ末端の110〜120アミノ酸及び成熟軽鎖のほぼアミノ末端の90〜100アミノ酸を指す。
配列のばらつきは、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる領域に集中しており、一方、可変ド
メイン中のより高度に保存された領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる。CDRの両
側に、FRが配置されている。通常、CDR及びFRの空間的配向は、N末端からC末端の方向に
、次の通りである:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。任意の特定の機構又は理論に束縛
されることを望むものではないが、軽鎖及び重鎖のCDRは、抗原との抗体の相互作用及び
特異性に主に関与していると考えられる。ある実施態様において、可変領域は、齧歯類(
例えば、マウス又はラット)可変領域である。ある実施態様において、可変領域は、ヒト
可変領域である。ある実施態様において、可変領域は、齧歯類(例えば、マウス又はラッ
ト)CDR及びヒトフレームワーク領域(FR)を含む。特定の実施態様において、可変領域は、
霊長類(例えば、非ヒト霊長類)可変領域である。ある実施態様において、可変領域は、齧
歯類又はマウスCDR及び霊長類(例えば、非ヒト霊長類)フレームワーク領域(FR)を含む。
MGT、並びに例示的定義が含まれる。Kabat定義は、配列のばらつきに基づくものである(K
abat、Elvin A.らの文献、免疫学的対象となるタンパク質の配列(Sequencesof Proteins
ofImmunological Interest). Bethesda: National Institutes of Health, 1983)。Kab
at付番体系に関して、(i)VHCDR1は、典型的には、アミノ酸位置35に続く1つ又は2つの追
加のアミノ酸(Kabat付番スキームにおいて35A及び35Bと呼ばれる)を任意に含むことがで
きる重鎖のアミノ酸位置31〜35に存在し;(ii)VH CDR2は、典型的には、重鎖のアミノ酸位
置50〜65に存在し;かつ(iii)VHCDR2は、典型的には、重鎖のアミノ酸位置95〜102に存在
する(Kabat,Elvin A.らの文献、免疫学的対象となるタンパク質の配列(Sequences of Pr
oteins ofImmunological Interest). Bethesda: National Institutes of Health, 1983
)。Kabat付番体系に関して、(i)VLCDR1は、典型的には、軽鎖のアミノ酸位置24〜34に存
在し;(ii)VLCDR2は、典型的には、軽鎖のアミノ酸位置50〜56に存在し;かつ(iii)VL CDR
3は、典型的には、軽鎖のアミノ酸位置89〜97に存在する(Kabat,Elvin A.らの文献、免
疫学的対象となるタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest
). Bethesda:National Institutes of Health, 1983)。当業者には周知であるように、K
abat付番体系を用いると、抗体可変ドメインの実際の直線的アミノ酸配列は、FR及び/又
はCDRの短縮又は延長が原因で、より少ない又は追加のアミノ酸を含むことがあり、した
がって、アミノ酸のKabat番号は、その直線的アミノ酸番号と必ずしも同じではない。
) J Mol Biol196: 901-917;及び米国特許第7,709,226号)。「Chothia CDR」という用語
及び同様の用語は当技術分野で認識されており、本明細書において「Chothia CDR」とも
呼ばれる、Chothia及びLeskの文献(1987,J. Mol. Biol., 196:901-917)の方法に従って
決定されるような抗体CDR配列を指す(例えば、米国特許第7,709,226号及びKontermann及
びDubel編、抗体エンジニアリング(AntibodyEngineering)、第31章、422-439頁、Spring
er-Verlag,Berlin(2001)のMartin, A.の文献、「抗体可変ドメインのタンパク質配列及
び構造解析(ProteinSequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains)
」も参照されたい)。Chothia付番体系に関して、VH領域中のアミノ酸残基を付番するKaba
t付番体系を用いると、(i)VHCDR1は、典型的には、重鎖のアミノ酸位置26〜32に存在し;
(ii)VH CDR2は、典型的には、重鎖のアミノ酸位置53〜55に存在し;かつ(iii)VHCDR3は、
典型的には、重鎖のアミノ酸位置96〜101に存在する。具体的な実施態様において、Choth
ia付番体系に関して、VH領域中のアミノ酸残基を付番するKabat付番体系を用いると、(i)
VH CDR1は、典型的には、重鎖のアミノ酸位置26〜32又は34に存在し;(ii)VHCDR2は、典
型的には、重鎖のアミノ酸位置52〜56に存在し(一実施態様において、CDR2は、位置52A〜
56(ここで、52Aは位置52の次に位置する)にある);かつ(iii)VHCDR3は、典型的には、重
鎖のアミノ酸位置95〜102に存在する(一実施態様において、96〜100の番号の位置にアミ
ノ酸はない)。Chothia付番体系に関して、VL領域中のアミノ酸残基を付番するKabat付番
体系を用いると、(i)VLCDR1は、典型的には、軽鎖のアミノ酸位置26〜33に存在し;(ii)V
L CDR2は、典型的には、軽鎖のアミノ酸位置50〜52に存在し;かつ(iii)VLCDR3は、典型
的には、軽鎖のアミノ酸位置91〜96に存在する。具体的な実施態様において、Chothia付
番体系に関して、VL領域中のアミノ酸残基を付番するKabat付番体系を用いると、(i)VLC
DR1は、典型的には、軽鎖のアミノ酸位置24〜34に存在し;(ii)VLCDR2は、典型的には、
軽鎖のアミノ酸位置50〜56に存在し;かつ(iii)VLCDR3は、典型的には、軽鎖のアミノ酸
位置89〜97に存在する(一実施態様において、96〜100の番号の位置にアミノ酸はない)。
これらのChothiaCDR位置は、抗体によって異なる場合があり、当技術分野で公知の方法
に従って決定することができる。
s informationsystem(登録商標) website imgt.org、設立者兼責任者: Marie-Paule Lef
ranc, Montpellier,France;例えば、どちらも引用により完全に本明細書中に組み込まれ
る、Lefranc,M.-P.の文献、1999, The Immunologist, 7:132-136及びLefranc, M.-P.ら
の文献、1999,Nucleic Acids Res., 27:209-212を参照)。IMGT付番体系に関して、(i)VH
CDR1は、典型的には、重鎖のアミノ酸位置25〜35に存在し;(ii)VHCDR2は、典型的には
、重鎖のアミノ酸位置51〜57に存在し;かつ(iii)VH CDR2は、典型的には、重鎖のアミノ
酸位置93〜102に存在する。IMGT付番体系に関して、(i)VLCDR1は、典型的には、軽鎖の
アミノ酸位置27〜32に存在し;(ii)VLCDR2は、典型的には、軽鎖のアミノ酸位置50〜52に
存在し;かつ(iii)VLCDR3は、典型的には、軽鎖のアミノ酸位置89〜97に存在する。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、例えば、表1、3、及び5に示され
る、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体のいずれかのVH CDRを含むMUC16グリコ
シル化抗体又はその抗原結合断片である。ある実施態様において、本明細書に提供される
MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、表1、3、又は5に示されるMUC16グリコ
シル化抗体のVHCDR1を含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコ
シル化抗体又はその抗原結合断片は、表1、3、又は5に示されるMUC16グリコシル化抗体の
VH CDR2を含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又
はその抗原結合断片は、表1、3、又は5に示されるMUC16グリコシル化抗体のVH CDR3を含
む。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原
結合断片は、表1、3、又は5に示されるMUC16グリコシル化抗体のVHCDRのうちの1つ、2つ
、又は3つ全て(例えば、表1の2列目のVLCDR、例えば、抗体10C6のVH CDRの全て)を含む
。
る、本明細書に提供される抗MUC16抗体のいずれかのVL CDRを含むMUC16グリコシル化抗体
又はその抗原結合断片である。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリ
コシル化抗体又はその抗原結合断片は、表2、4、又は6に示されるMUC16グリコシル化抗体
のVH CDR1を含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体
又はその抗原結合断片は、表2、4、又は6に示されるMUC16グリコシル化抗体のVH CDR2を
含む。ある実施態様において、本明細書に提供される抗MUC16抗体又はその抗原結合断片
は、表2、4、又は6に示されるMUC16グリコシル化抗体のVHCDR3を含む。ある実施態様に
おいて、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、表2、4
、又は6に示されるMUC16グリコシル化抗体のVLCDRのうちの1つ、2つ、又は3つ全て(例え
ば、表2の2列目のVLCDR、例えば、抗体10C6のVH CDRの全て)を含む。
結合断片は:
(a)アミノ酸配列
(ここで、X1は、L又はVである)を含むVHCDR1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X2は、E又は非存在であり、かつX3は、Y又はNである)を含むVHCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含むVHCDR3
を含むVHを含む。
結合断片は:
(a)アミノ酸配列
(ここで、X8は、N又はSであり、かつX9は、L又はVである)を含むVHCDR1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X10は、E又は非存在である)を含むVHCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含むVHCDR3
を含むVHを含む。
結合断片は:
(a)アミノ酸配列
(ここで、X15は、N又はSであり、かつX16は、V又はLである)を含むVHCDR1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X17は、E又は非存在である)を含むVHCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
(ここで、X18は、T、A、又はSである)を含むVHCDR3
を含むVHを含む。
結合断片は、配列番号3のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むV
H CDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含む。特定の実施態様に
おいて、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番
号9のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列
番号11のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含む。特定の実施態様において、本明細
書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号15のアミノ酸
配列を含むVHCDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号17のアミノ
酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含む。
結合断片は、配列番号23のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号24のアミノ酸配列を含
むVH CDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含む。特定の実施態
様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配
列番号29のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び
配列番号31のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含む。特定の実施態様において、本
明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号35のアミ
ノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号37のア
ミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含む。
結合断片は、配列番号43のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号44のアミノ酸配列を含
むVH CDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含む。特定の実施態
様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配
列番号49のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号50のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び
配列番号51のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含む。特定の実施態様において、本
明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号55のアミ
ノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号56のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号57のア
ミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含む。
結合断片は、配列番号63のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号64のアミノ酸配列を含
むVH CDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含む。特定の実施態
様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号69のアミノ酸配
列を含むVHCDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号71のアミノ酸
配列を含むVHCDR3を含むVHを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC
16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号75のアミノ酸配列を含むVHCDR1
、配列番号76のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列を含むVH CD
R3を含むVHを含む。
結合断片は、配列番号83のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列を含
むVH CDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含む。特定の実施態
様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配
列番号89のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号90のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び
配列番号91のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含む。特定の実施態様において、本
明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号95のアミ
ノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号96のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号97のア
ミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVHを含む。
結合断片は:
(a)アミノ酸配列
(ここで、X4は、R又はLであり、かつX5は、K又はHである)を含むVLCDR1;
(b)アミノ酸配列
を含むVLCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
(ここで、X6は、G又はSであり、かつX7は、H又はYである)を含むVLCDR3
を含むVLを含む。
結合断片は:
(a)アミノ酸配列
(ここで、X11は、L又はRであり、かつX12は、H又はKである)を含むVLCDR1;
(b)アミノ酸配列YMS(配列番号:113)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
(ここで、X13は、G又はSであり、かつX14は、H又はYである)を含むVLCDR3
を含むVLを含む。
結合断片は:
(a)アミノ酸配列
(ここで、X19は、V又はLであり、かつX20は、H又はKである)を含むVL相補性決定領域(CDR
)1;
(b)アミノ酸配列YMS(配列番号:119)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含むVL CDR3
を含むVLを含む。
結合断片は、配列番号6のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むV
L CDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVLを含む。特定の実施態様に
おいて、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番
号12のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列
番号14のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含む。特定の実施態様において、本明細書に記載
されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号18のアミノ酸配列を含
むVL CDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号20のアミノ酸配列を
含むVL CDR3を含む。
結合断片は、配列番号26のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含
むVL CDR2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVLを含む。特定の実施態
様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配
列番号32のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び
配列番号34のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本
明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号38のアミ
ノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号40のア
ミノ酸配列を含むVLCDR3を含む。
結合断片は、配列番号46のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号47のアミノ酸配列を含
むVL CDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVLを含む。特定の実施態
様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配
列番号52のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び
配列番号54のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本
明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号58のアミ
ノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号59のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号60のア
ミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVLを含む。
結合断片は、配列番号66のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号67のアミノ酸配列を含
むVL CDR2、及び配列番号68のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVLを含む。特定の実施態
様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配
列番号72のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び
配列番号74のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本
明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号78のアミ
ノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号79のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号80のア
ミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVLを含む。
結合断片は、配列番号86のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含
むVL CDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVLを含む。特定の実施態
様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配
列番号92のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号93のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び
配列番号94のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本
明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号98のアミ
ノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号99のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号100の
アミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVLを含む。
結合断片は:
(i)
(a)アミノ酸配列
(ここで、X1は、L又はVである)を含むVHCDR1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X2は、E又は非存在であり、かつX3は、Y又はNである)を含むVHCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含むVHCDR3;
を含むVH;並びに
(ii)
(a)アミノ酸配列
(ここで、X4は、R又はLであり、かつX5は、K又はHである)を含むVLCDR1;
(b)アミノ酸配列
を含むVLCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
(ここで、X6は、G又はSであり、かつX7は、H又はYである)を含むVLCDR3
を含むVL
を含む。
結合断片は、
(i)
(a)アミノ酸配列
(ここで、X8は、N又はSであり、かつX9は、L又はVである)を含むVHCDR1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X10は、E又は非存在である)を含むVHCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含むVHCDR3;
を含むVH;並びに
(ii)
(a)アミノ酸配列
(ここで、X11は、L又はRであり、かつX12は、H又はKである)を含むVLCDR1;
(b)アミノ酸配列YMS(配列番号:113)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
(ここで、X13は、G又はSであり、かつX14は、H又はYである)を含むVLCDR3;
を含むVL
を含む。
結合断片は、
(i)
(a)アミノ酸配列
(ここで、X15は、N又はSであり、かつX16は、V又はLである)を含むVHCDR1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X17は、E又は非存在である)を含むVHCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
(ここで、X18は、T、A、又はSである)を含むVHCDR3;
を含むVH、並びに
(ii)
(a)アミノ酸配列
(ここで、X19は、V又はLであり、かつX20は、H又はKである)を含むVLCDR1;
(b)アミノ酸配列YMS(配列番号:119)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含むVLCDR3;
を含むVL
を含む。
結合断片は:
(i)
(a)アミノ酸配列
(ここで、X1は、L又はVである)を含むVHCDR1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X2は、E又は非存在であり、かつX3は、Y又はNである)を含むVHCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含むVHCDR3;
を含むVH、並びに
(ii)
(a)配列番号6のアミノ酸配列を含むVLCDR1;
(b)配列番号7のアミノ酸配列を含むVLCDR2;及び
(c)配列番号8のアミノ酸配列を含むVLCDR3;
を含むVL
を含む。
結合断片は、
(i)
(a)アミノ酸配列
(ここで、X8は、N又はSであり、かつX9は、L又はVである)を含むVHCDR1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X10は、E又は非存在である)を含むVHCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含むVHCDR3;
を含むVH;並びに
(ii)
(a)配列番号12のアミノ酸配列を含むVLCDR1;
(b)配列番号13のアミノ酸配列を含むVLCDR2;及び
(c)配列番号14のアミノ酸配列を含むVLCDR3;
を含むVL
を含む。
結合断片は、
(a)アミノ酸配列
(ここで、X15は、N又はSであり、かつX16は、V又はLである)を含むVHCDR1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X17は、E又は非存在である)を含むVHCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
(ここで、X18は、T、A、又はSである)を含むVHCDR3;
を含むVH、並びに
(ii)
(a)配列番号18のアミノ酸配列を含むVLCDR1;
(b)配列番号19のアミノ酸配列を含むVLCDR2;及び
(c)配列番号20のアミノ酸配列を含むVLCDR3;
を含むVL
を含む。
結合断片は、
(i)
(a)アミノ酸配列
(ここで、X1は、L又はVである)を含むVHCDR1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X2は、E又は非存在であり、かつX3は、Y又はNである)を含むVHCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含むVHCDR3;
を含むVH、並びに
(ii)
(a)配列番号26のアミノ酸配列を含むVLCDR1;
(b)配列番号27のアミノ酸配列を含むVLCDR2;及び
(c)配列番号28のアミノ酸配列を含むVLCDR3;
を含むVL
を含む。
結合断片は、
(i)
(a)アミノ酸配列
(ここで、X8は、N又はSであり、かつX9は、L又はVである)を含むVHCDR1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X10は、E又は非存在である)を含むVHCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含むVHCDR3;
を含むVH;並びに
(ii)
(a)配列番号32のアミノ酸配列を含むVLCDR1;
(b)配列番号33のアミノ酸配列を含むVLCDR2;及び
(c)配列番号34のアミノ酸配列を含むVLCDR3;
を含むVL
を含む。
結合断片は、
(i)
(a)アミノ酸配列
(ここで、X15は、N又はSであり、かつX16は、V又はLである)を含むVHCDR1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X17は、E又は非存在である)を含むVHCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
(ここで、X18は、T、A、又はSである)を含むVHCDR3;
を含むVH、並びに
(ii)
(d)配列番号38のアミノ酸配列を含むVLCDR1;
(e)配列番号39のアミノ酸配列を含むVLCDR2;及び
(f)配列番号40のアミノ酸配列を含むVLCDR3;
を含むVL
を含む。
結合断片は、(a)配列番号3のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含
むVH CDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVH;並びに(b)配列番号6の
アミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号8の
アミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載
されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号9のアミノ酸配列を
含むVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列
を含むVHCDR3を含むVH;並びに(b)配列番号12のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号13
のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む。特
定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合
断片は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含む
VH CDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVH;並びに(b)配列番号18の
アミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号20
のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む。
結合断片は、(a)配列番号23のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号24のアミノ酸配列を
含むVH CDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVH;並びに(b)配列番号
26のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番
号28のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書
に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号29のアミノ酸
配列を含むVHCDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号31のアミノ
酸配列を含むVHCDR3を含むVH;並びに(b)配列番号32のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列
番号33のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号34のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含
むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又
はその抗原結合断片は、(a)配列番号35のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号36のアミ
ノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号37のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;並びに(
b)配列番号38のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVL CDR2、
及び配列番号40のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含む。
結合断片は、(a)配列番号43のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号44のアミノ酸配列を
含むVH CDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVH;並びに(b)配列番号
46のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号47のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番
号48のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書
に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号49のアミノ酸
配列を含むVHCDR1、配列番号50のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号51のアミノ
酸配列を含むVHCDR3を含むVH;並びに(b)配列番号52のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列
番号53のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含
むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又
はその抗原結合断片は、(a)配列番号55のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号56のアミ
ノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;並びに(
b)配列番号58のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号59のアミノ酸配列を含むVL CDR2、
及び配列番号60のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVLを含む。
結合断片は、(a)配列番号63のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号64のアミノ酸配列を
含むVH CDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVH;並びに(b)配列番号
66のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号67のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番
号68のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書
に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号69のアミノ酸
配列を含むVHCDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号71のアミノ
酸配列を含むVHCDR3を含むVH;並びに(b)配列番号72のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列
番号73のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号74のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含
むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又
はその抗原結合断片は、(a)配列番号75のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号76のアミ
ノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;並びに(
b)配列番号78のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号79のアミノ酸配列を含むVL CDR2、
及び配列番号80のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVLを含む。
結合断片は、(a)配列番号83のアミノ酸配列を含むVHCDR1、配列番号84のアミノ酸配列を
含むVH CDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列を含むVHCDR3を含むVH;並びに(b)配列番号
86のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番
号88のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書
に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号89のアミノ酸
配列を含むVHCDR1、配列番号90のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号91のアミノ
酸配列を含むVHCDR3を含むVH;並びに(b)配列番号92のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列
番号93のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含
むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又
はその抗原結合断片は、(a)配列番号95のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号96のアミ
ノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;並びに(
b)配列番号98のアミノ酸配列を含むVLCDR1、配列番号99のアミノ酸配列を含むVL CDR2、
及び配列番号100のアミノ酸配列を含むVLCDR3を含むVLを含む。
結合断片は、
(ここで、X21は、T又はNであり、X22は、I又はKであり、X23は、N又はSであり、X24は、V
又はLであり、X25は、S又はIであり、X26は、P又はSであり、X27は、E又は非存在であり
、X28は、N又はYであり、X29は、K又はRであり、X30は、A又はDであり、X31は、T又はSで
あり、X32は、V又はAであり、X33は、G又はDであり、X34は、T、I、又はSであり、かつX3
5は、T、S、又はAである)を含むVH領域を含む。
結合断片は、
(ここで、X36は、I又はVであり、X37は、P又はSであり、X38は、R又はLであり、X39は、K
又はHであり、X40は、R又はKであり、X41は、E又はGであり、X42は、S又はGであり、かつ
X43は、Y又はHである)を含むVL領域を含む。
結合断片は、
(a)
(ここで、X21は、T又はNであり、X22は、I又はKであり、X23は、N又はSであり、X24は、V
又はLであり、X25は、S又はIであり、X26は、P又はSであり、X27は、E又は非存在であり
、X28は、N又はYであり、X29は、K又はRであり、X30は、A又はDであり、X31は、T又はSで
あり、X32は、V又はAであり、X33は、G又はDであり、X34は、T、I、又はSであり、かつX3
5は、T、S、又はAである)を含むVH領域;及び
(b)
(ここで、X36は、I又はVであり、X37は、P又はSであり、X38は、R又はLであり、X39は、K
又はHであり、X40は、R又はKであり、X41は、E又はGであり、X42は、S又はGであり、かつ
X43は、Y又はHである)を含むVL領域を含む。
結合断片は、
(a)
(ここで、X21は、T又はNであり、X22は、I又はKであり、X23は、N又はSであり、X24は、V
又はLであり、X25は、S又はIであり、X26は、P又はSであり、X27は、E又は非存在であり
、X28は、N又はYであり、X29は、K又はRであり、X30は、A又はDであり、X31は、T又はSで
あり、X32は、V又はAであり、X33は、G又はDであり、X34は、T、I、又はSであり、かつX3
5は、T、S、又はAである)を含むVH領域;及び
(b)配列番号2のアミノ酸配列を含むVL領域を含む。
結合断片は、
(a)
(ここで、X21は、T又はNであり、X22は、I又はKであり、X23は、N又はSであり、X24は、V
又はLであり、X25は、S又はIであり、X26は、P又はSであり、X27は、E又は非存在であり
、X28は、N又はYであり、X29は、K又はRであり、X30は、A又はDであり、X31は、T又はSで
あり、X32は、V又はAであり、X33は、G又はDであり、X34は、T、I、又はSであり、かつX3
5は、T、S、又はAである)を含むVH領域;及び
(b)配列番号62のアミノ酸配列を含むVL領域を含む。
原結合断片は、表7に示されるアミノ酸配列を含むVHを含む。具体的な実施態様において
、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号1のア
ミノ酸配列(表7)を含む重鎖可変領域配列(例えば、抗体10C6のVH)を含む。具体的な実施
態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号21のアミノ酸配列(表7)を含む重鎖可変領域配列(例えば、抗体7B12のVH)を含む
。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗
原結合断片は、配列番号41のアミノ酸配列(表7)を含む重鎖可変領域配列(例えば、抗体19
C11のVH)を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化
抗体又はその抗原結合断片は、配列番号61のアミノ酸配列(表7)を含む重鎖可変領域配列(
例えば、抗体16C5のVH)を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16
グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号81のアミノ酸配列(表7)を含む重鎖
可変領域配列(例えば、抗体18C6のVH)を含む。
原結合断片は、表8に示されるアミノ酸配列を含むVLを含む。具体的な実施態様において
、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号2のア
ミノ酸配列(表8)を含む軽鎖可変領域配列(例えば、抗体10C6のVL)を含む。具体的な実施
態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号22のアミノ酸配列(表8)を含む軽鎖可変領域配列(例えば、抗体7B12のVL)を含む
。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗
原結合断片は、配列番号42のアミノ酸配列(表8)を含む軽鎖可変領域配列(例えば、抗体19
C11のVL)を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化
抗体又はその抗原結合断片は、配列番号62のアミノ酸配列(表8)を含む軽鎖可変領域配列(
例えば、抗体16C5のVL)を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16
グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号82のアミノ酸配列(表8)を含む軽鎖
可変領域配列(例えば、抗体18C6のVL)を含む。
原結合断片は、(a)表7に示されるアミノ酸配列を含むVH;及び(b)表8に示されるアミノ酸
配列を含むVLを含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシ
ル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号1のアミノ酸配列(表7)を含む重鎖可変領
域配列(例えば、抗体10C6のVH);及び(b)配列番号2のアミノ酸配列(表8)を含む軽鎖可変領
域配列(例えば、抗体10C6のVL)を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載され
るMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号21のアミノ酸配列(表7)
を含む重鎖可変領域配列(例えば、抗体7B12のVH);及び(b)配列番号22のアミノ酸配列(表8
)を含む軽鎖可変領域配列(例えば、抗体7B12のVL)を含む。具体的な実施態様において、
本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号41の
アミノ酸配列(表7)を含む重鎖可変領域配列(例えば、抗体19C11のVH);及び(b)配列番号42
のアミノ酸配列(表8)を含む軽鎖可変領域配列(例えば、抗体19C11のVL)を含む。具体的な
実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片
は、(a)配列番号61のアミノ酸配列(表7)を含む重鎖可変領域配列(例えば、抗体16C5のVH)
;及び(b)配列番号62のアミノ酸配列(表8)を含む軽鎖可変領域配列(例えば、抗体16C5のVL
)を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又は
その抗原結合断片は、(a)配列番号81のアミノ酸配列(表7)を含む重鎖可変領域配列(例え
ば、抗体18C6のVH);及び(b)配列番号82のアミノ酸配列(表8)を含む軽鎖可変領域配列(例
えば、抗体18C6のVL)を含む。
合断片は、表7に示されるアミノ酸配列を含むVHのVHCDR(例えば、表1、3、又は5に示さ
れるもの)及び表8に示されるアミノ酸配列を含むVLのVLCDR(例えば、表2、4、又は6に示
されるもの)を含む。
合断片は、そのVHドメインのみもしくはそのVLドメインのみによるか、又はその3つのVH
CDRのみによるか、又はその3つのVLCDRのみによって記載されてもよい。例えば、ヒト軽
鎖又は重鎖ライブラリーから、それぞれ、相補する軽鎖又は重鎖を同定し、もとの抗体の
親和性と同じくらい高いか又はそれよりも高い親和性を有するヒト化抗体変異体を得るこ
とによるマウス抗αvβ3抗体のヒト化を記載している、引用により完全に本明細書中に組
み込まれる、RaderCらの文献(1998) PNAS 95: 8910-8915を参照されたい。特定のVHドメ
イン(又はVLドメイン)を使用し、相補的な可変ドメインについてライブラリーをスクリー
ニングすることにより、特定の抗原に結合する抗体を産生する方法を記載している、引用
により完全に本明細書中に組み込まれる、Clackson Tらの文献(1991) Nature 352: 624-6
28も参照されたい。特定のVHドメインを使用し、相補的なVLドメインについてライブラリ
ー(例えば、ヒトVLライブラリー)をスクリーニングすることにより、特定の抗原に結合す
る抗体を産生し;さらに、選択されたVLドメインを用いて、さらなる相補的な(例えば、ヒ
トの)VHドメインの選択を導くことができる、方法を記載している、引用により完全に本
明細書中に組み込まれる、Kim SJ及びHong HJの文献(2007) J Microbiol 45: 572-577も
参照されたい。
合断片は、ヒト化抗体、例えば、齧歯類抗体のヒト化形態であってもよい。ヒト化抗体は
、限定されないが、CDRグラフティング(欧州特許EP239,400号;国際公開WO 91/09967号;
及び米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、及び第5,585,089号)、鎖シャッフリング(
米国特許第5,565,332号)、ベニアリング又はリサーフェシング(欧州特許EP592,106号及
びEP 519,596号;Padlanの文献、1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studni
ckaらの文献、1994,Protein Engineering 7(6):805-814;及びRoguskaらの文献、1994, P
NAS 91:969-973)、並びに例えば、米国特許第6,407,213号、米国特許第5,766,886号、WO
9317105号、SandhuJSの文献、Gene 150(2):409-10(1994)、Pedersenらの文献、J. Mol.
Biol.235(3):959-73(1994)、Coutoらの文献、Cancer Res. 55(8):1717-22(1995)、Rogus
kaらの文献、ProteinEng. 9(10):895 904(1996)、Bacaらの文献、J. Biol. Chem. 272(1
6):10678-84(1997)、Coutoらの文献、CancerRes. 55(23 Supp):5973s- 5977s(1995)、Ca
ldasらの文献、ProteinEng. 13(5):353-60(2000)、Moreaらの文献、Methods 20(3):267
79(2000)、及びTanらの文献、J.Immunol. 169:1119 25(2002)に開示されている技法を含
む、当技術分野で公知の種々の技法を用いて産生することができる。その各々が引用によ
り完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許公開US 2005/0042664 A1号(2005年2月24日
)も参照されたい。
合断片は、合成ヒト抗体であってもよい。合成ヒト抗体は、例えば、T細胞エピトープを
回避し、それにより、得られる抗体の免疫原性を最小限に抑える形で多数のヒト抗体可変
領域配列の断片から可変領域配列を設計することにより作製することができる(例えば、B
akerらの文献、2010,Self Nonself., 1(4):314-322; Brysonらの文献、2010, BioDrugs,
24(1):1-8;及びJonesらの文献、2009,Methods Mol Biol., 525:405-23を参照)。そのよ
うな抗体は、ヒト定常領域配列、例えば、ヒト軽鎖及び/又は重鎖定常領域を含むことが
できる。
合断片は、脱免疫化抗体であってもよい。脱免疫化抗体は、T細胞エピトープが除去され
ている抗体である。脱免疫化抗体を作製する方法は記載されている。例えば、Jonesらの
文献、MethodsMol Biol. 2009;525:405-23, xiv、及びDe Grootらの文献、Cell. Immuno
l.244:148-153(2006)を参照されたい。
原結合断片は、それぞれ、表1、表2、及び表3、並びに表4、表5、及び表6の抗体のいずれ
かの3つのVHCDR及び3つのVL CDR(すなわち、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL
CDR2、及びVL CDR3)とヒト由来フレームワーク領域とヒト由来定常領域とを含むヒト化免
疫グロブリンである。ヒトフレームワーク領域の非限定的な例は、当技術分野で記載され
ており、例えば、Kabatらの文献(1991)、免疫学的対象となるタンパク質の配列(Sequence
s of Proteinsof Immunological Interest)、第5版、U.S. Department of Health and H
uman Services,NIH Publication No. 91-3242を参照されたい。ある実施態様において、
本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、ヒトフレームワ
ーク領域であるか又はヒトフレームワーク領域に由来するフレームワーク領域(例えば、V
Lドメイン及び/又はVHドメインのフレームワーク領域)を含む。ある実施態様において、
本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、霊長類(例えば、
非ヒト霊長類)フレームワーク領域であるか又は霊長類(例えば、非ヒト霊長類)フレーム
ワーク領域に由来するフレームワーク領域(例えば、VLドメイン及び/又はVHドメインのフ
レームワーク領域)を含む。例えば、典型的には、齧歯類起源(例えば、マウス又はラット
)の抗原特異的非ヒト抗体由来のCDRを相同なヒト又は非ヒト霊長類(例えば、旧世界類人
猿、例えば、チンパンジー(Pan troglodytes)、ボノボ(Pan paniscus)、もしくはニシゴ
リラ(Gorillagorilla)、チンパンジー、例えば、マカク属の旧世界猿、又はマカクザル
であるカニクイザル(Macacacynomolgus))に移植する。非ヒト霊長類フレームワーク配列
は、米国特許出願公開US 2005/0208625号に記載されている。
原結合断片のVH領域中のVHCDR1、VH CDR2、及び/もしくはVH CDR3の位置、並びに/又はV
L領域中のVL CDR1、VLCDR2、及び/もしくはVL CDR2の位置は、(i)MUC16の第一の形態(こ
の第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番
号133である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合が維持され;(ii)MUC16の第二
の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸
配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合の欠如が維持さ
れ;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸
潤の阻害が維持される(例えば、実質的に、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、
少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%維持される)限り、1
、2、3、4、5、6、又はそれより多くのアミノ酸位置だけ異なっていてもよい。別の実施
態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片のVH
領域中のVHCDR1、VH CDR2、及び/もしくはVH CDR3の長さ、並びに/又はVL領域中のVL CD
R1、VL CDR2、及び/もしくはVLCDR2の長さは、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態は
グリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を
組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合が維持され;(ii)MUC16の第二の形態(この第
二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号
139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合の欠如が維持され;かつ(iii)MU
C16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤の阻害が維持
される(例えば、実質的に、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%
、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%維持される)限り、1、2、3、4、5、
6、又はそれより多くのアミノ酸だけ異なっていてもよい(例えば、短くても長くてもよい
)。別の実施態様において、本明細書に記載されるVHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1
、VL CDR2、及び/又はVLCDR3のアミノ末端及び/又はカルボキシ末端は、(i)MUC16の第一
の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配
列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合が維持され;(ii)M
UC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態
のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合の欠
如が維持され;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマ
トリゲル浸潤の阻害が維持される(例えば、実質的に、例えば、少なくとも50%、少なく
とも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%維持され
る)限り、本明細書に記載されるCDRのうちの1つ又は複数と比較して1、2、3、4、5、6、
又はそれより多くのアミノ酸だけ伸長されていても、短縮されていてもよい。本明細書で
使用される場合、「免疫特異的に結合する」、「免疫特異的に認識する」、「特異的に結
合する」、及び「特異的に認識する」という用語は、抗体との関連における類似用語であ
り、当業者によって理解されているように抗原結合部位を介して抗原(例えば、エピトー
プ又は免疫複合体)に結合する抗体及びその抗原結合断片を指し、該抗体又は抗原結合断
片と他の抗原との交差反応性を排除するものではない。当技術分野で公知の任意の方法、
例えば、下記の第6節に記載されているようなELISA結合アッセイ又はFACs解析を用いて、
(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形
態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合が
維持され;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで
、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫
特異的結合の欠如が維持され;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のイ
ンビトロでのマトリゲル浸潤の阻害が維持されるかどうかを確認することができる。
、重鎖のみ、軽鎖のみ、又は重鎖と軽鎖の両方を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗
原結合断片である。重鎖に関して、具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMU
C16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の重鎖は、アルファ(α)、デルタ(δ)、イプ
シロン(ε)、ガンマ(γ)、又はミュー(μ)重鎖であることができる。別の具体的な実施態
様において、記載されているMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の重鎖は、ヒ
トアルファ(α)、デルタ(δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、又はミュー(μ)重鎖を含む
ことができる。
ており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細
胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されて
おらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細
胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞
のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化
抗体又はその抗原結合断片は重鎖を含み、ここで、該重鎖の可変領域のアミノ酸配列は、
それぞれ、配列番号103、配列番号104、及び配列番号105、それぞれ、配列番号109、配列
番号110、及び配列番号111、又はそれぞれ、配列番号115、配列番号116、及び配列番号11
7のアミノ酸配列を有するVHCDR1、VH CDR2、及びVH CDR3を含み、かつ該重鎖の定常領域
は、ヒトアルファ(α)、デルタ(δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、又はミュー(μ)重鎖
定常領域である。本明細書で使用される場合、「定常領域」又は「定常ドメイン」という
用語は互換的なものであり、当技術分野で共通のその意味を有する。定常領域は、抗原に
対する抗体の結合に直接的には関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば、Fc受容
体との相互作用を示すことができる抗体部分、例えば、軽鎖及び/又は重鎖のカルボキシ
ル末端部分である。免疫グロブリン分子の定常領域は、通常、免疫グロブリン可変ドメイ
ンと比べてより保存されたアミノ酸配列を有する。特定の実施態様において、本明細書に
記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は重鎖を含み、ここで、該重鎖
の可変領域のアミノ酸配列は、抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6のVH CDR1、VH C
DR2、及びVH CDR3(すなわち、表1、表3、又は表5に掲載されているもの)を含み、かつ該
重鎖の定常領域は、ヒトアルファ(α)、デルタ(δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、又は
ミュー(μ)重鎖定常領域である。
抗原結合断片は重鎖を含み、ここで、該重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号101の
アミノ酸配列を含み、かつ該重鎖の定常領域は、ヒトアルファ(α)、デルタ(δ)、イプシ
ロン(ε)、ガンマ(γ)、又はミュー(μ)重鎖定常領域である。別の特定の実施態様におい
て、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は重鎖を含み、
ここで、該重鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1、配列番号21、配列番号41、配
列番号61、又は配列番号81のアミノ酸配列を含み、かつ該重鎖の定常領域は、ヒトアルフ
ァ(α)、デルタ(δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、又はミュー(μ)重鎖定常領域である
。
原結合断片は重鎖を含み、ここで、該重鎖の可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ、配列
番号103、配列番号104、及び配列番号105、又はそれぞれ、配列番号109、配列番号110;も
しくは配列番号111、又はそれぞれ、配列番号115、配列番号116、もしくは配列番号117の
アミノ酸配列を有するVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3を含み、かつ該重鎖の定常領域は
、ヒト重鎖定常領域である。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グ
リコシル化抗体又はその抗原結合断片は重鎖を含み、ここで、該重鎖の可変領域のアミノ
酸配列は、抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6のVHCDRのいずれか1つのVH CDR1、V
H CDR2、及びVH CDR3(すなわち、表1、表3、及び表5に掲載されているもの)を含み、かつ
該重鎖の定常領域は、ヒト重鎖定常領域である。具体的な実施態様において、本明細書に
記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は重鎖を含み、ここで、該重鎖
の可変領域のアミノ酸配列は配列番号101のアミノ酸配列を含み、かつ該重鎖の定常領域
は、ヒト重鎖定常領域である。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16
グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は重鎖を含み、ここで、該重鎖の可変領域のアミ
ノ酸配列は、抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6のVHCDR(すなわち、表7に掲載さ
れているもの)のいずれか1つのアミノ酸配列を含み、かつ該重鎖の定常領域は、ヒト重鎖
定常領域である。ヒト定常領域配列の非限定的な例は当技術分野で記載されており、例え
ば、上記KabatEAらの文献(1991)を参照されたい。
抗体又はその抗原結合断片の軽鎖はカッパ軽鎖である。別の具体的な実施態様において、
本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の軽鎖はラムダ軽鎖
である。また別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化
抗体又はその抗原結合断片の軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖又はヒトラムダ軽鎖である。
結合断片は軽鎖を含み、ここで、該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番
号106、配列番号107、及び配列番号108、又はそれぞれ、配列番号112、配列番号113、及
び配列番号114、又はそれぞれ、配列番号118、配列番号119、及び配列番号120の抗体のア
ミノ酸配列を有するVLCDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含み、かつ該軽鎖の定常領域は、
カッパ又はラムダ軽鎖定常領域である。特定の実施態様において、本明細書に記載される
MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は軽鎖を含み、ここで、該軽鎖の可変領域
のアミノ酸配列は、抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6のVL CDR1、VL CDR2、及びV
L CDR3(すなわち、表2、表4、又は表6に掲載されているもの)を含み、かつ該軽鎖の定常
領域は、カッパ又はラムダ軽鎖定常領域である。
抗原結合断片は軽鎖を含み、ここで、該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号102
のアミノ酸配列を含み、かつ該軽鎖の定常領域は、カッパ又はラムダ軽鎖定常領域である
。別の特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその
抗原結合断片は軽鎖を含み、ここで、該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号2、
配列番号22、配列番号42、配列番号62、又は配列番号82のアミノ酸配列を含み、かつ該軽
鎖の定常領域は、カッパ又はラムダ軽鎖定常領域である。
原結合断片は軽鎖を含み、ここで、該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ、配列
番号106、配列番号107、及び配列番号108、又はそれぞれ、配列番号112、配列番号113、
及び配列番号114、又はそれぞれ、配列番号118、配列番号119、及び配列番号120のアミノ
酸配列を有するVLCDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含み、かつ該軽鎖の定常領域は、ヒト
軽鎖定常領域のアミノ酸を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC1
6グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は軽鎖を含み、ここで、該軽鎖の可変領域のア
ミノ酸配列は、抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6のVLCDRのいずれか1つのアミノ
酸配列を有するVLCDR1、VL CDR2、及びVL CDR3(すなわち、表2、表4、及び表6に掲載さ
れているもの)を含み、かつ該軽鎖の定常領域は、ヒト軽鎖定常領域である。具体的な実
施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は
軽鎖を含み、ここで、該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号102のアミノ酸配列
を含み、かつ該軽鎖の定常領域は、ヒト軽鎖定常領域である。具体的な実施態様において
、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は軽鎖を含み、こ
こで、該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6のV
L CDR(すなわち、表8に掲載されているもの)のいずれか1つのアミノ酸配列を含み、かつ
該軽鎖の定常領域は、ヒト軽鎖定常領域である。ヒト定常領域配列の非限定的な例は当技
術分野で記載されており、例えば、上記のKabat EAらの文献(1991)を参照されたい。
原結合断片は、本明細書に記載される重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含み、こ
こで、該定常領域は、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、もしくはIgY免疫グロブリン分子、又は
ヒトIgG、IgE、IgM、IgD、IgA、もしくはIgY免疫グロブリン分子に見られるタイプのもの
である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体
又はその抗原結合断片は、本明細書に記載される任意のアミノ酸配列を含むVH及びVLを含
み、ここで、該定常領域は、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、又はIgY免疫グロブリン分子、免
疫グロブリン分子の任意のクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)又
は任意のサブクラス(例えば、IgG2a及びIgG2b)に見られるタイプのものである。特定の実
施態様において、該定常領域は、ヒトIgG、IgE、IgM、IgD、IgA、又はIgY免疫グロブリン
分子、免疫グロブリン分子の任意のクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及
びIgA2)又は任意のサブクラス(例えば、IgG2a及びIgG2b)に見られるタイプのものである
。
抗原結合断片は重鎖及び/又は軽鎖を含み、ここで、(i)該重鎖は、(a)それぞれ、配列番
号103、配列番号104、及び配列番号105、それぞれ、配列番号109、配列番号110、及び配
列番号111、又はそれぞれ、配列番号115、配列番号116、及び配列番号117のアミノ酸配列
を有するVHCDR1、VH CDR2、及びVH CDR3を含む可変領域を含み、かつ(b)ヒトIgG重鎖の
定常ドメインである定常重鎖ドメインを含み;並びに/又は(ii)該軽鎖は、(a)それぞれ、
配列番号106、配列番号107、及び配列番号108、又はそれぞれ、配列番号112、配列番号11
3、及び配列番号114、又はそれぞれ、配列番号118、配列番号119、及び配列番号120のア
ミノ酸配列を有するVLCDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含む可変領域、並びに(b)ヒトIgG
の定常ドメインである定常軽鎖ドメインを含む。別の特定の実施態様において、本明細書
に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は重鎖及び/又は軽鎖を含み、
ここで、(i)該重鎖は、(a)抗体10C6、7B12、19C11、16C5、もしくは18C6のVHCDRのうち
のいずれか1つのアミノ酸配列を有するVHCDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(すなわち、表1、
表3、及び表5に掲載されているもの)を含む可変領域を含み、かつ(b)ヒトIgG重鎖の定常
ドメインである定常重鎖ドメインを含み;並びに/又は(ii)該軽鎖は、(a)抗体10C6、7B12
、19C11、16C5、又は18C6のVLCDRのいずれか1つのアミノ酸配列を有するVL CDR1、VL CD
R2、及びVL CDR3(すなわち、表2、表4、及び表6に掲載されているもの)を含む可変領域、
並びに(b)ヒトIgGの定常ドメインである定常軽鎖ドメインを含む。
抗原結合断片は重鎖及び/又は軽鎖を含み、ここで、(i)該重鎖は、(a)配列番号101のアミ
ノ酸配列を含む可変領域、及び(b)ヒトIgGの定常ドメインである定常重鎖ドメインを含み
;並びに/又は(ii)該軽鎖は、(a)配列番号102のアミノ酸配列を含む可変領域、及び(b)ヒ
トカッパ軽鎖の定常ドメインである定常軽鎖ドメインを含む。別の特定の実施態様におい
て、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は重鎖及び/又は
軽鎖を含み、ここで、(i)該重鎖は、(a)抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6のいず
れか1つのVH(すなわち、表7に掲載されているもの)のアミノ酸配列を含む可変領域、及び
(b)ヒトIgGの定常ドメインである定常重鎖ドメインを含み;並びに/又は(ii)該軽鎖は、(a
)抗体10C6、7B12、19C11、16C5、もしくは18C6のいずれか1つのVL(すなわち、表8に掲載
されているもの)のアミノ酸配列を含む可変領域、及び(b)ヒトカッパ軽鎖の定常ドメイン
である定常軽鎖ドメインを含む。
合断片又はその抗原結合断片は、配列番号1〜100のいずれか1つに対して下記のパーセン
ト同一性を有するアミノ酸配列を含む。数学的アルゴリズムを利用して、2つの配列(例え
ば、アミノ酸配列又は核酸配列)間のパーセント同一性を決定することができる。2つの配
列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin及びAltsch
ulの文献(1993,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873 5877)に見られるように改変さ
れた、Karlin及びAltschulの文献(1990,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264 2268)
のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Altschulらの文献(1990, J. Mol. B
iol. 215:403)のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検
索を、例えば、スコア=100、ワード長=12に設定されたNBLASTヌクレオチドプログラム
パラメータを用いて実施し、本明細書に記載される核酸分子と相同なヌクレオチド配列を
得ることができる。BLASTタンパク質検索を、例えば、スコア50、ワード長=3に設定され
たXBLASTプログラムパラメータを用いて実施し、本明細書に記載されるタンパク質分子と
相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップのあるアラインメントを得
るために、GappedBLASTをAltschulらの文献(1997, Nucleic Acids Res. 25:3389 3402)
に記載されている通りに利用することができる。或いは、分子間の距離関係を検出する反
復検索をPSIBLASTによって実施することができる(同上)。BLAST、Gapped BLAST、及びPS
I Blastプログラムを利用する場合、(例えば、XBLAST及びNBLASTの)それぞれのプログラ
ムのデフォルトパラメータを使用することができる(例えば、ワールドワイドウェブ、ncb
i.nlm.nih.govにおけるNationalCenter for Biotechnology Information(NCBI)を参照)
。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Myers及
びMillerの文献(1988,CABIOS 4:11 17)のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズム
は、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バー
ジョン2.0)に組み込まれている。アミノ酸配列の比較のためにALIGNプログラムを利用す
る場合、PAM120加重残基表、12のギャップ長ペナルティ、及び4のギャップペナルティを
使用することができる。さらに、2つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許容す
るしないにかかわらず、上記の技法と同様の技法を用いて決定することができる。典型的
には、パーセント同一性を計算するときに、正確な一致のみをカウントする。
のアミノ酸配列との少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%
、又は少なくとも98%の配列同一性を有するVHを含む。ある実施態様において、MUC16グ
リコシル化抗体又はその抗原結合断片は、抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は1B5のいず
れか1つのVH(すなわち、表7に掲載されているもの)のアミノ酸配列との少なくとも80%、
少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも98%の配列同一性を
有するVHを含む。ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片
は、配列番号101のアミノ酸配列との少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%
、少なくとも95%、又は少なくとも98%の配列同一性を有するVHドメインを含み、ここで
、該抗体又は抗原結合断片は、表1、表2、表3、表4、表5、又は表6に示されるCDR(例えば
、VH CDR及び/又はVLCDR)と同一であるCDR(例えば、VH CDR及び/又はVL CDR)を含む。あ
る実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、抗体10C6、7B12
、19C11、16C5、又は18C6のいずれか1つのVH(すなわち、表7に掲載されているもの)のア
ミノ酸配列との少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又
は少なくとも98%の配列同一性を有するVHドメインを含み、ここで、該抗体又は抗原結合
断片は、表1、表2、表3、表4、表5、又は表6に示されるCDR(例えば、VHCDR及び/又はVL
CDR)と同一であるCDR(例えば、VHCDR及び/又はVL CDR)を含む。
のアミノ酸配列との少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%
、又は少なくとも98%の配列同一性を有するVLを含む。ある実施態様において、MUC16グ
リコシル化抗体又はその抗原結合断片は、抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は1B5のいず
れか1つのVL(すなわち、表8に掲載されているもの)のアミノ酸配列との少なくとも80%、
少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも98%の配列同一性を
有するVLを含む。ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片
は、配列番号102のアミノ酸配列との少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%
、少なくとも95%、又は少なくとも98%の配列同一性を有するVLドメインを含み、ここで
、該抗体又は抗原結合断片は、表1、表2、表3、表4、表5、又は表6に示されるCDR(例えば
、VH CDR及び/又はVLCDR)と同一であるCDR(例えば、VH CDR及び/又はVL CDR)を含む。あ
る実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、抗体10C6、7B12
、19C11、16C5、又は18C6のいずれか1つのVL(すなわち、表7に掲載されているもの)のア
ミノ酸配列との少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又
は少なくとも98%の配列同一性を有するVLドメインを含み、ここで、該抗体又は抗原結合
断片は、表1、表2、表3、表4、表5、又は表6に示されるCDR(例えば、VHCDR及び/又はVL
CDR)と同一であるCDR(例えば、VHCDR及び/又はVL CDR)を含む。
01のアミノ酸配列との少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95
%、又は少なくとも98%の配列同一性を有するVHドメイン;及び(ii)配列番号102のアミノ
酸配列との少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少
なくとも98%の配列同一性を有するVLドメインを含む。ある実施態様において、MUC16グ
リコシル化抗体又はその抗原結合断片は:(i)抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6の
いずれか1つのVH(すなわち、表8に掲載されているもの)のアミノ酸配列との少なくとも80
%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも98%の配列同一
性を有するVHドメイン;及び(ii)抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6のいずれか1つ
のVL(すなわち、表7に掲載されているもの)のアミノ酸配列との少なくとも80%、少なく
とも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも98%の配列同一性を有する
VLドメインをそれぞれ含む。ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗
原結合断片は:(i)配列番号101のアミノ酸配列との少なくとも80%、少なくとも85%、少
なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも98%の配列同一性を有するVHドメイン;
及び(ii)配列番号102のアミノ酸配列との少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも9
0%、少なくとも95%、又は少なくとも98%の配列同一性を有するVLドメインを含み、こ
こで、該抗体又は抗原結合断片は、表1、表2、表3、表4、表5、又は表6に示されるCDR(例
えば、VH CDR及び/又はVLCDR)と同一であるCDR(例えば、VH CDR及び/又はVL CDR)を含む
。ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は:(i)抗体10C6
、7B12、19C11、16C5、又は18C6のいずれか1つのVH(すなわち、表8に掲載されているもの
)のアミノ酸配列との少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95
%、又は少なくとも98%の配列同一性を有するVHドメイン;及び(ii)抗体10C6、7B12、19C
11、16C5、又は18C6のいずれか1つのVL(すなわち、表7に掲載されているもの)のアミノ酸
配列との少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少な
くとも98%の配列同一性を有するVLドメインをそれぞれ含み、ここで、該抗体又は抗原結
合断片は、表1、表2、表3、表4、表5、又は表6に示されるCDR(例えば、VHCDR及び/又はV
L CDR)と同一であるCDR(例えば、VHCDR及び/又はVL CDR)を含む。
ル化抗体又はその抗原結合断片(例えば、10C6、7B12、19C11、16C5、及び/又は16C5)の同
じ又は重複するエピトープに結合する抗体である。本明細書で使用される場合、「エピト
ープ」は当技術分野の用語であり、抗体が免疫特異的に結合することができる抗原の局所
領域を指すことができる。エピトープは、例えば、ポリペプチドの隣接するアミノ酸であ
ることができ(線形もしくは隣接エピトープ)、又はエピトープは、例えば、ポリペプチド
(単数)もしくはポリペプチド(複数)の2以上の非隣接領域から集合したものであることが
できる(立体構造的、非線形、不連続、もしくは非隣接エピトープ)。ある実施態様におい
て、抗体のエピトープは、例えば、NMR分光法、X線回折結晶学研究、ELISAアッセイ、質
量分析(例えば、MALDI質量分析)と連動した水素/重水素交換、アレイベースのオリゴペプ
チドスキャニングアッセイ、及び/又は突然変異生成マッピング(例えば、部位特異的突然
変異生成マッピング)によって決定することができる。X線結晶学について、結晶化は、当
技術分野における公知の方法のいずれかを用いて達成することができる(例えば、Giege R
らの文献(1994)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson
Aの文献(1990) EurJ Biochem 189: 1-23; Chayen NEの文献(1997) Structure 5: 1269-1
274; McPhersonAの文献(1976) J Biol Chem 251: 6300-6303)。抗体:抗原結晶は、周知
のX線回折技法を用いて研究することができ、かつX-PLOR(YaleUniversity, 1992, Molec
ularSimulations社により配布;例えば、Meth Enzymol(1985)、第114巻及び第115巻、Wyc
koff HWら編;米国特許出願第2004/0014194号を参照)、並びにBUSTER(BricogneGの文献(1
993) ActaCrystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne Gの文献(1997)
MethEnzymol 276A: 361-423、Carter CW編; Roversi Pらの文献(2000) Acta Crystallo
gr D BiolCrystallogr 56(Pt 10): 1316-1323)などのコンピュータソフトウェアを用い
て洗練させることができる。突然変異生成マッピング研究は、当業者に公知の任意の方法
を用いて達成することができる。アラニンスキャニング突然変異生成技法を含む、突然変
異生成技法の説明については、例えば、Champe Mらの文献(1995)並びにCunningham BC及
びWells JAの文献(1989)を参照されたい。さらに、同じ又は重複するエピトープを認識し
、それに結合する抗体は、例えば、ある抗体が別の抗体の標的抗原に対する結合を阻止す
る能力を示すことにより、免疫アッセイなどのルーチンの技法、すなわち、競合的結合ア
ッセイを用いて同定することができる。競合結合アッセイを用いて、2つの抗体がエピト
ープに対する同様の結合特異性を有するかどうかを決定することもできる。競合的結合は
、試験下の免疫グロブリンが参照抗体の共通抗原に対する免疫特異的結合を阻害するアッ
セイで決定することができる。数多くのタイプの競合的結合アッセイが知られており、例
えば:固相直接又は間接放射免疫アッセイ(RIA)、固相直接又は間接酵素免疫アッセイ(EIA
)、サンドイッチ競合アッセイ(StahliCらの文献(1983) Methods Enzymol 9: 242-253を
参照);固相直接ビオチン-アビジンEIA(KirklandTNらの文献(1986) J Immunol 137: 3614
-9を参照);固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ(HarlowE及びLan
e Dの文献(1988)、抗体:実験マニュアル(Antibodies:A Laboratory Manual)、Cold Spri
ng HarborPress); I-125標識を用いる固相直接標識RIA(Morel GAらの文献(1988) Mol Im
munol 25(1):7-15を参照);固相直接ビオチン-アビジンEIA(Cheung RCらの文献(1990) Vi
rology 176:546-52);及び直接標識RIA(Moldenhauer Gらの文献(1990) Scand J Immunol
32: 77-82)がある。典型的には、そのようなアッセイは、これらの標識されていない試験
免疫グロブリン及び標識された参照免疫グロブリンのどちらかを担持する固体表面又はセ
ルに結合した精製抗原の使用を伴う。競合的阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体
表面又はセルに結合した標識の量を決定することにより測定することができる。通常、試
験免疫グロブリンは過剰に存在する。通常、競合する抗体が過剰に存在するとき、それは
、参照抗体の共通抗原に対する免疫特異的結合を、少なくとも50〜55%、55〜60%、60〜
65%、65〜70%、70〜75%、又はそれより大きく阻害する。競合結合アッセイは、標識抗
原又は標識抗体のいずれかを用いる多数の異なるフォーマットで構成されることができる
。このアッセイの共通のバージョンでは、抗原を96ウェルプレートに固定する。その後、
標識抗体の抗原に対する結合を阻止する標識されていない抗体の能力を放射性標識又は酵
素標識を用いて測定する。さらなる詳細については、例えば、Wagener Cらの文献(1983)
J Immunol 130:2308-2315; Wagener Cらの文献(1984) J Immunol Methods 68: 269-274;
Kuroki Mらの文献(1990)Cancer Res 50: 4872-4879; Kuroki Mらの文献(1992) Immunol
Invest21: 523-538; Kuroki Mらの文献(1992) Hybridoma 11: 391-407、及び抗体:実験
マニュアル(Antibodies:A Laboratory Manual)、Harlow E及びLane D編、上記、pp. 386
-389を参照されたい。
別の抗体によって競合的に阻止されるかどうかを決定することができ、例えば、2つの抗
体が、標識抗原又は標識抗体のいずれかを用いる、全ての数の異なるフォーマットで構成
されることができる、競合ELISAアッセイなどの、競合結合アッセイで同一の又は立体的
に重複するエピトープを認識するとき、抗体は、参照抗体と本質的に同じエピトープ、又
は重複するエピトープに結合する。特定の実施態様において、抗体は、本明細書に記載さ
れるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(例えば、10C6、7B12、19C11、16C5、
又は16C5の可変領域を含むマウスIgG抗体)を用いる競合結合アッセイで試験することがで
きる。
ッセイ(例えば、ELISA)を用いて決定したとき、MUC16に対する結合を、本明細書に記載さ
れるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(例えば、10C6、7B12、19C11、16C5、
又は16C5の可変領域を含むマウスIgG抗体)と(例えば、用量依存的な形で)競合する抗体で
ある。別の態様において、本明細書に提供されるのは、当業者に公知又は本明細書に記載
のアッセイ(例えば、ELISA)を用いて決定したとき、本明細書に記載されるMUC16グリコシ
ル化抗体又はその抗原結合断片(例えば、10C6、7B12、19C11、16C5、又は16C5の可変領域
を含むマウスIgG抗体)がMUC16に結合するのを(例えば、用量依存的な形で)競合的に阻害
する抗体である。
コシル化抗体又はその抗原結合断片がMUC16に対する結合を自己競合するのと同じ程度に
結合を本明細書に記載される抗体と競合する抗体である。ある実施態様において、本明細
書に提供されるのは、MUC16に対する結合を本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体
又はその抗原結合断片と競合する第一の抗体であり、ここで、該競合は、第一の抗体のエ
ピトープに対する結合の80%を上回る(例えば、85%、90%、95%、もしくは98%、又は8
0%〜85%、80%〜90%、85%〜90%、もしくは85%〜95%の)低下として示される。
、表1、表3、又は表5に記載されているようなアミノ酸配列を含むVHCDR1、VH CDR2、及
び/又はVHCDR3を含むVHを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、
用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の
実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、10C6
のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片
と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片で
ある。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的
結合を、7B12のVHCDR(表1、表3、及び表5を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその
抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗
原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対す
る免疫特異的結合を、19C11のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照)を含むMUC16グリコシル
化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化
抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは
、MUC16に対する免疫特異的結合を、16C5のVHCDR(表1、表3、及び表5を参照)を含むMUC1
6グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グ
リコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供
されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、18C6のVHCDR(表1、表3、及び表5を参照)
を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合
するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。
、表2、表4、又は表6に記載されているようなアミノ酸配列を含むVLCDR1、VL CDR2、及
び/又はVLCDR3を含むVLを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、
用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の
実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、10C6
のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片
と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片で
ある。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的
結合を、7B12のVLCDR(表2、表4、及び表6を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその
抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗
原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対す
る免疫特異的結合を、19C11のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含むMUC16グリコシル
化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化
抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは
、MUC16に対する免疫特異的結合を、16C5のVLCDR(表2、表4、及び表6を参照)を含むMUC1
6グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グ
リコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供
されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、18C6のVLCDR(表2、表4、及び表6を参照)
を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合
するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。
、(a)表1、表3、又は表5に記載されているようなアミノ酸配列を含むVHCDR1、VH CDR2、
及び/又はVHCDR3を含むVH;並びに(b)表2、表4、又は表6に記載されているようなアミノ
酸配列を含むVL CDR1、VLCDR2、及び/又はVL CDR3を含むVLを含むMUC16グリコシル化抗
体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体
又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、MU
C16に対する免疫特異的結合を、(a)10C6のVHCDR(表1、表3、及び表5を参照);並びに(b)1
0C6のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合
断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断
片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特
異的結合を、(a)7B12のVHCDR(表1、表3、及び表5を参照);並びに(b)7B12のVL CDR(表2、
表4、及び表6を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用
量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実
施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、(a)19C1
1のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照);並びに(b)19C11のVLCDR(表2、表4、及び表6を参
照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競
合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、
本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、(a)16C5のVH CDR(表1、表
3、及び表5を参照);並びに(b)16C5のVLCDR(表2、表4、及び表6を参照)を含むMUC16グリ
コシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコ
シル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供され
るのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、(a)18C6のVHCDR(表1、表3、及び表5を参照);
並びに(b)18C6のVLCDR(表2、表4、及び表6を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はそ
の抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその
抗原結合断片である。
、表7に記載されているようなアミノ酸配列を有するVHドメインを含むMUC16グリコシル化
抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗
体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MU
C16に対する免疫特異的結合を、配列番号1のアミノ酸配列を有するVHドメインを含むMUC1
6グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グ
リコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供さ
れるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、配列番号21のアミノ酸配列を有するVHドメ
インを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)
競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、
本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、配列番号41のアミノ酸配
列を有するVHドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用
量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な
態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、配列番号6
1のアミノ酸配列を有するVHドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片
と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片で
ある。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結
合を、配列番号81のアミノ酸配列を有するVHドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又は
その抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はそ
の抗原結合断片である。
、表8に記載されているようなアミノ酸配列を有するVLドメインを含むMUC16グリコシル化
抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗
体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MU
C16に対する免疫特異的結合を、配列番号2のアミノ酸配列を有するVLドメインを含むMUC1
6グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グ
リコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供さ
れるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、配列番号22のアミノ酸配列を有するVLドメ
インを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)
競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、
本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、配列番号42のアミノ酸配
列を有するVLドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用
量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な
態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、配列番号6
2のアミノ酸配列を有するVLドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片
と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片で
ある。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結
合を、配列番号82のアミノ酸配列を有するVLドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又は
その抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はそ
の抗原結合断片である。
、(a)表7に記載されているようなアミノ酸配列を有するVHドメイン;及び(b)表8に記載さ
れているようなアミノ酸配列を有するVLドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその
抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗
原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する
免疫特異的結合を、(a)配列番号1のアミノ酸配列を有するVHドメイン;及び(b)配列番号2
のアミノ酸配列を有するVLドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片
と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片で
ある。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結
合を、(a)配列番号21のアミノ酸配列を有するVHドメイン;及び(b)配列番号22のアミノ酸
配列を有するVLドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、
用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的
な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、(a)配列
番号41のアミノ酸配列を有するVHドメイン;及び(b)配列番号42のアミノ酸配列を有するVL
ドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形
で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において
、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、(a)配列番号61のアミノ
酸配列を有するVHドメイン;及び(b)配列番号62のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む
MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC
16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提
供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、(a)配列番号81のアミノ酸配列を有する
VHドメイン;及び(b)配列番号82のアミノ酸配列を有するVLドメインを含むMUC16グリコシ
ル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル
化抗体又はその抗原結合断片である。
いるようなアミノ酸配列を含むVH CDR1、VH CDR2、及び/又はVH CDR3を含むVHを含む抗体
の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片
である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、10C6のVH CDR(表1、表3
、及び表5を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル
化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるの
は、7B12のVHCDR(表1、表3、及び表5を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープ
に結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様におい
て、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、19C11のVH CDR(表1、
表3、及び表5を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用
量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実
施態様において、本明細書に提供されるのは、16C5のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照)
を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗
原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、18C6のVH CDR
(表1、表3、及び表5を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グ
リコシル化抗体又はその抗原結合断片である。
いるようなアミノ酸配列を含むVL CDR1、VL CDR2、及び/又はVL CDR3を含むVLを含む抗体
の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片
である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、10C6のVL CDR(表2、表4
、及び表6を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル
化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるの
は、7B12のVLCDR(表2、表4、及び表6を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープ
に結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様におい
て、本明細書に提供されるのは、19C11のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含む抗体の
同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片で
ある。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、16C5のVL CDR(表2、表4、
及び表6を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化
抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは
、18C6のVLCDR(表2、表4、及び表6を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに
結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。
ているようなアミノ酸配列を含むVH CDR1、VH CDR2、及び/又はVH CDR3を含むVH;並びに(
b)表2、表4、又は表6に記載されているようなアミノ酸配列を含むVLCDR1、VL CDR2、及
び/又はVLCDR3を含むVLを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリ
コシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供さ
れるのは、(a)10C6のVHCDR(表1、表3、及び表5を参照);並びに(b)10C6のVL CDR(表2、表
4、及び表6を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル
化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるの
は、(a)7B12のVHCDR(表1、表3、及び表5を参照);並びに(b)7B12のVL CDR(表2、表4、及
び表6を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗
体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、
(a)19C11のVHCDR(表1、表3、及び表5を参照);並びに(b)19C11のVL CDR(表2、表4、及び
表6を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体
又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a
)16C5のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照);並びに(b)16C5のVLCDR(表2、表4、及び表6を
参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はそ
の抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)18C6
のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照);並びに(b)18C6のVLCDR(表2、表4、及び表6を参照)
を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗
原結合断片である。
ノ酸配列を有するVHドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16
グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供
されるのは、配列番号1のアミノ酸配列を有するVHドメインを含む抗体の同じ又は重複す
るエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な
態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号21のアミノ酸配列を有するVHドメイ
ンを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその
抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号41の
アミノ酸配列を有するVHドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMU
C16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に
提供されるのは、配列番号61のアミノ酸配列を有するVHドメインを含む抗体の同じ又は重
複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体
的な態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号81のアミノ酸配列を有するVHド
メインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又は
その抗原結合断片である。
ノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16
グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供
されるのは、配列番号2のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体の同じ又は重複す
るエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な
態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号22のアミノ酸配列を有するVLドメイ
ンを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその
抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号42の
アミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMU
C16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に
提供されるのは、配列番号62のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体の同じ又は重
複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体
的な態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号82のアミノ酸配列を有するVLド
メインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又は
その抗原結合断片である。
ミノ酸配列を有するVHドメイン;及び(b)表8に記載されているようなアミノ酸配列を有す
るVLドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗
体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、(a
)配列番号1のアミノ酸配列を有するVHドメイン;及び(b)配列番号2のアミノ酸配列を有す
るVLドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗
体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、(a
)配列番号21のアミノ酸配列を有するVHドメイン;及び(b)配列番号22のアミノ酸配列を有
するVLドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化
抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、
(a)配列番号41のアミノ酸配列を有するVHドメイン;及び(b)配列番号42のアミノ酸配列を
有するVLドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル
化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは
、(a)配列番号61のアミノ酸配列を有するVHドメイン;及び(b)配列番号62のアミノ酸配列
を有するVLドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシ
ル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるの
は、(a)配列番号81のアミノ酸配列を有するVHドメイン;及び(b)配列番号82のアミノ酸配
列を有するVLドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコ
シル化抗体又はその抗原結合断片である。
を用いて、2つの抗体が同じエピトープに結合するかどうかを決定することができる。親
和性を、限定されないが、平衡解離定数(KD)及び平衡会合定数(KA)を含む、当技術分野で
公知のいくつかの方法で測定し及び/又は表すことができる。KDは、バイオレイヤー干渉
法などの、当業者に公知の技法によって決定することができる。
合断片のエピトープを免疫原として用いて、抗体を産生する。例えば、抗体を産生する方
法については、第5.3節及び第6.2節を参照されたい。
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結
合断片は、0.5×10-3/s、1×10-3/s、1.5×10-3/s、2×10-3/s、2.5×10-3/s、3×10-3/s
、4×10-3/s、5×10-3/s、6×10-3/s、7×10-3/s、8×10-3/s、9×10-3/s、1×10-4/s、2
×10-4/s、3×10-4/s、4×10-4/s、5×10-4/s、6×10-4/s、7×10-4/s、又は8×10-4/s未
満のkdでMUC16に結合する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グ
リコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約0.5×10-3/s、1×10-3/s、1.5×10-3/s、2×
10-3/s、2.5×10-3/s、3×10-3/s、4×10-3/s、5×10-3/s、6×10-3/s、7×10-3/s、8×1
0-3/s、9×10-3/s、1×10-4/s、2×10-4/s、3×10-4/s、4×10-4/s、5×10-4/s、6×10-4
/s、7×10-4/s、又は8×10-4/sのkdでMUC16に結合する。いくつかの実施態様において、
本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約0.5×10-3/s〜
8×10-4/sのkdでMUC16に結合する。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMU
C16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約1×10-3/sのkdでMUC16に結合する。具
体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結
合断片は、約1.5×10-3/sのkdでMUC16に結合する。具体的な実施態様において、本明細書
に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約2×10-3/sのkdでMUC16
に結合する。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体
又はその抗原結合断片は、約2×10-4/sのkdでMUC16に結合する。具体的な実施態様におい
て、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約7×10-4/s
のkdでMUC16に結合する。
合断片は、少なくとも2.5×104/s、3×104/s、3.5×104/s、4×104/s、4.5×104/s、5×1
04/s、5.5×104/s、6×104/s、6.5×104/s、7×104/s、7.5×104/s、8×104/s、9×104/s
、又は9×105/sのkaでMUC16に結合する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載
されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約2.5×104/s、3×104/s、3.5×
104/s、4×104/s、4.5×104/s、5×104/s、5.5×104/s、6×104/s、6.5×104/s、7×104/
s、7.5×104/s、8×104/s、9×104/s、又は9×105/sのkaでMUC16に結合する。いくつかの
実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片
は、約4×104/sのkaでMUC16に結合する。具体的な実施態様において、本明細書に記載さ
れるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約6×104/sのkaでMUC16に結合する
。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗
原結合断片は、約7.5×104/sのkaでMUC16に結合する。
合断片は、1000nM、500nM、100nM、50nM、25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM
、1nM、0.5nM、0.1nM、又は0.05nM未満のKDでMUC16に結合する。いくつかの実施態様にお
いて、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約1000nM
、500nM、100nM、50nM、25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.
1nM、又は0.05nMのKDでMUC16に結合する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載
されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約500nM〜1000nMのKDでMUC16に
結合する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体
又はその抗原結合断片は、約5nM〜75nMのKDでMUC16に結合する。具体的な実施態様におい
て、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約7nMのKDで
MUC16に結合する。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシ
ル化抗体又はその抗原結合断片は、約10pMのKDでMUC16に結合する。別の具体的な実施態
様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約1
5pMのKDでMUC16に結合する。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC1
6グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約20pMのKDでMUC16に結合する。別の具体的
な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断
片は、約25pMのKDでMUC16に結合する。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載
されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約65pMのKDでMUC16に結合する。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、数値又は数の範囲を修飾するために使
用されるとき、該値又は範囲の5%〜10%を上回る偏差及び5%〜10%を下回る偏差が列挙
された値又は範囲の意図された意味の範囲内にとどまっていることを示す。
合断片は、MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第
一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に結合する。ある実
施態様において、該細胞は、癌細胞(例えば、卵巣癌細胞、肺癌細胞、膵癌細胞、乳癌細
胞、卵管癌細胞、子宮(例えば、子宮内膜)癌細胞、又は原発性腹膜癌細胞)である。ある
実施態様において、該細胞は、卵巣癌細胞である。ある実施態様において、該細胞は、肺
癌細胞である。ある実施態様において、該細胞は、膵癌細胞である。ある実施態様におい
て、該細胞は、乳癌細胞である。ある実施態様において、該細胞は、子宮(例えば、子宮
内膜)癌細胞である。ある実施態様において、該細胞は、卵管癌細胞である。ある実施態
様において、該細胞は、原発性腹膜癌細胞である。ある実施態様において、該細胞は、SK
OV3細胞である。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又
はその抗原結合断片は、MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、
ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に対し
て、アイソタイプ対照抗体が該細胞に結合するよりも、少なくとも10、20、30、40、50、
60、70、80、90、100、250、500、又は1000倍多く結合する。アイソタイプ対照抗体は、
当技術分野で認められている用語である。ある実施態様において、本明細書に提供される
MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、MUC16の第一の形態(この第一の形態は
グリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を
組換え発現する細胞に対して、アイソタイプ対照抗体が該細胞に結合するよりも、約10、
20、30、40、50、60、70、80、90、100、250、500、又は1000倍多く結合する。ある実施
態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、M
UC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態の
アミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に対して、アイソタイプ対照抗
体が該細胞に結合するよりも、10〜50、50〜100、100〜250、250〜500、又は500〜1000倍
多く結合する。
16c114とも呼ばれ、成熟MUC16のC末端の114アミノ酸残基からなる(配列番号150は成熟MUC
16の配列である)。MUC16c114は、配列番号133の位置1、24、及び30のアスパラギンアミノ
酸(配列番号150のアミノ酸位置Asn1777、Asn1800、及びAsn1806に対応する)でN-グリコシ
ル化されることができる。
合断片は、MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該
第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異
的結合を欠く。ある実施態様において、該細胞は、卵巣癌細胞である。ある実施態様にお
いて、該細胞は、肺癌細胞である。ある実施態様において、該細胞は、膵癌細胞である。
ある実施態様において、該細胞は、乳癌細胞である。ある実施態様において、該細胞は、
子宮(例えば、子宮内膜)癌細胞である。ある実施態様において、該細胞は、卵管癌細胞で
ある。ある実施態様において、該細胞は、原発性腹膜癌細胞である。ある実施態様におい
て、該細胞は、SKOV3細胞である。ある実施態様において、MUC16の第二の形態は、例えば
、緑色蛍光タンパク質又は赤色蛍光タンパク質などの検出可能なタンパク質に融合される
。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結
合断片は、MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該
第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対して、アイソ
タイプ対照抗体が該細胞に結合するよりも、最大でも1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4
、又は5倍多く結合する。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル
化抗体又はその抗原結合断片は、MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化され
ておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する
細胞に対して、アイソタイプ対照抗体が該細胞に結合するよりも、約1.1、1.2、1.3、1.4
、1.5、2、3、4、又は5倍多く結合する。ある実施態様において、本明細書に提供されるM
UC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、MUC16の第二の形態(この第二の形態はグ
リコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を
組換え発現する細胞に対して、アイソタイプ対照抗体が該細胞に結合するよりも、0〜1.1
、1.1〜1.5、1.5〜3、又は3〜5倍多く結合する。
16c114-N3とも呼ばれる。MUC16c114-N3は、アミノ酸位置30の(配列番号150のアミノ酸位
置1806に対応する)アスパラギンがアラニンに突然変異させられていることを除いて、成
熟MUC16のC末端の114アミノ酸残基からなる(配列番号150は成熟MUC16の配列である)。し
たがって、MUC16c114-N3は、配列番号139のアミノ酸位置30(配列番号150のアミノ酸位置A
sn1806に対応する)でN-グリコシル化されることができない。
合断片は、4H11が該細胞に結合するよりも、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、1
2、13、14、15、20、30、又は40倍少なく、MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコ
シル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換
え発現する細胞に結合する。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコ
シル化抗体又はその抗原結合断片は、4H11が該細胞に結合するよりも、約3、4、5、6、7
、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、又は40倍少なく、MUC16の第二の形態(この第
二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号
139である)を組換え発現する細胞に結合する。ある実施態様において、本明細書に提供さ
れるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、4H11が該細胞に結合するよりも、3
〜5、5〜10、10〜20、又は20〜40倍少なく、MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコ
シル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換
え発現する細胞に結合する。
その抗原結合断片の結合を決定するためのアッセイは、当業者に公知である。例えば、第
6.2節に記載されている方法を参照されたい。
orphol, 2010,18(5):462-72及び国際特許出願公開WO 2011/119979号において4H11と表記
されているモノクローナル抗MUC16抗体を指す。
合断片は、アミノ酸配列
を含むペプチドに結合し、ここで、
のアミノ酸残基番号4(N4)及びアミノ酸残基番号10(N10)は、グリコシル化されている。あ
る実施態様において、該ペプチドは、アミノ酸配列
からなり、ここで、
のアミノ酸残基番号4(N4)及びアミノ酸残基番号10(N10)は、グリコシル化されている。あ
る実施態様において、該グリコシル化は、N-結合型キトビオースからなる。ある実施態様
において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列
を含むペプチドに結合し、ここで、
のアミノ酸残基番号7(N7)は、グリコシル化されている。ある実施態様において、該ペプ
チドは、アミノ酸配列
からなり、ここで、
のアミノ酸残基番号7(N7)は、グリコシル化されている。ある実施態様において、該グリ
コシル化は、N-結合型キトビオースからなる。ある実施態様において、MUC16グリコシル
化抗体又はその抗原結合断片は、ペプチドの混合物に結合し、ここで、該ペプチドの混合
物は、(a)アミノ酸配列
を含む第一のペプチド(ここで、
のアミノ酸残基番号4(N4)及びアミノ酸残基番号10(N10)は、グリコシル化されている)及
び(b)アミノ酸配列
を含む第二のペプチド(ここで、
のアミノ酸残基番号7(N7)はグリコシル化されている)を含む。ある実施態様において、該
第一のペプチドは、アミノ酸配列
からなり、ここで、
のアミノ酸残基番号4(N4)及びアミノ酸残基番号10(N10)は、グリコシル化されている。あ
る実施態様において、該第二のペプチドは、アミノ酸配列
からなり、ここで、
のアミノ酸残基番号7(N7)は、グリコシル化されている。ある実施態様において、該グリ
コシル化は、N-結合型キトビオースからなる。
断片の細胞に対する結合を決定するためのアッセイは、当業者に公知である。例えば、第
6.2節に記載されている方法を参照されたい。ある実施態様において、本明細書に提供さ
れるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、抗MUC16モノクローナル抗体4H11が
ペプチドに結合するよりも、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、又は30倍多く、該ペプチドに結合する。ある実施態様において
、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、抗MUC16モノク
ローナル抗体4H11がペプチドに結合するよりも、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12
、13、14、15、16、17、18、19、20、又は30倍多く、該ペプチドに結合する。
合断片は、0.5×10-3/s、1×10-3/s、1.5×10-3/s、2×10-3/s、2.5×10-3/s、3×10-3/s
、4×10-3/s、5×10-3/s、6×10-3/s、7×10-3/s、8×10-3/s、9×10-3/s、1×10-4/s、2
×10-4/s、3×10-4/s、4×10-4/s、5×10-4/s、6×10-4/s、7×10-4/s、又は8×10-4/s未
満のkdでペプチドに結合する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるMUC1
6グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約0.5×10-3/s、1×10-3/s、1.5×10-3/s、
2×10-3/s、2.5×10-3/s、3×10-3/s、4×10-3/s、5×10-3/s、6×10-3/s、7×10-3/s、8
×10-3/s、9×10-3/s、1×10-4/s、2×10-4/s、3×10-4/s、4×10-4/s、5×10-4/s、6×1
0-4/s、7×10-4/s、又は8×10-4/sのkdでペプチドに結合する。いくつかの実施態様にお
いて、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約0.5×10
-3/s〜8×10-4/sのkdでペプチドに結合する。
合断片は、少なくとも2.5×104/s、3×104/s、3.5×104/s、4×104/s、4.5×104/s、5×1
04/s、5.5×104/s、6×104/s、6.5×104/s、7×104/s、7.5×104/s、8×104/s、9×104/s
、又は9×105/sのkaでペプチドに結合する。いくつかの実施態様において、本明細書に提
供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約2.5×104/s、3×104/s、3.5
×104/s、4×104/s、4.5×104/s、5×104/s、5.5×104/s、6×104/s、6.5×104/s、7×10
4/s、7.5×104/s、8×104/s、9×104/s、又は9×105/sのkaでペプチドに結合する。いく
つかの実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結
合断片は、約2.5×104/s〜9×105/sのkaでペプチドに結合する。
合断片は、1000nM、500nM、100nM、50nM、25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM
、1nM、0.5nM、0.1nM、又は0.05nM未満のKDでペプチドに結合する。いくつかの実施態様
において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約100
0nM、500nM、100nM、50nM、25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM
、0.1nM、又は0.05nMのKDでペプチドに結合する。いくつかの実施態様において、本明細
書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約500nM〜1000nMのKDで
ペプチドに結合する。
に対する免疫特異的結合を欠いており、ここで、
のアミノ酸残基番号4(N4)及びアミノ酸残基番号10(N10)は、グリコシル化されてない。あ
る実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列
に対する免疫特異的結合を欠いており、ここで、
のアミノ酸残基番号7(N7)は、グリコシル化されている。ある実施態様において、本明細
書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、ペプチドの混合物に対
する免疫特異的結合を欠いており、ここで、該ペプチドの混合物は、(a)アミノ酸配列
からなる第一のペプチド(ここで、
のアミノ酸残基番号4(N4)及びアミノ酸残基番号10(N10)は、グリコシル化されている)及
び(b)アミノ酸配列
からなる第二のペプチド(ここで、
のアミノ酸残基番号7(N7)は、グリコシル化されている)を含む。
合断片は、グリコシル化されているMUC16の形態(ここで、該MUC16の形態のアミノ酸配列
は配列番号133である)(MUC16c114)を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸
潤を阻害する。ある実施態様において、グリコシル化MUC16c114を組換え発現する細胞は
、SKOV3細胞である。ある実施態様において、該MUC16c114のグリコシル化形態は、N-グリ
コシル化されている。ある実施態様において、該MUC16c114のグリコシル化形態は、アミ
ノ酸残基Asn30(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する)でN-グリコシル化されてい
る。ある実施態様において、該MUC16c114のグリコシル化形態は、アミノ酸残基Asn24及び
Asn30(それぞれ、成熟MUC16(配列番号150)のAsn1800及びAsn1806に対応する)でN-グリコ
シル化されている。ある実施態様において、該MUC16c114のグリコシル化形態は、アミノ
酸残基Asn1、Asn24、及びAsn30(それぞれ、成熟MUC16(配列番号150)のAsn1777、Asn1800
、及びAsn1806に対応する)でN-グリコシル化されている。ある実施態様において、該グリ
コシル化は、N-結合型キトビオースを含む。ある実施態様において、該グリコシル化は、
N-結合型キトビオースからなる。ある実施態様において、マトリゲル浸潤は、細胞(ここ
で、該細胞は、対照抗体(例えば、MUC16を標的としない抗体)又は4H11で処理される)のイ
ンビトロでのマトリゲル浸潤と比較して、少なくとも1.25、1.5、1.75、2、3、4、5、6、
7、8、9、又は10倍阻害される。ある実施態様において、マトリゲル浸潤は、細胞(ここで
、該細胞は、対照抗体(例えば、MUC16を標的としない抗体)又は4H11で処理される)のイン
ビトロでのマトリゲル浸潤と比較して、約1.25、1.5、1.75、2、3、4、5、6、7、8、9、
又は10倍阻害される。
決定するためのアッセイは、当業者に公知である。例えば、第6.2節に記載されている方
法を参照されたい。例えば、BD BioCoat(商標) Matrigel(商標)浸潤インサート又はチャ
ンバー(カタログ#354480、24ウェルプレート中)及び対照インサート(カタログ# 354578
、24ウェルプレート中)は、BDBiosciences, MAから購入することができる。マトリゲル
浸潤アッセイは、製造元のプロトコルに従って実施することができる。簡潔に述べると、
24ウェルプレート中のマトリゲルチャンバー(-20℃で保存されたもの)及び対照インサー
ト(4℃で保存されたもの)を室温に至らせておく。両方のインサートを、インサート中で
、及び24ウェルプレートの外側のウェル中で、37℃の5%CO2加湿インキュベーターにて2
時間、0.5mLの無血清培地で再水和させる。培養したSKOV3細胞をトリプシン処理し、培養
培地で洗浄する。100万個の細胞を別の遠心分離チューブに分け、無血清培地で3回洗浄す
る。後に、これらの細胞を調整して、0.5mLの無血清培地中、5,000細胞にする。再水和さ
せたインサート中の培地を除去し、このインサートを、化学誘引物質としての役割を果た
すウェル中の0.75mLの10%胎仔ウシ血清(FBS)含有培養培地を含む新しい24ウェルプレー
トに移した。すぐに、無血清培地中の0.5mLの該細胞(5,000細胞)をインサートに添加する
。適切な注意を払って、インサート及び外側のウェルに気泡が閉じ込められないように配
慮する。24ウェルプレートを37℃の5%CO2加湿インキュベーターで48時間インキュベート
する。インキュベーション後、綿棒をマトリゲル又は対照インサートに挿入して「擦る」
ことにより、非浸潤細胞を膜の上表面から除去し、綿棒の先端を膜表面にわたって移動さ
せながら、穏やかに圧力をかける。培地に浸した第二の綿棒で擦ることを繰り返す。その
後、蒸留水中の0.5mLの0.5%クリスタルバイオレット染料を含む新しい24ウェルプレート
中で30分間、インサートを染色する。染色後、インサートを蒸留水の3つのビーカー中で
すすいで、余分な染料を除去する。インサートを新しい24ウェルプレート中で風乾させる
。浸潤した細胞を、200倍の倍率の倒立顕微鏡下で、手でカウントする。3つ組の膜のいく
つかの視野をカウントし、図に記録した。
合断片は、マウスモデル研究において、転移を阻害もしくは軽減するか、腫瘍成長を阻害
するか、又は腫瘍退縮を誘導することができる。例えば、腫瘍細胞株を無胸腺ヌードマウ
スに導入することができ、無胸腺マウスに本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体
を1回以上を投与することができ、注入された腫瘍細胞の腫瘍進行を数週間及び/又は数カ
月にわたってモニタリングすることができる。場合により、無胸腺ヌードマウスへのMUC1
6グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の投与は、腫瘍細胞株の導入前に行うことがで
きる。ある実施態様において、MUC16c114を発現するSKOV3細胞を本明細書に記載されるマ
ウス異種移植モデルに利用する。例えば、第6.2節及び第6.3節を参照されたい。
原結合断片は、本明細書に記載の又は当業者に公知の方法によって評価したとき、模擬処
置マウスと比較して、マウスモデルで、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30
%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%
、98%、99%、又は100%腫瘍成長を阻害するか又は腫瘍退縮を誘導する。具体的な実施
態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、
本明細書に記載の又は当業者に公知の方法によって評価したとき、模擬処置マウスと比較
して、マウスモデルで、少なくとも約25%又は35%、任意に約75%まで腫瘍成長を阻害す
るか又は腫瘍退縮を誘導する。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16
グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載の又は当業者に公知の方法に
よって評価したとき、模擬処置マウスと比較して、マウスモデルで、少なくとも約1倍、1
.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8
倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、又は100倍腫
瘍成長を阻害するか又は腫瘍退縮を誘導する。模擬処置マウスは、例えば、リン酸緩衝食
塩水又は対照(例えば、抗IgG抗体)で処置することができる。
視覚的検出法によって、例えば、腫瘍サイズを一定期間にわたってモニタリングすること
により評価することができる。例えば、腫瘍細胞株を、緑色蛍光タンパク質(GFP)又はル
シフェラーゼなどの可視化物質を組換え発現するように作製することができ、その後、GF
Pのインビボ可視化を顕微鏡観察により実施することができ、ルシフェラーゼのインビボ
可視化を、ルシフェラーゼ基質を異種移植マウスに投与し、かつルシフェラーゼ酵素がル
シフェラーゼ基質を処理することによる発光を検出することにより実施することができる
。GFP又はルシフェラーゼの検出の程度又はレベルは、異種移植マウスにおける腫瘍のサ
イズと相関する。
合断片は、模擬処置マウスと比較して、腫瘍異種移植モデルで、動物の生存を増大させる
ことができる。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗
体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載の又は当業者に公知の方法によって評価した
とき、模擬処置マウスと比較して、腫瘍異種移植モデルで、マウスの生存を、少なくとも
約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、7
0%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%増大させる。具体的な実施態様に
おいて、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、本明細
書に記載の又は当業者に公知の方法によって評価したとき、模擬処置マウスと比較して、
腫瘍異種移植モデルで、マウスの生存を、少なくとも約25%又は35%、任意に約75%まで
増大させる。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体
又はその抗原結合断片は、本明細書に記載の又は当業者に公知の方法によって評価したと
き、模擬処置マウスと比較して、腫瘍異種移植モデルで、マウスの生存を、少なくとも約
1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7
倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、又は10
0倍増大させる。生存は、例えば、腫瘍細胞株注入後の時間(例えば、日又は週)に対する
生存マウスの数の生存曲線をプロットすることにより決定することができる。模擬処置マ
ウスは、例えば、リン酸緩衝食塩水又は対照(例えば、抗IgG抗体)で処置することができ
る。
合断片は、グリコシル化されているMUC16の形態(ここで、該MUC16の形態のアミノ酸配列
は配列番号133である)(MUC16c114)を発現する細胞を該MUC16グリコシル化抗体又はその抗
原結合断片と接触させたとき、該細胞に内在化される。「内在化される」又は「内在化」
は、細胞によって内在化される分子に関するものであるとき、細胞膜の細胞外表面と接触
している分子が細胞膜を横断して細胞膜の細胞内表面に及び/又は細胞質内に移動するこ
とを指す。ある実施態様において、グリコシル化MUC16c114を組換え発現する細胞は、SKO
V3細胞である。ある実施態様において、MUC16c114のグリコシル化形態は、N-グリコシル
化されている。ある実施態様において、MUC16c114のグリコシル化形態は、アミノ酸残基A
sn30(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する)でN-グリコシル化されている。ある
実施態様において、MUC16c114のグリコシル化形態は、アミノ酸残基Asn24及びAsn30(それ
ぞれ、成熟MUC16(配列番号150)のAsn1800及びAsn1806に対応する)でN-グリコシル化され
ている。ある実施態様において、MUC16c114のグリコシル化形態は、アミノ酸残基Asn1、A
sn24、及びAsn30(それぞれ、成熟MUC16(配列番号150)のAsn1777、Asn1800、及びAsn1806
に対応する)でN-グリコシル化されている。ある実施態様において、該グリコシル化は、N
-結合型キトビオースを含む。ある実施態様において、該グリコシル化は、N-結合型キト
ビオースからなる。
ル化抗体又はその抗原結合断片の細胞への内在化を決定するためのアッセイは、当業者に
公知である。例えば、第6.2節に記載されている方法を参照されたい。例えば、89Zr標識
抗体の内在化は、MUC16c114を発現するSKOV3細胞で調べることができる。簡潔に述べると
、約1×105個の細胞を12ウェルプレートに播種し、37℃の5%CO2インキュベーターで一晩
インキュベートする。ある容量の放射性標識タンパク質を各々のウェルに添加し、プレー
トを37℃及び4℃で1、5、12、及び24時間インキュベートする。各々のインキュベーショ
ン期間の後、培地を回収し、細胞を1mLのリン酸緩衝食塩水(PBS)ですすぐ。細胞を、100m
Mグリシンを含む1mLの100mM酢酸(1:1、pH3.5)中、4℃で洗浄することにより、表面結合
活性を回収する。その後、接着細胞を1mLの1M NaOHで溶解させる。各々の洗浄液を回収し
、活性についてカウントする。最終洗浄液の活性と全ての洗浄液の全活性との比を用いて
、内在化された%を決定する。ある実施態様において、アッセイを37℃で実施する。ある
実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、該MUC16グリコシル
化抗体又はその抗原結合断片とともにインキュベートされた細胞の少なくとも1、2、3、5
、6、7、8、9、又は10パーセントに内在化される。ある実施態様において、MUC16グリコ
シル化抗体又はその抗原結合断片は、該MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と
ともにインキュベートされた細胞の約1、2、3、5、6、7、8、9、又は10パーセントに内在
化される。ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、細
胞を該MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と接触させてから1、2、3、4、8、12
、16、20、又は24時間以内に内在化される。
好ましい実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗
原結合断片(第5.1節を参照)は、任意の他の分子、例えば、有機部分、検出可能標識、又
は同位体にコンジュゲートされていない。代わりの実施態様において、本明細書に提供さ
れるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節を参照)は、1以上の有機部分
にコンジュゲートされている。代わりの実施態様において、本明細書に提供されるMUC16
グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、1以上の検出可能標識にコンジュゲートされ
ている。代わりの実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又は
その抗原結合断片は、1以上の同位体にコンジュゲートされている。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16グリコシル化抗体又はその
抗原結合断片(第5.1節を参照)コンジュゲートであり、ここで、該MUC16グリコシル化抗体
又はその抗原結合断片は、1以上の薬剤、例えば、イメージング剤又は細胞毒性剤にコン
ジュゲートされている。また本明細書に提供されるのは、二重特異性抗体コンジュゲート
であり、ここで、該二重特異性抗体は、1以上の薬剤、例えば、イメージング剤又は細胞
毒性剤にコンジュゲートされている。また本明細書に提供されるのは、抗体重鎖コンジュ
ゲートであり、ここで、該抗体重鎖は、1以上の薬剤、例えば、イメージング剤又は細胞
毒性剤にコンジュゲートされている。また本明細書に提供されるのは、抗体軽鎖コンジュ
ゲートであり、ここで、該抗体軽鎖は、1以上の薬剤、例えば、イメージング剤又は細胞
毒性剤にコンジュゲートされている。また本明細書に提供されるのは、融合タンパク質コ
ンジュゲートであり、ここで、該融合タンパク質は、薬剤、例えば、イメージング剤又は
細胞毒性剤にコンジュゲートされている。ある実施態様において、該薬剤は、共有結合的
に又は非共有結合的にコンジュゲートされている。
識、放射性同位体標識、同位体標識、蛍光標識、毒性標識、化学発光標識、核磁気共鳴造
影剤標識、又は他の標識である。
ベンゼン-2-カルボン酸が挙げられる。
レアーゼ、δ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α-グリセ
ロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、ア
ルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダ
ーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナ
ーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。
、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc
、223Ra、223Ra、89Zr、177Lu、及び109Pdが挙げられる。ある実施態様において、111In
は、それが肝臓での125I又は131I-標識されたMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断
片の脱ハロゲン化の問題を回避するので、インビボイメージングのための好ましい同位体
である。さらに、111Inは、イメージングのためのより好都合なガンマ放出エネルギーを
有する(Perkinsらの文献、Eur.J. Nucl. Med. 70:296-301(1985); Carasquilloらの文献
、J. Nucl.Med. 25:281-287(1987))。例えば、1-(P-イソチオシアナトベンジル)-DPTAと
ともにモノクローナル抗体にカップリングされた111Inは、非腫瘍性組織、特に、肝臓で
の取込みをほとんど示さず、それゆえ、腫瘍局在化の特異性を増強する(Estebanらの文献
、J. Nucl.Med. 28:861-870(1987))。
56Feが挙げられる。
シアネート標識、ローダミン標識、フィコエリスリン標識、フィコシアニン標識、アロフ
ィコシアニン標識、緑色蛍光タンパク質(GFP)標識、o-フタルアルデヒド標識、及びフル
オレスカミン標識が挙げられる。
アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エス
テル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、及びイクオリン標識が挙げられる。
る。
体重鎖、抗体軽鎖、及び融合タンパク質にコンジュゲートするための当業者に公知の技法
は、例えば、Kennedyらの文献、Clin.CMm. Acta 70:1-31(1976)、及びSchursらの文献、
Clin. CMm. Acta81:1-40(1977)に記載されている。後者において言及されているカップ
リング技法は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸塩法、ジマレイミド法、m-マレイミド
ベンジル-N-ヒドロキシ-スクシンイミドエステル法であり、これらの方法は全て、引用に
より本明細書中に組み込まれる。
ン、例えば、α-放射体、並びに毒素、例えば、緑膿菌外毒素、アブリン、コレラ毒素、
リシンA、及びジフテリア毒素が挙げられる。
定することによって疾患を診断又は検出する際に有用な薬剤である。有用な診断剤として
は、放射性同位体、色素(例えば、ビオチン-ストレプトアビジン複合体を有するもの)、
造影剤、蛍光化合物又は蛍光分子、及び磁気共鳴イメージング(MRI)用の増強剤(例えば、
常磁性イオン)が挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第6,331,175号は、MRI
技法及びMRI増強剤にコンジュゲートされた抗体の調製を記載しており、引用により完全
に組み込まれる。診断剤は、放射性同位体、磁気共鳴イメージングで使用するための増強
剤、及び蛍光化合物からなる群から選択されることが好ましい。MUC16グリコシル化抗体
又はその抗原結合断片に放射性金属又は常磁性イオンを担持させるために、それを、イオ
ンに結合させるための多数のキレート基が付着している長い尾部を有する試薬と反応させ
る必要がある場合がある。そのような尾部は、ポリリジン、多糖、又は例えば、エチレン
ジアミン四酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、ポルフィリン、ポリアミン
、クラウンエーテル、ビス-チオセミカルバゾン、ポリオキシム、及びこの目的のために
有用であることが知られている同様の基などのキレート基に結合することができるペンダ
ント基を有する、他の誘導体化されたもしくは誘導体化可能な鎖などの、ポリマーである
ことができる。キレートは、標準的な化学反応を用いて抗体にカップリングされる。キレ
ートは、通常、免疫反応性の最小限の損失並びに最小限の凝集及び/又は内部架橋を伴っ
て、分子への結合の形成を可能にする基によって抗体に連結され、キレートを抗体にコン
ジュゲートするための他のより珍しい方法及び試薬は、その開示が引用により完全に本明
細書中に組み込まれる、1989年4月25日に発行された「抗体コンジュゲート(Antibody Con
jugates)」という表題のHawthorneの米国特許第4,824,659号に開示されている。特に有用
な金属-キレート組合せとしては、放射性イメージング用の診断的同位体とともに使用さ
れる、2-ベンジル-DTPA並びにそのモノメチル及びシクロヘキシル類似体が挙げられる。
同じキレートは、マンガン、鉄、及びガドリニウムなどの非放射性金属とともに錯体を形
成させると、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片ととも
に使用される場合、MRIに有用である。NOTA、DOTA、及びTETAなどの大環状キレートは、
種々の金属及び放射性金属と合わせて、最も具体的には、それぞれ、ガリウム、イットリ
ウム、及び銅の放射性核種と合わせて有用である。そのような金属-キレート錯体は、環
のサイズを対象となる金属に合わせて調整することにより非常に安定にすることができる
。RAIT用の223Raなどの、安定に結合する核種のために対象となる、大環状ポリエーテル
などの他の環型キレートは、本明細書に包含される。
特性が改善された(例えば、インビボ血清半減期が増大した)コンジュゲートを生じさせる
ことできる。該有機部分は、親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基である
ことができる。本明細書で使用される場合、「脂肪酸」という用語は、モノ-カルボン酸
及びジ-カルボン酸を包含する。本明細書で使用される場合、「親水性ポリマー基」は、
オクタンによりも水に溶ける有機ポリマー、例えば、ポリリジンを指す。本明細書に提供
されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を修飾するのに好適な親水性ポリマ
ーは、線状又は分岐状であることができ、これには、例えば、ポリアルカングリコール(
例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、モノメトキシ-ポリエチレングリコール、及びポ
リプロピレングリコール)、炭水化物(例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖、及
び多糖)、親水性アミノ酸のポリマー(例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、及びポリア
スパラギン酸)、ポリアルカンオキシド(例えば、ポリエチレンオキシド及びポリプロピレ
ンオキシド)、並びにポリビニルピロリドンが含まれる。ある実施態様において、本明細
書に提供されるMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片、二重特異性抗体、抗
体重鎖、抗体軽鎖、又は融合タンパク質を修飾する親水性ポリマーは、個別の分子実体と
して、約800〜約150,000ダルトンの分子量を有する。例えば、PEG5000及びPEG20,000(こ
こで、下付き文字は、ダルトンで示したポリマーの平均分子量である)を使用することが
できる。該親水性ポリマー基は、1〜約6個のアルキル、脂肪酸、又は脂肪酸エステル基で
置換することができる。脂肪酸又は脂肪酸エステル基で置換される親水性ポリマーは、好
適な方法を利用することによって調製することができる。例えば、アミン基を含むポリマ
ーは、脂肪酸又は脂肪酸エステルのカルボキシレートにカップリングさせることができ、
脂肪酸又は脂肪酸エステル上の活性化カルボキシレート(例えば、N,N-カルボニルジイミ
ダゾールで活性化されたもの)は、ポリマー上のヒドロキシル基にカップリングさせるこ
とができる。
抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、又は融合タンパク質を修飾するのに好適な脂肪酸及び脂肪酸
エステルは飽和状態であることができるか、又は1以上の不飽和単位を含むことができる
。本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片、二重特異性
抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、又は融合タンパク質を修飾するのに好適である脂肪酸として
は、例えば、n-ドデカン酸、n-テトラデカン酸、n-オクタデカン酸、n-エイコサン酸、n-
ドコサン酸、n-トリアコンタン酸、n-テトラコンタン酸、シス-デルタ-9-オクタデカン酸
、全シス-デルタ-5,8,11,14-エイコサテトラエン酸、オクタン二酸、テトラデカン二酸、
オクタデカン二酸、ドコサン二酸などが挙げられる。好適な脂肪酸エステルとしては、線
状又は分岐状の低級アルキル基を含むジカルボン酸のモノ-エステルが挙げられる。該低
級アルキル基は、1〜約12個の、好ましくは、1〜約6個の炭素原子を含むことができる。
剤との反応によって調製することができる。本明細書で使用される場合、「活性化基」は
、適当な条件下で、第二の化学基と反応し、それにより、修飾剤と第二の化学基の間で共
有結合を形成することができる、化学的部分又は官能基である。例えば、アミン反応性の
活性化基としては、例えば、トシレート、メシレート、ハロ(クロロ、ブロモ、フルオロ
、ヨード)、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(NHS)などのような求電子基が挙げら
れる。チオールと反応することができる活性化基としては、例えば、マレイミド、ヨード
アセチル、アクリロリル(acrylolyl)、ピリジルジスルフィド、5-チオール-2-ニトロ安息
香酸チオール(TNB-チオール)などが挙げられる。アルデヒド官能基は、アミン又はヒドラ
ジド含有分子にカップリングさせることができ、アジド基は、三価リン基と反応して、ホ
スホロアミデート又はホスホルイミド結合を形成することができる。分子に活性化基を導
入する好適な方法は、当技術分野で公知である(例えば、Hernanson, G. T.の文献、バイ
オコンジュゲート技法(Bioconjugate Techniques)、Academic Press: San Diego, Calif.
(1996)を参照)。活性化基は、有機基(例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル
)に直接的に、又はリンカー部分、例えば、二価C1-C12基(ここで、1以上の炭素原子は、
酸素、窒素、もしくは硫黄などのヘテロ原子に置換することができる)を介して結合させ
ることができる。好適なリンカー部分としては、例えば、テトラエチレングリコール、(C
H2)3、及びNHが挙げられる。リンカー部分を含む修飾剤は、例えば、モノ-Boc-アルキル
ジアミン(例えば、モノ-Boc-エチレンジアミン又はモノ-Boc-ジアミノヘキサン)を1-エチ
ル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)の存在下で脂肪酸と反応させて、
遊離アミンと脂肪酸カルボキシレートの間でアミド結合を形成させることにより生成させ
ることができる。Boc保護基を、トリフルオロ酢酸(TFA)による処理によって生成物から除
去して、記載されているような別のカルボキシレートにカップリングさせることができる
1級アミンを露出させることができるか、又は無水マレイン酸と反応させ、得られる生成
物を環化して、脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生成させることができる(例えば、そ
の教示の全体が引用により本明細書中に組み込まれる、Thompsonらの文献、WO 92/16221
号を参照)。
脂肪酸エステル)を指すことができる。例えば、有機部分は、アミン反応性の修飾剤、例
えば、PEGのN-ヒドロキシスクシンイミドエステルを利用することにより、部位非特異的
な形でMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片に結合させることができる。修飾さ
れたMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、該MUC16グリコシル化抗体もしくは
その抗原結合断片、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、又は融合タンパク質のジスル
フィド結合(例えば、鎖内ジスルフィド結合)を還元することによって調製することもでき
る。その後、還元されたMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片、二重特異性
抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、又は融合タンパク質をチオール反応性の修飾剤と反応させて
、本明細書に提供されるコンジュゲートを生成させることができる。本明細書に提供され
るMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の特定の部位に結合している有機部分を
含むコンジュゲートは、好適な方法、例えば、逆タンパク質分解(reverse proteolysis)(
Fischらの文献、BioconjugateChem., 3:147-153(1992); Werlenらの文献、Bioconjugate
Chem.,5:411-417(1994); Kumaranらの文献、Protein Sci. 6(10):2233-2241(1997); It
ohらの文献、Bioorg.Chem., 24(1): 59-68(1996); Capellasらの文献、Biotechnol. Bio
eng., 56(4):456-463(1997))、及びHermanson,G. T.の文献、バイオコンジュゲート技法
(BioconjugateTechniques)、Academic Press: San Diego, Calif.(1996)に記載されてい
る方法を用いて調製することができる。
(5.3.1 抗体の産生及びスクリーニング)
別の態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原
結合断片を産生する方法である(第5.1節及び第5.2節を参照)。
公知の任意の方法によって、例えば、化学合成によって又は組換え発現技法によって産生
することができる。本明細書に記載される方法は、別途示されない限り、分子生物学、微
生物学、遺伝子解析、組換えDNA、有機化学、生化学、PCR、オリゴヌクレオチド合成及び
修飾、核酸ハイブリダイゼーション、並びに当業者の範囲内の関連分野における従来の技
法を利用する。これらの技法は、例えば、本明細書に引用される参考文献に記載されてお
り、文献中で十分に説明されている。例えば、Maniatis Tらの文献(1982)、分子クローニ
ング:実験マニュアル(MolecularCloning: A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor
LaboratoryPress; Sambrook Jらの文献(1989)、分子クローニング:実験マニュアル(Mole
cular Cloning:A Laboratory Manual)、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press;
SambrookJらの文献(2001)、分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning: A
LaboratoryManual)、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY;
AusubelFMらの文献、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular B
iology)、JohnWiley & Sons(1987年版及び年次改訂版);免疫学の最新プロトコル(Curren
t Protocols inImmunology)、John Wiley & Sons(1987版及び年次改訂版)、Gait(編)(19
84)、オリゴヌクレオチド合成:実践的アプローチ(OligonucleotideSynthesis: A Practi
cal Approach)、IRLPress; Eckstein(編)(1991)、オリゴヌクレオチド及び類似体:実践
的アプローチ(Oligonucleotidesand Analogues: A Practical Approach)、IRL Press; B
irren Bら(編)(1999)、ゲノム解析:実験マニュアル(GenomeAnalysis: A Laboratory Man
ual)、ColdSpring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。
原結合断片は、例えば、DNA配列の合成、遺伝子工学による作出を伴う任意の手段によっ
て調製、発現、作出、又は単離された抗体(例えば、組換え抗体)である。ある実施態様に
おいて、そのような抗体は、インビボの動物又は哺乳動物(例えば、ヒト)の抗体生殖系列
レパートリー中に天然では存在しないDNA配列によってコードされる配列を含む。具体的
な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断
片は、配列番号129、配列番号130、及び/又は配列番号131のグリコシル化形態を使用する
ことを含む方法によって作製される。具体的な実施態様において、配列番号129、配列番
号130、及び/又は配列番号131のグリコシル化形態は、1以上のキトビオースでグリコシル
化されている。例えば、本明細書に記載される抗体を産生する方法の詳細な説明について
は、第6.2節、第6.3節、及び第6.4節を参照されたい。
原性糖ペプチドであり、ここで、(i)該免疫原性糖ペプチドは、10〜60アミノ酸残基、10
〜30アミノ酸残基、15〜25アミノ酸残基、15〜20アミノ酸残基、又は15〜18アミノ酸残基
の長さであり、かつ(ii)該1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つは、炭水化物
と結合している。
シル化部位を含む。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、1つのグリコ
シル化部位を含む。別の具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、2つのグ
リコシル化部位を含む。
グリコシル化部位を含む。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、炭水化
物と各々結合している2つのグリコシル化部位を含む。
水化物、O-結合型炭水化物、又はC-結合型炭水化物であることができる。N-結合型炭水化
物は、アスパラギン残基に結合しており、かつ天然で見られる最も一般的な形態である。
N-結合型炭水化物の大多数は、GlcNAc-β-Asnの形態でペプチドに結合している。O-結合
型炭水化物は、アミノ酸ヒドロキシル側鎖(通常、セリン又はトレオニンに由来する)に結
合している。O-結合型炭水化物の大多数は、GlcNAc-β-Ser/Thr又はGlcNAc-α-Ser/Thrの
形態でペプチドに結合している。C-結合型炭水化物は、トリプトファン残基に結合したマ
ンノースを指し、かつ天然で見られる最も一般的でない形態である。一実施態様において
、該免疫原性糖ペプチド中の炭水化物は、N-又はO-結合型炭水化物である。具体的な実施
態様において、該免疫原性糖ペプチド中の炭水化物は、N-結合型炭水化物である。
、オリゴ糖(例えば、三糖、四糖、もしくは五糖)、又は多糖であることができる。ある実
施態様において、該炭水化物は、単糖、二糖、三糖、四糖、又は五糖である。具体的な実
施態様において、該炭水化物は、二糖である。特定の実施態様において、二糖は、キトビ
オースである。別の具体的な実施態様において、該炭水化物は、Man3GlcNAc2である。具
体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドのN末端は、アセチル化されている。具
体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドのC末端は、N-メチルカルボキサミド誘
導体の形態のものである。
ジュゲートされる。ほとんどの場合、小さい抗原(例えば、短いペプチド又は小さいハプ
テン)は、抗体の産生を誘発するのに十分複雑ではない。該免疫原性キャリアタンパク質
は、その大きいサイズ及び複雑な構造が理由で、コンジュゲートされた小さい抗原に対し
て免疫原性を付与し、小さい抗原及び免疫原性キャリアタンパク質上のエピトープに対し
て産生される抗体を生じさせることができる。それゆえ、小さい抗原は、常に、抗体の産
生の成功に向けて免疫応答を強化するために免疫原性キャリアタンパク質と化学的にコン
ジュゲートされる。一般的に使用される免疫原性キャリアタンパク質としては、キーホー
ルリンペットヘモシアニン(KLH)、ロコガイヘモシアニン(CCH)、ウシ血清アルブミン(BSA
)、及びオボアルブミン(OVA)が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施態様
において、該免疫原性糖ペプチドは、KLHにコンジュゲートされる。KLHは、節足動物及び
軟体動物に見出されるヘモシアニンと呼ばれる非ヘムタンパク質の群に属する銅含有ポリ
ペプチドである。KLHは、キーホールリンペット(メガトゥーラ・クレヌラータ(Megathura
crenulata))から単離される。哺乳動物からのその進化的な距離、大きい分子量、複雑な
構造、及びコンジュゲーションの標的としての一級アミンを提供する数百個のリジン基を
含有する巨大な表面のために、KLHは、哺乳動物における極めて免疫原性が高くかつ効果
的なキャリアタンパク質である。
いくつかの実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、10〜30アミノ酸残基の長さであ
る。いくつかの実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、15〜25アミノ酸残基の長さ
である。いくつかの実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、15〜20アミノ酸残基の
長さである。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、15〜18アミノ酸残基
の長さである。免疫原性糖ペプチドが15〜18アミノ酸残基の長さであるそのような具体的
な実施態様の特定の態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと結合してい
るグリコシル化部位を含む。免疫原性糖ペプチドが15〜18アミノ酸残基の長さであるその
ような具体的な実施態様の別の特定の態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオ
ースと各々結合している2つのグリコシル化部位を含む。具体的な実施態様において、該
免疫原性糖ペプチドは、55アミノ酸残基の長さである。免疫原性糖ペプチドが55アミノ酸
残基の長さであるそのような具体的な実施態様の特定の態様において、該免疫原性糖ペプ
チドは、キトビオースと結合しているグリコシル化部位を含む。具体的な実施態様におい
て、該免疫原性糖ペプチドは、18アミノ酸残基の長さである。免疫原性糖ペプチドが18ア
ミノ酸残基の長さであるそのような具体的な実施態様の特定の態様において、該免疫原性
糖ペプチドは、キトビオースと各々結合している2つのグリコシル化部位を含む。別の具
体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、15アミノ酸残基の長さである。免疫
原性糖ペプチドが15アミノ酸残基の長さである、そのような具体的な実施態様の特定の態
様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと結合しているグリコシル化部位を
含む。
くとも10アミノ酸部分を含み、かつ該免疫原性糖ペプチドの該1以上のグリコシル化部位
のうちの少なくとも1つは、該アミノ配列の部分にある。ある他の実施態様において、該
免疫原性糖ペプチドは、配列番号150のアミノ酸配列の少なくとも15、20、25、又は30ア
ミノ酸部分を含み、かつ該免疫原性糖ペプチドの該1以上のグリコシル化部位のうちの少
なくとも1つは、該アミノ配列の部分にある。具体的な実施態様において、該免疫原性糖
ペプチドは、15〜18アミノ酸残基の長さである。具体的な実施態様において、該免疫原性
糖ペプチドは、55アミノ酸残基の長さである。具体的な実施態様において、該免疫原性糖
ペプチドは、配列番号129のアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該免疫原
性糖ペプチドは、55アミノ酸残基の長さであり、かつ配列番号129のアミノ酸配列を含む
。特定の実施態様において、配列番号129のアミノ酸配列を含む免疫原性糖ペプチドは、
キトビオースと結合している30番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む。別の
特定の実施態様において、配列番号129のアミノ酸配列を含む免疫原性糖ペプチドは、Man
3GlcNAc2部分と結合している配列番号129の30番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位
を含む。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、18アミノ酸残基の長さで
ある。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、配列番号130のアミノ酸配
列を含む。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、18アミノ酸残基の長さ
であり、かつ配列番号130のアミノ酸配列を含む。特定の実施態様において、配列番号130
のアミノ酸配列を含む免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと各々結合している4番目の
残基(Asn)及び10番目の残基(Asn)における2つのグリコシル化部位を含む。具体的な実施
態様において、該免疫原性糖ペプチドは、15アミノ酸残基の長さである。具体的な実施態
様において、該免疫原性糖ペプチドは、配列番号131のアミノ酸配列を含む。具体的な実
施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、15アミノ酸残基の長さであり、かつ配列番号
131のアミノ酸配列を含む。特定の実施態様において、配列番号131のアミノ酸配列を含む
免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと結合している7番目の残基(Asn)におけるグリコシ
ル化部位を含む。
又はその抗原結合断片を作製する方法であって、対象を、上記のような1以上のグリコシ
ル化部位を含む免疫原性糖ペプチドで免疫することを含む、方法である。ある実施態様に
おいて、該免疫原性糖ペプチドは、該糖タンパク質アミノ酸配列の少なくとも10アミノ酸
部分を含み、かつ該免疫原性糖ペプチドの該1以上のグリコシル化部位のうちの少なくと
も1つは、該アミノ酸配列の部分にある。他のある実施態様において、該免疫原性糖ペプ
チドは、糖タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも15、20、25、又は30アミノ酸部分を含
み、かつ該免疫原性糖ペプチドの該1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つは、
該アミノ酸配列の部分にある。特定の実施態様において、該糖タンパク質は、配列番号15
0のアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、
該糖タンパク質の非グリコシル化形態に対する特異的結合を欠いている。本明細書に記載
される方法に従って免疫される対象は、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ニワトリ、モルモット、ラ
ット、ウサギ、又はマウスであることができるが、これらに限定されない。いくつかの実
施態様において、本明細書に記載される方法に従って免疫される対象は、ラット、ウサギ
、又はマウスである。具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って免
疫される対象は、マウスである。対象の免疫付与は、当技術分野で公知の任意の方法によ
って、例えば、実施例2及び実施例3に記載されているように該免疫原性糖ペプチド及びア
ジュバントを該対象に投与することによって実施することができる(第6.2節及び第6.3節
を参照)。
ペプチドを調製する方法である。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドを調製す
る方法は、本明細書に記載される免疫原性糖ペプチドの1以上のグリコシル化部位を炭水
化物(例えば、キトビオース)と結合させることを含む。ある実施態様において、該免疫原
性糖ペプチドを調製する方法は、ペプチド部分を合成することも含む。該免疫原性糖ペプ
チドのペプチド部分は、当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、実施例2に記
載されているようなFmoc固相ペプチド合成によって合成することができる(第6.2節を参照
)。ある実施態様において、該1以上のグリコシル化部位のアミノ酸(例えば、アスパラギ
ン)は、該免疫原性糖ペプチドの合成中、保護基によって保護される。具体的な実施態様
において、該ペプチド部分のただ1つのアスパラギン残基を炭水化物(例えば、キトビオー
ス)と結合させ、該アスパラギン上の保護基は、アリル基である。別の具体的な実施態様
において、該ペプチド部分の複数の(例えば、2つの)アスパラギン残基を炭水化物(例えば
、キトビオース)と各々結合させ、該アスパラギン残基上の保護基は、O-2-フェニルイソ
プロピルエステル(O-2-PhiPr、OPp)である。結合させる工程は、当技術分野で公知の任
意の方法によって実施することができる。好ましい実施態様において、該炭水化物部分を
、実施例2に記載されているような1フラスコアスパラギン酸化(aspartylation)/脱保護手
順を用いて、ペプチド部分と結合させる(第6.2.2.1節を参照)。
、当業者に公知であり、例えば、化学合成によるもの、生物源からの精製によるもの、又
は例えば、哺乳動物細胞もしくはトランスジェニック調製物からのものを含む、組換え発
現技法によるものがある。本明細書に記載される方法は、別途示されない限り、分子生物
学、微生物学、遺伝子解析、組換えDNA、有機化学、生化学、PCR、オリゴヌクレオチド合
成及び修飾、核酸ハイブリダイゼーション、並びに当業者の範囲内の関連分野における従
来の技法を利用する。これらの技法は、例えば、本明細書に引用される参考文献に記載さ
れており、文献中で十分に説明されている。例えば、Maniatisらの文献(1982)、分子クロ
ーニング:実験マニュアル(MolecularCloning: A Laboratory Manual)、Cold Spring Har
bor LaboratoryPress; Sambrookらの文献(1989)、分子クローニング:実験マニュアル(Mo
lecularCloning: A Laboratory Manual)、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s; Sambrookらの文献(2001)、分子クローニング:実験マニュアル(MolecularCloning: A
LaboratoryManual)、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY;
Ausubelらの文献、分子生物学の最新プロトコル(CurrentProtocols in Molecular Biol
ogy)、John Wiley& Sons(1987年版及び年次改訂版);免疫学の最新プロトコル(Current P
rotocols inImmunology)、John Wiley & Sons(1987年版及び年次改訂版)、Gait(編)(198
4)、オリゴヌクレオチド合成:実践的アプローチ(OligonucleotideSynthesis: A Practic
al Approach)、IRLPress; Eckstein(編)(1991)、オリゴヌクレオチド及び類似体:実践的
アプローチ(Oligonucleotidesand Analogues: A Practical Approach)、IRL Press; Bir
renら(編)(1999)、ゲノム解析:実験マニュアル(GenomeAnalysis: A Laboratory Manual)
、ColdSpring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。
々の方法が当技術分野で存在する(第5.1節及び第5.2節を参照)。例えば、MUC16グリコシ
ル化抗体又はその抗原結合断片は、組換えDNA法、例えば、米国特許第4,816,567号に記載
されている組換えDNA法によって作製することができる。本明細書に提供されるMUC16グリ
コシル化抗体又はその抗原結合断片をコードする1以上のDNAは、従来の手順を用いて(例
えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖、又はヒト、ヒト化、もしくは他の源由来のそのような
鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使
用することにより)、容易に単離し、シークエンシングすることができる。ひとたび単離
すれば、該DNAを発現ベクター中に入れることができ、その後、これを、形質転換されな
ければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない、NS0細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハ
ムスター卵巣(CHO)細胞、酵母細胞、藻類細胞、卵、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞に入
れて形質転換し、組換え宿主細胞内でのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の
合成を得る。該DNAは、例えば、所望の種のヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列
を相同なヒト配列の代わりに使用することによるか(米国特許第4,816,567号; Morrisonら
の文献、上記)、又は免疫グロブリンコード配列を非免疫グロブリンポリペプチドのコー
ド配列の全てもしくは一部と共有結合させることによって修飾することもできる。そのよ
うな非免疫グロブリンポリペプチドは、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又
はその抗原結合断片の定常ドメインの代わりに使用することができる。ある実施態様にお
いて、該DNAは、第5.3.2節に記載されている通りである。
ル化抗体又はその抗原結合断片をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを用いて
、そのような抗体をその乳中に産生する、トランスジェニック動物又は哺乳動物、例えば
、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジなどを提供することにより調製することもできる。そのよう
な動物は、公知の方法を用いて提供することができる。例えば、限定されないが、その各
々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許第5,827,690号;第5,849,992
号;第4,873,316号;第5,849,992号;第5,994,616号、第5,565,362号;第5,304,489号などを
参照されたい。
合断片はさらに、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を
コードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを用いて、そのような抗体、特定の部分、
又は変異体を、植物部分で又はそれから培養した細胞で産生する、トランスジェニック植
物及び培養植物細胞(例えば、限定されないが、タバコ及びトウモロコシ)を提供すること
により調製することができる。非限定的な例として、組換えタンパク質を発現するトラン
スジェニックタバコの葉が、例えば、誘導性プロモーターを用いて大量の組換えタンパク
質を提供するためにうまく使用されている。例えば、Cramerらの文献、Curr. Top. Micro
bol. Immunol.240:95-118(1999)及びその中に引用されている参考文献を参照されたい。
また、トランスジェニックトウモロコシも、他の組換え系で産生されたもの又は天然源か
ら精製されたものと同等の生物活性を有する哺乳動物タンパク質を商業的生産レベルで発
現させるために使用されている。例えば、Hoodらの文献、Adv. Exp. Med. Biol. 464:127
-147(1999)及びその中に引用されている参考文献を参照されたい。抗体は、タバコの種及
びジャガイモの塊茎を含め、scFvなどの抗体断片を含むトランスジェニック植物の種から
も大量に産生されている。例えば、Conradらの文献、Plant Mol. Biol. 38:101-109(1998
)及びその中に引用されている参考文献を参照されたい。このように、MUC16グリコシル化
抗体又はその抗原結合断片は、公知の方法に従って、トランスジェニック植物を用いて産
生することもできる。例えば、Fischerらの文献、Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-10
8(1999年10月)、Maらの文献、TrendsBiotechnol. 13:522-7(1995); Maらの文献、Plant
Physiol.109:341-6(1995); Whitelamらの文献、Biochem Soc. Trans. 22:940-944(1994)
;及びこれらの中に引用されている参考文献も参照されたい。上記の参考文献の各々は、
引用により完全に本明細書中に組み込まれる。
合断片は、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコード
する少なくとも1つのポリヌクレオチドを用いて、そのようなMUC16グリコシル化抗体又は
抗原結合断片を産生する細菌を提供することにより調製することができる。非限定的な例
として、組換えタンパク質を発現する大腸菌(E. coli)が、大量の組換えタンパク質を提
供するためにうまく使用されている。例えば、Vermaらの文献、1998, 216(1-2): 165-181
及びその中に引用されている参考文献を参照されたい。
特許第7,951,917号;第7,183,076号;第8,227,577号;第5,837,242号;第5,989,830号;第5,86
9,620号;第6,132,992号、及び第8,586,713号を参照されたい。
合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)は、二重特異性抗体の作製において利用される。二重
特異性抗体は、2つのハイブリドーマを融合させて、2つの結合部位を有するハイブリッド
免疫グロブリン分子を作出することにより作製することができる。二重特異性抗体は、腫
瘍をT細胞に拘束するだけでなく;それらは、T細胞上のCD3を架橋し、活性化カスケードを
開始させる。このようにして、T細胞受容体ベースの細胞傷害性を所望の腫瘍標的に向け
直し、MHC拘束性を回避する。ポリクローナルに活性化されたT細胞(ATC)に抗CD3-抗MUC16
二重特異性結合分子を装備することにより、MUC16グリコシル化抗体の標的化特異性とパ
ーフォリン/グランザイムによって媒介されるT細胞の非MHC拘束性細胞傷害性とが組み合
わされる。二重特異性結合分子BsAb又はBiTEは、患者への注入前に、エクスビボで増殖し
、活性化されたT細胞を装備することができる。この戦略によって、全てのATCが特異的CT
Lに変換される(Thakur及びLumの文献、2010,Curr Opin Mol Ther 12, 340-349; Grabert
らの文献、2006,Clin Cancer Res 12, 569-576)。
該MUC16グリコシル化抗体は免疫グロブリンであり、ここで、該免疫グロブリンの各々の
軽鎖は融合タンパク質であり、ここで、該融合タンパク質は、ペプチドリンカーによって
CD3を標的とするscFvに連結された免疫グロブリン軽鎖である。CH2ドメインにおけるN297
A突然変異は非グリコシル化をもたらし、FcR結合もClq結合も生じさせない。
。CARは、最も一般的には、単鎖可変断片長抗体(scFv)、例えば、所与の腫瘍関連抗原及
び/又はその変異体、膜貫通ドメイン(例えば、T細胞表面分子、例えば、共刺激分子、例
えば、CD8、CD28、OX-40、及び4-1BBに由来する膜貫通ドメイン)、TCR複合体のシグナル
伝達部分、例えば、TCRゼータ(ζ)鎖の細胞内ドメイン及び/又はさらなる部分、例えば、
その細胞質シグナル伝達ドメインを標的とするモノクローナル抗体に由来するものから構
成される。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるモノクローナルMUC16グリ
コシル化抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を、モノクローナルMUC16グリコシル化抗体を生成
するハイブリドーマ細胞株から単離する。例えば、RNAを該ハイブリドーマ細胞株から抽
出し、cDNAを該RNAから逆転写PCRによって生成させる。VH及びVL鎖可変領域を、そのよう
な可変領域に特異的なプライマーを利用する標準的なPCRによってクローニングする。得
られるVH及びVL断片を、例えば、TopoTAPCR 2.1クローニングベクター(Invitrogen)など
のシャトルベクターにサブクローニングし、シークエンシングする。その後、VH及びVL断
片を(Gly4Ser)3スペーサードメインにライゲーションして、MUC16グリコシル化抗体scFv
を生じさせ、重複PCR(例えば、MaherJらの文献、Nat Biotechnol 2002;20(1):70-5.;及
びGong MCらの文献、Neoplasia1999;1(2):123-7を参照)によってヒトCD8リーダーペプチ
ド(CD8L)に融合させる(CD8L-MUC16グリコシル化抗体scFv)。CD8L-MUC16グリコシル化抗体
scFvのコード領域を、ヒトCD8ヒンジ及び膜貫通ドメインに、或いはCD28膜貫通及び細胞
質シグナル伝達ドメインに融合させ、T細胞受容体CD3-ζシグナル伝達ドメインに融合さ
せる(例えば、MaherJらの文献、Nat Biotechnol 2002;20(1):70-5.; Brentjens RJらの
文献、NatMed 2003;9(3):279-86;及びBrentjens RJらの文献、Clin Cancer Res 2007;13
(18 Pt1):5426-35を参照)。
Rを発現するT細胞の作製方法は、当技術分野で公知である。例えば、CARコンストラクト
は、改変されたMMLVレトロウイルスベクターSFG(例えば、RiviereIらの文献、Proc Natl
Acad SciUSA 1995;92(15):6733-7を参照)又は他の好適なレトロウイルスベクターにサ
ブクローニングすることができる。いくつかの実施態様において、レトロウイルスベクタ
ーは、レンチウイルスベクター、例えば、HIVベースのベクターである。形質導入したgpg
29線維芽細胞に由来するVSV-G偽型レトロウイルス上清を用いて、安定なPG13テナガザル
白血病ウイルス(GaLV)エンベロープ偽型レトロウイルス産生細胞株を構築することができ
る(例えば、GongMCらの文献、Neoplasia 1999;1(2):123-7を参照)。単離された健常ドナ
ー末梢血単核細胞(PBMC)を2μg/m1のフィトヘマグルチニン(PHA)(Sigma.St. Louis, MO)
で活性化し、レトロネクチンコーティングされた非組織培養プレート(Quintas-Cardama A
らの文献、HumGene Ther 2007;18(12):1253-60)上でレトロウイルスにより形質導入して
、CARを組換え発現するT細胞を作製することができる。該T細胞へのCARの遺伝子移入は、
FACSにより評価することができる。
することができる。RiechmannL及びMuyldermans Sの文献(1999) J Immunol 231: 25-38;
NuttallSDらの文献(2000) Curr Pharm Biotechnol 1(3): 253-263; Muyldermans Sの文
献(2001) JBiotechnol 74(4): 277-302;米国特許第6,005,079号;並びに国際公開WO 94/0
4678号、WO94/25591号、及びWO 01/44301号を参照されたい。
複するエピトープに結合する本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原
結合断片は、ヒトMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様
において、本明細書に記載される抗体のいずれか1つがMUC16に結合するのを(例えば、用
量依存的な形で)競合的に阻止する本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその
抗原結合断片は、ヒトMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。ヒト抗体は
、当技術分野で公知の任意の方法を用いて産生することができる。例えば、機能的な内在
性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するこ
とができるトランスジェニックマウスを使用することができる。特に、ヒト重鎖及び軽鎖
免疫グロブリン遺伝子複合体をランダムに又は相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導
入することができる。或いは、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領
域、及び多様性領域をマウス胚性幹細胞に導入することができる。マウス重鎖及び軽鎖免
疫グロブリン遺伝子を、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入によって個別に又
は同時に機能しないようにすることができる。特に、JH領域のホモ接合性欠失は内在性抗
体の産生を妨げる。修飾された胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞に顕微注入して、キメラマ
ウスを生じさせる。その後、キメラマウスを交配させて、ヒト抗体を発現するホモ接合性
子孫を生じさせる。トランスジェニックマウスを、選択された抗原、例えば、抗原の全て
又は一部を用いて、通常の方法で免疫する。該抗原に対するモノクローナル抗体は、従来
のハイブリドーマ技術を用いて、免疫されたトランスジェニックマウスから得ることがで
きる。このトランスジェニックマウスが有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、B細胞
分化の間に再編成し、その後、クラススイッチング及び体細胞突然変異を経る。したがっ
て、そのような技法を用いて、治療的に有用なIgG、IgA、IgM、及びIgE抗体を産生するこ
とが可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概説については、例えば、Lonber
g N及びHuszar Dの文献(1995)Int Rev Immunol 13:65-93を参照されたい。ヒト抗体及び
ヒトモノクローナル抗体を産生するこの技術並びにそのような抗体を産生するためのプロ
トコルの詳細な議論については、例えば、国際公開WO 98/24893号、WO 96/34096号、及び
WO 96/33735号;並びに米国特許第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569
,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号、及び第5,939,598号を参照され
たい。ヒト抗体を産生することができるマウスの例としては、Xenomouse(商標)(Abgenix
社;米国特許第6,075,181号及び第6,150,184号)、HuAb-Mouse(商標)(Mederex社/GenPharm
;米国特許第5,545,806号及び第5,569,825号)、TransChromo Mouse(商標)(Kirin)、並び
にKM Mouse(商標)(Medarex/Kirin)が挙げられる。
イブラリーを用いて、上記のファージディスプレイ法を含む、当技術分野で公知の種々の
方法によって作製することができる。米国特許第4,444,887号、第4,716,111号、及び第5,
885,793号;並びに国際公開WO98/46645号、WO 98/50433号、WO 98/24893号、WO 98/16654
号、WO96/34096号、WO 96/33735号、及びWO 91/10741号も参照されたい。
することができる。例えば、エプスタイン-バーウイルス(EBV)で形質転換されたヒト末梢
血リンパ球をマウス骨髄腫細胞と融合させて、ヒトモノクローナル抗体を分泌するマウス
-ヒトハイブリドーマを産生することができ、かつこれらのマウス-ヒトハイブリドーマを
スクリーニングして、標的抗原に免疫特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を分泌す
るものを決定することができる。そのような方法は公知であり、当技術分野で記載されて
おり、例えば、ShinmotoHらの文献(2004) Cytotechnology 46: 19-23; Naganawa Yらの
文献(2005)Human Antibodies 14: 27-31を参照されたい。
を産生する方法は、下記の第6.2節に記載されている通りである。
をスクリーニング及び選択する方法は、下記の第6.2節に記載されている通りである。
れれば、それを、免疫グロブリン分子の精製のための当技術分野で公知の任意の方法によ
って、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、特に、プロテインA後
の特異的抗原に対する親和性によるもの、及びサイジングカラムクロマトグラフィー)、
遠心分離、示差溶解度によるか、又はタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技法
によって精製することができる。さらに、本明細書に記載される抗体を、本明細書に記載
されるか又はさもなければ当技術分野で公知の異種ポリペプチド配列と融合させて、精製
を容易にすることができる。
原結合断片は、単離又は精製されている。通常、単離された抗体は、該単離された抗体と
異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体である。例えば、特定の実施
態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の調
製物は、細胞材料及び/又は化学的前駆物質を実質的に含まない。「細胞材料を実質的に
含まない」という言葉には、抗体が、それが単離される又は組換え産生される細胞の細胞
成分から分離されているMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の調製物が含まれ
る。したがって、細胞材料を実質的に含まないMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合
断片には、(乾燥重量で)約30%、20%、10%、5%、2%、1%、0.5%、又は0.1%未満の
異種タンパク質(本明細書において「夾雑タンパク質」とも呼ばれる)及び/或いはMUC16グ
リコシル化抗体又はその抗原結合断片の変異体、例えば、MUC16グリコシル化抗体もしく
はその抗原結合断片の異なる翻訳後修飾形態又はMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗
原結合断片の他の異なるバージョン(例えば、抗体断片)を有する抗体の調製物が含まれる
。抗体が組換え産生される場合、それは、通常、培養培地も実質的に含まない、すなわち
、培養培地は、タンパク質調製物の容量の約20%、10%、2%、1%、0.5%、又は0.1%未
満に相当する。抗体が化学合成によって産生される場合、それは、通常、化学的前駆物質
又は他の化学物質を実質的に含まない、すなわち、それは、タンパク質の合成に関与する
化学的前駆物質又は他の化学物質から分離されている。したがって、抗体のそのような調
製物は、(乾燥重量で)約30%、20%、10%、又は5%未満の化学的前駆物質又は対象とな
る抗体以外の化合物を有する。具体的な実施態様において、本明細書に記載される抗体は
、単離又は精製されている。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16グリコシル化抗体又はその
抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである(第5.1節及び
第5.2節を参照)。また本明細書に提供されるのは、そのようなポリヌクレオチドを含むベ
クターである(第5.3.3節を参照)。また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載され
るMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の抗原をコードするポリヌクレオチドで
ある(第5.1節及び第5.2節を参照)。また本明細書に提供されるのは、ストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件又はより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション
条件下で、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコード
するポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
特に、約10%未満)の他の材料、例えば、細胞材料、培養培地、他の核酸分子、化学的前
駆物質、及び/又は他の化学物質を有するポリヌクレオチド又は核酸分子の調製物を含む
。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗
原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)をコードする核酸分子は、単離又は精製されてい
る。
任意の他の形態、又は限定されないが、クローニングによって得られるもしくは合成によ
って産生されるcDNA及びゲノムDNAを含むDNAの形態のもの、或いはこれらの任意の組合せ
であることができる。DNAは、三本鎖、二本鎖、もしくは一本鎖、又はその任意の組合せ
であることができる。DNA又はRNAのうちの少なくとも1つの鎖の任意の部分は、センス鎖
としても知られるコード鎖であることができ、又はそれは、アンチセンス鎖とも呼ばれる
非コード鎖であることができる。
コシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)をコードするヌクレオチ
ド配列を含むポリヌクレオチドである。
かつ本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結
合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)、並びにそのようなMUC16グリコシル化抗体もしくは
その抗原結合断片とMUC16に対する結合を競合するか、又はそのような抗体のエピトープ
と同じエピトープに結合する抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
である。
ることができる。例えば、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結
合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)をコードするヌクレオチド配列が公知である場合、該
MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドは、化学合
成されたオリゴヌクレオチド(例えば、Kutmeierらの文献、BioTechniques 17:242(1994)
に記載されているもの)から構築することができ、これは、簡潔に述べると、抗体をコー
ドする配列の部分を含む重複するオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチ
ドのアニーリング及びライゲーション、並びにその後、ライゲーションされたオリゴヌク
レオチドのPCRによる増幅を伴う。
コードするポリヌクレオチドは、好適な源由来の核酸から作製することができる。特定の
MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を含むクローンは利用不
可能であるが、該MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の配列が公知である場合
、該MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を化学合成するか、
或いは好適な源(例えば、抗体cDNAライブラリー、又は抗体を発現する任意の組織もしく
は細胞、例えば、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を
発現させるべく選択されたハイブリドーマ細胞から作製されたcDNAライブラリー、又は該
組織もしくは細胞から単離された核酸、好ましくは、ポリA+ RNA)から、該配列の3'及び5
'末端にハイブリダイズする合成プライマーを用いるPCR増幅によるか、又は例えば、該抗
体をコードするcDNAライブラリーからcDNAクローンを同定するための、特定の遺伝子配列
に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるクローニングによって得ることができる
。その後、PCRによって生成された増幅核酸を、当技術分野で周知の任意の方法を用いて
、複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる(例えば、第5.3.3節
を参照)。
片をコードするポリペプチドを、ヌクレオチド配列の操作のための当技術分野で周知の方
法、例えば、組換えDNA技法、部位特異的突然変異生成、PCRなど(例えば、どちらも引用
により完全に本明細書中に組み込まれる、Sambrookらの文献(1990)、分子クローニング、
実験マニュアル(MolecularCloning, A Laboratory Manual)、第2版、Cold Spring Harbo
r Laboratory,Cold Spring Harbor, N.Y.及びAusubelら編(1998)、分子生物学の最新プ
ロトコル(CurrentProtocols in Molecular Biology)、John Wiley & Sons, N.Y.に記載
されている技法を参照)を用いて操作して、異なるアミノ酸配列を有するMUC16グリコシル
化抗体又はその抗原結合断片を生成させ、例えば、アミノ酸の置換、欠失、及び/又は挿
入を作り出すことができる。例えば、そのような操作を行って、コードされたアミノ酸を
非グリコシル化するか、又はC1q、Fc受容体に結合し、もしくは補体系を活性化させる抗
体の能力を破壊することができる。
ープンリーディングフレーム(ORF)、例えば、限定されないが、少なくとも1つの重鎖又は
軽鎖のCDR1、CDR2、及び/又はCDR3のような少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)の少な
くとも1つの特定の部分を含む核酸分子;MUC16グリコシル化抗体又は可変領域のコード配
列を含む核酸分子;並びに上記のヌクレオチド配列とは実質的に異なるが、遺伝暗号の縮
重のために、本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原
結合断片を依然としてコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むことができる。
書に開示されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離された核酸である。したがっ
て、この実施態様のポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドを含む核酸を単離
し、検出し、及び/又は定量するために使用することができる。例えば、本明細書に提供
されるポリヌクレオチドを用いて、寄託されたライブラリー中の部分的又は全長クローン
を同定し、単離し、又は増幅することができる。いくつかの実施態様において、該ポリヌ
クレオチドは、ヒトもしくは哺乳動物核酸ライブラリーから単離されたゲノムもしくはcD
NA配列、又はさもなければ、該ライブラリー由来のcDNAに相補的なゲノムもしくはcDNA配
列である。
ことができる。例えば、1以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチクローニング
部位を該核酸に挿入して、該ポリヌクレオチドの単離を助けることができる。さらに、翻
訳可能な配列を挿入して、本明細書に提供される翻訳されたポリヌクレオチドの単離を助
けることができる。例えば、ヘキサ-ヒスチジンマーカー配列は、本明細書に提供される
ポリペプチドを精製するための好都合な手段を提供する。本明細書に提供される核酸−コ
ード配列を除く−は、任意に、本明細書に提供されるポリヌクレオチドのクローニング及
び/又は発現用のベクター、アダプター、又はリンカーである。
グ及び/又は発現におけるその機能を最適化し、該ポリヌクレオチドの単離を助け、又は
該ポリヌクレオチドの細胞への導入を改善することもできる。クローニングベクター、発
現ベクター、アダプター、及びリンカーの使用は、当技術分野で周知である(例えば、Aus
ubelの文献、上記;又はSambrookの文献、上記を参照)。
るMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片のCDRのうちの1つ又は複数を既知のフレ
ームワーク領域内に挿入することができる。フレームワーク領域は、天然のフレームワー
ク領域又はコンセンサスフレームワーク領域、好ましくは、ヒトフレームワーク領域であ
ることができる(例えば、ヒトフレームワーク領域のリストについては、Chothiaらの文献
、J. Mol.Biol. 278: 457-479(1998)を参照)。フレームワーク領域とCDRの組合せによっ
て作製されるポリヌクレオチドは、MUC16に免疫特異的に結合するMUC16グリコシル化抗体
又はその抗原結合断片をコードすることが好ましい。1以上のアミノ酸置換は、フレーム
ワーク領域内で行うことができ、該アミノ酸置換は、該抗体のその抗原に対する結合を改
善することが好ましい。さらに、そのような方法を用いて、鎖内ジスルフィド結合に関与
する1以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換又は欠失を行い、1以上の鎖内ジスル
フィド結合を欠く抗体分子を作製することができる。該ポリヌクレオチドに対する他の改
変は本明細書に提供されており、かつ当業者の能力の範囲内である。
の連結させたとき、融合タンパク質をコードすることができる。融合タンパク質の作製は
、当業者の能力の範囲内であり、制限酵素又は組換えクローニング技法の使用を伴うこと
ができる(例えば、Gateway(商標)(Invitrogen)を参照)。米国特許第5,314,995号も参照さ
れたい。
されるベクター(例えば、発現ベクター)の形態である。
書に記載されるMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片又はその抗原結合断片(
例えば、可変軽鎖領域及び/もしくは可変重鎖領域)をコードするヌクレオチド配列を含む
ポリヌクレオチド、並びにベクター、例えば、そのようなポリヌクレオチドを含む、宿主
細胞(例えば、大腸菌及び哺乳動物細胞)におけるその効率的な発現のためのベクターであ
る。いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチドは、単離又は精製されている。
酸分子の天然源に(例えば、マウス又はヒトに)存在する他の核酸分子から分離されている
ものである。さらに、「単離された」核酸分子、例えば、cDNA分子は、組換え技法によっ
て産生される場合は、他の細胞材料、もしくは培養培地を実質的に含まないものであるこ
とができ、又は化学合成される場合は、化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に
含まないものであることができる。例えば、「実質的に含まない」という言葉は、約15%
、10%、5%、2%、1%、0.5%、又は0.1%未満の他の材料、例えば、細胞材料、培養培
地、他の核酸分子、化学的前駆物質、及び/又は他の化学物質を有するポリヌクレオチド
又は核酸分子の調製物を含む。
を含む、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片、及びそのような抗体とMUC16に対
する結合を(例えば、用量依存的な形で)競合するか、又はそのような抗体のエピトープと
同じもしくは重複するエピトープに結合する抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポ
リヌクレオチドである。
ル化抗体又はその抗原結合断片の軽鎖又は重鎖をコードする核酸配列を含むポリヌクレオ
チドである。該ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるVH CDR(例えば、表1、表3、
及び表5を参照)を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。該ポリヌ
クレオチドは、本明細書に記載されるVL CDR(例えば、表2、表4、及び表6を参照)を含む
軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。
記載されているようなVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3を含有する、3つのVH CDRを含むMU
C16グリコシル化抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。具
体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、10C6、7B12、19C1
1、16C5、及び18C6コンセンサスVHCDRのVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(すなわち、そ
れぞれ、配列番号103、配列番号104、及び配列番号105、又はそれぞれ、配列番号109、配
列番号110、及び配列番号111、又は配列番号115、配列番号116、及び配列番号117)をコー
ドする。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、10C6の
VH CDR1、VH CDR2、及びVHCDR3(すなわち、それぞれ、配列番号3、配列番号4、及び配列
番号5、又はそれぞれ、配列番号9、配列番号10、及び配列番号11、又はそれぞれ、配列番
号15、配列番号16、及び配列番号17)をコードする。具体的な実施態様において、本明細
書に記載されるポリヌクレオチドは、7B12のVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(すなわち、
それぞれ、配列番号23、配列番号24、及び配列番号25、又はそれぞれ、配列番号29、配列
番号30、及び配列番号31、又はそれぞれ、配列番号35、配列番号36、及び配列番号37)を
コードする。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、19
C11のVH CDR1、VHCDR2、及びVH CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号43、配列番号44、
及び配列番号45、又はそれぞれ、配列番号49、配列番号50、及び配列番号51、又はそれぞ
れ、配列番号55、配列番号56、及び配列番号57)をコードする。具体的な実施態様におい
て、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、16C5のVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(
すなわち、それぞれ、配列番号63、配列番号64、及び配列番号65、又はそれぞれ、配列番
号69、配列番号70、及び配列番号71、又はそれぞれ、配列番号75、配列番号76、及び配列
番号77)をコードする。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオ
チドは、18C6のVHCDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号83、配列
番号84、及び配列番号85、又はそれぞれ、配列番号89、配列番号90、及び配列番号91、又
はそれぞれ、配列番号95、配列番号96、及び配列番号97)をコードする。
表5に記載されているようなVHCDR1、VH CDR2、及びVH CDR3を含有する、3つのVH CDR、
並びに(b)例えば、表2、表4、又は表6に記載されているようなVLCDR1、VL CDR2、及びVL
CDR3を含有する3つのVL鎖CDRを含むMUC16グリコシル化抗体をコードするヌクレオチド配
列を含むポリヌクレオチドである。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポ
リヌクレオチドは、(a)10C6、7B12、19C11、16C5、及び18C6コンセンサスVHCDRのVH CDR
1、VH CDR2、及びVHCDR3(すなわち、それぞれ、配列番号103、配列番号104、及び配列番
号105、又はそれぞれ、配列番号109、配列番号110、及び配列番号111、又は配列番号115
、配列番号116、及び配列番号117)、並びに(b)10C6、7B12、19C11、16C5、及び18C6コン
センサスVLCDRのVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号106、
配列番号107、及び配列番号108、又はそれぞれ、配列番号112、配列番号113、及び配列番
号114、又は配列番号118、配列番号119、及び配列番号120)をコードする。具体的な実施
態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、(a)10C6のVH CDR1、VH CDR2
、及びVHCDR3(すなわち、それぞれ、配列番号3、配列番号4、及び配列番号5、又はそれ
ぞれ、配列番号9、配列番号10、及び配列番号11、又はそれぞれ、配列番号15、配列番号1
6、及び配列番号17)、並びに(b)10C6のVLCDR1、VL CDR2、及びVL CDR3(すなわち、それ
ぞれ、配列番号6、配列番号7、及び配列番号8、又はそれぞれ、配列番号12、配列番号13
、及び配列番号14、又はそれぞれ、配列番号18、配列番号19、及び配列番号20)をコード
する。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、(a)7B12
のVH CDR1、VHCDR2、及びVH CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号23、配列番号24、及び
配列番号25、又はそれぞれ、配列番号29、配列番号30、及び配列番号31、又はそれぞれ、
配列番号35、配列番号36、及び配列番号37)、並びに(b)7B12のVLCDR1、VL CDR2、及びVL
CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号26、配列番号27、及び配列番号28、又はそれぞれ、
配列番号32、配列番号33、及び配列番号34、又はそれぞれ、配列番号38、配列番号39、及
び配列番号40)をコードする。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌ
クレオチドは、(a)19C11のVHCDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(すなわち、それぞれ、配列番
号43、配列番号44、及び配列番号45、又はそれぞれ、配列番号49、配列番号50、及び配列
番号51、又はそれぞれ、配列番号55、配列番号56、及び配列番号57)、並びに(b)19C11のV
L CDR1、VL CDR2、及びVLCDR3(すなわち、それぞれ、配列番号46、配列番号47、及び配
列番号48、又はそれぞれ、配列番号52、配列番号53、及び配列番号54、又はそれぞれ、配
列番号58、配列番号59、及び配列番号60)をコードする。具体的な実施態様において、本
明細書に記載されるポリヌクレオチドは、(a)16C5のVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(す
なわち、それぞれ、配列番号63、配列番号64、及び配列番号65、又はそれぞれ、配列番号
69、配列番号70、及び配列番号71、又はそれぞれ、配列番号75、配列番号76、及び配列番
号77)、並びに(b)16C5のVLCDR1、VL CDR2、及びVL CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号
66、配列番号67、及び配列番号68、又はそれぞれ、配列番号72、配列番号73、及び配列番
号74、又はそれぞれ、配列番号78、配列番号79、及び配列番号80)をコードする。具体的
な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、(a)18C6のVH CDR1、VH
CDR2、及びVHCDR3(すなわち、それぞれ、配列番号83、配列番号84、及び配列番号85、
又はそれぞれ、配列番号89、配列番号90、及び配列番号91、又はそれぞれ、配列番号95、
配列番号96、及び配列番号97)、並びに(b)18C6のVLCDR1、VL CDR2、及びVL CDR3(すなわ
ち、それぞれ、配列番号86、配列番号87、及び配列番号88、又はそれぞれ、配列番号92、
配列番号93、及び配列番号94、又はそれぞれ、配列番号98、配列番号99、及び配列番号10
0)をコードする。
れるアミノ酸配列(例えば、配列番号1、配列番号21、配列番号41、配列番号61、配列番号
81、又は配列番号101)を含む重鎖可変領域を含む本明細書に記載されるMUC16グリコシル
化抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該抗体は、MUC16に免疫特異的に
結合する。
れるアミノ酸配列(例えば、配列番号2、配列番号22、配列番号42、配列番号62、配列番号
82、又は配列番号102)を含む軽鎖可変領域を含む本明細書に記載されるMUC16グリコシル
化抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該抗体は、MUC16に免疫特異的に
結合する。
ミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号102のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含
む本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。
ある実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号101のアミ
ノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号2のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む本
明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。ある
実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号101のアミノ酸
配列を含む重鎖可変領域及び配列番号42のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む本明細
書に記載されるMUC16グリコシル化抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施
態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号1のアミノ酸配列を
含む重鎖可変領域及び配列番号2のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む本明細書に記
載されるMUC16グリコシル化抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施態様に
おいて、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号21のアミノ酸配列を含む重
鎖可変領域及び配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む本明細書に記載され
るMUC16グリコシル化抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において
、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号41のアミノ酸配列を含む重鎖可変
領域及び配列番号42のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む本明細書に記載されるMUC1
6グリコシル化抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、本明
細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号61のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及
び配列番号62のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む本明細書に記載されるMUC16グリ
コシル化抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、本明細書に
記載されるポリヌクレオチドは、配列番号81のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列
番号82のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む本明細書に記載されるMUC16グリコシル
化抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。
列番号142、配列番号144、配列番号146、又は配列番号148の核酸配列を含むVHをコードす
る。ある実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号141、
配列番号143、配列番号145、配列番号147、又は配列番号149の核酸配列を含むVLをコード
する。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号
140の核酸配列を含むVH、及び配列番号141の核酸配列を含むVLをコードする(例えば、10C
6)。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号14
2の核酸配列を含むVH、及び配列番号143の核酸配列を含むVLをコードする(例えば、7B12)
。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号144
の核酸配列を含むVH、及び配列番号145の核酸配列を含むVLをコードする(例えば、19C11)
。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号146
の核酸配列を含むVH、及び配列番号147の核酸配列を含むVLをコードする(例えば、16C5)
。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号148
の核酸配列を含むVH、及び配列番号149の核酸配列を含むVLをコードする(例えば、18C6)
。
鎖及び重鎖を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチ
ド配列を含むポリヌクレオチドである。重鎖に関して、具体的な実施態様において、本明
細書に提供されるポリヌクレオチドは、ガンマ(例えば、ガンマ1、ガンマ2、ガンマ3、又
はガンマ4)重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施態様において、本明細
書に提供されるポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又は
その抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該抗体は重鎖を含み、
かつ該重鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1、配列番号21、配列番号41、配列番
号61、配列番号81、又は配列番号101の任意のアミノ酸配列を含むことができ、かつ該重
鎖の定常領域は、ヒトガンマ重鎖定常領域である。
、カッパ軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。別の具体的な実施態様において、本
明細書に提供されるポリヌクレオチドは、ラムダ軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含
む。また別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、ヒ
トカッパ軽鎖又はヒトラムダ軽鎖を含む本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又
はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施態様において、本
明細書に提供されるポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体
又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該抗体は軽鎖を含
み、かつ該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号2、配列番号22、配列番号42、配
列番号62、配列番号82、又は配列番号102の任意のアミノ酸配列を含むことができ、かつ
該軽鎖の定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域である。別の特定の実施態様において、本
明細書に提供されるポリヌクレオチドは、軽鎖を含む本明細書に記載されるMUC16グリコ
シル化抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該軽鎖
の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号2、配列番号22、配列番号42、配列番号62、配列
番号82、又は配列番号102の任意のアミノ酸配列を含むことができ、かつ該軽鎖の定常領
域は、ヒトラムダ軽鎖定常領域である。
び第6.3節を参照されたい。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、1以上のMUC16グリコシル化抗体又
はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)を(例えば、組換え)発現する細胞(例え
ば、エクスビボ細胞)である。また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるMUC
16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列(例えば、第5.3
.2節を参照)を含む、宿主細胞における、好ましくは、哺乳動物細胞における組換え発現
のためのベクター(例えば、発現ベクター)である。また本明細書に提供されるのは、その
ようなベクター又はヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化
抗体又はその抗原結合断片を組換え発現するための細胞(例えば、エクスビボ細胞)である
。また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はそ
の抗原結合断片を産生する方法であって、そのようなMUC16グリコシル化抗体又はその抗
原結合断片を細胞(例えば、エクスビボ細胞)から発現させることを含む、方法である。好
ましい実施態様において、該細胞は、エクスビボ細胞である。
子を含むDNA分子である。通常、遺伝子発現は、構成的又は誘導性プロモーター、組織特
異的調節エレメント、及びエンハンサーを含む、特定の調節エレメントの制御下に置かれ
る。そのような遺伝子は、調節エレメント、例えば、プロモーター「に動作可能に連結さ
れている」と言われる。組換え宿主は、クローニングベクター又は発現ベクターのいずれ
かを含む任意の原核生物又は真核生物細胞であることができる。この用語には、宿主細胞
の染色体もしくはゲノム又は宿主細胞の細胞(例えば、エクスビボ細胞)にクローン化され
た遺伝子を含むように遺伝子操作されている、原核生物又は真核生物細胞、及びトランス
ジェニック動物も含まれる。一実施態様において、プロモーターは、CMVプロモーターで
ある。
リヌクレオチドを含むベクターである。ある実施態様において、第5.3.2節に記載される
ポリヌクレオチドを好適なベクターにクローニングすることができ、任意の好適な宿主を
形質転換又はトランスフェクトするために使用することができる。そのようなベクターを
構築するためのベクター及び方法は当業者に公知であり、一般の技術的参考文献に記載さ
れている(一般には、「組換えDNAパートD(RecombinantDNA Part D)」、Methods in Enzy
mology、第153号、Wu及びGrossman編、AcademicPress(1987)を参照)。ある実施態様にお
いて、ベクターは、適切な場合、及び該ベクターがDNAであるか、それともRNAであるかと
いうことを考慮に入れて、該ベクターを導入することになる宿主のタイプ(例えば、細菌
、真菌、植物、昆虫、又は哺乳動物)に特異的である調節配列、例えば、転写及び翻訳の
開始及び終止コドンを含む。ある実施態様において、ベクターは、宿主の属に特異的であ
る調節配列を含む。ある実施態様において、ベクターは、宿主の種に特異的である調節配
列を含む。
を可能にする1以上のマーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子の非限定的な例としては、
殺生物剤抵抗性、例えば、抗生物質、重金属などに対する抵抗性、原栄養性を提供するた
めの栄養要求性宿主における相補性などが挙げられる。好ましい実施態様において、ベク
ターは、アンピシリン及びハイグロマイシン選択可能マーカーを含む。
動作可能に連結された天然又は標準のプロモーターを含むことができる。例えば、強い、
弱い、誘導性、組織特異的、及び発生特異的な、プロモーターの選択は、当業者の能力の
範囲内である。同様に、上記の核酸分子又はその断片をプロモーターと組み合わせること
も、当業者の能力の範囲内である。
その両方のために設計されているものが挙げられる。例えば、クローニングベクターは、
pUCシリーズ、pBluescriptシリーズ(Stratagene,LaJolla, Calif.)、pETシリーズ(Novag
en, Madison, Wis.)、pGEXシリーズ(PharmaciaBiotech, Uppsala, Sweden)、及びpEXシ
リーズ(Clontech,Palo Alto, Calif.)からなる群から選択することができる。ラムダ-GT
10、ラムダ-GT11、ラムダ-ZapII(Stratagene)、ラムダ-EMBL4、及びラムダ-NM1149などの
バクテリオファージベクターを使用することもできる。植物発現ベクターの非限定的な例
としては、pBI110、pBI101.2、pBI101.3、pBI121、及びpBIN19(Clontech)が挙げられる。
動物発現ベクターの非限定的な例としては、pEUK-C1、pMAM、及びpMAMneo(Clontech)が挙
げられる。TOPOクローニングシステム(Invitrogen,Carlsbad, Calif.)を製造元の推奨に
従って使用することもできる。
哺乳動物ベクターは、mRNAの転写の開始を媒介する少なくとも1つのプロモーターエレメ
ント、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードする配列、並びに転写の終
結及び転写物のポリアデニル化に必要とされるシグナルを含む。ある実施態様において、
哺乳動物ベクターは、例えば、エンハンサー、Kozak配列、及びRNAスプライシングのため
のドナー部位とアクセプター部位に隣接する介在配列などの、さらなるエレメントを含む
。ある実施態様において、高効率の転写は、例えば、SV40由来の初期及び後期プロモータ
ー、レトロウイルス、例えば、RSV、HTLVI、HIVI由来の長い末端リピート(LTRS)、並びに
サイトメガロウイルス(CMV)の初期プロモーターを用いて達成することができる。しかし
ながら、細胞性エレメントを使用することもできる(例えば、ヒトアクチンプロモーター)
。哺乳動物発現ベクターの非限定的な例としては、pIRESlneo、pRetro-Off、pRetro-On、
PLXSN、又はpLNCX(ClonetechLabs, Palo Alto, Calif.)、pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/
-)、又はpcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen)、PSVL及びPMSG(Pharmacia,Uppsala, Sweden
)、pRSVcat(ATCC37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)、並びにpBC12MI(ATCC 67109)などのベ
クターが挙げられる。そのような哺乳動物ベクターと組み合わせて使用することとができ
る哺乳動物宿主細胞の非限定的な例としては、ヒトHela 293、H9、及びJurkat細胞、マウ
スNIH3T3及びC127細胞、Cos1、Cos 7、及びCV 1、ウズラQC1-3細胞、マウスL細胞、並び
にチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が挙げられる。
ター、パルボウイルスに基づくベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス(AAV)に基づくベ
クター、AAV-アデノウイルスキメラベクター、及びアデノウイルスに基づくベクター、並
びにレンチウイルスベクター、例えば、単純ヘルペス(HSV)に基づくベクターである。あ
る実施態様において、ウイルスベクターを操作して、ウイルスを複製欠損にする。ある実
施態様において、ウイルスベクターを操作して、宿主に対する毒性を消失させる。これら
のウイルスベクターは、例えば、Sambrookらの文献、分子クローニング、実験マニュアル
(MolecularCloning, a Laboratory Manual)、第2版、Cold Spring Harbor Press, Cold
Spring Harbor,N.Y.(1989);及びAusubelらの文献、分子生物学の最新プロトコル(Curren
t Protocols inMolecular Biology)、Greene Publishing Associates and John Wiley &
Sons, NewYork, N.Y.(1994)に記載されている標準的な組換えDNA技法を用いて調製する
ことができる。
技法によって細胞(例えば、エクスビボ細胞)に転移させることができ、得られた細胞を従
来の技法によって培養して、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原
結合断片を産生することができる。したがって、本明細書に提供されるのは、宿主細胞に
おけるそのような配列の発現のためのプロモーターに動作可能に連結された、MUC16グリ
コシル化抗体もしくはその抗原結合断片、その重鎖もしくは軽鎖、又はその軽鎖融合ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞である。ある実施態様において、プロ
モーターに動作可能に連結された重鎖をコードするベクター及びプロモーターに動作可能
に連結された軽鎖をコードするベクターを、MUC16グリコシル化抗体全体の発現のために
細胞で共発現させることができる。ある実施態様において、プロモーターに動作可能に連
結された重鎖をコードするベクター及びプロモーターに動作可能に連結された軽鎖融合ポ
リペプチドをコードするベクターを、二重特異性結合分子全体の発現のために細胞で共発
現させることができる。ある実施態様において、細胞は、プロモーターに動作可能に連結
された本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体の重鎖と軽鎖ポリペプチドの両方を
コードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。ある実施態様において、細胞は、プ
ロモーターに動作可能に連結された本明細書に記載される二重特異性結合分子の重鎖と軽
鎖融合ポリペプチドの両方をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。ある実
施態様において、細胞は、プロモーターに動作可能に連結された重鎖をコードするポリヌ
クレオチドを含む第一のベクター及びプロモーターに動作可能に連結された軽鎖ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドを含む第二のベクターという、2つの異なるベクター
を含む。ある実施態様において、細胞は、プロモーターに動作可能に連結された重鎖をコ
ードするポリヌクレオチドを含む第一のベクター及びプロモーターに動作可能に連結され
た軽鎖融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第二のベクターという、2
つの異なるベクターを含む。ある実施態様において、第一の細胞は、本明細書に記載され
るMUC16グリコシル化抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第一のベクターを
含み、第二の細胞は、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体の軽鎖ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを含む第二のベクターを含む。ある実施態様において、本
明細書に提供されるのは、そのような第一の細胞及びそのような第二の細胞を含む細胞の
混合物である。ある実施態様において、第一の細胞は、本明細書に記載される二重特異性
結合分子の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第一のベクターを含み、第二の細胞
は、本明細書に記載される二重特異性結合分子の軽鎖融合ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドを含む第二のベクターを含む。ある実施態様において、本明細書に提供され
るのは、そのような第一の細胞及びそのような第二の細胞を含む細胞の混合物である。好
ましい実施態様において、該細胞は、該オリゴヌクレオチドが細胞によって効率的に転写
されなおかつ効率的に翻訳されるように、ベクター(単数)又はベクター(複数)を発現する
。
転写されなおかつ効率的に翻訳されるように、ベクターを発現する。
あることができる。細胞の例としては、ヒト細胞、ヒト細胞株、大腸菌(例えば、大腸菌T
B-1、TG-2、DH5a、XL-BlueMRF'(Stratagene)、SA2821、及びY1090)、枯草菌(B. subtili
s)、緑膿菌(P.aerugenosa)、出芽酵母(S. cerevisiae)、アカパンカビ(N. crassa)、昆
虫細胞(例えば、Sf9、Ea4)、並びに本明細書で以下に示されるその他のものが挙げられる
が、これらに限定されない。好ましい実施態様において、細胞は、CHO細胞である。特に
好ましい実施態様において、細胞は、CHO-S細胞である。
ドを細胞に導入することによって染色体に組み込まれた該ポリヌクレオチドを含む安定細
胞株で発現させることができる。ある実施態様において、該ポリヌクレオチドは、例えば
、エレクトロポレーションによって細胞に導入される。ある実施態様において、該ポリヌ
クレオチドは、例えば、該ポリヌクレオチドを含むベクターの細胞へのトランスフェクシ
ョンによって細胞に導入される。ある実施態様において、該ベクターは、トランスフェク
トされた細胞の同定及び単離を可能にするDHFR、GPT、ネオマイシン、又はハイグロマイ
シンなどの選択可能マーカーと共トランスフェクトされる。ある実施態様において、トラ
ンスフェクトされたポリヌクレオチドを増幅させて、大量のコードされたMUC16グリコシ
ル化抗体又はその抗原結合断片を発現させることもできる。例えば、DHFR(ジヒドロ葉酸
レダクターゼ)マーカーを用いて、対象となるポリヌクレオチドの数百又は数千ものコピ
ーを保有する細胞株を開発することができる。選択マーカーの別の例は、酵素グルタミン
シンターゼ(GS)である(Murphyらの文献、Biochem.J. 227:277-279(1991); Bebbingtonら
の文献、Bio/Technology10:169-175(1992))。これらのマーカーを用いて、細胞を選択培
地で成長させ、最も大きい耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体に組
み込まれた増幅遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞及びNSO細胞は、抗
体の産生に使用されることが多い。
UC16に結合する免疫グロブリン軽鎖をコードする第一のポリヌクレオチド配列、及び(ii)
第二のプロモーターに動作可能に連結された、MUC16に結合する免疫グロブリン重鎖をコ
ードする第二のポリヌクレオチドを含む。ある実施態様において、ベクターは、ウイルス
ベクターである。
ペプチドリンカーを介してscFvに融合した免疫グロブリン軽鎖(ここで、該軽鎖はMUC16に
結合し、該scFvはCD3に結合する)を含む軽鎖融合ポリペプチドをコードする第一のポリヌ
クレオチド配列及び(ii)第二のプロモーターに動作可能に連結された、MUC16に結合する
免疫グロブリン重鎖をコードする第二のポリヌクレオチドを含む。ある実施態様において
、ベクターは、ウイルスベクターである。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、1以上のMUC16グリコシル化抗体又
はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)の医薬有効量を含む組成物(例えば、医
薬組成物)及びキットである。ある実施態様において、該医薬組成物は、本明細書に記載
される抗体、その抗原結合断片、及び/又はCARを組換え発現する免疫細胞、例えば、T細
胞を含む。組成物は、個々の単一単位剤形の調製において使用することができる。本明細
書に提供される組成物は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、関
節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、オンマヤ内、眼内、硝子体内、結腸内、
子宮頸部内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、
肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス
、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、髄腔内、脳室内、脳実質内、又は経皮投与用に製
剤化することができる。好ましい実施態様において、該組成物は、非経口投与用に製剤化
される。特に好ましい実施態様において、該組成物は、静脈内投与用に製剤化される。好
ましい実施態様において、該組成物は、腹腔内投与用に製剤化される。具体的な実施態様
において、該組成物は、腹膜転移を治療するための腹腔内投与用に製剤化される。好まし
い実施態様において、該組成物は、髄腔内投与用に製剤化される。具体的な実施態様にお
いて、該組成物は、脳転移を治療するための髄腔内投与用に製剤化される。例えば、Kram
erらの文献、2010,97: 409-418を参照されたい。好ましい実施態様において、該組成物
は、脳における脳室内投与用に製剤化される。具体的な実施態様において、該組成物は、
脳転移を治療するための脳室内投与用に製剤化される。例えば、Kramerらの文献、2010,
97: 409-418を参照されたい。好ましい実施態様において、該組成物は、脳における実質
内投与用に製剤化される。具体的な実施態様において、該組成物は、脳腫瘍又は脳腫瘍転
移を治療するための実質内投与用に製剤化される。例えば、Lutherらの文献、2014, Neur
o Oncol, 16:800-806、及びClinical Trial ID NO NCT01502917を参照されたい。
る。
コシル化抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む1以上のポリヌ
クレオチドを含む組成物である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、細
胞を含む組成物であり、ここで、該細胞は、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗
体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む1以上のポリヌクレオチド
を含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、ベクターを含む組成物であ
り、ここで、該ベクターは、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原
結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む1以上のポリヌクレオチドを含む。ある実
施態様において、本明細書に提供されるのは、細胞を含む組成物であり、ここで、該細胞
はベクターを含み、ここで、該ベクターは、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗
体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む1以上のポリヌクレオチド
を含む。
。ある実施態様において、安定製剤は、塩分又は選択された塩を含むリン酸緩衝剤を含む
。ある実施態様において、記載されている組成物は、薬学的又は獣医学的使用に好適な多
目的の保存製剤である。ある実施態様において、本明細書に記載される組成物は防腐剤を
含む。防腐剤は当業者に公知である。防腐剤の非限定的な例としては、フェノール、m-ク
レゾール、p-クレゾール、o-クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝
酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マ
グネシウム(例えば、六水和物)、アルキルパラベン(メチル、エチル、プロピル、ブチル
など)、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、及びデヒドロ酢酸ナトリウム、並
びにチメロサール、又は水性希釈剤中のこれらの混合物が挙げられる。任意の好適な濃度
又は混合物、例えば、0.001〜5%、又はその中の任意の範囲もしくは値、例えば、限定さ
れないが、0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.
3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.
9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.
5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、又はその中の任意の範囲
もしくは値を、当技術分野で公知の通りに使用することもできる。非限定的な例としては
、防腐剤なし、0.1〜2%のm-クレゾール(例えば、0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0%)、0.
1〜3%のベンジルアルコール(例えば、0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5%)、0.001〜
0.5%のチメロサール(例えば、0.005、0.01)、0.001〜2.0%のフェノール(例えば、0.05
、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0%)、0.0005〜1.0%のアルキルパラベン(例えば、0.00075
、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1
、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0%)などが挙げられる。
はそれよりも長い間、単一の投与から送達することが望ましい場合もあり得る。様々な低
速放出、デポ、又はインプラント剤形を利用することができる。例えば、剤形は、体液へ
の溶解度が低い化合物の医薬として許容し得る無毒な塩、例えば、(a)多塩基酸、例えば
、リン酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、タンニン酸、パモン酸、アルギン酸、ポリグルタミ
ン酸、ナフタレンモノ-もしくはジ-スルホン酸、ポリガラクツロン酸などとの酸付加塩;(
b)亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト
、ニッケル、カドミウムなどの多価金属カチオンとの、もしくは例えば、N,N'-ジベンジ
ル-エチレンジアミンもしくはエチレンジアミンから形成される有機カチオンとの塩;又は
(c)(a)と(b)の組合せ、例えば、タンニン酸亜鉛塩を含むことができる。さらに、本明細
書に提供される組成物、好ましくは、比較的不溶性の塩、例えば、今述べた塩は、例えば
、注射に好適なゴマ油とともに、ゲル、例えば、モノステアリン酸アルミニウムゲルの中
に製剤化することができる。特に好ましい塩は、亜鉛塩、タンニン酸亜鉛塩、パモ酸塩な
どである。注射用の低速放出デポ製剤の別のタイプは、例えば、米国特許第3,773,919号
に記載されているような、ポリ乳酸/ポリグリコール酸ポリマーなどの、ゆっくりと分解
する、無毒で、非抗原性のポリマーに分散又は封入された、化合物又は塩を含む。化合物
又は好ましくは、比較的不溶性の塩、例えば、上記の塩は、特に動物で使用するための、
コレステロールマトリックスシラスティックペレット中に製剤化することもできる。さら
なる低速放出、デポ、又はインプラント組成物、例えば、気体又は液体リポソームは、文
献で知られている(米国特許第5,770,222号及び「持続及び制御放出薬物送達系(Sustained
andControlled Release Drug Delivery Systems)」、J. R. Robinson編、Marcel Dekke
r社, N.Y., 1978)。
成物(第5.1節及び第5.2節を参照)の範囲は、再構成時に、湿潤/乾燥系の場合、約1.0マイ
クログラム/ml〜約1000mg/mlの濃度をもたらす量を含むが、より低い濃度及びより高い濃
度が操作可能であり、これらは、意図される送達ビヒクルに依存し、例えば、溶液製剤は
、経皮パッチ、経肺的、経粘膜的方法、又は浸透圧もしくはマイクロポンプ法と異なる。
、限定されないが、希釈剤、結合剤、安定化剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、防腐剤、アジ
ュバントなどのうちの少なくとも1つを含む。ある実施態様において、医薬として許容し
得る補助剤が好ましい。そのような滅菌溶液及びそのような滅菌溶液を調製する方法の非
限定的な例は当技術分野で周知であり、例えば、Gennaro編、レミントンの医薬科学(Remi
ngton'sPharmaceutical Sciences)、第18版、Mack Publishing Co.(Easton, Pa.) 1990
があるが、これに限定されない。本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその
抗原結合断片の投与の様式、溶解性、及び/又は安定性に好適である医薬として許容し得
る担体は、ルーチンで選択することができる。
添加剤を含む。医薬賦形剤及び添加剤の非限定的な例は、タンパク質、ペプチド、アミノ
酸、脂質、並びに炭水化物(例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、及びオリゴ糖を含む糖;誘
導体化糖、例えば、アルジトール、アルドン酸、エステル化糖など;並びに多糖又は糖ポ
リマー)であり、これらは、単独又は組合せで存在し、単独又は組合せで1〜99.99重量又
は体積%を含むことができる。タンパク質賦形剤の非限定的な例としては、血清アルブミ
ン、例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)、組換えヒトアルブミン(rHA)、ゼラチン、カゼイ
ンなどが挙げられる。緩衝能力において機能することもできるアミノ酸/抗体成分の非限
定的な例としては、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミ
ン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオ
ニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが挙げられる。ある実施態様において、該
アミノ酸はグリシンである。炭水化物賦形剤の非限定的な例としては、単糖、例えば、フ
ルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、D-マンノース、ソルボースなど;
二糖、例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど;多糖、例え
ば、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなど;
及びアルジトール、例えば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール
、キシリトールソルビトール(グルシトール)、ミオイノシトールなどが挙げられる。ある
実施態様において、炭水化物賦形剤は、マンニトール、トレハロース、又はラフィノース
である。
を含み;通常、緩衝剤は、有機酸又は有機塩基から調製される塩である。緩衝剤の非限定
的な例としては、有機酸塩、例えば、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒
石酸、コハク酸、酢酸、もしくはフタル酸の塩; Tris、トロメタミン塩酸塩、又はリン酸
塩緩衝剤が挙げられる。ある実施態様において、緩衝剤は、有機酸塩、例えば、クエン酸
塩である。他の賦形剤、例えば、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、防腐増強剤を任意にかつ好
ましく希釈剤に添加することができる。等張剤、例えば、グリセリンは、一般に、既知の
濃度で使用される。生理的に許容される緩衝剤を添加して、pH制御の改善をもたらすこと
が好ましい。該組成物は、約pH 4〜約pH 10などの広範囲のpH、及び約pH 5〜約pH 9の好
ましい範囲、及び約6.0〜約8.0の最も好ましい範囲にわたることができる。本明細書に提
供される組成物は、約6.8〜約7.8のpHを有することが好ましい。好ましい緩衝剤としては
、リン酸塩緩衝剤、最も好ましくは、リン酸ナトリウム、特に、リン酸緩衝食塩水(PBS)
が挙げられる。
ン、フィコール(ポリマー糖)、デキストレート(例えば、シクロデキストリン、例えば、2
-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン)、ポリエチレングリコール、香味剤、抗微
生物剤、甘味料、抗酸化剤、帯電防止剤、界面活性剤(例えば、ポリソルベート、例えば
、「TWEEN20」及び「TWEEN 80」)、脂質(例えば、リン脂質、脂肪酸)、ステロイド(例え
ば、コレステロール)、並びに/又はキレート化剤(例えば、EDTA)などの、1以上のポリマ
ー性賦形剤/添加剤を含む。
Tween 40(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノパルミテート)、Tween80(ポリオキシ
エチレン(20)ソルビタンモノオレエート)、PluronicF68(ポリオキシエチレンポリオキシ
プロピレンブロックコポリマー)、及びPEG(ポリエチレングリコール)又は非イオン性界面
活性剤、例えば、ポリソルベート20もしくは80又はポロキサマー184もしくは188、Pluron
ic(登録商標) ポリル(polyls)、他のブロックコポリマーのような医薬として許容し得る
可溶化剤、並びにキレート剤、例えば、EDTA及びEGTAを組成物に任意に添加して、凝集を
低下させることができる。これらの添加剤は、ポンプ又はプラスチック容器を用いて組成
物を投与する場合に、特に有用である。医薬として許容し得る界面活性剤の存在は、タン
パク質が凝集する傾向を軽減する。
加剤は当業者に公知であり、例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、「レ
ミントン:医薬の科学及び実践(Remington:The Science & Practice of Pharmacy)」、第
19版、Williams& Williams,(1995)及び「医師の卓上参考書(Physician's Desk Referenc
e)」、第52版、MedicalEconomics, Montvale, N.J.(1998)に言及されている。ある好ま
しい実施態様において、担体又は賦形剤の材料は、炭水化物(例えば、サッカリド及びア
ルジトール)並びに緩衝剤(例えば、クエン酸塩)又はポリマー剤である。
しい防腐剤としては、フェノール、m-クレゾール、p-クレゾール、o-クレゾール、クロロ
クレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン(メチル、エチル、プロピル、ブチ
ルなど)、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、及び
チメロサール、又はこれらの混合物からなる群から選択されるものが挙げられる。組成物
中で使用される防腐剤の濃度は、抗微生物効果をもたらすのに十分な濃度である。そのよ
うな濃度は、選択される防腐剤に依存し、当業者によって容易に決定される。
ル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)とフェノール、m-クレゾール
、p-クレゾール、o-クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラ
ベン(メチル、エチル、プロピル、ブチルなど)、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニ
ウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、及びチメロサール、又はこれらの混合物からなる群から
選択される防腐剤とを水性希釈剤中で混合することを含むプロセスによって調製すること
ができる。本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結
合断片と防腐剤とを水性希釈剤中で混合することは、従来の溶解及び混合手順を用いて実
施される。好適な組成物を調製するために、例えば、緩衝溶液中の一定量の本明細書に記
載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を、所望の濃度の
本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片及び防腐剤を提供す
るのに十分な分量の緩衝溶液中の所望の防腐剤と組み合わせる。本明細書に提供される組
成物は、本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合
断片と選択された緩衝剤、好ましくは、塩分又は選択された塩を含むリン酸緩衝剤を混合
することを含むプロセスによって調製することができる。本明細書に記載される少なくと
も1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と緩衝剤を水性希釈剤中で混合する
ことは、従来の溶解及び混合手順を用いて実施される。好適な組成物を調製するために、
例えば、水又は緩衝溶液中の一定量の本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコ
シル化抗体又はその抗原結合断片を、所望の濃度のタンパク質及び緩衝剤を提供するのに
十分な分量の水中の所望の緩衝剤と組み合わせる。これらのプロセスのバリエーションは
、当業者によって認識されているであろう。例えば、成分を添加する順序、さらなる添加
剤を使用するかどうかということ、組成物を調製する温度及びpHは全て、使用される濃度
及び投与手段について最適化することができる因子である。
ある実施態様において、本明細書に提供される組成物は、非経口的な注射投与用に製剤
化される。本明細書で使用される場合、「非経口」という用語は、静脈内、血管内、筋肉
内、皮内、皮下、及び眼内を含む。非経口投与用に、該組成物は、医薬として許容し得る
非経口ビヒクルと関連した、又はそれとは別々に提供される、溶液、懸濁液、エマルジョ
ン、又は凍結乾燥粉末として製剤化することができる。そのようなビヒクルの非限定的な
例は、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、グリセロール、エタノール
、及び1〜10%ヒト血清アルブミンである。リポソーム及び非水性ビヒクル、例えば、固
定油を使用することもできる。ビヒクル又は凍結乾燥粉末は、等張性を維持する添加剤(
例えば、塩化ナトリウム、マンニトール)並びに化学的安定性を維持する添加剤(例えば、
緩衝剤及び防腐剤)を含むことができる。製剤は、公知の又は好適な技法によって滅菌さ
れる。
emington'sPharmaceutical Sciences)、A. Osolの最新版に記載されている。
ングリコール、例えば、ポリエチレングリコール、植物起源の油、水素化ナフタレンなど
を含むことができる。注射用の水性又は油性懸濁液は、公知の方法に従って、適当な乳化
剤又は湿度調整剤及び懸濁化剤を使用することにより調製することができる。注射用の薬
剤は、無毒で、非経口投与可能な希釈剤、例えば、水溶液又は溶媒中の滅菌注射溶液もし
くは懸濁液であることができる。使用可能なビヒクル又は溶媒として、水、リンガー溶液
、等張生理食塩水などが許容され;通常の溶媒、又は懸濁溶媒として、滅菌不揮発性油を
使用することができる。これらの目的のために、天然又は合成又は半合成の脂肪油又は脂
肪酸;天然又は合成又は半合成のモノグリセリド又はジグリセリド又はトリグリセリドを
含む、任意の種類の不揮発性油及び脂肪酸を使用することができる。非経口投与は当技術
分野で公知であり、これには、従来の注射手段、引用により完全に本明細書中に組み込ま
れる、米国特許第5,851,198号に記載されるガス加圧式無針注射装置及び米国特許第5,839
,446号に記載されるレーザー穿孔装置が含まれるが、これらに限定されない。
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結
合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)を含む組成物は、肺投与用に製剤化される。肺投与用
に、該組成物は、肺の下気道又は鼻洞(sinuses)に達するのに有効な粒子サイズで送達さ
れる。肺投与用の組成物は、吸入による治療剤の投与のための当技術分野で公知の種々の
吸入装置又は鼻腔用装置のいずれかによって送達することができる。エアロゾル化製剤を
患者の鼻腔(sinuscavity)又は肺胞に堆積させることができるこれらの装置としては、定
量吸入器、ネブライザー、乾燥粉末発生器、スプレーなどが挙げられる。本明細書に記載
されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の肺又は鼻腔投与を導くのに好適な
他の装置も当技術分野で公知である。そのような装置は全て、本明細書に記載されるMUC1
6グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をエアロゾル中に分配するための投与に好適な
製剤を使用する。そのようなエアロゾルは、溶液(水性と非水性の両方)又は固形粒子のい
ずれかから構成されることができる。Ventolin(登録商標)定量吸入器のような定量吸入器
は、通常、噴射剤ガスを使用し、吸気中の作動を必要とする(例えば、WO 94/16970号、WO
98/35888号を参照)。いくつか例を挙げると、Turbuhaler(商標)(Astra)、Rotahaler(登
録商標)(Glaxo)、Diskus(登録商標)(Glaxo)、InhaleTherapeuticsによって市販されてい
る装置のような乾燥粉末吸入器は、混合粉末の呼吸作動を使用する(引用により完全に本
明細書中に組み込まれる、米国特許第4,668,218号(Astra)、EP 237507号(Astra)、WO 97/
25086号(Glaxo)、WO94/08552号(Dura)、米国特許第5,458,135号(Inhale)、WO 94/06498
号(Fisons))。Ultravent(登録商標)ネブライザー(Mallinckrodt)及びAcornII(登録商標)
ネブライザー(MarquestMedical Products)(米国特許第5,404,871号(Aradigm)、WO 97/22
376号)のようなネブライザー(上記の参考文献は引用により完全に本明細書中に組み込ま
れる)は、溶液からエアロゾルを生じさせるが、定量吸入器、乾燥粉末吸入器などは、小
粒子エアロゾルを発生させる。そのような市販の吸入装置の例は非限定的な例であり、範
囲が限定されることを意図するものではない。
合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)を含むスプレーは、本明細書に記載される少なくとも
1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の懸濁液又は溶液を加圧下でノズルか
ら押し出すことによって生成させることができる。ノズルのサイズ及び形状、加えられる
圧力、並びに液体供給速度は、所望の産出量及び粒子サイズを達成するように選択するこ
とができる。エレクトロスプレーは、例えば、キャピラリー又はノズルフィードと接続し
た電場によって生成させることができる。好都合なことに、スプレーによって送達される
本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を含
む組成物の粒子は、約10um未満、好ましくは、約1um〜約5um、最も好ましくは、約2um〜
約3umの範囲の粒子サイズを有する。
コシル化抗体又はその抗原結合断片を含む組成物の製剤(第5.1節及び第5.2節を参照)は、
通常、少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を、水溶液中に、約
0.1mg〜約100mg/溶液のmlもしくはmg/gmの濃度、又はその中の任意の範囲もしくは値、例
えば、限定されないが、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5
、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26
、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90、又は100mg/ml又はmg/gmで含む。該製
剤は、賦形剤、緩衝剤、等張剤、防腐剤、界面活性剤、及び好ましくは、亜鉛などの薬剤
を含むことができる。該製剤は、賦形剤又はMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結
合断片組成物の安定化のための薬剤、例えば、緩衝剤、還元剤、バルクタンパク質、もし
くは炭水化物を含むこともできる。そのような組成物を製剤化する際に有用なバルクタン
パク質としては、アルブミン、プロタミンなどが挙げられる。抗体組成物タンパク質を製
剤化する際に有用な典型的な炭水化物としては、スクロース、マンニトール、ラクトース
、トレハロース、グルコースなどが挙げられる。該組成物は、エアロゾルを形成する際の
溶液の噴霧化によって引き起こされる該組成物の表面誘導凝集を低下させるか又は防止す
ることができる界面活性剤を含むこともできる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステル及び
アルコール、並びにポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルなどの、様々な従来
の界面活性剤を利用することができる。量は、通常、製剤の0.001〜14重量%の範囲であ
る。好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベ
ート80、ポリソルベート20などである。
は超音波ネブライザーを介して投与される。通常、ジェットネブライザーでは、圧搾空気
源を用いて、開口部を通して高速空気噴射を生み出す。ガスがノズルの先に広がると、低
圧力領域が生じ、これにより、抗体組成物タンパク質の溶液が、液体リザーバに接続され
たキャピラリーチューブを通して引かれる。キャピラリーチューブからの液体流は、それ
が該チューブから出る時に剪断されて、不安定なフィラメント及び液滴になり、エアロゾ
ルを生成する。様々な形状、流速、及びバッフルタイプを利用して、所与のジェットネブ
ライザーから所望の性能特性を達成することができる。超音波ネブライザーでは、高周波
数電気エネルギーを用いて、典型的には圧電変換器を利用して、力学的振動エネルギーを
生み出す。このエネルギーは、直接的にか又はカップリング流体を通してかのいずれかで
、抗体組成物タンパク質の製剤に伝達され、該抗体組成物タンパク質を含むエアロゾルを
生成する。ネブライザーによって送達される抗体組成物タンパク質の粒子は、約10um未満
、好ましくは、約1um〜約5um、及び最も好ましくは、約2um〜約3umの範囲の粒子サイズを
有することが好都合である。
UC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)、並びに任意の
賦形剤又は他の添加剤が液化高圧ガスを含む混合物としてキャニスターに含まれる、定量
吸入器(MDI)を介して投与される。定量バルブの作動は、ダイ混合物(diemixture)を、好
ましくは、約10um未満、好ましくは、約1um〜約5um、及び最も好ましくは、約2um〜約3um
のサイズ範囲の粒子を含むエアロゾルとして放出させる。所望のエアロゾル粒子サイズは
、ジェットミリング、スプレー乾燥、臨界点凝縮などを含む、当業者に公知の様々な方法
によって産生される抗体組成物タンパク質の製剤を利用することによって得ることができ
る。好ましい定量吸入器としては、3M又はGlaxoによって製造され、かつハイドロフルオ
ロカーボン噴射剤を利用しているものが挙げられる。
又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)の製剤は、通常、少なくとも1つの抗I
L-6抗体を含む微細粉末を、例えば、界面活性剤の助けを借りて噴射剤に懸濁された非水
性媒体中の懸濁液として含む。噴射剤は、この目的で利用される任意の従来の材料、例え
ば、クロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカー
ボン、又はトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフル
オロエタノール、及び1,1,1,2-テトラフルオロエタンを含む炭化水素、HFA-134a(ハイド
ロフルオロアルカン-134a)、HFA-227(ハイドロフルオロアルカン-227)などであることが
できる。噴射剤はハイドロフルオロカーボンであることが好ましい。該界面活性剤は、活
性剤を化学分解などに対して保護するために、本明細書に記載される少なくとも1つのMUC
16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を噴射剤中の懸濁液として安定化するように選
択することができる。好適な界面活性剤としては、ソルビタントリオレエート、大豆レシ
チン、オレイン酸などが挙げられる。場合によっては、エタノールなどの溶媒を使用する
溶液エアロゾルが好ましい。タンパク質の製剤のための当技術分野で公知のさらなる薬剤
を製剤中に含めることもできる。
ある実施態様において、本明細書に提供される組成物は、経口投与用に製剤化される。
ある実施態様において、経口投与用に、組成物及び本明細書に記載される少なくとも1つ
のMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を投与する方法は、腸壁の透過性を人為
的に増大させるための、例えば、レゾルシノール並びに非イオン性界面活性剤、例えば、
ポリオキシエチレンオレイルエーテル及びn-ヘキサデシルポリエチレンエーテルなどのア
ジュバントの共投与、並びに酵素的分解を阻害するための、例えば、膵臓トリプシン阻害
剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート(DFF)、及びトラジロールなどの酵素阻害剤の
共投与に頼っている。経口投与用の固体型剤形の活性成分化合物は、スクロース、ラクト
ース、セルロース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、マルチトール、デキス
トラン、デンプン、寒天、アルギネート、キチン、キトサン、ペクチン、ガムトラガカン
ト、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成又は半合成ポリ
マー、及びグリセリドを含む、少なくとも1つの添加剤と混合することができる。これら
の剤形は、例えば、不活性希釈剤、滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、パラベ
ン、防腐剤、例えば、ソルビン酸、アスコルビン酸、α-トコフェロール、酸化防止剤、
例えば、システイン、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味剤、香味剤、芳香剤などの
ような、他のタイプの添加剤を含むこともできる。
ングされた調製物にすることができる。ある実施態様において、経口投与用の液体調製物
としては、例えば、医学的使用に対して許容されるエマルジョン、シロップ、エリキシル
、懸濁液、及び溶液調製物が挙げられる。これらの調製物は、該分野で通常使用される不
活性希釈剤、例えば、水を含むことができる。リポソーム調製物は、例えば、インスリン
及びヘパリンについて記載されている(米国特許第4,239,754号)ような、経口投与調製物
に利用することができる。さらに、混合アミノ酸の人工ポリマーのマイクロスフェア(プ
ロテノイド)は、例えば、米国特許第4,925,673号に記載されているような、医薬の経口投
与において利用することができる。さらに、担体化合物、例えば、米国特許第5,879,681
号及び米国特許第5,871,753号に記載されているものが、生物活性剤の経口投与において
使用される。
ある実施態様において、本明細書に提供される組成物は、粘膜表面からの吸収用に製剤
化される。ある実施態様において、粘膜表面からの吸収用に、組成物及び本明細書に記載
される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2
節を参照)を投与する方法は、エマルジョン粒子の粘膜付着を達成することによって粘膜
表面からの吸収を促進する、複数のサブミクロン粒子、粘膜付着性巨大分子、生体活性ペ
プチド、及び水性連続相を含むエマルジョンを含む(米国特許第5,514,670号)。本明細書
に提供されるエマルジョンの適用に好適な粘膜表面としては、例えば、角膜、結膜、口腔
内、舌下、鼻腔、膣内、肺、胃、腸、及び直腸への投与経路を挙げることができる。膣内
又は直腸投与用の製剤、例えば、坐剤は、賦形剤として、例えば、ポリアルキレングリコ
ール、ワセリン、ココアバターなどを含むことができる。鼻腔内投与用の製剤は固体であ
り、かつ賦形剤として、例えば、ラクトースを含むことができるか、又は点鼻剤の水性も
しくは油性溶液であることができる。口腔内投与用に、賦形剤としては、例えば、糖、ス
テアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、アルファ化デンプンなどが挙げられ
る(米国特許第5,849,695号)。
ある実施態様において、本明細書に提供される組成物は、経皮投与用に製剤化される。
ある実施態様において、経皮投与用に、該組成物は、例えば、リポソーム又はポリマー性
ナノ粒子、マイクロ粒子、マイクロカプセル、又はマイクロスフェア(別途明記されない
限り、マイクロ粒子と総称される)などの送達装置に封入された、本明細書に記載される
少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参
照)を含む。いくつかの好適な装置が経皮投与用に知られており、これには、合成ポリマ
ー、例えば、ポリヒドロキシ酸、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びこれらのコ
ポリマー、ポリオルトエステル、ポリ無水物、並びにポリホスファゼン、並びに天然ポリ
マー、例えば、コラーゲン、ポリアミノ酸、アルブミン、及び他のタンパク質、アルギネ
ート及び他の多糖、並びにこれらの組合せから作られたマイクロ粒子が含まれる(米国特
許第5,814,599号)。
また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される1以上の抗体もしくはその抗原
結合断片、又はそれらのコンジュゲートを含むキットである。具体的な実施態様において
、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される医薬組成物の成分のうちの1つ又は
複数、例えば、本明細書に記載される1以上の抗体又はその抗原結合断片が充填された1以
上の容器を含む医薬パック又はキットである。いくつかの実施態様において、該キットは
、本明細書に記載される医薬組成物及び予防剤又は治療剤を含む。
政府機関によって規定された形式の注意書き、剤形、及び/又はその使用説明書が任意に
関連付けられることがある。ある実施態様において、該キットに含まれる説明書は、医薬
組成物の投与についての投薬量及び/又は投与レジメンに関する指針を提供する。
器、ポンプ、袋、バイアル、容器、シリンジ、並びに選択された医薬組成物並びに意図さ
れた投与及び治療の様式に好適な任意の包装材料が挙げられるが、これらに限定されない
。
むことができる。そのような装置の例としては、シリンジ、無針注射器、点滴袋、パッチ
、及び吸入器が挙げられるが、これらに限定されない。
て許容し得るビヒクルをさらに含むことができる。例えば、成分が、非経口投与用に再構
成されなければならない固体形態で提供される場合、キットは、非経口投与に好適である
微粒子非含有滅菌溶液を形成するように成分を溶解させることができるか、又は経口投与
用の懸濁剤として再構成することができる好適なビヒクルの密閉容器を含むことができる
。医薬として許容し得るビヒクルの例としては:注射用水USP;限定されないが、塩化ナト
リウム注射液、リンガー注射液、デキストロース注射液、デキストロース及び塩化ナトリ
ウム注射液、並びに乳酸加リンガー注射液を含む、水性ビヒクル;限定されないが、エチ
ルアルコール、ポリエチレングリコール、及びポリプロピレングリコールを含む、水混和
性ビヒクル;並びに限定されないが、トウモロコシ油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、
オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、及び安息香酸ベンジルを含む、非水性ビ
ヒクルが挙げられるが、これらに限定されない。
(5.5.1 治療的使用及び方法)
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象の癌、特に、対象のMUC16陽
性癌を治療する方法であって、それを必要としている対象に、MUC16グリコシル化抗体又
はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)の治療有効量を投与することを含む、方
法である。具体的な実施態様において、該対象は、第5.5.5節に記載されているような対
象である。具体的な実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は
、第5.5.3節に記載されているような用量で投与される。具体的な実施態様において、MUC
16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、第5.5節に記載されているような方法に従
って投与される。具体的な実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合
断片は、第5.5.4節に記載されているような1以上の追加の医薬活性剤と組み合わせて投与
される。
定の種のMUC16に結合するMUC16グリコシル化抗体又はその断片が使用される。例えば、ヒ
トを治療するために、ヒトMUC16に結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片
が使用される。具体的な実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断
片は、免疫グロブリンである。
、MUC16グリコシル化抗体、好ましくは、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の
定常領域は、その特定の種に由来する。例えば、ヒトを治療するために、MUC16グリコシ
ル化抗体又はその断片は、免疫グロブリンであるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結
合断片を含むことができ、ここで、該免疫グロブリンは、ヒト定常領域を含む。具体的な
実施態様において、該対象は、ヒトである。
宮(例えば、子宮内膜)癌、原発性腹膜癌、又はMUC16受容体を発現する任意の他の組織の
癌である。
能であるかを問わず、症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の状態の安定化(すなわち、
悪化させないこと)、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解(部分
的又は完全を問わない)を含む、有益な又は所望の臨床的結果を達成するためのものであ
り得る。具体的な実施態様において、「治療」は、治療を受けない場合の予想される生存
と比較して、生存を延長させるためのものでもあり得る。具体的な実施態様において、癌
(例えば、卵巣癌、肺癌、膵癌、乳癌、卵管癌、子宮(例えば、子宮内膜)癌、原発性腹膜
癌、又はMUC16受容体を発現する任意の他の組織の癌)を有する対象への本明細書に記載さ
れるMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片、又は本明細書に記載される医薬
組成物の投与は、以下の効果:(i)癌の1以上の症状の重症度の低下もしくは改善;(ii)癌と
関連する1以上の症状の持続期間の低下;(iii)癌と関連する症状の再発の予防;(iv)対象の
入院の減少;(v)入院期間の短縮;(vi)対象の生存の増加;(vii)別の療法の治療効果の増強
もしくは改善;(viii)癌と関連する1以上の症状の発生もしくは開始の阻害;(ix)癌と関連
する症状の数の低下;(x)当技術分野で周知の方法によって評価される生活の質の改善;(x)
腫瘍の再発の阻害;(xi)腫瘍及び/もしくはそれと関連する1以上の症状の退行;(xii)腫瘍
及び/もしくはそれと関連する1以上の症状の進行の阻害;(xiii)腫瘍の成長の低下;(xiv)
腫瘍サイズ(例えば、体積もしくは直径)の減少;(xv)新たに形成される腫瘍の形成の低下;
(xvi)原発性、局所性、及び/もしくは転移性腫瘍の予防、根絶、除去、もしくは制御;(xv
ii)転移の数もしくはサイズの減少;(xviii)死亡率の低下;(xix)無再発生存の増加;(xx)当
業者に利用可能な従来の方法、例えば、磁気共鳴イメージング(MRI)、ダイナミック造影M
RI(DCE-MRI)、X線、及びコンピュータ断層撮影(CT)スキャンもしくは陽電子放出断層撮影
(PET)スキャンによって測定したとき、腫瘍のサイズが維持されるか、増大しないか、も
しくは標準療法の投与後の腫瘍の増加よりも少なく増加すること;並びに/又は(xxi)患者
の寛解期間の増加のうちの少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、又はそれより多くを達成する
。治療は、前述のうちの1つ又は複数を達成することであることができる。
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結
合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)は、本明細書に記載される疾病(例えば、MUC16陽性癌
細胞が関与する疾病)を検出、診断、又はモニタリングするために、診断目的で使用する
ことができる。ある実施態様において、診断目的で使用するためのMUC16グリコシル化抗
体又はその抗原結合断片は、第5.2節に記載されている通りに標識される。
のための方法であって、(a)対象の細胞又は組織試料中のMUC16又はその断片の発現を、本
明細書に記載される1以上のMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を用いてアッセ
イすること;及び(b)MUC16又はその断片の発現のレベルを、対照レベル、例えば、正常組
織試料(例えば、本明細書に記載される疾病を有しない対象に由来するもの、又は該疾病
の発症前の同じ患者に由来するもの)のレベルと比較することを含み、それにより、MUC16
又はその断片の発現の対照レベルと比較したMUC16又はその断片の発現のアッセイレベル
の増大又は減少が本明細書に記載される疾病を示すものとなる、方法である。
疫組織学的方法を用いて、生体試料中のMUC16又はその断片のレベルをアッセイすること
ができる(例えば、Jalkanenらの文献、1985,J. Cell. Biol. 101:976-985;及びJalkanen
らの文献、1987,J. Cell . Biol. 105:3087-3096を参照)。タンパク質遺伝子発現を検出
するのに有用な他の抗体ベースの方法としては、免疫アッセイ、例えば、酵素結合免疫吸
着アッセイ(ELISA)及び放射免疫アッセイ(RIA)が挙げられる。好適な抗体アッセイ標識は
当技術分野で公知であり、これには、酵素標識、例えば、グルコースオキシダーゼ;放射
性同位体、例えば、ヨウ素(125I、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、イン
ジウム(121In)、及びテクネチウム(99Tc);発光標識、例えば、ルミノール;及び蛍光標識
、例えば、フルオレセイン及びローダミン、並びにビオチンが含まれる。
ングは、該診断方法を初回診断後のしばらくの間繰り返すことによって実施される。
対象で検出することができる。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定
することができるであろう。本発明の診断方法において使用し得る方法及び装置としては
、コンピュータ断層撮影法(CT)、全身スキャン、例えば、陽電子放出断層撮影法(PET)、
磁気共鳴イメージング(MRI)、及び超音波検査法が挙げられるが、これらに限定されない
。
本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片(第5.1節及び
第5.2節を参照)、又は組成物(第5.4節を参照)、又は該抗体もしくはその抗原結合断片を
発現する細胞は、種々の経路によって対象に送達することができる。これらには、限定さ
れないが、非経口、鼻腔内、気管内、経口、皮内、局所、筋肉内、腹腔内、経皮、静脈内
、腫瘍内、結膜、及び皮下経路が含まれる。肺投与は、例えば、吸入器又はネブライザー
、及びスプレー剤として使用されるエアロゾル化剤を含む製剤の使用によって利用される
こともできる。一実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体もし
くはその抗原結合断片又は組成物は、対象(例えば、第5.5.5節に記載されているような対
象)に非経口投与される。具体的な実施態様において、該非経口投与は、静脈内、筋肉内
、又は皮下である。
結合断片又は組成物の量は、疾患の性質によって決まり、標準的な臨床的技法によって決
定することができる。
術者の判断及び各々の対象の状況に従って決定されるべきである。例えば、有効用量は、
投与の手段、標的部位、患者の生理的状態(年齢、体重、及び健康を含む)、患者がヒトで
あるか動物であるかということ、投与される他の薬物、又は治療が予防的か治療的かとい
うことによっても変わり得る。治療投薬量は、安全性及び有効性を最適化するために、任
意に用量設定される。
るために利用される。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られる用量応
答曲線から外挿することができる。
り約0.0001〜100mg、より一般的には、0.01〜15mgの範囲であり得る。例えば、投薬量は
、1mg/kg体重、10mg/kg体重、又は1〜10mg/kgの範囲内、すなわち、言い換えると、70kg
の患者の場合、それぞれ、70mg又は700mg又は70〜700mgの範囲内であることができる。通
常、ヒト抗体は、異種ポリペプチドに対する免疫応答のため、他の種由来の抗体よりも長
いヒト体内での半減期を有する。したがって、ヒト抗体のより少ない投薬量及びより少な
い投薬頻度が可能となることが多い。
る改変細胞の投与において、対象物は、対象に、約100万〜約1000億細胞の範囲で、例え
ば、100万〜約500億細胞など(例えば、約500万細胞、約2500万細胞、約5億細胞、約10億
細胞、約50億細胞、約200億細胞、約300億細胞、約400億細胞、又は前述の値のいずれか2
つによって定義される範囲)、例えば、約1000万〜約1000億細胞(例えば、約2000万細胞、
約3000万細胞、約4000万細胞、約6000万細胞、約7000万細胞、約8000万細胞、約9000万細
胞、約100億細胞、約250億細胞、約500億細胞、約750億細胞、約900億細胞、又は前述の
値のいずれか2つによって定義される範囲)、及び場合により、約1億細胞〜約500億細胞(
例えば、約1億2000万細胞、約2億5000万細胞、約3億5000万細胞、約4億5000万細胞、約6
億5000万細胞、約8億細胞、約9億細胞、約30億細胞、約300億細胞、約450億細胞)、又は
これらの範囲の間の任意の値で投与される。いくつかの実施態様において、全細胞の用量
及び/又は細胞の個々の亜集団の用量は、104又は約104〜109又は約109細胞/キログラム(k
g)体重の範囲、例えば、105〜106細胞/kg体重の範囲であり、例えば、1×105細胞/kgもし
くは約1×105細胞/kg、1.5×105細胞/kgもしくは約1.5×105細胞/kg、2×105細胞/kgもし
くは約2×105細胞/kg、又は1×106細胞/kgもしくは約1×106細胞/kg、2×106細胞/kgもし
くは約2×106細胞/kg、5×106細胞/kgもしくは約5×106細胞/kg、又は10×106細胞/kgも
しくは約10×106細胞/kg体重である。例えば、いくつかの実施態様において、該細胞は、
104T細胞/キログラム(kg)もしくは約104 T細胞/kg〜109 T細胞/kgもしくは約109T細胞/
kg体重、又はその一定の誤差範囲内、例えば、105〜107T細胞/kg体重で投与される。
薬間の間隔は、1週間、2週間、3週間、4週間、1カ月、2カ月、3カ月、6カ月、1年、又は2
年であることができる。
具体的な実施態様において、対象の癌(例えば、卵巣癌、膵癌、肺癌、乳癌、卵管癌、
子宮(例えば、子宮内膜)癌、又は原発性腹膜癌)を治療するための本明細書に提供される
方法であって、それを必要としている対象に、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化
抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)を含む医薬組成物を投与すること
を含む方法は、該対象に、1以上の追加の治療剤を投与することをさらに含む。具体的な
実施態様において、該追加の治療剤は、対象の癌(例えば、卵巣癌、膵癌、肺癌、乳癌、
卵管癌、子宮(例えば、子宮内膜)癌、及び原発性腹膜癌)を治療するためのものである。
具体的な実施態様において、該追加の治療剤は、本明細書に記載されるMUC16グリコシル
化抗体又は抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)による治療の任意の副作用を治療す
るためのものである。
ないMUC16中のエピトープを認識する(すなわち、それは、MUC16に結合するのに、N-グリ
コシル化Asn1800ではなく、N-グリコシル化Asn1806を必要とする)第一のMUC16グリコシル
化抗体又はその抗原結合断片は、N-グリコシル化Asn1806を含み、かつN-グリコシル化Asn
1800も含むMUC16中のエピトープを認識する(すなわち、両方のN-グリコシル化部位が、MU
C16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片によって認識されるエピトープの一部である)
第二のMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と組み合わせて投与される。そのよ
うな第一のMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この
MUC16の第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は
配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;(ii)MUC16の
第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ
酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如;
及び(iii)MUC16の第四の形態(この第四の形態はグリコシル化されており、ここで、該第
四の形態のアミノ酸配列は配列番号152である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合
するその能力によって同定されることができ、ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発
現する細胞、MUC16の該第三の形態を組換え発現する細胞、及びMUC16の該第四の形態を組
換え発現する細胞は、同じ細胞型のものである。そのような第二のMUC16グリコシル化抗
体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化され
ており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細
胞に免疫特異的に結合するその能力;及び(ii)MUC16の第五の形態(この第五の形態はグリ
コシル化されており、ここで、該第五の形態のアミノ酸配列は配列番号172である)を組換
え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如によって同定されることができ、ここ
で、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞は、MUC16の該第五の形態を組換え発現す
る細胞と同じ型の細胞である。配列番号172のアミノ酸配列によってコードされるタンパ
ク質は、本明細書において、MUC16c114-N23とも呼ばれる。MUC16c114-N23は、アミノ酸位
置24及び30のアスパラギン(配列番号150のアミノ酸位置Asn1800及びAsn1806に対応する)
がアラニンに突然変異させられていることを除いて、成熟MUC16(配列番号150は成熟MUC16
の配列である)のC末端の114アミノ酸残基からなる。したがって、MUC16c114-N23は、配列
番号172のアミノ酸位置24及び30(配列番号150のアミノ酸位置Asn1800及びAsn1806に対応
する)でN-グリコシル化されることができない。
ないMUC16中のエピトープを認識する(すなわち、それは、MUC16に結合するのに、N-グリ
コシル化Asn1800ではなく、N-グリコシル化Asn1806を必要とする)第一のMUC16グリコシル
化抗体又はその抗原結合断片は、N-グリコシル化Asn1800を含むが、N-グリコシル化Asn18
06を含まないMUC16中のエピトープを認識する(すなわち、それは、MUC16に結合するのに
、N-グリコシル化Asn1806ではなく、N-グリコシル化Asn1800を必要とする)第二のMUC16グ
リコシル化抗体又はその抗原結合断片と組み合わせて投与される。そのような第一のMUC1
6グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(このMUC16の第一の
形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133で
ある)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;(ii)MUC16の第三の形態(こ
の第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番
号139である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如;及び(iii)MUC16
の第四の形態(この第四の形態はグリコシル化されており、ここで、該第四の形態のアミ
ノ酸配列は配列番号152である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力に
よって同定されることができ、ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞、MUC
16の該第三の形態を組換え発現する細胞、及びMUC16の該第四の形態を組換え発現する細
胞は、同じ細胞型のものである。そのような第二の抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC
16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のア
ミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力
;(ii)MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の
形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合する
その能力;及び(iii)MUC16の第四の形態(この第四の形態はグリコシル化されており、ここ
で、該第四の形態のアミノ酸配列は配列番号152である)を組換え発現する細胞に対するそ
の免疫特異的結合の欠如によって同定されることができ、ここで、MUC16の該第一の形態
を組換え発現する細胞、MUC16の該第三の形態を組換え発現する細胞、及びMUC16の該第四
の形態を組換え発現する細胞は、同じ細胞型のものである。
である。具体的な実施態様において、該追加の薬剤は、膵癌を治療するために使用される
薬剤である。具体的な実施態様において、該追加の薬剤は、肺癌を治療するために使用さ
れる薬剤である。具体的な実施態様において、該追加の薬剤は、乳癌を治療するために使
用される薬剤である。具体的な実施態様において、該追加の薬剤は、卵管癌を治療するた
めに使用される薬剤である。具体的な実施態様において、該追加の薬剤は、子宮(例えば
、子宮内膜)癌を治療するために使用される薬剤である。具体的な実施態様において、該
追加の薬剤は、原発性腹膜癌を治療するために使用される薬剤である。
節を参照)は、追加の治療剤とともに、同時に又は連続的に(前及び/もしくは後に)投与す
ることができる。該抗体又はその抗原結合断片及び該追加の治療剤は、同じ又は異なる組
成物中で、及び同じ又は異なる投与経路によって投与することができる。第一の療法(こ
れは、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片(第5.1節
及び第5.2節を参照)、又は追加の治療剤である)は、第二の療法(本明細書に記載されるMU
C16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)、又は追加
の治療剤)の投与の前に(例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間
、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週
間、8週間、もしくは12週間前に)、それと同時に、又はその後に(例えば、5分、15分、30
分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1
週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、もしくは12週間後に)、癌(例えば、
卵巣癌、膵癌、肺癌、乳癌、卵管癌、子宮(例えば、子宮内膜)癌、及び原発性腹膜癌)を
有する対象に施すことができる。ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グ
リコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)と組み合わせて対象に
投与される追加の治療剤は、同じ組成物(医薬組成物)中で投与される。他の実施態様にお
いて、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び
第5.2節を参照)と組み合わせて投与される追加の治療剤は、本明細書に記載されるMUC16
グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)と異なる組成物中で
対象に投与される(例えば、2以上の医薬組成物が使用される)。
本明細書に提供される方法に従って治療される対象は、任意の哺乳動物、例えば、齧歯
類、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、霊長類、又はヒトなどであることができる。
好ましい実施態様において、該対象は、ヒトである。別の好ましい実施態様において、該
対象は、イヌである。本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、
互換的に使用される。
れないが、卵巣、肺、膵臓、乳房、子宮、卵管、もしくは原発性腹膜癌、又はMUC16を発
現する任意の他の組織の癌を含む、MUC16陽性癌を有すると診断されている。
(6.1 実施例1:MUC16/CA125のカルボキシ末端部分の発現は形質転換及び腫瘍浸潤を誘導
する)
(6.1.1 序論)
MUC16の抗原性断片である血清CA125抗原は、1980年代初頭から卵巣癌の評価及び管理の
中心であるが、その生物現象及び卵巣癌の発現への寄与はあまり理解されていない(下記
の第6.1.5節に列挙されている参考文献1〜3を参照)。2001年に達成されたCA125のクロー
ニングにより、小さい細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、推定切断部位の近位にあるエク
トドメイン、及び各々156アミノ酸長の12〜20個のタンデムリピートの大きい重度グリコ
シル化領域を有する繋留型ムチンとしてのMUC16が初めて同定された(図1A)(下記の第6.1.
5節に列挙されている参考文献4〜6を参照)。卵巣、卵管、及び子宮の漿液性癌は、多くの
場合、大量のMUC16を発現し、異常なMUC16発現は、肺、膵臓、及び乳房の癌を含む、いく
つかの他の悪性腫瘍に見出すことができる。他の繋留型ムチンの発現は上皮器官の共通の
特徴であり、それらは、悪性腫瘍で過剰発現されることが多い。2つの著明な例は、多く
の乳癌及び卵巣癌で過剰発現されるMUC1と膵癌及び消化器癌で特徴的に多く存在するMUC4
である(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献7を参照)。これらのムチンはどちらも
、形質転換特性を有することが確認されている(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文
献8及び9を参照)。これらの形質転換機構は異なっており、完全には理解されていない。M
UC1は、核に移行して、転写因子として作用することが示されているβ-カテニン相同性領
域を有する(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献10及び11を参照)。対照的に、MUC
4は、その膜貫通領域内にHER結合ドメインを有し、少なくとも一部は、HERファミリーキ
ナーゼを介して作用する(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献12及び13を参照)。M
UC16は、これらのドメインの両方に対する相同領域を欠いており、独立に進化したと思わ
れる(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献12を参照)。MUC1とMUC4の両方と比較し
て、MUC16の発現はより制限されており、通常、ほとんどミュラー管及び眼球上皮のみに
発現される(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献14〜16を参照)。MUC16分子のタン
デムリピート領域は、メソテリン及び他の間質タンパク質との重要な相互作用タンパク質
として機能するように思われる(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献17を参照)。
これらの相互作用は、おそらく、卵巣癌による古典的なパターンの漿膜拡散に関与してい
る。臨床状況では、CA125抗原をコードするMUC16由来の高レベルの循環エレメントは、病
期、悪性度、及び他の伝統的な臨床的因子とは独立に、有害な臨床転帰と関連している(
下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献18を参照)。MUC16のC末端を浸潤及び成長に重
要なものと特定している者もいるが、形質転換に関与する近位MUC16配列の特定の領域は
明らかにされていない(例えば、Therialtらの文献、Gynecol Oncol 2011, 121(3):434-44
3及びGiannakourosらの文献、Int.J. Oncol. 2015, 41(1):91-98を参照)。卵巣癌DNA中
のMUC16をコードするゲノム領域の増幅及びMUC16mRNAの過剰発現が癌ゲノムアトラス(Th
e Cancer GenomeAtlas)(TCGA)卵巣癌プロジェクトで認められており、より悪い転帰と関
連している(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献19を参照)。マウスにおけるMUC16
の喪失は明確な表現型と関連しているわけではなく、持続的な又は異常なMUC16発現の効
果は不明である(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献20を参照)。本実施例におけ
るデータは、MUC16の114個のC末端アミノ酸残基(MUC16c114、配列番号133)の発現、特に
、MUC16c114の残基Asn30(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する)のグリコシル化
が、シグナル伝達、遺伝子発現、及び侵襲的な生物学的挙動の特定の変化と関連すること
を示している。
(6.1.2.1 MUC16カルボキシ末端(MUC16c114)及びMUC16-CA125ドメイン(MUC16c344)DNAコ
ンストラクト並びにグリコシル化融合タンパク質の合成)
MUC16の切断形態(MUC16c344、MUC16c114、MUC16c80、及びMUC16c86と表記される;図1B
及び図1C)をコードするDNAコンストラクトを作製した。phrGFPII-Cベクター(phrGFP)(St
ratagene,LaJolla, CA)のEcoRV及びNotIマルチクローニングサイトを用いて、MUC16c114
、MUC16c80、MUC16c86、及びMUC16c344DNAを組み込み、GFPタンパク質が切断型MUC16融
合タンパク質のカルボキシ末端に存在する状態で得られるGFP融合コンストラクトを作製
した。鋳型としてのpBK-CMV-MUC16-B53DNA(Yin BWTらの文献、International Journal o
f Cancer, 2002,98(5):737-740)を用いて、MUC16断片(MUC16c344、MUC16c114、MUC16c80
、及びMUC16c86)のPCR産物を作製し、PCR産物を1%アガロースゲル中で精製し、シークエ
ンシングし、phrGFPII-Cベクター(phrGFP)のEcoRV及びNotIマルチクローニングサイトに
挿入した。pFUSE-hIgG1-Fc2ベクターは、InvivoGen(SanDiego, CA)から購入した。ポリ
メラーゼ連鎖反応(PCR)プライマーをエクトドメインMUC16c57-114(配列番号150の位置177
7〜1834)用に設計するか、又は制限酵素部位EcoRVをフォワードプライマーとして、及び
制限酵素部位NcoIをリバースプライマーとして、117-244LGALS3の糖結合ドメインのDNA配
列を合成した(Sigma-Genosys,The Woodlands, TX)。pBK-CMV-MUC16-B53 DNAを鋳型とし
て用いて、MUC16c57-114断片のPCR産物を生成し、ATCC(Manassas,VA)から入手したLGALS
3 cDNAクローン(MGC:2058IMAGE:3050135 GenBank: AAH01120.1; DBSourceアクセッショ
ンBC001120.2)をDNA鋳型として用いて、LGALS3の糖結合ドメインのPCR産物を合成した。P
CR産物を1%アガロースゲル中で精製し、シークエンシングし、pFUSE-hIgG1-Fc2ベクター
に挿入した。
MUC16-細胞質ドメイン(MUC16c114、カルボキシ末端114aa)のフォワード及びリバースプ
ライマー
。フォワードプライマー中にEcoRV及びKOZAKがあり、リバースプライマー中にNotIがある
、MUC16c344(システインループを1つだけ有する1つのタンデムリピート、344aa)
。MUC16c114-GFPDNAコンストラクトを用いて、クイックチェンジプライマーにより、MUC
16c80及びMUC16c86コンストラクトを生成した。フォワードプライマー中にEcoRVがあり、
リバースプライマー中にNcoIがある、MUC16c57-114 pFUSE-hIgG1-Fc2ベクター用のフォワ
ード及びリバースプライマー
並びにpFUSE-hIgG1-Fc2ベクター用の117-244LGALS3の糖結合ドメインのフォワード及びリ
バースプライマー
。上記のプライマーは全て、Sigma Genosys, The Woodlands, TXにより合成された。
融解させた。97℃で30秒間加熱し、60℃で1分間アニーリングさせ、72℃で1分間伸長させ
るという30回の反復サイクルを実施した。これに続いて、生成されたPCR産物鎖を72℃で5
分間伸長させ、その後、4℃で一晩冷却した。
8ゲル精製DNAを、EcoRV及びNotI(New EnglandBiolabs, Beverly, MA)制限酵素を用いて
、37℃の水浴で一晩、個別に消化した。pFUSE-hIgG1-Fc2ベクターDNA、MUC16c57-114、及
び117-244LGALS3ゲル精製DNAを、EcoRV及びNcoI(New England Biolabs, Beverly, MA)制
限酵素を用いて、37℃の水浴で一晩、個別に消化した。MUC16c114及びphrGFP;MUC16c344
及びphrGFP;又はMUC16c678及びphrGFPの制限消化DNAをゲル精製し、T4リガーゼ(RocheDi
agnosticsCorporation, Indianapolis, IN)を用いて一晩ライゲーションした。同様に、
MUC16c57-114及びpFUSE-hIgG1-Fc2;117-244LGALS3及びpFUSE-hIgG1-Fc2の制限消化DNAを
ゲル精製し、T4リガーゼ(RocheDiagnostics Corporation, Indianapolis, IN)を用いて
一晩ライゲーションした。ライゲーションされたDNAを、製造元のプロトコルに従って、X
L-1 Blueスーパーコンピテント細胞(Stratagene,La Jolla, CA)に形質転換し、それらを
、phrGFPベクター用のカナマイシン(50μg/mL、SigmaChemical Co., St. Louis, MO)を
含むLB培地を含む寒天プレートに、又は25μg/mlのZeocin(Invitrogen,CA)を含むLB培地
を含む寒天プレートにプレーティングした。クローンを翌日に選択し、ミニプレップDNA
を、WizardPlusミニプレップDNA精製システム(Promega Corporation, Madison, WI)を用
いて抽出した。選択されたクローンのDNAを、MUC16及びphrGFPのフォワード及びリバース
プライマーを用いて、MSKCC DNAシークエンシングコア施設でシークエンシングし、融合
コンストラクト又はMUC16c57-114及びpFUSE-hIgG1-Fc2又は117-244LGALS3及びpFUSE-hIgG
1-Fc2としての配列中のMUC16及びphrGFPの存在を確認した。そのようなクローン由来のメ
ガプレップDNAを、WizardPlusメガプレップDNA精製システム(Promega Corporation, Mad
ison, WI)を使用することにより作製し、これにより、融合コンストラクトとしてのその
配列中のMUC16及びphrGFP又はMUC16c57-114及びpFUSE-hIgG1-Fc2又は117-244LGALS3及びp
FUSE-hIgG1-Fc2の存在も確認された。
トランスフェクトされた細胞をトリプシン処理し、洗浄し、血球計算盤によりカウント
した。細胞を複数のエッペンドルフチューブに少なくとも0.5〜1×106個/チューブで分配
した。細胞を、1%FCS及び0.025%アジ化ナトリウムを含むPBS(FACSバッファー)で洗浄し
た。表面FACS染色のために、細胞を、1μg/チューブのMUC16-カルボキシ末端モノクロー
ナル体(4H11.2.5)の生体反応性上清、マウス抗ヒトOC125(M3519)(DakoCytomation,Dako
North America社,Carpinteria, CA)なしで(二次抗体対照用に)、又はこれらとともに、
氷上で30分間インキュベートした。エッペンドルフチューブ中の細胞を、1μg/チューブ
の非特異的アイソタイプマッチ対照マウス抗体(MSKCCモノクローナルコア施設から入手し
たIgG1モノクローナル体に対する13C4及びIgG2bモノクローナル体に対する4E11)でも表面
染色し(データは示さない)、氷上で30分間インキュベートした。全ての細胞をFACSバッフ
ァーで3回洗浄した。細胞を1μg/チューブの二次抗体ヤギ抗マウスIgG1-PE又はIgG2b-PE
とともに氷上で30分間インキュベートし、その後、FACSバッファーで3回洗浄した。細胞
をFACSCaliburにより解析した。
NIH/3T3(3T3)細胞(線維芽細胞)は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(A
merican TypeCulture Collection)(ATCC, Manassas, VA)から入手した。A2780細胞は、
ヒト卵巣癌細胞株である(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献28を参照)。両方の
細胞株を公開されている条件に従って維持した。安定なMUC16陽性細胞株をMUC16発現ベク
ター(phrGFP-MUC16c344、phrGFP-MUC16c114、phrGFP-MUC16c80、及びphrGFP-MUC16c86)の
トランスフェクションによって作出し、ジェネティシン(G418、Invitrogen, Grand Islan
d, NY)を用いてそのそれぞれの培養培地中で選択し、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現に
基づいて単離した。MUC16c114トランスフェクタントは、推定切断部位からカルボキシ末
端まで(配列番号150のアミノ酸1777〜1890)のMUC16タンパク質の細胞表面発現を有する(
下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献5を参照)。MUC16のカルボキシ末端(アミノ酸1
547〜1890)にまで及ぶ344アミノ酸断片としてのMUC16タンパク質の細胞表面発現を有する
MUC16c344-GFPベクターの発現を有する株を含む、より長いMUC16断片を有する細胞株を同
様の方法で調製した(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献5を参照)。
全てのコンストラクトを、製造元のプロトコルに従ってDOTAP(Roche Diagnostics, Ind
ianapolisCorporation, IN)を用いて、NIH/3T3(3T3)及びA2780細胞に導入した。安定な
トランスフェクタントを、400μg/mLのG418を用いて、3T3及びA2780細胞について、その
それぞれの培養培地中で選択した。これらをMSKCCフローサイトメトリーコア施設(FCCF)
でGFP発現について2回細胞選別し、選択された細胞を、最大15回の継代の間、株として成
長させた。FACS解析によるルーチンのモニタリングを行って、これらの株のGFP陽性を確
認した。これらの株のタンパク質抽出物を、抗hrGFP(Stratagene, La Jolla, CA)及び抗M
UC16-カルボキシ末端モノクローナル抗体を用いるウェスタンブロットによって解析した(
下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献5及び14を参照)。
1000個の安定なトランスフェクト細胞/ウェルをマルチプル96ウェル平底プレート中の2
00μLの培養培地/ウェルに播種し、37℃及び5%CO2で5日間インキュベートした。毎日、3
つ組の培養プレートを25μL/ウェルのAlamar Blue(ABD Serotec Co. UK)で発色させ、37
℃及び5%CO2で4時間インキュベートした。プレートを、530nMでの励起及び620nMでの放
射を用いて、PerSeptiveBiosystems CytoFluorマルチウェル蛍光プレートリーダーモデ
ル# 4000で読み取った。4日間にわたる成長曲線を記録し、3つ組のプレートの平均値をそ
れに応じてプロットした。
安定なトランスフェクト細胞をアガロース懸濁液に入れ、薄いアガロース層の上にプレ
ーティングし、足場非依存性コロニーを形成するその能力について解析した。ディッシュ
当たり10mLの培地-アガロース懸濁液中の100〜500万個の細胞をプレーティングし、37℃
及び5%CO2でインキュベートした。プレートをコロニー形成についてモニタリングした。
追加の培養培地を4〜5日毎に重層した。11〜14日間培養した後、コロニーを数え、コロニ
ーの写真を撮った。
MUC16c57-114-pFUSE-hIgG1-Fc2及び117-244LGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2コンストラクトを
、融合タンパク質を無血清培地中に発現及び分泌するヒト胚性腎臓(HEK) FreeStyle 293F
細胞(Invitrogen,CA)に別々にトランスフェクトした。3枚の10%SDS-PAGEゲルに、pFUSE
-hIgG1-Fc2対照空ベクター、MUC16c57-114-pFUSE-hIgG1-Fc2ベクター、及びLGALS3-pFUSE
-hIgG1-Fc2ベクターで一過性トランスフェクトされたHEK293F細胞由来の5μg/レーンの
融合タンパク質上清を泳動させた。1枚のゲルを、製造元のプロトコルに従って、Gelcode
試薬で直接染色した。2枚のゲル由来のタンパク質を、5%無脂肪乳-0.1%Tween-20を含む
リン酸緩衝食塩水(PBST)で、シェーカー上で、室温で1時間ブロッキングした2枚のニトロ
セルロース膜に転写した。これらの膜を、5%無脂肪乳PBST中1:5,000希釈の抗ヒトIgG1-F
c-HRP(γ1鎖特異的)(SouthernBiotech社、CA); 5%無脂肪乳PBST中1:2000希釈の4H11-HR
P mAb(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献14を参照)、及び5%無脂肪乳PBST中1:2
00希釈の抗ヒトGAL3mAb(Santa Cruz Biotechnology, CA)で、シェーカー上で、4℃で一
晩プロービングした。GAL3膜をPBSTで3回洗浄し、5%無脂肪乳PBST中1:3,000希釈の抗マ
ウスIgG-HRP二次抗体で、シェーカー上で、室温で1時間標識した。膜をPBSTで3回洗浄し
、その後、これらをECL試薬(PerkinElmer, NY)化学発光基質で5分間処理し、発光したシ
グナルをX線フィルム上に捕捉した。
基底膜浸潤をマトリゲル浸潤チャンバー(BD Biosciences, Bedford, MA)で決定した。
マトリゲル遊走を48時間で3つ組のウェル中で測定し、phrGFPベクター対照と比較し、%p
hrGFP対照マトリゲル浸潤として表した。0.1μg/mLのツニカマイシン(Sigma-Aldrich,St
. Louis MO cat# T7765)又は5μg/mLのMUC16c57-c114-pFUSE-hIgG1-Fc2又は5μg/mLの11
7-244LGALS3 pFUSE-hIgG1-Fc2融合タンパク質で処理された安定細胞株の48時間後のマト
リゲル遊走を測定し、%phrGFP対照マトリゲル浸潤として表した。
24ウェルプレート中)及び対照インサート(カタログ#354578、24ウェルプレート中)は、B
D Biosciences,MAから購入した。マトリゲル浸潤アッセイは、製造元のプロトコルに従
って実施した。簡潔に述べると、24ウェルプレート中のマトリゲルチャンバー(-20℃で保
存されたもの)及び対照インサート(4℃で保存されたもの)を室温に至らせておいた。両方
のインサートを、インサート中で、及び24ウェルプレートの外側のウェル中で、37℃の5
%CO2加湿インキュベーターにて2時間、0.5mLの無血清培地で再水和させた。培養した3T3
又はA2780細胞をトリプシン処理し、培養培地で洗浄した。100万個の細胞を別の遠心分離
チューブに分け、無血清培地で3回洗浄した。後に、これらの細胞を調整して、0.5mLの無
血清培地中、10,000細胞にした。再水和させたインサート中の培地を除去し、このインサ
ートを、化学誘引物質としての役割を果たすウェル中の0.75mLの10%胎仔ウシ血清(FBS)
含有培養培地を含む新しい24ウェルプレートに移した。すぐに、無血清培地中の0.5mLの
該細胞(10,000細胞)をインサートに添加した。適切な注意を払って、インサート及び外側
のウェルに気泡が閉じ込められないように配慮した。24ウェルプレートを37℃の5%CO2加
湿インキュベーターで48時間インキュベートした。インキュベーション後、綿棒をマトリ
ゲル又は対照インサートに挿入して「擦る」ことにより、非浸潤細胞を膜の上表面から除
去し、綿棒の先端を膜表面にわたって移動させながら、穏やかに圧力をかけた。培地に浸
した第二の綿棒で擦ることを繰り返した。その後、蒸留水中の0.5mLの0.5%クリスタルバ
イオレット染料を含む新しい24ウェルプレート中で30分間、インサートを染色した。染色
後、インサートを蒸留水の3つのビーカー中ですすいで、余分な染料を除去した。インサ
ートを新しい24ウェルプレート中で風乾させた。浸潤した細胞を、200倍の倍率の倒立顕
微鏡下で、手でカウントした。3つ組の膜のいくつかの視野をカウントし、図に記録した
。
RNA単離物をRiboPureキット(Ambion,Austin, TX)プロトコルに従って調製した。転移
及び細胞外マトリックスタンパク質遺伝子のパネルのRT PCRを、以前に記載されている通
りに、RT2Profiler PCRアレイシステム(Super Array, Frederick, MD)を用いて実施した
(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献29を参照)。
トランスフェクトされた細胞株及び適当な対照細胞株を無胸腺ヌードマウスの側腹又は
腹腔に導入し、日常的な動物の世話は、MSKCC抗癌評価コア施設(MSKCC Antitumor Assess
ment CoreFacility)によって提供された。腫瘍成長評価実験のために、各々の腫瘍株由
来の200万個の細胞を5〜15匹の無胸腺ヌードマウスの各々に移植した。腫瘍測定を週2回
行い、腫瘍成長を、MSKCCRARCガイドラインに従って、1500mm3の最大サイズまで記録し
た。
安定細胞株を、10cmディッシュで、そのそれぞれの培養培地中で培養し、37℃及び5%C
O2で3日間インキュベートした。その後、これらを氷冷PBSで2回洗浄し、1〜2mLの氷冷PBS
で擦り落とし、遠心分離した。ペレット化した細胞を、0.2mLの改変Ripa溶解バッファー(
20mM Tris-HCL、pH7.4; 150mM NaCl; 1%NP-40; 1mM Na3VO4; 1mM PMSF; 1mM DTT;プロ
テアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル(cat # 11836170001、Roche Diagnostics, I
N製)を含む)で、氷上で30分間溶解させ、4℃で10分間遠心分離した。上清のタンパク質濃
度をBio-Radタンパク質アッセイ(BioRaDLaboratories, Hercules, CA)を用いて測定した
。等量のタンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で分離し、BioRad
転写装置を用いて4℃でPVDF膜に転写した。膜を、0.1%Tween-20を含むPBS(PBST)中の3%
ウシ血清アルブミン(BSA)又は5%無脂肪乳で、4℃で一晩ブロッキングした。膜を種々の
一次抗体(CellSignaling, MA: Akt cat #9272;ホスホ-Akt(Ser473)(193H12) cat # 4058
; p44/43MAPK(Erk1/2) cat # 9102;ホスホ-p44/43 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204) cat #
9101);(Sigma-Aldrich社,St. Louis, MO:β-アクチン cat # A5441);(Southern BioTech
, Birmingham,AL:抗ヒト-Fc-IgG1-HRP cat # 9054-05、及びAbgent, San Diego, CA:ポ
リクローナルLGALS3抗体 cat # AP11938b)で4℃で一晩発色させた。膜をPBSTで3回洗浄
し、HRPコンジュゲート抗マウス又は抗ウサギ抗体(GEHealthcare, UK)(1:5000希釈)で室
温で1時間で発色させた。その後、膜をPBS-Tで3回洗浄し、WesternLightning化学発光試
薬(ECL,Perkin Elmer)で室温で1〜5分間発色させ、シグナルをHyBlot CLフィルム(Denvi
lle Scientific社.Metuchen, NJ)上で現像した。
包括的なゲノムデータは、316個の漿液性卵巣癌試料について、TCGAプロジェクト(tcga
.cancer.gov)の一部として入手可能であった。遺伝子レベルのDNAコピー数のコールを、G
ISTICを用いてCBSセグメント化Agilent1Mマイクロアレイデータから得た。MUC16 mRNA発
現を3つの異なるプラットフォーム(Agilent244K全ゲノム発現アレイ、Affymetrix HT-HG
-U133A、及びAffymetrixExon 1.0アレイ)を用いて測定し、遺伝子発現値を以前に記載さ
れている通りに導出した(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献30を参照)。MUC16中
の体細胞突然変異を、全エクソーム捕捉と、それに続く、次世代シークエンシング(SOLiD
又はIllumina)により同定した。全てのTCGAデータをcBioCancer Genomics Portal(www.c
bioportal.org)からダウンロードした。その後、mRNA発現値を対応するDNAコピー数のカ
テゴリー(ホモ接合性欠失、半接合性欠失、二倍体、増加、高レベルの増幅)と関連付け、
体細胞突然変異を全試料にわたって重ね合わせ、以前に記載されている通りに、統計的フ
レームワークR(www.R-project.org)を用いて、ボックスプロットとしてプロットした(下
記の第6.1.5節に列挙されている参考文献31を参照)。臨床データは、TCGAデータポータル
(tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)から入手した。
コンディショナルなカルボキシ末端354アミノ酸(MUC16c354)トランスジェニックコンス
トラクトを、ベクターphrGFP II-C(Stratagene, La Jolla, CA)を用いて作製し、CMVプロ
モーターをベクターpCAG-CreERT2(Addgene,Cambridge, MA)由来のCAGプロモーターと交
換した。MUC16c354断片を、YinBWらによって作製されたコンストラクトB53から、PCRに
よって増幅させた(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献5及び6を参照)。MUC16c354
コンディショナルコンストラクトは、以下のユニット: pCAG、5'loxP、hrGFP、BGHpA、3'
loxP、MUC16c354、HA、及びSV40pAを含有する。
マウス遺伝学コア施設(Mouse Genetics Core Facility)でB6CBAF1/Jマウスに対する顕微
注入処置を行った。12匹のMUC16c354コンディショナルトランスジェニックマウスを99匹
のマウスからサザンブロットにより同定した。全12匹のプロファウンダーをB6.FVB-Tg(EI
Ia-cre)C5379Lmgd/Jマウス(TheJackson Laboratory, Bar Harbor, MI)と交配させて、2
つのloxPの間に位置するhrGFPを除去した。各々のプロファウンダーのMUC16c354PCR陽性
雌マウスを解剖した。これらの解剖されたマウス由来の器官(脳、結腸、心臓、腎臓、肝
臓、肺、卵巣、及び脾臓)を細かく切り、ホモジナイズした。タンパク質試料をウェスタ
ンブロットにより解析して、MUC16c354を高発現するファウンダーを特定した。得られた
トランスジェニックマウスを混合バックグラウンドで維持した。
.129S2-Trp53tm1Tyj/J)(TheJackson Laboratory, Bar Harbor, MI)と掛け合わせて、二
重トランスジェニックMUC16c354:p53+/-を作出した。得られたトランスジェニックマウス
を混合バックグラウンドで維持した。全てのマウスを抽出された足指又は尻尾のDNAを用
いるPCRによりジェノタイピングした。全ての実験動物をMSKCC施設内動物管理使用委員会
及び研究動物資源センターにより承認されたガイドライン並びに実験動物の管理使用に関
するNIH指針に準拠して維持した。
12カ月齢のマウスを屠殺し、剖検した。肉眼検査の後、解剖された組織試料を10%中性
緩衝ホルマリンで24時間固定し、その後、アルコール及びキシレン中で処理し、パラフィ
ンに包埋し、5μmの厚さで切削し、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色した。組織
は、獣医病理学者(SM)によって調べられ、腫瘍性病変と非腫瘍性病変が、齧歯類病理命名
法に関する公表されたガイドラインに従って診断された。
インビトロ成長、浸潤、及び軟寒天成長潜在能力の検討のために、スチューデントの対
応のある両側t検定を用いて、群を比較した。χ二乗検定を用いて、提供されているソフ
トウェア(SuperArray)に従って、RT-PCRデータを有意性について解析した。各々の動物に
おける全腫瘍体積の経時的な曲線下面積評価を用いて、腫瘍体積の比較を行った。全ての
動物が両方の群で生きていた最後の日を基にして、腫瘍体積の評価を行った。ノンパラメ
トリック順位検定(ウィルコクソン二標本検定)を用いて、群間分布差について検定した。
動物生存研究で、事象を腫瘍体積が1,500mm3を超えるまでの時間又は潰瘍形成までの時間
と定義して、時間事象解析を行った。1,500mm3未満の腫瘍体積を有する動物を最大60日間
追跡調査し、その後、打ち切った。カプラン-マイヤー法を用いて、生存分布を推定した(
下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献32を参照)。
MUC16タンパク質のタンデムリピート領域の明かな切断及び放出の後、このタンパク質
のカルボキシ末端の約114アミノ酸(c114)は細胞表面に残ると考えられており、この分子
のこの部分の潜在的な機能は不明である。3T3線維芽細胞及び卵巣癌細胞株の悪性形質転
換及び挙動におけるMUC16タンパク質のこの最近位部分の役割を解析した。切断部位の近
位にある残りのc114アミノ酸エレメントの効果を検討するために、2つのベクター:(1)MUC
16c114-GFPベクター及び(2)切断型MUC16c344-GFPベクター(図1)を設計し、これらのベク
ター及びphrGFP対照ベクターを3T3線維芽細胞に独立にトランスフェクトした。MUC16c114
発現細胞株及びMUC16c344発現細胞株をG418を用いて選択し、維持し、MUC16c114及びMUC1
6c344の安定発現を、MUC16カルボキシ末端のユニークなアミノ酸配列を認識するモノクロ
ーナル抗体を用いるFACS解析により確認した(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献
14を参照)。MUC16タンパク質由来の344アミノ酸(配列番号132)を発現する細胞株(MUC16c3
44-GFP株)は、FACS解析により細胞表面でOC125抗体によって認識される古典的なCA125エ
ピトープを担持しており、CA125は細胞培養上清中に放出される。OC125は、MUC16c114-GF
P細胞を認識しない。しかしながら、トランスフェクトされた株は全て、推定切断部位の
近位にあり、かつMUC16エクトドメイン特異的4H11抗体によって認識されるMUC16c114細胞
外配列(配列番号133)について細胞表面陽性であった(下記の第6.1.5節に列挙されている
参考文献14を参照;図1)。
MUC16の切断後の残存エレメントによって付与される形質転換特性を調べるために、3T3
MUC16c114-GFP及び3T3MUC16c344-GFP細胞株の特徴を解析し、これら2つの最小MUC16エ
レメントの効果をベクター対照と比較した。MUC16配列の最近位の114アミノ酸(MUC16c114
)又は近位の344アミノ酸(MUC16c344)のいずれかの発現は、親株のインビトロ成長速度と
比較したとき、トランスフェクトされた細胞株のどのインビトロ成長速度にも有意な効果
を有しなかった(図2A)。しかしながら、MUC16タンパク質の同じエレメントの発現は、軟
寒天クローニングにおいて3T3足場依存性成長を実質的に変化させた。最小c114断片とc34
4断片はどちらも、ベクターのみの対照と比較して軟寒天コロニーの数を有意に増加させ
た(図3A)。MUC16タンパク質の近位部分の発現は、phrGFPベクター対照でトランスフェク
トされた3T3細胞と比較して、古典的マトリゲル浸潤アッセイでMUC16+3T3細胞の遊走も増
強した(p<0.0001)(図3B)。様々なMUC16タンパク質断片を発現する3T3細胞を選択された
転移及び浸潤遺伝子転写物の発現について調べたとき、ケモカインリガンド12(CXCL12)、
カドヘリン11(CDH11)、並びにマトリックスメタロプロテイナーゼMMP2及びMMP9を含む、
多数の浸潤遺伝子が上方調節されていた(図3C)。フィブロネクチン(FN1)及びニューロフ
ィブロミン(NF2)を含む他の転写物は一貫して減少している。MUC16はインビボ腫瘍成長を
変化させ、かつMUC16タンパク質を担持する細胞の浸潤特性を増大させるので、MUC16は、
MUC1及びMUC4の効果と同様の方法で、標準的なシグナル伝達経路を介して作用し得る。相
互作用するERK及びAKT経路は、卵巣癌における重要なシグナル伝達機構及び腫瘍細胞浸潤
の調節因子として以前に同定されている(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献21及
び22を参照)。図3Dに示されているように、pAKT(S473)及びpERK(T202/Y204)の増大から明
らかな両方の経路の活性化が見られた。
瘍成長速度に対するMUC16の効果を測定するために、側腹腫瘍モデルを用いて、定期的な
腫瘍測定を容易にした。図3Eに示されているように、MUC16を発現する3T3細胞株(ベクタ
ーphrGFP、MUC16c114-GFP、及びMUC16c344-GFP)を無胸腺ヌードマウスの側腹に移植した
とき、MUC16c114-GFPとMUC16c344-GFPはどちらも、4週でベクターのみの対照と比較して
より大きい腫瘍を形成した。MUC16c114-GFPタンパク質を発現する細胞株とMUC16c344-GFP
タンパク質を発現する細胞株の間に統計的な差はなく(図3E)、MUC16発現の発癌効果がこ
の分子の最近位部分と関連していることを示唆した。この腫瘍成長速度の増加は、腫瘍成
長の期間の全体を通して見られ、(血清CA125としての)高レベルのMUC16発現と不良な生存
との臨床的関連と一致している(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献18を参照)。
3T3細胞におけるMUC16タンパク質の発現は形質転換の特徴と明確に関連していたが、完
全に形質転換した卵巣癌細胞株の中には、培養したとき、MUC16発現を欠くものもある。
ヒト卵巣癌細胞の挙動に対するMUC16の寄与を調べるために、A2780細胞(MUC16を発現しな
いヒト卵巣癌細胞株)をMUC16c114-GFP又はMUC16c344-GFPでトランスフェクトした。MUC16
発現細胞をG418により選択し、MUC16及びGFP発現についてのFACSに供した。これらの細胞
は、MUC16発現がなくても軟寒天中でよく成長するので、マトリゲル浸潤に対するMUC16c3
44及びMUC16c114の効果を解析した。図4Aに示されているように、MUC16c114及びMUC16c34
4発現は、A2780細胞におけるマトリゲル浸潤を明らかに促進した。同様に、ERK及びAKT経
路の活性化に対するMUC16c114及びMUC16c344の効果は、3T3細胞で見られるものと類似し
ており、pAKT(S473)とpERK(T202/Y204)の両方の基礎レベルを増大させた(図4B)。したが
って、悪性卵巣細胞株でも、MUC16カルボキシ末端エレメントの発現の増大は、浸潤の増
大及び癌遺伝子活性化と関連している。さらに、MUC16c114及びMUC16c344トランスフェク
トA2780株のインビボ腫瘍成長を解析した(図4C)。両方の状況において、MUC16c114細胞株
及びMUC16c344細胞株は、ベクターのみの対照よりも急速に成長した。このヒト癌モデル
において、ベクター対照は、実際、十分な速度で成長し、最後には動物を死滅させた。
形質転換に関与するMUC16c114の特定の部分を決定するために、2つのさらなるMUC16断
片:(1)MUC16c114のエクトドメイン由来の34アミノ酸配列(原著公開文献で付番されている
、位置1798〜1831)が欠失しているMUC16c80(図1D;配列番号135)(下記の第6.1.5節に列挙
されている参考文献5を参照);並びに(2)MUC16c114コンストラクトがMUC16のエクトドメイ
ン全体を保持しているが、細胞質ドメインの推定Ezrinドメイン、潜在的なチロシンリン
酸化部位、及びSH2ドメイン由来の28アミノ酸配列(位置1857〜1884)を除去しているMUC16
c86(図1D;配列番号134)を構築した。これらのコンストラクトを3T3細胞に導入し、残りの
MUC16c80及びMUCc86配列の細胞表面発現についてFACSにより選択した。その後、これら2
つのさらなる細胞集団をMUC16c80及びMUCc86依存的変化について調べた。MUC16c86コンス
トラクト(インタクトなエクトドメインを有するコンストラクト)は、MUC16c80コンストラ
クト(インタクトな細胞質ドメインを有するコンストラクト)よりもはるかに大きい軟寒天
コロニー形成能力を保持していた(図5A)。これは、マトリゲル浸潤能力についても当ては
まった(図5B)。MUC16c80発現3T3細胞は、phrGFPベクター対照の浸潤速度と統計的に異な
らない浸潤速度を有していた。対照的に、MUC16c86発現3T3細胞は、インタクトなMUC16c1
14及びMUC16c344細胞と同様の、より浸潤性の高い表現型を保持していた。AKT及びERK経
路の活性化を調べたとき、結果は、軟寒天コロニー及びマトリゲル浸潤研究と一致した(
図5C)。(完全にインタクトなエクトドメインを有しない)MUC16c80断片の発現は、ERK及び
AKTを活性化せず、phrGFPベクター対照と類似していたが、対照的に、(インタクトなエク
トドメインを有する)MUC16c86を発現する3T3細胞は、ERK及びAKTの活性化に関して完全な
MUC16c114を発現する3T3細胞と類似していた。最後に、インタクトなエクトドメインの重
要性を異種移植腫瘍モデルで確認した。
、MUC16c114依存的3T3成長増強の喪失をもたらし、一方、MUC16c86発現3T3細胞は、わず
かに成長が遅延していたが、MUC16c114発現3T3細胞と類似した全体的効果を有していた(
図5D)。したがって、MUC16c114断片の細胞外部分は、3T3細胞におけるMUC16の形質転換効
果に関与していた。MUC16c114の細胞外断片の役割をさらに調べるために、MUC16c114発現
3T3細胞に関して、MUC16を標的とする抗体のパネルを用いて、共沈研究を実施した(下記
の第6.1.5節に列挙されている参考文献14を参照)。共沈する単一バンドは銀染色によって
同定されず、EGFR、インテグリン、及びHER3の特異的ウェスタンブロットは陰性であった
。しかしながら、MUC16c114配列の解析により、エクトドメインの3つの潜在的N-グリコシ
ル化部位(Asn1777、Asn1800、及びAsn1806(図6、配列番号132及び配列番号133))が役割を
果たし得ることが示唆された。これらのN-グリコシル化部位の役割を解析した。部位特異
的点突然変異を用いて、3つ全てのアスパラギンをアラニンに変化させた。MUC16c114-N12
3と表記される、この修飾MUC16c114コンストラクトを3T3細胞に導入し、MUC16c114-N123
発現細胞をFACS及び4H11エクトドメイン抗体により単離した。図7Aに示されているように
、これらのアスパラギンからアラニンへの突然変異は、もとのMUC16c114発現ベクターで
見られるMUC16c114誘導性のマトリゲル浸潤の増強を3T3細胞で完全に無効化した。N-グリ
コシル化の役割を確認するために、3T3細胞をグリコシル化阻害剤のツニカマイシン(0.1
μg/mL)で処理し、マトリゲル浸潤の顕著な減少が認められた。MUC16c114細胞外配列の役
割をさらに調べるために、2つの合成タンパク質阻害剤も試験した。MUC16外部配列(下記
の第6.1.5節に列挙されている参考文献5で付番されている位置1777〜1834)をヒトFc骨格p
FUSEに接続して(MUC16c57-c114pFUSE)、「ダミー」受容体を提供した。このコンストラ
クトをMUC16c114浸潤対照とpFUSEベクター対照の両方と比較した。図7Bに示されているよ
うに、「ダミー」受容体コンストラクトは、マトリゲル浸潤に対するMUC16c114発現ベク
ターの全体的効果を減少させた(図7)。レクチンがグリコシル化MUC16c114タンパク質の効
果に関連があると仮定して、第二の阻害剤を、LGALS3の糖結合ドメイン(アミノ酸117〜24
4;図7及び図8)(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献23を参照)が同じpFUSE骨格に
接続されたもの(117-244LGALS3pFUSE)から構築した。ツニカマイシンと同様、これらのタ
ンパク質阻害剤はどちらも、MUC16c114と他の細胞表面タンパク質との相互作用を妨害し
たが、pFUSEベクターのみでは効果がなかった(図7B)。他の妨害と同様に、pAKT発現及びp
ERKに対する効果は、図7Cに示されているように、N-グリコシル化部位を除去したとき、
マトリゲル浸潤の喪失と同時に減少した。しかしながら、MUC16c114-N123コンストラクト
は、4H11(MUC16エクトドメイン特異的)結合によって示されるように、高レベルのMUC16c1
14-N123タンパク質の発現を有していた。N-グリコシル化の喪失の影響は、図7Dに示され
ているような、nu/nuマウスにおけるトランスフェクト3T3細胞の成長の低下においても同
様に確認された。
トランスジェニックマウスにおけるカルボキシ末端MUC16エレメントの発現の効果及び
自然発生的な腫瘍形成の割合を調べた。MUC16c354(完全なc114配列及び最近位のCA125担
持タンデムリピート)を発現するコンディショナルトランスジェニックマウスを作製した
。CMV初期エンハンサー+ニワトリβアクチンプロモーター(CAG)を用いて、全てのマウス
組織における実質的なMUC16c354発現を強制した。ヒト卵巣の生理機能がマウス生殖器系
と非常に異なり、組織特異的卵巣プロモーターが弱く、かつトランスジェニックシステム
で使用するのが比較的難しいので、この戦略を選んだ。これらのマウスについての戦略を
図9Aに示す。
ットによって選択し、EIIa-Creマウスと掛け合わせて、MUC16c354トランスジェニックフ
ァウンダーを生じさせた。図9Cに示されているように、2匹のファウンダーを選び、MUC16
c354トランスジェニックマウスのコロニーを作り出した。この2匹のファウンダーは、多
くの器官、例えば、脳、結腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、卵巣、及び脾臓でMUC16c354を高
発現する。これらのマウスは、MUC16c354の広範な異所性発現から影響を受けず、正常な
雄:雌子孫比、正常な受精能、及び2年を超える明らかに正常な生存期間を有する。3カ月
間隔で最大1年の対照集団及びMUC16c354トランスジェニックマウス由来の2匹の外見上健
康な動物(雄1匹及び雌1匹)の剖検では、高齢の雌マウスにおける軽度/中程度の子宮内膜
過形成が目立つだけであったが、発生率及び重症度は、野生型対照と顕著には異ならなか
った。選択された組織を図10に示す。1つの自然発生的軟部組織腫瘍(肉腫)しか、2年以上
観察した100匹を超える動物のコロニーで認められなかった。
た。BRCA1突然変異のマウスモデルもセカンドヒットを必要とし、p53の喪失が腫瘍の頻度
を顕著に増加させたことは注目に値する。MUC16c354マウスをJackson Laboratoryからのp
53+/-マウスと掛け合わせた。初期影響は限られていた。しかしながら、約6カ月後、p53+
/-を有するMUC16c354マウスは、正常な対照動物の速度よりも高い速度で軟部組織の自然
発生的肉腫性腫瘍及びリンパ腫を発症し始めた。選択された腫瘍を図9Dのパネル挿入図に
示す。これらのマウスのカプラン-マイヤー生存を図9Eに示す。MUC16c354:p53+/-マウス
は、自然発生的腫瘍発生のために、有意により悪い全生存を示した(p<0.014)。各々の群
で見られた腫瘍の総数は: p53+/-マウス、20/107匹のマウス; MUC16c354及びp53+/-マウ
ス、34/91匹のマウス;MUC16c354マウス、1/72匹のマウス;野生型マウス、0/91匹のマウ
スであった。8つの選択された腫瘍をp53ゲノムシークエンシングについて調べたとき、自
然発生的腫瘍は全て、正常なp53アレルを喪失しており、MUC16依存的腫瘍発生が正常なp5
3機能の喪失も必要とすることを示した。
実験モデルにおける形質転換及び腫瘍侵襲性に対するMUC16断片に基づいて、MUC16の遺
伝子変化と卵巣癌の転帰の関連を調べた。TCGA卵巣癌プロジェクトは、臨床転帰データを
含む完全なデータを備えた316種の漿液性卵巣癌を含むよく研究されたコレクションであ
る。MUC16タンパク質の発現は癌挙動の重要な原動力であるので、MUC16mRNA発現に対す
るMUC16コピー数の影響を解析した。MUC16転写物発現は、MUC16遺伝子コピー数に概ね関
連していたが、調べた群の全て(当然ながら、MUC16の稀なホモ接合性欠失を除く)におい
てMUC16転写物発現に広範な変動があった。ほとんどの場合、MUC16mRNA発現は、対照と
して含まれる正常な卵管試料よりも大きい転写物数でクラスター化した。遺伝子コピー数
は、MUC16タンパク質の発現を変化させる可能性があるいくつかの変数の1つであるが、MU
C16 mRNA発現(及び当然、MUC16タンパク質)が漿液性卵巣癌で増大していることが多いこ
とは明白である。TCGAデータセットにおける臨床転帰に対するMUC16過剰発現又は突然変
異の複合的影響も調べた。TCGAデータセットをMUC16発現五分位数に分けたとき、最大のM
UC16発現を有する20%の患者は、より低いMUC16発現を有する患者よりも有意に悪い生存
率を有していた(p=0.02969)。図11Aに示されているように、この関係は、MUC16突然変異
を有する18人の患者を高MUC16発現群に含めるとさらに強くなった(p=0.02117)。まとめ
ると、この解析から、MUC16発現が卵巣癌を有する患者の生存に対する悪影響を有するこ
とが示され、本発明者らの前臨床モデルで同定されたMUC16発現の負の生物学的効果が確
認される。
よって特徴付けられるので、これらの活性化は、主に、点突然変異事象ではなく、増幅及
び過剰発現を通じて生じる。本発明者らの細胞株モデルにおけるPI3K/AKT経路の活性化に
基づいて、PI3K経路におけるMUC16と他の活性化遺伝子変化の関係を調べた。図11Bに示さ
れているように、MUC16と関連する過剰発現及び突然変異事象は、通常、PTEN喪失、AKT1
、AKT2、又はPI3KCAの増幅のような他の経路事象を補完する。このMUC16駆動性AKT活性化
の機構は依然として不明である。さらに、ERK活性化の役割を調べたが、MUC16発現とERK
経路突然変異の関連は確認されなかった。
CA125抗原をコードするMUC16は、卵巣癌を有する多くの患者の血漿中に循環する(下記
の第6.1.5節に列挙されている参考文献1を参照)。MUC16は、その発現がミュラー組織の外
側に限定されている点で、繋留型ムチンの中で独特である(下記の第6.1.5節に列挙されて
いる参考文献2及び14を参照)。腫瘍の大きさと独立した有害な予後因子と見なされること
が増えているが、その負の影響の生物学的機構は、十分には理解されていない(下記の第6
.1.5節に列挙されている参考文献18を参照)。この分子のNH2-部分は、CA125抗原をコード
し、かつメソテリン及びいくつかのガレクチンの重要な接着パートナーとしての機能を果
たすと思われる多数のタンデムリピートを含む(図1A)(下記の第6.1.5節に列挙されている
参考文献5、17、及び24〜26を参照)。これらの接着機能はMUC16関連の有害転帰に極めて
重要であることが示唆されているが、これらの研究が、観察された卵巣癌細胞挙動の変化
の全てを説明しているわけではない。MUC16糖タンパク質のクローニングにより、MUC16遺
伝子産物に関する基本的な構造情報が提供された(下記の第6.1.5節に列挙されている参考
文献4及び5を参照)。本実施例に提示されたデータは、MUC16が環境から癌細胞へのシグナ
ル伝達を媒介し得ることを示す最初のデータであり、特に、本実施例に提示されたデータ
から、グリコシル化MUC16エクトドメインがMUC16による癌細胞挙動の変化にとって極めて
重要なものとして特定される。
し、軟寒天成長の増大とマトリゲル浸潤の増大の両方を支持するのに十分であることを示
している。MUC16の最も膜に近いC末端部分をMUC16誘導性挙動における極めて重要なエレ
メントと特定している者もいるが、本発明者らは、これらの挙動を保持されたMUC16エク
トドメイン中のN-グリコシル化部位と関連付けている。これらの変化は、遺伝子発現プロ
ファイルの変化、並びにMMP2、MMP9、CXCL12、及びCDH11などの極めて重要な浸潤遺伝子
の発現の増大と関連している。より長いエレメントはより悪性の強い挙動を誘導すること
ができるが、推定切断部位の近位の残りの114アミノ酸でさえも、3T3細胞で浸潤遺伝子発
現の同じ変化を誘導するのに十分である。さらに、MUC16c114のAsn30(成熟MUC16(配列番
号150)のAsn1806に対応する)のグリコシル化は、MUC16c114発癌特性に不可欠であった。
任意の特定の理論に束縛されるものではないが、これらの研究結果は、残りの細胞外ドメ
インと膜貫通ドメイン及び細胞質テールを合わせたもの含む、このタンパク質の最近位部
分による「外から内への」シグナル伝達とほとんど一致する。Theriault(Therialtらの文
献、GynecolOncol 2011, 121(3):434-443)及びGiannakouros(Giannakourosらの文献、In
t. J. Oncol.2015, 41(1):91-98)の結果とは対照的に、細胞内の細胞質ドメインの喪失
は、グリコシル化エクトドメインの喪失よりも影響が小さかった。これらの違いは、選ば
れた特定の突然変異及び発現を低下させる方法を反映している可能性がある。「内から外
への」シグナルは、軟寒天及びヌードマウスにおけるMUC16発現細胞の着床及び成長を促
進する遺伝子プログラムの転写を活性化するように思われる。トランスフェクトされた細
胞を一般的な発癌経路の活性化について調べると、AKT経路とERK経路の両方がMUC16の構
成的発現によって活性化されるように思われる。MUC16がAKT/ERKリン酸化を増大させる機
構は不明確であり、さらなる研究を必要とする。共沈する受容体が存在しないことから、
他の機構も関与し得ることが示唆される。MUC16配列は非常に異なっているが、MUC1とMUC
4の両方を含む他の繋留型ムチンは、3T3細胞及びラット線維芽細胞でシグナル発生癌遺伝
子として作用することが示されている(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献8及び9
を参照)。癌細胞表面のムチンの役割は、未だ規定されていない機構を介して重要な役割
を果たしている可能性がある。
支持的である。単独で、同じMUC16近位354配列を、トランスジェニックマウスに有害効果
を及ぼすことなく、ほとんど全てのマウス組織で容易に発現させることができた。自然発
生的な腫瘍形成の割合はこれらのマウスで非常に低く、生殖機能は影響を受けていないよ
うに思われた。しかしながら、他のマウス卵巣癌モデルと同様、p53機能の喪失は、MUC16
依存的腫瘍形成において強い許容的役割を果たしているように思われる(下記の第6.1.5節
に列挙されている参考文献27を参照)。これらの結果は、TCGAデータセットにおいて卵巣
癌を特徴付ける、均一なp53不活化と確かに一致している。
である。このインビトロ及びインビボモデルは、漿液性卵巣癌におけるMUC16発現レベル
の有害作用と一致しており、卵巣癌の挙動の発症誘因としてのMUC16の理解を促進する。
増大するCA125発現の悪い影響は、MUC16(+)3T3トランスフェクタントのインビボ腫瘍成
長及び致死率の増大と一致している(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献18を参照
)。
(6.1.5 実施例1で引用された参考文献)
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(6.2.1 序論)
OC125抗体によって認識されるCA125抗原(下記の第6.2.5節に列挙されている参考文献1
を参照)は、MUC16糖タンパク質の細胞外部分由来のタンデムリピートドメイン中で発現さ
れる重度グリコシル化抗原である(下記の第6.2.5節に列挙されている参考文献2及び3を参
照)。この循環抗原は、主に、良性又は悪性のミュラー組織に由来し、ヒト卵巣癌の腫瘍
マーカーとしてFDAに認可されているが、発癌におけるその機能及び役割は不明である(下
記の第6.2.5節に列挙されている参考文献4〜6を参照)。MUC16は、複合繋留型ムチンのフ
ァミリーに属し、それは、大きい重度グリコシル化細胞外ドメイン、膜と推定切断部位の
間にある小さいエクトドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、及び短い細胞質テールからなる
(図1)(下記の第6.2.5節に列挙されている参考文献7及び8を参照)。ほとんどのMUC16タン
パク質は、切断後、周囲の空間に放出され、エクトドメインは細胞表面に残る。OC125及
び他のMUC16反応性モノクローナル抗体(mAb)の大半は、この分子の切断部分にのみ存在す
るタンデムリピート領域中の抗原と反応する。これらのエピトープは循環中に見られる可
能性が高いので、既存のmAbを用いて、残りのMUC16タンパク質断片の結末を追跡すること
はできず、MUC16発現の真の分布を正確には反映しない可能性がある(下記の第6.2.5節に
列挙されている参考文献9を参照)。グリコシル化された表面タンパク質が、EGFR、PDGFR
、及びその他のようなチロシンキナーゼ受容体のN-グリコシル化部位とのガレクチン3に
基づく相互作用を通じて細胞増殖及び分化を調節することができることを示している者も
いる(KS LauCell 129:123, 2007)。実施例1(第6.1節を参照)に示されているように、MUC
16の近位部分(わずか114アミノ酸程度のもの)は、不死化3T3細胞を形質転換することがで
き、この効果は、ツニカマイシンによって無効化されるように思われる。
換におけるガレクチン3の必須の役割を示している。したがって、接着及び浸潤などの重
要なMUC16媒介性癌機能を阻害するために、グリコシル化特異的な形で近位ペプチド配列(
例えば、MUC16c114)に結合することができる抗体を開発した。規定の合成N-糖ペプチド抗
原を重要なエピトープ模倣体として使用することにより、MUC16エクトドメイン内の重要
なN-グリコシル化部位に対するモノクローナル抗体を作製した。効果のない他の非グリコ
シル化タンパク質に対するmAbとは対照的に、これらの抗体は、MUC16駆動性のマトリゲル
浸潤、癌遺伝子活性化、及び腫瘍成長を減少させることにより、MUC16の発癌性生物現象
を阻害した。これらの抗体はムチン形質転換の機構を示し、これにより、MUC16陽性腫瘍
における診断的及び治療的使用のための有用なツールが提供される。
(6.2.2.1 糖ペプチドの合成)
合成糖ペプチドを、MUC16c55(配列番号129、図13)のAsn30に明確に定義されたキトビオ
ース(GlcNAc2)を取り込んだ重要なエピトープ模倣体として用いて、MUC16の55-アミノ酸
配列
の3番目のグリコシル化部位(MUC16のAsn1806と類似している、Asn30)に特異的な抗体を作
製した。均一なN-糖ペプチドの合成は高度に収束的であり、ランズベリーアスパラギン酸
化条件下での部分的に保護された全長ペプチド(MUC16c55;配列番号129)とキトビオースア
ミンとのカップリングを伴った(下記の第6.2.5節に列挙されている参考文献11を参照)。M
UC16c55(配列番号129)は、マイクロ波支援Fmoc固相ペプチド合成(SPPS)と、それに続く、
樹脂上でのN-アセチル化(Ac2O、DIEA)、Asp30の脱アリル化(Pd(PPh3)4、PhSiH3)、及びそ
の後の樹脂の切り離し(1〜2%TFA/CH2Cl2)によって得られた。1フラスコアスパラギン酸
化/脱保護手順(下記の第6.2.5節に列挙されている参考文献12に記載されているもの)を用
いて、位置Asn30の遊離カルボン酸側鎖をキトビオースアミンとカップリングさせ(下記の
第6.2.5節に列挙されている参考文献13を参照)、その後、TFA処理して(カクテルR:90%T
FA、5%チオアニソール、3%エタンジチオール、2%アニソール)、糖ペプチドGlcNAc2-55
-merを生じさせた。シュードプロリンモチーフの存在は、アスパラギン酸化時の望ましく
ないアスパルチミド形成を軽減する役割を果たした。
似している)を包含するより短い糖ペプチドである、
を調製した。18-mer及び15-merの糖ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)
にコンジュゲートした。15-mer(配列番号131)は、Asn7(MUC16のAsn1806に類似している)
にキトビオースを取り込んだ。15-merの糖ペプチドは、55merの糖ペプチドの合成と類似
の方法で合成した。
している)にキトビオースを取り込んだ。18-merのAsn4及びAsn10(それぞれ、MUC16のAsn1
800及びAsn1806に類似している)のアリル保護は、顕著なアスパルチミド形成をもたらし
た。したがって、より束縛の大きいO-2-フェニルイソプロピルエステル(O-2-PhiPr、OPp)
をSPPSで用いて、N-アセチル化及び同時的な樹脂切断/OPp除去(1〜2%TFA/CH2Cl2)の後に
、遊離のAsn4及びAsn10側鎖(それぞれ、MUC16のAsn1800及びAsn1806に類似している)を有
する18-merの部分的に保護されたペプチドを提供した。二重ランズベリーアスパラギン酸
化と、それに続く、全体的な酸脱保護による2つのキトビオース単位の高度に収束的な導
入を実施して、ビス-グリコシル化された18-merペプチドを生成させた(HPLC精製後、27%
)。
タンパク質との最後のカップリングにより、マウスワクチン接種用のKLHコンジュゲート
コンストラクトが提供された。
5匹のBALB/c及び5匹のSwissWebsterマウスを、25μLのTitermaxアジュバントの存在下
、55-merの糖ペプチド(第6.2.2.1節を参照)で3週間毎に3回免疫して、マウスを免疫した
。3週間後、マウスを、モノ-グリコシル化された15-mer(配列番号131)のKLHコンジュゲー
トコンストラクトとビス-グリコシル化された18-mer(配列番号130)のKLHコンジュゲート
コンストラクトの混合物で免疫した。血清を、KLHにコンジュゲートされていない55-mer
のGlcNAc2-グリコシル化糖ペプチド及びより短い糖ペプチドに対する反応性について解析
した。グリコシル化されていない55-mer、15-mer、及び18-merペプチドを、2つのMUC16非
関連キトビオース含有ペプチドとともに、スクリーニングの陰性対照として使用した。マ
ウスを15-mer及び18-merのKLH-コンジュゲートで3週間毎にさらにもう2回免疫し、各々の
免疫付与後に、応答をELISAによって解析した。
第6.1.2.9節を参照されたい。shRNA実験のために、BDBioCoat(商標) Matrigel(商標)
浸潤インサート又はチャンバー(カタログ# 354480、24ウェルプレート中)及び対照インサ
ート(カタログ#354578、24ウェルプレート中)は、BD Biosciences, MAから購入した。マ
トリゲル浸潤アッセイは、製造元のプロトコルに従って実施した。簡潔に述べると、24ウ
ェルプレート中のマトリゲルチャンバー(-20℃で保存されたもの)及び対照インサート(4
℃で保存されたもの)を室温に至らせておいた。両方のインサートを、インサート中で、
及び24ウェルプレートの外側のウェル中で、37℃の5%CO2加湿インキュベーターにて2時
間、0.5mLの無血清培地で再水和させた。培養したSKOV3細胞をトリプシン処理し、培養培
地で洗浄した。100万個の細胞を別の遠心分離チューブに分け、無血清培地で3回洗浄した
。後に、これらの細胞を調整して、0.5mLの無血清培地中、5,000細胞にした。再水和させ
たインサート中の培地を除去し、このインサートを、化学誘引物質としての役割を果たす
ウェル中の0.75mLの10%胎仔ウシ血清(FBS)含有培養培地を含む新しい24ウェルプレート
に移した。すぐに、無血清培地中の0.5mLの該細胞(5,000細胞)をインサートに添加した。
適切な注意を払って、インサート及び外側のウェルに気泡が閉じ込められないように配慮
した。24ウェルプレートを37℃の5%CO2加湿インキュベーターで48時間インキュベートし
た。インキュベーション後、綿棒をマトリゲル又は対照インサートに挿入して「擦る」こ
とにより、非浸潤細胞を膜の上表面から除去し、綿棒の先端を膜表面にわたって移動させ
ながら、穏やかに圧力をかける。培地に浸した第二の綿棒で擦ることを繰り返した。その
後、蒸留水中の0.5mLの0.5%クリスタルバイオレット染料を含む新しい24ウェルプレート
中で30分間、インサートを染色した。染色後、インサートを蒸留水の3つのビーカー中で
すすいで、余分な染料を除去した。インサートを新しい24ウェルプレート中で風乾させた
。浸潤した細胞を、200倍の倍率の倒立顕微鏡下で、手でカウントした。3つ組の膜のいく
つかの視野をカウントし、図に記録した。
第6.1.2.11節を参照されたい。
ForeBioOctet QKを用いて、結合親和性を決定した。ビオチン化され、キトビオースが
コンジュゲートされた5μg/mLの18-merの糖ペプチドをストレプトアビジンバイオセンサ
ー上にローディングした。余分な抗原を洗い流した後、マウス抗体を、それぞれ、会合及
び解離工程について、10μg/mLで試験した。1:1結合部位モデル、部分フィットを用いて
、結合パラメータを計算した。
既存のパラフィン包埋組織のコア針生検を、いわゆる、ドナーブロックから入手し、そ
の後、Kononenらによる技法(KononenJらの文献、 Nat Med 1998;4(7):8447を参照)、そ
の後、Hedvatら(HedvatCVらの文献、Hum Pathol 2002;33(10):968-74を参照)によって改
変された技法を用いて、レシピエントパラフィンアレイ「マスター」ブロックに再配置し
た。BeecherInstruments社(Sun Prairie, WI)製の手動で操作されるTissue Arrayer MTA
-1を用いて、直径が0.6〜1.0mmの大きさの試料円形スポット(コア)を作製した。コアを、
互いに0.3〜0.4mm離してアレイ化した。エッジング効果を避けるために、対照組織の層を
実際の組織マイクロアレイの周囲に戦略的に置いた。各々の組織マイクロアレイの具体的
な組成は、以下で詳述されている。卵巣癌又は対照組織についての組織マイクロアレイの
スライドを、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から4um切片を切ることにより調製した
。
l Morphol,2010, 18(5):462-72を参照)、及び19C11モノクローナル抗体による組織マイ
クロアレイで免疫組織化学検査を実施した。組織マイクロアレイの切片を4ミクロンで切
削し、Superfrost/Plus顕微鏡スライド(Fisher銘柄)上に置き、60°のオーブンで少なく
とも60分間焼いた。その後、スライドを脱パラフィン処理し、蒸留水に対して水和させ、
pH 6.00のクエン酸塩バッファーに97℃で30分間浸漬させ、流水で2〜5分間洗浄し、蒸留
水に希釈した3%過酸化水素中で5分間インキュベートした。スライドを蒸留水中で1分間
洗浄し、リン酸緩衝食塩水(PBS)、pH 7.2の浴槽に移して、各々5分間で2回交換し、PBSに
希釈した0.05%BSA中に最低1分間入れた。組織切片の周囲を乾燥させた後、正常血清を2
%BSA/PBS中1:20希釈で適用し、湿度チャンバーにて室温で最低10分間インキュベートし
た。その後、切片を乾燥させないように、血清を最後まで吸引し、1:1000の希釈の約150
ラムダの新しい抗体を組織の上に載せた。スライドを湿度チャンバーにて4℃で一晩(約15
〜18時間)インキュベートした。各々10分間の3回のPBS交換を用いて、一次抗体を洗い流
した。二次抗体であるVector laboratories(Burlingame、Ca)製のビオチン化α-マウスを
1%BSA/PBS中1:500希釈で適用し、湿度チャンバーにて室温で45〜60分間インキュベート
した。上記のように、3回のPBS交換を用いて、抗体を再び洗い流した。その後、スライド
を、PBSに希釈したジアミノベンジジン(DAB)の浴槽に5〜15分間移した。その後、スライ
ドを水道水中で1分間洗浄し、Harris改変ヘマトキシリン(Fisher)を用いて対比染色し、1
%酸アルコールで脱色し、アンモニア水中で青色にし、各々2分間の95%エタノール、100
%エタノール、及びキシレンの各々3回の交換で脱水し、永久封入媒体を用いてカバーグ
ラスで覆った。
89Zr-19C11の内在化を、MUC16c114を発現するSKOV3細胞で調べた。約1×105個の細胞を
12ウェルプレートに播種し、37℃の5%CO2インキュベーターで一晩インキュベートした。
ある容量の放射性標識タンパク質を各々のウェルに添加し、プレートを37℃及び4℃で1、
5、12、及び24時間インキュベートした。各々のインキュベーション期間の後、培地を回
収し、細胞を1mLのリン酸緩衝食塩水(PBS)ですすいだ。細胞を、100mMグリシンを含む1mL
の100mM酢酸(1:1、pH3.5)中、4℃で洗浄することにより、表面結合活性を回収した。そ
の後、接着細胞を1mLの1MNaOHで溶解させた。各々の洗浄液を回収し、活性についてカウ
ントした。最終洗浄液の活性と全ての洗浄液の全活性との比を用いて、内在化された%を
決定した。
(6.2.3.1 MUC16病理生物現象はC末端のMUC16エクトドメインのN-グリコシル化に依存的
である)
実施例1(第6.1節を参照)は、MUC16c114の発現が3T3マウス線維芽細胞のより侵襲的なイ
ンビトロ/インビボ挙動をもたらし、MUC16c114駆動性マトリゲル浸潤の顕著な増大及びイ
ンビボでのより急速な腫瘍成長をもたらすことを示した。したがって、SKOV-3細胞株(MUC
16の発現を欠くヒト卵巣細胞株)をMUC16c114依存的特性の効果について調べた。MUC16c11
4発現は、細胞表面発現とマトリゲル浸潤のほぼ3倍の増大とを引き起こした(図12Aのレー
ン1と2を比較されたい)。Asn30のアラニンへの突然変異(MUC16c114-N3、図12A、レーン3)
、Asn1及びAsn24のアラニンへの突然変異(MUC16c114-N12、図12A、レーン4)、並びにAsn1
、Asn24、及びAsn30のアラニンへの突然変異(MUC16c114-N123、図12A、レーン4)がマトリ
ゲル浸潤を無効化したので、この浸潤の増大は、MUC16c114のアミノ酸位置1(Asn1)、24(A
sn24)、及び30(Asn30)のアスパラギン(それぞれ、成熟MUC16(配列番号150)のAsn1777、A
sn1800、及びAsn1806に対応する;MUC16c114-N123)のN-グリコシル化に依存的であった。
図12Bも参照されたい。さらに、MGAT5又はLGALS3発現を低下させるノックダウンshRNA実
験がN-グリコシル化部位におけるMUC16c114突然変異と類似した効果を有し、かつ浸潤を
基礎レベル近くにまで低下させたので、MUC16c114によって誘導されるマトリゲル浸潤の
増大は、MGAT5(N-グリコシル化反応に関与する最初の酵素)及び/又はLGALS3(多くの悪性
度の高い漿液性癌で増幅される酵素)に依存的であった(図12A、レーン6〜10)。
瘍成長速度に対するMUC16のN-グリコシル化、MGAT5、及びLGALS2の効果を測定するために
、側腹腫瘍モデルを用いて、定期的な腫瘍測定を容易にした。図12Cに示されているよう
に、ベクター(phrGFP)、MUC16c114、MUC16c114-N123、MUC16c114と抗MGAT5shRNA(MUC16c
114-shMGAT5)、又はMUC16c114と抗LGALS3shRNA(MUC16c114-shLGALS3)を発現する3T3細胞
株を無胸腺ヌードマウスの側腹に移植したとき、MUC16c114 3T3細胞のみが24日でベクタ
ーのみの対照と比較してより大きい腫瘍を形成した。これらのデータは、MUC16のN-グリ
コシル化、MGAT5、及びLGALS3が腫瘍成長に必要であることを示すインビトロ解析を裏付
けるものである
MUC16c114のAsn30部位(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する; MUC16c114-N3)
におけるN-グリコシル化はMUC16発癌作用の主要な要件であることが明らかになったので
、MUC16c114-N12がAsn30(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する)でN-グリコシル
化される能力を保持するため、SKOV3細胞で発現されるMUC16c114-N12のグリカンプロファ
イリングを実施した。グライコーム解析により、様々なマンノース部分が結合する最小反
復単位としての極めて重要なキトビオース(GlcNAc2)ステムを有する、このC末端MUC16断
片の極めて多様なN-グリコシル化パターンが示された(図13A)。
、グリコシル化に対するmAbを作製した。これらの抗体は、MUC16エクトドメイン内のより
短い55-アミノ酸配列(MUC16C55;配列番号129)上の重要な3番目のグリコシル化部位(MUC16
c114のAsn30)を含むN-糖ペプチドエピトープを標的とするように設計された。免疫原とし
て利用される糖ペプチドの合成の説明については、第6.2.2.1節、並びに図13B、図13C、
及び図13Dを参照されたい。免疫付与プロセスの説明については、第6.2.2.2節を参照され
たい。
1800及びAsn1806に対応する)アミノ酸残基にキトビオースを含む短い(55-mer、18-mer、
及び15-merの)MUC16糖ペプチドで免疫することにより、抗体を作製した。より大きいNグ
リカンに共通する最も小さいモチーフであることに加えて、キトビオースは、グリカンに
対する依存性だけでなく、ペプチド特異性も示す抗体を誘導するための基礎にあるMUC16
由来ペプチドのより良好な曝露も可能にするであろう。この低グリコシル化は、正常細胞
と比較した腫瘍細胞の表面のムチン糖タンパク質のよくある際立った特徴である。
ッセイ)
マウスワクチン接種及び血清回収を第6.2.2.2節に記載されているプロトコルに従って
実施した。GlcNAc2-55-mer(図13B)による3回の免疫付与の後、マウスをKLHコンジュゲー
トコンストラクトの混合物(モノ-グリコシル化15-mer(配列番号131;図13C)及びビス-グリ
コシル化18-mer(配列番号130;図13D))でさらに免疫し、10匹のマウスのうち2匹が、両方
の55-mers(GlcNAc2ありとGlcNAc2なし)について陽性のELISAシグナルを示したが、応答は
概して弱く、マウスが55-merの免疫付与で完全には感作されなかったことを示唆している
。KLHコンジュゲート(GlcNAc2-15-mer(図13C)及び(GlcNAc2)2-18-mer(図13D))によるさら
に2回の免疫付与は、特に、2匹のマウス(マウス7及びマウス8)において、より短い15-mer
及び18-merの糖ペプチドに対するIgG免疫応答の増強をもたらした。しかしながら、これ
らの抗体は、55-mer-糖ペプチドとのELISAによる検出可能な反応性を示さず、これにより
、この特定のアッセイでは、この大きい断片中のエピトープが接近不可能であるか又は立
体構造的に異なるかのどちらかであることが示唆される。両方の55-mer(キトビオース含
有ペプチド及び/又は非グリコシル化ペプチド)に応答したマウス5は、Man3GlcNAc2誘導体
化55-merに対して陰性であった。非グリコシル化ペプチド骨格に対する4H11mAb(Raoらの
文献、Appl.Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462-72)が、コンジュゲートさ
れていない15/18-merの糖ペプチドに対する結合を示さなかったことは驚くべきことでは
なく、利用可能なエピトープにある程度の違いがあり得ることを示した。図14を参照され
たい。
ッセイ−MUC16駆動性マトリゲル浸潤)
その血清が非グリコシル化ペプチドと比較して短い糖ペプチドに対する最大の反応性比
を示し、したがって、糖の存在に対してある程度の選好を示す、10匹のマウスのうちの1
匹(マウス7)を選択した。マウス7の脾臓を摘出し、標準的なハイブリドーマ培養技術によ
り、IgG産生ハイブリドーマ細胞株を提供した。脾細胞をハイブリドーマ融合パートナー
と融合させ、並外れて高い融合効率を得た(平均して>5.5コロニー/ウェル、>30,000個
のハイブリドーマ)。上清を、個々の糖ペプチドに対するELISAによる反応性について選択
し、スクリーニングした。(同じウェル中で組み合わせた)15mer-キトビオースペプチド及
び18mer-キトビオースペプチドに対する融合試験プレートの予備的なELISA解析は、抗ペ
プチド抗体の存在を示すいくつかの陽性シグナルを示したが、そのグリコシル化依存性を
この時点で完全には評価することができなかった。図14を参照されたい。それにもかかわ
らず、キトビオース-グリコシル化抗原に対する、好ましい陽性度を有し、したがって、
より特異的な抗体の割合が、非グリコシル化抗原と比較してより高いことが観察された。
培養物の希釈により、各々のウェルで成長している単一のクローン(上記の1:1の比)が得
られ、一次スクリーニングにより、これらのハイブリドーマによって産生された抗体がグ
リコシル化されていない15-/18-merの近くにある4H11エピトープを認識しないことが明ら
かになった。図14を参照されたい。より大きい希釈でモノクローナル抗体スクリーニング
を遂行した後に、糖ペプチドエピトープに対する選好を示す抗体が得られた。このように
、このプロセスによって、36個のキトビオース依存性一次mAbが得られ、これをMUC16に対
する反応性について試験した。これらのうち、15個のmAbを(4H11と並行して)、浸潤に対
するその効果について、SKOV3-MUC16c114トランスフェクタントを用いるマトリゲルアッ
セイにより評価した(図15A)。MUC16グリコシル化抗体1B5、10C6、13A7、18C6、19C11、16
C5、6H10、21F8、7B12は、マトリゲル浸潤の阻害を示したが、4H11は、この特性に対して
効果がなく、MUC16c114のAsn30(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する)に対する
抗体がMUC16の生物現象を阻害することを示した。後に、MUC16グリコシル化抗体をサブク
ローニングし、精製した。特定のMUC16グリコシル化抗体の結合パラメータを決定した(表
9を参照)。
*=計算の信頼性が低い;解離速度にフィットするものがない
**=kaが低すぎて、会合速度を決定することができない
化学検査は、4H11又はOC125を用いて実施された免疫組織化学検査と比較して、MUC16の検
出の向上を示した(図16E)。
MUC16グリコシル化抗体の特異性を調べるために、(i)ネイティブの(成熟)MUC16を発現
する細胞(OVCA-433細胞)、(ii)対照ベクターを発現し、MUC16発現を欠く、SKOV3細胞(SKO
V3 phrGFP細胞)、(iii)MUC16c114を発現するSKOV3細胞(SKOV3MUC16c114)、(iv)MUC16c11
4-N1を発現するSKOV3細胞(SKOV3 MUC16c114-N1)、(v)MUC16c114-N3を発現するSKOV3細胞(
SKOV3 MUC16c114-N3)、又は(vi)SKOV3MUC16c114-N123を発現するSKOV3細胞(SKOV3 MUC16
c114-N123)に対して、MUC16グリコシル化抗体(18C6、19C11、10C6、1B5、もしくは13A7)
又はモノクローナル抗MUC16抗体4H11の存在下又は非存在下で、FACs解析を実施した。(表
10)抗体4H11、18C6、19C11、10C6、1B5、及び13A7は、OVCA-433細胞に対する結合を示し
た(表10; ID番号3〜8を陰性対照のID番号1及び2と比較されたい)。対照的に、抗体の研究
及び作製の設計に基づいて予想されたように、抗体4H11、18C6、19C11、10C6、1B5、及び
13A7はいずれも、SKOV3phrGFP細胞に結合しなかった(表10、陰性対照のID番号9及び10と
比較した、ID番号11〜16)。抗体4H11、18C6、19C11、10C6、1B5、及び13A7は、SKOV3MUC
16c114に結合した(表10、陰性対照のID番号17及び18と比較した、ID番号19〜24)。MUC16c
114のAsn1(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1777に対応する)の突然変異は、SKOV3MUC16c11
4-N1細胞に対する抗体結合を阻害しなかった(表10、陰性対照のID番号25及び26と比較し
た、ID番号27〜32)。しかしながら、MUC16c114のAsn30(成熟MUC16(配列番号150)のAsn180
6に対応する)の突然変異は、MUC16グリコシル化抗体18C6、19C11、10C6、1B5、及び13A7
の結合を無効化した(表10、陰性対照のID番号33及び34と比較した、ID番号36〜40)。さら
に、MUC16c114のAsn30(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する)の突然変異は、MUC
16グリコシル化抗体ではない抗体4H11の結合を無効化しなかった(表10、陰性対照のID番
号33及び34と比較した、ID番号35)。さらに、Asn1、Asn24、及びAsn30(それぞれ、成熟MU
C16(配列番号150)のAsn1777、Asn1800、及びAsn1806に対応する)におけるアスパラギンか
らアラニンへの突然変異は、MUC16グリコシル化抗体18C6、19C11、10C6、及び1B5の結合
を無効化したが(表10、陰性対照のID番号41及び42と比較した、ID番号44〜47)、4H11の結
合は無効化されなかった。13A7がSKOV3 MUC16c114-N123細胞に対する結合を維持したこと
が留意される。これらのデータは、MUC16グリコシル化抗体がグリコシル化依存的な様式
でMUC16c114に結合することを示している。
Cs解析
*は、結合が認められないと考えられることを示している。
MUC16グリコシル化抗体のグリコシル化特異性(表9)を考慮して、MUC16グリコシル化抗
体の生体反応性上清がグリコシル化特異的な形でマトリゲル浸潤を阻害する能力を評価し
た。したがって、マトリゲル浸潤アッセイを、phrGFPを発現するSKOV3卵巣癌安定細胞株(
図15A、レーン1)又はphr-GFP-MUC16c114を発現するSKOV3卵巣癌安定細胞株(MUC16c114;図
15A、レーン2〜18)を用いて、MUC16グリコシル化抗体の生体反応性上清の存在下(図15A、
レーン3〜18)又は非存在下(図15A、レーン1及び2)で実施した。MUC16モノクローナル抗体
4H11(図15A、レーン3)をMUC16グリコシル化抗体の生体反応性上清(図15A、レーン4〜18)
の対照として用いて、マトリゲル浸潤のグリコシル化依存性を評価した。単独又は4H11の
存在下(図15A、それぞれ、レーン2及び3)のいずれかのMUC16c114の発現は、マトリゲル浸
潤活性の増大をもたらした。対照的に、MUC16グリコシル化抗体とのインキュベーション(
図15A、レーン4〜18)は、MUC16c114発現卵巣癌細胞のマトリゲル浸潤を減少させた。
目的のために、MUC16c114を発現するSKOV3細胞をMUC16抗体4H11又は精製MUC16グリコシル
化抗体の存在下及び非存在下でインキュベートした(図15B)。MUC16グリコシル化抗体7B12
、19C11、18C6、及び10C6は、MUC16c114誘導性マトリゲル浸潤を阻害した(図15B、レーン
3〜6を陰性対照のレーン2と比較されたい)。対照的に、モノクローナル抗MUC16抗体4H11
は、MUC16c114誘導性マトリゲル浸潤を阻害しなかった(図15B、レーン2を陰性対照のレー
ン1と比較されたい)。これらのデータは、モノクローナル抗体4H11と対照的に、MUC16グ
リコシル化抗体(例えば、7B12、19C11、18C6、及び10C6)がマトリゲル浸潤を阻止するこ
とを示している。
突然変異体との関連でアッセイした(図16A)。この目的のために、マトリゲル浸潤アッセ
イを、SKOV3phrGFP細胞、SKOV3 MUC16c114細胞、SKOV3 MUC16c114-N1細胞、SKOV3MUC16
c114-N2細胞、又はSKOV3 MUC16c114-N3細胞に対して、(i)対照抗体;(ii)4H11抗体;又は(i
ii)MUC16グリコシル化抗体10C6の存在下で実施した(図16A、それぞれ、レーン1〜5)。MUC
16c114のAsn30がMUC16c114マトリゲル浸潤に必要であるため、MUC16c114誘導性マトリゲ
ル浸潤は、SKOV3MUC16c114-N3細胞で阻害された。さらに、マトリゲル浸潤は、MUC16モ
ノクローナル抗体4H11の存在下及び非存在下、SKOV3MUC16c114細胞、SKOV3 MUC16c114-N
1細胞、及びSKOV3 MUC16c114-N2細胞で誘導された。対照的に、これらの細胞のMUC16グリ
コシル化抗体10C6とのインキュベーションは、マトリゲル浸潤を無効化した(図16A)。こ
れらのデータは、図16B及びMUC16c344突然変異体を発現する3T3細胞でも裏付けられた(図
16C)。
体4H11とは対照的に、マトリゲル浸潤をグリコシル化依存的な形でを阻害することができ
ることを示している。
最後に、MUC16c114のAsn30を標的とするMUC16グリコシル化抗体が内在化される能力を
評価した。MUC16c114を発現するSKOV3細胞を89Zr-DFO標識19C11抗体とともにインキュベ
ートし、内在化をRadiotracerにより決定した(図17)。これらのデータは、37℃でインキ
ュベートされたMUC16c114発現SKOV3細胞とともにインキュベートしたとき、抗体で処理し
てから早くも1時間後に標識19C11抗体が内在化されたことを示している。標識抗体の細胞
取込みは4℃で減少した。
MUC1との相当な相同性を有するムチンファミリーのメンバーであるMUC16/CA125抗原は
、長い間、婦人科悪性腫瘍と関連付けられてきた(下記の第6.2.5節に列挙されている参考
文献4を参照)。一般的なスクリーニングツールとして十分に感度が高いわけでも、特異的
であるわけでもないが、CA125測定は、通常、抗体ベースの検出方法によって、卵巣癌を
有する患者をモニタリングするために使用される。OC125などの、圧倒的多数のMUC16反応
性抗体は、この分子の切断画分に見られるグリコシル化依存性エピトープに対するもので
あり、切断後のMUC16の近位部分を検出するスクリーニングツールとしては有用でない。
結果として、残りのMUC16タンパク質断片に関する生物学的研究が不足している。実施例1
(第6.1節)のデータは、近位MUC16領域(MUC16C114)の114アミノ酸配列がいくつかの卵巣癌
細胞株で浸潤及び腫瘍成長を増大させるのに十分であることを示した。このC末端エクト
ドメインの、特に、3番目のAsn部位(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する、Asn3
0)におけるN-グリコシル化が、MUC16の発癌効果にとって重要であるという本明細書にお
ける特筆すべき発見は、MUC16の新しい役割を示唆しており、その結果、疾患の消極的マ
ーカーと考えることができるだけでなく、病原性分子と考えることもできる。この前提に
基づいて、MUC16のこれらの保持される部分に対するモノクローナル抗体の開発は、この
ムチンの病理生物現象を探索し、かつMUC16を標的とする治療薬を作出するための強力な
ツールのように思われる。
は対照的に、これらは、複雑な糖タンパク質エピトープに対してではなく、非グリコシル
化ペプチド骨格に対するものであった。特に、4H11は、MUC16エクトドメインに対する高
親和性結合を示し、エピトープの位置が近接しているために、OC125よりも効率的に卵巣
癌細胞によって内在化された。この研究結果から、糖タンパク質の近位領域が推定切断部
位の遠位にあるMUC16の放出部分と無関係な生物現象を有することが示唆された。しかし
ながら、4H11は、MUC16の病原性作用に必要とされるエクトドメイン内の重要なグリコシ
ル化部位を認識しないので、標的療法におけるその将来の研究の可能性は限られる。
ることにより、MUC16エクトドメイン中の重要な糖ペプチドエピトープに対するグリコシ
ル化依存的モノクローナル抗体のパネルを開発した。この方法は、ポリクローナル抗体作
製よりも好ましいが、それは、ポリクローナル段階では、糖ペプチド特異性が完全ではな
く、一部には、非グリコシル化MUC16ペプチド断片に対する結合も、検出されたからであ
る。MUC16グリコシル化抗体を得るために、モノクローナル抗体作製の一次選択は、糖の
存在に対するある程度の選好に対して関連付けられた多クローン培養物におけるより高い
割合のグリコシル化依存性を基にした。新しいモノクローナル抗体の能力及び糖ペプチド
エピトープに対するそのより高い特異性は、MUC16駆動性マトリゲル浸潤に対するその効
果を検討することにより示された。これらのMUC16グリコシル化抗体がマトリゲルアッセ
イで浸潤を阻害することができたのに対し、非グリコシル化に対する4H11は浸潤を阻害す
ることができなかった。Asn30におけるN-グリコシル化がMUC16作用に不可欠であるという
研究結果に基づいて、これらの結果により、新たに作製された抗体が、MUC16エクトドメ
インの重要な糖ペプチドエピトープを特異的に標的とし、それにより、MUC16病理生物現
象の阻害をもたらすことが確認される。重要なことに、MUC16グリコシル化抗体10C6は、M
UC16c114発現卵巣癌細胞が移植された無胸腺ヌードマウスモデルでMUC16陽性腫瘍成長を
顕著に遅延させ、これらのモノクローナル抗体が最適化された臨床用途でのその治療的使
用のための有望なツールとして浮上する可能性を示した。
(6.2.5 引用された参考文献)
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必要とする)
本実施例は、(a)実施例2(第6.2節)に記載されている実験のうちのいくつかのより詳細
な説明;並びに(b)実施例2(第6.2節)と比較した追加実験を提供するものである。
MUC16/CA125の過剰発現は、漿液性卵巣癌で一般的であり、血清CA125レベルの上昇は、
生存の減少と関連している。OC125抗体によって認識されるCA125抗原は、MUC16糖タンパ
ク質の細胞外部分由来のタンデムリピートドメイン内に発現される重度グリコシル化抗原
である(下記の第6.3.13節の参考文献3及び22を参照)。この抗原は、良性又は悪性のミュ
ラー組織によって主に発現されるが、発癌におけるその機能及び役割は、現在、完全には
理解されていない(下記の第6.3.13節の参考文献4を参照)。MUC16は、不均一にグリコシル
化された大きい細胞外ドメイン、細胞膜と推定切断部位の間にある58アミノ酸のエクトド
メイン、疎水性膜貫通領域、及び短い細胞質テールからなる非常に複雑な繋留型ムチンで
ある(下記の第6.3.13節の参考文献21を参照)。OC125及びほとんどの他のMUC16反応性モノ
クローナル抗体(mAb)は、この分子の切断部分に存在する免疫原性のある156アミノ酸のタ
ンデムリピート領域を認識する。より新しいエクトドメイン特異的抗体(例えば、4H11及
び4A5)は、切断後に保持されるMUC16の部分中のペプチドエピトープを認識する(下記の第
6.3.13節の参考文献6を参照)。MUC16のC末端部分(MUC16c114)は、足場非依存的成長の増
大、AKT及びERK経路の活性化、マトリゲル浸潤の増大、並びにヌードマウス異種移植片に
おける成長の増強によって測定したとき、不死化3T3細胞を形質転換することが示されて
いる(第6.1節及び下記の第6.3.13節の参考文献19を参照)。これらの効果はMUC16のエクト
ドメインに依存的であったが、31アミノ酸の細胞質テールの喪失は、これらの特性にほと
んど効果がなかった。エクトドメインが発癌性挙動を促進する機構は完全には理解されて
いない(下記の第6.3.13節の参考文献19を参照)。コンセンサスタンパク質結合ドメインは
存在しないが、MUC16エクトドメインの58アミノ酸配列は、MUC16の他の細胞表面分子との
潜在的な相互作用/調節部位を表す3つのN-グリコシル化部位を含む。
容体(PDGFR)、及びその他のN-グリコシル化部位は、ガレクチン-3などの細胞性レクチン
と相互作用して、表面滞留、シグナル伝達の強度、及び細胞挙動を調節するように思われ
る(下記の第6.3.13節の参考文献12を参照)。N-グリコシル化の効果は、成長増強受容体上
のN-グリコシル化部位の数及び複雑なN-グリコシル化種に対するガレクチン-3の親和性に
依存する。N-グリコシル化部位は、形質転換成長因子-ベータ(TGF-β)受容体などの細胞
表面分子からの拮抗阻害シグナル上にほとんど存在しない。これらの受容体は、成長因子
関連の高栄養フラックスに感受性であり、通常の状況において減衰機能をもたらす。しか
しながら、癌関連糖タンパク質の古典的な受容体チロシンキナーゼとの相互作用の機構は
不明である。MUC1、MUC4、及びMUC16は全て、膜貫通ドメインの存在を特徴とする重度に
グリコシル化された繋留型糖タンパク質であり、上皮癌で過剰発現される(下記の第6.3.1
3節の参考文献10を参照)。
とにより、ムチン関連の形質転換において重要な役割を果たすことを示している。
れらの効果は、58アミノ酸の保持されるMUC16エクトドメイン中の2つの近位Nグリコシル
化部位のMGAT5依存的グリコシル化に依存的であった。より遠位のMUC16タンデムリピート
領域におけるN-グリコシル化部位も、O-グリコシル化部位も、これら2つの部位を機能的
に代替することができなかった。MUC16グリコシル化のパターンは多様であったが、キト
ビオースステムが全てのN-グリコシル化種の基部を特徴付けた。近位のキトビオース含有
MUC16糖ペプチドに対する抗体は、ガレクチン3媒介性の細胞表面シグナル伝達受容体に対
する結合を遮断し、MUC16の腫瘍促進効果を阻害した。
る腫瘍促進効果との関係を直接調べた。これらの効果は、共局在、癌遺伝子活性化、マト
リゲル浸潤、及び腫瘍異種移植片成長を含め、MUC16の保持される非循環部分上のN-グリ
コシル化配列と上皮成長因子受容体(EGFR)及びインテグリンβ1などの細胞表面分子との
ガレクチン-3媒介性結合によってもたらされた。細胞外ムチン駆動性腫瘍促進は、N-グリ
コシル化部位に対する抗体によってうまく標的化することができる、本明細書に提示され
た研究結果及びデータによって裏付けられた機構である。
挙動を駆動し;(2)浸潤及びMUC16+異種移植片成長は、特定のMUC16N-グリコシル化部位に
依存し;(3)MUC16は、ガレクチン-3及びEGFR又はインテグリンβ1のいずれかとのヘテロ三
量体複合体を形成し;かつ(4)抗グリコシル化部位抗体は、細胞外MUC16腫瘍促進を阻止し
た。
(6.3.2.1 MUC16カルボキシ末端(MUC16c114)、MUC16-CA125ドメイン(MUC16c344)、及びグ
リコシル化融合タンパク質DNAコンストラクトの合成)
MUC16 C末端コンストラクトの説明については、第6.1.2節及び第6.2.2節、並びに下記
の第6.3.13節の参考文献19を参照されたい。pFUSE-ヒトIgG1-Fc2ベクター(pFUSE)は、Inv
ivoGen(SanDiego, CA)から購入した。キメラタンパク質MUC16c57-114-pFUSE及び117-244
LGALS3-pFUSEの構築も、第6.1.2節及び第6.2.2節、並びに下記の第6.3.13節の参考文献19
に記載されている。
SKOV3、CAOV3、及びOVCAR3細胞株を入手し、第6.1.2節及び第6.2.2節、並びに下記の第
6.3.13節の参考文献19に記載されている通りに維持した。詳細については、第6.3.6節を
参照されたい。
MUC16糖ペプチドの詳細な合成の説明については、第6.4節を参照されたい。
基底膜浸潤をマトリゲル浸潤チャンバー(BD Biosciences, Bedford, MA)で決定した。
安定細胞株を、5μg/mLのツニカマイシン(Sigma-Aldrich,St. Louis MO cat # T7765)、
又は5μg/mLのMUC16c57-c114-pFUSE、又は5μg/mLの117-244LGALS3-pFUSE融合タンパク質
で処理し;次に、マトリゲル遊走を48時間後に3つ組のウェルで測定し、phrGFPベクター対
照及びMUC16c114トランスフェクタントと比較した。第6.1.2節及び第6.2.2節、並びに下
記の第6.3.13節の参考文献19も参照されたい。
トランスフェクトされた細胞株及び適当な対照細胞株を無胸腺雌ヌードマウスの側腹に
導入し、日常的な動物の世話は、メモリアル・スローン・ケタリング癌センター抗腫瘍評
価コア施設(MemorialSloan Kettering Cancer Center Antitumor Assessment Core Faci
lity)によって提供された。腫瘍測定を週2回行い、腫瘍成長を、メモリアル・スローン・
ケタリング癌センター研究動物資源センター(Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Research AnimalResource Center)のガイドラインに従って、1,500mm3の最大サイズまで
記録した。第6.1.2節及び第6.2.2節、並びに下記の第6.3.13節の参考文献19も参照された
い。
免疫付与プロトコルは、5匹のBALB/cマウス及び5匹のSwiss Websterマウスにアジュバ
ントの存在下で3週間毎に3回投与される、キトビオースを含有する55-merのMUC16糖ペプ
チド(GlcNAc2-55-mer;配列番号129)から開始された。4回目の免疫付与は、KLHコンジュゲ
ートされ、モノ-グリコシル化された15-merのMUC16コンストラクト(GlcNAc2-15-mer-KLH;
配列番号131)とKLHコンジュゲートされ、ビス-グリコシル化された18-merのMUC16コンス
トラクト([GlcNAc2]2-18-mer-KLH;配列番号130)の混合物を用いて実施した。血清を、Glc
NAc2-55-mer(配列番号129)並びにコンジュゲートされていない、キトビオースを担持する
15/18-merの糖ペプチド(それぞれ、配列番号131及び配列番号130)に対する反応性につい
て解析した。さらに、グリコシル化されていない55-merペプチド(配列番号129)、15-mer
ペプチド(配列番号131)、及び18-merペプチド(配列番号130)を、2つのMUC16非関連キトビ
オース含有ペプチドとともに、スクリーニングの陰性対照として使用した(配列番号168及
び169)。マウスを、より短いKLH-コンジュゲート(配列番号130及び配列番号131)で3週間
毎にさらにもう2回免疫し、各々の免疫付与の後、応答をELISAにより解析した。第6.2.2
節も参照されたい。
サンドイッチELISAを実施し、ELISAアッセイのルーチンのコア施設プロトコルに従って
、個々の(グリコール)ペプチドに対する抗体の陽性度を評価した。第6.2.2節も参照され
たい。
等量のタンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により分離し、Bi
oRad転写装置を用いて4℃で二フッ化ポリビニリデン(PVDF)又はニトロセルロース膜に転
写した。膜を0.1%Tween-20を含むPBS(PBST)中の3%ウシ血清アルブミン(BSA)又は5%無
脂肪乳で室温で1時間ブロッキングした。膜を種々の一次抗体[CellSignaling, MA: Akt
cat #9272;ホスホ-Akt(Ser473)(193H12)cat # 4058; p44/43 MAPK(Erk1/2) cat # 9102;
ホスホ-p44/43MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204) cat #9101; Src cat # 2109S;ホスホ-Src
cat # 2101L; EGFRcat # 2237L;ホスホ-EGFR(Y1068)(D7A5) XP(R) cat #3777S];(Sigma-
Aldrich社, St.Louis, MO:β-アクチンcat # A5441);(Southern BioTech, Birmingham,
AL:抗ヒト-Fc-IgG1-HRPcat # 9054-05);(Abgent, San Diego, CA:ポリクローナルLGALS3
抗体 cat #AP11938b);及び(Origene, Rockville, MD:マウスモノクローナル抗EGFR v3ク
ローンOTI3H2cat # TA506224;マウスモノクローナル抗DDKクローン4C5 cat # TA50011-1
00)で4℃で一晩発色させた。膜をPBS-Tで3回洗浄し、HRPコンジュゲート抗マウス又は抗
ウサギ抗体(GEHealthcare, UK)(1:5000希釈)で室温で1時間で発色させた。その後、膜を
PBS-Tで3回洗浄し、WesternLightning化学発光試薬(ECL, Perkin Elmer)で室温で1〜5分
間発色させ、シグナルをHyBlot CLフィルム(Denville Scientific社. Metuchen, NJ)上で
現像した。
に下記の第6.3.13節の参考文献6も参照されたい。
ヒトTMAスクリーニングの免疫組織化学検査を以前に記載されている通りに実施した(下
記の第6.3.13節の参考文献6を参照)。
50,000個の細胞をDeltaTPG 0.17mmディッシュに個別に播種し、そのそれぞれの培地中
、37℃、5%CO2で一晩培養した。接着細胞を、1%胎仔ウシ血清(FCS)及び0.025%アジ化
ナトリウムを含むPBS(FACSバッファー)で2回洗浄した。細胞を、1:50希釈で、EGFR(R-1)-
Alexa Fluor647nm(Santa Cruz Biotechnology, CA, cat # sc-101 AF647)と4H11又はイ
ンテグリンβ1(4B7R)-AlexaFluor 647nm(Santa Cruz Biotechnology, CA, cat # sc-997
0 AF647)と4H11のいずれかで、4℃で30分間染色した。細胞をFACSバッファーで3回洗浄し
、その後、ヤギ抗マウスIgG2b-PE(Santa Cruz Biotechnology, CA, cat # sc-3766-PE)で
、4℃で30分間標識した。細胞をFACSバッファーで3回洗浄し、20x/0.8NAエア対物レンズ
及び63x/1.4NAオイル対物レンズを備えたZeissAxio Observer Z1で、ZEN2取得ソフトウ
ェアを用いて、画像を撮影した
成長及び浸潤のインビトロ及びインビボ研究で評価した群を比較するために、両側スチ
ューデントt-検定をGraphPadPrismソフトウェア(San Diego, CA)とともに用いて、デー
タを統計的有意性について解析した。
OVCA-433細胞株に関しては、第6.3.13節の参考文献3を参照されたい。pLentiテトラサ
イクリン誘導性システムをInvitrogen, CA(cat # K4925-00)から購入し、pLenti-SKOV3c1
14を生成するために使用した。EGFR発現ウイルスプラスミドのshRNAヘアピンノックアウ
トは、メモリアル・スローン・ケタリング癌センターハイスループットスクリーニング(H
TS)コア施設(MemorialSloan Kettering Cancer Center High Throughput Screening(HTS
) CoreFacility)によって得られた;トランスフェクトされたHEK293細胞及びウイルス上
清をHEK293細胞から回収して、pLenti-SKOV3c114-shEGFR細胞株に感染させた。MUC16c114
トランスフェクタントは、推定切断部位からカルボキシ末端まで(配列番号150のアミノ酸
1777〜1890)のMUC16タンパク質の細胞表面発現を有していた(下記の第6.3.13節の参考文
献21を参照)。MUC16のカルボキシ末端にまで及ぶ344アミノ酸断片(配列番号150のアミノ
酸1547〜1890)としてのMUC16タンパク質の細胞表面発現を有するMUC16c344-GFPベクター
の発現を有する株を含む、より長いMUC16断片を有する細胞株を同様の方法で調製した(下
記の第6.3.13節の参考文献19及び22を参照)。
製造元のプロトコルに従ってDOTAP(Roche Diagnostics, Indianapolis Corporation, I
N)を用いて、DNAコンストラクトをSKOV3細胞に導入した。安定なトランスフェクタントを
、その培養培地中のSKOV3細胞について、800μg/mLのG418で選択した。該細胞をGFP発現
について2回細胞選別し、選択した細胞を最大15回の継代の株として成長させた。FACS解
析のルーチンのモニタリングを行って、これらの株のGFP陽性を確認した。これらの株の
タンパク質抽出物を、抗hrGFP(Stratagene, La Jolla, CA)及び抗MUC16-カルボキシ末端
モノクローナル抗体を用いるウェスタンブロットにより解析した(下記の第6.3.13節の参
考文献19を参照)。第6.1節に記載されているように、MUC16c57-114-pFUSE-hIgG1-Fc2及び
117-244LGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2コンストラクトを、製造元のプロトコルに従って、融合
タンパク質を無血清培地中に発現及び分泌するヒト胚性腎臓(HEK) FreeStyle 293F細胞(I
nvitrogen, CA)に別々にトランスフェクトした(第6.1節及び下記の第6.3.13節の参考文献
19を参照)。分泌された融合タンパク質を精製し、抗ヒトIgG1-Fc-HRP(γ1鎖特異的)(Sout
hern Biotech社,Birmingham, AL)又は4H11-HRP又はポリクローナル抗ヒトLGALS3抗体(Ab
gent, SanDiego, CA)を用いるウェスタンブロット解析により特徴付けた。HEK293細胞で
発現されるEGFRDDK-HIS(cat# TP700043)、LGALS3Myc-DDK(cat # TP308785)、及びインテ
グリン-β1Myc-DDK(cat# TP303818)精製タンパク質は、Origene, Rockville, MDから購
入した。
MUC16発現のFACS解析は、第6.1節及び下記の第6.3.13節の参考文献6に記載されている
通りに実施した。
成長曲線は、第6.1節及び第6.2節並びに下記の第6.3.13節の参考文献18及び19に記載さ
れている通りに実施した。
実施例3(第6.3節)で使用されているように、「N1」は、「Asn1777」とも呼ばれる、配
列番号150の位置1777のアスパラギンを指す。実施例3(第6.3節)で使用されているように
、「N24」は、「Asn1800」とも呼ばれる、配列番号150の位置1800のアスパラギンを指す
。実施例3(第6.3節)で使用されているように、「N30」は、「Asn1806」とも呼ばれる、配
列番号150の位置1806のアスパラギンを指す。
(6.3.11.1 MUC16の病理生物現象はC末端MUC16エクトドメインのN-グリコシル化に依存
的である)
C末端MUC16エクトドメインの最近位の114アミノ酸(MUC16c114)の発現は、MUC16駆動性
マトリゲル浸潤の顕著な増大及びインビボでのより急速な腫瘍成長を含む、3T3マウス線
維芽細胞のより侵襲的なインビトロ/インビボ挙動を引き起こした(第6.1節及び下記の第6
.3.13節の参考文献19を参照)。ヒト卵巣細胞におけるMUC16の役割及びそのグリコシル化
効果を調べるために、MUC16陰性SKOV3ヒト卵巣細胞株をMUC16発現の影響について調べた(
図18A〜18C)。図19Aに示されているように、MUC16c114安定発現ベクターによるSKOV3細胞
のトランスフェクションは、高レベルの細胞表面MUC16発現及び2倍を超えるマトリゲル浸
潤の増大をもたらした。該細胞をN-グリコシル化阻害剤のツニカマイシンに24時間曝露さ
せると、SKOV3-MUC16c114細胞の浸潤特性が大きく減少したが、SKOV3-phrGFPベクターの
みでトランスフェクトされた細胞のマトリゲル浸潤に対してはほとんど効果がなかった(
図19A)。
.3.13節の参考文献17を参照)、ガレクチン-3は、ヒト卵巣癌で過剰発現されていることが
多いので、ガレクチン-3の糖結合ドメイン(117-244LGALS3)と可変結合ドメインを欠く切
断型pFUSE-ヒトIgG1-Fc2配列(pFUSE)とを組み合わせることにより、レクチン遮断コンス
トラクトを生成した(「117-244LGALS3-pFUSE」)(下記の第6.3.13節の参考文献1を参照)。
このキメラ分子は、ガレクチン-3リガンドに結合するが、ガレクチン-3五量体を形成する
能力を欠く。図19Aに示されているように、このガレクチン遮断コンストラクトを細胞に
導入したとき、それは、対照SKOV3-phrGFP細胞によるマトリゲル浸潤に対してほとんど効
果がなかったが、SKOV3-MUC16c114浸潤を顕著に低下させた。ガレクチン-3糖結合ドメイ
ンを欠く対照pFUSEベクターは効果がなかった。同じpFUSEベクターをMUC16エクトドメイ
ン由来の58アミノ酸に連結することにより構築された可溶性MUC16エクトドメインも作製
した(「MUC16c57-114-pFUSE」)。ガレクチン-3-pFUSE(117-244LGALS3-pFUSE)遮断コンス
トラクトの場合と同様、MUC16c57-114-pFUSEコンストラクトもまた、SKOV3-MUC16c114細
胞の浸潤を顕著に減少させたが、SKOV3-phrGFP細胞の浸潤は減少させなかった。MGAT5は
、ガレクチン-3結合に対する最も高い親和性を有する四本鎖N-グリカンの形成を触媒する
グリコシル化酵素である(下記の第6.3.13節の参考文献9を参照)。MGAT5ノックアウトマウ
スは、腫瘍成長に抵抗性である(下記の第6.3.13節の参考文献8を参照)。任意の特定の理
論に束縛されるものではないが、MUC16効果はガレクチン-3とMGAT5発現の両方に依存的で
あるという仮説を立てた。図19Bに示されているように、MGAT5又はガレクチン-3(LGALS3)
のいずれかを低下させるshRNAは、SKOV3-MUC16c114浸潤を著しく減少させたが、Lamelli
をノックダウンする陰性対照shRNAは効果がなかった。
びN30のアスパラギン残基)への突然変異の導入は、観察されるMUC16-グリコシル化依存的
変化を低下させた。図19Cに示されているように、切断部位に隣接する、最遠位のアスパ
ラギン(N1)のアスパラギンからアラニンへの突然変異は、浸潤に対する負の効果を有しな
かった。対照的に、より近位のアスパラギン(N24又はN30)のどちらかのアスパラギンから
アラニンへの突然変異は、浸潤に負の影響を及ぼした。特に、膜表面に最も近いアスパラ
ギン(N30)の保存は、浸潤の増強に最も重要であり、その効果は、他のアスパラギン残基
のアスパラギンからアラニンへのさらなる突然変異によって大きくは増大しなかった。MU
C16 C末端由来の344アミノ酸を有するより大きいMUC16コンストラクト(MUC16c344)も調べ
た。MUC16c344のN30又はMUC16c344のN24及びN30にMUC16突然変異を担持する発現ベクター
をSKOV3細胞株にトランスフェクトすると、マトリゲル浸潤が顕著に低下した(図19D)。こ
のより大きいコンストラクトは、切断部位の遠位にある7つのさらなるN-グリコシル化部
位を有するが、図19Dに示されているように、重要な近位のN24及びN30部位を突然変異さ
せてもなお、これらの突然変異がSKOV3-MUC16c114で浸潤を変化させたのと全く同じよう
に、マトリゲル浸潤を減少させた。
されている(第6.1節及び下記の第6.3.13節の参考文献19を参照)。図19Eにおいて、MUC16c
114によるSKOV3細胞のトランスフェクションが、pERK1/2、pSRC、及びEGFRのリン酸化を
含む、種々の癌遺伝子を活性化させたことが分かる。図19Eは、以下の条件の各々が、MUC
16c114誘導性の癌遺伝子活性化:MGAT5のノックダウン(shMGAT5)、ガレクチン-3のノック
ダウン(shLGALS3)、及びN30のアスパラギンからアラニンへの突然変異を障害することを
示している。これらのデータは、MUC16c114発現に関連するマトリゲル浸潤で観察される
減少と一致している。
の突然変異の効果をヌードマウスにおける異種移植腫瘍成長で調べた。図19Fに示されて
いるように、これらのN-グリコシル化に対する介入のいずれかによって、MUC16c114誘導
性腫瘍成長の完全な無効化が見られた。受容体安定性に対するMUC16c114の効果も調べた
。N-グリコシル化とガレクチン格子への結合の両方の存在が細胞表面でのEGFRの安定化と
関連付けられている(下記の第6.3.13節の参考文献11を参照)。任意の特定の理論に束縛さ
れるものではないが、MUC16の存在の増大が細胞表面ガレクチン格子を安定化し、それに
より、細胞表面のEGFRを安定化すると推論された。図20Aに示されているように、SKOV3細
胞の細胞表面のEGFRの存在は、FACS解析を用いて安定なSKOV3-MUC16c114トランスフェク
タントをベクターのみの対照と比較したとき増大していた。さらに、MUC16c114発現は、
新しいEGFR合成を阻害するためのシクロヘキシミド(CHX)処理の後、phrGFPベクター対照
と比較して、細胞表面のEGFRのほぼ2倍であった。MUC16c114エクトドメイン(4H11陽性)の
安定性はCHXによって変化しなかった。経時的な全EGFRを、ウェスタンブロッティングに
より、CHXで24時間処理した安定なSKOV3-MUC16c114及びSKOV3-phrGFP細胞で比較し、EGFR
をβ-アクチンと比較した。デンシトメトリー曲線(図20B)は、細胞表面のMUC16c114の存
在がphrGFP-ベクター対照と比較してEGFRを安定化することを示した。この効果がSKOV3安
定MUC16c114クローンの選択と関連する可能性を排除するために、テトラサイクリン誘導
性MUC16c114系を利用した。図20Cに示されているように、24時間のテトラサイクリン曝露
は、空のphrGFPベクターでトランスフェクトされた対照SKOV3細胞でも、安定なCMV駆動性
MUC16c114発現ベクターでトランスフェクトされた対照SKOV3細胞でも、マトリゲル浸潤に
効果がなかった。MUC16c114テトラサイクリン誘導系では、テトラサイクリン曝露によっ
て、対照とMUC16c114の両方の安定トランスフェクタントと同様のMUC16c114依存的マトリ
ゲル浸潤が誘導された。EGFRの必要性を、SKOV3細胞に導入される、EGFR発現を低下させ
るshRNAコンストラクト(shEGFR)の安定発現によって調べた。shEGFRトランスフェクト細
胞の単一細胞クローンはどちらも、マトリゲル浸潤の著しい減少を示した。これら2つのs
hEGFR細胞株におけるMUC16c114のテトラサイクリン誘導性発現は、SKOV3-MUC16c114細胞
株と比較して、マトリゲル浸潤に対する最小限の効果しか有せず、SKOV3-MUC16c114誘導
性マトリゲル浸潤がEGFRの発現に共依存的であることが確認された。CHXで処理されたテ
トラサイクリン誘導性SKOV3-MUC16c114におけるEGFRの安定性をウェスタンブロッティン
グによって調べ、β-アクチンと比較した。図20Dに示されているように、24時間のCHX曝
露は、未誘導のMUC16(-)SKOV3細胞における全EGFRタンパク質の着実な低下をもたらした
。同じ実験をSKOV3-MUC16c114(tet)細胞のテトラサイクリン誘導後に実施した場合、CHX
誘導性のEGFR喪失率は低下した。MUC16が該細胞のEGFR含有量を安定化しただけでなく、
それは、未誘導のSKOV3-MUC16c114(tet)細胞と比較して、テトラサイクリン誘導性SKOV3-
MUC16c114(tet)細胞におけるpEGFR発現レベルも安定化した(図21)。
ペプチドの合成)
MUC16c114のN24及びN30部位におけるN-グリコシル化がMUC16作用にとって重要な必要条
件であることを確認したので、SKOV3-MUC16c114細胞株から精製された、N1及びN24にアラ
ニンからアスパラギンへの突然変異を含むMUC16c114突然変異型糖ペプチドのグリカンプ
ロファイルを解析した(図22)。この精製糖ペプチドは、したがって、N-グリコシル化のた
めの単一のアスパラギン残基(N30)を含有していた。この精製糖ペプチドのグライコーム
解析を図22Aに示す。これは、大部分は、フコース及び様々なマンノース残基が結合する
最小反復単位としての共通の近位キトビオース(GlcNAc2)二糖を共有する切断されたグリ
コシル化種からなる多様なN-グリコシル化パターンを特徴とした(図22A)。
抗体が、MUC16とガレクチン格子との相互作用を阻害し、腫瘍成長及び浸潤を含む、MUC16
発現の有害作用を減少させ得るという仮説を立てた。したがって、このN30部位において
キトビオースでグリコシル化された、MUC16エクトドメイン内の様々な長さの合成ペプチ
ド抗原(すなわち、55、18、及び15アミノ酸の長さ;それぞれ、配列番号129、131、及び13
0)を設計した。より大きく、より複雑なN-グリカンに共通する最小モチーフであることに
加え、キトビオース二糖は、基礎にあるペプチドのより良好な露出がペプチド特異性を保
持するグリカンに対する抗体の誘発を可能にするはずでもあった。
高度に収束的であり、好都合に保護された全長ペプチド(55-mer)とキトビオースアミンと
のカップリングと、それに続く、本発明者らの1フラスコアスパラギン酸化/脱保護手順を
用いる酸による全体的な脱保護を伴った(第6.2節及び第6.4節並びに下記の第6.3.13節の
参考文献7及び20を参照)。同様のアプローチの後、末端トリマンノースグリカンを担持す
るより複雑なMan3GlcNAc2-55-mer糖ペプチドも収束的アスパラギン酸化によって調製した
。
焦点を当てるために、それぞれ、1つのキトビオースグリカン(N30)及び2つのキトビオー
スグリカン(N24及びN30)を担持する、より短い15-mer及び18-merの糖ペプチドも合成した
(図22C;それぞれ、配列番号131及び130)。後者は、いくつかのmAbに対する結合に必要で
あることが示されている、Tn抗原(GalNAc-α-O-Ser/Thr)のクラスター提示との類似によ
るものである(第6.2節及び第6.4節並びに下記の第6.3.13節の参考文献14〜16を参照)。そ
の後、これらの糖ペプチドを、N末端システインを介してKLHキャリアタンパク質にコンジ
ュゲートして、マウスワクチン接種のための対応する免疫原を作製した。
ッセイ)
マウスワクチン接種及び血清回収は、第6.2節及び第6.4節に記載されているプロトコル
に従って実施した。GlcNAc2-55-mer糖ペプチド(配列番号129、図22B)による3回の免疫付
与と、それに続く、キトビオース担持KLHコンジュゲートコンストラクト(モノ-グリコシ
ル化された15-mer(配列番号131)とビス-グリコシル化された18-mer(配列番号130))の等量
の混合物による免疫付与の後、10匹のマウスのうちの2匹しか、両方の55-mer(GlcNAc2あ
りとGlcNAc2なし(配列番号129))について弱陽性のELISAシグナルを示さず、これらのマウ
スが、55-merの免疫付与に対する限られた免疫応答しか有しないことが示唆された。両方
のKLHコンジュゲート(GlcNAc2-15-mer(配列番号131)及び(GlcNAc2)2-18-mer(配列番号130
))によるさらに2回の追加免疫付与は、特に2匹のマウス(マウス7及びマウス8)において、
より短い糖ペプチドに対する免疫応答(IgGタイプ)の増強をもたらした。MUC16ペプチド骨
格の異なる非グリコシル化部分に対する4H11 mAbは、15-mer/18-merの糖ペプチドに対す
る結合を示さず、マウス血清陽性とは別の異なる認識エピトープを示した。
り及びMUC16c114発現なしのいくつかの細胞株に対するFACSによってスクリーニングした
。これらの細胞選別研究により、抗MUC16 4H11抗体対照と同様の、SKOV3-MUC16c114細胞
とOVCAR3細胞の両方に対する陽性シグナルが確認された(下記の第6.3.13節の参考文献6を
参照)。MUC16を欠くSKOV3-phrGFP対照細胞は、マウス7血清での結合について陰性であっ
た。
マウス7の脾臓を摘出し、脾細胞を高い融合効率でハイブリドーマ融合パートナーと融
合させた。上清を選択し、個々の糖ペプチドに対するELISAによる反応性についてスクリ
ーニングした(図22C)。複数の上清がGlcNAc2-15-mer及び(GlcNAc2)2-18-mer糖ペプチドと
反応したが、スクリーニングされたハイブリドーマ上清の中に、ELISAスクリーニングで
、非グリコシル化ペプチドよりもグリコシル化に対して高度の選択性を示すものはなかっ
た。MUC16特異性は維持され、陽性の上清の中に、キトビオースでグリコシル化された無
関係なペプチドと反応するものはなかった。4H11 mAbによって認識されるペプチド配列と
の重複は見られなかった。
相同な非グリコシル化配列と反応するが、陰性対照としての役割を果たす、キトビオース
を担持する無関係なペプチドとは反応しないキトビオースに対する複数の一次mAbが得ら
れた。このプールのうち、4つの高親和性抗体を選択し、特徴解析のためにさらに精製し
た。
4つの代表的な抗体についての確証的特徴解析研究の結果は、図23AのELISAにより示さ
れている。様々な合成ペプチドに対する候補抗体の結合を評価し、MUC16-エクトドメイン
ペプチド骨格を認識する4H11抗体の結合と比較した。関連のないキトビオース結合ペプチ
ドは、選択されたどの抗グリカン-MUC16抗体による顕著な結合も示さなかった。候補抗体
は全て、両方のMUC16由来の15-mer(すなわち、非グリコシル化ペプチド及び対応するキト
ビオース糖ペプチド)に対する同様の結合親和性を示した。単一のGlcNAc、末端トリマン
ノース-キトビオース(Man3GlcNAc2)、及びフコシル化キトビオース(GlcNAc2Fuc)を含む、
別の糖部分を担持するさらなる合成糖ペプチドは、免疫付与に使用されたキトビオース結
合MUC16ペプチドに対する抗体反応性を大きくは変化させなかった。
パネルで、グリカン-MUC16c114及びグリカン-MUC16c344特異性についても試験した(表11)
。これらの研究では、SKOV3-phrGFPトランスフェクタントを、SKOV3-MUC16c114(完全N-グ
リコシル化)、SKOV3-MUC16N24c114突然変異体(N24グリコシル化部位がないもの)、SKOV3-
MUC16N30c114(N30グリコシル化部位がないもの)、及びSKOV3-MUC16N1-N24-N30c114(N1グ
リコシル化部位も、N24グリコシル化部位も、N30グリコシル化部位もないもの)と比較し
た。SKOV3-MUC16c114は、N1、N24、及びN30でN-グリコシル化されることができるMUC16の
切断形態を発現するSKOV3細胞を指す。SKOV3-MUC16N24c114は、配列番号150のAsn1800に
対応するアミノ酸位置がアスパラギンからアラニンへの突然変異を含み、したがって、こ
の位置でN-グリコシル化されることができない、MUC16の切断された突然変異体形態を発
現するSKOV3細胞を指す。SKOV3-MUC16N30c114は、配列番号150のAsn1806に対応するアミ
ノ酸位置がアスパラギンからアラニンへの突然変異を含み、したがって、この位置でN-グ
リコシル化されることができない、MUC16の切断された突然変異体形態を発現するSKOV3細
胞を指す。SKOV3-MUC16N1-N24-N30c114は、配列番号150のAsn1777、Asn1800、及びAsn180
6に対応するアミノ酸位置がアスパラギンからアラニンへの突然変異を含み、したがって
、これらの位置でN-グリコシル化されることができない、MUC16の切断された突然変異体
形態を発現するSKOV3細胞を指す。ELISAデータと同様に、これらの結果は、MUC16特異的
標的化が存在することを示した。
とN30グリコシル化部位の両方の喪失は、グリコシル化を標的とする抗体の反応性を低下
させるのに対し、4H11抗体に対する反応性は保持され、それにより、細胞表面SKOV3-MUC1
6c114の存在が確認された。344アミノ酸にまで延長されたMUC16C末端鎖を担持する細胞(
例えば、SKOV3-MUC16c344)も、N24又はN30グリコシル化を同様に必要とした(表11)。さら
に、グリカン-MUC16エクトドメインに対する抗体との反応性は、MGAT5の下方調節によっ
て低減せず(表11)、N24/N30部位のキトビオースが、より複雑な分岐にもかかわらず、全
細胞との抗体結合に寄与することが確認された。
1及び4つのGlcNAc2-MUC16エクトドメインモノクローナル抗体の幾何平均フィコエリスリ
ン(PE)蛍光を提供している。4H11は、グリコシル化修飾の有無を問わず、全ての細胞株(M
UC16を発現しないSKOV3-phrGFP株を除く)に対する結合を保持し、したがって、細胞表面
のMUC16タンパク質が確認された。グリコシル化のN24部位とN30部位の両方が失われたと
き、MUC16c114トランスフェクタントとMUC16c344トランスフェクタントの両方についてグ
リカン-MUC16抗体結合の低下が見られた。MGAT5ノックダウン細胞株に対する反応性の限
られた喪失により、キトビオースが各々のGlcNAc2-MUC16エクトドメイン抗体に不可欠で
ある一方で、より規模の大きい分岐が限られた効果しか有しないことが確認された。
「G抗M」は、ヤギ抗マウスを指す。「PE」は、フィコエリスリンを指す。
結合親和性(表12)及びSKOV3-MUC16c114トランスフェクタントを用いるマトリゲルアッセ
イによる浸潤に対するその効果について、4H11とともに評価した。図23B〜23Dに示されて
いるように、新しく開発された抗体がマトリゲル浸潤の広範な阻害を示したのに対し、4H
11は、そのSKOV3-MUC16c114媒介性浸潤を阻止する能力の欠如によって区別され、MUC16エ
クトドメイン中のグリコシル化ペプチドエピトープを標的とするこれらの抗体が、密に隣
接するエピトープを標的とする抗体よりも良好にMUC16の重要な生物学的特性のいくつか
を阻害することを示した。MUC16グリコシル化抗体は全て、CAOV3及びOVCA-433細胞などの
、ネイティブの全長MUC16を発現する卵巣癌細胞で阻害性であった。これにより、N24/N30
グリコシル化部位がMUC16の浸潤特性の増強に極めて重要である一方で、他のMUC16N-及
びO-グリコシル化部位の存在は、MUC16グリコシル化抗体によるこの極めて重要なエピト
ープの遮断を克服するのに不十分であることが示唆される。任意の特定の理論に束縛され
るものではないが、MUC16に対するガレクチン-3のN24/30結合の抗体阻害も同様に、EGFR
細胞表面安定化を障害すると予想される。図23B〜23Dは、これらの抗体のうちの1つ(10C6
)を細胞培養物に導入したとき、テトラサイクリン誘導性SKOV3-MUC16c114(tet)のEGFR安
定化効果が克服され、CHXに曝露された細胞におけるEGFR喪失の割合がMUC16c114発現のな
い未誘導のSKOV3-MUC16c114(tet)細胞株のEGFR喪失の割合と同様であったことを示してい
る。抗体による免疫組織化学染色も卵巣癌組織マイクロアレイで調べた。図23Eに示され
ているように、グリカンに対するMUC16エクトドメイン抗体の各々は、4H11挙動と同様に
、パラフィン固定組織中の漿液性卵巣癌細胞に結合し、他の間質組織との相互作用は限ら
れていた。最後に、免疫不全マウスにおけるSKOV3-MUC16344の成長に対する10C6抗体の効
果を試験した。複数のN-及びO-グリコシル化部位を有するMUC16陽性腫瘍細胞における抗
体効果のよりストリンジェントな試験として、SKOV3-MUC16c114細胞の代わりに、SKOV3-M
UC16c344細胞を利用した。10C6抗体は、MUC16c344細胞によるマトリゲル浸潤を減少させ(
図23F)、腫瘍担持マウスに週2回投与したとき、マウス側腹におけるSKOV3-MUC16c344腫瘍
細胞の成長を顕著に低下させた(図23G)。
*計算の信頼性が低く、解離速度にフィットするものがない
**kaが低すぎて、会合速度を決定することができない
MUC16安定化EGFRは、卵巣癌細胞浸潤の重要な原動力であるように思われ、この相互作
用は、EGFRと、適切にN-グリコシル化されたMUC16タンパク質エクトドメインと、ガレク
チン-3の存在とに依存する。これら3つのタンパク質間の必要/十分な3者相互作用を立証
するために、この相互作用を、精製タンパク質を用いて評価した。この目的のために、精
製MUC16c57-114-pFUSEタンパク質(ヒト胚性腎臓[HEK]FreeStyle 293F細胞で産生される)
(相互作用のMUC16部分としてのもの)、精製EGFRタンパク質(HEK293細胞によって産生され
る)、及び精製ガレクチン-3タンパク質(LGALS3;HEK293細胞によって産生される)を利用
した。これらのタンパク質はヒト細胞で産生されるので、それらは、典型的なネイティブ
のグリコシル化種を担持すると予想された。任意の特定の理論に束縛されるものではない
が、この3つのタンパク質は、免疫共沈降法によって同定することができるヘテロマーを
形成するという仮説を立てた。図24Aは、この免疫共沈降の結果を示しており、ここでは
、検出された3つのタンパク質の各々が左の3つのレーンの直接的な免疫ブロットに示され
ている。アガロースプロテインA/G PLUSビーズを用いると、MUC16c57-114-pFUSEタンパク
質がプロテインA/GPLUSコンジュゲートビーズに結合し、SDS-PAGEゲルで分離したとき、
溶出液中に存在したことが分かる。EGFRは、ガレクチン-3(LGALS3)も存在したときにのみ
、組み合わせた溶出液中でMUC16c57-114-pFUSEとともに存在した。抗体18C6は、ガレクチ
ン-3のN-グリコシル化結合部位を遮断することにより、EGFR-MUC16相互作用を消失させた
(図24Aを参照)。また、直接的な分子二重免疫蛍光イメージングを用いて、生きた細胞に
おけるEGFRとMUC16の共局在を確認した。図24B及び図25Aに示されているように、EGFRとM
UC16は、OVCAR3、SKOV3-MUC16c344、及びSKOV3-MUC16c114細胞において密に共局在した(
図24B及び25Aの矢印を参照)。これらの研究により、MUC16がガレクチン-3と組み合わさっ
て、MUC16陽性卵巣癌細胞の表面のEGFRと関連することが強く確認された。任意の特定の
理論に束縛されるものではないが、多くの成長増強受容体はグリコシル化されているので
、レクチン依存的なMUC16細胞表面効果は他のN-グリコシル化タンパク質を含み、EGFRに
限定されない可能性があると推論された。インテグリンタンパク質は癌で変化し、SRCリ
ン酸化及び他の下流の効果を誘発する間質-上皮相互作用によって開始される「外から内
への」シグナル伝達に関与することが多い。図24Cは、MUC16と、癌の発生及び進行と関連
する頻度が高いインテグリン成分であるインテグリンβ1との相互作用を示している。EGF
Rの場合と同様に、精製MUC16c57-114-pFUSEは、ガレクチン-3依存的な形でインテグリン
β1に結合し、このヘテロ三量体相互作用は、3つ全てのタンパク質を必要とした。EGFRと
同様に、この相互作用は、抗MUC16c114グリコシル化部位ブロッキング抗体の18C6によっ
て完全に遮断された。MUC16とインテグリンβ1の共局在もいくつかの卵巣癌細胞株におけ
る二重免疫蛍光により確認された(図24D及び図25B)。したがって、MUC16-エクトドメイン
ペプチドエピトープ上の重要な部位におけるN-グリコシル化は、細胞表面タンパク質受容
体との相互作用をレクチン特異的な形で媒介して、マトリゲル浸潤、PI3K/ERK及びSRC経
路の活性化、及び免疫不全マウスにおけるMUC16陽性腫瘍成長の増強を含む、悪性挙動の
特徴を生じさせた。
挙動に対するその効果の機械的モデルが図26に示されている。図26Aにおいて、MUC16は、
ガレクチン-3を介してEGFR及びインテグリンβ1に結合して、安定性並びに成長及び浸潤
を促進する「内から外への」シグナルを増強する。MUC16エクトドメインN-グリコシル化
部位を突然変異させるか又はMGAT5活性を抑制すると(図26B)、その結合は妨げられ、EGFR
/インテグリンシグナルは低下する。同様に、ガレクチン-3タンパク質発現が抑制された
場合(図26C)、分子会合は失われ、シグナル及び浸潤は低下する。最後に、MUC16-エクト
ドメインキメラ抗体又はキメラ「TRAP」LGALS3分子は分子相互作用を妨げ、癌細胞は、観
察されるMUC16腫瘍促進特性の全てを欠く(図26D)。
MUC16並びにMUC1及びMUC4などの他の繋留型ムチンは、3T3細胞を形質転換することがで
き、かつ有害転帰と関連している。癌における異常発現ムチンの機構は複雑かつ多様であ
る。N-グリコシル化パターンが局所環境に応答した細胞成長において重要な役割を果たす
ということが十分に記載されている。糖タンパク質パターンの多様性は、ゴルジ体ベース
のグリコシル化による環境依存的なヘキソサミンフラックスによって影響を受ける。EGFR
、インスリン様成長因子受容体(IGF1R)、及びPDGFRなどの一般的な成長因子受容体は、栄
養依存的な形で最初に優先的にグリコシル化され、これらの重度にグリコシル化された受
容体は、細胞表面に優先的に送達される。対照的に、TGF-βなどの抑制性受容体はN-グリ
コシル化部位が少なく、後になって細胞表面に提示され、結果として成長プログラムの阻
害が生じる(下記の第6.3.13節の参考文献12を参照)。卵巣癌において、EGFR発現は、侵襲
的挙動と関連付けられており、EGFRシグナル伝達は、受容体のグリコシル化状態及びレク
チンに対するN-グリコシル化種の親和性に依存的である(下記の第6.3.13節の参考文献2を
参照)。酵素MGAT5は、癌細胞で過剰発現される重要なレクチンである、ガレクチン-3に対
する最も大きい親和性を有する四本鎖の分岐N-グリカンの合成に重要であると思われる(
下記の第6.3.13節の参考文献17を参照)。
メイン領域上の特定のN-グリコシル化部位に対するこれらのプロセスを介して媒介される
という証拠を提供した。MGAT5依存的なN-グリコシル化パターンは、浸潤、癌遺伝子活性
化、及び免疫不全マウスにおける腫瘍成長の増大を促進するためのガレクチン-3及び細胞
表面タンパク質との高親和性相互作用に必要とされた。特に、切断後に保持されるMUC16
のエクトドメイン上の最近位部位におけるN-グリコシル化は、この相互作用に極めて重要
であった。これらのN-グリコシル化部位を除去するか、該部位をダミー受容体で遮断する
か、又はその完全N-グリコシル化を妨害する介入は全て、MUC16の形質転換効果を障害し
た。これらの形質転換効果は、MUC16のみにではなく、近位N-グリコシル化部位におけるN
-グリコシル化MUC16とガレクチン-3及び他の細胞表面タンパク質との相互作用にも依存す
ると思われた。MUC16エクトドメイン発現は、成長及び浸潤のメディエーターであるEGFR
を安定化することが示され、もとのSKOV3phrGFP細胞と比較して、SKOV3-MUC16c114細胞表
面におけるその滞留を引き延ばした。1つのN-グリコシル化部位しか保持しない単純化さ
れたMUC16糖ペプチドモデルでさえも、グリコシル化の確率的性質のために、全て共通の
キトビオースステムを介してMUC16タンパク質骨格に結合している種々のN-グリカンの存
在をもたらした。したがって、MUC16エクトドメインの(N24/N30部位で)キトビオースに結
合したMUC16c114グリカン-ペプチドエピトープに対する抗体を調製した。これらの新しい
抗体(MUC16グリコシル化抗体)は、MUC16増強性の浸潤、癌遺伝子活性化、及びインビボ腫
瘍成長を阻止した。重要なことに、これらのMUC16グリコシル化抗体は、全長MUC16発現を
伴う細胞だけでなく、より短いMUC16 C末端発現を伴う切断型試験コンストラクトでもMUC
16関連特性を阻害した。MUC16グリコシル化抗体は、CHXの存在下で卵巣癌細胞表面のEGFR
安定化を妨害し、かつヌードマウスにおける移植された成長物を障害した。さらに、MUC1
6グリコシル化抗体の効果は、組換えガレクチン-3の存在下で、精製MUC16と精製EGFR又は
インテグリンβ1のいずれかとの相互作用も妨げた。
チン媒介性の低親和性多分子複合体の形成を通じて、MUC16は、グリコシル化依存的な形
で「外から内への」シグナル伝達を増強することができた。最大限の効果の原因となる特
定のN-グリコシル化部位は独特で、かつ細胞表面の近くにあり、一方、他のより遠位のN-
グリコシル化部位は、あまり重要ではない可能性がある。臨床開発中のガレクチン-3阻害
剤が存在するが、ダミー受容体「ガレクチン-3-TRAP」コンストラクト又は切断型「MUC16
-TRAP」分子は、本実施例のインビトロモデルで同様の効果を有した。本実施例で同定さ
れたMUC16グリコシル化抗体は、MUC16の形質転換効果を阻害した。
(6.3.13 参考文献)
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75.
本実施例は、(a)実施例2及び3(第6.2節及び第6.3節)で使用された方法及び記載された
実験のいくつかのより詳細な説明;並びに(b)実施例2及び3(第6.2節及び第6.3節)と比較し
た追加の情報を提供する。
市販の材料(Aldrich、Fluka、Novabiochem)は全て、それ以上精製することなく使用し
た。N-α-Fmoc保護アミノ酸、シュードプロリンジペプチド、OxymaPure、及びNovaSyn T
G Sieber樹脂は、Novabiochemから購入した。1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2
,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスフェート(HATU)は、G
enscriptから購入した。(7-アザベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホス
ホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyAOP)は、Oakwood Products社から購入した。キ
トビオースオクタアセテートは、Carbosynth Limitedから購入した。TCEP溶液(0.5M、中
性pH)及びヘテロ二官能性リンカーのスルホ-GMBSは、Pierce,ThermoScientificから購入
した。他の全ての試薬は、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を含め、Aldrichから
購入した。溶媒は全て、試薬等級又はHPLC等級(Fisher Scientific)であった。無水テト
ラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、トルエン、及びベンゼンは、無水
溶媒系(アルゴン雰囲気下で中性アルミナのカラムに通したもの)から取得し、それ以上乾
燥させることなく使用した。
び溶液をシリンジで移した。適当な炭水化物試薬をトルエンによる水の共沸除去により乾
燥させた。分子篩を350℃で活性化し、使用直前に粉砕し、その後、真空下で火炎乾燥さ
せた。有機溶液を、減圧下、回転蒸発により、30℃未満で濃縮した。NMRスペクトル(1H及
び13C)をBruker Advance DRX-600 MHz分光計で記録し、TMS又は残留溶媒を基準とした。
低分解能質量スペクトル分析をJOEL JMS-DX-303-HF質量分析計又はWaters Micromass ZQ
質量分析計を用いて実施した。分析的TLCをE. Merckシリカゲル60 F254プレートで実施し
、UV光(254nm)下で、又はモリブデン酸セリウムアンモニウム(CAM)もしくはメタノール中
5%硫酸で染色することにより可視化した。シリカフラッシュカラムクロマトグラフィー
をE. Merck230-400メッシュシリカゲル60で実施した。
逆相クロマトグラフィー分離は全て、水中の0.05%トリフルオロ酢酸(TFA)(v/v)及びア
セトニトリル中の0.04%TFAからなる移動相を伴った。反応進行は、光ダイオード検出器
及び単一の四重極質量検出器を有し、Acquity UPLC BEH C18/C8/C4カラム(1.7μm、2.1×
100mm)を備えた、WatersAcquityTM超高速液体クロマトグラフィーシステムでのUPLC-MS
分析により、0.3mL/分の流速でモニタリングした。分析的LC-MS分析は、VarianMicrosor
b C18カラム(150×2.0mm)、VarianMicrosorb C8/C4カラム(250×2.0mm)、又はWaters X-
Bridge C18カラム(150×2.1mm)を用いて、Waters2996光ダイオードアレイ検出器を備え
たWaters2695分離モジュールで、0.2mL/分の流速で実施した。分取スケールのHPLC精製
は、AgilentDynamax逆相HPLC Microsorb C18/C8/C4カラム(250×21.4mm)又はWaters X-B
ridge C18カラム(150×19.0mm)を用いて、RaininUV-1検出器を備えたRanin HPLC溶媒送
達系で、16.0mL/分の流速で実施した。
(6.4.2.1 Fmocベースの固相ペプチド合成(SPPS))
自動ペプチド合成をCEM Libertyマイクロ波ペプチド合成装置で行った。ペプチドを、
標準的なFmocプロトコルの下、NovaSynTG Sieber樹脂上で合成した。デブロック混合物
は、OxymaPure(0.1M)の20%ピペリジン/DMF溶液からなっていた。Novabiochem製の以下
のFmocアミノ酸:Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Dmcp)-OH、Fmoc-Asp(OMpe)
-OH、Fmoc-Asp(OPp)-OH、Fmoc-Asp(OAllyl)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Dmcp)-OH
、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Ph
e-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(OtBu)-OH、Fmoc
-Val-OHを使用した。以下のDmb(2,4-ジメトキシベンジル)及びシュードプロリンジペプチ
ド(Novabiochem):Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH、Fmoc-Gly-Thr(ψMe,MePro)-OH、Fmoc-P
he-Thr(ψMe,MePro)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(ψMe,MePro)-OHを使用した。
0.1mmolスケールでの自動合成の終了後、ペプチド-樹脂をDMF(2mL)で洗浄して、ペプチ
ド合成容器に入れ、DMF(2mL)中の無水酢酸(188μL、2mmol)及びDIEA(384μL、2.2mmol)で
処理した。混合物を穏やかな窒素バブリングによって1時間振盪させ、その後、DMF及びCH
2Cl2で洗浄した後、脱アリル化に供した。
N-アセチル化樹脂結合ペプチド(0.1mol)をDMF/CH2Cl2中のPd(PPh3)4(7.5mg、6.5μmol)
及びフェニルシラン(75μL、0.6mmol)(4mL、1:1)で処理した。20分間の穏やかな窒素バブ
リングの後、Pd(PPh3)4/フェニルシラン処理を2回繰り返した。その後、ペプチド-樹脂を
、DMF、CH2Cl2、及びメタノールで洗浄し、真空下で乾燥させた。
乾燥後、ペプチド-樹脂を切断カクテル(1%TFA/CH2Cl2、4mL)に5サイクル×5分で供し
、このプロセスを4回繰り返した。さらなる切断シーケンスには、1.5%TFA/CH2Cl2(4mL、
5サイクル×5分)及び2%TFA/CH2Cl2(4mL、5サイクル×5分)による処理が含まれた。切断
溶液のそれぞれの部分を氷冷Et2Oに個別にプールし、濃縮した。対応する油性残渣を最小
量のトリフルオロエタノールに再懸濁させ、水で沈殿させた。得られた混合物をすぐに凍
結乾燥させると、C末端アミドを担持する粗保護ペプチドが得られた。
r)とグリカンアミンとのカップリングと、その後のカクテルRによる酸に不安定な保護基
の除去)
部分的に保護された全長ペプチド(1.0当量)及びグリカンアミン(キトビオース: 4.0当
量; Man3GlcNAc21.6当量)を合わせ、無水DMSOに溶解させた。この混合物に、新たに調製
されたPyAOP(4.0当量)のDMSO溶液、その後、DIEA(6.0当量)を添加した。反応混合物を3時
間撹拌し、1mLの氷冷水(0.05%TFA)の添加によりクエンチした。形成された沈殿を遠心分
離により単離し、水/CH3CN(1:1、0.05%TFA)に再懸濁させ、すぐに凍結乾燥させた。
ンジチオール、2%アニソール)(1mL)での2時間の処理による全体的な酸脱保護に供した。
残渣を氷冷Et2O(12mL)で沈殿させ、得られた懸濁液を遠心分離すると、白色のペレットが
得られた。上清をデカントで捨て、ペレットを氷冷ジエチルエーテル(12mL)で粉砕した。
このプロセスを合計3回繰り返し、得られた沈殿を水/CH3CN(1:1、0.05%TFA)に可溶化さ
せ、凍結乾燥させた。対応する粗糖ペプチドをRP-HPLCにより精製した。
サイズの小さいペプチド(15-及び18-mer)とキトビオースアミンとのカップリングと、そ
の後の酸に不安定な保護基の除去)
部分的に保護されたペプチド(1.0当量)及びキトビオースアミン(3.0当量/二重ランズベ
リーアスパラギン酸化については、7.0当量)を合わせ、無水DMSOに溶解させた。この混合
物に、新たに調製されたPyAOP(4当量/後者の場合、6当量)のDMSO溶液、その後、DIEA(そ
れぞれ、6当量/8当量)を添加した。反応混合物を2.5時間撹拌し、1mLの氷冷水(0.05%TFA
)の添加によりクエンチした。形成された沈殿を遠心分離により単離し、水/CH3CN(1:1、0
.05%TFA)に再懸濁させ、すぐに凍結乾燥させた。
PSH)(1mL)での2時間の処理による全体的な酸脱保護に供した。残渣を氷冷Et2O(12mL)で沈
殿させ、懸濁液を遠心分離すると、白色のペレットが得られた。上清をデカントで捨て、
ペレットを氷冷ジエチルエーテル(12mL)で粉砕した。このプロセスを合計3回繰り返し、
得られた沈殿を水/CH3CN(1:1、0.05%TFA)に溶解させ、凍結乾燥させた。対応する粗糖ペ
プチドをRP-HPLCにより精製した。
KLHを、まず、ヘテロ二官能性架橋剤のスルホ-GMBS)とともに、pH7のリン酸緩衝食塩
水(PBS)中で2時間インキュベートした。コンジュゲートされなかった架橋剤をサイズ排除
クロマトグラフィー(それぞれ、Bio-GelP-10微細カラムに通す)より除去し、その後、マ
レイミド活性化KLHを得た。末端チオール官能基を担持する新たに脱保護された(糖)ペプ
チドをマレイミド含有KLHとpH 7のPBS中で混合し、室温で6時間インキュベートした。こ
の後、AmiconUltra-4遠心分離フィルター(分子量カットオフは50000)を用いて、未反応
の(糖)ペプチドを除去した。最終的に、対応するKLHコンジュゲートがPBS溶液として得ら
れた。
(6.4.3.1 キトビオース担持全長糖ペプチドの合成)
第6.4.2.1節の方法による自動合成の終了後、ペプチド-樹脂をN-アセチル化及び脱アリ
ル化(それぞれ、第6.4.2.2節及び第6.4.2.3節を参照)に供すると、樹脂からの切断(第6.4
.2.4節を参照)の後に、Asp30側鎖に遊離カルボン酸を担持する部分的に保護されたペプチ
ドp55-mer[N1-S55]が得られた。この粗ペプチドの画分を5→12%MeOH/CH2Cl2で溶出させ
るシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製すると、凍結乾燥後に、ペプチドp55-
mer[N1-S55](70mg)が白色の固体として得られた。図27Aは、側鎖が保護されたN-アセチル
化55-merペプチドアミドを示している。図27Bは、糖ペプチドp55-mer[N1-S55]についての
ESI-MSとUPLC分析からのUVトレースとを示している。
lcNAc2)アノマーアミン(3.5mg、8.1μmol)を合わせ、無水DMSO(100μL)に溶解させた。Py
AOP(4.3mg、8.1μmol)のDMSO(30μL)溶液、その後、DIEA(2.0μL、12.2μmol)を添加した
。金色〜黄色の混合物を3時間撹拌し、1mLの氷冷水(0.05%TFA)の添加によりクエンチし
、凍結させ、凍結乾燥させた。
.0mL)に2時間供し、氷冷Et2Oで沈殿させ、遠心分離し、再懸濁させ、凍結乾燥させた。粗
ペプチドを25%アセトニトリル/水(0.05%TFA)(2mL)に溶解させ、30分かけての水中25〜3
5%アセトニトリル(0.05%TFA)の線形勾配を用いて、X-BridgeC18カラムでのHPLCにより
精製した。20分で溶出する所望の生成物を含む画分を回収し、凍結乾燥させると、糖ペプ
チド「55-mer(キトビオース)[N1-S55]」(GlcNAc2-55-mer)(3.0mg、22%収率)が白色の固
体として得られた(図28A)。図28Bは、糖ペプチド「55mer(キトビオース)[N1-S55]」(GlcN
Ac2-55-mer)についてのESI-MSとUPLC分析からのUVトレースとを提供している。
第6.4.2.6節に従って、ペプチドp55-mer[N1-S55](10mg、1.0μmol)及び五糖Man3GlcNAc
2アノマーアミン(1.5mg、1.6μmol)を合わせ、無水DMSO(30μL)に溶解させた。その後、P
yAOP(2.1mg、4.1μmol)のDMSO(5μL)溶液、その後、DIEA(1.0μL、6.1μmol)を添加した
。金色〜黄色の混合物を3時間撹拌し、1mLの氷冷水(0.05%TFA)の添加によりクエンチし
、凍結させ、凍結乾燥させた。
.0mL)に2時間供し、氷冷Et2Oで沈殿させ、遠心分離し、再懸濁させ、凍結乾燥させた。粗
ペプチドを25%アセトニトリル/水(0.05%TFA)(2mL)に溶解させ、30分かけての水中25〜3
5%アセトニトリル(0.05%TFA)の線形勾配を用いて、X-BridgeC18カラムでのHPLCにより
精製した。18分で溶出する所望の生成物を含む画分を回収し、凍結乾燥させると、糖ペプ
チド「55-mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]」(Man3GlcNAc2-55-mer)(1.5mg、20%収率)が白色の
固体として得られた。図29Aは、Man3GlcNAc2を担持する55-merの糖ペプチド:「55-mer(Ma
n3GlcNAc2)[N1-S55]」(Man3GlcNAc2-55-mer)を示している。図29Bは、糖ペプチド「55mer
(Man3GlcNAc2)[N1-S55]」(Man3GlcNAc2-55-mer)についてのESI-MSと分析的HPLC分析から
のUVトレースとを示している。
(6.4.4.1 キトビオース-モノグリコシル化15-merの合成)
第6.4.2.1節による自動合成の終了後、ペプチド-樹脂をN-アセチル化及び脱アリル化(
それぞれ、第6.4.2.2節及び第6.4.2.3節を参照)に供すると、樹脂からの切断(第6.4.2.4
節を参照)の後に、Asp30(配列番号150のAsn1806に対応する)側鎖に遊離カルボン酸を担持
する部分的に保護されたペプチドp15-mer[C-G25-V38]が得られた。図30A。このペプチド
を、それ以上精製することなく、次の工程で使用した。
ミン(4.8mg、11.3μmol)を合わせ、無水DMSO(80μL)に溶解させた。PyAOP(5.9mg、11.3μ
mol)のDMSO(20μL)溶液、その後、DIEA(2.6μL、15μmol)を添加し、金色〜黄色の混合物
を2.5時間撹拌し、凍結させ、凍結乾燥させた。その後、保護された糖ペプチドを、第6.4
.2.6節に従って、TFAカクテル(1mL)に2時間供し、氷冷ジエチルエーテルで沈殿させ、遠
心分離し、再懸濁させ、凍結乾燥させた。粗ペプチドを15%アセトニトリル/水(0.05%TF
A)(2mL)に溶解させ、30分かけての水中15〜35%アセトニトリル(0.05%TFA)の線形勾配を
用いて、C18カラムでのHPLCにより精製した。17分で溶出する所望の生成物を含む画分を
回収し、凍結乾燥させると、糖ペプチド「15-mer(キトビオース)[C-G25-V38]」(GlcNAc2-
15-mer)(2.0mg、25%収率)が白色の固体として得られた。キトビオース-モノグリコシル
化15-mer糖ペプチド:15-mer(キトビオース)[C-G25-V38](GlcNAc2-15-mer)については、
図30Bを参照されたい。図30Cは、糖ペプチド「15mer(キトビオース)[C-G25-V38]」(GlcNA
c2-15-mer)についてのESI-MSと分析的HPLC分析からのUVトレースとを示している。
第6.4.2.1節による自動合成の終了後、ペプチド-樹脂をN-アセチル化に供した(第6.4.2
.2節を参照)。その後、樹脂からの切断及びそれと同時のOPp保護基の除去を、第6.4.2.4
節に示される方法に従って達成すると、Asp24側鎖とAsp30側鎖の両方(それぞれ、配列番
号150のAsn1800及びAsn1806に対応する)に遊離カルボン酸を担持する部分的に保護された
ペプチドp18-mer[C-T22-V38]が得られた。このペプチドを、それ以上精製することなく、
次の工程で使用した。図32Aを参照されたい。
ミン(27mg、63.4μmol)を合わせ、無水DMSO(150μL)に溶解させた。その後、PyAOP(28.5m
g、54.6μmol)をDMSO(50μL)中に添加し、その後、DIEA(2.6μL、15μmol)を添加し、金
色〜黄色の混合物を2.5時間撹拌し、凍結させ、凍結乾燥させた。その後、保護された糖
ペプチドを、第6.4.2.6節に従って、TFAカクテル(1mL)に2時間供し、氷冷ジエチルエーテ
ルで沈殿させ、遠心分離し、再懸濁させ、凍結乾燥させた。粗ペプチドを15%アセトニト
リル/水(0.05%TFA)(6mL)に溶解させ、30分かけての水中15〜27%アセトニトリル(0.05%
TFA)の線形勾配を用いて、C8カラムでのHPLCにより精製した。15分で溶出する所望の生成
物を含む画分を回収し、凍結乾燥させると、糖ペプチド「18-mer(キトビオース)2[C-T22-
V38]」[(GlcNAc2)2-18-mer](6.5mg、25%収率)が白色の固体として得られた。図32Bを参
照されたい。図32Cは、糖ペプチド「18mer(キトビオース)2[C-T22-V38]」[(GlcNAc2)2-18
-mer]についてのESI-MSと分析的HPLC分析からのUVトレースとを示している。
糖ペプチド「15-mer(キトビオース)[C-G25-V38]」及び「18-mer(キトビオース)2[C-T22
-V38]」を、第6.4.2.7節に示された手順に従って、KLHにコンジュゲートすると、それぞ
れ、対応するKLHコンジュゲートのGlcNAc2-15-mer-KLH及び(GlcNAc2)2-18-mer-KLHが得ら
れた。図33A及び図33Bを参照されたい。
表13.配列の表
本明細書に引用されている全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも各々の個々
の刊行物又は特許出願が、引用により組み込まれることが具体的かつ個別的に示されてい
るかのように引用により本明細書中に組み込まれる。上の発明は、理解の明快さのために
図及び実施例としていくらか詳細に記載されているが、本発明の教示に照らし、添付の特
許請求の範囲の精神又は範囲を逸脱することなく、一定の変更及び修正をそれに加えるこ
とができることが当業者には容易に明らかになるであろう。
Claims (1)
- 明細書に記載の発明。
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