PT970126E - Novo metodo para a producao de receptores de antigenios anti-humanos e suas utilizacoes - Google Patents

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DESCRIÇÃO “Novo método para a produção de receptores de antigénios anti-humanos e suas utilizações” A presente invenção refere-se a um método para a produção de um receptor de antigénios anti-humanos (ou seja. de imunogenicidade baixa ou não imunogénico em seres humanos) compreendendo as etapas de selecção de uma combinação de cadeias de imunoglobulina VH e VL rearranjadas funcionalmente, em que pelo menos a dita cadeia VH é derivada de linfócitos B humanos maduros não sensibilizados, e a dita cadeia VL é derivada de um repertório de células B humanas de ocorrência natural, sendo as ditas cadeias expressas a partir de um vector recombinante e usando um sistema de exposição in vitro para ligação a um antigénio humano, em que, antes da referida etapa de selecção, é realizada uma etapa de selecção quer da referida cadeia VH, quer da referida cadeia VL, para ligação ao referido antigénio juntamente com uma cadeia V substituta. A presente invenção refere-se ainda a receptores que têm baixa imunogenicidade ou não são imunogénicos em seres humanos e dirigidos a antigénios humanos, sendo os ditos receptores obteníveis pelo método da invenção. Os receptores da invenção são dirigidos ao antigénio de tumor nativo humano 17-1 A, também conhecido como EpCAM, EGP-40 ou GA 733-2.

Os sistemas imunitários de mamíferos, tais como o sistema imunitário humano, seleccionam contra as células e moléculas imunitárias competentes, que são específicas para auto-antigénios. A desregulação do sistema imunitário neste sentido pode resultar em doenças auto-imunes, tais como artrite reumatóide. Em geral, o acompanhamento do sistema imunitário em relação aos anticorpos auto-reactivos ou células T é, portanto, altamente benéfico. No entanto, pode haver casos nos quais seria vantajoso ter anticorpos auto-reactivos que sejam dirigidos aos antigénios expressos no corpo de mamíferos e, em particular, no corpo humano. Estes antigénios são, por exemplo, antigénios associados a tumores. Por exemplo, mostrou-se que o antigénio 17-1A ou EpCAM humano, uma glicoproteína de superfície expressa por células de epitélios simples e tumores malignos deles derivados, é um alvo compensador para terapia do cancro com anticorpos monoclonais, especialmente em pacientes com doença residual mínima sofrendo de células de tumores disseminadas, que podem provocar metástase sólida posterior e, deste modo, conferir prognóstico aos pacientes. Nos pacientes com 2 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ cancro colorretal residual mínimo, um anticorpo monoclonal de murino específico para o antigénio 17-1A humano diminuiu a taxa de mortalidade até 5 anos em 30%, em comparação com pacientes não tratados, quando aplicado sistemicamente em cinco doses num período de quatro meses após cirurgia do tumor primário; no total, cada paciente foi tratado com 900 mg de anticorpo (Riethmuller, Lancet 343 (1994), 1177 - 1183). No entanto, durante o período do tratamento com anticorpo, os pacientes desenvolveram uma forte resposta de anticorpos contra a imunoglobulina de murino. Estes anticorpos anti-ratinho humanos (HAMA) limitam, severamente, a aplicação contínua de terapias de anticorpos e reduzem, cada vez mais, a sua eficácia. Além do mais, os HAMA pré-formados induzidos por tratamento com anticorpo anterior ou outro contacto com imunoglobulina de murino podem interferir, gravemente, com terapias de anticorpos posteriores.

Para evitar estes problemas, os anticorpos terapêuticos com imunogenicidade mínima seriam preferíveis. Para atingir este objectivo pode-se, por exemplo, considerar que os anticorpos ou derivados de anticorpos terapêuticos são completamente humanos em virtude das suas sequências de aminoácidos e o perfil imunogénico do idiótipo de anticorpo humano é minimizado por uso de regiões variáveis de Ig humanas prováveis de serem toleradas pelo sistema imunitário humano.

No entanto, a produção de anticorpos humanos contra antigénios humanos enfrenta dois grandes problemas: (1) as técnicas de imortalização de hibridomas ou outras células provaram ser bastante ineficientes na produção de linhagens celulares produtoras de anticorpos humanos, comparadas com a tecnologia de hibridomas de murino; (2) os anticorpos auto-reactivos são relativamente e eficientemente destituídos de repertórios de anticorpos de ocorrência natural, devido aos mecanismos mediadores de auto-tolerância.

Os anticorpos humanos têm-se tornado, em geral, muito mais acessíveis, uma vez que a disponibilidade de ratinhos transgénicos expressando anticorpos humanos (Brijggemann, Immunol. Today 17 (1996), 391 - 397) e da biblioteca de anticorpos combinatórios e tecnologia de exposição em fagos, permitindo a combinação in vitro de regiões variáveis de cadeias pesadas e leves de Ig (VH e VL) e a selecção in vitro das suas especificidades de ligação a antigénios (Winter, Annu. Rev. Immunol. 12 (1994), 433 - 455). Por uso do método de exposição em

86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ 3 fagos, eventos raros como uma entidade de ligação específica de 107 a 109 diferentes pares VL/VH ou VH/VL podem ser facilmente isolados; isto é especialmente verdade, quando o repertório de regiões variáveis tiver sido enriquecido nas entidades de ligação específica por uso de linfócitos B de hospedeiros imunizados, como uma fonte de clonagem do repertório.

Frequentemente, no entanto, a frequência de entidades de ligação específica é substancialmente diminuída em repertórios de anticorpos de ocorrência natural. Isso é particularmente verdade para os casos de anticorpos de ligação a auto-antigénios. As combinações aleatórias de regiões VL e VH de um hospedeiro auto-tolerante, resultando numa biblioteca de anticorpos combinatórios de tamanho convencional (107 a 109 clones independentes), não são na maior parte das vezes suficientes para o sucesso da selecção in vitro de anticorpos auto-reactivos pelo método de exposição em fagos.

Uma estratégia para evitar este problema é o uso de bibliotecas de anticorpos combinatórios muito grandes, que compensam, pelo tamanho da biblioteca, a baixa frequência de anticorpos reactivos em repertórios de ocorrência natural. As bibliotecas de anticorpos combinatórios excedendo um tamanho de 109 clones independentes são, no entanto, difíceis de obter, por causa do limite técnico actual da eficiência de transformação para o plasmídeo de ADN em células de E. coli.

Para evitar a tendência mediada pela auto-tolerância em repertórios de anticorpos de ocorrência natural, que sub-representa anticorpos auto-reactivos e diminui acentuadamente as probabilidades de isolamento de anticorpos que especificamente reconhecem auto-antigéníos, foram desenvolvidas abordagens usando repertórios de cadeias VH e/ou VL semi-sintéticas ou inteiramente sintéticas. Por exemplo, clonou-se o repertório quase completo de segmentos de genes de V humanos rearranjados, a partir de ADN genómico, e utilizou-se para a recombinação in vitro de genes de regiões variáveis funcionais, assemelhando-se à recombinação V-J ou V-D-J in vivo (Hoogenboom, J. Mol. Biol. 227 (1992), 381 -388; Nissim, EMBO J. 13 (1994) 692 - 698; Griffiths, EMBO J. 13 (1994), 3245 -3260). Usualmente, a diversidade da junção V-D-/D-J e do segmento D, principalmente responsável pela extraordinária variabilidade de comprimentos e sequências de CDR3 de cadeia pesada, bem como a diversidade da junção V-J contribuindo para a variabilidade da sequência de CDR3 de cadeia leve é imitada pelas sequências aleatórias usando oligonucleótidos degenerados em abordagens 4 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ inteiramente sintéticas e semi-sintéticas (Hoogenboom (1994), supra; Nissim, supra; Griffiths, supra; Barbas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992), 4457 -4461).

No entanto, os pares VL/VH ou VH/VL seleccionados para ligação a um antigénio humano a partir destes repertórios semi-sintéticos ou inteiramente sintéticos, baseados em sequências de genes de V humanos, correm o risco de formar epítopos imunogénicos, que podem induzir uma resposta imunitária indesejada em seres humanos (Hoogenboom, TIBTECH 15 (1997), 62 - 70); especialmente, as regiões de CDR3 derivadas de repertórios de sequências completamente aleatórias são predestinadas para formar epítopos potencialmente imunogénicos, pois nunca tiveram que suportar a vigilância imunitária humana sem serem reconhecidas como um antigénios estranhos resultando em eliminação subsequente. Isso é igualmente verdade para anticorpos humanos de ratinhos transgénicos expressando anticorpos humanos, pois estas moléculas de imunoglobulina foram seleccionadas para serem toleradas pelo sistema imunitário de murino, mas não pelo humano. WO 97/00271 revela anticorpos humanos de alta afinidade para antigénios tumorais, em particular anticorpos que se ligam especificamente a c-erbB-2. Os anticorpos são descritos como sendo úteis sozinhos ou como componentes de moléculas quiméricas que especificamente têm como alvo e entregam moléculas efectoras, a células que superexpressam c-erbB-2.

Noutro pedido de patente (WO 93/11236) revelam-se métodos para a produção de auto-anticorpos e fragmentos de auto-anticorpos próprios. Os fragmentos de auto-anticorpos próprios são seleccionados por ligação a um auto-antigénio a partir do mamífero seleccionado.

Consequentemente, o problema técnico subjacente à presente invenção era proporcionar um método que permitisse a produção de receptores de baixa imunogenicidade ou não imunogénicos em seres humanos e que pudesse ser usado para atingir antigénios no corpo humano. A solução para o dito problema técnico é conseguida proporcionando as concretizações caracterizadas nas reivindicações.

Deste modo, a presente invenção refere-se a um método para a produção de um receptor de antigénios anti-humanos, de baixa imunogenicidade ou não

86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ 5 imunogénico em seres humanos, compreendendo o dito método as etapas apresentadas com maior detalhe na reivindicação 1. O método da presente invenção é altamente vantajoso para proporcionar receptores que podem ser usados para atingir antigénios em seres humanos, sem serem, de todo ou em qualquer grau significativo, eles próprios imunogénicos. Estes receptores podem ser vantajosamente usados para o tratamento de várias doenças, tais como doenças tumorais ou auto-imunes, rejeição de enxertos após transplante, doenças infecciosas por direccionamento de receptores celulares, bem como doenças alérgicas, inflamatórias, endócrinas e degenerativas por direccionamento às moléculas-chave envolvidas no processo patológico.

As cadeias de imunoglobulina VH/VL dos receptores da presente invenção podem, evidentemente, ser ainda investigadas em relação às suas sequências de ácido nucleico e de aminoácidos, usando técnicas bem conhecidas na arte, consultar, por exemplo, Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY (1989)). Uma vez determinada a sequência de ácido nucleico ou a sequência de aminoácidos, os receptores da invenção também podem ser produzidos por outros métodos, tais como por métodos sintéticos ou semi-sintéticos produzindo receptores sintéticos ou semi-sintéticos, ou em ratinhos transgénicos expressando receptores de imunoglobulina humanos; possuindo os receptores as características prescritas acima e produzidos por estes métodos sintéticos ou semi-sintéticos ou nos ditos ratinhos transgénicos também estão incluídos no âmbito da presente invenção.

Após ligação do receptor ao antigénio humano, o receptor pode ser posteriormente purificado. Por exemplo, os receptores não ligados que não possuem a especificidade do antigénio podem ser removidos por etapas de lavagem. O receptor ligado pode ser eluído do antigénio humano e posteriormente purificado, em que séries adicionais de expressão, ligação e selecção do receptor desejado podem ser usadas até que o receptor desejado e/ou o vector recombinante correspondente tenha(m) sido isolado(s) na forma pura. O método da presente invenção faz, assim, uso da pré-selecção de regiões variáveis de Ig pelo sistema imunitário humano. Os receptores são derivados de um repertório seleccionado in vitro de bibliotecas de anticorpos combinatórios humanos, exclusiva ou preferivelmente, constituídas por repertórios de anticorpos

86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ 6 de ocorrência natural expressos por linfócitos B humanos maduros não sensibilizados.

No entanto, os domínios variáveis de Ig também podem ser derivados de várias outras fontes, que representam estas populações pré-seleccionadas de células B.

Os antecedentes científicos, em relação à origem das células B funcionando como uma fonte das ditas cadeias VH ou VL, podem ser explicados da seguinte maneira: os linfócitos B maduros não sensibilizados, expressando IgD e IgM como receptores de antigénios de membrana entram nos folículos primários durante o seu tráfego para, e entre, os órgãos linfóides secundários, a menos que tenham encontrado um auto-antigénio multivalente, resultando em deleção clonal, ou auto-antigénio monovalente solúvel tornando-os anérgicos e de vida curta, devido à exclusão de folículos primários. O contacto de células B imaturas, que expressam, exclusivamente, IgM, com auto-antigénio na medula óssea, resulta em deleção clonal ou anergia, dependendo da valência do antigénio. As células B anérgicas, embora expressando IgD de superfície, são incapazes de responder ao antigénio através deste receptor; sem ter acesso aos folículos primários e na ausência de ajuda de células T, estas células têm uma semivida curta de apenas uns poucos dias.

Em contraste, os linfócitos B maduros não sensibilizados que não tenham encontrado auto-antigénios e, portanto, têm acesso aos folículos primários, têm uma semivida longa de várias semanas. Apesar dos mecanismos descritos de mediação de auto-tolerância, estas populações de linfócitos B maduros não sensibilizados de vida longa ainda contêm células B potencialmente auto-reactivas que, no entanto, não é provável que encontrem ajuda de células T específicas, devido à tolerância das células T, e assim são impedidas de proliferação e de secreção de anticorpo. Parece que a não resposta de células B a muitos auto-antigénios, que estão presentes em baixos níveis, é deste tipo, afectando as células T auxiliadoras, mas não as células B. Na presente invenção, estes linfócitos B maduros não sensibilizados potencialmente auto-reactivos, não responsivos, de vida longa, foram identificados como o repertório de anticorpos humanos de ocorrência natural mais promissor, para construção de bibliotecas de anticorpos

86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ 7 combinatórios especialmente adequados para seleccionar anticorpos humanos para antigénios humanos, por exemplo, pelo método de exposição em fagos.

Espera-se que este repertório de anticorpos altamente seleccionado, usado como uma base para a presente invenção, principalmente derivado de células B com uma semivida longa in vivo e, deste modo, exposto ao sistema imunitário humano por períodos de tempo prolongados, fique acentuadamente destituído de moléculas de anticorpos que formam epítopos, especialmente dentro das regiões CDR3 altamente variáveis, que são imunogénicos para o sistema imunitário humano. Portanto, espera-se que os anticorpos humanos seleccionados deste repertório de anticorpos tenham um perfil imunogénico mais baixo em seres humanos do que os anticorpos humanos seleccionados de bibliotecas de anticorpos humanos semi-sintéticos ou inteiramente sintéticos.

As células B não sensibilizadas maduras, que são activadas por contacto com antigénio estranho, param de expressar IgD e começam a proliferação clonal e a diferenciação em células do plasma que segregam imunoglobulina solúvel; os estágios precoces da resposta de anticorpos são dominados anticorpos IgM, enquanto que posteriormente, ígG e IgA são os isótipos predominantes, contribuindo a IgE com uma pequena, mas biologicamente importante, parte da resposta de anticorpos.

Pelo contrário, os linfócitos B sensibilizados com antigénios maduros negativos para IgD, que expressam IgM, IgG, IgA ou IgE, as células B não sensibilizadas positivas para IgD ainda não sofreram proliferação clonal, de modo que as bibliotecas de IgD combinatórias não super-representaram especificidades de anticorpos, que estão actualmente ou tenham sido anteriormente envolvidos em respostas imunitárias, usualmente accionadas por antigénios estranhos, diminuindo assim a diversidade do repertório e desperdiçando espaço na biblioteca para anticorpos candidatos que provavelmente se ligam ao auto-antigénio. Isso está em claro contraste com a arte anterior, que recomenda o uso de bibliotecas de anticorpos combinatórios IgM humanos, para a selecção in vitro de anticorpos humanos contra antigénios humanos dos repertórios de anticorpos humanos de ocorrência natural (Hoogenboom (1997), supra).

Numa concretização preferida do método da invenção, o dito receptor de antigénio é uma imunoglobulina ou um seu fragmento.

86 428 ΕΡ 0 970 126/ΡΤ Ο fragmento da imunoglobulina pode ser qualquer fragmento que seja convencionalmente conhecido na arte, como fragmentos Fab ou F(ab)2-

Numa concretização particularmente preferida do método da invenção, o dito fragmento de imunoglobulina é um fragmento Fv.

Numa outra concretização preferida do método da invenção, pelo menos a dita cadeia de imunoglobulina VH e, opcionalmente, a dita VL, são derivadas de um repertório IgD humano.

Chegou-se à conclusão que este receptor e, de preferência, o repertório de anticorpos seleccionados para baixa imunogenicidade são mais bem representados numa biblioteca de anticorpos IgD humanos. A IgD é expressa como receptor de antigénios de membrana, conjuntamente com a IgM de superfície em linfócitos B maduros não sensibilizados, que entram em folículos primários durante o seu tráfego para, e entre, os órgãos linfóides secundários, a menos que tenham encontrado um auto-antigénio multivalente resultando em deleção clonal ou um auto-antigénio monovalente solúvel, tornando-os anérgicos e de vida curta, devido à exclusão de folículos primários. Além do repertório de anticorpos de linfócitos B maduros não sensibilizados, as bibliotecas de IgD humanas apenas representam ainda as células B de vida curta que foram tornadas anérgicas em contacto com auto-antigénio monovalente solúvel, mas provavelmente não contribuem com aglutinantes específicos para moléculas da superfície de células humanas que se assemelham a auto-antigénios multivalentes que induzem deleção clonal em vez de anergia em células B.

Numa outra concretização preferida do método da invenção, o dito sistema de exposição in vitro é um sistema de exposição em fagos. O sistema de exposição em fagos foi convenientemente usado no passado para a selecção de uma variedade de péptidos e proteínas que se ligam a alvos específicos. Com base neste conhecimento, as cadeias de imunoglobulina, VH e VL podem ser convenientemente clonadas em vectores que também compreendem moléculas úteis para os sistemas de exposição em fagos. Estas moléculas e vectores são, respectivamente, bem conhecidos na arte (Winter, supra; Barbas, METHODS: A Companion to Methods in Enzymalogy 2 (1991), 119 - 124) e não precisam ser aqui explicados com mais detalhes. 86 428 ΕΡ 0 970 126/ΡΤ 9

Numa outra concretização preferida do método da invenção, a dita combinação de cadeias rearranjadas é expressa a partir de uma ou mais bibliotecas diferentes.

Esta concretização é particularmente preferida, quando se sabe que uma cadeia VH ou VL se liga a um alvo específico e é seleccionada a segunda cadeia V correspondente que reconstitui ou aperfeiçoa a ligação.

Numa outra concretização preferida do método da invenção, o dito antigénio humano é um antigénio de tumor.

Se o antigénio humano é um antigénio de tumor, o dito antigénio é, de preferência, expresso sobre a superfície do dito tumor. Neste caso, as cadeias VH e VL são vantajosamente acopladas a uma toxina. O acoplamento pode ser efectuado ao nível do ácido nucleico por engenharia genética ou ao nível da proteína, por exemplo, por acoplamento químico. É particularmente preferido que o dito antigénio de tumor seja o antigénio 17-1 A.

Numa outra concretização particularmente preferida do método da invenção, a dita cadeia VH compreende uma das duas sequências mostradas na Figura 7 (nucleótidos 1 a 381) e Figura 8 (nucleótidos 1 a 339) e/ou a dita cadeia VL compreende uma das duas seguintes sequências mostradas na Figura 6 (nucleótidos 1 a 321) e a Figura 9 (nucleótidos 1 a 321). Os receptores com estas regiões VH e VL específicas, em que a dita região VL pode ser combinada com ambas as regiões VH, são os primeiros anticorpos humanos que são específicos para o antigénio humano 17-1 A.

Numa outra concretização preferida do método da invenção, a dita etapa de selecção envolve: (i) ligação do veículo de exposição que expressa um receptor de antigénio: (a) a um antigénio alvo imobilizado ou seus fragmentos; (b) a células opcionalmente marcadas que expressam o antigénio alvo ou seus fragmentos; ou (c) a um antigénio alvo solúvel, de preferência marcado, ou seus fragmentos; (ii) lavagem do veículo de exposição não especificamente ligado (a e b) e eluição subsequente do veículo de exposição especificamente ligada por meios não 10 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ específicos (por exemplo, tampão de baixo pH) ou por meios específicos (por exemplo, anticorpo específico para o antigénio alvo) ou (iii) enriquecimento positivo de veiculo de exposição ligado ao antigénio alvo (b e c) da solução de antigénio alvo ou de suspensões de células que expressam o antigénio alvo usando, por exemplo, contas magnéticas que se ligam ao antigénio alvo marcado ou a células marcadas que expressam o antigénio alvo, respectivamente; sendo os veículos de exposição assim isolados incluindo os seus receptores de antigénios, opcionalmente multiplicados por replicação e submetidos a mais ciclos de selecção in vitro, como descrito. O procedimento em duas etapas como definido na reivindicação 1, pode ser empregue usando um anticorpo molde específico para o antigénio alvo, de uma espécie diferente, por exemplo, um anticorpo monoclonal de murino contra o antigénio alvo humano. Primeiro, um repertório de VL ou VH humanas é combinado com uma cadeia única VH ou VL substituta do anticorpo molde de murino, exibido, por exemplo, sobre fago filamentoso e seleccionado in vitro quanto à ligação ao antigénio. Deste modo, o tamanho da biblioteca completo está exclusivamente disponível para o repertório de VL ou VH humanas e podem ser isoladas as cadeias VL ou VH humanas candidatas, que são capazes de contribuir para a ligação específica ao antigénio alvo humano. Numa segunda etapa, a região variável substituta do anticorpo molde é substituída pelo repertório da região variável humana correspondente, seguindo-se um segundo ciclo de selecção in vitro; de novo, o tamanho da biblioteca completa está exclusivamente disponível para um único repertório de região VH ou VL, possibilitando assim que muitos mais candidatos da região VH ou VL sejam pesquisados quanto à ligação ao antigénio, sob condições de tamanho de biblioteca limitada pelo procedimento em duas etapas do que por um procedimento numa única etapa.

Para clonagem das sequências de ADN codificando as regiões variáveis de anticorpos humanos que se ligam, especificamente, ao antigénio humano 17-1 A, este procedimento de selecção em duas etapas para pesquisa de bibliotecas de anticorpos combinatórios IgD humanos pelo método de exposição em fagos foi empregue com vantagem. Primeiro, o segmento de cadeia pesada Fd (VH+CH1) do anticorpo monoclonal de murino M79 (Gõttlinger, Int. J. Câncer 38 (1986), 47 -53) que se liga, especificamente, ao antigénio humano 17-1 A, foi combinado, respectivamente, com um repertório de cadeias leves capa e lambda humanas. As bibliotecas resultantes foram expostas em fago filamentoso e seleccionadas in vitro por vários ciclos de prospecção fpanning”) com antigénio humano 17-1A τ

86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ 11 recombinante imobilizado. Os fragmentos Fab solúveis foram expressos a partir de vários clones após cada ciclo de prospecção e pesquisados por ELISA quanto à ligação ao antigénio. [Cada uma das entidades de ligação forte enriquecidas durante o procedimento de prospecção provou conter a mesma cadeia leve capa humana, como confirmado por análise da sequência. Esta cadeia leve humana daqui por diante chamada K8 foi depois combinada com uma biblioteca de cadeias pesadas de IgD humana, que foi de novo exposta em fago filamentoso e seleccionada in vitro por vários ciclos de prospecção com antigénio humano 17-1A recombinante imobilizado. Vários fragmentos Fab foram expressos a partir de vários clones após cada ciclo de prospecção e de novo pesquisados por ELISA quanto à ligação ao antigénio], A análise da sequência das entidades de ligação enriquecidas durante o procedimento de prospecção revelaram duas regiões variáveis de cadeia pesada diferentes, chamadas D4.5 e D7.2, cada uma das quais que se combina com a cadeia leve K8, para formar diferentes locais de ligação ao antigénio humano com especificidade para o antigénio humano 17-1 A. Os repertórios de cadeias leves e pesadas humanas foram clonados a partir de várias preparações de ARN total isolado de amostras de sangue humano e medula óssea de vários doadores utilizando cadeia leve capa ou lambda específica, bem como cadeia pesada de IgD específica de RT-PCR. Como é impossível amplificar selectivamente o repertório de cadeias leves, que é combinado com cadeias pesadas de IgD in vivo, a menos que as células B positivas para IgD sejam purificadas para preparação do ARN, as bibliotecas de cadeias leves usadas não são limitadas ao repertório de anticorpos de linfócitos B maduros não sensibilizados ou anérgicos. No entanto, devido à predominância da cadeia pesada no reconhecimento do antigénio. esta não prejudica substancialmente as vantagens do repertório de IgD para selecção de anticorpos humanos para auto-antigénios. Ainda, e de forma mais importante, devido à exposição ao sistema imunitário humano, a selecção destas cadeias leves garante ainda um perfil de baixa imunogenicidade em seres humanos.

Numa outra concretização particularmente preferida do método da invenção, a dita cadeia substituída é uma cadeia VH ou VL de ratinho.

Numa outra concretização preferida do método da invenção, a dita selecção de uma combinação adequada envolve: (a) o teste de uma e da mesma cadeia VH em combinação com uma variedade de diferentes cadeias VL, para ligação ao dito antigénio humano; ou 12 12 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ ί/-~ (b) ο teste de uma e da mesma cadeia VL em combinação com uma variedade de diferentes cadeias VH, para ligação ao dito antigénio humano.

Esta concretização é vantajosamente empregue de novo, quando se sabe que as cadeias VL ou VH interagem especificamente com a molécula alvo humana. Depois, uma segunda cadeia apropriada pode ser seleccionada com base, de preferência, numa ligação aperfeiçoada à molécula alvo.

Numa outra concretização preferida do método da invenção, o dito método compreende as etapas de obtenção, após selecção, das cadeias humanas VH ou VL ou dos ácidos nucleicos correspondentes e a fusão das ditas cadeias com as mesmas ou outras cadeias VH ou VL, com regiões constantes de imunoglobulina de cadeias pesadas (CH) ou leves (CL) ou partes destas ou com outras moléculas biologicamente activas, tais como péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, pequenos compostos orgânicos, hormonas, transmissores neurais, péptidomímicos, PNA (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879 - 880; Hupp, Cell 83 (1995), 237 - 245; Gibbs e Oliff, Cell 79 (1994), 193 - 198). A outra molécula funcional pode ser fisicamente ligada, por exemplo, por meios químicos, a cadeias VH ou VL ou pode ser fundida por técnicas de ADN recombinante bem conhecidas na arte.

Esta concretização da invenção é particularmente útil para o desenvolvimento de drogas específicas, que podem ser usadas para atingir antigénios desejados no corpo humano. Por exemplo, se os antigénios de tumor são atingidos, as cadeias VH ou VL podem, ao nível do ácido nucleico ou dos aminoácidos, ser fundidas a uma porção de toxina, resultando, assim, uma imunotoxina, à porção extraceluiar de um receptor celular ou a uma citóquina solúvel ou partes desta, respectivamente, resultando assim construções que melhoram a resposta imunitária antitumoral ou um fragmento Fv de anticorpo, resultando, assim, um derivado de anticorpo biespecífico.

Numa outra concretização particularmente preferida do método da invenção, as ditas cadeias de regiões constantes são derivadas de lgG1 ou lgG3 humanas.

As cadeias de regiões constantes de IgG 1 ou lgG3 humanas são usadas, de preferência, se as células que expressam o antigénio alvo devem ser destruídas no corpo humano. É bem conhecido na arte que estas subclasses de IgG mediam, eficientemente, a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e 13 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ contribuem para a destruição das células reconhecidas e ligadas pòr estas subclasses de anticorpos.

Numa outra concretização preferida do método da invenção, as ditas cadeias VH e/ou VL são acopladas a fármacos não proteínicos, de preferência, de baixo peso molecular, tais como radioisótopos ou substâncias usadas para quimioterapia, resultando, assim, um direccionamento in vivo mais específico dos ditos fármacos.

Numa outra concretização preferida do método da invenção, as ditas cadeias VH ou VL são expressas a partir de sequências de ácido nucleico, que são o resultado da amplificação RT-PCR de ARNm derivado de linfócitos B humanos maduros essencialmente não sensibilizados. É preferido amplificar as cadeias VH ou VL por PCR-RT, uma vez que a sua fonte adequada tenha sido identificada e isolada. É preferido usar o ARNm de células nucleadas de medula óssea humana ou, com maior preferência, de sangue humano, para amplificação de cadeias VH ou VL por PCR-RT, pois estes dois compartimentos de tecido são as fontes de células B mais facilmente acessíveis em seres humanos. Prefere-se ainda isolar os linfócitos B maduros não sensibilizados a partir de células nucleadas dos ditos compartimentos de tecidos utilizando, por exemplo, contas magnéticas ou citometria de fluxo com base na classificação de células antes da preparação do ARN. Este procedimento garante que ambas as cadeias VH e VL amplificadas por PCR-RT sejam derivadas da população preferida de células B. Alternativamente, se o ARNm da fracção integral de células nucleadas dos ditos compartimentos de tecido for usado para amplificar as cadeias VH ou VL por PCR-RT, é preferível amplificar a região VH, como metade do segmento Fd de cadeia pesada (VH-CH1) de IgD humana utilizando um iniciador de PCR em 3' específico de IgD, por exemplo, o que está incluído na tabela 1, que origina exclusivamente, produtos de PCR a partir da cadeia pesada de IgD humana, expressos em linfócitos B humanos maduros não sensibilizados.

Quando se aplica o método da invenção, obtém-se um receptor de antigénios anti-humanos, de baixa imunogenicidade ou não imunogénico em seres humanos. O receptor compreende uma combinação de cadeias VH e VL funcionalmente rearranjados, de preferência, de linfócitos B humanos maduros não sensibilizados. Tal como atrás referido, é obtenível pelo método de acordo com a invenção descrito acima.

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As vantagens do anticorpo obtenível pelo método da invenção foram descritas acima. Tem-se que enfatizar que ainda não tinham sido isolados na arte anticorpos correspondentes dirigidos contra antigénios humanos e derivados de fontes humanas, tendo assim os ditos anticorpos pouca ou nenhuma imunogenicidade em seres humanos. Consequentemente, os anticorpos proporcionados pela invenção são o ponto de partida de um novo desenvolvimento global de anticorpos que podem ser usados em vários campos da medicina e da farmácia.

Numa concretização preferida adicional do método da invenção, o receptor é um anticorpo ou um seu fragmento.

Numa outra concretização preferida do método da invenção, o receptor é específico para um antigénio de tumor humano, mais preferivelmente, para o antigénio humano 17-1 A. A invenção refere-se ainda a um receptor, em que a dita cadeia VH compreende uma das sequências mostradas na Figura 7 (nucleótidos 1 a 381) e na Figura 8 (nucleótidos 1 a 339) e/ou a dita cadeia VL compreende uma das duas seguintes sequências mostradas na Figura 6 (nucleótidos 1 a 321) e na Figura 9 (nucleótidos 1 a 321).

Além do mais, pode ser proporcionado, com base na descrição deste pedido, um estojo compreendendo uma combinação de cadeias VH e VL de imunoglobulina funcionalmente rearranjadas, em que pelo menos uma das cadeias VH e VL é derivada de linfócitos B humanos maduros não sensibilizados, sendo as ditas cadeias expressáveis a partir de vectores recombinantes de um sistema de exposição in vitro. O dito estojo é vantajosamente usado na aplicação do método da invenção e, deste modo, na obtenção de receptores com a especificidade desejada.

De preferência, no dito estojo, o dito sistema de exposição in vitro é um sistema de exposição em fagos. A invenção refere-se ainda a um anticorpo caracterizado por ser derivado de sequências humanas e ser específico para o antigénio humano nativo 17-1 A. 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ 15

Com ο método da invenção, pela primeira vez foi desenvolvido um anticorpo humano que é específico para o antigénio humano nativo 17-1 A,. Como foi apontado acima, este desenvolvimento não foi uma tarefa trivial, uma vez que os anticorpos humanos contra antigénios associados a tumores humanos estão usualmente sujeitos a mecanismos que medeiam a auto-tolerância do sistema imunitário, resultando assim na eliminação de linfócitos B que expressam anticorpos auto-reactivos in vivo. Tentativas anteriores para obter anticorpos de baixa imunogenicidade específicos para o antigénio humano nativo 17-1 A, estavam limitadas à produção de anticorpos quiméricos ratinho/humano ainda portadores de regiões variáveis de murino (LoBuglio et ai, (1989), Proc. Natl. Acad. Sc. USA, 86:4220-4224) ou falhavam devido se obterem anticorpos humanos que reagiam exclusivamente com epítopos artificiais do antigénio 17-1A recombinante (Hoess et ai, Proc. Am. Ass. Câncer Res., 38:30 (1997); de Kruif et ai, J. Moi Biol., 248:97-105 (1995)). Entre os antigénios associados a tumores conhecidos, o 17-1A é de longe o mais ubiquamente expresso numa ampla gama de tecidos epiteliais normais do que outros antigénios de tumores, além da sua expressão em tumores epiteliais.

Portanto, o antigénio 17-1A é actualmente considerado como representando um antigénio pan-epitelial em vez de um antigénio de tumor que se pensou ser aquando da sua primeira descrição. Em comparação, outros denominados antigénios de tumores encontrados em tumores epiteliais, como erb-B2 (Her 2/neu), Muc-1 (PEM) ou o antigénio Thomson-Friedenreich, apresentam normalmente um padrão de expressão muito mais restrito em tecidos epiteliais normais. Deste modo, a força selectiva de auto-tolerância contra linfócitos B expressando anticorpos 17-1A reactivos, mesmo com baixa afinidade, prevê-se excepcionalmente alta, uma vez que parece praticamente impossível que estas células B evitem os encontros com o antigénio 17-1A por períodos de tempo mais longos, devido à ubiquidade deste antigénio. Portanto, verificou-se, surpreendentemente, de acordo com a presente invenção, que os anticorpos 17-1A específicos, ou pelo menos as cadeias pesadas correspondentes, podem ser isolados do repertório de anticorpos de células B humanas, tais como, por exemplo, linfócitos B maduros não sensibilizados. Sabe-se que estas células B têm uma semivida in vivo longa e já foram tratados para evitar destituição antes da sua maturação, apesar da presença do antigénio 17-1A mesmo no local de maturação; a anergia da célula B não ocorre no caso do antigénio 17-1 A, pois este tipo de tolerância de células B é apenas induzida pelo auto-antigénio solúvel. Apenas células B de longa vida, que foram

86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ 16 tratadas para sobreviver, apesar do seu potencial de reactividade com 17-1 A, representam um repertório de regiões variáveis de imunoglobulina humana com probabilidade de serem bem toleradas pelo sistema imunitário humano, quando usado para a construção de anticorpos e derivados de anticorpos humanos concebidos para serem repetidamente administrados por via sistémica a seres humanos, uma vez que já tinha sido pesquisado quanto sequências imunogénicas e, subsequentemente, lhe tinham sido eliminadas essas sequências imunogénicas através da função de vigilância do sistema imunitário. Portanto, a presente invenção também se refere a anticorpos humanos específicos para o antigénio 17-1A nativo e adequados para aplicação in vivo repetida, independentemente do método pelo qual são obtidos, uma vez que é altamente esperado que sequências de anticorpos humanos com a dita alta compatibilidade in vivo sejam também encontradadas no repertório de células B de seres humanos saudáveis, por exemplo, pelo método da invenção. Consequentemente, pela primeira vez foi agora desenvolvido um anticorpo humano que pode ser vantajosamente usado na monitorização e/ou na destruição de células de tumores portadoras do antigénio 17-1 A.

Deste modo, o anticorpo da invenção, vantajosamente, tem baixa imunogenicidade ou não é imunogénico em seres humanos. Numa concretização preferida, o dito anticorpo é obtenível de acordo com um método descrito acima. Noutra concretização preferida, o anticorpo da invenção reconhece um epítopo do domínio extracelular do antigénio 17-1A compreendendo, de preferência, pelo menos uma sequência de aminoácidos dos péptidos de N—. 8, 11, 13, 14, 59, 60, 77 e 79. De preferência, a cadeia VH do anticorpo da invenção compreende, pelo menos, uma CDR de uma das duas sequências seguintes mostradas na Figura 7 (nucleótidos 1 a 381) e na Figura 8 (nucleótidos 1 a 339) e/ou a cadeia VL compreende pelo menos uma CDR das duas sequências seguintes mostradas na Figura 6 (nucleótidos 1 a 321) e na Figura 9 (nucleótidos 1 a 321). É particularmente preferido um anticorpo no qual a dita cadeia VH compreende uma das duas sequências seguintes mostradas na Figura 7 (nucleótidos 1 a 381) e na Figura 8 (nucleótidos 1 a 399) e/ou a dita cadeia VL compreende uma das duas seguintes sequências mostradas na Figura 6 (nucleótidos 1 a 321) e na Figura 9 (nucleótidos 1 a 321).

Concluiu-se que este receptor e, de preferência o repertório de anticorpos seleccionado quanto a baixa imunogenicidade, é mais bem representado numa biblioteca de anticorpos IgD humanos. A IgD é expressa como receptor de

86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ antigénios de membrana, juntamente com a IgM de superfície em linfócitos B maduros não sensibilizados que entram nos folículos primários durante o seu tráfego para, e entre, os órgãos linfóides secundários, a menos que tenham encontrado um auto-antigénio multivalente, resultando em deieção clonal, ou um auto-antigénio monovalente solúvel, tornando-os anérgicos e de vida curta devido à exclusão de folículos primários. Excepto linfócitos B maduros não sensibilizados, as bibliotecas de IgD humana apenas representam o repertório de anticorpos de células B de vida curta que tinham sido tornadas anérgicas em contacto com o auto-antigénio monovalente, mas provavelmente não contribuem para entidades de ligação específicas para moléculas de superfície de células humanas que se assemelham a auto-antigénios multivalentes que induzem deieção clonal em vez de anergia de células B.

Adicionalmente, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica, compreendendo pelo menos um dos receptores mencionados acima, sozinhos ou em combinação, e opcionalmente, um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Os exemplos de transportadores farmacêuticos adequados são bem conhecidos na arte e incluem soluções salinas tamponadas com fosfato, água, emulsões tais como emulsões de óleo/água, vários tipos de agentes molhantes, soluções estéreis, etc. As composições compreendendo estes transportadores podem ser formuladas por métodos convencionais bem conhecidos.

Estas composições farmacêuticas podem ser administradas ao indivíduo numa dose adequada. A administração das composições adequadas pode ser efectuada por diferentes vias, por exemplo, por administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, tópica ou intradérmica.

Deste modo, os receptores da presente invenção e suas partes podem ser utilizados para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento, prevenção e/ou atraso de um tumor, num indivíduo, de preferência, quando o tumor é de origem epitelial.

As figuras mostram:

Figura 1: Local de clonagem de pComb3H com os locais de restrição importantes. Foram usadas as seguintes abreviaturas: P, promotor; VL, domínio de cadeia leve variável; CL, domínio de cadeia leve constante; VH, domínio de cadeia 18 86 428 ΕΡ 0 970 126/ΡΤ pesada variável; CH1, domínio 1 de cadeia pesada constante; L1/2, sequências de comando procarióticas. O domínio designado por gene III em pComb3H codifica para a parte não infecciosa do produto do gene III de fagos filamentosos como, por exemplo, VCSM13.

Figura 2: Esquema do plasmídeo pComb3H e o fago M13 completamente expresso. Em pComb3H, mostram-se a organização do comando (L) ompA, cadeia leve, comando (L) pelB, cadeia pesada e o gene III; O fago M13 completamente expresso expõe sobre a sua superfície o fenótipo de um certo fragmento de anticorpo Fab, consistindo numa cadeia leve e o segmento Fd (VH+CH1) de uma cadeia pesada ligada à parte não infecciosa do produto do gene III e contém o genótipo correspondente na forma de um ADN de cadeia simples codificando as cadeias pesada e leve do fragmento Fab exposto. A proteína do gene III infecciosa é proporcionada pelo fago auxiliar VCSM13.

Figura 3: ELISA de fragmentos Fab solúveis. Preparações de periplasma de fragmentos Fab solúveis, cada uma contendo o segmento Fd de M79 quimerizado e uma cadeia capa humana única por clone. As placas de ELISA foram incubadas de um dia para o outro com antigénio 17-1A solúvel. A detecção de fragmentos de anticorpos Fab ligados foi realizada com um anticorpo de imunoglobulina anti-humano policlonal conjugado com peroxidase. O ELISA foi finalmente desenvolvido por adição de uma solução de substrato de ABTS (ABTS = ácido 2,2-azino-bis (3-etilbenzotiazolino-6-sulfónico)) e a viragem do substrato foi medida a um comprimento de onda de 405 mm (eixo dos y). Os clones são apresentados no eixo dos x, onde o primeiro número indica o ciclo de prospecção, o segundo é o número do clone. Os clones 1.5-9 têm uma combinação de segmento Fd M79 quimérico com uma cadeia capa aleatória e representam controlos negativos.

Figura 4: ELISA de fragmentos Fab solúveis. Preparações de periplasma de fragmentos Fab solúveis, cada uma contendo a cadeia leve k8 e um único segmento Fd de cadeia delta de Ig humana. As placas de ELISA foram incubadas de um dia para o outro com antigénio 17-1A solúvel. A detecção de fragmentos de anticorpos Fab ligados foi realizada com um anticorpo policlonal de cadeia leve capa anti-humano, biotinilado, seguida por estreptavidina conjugada com peroxidase. O ELISA foi finalmente desenvolvido por adição de uma solução de substrato ABTS (ABTS = ácido 2,2-azino-bis(3-etilbenztiazolino-6-sulfónico) e a viragem do substrato foi medida a um comprimento de onda de 405 mm (eixo dos y). Os clones são apresentados no eixo dos x, onde o primeiro número indica o 19 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ ciclo de prospecção, ο segundo é o número do clone. Os clones 1.2-6 têm uma combinação de cadeia leve k8 com uma cadeia pesada delta de Ig aleatória e representam controlos negativos.

Figura 5: ELISA de fragmentos Fab solúveis. Preparações de periplasma de fragmentos Fab solúveis, cada uma contendo o segmento D4.5 Fd e uma cadeia capa humana única por clone. As placas ELISA foram incubadas de um dia para o outro com antigénio 17-1A solúvel. A detecção de fragmentos de anticorpos Fab ligados foi realizada com um anticorpo policlonal de cadeia leve capa anti-humano biotinilado, seguida por estreptavidina conjugada com peroxidase. O ELISA foi finalmente desenvolvido por adição de uma solução de substrato ABTS (ABTS = ácido 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfónico) e a viragem do substrato foi medida a um comprimento de onda de 405 mm (eixo dos y). Os clones são apresentados no eixo dos x, onde o primeiro número indica o ciclo de prospecção, o segundo é o número do clone; S. é a abreviatura para os clones antes do primeiro ciclo de selecção. Os clones S.1-3 têm uma combinação de cadeia leve k8 com um segmento Fd de cadeia pesada delta de Ig aleatória e representam controlos negativos.

Figura 6; Sequência de ADN e da proteína da região variável da cadeia leve capa 8 humana. Os números indicam as posições dos nucleótidos (nt), os aminoácidos são apresentados no código de letra única. CDR1 inclui do nt 70 ao nt 102, CDR2 do nt 148 ao nt 168, CDR3 do nt 265 ao nt 294.

Figura 7: Sequência de ADN da região variável de cadeia pesada D4.5 humana. Os números indicam as posições dos nucleótidos (nt), os aminoácidos são apresentados no código de letra única; CDR1 inclui do nt 91 ao nt 105, CDR2 do nt 148 ao nt 198, CDR3 do nt 292 ao 351. O limite entre a região variável de cadeia pesada e o domínio CH1 da região constante delta de ig localiza-se entre o nt 382 e o nt 383 iniciando-se a sequência da proteína da região constante delta no nt 384.

Figura 8: Sequência de ADN da região variável de cadeia pesada D7.2 humana. Os números indicam as posições dos nucleótidos (nt), os aminoácidos são apresentados no código de letra única; CDR1 inclui do nt 91 ao nt 105, CDR2 do nt 148 ao nt 198, CDR3 do nt 292 ao 309. O limite entre a região variável de cadeia pesada e o domínio CH1 da região constante delta de Ig localiza-se entre o nt 340 e o nt 341 iniciando-se a sequência da proteína da região constante delta no nt 343.

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Figura 9: Sequência de ADN e da proteína da região variável de cadeia leve capa 5.1 humana. Os números indicam as posições dos nucleótidos (nt), os aminoácidos são apresentados no código de letra única. CDR1 inclui do nt 70 ao nt 102, CDR2 do nt 148 ao nt 168, CDR3 do nt 265 ao nt 294.

Figura 10: Análise de citometria de fluxo de fragmentos de anticorpos Fab e anticorpo de controlo M79, em células Kato positivas para 17-1A para o teste da actividade de ligação de uma preparação de periplasma contendo o fragmento k8-D4.5-Fab. As células Kato foram incubadas com I) preparação de periplasma irrelevante, II) 10 pg/ml de M79 quimérico (bivalente!), III) preparação de periplasma k8-D4.5 e IV) diluição 1:10 de preparação de periplasma K8-D4.5. Os números de células relativos são apresentados no eixo dos y, a intensidade de fluorescência relativa é apresentada no eixo dos x.

Figura 11: Análise de citometria de fluxo de fragmentos de anticorpos Fab e anticorpos completos em células Kato positivas para 17-1 A, células CHO transfectadas e não transfectadas com 17-1 A, respectivamente, para o teste da actividade de ligação de preparações de periplasma (pp) contendo o fragmento k8-D4.5-Fab, o k5.1-D4.5-Fab ou um k-D4.5-Fab irrelevante. As células Kato foram incubadas I) com pp irrelevante (linha tracejada) ou com k5.1-D4.5-pp (linha contínua), ou II) com 20 ,ug/ml de anticorpo M79 (linha contínua) ou o controlo de isótipo lgG2a de murino correspondente (linha tracejada). As células CHO transfectadas com 17-1A foram incubadas III) com pp irrelevante (linha tracejada) ou k5.1-D4.5-pp (linha contínua), IV) com pp irrelevante (linha tracejada) ou k8-D4.5-pp (linha contínua), ou V) com 20 ,ug/ml de anticorpo M79 (linha contínua) ou o controlo de isótipo lgG2a de murino correspondente (linha tracejada). Em III), IV) e V) a incubação e a detecção de pp relevante (k5.1-D4.5Fab-pp e k8-D4.5-Fab-pp, respectivamente) e do anticorpo de murino M79 também foram realizadas em células CHO não transfectadas (linhas ponteadas). Os números de células relativos são mostrados no eixo dos y, a intensidade de fluorescência relativa é mostrada no eixo dos x.

Figura 12: Local de clonagem de pEF-ADA com os locais de restrição importantes. Foram usadas as seguintes abreviaturas: P, promotor; VL, domínio de cadeia leve variável; CL, domínio de cadeia leve constante; Leuc, sequência de comando eucariótica. 21 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ

Figura 13: Local de clonagem de pEF-DHFR com os locais de restrição importantes. Foram usadas as seguintes abreviaturas: P, promotor; VH, domínio de cadeia pesada variável; CH1/2/3, domínio 1/2/3 de cadeia pesada constante; Leuc, sequência de comando eucariótica.

Figura 14: SDS-PAGE de preparações de anticorpo humano H79. Testaram-se aproximadamente 10 ng de cada anticorpo num gel de poliacrilamida desnaturante a 12,5%, sob condições redutoras e não redutoras, e corado com azul de Coomassie.

Pista T. marcador (PM [kDa] de bandas simples no lado esquerdo do gel);

Pista 2: versão de lgG1 humana H79 (não redutora);

Pista 3: versão de lgG1 humana H79 sob condições redutoras;

Pista 4: versão de IgG 1 de murino H79 (não redutora);

Pista 5: versão de IgG 1 de murino H79 sob condições redutoras;

Figura 15: SDS-PAGE de preparações dos anticorpos humanos H79 e HD70. Correram-se 10 ,ug de H79 e 3,5 ,ug de HD70 em gel de poliacrilamida desnaturante a 12,5% sob condições não redutoras (gel 1) e redutoras (gel 2) e corado com azul de Coomassie;

Gel 1:

Pista 1: marcador (PM [kDa] de bandas simples no lado esquerdo do gel);

Pista 2: versão de IgG 1 humana H79 (não redutora);

Pista 3: versão de IgG 1 humana HD70 (não redutora);

Gel 2:

Pista 4: marcador (PM [kDa] de bandas simples no lado esquerdo do gel);

Pista 5: versão de IgG 1 humana H79 sob condições redutoras;

Pista 6: versão de lgG1 humana HD70 sob condições redutoras;

Figura 16: Análise de citometria de fluxo de células Kato positivas para 17-1A para o teste da actividade de ligação de IgG 1 humana H79 purificada, bem como de lgG1 de murino H79 purificada. As células Kato foram incubadas com controlos de isótipo de IgG (10 iig/ml de lgG1 humana e lgG1 de murino, respectivamente), controlos positivos (M79 e M74 quimerizado a 10 ,ug/ml, respectivamente; (ambos específicos para 17-1 A) e com lgG1 humana H79 ou lgG1 de murino H79 (10 Lig/ml e 1 Lig/ml de cada). Os números de células relativos 22 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ são mostrados no eixo dos y, a intensidade de fluorescência relativa é mostrada no eixo dos x.

Figura 17: Análise de citometria de fluxo de anticorpos (concentração: 20 μ g/ml cada) em células Kato positivas para 17-1 A, células CHO transfectadas e não transfectadas com 17-1 A, para teste da actividade de ligação dos anticorpos purificados lgG1 humana H79, lgG1 de murino H79, HD70, D7.2, M79, Panorex e controlos de isótipo (IgG 1 humana, lgG1 de murino e 2a.); 0 lgG1 humana H79 (linha contínua) e controlo de isótipo de IgG 1 (linha tracejada) em células Kato; II) lgG1 de murino H79 (linha contínua) e controlo de isótipo IgG 1 de murino em células Kato (linha tracejada); III) HD70 (linha contínua) e controlo de isótipo de lgG1 humana (linha tracejada) em células Kato; IV) D7.2 (linha contínua) e controlo de isótipo de IgG 1 humana (linha tracejada) em células Kato; V) M79 (linha contínua) e controlo de isótipo de lgG2a de murino (linha tracejada) em células Kato; VI) Panorex (linha contínua) e controlo de isótipo de lgG2a de murino (linha tracejada) em células Kato; VII) lgG1 humana H79 (linha contínua) e controlo de isótipo de lgG1 humana (linha tracejada) em células CHO transfectadas com 17-1 A; VIII) IgG 1 de murino H79 (linha contínua) e controlo de isótipo de IgG 1 de murino (linha tracejada) em células CHO transfectadas com 17-1 A; IX) HD70 (linha contínua) e controlo de isótipo de lgG1 humana (linha tracejada) em células CHO transfectadas com 17-1 A; X) D7.2 (linha contínua) e controlo de isótipo de lgG1 humana (linha tracejada) em células CHO transfectadas com 17-1 A; XI) M79 (linha contínua) e controlo de isótipo de lgG2a de murino (linha tracejada) em células CHO transfectadas com 17-1 A; XII) Panorex (linha contínua) e controlo de isótipo de lgG2a de murino (linha tracejada) em células CHO transfectadas com 17-1 A. As Figuras VII - XII também mostram os resultados da incubação e da detecção dos anticorpos relevantes em células CHO não transfectadas (linha ponteada).

Figura 18: Ensaio de citotoxicidade celular dependente de anticorpos de 51Cr. Para libertação de 51Cr, incubaram-se células mononucleares de sangue periférico humano não estimuladas (PBMC, 5x105 células), como células efectoras, com células alvo marcadas (células Kato marcadas durante 2 h com 01 Cr) e anticorpos em diferentes concentrações durante 4 ou 20 h a 37°C. Os isótipos que não se ligam, correspondentes, (h-lgG = lgG1 humana; m-lgG2a = lgG2a de murino) foram usados como controlos negativos (H79 = H79hulgG1). A lise específica foi calculada como ((cpm, libertação experimental) - (cpm, libertação espontânea))/((cpm, libertação máxima) - (cpm, libertação espontânea)).

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Figura 19: Fotografia ao microscópio óptico de tecido de cólon humano saudável corado com controlo de M79 (positivo). Incubaram-se criosseções de 5 nm de tecido de mucosa normal com o anticorpo M79 de murino (lgG2a) como controlo positivo (10 ,ug/ml). A detecção de anticorpos de murino ligados foi realizada com um anticorpo policlonal Ig anti-ratinho conjugado com peroxidase e coloração com carbazol (castanho). A contracoloração foi realizada com hemalaun (azul).

Figura 20: Fotografia ao microscópio óptico de tecido de cólon humano saudável corado com lgG1 de murino H79. Incubaram-se criosseções de 5 nm de tecido de mucosa normal com a versão de IgG de murino do anticorpo H79 (10 μ g/ml). A detecção de anticorpos lgG1 de murino ligados foi realizada com um anticorpo policlonal Ig anti-ratinho conjugado com peroxidase e coloração com carbazol (castanho). A contracoloração foi realizada com hemalaun (azul).

Figura 21: Fotografia ao microscópio óptico de carcinoma de cólon corado com M79 (controlo positivo). Incubaram-se criosseções de 5 nm de carcinoma de cólon com o anticorpo M79 de murino (lgG2a) como controlo positivo (10 pg/ml). A detecção de anticorpos de murino ligados foi realizada com um anticorpo policlonal Ig anti-ratinho conjugado com peroxidase e coloração com carbazol (castanho). A contracoloração foi realizada com hemalaun (azul).

Figura 22: Fotografia ao microscópio óptico de carcinoma de cólon corado com IgG 1 de murino H79. Incubaram-se criosseções de 5 nm de carcinoma de cólon com a versão IgG 1 de murino do anticorpo H79 (1(^ug/ml). A detecção de anticorpos lgG1 de murino ligados foi realizada com um anticorpo policlonal Ig anti-ratinho conjugado com peroxidase e coloração com carbazol (castanho). A contracoloração foi realizada com hemalaun (azul).

Figura 23: Fotografia ao microscópio óptico de tecido de cólon humano corado com controlo de isótipo de lgG2a de murino. Incubaram-se criosseções de 5 nm de tecido de mucosa normal com anticorpo lgG2a de murino irrelevante como controlo negativo (10 ug/ml). A detecção de anticorpos de murino ligados foi realizada com um anticorpo policlonal Ig anti-ratinho conjugado com peroxidase e coloração com carbazol (castanho). A contracoloração foi realizada com hemalaun (azul).

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Figura 24: Fotografia ao microscópio óptico de tecido de cólon humano saudável corado com controlo de isótipo lgG1. Incubaram-se criosseções de 5 nm de tecido de mucosa normal com anticorpo lgG1 de murino irrelevante como controlo negativo (10 ,ug/ml). A detecção de anticorpos de murino ligados foi realizada com um anticorpo policlonal Ig anti-ratinho conjugado com peroxidase e coloração com carbazol (castanho). A contracoloração foi realizada com hemalaun (azul).

Figura 25: Fotografia ao microscópio óptico de tecido de carcinoma de cólon humano corado com controlo de isótipo lgG2a de murino. Incubaram-se criosseções de 5 nm de tecido de mucosa normal com o anticorpo lgG2a de murino irrelevante como controlo negativo (10 ,ug/ml). A detecção de anticorpos de murino ligados foi realizada com um anticorpo policlonal Ig anti-ratinho conjugado com peroxidase e coloração com carbazol (castanho). A contracoloração foi realizada com hemalaun (azul).

Figura 26: Fotografia ao microscópio óptico de tecido de carcinoma de cólon humano corado com controlo de isótipo igG1. Incubaram-se criosseções de 5 nm de tecido de mucosa normal com anticorpo IgG 1 de murino irrelevante como controlo negativo (10 Lig/ml). A detecção de anticorpos de murino ligados foi realizada com um anticorpo policlonal Ig anti-ratinho conjugado com peroxidase e coloração com carbazol (castanho). A contracoloração foi realizada com hemalaun (azul).

Figura 27: Análise dos epítopos do anticorpo de murino M79 e dos anticorpos humanos H79 e HD70, cada um dos quais é específico para o antigénio 17-1A humano. Os anticorpos foram incubados com uma disposição de grade de péptidos compreendendo 119 polipéptidos de 13 aminoácidos, deslocados dois aminoácidos e cobrindo toda a sequência de aminoácidos extracelular do antigénio 17-1A humano. Os péptidos foram ligados covalentemente nos seus terminais C a uma membrana Pep Spots (Jerini Biotools, Berlim) na forma de pontos individuais. O anticorpo M79 de murino ligado foi directamente detectado na membrana Pep Spots por um anticorpo imunoglobulina anti-murino acoplado a peroxidase de rábano silvestre (HRP) por quimioluminescência. Os sinais que são devidos à reactividade do anticorpo secundário sozinho com pontos de péptidos únicos são mostrados na coloração de controlo correspondente da membrana Pep Spots. Por subtracção da coloração de fundo principal no ponto do péptido 87, os pontos dos péptidos 38 e 95 alteraram-se representando a ligação específica de anticorpo de 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ

murino Μ79. Devido a um grau mais elevado de reactividade cruzada do anticorpo imunoglobulina anti-humano conjugado com HRP secundário com vários pontos de péptidos, os anticorpos humanos ligados H79 e HD70 foram transferidos da membrana Pep Spots para uma membrana de transferência, respectivamente, por meio de electrotransferência e subsequentemente foram detectados pelo dito anticorpo secundário anti-humano e quimioluminescência. A ligação específica do anticorpo humano H79 podia ser detectada principalmente nos pontos dos péptidos 8, 11, 13, 14, 59 - 60, 77 e 79; contudo, não foi detectada qualquer ligação no caso do anticorpo humano HD70.

Os seguintes exemplos ilustram a invenção.

Exemplo I: Construção das bibliotecas de anticorpos combinatórios e exposição em fagos

Uma biblioteca de fragmentos Fd-ADN de cadeia leve de imunoglobulina (Ig) e de cadeia pesada Ig humana foi construída por RT-PCR com conjuntos de iniciadores específicos capa, lambda e delta Fd no ARN total preparado a partir de amostras de linfócitos de sangue periférico (PBL) e de medula óssea de quatro e dez doadores humanos, respectivamente, de acordo com Chomczynski, Analytical Biochemistry 162 (1987), 156 - 159. O ADNc foi sintetizado de acordo com os métodos Standard (Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, segunda edição).

Foram escolhidos os seguintes conjuntos de iniciadores, que originam um local de reconhecimento Xhol a 5' e um Spel a 3' para os fragmentos de cadeia pesada e um local de reconhecimento Saci a 5' e um Xbal a 3' para as cadeias leves:

Para a amplificação por PCR dos fragmentos de ADNc Fd, cada um de cinco diferentes iniciadores específicos da família 5’-VH foi combinado com um iniciador 3'-CH1 delta; para a amplificação por PCR dos fragmentos de cadeia leve capa (K), cada um de cinco diferentes iniciadores específicos de família 5'-VK foi combinado com um iniciador 3-CK e para a amplificação dos fragmentos de cadeia leve lambda (L), cada um de oito diferentes iniciadores específicos de família 5'-VL foi combinado com um iniciador 3'-CL delta. 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ 26

Os conjuntos de iniciadores para a amplificação dos fragmentos de ADN Fab (5' para 3’) são mostrados na Tabela I abaixo.

Foi usado o seguinte programa de PCR para amplificação: desnaturação a 94°C por 15 segundos, hibridação do iniciador a 52°C por 50 segundos e prolongamento do iniciador a 72°C por 90 segundos por 40 ciclos, seguida por um prolongamento final de 10 minutos a 72°C. 27 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ

Tabela I: Conjuntos de iniciadores

Fragmento Fd de cadeia pesada: iniciador 5’:

VH1,3,5,7: AGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGG VH2: C AG (AG )TC ACCTTGCT CG AGTCTG G

VH4: CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGG

VH4B: CAGGTGCAGCTACTCGAGTGGGG

VH6: CAGGTACAGCTGCT CG AGT CAGG iniciador 3':

CD1: TGCCTTACTAGTCTCTGGCCAGCGGAAGAT fragmento de cadeia capa: iniciador 5':

VK1: G AGCCGC ACG AGCCCGAGCTCCAG AT G ACCC AGT CT CC

VK3: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTG(AT)TGAC(AG)CAGTCTCC

VK2/4: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGATGAC(CT)CAGTCTCC

VK5: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCACACTCACGCAGTCTCC

VK6: GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGT GCTG ACT CAGTCTCC iniciador 3': CK1D:

GCGCCGTCTAGAATTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGA

CGGGCGAACTCAG fragmento de cadeia lambda: iniciador 5': > 86 428 ΕΡ 0 970 126/ΡΤ 28

VL1: ΑΑΤΤΤΤ GAGCTCACT CAGCCCCAC

VL2: Τ CT GCCG AGCT CCAGCCT GCCT CCGTG

VL3: TCTGTGGAGCTCCAGCCGCCCTCAGTG

VL4: Τ CT GAAGAGCTCCAGGACCCTGTT GT GTCT GTG

VL5: CAGTCTGAGCTCACGCAGCCGCCC

VL6: CAGACT G AGCT CACTCAGG AGCCC

VL7: CAGGTTGAGCTCACTCAACCGCCC VL8: CAGGCTGAGCTCACTCAGCCGTCTTCC iniciador 3':

CL2: CGCCGTCTAGAATTATGAACATTCTGTAGG 450 ng dos fragmentos de cadeia leve capa (digeridos com Saci e Xbal) foram ligados com 1.400 ng do fagemídeo pComb3H (digerido com Saci e Xbal; fragmento ADN grande) derivado de pComb3 (Barbas, Proc. Natl. Acad. Sei U.S.A. 88 (1991) 7978 - 7982), em que a posição da cadeia pesada já foi ocupada pelo fragmento Fd do anticorpo de murino quimerizado M79 (contendo uma CH1 de IgG 1 humana) dirigido contra a parte extracelular da proteína 17-1A (consultar a Figura 1 para o local de clonagem de pComb3H). A biblioteca ADN de anticorpos combinatórios resultante foi depois transformada em 300 μΙ de Escherichia coli XL1 Blue electrocompetente por electroporação (2,5 kV, fenda da cuvete de 0,2 cm, 25 FD, 200 Ohm, Biorad gene-pulser), resultando assim num tamanho de biblioteca de 4 x 107 clones independentes. Após uma hora de expressão do fenótipo, os transformantes positivos foram seieccionados quanto a resistência à carbenicilina codificada pelo vector pComb. Após esta adaptação, estes clones foram infectados com uma dose infecciosa de 1 x 1012 partículas fágicas do fago auxiliar VCSM13, resultando a produção e a secreção de fagos M13 filamentosos, cada um contendo pComb3H-DNA de cadeia simples codificando uma cadeia leve humana única e o segmento Fd de M79 quimérico e apresentando o fragmento Fab correspondente sobre a superfície do fago na forma de uma fusão de tradução para a parte não infecciosa da proteína III de revestimento do fago (exposição do fago), consultar a Figura 2.

Esta biblioteca de fagos portadores do repertório de Fab clonado foi colhida do sobrenadante da cultura por precipitação em PEG8000/NaCI e centrifugação, 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ 29 redissolvida em TBS/BSA a 1% e incubada com S17-1A recombinante imobilizado em placas ELISA de 96 poços. O s17-1A foi preparado como descrito (Mack, Proc. Natl. Sei. U.S.A. 92 (1995) 7021 - 7025). Os fagos Fab que não se ligaram especificamente ao antigénio alvo foram eliminados através de até 10 etapas de lavagem com TBS/Tween a 0,5%. Os aglutinantes foram eluídos utilizando HCI -Glicina a pH 2,2 e após neutralização do eluato com Tris 2 M pH 12, usados para infecção de uma nova cultura E. coli XL1 Blue não infectada. As células foram transduzidas com sucesso com uma cópia do fagemídeo pComb, codificando um fragmento Fag de ligação ao antigénio, foram novamente seleccionadas quanto a resistência à carbenicilina e subsequentemente foram infectadas com fago auxiliar VCSM13, para iniciar o segundo ciclo de exposição do anticorpo e selecção in vitro.

Após cinco ciclos de produção e selecção de fagos Fab de ligação ao antigénio, foi preparado o ADN plasmídico contendo o repertório de Fab seleccionado.

Para a produção de proteínas Fab solúveis, o fragmento de ADN do gene III foi excisado dos plasmídeos, destruindo assim a fusão por tradução do segmento de cadeia pesada Fd com a proteína do gene III. Após nova ligação, este conjunto de ADN de plasmídeo foi transformado em 100 μΙ de E. coli XL1 Blue competente de choque térmico e plaqueou-se sobre Carbenecilina (Carb) LB-Ágar. As colónias únicas foram crescidas em 10 ml de culturas de LB-Carb/ MgCL 20 mM e a expressão de Fab foi induzida após seis horas por adição de isopropil^-D-tiogalactósido (IPTG) até uma concentração finai de 1 mM. Esta selecção in vitro, bem como a expressão de fragmentos Fab solúveis, foi realizada de acordo com Burton, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 88 (1991), 10134 - 10137. As células foram colhidas após 20 horas; a preparação de periplasma foi realizada por quatro ciclos de congelamento (etanol/gelo seco) e descongelamento (37°C) e testadas por ELISA quanto à ligação de fragmentos Fab a clones s17-1A. Vinte e três dos 27 clones apresentaram actividade de ligação. Após sequenciação, verificou-se que os dois clones com os sinais mais fortes (consultar a Figura 3) tinham cadeias capa idênticas e foram chamados k8; consultar a Figura 6.

Esta cadeia leve capa humana k8 foi então usada como um parceiro de ligação para o conjunto de cadeias pesadas delta de Ig humana; 2.250 ng de fragmentos de ADN Fd de cadeia pesada delta humanos (digeridos com Xhol e Spel) foram ligados a 7.000 ng do vector fagemídico pComb3H (digerido com Xhol

86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ 30 e Spel; grande fragmento de ADN) contendo o fragmento de ADN k8 na posição da cadeia leve. A escolha do repertório de cadeias delta humanas, como fonte de regiões variáveis de cadeia pesada, que se ligam, especificamente, ao antigénio 17-1 A, quando combinado com a cadeia leve k8, parece ser o mais adequado. As cadeias delta são apenas produzidas em células B anérgicas específicas não sensibilizadas maduras específicas para o auto-antigénio, que não sofreram ainda ou não vão sofrer proliferação; portanto; portanto, a diversidade do seu repertório de cadeias pesadas é mais elevado e o número de cada especificidade única é mais baixo, comparado com os repertórios de cadeias pesadas de outros isótipos de imunoglobulina. A transformação da biblioteca de fragmentos Fd pComb-k8-delta num total de 1 500 ui de E. coli XL1 Blue através de cinco electroporações iguais (2,5 kV, 0,2 cm de fenda da cuvete, 25 FD, 200 Ohm) resultou num número final de 1,1 x 109 clones independentes. A selecção in vitro desta biblioteca de anticorpos combinatórios foi realizada como descrito acima para o repertório de cadeias leves humanas. Após quatro ciclos de prospecção, os fragmentos Fab solúveis foram preparados a partir de oito clones.

As preparações de periplasma foram testadas em ELISA. Um dos clones apresentou forte ligação ao antigénio (consultar a Figura 4). Este clone foi chamado D4,5 e o ADN do fragmento Fd delta foi sequenciado com um iniciador específico de CH1 delta inverso (consultar a Figura 7).

Outro fragmento Fab de ligação a s 17-1A foi isolado após quatro ciclos de prospecção, aparecendo primeiro no sétimo ciclo com um sinal de ELISA acentuadamente mais fraco, comparado com o D4.5 (consultar a Figura 4). O clone foi designado como D7.2 e a sequência de ADN foi novamente determinada usando o iniciador específico de delta (consultar a Figura 8).

Para identificar outros parceiros de cadeia leve, que se combinam com o segmento Fd de cadeia pesada D4.5 delta, para formar um fragmento Fab específico i 7-1 A, realizou-se uma experiência de reembaralhamento.

86 428 ΕΡ 0 970 126/ΡΤ 31 450 ng de fragmentos de cadeia leve capa humanos e 450 ng de fragmentos de cadeia leve lambda humanos (ambos digeridos com Saci e Xbal) foram ambos ligados com 1.400 ng do fagemídeo pComb3H (digerido com Saci e Xbal; grande fragmento de ADN), em que a posição de cadeia pesada já foi ocupada pelo fragmento D4.5 Fd.

As bibliotecas de anticorpos combinatórios resultante (capa e lambda) foram depois ambas transformadas em 300 μΙ de Escherichia coli XL1 Blue electrocompetente por electroporação (2,5 kV, 0,2 cm de fenda da cuvete, 25 FD, 200 ohm, pulsador de genes Biorad), resultando assim num tamanho de biblioteca de 0,5 x 107 clones independentes para a biblioteca capa e de 1,4 x 107 clones independentes para a biblioteca lambda. Após uma hora de expressão de fenótipo, os transformantes positivos foram seleccionados para resistência de carbenecilina codificada pelo vector pComb, Após esta adaptação, estes clones foram infectados com uma dose infecciosa de 1 x 1012 partículas de fagos do fago auxiliar VCMS13, resultando em produção e secreção de fagos M13 filamentosos, cada um deles contendo pComb3H-ADN de CADEIA único codificando uma cadeia leve humana única e o segmento Fd de cadeia pesada D4.5 e exibição do fragmento Fab correspondente sobre a superfície do fago, como uma fusão de translação para a parte não infecciosa da proteína de revestimento de fago III.

Ambas as bibliotecas de fagos portando os repertórios Fab clonados (capa e lambda) foram colhidas do sobrenadante da cultura por precipitação e centrifugação com PEG8000/NaCI, redissolvidas em TBS/1% BSA e incubadas com s17-1A recombinante imobilizado em placas ELISA de 96 poços. Os fagos Fag que não se ligavam, especificamente, ao antigénio alvo, foram eliminados por até dez etapas de lavagem com TBS/0,5% Tween. Os aglutinantes de ambas as bibliotecas (capa e lambda) foram eluídos por uso de HCI-Glicina, pH 2,2, e após neutralização do eluato com Tris 2 M pH 12, usados para infecção de novas culturas E. coli XL1 Blue não infectadas, uma para a biblioteca capa e uma para a biblioteca lambda. As células transduzidas com sucesso com uma cópia de fagemídeo pComb, codificando um fragmento Fab de ligação de antigénio, foram novamente seleccionadas para resistência à carbenicilina e subsequentemente infectadas com fago auxiliar VCMS13, para iniciar o segundo ciclo de exposição e selecção in vitro do anticorpo, 32 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ

Após cinco ciclos de produção e selecção de fagos Fab de ligação em antigénio, as preparações de ADN de plasmídeo foram realizadas contendo o repertório Fab seleccionado de cada ciclo de prospecção, respectivamente.

Para a produção de proteínas Fab solúveis, o fragmento de ADN de gene III foi excisado dos plasmídeos, destruindo assim a fusão com translação do segmento de cadeia pesada Fd com a proteína de gene III. Após nova ligação, este conjunto de ADN de plasmídeo foi transformado em 100 μΙ de E. coli XL1 Blue competente a choque térmico e revestido sobre Carbenicilina (Carb) LB- Ágar. As colónias únicas foram crescidas em 10 ml de culturas LB-Carb/MgCb 20 mM e a expressão Fab foi induzida após seis horas por adição de Isopropil-P-D-tiogalactosido (IPTG), a uma concentração final de 1 mM. As células foram colhidas após 20 horas; a preparação do periplasma foi realizada por congelamento e descongelamento e testada por ELISA para ligação dos fragmentos Fab a s17-1 A.

No total, 45 clones da biblioteca capa e 45 clones da lambda derivaram, predominantemente, do quinto ciclo de prospecção, mas num menor grau também de outros ciclos foram testadas para ligação ao antigénio 17-1 A. Apenas um clone designado k5.1 (biblioteca capa), que apareceu no quinto ciclo, mostrou actividade de ligação (consultar a Figura 5). A sequência de ADN da região capa V de k5.1 foi determinada (consultara Figura 9).

Exemplo II: Expressão bacterial em £. coli XL1 Blue

Como mencionado acima no Exemplo I, E. coli XL1 Blue transformado com pComb3H, contendo um leve o segmento Fd de uma cadeia pesada, produziu Fab solúvel em quantidades suficientes após excisão do fragmento de gene III e indução com IPTG. O segmento Fd de cadeia pesada e a cadeia leve são exportados para o periplasma, quando montam e formam fragmentos Fab funcionais.

Para melhores preparações de periplasma, as células foram crescidas em meio SB suplementado com MgCh 20 mM e são redissolvidos em PBS após colheita. Após quatro ciclos de congelamento a -70°C e descongelamento a 37°C, a membrana externa das bactérias foi destruída pelo choque de temperatura e as proteínas periplasmáticas, incluindo os fragmentos Fab, foram liberadas para o sobrenadante. Após eliminação das células intactas e dos fragmentos de células 33 1 86 428

EP 0 970 126/PT por centrifugação, os sobrenadantes contendo os fragmentos de anticorpos Fab foram recolhidos e usados para posterior exame.

Primeiro, as preparações de periplasma k8-D4.5-Fab e k5.1-D4.5-Fab foram testadas para ligação em antigénio S17-1A imobilizado, ambos mostrando fortes sinais ELISA (consultar Exemplo I). A detecção dos fragmentos Fab k8-D4.5 e k5.1-D4.5 ligados no antigénio s17-1A foi realizada usando-se um anticorpo de cadeia leve capa anti-humano biotinilado policlonal (1 Lig/ml PBS) detectado com Avidina conjugada com rábano silvestre (1 ,ug/ml de PBS). O sinal foi desenvolvido por adição de uma solução de substrato, contendo ácido 2,2'azino-bis (3-etilbenz-tiazolina-6-sulfônico) e perborato de Na e detectado a um comprimento de onda de 405 nm. O teste para ligação dos dois fragmentos Fab humanos positivos 17-1A (k8-D4.5-Fab e k5.1-D4.5-Fab) em células Kato (linhagem celular de cancro gástrico expressando 17-1 A), células CHO transfectadas 17-1A (CHO/17-1A) e células CHO não transfectadas foi de novo realizado com as preparações de periplasma. As linhagens celulares CHO foram geradas por subclonagem de um fragmento ADN codificando a sequência completa de aminoácido do antigénio 17-1A, também conhecidas como GA733-2 (Szala, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 87 (1990), 3542 -3546), no vector de expressão eucariótico pEF-DHFR (Mack, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 92 (1995) 7021 - 7025) de acordo com os procedimentos padrão (Sambrook, Molecular Cloning; “A Laboratory Manual”, Segunda Edição, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY (1989)). O plasmídeo resultante foi linearizado com Ndel e transfectado em células CHO deficientes em DHFR para expressão estável. A expressão transmembranar de 17-1A foi aumentada por amplificação de gene escalonada induzida por adição subsequente de concentrações crescentes do inibidor DHFR Methotretax (MTX) a uma concentração final de 500 nM, com as etapas de concentração entre sendo 20 nM e 100 nM (Kaufmann, Methods Enzymol. 185 (1990), 537 - 566). 200.000 células (células Kato, CHO/17-1A ou CHO) foram incubadas com uma das preparações de periplasma contendo Fab relevante ou irrelevante, seguido por anticorpo de cadeia leve capa anti-humano policlonal biotinilado (20 μ g/ml PBS) e Estreptavidina conjugada com FITC. As células marcadas foram depois analisadas por citometria de fluxo. As preparações de periplasma contendo k8-D4.5-Fab e k5.1-D4.5-Fab mostraram, respectivamente, sinais distintos

86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ 34 comparados com a preparação de periplasma irrelevante (controlo negativo), mas nenhuma coloração de células CHO transfectadas, demonstrando assim especificidade para o antigénio 17-1 A. O antigénio 17-1A M79 (Gõttlinger, Int. J. Câncer 38 (1986), 47-53) foi usado como um controlo positivo para as células positivas 17-1A e um anticorpo lgG2a de murino como controlo de isótipo (consultar as Figuras 10 e 11).

Exemplo III: Expressão eucariótica em células CHO

As bactérias não são usualmente capazes de produzir imunoglobulinas funcionais completas, embora expressem fragmentos Fab funcionais.

Para a produção dos anticorpos funcionais completos, as células de mamíferos têm que ser usadas e, portanto, a cadeia leve k8 e o domínio variável de cadeia pesada D4.5 foram subclonados em vectores de expressão de mamíferos. a) cadeias leves (k8 e k5.1): para gerar locais de restrição terminais adequados, os fragmentos ADN K8 e k5.1 foram novamente amplificados por PCR, resultando em fragmentos capa com um local Bsu36l na extremidade 5', bem como um local Sal I e um Not I na extremidade 3'.

Estes fragmentos (k8 e k5.1) foram subclonados no plasmídeo BSPOLL por Bsu36 I e Not I, adicionando assim uma sequência de comando de mamífero e disposto em sequência para evitar mutações induzidas por PCR.

Utilizando EcoR I e Sal I, k8 e k5.1 foram excisados de BSPOLL e subclonados no vector de expressão eucariótica pEF-ADA (consultar a Figura 12), derivado do vector de expressão pEF-DHFR (Mack, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 92 (1995) 7021 - 7025) por substituição da di-hidrofoliato-redutase de murino codificando ADNc (DHFR) por aquela adenosina-desaminase de murino de codificação (ADA).

Para cada espécie de cadeia leve (k8 e k5.1), 107 células CHO foram transfectadas com 100 ,ug de ADN de plasmídeo linearizado, respectivamente, e subsequentemente cultivado sob condições de selecção para adenosina-desaminase (ADA) codificada pelo vector de expressão. 35 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ

As células positivas a ADA sobreviventes foram cultivadas para posterior transfecção com cadeias pesadas portando o domínio variável D4.5 ou D7.2. b) domínio variável D4.5 pesado: do fragmento Fd delta D4.5, a região variável foi novamente amplificada por PCR gerando locais de restrição Bsu36l em ambas as extremidades. O fragmento ADN V-D4.5 resultante foi depois subclonado, por uso destes locais de restrição, no vector de expressão eucariótica pEF-DHFR já contendo uma sequência de comando eucariótica, bem como fragmento de ADN codificando a região constante de cadeia pesada lgG1 (consultar a Figura 13). A região variável de cadeia pesada D4.5 foi assim inserida entre o líder e a região constante de cadeia pesada. A região variável foi disposta em sequência e o clone completo foi designado H79V-D4.5 hu lgG1.

Para coloração do tecido posterior, a região constante de cadeia pesada de lgG1 humana foi substituída pela região constante de cadeia pesada lgG1 de murino usando-se Xba I para subclonagem. Este plasmídeo foi designado H79V-D4.5 MlgG1.

Ambas, a versão de IgG 1 humana e de murino da cadeia pesada D4.5 foram transfectadas em 107 células CHO, já expressando a cadeia leve k8, respectívamente. A versão IgG 1 humana também foi transfectada em células CHO expressando a cadeia leve k5.1. 100 ,ug de ADN de plasmídeo linearizado foram usados para transfecção de cadeia pesada, respectívamente. A região variável do fragmento Fd de cadeia pesada D7.2 também foi subclonada em pEF-DHFR resultando numa cadeia pesada lgG1 expressando plasmídeo, como descrito para VD4.5. Este plasmídeo de expressão foi depois transfectado em células CHO já expressando a cadeia leve k8, como descrito acima para H79V-D4.5 hu lgG1.

As células transfectadas foram submetidas à selecção para activídade ADA e DHFR, como descrito (Kauffman, Methods Enzymol. 185 (1990), 537 - 566). 36 86 428 ΕΡ 0 970 126/ΡΤ

As linhagens celulares resultantes foram designadas H79-hulgG1 (VD4.5hulgG1-k8), H79-MlgG1 (VD4.5-hulgG1-k8), D7.2 (VD7.2hulgG1-k8) e HD70 (VD4.5hulgG1-k5.1).

Sobrenadantes de cultura velha de três dias de quatro diferentes culturas de células de 30 ml, cada uma produzindo um dos quatro anticorpos anti-17-1A (H79hulgG1, H79-MlgG1, D7.2 e HD70), foram testados por ELISA para ligação em S17-1A imobilizado. Excepto para D7.2 apresentando um sinal ELISA fraco, os três outros anticorpos mostraram sinais fortes, estimados para representar uma afinidade de ligação na faixa do anticorpo de murino M79. A produção de anticorpos em grande escala foi realizada em garrafas de rolamento, usando-se 500 ml de meio.

Os anticorpos H79-hulgG1, D7.2 e HD70 foram purificados por uso de uma coluna de afinidade de proteína A. O anticorpo H79-MlgG1 foi purificado por cromatografia de afinidade de IgG anti-ratinho. A pureza e o peso molecular dos anticorpos recombinantes foram determinados por SDS-PAGE sob condições redutoras e não redutoras (Figuras 14 e 15). A purificação da proteína e o SDS-PAGE foram realizados de acordo com procedimentos padrão.

Exemplo IV: Análise funcional dos anticorpos H79 e HD70 IV.1. Teste em antiaénio imobilizado O sobrenadante de cultura de três dias de 30 ml de confluente de transfectantes de lgG1 humana e de murino, respectivamente, bem como as preparações correspondentes de anticorpo purificado, foram testados para ligação em antigénio s17-1A imobilizado por ELISA e comparados com o anticorpo M79 anti-17-1A. A detecção foi realizada como descrito no Exemplo II.

Os anticorpos H79 (versões hulgGI e MlgG1) e HD70 foram estimados como tendo afinidades de ligação similares na faixa do M79 de murino.

86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ 37 IV.2. Determinação das afinidades A medida de ressonância de plasmónio superficial foi realizada usando-se o dispositivo BIACORE 2000 (Biacore AB, Freiburg, Freiburg, Alemanha). A imobilização de antigénio 17-1A solúvel recombinante em cada célula de fluxo e a análise da interacção foi realizada com um método automático em BIACORE 2000. O antigénio foi acoplado covalentemente ao chip do sensor CM5 via grupos de amina primários. Após activação da matriz de dextrano do chip do sensor CM5 com uma única injecção de 80 ul de N-hidroxissuccinimida 0,1 M/N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (NHS/EDC9) através de todas as quatro células de fluxo, as células de fluxo 1,2, 3 e 4 foram incluídas sucessivamente no caminho do fluxo durante injecção do antigénio s17-1A (60 Lig/ml em acetato de sódio 10 mM, pH 4,7). Diferentes tempos de contacto de 17-1A para a superfície activada levaram a aproximadamente 2.500 unidades de resposta (RU9 em célula de fluxo 1, 14000 RU em célula de fluxo 2, 780 RU em célula de fluxo 3 e 290 RU em célula de fluxo 4). O excesso de ésteres activados foi bloqueado por injecção de 85 μΙ de etanolamina 1 M, pH 5, por todas as quatro células de fluxo. As experiências de ligação foram realizados a 25°C em tampão de pH 7,4 contendo Hepes 10 mM, NaCI 150 mM, EDTA 3 mM e 0,005% de tensioactivo P20. A cinética de ligação dos anticorpos em 17-1A recombinante imobilizado foi determinada por injecção de anticorpos em concentrações variando de 0,5 a 2 μΜ. O chip do sensor foi regenerado entre cada ensaio com glicina 100 mM, NaCI 500 mM, 0,005% de Tween pH 3. As constantes de velocidade de associação e dissociação, Kon e Koff foram analisadas usando software de avaliação BIA da Biacore AB como descrito (Karlsson, (1991) J Immunol Meth 145:229 - 240).

Dois conjuntos de determinações de afinidade foram realizados (1o conj.: M79, H79, D7.2, Panorex; 2° conj.: Panorex, HD70); o Panorex de murino também foi incluído no conjunto 2 como referência interna. O Kq de D7.2 provou estar abaixo do valor de detecção mínima de 10'4 M e não é, portanto, mostrado na Tabela 2.

Tabela 2: velocidades Kd, Kon e K0ff de anticorpos 17-1A humanos e de murino relevantes

Anticorpo KoníM-s') Koff(s-') KD (M) 1o conj. M79 de murino 6.0 X 104 4,5 X 10'2 7,5 X 10'7 H79 humana 2,1 X 104 7,2 X 10‘3 3,4 X 10'7

86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ 38

Panorex de murino 1,1 X 105 2,2 X 10'^ 2,0 X 10'" 2o conj. HD70 humana 0,9 X 105 3,5 X 10'2 3,9 X 10‘7 Panorex de murino 1,0 X 105 2,7 X 10'2 2,7 X 10‘7

IV.3. Citometria de fluxo em células eucarióticas expressando 17-1A

As preparações de anticorpos purificados de H79 (versões IgG 1 humana e de murino), HD70 (lgG1 humana) e D7.2 (lgG1 humana) foram testadas por análise FACS em células Kato expressando 17-1 A, células CHO transfectadas por 17-1A e células CHO não transfectadas. 2 x 105 células foram incubadas com H79-hulgG1, H79-MlgG1, HD70, D7.2, M79, Panorex, M74ch purificadas (= versão CHIgGI humana - Ccapa humana do anticorpo anti-17-1A de murino M74 (Gõttlinger, Int. J. Câncer 38 (1986), 47-53)), lgG2a de murino, lgG1 de murino ou lgG1 humana (20 Lig/ml de cada anticorpo), respectivamente. A detecção de anticorpos ligados em células foi realizada com anticorpos anti-lgG de ratinho marcado com FITC ou anti-IgG humana (20 ^ig/ml cada). A incubação foi realizada por 45-60 min em gelo.

IgG 1 humana H79, lgG1 de murino H79 e HD70 mostraram ligações distintas nas células positivas 17-1 A, bem como M79 e Panorex. D7.2 mostrou ligação fraca, mas significativa, em células positivas 17-1 A. Nenhum dos anticorpos mostrou ligação em células CHO transfectadas e os controlos IgG foram negativos em células Kato, células CHO/17-1A e células CHO transfectadas (consultar Figuras 16 e 17). IV.4. Citotoxicidade celular dependente de anticorpos (libertação de 51Cr)

Para libertação de 51Cr, células mononucleares de sangue periféricas humanas (PBMC), como células efectoras, foram isoladas do revestimento de aparência de camurça fresca de doadores saudáveis. As PBMC foram separadas por centrifugação em gradiente de densidade Ficoll com uma etapa de centrifugação subsequente 100 x g. PBMC não estimuladas (5x10° células) foram adicionadas num volume de 100 ul de meio RPMI 1640 com 10% FCS para cada cavidade de uma placa de microtítulo de fundo plano e incubadas de um dia para o outro a 37°C. As células alvo foram marcadas por 2 h com 51 Cr. As células alvo marcadas (100 μΙ) e os anticorpos em diferentes concentrações (50 μ|) foram

86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ 39 adicionados às PBMC e incubadas por 18 h a 37°C. Os isótipos de não ligação correspondentes foram usados como controlos negativos. A lise específica foi calculada como ((cpm, libertação experimental) - (cpm, libertação espon-tânea))/((cpm, libertação máxima) - (cpm, libertação espontânea)).

Os anticorpos anti-17-1A H79 e HD70 provaram mediar alta citotoxicidade para a linhagem celular de cancro gástrico positiva ΚΑΤΟ 17-1A neste ensaio de libertação de 51Cr. Os anticorpos anti-17-1A M79 e Panorex provaram mediar o extermínio celular a um nível distintamente mais baixo (Figura 18). IV,5. Teste em tecido humano

Criosseções de 5 nm de um tecido de carcinoma de cólon e de cólon normal foram, respectivamente, incubados com a versão IgG de murino do anticorpo H79 (10 Lig/ml). Neste experimento, a versão IgG 1 de murino de H79 foi usada para evitar coloração não específica, devido à presença de imunoglobulina humana em tecido humano. A detecção de H79MlgG1 ligada foi realizada com um anticorpo anti-lg de ratinho policlonal conjugado com peroxidase e a coloração foi feita com carbazol. A coloração de contagem foi realizada com hemalaun.

Os resultados foram avaliados por microscopia de luz. H79MlgG1, bem como o anticorpo monoclonal de murino M79 (controlo positivo), mostraram forte coloração em mucosa de cólon normal (M79, Figura 19; H79-MlgG1, Figura 20) e coloração mais fraca em células de carcinoma de cólon (M79, Figura 21; H79-MlgG1, Figura 22). Em contraste, os controlos de isótipos não mostraram qualquer coloração nos tecidos de mucosa do cólon e de carcinoma de cólon (para M79, Figuras 23 e 25 e para H79-MlgG1, Figuras 24 e 26).

Exemplo V: Análise de epítopo de H79 e HD70

Para comparar os epítopos 17-1A reconhecidos pelos anticorpos humanos H79 e HD70 e pelo anticorpo molde de murino M79, péptidos 13mer derivados da sequência de aminoácido da parte extracelular do antigénio 17-1A foram sintetizados como manchas únicas numa membrana Pep Spots. Estes péptidos cobrem toda a sequência de aminoácido extracelular do antigénio 17-1A (como definido por Szala, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 87 (1990), 3542 - 3546) por terem uma sobreposição de 11 aminoácidos com cada um dos péptidos vizinhos, com o primeiro aminoácido do péptido 1 sendo idêntico ao aminoácido de terminal N do 40 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ antigénio 17-1A e ο aminoácido de terminal último aminoácido do péptido 119 sendo idê C da parte extracelular do antigénio 17-1A (Tabela 3). (segue Tabela 3) 41 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ

Tabela 3: Péptidos sintetizados (os números correspondem aos números das manchas de péptidos)

I. TATFAAAQEECVC 3. AAAQEECVCENYK 5. EECVCENYKLAVN 7. CENYKLAVNCFVN 9. KLAVNCFVNNNRQ

II. NCFVNNNRQCQCT 13. NNNRQCQCTSVGA 15. QCQCTSVGAQNTV 17. TSVGAQNTVICSK 19. AQNTVICSKLAAK 21. VICSKLAAKCLVM 23. KLAAKCLVMKAEM 25. KCLVMKAEMNGSK 27. MKAEMNGSKLGRR 29. MNGSKLGRRAKPE 31. KLGRRAKPEGALQ 33. RAKPEGALQNNDG 35. EGALQNNDGLYDP 37. QNNDGLYDPDCDE 39. GLYDPDCDESGLF 41. PDCDESGLFKAKQ 43. ESGLFKAKQCNGT 45. FKAKQCNGTSTCW 47. QCNGTSTCWCVNT 49. TSTCWCVNTAGVR 51. WCVNTAGVRRTDK 53. TAGVRRTDKDTE! 55. RRTDKDTEITCSE 57. KDTEITCSERVRT 59. ITCSERVRTYWII 61. ERVRTYWIIIELK 63. TYWIIIELKHKAR 65. IIELKHKAREKPY 67. KHKAREKPYDSKS 69. REKPYDSKSLRTA 71. YDSKSLRTALQKE 73. SLRTALQKEITTR 75. ALQKEITTRYQLD 77. EITTRYQLDPKFI 79. RYQLDPKFITSIL 81. DPKFITSILYENN

2. TFAAAQEECVCEN 4. AQEECVCENYKLA 6. CVCENYKLAVNCF 8. NYKLAVNCFVNNN 10. AVNCFVNNNRQCQ 12. FVNNNRQCQCTSV 14. NRQCQCTSVGAQN 16. QCTSVGAQNTVIC 18. VGAQNTVICSKLA 20. NTVICSKLAAKCL 22. CSKLAAKCLVMKA 24. AAKCLVMKAEMNG 26. LVMKAEMNGSKLG 28. AEMNGSKLGRRAK 30. GSKLGRRAKPEGA 32. GRRAKPEGALQNN 34. KPEGALQNNDGLY 36. ALQNNDGLYDPDC 38. NDGLYDPDCDESG 40. YDPDCDESGLFKA 42. CDESGLFKAKQCN 44. GLFKAKQCNGTST 46. AKQCNGTSTCWCV 48. NGTSTCWCVNTAG 50. TCWCVNTAGVRRT 52. VNTAGVRRTDKDT 54. GVRRTDKDTEITC 56. TDKDTEITCSERV 58. TEITCSERVRTYW 60. CSERVRTYWIIIE 62. VRTYVVIIIELKHK 64. WIIIELKHKAREK 66. ELKHKAREKPYDS 68. KAREKPYDSKSLR 70. KPYDSKSLRTALQ 72. SKSLRTALQKEIT 74. RTALQKEITTRYQ 76. QKEITTRYQLDPK 78. TTRYQLDPKFITS 80. QLDPKFITSILYE 82. KFiTSILYENNVI 42 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ

83. ITSILYENNVITI 85. LYENNVITIDLVQ 87. NVITIDLVQNSSQ 89. IDLVQNSSQKTQN 91. QNSSQKTQNDVDI 93. QKTQNDVDIADVA 95. NDVDIADVAYYFE 97. IADVAYYFEKDVK 99. AYYFEKDVKGESL 101. EKDVKGESLFHSK 103. KGESLFHSKKMDL 105. LFHSKKMDLTVNG 107. KKMDLTVNGEQLD 109. LTVNGEQLDLDPG 111. GEQLDLDPGQTLI 113. DLDPGQTLIYYVD 115. GQTLIYYVDEKAP 117. IYYVDEKAPEFSM 119. DEKAPEFSMQGLK 84. SILYENNVITIDL 86. ENNVITÍDLVQNS 88. ITIDLVQNSSQKT 90. LVQNSSQKTQNDV 92. SSQKTQNDVD1AD 94. TQNDVDIADVAYY 96. VDIADVAYYFEKD 98. DVAYYFEKDVKGE 100. YFEKDVKGESLFH 102. DVKGESLFHSKKM 104. ESLFHSKKMDLTV 106. HSKKMDLTVNGEQ 108. MDLTVNGEQLDLD 110. VNGEQLDLDPGQT 112. QLDLDPGQTLIYY 114. DPGQTLIYYVDEK 116. TLIYYVDEKAPEF 118. YVDEKAPEFSMQG A membrana Pep Spots com os péptidos sintetizados foi sacudida por dez minutos em metanol e depois lavada três vezes por dez minutos em tampão TBS de pH 8. A membrana foi depois bloqueada em solução de bloqueio à base de caseína contendo 0,05 g/ml de sacarose por uma hora e depois mais uma vez sacudida em TBS pH 8/0,05% Tween 20 (TBS-T). Cada um dos anticorpos anti-17-1A foi incubado à temperatura ambiente juntamente com a membrana por três horas em solução de bloqueio (1 ,ug de anticorpo/ml). Após três lavagens em TBS-T por dez minutos cada, o anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (anti-ratinho/anti-humana; 1 ug/ml de solução de bloqueio) foi incubado por duas horas à temperatura ambiente juntamente com a membrana. Depois, a membrana foi lavada três vezes em TBS-T por dez minutos cada. A detecção dos anticorpos ligados foi feita directamente na membrana Pep Spots no caso de M79 de acordo com o protocolo do fabricante do estojo de quimíoluminescência (Boehringer). Os filmes desenvolvidos são mostrados na Figura 27. A mancha foi regenerada após três lavagens com TBS-T (10 min) numa solução contendo Tris-HCI 50 mM pH 6,7, 2-mercaptoetanol 100 mM e SDS 2% (p/v) por 30 min a 50°C e reutilizada subsequentemente para mapeamento de epítopo do próximo anticorpo.

Devido ao grau mais alto de ligação não específica do anticorpo secundário de imunoglobulina anti-humana para as manchas de polipéptidos na membrana, uma electrotransferência fraccionada para uma segunda membrana de manchamento, seguida por detecção com o anticorpo secundário anti-humano de

86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ imunoglobulina, foi realizada no caso de HD70 e H79, de acordo com Riidiger, EMBO 16 (1997) 1501 - 1507. A incubação com o anticorpo secundário e a detecção com o anticorpo nas manchas foram feitas como descrito acima. Os filmes descritos são apresentados na Figura 27.

Como mostrado nesta figura (Figura 27), os resultados do mapeamento com epítopo à base de péptido indicam que o epítopo reconhecido pelo anticorpo de molde de murino M79, principalmente representado pelas manchas de péptidos 38 e 95, difere, profundamente, daquele reconhecido pelo anticorpo de ser humano H79, principalmente representado pelas manchas de péptidos 8, 11, 13, 14, 59 - 60, 77 e 79. Como o anticorpo humano HD70 não mostra de modo algum qualquer ligação detectável, pode-se ainda antecipar que o seu epítopo também difere daquele do anticorpo de murino M79 e que os epítopos dos anticorpos de seres humanos H79 e HD 70 também não são idênticos. A ausência de sinais de ligação detectáveis, no caso do anticorpo de ser humano HD70 pode ser explicada por seu possível reconhecimento de um epítopo conformacional, contínuo ou descontínuo, ou de um epítopo consistindo, parcial ou inteiramente, em hidratos de carbono, em qualquer caso pode-se dificilmente esperar a reprodução destes epítopos por péptidos curtos. 44 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÕES GERAIS (i) REQUERENTE: (A) NOME: KUFER, Peter (B) ENDEREÇO: Graf-Konrad-Strasse 2 (C) CIDADE: Moosburg

(E) PAÍS: DE (F) CÓDIGO POSTAL: 85386 (A) NOME: RAUM, Tobias (B) ENDEREÇO: Zentnerstrasse 20 (C) CIDADE: Munique

(E) PAÍS: DE (F) CÓDIGO POSTAL: 80798 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Novo método para a produção de receptores de antigénios anti-humanos e os suas utilizações. (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 148 (iv) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disco flexível

(B) COMPUTADOR: compatível com IBM PC

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão # 1.30 (EPO) (v) DADOS DO PRESENTE PEDIDO DE PATENTE: NÚMERO DO PEDIDO DE PATENTE: WO PCT/EP98/02180 (vi) DADOS DO PEDIDO DE PATENTE ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO DE PATENTE: EP 97 10 6109.8 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 14/ABR/1997 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 1: (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1:

AGGTGCAGCT GCTCGAGTCT GG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 22 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ

45 (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2: 24

CAGAGTCACC TTGCTCGAGT CTGG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

CAGGTGCAGC TGCTCGAGTC GGG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4:

CAGGTGCAGC TACTCGAGTG GGG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "iniciador"

23 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ 46 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5:

CAGGTACAGC TGCTCGAGTC AGG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6: 30

TGCCTTACTA GTCTCTGGCC AGCGGAAGAT (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7: 38

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CCAGATGACC CAGTCTCC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 40 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATTGAC AGCAGTCTCC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 40

(C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATGACC TCAGTCTCC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CACACTCACG CAGTCTCC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGCTGACT CAGTCTCC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 58 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12:

GCGCCGTCTA GAATTAACAC TCTCCCCTGT TGAAGCTCTT TGTGACGGGC GAACTCAG 58

86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ 48 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13: 24

AATTTTGAGC TCACTCAGCC CCAC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14: 27

TCTGCCGAGC TCCAGCCTGC CTCCGTG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15:

TCTGTGGAGC TCCAGCCGCC CTCAGTG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico 49 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (A) DESCRIÇÃO: /desc = "iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16:

TCTGAAGAGC TCCAGGACCC TGTTGTGTCT GTG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17:

CAGTCTGAGC TCACGCAGCC GCCC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18:

CAGACTGAGC TCACTCAGGA GCCC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 19:

CAGGTTGAGC TCACTCAACC GCCC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 50 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 20:

CAGGCTGAGC TCACTCAGCC GTCTTCC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 21:

CGCCGTCTAG AATTATGAAC ATTCTGTAGG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 22:

Thr Ala Thr Phe Ala Ala Ala Gin Glu Glu Cys Vai Cys 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 23:

Thr Phe Ala Ala Ala Gin Glu Glu Cys Vai Cys Glu Asn 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 24: 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ 51

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 24:

Ala Ala Ala Gin Glu Glu Cys Vai Cys Glu Asn Tyr Lys 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 25:

Ala Gin Glu Glu Cys Vai Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Ala 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 26:

Glu Glu Cys Vai Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Ala Vai Asn 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 27: 52 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ

Cys Vai Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Ala Vai Asn Cys Phe 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 28:

Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Ala Vai Asn Cys Phe Vai Asn 15 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 29:

Asn Tyr Lys Leu Ma Vai Asn Cys Phe Vai Asn Asn Asn 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 30: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 30:

Lys Leu Ma Vai Asn Cys Phe Vai Asn Asn Asn Arg Gin 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 31: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 53 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (Η) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 31:

Ala Vai Asn Cys Phe Vai Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 32:

Asn Cys Phe Vai Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 33: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 33:

Phe Vai Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr Ser Vai 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 34: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 34:

Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr Ser Vai Gly Ala 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 35: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 54 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 35:

Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr Ser Vai Gly Ala Gin Asn 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 36: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 36:

Gin Cys Gin Cys Thr Ser Vai Gly Ala Gin Asn Thr Vai 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 37: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 37:

Gin Cys Thr Ser Vai Glv Ala Gin Asn Thr Vai Ile Cys 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 38: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 38:

Thr Ser Vai Gly Ala Gin Asn Thr Vai Ile Cys Ser Lys 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 39: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 55 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (Β) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 39:

Val Gly Ala Gin Asn Thr Vai Ile Cys Ser Lys Leu Ala 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 40: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 40:

Ala Gin Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala Lys 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 41: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 41:

Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala Lys Cys Leu 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 42: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 42:

Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala Lys Cys Leu Val Met 15 10 56 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 43: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 43:

Cys Ser Lys Leu Ala Ala Lys Cys Leu Vai Met Lys Ala 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 44: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 44:

Lys 1

Leu Ala Ala Lys Cys Leu Vai Met Lys Ala Glu Met 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 45: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 45:

Ala Ala Lys Cys Leu Vai Met Lys Ala Glu Met Asn Gly 1 5 10 - (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 46: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 46: 57 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ

Lys Cys Leu Vai Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 47: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 47:

Leu Vai Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 48: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 48:

Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 49: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 49:

Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg Ala Lys 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 50: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 58 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (ii)TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 50:

Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg Ala Lys Pro Glu 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 51: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 51:

Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 52: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 52:

Lys Leu Gly Arç Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gin 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 53: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 53:

Gly Arg Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asn 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 54: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 59 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 54:

Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asn Asp Gly 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 55: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 55:

Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 56: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 56:

Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 57: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 57:

Ala Leu Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 58:

86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ 60 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (Β) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 58:

Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 59: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 59:

Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu Ser Glv 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 60: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 60:

Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 61: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 61: 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ

Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 62: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 62:

Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lvs Gin 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 63: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 63:

Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ma Lys Gin Cys Asn 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 64: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 64:

Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gin. Cys Asn Gly Thr 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 65: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples 62 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 65:

Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 66: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 66:

Phe Lys Ala Lys Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 67: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 67:

Ala Lys Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp Cys Vai 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 68: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 68:

Gin Cys 1

Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp Cys Vai Asn Thr 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 69: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos 63 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (Β) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 69:

Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp Cys Vai Asn Thr Ala Gly 1 S io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 70: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 70:

Thr Ser Thr Cys Trp Cys Vai Asn Thr Ala Gly Vai Arg 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 71: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 71:

Thr Cys Trp Cys Vai Asn Thr Ala Gly Vai Arg Arg Thr 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 72: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 72:

Trp Cys Vai Asn Thr Ala Gly Vai Arg Arg Thr Asp Lys 1 5 *10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 73: 64 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 73:

Val Asa Thr Ala Gly Vai Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 74: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 74:

Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr Glu Ile 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 75: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 75:

Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 76: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 76: 65 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ

Arg Arg Thr Asd Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 77: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 77:

Thr Asp Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Vai 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 78: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 78:

Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Vai Arg Thr 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 79: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 79:

Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Vai Arg Thr Tyr Trp 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 80: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples 66 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 80:

Ile Thr Cys Ser Glu Arg Vai Arg Thr Tyr Trp Ile Ile 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 81: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 81:

Cys Ser Glu Arg Vai Arg Thr Tyr Trp Ile Ile Ile Glu 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 82: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 82:

Glu Arg Vai Arg Thr Tyr Trp Ile Ile Ile Glu Leu Lys 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 83: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 83:

Val Arg Thr Tyr Trp Ile Ile Ile Glu Leu Lys His Lys 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 84: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 67 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (Β) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 84:

Thr Tyr Trp Ile Ile Ile Glu Leu Lys His Lys Ala Arg 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 85: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 85:

Trp Ile Ile Ile Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 86: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 86:

Ile Ile Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 87: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 87: 68 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ

Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 88: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 88:

Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys Ser 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 89: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 89:

Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 90: (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 90:

Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 91: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples 69 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (D) TOPOLOGIA: linear (ίί) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 91:

Lys Pro Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gin 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 92: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 92:

Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gin Lys Glu 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 93: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 93:

Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gin Lys Glu Ile Thr 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 94: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 94:

Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gin Lys Glu Ile Thr Thr Arg 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 95: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 70 86 428 ΕΡ 0 970 126/ΡΤ (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (Β) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 95:

Arg Thr Ala Leu Gin Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gin 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 96: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 96:

Ala Leu Gin Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 97: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 97:

Gin Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 98: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 98: 71 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ

Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys Phe Ile 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 99: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 99:

Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 100: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 100:

Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 101: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 101:

Gin Leu Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu 15 10 72 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 102: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 102:

Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 103: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 103:

Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Vai Ile 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 104: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 104:

Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Vai Ile Thr Ile 15 10 73 86 428 ΕΡ 0 970 126/ΡΤ (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 105: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 105:

Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Vai Ile Thr Ile Asp Leu 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 106: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 106:

Leu Tyr Glu Asn Asn Vai Ile Thr Ile Asp Leu Vai Gin 1 5 10* (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 107: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 107:

Glu Asn Asn Vai Ile Thr Ile Asp Leu Vai Gin Asn Ser 15 10 74 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 108: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 108:

Asn Vai Ile Thr Ile Asp Leu Vai Gin Asn Ser Ser Gin 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 109: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 109:

Thr Ile Asp Leu Vai Gin Asn Ser Ser Gin Lvs Thr 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 110: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 110:

Ile 1

Asp Leu Vai Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 111: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 111: 75 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ

Leu Vai Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn Asp Vai 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 112: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 112:

Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn Asp Vai Asp Ile 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 113: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 113:

Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn Asp Vai Asp Ile Ala Asp 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 114: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 114:

Gin Lys Thr Gin Asn Asp Vai Asp Ile Ala Asp Vai Ala 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 115: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples 76 86 428 ΕΡ 0 970 126/ΡΤ (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 115:

Thr Gin Asn Asp Vai Asp Ile Ala Asp Vai Ala Tyr Tyr 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 116: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 116:

Asn Asp Vai Asp Ile Ala Asp Vai Ala Tyr Tyr Phe Glu 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 117: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 117:

Val Asp Ile Ala Asp Vai Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 118: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 118:

Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 119: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 77 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (Β) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 119:

Asp Vai Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Vai Lys Gly Glu 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 120: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 120:

Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Vai Lys Gly Glu Ser Leu 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 121: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 121:

Tyr Phe Glu Lys Asp Vai Lys Gly Glu Ser Leu Phe His 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 122: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 122: 78 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ

Glu Lys Asp Vai Lys Gly Glu Ser Leu Phe His Ser Lys 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 123: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 123:

Asp Vai Lys Gly Glu Ser Leu Phe His Ser Lys Lys Met 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 124: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 124:

Lys Gly Glu Ser Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 125: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 125:

Glu Ser Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Vai 1 5 xo (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 126: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples 79 86 428 ΕΡ 0 970 126/ΡΤ (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 126:

Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Vai Asn Gly 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 127: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 127:

His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Vai Asn Gly Glu Gin 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 128: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 128:

Lys Lys Met Asp Leu Thr Vai Asn Gly Glu Gin Leu Asp 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 129: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 129:

Met Asp Leu Thr Vai Asn Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 130: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos 80 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (Β) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 130:

Leu Thr Vai Asn Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp Pro Gly 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 131: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 131:

Val Asn Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp Pro Gly Gin Thr 1 5 * 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 132: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 132:

Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp Pro Gly Gin Thr Leu Ile 1 5 * 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 133: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 133:

Gin Leu Asp Leu Asp Pro Gly Gin Thr Leu Ile Tyr Tyr 15 10 81 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 134: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 134:

Asp Leu Asp Pro Gly Gin Thr Leu Ile Tyr Tyr Vai Asp 1 5 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 135: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 135:

Asp Pro Gly Gin Thr Leu Ile Tyr Tyr Vai Asp Glu Lys 15 10 82 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 136: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 136:

Gly Gin Thr Leu Ile Tyr Tyr Vai Asp Glu Lys Ala Pro 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 137: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 137:

Thr Leu Ile Tyr Tyr Vai Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe 15 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 138: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 138:

Ile Tyr Tyr Vai Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met 15 10 83 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 139: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 139:

Tyr Vai Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met Gin Gly 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 140: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 140:

Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met Gin Gly Leu Lys 1 5 io (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 141: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 321 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: duplo (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..321 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 141: GAG CTC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCT TCT GTG GGA 49

Glu Leu Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGT CGG ACA AGT CAG AGC ATT AGC AGC TAT

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30 96 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ 84 TTA AAT TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGA CAG CCT CCT AAG CTG CTC ATT 144 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 TAC TGG GCA TCT ACC CGG GAA TCC GGG GTC CCT GAC CGA TTC AGT GGC 192 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly SO 55 60 AGC GGG TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTA CAA CCT 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 GAA GAT TCT GCA ACT TAC TAC TGT CAG CAG AGT TAC GAC ATC CCG TAC 288 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Asp Ile Pro Tyr 85 90 95 ACT TTT GGC CAG GGG ACC AAG CTG GAG ATC AAA 321 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105

(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 142: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 107 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO : 142: Glu Leu Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gin Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile 3*5 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 7*0 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Asp Ile Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 143: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 414 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: duplo (D) TOPOLOGIA: linear

(ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: CDS 85 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (Β) LOCALIZAÇÃO: 1..414 (χί) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 143: GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG 48 Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 110 115 120 TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 125 130 135 GGC ATG CAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG 144 Gly Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 140 145 150 155 GCA GTT ATA TCA TAT GAT GGA AGT AAT AAA TAC TAT GCA GAC TCC GTG 192 Ala Vai Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 160 165 170 AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 175 180 185 CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT 288 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 190 195 200 GCG AAA GAT ATG GGG TGG GGC AGT GGC TGG AGA CCC TAC TAC TAC TAC 336 Ala Lys Asp Met Gly Trp Gly Ser Gly Trp Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr 205 210 215 GGT ATG GAC GTC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GCA 384 Gly Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala 220 225 230 235 CCC ACC AAG GCT CCG GAT GTG TTC CCT CTA 414 Pro Thr Lys Ala Pro Asp Vai Phe Pro Leu 240 245 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 144: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 138 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 144:

Glu 1 X Vai Gin Leu Leu 5 Glu Ser Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Gly Met His 35 Trp Vai Arg Gin Ala 40

Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 10 15

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 45 86 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ

Ala Vai 50 Ile Ser Tyr Asp Gly 55 Ser Asn Lys Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Vai Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Vai Tyr Tyr 95 Cys Ala Lys Asp Met 100 Gly Trp Gly Ser Gly 105 Trp Arg Pro Tyr Tyr 110 Tyr Tyr Gly Met Asp 115 Vai Trp Gly Gin Gly 120 Thr Thr Vai Thr Vai 125 Ser Ser Ala Pro Thr 130 Lys Ala Pro Asp Vai 135 Phe Pro Leu (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 145: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 327 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: duplo (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..372 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 145: GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG GGA GTC GTG GTA CAG CCT GGG GGG 48 Glu Vai 140 Gin Leu Leu Glu Ser 145 Gly Gly Vai Vai Vai 150 Gin Pro Gly Gly TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT GAT GAT TAT 96 Ser 155 Leu Arg Leu Ser Cys 160 Ala Ala Ser Gly Phe 165 Thr Phe Asp Asp Tyr 170 GCC ATG CAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG 144 Ala Met His Trp Vai 175 Arg Gin Ala Pro Gly 180 Lys .Gly Leu Glu Trp 185 Vai GCA GTT ATA TCA TAT GAT GGA AGT AAT AAA TAC TAT GCA GAC TCC GTG 192 Ala Vai Ile Ser 190 Tyr Asp Gly Ser Asn 195 Lys Tyr Tyr Ala Asp 200 Ser Vai AAG GoC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 205 210 215 CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT 288 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 220 225 230 GCG AAA AAG GAA GGC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC 336 Ala Lys Lys Glu Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser 235 240 245 250

86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ 87 TCA GCA CCC ACC AAG GCT CCG GAT GTG TTC CCT CTA Ser Ala Pro Thr Lys Ala Pro Asp Vai Phe Pro Leu 255 260 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 146: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 124 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 146:

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Vai Vai Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe .Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Vai Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Lys Glu Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser Ala Pro Thr Lys Ala Pro Asp Vai Phe Pro Leu 115 120 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 147: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 321 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: duplo (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..321 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 147: 88 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ GAG CTC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA 48 Glu Leu Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 125 130 135 140 GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT AGC AGC TAT 96 Asd Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ser Tyr 145 150 155 ΤΤΑ AAT TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGA CAG CCT CCT AAG CTG CTC ATT 144 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile 160 165 170 TAC TGG GCA TCT ACC CGG GAA TCC GGG GTC CCT GAC CGA TTC AGC GGC 192 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly 175 180 185 AGT GAA TCT GGG ACA AAT TAC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT 240 Ser Glu Ser Gly Thr Asn Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 190 195 200 GAA GAT TTT GCT ACT TAC TTT TGT CAA CAG TCT GAC AGT TTG CCG ATC 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Asp Ser Leu Pro Ile 205 210 215 220 ACC TTC GGC CAA GGG ACA CGA CTG GAC ATT CAA 321 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Asp Ile Gin 225 230 89 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 148: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 107 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 148:

Glu Leu Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Glu Ser Gly Thr Asn Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Asp Ser Leu Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Asp Ile Gin 100 105

Lisboa, 16. JUL 2001

Por MICROMET AG 0 ^MuSroL'

Claims (19)

1. 86 428 ΕΡ 0 970 126/ΡΤ REIVINDICAÇÕES 1. Método para produção de um receptor de antigénio anti-humano que compreende as etapas de (b) seleccionar uma combinação de cadeias de imunoglobulina VH e VL funcionalmente rearranjadas, em que pelo menos a dita cadeia VH é derivada de linfócitos B humanos maduros essencialmente não sensibilizados e a dita cadeia VL é derivada de um repertório de células B humanas de ocorrência natural, sendo as ditas cadeias expressas a partir de um vector recombinante, e (c) usar um sistema de exposição in vitro, para ligação a um antigénio de ser humano, em que antes da dita etapa de selecção (b), é realizado uma etapa (a) de selecção quer da dita cadeia VH quer da dita cadeia VL para ligação ao dito antigénio junto com uma cadeia V de um anticorpo específico de antigénio alvo não-humano.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o dito receptor é uma imunoglobulina ou um fragmento de imunoglobulina tal como um fragmento Fv.
3. 3. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que pelo menos as ditas cadeias de imunoglobulina VH e, opcionalmente, VL são derivadas de um repertório IgD humano.
4. 4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o dito sistema de exposição in vitro é um sistema de exposição de fagos.
5. 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita combinação de cadeias rearranjadas é expressa a partir de uma ou mais diferentes bibliotecas.
6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o dito antigénio de ser humano é um antigénio de tumor, tal como o antigénio 17-1A humano.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a dita cadeia VH compreende uma das duas sequências apresentadas na Figura 7, nucleótidos 1 a 381, e Figura 8, nucleótidos 1 a 339, e/ou a dita cadeia VL compreende uma das duas sequências mostradas na Figura 6, nucleótidos 1 a 321, e Figura 9, nucleótidos 1 a 321.

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8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita etapa de selecção (b) envolve (i) ligação do veículo de exposição expressando um receptor de antigénio: (a) a um antigénio alvo imobilizado ou seus fragmentos; (b) a células opcionalmente marcadas expressando o antigénio alvo ou seus fragmentos; ou (c) a um antigénio alvo solúvel, de preferência marcado, ou seus fragmentos; (ii) lavagem de veículo de exposição não especificamente em ligação (a e b) e eluição subsequente de veículo de exposição não especificamente em ligação, ou (iii) enriquecimento positivo de veículo de exposição ligado ao antigénio alvo (b e c) da solução de antigénio alvo ou de suspensões de células expressando o antigénio alvo; sendo os veículos de exposição assim isolados, incluindo os seus receptores de antigénio, opcionalmente multiplicados por réplica e submetidos a outros ciclos de selecção in vitro, como descrito em (i) a (iii).
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita cadeia de um anticorpo específico de antigénio alvo não-humano é uma cadeia VH ou VL de ratinho.
10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita selecção de uma combinação adequada envolve; (a) teste de uma e da mesma cadeia VH em combinação com uma variedade de diferentes cadeias VL, para ligação ao dito antigénio de ser humano; ou (b) teste de uma e da mesma cadeia VL em combinação com uma variedade de diferentes cadeias VH, para ligação ao dito antigénio de ser humano.
11. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, compreendendo ainda as etapas de obtenção, após selecção, das cadeias VH e VL humanas ou dos ácidos nucleicos correspondentes e fusão das ditas cadeias às mesmas ou outras cadeias VH ou VL, em regiões constantes de imunoglobulina de cadeias pesadas (CH) ou cadeias leves (CL) ou partes delas, ou em cadeias de não imunoglobulina e ácidos nucleicos correspondentes, respectivamente. 86 428 ΕΡ Ο 970 126/ΡΤ 3/3
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que as ditas cadeias de regiões constantes são derivadas de lgG1 ou lgG3 humanas.
13. 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, compreendendo ainda as etapas de obtenção, após selecção, das cadeias VH e VL humanas e ligação física das ditas cadeias a produtos farmacêuticos não proteínicos e/ou outras moléculas biologicamente activas.
14. 14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que as ditas cadeias VH ou VL são expressas a partir de sequências de ácidos nucleicos, que são os resultados da amplificação RT-PCR de ARNm derivado de linfócitos B humanos maduros não sensibilizados.
15. 15. Anticorpo humano específico para o antigénio 17-1A humano natural.
16. 16. Anticorpo de acordo com a reivindicação 15, que é obtenível de acordo com o método de qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
17. 17. Anticorpo de acordo com a reivindicação 15 ou 16, que reconhece um epítopo do domínio extracelular do antigénio 17-1 A, compreendendo, de preferência, pelo menos uma sequência de aminoácido dos péptidos de N—. 8, 11, 13, 14,59, 60, 77 e 79.
18. 18. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, em que a cadeia VH compreende pelo menos um CDR de uma das duas sequências apresentadas na Figura 7, nucleótidos 1 a 381, e Figura 8, nucleótidos 1 a 339, e/ou em que a cadeia VL compreende pelo menos um CDR de uma das seguintes duas sequências mostradas na Figura 6, nucleótidos 1 a 321, e Figura 9, nucleótidos 1 a 321.
19. 19. Composição farmacêutica que compreende um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, e opcionalmente um transportador farmaceuticamente aceitável. Lisboa, t6. JUL 2001 Por MICROMET AG-0AaEANQTOAL·

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