NL2000439C2 - Therapeutische toepassingen van inhibitoren van RTP801. - Google Patents

Description

THERAPEUTISCHE TOEPASSINGEN VAN INH1BITOREN VAN RTP801 GEBIED VAN DE UITVINDING

5 De onderhavige uitvinding heeft betrekking op nieuwe siRNA-moleculen die het RTP801-gen remmen en op de toepassing van deze moleculen ter behandeling van ademhalingsstoomissen van allerlei soorten (waaronder longstoomissen), oogziekten en -toestanden, microvasculaire stoornissen, toestanden geassocieerd met angiogenese en apoptose, en gehoorstoomissen.

10

ACHTERGROND VAN DE UITVINDING

Chronische obstructieve longziekte (COPDI

Chronische obstructieve longziekte (COPD) tast meer dan 16 miljoen 15 Amerikanen aan en is de vierde grootste doodsoorzaak in de Verenigde Staten. Sigaretten roken veroorzaakt de meeste gevallen van deze slopende ziekte, maar andere milieufactoren kunnen niet uitgesloten worden (Petty TL. 2003. Definition, epidemiology, course, and prognosis of COPD. Clin. Cornerstone, 5-10).

Pulmonair emfyseem is een hoofdverschijnsel van COPD. Permanente 20 destructie van perifere luchtruimten, distale tot terminale bronchiolen is het kenmerk van emfyseem (Tuder R.M. et al., Oxidative stress and apoptosis interact and cause emphysema due to vascular endothelial growth factor blocade. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 29:88-97; 2003). Emfyseem wordt tevens gekenmerkt door een accumulatie van inflammatoire cellen, zoals macrofagen en neutrofielen in bronchiolen en alveolaire 25 structuren (Petty, 2003).

De pathogenese van emfyseem is complex en multifactorieel. Bij de mens heeft men een deficiëntie van inhibitoren van proteasen die door ontstekingscellen geproduceerd worden, zoals bijvoorbeeld αΐ-antitrypsine, aangetoond als zijnde een bijdrage tot een protease/antiproteaseonbalans, waardoor de destructie van alveolaire 30 extracellulaire matrix in door sigarettenrook (CS) geïnduceerd emfyseem bevorderd wordt (Eriksson, S. 1964. Pulmonary Emphysema and Alpha 1-Antitrypsin Deficiency. Acta Med Scand 175:197-205. Joos, L., Pare, P.D., en Sandford, A.J. 2002. Genetic risk factors of chronic obstructive pulmonary disease. Swiss Med Wkly 132:27-37).

2000439 2

Matrixmetalloproteïnasen (MMP’s) spelen een centrale rol in experimenteel emfyseem, zoals gedocumenteerd is door de weerstand van macrofaag metalIo-elastase-knock-outmuizen tegen emfyseem veroorzaakt door de chronische inhalatie van CS (Hautamaki et al.: Requirement for macrophage elastase for cigarette smoke-induced 5 emphysema in mice. Science 277:2002-2004). Bovendien resulteert de pulmonaire overexpressie van interleukine-13 in transgene muizen in MMP- en cathepsine-afhan-kelijk emfyseem (Zheng, T. et al., 2000. Inducible targeting of IL-13 to the adult lung causes matrix metalloproteinase- and cathepsin-dependent emphysema. J Clin Invest 106:1081-1093). Recente onderzoekingen beschrijven de rol van ceptale celapoptose in 10 longweefseldestructie die tot emfyseem leidt (Rangasami T. et al., Genetic ablation of Nrf2 enhances susceptibility to cigarette smoke-induced emphysema in mice. Ingediend bij het Journal of Clinical Investigation; Tuder R.M. et al., Oxidative stress and apoptosis interact and cause emphysema due to vascular endothelial growth factor blocade. AmJRespir Cell Mol Biol, 29:88-97; 2003; Yokohori N., Aoshiba K., Nagai 15 A., Increased levels of cell death and proliferation in alveolar wall cells in patients with pulmonary emphysema. Chest, februari 2004; 125(2):626-32-, Aoshiba K., Yokohori N., Nagai A., Alveolar wall apoptosis causes lung destruction and emphysematous changes, AmJRespir Cell Mol Biol, mei 2003; 28(5):555-62).

Onder de mechanismen die ten grondslag liggen aan beide paden van long-20 destructie in emfyseem, dient de buitengewoon sterke vorming van reactieve zuurstof-species (ROS) op de eerste plaats te worden vermeld. Vastgesteld is dat een pro-oxi-dans/antioxidansonbalans in het bloed en in het iongweefsel van rokers bestaat (Hulea S.A. et al.: Cigarette smoking causes biochemical changes in blood that are suggestive of oxidative stress: a case-control study. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 1995; 14(3-25 4): 173-80; Rahman I., MacNee W., Lung glutathione and oxidative stress: implications in cigarette smoke-induced airway disease. Am J Physiol, december 1999; 277(6 Pt 1):L1067-88; MacNee W., Oxidans/antioxidans and COPD. Chest, mei 2000; 117(5 Suppl 1):303S-17S; Marwick J.A., Kirkham P., Gilmour P.S., Donaldson K., MacNee W., Rahman I. Cigarette smoke-induced oxidative stress and TGF-betal increase 30 p21wafl/cipl expression in alveolar epithelial cells. Ann N Y Acad Sci. november 2002; 973:278-83; Aoshiba K., Koinuma M., Yokohori N., Nagai A. Immunohisto-chemical evaluation of oxidative stress in murine lungs after cigarette smoke exposure. Inhal Toxicol, september 2003; 15(10):1029-38; Dekhuijzen P.N., Antioxidant 3 properties of N-acetylcysteine: their relevance in relation to chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J. april 2004; 23(4):629-36; Tuder R.M., Zhen L., Cho C.Y., Taraseviciene-Stewart L., Kasahara Y., Salvemini D., Voelkel N.F. en Flores S.C. Oxidative stress and apoptosis interact and cause emphysema due to vascular 5 endothelial growth factor blocade. Am J Respir Cell Mol Biol, 29:88-97; 2003). Na een blootstelling van muizen gedurende één uur aan CS is er een dramatische toename van 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG) in de alveolaire epitheliale cellen, in het bijzonder van Type II (zie Inhal Toxicol, september 2003; 15(10):1029-38, hierboven). Overgeproduceerde reactieve zuurstofspecies staan bekend om hun cytotoxische acti-10 viteit, die afkomstig is van een rechtstreeks DNA-schadelijk effect en van de activering van apoptotische signaaltransductiepaden (Takahashi A., Masuda A., Sun M., Centonze V.E., Herman B. Oxidative stress-induced apoptosis is associated with alterations in mitochondrial caspase activity and Bel-2-dependent alterations in mitochondrial pH (pHm). Brain Res Bull 15 Februari 2004; 62(6):497-504; Taniyama Y., Griendling 15 K.K. Reactive oxygen species in the vasculature: molecular and cellular mechanisms. Hpertension. December 2003; 42(6):1075-81. Gepubliceerd 27 oktober 2003; Higuchi Y. Chromosomal DNA fragmentation in apoptosis and necrosis induced by oxidative stress. Biochem Pharmacol. 15 Oktober 2003; 66(8):1527-35; Punj V., Chakrabarty A.M. Redox proteins in mammalian cell death: an evolutiortarily conserved function in 20 mitochondria and prokaryotes. Cell Microbiol. April 2003; 5(4):225-31; Ueda S., Masutani H., Nakamura H., Tanaka T., Ueno M., Yodoi J. Redox control of cell death. Antioxid Redox Signal. Juni 2002; 4(3):405-14).

ROS-en zijn niet alleen cytotoxisch per se, maar zijn tevens pro-ontstekingsstimuli, aangezien zij prominente activatoren van redoxgevoelige transcriptiefactoren NFkB en 25 AP-1 zijn (besproken in Rahman I. Oxidative stress and gene transcription in asthma and chronic obstructive pulmonary disease: antioxidant therapeutic targets. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. September 2002; 1(3):291-315).

Beide transcriptiefactoren zijn op hun beurt sterk betrokken bij de stimulering van transcriptie van proinflammatoire cytokinen (besproken in Renard P., Raes M. 30 The proinflammatory transcription factor NFkappaB: a potential target for novem therapeutical strategies. Cell Biol Toxicol. 1999; 15(6):341-4; Lentsch A.B., Ward P.A. The NFkappaBb/IkappaB system in acute inflammation. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2000; 48(2):59-63) en matrixontledende proteïnasen (Andela V.B., Gordon 4 A.H., Zotalis G., Rosier R.N., Goater J.J., Lewis G.D., Schwarz E.M., Puzas J.E., O 'Keefe R.J. NFkappaB: a pivotal transcription factor in prostate cancer metastasis to bone. Clin Orthop. Oktober 2003; (415 Suppl):S75-85; Fleenor D.L., Pang I.H., Clark A.F. Involvement of AP-1 in interleukin-1 alpha-stimulated MMP-3 expression in 5 human trabecular meshwork cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. Augustus 2003; 44(8):3494-501; Tuhul Amin A.R., Senga T., Oo M.L., Thant A.A., Hamaguchi M. Secretion of matrix metalloproteinase-9 by the proinflammatory cytokine, IL-lbeta: a role for the dual signalling pathways, Akt and Erk Genes Cells. Juni 2003; 8(6):515- 23). Pro-inflammatoire cytokinen op hun beurt dienen als attractoren van inflammatoire 10 cellen die tevens matrixontledende enzymen, cytokinen en reactieve zuurstofspecies afscheiden. Derhalve schijnt het zo te zijn dat een pathogene factor, zoals bijvoorbeeld CS een pathologisch netwerk stimuleert waarbij reactieve zuurstofspecies als hoofdmediatoren van longdestructie fungeren.

Zowel reactieve zuurstofspecies (ROS) afkomstig van geïnhaleerde sigarettenrook als 15 die welke endogeen worden gevormd door ontstekingscellen, dragen bij tot een verhoogde intrapulmonaire oxidansbelasting.

Eén additionele pathogene factor met betrekking tot COPD-pathogenese is de waargenomen afgenomen expressie van VEGF en VEGFRII in longen van patiënten die aan emfyseem lijden (Yasunori Kasahara, Rubin M. Tuder, Carlyne D. Cool, David 20 A. Lynch, Sonia C. Flores, en Norbert F. Voelkel. Endothelial Cell Death and Decreased Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 in Emphysema. Am J Respir Crit Care Med Vol 163, biz. 737-744, 2001). Bovendien leidt de inhibitie van VEGF-signalering gebruikmakend van een chemische VEGFR-inhibitor tot alveolaire septale endotheliale en ver-25 volgens tot epitheliale celapoptose, waarschijnlijk te wijten aan de verstoring van de nauwe structurele/functionele verbondenheid van beide typen cellen binnen alveoli (Yasunori Kasahara, Rubin M. Tuder, Laimute Taraseviciene-Stewart, Timothy D. Le Cras, Steven Abman, Peter K. Hirth, Johannes Waltenberger en Norbert F. Voelkel. Inhibition of VEGF receptors causes lung cell apoptosis and emphysema. J. Clin. 30 Invest. 106:1311-1319 (2000); Voelkel N.F., Cool C.D. Pulmonary vascular involvement in chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J Suppl. November 2003; 46:28s-32s).

5

Maculaire degeneratie

De meest gebruikelijke oorzaak van afgenomen best gecorrigeerd zichtvermogen in 65 jaar oude personen in de Verenigde Staten is de retinale stoornis die bekend staat als ouderdomsmaculaire degeneratie (AMD). Naarmate AMD voort-5 schrijdt wordt de ziekte gekenmerkt door een verlies aan scherp, centraal zichtvermogen. Het gebied van het oog dat door AMD beschadigd wordt is de Macula, een klein gebied in het centrum van de retina, hoofdzakelijk samengesteld uit fotoreceptorcellen. Zogenoemde “droge” AMD, verantwoordelijk voor ongeveer 85 tot 90% van de AMD-patiënten, omvat veranderingen in de oogpigmentverdeling, verlies aan fotoreceptoren 10 en verminderde retinale functie die te wijten is aan een algemene atrofie van cellen. De zogenoemde natte AMD omvat de proliferatie van abnormale choroïdale vaten welke tot samenklonteringen of littekens in de subretinale ruimte leidt. Dus geschiedt het optreden van de natte AMD vanwege de vorming van een abnormaal choroïdaal neovas-culaire netwerk (choroïdale neovascularisatie, CNV) onder de neurale retina. De nieuw 15 gevormde bloedvaten lekken in sterke mate. Dit leidt tot een accumulatie van subreti-naal vocht en bloed die tot verlies aan visuele scherpte leidt. Eventueel is er een totaal verlies aan functionele retina in het gebied dat hierbij betrokken is, naarmate een groot disciform litteken dat choroïden en de retina treft, wordt gevormd. Terwijl droog AMD-patiënten een gezichtsvermogen van afgenomen kwaliteit kunnen behouden re-20 sulteert AMD vaak in blindheid (Hamdi & Kenney, Age-related Macular degeneration - a new viewpoint, Frontiers in Bioscience, e305-314, mei 2003). CNV geschiedt niet slechts bij de natte AMD, maar tevens in andere oculaire pathologieën, zoals bijvoorbeeld een oculair histoplasmosissyndroom, angiodestrepen, breuken in het membraan van Bruch, myopiedegeneratie, oculaire tumoren en enkele retinale degeneratieve 25 ziekten.

Verscheidene onderzoekingen die uitgevoerd zijn, hebben verscheidene risicofactoren voor AMD bepaald, zoals bijvoorbeeld roken, oud worden, familiegeschiedenis (Milton, Am J Ophthalmol 88,269 (1979); Mitchell et al., Ophthalmology 102, 1450-1460 (1995); Smith et al., Ophthalmology 108, 697-704 (2001)) geslacht (7-30 maal hogere kans bij vrouwen: Klein et al., Ophthalmology 99, 933-943 (1992) en ras (blanken zijn meer vatbaar). Additionele risicofactoren kunnen oogkenmerken, zoals verziendheid (hyperopia) en lichtgekleurde ogen, alsmede cardiovasculaire ziekte en 6 hypertensie omvatten. Bewijs van genetische betrokkenheid in de progressie van het optreden van de ziekte is eveneens gedocumenteerd (zie Hamdi & Kenney hierboven).

Twee firma’s, Acuity Pharmaceuticals en Sima Therapeutics, hebben recentelijk beide een IND ingediend voor siRNA-moleculen die VEGF respectievelijk 5 VEGF-R1 (Fit-1) remmen, ter behandeling van AMD. Deze moleculen worden Cand5-inhibitor en respectievelijk 027-inhibitor genoemd.

Microvasculaire aandoeningen

Microvasculaire aandoeningen zijn samengesteld uit een brede groep van 10 aandoeningen die hoofdzakelijk de microscopische capillairen en lymfatica beschadigen en derhalve buiten het domein van de rechtstreekse chirurgische interventie vallen. De microvasculaire ziekte kan breed gegroepeerd zijn in de vasospastische. de vasculitische en de lymfatische occlusieve ziektetoestand. Bovendien hebben vele van de bekende vasculaire ziektetoestanden een microvasculair 15 element dat hiermee geassocieerd is.

• Vasospastische ziekte - Vasospastische ziekten zijn een groep van betrekkelijk gebruikelijke ziektetoestanden waarbij om onbekende oorzaken, de perifere vaso-constrictieve reflexen hypersensitief zijn. Dit resulteert in een ongeschikte vasocon- 20 strictie en weefselischemie, zelfs tot het bereiken van weefsel verlies. Vasospastische symptomen zijn gewoonlijk gerelateerd aan temperatuur of de toepassing van een vibrerende inrichting, maar kunnen secundair zijn aan andere ziektetoestanden.

• Vasculitische ziekte - Vasculitische ziekten zijn die welke een primair ontstekingsproces in de microcirculatie omvatten. Vasculitisch is gewoonlijk een 25 component van een autoimmune of bindweefselaandoening en is niet-algemeen vatbaar voor chirurgische behandeling, maar vereist een immunosuppressieve behandeling indien de symptomen ernstig zijn.

• Lymfatische occlusieve ziekte - Chronische zwelling van het lagere of bovenste ledemaat (lymfoedema) is het resultaat van een perifere lymfatische occlusie. Dit is 30 een betrekkelijk zeldzame ziektetoestand die een groot aantal oorzaken heeft die soms erfelijk en soms verworven zijn. De hoofdbehandelingswijzen zijn de op de juiste wijze aangebrachte drukverbanden en de toepassing van intermitterende drukapparaten.

7

Microvasculaire pathologieën die met diabetes geassocieerd zijn

Diabetes is de hoofdoorzaak van blindheid, de hoofdoorzaak van amputaties en impotentie, en één van de meest frequent optredende chronische ziekten in de 5 kindeijaren. Diabetes is tevens de hoofdoorzaak van de eindstadiumnierziekte in de Verenigde Staten met een prevalentiepercentage van 31% vergeleken met andere ziekten van de nieren. Diabetes is tevens de meest frequente indicatie voor niertransplantatie die verantwoordelijk is voor 22% van alle transplantatie-ingrepen.

In het algemeen kunnen diabetische complicaties breed worden geclassifi-10 ceerd als microvasculaire of macrovasculaire zieke. Microvasculaire complicaties omvatten neuropathie (schade aan de zenuwen), nefropathie (nierziekte) en aandoeningen van het gezichtsvermogen (bijvoorbeeld retinopathie, glaucoma, cataract en comeale ziekte). In de retina, glomerulus en vasa nervorum, kenmerken vergelijkbare pathofysi-ologische kenmerken diabetesspecifieke microvasculaire ziekte.

15 Microvasculaire pathologieën die met diabetes geassocieerd zijn, zijn gedefinieerd als een ziekte van de kleinste bloedvaten (capillairen) die bijvoorbeeld bij mensen kunnen optreden, die reeds lang aan diabetes lijden. De wanden van de vaten worden abnormaal dik, maar zijn zwak. Derhalve bloeden zij, proteïne lekt hieruit en de bloedstroom door het lichaam wordt vertraagd.

20 Klinische en diermodeldata geven aan dat chronische hyperglycemie de centraal initiërende factor is voor alle typen diabetische microvasculaire ziekte. Duur en om vang van hyperglycemie zijn beide sterk gecorreleerd met de mate en graad van progressie van de diabetische microvasculaire ziekte. Ofschoon alle diabetische cellen blootgesteld worden aan verhoogde plasmaglucosespiegels, is de hyperglycemische 25 schade tot deze celtypen (bijvoorbeeld endotheliale cellen) beperkt die intracellulaire hyperglycemie ontwikkelen. Endotheliale cellen ontwikkelen intracellulaire hyperglycemie omdat zij, anders dan vele andere cellen, glucosetransport niet benedenwaarts kunnen reguleren wanneer zij aan extracellulaire hyperglycemie blootgesteld worden. Dat intracellulaire hyperglycemie noodzakelijk en voldoende is voor de ontwikkeling 30 van een diabetische pathologie is verder bewezen door het feit dat overexpressie van het GLUTl-glucosetransportmiddel in mesangiale cellen gekweekt in een normaal glu-cosemedium het diabetische fenotype nabootst, waardoor dezelfde toenamen in colla- 8 geen Type IV, collageen Type I en fibronectinegenexpressie als diabetische hypergly-cemie geïnduceerd worden.

Abnormale endotheliale celfunctie: Vroeg tijdens het verloop van diabetes melli- tus voordat structurele veranderingen duidelijk zijn, veroorzaakt hyperglycemie abnor-5 maliteiten in de bloedstroom en vasculaire permeabiliteit in de retina, glomerulus en perifere zenuw vasa nervorum. Van de toename in de bloedstroom en intracapillaire druk wordt gedacht dat deze de hyperglycemiegeïnduceerde afgenomen stikstofoxide (NO)-productie aan de aanvoerzijde van capillaire bedden en mogelijkerwijze een verhoogde gevoeligheid voor angiotensine II, weergeeft. Ten gevolge van een verhoogde 10 intracapillaire druk en endotheliale celdysfunctie, vertonen retinale capillairen een verhoogde lekkage van fluoresceïne en glomerulaire capillairen hebben een verhoogde albumineafscheidingssnelheid (AER). Vergelijkbare veranderingen treden in het vasa vasorum van de perifere zenuw op. Vroeg tijdens het verloop van diabetes is een verhoogde permeabiliteit omkeerbaar; na verkoop van tijd wordt dit echter onomkeerbaar. 15 V erhooede vaatwandproteïneaccumulatie

Het gemeenschappelijke pathofysiologische kenmerk van de diabetische microvasculaire ziekte is de progressieve vernauwing en uiteindelijke occlusie van vasculaire lumina, die in een niet-adequate perfusie en functie van de beschadigde weef-20 seis resulteert. Vroege door hyperglycemie geïnduceerde microvasculaire hypertensie en een verhoogde vasculaire permeabiliteit dragen bij tot onomkeerbare microvaat-occlusie via drie processen: • Het eerste is een abnormale lekkage van peijoodzuur-Schifif-(PAS)-positieve 25 koolhydraat bevattende plasmaproteïnen die in de capillaire wand afgezet worden en die perivasculaire cellen, zoals pericyten en mesangiale cellen kunnen stimuleren ter productie van groeifactoren en extracellulaire matrix.

• Het tweede is extravasatie van groeifactoren, zoals transformerende groeifactor β 1 (TGF-βΙ), die de overproductie van extracellulaire matrixcomponenten stimuleert 30 en apoptose in bepaalde complicatierelevante celtypen kunnen induceren.

• Het derde is de door hypertensie geïnduceerde stimulatie van pathologische genexpressie door endotheliale cellen en hulpcellen die glut-1 glucosedragers, groeifactoren, groeifactorreceptoren, extracellulaire matrixcomponenten en adhesie- 9 moleculen die circulerende leukocyten kunnen activeren, omvatten. De waarneming dat unilaterale reductie in de ernst van de diabetische microvasculaire ziekte aan de zijde met optalmische of renale vaatstenosis optreedt is in overeenstemming met dit concept.

5

Microvasculair celverlies en vaatocclusie

De progressieve vernauwing en occlusie van diabetische microvasculaire lumina gaan tevens gepaard met microvasculair celverlies. In de retina induceert diabetes mellitus de geprogrammeerde celdood van Müller-cellen en ganglioncellen, peri-10 cyten en endotheliale cellen. In de glomerulus wordt de afnemende renale functie geassocieerd met de breed voorkomende capillaire occlusie en podocytverlies, maar de mechanismen die aan glomerulair celverlies ten grondslag liggen zijn nog niet bekend. In het vasa nervorum treden endotheliale cel- en pericytdegeneratie op en deze microvasculaire veranderingen schijnen aan de ontwikkeling van diabetische perifere neuropa-15 thie vooraf te gaan. De multifocale verdeling van axonale degeneratie in diabetes ondersteunt een causale rol voor microvasculaire occlusie, maar kunnen door hyper-glycemie geïnduceerde afnamen in neurotrofinen bijdragen tot het verhinderen van normale axonale reparatie en regeneratie.

Een ander gemeenschappelijk kenmerk van de diabetische microvasculaire 20 ziekte wordt hyperglycemisch geheugen of de persistentie of progressie van door hy-perglycemie geïnduceerde microvasculaire veranderingen tijdens hierop volgende perioden van normale glucosehomeostasis, genoemd. Het meest frappante voorbeeld van dit verschijnsel is de ontwikkeling van ernstige retinopathie in histologisch normale ogen van diabetische honden die geheel optrad tijdens een 2 Ά jaar durende periode van 25 genormaliseerd bloedglucose na een periode van 2 lA jaar hyperglycemie. Door hyper-glycemie geïnduceerde toenamen in de geselecteerde matrixgentranscriptie blijft tevens gedurende weken voortduren na herstel van normoglycemie in vivo en een minder uitgesproken, maar kwalitatief vergelijkbare, verlenging van door hyperglycemie geïnduceerde toename in geselecteerde matrixgentranscriptie treedt in gekweekte andotheliale 30 cellen op.

Voor verdere informatie zie “Shared pathophysiologic features of microvascular complications of diabetes” (Larsen: Williams Textbook of Endocrinology, 10de druk, copyright © 2003 Elsevier).

Microvasculaire complicaties treden niet slechts op in duidelijke diabetes, maar is tevens te wijten aan de verminderde glucosetolerantie (IGT). Microvasculaire competenties van IGT: neuropathie, retinopathie en renale microproteïnuria.

10 5 Diabetische neuropathie.

Diabetische neuropathieën zijn neuropathische stoornissen (perifere zenuw-schade) die met diabetes mellitus geassocieerd zijn. Deze ziektetoestanden resulteren gewoonlijk van diabetisch micro vasculair letsel waarbij kleine bloedvaten betrokken zijn die zenuwen (vasa nervorum) voorzien. Betrekkelijk gebruikelijke ziektetoestan-10 den die geassocieerd kunnen zijn met diabetische neuropathie, omvatten derde zenuw-verlamming; mononeuropathie; mononeuropathische multiplex; diabetische amyotro-fie; een pijnlijke polyneuropathie; autonome neuropathie; en thoracoabdominale neuropathie en de meest gebruikelijke vorm, perifere neuropathie die hoofdzakelijk de voeten en de benen beschadigen. Er zijn vier factoren die betrokken zijn bij de ontwikke-15 ling van diabetische neuropathie: microvasculaire ziekte, gevorderde glucose bevattende eindproducten, proteïnekinase C en het polyolpad.

Microvasculaire ziekte in diabetische neuropathie

Vasculaire en neurale ziekten zijn nauw geassocieerd met elkaar en zijn 20 sterk met elkaar gerelateerd. Bloedvaten hangen van normale zenuwfunctie af en zenuwen zijn afhankelijk van een adequate bloedstroom. De eerste pathologische verandering in de microvasculatuur is vasoconstrictie. Naarmate de ziekte voortschrijdt, correleert de neuronale dysfunctie sterk met de ontwikkeling van vasculaire abnormaliteiten, zoals de capillaire basismembraanverdikking en de endotheliale hyperplasie die 25 bijdragen tot een verminderde zuurstofspanning en hypoxia. Neuronale ischemie is een algemeen aanvaard kenmerk van de diabetische neuropathie. Vasodilatoire middelen (bijvoorbeeld angiotensine-converterende enzyminhibitoren, alfal -antagonisten) kunnen leiden tot aanmerkelijke veranderingen in de neuronale bloedstroom met de corresponderende verbeteringen in zenuwgeleidingssnelheden. Dus treedt de microvasculaire 30 dysfunctie vroeg in diabetes op, loopt parallel met de progressie van de neurale dysfunctie en kan voldoende zijn om de ernst van de structurele functie te ondersteunen, en in diabetische neuropathie waargenomen klinische veranderingen. Perifere neuropathie 11 (benen), sensorimotomeuropathie is een significante component in de pathogenese van beenzweren in diabetes.

Neuropathie is een gebruikelijke complicatie van diabetes die na verloop van tijd optreedt in meer dan de helft van patiënten met Type 2 diabetes. Zenuwgelei-5 dingonderzoekingen demonstreren dat neuropathie reeds aanwezig is in 10 tot 18% van de patiënten ten tijde van diabetesdiagnosis, hetgeen suggereert dat perifeer zenuwstelsel in de eerdere stadia van de ziekten en met een mildere glycemische disregulering optreedt. Het concept dat neuropathie een vroeg klinisch teken van diabetes is werd meer dan 40 jaar geleden voorgesteld en de meeste onderzoekingen rapporteren een 10 associatie tussen IGT en neuropathie. De meest patiënten met IGT en geassocieerde neuropathie hebben een symmetrische, distale sensorische polyneuropathie met een prominente neuropathische pijn. IGT-neuropathie (Microvascular complications of impaired glucose tolerance - Perspectives in Diabetes, J. Robinson Singleton, in Diabetes 1 december 2003) is fenotypisch vergelijkbaar met de vroege diabetische neuro-15 pathie die tevens sensorische symptomen veroorzaakt, waaronder pijn en een autonome dysfunctie. In een overzichtstudie van 669 patiënten met een vroege diabetische neuropathie waren sensorische symptomen aanwezig in meer dan 60%, impotentie in ca. 40% en andere autonome betrokkenheid in 33%, maar bewijs van motorische betrokkenheid in slechts 12%. Deze klinische bevindingen suggereren een prominente vroege 20 betrokkenheid van de kleine niet-gemyelineerde zenuwvezels die pijn, temperatuur en autonome signalen dragen. Rechtstreekse kwantificering van niet-gemyelineerde intra-epidermale zenuwvezels afkomstig van huidbiopsieën laat een vergelijkbaar vezelver-lies en een gewijzigde morfologie in patiënten met neuropathie geassocieerd met IGT en vroege diabetes zien.

25 Een autonome dysfunctie, in het bijzonder een erectiele dysfunctie en gewijzigde cardiale vagale respons zijn gebruikelijke vroege kenmerken van neuro-pathisch letsel in diabetes. Werk met IGT-patiënten suggereert tevens een prevalente vagale dysautonomia: afzonderlijke onderzoekingen hebben een abnormaal hartsnel-heidsherstel na oefening, een verminderde R-R-intervalvariabiliteit ten aanzien van 30 diep ademhalen en een gereduceerde expiratie- tot inspiratieverhouding (alle zijn maten van vagale dysautonomia) in een grotere fractie van IGT-patiënten dan normoglycemi-sche controlepatiënten met een overeenkomstige leeftijd, zien.

12

Zenuwschade in diabetes beïnvloedt de motorische, sensorische en autonome vezels. Motorische neuropathie veroorzaakt spierzwakte, atrofie en paresis. Sensorische neuropathie leidt tot verlies aan de beschermende sensaties van pijn, druk en hitte. De afwezigheid van pijn leidt tot vele problemen in de ongevoelige voet, waar-5 onder zweervorming, niet-waargenomen traumata en Charcot-neuroartropathie. De patiënt zou mogelijkerwijze niet om behandeling vragen tot het tijdstip nadat de wond in een vergevorderd stadium voorkomt. Een combinatie van sensorische en motorische dysfunctie kan er de oorzaak van zijn dat de patiënt een abnormale belasting legt op de voet hetgeen resulteert in traumata die tot infectie kunnen leiden. Autonome sympathe-10 tische neuropathie veroorzaakt vasodilatatie en een verminderd zweten hetgeen resulteert in warme, zeer droge voeten die in het bijzonder de neiging hebben tot huid-afbraak alsmede functionele veranderingen in de microvasculaire stroom. Autonome dysfunctie (en ontzenuwing van dermale structuren) resulteert tevens in het verlies aan huidintegriteit hetgeen een ideale plaats voor microbiële invasie verschaft. De neuro-15 pathische voet vormt niet spontaan zweren, maar is eerder de combinatie van enige vorm van trauma geassocieerd met neuropathie.

Microvasculaire dysfunctie treedt vroeg in diabetes op, loopt parallel met de progressie van neurale dysfunctie en kan voldoende zijn om de ernst van structurele, functionele en klinische veranderingen die in diabetische neuropathie waargenomen 20 worden, te ondersteunen.

Vergevorderde glucose bevattende eindproducten - Verhoogde intracellulaire niveaus van glucose veroorzaken een niet-enzymatische covalente binding met proteïnen, die hun structuur verandert en hun functie vernietigt. Bepaalde van deze glucose bevattende proteïnen zijn betrokken in de pathologie van diabetische neuropathie 25 en andere lange-termijncomplicaties van diabetes.

Proteïnekinase C (PKC) - PKC is betrokken bij de pathologie van diabetische neuropathie. Verhoogde spiegels van glucose veroorzaken een toename in intracellulaire diacylglycerol die PKC activeert. PKC-inhibitoren in diermodellen zullen zenuwgeleidingsnelheid verhogen door een verhoging van de neuronale bloedstroom.

Sensorimotorische polyneuropathie

Langere zenuwvezels worden in grotere mate beïnvloed dan de korte omdat zenuwgeleidingsnelheid evenredig met de zenuwlengte vertraagd wordt. In dit syn- 30 13 droom treden een verlaagd gevoel en verlies aan reflexen eerst in de tenen bilateraal op en breidt zich in bovenwaartse richting uit. Het wordt gewoonlijk beschreven als de zogenoemde “handschoenverdeling” van ongevoeligheid, verlies aan sensorische eigenschappen, dysesthesia en pijn gedurende de nacht. De pijn kan ondervonden wor-5 den als verbranding, steken, jeuk of sloomheid. Het gevoel van naalden en pinnen is gebruikelijk. Verlies aan proprioceptie, dat wil zeggen het gevoel dat het lid of ledemaat in de ruimte ligt is eerder aangetast. Deze patiënten hebben niet het gevoel wanneer zij op een vreemd lichaam, zoals bijvoorbeeld een splinter stappen, dan wel wanneer zij een eeltplek ontwikkelen door een schoen die niet past. Dientengevolge lopen 10 zij het risico zweren en infecties aan de voeten en benen te ontwikkelen die tot amputatie kunnen leiden. Op vergelijkbare wijze kunnen deze patiënten een aantal fracturen van de knie, enkel of voet ontwikkelen en ontwikkelen een Charcot-gewricht. Verlies aan motorfunctie resulteert in dorsiflexiecontracturen van de tenen, de zogenoemde hamertenen. Deze contracturen treden niet slechts in de voet, maar tevens in de hand 15 op.

Autonome neuropathie

Het autonome zenuwstelsel is samengesteld uit zenuwen die het hart, het maagdarmkanaal en het urinaire systeem bedienen. Autonome neuropathie kan één of 20 meer van deze orgaansystemen aantasten. De meest erkende autonome dysfunctie in diabetici is de orthostatische hypotensie dan wel de onplezierige sensatie van flauwvallen wanneer een patiënt opstaat. In het geval van de diabetische autonome neuropathie is deze te danken aan het hartfalen en het falen van de bloedvaten bij het op geschikte wijze instellen van het hartritme en vasculaire spanning om het bloed continu te 25 laten stromen en het volledig naar de hersenen te laten stromen. Dit symptoom is gewoonlijk vergezeld met een verlies van sinusademhalingsvariatie, dat is de gebruikelijke verandering in hartritme gezien met een abnormaal ademhalen. Wanneer deze twee vindingen aanwezig zijn is een cardiale autonome neuropathie aanwezig.

Maagdarmkanaal verschijnselen omvatten een vertraagd leegmaken van de 30 maag, gastroparesis, nausea, opgeblazen gevoel en diarree. Omdat vele diabetici orale medicatie voor hun diabetes innemen is de absorptie van deze geneesmiddelen sterk beïnvloed door het vertraagd leegmaken ofwel leeg worden van de maag. Dit kan leiden tot hypoglycemie wanneer een oraal diabetisch middel voorafgaande aan de maal- 14 tijd wordt ingenomen en tot uren hierna of soms dagen hierna niet geabsorbeerd raakt, wanneer er reeds een normale of lage bloedsuikerspiegel heerst. Trage beweging van de dunne darm kan een overproductie van bacteriën veroorzaken die verergerd wordt door de aanwezigheid van hyperglycemie. Dit leidt tot een gevoel van opgeblazen zijn, gas 5 en diarree.

Urinaire symptomen omvatten urinaire frequentie, urgentie, incontinentie en retentie. Wederom omdat de retentie van zoete urine, zijn urinaire stelselinfecties zeer frequent. Urinaire retentie kan leiden tot blaasdiverticula, stenen en refluxnefro-pathie.

10

Craniale neuropathie

Wanneer craniale zenuwen aangetast zijn, zijn oculomotor (B^j-neuropa-thieën zeer gebruikelijk. De oculomotorische zenuw beheerst alle spieren die het oog in beweging brengen met uitzondering van de laterale rectus en de bovenste dwarsspieren. 15 Het dient tevens tot de constrictie van de pupil en het openen van het ooglid. Het begin van een diabetische derde zenuwpalsie is gewoonlijk abrupt, beginnende met een frontale of periorbitale pijn en vervolgens diplopia. Al deze oculomotorische spieren die gestimuleerd worden door de derde zenuw kunnen worden aangetast, behalve die welke de grootte van de pupil beheersen. De zesde zenuw, de abducenszenuw, die de laterale 20 rectusspier van het oog stimuleert (het oog lateraal in beweging brengt) is tevens gewoonlijk aangetast, maar de vierde zenuw, de trochlea-zenuw- (stimuleert de bovenste dwarsspier die het oog naar beneden toe in beweging brengt) betrokkenheid is ongebruikelijk. Mononeuropathieën van de thorax of lumbale ruggenmergzenuwen kunnen optreden en leiden tot pijnlijke syndromen die het myocardiale infarct, cholecystitis of 25 appendicitis nabootsen. Diabetici hebben een hogere incidentie van vang-neuropa-thieën, zoals het carpaaltunnelsyndroom.

15

Diabetische ledcmaatischemie en diabetische voetzweren

Diabetes en druk kunnen de microvasculaire circulatie nadelig beïnvloeden en leiden tot veranderingen in de huid op de lagere extremiteiten die op hun beurt tot zweervorming en hierop aansluitende infectie kunnen leiden. Microvasculaire verande-5 ringen leiden tot ledemaatspiermicroangiopathie alsmede een predispositie tot de ontwikkeling van perifere ischemie en een verminderde angiogenesecompensatoire respons op ischemische gebeurtenissen. Microvasculaire pathologie verergert de perifere vasculaire ziekte (PVD), ofwel perifere arteriële ziekte (PAD) dan wel lagere extremi-teitarteriële ziekte (LEAD)- een MACRO-vasculaire complicatie - vernauwing van de 10 vaten in de benen die te wijten is aan artherosclerosis. PVD treedt eerder op in diabetici, is meer ernstig en is breed verspreid en omvat tevens bijkomende microcirculatoire problemen die de benen, ogen en nieren beschadigen.

Voetzweren en gangreen zijn vaak comorbide ziektetoestanden van PAD. Hiermee gepaard gaande perifere neuropathie met een verminderd gevoel maakt de 15 voet vatbaar voor traumata, zweervorming en infectie. De progressie van PAD in diabetes is samengesteld uit een dergelijke comorbiditeit als perifere neuropathie en ongevoeligheid van de voet en lager gelegen extremiteiten voor pijn en traumata. Met een verminderde circulatie en een verminderd gevoel treden zweervorming en infectie op. Progressie tot osteomyelitis en gangreen kunnen een amputatie noodzakelijk maken.

20 Personen met diabetes zijn tot 25 maal meer vatbaar dan niet-diabetische personen voor het ondergaan van een amputatie van een lager ledemaat, hetgeen de noodzaak onderstreept van de preventie van voetzweren en een hierop aansluitend verlies van een ledemaat.

Diabetische voetzweren kunnen niet slechts optreden in samenhang met PAD, maar 25 kunnen tevens geassocieerd zijn met neuropathie, vaatinsufficiëntie (varicose vaten), traumata en infectie. PAD draagt bij tot deze andere ziektetoestanden bij het produceren of versnellen van het voorkomen van voetzweren. Voetzweren vertegenwoordigen niet noodzakelijk een progressie van de PAD aangezien zij kunnen optreden bij aanwezigheid van adequate klinische perifere arteriële perfusie. Op patiënten gebaseerde on-30 derzoekingen geven een verhoogd risico van voetzweren in diabetische patiënten aan, die een perifere neuropathie en een hoge voetbeddruk aan. De prevalentie van een geschiedenis van zweren of wonden aan de voet of enkels was 15% van alle diabetische patiënten in het op populatie gebaseerde onderzoek in zuidelijk Wisconsin. De preva- 16 lentie was hoger voor diabetische patiënten die op een leeftijd lager dan 30 jaar gediagnosticeerd waren, was enigszins hoger in mannen (16%) dan in vrouwen (13%) en was groter in met insuline behandelde diabetische patiënten (17%) dan in patiënten die geen insuline innemen (10%). De prevalentie nam met de leeftijd toe, in het bijzonder in 5 diabetische patiënten die op een leeftijd beneden de 30 jaar gediagnosticeerd waren. In patiëntenonderzoekingen uit Europa was de prevalentie van voetzweren in diabetische patiënten 3% in patiënten die minder dan 50 jaar oud waren, 7% in patiënten die jonger waren dan 60 jaar en 14% in de patiënten die jonger waren dan 80 jaar. Prevalentie was groter in mannen dan in vrouwen in de leeftijd van 70 jaar.

10 In diabetische patiënten waren voetischemie en -infectie ernstige en zelfs levensbedreigende gebeurtenissen; echter is neuropathie de meest moeilijk te behandelen ziektetoestand. De medische en chirurgische literatuur met betrekking tot alle aspecten van de klinische en pathologische manifestaties van de diabetische voet is overweldigend. Neuropathie, angiopathie, retinopathie en nefropathie alleen of in combina-15 tie en in verschillende graden van ernst kunnen de behandeling van de diabetische voet beïnvloeden.

Elk jaar worden 82.000 amputaties van de ledematen uitgevoerd in patiënten met diabetes mellitus. De meerderheid van deze amputaties worden in de oudere populatie uitgevoerd. Amputaties resulterende van diabetes kunnen optreden afkomstig 20 van een groot aantal etiologieën waaronder voetzweren, ischemie, aderzweren van het been (ofwel de zweren die als bijwerking optreden van veneus reflux) en hielzweren (ofwel die welke resulteren van onbehandelde drukzweren in de hiel). De meerderheid van deze amputaties zijn afkomstig van zweren. De prevalentie van voetzweren onder patiënten met diabetes is 12%. Bovendien, de gedurende 20 jaar cumulerende inciden-25 tie van zweren van de lagere extremiteiten in patiënten met Type I diabetes is 9,9%. Door diabetes geïnduceerde ledemaatamputaties resulteren in een 5-jaar mortaliteits-percentage van 39% tot 68% en zijn geassocieerd met een verhoogd risico van additionele amputaties. De duur van het verblijf in een ziekenhuis is ca. 60% langer om de patiënten met diabetische voetzweren vergeleken met die zonder zweren.

30 Diabetische neuropathie vermindert de zenuwasreflex die afhankelijk is van gezonde C-vezelnociceptorfunctie en veroorzaakt lokale vasodilatatie in respons op een pijnlijk stimulus. Deze ziektetoestand compromitteert verder de vasodilatoire respons aanwezig in ziektetoestanden van stress, zoals letsel of ontsteking in de diabetische 17 neuropathische voet. Deze verslechtering kan tendele verklaren waarom enkele zweren in de diabetische neuropathische voet langzaam helen dan wel helemaal niet helen ondanks een succesvolle revascularisatie van de lagere uiteinden.

Het meest gebruikelijke causale pad tot diabetische voetzweervorming kan 5 dus worden geïdentificeerd als de combinatie van neuropathie (gevoelverlies), deformatie (bijvoorbeeld prominente metatarsale hoofden), en traumata (bijvoorbeeld slecht passend schoeisel).

De meeste chirurgen geven de voorkeur een popliteale of tibiale arteriële bypass uit te voeren vanwege lagere percentages redding van de ledemaat en duidelijk-10 heid vergeleken met andere proximale procedures. Indien popliteale of tibiale arteriële bypass niet in staat is om een tastbare voetpuls te herstellen, is een pedale bypass gerapporteerd waarbij een meer duurzame en effectieve procedure voor het redden van de ledemaat verschaft wordt voor patiënten met diabetes en wonden van de ischemische voet. Zelfs een uitgebreide multisegment occlusieve ziekte in patiënten met diabetes 15 vertegenwoordigt niet een belemmering voor het redden van de voet. Hoewel ernstige wondcomplicaties desastreuze resultaten kunnen hebben zijn zij ongebruikelijk na een pedale bypasstransplantatie. Adequate controle van bestaande voetinfectie en een zorgvuldige transplantatietunneling zijn werkzaam gebleken bij het vermijden van verdere complicaties. Angioplastie in de lagere extremiteit wordt steeds meer progressief toe-20 gepast. Echter dient onderstreept te worden dat voor het verkrijgen van een werkzame angioplastie een distaai vat of voedingvat open moet zijn indien men een succesvolle meer proximale angioplastie wenst te bereiken.

Terwijl diabetische zweren/ledemaatpathologieën in enkele patiënten beheerst kunnen worden (door uitsnijden voor verbranding, antibiotische behandeling, 25 toepassing van preparaten ter stimulering van granuleringsweefsel (nieuw collageen en angiogenese) en reductie van bacteriële belasting in de wond), zou het van voordeel kunnen zijn een farmaceutisch preparaat te hebben dat beter in staat zou zijn deze ziektetoestanden te behandelen en/of de symptomen te verlichten.

Voor verdere informatie zie American Journal of Surgery, band 187, num-30 mer 5 Suppl 1,1 mei 2004, copyright © 2004 Elsevier.

18

Coronaire microvasculaire dysfunctie in diabetes

De correlatie tussen histopathologie en microcirculatoire dysfunctie in diabetes is bekend uit oude experimentele onderzoekingen en uit de autopsie, waarbij verdikking van het basale membraan, perivasculaire fibrosis, vasculaire rareficatie en 5 capillaire hemorrhagie vaak gevonden worden. Het blijft moeilijk deze data in vivo te bevestigen ofschoon een recente publicatie een correlatie demonstreerde tussen pathologie en oculaire microvasculaire dysfunctie (Am J Physiol 2003;285). Een groot aantal klinische onderzoekingen indiceren echter dat niet slechts open diabetes, maar tevens een verslechterde metabolische controle de coronaire microcirculatie kan beïnvloeden 10 (Hypert Res 2002;25:893). Wemer verwees naar de belangrijke publicatie door Sambuceti et al. (Circulation 2001; 104:1129) die de persistentie laat zien van de microvasculaire dysfunctie in patiënten na het succesvolle heropenen van het met het infarct geassocieerde bloedvat en dat de verhoogde cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit in deze patiënten verklaren kan. Er is toenemend bewijs uit grote acute reperfusie-15 onderzoekingen dat morbiditeit en mortaliteit niet geassocieerd zijn met het heropenen zelf van het met het infarct gerelateerde vat, maar veel meer afhankelijk is van de TIMI-stroom+/- myocardiaal blush (Stone 2002; Feldmann Circulation 2003). Herrmann onder anderen gaf aan dat de integriteit van de coronaire microcirculatie waarschijnlijk de meest belangrijke klinische en voorspellende factor is in deze context 20 (Circulation 2001). Het neutrale effect van beschermingsapparaten (geen relevante verandering voor TIMI-stroom, voor ST-resolutie of voor MACE) kan een indicatie zijn dat een functionele verslechtering van de microcirculatie de hoofdbepalende factor is van prognose. Er bestaat tevens een toenemend bewijs dat coronaire microvasculaire dysfunctie een hoofdrol speelt in niet-obstructieve CAD. Coronaire endotheliale dys-25 functie blijft een sterke prognosevoorspeller in deze patiënten.

Diabetische nefropathie (renale dysfunctie in patiënten met diabetes)

Diabetische nefropathie omvat microalbuminuria (een microvasculair ziekte-effect), proteinuria en ESRD. Diabetes is de meest gebruikelijke oorzaak van 30 nierfalen, verantwoordelijk voor meer dan 40% van nieuwe gevallen. Zelfs wanneer geneesmiddelen en dieet in staat zijn tot het beheersen van diabetes kan de ziekte leiden tot nefropathie en nierfalen. De meeste mensen met diabetes ontwikkelen geen nefiro-pathie die ernstig genoeg is om nierfalen te veroorzaken. Ongeveer 16 miljoen mensen 19 in de Verenigde Staten hebben diabetes en ongeveer 100.000 mensen lijden aan nier-falen ten gevolge van diabetes.

Diabetische retinopathie 5 In de diabetische toestand leidt hyperglycemie tot een verminderde retinale bloedstroom, retinale hyperpermeabiliteit, vertragingen in de fotoreceptorzenuwgelei-ding en retinale neuronale celdood. In kortdurende diabetes is neuronale celdood geïdentificeerd binnen de inwendige kemlaag van de retina. Specifiek is apoptose gelokaliseerd aan gliale cellen, zoals Müller-cellen en astrocyten en bleek op te treden 10 binnen één maand van diabetes in het door STZ geïnduceerde diabetische ratmodel. De oorzaak van deze gebeurtenissen is multifactorieel waaronder activering van het dia-cylglycerol/PKC-pad, oxidatieve belasting en niet-enzymatische glycosylering. De combinatie van deze gebeurtenissen maakt de retina hypoxisch en leidt uiteindelijk tot de ontwikkeling van diabetische retinopathie. Eén mogelijk verband tussen retinale 15 ischemie en de vroege veranderingen in de diabetische retina is de door hypoxia geïnduceerde productie van groeifactoren, zoals VEGF. De hoofdregulator van de hy-poxische respons is geïdentificeerd als hypoxia-induceerbare factor-1 (HIF-1) die genen controleert welke cellulaire proliferatie en angiogenese reguleren. Eerdere onderzoekingen hebben gedemonstreerd dat inhibitie van HIF-l-ubiquitinatie leidt tot 20 binding met hypoxiaresponsafgevende elementen (HRE) en productie van VEGF-mRNA.

Diabetische retinopathie wordt gedefinieerd als de progressieve dysfunctie van de retinale vasculatuur die veroorzaakt is door chronische hyperglycemie. Sleutel-kenmerken van diabetische retinopathie omvatten microaneurysmen, retinale hemor-25 rhagieën, retinale lipide-exudaten, katoen-wol-vlekken, capillaire nonperfusie, maculair oedeem en neovascularisatie. Geassocieerde kenmerken omvatten vitreuze hemorrha-gie, retinaal losraken, neovasculaire glaucoma, prematuur cataract en craniale zenuw-verlammingen.

Er zijn 16 miljoen mensen in de Verenigde Staten met Type 1 en Type 2 diabetes. Bin-30 nen 15 jaar hebben 80% van Type 1 patiënten diabetische retinopathie ontwikkeld, terwijl 84% van Type 2 diabetische patiënten binnen 19 jaar retinopathie ontwikkelen. Deze aantallen vormen een significante markt voor therapeutische middelen die gericht zijn op oculaire ziekten van neovasculatuur. De ontwikkeling van diabetische retino- 20 pathie is tijdsafhankelijk. Ondanks een optimale bloedsuikercontrole wordt van patiënten die langdurig ziek zijn verwacht dat zij uiteindelijk enige vorm van retinopathie ontwikkelen. De National Society ter voorkoming van blindheid heeft geschat dat 4 tot 6 miljoen diabetici in de Verenigde Staten diabetische retinopathie hebben. De ge-5 schatte jaarlijkse incidentie van nieuwe gevallen van proliferatieve diabetische retinopathie en diabetisch maculair oedeem zijn 65.000 respectievelijk 75.000 met een prevalentie van 700.000 respectievelijk 500.000. Diabetische retinopatie veroorzaakt 12.000 tot 24.000 nieuwe gevallen van blindheid elk jaar in de Verenigde Staten. Retinopathie wordt behandeld door middel van chirurgische methoden die werkzaam zijn 10 bij het reduceren van ernstig verlies aan gezichtsvermogen, maar de met laser behandelde gedeelten van de retina zijn onomkeerbaar vernietigd. Er zijn geen beschikbare behandelingen met een geneesmiddel.

Een microvasculaire ziekte die primair de capillairen beschadigt, diabetes mellitus beschadigt het oog door vernietiging van de vasculatuur in de conjunctiva, retina en het 15 centrale zenuwstelsel. Patiënten kunnen met voorgeschiedenissen van langdurig geïnjecteerde conjunctivae van de oogbol tezamen met systemische klachten van gewichtsverlies ondanks een grotere dan normale eetlust (polyfasia), abnormale dorst (poly-dypsia) en abnormaal frequent urineren (polyuria) vertonen.

20 Een fluctuerende visuele scherpte die ondergeschikt is aan een niet-stabiele bloedsuikerspiegel is een gebmikelijk oculair teken. Een zwelling binnen de kristallijne lens resulteert in grote plotselinge verschuivingen in refractie alsmede een premature cataractvorming. Veranderingen in visuele scherpte zal van de ernst en het stadium van de ziekte afhankelijk zijn.

25

In de retina kan verzwakking van de arteriolen en capillairen resulteren in het kenmerkende verschijnen van een intraretinaal punt en blothemorrhagieën, exuda-ten, intraretinale microvasculaire abnormaliteiten (IRMA) microaneurysma, oedeem en katoen-wol-infarcten. Proliferatieve diabetische retinopathie is het resultaat van em-30 stige vasculaire deficiëntie en is zichtbaar als neovascularisatie van de schijf (NVD), neovascularisatie elders (NVE) en neovascularisatie van de iris (NVI of rubeosis iri-des). Neurologische complicaties omvatten verlammingen van de derde, vierde en zesde craniale zenuwen alsmede diabetische papillitis en gezichtszenuwverlamming.

21

Diabetes mellitus is een genetisch beïnvloede groep van ziekten die glu-cose-intolerantie delen. Deze wordt gekenmerkt als een stoornis van de metabolische regulering ten gevolge van een deficiënte of slecht functionerende insuline of deficiënte dan wel slecht functionerende cellulaire insulinereceptoren.

5 Biochemie die de vorming van sorbitol omvat, speelt een rol in de destructie van pericyten, die cellen zijn welke het vasculaire endothelium steunen. Naarmate de ondersteunende pericyten sterven wordt het capillaire endothelium beschadigd, hetgeen resulteert in het vasculair lekken van bloed, proteïne en lipide. Dit in combinatie met verdikt, glucose bevattend bloed, produceert een vasculaire 10 insufïïciëntie, capillaire non-perfusie, retinale hypoxia, veranderde structuur en een verminderde functie. De vorming en afgifte van vasoproliferatieve factoren die een rol spelen in de genese van retinale neovascularisatie zijn in onvoldoende mate begrepen.

De meeste bedreigende gevolgen van diabetes die niet op het gezichtsvermogen betrekking hebben verdwijnen spontaan na verloop van weken tot 15 maanden na medische controle. In gevallen waarbij er grote refractieve veranderingen zijn kunnen patiënten een tijdelijk voorschrift voor een bril nodig hebben totdat de refractie stabiliseert. Wanneer retinopathie de macula bedreigt of wanneer nieuwe bloedvaten prolifereren kan de patiënt worden verwezen voor een fotocoagulatie met behulp van een laser. Het diabetische retinopathieonderzoek (DRS) heeft beslist bewezen dat 20 panretinale fotocoagulatie succesvol was in het reduceren van het risico van ernstig verlies aan gezichtsvermogen in hoog-risicopatiënten. Het definieerde de hoog-risico-kenmerken als: (1) neovascularisatie van de optische schijf (NVD) een vierde tot een derde van een schijfdiameter in afmeting en (2) neovascularisatie elders (NVE) met enige vitreuze hemorrhagie.

25

Diabetisch Maculair Oedeem (DME) DME is een complicatie van diabetische retinopathie, een ziekte die de bloedvaten van de retina beschadigt. Diabetische retinopathie resulteert in een aantal afwijkingen in de retina waaronder retinale verdikking en oedeem, hemorrhagieën, 30 verminderde bloedstroom, overmatige lekkage van vloeistof uit bloedvaten en in de laatste stadia abnormale bloedvatgroei. Deze bloedvatgroei kan leiden tot grote hemorrhagieën en ernstige retinale beschadiging. Wanneer de bloedvatlekkage van diabetische retinopathie zwelling in de macula veroorzaakt wordt het aangeduid met DME.

22

Het hoofdsymptoom van DME is een verlies van centraal gezichtsvermogen. Risicofactoren geassocieerd met DME omvatten onvoldoende gecontroleerde bloedglucose-spiegels, een hoge bloeddruk, een abnormale nierfunctie, die vloei stofretentie, hoge cholesterolspiegels en andere algemene systemische factoren veroorzaken.

5 Volgens de wereldgezondheidsorganisatie is de diabetische retinopathie de hoofdoorzaak van blindheid in volwassenen die werkzaam zijn en een hoofdoorzaak van verlies aan gezichtsvermogen bij diabetici. De Amerikaanse diabetesassociatie rapporteert dat er ca. 18 miljoen diabetici in de Verenigde Staten zijn en ca. 1,3 miljoen recentelijk gediagnosticeerde gevallen van diabetes elk jaar in de Verenigde Staten. De 10 stichtingen Prevent Blindness America en het Nationale Ooginstituut schatten dat in de Verenigde Staten er meer dan 5,3 miljoen mensen van 18 jaar of ouder zijn met diabetische retinopathie waaronder ca. 500.000 met DME. Het CDC schat dat er ca. 75.000 nieuwe gevallen van DME elk jaar in de Verenigde Staten zijn.

15 Additionele neuropathieën

Behalve diabetes zijn de gebruikelijke oorzaken van neuropathie herpes zoster-infectie, chronische of acute traumata (waaronder chirurgie) en verscheidene neurotoxinen. Neuropathische pijn is gebruikelijk bij kanker als een direct resultaat van kanker op perifere zenuwen (bijvoorbeeld compressie door een tumor) en als bijwer-20 king van vele chemotherapiegeneesmiddelen.

Microvasculaire ziekte - Vasculaire en neurale ziekten zijn nauw verwant met elkaar en hangen met elkaar samen. Bloedvaten zijn afhankelijk van een normale zenuwfunctie en zenuwen zijn afhankelijk van een adequate bloedstroom. De eerste pathologische 25 verandering in de microvasculatuur is de vasoconstrictie. Naarmate de ziekte voortschrijdt, correleert neuronale dysfunctie nauw met de ontwikkeling van vasculaire afwijkingen, zoals bijvoorbeeld capillaire basismembraanverdikking en endotheliale hyperplasia die een bijdrage leveren tot een verminderde zuurstofspanning en hypoxia. Vasodilatormiddelen (bijvoorbeeld angiotensine-converterende enzyminhibitoren, al-30 antagonisten) kunnen leiden tot aanzienlijke verbeteringen in neuronale bloedstroom, met overeenkomstige verbeteringen in zenuwgeleidingssnelheden.

23

Klinische verschijnselen

Neuropathie beïnvloedt alle perifere zenuwen: pijnvezels, motorische neuronen, autonome zenuwen. Noodzakelijkerwijze kan deze derhalve alle organen en systemen beïnvloeden aangezien zij alle zenuwen omvatten. Er zijn verscheidene af-5 zonderlijke syndromen gebaseerd op de orgaansystemen en leden die beïnvloed worden, maar deze zijn in geen geval uitsluitend. Een patiënt kan een sensorimotorische en autonome neuropathie of elke andere combinatie hebben.

Ondanks vooruitgang in het begrip van de metabolische oorzaken van neuropathie, zijn behandelingen gericht op het onderbreken van deze pathologische 10 processen beperkt door bijwerkingen en gebrek aan doelmatigheid. Dus zijn behandelingen symptomatisch en zijn niet gericht tot de problemen die hieraan ten grondslag liggen. Middelen tegen pijn veroorzaakt door een sensorimotorische neuropathie omvatten tricyclische antidepressieve middelen (TCA’s), serotonineheropname-inhibitoren (SSRTs) en anti-epileptische geneesmiddelen (AED’s). Geen van deze middelen keren 15 de pathologische processen om die tot diabetische neuropathie leiden en geen hiervan verandert het niet-stuitbare verloop van de ziekte. Dus zou het nuttig zijn om een farmaceutische samenstelling te hebben die deze aandoeningen beter kan behandelen en/of die de symptomen verlichten.

20 Additionele retinopathieën

Retinale microvasculopathie fAIDS-retinopathie)

Retinale microvasculopathie wordt in 100% van AIDS-patiënten waargenomen. Het wordt gekenmerkt door intraretinale hemorrhagieën, microaneurysma, Roth-vlekken, katoen-wolvlekken, (micro-infarcten van de zenuwvezellaag) en perivascu-25 laire omhulling. De etiologie van de retinopathie is bekend ofschoon men gedacht heeft de deze te wijten was aan circulerende immune complexen, lokale afgifte van cytotoxi-sche stoffen, abnormale hemorheologie en HIV-infectie van endotheliale cellen. AIDS-retinopathie is nu zo gebruikelijk dat katoen-wolvlekken in een patiënt zonder diabetes of hypertensie, maar die een risico lopen voor HIV snel de arts dient te overtuigen om 30 een virale test in overweging te nemen. Er is geen specifieke behandeling voor AIDS-retinopathie, maar zijn voortdurende aanwezigheid kan een arts stimuleren om de doelmatigheid van de HIV-therapie en het volgen van de behandeling van de patiënt opnieuw te onderzoeken.

24

Beenmergtransplantatie (MBT) retinopathie

Beenmergtransplantatieretinopathie werd voor het eerst gerapporteerd in 1983. Deze treedt gewoonlijk op binnen zes maanden, maar kan zelfs na 62 maanden 5 na BMT optreden. Risicofactoren, zoals diabetes en hypertensie kunnen de ontwikkeling van BMT - retinopathie door verhoging van de ischemische microvasculopathie bevorderen. Er is geen bekende leeftijds-, geslachts- of rasvoorspelling voor de ontwikkeling van BMT-retinopathie. Patiënten vertonen een verminderde nauwkeurigheid van het gezichtsvermogen en/of een gezichtsveldgebrek. Bevindingen aan het achterste 10 segment zijn gewoonlijk bilateraal en symmetrisch. Klinische verschijnselen omvatten een groot aantal katoen-wolvlekken, telangiectasia, microaneurysma, maculair oedeem, harde exudaten en retinale hemorrhagieën. Fluoresceïne angiografie demonstreert een capillaire niet-perfusie en afval, intraretinale microvasculaire afwijkingen, microaneurysma en maculair oedeem. Ofschoon de nauwkeurige ethiologie van BMT-reti-15 nopathie niet ontdekt is, schijnt het beïnvloed te worden door verscheidene factoren: cyclosporinetoxiciteit, totaal-lichaamsbestraling (BTI) en chemotherapeutische middelen. Cyclosporine is een sterk immunomodulerend middel dat transplantaat-versus-gastheer-immune respons onderdrukt. Het kan leiden tot endotheliaal celletsel en neurologische bijwerkingen en ten gevolge hiervan werd gesuggereerd als de oorzaak van 20 BMT-retinopathie. Echter kan BMT-retinopathie in afwezigheid van cyclosporine-gebruik zich ontwikkelen en cyclosporine is niet aangetoond als de oorzaak van BMT-retinopathie in autologe of syngenische beenmergrecipiënten. Cyclosporine schijnt derhalve niet de enige oorzaak te zijn van BMT-retinopathie. Totale lichaamsbestraling (TBI) is tevens betrokken als de oorzaak van BMT-retinopathie. Bestraling beschadigt 25 de retinale microvasculatuur en leidt tot ischemische vasculopathie. Variabelen, zoals de totale dosering van bestraling en tijdsinterval tussen bestraling en beenmergablatie schijnen belangrijk te zijn. Echter kan BMT-retinopathie in patiënten optreden die geen TBI ontvingen en BMT-retinopathie wordt niet waargenomen in vaste orgaantrans-plantaatrecipiënten die vergelijkbare doseringen van bestraling ontvingen. Dus is TBI 30 niet de enige oorzaak, maar er is een andere factor die bijdraagt tot de ontwikkeling van BMT-retinopathie. Chemotherapeutische middelen zijn gesuggereerd als een potentiële bijdrageleverende factor in BMT-retinopathie. Geneesmiddelen, zoals cisplatine, car-mustine en cyclofosfamide kunnen oculaire bijwerkingen veroorzaken waaronder 25 papilledema, optische neuritis, visueel veldgebrek en corticale blindheid. Gesuggereerd werd dat deze chemotherapeutische geneesmiddelen patiënten kunnen predisponeren tot door bestraling geïnduceerde retinale beschadigingen en bevorderen het nadelige effect van bestraling. In het algemeen hebben patiënten met BMT-retinopathie een 5 goede prognose. De retinopathie verdwijnt gewoonlijk binnen twee tot vier maanden na het stoppen of verlaging van de dosering van cyclosporine. In één rapport ervoer 69 procent van de patiënten een volledige verdwijning van de retinale bevindingen en 46 procent van de patiënten herstelden volledig hun basislijn visuele scherpte. Vanwege de gunstige prognose en betrekkelijk niet progressieve aard van BMT-retinopathie is een 10 agressieve interventie gewoonlijk niet noodzakelijk.

Ischemische omstandigheden

Ischemie kan worden verdeeld in twee categorieën: de eerste omvat de versnelde atherosclerose die gewoonlijk in patiënten met diabetes optreedt ofwel in de 15 femorale, popliteale en posterieure tibiale aderen. Deze vaten die vaak slechts 1 of 2 cm in diameter zijn kunnen atherosclerotische plaque ontwikkelen die de bloedstroom in ernstige mate doet afhemen. Nadat grote vaten volledig dicht raken kunnen een beroerte, myocardiaal infarct, ischemie en niet-helende diabetische voetzweren optreden. Deze vorm van ischemie is hoofdzakelijk een ziekte van de grote vaten.

20

Post-beroertedementie 25 Procent van de mensen hebben dementie na een beroerte waarbij vele anderen dementie ontwikkelen na 5 tot 10 jaar. Bovendien ervaren vele personen meer subtiele veranderingen van hun hogere hersenfuncties (zoals het vermogen tot plannen 25 en snelheid van het verwerken van informatie) en lopen een zeer hoog risico van een hierop aansluitende ontwikkeling van dementie. Zeer kleine beroerten in de diepe gedeelten van de hersenen in dit proces (genoemd microvasculaire ziekte) schijnt essentieel te zijn bij het proces dat leidt tot een geïdentificeerd patroon van hersenatrofie dat specifiek is voor post-beroertedementie.

30

Oculair ischemisch syndroom

Patiënten die lijden aan het oculair ischemische syndroom (OIS) zijn in het algemeen oudere mensen in de leeftijd van 50 tot 80 jaar. Mannelijke personen worden 26 tweemaal vaker beïnvloed dan vrouwelijke personen. De patiënt is slechts zelden asymptomatisch. Een afgenomen gezichtsvermogen treedt op in 90 procent van de gevallen en 40 procent van de patiënten hebben een hiermee gepaard gaande oogpijn. Er kunnen tevens een bijkomende of geschiedenis in het verleden van overgangsischemi-5 sche aanvallen of amaurosis fugax bestaan. Patiënten hebben tevens een significante bekende of onbekende systemische ziekte ten tijde van de presentatie. De meest voorkomende systemische ziekten zijn hypertensie, diabetes, ischemische hartziekten, beroerte en perifere vaatziekte. In mindere mate manifesteren patiënten OIS als resultaat van reuzencelartritis (GCA).

10 Unilaterale bevindingen zijn aanwezig in 80 procent van de gevallen.

Gebruikelijke bevindingen kunnen vergevorderd unilateraal cataract, anterieure seg-mentontsteking, asymptomatische anterieure kamerreactie, maculair oedeem, gedilateerde, maar niet-kronkelende retinale aderen, middenperifere dot- en blothemorrha-gieën, katoen-wol vlekken, exudaten en neovascularisatie van de schijf en retina om- 15 vatten. Er kunnen ook spontane arteriële pulsatie, verhoogde intraoculaire druk en neovascularisatie van de iris en hoek met neovasculair glaucoma (NVG) bestaan. Hoewel de patiënt een anterieur segmentneovascularisatie kan vertonen, kan oculaire hypotonie optreden die te wijten is aan een lage arteriële perfusie na het ciliaire lichaam. Af en toe is er een retinale embolie (Hollenhorst-plaques) zichtbaar.

20 De bevindingen in OIS worden veroorzaakt door een interne carotide ader- artheromateuze zweervorming en stenosis bij de bifurcatie van de gebruikelijke carotide ader. Vijf procent van de patiënten met een inwendige arteriële stenosis ontwikkelen OIS. Echter treedt OIS slechts op indien de stenosisgraad 90 procent overstijgt. Stenosis van de carotide ader reduceert de perfusiedruk naar het oog hetgeen resulteert 25 in de bovenvermelde ischemische verschijnselen. Wanneer de stenose de 90 procent bereikt valt de perfusiedruk in de centrale retinale ader (CRA) tot slechts 50 procent. Vaak manifesteert zich de gereduceerde arteriële druk als spontane pulsatie van het CRA. De bevindingen zijn variabel en kunnen één of meer van de bovenstaande bevindingen omvatten.

30 Patiënten met OIS hebben een significante systemische ziekte die beoor deeld dient te worden. Cardiale dood is de hoofdoorzaak van mortaliteit in patiënten met OIS - het percentage mortaliteit in vijf jaar is 40 procent. Om deze reden dienen 27 patiënten met OIS verwezen te worden naar een cardiologist ter uitvoering van een volledige serologie, EKG, ECG en carotide evaluatie.

Microvasculaire ziekten van de nier 5 De nier is betrokken in een aantal discrete clinicopathologische ziekten die de systemische en renale microvasculatuur beïnvloeden. Enkele van deze ziektetoestanden zijn gekenmerkt door een primair letsel aan endotheliale cellen, zoals bijvoorbeeld: 10 · Hemolytisch-ur etnisch syndroom (HUS) en trombotisch tromhocytopenisch purpura (TTP). HUS en TTP zijn nauw verwante ziekten, gekenmerkt door microangiopa-thische hemolytische anemie en een variabele orgaanachteruitgang. Traditioneel wordt de diagnose van HUS gemaakt wanneer renaal falen een predominant kenmerk is van het syndroom zoals gebruikelijk is bij kinderen. In volwassenen komt 15 overwegend neurologische beschadiging voor en het syndroom wordt dan aangeduid met TTP. Trombotische microangiopathie is de hieraan ten grondslag liggende pathologische beschadiging in beide syndromen en de klinische en laboratorium bevindingen bij patiënten met hetzij HUS hetzij TTP overlappen elkaar in sterke mate. Dit heeft verscheidene onderzoekers gestimuleerd tot het beschouwen van de 20 twee syndromen als een continuüm van een enkele ziekte-entiteit.

Pathoeenese: Experimentele data suggereren sterk dat endothelial celletsel de primaire gebeurtenis is bij de pathogenese van HUS/TTP. Endotheliale beschadiging zet een cascade gebeurtenissen op gang welke lokale intravasculaire coagulatie, fibrineafzetting en plateletactivering en aggregatie omvat. Het eindresultaat is de 25 histopathologische bevinding van trombotische microangiopathie die gebruikelijk is voor de verschillende vormen van het HUS/TTP-syndroom. Indien HUS/TTP onbehandeld wordt gelaten benadert het mortaliteitspercentage 90%. Ondersteunende therapie waaronder dialyse, antihypertensieve medicaties, bloedtransfusies en beheersing van neurologische complicaties draagt bij tot de verbeterde overleving van 30 patiënten met HUS/TTP. Adequate vloeistofbalans en ingewandenrust zijn belangrijk bij de behandeling van gebruikelijk HUS geassocieerd met diarree.

• Bestralingsnefritis - De consequenties op lange termijn van renale bestraling in een hoeveelheid die 2500 rad overstijgt kan in vijf klinische syndromen onderverdeeld worden: 28 (i) Acute bestralingsnefritis treedt in ca. 40% van de patiënten op na een latentie-5 periode van 6 tot 13 maanden. Dit wordt klinisch gekenmerkt door een plotseling begin van hypertensie, proteinuria, oedeem en een progressief renaal falen in de meeste gevallen leidend tot eindstadium nieren.

(ii) Chronische bestralingsnefritis heeft omgekeerd een latentieperiode variërende van 18 maanden tot 14 jaar na de initiële belasting. Het is verraderlijk aan het begin 10 en is gekenmerkt door hypertensie, proteinuria en geleidelijk verlies aan renale functie.

(iii) Het derde syndroom manifesteert zich 5 tot 19 jaar na blootstelling aan bestraling als een goedaardige proteinuria met een normale nierfunctie.

(iv) Een vierde groep patiënten vertoont slechts een goedaardige hypertensie 2 tot 15 5 jaar later en kan een variabele proteinuria hebben. Een late kwaadaardige hyper tensie treedt op 18 maanden tot 11 jaar na bestraling in patiënten met hetzij chronische bestralingsnefritis hetzij een goedaardige hypertensie. Verwijdering van de beschadigde nier keerde de hypertensie om. Door bestraling geïnduceerde schade aan de renale aderen met een hierop volgende renovasculaire hypertensie is gerappor- 20 teerd.

(v) Een syndroom van renale insufïïciëntie analoog aan acute bestralingsnefritis is waargenomen in beenmergtransplantatie- (BMT) patiënten die behandeld waren geweest met een totale lichaambestraling (TBI).

25 Gerapporteerd werd dat bestraling endotheliale dysfunctie veroorzaakt, maar de vasculaire gladde spiercellen in de vroege post-bestralingsfase ontziet. Bestraling zou rechtstreeks DNA kunnen beschadigen, hetgeen leidt tot een verminderde regeneratie van deze cellen en blootlegging van het basismembraan in de glomerulaire capillairen en tubules. Hoe deze initiële belasting tenslotte tot glomerulosclerosis, tu- 30 bule atrofie en interstitiële fibrosis leidt is niet duidelijk. Gepostuleerd is dat degeneratie van de endotheliale cellaag resulteren kan in intravasculaire trombose in capillairen en kleinere arteriolen. Deze intrarenale angiopathie zou dan de progressieve renale fibrosis en de hypertensie die bestralingsnefritis kenmerken, verklaren. Een recente 29 onderzoeking van bestraalde muizennieren liet een dosisafhankelijke toename zien in leucocyten in de renale cortex hetgeen suggereert een rol voor ontstekingsprocessen in door bestraling geïnduceerde nefritis.

Bij andere nierziekten is de microvasculatuur van de nier betrokken in auto-5 immune aandoeningen, zoals systemische sclerosis (scleroderma). Betrokkenheid van de nieren bij systemische sclerose manifesteert zich als een langzaam zich ontwikkelende chronische nierziekte of als een sclerodermaniercrisis (SRC) die gekenmerkt is door een kwaadaardige hypertensie en een acute azotemia. Gepostuleerd is dat SRC veroorzaakt is door een Raynaud-achtig verschijnsel in de nier. Een ernstig vasospasme 10 leidt tot een corticale ischemie en een verhoogde productie van renine en angiotensine II, die op zijn beurt de renale vasoconstrictie perpetueert. Hormonale veranderingen (zwangerschap), fysieke en emotionele stress of een lage temperatuur kan het Raynaud-achtige arteriële vasospasme teweegbrengen. De rol van het renine-angiotensine-systeem bij het perputueren van renale ischemie wordt onderstreept het significante 15 voordeel van ACE-inhibitoren bij de behandeling van SRC. In patiënten met SRC die zich ontwikkelen tot een ernstige nierinsufïiciëntie ondanks een antihypertensieve behandeling wordt dialyse een noodzaak. Zowel peritoneale dialyse als hemodialyse zijn toegepast. Het eindstadium renale-ziektenetwerk (End-Stage Renal Disease ESRD) rapport over 311 patiënten met een systemische door sclerosis geïnduceerd ESRD die 20 gedialyseerd waren tussen de jaren 1983 en 1985 bracht een overlevingspercentage van 33% na 3 jaar aan het licht.

De renale microcirculatie kan eveneens beïnvloed worden bij de sikkelcel-ziekte waarvoor de nier bijzonder vatbaar is vanwege de lage zuurstofspanning die bereikt wordt in de diepe vaten van de renale medulla ten gevolge van een tegenstroom-25 overdracht van zuurstof langs de vasa recta. De kleinere renale vaten en arteriolen kunnen eveneens de locatie zijn van trombo-embolisch letsel afkomstig van cholesterol bevattend materiaal dat verdrongen is uit de wanden van de grote vaten.

Wanneer zij als een groep worden beschouwd resulteren ziekten die een tijdelijke of permanente occlusie van renale microvasculatuur gelijkmatig in een onder-30 breking van glomerulaire perfussie en derhalve van de glomerulaire fïltratiesnelheid, hetgeen een ernstige bedreiging voor systemische homeostasis inhoudt.

30

Acuut renaal falen (ARF) ARF kan veroorzaakt zijn door microvasculaire of macrovasculaire ziekte (hoofdniervatocclusie of ernstige abdominale aortaziekte). De klassieke microvasculaire ziekten die vaak aanwezig zijn met microangiopathische hemolyse en acuut nier-5 falen treden vanwege glomerulaire capillaire trombose of occlusie vaak met bijkomende trombocytopenia op. Gebruikelijke voorbeelden van deze ziekten omvatten: a) Trombotische trombocvtopenische purpura - De klassieke pentade in trombotische trombocytopenische purpura omvat koorts, neurologische veranderingen, nierfalen, microangiopathische hemolytische anemie en trombocytopenia. 10 b) Hemolvtisch uremisch syndroom - Hemolytisch uremisch syndroom is vergelijkbaar met trombotische trombocytopenische purpura, maar manifesteert zich niet met neurologische veranderingen.

c) HELLP-svndroom (hemolyse, verhoogde leverenzymen en lage platelets). HELLP-syndroom is een type van hemolytisch uremisch syndroom dat in zwan-15 gere vrouwen met de bijkomende transaminaseverhogingen, optreedt.

Acuut nierfalen kan aanwezig zijn in alle medische instellingen, maar wordt hoofdzakelijk in ziekenhuizen opgelopen. De ziekte ontwikkelt zich in 5 procent van de opgenomen patiënten en ca. 0,5 procent van de opgenomen patiënten hebben een dia-20 lyse nodig. Over de laatste 40 jaar is het overlevingspercentage voor acuut nierfalen niet verbeterd, hoofdzakelijk omdat aangetaste patiënten nu ouder zijn en meer comor-bide ziektetoestanden hebben. Infectie is verantwoordelijk voor 75 procent van de sterfgevallen in patiënten met een acuut renaal falen en cardio-respiratoire complicaties is de tweede meest gebruikelijke oorzaak van sterfgevallen. Afhankelijk van de ernst 25 van het hartfalen kan het mortaliteitspercentage variëren van 7 procent tot zelfs 80 procent. Acuut nierfalen kan in drie categorieën worden onderverdeeld: prerenaal, intrinsiek en postrenaal ARF. Intrinsiek ARF is onderverdeeld in vier categorieën: tubulaire ziekte, glomerulaire ziekte, vasculaire ziekte (waaronder microvasculair) en interstitiële ziekte.

30

Progressieve nierziekte

Er is bewijs dat progressieve nierziekte gekenmerkt is door een progressief verlies aan microvaculatuur. Het verlies aan microvasculatuur correleert rechtstreeks 31 met de ontwikkeling van glomerulaire en tubulo-interstitiële littekenvorming. Het mechanisme wordt gemedieerd tendele door een reductie in de endotheliale proliferatieve respons en deze achteruitgang in capillair herstel is gemedieerd door de verandering in de lokale expressie van zowel angiogene (vasculaire endotheliale groeifactor) en anti-5 angiogene (trombospondine 1) factoren in de nier. De verandering in balans van angiogene groeifactoren wordt gemedieerd door beide met macrofaag geassocieerde cytoki-nen (interleukine-ΐβ) en vasoactieve mediatoren. Tenslotte is er een intrigerend bewijs dat stimulering van angiogenese en/of capillair herstel de renale functie en de langzame progressie kan stabiliseren en dit voordeel treedt op onafhankelijk van effecten op BP 10 of proteinuria.

Voor verdere informatie zie Brenner & Rector’s The Kidney, 7de druk, Copyright © 2004 Elsevier: hoofdstuk 33 - Microvascular diseases of the kidney en tevens Tiwari en Vikrant Journal of Indian Academy of Clinical Medicine, band 5, nr. 1 Overzichtsartikel - Sepsis en de nier.

15

Gehoorstoornissen

Chemisch geïnduceerde ototoxiciteit

De toxische effecten van verscheidene ototoxische therapeutische geneesmiddelen op gehoorcellen en spirale ganglionneuronen zijn vaak de beperkende 20 factor voor hun therapeutische toepasbaarheid. Belangrijke ototoxische geneesmiddelen omvatten het breed toegepaste chemotherapeutische middel cisplatine en de analoga hiervan, gewoonlijk toegepaste aminoglycosideantibiotica, bijvoorbeeld gentamicine, voor de behandeling van infecties die veroorzaakt zijn door gramnegatieve bacteriën, kinine en de analoga hiervan, salicylaat en de analoga hiervan en omloopdiuretica.

25 Bijvoorbeeld is van antibacteriële aminoglycosiden, zoals gentamicinen, streptomycinen, kanamycinen, tobramycinen en dergelijke bekend dat zij een ernstige toxiciteit, in het bijzonder ototoxiciteit en nefrotoxiciteit bezitten die de toepasbaarheid van deze antimicrobiële middelen reduceren (zie Goodman en Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 6de druk, A. Goodman Gilman et al., uitg.; MacMillan 30 Publishing Co., Inc., New York, biz. 1169-71 (1980)). Het is duidelijk dat ototoxiciteit een dosislimiterende bijwerking van de toediening van antibiotica is. 4 Tot 15% van de patiënten die 1 gram per dag langer dan een week ontvangen ontwikkelen een meetbaar 32 gehoorverlies dat langhaam erger wordt en tot complete permanente doofheid kan leiden indien de behandeling voortgezet wordt.

Ototoxiciteit is tevens een ernstige dosislimiterende bijwerking voor cispla-tine, een platinumcoördinatiecomplex dat doelmatig bleek te zijn op een verscheiden-5 heid van humane kankersoorten waaronder testiculaire, eileider-, blaas- en hoofd- en nekkanker. Cisplatine (Platinol®) beschadigt gehoor en vestibulaire systemen. Sali-cylaten, zoals aspirine, zijn de meest gewoonlijk toegepaste therapeutische geneesmiddelen vanwege hun antiontstekings-, analgetische, antipyretische en antitrombose-ef-fecten. Ongelukkigerwijze hebben zij tevens ototoxische bijwerkingen. Zij leiden vaak 10 tot tinnitus (“gerinkel in de oren”) en tijdelijk gehoorverlies. Bovendien, indien het geneesmiddel bij hoge doseringen gedurende lange tijd wordt gebruikt, kan de gehoor-beschadiging persistent en onomkeerbaar worden.

Dientengevolge bestaat er een behoefte aan middelen ter preventie, reduceren of behandeling van de incidentie en/of ernst van inwendige ooraandoeningen en 15 gehoorbeschadigingen, waarbij het inwendige oorweefsel, in het bijzonder inwendige oorhaarcellen, betrokken zijn. Van bijzonder belang zijn die ziekten welke optreden als een ongewenste bijwerking van ototoxische therapeutische middelen, waaronder cisplatine en de analoga hiervan, aminoglycosideantibiotica, salicylaat en de analoga hiervan of omloopdiuretica. Bovendien bestaat er een behoefte aan methoden die een ho-20 gere en dus meer effectieve dosering met deze ototoxiciteitsinducerende farmaceutische geneesmiddelen mogelijk maken terwijl door deze geneesmiddelen veroorzaakte ototoxische effecten simultaan verhinderd of gereduceerd worden. Wat nodig is is een methode welke een veilige, effectieve en duurzame werkwijze verschaft voor profylactische of curatieve behandeling van gehoorstoomissen die gerelateerd zijn aan schade 25 aan weefsel van het inwendige oor, verlies of degeneratie, in het bijzonder door oto-toxine geïnduceerd en in het bijzonder waarbij haarcellen van het inwendige oor betrokken zijn. Bovendien is een methode en een samenstelling vereist voor de behandeling van schade en doofheid resulterende van traumata van het inwendige oor (akoestische traumata).

30 Zonder aan enige theorie gebonden te willen zijn wordt gedacht dat cisplati- negeneesmiddelen en andere geneesmiddelen die ototoxiciteit induceren (zoals bijvoorbeeld aminoglycosideantibiotica) alsmede akoestische traumata, de ototoxische effecten via geprogrammeerde celdood of apoptose in weefsel van het inwendige oor, 33 in het bijzonder haarcellen van het inwendige oor, kunnen induceren (Zhang et al., Neuroscience 120 (2003) 191-205; Wang et al., J. Neuroscience 23((24):8596-8607). In zoogdieren worden haarcellen van het gehoororgaan slechts geproduceerd tijdens de embryonische ontwikkeling en regenereren niet indien zij verloren gaan tijdens het 5 postnatale leven, derhalve een verlies aan haarcellen zou resulteren in een aanmerkelijke en onomkeerbare doofheid. Ongelukkigerwijze zijn er tegenwoordig geen effectieve therapieën ter behandeling van de cochlea en ter omkering van deze ziektetoestand. Dus zou een effectieve therapie ter preventie van celdood van haarcellen van het gehoororgaan een grote therapeutische waarde hebben.

10

Drukzweren

Drukzweren zijn gebieden van beschadigde huid en weefsel die zich ontwikkelen wanneer een duurzame druk (gewoonlijk afkomstig van een bed of rolstoel) de circulatie naar kwetsbare delen van het lichaam, in het bijzonder de huid op de 15 billen, heupen en hielen, afsnijdt. Het gebrek aan adequate bloedstroom leidt tot ische-mische necrosis en zweervorming van het beschadigde weefsel. Drukzweren treden vaak op in patiënten met verminderd of afwezig gevoel of die invalide zijn, uitgemergeld zijn, verlamd zijn of gedurende lange tijd bedlegerig zijn. Weefsels over het sacrum, ischia, grotere trochanters, uitwendige malleolie en hielen zijn in het bijzonder 20 vatbaar; andere locaties kunnen hierbij betrokken zijn afhankelijk van de positie van de patiënten.

Drukzweren zijn wonden die normaal gesproken slechts zeer langzaam helen en in het bijzonder in die gevallen is een verbeterd en meer snel helen vanzelfsprekend van groot belang voor de patiënt. Bovendien zijn de kosten betrokken bij de 25 behandeling van patiënten die aan deze wonden lijden significant gereduceerd wanneer het helen verbeterd wordt en sneller plaatsvindt.

Ischemische ziektetoestanden

Ischemisch letsel is de meest gebruikelijke klinische expressie van celletsel 30 door zuurstofgebrek. De meest nuttige modellen voor het bestuderen van ischemisch letsel omvatten een volledige occlusie van één van de eindslagaderen naar een orgaan (bijvoorbeeld een coronaire slagader) en onderzoek van het weefsel (bijvoorbeeld de hartspier) in gebieden die door de slagader bediend worden. Complexe pathologische 34 veranderingen treden op in diverse cellulaire systemen tijdens ischemie. Tot op zekere hoogte gedurende een tijd die varieert onder de verschillende typen cellen kan het letsel gerepareerd worden en de beschadigde cellen kunnen zich herstellen indien zuurstof en metabolische substraten wederom ter beschikking worden gesteld door herstel van de 5 bloedstroom. Met een verdere verlenging van de ischemische periode gaat de celstructuur verder met deterioreren vanwege de onstuitbare progressie van de lopende letsel-mechanismen. Met de tijd worden de energetische mechanismen van de cel - de mitochondriale oxidatieve elektrische centrale en het glycolytische pad - onherstelbaar beschadigd en herstel van bloedstroom (reperfusie) kan de beschadigde cel niet redden. 10 Zelfs indien de cellulaire energiemechanismen intact zouden blijven zou onherstelbare schade aan het genoom of aan de cellulaire membranen een letale uitkomst verzekeren ongeacht de reperfusie. Dit onomkeerbare letsel manifesteert zich gewoonlijk als necrosis, maar apoptose kan eveneens een rol spelen. Onder bepaalde omstandigheden wanneer de bloedstroom hersteld wordt naar cellen die eerder ischemisch gemaakt zijn, 15 maar niet doodgegaan zijn, is letsel vaak paradoxaal verergerd en zet zich voort met een verhoogd tempo - hierbij gaat het om reperfixsieletsel.

Reperfiisieletsel kan onder een verscheidenheid van omstandigheden, in het bijzonder tijdens medische interventie waaronder, maar niet beperkt tot angioplastie, cardiale chirurgie of trombolyse; orgaantransplantatie; ten gevolge van plastische chi-20 rurgie; tijdens een ernstig gedragssyndroom; tijdens het opnieuw hechten van beschadigde ledematen; ten gevolge van een multi-orgaanfalensyndroom; in de hersenen ten gevolge van een beroerte of hersentrauma; in samenhang met chronische wonden, zoals drukzweren, aderzweren en diabetische zweren; tijdens skeletspierischemie of lede-maattransplantatie; ten gevolge van mesenterische ischemie of acute ischemische inge-25 wandenziekte; ademhalingsfalen ten gevolge van een lagere torso-ischemie, leidende tot pulmonaire hypertensie, hypoxemia en niet-cardiogeen pulmonair oedeem; acuut nierfalen, zoals waargenomen na een niertransplantatie, een belangrijke chirurgische ingreep, traumata en septisch alsmede hemorrhagieshock; sepsis; retinale ischemie die optreedt ten gevolge van een acute vasculaire occlusie, welke leidt tot een verlies aan 30 gezichtsvermogen in een aantal oculaire ziekten, zoals acute glaucoma, diabetische retinopathie, hypertensieve retinopathie en retinale vasculaire occlusie; Cochlear-ischemie; klepfalen in microvasculaire chirurgie voor hoofd- en nekgebreken; het verschijnsel van Raynaud en de hiermee geassocieerde digitale ischemische letsels in scle- 35 roderma; ruggenmergletsel; vasculaire chirurgie; traumatische rhabdomyolyse (het crushsyndroom); en myoglobinurie, optreden.

Verder kan ischemie/reperfusie onder de volgende omstandigheden betrokken zijn: hypertensie, hypertensieve cerebrale vasculaire ziekte, breuk of aneurysma, 5 een constructie of obstructie van een bloedvat, zoals deze optreedt in het geval van een trombus of embolus, angioma, bloeddyscrasias, elke vorm van een gebrekkige hart-functie waaronder hartstilstand of -falen, systemische hypotensie, hartstilstand, cardio-gene shock, septische shock, trauma van het ruggenmerg, hoofdtrauma, aanval, bloeden vanuit een tumor; en ziekten, zoals een beroerte, de ziekte van Parkinson, epilepsie, 10 depressie, ALS, ziekte van Alzheimer, ziekte van Huntington en elke andere door ziekte geïnduceerde dementie (zoals bijvoorbeeld door HIV geïnduceerde dementie).

Bovendien kan een ischemische episode veroorzaakt zijn door een mechanisch letsel van het centrale zenuwstelsel, zoals deze resulteert van een klap op het hoofd of ruggenmerg. Traumata kunnen weefselletsel omvatten, zoals bijvoorbeeld een 15 wrijving, incisie, contusie, punctuur, compressie enz., zoals deze kan optreden na een traumatisch aanraken van een vreemd object en een plek van of behorende tot het hoofd, de nek of de wervelkolom. Andere vormen van traumatisch letsel kunnen ontstaan uit een constrictie of compressie van het centrale zenuwstelselweefsel door een ongeschikte accumulatie van vloeistof (bijvoorbeeld een blokkade of dysfunctie van 20 normaal cerebrospinaal vocht- of vitreus vochtproductie, omzet of volumeregeling of een subduraal of intracamiaal hematoom of oedeem). Op vergelijkbare wijze kan een traumatische constrictie of compressie ontstaan uit de aanwezigheid van een massa van abnormaal weefsel, zoals een metastatische of primaire tumor.

Tenslotte zijn hedendaagse methoden van therapie ter preventie en/of 25 behandeling van COPD, maculaire degeneratie, microvasculaire ziekten en ototoxische toestanden onbevredigend en er is een behoefte aan het ontwikkelen van nieuwe verbindingen voor dit doel. Er bestaat tevens een behoefte aan het ontwikkelen van een therapie en een geneesmiddel, die ototoxische effecten kan bevatten die vandaag geassocieerd zijn met bepaalde geneesmiddelen en toestanden, in het bijzonder met cispla-30 tinechemotherapeutica en bepaalde antibiotica zonder de effectiviteit van de geneesmiddelen op te offeren. Bovendien is er een behoefte aan het ontwikkelen van een therapie en geneesmiddel die de ototoxische effecten die geassocieerd zijn met akoestische traumata of mechanische traumata binnen het inwendige oor kunnen behandelen. Ver- 36 der is er een behoefte aan het ontwikkelen van een therapie en een geneesmiddel ter behandeling van drukzweren, ischemie en met ischemie-reperfusie geassocieerde toestanden. Alle ziekten en indicaties die in de beschrijving hierboven beschreven zijn alsmede andere ziekten en toestanden die in de beschrijving beschreven zijn, zoals MI, 5 kunnen eveneens door middel van de nieuwe verbindingen van de onderhavige uitvinding worden behandeld.

RTP801

Gen RTP801 werd eerst gerapporteerd door een mederechthebbende van de 10 onderhavige aanvrage. Amerikaanse octrooischriften 6.455.674, 6.555.667 en 6.740.738, die alle overgedragen zijn aan één van de mederechthebbenden van de onderhavige aanvrage, beschrijven en claimen per se de RTP801-polynucleotide en -polypeptide en antilichamen gericht tegen het polypeptide. RTP801 vertegenwoordigt een uniek gentarget voor hypoxia-induceerbare factor-1 (HIF-1) die door hypoxia geïn-15 duceerde pathogenese onafhankelijk van groeifactoren, zoals VEGF, kan reguleren.

De volgende octrooiaanvragen en publicaties leveren aspecten van achtergrondinformatie op 20 WO 2001/070979 heeft betrekking op nucleïnezuurmarkers die tot over- expressie zijn gebracht in ovariakankercellen.

Amerikaans octrooischrift 6.673.549 beschrijft een combinatie die cDNA’s omvat die verschillend tot expressie gebracht zijn in respons op een steroïdebehandeling.

Amerikaanse octrooiaanvrage 2003/165864 heeft betrekking op cDNA’s 25 die verschillend tot expressie gebracht zijn in cellen die met een DNA-demethyle-ringsmiddel behandeld zijn.

Amerikaanse octrooiaanvrage 2003/108871 heeft betrekking op een samenstelling die verscheidene cDNA’s omvat, die verschillend tot expressie gebracht zijn in behandelde humane C3A-levercelcultures.

30 Amerikaanse octrooiaanvrage 2002/119463 beschrijft een nieuwe samenstelling die toepasbaar is voor de behandeling en de diagnose van prostaatkanker, waarbij deze verbinding humane cDNA’s omvat die verschillend tot expressie gebracht zijn in prostaatkanker.

37 WO 2004/018999 beschrijft een methode voor de beoordeling, karakterisering, volgen, preventie en behandeling van cervicale kanker.

EP 1.394.274 heeft betrekking op een methode voor het testen op bronchi-ale astma of chronische obstructieve pulmonaire ziekte door vergelijking van het ex-5 pressieniveau van een markergen in een biologisch monster afkomstig van een patiënt met het expressieniveau van het gen in een monster afkomstig van een gezonde patiënt.

WO 2002/101075 heeft betrekking op een geïsoleerd nucleïnezuurmole-cuul, toepasbaar voor het detecteren, karakteriseren, preventie en behandeling van humane cervicale kankers.

10 WO 2003/010205 heeft betrekking op het remmen van angiogenese voor de behandeling van wond helen, retinopathie, ischemie, ontsteking, microvasculopathie, beender helen en huidontsteking.

WO 2002/046465 heeft betrekking op het identificeren van een gen dat betrokken is bij een ziekte voor de behandeling van door hypoxia gereguleerde 15 toestanden.

WO 2002/031111 heeft betrekking op polypeptiden en hun gecodeerde eiwitten en vele toepassingen hiertoe worden ter beschikking gesteld.

WO 2001/012659 heeft betrekking op nucleïnezuren die toepasbaar zijn in recombinant-DNA-methodologieën, 20 WO 2001/077289 beschrijft 623 polynucleotiden die afgeleid zijn van een verscheidenheid van humane weefselbronnen.

WO 2003/101283 heeft betrekking op een combinatie die vele cDNA’s en eiwitten omvat.

JP 2003/259877 heeft betrekking op vele hepatische fibrosisziektemarkers.

25 Tzipora Shoshani et al., Identification of a Novel Hypoxia-Inducible Factor 1-Responsive Gene, RTP801. Involved in Apoptosis. MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, april 2002, biz. 2283-2293; deze publicatie, waarbij de uitvinders van de onderhavige uitvinding medeauteur zijn, beschrijven gedetailleerd de ontdekking van het RTP801-gen (een toen nieuw HIF-1-afhankelijk gen), Anat Brafman et al., 30 Inhibition of Oxygen-Induced Retinopathy in RTP801 -Deficient Mice. Invest Ophthalmol Vis Sci., oktober 2004; 45(10): 3796-805; tevens zijn hierbij de uitvinders van de onderhavige uitvinding medeauteurs, deze publicatie bewijst dat in RTP801- 38 knock-outmuizen hyperoxia geen degeneratie van het retinale capillaire netwerk veroorzaakt.

Leif W. Ellisen et al., REDD1, a Developmentally Regulated Transcriptional Target van pagina 63 en pagina 53, verbindt pagina 63 met Regulation of Reactive 5 Oxygen Species. Molecular Cell, Band 10, 995-1005, november 2002; deze publicatie bewijst dat overexpressie van RTP801 (hieraan gerefereerd daarin als REDD1) leidt tot een verhoogde productie van reactieve zuurstofspecies.

Richard D.R., Berra E. en Pouyssegur J., Non-hypoxic pathway mediates the induction of hypoxia-inducible factor 1 alpha in vascular smooth muscle cells. J. 10 Biol. Chem.,1 september 2000; 275(35): 26765-71. Deze publicatie bewijst dat HIF-1-afhankelijke transcriptie geïnduceerd kan worden door een overmatige productie van reactieve zuurstofspecies.

Rangasami T. et al., Genetic ablation of Nrf2 enhances susceptibility to cigarette smoke-induced emphysema in mice. Ingediend bij het Journal of Clinical 15 Investigation. Dit werk heeft betrekking op muizen met een gebrekkige anti-oxidans-afweer.

SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

20 De onderhavige uitvinding verschaft nieuwe methoden en samenstellingen voor de behandeling van microvasculaire stoornissen, maculaire degeneratie, adem-halingsstoomissen en ruggenmergletsel of -ziekte.

In één uitvoeringsvorm worden nieuwe moleculen die RTP801 remmen en die gebruikt kunnen worden ter behandeling van verscheidene ziekten en indicaties, 25 verschaft

In een andere uitvoeringsvorm verschaft de onderhavige uitvinding een methode voor de behandeling van een patiënt die aan een microvasculaire aandoening, maculaire degeneratie of een ademhalingsstoomis lijdt, welke omvat het toedienen aan een patiënt van een farmaceutische samenstelling welke een RTP801-inhibitor omvat. 30 Een andere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding heeft betrek king op een methode voor de behandeling van een patiënt die aan COPD lijdt, welke omvat het toedienen aan de patiënt van een farmaceutische samenstelling die een therapeutisch werkzame hoeveelheid van een RTP801-inhibitor omvat. In één uitvoerings- vorm is de inhibitor een siRNA-molecuul, een antisens molecuul, een antilichaam (zo als bijvoorbeeld een neutraliserend antilichaam), een dominant negatief peptide of een ribozyme.

39

Een andere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding heeft betrek-5 king op een methode voor de behandeling van een patiënt die aan maculaire degeneratie lijdt, welke omvat het toedienen aan de patiënt van een farmaceutische samenstelling die een therapeutisch werkzame hoeveelheid van een RTP801-inhibitor omvat. In één uitvoeringsvorm is de inhibitor een siRNA-molecuul, een antisens molecuul, een antilichaam (zoals bijvoorbeeld een neutraliserend antilichaam), een dominant negatief 10 peptide of een ribozyme.

Een andere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding heeft betrekking op een methode ter behandeling van een patiënt die aan een microvasculaire aandoening lijdt welke omvat het toedienen aan een patiënt van een farmaceutische samenstelling die een therapeutisch werkzame hoeveelheid van een RTP801-inhibitor omvat. 15 In een uitvoeringsvorm is de inhibitor een siRNA-molecuul, een antisens molecuul, een antilichaam (zoals bijvoorbeeld een neutraliserend antilichaam), een dominant negatief peptide of een ribozyme.

Een additionele uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding verschaft de toepassing van een therapeutisch werkzame hoeveelheid van een RTP801-inhibitor 20 voor de bereiding van een geneesmiddel ter bevordering van het herstel in een patiënt die aan een ademhalingsstoomis lijdt. In één uitvoeringsvorm is de ademhalings-aandoening COPD en de inhibitor is bij voorkeur een siRNA.

Een verdere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding verschaft de toepassing van een therapeutisch werkzame hoeveelheid van een RTP801 -inhibitor 25 voor de bereiding van een geneesmiddel ter bevordering van het herstel in een patiënt die aan maculaire degeneratie lijdt. In één uitvoeringsvorm is de maculaire degeneratie AMD en de inhibitor is bij voorkeur een siRNA.

Een verdere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding verschaft de toepassing van een therapeutisch werkzame hoeveelheid van een RTP801 -inhibitor ter 30 bereiding van een geneesmiddel ter bevordering van het herstel in een patiënt die aan een microvasculaire aandoening lijdt. In één uitvoeringsvorm is de microvasculaire aandoening diabetische retinopathie en is de inhibitor bij voorkeur een siRNA.

40

De onderhavige uitvinding heeft in het algemeen betrekking op methoden en samenstellingen ter behandeling of ter preventie van de incidentie of ernst van ge-hoorbeschadiging (of balansachteruitgang), in het bijzonder gehoorverlies geassocieerd met celdood van de inwendige oorhaarcellen. De methoden en samenstellingen omvat-5 ten het toedienen aan een zoogdier dat behoefte heeft aan een dergelijke behandeling van een profylactisch of therapeutisch werkzame hoeveelheid van één of meer verbindingen die de expressie van het RTP801-gen, down-reguleren (d.w.z. op zodanige wijze reguleren dat deze afheemt) in het bijzonder nieuwe kleine interfererende RNA’s (siRNA’s).

10 Meer specifiek verschaft de onderhavige uitvinding methoden en samenstellingen ter behandeling van een patiënt die aan een gehoorbeschadiging of andere otopathologieën geassocieerd met celdood van de inwendige oorhaarcellen lijdt. Deze otopathologieën kunnen resulteren van akoestische traumata, mechanische traumata of door ototoxine geïnduceerd gehoorverlies. De methoden volgens de uitvinding 15 omvatten het toedienen aan de patiënt van één of meer verbindingen die de expressie down-reguleren van het RTP801-gen, in het bijzonder siRNA’s die RTP801 remmen, gewoonlijk als een farmaceutische samenstelling, in een therapeutisch werkzame dosis waardoor de patiënt behandeld wordt.

In één uitvoeringsvorm verschaft de onderhavige uitvinding verbeterde 20 samenstellingen en methoden voor behandelingen die de toediening vereisen van een farmaceutisch geneesmiddel met een ototoxische, gehoorbeschadigende bijwerking, in combinatie met een therapeutisch werkzame hoeveelheid van één of meer siRNA-mo-leculen die RTP801 remmen, ter behandeling of ter preventie van de ototoxiciteit die geïnduceerd is door het farmaceutische geneesmiddel. De samenstellingen van de uit-25 vinding kunnen worden toegediend in één of meer geschikte intervallen hetzij voorafgaande aan, in aansluiting op, hetzij nagenoeg tegelijk met de toediening van het ototoxische, gehoorbeschadigende geneesmiddel dat een inwendig oor-apoptotische weef-selbeschadiging induceert. Eveneens kan deze behandeling effectief zijn als profylactische behandeling voorafgaande aan of tezamen met omstandigheden die akoestische 30 traumata veroorzaken.

Dientengevolge is het een doelstelling van de onderhavige uitvinding een verbeterde samenstelling te verschaffen die een therapeutisch werkzame hoeveelheid van één of meer siRNA-moleculen bevat welke RTP801 remmen in combinatie met een oto- 41 toxisch, gehoorbeschadigend farmaceutisch geneesmiddel voor de behandeling aan een zoogdier. Deze combinatiegeneesmiddelen kunnen afzonderlijk worden toegediend; de siRNA-moleculen die RTP801 remmen zouden dan lokaal worden toegediend terwijl het ototoxische, gehoorbeschadigend farmaceutisch geneesmiddel systemisch wordt 5 toegediend. De siRNA-moleculen kunnen voorafgaand aan simultaan of in aansluiting op het ototoxische geneesmiddel worden toegediend. Deze combinatiesamenstellingen kunnen verder een farmaceutisch aanvaardbare drager bevatten. De farmaceutische samenstelling zal een lagere ototoxiciteit hebben dan het ototoxische farmaceutische middel alleen, en bij voorkeur zal deze een hogere dosering van de ototoxische farma-10 ceutische stof dan gebruikelijk wordt toegepast, hebben. Voorbeelden van deze verbeterde samenstellingen omvatten cisplatine of andere ototoxische neoplastische middelen of een aminoglycoside antibioticum of antibiotica in combinatie met de therapeutisch werkzame hoeveelheid van één of meer siRNA-moleculen die RTP801 remmen.

Nog verder heeft de uitvinding betrekking op de toepassing van de 15 samenstellingen volgens de uitvinding in gevallen waarbij diuretica nodig zijn. De onderhavige uitvinding verschaft een oplossing voor het gebied dat een therapie en een geneesmiddel die de ototoxische effecten kunnen behandelen die heden geassocieerd zijn met bepaalde diuretica en in het bijzonder met de meer populaire en gewoonlijk toegepaste omloopdiuretica zonder het opofferen van hun diuretische werkzaamheid, 20 kunnen behandelen.

Nog verder heeft de uitvinding betrekking op de toepassing van de samenstellingen volgens de uitvinding in die gevallen waarbij kinine of kinineachtige verbindingen nodig zijn. De onderhavige uitvinding verschaft een oplossing voor het gebied dat lang een therapie en een geneesmiddel gezocht heeft die de ototoxische ef-25 fecten die heden geassocieerd zijn met bepaalde kininen zonder het opofferen van him werkzaamheid, kunnen behandelen.

De onderhavige uitvinding heeft verder betrekking op methoden en samenstellingen voor de behandeling of preventie van de incidentie of ernst van drukzweren. De methoden en samenstellingen omvatten het toedienen aan een zoogdier dat behoefte 30 heeft aan deze behandeling van een profylactisch of therapeutisch effectieve hoeveelheid van één of meer verbindingen die de expressie van het RTP801-gen down-reguleren, in het bijzonder nieuwe kleine interfererende RNA’s (siRNA’s).

42

Verder heeft de onderhavige uitvinding betrekking op methoden en samenstellingen voor de behandeling van één of meer ischemische of ischemie-reperfusieletsels of -toestanden, zoals deze in de beschrijving beschreven zijn. Deze methoden en samenstellingen omvatten het toedienen aan een dier dat behoefte heeft aan een dergelijke be-5 handeling van een profylactisch of therapeutisch werkzame hoeveelheid van één of meer verbindingen die de expressie van het RTP801-gen down-reguleren, in het bijzonder nieuwe kleine interfererende RNA’s (siRNA’s).

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING

10

De onderhavige uitvinding heeft in enkele van haar uitvoeringsvormen betrekking op de inhibitie van het RTP801-gen of polypeptide voor de behandeling van onder andere oogziekten, ademhalingsaandoeningen, microvasculaire aandoeningen, gehooraandoeningen en ischemische toestanden. Zoals in de beschrijving zal worden 15 beschreven zijn de voorkeurinhibitoren die toegepast moeten worden in de onderhavige uitvinding biologische moleculen.

Zonder aan een bepaalde theorie gebonden te willen zijn hebben de uitvinders van de onderhavige uitvinding gevonden dat RTP801 betrokken is bij verscheidene ziektetoestanden waaronder microvasculaire aandoeningen, oogziekten, ademha-20 lingsziekten, gehoorziekten, drukzweren, ischemische toestanden en ruggenmergletsel en -ziekte en dat het van voordeel zou zijn RTP801 te remmen teneinde één of meer van deze ziekten of aandoeningen te behandelen. Methoden, moleculen en samenstellingen die RTP801 remmen worden in de beschrijving uitgebreid besproken en één of meer van deze moleculen en/of samenstellingen kunnen met voordeel worden toegepast 25 bij de behandeling van een patiënt die aan één of meer van deze ziektetoestanden lijdt.

De onderhavige uitvinding verschaft methoden en samenstellingen voor het remmen van de expressie van het RTP801-gen in vivo. In het algemeen omvat de methode het toedienen van oligoribonucleotiden, zoals kleine interfererende RNA’s (d.w.z. siRNA’s) die gericht zijn op een bepaald mRNA en hiermee hybridiseren, dan 30 wel nucleïnezuurmateriaal dat siRNA’s in een cel in een voldoende hoeveelheid voor het downreguleren van de expressie van een targetgen door middel van een RNA-inter-ferentiemechanisme kan produceren. In het bijzonder kan de onderhavige methode worden gebruikt voor het remmen van de expressie van het RTP801-gen ter behande- 43 ling van ademhalingsstoomissen, microvasculaire stoornissen, oogstoomissen en ge-hoorbeschadigingen.

Derhalve verschaft in één uitvoeringsvorm de onderhavige uitvinding een methode voor de behandeling van een patiënt die aan een ziektetoestand lijdt die geko-5 zen is uit een microvasculaire aandoening, een oogziekte, een ademhalingsaandoening, een gehoorstoomis, drukzweren of een ruggenmergletsel of een andere wond, welke omvat het toedienen aan de patiënt van een farmaceutische samenstelling die een RTP801 -inhibitor in een therapeutisch werkzame hoeveelheid omvat, één en ander zodanig dat de patiënt hierdoor behandeld wordt. De uitvinding verschaft verder een me-10 thode voor de behandeling van een patiënt die aan een microvasculaire ziekte, een oogziekte, een ademhalingsziekte, een gehoorstoomis, drukzweren of een ruggenmergletsel of een andere wond lijdt, welke omvat het toedienen aan de patiënt van een farmaceutische samenstelling die een RTP801-inhibitor omvat, in een dosering en over een tijdsperiode die voldoende is om herstel te bevorderen. De oogziekte kan maculaire degene-15 ratie zijn, zoals onder andere ouderdommaculaire degeneratie (AMD). De microvasculaire aandoening kan diabetische retinopathie of onder andere acuut nierfalen zijn. De ademhalingsstoomis kan chronisch obstructieve pulmonaire ziekte (COPD), emfyseem, chronische bronchitis, astma en onder andere longkanker zijn. De gehoorstoomis kan een akoestisch trauma of onder andere cisplatinegeïnduceerde doofheid zijn. De 20 RTP801-inhibitor kan gekozen zijn uit een grote verscheidenheid aan moleculen waar onder, maar niet beperkt tot, verbindingen, zoals polynucleotiden, antisens fragmenten, RNA-moleculen die het RTP801-gen mRNA, als target hebben, zoals ribozymen of siRNA’s (bijvoorbeeld de siRNA’s van de tabellen A-D en in het bijzonder siRNA nrs. 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 en 50 van tabel A of de siRNA nrs. 257, 260-262 en 25 264-268 van tabel D), of expressievectoren waarin deze opgenomen zijn; polypeptiden, zoals dominant negatieven, antilichamen (zoals bijvoorbeeld een antilichaam dat specifiek bindt aan een epitoop dat aanwezig is binnen een polypeptide dat achtereenvolgende aminozuren omvat, waarvan de sequentie in figuur 2 (SEQ ID NO:2) is weergegeven), dan wel in sommige gevallen enzymen. Bovendien kan de RTP801 -inhibitor 30 een chemische inhibitor zijn, zoals een klein molecuul, bijvoorbeeld chemische moleculen met een laag molecuulgewicht, bijvoorbeeld een molecuulgewicht beneden 2000 dal tons. Specifiek RTP801-inhibitoren worden hieronder gegeven.

44

De onderhavige uitvinding verschaft verder een methode voor de behandeling van een patiënt die aan maculaire degeneratie, COPD, diabetische retinopathie, dan wel een akoestische door trauma geïnduceerde doofheid lijdt, welke het toedienen aan de patiënt omvat van een farmaceutische samenstelling die een therapeutisch werkzame 5 dosering van een RTP801-inhibitor bevat, die een polynucleotide omvat dat specifiek hybridiseert met mRNA getranscribeerd vanuit het RTP801-gen en de expressie van het RTP801-gen down-reguleert, waardoor de patiënt wordt behandeld. Het polynucleotide kan een siRNA zijn dat achtereenvolgende nucleotiden omvat met een sequentie die identiek is aan één of meer sequenties die in de tabellen A-D zijn weergegeven (SEQ 10 ID NOS:3-536) en in het bijzonder siRNA nrs. 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 en 50 van tabel A of siRNA nrs. 257, 260-262 en 264-268 van tabel D.

Verder heeft een additionele uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding betrekking op een methode voor de behandeling van een patiënt die lijdt aan een microvasculaire aandoening, een oogziekte, een ademhalingsziekte, een gehoorstoomis, 15 drukzweren of een ruggenmergletsel of een andere wond, welke omvat het toedienen aan de patiënt van een farmaceutische samenstelling die een therapeutisch werkzame dosis van een RTP801-inhibitor die een siRNA-molecuul omvat, optioneel een siRNA-molecuul gespecificeerd in één of meer van de tabellen A-D in een dosering en over een tijdsperiode zodanig dat de patiënt hierdoor behandeld wordt.

20 Een additionele methode voor de behandeling van een patiënt die aan een microvasculaire aandoening, een oogaandoening, een ademhalingsstoomis, een gehoorstoomis, drukzweren of een ruggenmergletsel of een andere wond lijdt, wordt verschaft, welke omvat het toedienen aan de patiënt van een farmaceutische samenstelling die een therapeutisch werkzame dosering van een RNA-molecuul omvat dat het 25 RTP801 -gen mRNA als doel heeft, in een dosering en over een tijdsperiode zodanig dat hierdoor de patiënt behandeld wordt. Het RNA-molecuul kan een siRNA-molecuul zijn, zoals bijvoorbeeld een siRNA-molecuul, zoals gespecificeerd in de tabellen A-D en in het bijzonder siRNA nrs. 14, 22, 23, 25, 27, 39, 4, 42, 49 en 50 van tabel A of siRNA nrs. 257,260-262, en 264-268 van tabel D, of een ribozyme.

30 De onderhavige uitvinding verschaft verder een methode voor de behande ling van een patiënt die aan een microvasculaire aandoening, een oogziekte, een ademhalingsstoomis, een gehoorstoomis, drukzweren of een ruggenmergletsel of een andere wond of één of meer van de in de beschrijving beschreven ziektetoestanden lijdt, welke 45 omvat toedienen aan een patiënt van een farmaceutische samenstelling die een therapeutisch werkzame dosis van een siRNA-molecuul omvat die het RTP801-gen mRNA, eventueel een siRNA-molecuul gespecificeerd in tabellen A-D omvat, in een dosering en over een tijdsperiode zodanig dat hierdoor de patiënt wordt behandeld. Verder kan 5 de oogziekte maculaire degeneratie, zoals ouderdommaculaire degeneratie (AMD) zijn; de microvasculaire stoornis kan diabetische retinopathie of acuut renaal falen zijn; de ademhalingsstoomis kan COPD zijn en de aspecten van COPD die behandeld worden kunnen omvatten, maar zijn niet beperkt tot emfyseem, chronische bronchitis of beide; en de gehoorstoomis kan akoestische door trauma geïnduceerde doofheid zijn.

10 De onderhavige uitvinding heeft verder betrekking op de toepassing van de nieuwe siRNA’s die in de beschrijving besproken worden bij de behandeling van gehoorbeschadiging, waarbij inhibitie van de RTP801-expressie van voordeel is. In één uitvoeringsvorm vormt de onderhavige uitvinding een methode voor de behandeling van een zoogdier dat een gehoor- (of balans-) beschadiging heeft of hiervoor vatbaar is, 15 dan wel voor de profylactische behandeling van een zoogdier onder omstandigheden waarbij de inhibitie van de RTP801-expressie van voordeel is. De methode van deze uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding zou het optreden of de ernst van een gehoor- (of balans-) beschadiging die zou resulteren van een inwendig oorcelletsel, verlies of degeneratie, in het bijzonder veroorzaakt door een akoestisch trauma of een 20 ototoxisch middel, voorkomen of reduceren. In deze uitvoeringsvorm omvat de methode volgens de uitvinding het toedienen van een therapeutisch werkzame hoeveelheid van één of meer verbindingen die de expressie van het RTP801-gen down-reguleren, in het bijzonder de nieuwe siRNA’s van de onderhavige uitvinding,.

In één uitvoeringsvorm is de doelstelling van de onderhavige uitvinding het 25 verschaffen van een methode voor de behandeling van een zoogdier ter preventie, reduceren of behandelen van een gehoorbeschadiging, stoornis of onbalans, bij voorkeur een akoestisch trauma of een door ototoxine geïnduceerde gehooraandoening, door het toedienen aan een zoogdier dat behoefte heeft aan een dergelijke behandeling van een samenstelling volgens de uitvinding. Eén uitvoeringsvorm is een werkwijze voor de 30 behandeling van een gehoorstoomis of -beschadiging waarbij het akoestische trauma resulteert van een éénmalige blootstelling aan een extreem hoog geluid of continue blootstelling aan een geluidsrijke omgeving die na verloop van tijd doofheid kan veroorzaken. De gehoorbeschadiging kan eveneens worden veroorzaakt door een fysiek 46 trauma aan het oor. Een andere uitvoeringsvorm is een methode voor de behandeling van een gehoorbeschadiging of -stoornis waarbij de ototoxiciteit resulteert van de toediening van een therapeutisch werkzame hoeveelheid van een ototoxisch farmaceutisch geneesmiddel. Typische ototoxische geneesmiddelen zijn chemotherapeutische midde-5 len, bijvoorbeeld antineoplastische middelen en antibiotica. Andere mogelijke kandidaten omvatten omloopdiuretica, kininen of een kinineachtige verbinding en een sali-cylaat of salicylaatachtige verbindingen. Deze methoden zijn bijzonder werkzaam wanneer de ototoxische verbinding een antibioticum, bij voorkeur een aminoglycoside-antibioticum is. Ototoxische aminoglycoside antibiotica omvatten, maar zijn niet be-10 perkt tot neomycine, paromomycine, ribostamycine, lividonycine, kanamycine, amika-cine, tobramycine, viomycine, gentamicine, sisomicine, netilmicine, streptomycine, dibekacine, fortimicine en dihydrostreptomycine of combinaties hiervan. Bijzondere antibiotica omvatten neomycine B, kanamycine A, kanamycine B, gentamicine Cl, gentamicine Cla en gentamicine C2. De methoden volgens de uitvinding zijn tevens ef-15 fectief wanneer de ototoxische verbinding een neoplastisch middel is, zoals bijvoorbeeld vincristine, vinblastine, cisplatine en cisplatineachtige verbindingen en taxol en taxolachtige verbindingen.

In enkele uitvoeringsvormen die gericht zijn op de behandeling of de preventie van een gehooraandoening, wordt de samenstelling volgens de uitvinding 20 mede toegediend met een ototoxine. Bijvoorbeeld wordt een verbeterde methode verschaft voor de behandeling van een infectie van een zoogdier door toediening van een aminoglycosideantibioticum, waarbij de verbetering het toedienen omvat van een therapeutisch werkzame hoeveelheid van één of meer verbindingen die de expressie van het RTP801-gen down-reguleert, in het bijzonder nieuwe siRNA’s, aan de patiënt die 25 behoefte heeft aan deze behandeling ter reductie of preventie van door ototoxine geïnduceerde gehoorbeschadiging geassocieerd met het antibioticum. De verbindingen die de door ototoxine geïnduceerde gehoorbeschadiging reduceren of voorkomen, in het bijzonder de nieuwe siRNA’s worden bij voorkeur lokaal binnen het inwendige oor toegediend.

30 In nog een andere uitvoeringsvorm wordt een verbeterde methode voor de behandeling van kanker in een zoogdier verschaft door toediening van een chemotherapeutische verbinding, waarbij de verbetering het toedienen omvat van een therapeutisch werkzame hoeveelheid van een samenstelling volgens de uitvinding aan de patiënt die 47 behoefte heeft aan deze behandeling ter reductie of preventie van door ototoxine geïnduceerde gehoorbeschadiging geassocieerd met het chemotherapeutische geneesmiddel. In een andere uitvoeringsvorm worden de methoden van behandeling toegepast of ge-hoorbeschadigingen resulterende uit de toediening van een chemotherapeutisch middel 5 ter behandeling van zijn ototoxische bijwerking. Ototoxische chemotherapeutische middelen die geschikt zijn voor de methoden volgens de uitvinding omvatten, maar zijn niet beperkt tot een antineoplastisch middel, waaronder cisplatine of cisplatineachtige verbindingen, taxol of taxolachtige verbindingen en andere chemotherapeutische middelen waarvan gedacht wordt dat zij door ototoxine geïnduceerde gehoorbeschadigin-10 gen veroorzaken, bijvoorbeeld vincristine, een antineoplastisch geneesmiddel die toegepast wordt ter behandeling van hematologische kwaadaardige tumoren en sarcomen. Cisplatineachtige verbindingen omvatten carboplatine (Paraplatin®), tetraplatine, oxa-liplatine, aroplatine en onder andere transplatine. In een andere uitvoeringsvorm worden de methoden volgens de uitvinding toegepast op gehoorbeschadigingen resulte-15 rende van de toediening van kinine en zijn synthetische substituten, gewoonlijk gebruikt bij de behandeling van malaria, ter behandeling van zijn ototoxische bijwerking. In een andere uitvoeringsvorm worden de methoden volgens de uitvinding toegepast op gehoorbeschadigingen resulterende uit de toepassing van een diureticum. Diuretica, in het bijzonder “omloop”diuretica, dat wil zeggen die welke hoofdzakelijk in de Loop 20 van Henle inwerken, zijn kandidaatototoxinen. Illustratieve voorbeelden die de methode volgens de uitvinding niet beperken omvatten furosemide, ethacrylzuur en mercurials. Diuretica worden gewoonlijk gebruikt ter preventie of ter eliminering van oedeem. Diuretica worden tevens gebruikt in niet-oedeemachtige toestanden, bijvoorbeeld hypertensie, hypercalcemie, idiopatische hypercalciurie en nefrogene diabetes 25 insipidus.

In een andere uitvoeringsvorm worden de methoden volgens de uitvinding toegepast ter behandeling of preventie van de incidentie of ernst van drukzweren. De methoden en samenstellingen omvatten het toedienen aan een zoogdier dat behoefte heeft aan een dergelijke behandeling van een profylactisch of therapeutisch werkzame 30 hoeveelheid van één of meer verbindingen die de expressie van het RTP801-gen down-reguleren, in het bijzonder nieuwe kleine interfererende RNA’s (siRNA’s). De verbindingen die de incidentie of de ernst van drukzweren behandelen of verhinderen, in het bijzonder de nieuwe siRNA’s, worden bij voorkeur lokaal binnen het beschadigde ge- 48 bied toegediend. De methoden en samenstellingen van de onderhavige uitvinding zijn werkzaam bij de behandeling en de preventie van drukzweren die zich ontwikkelen wanneer een duurzame druk (gewoonlijk afkomstig van een bed of rolstoel) de circulatie naar kwetsbare delen van het lichaam afsnijdt. De methoden en samenstellingen zijn 5 werkzaam in patiënten met een verminderd of afwezig gevoel of die invalide zijn, uitgemergeld zijn, verlamd zijn of gedurende een lange periode bedlegerig zijn. De samenstellingen volgens de uitvinding zijn tevens werkzaam bij de verbetering van het helen van drukzweren onder toepassing van de samenstellingen. De samenstellingen kunnen in elk bijzonder stadium in het helingsproces worden toegepast, waaronder het 10 stadium voordat één of meer genezingsprocessen begonnen is of zelfs voordat een specifieke zweer gevormd is (profylactische behandeling).

Andere volgens de uitvinding te behandelen wonden omvatten tevens i) algemene wonden, zoals bijvoorbeeld chirurgische, traumatische, ontstekings-, ische-mische, thermische, chemische en grote wonden; ii) wonden specifiek voor de mond-15 holte, zoals bijvoorbeeld wonden na extractie, endodontische wonden, in het bijzonder in samenhang met de behandeling van cysten en abcessen, zweren en letsels van bacte-riële, virale of auto-immunologische oorsprong, mechanische, chemische, thermische, ontstekings- en lichenoïde wonden; herpeszweren, stomatitis afthosa, acute necrotise-rende ulceratieve gingivitis en het mondverbrandingssyndroom zijn specifieke voor-20 beelden; en iii) wonden op de huid, zoals bijvoorbeeld een neoplasme, verbrandingen (bijvoorbeeld chemische, thermische), letsels (bacteriële, virale, auto-immunologische), beten en chirurgische incisies.

De methoden en samenstellingen van de onderhavige uitvinding zijn tevens werkzaam bij de behandeling en preventie van één of meer chronische wonden, waar-25 onder drukzweren, aderzweren en diabetische zweren. In al deze chronische wondtypen is de hieraan ten grondslag liggende oorzaak van de gebeurtenis een periode van ischemie, gevolgd door een periode van reperfusie. Deze ischemie-reperfusiegebeurte-nissen zijn gewoonlijk repetitief, dit betekent dat de nadelige effecten van ischemie-reperfusie gepotentieerd zijn en eventueel voldoende zijn om zweervorming te veroor-30 zaken. Voor zowel drukzweren als diabetische voetzweren is de ischemische gebeurtenis het resultaat van een geprolongeerde druk die voldoende is voor de verhindering van weefselperfixsie en wanneer de druk tenslotte afneemt treedt het reperfusieletsel op.

49

De onderhavige samenstellingen zijn werkzaam bij het remmen van de schade die veroorzaakt wordt door ischemie-reperfusie in chronische wonden.

De onderhavige samenstellingen zijn tevens werkzaam in andere ziektetoestanden die geassocieerd zijn met ischemie-reperfusie, zoals bijvoorbeeld, maar niet 5 beperkt tot: orgaantransplantatie, darm- en colonanastamosen, chirurgische ingrepen op grote bloedvaten, het hechten van losgeraakte ledematen, ballonangioplastie of één of andere chirurgische ingreep op het hart, beroerte of hersentrauma, ledemaattransplanta-tie, longhypertensie, hypoxemie en niet-cardiogeen pulmonair oedeem, acuut renaal falen, acute glaucoma, diabetische retinopathie, hypertensieve retinopathie, retinale 10 vasculaire occlusie, cochleaire ischemie, microvasculaire chirurgie en ischemische letsels in scleroderma.

De methoden en samenstellingen volgens de onderhavige uitvinding zijn tevens werkzaam bij de behandeling van akoestische traumata of mechanische traumata, bij voorkeur een akoestisch of mechanisch trauma die tot haarcelverlies in het 15 inwendige oor leidt. Een akoestisch trauma die volgens de onderhavige uitvinding behandeld moet worden, kan worden veroorzaakt door één enkele blootstelling aan een extreem hard geluid of na een langdurige blootstelling aan dagelijkse harde geluiden boven ongeveer 85 decibel. Een volgens de onderhavige uitvinding te behandelen mechanisch trauma in het inwendige oor is bijvoorbeeld het trauma in het inwendige oor 20 na een operatie met behulp van een elektronisch apparaat dat in het inwendige oor gebracht wordt. De samenstellingen volgens de onderhavige uitvinding verhinderen of minimaliseren de schade aan haarcellen in het inwendige oor die met de ingreep geassocieerd is. De verbindingen die de door ototoxine geïnduceerde gehoorbeschadiging reduceren dan wel verhinderen, in het bijzonder de nieuwe siRNA’s, worden bij voor-25 keur lokaal in het inwendige oor toegediend.

Bovendien kan de verbinding volgens de uitvinding worden gebruikt ter behandeling van één of meer ziektetoestanden, waarbij ischemie betrokken is, eventueel de ischemie-reperfusie. Deze ziektetoestanden omvatten ischemie of ischemie-reperfusie resulterende van een angioplastie, chirurgische ingreep aan het hart of trom-30 bolyse; orgaantransplantatie; ten gevolge van plastische chirurgie; bij het ernstige com-partimentsyndroom; bij het opnieuw hechten van losgeraakte ledematen; ten gevolge van het multiorgaanfalensyndroom; in de hersenen ten gevolge van een beroerte of hersentrauma; in samenhang met chronische wonden, zoals drukzweren, aderzweren en 50 diabetische zweren; bij skeletspierischemie of Iedemaattransplantatie; ten gevolge van een mesenterische ischemie of acute ischemische darmziekte; ademhalingsfalen ten gevolge van een lagere torso-ischemie, die tot pulmonaire hypertensie, hypoxemie lijdt en niet-cardiogeen pulmonair oedeem; acuut renaal falen, zoals waargenomen na een 5 renale transplantatie, een belangrijke chirurgische ingreep, trauma en septische alsmede hemorrhagieshock; sepsis; retinale ischemie die optreedt ten gevolge van een acute vasculaire occlusie, die tot verlies van het gezichtsvermogen in een aantal oculaire ziekten leidt, zoals bijvoorbeeld acute glaucoma, diabetische retinopathie, hyperten-sieve retinopathie en retinale vasculaire occlusie; cochleaire ischemie; klepfalen in 10 microvasculaire chirurgie voor hoofd- en nekgebreken; het verschijnsel van Raynaud en de geassocieerde digitale ischemische letsels in scleroderma; ruggenmergletsel; vasculaire chirurgische ingreep; traumatische rhabdomyolyse (het crushsyndroom); en myoglobinurie. Verder kan ischemie/reperfusie bij de volgende ziektetoestanden betrokken zijn: hypertensie, hypertensieve cerebrale vasculaire ziekte, breuk van aneu-15 rysme, een constrictie of obstructie van een bloedvat, zoals zij optreedt in het geval van een trombus of embolus, angioma, bloeddyscrasias, één of andere vorm van gebrekkige hartfunctie waaronder hartstilstand of -falen, systemische hypotensie, hartstilstand, cardiogene shock, septische shock, ruggenmergtrauma, hoofdtrauma, aanval, bloeding uit een tumor; en ziekten zoals beroerte, ziekte van Parkinson, epilepsie, depressie, 20 ALS, ziekte van Alzheimer, ziekte van Huntington en één of meer andere door ziekte geïnduceerde dementie (zoals bijvoorbeeld door HIV geïnduceerde dementie). Bovendien kan een ischemische episode worden veroorzaakt door een mechanisch letsel aan het centrale zenuwstelsel, zoals deze resulteert uit een klap op het hoofd of op de wervelkolom. Een trauma kan letsel aan weefsel inhouden, zoals bijvoorbeeld een scheur-25 wond, incisie, contusie, punctuur, compressie, etc., zoals zij kunnen ontstaan uit een traumatisch contact van een vreemd voorwerp met een plek of in de nabijheid van het hoofd, de nek of de wervelkolom. Andere vormen van traumatisch letsel kunnen ontstaan uit constrictie of compressie van het centrale zenuwweefsel door middel van een ongeschikte accumulatie van vocht (bijvoorbeeld een blokkade of dysfunctie van nor-30 maal cerebrospinaal vocht of vitreus lichaamsvloeistofproductie, omzet of volumerege-ling of een subduraal of intracamiaal hematoom of oedeem). Op vergelijkbare wijze kan traumatische constrictie of compressie ontstaan uit de aanwezigheid van een massa van abnormaal weefsel, zoals een metastatische of primaire tumor.

51 “Behandeling van een ziekte” heeft betrekking op het toedienen van een therapeutische stof die werkzaam is ter verlichting van symptomen die geassocieerd zijn met een ziekte, voor het verminderen van de ernst dan wel voor het genezen van de ziekte dan wel voor het verhinderen van het optreden van de ziekte. “Behandeling” 5 heeft zowel betrekking op een therapeutische behandeling als op een profylactische behandeling dan wel voor preventieve maatregelen, waarbij de doelstelling is het voorkomen of vertragen (verzachten) van een ziekte dan wel aandoening.

Een “therapeutisch werkzame dosis” heeft betrekking op een hoeveelheid van een farmaceutische verbinding of samenstelling die werkzaam is voor het bereiken 10 van een verbetering in een patiënt of zijn fysiologische systemen, waaronder, maar niet beperkt tot een verbeterd overlevingspercentage, een sneller herstel, of een verbetering of eliminering van symptomen en andere indicatoren, zoals zij door de deskundigen geselecteerd zijn als geschikte bepalende maatregelen.

De methoden voor de behandeling van de ziekten die in de beschrijving 15 beschreven zijn en die in de onderhavige uitvinding opgenomen zijn kunnen het toedienen omvatten van een RTP801-inhibitor tezamen met een additionele RTP801-inhibitor, een stof die de farmacologische eigenschappen van de actieve ingrediënten, zoals hieronder wordt aangegeven, of van een additionele verbinding, waarvan bekend is dat zij werkzaam is in de behandeling van de ziekte van de te behandelen ziekte, zoals bij-20 voorbeeld maculaire degeneratie, COPD, ARF, DR, cisplatine of akoestische door trauma geïnduceerde doofheid, onder andere, verbetert. Met “tezamen met” wordt bedoeld voorafgaande aan, simultaan of in aansluiting op. Verder detail over voorbeelden van combinatietherapieën wordt hieronder gegeven.

In een andere uitvoeringsvorm verschaft de onderhavige uitvinding de 25 toepassing van een therapeutisch werkzame dosis van een RTP801-inhibitor voor de bereiding van een geneesmiddel voor het bevorderen van het herstel bij een patiënt die aan maculaire degeneratie, COPD, ARF, DR, cisplatine of akoestische door trauma geïnduceerde doofheid of één of andere oogziekte, microvasculaire of ademhalingstoe-stand of gehoorstoomis, zoals hierboven gedetailleerd is lijdt, en de toepassing van een 30 therapeutisch werkzame dosis van een RTP801-inhibitor voor de productie van een geneesmiddel voor de behandeling van deze ziekten en aandoeningen. In deze uitvoeringsvorm kan de RTP801-inhibitor een polynucleotide omvatten welke opeenvolgende nucleotiden omvat met een sequentie welke een antisens sequentie ten opzichte van de 52 sequentie weergegeven in figuur 1 (SEQ ID N0:1) omvat. Bovendien kan de RTP801-inhibitor een expressievector zijn die een polynucleotide omvat met een sequentie die een antisens sequentie is ten opzichte van de sequentie weergegeven in figuur 1 (SEQ ID NO:l). De RTP801-inhibitor volgens de vermelde toepassingen kan eveneens een 5 antilichaam zijn, zoals bijvoorbeeld een neutraliserend antilichaam dat specifiek bindt aan een epitoop die aanwezig is binnen een polypeptide welke achtereenvolgende aminozuren omvat, waarvan de sequentie in figuur 2 is weergegeven (SEQ ID NO:2). Bovendien kan de RTP801 -inhibitor een RNA-molecuul zijn dat het RTP801-gen mRNA als doel heeft, eventueel een siRNA, eventueel een siRNA dat opeenvolgende 10 moleculen met een sequentie omvat die identiek is aan de sequentie weergegeven in de tabellen A-D (SEQ ID NOS:3-536) en in het bijzonder siRNA nrs.: 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 en 50 van tabel A of siRNA nrs.: 257, 260-262, en 264-268 van tabel D, dan wel een ribozyme.

Dus volgens de hierin geopenbaarde informatie, kan de met één of meer 15 van de hierin beschreven methoden te gebruiken RTP801-inhibitor in één of meer van de toepassingen die in de beschrijving geopenbaard zijn en in één van de farmaceutische samenstellingen die in de beschrijving geopenbaard zijn, uit de groep worden geselecteerd, bestaande uit een siRNA, een vector die een siRNA omvat, een vector die een siRNA tot expressie brengt en elk molecuul dat endogeen in siRNA 20 omgezet wordt. Zoals hierin gedetailleerd beschreven wordt is het siRNA bij voorkeur een siRNA dat opeenvolgende nucleotiden met een sequentie die identiek is met één of meer sequenties weergegeven in de tabellen A-D (SEQ ID NOS.3-536) en in het bijzonder siRNA nrs. 14,22, 23, 25,27, 39,41, 42, 49 en 50 van tabel A of siRNA nrs.: 257, 260-262, en 264-268 van tabel D, omvat.

25 “Ademhalingsstoomis” heeft betrekking op ziektetoestanden, ziekten of syndromen van het ademhalingssysteem waaronder, maar niet beperkt tot longaandoeningen van alle typen waaronder de chronische obstructieve longziekte (COPD), emfyseem, chronische bronchitis, astma en onder andere longkanker. Emfyseem en chronische bronchitis kunnen als onderdeel van COPD of onafhankelijk optreden.

30 “Microvasculaire aandoening” heeft betrekking op elke ziektetoestand die microscopische capillairen en lymfen aantast, in het bijzonder vasospastische ziekten, vasculitische ziekten en lymfatische occlusieve ziekten. Voorbeelden van microvasculaire aandoeningen omvatten onder andere: oogziekten, zoals Amaurosis Fugax (embo- 53 lisch of secundair ten opzichte van SLE), het aplasyndroom, Prot CS en ATIII-defï-ciëntie, microvasculaire pathologieën die veroorzaakt zijn door IV-geneesmiddel-gebruik, dysproteïnemia, temporale arteritis, anterieure ischemische optische neuropathie, optische neuritis (primair of secundair ten opzichte van auto-immune ziekten), 5 glaucoma, Von Hippel Lindau-syndroom, comeale ziekte, comeale transplantatieafsto-tingscataracten, ziekte van Eales, frosted-branch-angiïtis, encircling-buckling-operatie, uveïtis waaronder pars planitis, choroïdaal melanoom, choroïdaal hemangioom, optische zenuwaplasia; retinale ziektetoestanden, zoals retinale slagaderocclusie, retinale aderocclusie, retinopathie van prematuriteit, HIV-retinopathie, Purtscher-retinopathie, 10 retinopathie van systemische vasculitis en auto-immune ziekten, diabetische retinopathie, hypertensieve retinopathie, bestral ingsretinopathie, vertakkingsretinale ader of aderocclusie, idiopathische retinale vasculitis, aneurysmen, neuroretinitis, retinale em-bolisering, acute retinale necros, vogelshotretinochoroïdopathie, duurzaam retinaal losraken; systemische toestanden, zoals diabetes mellitus, diabetische retinopathie (DR), 15 met diabetes geassocieerde microvasculaire pathologieën (zoals hieronder gedetailleerd weergegeven wordt), hyperviscositeitssyndromen, aortaboogsyndromen en oculaire ischemische syndromen, carotide-cavemeuze fistula, multiple sclerosis, systemische lupus erythematosus, arteriolitis met SS-A autoantilichaam, acute multifocale hemor-rhagie vasculitis, vasculitis resulterende van infectie, vasculitis resulterende van de 20 ziekte van Bellet, sarcoidosis, coagulopathieën, neuropathieën, nefropathieën, microvasculaire ziekten van de nier, en onder andere ischemische microvasculaire ziektetoestanden.

Microvasculaire aandoeningen kunnen een neovasculair element omvatten. De term “neovasculaire aandoening” heeft betrekking op de ziektetoestanden, waarbij de vor-25 ming van bloedvaten (neovascularisatie) schadelijk is voor de patiënt. Voorbeelden van oculaire neovascularisatie omvatten: retinale ziekten (diabetische retinopathie, diabe-tisch maculair oedeem, chronische glaucoma, retinaal losraken en sikkelcelretinopa-thie); rubeosis iritis; proliferatieve vitreo-retinopathie; inflammatoire ziekten; chronische uveïtis; neoplasmen (retinoblastomen, pseudo-gliomen en melanomen); Fuchs 30 heterochromische iridocyclitis; neovasculaire glaucoma; comeale neovascularisatie (inflammatoire, transplantatie- en ontwikkelingshypoplasia van de iris); neovascularisatie na een gecombineerde vitrectomie en lensectomie; vasculaire ziekten (retinale ischemie, choroïdale vasculaire insufficiëntie, choroïdale trombose en carotide ader- 54 ischemie); neovascularisatie van de optische zenuw; en neovascularisatie die te wijten is aan de penetratie van het oog of contusief oculair letsel. Al deze neovasculaire ziektetoestanden kunnen onder toepassing van de verbindingen en farmaceutische samenstellingen van de onderhavige uitvinding worden behandeld.

5 “Oogziekte” heeft betrekking op ziektetoestanden, ziekten of syndromen van het oog waaronder, maar niet beperkt tot één of meer ziektetoestanden, waarbij choroïdale neovascularisatie (CNV), nat en droog AMD, oculair histoplasmosis-syndroom, angiodestrepen, breuken in Bruchsmembraan, myopische degeneratie, ocu-laire tumoren, retinale degeneratieve ziekten en retinale aderocclusie (RVO) betrokken 10 zijn. Enkele ziektetoestanden die in de beschrijving geopenbaard worden, zoals DR, die volgens de methode van de onderhavige uitvinding kunnen worden behandeld, worden beschouwd als een microvasculaire aandoening en een oogaandoening of beide, onder de definities die in de beschrijving gegeven zijn.

Gehoorbeschadigingen die relevant zijn voor de onderhavige uitvinding 15 kunnen te wijten zijn aan eindorgaanletsels die haarcellen van het inwendige oor omvatten, bijvoorbeeld akoestisch trauma, virale endolymfatische labyrinthitis, ziekte van Menière. Gehoorbeschadigingen omvatten tinitis, die een perceptie van geluid is in afwezigheid van een akoestische stimulus, en intermitterend of continu kan zijn, waarbij een sensorineuraal verlies gediagnosticeerd is. Gehoorverlies kan te wijten zijn aan 20 bacteriële of virale infecties, zoals herpes zoster oticus, purulente labyrinthitis welke ontstaat uit acute otitismedia, purulente meningitis, chronische otitismedia, plotselinge doofheid waaronder die van virale oorsprong, bijvoorbeeld virale endolymfatische labyrinthitis veroorzaakt door virussen waaronder de bof, mazelen, influenza, waterpokken, mononucleose en adenovirussen. Het gehoorverlies kan congenitaal zijn, zoals 25 dat veroorzaakt door rubella, anoxia tijdens de geboorte, bloeden in het inwendige oor dat te wijten is aan een trauma tijdens de bevalling, ototoxische geneesmiddelen die aan de moeder toegediend zijn, erythroblastosis fetalis, en erfelijke ziektetoestanden waaronder het syndroom van Waardenburg en het syndroom van Hurler. Het verlies aan gehoor kan door geluid geïnduceerd zijn, in het algemeen is dat te wijten aan een geluid 30 groter dan ongeveer 85 decibel (db) dat het inwendige oor beschadigt. Bij voorkeur wordt het verlies aan gehoorvermogen veroorzaakt door een akoestisch trauma dan wel een ototoxisch geneesmiddel dat het gehoorgedeelte van het inwendige oor, in het bijzonder haarcellen van het inwendige oor aantast. Opgenomen in de beschrijving als 55 referenties zijn hoofdstukken 196, 197, 198 en 199 van Het Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 14e editie, (1982), Merck Sharp & Dome Research Laboratories, N.J. en de overeenkomstige hoofdstukken in de meest recente 1606 editie, waaronder hoofdstukken 207 en 210) die betrekking hebben op de beschrijving en diagnose van gehoor 5 en balansbeschadigingen.

Gehoorstoomissen of -beschadigingen (ofwel balansbeschadiging) die behandeld moeten worden of die voorkomen moeten worden in de context van de onderhavige uitvinding zijn bij voorkeur zonder aan een bepaalde theorie gebonden te willen zijn, door ototoxine of trauma geïnduceerde apoptotische beschadiging aan de 10 haarcellen van het inwendige oor. De patiënten die behoefte hebben aan een behandeling omvatte die personen die reeds een gehoorbeschadiging ervaren hebben, die welke vatbaar zijn voor deze beschadiging en die waarbij de beschadiging voorkomen moet worden. Zonder aan enige theorie gebonden te willen zijn kunnen de gehoorbeschadi-gingen te wijten zijn aan apoptotische haarcelbeschadiging of verlies in het inwendige 15 oor, waarbij de beschadiging of verlies veroorzaakt is door infectie, mechanisch letsel, lawaai, veroudering of chemisch-geïnduceerde ototoxiciteit. Ototoxinen omvatten therapeutische geneesmiddelen, waaronder antineoplastische middelen, salicylaten, kini-nen en aminoglycoside antibiotica, contaminanten in voedingsmiddelen of medicijnen en milieu of industriële verontreinigingen. Gewoonlijk wordt de behandeling uitge-20 voerd ter preventie of ter reductie van ototoxiciteit of akoestisch trauma, in het bijzonder resulterende van of waarvan verwacht wordt dat zij resulteren van de toediening van therapeutische geneesmiddelen of blootstelling aan akoestisch trauma waaronder het milieu. Bij voorkeur wordt een therapeutisch werkzame samenstelling onmiddellijk gegeven na de blootstelling ter preventie of ter reductie van het ototoxische effect of 25 het traumatische effect. Meer bij voorkeur wordt een behandeling profylactisch verschaft door toediening van de samenstelling voorafgaande aan of tegelijkertijd met het ototoxische farmaceutische middel dan wel door blootstelling aan de ototoxine dan wel aan de akoestisch trauma inducerende omgeving.

De gehoorbeschadiging kan door chemotherapie geïnduceerd zijn. Meer 30 gedetailleerd, de gehoorbeschadiging kan veroorzaakt zijn door chemotherapeutische middelen, zoals etoposide, 5-FU (5-fluoruracil), cis-platina, doxorubicine, een vinca-alkaloïde, vincristine, vinblastine, vinorelbine, taxol, cyclofosfamide, ifosfamide, chloorambucil, busulfan, mechloorethamine, mitomycine, dacarbazine, carboplatina, 56 thiotepa, daunorubicine, idarubicine, mitoxantron, bleomycine, esperamicine Al, dacti-nomycine, plicamycine, carmustinc, lomustine, tauromustine, streptozocine, melfalan, dactinomycine, procarbazine, dexamethason, prednison, 2-chloordeoxyadenosine, cyta-rabine, docetaxel, fludarabine, gemcitabine, herceptine, hydroxyureum, irinotecan, 5 methotrexaat, oxaliplatine, rituxine, semutine, epirubicine, etoposide, tomudex en topotecan, of een chemische analoge verbinding van één van deze chemotherapeutische middelen. De chemotherapeutische middelen die zeer waarschijnlijk een gehoorbe-schadiging veroorzaken zijn cisplatinum(cisplatine) en cisplatineachtige verbindingen.

In de context van de onderhavige uitvinding wordt met “ototoxine” bedoeld 10 een stof die vanwege zijn chemische werking de activiteit van de geluidsreceptoren van het zenuwstelsel dat geassocieerd is met het gehoor aantast, beschadigt of remt, hetgeen achtereenvolgens het gehoor (en/of de balans) benadeelt. In de context van de onderhavige uitvinding omvat ototoxiciteit een nadelig effect op de haarcellen van het inwendige oor. Ototoxische middelen die gehoorbeschadigingen veroorzaken omvatten, maar 15 zijn niet beperkt tot neoplastische middelen, zoals vincristine, vinblastine, cisplatine en cisplatineachtige verbindingen, taxol en taxolachtige verbindingen, dideoxyverbindin-gen, bijvoorbeeld dideoxyinosine; alcohol; metalen; industriële toxinen die betrokken zijn bij de werkomgeving dan wel bij blootstelling aan het milieu; contaminanten van voedingsmiddelen of geneesmiddelen; en overdoseringen van vitaminen of therapeuti-20 sche geneesmiddelen, bijvoorbeeld antibiotica, zoals penicilline of chlooramfenicol, en megadoses van vitaminen A, D of B6, salicylaten, kininen en loopdiuretica. Met “blootstelling aan een ototoxisch middel” wordt bedoeld dat het ototoxische middel beschikbaar gesteld wordt aan of in aanraking komt met een zoogdier. Blootstelling aan een ototoxisch middel kan optreden door rechtstreekse toediening, bijvoorbeeld door 25 innemen of toediening van een voedingsmiddel, geneesmiddel of therapeutisch middel, bijvoorbeeld een chemotherapeutisch middel, door onwillekeurige contaminatie of door blootstelling aan het milieu, bijvoorbeeld blootstelling aan lucht of aan een waterig milieu.

“RTP801-gen” heeft betrekking op de RTP801-coderende sequentie open 30 reading frame, zoals weergegeven in figuur 1 (SEQ ID NO:l) of een willekeurige homologe sequentie hiervan met bij voorkeur ten minste 70% identiciteit, meer bij voorkeur 80% identiciteit, zelfs nog meer bij voorkeur 90 of 95% identiciteit. Dit omvat één of meer sequenties afgeleid van SEQ ID NO:l die mutaties, wijzigingen of 57 modificaties, zoals zij in de beschrijving beschreven zijn, ondergaan hebben. Dus wordt RTP801 in een voorkeursuitvoeringvorm gecodeerd door een nucleïnezuursequentie volgens SEQ ID NO:l. Het valt tevens binnen de onderhavige uitvinding dat de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding slechts complementair en 5 respectievelijk identiek zijn met een deel van het nucleïnezuur coderende voor RTP801 aangezien het eerste stukje, bij voorkeur een eerste streng, gewoonlijk korter is dan het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding. Tevens dient erkend te worden dat gebaseerd op de aminozuursequentie van RTP801 elke nucleïnezuursequentie coderende voor een dergelijke aminozuursequentie door de deskundige als gebaseerd 10 op de genetische code opgevat kan worden. Echter vanwege de veronderstelde wijze van inwerking van de nucleïnezuren volgens de uitvinding verdient het zeer de voorkeur dat het nucleïnezuur coderende voor RTP801, bij voorkeur het mRNA hiervan, er één is in het organisme, weefsel en/of respectievelijk cel, waarbij de expressie van RTP801 gereduceerd moet worden.

15 “RTP801-polypeptide” heeft betrekking op het polypeptide van het RTP801-gen en men vindt dat dit voor de doelstellingen van de onderhavige uitvinding de termen “RTP779”, “REDD1”, “Ddit4”, “FLJ20500”, “Dig2”, en “PRF1” omvat, afgeleid van welk organisme dan ook, eventueel een mens, splitsingsvarianten en fragmenten hiervan die de biologische activiteit behouden en homologen hiervan, bij voor-20 keur met ten minste 70%, nog meer bij voorkeur met ten minste 80%, of zelfs nog meer bij voorkeur met ten minste 90% of 95% homologie hiermee. Bovendien vindt men dat de term tevens polypeptiden omvat welke resulteren van ondergeschikte wijzigingen in de RTP801-coderende sequentie, zoals onder andere puntmutaties, substituties, deleties en inserties die een verschil in enkele aminozuren tussen het resulterende polypeptide 25 en het in de natuur voorkomende RTP801 kunnen veroorzaken. Polypeptiden gecodeerd door nucleïnezuursequenties die aan de RTP801-coderende sequentie of genome sequentie onder omstandigheden van zeer strikte hybridisatie die uit de stand der techniek bekend zijn, gebonden worden (zie bijvoorbeeld Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1988), herzien in 30 1995 en 1998) vallen eveneens onder deze term. Chemisch gemodificeerd RTP801 of chemisch gemodificeerde fragmenten van RTP801 zijn eveneens in deze term opgenomen zolang de biologische activiteit behouden blijft. RTP801 heeft bij voorkeur of omvat een aminozuursequentie volgens SEQ ID NO:2. Erkend wordt dat er verschillen 58 kunnen zijn in de aminozuursequentie onder verschillende weefsels van een organisme en onder verschillende organismen van één species of onder verschillende species waarop het nucleïnezuur volgens de uitvinding in verscheidene uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding toegepast kunnen worden. Echter gebaseerd op de techni-5 sche leer die in de beschrijving verschaft wordt kan de respectievelijke sequentie dienovereenkomstig in aanmerking worden genomen wanneer één of meer van de nucleïne-zuren volgens de onderhavige uitvinding ontworpen worden. Bepaalde fragmenten van RTP801 omvatten aminozuren 1-50, 51-100, 101-150, 151-200 en 201-232 van de sequentie weergegeven in figuur 2. Verder omvatten bepaalde fragmenten van RTP801 10 aminozuren 25-74, 75-124, 125-174,175-224 en 225-232 van de in figuur 2 weergegeven sequentie.

RTP801, zoals hierin wordt gebruikt, is een eiwit dat onder andere beschreven is in WO 99/09046. RTP801 dat tevens als RTP801 wordt aangeduid, is beschreven als een transcriptionele target van HIF-Ια door Shoshani T. et al. (Shoshani et al., 2002, Mol 15 Cell Biol, 22, 2283-93). Verder heeft het onderzoek door Ellisen et al. (Ellisen et al., Mol Cell, 10, 995-1005) RTP801 geïdentificeerd als een p53-afhankelijke DNA-beschadigingresponsgen en als een p63-afhankelijk gen betrokken bij epitheliale differentiatie. Tevens reflecteert RTP801 het weefselspecifieke patroon van het p53-familielid p63, is effectief vergelijkbaar met of behalve TP 63 is deze een inhibitor voor 20 de in vitro differentiatie en is betrokken bij de regulering van reactieve zuurstofspecies. Behalve dat is RTP801 gevoelig voor hypoxia-reagerende transcriptiefactorhypoxia-induceerbare factor 1 (HIF-1) en wordt gewoonlijk bovenwaarts gereguleerd gedurende hypoxia zowel in vitro als in vivo in een diermodel van de ischemische beroerte. RTP801 schijnt te werken bij de regulering van reactieve zuurstofspecies (ROS) en 25 ROS-niveaus en gereduceerde gevoeligheid voor oxidatieve stress worden beide verhoogd na een ectopische expressie RTP801 (Ellisen et al., 2002, supra; Soshani et al., 2002, supra). Bij voorkeur is RTP801 een biologisch actief RTP801 -eiwit dat bij voorkeur ten minste één van deze kenmerken, bij voorkeur twee of meer en het meest bij voorkeur elk van deze kenmerken.

30 Zonder aan enige theorie gebonden te willen zijn, is RTP801, zijnde een stressinduceerbaar eiwit (reagerend op hypoxia, oxidatieve stress, thermische stress, ER-stress), een factor die betrokken is bij het nuanceren van de celreactie op een ener-gieonbalans. Als zodanig is het een target die geschikt is voor de behandeling van elke 59 ziekte, waarbij cellen gered moeten worden van apoptose te wijten aan stressvolle omstandigheden (bijvoorbeeld ziekten die vergezeld gaan met de dood van normale cellen) of waarbij cellen die aangepast zijn aan stressvolle omstandigheden die te wijten zijn aan veranderingen in de RTP801-expressie (bijvoorbeeld kankercellen) gedood moeten 5 worden. In het laatstgenoemde geval kan RTP801 beschouwd worden als een overle-vingsfactor voor kankercellen en zijn inhibitoren kunnen kanker behandelen als een monotherapie of als sensibiliserende geneesmiddelen in combinatie met chemotherapie of radiotherapie.

De term “polynucleotide” heeft betrekking op elk molecuul dat samenge-10 steld is uit DNA-nucleotiden, RNA-nucleotiden of een combinatie van beide typen, dat wil zeggen een molecuul dat twee of meer van de basen guanidine, cytosine, thymidine, adenine, uracil of inosine onder andere omvat. Een polynucleotide kan natuurlijke nu-cleotiden, chemisch gemodificeerde nucleotiden en synthetische nucleotiden dan wel chemische analoga hiervan omvatten. De term omvat “oligonucleotiden” en omvat te-15 vens “nucleïnezuren”.

De term “aminozuur” heeft betrekking op een molecuul dat uit één of meer van de 20 in de natuur voorkomende aminozuren, aminozuren die chemisch gemodificeerd zijn (zie hieronder) of synthetische aminozuren bestaat.

De term “polypeptide” heeft betrekking op een molecuul samengesteld uit 20 twee of meer aminozuurresten. De term omvat peptiden, polypeptiden, eiwitten en peptidomimetica.

Een “peptidomimetische verbinding” is een verbinding die niet-peptide-structurele elementen bevat welke in staat is tot het nabootsen van één of meer biologische werking(en) van een natuurlijk ouderpeptide. Enkele van de klassieke peptide-25 kenmerken, zoals enzymatisch splitsbare peptidebindingen zijn gewoonlijk in een peptidomimetische verbinding niet aanwezig.

Onder de term “dominant negatief peptide” wordt bedoeld een polypeptide gecodeerd door een cDNA-fragment dat voor een deel van een eiwit codeert (zie Herskowitz I.: Functional inactivation of genes by dominant negative mutations. 30 Nature. 17-23 september 1987; 329(6136):219-22. Review; Roninson E.B. et al., Genetic suppressor elements: new tools for molecular oncology - 13th Cornelius P. Rhoads Memorial Award Lecture. Cancer Res. 15 september 1995; 55(18):4023). Dit peptide kan een functie hebben die verschilt van die van het eiwit waaruit het afgeleid 60 was. Het kan in wisselwerking treden met het volledige eiwit en zijn activiteit remmen dan wel kan dit in wisselwerking treden met andere eiwitten en him activiteit remmen als reactie op de proteïne met een volledige lengte (een ouderproteïne). Dominant negatief betekent dat het peptide in staat is tot het domineren van de natuurlijke ouder-5 proteïne en zijn activiteit remmen waarbij de cel een verschillend kenmerk wordt gegeven, zoals bijvoorbeeld resistentie of sensibilisering voor de dood of elk cellulair fenotype van belang. Voor een therapeutische interventie kan het peptide zelf worden afgegeven als actief ingrediënt van een farmaceutische samenstelling dan wel kan het cDNA aan de cel worden afgegeven, onder toepassing van bekende methoden.

10

Bereiding van peptiden en polvpeptiden

Polypeptiden kunnen via verscheidene methoden worden geproduceerd, bijvoorbeeld: 15 1) Synthetisch:

Synthetische polypeptiden kunnen onder toepassing van een in de handel verkrijgbare inrichting, onder toepassing van een bekende sequentie van RTP801 of een deel hiervan, worden geproduceerd.

20 2) Recombinantmethoden:

Een voorkeursmethode voor de bereiding van RTP801-polypeptiden of fragmenten hiervan is het kloneren van een polynucleotide dat het cDNA van het RTP801-gen omvat, in een expressievector en het kweken van de cel waarin de vector is opgenomen, zodanig dat het gecodeerde polypeptide tot expressie wordt gebracht en 25 vervolgens zuiveren van het resulterende peptide, waarbij al deze maatregelen uitgevoerd worden onder toepassing van methoden die uit de stand der techniek bekend zijn, zoals bijvoorbeeld beschreven is in Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization. A laboratory course manual ” CSHL Press (1996) (als aanvulling, zie Bibl Haematol. 1965:23:1165-74 Appl Microbiol, juli 1967; 15(4):851-6; Can 30 J Biochem. mei 1968; 46(5):441-4: Biochemistry, juli 1968; 7(7):2574-80; Arch Bio-chem Biophys. 10 september 1968; 126(3):746-72; Biochem Biophys Res Commun. 20 februari 1970; 38(4):825-30)).

61

De expressievector kan een promotor voor het beheersen van de transcriptie van het heterologe materiaal omvatten en kan een constitutieve of een induceerbare promotor zijn teneinde een selectieve transcriptie mogelijk te maken. Promotoren die vereist kunnen zijn voor het verkrijgen van noodzakelijke transcriptieniveaus kunnen 5 eventueel worden opgenomen. De expressiedrager kan tevens een selectiegen omvatten.

Vectoren kunnen in cellen of weefsels onder toepassing van één of meer van een verscheidenheid van uit de stand der techniek bekende methoden worden geïntroduceerd. Deze methoden kunnen worden gevonden en zijn in het algemeen beschre-10 ven in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor, MI (1995), Vectors: A survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston MA (1988) en Gilboa et al. 15 (1986).

3) Zuivering uit natuurlijke bronnen: RTP801-polypeptide of in de natuur voorkomende fragmenten hiervan kunnen uit natuurlijke bronnen, zoals weefsels worden gezuiverd onder toepassing van vele 20 uit de stand der techniek bekende methoden, zoals bijvoorbeeld: immunoprecipitatie met anti-RTP801-antilichaam of aan een matrix gebonden affiniteitchromatografie met een willekeurig molecuul waarvan bekend is dat het RTP801 bindt.

Eiwitzuivering wordt uitgevoerd zoals uit de stand der techniek bekend is en beschreven is in bijvoorbeeld Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and 25 Characterization. A laboratory course manual”. CSHL Press (1996).

Onder “biologisch effect van RTP801” of “RTP801-biologische activiteit” wordt bedoeld het effect van RTP801-ademhalingsziekten, dat rechtstreeks of indirect kan zijn en omvat, zonder door enige theorie gebonden te willen zijn, het effect van RTP801 op apoptose van alveolaire cellen geïnduceerd door hypoxische of hyperoxi-30 sche omstandigheden. Het indirecte omvat, maar is niet beperkt tot het binden van RTP801 aan of het hebben van een effect op één van verscheidene moleculen die betrokken zijn bij een signaaltransductiecascade resulterende in apoptose.

62 “Apoptose” heeft betrekking op een fysiologisch type van celdood resulterende uit de activering van enkele cellulaire mechanismen, dat wil zeggen dood die beheerst wordt door het mechanisme van de cel. Apoptose kan bijvoorbeeld het resultaat zijn van activering van het celapparaat door middel van een uitwendige trigger, 5 bijvoorbeeld een cytokine of anti-FAS-antilichaam, leidende tot de celdood dan wel door middel van een inwendig signaal. De term “geprogrammeerde celdood” kan eveneens worden gebruikt en is met “apoptose” uitwisselbaar.

“Met apoptose geassocieerde ziekte” heeft betrekking op een ziekte waarvan de etiologie gerelateerd is geheel of tendele aan het proces van apoptose. De ziekte 10 kan veroorzaakt zijn door een slecht functioneren van het apoptotische proces (zoals in kanker of in een auto-immune ziekte) dan wel door een overactiviteit van het apoptotische proces (zoals in bepaalde neurodegeneratieve ziekten). Vele ziekten, waarbij RTP801 betrokken is zijn met apoptose geassocieerde ziekten. Bijvoorbeeld is apoptose een significant mechanisme in droog AMD, waarbij langzame atrofie van een foto-15 receptor en pigmentepitheliumcellen hoofdzakelijk in het centrale (maculaire) gebied van de retina plaatsvindt. Neuroretinale apoptose is tevens een significant mechanisme in diabetische retinopathie.

Een “inhibitor” is een verbinding die in staat is de activiteit te remmen van een gen of het product van een dergelijk gen in een mate die voldoende is om een ge-20 wenst biologisch of fysiologisch effect te bereiken. Een “RTP801 -inhibitor” is een verbinding die in staat is tot het remmen van de activiteit van het RTP801-gen of RTP801-genproduct, in het bijzonder het humane RTP801-gen of -genproduct. Deze inhibitoren omvatten stoffen die de transcriptie of translatie van het gen beïnvloeden, alsmede stoffen die de activiteit van het genproduct beïnvloeden. Een RTP801-inhibitor kan tevens 25 een inhibitor van de RTP801 -promotor zijn. Voorbeelden van deze inhibitoren kunnen onder andere omvatten: polynucleotiden, zoals AS-fragmenten, siRNA of vectoren waarin deze opgenomen zijn; polypeptiden, zoals dominantnegatieven, antilichamen en enzymen; katalytische RNA’s, zoals ribozymen en chemische moleculen met een klein molecuulgewicht, bijvoorbeeld een molecuulgewicht onder 2000 daltons. Specifieke 30 RTP801 -inhibitoren zijn hieronder gegeven.

“Expressievector” heeft betrekking op een vector die het vermogen heeft om heterologe DNA-ffagmenten in een vreemde cel op te nemen en tot uitdrukking te brengen. Vele prokaryotische en eukaryotische expressievectoren zijn bekend en/of in 63 de handel verkrijgbaar. Een selectie van geschikte expressievectoren ligt binnen de kennis van de deskundige.

De term “antilichaam” heeft betrekking op onder andere IgG-, IgM-, IgD-, IgA- en IgE-antilichaam. De definitie omvat polyklonale antilichamen of monoklonale 5 antilichamen. Deze term heeft betrekking op hele antilichamen of fragmenten van antilichamen welke een antigenbindingdomein omvatten, bijvoorbeeld antilichamen zonder het Fc-gedeelte, antilichamen met één enkele keten, miniantilichamen, fragmenten bestaande uit hoofdzakelijk slechts het variabele, antigen bindend gebied van het antilichaam etc. De term “antilichaam” kan tevens betrekking hebben op antilichamen te-10 gen polynucleotidesequenties verkregen door cDNA-vaccinatie. De term omvat tevens antilichaamfragmenten die het vermogen behouden tot selectief binden met hun antigen of receptor en zijn onder andere als volgt geïllustreerd: (1) Fab, het fragment dat een monovalent antigen bindend fragment van een antilichaammolecuul bevat dat door digereren van een geheel anti- 15 lichaam met het enzym papain geproduceerd kan worden, waarbij een lichte keten en een deel van de hevige keten verkregen worden; (2) Fab')2, het fragment van het antilichaam dat verkregen kan worden door behandeling van het gehele antilichaam met het enzym pepsine zonder een hierop aansluitende reductie; F(ab’2) is een dimeer van twee Fab-frag- 20 menten die door twee disulfïdebindingen bij elkaar gehouden worden; (3) Fv wordt gedefinieerd als een door genetische manipulatie verkregen fragment dat het variabele gebied bevat van de lichte keten en het variabele gebied van de zware keten tot expressie gebracht als twee ketens; en (4) Een antilichaam met één enkele keten (SCA), gedefinieerd als een 25 genetisch gemanipuleerd molecuul dat het variabele gebied van de lichte keten en het variabele gebied van de zware keten bevat, die verbonden is met behulp van een geschikte polypeptidelinker als een genetisch gefuseerd molecuul met één enkele keten.

Minilichamen en microlichamen vallen eveneens onder deze term. Micro-30 lichamen zijn zeer kleine proteïnen (gewoonlijk met 28-45 aminozuren) met pseudo-kluwen structuren, die zeer selectief en stabiel zijn. Eén of meer van deze toepassingen en nieuwe verbindingen die in de beschrijving geopenbaard zijn en welke antilichamen omvatten kunnen derhalve worden 64 opgenomen in plaats van een minilichaam of microlichaam als het anti- lichaamgedeelte van het molecuul.

Onder de term “epitoop”, zoals deze in de uitvinding wordt gebruikt, wordt verstaan een antigeen determinant op een antigen waaraan het antilichaam bindt. Epitoop-5 determinanten bestaan gewoonlijk uit chemisch actieve oppervlaktegroepen van moleculen, zoals aminozuren of suikerzijketens en hebben gewoonlijk specifieke driedimensionale structurele kenmerken alsmede specifieke ladingskenmerken.

Bereiding van anti-RTP801-antilichamen 10 Antilichamen die aan RTP801 binden of een fragment afgeleid hiervan kunnen worden bereid onder toepassing van een intact polypeptide of fragmenten die kleinere polypeptiden als het immuniserende antigen bevatten. Bijvoorbeeld kan het wenselijk zijn antilichamen te produceren die specifiek aan het N- of C-terminale of elk ander geschikt domein van het RTP801 binden. Het polypeptide dat gebruikt wordt 15 voor het immuniseren van een dier kan afgeleid zijn uit getranslateerd cDNA of chemische synthese en kan desgewenst met een dragerproteïne geconjugeerd worden. Deze gewoonlijk gebruikte dragers die chemisch gekoppeld zijn aan een polypeptide omvatten een sleutelgatkleefhemocyanine (KLH), thyroglobuline, runderserumalbumine (BSA) en tetanus toxoïde. Het gekoppelde polypeptide wordt vervolgens ter immunise-20 ring van het dier toegepast.

Desgewenst kunnen polyklonale of monoklonale antilichamen verder worden gezuiverd, bijvoorbeeld door binden aan en elutie vanuit een matrix waaraan het polypeptide of een peptide waartegen de antilichamen waren gevormd, gebonden is. De deskundigen op dit gebied kennen verscheidene technieken die gebruikelijk zijn op het 25 gebied van de immunologie voor de zuivering en/of het concentreren van polyklonale alsmede monoklonale antilichamen (Coligan et al., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1994).

Methoden voor de bereiding van antilichamen van allerlei typen, waaronder fragmenten, zijn uit de stand der techniek bekend (zie bijvoorbeeld Harlow en Lane, 30 Antibodies: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)). Methoden voor het immuniseren, waaronder alle noodzakelijke stappen voor de bereiding van het immunogen in een geschikt adjuvans, het bepalen van de antilichaam-binding, isolatie van antilichamen, methoden voor het verkrijgen van monoklonale 65 antilichamen en humanisering van monoklonale antilichamen zijn alle de deskundige bekend.

De antilichamen kunnen gehumaniseerde antilichamen of humane antilichamen zijn. Antilichamen kunnen worden gehumaniseerd onder toepassing van een ver-5 scheidenheid van technieken die op dit gebied bekend zijn, zoals bijvoorbeeld CDR-transplanteren (EP 239.400: PCT-publicatie WO 91/09967; Amerikaans octrooischrift 5.225.539; 5.530.101; en 5.585.089, het bekleden of van een nieuw oppervlak voorzien (EP-592.106; EP-519.596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 10 91:969-973 (1994)) en ketenverwisseling (Amerikaans octrooischrift 5.565.332).

De monoklonale antilichamen, zoals gedefinieerd omvatten antilichamen afgeleid van één species (zoals de muis, het konijn, de geit, de rat, de mens, enz.) alsmede antilichamen afgeleid van twee (of meer) species, zoals chimère en gehumaniseerde antilichamen.

15 Volledig humane antilichamen zijn bijzonder wenselijk voor de therapeuti

sche behandeling van humane patiënten. Humane antilichamen kunnen worden bereid door een verscheidenheid aan methoden die uit de stand der techniek bekend zijn, waaronder faagdisplaymethoden onder toepassing van antilichaambibliotheken afgeleid van humane immunoglobulinesequenties. Zie tevens Amerikaanse octrooischriften 20 4.444.887 en 4.716.111; en PCT-publicaties WO 98/46645, WO 98/50433, WO

98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 en WO 91/10741, waarvan elke in de beschrijving in zijn geheel als referentie wordt opgenomen.

Additionele informatie met betrekking tot alle typen antilichamen waaronder gehumaniseerde antilichamen, humane antilichamen en antilichaamfragmenten 25 kunnen in WO 01/05998 worden gevonden, die in zijn geheel als referentie in de beschrijving wordt opgenomen.

Neutraliserende antilichamen kunnen worden bereid onder toepassing van de hierboven beschreven methoden, mogelijkerwijs met een additionele stap van screenen op neutraliserende activiteit door bijvoorbeeld een overlevingstest.

30 De termen “chemische verbinding” en “klein molecuul”, “chemisch mole cuul”, “klein chemisch molecuul” en “kleine chemische verbinding”, zoals zij in de beschrijving door elkaar worden gebruikt, betekenen chemische groepen van elk bijzonder type die synthetisch worden kunnen worden geproduceerd dan wel uit natuur 66 lijke bronnen kunnen worden verkregen en die gewoonlijk een molecuulgewicht hebben van minder dan 2000 daltons, minder dan 1000 daltons of zelfs minder dan 600 dal tons.

De onderhavige uitvinding heeft tevens betrekking op functionele nucleïne-5 zuren die een structuur met een dubbele streng omvatten, hun toepassing voor de productie van een geneesmiddel, een farmaceutische samenstelling die deze functionele nucleïnezuren omvatten en een werkwijze ter behandeling van een patiënt.

Hypoxia is erkend als een sleutelelement in het pathomechanisme van een groot aantal ziekten, zoals beroerte, emfyseem en infarct die geassocieerd zijn met een 10 suboptimale zuurstofbeschikbaarheid en weefselbeschadigingsreacties op de hypoxia-omstandigheden. In snel groeiende weefsels waaronder tumor, wordt een suboptimale zuurstofbeschikbaarheid gecompenseerd door een ongewenste neoangiogenese. Derhalve is de groei van vasculatuur tenminste in het geval van kankerziekten, ongewenst.

Met het oog hierop is de inhibitie van de angiogenese en vasculaire groei 15 afhankelijk van intensief onderzoek. Reeds vandaag zijn enkele verbindingen beschikbaar die een ongewenste angiogenese en vasculaire groei remmen. Enkele van de meer prominente verbindingen zijn die welke VEGF en de VEGF-receptor remmen. In beide gevallen wordt het effect van VEGF vermeden door het blokkeren van VEGF als zodanig, bijvoorbeeld onder toepassing van een antilichaam gericht tegen VEGF, zoals uit-20 gevoerd door Genentech AVASTIN (monoklonaal AB specifiek voor VEGF) (Ferrara N.; Endocr Rev. 2004 augustus; 25(4):581-611) dan wel door het blokkeren van de corresponderende receptor ofwel de VEGF-receptor Traxler P.; Cancer Res. 15 juli 2004; 64(14):4931-41; of Stadler W.M. et al., Clin Cancer Res. 15 mei 2004; 10(10):3365-70).

25 Aangezien angiogenese en de groei van vasculatuur echter een zeer basis ontwerp en vitaal proces is in een willekeurig dier en bij de mens dient het effect van deze soort verbinding geconcentreerd te zijn op de bijzondere plaats waar angiogenese en vasculaire groei daadwerkelijk ongewenst is hetgeen het als target gebruiken of het afgeven een kritische zaak maakt in samenhang met deze soort therapeutische benade-30 ring.

Het is derhalve een doelstelling van de onderhavige uitvinding verdere middelen te verschaffen voor de behandeling van ziekten, waarbij ongewenste groei van vasculatuur en respectievelijk angiogenese betrokken zijn.

67

Met “klein interfererend DNA” (siRNA) wordt bedoeld een RNA-molecuul dat reduceert of verhindert de expressie van een gen/mRNA van zijn endogene cellulaire tegenpool. De term dient “RNA-interferentie” (RNAi) mede te omvatten. RNA-interferentie (RNAi) heeft betrekking op het proces van sequentiespecifïeke posttrans-5 criptionele genblokkering in zoogdieren, gemedieerd door kleine interfererende RNA’s (siRNA’s) (Fire et al., 1998. Nature 391, 806). Het overeenkomstige proces in planten wordt tevens aangeduid als specifieke posttranscriptionele genblokkering of RNA-blokkering en wordt tevens aangeduid met onderdrukking in fungi. De RNA-interfe-rentierespons kan een endonucleasecomplex omvatten dat een siRNA bevat, gewoon-10 lijk aangeduid met een RNA-geïnduceerd blokkerend complex (RISC), dat splitsing van een RNA met één enkele streng met een sequentie complementair aan de antisens streng van het siRNA-duplex, medieert. Splitsing van het target-RNA kan in het midden van het gebied complementair aan de antisens streng van het siRNA-duplex plaatsvinden (Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15, 188). Voor recente informatie op deze 15 termen en voorgestelde mechanismen zie Bernstein E., Denli A.M., Hannon G.J.: The rest is silence. RNA. november 2001; 7(11): 1509-21; en Nishikura K.: A short primer on RNAi: RNA-directed RNA polymerase acts as a key catalyst. Cell., 16 november 2001; 107(4):415-8. Voorbeelden van siRNA-moleculen die in de onderhavige uitvinding gebruikt kunnen worden zijn in de tabellen A-D gegeven.

20 Gedurende recente jaren is RNAi gebleken één van de meest efficiënte methoden voor inactivering van genen (Nature Reviews, 2002, v.3, blz. 737-47; Nature, 2002, v.418, blz. 244-51). Als methode is deze gebaseerd op het vermogen van dsRNA-species om een specifiek proteïnecomplex binnen te dringen waar deze dan getarget wordt op het complementaire cellulaire RNA en dit specifiek afbreekt. Meer 25 gedetailleerd, dsRNA’s worden gedigereerd in korte (17-29 basenparen) remmende RNA’s (siRNA’s) door middel van type III RNAsen (DICER, Drosha, enz.) (Nature, 2001, v,409, blz. 363-6; Nature, 2003, v.425, blz. 415-9). Deze fragmenten en complementair mRNA worden herkend door het specifieke RISC-proteïnecomplex. Het gehele proces is geculmineerd door endonucleasesplitsing van target-mRNA (Nature 30 Reviews, 2002, v.3, blz. 737-47; Curr Opin Mol Ther. juni 2003; 5(3):217-24).

Voor de beschrijving van op welke wijze siRNA te ontwerpen en te bereiden voor bekende genen, zie bijvoorbeeld Pei & Tuschl On the Art of Identifying Effective and Specific siRNAs Nature Methods 3 nr. 9, september 2006; Chalk A.M., 68

Wahlestedt C., Sonnhammer E.L., Improved and automated prediction of effective siRNA Biochem. Biophys. Res. Commun., 18 juni 2004; 319(l):264-74; Sioud M., Leirdal M., Potential design rules and enzymatic synthesis of siRNAs, Methods Mol Biol. 2004; 252:457-69; Levenkova N., Gu Q., Rux J.J.: Gene specific siRNA selector 5 Bioinformatics, 12 februari 2004; 20(3):430-2, en Ui-Tei K., Naito Y., Takahashi F., Haraguchi T., Ohki-Hamazaki H., Juni A., Ueda R., Saigo K., Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference Nucleic Acids Res., 9 februari 2004; 32(3):936-48. Zie tevens Liu Y., Braasch D.A., Nulf C.J., Corey D.R., Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene 10 expression by peptide nucleic acids Biochemistry, 24 februari 2004; 43(7):1921-7. Zie tevens PCT-publicaties WO 2004/015107 (Atugen) en WO 02/44321 (Tuschl et al.) en tevens Chiu Y.L., Rana T.M., siRNA function in RNAi: a chemical modification analysis, RNA september 2003; 9(9):1034-48 en Amerikaanse octrooischriften 5.898.031 en 6.107.094 (Crooke) voor de productie van gemodifïceerde/meer stabiele 15 siRNA’s.

Op DNA gebaseerde vectoren die in staat zijn tot genereren van siRNA binnen cellen zijn ontwikkeld. De methode omvat in het algemeen transcriptie van korte naaldvormige RNA’s die op efficiënte wijze verwerkt worden, waarbij siRNA’s binnen cellen gevormd worden. Paddison et al., PNAS 2002, 99:1443-1448; Paddison et 20 al., Genes % Dev 2002, 16:948-958; Sui et al., PNAS 2002, 8:5515-5520; en Brummelkamp et al., Science 2002, 296:550-553. Deze rapporten beschrijven methoden voor het genereren van siRNA’s die in staat zijn tot specifiek targetten van talrijke endogene en exogene tot expressie gebrachte genen.

Voor afgifte van siRNA’s, zie bijvoorbeeld Shen et al. (FEBS letters 539: 25 111-114 (2003)), Xia et al., Nature Biotechnology 20: 1006-1010 (2002), Reich et al.,

Molecular Vision 9: 210-216 (2003), Sorensen et al. (J.Mol.Biol. 327: 761-766 (2003), Lewis et al., Nature Genetics 32: 107-108 (2002) en Simeoni et al., Nucleic Acids Research 31, 11: 2717-2724 (2003). siRNA is recentelijk met succes toegepast voor de inhibitie in primaten; voor verdere details zie Tolentino et al., Retina 24(1), februari 30 2004, blz. 132-138.

siRNA’s van de onderhavige uitvinding 69

Algemene specificaties van siRNA’s van de onderhavige uitvinding

In het algemeen omvatten de siRNA’s die toegepast zijn in de onderhavige uitvinding een ribonucleïnezuur dat een structuur met een dubbele streng omvat waarbij 5 de structuur met een dubbele streng een eerste streng en een tweede streng omvat waarbij de eerste streng een eerste stukje van aan elkaar grenzende nucleotiden omvat en waarbij het eerste stukje ten minste tendele complementair is met een targetnucleï-nezuur en de tweede streng een tweede stukje omvat van aan elkaar grenzende nucleotiden en waarbij het tweede stukje ten minste tendele identiek is aan een targetnucleï-10 nezuur, waarbij de eerste streng en/of de tweede streng een aantal groepen van gemodificeerde nucleotiden met een modificatie op de 2'-positie omvat, waarbij binnen de streng elke groep van gemodificeerde nucleotiden aan één of aan beide zijden grenst aan een aangrenzende groep van nucleotiden, waarbij de aangrenzende nucleotide die de aangrenzende groep van nucleotiden vormt hetzij een niet gemodificeerd nucleotide 15 is, hetzij een nucleotide is met een modificatie die verschilt van de modificatie van de gemodificeerde nucleotiden. Verder kan de eerste streng en/of de tweede streng het aantal gemodificeerde nucleotiden omvatten en kan het aantal groepen van gemodificeerde nucleotiden omvatten.

De groep van gemodificeerde nucleotiden en/of de groep van aangrenzende 20 nucleotiden kunnen een aantal nucleotiden omvatten, waarbij het aantal gekozen is uit de groep bestaande uit één tot tien nucleotiden. In samenhang met een willekeurig gebied dat in de beschrijving gespecificeerd is dient men te begrijpen dat elk gebied elk afzonderlijk geheel getal openbaart tussen de respectievelijke getallen die gebruikt worden voor het definiëren van het gebied met inbegrip van twee getallen die het ge-25 bied definiëren. In het onderhavige geval omvat dus de groep één nucleotide, twee nucleotiden, drie nucleotiden, vier nucleotiden, vijf nucleotiden, zes nucleotiden, zeven nucleotiden, acht nucleotiden, negen nucleotiden en tien nucleotiden.

Het patroon van gemodificeerde nucleotiden van de eerste streng kan dezelfde zijn als het patroon van gemodificeerde nucleotiden van de tweede streng en kan 30 passen bij het patroon van de tweede streng. Bovendien kan het patroon van de eerste streng verschoven worden door één of meer nucleotiden geassocieerd met het patroon van de tweede streng.

70

De hierboven besproken modificaties kunnen gekozen worden uit de groep bestaande uit amino, fluor, methoxy, alkoxy en alkyl.

De structuur met twee strengen van het siRNA kan aan één of aan beide zijden bot zijn. Meer specifiek kan de structuur met een dubbele streng aan het einde 5 bot zijn op de structuurzijde met de dubbele streng die gedefinieerd is door het S-uiteinde van de eerste streng en het 3'-uiteinde van de tweede streng dan wel kan de structuur met een dubbele streng aan het einde bot zijn op de zijde van de structuur met een dubbele streng die gedefinieerd is aan het 3'-uiteinde van de eerste streng en de 5'-uiteinde van de tweede streng.

10 Bovendien kan ten minste één van de twee strengen een overhang/uitstekend stuk hebben van ten minste één nucleotide aan het 5 '-uiteinde; het overhangende stuk kan bestaan uit ten minste één deoxyribonucleotide. Ten minste één van de strengen kan tevens eventueel een overhangend stuk van ten minste één nucleotide aan het 3 '-uiteinde hebben.

15 De lengte van de structuur met een dubbele streng van het siRNA is gewoonlijk van ongeveer 17 tot 21 en meer bij voorkeur 18 of 19 basen. Verder kan de lengte van de eerste streng en/of de lengte van de tweede streng onafhankelijk van elkaar gekozen zijn uit de groep bestaande uit de gebieden van ongeveer 15 tot ongeveer 23 basen, 17 tot 21 basen en 18 of 19 basen.

20 Bovendien kan de complementariteit tussen de eerste streng en het target- nucleïnezuur perfect zijn of kan het duplex gevormd tussen de eerste streng en het tar-getnucleïnezuur ten minste 15 nucleotiden omvatten waarbij er één of twee niet-pas-sende stukken zijn tussen de eerste streng en het targetnucleïnezuur die de structuur met een dubbele streng vormen.

25 In enkele gevallen omvatten zowel de eerste streng als de tweede streng ten minste één groep van gemodificeerde nucleotiden en ten minste één aangrenzende groep van nucleotiden, waarbij elke groep van gemodificeerde nucleotiden ten minste één nucleotide omvat en waarbij elke aangrenzende groep van nucleotiden ten minste één nucleotide omvat, waarbij elke groep van gemodificeerde nucleotiden van de eerste 30 streng op één lijn ligt met een aangrenzende groep van nucleotiden van de tweede streng, waarbij het meest terminale S'-nucleotide van de eerste streng een nucleotide-groep van gemodificeerde nucleotiden is en het meest terminale 3 '-nucleotide van de tweede streng een nucleotide van de aangrenzende groep van nucleotiden is. Elke groep 71 van gemodificeerde nucleotiden kan uit één enkel nucleotide bestaan en/of kan elke aangrenzende groep van nucleotiden uit één enkel nucleotide bestaan.

Bovendien is het mogelijk dat op de eerste streng het nucleotide dat de aangrenzende groep van nucleotiden vormt een niet-gemodifïceerd nucleotide is dat opge-5 steld is in een 3 -richting ten opzichte van het nucleotide dat de groep van gemodificeerde nucleotiden vormt en op de tweede streng het nucleotide dat de groep van gemodificeerde nucleotiden vormt een gemodificeerd nucleotide is dat in de 5'-richting ten opzichte van het nucleotide dat de aangrenzende groep van nucleotiden vormt, is opgesteld.

10 Verder kan de eerste streng van het siRNA acht tot twaalf, bij voorkeur negen tot elf groepen van gemodificeerde nucleotiden omvatten en de tweede streng kan zeven tot elf, bij voorkeur acht tot tien groepen van gemodificeerde nucleotiden omvatten.

De eerste streng en de tweede streng kunnen verbonden zijn via een loop-15 structuur die een niet-nucleïnezuurpolymeer, zoals onder andere polyethyleenglycol, kan omvatten. Op een andere wijze kan de loopstructuur een nucleïnezuur omvatten.

Verder kan het 5-terminus van de eerste streng van het siRNA verbonden zijn met het 3-terminus van de tweede streng dan wel kan het 3-uiteinde van de eerste streng verbonden zijn met het 5'-terminus van de tweede streng, waarbij de verbinding 20 loopt via een “nucleïnezuurlinker” die gewoonlijk een lengte heeft tussen 10-2000 nu-cleobasen.

Bijzondere specificaties van siRNA’s van de onderhavige uitvinding

De uitvinding verschaft een verbinding met de structuur (structuur A): 25 5' (N)x - Z 3' (antisens streng) 3' Z '-(N ')y5' (sens streng) waarbij elke N en N' een ribonucleotide is die al dan niet gemodificeerd kan zijn in zijn suikerrest en (N)x en (N')y een oligomeer is 30 waarbij elke achtereenvolgende N of N' verbonden is met de vol gende N of N' via een covalente binding; waarbij elke x en y een geheel getal tussen 19 en 40 is; 72 waarbij elke van de groepen Z en Z' aanwezig of afwezig kan zijn, maar indien aanwezig dTdT kan zijn en covalent verbonden kan zijn aan het 3'-terminus van de streng, waarin deze aanwezig is; 5 en waarbij de sequentie van (N)x een complementaire sequentie met betrekking tot cDNA van het RTP801-gen omvat.

In het bijzonder verschaft de onderhavige uitvinding de bovenstaande 10 verbinding, waarbij de sequentie van (N)x één of meer van de antisens sequenties aanwezig in de tabellen A, B, C en D, in het bijzonder tabel D omvat.

In het bijzonder verschaft de uitvinding de bovenstaande verbinding, waarbij de covalente binding een fosfodiesterbinding is, waarbij x = y, bij voorkeur waarin x = y = 19, waarbij Z en Z' beide afwezig zijn, waarbij ten minste één ribonucleotide 15 gemodificeerd is in zijn suikergroep op de 2'-positie, waarbij de groep op de 2'-positie methoxy (2-O-methyl) is, waarin alternerende ribonucleotiden gemodificeerd zijn in zowel de antisens als de sens strengen en waarbij de ribonucleotiden op de 5'- en 3 '-termini van de antisens streng gemodificeerd zijn in hun suikergroepen, en de ribonucleotiden op de 5'- en 3-termini van de sens streng gemodificeerd zijn in hun sui-20 kergroepen.

In het bijzonder is het siRNA, gebruikt in de onderhavige uitvinding een oligoribonucleotide, waarbij één streng achtereenvolgende nucleotiden omvat met, van 5' naar 3' de sequentie weergegeven in SEQ ID NOS: 3-52 of in SEQ ID NOS: 103-174 of in SEQ ID NOS: 247-295 of in SEQ ID NOS: 345-440 (welke sens strengen 25 zijn) heeft, waarbij een aantal van de basen gemodificeerd kan zijn, bij voorkeur door een 2-O-methylmodificatie, dan wel een homoloog hiervan, waarin ten hoogste 2 van de nucleotiden in elk terminaal gebied een base veranderd is.

Verder verschaft de onderhavige uitvinding een methode voor de behandeling van een patiënt die aan een ademhalingsziekte, een oogziekte, een microvasculaire 30 ziekte, een gehoorziekte, drukzweren of andere met bedlegerigheid geassocieerde huidwonden of een ruggenmergletsel of ziekte die het toedienen aan de patiënt van een farmaceutische samenstelling die een verbinding van bovenstaande structuur (A) (met één van de hierboven vermelde specifieke kenmerken) in een therapeutisch werkzame 73 hoeveelheid omvat, waardoor de patiënt hiermee behandeld wordt. Bovendien verschaft de uitvinding de toepassing van een therapeutisch werkzame hoeveelheid van bovenstaande structuur (A) (die één of meer van de bovenstaande specifieke kenmerken heeft) voor de bereiding van een geneesmiddel voor het bevorderen van het herstel in 5 een patiënt die aan een ademhalingsstoomis, een oogziekte, een microvasculaire stoornis, een gehoorstoomis, drukzweren of andere met bedlegerigheid geassocieerde huid-wonden of ruggenmergletsel of ziekte.

Een additioneel aspect van de onderhavige uitvinding verschaft een farmaceutische samenstelling die een verbinding van bovenstaande structuur (A) omvat 10 voor de behandeling van één of meer van de ziekten en ziektetoestanden die in de beschrijving vermeld zijn.

Verder verschaft dit aspect een farmaceutische samenstelling die twee of meer verbindingen van bovenstaande structuur (A) omvat voor de behandeling van één of meer van de ziekten en ziektetoestanden die in de beschrijving vermeld zijn, waarbij 15 de twee verbindingen fysisch met elkaar in de farmaceutische samenstelling gemengd zijn in hoeveelheden die gelijke activiteiten genereren dan wel op een andere wijze een voordelige activiteit vertonen of al dan niet covalent gebonden kunnen zijn dan wel met elkaar verbonden zijn via een nucleïnezuurlinker met een lengte variërende van 2-100, bij voorkeur 2-50 of 2-30 nucleotiden. Deze siRNA-moleculen omvatten derhalve een 20 nucleïnezuurstructuur met een dubbele streng, zoals in de beschrijving beschreven is, waarbij twee siRNA-sequenties gekozen zijn uit de tabellen A-D en bij voorkeur uit de tabel A, ID nrs.: 14,22,23, 25, 27, 39, 41,42,49 en 50 of siRNA nrs.: 257,260-262 en 264-268 van tabel D zijn al dan niet covalent gebonden dan wel verbonden met een linker, waarbij een tandem-siRNA-molecuul wordt gevormd. Deze tandem-siRNA-25 moleculen die twee siRNA-sequenties omvatten zouden typisch 38-150 nucleotiden in lengte, meer bij voorkeur 38 of 40-60 nucleotiden in lengte, en dienovereenkomstig langer zijn indien meer dan twee siRNA-sequenties in het tandemmolecuul opgenomen zijn. Een langer tandemmolecuul die twee of meer langere sequenties omvat welke siRNA coderen, geproduceerd via inwendig cellulair processing, bijvoorbeeld lange 30 dsRNA’s, komt eveneens in aanmerking, evenals een tandemmolecuul coderende voor twee of meer shRNA’s. Dergelijke tandemmoleculen worden eveneens beschouwd als onderdeel van de onderhavige uitvinding en verdere informatie daarover wordt hieronder gegeven.

74

De gecombineerde of tandemstructuren hebben het voordeel dat toxiciteit en/of off-targeteffecten van elke siRNA geminimaliseerd zijn, terwijl de doeltreffendheid verhoogd wordt.

In het bijzonder is het in de voorbeelden toegepaste siRNA zodanig 5 gemodificeerd dat een 2'-0-Me-groep aanwezig was op de eerste, derde, vijfde, zevende, negende, elfde, dertiende, vijftiende, zeventiende en negentiende nucleotide van de antisens streng, waarbij dezelfde modificatie ofwel een 2 -O-Me-groep aanwezig was in de tweede, vierde, zesde, achtste, tiende, twaalfde, viertiende, zestiende en achttiende nucleotide van de sens streng. Bovendien dient opgemerkt te worden dat in het 10 geval van deze bijzondere nucleïnezuren volgens de uitvinding het eerste stuk identiek is met de eerste streng en het tweede stuk identiek is met de tweede streng en deze nucleïnezuren zijn aan de uiteinden afgestompt. Het gebruikte siRNA was gefosforyleerd, maar beschouwd wordt dat een niet-gefosforyleerde versie eenvoudiger kan zijn om te bereiden op grote schaal en het niet-gefosforyleerde REDD-14, genoemd REDD-14NP, 15 werd bevonden als even biologisch actief als REDD-14 in een CNV-model (zie voorbeeld 6). De sequentie van dit in de experimenten in de voorbeelden 6-8 toegepaste siRNA is dat van REDD-14, ofwel de sequentie met een inwendig referentienr. 14 (zie tabel A). De in de experimenten in voorbeeld 14 toegepaste siRNA’s worden 801_1 en 8014 genoemd; 8011 heeft een intem referentienummer 257 in tabel D (SEQ ID NO: 20 429 [sens] en 525 [antisens]) en 801 _4 heeft een intem referentienummer 260 in tabel D (SEQ ID NO: 432 [sens] en 528 [antisens]) (zie tabel D).

Deze sRNA’s kunnen eveneens al dan niet gefosforyleerd zijn.

Het terminale gebied van het oligonucleotide heeft betrekking op basen 1-4 en/of 16-19 in de 19-mer-sequenties (tabellen A, B en D hieronder) en op basen 1-4 25 en/of 18-21 in de 21 -mer-sequenties (tabel C hieronder).

Bovendien zijn de in de onderhavige uitvinding toegepaste siRNA’ s oligoribonucleoti-den, waarbij één streng achtereenvolgende nucleotiden omvat met, van 5' naar 3', de sequenties weergegeven in SEQ ID NOS: 53-102 of SEQ ID NOS: 175-246 of SEQ ID NOS: 296-344 of SEQ ID NOS:441-536 (antisens strengen) of een homoloog hiervan 30 hebben, waarin ten hoogste 2 van de nucleotiden in elk terminaal gebied een base veranderd is.

Dus in bepaalde aspecten omvat het oligonucleotide een structuur met een dubbele streng, waarbij deze structuur met een dubbele streng een eerste streng en een tweede 75 streng omvat, waarbij de eerste streng een eerste stukje van achtereenvolgende nucleo-tiden omvat en de tweede streng een tweede stuk van aangrenzende nucleotiden omvat, waarbij het eerste stukje hetzij complementair, hetzij identiek is met een nucleïnezuur-sequentie coderende voor het RTP801-gen en waarbij het tweede stuk identiek is of 5 complementair met een nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801. Het eerste stuk omvat ten minste 14 nucleotiden, bij voorkeur ten minste 18 nucleotiden en zelfs meer bij voorkeur 19 nucleotiden of zelfs ten minste 21 nucleotiden. In een uitvoeringsvorm omvat het eerste stuk van ongeveer 14 tot 40 nucleotiden bij voorkeur ongeveer 18 tot 30 nucleotiden, meer bij voorkeur van ongeveer 19 tot 27 nucleotiden en het meest bij 10 voorkeur van ongeveer 19 tot 23 nucleotiden. In een uitvoeringsvorm omvat het tweede stuk van ongeveer 14 tot 40 nucleotiden bij voorkeur ongeveer 18 tot 30 nucleotiden, meer bij voorkeur van ongeveer 19 tot 27 nucleotiden en het meest bij voorkeur van ongeveer 19 tot 23 nucleotiden of zelfs ongeveer 19 tot 21 nucleotiden. In een uitvoeringsvorm correspondeert het eerste nucleotide van het eerste stuk met een nucleotide 15 van de nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801, waarbij het laatste nucleotide van het eerste stuk correspondeert met een nucleotide van de nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801. In een uitvoeringsvorm omvat het eerste stuk een sequentie van ten minste 14 aangrenzende nucleotiden van een oligonucleotide, waarbij dit oligonucleotide gekozen is uit de groep bestaande uit SEQ ID NOS: 3-536, bij voorkeur uit 20 de groep bestaande uit de oligoribonucleotiden met de sequentie van één of meer van de serienummers 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 en 50 in tabel A of 260-262 en 264-268 in tabel D. Verdere specificaties van de siRNA-moleculen die in de onderhavige uitvinding worden gebruikt kunnen een oligonucleotide verschaffen, waarbij het dinucleotide dTdT covalent verbonden is met het 3'-terminus, en/of in ten minste één 25 nucleotide een suikergroep gemodificeerd is, mogelijkerwijze met een modificatie die een 2'-0-methylmodificatie omvat. Verder kan de 2'-OH-groep vervangen zijn door een groep of rest gekozen uit de groep bestaande uit -H-OCH3, -OCH2CH3, -OCH2CH2CH3, -NH2 en F. Verder kunnen de voorkeurverbindingen van de onderhavige uitvinding, zoals zij hierboven beschreven zijn al dan niet gefosforyleerd zijn.

30 Bovendien kan het in de onderhavige uitvinding gebruikte siRNA een oli gonucleotide zijn, waarin in de alternerende nucleotiden gemodificeerde suikers op beide strengen gelokaliseerd zijn. In het bijzonder kan het oligoribonucleotide één van de sens strengen omvatten, waarin het suiker gemodificeerd is in de terminale 5'- en 3'- 76 nucleotiden of één van de antisens strengen, waarin het suiker in de terminale 5en 3 '-nucleotiden gemodificeerd is.

Verder omvatten verdere in de uitvinding toe te passen nuclemezuren ten minste 14 aangrenzende nucleotiden van één van de SEQ ID NOS: 3 tot 536 en meer 5 bij voorkeur 14 aangrenzende nucleotidebasenparen aan elk willekeurig uiteinde van de structuur met een dubbele streng die het eerste stuk en het tweede stuk, zoals hierboven beschreven omvat. De deskundige zal duidelijk zijn dat gegeven de potentiële lengte van het nucleïnezuur volgens de uitvinding en in het bijzonder van de afzonderlijke stukken die dit nucleïnezuur volgens de uitvinding vormen, enige verschuivingen met 10 betrekking tot de coderende sequentie van het RTP801-gen, zoals gedetailleerd in SEQ ID NO: 1 aan elke zijde mogelijk is, waarbij deze verschuivingen ten hoogste 1, 2, 3, 4, 5 en 6 nucleotiden in beide richtingen kunnen zijn en waarbij de aldus gegenereerde nucleïnezuurmoleculen als dubbele streng eveneens binnen de onderhavige uitvinding zullen vallen.

15 Een additioneel aspect van de onderhavige uitvinding heeft betrekking op een functioneel nucleïnezuur dat een structuur met een dubbele streng omvat, waarbij deze structuur met een dubbele streng omvat: een eerste streng en een tweede streng, waarbij 20 de eerste streng een eerste stuk van aangrenzende nucleotiden omvat en de tweede streng een tweede stuk van aangrenzende nucleotiden omvat, waarbij 25 het eerste stuk hetzij complementair, hetzij identiek is met een nucleïne- zuursequentie coderende voor RTP801 en waarbij het tweede stuk hetzij identiek, hetzij complementair is met een nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801.

30 In een uitvoeringsvorm downreguleert het nucleïnezuur RTP801, waarbij het downreguleren van RTP801 gekozen is uit de groep bestaande uit het downregule-ren van de RTP801-functie, het downreguleren van de RTP801 -proteïne en het downreguleren van de RTP801-mRNA-expressie.

77

In een uitvoeringsvorm omvat het eerste stuk ten minste 14 nucleotiden, bij voorkeur ten minste 18 nucleotiden en zelfs nog meer bij voorkeur 19 nucleotiden.

In een uitvoeringsvorm omvat het eerste stuk van ongeveer 14 tot 40 nucleotiden, bij voorkeur ongeveer 18 tot 30 nucleotiden, meer bij voorkeur van onge-5 veer 19 tot 27 nucleotiden en het meest bij voorkeur van ongeveer 19 tot 23 nucleotiden.

In een uitvoeringsvorm omvat het tweede stuk van ongeveer 14 tot 40 nucleotiden, bij voorkeur ongeveer 18 tot 30 nucleotiden, nog meer bij voorkeur van ongeveer 19 tot 27 nucleotiden en het meest bij voorkeur van ongeveer 19 tot 23 nucle-10 otiden.

In een uitvoeringsvorm correspondeert het eerste nucleotide van het eerste stuk met een nucleotide van de nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801, waarbij het laatste nucleotide van het eerste stuk correspondeert met een nucleotide van de nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801.

15 In een uitvoeringsvorm omvat één stuk een sequentie van ten minste 14 aangrenzende nucleotiden met een nucleïnezuursequentie, waarbij deze nucleïnezuursequentie gekozen is uit de sequenties beschreven in tabellen A-D, bij voorkeur uit de groep omvattende SEQ ID NOS: 53, 66, 6, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 91, 92, 93, 94, 96, 101, 102, 525, 529, 530, 532, 533, 534, 535 en 536, meer bij voorkeur gekozen uit de 20 groep omvattende SEQ ID NOS: 66, 75, 79, 91, 94, 101, 102, 525 en 528, en het meest bij voorkeur gekozen uit de groep omvattende SEQ ID NOS: 66, 74, 75, 79, 525 en 528.

In een uitvoeringsvorm omvat het andere stuk een sequentie van ten minste 14 aangrenzende nucleotiden van een nucleïnezuursequentie, waarbij deze nucleïne-25 zuursequentie gekozen is uit de sequenties weergegeven in tabellen A-D, bij voorkeur uit de groep omvattende SEQ ID NOS: 3, 16, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 51, 52, 429, 432, 433,434,436, 437, 438, 439 en 440, meer bij voorkeur gekozen uit de groep omvattende SEQ ID NOS: 16, 24, 25, 29, 41, 44, 51 en 52 en het meest bij voorkeur gekozen uit de groep omvattende SEQ ID NOS: 16,24,25 en 29.

30 In een uitvoeringsvorm heeft het eerste stuk een sequentie volgens SEQ ID NO: 53 en het tweede stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 3; 78 het eerste stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 66 en het tweede stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 16; het eerste stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 67 en het tweede stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 17; 5 het eerste stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 72 en het tweede stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 22; het eerste stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 73 en het tweede stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 23; het eerste stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 74 en het 10 tweede stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 24; het eerste stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 75 en het tweede stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 25; het eerste stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 76 en het tweede stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 26; 15 het eerste stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 77 en het tweede stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 27; het eerste stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 79 en het tweede stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 29; het eerste stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 91 en het 20 tweede stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 41; het eerste stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 92 en het tweede stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 42; het eerste stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 93 en het tweede stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 43; 25 het eerste stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 94 en het tweede stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 44; het eerste stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 95 en het tweede stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 45; het eerste stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 96 en het 30 tweede stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 46; het eerste stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 101 en het tweede stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 51; en 79 het eerste stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 102 en het tweede stuk heeft een sequentie volgens SEQ ID NO: 52.

In een uitvoeringsvorm heeft het eerste stuk ene nucleïnezuursequentie die 5 gekozen is uit de groep omvattende SEQ ID NO: 53, 66, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 79, 91, 92,93,94,95, 96, 101, 102, 525, 528, 529, 530, 532, 533,534, 535 en 536.

Begrepen dient te worden dat hoewel de termen “eerste” en “tweede” stuk gebruikt worden in samenhang met de nucleïnezuren volgens de uitvinding, worden zij gebruikt slechts voor het gemak en elk willekeurig nucleïnezuurmolecuul volgens de 10 uitvinding dat beschreven is als hebbende een eerste stuk met de sequentie X en een tweede stuk met de sequentie Y eveneens beschreven zou kunnen worden als hebbende een eerste stuk met de sequentie Y en een tweede stuk met de sequentie X, vooropgesteld dat begrepen wordt dat één stuk opgenomen in de antisens streng, die antisens dient te zijn ten opzichte van een deel van de coderende sequentie van het RTP801-gen, 15 en het andere stuk opgenomen is in de sens streng die complementair moet zijn (ofschoon niet voor 100% complementair) met de antisens streng, alles volgens de definities en specificaties die in de beschrijving voorgesteld zijn.

In een eerste uitvoeringsvorm omvat de eerste en/of de tweede streng ten minste één overlapnucleotide aan het 3 -uiteinde dat complementair is met of identiek 20 is aan het corresponderende nucleotide van een nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801.

In een eerste uitvoeringsvorm omvat de eerste en/of de tweede streng 1 tot 15 overlapnucleotiden aan het 3 -uiteinde, bij voorkeur omvat de eerste en/of de tweede streng 1 tot 10 overlapnucleotiden aan het 3'-uiteinde en meer bij voorkeur omvat de 25 eerste en/of de tweede streng 1 tot 5 overlapnucleotiden aan het 3'-uiteinde, en het meest bij voorkeur omvat de eerste en/of de tweede streng 1 tot 2 overlap (overhang) nucleotiden aan het 3 '-uiteinde.

In een uitvoeringsvorm omvat de eerste streng en/of de tweede streng ten minste één overhangnucleotide dat verschilt van het corresponderende nucleotide van 30 de nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801.

In een eerste uitvoeringsvorm omvat de eerste streng twee overhangnucleotiden die verschillen van het corresponderende nucleotide van een nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801.

80

In een eerste uitvoeringsvorm bestaat de eerste streng uit slechts het eerste stuk.

In een uitvoeringsvorm bestaat de tweede streng uit slechts het tweede stuk.

In een uitvoeringsvorm omvat(ten) het eerste stuk en/of de eerste streng 5 ribonucleotiden.

In een uitvoeringsvorm omvat(ten) het tweede stuk en/of de tweede streng ribonucleotiden.

In een uitvoeringsvorm bestaat het eerste stuk en/of de tweede streng uit ribonucleotiden.

10 In een uitvoeringsvorm worden enkele of alle nucleotiden gemodificeerd.

In een geprefereerde uitvoeringsvorm is deze modificatie gerelateerd aan de nucleobasegroep van het nucleotide, aan de suikergroep van het nucleotide en/of de fosfaatgroep van het nucleotide.

In een meer geprefereerde uitvoeringsvorm is de modificatie een modifica-15 tie van een suikergroep en de modificatie is een modificatie aan de 2'-positie, waarbij de 2'-OH-groep vervangen is door een groep of rest die gekozen is uit de groep bestaande uit -H-OCH3, -OCH2CH3, -OCH2CH2CH3, -NH2 en -F.

In een uitvoeringsvorm van de modificatie is een modificatie van de nucleobasegroep en de modificatie of de gemodificeerde nucleobase gekozen uit de 20 groep omvattende inosine, xanthine, hypoxanthine, 2-aminoadenine, 6-methyl, 2-pro-pyl en andere alkyladeninen, 5-halogeenuracil, 5-halogeencytosine, 5-halogeencyto-sine, 6-azacytosine, 6-azethymine, pseudo-uracil, 4-thiouracil, 8-halogeenadenine, 8-aminodenine, 8-thioladenine, 8-thiolalkyladeninen, 8-hydroxyladenine en andere 8-gesubstitueerde adeninen, 8-halogeenguaninen, 8-aminoguanine, 8-thiolguanine, 8-25 thioalkylguanine, 8-hydroxylguanine en andere gesubstitueerde guaninen, andere aza- en deaza-adeninen, andere aza- en deazaguaninen, 5-trifluormethyluracil en 5-trifluor-cytosine.

In een uitvoeringsvorm is de modificatie een modificatie van de fosfaatgroep, waarbij de gemodificeerde fosfaatgroep gekozen is uit de groep die fosfothioaat 30 omvat.

In een uitvoeringsvorm omvat het eerste stuk en/of het tweede stuk een aantal groepen van gemodificeerde nucleotiden met een modificatie op de 2'-positie, waarbij binnen het stuk elke groep van gemodificeerde nucleotiden geflankeerd is aan 81 één of aan beide zijden door een aangrenzende groep van nucleotiden, waarbij de aangrenzende nucleotiden die de aangrenzende groep van nucleotiden vormt hetzij een niet-gemodificeerd nucleotide, hetzij een nucleotide met een modificatie die verschilt van de modificatie van de gemodificeerde nucleotiden zijn.

5 In een geprefereerde uitvoeringsvorm bestaat het eerste stuk en/of het tweede stuk uit ribonucleotiden.

In een meer geprefereerde uitvoeringsvorm omvat het eerste en het tweede stuk een aantal groepen van gemodificeerde nucleotiden.

In een uitvoeringsvorm omvat het eerste stuk een aantal groepen van 10 gemodi ficeerde nucleotiden.

In een uitvoeringsvorm omvat het tweede stuk de veelheid groepen van gemodificeerde nucleotiden.

In een uitvoeringsvorm omvat elke groep van gemodificeerde nucleotiden en/of elke groep van aangrenzende nucleotiden een aantal nucleotiden, waarbij het 15 aantal gekozen is uit de groep die één nucleotide tot tien nucleotiden omvat.

In een uitvoeringsvorm omvat het eerste stuk een eerste patroon van gemodificeerde nucleotiden en het tweede stuk omvat een tweede patroon van gemodificeerde nucleotiden.

In een uitvoeringsvorm is het eerste patroon hetzelfde patroon als het 20 tweede patroon.

In een andere uitvoeringsvorm ligt het eerste patroon in dezelfde richting als het tweede patroon.

In een voorkeursuitvoeringsvorm is het eerste patroon verschoven door één of meer nucleotiden ten opzichte van het tweede patroon.

25 In een uitvoeringsvorm bestaat elke van de groepen gemodificeerde nucleotiden uit één gemodificeerd nucleotide en elke van de groep van aangrenzende nucleotiden bestaat uit één niet-gemodificeerd nucleotide of een nucleotide met een modificatie die verschilt van de modificatie van de gemodificeerde nucleotiden.

In een voorkeursuitvoeringsvorm heeft het gemodificeerde nucleotide een -30 OMe-groep aan de 2-positie.

In een voorkeursuitvoeringsvorm is het aangrenzende nucleotide een ribonucleotide dat een 2'-OH-groep heeft.

82

In een uitvoeringsvorm begint het eerste stuk met een gemodificeerd nucleotide aan het 5 '-uiteinde en elk ander nucleotide van het stuk is tevens een gemodificeerd nucleotide, terwijl een tweede nucleotide beginnende met het 5'-uiteinde en elk ander nucleotide een niet-gemodificeerd nucleotide is of een nucleotide met een 5 modificatie die verschilt van de modificatie van één of meer gemodificeerde nucleoti-den.

In een uitvoeringsvorm is het eerste stuk een antisens oriëntering ten opzichte van de nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801.

Een ander aspect van de onderhavige uitvinding gerelateerd aan een farma-10 ceutische samenstelling die een nucleïnezuur volgens het eerste aspect van de onderhavige uitvinding en/of een vector volgens het tweede aspect van de onderhavige uitvinding en bij voorkeur een farmaceutisch aanvaardbare drager omvat; deze samenstelling is eventueel bestemd voor systemische of voor lokale toediening.

In een uitvoeringsvorm is de samenstelling voor de behandeling van een 15 ziekte, waarbij de ziekte gekozen is uit de groep die tumorziekten omvat.

In een ander aspect wordt het aan de onderhavige uitvinding ten grondslag liggende probleem opgelost door een methode voor de preventie en/of behandeling van een patiënt die behoefte heeft aan deze preventie en/of behandeling, welke omvat de toediening van een nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding en/of een vector 20 volgens de onderhavige uitvinding en/of een farmaceutische samenstelling volgens de onderhavige uitvinding.

In een verdere uitvoeringsvorm worden een nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding en/of een vector volgens de onderhavige uitvinding gebruikt voor de productie van een geneesmiddel. Het geneesmiddel kan zijn voor de preventie 25 en/of de behandeling van een ziekte, waarbij deze ziekte gekozen is uit de groep die tumorziekten omvat. De tumorziekte kan gekozen zijn uit de groep die vaste tumoren, metastatische tumoren, waaronder PTEN-negatieve tumoren, tumoren die geneesmid-delresistent zijn en tumoren waarbij RTP801-inhibitie kan worden gebruikt voor het sensibiliseren. Verder kan de tumorziekte een tumorziekte in een laat stadium zijn dan 30 wel kan deze cellen omvatten die tumorsuppressomegatief zijn; waarbij de tumorsup-pressor PTEN kan zijn.

Een verder aspect van de onderhavige uitvinding wordt opgelost door mid del van een methode voor het ontwerpen of screenen van een nucleïnezuur dat geschikt is voor het downreguleren van RTP801, welke methode de volgende stappen omvat: 83 5 a) het ontwerpen of screenen van een nucleïnezuur dat geschikt is voor het downreguleren van RTP801; b) het beoordelen van een defect van een nucleïnezuur volgens één of meer van de bovenstaande aspecten van de onderhavige uitvinding; 10 en c) het vergelijken van het effect van het nucleïnezuur van trap a) met het effect van het nucleïnezuur van trap b).

15 In een uitvoeringsvorm is het effect het downreguleren van RTP801.

Een additioneel aspect van de onderhavige uitvinding is de toepassing van een nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding als sensibiliseermiddel, in het bijzonder als sensibiliseermiddel bij de behandeling van een ziekte waarbij deze ziekte bij voorkeur gekozen is uit de groep die tumor en meer bijzonder tumoren die resistent zijn 20 tegen een behandeling onder toepassing van chemotherapeutica en/of radiotherapeutica, omvat. Additionele ziekten waarvoor een nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding als sensibiliseermiddel kan dienen, zijn in de beschrijving geopenbaard.

De onderhavige aanvrage openbaart dat een nucleïnezuur dat een structuur met een dubbele streng omvat die specifiek is voor RTP801 een geschikt middel is voor 25 het remmen van angiogenese/groei van vasculatuur en vasculair lekken (zowel uit de bestaande vasculatuur als vanuit groeiende vasculatuur). Verder beschrijft de onderhavige aanvrage (zonder aan enige theorie gebonden te willen zijn) dat RTP801 aangezien dit gen een stressinduceerbare proteïne is (geïnduceerd door hypoxia, oxidatieve stress, thermische stress, ER-stress) een factor is die als functie heeft het nuanceren van 30 de celrespons op een energieonbalans. Deze inhibitie van RTP801 door middel van dit nucleïnezuur met een dubbele streng is geschikt voor de behandeling van elke ziekte waarbij cellen gered moeten worden van apoptose te wijten aan stressvolle omstandigheden bijvoorbeeld ziekten die vergezeld gaan met de dood van normale cellen) dan 84 wel waarbij cellen aangepast aan stressvolle omstandigheden te wijten aan veranderingen in RTP801 -expressie gedood dienen te worden (bijvoorbeeld tumorcellen). In het laatste geval wordt na remmen van RTP801 via dit nucleïnezuur met een dubbele streng, deze overlevingsfactor met anti-apoptotische functie in hypoxische cellen, meer 5 in het bijzonder in hypoxische kankercellen, onwerkzaam gemaakt waardoor de cellen vrij van door RTP801 gemedieerde bescherming tot apoptose gebracht kunnen worden. Dit kan bovendien optreden wanneer andere apoptose bevorderende factoren aanwezig zijn. Deze andere apoptose bevorderende factoren omvatten onder andere chemotherapie en radiotherapie. Met andere woorden, kan het nucleïnezuur met een dubbele streng 10 volgens de onderhavige uitvinding werkzaam zijn alleen in kankerbehandeling (mono-therapie) en tevens als supplementaire therapie.

Deze structuur met een dubbele streng omvat een eerste streng en een tweede streng, waarbij de eerste streng een eerste stuk van aangrenzende nucleotiden omvat en de tweede streng een tweede stuk van aangrenzende nucleotiden omvat, 15 waarbij het eerste stuk hetzij complementair is, hetzij identiek aan een nucleïnezuur-sequentie coderende voor RTP801 en waarbij het tweede stuk hetzij identiek, hetzij complementair is aan een nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801. Door in het bijzonder RTP801 als target te gebruiken voor dit soort nucleïnezuur met een dubbele streng is het dus tevens mogelijk om onmiddellijk een target in de betrokken cascade in 20 de groei en ontwikkeling van vasculatuur en respectievelijk angiogenese te behandelen en dus geschiedt dit op een wijze die verschillend is vergeleken met het door VEGF-inhibitoren, zoals VEGF-antilichamen, gebruikte pad. Zonder aan enige theorie gebonden te willen zijn veronderstellen de uitvinders van de onderhavige uitvinding dat het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding zijn functie kan uitoefenen in die cel-25 len welke een achtergrond verschaffen die betrokken is bij of waargenomen is in samenhang met één of andere ziekte, waarbij ongewenste, in het bijzonder door hypoxie geïnduceerde angiogenese en/of groei of ontwikkeling van vasculatuur optreedt. Dit begrip wordt ondersteund door de bevinding dat RTP801-knock-outmuizen geen fenotype vertonen dat verschilt van wilde typen muizen onder niet-hypoxische omstandig-30 heden. Na inductie van hypoxie, zoals waargenomen in een ziektetoestand, zoals bijvoorbeeld tumorgroei, resulteert de RTP801-geassocieerde knock-out in een pathologie die vergelijkbaar is met die van één waargenomen bij de mens die aan dit soort ziekte lijdt.

85

Men dient te begrijpen dat het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding bij voorkeur een functioneel nucleïnezuur is. Zoals in de beschrijving wordt gebruikt betekent de term functioneel nucleïnezuur bij voorkeur een nucleïnezuur waarvan de functie verschilt van activiteit als template in de cel voor de transcriptie van één 5 of ander hnRNA, mRNA of elk ander transcriptieproduct, waarbij hetzij het hnRNA, mRNA of elk ander transcriptieproduct dan wel het nucleïnezuur volgens de uitvinding onderworpen wordt aan een translatieproces, bij voorkeur een cellulair translatieproces resulterende in een biologisch actief RTP801-proteïne. Erkend dient te worden dat een functioneel nucleïnezuur, zoals hier toegepast wordt, in staat is tot het reduceren van de 10 expressie van een targetnucleïnezuur. Meer bij voorkeur is de reductie gebaseerd op een posttranscriptioneel gen-inactiveringsproces van het targetnucleïnezuur. Zelfs meer bij voorkeur is deze reductie gebaseerd op RNA-interferentie. Een zeer geprefereerde vorm van het functionele nucleïnezuur is een siRNA-moIecuul of elk ander molecuul met hetzelfde effect als een siRNA-molecuul. Dit andere molecuul wordt gekozen uit 15 de groep omvattende siRNA’s, synthetische siRNA’s, shRNA’s en synthetische shRNA’s. Zoals in de beschrijving wordt toegepast kunnen siRNA’s verder een expressievector omvatten die afgeleid is van siRNA’s, waarbij de expressievector in een voorkeursuitvoeringsvorm een virus is, zoals bijvoorbeeld adenovirussen, adenogeassocieerde virussen, herpesvirussen en lentivirussen. Zoals gebezigd wordt in 20 de beschrijving betekent shRNA bij voorkeur korte haarspeld-RNA’s. Dit shRNA kan synthetisch geproduceerd worden dan wel worden gegenereerd onder toepassing van vectorgecodeerde expressiesystemen, bij voorkeur onder toepassing van RNA-poly-merase III-promotoren. In samenhang hiermee dient erkend te worden dat het functionele zuur volgens de onderhavige uitvinding gericht is op RTP801 waarnaar in de be-25 schrijving verwezen wordt als de target en het nucleïnezuur coderende voor de target als het targetnucleïnezuur.

Zoals bij voorkeur in de beschrijving wordt gebezigd omvat de structuur met een dubbele streng van het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding elke structuur met een dubbele streng waarbij deze structuur met een dubbele streng bij 30 voorkeur gegenereerd wordt door het eerste stuk en het tweede stuk verschaft door het nucleïnezuur dat het basisontwerp heeft. De dubbelstrengstructuur kan één of verscheidene niet-passende stukken hebben. Deze structuur met een dubbele streng wordt gevormd door Watson-Crick-basenparen en/of Hoogsteen-basenparen en/of vergelijkbare 86 basenparenmechanismen. Gebaseerd op het basisontwerp van het nucleïnezuur volgens de uitvinding verdient het de voorkeur dat één stuk in antisens oriëntering is ten opzichte van een nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801 of een deel hiervan, terwijl het andere stuk is in de sens oriëntering ten opzichte van een nucleïnezuursequen-5 tie coderende voor RTP801 of een onderdeel hiervan. Daardoor is één stuk complementair met een nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801 of een onderdeel hiervan en het andere stuk is identiek aan de nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801 dan wel een onderdeel hiervan. In samenhang hiermee dient erkend te worden dat de term identiek vanzelfsprekend betekent tevens tendele identiek, waarbij de 10 identiciteit uitgedrukt als homologie is ten minste 80%, bij voorkeur 90%, nog meer bij voorkeur 95, 96, 97, 98, 99 of 100%. Evenals de definitie van identiciteit, kan complementariteit worden gedefinieerd in termen van homologie, waarbij deze homologie van dezelfde orde van grootte is als de identiciteit indien de complementaire streng ge-translateerd zou worden in de identieke streng volgens de Watson-Crick-basenparen-15 regels. In een alternatieve uitvoeringsvorm is één stuk identiek met een nucleïnezuur sequentie coderende voor RTP801 of een onderdeel hiervan en het andere stuk is complementair met een nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801 of een onderdeel hiervan.

In een geprefereerde uitvoeringsvorm downreguleert het nucleïnezuur vol-20 gens de onderhavige uitvinding de RTP801-functie. Het downreguleren van de RTP801-functie geschiedt bij voorkeur door reductie in het niveau van expressie op het proteïneniveau en/of het mRNA-niveau, waarbij dit gereduceerde niveau van expressie bij voorkeur op het niveau van de proteïne heel laag kan zijn en zelfs 5% kan bedragen en hoog kan zijn tot een waarde van 100%, met verwijzing naar een expressie onder 25 omstandigheden waarbij het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding niet wordt toegediend of niet functioneel actief is. Deze omstandigheden zijn bij voorkeur de omstandigheden van, dan wel als aanwezig in een expressiesysteem, bij voorkeur een ex-pressiesysteem voor RTP801. Dit expressiesysteem is bij voorkeur een translatie-systeem dat een in vitro translatiesysteem, meer bij voorkeur een cel, orgaan en/of een 30 organisme kan zijn. Het verdient meer de voorkeur dat het organisme een multicellulair organisme is, meer bij voorkeur een zoogdier, waarbij dit zoogdier bij voorkeur gekozen is uit de groep omvattende mens, aap, muis, rat, cavia, konijn, kat, hond, schaap, koe, paard, vee en varken. In samenhang met het downreguleren dient erkend te wor- 87 den dat het downreguleren een functie van tijd kan zijn, dat wil zeggen het downregule-rende effect wordt niet noodzakelijkerwijze onmiddellijk waargenomen na toediening of functionele activering van de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding, maar kan zowel in tijd als in ruimte uitgesteld zijn, dat wil zeggen in verschillende cellen, 5 weefsels en/of organen. Deze verschuiving kan variëren van 5 tot 100%, bij voorkeur 10 tot 50%. Erkend zal worden door de deskundigen op dit gebied dat een 5% reductie voor een langere tijdsperiode even effectief kan zijn als een 100% reductie over een korte tijdsperiode. Het zal ook door de deskundigen op dit gebied erkend worden dat deze verschuiving sterk afhankelijk is van het bijzondere functionele nucleïnezuur dat 10 daadwerkelijk wordt gebruikt alsmede van de targetcelpopulatie en dus uiteindelijk van de te behandelen ziekte en/of de te voorkomen ziekte volgens de technische leer van de onderhavige uitvinding. Voorzover een 5% reductie over een langere tijdsperiode even effectief kan zijn als een 100% reductie over een kortere tijdsperiode zal het door de deskundigen op dit gebied erkend worden dat de verschuiving kan optreden op elk ni-15 veau zoals hierboven beschreven, dat wil zeggen een verschuiving in functie, waarbij deze functie elke functie kan zijn die door RTP801 vertoond wordt, een verschuiving in proteïne-expressie of een verschuiving op het mRNA-expressieniveau.

In een voorkeursuitvoeringsvorm omvat het eerste stuk ten minste 14 nucleotiden, bij voorkeur 14 aangrenzende nucleotiden. Door de deskundige op dit 20 gebied zal erkend worden dat het eerste stuk een lengte dient te hebben die specifiek gericht is op een nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801 en meer specifiek het nucleïnezuur coderende voor RTP801, zoals aanwezig in het translatiesysteem, waarbij de expressie van RTP801 gereduceerd moet worden, mogelijk te maken. Wederom zonder aan enige theorie of enige werkingswijze van het nucleïnezuur volgens de on-25 derhavige uitvinding gebonden te willen zijn schijnt het zo te zijn dat er een interactie bestaat tussen het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding en de nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801, bij voorkeur op het transcriptieniveau, dat wil zeggen na het produceren van een mRNA uitgaande van de respectievelijke nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801. Vanwege de waarschijnlijkheid dat elke sequentie 30 van het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding identiek is aan of complementair is met een sequentie aanwezig in het genoom of transcriptoom van het translatiesysteem, dient de lengte van het eerste stuk zodanig lang te zijn dat gewaarborgd wordt, dat in de veronderstelling dat één of ander soort basenparen tussen het nucleïnezuur 88 coderende voor RTP801 en één van de strengen van het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding daadwerkelijk optreedt, slechts de sequentie coderende voor RTP801, maar geen andere coderende sequentie, zeker geen andere essentiële coderende sequentie van het genoom of het transcriptoom in aanmerking komt voor of door 5 een dergelijk basenparen. Door deze lengte kan het optreden van off-targeteffecten gereduceerd en bij voorkeur geëlimineerd worden. Ter verhoging van dit specifieke gericht zijn op RTP801 en de nucleïnezuursequentie coderende hiervoor heeft het eerste stuk bij voorkeur een lengte van ten minste 18 of 19 nucleotiden. De bovengrens voor de lengte van het eerste stuk is bij voorkeur minder dan 50 nucleotiden, echter kan de 10 lengte significant langer zijn en kan 100, 200 of zelfs 500 nucleotiden van elke lengte daartussen omvatten. Afgezien daarvan zou de deskundige de voorkeur geven aan een tamelijk kort eerste stuk, in het bijzonder in het geval van het nucleïnezuur volgens de uitvinding chemisch gesynthetiseerd wordt naarmate de sequentie korter is, hoe korter de tijd is en minder materiaal consumerende de synthese daarvan zal zijn en des te lager 15 de snelheid zal zijn waarbij onjuiste nucleotiden in de respectievelijke sequentie er ingevoegd worden. Een andere factor die in aanmerking dient te worden genomen in samenhang met het vaststellen van de lengte van het eerste stuk is het feit dat gewoonlijk bij een lengte onder de 50 of meer nucleotiden een niet-specifieke interferonrespons waargenomen kan worden. Het hangt af van de bijzondere te behandelen ziektetoestand 20 of deze soort niet-specifieke interferonrespons al dan niet getolereerd moet worden. Bijvoorbeeld zou een interferonrespons getolereerd worden indien de interferonrespons en/of de expressie van de interferongenen tot de pathogene cellen beperkt kunnen worden.

Met het oog hierop zijn lengten van het eerste stuk die meer de voorkeur 25 verdienen van ongeveer 14 tot 40 nucleotiden, 18 tot 30 nucleotiden, 19 tot 27 nucleotiden, 21 tot 25 nucleotiden en 19 tot 23 nucleotiden.

Dezelfde overwegingen als hierboven beschreven voor het eerste stuk zijn van toepassing op het tweede stuk die dus elke lengte kan omvatten, zoals in de beschrijving beschreven is, in samenhang met het eerste stuk. Het valt tevens binnen de 30 onderhavige uitvinding dat de lengte van het eerste stuk verschilt van de lengte van het tweede stuk, echter verdient het de voorkeur dat beide stukken dezelfde lengte hebben.

Volgens het basisontwerp van het nucleïnezuur zijn het eerste en het tweede stuk onderdelen van de eerste streng en de tweede streng respectievelijk van het nuclei- 89 nezuur volgens de onderhavige uitvinding. Erkend zal worden dat aan beide uiteinden, dat wil zeggen aan het 5-uiteinde en aan het 3'-uiteinde de eerste streng en/of de tweede streng één of verscheidene nucleotiden, bij voorkeur additionele nucleotiden, in elke combinatie kunnen omvatten.

5 In samenhang hiermee dient erkend te worden dat die nucleotiden van de afzonderlijke streng die verder gaat dan de uiteinden van het stuk corresponderende met de respectievelijke streng gebruikt kan worden om een verdere bijdrage te leveren tot de complementariteit en identiciteit respectievelijk van het stuk en dus tot het specifiek adresseren van de nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801.

10 Erkend zal worden dat in principe, gebaseerd op de technische leer die in de beschrijving beschreven is, het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding gericht kan zijn op elk deel van de nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801, bij voorkeur coderende voor RTP801 in het translatiesysteem waar de expressie van RTP801 gereduceerd dient te worden. Tot dusver omvat de onderhavige uitvinding elk nucleï-15 nezuur met de kenmerken zoals gedefinieerd in de beschrijving, waarbij de complementariteit en identieke strengen en stukken van het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding in principe kan beginnen uitgaande van elk nucleotide van de nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801. Dientengevolge, onder de voorwaarde dat het eerste stuk van het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding complementair is 20 met de nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801, dat wil zeggen is de antisens streng daarvan of is in antisens oriëntering ten opzichte daarvan, correspondeert het eerste nucleotide van dit stuk, dat wil zeggen het meest 5 '-terminale nucleotide correspondeert, dat wil zeggen ligt in dezelfde richting als het laatste nucleotide van de sequentie coderende voor RTP801 aan het 3 -uiteinde. In een andere uitvoeringsvorm 25 correspondeert dit meest 5'-terminale nucleotide met het op één na laatste nucleotide van het nucleïnezuur coderende voor RTP801 enz. totdat de laatste positie bereikt is die gegeven de lengte van het antisens stuk nog steeds het mogelijk maakt dat de antisens streng van het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding complementair is met de nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801. In zoverre elk nucleïnezuur volgens 30 de onderhavige uitvinding binnen de onderhavige uitvinding valt, dat gegenereerd kan worden door het scannen van de nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801 uitgaande van het meest 5 -terminale nucleotide hiervan en liggende op het basisontwerp van het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding en het realiseren van de ken- 90 merken van dit nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding. Dezelfde overwegingen zijn van toepassing op de uitvoeringsvormen die in de beschrijving beschreven zijn, waarbij de complementariteit en de identiciteit van het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding niet slechts verschaft is door het eerste stuk en het tweede stuk 5 respectievelijk, maar deze complementariteit en identiciteit omvatten tevens één of meer nucleotiden verder dan het eerste en het tweede stuk respectievelijk, zijnde dan een onderdeel van de eerste streng respectievelijk de tweede streng.

Van de verscheidene nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding, zoals deze in de beschrijving beschreven zijn verdienen die met de interne referentie-10 nummers 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 en 50 (zie tabel A) en 257, 260-262 en 264-268 (zie tabel D) in het bijzonder de voorkeur. In samenhang hiermee dient opgemerkt te worden dat die nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding die gebruikt kunnen worden in zowel de mens als het diermodel, zoals bijvoorbeeld een rat en/of een muis bijzonder nuttig zijn. Het verrassende voordeel van deze bijzondere nucleïnezuren vol-15 gens de onderhavige uitvinding berust op het feit dat zij effectief zijn in zowel de mens als in het diermodel, hetgeen betekent dat de testresultaten verkregen uit het diermodel onmiddellijk overgebracht kunnen worden vanuit het diermodel naar de mens en meer in het bijzonder zonder de noodzaak voor het maken van veranderingen aan de humane sequentie die anders noodzakelijk worden in het geval dat het nucleïnezuur volgens de 20 onderhavige uitvinding ontworpen was zodanig dat zij (a) één of meer sequenties die verschillen tussen de species, meer in het bijzonder de species gebruikt voor het dier-modeltesten en de mens als de uiteindelijk geprefereerde organismen of patiënt. Het verdient verder de voorkeur dat deze nucleïnezuren een modificatiepatroon hebben, zoals tevens in de voorbeelden is beschreven.

25 Echter valt het eveneens binnen de onderhavige uitvinding dat elke van de sequenties volgens SEQ ID NOS: 3, 16-17, 22-27, 29, 41-46, 51-53, 66-67, 72-77, 79, 91-96, 101-102, 525, 528-530, 532-536 en respectievelijke combinaties resulterende van de nucleïnezuurmoleculen volgens de onderhavige uitvinding met interne referen-tienummers 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 en 50 (van tabel A) en 257, 260-262 en 30 264-268 (van tabel D) slechts tendele opgenomen is in een verder nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding. Bij voorkeur omvatten de andere nucleïnezuren volgens de uitvinding ten minste 14 aangrenzende nucleotiden van de SEQ ID NOS: 3, 16-17, 22-27, 29,41-46, 51-53, 66-67, 72-77, 79, 91-96,101-102, 525, 528-530, 532-536 en meer 91 bij voorkeur 14 aangrenzende nucleotidebasenparen aan elk uiteinde van de structuur met een dubbele streng samengesteld uit het eerste stuk en het tweede stuk, zoals in de voorafgaande tabel is weergegeven. De deskundigen op dit gebied zullen begrijpen dat, gegeven de potentiële lengte van het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding 5 en in het bijzonder van de afzonderlijke stukken die dit nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding vormen, zullen enkele verschuivingen met betrekking tot de coderende sequentie van RTP801 aan elke zijde mogelijk zijn, waarbij deze verschuivingen tot 1, 2, 3, 4, 5 en 6 nucleotiden in beide richtingen kunnen zijn en waarbij de aldus gegenereerde nucleïnezuurmoleculen met een dubbele streng tevens 10 binnen de onderhavige uitvinding vallen.

In een geprefereerde uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding hebben het eerste stuk en de eerste streng dezelfde lengte. Op dezelfde wijze verdient het de voorkeur dat de tweede streng dezelfde lengte heeft als het tweede stuk, waarbij het nog meer de voorkeur verdient dat het eerste stuk en de tweede streng dezelfde lengte 15 hebben. In een nog meer geprefereerde uitvoeringsvorm omvat slechts de eerste streng het eerste stuk en de tweede streng omvat slechts het tweede stuk. In een zelfs nog meer geprefereerde uitvoeringsvorm omvatten noch het eerste stuk en dus de eerste streng noch het tweede stuk en dus de tweede streng een overhang. Met andere woorden, het valt tevens binnen de onderhavige uitvinding dat de nucleïnezuren met een dubbele 20 streng volgens de onderhavige uitvinding bot zijn aan het uiteinde, bij voorkeur aan elk uiteinde van de structuur met een dubbele streng van de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding. Een dergelijke structuur met een afgestompt uiteinde kan gerealiseerd worden in samenhang met alle andere uitvoeringsvormen van de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding, in het bijzonder die uitvoeringsvormen waarbij de 25 nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding een modificatiepatroon hebben, meer bij voorkeur een modificatiepatroon zoals in de beschrijving beschreven is.

In een verder aspect heeft het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding dus ene basisontwerp dat afgestompte uiteinden aan beide uiteinden van de structuur met een dubbele streng van het nucleïnezuur volgens de uitvinding verschaft. 30 Echter valt het eveneens binnen de onderhavige uitvinding dat er een overhang bestaat, dat wil zeggen een stuk van één of meer nucleotiden dat uit de structuur met een dubbele streng uitsteekt. Deze overhang kan in principe aan het 5 '-uiteinde van de antisens streng, aan het 3-uiteinde van de antisens streng, aan het 5'-uiteinde van de sens streng 92 en/of het 3'-uiteinde van de sens streng zijn. Opgemerkt dient te worden dat het realiseren van één van deze opties alsmede elke combinatie hiervan binnen de onderhavige uitvinding valt. Meer geprefereerd is een combinatie waarbij de overhang gelokaliseerd is aan het 3 '-uiteinde van de antisens streng en aan het 3 '-uiteinde van de sens streng.

5 Het valt tevens binnen de onderhavige uitvinding dat de overhang aan het 5'-uiteinde van de antisens streng is en aan het 5-uiteinde van de sens streng. Verder ligt binnen de onderhavige uitvinding dat de overhang slechts gelokaliseerd is aan de antisens streng van de structuur met een dubbele streng, meer bij voorkeur aan het 3-uiteinde van de antisens streng van de dubbele strengstructuur.

10 In samenhang met de overhangs dient opgemerkt te worden dat de over hang plus het stuk bij voorkeur de streng vormen en de lengten die verschaft worden voor de stukken tevens van toepassing zijn op deze uitvoeringsvormen. De afzonderlijke overhang kan onafhankelijk van zijn locatie bestaan uit ten minste één nucleotide. Echter kan de afzonderlijke overhang zelfs 10 nucleotiden omvatten en heeft bij voor-15 keur een lengte van twee nucleotiden. Het valt binnen de onderhavige uitvinding dat de respectievelijke nucleotiden die één of meer overhangs vormen, is/zijn tevens complementair met de nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801 in het geval dat de eerste streng complementair is met de nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801 en waarbij de overhang aan het 3 - of 5'-uiteinde van de antisens streng is dan wel dat één 20 of meer overhangs identiek is/zijn met de nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801 in het geval dat de eerste streng identiek is met de nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801. Hetzelfde is van toepassing op elke overhang gelokaliseerd op het tweede stukje van het basisontwerp van het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding, waarbij erkend dient te worden dat het overhangontwerp aan het tweede stuk 25 onafhankelijk kan zijn van het overhangontwerp van het eerste stuk.

Het valt tevens binnen de onderhavige uitvinding dat de overhangvormende nucleotiden noch complementair noch identiek zijn met de corresponderende nucleotiden van de nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801. Zoals in de beschrijving wordt gebruikt en bij voorkeur in deze uitvoeringsvorm wordt gebruikt betekent “cor-30 responderende met” de respectievelijke nucleotiden die volgen aan het 5'-uiteinde en/of het 3 '-uiteinde van het stuk met een nucleotidetegenhanger op het nucleïnezuur coderende voor RTP801.

93

Bij voorkeur omvat de eerste streng aan zijn 3'-uiteinde twee nucleotiden, bij voorkeur deoxynucleotiden en meer bij voorkeur twee TT en/of dit soort nucleotiden tevens aan het 3'-uiteinde van de tweede streng, waarbij meer bij voorkeur de lengte van het eerste stuk en het tweede stuk uit 19 nucleotiden bestaat. De strengen 5 zijn dus samengesteld uit het stuk en de overhang. In deze uitvoeringsvorm bestaat de dubbele-strengstructuur uit 19 basenparen en een overhang van twee nucleotiden aan elk uiteinde van het 3'-uiteinde van het afzonderlijke stuk.

In een voorkeursuitvoeringsvorm omvat het eerste stuk en/of de eerste streng ribonucleotiden, waarbij het in het bijzonder de voorkeur verdient dat het eerste 10 stuk in zijn geheel bestaat uit ribonucleotiden. Hetzelfde is van toepassing op het tweede stuk en de tweede streng respectievelijk. In samenhang hiermee echter wordt één of meer van de nucleotiden van het eerste stuk en het tweede stuk in een voor-keursuitvoeringsvorm gemodificeerd. Hetzelfde is van toepassing op de eerste streng respectievelijk de tweede streng. In het bijzonder kunnen de terminale nucleotiden on-15 geacht of zij ribonucleotiden of deoxyribonucleotiden zijn een OH-groep hebben die als zodanig gemodificeerd kan zijn. Deze OH-groep kan afkomstig zijn van elke suiker-groep van het nucleotide, meer bij voorkeur vanuit de 5-positie in het geval van de 5'-OH-groep en ook vanuit de 3'-positie in het geval van de 3-OH-groep, dan wel van een fosfaatgroep verbonden met de suikergroep van het respectievelijke terminale nu-20 cleotide. De fosfaatgroep kan in principe verbonden zijn met elke OH-groep van de suikergroep van het nucleotide. Bij voorkeur is de fosfaatgroep verbonden met de 5 '-OH-groep van de suikergroep in het geval van de vrije 5-OH-groep en/of de 3-OH-groep van de suikergroep in het geval van de vrije 3'-OH-groep nog steeds wat in de beschrijving genoemd wordt, de vrije 5'- of de 3'-OH-groep verschaft.

25 Zoals in de beschrijving wordt gebruikt met betrekking tot een strategie voor het ontwerpen van RNAi of elke uitvoeringsvorm van het RNAi beschreven in de beschrijving betekent de term eindmodificatie een chemische entiteit die toegevoegd wordt het meest 5 - of het 3-nucleotide van de eerste en/of de tweede streng. Voorbeelden van deze eindmodificaties omvatten, maar zijn niet beperkt tot 3'- of 5 '-fos-30 faat, geïnverteerde (deoxy)abasische, amino, fluor, chloor, broom, CN, CF, methoxy, imidazool, carboxylaat, thioaat, Ci tot Cio klein alkyl, gesubstitueerd klein alkyl, alka-ryl of aralkyl, OCF3, OCN, O-, S- of N-alkyl; O-, S- of N-alkenyl; SOCH3; S02CH3; 0N02; N02, N3; heterocycloalkyl; heterocycloalkaryl; aminoalkylamino; polyalkyl- 94 amino of gesubstitueerd silyl, zoals onder andere beschreven in Europese octrooiaanvragen EP-0.586.520 BI ofEP-0.618.925 BI.

Zoals gebruikt wordt in de beschrijving betekent “alkyl” of elke term die alkyl omvat bij voorkeur één of andere koolstofketen die 1 tot 12, bij voorkeur 1 tot 6 5 en meer bij voorkeur 1 tot 2 C-atomen omvat.

Een verdere eindmodificatie is een biotinegroep. Deze biotinegroep kan bij voorkeur verbonden zijn met één of beide van de meeste 5'- of de meeste 3 -nucleotide van de eerste en/of de tweede streng of met beide uiteinden. In een meer geprefereerde uitvoeringsvorm is de biotinegroep gekoppeld aan een polypeptide of een proteïne. Het 10 valt tevens binnen de beschermingsomvang van de onderhavige uitvinding dat het polypeptide of proteïne verbonden is via één of meer van de bovenvermelde eindmodi-ficaties. Het polypeptide of proteïne kan verdere kenmerken aan de nucleïnezuurmole-culen volgens de onderhavige uitvinding verlenen. Onder andere kan het polypeptide of proteïne fungeren als een ligand ten opzichte van een ander molecuul. Indien het andere 15 molecuul een receptor is kunnen de receptorfunctie en -activiteit door het bindings-ligand geactiveerd worden. De receptor kan een intemaliseringsactiviteit vertonen die een effectieve transfectie van het aan het ligand gebonden nucleïnezuurmolecuul volgens de onderhavige uitvinding mogelijk maakt. Een voorbeeld van het te koppelen ligand met het inventieve nucleïnezuurmolecuul is VEGF en de corresponderende 20 receptor is de VEGF-receptor.

Verschillende mogelijke uitvoeringsvormen van het RNAi van de onderhavige uitvinding met verschillende soorten eindmodificaties zijn in de volgende tabel 1 weergegeven.

95 TABEL 1 VERSCHILLENDE UITVOERINGSVORMEN VAN HET INTERFERERENDE RIBONUCLEÏNEZUUR VOLGENS DE _ONDERHAVIGE UITVINDING_ lste streng/lste stuk 2de streng/2d* stuk

1. ) 5'-uiteinde vrije OH vrije OH

3-uiteinde vrije OH vrije OH

2. ) 5-uiteinde vrije OH vrije OH

3 -uiteinde eindmodifïcatie eindmodificatie

3. ) 5'-uiteinde vrije OH vrije OH

3'-uiteinde vrije OH eindmodificatie

4. ) 5-uiteinde vrije OH vrije OH

3'-uiteinde eindmodificatie vrije OH

5. ) 5'-uiteinde vrije OH eindmodificatie

3-uiteinde vrije OH vrije OH

6. ) 5-uiteinde vrije OH eindmodificatie

3-uiteinde eindmodificatie vrije OH

7. ) 5-uiteinde vrije OH eindmodificatie 3-uiteinde vrije OH eindmodificatie 8. ) 5'-uiteinde vrije OH eindmodificatie 3 '-uiteinde eindmodificatie eindmodificatie

De verschillende eindmodificaties zoals hierin beschreven, zijn bij voorkeur 5 gelokaliseerd aan de ribosegroep van een nucleotide van het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding. Meer in het bijzonder kan de eindmodificatie verbonden zijn met of één van de OH-groepen van de ribosegroep vervangen, met inbegrip van, maar niet beperkt tot de 2'OH-, 3'OH- en 5'OH-positie, met dien verstande dat het nucleotide dat aldus gemodificeerd is een terminaal nucleotide is. Geïnverteerde 10 abasische eenheden zijn nucleotiden hetzij deoxyribonucleotiden, hetzij ribonucleoti-den die geen nucleobasegroep hebben. Dit soort verbinding is onder andere beschreven in Stemberger, M., Schmiedeknechts, A., Kretschmer, A., Gebhardt, F., Leenders, F., Czaudema, F., Von Carlowitz, I., Engle, M., Giese, K., Beigelman, L. & Klippel, A. (2002), Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 12, 131-43.

15 Elke van de bovenvermelde eindmodificaties kunnen worden gebruikt in samenhang met de verschillende uitvoeringsvormen van RNAi weergegeven in tabel 1; opgemerkt 96 dient te worden dat de 5'-eindmodificaties die hierboven vermeld zijn gewoonlijk slechts aanwezig zijn in de sens streng van het siRNA-molecuul.

Verdere modificaties kunnen in verband worden gebracht met de nucleobasegroep, de suikergroep of de fosfaatgroep van het afzonderlijke nucleotide.

5 Deze modificatie van de nucleobasegroep kan zodanig zijn dat de derivaten van adenine, guanine, cytosine en thymidine en uracil, respectievelijk gemodificeerd zijn. Bijzonder geprefereerde gemodificeerde nucleobasen zijn gekozen uit de groep bestaande uit inosine, xanthine, hypoxanthine, 2-aminoadenine, 6-methyl, 2-propyl en andere alkyladeninen, 5-halogeenuracil, 5-halogeencytosine, 5-halogeencytosine, 6-10 azacytosine, 6-azathymine, pseudo-uracil, 4-thiouracil, 8-halogeenadenine, 8-amino-adenine, 8-thioladenine, 8-thiolalkyladeninen, 8-hydroxyladenine en andere 8-gesub-stitueerde adeninen, 8-halogeenguaninen, 8-aminoguanine, 8-thiolguanine, 8-thioalkyl-guanine, 8-hydroxylguanine en andere gesubstitueerde guaninen, andere aza- en deazaadeninen, andere aza- en deazaguaninen, 5-trifluormethyluracil en 5-trifluorcyto-15 sine.

In een andere uitvoeringsvorm wordt de suikergroep van het nucleotide gemodificeerd, waarbij deze modificatie bij voorkeur zich op de 2'-positie van de ribose en deoxyribosegroep van het nucleotide bevindt. Meer bij voorkeur is de 2'-OH-groep vervangen door een groep of rest die gekozen is uit de groep bestaande uit 20 amino, fluor, alkoxy en alkyl. Bij voorkeur is alkoxy hetzij methoxy, hetzij ethoxy. Tevens betekent alkyl bij voorkeur methyl, ethyl, propyl, isobutyl, butyl en isobutyl. Het verdient zelfs nog meer de voorkeur dat ongeacht het type modificatie het nucleotide bij voorkeur een ribonucleotide is.

De modificatie van de fosfaatgroep is bij voorkeur gekozen uit de groep 25 bestaande uit fosfothioaten.

Het zal door de deskundige op dit gebied erkend worden dat het nucleïne-zuur van de onderhavige uitvinding dat uit een groot aantal nucleotiden bestaat dus gevormd kan worden door nucleotiden die via een fosfodiesterbrug of via een fosfo-thioaatbrug, dan wel een combinatie van beide over de lengte van de nucleotidesequen-30 tie van de afzonderlijke streng en respectievelijk stuk met elkaar verbonden zijn.

Een andere vorm van nucleotiden die gebruikt zijn kan daadwerkelijk siRNA zijn die onder andere in de Internationale octrooiaanvrage WO 03/070918 beschreven is.

97

De nucleotiden die het eerste stuk en de eerste streng vormen van het nucleïnezuur volgens de uitvinding kan één of meer gemodificeerde nucleotiden omvatten, waarbij het afzonderlijk gemodificeerde nucleotide een modificatie heeft die bij voorkeur een modificatie is zoals in de beschrijving beschreven is. Behalve de bijzon-5 dere modificatie kan de modificatie zijn of omvatten één of andere soort label, waarbij de label gekozen is uit de groep bestaande uit chemiluminescente labels, fluorescerende labels en radioactieve labels. Deze soort labels zijn de deskundige bekend en zijn bijvoorbeeld beschreven in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland, 1998. Het aldus gelabelde nucleïnezuur volgens 10 de uitvinding kan tevens worden toegepast voor diagnostische doeleinden dan wel voor het volgen van de werkingsplaats alsmede voor het in trappen uitvoeren van één of andere behandeling, bij voorkeur gerelateerd aan één of andere van de in de beschrijving beschreven ziekte.

In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt het nucleïnezuur volgens de 15 onderhavige uitvinding zodanig gemodificeerd dat de pyrimidinenucleotiden in de sens streng of stuk 2'-0-methylpyrimidinenucleotiden zijn en hetzij additioneel, hetzij alternerend de purinenucleotiden in het sens stukje of streng 2'-deoxypurinenucleotiden zijn. In een verdere uitvoeringsvorm zijn de pyrimidinenucleotiden aanwezig in het sens stukje of de sens streng 2'-deoxy-2'-fluorpyrimidinenucleotiden.

20 In een alternatieve uitvoeringsvorm is de modificatie niet gebaseerd op de chemie van het nucleotide, dat wil zeggen hangt de modificatie af van het feit of het te modificeren nucleotide hetzij een purinenucleotide, hetzij een pyrimidinenucleotide is, maar is hoofdzakelijk gebaseerd op de afzonderlijke nucleotide ruimtelijke ordening in de gehele dubbelestrengstructuur van het basisontwerp van het nucleïnezuur volgens de 25 onderhavige uitvinding.

Meer in het bijzonder vertonen hetzij de eerste streng en het eerste stuk, hetzij de tweede streng en het tweede stuk een ruimtelijk patroon van modificatie van de nucleotiden die de stukken respectievelijk strengen vormen.

Focusserend eerst op het eerste stuk is er een patroon van groepen van 30 gemodificeerde nucleotiden en groepen van niet-gemodificeerde nucleotiden. Deze groepen van niet-gemodificeerde nucleotiden verdienen tevens de voorkeur als aangrenzende groepen van nucleotiden. Meer bij voorkeur bestaat het patroon uit groepen van gemodificeerde nucleotiden en niet-gemodificeerde nucleotiden. Zelfs nog meer bij 98 voorkeur is het patroon een regelmatig patroon en zelfs nog meer bij voorkeur een alternerend patroon langs de lengte van het eerste stuk van het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding. De groep van gemodificeerde nucleotiden kan hetzij bestaan uit één of uit verscheidene nucleotiden die gemodificeerd zijn en die bij voorkeur nu-5 cleotiden zijn die op de 2-positie gemodificeerd zijn, dat wil zeggen een modificatie op de suikergroep hebben. Meer bij voorkeur is deze modificatie een 2'-0-Me-modifi-catie.

De groep van niet-gemodificeerde nucleotiden kan hetzij bestaan uit één of uit verscheidene nucleotiden die hetzij niet gemodificeerd zijn, waarbij de niet-gemodi-10 ficeerde nucleotiden bij voorkeur ribonucleotiden zijn, dan wel zijn de niet-gemodificeerde nucleotiden nucleotiden met een modificatie, waarbij de modificatie verschillend is van de modificatie getoond door de nucleotiden die de groep van gemodificeerde nucleotiden vormen. Zelfs nog meer bij voorkeur zijn de niet-gemodificeerde nucleotiden ribonucleotiden. Opgemerkt dient te worden dat de term niet-gemodifi-15 ceerd en niet-gemodificeerd nucleotide uitwisselbaar zijn tenzij anders wordt aangegeven. Het eerste stuk van het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding kan hetzij beginnen met de groep van gemodificeerde nucleotiden dan wel beginnen met een groep van niet-gemodificeerde nucleotiden, zoals in de beschrijving gedefinieerd is. Echter verdient het de voorkeur dat het eerste stuk begint met een groep van gemodifi-20 ceerde nucleotiden. Het meest bij voorkeur bestaat de groep van gemodificeerde nucleotiden uit één enkel nucleotide. In samenhang met deze uitvoeringsvorm is het eerste stuk bij voorkeur in een antisens oriëntering ten opzichte van het nucleïnezuur coderende voor RTP801. Het ligt binnen de onderhavige uitvinding dat de modificatie, zoals vertoond door de nucleotiden die de groep van gemodificeerde nucleotiden vormen 25 dezelfde is voor alle groepen van gemodificeerde nucleotiden aanwezig in het eerste stuk. Echter valt het eveneens binnen de onderhavige uitvinding dat enkele groepen van gemodificeerde nucleotiden een andere modificatie hebben dan één of verscheidene groepen van de gemodificeerde nucleotiden die in het eerste stuk aanwezig zijn.

Op de tweede streng van het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvin-30 ding kan een patroon zoals beschreven in het eerste stuk eveneens gerealiseerd worden. Dezelfde kenmerken als beschreven in samenhang met het eerste stuk kunnen gerealiseerd worden in een uitvoeringsvorm van het tweede stuk ook, waarbij het de voorkeur verdient dat onder voorwaarde dat het tweede stuk in sens oriëntering is met betrekking 99 tot de nucleïnezuursequentie coderende voor RTP801, de tweede streng van het nucleï-nezuur volgens de onderhavige uitvinding met een groep van niet-gemodificeerde nu-cleotiden begint.

Het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding dat een dubbelestreng-5 structuur omvat kan een eerste stuk omvatten met het modificatiepatroon zoals het in de beschrijving beschreven is. Op een andere wijze kan het dubbele-strengnucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding een tweede stukje omvatten met een modificatiepatroon zoals hierboven beschreven. Het verdient echter het meest de voorkeur dat het dubbelestrengnucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding uit een eerste stuk en een 10 tweede stuk bestaat, waarbij zowel het eerste stuk als het tweede stuk een ruimtelijk modificatiepatroon, zoals in de beschrijving beschreven is, hebben.

Het valt binnen de onderhavige uitvinding dat de kenmerken van het ruimtelijke modificatiepatroon hetzelfde zijn op beide stukken in termen van afmeting van de groepen van gemodificeerde nucleotiden en groepen van niet-gemodificeerde 15 nucleotiden en de soort van daadwerkelijke toegepaste modificaties. Bij voorkeur wordt het ruimtelijke patroon van modificatie van het eerste stuk zodanig verschoven dat een groep van gemodificeerde nucleotiden op het eerste stuk tegenover een groep van niet-gemodificeerde nucleotiden op het tweede stuk en vice versa aanwezig is. Echter valt het eveneens binnen de onderhavige uitvinding dat de patronen nauwkeurig gelijk lo-20 pen, dat wil zeggen dat een groep van gemodificeerde nucleotiden op het eerste stuk tegenover een groep van niet-gemodificeerde nucleotiden op het tweede stuk staat en een groep van niet-gemodificeerde nucleotiden op het eerste stuk aanwezig is tegenover een groep van niet-gemodificeerde nucleotiden op het tweede stuk. Het ligt nog steeds binnen de onderhavige uitvinding dat het ruimtelijke patroon van modificatie op het 25 eerste stuk en het tweede stuk verschoven wordt ten opzichte van elkaar, zodanig dat slechts één eerste gedeelte van een groep van gemodificeerde nucleotiden op één stuk tegenover een deel van een groep van niet-gemodificeerde nucleotiden op het andere stuk staat, terwijl het tweede gedeelte van de groep van gemodificeerde moleculen tegenover een andere groep van gemodificeerde nucleotiden staat. Het ligt binnen de 30 onderhavige uitvinding dat de hierin verschafte beschrijving over het ruimtelijke modificatiepatroon van de stukken van het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding tevens van toepassing is op één of meer strengen van het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding. Het verdient echter de voorkeur dat de stukken van het nucleïne- 100 zuur het ruimtelijke modifïcatiepatroon omvatten en de strengen deze stukken en één of meer overhangs, zoals in de beschrijving beschreven zijn, omvatten. Het verdient in het bijzonder de voorkeur dat de overhang een fosfaatgroep is aan het 3'-uiteinde van elke van de antisens strengen dan wel de sens streng dan wel beide strengen, waarbij het 5 meer de voorkeur verdient dat de fosfaatgroep aan het 3 -uiteinde is van zowel de antisens streng als de sens streng. In een zelfs meer geprefereerde uitvoeringsvorm is de fosfaatgroep een fosfaatgroep, zoals in de beschrijving gedefinieerd is.

Het valt tevens binnen de onderhavige uitvinding dat het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding een brug die het eerste en het tweede stuk verbindt kan 10 vertonen. Een dergelijke brug is bij voorkeur een polymeer. Het polymeer kan elk synthetisch of natuurlijk polymeer zijn. Mogelijke synthetische linkers (brugvormers) zijn onder andere PEG of een polynucleotide. Een dergelijke linker wordt bij voorkeur zodanig ontworpen dat het hetzij tendele, hetzij volledig terugvouwen van het eerste stuk op het tweede stuk en vice versa mogelijk is.

15 Tenslotte valt het binnen de onderhavige uitvinding dat het nucleïnezuur volgens de uitvinding een synthetisch nucleïnezuur, een chemisch gesynthetiseerd nucleïnezuur, een geïsoleerd nucleïnezuur of een nucleïnezuur afgeleid van één of meer natuurlijke bronnen, zoals bijvoorbeeld bereid door middel van recombinant-technolo-gie is. In samenhang met de bereiding van één of ander nucleïnezuur volgens de onder-20 havige uitvinding kan elke modificatie zoals zij beschreven is in de beschrijving geïntroduceerd worden hetzij voorafgaande aan, gedurende of na de bereiding van het respectievelijke nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding, zoals de deskundigen bekend is.

De vector volgens de onderhavige uitvinding omvat een nucleïnezuur vol-25 gens de onderhavige uitvinding. Bovendien kan de vector elementen omvatten ter beheersing van het targetten, expressie en transcriptie van het nucleïnezuur in een cel-selectieve wijze, zoals uit de stand der techniek bekend is. Het plasmide kan een promotor voor het beheersen van de transcriptie van het heterologe materiaal omvatten, dat wil zeggen het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding en kan hetzij een con-30 stitutieve, hetzij een induceerbare promotor zijn teneinde een selectieve transcriptie mogelijk te maken. Versnellers die vereist kunnen zijn ter verkrijging van noodzakelijke transcriptieniveaus kunnen eventueel worden opgenomen. Versnellers zijn in het algemeen willekeurige niet-getranslateerde DNA-sequenties die aangrenzend aan de 101 coderende sequentie werken, dus in cis, ter verandering van het basale transcriptie-niveau dat door de promotor gedicteerd wordt. De expressie van deze constructen is de deskundige op dit gebied bekend en kan worden uitgevoerd bijvoorbeeld door het verschaffen van een respectievelijk tandemconstruct dan wel door het hebben van ver-5 schillende promotoren die voor de eerste streng en het eerste en tweede stuk respectievelijk van het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding, transcriberen.

Wanneer het nucleïnezuur volgens de uitvinding geproduceerd dan wel tot expressie gebracht wordt, bij voorkeur in vivo tot expressie gebracht wordt, meer bij voorkeur in een patiënt die behoefte heeft aan het nucleïnezuur volgens de onderhavige 10 uitvinding, maakt deze productie of tot expressie brengen bij voorkeur gebruik van een expressievector, bij voorkeur een zoogdierexpressievector. Expressievectoren zijn op dit gebied bekend en omvatten bij voorkeur plasmiden, cosmiden, virale expressie-systemen. Voorkeurvirale expressiesysternen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, adenovirus, retrovirus en lentivirus.

15 Methoden zijn uit de stand der techniek bekend voor het introduceren van de vectoren in cellen of weefsels. Deze methoden kunnen gevonden worden in een algemene beschrijving in Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbour Laboratory, New York (1983, 1992) of in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland, 1998.

20 Geschikte methoden omvatten onder andere transfectie, lipofectie, elektro- poratie en infectie met recombinante virale vectoren. In samenhang met de onderhavige uitvinding is een additioneel kenmerk van de vector in één uitvoeringsvorm een expres-sielimiterend kenmerk, zoals een promotor en een regulerend element, respectievelijk, die specifiek zijn voor het gewenste celtype, waardoor de expressie van de nucleïne-25 zuursequentie volgens de onderhavige uitvinding mogelijk gemaakt wordt, slechts pas nadat de achtergrond verschaft is die de gewenste expressie mogelijk maakt.

In een verder aspect heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een farmaceutische samenstelling die een nucleïnezuur volgens de uitvinding en/of een vector volgens de onderhavige uitvinding en eventueel een farmaceutisch aanvaarbare 30 drager, verdunningsmiddel of hulpmiddel of andere dragers omvat. Bij voorkeur zijn deze dragers, verdunningsmiddelen, hulpmiddelen inert en niet-toxisch. De farmaceutische samenstelling is in zijn verscheidene uitvoeringsvormen aangepast voor toediening op verschillende wijzen. Deze toediening omvat een systemische en een lokale 102 toediening alsmede een orale, subcutane, parenterale, intraveneuze, intra-arteriële, intramusculaire, intraperitoneale, intranasale en intrategrale toediening.

Door de deskundigen op dit gebied zal worden erkend dat de hoeveelheid van de farmaceutische samenstelling en het respectievelijke nucleïnezuur en vector 5 afhangt van de klinische toestand van de individuele patiënt, de locatie en methode van toediening, het plannen van de toediening, de leeftijd van de patiënt, het geslacht, het lichaamsgewicht en andere factoren die de dokters bekend zijn. De farmaceutisch werkzame hoeveelheid voor doeleinden van preventie en/of behandeling is dus bepaald door deze overwegingen, zoals zij in de geneeskunde bekend zijn. Bij voorkeur is de 10 hoeveelheid werkzaam om een verbetering tot stand te brengen, waaronder, maar niet beperkt tot het verbeteren van de ziektetoestand of het verschaffen van een sneller herstel, verbetering of eliminering van symptomen en andere indicatoren die gekozen zijn als geschikte maatregelen door de deskundigen op het gebied van de geneeskunde.

In een voorkeursuitvoeringsvorm kan de farmaceutische samenstelling vol-15 gens de onderhavige uitvinding andere farmaceutisch actieve verbindingen omvatten. Bij voorkeur zijn deze andere farmaceutisch actieve verbindingen gekozen uit de groep bestaande uit verbindingen die een opname intracellulaire celafgifte mogelijk maken, verbindingen die endosomale afgifte mogelijk maken, verbindingen die een langer cir-culatietijd mogelijk maken en verbindingen die het targetten van endotheliale cellen of 20 pathogene cellen mogelijk maken. Voorkeurverbindingen voor endosomale afgifte zijn chloroquine en inhibitoren van ATP-afhankelijke H4-pompen.

De farmaceutische samenstelling wordt bij voorkeur geformuleerd zodanig dat één enkele doseringstoediening of een multidoseringstoediening mogelijk gemaakt worden.

25 Erkend zal worden dat de farmaceutische samenstelling volgens de onderhavige uitvinding gebruikt kan worden voor elke ziekte die een ongewenste ontwikkeling van groei van vasculatuur waaronder angiogenese, alsmede elke andere van de ziekten en ziektetoestanden die in beschrijving beschreven zijn omvatten. Bij voorkeur zijn deze soorten ziekten tumorziekten. Onder tumorziekten verdienen de vol-30 gende tumoren de voorkeur: endometriaal kanker, colorectaal carcinoma’s, glioma’s, endometriaal kanker, adenocarcinoma’s, endometriale hyperplasia’s, syndroom van Cowden, erfelijke niet-polyposis colorectal carcinima, syndroom van Li-Fraumene. borst-eierstokkanker, prostaatkankr (Ali, I.U., Journal of the National Cancer Institute, 103

Vol. 92, nr. 11, 07 juni 2000, biz. 861-863), Bannayan-Zonanasyndroom, LDD (Lhermitte-Duklos-syndroom) (Macleod, K., supra) hamatoma-macrocephale ziekten waaronder koeienziekte (CD) en Bannayan-Ruvalcaba/Rily-syndroom (BRR), muco-cutane letsels (bijvoorbeeld trichilenunonma’s), macrocephalie, mentale retardatie, 5 maagdarm harmatoma’s, lipoma’s, thyroïde adenoma’s, fibrocystische ziekte van de borst, cerebellaire dysplastische gangliocytoma en borst- en thyroïde kwaadaardige tumoren (Vazquez, F., Sellers, W.R., supra).

Erkend dient te worden dat elke van de tumorziekten die behandeld moeten worden met de samenstelling volgens de onderhavige uitvinding bij voorkeur een tu-10 morziekte is in een laat stadium. In een andere uitvoeringsvorm omvat de tumorziekte cellen die tumorsuppressomegatief zijn, waarbij nog meer bij voorkeur PTEN de tu-morsuppressor is.

De farmaceutische samenstelling volgens de onderhavige uitvinding kan tevens worden toegepast bij een werkwijze voor het voorkomen en/of behandelen van 15 een ziekte, zoals zij in de beschrijving beschreven is, waarbij de methode de toediening omvat van een nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding, een vector volgens de onderhavige uitvinding of een farmaceutische samenstelling dan wel een geneesmiddel volgens de onderhavige uitvinding voor elke van de in de beschrijving beschreven ziekten.

20 In een verder aspect heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een methode voor het ontwerpen of screenen van een nucleïnezuur dat geschikt is voor het downreguleren van RTP801, meer in het bijzonder voor het downreguleren van de RTP801-functie. Deze methode omvat de toepassing van een nucleïnezuursequentie, zoals beschreven in de beschrijving en het bepalen van dit nucleïnezuur in een ge-25 schikte test. Een dergelijke test is uit de stand der techniek bekend en is bijvoorbeeld beschreven in het voorbeeldgedeelte van de onderhavige aanvrage. In een verdere trap wordt een dubbelestrengnucleïnezuur ontworpen, bij voorkeur volgens de ontwerpprincipes zoals zij in de beschrijving zijn neergelegd, dat geschikt is voor het downreguleren van RTP801, bij voorkeur in samenhang met een posttranscriptioneel gen-30 remmend mechanisme, zoals RNA-interferentie. Tevens wordt het aldus verkregen oftewel ontworpen of gescreend aminozuur bepaald in de test en het resultaat ofwel het effect van zowel het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding als het pas ontworpen of gescreende nucleïnezuur in deze test vergeleken. Bij voorkeur is het ontwor- 104 pen of gescreende nucleïnezuur meer geschikt in het geval dat het meer stabiel dan wel meer effectief of beide is. Erkend zal worden dat de methode bijzonder doelmatig zal zijn indien één van de nucleïnezuren volgens de uitvinding als uitgangspunt wordt toegepast. Het valt dus binnen de onderhavige uitvinding dat nieuwe nucleïnezuurmole-5 culen ontworpen zullen worden, gebaseerd op de in de beschrijving beschreven principes, waarbij de targetsequentie op het RTP801-mRNA enigszins verschoven zal zijn ten opzichte van de targetsequentie op het RTP801-mRNA voor het overeenkomstige nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding. Bij voorkeur zou het nieuwe nucleïnezuur verschoven zijn met ten minste één of meer nucleotiden ten opzichte van het 10 stuk op de target-mRNA in de 5'- dan wel de 3'-richting van het mRNA coderende voor RTP801. Het ligt echter binnen de onderhavige uitvinding dat de verschuiving optreedt in beide richtingen simultaan hetgeen betekent dat het nieuwe nucleïnezuur het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding gebruikt als uitgangspunt, bevat. Het ligt eveneens binnen de onderhavige uitvinding dat de verlenging van het nucleïnezuur 15 volgens de onderhavige uitvinding en gebruikt als uitgangspunt verschoven is naar het 3-uiteinde dan wel het 5-uiteinde. In het geval van een dergelijke verschuiving is het 3-uiteinde of het 5'-uiteinde van het nieuwe nucleïnezuur langer ofwel meer uitgestrekt dan het andere uiteinde. Wanneer het nieuwe nucleïnezuurmolecuul geproduceerd wordt door de verlenging van het 3'-uiteinde dan wel het 5'-uiteinde van de anti-20 sens streng en/of de sens streng wordt de volgende sequentie van trappen gewoonlijk toegepast. Indien de verschuiving is naar het 5'-uiteinde van het mRNA van RTP801 dient het 3 -uiteinde van de antisens streng verlengd te worden met het aantal nucleotiden waarmee het 5'-uiteinde van het mRNA van RTP801 verschoven is. Eén of meer nucleotiden die aldus worden toegevoegd aan het 3'-uiteinde van de antisens streng van 25 het nieuwe nucleïnezuur is/zijn complementair met de nucleotiden volgende op het 5 '-uiteinde van de targetsequentie op het gebruikte RTP801-mRNA voor het nucleïnezuurmolecuul volgens de onderhavige uitvinding dat als uitgangspunt wordt gebruikt. Hetzelfde dient te worden gedaan met de sens streng. Echter de aan de sens streng toe te voegen nucleotiden dienen te corresponderen ofwel complementair te zijn met de pas 30 toegevoegde nucleotiden aan het 3'-uiteinde van de antisens streng, hetgeen betekent dat ze toegevoegd moeten worden aan het 5'-uiteinde van de sens streng. Laatstgenoemde trap op de sens streng echter dient uitgevoerd te worden slechts in zoverre dat behalve de antisens streng tevens de sens streng verschoven wordt hetgeen het geval is 105 in voorkeursuitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding. Ofschoon deze verschuiving uitgevoerd kan worden in een graad gedefinieerd door de deskundigen op dit gebied zal de verschuiving meer bij voorkeur zodanig worden uitgevoerd dat tevens het nucleïnezuur nog steeds een stuk bevat van ten minste 14 nucleotiden, bij voorkeur 14 5 aangrenzende nucleotiden, zoals vertoond door één of meer van de nucleïnezuurmole-culen die in de beschrijving beschreven zijn.

De synthese van één of meer van de in de beschrijving beschreven nucleïnezuren ligt binnen het vermogen van de deskundige op dit gebied. Deze synthese is onder andere beschreven in Beaucage S.L. en Iyer R.P., Tetrahedron 1992; 48: 10 2223-2311. Beaucage S.L. en Iyer R.P., Tetrahedron 1993; 49: 6123-6194 en Caruthers M.H. et al., Methods Enzymol. 1987; 154: 287-313, de synthese van thioaten is onder andere beschreven in Eckstein F., Annu. Rev. Biochem. 1985; 54: 367-402, de synthese van RNA-moleculen is beschreven in Sproat B., in Humana Press 2005, uitgegeven door Herdewijn P.; hoofdstuk 2: 17-31 en respectievelijke downstreamprocessen zijn 15 onder andere beschreven in Pingoud A. et al., in IRL Press 1989, uitgegeven door Oliver R.W.A.; hoofdstuk 7: 183-208 en Sproat B., in Humana Press 2005, uitgegeven door Herdewijn P.; hoofdstuk 2: 17-31 (supra).

siRNA voor RTP801 kan geproduceerd worden onder toepassing van methoden die uit de stand der techniek bekend zijn, zoals ze hierboven beschreven zijn, 20 gebaseerd op de bekende sequentie van RTP801 (SEQ ID NO: 1) en kan stabiel worden gemaakt door toepassing van verschillende modificaties zoals zij hierboven beschreven zijn. Voor verdere informatie zie voorbeeld 9.

Verder met betrekking tot de methoden van de onderhavige uitvinding zoals zij hierin in de beschrijving beschreven zijn, kunnen additionele RNA-moleculen 25 worden toegepast met deze methoden, bijvoorbeeld omvatten remmende RNA-moleculen van de onderhavige uitvinding oligoribonucleotiden met één enkele streng die bij voorkeur stukken omvatten van ten minste 7-10 achtereenvolgende nucleotiden aanwezig in de sequenties gedetailleerd in de tabellen A-D, waarbij de oligoribonucleotiden in staat zijn tot vorming (en/of omvattende) dubbelstrenggebieden in bepaalde 30 conformaties die erkend worden door intracellulaire complexen, hetgeen leidt tot de degradatie van de oligoribonucleotiden tot kleinere RNA-moleculen die in staat zijn tot het uitoefenen van een remming van hun corresponderende endogene gen en DNA-moleculen coderende voor deze RNA-moleculen. Het corresponderende endogene gen 106 is bij voorkeur het 801-gen en kan bovendien het VEGF-gen en/of het VEGF-Rl-gen zijn. De uitvinding verschaft tevens een samenstelling die het bovenbeschreven enkel-voudige-strengoligoribonucleotide in een drager, bij voorkeur een farmaceutisch aanvaardbare drager, omvat.

5 Bovendien verschaft de onderhavige uitvinding een combinatietherapie voor alle ziektetoestanden die in de beschrijving beschreven zijn en in bijzondere ziektetoestanden die de choroïdale neovascularisatie omvat. In deze combinatietherapie worden zowel de RTP801- als de VEGFR-genen geremd ter verbetering van de symptomen van de onder behandeling zijnde ziekten. Deze genen kunnen geremd zijn met 10 een combinatie van één of meer siRNA’s of antilichamen of aptameren. De onderhavige uitvinding verschaft tevens een nieuwe farmaceutische samenstelling die een RTP801-inhibitor en een VEGF- of VEGFR-1-inhibitor omvat, waarbij de RTP801-inhibitor bij voorkeur een siRNA is, bij voorkeur een siRNA-molecuul is dat weergegeven is in de tabellen A-D en in het bijzonder siRNA nrs. 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 15 42, 49 en 50 van tabel A of siRNA nrs.: 257, 260-262 en 264-268 van tabel D en de VEGF/VEGFR-1-inhibitor is eventueel een antilichaam of aptameer. Het gecombineerde gebruik van deze verbindingen (ofwel RTP801 -siRNA- en VEGF-antilichaam of elk ander gecombineerd voorbeeld dat in de beschrijving beschreven is) bij de bereiding van een geneesmiddel is tevens een onderdeel van de onderhavige uitvinding.

20 Dus RTP801-siRNA, zoals een siRNA-molecuul weergegeven in tabellen A-D en in het bijzonder siRNA nrs.: 14, 22,23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 en 50 van tabel A of siRNA nrs.: 257, 260-262 en 264-268 van tabel D kunnen worden toegediend tezamen met middelen die als target hebben VEGF of VEGF-receptor 1 (VEGFR1). Deze middelen bestaan heden op de markt of verkeren in verschillende stadia van de toela-25 tingsprocedure en werken via verschillende mechanismen. Antilichamen en anti-lichaamfragmenten, zoals ranibizumab (Lucentis, Genentech) binden zich aan afgegeven VEGF voor het remmen van de binding van VEGF aan actieve receptoren. Een aptameer dat kan fungeren als een ligand/antilichaam (Macugen, Eyetech/Pfizer, recentelijk door de FDA toegelaten voor nat AMD) is tevens een mogelijkheid. Macugen 30 bindt zich met extracellulair VEGF voor het blokkeren van zijn activiteit. Deze geneesmiddelen worden lokaal toegediend door middel van een intravitreale injectie. Op anti-VEGF-siRNA gebaseerde verbindingen (zoals Acuity’s Cand5-inhibitor van VEGF of siRNA’s 027-inhibitor van VEGFR-1) zijn tevens beschikbaar. Bovendien 107 wordt gerapporteerd dat het kleine molecuul aminosterol Squalamine (Genaera) dat systemisch wordt toegediend in vele facetten van het angiogene proces, waaronder het remmen van VEGF en andere groeifactorsignalering in endotheliale cellen, interfereert.

De simultane toediening van een RTP801-inhibitor, bij voorkeur een 5 siRNA en één of meer van de bovenstaande VEGF/VEGFR-1 -remmers kunnen een synergistisch effect hebben, waarbij de gecombineerde behandeling meer effectief is dan behandeling door één of meer van deze afzonderlijke samenstellingen ongeacht de dosering in de enkelvoudige therapieoptie. Dit synergistische effect wordt tevens ondersteund door de eerste resultaten, zoals gedetailleerd in voorbeeld 6.

10 RTP801i heeft een verschillend mechanisme van werking en is potentieel synergistisch met VEGF-VEGFR-inhibitoren. Een onderzoek in RTP801-KO-muizen geeft aan dat een beschermend fenotype in de KO-muizen blijft bestaan ondanks het feit dat expressie van VEGF-mRNA in het oog even hoog is als in de WT-muizen. Onze additionele eerste data geven aan dat inhibitie van RTP801 synergistisch kan zijn 15 met de inhibitie van de VEGF-VEGFR-regulerende as bij de behandeling van retinale pathologie. De uitvinders van de onderhavige uitvinding hebben in geschikte experimenten gevonden dat toediening van siRNA tegen RTP801 in een model van AMD (zie onderstaand voorbeeld 6) niet slechts tot downregulering van RTP801 zelf, maar tevens ten gevolge hiervan tot het upreguleren van de antiangiogene en neurobeschermende 20 factor PEDF alsmede het downreguleren van de expressie van MCP1, een macrofaag chemobindende proteïne, leidt. Dus inhibitie van RTP801 verleent simultaan antiangio-genen, neurobeschermende en anti-ontstekingseffecten.

Zoals beschreven in de beschrijving kunnen aptameren ook in de onderhavige uitvinding in combinatie met de nieuwe siRNA’s die in de beschrijving beschre-25 ven zijn worden toegepast. Bijvoorbeeld kan een aptameer worden toegepast met één of meer van de siRNA’s die in de beschrijving beschreven zijn in een combinatietherapie voor de behandeling van één of meer van de in de beschrijving beschreven ziektetoestanden. De nieuwe farmaceutische samenstelling die toegepast wordt voor deze combinatietherapie, die tevens onderdeel van de onderhavige uitvinding is, kan een siRNA 30 van de onderhavige uitvinding al dan niet covalent aan een aptameer omvatten. Aptameren zijn RNA of DNA enkelvoudige streng of dubbele streng oligonucleïnezuren die aan een targetproteïne binden en in het algemeen geen niet-specifieke effecten vertonen. Aptameren kunnen voor stabiliteit of andere gewenste eigenschappen gemodifï- 108 ceerd zijn volgens één of meer nucle'üiezuurmodificaties die in de beschrijving beschreven zijn en/of die welke de deskundige bekend zijn. Modificaties aan aptameren kunnen op elke plek in het molecuul worden geïntroduceerd, zoals de 5'- of 3'-termini, of op elk intem gedefinieerde modificatielocatie. Bijvoorbeeld kunnen RNA-aptameren 5 gestabiliseerd worden met 2-fluor- of 2'-aminogemodificeerde pyrimidinen. Aptameren kunnen eveneens verbonden zijn met reportermoleculen of linker/brugvormende verbindingen en kunnen zonodig gehecht zijn aan parels of andere vaste drager (bijvoorbeeld 5'- of 3'-amino-, thiolester- of biotinegroepen). Thioaptameren zijn aptameren die zwavelmodificaties bevatten op specifieke intemucleosidefosforyllocaties en 10 kunnen een verhoogde stabiliteit, nucleasebestendigheid, targetaffiniteit en/of selectiviteit bezitten. Voorbeelden van thioaptameren omvatten fosformonothioaat (S-ODN) en fosfordithioaat (S2-ODN) oligodeoxythioaptameren. Voor verdere informatie op aptameren en thioaptameren zie de Amerikaanse octrooischriften 5.218.088 en 6.423.493.

15 Begrepen dient te worden dat in de context van de onderhavige uitvinding één of meer van de siRNA-moleculen die in de beschrijving beschreven zijn of één of meer lange dubbelstreng-RNA-moleculen (gewoonlijk 25-500 nucleotiden in lengte) die geprocessed worden door endogene cellulaire complexen (zoals DICER - zie hierboven) ter vorming van de siRNA-moleculen die in de beschrijving beschreven zijn 20 dan wel moleculen die de siRNA-moleculen die in de beschrijving beschreven zijn omvatten, toegepast kunnen worden bij de behandeling van die ziekten of aandoeningen die in de beschrijving beschreven zijn.

Additionele aandoeningen die behandeld kunnen worden door middel van de moleculen en samenstellingen van de onderhavige uitvinding omvatten alle typen 25 choroïdale neovascularisatie (CNV), welke optreden niet slechts in nat AMD, maar tevens in andere oculaire pathologieën, zoals oculaire histoplasmose, zoals het oculaire histoplasmosesyndroom, angiodestrepen, breuken in Bruch’s membraan, myopische degeneratie, oculaire tumoren en enige retinale degeneratieve ziekten.

Een additioneel aspect van de onderhavige uitvinding verschaft methoden 30 voor de behandeling van met apoptose geassocieerde ziekten. Methoden voor de therapie van ziekten of aandoeningen die geassocieerd zijn met een ongecontroleerde, pathologische celgroei, bijvoorbeeld kanker, psoriasis, autoimmune ziekten onder andere, en methoden voor de therapie van ziekten die geassocieerd zijn met ischemie en gebrek 109 aan een adequate bloedstroom, bijvoorbeeld myocardiaal infarct en beroerte worden verschaft. De term “kanker” of “tumor” heeft betrekking op een ongecontroleerde groeiende massa van abnormale cellen. Deze termen omvatten beide primaire tumoren die goedaardig of kwaadaardig kunnen zijn, alsmede secundaire tumoren of metastasen 5 die zich naar andere plekken in het lichaam verspreid hebben. Voorbeelden van kankerachtige ziekten omvatten onder andere carcinoma (bijvoorbeeld borst, colon en long), leukemie zoals B-celleukemie, lymfoma zoals B-cellymfoma, blastoma zoals neuroblastoma en melanoma.

De uitvinding verschaft tevens een samenstelling die één of meer van de 10 verbindingen volgens de uitvinding in een drager, bij voorkeur een farmaceutisch aanvaardbare drager omvat. Deze samenstelling kan een mengsel omvatten van twee of meer siRNA’s voor verschillende genen of verschillende siRNA’s voor hetzelfde gen. Een samenstelling die siRNA voor het RTP801-gen en siRNA voor het VEGF-gen en/of het VEGF-Rl-gen omvat, komt in aanmerking.

15 Een andere verbinding volgens de uitvinding omvat de bovenstaande verbinding volgens de uitvinding (structuur A) al dan niet covalent gebonden aan één of meer verbindingen volgens de uitvinding (structuur A). Deze verbinding kan in een drager worden afgegeven, bij voorkeur een farmaceutisch aanvaardbare drager en kan intracellulair geprocessed worden door middel van endogene cellulaire complexen voor 20 het produceren van één of meer siRNA’s volgens de uitvinding. Een andere verbinding volgens de uitvinding omvat de bovenstaande verbinding volgens de uitvinding (structuur A) die al dan niet covalent gebonden is aan een siRNA voor een ander gen, in het bijzonder het VEGF-gen en/of het VEGF-Rl-gen.

De onderhavige uitvinding omvat tevens een nieuwe chemische entiteit die 25 een RTP801-inhibitor, bij voorkeur een siRNA, is die chemisch gebonden is, al dan niet covalent met één van de bovenstaande VEGF/VEGF-R1-remmers. Een bijzondere chemische entiteit die in aanmerking komt is een siRNA-RTP801-inhibitor die covalent gebonden is aan een antilichaam tegen VEGF óf de VEGF-receptor-1. Een additionele chemische entiteit die in aanmerking komt is een al dan niet gemodificeerd DNA-ap-30 tameer dat VEGF-receptor-1 als target heeft dat covalent gebonden is aan RTP801-siRNA dat in de beschrijving beschreven is. Zonder aan enige theorie gebonden te willen zijn zou het aptameer onderdeel van deze farmaceutische samenstelling aan de VEGF-receptor-1 binden en in de cel worden opgenomen, waarna het siRNA-gedeelte 110 van het molecuul de RTP801-expressie in de cel zal remmen. Een dergelijke farmaceutische stof zou dus het voordeel hebben van een verhoogde selectiviteit en targeting alsmede de additionele voordelen van een combinatietherapie zoals zij in de beschrijving beschreven is. Productiemethoden voor deze nieuwe chemische entiteiten zijn de S deskundigen bekend.

De onderhavige uitvinding omvat tevens een tandemdubbelstrengstructuur welke twee of meer siRNA-sequenties omvat, die intracellulair geprocessed wordt ter vorming van twee of meer verschillende siRNA’s, één dat 801 remt en een tweede dat VEGF/VEGFR-1 remt. In een aanverwant aspect omvat de onderhavige uitvinding 10 tevens een tandemdubbelstrengstructuur die twee of meer siRNA-sequenties omvat, die intracellulair ontleed wordt ter vorming van twee of meer verschillende siRNA’s die beide 801 remmen.

In het bijzonder wordt gedacht dat een lang oligonucleotide (gewoonlijk ongeveer 80-500 nucleotiden in lengte) die één of meer hoofd- en lusstructuren bezit, 15 waarbij hoofdgebieden de sequenties omvatten van de oligonucleotiden volgens de uitvinding in een drager, bij voorkeur een farmaceutisch aanvaardbare drager, afgegeven kan worden en intracellulair geprocessed kan worden door middel van endogene cellulaire complexen (bijvoorbeeld door DROSHA en DICER zoals hierboven beschreven) ter productie van één of meer kleinere dubbelstrengoligonucleotiden 20 (siRNA’s) die oligonucleotiden volgens de uitvinding zijn. Dit oligonucleotide kan een tandem-shRNA-construct worden genoemd. Gedacht wordt dat dit lange oligonucleotide een enkelvoudige streng oligonucleotide is dat één of meer hoofd- en loopstructu-ren omvat, waarbij elk hoofdgebied een sens en een corresponderende antisens siRNA-sequentie van een 801-gen omvat. In het bijzonder wordt gedacht dat dit oligonucleo-25 tide sens en antisens siRNA-sequenties, zoals weergegeven in één van de tabellen A-D, omvat. Op een andere wijze kan het tandem-shRNA-construct sens en corresponderende antisens siRNA-sequentie van een 801-gen en bovendien een sens en een corresponderende antisens siRNA-sequentie van een verschillend gen, zoals VEGF of VEGF-R1 omvatten.

30 Zoals vermeld in de beschrijving kan siRNA tegen RTP801 de hoofd ac tieve component zijn in een farmaceutische samenstelling dan wel kan een actieve component zijn van een farmaceutische samenstelling die twee of meer siRNA’s bevat (of moleculen die voor twee of meer siRNA’s coderen of endogeen produceren, of een

Ill mengsel van moleculen of één of meer tandemmolecuul dat voor twee of meer siRNA’s codeert), waarbij de farmaceutische samenstelling verder bestaat uit één of meer additioneel siRNA-molecuul dat één of meer additionele genen als target heeft. Simultane inhibitie van RTP801 en één of meer additionele genen zullen waarschijnlijk een addi-5 tief of synergistisch effect hebben voor de behandeling van de ziekten die in de beschrijving beschreven zijn, als volgt:

Acuut renaal falen (ARF) en andere microvasculaire aandoeningen, alsmede gehoorbeschadigingen en drukzweren: de farmaceutische samenstelling voor de behandeling van ARF kan samengesteld zijn uit de volgende combinaties van verbin-10 dingen: 1) RTP801-siRNA en p53-siRNA-dimeren; 2) RTP801 en Fas-siRNA-dime-ren; 3) RTP801 en Bax-siRNA-dimeren; 4) RTP801 en Fas-siRNA-dimeren; 5) RTP801 en Bax-siRNA-dimeren; 6) RTP801 en Noxa-siRNA-dimeren; 7) RTP801 en Puma-siRNA-dimeren; 8) RTP801 (REDD1) en RTP801L (REDD2) siRNA-dimeren; 9) RTP801-siRNA, Fas-siRNA en elk van de RTP801L-siRNA-p53-siRNA, Bax-15 siRNA, Noxa-siRNA of Puma-siRNA ter vorming van trimeren of polymeren (ofwel tandemmoleculen die voor drie of meer siRNA’s coderen).

Verdere additionele farmaceutische samenstellingen voor combinatiethera-pieën voor ARF, gehoorbeschadigingen, drukzweren en elke andere ziekte of ziektetoestand beschreven in de beschrijving kunnen twee siRNA’s omvatten, waarbij het eerste 20 siRNA een RTP801-siRNA is dat bij voorkeur gekozen is uit de tabellen A-D en het tweede siRNA dat al dan niet covalent gebonden is aan het eerste siRNA of gemengd is met het eerste siRNA, een siRNA is dat een gen als target heeft, dat gekozen is uit de volgende groep: tumorproteïne p53-bindingproteïne, 2 (TP53BP2); leucinerijke zich herhalende eenheden en dood gebied dat (LRDD) bevat; cytochroom b-245, alfapoly-25 peptide (CYBA); activerende transcriptiefactor 3 (ATF3); caspase 2, met apoptose geassocieerde cysteïnepeptidase (neurale precursorcel tot expressie gebracht, met betrekking tot ontwikkeling gedownreguleerd 2) (CASP2); NADPH-oxidase 3 (NOX3); harakiri, BCL2 in wisselwerking tredende proteïne (HRK); complement component 1, q subcomponentbindingproteïne (C1QBP); BCL2/adenovirus E1B 19kDa in wissel-30 werking tredende proteïne 3 (BNIP3); mitogengeactiveerde proteïnekinase 8 (MAPK8); mitogengeactiveerde proteïnekinase 14 (MAPK14); rasgerelateerde C3-botulinumtoxinesubstraat 1 (rho-familie, kleine GTP-bindingproteïne Racl); glycogen-synthasekinase 3 bèta (GSK3B); purinergische receptor P2X, met een ligand afgesloten 112 ionkanaal, 7 (P2RX7); overgangsreceptorpotentiaalkationkanaal, subfamilie M, lid 2 (TRPM2); poly (ADP-ribose) blycohydrolase (PARG); CD38-molecuul (CD38); STEAP-familie lid 4 (STEAP4); beendermorfogenetische proteïne 2 - BMP2; gap junction proteïne, alfa 1, 43kDa (connexine 43) (GJA1); TYRO-proteïnetyrosine-5 kinasebindingsproteïne (TYROBP); bindweefselgroeifactor (CTGF); afgescheiden fosfoproteïne 1 (osteopontine, beendersialoproteïne I, vroege T-lymfocyteactivering 1) (SPP1); reticulon 4-receptor (RTN4R); annexine A2 (ANXA2); rashomologe genfamilie, lid A (RHOA); en dual oxidase 1 (DUOX1);

Maculaire degeneratie (MD), diabetische retinopathie (DR), ruggenmerg-10 letsel: farmaceutische samenstelling voor de behandeling van MD, DR en ruggen-mergletsel kunnen samengesteld zijn uit de volgende combinatieverbindingen: 1) RTP801-siRNA gecombineerd met hetzij VEGF-siRNA, VEGF-Rl-siRNA, VEGF-R2-siRNA, PKC-bèta-siRNA, MCPl-siRNA, eNOS-siRNA, KLF2-siRNA, RTP801L-siRNA (hetzij fysisch gemengd of in een tandemmolecuul); 2) RTP801-siRNA in com-15 binatie met twee of meer siRNA’s van bovenstaande lijst (fysisch gemengd of in een tandemmolecuul coderende voor drie siRNA’s of een combinatie hiervan).

COPD en ademhalingsstoomissen: de farmaceutische samenstelling voor de behandeling van ademhalingsaandoeningen kunnen samengesteld zijn uit de volgende combinaties van verbindingen: RTP801-siRNA gecombineerd met siRNA tegen één of 20 meer van de volgende genen: elastasen, matrixmetalloproteasen, fosfolipasen, caspa-sen, sfmgomyelinase en ceramidesynthase.

Bovendien kunnen RTP801-siRNA of elk nucleïnezuurmolecuul dat RTP801 -siRNA omvat of hiervoor codeert, al dan niet covalent gebonden zijn aan een antilichaam of aptameer, teneinde een verhoogde targetting te bereiken voor de behan-25 deling van de ziekten die in de beschrijving beschreven zijn, als volgt: ARF: anti-Fas-antilichaam (bij voorkeur neutraliserende antilichamen).

Maculaire degeneratie, diabetische retinopathie, ruggenmergietsel: anti-Fas-30 antilichaam of -aptameer, anti-MCPl-antilichaam of -aptameer, anti-FEGFRl en anti-VEGFR1-antilichaam of -aptameer. De antilichamen dienen bij voorkeur neutraliserende antilichamen te zijn.

113

Alle moleculen, zoals bijvoorbeeld antisens DNA-moleculen die de siRNA-sequenties die in de beschrijving beschreven zijn omvatten (met de adequate nudeïne-zuurmodificaties) zijn bijzonder wenselijk en kunnen worden gebruikt in dezelfde capaciteit als hun corresponderende siRNA’s voor alle toepassingen en methoden die in 5 de beschrijving beschreven zijn.

De uitvinding omvat tevens een methode voor de behandeling van een patiënt die lijdt aan een aandoening, zoals de aandoeningen die in de beschrijving beschreven zijn, welke het toedienen aan een patiënt omvat van de bovenstaande samenstelling of verbinding in een therapeutisch werkzame dosering, waardoor de patiënt 10 hiermee behandeld wordt.

Onder “antisens” (AS) of “antisens fragment” wordt bedoeld een polynucleotidefragment (dat deoxyribonucleotiden, ribonucleotiden of een mengsel van beide omvat) dat een remmende antisens activiteit heeft, waarbij de activiteit een afname veroorzaakt in de expressie van de endogene genomische kopie van het overeen-15 komstige gen (in dit geval RTP801). Een RTP801-AS-polynucleotide is een polynucleotide dat achtereenvolgende nucleotiden omvat die een sequentie van voldoende lengte en homologie ten opzichte van een sequentie aanwezig binnen de sequentie van het RTP801-gen weergegeven in SEQ ID NO: 1, heeft, om hybridisatie van het AS met het gen mogelijk te maken. De sequentie van AS wordt ontworpen om een target-mRNA 20 van belang te complementeren en een RNA:AS-duplex te vormen. Deze duplex-vorming kan processing, splitsing, transport of translatie van het relevante mRNA verhinderen. Bovendien kunnen bepaalde AS-nucleotidensequenties een cellulaire RNase-H-activiteit veroorzaken wanneer zij gehybridiseerd worden met hun target-mRNA, hetgeen resulteert in mRNA-degradatie (Calabretta et al., 1996: Antisense strategies in 25 the treatment of leukemias. Semin Oncol. 23(1):78-87). In dat geval zal RNase-H de RNA-component van de duplex splitsen en kan het AS potentieel afgeven ter verdere hybridisatie met additionele moleculen van het target-RNA. Een additionele wijze van werking resulteert uit de interactie van AS met genoom DNA ter vorming van een drievoudige helix die transcriptioneel inactief kan zijn. Bijzondere AS-firagmenten zijn de 30 AS van het DNA coderende voor de bijzondere fragmenten van RTP801, zoals zij in de beschrijving beschreven zijn.

Vele overzichtartikelen hebben de hoofdaspecten van antisens (AS) technologie en zijn therapeutisch potentiaal behandeld (Wright & Anazodo, 1995.

114

Antisense Molecules and Their Potential For The Treatment Of Cancer and AIDS. Cancer J 8:185-189). Er zijn overzichten over de chemische (Crooke, 1995. Progress in antisense therapeutics, Hematol. Pathol. 2:59; Uhlmann en Peyman, 1990. Antisense Oligonucleotides: A New Therapeutic Principle. Chem Rev 90(4):543-584), cellulaire 5 (Wagner, 1994. Gene inhibition using antisense oligodeoxynucleotides. Nature 372:333) en therapeutische (Hanania et al. 1995. Recent advances in the application of gene therapy to human disease. Am. J. Med. 99:537; Scanlon et al., 1995. Oligonucle-otides-mediated modulation of mammalian gene expression. FASEB J. 9:1288; Gewirtz, 1993. Oligodeoxynucleotide-based therapeutics for human leukemias, Stem 10 Cells Dayt. 11:96) aspecten van deze technologie.

Antisens interventie in de expressie an specifieke genen kan tot stand worden gebracht door de toepassing van synthetische AS-oligonucleotidesequenties (zie Lefebvre-d’Hellencourt et al., 1995. Immunomodulation by cytokine antisense oligonucleotides. Eur. Cytokine Netw. 6:7; Agrawal, 1996. Antisense oligonucleotides: 15 towards clinical trials, TIBTECH, 14:376; Lev-Lehman et al., 1997. Antisense Oligomers in vitro and in vivo. In Antisense Therapeutics, A. Cohen and S. Smicek, uitgevers (Plenum Press, New York)). AS-oligonucleotidesequenties zijn ontworpen om een tar-get-mRNA van belang te complementeren en een RNA:AS-duplex te vormen. Deze duplexvorming kan processing, splitsing, transport of translatie van het relevante 20 mRNA verhinderen. Bovendien kunnen bepaalde AS-nucleotidesequenties cellulaire RNase-H-activiteit veroorzaken wanneer zij gehybridiseerd worden met hun target-mRNA, hetgeen resulteert in mRNA-ontleding (Calabretta et al., 1996. Antisense strategies in the treatment of leukemias. Semin. Oncol. 23:78). In dit geval zal RNase-H de RNA-component van het duplex splitsen en kan het AS potentieel afgeven ter verdere 25 hybridisering met additionele moleculen van het target-RNA. Een additionele wijze van werking resulteert uit de interactie van AS met genomische DNA ter vorming van een drievoudige helix die transcriptioneel inactief kan zijn.

Het sequentietargetsegment voor het antisens oligonucleotide wordt zodanig gekozen dat de sequentie een geschikte energie vertoont die gerelateerd is met 30 kenmerken die belangrijk zijn voor de oligonucleotideduplexvorming met hun complementaire templates en vertoont een laag potentieel voor zelfdimerisatie of zelf-complementering (Anazodo et al., 1996). Bijvoorbeeld kan het computerprogramma OLIGO (primer Analysis Software, versie 3.4) worden gebruikt ter bepaling van anti- 115 sens sequentiesmelttemperatuur, vrije energie-eigenschappen en ter beoordeling van de potentiaal zelfdimeervorming en zelfcomplementaire eigenschappen. Het programma maakt de bepaling mogelijk van een kwantitatieve beoordeling van deze twee parameters (potentieel zelfdimeervorming en zelfcomplementariteit) en verschaft een indicatie 5 van “geen potentieel” of “enig potentieel” of “wezenlijk volledig potentieel”. Onder toepassing van dit programma worden targetsegmenten in het algemeen gekozen die beoordeeld zijn als geen potentieel in deze parameters. Echter kunnen segmenten worden gebruikt die “enig potentieel” hebben in één van de categorieën. Een balance van de parameters wordt gebruikt in de selectie zoals uit de stand der techniek bekend is. 10 Verder worden de oligonucleotiden tevens geselecteerd naar behoefte zodat een analoge substitutie de functie nagenoeg niet beïnvloedt.

Fosforthioaatantisens oligonucleotiden vertonen gewoonlijk geen significante toxiciteit bij concentraties die werkzaam zijn en vertonen voldoende farmacody-namische halfwaardetijden in dieren (Agrawal, 1996. Antisense oligonucleotides: to-15 wards clinical trials, TIBTECH, 14:376) en zijn nucleaseresistent. Antisens geïnduceerde verlies-aan-functie-fenotypen gerelateerd met cellulaire ontwikkeling zijn aangetoond voor de gliale fïbrillaire zure proteïne (GFAP), voor het tot stand komen van een tectale plaatvorming bij een kuikentje (Calileo et al., 1991, J. Cell. Biol., 112:1285) and voor de N-myc-proteïne die verantwoordelijk is voor het instandhouden van de 20 cellulaire heterogeniteit in neuro-ectodermale cultures (epitheliaal versus neuroblasti-sche cellen die verschillen in hun kolonievormend vermogen, tumorigeniciteit en hechting) (Rosolen et al., 1990, Cancer Res. 50:6316; Whitesell et al., 1991. Episome-generated N-myc antisense RNA restricts the differentiation potential of primitive neuroectodermal cell lines. Mol. Cell. Biol. 11:1360). Antisens oligonucleotide-inhibi-25 tie van basisfibroblastgroeifactor (bFgF), met mitogene en angiogene eigenschappen remde 80% van de groei in gliomacellen (Morrison, 1991. Suppression of basic fibroblast growth factor expression by antisense oligonucleotides inhibits the growth of transformed human astrocytes. J. Bio. Chem. 266:728) op een bevredigende en specifieke wijze. Antisens oligonucleotiden zullen aangezien zij hydrofoob zijn, goed in 30 wisselwerking treden met fosfolipide membranen (Akhter et al., 1991. Interactions of antisense DNA oligonucleotide analogs with phospholipid membranes (liposomes) Nuc. Res. 19:5551-5559). Na him interactie met het cellulaire plasmamembraan worden zij actief (of passief) getransporteerd in levende cellen (Loke et al., 1989.

116

Characterization of oligonucleotide transport into living cells. PNAS USA 86:3474), in een verzadigbaar mechanisme waarvan voorspeld wordt specifieke receptoren te omvatten (Yakubov et al., 1989, PNAS USA 86:6454).

Een “ribozyme” is een RNA-molecuul dat een RNA-katalytisch vermogen 5 bezit (zie Cech voor een overzicht) en splitst een specifieke locatie in een target-RNA.

Volgens de onderhavige uitvinding kunnen ribozymen die RTP801-mRNA splitsen als RTP801-inhibitoren worden gebruikt. Dit kan noodzakelijk zijn in gevallen waarbij antisens therapie beperkt is door stoichiometrische overwegingen (Sarver et al., 1990, Gene Regulation and Aids, blz. 305-325). Ribozymen kunnen vervolgens worden 10 gebruikt die de RTP801-sequentie als target zullen hebben. Het aantal RNA-moleculen die door een ribozyme gesplitst worden is groter dan het aantal voorspeld door de stoi-chiometrie (Hampel en Tritz, 1989; Uhlenbeck, 1987).

Ribozymen katalyseren de fosfodiesterbindingsplitsing van RNA. Verscheidene ribozyme structurele families zijn geïdentificeerd waaronder Groep I introns, 15 RNase P, de hepatitis delta virus ribozyme, hamerhoofdribozymen en de haarpinribo-zyme oorspronkelijk afgeleid van de negatieve streng van de tabakringspotvirussatelliet RNA (sTRSV) (Sullivan, 1994; Amerikaanse octrooiaanvrage 5.225.347, kolommen 4- 5). De laatstgenoemde twee families zijn afgeleid van viroïden en virusoïden, waarin de ribozyme waarschijnlijk monomeren van oligomeren produceert tijdens de rollende 20 cirkelreplicatie (Symons, 1989 en 1992) scheidt. Hamerhoofd- en haarpinribozyme-patronen zijn gewoonlijk aangepast voor transsplitsing van mRNA’s voor gentherapie (Sullivan, 1994). Het volgens de uitvinding toegepaste ribozymetype wordt op bekende wijze geselecteerd. Haarpinribozymen verkeren nu in een klinische test en verdienen de voorkeur. In het algemeen bevat het ribozyme 30-100 nucleotiden. Afgifte van ribozy-25 men is vergelijkbaar met die van AS-ffagmenten en/of siRNA-moleculen.

Opgemerkt zal worden dat alle te gebruiken polynucleotiden in de onderhavige uitvinding modificaties kunnen ondergaan zodat zij verbeterde therapeutische eigenschappen zullen hebben. Modificaties of analoga van nucleotiden kunnen geïntroduceerd worden ter verbetering van de therapeutische eigenschappen van deze poly-30 nucleotiden. Verbeterde eigenschappen omvatten een verhoogde nucleaseresistentie en/of een verhoogd vermogen tot het doordringen van celmembranen. Nucleaseresistentie wordt zo nodig verschaft door elke op zichzelf bekende methode die niet interfereert met de biologische activiteit van het AS-polynucleotide, siRNA, cDNA en/of 117 ribozymen, zoals vereist voor de methode voor gebruik en afgifte (Iyer et al., 1990; Eckstein, 1985; Spitzer en Eckstein, 1988; Woolf et al., 1990; Shaw et al., 1991). Modificaties die op oligonucleotiden gedaan kunnen worden ter verhoging van de nuclea-seresistentie omvatten het modificeren van het fosfor- of zuurstofheteroatoom in het 5 fosfaatskelet. Deze omvatten de bereiding van methylfosfonaten, fosforthioaten, fos-fordithioaten en morfolino-oligomeren. In één uitvoeringsvorm wordt deze verschaft door het hebben van fosforthioaatbindingen die een verbinding maken tussen de vier tot zes 3 '-terminusnucleotidebasen. Op een andere wijze verbinden fosforthioaatbindingen alle nucleotidebasen. Andere modificaties die uit de stand der techniek bekend zijn 10 kunnen worden toegepast daar waar de biologische activiteit is behouden, maar de stabiliteit tot nucleasen wezenlijk verhoogd is.

Alle analoga van of modificaties aan een polynucleotide kunnen in de onderhavige uitvinding worden toegepast vooropgesteld dat het analoog of de modificatie de functie van het polynucleotide niet wezenlijk beïnvloedt. De nucleotiden kun-15 nen worden gekozen uit de in de natuur voorkomende of synthetisch gemodificeerde basen. In de natuur voorkomende basen omvatten adenine, guanine, cytosine, thymine en uracil. Gemodificeerde basen van nucleotiden omvatten inosine, xanthine, hypoxanthine, 2-aminoadenine, 6-methyl, 2-propyl en andere alkyladeninen, 5-halo-geenuracil, 5-halogeencytosine, 6-azacytosine en 6-azathymine, pseudo-uracil, 4-20 thiuracil, 8-halogeenadenine, 8-aminoadenine, 8-thioladenine, 8-thiolalkyladeninen, 8-hydroxyladenine en andere 8-gesubstitueerde adeninen, 8-halogeenguaninen, 8-amino-guanine, 8-thiolguanine, 8-thioalkylguaninen, 8-hydroxylguanine en andere gesubstitueerde guaninen, andere aza- en deaza-adeninen, andere aza- en deazaguaninen, 5-tri-fluormethyluracil en 5-trifluorcytosine.

25 Bovendien kunnen analoga van polynucleotiden worden bereid waarbij de structuur van het nucleotide fundamenteel gewijzigd is en zijn beter aangepast aan therapeutische of experimentele reagentia. Een voorbeeld van een nucleotideanalogon is een peptide-nucleïnezuur (PNA), waarbij het deoxyribose (of ribose) fosfaatskelet in DNA (of RNA) vervangen is door een polyamideskelet dat vergelijkbaar is met dat welke in 30 peptiden wordt gevonden. PNA-analoga bleken resistent te zijn tegen ontleding door enzymen en een verlengde levensduur in vivo en in vitro te hebben. Verder bleken PNA’s sterker te binden aan een complementaire DNA-sequentie dan een DNA-mole-cuul. Deze waarneming wordt toegeschreven aan het gebrek van ladingsafstoting tussen 118 de PNA-streng en de DNA-streng. Andere modificaties die geïntroduceerd kunnen worden in oligonucleotiden omvatten polymere skeletten, cyclische skeletten of acycli-sche skeletten.

De in de onderhavige uitvinding toegepaste polypeptiden kunnen eveneens 5 gemodificeerd zijn, eventueel chemisch gemodificeerd zijn, ter verbetering van hun therapeutische activiteit. “Chemisch gemodificeerd” - wanneer deze term betrekking heeft op de polypeptiden, betekent een polypeptide waar ten minste één van de amino-zuurgroepen gemodificeerd is door natuurlijke processen, zoals het processen of andere posttranslationele modificaties dan wel door chemische modificatietechnieken die uit 10 de stand der techniek bekend zijn. Onder talrijke bekende modificaties omvatten gebruikelijke modificaties de volgende niet-uitsluitende voorbeelden: acetylering, acylering, amidering, ADP-ribosylering, glycosylering, GPI-ankervorming, covalente binding van een lipide of lipidederivaat, methylering, myristylering, pegylering, prenyle-ring, fosforylering, ubiqutinatie of soortgelijke processen.

15 Additionele mogelijke peptidemodificaties (zoals die resulterende van nucleïnezuursequentiewijziging) omvatten de volgende: “Conservatieve substitutie” - heeft betrekking op de substitutie van een aminozuur in één klasse door een aminozuur van dezelfde klasse, waarbij een klasse gedefinieerd wordt door gebruikelijke fysicochemische aminozuurzijketeneigenschappen en hoge 20 substitutiefrequenties in homologe polypeptiden die in de natuur worden gevonden, zoals bijvoorbeeld bepaald door een standaard DayhofF-frequentie-uitwisselingsmatrix of BLOSUM-matrix. Zes algemene klassen van aminozuurzijketens zijn in categorieën onderverdeeld en omvatten: Klasse I (Cys); Klasse II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); Klasse III (Asn, Asp, Gin, Glu); Klasse IV (His, Arg, Lys); Klasse V (Ile, Leu, Val, Met); en 25 Klasse VI (Phe, Tyr, Trp). Bijvoorbeeld, het vervangen van een Asp door een andere Klasse III-groep, zoals Asn, Gin of Glu, is een conservatieve vervanging/substitutie. “Niet-conservatieve substitutie” - heeft betrekking op de vervanging van een aminozuur in één klasse door een aminozuur van een andere klasse; bijvoorbeeld, vervanging van een Ala, een klasse II-groep, met een klasse III-groep, zoals Asp, Asn, Glu of Gin. 30 “Deletie” - is een verandering in een nucleotide- of aminozuursequentie, waarin één of meer nucleotiden of aminozuurgroepen, respectievelijk, afwezig is.

119 “Insertie” of “additie” - is de verandering in een nucleotide- of aminozuursequentie, die geresulteerd heeft in de additie van één of meer nucleotiden of aminozuurgroepen, respectievelijk, vergeleken met de in de natuur voorkomende sequentie.

“Substitutie” - vervanging van één of meer nucleotiden of aminozuren door 5 verschillende nucleotiden of aminozuren, respectievelijk. Met betrekking tot amino-zuursequenties kan de substitutie al dan niet conservatief zijn.

In een additionele uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding kan het RTP801 -polypeptide of polynucleotide worden gebruikt voor het diagnostiseren of detecteren van maculaire degeneratie in een patiënt. Een detectiemethode zou gewoon-10 lijk omvatten het testen op RTP801-mRNA of RTP801-polypeptide in een van een patiënt afkomstig monster.

“Detectie” - heeft betrekking op een methode voor het detecteren van een ziekte. Deze term kan betrekking hebben op de detectie van een predispositie op een ziekte of op de detectie van de ernst van de aandoening.

15 Met “homoloog/homologie”, zoals deze term in de uitvinding wordt ge bruikt wordt bedoeld ten minste ongeveer 70%, bij voorkeur ten minste ongeveer 75% homologie, met voordeel ongeveer ten minste 80% homologie, meer met voordeel ten minste ongeveer 90% homologie, zelfs nog meer met voordeel ten minste ongeveer 95%, bijvoorbeeld ten minste ongeveer 97%, ongeveer 98%, ongeveer 99% of zelfs 20 ongeveer 100% homologie. De uitvinding omvat tevens het feit dat deze polynucleoti-den en polypeptiden gebruikt kunnen worden op dezelfde wijze als de eerder vermelde in de beschrijving beschreven polynucleotiden en polypeptiden.

Op een andere wijze of bovendien kan “homologie” met betrekking tot sequenties betrekking hebben op het aantal posities met identieke nucleotiden of aminozuurgroepen, 25 gedeeld door het aantal nucleotiden of aminozuurgroepen in de kortere van de twee sequenties, waarbij de mate van gelijk lopen van de twee sequenties bepaald kan worden volgens de Wilbur en Lipman algoritme ((1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726); bijvoorbeeld, onder toepassing van een raamwerk van 20 nucleotiden, een woordlengte van 4 nucleotiden en een gappenalty of 4, kan een analyse met behulp van een compu-30 ter en interpretatie van de sequentiedata waaronder de mate van gerichtheid met voordeel worden uitgevoerd onder toepassing van in de handel verkrijgbare programma’s (bijvoorbeeld Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Ine., CA). Wanneer RNA-sequen-ties gerapporteerd worden als zijnde vergelijkbaar of als hebbende een graad van se- 120 quentie die identiek is of homoloog is met DNA-sequenties, thymidine (T) in de DNA-sequentie wordt beschouwd gelijk aan uracil (U) in de RNA-sequentie. RNA-sequen-ties die binnen de beschermingsomvang van de onderhavige uitvinding vallen kunnen van DNA-sequenties of hun complementen worden afgeleid door vervanging van 5 thymidine (T) in de DNA-sequentie door uracil (U).

Additioneel of op andere wijze kan aminozuursequentiegelijkenis of homologie worden bepaald, bijvoorbeeld onder toepassing van het BlastP-programma (Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402) en beschikbaar bij NCBI. De volgende referenties verschaffen algoritmen voor het vergelijken van de relatieve identiciteit of 10 homologie van aminozuurgroepen van twee polypeptiden en additioneel of anders met betrekking tot het bovenstaande, kan de leer in deze referenties worden gebruikt ter bepaling van het percentage homologie: Smith et al., (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489; Smith et al., (1983) Nucl. Acids Res. 11:2205-2220; Devereux et al., (1984) Nucl. Acids Res. 12:387-395; Feng et al., (1987) J. Molec. Evol. 25:351-360; Higgins et al., 15 (1989) CABIOS 5:151-153; en Thompson et al., (1994) Nucl. Acids Res. 22:4673- 4680.

“Met ten minste X% homologie” - met betrekking tot twee aminozuur- of nucleotide-sequenties heeft betrekking op het percentage groepen die identiek zijn in de twee sequenties wanneer de sequenties optimaal ten opzichte van elkaar gericht zijn. Dus 20 90% aminozuursequentie-identiciteit betekent dat 90% van de aminozuren in twee of meer optimaal opgestelde/gerichte polypeptidesequenties identiek zijn.

Een additionele uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding heeft betrekking op een farmaceutische samenstelling die een RTP801-inhibitor in een therapeutisch werkzame hoeveelheid als een actief ingrediënt en een farmaceutisch aan-25 vaardbare drager omvat. De inhibitor kan een biologische inhibitor, een organisch molecuul, een chemisch molecuul enz. zijn, waarbij de farmaceutische samenstelling een RTP801-inhibitor kan omvatten, dat een polynucleotide is dat achtereenvolgende nu-cleotiden omvat die een sequentie hebben die een antisens sequentie is ten opzichte van de sequentie weergegeven in figuur 1 (SEQ ID NO: 1). Verder kan de RTP801-inhibi-30 tor een vector zijn die deze polynucleotiden omvat. Bovendien kan de RTP801-inhibitor een monoklonaal antilichaam zijn die specifiek bindt aan een epitoop die 4-25 aminozuren weergegeven in figuur 2 (SEQ ID NO: 2) omvat, of een RNA-molecuul dat het RTP801-gen-mRNA als target heeft, zoals bijvoorbeeld een siRNA-molecuul (eventu- 121 eel weergegeven in de tabellen A-D en in het bijzonder siRNA nrs: 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 en 50 van tabel A of siRNA nrs: 257, 260-262 en 264-268 van tabel D) dan wel een ribozyme.

De actieve ingrediënten van de farmaceutische samenstelling kunnen oligonucleotiden 5 omvatten die nucleaseresistent zijn en die nodig zijn voor de uitvoering van de uitvinding dan wel een fragment daarvan, waarvan bewezen is dat het hetzelfde effect gericht tegen één of meer geschikte sequenties en/of ribozymen heeft. Combinaties van actieve ingrediënten, zoals beschreven in de onderhavige uitvinding kunnen worden gebruikt, waaronder combinaties van antisens sequenties.

10 Een additionele uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding verschaft de toepassing van een therapeutisch werkzame dosering van een RTP801-inhibitor voor de bereiding van een geneesmiddel voor het bevorderen van het herstel van een patiënt die lijdt aan een ruggenmergziekte of -letsel. In één uitvoeringsvorm is de inhibitor bij voorkeur een siRNA. In een andere uitvoeringsvorm is de inhibitor bij voorkeur struc-15 tuur A die in de beschrijving weergegeven is.

De uitvinding is beschreven op een illustratieve wijze en begrepen dient te worden dat de terminologie die gebruikt is bedoeld is als een beschrijvende terminologie die niet beperkend dient te worden uitgelegd.

Vanzelfsprekend zijn vele modificaties en variaties van de onderhavige 20 uitvinding in het licht van de bovenstaande leer mogelijk. Men dient derhalve te begrijpen dat binnen de beschermingsomvang van de aangehechte conclusies de uitvinding op een andere wijze dan die welke specifiek beschreven is uitgevoerd kan worden.

Door de hele aanvrage heen zijn verschillende publicaties, waaronder Amerikaanse octrooischriften, genoemd met auteur en jaar en de octrooischriften aan 25 de hand van een nummer. De openbaringen uit deze publicaties en octrooischriften en octrooiaanvragen zijn geheel bij wijze van referentie in de onderhavige aanvrage opgenomen teneinde de stand der techniek waartoe deze uitvinding behoort op volledige wijze te beschrijven.

122

KORTE BESCHRIJVING VAN DE FIGUREN

Fig. 1 geeft de coderende sequentie van het RTP801-gen (SEQ ID NO: 1) gedetailleerd weer; 5 Fig. 2 geeft de aminozuursequentie van het RTP801-polypeptide (SEQ ID NO: 2) gedetailleerd weer;

Fig. 3 is een diagram dat de exons, CDS, humane SNP’s en de positie van de verschillende nucleïnezuurmoleculen die humaanspecifiek of specifiek voor de mens, muis en rat in parallel weergeeft; 10 Fig. 4A-H geeft een panel van Westem-blot-analyseresultaten weer, die verkregen zijn na toepassing van verscheidene dubbelstrengnucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding op een eerste humane cellijn, waarbij het experiment tweemaal was uitgevoerd, aangeduid met experiment 1 en experiment 2, en waarbij het expressieniveau van pl 10a en p85 weergege-15 ven is als beladingscontroles en de intensiteit (dichtheid) van de RTP801-band is een mate voor de remmende activiteit van het bepaalde toegepaste dubbelstrengnucleïnezuur;

Fig. 5A-F geeft een panel van Westem-blot-analyseresultaten weer, die verkregen zijn na toepassing van verscheidene dubbelstrengnucleïnezuren volgens 20 de onderhavige uitvinding op een tweede humane cellijn, waarbij het experiment tweemaal werd uitgevoerd, aangeduid met experiment 1 en experiment 2 en waarbij het expressieniveau van pl 10a en p85 weergegeven is als beladingscontroles en de dichtheid van de RTP801-band is een mate voor de remmende activiteit .van het bepaalde toegepaste dub-25 belstrengnucleïnezuur;

Fig. 6A-C geeft een panel van Westem-blot-analyseresultaten weer, die verkregen zijn na toepassing van verscheidene dubbelstrengnucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding op de eerste humane cellijn bij verschillende concentraties, namelijk 10 nM (5A), 5 nM (5B) en 1 nM (5C), waarbij 30 het experiment tweemaal was uitgevoerd, aangeduid met experiment 1 en experiment 2 en waarbij het expressieniveau van pllOa en p85 is weergegeven als beladingscontroles en de dichtheid van de RTP801- 123 band is een mate voor de remmende activiteit van het bepaalde toegepaste dubbelstrengnucleïnezuur;

Fig. 7 geeft een panel van Westem-blot-analyseresultaten weer, die verkregen zijn door toepassing van verscheidene dubbelstrengnucleïnezuren vol-5 gens de onderhavige uitvinding op een muizencellijn, waarbij het expe riment tweemaal was uitgevoerd, aangeduid met experiment 1 en experiment 2, en waarbij het expressieniveau van pl 10a en p85 is weergegeven als beladingscontroles en de dichtheid van de RTP801-band is een mate voor de remmende activiteit van het bepaalde toegepaste dubbel- 10 strengnucleïnezuur;

Fig. 8 geeft de resultaten van experimenten in een muizen-AMD-modelsys- teem weer;

Fig. 9 geeft de resultaten van additionele experimenten in een muizen-AMD- modelsysteem weer; 15 Fig. 10 geeft de resultaten van experimenten in een niet-humaan primaat-AMD-modelsysteem weer;

Fig. 11A-B geeft de resultaten van additionele experimenten in een niet-humaan primaat-AMD-modelsysteem weer;

Fig. 12A-B geeft de resultaten van verdere additionele experimenten in een niet-hu- 20 maan primaat-AMD-modelsysteem weer;

Fig. 13A-B stelt een analyse van de experimentele resultaten die bereikt zijn in een niet-humaan primaat-AMD-model voor;

Fig. 14 stelt een additionele analyse van de experimentele resultaten die bereikt zijn in een niet-humaan primaat-AMD-model voor; 25 Fig. 15A-C laat de resultaten van een experiment waarbij de intratracheale instillatie van een RTP801 dat plasmide in muizen tot expressie brengt betrokken is, zien;

Fig. 16A-C laat de resultaten zien van een korte termijn (7 dagen) sigarettenrokenmodel in RTP801-KO- en -WT-muizen zien; 30 Fig. 17A-C laat de resultaten van een korte termijn sigarettenrokenmodel in WT-muizen geïnstilleeerd met actief anti-RTP801 (REDD 14) en controle (REDD8) siRNA zien; 124

Fig. 18 laat de resultaten van experimenten met RTP801-KO-muizen in een lange termijn CS-model zien;

Fig. 19 laat de resultaten van experimenten in een muizen-ARF-modelsysteem zien; 5 Fig. 20 laat de resultaten van experimenten in een muizendiabetisch retinopathiemodelsysteem zien;

Fig. 21 laat de resultaten van additionele experimenten in een muizendiabetisch retinopathiemodelsysteem zien;

Fig. 22 laat de resultaten van verdere additionele experimenten in een 10 muizendiabetisch retinopathiemodelsysteem zien;

Fig. 23 laat de resultaten van gecombineerde RTP801/VEGF-inhibitie- experimenten in een muizen-CNV-modelsysteem zien;

Fig. 24 laat de resultaten van additionele gecombineerde RTP801/VEGF-inhibi-tie-experimenten in een muizen-CNV-modelsysteem zien; 15 Fig. 25 laat de resultaten van experimenten die het effect onderzoeken van RTP801-siRNA op genexpressie in RPE en neuraal retina zien;

Fig. 26A-B laat additionele resultaten van experimenten die het effect bestuderen van RTP801-siRNA op de genexpressie in RPE en neuraal retina zien; en 20 Fig. 27 laat de resultaten van experimenten die bewijzen dat RTP801NP even actief is als RTP801 zien;

Fig. 28 laat de efficiëntieresultaten zien met betrekking tot 8011 (SEQ ID NOS: 430 en 527) en 801_4 (SEQ ID NOS: 433 en 530);

Fig. 29 laat verdere efficiëntieresultaten zien met betrekking tot 801_1 (SEQ ID

25 NOS: 430 en 527) en 801_4 (SEQ 1D NOS: 433 en 530);

Fig. 30 laat verdere efficiëntieresultaten zien met betrekking tot 801_1 (SEQ ID NOS: 430 en 527) en 80l_4 (SEQ ID NOS: 433 en 530).

125

VOORBEELDEN

Zonder verder te willen uitwijden wordt gemeend dat een deskundige op dit gebied kan, gebruikmakend van de bovenstaande beschrijving, de onderhavige uitvin-5 ding volledig gebruiken. De volgende geprefereerde specifieke uitvoeringsvormen zijn derhalve als slechts illustratief op te vatten zonder dat zij op enigerlei wijze de geclaimde uitvinding beperken.

Standaardmoleculaire biologieprotocollen die uit de stand der techniek bekend zijn en die niet specifiek in de beschrijving beschreven zijn kunnen in het alge-10 meen hoofdzakelijk worden gevonden in Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992) en in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1988).

Standaardorganische syntheseprotocollen die uit de stand der techniek be-15 kend zijn en die niet specifiek in de beschrijving beschreven zijn worden in het alge meen en hoofdzakelijk gevonden in Organic syntheses: Band 1-79, verschillende uitgevers, J. Wiley, New York, (1941-2003); Gewert et al., Organic synthesis workbook, Wiley-VCH, Weinheim (2000); Smith & March, Advanced Organic Chemistry, Wiley-Interscience; 5de druk (2001).

20 Standaardmedische chemiemethoden die uit de stand der techniek bekend zijn en die niet specifiek in de beschrijving beschreven zijn worden in het algemeen en hoofdzakelijk gevonden in de serie “Comprehensive Medicinal Chemistry”, door verschillende auteurs en uitgevers, gepubliceerd door Pergamon Press.

De kenmerken van de uitvinding die in de beschrijving, de conclusies en/of 25 de tekeningen beschreven zijn kunnen zowel afzonderlijk als in combinatie daarvan materiaal zijn voor het tot stand brengen van de uitvinding in verscheidene vormen hiervan.

Voorbeeld 1 30 Algemene materialen en methoden

Indien niet anders wordt aangegeven werden de volgende materialen en methoden in de voorbeelden 1-5 gebruikt: 126

Celculture

De eerste humane cellijn, namelijk HeLa-cellen (American Type Culture Collection) werden als volgt gekweekt: HeLa-cellen (American Type Culture Collection) werden gekweekt zoals beschreven in Czaudema F. et al. (Czaudema, F., 5 Fechtner, M., Aygu, H., Arnold, W., Klippel, A., Giese, K. & Kaufmann, J (2003). Nucleic Acids Res. 31,670-82).

De tweede humane cellijn was een humane keratinozytcellijn die als volgt gekweekt was:

Humane keratinocyten werden bij 37°C in Dulbecco’s gemodificeerd Eagle-medium 10 (DMEM) dat 10% FCS bevatte, gekweekt.

De muizencellijn was B16V (American Type Culture Collection) gekweekt bij 37°C in Dulbecco’s gemodificeerd Eagle-medium (DMEM) dat 10% FCS bevatte. Kweek-omstandigheden waren zoals beschreven in Methods Find Exp Clin Pharmacol. 1997 mei; 19(4):231-9: 15 In elk geval werden de cellen onderworpen aan de experimenten zoals in de beschrijving beschreven bij een dichtheid van ongeveer 50.000 cellen per putje en het dubbelstrengnucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding werd toegevoegd in een concentratie van 20 nM, waarbij het dubbelstrengnucleïnezuur gecomplexeerd was, gebruikmakend van 1 pg/ml van een gedeponeerde lipide.

20

Inductie van hypoxia-achtige conditie

De cellen werden met C0CI2 behandeld ter inductie van een hypoxiaachtige toestand, als volgt: siRNA-transfecties werden uitgevoerd in 10 cm platen (30-50% confluentie), zoals beschreven door (Czaudema et al., 2003; Kretschmer et al., 2003). 25 In het kort werden siRNA getransfecteerd door toevoeging van een vooraf gevormd lOx geconcentreerd complex van GB en lipide in serumvrij medium aan cellen in een compleet medium. Het totale transfectievolume was 10 ml. De uiteindelijke lipide-concentratie was 1,0 pg/ml; de uiteindelijke siRNA-concentratie was 20 nM tenzij anders wordt aangegeven. Inductie van de hypoxische responsen werd uitgevoerd door 30 toevoeging van C0CI2 (100 μΜ) rechtstreeks aan het weefselculturemedium 24 uur voorafgaande aan lyse.

127

Bereiding van celextracten en immunoblotting

De bereiding van celextracten en immunoblot-analyse werd uitgevoerd hoofdzakelijk zoals beschreven door Klippel et al. (Klippel, A., Escobedo, M.A., Wachowicz, M.S., Apell, G., Brown, T.W., Giedlin, M.A., Kavanaugh, W.M. & 5 Williams, L.T. (1998). Mol Cell Biol, 18, 5699-711; Klippel, A., Reinhard, C., Kavanaugh, W.M., Apell, G., Escobedo, M.A. & Williams, L.T. (1996). Mol Cell Biol, 16,4117-27). Polyklonale antilichamen tegen RTP801 volledige lengte werden gegenereerd door immuniserende konijnen met recombinant RTP801-proteïne producerende bacteriën afkomstig van de pET19-b-expressievector (Merck Biosciences GmbH, 10 Schwalbach, Duitsland). De muizenmonoklonale anti-pllOa- en anti-p85-antilichamen zijn door Klippel et al. beschreven (supra).

Voorbeeld 2

Reductie van de RTP801-expressie in een eerste humane cellijn 15 Verscheidene dubbelstrengnucleïnezuren werden bereid. Hun locatie ten opzichte van het mRNA en CDS alsmede humane SNP’s in het nucleïnezuur coderende voor humaan RTP801 (databanktoegang nummer NMO19058) is in figuur 3 weergegeven. De eerste humane cellijn werd in aanraking gebracht met de dubbelstrengnucleïnezuren zoals beschreven in voorbeeld 1. Na inductie van een hypoxiaachtige 20 toestand en behandeling met dubbelstrengnucleïnezuren werden de cellen gelyseerd en de cellysaten werden onderworpen aan immunoblotting. pllOa die een katalytische eenheid is van de PI3-kinase en p85 werden als beladingscontroles toegepast. De intensiteit van de RTP801-band zoals zichtbaar gemaakt gebruikmakend van de RTP801-polyklonale antilichamen is een mate van de activiteit van de afzonderlijke dubbel-25 strengnucleïnezuren in termen van het reduceren van het expressieniveau van RTP801.

Elke van de dubbelstrengnucleïnezuren is zodanig gemodificeerd dat een 2'-0-Me-groep aanwezig was op het eerste, derde, vijfde, zevende, negende, elfde, dertiende, vijftiende, zeventiende en negentiende nucleotide nucleotide van de antisens streng, waarbij dezelfde modificatie ofwel een 2-O-Me-groep aanwezig was op het 30 tweede, vierde, zesde, achtste, tiende, twaalfde, veertiende, zestiende en achttiende nucleotide van de sens streng. Bovendien dient opgemerkt te worden dat in het geval van deze bepaalde nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding het eerste stuk 128 identiek is aan de eerste streng en het tweede stuk is identiek aan de eerste streng en deze nucleïnezuren hebben een afgestompt uiteinde.

De experimenten werden tweemaal uitgevoerd en de afzonderlijke resultaten zijn in de figuren 4A tot H weergegeven, waar zij aangeduid zijn als experiment 1 5 en respectievelijk experiment 2.

De weergaven h, hr en hmr in de figuren 4A tot H geven aan dat het dubbelstrengnucleïnezuur zodanig was aangegeven dat een sectie van het RTP801-mRNA beschouwd werd dat specifiek is voor humaan RTP801-mRNA (h) om een sectie van het RTP801-mRNA te beschouwen dat specifiek is voor humaan en ratten-10 RTP801-mRNA (hr) en om een sectie van het RTP801-mRNA te beschouwen dat specifiek is voor humaan, muizen en ratten-RTP801-mRNA (hmr). Het dubbelstrengnucleïnezuur, aangeduid met nr. 40.1, werd gebruikt als positieve controle en onbehandelde cellen (UT+) werden als negatieve controle gebruikt.

Volgens de resultaten bleken de volgende dubbelstrengnucleïnezuren 15 bijzonder nuttig te zijn in het downreguleren van de expressie van RTP801 nrs.: 14, 15, 20,21, 22, 23, 24, 25,27, 39,40,41,42,43,44,49 en 50 (zie tabel A).

Voorbeeld 3

Reductie van de RTP801 -expressie in een tweede humane celliin 20 De experimenten, zoals beschreven in samenhang met voorbeeld 2 werden herhaald onder toepassing van de tweede humane cellijn, zoals gespecificeerd in voorbeeld 1 en de resultaten zijn in de figuren 5A tot F weergegeven.

Zoals uit deze figuren kan worden afgeleid werden de resultaten zoals verkregen in samenhang met de in voorbeeld 2 beschreven experimenten, gebruikma-25 kend van deze tweede humane cellijn, bevestigd.

Voorbeeld 4

Doseringseffect van RTP801-specifieke dubbelstrengnucleïnezuren

In dit experiment werd het doseereffect van RTP801 -specifieke 30 dubbelstrengnucleïnezuren onderzocht.

Voor dit doel werden HeLa-cellen behandeld, evenals in samenhang met de voorbeelden 2 en 3, waarbij de concentratie van dubbelstrengnucleïnezuur in het kweekbouillon 10 nM, 5 nM en 1 nM was. Als positieve controle werd dubbelstreng- 129 nucleïnezuur nr. 40.1 toegepast, als negatieve controle werden onbehandelde cellen (UT+) toegepast. Het aflezen was hetzelfde als beschreven in samenhang met de voorbeelden 2 en 3. De bepaalde dubbelstrengnucleïnezuren die gebruikt waren, waren die met interne referentienummers 14, 22, 23 en 27 die gericht zijn op stukken op het 5 RTP801-mRNA die gedeeld worden door mensen, muizen en ratten en dubbelstreng-nucleïnezuur met interne referentienummers 39 en 42 die gericht zijn op stukken van het RTP801-mRNA die specifiek zijn voor humaan RTP801.

De resultaten zijn in de figuren 6A tot C weergegeven. Uit deze figuren kan worden afgeleid dat er een duidelijke concentratieafhankelijkheid van het effect van de 10 dubbelstrengnucleïnezuren specifiek voor RTP801 is, waarbij de nucleïnezuurmolecu-len met interne referentienummers 1, 15, 20, 21, 24,40, 41, 43, 44, 22, 23, 27, 39, 42, 40,1, 44,1 en 14, bij voorkeur 22, 23,27, 39,42,40,1 en 44,1 en meer bij voorkeur 14, 23 en 27 en bij voorkeur elk van de nucleïnezuurmoleculen met het bepaalde modifica-tiepatroon zoals beschreven hiertoe in het voorbeeldgedeelte van de beschrijving bij-15 zonder werkzaam zijn.

Voorbeeld 5

Speciesspecificiteit van het RTP801-specifiek dubbelstrengnucleïnezuur

De dubbelstrengnucleïnezuren volgens de uitvinding zijn ontworpen tegen 20 stukken van het RTP801-mRNA die gelijk of verschillend zijn in verschillende species. Om te testen of er een speciesspecificiteit bestaat van een RTP801-specifiek dubbelstrengnucleïnezuur, de dubbelstrengnucleïnezuren met interne referentienummers 14, 22, 23 en 27 die gericht zijn op een stuk van het RTP801-mRNA dat geconserveerd is onder de mens, muis en rat RTP801-mRNA en de dubbelstrengnucleïnezuren met in-25 terne referentienummers 39 en 42 die gericht zijn op een stuk van het RTP801-mRNA dat specifiek is voor humaan RTP801-mRNA ofwel dat gericht is op een stuk dat op zichzelf niet aanwezig is in de muis of de rat, vergeleken in termen van downreguleren van RTP801 onder toepassing van dezelfde benadering en aflezen zoals gespecificeerd in de voorbeelden 1 en 2.

30 Ofschoon alle dubbelstrengnucleïnezuren die toegepast zijn in principe actief zijn tegen humaan mRNA en, zoals weergegeven in de voorafgaande voorbeelden, zijn tevens geschikt voor het downreguleren van de expressie van RTP801, na toepassing van een muizencellijn hebben slechts die dubbelstrengnucleïnezuren die 130 tevens specifiek zijn voor muizen-RTP801-mRNA de RTP801 -expressie effectief gereduceerd, namelijk de dubbelstrengnucleïnezuren nrs. 14, 22, 23 en 27.

Uit dit resultaat kan worden geconcludeerd dat het mogelijk is om een RTP801 te ontwerpen dat gericht is op dubbelstrengnucleïnezuren die specifiek zijn 5 voor één of verscheidene species. Dit maakt het gebruik mogelijk van hetzelfde molecuul in diermodellen en bij de mens.

Voorbeeld 6

Experimentele modellen, methoden en resultaten met betrekking tot de maculaire 10 degeneratie

De verbindingen van de onderhavige uitvinding werden in het volgende diermodel van choroïdale neovascularisatie (CNV) getest. Dit kenmerk van nat AMD wordt geïnduceerd in modeldieren door middel van laserbehandeling.

15 A) MUIZENMODEL

Choroïdale neovascularisatie (CNV) inductie

Choroïdeneovascularisatie (CNV), een kenmerk van nat AMD, werd ge-triggerd door laserfotocoagulatie (532 ran, 200 mW, 100 ms, 75 pm) (OcuLight GL, Iridex, Mountain View, CA) op beide ogen van elke muis op dag 0 door middel van 20 één enkele individu die gemaskeerd was voor geneesmiddelgroeptoekenning. Laser-vlekken werden toegepast op gestandaardiseerde wijze rond de optische zenuw, gebruikmakend van een spleetlampafgiftesysteem en een afdeklaag als contactlens.

Behandelingsgroepen 25 CNV werd geïnduceerd in de volgende groepen van muizen (mannelijke 6- 8 weken oud): (1) 12 WT-muizen; (2) 12 RTP801-knock-outmuizen; 30 (3) 12 WT-muizen werden geïnjecteerd met 0,25 pg synthetische gestabili seerde actieve anti-RTP801-siRNA (REDD 14) in één oog en inactieve anti-RTP801-siRNA (REDD8 - negatieve controle) in het andere oog op dagen 0 en 7; 131 (4) 12 WT-muizen werden geïnjecteerd met 0,25 μg van synthetisch gestabiliseerde actieve anti-RTP801-siRNA (REDD 14) in één oog en inactieve anti-GFP-siRNA (negatieve controle) in het andere oog op dagen 0 en 7; (5) 12 WT-muizen werden geïnjecteerd met hetzij 0,1 pg synthetisch gestabili- 5 seerde actieve anti-RTP801-siRNA (REDD 14) in één oog en PBS (nega tieve controle) in het andere oog op dagen 0 en 7; (6) 12 WT-muizen werden geïnjecteerd met hetzij 0,05 pg synthetisch gestabiliseerde actieve anti-RTP801-siRNA (REDD 14) in één oog en PBS (negatieve controle) in het andere oog op dagen 0 en 7.

10

Beide ogen van elke muis werden met een laser behandeld. Het geïnjecteerde volume was 2 pl.

Beoordeling 15 1. Het experiment werd beëindigd op dag 14. Voor de evaluatie werden de ogen kemvrij gemaakt en werden gefixeerd met 4% paraformaldehyd gedurende 30 min bij 4°C. De neurosensorische retina werd losgemaakt en van de optische zenuw gescheiden. Het overgebleven RPE-choroïde-sclera-complex werd vlak gemonteerd in Immu-Mount (Vectashield Mounting 20 Medium, Vector) en werd bedekt. Vlakke monsters werden onderzocht met behulp van een scanninglaser confocale microscoop (TCS SP, Leica, Duitsland). Vaten werden zichtbaar gemaakt door excitatie met een blauwe argonlaser. Horizontale optische secties (1 pm stap) werden verkregen vanuit het oppervlak van het RPE-choroïde-scleracomplex. Het diepste vocale 25 vlak waarin het omgevende choroïdale vasculaire netwerk dat in verbinding staat met het letsel kon worden geïdentificeerd, werd beoordeeld als zijnde de bodem van het letsel. Elk vat in het door laser behandelde gebied en oppervlakkig ten opzichte van dit referentievlak werd als CNV beoordeeld. Beelden van elke sectie werden digitaal opgeslagen. Het gebied van met 30 CNV gerelateerde fluorescentie werd gemeten door een gecomputeriseerde beeldanalyse, gebruikmakend van de Leica TCS SP software. De som van het gehele fluorescentiegebied in elke horizontale sectie werd gebruikt als een index voor het volume CNV.

132 2. Afzonderlijke WT-muizen (5 ogen per groep) werden gebruikt voor het evalueren van RTP801-mRNA-expressie in CNV (alsmede de expressie van andere genen die relevant zijn voor AMD) (onbehandeld en behandeld 5 met siRNA) gebruikmakend van real-time PCR op RNA dat geëxtraheerd was uit RPE/choroïden of uit neurale retina.

Resultaten 10 1. RTP801-KO-muizen vertoonden 30% minder bloedvatlekkage vergeleken met WT-muizen na de CNV-inductie; zie figuur 8.

2. Synthetisch gestabiliseerde siRNA tegen RTP801, REDD 14, veroorzaakte een dosisafhankelijke reductie van het CNV-volume. Een maximum van 15 -70% inhibitie vergeleken met PBS-geïnjecteerde ogen werd tot stand ge bracht met een REDD14 (sequentie nr. 14 in tabel A, SEQ ID NOS: 16 (sens) en 66 (antisens)) dosering van 0,25 pg per oog. Bij dezelfde dosering vertoonde zowel negatieve controle siRNA’s, REDD8 en anti-GFP-siRNA slechts 27% en 33% CNV-volumereductie, hetgeen zowel de superieure 20 doeltreffendheid van REDD 14 als de specificiteit van dit effect onder steunde.

B) NIET-HUMAAN PRIMAATMODEL 25 CNV-inductie

Acht mannelijke cynomolgus-apen (Macaca fascicularis), 2-6 jaar oud, werden gebruikt voor dit onderzoek. Choroïdale neovascularisatie (CNV) werd geïnduceerd door perimaculaire laserbehandeling van beide ogen voorafgaande aan de toediening van de dosis. Negen letsels werden geplaatst in de macula met een laser [OcuLight 30 GL (532 nm) laser fotocoagulator met een IRIS Medical® portable spleetlampadapter] en laserspots in het rechteroog waren het spiegelbeeld van de ligging in het linkeroog. De laserparameters waren bij benadering als volgt: spotafmeting: 50-100 pm diameter; laservermogen: 300-700 milliwatt; blootstellingtijd: 0,1 sec.

133

Behandeling

Onmiddellijk in aansluiting op de laserbehandeling werden beide ogen van alle dieren onderworpen aan één enkele intravitreale injectie. Het linkeroog werd gedo-5 seerd met 350 pg synthetisch gestabiliseerd siRNA tegen RTP801 (hetzelfde dat in het muizenonderzoek was gebruikt) in het uiteindelijke volume van 50 μΐ, terwijl het contralaterale oog 50 μΐ PBS (drager) ontving.

Beoordeling 10 1. Alle dieren werden onderworpen aan een dagelijks onderzoek van voedingsmiddelconsumptie en lichaamsgewichtmetingen.

2. Twee apen werden opgeofferd op dag 6 na de CNV-inductie. Hun ogen werden eruit gehaald (kemvrij gemaakt) en de achterste pool werd vlak gemaakt. Vervolgens werd het foveagebied eruit geprepareerd en geschei- 15 den in choroïden en neuroretina die gescheiden (voor elk dier) bevroren werden in vloeibare stikstof teneinde hierna gebruikt te worden voor RNA-extractie en real-time-PCR-evaluatie van de RTP801-expressie.

3. Fluoresceïneangiogrammen werden uitgevoerd voorafgaande aan het onderzoek en aan het einde van week 1, 2 en 3 na de CNV-inductie. Foto’s

20 werden genomen, gebruikmakend van een funduscamera (TRC-50EX

Retina-camera). Beelden werden vastgelegd, gebruikmakend van het TOPCON IMAGEnet™-systeem. Fluoresceïnekleurstof (10% fluoresceï-nenatrium, ca. 0,1 ml/kg) werd geïnjecteerd via vasculaire toegangspoorten. Foto’s werden genomen op verschillende tijdstippen na het injecteren van 25 de kleurstof teneinde de arteriële fase, de vroege arterioveneuze fase en en kele late arterioveneuze fasen op te nemen, teneinde de neovascularisatie te evalueren en lekkage van fluoresceïhe geassocieerd met CNV-letsels te volgen. Interpretatie en analyse van de fluoresceïneangiogrammen werd onafhankelijk uitgevoerd door middel van twee oogartsen.

30

Neovascularisatie (NV) werd beoordeeld in vroege angiogrammen en elke spot werd volgens het volgende schema beoordeeld:

0 - geen tekenen van NV

134 0,5 - verdachte spot 1 - “hot” spot 2 - NV in de laserverbranding

3 - evidente NV

5

Lekkage werd volgens het volgende schema beoordeeld: 0 - geen lekkage 0,5 - verdachte spot 1 - evidente spotlekkage 10 2 - lekkage die met de tijd toenam 3 - lekkage groter dan eerdere grensgebieden (evident)

Bovendien werd de afmeting van elke spot vergeleken tussen de vroege en de late angiogrammen gebruikmakend van morfometrische metingen en de toename in de af-15 meting van de spot resulterende uit de lekkage werd berekend.

4. Elektroretinogrammen (ERG’s) werden geregistreerd gebruikmakend van een Epic 2000 elektroretinograaf volgens Siërra’s SOP’s en het onderzoek-specifieke SOP, met inbegrip van de toepassing van het Ganzfield-apparaat 20 bij het vooronderzoek en aan het einde van week 3. De in de tabel opgeno men ERG-data werden geëvalueerd door een veterinaire oogarts.

Het onderzoek werd beëindigd op dag 21 na CNV-inductie. Algemene necropsie en histologisch onderzoek werden uitgevoerd op organen en weefsels, waaronder de ogen. 25

Resultaten 1. siRNA tegen RTP801 gereduceerde RTP801-expressie in de RPE/choroïden van met laser behandelde dieren, zoals gemeten op dag 6 na CNV-inductie door mid- 30 del van real-time-PCR (zie figuur 10).

2. Vergelijking van de spotbeoordeling voor lekkage en neovascularisatie tussen de gelijke ogen in elke afzonderlijke aap bracht aan het licht dat beide pathologische 135 kenmerken verminderd waren in de ogen die geïnjecteerd waren met RTP801-siRNA vergeleken met de controle (voor lekkageresultaten, zie figuur 11; voor neovascularisatieresultaten, zie figuur 12).

5 3. Berekening van het algemene aantal spots met hogere klinisch relevante beoordelingen (2 en 3) van lekkage of neovascularisatie in alle met siRNA geïnjecteerde ogen vergeleken met alle met PBS geïnjecteerde ogen wederom bracht aan het licht dat met siRNA geïnjecteerde ogen minder aangetast waren (zie figuur 13, a+b).

10 4. De algemene beoordelingsdata voor lekkage van spots en neovascularisatie werden onderworpen aan statistische beoordeling. Het bestaan van verschillen tussen de siRNA- en controlebehandelingen werd geanalyseerd door berekening van de delta tussen de gemiddelde spotbeoordelingen van het controlerechteroog (R) en 15 het met siRNA geïnjecteerde linkeroog (L) (delta=R-L). De significantie van het verschil werd berekend onder toepassing van een niet-parametrische statistische methode, Wilcoxon Signed Beoordelingstest - een zogenoemde “one tail test”. Verschillende fasen van angiogrammen (vroeg arterieel, arterio-veneus en laat veneus) werden afzonderlijk voor elke week (1,2 en 3) geanalyseerd.

20

Tabel 2 laat de significantie zien (“one tail test”) van lekkagebeoordelings-verschil van 0 voor elke groep (p-waarden <0,05 zijn onderstreept). Een significante lekkagebeoordelingsreductie werd gevonden in de linkerogen (met siRNA behandeld) met betrekking tot het rechteroog (met placebo behandeld) in de weken 2 en 3 in de late 25 angiogrammen.

136 TABEL 2

Lekkage P-waarde

Angiogrammen Week Wilcoxon Signed

Beoordelingslest

Vroeg 1 0,2500 2 0,5000 3 0,5000

Arterio-veneus 1 0,3438 2 0,1250 3 0,2344

Laat 1 0,1250 2 0.0313 3 0.0156

Opgemerkt dient te worden dat late angiogrammen gewoonlijk worden toegepast voor 5 de evaluatie van lekkageparameters.

Tabel 3 laat de significantie zien (“one tail test”) van neovascularisatie (NV) beoordelingsverschil van 0 voor elke groep (p-waarden <0,05 zijn onderstreept).

10 TABEL 3 NV P-waarde

Angiogrammen Week Wilcoxon Signed

Beoordelingslest

Vroeg 1 0,0781 2 0.0313 3 0.0313

Arterio-veneus 1 0,0625 2 0,0313 3 0,1563

Laat 1 0,2500 2 0,3438 3 0,2500 137

Een significante NV-beoordelingsreductie werd gevonden in de linkerogen ten opzichte van de rechterogen in de weken 2 en 3 in de vroege periode en in de arterio-veneusperiode in week 2.

Opgemerkt dient te worden dat vroege angiogrammen gewoonlijk worden 5 toegepast voor de evaluatie van neovascularisatieparameters.

5. Kwantitatieve morfometrische evaluatie van de toename in het gebied van de spots die optreden tussen de vroege (arteriële fase) en de late (veneuze fase) angiogrammen te wijten aan de lekkage, bracht aan het licht dat deze parameter 10 significant was gereduceerd in de laserspots binnen de met siRNA geïnjecteerde ogen (linkerogen, OS) vergeleken met de controle (rechterogen, OD). Twee voorbeelden zijn in figuur 14 weergegeven. De grafieken bewijzen de relatieve toename (in %) in het gebied van elke spot in het linker- en in het rechteroog van dieren #3315 en 3300.

15

Bovendien werd opgemerkt in alle bovenstaande onderzoekingen dat anti-RTP8 01-siRNA geen nadelige effecten had op elektroretinogrammen (ERG), op oog-histologie of op structuur en functie van andere organen en systemen.

20 Ter samenvatting van de bovenstaande experimenten en resultaten 1. Beide genetische (RTP801 -/-) en therapeutische siRNA-inhibitie van RTP801-expressie in het door laser geïnduceerde CNV-model van de natte ouderdomsmaculaire degeneratie (nat AMD) resulteren in een significante 25 reductie van het CNV-volume.

2. Positieve resultaten werden in het muizen- en in het niet-humane primaatmodel verkregen.

30 3. Pathologisch en ERG-onderzoek bij de aap bracht niet aan het licht enige door siRNA gemedieerde toxiciteit in ogen dan wel in één of ander orgaan of systeem.

138

C) DOELTREFFENDHEID VAN DE COMBINATIETHERAPIE VAN RTP801-siRNA (REDD 14) EN ANTI-VEGF-ANTILICHAAM

De doeltreffendheid van combinatietherapie van RTP801-siRNA 5 (REDD 14) en anti-VEGF-antilichaam in de behandeling van ziekten waarbij CNV op treedt werd in het bovenstaande muizen-CNV-model beproefd.

A) CNV-volumeonderzoekingen

Het volume van choroïdale neovascularisatie (CNV) 3 weken na laserletsel 10 werd gecomputeriseerd door middel van confocale fluorescentiemicroscopie, zoals eerder beschreven (Sakurai et al., 10VS 2003; 44:3578-85 & Sakurai et al., IOVS 2003; 44:2743-2749).

In eerdere onderzoekingen werd gevonden dat anti-VEGF-A-antilichaam (Ab) het CNV-volume in een dosisafhankelijke wijze reduceerde. Een dosis van 1 ng VEGF-A-15 Ab werd gekozen voor de REDD14+VEGF-A-Ab-combinatieonderzoekingen omdat deze dosering een intermediair remmend effect had: VEGF-A-Ab (1 ng) reduceerde de afmeting van CNV met 26±6%.

De hoofdbevindingen van het REDD14+VEGF-A-antilichaam (Ab) onderzoek zijn: • De toevoeging van REDD 14 bij de lagere 0,05 pg dosering reduceerde de afine-20 ting van CNV met 27±4% vergeleken met VEGF-A-Ab alleen.

• De toevoeging van REDD 14 bij de hogere 0,25 pg dosering reduceerde de afmeting van CNV met 55±3% vergeleken met VEGF-A-Ab alleen.

B) CNV-lekkageonderzoekingen 25

Experiment 1

Dit experiment werd ontworpen ter identificatie van een potentieel additief of synergistisch therapeutisch effect van inhibitie van VEGF en RTP801 in het model van de met laser geïnduceerde choroïdeneovascularisatie in muizen.

30 139

Materialen: • REDD 14 (RTP801 -siRNA) • REDD8 (negatieve controle) • Anti-VEGF-antilichamen 5 · Niet-specifieke IgG (negatieve controle) CNV werd geïnduceerd op dag nul zoals hierboven beschreven; het testmateriaal werd in de patiënten geïnjecteerd op dag 0 en op dag 7.

De resultaten werden geëvalueerd door fluoresceïneangiografïe in de weken 1, 2, 3 en 10 door CNV-volumemeting in week 3. Elke testgroep bestond uit 10 ogen.

Experimentele groepen: • VEGF-Ab 0,5 ng/oog • VEGF-Ab 1 ng/oog 15 · VEGF-Ab 2 ng/oog • VEGF-Ab 4 ng/oog • REDD 14 0,05 pg/oog • REDD 14 0,1 pg/oog • REDD14 0,25 pg/oog 20 · REDD 14 0,05 pg/oog + VEGF-Ab 1 ng/oog • REDD 14 0,1 pg/oog + VEGF-Ab 1 ng/oog • REDD 14 0,25 pg/oog + VEGF-Ab 1 ng/oog

Controle groepen:

25 · PBS

• Niet-specifiek IgG 2 ng/oog • REDD8 0,1 pg/oog • REDD8 0,1 pg/oog + VEGF-Ab 1 ng/oog 30 Resultaten:

De resultaten in de het bovenstaande experiment zijn in de figuren 23-24 weergegeven. Deze resultaten laten zien dat simultane intravitreale toediening van 140 VEGF-Ab en REDD14 leidt tot een verhoogde en dosisafhankelijke inhibitie van choroïdeneovascularisatie en choroïdebloedvatlekkage, zoals uitgedrukt in een gereduceerde incidentie van beoordeling 4-spots en een verhoogde incidentie van beoordeling 1-spots.

5 Angiogrammen werden beoordeeld onder toepassing van een modificatie van een semi-kwantitatieve beoordeling (1-4) schema dat eerder gepubliceerd was (Sakurai et al., IOVS 2003; 44:2743-2749). Beoordeling 1-letsels worden beschouwd als nooit eerder gevormd ofwel equivalent aan een volledige preventie. Beoordeling 4-letsels worden beschouwd als pathologisch significant ofwel equivalent aan letsels die behandeld zou-10 den worden in patiënten. VEGF-A-Ab (1 ng) reduceerde de incidentie van beoordeling 4-letsels per oog met 38±8% en een verhoogde incidentie van beoordeling 1-letsels per oog met 66±43%.

De hoofdbevindingen van de REDD14+VEGF-A-Ab-combinatielekkageonderzoek zijn: 15 · De toevoeging van REDD 14 bij de lagere 0,05 pg dosering reduceerde de incidentie van beoordeling 4-letsels met 66±12% vergeleken met VEGF-A-Ab alleen.

• De toevoeging van REDD 14 bij de hogere 0,25 pg dosering reduceerde de incidentie van beoordeling 4-letsels met 60±12% vergeleken met VEGF-A-Ab alleen.

• De toevoeging van REDD 14 bij de hogere 0,25 pg dosering verdubbelde (100±34%) 20 de incidentie van beoordeling 1 -letsels vergeleken met VEGF-A-Ab alleen.

Experiment 2:

Dit experiment werd ontworpen ter bestudering van het effect van REDD 14 op genexpressie in RPE en neuraal retina.

25

Experimenteel ontwerp:

Groepen:

• PBS

• REDD14 0,25 mg 30

De groepgrootte was 5 ogen. CNV werd geïnduceerd door laserbehandeling, zoals hierboven beschreven, op dag nul; het testmateriaal werd eveneens geïnjecteerd op dag 141 nul en het effect werd geëvalueerd door middel van qPCR-analyse van genexpressie in RPE en neuraal retina op dagen nul en 5.

Resultaten: 5 De resultaten van bovenstaand experiment zijn weergegeven in figuur 25.

Deze resultaten laten zien dat de toediening van REDD 14 veroorzaakt: • -40% downregulering van RET801-expressie onder de basislijn zowel in REP als in neuraal retina (zie tevens figuur 26); • -70% upregulering van PEDF-expressie op de basislijn in neuraal retina 10 (opmerking: in met PBS geïnjecteerde ogen is expressie van PEDF 40% gedownreguleerd onder de basislijn) • -40% downregulering van VEGF164-expressie onder de basislijn in RPE (opmerking: in met PBS geïnjecteerde ogen is expressie van VEGF164 20% gedownreguleerd) 15 · -50% reductie van MCPl-expressie in RPE/choroïden (figuur 26).

Algemene conclusies van beide experimenten: • Simultane inhibitie van RTP801 en VEGF heeft een verhoogd remmend effect op de choroïdeneovascularisatie en neovasculaire lekkage.

20 · Inhibitie van RTP801 -expressie door middel van REDD 14 voorkomt niet alleen PEDF-downregulering in het CNV-model, maar verhoogt zijn expressie vergeleken met de basislijn.

• Inhibitie van RTP801-expressie leidt tot simultane downregulering van MCPl dat een anti-ontstekingseffect zou moeten hebben.

25 · Zonder gebonden te willen zijn aan enige theorie kan de toename van PEDF- expressie door REDD 14 ten grondslag liggen aan het waargenomen meewerkende effect van de simultane inhibitie van VEGF en RTP801 (PEDF is een bekende anti-angiogene en neurobeschermende factor).

• Zonder aan enige theorie gebonden te willen zijn kan de reductie van de MCP1- 30 expressie door REDD14 tevens ten grondslag liggen aan het waargenomen meewerkende effect van de simultane inhibitie van VEGF en RTP801 (MCPl is een bekende pro-ontstekingschemkine betrokken in de pathogenese van AMD).

142

Additionele AMD-modellen die gebruikt kunnen worden voor het testen van de methode volgens de uitvinding: • Ccl-2 of Ccr-2 deficiënte dieren - deficiëntie in één van deze proteïnen veroorzaakt 5 de ontwikkeling van enkele van de hoofdkenmerken van AMD. Dieren die deficiënt zijn in deze proteïnen kunnen worden gebruikt voor het beproeven van de methoden van de onderhavige uitvinding.

Voor verdere informatie over AMD-diermodellen, zie: Chader, Vision re-10 search 42 (2002) 393-399; Ambati et al., Nature Medicine 9(11) (2003) 1390-1397; Tolentino et al., Retina 24 (2004) 132-138.

D) Vergelijking van de activiteit van REDD14 anti-RTP801-siRNA die een 3'-fos-faatgroep op elke streng bezitten met hetzelfde molecuul zonder 3'-fosfaten 15 (REDD14NP) in het met laser geïnduceerde CNV-model.

Het experiment werd in het algemeen uitgevoerd en geëvalueerd zoals hierboven beschreven. Eén oog van elke muis (12 per groep) werd geïnjecteerd met 0,25 pg REDD14-siRNA, terwijl een ander oog geïnjecteerd werd met REDD14NP-20 siRNA.

Resultaten:

Beide siRNA’s reduceerden het CNV-volume even efficiënt (figuur 27).

25 Voorbeeld 7

Modellen en resultaten met betrekking tot COPD en emfyseem

De verbindingen volgens de uitvinding werden op de volgende diermodel-len beproefd: 30 * Door sigarettenrook geïnduceerd emfyseemmodel: chronische blootstelling aan sigarettenrook veroorzaakt emfyseem in verschillende dieren, zoals onder andere de muis en de cavia.

* Longproteaseactiviteit als een trigger van emfyseem.

143 * VEGFR-inhibitiemodel van emfyseem.

* Bronchiale instillatie met humane neutrofiele/pancreaselastase in knaagdieren.

* Met MMP (matrixmetalloprotease) geïnduceerd emfyseem.

* Door ontsteking geïnduceerd emfyseem.

5

Bovendien kunnen emfyseemmodellen gegenereerd worden door genetische middelen (bijvoorbeeld muizen die de rSA-mutatie dragen) en emfysemateuze dieren kunnen worden gegenereerd door bekende modificeermiddelen van vatbaarheid voor emfysemen, zoals onder andere longletsel, alveolaire hypoplasie, hyperoxia, 10 glucocorticoïdebehandeling en -voeding.

A. Evaluatie van de invloed van het gebrek aan RTP801 op de ziekteontwikke-ling in muizenmodellen van emfyseem (onder toepassing van RTP801-knock-out-muizen) 15 (1) Door sigaretten roken (CS) geïnduceerde ontsteking en apoptose wordt geïnitieerd in 5 RTP801-KO en 5 controle-wildetypen 4 maanden oude mannelijke muizen. De muizen worden onderworpen aan intens CS (zoals beschreven in Rangasamy et al., zie boven) gedurende 7 dagen. KO- en WT-niet-behandelde 20 muizen afkomstig van het VEGFR-inhibitie-experiment van hierboven kunnen eveneens dienen als niet-behandelde controlegroepen voor dit experiment. De longen worden vervolgens met agarose gevuld, gefixeerd en in paraffine ingebed, en de ontwikkeling van oxidatieve stress in de KO-muizen wordt bepaald door: a) immunohistochemische lokalisatie en kwantitatieve evaluatie van 8- 25 oxo-dG in de longsecties; b) immunohistochemische lokalisatie en kwantitatieve bepaling van actieve caspase-3 in de longsecties, gebruikmakend van specifieke anti-lichamen, dan wel kwantitatieve evaluatie van het aantal TUNEL-po-sitieve cellen; 30 c) meting van de ceramideconcentratie in de longextracten; d) meting van de caspaseactiviteit in de longextracten.

144 (2) Lange termijn sigaretten roken in de KO-muizen.

6 KO- en 6 wat leeftijd betreft bij elkaar passende WT-vrouwelijke muizen werden onderworpen aan intens sigaretten roken (5 uur gedurende een dag) tijdens een periode van 6 maanden. De muizen werden vervolgens opgeofferd en de ge-5 middelde interseptale diameter (een parameter van emfyseemontwikkeling) werd geëvalueerd onder toepassing van een morfometrische benadering.

B. Evaluatie van de invloed van het gebrek aan RTP801 op de ziekteprogressie in muizenmodellen van emfyseem door endogeen RTP801 te remmen onder toe-10 passing van een intralongafgifte-RTP801-inactiverend siRNA.

Door CS geïnduceerde ontsteking werd geïnduceerd door 7 dagen roken in 2 groepen van C57BL6-muizen, 10 muizen per groep. Groep 1: CS + afgifte van con-trole-siRNA (REDD8) siRNA; groep 2: CS + RTP801-siRNA (REDD14). Controle-15 groepen van muizen kregen één van de typen siRNA toegediend, maar werden in kamerluchtomstandigheden instandgehouden. De dieren werden geëvalueerd zoals in bovenstaand experiment met de knock-outmuizen.

Methoden: 20 Blootstelling aan sigaretten roken (CS1

Blootstelling wordt uitgevoerd (7 uur/dag, 7 dagen/week) door verbranding van 2R4F-referentiesigaretten (2,45 mg nicotine per sigaret; gekocht van het Tobacco Research Institute, University of Kentucky, Lexington, KY, USA), gebruikmakend van een rookinrichting (Model TE-10, Teague Enterprises, Davis, CA, USA). Elke gloei-25 ende sigaret werd gepuft gedurende 2 sec, éénmaal elke minuut voor een totaal van acht puffen, met een totale stroomsnelheid van 1,05 1/min, teneinde een standaardpuf van 35 cm3 te verschaffen. De rookinrichting wordt ingesteld ter productie van een mengsel van zijstroomrook (89%) en hoofdstroomrook (11%) door verbranding van 5 sigaretten tegelijkertijd. De kameratmosfeer wordt gevolgd met betrekking tot totaal gesuspen· 30 deerde deeltjes en koolmonoxide met concentraties van 90 mg/m respectievelijk 350 ppm.

145

Morfologische en morfometrische analysen

Na blootstelling van de muizen aan CS of instillatie van RTP801 tot expressie gebrachte plasmide werden de muizen verdoofd met halothaan en de longen werden gevuld met 0,5% laagsmeltende agarose bij een constante druk van 25 cm, zoals eerder 5 beschreven is. De gevulde longen worden gefixeerd in 10% gebufferde formaline en worden in paraffine ingebed. Secties van 5 pm worden gekleurd met hematoxyline en eosine. De gemiddelde alveolaire diameter, alveolaire lengte en gemiddelde lineaire intercepten worden bepaald door middel van computergestuurde morfometrie met de Image Pro Plus-software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA). De longsecties 10 in elke groep worden gecodeerd en representatieve beelden (15 per longsectie) worden verkregen door een ten aanzien van de identiciteit van de slides gemaskeerde onderzoeken, met behulp van een Nikon E800-microscoop, 20X lens.

Bronchoalveolaire wasbewerking (BAL1 en fenotvperen 15 Na blootstelling aan CS of instillatie van RTP801 tot expressie gebrachte plasmide, worden de muizen verdoofd met natriumpentobarbital. De uit de longen van de muizen verzamelde BAL-vloeistof wordt gecentrifugeerd (500 x g bij 4°C) en de celpellet wordt opnieuw in fosfaatgebufferde zoutoplossing gesuspendeerd. Het totale aantal cellen in de wasvloeistof wordt bepaald en 2 x 104 cellen worden cytogecentri-20 fugeerd (Shandon Southern Products, Pittsburgh, PA, USA) op glasschijfjes en worden gekleurd met Wright-Giemsa-kleurstof. Differentiële celtellingen worden op 300 cellen volgens standaardcytologische technieken uitgevoerd.

Identificatie van alveolaire apoptotische celpopulaties in de longen 25 Ter identificatie van de verschillende alveolaire celtypen die apoptose in de longen ondergaan, wordt een immunohistochemisch kleuren van actieve caspase-3 in de longsecties afkomstig van de kamerlucht (RA) alsmede aan CS blootgestelde muizen uitgevoerd. Ter identificatie van de apoptotische type II epitheliale cellen in de longen, worden na actieve caspase-3-labeling de longsecties geïncubeerd, eerst met 30 antimuizenoppervlakte-actieve proteïne C (SpC) antilichaam en vervolgens met een antikonijn-Texas-rood-antilichaam. Apoptotische endotheliale cellen worden geïdentificeerd door incuberen van de secties, eerst met het antimuis CD 31-antilichaam en \ vervolgens met het gebiotinyleerde konijnenantimuizensecundaire antilichaam. De 146 longsecties worden gespoeld in PBS en worden vervolgens geïncubeerd met het strep-tavidine-Texas-rood geconjugeerde complex. De apoptotische macrofagen in de longen worden geïdentificeerd door incuberen van de secties, eerst met het rattenantimuizen-Mac-3-antilichaam en vervolgens met het antirat-Texas-rood-antilichaam. Tenslotte 5 wordt DAPI op alle longsecties toegepast, gedurende 5 minuten geïncubeerd, gewassen en gemonteerd met Vectashield HardSet-monteermedium. DAPI en fluoresceüie worden zichtbaar gemaakt bij 330-380 nm respectievelijk 465-495 nm. Beelden van de longsecties worden verkregen met een Nikon E800-microscoop, 40X lens.

10 Immunohistochemische lokalisatie van actieve caspase-3

Immunohistochemisch kleuren van een actief caspase-3-proefmonster wordt uitgevoerd onder toepassing van antiactief caspase-3-antilichaam en de actieve caspase-3-positieve cellen worden geteld met behulp van een macro onder toepassing van een Image Pro Plus-programma. De tellingen worden genormaliseerd door de som 15 van de alveolaire profielen die hierin genoemd worden als alveolaire lengte en worden in pm uitgedrukt. Alveolaire lengte correleert omgekeerd met het gemiddelde lineaire intercept, dat wil zeggen naarmate de alveolaire septa vernietigd worden, nemen de gemiddelde lineaire intercepten toe naarmate de totale alveolaire lengte ofwel de totale alveolaire septale lengte afheemt.

20

Caspase-3-activiteittest

De caspase-3/7-activiteit wordt gemeten in longweefselextracten gebruikmakend van een fluorometrische test volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Snel bevroren longweefsel (n = 3 per groep) werd met de testbuffer gehomogeniseerd, 25 gevolgd door sonicatie en centrifugatie bij 800 x g. Na verwijdering van de kernen en cellulaire debris wordt de supernatant (300 pg proteïne) vervolgens geïncubeerd met het profluorescerende substraat bij kamertemperatuur gedurende 1 uur en de fluores-centie-intensiteit werd gemeten, gebruikmakend van een Typhoon-fosfoimager (Amersham Biosciences, Inc., Piscataway, NJ, USA). De resultaten zijn uitgedrukt in 30 de snelheid van specifieke caspase-3-substraatsplitsing uitgedrukt in eenheden van caspase-3-enzymatische activiteit, genormaliseerd door totale proteïneconcentratie. Actieve recombinant-caspase-3 werd gebruikt als de teststandaard (0-4 U). Weefsel- 147 lysaten zonder substraat, testbuffer alleen en lysaten met caspase-3-inhibitor werden als negatieve controles gebruikt.

Immunohistoehemische lokalisatie van 8-oxo-dG

5 Voor de immunohistoehemische lokalisatie en kwantificering van 8-oxo-dG

worden longsecties afkomstig van de muizen die blootgesteld zijn aan CD of die met RTP801 tot expressie gebrachte plasmide geïnstilleerd waren, geïncubeerd met anti-8-oxo-dG-antilichaam en werden gekleurd, gebruikmakend van een InnoGenexTM Iso-IHC DAB-kit onder toepassing van muizenantilichamen. De 8-oxo-dG-positieve cellen 10 worden met behulp van een macro (gebruikmakend van Image Pro Plus) geteld en de tellingen werden door middel van de alveolaire lengte, zoals reeds beschreven, genormaliseerd.

Instillatie van plasmide-DNA in muizenlongen 15 Plasmide-DNA an RTP801 tot expressie brengen en controlevectoren wer den bereid, gebruikmakend van een endotoxinevrije DNA-isolatiekit. Voor intratra-cheale instillatie wordt 50 pg plasmide-DNA afgegeven in 80 μΐ steriele perfluorkool-stof. De zuurstofdragende eigenschappen van perfluorkoolstof maken deze bij deze volumina goed getolereerd, terwijl zijn fysisch-chemische eigenschappen verantwoor-20 delijk zijn voor een extreem efficiënte distale longafgifte wanneer intratracheaal geïnstilleerd. Muizen worden verdoofd door een korte inhalatiehalothaanblootstelling, de tong wordt zacht naar voren getrokken door middel van forceps en de trachea wordt geïnstilleerd met een perfluorkoolstofoplossing die toegepast werd aan de basis van de tong via een afgestompte angiokatheter.

25

Instillatie van siRNA in muizenlongen

Muizen worden verdoofd met behulp van een intraperitoneale injectie van ketamine/xylazine (115/22 mg/kg). 50 pg siRNA wordt intranasaal geïnstilleerd in een volume van 50 pl 0,9%’s NaCl door afgifte van vijf achtereenvolgende porties van 10 30 pl. Aan het einde van de intranasale instillatie wordt het hoofd van de muizen gedurende 1 min rechtop gehouden om ervoor te zorgen dat de gehele geïnstilleerde oplossing binnen afgegeven wordt.

148

Voor verdere informatie, zie: Rangasamy T., Cho C.Y., Thimmulappa, R.K., Zhen L., Srisuma S.S., Kensler T.W., Yamamoto M., Petrache I., Tuder R.M., Biswal S., Genetic ablation of Nrf2 enhances susceptibility to cigarette smoke-induced emfysema in mice. Submitted to Journal of Clinical Investigation', Yasunori Kasahara, 5 Rubin M. Tuder, Carlyne D. Cool, David A. Lynch, Sonia C. Flores en Norbert F. Voelkel. Indothelial Cell Dearh and Decreased Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 in Emphysema. Am J Respir Crit Care Med, band 163, biz. 737-744, 2001; Yasunori Kasahara, Rubin M. Tuder, Laimute Taraseviciene-Stewart, Timothy D. Le Cras, Steven Abman, Peter 10 K. Hirth, Johannes Waltenberger en Norbert F. Voelkel. Inhibition ofVEGF receptores cuases lung cell apoptosis and emphysema. J. Clin. Invest. 106:1311-1319 (2000); en een overzichtsartikel op dit gebied: Robin M. Tuder, Sharon McGrath en Enid Neptune, The pathological mechanisms of emphysema models: what do they have in common?, Pulmonary Pharmacology & Therapeutics, 2002.

15

Resultaten: 1. Instillatie van een plasmide die RTP801 tot expressie brengt resulteert in een emfyseemachtig fenotype in muizenlongen die evident is door (1) toename in bronchoalveolaire lavage celtellingen (fig. 15a); (2) apoptose van 20 longseptale cellen (fig. 15b) en toename in de alveolaire diameter (fig. 15c).

2. Instillatie van RTP801-siRNA (REDD14) resulteert in een reductie van de RTP801 -expressie in de longen (fig. 17b).

3. RTP801-KO-muizen worden beschermd tegen emfyseemontwikkeling na 6 maanden sigaretten roken, zoals blijkt door het uitblijven van een vergro- 25 ting van de alveolaire diameter (fig. 18).

4. RTP801-KO-muizen worden beschermd tegen door sigaretten roken geïnduceerde ontsteking, zoals blijkt uit het verminderde aantal inflamma-toire bronchoalveolagecellen na 1 week sigaretten roken (fig. 16, a-b).

5. RTP801-KO-muizen worden beschermd tegen door sigaretten roken 30 geïnduceerde apoptose van longseptale cellen, zoals blijkt door het kleinen van een longsectie voor geactiveerde caspase (fig. 16c).

6. Met REDD 14 geïnstilleerde muizen worden tendele beschermd tegen door sigaretten roken geïnduceerde ontsteking, zoals blijkt door het gereduceerde 149 aantal inflammatoire bronchoalveolagecellen na 1 week sigaretten roken (fig. 17a).

7. Met REDD 14 geïnstilleerde muizen worden tendele beschermd tegen door sigaretten roken geïnduceerde apoptose van longseptale cellen, zoals blijkt 5 door kleuring van een longsectie voor geactiveerde caspase en door immu- noblotting van longextracten met antigeactiveerde caspase-3-antilichamen (fig· 17c).

Voorbeeld 8 10 Modellen en resultaten met betrekking tot microvasculaire aandoeningen

De verbindingen van de onderhavige uitvinding werden in diermodellen getest op een reeks microvasculaire aandoeningen, zoals hieronder beschreven wordt.

1. Diabetische retinopathie 15 RTP801 bevordert neuronale celapoptose en het genereren van reactieve zuurstofspecies in vitro. De uitvinder van de onderhavige uitvinding vond tevens dat in RTP801-knock-out (KO) muizen die onderworpen waren aan het model van retinopathie van prematuriteit (ROP), pathologische neovascularisatie NV gereduceerd werd onder hypoxische omstandigheden ondanks verhogingen in VEGF, terwijl het gebrek 20 aan dit gen het fysiologische neonatale retinale NV niet beïnvloedde. Bovendien was in dit model het gebrek aan RTP801 tevens beschermend tegen hypoxische neuronale apoptose en hyperoxische vaso-obliteratie.

Experiment 1 25 Diabetes werd geïnduceerd in 8 weken oude RTP801-KO- en C57/129sv wilde type (WT) littermate-muizen door intraperitoneale injectie van STZ. Na 4 weken werd ERG (single white flash, 1,4χ10Λ4 ftc, 5 ms) verkregen uit het linkeroog na 1 uur aanpassing aan donkere omstandigheden. RVP werd bepaald uit beide ogen, gebruikmakend van de Evans blue albuminepermeatietechniek 30

Resultaten

Bloedglucose was niet verschillend tussen diabetische (DM) WT en DM KO (495+109 vs 513±76 mg/dl), niet-diabetische (NDM) WT en KO (130+10 vs 150 135±31 mg/dl respectievelijk). RVP in de DM WT-groep werd verhoogd met 138% (51,2 ± 37,9 μΐ/g/h, n=8) vergeleken met NDM WT (21,5 ± 18,8 μΐ/g/h, n=9, p=0,055). Daarentegen werd RVP gereduceerd met 80% in DM KO 9,5 ± 8,5 μΐ/g/h, n=6, p=0,023) vergeleken met de DM-WT-muizen, hetgeen resulteert in een 140% afname 5 van door diabetes geïnduceerd RVP. In DM-WT-muizen was er een verlenging (p<0,05) van de oscillatoire potentiële impliciete tijden voor OP2 (11%), OP3 (12%) & OP4 (14%) en voor de B-golf (23%) vergeleken met NDM WT. De A-golf was niet significant veranderd. Deze veranderingen werden genormaliseerd -100% in DM-KO-muizen voor OP3 & OP4 en 65% voor B-golf vergeleken met NDM KO.

10

Conclusie:

Knock-out van RTP801 verbetert door diabetes geïnduceerde RVP- en ERG-abnormaliteiten in muizen, hetgeen suggereert dat dit hypoxia induceerbare gen een belangrijke rol kan spelen in de pathogenese van een vroege diabetische retinale 15 ziekte.

Experiment 2

Diabetes werd geïnduceerd in RTP801-knock-out en in controle wilde typen muizen met de gepaste genetische achtergrond. Bovendien werd deze geïnduceerd 20 in C57B16-muizen die hierop aansluitend werden gebruikt voor intravitreale injectie van anti-RTP801 en controle-siRNA’s. Voor diabetesinductie werden de muizen geïnjecteerd met streptozotocine (STZ 90 mg/kg/d gedurende 2 dagen na vasten gedurende een nacht). Dierfysiologie werd gevolgd door het gehele onderzoek heen op veranderingen in bloedglucose, lichaamsgewicht en hematocriet. Muizen geïnjecteerd met een 25 drager dienden als controles. De geschikte dieren werden behandeld door middel van intravitreale injecties van 1 pg REDD 14 anti-RTP801-siRNA of 1 pg anti-GFP-con-trole-siRNA. siRNA werd tweemaal tijdens het verloop van het onderzoek geïnjecteerd - op dag nu, wanneer de eerste STZ-injectie werd uitgevoerd en op dag 14 na de STZ-injectie.

30 Retinale vasculaire lekkage werd gemeten gebruikmakend van de Evans blue (EB) kleuringtechniek op de dieren na een 4 weken durende diabetes. Muizen hadden een katheter geïmplanteerd in de rechter halsslagader 24 uur voorafgaande aan 151 de Evans blue (EB) metingen. Retinale permeabiliteitsmetingen in beide ogen van elk dier volgden een standaard Evans blue protocol.

Resultaten 5 1. Retinaal bloedvatlekkage werd met 70% gereduceerd in RTP801-KO-diabeti- sche muizen vergeleken met wilde typen diabetische muizen (zie fïg. 20).

2. De knock-out van RTP801 normaliseert ERG-abnormaliteiten in muizen: In DM-WT-muizen was er een verlenging (p<0,05) van de oscillatoire potentiële impliciete tijden voor OP2 (11%), OP3 (12%) & OP4 (14%) en voor de B-golf 10 (23%) vergeleken met NDM WT. De A-golf was niet significant veranderd.

Deze veranderingen werden genormaliseerd -100% in DM-RTP801-KO-mui-zen voor OP3 & OP4 en 65% voor B-golf vergeleken met NDM RTP801-KO (zie fig. 21).

3. Vergelijkbaar met de resultaten in KO-muizen werd retinaalbloedvatlekkage 15 gereduceerd met 50% in diabetische muizen, geïnjecteerd intravitreaal met REDD14-siRNA tegen RTP801 vergeleken met diabetische muizen die intravitreaal geïnjecteerd waren met controle-siRNA tegen GFP (zie fig. 22).

2. Retinopathie van prematuriteit 20 Retinopathie van prematuriteit werd geïnduceerd door blootstelling van de testdieren aan hypoxische en hyperoxische omstandigheden en hierna testen van de effecten op de retina. De resultaten lieten zien dat RTP801-KO-muizen beschermd waren tegen retinopathie van prematuriteit, waardoor het beschermende effect van RTP801-inhibitie gevalideerd werd.

25 3. Myocardiaal infarct

Myocardiaal infarct werd geïnduceerd door linker anterieure afdalende aderligatie in muizen, zowel op korte als op lange termijn. Resultaten: reductie van TnT en CPK-MB-fractieniveaus 24 uur postinfarct in het bloed en beter echocardiogram (ejectie-30 fractievolume) 28 dagen postinfarct in RTP801 -KO-muizen.

152 4. Microvasculaire ischemische ziektetoestanden

Diermodellen voor de bepaling van ischemische ziektetoestanden omvatten: 1. Gesloten hoofdletsel (CHI) - Experimenteel TBI produceert een reeks gebeurtenis-5 sen die bijdragen tot neurologische en neurometabolische cascaden die samenhangen met de mate en ernst van gedragsgebreken. CHI is geïnduceerd onder verdoving terwijl een gewicht vanaf een vooraf vastgestelde hoogte kan vrijvallen (Chen et al., J. Neurotrauma 13, 557, 1996) over het blootgestelde hoofdskelet dat de linker halve bol in het midcoronale vlak bedekt.

10 2. Overgangsmiddelcerebrale vaatocclusie (MCAO) - Een 90 tot 120 minuten durende overgangs/tijdelijke vocale ischemie werd in volwassen, mannelijke Sprague Daw-ley-ratten met een gewicht van 300 tot 370 g uitgevoerd. De toegepaste methode is de intraluminale suture/hechting MCAO (Longa et al., Stroke, 30, 84, 1989 en Do-gan et al., J. Neurochem. 72, 765, 1999). In het kort onder een halothaanverdoving 15 wordt een 3-0-nylonhechtingsmateriaal bekleed met poly-L-lysine in de rechter interne carotideader (ICA) door een gat in de externe carotideader gebracht. De nylondraad wordt in het ICA geduwd naar de rechter MCA-oorsprong (20-23 mm). 90-120 minuten later wordt de draad eruit getrokken en het dier wordt dichtgenaaid en men laat het dier herstellen.

20 3. Permanente middel-cerebrale vaatocclusie (MCAO) - Occlusie is permanent, uni lateraal geïnduceerd door elektrocoagulatie van MCA. Beide methoden leiden tot focale breinischemie van de ipsilaterale zijde van de hersencortex die de contra-laterale zijde intact (controle) achterlaat. Het linker-MCA wordt blootgesteld via een tijdelijke craniëctomie, zoals beschreven voor ratten door Tamura A. et al., J 25 Cereb Blood Flow Metab. 1981; 1:53-60. Het MCA en zijn lenticulostriatale tak zijn proximaal ten opzichte van de mediale grens van het olfactorische kanaal met microbipolaire coagulatie gesloten. De wond wordt gehecht en de dieren worden teruggebracht naar him kooi in een ruimte die op 26 tot 28°C is verwarmd. De temperatuur van de dieren wordt de gehele tijd met een automatische thermostaat in-30 standgehouden.

153 5. Acuut nierfalen (ARF)

Het testen van actief siRNA voor de behandeling van ARF kan worden uitgevoerd onder toepassing van door sepsis geïnduceerd ARF of door ischemie-her-perfusie geïnduceerd ARF.

5

1. Door sepsis geïnduceerd ARF

Twee voorspellende diermodellen van door sepsis geïnduceerd ARF zijn beschreven door Miyaji T., Hu X., Yuen P.S., Muramatsu Y., Iyer S., Hewitt S.M., Star R.A., 2003, Ethyl pyruvate decreases sepsis-induced acute renal failure and multiple 10 organ damage in aged mice, Kidney Int. november; 64(5): 1620-31.

Deze twee modellen zijn de lipopolysacharidetoediening en de cefale ligatiepunctuur in muizen, bij voorkeur in oude muizen.

2. Door ischemie-herperfusie geïnduceerd ARF

15 Dit voorspellende diermodel wordt beschreven door Kelly K.J. Plotkin Z.,

Vulgamott S.L., Dagher P.C., januari 2003, P53 mediates the apoptotic response to GTP depletion after renal ischemia-reperfusion: protective role of a p53 inhibitor, J Am Soc Nephrol.; 14(1):128-38.

Ischemie-herperfusieletsel werd geïnduceerd in ratten na 45 min bilateraal 20 nierarterieel afklemmen en hierop aansluitend losmaken van de klem om herperfusie gedurende 24 uur mogelijk te maken. 250 pg REDD 14 of GFP-siRNA (negatieve controle) werden geïnjecteerd in de halsslagader 2 uur voorafgaande aan en 30 min na het afklemmen. Een additionele hoeveelheid van 250 pg siRNA werd gegeven via de staartader 4 en 8 uur na het afklemmen. siRNA tegen GFP diende als een negatieve 25 controle. ARF-progressie werd gevolgd door meting van de serumcreatinineniveaus voorafgaande aan en 24 uur na de chirurgische ingreep. Aan het einde van het experiment werden de ratten geperfuseerd via een interne femorale lijn met warm PBS, gevolgd door 4% paraformaldehyd. De linkemieren werden verwijderd en in 4% para-formaldehyd opgeslagen voor een hierop aansluitende histologische analyse. Acuut 30 nierfalen is vaak gedefinieerd als een acute toename van het serumcreatinineniveau vanuit de basislijn. Een toename van ten minste 0,5 mg per dl of 44,2 pmol per liter serumcreatinine wordt beschouwd als een indicatie voor acuut nierfalen. Serumcreati- 154 nine werd gemeten op tijdstip nul voorafgaande aan de chirurgische ingreep en 24 uur na ARF-chirurgie.

Ter bestudering van de verdeling van siRNA in de rattennier, werden Cy3-gelabelde 19-mer siRNA-moleculen met een afgestompt uiteinde (2/kg), met een alter-5 nerende O-methylmodificatie in de suikergroepen intraveneus toegediend gedurende 3-5 min, waarna in vivo beeldvorming werd uitgevoerd, gebruikmakend van twee-fotonenconfocale microscopie. De confocale microscopieanalyse bracht aan het licht dat het grootste gedeelte van siRNA in de nieren geconcentreerd is in het endosomale compartiment van proximale tubulaire cellen. Zowel endosomale als cytoplasmische 10 siRNA-fluorescentie waren relatief stabiel tijdens de eerste 2 uren na afgifte en verdwenen na 24 uur.

Zoals uit fig. 19 blijkt was er een tienvoudige toename in het niveau van serumcreatinine na een 45 min durende nierbilaterale arteriële afklembehandeling (PBS-behandeling). Vier injecties van 801-siRNA (REDD14, SEQ ID NOS: 16 en 66) 15 (2 uur voorafgaande aan het afklemmen en 30 min, 4 uur en 8 uur na het afklemmen) reduceerde significant het creatinineniveau in serum met 40% (P <0,02). Deze resultaten suggereren dat 801-siRNA nierweefsel tegen de effecten van ischemie-herperfusie-letsel kan beschermen en dus de ernst van ARF reduceert.

20 Voorbeeld 9

Bereiding van siRNA’s

Onder toepassing van beschermde algoritmen en de bekende sequentie van gen RTP801 (SEQ ID NO: 1), werden de sequenties van vele potentiële siRNA’s geproduceerd. siRNA-moleculen volgens de bovenstaande specificaties werden hoofdza-25 kelijk, zoals beschreven in de beschrijving, bereid.

De siRNA’s van de onderhavige uitvinding kunnen worden gesynthetiseerd onder toepassing van één of meer van de methoden die uit de stand der techniek bekend zijn voor de synthese van ribonucleïne (of deoxyribonucleïne) oligonucleotiden. Bijvoorbeeld een in de handel verkrijgbare inrichting (onder andere verkrijgbaar van Ap-30 plied Biosystems) kan worden gebruikt; de oligonucleotiden worden bereid volgens de in de beschrijving beschreven sequenties. Overlappende paren van chemisch gesynthetiseerde fragmenten kunnen worden geligeerd onder toepassing van methoden die uit de stand der techniek bekend zijn (bijvoorbeeld, zie Amerikaans octrooischrift 6.121.426).

155

De strengen worden afzonderlijk gesynthetiseerd en worden vervolgens in de buis aan elkaar geregen. Vervolgens worden de dubbelstreng-siRNA’s gescheiden van de enkel-strengoligonucleotiden die niet aan elkaar geregen waren (bijvoorbeeld, omdat één daarvan in overmaat aanwezig is) door middel van HPLC. In samenhang met de 5 siRNA’s of siRNA-fragmenten van de onderhavige uitvinding kunnen twee of meer van deze sequenties gesynthetiseerd worden en met elkaar worden verbonden voor gebruik in de onderhavige uitvinding. De siRNA-moleculen van de uitvinding kunnen onder toepassing van uit de stand der techniek bekende procedures worden gesynthetiseerd, bijvoorbeeld de procedures zoals beschreven in Usman et al., 1987, J. Am.

10 Chem. Soc., 109, 7845; Scaringe et al., 1990, Nucleic Acids Res., 18, 5433; Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684; en Wincott et al., 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59, en kunnen gebruikmaken van gebruikelijke nucleïnezuurbeschermende en koppelingsgroepen, zoals dimethoxytrityl aan het 5'-uiteinde en fosforamiditen aan het 3'-uiteinde. De gemodificeerde (bijvoorbeeld 2'-0-gemethyleerde) nucleotiden en niet-15 gemodificeerde nucleotiden worden desgewenst opgenomen.

Op een andere wijze kunnen de nucleïnezuurmoleculen van de onderhavige uitvinding afzonderlijk worden gesynthetiseerd en na de synthese, bijvoorbeeld door ligatie, met elkaar worden verbonden (Moore et al., 1992, Science 256, 9923; Draper et al., Internationale PCT-publicatie nr. WO 93/23569; Shabarova et al., 1991, Nucleic Acids 20 Research 19, 4247; Bellon et al., 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951; Bellon et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204), dan wel door hybridisatie na synthese en/of verwijdering van de beschermende groep.

De siRNA-moleculen volgens de uitvinding kunnen eveneens via een tandemsynthe-semethodologie, zoals beschreven in Amerikaanse octrooipublicatie nr. US-25 2004/0019001 (McSwiggen) worden gesynthetiseerd, waarbij beide siRNA-strengen als een enkel aangrenzend oligonucleotidefragment of -streng gescheiden door een af-splitsbare linker/brugvormende groep, die hierna gesplitst wordt ter verkrijging van afzonderlijke siRNA-fragmenten of -strengen die hybridiseren en zuivering van het siRNA-duplex mogelijk maken, gesynthetiseerd worden. De brugvormende groep kan 30 een polynucleotidelinker/brugvormende groep of een niet-nucleotidelinker zijn.

Voor verdere informatie, zie PCT-publicatie nr. WO 2004/015107 (ATUGEN).

Zoals hierboven beschreven is, waren de siRNA’s van tabel A (hieronder) zodanig opgebouwd dat alternerende suikers een 2'-0-methylmodificatie hebben, dan 156 wel waren alternerende nucleotiden op deze wijze gemodificeerd. In deze voorkeursuitvoeringsvormen waren in één streng van het siRNA de gemodificeerde nucleotiden nummers 1, 3, 5, 7, 9,11, 13, 15, 17 en 19 en in de tegenovergestelde streng waren de gemodificeerde nucleotiden nummers 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 en 18. Dus zijn deze 5 siRNA’s 19-mer RNA-moleculen die afgestompt zijn aan hun uiteinde, met alternerende 2-O-methylmodificaties, zoals hierboven beschreven. De siRNA’s van de tabellen 2 en 3 (hieronder) zijn eveneens op deze wijze opgebouwd; de siRNA’s van de tabellen B en D zijn 19-mer RNA-moleculen met een afgestompt uiteinde, met alternerende 2'-0-methylmodificaties; de siRNA’s van tabel C zijn 21-mer RNA-moleculen 10 met een afgestompt uiteinde, met alternerende 2 '-O-methylmodificaties.

Tabel A geeft verscheidene nieuwe siRNA-moleculen weer die geproduceerd werden en hierna voor gen-RTP801 gesynthetiseerd waren. De twee laatste kolommen geven de resultaten aan van twee experimenten die uitgevoerd zijn voor het onderzoeken van de activiteit van de nieuwe moleculen. In het kort waren HeLa- of 15 HaCat-cellen getransfecteerd met een specifiek nieuw siRNA dat getest moet worden. Expressie van het RTP801-polypeptide werd vervolgens bepaald door middel van Western blotting, gebruikmakend van een antilichaam tegen het RTP801-polypeptide. Met betrekking tot de twee rechterkolommen van tabel A, betekent een molecuul dat niet-actief is of een lage activiteit heeft (die de expressie van het RTP801-gen na-20 genoeg niet remt); “+” betekent een siRNA-molecuul met enige remmende activiteit (van RTP801-genexpressie), “++” betekent een molecuul met een hogere remmende activiteit enz. Elk molecuul uit de siRNA-moleculen die in de beschrijving beschreven zijn en in het bijzonder de actieve moleculen die in tabel A zijn weergegeven zijn nieuw en worden beschouwd als een onderdeel van de onderhavige uitvinding.

157

TABEL A

_ID Haam ORG Locatie POS AS (5'->3')_SS (5'->3')__HaI.aB,20nM HaCat,20nM

1 REDD1 h 5'UTR 128 UAGAAGCCGCAGCUAGCGC GCGCUAGCUGCGGCUUCUA + + 2 REDD2 hmr CDS 337 UCCGAGCUCUCCAGGCUCG CGAGCCUGGAGAGCUCGGA - - 3 REDD3 hmr CDS 360 UGCUGCOGOCCAGGGACUC GAGUCCCUGGACAGCAGCA - - 4 REDD4 hmr CDS 478 AGCAGCUGCAUCAGGUÜGG CCAACCUGAUGCAGCUGCU - - 5 REDD5 h CDS 728 UGAGUCCAGGCGCAGCACG CGUGCUGCGCCUGGACUCA - -

6 Redd6 hmr 5'UTR 119 CAGCUAGCGCGGUCAGCGA UCGCUGACCGCGCUAGCUG

7 Redd7 hiiir 5‘UTR 122 CCGCAGCUAGCGCGGUCAG CUGACCGCGCUAGCUGCGG 1 = 8 Redd8 hmr 5'OTR 125 AAGCCGCAGCUAGCGCGGU ACCGCGCUAGCUGCGGCUU - - 9 Redd9 hmr CDS 339 AGUCCGAGCUCUCCAGGCU AGCCUGGAGAGCUCGGACU - - 10 ReddlO hmr CDS 341 GCAGUCCGAGCUCUCCAGG CCUGGAGAGCUCGGACUGC - - 11 Reddll hmr CDS 363 OGOOGCUGCUGUCCAGGGA UCCCUGGACAGCAGCAACA 1 -

12 Reddl2 hmr CDS 369 AGCCACUGOUGCOGCUGUC GACAGCAGCAACAGUGGCU

13 Reddl3 hmr CDS 370 AAGCCACUGUUGCUGCUGU ACAGCAGCAACAGOGGCUU

14 Reddl4 hmr CDS 475 AGCUGCAOCAGGOOGGCAC GUGCCAACCUGAUGCAGCU +++ +++ 15 Redd15 hmr CDS 481 OGCAGCAGCUGCAUCAGGO ACCÜGAOGCAGCOGCOGCA + +

16 Redd16 hmr CDS 486 OCUCCOGCAGCAGCUGCAO AOGCAGCUGCOGCAGGAGA

17 Reddl7 hmr CDS 610 CCCCGCAGGCCGCACGGCO AGCCGUGCGGCCUGCGGGG

18 Reddl8 hmr CDS 750 CCUGGAUCUUGGGCCAGAG CUCUGGCCCAAGAOCCAGG

19 Reddl9 hmr CDS 809 CAGCGUCAGGGACOGGCUG CAGCCAGOCCCOGACGCUG

20 Redd20 hmr 3'OTR 1097 AOGCOACAGOACOGAGGGG CCCCUCAGUACUGUAGCAU + + 21 Redd21 hmr 3'UTR 1419 GUCOGOAAGAOAGCUGCCU AGGCAGCUAOCUUACAGAC + + 22 Redd22 hmr 3'UTR 1617 UUCUAGAUGGAAGACCCAG CUGGGUCUUCCAUCUAGAA ++ ++ 23 Redd23 hmr 3'UTR 1670ÜUGAACAUCAAGUGUAUUC GAAUACACUUGAUGUUCAA ++ ++ 24 Redd24 hmr 3'UTR 1693 AAAUAUUGCAUAGGUCUUA UAAGACCUAUGCAAUAUUU + + 25 Redd25 hmr 3'UTR 1695 AAAAAUAUUGCAUAGGUCU AGACCUAUGCAAUAUUUUU ++ ++

26 Redd26 hmr CDS 349 AGGGACUCGCAGUCCGAGC GCUCGGACUGCGAGUCCCU

27 Redd27 hmr 3'UTR 1673 UACUUGAACAUCAAGUGUA UACACUUGAUGUUCAAGUA ++ ++

28 Redd28 hmr 3’UTR 1717 AAACAUGUUUAUUAGAAAA UUUUCUAAUAAACAUGUUU

29 Redd29 h 5'UTR 99 AACUGCUAAGACAAGUGCG CGCACUUGUCUUAGCAGUU

30 Redd30 h CDS 213 ACGACGACGAGAAGCGGUC GACCGCUUCUCGUCGOCGU

31 Redd31 h CDS 393 AAGCCGUGUCUUCCUCCGG CCGGAGGAAGACACGGCUU

32 Redd32 h CDS 453 AGUGUUCAUCCUCAGGGUC GACCCUGAGGAUGAACACU

33 Redd33 h CDS 521 AGGGCGUCGAGAGCCCAGC GCUGGGCUCUCGACGCCCU

34 Redd34 hr CDS 535 AUCAGCAGGCGCGCAGGGC GCCCUGCGCGCCUGCUGAU

35 Redd35 h CDS 571 AGUUCUUUGCCCACCUGGC GCCAGGUGGGCAAAGAACü

36 Redd36 h CDS 597 ACGGCUCGCUGUAGGCCAG CUGGCCUACAGCGAGCCGU

37 Redd37 h CDS 625 ACGUCCAGCAGCGCCCCCC GGGGGGCGCUGCUGGACGU

38 Redd38 h CDS 829 AUGACUCGGAAGCCAGUGC GCACUGGCUUCCGAGUCAU

158 39 Redd39 h 3’UTR 1046 AACUCAAUGAGCUUCCUGG CCAGGAAGCUCAUUGAGUU ++ ++ 40 REDD40 h 3’UTR 1539 CUCAACUCUGCAGUACACG CGUGUACUGCAGAGUUGAG + + 41 Redd41 h 3'UTR 1317 AGAUACACAAACCACCUCC GGAGGUGGUUUGUGUAUCU + + 42 Redd42 h 3'UTR 1350 ACAACAAACACACUUGGUC GACCAAGUGUGUUUGUUGU ++ ++ 43 Redd43 hmr CDS 473 CUGCAUCAGGUUGGCACAC GUGUGCCAACCUGAUGCAG + + 44 REDD44 h 3’UTR 955 UCCUGCCUCUAGUCUCCAC GUGGAGACUAGAGGCAGGA + +

45 Redd45 hmr CDS 476 CAGCUGCAUCAGGUUGGCA UGCCAACCUGAUGCAGCUG

46 Redd4 6 hiiir CDS 479 CAGCAGCUGCAUCAGGUUG CAACCUGAUGCAGCUGCUG

47 Redd47 hiiir CDS 483 CCUGCAGCAGCUGCAUCAG CUGAUGCAGCUGCUGCAGG - :

48 Redd48 hmr CDS 485 CUCCUGCAGCAGCUGCAUC GAUGCAGCUGCUGCAGGAG

49 REDD40.1 h 3'UTR 1536 AACUCUGCAGUACACGAUG CAUCGUGUACUGCAGAGUU ++ ++ 50 REDD44.1 h 3'UTR 954 CCUGCCUCUAGUCUCCACC GGUGGAGACUAGAGGCAGG ++ ++

Opgemerkt dient te worden dat in bovenstaande tabel A de sens strengen van siRNA’s 1-50 de SEQ ID NOS: 3-52 hebben, en de antisens strengen van siRNA’s 1-50 SEQ ID 5 NOS: 53-102 hebben. Het molecuul aangeduid met REDD 14 heeft SEQ ID NOS: 16 (sens streng) en 66 (antisens streng).

p * ύ) — g <0 «—« c α I φ <0 4-» (0 III ll + lll + ll III I I I |-t-l II I l-Kl r-i <D Ή μ a p 0) c 5> »0 O ~ (U H ^ ^ hi ' ao o vx> vr ^ vo r— ^ ® zr cn σ> o us in r~- o^o m V?S-— ID ο Η ΰ Η \β tH T-H 00 ®~J-P rH p-l rH rH 1—4 00 rH «—· **

iPS<oi I I I I I I I I .......... I

LT ~ c£ ο r-t cn cm σ» ι-H i-t m ‘ZJ — rH oo oo m m tn tn in vo ® -1 U>OO^«H0D O rH *9 2 rH i—l 1-( iH i—( ·—» r-4 »—l '—* O'w * ' ' * i < ' * » ' 1—1 ^ <l> «-h ___ _____ _ _____ ___ ___ _ £ * --- m CM 0O Γ' Or'r-^O^r-.ODVDr—.

JZ V? rH CD <\l Γ-4 *3< CN <N *TC\CD&>r~<J\*rO

Z" ~ ''T 00 LO VO 1-H TT rH i-H VOCOrHCOi-HCOVOm ® ° ” Γ" 1-1 Η H CD iH rH I—( ΉγΗΠγΗΠγΗγ^^Γ

<J z) *3 I I I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I

-d n cn cm σ> i-η *a· cn i-h (NO>OrHa>ococN

*J <0 VO 1HCT»0 CM rH ι-Η ΓΜΓ^ΟΟΟ<ΤιΟΟ(Ν«-Η

£ I r- m vo o oo tt r-\ 1—( vDromoocNcovo^T

^ --1 1—I iH r—I '—· 1—( rH i-H ι-I rH 1—· 1—I ·—1 rH rH 1—'

Cr» P “ 1 1 “ ^ ^ Φ · r—.77^7»—ιΓ“·«-ηοοο©οο<3·γ—. Z7 vo i-h ο σ» r- a> cn vo i—«οο — r^oo^ ” oo '^•*r)_*;_:r)vor*-)r-OrHr-'Dvo;7ioooorHr-voa>inomcr»incr»cN ‘flinOjlir-^^inOVDi-Hi-IrHVDrHOO^THinrHrHr-HiH^Trav^rOO'irVOO tT^OEhm^^OOi-HTHi-Hi-HrHi-HrHaoXT-HrHrHi-HrHrHrHrHfOrHmrHrHin

X Λ O 3 I , , I I I I « I I I I V I I I I I I I I I I 1 I I I

'ri-H3C'S,x>''tn<T»mcNO(No^ocoAoorocMrH(j\o^oocsjOrHcr»o^r ^O’-'JfinZzZro^'rHinono^vD^'VD^roocovooininr-mr'^'r'ncocD

xZ I ‘SinSSaoo^DrHOOvoi-iooiiio^rHrHi-HrH'JO^rm^rm^rvö^j· σ>2 W '—’ 1—I T-H 1—I 1—1 c-Η pH t—I >—' ^ i—1 τ-H r—I i—I i—T i—I i—» — »—I —· <—> «—» ·—· O' 2 — ^ _ — —

OrtOOL>U(J3300l3000L><«:03U3300C_>(<

fCOUUUUUOOaOODUCJrtOCJrtOOUCDDDW

,*333<3333303L>33333fa:033CJ(JO><C3

§~ο«:ο<οα:<:ο<0;υΒοω<ουυοο<ΒΒυυυΛ; OrtcCOUOUBBOOSOBOOfdfSBrtUUBBDrtU UU)CJUOrt:<rt;OiicCOrt;t5<BDB<<DO<UDfiO ‘SDUUUietUUBO<OBl3B<rtOUUUDBOUia:OB ">UDifDOO<UOOUUB«i>ÏUa:Oö:D«iBCBUDU

-rtOrtuooouoDaortouinooortousortDU» i53«to<«irt<U(<<«:<;3i3BDa:<rt;u<DBODu<; S UUUOSCOOUOUUOUU>l!>U3(_>L><53[->U33<3 rÏUOBDU«ï<<BB<OBODOO«:<fiB<BOUDe3 rr\ “jeC<i3«:3<i3003C><L>l30<03UUCJUU<3<<: ·πΒ3ΒθυοοΒ<<<«:Β«;<ί<<Βθ(ϊΒΒυ<υυ3υ

v‘ BBUPBrtJOOOBBOBfilJJfiBrtJOBBUOBOfïBU

— 5uaiDOiiooa;oufCa;ur>uauf£uuriftL>(s>soo “•UB<0O<<B<Bu3«ÏOB<O<0«:B3Oi=IBUO UBUBcCOUUOOiiUOiïBBBBBBOOBrtOBB ΒΒΒΒυ<<<ίΐ<3Β<ΒΒ(<Β<«ΐ:<υυΒΒΒΒΒ <Λ<«;ΐ3ΒΒΏΒΒ<<Β<3;<Β<ίΒΒΒωΒ>ΐυ<υ»ϊ o3u<300oU0BUl3B3rt:<<<;'ÏWU3BU<0

OrtBOOBBrfB<OBBl5<iBOBUB(<BOBBOtJ

OOU<B<C"5oUBBOiO:OBC)BBC33BUU><<Ci< rf>i0rtrtBUürÏrt<0ia;BOB<BO<n50Ui=iCIBrt!0

§™·<Β3υΐίΙ00^ΒΒΒ0ΒΒΒΒ«:οΒ3«ϊ15Β130Β0 BB<Bi<Brtr)W'I?W3UUBBU<l!!UOl5UO<DB B0<<BBByrt<BU<0rt:ue)BBB«£Brt00rt;0 'ïluuouBuuoOOOuutjoortuoaioortitDU "BBOBBBBoOBBBBOCrtBBBBBrtrtO^OB ,„BUB0fiC0uKu<fl:u3fi03Ui=i:0Bwu3<ai5<J ÏÏU<tB<OOBijOOOOrt:BBOBUB<Bf5B3<JiiO SftOOBBUOrfUBUrtUiiBBUUUBfifïOUBUfi rn0U0U03ögu3303U3«ïi<ia!3Bii030><3U

w033UU00rf<0Ufi0i=C0333fi3C)(J<iie<30 O333<433o33O<l3UDOUUOU3i=trtUU03 <«:<3<<ίϊΛΛ:ο«<οια;ίϊι<<«:3οα:<οοΐ333<

3UUU000ot-)<UUrtUU3UU3U0U3rtrt:ö:O

U3UU300^iCL>UtJC)e)U033Urt0rt:<U0U3 σ O'

(Η O Φ P 1—I rH rH rH i—I rH rH rH rH i—I rH H rH r-I rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH

O Ή

P

<0 coOTcococotnto*"1 •rH ·*Η -Η ·Η ·Η Ή ·γΗ 3 3 3 3 3 3 3 *" (ototocotocntoiocotototocotoEEEgSÊEiii 33333333333333 Ξ O'O'O'O'O'O'tJiCf'ö'O'O'O'Ö'D' * * ** κ. *» ·* *.p

»—IrHrHrH,—Ir—IrHr—|(—IrHr—|ιΗ«ΗΉ O) CD tO (0 CO CO (0 K

000000000000003333333 ggggEgggggggggtrcrcncncn^a'^ CCCCCOOOOOOOOOOOOOO^HrHrHrHrHcHrH^

Cfoiocdajcoccccccccdcccccogooooo^ o dj <o «j co ca >i>*>ipH>i>i>H>,>i>i>»>!>>>»g e ε ε ε ε ε zl ΜεεβεευυουυυυυουυϋουοοοοοοοΤ? 0Q33333 CCCCCCC5 xacxacx - - .. ^ ^ «. *. * - - *. ^>»>,>ι>η>ι5η>ι5 cccccccccaccccuuuooouy aj<oco<aiatacocofOnjtOfO<Ofd ^ cardcamracacacaajcacacacaca ·* ^ ··» * ^ *· 7? CÖ ggeeeeEeiieegeacc;occcu —' 333θθ33ρ3οοοΟοΌ(ΰ(θ<τϊιτϊθ(θ

. i incxKxixKixxxascstdioiBtdggJ

ω iiiilils

555 xacxxxxxS

CQ § < * H____________________________

JrHCMro';Tin^Dr-cocnorHogco’5’in'^>r'00criOrHCMro'Tin'x>r' gininininmininininvo^P^o^Dvo^MovoujvDr-r-r-r- [^- r~ r~ r- + + + +I++I I + I t | I I + I+ + +I + + + + + + + + + + ^o^-'^-’r'^^rocri^i-irrrHr'^Tr'jrooDO*^)

r'r~r-Lr)r-r-'^'^r^<T'00,=rrofs'r'pr),3'rn'3''3‘«3’mmrr)^rrompr)fO

VD'^VD'*OVOVD^Or“'ör,‘VOi^'>Dr~VOVDOOv^^OVO^P^OVDV£>\lOVDVC>^DVO

rHrHr-HrOrHr-Hn'TrH^rOi-Hm'Tr-IrH'TrHrHCsJrHrHi-HrH.-HrHrHrHrH.-l

I I I I I I I I I I I I I I t I « 1 I t I I I I I | | I I I

r-omr-CN4'^roomro^H(NCDlx»Lncri'^>Lnir>rHVDm^orncr.vD^rLnorsico in^Om'i,ir>ino,ininvö^ra5<3,inmir)'X»r'iCMCOCiCM»H»H«-ICslTH(MiHi-» ^USVOr’VVÖ^ÖCO^ykC'TO^OCO^^O^^J'VOlXïrHVOkOVOVOVOVOVOVOVOVO Η «H i—I 1—* rH rH '—‘ ‘—1 r-I *—· *—> »—( 1 '—* r—( «—( «—* rH H ·—> r-( rH rH rH rH i—I i—| i—I rH rH

kOvDOOrO· OCVjr-'^l—Ir—,, . VX) . r—, ^ r^mromcsjrororooop^^r-^DiHomro

VD VD Ό VO rH VD kO rH rH VP OJ O O rH OJ kD VD

γΗτ-Ηι-ΗτΗΟΊγΗγΗΓΟ^ρΗ^ΓΟι-ΗΓΟ^ϊΗι-Η I I 1 I I 1 I I I I I I I I I I I

oor-om^CM'TiOonooo^oontNCTiVD r—i i—I f\ t—i £T> t—I i—i O rH O CD O i—I rH

i—I rH rH rH *—* i—1 t-H ·—· *—* rH *— ’ rH 1—‘ 1—1 rH rH

COr^OLD-—CNJ'^r-.^OOi—. —.VDi—>Γ—.ΟΊ^Ο.—. O >£> ·—COrHCD'ir.—ICTiOinr-rO

o3a5ChcD^roocDinoooao<j>rHroc\iCDoocNir)^r^r^rir)Pr)'5'^r^r^'^m»5' VDVDM>VDcOVÜ'*DCDCJ^kO<yir^rHOÖ<^^VDO'i)^rHVDtOVDVOVOVD^D^i)«OVD rHrHrHrHrOrHrHrO^TrH^COrHCO’iTrHrHinrHrHCMrHrHrHrHrHrHrHrHrHrH I I I I 1 I I I I I I I 1 I I I I I I I I I I I I I I 1 I I I

00>CsJr,‘'X>'3,VDr*rvlir>OrHOOin*3,rHCO<TC\JQD^DOrOOVOCOrHCNJr~^m r-VOr'-VOVDVDVOVDr-^DODVOO'Or-r-VOOOCOCNCyirOnfMf^CNrOCNJOJrHfM vX>VDVOV£)CO'X)VDr0^i,VD'3'rOOrn»3,VDVD^VDVDrHVOV£)^^D'X>^DVDVi)kD^£>

rH rH rH rH rH rH rH rH * *——1 rH rH ·—* rH rH 1—* rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH

OrtJDOOUrtifisCrtDDOOiÏDöicCDDOÜOOOOisiCÜOrf: PO<D<tfCDOO<DOÜOUD<OCJ<C)rf:DUOrt;DOOOÜ <οϋυοο<Ρθοοο<υο&Ε><ο*ι:<υοθί3:οΓ)5:ο<!3 D<ÖDDDOOd;rt:<(J)OU0<!)DOCDDOD<rf0ODt3<Ort: üDODe)<t>QOoooDDOört:o<oc3öc><iÏE30ünrf;o DUi£rt:DODU(J)DD<OODe)DPCJDüOrt;e)D<rt:DU(irt:

OD<DUD<0{JD<Urt:DD«£0O<Drt:<i20L)ÜUrt:t>OD

3UUÜUD^)PD<OUDCJO<DU<ODO<DD<<UOOO rfODn>rt:ooDDooooooe)<<rt:u<c)rt:D=>iirt:oDD U<<aUDOOUODOrtD<t3*4;ODC>Oiie)OtDO<CD<<D r3uuscooo^UDorDcjcjo<<oOi<o<iDrt:rt:Dt>c>ooo O <D<»iDD*ÏO<OOOri:(JDüL)<D<<Drt;D(jrDODrt:<< ο#<<οοϋίίου·ΐ<οοθ4:»ίοο<#ί<0υυ<ςο^>0<Γ3υ ^ tfCJÜDÜ<UDD<UDODO<COODfiDDDii<<:OiiOrt; ^ <<D<in><DOrt;ouoüOUüuoDe)o<DD<oart;Do2

0<DOOO<fÏODrt:ODD3Di«ÏCjDDOCJUÜD<DOOn>2 POO<CDOUÜ<UO<L)OD»iuU<UDD<OrfD<De)D DD<<ort:rt:oDooDOrt:ooon>Do&ort:ot>fioii<rt:cD

(<<ÖDOC>00<OU<UDO(J>0»<<0<rt500<300000 ODrfOOOODe>fiDUrt:<<i<DO<<OOUOf<C)iit50rt;r>

C>D<iDrt:Drt:ODOOÜÜOOOO<fiOODicCisCDUCDD<3D

DOO^ODOrf^DOeiUJ^ODDOtJtfDdJicCiiDDDODOD

uDöo*ioöc>oDDUrt:<oDi<ooDocje)oc>u<rt:t>rt:e3

D<ÖD<<D#iDaOODUö:e)ÜD*iDDrt:Drt:OiÏO<^»DD

rf;oe»Douu<Ori;o<Cüe)üDDüc>Doo#<DD(c2»a:üüuo oDöue><rt;auort:uDfl:ü<Dü<uoDüoouo<öDrt; DD<Cri:t>uo<<urt:ouoüoDüDüOd:D<ri:DDo<< poouutf<ri:iiDoe3<oc)D<ooort:oort:iiDDOrt:oo

CJ<Ö<U<E3OO<dÜOO<*<DOO3<;ODr3O0L>OD<OrtJ

<UDDi<0»i0C><rt:DOU<L><rt:0<OOt>U<DD<ODtD

od:u<u=><rf;e>üüu<rt:cjri:DUDüo»!iüDDrt:oo4:Du

<DfiCiii<<ÜUODDUUC5UUrt;OUrt:0<t)DUUrtODOD

^Λυοϋυο<ο<ουαοο<<ο<οοουυου<ουο<

tfiiCDODrfiÜDUODUDnDÜiÏfitJrtirfitfDCDOOÜOO

fitJÜFiDDOOODiiÜUUOrtJDÜÜDOD^OODfiOrtJOO

OD<DOOOC>D!D<i4:c_)OC><rt:D<<OOÜl500t)DL)OD

^iTiCTic^oiT'Oö^ö^tTtt^cr'CT^ö^^cr'cno^iTtO'iO^D^cricnc^tno^a^o^o^o^

rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH ι—I rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH

4J+J4J4J4J-P4J4J-P4J-P-P4J4J-U4J+J

fÜdJiOfQtifiJCOfOttftifQcOfOrOfOtfrO

VHlHMiHMWiHUMtHHMtHUtHMlH

4J^J4J4->4J4J^-U4J-P-P-P4-).P >- v *. ·. *. ·* h *· » ·>. ·» «. *. ·» «. - «.(ü<QfOfOr0tQO<T}(Or0<T)<T3(Üf0

(nn(A(n<ococo<ncoco(nv)ton<oa)(nM)H)HMMMUiV4MiHM)HM)H

•Η ‘Η Ή -«H -rH Ή -Η Ή Ή ·Η ·Η *Η ·Η ·Η -Η -Η ·Η 33333332233333333 * - - » ^ ^ * gEgggggÊÊEEggggggtntf>«ö>(nOTrtin<n<nwrt(rtvï 33333333333333 * ^ „ * - ·. «. ν *- * - ^ w - χ - sOiD'iO»Ü'tJ'ÖiO»OiCrO'CnC3>0»^

WCOCOiOinOTinüïWtOCOiniOWCOcnOrHrHf-HrHrHrHrHrHHrHrHrHrHrH

3333333333333333300000000000000 O'O'O'd'D'O'O'ö’OiO'O'D'O'a'D'OO'Ê β Β Β Β β β Β Β Β Β Β Β Β <-Η rH rH rH rH I-H r-4 rH · I rH i—1 rH I-H r-H I~H rH rH OOOOOOOOOOOOOO

OOOOOOOOOOOOOOOOOCCCCCCCCCCCCCC eEEeEEEeegegEEggg>,>i5H>i>,>,>i>i>.>,>,>i>i>, οοοοοοοοοοοοοοοοουυυυυυυυυυυυυυ ccccccccccccccccc

OUUOÜÜOOUUUUUOOUUCCCCCCCCCCCCCC

·* *. ·* » *. *. *. - ·> «. ·>. «. «. ·» «. *. ^fO<OtOfünJcO(OfOfÖfd<T3<TjftJ<d ccccccddcdddcccccggggggggggg^gg aJfdnJ<0f0f0fae<0<tJfdi0<T3f0aJrtJr033333333D3333D <otd»o«3fafO(ütti<0(0(D'0<ofdfomTJx®3:wacxsffiïixxxx BB BBBBBBBBBBBBBBB 33333333333333333 xxxxxxxxxxxxxxxxx αοσ»ο»π(Μη^ριηΊ>Γ«-σοσίθ^(Νη^Γϋ->νθΓ-οοσ\^!Ζ!^^2!ΰ^^5? r'r'CDcDCDCDCDaicDtDtDco^O'OioiaitjiOi^c^oi-··’”'-;0000

rH«—li-lr—(rHi—IrHrHrH

'ί + + + + + + + + I + + + + + ^ Μ -------------- > „ „ „ .22 ο m cm σ' ϊΐ «τ η η om Jrf

φ Φ ID <0 W

1—I 1—I Ή Ή CX

III I ΟΛ

Μ Γ' «ƒ ι-Η QJ

Ν Η Η rH

U3 VD Φ ΙΟ

Η Η Η Η Q

" " “ 1—' ♦-» -------------- m ο OJ if) Γ' Η ι—, CTS «-Η m 00 00 inifim'rq'n’ririiniTOD *2

'ΌΦΦΦΦΟ^^νβΦιΛ V/J

τ—4 γΗ ι—I ι—4 ι—4 { «Η ι—* τ—I γΗ r-t

I I I I I I I I I I I

«i'r^'Po^minfHcninoo 2

Π (Ί fO CM (Ν 00 Π ΓΟ ΓΟ ΙΌ I

ΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦιη ^ τ—4 «"Η ι—4 «Η ι—4 ι-Η ι—I ι-Η γΗ 1—4 _______________ο § w £ r-iNjffi'Tr'Uiain.—. .η m ld ο <£> ϋ ^«τοΊΟΟοσ^σ^ιηοοοοίΛ λ» ^DkOvor-r'-r^'P^Dp^p-r-p-r^'P 1/! 1-Η ι—I 1—4 «-Η ι-Η τ—I ι—I 1-Η f**· ι—I r—I 1—I ι—I ι—4 >0 1 I I I I I I I I I I I ι ι *—* oiTHiDoicoHinr'minr-ojco ι <-ο CNfNCNCDOOCOOTr^LnOOCDCOCOi—I ι—“4 ν Ν ΦΊΐΦΦΦνοφφΓ'^^ιβ'ΰ^ (λ ο ι-I γΗ 1-Η ι-I 1—4 1-Η 1-Η 1-Η '—· ι—I ι-Η ι—I ιΗ *-Η Ί3 —I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I < > α) •a DO<U<D<<DOO<<U ΧΛ Si UD<<<<<<00000< _ Ο* 0<OOD<OUDD<<DO Ö (Λ

DOO<DDDO<OD<D< CO U

0<D<UDD<0<<DU< > I-η <D<DDUOUOD<D<O UUODOD<<D<DUDO e q <D<UOOD<U<DD<D « & <DDD<0<0UDU0<< S> <OUOD<<DUDDODO Op ΙΛ

D<DO<DDDUUO<D< G

Ό OUD<U<DOODODOD rt) L-

' D<ODOUO<<U<<DU H

<<<<DODDUODOOD

u<ouddo<<<<ood co ^ DD<O<DU<<DOD<0 CO0 -------------- | J2

<<DOD<ODD<O<DU Q

UDOO<<UDDDDUU< 0) ö DDDD<U<<OU<OU< -rt <DU<UOODDUDD<U /^y oo<dod<uo<o<o< rn w <o<ud<<<üooo<d m-Ι ng OUOU<DD<0<<U<U ^ 77 D<<<OUDUO<OUDO flj D<OOUU<DOO<<D< c\ ro 0OU<U<DD<O<O<U -¾ ST:

D<D<<OOOU<0<OU ^ <N

UO<DO<<OUDO<00 ** ^

<UUD<<<<00<0<0 «ι I

<DU<<DU0<<00<U ι—» 0<ODDDODO<0<UO ^ yj-s

<UOOO<DO<U<ODO H

OUU<<DOU<D<ODO OT xfi UDD<D0D<UOU<00 Cd DDOUO<<UUOO<DD -g* ^ ______________ c z > .¾ ΟΙΟ^ΦΦΟ^^Ο^ΙΛ^ίΛΟ'Ο'Ο'Λ Q r/} ι—I ι-Η ι-Η ι-Η ι—4 1—4 1—4 t—I t—4 Η i—4 i—4 ι—I i—4 ^ ______________ t | 1 § ^ 00

4-> 4-> 4-> CC

2 2 2 « g « g <Z> iÏÏÏÏcowtotnwcototococo^ ^ co

rri m H <H <H ‘H ·Μ -Η -Η -Η ·Η > C

5,52^3333333333^ Jg 333eeeegeeees.a « 8 eee..........g

222cccccccccce ö G

s.s-rï.^rcfdfoajfaca^njm it ra unnfl<0f0a3<Bf0i0f0f0,TJe .Si „ „ „ iiiiiiiiiig Ό gg^xxxxxxxxxxïï +_.

10 « (O 3 Λί S

§« « x h w e I 2 _r 3 3 3 Cc XXX g « a s ^ a> ______________ O ju

σ4θ«Η(\}Γθ^ΓΐηνοΓ*·οοσ»θι-Η(\ι ΟγΗτ-Ηι-Ηι-ΗγΗτΗγΗι-4ι-Ηι—(CNJCNCN ι-1 rH ι-Η i-H i—4 t—4 τ—4 i—( ι—4 ι—I ι—I τ—4 i—t i—I

a c m η j

η y I J

n O ij J I + I | | | I I 1++1 I I I + I I I I I I I I++I

Φ E Φ fj > at! o S w (0

0) 1-H

^ . O (Λ M3 i-H M> co GD m σι GO 10 .—. Γ*· CD —I

r: " w 3 cm m> o r* <n σ\ ro vu σ\ Ό id r- r- <X3 j !r 3 U M) rH rH V0 VD O VO rH CD rH c0 VD M>

,n .—. JJ ·Η 1-H f-H «-H Η 1-H rH «—1 rH rH »—♦ 1-H i-H PO

Γ;^^σΐ||ΙΙΙ1Ι I I I I I I I I III |lll L Jx fll (D OM O» 00 ^ rH PO f-H rovo ιΠ Γ- lD CTi L_' , Pi > 1-H 00 ιΓ) p- 00 «HUO 00 <T CD ifl in ΓΓ ~ ^,1 M 40 rH O 40 40 O 40 1-H ΓΟ rH «t vo vo cd n! O rH rH i“H rH rH rH H rH rH rH >—r i-H rH ' -ΓΊ *5 r* ._, ._, _ ,_, ,_l ._. ._. ._. ._. ._. ,_. ,_.

CTl ΜΗ *- ü> rH ^ ^ „„ _J — m CN M> i—> — <\J CO ^ 00 CD CN 00 00 4θ4οσ\—.

[D L; w oo cn M> ro 40 r» cd m in M) >cr co c\i inc\io\r-*CNjromko

rnf-^m3 lO rH O 0D 00 O 40 40 O CM ^ lD rH pOrHPOrHPO^D^OrH

j rl i—I rH rH I O^rHrHrH rHrHrHrHrH rHrHrHfDM'rHt-HCD

IJ z.-s o i i i i i ι i i ι ι ι ι i ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι i l: Ij “ ü σι cv 0¾ cd vo <n co r- 40 cm «-h t-HCöo^r'-CMr-m'o | CO VOO D1 M3 Γ- ÜO rH PO <a*lf>CNjr-*rH *3<ΟΓ·~σΊι—IrHrHCXl

!Γ] v 1 33 LD rH O Γ" Oï O 40 40 OCN^fiDrH CDrH<DCN,;3,404OCM

^ E rH rH rH ' *—< rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH «—» ‘— rH rH —· CP UH ' ‘ ‘ 1 --1 ^ —Λ ^ ’ ^ ·~· ’ 1 1 ι-"' *H „ _ „ „ „ ^ π ι-.^, g · ^M)rocMPOC^Or^^(MOM)r->cDr'roocnLnr'CriM)ODr--,^(nr- -—, ίο® „,νοροΓ'Γ'ιΗΡ-ΐπ^ΓΓΜσ^ο^τΟΓΟο^Γ-ιησίιΗΓ-ιηίη^αοοοοο ^lOOeOVOrHfOrHOOLOOiHVOr-OrHrOiOVDrHrH^'^rH^roooVOO®

. q O β fl. rH rH rH rH rH rH OO rH rH rH «H O^i rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH CO LD rH rH CD

r5CTOjl||lllllllltlll|ll|lll||lli ^-jrHa^vDroosicocriOinD'C'jOMiD’aDr'Coocninr-criMicocri^j'C^r-ao ^rO'~'!TD’rHiDlD<^inCDCviOr,'00D,00rHC0CNi4nP0r^C^lOCDM300M>M)^D ~ | ;ÏOM)rHPOOPOCDOrHM)VO(TiOrOD,M)rHrHD'nrHD'r,0«TM3C£)PO

^ 2 1—f rH rH i—I ι—t i—1 1—’ i—( rH rH rH 1—* —< rH i—I rH rH rH rH rH i—I i—I >—1 ·—' rH rH '—· üuoüüuooüoouuauo<oooucjurt:rt:ou

ÜOODOOOCjDÖDDUaUOUDSDOrilÜCDOODCJ

DDODtfUiiDUDDDDEODciCCXOtflCJÖOlOXCD

^OsC^CUOÜiiOrtiÏOUCJCJiiOOÜisCOii^DrijrJUO

St3<rt:uODO<OC>tDsCtDrfp<iiötDOU<tDOODDO

ZjÜCJO<<UUO<DiÏ#iDUiStDL>OC_>CUönDe>rt;C3

^UCJciUDiÏDUUOiiiiiÏUiiOÜJUODrtlCCJUDtDD

UUU<00(J(Jrt:<DCJD<ODDOOC!3DUe)ÜOO(J

r-OOUrflOCJUCJCJOUOUdJOüUiiOCJODXCjKiOX r.Drt:rt:u<rtPDüPDc>üOD<rt:o<oDc>ooort:p ^tfiiD<D<ri:öDrt:ürt;e3pÏODD(j*ie)<ut>rt:Diio ”j<00<O»<Ürt:rt:OÜOrt:0<CUC5Diit!3{JD0U<OD [jOOOOOODt)Oi<i<UOf<<DUUUrf:<Dd;üODO tHDDD<D<DOO<Dt3DDUDrfODUr>fq:ODrt:<rt: ^ .SüieCrti^iCiiUfllDÜiiDCJrtDOiiitïCJiÏODOOiioO

so ”·«:οο<υοοοθΕ3ο:ζ><θΕ><ουΓ3*ίουουο<υ ^ <<<OL)tfDe£ÜDUOOiÏDO#ïoe)U<OiipDi5u <oe)*iöi<D<Drt:DOrt:^>D<srt:iiDo^>oDcjr>^

öouo<ort:DrtDKirt:Dri:*cc><:nort:<pfc_><Ort:D

Üi0:<D<r>C!)D»iOi4DU»iiDDri:DDDfiDC!)rf:OD

OUODOOiiOrtiiO^DOiiOiiOPÏDOOOOOOO

οοοοοοοο<οοοοοιίοοοοιι>ο<οοοοο (!ί.<<<ο«5;ο»ίυοο<Λ:<κίο<ουί<θί<οο<οοο

SoooooOfi<ooooooo<ooooDoooorto ÓOOODODOOOOOOOOOOOrtJOOOCOOOOfl: ^oo<Dd:oofi<oooooo<fl:ooooort:ort:oo ^<oooooF<iio<rt:ooo<oDOört:crt:oooort: wOOODOOOOOOOOOOOOOOOOO<rfJODO< Λοοοοοοοο«:οίςοοοΛ:οοοοοοο<οο<ο ctJOODcjoooDOiio<coo<rt:o<ort:ooocjoo Γ,οοοο<ο<:οοοοοοοί=>οοοο<οοοο»<<0:

rr<OODDOOOD<DD<ODOOOOOOiÏ<rt:oOO

ÜJ<oooo<oooo<ooooort:<ooo<oort:rt:o 0000<<00<<00<0000<0<00000<<

OOOOOOOOOOOOOOÖOOOÖOOOrtJOrtiOO

<<<<ooo<o<iitfi<rt:fl:oois£ooo<ort:<ort: oooffo<:oort:<«iiooooOiirt:rt:DOrt:oo<o ooooooooooooooooooooooooooo

I Φ O U

O' O' rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH 1—I rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH

•HCCNJCNCNCHC'lCMCMCNiCMCNCHCMCHCMCNOHC'JCvlCslCMCMCMesICsJC'JCNICN rH φ O rH

4J -M 4J 4J

<0 <0 <0 aJ

m m M t-ι n n

‘H -H

D D *“ "* ^ * wwiotnmcniocnwwwcnEË1?”0’^ O'O'O'O'O'b'O'CT'O'O'O'O' - **cec2

rH rH rH rH rH i~H rH rH rH rH rH rH yj y) C t3 R CS

00000000000033 EEggdgeeseesü'0'Drt/r'' CCCCCCCCCOOOOOOOOOOOOMrHÏÏÏÏÏÏ” ötofOnjflcTjcTjajtoiOCdCCücccccccooB.B.S,^ 0(0 m Γ0 (0 (0 (0 (0 (0 (0 >ι>ι>ι>ι>ι>ι>ι>ι>,>ι>ι>ιβ E ^ ^ ^ VHEEEEËEEEEUUUOÜOOUUUUOOO'dTi'd'd CQ33333P333 CCgggg χοκηΰκκχοπ - * * ^ ^ » - - - ^ '>^>iSMSk ccccdcccccccuo22°2 <0(0(03ajf0(0(0(0(d(0(0 b b F r

υ(0<0(03(0(0(0«(0(0<0(0 * - rt1 m ?V ?V

ggE§geeeees|ccoouu ^ 333333333333(0(0 M XXXXXXXXXXXXiOiOJ-^J'J·

We c= C C C C

S 5 co 03 co m PQ i X g S g §

7^· X X X X

H _____________________________

•fDD,lDM3r'XCT\OrH(NPr)^inC3r>aOCriOrHCNJ(D^LDM)r^X(Tl kHC\JPHCMCsJCNC\:CNJCnrr)P3CDmCD(DrnCDP^D,'T,3,D,»^^^r^rD’^r Z rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH Ή rH rH rH «-H rH rH rH rH rH rH rH rH

+ + ιι + + + + + + + + + + + + + + + + + +

O

(N

______________________ <L> <\J .—. CO PO <Xv VO lT) O CH 00 (\ί Γ" *=T O rH Q> r-r-'<rcsir-s3,Poc,'>cr>*rmm*3,mpo mm · r* \D vo vo yr (Η rH m m i—I «—4 rH i—I rH rH rH i—I t—I rH rH r—I f—I J"

I I I I I I I I I t I I I I I II

<VJ*r^(NGDma*VDinO(N®CNr~^' O rH (O* ÜO liO ^ t-O CsJ i—( rH rH (NJ rH rH (NJ rH rH t—I ι-H C/5 VOVDmmVDVDVOVDVOVDVOVOVDVOVO VD VO <^>

rH rH l—“* rH iH rH rH rH rH »H rH t—I H i—I rH rH tM

^ “ H-*

O

-------.--------------- -4—» _ _ r-

Cvl ^ ·—· —· Γ- rH m 00 Cs} vj

m m vH <Ti q· m λ ^ in CS

VDVDrHO VD VO VO VD VD

fH rH m m rH rH rH iH fH * *

I I I I I I I I I CfJ

eg *τ ή σο r- rH m co cn rH «η ov co eg m m og m w

VDVDCsJCM VD VO VD VO VO

rH fH *—11 1— rH rH rH iH rH ^ * ii_____________urn__a «=

Q, O

vo <—.·—oovopocsir-<y»in<Tv«i'rH<rvmino«3'r-ao rrj o aooorOrHO'vir>«ir«3',!y^rpo^j,<a,«3,«a,<r>ooooPom VOVDOOOOVOVDVDVDVDVOVDVDVDVDVDVOr^r-C'r^VDVO CA3 =

rH rH PO PO rH iH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH H rH rH r^H

| | I I I I | I I I I I I I I I I I I I I I

-ςτνοροΗοονοροΓΜΓ'-σϊιησν^ΓΗσνροιηο^Γ-οο fv VOVDVOVDr-mCHCNCNJCNrHCNJCsJCNCgr^COaDCOOOrHrH ^

VOVOPOPOVOVOVOVOVOVOVOVDVDVDVDVOVOVOVDVDVOVO I fO

fH rH '—1 rH rH fH rH I—I rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH CO KA

Z_Z___2 & CO !? L)<scrt:t)(jooort:ourtirti<u*<o<oiscuri: ^ > rtJC50UDri:0<0DU0L3<ri;U(<0D<Crt:L) ^ 4> 2DOrt3DDDci<«CUOrt:OODfi^>rt:C!)UL) ürt;oofl;cjrt:u<Ort:DDe)»i<oo(JDou *7 ου<ϋ&οϋθθ<ϋ<υο<νου<ον< ft rt:DUoe)D<oon<OD<o<Drt:<o<o ql x D<DOOCUO<OODÜrt:DOia:»iDDfi< C/5 05

D=)C50»Ï0D<U0(50rt:0<DD<Drf<C5 _ V

OÜUPDrtlrtlPUUOOrtiPDrtJDOPPOrt: > O

D<DOn;C0OODicC<<iiOOODD<O<Ü ^ +3 ü*ioeJUO<OD«DUD<C5<OOrt;DO< ö rt;OC)Drt;ortrfU(iO<ÜOE)<DÜC0Oi<D Π Ό 2öDO<<2ort:DD<E><ODe?rt:Pe>PU rfr\ 0\ f2 Ori3POüUD^UOD2rf:2<PÜDO<UD 2P #m

OUÜPPPO«<DÜDO<L>Ort;rt:PPPD C

<i£DDPDD<ii<<ODDisCDPUO<DÜ ü · · υ»ίυοοο<ρ<υορρϋ<ο<οοοο< Η ζ/ϋ <ϋ<Ρ<οοϋΡΡ<<υΡίίοορ<ο<ο q ---------------------- g ^ Ρϋο<ΡΛ:οο<»<ΡΡϋ<Ροο<:Ρορο δ r*\

ÜPÜUe)ÜD<PUÜ<«sÉUDODUUUUP Si W

DPrilrtlrfriJrtJPDOPUrtlrtlDrtJ^OUDrtlU »—· <0θ#ϊ<<υορ<υίΐϋΡοορρι<Λ:<ίί d z-v OD<UÜO<PU3UiiDPDP<s£CJrt:ODOii rjH Q./ 0<<0PDDC5D<iiDrt:PO<0P<0<ü ^ ril

Dt3U<Drt:DPODOÖUO<Drt:O^CJDri: r o ODOOÜUPOiiDiiOCPrtDOOPrtJOP w Kfl <D<oprf:c)^»ippppucjrt:tf<PODo ^ UOOC<DD«OOOOprf<D<Ort<<D <ri:OU(J3DüO<DPrtP<DÜP<P»iO< jX Γ*-*

DO<CPDrt;<POrt:<C3ÜO<<PiiOPOO -¾ ,-H

ιΐ<οορϋ<ρο5υορ»ί:ρ<<ρ<ρρο 2 , <ρΛ:οοΡϋορ·ίίυ«:ορ<οροιΐ·<ρρ ^ θΛ:ορ<ο<ρ*:ορΡί£υυρ<3<υροο a>

D<ÜOUri:D<U<DO(5PUDi£PPÜDU «h <N

rt:OPO<«UOUPCJPOrt:PO<üP<OD s »—· UPUODÜDUDODiirtUDPUiÏOiiOO Η ,.Λ

Drt;oort:rt:<PDP(Jcjpuu<D<P<jOü g OOUÜ»iPUPU<tJOOPDODOrt:DPÜ Cy ^ ODD<UOUUPUODPDODODODOD ^ ^

----------------- c: Z

<D S

> fa rH rH rH rH iH rH rH rH rH fH <H I—I rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH O 5Λ

Cs}<MCHCV}PsJCNCgCg<M<McgPslCN<MfMCM(M<NCslPsJCslCJ *£j ^

c S

______________________ -5 >

eö C

*J 4-> -P -M ^ <U

<0 m iT3 m ^3 ftn V-| P P —-

pgj4->P-MP-PPPPP

».v^^(TJ(0i0n3*Tj(TJ(TJ(0(T}<0f0 (ü

cnncocnpppMPMPMppp "Q H

•Η -Η Ή ·Η C/3

EeeewtnOTcoco(ntncnw(ftto ww > co *.*.«.*.D>DvO^O'O'CT'O>OiD'O'D>«22HH'T>f0 fl> «CTtOCOrHrHrHrHrHrHrHrHrHrHrHrfëeëc^^ 4> V5 333300000000000^ = ^^= ^ ··-« cT'CPO'^eeeegdeeeee ^ ^ ^ ^ * w ti

rHrHrHi-HOOOOOOOOOOO^f-. — c^CC C Q

OOOOCCCCCCCCCCCEESSSrötO S OT

oooouuüuuouuuuugggssii T3 ,2 cccc Rh§§§33 >1 >1 ^ ·» " ^ v v "· " ^ «» ·* '“•T'OCOPrdrC DCffi ^

UUUUCCCCCCCCCCC*3-1^*1* G

<T3(TJ(0<T3t0rt3f0a3n3<T3n} Vm <U

·> *. ^(Q(TJ(Q<TI(T3f0iTl<Qn)^lT} ü «s ccccegiegeiegee cc (0aJf0t03D3PP333333 CSt (orommxxAAsxxxzxx

ë b i e do -S

3 3 3 3 m Λ x x a w ±r* ü ______________________ O J3

OrHOsimsTUOVOr-QOCTiOrHCNm^LOVDr'COtTiOrH

mir>ioir>inuoini/Oinir)VDvDvovDVDVDVDVDVovDr‘r,‘ rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH

04 CD 04 rH <\J

*H rH —* rH .*-* rH r—( . —* ·—

-V '-v <T\ '-v r- -n. ’•'voo er» <T\ in 'T

rH CD OD <H GO tH tH <\J rH rH tH rH rH

Cï t*H «—4 Ss*h. rH — rH """Ν '"sv '**<«» CO — —· co — r- — —'co co co tn «r

.—· «—I rH ·—« rH r—ι .—I rH rH rH »H *H

O p«* <J\ — CO — CD VD — — — — — &^T --< «T V 04 o *—« . r-· — (nmcMcnr^ro μ φ m m o cm

rH i—( «H 0% «H rH rH Η Π OJ rH _ O O

Q i r σ» i ro i irn η <J4 oo 8 ovrHioiao ini ι ι ι i O cm co 'T m rH co C4 σ» m ld 40 οί C m m r- m o m rHrn o m co co D>1 rHrHONtHrOrH tH m PO CO CO Γ-

_Ü__j__^^~_L_~ _i__i__j__^_j__j__i___i__^^ _L

r- 00 04

^ rH rH rH

O \ N. \

CO 0- CO CD

40 rH rH rH

• O — — — Φ Ol . r-,

(D <v> O (Ti VO

Sm c\J m og 40 «t «ï1

tin III

tn c eg co I o cn o Δ Η <r O Cfl__!__j__!__|__j_ _ι__j__1_ —_ι__j__j_ —_j__\__ι__ι__|__j__j__(_ co

rH

s co

CD rH

m — co ^ U> o rH r- r- o m

00 GO I

H m P ι m 4d ·Η « O__j___i__j___t__!__i__j__|_ _i__|__j__|__j__ι__j__|__!__j__j__|_ rH CN rH ΓΟ

rH rH rH rH «—>» rH

\ \ \ \ co \ «T rH CM rH .Η ΓΟ

rH «H rH rH S» rH

----- — CO — r· r-, ^ ^ π rH r-1 •0 <N 1-0 — 40 CO lO «?T LO LO r—. U0

r- «T

O rH rH rH rH rH rH rH

d> m ι ι l I I

*-| CN «3* «3* | ^ O CH ro ^ O •o1

Hl T T sji o «31

J*H rH rH rH rH ^ rH

C5__~^^^_j__|__|___ι__j__^_j__i__i__j__ι__j__i__|__[_ —a. <ts cti οί 04 04 <7\ 04

. )*. rH rH rH rH iH rH rH

>0 S. \ \ S\ \ \ r—^ —. .— CT) . Λ cn — —s —»<T) . CT) CT> —» —s — CTi (Tl

04 (Tl cn (Tl (Tl CTl ^H (Tl CTl 0)rH CJ4 CD σ*τΗ Οι rH rH CD O) O) rH rH

H 40 rH rH ι—I rH rH |H «Η «Η — i—I ι—I rH '— rH rH «H rH —’ ' OW \ N. \ \ \ r—ι S. \ \ r-, N. \ \ --- \ N. \ \ m ^ 00 40 CD σι O) 04 Oir- <D 04 04«3* 04 04 04 H 0440CM 04 04 0401Γ)

r« rH rH «H rH ιΗ rH rH tH 04 rH rH rH CD rH LO ΙΛ rH rH rH 40 LO

S40 I — 1—· I — I — I — «ί1! — I — I — Sfl — ι — I — rsjrj—r CD04I — I — I — 04 04 40 (\J^40r—,αΟ—,ΓΜ'-ϊΓ''-^ I „ in „ H rn I CM >—^ O I—. 04 ι—I J{v>„ | | CD <—> Γ0 >—i «3* ι—. | | A tf) 0004^0440(00(341^ 04 ifl Π 4D 04 40 ^ O 'T CO 04 Γ- η Η H CD <H 40 tT) τ—I «3* CN OJ r~ 8 1 ΐη(4]4ΓΗ«ΙΗΗΐΛ^Η LD LD 40 LT) 40 PO l— LD 40 Lf) if) 4J1 H 40 LD ΓΟ ΓΠ Π (Π Π O Γ~ O 40 sr Γ0 p-rl ΗίΛΗΐηΗίΠΗΗΗΐη Η ΐΠ Η 1ί) Η ΓΟ «T rH LO H LO rH lO V H lT) 04 CDtHlDtHOrHO 04 04 Q3 tH '—’ rH '—’ rH rH ' rH *—* 1—1 rH *—1 i—I ‘—1 rH '—‘ * rH rH 1—‘ rH '—1 1— rH '—· '—* ’—1 tH rH ' rH *—· ·—1

< U U rf OD O O Orfl D O E>< OOD U D UUD

O D D OO < < < < O Ου OD3 O O <ÜO

D O O D DO D O OO O D OUO D O OOD

D D tf O OO O < < < O < <0 <DD O D rfOO

D O ft O < < < Ö OU *£ O OU OUO O D rt D D

< DtfUO(3oUO»Ï«iUUDDODD<0(iOU

Z DiiDOODOriliiOcdCDcCOOOUOOiiD

S «£UD0DODO<ODODODUD0<OO0

•H fiDDODOUOUOO^CDDODUUOODU

<0 D D D D DD D D <0 ^ O DD OOD Λ D DDD

O D D D D< O O ft D U O <0 <<0 ft rf OOO

Q D D < C DO ft O OO O < ft to OUO ft < U<C<

C O D < D ft O < O D O DO ODD D O D<U

<D O ft D D U < < < V O O tf ODO D D D<D

O <<OUDOD<<ODDD^f£0<OOUiiD

•H O D D O OD U O OD U O OO rtrtJU O rt! OOO

4J O O O O DO O D ft < < ö 0< ft ft O O ft < O ft C ODOrtOrtJ<U<U#iU<Oi=>*iO»=iUOU^ __D _O __S._O _O _O _< _0 _U _< _O _< _D _< _0 _< _< _D _U _jt

< U D D UD O U DU O D OD itfDU D D <OD

U < U D UD D O DO D O DO ft < & O UOD

O U O U <U U < DD D < UD DD< U D DOD

O < < O U< O O O ft O O UO DDO U D UOU

D D U O < U ft D DO < ft ft D DOD O O OD< U D < ^ D< O D DD O U UD 0<U < < <D<

U < ΣΖ) ft Drt D O DU ft O <U U<< < O <DO

(t fi D U *CO D ft OU U D D< OOO D D ODD

U ιί < < »iD O O Drf O U DU DDU D D OUU

< ft ft < < < ft ft O ft D < *t *t UU< D < ft < < Z D<(iUtfOOUOUUDi£<Ort;OOUU<0

B D O (¾ U <0 ft O DU < O ft O <0< U D UOU

•H ri! D rt! O O ft O D DO D D ft D UOO O O UD<

O ft D O O DO O U DD O O ft ft O < < D O DOO

.tf U D O DD D < OO D U OO OOU O < O < ft

tt ft < D O OU U D DD O D DO D<< O < DOO

C ιαΙυυ<ίίυίίθοου»<ο<υοο<<οου(5ϊ;

Φ o < < D OU D D DD D U UO O < *t U O D<U

Λ__D_O_U _D _< O _^_O < U _< _Ö _< _U _O _£_O O tf

Q

. Ί cccccccccccccccccccccc (ü «o <0 tn (d <0 (Q (Ofl (O cd <d*o n]<o<d ro (d <d(d*d (3 n3 na (O <d (d (O nj (ü(C(d co (d (d <o <d(d<d (O to ro <d <o

^ jg__I_ï_ï_I_£JE_X_X_x_x_x_x_X_®_X_®._®._X _X_XXX

H

rsj ro m m to r- oo oi o >- cm co r η io n cd σι o *-cgco O U h- h- |S* fs. h. r>s. h*. co GO GO oo GO co CO GO CO co d) O) O) O)

'OlDCD

,—, .—. I—4 f—1 ,—4 i0tmi «—. .—. .—. «—» «—» rH f—4 Η rH rH rH t—I H rH

040^^-^(0 0440 00 Γ* 00 Η H ID (ƒ) 5) h rH Η H ·—I tH CTS φ (Ji O' O' O' O' O'

-N, -s* rH «-Η rH —»s. —v* '—s. "—s. N. t-H t-H rH rH i-H rH rH r—( rH

CD CD '— — — VP CO VO OD Γ- 00 VP ·— ·— —-- — 1—I iH r—I r—. r—1 (H iH rH rH «—I rH «-· ·—< ·~^ <-· * ,—· r—« r—« r—>

—— rHOoD'-r-— ·—----- — — iHE—mCNCOOtH^rtH

.—. ,—, r- r- O'^'·—. —> ·—.·—· —· r—•o'ooisio'ooo'ooiom incvi^r^r«H^,ooO'0'0' cmcmcmocmcmcscmcmcm

CMCMT-t«HrH00OfT'C0fr) 00 OrHrHtHrHrHiHrHrHrH

nroiiio'O'^^'T *3· i— i i i i i i « i i iiiovorHiiiii i imo'm^mcMcovpco r-^rinmooo'O^'fMn r- r-r-voor-vor-voroo'·)

OO^'^’rHOO'OjCMCM tH CDCsICMOCMOnJCNCMOMCSJ

(^Ip^^HrHrHO^CO'T'^'^ VOtHtHtHrHtHrHrHrHrH

O' O' O'O'O'O'O'O'O»

•H rH rH rH <—I rH rH fH rH

N N \ N. -S \ \ \ \ OOOO O'O'O'O'O'O'O»

rH rH rH rH rH rH rH rH rH

CO lD LT) O'") *7 «Η f— O lT) c\j cm <7 <r cm cn cm o ^r^j* m m m m m m oo

II I I I I I I I

o r- r- m vo r> o» cm r-

rH o CM CM CM O rH O OO

«T 53« U") ιΠ lO lO LD ΙΓ) Γ-

_L_L_L_L_L_—_—_—_—_—_—__L_L_L_L_L_L_L_L_L

rH

\ CO [— rH «^'CM'D^'O^’Cn'DO'

rH i—l '—" rH rH rH rH CM rH rH rH rH

N \ i—

oor- «7 ^CMm^O'^TPOVDOO

rH rH VP rH rH rH rH rH rH rH rH rH

ι — i — m i -—- i —· i -— i -—- i — i — , —- i — i - O -—' O >—* I rHr—.rHi—rrHr-,<Hr—.O».—i rH <—. I— —. m —I Γ- .—.

H r Η Φ rH rvIM'CMNin'DWVOODNM'OO'CDCOMn 'O CM 40 CM lO ^fDq,(r)H'D<a,f,)'iMV(r)^Hfn(J'rOÖ' rH VP rH (O lT) Η*ΤΗ^ΗΗΗ'ΓΗ'ΤΗ^Η'ίΗ(τ1Η(η

| | *—* rH —^ rH I I I I I I I *—* I I rH 1—‘ rH ·—-» rH *—1 rH rH — rH 1—* rH 1—1 rH 1—1 rH

oor- vDcMVor-omrovoc'*)

rH rH ·—. —- rH rH rH rH CM rH rH rH rH

\ S. M· LT) \ \ \ \ \ \ \ N. \ oor- rH rHvocMvor-o»mc">voco

rH rH -S "S rH rH rH rH rH rH rH rH rH

—- — <=3· m — — — — — — — — — vp ld — — ^ovomvocor- νοοη oooo *—< i—lO'O'CMO'ooo'r-iom mm «h cncocorHcofonromcn

rH rH rH 00 rH rH rH rH rH rH rH rH rH

ii m r- i » i i i » » i »

O' O' I lO'O'rHO'r-O'lDrHrH

vo vp oo cnr-r-rnr-vor-vo^^ mm θ' 'DcorOrHConrocomcn

rH r—I C— rH rH rH tH tH rH rH rH rH

O' O' O'O'O'O'O'O'O»

~*L_ rH rH rH i—I rH rH rH rH <—I

VU x x \ Ss V. N \ V N.

O' O' — — —- — —. O' O' O» O' O' o» o» .— — —. -—. ~ «

rHiHO'O'O'O'O'HrHrHrHHrHrHO'O'O'O'O'O'O'O'O' ——- —<" rH rH rH rH tH — ' — -—’ — — —rH rH H rH rH rH rH rH rH

m,-.SSS\\^--'^r-,^r-,^-,SSSN.\N\\S

COOO'O'O'O'O'OOOO'VDCMmOO'O'O'O'O'O'O'O'O'

OOOOrHtHrHrHrHOO'O'r-O'r-VDrHrHiHrHrHrHrHrHrH

v^i — i— i— i — i— vo m m m m m 001-1-1-1^1-1--^1-1-1- I 1 T-Hr—,ο.—! o — Γ- '—-00·—. I I I I | I I O —> VO «—> (Ό r-. rH <—« CM i—-O» «—* O «—* CO —-O ·—> m cMCMO'CMComcocMm'^vci cm o rH 00 r- ΝΜΌη^νοΗτσιηοη^ηιοοΗοα)

OVOVQnVOcOCOVOrH^TOVO CO 00 CO m Γ- m '3,'TlO'TinHCO^,lO'3,Ln,TU'r3-^r3'CN^rH

^ ^ηιοη^ηοηηηο m m m m m m cd η -r 1 η η η <τ η «r η ^ h rH«r r-π «c*

•—‘ *—* 1—’ tH k—> rH '—* rH ·—· rH 1—1 tH *—1 1—1 1—* 1—· *—* ’ rH '—· rH '—‘ rH '—1 rH — rH *—1 r—I '—’ rH '—1 rH *—1 rH

Γ3θΛ:οοΓ3ΐ<<οο<0θΛςο<:υοοοοοο να:ο<οζ><υυα:υο<<&ζ><ο<υ<οο UU<ODUOOrt:uOOOOOÜOOOC5DDn

OL>o<uoc3ouL>e>ejoouD<ü<e><;»4:D

<υαυοουϋοο<οουυουο«ιοοοο

OOUOOrt:öD(JOC>D<!=>DD<icCDOrt:3D

DD<ODiiODÜDOODCJri:t5DOC5D<C)<

D<Ort3OOUOi0C>OCJOrt;UCJCJDD<U<O

ou<üü)o^uDDe)<oonoe)Ouoe>DD

OD<tfOOt>DDODOOr>OOrD<Dr5L>ÜO

0D0iiDOL>DL>POUDrt;<<<i<O(JDO<rt:

#iOÜOOOOODP#iOOOUOO<U<POP

00<D000DÜri;0D<PPDDDD<U0< <«£θ<<ρρϋ<ρορυυρΐ6ίου»ο:ροοο

0»i<CJ)UD<rt:PO<PUDUUe)PODDri:D

ο<υρ»ίρ(υο<:ορρρο·ορίί<ρρο<ο (J o _D _o _< _D _D _O _O _O _U _P _P _P _< _P _D _P _< _O _P _< _< oo<o&<<oiDL>Of£d:< ρλ:<λ:ρο<ρρ opo<p<ooPü<ii»ioofipp<<e>Pü Ρϋ<ΡΡΟΡϋΟΡ»ίθΡ<<ΡΡϋ^θΡΟΟ OPDuo<PD<uDfÏü<oou<o<rt:prt: ρρυρρ»ί<υρ#ΐθίίοο<ρυορίίουυ ÜUD<ÜUL>rt:UPO<P<<iiC<<rt:POUD PC<UPUPDtfOPOPrt.P»iP«oe)U<0 ρυυυυουυ*ί<ροουοοορορίίο<

u5upi£OO<O<O0rt!PPPPÜO<«ÏÜDP

»α:<ρρ<ο*<#ί<ϋ<ου<ίί·<<ρ<<<αο UODUUID<0<AUZ>U<J<UU<UU)U<< <ρορο<ο<<2οϋθΡϋοο<Λ:ρ<Ρθ

<<port:Du<uSuurt:opurt:uu<pL>D

ϋϋΟϋϋΡ<<00<<Ρ<<<ΡΡ<ΟΡ<<

DOOOÜUOOOÜPCJOOOOOrtlPOOOO

<<OPÜCJOOe}OOCJOO(J)rt:PUPUDDO

οορο«ο:ουορϋοοϋυοοοϋο<<<<:

U>DOD<<DUUP0tfDPa:<DCJPODL>O

< ο_p <_0__p_p_0_0_5._a._<__L2._^_0_<_<._<_0_0_0 00)00)0)0)0(/)(0(0(0(0(0(0(0(0

Oa)OOOOOD333^3i333 (OCOcncoiOWCOO'O'O'O'O'O'O'O'O’

- C - G - C *. C - C - C - rH .H — rH -rH v rH - rH wrH - rH - rH

C C C G C C CC<ÜCfÜC«GröCaje<SC<TJGOGOGOCOCOGOeOCOqO

(0 ro (0 Π3 03 <0 Ό OaOO.flft'OCIlDQ.cJCIliCl'CË (0Ë fiË DE flÊ flË Oc DË aj o <ö ta ώ (TJ(OËrt3Ê(OgfOEiö6rtjg<dË^o<oOiOO<üO<TJOfeO(OOfOO«go

ï ë ë £ E g Éi-HÊ-HE-HE-HgHÊ-HÊ-HgGECÊGÉGÉCEGgGgGgG

3 3 3 3 3 3 33ï 3^ 3i 3i 3r 3£ 3>3>i3>3>i3>iP>'3>3>3>i a a_a_a_a_a_a a o a 0 a 0 a 0 a u a 0 a 0 a 0 a 0 a 0 a 0 a 0 a u a 0 a 0 a u

Sin(ors.a><nOt-cNco^-to(Dr^coo>o^cN(0^(0(o OOOOOOOOOOOOOOOt-*-*-1»-*-*-*-T- 5T- t- _^_CM_CM CM CM CM _CM CM CM _CM CM CM CM_CM _CM CM _CM_CM

onononononononononononononononononon ov on Ή rH ,-π rH Ή r-H rHr-HrHrHrHrHrHrH »—< ι-Η rH τ—< — *—t »—< <TiS\\SNNNSXNNNN>NN\'s'N-^\N.

ΗΦσΐ(^σι(Λσισΐσι(τΐίΛ(^(ΛσίΦ(Λ^(Λθ'Ησ^(^ ^ Η Η Η Η γΗ ι-Η Η Η Η Η Η Η Η rH Η Η Η Η \ ' I Η — 0N*a‘S0fn*3,in«a,O00«H<M0D00f-‘(NCNlf>r*'‘ — CD P*· -—'Γ^·Γ^·'χ>ιη^ΓΐΓ)ΐΓ>ΐτ)^Γ^Ηπα5Γ-ιηιΛα>Γ'ΐθ.—. -η γ-η ON(\|(NCNCNCNOOOOLnmCNrMCN(\J<Hr-iOr'inin I Η Η (—4 Η Η Η Η »-Η Η Η Η Η Η rH rH rH Η Η SO Η «Η

Cn I I I I I I * I I I I I I I I I I I CD I ! ι HVOooiovor-vDrjonvooo'^'^'^'J' I ο σι

,—ivDin-crmcMr^rommci'—'Γ"- sonnsotnmoNOON

S0CNCNCNCNCNOOOO'3,Cr>rMCNCN<N*H«-<O*rin^' ON rH rH H rH rH rH rH rH r-H t-H I-H *—I rH τ-H rH rH r-H rH 00 rH rH

_L_L_L_L_L_L_L_L_L_L_L_L_L_L_L_L_L_L_L_L_L_L

inmoom ON PO SO SO ON 00 r-

rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH

N. S S N \ \ V \ \ \ lO <n 00 m 00 Γ0 SO SO 00 CD Γ-

rH rH rH rH rH rH rH r-H rH ι-H rH

I — I '— I I'-' I — 1--1-1-1- I — I — ** *—I U1 r Η Γ-, m I—. . 1—I · ι ^ r-. n r-, CD r-, <M . (NJ .

O 00 O ON O 00 CD r~ CM CMCnOONCDCOr-SO lO ON LO CD

rHrHsTrH^J'rH ΓΟ ON SO VO ^Π'ΤΗΠί^Πσΐ SO VO SO SO

rH rH T-H rH ^ Η Π Η Φ Η-ίΗ^ΠΠΗΡΙ H U) Η Φ

— rH — rH rH I — rH _j__|__|__ I I —» rH _|_ — rH t—* rH — rH — rH I I I__J_ _*— rH — rH

CO lD 00 iO rH CO SO VO Γ0 CO Γ"

rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH

X \ \ X X X X X X X X X

oo lo co in rH co so so *3· co co r~~

rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH

rH r» VD in <XJ Η Γ- SO *3» OO ON oo oo r- r- in oi on (— in m so cnj cm o ro m co so <o co co ro <xi so so

rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH

I I I I I I I I I I II

ON ON rH CM ON CM <-H rH SO CM CM

SO SO m "3> rH r-SOsr^T in rHrH

o m rn ro so ro ro ro ro cm so so

rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH

_^^^_i__^_i__\__l_L_L_—_L_—_iz!_“_^_i__^_l_!__—_—

VO

VO

ON ON ON on on on on on on ON On on on on on on on on on on on on

rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH

\X\XXXXXXXXXXXXXXXX\XX

onononononononononononononononononononononon

rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH

I— I— I — I — I —' I — I — I '— I —' I — I — I '—’ I — I —' I — I — ! '— I — I — I — I — I —

ON-—.CD·—•ΓΟ—,ι/Νι—.CNr-.f’·)'—I UN ΓΊ NT r-> O r. 03 ,—.Hr—.rH.—, Γ"· <—ιΓ-'—iSO.—. rH .—, Γ0 '—iSOf—>r-·—,r-r—<C0i—. Γ" '—I

rHr~<MsocMrHrHcnooONrHONcoON(MONGocDsosooNoooNCr>incMino^pooNmrHCM,ia,ONinoinsososoin

HrO'T'T^Vvrr'l’TtN^HHHHHHOHOSOr'TON'Tin'rvTvrtN'THfnmnvTHrHO^OCOSilCD rHrHrH^J'rHsrrHM'rH^,rH^rrHC>4rHCMrHCMrHCMrHSOrH«TrH<ri-H«TrH^rrH<rrHmtHCnrHCMrHOrHSOrHSO 1 rH 1—‘ rH ·—’ rH *—· rH ' rH '—' rH ·—> rH 1—1 rH *—* rH 1—' rH '—1 rH ·—* rH —* rH 1—’ rH —· rH “—* rH ’ rH 1—1 rH l—‘ rH —‘ rH ·—« ,—j ·— j oD<DZ><rf;eJo<<<POrt;u(Jor)^rt;o <ΟΡθυυυ<»£2ΡΟθΡΟΡ<<θΡ(_>ί3:

OOCJOOCPOieiOOPPCJPCJtJOPOrfCJ

o<u<DotDDDrt;<oootDO<oui<<rt:

DDOOdJDPOlSrtJOrfiPditfDOrfiiUOS

Ρ<Ρ<0<0Ρ<ΡΡ<0ΡΡ<<2«ί0Ρ0 οου2ηο«:υυουου«:οοο2ρυ<:3 ρ*£υοοο2<ρ<<(_>οο<ρ*ί;ορυο<

D<<<rt:UOiiüUUL)DrtUO<i<OOn>U

ΡΡΡΡΡΡΡΡΡΡ<Ρ<<Ρ<ΡΟΡΡΡΡ υυ*:υϋυορου2»<ορυρο<ου<:ρ ορου<υρο*£ρο(2>ροοϋ<ρ<:ο:3»< ourt:ooPOp2oprt:pprt:rt:o<cjoop

rfPrtlPPrtJCOPrfrtJii^OOOOOOPPO

2θΡθ(2)0(_><ρ2υ2θΡ*£Ρ<ί£Λ:θΟΡ ρυοοορυυορρο4:ο2(:)θ2οο«:ο ρ0ρ<<α<ορρρρρυυο<ρ*3:<<*ι: υρυρυ<υ»ΐυο<ϋΡθ<<υοαρυ2

_O _< _P _< _< _P _< _O _< _P _P _P _O _p _P _o _P _< _P _p _P _O

OD<PP<PUpd:rt<o<ri;ori;p<rf;<o o<w<opopocjpu<oppüoo3e)p

OU<PDOPO<tf*i<ö:u<J)UDtfPDDP

<υυυο*<οοο22ορορυορουρο

Du«:uDue)P»iPüpo<pri:Dppocjri: p<cprt:rt:pp0iippppe)ooouo<ri:o uupuo<e><po<p<<ppe)püoo< o<oopu<oprt:cjort!uucjprt:pui<p OUPÜOOO<üOPPOri:o<OPUUP<£ *£ppppürt2poü>oo*CPooppocj2e>

iCPUOOCDPPfsCPDOUUPrtJPOrfOOD

υοορ«:ορϋοοοοοροοορ^ορ< tfDCDUDOiÏDriifiPOiÏrtDPPDsisCü Λ<ΟΟΡ<#<θυΡθΡι<ΡΡ(«ΐ<ΡΡΟΟΡ

(siPüD<OUrt:rt:PPOC?OCJCJDÜODDP

οοοοορ<οροο<<ο<οο^)<υοο ρο<οουϋρρρ**υο<υ<ρρ<_><ορ _< _< _P _< _< _P _P _u _o _P _P _P _< _O _P _Ü _O _ü _< _2 _P _o tnntncncncocncncncomcncococnsncocncr) cocon

3D3333333333PP33333POP

D>tTÖNCj'CT'tJ«(0'ONCT'aiONDNDNDNDNDiCTiONCnDNCnDN

*. rH ·» rH w r-| ^ Ή *» rH Ή ·> r—I *» r—4 «. rH ^ rH ^ «H «. rH ·. r-H ^ rH » rH «. rH «. r-H ·. rH «. rH «. rH rH « rH

COÖOCOCOCQCOCOCOCOCOCOCOCQCOGOCOCOGOCOCOCOCO

iöËtöÊcxJGcoSiTJËcoËnjËcoËcTjgfOëfoGfQËcflëcoÊiOËfTSÊiOGcoËiOEfOËfaÊiOË

(OOcOOcTJOiTJOfOOcdOidOcOOcTjOfdOfdOfdOfdOfOOOOcOOidOcxJOcOOiTJOcoOiOO

gC§ceceCÊGiCËCëCÊcëcGc|CÊCiGÊCÊCececicicicgC

3>i3>i3S3>3>3>3>iD>ia>3>>3>3>3>3>3>i3>D>3>.3>i3>3>i3>1 a u a o a o a u a o a u a o a u a cj a o a u a o a o a o a u a o aoauaoau a o a o h-flooo^-Mco^tmcoKcodiO'v-cM^incoKcoo)

^-T-^-CMCMCMCMCNCMCMCMCMCMCOcncOCÏcOcncnOOfO _CM__CM _CM _CM _CM_CM _CM_CM_CM _CM _CN _CM_CM _CM _CM _CM _CM_CM CM CM CM_CM

O^CTVONCTOïCTeNCTCT

•HrHrHrHrHrHrHrHrH —- ^ ^ 'Z' ZZ ΖΓ ‘—'

<t σ% er <T CT CT <T CT

CTCTO'lO'VCTCTd'lCTCT rH rH rH «Η «-H »H rH rH

*“_Ι·ΗΓΗτΗι-Η*Η«Ητ-Ηι-Η ^ "X ^ "x — CTi (Tv (Tv «Ti <T <T CT CTv

I—, ,—, _ _ . r— <—« i—I <—« «—I rH Ή rH i—I rH

COCTp-VOp-CMCTCMii·» ^ ·~* *—* ^ v 'w' ^ o<r>r-r~r-r-~uDin<N -—> >—· <—· ·—· ·— 1—· —1 >—

iOCMCMCMrHrHrHOO <T> ^ 00 Γ~~ Γ> Μ* Γ- KD

rH t—4 rH r—4 rH rH rH rH rH ΓΠ rH ΓΟ PO CM CM I Γ**

| | I · I | | | | »J m *3" ^ MD <T tT

owo>OD<J><rrH<rr~ i i i * · ι ) » σίΓ^ιηιηιηιηιηηο ή co o <r er vo er co '^J'CMCMCMrHrHrHOO CM CT CM rH O O lO ΐΛ

rHi-HrHrHrHrHrHrHrH *T CM -3* ^ »X> CT CT

(T CT CT CT <T <T

rH rH rH rH rH rH

\ V. \ \ \ \

o> «T CT CT <T

rH rH rH rH rH rH

CMCTrHOOr-

sj- rH <3· CO CM

in «3· in in r- r-

I I I I I I

«3* rH CO CM CM CT

CM O CNJ (N Ή O

in «3> in io r^· r»

_i__j__|__l_L_L_L_L_ί__“_Dl_“_Π“_!__L

f- 00 Γ-

rH rH rH

X \ X

. V£>r- v£>r-.r-.

Γ» 0D 00 rH rH rH [ 00

rH ι—I rH rH ' '—’ rH rH

XXX X „r-, —XX

^rr*co r- oo vor— eo

rH rH rH rH Γ~ Γ" m rH rH

ι -— ι '—' t -— ι '— υΟιΛ r— ι — ι -—' rH .—ι Π " (M !—. rH I I I CM rH r—.

CM O <T O CT iC) CO «3* CO O O 00 O CD

^ Π V H «f H rH tO lD lD rH rH rH rH

Η «T rH «T Η «Η H l_n lD f- rH rH rH rH

| >—< rH 1—1 rH 1—· rH I I 1—· rH I 1—1 «—* *—1 rH *—1 rH

<3· r- oo po co cd er er

«H rH rH rH rH rH λ <*-^ r* rH rH

\\x — x x r~~ cd *3* ι x~ x.

^ r* 00 Γ0 CO 00 rHrHrHrHCTCT

rH rH rH rH rH rH X X "X» X rH rH

*— — «— '— —- >— vd r- «3· r- ·— -- ι—ι ,—. ι—ι I—1 f—> ι—i rH *H rH >—I <—ι ι—ι

CMr-P^OOCD CD

(ΤΡ-Γ'^Ο^ CM ·—. — <— r—, oo r»

CO CO PO CM CM *Η Γ- CO CO O O

rH rH rH rH rH rH rH rH O O rH H

ι ι ι ι ι ι i/omr-r-ii

<T«HO»X>VO rH I I I I CM rH

Γ— CO CD LfO LO rH rH O O P~ co CD

CO CO CO CM CM rH O O <T 00 O O

rH rH rH rH rH rH LOlOVDVDrHrH

(T (T CT CT CT (T

rH rH rH rH rH rH

Ό x x x x x x *-**-*.— —^ —. —. -—CT CT CT CT CT CT -—· .—.

ff) CT CT CT CT CTV CT OO <T i—I ι—I ι—t «-H «—I i—I CT CT

rH rH rH rH rH rH rH rH rH '— '— '— rH rH

XXXXXXXXX r-, r-, m r-. m X- X.

CTCTCTCTCTCTCTCTCT r- «sr CD U“> LiO CM oo CT

rH rH rH rH rH rH rH rH rH Γ"* OO OO 00 00 rH rH

1 — | — | — | — | —- ι -—- J —- I — I — I/O «3* U0 LD Γ- Γ*· |·~· l'-' 00 <—i 00 r-« VD r-. UO ·—< 00 ·—ι CO <—· O ·—. CM ·—’ uo <— I l I I I \ Γ— co .—.

if) cd CO CO CM'S* (M CO CM CD CM rH CMCD <TO CDCO <T CO CD Γ~ Γ~ ST τΗΐΓ> rH <Τ cDpM’i/ov^'M'M'fo^'rn^'noHHH® r** lo ι— co cd η π thpo

Η^Η^Η'ίΗ'ΓΗΠΗΠΗΓΟΗΝιΗΗ U0 <T IT) IT) r~ Γ- Η Η Η H

Duuuuuofiu p ο ο o d d a d 000υ0Ε><3< U < E> O < O O L> DOpOrtJUCJOU o o u ro o o d o <Doo»2uoi3:rt: < z> u ο o d < d OCJOO<rt:C0CJD CJ O < V O < CJ < ou<auuoDU ο o u < u π o <e)nrt:«a;uoc50 o o u o u u co o

ÜDiCDOrtiiDD Ü < U O U O D D

D<u<*irt!oo< tD a o o ο o o o OCJrtJUD^OfiO no O D o Ü CJ no o <r>2<<cjri:<< t> o ro & < cj d d CJtop^OrtJiiDO ο 0 d to CJ CJ D no <»a:e)s<o<t3C!5 no d o no *t u 0 d 2cjdcj<2<cjocj no < d o < < 0 cj

Ori:cjDDDri:D3 O CJ D D < u 0 u

DnoDuo^uuii < no 0 d no < cj

CtJüDiCüiCiiD D no < O CJ < < < oucjcjo<noo< 0 0 d < 0 < no < __D_D_0_u_u_<_<_u_<_<_2._C5_2._<_2._2_2 tfritOCDOrolDCJD D < O < D < C3 <

ououoDiiOD ο u < no u no < D

t>rt;cj<couDDri: < < 0 0 0 no no

<<fiUODUOD D ^ CJ < < no D O

CJDO<ieCrt:D<D CJ (3 < < no O CJ 0 tJC3<cjpDCJucj <. no 0 no no e> 0 PDU<POP<CJ «4 rt! o D o e> <

Orf<DODP<< O O ft Λ o O < <

PrtDDDODDD ft CD <C < D O < <

OCDPUrtiDÜDÜ *i < CJ O O fit CJ

< DCJDDDCDOD < CD O CD CD CD CJ

cjfCP<cDDDrt:«3: 0 p cd cd cd < < < DCJ<noPC5CDCJCJ CD U CD CD CD CJ < <

OCDPCJCDCDCDCCD CD CJ CD P CD CJ *t CD

<CJUCDPP<CD< CD U P CD < P CD P

P<ID<D<DCDPD D < CD CD U < P *C

<CD<ODCD<DOCD CD CD CD < O CD < O

CD<OCDCD<D<D CD P < O D < CJ CD

__< _U_CD _CD _CD_CD _CD_P _<D _< _CD _O _O _<__< _CD _<

(0 CO CO to CO to CO (0 to 0 <D (0 ai CO 0) CO a> CO φ cod) CO CO

3 3 3 P P p P p P Pa> pa» ρα> ρα> ρφ ρφ p P

ct cn cr σι σ σ σ σ σ σ« σ<ο σ co σ« σ« σ σ »- Ή »»·Η ·»γΗ *»· —I *»r-H ·» rH r| **rH * rH *.rHC3 ·> Ή p * Ή C *· rH c *»rHC * '—I C «.rH *·Ή cocococococococococofOcoincofOcofOCOfdcionjCQ co

6ilE«E<>S<IE*E«Ë<EiilE<IEailSMEMEa<lEailEB<IË n)B

fOOfOOctJOaJOfOOmOOOcoocoOiOOÊtoOËfOOgfdOËcooËfOOËaJOcoaJOco écececicecêcecêcËcËc-rHêc-HËc-rHec-wec-Hec-Hêc-HËc-H P>p>,3>B>iP>'P>iP>iP>P>iP>tx: 3 >i x: 3>..c 3>ijn p>ix: 9 3>ip 3 oh p a: u p o x o x o x o a o a o a o x o a o o a o o a o o a o o a o o aoo a os aoa o-r-CMcontmcoixco σ> o *- cn co ^ uo co

^ lD U"> ΙΟ IA IO U) lO

_CM _CM_CM _CM_^_fM _CM_CM _CM_CM _CM_CM _CM _CM _CM_CM_CM

OïO^CTlirvcXtCTïO'iCriOïOïCT'^» tHrHiHrHt-HfHrHr—I rH «—I ·—< ·—♦ nxnnnnnnnvns » ΟΝσνίΓνσισϊ^σνσίΟ'ΐσ'ϊΟϊσν J-s

rHrHHtHrHrHtHt—I rH rH iH rH W

— ~ — — O.

Oin^r'ONVDroi—ffMCD'TiT) <ü Γ·'Γ·'Γ~-Ό'>Ο'Χ>Γ·~Γ~Γ''-'Όν·0ν0 Ih C^CT\CT\(TiCrv<T\O^CT\CT»(Ti(TsCT>

I I I I I I | I I I I I

CMr'MJ<rtTHCDinn,^ro^>r' M

ιΟιΟιη^ιΟ^ΤιΠιΟίΛιΓ)^·^· U

-—-^Π^-“-—-—-—-—-—-— ^ r> m £ <u cn ja O ό Z ^ 9 .·* o '-§ w si _!__!__!__!__j__S__|__!__!__j__!__L C/3 00 υ VO 0)

(N Οι CA

O

<r.cncricnaïcricrv<T\aïcTïCr><^ Λ1 f , «“I i—I Η tH Η Η H t—I tH tH Η H '’l

N\\V'\NNVN'sNS. (N

σ^α>σ\σ»σ\<τ»σ^σ^σ^σ>σ\σ» O

rHHHtHtHHHr—IHrHHH C

I — I I *— I I — I'— I— I—- I"- I —' i'-' I — O pH

LD r-Λ Or—. O» r-. C\>—1 -5T r—I rl m CO.—. Ό r—. m »—» O' f—» O --< _4> er. m o ao σι r- σ o σ cn σ> σ σ co σ -q· σ in <y> tH oor- σ co fsj O rH H rt OH O rH O *-H O O O iH O rH OH O rH OO O O “ r*H Η Η Η tH Η Η tH Η Η H tH Η Η «Η Η H t—I i—I «—1 «-H Η H f-sj · · ' tH ^ H ’—* i—I -- tH ' H *—1 i—I *—* H —* H ·—^ «H ^ «—) ·—' H *—1 H * j*

— — ~ ~ ” ~ ~ ~ ~ ~ ~ — <N O

σσσ'σσ'σ»σο,>σσ»σσ rs, rH rH i—t rH «—I tH r—| ·—I tH i—( rH »—t 1 ^ \ ^ 1^· σσσσσσσσσσσσ ys f*.

rH rH tH iH rH rH rH rH rH rH rH «H #, cocor-ocNO'co^mHr-ao *-7 r-r-r-r-'r-cor-r-r-r'-vovo r—\ Γτ-%

oooooooooooo rvr t-M

rH rH rH rH iH H rH 1—I rH iH iH rH «rH

I I I I I I I I 1 I I I CS)

inoo^cvi^riHaovor—coiTiO - OO

i-O CO lT) lO lO LO lO lO lO lO ^3" LO C VO

OOOOOOOOOOOO COrvl *H rH rH rH rH rH rH rH rH «H rH rH — j- -^-=-“-“-“-“-“-=-“-^-—--— - H- 5 s

OO on <N

£ gg σσσσσσσσσσσσ ^ rH rH rH τ—I rH rH rH rH rH rH rH rH +J* fN)

\\\\\\\\\\\ \ CS) WK

σσσσσσσσσσσσ γλ rH tH rH rH rH rH rH rH rH tH rH rH * Λ i — i -— i — i i— i —' t — i —- \ — i -—’ i —' i - *r? in^ Γ-r-. σ>.—. \D ^ CO ^ rH . OJr-. 00 r—i rcj.„ LD ^ ^ rH CO Η η H (NI O ΙΟ ΟΓ- O tsT rH H rH ΟΛ rH O O «) O M O CO CA Γ**-

iHCSJ Η n rH CO rH CN rH CM rH CN rH Γ0 rH CNJ rH CO H CN rH CN rH (N -¾ 1-H

rH tH Η H rH rH rH rH rH rH rH rH rH «H rH rH «—I rH rH tH rH rH rH rH

1—1 rH *—* rH ' rH 1—1 rH ·—1 rH —· rH 1— rH 1—‘ rH '—1 rH * rH ·—* rH rH ’ VS CA

Q < <<υου<<Ξ>ϋΞ>οο ►y DOsCDrtJÜUO^OOrf; 00DUn0<<0<<0 COOCOODCJiiöOD -¾¾ ODÜDrtirtJO-iDODO Scs) riJ^DOODODOCOpi .

OU<<<UDUÜïU<D <1>£

ODOUDril<OC3ri:DO OT

ODD<UCJOD<DOrt: S>

OC>DDO<Drt:oUrt:o H

<0ÜUDDDUDCJ30< «5C

UDCJOCODDDOrtJD CdS

ODDDUOOSOriJDO tiftn

DDDrtJDDDDOOUO 5G2H

OUDOIDicCDODDUD CC

0OUDDUDODDD< 0>W

OÜUDÜOUDDOrtJCJ >H

DtfUDDDUDUOUD Dii^OODUOCJDDD yc/3 ------------^ ^ C C3 »<DÖU^iCOÜO<<<< .3¾

w CA

0t50<-CC3rf23<<D -rtC

<<<0#ί<<ί£0000 r* <<<<ouuFii!CDrt:c3 haj C3iioOOOrf<tf<Ort: _2i-rn

Do<o<rt;i2(j)2ooD Ό w ίίι<#ΐίίυθίί^οοοο *^c

Oni ÜiiOOCDDOrtlDrtO <ODDDO<OOOD< ? _r

DD<00<0<0D0D C

O<O<DDOD<O<O J*sa>

DUODUO<OD<O< ^ fO

UO<O<<DDODDO <<D<DOOODOOD G-ï<

_D_D _O _O _O _D_D _< _O _< _O _O O

• η Jh «ncowcowcowwwcncow w a tl OU OU OU OU OU 34-» D4-» OU OU OU h-»3Ë

0»<ΰ O'fl D»<0 σ' rQ O'fTJ O^fO fO O' <Ü tji (O O' IC O'fO N

‘H o: -HOS - H OS - H OS -H tó -HOS - H CS -H Pi -HOS - H OS - H PS -H fH 3 ^T

co co co co co co co co CO CO CO CO o ^ me - rag - « Ê - mg - m E - ng - mg - <og - « g - <og '<og - mg . g ^5.

mommommommommommommoinmommommooimotnmom C

g C -H g C H g C -H g C -H g C Ή g C -iH g G -rt e C --H g C H g C -H g C -H g C Λ1 —

Sn ω lusxussosioaxoaiossoEiosxuaacosacosacus sr > ^ ^ <§ .g r-^<D«- co O) o Qi- ▼- cn co m co r--. co m yo ir> «o cojco co co co co co co co co

CN (O CO _CN _CN CN CO CQ_CN _CN _CM CN_CN _CN _CN_(N

169

Voorbeeld 10

Farmacologie en afgifte van het geneesmiddel

De nucleotidesequenties van de onderhavige uitvinding kunnen rechtstreeks dan wel met virale of niet-virale vectoren worden afgegeven. Wanneer zij rechtstreeks 5 worden afgegeven zijn de sequenties in het algemeen nucleaseresistent gemaakt. Op een andere wijze kunnen de sequenties worden opgenomen in expressiecassettes of -constructen, zodanig dat de sequentie tot expressie wordt gebracht in de cel, zoals in de beschrijving hieronder besproken wordt. In het algemeen bevat het construct de geschikte regulerende sequentie of promotor om de expressie van de sequentie in de als 10 target dienende cel mogelijk te maken.

De verbindingen of farmaceutische samenstellingen van de onderhavige uitvinding worden toegediend en gedoseerd volgens goede medische praktijk rekeninghoudend met de klinische toestand van de individuele patiënt, de te behandelen ziekte, de locatie en de wijze van toediening, het plannen van de toediening, de leeftijd van de 15 patiënt, het geslacht, het lichaamsgewicht en andere factoren die de artsen bekend zijn.

De farmaceutisch werkzame hoeveelheid voor de doeleinden van de uitvinding wordt dus bepaald door overwegingen die uit de stand der techniek bekend zijn. De hoeveelheid dient dus effectief te zijn voor het tot stand brengen van een verbetering waaronder, maar niet beperkt tot de verbetering van het overlevingspercentage of 20 een sneller herstel, dan wel verbetering of eliminering van symptomen en andere indicatoren, zoals zij geselecteerd worden als geschikte maatregelen door diegenen die op dit gebied deskundig zijn.

De behandeling heeft in het algemeen een duur die evenredig is met de duur van het ziekteproces en geneesmiddelwerkzaamheid en de in behandeling zijnde 25 patiëntspecies. Opgemerkt dient te worden dat mensen in het algemeen langer worden behandeld dan muizen of andere experimentele dieren die als voorbeelden in de beschrijving voorkomen.

De verbindingen van de onderhavige uitvinding kunnen onder toepassing van één of meer van de conventionele wijzen van toediening worden toegediend. Op-30 gemerkt dient te worden dat de verbinding toegediend kan worden als de verbinding zelf of in de vorm van een farmaceutisch aanvaardbaar zout en kan alleen of als een actief ingrediënt in combinatie met farmaceutisch aanvaardbare dragers, oplosmiddelen, verdunningsmiddelen, hulpstoffen, adjuvans en transporthulpmiddelen worden 170 toegediend. De verbindingen kunnen oraal, subcutaan of parenteraal, waaronder intraveneus, intra-arterieel, intramusculair, intraperitoneaal en intranasaal alsmede intrathe-caal worden toegediend en infusietechnieken kunnen worden toegepast. Implantaten van de verbindingen zijn eveneens nuttig. Vloeibare vormen kunnen voor injectie wor-5 den bereid, waarbij de term subcutaan, transdermaal, intraveneus, intramusculair, intrathecaal en andere parenterale wijzen van toediening omvat. De vloeibare samenstellingen omvatten waterige oplossingen, met en zonder organische hulpoplosmidde-len, waterige of olie bevattende suspensies, emulsies met eetbare oliën, alsmede vergelijkbare farmaceutische dragers. Bovendien kunnen de samenstellingen voor gebruik in 10 de nieuwe behandelingen volgens de onderhavige uitvinding onder bepaalde omstandigheden als aerosols worden gevormd voor intranasale en een soortgelijke toediening. De onder behandeling zijnde patiënt is een warmbloedig dier en in het bijzonder zoogdieren waaronder de mens. De farmaceutisch aanvaardbare dragers, oplosmiddelen, verdunningsmiddelen, hulpstoffen, adjuvantia en transporthulpmiddelen alsmede im-15 plantaatdragers hebben in het algemeen betrekking op inerte, niet-toxische vaste of vloeibare vulmiddelen, verdunningsmiddelen of encapsuleringsmateriaal dat niet reageert met de actieve ingrediënten volgens de uitvinding.

Wanneer de verbinding volgens de onderhavige uitvinding parenteraal wordt toegediend wordt deze in het algemeen geformuleerd in een eenheidsdosering 20 injecteerbare vorm (oplossing, suspensie, emulsie). De farmaceutische formuleringen die geschikt zijn voor injectie omvatten steriele waterige oplossingen of dispersies of steriele poeders voor reconstitutie in steriele injecteerbare oplossingen of dispersies. De drager kan een oplosmiddel zijn of een dispergeermedium zijn dat bijvoorbeeld water, ethanol, polyol (bijvoorbeeld glycerol, propyleenglycol, vloeibaar polyethyleenglycol 25 en dergelijke), geschikte mengsels hiervan en plantaardige oliën bevat.

Adequate fluïditeit kan in stand worden gehouden, bijvoorbeeld door de toepassing van een coating, zoals lecithine, door het instandhouden van de vereiste deeltjesgrootte in het geval van een dispersie en door de toepassing van oppervlakte-actieve middelen. Niet-waterige dragers, zoals katoenzaadolie, sesamolie, olijfolie, 30 sojaboonolie, maïsolie, zonnebloemolie of pindaolie en esters, zoals isopropylmyris-taat, kunnen eveneens als oplosmiddelsystemen voor gemengde samenstellingen worden gebruikt. Bovendien kunnen verschillende additieven die de stabiliteit, steriliteit en isotoniciteit van de samenstellingen bevorderen, waaronder antimicrobiële conserveer- 171 middelen, antioxidantia, chelaatvormers en buffers worden toegevoegd. Preventie van de werking van micro-organismen kan worden verzekerd door middel van verschillende antibacteriële middelen en antifungie, bijvoorbeeld parabens, chloorbutanol, fenol, sorbinezuur en dergelijke. In vele gevallen is het wenselijk om isotonische mid-5 delen, bijvoorbeeld suikers, natriumchloride en dergelijke op te nemen. Een verlengde absorptie van de injecteerbare farmaceutische vorm kan teweeg worden gebracht door de toepassing van middelen die de absorptie vertragen, bijvoorbeeld aluminium-monostearaat en gelatine. Volgens de onderhavige uitvinding dienen echter alle dragers, verdunningsmiddelen of additieven die gebruikt zijn, met de verbindingen com-10 patibel te zijn.

Steriele injecteerbare oplossingen kunnen worden bereid door het opnemen van de gebruikte verbindingen bij de uitvoering van de onderhavige uitvinding in de vereiste hoeveelheid van het geschikte oplosmiddel met desgewenst verschillende van de andere ingrediënten.

15 Een farmacologische formulering van de onderhavige uitvinding kan aan de patiënt worden toegediend in een injecteerbare formulering die elke verenigbare drager, zoals verscheidene dragers, adjuvantia, additieven en verdunningsmiddelen, bevat; dan wel kunnen de verbindingen die in de onderhavige uitvinding worden gebruikt parente-raal aan de patiënt worden toegediend in de vorm van subcutane implantaten met een 20 langzame afgifte, dan wel met behulp van toegerichte afgiftesystemen, zoals mono-klonale antilichamen, afgifte met behulp van een vector, iontoforetisch, polymeer-matrices, liposomen en microsferen. Voorbeelden van afgiftesystemen die nuttig zijn in de onderhavige uitvinding omvatten de Amerikaanse octrooischriften 5.225.182; 5.169.383; 5.167.616; 4.959.217; 4.925.678; 4.487.603; 4.486.194; 4.447.233; 25 4.447.224; 4.439.196; en 4.475.196. Vele andere van dergelijke implantaten, afgifte systemen en modules zijn de deskundigen op dit gebied bekend.

Een farmacologische formulering van de in de onderhavige uitvinding gebruikte verbinding kan oraal aan de patiënt worden toegediend. Conventionele methoden, zoals het toedienen van de verbinding in tabletten, suspensies, oplossingen, emul-30 sies, capsules, poeders, siropen en dergelijke zijn toepasbaar. Bekende technieken die dit oraal of intraveneus afgeven en de biologische activiteit behouden, verdienen de voorkeur. In één uitvoeringsvorm kan de verbinding volgens de onderhavige uitvinding aanvankelijk worden toegediend door middel van een intraveneuze injectie teneinde de 172 bloedspiegels op een geschikt niveau te brengen. De niveaus van de patiënt worden vervolgens instandgehouden door middel van een orale doseringsvorm ofschoon andere vormen van toediening in afhankelijkheid van de conditie van de patiënt en zoals hierboven aangegeven is, kunnen worden gebruikt.

5 In het algemeen ligt de actieve dosering van de verbinding voor de mens binnen het gebied van lng/kg tot ongeveer 20-100 mg/kg lichaamsgewicht per dag, bij voorkeur ongeveer 0,01 mg tot ongeveer 2-10 mg/kg lichaamsgewicht per dag, in een regiem van één dosering per dag of twee of drie of meerdere malen per dag gedurende een periode van 1-2 weken of langer, bij voorkeur gedurende 24 tot 48 uur of door 10 middel van een continue infusie gedurende een periode van 1 -2 weken of langer.

Toediening van verbindingen van de onderhavige uitvinding aan het oog

De verbindingen van de onderhavige uitvinding kunnen topisch aan het oog worden toegediend, dan wel worden zij in de vorm van een injectie toegediend, zoals 15 bijvoorbeeld een intravitreale injectie, een subretinale injectie of een bilaterale injectie. Verdere informatie over de toediening van de verbinding van de onderhavige uitvinding kan in Tolentino et al., Retina 24 (2004) 132-138; Reich et al., Molecular vision 9 (2003) 210-216, worden gevonden.

20 Pulmonaire toediening van verbindingen van de onderhavige uitvinding

De therapeutische samenstellingen van de onderhavige uitvinding worden bij voorkeur in de long toegediend door middel van inhalatie van een aerosol die deze samenstellingen/verbindingen bevatten, dan wel door middel van intranasale of intra-tracheale instillatie van deze samenstellingen. Formulering van de verbindingen in lipo-25 somen kan gunstig zijn voor de absorptie. Bovendien kunnen de samenstellingen een PFC-vloeistof, zoals perfluorbron omvatten, en de samenstellingen kunnen als een complex van de verbindingen van de uitvinding met polyethyleenimine (PEI) worden geformuleerd.

Voor verdere informatie over pulmonaire afgifte van farmaceutische 30 samenstellingen zie Weiss et al., Human gene therapy 10:2287-2293 (1999); Densmore et al., Molecular therapy 1:180-188 (1999); Gautam et al., Molecular therapy 3:551-556 (2001); en Shahiwala & Misra, AAPS PharmSciTech 5 (2004). Bovendien zijn 173 ademhalingsformuleringen voor siRNA in de Amerikaanse octrooiaanvrage nr. 2004/0063654 of naam van Davis et al. beschreven.

Verder kunnen de verbindingen van de onderhavige uitvinding topisch worden toegediend daar waar dit geschikt is (zoals bijvoorbeeld in het geval van diabeti-5 sche voetzweren), eventueel in een lipide/liposoomformulering.

Een voorkeurstoedieningsvorm is de topische afgifte van de RTP801-inhibitoren op het ronde raammembraan van het cochlea, zoals beschreven, bijvoorbeeld in Tanaka et al., (Hear Res. maart 2003; 177(1-2):21-31).

Bij de behandeling van drukzweren of andere wonden is de toediening van 10 de farmaceutische samenstelling bij voorkeur door middel van topische toepassing op de beschadigde gebieden, maar de samenstellingen kunnen tevens systemisch worden toegediend.

Verdere formuleringen voor een verbeterde afgifte van de verbindingen volgens de uitvinding kunnen niet-geformuleerde verbindingen, verbindingen die co-15 valent aan cholesterol gebonden zijn en verbindingen die aan doelgerichte antilichamen gebonden zijn, omvatten (Song et al., Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors, Nat Biotechnol. juni 2005; 23(6):709-17).

Voorbeeld 11

20 Ex vivo model voor door cisnlatine geïnduceerde ototoxiciteit en het beschermende effect van RTP801-siRNA

Door cisplatine geïnduceerde ototoxiciteit wordt geïnduceerd in cochleaire en vestibulaire organotypische cultures. Op de dag na de geboorte worden 3-4 rattenpups gebruikt ter bereiding van de cochleaire en vestibulaire organotypische cultures, 25 zoals beschreven in Zhang et al., Neuroscience 120 (2003) 191-205. Cochleae worden zorgvuldig uitgeprepareerd en het cochleaire weefsel dat het spirale ganglion, orgaan van Corti en het middengedeelte bevat, wordt verwijderd ter bereiding van de organotypische cultures, zoals beschreven in Zhang et al. De cultures worden geplaatst in een C02-incubator gedurende 24 uur voor het conditioneren voorafgaande aan de behande-30 ling. Na conditioneren worden de cultures behandeld met cisplatine alleen bij een concentratie van 1, 5 of 01 pg/ml gedurende 48 uur. Ter bestudering van het beschermende effect van RTP801-siRNA worden de cochleaire explanten (5 cochlea’s per groep) gedurende 48 uur met 10 pg/ml cisplatine en variërende concentraties van RTP801- 174 siRNA met of zonder lipofectamine behandeld. Onbehandelde controlecultures en cultures behandeld met RTP801-siRNA gedurende 48 uur worden parallel behandeld. Aan het einde van de experimenten worden de cultures gefixeerd met 10% formaline en worden gekleurd met FITC-geconjugeerde falloïdine. De aantallen inwendige haar-5 cellen en uitwendige haarcellen per 0,25 mm lengte van het cochlean worden geteld en het gemiddelde aantal haarcellen voor elke behandeling wordt bepaald.

Voorbeeld 12

In vivo model voor door gentamicine geïnduceerde ototoxiciteit en het bescher-10 mende effect van RTP801-siRNA

Chinchilla’s worden hetzij behandeld met gentamicinesulfaat alleen gedurende 5 dagen (125-300 mg/kg, intramusculair), hetzij in combinatie met RTP801-siRNA. De siRNA-moleculen worden topisch op het ronde raammembraan van het cochlea twee dagen voorafgaande aan en gedurende de 5 daagse blootstelling aan gen-15 tamicine, toegediend. Aan het einde van de behandeling worden de dieren gedood door blootstelling aan kooldioxide en onthoofding. De cochlea’s worden verwijderd en klaargemaakt voor kleuring met FITC-geconjugeerde falloïdine ter bepaling van het aantal inwendige haarcellen en uitwendige haarcellen in het cochleaire weefsel (zoals beschreven in Ding et al., Hearing Research 164 (2002) 115-126 en in Wang et al., The 20 Journal of Neuroscience 23(24):8596-8607).

Voorbeeld 13

In vivo model voor akoestisch trauma en het beschermende effect van RTP801-siRNA

25 Gepigmenteerde cavia’s worden gebruikt in het akoestische traumaonder- zoek (beschreven in Wang et al., The Journal of Neuroscience 23(24):8596-8607). RTP801-siRNA-moleculen worden topisch op het ronde raammembraan van het cochlea over een tijdsperiode van 7 dagen toegediend. Onbehandeld linkercochlea diende als controle voor de effectiviteit van het akoestische trauma bij het veroorzaken 30 van gehoorhaarcelverlies en verlies aan gehoorfunctie. Dieren worden aan akoestisch trauma blootgesteld (6 kHz., 120 dB geluidsdrukniveau (SPL), 30 min] en audiogram-men van beide oren worden afgeleid van de samengestelde werkingspotentialen (CAP’s) die geregistreerd zijn vanuit de gehoorzenuwen via chronische ronde raam- 175 membraanelektroden. De CAP-audiogrammen van beide oren worden dagelijks gemeten in wakkere dieren. 30 Dagen na blootstelling aan geluid worden de dieren opgeofferd en hun cochlea’s worden klaargemaakt voor een kwantitatieve evaluatie van haar-celverliezen, gebruikmakend van scanningelektromicroscopie teneinde alle haarcellen 5 te tellen voor de gehele lengte van de cochleaire buis.

Voorbeeld 14

Experimentele resultaten met betrekking tot 801 1 (ID NO. 257 in tabel D. SEO ID NO; 527 [antisens strengt) en 801 4 (ID NO. 260 in tabel D. SEO ID NO: 530 ianti-10 sens strengll

In vitro efficiëntie in HEK293-cellen

Drie verschillende concentraties aan siRNA’s, 5, 10 en 20 nm werden in HEK293-cellen getransfecteerd. Identieke concentraties van een irrelevante siRNA 15 (siTG) werden als negatieve controle gebruikt terwijl identieke concentraties van REDD 14 als positieve controle werden gebruikt. 72 Uur na transfectie werden de cellen geoogst; RNA werd gezuiverd en als template gebruikt in een qPCR-reactie voor de kwantitatieve bepaling van de niveaus van endogeen RTP801-transcript.

Humaan cyclofïline A werd gebruikt als inwendige referentie voor qPCR. 20 Referentie genormaliseerde data werden verder aan biologische normalisatie onderworpen: voor elke siRNA-concentratie werden de gedetecteerde RTP801-niveaus uitgedrukt in procent RTP801 in het corresponderende negatieve controlemonster. De resultaten zijn in figuur 28 weergegeven.

25 In vitro efficiëntie in BE2C-cellen

Terwijl basale RTP801-expressieniveaus in HEK293-cellen werden geanalyseerd, voor de bepaling van het siRNA-vermogen tot verlaging van de geïnduceerde RTP801-expressieniveaus, werden BE2C-cellen met C0CI2 behandeld als in-ductiemiddel voor RTP801 gebruikt. Het ontwerp en dataevaluatie waren in wezen zo-30 als hierboven beschreven. 24 Uur na siRNA-transfectie, werden de BE2C-cellen met 10 μΜ C0CI2 behandeld gedurende nog 24 uur en werden vervolgens aan extractie onderworpen. De resultaten zijn in figuur 29 weergegeven.

176

De resultaten geven aan dat 8011 en 8014 ten minste even effectief zijn als REDD14 tegen RTP801 in in vitro tests.

In vivo efficiëntie in het muizen-CNV-model 5 De experimenten werden met de volgende experimentele groepen zoals beschreven in voorbeeld 6, uitgevoerd,:

Tabel 4

Groep Gemiddeld CNV- SEM Aantal __volume (μιη3)___laserplekjes PBS 471698,3 26163,96 22 REDD14 (0,05 pg) 237326,9 24136,19 29 REDD14 (0,1 pg) 182997,0 29213,82 25 REDD14 (0,5 pg) 207235,7 20420,18 29 RTP801#1 siRNA (0,05 pg) 334196,8 32429,66 3Ö RTP801#1 siRNA(0,l pg 176091,1 37343,13 24 RTP801#1 siRNA0,5 pg) 226063,0 17906,91 33 RTP801#1 siRNA (0,05 pg) 304325,6 30584,33 3Ö RTP801#1 siRNA (0,1 pg) 265668,5 20287,93 28 RTP801#1 siRNA (0,5 pg) 269164,4 2477βΜ 31 10 De resultaten zijn in figuur 30 weergegeven en laten zien dat 8014 ten minste even effectief is als REDD 14 in het in vivo model van muizen-CNV.

177

Voorbeeld 15

Modellen en resultaten met betrekking tot doofheid

Het effect van een als voorbeeld gegeven (p53) siRNA-behandeling op akoestisch geïnduceerde haarceldood in de cochlea van chinchilla 5

De activiteit van een als voorbeeld gegeven siRNA (QM5-anti-p53) in een akoestisch traumamodel werd in chinchilla bestudeerd. Een groep van zeven dieren ondergingen een akoestisch trauma. Dieren werden aan een octaafband van geluid, gecentreerd op 4 kHz gedurende 3 uur bij 105 dB blootgesteld. Het linkeroor van de 10 aan geluid blootgestelde chinchilla’s werd behandeld met 30 μg siRNA in ongeveer 20 μΐ; het rechteroor werd met een drager behandeld. De gemiddelde drempel van het werkingspotentiaal van de verbinding geregistreerd vanuit het ronde raampje werd bepaald 2,5 weken na het akoestische trauma teneinde te bepalen of de drempels in het met siRNA behandelde oor lager waren (beter) dan het onbehandelde (drager) oor. De 15 gemiddelde drempels waren lager in de met siRNA behandelde oren ten opzichte van de onbehandelde oren. Het verschil bij 4 kHz was statistisch significant (p<0,033). Deze resultaten geven aan dat het als voorbeeld gegeven p53 siRNA toegediend aan het ronde raampje van de cochlea in staat is de schade veroorzaakt door het akoestische trauma te verminderen.

20

Het effect van p53- of 801 siRNA-behandeling op door cisplatine geïnduceerde haarceldood in de cochlea van ratten

Mannelijke Wistar-ratten werden beproefd op basale 25 gehoorhersenstamresponsdrempels voor signalen van klikken 8, 16 en 32 kHz voorafgaande aan de cisplatinebehandeling. Na het testen van de basale gehoorhersenstamrespons werd cisplatine toegediend in de vorm van een intraperitoneale infusie van 13 mg/kg over een tijdsperiode van 30 minuten. Behandelde orden ontvingen hetzij 15 pg/4 microliter van het als voorbeeld gegeven 30 p53-siRNA (zoals hierboven), dan wel RTP801 siRNA REDD 14 (sequentie nr. 14 in tabel A, SEQ ID Nos 16 (sens) en 66 (antisens)) rechtstreeks toegepast op het ronde raampjemembraan. Controleoren werden behandeld met hetzij niet-gerelateerd GFP siRNA, hetzij PBS. De siRNA-moleculen werden toegediend tussen 3-5 dagen 178 voorafgaande aan de cisplatinetoediening teneinde het beschermde effect op de cochlea te onderzoeken.

Het testen ten aanzien van de gehoorhersenstamrespons werd 3 dagen herhaald na cisplatinetoediening. De gehoorhersenstamresponsdrempels werden 5 vergeleken tussen voorbehandeling en postbehandeling en de verschuiving in drempels is in tabel 5 aangegeven. Hogere verschuiving in drempels na de cisplatinebehandeling is een indicatie voor een meer ernstig haarcelverlies in de cochlea. Na de herhaling van het testen op gehoorhersenstamrespons werden de dieren opgeofferd en werden de cochlea verwijderd en verder verwerkt voor scanning electron microscopy (SEM) ter 10 kwantificering van uitwendig haarcelverlies (OHS) in de hoekregio (hoogfrequentiegebied). Het percentage uitwendig haarverlies werd berekend door het aantal ontbrekende of ernstig beschadigde cellen te delen door het aantal uitwendige haarcellen in het gebied van de foto.

Tabel 5 demonstreert de resultaten die verkregen zijn uit vier dieren die de 15 door cisplatine geïnduceerde schade ondergingen en geanalyseerd werden op uitwendig haarcelverlies in de Hook-regio. Zoals aan het licht werd gebracht uit de resultaten, vertoonden dieren die siRNA verkregen gericht tegen p53 of 801, een lager uitwendig haarcelverlies en lagere verschuivingen in de drempel voor signalen van 32 kHz. Beide parameters geven aan dat siRNA gericht tegen p53 of 801 een beschermend effect heeft 20 tegen door cisplatine geïnduceerde schade in de cochlea.

Tabel 5: Haarcelverlies versus drempelverschuiving in door cisplatine behandelde cochlea van ratten

Behandeling Uitwendig Gehoorhersenstam response haarcelverlies (OHC) (drempelverschuiving bij 32 ___KHz)_

QC/L P53 siRNA (QM5) 50% 10 dB

QC/RPBS__100%__30 dB_

QF/L P53 siRNA (QM5) 20% 10 dB

QF/R GFP__56%__27,5 dB_

QJ/R 801 siRNA (REDD 14) 20% 17,5 dB

QJ/L GFP__100%__27,5 dB_

QN/L 801 siRNA (REDD 14) 0% 10 dB

QN/R PBS_ 100%_ 17,5 dB_ 2000439

Claims (65)

1. Werkwijze voor de behandeling van een patiënt die aan een gehoorstoomis lijdt, welke het toedienen omvat aan de patiënt van een farmaceutische samenstelling 5 die een RTP801-polypeptide-inhibitor in een werkzame hoeveelheid bevat ter behandeling van de patiënt.

2. Werkwijze ter behandeling van een patiënt die aan drukzweren lijdt, welke het toedienen aan de patiënt omvat van een farmaceutische samenstelling die een

3. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de gehoorstoomis akoestisch trauma is.

4. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarbij de inhibitor een polynucleotide om vat dat achtereenvolgende nucleotiden omvat die een sequentie van voldoende lengte en homologie ten opzichte van een sequentie die aanwezig is binnen de sequentie van een gen coderende voor RTP801, zoals weergegeven in SEQ ID NO: 1 hebben, voor het mogelijk maken van hybridisatie van de inhibitor aan het gen 20 en het verhinderen van de expressie van RTP801 in de patiënt.

5. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarbij de inhibitor een antilichaam omvat dat specifiek aan een epitoop bindt, welke aanwezig is binnen een RTP801-polypeptide dat achtereenvolgende aminozuren omvat, waarvan de sequentie in figuur 25 2 (SEQ ID NO: 2) weergegeven is en de activiteit van het RTP801-polypeptide in de patiënt remt.

6. Werkwijze voor de behandeling van een patiënt die aan een gehoorstoomis of aan drukzweren lijdt, welke het toedienen aan de patiënt van een farmaceutische sa- 30 menstelling omvat, die een therapeutisch werkzame hoeveelheid van een RTP801-polynucleotide-inhibitor omvat, waardoor de patiënt behandeld wordt.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, waarbij het polynucleotide een siRNA is. 2000439

8. Werkwijze volgens conclusie 7, waarbij het siRNA achtereenvolgende nucleoti-den omvat met een sequentie die identiek is aan één van de sequenties weergegeven in één of meer van de tabellen A-D (SEQ ID NOS : 3-536). 5

9. Werkwijze volgens conclusie 6, waarbij de inhibitor gekozen is uit de groep bestaande uit een siRNA, een vector die een siRNA omvat, een vector die een siRNA tot expressie brengt en een molecuul dat endogeen in een siRNA verwerkt wordt. 10

10. Toepassing van een therapeutisch werkzame hoeveelheid van een RTP801-inhibitor voor de bereiding van een geneesmiddel ter bevordering van het herstel in een patiënt die aan een gehoorstoomis lijdt.

10 RTP801-polypeptide-inhibitor bevat in een werkzame hoeveelheid ter behandeling van de patiënt.

11. Toepassing van een therapeutisch werkzame hoeveelheid van een RTP801 -inhibi tor ter bereiding van een geneesmiddel ter bevordering van het herstel in een patiënt die aan drukzweren lijdt.

12. Toepassing volgens conclusie 10, waarbij de gehoorstoomis akoestisch trauma is. 20

13. Toepassing volgens conclusie 10 of 11, waarbij de inhibitor een polynucleotide omvat dat achtereenvolgende nucleotiden omvat met een sequentie van voldoende lengte en homologie ten opzichte van een sequentie die aanwezig is binnen de sequentie coderende voor RTP801, zoals weergegeven in SEQ ID NO: 25 1, teneinde hybridisatie van de inhibitor aan het gen en het voorkomen van de expressie van RTP801 in de patiënt, mogelijk te maken.

14. Toepassing volgens conclusie 10 of 11, waarbij de RTP801-inhibitor een anti-lichaam is dat specifiek aan een epitoop bindt die aanwezig is binnen een

15 -H-OCH3, -OCH2CH3, -OCH2CH2CH3, -NH2 en F omvat.

15. Toepassing volgens conclusie 10 of 11, waarbij het polynucleotide de expressie van een RTP801 -gen downreguleert.

16. Toepassing volgens conclusie 10 of 11, waarbij het polynucleotide een siRNA is. 5

17. Toepassing volgens conclusie 16, waarbij het siRNA achtereenvolgende nucleoti-den met een sequentie die identiek is aan één of meer sequenties weergegeven in één of meer van de tabellen A-D (SEQ ID NOS: 3-536), omvat.

18. Toepassing volgens conclusie 14, waarbij de inhibitor gekozen is uit de groep bestaande uit een siRNA, een vector die een siRNA omvat, een vector die een siRNA tot expressie brengt en een molecuul dat endogeen in een siRNA verwerkt wordt.

19. Werkwijze voor de behandeling van een patiënt die aan een ziektetoestand lijdt die gekozen is uit een ademhalingsstoomis, een oogziekte, een microvasculaire stoornis, of een ruggenmergletsel of ziekte welke het toedienen aan een patiënt van een farmaceutische samenstelling omvat, die een therapeutisch werkzame hoeveelheid van een siRNA omvat, die de expressie van een RTP801-gen remt, 20 welke achtereenvolgende nucleotiden met een sequentie die identiek is aan de sequentie weergegeven in tabel D (SEQ ID NOS: 345-536) omvat, waardoor de patiënt behandeld wordt.

20. Werkwijze volgens conclusie 19, waarbij de ziektetoestand een oogziekte is. 25

21. Werkwijze volgens conclusie 20, waarbij de oogziekte maculaire degeneratie is.

22. Werkwijze volgens conclusie 19, waarbij de ziekte een ademhalingsziekte is.

23. Werkwijze volgens conclusie 22, waarbij de ademhalingsziekte COPD is.

24. Werkwijze volgens conclusie 22, waarbij de ademhalingsziekte astma is.

25. Werkwijze volgens conclusie 22, waarbij de ademhalingsziekte chronische bronchitis is.

26. Werkwijze volgens conclusie 22, waarbij de ademhalingsziekte emfyseem is. 5

27. Werkwijze volgens conclusie 19, waarbij de ziektetoestand een microvasculaire stoornis is.

28. Werkwijze volgens conclusie 27, waarbij de microvasculaire stoornis diabetische 10 retinopathie is.

29. Werkwijze volgens conclusie 27, waarbij de microvasculaire stoornis acuut nier-falen is.

30. Toepassing van een therapeutisch werkzame hoeveelheid van een siRNA dat de expressie van een RTP801-gen remt, dat achtereenvolgende nucleotiden omvat met een sequentie die identiek is aan de sequentie weergegeven in tabel D (SEQ ID NOS: 345-536) ter bereiding van een geneesmiddel ter bevordering van het herstel in een patiënt die aan een ziektetoestand lijdt die gekozen is uit een adem- 20 halingsstoomis, een oogziekte, een microvasculaire stoornis of een ruggen- mergletsel of -ziekte.

30 RTP801-polypeptide dat achtereenvolgende aminozuren omvat, waarvan de sequentie in figuur 2 (SEQ ID NO: 2) weergegeven is en de activiteit van het RTP801-polypeptide in de patiënt remt.

31. Toepassing volgens conclusie 30, waarbij de ziektetoestand een oogziekte is.

32. Toepassing volgens conclusie 31, waarbij de oogziekte maculaire degeneratie is.

33. Toepassing volgens conclusie 30, waarbij de ziektetoestand een ademhalingsstoomis is.

34. Toepassing volgens conclusie 33, waarbij de ademhalingsstoomis COPD is.

35. Toepassing volgens conclusie 33, waarbij de ademhalingsstoomis astma is.

36. Toepassing volgens conclusie 33, waarbij de ademhalingsstoomis chronische bronchitis is.

37. Toepassing volgens conclusie 33, waarbij de ademhalingsstoomis emfyseem is. 5

38. Toepassing volgens conclusie 30, waarbij de ziektetoestand een microvasculaire stoornis is.

39. Toepassing volgens conclusie 38, waarbij de microvasculaire stoornis diabetische 10 retinopathie is.

40. Toepassing volgens conclusie 38, waarbij de microvasculaire stoornis acuut renaal falen is.

41. Verbinding met de structuur: 5'(N)X - Z3' (antisens streng) 3'Z'-(N')y5' (sens streng), 20 waarbij elke N en N' een ribonucleotide is dat al dan niet gemodificeerd is in zijn suikerrest en (N)x en (N')y een oligomeer is waarin elke achtereenvolgende N of N' met de volgende N of N' door middel van een covalente binding verbonden is; waarin elke van x en y een geheel getal tussen 19 en 40 is; 25 waarin elke van Z en Z' al dan niet aanwezig kan zijn, maar indien aanwezig dTdT is en met de 3'-terminus van de streng waarin deze aanwezig is, covalent gebonden is; en 30 waarin de sequentie van (N)x één van de sequenties aanwezig in tabel D omvat.

42. Verbinding volgens conclusie 41, waarbij de covalente binding een fosfodiester-binding is, waarin x = y, bij voorkeur waarin x = y = 19, waarin Z en Z' beide afwezig zijn, waarbij ten minste één ribonucleotide in zijn suikergroep op de 2'-positie gemodificeerd is, waarin de groep op de 2'-positie methoxy (2'-0-methyl) is, waarbij alternerende ribonucleotiden zowel in de antisens als in de sens strengen gemodificeerd zijn en waarbij de ribonucleotiden aan de 5'- en 3 '-termini van 5 de antisens streng in hun suikergroepen gemodificeerd zijn en de ribonucleotiden aan de 5'- en 3'-termini van de sens streng in hun suikergroepen gemodificeerd zijn.

43. Verbinding volgens één of meer der conclusies 41-42, waarbij de sequentie van 10 (N)x de antisens sequentie nr. 257 van tabel D (SEQ ID NO: 525) dan wel de antisens sequentie nr. 260 van tabel D (SEQ ID NO: 528) omvat.

44. Verbinding volgens conclusie 43, waarbij de verbinding een terminaal fosfaat ontbreekt. 15

45. Verbinding die een oligoribonucleotide omvat, waarin één streng achtereenvolgende nucleotiden die van 5' naar 3' de sequentie weergegeven in SEQ ID NOS: 441-536 of een homoloog hiervan hebben, waarin in ten hoogste 2 van de nucleotiden in elk terminaal gebied een base gewijzigd is. 20

46. Verbinding die een oligoribonucleotide omvat, waarin één streng achtereenvolgende nucleotiden omvat die van 5' naar 3' de sequentie weergegeven in SEQ ID NOS: 345-440 hebben, waarin een aantal van deze basen bij voorkeur door een 2-O-methylmodificatie gemodificeerd kunnen zijn, dan wel een homoloog hiervan, 25 waarin in ten hoogste 2 van de nucleotiden in elk terminaal gebied een base ge wijzigd is.

47. Verbinding volgens één of meer der voorafgaande conclusies 41-46 die een 2'-0-Me-groep op het eerste, derde, vijfde, zevende, negende, elfde, dertiende, vijf- 30 tiende, zeventiende en negentiende nucleotide van de antisens streng en het tweede, vierde, zesde, achtste, tiende, twaalfde, veertiende, zestiende en achttiende nucleotide van de sens streng omvat.

48. Verbinding volgens één of meer der voorafgaande conclusies 41-47, waarbij de verbinding een al dan niet gefosforyleerde verbinding is.

49. Verbinding volgens één of meer der voorafgaande conclusies 41-48, waarbij het 5 dinucleotide dTdT met het 3 -terminus covalent verbonden is.

50. Verbinding volgens één of meer der voorafgaande conclusies 41-49, waarbij in ten minste één nucleotide een suikergroep gemodificeerd is.

51. Verbinding volgens conclusie 50, waarbij de modificatie een 2-0- methylmodificatie is.

52. Verbinding volgens één of meer der voorafgaande conclusies 41-51, waarbij de 2'-OH-groep vervangen is door een groep of rest die gekozen is uit de groep die

53. Werkwijze ter behandeling van een patiënt die aan een ziektetoestand lijdt die gekozen is uit een ademhalingsstoomis, een oogziekte, een microvasculaire stoornis, een gehoorstoomis, drukzweren of een ruggenmergletsel of ziekte welke 20 het toedienen aan een patiënt van een farmaceutische samenstelling die een ver binding volgens één of meer der voorafgaande conclusies 41-52 in een therapeutisch werkzame hoeveelheid omvat, zodanig dat de patiënt hierdoor wordt behandeld.

54. Werkwijze volgens conclusie 53, waarbij de ziektetoestand de oogziekte AMD is.

55. Werkwijze volgens conclusie 53, waarbij de ziektetoestand de gehoorstoomis akoestisch trauma is.

56. Toepassing van een therapeutisch werkzame hoeveelheid van een verbinding volgens één of meer der voorafgaande conclusies 41-52 voor de bereiding van een geneesmiddel ter bevordering van het herstel van een patiënt die aan een ziektetoestand lijdt die gekozen is uit een ademhalingsstoomis, een oogziekte, een microvasculaire stoornis, een gehoorstoomis, drukzweren of ruggenmerg-letsel of -ziekte.

57. Farmaceutische samenstelling die twee of meer verbindingen volgens één of meer 5 der voorafgaande conclusies 41-52 omvat.

58. Farmaceutische samenstelling die twee of meer verbindingen omvat, waarin de eerste verbinding een oligoribonucleotide van tabel D en de tweede verbinding een oligoribonucleotide volgens één of meer van de tabellen A-C of een anti- 10 lichaam of een aptameer is.

59. Samenstelling volgens conclusie 57, waarbij één of meer van de verbindingen een oligoribonucleotide is dat uit ID nrs. 257, 260-262 en 264-268 van tabel D gekozen is. 15

60. Samenstelling volgens conclusie 58, waarbij de eerste verbinding een oligoribonucleotide is dat uit ID nrs. 257, 260-262 en 264-268 van tabel D gekozen is

61. Samenstelling volgens conclusie 58, waarbij de tweede verbinding een oligoribo- 20 nucleotide is dat uit ID nrs. 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 en 50 van tabel A gekozen is.

62. Samenstelling volgens één of meer der voorafgaande conclusies 57-61, waarbij de twee verbindingen fysisch met elkaar gemengd worden in hoeveelheden die 25 een gunstige activiteit genereren.

63. Samenstelling volgens één of meer der voorafgaande conclusies 57-61, waarbij de twee verbindingen al dan niet covalent verbonden zijn.

64. Samenstelling volgens één of meer der voorafgaande conclusies 57-61, waarbij de twee verbindingen met elkaar verbonden zijn door middel van een nucleïne-zuurbrugvormer met een lengte variërende van 2-100, bij voorkeur 2-50 of 2-30 nucleotiden.

65. Toepassing van een samenstelling volgens één of meer der voorafgaande conclusies 57-64 voor de behandeling van een ademhalingsstoomis, een oogziekte, een microvasculaire stoornis, drukzweren of een ruggenmergletsel of -ziekte. 2000439