BRPI0707160A2 - usos terapêuticos de inibidores de rtp801 - Google Patents

Abstract

USOS TERAPêUTICOS DE INIBIDORES DE RTPB8O1. A presente invenção fornece moléculas, composições, métodos e usos inéditos para tratar desordens microvasculares, desordens nos olhos, condições respiratórias e desordens de ouvido com base na inibição do gene e/ou proteína RTPB8O1.

Description

"USOS TERAPÊUTICOS DE INIBIDORES DE RTP801"

Por todo este pedido, várias publicações e paten-tes, incluindo patentes dos Estados Unidos, são referencia-das pelo autor e ano, e patentes pelo número. As divulgaçõesdas publicações e patentes e de pedidos de patente em suasintegras são por meio desta incorporadas pela referêncianeste pedido a fim de descrever mais completamente a tecno-logia de ponta à qual esta invenção diz respeito.

Campo técnico

A presente invenção diz respeito a moléculas deRNAsi inéditas que inibem o gene RTP801 e ao uso de tais mo-léculas para tratar distúrbios respiratórios de todos os ti-pos (incluindo distúrbios pulmonares), doenças e distúrbiosoculares, distúrbios microvasculares, distúrbios relaciona-dos a angiogênese e a apoptose, e deficiências auditivas.

Antecedentes da invenção

Doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD)A doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) afetamais de 16 milhões de americanos e é a quarta maior causa demorte nos Estados Unidos. 0 consumo de cigarro ocasiona amaior parte das ocorrências de doença debilitante, mas ou-tros fatores ambientais não podem ser excluídos (Petty TL.2003. Definition, epidemiology, course, and prognosis ofCOPD. Clin. Cornerstum, 5-10).

Enfisema pulmonar é uma importante manifestação daCOPD. A destruição permanente de espaços aéreos periféricos,distai dos bronquíolos terminais, é a marca característicado enfisema (Tuder RM, et al. Oxidative stress and apoptosisinteract and cause emphysema due to vascular endothelialgrowth factor blocade. Am J Respir Cell Mol Biol, 29:88-97;2003.)· Enfisema também é caracterizado pelo acúmulo de cé-lulas inflamatórias, tais como macrófagos e neutrófilos emestruturas de bronquiolos e alveolares (Petty, 2003).

A patogênese do enfisema é complexa e multifatori-al. Em humanos, uma deficiência de inibidores de proteasesproduzida por células inflamatórias, tal como alfal-antitripsina, mostrou contribuir para o desequilíbrio prote-ase / antiprotease, desse modo, favorecendo a destruição damatriz extracelular alveolar em enfisema induzida por fumaçade cigarro (CS) (Eriksson, S. 1964. Pulmonary Emphysema andAlphal-Antitrypsin Deficiency. Acta Med Scand 175:197-205.Joos, L., Pare, P.D., e Sandford, A.J. 2002. Genetic factorsof risc of chronic obstructive pulmonary disease. Swiss MedWkly 132:27-37). Metaloproteinases matrizes (MMPs) desempe-nham um papel central em enfisema experimental, documentadopela resistência de metaloelastase de macrófago em camundon-gos knockout contra enfisema ocasionada pela inalação crôni-ca de CS (Hautamaki, et al: Requirement for macrophage elas-tase for cigarette smoke-induced emphysema in mice. Science277:2002-2004). Além do mais, a sobrexpressão pulmonar deinterleucina-13 em camundongos transgênicos resulta em enfi-sema dependente de MW e de catepsina (Zheng, T., et at 2000.Inducible targeting of IL-13 to the adult Iung causes matrixmetalloproteinase- and cathepsin-dependent emphysema. J ClinInvest 106:1081-1093). Trabalhos recentes descrevem o envol-vimento da apoptose celular do septo na destruição do tecidopulmonar que leva à enfisema (Rangasami T, et al. Geneticablation of Nrf2 enhances susceptibility to cigarette smoke-induced emphysema in mice. Submitted to Journal of ClinincalInvestigation.; Tuder RM et al. Oxidative stress and apop-tosis interact and cause emphysema due to vascular endothe-Iial growth factor blocade. Am J Respir Cell Mol Biol,29:88-97; 2003.; Yokohori N, Aoshiba K, Nagai A, Increasedleveis of cell death and proliferation in alveolar wallcells in patients with pulmonary emphysema. Chest. 2004 Feb;125(2): 626-32.; Aoshiba K, Yokohori Nf Nagai A., Alveolarwall apoptose causes Iung destruction and emphysematouschanges. Am J Respir Cell Mol Biol. 2003 M;28(5):555-62.).

Entre os mecanismos que baseiam ambas as rotas dedestruição pulmonar em enfisema, a formação excessiva de es-pécies reativas ao oxigênio (ROS) deve ser mencionada emprimeiro lugar. É bem estabelecido que existe desequilíbriopró-oxidante / antioxidante no sangue e no tecido pulmonarde fumantes (Hulea SA, et al: Cigarette smoking causes bio-chemical changes in blood that are suggestive of oxidativestress: a case-control study. J Environ Pathol Toxicol On-col. 1995; 14(3-4) :173-80.; Rahman I, MacNee W. Lung glu-tathium and oxidative stress: implications in cigarettesmoke-induced airway disease. Am J Physiol. 1999 Dec; 277(6Pt 1):L1067-88.; MacNee W. Oxidants / antioxidants and COPD.Chest. 2000 May; 117(5 Suppl 1) : 303S-17S.; Marwick JA, Kirk-ham P, Gilmour PS, Donaldson K, MacNEE W, Rahman I. Ciga-rette smoke-induced oxidative stress and TGF-betal increasep21wafl/cipl expression in alveolar epithelial cells. Ann NYAcad Sei. 2002 Nov; 973:278-83.; Aoshiba Κ, Koinuma Μ, Yoko-hori Ν, Nagai Α. Immunohistochemical evaluation of oxidativestress in murine lungs after eigarette smoke exposure. InhalToxicol. 2003 Sep; 15(10): 1029-38.; Dekhuijzen PN. Antioxi-dant properties of N-aeetyleysteine: their relevanee in re-lation to ehronie obstruetive pulmonary disease. Eur RespirJ. 2004 Apr, 23(4): 629-36.; Tuder RM, Zhen L, Cho CY, Ta-raseviciene-Stewart L, Kasahara Y, Salvemini D, Voelkel NF,e Flores SC. Oxidative stress and apoptosis interact andcause emphysema due to vascular endothelial growth fatorblocade. Am J Respir Cell Mol Biol, 29:88-97; 2003.). Depoisde uma hora de exposição de camundongos à CS, há um drásticoaumento de 8-hidroxi-21-deoxiguanosina (8-OHdG) nas célulasepiteliais alveolares, particularmente, do tipo II (veja I-nhal Toxicol. 2003 Sep;15(10):1029-38. supra).

Espécies reativas ao oxigênio sobreproduzidas sãoconhecidas por suas atividades citotóxicas, que é originadade um efeito nocivo direto de DNA e da ativação de rotas detransdução de sinal apoptótico (Takahashi A, Masuda A, SunM, Centonze VE, Herman B. Oxidative stress-induced apoptosisis associated with alterations in mitochondrial caspase ac-tivity and Bcl-2-dependent alterations in mitochondrial pH(pHm). Brain Res Buli. 2004 Feb 15; 62(6) :497-504.; TaniyamaY, Griendling K.K. Reactive oxygen species in the vascula-ture: molecular and cellular mechanisms. Hypertension. 2003Dec; 42(6):1075-81. Epub 2003 Oct 27.; Higuchi Y. Chromoso-mal DNA fragmentation in apoptosis and necrosis induced byoxidative stress. Biochem Pharmacol. 2003 Oct 15;66(8):1527-35.; Punj V, Chakrabarty AM. Redox proteins in mammaliancell death: an evolutionarily conserved function in mito-chondria and prokaryotes. Cell Microbiol. 2003 Apr;5(4):225-31.; Ueda S, Masutani H, Nakamura H, Tanaka T, Ueno M, YodoiJ. Redox controle of cell death. Antioxid Redox Signal. 2002Jun; 4(3):405-14.).

ROS's não são somente citotóxicos por si mesmos,mas também são estímulos pró-inflamatórios, sendo proeminen-tes ativadores de fatores de transcrição sensíveis ao redoxNFkB e AP-I (revisado em Rahman I. Oxidative stress and genetranscription in asthma and chronic obstrutive pulmonary di-sease: antioxidant therapeutic targets. Curr Drug TargetsInflamm Allergy. 2002 Sep; 1 (3) : 291-315.) . Por sua vez, am-bos os fatores de transcrição estão fortemente implicados noestímulo da transcrição de citocinas pró-inflamatórias (re-visado em Renard P, Raes M. The proinflammatory transcripti-on factor NFkappaB: a potencial target for novel therapeuti-cal strategies. Cell Biol Toxicol. 1999; 15 (6) : 34-1-4 . ;Lentsch AB, Ward PA. The NFkappaBb/IkappaB system in acuteinflammation. Arch Immunol Ther Exp (Warsz) . 2000;48(2):59-63) e proteinases degradantes de matriz (Andela VB, GordonAH, Zotalis G, Rosier RN, Goater JJ, Lewis GD, Schwarz EM,Puzas JE, 0'Keefe RJ. NFkappaB: a pivotal transcription fac-tor in prostate câncer metastasis to bone. Clin Orthop. 2003Oct; (415 Suppl) :S75-85.; Fleenor DL, Pang IH, Clark AF. In-volvement of AP-I in interleukin-lalpha-stimulated MMP-3 ex-pression in human trabecular meshwork cells. Invest Ophthal-mol Vis Sei. 2003 Aug; 44 (8) :3494-501.; Ruhul Amin AR, SengaΤ, Oo ML, Thant AA, Hamaguchi Μ. Secretion of matrix metal-loproteinase-9 by the proinflammatory cytokine, IL-Ibeta: arole for the dual signalling pathways, Akt and Erk. GenesCells. 2003 Jun;8(6) :515-23.) · Por sua vez, citocinas pró-inflamatórias servem como atrativos de células inflamatóriasque também secretam enzimas degradantes de matriz, citocinase espécies reativas ao oxigênio. Assim, parece que um fatorpatogênico, como, por exemplo, CS, dispara uma rede patoló-gica em que espécies reativas ao oxigênio agem como os prin-cipais mediadores de destruição pulmonar.

Tanto a espécie reativa ao oxigênio (ROS) da fuma-ça de cigarro inalada quanto aquela endogenamente formadapelas.células inflamatórias contribuem para uma maiòr cargaoxidante intrapulmonar.

Um fator patogênico adicional em relação à patogê-nese COPD é a menor expressão observada de VEGF e VEGFRII empulmões de pacientes enfisematosos (Yasunori Kasahara, RubinM. Tuder, Carlyne D. Cool, David A. Lynch, Sonia C. Flores,and Norbert F. Voelkel. Endothelial Cell Death and DecreasedExpression of Vascular Endothelial Growth Factor and Vascu-lar Endothelial Growth Fator Receptor 2 in Emphysema. Am JRespir Crit Care Med Vol 163. pp 737-744, 2001). Além domais, a inibição de sinalização VEGF usando inibidor VEGFRquímico leva à apoptose celular endotelial do septo alveolare, então, à apoptose celular epitelial, provavelmente, emfunção da interrupção de íntima conexão estrutural / funcio-nal de ambos os tipos de células nos alvéolos (Yasunori Ka-sahara, Rubin M. Tuder, Laimute Taraseviciene-Stewart, Timo-thy D. Le Cras, Steven Abman, Peter K. Hirth, Johannes Wal-tenberger, and Norbert F. Voelkel. Inhibition of VEGF recep-tors causes Iung cell apoptosis and emphysema. J. Clin. In-vest. 106:1311-1319 (2000).; Voelkel NF, Cool CD. Pulmonaryvascular involvement in chronic obstructive pulmonary dis-ease. Eur Respir J Suppl. 2003 Nov; 46: 28s-32s).

Degeneração macular

A causa mais comum de menor visão mais bem corri-gida em indivíduos acima dos 65 anos de idade nos EUA é umdistúrbio retinal conhecido como degeneração macular rela-cionada à idade (AMD). À medida gue a AMD progride, a doençaé caracterizada pela perda da visão aguda e central. A áreaocular afetada pela AMD é a Mácula - uma peguena área nocentro da retina composta, primariamente, por células foto-receptoras. A assim denominada AMD "seca", responsável porcerca de 85 % - 90% dos pacientes de AMD, envolve alteraçõesna distribuição do pigmento ocular, perda de fotorreceptorese menor função retinal em função da total atrofia das célu-las. A assim denominada AMD "molhada" envolve a proliferaçãode vasos coroidais anormais que leva a coágulos ou cicatri-zes no espaço subretinal. Assim, o início de AMD molhada o-corre em virtude da formação de uma rede neovascular coroi-dal anormal (neovascularização coroidal, CNV) debaixo da re-tina neural. Os vasos sangüíneos recém-formados vazam exces-sivamente. Isto leva ao acúmulo de fluido subretinal e san-gue levando à perda de acuidade visual. Eventualmente, háperda total de retina funcional na região envolvida, à medi-da que uma grande cicatriz disquiforme que envolve as corói-des e a retina se forma. Embora pacientes da AMD seca possamreter visão de menor qualidade, freqüentemente, AMD molhadaresulta em cegueira. (Hamdi & Kenney, Age-related Maculardegeneration - a new viewpoint, Frontiers in Bioscience,e305-314, May 2003). CNV ocorre não somente na AMD molhada,mas também em outras patologias oculares, tais como, síndro-me da histoplasmose ocular, estrias angióides, rupturas namembrana de Bruch, degeneração miópica, tumores oculares ecertas doenças degenerativas da retina.

Vários estudos conduzidos determinaram diversosfatores de risco de AMD, tais como fumar, envelhecimento,histórico familiar (Milton, Am J Ophthalmol 88, 269 (1979);Mitchell et al., Ophthalmology 102, 1450-1460 (1995); Smithet al., Ophthalmology 108, 697-704 (2001)) sexo (7-fold hi-gher likelihood in females: Klein et al., Ophthalmology 99,933-943 (1992) e raça (brancos são mais suscetíveis). Fato-res de risco adicionais podem incluir características ocula-res, tais como, hipermetropia (hiperopia) e olhos de colora-ção clara, bem como doença cardiovascular e hipertensão. E-vidência de envolvimento genético na progressão do início dadoença também foi documentada (veja Hamdi & Kenney supra).

Duas empresas, Acuity Pharmaceuticals e Sima The-rapeutics, depositaram recentemente um IND para moléculas deRNAsi que inibem VEGF e VEGF-Rl (Flt-I) , respectivamente,para o tratamento de AMD. Estas moléculas são chamadas deinibidor Cand5 e de inibidor 027, respectivamente.

Distúrbios microvasculares

Distúrbios microvasculares são compostos por umamplo grupo de distúrbios que afetam primariamente os vasoscapilares microscópicos e o sistema linfático e, portanto,estão fora do escopo da intervenção cirúrgica direta. A do-ença microvascular pode ser amplamente agrupada em vasospás-tica, vasculite e oclusiva linfática. Adicionalmente, muitosdos distúrbios vasculares conhecidos têm um elemento micro-vascular em si.

* Doença Vasospástica - Doenças vasospásticas sãoum grupo de distúrbios relativamente comuns em que, por mo-tivos desconhecidos, os reflexos vasoconstritivos periféri-cos são hipersensiveis. Isto resulta em vasoconstrição ina-propriada e isquemia de tecido, até o ponto da perda de te-cido. Usualmente, sintomas de vasospástica são relacionadosà temperatura ou ao uso de maquinário vibratório, mas podemser secundário em relação a outros distúrbios.

*Doença Vasculitica - Doenças vasculiticas sãoaquelas que envolvem um processo inflamatório primário namicrocirculação. Usualmente, vasculite é um componente de umdistúrbio auto-imune ou distúrbio do tecido conjuntivo e, nogeral, não é t.ratável por tratamento cirúrgico, mas exigetratamento imunossupressivo se os sintomas forem severos.

*Doença Oclusiva Linfática - Inchaço crônico domembro inferior ou superior (Iinfoedema) é o resultado deoclusão linfática periférica. Esta é uma condição relativa-mente rara que tem um grande número de causas, algumas her-dadas, algumas adquiridas. Os suportes principais do trata-mento são vestuários de compressão corretamente instalados eo uso de dispositivo de compressão intermitente.Patologias microvasculares associadas com diabetes

Diabetes é a principal causa de cegueira, a causanúmero um de amputações e de impotência, e uma das doençasinfantis crônicas com ocorrência mais freqüente. Diabetestambém é a principal causa de doença renal em estágio termi-nal nos Estados Unidos, com uma taxa de prevalência de 31 %em comparação com outras doenças renais. Diabetes também é aindicação mais freqüente para transplante de rins, responsá-vel por 22 % de todas as operações de transplante.

No geral, complicações diabéticas podem ser clas-sificadas amplamente como doença microvascular ou macrovas-cular. Complicações microvasculares incluem neuropatia (danodo nervo), nefropatia (doença renal) e distúrbios da visão(por exemplo, retinopatia, glaucoma, catarata e doença decórnea). Na retina, glomérulo, e vasa nervorum, recursos pa-tofisiológicos similares caracterizam doença microvascularespecifica de diabetes.

Patologias microvasculares associadas com diabetessão definidas como uma doença dos vasos sangüíneos menores(vasos capilares) que pode ocorrer, por exemplo, em pessoasque tiveram diabetes por um longo tempo. As paredes dos va-sos ficam anormalmente espessas, mas fracas. Portanto, elessangram, vazam proteína e diminuem o fluxo sangüíneo atravésdo corpo.

Dados clínicos e de modelo animal indicam que hi-perglicemia crônica é o fator de iniciação central para to-dos os tipos de doença microvascular diabética. Tanto a du-ração quanto a magnitude da hiperglicemia são fortementecorrelacionadas com a quantidade e a taxa de progressão dadoença microvascular diabética. Embora todas as células dia-béticas sejam expostas a elevados níveis de glicose plasmá-tica, o dano hiperglicêmico é limitado àqueles tipos de cé-lulas (por exemplo, células endoteliais) que desenvolvem hi-perglicemia intracelular. Células endoteliais desenvolvemhiperglicemia intracelular em virtude de, diferente de mui-tas outras células, elas não poderem regular para baixo otransporte de glicose quando expostas a hiperglicemia extra-celular. É adicionalmente demonstrado que a hiperglicemiaintracelular é necessária e suficiente para o desenvolvimen-to de patologia diabética pelo fato de que a sobrexpressãodo transporte de glicose GLUTl em células mesangiais coloca-das em cultura em um meio de glicose normal imita o fenótipodiabético, induzindo os mesmos aumentos no colágeno tipo IV,colágeno tipo I, e expressão genética de fibronectina comohiperglicemia diabética.

Função Celular Endotelial Anormal: Inicialmente nocurso da diabetes mellitus, antes que as mudanças estrutu-rais fiquem evidentes, a hiperglicemia causa anormalidadesno fluxo sangüíneo e permeabilidade vascular na retina, noglomérulo, e no vasa nervorum do nervo periférico. 0 aumentodo fluxo sangüíneo e da pressão intracapilar é concebido pa-ra refletir a menor produção de óxido nítrico (NO) induzidapor hiperglicemia no lado eferente dos leitos capilares e,possivelmente, uma maior sensibilidade a angiotensina II.Como uma conseqüência da maior pressão intracapilar e dadisfunção celular endotelial, vasos capilares da retina exi-bem maior vazamento de fluoresceina e os vasos capilaresglomerulares têm uma elevada taxa de excreção de albumina(AER). Mudanças comparáveis ocorrem no vasa vasorum do nervoperiférico. Inicialmente no curso do diabetes, a maior per-meabilidade é reversível à medida que o tempo progride, en-tretanto, ele se torna irreversível.

Maior Acúmulo de Proteína na Parede do Vaso

O recurso patofisiológico comum da doença micro-vascular diabética é o progressivo estreitamento e eventualoclusão de lumina vascular, o que resulta em perfusão e fun-ção inadequadas dos tecidos afetados. Hipertensão microvas-cular inicialmente induzida por hiperglicemia e maior perme-abilidade vascular contribuem para a oclusão irreversível domicrovaso por três processos:

O primeiro é um vazamento anormal de proteínasplasmáticas contendo carboidrato com ácido Schiff periódico(PAS) positivo, que são depositadas na parede do vaso capi-lar e que podem estimular células perivasculares, tais comoperícitos e células mesangiais, para elaborar fatores decrescimento e matriz extracelular.

* O segundo é o extravasamento de fatores de cres-cimento, tais como fator de crescimento transformante βΐ(TGF-βί), que estimula diretamente a superprodução de compo-nentes da matriz extracelular e podem induzir a apoptose emcertos tipos de células com complicação relevante.

* O terceiro é estímulo induzido por hipertensãode expressão genética patológica por células endoteliais ecélulas de suporte, que incluem transportadores de glicoseglut-1, fatores de crescimento, receptores de fator de cres-cimento, componentes de matriz extracelular e moléculas deadesão que podem ativar leucócitos circulantes. A observaçãode que a redução unilateral na severidade da doença micro-vascular diabética ocorre no lado com arteriostenose oftál-mica ou renal é consistente com este conceito.

Perda de Célula Microvascular e Oclusão de Vaso

O progressivo estreitamento e a oclusão de luminamicrovascular diabética também são acompanhados pela perdade célula microvascular. Na retina, diabetes mellitus induzmorte celular programada de células Müller e de células degânglio, de pericitos, e de células endoteliais. No gloméru-lo, a função renal declinante é associada com oclusão de ca-pilar expandida e perda de podócito, mas os mecanismos quefundamentam a perda de célula glomerular ainda não são co-nhecidos. No vasa nervorum, ocorre degeneração de célula en-dotelial e de pericito, e estas mudanças microvasculares pa-recem preceder o desenvolvimento de neuropatia periféricadiabética. A distribuição multifocal de degeneração axonalem diabetes suporta um papel causai para oclusão microvascu-lar, mas a indução por hiperglicemia diminui em neurotrofi-nas pode contribuir pelo impedimento de reparo e regeneraçãoaxonal normal.

Um outro recurso comum da doença microvascular di-abética foi denominado memória hiperglicêmica, ou a persis-tência ou progressão de alterações microvasculares induzidaspor hiperglicemia durante subseqüentes períodos de homeosta-se normal de glicose. 0 exemplo mais impressionante destefenômeno é o desenvolvimento de severa retinopatia em olhoshistologicamente normais de cães diabéticos que ocorreu in-teiramente durante um periodo de 2,5 anos de glicose sangüí-nea normalizada que seguiu 2,5 anos de hiperglicemia. 0 au-mento induzido por hiperglicemia na transcrição genética damatriz selecionada também persiste por semanas depois darestauração de normoglicemia in vivo, e um menos pronuncia-do, mas qualitativamente similar, prolongamento do aumentoinduzido por hiperglicemia na transcrição genética da matrizselecionada ocorre em células endoteliais colocadas em cul-tura.

Para informação adicional, veja "Shared patho-physiologic features of microvascular complications of dia-betes" (Larsen: Williams Textbook of Endocrinology, IOthed., Copyright © 2003 Elsevier).

Complicações microvasculares ocorrem não somenteem diabetes observável, mas também ocorrem em função de To-lerância de Glicose Danificada (IGT). Complicações microvas-culares de IGT: neuropatia, retinopatia, e microproteinúriarenal.

Neuropatia Diabética

Neuropatias diabéticas são distúrbios neuropáticos(dano do nervo periférico) que são associados com diabetesmellitus. Usualmente, estes distúrbios resultam de lesão mi-crovascular diabética que envolve pequenos vasos sangüíneosque suprem os nervos (vasa nervorum). Distúrbios relativa-mente comuns que podem ser associados com neuropatia diabé-tica incluem paralisia do terceiro nervo, mononeuropatia,mononeuropatia multiplex, amiotrofia diabética, uma dolorosapolineuropatia, neuropatia autonômica e neuropatia toracoab-dominal, e a forma mais comum, neuropatia periférica, queafeta principalmente os pés e as pernas. Há quatro fatoresenvolvidos no desenvolvimento de neuropatia diabética: doen-ça microvascular, produtos glicolisados finais avançados,proteína quinase Cea rota de poliol.

Doença microvascular em neuropatia diabética

Doenças vasculares e neurais são intimamente rela-cionadas e misturadas. Vasos sangüíneos dependem da funçãonerval normal, e nervos dependem de fluxo sangüíneo adequa-do. A primeira mudança patológica na microvasculatura é avasoconstrição. À medida que a doença progride, a disfunçãoneuronal se correlaciona intimamente com o desenvolvimentode anormalidades vasculares, tais como o espessamento damembrana da base do vaso capilar e hiperplasia endotelial,que contribuem para a menor tensão de oxigênio e hipóxia. Aisquemia neuronal é uma característica bem estabelecida deneuropatia diabética. Agentes vasodilatadores (por exemplo,inibidores angiotensina-converting-enzyme, antagonistas al-fal) podem levar a melhorias substanciais no fluxo sangüíneoneuronal, com melhorias correspondentes nas velocidades decondução nerval. Assim, a disfunção microvascular ocorre i-nicialmente em diabetes, paralela à progressão da disfunçãorieural, e pode ser suficiente para suportar a severidade dasmudanças estrutural, funcional e clínica observadas na neu-ropatia diabética. A neuropatia periférica (pernas), neuro-patia sensorimotor é um componente significativo na patogê-nese de úlceras na perna em diabetes.

Neuropatia é uma complicação comum de diabetes queocorre durante o tempo em mais da metade dos pacientes comdiabetes tipo 2. Estudos de condução nerval demonstram queneuropatia já está presente em 10 - 18 % dos pacientes nomomento do diagnóstico do diabetes, sugerindo que a lesão donervo periférico ocorre em estágios iniciais da doença e comdesregularão glicêmica mais suave. 0 conceito de que a neu-ropatia é um sinal clinico inicial de diabetes foi proposto> 40 anos atrás, e a maior parte dos estudos relata uma as-sociação entre IGT e neuropatia. A maior parte dos pacientescom IGT e neuropatia associada tem um polineuropatia senso-rial simétrica distai com dor neuropática proeminente. Neu-ropatia IGT (Microvascular complications of impaired glucosetolerance - Perspectives in Diabetes, J. Robinson Singleton,in Diabetes December 1, 2003) é fenotipicamente similar àneuropatia diabética inicial, que também' causa sintomas sen-soriais, incluindo dor, e disfunção autonômica. Em uma pes-quisa de 669 pacientes com neuropatia diabética inicial,sintomas sensoriais estavam presentes em > 60 %, impotênciaem quase 40 %, e outro envolvimento autonômico em 33 %, masevidência de envolvimento motor em somente 12 %. Estes acha-dos clínicos sugerem envolvimento inicial proeminente daspequenas fibras de nervo não mielinadas que conduzem dor,temperatura e sinais autonômicos. Quantização direta de fi-bras de nervo intraepidérmico não mielinado das biópsias dapele mostra perda de fibra similar e morfologia alterada empacientes com neuropatia associada com IGT e diabetes inici-al.

Disfunção autonômica, particularmente disfunçãoerétil e resposta vagai cardíaca alterada, são recursos ini-ciais comuns da lesão neuropática em diabetes. Trabalho compacientes IGT também sugere disautonomia vagai prevalente:estudos separados descobriram recuperação de taxa cardíacaanormal depois do exercício, variabilidade do intervalo R-Rrombudo em relação à respiração profunda, e expiração redu-zida em relação à taxa de inspiração (todas as medidas dedisautonomia vagai) em uma maior fração de pacientes IGT doque sujeitos em controle normoglicêmico com idade casada.

Dano do nervo em diabetes afeta as fibras motores,sensoriais e autonômicas. Neuropatia motor causa fraquezamuscular, atrofia e paresia. Neuropatia sensorial leva àperda das sensações protetoras de dor, pressão, e calor. Aausência de dor leva a muitos problemas no pé insensível,incluindo ulceração, trauma não percebido e neuroartropatiade Charcot. O paciente pode não buscar tratamento até depoisque o ferimento tenha avançado. Uma combinação de disfunçãosensorial e motor pode fazer com que o paciente coloque ten-sões anormais no pé, resultando em trauma, o que pode levarà infecção. Neuropatia simpática autonômica causa vasodila-tação e menor sudorese, o que resulta em aquecimento, pésexcessivamente secos que são particularmente propensos àruptura da pele, bem como em alterações funcionais no fluxomicrovascular. A disfunção autonômica (e denervação das es-truturas dérmicas) também resulta na perda de integridade dapele, o que fornece um local ideal para a invasão microbia-na. O pé neuropático não passa por ulceração espontânea. Emvez disto, ela é a combinação de alguma forma de trauma a-companhada pela neuropatia.

A disfunção microvascular ocorre inicialmente emdiabetes, paralela à progressão da disfunção neural, e podeser suficiente para suportar a severidade das mudanças es-truturais, funcionais e clinicas observadas na neuropatiadiabética.

Produtos glicolisados finais avançados - Elevadosníveis intracelulares de glicose causam uma ligação covalen-te não enzimática com proteínas, o que altera suas estrutu-ras e destrói suas funções. Algumas destas proteínas glico-lisadas são implicadas na patologia de neuropatia diabéticae em outras complicações de diabetes de longo prazo.

Proteína quinase C (PKC) - PKC é implicada na pa-tologia de neuropatia diabética. Maiores níveis de glicosecausam um aumento no diacilglicerol intracelular, o que ati-va PKC. Inibidores PKC em modelos animais aumentarão veloci-dade da condução nerval pelo aumento do fluxo sangüíneo neu-ronal.

Polineuropatia sensorimotor

Fibras de nervo mais longas são afetadas em umgrau maior do que as mais curtas em virtude de a velocidadeda condução nerval ser diminuída em proporção ao comprimentode um nervo. Nesta síndrome, menores sensação e perda de re-flexos ocorrem primeiro nos dedos dos pés bilateralmente,então, se estende para cima. Usualmente, ela é descrita comodistribuição nas extremidades dos membros, perda sensorial,disestesia e dor noturna. A dor pode ser percebida comoqueimadura, sensação de formigamento, dolorosa ou embotamen-to. Sensação de comichão é comum. Perda de propriocepção,isto é, o sentido de onde um membro está no espaço é afetadoinicialmente. Estes pacientes não podem sentir quando elesestão pisando em um corpo estranho, como um estilhaço, ouquando eles estão desenvolvendo um calo por causa de sapatomal ajustado. Consequentemente, eles estão em risco de de-senvolver úlceras e infecções nos pés e nas pernas, o quepode levar à amputação. Similarmente, estes pacientes podemsofrer múltiplas fraturas do joelho, tornozelo ou pé, e po-dem desenvolver uma junta de Charcot. A perda de função mo-tora resulta em contraturas em dorsoflexão dos dedos dospés, assim denominadas dedos em forma de martelo. Estas con-traturas ocorrem não somente no pé, mas também na mão.

Neuropatia autonômica

O sistema nervoso autonômico é composto por nervosque servem o coração, o trato GI e o sistema urinário. Aneuropatia autonômica pode afetar qualquer um destes siste-mas de órgãos. A disfunção autonômica mais comumente reco-nhecida em diabéticos é a hipotensão ortostática ou a des-confortável sensação de desmaio quando um paciente fica depé. No caso da neuropatia diabética autonômica, ela ocorreem função da falência cardíaca e de artérias para ajustarapropriadamente a taxa cardíaca e tom vascular para manter osangue fluindo contínua e completamente até o cérebro. Usu-almente, este sintoma é acompanhado por uma perda de varia-ção respiratória do seio, isto é, a mudança usual na taxacardíaca vista com a respiração normal. Quando estes doisachados estão presentes, neuropatia cardíaca autonômica estápresente.

Manifestações do trato GI incluem esvaziamentogástrico atrasado, gastroparesia, náusea, inchaço e diarréi-a. Em virtude de muitos diabéticos tomarem medicamento oralpara suas diabetes, a absorção destes remédios é enormementeafetada pelo esvaziamento gástrico atrasado. Isto pode levara hipoglicemia quando um agente diabético oral for tomadoantes de uma refeição e não for absorvido por horas ou, al-gumas vezes, dias depois, quando já há índice normal ou bai-xo de açúcar no sangue. Movimento moroso do intestino delga-do pode causar o supecrescimento bacteriano, que fica piorpela presença de hiperglicemia. Isto leva ao inchaço, gás ediarréia.

Sintomas urinários incluem freqüência urinária,urgência, incontinência e retenção. Novamente, em virtude daretenção de urina doce, infecções do trato urinário são fre-qüentes. A retenção urinária pode levar a divertículos dabexiga, pedras, nefropatia de refluxo.

Neuropatia craniana

Quando os nervos cranianos são afetados, neuropa-tias oculomotores (3a) são mais comuns. O nervo oculomotorcontrola todos os músculos que movem o olho com a exceçãodos músculos retos laterais e oblíquos superiores. Ele tam-bém serve para constringir a pupila e para abrir a pálpebra.Usualmente, o início da paralisia de um terceiro nervo dia-bético é abrupto, começando com dor frontal ou periorbitale, então, diplopia. Todos os músculos oculomotores enervadospelo terceiro nervo podem ser afetados, exceto aqueles quecontrolam o tamanho da pupila. 0 sexto nervo, o nervo abdu-cente, que enerva o músculo reto lateral ocular (move o olholateralmente), também é comumente afetado, mas o envolvimen-to do quarto nervo, o nervo troclear, (enerva o músculo o-bliquo superior, que move o olho para baixo) não é usual.Mononeuropatias dos nervos torácicos ou da espinha lombarpodem ocorrer e levar a dolorosas sindromes que imitam o in-farto do miocárdio, colecistite ou apendicite. Diabéticostêm uma maior incidência de neuropatias compressivas, talcomo sindrome do túnel carpal.

Isquemia Diabética de Membro e Úlceras Diabéticasno Pé

Diabetes e pressão podem prejudicar a circulaçãomicrovascular e levar a mudanças na pele nas extremidadesinferiores que, por sua vez, podem levar à formação de úlce-ras e subseqüente infecção. Mudanças microvasculares levam àmicroangiopatia de músculo do membro, bem como a uma predis-posição a desenvolver isquemia periférica e a uma reduzidaresposta compensatória de angiogênese a eventos isquêmicos.A patologia microvascular exacerba a Doença Vascular Perifé-rica (PVD) (ou Doença Arterial Periférica (PAD) ou DoençaArterial da Extremidade Inferior (LEAD)) uma complicação MA-CROvascular que estreita as artérias das pernas em função dearteriosclerose. PVD ocorre mais cedo em diabéticos, é maissevera e difundida e, freqüentemente, envolve problemas mi-crocirculatórios intercorrentes que afetam as pernas, olhose rins.

Úlceras no pé e gangrena são distúrbios comórbidosfreqüentes da PAD. Neuropatia periférica concorrente comsensação de debilidade torna o pé suscetível a trauma, ulce-ração e infecção. A progressão da PAD em diabetes é compostapor tal comorbidade como neuropatia periférica e insensibi-lidade dos pés e extremidades inferiores à dor e ao trauma.Com circulação debilitada e sensação de debilidade, ocorremulceração e infecção. A progressão para osteomielite e gan-grena pode necessitar de amputação.

É até 25 vezes mais provável que pessoas com dia-betes passem por uma amputação de membro inferior do quepessoas não diabéticas, ressaltando a necessidade de impedirúlceras no pé e subseqüente perda de membro. Úlceras diabé-ticas do pé podem ocorrer não somente em conjunto com a PAD,mas também pode ser associada com neuropatia, insuficiênciavenosa (veias com varizes), trauma e infecção. A PAD contri-bui para estes outros distúrbios na produção ou precipitaçãode úlceras no pé. Úlceras no pé não representam, necessaria-mente, progressão da PAD, já que elas podem ocorrer na pre-sença de adequado perfusão arterial periférica clínica. Es-tudos com base em paciente indicam um maior risco de ulcera-ção no pé em pacientes diabéticos que têm neuropatia perifé-rica e uma maior pressão plantar no pé. A prevalência de umhistórico de úlceras ou chagas no pé ou tornozelos foi 15 %de todos os pacientes diabéticos no estudo com base em popu-lação no sul do Wisconsin. A prevalência foi maior para in-divíduos diabéticos diagnosticados com < 30 anos de idade,foi ligeiramente mais alta em homens (16 %) do que em mulhe-res (13 %) , e foi maior em pacientes diabéticos tratado cominsulina (17 %) do que em pacientes que não tomam insulina(10 %) . A prevalência aumentou com a idade, especialmente empacientes diabéticos diagnosticados com < 30 anos de idade.Em estudos em pacientes da Europa, a prevalência de úlcerasno pé em pacientes diabéticos foi de 3 % naqueles com < 50anos de idade, 7 % naqueles com < 60 anos de idade e 14 %naqueles com < 80 anos de idade. A prevalência foi maior emmachos do que em fêmeas com 70 anos de idade.

Em pacientes diabéticos, isquemia e infecção no pésão serias ocorrências e, até mesmo, com riso de morte. En-tretanto, a neuropatia é a condição mais dificil de tratar.A literatura médica e cirúrgica que considera todos os as-pectos das manifestações clinicas e patológicas do pé diabé-tico é decisiva. Neuropatia, angiopatia, retinopatia e ne-fropatia, sozinhas ou em combinação e em variados graus deseveridade, podem influenciar o tratamento do pé diabético.

A cada ano, 82.000 amputações de membro são reali-zadas em pacientes com diabetes mellitus. A maioria destasamputações é realizada na população mais idosa. Amputaçõesque resultam de diabetes podem surgir de múltiplos etiologi-as, incluindo úlceras no pé, isquemia, úlceras venosas naperna (isto é, aquelas secundárias em relação ao refluxo ve-noso) e úlceras no calcanhar (isto é, aquelas resultantesdas úlceras de pressão não tratadas no calcanhar). A maioriadestas amputações se origina das úlceras. A prevalência deúlceras no pé entre pacientes com diabetes é de 12 %. Alémdo mais, a incidência cumulativa de 20 anos das úlceras deextremidade inferior em pacientes com diabetes tipo I é de9,9 %. Amputações de membro induzidas por diabetes resultamem uma taxa de mortalidade de 5 anos de 39 % até 68 %, e sãoassociadas com um maior risco de amputações adicionais. Aduração da permanência em hospital é aproximadamente 60 %maior entre pacientes com úlceras diabéticas no pé, se com-parado com aqueles sem úlceras.

Neuropatia diabética debilita o reflexo axônio donervo que depende da função nociceptora da fibra C saudávele causa vasodilatação local em resposta a um estimulo dolo-roso. Esta condição compromete adicionalmente o resposta va-sodilatadora presente em distúrbios de tensão, tais como le-são ou inflamação, no pé diabético neuropático. Esta debili-tação pode explicar parcialmente porque algumas úlceras nopé diabético neuropático são lentas para curar ou não curamde nenhuma maneira, apesar da revascularização com sucessoda extremidade inferior.

Assim, a rota causai mais comum para a ulceraçãodiabética no pé pode ser identificada como a combinação deneuropatia (perda sensorial), deformidade (por exemplo, ca-beças metatársicas proeminente) e trauma (por exemplo, cal-çados mal ajustados).

A maior parte dos cirurgiões prefere realizar des-vio arterial popliteal ou tibial em virtude de taxas inferi-ores de salvação e revelação de membro se comparadas comprocedimentos mais proximais. Foi relatado que se o desvioarterial popliteal ou tibial for incapaz de restaurar umpulso palpável no pé, o desvio pedal fornece um procedimentode salvação de membro mais durável e efetivo para pacientescom diabetes e ferimentos isquêmico no pé. Mesmo a doençaoclusiva multi-segmento extensiva em pacientes com diabetesnão apresenta um impedimento para o salvamento do pé. Apesarde sérias complicações de ferimento poder ter resultados de-sastrosos, elas são incomuns depois do enxerto do desvio pe-dal. Controle adequado de infecção pré-existente no pé ecuidadoso tunelamento de enxerto mostraram ser efetivos paraevitar complicações adicionais. Angioplastia na extremidadeinferior está sendo progressivamente mais utilizada. Entre-tanto, deve-se enfatizar que para que a angioplastia sejaefetiva, um vaso distai ou vaso de alimentação deve estarpresente se a angioplastia mais proximal deve ter sucesso.

Embora úlceras diabéticas / patologias de membropossam ser tratadas em alguns pacientes (por debridamento,tratamento com antibiótico, uso de preparações para estimu-lar tecido de granulação (novos colágeno e angiogênese) eredução de carga bacteriana no ferimento), será benéfico teruma composição farmacêutica que pode mais bem tratar estesdistúrbios e/ou aliviar os sintomas.

Para informação adicional, veja American Journalof Surgery, Volume 187 · Number 5 Suppl 1 May 1, 2004, Copy-right ® 2004 Elsevier .

Disfunção microvascular coronária em diabetes

A correlação entre histopatologia e disfunção mi-crocirculatória em diabetes é bem conhecida de estudos expe-rimentais antigos e de autópsia, em que o espessamento damembrana basal, fibrose perivascular, rareação vascular ehemorragia do vaso capilar são freqüentemente encontrados.Permanece difícil confirmar estes dados in vivo, embora umdocumento recente tenha demonstrado uma correlação entre apatologia e a disfunção microvascular ocular (Am J Physiol2003;285). Entretanto, uma grande quantidade de estudos clí-nicos indica que não somente diabetes observável, mas tambémcontrole metabólico debilitado, podem afetar a microcircula-ção coronária (Hypert Res 2002;25:893). Werner aludiu ao im-portante documento de Sambuceti et al (Circulation 2001;104:1129) que mostra a persistência da disfunção microvascu-lar em pacientes depois da reabertura com sucesso da artériarelacionada ao infarto, e que pode explicar a maior morbidezcárdiovascular e mortalidade nestes pacientes. Há evidênciacrescente de grandes estudos de reperfusão aguda de que amorbidez e a mortalidade não são relacionadas com a própriareabertura da artéria relacionada ao infarto, mas muito maisdependente do fluxo+/- TIMI do rubor miocardial (Stone 2002;Feldmann Circulation 2003). Herrmann indicou, entre outros,que, provavelmente, a integridade da microcirculação coroná-ria é o fator clínico e prognóstico mais importante nestecontexto (Circulation 2001). O efeito neutro do dispositivode proteção (nenhuma mudança relevante para o fluxo TIMI pa-ra resolução ST ou para MACE) pode indicar que uma debilida-de funcional da microcirculação é o principal determinantedo prognóstico. Também há evidência crescente de que a dis-função microvascular coronária desempenha um papel principalna CAD não obstrutiva. Disfunção endotelial coronária perma-nece um forte preditor de prognóstico nestes pacientes.

Nefropatia diabética (Disfunção renal em pacientescom diabetes)

Nefropatia diabética abrange microalbuminúria (umefeito da doença microvascular), proteinúria e ESRD. Diabe-tes é a causa mais comum de falha renal, responsável pormais de 4 0 porcento dos novos casos. Mesmo quando medicamen-tos e dieta alimentar são capazes de controlar a diabetes, adoença pode levar à nefropatia e à falha renal. A maior par-te das pessoas com diabetes não desenvolve nefropatia que ésevera o suficiente para causar falha renal. Cerca de 16 mi-lhões de pessoas nos Estados Unidos têm diabetes, e cerca de100.000 pessoas têm falha renal em decorrência da diabetes.

Retinopatia diabética

No estado diabético, a hiperglicemia leva ao menorfluxo sangüíneo na retina, hiperpermeabilidade na retina,atrasos na condução nerval do fotorreceptor e morte celularneuronal da retina. Em diabetes de curta duração, morte ce-lular neuronal foi identificada na camada nuclear interna daretina. Especificamente, a apoptose foi localizada em célu-las gliais, tais como células Mueller e astrócitos, mostrou-se ocorrer em 1 mês de diabetes no modelo de rato diabéticoinduzido por STZ. A causa destes eventos é multifatorial,incluindo a ativação da rota diacilglicerol / PKC, tensãooxidante e glicosilação não enzimática. A combinação desteseventos produz a retina hipóxica e, em última análise, levaao desenvolvimento de retinopatia diabética. Uma possívelconexão entre a isquemia retinal e as mudanças iniciais naretina diabética é a produção de fatores de crescimento in-duzida por hipóxia, tal como VEGF. 0 principal regulador doresposta hipóxica foi identificado como fator-1 indutivelpor hipóxia (HIF-I), que controla os genes que regulam aproliferação celular e a angiogênese. Estudos anteriores de-monstraram que a inibição da ubiquitinação de HIF-I leva àligação com os elementos responsivos da hipóxia (HRE) e coma produção de RNAm do VEGF.

Retinopatia diabética é definida como a disfunçãoprogressiva da vasculatura retinal causada por hiperglicemiacrônica. Recursos chaves de retinopatia diabética incluemmicroaneurismas, hemorragias retinais, exudatos de lipidioretinal, marcas de algodão, não perfusão de vaso capilar,edema macular e neovascularização. Recursos associados in-cluem hemorragia vitrea, descolamento da retina, glaucomaneovascular, catarata prematura e paralisias do nervo crani-ano.

Há 16 milhões de pessoas nos EUA com diabetes Tipo1 e Tipo 2. Em 15 anos, 80 % dos pacientes do Tipo 1 desen-volveram retinopatia diabética, enquanto que 84 % dos paci-entes diabéticos do Tipo 2 desenvolveram retinopatia em 19anos. Estes números constituem um significativo mercado paraagentes terapêuticos direcionados para doenças oculares deneovasculatura. 0 desenvolvimento de retinopatia diabética édemorado. Apesar do controle ideal de açúcar no sangue, po-de-se esperar que, eventualmente, pacientes com doença hámuito tempo desenvolvam alguma forma de retinopatia. A Nati-onal Society to Prevent Blindness estimou que de 4 a 6 mi-lhões de diabéticos nos EUA têm retinopatia diabética. A in-cidência anual estimada de novos casos de retinopatia diabé-tica proliferativa e de edema macular diabético são 65.000 e75.000, respectivamente, com uma prevalência de 700.000 e500.000, respectivamente. A retinopatia diabética causa de12.000 a 24.000 novos casos de cegueira nos EUA todos os a-nos. A retinopatia é tratada por métodos cirúrgicos, efeti-vos na redução de severa perda de visão, mas as partes daretina tratadas com laser são irreversivelmente destruídas.Não há tratamentos por medicamento disponíveis.

Uma doença microvascular que afeta primariamenteos vasos capilares, a diabetes mellitus afeta o olho peladestruição da vasculatura na conjuntiva, na retina e no sis-tema nervoso central. Pacientes podem apresentar históricosde conjuntiva bulbar injetada há muito tempo juntamente comreclamações sistêmicas de perda de peso apesar do apetitemaior do que o normal (polifasia), sede anormal (polidipsia)e freqüência anormal de urina (poliúria).

Acuidade visual flutuante secundária em relação aoaçúcar instável no sangue é um sinal ocular comum. Inchaçodas lentes do cristalino resulta em grandes deslocamentossúbitos na refração, bem como em prematura formação de cata-rata. Mudanças na acuidade visual dependerão da severidade edo estágio da doença.

Na retina, o enfraquecimento das arteríolas e dosvasos capilares pode resultar na aparência característica doponto intraretinal e em hemorragias em manchas, exudatos,microanormalidades vasculares intraretinais (IRMA) microa-neurismas, edema e infartos de algodão. A retinopatia diabé-tica proliferativa é o resultado de severo comprometimentovascular e é visível como neovascularização do disco (NVD),neovascularização em outro lugar (NVE) e neovascularizaçãoda íris (NVI, ou rubeose da íris). Complicações neurológicasincluem paralisias do terceiro, quarto e sexto nervos crani-anos bem como papilite diabética e paralisia do nervo facial.

Diabetes mellitus é um grupo de doenças genetica-mente influenciadas que compartilham intolerância à glicose.Ela é caracterizada como um distúrbio de regulação metabóli-ca em decorrência de insulina deficiente ou com mau funcio-namento ou de receptores de insulina celular deficientes oucom mau funcionamento.

A bioquímica que envolve a formação de sorbitoldesempenha um papel na destruição de perícitos, que são cé-lulas que suportam o endotélio vascular. À medida que os pe-rícitos de suporte morrem, o endotélio do vaso capilar ficacomprometido, resultando no vazamento vascular de sangue,proteína e lipídeo. Isto, em combinação com o sangue espessocom carga de glicose, produz insuficiência vascular, nãoperfusão do vaso capilar, hipóxia retinal, estrutura altera-da e menor função. A formação e a liberação de fatores vaso-proliferativos que desempenham um papel na gênese da neovas-cularização retinal são muito pouco entendidos.

A maior parte das seqüelas de diabetes que ameaçama não visão se resolve espontaneamente durante o curso dassemanas a meses seguintes ao controle médico. Em casos emque há grandes mudanças refrativas, pacientes podem exigiruma prescrição de espetáculo temporário até que a refraçãoestabilize. Quando a retinopatia ameaça a mácula ou quandonovos vasos sangüíneos proliferam, o paciente pode ser con-duzido para fotocoagulação a laser. 0 Estudo da RetinopatiaDiabética (DRS) provou conclusivamente que a fotocoagulaçãopanretinal teve sucesso na redução do risco de severa perdada visão em pacientes de alto risco. Ele definiu como as ca-racterísticas de alto risco como: (1) Neovascularização dodisco ótico (NVD) um quarto até um terço do tamanho do diâ-metro de um disco e (2) Neovascularização em outro lugar(NVE) com alguma hemorragia vítrea.

Edema macular diabético (DME)

DME é uma complicação da retinopatia diabética,uma doença que afeta os vasos sangüíneos da retina. A reti-nopatia diabética resulta em múltiplas anormalidades na re-tina, incluindo espessamento e edema retinal, hemorragias,fluxo sangüíneo impedido, vazamento excessivo de fluido dosvasos sangüíneos e, nos estágios finais, crescimento anormaldo vaso sangüíneo. Este crescimento do vaso sangüíneo podelevar a grandes hemorragias e severo dano retinal. Quando ovazamento do vaso sangüíneo da retinopatia diabética causainchaço na mácula, ele é chamado de DMA.O principal sintomado DME é uma perda da visão central. Fatores de risco asso-ciados com DME incluem níveis de glicose sangüínea fracamen-te controlados, alta pressão sangüínea, função renal anormalque causa retenção de fluido, altos níveis de colesterol eoutros fatores sistêmicos gerais.De acordo com a Organização Mundial da Saúde, aretinopatia diabética é a principal causa de cegueira em a-dultos com idade para trabalhar e uma causa principal deperda de visão em diabéticos. A American Diabetes Associati-on relata que há aproximadamente 18 milhões de diabéticosnos Estados Unidos e aproximadamente 1,3 milhões casos re-cém-diagnosticados de diabetes nos Estados Unidos a cada a-no. A Prevent Blindness America e a National Eye Instituteestimam que nos Estados Unidos haja mais de 5,3 milhões depessoas com 18 anos ou mais com retinopatia diabética, in-cluindo aproximadamente 500.000 com DME. O CDC estima quehaja aproximadamente 75.000 novos casos de DME no EstadosUnidos a cada ano.

Neuropatias Adicionais

Além da diabetes, as causas comuns de neuropatiasão infecção de herpes zóster, trauma crônico ou agudo (in-cluindo cirurgia) e várias neurotoxinas. Dor neuropática écomum em câncer como um resultado direto do câncer nos ner-vos periféricos (por exemplo, compressão por um tumor) e co-mo um efeito colateral de muitos medicamentos quimioterápi-cos.

Doença microvascular - Doenças vasculares e neu-rais são intimamente relacionadas e misturadas. Vasos san-güíneos dependem da função nerval normal, e nervos dependemdo fluxo sangüíneo adequado. A primeira mudança patológicana microvasculatura é a vasoconstrição. À medida que a doen-ça progride, a disfunção neuronal se correlaciona intimamen-te com o desenvolvimento de anormalidades vasculares, taiscomo espessamento da membrana da base do vaso capilar e hi-perplasia endotelial, que contribuem para a menor tensão deoxigênio e hipóxia. Agentes vasodilatadores (por exemplo,inibidores enzima de conversão da angiotensina, antagonistasal) pode levar a melhorias substanciais no fluxo sangüíneoneuronal, com melhorias correspondentes nas velocidades decondução nerval.

Manifestações clinicas

A neuropatia afeta todos os nervos periféricos:fibras dolorosas, neurônios motores e nervos autonômicos.Portanto, ela pode, necessariamente, afetar todos os órgãose sistemas desde que todos sejam enervados. Há diversas sín-dromes distintas com base nos sistemas de órgãos e membrosafetados, mas estas não são, de nenhuma maneira, exclusivas.Um paciente pode ter neuropatia sensorimotor e autonômica ouqualquer outra combinação.

Apesar dos avanços no entendimento das causas me-tabólicas de neuropatia, os tratamentos direcionados para ainterrupção destes processos patológicos foram limitados pe-los efeitos colaterais e pela falta de eficácia. Assim, tra-tamentos são sintomáticos e não abordam os problemas funda-mentais. Agentes para dor causados pela neuropatia sensori-motor incluem antidepressivos tricíclicos (TCAs), inibidoresde reabsorção de serotonina (SSRIs) e medicamentos antiepi-léticos (AEDs). Nenhum destes agentes reverte os processospatológicos que levam à neuropatia diabética e nenhum alterao severo curso da enfermidade. Assim, será útil ter uma com-posição farmacêutica que pode mais bem tratar estes distúr-bios e/ou aliviar os sintomas.

Retinopatias Adicionais

Microvasculopatia retinal (retinopatia da AIDS)

Microvasculopatia retinal é vista em 100 % dos pa-cientes com AIDS. Ela é caracterizada por hemorragias intra-retinais, microaneurismas, marcas Roth, marcas de algodão(microinfartos da camada de fibra do nervo) e embainhamentoperivascular. A etiologia da retinopatia é desconhecida, em-bora tenha-se pensado que ela seja em função de complexosimunológicos circulantes, liberação local de substâncias ci-totóxicas, hemorreologia anormal, e infecção de células en-doteliais com o HIV. Agora, a retinopatia da AIDS é tão co-mum que marcas de algodão em um paciente sem diabetes ou hi-pertensão, mas com risco de HIV deve estimular o médico aconsiderar o teste viral. Não há tratamento especifico pararetinopatia da AIDS, mas sua presença continua pode estimu-lar um médico a reexaminar a eficácia da terapia contra oHIV e a adaptação do paciente.

Retinopatia do transplante de medula óssea (BMT)

Retinopatia do transplante de medula óssea foi re-latado pela primeira vez em 1983. Tipicamente ela ocorre emseis meses, mas ela pode ocorrer com atraso de 62 meses de-pois da BMT. Fatores de risco, tais como diabetes e hiper-tensão podem facilitar o desenvolvimento da retinopatia doBMT pelo aumento da microvasculopatia isquêmica. Não há pre-dileção de idade, sexo ou raça conhecida para o desenvolvi-mento da retinopatia do BMT. Pacientes apresentam menor acu-idade visual e/ou déficit de campo visual. Tipicamente, a-chados de segmento posteriores são bilaterais e simétricas.Manifestações clinicas incluem múltiplas marcas de algodão,telangiectasia, microaneurismas, edema macular, exudatos du-ros e hemorragias retinais. Angiografia com fluoresceina de-monstra não perfusão e perda de vaso capilar, anormalidadesmicrovasculares intrarretinais, microaneurismas e edema ma-cular. Embora a precisa etiologia da retinopatia do BMT nãofoi elucidada, ela parece ser afetada por diversos fatores:toxicidade de ciclosporina, irradiação total do corpo (TBI)e agentes quimioterapêuticos. Ciclosporina é um poderoso a-gente imunomodulatório que suprime enxerto contra hospedeiroimunoresposta. Ela pode levar a lesão da célula endotelial ea efeitos colaterais neurológicos, e em decorrência disto,ela foi sugerida como a causa da retinopatia do BMT. Entre-tanto, a retinopatia do BMT pode se desenvolver na ausênciado uso de ciclosporina e a ciclosporina não mostrou causar aretinopatia do BMT em receptores autólogos ou singenéticosde medula óssea. Portanto, ciclosporina não parece ser acausa exclusiva da retinopatia do BMT. A irradiação total docorpo (TBI) também foi implicada como a causa da retinopatiado BMT. A radiação lesiona a microvasculatura retinal e levaà vasculopatia isquêmica. Variáveis tais como a dose totalde radiação e o intervalo de tempo entre a radiação e a a-blação da medula óssea parecem ser importantes. Entretanto,a retinopatia do BMT pode ocorrer em pacientes que não rece-bem TBI, e retinopatia do BMT não é observada em receptoresde transplante de órgão sólido que receberam doses de radia-ção similares. Assim, a TBI não é a causa exclusiva, mas elaé um outro fator que contribui para o desenvolvimento de re-tinopatia do BMT. Agentes quimioterapêuticos foram sugeridoscomo um fator potencial que contribui para a retinopatia doBMT. Medicamentos, tais como cisplatina, carmustina e ciclo-fosfamida podem causar efeitos colaterais oculares, incluin-do papiledema, neurite ótica, déficit de campo visual e ce-gueira cortical. Foi sugerido que estes medicamentos quimio-terapêuticos podem predispor pacientes a danos retinais in-duzidos por radiação e melhorar o efeito deletério da radia-ção. No geral, pacientes com retinopatia do BMT têm um bomprognóstico. Usualmente, a retinopatia se resolve em dois aquatro meses depois da interrupção ou da diminuição da dosa-gem de ciclosporina. Em um relatório, 69 porcento dos paci-entes obtiveram a completa resolução da achados retinais, e4 6 porcento dos pacientes recuperaram completamente suas a-cuidades visuais básicas. Em virtude do prognóstico favorá-vel e da natureza relativamente não progressiva da retinopa-tia do BMT, usualmente, a intervenção agressiva não é neces-sária .

Distúrbios isquêmicos

A isquemia pode ser dividida em 2 categorias: aprimeira envolve a arteriosclerose acelerada que ocorre co-mumente em pacientes com diabetes, isto é, nas artérias fe-mural, popliteal, e tibial posterior. Estes vasos, freqüen-temente com somente 1 ou 2 cm de diâmetro, podem desenvolverplaca aterosclerótica, que diminui seriamente o fluxo san-güíneo. Depois que os grandes vasos ficam completamente o-cluídos, pode ocorrer derrame cerebral, infarto do miocár-dio, isquemia e úlceras diabéticas do pé sem cura. Essenci-almente, esta forma de isquemia é uma doença de vaso grande.

Demência pós-derrame cerebral

25% das pessoas tem demência depois de um derramecerebral com muitas outras desenvolvendo demência durante os5 a 10 anos seguintes. Além do mais, muitos indivíduos so-frem de debilidades mais delicadas de suas funções cerebraissuperiores (tais como habilidades de planejamento e veloci-dade de processamento de informação) e estão em risco muitoalto de desenvolver a demência subseqüentemente. Neste pro-cesso (chamado de doença microvascular) , derrames muito pe-quenos nas partes profundas do cérebro parecem ser essenci-ais no processo que leva a um padrão identificado de atrofiacerebral específico da demência pós-derrame cerebral.

Síndrome da isquemia ocular

No geral, pacientes que sofrem da síndrome da is-quemia ocular (OIS) são idosos, com idade variando dos 50aos 80. Machos são afetados duas vezes mais comumente quefêmeas. Apenas raramente, o paciente é assintomático. Ocorrediminuição da visão na apresentação em 90 porcento dos ca-sos, e 40 porcento dos pacientes tem dor concomitante no o-lho. Também pode haver um histórico concomitante ou antece-dente de ataques isquêmicos transitórios ou amaurose fugaz.Pacientes também têm significativa doença sistêmica conheci-da ou desconhecida no momento da apresentação. As doençassistêmicas mais comumente encontradas são hipertensão, dia-betes, doença isquêmica cardíaca, derrame cerebral, e doençavascular periférica. Em uma quantidade menor, pacientes ma-nifestam OIS em decorrência de arterite de célula gigante(GCA).

Achados unilaterais estão presentes em 80 porcentodos casos. Achados comuns podem incluir catarata unilateralavançada, inflamação do segmento anterior, reação assintomá-tica de câmara anterior, edema macular, veias retinais dila-tadas mas não tortuosas, hemorragias em ponto mesoperiféricoe em manchas, marcas de algodão, exudatos e neovasculariza-ção do disco e da retina. Também pode haver pulso arterialespontâneo, elevada pressão intraocular, e neovascularizaçãodo iris e ângulo com glaucoma neovascular (NVG). Embora opaciente possa exibir neovascularização do segmento anteri-or, hipotonia ocular pode ocorrer em função de baixa perfu-são arterial em relação ao corpo ciliar. Ocasionalmente, hávisível embolia retinal (Placas de Hollenhorst).

Os achados na OIS são causados pela ulceração ate-romatosa da artéria carótida interna e pela estenose na bi-furcação da artéria carótida comum. Cinco porcento dos paci-entes com arteriostenose interna desenvolve OIS. Entretanto,OIS ocorre somente se o grau de estenose exceder 90 porcen-to. A estenose da artéria carótida reduz a pressão de perfu-são ocular, resultando no supramencionado fenômeno isquêmi-co. Uma vez que a estenose alcança 90 porcento, a pressão deperfusão na artéria retinal central (CRA) cai somente até 50porcento. Freqüentemente, a reduzida pressão arterial se ma-nifesta como pulso espontâneo da CRA. Os achados são variá-veis e podem incluir qualquer um ou todos os achados expos-tos .Pacientes com OIS têm significativa doença sistê-mica que deve ser avaliada. A morte cardíaca é a causa pri-mária de mortalidade em pacientes com OIS - a taxa de morta-lidade em cinco anos é de 40 porcento. Por este motivo, pa-cientes com OIS devem ser encaminhados a um cardiologistapara serologia, EKG, ECG e avaliação da carótida completos.Doenças Microvasculares do Rim

0 rim é envolvido em inúmeras condições clinicopa-tológicas discretas que afetam microvasculatura sistêmica erenal. Algumas destas condições são caracterizadas pela le-são primária das células endoteliais, tais como:

* síndrome hemolítica-urêmica (HUS) e púrpuratrombótica trombocitopênica (TTP) - HUS e TTP são doençasintimamente relacionadas caracterizadas por anemia microan-giopática hemolítica e debilidade variável de órgão. Tradi-cionalmente, o diagnóstico de HUS é feito quando falha renalé uma característica predominante da síndrome, como é comumem crianças. Em adultos, debilidade neurológica predominafreqüentemente e, então, a síndrome é chamada de TTP. Micro-angiopatia trombótica é a lesão patológica fundamental emambas as síndromes, e os achados clínicos e laboratoriais empacientes tanto com HUS quanto com TTP coincidem em umagrande quantidade. Isto motivou diversos investigadores aconsiderar as duas síndromes como uma variedade de uma únicaentidade de doença. Patogênese: Dados experimentais sugeremfortemente que a lesão da célula endotelial é o evento pri-mário na patogênese de HUS/TTP. 0 dano endotelial disparauma sucessão de eventos que inclui coagulação intravascularlocal, deposição de fibrina, e ativação e agregação de pla-queta sangüínea. O resultado final é a observação histopato-lógica de microangiopatia trombótica comum às diferentesformas da sindrome HUS/TTP. Se HUS/TTP for deixada sem tra-tamento, a taxa de mortalidade aproxima-se de 90 %. Terapiade apoio - incluindo diálise, medicamentos anti-hipertensivos, transfusões sangüíneas e tratamento de com-plicações neurológicas contribuem para a maior sobrevivênciade pacientes com HUS/TTP. Equilíbrio adequado de fluido edescanso do intestino são importantes no tratamento típicoda HUS associada com diarréia.

* nefrite por radiação - As conseqüências de longoprazo de irradiação renal em excesso de 2.500 rad pode serdividida em cinco síndromes clínicas:

(i) Nefrite por radiação aguda ocorre em aproxima-damente 40 % dos pacientes depois de um período de latênciade 6 a 13 meses. Ela é clinicamente caracterizada pelo iní-cio abrupto de hipertensão, proteinúria, edema e progressivafalha renal que, na maior parte dos casos, leva aos rins emestágio terminal.

(ii) Inversamente, a nefrite por radiação crônicatem um período de latência que varia entre 18 meses e 14 a-nos depois do insulto inicial. Ela é insidiosa no início e écaracterizada por hipertensão, proteinúria, e perda gradualda função renal.

(iii) A terceira sindrome se manifesta se 5 a 19anos depois da exposição à radiação como proteinúria benignacom função renal normal.(iv) Um quarto grupo de pacientes exibe somentehipertensão benigna de 2 a 5 anos mais tarde e pode ter pro-teinúria variável. Hipertensão maligna posterior surge de 18meses a 11 anos depois da irradiação em pacientes tanto comnefrite crônica por radiação quanto com hipertensão benigna.A remoção do rim afetado reverteu a hipertensão. Dano indu-zido por radiação nas artérias renais com subseqüente hiper-tensão renovascular foi relatado.

(v) Uma sindrome de insuficiência renal análoga ànefrite aguda por radiação foi observada em pacientes detransplante de medula óssea (BMT) que foram tratados com ir-radiação de corpo inteiro (TBI).

Relatou-se que a irradiação causa disfunção endo-telial, mas poupa células do músculo liso vascular no faseinicial pós-radiação. A radiação pode danificar diretamenteo DNA, levando à menor regeneração destas células e desnuda-mento da membrana basal no vasos capilares e túbulos glome-rulares. Como este insulto inicial leva, eventualmente, àglomerulosclerose, atrofia do túbulo e fibrose intersticialé incerto. Postula-se que a degeneração da camada da célulaendotelial pode resultar em trombose intravascular em vasoscapilares e em arteriolas menores. Então, esta angiopatiainterna explicará a fibrose renal progressiva e a hiperten-são que caracterizam a nefrite por radiação. Um estudo re-cente de rins de camundongo irradiados mostrou um aumento deleucócitos no córtex renal dependente da dose, sugerindo umpapel para os processos inflamatórios em nefrite induzidapor radiação.Em outro doenças renais, a microvasculatura do rimé envolvida em distúrbios autoimunes, tal como esclerosesistêmica (escleroderma). 0 envolvimento renal em esclerosesistêmica se manifesta como uma doença renal crônica lenta-mente progressiva ou como crise renal do escleroderma (SRC),que é caracterizada pela hipertensão maligna e azotemia agu-da. Postula-se que SRC é causada por um fenômeno tipo Ray-naud no rim. Vasospasmo severo leva à isquemia cortical emaior produção de renina e angiotensina II que, por sua vez,perpetua a vasoconstrição renal. Mudanças hormonais (gravi-dez), tensão física e emocional, ou baixa temperatura podemdisparar o vasospasmo arterial tipo Raynaud. 0 papel do sis-tema renina-angiotensina na perpetuação da isquemia renal éressaltado pelo significativo benefício de inibidores ACE notratamento da SRC. Em pacientes com SRC que avança para se-vera insuficiência renal, apesar do tratamento anti-hipertensivo, a diálise se torna uma necessidade. Tanto diá-Iise peritoneal quanto hemodiálise foram empregadas. Um re-latório da Rede da Doença Renal em Estágio Terminal (ESRD)sobre 311 pacientes com ESRD induzida por esclerose sistêmi-ca dialisados entre 1983 e 1985 revelou uma taxa de sobrevi-vência de 33 % em 3 anos.

A microcirculação renal também pode ser afetada nadoença da célula falciforme, à qual o rim é particularmentesuscetível em virtude da baixa tensão de oxigênio alcançadanos vasos profundos da medula renal em decorrência da trans-ferência de oxigênio contracorrente ao longo do vasa recta.As artérias renais e arteríolas menores também podem ser osítio da lesão tromboembólica do material que contém coles-terol desalojado das paredes dos grandes vasos.

Tomadas como um grupo, doenças que causam oclusãotransitória ou permanente da microvasculatura renal resultamuniformemente na interrupção da perfusão glomerular e, por-tanto, da taxa de filtração glomerular, desse modo, consti-tuindo uma séria ameaça a homeostase sistêmica.

Falha Renal Aguda (ARF)

ARF pode ser causada por doença microvascular oumacrovascular (oclusão da artéria renal principal ou severadoença aórtica abdominal). Freqüentemente, as doenças micro-vasculares clássicas apresentam hemólise microangiopática eFalha Renal Aguda que ocorrem em virtude da trombose ou o-clusão do vaso capilar glomerular, freqüentemente, com trom-bocitopenia associada. Exemplos típicos destas doenças in-cluem:

a) Púrpura trombótica trombocitopênica - O elemen-to pentavalente clássico na púrpura trombótica trombocitopê-nica inclui febre, mudanças neurológicas, falha renal, ane-mia microangiopática hemolítica e trombocitopenia.

b) Sindrome hemolítica urêmica - A síndrome hemo-lítica urêmica é similar à púrpura trombótica trombocitopê-nica, mas não apresenta mudanças neurológicas.

c) Síndrome HELLP (hemólise, elevados níveis deenzimas do fígado e baixos níveis de plaquetas sangüíneas).

A síndrome HELLP é um tipo de síndrome hemolítica urêmicaque ocorre em mulheres grávidas com a adição de elevações detransaminase.A falha renal aguda pode estar presente em todosos ambientes médicos, mas é predominantemente adquirida emhospitais. A condição se desenvolve em 5 porcento dos paci-entes hospitalizados, e aproximadamente 0,5 porcento dos pa-cientes hospitalizados exigem diálise. Durante os últimos 40anos, a taxa de sobrevivência para a falha renal aguda nãomelhorou, primariamente, em virtude de os pacientes afetadoser, agora, mais velhos e ter mais distúrbios comórbidos. Ainfecção é responsável por 75 porcento das mortes em pacien-tes com falha renal aguda, e complicações cardiorespirató-rias são a segunda causa mais comum de morte. Dependendo daseveridade da falha renal, a taxa de mortalidade pode variarde 7 porcento até tão alto quanto 80 porcento. A falha renalaguda pode ser dividida em três categorias: ARF pré-renal,intrínseca e pós-renal. A ARF intrínseca é subdividida emquatro categorias: doença tubular, doença glomerular, doençavascular (inclui microvascular) e doença intersticial.

Doença Renal Progressiva

Há evidência de que a doença renal progressiva écaracterizada por uma progressiva perda da microvasculatura.A perda da microvasculatura correlaciona-se diretamente como desenvolvimento de cicatrizes glomerulares e tubulointers-ticial. O mecanismo é mediado, em parte, por uma redução naresposta proliferativa endotelial, e esta debilitação no re-paro do vaso capilar é mediada pela alteração na expressãolocal tanto dos fatores angiogênicos (fator de crescimentoendotelial vascular) quanto antiangiogênico (trombospondina1) no rim. A alteração no equilíbrio dos fatores de cresci-mento angiogênicos é mediada tanto por citocinas associadasa macrófago (interleucina-ΐβ) quanto por mediadores vasoati-vos. Finalmente, há evidência intrigante de que o estimulodo reparo da angiogênese e/ou do vaso capilar pode estabili-zar a função renal e retardar a progressão e de que este be-neficio ocorre independentemente dos efeitos no BP ou prote-inúria.

Para informação adicional, veja Brenner & Rector1SThe Kidney, 7th ed., Copyright © 2004 Elsevier. Chapter 33 -Microvascular diseases of the kidney e também Tiwari andVikrant Journal of Indian Academy of Clinicai MedicineVol.5, No.l Review Article-Sepsis and the Kidney.

Distúrbio dos ouvidos

Ototoxicidade induzida por produtos químicosFreqüentemente, os efeitos tóxicos de vários medi-camentos ototóxicos terapêuticos nas células auditivas eneurônios do gânglio espiral são o fator limitante para suasutilidades terapêuticas. A maior parte dos medicamentos oto-tóxicos inclui o agente quimioterápico amplamente usado cis-platina e seus análogos, antibióticos aminoglicosídeo comu-mente usados, por exemplo, gentamicina, para o tratamento deinfecções causadas por bactérias gram negativo, quinina eseus análogos, salicilato e seus análogos, e diuréticos dealça.

Por exemplo, aminoglicosídeos antibacterianos,tais como gentamicinas, estreptomicina, canamicinas, tobra-micinas e congêneres são conhecidos por ter séria toxicida-de, particularmente, ototoxicidade e nefrotoxicidade, quereduzem a utilidade de tais agentes antimicrobianos (vejaGoodman e Gilman1S The Pharmacological Basis of Therapeu-tics, 6th ed., A. Goodman Gilman et al., eds; Macmillan Pu-blishing Co., Inc., New York, pp. 1169-71 (1980)). Certamen-te, a ototoxicidade é um efeito colateral limitador de dosede administração de antibiótico. De 4 a 15 % dos pacientesque recebem 1 grama por dia por mais do que 1 semana desen-volve perda de audição mensurável, que, lentamente, se tornapior e pode levar à completa surdez permanente se o trata-mento continuar.

Ototoxicidade também é um sério efeito colaterallimitador de dose para cisplatina, um complexo de coordena-ção de platina, que se provou efetivo em uma variedade decânceres humanos, incluindo câncer testicular, ovariana, nabexiga, e na cabeça e no pescoço. Cisplatina (Platinol®) da-nifica os sistemas auditivo e vestibular. Salicilatos, talcomo aspirina, são os medicamentos terapêuticos mais comu-mente usados por seus efeitos antiinflamatório, analgésico,antipirético e antitrombótico. Infelizmente, eles também têmefeitos colaterais ototóxicos. Freqüentemente, eles levam atinido ("zumbido nos ouvidos") e perda de audição temporá-ria. Além do mais, se o medicamento for usado em grandes do-ses por um período prolongado, a debilidade auditiva pode setornar persistente e irreversível.

Dessa maneira, existe uma necessidade de disposi-tivo para impedir, reduzir ou tratar a incidência e/ou seve-ridade dos distúrbios do ouvido interno e deficiências audi-tivas que envolvem o tecido do ouvido interno, particular-mente, células de cabelo do ouvido interno. De interesseparticular são aqueles distúrbios que surgem como efeito co-lateral indesejável dos medicamentos terapêuticos ototóxicosque incluem cisplatina e seus análogos, antibióticos de ami-noglicosideo, salicilato e seus análogos, ou diuréticos dealça. Além do mais existe uma necessidade de métodos quepermitirão maior e, assim, mais efetiva, dosagem com estesmedicamentos farmacêuticos que induzem ototoxicidade, impe-dindo ou reduzindo concomitantemente os efeitos citotóxicoscausados por estes medicamentos. O que é necessário é um mé-todo que forneça um dispositivo seguro, efetivo e prolongadopara o tratamento profilático ou curativo das deficiênciasauditivas relacionadas ao dano, perda ou degeneração do te-cido do ouvido interno, particularmente, induzidos por oto-toxina, e, particularmente, envolvendo células de cabelo doouvido interno. Além do mais, é exigido um método e composi-ção para o tratamento de dano e surdez resultantes do traumano ouvido interno (trauma acústico) .

Sem ser limitado pela teoria, acredita-se que me-dicamentos de cisplatina e outros medicamentos que induzemototoxicidade (tal como antibióticos aminoglicosideo) , bemcomo trauma acústico, podem induzir os efeitos ototóxicospor meio de morte celular programado ou apoptose no tecidodo ouvido interno, particularmente, células de cabelo do ou-vido interno (Zhang et al., Neuroscience 120 (2003) 191-205;Wang et al., J. Neuroscience 23 ((24):8596-8607)) . Em mamífe-ros, células de cabelo auditivas são produzidas somente du-rante o desenvolvimento embriônico e não regeneram se perdi-das durante a vida pós-natal, portanto, uma perda de célulasde cabelo resultará em profunda e irreversível surdez. Infe-lizmente, nos dias de hoje, não há terapias efetivas paratratar a cóclea e reverter esta condição. Assim, uma terapiaefetiva para impedir a morte celular de células de cabeloauditivas será de grande valor terapêutico.

Úlceras de pressão

Inflamações de pressão ou úlceras de pressão sãoáreas de pele e tecido danificados que se desenvolvem quandopressão prolongada (usualmente de uma cama ou cadeira de ro-das) interrompe a circulação a partes vulneráveis do corpo,especialmente a pele das nádegas, coxa e calcanhar. A faltade fluxo sangüíneo adequado leva à necrose isquêmica e à ul-ceração do tecido afetado. Úlceras de pressão ocorrem maisfreqüentemente em pacientes com sensação reduzida ou ausenteou que são debilitados, macilentos, paralisados, ou que es-tão acamados há muito tempo. Tecidos sobre o sacro, ísquio,trocânteres maiores, maléolo externo e calcanhar são especi-almente suscetíveis. Outros sítios podem ser envolvidos de-pendendo da posição do paciente.

Ulceras de pressão são ferimentos que, normalmen-te, curam apenas muito lentamente e, especialmente tais ca-sos, uma cura melhor e mais rápida é, certamente, de grandeimportância para o paciente. Além do mais, os custos envol-vidos no tratamento de pacientes que sofrem de tais ferimen-tos são acentuadamente reduzidos quando a cura é melhor eocorre mais rapidamente.

Condições IsquêmicasLesão isquêmica é a expressão clínica mais comumde lesão celular por falta de oxigênio. Os modelos mais usa-dos para estudar a lesão isquêmica envolvem a completa oclu-são de uma das artérias em um órgão (por exemplo, uma arté-ria coronária) e exame do tecido (por exemplo, músculo car-díaco) em áreas supridas pela artéria. Complexas mudançaspatológicas ocorrem em diversos sistemas celulares durante aisquemia. Até um certo ponto, por uma duração que varia en-tre diferentes tipos de células, a lesão pode ser fácil dereparar, e as células afetadas podem recuperar se oxigênio esubstratos metabólicos são novamente tornados disponíveispela restauração de fluxo sangüíneo. Com prorrogação adicio-nal da duração isquêmica a estrutura celular continua a de-teriorar devido à severa progressão mecanismos de lesão e-xistentes. Com o tempo, o mecanismo energético da célula - ausina de força oxidativa da mitocôndria e a rota glicólicaficam irreparavelmente danificadas, e a restauração de fluxosangüíneo (reperfusão) não pode salvar a célula danificada.Mesmo se o mecanismo energético celular tivesse que permane-cer intacto, dano irreparável ao genoma ou às membranas ce-lulares garantirá um resultado letal independente da reper-fusão. Esta lesão irreversível é usualmente manifestada comonecrose, mas apoptose também pode desempenhar um papel. Sobcertas circunstâncias, quando o fluxo sangüíneo for restau-rado em células que se tornaram previamente isquêmicas, masnão morreram, freqüentemente, a lesão é paradoxicalmente e-xacerbada e prossegue em um ritmo acelerado - isto é, lesãopor reperfusão.Lesão por reperfusão pode ocorrer era uma variedadede distúrbios, especialmente durante intervenção médica, in-cluindo, mas sem limitações, angioplastia, cirurgia cardíacaou trombose; transplante de órgão (pulmão, coração, rim, fí-gado, etc.), que, possivelmente, resulta em rejeição dotransplante em decorrência de isquemia-reperfusão seguinte àrenovação do fluxo sangüíneo ao órgão transplantado; em de-corrência de cirurgia plástica; durante severa síndrome docompartimento; durante reanexação de membros amputados; emdecorrência de síndrome da falência múltipla dos órgãos; nocérebro em decorrência de derrame cerebral ou trauma cere-bral; em conjunto com ferimentos crônicos, tais como uma úl-cera de pressão, uma úlcera venosa e uma úlcera diabética;durante isquemia do músculo esquelético ou transplante demembro; em decorrência de isquemia mesentérica ou doença is-quêmica do intestino aguda; falha respiratória em decorrên-cia de isquemia do torso inferior que leva à hipertensãopulmonar, hipoxemia e edema pulmonar não cardiogênico; falharenal aguda observada depois do transplante renal, grandecirurgia, trauma, e séptico, bem como choque hemorrágico,sepsia, isquemia retinal que ocorre em decorrência de oclu-são vascular aguda que leva à perda de visão em inúmeras do-enças oculares, tais como glaucoma agudo, retinopatia diabé-tica, retinopatia hipertensiva e oclusão vascular retinal;isquemia cóclear; falha de presilha em cirurgia microvascu-lar para defeitos da cabeça e do pescoço; fenômeno de Ray-naud e as lesões isquêmicas digitais associadas no esclero-derma, lesão da medula espinhal, cirurgia vascular, rabdomi-ólise traumática (sindrome do esmagamento); e mioglobinúria.

Adicionalmente, isquemia / reperfusão podem estarenvolvidas nos seguintes distúrbios: hipertensão, doençavascular cerebral hipertensiva, ruptura de aneurisma, umaconstrição ou obstrução de um vaso sangüíneo - como ocorreno caso de um angioma do trombo ou do êmbolo, discrasiassangüínea, qualquer forma de função cardíaca comprometida,incluindo parada ou falha cardíaca, hipotensão sistêmica,parada cardíaca, choque cardiogênico, choque séptico, traumada medula espinhal, trauma na cabeça, convulsão, sangramentode um tumor, e doenças, tais como derrame cerebral, doençade Parkinson, epilepsia, depressão, ALS, doença de Alzhei-mer, doença de Huntington e qualquer outra, demência induzi-da por doença (tal como demência induzida por HIV, por exem-pio) .

Adicionalmente, um episódio isquêmico pode ser o-casionado por uma lesão mecânica no Sistema Nervoso Central,tal como resultado de uma pancada na cabeça ou na espinha. 0trauma pode envolver um insulto de tecido, tais como uma a-brasão, incisão, contusão, punção, compressão, etc., tal co-mo pode surgir do contato traumático de um objeto estranhocom qualquer local da cabeça, pescoço ou coluna vertebral oupertinente a elas. Outras formas de lesão traumática podemsurgir da constrição ou compressão de tecido CNS por um acú-mulo inapropriado de fluido (por exemplo, um bloqueio oudisfunção de fluido cerebrospinal normal ou produção dofluido humor vítreo, modificação, ou regulação de volume, ouum hematoma ou edema subdural ou intracarniano). Similarmen-te, constrição ou compressão traumática podem surgir da pre-sença de uma massa de tecido anormal, tais como um tumor me-tastático ou primário.

Concluindo, modos de terapia atuais para o impedi-mento e/ou tratamento da COPD, doença microvasculares de de-generação macular e condições ototóxicas são insatisfatóriase, portanto, há uma necessidade de desenvolver compostos i-néditos com este propósito. Também há uma necessidade de de-senvolver uma terapia e um medicamento que podem tratar osefeitos ototóxicos atualmente associados com certos medica-mentos e distúrbios, em particular, com agentes quimiotera-pêuticos de cisplatina e certos antibióticos sem sacrificara efetividade dos medicamentos. Adicionalmente, há uma ne-cessidade de desenvolver uma terapia e medicamento que podemtratar os efeitos ototóxicos associados com trauma acústicoou trauma mecânico no ouvido interno. Além do mais, há umanecessidade de desenvolver uma terapia e um medicamento parao tratamento de úlceras de pressão, isquemia e distúrbiosrelacionados à isquemia-reperfusão. Todas as doenças e indi-cações aqui divulgadas anteriormente, bem como outras doen-ças e distúrbios aqui descritos, tal como MI, também podemser tratadas pelos compostos inéditos desta invenção.

RTP801

0 gene RTP801, foi relatado pela primeira vez porum co-requerente do presente pedido. As patentes US6.455.674, 6.555.667 e 6.740.738, todas atribuídas a um doscorrequerentes do presente pedido, divulgam e reivindicampor si mesmas o polinucleotídeo e polipeptídeo RTP801, e an-ticorpos direcionados ao polipeptideo. RTP801 representa umalvo genético exclusivo para fator-1 indutivel por hipóxia(HIF-I) que pode regular patogênese induzida por hipóxia in-dependente de fatores de crescimento, tal como VEGF.

Os seguintes pedidos de patente e publicações dãoaspectos de informação de fundo.

O WO 2001070979 diz respeito a marcadores de ácidonucléico que são sobre-expressos em células com câncer deovário.

A US 6.67 3.54 9 divulga uma combinação que compre-ende DNAcs que são diferentemente expressados em resposta aotratamento de esteróide.

O pedido US 2003165864 diz respeito a DNAcs quesão diferentemente expressados em células tratadas com umagente desmetilante de DNA.

O pedido US 2003108871 diz respeito a uma composi-ção que compreende diversos DNAcs que são diferentemente ex-pressados em culturas de célula de fígado humano C3A trata-do .

O pedido US 2002119463 divulga uma nova composiçãousada para tratar e diagnosticar câncer de próstata, a ditacomposição compreendendo DNAcs humanos que são diferentemen-te expressados em câncer de próstata.

WO 2004018999 divulga um método for avaliar, ca-racterizar, monitorar, impedir, e tratar câncer cervical.

EP 1394274 diz respeito a um método para testarasma brônquica ou doença obstrutiva pulmonar crônica pelacomparação do nível de expressão de um gene marcador em umaamostra biológica de um sujeito com o nível de expressão dogene em uma amostra de um sujeito saudável.

WO 2002101075 diz respeito a uma molécula de ácidonucléico isolado usada para detectar, caracterizar, impedire tratar cânceres cervicais humanos.

WO 2003010205 diz respeito a inibir angiogênesepara tratar cura de ferimento, retinopatia, isquemia, infla-mação, microvasculopatia, ferimento ósseo e inflamação dapele.

WO 2002046465 diz respeito a identificar um geneenvolvido na doença para tratar condições reguladas por hi-póxia.

WO 2002031111 diz respeito a polipeptídeos e suasproteínas codificadas e, portanto, muitos usos são forneci-dos.

WO 2001012659 diz respeito a ácidos nucléicos usa-dos em metodologias de DNA recombinante.

WO 2001077289 divulga seiscentos e vinte e trêspolinucleotídeos derivados de uma variedade de fontes de te-cido humano.

WO 2003101283 diz respeito a uma combinação quecompreende muitos DNAcs e proteínas.

JP 2003259877 diz respeito a muitos marcadores dadoença de fibrose hepática.

Tzipora Shoshani, et al. Identification of a NovelHypoxia-Inducible Factor I-Responsive Gene, RTP801, Involvedin Apoptosis. MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Apr. 2002, p.2283-2293; este documento, de co-autoria dos inventores dapresente invenção, detalha a descoberta do gene RTP801 (aentão gene depentende de HIF-I inédito.

Anat Brafman, et al. Inhibition of Oxygen-InducedRetinopathy in RTP801-Deficient Mice. Invest Ophtalmol VisSei. 2004 Oct; 45 (10): 3796-805; também de co-autoria dosinventores da presente invenção, este documento demonstraque em camundongos knock out com RTP801, hiperóxia não oca-siona a degeneração da rede de vasos capilares retinais.

Leif W. Ellisen, et al. REDD1, a DevelopmentallyRegulated Transcriptional Target of p63 and p53, Links p63to Regulation of Reactive Oxygen Species. Molecular Cell,Vol. 10, 995-1005, November, 2002; este documento demonstraque a sobrexpressão de RTP801 (aqui chamada de REDDl) leva àmaior produção de espécies reativas ao oxigênio.

Richard DR, Berra E, e Pouyssegur J. Non-hypoxicpathway mediates the induetion of hypoxia-inducible factor 1alpha in vascular smooth muscle cells. J Biol. Chem. 2000,Sepl; 275(35): 26765-71. Este documento demonstra que trans-crição dependente de HIF-I pode ser induzida pela excessivaprodução de espécies reativas ao oxigênio.

Rangasami T, et al., Genetic ablation of Nrf2 en-hances susceptibility to cigarette smoke-induced emphysemain mice. Submetido ao Journal of Clinicai Investigation. Es-te trabalho diz respeito a camundongos com uma defesa antio-xidante comprometida.

Sumário da invenção

A presente invenção fornece métodos e composiçõesinéditos para tratar distúrbios microvasculares, degeneraçãomacular, distúrbios respiratórios, e lesão ou doença da me-dula espinhal.

Em uma modalidade, são fornecidas moléculas inédi-tas que inibem RTP801 e podem ser usadas para tratar váriasdoenças e indicações.

Em uma outra modalidade, a presente invenção for-nece um método para tratar um paciente que sofre de um dis-túrbio microvascular, degeneração macular ou um distúrbiorespiratório, compreendendo administrar ao paciente uma com-posição farmacêutica que compreende um inibidor de RTP801.

Uma outra modalidade da presente invenção diz res-peito a um método para tratar um paciente que sofre de COPD,compreendendo administrar ao paciente uma composição farma-cêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente efe-tiva de um inibidor de RTP801. Em uma modalidade, o inibidoré uma molécula de RNAsi, uma molécula anti-sentido, um anti-corpo (tal como um anticorpo neutralizante), um peptideo ne-gativo dominante ou um ribossomo.

Uma outra modalidade da presente invenção diz res-peito a um método para tratar um paciente que sofre de dege-neração macular, compreendendo administrar ao paciente umacomposição farmacêutica que compreende uma quantidade tera-peuticamente efetiva de um inibidor de RTP801. Em uma moda-lidade, o inibidor é uma molécula de RNAsi, uma molécula an-ti-sentido, um anticorpo (tal como um anticorpo neutralizan-te), um peptideo negativo dominante ou um ribossomo.

Uma outra modalidade da presente invenção diz res-peito a um método para tratar um paciente que sofre de umdistúrbio microvascular, compreendendo administrar ao paci-ente uma composição farmacêutica que compreende uma quanti-dade terapeuticamente efetiva de um inibidor de RTP801. Emuma modalidade, o inibidor é uma molécula de RNAsi, uma mo-lécula anti-sentido, um anticorpo (tal como um anticorponeutralizante), um peptideo negativo dominante ou um ribos-somo.

Uma modalidade adicional da presente invenção for-nece o uso de uma quantidade terapeuticamente efetiva de uminibidor de RTP801 para a preparação de um medicamento parapromover a recuperação em um paciente que sofre de um dis-túrbio respiratório. Em uma modalidade, o distúrbio respira-tório é COPD e o inibidor é, preferivelmente, um RNAsi.

Uma modalidade adicional da presente invenção for-nece o use de uma dose terapeuticamente efetiva de um inibi-dor de RTP801 para a preparação de um medicamento para pro-mover a recuperação em um paciente que sofre de degeneraçãomacular. Em uma modalidade, a degeneração macular é AMD e oinibidor é, preferivelmente, um RNAsi.

Uma modalidade adicional da presente invenção for-nece o uso de uma quantidade terapeuticamente efetiva de uminibidor de RTP801 para a preparação de um medicamento parapromover a recuperação em um paciente que sofre de um dis-túrbio microvascular. Em uma modalidade, o distúrbio micro-vascular é retinopatia diabética e o inibidor é, preferivel-mente, um RNAsi.

A presente invenção diz respeito, no geral, a mé-todos e composições para tratar ou impedir a incidência ou aseveridade de debilidade auditiva (ou debilidade do equilí-brio) , particularmente, debilidade auditiva associada com amorte celular das células de cabelo do ouvido interno. Osmétodos e composições envolvem administrar em um mamíferocom necessidade de tal tratamento uma quantidade profiláticaou terapeuticamente efetiva de um ou mais compostos que in-fra-regulam a expressão do gene RTP801, particularmente, pe-quenos RNAs interferentes (RNAsis) inéditos.

Mais especificamente, a presente invenção fornecemétodos e composições para tratar um paciente que sofre dedebilidade auditiva ou outras otopatologias associadas com amorte celular de células de cabelo do ouvido interno. Taisotopatologias podem ser o resultado de trauma acústico,trauma mecânico, ou perda de audição induzida por ototoxina.Os métodos da invenção que compreendem administrar ao paci-ente um ou mais compostos que infra-regulam a expressão dogene RTP801, particularmente, RNAsis que inibem RTP801 tipi-camente como uma composição farmacêutica, em uma dose tera-peuticamente efetiva para, desse modo, tratar o paciente.

Em uma modalidade, a presente invenção fornece me-l hores composições e métodos para tratamentos que exigem aadministração de um medicamento farmacêutico com um efeitocolateral ototóxico debilitador da audição em combinação comuma quantidade terapeuticamente efetiva de uma ou mais molé-cuias de RNAsi que inibem RTP801 para tratar ou impedir aototoxicidade induzida pelo medicamento farmacêutico. Ascomposições da invenção podem ser administradas em um(s) in-tervalo (s) adequado(s) anterior, subseqüentemente ou subs-tancialmente concorrente com a administração do medicamentoototóxico debilitador da audição que induz dano ao tecidoapoptótico do ouvido interno. Similarmente, este tratamentopode ser efetivo como um tratamento profilático anterior ouem conjunto com distúrbios que causam trauma acústico.

Dessa maneira, é um objetivo da invenção forneceruma melhor composição que contém uma quantidade terapeutica-mente efetiva de uma ou mais moléculas de RNAsi que inibemRTP801 em combinação com um medicamento farmacêutico ototó-xico debilitador da audição para administração em um mamífe-ro. A dita combinação de medicamentos pode ser administradaseparadamente; então, as moléculas de RNAsi que inibemRTP801 serão administradas localmente, enquanto que o medi-camento farmacêutico ototóxico debilitador da audição é ad-ministrado sistematicamente. As moléculas de RNAsi podem seradministradas anterior, simultaneamente ou subseqüente aomedicamento ototóxico. Tal combinação de composições podeconter adicionalmente um carreador farmaceuticamente aceitá-vel. A composição farmacêutica terá ototoxicidade inferiordo que o agente farmacêutico ototóxico sozinho e, preferi-velmente, terá uma maior dosagem do agente farmacêutico oto-tóxico do que é tipicamente usado. Exemplos de tais melhorescomposições incluem cisplatina ou outro agente neoplásticoototóxico ou um(s) antibiótico(s) aminoglicosídeo em combi-nação com a quantidade terapeuticamente efetiva de uma oumais moléculas de RNAsi que inibem RTP801.

Ainda adicionalmente, a invenção diz respeito aouso das composições da invenção em casos em que diuréticossão necessários. A presente invenção fornece uma solução pa-ra a tecnologia que tem procurado há muito tempo uma terapiae um medicamento que podem tratar os efeitos ototóxicos atu-almente associados com certos diuréticos e, em particular,com os diuréticos de alça mais populares e mais comumenteusados sem sacrificar suas efetividades diuréticas.

Ainda adicionalmente, a invenção diz respeito aouse de composições da invenção em casos em que quinina oucompostos tipo quinina são necessários. A presente invençãofornece uma solução para a tecnologia que tem procurado hámuito tempo uma terapia e um medicamento que podem tratar osefeitos ototóxicos atualmente associados com certas quininassem sacrificar suas efetividades.

A presente invenção diz respeito adicionalmente amétodos e composições para tratar ou impedir a incidência ouseveridade de úlceras de pressão. Os métodos e composiçõesenvolvem administrar em um mamífero com necessidade de taltratamento uma quantidade profilática ou terapeuticamenteefetiva de um ou mais compostos que infra-regulam a expres-são do gene RTP801, particularmente, pequenos RNAs interfe-rentes (RNAsis) inéditos.

Adicionalmente, a presente invenção diz respeito amétodos e composições para o tratamento de todas as lesõesou distúrbios isquêmicos ou de isquemia-reperfusão, como a-qui descrito. Os ditos métodos e composições envolvem admi-nistrar em um mamífero com necessidade de tal tratamento umaquantidade profilática ou terapeuticamente efetiva de um oumais compostos que infra-regulam a expressão do gene RTP801,particularmente, pequenos RNAs interferentes (RNAsis) inédi-tos .

Descrição detalhada da invenção

A presente invenção, em algumas de suas modalida-des, diz respeito à inibição do gene RTP801 ou polipeptideopara o tratamento de doenças oculares, distúrbios respirató-rios, distúrbios microvasculares, distúrbio dos ouvidos edistúrbios isquêmicos, entre outros. Como será aqui descri-to, os inibidores preferidos que serão usados com a presenteinvenção são moléculas biológicas.

Sem ser limitado pela teoria, os inventores dapresente invenção descobriram que RTP801 está envolvido emvários estados da doença, incluindo distúrbios microvascula-res, doenças oculares, distúrbios respiratórios, distúrbiodos ouvidos, úlceras de pressão, distúrbios isquêmicos e le-são e doença da medula espinhal, e será benéfico inibirRTP801 a fim de tratar todas as ditas doenças ou distúrbios.Métodos, moléculas e composições que inibem RTP801 são aquidetalhadamente discutidos, e todas as ditas moléculas e/oucomposições podem ser beneficamente empregadas no tratamentode um paciente que sofre de qualquer um dos ditos distúr-bios .

A presente invenção fornece métodos e composiçõespara inibir a expressão do gene RTP801 in vivo. No geral, ométodo inclui administrar oligoribonucleotideos, tal comopequenos RNAs interferentes (isto é, RNAsis) que são alveja-dos a um RNAm particular e hibridiza com ele, ou material deácido nucléico que pode produzir RNAsis em uma célula em umaquantidade suficiente para infra-regular a expressão de umgene alvo por um mecanismo de interferência do RNA. Em par-ticular, o presente método pode ser usado para inibir ex-pressão do gene RTP801 para o tratamento de distúrbios res-piratórios, distúrbios microvasculares, distúrbios ocularese-deficiências auditivas.

Assim, em uma modalidade, a presente invenção for-nece um método para tratar um paciente que sofre de uma con-dição selecionada de um distúrbio microvascular, uma doençaocular, um distúrbio respiratório, um distúrbio do ouvido,úlceras de pressão ou uma lesão ou outro ferimento da medulaespinhal, compreendendo administrar ao paciente uma composi-ção farmacêutica que compreende um inibidor de RTP801 em umaquantidade terapeuticamente efetiva para, desse modo, trataro paciente. A invenção fornece adicionalmente um método paratratar um paciente que sofre de um distúrbio microvascular,um doença ocular, um distúrbio respiratório, um distúrbio doouvido, úlceras de pressão ou uma lesão ou outro ferimentoda medula espinhal, compreendendo administrar ao pacienteuma composição farmacêutica que compreende um inibidor deRTP801 em uma dosagem e durante um período de tempo sufici-ente para promover a recuperação. A doença ocular pode serdegeneração macular, tal como degeneração macular relaciona-da à idade (AMD), entre outros. 0 distúrbio microvascularpode ser retinopatia diabética ou falha renal aguda, entreoutros. O distúrbio respiratório pode ser doença pulmonarobstrutiva crônica (COPD), enfisema, bronquite crônica, asmae câncer do pulmão, entre outros. 0 distúrbio do ouvido podeser trauma acústico ou surdez induzida por cisplatina, entreoutros. 0 inibidor de RTP801 pode ser selecionado de umagrande variedade de moléculas, incluindo, mas sem limita-ções, compostos tais como polinucleotideos, fragmentos anti-sentido, Moléculas de RNA que alvejam o RNAm do gene RTP801,tais como ribozimas ou RNAsis (tais como os RNAsis das Tabe-las A-D e, em particular, RNAsi Nos: 14, 22, 23, 25, 27, 39,41, 42, 49 e 50 da Tabela A ou RNAsi Nos: 257, 260-262 e264-268 da Tabela D), ou os vetores de expressão que os com-preendem; polipeptideos tais como os negativos dominantes,anticorpos (tal como um anticorpo que se liga especificamen-te em um epitopo presente em um polipeptideo que compreendeaminoácidos consecutivos, o cuja seqüência é apresentada naFigura 2 (SEQ ID No:2)), ou, em alguns casos, enzimas. Adi-cionalmente, o inibidor de RTP801 pode ser um inibidor quí-mico, tal como uma pequena molécula, por exemplo, moléculasquímicas com um baixo peso molecular, por exemplo, um pesomolecular abaixo de 2.000 daltons. Inibidores específicos deRTP801 são dados a seguir.

A presente invenção fornece adicionalmente um mé-todo para tratar um paciente que s.ofre de degeneração macu-lar, COPD, retinopatia diabética ou surdez induzida portrauma acústico, compreendendo administrar ao paciente umacomposição farmacêutica que compreende uma dose terapeutica-mente efetiva de um inibidor de RTP801 que compreende um po-linucleotídeo que hibridiza especificamente com RNAm trans-crito do gene RTP801 e infra-regula a expressão do geneRTP801 para, desse modo, tratar o paciente. O polinucleotí-deo pode ser um RNAsi que compreende nucleotídeos consecuti-vos com uma seqüência idêntica a qualquer seqüência apresen-tada nas Tabelas A-D (SEQ ID NOs:3-536) e, em particular,RNAsi Nos: 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 e 50 da TabelaA ou RNAsi Nos: 257, 260-262, e 264268 da Tabela D.

Adicionalmente, uma modalidade adicional da pre-sente invenção diz respeito a um método para tratar um paci-ente que sofre de um distúrbio microvascular, um doença ocu-lar, um distúrbio respiratório, um distúrbio do ouvido, úl-ceras de pressão ou uma lesão ou outro ferimento da medulaespinhal, compreendendo administrar ao paciente uma composi-ção farmacêutica que compreende uma dose terapeuticamenteefetiva de um inibidor de RTP801 que compreende uma moléculade RNAsi, opcionalmente, uma molécula de RNAsi detalhada emqualquer uma das Tabelas A-D, em uma dosagem e durante umperíodo de tempo para, desse modo, tratar o paciente.

É fornecido um método adicional para tratar um pa-ciente que sofre de um distúrbio microvascular, uma doençaocular, um distúrbio respiratório, um distúrbio do ouvido,úlceras de pressão ou uma lesão ou outro ferimento da medulaespinhal, compreendendo administrar ao paciente uma composi-ção farmacêutica que compreende uma dose terapeuticamenteefetiva de uma Molécula de RNA que alveja o RNAm do geneRTP801 em uma dosagem e durante um período de tempo para,desse modo, tratar o paciente. A molécula de RNA pode seruma molécula de RNAsi, tal como uma molécula de RNAsi deta-lhada nas Tabelas A-D e, em particular, RNAsi Nos:14, 22,23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 e 50 da Tabela A ou RNAsi Nos:257, 260-262, e 264-268 da Tabela D, ou um ribossomo.

A presente invenção fornece adicionalmente um mé-todo para tratar um paciente que sofre de um distúrbio mi-crovascular, um doença ocular, um distúrbio respiratório, umdistúrbio do ouvido, úlceras de pressão ou uma lesão ou ou-tro ferimento da medula espinhal ou qualquer um dos distúr-bios aqui divulgados, compreendendo administrar ao pacienteuma composição farmacêutica que compreende uma dose terapeu-ticamente efetiva de uma molécula de RNAsi que alveja o RNAmdo gene RTP801, opcionalmente, uma molécula de RNAsi deta-lhada nas Tabelas A-D, em uma dosagem e durante um períodode tempo para, desse modo, tratar o paciente. Adicionalmen-te, a doença ocular pode ser degeneração macular, tal comodegeneração macular relacionada à idade (AMD); o distúrbiomicrovascular pode ser retinopatia diabética ou falha renalaguda; o distúrbio respiratório pode ser COPD e os aspectosda COPD que são tratados podem compreender, mas sem limita-ções, enfisema, bronquite crônica ou ambos; e o distúrbioauditivo pode ser surdez induzida por trauma acústico.

A presente invenção diz respeito adicionalmente aouso dos RNAsis inéditos aqui divulgados no tratamento de de-bilidade auditiva na qual a inibição da expressão de RTP801é benéfica. Em uma modalidade, a presente invenção constituium método para tratar um mamífero com uma debilidade auditi-va (ou de equilíbrio) ou propenso a ela, ou para tratar pro-filaticamente um mamífero em distúrbios em que a inibição daexpressão de RTP801 é benéfica. 0 método desta modalidade dapresente invenção impedirá ou reduzirá a ocorrência ou seve-ridade de uma debilidade auditiva (ou de equilíbrio) que re-sulta da lesão, perda, ou degeneração de célula do ouvidointerno, em particular, causadas por trauma acústico ou porum agente ototóxico. Nesta modalidade, o método da invençãoinclui administrar uma quantidade terapeuticamente efetivade um ou mais compostos que infra-regulam a expressão do ge-ne RTP801, particularmente, os RNAsis inéditos da presenteinvenção.

Em uma modalidade, o objetivo da presente invençãoé fornecer um método para tratar um mamífero, para impedir,reduzir ou tratar uma debilidade, distúrbio ou desequilíbrioauditivos, preferivelmente, trauma acústico ou uma condiçãoauditiva induzida por ototoxina, pela administração a um ma-mífero, com necessidade de tal tratamento, de uma composiçãoda invenção. Uma modalidade é um método para tratar um dis-túrbio ou debilidade do ouvido em que o trauma acústico re-sulta de uma única exposição a um som extremamente alto oude exposição contínua a um ambiente ruidoso que pode causarsurdez com o passar do tempo. A debilidade auditiva tambémpode ser causada por trauma físico ao ouvido. Uma outra mo-dalidade é um método para tratar um distúrbio ou debilidadedo ouvido em que a ototoxicidade resulta da administração deuma quantidade terapeuticamente efetiva de um medicamentofarmacêutico ototóxico. Medicamentos ototóxicos típicos sãoagentes quimioterapêuticos, por exemplo, agentes antineo-plásticos e antibióticos. Outros possíveis candidatos inclu-em diuréticos de alça, quininas ou um composto tipo quinina,e salicilato ou compostos tipo salicilato. Estes métodos sãoespecialmente efetivos quando o composto ototóxico é um an-tibiótico, preferivelmente um antibiótico aminoglicosideo.Antibióticos aminoglicosideo ototóxicos incluem, mas sem li-mitações, neomicina, paromomicina, ribostamicina, lividomi-cina, canamicina, amicacina, obramicina, viomicina, gentami-cina, sisomicina, netilmicina, estreptomicina, dibecacina,fortimicina e diidroestreptomicina, ou combinações destes.Antibióticos particulares incluem neomicina B, canamicina A,canamicina B, gentamicina Cl, gentamicina Cla e gentamicinaC2. Os métodos da invenção também são efetivos quando o com-posto ototóxico for um agente neoplástico, tais como vin-cristina, vinblastina, cisplatina e compostos tipo cisplati-na, e taxol e compostos tipo taxol.

Em algumas modalidades voltadas para o tratamentoou impedimento dé um distúrbio do ouvido, a composição dainvenção é co-administrado com uma ototoxina. Por exemplo, éfornecido um melhor método para o tratamento de infecção deum mamífero pela administração de um antibiótico aminoglico-sideo, a melhoria compreendendo administrar uma quantidadeterapeuticamente efetiva de um ou mais compostos que infra-regulam a expressão do gene RTP801, particularmente, RNAsisinéditos, no paciente com necessidade de tal tratamento parareduzir ou impedir debilidade auditiva induzida por ototoxi-na associada com o antibiótico. Preferivelmente, os compos-tos que reduzem ou impedem a debilidade auditiva induzidapor ototoxina, particularmente, os RNAsis inéditos, são ad-ministrados localmente no ouvido interno, opcionalmente, porinjeção transtimpânica.Em uma ainda outra modalidade é fornecido um me-lhor método para o tratamento de câncer em um mamífero pelaadministração de um composto quimioterapêutico, a melhoriacompreendendo administrar uma quantidade terapeuticamenteefetiva de uma composição da invenção no paciente com neces-sidade de tal tratamento para reduzir ou impedir debilidadeauditiva induzida por ototoxina associada com o medicamentoquimioterapêutico. Em uma outra modalidade, os métodos detratamento são aplicados às deficiências auditivas resultan-tes da administração de um agente quimioterápico para tratarseus efeitos colaterais ototóxicos. Agentes quimioterapêuti-cos ototóxicos tratáveis pelos métodos da invenção incluem,mas sem limitações, um agente antineoplástico, incluindocisplatina ou compostos tipo cisplatina, taxol ou compostostipo taxol, e outro agentes quimioterapêuticos que, acredi-ta-se, causam deficiências auditivas induzidas por ototoxi-na, por exemplo, vincristina, um medicamento antineoplásticousado para tratar malignidades hematológicas e sarcomas.Compostos tipo cisplatina incluem carboplatina (Paraplatina®) tetraplatina, oxaliplatina, aroplatina e transplatina,entre outros. Em uma outra modalidade, os métodos da inven-ção são aplicados a deficiências auditivas que resultam daadministração de quinina e seus substitutos sintéticos usa-dos, tipicamente, no tratamento da malária para tratar seusefeitos colaterais ototóxicos. Em uma outra modalidade, osmétodos da invenção são aplicados a deficiências auditivasresultantes da administração de um diurético. Diuréticos,particularmente, diuréticos "de alça", isto é, aqueles queagem primariamente na Alça de Henle, são ototoxinas candida-tas. Exemplos ilustrativos, não limitantes do método da in-venção, incluem furosemida, ácido etacrilico, e mercuriais.Tipicamente, diuréticos são usados para impedir ou eliminaredema. Diuréticos também são usados em estados não edemato-sos, por exemplo, hipertensão, hipercalcemia, hipercalciúriàidiopática e diabetes nefrogênica insipida.

Em uma outra modalidade, os métodos da invençãosão aplicados ao tratamento ou impedimento da incidência ouseveridade de úlceras de pressão. Os métodos e composiçõesenvolvem administrar em um mamífero com necessidade de taltratamento uma quantidade profilática ou terapeuticamenteefetiva de um ou mais compostos que infra-regulam a expres-são do gene RTP801, particularmente, pequenos RNAs interfe-rentes (RNAsis) inéditos. Preferivelmente, os compostos quetratam ou impedem a incidência ou severidade de úlceras depressão, particularmente, os RNAsis inéditos são administra-dos localmente na área danificada. Os métodos e composiçõesda presente invenção são efetivos no tratamento e impedimen-to de úlceras de pressão ou úlceras de pressão desenvolvidasquando pressão prolongada (usualmente de uma cama ou cadeirade rodas) interrompe a circulação a partes vulneráveis docorpo. Os métodos e composições são efetivos em pacientescom sensação reduzida ou ausente ou que são debilitados, ma-cilentos, paralisados, ou que estão acamados há muito tempo.As composições da presente invenção também são efetivas paramelhorar a cura de úlceras de pressão usando as composições.As composições podem ser usadas em qualquer estágio particu-lar do processo de cura, incluindo o estágio antes que algu-ma cura tenha iniciado ou mesmo antes que uma úlcera especi-fica seja formada (tratamento profilático).

Outros tipos de ferimentos a ser tratados de acor-do com a invenção também incluem i) ferimentos gerais, taiscomo, por exemplo, ferimentos cirúrgicos, traumáticos, in-fecciosos, isquêmicos, térmicos, químicos e em bolhas; ii)ferimentos específicos da cavidade oral tais como, por exem-plo, ferimentos pós-extração, ferimentos endodônticos, espe-cialmente, em conjunto com o tratamento de cistos e abces-sos, úlceras e lesões de origem bacteriana, viral ou autoi-munológica, ferimentos mecânicos, químicos, térmicos, infec-ciosos e liquenóide; úlceras de herpes, estomatite aftosa,gengivite ulcerativa necrosante aguda e síndrome da queima-dura bucal são específico exemplos; e iii) ferimentos na pe-le tais como, por exemplo, neoplasma, queimaduras (por exem-plo, química, térmica), lesões (bacterianas, virais, autoi-munológicas), mordidas e incisões cirúrgicas.

Os métodos e composições da presente invenção tam-bém são efetivos no tratamento e impedimento de qualquer fe-rimento crônico incluindo, entre outros, úlceras de pressão,úlceras venosas e úlceras diabéticas. Em todos estes tiposde ferimento crônico, o evento de precipitação fundamental éum período de isquemia seguido por um período de reperfusão.Usualmente, estes eventos de isquemia-reperfusão são repeti-tivos, o que significa que os efeitos deletérios de isque-mia-reperfusão são potencializados e, eventualmente, sufici-entes para causar ulceração. Tanto para úlceras de pressãoquanto para úlceras diabéticas do pé, o evento isquêmico é oresultado de pressão prolongada suficiente para impedir aperfusão do tecido, e quando a pressão for finalmente alivi-ada, a lesão por reperfusão ocorre. As presentes composiçõessão efetivas para inibir o dano causado por isquemia-reperfusão em ferimentos crônicos.

As presentes composições também são efetivas emoutros distúrbios associados com isquemia-reperfusão, taiscomo, mas sem limitações: transplante de órgão, anastamosesintestinal e do cólon, operações em grandes vasos sangüí-neos, pontos em membros amputados, angioplastia balão ouqualquer cirurgia cardíaca, derrame cerebral ou trauma cere-bral, transplante de membro, hipertensão pulmonar, hipoxemi-a, e edema pulmonar não cardiogênico, falha renal aguda,glaucoma agudo, retinopatia diabética, retinopatia hiperten-siva, oclusão vascular retinal, isquemia cóclear, cirurgiamicrovascular e lesões isquêmicas em escleroderma.

Os métodos e composições da presente invenção tam-bém são efetivos no tratamento de trauma acústico ou traumamecânico, preferivelmente, traumas acústico ou mecânico quelevam à perda de célula de cabelo do ouvido interno. 0 trau-ma acústico a ser tratado na presente invenção pode ser cau-sado por uma única exposição a um som extremamente alto, ouseguinte a uma exposição de longo prazo a sons altos diáriosacima de cerca de 85 decibéis. Por exemplo, o trauma mecâni-co do ouvido interno a ser tratado na presente invenção é otrauma do ouvido interno seguinte a uma operação de inserçãode dispositivo no ouvido interno. As composições da presenteinvenção impedem ou minimizam o dano às células de cabelo doouvido interno associado com a operação. Preferivelmente, oscompostos que reduzem ou impedem a debilidade auditiva indu-zida por ototoxina, particularmente os RNAsis inéditos, sãoadministrados localmente no ouvido interno, opcionalmente,por injeção transtimpânica.

Adicionalmente, o composto da presente invençãopode ser usado para tratar qualquer condição na qual a is-quemia está envolvida, opcionalmente, isquemia-reperfusão.

Tal condição inclui isquemia ou isquemia-reperfusão resul-tante de uma angioplastia, cirurgia cardíaca ou trombose;transplante de . órgão; em decorrência de cirurgia plástica;durante severa síndrome do compartimento; durante reanexaçãode membros amputados; em decorrência de síndrome da falênciamúltipla dos órgãos; no cérebro em decorrência de derramecerebral ou de trauma cerebral; em conjunto com ferimentocrônicos tais como úlceras de pressão, úlceras venosas e úl-ceras diabéticas; durante isquemia do músculo esquelético outransplante de membro; em decorrência de isquemia mesentéri-ca ou doença isquêmica do intestino aguda; falha respirató-ria em decorrência de isquemia do torso inferior que leva àhipertensão pulmonar, hipoxemia, e edema pulmonar não cardi-ogênico; falha renal aguda observada depois de transplanterenal, grande cirurgia, trauma, e choque séptico bem comochoque hemorrágico; sepsia; isquemia retinal que ocorre emdecorrência de oclusão vascular aguda que leva à perda devisão em inúmeras doenças oculares, tais como glaucoma agu-do, retinopatia diabética, retinopatia hipertensiva e oclu-são vascular retinal; isquemia cóclear; falha de presilha emcirurgia microvascular para defeitos da cabeça e pescoço;fenômeno de Raynaud e as lesões isquêmicas digitais associa-das no escleroderma; lesão da medula espinhal; cirurgia vas-cular; rabdomiólise traumática (sindrome do esmagamento) ; emioglobinúria. Adicionalmente, isquemia/reperfusão pode es-tar envolvida nos seguintes distúrbios: hipertensão, doençavascular cerebral hipertensiva, ruptura de aneurisma, umaconstrição ou obstrução de um vaso sangüíneo - como ocorreno caso de um trombo ou êmbolo, angioma, discrasias sangüí-nea, qualquer forma de função cardíaca comprometida incluin-do parada ou falha cardíaca, hipotensão sistêmica, paradacardíaca, choque cardiogênico, choque séptico, trauma da me-dula espinhal, trauma na cabeça, convulsão, sangramento deum tumor; e doenças tais como derrame cerebral, doença deParkinson, epilepsia, depressão, ALS, doença de Alzheimer,doença de Huntington e qualquer outra demência induzida pordoença (tal como demência induzida por HIV, por exemplo) .Adicionalmente, um episódio isquêmico pode ser causado poruma lesão mecânica ao Sistema Nervoso Central, tal como re-sulta de uma pancada na cabeça ou na espinha. 0 trauma podeenvolver um insulto no tecido tais como uma abrasão, inci-são, contusão, punção, compressão, etc., tal como pode sur-gir do contato traumático de um objeto estranho com qualquerlocal da cabeça, pescoço, ou coluna vertebral ou anexo a e-las. Outras formas de lesão traumática podem surgir da cons-trição ou compressão do tecido por um acúmulo inapropriadode fluido (por exemplo, um bloqueio ou disfunção da produçãonormal de fluido cerebrospinal ou fluido humor vitreo, modi-ficação, ou regulação de volume, ou um hematoma ou edemasubdural ou intracarniana). Similarmente, a constrição oucompressão traumática podem surgir da presença de uma massade tecido anormal, tais como um tumor metastático ou primá-rio .

"Tratar uma doença" diz respeito a administrar umasubstância terapêutica efetiva para melhorar os sintomas as-sociados com uma doença, para reduzir a severidade ou paracurar a doença, ou para impedir que a doença ocorra. "Trata-mento" diz respeito tanto a tratamento terapêutico quanto amedidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é im-pedir ou desacelerar (reduzir) uma doença ou distúrbio.

Uma "dose terapeuticamente efetiva" diz respeito auma quantidade de um composto ou composição farmacêutico queé efetivo para alcançar uma melhoria em um paciente ou emseus sistemas fisiológicos incluindo, mas sem limitações,maior taxa de sobrevivência, recuperação mais rápida, ou me-lhoria ou eliminação de sintomas, e outros indicadores quesão selecionados como apropriados pelos versados na técnicapara determinar medidas.

Os métodos para tratar as doenças aqui divulgadose incluídos na presente invenção podem incluir administrarum inibidor de RTP801 em conjunto com um inibidor de RTP801adicional, uma substância que melhora as propriedades farma-cológicas do ingrediente ativo como detalhado a seguir, ouum composto adicional conhecido por ser efetivo no tratamen-to da doença a ser tratada, tais como degeneração macular,COPD, ARF, DR, surdez induzida por cisplatina ou trauma a-cústico, entre outros. "Em conjunto com" significa anterior,simultaneamente ou subseqüente. Detalhes adicionais sobreterapias associadas exemplares são dados a seguir.

Em uma outra modalidade, a presente invenção for-nece o uso de uma dose terapeuticamente efetiva de um inibi-dor de RTP801 para a preparação de um medicamento para pro-mover a recuperação em um paciente que sofre de degeneraçãomacular, COPD, ARF, DR, surdez induzida por cisplatina outrauma acústico ou qualquer outra doença ocular, condiçãomicrovascular ou respiratória ou distúrbio auditivo como de-talhado anteriormente, e o uso de uma dose terapeuticamenteefetiva de um inibidor de RTP801 para a preparação de um me-dicamento para tratar as ditas doenças e distúrbios. Nestamodalidade, o inibidor de RTP801 pode compreender um polinu-cleotideo que compreende nucleotideos consecutivos com umaseqüência que compreende uma seqüência anti-sentido em rela-ção à seqüência apresentada na Figura 1 (SEQ ID No: 1). Adi-cionalmente, o inibidor de RTP801 pode ser um vetor de ex-pressão que compreende um polinucleotideo com uma seqüênciaque é uma seqüência anti-sentido em relação à seqüência a-presentada na Figura 1 (SEQ ID No:l). O inibidor de RTP801de acordo com os ditos usos também pode ser um anticorpo,tal como um anticorpo neutralizante que se liga especifica-mente a um epitopo presente em um polipeptideo que compreen-de aminoácidos consecutivos, cuja seqüência é apresentada naFigura 2 (SEQ ID No:2). Adicionalmente, o inibidor de RTP801pode ser uma molécula de RNA que alveja o RNAm do geneRTP801, opcionalmente um RNAsi, opcionalmente um RNAsi quecompreende nucleotideos consecutivos com uma seqüência idên-tica a qualquer seqüência apresentada nas Tabelas A-D (SEQID NOs:3-536) e, em particular, RNAsi Nos: 14, 22, 23, 25,27, 39, 41, 42, 49 e 50 da Tabela A ou RNAsi Nos: 257, 260-262, e 264-268 de Tabela D, ou um ribossomo.

Assim, de acordo com a informação aqui divulgada,o inibidor de RTP801 a ser usado com qualquer um dos métodosaqui divulgados, em qualquer um dos usos aqui divulgados eem qualquer uma das composições farmacêuticas aqui divulga-das, pode ser selecionado do grupo que consiste em um RNAsi,um vetor que compreende um RNAsi, um vetor que expressa umRNAsi e qualquer molécula que é endogenamente processada emum RNAsi. Como aqui detalhado, preferivelmente, o dito RNAsié um RNAsi que compreende nucleotideos consecutivos com umaseqüência idêntica a qualquer seqüência apresentada nas Ta-belas A-D (SEQ ID Nos:3-536) e, em particular, RNAsi Nos:14,22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 e 50 da Tabela A ou RNAsiNos: 257, 260-262, e 264-268 da Tabela D.

"Distúrbio respiratório" diz respeito a distúr-bios, doenças ou sindromes do sistema respiratório que in-cluem, mas sem limitações, distúrbios pulmonares de todos ostipos incluindo doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD),enfisema, bronquite crônica, asma e câncer do pulmão, entreoutros. Enfisema e bronquite crônica podem ocorrer como par-te da COPD ou independentemente.

"Distúrbio microvascular" diz respeito a qualquercondição que afeta os vasos capilares e sistema linfáticomicroscópicos, em particular, doenças vasospásticas, doençasvasculiticas e doenças oclusivas linfáticas. Exemplos dedistúrbios microvasculares incluem, entre outros: distúrbiosoculares tais como Amaurose Fugaz (embólica ou secundária emrelação a SLE), sindrome da apla, deficiência Prot CS e ATI-II, patologias microvasculares causadas pelo uso de medica-mento IV, disproteinemia, arterite temporal, neuropatia óti-ca isquêmica anterior, neurite ótica (primária ou secundáriaem relação a doenças autoimunes), glaucoma, sindrome de VonHippel Lindau, doença de córnea, rejeição do transplante decórnea por catarata, doença de Eales, angiite de ramificaçãocongelada, operação de encurvamento circundante, uveite queinclui pars planitis, melanoma coroidal, hemangioma coroi-dal, aplasia do nervo ótico; distúrbios retinais, tais comooclusão da artéria retinal, oclusão da veia retinal, retino-patia da prematuridade, retinopatia do HIV, retinopatia dePurtscher, retinopatia de vasculite sistêmica e de doençasautoimunes, retinopatia diabética, retinopatia hipertensiva,retinopatia por radiação, oclusão de ramificação de artériaou veia retinal, vasculite retinal idiopática, aneurismas,neuroretinite, embolização retinal, necrose retinal aguda,retinocoroidopatia birdshot, descolamento prolongado da re-tina; distúrbios sistêmicos tais como diabetes mellitus, re-tinopatia diabética (DR) , patologias microvasculares rela-cionadas à diabetes (como aqui detalhado), sindromes de hi-perviscosidade, sindromes do arco aórtico e sindrome isquê-mica ocular, fistula carótida cavernosa, esclerose múltipla,lupus eritematoso sistêmico, arteriolite com autoanticorpoSS-A, vasculite hemorrágica multifocal aguda, vasculite re-sultante de infecção, vasculite resultante da doença de Beh-çet, sarcoidose, coagulopatias, neuropatias, nefropatias,doenças microvasculares do rim e distúrbios isquêmicos mi-crovasculares, entre outros.

Distúrbios microvasculares podem compreender umelemento neovascular. 0 termo "distúrbio neovascular" dizrespeito àqueles distúrbios em que a formação de vasos san-güíneos (neovascularização) é nociva ao paciente. Exemplosde neovascularização ocular incluem: doenças retinais (reti-nopatia diabética, Edema Macular diabético, glaucoma crôni-co, descolamento da retina e retinopatia da célula falcifor-me) ; rubeose da íris; vitreorretinopatia proliferativa; do-enças inflamatórias; uveíte crônica; neoplasmas (retinoblas-toma, pseudoglioma e melanoma); iridociclite heterocrômicade Fuchs; glaucoma neovascular; neovascularização corneana(hipoplasia inflamatória, de transplante e desenvolvida daíris); neovascularização após uma vitrectomia e lensectomiacombinadas; doenças vasculares (isquemia retinal, insufici-ência vascular coroidal, trombose coroidal e isquemia da ar-téria carótida); neovascularização do nervo ótico; e neovas-cularização em função de penetração do olho ou de lesão ocu-lar contusiva. Todas estas condições neovasculares podem sertratadas usando os compostos e composições farmacêuticos dapresente invenção.

"Doença ocular" diz respeito a distúrbios, doençasou síndromes do olho incluindo, mas sem limitações, quais-quer distúrbios que envolvem neovascularização coroidal(CNV), AMD úmida e seca, sindrome da histoplasmose ocular,estrias angióides, rupturas na membrana de Bruch, degenera-ção miópica, tumores oculares, doenças degenerativas da re-tina e oclusão da veia retinal (RVO). Algumas condições aquidivulgadas, tal como DR, que pode ser tratada de acordo comos métodos da presente invenção, foram consideradas tantocomo um distúrbio microvascular quanto como uma doença ocu-lar, ou ambas, sob as definições aqui apresentadas.

Debilidades auditivas relevantes para a invençãopodem ser em função de lesões do órgão final que envolvem ascélulas de cabelo do ouvido interno, por exemplo, trauma a-cústico, labirintite endolinfática viral, doença de Meniere.Deficiências auditivas incluem tinido, que é uma percepçãode som na ausência de um estimulo acústico, e pode ser in-termitente ou continuo, em que é diagnosticada uma perdasensorioneural. A perda de audição pode ser em função de in-fecção bacteriana ou viral, tal como in herpes zoster oti-cus, labirintite purulenta que surge a de otite média aguda,meningite purulenta, otite média crônica, surdez súbita in-cluindo. aquela de origem viral, por exemplo, labirintite en-dolinfática viral causada por virus que incluem caxumba, sa-rampo, gripe, catapora, mononucleose e adenovirus. A perdade audição pode ser congênita, tal como aquela causada porrubéola, anoxia durante o nascimento, sangramento no ouvidointerno em função de trauma durante distribuição de medica-mentos ototóxicos administrados à mãe, eritroblastose fetale distúrbios hereditários incluindo sindrome de Waardenburge sindrome de Hurler. A perda de audição pode ser induzidapor ruído, no geral, em função de um ruído maior do que cer-ca de 85 decibéis (db) que danifica o ouvido interno. Prefe-rivelmente, a perda de audição é causada por trauma acústicoou por um medicamento ototóxico que impacta a parte auditivado ouvido interno, particularmente, células de cabelo do ou-vido interno. Os capítulos 196, 197, 198 e 199 do The MerckManual of Diagnosis and Therapy, 14th Edition, (1982), MerckSharp & Dome Research Laboratories, N.J. e capítulos corres-pondentes da 16a edição mais recente, (incluindo capítulos207 e 210) que dizem respeito à descrição e ao diagnósticode debilidade auditiva e de equilíbrio são aqui incorporadospela referência.

Preferivelmente, sem ser limitado pela teoria,distúrbios ou debilidades dos ouvidos (ou debilidade do e-quilíbrio) a ser tratados ou impedidos no contexto da pre-sente invenção são dano apoptótico às células de cabelo doouvido interno induzido por ototoxina ou por trauma. Aquelescom necessidade de tratamento incluem aqueles que já passa-ram por uma debilidade auditiva, aqueles propensos a ter adebilidade e aqueles nos quais a debilidade deve ser impedi-da. Sem ser limitado pela teoria, as debilidades auditivaspode ser em função de dano ou perda de célula apoptótica decabelo do ouvido interno, em que o dano ou a perda são cau-sados por infecção, lesão mecânica, com alto, envelhecimen-to, ou ototoxicidade induzida por produtos químicos. Ototo-xinas incluem medicamentos terapêuticos que incluem agentesantineoplásticos, salicilatos, quininas, e antibióticos ami-noglicosídeo, contaminantes em comidas ou medicamentos, epoluentes ambientais ou industriais. Tipicamente, tratamentoé realizado para impedir ou reduzir a ototoxicidade ou trau-ma acústico, especialmente resultantes ou supostos que seresultem da administração de medicamentos terapêuticos ou daexposição a ambientes que induzem trauma acústico. Preferi-velmente, um composição terapeuticamente efetiva é dada ime-diatamente depois da exposição para impedir ou reduzir o e-feito ototóxico ou o efeito traumático. Mais preferivelmen-te, o tratamento é fornecido profilaticamente, tanto por ad-ministração da composição anterior ou concomitantemente como produto farmacêutico ototóxico ou com a exposição à oto-toxnina ou ao ambiente que induz trauma acústico.

A debilidade auditiva pode ser induzida por quimi-oterapia. Com mais detalhes, a debilidade auditiva pode sercausada por agentes quimioterapêuticos, tais como etoposí-deo, 5-FU (5-fluoruracila), cis-platina, doxorubicina, umalcalóide vinca, vincristina, vinblastina, vinorelbina, ta-xol, ciclofosfamida, ifosfamida, clorambucila, bussulfano,mecloretamina, mitomicina, dacarbazina, carboplatina, tiote-pa, daunorrubicina, idarrubicina, mitoxantro, bleomicina,esperamicina Al, dactinomicina, plicamicina, carmustina, Io-mustina, tauromustina, estreptozocina, melfalana, dactinomi-cina, procarbazina, dexametaso, prednisona, 2-clorodeoxi-adenosina, citarabina, docetaxel, fludarabina, gemcitabina,herceptina, hidroxiuréia, irinotecano, metotrexato, oxali-platina, rituxina, semustina, epirubicina, etoposideo, tomu-dex e topotecano ou um análogo químico de um destes agentesquimioterapêuticos. Os agentes quimioterapêuticos mais pro-váveis de causar debilidade auditiva são cis-platina (cis-platina) e compostos tipo cisplatina

Por "ototoxina", no contexto da presente invenção,entende-se uma substância que por meio de suas lesões poração química, debilita ou inibe a atividade dos receptoresde som do sistema nervoso relacionada à audição que, por suavez, debilita a audição (e/ou o equilíbrio). No contexto dapresente invenção, a ototoxicidade inclui um efeito deleté-rio nas células de cabelo do ouvido interno. Agentes ototó-xicos que causam deficiências auditivas incluem, mas sem li-mitações, agente neoplásticos tais como vincristina, vin-blastina, cisplatina e compostos tipo cisplatina, taxol ecompostos tipo taxol, compostos dideóxi, por exemplo, dideo-xiinosina; álcool; metais; toxinas industriais envolvidas naexposição ocupacional ou ambiental; contaminantes de alimen-tos ou medicamentos; e sobredoses de vitaminas ou de medica-mentos terapêuticos, por exemplo, antibióticos tais como pe-nicilina ou cloranfenicol, e megadoses de vitaminas A, D, ouB6, salicilatos, quininas e diuréticos de alça. Por "exposi-ção a um agente ototóxico" entende-se que o agente ototóxicoé tornado disponível a um mamífero ou entra em contato comele. A exposição a um agente ototóxico pode ocorrer pela ad-ministração direta, por exemplo, pela ingestão ou adminis-tração de um alimento, medicamento ou agente terapêutico,por exemplo, um agente quimioterápico, por contaminação aci-dental ou por exposição ambiental, por exemplo, exposiçãoaérea ou aquosa.

"Gene RTP801" diz respeito ao quadro de leituraaberta de seqüência de codificação de RTP801 mostrado na fi-gura 1 (SEQ ID N0:1), ou qualquer seqüência homóloga destecom, preferivelmente, pelo menos 70 % de identidade, maispreferivelmente 80 % de identidade, ainda mais preferivel-mente 90 % ou 95 % de identidade. Isto abrange todas as se-qüências derivadas de SEQ ID NO:l que passaram pelas muta-ções, alterações ou modificações aqui descritas. Assim, emuma modalidade preferida, RTP801 é codificado por uma se-qüência de ácido nucléico de acordo com SEQ. ID. NO. 1. Tam-bém está na presente invenção o fato de que os ácidos nu-cléicos de acordo com a presente invenção são somente com-plementares e idênticos, respectivamente, a uma parte do á-cido nucléico que codifica para RTP801 como, preferivelmen-te, o primeiro trecho e a primeira fita são, tipicamente,mais curtos do que o ácido nucléico de acordo com a presenteinvenção. Também reconhece-se que, com base na seqüência deaminoácidos de RTP801, a codificação de qualquer seqüênciaácido nucléico para tal seqüência de aminoácido pode serpercebida pelos versados na técnica com base no código gené-tico. Entretanto, em função do modo de ação considerado doácido nucléico de acordo com a presente invenção, é maispreferido que a codificação do ácido nucléico para RTP801,preferivelmente o seu RNAm, seja aquela presente no organis-mo, tecido e/ou célula, respectivamente, onde a expressão deRTP8 01 deve ser reduzida.

"Polipeptídeo de RTP801" diz respeito ao polipep-tideo do gene RTP801, e entende-se que inclui, com os propó-sitos da presente invenção, os termos "RTP779", "REDD1","Ddit4", "FLJ20500", "Dig2" e "PRFl", derivados de qualquerorganismo, opcionalmente macho, variantes de recombinação eseus fragmentos que retêm atividade biológica, e seus homó-logos, preferivelmente, com pelo menos 70 %, mais preferi-velmente pelo menos 80 %, ainda mais preferivelmente pelomenos 90 % ou 95 % de homologia em relação a eles. Além domais, entende-se que este termo abrange polipeptideos queresultam de alterações menores da seqüência de codificaçãodo RTP801, tais como, entre outras, mutações, substituições,deleções e inserções de ponto que podem causar uma diferençaem uns poucos aminoácidos entre o polipeptideo resultante eo RTP801 de ocorrência natural. Polipeptideos codificadospelas seqüências de ácido nucléico que se ligam na seqüênciade codificação do RTP801 ou seqüência genômica sob distúr-bios de hibridização altamente rigorosa, que são bem conhe-cidas na tecnologia (por exemplo, Ausubel et al., CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley e Sons, Baltimo-re, Maryland (1988), atualizado em 1995 e 1998), também sãoabrangidas por este termo. RTP801 quimicamente modificado oufragmentos de RTP801 quimicamente modificados também são in-cluídos no termo, contanto que a atividade biológica sejaretida. Preferivelmente, RTP801 tem ou abrange uma seqüênciade aminoácido de acordo com SEQ. ID. NO. 2. Reconhece-se quepode haver diferenças na seqüência de aminoácido entre vá-rios tecidos de um organismo e entre diferentes organismosde uma espécie ou entre diferentes espécies na qual o ácidonucléico de acordo com a presente invenção pode ser aplicadoem várias modalidades da presente invenção. Entretanto, combase no preceito técnico aqui fornecido, a respectiva se-qüência pode ser tomada em consideração dessa maneira duran-te o desenho de qualquer um dos ácidos nucléicos de acordocom a presente invenção. Fragmentos de RTP801 em particularincluem os aminoácidos 1-50, 51-100, 101-150, 151-200 e 201-232 da seqüência mostrada na figura 2. Fragmentos de RTP801em particular adicionais incluem os aminoácidos 25-74, 75-124, 125-174, 175-224 e 225-232 da seqüência mostrada na fi-gura 2.

RTP801 aqui usado é um proteína descrita, entreoutros, em WO 99/09046. RTP801 que também é chamado deRTP801, foi descrito como um alvo transcricional de HIF-Iapor Shoshani T et al. (Shoshani et al., 2002, Mol Cell Biol,22, 2283-93). Adicionalmente, o estudo de Ellisen et al.(Ellisen et al., Mol Cellf 10, 995-1005) identificou RTP801como um gene de resposta ao dano de DNA dependente de p53 ecomo um gene dependente de p63 envolvidos na diferenciaçãoepitelial. Também, RTP801 reflete o padrão específico de te-cido do elemento da família p53 p63, é efetivo similar ou emadição ao TP 63, é um inibidor de diferenciação in vitro eestá envolvido na regulação de espécies reativas ao oxigê-nio. Além disto, RTP801 é responsivo ao fator indutível porhipóxia 1 (HIF-I) do fator de transcrição responsivo a hipó-xia e, tipicamente, é supra-regulado durante a hipóxia tantoin vitro quanto in vivo em um modelo de animal com derramecerebral isquêmico. RTP801 parece funcionar na regulação deespécies reativas ao oxigênio (ROS) e tanto níveis ROS quan-to reduzida sensibilidade à tensão oxidante aumentam apósexpressão ectópica de RTP801 (Ellisen et al. 2002, supra;Soshani et al. 2002, supra). Preferivelmente, RTP801 é umaproteína de RTP801 biologicamente ativa que, preferivelmen-te, exibe pelo menos uma destas características, preferivel-mente, duas ou mais e mais preferivelmente cada uma e todasestas características.

Sem ser limitado pela teoria, RTP801, sendo umproteína indutível por tensão (respondendo À hipóxia, tensãooxidante, tensão térmica, tensão ER) é um fator que age noajuste fino da resposta da célula ao desequilíbrio energéti-co. Como tal, ele é um alvo adequado para o tratamento dequalquer doença em que as células devem ser salvas da apop-tose em função de distúrbios por tensão (por exemplo, doen-ças acompanhadas pela morte de células normais) ou em quecélulas, que são adaptadas a distúrbios com tensão em funçãode mudanças na expressão de RTP801 (por exemplo, célulascancerosas), devem ser mortas. Neste último caso, RTP801 po-de ser visto como um fator de sobrevivência para célulascancerosas e seus inibidores podem tratar câncer como umamonoterapia ou como medicamentos sensibilizantes em conjuntocom quimioterapia ou radioterapia.

0 termo "polinucleotídeo" diz respeito a qualquermolécula composta por nucleotídeos de DNA, nucleotídeos deRNA ou um combinação de ambos os tipos, isto é, que compre-ende duas ou mais das bases guanidina, citosina, timidina,adenina, uracila ou inosina, entre outros. Um polinucleotí-deo pode incluir nucleotídeos naturais, nucleotídeos quimi-camente modificados e nucleotídeos sintéticos, ou seus aná-logos químicos. O termo inclui "oligonucleotideos" e abrange"ácidos nucléicos".

O termo "aminoácido" diz respeito a uma moléculaque consiste em qualquer um dos 20 aminoácidos de ocorrêncianatura, aminoácidos que foram quimicamente modificados (vejaabaixo) ou aminoácidos sintéticos.

0 termo "polipeptídeo" diz respeito a uma moléculacomposta por dois ou mais resíduos de aminoácidos. 0 termoinclui peptídeos, polipeptídeos, proteínas e peptideomiméti-cos.

Um "peptideomimético" é um composto que contém e-lementos estruturais não peptídicos que podem imitar a(s)ação(s) biológica(s) de um peptídeo pai natural. Normalmen-te, algumas das características do peptídeo clássico, taiscomo ligações peptídicas enzimaticamente quebráveis não es-tão presentes em um peptideomimético.

Pelo termo "peptídeo negativo dominante" entende-se um polipeptídeo codificado por um fragmento de DNAc quecodifica para uma parte de uma proteína (veja Herskowitz I.:Functional inactivation of genes by dominant negative muta-tions. Nature. 1987 Sep 17-23;329(6136):219-22. Review; Ron-inson IB et al., Genetic suppressor elements: new tools formolecular oncology-thirteenth Cornelius P. Rhoads MemorialAward Lecture . Câncer Res. 1995 Sep 15; 55 (18 ) : 4023) . Estepeptídeo pode ter uma função diferente da proteína da qualele foi derivado. Ele pode interagir com a proteína completae inibir sua atividade ou ele pode interagir com outras pro-teínas e inibir suas atividades em resposta à proteína decomprimento completo (pai). Negativo dominante significa queo peptideo pode superar a proteína pai natural e inibir suaatividade para dar à célula uma característica diferente,tais como resistência ou sensibilização à morte ou qualquerfenótipo celular de interesse. Para intervenção terapêutica,o próprio peptideo pode ser distribuído como o ingredienteativo de uma composição farmacêutica, ou o DNAc pode serdistribuído à célula utilizando métodos conhecidos.

Preparação de peptídeos e polipeptídeos

Polipeptídeos podem ser produzidos por meio de di-versos métodos, por exemplo:

1) Sinteticamente:

Polipeptídeos sintéticos podem ser feitos usandouma máquina comercialmente disponível, usando a seqüência deRTP801 conhecida ou uma parte desta.

2) Métodos Recombinantes:

Um método preferido para fazer os polipeptídeos deRTP801 dos seus fragmentos é clonar um polinucleotídeo quecompreende o DNAc do gene RTP801 em um vetor de expressão efazer cultura da célula que hospeda o vetor para expressar opolipeptídeo codificado e, então, purificar o polipeptídeoresultante, tudo realizado usando métodos conhecidos na tec-nologia como descrito, por exemplo, em Marshak et al., "S-trategies for Protein Purification and Characterization. Alaboratory course manual". CSHL Press (1996). (além do mais,veja Bibl Haematol. 1965; 23:1165-74 Appl Microbiol. 1967Jul; 15(4): 851-6; Can J Biochem. 1968 May; 46(5): 441-4;Biochemistry. 1968 Jul; 7(7 ) :257 4-8 0; Arch Biochem Biophys.1968 Sep 10; 126(3) :746-72; Biochem Biophys Res Commun. 1970Feb 20;38 (4) :825-30) .).

0 vetor de expressão pode incluir um promotor paracontrolar a transcrição do material heterólogo e pode sertanto um promotor constitutivo quanto indutivel para permi-tir transcrição seletiva. Intensificadores que podem ser e-xigidos para obter níveis de transcrição necessários podemser opcionalmente incluídos. 0 veículo de expressão tambémpode incluir um gene de seleção.

Vetores podem ser introduzidos em células ou teci-dos por qualquer um de uma variedade de métodos conhecidosna tecnologia. Tais métodos podem ser encontrados descritosno geral em Sambrook et al., Molecular Cloning: A LaboratoryManual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989,1992), em Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Bi-ology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989), Vegaet al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor, MI (1995),Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectores and TheirUses, Butterworths, Boston MA (1988) e Gilboa et al. (1986).

3) Purificação de fontes naturais:

O polipeptídeo de RTP801, ou seus fragmentos deocorrência natural, pode ser purificado de fontes naturais(tais como tecidos) usando muitos métodos conhecidos pelosversados na técnica, tais como, por exemplo: imunoprecipita-ção com anticorpo anti-RTP801, ou cromatografia de afinidadeligada em matriz com qualquer molécula conhecido por se li-gar em RTP801. A purificação de proteína é realizada como éconhecido na tecnologia como descrito, por exemplo, em Mar-shak et al., "Strategies for Protein Purification and Cha-racterization. A laboratory course manual." CSHL Press(1996).

Por "efeito biológico de RTP801" ou "atividade bi-ológica de RTP801" entende-se o efeito de RTP801 em distúr-bios respiratórios, que pode ser direto ou indireto, e in-clui, sem ser limitado pela teoria, o efeito de RTP801 naapoptose de células alveolares induzidas por distúrbios hi-póxicos ou hiperóxicos. Os efeitos indiretos incluem, massem limitações, RTP801 se ligando a diversas moléculas queestão envolvidas em uma cascata de transdução de sinal queresulta em apoptose ou tendo um efeito sobre elas.

"Apoptose" diz respeito a um tipo fisiológico demorte celular que resulta da ativação de certos mecanismoscelulares, isto, é morte que é controlada pelo mecanismo dacélula. Por exemplo, a apoptose pode ser o resultado da ati-vação do mecanismo da célula por um disparador externo, porexemplo, uma citocina ou anticorpo anti-FAS que leva à mortecelular, ou por um sinal interno. 0 termo "morte celularprogramada" também pode ser usado intercambiavelmente com"apoptose".

"Doença relacionada à apoptose" diz respeito a umadoença cuja etiologia está relacionada tanto completamentequanto parcialmente ao processo de apoptose. A doença podeser causada tanto por uma disfunção do processo apoptótico(tais como no câncer em uma doença autoimune) ou por supera-tividade do processo apoptótico (tais como em certas doençasneurodegenerativas). Muitas doenças nas quais o RTP801 estáenvolvido são doenças relacionadas à apoptose. Por exemplo,apoptose é um mecanismo significativo na AMD seca, atravésda qual ocorre lenta atrofia do fotorreceptor e das célulasepiteliais de pigmento, primariamente, na região central(macular) da retina. Apoptose neurorretinal também é um me-canismo significativo na retinopatia diabética.

Um "inibidor" é um composto que pode inibir a ati-vidade de um gene ou do produto de tal gene até uma quanti-dade suficiente para alcançar um efeito biológico ou fisio-lógico desejado. Um "inibidor de RTP801" é um composto quepode inibir a atividade do gene RTP801 ou do produto do geneRTP801, particularmente, o gene ou o produto do gene RTP801humano. Tais inibidores incluem substâncias que afetam atranscrição ou tradução do gene, bem como substâncias queafetam a atividade do produto do gene. Um inibidor de RTP801também pode ser um inibidor do Promotor de RTP801. Exemplosde tais inibidores podem incluir, entre outros: polinucleo-tideos, tais como fragmentos AS, RNAsi, ou vetores que oscompreendem; polipeptideos tais como negativos dominantes,anticorpos, e enzimas; RNAs cataliticos, tais como ribozi-mas; e moléculas químicas com um baixo peso molecular, porexemplo, um peso molecular abaixo de 2.000 daltons. Inibido-res de RTP801 específicos são dados a seguir.

"Vetor de expressão" diz respeito a um vetor quetem a capacidade de incorporar e expressar fragmentos de DNAheterólogos em uma célula estrangeira. Muitos vetores de ex-pressão procarióticos e eucarióticos são conhecidos e/ou co-mercialmente disponíveis. A seleção de vetores de expressãoapropriados é de conhecimento dos versados na técnica.

0 termo "anticorpo" diz respeito a anticorpos IgG,IgM, IgD, IgA, e IgE, entre outros. A definição inclui anti-corpos policlonais ou anticorpos monoclonais. Este termo dizrespeito a anticorpos completos ou fragmentos de anticorposque compreendem um domínio que se liga a antígeno, por exem-plo, anticorpos sem a parte Fc, anticorpos de cadeia única,mini-anticorpos, fragmentos que consistem, essencialmente,somente do domínio que se liga a antígeno variável do anti-corpo, etc. O termo 'anticorpo" também pode dizer respeito aanticorpos contra seqüências de polinucleotídeo obtidos porvacinação de DNAc. O termo também abrange fragmentos de an-ticorpo que retêm a capacidade de se ligar seletivamente comseus antígenos ou receptores e são exemplificados como se-gue, entre outros:

(1) Fab, o fragmento que contém um fragmento mono-valente que se liga a antígeno de um molécula de anticorpoque pode ser produzida pela digestão de todo o anticorpo como enzima papaína para produzir uma cadeia leve e uma parteda cadeia pesada;

(2) (Fab1)2, o fragmento do anticorpo que pode serobtido pelo tratamento de todo o anticorpo com a enzima pep-sina sem subseqüente redução; F(ab'2) é um dímero de doisfragmentos Fab mantidos juntos por duas ligações dissulfeto;

(3) Fv, definido como um fragmento geneticamenteconstruído que contém a região variável da cadeia leve e aregião variável da cadeia pesada expressadas como duas ca-deias; e(4) Anticorpo de cadeia única (SCA), definido comouma molécula geneticamente construída que contém a regiãovariável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesadaligadas por um ligador de polipeptídeo adequado como uma mo-lécula de cadeia única geneticamente fundida.

Minicorpos e Microcorpos também são incluídos nes-te termo. Microcorpos são proteínas muito pequenas (tipica-mente, cerca de 28-45 aminoácidos) com estruturas pseudonó,que são altamente seletivos e estáveis. Portanto, qualqueruma das aplicações e compostos inéditos aqui divulgados queincluem anticorpos pode incluir, como substituição, um mini-corpo ou microcorpo como a parte de anticorpo da molécula.

Pelo termo "epítopo", como usado nesta invenção,entende-se um determinante antigênico em um antígeno no qualo anticorpo se liga. Usualmente, determinantes epitópicosconsistem de agrupamentos de moléculas com superfície quimi-camente ativa, tais como aminoácidos ou cadeias laterais deaçúcar e, usualmente, têm características estruturais tridi-mensionais específicas, bem como, características de cargaespecíficas.

Preparação de anticorpos anti-RTP801

Anticorpos que se ligam em RTP801 ou em um frag-mento derivado dele podem ser preparados usando um polipep-tídeo intacto ou fragmentos que contêm polipeptídeos menorescomo o antígeno imunizante. Por exemplo, pode ser desejávelproduzir anticorpos que se ligam especificamente a N- ou C-terminais ou a quaisquer outros domínios adequados doRTP801. O polipeptídeo usado para imunizar um animal podeser derivado de DNAc traduzido ou de síntese química e podeser conjugado a uma proteína carreadora, se desejado. Taiscarreadores comumente usados que são quimicamente acopladosno polipeptídeo incluem hemocianina de lapa californiana (K-LH) , tiroglobulina, albumina sérica bovina (BSA) e toxóidedo tétano. Então, o polipeptídeo acoplado é usado para imunizaro animal.

Se desejado, anticorpos policlonais ou monoclonaispodem ser adicionalmente purificados, por exemplo, pela li-gação em uma matriz na qual o polipeptídeo ou um peptídeo noqual os anticorpos foram destacados é ligado e pela eluiçãodela. Versados na técnica conhecem várias técnicas comuns emimunologia para a purificação e/ou concentração de anticor-pos policlonais bem como monoclonais (Coligan et al, Unit 9,Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1994).

Métodos para fazer anticorpos de todos os tipos,incluindo fragmentos, são conhecidos na tecnologia (veja,por exemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manu-al, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)). Métodosde imunização, incluindo todas as etapas necessárias parapreparar o imunógeno em um adjuvante adequado, para determi-nar a ligação de anticorpo, isolamento de anticorpos, méto-dos para obter anticorpos monoclonais, e humanização de an-ticorpos monoclonais são todos conhecidos pelos versados natécnica.

Os anticorpos podem ser anticorpos humanizado ouanticorpos humanos. Anticorpos podem ser humanizados usandouma variedade de técnicas conhecidas na tecnologia, incluin-do enxerto CDR (EP 239,400: publicação PCT WO91/09967; pa-tente US 5.225.539, 5.530.101 e 5.585.089, entalhe ou res-surgimento (EP 592.106; EP 519.596; Padlan, Molecular Immu-nology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein En-gineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 91:969-973 (1994)), e embaralhamento de cadeias (patente US5.565.332) .

Os anticorpos monoclonais definidos incluem anti-corpos derivados de uma espécie (tais como murino, coelho,cabra, rato, humano, etc.), bem como anticorpos derivados deduas (ou mais) espécies, tais como anticorpos guiméricos ehumanizados.

Anticorpos completamente humanos são particular-mente desejáveis para o tratamento terapêutico de pacienteshumanos. Anticorpos humanos podem ser feitos por uma varie-dade de métodos conhecidos na tecnologia, incluindo métodosde exibição de fago que usam bibliotecas de anticorpo deri-vadas de seqüências de imunoglobulina humana. Veja, também,patente US 4.444.887 e 4.716.111 e publicações PCT WO98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO96/34096, WO 96/33735, e WO 91/10741, cada uma das quais éaqui incorporada pela referência em suas integras.

Informação adicional considerando todos os tiposde anticorpos, incluindo anticorpos humanizados, anticorposhumanos e fragmentos de anticorpos, pode ser encontrada emWO 01/05998, que é aqui incorporada pela referência em suaintegra.

Anticorpos neutralizantes podem ser preparados pe-Ios métodos discutidos anteriormente, possivelmente, com umaetapa adicional de triagem para atividade neutralizante, porexemplo, por um ensaio de sobrevivência.

Os termos "composto químico", "pequena molécula","molécula química" "pequena molécula química" e "pequenocomposto químico" são aqui usados intercambiavelmente e sãoentendidos por dizer respeito a frações químicas de qualquertipo em particular que pode ser sinteticamente produzido ouobtido de fontes naturais e, usualmente, têm um peso molecu-lar de menos de 2.000 daltons, menos de 1.000 daltons ou a-inda menos do que 600 daltons.

A presente invenção também diz respeito a ácidosnucléicos funcionais que compreendem uma estrutura de fitadupla, seus usos para a fabricação de um medicamento, umacomposição farmacêutica que compreende tais ácidos nucléicosfuncionais e um método para o tratamento de um paciente.

Hipóxia foi reconhecida como um elemento chave nopatomecanismo de um grande número de doenças, tais como der-rame cerebral, enfisema e infarto que são associados comdisponibilidade de oxigênio e respostas ao dano do tecido emrelação às condições de hipóxia subideais. Em tecidos decrescimento rápido, incluindo tumor, uma disponibilidade deoxigênio subideal é compensada por neoangiogênese indeseja-da. Portanto, pelo menos no caso de doenças do câncer, ocrescimento de vasculatura é indesejado.

Em vista disto, a inibição de angiogênese e docrescimento vascular, respectivamente, são objetos de inten-sa pesquisa. Hoje em dia, já estão disponíveis alguns com-postos que inibem angiogênese e crescimento vascular indese-jados. Alguns dos compostos mais proeminentes são aquelesque inibem VEGF e o receptor de VEGF. Em ambos os casos, oefeito de VEGF é evitado tanto pelo bloqueio de VEGF comotal, por exemplo, pelo uso de um anticorpo direcionado con-tra VEGF, tal como perseguido por AVASTIN de Genentech (ABmonoclonal especifico para VEGF) (Ferrara N.; Endocr Rev.2004 Aug; 25 (4):581-611), quanto pelo bloqueio do receptorcorrespondente, isto é o receptor de VEGF (Trailer P; CâncerRes. 2004 Jul 15; 64 (14):4931-41; ou Stadler WM et al., ClinCâncer Res. 2004 May 15;10(10) :3365-70) .

Entretanto, já que a angiogênese e o crescimentode vasculatura é um processo muito básico e vital em qual-quer animal e ser humano, o efeito deste tipo de compostodeve ser focalizado no sitio em particular onde a angiogêne-se e o crescimento vascular é realmente indesejado, que pro-duz alvejamento apropriado ou distribui um assunto criticoem conjunto com este tipo de abordagem terapêutica.

Assim, é um objetivo da presente invenção fornecerdispositivo adicionalmente para o tratamento de doenças queenvolvem crescimento de vasculatura e angiogênese indeseja-dos, respectivamente.

Por "pequeno RNA interferente" (RNAsi) entende-seuma molécula de RNA que diminui ou silencia (impede) a ex-pressão de um gene / RNAm de suas contrapartes celulares en-dógenas. Entende-se que o termo abrange "interferência deRNA" (RNAi) . Interferência de RNA (RNAi) diz respeito aoprocesso de silenciamento genético pós-transcricional espe-cifico de seqüência em mamíferos mediado por pequenos RNAsinterferentes (RNAsis) (Fire et al, 1998, Nature 391, 806).

O processo correspondente em plantas é comumente chamado desilenciamento genético ou silenciamento de RNA pós-transcricional específico, e também é chamado de repressãoem fungos. A resposta da interferência de RNA pode apresen-tar um complexo de endonuclease que contém um RNAsi, comu-mente chamado de um complexo de silenciamento induzido porRNA (RISC), que media a clivagem de RNA de fita única comseqüência complementar à fita anti-sentido do duplex RNAsi.

A clivagem do RNA alvo pode ocorrer no meio da região com-plementar à fita anti-sentido do duplex RNAsi (Elbashir etal 2001, Genes Dev., 1_5, 188). Para informação recente sobreestes termos e mecanismos propostos, veja Bernstein E., Den-li AM., Hannon GJ: The rest is silence. RNA. 2001 Nov;7(11): 1509-21; e Nishikura K.:, A short primer on RNAi: RNA-directed RNA polymerase acts as a key catalyst. Cell. 2001Nov 16; 107(4) :415-8 . Exemplos de moléculas de RNAsi que po-dem ser usados na presente invenção são dados nas Tabelas A-D.

Durante os anos atuais, RNAi surgiu como um dosmétodos mais eficientes para a inativação de genes (NatureReviews, 2002, v.3, p.737-47; Nature, 2002, ν.418,ρ.244-51). Como um método, ele é baseado na disponibilidade da espéciede RNAds entrar em um complexo de proteína específico, onde,então, ela é alvejada ao RNA celular complementar e o degra-da especificamente. Com mais detalhes, RNAdss são digeridosem curtos (17-29 bp) RNAs inibidores (RNAsis) pelos RNAsestipo III (DICER, Drosha, etc.) (Nature, 2001, v.409, p.363-6; Nature, 2003, 425, p.415-9). Estes fragmentos e RNAm com-plementar são reconhecidos pelo complexo RISC especifico daproteína. O processo completo é culminado pela clivagem comendonuclease do RNAm alvo (Nature Reviews, 2002, v.3, p.737-47; Curr Opin Mol Ther. 2003 Jun; 5(3):217-24).

Para a divulgação de como projetar e preparar RNA-si para genes conhecidos, veja, por exemplo, Pei & Tuschl Onthe Art of Identifying Effective and Specific siRNAs NatureMethods 3 No. 9 September 2006; Chalk AM, Wahlestedt C, Son-nhammer EL. Improved and automated prediction of effectivesiRNA Biochem. Biophys. Res. Comum. 2004 Jun 18; 319(1):264-74; Sioud M, Leirdal M., Potential design rules and enzy-matic synthesis of siRNAs, Methods Mol Biol. 2004; 252:457-69; Levenkova N, Gu Q, Rux JJ.: Gene specific siRNA selectorBioinformatics. 2004 Feb 12; 20(3):430-2. e Ui-Tei K, NaitoY, Takahashi F, Haraguchi T, Ohki-Hamazaici H, Juni A, UedaR, Saigo Κ. , Guidelines for the selection of highly effec-tive siRNA sequences for mammalian and chick RNA interfer-ence Nucleic Acids Res. 2004 Feb 9; 32 (3) : 936-48. Veja tam-bém Liu Y, Braasch DA, Nulf CJ, Corey DR. Efficient and iso-formselective inhibition of cellular gene expression by pep-tide nucleic acids Biochemistry, 2004 Feb 24; 43 (7):1921-7.Veja também publicações PCT WO 2004/015107 (Atugen) e WO02/44321 (Tuschl et al), e também Chiu YL, Rana TM. siRNAfunction in RNAi: a chemical modification analysis, RNA 2003Sep; 9(9):1034-48 e patentes US 5.898.031 e 6.107.094 (Croo-ke) para a produção de RNAsis modificados / mais estáveis.Foram desenvolvidos vetores com base em DNA quepodem gerar RNAsi em células. No geral, o método envolve atranscrição de curtos RNAs tipo alça que são eficientementeprocessados para forma RNAsis nas células. Paddison et al.PNAS 2002, 99:1443-1448; Paddison et al. Genes & Dev 2002,16:948-958; Sui et al. PNAS 2002, 8:5515-5520; e Brummelkampet al. Science 2002, 296:550-553. Estes relatórios descrevemmétodos para gerar RNAsis que podem alvejar especificamenteinúmeros genes endógena e exogenamete expressados.

Para distribuição de RNAsis, veja, por exemplo,Shen et al (FEBS letters 539: 111-114 (2003)), Xia et al. ,Nature Biotechnology 20: 1006-1010 (2002), Reich et al., Mo-lecular Vision 9: 210-216 (2003), Sorensen et al.(J.Mol.Biol. 327: 761-766 (2003), Lewis et al., Nature Ge-netics 32: 107-108 (2002) e Simeoni et al., Nucleic AcidsResearch 31, 11: 2717-2724 (2003). RNAsi foi recentementeusado com sucesso para inibição em primatas; para detalhesadicionais, veja Tolentino et al., Retina 24(1) February2004 pp 132-138.

RNAsis da presente invenção

Especificações gerais dos RNAsis da presente in-venção

No geral, os RNAsis usados na presente invençãocompreendem um ácido ribonucléico que compreende uma estru-tura de fita dupla, em que a estrutura de fita dupla compre-ende uma primeira fita e uma segunda fita, em que a primeirafita compreende um primeiro trecho de nucleotideos contíguose em que o dito primeiro trecho é pelo menos parcialmentecomplementar a um ácido nucléico alvo, e a segunda fita com-preende um segundo trecho de nucleotideos contíguos e em queo dito segundo trecho é pelo menos parcialmente idêntico aum ácido nucléico alvo, em que a dita primeira fita e/ou adita segunda fita compreende uma pluralidade de grupos denucleotideos modificados com uma modificação na posição 2',em que, na fita, cada grupo de nucleotideos modificados éflanqueado em um ou em ambos os lados por um grupo de flan-queamento de nucleotideos, em que os nucleotideos de flan-queamento que formam o grupo de flanqueamento de nucleoti-deos é tanto um nucleotídeo não modificado quanto um nucleo-tídeo com uma modificação diferente da modificação dos nu-cleotideos modificados. Adicionalmente, a dita primeira fitae/ou a dita segunda fita podem compreender a dita pluralida-de de nucleotideos modificados e podem compreender a ditapluralidade de grupos de nucleotideos modificados.

0 grupo de nucleotideos modificados e/ou o grupode nucleotideos de flanqueamento pode compreender um númerode nucleotideos de acordo como qual o número é selecionadodo grupo que compreende um nucleotídeo até 10 nucleotideos.Em conjunto com qualquer uma das faixas aqui especificadas,entende-se que cada faixa divulga qualquer número inteiroindividual entre as respectivas figuras usadas para definira faixa que inclui as ditas duas figuras que definem a ditafaixa. Assim, no caso atual, o grupo compreende um nucleotí-deo, dois nucleotideos, três nucleotideos, quatro nucleoti-deos, cinco nucleotideos, seis nucleotideos, sete nucleoti-deos, oito nucleotideos, nove nucleotideos e dez nucleotí-deos.

0 padrão de nucleotídeos modificados da dita pri-meira fita pode ser o mesmo padrão de nucleotídeos modifica-dos da dita segunda fita, e pode alinhar com o padrão da di-ta segunda fita. Adicionalmente, o padrão da dita primeirafita pode ser deslocado em um ou mais nucleotídeos em rela-ção ao padrão da segundo fita.

As modificações discutidas anteriormente podem serselecionadas do grupo que compreende amina, flúor, metóxi ealquila.

A estrutura de fita dupla do RNAsi pode ter extre-midade cega em um ou em ambos os lados. Mais especificamen-te, a estrutura de fita dupla pode ter extremidade cega nolado da estrutura de fita dupla que é definido pela extremi-dade S' da primeira fita e pela extremidade 3' da segundafita, ou a estrutura de fita dupla pode ter extremidade cegano lado da estrutura de fita dupla que é definido pela ex-tremidade 3' da primeira fita e pela extremidade 5' da se-gunda fita.

Adicionalmente, pelo menos uma das duas fitas podeter uma abundância de pelo menos um nucleotídeo na extremi-dade 5'; a abundância pode consistir de pelo menos um deso-xiribonucleotídeo. Opcionalmente, pelo menos uma das fitastambém pode ter uma abundância de pelo menos um nucleotídeona extremidade 3'.

Tipicamente, o comprimento da estrutura de fitadupla do RNAsi é de cerca de 17 a 21, e mais preferivelmen-te, 18 ou 19 bases. Adicionalmente, o comprimento da ditaprimeira fita e/ou o comprimento da dita segunda fita pode,independentemente um do outro, ser selecionado do grupo quecompreende as faixas de cerca de 15 até cerca de 23 bases,17 a 21 bases e 18 ou 19 bases.

Adicionalmente, a complementaridade entre a ditaprimeira fita e o ácido nucléico alvo pode ser perfeita, ouo duplex formado entre a primeira fita e o ácido nucléicoalvo pode compreender pelo menos 15 nucleotideos em que háuma não correspondência ou duas não correspondências entre adita primeira fita e o ácido nucléico alvo que forma a ditaestrutura de fita dupla.

Em alguns casos, tanto a primeira fita quanto asegundo fita, cada qual, compreende pelo menos um grupo denucleotideos modificados e pelo menos um grupo de flanquea-mento de nucleotideos, em que cada grupo de nucleotideos mo-dificados compreende pelo menos um nucleotideo e em que cadagrupo de flanqueamento de nucleotideos compreendendo pelomenos um nucleotideo com cada grupo de nucleotideos modifi-cados da primeira fita sendo alinhado com um grupo de flan-queamento de nucleotideos na segundo fita, de acordo comqual o nucleotideo mais S'-terminal da primeira fita é umnucleotideo do grupo de nucleotideos modificados, e o nucle-otideo mais 3'-terminal da segundo fita é um nucleotideo dogrupo de flanqueamento de nucleotideos. Cada grupo de nucle-otideos modificados pode consistir de um único nucleotideoe/ou cada grupo de flanqueamento de nucleotideos pode con-sistir de um único nucleotideo.

Adicionalmente, é possível que, na primeira fita,o nucleotídeo que forma o grupo de flanqueamento de nucleo-tideos seja um nucleotídeo não modificado que é arranjado emuma direção 3' em relação ao nucleotídeo que forma o grupode nucleotídeos modificados, e, na segunda fita, o nucleotí-deo que forma o grupo de nucleotídeos modificados seja umnucleotídeo modificado que é arranjado na direção 5' em re-lação ao nucleotídeo que forma o grupo de flanqueamento denucleotídeos.

Adicionalmente, a primeira fita do RNAsi pode com-preender oito a doze, preferivelmente, nove a onze grupos denucleotídeos modificados, e a segunda fita pode compreendersete a onze, preferivelmente, oito a dez grupos de nucleotí-deos modificados.

A primeira fita e a segunda fita podem ser ligadaspor uma estrutura de laço, que pode ser composta por um po-límero de ácido não nucléico, tais como, entre outros, poli-etilenoglicol. Alternativa, a estrutura de laço pode sercomposta por um ácido nucléico.

Adicionalmente, o 5'-terminal da primeira fita doRNAsi pode ser ligado ao 3.'-terminal do segunda fita, ou aextremidade 3' da primeira fita pode ser ligado ao 5'-terminal do segunda fita, a dita ligação sendo por meio deum ligador de ácido nucléico, tipicamente, com um comprimen-to entre 10 - 2.000 nucleobases.

Especificações em particular de RNAsis da presenteinvenção

A invenção fornece um composto com a estrutura(estrutura A):5'(N)Χ-Ζ3' (fita anti-sentido)3'Z'-(N')y 5' (fita sentido)

em que cada NeN' é um ribonucleotideo que podeser modificado ou não modificado em seu residuo de açúcar e(N)x e (N1)y, são oligômeros nos quais cada N ou N' consecu-tivo é unido ao próximo N ou N' por uma ligação covalente;

em que cada um de χ e y é um número inteiro entre19 e 40;

em que cada um de Z e Z' pode estar presente ouausente, mas se presente pode ser dTdT e covalentemente ane-xado no 3'-terminal da fita na qual ele está presente;

e em que a seqüência de (N)x compreende uma se-qüência complementar ao DNAc do gene RTP801.

Em particular, a invenção fornece o composto ante-rior, em que a seqüência de (N)x compreende uma ou mais dasseqüências anti-sentido presentes nas Tabelas A, B, C e D,em particular, Tabela D.

Em particular, a invenção fornece o composto ante-rior em que a ligação covalente é uma ligação fosfodiéster,em que χ = y, preferivelmente, em que χ = y = 19 , em que Ze Z1 estão ambos ausentes, em que pelo menos um ribonucleo-tideo é modificado em seu residuo de açúcar na posição 2',em que a fração na posição 2' é metóxi (21-0-metila), em queribonucleotideos alternados são modificados tanto na fitaanti-sentido quanto na fita sentido, e em que ribonucleoti-deos nos 5' e 3'-terminais do fita anti-sentido são modifi-cados em seus resíduos de açúcar, e os ribonucleotideos nos5' e 3'-terminais da fita sentido não são modificados emseus resíduos de açúcar.

Em particular, o RNAsi usado na presente invençãoé um oligoribonucleotideo em que uma fita compreende nucleo-tídeos consecutivos com, de 5' a 31, a seqüência apresentadaem SEQ ID NOs: 3-52 ou nas SEQ ID NOs: 103-174 ou nas SEQ IDNOs: 247-295 ou nas SEQ ID NOs 345-440 (que são fitas senti-do) , em que uma pluralidade de bases pode ser modificada,preferivelmente por uma modificação 2-0-metila ou por um ho-mólogo desta, em que em até 2 dos nucleotídeos em cada regi-ão terminal uma base é alterada.

Adicionalmente, a presente invenção fornece um mé-todo para tratar um paciente que sofre de um distúrbio res-piratório, de uma doença ocular, de um distúrbio microvascu-lar, de um distúrbio do ouvido, de úlceras de pressão ou deoutros ferimentos da carne associados ao acamamento ou deuma lesão ou doença da medula espinhal, compreendendo admi-nistrar ao paciente uma composição farmacêutica que compre-ende um composto da estrutura exposta (A) (com qualquer umadas especificações supramencionadas) em uma quantidade tera-peuticamente efetiva para, desse modo, tratar o paciente.Adicionalmente, a invenção fornece o uso de uma quantidadeterapeuticamente efetiva da estrutura exposta (A) (com qual-quer uma das especificações supramencionadas) para a prepa-ração de um medicamento para promover a recuperação em umpaciente que sofre de um distúrbio respiratório, de uma do-ença ocular, de um distúrbio microvascular, de um distúrbiodo ouvido, de úlceras de pressão ou de outros ferimentos dacarne associados ao acamamento ou de lesão ou doença da me-dula espinhal.

Um aspecto adicional da presente invenção forneceuma composição farmacêutica que compreende um composto daestrutura exposta (A) para o tratamento de qualquer uma dadoenças e distúrbios aqui mencionados.

Adicionalmente, este aspecto fornece uma composi-ção farmacêutica que compreende dois ou mais compostos daestrutura exposta (A) para o tratamento de qualquer uma dasdoenças e distúrbios aqui mencionados, em que os ditos doiscompostos podem ser fisicamente misturados juntamente nacomposição farmacêutica em quantidades que geram atividadebenéfica igual ou de outra forma benéfica, ou podem ser co-valentemente ou não covalentemente ligados, ou unidos por umligador de ácido nucléico de um comprimento que varia de 2-100, preferivelmente, 2-50 ou 2-30 nucleotideos. Portanto,tais moléculas de RNAsi são compostas por estrutura de ácidonucléico de fita dupla como aqui descrito, em que duas se-qüências de RNAsi selecionadas das Tabelas A-D, e preferi-velmente da Tabela A, ID Nos: 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41,42, 49 e 50 ou RNAsi Nos: 257, 260-262, e 264-268 da TabelaD são covalentemente ou não covalentemente ligados ou unidospor um ligador para formar uma molécula acoplada de RNAsi.

Tipicamente, tais moléculas acopladas de RNAsi compreendendoduas seqüências de RNAsi terão 38-150 nucleotideos de com-primento, mais preferivelmente 38 ou 40-60 nucleotideos decomprimento, e maior, dessa maneira, se mais do que duas se-qüências de RNAsi forem incluídas na molécula acoplada. Umamolécula acoplada maior composta por duas ou mais seqüênciasmaiores que codificam RNAsi produzido por meio de processa-mento celular interno, por exemplo, grandes RNAdss, também éconcebida, como é uma molécula acoplada que codifica dois oumais RNAshs. Tais molécula acopladas também são consideradasuma parte da presente invenção, e informação adicional asconsiderando é dada a seguir.

As ditas estruturas combinadas ou acopladas têm avantagem de que a toxicidade e/ou efeitos fora do alvo decada RNAsi são minimizados, enquanto que a eficácia aumenta.

Em particular, o RNAsi usado nos exemplos foi domesmo modo modificado de maneira tal que um grupo 2'O-Me es-tava presente nos primeiro, terceiro, quinto, sétimo, nono,décimo primeiro, décimo terceiro, décimo quinto, décimo sé-timo e décimo nono nucleotideos da fita anti-sentido, em queexatamente a mesma modificação, isto é, um grupo 2'-O-Me es-tava presente nos segundo, quarto, sexto, oitavo, décimo,décimo segundo, décimo quarto, décimo sexto e décimo oitavonucleotideo da fita sentido. Adicionalmente, percebe-se queno caso destes ácidos nucléicos em particular de acordo coma presente invenção, o primeiro trecho é idêntico à primeirafita e o segundo trecho é idêntico à segunda fita e que es-tes ácidos nucléicos também têm extremidade cega. 0 RNAsiusado foi fosforilado, mas percebe-se que uma versão fosfo-rilada pode ser mais simples de preparar em grande escala edescobriu-se que o dito REDD14 desfosforilado, chamado REDD-14NP, é exatamente tão biologicamente ativo quanto REDD-14em um modelo CNV (veja Exemplo 6) . A seqüência deste RNAsiusado nos experimentos dos Exemplos 6-8 é aquela do REDD14,isto é, a seqüência com referência interna No. 14 (veja Ta-bela A). Os RNAsis usados nos experimentos do Exemplo 14 sãochamados 801_1 e 801_4; 801_1 tem número de referência in-terno 257 na Tabela D (SEQ ID NO: 429 [sentido] e 525 [anti-sentido]) e 801_4 tem número de referência interno 260 naTabela D (SEQ ID NO: 432 [sentido] e 528 [anti-sentido] )(veja Tabela D) .

Tais RNAss também podem ser fosforilados ou des-fosforilados.

A região terminal do oligonucleotideo diz respeitoàs bases 1-4 e/ou 16-19 nas seqüências 19-mer (Tabelas A, Be D a seguir) e às bases 1-4 e/ou 18-21 nas seqüências 21-mer (Tabela C a seguir).

Adicionalmente, os RNAsis usados na presente in-venção são oligoribonucleotideos em que uma fita compreendenucleotideos consecutivos com, de 5' a 3', a seqüência apre-sentada SEQ ID NOS: 53-102 ou SEQ ID NOS: 175-246 ou SEQ IDNOS: 296-344 ou SEQ ID NOS: 441-536 (fitas anti-sentido) ouum homólogo destes em que em até 2 dos nucleotideos em cadaregião terminal uma base é alterada.

Assim, em aspectos em particular, o oligonucleoti-deo compreende uma estrutura de fita dupla, em que tal es-trutura de fita dupla compreende uma primeira fita e uma se-gunda fita, em que a primeira fita compreende um primeirotrecho de nucleotideos contíguos e a segunda fita compreendeum segundo trecho de nucleotideos contíguos, em que o pri-meiro trecho é tanto complementar quanto idêntico a uma se-qüência de ácido nucléico que codifica para o gene RTP801 eem que o segundo trecho é tanto idêntico quanto complementara uma seqüência de ácido nucléico que codifica para RTP801.

O dito primeiro trecho compreende pelo menos 14 nucleotí-deos, preferivelmente pelo menos 18 nucleotideos, e aindamais preferivelmente 19 nucleotideos ou mesmo pelo menos 21nucleotideos. Em uma modalidade, o primeiro trecho compreen-de de cerca de 14 a 40 nucleotideos, preferivelmente de cer-ca de 18 a 30 nucleotideos, mais preferivelmente de cerca de19 a 27 nucleotideos, e ainda mais pref erivelmente de cercade 19 a 23 nucleotideos. Em uma modalidade, o segundo trechocompreende de cerca de 14 a 40 nucleotideos, preferivelmentede cerca de 18 a 30 nucleotideos, mais pref erivelmente decerca de 19 a 27 nucleotideos, a ainda mais pref erivelmentede cerca de 19 a 23 nucleotideos ou mesmo cerca de 19 a 21nucleotideos. Em uma modalidade, o primeiro nucleotideo doprimeiro trecho corresponde a um nucleotideo da seqüência deácido nucléico que codifica para RTP801, em que o último nu-cleotideo do primeiro trecho corresponde a um nucleotideo daseqüência de ácido nucléico que codifica para RTP801. Em umamodalidade o primeiro trecho compreende uma seqüência de pe-lo menos 14 nucleotideos contíguos de um oligonucleotídeo,em que tal oligonucleotídeo é selecionado do grupo que com-preende SEQ. ID. Nos. 3-536, pref erivelmente do grupo quecompreende os oligoribonucleotídeos com a seqüência de qual-quer um dos números seriais 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42,49 e 50 na Tabela A ou 260-262, e 264-268 na Tabela D. Adi-cionalmente, especificações das moléculas de RNAsi usadas napresente invenção podem fornecer um oligoribonucleotídeo emque o dinucleotídeo dTdT é covalentemente anexado no 3'-terminal, e/ou em pelo menos um nucleotideo um resíduo deaçúcar é modificado, possivelmente, com uma modificação com-preendendo uma modificação 2'-0-metila. Adicionalmente, ogrupo 2'OH pode ser substituído por um grupo ou fração sele-cionados dos grupos que compreendem -H-OCH3, -OCH2CH3,OCH2CH2CH3, -NH2, e F. Adicionalmente, os compostos preferí-veis da presente invenção divulgados anteriormente podem serfosforilados ou desfosforilados.

Adicionalmente, o RNAsi usado na presente invençãopode ser um oligoribonucleotídeo em que em nucleotídeos al-ternados, açúcares modificados estão localizados em ambas asfitas. Particularmente, o oligoribonucleotídeo pode compre-ender uma das fitas sentido em que o açúcar não é modificadonos nucleotídeos 5' e 3'- terminal, ou uma das fitas anti-sentido fitas em que o açúcar é modificado nos nucleotídeos5' e 3'- terminal.

Adicionalmente, ácidos nucléicos adicionais a serusados na presente invenção compreende pelo menos 14 nucleo-tídeos contíguos de qualquer uma das SEQ. ID. NO. 3 a 536, emais preferivelmente 14 pares base de nucleotídeos contíguosem qualquer final da estrutura de fita dupla composta peloprimeiro trecho e pelo segundo trecho, como exposto. Versa-dos na técnica entendem que dado o comprimento potencial doácido nucléico de acordo com a presente invenção e, particu-larmente, dos trechos individuais que formam tal ácido nu-cléico de acordo com a presente invenção, alguns deslocamen-tos em relação à seqüência de codificação do gene RTP801 de-talhados na SEQ ID N0:1 para cada lado é possível, em quetais deslocamentos podem ser de até 1, 2, 3, 4, 5 e 6 nucle-otideos em ambas as direções, e em que a assim gerada molé-cula de ácidos nucléicos de fita dupla também devem estar napresente invenção.

Um aspecto adicional da presente invenção diz res-peito a um ácido nucléico funcional que compreende uma es-trutura de fita dupla, em que tal estrutura de fita duplacompreende:

uma primeira fita e uma segunda fita, em quea primeira fita compreende um primeiro trecho denucleotídeos contíguos e a segunda fita compreende um segun-do trecho de nucleotídeos contíguos, em que

o primeiro trecho é tanto complementar quanto i-dêntico a um seqüência de ácido nucléico que codifica paraRTP801 e em que o segundo trecho é tanto idêntico quantocomplementar a uma seqüência de ácido nucléico que codificapara RTP801.

Em uma modalidade, o ácido nucléico é infraregula-dor do RTP801, em que a infra-regulação de RTP801 é selecio-nada do grupo que compreende infra-regulação da funçãoRTP801, infra-regulação da proteína de RTP801 e infra-regulação de expressão de RNAm de RTP801.

Em uma modalidade, o primeiro trecho compreendepelo menos 14 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos 18nucleotídeos e ainda mais preferivelmente 19 nucleotídeos.

Em uma modalidade, o primeiro trecho compreende decerca de 14 a 40 nucleotídeos, pref erivelmente de cerca de18 a 30 nucleotídeos, mais preferivelmente de cerca de 19 a27 nucleotídeos e ainda mais preferivelmente de cerca de 19a 23 nucleotídeos.

Em uma modalidade, o segundo trecho compreende decerca de 14 a 40 nucleotídeos, preferivelmente de cerca de18 a 30 nucleotídeos, mais preferivelmente de cerca de 19 a27 nucleotídeos e ainda mais preferivelmente de cerca de 19a 23 nucleotídeos.

Em uma modalidade, o primeiro nucleotídeo do pri-meiro trecho corresponde a um nucleotídeo da seqüência deácido nucléico que codifica para RTP801, em que o último nu-cleotídeo do primeiro trecho corresponde a um nucleotídeo daseqüência de ácido nucléico que codifica para RTP801.

Em uma modalidade, um trecho compreende uma se-qüência de pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma se-qüência de ácido nucléico, em que tal seqüência de ácido nu-cléico é selecionada das seqüências divulgadas nas TabelasA-D, preferivelmente do grupo que compreende SEQ. ID. NOs53, 66, 67, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 91, 92, 93, 94, 96, 101102, 525, 528, 529, 530, 532, 533, 534, 535 e 536, mais pre-ferivelmente selecionado do grupo que compreende SEQ. ID.Nos 66, 75, 79, 91, 94, 101, 102, 525 e 528, e ainda maispreferivelmente selecionado do grupo que compreende SEQ. ID.Nos 66, 74, 75, 79, 525 e 528.

Em uma modalidade, o outro trecho compreende umaseqüência de pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma se-qüência de ácido nucléico, em que tal seqüência de ácido nu-cléico é selecionada das seqüências divulgadas nas TabelasA-D, preferivelmente do grupo que compreende SEQ. ID. NOs.3, 16, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 41, 42, 43, 44, 45, 46,51, 52, 429, 432, 433, 434, 436, 437, 438, 439, e 440, maispreferivelmente selecionada do grupo que compreende SEQ. ID.Nos 16, 24, 25, 29, 41, 44, 51, e 52, e ainda mais preferi-velmente selecionada do grupo que compreende SEQ. ID. Nos16, 24, 25 e 29.

Em uma modalidade:

o primeiro trecho tem uma seqüência de acordo comSEQ. ID. NO. 53 e o segundo trecho tem uma seqüência de a-cordo com SEQ. ID. NO. 3;

o primeiro trecho tem uma seqüência de acordo comSEQ. ID. NO. 66 e o segundo trecho tem uma seqüência de a-cordo com SEQ. ID. NO. 16;

o primeiro trecho tem uma seqüência de acordo comSEQ. ID. NO. 67 e o segundo trecho tem uma seqüência de a-co.rdo com SEQ. ID. NO. 17;

o primeiro trecho tem uma seqüência de acordo comSEQ. ID. NO. 72 e o segundo trecho tem uma seqüência de a-cordo com SEQ. ID. NO. 22;

o primeiro trecho tem uma seqüência de acordo comSEQ. ID. NO. 73 e o segundo trecho tem uma seqüência de a-cordo com SEQ. ID. NO. 23;

o primeiro trecho tem uma seqüência de acordo comSEQ. ID. NO. 74 e o segundo trecho tem uma seqüência de a-cordo com SEQ. ID. NO. 24;

o primeiro trecho tem uma seqüência de acordo comSEQ. ID. NO. 75 e o segundo trecho tem uma seqüência de a-cordo com SEQ. ID. NO. 25;

o primeiro trecho tem uma seqüência de acordo comSEQ. ID. NO. 7 6 e o segundo trecho tem uma seqüência de a-cordo com SEQ. ID. NO. 26;

o primeiro trecho tem uma seqüência de acordo comSEQ. ID. NO. 77 e o segundo trecho tem uma seqüência de a-cordo com SEQ. ID. NO. 27;

o primeiro trecho tem uma seqüência de acordo comSEQ. ID. NO. 79 e o segundo trecho tem uma seqüência de a-cordo com SEQ. ID. NO. 29;

o primeiro trecho tem uma seqüência de acordo comSEQ. ID. NO. 91 e o segundo trecho tem uma seqüência de a-cordo com SEQ. ID. NO. 41;

o primeiro trecho tem uma seqüência de acordo comSEQ. ID. NO. 92 e o segundo trecho tem uma seqüência de a-cordo com SEQ. ID. NO. 42;

o primeiro trecho tem uma seqüência de acordo comSEQ. ID. NO. 93 e o segundo trecho tem uma seqüência de a-cordo com' SEQ. ID. NO. 43;

o primeiro trecho tem uma seqüência de acordo comSEQ. ID. NO. 94 e o segundo trecho tem uma seqüência de a-cordo com SEQ. ID. NO. 44;

o primeiro trecho tem uma seqüência de acordo comSEQ. ID. NO. 95 e o segundo trecho tem uma seqüência de a-cordo com SEQ. ID. NO. 45;

o primeiro trecho tem uma seqüência de acordo comSEQ. ID. NO. 96 e o segundo trecho tem uma seqüência de a-cordo com SEQ. ID. NO. 4 6;o primeiro trecho tem uma seqüência de acordo comSEQ. ID. NO. 101 e o segundo trecho tem uma seqüência de a-cordo com SEQ. ID. NO. 51;

o primeiro trecho tem uma seqüência de acordo comSEQ. ID. NO. 102 e o segundo trecho tem uma seqüência de a-cordo com SEQ. ID. NO. 52.

Em uma modalidade, o primeiro trecho tem uma se-qüência de ácido nucléico que é selecionada do grupo quecompreende SEQ. ID. NO. 53, 66, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 79,91, 92, 93, 94, 95, 96, 101, 102, 525, 528, 529, 530, 532,533, 534, 535 e 536.

Entende-se que, embora os termos "primeiro" e "se-gundo" trechos sejam usados em conjunto com os ácidos nu-cléicos da presente invenção, eles são usados somente a ti-tulo de conveniência, e qualquer molécula de ácido nucléicoda invenção que é descrita com um primeiro trecho com a se-qüência X e com um segundo trecho com a seqüência Y, tambémpode, igualmente, ser descrito com um primeiro trecho com aseqüência Y e com um segundo trecho com a seqüência X, con-tanto que entenda-se que um trecho está incluído na fita an-ti-sentido, que deve ser anti-sentido em relação a uma parteda seqüência de codificação do gene RTP801, e que o outrotrecho está incluído na fita sentido, que deve ser comple-mentar (embora não 100 % complementar) à fita anti-sentido,tudo de acordo com as definições e especificações aqui apre-sentadas .

Em uma modalidade, a primeiro e/ou a segunda fitascompreendem pelo menos um nucleotídeo em abundância na ex-tremidade 3' que é complementar ou idêntico ao nucleotideocorrespondente de uma seqüência de ácido nucléico que codi-fica para RTP801.

Em uma modalidade, a primeira e/ou a segunda fitascompreendem de 1 a 15 nucleotideos em abundância na extremi-dade 3', preferivelmente a primeira e/ou a segunda fitascompreendem de 1 a 10 nucleotideos em abundância na extremi-dade 3', mais preferivelmente a primeira e/ou a segunda fi-tas compreendem de 1 a 5 nucleotideos em abundância na ex-tremidade 3', e ainda mais preferivelmente a primeira e/ou asegunda fitas compreendem de 1 a 2 nucleotideos em abundân-cia na extremidade 3'.

Em uma modalidade, a primeira fita e/ou a segundafita compreendem pelo menos um nucleotideo em abundância queé diferente do nucleotideo correspondente da seqüência deácido nucléico que codifica para RTP801.

Em uma modalidade, a primeira fita compreende doisnucleotideos em abundância que são diferentes do nucleotideocorrespondente de uma seqüência de ácido nucléico que codi-fica para RTP801.

Em uma modalidade, a primeira fita consiste doprimeiro trecho somente.

Em uma modalidade, a segunda fita consiste do se-gundo trecho somente.

Em uma modalidade, o primeiro trecho e/ou a pri-meira fita compreende(s) ribonucleotideos.

Em uma modalidade, o segundo trecho e/ou a segundafita compreende(s) ribonucleotideos.Em uma modalidade, o primeiro trecho e/ou a segun-da fita consiste(s) de ribonucleotideos.

Em uma modalidade, alguns ou todos os nucleotideossão modificados.

Em uma modalidade preferida, tal modificação estárelacionada à fração de nucleobase do nucleotideo, À fraçãode açúcar do nucleotideo e/ou à fração de fosfato do nucleo-tideo .

Em uma modalidade mais preferida, a modificação éum modificação de uma fração de açúcar e a modificação é umamodificação na posição 2', em que o grupo 2'OH é substituídopor um grupo ou fração selecionados do grupo que compreende-H-OCH3, -OCH2CH3, -OCH2CH2CH3, -NH2, e -F.

Em uma modalidade, a modificação é uma modificaçãoda fração de nucleobase e a modificação ou nucleobase modi-ficado é selecionado do grupo que compreende inosina, xanti-na, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metila, 2-propila e ou-tras alquiladeninas, 5-halo uracila, 5-halocitosina, 5-halocitosina, 6-azacitosina, 6-aza timina, pseudo-uracila, 4-tiouracila, 8-halo adenina, 8-aminoadenina, 8-tiol adenina,8-tiolalquil adeninas, 8-hidroxil adenina e outras adeninas8-substituídas, 8-halo guaninas, 8-amino guanina, 8-tiolguanina, 8-tioalquil guanina, 8-hidroxilguanina e outrasguaninas substituídas, outras aza- e deaza adeninas, outrasaza- e deaza guaninas, 5-trifluormetil uracila e 5-triflúorcitosina.

Em uma modalidade, a modificação é uma modificaçãoda fração de fosfato, em que a fração de fosfato modificadaé selecionada do grupo que compreende fosfotioato.

Em uma modalidade, o primeiro trecho e/ou o segun-do trecho compreendem uma pluralidade de grupos de nucleotí-deos modificados com uma modificação na posição 2', em que,no trecho, cada grupo de nucleotideos modificados é flanque-ado em um ou em ambos os lados por m grupo de flanqueamentode nucleotideos, de acordo com qual os nucleotideos de flan-queamento que formam o grupo de flanqueamento de nucleoti-deos são tanto um nucleotideo não modificado quanto um nu-cleotideo com uma modificação diferente da modificação dosnucleotideos modificados.

Em uma modalidade preferida, o primeiro trechoe/ou o segundo trecho consistem de ribonucleotideos.

Em uma modalidade mais preferida, o primeiro e osegundo trechos compreendem uma pluralidade de grupos de nu-cleotideos modificados.

Em uma modalidade, o primeiro trecho compreende adita pluralidade de grupos de nucleotideos modificados.

Em uma modalidade, o segundo trecho compreende adita pluralidade de grupos de nucleotideos modificados.

Em uma modalidade, cada grupo de nucleotideos mo-dificados e/ou cada grupo de nucleotideos de flanqueamentocompreendem inúmeros nucleotideos, em que o número é sele-cionado do grupo que compreende de um nucleotideo a dez nu-cleotideos.

Em uma modalidade, o primeiro trecho compreende umprimeiro padrão de nucleotideos modificados e o segundo tre-cho compreende um segundo padrão de nucleotideos modifica-dos.

Em uma modalidade, o primeiro padrão é o mesmo pa-drão do segundo padrão.

Em uma outra modalidade, o primeiro padrão se ali-nha com o segundo padrão.

Em uma modalidade preferida, o primeiro padrão édeslocado em um ou mais nucleotideos em relação ao segundopadrão.

Em uma modalidade, cada um dos grupos de nucleotí-deos modificados consiste de um nucleotideo modificado e ca-da um dos grupos de nucleotideos de flanqueamento consistede um nucleotideo não modificado ou de um nucleotideo comuma modificação que é diferente da modificação dos nucleoti-deos modificados.

Em uma modalidade preferida, o nucleotideo modifi-cado tem um grupo -OMe na posição 2'.

Em uma modalidade preferida, o nucleotideo deflanqueamento é um ribonucleotideo que tem um grupo 21OH.

Em uma modalidade, o primeiro trecho começa com umnucleotideo modificado na extremidade 5' e todos os outrosnucleotideos do trecho também são um nucleotideo modificado,enquanto que um segundo nucleotideo que começa da extremida-de 5 ' e todos os outros nucleotideos são um nucleotideo nãomodificado ou um nucleotideo com uma modificação que é dife-rente da modificação do(s) nucleotideo(s) modificado(s) .

Em uma modalidade, o primeiro trecho está em ori-entação anti-sentido em relação à seqüência de ácido nucléi-co que codifica para RTP801.Um aspecto adicional da presente invenção diz res-peito a uma composição farmacêutica que compreende um ácidonucléico de acordo com o primeiro aspecto da presente inven-ção e/ou um vetor de acordo com o segundo aspecto da presen-te invenção e, preferivelmente, um carreador farmacéutica-mente aceitável. A dita composição sendo, opcionalmente, pa-ra administração sistêmica ou local.

Em uma modalidade, a composição é para o tratamen-to de uma doença, em que a doença é selecionada do grupo quecompreende doenças de tumor.

Em um aspecto adicional, o problema fundamental dapresente invenção é resolvido por um método para o impedi-mento e/ou tratamento de um paciente com necessidade de taisimpedimento e/ou tratamento que compreendem a administraçãode um ácido nucléico de acordo com a presente invenção e/oudo vetor de acordo com a presente invenção e/ou de uma com-posição farmacêutica de acordo com a presente invenção.

Em uma modalidade adicional, um ácido nucléico deacordo com a presente invenção e/ou um vetor de acordo com apresente invenção são usados para a fabricação de um medica-mento. O medicamento pode ser para o impedimento e/ou trata-mento de uma doença, em que tal doença é selecionada do gru-po que compreende doenças de tumor. A doença de tumor podeser selecionada do grupo que compreende tumores sólidos, tu-mores metastáticos incluindo tumores PTEN negativo, tumoresque são resistentes a medicamentos e tumores em que a inibi-ção de RTP801 pode ser usada para sensibilização. Adicional-mente, a doença de tumor pode ser um doença de tumor em es-tágio avançado ou pode envolver células que são supressor-asnegativas de tumor. 0 dito supressor pode ser PTEN.

Um aspecto adicional da presente invenção é resol-vido por um método para desenhar ou para triar um ácido nu-cléico que é adequado para infra-regular RTP801, compreen-dendo as seguintes etapas:

a) desenhar ou triar um ácido nucléico que é ade-quado para infra-regular RTP801;

b) avaliar o defeito de um ácido nucléico de acor-do com qualquer um dos aspectos expostos da presente inven-ção; e

c) comparar o efeito do ácido nucléico da etapa a)com o efeito do ácido nucléico da etapa b).

Em uma modalidade, o efeito é a infra-regulação deRTP801.

Um aspecto adicional da presente invenção é o usode um ácido nucléico de acordo com a presente invenção comoum sensibilizador, particularmente, como um sensibilizadorno tratamento de uma doença, em que tal doença é seleciona-da, preferivelmente, do grupo que compreende tumor e, maisparticularmente, tumores que são resistentes a um tratamentousando produtos quimioterapêuticos e/ou radioterapêuticos.Doenças adicionais para as quais um ácido nucléico da pre-sente invenção pode servir como um sensibilizador são aquidivulgadas.

Este pedido divulga que um ácido nucléico que com-preende uma estrutura de fita dupla que é especifica paraRTP801 é um dispositivo adequado para inibir angiogênese /crescimento de vasculatura e vazamento vascular, (tanto davasculatura existente quanto da vasculatura desenvolvida).

Adicionalmente, este pedido divulga (sem ser limitado pelateoria) que RTP801, sendo uma proteína indutível por tensão(induzida por hipóxia, tensão oxidante, tensão térmica, ten-são ER), é um fator que age no ajuste fino da resposta celu-lar ao desequilíbrio energético. Assim, a inibição de RTP801por tal ácido nucléico de fita dupla é adequada para o tra-tamento de qualquer doença em que as células devem ser sal-vas da apoptose em função de distúrbios de tensão (por exem-plo, doenças acompanhadas pela morte de células normais) ouem que células adaptadas a distúrbios por tensão em funçãode mudanças na expressão de RTP801 devem ser mortas (por e-xemplo, células de tumor). Neste último caso, mediante a i-nibição de RTP801 por meio de tal ácido nucléico de fita du-pla, este fator de sobrevivência com função antiapoptóticanas células hipóxicas, mais particularmente, células cance-rosas hipóxicas, fica inefetivo, assim, permitindo que ascélulas desprovidas de proteção mediada por RTP801 sejam Ie-vadas à apoptose. Isto pode ocorrer, adicionalmente, quandooutros fatores de promoção de apoptose estão presentes. Taisoutros fatores de promoção de apoptose incluem, entre ou-tros, quimioterapia e radioterapia. Em outras palavras, oácido nucléico de fita dupla de acordo com a presente inven-ção pode ser efetivo sozinho no tratamento do câncer (mono-terapia) e também como uma terapia complementar.

Tal estrutura de fita dupla compreende uma primei-ra fita e uma segunda fita, em que a primeira fita compreen-de um primeiro trecho de nucleotideos contíguos e a segundafita compreende um segundo trecho de nucleotideos contíguos,em que o primeiro trecho é tanto complementar quanto idênti-co a uma seqüência de ácido nucléico que codifica paraRTP801 e em que o segundo trecho é tanto idêntico quantocomplementar a uma seqüência de ácido nucléico que codificapara RTP801. Assim, particularmente, pelo uso de RTP801 comoum alvo para tal tipo de ácido nucléico de fita dupla, tam-bém é possível abordar imediatamente um alvo na cascata en-volvida no crescimento e desenvolvimento da vasculatura e daangiogênese, respectivamente, e, assim, de uma maneira dife-rente, comparado com a rota usada por inibidores VEGF, taiscomo anticorpos VEGF. Sem desejar ser limitado por nenhumateoria, os presentes inventores consideram que o ácido nu-cléico de acordo com a presente invenção pode exercer suafunção naquelas células que fornecem um ambiente que estáenvolvido com qualquer doença em que ocorre angiogênese in-duzida por hipóxia e/ou crescimento ou desenvolvimento devasculatura particularmente indesejados ou que é observadoem conjunto com elas. Este entendimento é suportado pelo a-chado de que camundongos knock-out expostos a RTP801 não e-xibem nenhum fenótipo diferente dos camundongos tipo selva-gem sob distúrbios não hipóxicos. Somente mediante induçãode hipóxia como observado em uma condição de doença, tal co-mo, por exemplo, crescimento de tumor, o knock-out relacio-nado a RTP801 resulta em uma patologia similar àquela obser-vada em humanos que sofrem deste tipo de doença.

Entende-se que, preferivelmente, o ácido nucléicode acordo com a presente invenção é um ácido nucléico fun-cional. Como aqui usado, preferivelmente, o termo ácido nu-cléico funcional significa um ácido nucléico cuja função édiferente de ser ativo na célula como um modelo para atranscrição de qualquer RNAhn, RNAm, ou qualquer outro pro-duto de transcrição, em que ambos os ditos RNAhn, RNAm ouqualquer outro produto de transcrição, respectivamente, ou oácido nucléico de acordo com a presente invenção são sujei-tos a um processo de tradução, preferivelmente, um processode tradução celular que resulta em uma proteína de RTP801biologicamente ativa. Reconhece-se que um ácido nucléicofuncional, como aqui preferivelmente usado, pode reduzir aexpressão de um ácido nucléico alvo. Mais preferivelmente,tal redução é baseada em um processo de silenciamento gené-tico pós-transcricional do ácido nucléico alvo. Ainda maispreferivelmente, tal redução é baseada na interferência deRNA. Uma forma mais preferida do ácido nucléico funcional éuma molécula de RNAsi ou qualquer molécula adicional com omesmo efeito de uma molécula de RNAsi. Tal molécula adicio-nal é selecionada do grupo que compreende RNAsis, RNAsissintéticos, RNAshs e RNAshs sintéticos. Da forma aqui usada,RNAsis podem compreender adicionalmente RNAsis derivados devetor de expressão, em que o vetor de expressão é, em umamodalidade preferida, um vírus, tais como Adenovírus, vírusAdenoassociados, Herpesvirus e Lentivírus. Da forma aqui u-sada, preferivelmente, RNAsh significa RNAs tipo alça. TalRNAsh pode ser feito sinteticamente ou pode ser gerado usan-do sistemas de expressão codificados por vetor, preferível-mente, usando promotores de polimerase III de RNA. Em con-junto com isto, percebe-se que o ácido nucléico funcional deacordo com a presente invenção é direcionado ao RTP801 quetambém é preferivelmente aqui chamado de o alvo e o ácidonucléico que codifica para o dito alvo como o ácido nucléicoalvo.

Da forma preferivelmente aqui usada, a estruturade fita dupla do ácido nucléico de acordo com a presente in-venção compreende qualquer estrutura de fita dupla, em quetal estrutura de fita dupla é preferivelmente gerada peloprimeiro trecho e pelo segundo trecho fornecidos pelo ácidonucléico com o desenho básico. A estrutura de fita dupla po-de compreender uma ou diversas não correspondências. Tal es-trutura de fita dupla é formada pelo pareamento Watson-Crick-base e/ou pelo pareamento Hoogsteen base e/ou por me-canismos de pareamento de base similares. Com base no dese-nho básico do ácido nucléico de acordo com a presente inven-ção, é preferido que um trecho esteja em orientação anti-sentido em relação a uma seqüência de ácido nucléico que co-difica para RTP801 ou a uma parte desta, enquanto que o ou-tro trecho esteja na orientação sentido em relação a uma se-qüência de ácido nucléico que codifica para RTP801 ou a umaparte desta. Em virtude disto, um trecho é complementar auma seqüência de ácido nucléico que codifica para RTP801 oupara uma parte deste, e o outro trecho é idêntico a uma se-qüência de ácido nucléico que codifica para RTP801 ou parauma parte deste. Em conjunto com isto, percebe-se que o ter-mo idêntico, certamente, também significa parcialmente idên-tico, em que a identidade, expressa como homologia, é de pe-lo menos 80 %, preferivelmente 90 %, mais preferivelmente 95%, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %. Similar à definição daidentidade, complementaridade pode ser definida em termos dehomologia, em que tal homologia é da mesma faixa de identi-dade se a fita complementar for traduzida em fita idênticade acordo com as regras do pareamento Watson-Crick base. Emuma modalidade alternativa, um trecho é idêntico a uma se-qüência de ácido nucléico que codifica para RTP801 ou a umaparte deste, e o outro trecho é complementar a uma seqüênciade ácido nucléico que codifica para RTP801 ou a uma partedeste.

Em uma modalidade preferida, o ácido nucléico deacordo com a presente invenção consiste de função infraregu-lador de RTP801. Preferivelmente, a função de infra-regulação de RTP801 acontece pela redução no nível de ex-pressão no nível da proteína e/ou no nível do RNAm, em quetal reduzido nível de expressão, preferivelmente, no nívelda proteína, pode ser tão pequeno quanto 5 % e pode ser tãoalto quanto 100 %, em relação a uma expressão sob condiçõesem que o ácido nucléico de acordo com a presente invençãonão é administrado ou não está funcionalmente ativo. Prefe-rivelmente, tais condições são as condições de um sistema deexpressão, ou como presentes neles, preferivelmente, um sis-tema de expressão para RTP801. Preferivelmente, tal sistemade expressão é um sistema de tradução que pode ser um siste-ma de tradução in vitro, mais preferivelmente uma célula,órgão e/ou organismo. É mais preferível que o organismo sejaum organismo multicelular, mais preferivelmente um mamífero,em que tal mamífero seja selecionado, preferivelmente, dogrupo que compreende homem, macaco, camundongo, rato, por-quinho da índia, coelho, gato, cachorro, carneiro, vaca, ca-valo, gado e porco. Em conjunto com a infra-regulação, per-cebe-se que a dita inf ra-regulação pode ser em função dotempo, isto é, o efeito da infra-regulação não é, necessari-amente, observado imediatamente mediante a administração oua ativação funcional dos ácidos nucléicos de acordo com apresente invenção, mas pode ser atrasado no tempo bem comono espaço, isto é, em várias células, tecidos e/ou órgãos.

Tal atraso pode variar de 5 % - 100 %, preferivelmente de 10a 50 %. Versados na técnica percebem que uma redução de 5 %para um maior período de tempo pode ser tão efetiva quantouma redução de 100 % durante um menor período de tempo. Ver-sados na técnica também percebem que tal atraso depende for-temente ácido nucléico funcional em particular realmente u-sado, bem como da população celular alvo e, assim, em últimaanálise, da doença a ser tratada e/ou impedida de acordo como preceito técnico do presente pedido. Até um certo ponto,uma redução de 5 % durante um maior período de tempo podeser tão efetiva quanto uma redução de 100% durante um menorperíodo de tempo. Versados na técnica também percebem que oatraso pode ocorrer em qualquer nível como delineado anteri-ormente, isto é, um atraso na função, em que tal função équalquer função exibida por RTP801, um atraso na expressãode proteína ou um atraso no nível de expressão de RNAm.

Em uma modalidade preferida, o primeiro trechocompreende pelo menos 14 nucleotideos, preferivelmente 14nucleotídeos contíguos. Versados na técnica percebem que oprimeiro trecho deve ter um comprimento que seja adequadopara permitir abordar especificamente uma seqüência de ácidonucléico que codifica para RTP801 e, mais especificamente, oácido nucléico que codifica para RTP801 presente no sistemade tradução em que a expressão de RTP801 deve ser reduzida.Novamente, sem desejar ser limitado por nenhum teoria nempor nenhum modo de ação do ácido nucléico de acordo com apresente invenção, parece que há uma interação entre o ácidonucléico de acordo com a presente invenção e a seqüência deácido nucléico que codifica para RTP801, preferivelmente nonível de transcrição, isto é, mediante a geração de um RNAmda respectiva seqüência de ácido nucléico que codifica paraRTP801. Assim, em função da probabilidade de que alguma se-qüência do ácido nucléico de acordo com a presente invençãoseja idêntica ou complementar a uma seqüência contida no ge-noma ou no transcriptoma do sistema de tradução, o compri-mento do primeiro trecho deve ser tão longo quanto necessá-rio para a certeza de que, sob a consideração de que algumtipo de pareamento de base entre o ácido nucléico que codi-fica para RTP801 e uma das fitas do ácido nucléico de acordocom a presente invenção realmente ocorre, somente a seqüên-cia que codifica para RTP801, mas nenhuma outra seqüência decodificação, certamente nenhuma outra seqüência de codifica-ção essencial, do genoma ou do transcriptoma é abordada paratal pareamento de base ou por ele. Por este comprimento, aocorrência de efeitos fora do alvo pode ser reduzida e, pre-ferivelmente, eliminada. Para aumentar o rigor deste tipo deRTP801 especificamente abordante e a seqüência de ácido nu-cléico que codifica para ele, preferivelmente, o primeirotrecho tem um comprimento de pelo menos 18 ou 19 nucleotí-deos. Preferivelmente, o limite superior para o comprimentodo primeiro trecho é menor do que 50 nucleotideos, entretan-to, o comprimento pode ser significativamente maior e podecompreender 100, 200 ou mesmo 500 nucleotideos ou qualquercomprimento entre estes. Além disto, versados na técnicapreferirão ter um primeiro trecho especialmente curto, par-ticularmente, no caso em que o ácido nucléico de acordo coma presente invenção é quimicamente sintetizado, quanto maiscurta for a seqüência, o mais rápido e com menos consumo dematerial sua síntese ocorrerá e mais inferior será a taxa naqual nucleotideos incorretos são inseridos na respectiva se-qüência. Um outro fator que deve ser levado em consideraçãoem conjunto com a fixação do comprimento do primeiro trechoé o fato de que, tipicamente, em um comprimento além de 50ou mais nucleotideos, uma resposta de interferon não especí-fica pode ser observada. Depende da condição em particular aser tratada se este tipo de resposta de interferon não espe-cífica deve ser tolerada ou não. Por exemplo, uma respostade interferon pode ser tolerada se a resposta de interferone/ou a expressão dos genes de interferon puderem ser limita-dos às células patogênicas.

Em vista disto, comprimentos mais preferidos doprimeiro trecho são de cerca de 14 a 40 nucleotideos, de 18a 30 nucleotideos, de 19 a 27 nucleotideos, de 21 a 25 nu-cleotideos e de 19 a 23 nucleotídeos.

As mesmas considerações delineadas anteriormentepara o primeiro trecho são aplicáveis ao segundo trecho que,assim, pode compreender qualquer comprimento aqui descritoem conjunto com o primeiro trecho. Também está na presenteinvenção o fato de que o comprimento do primeiro trecho édiferente do comprimento do segundo trecho, entretanto, épreferido que ambos os trechos tenham o mesmo comprimento.

De acordo com o desenho básico do ácido nucléico,o primeiro trecho e segundo trecho são partes da primeirafita e da segunda fita, respectivamente, do ácido nucléicode acordo com a presente invenção. Percebe-se que em ambasas extremidades, isto é, na extremidade 5' bem como na ex-tremidade 3', a primeira fita e/ou a segunda fita podem com-preender um ou diversos nucleotídeos, preferivelmente, nu-cleotídeos adicionais, em qualquer combinação.

Em conjunto com isto, percebe-se que aqueles nu-cleotídeos da fita individual que vão além da(s) extremida-de (s) do trecho correspondente à respectiva fita podem serusados para contribuir adicionalmente com a complementarida-de e com a identidade do trecho, respectivamente, e, assim,com a abordagem específico da seqüência de ácido nucléicoque codifica para RTP801.

Percebe-se que, basicamente, com base no preceitotécnico aqui fornecido, o ácido nucléico de acordo com apresente invenção pode abordar qualquer parte da seqüênciade ácido nucléico que codifica para RTP801, preferivelmenteque codifica para RTP801 no sistema de tradução em que a ex-pressão de RTP801 deve ser reduzida. Até certo ponto, a pre-sente invenção compreende qualquer ácido nucléico com as ca-racterísticas aqui definidas, em que as fitas e trechos doácido nucléico de acordo com a presente invenção complemen-tares e idênticas podem começar, basicamente, de qualquernucleotideo da seqüência de ácido nucléico que codifica paraRTP801. Dessa maneira, sob a condição de que o primeiro tre-cho do ácido nucléico de acordo com a presente invenção sejacomplementar à seqüência de ácido nucléico que codifica paraRTP801, isto é, a sua fita anti-sentido ou que está em ori-entação anti-sentido a ela, o primeiro nucleotideo do ditotrecho, isto é, o nucleotideo mais 51-terminal corresponde,isto é, se alinha, ao último nucleotideo da seqüência quecodifica para RTP801 na extremidade 3'. Em uma modalidadeadicional, tal nucleotideo mais 5'-terminal corresponde aopenúltimo nucleotideo do ácido nucléico que codifica paraRTP801, e assim por diante, que seja alcançada a última po-sição que, dado o comprimento do trecho anti-sentido, aindapermite que a o fita anti-sentido do ácido nucléico de acor-do com a presente invenção seja complementar à seqüência deácido nucléico que codifica para RTP801. Até certo ponto,está na presente invenção qualquer ácido nucléico de acordocom a presente invenção que pode ser gerado pela varredurada seqüência de ácido nucléico que codifica para RTP801 co-meçando do seu nucleotideo mais 5'-terminal e cobrindo sobreo desenho básico do ácido nucléico de acordo com a presenteinvenção e realizando as características para tal ácido nu-cléico de acordo com a presente invenção. As mesmas conside-rações são aplicáveis às modalidades aqui divulgadas em quea complementaridade e a identidade do ácido nucléico de a-cordo com a presente invenção é fornecida não somente peloprimeiro trecho e pelo segundo trecho, respectivamente, mastais complementaridade e identidade também envolvem um oumais nucleotideos além do primeiro trecho e do segundo tre-cho, respectivamente, sendo, então, parte da primeira fita eda segunda fita, respectivamente.

Dos vários ácidos nucléicos de acordo com a pre-sente invenção aqui divulgados, aqueles com números de refe-rência internos 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 e 50 (ve-ja Tabela A) e 257, 260-262, e 264-268 (veja Tabela D) sãoparticularmente preferidos. Em conjunto com isto, percebe-seque aqueles ácidos nucléicos de acordo com a presente inven-ção que podem ser usados tanto em humano quanto em um modeloanimal, tais como rato e/ou camundongo, são particularmenteusados. A surpreendente vantagem destes ácidos nucléicos emparticular de acordo com a presente invenção reside no fatode que eles são efetivos tanto em humanos quanto em um mode-lo animal, o que significa que os resultados de teste obti-dos no modelo animal pode ser imediatamente transferido domodelo animal ao ser humano, e mais particularmente, sem anecessidade de fazer nenhuma mudança na seqüência humanaque, de outra forma, seria necessária no caso em que o ácidonucléico de acordo com a presente invenção fosse projetadotal como para compreender uma(s) seqüência(s) que difere en-tre as espécies, mais particularmente, a espécie usada parao teste em modelo animal e em homem como os organismos oupaciente preferidos definitivos. É adicionalmente preferívelque estes ácidos nucléicos tenham uma modificação padrão,também descrita nos exemplos.

Entretanto, também está na presente invenção o fa-to de que qualquer uma das seqüências de acordo com SEQ. ID.NOs. 3, 16-17, 22-27, 29, 41-46, 51-53, 66-67, 72-77, 79,91-96 101-102, 525, 528-530, 532-536, e respectivas combina-ções resultantes na molécula de ácidos nucléicos de acordocom a presente invenção com números de referência internos14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 e 50 (da Tabela A) e 257,260-262, e 264-268 (da Tabela D) estão somente parcialmentecontidas em um ácido nucléico adicional de acordo com a pre-sente invenção. Preferivelmente, os ácidos nucléicos adicio-nais de acordo com a presente invenção compreendem pelo me-nos 14 nucleotídeos contíguos do SEQ. ID. NOs 3, 16-17, 22-27, 29, 41-46, 51-53, 66-67, 72-77, 79, 91-96 101-102, 525,528-530, 532-536, e mais preferivelmente, 14 pares base denucleotídeos contíguos em qualquer extremidade da estruturade fita dupla incluída no primeiro trecho e no segundo tre-cho como delineado na tabela precedente. Versados na técnicatambém entendem que dado o comprimento em potencial do ácidonucléico de acordo com a presente invenção e, particularmen-te, dos trechos individuais que formam tal ácido nucléico deacordo com a presente invenção, são possíveis alguns deslo-camentos em relação à seqüência de codificação de RTP801 pa-ra cada lado, em que tais deslocamentos pode ser de até 1,2, 3, 4, 5 e 6 nucleotídeos em ambas as direções, e em que aassim gerada molécula de ácidos nucléicos de fita dupla tam-bém devem estar na presente invenção.

Em uma modalidade preferida da presente invenção,o primeiro trecho e a primeira fita têm o mesmo comprimento.Igualmente, é preferível que a segunda fita tenha o mesmocomprimento do segundo trecho, em que é ainda mais preferí-vel que o primeiro trecho e o segundo trecho tenham o mesmocomprimento. Em uma modalidade ainda mais preferida, a pri-meira fita compreende somente o primeiro trecho e a segundafita compreende somente o segundo trecho. Em uma modalidadeainda mais preferida, nem o primeiro trecho, e assim a pri-meira fita, nem o segundo trecho, e assim a segunda fita,compreendem uma abundância. Em outras palavras, também estána presente invenção o fato de que os ácidos nucléicos defita dupla de acordo com a presente invenção têm extremidadecega, preferivelmente, em cada extremidade da estrutura defita dupla dos ácidos nucléicos de acordo com a presente in-venção. Tal estrutura com extremidade cega pode ser realiza-da em conjunto com quaisquer outras modalidades dos ácidosnucléicos de acordo com a presente invenção, particularmen-te, aquelas modalidades em que os ácidos nucléicos de acordocom a presente invenção têm uma modificação padrão, maispreferivelmente, uma modificação padrão aqui descrita.

Em um aspecto adicional, o ácido nucléico de acor-do com a presente invenção tem, assim, um desenho básico quefornece extremidades cegas em ambas as extremidades da es-trutura de fita dupla do ácido nucléico de acordo com a pre-sente invenção. Entretanto, também está na presente invençãoo fato de que há uma abundância, isto é, um trecho de um oumais nucleotideos que projetam-se da estrutura de fita du-pla. A abundância pode ser, em principio, no extremidade 5'da fita anti-sentido, na extremidade 3! da fita anti-sentido, na extremidade 5' da fita sentido e/ou na extremi-dade 3' da fita sentido. Percebe-se que a realização dequalquer uma das ditas opções, bem como de qualquer combina-ção destas, está na presente invenção. É mais preferida umacombinação, em que a abundância está localizada na extremi-dade 3' da fita anti-sentido e na extremidade 3' da fitasentido. Também está na presente invenção o fato de que aabundância é na extremidade 5' da fita anti-sentido e na ex-tremidade 5' da fita sentido. Além do mais, está na presenteinvenção o fato de que a abundância é localizada somente nafita anti-sentido da estrutura de fita dupla, mais preferi-velmente, na extremidade 3' da fita anti-sentido da estrutu-ra de fita dupla.

Em conjunto com as abundâncias, percebe-se que aabundância mais o trecho formam, preferivelmente, a fita eos comprimentos aqui fornecidos para os trechos se aplicamtambém a estas modalidades. A abundância individual pode,independente de sua localização, consistir de pelo menos umnucleotideo. Entretanto, a abundância individual pode com-preender tanto quanto 10 e, preferivelmente, tem dois nucle-otideos de comprimento. Está na presente invenção o fato deque o(s) respectivo(s) nucleotideo(s) que formam a(s) abun-dância (s) também é(s) complementar(s) à seqüência de ácidonucléico que codifica para RTP801 no caso da primeira fitaser complementar à dita seqüência de ácido nucléico que co-difica para RTP801, e a abundância sendo na extremidade 3'ou 5' da fita anti-sentido, ou de que a(s) abundância (s)é(s) idêntica(s) à seqüência de ácido nucléico que codificapara RTP801 no caso da primeira fita ser idêntica à seqüên-cia de ácido nucléico que codifica para RTP801. O mesmo seaplica a qualquer abundâncias localizadas no segundo trechodo desenho básico do ácido nucléico de acordo com a presenteinvenção, em que percebe-se que o desenho da abundância nosegundo trecho pode ser independente do desenho da abundân-cia no primeiro trecho.

Também está na presente invenção o fato de que osnucleotideos que formam abundância não são nem complementa-res nem idênticos aos nucleotideos correspondentes da se-qüência de ácido nucléico que codifica para RTP801. Da formaaqui usada, e preferivelmente neste modalidade, "correspon-dente" significa os nucleotideos respectivos que seguem naextremidade 51 e/ou na extremidade 3' do trecho com uma con-traparte de nucleotideo no ácido nucléico que codifica paraRTP801.

Preferivelmente, a primeira fita compreende no seuextremidade 3' dois nucleotideos, preferivelmente, desoxinu-cleotideos, e mais preferivelmente, dois TT e/ou estes tiposde nucleotideos também na extremidade 3' da segunda fita, emque, mais preferivelmente, o comprimento do primeiro trechoe do segundo trecho é 19 nucleotideos. Assim, as fitas sãoincluídas no trecho e na abundância. Nesta modalidade, a es-trutura de fita dupla consiste em 19 pares base e uma abun-dância de dois nucleotideos em cada final da extremidade 3'trecho individual.

Em uma modalidade preferida, o primeiro trechoe/ou a primeira fita compreende(s) ribonucleotideos, em queé particularmente preferível que o primeiro trecho consista,em sua íntegra, de ribonucleotideos. O mesmo se aplica aosegundo trecho e à segunda fita, respectivamente. Entretan-to, em conjunto com isto, cada um e todos os nucleotídeos doprimeiro trecho e do segundo trecho, respectivamente, sãomodificados em uma modalidade preferida. O mesmo se aplica àprimeira fita e à segunda fita, respectivamente. Particular-mente, os nucleotídeos terminais, independente se eles sãoribonucleotideos ou desoxiribonucleotídeos, podem ter umgrupo OH que, como tal, pode ser modificado. Tal grupo OHpode derivar tanto da fração de açúcar do nucleotídeo, maispreferivelmente da posição 5 no caso do grupo 51OH e/ou daposição 3' no caso do grupo 31OH, quanto de um grupo fosfatoanexado na fração de açúcar do respectivo nucleotídeo termi-nal. Em princípio, o grupo fosfato pode ser anexado em qual-quer grupo OH da fração de açúcar do nucleotídeo. Preferi-velmente, o grupo fosfato é anexado no grupo 5'OH da fraçãode açúcar, no caso do grupo 5' OH livre, e/ou no grupo 31OHda fração de açúcar, no caso do grupo 3'OH livre, ainda for-necendo o que é aqui chamado de grupo 5' ou 3' OH livre.

Da forma aqui usada com qualquer estratégia para odesenho do RNAi ou com qualquer modalidade de RNAi aqui di-vulgada, o termo modificação final significa uma entidadequímica adicionada ao nucleotídeo mais 5' ou 3' das primeirae/ou segunda fitas. Exemplos para tais modificações finaisincluem, mas sem limitações, fosfato 3' ou 5', abásicos (de-soxi) invertidos, amina, flúor, cloro, bromo, CN, CF, metó-xi, imidazola, caboxilato, tioato, alquila Ci a Ci0 inferior,alquila inferior substituída, alcarila ou aralquila, OCF3,OCN, 0-, S- ou N-alquila; 0-, S- ou N-alquenila; SOCH3;SO2CH3; ONO2; NO2, N3; heterocicloalquila; heterocicloalcari-la; aminoalquilamino; polialquilamino ou silano substituído,como, entre outros, descritos nas patentes européias EP 0586 520 Bl ou EP 0 618 925 BI.

Da forma aqui usada, alquila ou qualquer termo quecompreende "alquila" significa, preferivelmente, qualquercadeia de átomo de carbono que compreende 1 a 12, preferi-velmente 1 a 6 e mais, preferivelmente 1 a 2 átomos C.

Uma modificação final adicional é um grupo bioti-na. Preferivelmente, tal grupo biotina pode ser anexado tan-to no nucleotídeo mais 5' quanto no mais 3' das primeirae/ou segunda fitas ou em ambos os finais. Em uma modalidademais preferida, o grupo biotina é acoplado em um polipeptí-deo ou em uma proteína. Também está no escopo da presenteinvenção o fato de que o polipeptídeo ou a proteína são ane-xados por meio de qualquer uma as outras supramencionadasmodificações finais. 0 polipeptídeo ou proteína podem confe-rir características adicionais à molécula de ácidos nucléi-cos de acordo com a presente invenção. Entre outros, o poli-peptídeo ou a proteína podem agir como um -Iigante a uma ou-tra molécula. Se a dita outra molécula for um receptor, afunção e a atividade do receptor podem ser ativadas pelo Ii-gante de ligação. 0 receptor pode mostrar uma atividade deinternalização que permite uma efetiva transfecção das molé-culas de ácidos nucléicos ligadas a ligante de acordo com apresente invenção. Um exemplo para o ligante a ser acopladona molécula de ácido nucléico inventiva é VEGF e o receptorcorrespondente é o receptor de VEGF.

Várias modalidades possíveis do RNAi da presenteinvenção com diferente(s) tipo(s) de modificação(s) final(s)são apresentadas na seguinte Tabela 1.

Tabela 1; várias modalidades do ácido ribonucléicointerferente de acordo com a presente invenção

<table>table see original document page 141</column></row><table><table>table see original document page 142</column></row><table>

As várias modificações finais aqui divulgadas es-tão preferivelmente localizadas na fração de ribose de umnucleotideo do ácido nucléico de acordo com a presente in-venção. Mais particularmente, a modificação final pode seranexada em qualquer um dos grupos OH da fração de ribose,incluindo, mas sem limitações, a posição 2ΌΗ, 3'OH e 51OH,ou substitui-los, contanto que o nucleotideo assim modifica-do seja um nucleotideo terminal. Abásicos invertidos são nu-cleotideos, tanto desoxiribonucleotideos quanto ribonucleo-tideos que não têm uma fração de nucleobase. Este tipo decomposto é descrito, entre outros, em Sternberger, M., Sch-miedeknecht, A., Kretschmer, A., Gebhardt, F., Leenders, F.,Czauderna, F., Von Carlowitz, I., Engle, M., Giese, K., Bei-gelman, L. & Klippel, A. (2002). Antisense Nucleic Acid DrugDev, 12, 131-43.

Qualquer uma das supramencionadas modificações fi-nais pode ser usada em conjunto com as várias modalidades deRNAi representadas na Tabela 1. Percebe-se, usualmente, queas modificações finais 5' supramencionadas são presentes so-mente na fita sentido da molécula de RNAsi.

Modificações adicionais podem estar relacionadas àfração de nucleobase, à fração de açúcar ou à fração de fos-fato do nucleotídeo individual.

Tal modificação da fração de nucleobase pode serde maneira tal que os derivados de adenina, guanina, citosi-na e timidina e uracila, respectivamente, sejam modificados.Nucleobases modificados particularmente preferidos são sele-cionados do grupo que compreende inosina, xantina, hipoxan-tina, 2-aminoadenina, β-metila, 2-propila e outras alquila-deninas, 5-halo uracila, 5-halocitosina, 5-halo citosina, 6-azacitosina, 6-aza timina, pseudo-uracila, 4-tiouracila, 8-halo adenina, 8-aminoadenina, 8-tiol adenina, 8-tioalquiladeninas, 8-hidroxil adenina e outras adeninas 8-substi-tuidas, 8-halo guaninas, 8-amino guanina, 8-tiol guanina, 8-tioalquil guanina, 8-hidroxilguanina e outras guaninas subs-tituidas, outras aza- e deaza adeninas, outras aza- e deazaguaninas, 5-trifluormetil uracila e 5-trifluor citosina.

Em uma outra modalidade preferida, a fração de a-çúcar do nucleotideo é modificada, em que tal modificaçãoestá, preferivelmente, na posição 2' das frações de ribose ede desoxiribose, respectivamente, do nucleotideo. Mais pre-ferivelmente, o grupo 2'OH é substituído por um grupo oufração selecionados do grupo que compreendendo amina, flúor,alcóxi e alquila. Preferivelmente, alcóxi é tanto metóxiquanto etóxi. Também preferivelmente, alquila significa me-tila, etila, propila, isobutila, butila e isobutila. É aindamais preferível que, independente do tipo de modificação, onucleotídeo seja, preferivelmente, um ribonucleotídeo.

Preferivelmente, a modificação da fração de fosfa-to é selecionada do grupo que compreende fosfotioatos.

Versados na técnica percebem que o ácido nucléicoda presente invenção que consiste de uma multiplicidade denucleotideos pode ser assim formado por nucleotideos que sãoligados por meio de uma ligação fosfodiéster ou por meio deuma ligação fosfotioato, ou um combinação de ambos ao longodo comprimento da seqüência de nucleotideo das fita e trechoindividuais, respectivamente.

Uma forma adicional de nucleotideos usados podeser, realmente, NAsi que é descrita, entre outros, no pedidode patente internacional WO 03/070918.

Os nucleotideos que formam o primeiro trecho e aprimeira fita, respectivamente, do ácido nucléico de acordocom a presente invenção podem compreende um ou mais nucleo-tideos modificados, em que o nucleotideo modificado indivi-dual tem uma modificação que é preferivelmente uma modifica-ção aqui divulgada. Além da modificação em particular, a mo-dificação pode ser ou compreender alguma espécie de rótulo,em que o rótulo é selecionado do grupo de rótulos quimiolu-minescentes, rótulos fluorescentes e rótulos radioativos.

Estes tipos de rótulos são conhecidos pelos versados na téc-nica e são descritos, por exemplo, em Ausubel et al., Cur-rent Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons,Baltimore, Maryland, 1998. 0 ácido nucléico assim rotuladode acordo com a presente invenção também pode ser usado compropósitos de diagnóstico ou para monitorar o sitio de ação,bem como para a preparação de qualquer tratamento, preferi-velmente, relacionados a qualquer uma das doenças aqui di-vulgadas.

Em uma modalidade preferida, o ácido nucléico deacordo com a presente invenção é modificado de maneira talque os nucleotideos pirimidina no trecho ou fita sentido se-jam nucleotideos pirimidina 2'0-metila e, tanto adicional-mente quanto alternativamente, os nucleotideos purina notrecho ou fita sentido são nucleotideos 21-desoxipurina. Emuma modalidade adicional, os nucleotideos pirimidina presen-tes no trecho sentido ou fita sentido são nucleotideos piri-midina 2'-desoxi-21-flúor.

Em uma modalidade alternativa, a modificação não ébaseada na química do nucleotídeo, isto é, a modificação de-pende se o nucleotídeo a ser modificado é tanto um nucleotí-deo purina quanto um nucleotídeo pirimidina, mas é predomi-nantemente baseado no arranjo espacial do nucleotídeo indi-vidual na estrutura geral de fita dupla do desenho básico doácido nucléico de acordo com a presente invenção.

Mais particularmente, tanto a primeira fita e oprimeiro trecho, respectivamente, quanto a segunda fita e osegundo trecho, respectivamente, mostram um padrão espacialde modificação do nucleotideos que forma os ditos trechos efitas, respectivamente.

Focalizando no primeiro trecho, há um padrão degrupos de nucleotideos modificados e grupos de nucleotideosnão modificados. Estes grupos de nucleotideos não modifica-dos também são aqui chamados de grupos de flanqueamento denucleotideos. Mais preferivelmente, o padrão consiste degrupos de nucleotideos modificados e nucleotideos não modi-ficados. Ainda mais preferivelmente, o padrão é um padrãoregular e, ainda mais preferivelmente, um padrão alternadoao longo do comprimento do primeiro trecho do ácido nucléicode acordo com a presente invenção. O grupo de nucleotideosmodificados pode consistir tanto em um quanto em diversosnucleotideos que são modificados e que são, preferivelmente,nucleotideos que são modificados na posição 2', isto é, comuma modificação na fração de açúcar. Mais preferivelmente,esta modificação é uma modificação 2'-O-Me.

O grupo de nucleotideos não modificados pode con-sistir tanto em um quanto vários nucleotideos que são tantonão modificados, por meio do que os nucleotideos não modifi-cados são preferivelmente ribonucleotideos, quanto os nucle-otideos não modificados são nucleotideos tendo uma modifica-ção, por meio do que tal modificação é diferente da modifi-cação apresentada pelos nucleotideos que formam o grupo denucleotideos modificados. Ainda mais preferivelmente, os nu-cleotideos não modificados são ribonucleotideos. Pode-se no-tar que o termo não modificado e nucleotideo não modificadosão utilizados indiferentemente, se não indicado o contrá-rio. O primeiro trecho do ácido nucléico de acordo com apresente invenção pode tanto começar com um grupo de nucleo-tideos modificados quanto começar com um grupo de nucleoti-deos não modificados da maneira aqui definida. Entretanto, épreferível que o primeiro trecho comece com um grupo de nu-cleotideos modificados. Acima de tudo preferivelmente, ogrupo de nucleotideos modificados consiste de um único nu-cleotideo. Com relação a esta modalidade, o primeiro trechoé preferivelmente uma orientação anti-sentido ao ácido nu-cléico codificado para RTP801. Está também de acordo com apresente invenção que a modificação apresentada pelos nucle-otideos que formam o grupo de nucleotideos modificados sejaa mesma para todos os grupos de nucleotideos modificadospresentes no primeiro trecho. Entretanto, está também de a-cordo com a presente invenção que algum grupo de nucleoti-deos modificados tenha uma modificação diferente de um ouvários grupos de nucleotideos modificados presente no pri-meiro trecho.

Na segunda fita de ácido nucléico de acordo com apresente invenção, um padrão descrito para o primeiro trechopode ser também realizado. As mesmas características descri-tas com relação ao primeiro trecho podem igualmente ser rea-lizadas em uma modalidade do segundo trecho, por meio do queé preferível que, com a condição que o segundo trecho sejaem orientação sentido relativo à seqüência do ácido nucléicoque codifica para RTP801, a segunda fita do ácido nucléicode acordo com a presente invenção comece com um grupo de nu-cleotídeos não modificados.

O ácido nucléico de acordo com a presente inven-ção, compreendendo uma estrutura de fita dupla, pode compre-ender um primeiro trecho tendo o padrão de modificação comoaqui descrito. Alternativamente, o ácido nucléico de fitadupla, de acordo com a presente invenção, pode compreenderum segundo trecho tendo o padrão de modificação como descri-to anteriormente. Entretanto, é acima de tudo preferível queo ácido nucléico de fita dupla, de acordo com a presente in-venção, consista em um primeiro trecho e um segundo trecho,por meio do que tanto o primeiro trecho quanto o segundotrecho tenham um padrão de modificação espacial como aquidescrito.

Está de acordo com a presente invenção que as ca-racterísticas do padrão de modificação espacial sejam asmesmas em ambos os trechos, em termos de tamanho dos gruposde nucleotídeos modificados e grupos de nucleotídeos não mo-dificados e o tipo de modificação realmente usada. Preferi-velmente, o padrão espacial de modificação no primeiro tre-cho é deslocado de maneira tal que um grupo de nucleotídeosmodificados no primeiro trecho seja oposto a um grupo de nu-cleotídeos não modificados no segundo trecho e vice-versa.Entretanto, está também de acordo com a presente invençãoque os padrões sejam alinhados exatamente, isto é, que umgrupo de nucleotídeos modificados no primeiro trecho fiqueoposto a um grupo de nucleotídeos não modificados no segundotrecho, e um grupo de nucleotídeos não modificados no pri-meiro trecho fique oposto a um grupo de nucleotídeos não mo-dificados no segundo trecho. Está ainda de acordo com a pre-sente invenção que o padrão espacial de modificação no pri-meiro trecho e no segundo trecho seja relativamente desloca-do um pelo outro, de forma que apenas uma primeira porção deum grupo de nucleotídeos modificados em um trecho fique o-posto a uma porção de um grupo de nucleotídeos não modifica-dos em outro trecho, ao passo que a segunda porção do grupode nucleotídeos modificados é oposta a um outro grupo de nu-cleotídeos modificados. Está de acordo com a presente inven-ção que a revelação aqui provida no padrão espacial de modi-ficação do(s) trecho(s) do ácido nucléico de acordo com apresente invenção aplica também na(s) fita(s) do ácido nu-cléico de acordo com a presente invenção. Entretanto, é pre-ferivel que os trechos do ácido nucléico compreendam o pa-drão espacial de modificação e as fitas compreendam taistrechos e uma ou mais saliência(s) aqui reveladas. É parti-cularmente preferível que a saliência seja um grupo fosfatona extremidade 3' tanto na fita anti-sentido quanto na fitasentido, quanto em ambas as fitas, por meio do que é maispreferível que o grupo fosfato esteja na extremidade 3' tan-to da fita anti-sentido quanto da fita sentido. Em uma moda-lidade ainda mais preferível, o grupo fosfato é um grupofosfato tal como aqui definido.

Está também de acordo com a presente invenção queo ácido nucléico de acordo com a presente invenção possa e-xibir um ligante que conecta a primeira e a segunda fita.Tal ligante é preferivelmente um polímero. O polímero podeser qualquer polímero sintético ou natural. Possíveis ligan-tes sintéticos são, entre outros, PEG ou um polinucleotídeo.Tal ligante é preferivelmente projetado de maneira que per-mita tanto dobra parcial quanto completa do primeiro trechosobre o segundo trecho e vice-versa.

Finalmente, está de acordo com a presente invençãoque o ácido nucléico de acordo com a presente invenção sejaum sintético, um quimicamente sintetizado, um isolado, ou umderivado de qualquer fonte natural tal como, por exemplo,preparado por meio de tecnologia recombinante. Com relação àpreparação de qualquer ácido nucléico, de acordo com a pre-sente invenção, qualquer modificação como aqui revelada podeser introduzida tanto antes, durante, quanto depois da pre-paração do respectivo ácido nucléico de acordo com a presen-te invenção como é de conhecimento dos versados na técnica.

0 vetor, de acordo com a presente invenção, com-preende um ácido nucléico de acordo com a presente invenção.Adicionalmente, o vetor pode incluir elementos para contro-lar alvejamento, expressão e transcrição do dito ácido nu-cleico de uma maneira célula seletiva como é de conhecimentona tecnologia. O plasmideo pode incluir um promotor paracontrolar a transcrição do material heterólogo, isto é, oácido nucléico de acordo com a presente invenção, e pode sertanto um promotor constitutivo quanto um indutivel para per-mitir a transcrição seletiva. Melhoradores que podem ser e-xigidos para obter níveis de transcrição necessária podemser incluídos opcionalmente. Melhoradores são, em geral,qualquer seqüência de DNA não traduzida que funciona conti-guamente com a seqüência de codificação, assim em eis, paramudança do nível de transcrição basal ditado pelo promotor.A expressão de tais construções é de conhecimento dos versa-dos na técnica e pode ser feita, por exemplo, pela provisãode uma respectiva construção em tandem ou tendo diferentespromotores transcrevendo para a primeira e segunda fita eprimeiro e segundo trecho, respectivamente, do ácido nucléi-co de acordo com a presente invenção.

Quando o ácido nucléico de acordo com a presenteinvenção é produzido ou expresso, preferivelmente expressoin vivo, mais preferivelmente em um paciente que precisa doácido nucléico de acordo com a presente invenção, tal produ-ção ou expressão preferivelmente usa um vetor de expressão,preferivelmente um vetor de expressão de mamífero. Vetoresde expressão são conhecidos na tecnologia e, preferivelmen-te, compreendem plasmídeos, cosmideos, sistemas de expressãoviral. Sistemas de expressão viral preferidos incluem, massem limitações, adenovírus, retrovírus e lentivirus.

Na tecnologia são conhecidos métodos para introdu-zir os vetores em células ou tecidos. Tal método pode serencontrado em geral descrito em Sambrook et al., Molecularcloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbour Labora-tory, New York (1983, 1992), ou em Ausubel et al. , CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley e Sons, Baltimo-re, Maryland, 1998.

Métodos adequados compreendem, entre outros,transfecção, lipofecção, eletroporação e infecção com veto-res virais recombinantes. Com relação a presente invenção,um recurso adicional do vetor é, em uma modalidade, um re-curso de limitação de expressão, tais como um promotor e e-lemento regulador, respectivamente, que são específicos parao tipo de célula desejada, permitindo assim a expressão daseqüência do ácido nucléico de acordo com a presente inven-ção, apenas uma vez que seja provido a base que permite aexpressão desejada.

Em um aspecto adicional, a presente invenção dizrespeito a uma composição farmacêutica compreendendo um áci-do nucléico de acordo com a presente invenção e/ou um vetorde acordo com a presente invenção e, opcionalmente, um car-reador, diluente ou adjuvantes ou outro(s) veiculo(s) farma-ceuticamente aceitável. Preferivelmente, tais carreadores,diluentes, adjuvantes e veículos são inertes, e não tóxicos.

A composição farmacêutica é, em suas várias modalidades, a-daptada para administração de várias maneiras. Tal adminis-tração compreende administração sistêmica e local bem comooral, subcutânea, parenteral, intravenosa, intra-arterial,intramuscular, intraperitonial, intranasal e intratecal.

É de conhecimento dos versados na técnica que aquantidade da composição farmacêutica e o respectivo ácidonucléico e vetor, respectivamente, dependem da condição clí-nica do paciente individual, do sítio e métodos de adminis-tração, programa de administração, idade do paciente, sexo,peso corporal e outros fatores conhecidos pelos profissio-nais médicos. A quantidade farmaceuticamente efetiva compropósitos de prevenção e/ou tratamento é assim determinadapor considerações tais como aquelas conhecidas pela tecnolo-gia médica. Preferivelmente, a quantidade é efetiva para al-cançar melhorias incluindo, mas sem limitações, melhorar acondição da doença ou proporcionar recuperação, melhorias oueliminação mais rápida dos sintomas e outros indicadorestais como selecionados como medidas apropriadas pelos versa-dos na técnica médica.

Em uma modalidade preferida, a composição farma-cêutica de acordo com a presente invenção pode compreenderoutros compostos farmaceuticamente ativos. Preferivelmente,tais outros compostos farmaceuticamente ativos são selecio-nados do grupo compreendendo compostos que permitem absorçãointracelular, compostos que permitem liberação endossomal,compostos que permitem um maior tempo de circulação e com-postos que permitem o alvejamento de células endoteliais oucélulas patogênicas. Compostos preferidos para liberação en-dossomal são cloroquina e inibidores de bombas de H+ depen-dentes de ATP.

A composição farmacêutica é preferivelmente formu-lada de maneira a proporcionar uma administração de dosagemúnica ou uma administração de dosagens múltiplas.

É de conhecimento que a composição farmacêutica deacordo com a presente invenção pode ser usada para qualquerdoença que envolve desenvolvimento ou crescimento indesejadode vasculatura, incluindo angiogênese, bem como qualquer dasdoenças e condições aqui descritas. Preferivelmente, essestipos de doenças são doenças tumorais. Entre doenças tumo-rais, os seguintes tumores são acima de tudo preferidos:câncer endometrial, carcinomas coloretais, gliomas, cânceresendometriais, adenocarcinomas, hiperplasia endometrial, sín-drome de Cowden, carcinoma coloretal hereditário sem polipo-se, sindrome de Li-Fraumene, câncer de mama-ovário, câncerde próstata (Ali, I. U., Journal of the National Câncer Ins-titute, Vol. 92, no. 11, June 07, 2000, page 861 - 863),Bannayan-Zonana syndrome, LDD (Lhermitte-Duklos'syndrome)(Macleod, Κ., supra) doenças hamartoma-macrocefalia incluin-do doença de Cow (CD) e sindrome de Bannayan-Ruvalcaba-Rily(BRR), lesões mucocutâneas (por exemplo, triquilemomas), ma-crocefalia, retardo mental, hamartomas gastrintestinais, li-pomas, adenomas da tireóide, doença fibrocística da mama,gangliocitoma displásico do cerebelo e malignidades da mamae tireóide (Vazquez, F., Sellers, W. R., supra).

Deve-se saber que quaisquer das doenças tumorais aser tratadas com a composição farmacêutica de acordo com apresente invenção é preferivelmente uma doença tumoral deúltimo estágio. Em uma outra modalidade, a doença tumoralenvolve células que são supressoras tumorais negativas, pormeio do que, mais pref erivelmente, o supressor de tumor éPTEN.

A composição farmacêutica de acordo com a presenteinvenção pode também ser usada em um método para prevenire/ou tratar uma doença aqui revelada, por meio do que o mé-todo compreende a administração de um ácido nucléico de a-cordo com a presente invenção, um vetor de acordo com a pre-sente invenção ou uma composição farmacêutica ou medicamentode acordo com a presente invenção, para quaisquer das doen-ças aqui descritas.

Em um aspecto adicional, a presente invenção dizrespeito a um método para projetar ou classificar um ácidonucléico que é adequado para infraregular RTP801, mais par-ticularmente para infraregular a função RTP801. Esse métodocompreende o uso de uma seqüência de ácido nucléico como a-qui revelada e a avaliação de tal ácido nucléico em um en-saio adequado. Tal ensaio é conhecido na tecnologia e, porexemplo, descrito na parte de exemplo deste pedido. Em umaetapa adicional, um ácido nucléico de fita dupla é projeta-do, preferivelmente de acordo com os princípios do projetoaqui estabelecidos, que é adequado para infraregular RTP801,preferivelmente, com relação a um mecanismo de silenciamentode genes pós-transcricional tal como interferência de RNA.Também o ácido nucléico assim obtido, isto é, projetado ouclassificado, é avaliado no respectivo ensaio e o resulta-do, isto é, o efeito tanto do ácido nucléico de acordo com apresente invenção bem como o ácido nucléico recém projetadoou classificado em tal ensaio é comparado. Preferivelmente,o ácido nucléico projetado ou classificado é mais adequadono caso em que ele é tanto mais estável quanto mais efetivo,preferivelmente ambos. É de conhecimento que o método seráparticularmente efetivo se qualquer dos ácidos nucléicos deacordo com a presente invenção for usado como um ponto departida. Está assim de acordo com a presente invenção que asinéditas moléculas de ácido nucléico serão projetadas combase nos princípios aqui revelados, por meio do que a se-qüência alvo do RNAm RTP801 será ligeiramente deslocada emrelação à seqüência alvo do RNAm RTP801 para o ácido nucléi-co correspondente de acordo com a presente invenção. Prefe-rivelmente, o novo ácido nucléico será deslocado pelo menospor um ou mais nucleotideos, em relação ao trecho do RNAmalvo tanto na direção 5' quanto 3' do RNAm que codifica pa-ra RTP801. Entretanto, está de acordo com a presente inven-ção que o deslocamento ocorre em ambas as direções simulta-neamente, que significa que o novo ácido nucléico incorporao ácido nucléico de acordo com a presente invenção usado co-mo um ponto de partida. Está também de acordo com a presenteinvenção que o alongamento do ácido nucléico de acordo com apresente invenção e usado como um ponto de partida tendetanto para a extremidade 3' quanto para a extremidade 5' . Nocaso de tal tendência, tanto a extremidade 3' quanto a ex-tremidade 5' do novo ácido nucléico é maior, isto é, maisextensa que a outra extremidade. Quando a molécula do novoácido nucléico é gerada estendendo tanto a extremidade 3'quanto a extremidade 5' da fita anti-sentido e/ou da fitasentido, a seqüência seguinte de etapas é tipicamente apli-cada. Se o deslocamento é para a extremidade 5' do RNAm deRTP801, a extremidade 3' da fita anti-sentido tem que serestendida pelo número de nucleotideos pelo qual a extremida-de 5' do RNAm de RTP801 é deslocada. 0(s) nucleotideo(s) as-sim a ser adicionado (s) na extremidade 3' da fita anti-sentido do novo ácido nucléico é/são complementar(s) a essesnucleotideos após a extremidade 5' da seqüência alvo no RNAmde RTP801 usado para a molécula de ácido nucléico de acordocom a presente invenção, usado como um ponto de partida. 0mesmo tem que ser feito para a fita sentido. Entretanto, osnucleotideos a ser adicionados na fita sentido tem que cor-responder, isto é, ser complementares aos nucleotideos recémadicionados na extremidade 3' da fita anti-sentido, que sig-nifica que eles tem que ser adicionados na extremidade 5' dafita sentido. A última etapa na fita sentido, entretanto,tem que ser feita apenas até o ponto em que, fora da fitaanti-sentido, também a fita sentido deve ser deslocada, queé o caso em modalidades preferidas da presente invenção. Em-bora esse deslocamento possa ser feito até um ponto definidopelos versados na técnica, mais preferivelmente o desloca-mento deve ser feito de maneira tal que também o novo ácidonucléico ainda contenha um trecho de pelo menos 14 nucleotí-deos, preferivelmente 14 nucleotideos contíguos exibidos porqualquer das moléculas de ácido nucléico aqui reveladas.

A síntese de qualquer dos ácidos nucléicos aquidescritos está de acordo com os versados na técnica. Talsíntese está, entre outras, descrita em Beaucage S.L. e IyerR.P., Tetrahedron 1992; 48: 2223-2311, Beaucage S.L. e IyerR.P., Tetrahedron 1993; 49: 6123-6194 e Caruthers M. H. et.al., Methods Enzymol. 1987; 154: 287-313, a síntese de tioa-to está, entre outras, descrita em Eckstein F., Aims. Rev.Biochem. 1985; 54: 367-402, a síntese de moléculas de RNAestá descrita em Sproat B., em Humana Press 2005 editado porHerdewijn P.; Kap. 2: 17-31 e respectivos processos à jusan-te estão, entre outros, descritos em Pingoud A. et. al., emIRL Press 1989 editado por Oliver R.W.UM.; Kap. 7: 183-208 eSproat B., em Human Press 2005 editado por Herdewijn P.;Kap. 2: 17-31 (supra).

RNAsi para RTP801 pode ser feito usando métodosconhecidos na tecnologia descrita anteriormente, com base naseqüência conhecida de RTP801 (SEQ ID N0:I), e pode se tor-nar estável por várias modificações descritas anteriormente.Para informação mais detalhada, ver exemplo 9.

Adicionalmente, com relação aos métodos da presen-te invenção aqui descritos, moléculas adicionais de RNA po-dem ser usadas com os ditos métodos, por exemplo, moléculasde RNA inibitórias da presente invenção incluem oligoribonu-cleotídeos de fita simples, preferivelmente compreendendotrechos de pelo menos 7-10 nucleotídeos consecutivos presen-tes nas seqüências detalhadas nas Tabelas A-D, os ditos oli-goribonucleotídeos sendo capazes de formar [e/ou compreen-der] regiões de fita dupla, em particular conformações quesão reconhecidas por complexos intracelulares, levando à de-gradação dos ditos oligoribonucleotideos em moléculas de RNAmenores que são capazes de exercer inibição de seus genesendógenos correspondentes, e moléculas de DNA codificandotais moléculas de RNA. O gene endógeno correspondente é pre-ferivelmente o gene 801 e pode ser adicionalmente o geneVEGF e/ou o gene VEGF-Rl. A invenção também fornece uma com-posição compreendendo o referido oligoribonucleotideo de fi-ta simples em um carreador, preferivelmente um carreadorfarmaceuticamente aceitável.

Adicionalmente, a presente invenção permite tera-pia de combinação para todas as condições aqui reveladas e,em particular, condições envolvendo neovascularização coroi-dal. Na dita terapia de combinação, tanto o gene RTP801quanto VEGFR são inibidos a fim de aliviar os sintomas dadoença que está sendo tratada. Esses genes podem ser inibi-dos com uma combinação de um ou mais RNAsi ou anticorpos ouaptâmeros. Portanto, a presente invenção também fornece umacomposição farmacêutica inédita compreendendo um inibidorRTP801 e um inibidor VEGF ou VEGFR-I, o inibidor RTP801 sen-do preferivelmente um RNAsi, mais preferivelmente uma molé-cula de RNAsi detalhada nas tabelas A-D e, em particular,RNAsi Nos: 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 e 50 da TabelaA ou RNAsi Nos: 257, 260-262, e 264-268 da tabela D, e o i-nibidor VEGF/ VEGFR-I sendo opcionalmente um anticorpo ouaptâmero. O uso combinado dos ditos compostos (isto é, RNAside RTP8 01 e anticorpo VEGF ou qualquer outro exemplo combi-nado aqui revelado) na preparação de um medicamento é tambémparte da presente invenção.

Assim, RNAsi de RTP801 tal como uma molécula deRNAsi detalhada nas tabelas A-D e, em particular, RNAsi Nos:14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42,· 49 e 50 da tabela A ou RNAsiNos: 257, 260-262, e 264-268 da tabela D pode ser adminis-trada em conjunto com agentes que alvejam VEGF ou receptor 1de VEGF (VEGFRl). Tais agentes atualmente existem no mercadoou em vários estágios de aprovação e funcionam por diferen-tes mecanismos. Anticorpos e fragmentos de anticorpos talcomo ranibizumab (Lucentis, Genentech) anexo ao VEGF libera-do para inibição da ligação de VEGF aos receptores ativos.Um aptâmero que pode agir como um ligante/anticorpo (Macu-gen, Eyetech/Pfizer, aprovado recentemente pelo FDA para AMDúmida) é também possível. Macugen se liga com VEGF extrace-lular para bloquear sua atividade. Esses medicamentos sãoadministrados localmente por injeção intravítrea. Compostosbaseados no RNAsi anti-VEGF (tal como inibidor Cand5 de VEGFda Acuity ou inibidor 027 de VEGFR-I da RNAsi) são tambémdisponíveis. Adicionalmente, a pequena molécula de aminoste-rol Squalamine (Genaera) que é administrada sistemicamenteinterfere reportadamente em múltiplas facetas do processoangiogênico, incluindo inibição de VEGF e outros fatores decrescimento que sinalizam em células endoteliais.

A administração conjunta de um inibidor RTP801,preferivelmente um RNAsi, e qualquer dos agentes inibidoresVEGF/VEGFR-I anteriores pode ter um efeito sinergistico, pormeio do que o dito tratamento combinado é mais efetivo que otratamento por qualquer dessas composições individuais, in-dependente da dosagem na opção de terapia única. Esse efeitosinergistico é também suportado por resultados preliminarescomo detalhado no exemplo 6.

RTP801 tem um mecanismo diferente de ação e é po-tencialmente sinergistico com inibidores VEGF-VEGFR. Um es-tudo em Camundongos KO RTP801 indica que o fenótipo protetorem Camundongos KO persiste, a despeito do fato de que a ex-pressão de RNAm VEGF no olho é tão alta quanto em Camundon-gos WT. Nossos dados preliminares adicionais indicam que i-nibição do RTP801 pode ser sinergistica com a inibição doeixo regulador do VEGF-VEGFR no tratamento de patologia re-tinal. Os inventores da presente invenção observaram em ex-perimentos apropriados que administração de RNAsi contraRTP801 em modelo de AMD (ver exemplo 6 a seguir) leva nãoapenas à infra-regulagem do próprio RTP801, mas também comouma conseqüência, à supra-regulagem do fator PEDF antiogêni-co e neuroprotetor, bem como a infra-regulagem de expressãode MCPl, uma proteína quimioatraente de macrófago. Assim, ainibição de RTP801 simultaneamente confere efeitos antiogê-nicos, neuroprotetores e antiinflamatórios.

Como aqui revelado, aptâmeros podem ser usadostambém na presente invenção em combinação com o RNAsi inédi-to aqui revelado. Por exemplo, um aptâmero pode ser usadocom qualquer um dos RNAsi aqui revelados em terapia de com-binação para o tratamento de qualquer uma das condições aquireveladas. A composição farmacêutica inédita empregada parauma terapia de combinação como esta, que é também parte dapresente invenção, pode compreender um RNAsi da presente in-venção covalentemente ou não covalentemente anexado a um ap-tâmero. Aptâmeros são ácidos oligonucléicos de RNA ou DNA defita simples ou fita dupla que se ligam a uma proteína alvoe geralmente não apresentam efeitos não específicos. Aptâme-ros podem ser modificados para estabilidade ou outra quali-dade desejada de acordo com qualquer modificação de ácidonucléico aqui revelada, e/ou conhecida pelos versados natécnica. Modificações nos aptâmeros podem ser introduzidasem qualquer local na molécula, tais como os terminais 5' ou3', ou em qualquer sítio de modificação definido internamen-te. Por exemplo, aptâmeros de RNA podem ser estabilizadoscom pirimidinas modificadas 2'-Fluor ou 2'-amino. Aptâmerospodem também ser ligados nas moléculas reportadoras ou com-postos químicos ligantes e podem ser anexados à contas ououtro suporte sólido se necessário (por exemplo, grupos de5' ou 31 amino, tiol éster ou biotina). Tioaptâmeros são ap-tâmeros que contém modificação de enxofre em sítios especí-ficos de internucleosídeo fosforila, e podem possuir uma me-lhor estabilidade, resistência à nuclease, afinidade e/ouseletividade ao alvo. Exemplos de tioaptâmeros incluem oli-godeóxi tioaptâmeros de fosforomonotioato (S-ODN) e fosforo-ditioato (S2-0DN). Para informação mais detalhada a respeitode aptâmeros e tioaptâmeros ver patentes U.S. 5.218.088 e6.423.493.Deve-se entender que, no contexto da presente in-venção, qualquer das moléculas de RNAsi aqui reveladas, ouquaisquer moléculas de RNA de fita dupla compridas (tipica-mente 25-500 nucleotideos de comprimento) que são processa-das por complexos celulares endógenos (tal como DICER - veranteriormente) para formar as moléculas de RNAsi aqui reve-ladas, ou moléculas que compreendem as moléculas de RNAsiaqui reveladas, podem ser empregadas no tratamento das doen-ças ou desordens aqui descritas.

Desordens adicionais que podem ser tratadas pelasmoléculas e composições da presente invenção incluem todosos tipos de neovascularização coroidal (CNV), que ocorremnão apenas em AMD úmida, . mas também em outras patologiasoculares, tais como sindrome da histoplasmose ocular, estri-as angióides, rupturas na membrana de Bruch, degeneração mí-ope, tumores oculares e algumas doenças degenerativas da re-tina.

Um aspecto adicional da presente invenção fornecemétodos de tratamento de doença relacionada à apoptose. Sãofornecidos métodos para terapia de doenças ou desordens as-sociadas ao crescimento celular patológico descontrolado,por exemplo, câncer, psoríase, doenças auto-imunes, interalia, e métodos para terapia de doenças associadas com is-quemia e falta de fluxo sangüíneo adequado, por exemplo, in-farto do miocárdio (MI) e acidente vascular cerebral. "Cân-cer" ou "Tumor" referem-se a uma massa de células anormaisde crescimento descontrolado. Esses termos incluem tanto tu-mores primários, que podem ser benignos ou malignos, quantotumores secundários, ou metástases que espalham para outrossítios no corpo. Exemplos de doenças tipo câncer incluem,inter alia: carcinoma (por exemplo: mama, cólon e pulmão),leucemia tal como leucemia de célula B, linfoma tal comolinfoma de célula B, blastoma tal como neuroblastoma e mela-noma.

A invenção também fornece uma composição compreen-dendo um ou mais dos compostos da invenção em um carreador,preferivelmente um carreador farmaceuticamente aceitável.Essa composição pode compreender uma mistura de dois ou maisRNAsi para diferentes genes ou diferentes RNAsi para o mesmogene. Uma composição compreendendo RNAsi para o gene RTP801e RNAsi para o gene VEGF e/oú o gene VEGF-Rl é considerada.

Um outro composto da invenção compreende o compos-to anterior da invenção (estrutura A) ligado covalentementeou não covalentemente a um ou mais compostos da invenção(estrutura A). Esse composto pode ser distribuído em um car-reador, preferivelmente um carreador farmaceuticamente acei-tável, e pode ser processado intracelularmente por complexoscelulares endógenos para produzir um ou mais RNAsi da inven-ção. Um outro composto da invenção compreende o composto an-terior da invenção (estrutura A) ligado covalentemente ounão covalentemente a um RNAsi para outro gene, especialmenteo gene VEGF e/ou o gene VEGF-Rl.

Essa invenção também compreende uma entidade quí-mica inédita que é um inibidor de RTP801, preferencialmenteRNAsi, quimicamente ligado, covalentemente ou não covalente-mente, a qualquer dos agentes inibidores VEGF /VEGFR-I ante-riores. Uma entidade química particular considerada é um i-nibidor de RNAsi de RTP801 ligado covalentemente a um anti-corpo VEGF ou receptor-1 de VEGF. Uma entidade química adi-cional considerada é um aptâmero de DNA modificado ou nãomodificado, que alveja o receptor-1 de VEGF ligado covalen-temente a um RNAsi de RTP801 aqui revelado. Sem ficar presoà teoria, a porção do aptâmero de uma composição farmacêuti-ca como esta ligaria o receptor-1 VEGF e internalizaria nacélula, mediante o que a porção da molécula de RNAsi inibi-ria a expressão de RTP801 na célula. Tal composição farma-cêutica assim teria o benefício de uma melhor seletividade ealvejamento, bem como o benefício adicional da terapia decombinação como aqui revelada. Métodos de produção de taisentidades químicas inéditas são conhecidos pelos versados natécnica.

Essa invenção também compreende uma estrutura fitadupla em tandem que compreende duas ou mais seqüências deRNAsi, que é processado intracelularmente para formar doisou mais diferentes RNAsi, um inibindo 801 e um segundo ini-bindo VEGF/VEGFR-1. Em um aspecto relacionado, essa invençãotambém compreende uma estrutura fita dupla em tandem quecompreende duas ou mais seqüências de RNAsi, que é degradadointracelularmente para formar dois ou mais RNAsi diferentes,ambos inibindo 801.

Em particular, considera-se que um oligonucleotí-deo comprido (tipicamente cerca de 80-500 nucleotídeos decomprimento) compreendendo uma ou mais estruturas de haste ealça, onde regiões da haste compreendem as seqüências dosoligonucleotídeos da invenção, pode ser distribuído em umcarreador, preferivelmente um carreador farmaceuticamenteaceitável, e pode ser processado intracelularmente por com-plexos celulares endógenos (por exemplo por DROSHA e DICERdescritos anteriormente) para produzir um ou mais oligonu-cleotídeos (RNAsi) de fita dupla menores, que são oligonu-cleotídeos da invenção. Esse oligonucleotídeo pode ser deno-minado uma construção de RNAsh em tandem. Considera-se queesse oligonucleotídeo comprido é um oligonucleotídeo de fitasimples compreendendo uma ou mais estruturas de haste e al-ça, em que cada região de haste compreende uma seqüênciasentido e uma anti-sentido correspondente de RNAsi de um ge-ne 801. Em particular, considera-se que esse oligonucleotí-deo compreende seqüências sentido e anti-sentido de RNAsirepresentadas em qualquer uma das tabelas de A a D. Alterna-tivamente, a construção de RNAsh em tandem pode compreenderuma seqüência sentido e anti-sentido correspondente de RNAside um gene 801, e adicionalmente uma seqüência sentido e an-ti-sentido correspondente de RNAsi de um gene diferente taiscomo VEGF ou VEGF-Rl.

Como aqui mencionado, RNAsi contra RTP801 pode sero principal componente ativo em uma composição farmacêutica,ou pode ser um componente ativo de uma composição farmacêu-tica contendo dois ou mais RNAsi (ou moléculas que codificamou produzem endogenamente dois ou mais RNAsi, seja ela umamistura de moléculas ou uma ou mais moléculas em tandem quecodificam dois ou mais RNAsi), a dita composição farmacêuti-ca adicionalmente sendo compreendida de uma ou mais molécu-Ias de RNAsi adicionais que alvejam um ou mais genes adicio-nais. Inibição simultânea de RTP801 e o(s) dito(s) gene(s)adicional(s) provavelmente terá(ão) um efeito aditivo ou si-nergistico para o tratamento das doenças aqui reveladas, deacordo com o seguinte:

Insuficiência Renal Aguda (IRA) e outras desordensmicrovasculares, bem como desordens de audição e úlcera depressão: a composição farmacêutica para o tratamento de IRApode ser compreendida nas seguintes combinações compostas:1) Dimeros de RNAsi de RTP801 e RNAsi p53; 2) Dimeros deRTP801 e RNAsi Fas; 3) Dimeros de RTP801 e RNAsi Bax; 4) Di-meros de RTP801 e RNAsi Fas; 5) Dimeros de RTP801 e RNAsiBax; 6) Dimeros de RTP801 e RNAsi Noxa; 7) Dimeros de RTP801e RNAsi Puma; 8) Dimeros de RTP801 (REDDl) e RTP801L (REDD2)RNAsi; 9)RNAsi de RTP801, RNAsi Fas e qualquer dos RTP801LRNAsi RNAsi p53, RNAsi Bax, RNAsi Noxa ou RNAsi Puma paraformar trimeros ou polímeros (isto é, moléculas em tandemque codificam três ou mais RNAsi).

Adicionalmente, composições farmacêuticas adicio-nais para terapias de combinação para IRA, desordens de au-dição, úlcera de pressão e qualquer outra doença ou condiçãoaqui revelada, podem compreender dois RNAsi, em que o pri-meiro RNAsi é um RNAsi de RTP801, preferivelmente seleciona-do das tabelas A-D, e o segundo RNAsi que pode ser ligadocovalentemente ou não covalentemente no primeiro RNAsi oumisturado com o primeiro RNAsi, é um RNAsi que alveja um ge-ne selecionado do seguinte grupo: proteína de ligação daproteína de tumor p53, 2 (TP53BP2); repetição rica em leuci-na e contendo domínio de morte (LRDD) ; citocromo b-245, po-lipeptideo alfa (CYBA); fator 3 de ativação de transcriçãoATF3); caspase 2, cisteína peptidase relacionada a apoptose(célula precursora neural expressa, desenvolvimentalmenteinfraregulada 2) (CASP2); NADPH oxidase 3 (N0X3); harakiri,proteína de interação BCL2 (HRK); componente do complemento1, proteína de ligação do subcomponente q (CIQBP); proteínade interação 3 19kDa de BCL2/adenovírus ElB (BNIP3); prote-ína quinase 8 ativada por mitógeno (MAPK8); proteína quinase14 ativada por mitógeno (MAPK14); substrato 1 de toxina bo-tulínica C3 relacionado ao ras (família rho, proteína de li-gação Rac 1 da GTP pequena); glicogênio sintase quinase 3beta (GSK3B); receptor purinérgico P2X, canal iônico contro-lado pelo ligante, 7 (P2RX7); canal catiônico de potencialreceptor transiente, subfamília M, membro 2 (TRPM2); poli(ADP-ribose) glicoidrolase (PARG); molécula CD38 (CD38);membro 4 da família STEAP (STEAP4); proteína morfogenéticaóssea 2 - BMP2; proteína da junção da folga, alfa 1, 43kDa(conexina 43) (GJAl); proteína de ligação da proteína tiro-sina quinase TYRO (TYROBP); fator de crescimento do tecidoconectivo (CTGF); fosfoproteína 1 secretada (osteopontina,sialoproteina óssea 1, ativação de linfócito T inicial 1)(SPPl); receptor de reticulon 4 (RTN4R) ; anexina A2 (ANXA2);gene homólogo da família ras, membro A (RHOA); oxidase dupla1 (DUOXl); carreador de soluto da família 5 (co-transportador de sódio/glicose), membro 1 (SLC5A1); carrea-dor de soluto da família 2 (transportador facilitador deglicose), membro 2 (SLC2A2); família 1 aldo-ceto redutase,membro Bl (aldose redutase) (AKRlBl); sorbitol deidrogenase(SORD); carreador de soluto da família 2 (transportador fa-cilitador de glicose), membro 1 (SLC2A1); e membrana metalo-endopeptidase (endopeptidase neutra, encefalinase) (MME).

Degeneração macular (MD), retinopatia diabética(DR) , lesão da medula espinhal: composições farmacêuticaspara o tratamento de MD, DR e lesão da medula espinhal podemcompreender as seguintes combinações compostas: 1) RNAsi deRTP801 combinada com qualquer um dos RNAsi VEGF, RNAsi VEGF-Rl, RNAsi VEGF R2, RNAsi PKCbeta, RNAsi MCP1, RNAsi e NOS,RNAsi KLF2, RTP801 L RNAsi (tanto fisicamente misturadasquanto em uma molécula em tandem); 2) RNAsi de RTP801 emcombinação com dois ou mais RNAsi da lista anterior (fisica-mente misturados ou em uma molécula em tandem que codificatrês RNAsi, ou uma combinação destes).

COPD e desordens respiratórias: a composição far-macêutica para tratamento de desordens respiratórias podecompreender as seguintes combinações de compostos: RNAsi deRTP801 combinado com RNAsi contra um ou mais dos seguintesgenes: elastase, metaloprotease de matriz, fosfolipase, cas-pase, esfingomielinase e ceramida sintase.

Adicionalmente, RNAsi de RTP801 ou qualquer molé-cula de ácido nucléico compreendendo ou codificando RNAsi deRTP801 pode ser ligada (covalentemente ou não covalentemen-te) a um anticorpo ou aptâmero, a fim de atingir um melhoralvejamento para tratamento das doenças aqui reveladas, deacordo com o seguinte:

ARF: anticorpo anti-Fas (preferivelmente anticor-pos neutralizantes).

Degeneração macular, retinopatia diabética, lesãoda medula espinhal: anticorpo ou aptâmero anti-Fas, anticor-po ou aptâmero anti-MCPl, anticorpo ou aptâmero anti-VEGFRle anti-VEGFR2. Os anticorpos devem ser preferivelmente anti-corpos neutralizantes.

Quaisquer moléculas tais como, por exemplo, molé-culas de DNA anti-sentido que compreendem as seqüências deRNAsi aqui reveladas (com as modificações apropriadas do á-cido nucléico), são particularmente desejáveis e podem serusadas com a mesma capacidade de seus RNAsi correspondentespara todas as utilizações e métodos aqui revelados.

A invenção também compreende um método para tratarum paciente sofrendo de uma desordem tais como as desordensaqui descritas, compreendendo administrar ao paciente a com-posição anterior ou composto de dose terapeuticamente efeti-va, de maneira assim a tratar o paciente.

0 termo "anti-sentido" (AS) ou " fragmento anti-sentido" significa um fragmento de polinucleotideo (compre-endendo tanto desoxiribonucleotideos, ribonucleotideos quan-to uma mistura de ambos) tendo atividade inibitória anti-sentido, a dita atividade causando uma diminuição na expres-são da cópia genômica endógena do gene correspondente (nessecaso RTP801). Um polinucleotideo RTP801 AS é um polinucleo-tideo que compreende nucleotideos consecutivos, tendo umaseqüência de comprimento e homologia suficientes para umaseqüência presente dentro da seqüência do gene RTP801 apre-sentada em SEQ ID N0:1 para permitir hibridização do AS parao gene. A seqüência do AS é projetada para complementar umRNAm alvo de interesse e formar um RNA:AS duplex. Essa for-mação duplex pode impedir o processamento, união, transporteou tradução do relevante RNAm. Além disso, certas seqüênciasde nucleotideo AS podem elicitar atividade celular de RNaseH quando hibridizado com seus alvos RNAm, resultando na de-gradação de RNAm (Calabretta et al, 1996: Antisense strate-gies in the treatment of leukemias. Semin Oncol. 23(1) :78-87). Neste caso, RNase H clivará o componente RNA do duplexe pode liberar potencialmente o AS para hibridizar aindamais com moléculas adicionais do RNA alvo. Um modo de açãoadicional resulta da interação de AS com DNA genômico paraformar uma tripla hélice que pode ser inativada transcricio-nalmente. Fragmentos particulares AS são o AS do DNA que co-difica os fragmentos particulares de RTP801 aqui descritos.

Muitas revisões cobriram os principais aspectos datecnologia anti-sentido (AS) e de seu potencial terapêutico(Wright & Anazodo, 1995. Antisense Molecules and Their Po-tential For the Treatment of Câncer and AIDS. Câncer J.8:185-189.). Existem revisões nos aspectos químico (Crooke,1995. Progress in antisense therapeutics, Hematol. Pathol.2:59; Uhlmann e Peyman, 1990. Antisense Oligonucleotides: ANew Therapeutic Principie. Chem Rev 90(4):543-584.), celular(Wagner, 1994. Gene inhibition using antisense oligodeoxynu-cleotides. Nature 372:333.) e terapêutico (Hanania, et al1995. Recent advances in the application of gene therapy tohuman disease. Am. J. Med. 99:537.; Scanlon et al., 1995.Oligonucleotides-mediated modulation of mammalian gene ex-pression. FASEB J. 9:1288.; Gewirtz, 1993. Oligodeoxynucleo-tide-based therapeutics for human leukemias. Stem CellsDayt. 11:96.) dessa tecnologia.

Intervenção anti-sentido na expressão de genes es-pecificos pode ser alcançada pelo uso de seqüências de oli-gonucleotideo AS sintéticas (ver Lefebvre-d1Hellencourt etal, 1995. Iramunomodulation by cytokine antisense oligonu-cleotides. Eur. Cytokine Netw. 6:7.; Agrawal, 1996. An-tisense oligonucleotides: towards clinicai trials, TIBTECH,14:376.; Lev-Lehman et al., 1997. Antisense Oligomers in vi-tro and in vivo. In Antisense Therapeutics, A. Cohen and S.Smicek, eds (Plenum Press, New York)). Seqüências de oligo-nucleotideo AS são projetadas para complementar um RNAm alvode interesse e formar um RNA: AS duplex. Essa formação du-plex pode impedir o processamento, união, transporte ou tra-dução do relevante RNAm. Além disso, certas seqüências denucleotideo AS podem elicitar atividade celular de RNase Hquando hibridizadas com seus RNAm alvos, resultando em umadegradação de RNTVm (Calabretta, et al, 1996. Antisense stra-tegies in the treatment of leukemias. Semin. Oncol. 23:78.).Neste caso, RNase H clivará o componente RNA do duplex e po-de liberar potencialmente o AS para hibridizar ainda maiscom moléculas adicionais do RNA alvo. Um modo de ação adi-cional resulta da interação de AS com DNA genômico para for-mar uma tripla hélice que pode ser inativada transcricional-mente.

0 segmento alvo da seqüência para o oligonucleotí-deo anti-sentido é selecionado de maneira tal que a seqüên-cia exiba características relacionadas a energia adequadasimportantes para formação de oligonucleotídeo duplex comseus gabaritos complementares, e mostre um potencial baixopara autodimerização ou autocomplementação (Anazodo et al.,1996). Por exemplo, o programa de computador OLIGO (PrimerAnalysis Software, Versão 3.4) pode ser usado para determi-nar temperatura de fusão da seqüência anti-sentido, proprie-dades de energia livre e estimar as propriedades potenciaisde autoformação de dímeros e autocomplementariedades. 0 pro-grama permite a determinação de uma estimativa qualitativadesses dois parâmetros (autoformação de dímeros e autocom-plementariedades potenciais) e fornece uma indicação de "ne-nhum potencial" ou "algum potencial" ou "potencial essenci-almente completo". Usando esse programa, são geralmente se-lecionados segmento alvos que tem estimativas de nenhum po-tencial nesses parâmetros. Entretanto, segmentos que tem"algum potencial" podem ser usados em uma das categorias. Umequilíbrio de parâmetros é usado na seleção, como é conheci-do na tecnologia. Adicionalmente, os oligonucleotídeos sãoselecionados também, conforme necessário, de maneira que asubstituição análoga não afete substancialmente a função.

Oligonucleotídeos anti-sentido fosforotioato nor-malmente não mostram toxicidade significante nas concentra-ções que são efetivas, e exibem meias vidas farmacodinâmicassuficientes em animais (Agrawal, 1996. Antisense oligonucle-otides: towards clinicai trials, TIBTECH, 14:376.) e são re-sistentes à nuclease. Fenótipos de perda de função induzidospor anti-sentido relacionados com desenvolvimento celulartêm sido apresentados para proteína ácida da fibra glial(GFAP), para o estabelecimento da formação de placa tecal emfrango (Galileo et al., 1991. J. Cell. Biol., 112:1285.) epara a proteína N-myc, responsável pela manutenção de hete-rogeneidade celular em culturas neuroectodermais (célulasepiteliais versus células neuroblásticas, que diferem em su-as capacidades de formar colônia, tumorigenicidade e aderên-cia) (Rosolen et al., 1990. Câncer Res. 50:6316.; Whitesellet al. , 1991. Episome-generated N-myc antisense RNA re-stricts the differentiation potential of primitive neuroec-todermal cell lines. Mot. Cell. Biol. 11:1360.). A inibiçãode oligonucleotídeo anti-sentido por fator de crescimento defibroblasto básico (bFgF), tendo propriedades mitogênicas eangiogênicas, suprime 80% do crescimento em células de glio-ma (Morrison, 1991. Suppression of fibroblast growth factorexpression by antisense oligonucleotides inhibits the growthof transformed human astrocytes. J. Biol. Chem. 266:728.) deuma maneira saturável e específica. Sendo hidrofóbicos, oli-gonucleotídeos anti-sentido interagem bem com membranas fos-folipídicas (Akhter et al, 1991. Interactions of antisenseDNA oligonucleotide analogs with phospholipid membranes (li-posomes) Nuc. Res. 19:5551-5559.). Após essas interações coma membrana plasmática celular, elas são ativamente (ou pas-sivamente) transportadas para dentro de células vivas (Lukeet al, 1989. Characterization of oligonucleotide transportinto living cells. PNAS USA 86:3474.), em um mecanismo satu-rável previsto envolver receptores específicos (Yakubov etal, 1989. PNAS USA 86:6454.).Uma "ribozima" é uma molécula de RNA que possuicapacidade catalitica de RNA (ver Cech para revisão) e clivaum sitio especifico em um RNA alvo.

De acordo com a presente invenção, ribozimas queclivam RNAm de RTP801 podem ser utilizadas como inibidoresde RTP801. Isso pode ser necessário em casos onde a terapiaanti-sentido é limitada por considerações estequiométricas(Sarver et al., 1990, Gene Regulation and Aids, pp. 305-325) . Ribozimas podem então ser usadas para alvejar a se-qüência de RTP801. 0 número de moléculas de RNA que são cli-vadas por uma ribozima é maior que o número previsto por es-tequiometria. (Hampei e Tritz, 1989; Uhlenbeck, 1987) .

Ribozimas catalizam a clivagem de ligação de fos-fodiéster do RNA. Várias famílias estruturais de ribozimaforam identificadas incluindo introns de Grupo I, RNase P,ribozima do vírus da hepatite delta, ribozima cabeça de mar-telo e a ribozima tipo alça originalmente derivadas da fitanegativa do RNA satélite do vírus do mosaico do tabaco (s-TRSV) (Sullivan, 1994; patentes U.S. No. 5,225,347, colunas4-5) . As duas últimas famílias são derivadas de viróides evirusóides, nas quais acredita-se que a ribozima separe mo-nômeros de oligômeros criados durante a replicação do círcu-lo de rolamento (Symons, 1989 e 1992). Motivos de ribozimacabeça de martelo e tipo alça são mais comumente adaptadospara trans-clivagem de RNAm para terapia de gene (Sullivan,1994). O tipo de ribozima utilizada na presente invenção éselecionado como é conhecido na técnica. Ribozimas tipo alçaestão atualmente em ensaio clínico e são o tipo preferível.Em geral, a ribozima tem 30-100 nucleotídeos de comprimento.Distribuição de ribozimas é similar às de fragmentos AS e/oumoléculas de RNAsi.

Pode-se notar que todos os polinucleotideos a serusados na presente invenção podem passar por modificaçõespara ter melhorias nas propriedades terapêuticas. Modifica-ções ou análogos de nucleotídeos podem ser introduzidos paramelhorar as propriedades terapêuticas dos polinucleotideos.

Melhores propriedades incluem maior resistência à nucleasee/ou maior capacidade de permear membrana celular. Resistên-cia à nuclease, quando necessária, é provida por qualquermétodo conhecido na técnica, que não interfira com a ativi-dade biológica do polinucleotídeo AS, RNAsi, DNAc e/ou ribo-zima necessária para o método de uso e distribuição (Iyer etal., 1990; Eckstein, 1985; Spitzer e Eckstein, 1988; Woolfet al., 1990; Shaw et al., 1991). Modificações que podem serfeitas nos oligonucleotídeos a fim de melhorar a resistênciaà nuclease incluem modificar o heteroátomo de fósforo ou o-xigênio em cerne do fosfato. Estas incluem preparar fosfona-tos, fosforotioatos, fosforoditioatos de metila e oligômerosmorfolinos. Em uma modalidade, é provido ter ligação de fos-forotioato ligando as quatro a seis bases de nucleotídeos determinação 3'. Alternativamente, ligações de fosforotioatoligam todas as bases de nucleotídeos. Outras modificaçõesconhecidas na técnica podem ser usadas quando a atividadebiológica é retida, mas a estabilidade para nucleases ésubstancialmente maior.

Todos os análogos ou modificações de um polinu-cleotideo podem ser empregados com a presente invenção, des-de que os ditos análogos ou modificações não afetem substan-cialmente a função do polinucleotideo. Os nucleotideos podemser selecionados de bases modificadas de ocorrência naturalou sintética. Bases de ocorrência natural incluem adenina,guanina, citosina, timina e uracila. Bases modificadas denucleotideos incluem inosina, xantina, hipoxantina, 2- ami-noadenina, 6-metila, 2-propila e outras adeninas alquilas,5-halo uracila, 5-halo citosina, β-aza citosina e 6-aza ti-mina, psuedo-uracila, 4- tiouracila, 8-halo adenina, 8-aminoadenina, 8-tiol adenina, 8-tiolalquila adeninas, 8-hidroxila adenina e outras 8-substitutas adeninas, 8-haloguaninas, 8-amino guanina, 8-tiol guanina, 8-tioalquila gua-ninas, 8- hidroxila guanina e outras guaninas substitutas,outras aza e deaza adeninas, outras aza e deaza guaninas, 5-trifluorometila uracila e 5-trifluor citosina.

Além do mais, análogos de polinucleotideos podemser preparados em que a estrutura do nucleotideo é fundamen-talmente alterada e estão mais bem adaptados como reagentesterapêuticos ou experimentais. Um exemplo de um nucleotideoanálogo é um ácido nucléico peptidico (PNA) em que o cernede desoxirribose (ou ribose) fosfato no DNA (ou RNA) é subs-tituído por um cerne de poliamida o qual é similar ao encon-trado em peptídeos. Análogos de PNA têm se mostrado resis-tentes à degradação por enzimas e têm vidas estendidas invivo e in vitro. Adicionalmente, PNAs têm-se mostrado ligarde maneira mais forte à uma seqüência de DNA complementar doque a uma molécula de DNA. Essa observação é atribuída àfalta de repulsão de carga entre a fita de PNA e a fita deDNA. Outras modificações que podem ser feitas nos oligonu-cleotideos incluem cernes de polímeros, cernes cíclicos, oucernes acíclicos.

Os polipeptídeos empregados na presente invençãotambém podem ser modificados, de forma opcional quimicamentemodificados, a fim de melhorar suas atividades terapêuticas.

"Quimicamente modificado" - quando referindo aos polipeptí-deos, significa um polipeptídeo onde pelo menos um de seusresíduos de aminoácidos é modificado tanto por processos na-turais, tal como processamento ou outra modificação pós-translacional, quanto por técnicas de modificação químicaque são bem conhecidas na técnica. Entre as inúmeras modifi-cações conhecidas, exemplos típicos, mas não exclusivos, in-cluem: acetilação, acilação, amidação, ADP-ribosilação, gli-cosilação, formação de âncora GPI, anexação covalente de umlipídeo ou derivado de lipídeo, metilação, miristilação, pe-guilação, prenilação, fosforilação, ubiquitinação, ou qual-quer processo similar.

Possíveis modificações adicionais de polipeptídeo(tais como aqueles resultantes da alteração da seqüência deácido nucléico) incluem as seguintes:

"Substituição conservativa" - refere-se à substi-tuição de um aminoácido em uma classe por um aminoácidos damesma classe, onde uma classe é definida por propriedadesfisicoquímicas comuns da cadeia lateral de aminoácidos esubstituição de alta freqüência em polipeptídeos homólogosencontrados na natureza, determinadas, por exemplo, por umamatriz Dayhoff de troca de freqüência padrão ou matriz BLO-SUM. Seis classes gerais de cadeias laterais aminoácidos deforam categorizadas e incluem: Classe I (Cys); Classe II(Ser, Thr, Pro, Ala, Gly) ; Classe III (Asn, Asp, Gln, Glu) ;Classe IV (His, Arg, Lys); Classe V (lie, Len, Vai, Met) ; eClasse VI (Phe, Tyr, Trp) . Por exemplo, o uso de Asp emsubstituição a um outro resíduo de classe III, tais comoAsn, Gin, ou Gin, é uma substituição conservativa.

"Substituição não conservativa" - refere-se àsubstituição de um aminoácido de uma classe com um aminoáci-do de outra classe; por exemplo, substituição de um Ala, umresíduo de classe II, com um resíduo de classe III tais comoAsp, Asn, Gin, ou Gln.

"Deleção" - é uma troca tanto no nucleotídeo quan-to na seqüência de aminoácidos em que um ou mais nucleotí-deos ou resíduos de aminoácidos, respectivamente, estão au-sentes .

"Inserção" ou "adição" - é a troca em um nucleotí-deo ou seqüência de aminoácidos que resultou na adição de umou mais nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos, respectiva-mente, comparado com a seqüência de ocorrência natural.

"Substituição" - substituição de um ou mais nucle-otídeos ou aminoácidos por nucleotídeos ou aminoácidos dife-rentes, respectivamente. No que diz respeito às seqüênciasde aminoácidos, a substituição pode ser conservativa ou nãoconservativa.

Em uma modalidade adicional da presente invenção,polipeptídeo ou polinucleotídeo RTP801 podem ser usados paradiagnosticar ou detectar degeneração macular em um sujeito.Um método de detecção tipicamente compreenderia ensaiar RNAmde RTP801 ou polipeptideo RTP801 em uma amostra derivada deum sujeito.

"Detecção" - refere-se à um método de detecção deuma doença. Esse termo pode referir-se à detecção de umapredisposição a uma doença, ou à detecção da severidade dadoença.

"Homólogo/homologia" utilizado na presente inven-ção, significa pelo menos cerca de 70%, preferivelmente pelomenos cerca de 75% de homologia, vantajosamente pelo menoscerca de 80% de homologia, mais vantajosamente pelo menoscerca de 90% de homologia, ainda mais vantajosamente pelomenos cerca de 95%, por exemplo, pelo menos cerca de 97%,cerca de 98%, cerca de 99% ou ainda cerca de 100% de homolo-gia. A invenção também compreende que estes polinucleotideose polipeptideos podem ser usados no mesmo modo que polinu-cleotideos e polipeptideos aqui citados ou citados anterior-mente .

Alternativamente, ou adicionalmente, "homologia",com respeito às seqüências, pode referir-se ao número de po-sições com resíduos de nucleotídeos ou aminoácidos idênticosdivido pelo número de resíduos de nucleotídeos ou de aminoá-cidos na menor das duas seqüências, em que o alinhamento dasduas seqüências pode ser determinado de acordo com o algo-ritmo de Wilbur e Lipman ((1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA80:726); por exemplo, usando o tamanho de uma janela de 20nucleotídeos, um comprimento de palavra de 4 nucleotídeos, euma penalidade de folga de 4, análise e interpretação da se-qüência de dados assistidos por computador, incluindo ali-nhamento, pode ser convenientemente realizado usando progra-mas disponíveis comercialmente (por exemplo, Intelligene-tics™ Suite, Intelligenetics Inc., CA). Quando seqüênciasde RNA são ditas similares, ou têm um grau de identidade ouhomologia de seqüência com seqüências de DNA, timidina (T)na seqüência de DNA é considerada igual à uracila (U) na se-qüência de RNA. Seqüências de RNA no escopo da invenção po-dem ser derivadas de seqüências de DNA ou seus complementos,substituindo timidina (T) na seqüência de DNA por uracila(U) .

Adicionalmente, ou alternativamente, similaridadeou homologia na seqüência de aminoácidos podem ser determi-nadas, por exemplo, usando o programa BlastP (Altschul etal., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402) e disponível no NCBI. Asreferências seguintes provêem algoritmos para comparar a i-dentidade ou homologia relativas de resíduos de aminoácidosde dois polipeptídeos e adicionalmente, ou alternativamente,com relação aos precedentes, os preceitos destas referênciaspodem ser usados para determinar percentuais de homologia:Smith et al., (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489; South etal., (1983) Nucl. Acids Res. 11:2205-2220; Devereux et al.,(1984) Nucl. Acids Res. 12:387-395; Feng et al., (1987) J.Molec. Evol. 25:351-360; Higgins et al., (1989) CABIOS5:151-153; e Thompson et al., (1994) Nucl. Acids Res.22:4673-4680.

"Tendo pelo menos X% de homologia" - com relação aduas seqüências de aminoácidos ou nucleotídeos, refere-se àporcentagem de resíduos que são idênticos em duas seqüênciasquando as seqüências estão alinhadas idealmente. Assim, aidentidade de 90% da seqüência dos aminoácidos significa que90% dos aminoácidos em duas ou mais seqüências de polipeptí-deos alinhadas idealmente são idênticos.

Uma modalidade adicional da presente invenção re-laciona uma composição farmacêutica compreendendo um inibi-dor de RTP801 com uma quantidade terapeuticamente efetivacomo um ingrediente ativo e um carreador farmaceuticamenteaceitável. 0 inibidor pode ser um inibidor biológico, umamolécula orgânica, uma molécula química, etc. A dita compo-sição farmacêutica pode compreender um inibidor de RTP801,que é um polinucleotídeo que compreende nucleotídeos conse-cutivos, tendo uma seqüência que é uma seqüência anti-sentido à seqüência apresentada na figura 1 (SEQ ID No: 1).Adicionalmente, o inibidor de RTP801 pode ser um vetor com-preendendo esses polinucleotídeos. Adicionalmente, o inibi-dor de RTP801 pode ser um anticorpo monoclonal que liga-seespecificamente à um epítopo compreendendo 4-25 aminoácidosapresentados na figura 2 (SEQ ID No:2), ou uma molécula deRNA que alveja o gene RNAm de RTP801 tal como uma moléculade RNAsi (descrita opcionalmente nas tabelas A-D e, em -par-ticular, RNAsi Nos: 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 e 50 databela A ou RNAsi Nos: 257, 260-262, e 264-268 da tabela D)ou uma ribozima.

Os ingredientes ativos da composição farmacêuticapodem incluir oligonucleotídeos que são resistentes à nucle-ase, necessários para a prática da invenção, ou um fragmentodestes que mostrou ter o mesmo efeito alvejado contra a(s)seqüência (s) e/ou ribozimas apropriadas. Combinações de in-gredientes ativos reveladas na presente invenção podem serusadas, incluindo combinações de seqüências anti-sentido.

Uma modalidade adicional da presente invenção pro-vê o uso de uma dose terapeuticamente efetiva de um inibidorde RTP801 para a preparação de um medicamento para promovera recuperação em um paciente sofrendo de doença ou lesão damedula espinhal. Em uma modalidade o inibidor é preferivel-mente um RNAsi. Em uma outra modalidade o inibidor é prefe-rivelmente a estrutura A aqui descrita.

A invenção foi descrita de uma maneira ilustrati-va, e deve-se entender que a terminologia que foi usada estána natureza das palavras da descrição em vez de limitação.

Obviamente, muitas modificações e variações dapresente invenção são possíveis à luz dos preceitos expos-tos. Portanto, deve-se entender que, no escopo das reivindi-cações anexas, a invenção pode ser praticada de outra manei-ra do que o especificamente descrito.

Descrição resumida das figuras

A figura 1 detalha a seqüência de codificação dogene RTP801 (SEQ ID NO:l);

A figura 2 detalha a seqüência de aminoácidos dopolipeptídeo RTP801 (SEQ ID NO:2);

A figura 3 é um diagrama descrevendo os éxons,CDS, SNPs humanos e a posição de várias moléculas de ácidonucléico que são tanto específicas de humanos quanto especí-ficas de humanos, camundongos e ratos em paralelo;

As figuras 4A-H representam um painel de resulta-dos de análise Western Blot obtidos aplicando vários ácidosnucléicos de fita dupla de acordo com a presente invenção auma primeira linha celular humana, por meio do que o experi-mento foi realizado duas vezes, referidos como experimento 1e experimento 2, e por meio do que o nivel da expressão depllOa e p85 é representado como controle de carregamento e aintensidade (densidade) da fita de RTP801 é uma medida paraa atividade inibitória do ácido nucléico de fita dupla par-ticular aplicado;

As figuras 5A-F representam um painel de resulta-dos de análise Western Blot obtidos aplicando vários ácidosnucléicos de fita dupla de acordo com a presente invenção auma segunda linha celular humana, por meio do que o experi-mento foi realizado duas vezes, referidos como experimento 1e experimento 2, e por meio do que o nivel da expressão depllOa e p85 é representado como controles de carregamento ea densidade da fita de RTP801 é uma medida para a atividadeinibitória do ácido nucléico de fita dupla particular apli-cado;

As figuras 6A-C representam um painel de resulta-dos de análise Western Blot obtidos aplicando vários ácidosnucléicos de fita dupla de acordo com a presente invenção auma primeira linha celular humana em diferentes concentra-ções, a saber 10 nM (5A), S nM (5B) e 1 nM (5C), por meio doque o experimento foi realizado duas vezes, referidos comoexperimento 1 e experimento 2, e por meio do que o nivel daexpressão de pllOa e p85 é representado como controles decarregamento e a densidade da fita de RTP8 01 é uma medidapara a atividade inibitória do ácido nucléico de fita duplaparticular aplicado;

A figura 7 representa um painel de resultados deanálise Western Blot obtidos aplicando vários ácidos nucléi-cos de fita dupla de acordo com a presente invenção a umalinha celular de camundongos, por meio do que o experimentofoi realizado duas vezes, referidos como experimento 1 e ex-perimento 2, e por meio do que o nivel da expressão de pllOae p85 é representado como controles de carregamento e a den-sidade da fita de RTP801 é uma medida para a atividade ini-bitória do ácido nucléico de fita dupla particular aplicado;

A figura 8 mostra os resultados de experimentos emum sistema modelo AMD de camundongos;

A figura 9 mostra os resultados de experimentosadicionais em um sistema modelo AMD de camundongos;

A figura 10 mostra os resultados de experimentosem um sistema modelo AMD de primatas não humanos;

As figuras IlA-B mostram os resultados de experi-mentos adicionais em um sistema modelo AMD de primatas nãohumanos;

As figuras 12A-B mostram os resultados de mais ex-perimentos adicionais em um sistema modelo AMD de primatasnão humanos;

As figuras 13A-B representam uma análise dos re-sultados experimentais obtidos em um modelo AMD de primatasnão humanos;A figura 14 representa uma análise adicional deresultados experimentais obtidos em modelos AMD de primatasnão humanos.

As figuras 15A-C mostram os resultados de um expe-rimento envolvendo a instilação intratraqueal de um plasmí-deo que expressa RTP801 em camundongo;

As figuras 16 A-C mostram os resultados de um mo-delo de tabagismo de curto prazo (7 dias) em camundongos KOe WT de RTP8 01;

As figuras 17 A-C mostram os resultados de um mo-delo de tabagismo de curto prazo em camundongos WT instila-dos com anti-RTP801 ativo (REDD14) e RNAsi controle (REDD8).

A figura 18 mostra os resultados de experimentoscom Camundongo KO RTP801 em um Modelo CS a longo prazo;

A figura 19 mostra os resultados de experimentosem um sistema modelo ARF de camundongo;

A figura 20 mostra os resultados de experimentosem um sistema modelo de retinopatia diabética de camundongo;

A figura 21 mostra os resultados de experimentosadicionais em um sistema modelo de Retinopatia diabética emcamundongo;

A figura 22 mostra os resultados de mais experi-mentos adicionais em um sistema modelo de Retinopatia diabé-tica em camundongo;

A figura 23 mostra os resultados dos experimentosde inibição combinada RTP801/VEGF em um sistema modelo CNVem camundongo;

A figura 24 mostra os resultados dos experimentosadicionais de inibição combinada RTP801 / VEGF em um sistemamodelo CNV em camundongo;

A figura 25 mostra os resultados de experimentosestudando o efeito de RNAsi de RTP801 no gene de expressãoem RPE e retina neural;

As figuras 26 A-B mostram adicional resultado deexperimentos estudando o efeito de RNAsi de RTP801 na ex-pressão de gene em RPE e retina neural;

A figura 27 mostra os resultados de experimentosdemonstrando que RT801NP é tão ativo quanto RTP801;

A figura 28 mostra resultados de eficácia relacio-nando 801_1 (SEQ ID Nos 430 e 527) e 801_4 (SEQ ID Nos 433 e530) ;

A figura 29 mostra resultados de eficácia adicio-nais relacionando 801_1 (SEQ ID Nos 430 e 527) e 801 4 (SEQID Nos 433 e 530);

A figura 30 mostra resultados de eficácia adicio-nais relacionando 801_1 (SEQ ID Nos 430 e 527) e 801 4 (SEQID Nos 433 e 530) .

Exemplos

Sem elaboração adicional, acredita-se que os ver-sados na técnica podem, usando a descrição anterior, utili-zar a presente invenção na sua máxima abrangência. As moda-lidades especificas preferidas seguintes, portanto, devemser interpretadas meramente como ilustrativas, e de qualquermaneira não limitativa.

Protocolos padrões de biologia molecular conheci-dos na técnica, não especificamente aqui descritos, são emgeral essencialmente seguidos como em Sambrook et al., Mole-cular cloning: A laboratory manual, Cold Springs Harbor La-boratory, New-York (1989, 1992), e em Ausubel et al., Cur-rent Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Sons, Bal-timore, Maryland (1988).

Protocolos padrões de síntese orgânica conhecidosna técnica, não especificamente aqui descritos, são em geralfessencialmente seguidos como em Organic syntheses: Vold- 79,vários editores, J. Wiley, New York, (1941 - 2003); Gewertet al., Organic sintesis workbook, Wiley-VCH, Weinheim(2000); Smith & March, Advanced Organic Chemistry, Wiley-Interscience; 5th edition (2001).

Métodos padrões de química medicinal conhecidos natécnica, não especificamente aqui descritos, são em geralessencialmente seguidos como na série "Comprehensive Medici-nal Chemistry", por vários autores e editores, publicadospor Pergamon Press.

Os recursos da presente invenção revelados na es-pecificação, nas reivindicações e/ou nos desenhos podem tan-to separadamente quanto em combinação destes, ser materialpara realizar a invenção nas suas várias formas.

Exemplo 1

Materiais e métodos gerais

Se não indicado ao contrário, os materiais e méto-dos seguintes foram usados nos exemplos 1-5:

Cultura de célula

A primeira linha celular humana, a saber, célulasHeLa (American Type Culture Collection) foram cultivadas daseguinte maneira: células Hela (American Type Culture Col-lection) foram cultivadas como descrito em Czauderna F et W.(Czauderna, F., Fechtner, M., Aygun, H., Arnold, W., Klip-pel, A., Giese, K. & Kaufmann, J. (2003). Nucleic Acids Res,31, 670-82) .

A segunda linha celular humana foi uma linha celu-lar queratinocita humana que foi cultivada como da seguintemaneira: queratinocitas humanas foram cultivadas a 37 0C emMeio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo FCS10%.

A linha celular de camundongo foi B16V (AmericanType Culture Collection) cultivada a 37 0C em Meio de Eaglemodificado por Dulbecco (DMEM) contendo FCS 10%. Condiçõesde cultura foram como descrito em Methods Find Exp ClinPharmacol. 1997 May; 19(4):231-9:

Nestes casos, as células foram sujeitas à experi-mentos aqui descritos na densidade de aproximadamente 50.000células por poço e o ácido nucléico de fita dupla de acordocom a presente invenção foi adicionado a 20 nM, por meio doque o ácido nucléico de fita dupla foi complexado usando 1pg/mL de lipideo patenteado.

Indução de condição semelhante à hipóxiaAs células foram tratadas com C0CI2 para induziruma condição semelhante à hipóxia da seguinte maneira:transfecções de RNAsi foram realizadas em placas de 10-cm(30-50% de confluência) descritas por (Czauderna et al.,2003; Kretschrner et al., 2003). Resumidamente, RNAsi foitransfectado por adição de um complexo concentrado IOx pré-formado de GB e lipídeo em um meio sem soro nas células emmeio completo. 0 volume total de transfecção foi 10 mL. Aconcentração final de lipídeos foi 1,0 μς/πΛ; a concentraçãofinal de RNAsi foi 20 nM, a menos que de outra forma decla-rado. Indução de respostas hipóxicas foi realizada por adi-ção de C0CI2 (100 μΜ) diretamente no meio de cultura de te-cido 24 horas antes da lise.

Preparação de extratos celulares e immuno blotting

A preparação de extratos celulares e análise imunoblot foram realizadas essencialmente como descrito por Klip-pel et al. (Klippel, A., Escobedo, M.A. , Wachowicz, M.S.,Apell, G., Brown, T.W., Giedlin, MA., Kavanaugh, .M. & Wil-liams, L. T. (1998). Mol Cell Biol, 18, 5699-711; Klippel,A., Reinhard, C., Kavanaugh, W.M., Apell, G., Escobedo,M.UM. & Williams, L.T. (1996). Mol Cell Biol, 16, 4117-27).Anticorpos policlonais contra RTP801 de comprimento totalforam gerados por imunização de coelhos com bactéria produ-tora de proteína RTP801 recombinante proveniente do vetor deexpressão pET19-b (Merck Biosciences GmbH, Schwalbach, Ale-manha). Os anticorpos monoclonais murina anti-pllOa e anti-p85 foram descritos por Klippel et M. (supra).

Exemplo 2

Redução na expressão de RTP801 em um primeira li-nha celular humana

Vários ácidos nucléicos de fita dupla são prepara-dos. Suas localizações relativas ao RNAm e CDS, bem comoSNPs humano no ácido nucléico que codifica para RTP801 huma-no (no. de acessões no banco de dados NM 019058) é represen-tada na figura 3. A primeira linha celular humana foi postaem contato com os ditos ácidos nucléicos de fita dupla des-critos no exemplo 1. Mediante indução de condição semelhanteà hipóxia e tratamento com os ditos ácidos nucléicos de fitadupla, as células foram lisadas e os lisados celulares sub-metidos à immunoblotting pllOa, que é uma unidade cataliticade PI3-quinase, e p85 foram usados como controles de carre-gamento. A intensidade da fita de RTP801 visualizada usandoos anticorpos policlonais RTP801 é uma medida da atividadedos ácidos nucléicos de fita dupla individuais em termos deredução do nivel de expressão de RTP801.

Todo e qualquer dos ácidos nucléicos de fita duplaforam modificados de maneira tal que um grupo 2' O-Me esti-vesse presente no primeiro, terceiro, quinto, sétimo, nono,décimo primeiro, décimo terceiro, décimo quinto, décimo sé-timo e décimo nono nucleotídeo da fita anti-sentido, pormeio do que exatamente a mesma modificação, isto é, um grupo2'-O-Me estava presente no segundo, quarto, sexto, oitavo,décimo, décimo segundo, décimo quarto, décimo sexto e décimooitavo nucleotideo da fita sentido. Adicionalmente, deve-senotar que, no caso desses ácidos nucléicos particulares deacordo com· a presente invenção, o primeiro trecho é idênticoà primeira fita e o segundo trecho é idêntico à segunda fitae esses ácidos nucléicos são também de extremidade cega.

Os experimentos foram realizados duas vezes e osresultados individuais mostrados nas figuras 4A a H, ondeeles são designados como experimento 1 e experimento 2, res-pectivamente .As representações h, hr e hmr nas figuras 4A a Hindicam que o ácido nucléico fita dupla respectivo foi pro-jetado de maneira tal a endereçar uma seção do RNAm deRTP801 que é especifica para RNAm RTP801 humano (h), a ende-reçar uma seção do RNAm de RTP801 que é especifica para RNAmRTP801 humano e de rato (hr) e a endereçar uma seção do RNAmde RTP801 que é especifica para RNAm RTP801 humano, de ca-mundongo e rato (hmr). O ácido nucléico fita dupla referidocomo no. 40.1 foi usado como um controle positivo e célulasnão tratadas (UT+) foram usadas como controle negativo.

De acordo com os resultados, os ácidos nucléicosde fita dupla seguintes se mostraram ser particularmente ú-teis na infra-regulagem da expressão de RTP801: no. 14, no.15, no. 20, no. 21, no. 22, no. 23, no. 24, no. 25, no. 27,no. 39, no. 40, no. 41, no. 42, no. 43, no. 44, no. 49 eno.50 (ver tabela A).

Exemplo 3

Redução na expressão de RTP801 em uma segunda li-nha celular humana

Os experimentos descritos com relação ao exemplo 2foram repetidos usando a segunda linha celular especificadano exemplo 1 e os resultados estão representado nas figuras5A a F.

Como pode-se deduzir dessas figuras, os resultadosobtidos com relação aos experimentos descritos no exemplo 2foram confirmados usando essa segunda linha celular humana.

Exemplo 4

Efeito de dosagem de ácidos nucléicos de fita du-pia específicos de RTP801

Nesse experimento, o efeito de dosagem de ácidosnucléicos de fita dupla específicos de RTP801 foi investiga-do .

Com este propósito, as células HeLa tratadas comrelação aos exemplos 2 e 3, por meio do que a concentraçãode ácido nucléico de fita dupla no caldo de cultura foi 10nM, 5 nM e 1 nM. Como controle positivo, ácido nucléico fitadupla no. 40.1 foi usado e como controle negativo célulasnão tratadas (UT+). A leitura foi a mesma descrita com rela-ção aos exemplos 2 e 3. Os ácidos nucléicos particulares defita dupla usados foram aqueles com números de referênciainternos 14, 22, 23 e 27 que são direcionados para trechosno RNAm de RTP801 que são compartilhados por humanos, camun-dongos e ratos, e ácido nucléico fita dupla com números dereferencia internos 39 e 42 que são direcionados para tre-chos do RNAm de RTP801 específicos para RTP801 humano.

Os resultados estão mostrados nas figuras 6A a C.Pelas ditas figuras, pode-se concluir que existe uma claradependência da concentração do efeito dos ácidos nucléicosde fita dupla específica para RTP801, por meio do que as mo-léculas de ácido nucléico tendo números de referência inter-nos 1, 15, 20, 21, 24, 40, 41, 43, 44, 22, 23, 27, 39, 42,40.1, 44.1, e 14, preferivelmente 22, 23, 27, 39, 42, 40.1 e44.1 e mais pref erivelmente 14, 23 e 27 e pref erivelmentecada das ditas molécula de ácido nucléico tendo o padrão demodificação particular descrito para elas na parte de exem-plos aqui são particularmente efetivas.Exemplo 5

Especificidade de espécies do ácido nucléico fitadupla especifico de RTP801

Os ácidos nucléicos de fita dupla de acordo com apresente invenção foram projetados contra trechos do RNAm deRTP801 que são os mesmos ou diferentes em várias espécies.Para testar se existe uma especificidade de espécies de umácido nucléico fita dupla especifico de RTP801, os ácidosnucléicos de fita dupla com números de referência internos14, 22, 23 e 27 que endereçam um trecho do RNAm de RTP801que é conservado entre RNAm de RTP801 humano, de camundongoe de rato, e o ácidos nucléicos de fita dupla com números dereferência internos 39 e 42 que endereçam um trecho de oRNAm de RTP801 que é especifico para RNAm de RTP801 de huma-no, isto é, que endereçam um trecho que como tal não estápresente em camundongo ou rato, foram comparados em termosde infra-regulagem de RTP801 usando a mesma abordagem e lei-tura especificadas nos exemplos 1 e 2.

Embora todos os ácidos nucléicos de fita dupla u-sados sejam em principio ativos contra RNAm humano e, comomostrado nos exemplos anteriores, sejam também adequados pa-ra infraregular a expressão de RTP801, mediante o uso de umalinha celular de camundongo, apenas aqueles ácidos nucléicosde fita dupla que são também específicos para RNAm de RTP801de camundongo reduziram efetivamente a expressão de RTP801,a saber, ácidos nucléicos de fita dupla nos. 14, 22, 23 e27.

A partir destes resultados pode-se concluir que épossível projetar ácidos nucléicos de fita dupla endereçadosà RTP801 que são específicos para uma ou várias espécies.Isso permite usar exatamente a mesma molécula em modelos a-nimas bem como no homem.

Exemplo 6

Modelos, métodos e resultados experimentais rela-cionados à Degeneração Macular

Os compostos da presente invenção foram testadosem um modelo animal de Neovascularização Coroidal (CNV) aseguir. Essa característica distintiva de AMD úmida é indu-zida em modelos animais por tratamento a laser.

A)Modelo camundongo

Indução por Neovascularização Coroidal (CNV)

Neovascularização Coroidal (CNV), uma caracterís-tica distintiva de AMD úmida foi desencadeada por fotocoagu-lação a laser (532 nM, 200 mW, 100 ms, 75 μΜ) (OcuLight GL,Iridex, Mountain View, CA) realizado em ambos os olhos decada camundongo no dia 0 por um único indivíduo mascaradopara a associação de grupo. Pontos de laser foram aplicadosem um modelo padronizado ao redor do nervo ótico usando umsistema de distribuição de lâmpadas de fendas e uma laminulacomo uma lente de contato.

Grupos de tratamento

CNV foi induzida nos seguintes grupos de camundon-gos (machos 6-8 semanas de idade):

(1) 12 camundongos WT;

(2) 12 camundongos Knock-Out RTP801;

(3) 12 camundongos WT injetados com 0,25 pg de an-ti RNAsi de RTP801 ativo estabilizado sintético (REDD14) emum olho e anti RNAsi de RTP801 inativo (REDD8 - controle ne-gativo) no olho contralateral, nos dias 0 e 7;

(4) 12 Camundongos WT injetados com 0,25 pg de an-ti RNAsi de RTP801 ativo estabilizado sintético (REDD14) emum olho e anti RNAsi de GFP inativo (controle negativo) noolho contralateral nos dias 0 e 7;

(5) 12 Camundongos WT injetados tanto com 0,1 ygde anti RNAsi de RTP801 ativo estabilizado sintético

(REDD14) em um olho quanto PBS (controle negativo) no olhocontralateral nos dias 0 e 7;

(6) 12 Camundongos WT injetados tanto com 0,05 pgde anti RNAsi de RTP801 ativo estabilizado sintético(REDD14) em um olho quanto PBS (controle negativo) no olhocontralateral nos dias 0 e 7.

Ambos os olhos de cada camundongo foram tratadoscom laser. 0 volume injetado foi 2 pL.

Avaliação

1.0 experimento terminou no dia 14. Para avalia-ção, os olhos foram anucleados e fixados com 4% de parafor-maldeido por 30 minutos a 4 °C. A retina neurossensorial foidescolada e separada do nervo ótico. 0 complexo esclera co-róide RPE remanescente foi montado nivelado em Immu-Mount(Vectashield Mounting Médium, Vector) e colocado em laminu-la. Montagens niveladas foram examinadas com um microscópioconfocal de varredura a laser (TCS SP, Leica, Alemanha). Osvasos foram visualizados pela excitação com laser de argônioazul. As seções óticas horizontais (etapa 1 μΜ) foram obti-das da superfície do complexo esclera coróide RPE. 0 planofocai mais profundo, no qual a rede vascular coroidal ao re-dor conecta-se com a lesão que poderia ser identificada, foiconsiderado o piso da lesão. Qualquer vaso na área tratadacom laser e superficial a este plano de referência foi con-siderado CNV. Imagens de cada seção foram armazenadas digi-talmente. A área de fluorescência CNV relacionada foi medidapor análise de imagem computadorizada usando o software Lei-ca TCS SP. A soma de toda a área fluorescente em cada seçãohorizontal foi usada como um índice para o volume de CNV.

2. Camundongos WT separados (5 olhos por grupo)foram usados para avaliar a expressão de RNAm de RTP801 emCNV (bem como a expressão de outros genes relevantes paraAMD) (não tratados e tratados com RNAsi) usando PCR em temporeal no RNA extraído de RPE/coróides ou da retina neural.

Resultados

1. Camundongos KO RTP801 exibiram 30% menos extra-vasamento de vaso sangüíneo comparado aos Camundongos WT a-pós indução CNV; ver figura 8.

2. RNAsi estabilizado sintético contra RTP801,REDD14, elicitou uma redução dependente de dose do volumeCNV. Uma inibição máxima de aproximadamente 70%, comparadaaos olhos injetados com PBS foi alcançada no REDD14 a umadose de (seqüência No. 14 na tabela A, SEQ ID No.s 16 (sen-tido) e 66 (anti-sentido)) 0,25 ug por olho. Na mesma dose,tanto RNAsi controle negativo, REDD8, quanto anti RNAsi deGFP exibiram apenas 27% e 33% de redução do volume CNV, res-pectivamente, sustentando tanto a eficácia superior deREDD14 quanto também a especificidade de seu efeitos.

B) Mdelo de primatas não humanosO

Indução CNV

Oito macacos cinomolgos machos (Macaca fascicula-ris) 2-6 anos de idade foram usados no estudo. Neovasculari-zação coroidal (CNV) foi induzida por tratamento a laser pe-rimacular de ambos os olhos antes da administração da dose.Nove lesões foram colocadas na mácula com um laser [OcuLightGL (532 nM) Laser Foto coagulador com um Adaptador de lâmpa-da de fenda portátil IRIS Medicai®] , e pontos de laser noolho direito espelharam a localização no olho esquerdo. Osparâmetros aproximados de laser foram como a seguir: tamanhode ponto: 50-100 μΜ de diâmetro; energia de laser: 300-700miliwats; tempo de exposição: 0,1 segundo.

Tratamento

Imediatamente após o tratamento a laser, ambos osolhos de todos os animais foram submetidos a uma injeção in-travitrea única. 0 olho esquerdo foi dosado com 350 ug deRNAsi estabilizado sintético contra RTP801 (o mesmo usado noestudo de camundongo) no volume final de 50 uL, ao passo queo olho contralateral recebeu 50 uL de PBS (veiculo).

Avaliação

1. Todos os animais foram submetidos a exames diá-rios de consumo de comida e medida de peso corporal.

2.2 macacos foram eutanizados no dia 6 após indu-ção por CNV. Seus olhos foram anucleados e o pólo posteriorfoi nivelado. A seguir a região da fóvea foi excisada e se-parada em coróides e neuroretina que foram separadamente(para cada animal) congeladas em nitrogênio liquido para sersubseqüentemente usados na extração de RNA e avaliação dePCR em tempo real de expressão de RTP801.

3. Angiogramas de fluoresceina foram realizados nopré-estudo e no fim das semanas 1, 2, e 3 após indução porCNV. Fotografias foram tiradas usando uma câmera de fundo(TRC-SOEX Retina Camera). Imagens foram capturadas usando osistema TOPCON IMAGEnet™. Corante fluoresceina (10% f luo-resceina sódio, aproximadamente 0,1 mL/kg) foi injetado porvia portas de acesso vascular. Fotografias foram tiradas emvários pontos de tempo após injeção de corante para incluira fase arterial, fase arteriovenosa anterior e várias fasesarteriovenosas posteriores, a fim de avaliar neovasculariza-ção e monitorar o extravasamento de fluoresceina associada alesões por CNV. Interpretação e análise dos angiogramas defluoresceina foram conduzidas independentemente por dois of-talmologistas.

Neovascularização (NV) foi avaliada em angiogramasantériores e cada ponto foi classificado de acordo com o es-quema a seguir:

0 - sem sinal de NV

0,5 - ponto suspeito

1 - ponto "quente"

2 - NV na queima a laser

3 - NV evidente

Extravasamento foi avaliado de acordo com o esque-ma a seguir:

0 - sem extravasamento0,5 - ponto suspeito

1 - pequeno ponto evidente de extravasamento

2 - extravasamento crescente com o tempo

3 - extravasamento maior do que os limites anterio-res (evidentemente)

Além do mais, o tamanho de cada ponto foi compara-do entre os angiogramas anterior e posterior usando medidasmorfométricas, e o aumento no tamanho do ponto resultante doextravasamento foi calculado.

4. Eletroretinogramas (ERGS) foram registrados u-sando um eletroretinógrafo Epic 2000 de acordo com os SOPsde Sierra e o SOP especifico do estudo, incluindo o uso doaparelho Ganzfield.,. no pré-estudo e no fim da semana 3. Osdados ERG tabulados foram avaliados por um oftalmologistaveterinário.

O estudo terminou no dia 21 depois da indução porCNV. Necropsia grosseira e exame histológico foram realiza-dos em órgãos e tecidos incluindo os olhos.

Resultados

1. RNAsi contra RTP801 reduziu a expressão deRTP801 no RPE/coróides de animais tratados com laser, medidano dia 6 depois da indução por CNV por PCR em tempo real(ver figura 10).

2. Comparação da classificação de ponto para ex-travasamento e neovascularização entre os olhos contralate-rais em cada macaco individual revelou que ambas as caracte-rísticas patológicas foram diminuídas nos olhos injetadoscom RNAsi de RTP801, comparado ao controle (para resultadosde extravasamento, ver figura 11; para resultados de neovas-cularização, ver figura 12).

3. Cálculo do número geral de pontos com maioresgraus clinicamente relevantes (2 e 3) de extravasamento ouneovascularização em todos os olhos injetados com RNAsi com-parado a todos os olhos injetados com PBS, novamente revelouque olhos injetados com RNAsi foram menos afetados (ver fi-gura 13, a+b).

4. Os dados da classificação geral por extravasa-mento de pontos e neovascularização foram submetidos à ava-liação estatística. A existência de diferenças entre os tra-tamentos controle e RNAsi foi analisada calculando-se o del-ta entre as graduações do ponto médio do olho direito (R)controle e olho esquerdo (L) injetado por RNAsi (delta=R-L).

A significância da diferença foi calculada usando um métodoestatístico não paramétrico, teste de graduação de sinais deWilcoxon - um teste de uma cauda. Diferentes fases de angio-gramas (arterial anterior, arteriovenosa e venosa posterior)foram analisadas separadamente para cada semana (1, 2 e 3) .

A tabela 2 mostra a significância (teste de umacauda) de diferença de graduação de extravasamento de 0 paracada grupo (valores ρ <0,05 são sublinhados). Uma reduçãosignificante na graduação de extravasamento foi encontradanos olhos esquerdos (tratados com RNAsi) com relação ao di-reito (tratado com placebo) nas semanas 2 e 3 nos angiogra-mas posteriores.

Tabela 2

<table>table see original document page 200</column></row><table><table>table see original document page 201</column></row><table>

Note que angiogramas posteriores são utilizadosusualmente para avaliação de parâmetros de extravasamento.

A tabela 3 mostra a significância (teste de umacauda) de diferença de graduação de neovascularização (NV) 0para cada grupo (valores ρ <0,05 são sublinhados).

Tabela 3

<table>table see original document page 201</column></row><table>Uma redução significante na graduação de NV foiencontrada nos olhos esquerdos com relação ao direito nassemanas 2 e 3 no período anterior e no período arteriovenosona semana 2.

Note que angiogramas anteriores são usualmente u-tilizados para avaliação de parâmetros de neovascularização.

5. Avaliações morfométricas quantitativas do au-mento na área de pontos que ocorrem entre angiogramas ante-rior (fase arterial) e posterior (fase venosa) por causa doextravasamento revelou que este parâmetro foi reduzido sig-nificativamente nos pontos de laser dentro de olhos injeta-dos com RNAsi (olho esquerdos, OS) comparados com o controle(olhos direitos, OD). Dois exemplos estão mostrados na figu-ra 14. Os gráficos demonstram o aumento relativo (em %) naárea de cada ponto no olho esquerdo e direito de animais#3315 e 3300.

Adicionalmente, notou-se em todos os estudos cita-dos que anti RNAsi de RTP801 não teve efeitos adversos noseletroretinogramas (ERG), na histologia do olho ou na estru-tura e função de outros órgãos e sistemas.

Para sumarizar os experimentos e resultados ante-riores :

1. Tanto inibição de RNAsi genética (RTP801-/-)quanto terapêutica de expressão de RTP801 no modelo CNV in-duzido por laser de degeneração macular relacionada com ida-de úmida (AMD úmida) resultam em significante redução do vo-lume CNV.

2. Resultados positivos foram obtidos em modelocamundongo e de primatas não humanos.

3. Exame patológico e ERG em macaco não revelounenhuma toxicidade mediada por RNAsi tanto nos olhos quantoem quaisquer outros órgãos ou sitemas.

C) EFICÁCIA DA TERAPIA DE COMBINAÇÃO DE RNASI DERTP801 (REDD14) E ANTICORPO ANTI-VEGF

A eficácia da terapia de combinação de RNAsi deRTP801 (REDD14) e anticorpo anti-VEGF no tratamento de doen-ças em que CNV ocorre foi testada em modelo camundongo CNVanterior.

A)Estudos do volume CNV

O volume de neovascularização coroidal (CNV) 3 se-manas após lesão por laser foi computado por microscopia defluorescência confocal previamente descrito (Sakurai et W.IOVS 2003/44: 3578-85 & Sakurai et al. TOYS 2003; 44: 2743-2749).

Em estudos prévios foi observado que anticorpo an-ti-VEGF-A (Ab) reduziu o volume CNV de uma maneira dependen-te da dose. Uma dose de 1 ng de VEGF-A Ab foi selecionadapara estudos de combinação REDDI4+VEGF-A Ab, porque essa do-se teve um efeito inibitório intermediário: VEGF-A Ab (1 ng)reduziu o tamanho de CNV em 26±6%.

Os principais resultados do estudo de anticorpoREDD14 + VEGF-A (Ab) são:

• A adição de REDD14 de uma dose inferior a 0,05pg reduziu o tamanho de CNV em 27±4% comparado ao VEGF-A Absozinho.

• A adição de REDD14 de uma dose superior a 0,25pg reduziu o tamanho de CNV em 55±3% comparado ao VEGF-A Absozinho.

B) Estudos de extravasamento de CNV

Experimento 1

Este experimento foi projetado a fim de identifi-car um efeito terapêutico de potencial aditivo ou sinergís-tico de inibição de VEGF e RTP801 no modelo de Neovasculari-zação Coroidal induzido por laser em camundongo

Materiais:

- REDD14 (RNAsi de RTP801 )

- REDD8 (controle negativo)

- Anticorpos anti-VEGF

- IgG não especifica (controle negativo)CNV foi induzida no dia zero descrito anteriormen-te; o material teste foi injetado nos sujeitos no dia zero edia 7.

Os resultados foram avaliados por angiografia defluoresceina nas semanas 1, 2, 3, e por medida do volume CNVna semana 3. Cada grupo teste foi composto de 10 olhos.

Grupos experimentais:

- VEGF Ab 0,5 ng/olho

- VEGF Ab 1 ng/olho

- VEGF Ab 2 ng/ olho

- VEGF Ab 4 ng/olho

- REDDI4 0,05 ug/olho

- REDDI4 0,1 ug/olho

- REDD14 0,25 ug/olho 30

- REDDI4 0,05 ug/olho + VEGF Ab 1 ng/olho- REDD14 0,1 ug/olho + VEGF Ab 1 ng/olho

- REDD14 0,25 ug/olho + VEGF Ab 1 ng/olho

Grupos controle

- PBS

- IgG não especifica 2 ng/olho

- REDD8 0,1 ug/olho

- REDD8 0,1 ug/olho + VEGF Ab 1 ng/olho

Resultados

Os resultados do experimento anterior estão apre-sentados nas figuras 23-24. Estes resultados mostram que ad-ministração intravitrea simultânea de VEGF Ab e REDD14 levaa uma inibição maior e dependente de dose de Neovasculariza-ção Coroidal e extravasamento de vaso sangüíneo .c.oróide, ex-pressa na menor incidência dos pontos grau 4 e maior inci-dência dos pontos grau 1.

Angiogramas foram graduados usando uma modificaçãode um esquema de graduação semiquantitativo (1-4) publicadopreviamente (Sakurai et al. IOVS 2003; 44: 2743-2749). Le-sões de grau 1 são consideradas como nunca formadas, isto é,equivalente a prevenção completa. Lesões de grau 4 são con-sideradas significantes patologicamente, isto é, equivalen-tes a lesões que seriam tratadas em pacientes. VEGF-A Ab (1ng) reduziu a incidência de lesões de grau 4 por olho em38±8% e aumentou a incidência de lesões de grau 1 por olhoem 66±43%.

Os principais resultados da combinação de REDD14 +VEGF-A Ab no estudo de extravasamento são:

- A adição de REDD14 de uma dose 0,05 pg mais bai-xa reduziu a incidência de lesões de grau 4 em 66+12% compa-rado ao VEGF-A Ab sozinho.

- A adição de REDD14 de uma dose 0,25 μς mais altareduziu a incidência de lesões de grau 4 em 60+12% comparadoao VEGF-A Ab sozinho.

- A adição de REDD14 de uma dose 0,25 pg mais altadobrou (100±34%) a incidência de lesões de grau 1 comparadoao VEGF-A Ab sozinho.

Experimento 2

Esse experimento foi projetado a fim de estudar oefeito de REDD14 na expressão de gene em RPE e retina neural.

Projeto experimentalGrupos:

- PBS

- REDD14 0,25 mg

O tamanho do grupo foi de 5 olhos. CNV foi induzi-da por tratamento a laser descrito anteriormente no dia ze-ro; o material teste foi injetado também no dia zero e o e-feito avaliado por análise de PCRq da expressão de gene emRPE e retina neural no dias zero e 5.

Resultados

Os resultados do experimento anterior estão apre-sentados na figura 25. Estes resultados mostram que a admi-nistração de REDD14 causa:

- « 40% de infra-regulagem da expressão de RTP801abaixo da linha de base tanto em RPE quanto em retina neural(ver também figura 26);- ~ 70% de supra-regulagem da expressão de PEDFacima da linha de base na retina neural (note: em olhos in-jetados com PBS, a expressão de PEDF é 40% inf ra-reguladaabaixo da linha de base);

- ~ 40% de inf ra-regulagem da expressão de VEGF164 abaixo da linha de base em RPE (note: em olhos injetadoscom PBS, a expressão de VEGF164 é 20% infraregulada);

- « 50% de redução da expressão de MCP 1 emRPE/coróides (Figura 26).

Conclusões gerais de ambos os experimentos:

- Inibição simultânea de RTP801 e VEGF teve efeitoinibitório melhor na neovascularização coroidal e extravasa-mento neovascular.

- Inibição da expressão de RTP801 por REDD14 nãoapenas previne infra-regulagem de PEDF no modelo CNV, masmelhora sua expressão comparada com a linha de base.

- Inibição de expressão de RTP801 leva a infra-regulagem concomitante de MCP 1 que deve ter um efeito anti-inflamatório.

- Sem ficar preso à teoria, o aumento na expressãode PEDF por REDD14 pode dar suporte ao efeito cooperativoobservado de inibição simultânea de VEGF e RTP801. (PEDF éum fator antiangiogênico e neuroprotetor bem conhecido.)

- Sem ficar preso à teoria, a redução de expressãode MCP 1 por REDD14 pode também dar suporte ao efeito coope-rativo observado de inibição simultânea de VEGF e RTP801.(MCP 1 é uma conhecida quemoquina pró-inflamatória envolvidana patogênese de AMD.)Modelos adicionais AMDs que podem ser usados paratestar os métodos da presente invenção:

- Animais deficientes de Ccl-2 ou Ccr-2 - defici-ência em qualquer destas proteínas causa o desenvolvimentode alguns das principais características de AMD. Animais de-ficientes destas proteínas podem ser usados para testar osmétodos da presente invenção.

Para informação mais detalhada de modelos animaisAMD, ver: Chader, Vision research 42 (2002) 393-399; Ambatiet al., Nature Medicine 9(11) (2003) 1390-1397; Tolentino etal., Retina 24 (2004) 132-138.

D) Comparação de atividade de REDD14 e RNAsi deRTP801 que possui um grupo fosfato 3' em cada fita com amesma molécula sem fosfatos 3' (REDD14NP) no modelo CNV in-duzido por laser.

O experimento foi em geral realizado e avaliadocomo descrito anteriormente. Um olho de cada camundongo (12por grupo) foi injetado com 0,25 ug de RNAsi de REDD14, aopasso que o outro olho foi injetado com RNAsi de REDD14NP.

Resultados

Ambos RNAsi reduziram de maneira igual e eficienteo volume de CNV (Figura 27) .exemplo 7

Modelos e resultados relacionados à COPD e Enfisema

Os compostos da presente invenção foram testadosem modelos animas a seguir:

* Modelo enfisema induzido por fumaça de cigarro:exposição crônica à fumaça de cigarro causa enfisema em vá-rios animais tais como, inter alia, camundongo, porquinho daíndia.

* Atividade de protease no pulmão como um desenca-deador de enfisema.

* Modelo de inibição de VEGFR de enfisema.

* Instilação bronquial com neutrófilo huma-no/elastase pancreática em roedores.

* Enfisema induzido por MMP (matriz metaloprotease).

* Enfisema induzido por inflamação.

Adicionalmente, modelos de enfisema podem ser ge-rados por meios genéticos (por exemplo, camundongos que car-regam a mutação TSK), e animais enfisematosos podem ser ge-rados por modificadores conhecidos de suscetibilidade a en-fisema tais como, inter alia, lesão de pulmão, hipoplasiaalveolar, hiperóxia, tratamento com glicocorticóides e nu-trição.

A. Avaliação da influência de ausência de RTP801no desenvolvimento da doença em modelo camundongo de enfise-ma (usando camundongo knockout RTP801)

(1) Inflamação e apoptose induzidas por fumaça decigarro (CS) são iniciadas em 5 camundongos KO RTP801 machosde quatro meses e 5 controles tipo selvagem. Os camundongossão submetidos à intensa CS (descrito em Rangasamy et al.,ver anteriormente) por 7 dias. Camundongos KO e WT não tra-tados do experimento de inibição de VEGFR anterior podemtambém servir como grupos controle não tratados para esseexperimento. Os pulmões são subseqüentemente inflados poragarose, fixados e embutidos em parafina, e o desenvolvimen-to do estresse oxidativo nos camundongos KO é avaliado por:

a) localização e quantificação imuno-histoquimicade 8-oxo-dG nas seções de pulmão;

b) localização e quantificação imuno-histoquimicade caspase 3 ativa nas seções de pulmão, usando anticorposespecíficos, ou avaliação quantitativa do número de célulasTUNEL positivas;

c) medida da concentração de ceramida nos extratosde pulmão;

d) medida de atividade da caspase nos extratos depulmão.

(2) Fumaça de cigarro a longo prazo em camundongosKO. 6 camundongos fêmeas KO e 6 WT de idade casada foramsubmetidos à intensa fumaça de cigarro (5 horas por dia) du-rante um período de 6 meses. Os camundongos foram então sa-crificados, e diâmetro interseptal médio (um parâmetro dedesenvolvimento do enfisema) foi avaliado usando uma aborda-gem morfométrica.

B. Avaliação da influência de ausência de RTP801na progressão da doença em modelos camundongo de enfisema,pela inibição de RTP801 endógena empregando RNAsi que inati-va RTP801 na distribuição intrapulmonar

Inflamação induzida por CS foi induzida por 7 diasde fumaça em 2 grupos de camundongos C57BL6, 10 camundongospor grupo. Grupo 1: CS + distribuição de RNAsi (REDD8) RNAsicontrole; Grupo 2: CS + RNAsi de RTP801 (REED14). Gruposcontrole de camundongos foram instilados com qualquer tipode RNAsi, mas mantidos em condições de ar ambiente. Os ani-mais foram avaliados como no experimento anterior com os ca-mundongos Knock-Out.

Métodos

Exposição à fumaça de cigarro (CS)

A exposição é realizada (7 horas/dia, 7 di-as/semana) queimando cigarros de referência 2R4F (2,45 mg denicotina por cigarro; comprados do Tobacco Research Institu-te, University de Kentucky, Lexington, KY, USA) usando umamáquina de fumaça (Modelo TE-10, Teague Enterprises, Davis,CA, USA). Cada cigarro queimando lentamente foi baforado por2 segundos, uma vez cada minuto por um total de oito bafora-das, em uma vazão de 1,05 L/minuto, para fornecer uma bafo-rada padrão de 35 cm3. A máquina de fumaça é ajustada paraproduzir uma mistura de fumaça secundária (89%) e fumaçaprincipal (11%) pela queima de cinco cigarros por vez. A at-mosfera da câmara é monitorada por particulados suspensos emonóxido de carbono totais, com concentrações de 90 mg/m3 e350 ppm, respectivamente.

Análise morfológica e morfométrica

Após a exposição dos camundongos à CS ou instila-ção de plasmideo que expressa RTP801, os camundongos são a-nestesiados com halotano e os pulmões são inflados com 0,5%de agarose de baixa fusão, a uma pressão constante, de 25 cmpreviamente descrita6. Os pulmões inflados são fixados emformalina tamponada a 10% e embutidos em parafina. Seções (5pm) são coradas com hematoxilina e eosina. 0 diâmetro alve-olar médio, comprimento alveolar e interceptos lineares mé-dios são determinadas por morfometria assistida por computa-dor com o software Imagem Pro Plus (Media Cybernetics, Sil-ver 30 Spring, MD, USA). As seções de pulmão em cada gruposão codificadas e imagens representativas (15 por seção depulmão) são adquiridas por um investigador que não conhece aidentidade das lâminas com um microscópio Nikon E800, lentesde 20X.

Lavagem broncoalveolar (BAL) e fenotipagem

Após a exposição à CS ou instilação de plasmideoque expressa RTP801, os camundongos são anestesiados com só-dio pentobarbital. O fluido BAL coletado dos pulmões dos ca-mundongos é centrifugado (500 g a 4°C), e o precipitado ce-lular é novamente suspenso em uma salina tamponada por fos-fato. O número total de células no fluido da lavagem é de-terminado, e 2 χ 10^4 células são citocentrifugadas (ShandonSouthern Products, Pittsburgh, PA, USA) sobre lâminas de vi-dro e coradas com corante Wright-Giemsa. As contagens dife-renciais de células são realizadas em 300 células, de acordocom as técnicas citológicas padrões.

Identificação de populações de células apoptóticasalveolares nos pulmões.

Para identificar os diferentes tipos de célula al-veolar submetendo-se a apoptose nos pulmões, uma coloraçãoimuno-histoquimica de caspase 3 ativa é realizada nas seçõesde pulmão de camundongos expostos ao ar ambiente (RA) bemcomo à CS. Para identificar as células epiteliais tipo IIapoptóticas nos pulmões, depois de marcação com caspase 3ativa, as seções de pulmão são incubadas primeiro com anti-corpo de proteína C do agente tensoativo anti-camundongo eentão com um anticorpo TexasRed anti-coelho. Células endote-liais apoptóticas são identificadas por incubação das pri-meiras seções com o anticorpo CD 31 anti-camundongo e entãocom o anticorpo secundário de coelho anti-camundongo bioti-nilado. As seções de pulmão são rinsadas em PBS e então in-cubadas com o complexo conjugado estreptavidina-TexasRed. Osmacrófagos apoptóticos nos pulmões são identificados por in-cubação das seções primeiramente com o anticorpo rato anti-camundongo Mac-3 e então com o anticorpo TexasRed anti-rato.

Finalmente, DAPI é aplicada em todas as seções de pulmão,incubadas por 5 minutos, lavadas e montadas com o meio demontagem Vectashield HardSet. DAPI e fluoresceina são visua-lizadas a 330-380 nM e a 465-495 nM, respectivamente. Ima-gens das seções de pulmão são adquiridas com o MicroscópioNikon E800, lentes de 40X.

Localização imuno-histoquímica de caspase-3 ativaColoração imuno-histoquímica do ensaio de caspase-3 ativa é realizada usando anticorpo anti-caspase-3 ativa eas células positivas caspase-3 ativa são contadas com um ma-cro, usando o programa Imagem Pro Plus. As contagens sãonormalizadas por uma soma dos perfis alveolares aqui nomea-dos comprimento alveolar e expressos em μΜ. Comprimento al-veolar correlaciona-se inversamente com o intercepto linearmédio, isto é, à medida que os septos alveolares são destru-ídos, interceptos lineares médios aumentam bem como o com-primento alveolar total, isto é, comprimento total dos sep-tos alveolares diminui.

Ensaio da atividade de caspase 3

A atividade de caspase-3/7 é medida em extratos detecido de pulmão usando um ensaio fluorométrico de acordocom as instruções do fabricante. Tecido de pulmão congeladorapidamente (n = 3 por grupo) foi homogeneizado com o tampãodo ensaio, seguido por sonificação e centrifugação a 800 χg. Após a remoção dos núcleos e fragmentos celulares, o so-brenadante (300 gg de proteína) é então incubado com o subs-trato pró-fluorescente à temperatura ambiente por 1 hora e aintensidade da fluorescência foi medida utilizando um fosfo-imageador Typhoon (Amersham Biosciences, Inc., Piscataway,NJ, USA). Os resultados são expressos como a taxa de cliva-gem de substrato específico de caspase-3, expresso em unida-des de atividade enzimática de caspase 3, normalizada poruma concentração de proteína total. Caspase 3 recombinanteativa foi utilizada como ensaio padrão (0-4 U) . Lisados detecidos sem substrato, tampão de ensaio sozinho e lisadoscom 3 inibidor de caspase 3 foram utilizados como controlesnegativos.

Localização imuno-histoquímica de 8-oxo-dG

Para a localização e quantificação imuno-histoquímica de 8-oxo-dG, seções de pulmão dos camundongosexpostos à CS ou instilado com plasmídeo que expressa RTP801são incubadas com anticorpo anti-8-oxo-dG e coradas usando oestojo InnoGenexTM Iso-IHC DAB usando anticorpos de camun-dongos. As células 8-oxo-dG-positivas são contadas com ummacro (usando Imagem Pro Plus), e as contagens foram norma-lizadas pelo comprimento alveolar da maneira descrita.

Instilação de plasmideo DNA nos pulmões de camun-dongos

DNA de plasmideo de vetores que expressam RTP801 ede controle são preparados usando um estojo de isolamento deDNA sem endotoxina. Para instilação infra-traqueal, 50 ug deDNA de plasmideo são distribuídos em 80 uL de perfluorocar-bono estéril. As propriedades de carregar oxigênio de per-fluorocarbono tornam-no bem tolerado nesses volumes, enquan-to suas propriedades fisicoquimicas permitem a distribuiçãode pulmão distai extremamente eficiente, quando instiladointratraquealmente. Os camundongos são anestesiados por ex-posição ao halotano inalacional rapidamente, a língua é gen-tilmente puxada para frente por fórceps e o instilado detraquéia com solução perflúor de carbono aplicado na base dalíngua via um angiocateter de extremidade cega.

Instilação de RNAsi em pulmões de camundongos.

Os camundongos são anestesiados com uma injeçãointraperitonial de cetamina/Xilazina (115/22 mg/kg). 50 pgde RNAsi são instilados intranasalmente em volume de 50 μΙ.de NaCl 0,9% por distribuição de cinco porções consecutivasde 10 pL. No fim da instilação intranasal, a cabeça do ca-mundongo é mantida esticada para cima por 1 minuto para as-segurar que toda a solução instilada drene por dentro.

Para informação mais detalhada, ver: Rangasamy T,Cho CY, Thin mulappa, RK, Zhen L, Srisuma SS, Kensler TW,Yamamoto M, Petrache I, Tuder RM, Biswal S. Genetic ablationofNrf2 enhances susceptibility to cigarette smoke-iduced em-physema in mice. Submitted to Journal of Clinincal Investi-gation; Yasunori Kasahara, Rubin M. Tuder, Carlyne D. CoolfDavid A. Lynch, Sonia C. Flores, e Norbert F. Voelkel. Endo-thelial Cell Death and Decreased Expression of Vascular En-dothelial Growth Factor and Vascular Endothelial Growth Fac-tor Receptor 2 in Emphysema. Am J Respir Crit Care Med Vol163. pp 737-744, 2001; Yasunori Kasahara, Rubin M. Tuder,Laimute Taraseviciene-Stewart, Timothy D. Le Cras, StevenAbman, Peter K. Hirth, Johannes Waltenberger, e Norbert F.Voelkel. Inhibition of VEGF receptors causes Iung cell apop-tosis and emphysema. J. Clin. Invest. 106:1311-1319 (2000);e uma revisão no tópico: Robin M. Tuder, Sharon McGrath eEnid Neptune, The pathological mechanisms of emphysema mod-els: what do they have in common?, Pulmonary Pharmacology &Therpaeutics 2002.

Resultados

1. A instilação de um plasmideo que expressaRTP801 resulta em um fenótipo semelhante a enfisema em pul-mões de camundongos que é evidente por (1) aumento na conta-gem de células de lavagem broncoalveolar (Figura 15a); (2)apoptose de células septais de pulmão (Figura 15b) e aumentono diâmetro alveolar (Figura 15c).

2. Instilação de RNAsi de RTP801 (REDD14) resultana redução da expressão de RTP801 nos pulmões (Figura 17b).

3. Camundongos KO RTP801 são protegidos do desen-volvimento do enfisema após 6 meses de fumaça de cigarro,evidenciado pela falta de aumento do diâmetro alveolar. (Fi-gura 18).4. Camundongos KO RTP801 são protegidos da infla-mação induzida por fumaça de cigarro evidenciado pelo númeroreduzido de células bronquioalveolares inflamatórias após 1semana de fumaça de cigarro (Figura 16, a-b) .

5. Camundongos KO RTP801 são protegidos de apopto-se induzida por fumaça de cigarro de células septais de pul-mão, evidenciada pela coloração da seção de pulmão por cas-pase ativado (Figura 16c).

6. Camundongos instilados por REDD14 são parcial-mente protegidos da inflamação induzida pela fumaça de ci-garro evidenciada pelo número reduzido de células broncoal-veolares inflamatórias após 1 semana de fumaça de cigarro(Figura 17a).

7. Camundongos instilados por REDD14 são parcial-mente protegidos da apoptose induzida pela fumaça de cigarrode células septais de pulmão, evidenciada pela coloração daseção de pulmão por caspase ativado e por immunoblotting deextratos de pulmão com anticorpos anti-caspase 3 ativado.

(Figura 17c)

Exemplo 8.

Modelos e resultados relacionados à desordens mi-crovasculares

Os compostos da presente invenção foram testadosem modelos animais com uma faixa de desordens microvascula-res como descrito a seguir.

1. Retinopatia diabética

RTP801 promove apoptose de célula neuronal e gera-ção de espécies oxigênio reativas in vitro. O inventor dapresente invenção também observou que, em camundongos knoc-kout (KO) RTP801 sujeitos ao modelo de retinopatia de prema-turidade (ROP), neovascularização patológica NV foi reduzidasob condições hipóxicas, apesar de elevações em VEGF, aopasso que a ausência desse gene não influenciou a neonatalretinal NV fisiológica. Além disso, nesse modelo, a ausênciade RTP801 foi também protetora contra apoptose neural hipó-xica e vaso-obliteração hiperóxica.

Experimento 1

Diabetes foi induzida em camundongos KO RTP801 etipo selvagem (WT) C57/129sv de mesma ninhada com 8 semanasde idade por injeção intraperitonial de STZ. Depois de 4 se-manas, ERG (lampejo branco individual, 1,4χ10Λ4 ftc, 5 ms)foi obtido do olho esquerdo depois de 1 hora de adaptação noescuro. RVP foi avaliada em ambos os olhos usando a técnicade permeação de albumina azul de Evans.

Resultados

A glicose sangüínea não foi diferente entre diabé-tico WT (DM) e KO DM (495±109 vs 513 + 76 mg/dL) nem WT e KOnão diabético (NDM) (130±10 vs 135±31 mg/dL, respectivamen-te). RVP no grupo WT DM aumentou 138% (51,2 ± 37,9 yL/g/hr,n=8) comparado ao WT NDM(21,5 ± 18,8 pL/g/hr, n=9, p=0, 055).Ao contrário, RVP foi reduzida em 80% em KO DM (9,5 ± 8,5yL/g/hr, n=6, p=0,023) comparada com os camundongos WT DM,resultando em uma diminuição de 140% de RPV induzida por di-abetes. Em camundongos WT DM, houve uma prolongação (p<0,05)do tempo implícito do potencial oscilatório para 0P2 (11%),0P3 (12%), & 0P4 (14%) e para a onda B (23%), comparado comos WT NDM. Onda Δ não mudou significativamente. Estas mudan-ças foram normalizadas «100% em camundongos KO DM para 0P3 &0P4 e 65% para onda B comparado com os KO NDM.

Conclusão: Knock out de RTP801 atenua anormalida-des RPV e ERG induzidas por diabetes em camundongos, suge-rindo que esse gene indutivel por hipóxia pode ter um papelimportante na patogênese de doença retinal diabética precoce.

Experimento 2

Diabetes foi induzida em camundongos knockoutRTP801 e em controle tipo selvagem com o fundo genético ca-sado. Além do mais, ela foi induzida em camundongos C57B16,que foram subseqüentemente usados para injeção intravitreade anti-RTP801 e RNAsi controle. Para indução de diabetes,os camundongos foram injetados com estreptozotocina (STZ 90mg/kg/d por 2 dias depois de jejum por toda a noite). A fi-siologia do animal foi monitorada durante todo o estudo comrelação às mudanças na glicose sangüínea, peso corporal, ehematócritos. Camundongos injetados com veículos serviramcomo controles. Os animais apropriados foram tratados porinjeções intravítreas de pulmão de anti-RNAsi de RTP801REDD14 ou pulmão de anti-RNAsi GFP controle. RNAsi foi inje-tado duas vezes no curso do estudo - no dia 0, quando a pri-meira injeção de STZ foi realizada, e no dia 14 após a inje-ção de STZ.

0 extravasamento retinal vascular foi medido usan-do a técnica de corante de azul de Evans (EB) nos animaisapós 4 semanas de duração do diabetes. Os camundongos tive-ram um cateter implantado na veia jugular direita 24 horasantes das medições com azul de Evans (EB). Medidas de perme-abilidade retinal em ambos os olhos de cada animal seguiramum protocolo azul de Evans padrão.

Resultados

1. Extravasamento retinal de vaso sangüíneo foireduzido em 70% em camundongos diabéticos KO RTP801 compara-do com camundongos diabéticos tipo selvagem (ver figura 20).

2. O Knock out de RTP801 normaliza anormalidadesERG em camundongos: Em camundongos WT DM, houve um prolonga-mento (p<0,05) dos tempos implícitos de potencial oscilató-rio para 0P2 (11%), 0P3 (12%), & 0P4 (14%) e para a onda B(23%) comparado com WT -NDM. A onda A não mudou significati-vamente. Essas mudanças foram normalizadas «100% em camun-dongo KO RTP801 DM para 0P3 & 0P4 e 65% por onda B comparadocom KO RTP801 NDM (ver figura 21).

3. Similarmente aos resultados em camundongos K0,extravasamento retinal de vaso sangüíneo foi reduzido em 50%em camundongos diabéticos injetados intravitralmente comRNAsi REDD14 contra RTP801 comparado com camundongos diabé-ticos injetados intravitralmente com RNAsi controle contraGFP (ver figura 22).

2. Retinopatia de prematuridade

Retinopatia de prematuridade foi induzida pela ex-posição de animais testes a condições hipóxicas e hiperóxi-cas, e subseqüentemente pelo teste dos efeitos na retina.Resultados mostraram que camundongos KO RTP801 foram prote-gidos da retinopatia de prematuridade, com isso validando oefeito protetor da inibição de RTP801.

3.Infarto do miocárdio

Infarto do miocárdio foi induzido pela ligação daartéria anterior descendente esquerda em camundongos, tantoa curto prazo quanto a longo prazo. Resultados: redução dosníveis de fração de TnT e CPK-MB em 24 horas pós-infarto nosangue e melhor ecocardiograma (volume de fração de ejeção)em 28 dias pós-infarto em camundongos KO RTP801.

4.Condições isquêmicas microvasculares

Modelos animais para avaliar condições isquêmicasincluem:

1. Trauma Fechado da Cabeça (CHI) - TBI experimen-tal produz uma série de eventos, que contribui para cascatasneurológicas e neurometabólicas, que estão relacionadas como grau e a extensão de déficits comportamentais. CHI é indu-zida sob anestesia, enquanto um peso é deixado em queda li-vre de uma altura pré-fixada (Chen et al, J. Neurotrauma 13,557, 1996) sobre o esqueleto exposto cobrindo o hemisférioesquerdo no plano médio-coronal.

2. Oclusão de artéria cerebral média transiente(MCAO) - Isquemia focai transiente de 90 a 120 minutos é re-alizada em ratos adultos, machos Sprague Dawley, 300-370 g.O método empregado é o MCAO de sutura intraluminal (Longa etal., Stroke, 30, 84, 1989, e Dogan et al., J. Neurochem. 72,765, 1999). Resumidamente, sob anestesia por halotano, ummaterial de sutura 3-0-náilon revestido com Poli-L-Lisina éinserido na artéria carótida interna direita (ICA) em um o-rifício na artéria carótida externa. 0 fio de náilon é pres-sionado contra a ICA para a origem direita da MCA (20-23mm). 90-120 minutos mais tarde o fio é retirado, o animal éfechado e deixado recuperar naturalmente.

3. Oclusão de artéria cerebral média permanente(MCAO) - a oclusão é permanente induzida unilateralmente porelectrocoagulação de MCA. Ambos os métodos levam à isquemiacerebral focai do lado ipsilateral do córtex cerebral, dei-xando o lado contralateral intacto (controle). 0 MCA esquer-do é exposto via uma cranioectomia temporal, descrita pararatos por Tamura A. et al., J Cereb Blood Flow Metab.1981;1:53-60. A MCA e seus ramos lenticulostriatais são fe-chados proximalmente à borda mediai do trato olfatório comcoa-gulação microbipolar. A f erida é suturada, e os animaisretornados para suas gaiolas em um ambiente aquecido a 26°Ca 28°C. A temperatura dos animais é mantida todo o tempo comum termostato automático.

5. Insuficiência renal aguda. (ARF)

Testes de RNAsi ativo para tratar ARF podem serfeito usando ARF induzida por sepse ou ARF induzida por re-perfusão isquêmica.

1. ARF induzida por sepse

Dois modelos animais preditivos de ARF induzidapor sepse são descritos por Miyaji T, Hu X, Yuen PS, Mura-matsu Y, Iyer S, Hewitt SM, Star RA, 2003, Ethyl pyruvatedecreases sepsis-induced acute renal failure and multipleorgan damage in aged mice, Rim Mt_ Nov; 64(5):1620-31. Estesdois modelos são administração de lipopolissacarideo e pun-ção de ligação cecal em camundongos, preferivelmente camun-dongos velhos.

2. ARF induzida pela reperfusão isquêmicaEsse modelo animal preditivo é descrito por KellyKJ, Plotkin Z, Vulgamott SL, Dagher PC, 2003 January,. P53mediates the apoptotic response to GTP depletion after renalischemiareperfusion: protective role of a p53 inhibitor, JAm Soc Nephrol;14(1):128-38.

A lesão de reperfusão isquêmica foi induzida emratos após 45 minutos de fixação arterial de rim bilateral esubseqüente liberação do grampo para permitir 24 horas dereperfusão. 250 μg de RNAsi REDD14 ou GFP (controle negati-vo) foram injetados na veia jugular 2 horas antes e 30 minu-tos após a fixação. 250 pg adicionais de RNAsi foram forne-cidos via veia caudal em 4 e 8 horas após a fixação. RNAsicontra GFP serviu como um controle negativo. A progressão daARF foi monitorada pela medida de niveis de creatinina séri-ca antes e 24 horas depois da cirurgia. No fim do experimen-to, os ratos foram perfundidos via uma linha femoral de per-manência com PBS aquecido seguido de 4% de paraformaldeido.

Os rins esquerdos foram removidos e armazenados em parafor-maldeido a 4% para subseqüente análise histológica. Insufi-ciência renal aguda é freqüentemente definida como um aumen-to agudo dos niveis de creatinina sérica em relação à linhade base. Um aumento de pelo menos 0,5 mg por dL ou 4 4,2 ymolpor L de creatinina sérica é considerado uma indicação parainsuficiência renal aguda. A creatinina sérica foi medida notempo zero antes da cirurgia e 24 horas depois da cirurgiade ARF.Para estudar a distribuição de RNAsi em rim de ra-to, moléculas de RNAsi de extremidade cega 19-mer marcadaspor Cy3 (2 mg/kg) tendo modificação O-metila alternada nosresíduos de açúcar foram administradas iv por 3-5 minutos,depois do que o imageamento in vivo foi conduzido usando mi-croscopia confocal de dois fótons. A análise de microscopiaconfocal revelou que a maioria de RNAsi nos rins é concen-trada no compartimento endossomal de células tubulares pro-ximais. Tanto fluorescência de RNAsi endossomal quanto cito-plásmica foram relativamente estáveis durante as primeiras 2horas após a distribuição e desapareceram em 24 horas.

Conforme evidenciado na figura 19, houve um aumen-to de dez vezes no nível de cre.atini.na sérica.após 45 minu-tos de tratamento de fixação da artéria bilateral do rim(tratamento com PBS). Quatro injeções de RNAsi 801 (REDD14,SEQ In No.s 16 e 66) (2 horas 30 minutos antes da fixação e,4 horas e 8 horas após a fixação) reduziram significativa-mente o nível de creatinina sérica em 40% (P<0,02). Estesresultados sugerem que RNAsi 801 pode proteger o tecido re-nal dos efeitos da lesão de reperfusão isquêmica e assim re-duzir a severidade de ARF.

Exemplo 9

Preparação de RNAsi

Usando algoritmos proprietários e a seqüência co-nhecida do gene RTP801 (SEQ ID NO:l), as seqüências de vá-rios RNAsi potenciais foram geradas. Moléculas de RNAsi deacordo com as especificações anteriores foram preparadas es-sencialmente como aqui descrito.O RNAsi da presente invenção pode ser sintetizadopor quaisquer dos métodos que são bem conhecidos na técnicapara síntese de oligonucleotídeos ribonucléicos (ou desoxir-ribonucléicos). Por exemplo, uma máquina disponível comerci-almente (disponível, inter alia, por Applied Biosystems) po-de ser usada; os oligonucleotídeos são preparados de acordocom as seqüências aqui reveladas. Pares sobrepostos de frag-mentos sintetizados quimicamente podem ser ligados usandométodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, ver patentesU.S. No. 6.121.426). As fitas são sintetizadas separadamentee então são aneladas umas as outras no tubo. Então, os RNAside fita dupla são separados dos oligonucleotídeos de fitasimples que não foram anelados (por exemplo, em virtude doexcesso de um deles) por HPLC. Com relação aos RNAsi oufragmentos de RNAsi da presente invenção, duas ou mais dastais seqüências podem ser sintetizadas e ligadas uma na ou-tra para uso na presente invenção.

As moléculas de RNAsi da invenção podem ser sinte-tizadas por procedimentos conhecidos na técnica, por exem-pio, os procedimentos descritos em Usman et al., 1987, J.Am. Chem. Soc., 109, 7845; Scaringe et al., 1990, NucleicsAcids Res., 18, 5433; Wincott et al., 1995, Nucleics AcidsRes. 23, 2677-2684; e Wincott et al., 1997, Methods Mal. Βί-ο., 74, 59, e podem fazer uso de grupos de proteção e aco-plamento de ácido nucléico comum, tal como dimetoxitritilana extremidade 5' e fosforamidites na extremidade 3'. Os nu-cleotídeos modificados (por exemplo, 2'-0-metilados) e nu-cleotídeos não modificados são incorporados como desejados.Alternativamente, as moléculas de ácido nucléicoda presente invenção podem ser sintetizadas separadamente eunidas entre si pós-sinteticamente, por exemplo, por ligação(Moore et al., 1992, Science 256, 9923; Draper et al., In-ternational PCT publication No. W093/23569; Shabarova etal., 1991, Nucleics Acids Research 19, 4247; Bellon et al.,1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951; Bellon et al.,1997, Bioconjugate Chem. 8, 204), ou por hibridização após asíntese e/ou desproteção.

As moléculas de RNAsi da invenção também podem sersintetizadas via uma metodologia de síntese em tandem, des-crita em publicação do pedido de patente U.S. No.US2004/0019001 (McSwiggen), em que ambas as fitas de RNAsisão sintetizadas como fragmentos ou fita de oligonucleotí-deos contíguos simples separados por um ligante clivável,que é subseqüentemente clivado para fornecer fragmentos oufitas de RNAsi separados que hibridizam e permitem purifica-ção do RNAsi duplex. 0 ligante pode ser um ligante de poli-nucleotídeo ou um ligante de não nucleotídeo.Para informaçãomais detalhada, ver PCT publicação No. WO 2004/015107 (ATU-GEN).

Como descrito anteriormente, os RNAsi da tabela A(a seguir) foram construídos de maneira tal que açúcaressubstitutos tenham modificação 2'-0-metila, isto é, nucleo-tídeos substitutos foram assim modificados. Nessas modalida-des preferidas, em um fita do RNAsi os nucleotídeos modifi-cados foram os números 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 e 19 ena fita oposta os nucleotídeos modificados foram os números2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 e 18. Assim esses RNAsi são molé-culas de RNA 19-mer de extremidade cega com modificação 2-Ο'-metila substituta da forma descrita anteriormente. OsRNAsi das tabelas 2 e 3 (a seguir) são também construídosdessa maneira; os RNAsi das tabelas BeD são moléculas deRNA 19-mer de extremidade cega com modificação 2-01-metilasubstituta; os RNAsi da tabela C são moléculas de RNA 21-merde extremidade cega com modificação 2-0'-metila substituta.

A tabela A detalha várias moléculas de RNAsi iné-ditas que foram geradas e subseqüentemente sintetizadas pelogene RTP801. As duas colunas finais indicam os resultados dedois experimentos realizados para examinar a atividade dasmoléculas inéditas. Resumidamente, células. HeLa ou HaCat fo-ram transfectadas com um RNAsi específico inédito para ser15 testado. A expressão do polipeptídeo RTP801 foi então deter-minada por western blotting usando um anticorpo contra o po-lipeptídeo RTP801. Referindo-se às duas colunas do lado di-reito da tabela A, "-" significa uma molécula inativa ou debaixa atividade (que não inibe substancialmente a expressãodo gene RTP801); "+" significa uma molécula de RNAsi com al-guma atividade inibitória (de expressão do gene RTP801),"++" significa uma molécula com atividade inibitória maior,e assim por diante. Qualquer uma das moléculas de RNAsi aquireveladas, e em particular as moléculas ativas detalhadas natabela A, são inéditas e também consideradas uma parte dapresente invenção.Tabela A

<table>table see original document page 228</column></row><table><table>table see original document page 229</column></row><table><table>table see original document page 230</column></row><table><table>table see original document page 231</column></row><table>Note que, na tabela A anterior, as fitas sentidode RNAsi 1-50 têm SEQ ID NOS: 3-52 respectivamente, e as fi-tas anti-sentido de RNAsi 1-50 têm SEQ ID NOS: 53-102, res-pectivamente. A molécula designada REDD14 tem SEQ ID Nos 16(Fita sentido) e 66 (fita anti-sentido).<table>table see original document page 233</column></row><table><table>table see original document page 234</column></row><table><table>table see original document page 235</column></row><table><table>table see original document page 236</column></row><table><table>table see original document page 237</column></row><table><table>table see original document page 238</column></row><table><table>table see original document page 239</column></row><table><table>table see original document page 240</column></row><table><table>table see original document page 241</column></row><table><table>table see original document page 242</column></row><table><table>table see original document page 243</column></row><table><table>table see original document page 244</column></row><table><table>table see original document page 244</column></row><table><table>table see original document page 246</column></row><table><table>table see original document page 247</column></row><table><table>table see original document page 248</column></row><table><table>table see original document page 249</column></row><table><table>table see original document page 250</column></row><table><table>table see original document page 251</column></row><table><table>table see original document page 252</column></row><table><table>table see original document page 253</column></row><table><table>table see original document page 254</column></row><table><table>table see original document page 255</column></row><table><table>table see original document page 256</column></row><table><table>table see original document page 257</column></row><table><table>table see original document page 258</column></row><table><table>table see original document page 259</column></row><table><table>table see original document page 260</column></row><table><table>table see original document page 261</column></row><table>Exemplo 10

Farmacologia e distribuição de medicamento

As seqüências de nucleotideo da presente invençãopodem ser distribuídas tanto diretamente quanto com vetoresvirais ou não virais. Quando distribuídas diretamente, asseqüências geralmente tornam-se resistentes à nuclease. Al-ternativamente, as seqüências podem ser incorporadas noscassetes ou construções de expressão, de maneira tal que aseqüência seja expressa na célula da maneira aqui discutidaa seguir. Geralmente a construção contém seqüência regulató-ria própria ou promotor para permitir que a seqüência sejaexpressa na célula alvejada.

Os compostos ou composições farmacêuticas da pre-sente invenção são administrados e dosados de acordo com boaprática médica, levando em consideração a condição clínicado paciente individual, a doença a ser tratada, os sítio emétodos de administração, programa de administração, idade,sexo e peso corporal do paciente e outros fatores conhecidospelos profissionais médicos.

A "quantidade efetiva" farmaceuticamente aqui como propósito, é assim determinada por considerações tais comosão conhecidas na técnica. A quantidade deve ser efetiva pa-ra atingir melhorias incluindo, mas sem limitações, taxa desobrevivência melhorada ou recuperação mais rápida, ou me-lhorias ou eliminação de sintomas e outros indicadores sele-cionados como medidas apropriadas pelos versados na técnica.

O tratamento geralmente tem uma duração proporcio-nal à duração do processo da doença e eficácia do medicamen-to e a espécie do paciente que está sendo tratado. Pode-senotar que humanos são tratados geralmente mais tempo que oscamundongos ou outros animais experimentais aqui exemplifi-cados.

Os compostos da presente invenção podem ser admi-nistrados por qualquer das vias de administração convencio-nais. Deve-se notar que o composto pode ser administrado co-mo composto ou como sal farmaceuticamente aceitável e podeser administrado sozinho ou como um ingrediente ativo emcombinação com carreadores, solventes, diluentes, excipien-tes, adjuvantes e veículos farmaceuticamente aceitáveis. Oscompostos podem ser administrados oralmente, subcutâneamenteou parenteralmente incluindo administração intravenosa, in-tra-arterial, intramuscular, intraperitoneal e intranasal,bem como técnicas intraqueal e de infusão. São também usadosimplantes dos compostos. As formas líquidas podem ser prepa-radas para injeção, o termo incluindo vias de administraçãosubcutânea, transdérmica, intravenosa, intramuscular, intra-tecal e outras parentais. As composições líquidas incluemsoluções aquosas, com e sem co-solventes orgânicos, suspen-sões aquosas ou oleosas, emulsões com óleos comestíveis, bemcomo veículos farmacêuticos similares. Além do mais, sobcertas circunstâncias, as composições para uso nos tratamen-tos inéditos da presente invenção podem ser formadas comoaerossóis para administração intranasal e semelhante. O pa-ciente em tratamento é um animal de sangue quente e, em par-ticular, mamíferos, incluindo o homem. Os carreadores, sol-ventes, diluentes, excipientes, adjuvantes e veículos farma-ceuticamente aceitáveis, bem como carreadores de implante,geralmente referem-se a cargas, diluentes ou material de en-capsulamento inerte, sólido ou liquido não tóxico que nãoreagem com os ingredientes ativos da invenção.

Quando o composto da presente invenção é adminis-trado parenteralmente, ele é geralmente formulado em umaforma injetável de dosagem de unidade (solução, suspensão,emulsão). As formulações farmacêuticas adequadas para inje-ção incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pósestéreis para reconstituição nas soluções ou dispersões in-jetáveis estéreis. O carreador pode ser um solvente ou ummeio de dispersão que contém, por exemplo, água, etanol, po-Iiol (por exemplo, glicerol, propile.no glicol, polietilenoglicol liquido e similares), misturas adequadas destes e ó-Ieos vegetais.

Fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo,pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manuten-ção do tamanho da partícula requerida no caso de dispersão epelo uso de agentes tensoativos. Veículos não aquosos taiscomo óleo de semente de algodão, óleo de sésamo, óleo de o-liva, óleo de soja, óleo de milho, óleo de girassol ou óleode amendoim e ésteres, tais como miristato de isopropila,também podem ser usados como sitemas solventes para composi-ções dos compostos. Adicionalmente, vários aditivos que au-mentam a estabilidade, esterilidade e isotonicidade das com-posições, incluindo conservantes antimicrobianos, antioxi-dantes, agentes quelantes e tampões podem ser adicionados. Aprevenção da ação de microrganismos pode ser assegurada porvários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo,parabéns, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e similares. Emmuitos casos, é desejável incluir agentes isotônicos, porexemplo, açúcares, cloreto de sódio e similares. A absorçãoprolongada da forma farmacêutica injetável pode ser realiza-da pelo uso de agentes que atrasam a absorção, por exemplo,monoestearato de alumínio e gelatina. De acordo com a pre-sente invenção, entretanto, qualquer veículo, diluente, ouaditivo usado tem que ser compatível' com os compostos.

Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadaspela incorporação dos compostos utilizados na prática dapresente invenção, na quantidade requerida do solvente apro-priado com vários outros ingredientes como desejado.

Uma formulação farmacológica da presente invençãopode ser administrada no paciente em uma formulação injetá-vel contendo qualquer carreador compatível, tais como váriosveículos, adjuvantes, aditivos e diluentes; ou os compostosutilizados na presente invenção podem ser administrados pa-renteralmente no paciente na forma de implantes subcutâneosde liberação lenta ou sistemas de distribuição de alvejamen-to, tais como anticorpos monoclonais, distribuição vetorada,iontoforética, matrizes de polímeros, lipossomos e microes-feras. Exemplos de sistemas de distribuição usados na pre-sente invenção incluem patentes U.S. Nos. 5.225.182,25 5.169.383, 5.167.616, 4.959.217, 4.925.678, 4.487.603,4.486.194, 4.447.233, 4.447.224, 4.439.196, e 4.475.196.Muitos outros tais implantes, sistemas de distribuição e mó-dulos são bem conhecidas pelos versados na técnica.Uma formulação farmacológica dos compostos utili-zados na presente invenção pode ser administrada oralmenteno paciente. Métodos convencionais tal como administração docomposto em tabletes, suspensões, soluções, emulsões, cápsu-las, pós, xaropes e similares são usáveis. As técnicas co-nhecidas que distribuem oralmente ou intravenosamente e man-tém a atividade biológica são preferíveis. Em uma modalida-de, o composto da presente invenção pode ser administradoinicialménte por injeção intravenosa para levar os níveissangüíneos para um nível adequado. Os níveis do paciente sãoentão mantidos por uma forma de dosagem oral, embora outrasformas de administração dependam da condição do paciente ede maneiras indicadas anteriormente, podem ser usados.

Em geral, a dose ativa dos compostos para humanosestá na faixa de 1 ng/kg a cerca de 20-100 mg/kg de pesocorporal por dia, preferivelmente cerca de 0,01 mg a cercade 2-10 mg/kg de peso corporal por dia, em um regime de umadose por dia ou duas ou três ou mais vezes por dia por umperíodo de 1-2 semanas ou mais, pref erivelmente por 24 a 48horas ou pela infusão contínua durante um período de 1-2 se-manas ou mais.

Administração de compostos da presente invenção noolho

Os compostos da presente invenção podem ser admi-nistrados topicamente no olho ou na forma de uma injeção,tal como uma injeção intravítrea, uma injeção subretinal ouuma injeção bilateral. Informação mais detalhada dobre a ad-ministração dos compostos da presente invenção pode ser en-contrada em Tolentino et al., Retina 24 (2004) 132-138; Rei-ch et al., Molecular vision 9 (2003) 210-216.

Administração pulmonar de compostos da presenteinvenção

As composições terapêuticas da presente invençãosão preferivelmente administradas no pulmão pela inalação deum aerossol contendo estas composições/compostos, ou pelainstilação intranasal ou intratraqueal das ditas composi-ções. A formulação das composições em lipossomos pode bene-ficiar a absorção. Adicionalmente, as composições podem in-cluir um liquido PFC tal como perflubron, e as composiçõespodem ser formuladas como um complexo dos compostos da in-venção com polietilenoimina (PEI) .

Para informação mais detalhada sobre distribuiçãopulmonar de composições farmacêuticas ver Weiss et al., Hu-man gene therapy 10:2287-2293 (1999); Densmore et al., Mole-cular therapy 1:180-188 (1999); Gautam et al., Moleculartherapy 3:551-556 (2001); e Shahiwala & Misra, RAPS PharmS-ciTech 5 (2004). Adicionalmente, formulações respiratóriaspara RNAsi são descritas em pedido de patente U.S. No.2004/0063654 de Davis et al.

Adicionalmente, os compostos da presente invençãopodem ser administrados topicamente quando apropriados (talcomo no caso de úlceras do pé diabético, por exemplo) opcio-nalmente em uma formulação lipideo/lipossomo.

Administração de compostos da presente invenção noouvido

Uma modo de administração preferível é a distribu-ição tópica do inibidor de RTP801 na membrana de janela re-donda da cóclea revelada, por exemplo, em Tanaka et M. (HearRes. 2003 Mar;177 (1-2):21-31) . Um modo adicional de adminis-tração no ouvido é pela injeção transtimpânica.

No tratamento de úlceras de pressão ou outras fe-ridas, a administração da composição farmacêutica é preferi-velmente por aplicação tópica na área danificada, mas ascomposições podem ser também administrada sistemicamente.

Formulações adicionais para melhorar a distribui-ção dos compostos da presente invenção podem incluir compos-tos não formulados, compostos covalentemente ligados ao co-lesterol e compostos ligados aos anticorpos que são alveja-dos (Song et al., Antibody mediated in vivo delivery ofsmall interfering RNAs via cell-surface receptors, Nat Bio-technol. 2005 Jun; 23(6):709-17).

Todos os RNAsi aqui revelados podem ser adminis-trados em um formato não formulado como RNAsi nu, para otratamento de qualquer das doenças ou condições aqui revela-das.

O termo "RNAsi nu" refere-se a moléculas de RNAsique são livres de qualquer veiculo de distribuição que atuapara assistir, promover ou facilitar a entrada na célula,incluindo seqüências virais, partículas virais, formulaçõesde lipossomos, lipofectina ou agentes de precipitação e si-milares. Por exemplo, RNAsi em PBS é "RNAsi nu".

Adicionalmente, a administração de qualquer RNAsinu, oligonucleotídeo, combinação de RNAsi nu ou combinaçãode RNAsi nu e molécula adicional a fim de tratar qualquerdas doenças e condições aqui reveladas está de acordo com oescopo da presente invenção.

Entretanto, como aqui reveladas, as moléculas deRNAsi da invenção também podem ser distribuídas em formula-ções de lipossomos e formulações de lipofectina e similarese podem ser preparadas pelos métodos bem conhecidos pelosversados na técnica. Tais métodos são descritos, por exem-plo, em patentes U.S. Nos. 5.593.972. 5.589.466. e5.580.859. que estão aqui incorporadas pela referência.

Exemplo 11

Modelo ex vivo para ototoxicidade induzida porcisplatina e o efeito protetor de RNAsi de RTP801

A ototoxicidade induzida por cisplatina é induzidaem culturas organotípicas cocleares e vestibulares. Os fi-lhotes de rato 3-4 dias após o parto são usados para prepa-rar as culturas organotípicas cocleares e vestibulares deta-lhadas em Zhang et al., Neuroscience 120 (2003) 191-205. Ascócleas são dissecadas cuidadosamente e os tecidos coclearescontendo o gânglio espiral, órgão de Corti e o giro médiosão removidos para preparar as culturas organotípicas daforma descrita em Zhang et al. As culturas são colocadas emum incubador de CO2 por 24 horas para condicionamento antesdo tratamento. Após condicionamento, as culturas são trata-das com cisplatina sozinha a 1, 5 ou 10 pg/mL por 48 horas.

Para estudar o efeito protetor de RNAsi de RTP801, os ex-plantes cocleares (5 cócleas por grupo) são tratados por 48horas com 10 pg/mL de cisplatina e concentrações variadas deRNAsi de RTP801 com ou sem lipofectamina. Culturas controlesnão tratadas e culturas tratadas com RNAsi de RTP801 sãocorridas em paralelo por 48 horas. No fim dos experimentos,as culturas são fixadas com formalina a 10% e coradas comfaloidina conjugada com FITC. Os números de células capila-res internas e células capilares externas de 0,25 mm de com-primento coclear são contados e o número médio de célulascapilares é determinado para cada tratamento.

Exemplo 12

Modelo in vivo para ototoxicidade induzida porgentamicina e o efeito protetor de RNAsi de RTP801

As chinchilas são tanto tratadas com sulfato degentamicina sozinho por 5 dias (125-300 mg/kg, intramuscu-lar) quanto em combinação com RNAsi de RTP801. As moléculasde RNAsi são administradas topicamente na membrana de janelaredonda da cóclea dois dias antes e durante os 5 dias de ex-posição à gentamicina. No final do tratamento, os animaissão sacrificados pela exposição ao dióxido de carbono e de-capitação. As cócleas são removidas e preparadas para colo-ração com faloidina conjugada com FITC para determinar osnúmeros de células capilares internas e células capilaresexternas no tecido coclear (da forma descrita em Ding etal., Hearing Research 164 (2002) 115-126 e em Wang et at. ,The Journal of Neuroscience 23 (24):8596-8607) .

Exemplo 13

Modelo in vivo para trauma acústico e o efeitoprotetor de RNAsi de RTP801

Porquinhos da índia pigmentados são usados no es-tudo do trauma acústico (descrito em Wang et al., The Jour-nal de Neuroscience 23(24):8596-8607). Moléculas RNAsi deRTP801 são administradas topicamente na membrana de janelaredonda da cóclea por um periodo de 7 dias. Cócleas esquer-das não tratadas serviram como controles para a efetividadedo trauma acústico que causam perda de capilar auditivo eperda de função da audição. Os animais são exposto ao traumaacústico [6 kHz, 120 dB nivel de pressão do som (SPL) , 30minutos], e audiogramas de ambos os ouvidos são derivadosdos potenciais de ação do composto (CAPs) gravado dos nervosauditivos via eletrodos da membrana de janela redonda crôni-ca. Os audiogramas CAP de ambos os ouvidos são medidos dia-riamente em animais acordados. Após 30 dias de exposição aosom, os animais são sacrificados e suas cócleas são prepara-das para uma avaliação quantitativa de perda de células ca-pilares usando microscopia eletrônica de varredura a fim decontar todas as células capilares para o comprimento inteirodo duto coclear.

Exemplo 14

Resultados experimentais relacionados com 801 1(IP No. 257 na tabela D, SEO ID NO: 527 [anti-sentido] e 8014 (IP No. 260 na tabela D, SEO ID NO:53Q [fita anti-sentido])

Eficácia in vitro em células HEK293

Três diferentes concentrações de RNAsi, 5, 10 e 20nm foram transfectadas para as células HEK293. Concentraçõesidênticas de um RNAsi irrelevante (siTG) foram usadas comoum controle negativo, ao passo que concentrações idênticasde REDD14 foram usadas como um controle positivo. 72 horasapós a transfecção as células foram colhidas; o RNA foi pu-rificado e usado como um gabarito em uma reação de PCRq paraa determinação quantitativa dos níveis da transcrição deRTP801 endógenos. Ciclofilina A humana foi usada como umareferência interna para PCRq. Dados normalizados de referên-cia foram adicionalmente submetidos à normalização biológi-ca: Para cada concentração de RNAsi, os níveis de RTP801 de-tectados foram expressos como porcentagem de RTP801 na amos-tra de controle negativo correspondente. Os resultados estãomostrados na figura 28.

Eficácia in vitro em células BE2C

Enquanto que níveis da expressão basal de RTP801foram analisados nas células HEK293 para avaliação da capa-cidade do RNAsi de diminuir os níveis de expressão induzidospor RTP801, células BE2C tratadas com C0CI2 como um indutorde RTP801 foram usadas. 0 projeto e avaliação de dados foramessencialmente da maneira descrita anteriormente. 24 horasapós a transfecção do RNAsi, as células BE2C foram tratadascom 10 uM de CoCl2 por mais 24 horas e então processadas pa-ra extração de RNA. Os resultados estão mostrados na figura29. Os resultados indicam que 801_1 e 801_4 são pelo menostão efetivos quanto REDD14 contra RTP801 em ensaios in vi-tro.

Eficácia in vivo no modelo camundongo CNV

Os experimentos foram realizados da forma descritano exemplo 6, com os seguintes grupos experimentais:Tabela 4

<table>table see original document page 273</column></row><table>

Os resultados estão apresentados na figura 30, e

mostram que 801_4 é pelo menos tão efetivo quanto REDD14 nomodelo in vivo de camundongo CNV.

Exemplo 15

Modelos e Resultados relacionados à Surdez

O efeito do tratamento de um RNAsi exemplar (p53)na morte da célula capilar induzida por acústica na cócleade chinchila

A atividade de um RNAsi exemplar (QM5 - anti p53)em um modelo de trauma acústico foi estudado em chinchila.Um grupo de sete animais foi submetido ao trauma acústico.Os animais foram expostos a ruido na faixa de oitavos cen-tralizada a 4 kHz por 3 horas a 105 dB. 0 ouvido esquerdodas chinchilas expostas ao ruido foi tratado com 30 μg deRNAsi em *20 yL; o ouvido direito foi tratado com veiculo. Olimiar médio do potencial de ação do composto registrado dajanela redonda foi determinado 2,5 semanas após o trauma a-cústico, a fim de determinar se os limiares no ouvido trata-do com RNAsi foram mais baixos (melhores) que o ouvido nãotratado (veiculo). Os limiares médios foram mais baixos nosouvidos tratados com RNAsi versus os ouvidos não tratados. Adiferença de 4 kHz foi estatisticamente significante(p<0,033). Estes resultados indicam que o RNAsi exemplar p53administrado na janela redonda da cóclea é capaz de reduziro dano causado por trauma acústico.

O efeito do tratamento com RNAsi p53 ou 801 namorte da célula capilar induzida por cisplatina na cóclea deratos

Ratos Wistar machos foram testados pelos limiaresde resposta da haste do cérebro auditivo basal para sinaisde cliques, 8, 16 e 32 kHz anterior ao tratamento com cis-platina. Após o teste de resposta da haste do cérebro audi-tivo basal, a cisplatina foi administrada como uma infusãointraperitoneal de 13 mg/kg por 30 minutos. Os ouvidos tra-tadas receberam tanto 15 ug/4 microlitros do RNAsi exemplarp53 (como anterior) quanto RNAsi de RTP801 REDD14 (seqüênciaNo. 14 na tabela A, SEQ ID No.s 16 (sentido) e 66 (anti-sentido)) aplicados diretamente na membrana de janela redon-da. Ouvidos controle foram tratados tanto com RNAsi GFPquanto PBS não relacionados. As moléculas de RNAsi foram ad-ministradas entre 3-5 dias anteriores à administração comcisplatina a fim de examinar o efeito protetor na cóclea.O teste da resposta da haste do cérebro auditivobasal foi repetido 3 dias após a administração com cisplati-na. Os limiares da resposta da haste do cérebro auditivo fo-ram comparados entre o pré-tratamento e o pós-tratamento e odeslocamento nos limiares é indicado na tabela 5. Desloca-mentos maiores nos limiares após o tratamento com cisplatinaé indicativo para perdas mais graves de células capilares nacóclea. Após a repetição do teste de resposta da haste docérebro auditivo, os animais foram sacrificados e as cócleasforam removidas e processadas por microscopia eletrônica devarredura (SEM), para quantificar a perda de célula capilarexterna (OHC) na região do gancho (região de alta freqüên-cia) . A._ porcentagem de perda de célula capilar externa foicalculada pela divisão do número de células ausentes ou da-nificadas severamente pelo número total células capilaresexternas no campo da fotografia.

A tabela 5 demonstra os resultados obtidos de qua-tro animais submetidos a dano induzido por cisplatina e ana-lisados pela perda de célula capilar externa na região dogancho. Da forma revelada nos resultados, animais que rece-beram o RNAsi diretamente contra p53 ou 801 exibiram perdade célula capilar externa mais baixa e deslocamentos menoresno limiar para sinais de 32 kHz. Ambos os parâmetros indicamque RNAsi direcionado contra p53 ou 801 é protetor contradanos induzidos por cisplatina na cóclea.

Tabela 5: Perda de célula capilar versus desloca-mento do limiar em cóclea de ratos tratadas com cisplatina.<table>table see original document page 276</column></row><table>LISTAGEM DE SEQÜENCIA

<110> Quark Biotech, Inc. Atugen AG<120> "USOS TERAPÊUTICOS DE INIBIDORES DE RTP801'<130> 20 97/7578O-A<150> US 60/760,586<151> 2006-01-20<150> US 60/796,901<151> 2006-05-01<150> Us 60/851,000<151> 2006-10-10<160> 536

<170> Patentln version 3.3<210> 1<211> 1782<212> DNA<213> Homo sapiens<4 00> 1.tttggccctcggacctgggacgggtctggggcggcaggacgcacttgtcttccggcactctgagttcatctgggaccgcttctcgtcgtcaccccagatcggccgccgcg

gaggccaaga60

cggctctcgg120tagcagttct180

attcggcacg agggggggag gtgcgagcgt

tggttggcac gggttcgcac acccattcaa

cgctgaccgc gctagctgcg gcttctacgc

ctggcgtctg tcctcaccat gcctagcctt

agcaaacgcc240

gtccacctcc tcttcgccct cgtccttgcc300

ctcagcctgg gggtcggcga cccgggagga

ccgaactccc

ggggtttgaccgctccacgagcctggagaggggccggaggaagacacggcagtgaccctgaggatgaacagcccaggcgcggctgggctcagccaggtgggcaaagaactgcgctgctggacgtctgcgtctcgaccccagcctggtgccctctggcccaagatccagggagccagtccctgacgctgaggaacagctgctcattgaggaagacagagacgactgaacttctgtggttggaaaactgagggaagctcatt

360ctcggactgc

420ttacctggat

480cttgtgtgcc

540tcgacgccct600actgcgcctg660ggagcagggc

720caccttccag

780gctgtttagc

840cagtggcttc

900gtgttgaact

960ttggggtgga1020

cagccaccta

gagtccctgg acagcagcaa cagtggcttc

ggggtgtcgt tgcccgactt cgagctgctc

aacctgatgc agctgctgca ggagagcctg

gcgcgcctgc tgatgcctag ccagttggta

gcctacagcg agccgtgcgg cctgcggggg

aagagctgcc acagcgtggg ccagctggca

ctgaccctcg tgctgcgcct ggactcacga

tccgccaact ctcccttcct ccctggcttc

cgagtcatca agaagaagct gtacagctcg

tcaacctgag ggggccgaca gtgccctcca

gactagaggc aggagctgag ggactgattc

gggggaatag tgtttcccag

aggtggaggt

1080 gagttgtgtg cgggtggctg tgcattgggg aca-cataccc ctcagtactg tagcatgaaa 1140 caaaggctta ggggccaacaaggcttccag ctggatgtgt gtgtagcatg taccttatta 1200tttttgttac tgacagttaa cagtggtgtg acatccagag agcagctgggctgctcccgc 1260 cccagcccgg cccagggtga aggaagaggc

acgtgctcct cagagcagcc ggagggaggg 1320 gggaggtcgg

aggtcgtgga ggtggtttgt gtatcttact ggtctgaagg gaccaagtgt1380 gtttgttgtt tgttttgtat cttgtttttc tgatcggagc atcactactgacctgttgta 1440 ggcagctatc ttacagacgc atgaatgtaa gagtag-gaag gggtgggtgt cagggatcac 1500 ttgggatctt tgacacttga

aaaattacac ctggcagctg cgtttaagcc ttcccccatc 1560

gtgtactgca gagttgagct ggcaggggag gggctgagag ggtgggggctggaacccctc 1620 cccgggagga gtgccatctg ggtcttccat cta-

gaactgt ttacatgaag ataagatact 1680 cactgttcat gaatacacttgatgttcaag tattaagacc tatgcaatat tttttacttt 1740

tctaataaac atgtttgtta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa as 1782

<210> 2<211> 232<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 2

Met Pro Ser Leu Trp Asp Arg Phe ser ser Ser Ser Thr ser serser

15 10 15

Pro Ser Ser Leu Pro Arg Thr Pro Thr Pro Asp Arg pro Pro Argser

20 25 30

Ala Trp Gly Ser Ala Thr Arg Glu Glu Gly Phe Asp Arg Ser ThrSer

35 40 45

Leu Glu ser ser ASp Cys Glu Ser Leu Asp Ser Ser Asn Ser GlyPhe50 55 60

Gly Pro Glu Glu Asp Thr Ala Tyr Leu Asp Gly vai Ser Leu ProAsp

65 70 75 80

Phe Glu Leu Leu ser Asp Pro Glu Asp Glu His Leu Cys Ala AsnLeu

85 90 95

Met Gln Leu Leu Gln Glu Ser Leu Ala Gln Ala Arg Leu Gly serArg

100 105 110

Arg Pro Ala Arg Leu Leu Met Pro Ser Gln Leu Val ser Gln ValGly

115 120 125

Lys Glu Leu Leu Arg Leu Ala Tyr ser Glu Pro Cys Gly Leu ArgGly

130 135 140

Ala Leu Leu ASp vai Cys Val Glu Gln Gly Lys Ser Cys His SerVal

145 150 155 160

Gly Gln Leu Ala Leu Asp Pro Ser Leu Val Pro Thr Phe Gln LeuThr

165 170 175

Leu vai Leu Arg Leu Asp Ser Arg Leu Trp Pro Lys Ile Gln GlyLeu

180 185 190

Phe ser ser Ala Asn Ser Pro Phe Leu Pro Gly Phe ser Gln SerLeu

195 200 205Thr Leu ser Thr Gly Phe Arg Val Ile Lys Lys Lys Leu Tyr Serser

210 215 220

Glu Gln Leu Leu Ile Glu Glu Cys225 230

<210> 3<211> 19<212> RNA<213> Homo sapiens<400> 3

uagaagccgc agcuagcgc 19

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

uccgagcucu ccaggcucg 19

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

ugcugcuguc cagggacuc 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 6agcagcugca

<210> 7<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 7ugaguccagg<210> 8<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 8cagcuagcgc<210> 9<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 9ccgcagcuag<210> 10<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 10aagccgcagc<210> 11<211> 19<212> RNA

ucagguugg

sapiens

cgcagcacg

sapiens

ggucagcga

sapiens

cgcggucag

sapiens

uagcgcggu<213> Homo<400> 11aguccgagcu<210> 12<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 12gcaguccgag<210> 13<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 13uguugcugcu<210> 14<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 14agccacuguu<210> 15<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 15aagccacugu<210> 16

sapiens

cuccaggcu

sapiens

cucuccagg

sapiens

guccaggga

sapiens

gcugcuguc

sapiens

ugcugcugu<211> 19

<212> RNA<213> Homo<400> 16agcugcauca<210> 17<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 17ugcagcagcu<210> 18<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 18ucuccugcag<210> 19<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 19ccccgcaggc<210> 20<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 20

sapiens

gguuggcac

sapiens

gcaucaggu

sapiens

cagcugcau

sapiens

cgcacggcu

sapiensccuggaucuu

<210> 21<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 21cagcgucagg<210> 22<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 22augcuacagu<210> 23<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 23gucuguaaga<210> 24<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 24uucuagaugg<210> 25<211> 19<212> RNA

gggccagag

sapiens

gacuggcug

sapiens

sapiens

sapiens

aagacccag<213> Homo<400> 25

uugaacauca<210> 26<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 26aaauauugca<210> 27<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 27aaaaauauug<210> 28<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 28agggacucgc<210> 29<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 29uacuugaaca<210> 30

sapiens

sapiens

uaggucuua

sapiens

cauaggucu

sapiens

aguccgagc

sapiens

ucaagugua<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 30aaacauguuu<210> 31<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 31aacugcuaag<210> 32<2-11> 19<212> RNA<213> Homo<400> 32acgacgacga<210> 33<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 33aagccguguc

<210> 34<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 34

sapiens

auuagaaaa

sapiens

acaagugcg

sapiens

gaagcgguc

sapiens

uuccuccgg

sapiensaguguucauc

<210> 35<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 35agggcgucga<210> 36<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 36aucagcaggc<210> 37<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 37aguucuuugc<210> 38<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 38acggcucgcu<210> 39<211> 19<212> RNA

cucaggguc

sapiens

gagcccagc

sapiens

gcgcagggc

sapiens

ccaccuggc

sapiens

guaggccag<213> Homo

<400> 39acguccagca<210> 40<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 40augacucgga<210> 41<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 41aacucaauga<210> 42<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 42cucaacucug<210> 43<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 43agauacacaa<210> 44

sapiens

gcgcccccc

sapiens

agccagugc

sapiens

gcuuccugg

sapiens

caguacacg

sapiens

accaccucc<211> 19

<212> RNA<213> Homo<400> 44acaacaaaca<210> 45<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 45cugcaucagg<210> 46<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 46uccugccucu<210> 47<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 47cagcugcauc<210> 48<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 48

sapiens

cacuugguc

sapiens

uuggcacac

sapiens

agucuccac

sapiens

agguuggca

sapienscagcagcugc<210> 49<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 49ccugcagcag<210> 50<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 50cuccugcagc<210> 51<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 51aacucugcag

<210> 52<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 52ccugccucua<210> 53<211> 19<212> RNA

aucagguug

sapiens

cugcaucag

sapiens

agcugcauc

sapiens

uacacgaug

sapiens

gucuccacc<213> Homo

<400> 53gcgcuagcug<210> 54<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 54cgagccugga<210> 55<211> 19<212> RNA<213> Hama<400> 55gagucccugg<210> 56<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 56ccaaccugau<210> 57<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 57cgugcugcgc<210> 58

sapiens

cggcuucua

sapiens

gagcucgga

sapiens

acagcagca

sapiens

gcagcugcu

sapiens

cuggacuca<211> 19<212> RNA

<213> Homo<400> 58ucgcugaccg<210> 59<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 59cugaccgcgc<210> 60<21-1 > 19<212> RNA<213> Homo<400> 60accgcgcuag<210> 61<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 61agccuggaga<210> 62<211> 19<212> RNA.<213> Hama<400> 62

sapiens

cgcuagcug

sapiens

uagcugcgg

sapiens

cugcggcuu

sapiens

gcucggacu

sapiensccuggagagc

<210> 63<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 63ucccuggaca<210> 64<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 64gacagcagca<210> 65<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 65acagcagcaa<210> 66<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 66gugccaaccu<210> 67<211> 19<212> RNA

ucggacugc

sapiens

gcagcaaca

sapiens

acaguggcu

sapiens

caguggcuu

sapiens

gaugcagcu<213> Homo

<400> 67accugaugca<210> 68<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 68augcagcugc<210> 69<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 69agccgugcgg<210> 70<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 70cucuggccca<210> 71<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 71cagccagucc<210> 72

sapiens

gcugcugca

sapiens

ugcaggaga

sapiens

ccugcgggg

sapiens

agauccagg

sapiens

cugacgcug<211> 19

<212> RNA<213> Homo<400> 72ccccucagua<210> 73<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 73aggcagcuau<210> 74<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 74cugggucuuc<210> 75<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 75gaauacacuu<210> 76<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 76

sapiens

cuguagcau

sapiens

cuuacagac

sapiens

caucuagaa

sapiens

gauguucaa

sapiensuaagaccuau

<210> 77<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 77

agaccuaugc

<210> 78<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 78gcucggacug

<210> 79<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 79uacacuugau<210> 80<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 80uuuucuaaua<210> 81<211> 19<212> RNA

gcaauauuu

sapiens

aauauuuuu

sapiens

cgagucccu

sapiens

guucaagua

sapiens

aacauguuu<213> Homo

<400> 81cgcacuuguc<210> 82<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 82gaccgcuucu<210. 83<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 83ccggaggaag<210> 84<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 84gacccugagg<210> 85<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 85gcugggcucu<210> 86

sapiens

uuagcaguu

sapiens

cgucgucgu

sapiens

acacggcuu

sapiens

augaacacu

sapiens

cgacgcccu<211> 19

<212> RNA<213> Homo<400> 86gcccugcgcg<210> 87<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 87gccagguggg<210> 88<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 88cuggccuaca<210> 89<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 89ggggggcgcu<210> 90<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 90

sapiens

ccugcugau

sapiens

caaagaacu

sapiens

gcgagccgu

sapiens

gcuggacgu

sapiensgcacuggcuu<210> 91

<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 91ccaggaagcu<210> 92<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 92cguguacugc<210> 93<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 93ggaggugguu<210> 94<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 94gaccaagugu<210> 95<211> 19<212> RNA

ccgagucau

sapiens

cauugaguu

sapiens

agaguugag

sapiens

uguguaucu

sapiens

guuuguugu<213> Homo<400> 95

gugugccaac<210> 96<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 96guggagacua<210> 97<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 97ugccaaccug<210> 98<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 98caaccugaug<210> 99<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 99cugaugcagc<210> 100

sapiens

cugaugcag

sapiens

gaggcagga

sapiens

augcagcug

sapiens

cagcugcug

sapiens

ugcugcagg<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 100

gaugcagcug<210> 101<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 101

caucguguac<210> 102<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 102

gguggagacu<210> 103<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 103cuagccaguu<210> 104<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 104

sapiens

cugcaggag

sapiens

ugcagaguu

sapiens

agaggcagg

sapiens

gguaagcca

sapiensugauuccagu

<210> 105<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 105ccagugguug<210> 106<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 106gcuuccgagu<210> 107<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 107ggaagcucau<210> 108<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 108ccaucugggu<210> 109<211> 19<212> RNA

gguuggaaa

sapiens

gaaaacuga

sapiens

caucaagaa

sapiens

ugaguugug

sapiens

cuuccaucu<213> Homo

<4 00> 109ggaugugugu<210> 110<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 110acacauaccc<210> 111<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 111acauaccccu<210> 112<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 112cacuguucau<210> 113<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 113ccagcuggau<210> 114

sapiens

guagcaugu

sapiens

cucaguacu

sapiens

caguacugu

sapiens

gaauacacu

sapiens

gugugugua<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 114cggaacagcu<210> 115<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 115gaagcucauu<210> 116<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 116ggacacauac<210> 117<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 117ggaucuuuga<210> 118<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 118

sapiens

gcucauuga

sapiens

gaguugugu

sapiens

cccucagua

sapiens

cacuugaaa

sapiensguagcaugua<210> 119

<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 119<210> 120<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 120uguguagcau<210> 121<211> 19<2-12> RNA<213> Homo<4 00> 121cuggaugugu<210> 122<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 122acacuugaug<210> 123<211> 19<212> RNA<213> Homo

ccuuauuau

sapiens

sapiens

guaccuuau

sapiens

guguagcau

sapiens

uucaaguau

sapiens<4 00> 123gcaugaaugu

<210> 124<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 124agcagcaaca<210> 125<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 125augaauguaa<210> 126<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 126cagcagcaac<210> 127<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 127caugaaugua<210> 128«211> 19

aagaguagg

sapiens

guggcuucg

sapiens

gaguaggaa

sapiens

aguggcuuc

sapiens

agaguagga<212> RNA<213> Homo<400> 128gauguucaag<210> 129<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 129ugaugcagcu<210> 130<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 130gaauacacuu<210> 131<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 131ugaauacacu<210> 132<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 132auacacuuga

sapiens

uauuaagac

sapiens

gcugcagga

sapiens

gauguucaa

sapiens

ugauguuca

sapiens

uguucaagu<210> 133<211> 19

<212> RNA<213> Homo<4 00> 133caugaauaca<210> 134<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 134cuggacagca<210> 135<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 135guucaugaau<210> 136<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 136ucaugaauac<210> 137<211> 19<212> RNA<213> Homo

sapiens

cuugauguu

sapiens

gcaacagug

sapiens

acacuugau

sapiens

acuugaugu

sapiens<400> 137uggacagcag<210> 138

<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 138ugugugccaa<210> 139<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 139uucaugaaua<210> 140<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 140aaccugaugc<210> 141<211> 19<212> RNA<213> Hnmo<4 00> 141agucccugga<210> 142<211> 19

caacagugg

sapiens

ccugaugca

sapiens

cacuugaug

sapiens

agcugcugc

sapiens

cagcagcaa<212> RNA<213> Homo<4 00> 142

cccucaguac<210> 143<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 143ccuggacagc<210> 144<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 144ugugccaacc<210> 145<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 145aauacacuug<210> 146<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 146augaauacac

sapiens

uguagcaug

sapiens

agcaacagu

sapiens

ugaugcagc

sapiens

auguucaag

sapiens

uugauguuc<210> 147<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 147ugaugcagcu<210> 148<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 148agaacuguuu<210> 149<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 149aucuagaacu<210> 150<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 150ccaugccuag<210> 151<211> 19<212> RNA<213> Homo

sapiens

gcugcagga

sapiens

acaugaaga

sapiens

guuuacaug

sapiens

ccuuuggga

sapiens<400> 151cuagaacugu

<210> 152<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 152gaacuguuua<210> 153<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 153ggucuuccau<210> 154<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 154ccaucuagaa<210> 155<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 155cuuccaucua<210> 156<211> 19

uuacaugaa

sapiens

caugaagau

sapiens

cuagaacug

sapiens

cuguuuaca

sapiens

gaacuguuu<212> RNA<213> Homo

<4 00> 156uagaacuguu<210> 157<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 157ucuuccaucu<210> 158<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 158caucuagaac<210> 159<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 159gggucuucca<210> 160<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 160uccaucuaga

sapiens

uacaugaag

sapiens

agaacuguu

sapiens

uguuuacau

sapiens

ucuagaacu

sapiens

acuguuuac<210> 161<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 161ucuagaacug<210> 162<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 162uuccaucuag<210> 163<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 163gucuuccauc<210> 164<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 164caaguauuaa<210> 165<211> 19<212> RNA<213> Homo

sapiens

uuuacauga

sapiens

aacuguuua

sapiens

uagaacugu

sapiens

gaccuaugc

sapiens<400> 165guauuaagac<210> 166<211> 19

<212> RNA<213> Homo<400> 166aguauuaaga<210> 167<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 167auguucaagu<210> 168<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 168cacuugaugu<210> 169<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 169ccaagaucca<210> 170<211> 19

cuaugcaau

sapiens

ccuaugcaa

sapiens

auuaagacc

sapiens

ucaaguauu

sapiens

ggggcuguu<212> RNA<213> Homo<4 00> 170guucaaguau

<210> 171<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 171ucaaguauua<210> 172<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 172aaguauuaag<210> 173<211> 19<212> RNA<213> Homo< 4 0 0 > 173uguucaagua<210> 174<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 174ugggucuucc

sapiens

uaagaccua

sapiens

agaccuaug

sapiens

accuaugca

sapiens

uuaagaccu

sapiens

aucuagaac<210> 175<211> 19<212> RNA<213> Homo

<4 00> 175uggcuuacca<210> 176<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 176uuuccaacca<210> 177<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 177ucaguuuucc<210> 178<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 178uucuugauga<210> 179<211> 19<212> RNA<213> Homo

sapiens

acuggcuag

sapiens

cuggaauca

sapiens

aaccacugg

sapiens

cucggaagc

sapiens<400> 179

cacaacucaa<210> 180<211> 19<212> RNA<213> Homo400> 180

agauggaaga<210> 181<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 181

acaugcuaca<210> 182<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 182

aguacugagg<210> 183<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 183

acaguacuga<210> 184<211> 19

ugagcuucc

sapiens

cccagaugg

sapiens

cacacaucc

sapiens

gguaugugu

sapiens

gggguaugu<212> RNA<213> Homo<4 00> 184aguguauuca<210> 185<211> 19

<212> RNA<213> Homo<400> 185uacacacaca<210> 186<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 186ucaaugagca<210> 187<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 187acacaacuca<210> 188<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 188uacugagggg

sapiens

ugaacagug

sapiens

uccagcugg

sapiens

gcuguuccg

sapiens

augagcuuc

sapiens

uaugugucc<210> 189<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 189uuucaagugu<210> 190

<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 190auaauaaggu<■210 > 191<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 191uuccaugcua<210> 192<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 192auaagguaca<210> 193<211> 19<212> RNA<213> Homo

sapiens

caaagaucc

sapiens

acaugcuac

sapiens

caguacuga

sapiens

ugcuacaca

sapiens<400> 193augcuacaca<210> 194<211> 192ί2> RNA<213> Homo<400> 194

auacuugaac<210> 195<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 195ccuacucuua<210> 196<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 196cgaagccacu<210> 197<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 197uuccuacucu<210> 198<211> 19

cacauccag

sapiens

aucaagugu

sapiens

cauucaugc

sapiens

guugcugcu

sapiens

uacauucau<212> RNA<213> Homo<400> 198gaagccacug<210> 199<211> 19<212> RNA

<213> Homo<4 00> 199uccuacucuu<210> 200<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 200gucuuaauac<210> 201<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 201uccugcagca<210> 202<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 202uugaacauca

sapiens

uugcugcug

sapiens

acauucaug

sapiens

uugaacauc

sapiens

gcugcauca

sapiens

aguguauuc<210> 203<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 203ugaacaucaa

<210> 204<211> 19<212> RNA<213> Homo400> 204acuugaacau<210> 205<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 205aacaucaagu<210> 206<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 206cacuguugcu<210> 20721].> 19<212> RNA<213> Homo

sapiens

guguauuca

sapiens

caaguguau

sapiens

guauucaug

sapiens

gcuguccag

sapiens<400> 207aucaagugua<210> 208<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 208

acaucaagug<210> 20921]> 19<212> RNA<213> Homo<400> 209ccacuguugc<210> 210<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 210ugcaucaggu<210> 211<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 211caucaagugu<210> 212<211> 19

uucaugaac

sapiens

uauucauga

sapiens

ugcugucca

sapiens

uggcacaca

sapiens

auucaugaa<212> RNA<213> Homo<400> 212

gcagcagcug<210> 213<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 213

uugcugcugu<210> 214<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 214

caugcuacag<210> 215<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 215

acuguugcug<210> 216<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 216gcugcaucag

sapiens

caucagguu

sapiens

ccagggacu

sapiens

uacugaggg

sapiens

cuguccagg

sapiens

guuggcaca<210> 217<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 217cuugaacauc<210> 218

<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 218gaacaucaag<210> 219<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 219uecugcagca<210> 220<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 220ucuucaugua<210> 221<211> 19<212> RNA<213> Homo

sapiens

aaguguauu

sapiens

uguauucau

sapiens

gcugcauca

sapiens

aacaguucu

sapiens<400> 221cauguaaaca<210> 222<211> 19<212> RNA<213> Homo

<400> 222ucccaaaggc<210> 223<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 223uucauguaaa<210> 224<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 224aucuucaugu<210> 225<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 225caguucuaga<210> 226<211> 19

guucuagau

sapiens

uaggcaugg

sapiens

caguucuag

sapiens

aaacaguuc

sapiens

uggaagacc<212> RNA<213> Homo<400> 226uguaaacagu<210> 227<211> 19<212> RNA<213> Homo<4.00> 227aaacaguucu

<210> 228<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 228cuucauguaa<210> 229<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 229aacaguucua<210> 230<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 230auguaaacag

sapiens

ucuagaugg

sapiens

agauggaag

sapiens

acaguucua

sapiens

gauggaaga

sapiens

uucuagaug<210> 231<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 231aguucuagau<210> 232<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 232guaaacaguu<210> 233<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 233ucauguaaac<210> 234<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 234uaaacaguuc<210> 235<211> 19<212> RNA<213> Homo

sapiens

ggaagaccc

sapiens

cuagaugga

sapiens

aguucuaga

sapiens

uagauggaa

sapiens<400> 235acaguucuag<210> 236<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 236gcauaggucu<210> 237

<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 237auugcauagg<210> 238<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 238uugcauaggu<210> 239<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 239ggucuuaaua<210> 240<211> 19

auggaagac

sapiens

uaauacuug

sapiens

ucuuaauac

sapiens

cuuaauacu

sapiens

cuugaacau<212> RNA<213> Homo<400> 240

aauacuugaa<210> 241<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 241

aacagccccu<210> 242<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 242

uaggucuuaa<210> 243<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 243

cauaggucuu<210> 244<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 244

ugcauagguc

sapiens

caucaagug

sapiens

ggaucuugg

sapiens

uacuugaac

sapiens

aauacuuga

sapiens

uuaauacuu<210> 245<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 245aggucuuaau<210> 246<211> 19<212> RNA

<213> Homo<400> 246guucuagaug<210> 247<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 247ccaggaagcu<210> 248<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 248ccaucugggu<21Ò> 249<211> 21<212> RNA<213> Homo

sapiens

acuugaaca

sapiens

gaagaccca

sapiens

cauugaguug

sapiens

cuuccaucua

sapiens<400> 249

ggaugugugu guagcaugua c 21

<210> 250

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 250

caaguguguu uguuguuugu u 21

<210> 251

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 251

ccucaguacu guagcaugga a 21

<210> 252

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 252

gaccaagugu guuuguuguu u 21

<210> 253

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 253

gcuuccgagu caucaagaag a 21

<210> 254<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 254ggaggugggg<210> 255<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 255caguacugua<210> 256<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 256gaauacacuu<210> 257<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 257caaguauuaa<210> 258<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 258gaacuuuugg

sapiens

gaauaguguu u 21

sapiens

gcauggaaca a 21

sapiens

gauguucaag u 21

sapiens

gaccuaugca a 21

sapiens

gguggagacu a 21<210> 259<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 259ggacacauac<210> 260<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 260ggaggugguu<210> 261<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 261ggaucuuuga<210> 262<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 262ggucuuccau<210> 263<211> 21<212> RNA<213> Homo

sapiens

cccucaguac u 21

sapiens

uguguaucuu a 21

sapiens

cacuugaaaa a 21

sapiens

cuagaacugu u 21

sapiens<400> 263

uguguagcau guaccuuauu a 21

<210> 264

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 264

caacaaggcu uccagcugga u 21

<210> 265

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 265

cacuugggau cuuugacacu u 21

<210> 266<211> 21<212> RNA<213> Homo sapiens<400> 266

caucacuacu gaccuguugu a 21

<210> 267

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 267

guguguguag cauguaccuu a 21

<210> 268<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 268gcaugaaugu<210> 269<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 269gacagcagca<210> 270<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 270ugaugcagcu<210> 271<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 271ugaauacacu<210> 272<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 272caugaauaca

sapiens

aagaguagga a 21

sapiens

acaguggcuu c 21

sapiens

gcugcaggag a 21

sapiens

ugauguucaa g 21

sapiens

cuugauguuc a 21<210> 273

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 273

ggacagcagc aacaguggcu u 21

<210>.274<211> 21<212> RNA<213> Homo sapiens<400> 274

guucaugaau acacuugaug u 21

<210> 275<211> 21<212> RNA<213> Homo sapiens<400> 275

ucaugaauac acuugauguu c 21

<210> 276

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 276

ucccuggaca gcagcaacag u 21

<210> 277

<211> 21

<212> RNA "

<213> Homo sapiens<400> 277

agucccugga cagcagcaac a 21

<210> 278<211> 21<212> RNA<213> Homo sapiens<400> 278

gaauacacuu gauguucaag u 21

<210> 279

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 279

cuagaacugu uuacaugaag a 21

<210> 280<211> 21<212> RNA

<213> Homo sapiens<400> 280

ccaucuagaa cuguuuacau g 21

<210> 281<211> 21<212> RNA<213> Homo sapiens<400> 281

cuuccaucua gaacuguuua c 21

<210> 282<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 282ucuuccaucu<210> 283<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 283caucuagaac<210> 284<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 284gggucuucca<210> 285<211> 21<212> RNA<213> Homo< 4 0 0 > 285uccaucuaga<210> 286<211> 21.<212> RNA<213> Homo<400> 285ucuagaacug

sapiens

agaacuguuu a 21

sapiens

uguuuacaug a 21

sapiens

ucuagaacug u 21

sapiens

acuguuuaca u 21

sapiens

uuuacaugaa g 21<210> 287<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 287uuccaucuag<210> 288<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 288gucuuccauc<210> 289<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 289ugauguucaa<210> 290<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 290guucaaguau<210> 291<211> 21<212> RNA<213> Homo

sapiens

aacuguuuac a 21

sapiens

uagaacuguu u 21

sapiens

guauuaagac c 21

sapiens

uaagaccuau g 21

sapiens<400> 291

ucaaguauua agaccuaugc a 21

<210> 292

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 292

gauguucaag uauuaagacc u 21

<210> 293

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 293

uucaaguauu aagaccuaug c 21

<210> 294<211> 21<212> RNA<213> Homo sapiens<400> 294

cugggucuuc caucuagaac u 21

<210> 295

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 295

ugggucuucc aucuagaacu g 21

<210> 296<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 296

acaacucaau<210> 297<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 297cuagauggaa<210> 298<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> '298guacaugcua<210> 299<211> 21<212> RNA<213> HOMO<400> 299aacaaacaac<210> 300<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 300uuccaugcua

sapiens

gagcuuccug

sapiens

gacccagaug

sapiens

cacacacauc

sapiens

aaacacacuu

sapiens

caguacugag<210> 301<211> 21<212> RNA<213> Homo sapiens<400> 301

aaacaacaaa cacacuuggu c 21

<210> 302

<211> 21

<21Ζ> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 302

ucuucuugau gacucggaag c 21

<210> 303

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 303

aaacacuauu cccccaccuc c 21

210> 304<211> 21<212> RNA<213> Homo sapiens<400> 304

uuguuccaug cuacaguacu g 21

<210> 305

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens<400> 305

acuugaacau caaguguauu c 21

<210> 306

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 306

uugcauaggu cuuaauacuu g 21

<210> 307

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 307

uagucuccac cccaaaaguu c 21

<210> 308

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 308

aguacugagg gguauguguc c 21

<210> 309

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 309

uaagauacac aaaccaccuc c 21

<210> 310<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 310uuuuucaagu<210> 311<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 311aacaguucua<210> 312<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 312uaauaaggua<210> 313<211> 21cuugaacauc<210> 321<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 321ugaacaucaa<210> 322<211> 21<212> RNA

sapiens

gucaaagauc c 21

sapiens

gauggaagac c 21

sapiens

caugcuacac a 21

aaguguauuc a 21

sapiens

guguauucau g 21<213> Homo<400> 322aagccacugu<210> 323<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 323acaucaagug<210> 324<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 324gaacaucaag<210> 325<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 325acuguugcug<210> 326<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 326uguugcugcu<210> 327

sapiens

ugcugcuguc c 21

sapiens

uauucaugaa c 21

sapiens

uguauucaug a 21

sapiens

cuguccaggg a 21

sapiens

guccagggac u 21<211> 21

<212> RNA<213> Homo<400> 327acuugaacau<210> 328<212> RNA<213> Homo<400> 313auccagcugg<210> 314<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 314aagugucaaa<210> 315<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 315uacaacaggu<210> 316<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 316uaagguacau

sapiens

caaguguauu

sapiens

aagccuuguu

sapiens

gaucccaagu

sapiens

caguagugau

sapiens

gcuacacaca<210> 317<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 317uuccuacucu<210> 318<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 318gaagccacug<210> 319213> 21<212> RNA<213> Homo<400> 319ucuccugcag<210> 320<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 320<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 328ucuucaugua

sapiens

uacauucaug c 21

sapiens

uugcugcugu c 21

sapiens

cagcugcauc a 21

sapiens

sapiens

aacaguucua g 21<210> 329<211> 21<212> RNA<213> Homo sapiens<400> 329

cauguaaaca guucuagaug g 21

<210> 330<211> 21<212> RNA<213> Homo sapiens<400> 330

guaaacaguu cuagauggaa g 21

<210> 331

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 331

uaaacaguuc uagauggaag a 21

<210> 332

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 332

ucauguaaac aguucuagau g 21

<210> 333<211> 21<212> RNA

<213> Homes sapiens<400> 333

acaguucuag auggaagacc c 21

<210> 334

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 334

auguaaacag uucuagaugg a 21

<210> 335

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 335

cuucauguaa acaguucuag a 21

<210> 336

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 336

uguaaacagu ucuagaugga a 21

<210> 337

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 337

aaacaguucu agauggaaga c 21

<210> 338<211> 2121

<212> RNA<213> Homo sapiens<400> 338

ggucuuaaua cuugaacauc a<210> 339<211> 21<212> RNA<213> HOmO sapiens<400> 339

cauaggucuu aauacuugaa c 21

<210> 340<211> 21<212> RNA<213> Homo sapiens<400> 340

ugcauagguc uuaauacuug a 21

<210> 341<211> 21<212> RNA<213> Homo sapiens<400> 341

aggucuuaau acuugaacau c 21

<210> 342

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 342

gcauaggucu uaauacuuga a 21<210> 343<211> 21

<212> RNA<213> Homo<400> 343aguucuagau<210> 344<211> 21<212> RNA<213> Homo<400> 344caguucuaga<210> 345<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 345ugaaaaauua<210> 346<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 346gacacuugaa<210> 347<211> 19<212> RNA<213> Homo

sapiens

ggaagaccca

sapiens

uggaagaccc

sapiens

caccuggca

sapiens

aaauuacac

sapiens<400> 347cacuugaaaa<210> 348<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 348uuaggggcca<210> 349<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 349acacuugaaa<210> 350<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 350acccugagga<210> 351<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 351

guacugcaga<210> 352<211> 19

auuacaccu

sapiens

acaaggcuu

sapiens

aauuacacc

sapiens

ugaacacuu

sapiens

guugagcug<212> RNA<213> Homo<400> 352guguacugca<210> 353<211> 19<212> RNA

<213> Homo<400> 353guguguuugu<210> 354<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 354uugugugcca<210> 355< 211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 355aucguguacu<210> 356<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 356ccaucgugua

sapiens

gaguugagc

sapiens

uguuuguuu

sapiens

accugaugc

sapiens

gcagaguug

sapiens

cugcagagu<210> 357<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 357acuugaaaaa<210> 358<211> 19<212> RNA

<213> Homo<400> 358ugaggaugaa<210> 359<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 359accuggcagc<210> 360<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 360cagagacgac<210> 363<211> 19<212> RNA<213> Homo

sapiens

uuacaccug

sapiens

cacuugugu

sapiens

ugcguuuaa

sapiens

ugaacuuuu

sapiens<400> 361

aagacagaga<210> 362<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 362gcagcugcgu<210> 363<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 363aggaagcuca<210> 364<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 364guguuuccca<210> 365<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 365gacgacugaa<210> 366<211> 19

cgacugaac

sapiens

uuaagccuu

sapiens

uugaguugu

sapiens

ggaagcuca

sapiens

cuuuugggg<212> RNA<213> Homo<400> 366acagagacga<210> 367<211.> 19<212> RNA<213> Homo<400> 367

aggaugaaca<210> 368<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 368cugaggauga<210> 369<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 369ucugggucuu<210> 370<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 370aucugggucu

sapiens

cugaacuuu

sapiens

cuugugugc

sapiens

acacuugug

sapiens

ccaucuaga

sapiens

uccaucuag<210> 371<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 371

gaagggacca<210> 372<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 372aaggcuuagg<210> 373<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 373uucccaggaa<210> 374<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 374ugggcaaaga<210> 375<211> 19<212> RNA<213> Homo

sapiens

aguguguuu

sapiens

ggccaacaa

sapiens

gcucauuga

sapiens

acuacugcg

sapiens<400> 375

ggugggcaaa<210> 376<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 376gugggcaaag<210> 377<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 377ugccuagcca<210> 378<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 378aagccaggug<210> 379<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 379augccuagcc<210> 380<211> 19

gaacuacug

sapiens

aacuacugc

sapiens

guugguaag

sapiens

ggcaaagaa

sapiens

aguugguaa<212> RNA<213> Homo<400> 380

uuccgaguca<210> 381<211> 39<212> RNA<213> Homo<400> 381gacgcaugaa<210> 382<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 382uacagacgca<210> 383<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 383guguguagca<210> 384<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 384acgcaugaau

sapiens

ucaagaaga

sapiens

uguaagagu

sapiens

ugaauguaa

sapiens

uguaccuua

sapiens

guaagagua<210> 385<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 385

aucuuacaga<210> 386<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 386agacgcauga<210> 387<211> 19<212> RNA<213> Homo400> 387cuaucuuaca<210> 388<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 388caucacuac<210> 389<211> 19.<212> RNA<213> Homo

sapiens

cgcaugaau

sapiens

auguaagag

sapiens

gacucauga

sapiens

ugaccuguu

sapiens<400> 389

ggagcaucac<210> 390<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 390augaaacaaa<210> 391<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 391agcuaucuua<210> 392<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 392uaggcagcua<210> 393<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 393accuguugua<210> 394<211> 19

uacugaccu

sapiens

ggcuuaggg

sapiens

cagacgcau

sapiens

ucuuacaga

sapiens

ggcagcuau<212> RNA<213> Homo<400> 394

agcaucacua<210> 395<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 395ucugaucgga<210> 396<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 396ugacaguuaa<210> 397<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 397cugacaguua<210> 398<211> 19<212> RNA<213> HOMO<400> 398guuacugaca

sapiens

cugaccugu

sapiens

gcaucacua

sapiens

caguggugu

sapiens

acaguggug

sapiens

guuaacagu210> 399<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 399

uuguuacuga<210> 400<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 400uacucacugu<210> 401<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 401ucacuuggga<210> 402<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 402acagacgcau<210> 403<211> 19<212> RNA<213> Homo

sapiens

caguuaaca

sapiens

ucaugaaua

sapiens

ucuuugaca

sapiens

gaauguaag

sapiens<400> 403cagcuaucuu

<210> 404<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 404ucacuacuga<210> 405<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 405gagcaucacu<210> 406<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 406guguaucuua<210> 407<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 407gugguuugug<210> 408<211> 19

acagacgca

sapiens

ccuguugua

sapiens

acugaccug

sapiens

cuggucuga

sapiens

uaucuuacu<212> RNA<213> Homo<400> 408

acaguuaaca<210> 409<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 409aacugaggca<210> 410<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 410uguucaugaa<210> 411<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 411cuguucauga<210> 412<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 412agauacucac

sapiens

gugguguga

sapiens

gccaccuaa

sapiens

uacacuuga

sapiens

auacacuug

sapiens

uguucauga<210> 413

<211> 19<212> RNA<213> HOmO<400> 413cagacgcaug<210> 414<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 414gcagcuaucu<210> 415<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 415ggcagcuauc<210> 416<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 416gguuugugua<210> 417<211> 19<212> RNA<213> Homo

sapiens

aauguaaga

sapiens

uacagacgc

sapiens

uuacagacg

sapiens

ucuuacugg

sapiens<400> 417

gaggugguuu<210> 418<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 418guggaggugg<210> 419<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 419uacugacagu<210> 420<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 420guguagcaug<210> 421<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 421aggugggcaa<210> 422<211> 19

guguaucuu

sapiens

uuuguguau

sapiens

uaacagugg

sapiens

uaccuuauu

sapiens

agaacuacu<212> RNA<213> Homo<400> 422gugacccuga

<210> 423<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 423caggugggca<210> 424<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 424ccaggugggc<210> 425<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 425auccaggggc<210> 426<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 426aagauccagg

sapiens

ggaugaaca

sapiens

aagaacuac

sapiens

aaagaacua

sapiens

uguuuagcu

sapiens

ggcuguuua<210> 427<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 427

gcaugaaaca<210> 428<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 428agcaugaaac<210> 429<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 429uacuguagca<210> 430<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 430uagcaugaaa<210> 431<211> 19<212> RNA<213> Homo

sapiens

aaggcuuag

sapiens

aaaggcuua

sapiens

ugaaacaaa

sapiens

caaaggcuu

sapiens400> 431guagcaugaa<210> 432<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 432caguacugua

<210> 433<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 433guacuguagc<210> 434<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 434ucaguacugu<210> 435<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 435uguagcauga<210> 436<211> 19

acaaaggcu

sapiens

gcaugaaac

sapiens

augaaacaa

sapiens

agcaugaaa

sapiens

aacaaaggc<212> RNA<213> Homo<400> 436acuguagcau

<210> 437<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 437cuguagcaug<210> 438<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 438aguacuguag<210> 439<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 439ccucaguacu<210> 440<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 440cucaguacug

sapiens

gaaacaaag

sapiens

aaacaaagg

sapiens

caugaaaca

sapiens

guagcauga

sapiens

uagcaugaa<210> 441<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 441ugccaggugu<210> 442

<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 442guguaauuuu<210> 4 43<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 443agguguaauu<210> 444<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 444aagccuuguu<210> 445<211> 19<212> RNA<213> Homo

sapiens

aauuuuuca

sapiens

ucaaguguc

sapiens

uuucaagug

sapiens

ggccccuaa

sapiens<400> 445

gguguaauuu<210> 446<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 446

aaguguucau<210> 447<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> 447cagcucaacu<210> 448<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 448gcucaacucu<210> 449<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 449aaacaaacaa<210> 450<211> 19

uucaagugu

sapiens

ccucagggu

sapiens

cugcaguac

sapiens

gcaguacac

sapiens

caaacacac<212> RNA<213> Homo<400> 450gcaucagguu<210> 451<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 451

caacucugca<210> 452<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 452acucugcagu<210> 453<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 453cagguguaau<210> 454<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 454acacaagugu

sapiens

ggcacacaa

sapiens

guacacgau

sapiens

acacgaugg

sapiens

uuuucaagu

sapiens

ucauccuca<210> 455<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 455

uuaaacgcag<210> 456<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 456

aaaaguucag<210> 457<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 457guucagucgu<210> 458<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 458aaggcuuaaa<210> 459<211> 19<212> RNA<213> Homo

sapiens

cugccaggu

sapiens

ucgucucug

sapiens

cucugucuu

sapiens

cgcagcugc

sapiens<400> 459acaacucaau<210> 460<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 460ugagcuuccu

<210> 461<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 461ccccaaaagu<210> 462«211.> 19<212> RNA<213> Homo<400> 462aaaguucagu<210> 463<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 463gcacacaagu<210> 464<211> 19

gagcuuccu

sapiens

gggaaacac

sapiens

ucagucguc

sapiens

cgucucugu

sapiens

guucauccu<212> RNA<213> Homo<400> 464

cacaaguguu<210> 465<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 465

ucuagaugga<210> 466<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 466cuagauggaa<210> 467<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 467aaacacacuu<210> 468<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 468uuguuggccc

sapiens

cauccucag

sapiens

agacccaga

sapiens

gacccagau

sapiens

ggucccuuc

sapiens

cuaagccuu<210> 469<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 469

ucaaugagcu<210> 470<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 470

cgcaguaguu<210> 471<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 471caguaguucu<210> 472<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 472gcaguaguuc<210> 473<211> 19<212> RNA<213> Homo

sapiens

uccugggaa

sapiens

cuuugccca

sapiens

uugcccacc

sapiens

uuugcccac

sapiens<400> 473cuuaccaacu<210> 474<211> 19<212> RNA

<213> Homo<400> 474uucuuugccc<210> 475<211> 19<212> RNA<213> Homo<40Ό> 475uuaccaacug<210> 476<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 476ucuucuugau<210> 477<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 477acucuuacau<210> 478<211> 19

ggcuaggca

sapiens

accuggcuu

sapiens

gcuaggcau

sapiens

gacucggaa

sapiens

ucaugcguc<212> RNA<213> Homo<400> 478

uuacauucau<210> 479<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 479

uaagguacau<210> 480<211> 19<2-12 > RNA<213> Homo<400> 480uacucuuaca<210> 481<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 481auucaugcgu<210> 482<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 482cucuuacauu

sapiens

gcgucugua

sapiens

gcuacacac

sapiens

uucaugcgu

sapiens

cuguaagau

sapiens

caugcgucu<210> 483<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 483ucaugcgucu

<210> 484<211> 19<212> RNA<213> Homo<4 00> .484aacaggucag<210> 485<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 485aggucaguag<210> 486<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 486cccuaagccu<210> 487<211> 19<212> RNA<213> Homo

sapiens

guaagauag

sapiens

uagugaugc

sapiens

ugaugcucc

sapiens

uuguuucau

sapiens<400> 487

augcgucugu<210> 488<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 488

ucuguaagau<210> 489<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 489auagcugccu<210> 490<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 490acaggucagu<210> 491<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 491uagugaugcu<210> 492<211> 19

aagauagcu

sapiens

agcugccua

sapiens

acaacaggu

sapiens

agugaugcu

sapiens

ccgaucaga<212> RNA<213> Homo<4 00> 492acaccacugu<210> 493<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 493caccacuguu

<210> 494<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 494acuguuaacu<210> 495<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 495uguuaacugu<210> 496<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 496uauucaugaa

sapiens

uaacuguca

sapiens

aacugucag

sapiens

gucaguaac

sapiens

caguaacaa

sapiens

cagugagua<210> 497<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 497

ugucaaagau<210> 498<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 498

cuuacauuca<210> 499<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 499ugcgucugua<210> 500<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 500uacaacaggu<210> 501<211> 19<212> RNA<213> Homo

sapiens

cccaaguga

sapiens

ugcgucugu

sapiens

agauagcug

sapiens

caguaguga

sapiens<400> 501caggucagua<210> 502<211> 19<212> RNA<213> HOMO<400> 502ucagaccagu<210> 503<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 503 aguaagauac<210> 504<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 504ucacaccacu<210> 505<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 505uuagguggcu<210> 506<211> 19

gugaugcuc

sapiens

aagauacac

sapiens

acaaaccac

sapiens

guuaacugu

sapiens

gccucaguu<212> RNA<213> Homo<400> 506

ucaaguguau<210> 507<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 507

caaguguauu<210> 508<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 508ucaugaacag<210> 509<211> 19<212> RNA<213> Homo400> 509ucuuacauuc<210> 510<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 510gcgucuguaa

sapiens

ucaugaaca

sapiens

caugaacag

sapiens

ugaguaucu

sapiens

augcgucug

sapiens

gauagcugc<210> 511<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 511cgucuguaag<210> 512<211> 19<212> RNA

<213> Homo<400> 512ccaguaagau<210> 513<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 513aagauacaca<210> 514<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 514auacacaaac<210> 515<211> 19<212> RNA<213> Homo

sapiens

auagcugcc

sapiens

acacaaacc

sapiens

aaccaccuc

sapiens

caccuccac

sapiens<400> 515

ccacuguuaa cugucagua 19

<210> 516

<211> 19

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 516

aauaagguac augc-uacac 19

<210> 517

<211> 19

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 517

aguaguucuu ugcccaccu 19

<210> 518

<211> 19

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 518

uguucauccu cagggucac 19

<210> 519<211> 19<212> RNA

<213> Horno sapiens<400> 519

guaguucuuu gcccaccug 19

<210> 520<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 520uaguucuuug<210> 521<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 521agcuaaacag

<210> 522<211> 19< 212 > RNA<213> Homo<400> 522uaaacagccc<210> 523<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 523cuaagccuuu<210> 524<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 524uaagccuuug

sapiens

cccaccugg

sapiens

ccccuggau

sapiens

cuggaucuu

sapiens

guuucaugc

sapiens

uuucaugcu<210> 525<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 525uuuguuucau<210> 526<211> 19

<212> RNA<213> Homo<400> 526aagccuuugu<210> 527<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 527agccuuuguu<210> 528<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 528guuucaugcu<210> 529<211> 19<212> RNA<213> Homo

sapiens

gcuacagua

sapiens

uucaugcua

sapiens

ucaugcuac

sapiens

acaguacug

sapiens<400> 529uuguuucaug<210> 530<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 530uuucaugcua

<210> 531<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 531gccuuuguuu<210> 532<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 532cuuuguuuca<210> 533<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 533ccuuuguuuc<210> 534<211> 19

cuacaguac

sapiens

caguacuga

sapiens

caugcuaca

sapiens

ugcuacagu

sapiens

augcuacag<212> RNA<213> Homo<400> 534uguuucaugc<210> 535<211> 19<212> RNA<213> Homo<400> 535ucaugcuaca<210> 536<211> 19<212> RNA<213> Homo

sapiens

uacaguacu

sapiens

guacugagg

sapiens

Claims (65)

1. Método de tratar um paciente que sofre de umadesordem do ouvido, CARACTERIZADO pelo fato de que compre-ende administrar ao paciente uma composição farmacêuticacompreendendo um inibidor do polipeptideo RTP801 em umaquantidade efetiva para tratar o paciente.

2. Método de tratar um paciente que sofre de umaúlcera de pressão, CARACTERIZADO pelo fato de que compreen-de administrar ao paciente uma composição farmacêutica com-preendendo um inibidor do polipeptideo RTP801 em uma quan-tidade efetiva para tratar o paciente.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a desordem do ouvido é trau-ma acústico.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o inibidor compreende um po-linucleotídêo que compreende nucleotideos consecutivos ten-do uma seqüência de comprimento e homologia suficientes a umaseqüência presente na seqüência de um gene que codifica RTP8 01da forma apresentada na SEQ ID N0:1 para permitir hibridi-zação do inibidor para o gene e prevenir expressão deRTP801 no paciente.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o inibidor compreende um an-ticorpo que especificamente se liga a um epitopo presenteem um polipeptideo RTP8 01 que compreende aminoácidos consecu-tivos, a seqüência dos quais é apresentada na figura 2 (SEQ IDNo:2) e inibe a atividade do polipeptideo RTP801 no paciente.

6. Método para tratar um paciente que sofre deuma desordem do ouvido ou uma úlcera de pressão,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar aopaciente uma composição farmacêutica compreendendo umaquantidade terapeuticamente efetiva de um Inibidor de poli-nucleotídeo RTP801 de maneira a, desta forma, tratar o pa-ciente.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6,CARACTERIZADO pelo fato de que o polinucleotideo é um siRNA.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7,CARACTERIZADO pelo fato de que o siRNA compreende nucleotí-deos consecutivos tendo uma seqüência idêntica a qualquerseqüência apresentada em qualquer uma das tabelas A-D (SEQID NOs:3-536).

9. Método, de acordo com a reivindicação 6,CARACTERIZADO pelo fato de que o inibidor é selecionado dogrupo que consiste em um siRNA, um vetor compreendendo umsiRNA, um vetor que expressa um siRNA e uma molécula que éendogenamente processada em um siRNA.

10. Uso de uma quantidade terapeuticamente efeti-va de um inibidor de RTP801, CARACTERIZADO pelo fato de queé para a preparação de um medicamento para promover recupe-ração em um paciente que sofre de uma desordem do ouvido.

11. Uso de uma quantidade terapeuticamente efeti-va de um inibidor de RTP801, CARACTERIZADO pelo fato de queé para a preparação de um medicamento para promover recupe-ração em um paciente que sofre de uma úlcera de pressão.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que a desordem do ouvido é trau-ma acústico.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 10 ou 11,CARACTERIZADO pelo fato de que o inibidor compreende um po-linucleotideo que compreende nucleotideos consecutivos ten-do uma seqüência de comprimento e homologia suficientes parauma seqüência presente na seqüência de um gene que codificaRTP801 da forma apresentada na SEQ ID N0:1 para permitirhibridização do inibidor para o gene e prevenir expressãode RTP8 01 no paciente.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 10 ou 11,CARACTERIZADO pelo fato de que o inibidor de RTP8 01 é umanticorpo que especificamente se liga a um epitopo presenteem um polipeptideo RTP801 que compreende aminoácidos conse-cutivos, a seqüência dos quais é apresentada na figura 2(SEQ ID No:2) e inibe a atividade do polipeptideo RTP801 nopaciente.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 10 ou 11,CARACTERIZADO pelo fato de que o polinucleotideo infraregu-Ia a expressão de um gene RTP801.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 10 ou 11,CARACTERIZADO pelo fato de que o polinucleotideo é um siR-NA.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 16,CARACTERIZADO pelo fato de que o siRNA compreende nucleoti-deos consecutivos tendo uma seqüência idêntica a qualquerseqüência apresentada em qualquer uma das tabelas A-D (SEQID NOs:3-536).

18. Uso, de acordo com a reivindicação 14,CARACTERIZADO pelo fato de que o inibidor é selecionado dogrupo que consiste em um siRNA, um vetor compreendendo umsiRNA, um vetor que expressa um siRNA e uma molécula que éendogenamente processada em um siRNA.

19. Método para tratar um paciente que sofre deuma condição selecionada de uma desordem respiratória, umadoença dos olhos, uma desordem microvascular, ou uma injúriaou doença da medula óssea, CARACTERIZADO pelo fato de que com-preende administrar ao paciente uma composição farmacêuticacompreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de umsiRNA que inibe expressão de um gene RTP801 compreendendo nu-cleotideos consecutivos tendo uma seqüência idêntica a qual-quer seqüência apresentada na tabela D (SEQ ID NOs: 345-536)de maneira a, desta forma, tratar o paciente.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição é uma doença dosolhos.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20,CARACTERIZADO pelo fato de que a doença dos olhos é degene-ração macular.

22. Método, de acordo com a reivindicação 19,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição é uma desordemrespiratória.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que a desordem respiratória éCOPD.

24. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que a desordem respiratória éasma.

25. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que a desordem respiratória ébronquite crônica.

26. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que a desordem respiratória éenfisema.

27. Método, de acordo com a reivindicação 19,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição é uma desordemmi crovascular.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27,CARACTERIZADO pelo fato de que a desordem microvascular éretinopatia diabética.

29. Método, de acordo com a reivindicação 27,CARACTERIZADO pelo fato de que a desordem microvascular éfalha renal aguda.

30. Uso de uma quantidade terapeuticamente efeti-va de um siRNA que inibe a expressão de um gene RTP801,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende nucleotideos con-secutivos tendo uma seqüência idêntica a qualquer seqüênciaapresentada na tabela D (SEQ ID NOs: 345-536) para a prepara-ção de um medicamento para promover recuperação em um paci-ente que sofre de uma condição selecionada de uma desordemrespiratória, uma doença dos olhos, uma desordem microvas-cular ou um injúria ou doença da medula óssea.

31. Uso, de acordo com a reivindicação 30,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição é uma doença dosolhos.

32. Uso, de acordo com a reivindicação 31,CARACTERIZADO pelo fato de que a doença dos olhos é degene-ração macular.

33. Uso, de acordo com a reivindicação 30,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição é uma desordemrespiratória.

34. Uso, de acordo com a reivindicação 33,CARACTERIZADO pelo fato de que a desordem respiratória éCOPD.

35. Uso, de acordo com a reivindicação 33,CARACTERIZADO pelo fato de que a desordem respiratória éasma

36. Uso, de acordo com a reivindicação 33,CARACTERIZADO pelo fato de que a desordem respiratória ébronquite crônica.

37. Uso, de acordo com a reivindicação 33,CARACTERIZADO pelo fato de que a desordem respiratória éenfisema.

38. Uso, de acordo com a reivindicação 30,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição é uma desordemmicrovascular.

39. Uso, de acordo com a reivindicação 38,CARACTERIZADO pelo fato de que a desordem microvascular éretinopatia diabética.

40. Uso, de acordo com a reivindicação 38,CARACTERIZADO pelo fato de que a desordem microvascular éfalha renal aguda.

41. Composto, CARACTERIZADO pelo fato de que tema estrutura:- 5' (N)x - Z3' (fita antisentido)- 3' Z'-(N')y 5 1 (fita sentido)em que cada N e N1 é um ribonucleotideo que podeser modificado ou não modificado em seu resíduo de açúcar e(N), e (N' ) y é oligômero em que cada N ou N1 consecutivo é u-nido ao próximo N ou N1 por uma ligação covalente;em que cada um de χ e y é um número inteiro entre 19 e 40;em que cada um de Z e Z1 pode estar presente ouausente, mas se presente é dTdT e é covalenteraente anexadoao 3' terminus da fita em que ele está presente;e em que a seqüência de (N) χ compreende uma dasseqüências presentes na tabela D.

42. Composto, de acordo com a reivindicação 41,CARACTERIZADO pelo fato de que a ligação covalente é umaligação fosfodiéster, em que χ = y, preferivelmente em queχ = y = 19 , em que ZeZ' são ambos ausentes, em que pelomenos um ribonucleotídeo é modificado no seu resíduo de a-çúcar na posição 2', em que a fração na posição 2' é metóxi(21-0-metila) em que ribonucleotídeos que alternam são mo-dificados tanto nas fitas antisentido quanto sentido e emque os ribonucleotídeos nas posições 5' e 3' termini da fi-ta antisentido são modificados em seus resíduos de açúcar, eos ribonucleotídeos no 5' e 3' termini da fita sentido sãonão modificados nos seus resíduos de açúcar.

43. Composto, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 41-42, CARACTERIZADO pelo fato de que a seqüên-cia de (N)x compreende a seqüência antisentido No. 257 databela D (SEQ ID NO:525) ou a seqüência antisentido No. 260da tabela D (SEQ ID NO:528).

44. Composto, de acordo com a reivindicação 43,CARACTERIZADO pelo fato de que o composto não tem um fosfa-to terminal.

45. Composto, CARACTERIZADO pelo fato de que com-preende um oligorribonucleotideo em que uma fita compreendenucleotideos consecutivos tendo, de 5' a 3', a seqüênciaapresentada na SEQ ID NOS: 441-536 ou um homólogo deste emque em até 2 dos nucleotideos em cada região terminal a ba-se é alterada.

46. Composto, CARACTERIZADO pelo fato de que com-preende um oligorribonucleotideo em que uma fita compreendenucleotideos consecutivos tendo, de 5' a 3', a seqüênciaapresentada em SEQ ID NOS 345-440 em que uma pluralidade debases pode ser modificada, preferivelmente por uma modificação - 2-0-metila, ou um homólogo deste em que em até 2 dos nucleo-tideos em cada região terminal uma base é alterada.

47. Composto, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 41-4 6, CARACTERIZADO pelo fato de que compreen-de um grupo 2' O-Me no primeiro, terceiro, quinto, sétimo,nono, décimo primeiro, décimo terceiro, décimo quinto, dé-cimo sétimo e décimo nono nucleotideo da fita antisentido e osegundo, quarto, sexto, oitavo, décimo, décimo segundo, décimoquarto, décimo sexto e décimo oitavo nucleotideo da fita sen-tido.

48. Composto, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 41-47, CARACTERIZADO pelo fato de que o compos-to é fosforilado ou não fosforilado.

49. Composto, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 41-48, CARACTERIZADO pelo fato de que o dinu-cleotídeo dTdT é covalentemente anexado ao 3' terminus.

50. Composto, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 41-49, CARACTERIZADO pelo fato de que em pelomenos um nucleotideo um resíduo de açúcar é modificado.

51. Composto, de acordo com a reivindicação 50,CARACTERIZADO pelo fato de que a modificação é uma modifi-cação 2'-O-metila.

52. Composto, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 41-51, CARACTERIZADO pelo fato de que o grupo-2' OH é substituído por um grupo ou fração selecionado dogrupo que compreende -H-OCH3, -OCH2CH3, -OCH2CH2 20 CH3, -NH2, e F.

53. Método de tratar um paciente que sofre de umacondição selecionada de uma desordem respiratória, uma do-ença dos olhos, uma desordem microvascular, uma desordem doouvido, um úlcera de pressão ou um injúria ou doença da medulaóssea, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrarao paciente uma composição farmacêutica compreendendo umcomposto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41--52, em uma quantidade terapeuticamente efetiva de maneiraa, desta forma, tratar o paciente.

54. Método, de acordo com a reivindicação 53,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição é a doença dosolhos AMD.

55. Método, de acordo com a reivindicação 53,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição é a desordem detrauma acústico.

56. Uso de uma quantidade terapeuticamente efeti-va de um composto, de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 41-52, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a pre-paração de um medicamento para promover recuperação em umpaciente que sofre de uma condição selecionada de uma de-sordem respiratória, uma doença dos olhos, uma desordem mi-crovascular, uma desordem do ouvido, um úlcera de pressãoou injúria ou doença da medula óssea.

57. Composição farmacêutica, CARACTERIZADO pelo fa-to de que compreende dois ou mais compostos, de acordo comqualquer uma das reivindicações 41-52.

58. Composição farmacêutica, CARACTERIZADO pelofato de que compreende dois ou mais compostos em que o pri-meiro composto é um oligorribonucleotideo da tabela Deosegundo composto é um oligorribonucleotideo de acordo comqualquer uma das tabelas A-C ou um anticorpo ou aptâmero.

59. Composição, de acordo com a reivindicação 57,CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais dos compostos éum oligorribonucleotideo selecionado das ID No.s 257, 260-- 262, e 264-268 da tabela D.

60. Composição, de acordo com a reivindicação 58,CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro composto é um o-ligorribonucleotideo selecionado das ID No.s 257, 260-262,e 264-268 da tabela D.

61. Composição, de acordo com a reivindicação 58,CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo composto é um oli-gorribonucleotideo selecionado das ID Nos: 14, 22, 23, 25,- 27, 39, 41, 42, 49 e 50 da tabela A.

62. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 57-61, CARACTERIZADO pelo fato de que os di-tos dois compostos são fisicamente misturados juntos emquantidades que geram atividade benéfica.

63. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 57-61, CARACTERIZADO pelo fato de que os di-tos dois compostos são covalentemente ou não covalentementeligados.

64. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 57-61, CARACTERIZADO pelo fato de que os di-tos dois compostos são unidos juntos por um ligante de áci-do nucléico de um comprimento que varia de 2-100, preferi-velmente 2-50 ou 2-30 nucleotideos.

65. Uso de uma composição, de acordo com qualqueruma das reivindicações 57-64, CARACTERIZADO pelo fato deque é para o tratamento de uma desordem respiratória, umadoença dos olhos, uma desordem microvascular, uma úlcera depressão ou uma injúria ou doença da medula óssea.