KR101094617B1 - 알티피801 억제제의 치료적 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 RTP801 유전자 및/또는 단백질의 억제에 근거하여 미세혈관 장애, 눈 질환 및 호흡 증상을 치료하기 위한 신규한 분자, 조성물, 방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

알티피801 억제제의 치료적 용도{THERAPEUTIC USES OF INHIBITORS OF RTP801}
본 발명은 RTP801 유전자를 억제하는 신규한 siRNA 분자, 및 모든 유형의 호흡 장애(폐 장애 포함), 눈 질환 및 증상, 미세혈관 장애, 혈관형성- 및 세포자멸-관련 증상을 치료하는데 있어서 상기 분자의 용도에 관한 것이다.
본 출원은 2004년 8월 16일자로 출원된 유럽 특허출원 EP 04019405.2호; 2004년 8월 17일자로 출원된 미국 가출원 제60/601,983호; 2004년 8월 25일자로 출원된 제60/604,668호; 2004년 9월 14일자로 출원된 제60/609,786호; 2004년 12월 22일자로 출원된 제60/638,659호; 2005년 3월 22일자로 출원된 제60/664,236호 및 2005년 6월 8일자로 출원된 제60/688,943호의 우선권을 주장하며, 이들 문헌 전부는 본원에서 전체적으로 참고문헌으로 인용된다.
만성 폐색성 폐질환( COPD )
만성폐색성 폐질환(COPD)은 1천 6백만명보다 많은 미국인에게 영향을 미치며, 미합중국의 상위 4번째 사망원인이다. 흡연이 대부분의 쇠약 질환을 발생시키지만, 다른 환경 요인도 배제할 수는 없다(문헌[Petty TL. 2003. Definition , epidemiology, course , and prognosis of COPD. Clin. Cornerstone, 5-10]).
폐기종은 COPD의 주요 증후이다. 종말 세기관지로부터 멀리있는 말단 공기공간이 영구 파괴되는 것이 폐기종의 특징이다(문헌[Tuder RM 등, Oxidative stress and apoptosis interact and cause emphysema due to vascular endothelial growth factor blocade. Am J Respir Cell Mol Biol, 29:88-97; 2003] 참고). 폐기종은 또한 세기관지 및 폐포 구조물내에 포식세포 및 중성구와 같은 염증세포를 축적시키는 것을 특징으로 한다(문헌[Petty, 2003]).
폐기종의 발병기전은 복잡하며 다인성이다. 인간에 있어서 알파1-항트립신과 같은 염증 세포에 의해 생성되는 프로테아제 억제제의 결핍은 프로테아제/항프로테아제 불균형을 일으키고, 그 결과 흡연(CS)-유도된 폐기종에서 폐포 세포외 기질 파괴를 돕는 것으로 보여진다(문헌[Eriksson, S. 1964. Pulmonary Emphysema and Alpha1 - Antitrypsin Deficiency . Acta Med Scand 175: 197-205. Joos, L., Pare, P.D. 및 Sandford, A.J. 2002. Genetic risk factors of chronic obstructive pulmonary disease. Swiss Med Wkly 132:27-37]). 만성 흡연 흡입에 의해 발생한 폐기종에 대한 포식세포 금속엘라스타제 녹아웃(knockout) 마우스의 내성에 의해 증명되는 바와 같이 기질 금속프로테아제(MMP)는 실험 폐기종에서 중요한 역할을 한다(문헌[Hautamaki 등: Requirement for macrophage elastase for cigarette smoke - induced emphysema in mice . Science 277: 2002-2004]). 또한, 유전자삽입 마우스에서 인터루킨-13이 폐에 과발현되면 MMP- 및 카텝신-의존적 폐기종을 발생시킨다(문헌[Zheng, T., 등 2000. Inducible targetting of IL -13 to the adult lung causes matrix metalloproteinase - and cathepsin - dependent emphysema. J. Clin Invest 106:1081-1093] 참고). 최근의 논문은 폐기종에 이르게하는 폐조직 파괴에 있어서 중격세포 세포자멸 관련에 대하여 기술하고 있다(문헌[Rangasami T. 등. Genetic ablation of Nrf2 enhances susceptibility to cigarette smoke - induced emphysema in mice . Journal of Clinical Investigation; Tuder RM 등. Oxidative stress and apoptosis interact and cause emphysema due to vascular endothelial growth factor blocade . Am J Respir Cell Mol Biol , 29:88-97; 2003; Yokohori N, Aoshiba K, Nagai A, Increased levels of cell death and proliferation in alveolar wall cells in patients with pulmonary emphysema. Chest. 2004 Feb; 125(2):626-32; Aoshiba K, Yokohori N, Nagai A., Alveolar wall apoptosis causes lung destruction and emphysematous changes. Am J Resp Cell Mol Biol. 2003 May; (28)5:555-62]).
폐기종에서 폐 파괴의 두가지 경로에 근원이 되는 메카니즘중에서 반응성 산소 종(ROS)의 과다 형성을 우선 언급하여야 한다. 산화촉진물질/산화방지물질의 불균형이 흡연자의 혈액 및 폐조직에 존재한다는 것이 이론으로 잘 정립되어 있다(문헌[Hulea SA 등: Cigarette smoking causes biochemical changes in blood that are suggestive of oxidative stress : a case - control study . J Environ Pathol Toxicol Oncol . 1995; 14(3-4):173-80; Rahman I, MacNee W. Lung glutathione and oxidative stress : implications in cigarette smoke - induced airway disease . Am J Physiol . 1999 Dec, 277(6 Pt 1): L1067-88; MacNee W. Oxidants/antioxidants and COPD. Chest. 2000 May; 117(5 Suppl 1): 303S-17S; Marwick JA, Kirkham P, Gilmour PS, Donaldson K, MacNEE W, Rahman I. Cigarette smoke - induced oxidative stress and TGF - betal increase p21waf1 / cip1 expression in alveolar epithelial cells . Ann N Y Acad Sci. 2002 Nov; 973:278-83; Aoshiba K, Koinuma M, Yokohori N, Nagai A. Immunohistochemical evaluation of oxidative stress in murine lungs after cigarette smoke exposure . Inhal Toxicol. 2003 Sep; 15(10):1029-38; Dekhuijen PN. Antioxidant properties of N- acetylcysteine : their relevance in relation to chronic obstructive pulmonary disease . Eur Respir J. 2004 Apr; 23(4):629-36; Tuder RM, Zhen L, Cho CY, Taraseviciene-Stewart L, Kasahara Y, Salvemini D, Voelkel NF, and Flores SC. Oxidative stress and apoptosis interact and cause emphysema due to vascular endothelial growth factor blocade . Am J Respir Cell Mol Biol, 29:88-97, 2003] ). 마우스를 흡연에 노출시킨지 한시간 후에 폐포 상피세포, 특히 II 유형에서 8-하이드록시-2'-디옥시구아노신(8-OHdG)이 크게 증가하였다(문헌[Inhal Toxicol . 2003 Sep; 15(10): 1029-38, 상기 참고]).
과생성된 반응성 산소 종의 세포 독성이 알려져 있으며, 상기 세포 독성은 직접적인 DNA 손상 효과 및 세포자멸 신호전달 경로의 활성화로부터 비롯된다(문헌[Takashaki A, Masuda A, Sun M, Centonze VE, Herman B. Oxidative stress -induced apoptosis is associated with alterations in mitochondrial caspase activity and Bcl -2- dependent alterations in mitochondrial pH ( pHm ). Brain Res Bull. 2004 Feb 15; 62(6):497-504; Taniyama Y, Griendling KK. Reactive oxygen species in the vasculature : molecular and cellular mechanisms . Hypertension. 2003 Dec; 42(6): 1075-81. Epub 2003 Oct 27; Higuchi Y. Chromosomal DNA fragmentation in apoptosis and necrosis induced by oxidative stress . Biochem Pharmacol. 2003 Oct 15; 66(8): 1527-35; Punj V, Chakrabarty AM. Redox proteins in mammalian cell death : an evolutionarily conserved function in mitochondria and prokaryotes . Cell Microbiol. 2003 Apr; 5(4):225-31; Ueda S, Masutani H, Nakamura H, Tanaka T, Ueno M, Yodoi J. Redox control of cell death. Antioxid Redox Signal. 2002 Jun; 4(3): 405-14] 참고).
ROS는 그 자체가 세포독성일 뿐 아니라 염증전 자극이며, 산환환원-민감성 전사인자 NFkB 및 AP-1의 중요한 활성제이다(문헌[Rahman I. Oxidative stress and gene transcription in asthma and chronic obstructive pulmonary disease : antioxidant therapeutic targets . Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 2002 Sep; 1(3): 291-315]에 개요). 상기 전사인자 둘다는 차례로 염증전 시토카인(문헌[Renard P, Raes M. The proinflammatory transcription factor NFkappaB : a potential target for novel therapeutical strategies . Cell Biol Toxicol. 1999; 15(6): 341-4; Lentsch AB, Ward PA. The NFkappaBb / IkappaB system in acute inflammation. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2000; 48(2):59-63]에 개요) 및 기질분해성 프로테아제(문헌[Andela VB, Gordon AH, Zotalis G, Rosier RN, Goater JJ, Lewis GD, Schwarz EM. Puzas JE, O'Keefe RJ. NFkappaB: a pivotal transcription factor in prostate cancer metastasis to bone . Clin Orthop. 2003 Oct; (415 Suppl): S75-85; Fleenor DL, Pang IH, Clark AF. Involvement of AP -1 in interleukin -1 alpha - stimulated MMP -3 expression in human trabecular meshwork cells . Invest Ophthalmol Vis Sci . 2003 Aug, 44(8):3494-501; Ruhul Amin AR, Senga T, Oo ML, Thant AA, Hamaguchi M. Secretion of matrix metalloproteinase-9 by the proinflammatory cytokine , IL -1 beta : a role for the dual signalling pathways , Akt and Erk . Genes Cells . 2003 Jun; 8(6): 515-23])의 전사 자극에 크게 관련되어 있다. 이어서, 염증전 시토카인은 기질 분해성 효소, 시토카인 및 반응성 산소 종을 또한 분비하는 염증 세포의 인력체(attractor)로 작용한다. 따라서, 예컨대, 흡연과 같은 발병 인자는 반응성 산소 종이 폐 파괴의 주요 매개체로서 작용하는 병리 네트워크를 유발시키는 것으로 보인다. 따라서, 흡입된 담배연기로부터의 반응성 산소 종(ROS) 및 염증 세포에 의해 내생적으로 형성된 반응성 산소 종(ROS) 둘다는 증가된 폐내 산화물질 부하에 기여한다.
COPD 발병기전과 관련된 하나의 추가적인 발병 인자는 폐기종 환자의 폐에 VEGF 및 VEGFRII의 관찰된 감소된 발현이다(문헌[Yasunori Kasahara, Rubin M. Tuder, Carlyne D. Cool, David A. Lynch, Sonia C. Flores, and Norbert F. Voelkel. Endothelial Cell Death and Decreased Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 in Emphysema . Am J Respir Crit Care Med Vol 163. pp 737-744, 2001] 참고). 또한, 화학적 VEGFR 억제제를 사용하는 VEGF 신호의 억제는 폐포중격 내피세포의 세 포자멸 및 이어서 상피세포의 세포자멸로 이어지는데, 아마도 폐포내 세포 유형 둘다의 친밀한 구조적/기능적 연결이 붕괴되기 때문인 것 같다(문헌[Yasunori Kasahara, Rubin M Tuder, Laimute Taraseviciene-Stewart, Timothy D. Le Cras, Steven Abman, Peter K. Hirth, Johannes Waltenberger, and Norbert F. Voelkel. Inhibition of VEGF receptors causes lung cell apoptosis and emphysema J. Clin. Invest. 106:1311-1319(2000); Voelkel NF, Cool CD. Pulmonary vascular involvement in chronic obstructive pulmonary disease . Eur Respir J Suppl . 2003 Nov; 46:28s-32s] 참고).
황반 변성
미국에서 65세가 넘는 개인의 최대 교정시력 감퇴의 가장 흔한 원인은 노년기 황반변성(AMD)으로 알려진 망막 장애이다. AMD가 진행됨에 따라, 상기 질환은 선명한 중심시력의 상실을 특징으로 한다. AMD에 걸리는 눈 부위는 주로 광수용 세포로 이루어진 망막 중심내의 작은 부위인 황반이다. AMD 환자의 약 85 내지 90%에 이르는 소위 "건식" AMD는 눈 색소분포의 변경, 광수용체의 상실, 및 세포의 전체적인 위축으로 인한 망막 기능의 감소를 포함한다. 소위 "습식" AMD는 망막하 공간내의 혈병 및 흉터에 이르게 하는 맥락막 혈관의 이상 증식을 포함한다. 따라서, 습식 AMD의 발병은 감각신경망막하의 맥락막 신생혈관 그물구조의 이상 형성(맥락막 혈관신생, CNV) 때문에 발생한다. 새롭게 형성된 혈관은 과도하게 누출되기 쉽다. 이는 망막하에 유체 및 혈액을 축적시키고, 그 결과 시력 상실에 이르게 된다. 결과적으로, 맥락막과 각막을 포함한 커다란 원반 흉터가 형성될 때, 관련 영역내의 전체적인 기능성 망막 상실이 있다. 건식 AMD 환자는 질적으로 낮은 시력을 보유할 수 있는 반면, 습식 AMD는 종종 실명에 이르게 한다(문헌[Hamdi & Kenney, Age - related Macular degeneration - a new viewpoint , Frontiers in Bioscience, e305-314, May 2003] 참고). CNV는 습식 AMD에서만 발생할 뿐만 아니라, 눈 히스토플라스마증 증후군, 혈관무늬병증, 브루크막 파열, 근시 변성, 눈 종양 및 일부 망막 변성 질환과 같은 다른 눈 병리현상에서도 발생한다.
실시되어온 다양한 연구는 흡연, 노화, 가족력(문헌[Milton, Am J Ophthalmol 88, 269(1979); Mitchell 등, Ophthalmology 102, 1450-1460(1995); Smith 등, Ophthalmology 108, 697-704 (2001)]), 성별(여성에서 7배 높은 가능성: 문헌[Klein 등, Ophthalmology 99, 933-943 (1992)]) 및 인종(백인이 가장 걸리기 쉽다)과 같은 AMD에 대한 다양한 위험 인자를 결정하였다. 추가적인 위험 인자는 원시(원시) 및 연한색(light-colored) 눈과 같은 눈 특징 뿐만 아니라 심혈관 질환 및 고혈압을 포함할 수 있다. 질환의 발병 진행에서의 유전적 관련의 증거가 또한 기록되어 있다(상기 문헌[Hamdi & Kenney] 참고).
어큐이티 파마슈티칼즈(Acuity Pharmaceuticals) 및 에스아이알엔에이 테라퓨틱스(Sirna Therapeutics)의 2개 회사 모두는 AMD를 치료하기 위하여 VEGF 및 VEGF-R1(Fit-1)을 각각 억제하는 siRNA 분자에 대한 IND을 최근에 정리하여 보존하고 있다. 상기 분자는 각각 캔드(Cand)5 억제제 및 027 억제제라고 부른다.
미세혈관 장애
미세혈관 장애는 주로 미세 모세관 및 림프관에 영향을 미치는 광범위한 증 상 군으로 구성되며, 따라서 직접적인 외과적 시술 범위 밖에 있다. 미세혈관 질환은 혈관경축, 맥관염 및 림프관 폐색으로 크게 분류될 수 있다. 또한, 공지된 혈관 증상중 다수는 미세혈관 요소를 갖는다.
· 혈관경축 질환 - 혈관경축 질환은 미지의 이유로 인해 말초 혈관수축 반사가 과민성인 비교적 흔한 증상 군이다. 이는 조직 상실에 이를 정도까지 부적절한 혈관 수축 및 조직 허혈을 일으킨다. 혈관경축 징후는 일반적으로 온도 및 진동 기계의 사용과 관련되지만, 다른 증상에 이차적일 수 있다.
· 맥관염 질환 - 맥관염 질환은 미세순환에서 일차 염증 과정을 포함하는 것이다. 맥관염은 일반적으로 자가면역 또는 결합조직장애의 구성성분이며, 일반적으로 외과적 치료를 할 수 없으나 징후가 심한 경우에는 면역억제 치료를 요한다.
· 림프관 폐색 질환 - 하지 또는 상지의 만성 팽윤(림프 부종)은 말초 림프관 폐색의 결과이다. 이는 일부는 선천적이고 일부는 후천적인 수많은 원인을 갖는 비교적 희귀한 증상이다. 치료의 주된 방법은 정확하게 맞는 압박 가멘트(garment), 및 간헐적인 압박 장치의 사용이다.
당뇨병과 관련된 미세혈관 병리현상
당뇨병은 실명의 주된 원인이며, 절단 및 발기부전의 첫 번째 원인이며, 가장 흔하게 발생하는 만성 소아기 질환의 하나이다. 당뇨병은 또한 미합중국에서 말기 신장 질환의 주된 원인이 되며, 다른 신장 질환과 비교할 때 31%의 유병율을 갖는다. 당뇨병은 또한 모든 이식 수술의 22%에 해당하는 신장 이식의 가장 흔한 지표이다.
일반적으로, 당뇨병 합병증은 미세혈관 질환 또는 큰혈관 질환으로 크게 분류될 수 있다. 미세혈관 합병증은 신경병증(신경 손상), 신장병증(신장 질환) 및 시력 장애(예컨대, 망막증, 녹내장, 백내장 및 각막 질환)를 포함한다. 망막, 사구체 및 신경 혈관에서 유사한 병태생리학적 특징이 당뇨병-특이적인 미세혈관 질환을 특징으로 할 수 있다.
당뇨병과 관련된 미세혈관 병리현상은 예컨대 오랜기간동안 당뇨병을 앓아온 사람에게서 발생할 수 있는 가장 작은 혈관(모세관) 질환으로 정의된다. 혈관벽은 비정상적으로 두껍지만 약하게 된다. 따라서, 혈관벽은 출혈을 일으키고, 단백질을 누출시키며, 전신에서의 혈류를 느리게 한다.
임상 및 동물 모델 데이터는 만성 고혈당증이 모든 당뇨병 미세혈관 질환 유형에서의 중심 개시 인자임을 나타낸다. 고혈당증의 지속기간 및 정도는 둘다 당뇨병 미세혈관 질환의 정도 및 진행속도와 크게 상호관련된다. 모든 당뇨병 세포가 높아진 혈장 당 수준에 노출되더라도, 고혈당증 손상은 세포내 고혈당증을 발현시키는 세포 유형(예컨대, 내피 세포)에 한정된다. 내피 세포는 많은 다른 세포와 달리 세포외 고혈당증에 노출될 때 당 운반을 하향 조절할 수 없기 때문에 세포내 고혈당증을 발현시킨다. 세포내 고혈당증이 당뇨병 병리현상의 발현에 필요하고 충분하다는 것은 정상 당 환경에서 배양된 혈관사이세포내의 GLUT1 당 전달체의 과발현이 당뇨병 표현형을 모방하여 당뇨병 고혈당증에서와 동일하게 콜라겐 IV형, 콜라겐 I형 및 피브로넥틴 유전자 발현의 증가를 유도한다는 사실에 의해 추가로 증명된다.
내피세포 이상 기능
당뇨병 초기 과정에서, 구조적 변화가 분명하기 이전에 고혈당증은 망막, 사구체 및 말초신경 신경혈관에서의 혈류 및 혈관 투과성의 이상을 일으킨다. 혈류 및 모세관내 압력의 증가는 모세혈관계의 날신경 측에 대한 고혈당증-유도된 감소된 산화질소(NO) 생성, 및 가능하게는 안지오텐신 II에 대한 감수성 증가를 반영하는 것으로 생각된다. 모세관내 압력의 증가 및 내피세포 기능상실의 결과로 인해, 망막 모세관은 형광물질 누출의 증가를 나타내고, 사구체 모세관은 높아진 알부민 배설 속도(AER)를 갖는다. 필적할만한 변화가 말초신경의 신경혈관에서 나타난다. 당뇨병의 초기 과정에서 증가된 투과성은 가역적이지만, 시간이 경과함에 따라 비가역적으로 된다.
증가된 혈관벽 단백질 축적
당뇨병 미세혈관 질환의 통상적인 병태생리학적 특징은 맥관판의 진행성 협착 및 결과적으로는 폐색이며, 이는 영향을 받은 조직의 부적절한 관류 및 기능을 발생시킨다. 초기 고혈당증-유도된 미세혈관 고혈압 및 증가된 혈관 투과성은 하기 3가지 과정에 의해 비가역적인 미세혈관 폐색을 일으킨다.
· 첫 번째는 과요오드산-쉬프(PAS)-양성인 탄수화물-함유 혈장 단백질의 비정상적인 누출인데, 상기 단백질은 모세관벽에 침착되며 외막세포 및 혈관사이세포와 같은 혈관주위세포를 자극시켜서 성장 인자 및 세포외 기질을 동화(elaboration)시킬 수 있다.
· 두 번째는 변환성 성장 인자 β1(TGF-β1)과 같은 성장인자의 혈관밖 유출인데, 이는 세포외 기질 구성성분의 과생성을 직접 자극하여서 특정한 합병증-관련 세포 유형에서 세포자멸을 유도할 수 있다.
· 세 번째는 내피세포와 버팀세포에 의한 병적 유전자 발현의 고혈압-유도된 자극인데, 이들은 글루트(glut)-1 당 전달체, 성장인자, 성장인자 수용체, 세포외 기질 구성성분, 및 순환 백혈구를 활성화시킬 수 있는 부착 분자를 포함한다. 당뇨병 미세혈관 질환의 중증도의 편측 감소가 눈 또는 신동맥 협착을 갖는 쪽에서 일어난다는 결과가 본 개념과 일치한다.
미세혈관 세포 소실 및 혈관 폐색
당뇨병 미세혈관 판의 진행성 협착화 및 폐색은 또한 미세혈관 세포 소실에 의해 동반된다. 망막에서 당뇨병은 뮐러 세포 및 신경절 세포, 외막 세포 및 내피 세포의 예정된 세포사를 유도한다. 사구체에서, 신장 기능의 감소는 널리 퍼진 모세관 폐색 및 발세포 소실에 관련되어 있으나, 사구체 세포소실의 근원이 되는 메카니즘은 아직 알려져 있지 않다. 신경 혈관에서, 내피세포 및 외막 세포 변성이 발생하며, 상기 미세혈관 변화는 당뇨병 말초 신경병증의 발현에 앞서는 것으로 보인다. 당뇨병에서 축삭 변성의 다초점 분포는 미세혈관 폐색의 우발성 역할을 지지하지만, 고혈당증-유도된 신경성장인자의 감소는 정상적인 축삭 복구 및 재생을 방해함으로써 일조할 수 있다.
당뇨병 미세혈관 질환의 또 다른 통상적인 특징은 고혈당증 메모리, 또는 정상 당 항상성의 후속 기간동안 고혈당증-유도된 미세혈관 변경의 존속 또는 진행이 라고 부른다. 상기 현상의 가장 현저한 예는 정상화된 혈당 2.5년 및 이후에 고혈당증 전체기간인 2.5년동안에 발생하는 당뇨병을 앓는 개의 조직학적으로 정상인 눈에서 중증 망막병증의 발현이다. 선별된 기질 유전자 전사의 고혈당증-유도된 증가는 또한 생체내에서 정상혈당의 복원 이후에 수 주동안 지속되고, 선별된 기질 유전자 전사의 고혈당증-유도된 증가의 덜 현저하지만 질적으로는 유사한 연장이 배양된 내피세포에서 발생한다.
추가적인 정보를 위해, 문헌[Shared pathophysiologic features of microvascular complications of diabetes, Larsen: Williams Textbook of Endocrinology, 10th ed., Copyright c 2003 Elsevier]을 참고한다.
미세혈관 합병증은 현성 당뇨병에서 뿐만 아니라 내당능장애(IGT) 때문에도 발생한다. IGT의 미세혈관 합병증은 신경병증, 망막병증 및 신장 미소단백뇨증이다.
당뇨병성 신경병증
당뇨병성 신경병증은 당뇨병과 관련된 신경병 장애(말초신경 손상)이다. 상기 증상은 일반적으로 신경을 공급하는 작은 혈관(신경 혈관)을 포함한 당뇨병 미세혈관 손상으로부터 발생한다. 당뇨병성 신경병증과 관련될 수 있는 비교적 통상적인 증상은 제3 뇌신경 마비; 단발신경병증; 다발성 단발신경병증; 당뇨병 근육위축증; 통증 다발신경병증; 자율 신경병증; 및 흉배 신경병증이 있고, 가장 흔한 형태인 발과 다리에 주로 걸리는 말초 신경병증이 있다. 당뇨병성 신경병증 발현에 관련된 4개 인자, 즉 미세혈관 질환, 진행성 당화 종말생성물, 단백질 키나아제 C 및 폴리올 경로가 있다.
당뇨병성 신경병증에서 미세혈관 질환
혈관 및 신경 질환은 밀접하게 관련되어 얽혀있다. 혈관은 정상적인 신경 기능에 의존하고, 신경은 적절한 혈류에 의존한다. 미세혈관에서의 첫 번째 병적 변화는 혈관수축이다. 질환이 진행됨에 따라, 신경 기능장애는 산소분압 감소 및 저산소증을 일으키는 모세관 기저막 비대 및 내피세포 과다형성과 같은 혈관 비정상의 발현과 밀접하게 관련되어 있다. 신경 허혈은 당뇨병성 신경병증의 충분히 정립된 특징이다. 혈관확장제(예컨대, 안지오텐신-전환-효소 억제제, 알파1-길항제)는 신경 혈류를 실질적으로 증가시킬 수 있고, 신경전도속도를 상응하게 증가시킬 수 있다. 따라서, 미세혈관 기능이상은 초기 당뇨병에서 발생하며, 신경 기능이상 진행과 나란히 진행되고, 당뇨병성 신경병증에서 관찰되는 구조적, 기능적 및 임상적 변화의 중증도를 뒷받침하기에 충분할 수 있다. 말초 신경병증(다리), 감각운동 신경병증은 당뇨병에서 다리궤양의 발병기전의 중요한 구성요소이다.
신경병증은 2가지 유형의 당뇨병을 갖는 환자의 절반 이상에서 시간 경과에 따라 발생하는 통상적인 당뇨병 합병증이다. 신경 전도에 대한 연구는 신경병증이 당뇨병 진단시에 환자의 10 내지 18%에 이미 존재함을 증명하고 있고, 이는 말초 신경 손상이 질환의 초기 단계에서 보다 가벼운 당뇨병 조절곤란과 함께 발생한다는 것을 나타낸다. 신경병증이 당뇨병의 초기 임상 징후라는 개념은 40년 이전에 제시되었으며, 대부분의 연구는 IGT와 신경병증의 관련에 대하여 보고하고 있다. IGT 및 관련 신경병증을 갖는 대부분의 환자는 현저한 신경병증 통증을 갖는 대칭 적인 원위 감각 다발신경병증을 갖는다. IGT 신경병증(문헌[Microvascular complications of impaired glucose tolerance - Perspectives in Diabetes, J. Robinson Singleton, in Diabetes December 1, 2003])은 표현형에서는 초기 당뇨병성 신경병증과 유사한데, 이는 통증을 포함한 감각징후 및 자율신경계 기능이상을 일으킨다. 초기 당뇨병성 신경병증을 갖는 669명의 환자 조사에서, 감각 징후는 60% 보다 많은 환자에게서 존재하였으며, 발기부전은 거의 40%에서 발견되었고, 다른 자율 관련 증상은 33%에서 발견되었으나, 운동 관련 징후의 증거는 단지 12%에서만 발견되었다. 상기 임상 결과는 통증, 온도 및 자율신경계 신호를 운반하는 작은 무수신경섬유의 현저한 초기 관련성을 나타낸다. 피부 생검으로부터 표피내 무수신경섬유의 직접적인 정량은 IGT 및 초기 당뇨병과 관련된 신경병증을 앓는 환자에게서 유사한 섬유소실 및 변경된 형태를 보여준다.
자율신경 기능이상, 특히 발기부전 및 변경된 심장 미주신경 반응은 당뇨병에서 신경병증 손상의 통상적인 초기 특징이다. IGT 환자를 대상으로 한 연구는 일반적인 미주신경 자율신경기능장애를 제시하였으며, 별도 연구는 나이를 일치시킨 정상혈당 대조군 피실험자보다 IGT 환자의 더 많은 분율에서 운동후 비정상적인 심박수 회복, 심호흡까지의 둔화된 R-R 간격 변동성 및 감소된 날숨 대 들숨 비(미주신경 자율신경기능장애의 모든 측정치)를 밝혀냈다.
당뇨병에서의 신경 손상은 운동, 감각 및 자율신경 섬유에 영향을 미친다. 운동 신경병증은 근육 약화, 위축 및 불완전마비를 일으킨다. 감각 신경병증은 통증, 압력 및 열의 보호 감각을 상실시킨다. 통증의 부재는 궤양, 인지되지 않는 외상 및 신경성 관절병증을 비롯하여 무감각 발에서 많은 문제를 일으킨다. 환자는 상처가 진행된 후까지는 치료를 찾지 않을 것이다. 감각 및 운동 기능이상의 결합은 환자가 발에 비정상적인 스트레스를 주어서 외상을 일으킬 수 있으며, 그 결과 감염을 발생시킬 수 있다. 자율신경 교감신경병증은 혈관확장 및 발한감소를 일으켜서, 피부 파괴 뿐만 아니라 미세혈관 유동의 기능 변경을 일으키기 쉬운 따뜻하고 지나치게 건조한 발이 되도록 한다. 자율신경 기능이상(및 진피 조직의 탈신경)은 피부 통합성을 상실시키며, 세균이 침입하기에 이상적인 부위를 제공한다. 신경병증 발은 자발적으로 궤양을 일으키지는 않으며, 오히려 신경병증에 의해 수반되는 몇몇 외상 형태의 조합물이다.
미세혈관 기능이상은 당뇨병 초기에 발병하며, 신경 기능이상의 진행과 함께 진행되고, 당뇨병성 신경병증에서 관찰되는 구조적, 기능적 및 임상적 변화의 중증도를 뒷받침하기에 충분할 수 있다.
진행성 당화 종말 생성물 - 높아진 세포내 당 수준은 단백질과 비효소적 공유결합을 일으키며, 이는 단백질 구조를 변경시키고, 그 기능을 파괴시킨다. 상기 당화 단백질중 일부는 당뇨병성 신경병증 및 그 밖의 장기 당뇨병 합병증의 병리현상에 관련되어 있다.
단백질 키나아제 C(PKC) - PKC가 당뇨병성 신경병증의 병리현상에 관련되어 있다. 증가된 당 수준은 세포내 다이아실글리세롤을 증가시키며, PKC를 활성화시킨다. 동물 모델에서의 PKC 억제제는 신경 혈류를 증가시킴으로써 신경 전도 속도를 증가시킨다.
감각운동 다발신경병증
신경 전도 속도가 신경 길이에 비례하여 느려지기 때문에 보다 긴 신경 섬유는 보다 짧은 신경보다 더 크게 영향을 받는다. 상기 증후군에서, 감각 감소 및 반사 소실은 양측 발가락에서 처음 발생하며, 위로 뻗어간다. 이는 일반적으로 무감각, 감각 소실, 감감 장애 및 야간 통증의 장갑-스타킹 분포라고 기술된다. 상기 통증은 화상, 자통, 동통 또는 둔통처럼 느껴질 수 있다. 핀 및 침 감각이 일반적이다. 고유감각, 즉 팔다리가 공간 어디에 있는지에 대한 감각의 소실이 초기에 영향을 받는다. 상기 환자는 이들이 조각과 같은 이물질을 밟고 있는지, 또는 맞지 않는 신발로 인해 피부 경결을 발생시키고 있다는 사실을 느낄 수 없다. 결과적으로, 이들은 발 및 다리상에 궤양과 감염을 발생시킬 위험이 있으며, 이는 절단으로 이어질 수 있다. 마찬가지로, 상기 환자는 무릎, 발목 또는 발에 다수의 골절을 입을 수 있으며, 신경변성 관절을 발생시킬 수 있다. 운동 기능 상실은 소위 장도리 발가락(hammertoe)이라고 불리우는 발가락의 후방굴곡 구축에서 일어난다. 상기 구축은 발에서 뿐만 아니라 손에서도 일어난다.
자율 신경병증
자율신경계는 심장, GI 관 및 비뇨기계통에서 기능하는 신경으로 구성된다. 자율 신경병증은 임의의 상기 기관계에 영향을 미칠 수 있다. 당뇨병에서 가장 보편적으로 알려진 자율신경 기능이상은 기립성 저혈압 또는 환자가 일어날 때의 불안정한 실신감이다. 당뇨병 자율 신경병증의 경우에는 혈액이 뇌로 지속적으로 완전히 유동하도록 심장 및 동맥이 심박수 및 혈관긴장도를 적절히 조정하지 못함으 로써 비롯된다. 상기 징후는 굴(sinus) 호흡 변화, 즉 일반적으로 정상 호흡에서 발견되는 일반적인 심박수 변화의 상실을 수반한다. 상기 2가지 결과가 존재할 때에 심장의 자율 신경병증이 존재한다.
GI 관 증상은 위 배출지연, 위 마비, 구역, 고장증 및 설사를 포함한다. 많은 당뇨병 환자는 당뇨병에 대한 경구 약을 섭취하기 때문에 상기 약의 흡수는 위 배출지연에 크기 영향을 받는다. 이는 경구 당뇨병 약제가 식사 이전에 섭취될 때와 수 시간 또는 때때로는 수일이 지나도 흡수되지 않을 때, 이미 정상 혈당 또는 저혈당일 때에 고혈당증을 일으킬 수 있다. 소장의 느린 운동은 세균 과증식을 일으킬 수 있으며, 고혈당증의 존재에 의해 악화될 수 있다. 이는 고장증, 가스 및 설사를 일으킨다.
뇨 징후는 빈뇨, 변절박증, 뇨실금 및 뇨정체를 포함한다. 당뇨 정체 때문에 요로 감염이 또한 빈번하다. 뇨정체는 방광 게실, 결석, 역류성 신병증에 이르게 할 수 있다.
뇌 신경병증
뇌 신경이 영향을 받을 때, 눈돌림(제 3) 신경병증이 가장 흔하다. 눈돌림 신경은 외측직근 및 상시근을 제외한 눈을 운동시키는 모든 근육을 조절한다. 이는 또한 동공을 수축시키고 눈꺼풀을 여는 역할을 한다. 당뇨병 제 3 신경 마비의 발병은 일반적으로 갑작스러우며, 이마 또는 눈주위의 통증으로 시작하고, 이어서 복시로 이어진다. 동공 크기 조절을 제외하고 제 3 신경에 의해 신경지배를 받는 눈돌림 근육 전부가 영향을 받을 수 있다. 눈 외측직근의 신경을 지배하는(눈을 외측으로 운동시키는) 외향 신경인 제 6 신경이 또한 통상적으로 영향을 받지만, 제 4 신경인 도르래 신경(눈을 아래로 운동시키는 상시근 신경을 지배한다) 관련은 일반적이지 않다. 가슴 또는 허리 척수신경의 단발신경병증이 일어날 수 있고, 심근경색증, 담낭염 또는 충수염을 모방한 통증 증후군을 일으킬 수 있다. 당뇨병은 손목터널증후군과 같은 포착 신경병증의 높은 발병률을 갖는다.
당뇨병 사지 허혈 및 당뇨병성 족부궤양
당뇨병 및 압력은 미세혈관 순환을 손상시킬 수 있고, 하지 피부에 변화를 일으켜서 결과적으로 궤양을 형성시키고, 이어서 감염을 일으킬 수 있다. 미세혈관 변화는 사지 근육 미세혈관병증을 일으킬 뿐만 아니라 말초 허혈을 발현시키는 소인 및 허혈 현상에 대해 보충적인 혈관형성의 감소를 일으킬 수 있다. 미세혈관 병리현상은 말초혈관질환(PVD)(또는 말초동맥질환(PAD), 또는 죽상동맥경화증으로 인해 다리 동맥을 협착시키는 하지동맥질환(LEAD)-큰혈관 합병증)을 악화시킨다. PVD는 당뇨병 초기에 나타나며, 보다 심각하고 널리 퍼져있으며, 종종 다리, 눈 및 신장에 영향을 미치는 병발성 미세순환 문제점을 포함한다.
족부궤양 및 괴저는 PAD의 빈번한 동반질환 증상이다. 감각부전을 갖는 동시 말초 신경병증은 발이 외상, 궤양 및 감염에 걸리게 한다. 당뇨병에서 PAD의 진행은 말초 신경병증, 및 발과 하지의 통증 및 외상에 대한 무감각과 같은 동반질환에 의해 복합된다. 순환 부전 및 감각 부전과 함께, 궤양 및 감염이 일어난다. 골수염 및 괴저로 진행되면 다리절단이 필요할 수 있다.
당뇨병을 앓는 사람은 당뇨병이 없는 사람보다 25배에 이르기까지 하지 절단 을 경험할 수 있으므로, 족부궤양 및 이후의 하지 소실을 방지해야할 필요성을 강조하게 된다. 당뇨병성 족부궤양은 PAD와 관련하여서 뿐만 아니라 신경병증, 정맥 부전증(정맥류), 외상 및 감염과 관련하여서도 발생할 수 있다. PAD는 족부궤양을 발생시키거나 촉진시키는데 있어서 다른 증상에 기여한다. 족부궤양은 적절한 임상적인 말초 동맥 관류의 존재하에서 발생할 수 있기 때문에 반드시 PAD의 진행을 대표하는 것은 아니다. 환자를 대상으로 한 연구는 말초 신경병증 및 높은 발바닥 발압력을 갖는 당뇨병 환자의 경우 족부궤양의 위험이 증가함을 보여준다. 발 또는 발목상의 궤양 또는 욕창 병력의 유병율은 남부 위스콘신주의 모집단 연구에서 모든 당뇨병 환자의 15%이었다. 유병율은 30세 미만의 연령에서 진단받은 당뇨병 개체의 경우에 보다 높았으며, 여자(13%)에서보다 남자(16%)에서 약간 더 높았고, 인슐린을 투여받지 않은 환자(10%)에서보다 인슐린-치료받는 당뇨병 환자(17%)에서 보다 컸다. 유병율은 특히 30세 미만의 연령에서 진단받은 당뇨병 환자의 경우에 연령에 따라 증가하였다. 유럽에서의 환자 연구에서 당뇨병 환자에서의 족부궤양의 유병율은 50세 미만의 연령에서 3%, 60세 미만의 연령에서 7% 및 80세 미만의 연령에서 14%이었다. 유병율은 70세 연령에서 여성보다 남성의 경우에 보다 컸다.
당뇨병 환자에서 발 허혈 및 감염은 심각하며, 심지어는 생명을 위협하는 현상이다; 그러나, 신경병증은 치료하기가 가장 어려운 증상이다. 당뇨병 발의 임상적 및 병리학적 증후의 모든 측면과 관련한 의학적 및 외과적 문헌이 방대하게 있다. 다양한 중증도의 신경병증, 혈관병증, 망막병증 및 신장병증이 단독으로 또는 조합하여 당뇨병 발의 치료에 영향을 미칠 수 있다.
매년 82,000건의 사지 절단이 당뇨병을 갖는 환자를 대상으로 실시된다. 상기 절단의 대부분은 노년 인구에서 실시된다. 당뇨병으로 인한 절단은 족부궤양, 허혈, 정맥 다리 궤양(즉, 정맥 역류에 이차적인 것) 및 뒤꿈치 궤양(즉, 뒤꿈치에서 치료받지 않은 압력 궤양으로부터 발생한 것)을 비롯한 다수의 병인으로부터 발생할 수 있다. 상기 절단의 대부분은 궤양으로부터 비롯된다. 당뇨병을 앓는 환자중 족부궤양의 유병율은 12%이다. 또한, 1유형 당뇨병을 갖는 환자중 하지 궤양의 20년 누적 발병율은 9.9%이다. 당뇨병-유도된 사지 절단은 39% 내지 68%의 5년 사망율에 이르게 하며, 추가 절단 위험의 증가와 관련되어 있다. 입원기간은 궤양이 없는 환자에 비해 당뇨병성 족부궤양을 갖는 환자의 경우 약 60% 정도 더 길다.
당뇨병성 신경병증은 건강한 C-섬유 통각수용기 기능에 의존하는 신경 축삭 반사를 부전시키고, 통증 자극에 대하여 국소적인 혈관확장을 일으킨다. 상기 증상은 또한 당뇨병성 신경병증 발에서 손상 또는 염증과 같은 스트레스 증상에 존재하는 혈관확장 반응을 손상시킨다. 상기 부전은 성공적인 하지 혈관재형성에도 불구하고 당뇨병성 신경병증 발의 일부 궤양이 느리게 치료되거나 전혀 치료되지 않는 이유를 부분적으로 설명할 수 있다.
따라서, 당뇨병성 족부궤양에 이르는 가장 보편적인 인과 경로는 신경병증(감각 상실), 변형(예컨대, 돌출된 발허리 머리) 및 외상(예컨대, 잘 맞지않는 신발)의 결합으로 확인될 수 있다.
대부분의 의사는 보다 근위 절차에 비해 낮은 사지 구제율 및 효능 때문에 오금 또는 정강 동맥 우회술을 실시하는 것을 선호한다. 오금 또는 정강 동맥 우 회술이 촉지성 발 맥박을 복원할 수 없는 경우에, 발 우회술은 당뇨병 및 허혈성 발 상처를 갖는 환자에게 보다 오래가고 효과적인 사지-구제 절차를 제공하는 것으로 보고되어 있다. 당뇨병을 앓는 환자의 광범위한 다분절 폐색 질환은 발 구제에 장애가 되지 않는다. 중증의 상처 합병증이 심각한 결과를 가져올 수 있으나, 상기 합병증은 발 회로 이식술 이후에는 보편적이지 않다. 기존의 발 감염의 적절한 조절 및 조심스러운 이식 터널링은 추가적인 합병증을 피하는데 효과적인 것으로 보인다. 하지 혈관성형술이 점차 점진적으로 이용되고 있다. 그러나, 혈관성형술이 효과적이기 위해서는 보다 근위 혈관성형술이 성공적인 경우에 원위 혈관 또는 영양 혈관이 개방되어야 함이 강조되어야 한다.
당뇨병 궤양/사지 병리현상이 일부 환자에서는 관리되고 있으나(죽은조직제거술, 항생제 처리, 육아조직(새로운 콜라겐 및 혈관형성)을 자극하는 제제의 사용, 및 상처내의 세균무리의 감소), 상기 증상을 보다 잘 치료할 수 있고/거나 징후를 경감시킬 수 있는 약학 조성물을 갖는 것이 유익할 것이다.
추가적인 정보에 대하여는 문헌[American Journal of Surgery, Volume 187, Number 5 Suppl 1, May 1, 2004, Copyright c 2004 Elsevier]을 참고한다.
당뇨병에서의 관상 미세혈관 기능이상
당뇨병에서 조직병리현상 및 미세순환 기능이상간의 상관관계가 기저막 비후, 혈관주위 섬유증, 혈관 희박화 및 모세관 출혈이 빈번하게 발견되어지는 기존의 실험 연구 및 생검으로부터 충분히 알려져 있다. 상기 데이터를 생체내에서 확인하는 것이 어렵지만, 최근 논문은 병리현상 및 눈 미세혈관 기능이상간의 상관 관계를 증명하였다(문헌[Am J Physiol 2003; 285] 참고). 그러나, 많은 임상 연구는 현성 당뇨병 뿐만 아니라 대사조절 부전도 관상 미세혈관에 영향을 미칠 수 있음을 지적하였다(문헌[Hypert Res 2002; 25:893]). 베르너(Werner)는 경색 관련 동맥의 성공적인 재개방 이후에 환자의 미세혈관 기능이상이 지속됨을 보여주는 중요한 문헌[Sambuceti 등, Circulation 2001; 104:1129]을 언급하였는데, 이는 상기 환자에 있어서 증가된 심혈관 동반질환 및 사망율을 설명할 수 있다. 동반질환 및 사망율이 경색 관련 동맥의 재개방 그 자체와는 관련이 없으며, TIMI 유동 +/- 심근 홍조에 보다 많이 좌우된다는 큰 급성 재관류 연구로부터의 표본 증거가 존재한다(문헌[Stone 2002; Feldmann Circulation 2003] 참고). 헤르만(Herrmann)은 특히 관상 미세순환의 통합성이 아마도 이와 관련하여 가장 중요한 임상 및 예후 인자일 것이라고 지적하였다(문헌[Circulation 2001] 참고). 보호 장치의 중화 효과(TIMI 유동, ST 분해능 또는 MACE에 대하여 관련 변화 없음)는 미세순환의 기능 부전이 예후의 중요한 결정인자임을 나타낼 수 있다. 또한, 관상 미세혈관 기능이상이 비폐쇄성 CAD에서 주요한 역할을 한다는 증거가 증가하고 있다. 관상 내피세포 기능이상은 상기 환자의 강력한 예후 예측자로 남는다.
당뇨병 신장병증 (당뇨병을 앓는 환자의 신장 기능이상)
당뇨병 신장병증은 미세알부민뇨(미세혈관 질환 결과), 단백뇨 및 ESRD를 포함한다. 당뇨병은 새로운 사례의 40%를 넘게 차지하는 가장 보편적인 신부전 원인이다. 약물 및 식이요법이 당뇨병을 조절할 수 있는 경우에도, 상기 질환은 신장병증 및 신부전에 이르게 할 수 있다. 당뇨병을 앓는 대부분의 사람은 신부전을 일으킬 정도로 중증인 신장병증을 발현시키지는 않는다. 미합중국에서 약 1천 6백만명의 사람이 당뇨병을 앓고 있지만, 약 십만명의 사람이 당뇨병의 결과로서 신부전을 앓는다.
당뇨병성 망막병증
당뇨병 상태에서, 고혈당증은 망막 혈류 감소, 망막 과투과성, 광수용체 신경 전도의 지연 및 망막 신경세포사에 이르게 한다. 보다 짧게 지속된 당뇨병에서, 신경세포사는 망막의 내핵층에서 확인되어 왔다. 구체적으로, 세포자멸은 뮐러세포 및 성상세포와 같은 신경아교세포에 편재되어 있으며, STZ-유도된 당뇨병 래트 모델에서 당뇨병 1달 이내에 발생하는 것으로 나타났다. 상기 현상의 원인은 다이아실글리세롤/PKC 경로의 활성화, 산화성 스트레스 및 비효소적 당화를 비롯한 다인성이다. 상기 현상의 조합은 망막을 저산소 상태로 만들어서, 결국에는 당뇨병성 망막병증의 발현에 이르게 한다. 망막 허혈 및 당뇨병성 망막의 초기 변화간의 하나의 가능한 연결관계는 VEGF와 같은 성장 인자의 저산소증-유도된 생성이다. 저산소증 반응의 지배 조절자는 세포 증식 및 혈관형성을 조절하는 유전자를 통제하는 저산소증 유도성 인자-1(HIF-1)로 확인된다. 선행 연구는 HIF-1 유비퀴틴화의 억제가 저산소증 반응성 요소(HRE)와 결합하게 하고, VEGF mRNA를 생성시킴을 증명하였다.
당뇨병성 망막병증은 만성 고혈당증에 의한 망막 혈관계의 진행성 기능이상으로 정의된다. 당뇨병성 망막병증의 주된 특징은 미세동맥류, 망막 출혈, 망막 지질 삼출물, 면화반, 모세관 비관류, 황반 부종 및 혈관 신생을 포함한다. 관련 된 특징은 유리체 출혈, 망막 박리, 신생혈관 녹내장, 미숙아 백내장 및 뇌신경 마비를 포함한다.
미국에서 1천 6백만명의 사람이 1유형 및 2유형 당뇨병을 앓고 있다. 1유형 환자의 80%가 15년 이내에 당뇨병성 망막병증을 발현시키는 반면, 2유형 당뇨병 환자의 84%가 19년 이내에 망막병증을 발현시킨다. 상기 숫자는 신생혈관계의 눈 질환을 목표로 하는 치료제의 중요한 시장을 구성한다. 당뇨병성 망막병증의 발현은 시간 의존적이다. 최적의 혈당 조절에도 불구하고, 장기간 지속되는 질환을 앓는 환자는 결국에는 일정 형태의 망막병증을 발현시킬 것으로 예상할 수 있다. 미국 국립실명예방협회(The National Society to Prevent Blindness)는 미합중국에서 4백만명 내지 6백만명의 당뇨병 환자가 당뇨병성 망막병증을 앓는 것으로 추정하였다. 증식성 당뇨병성 망막병증 및 당뇨병 황반부종의 새로운 사례의 매년 발병 추정치는 각각 65,000건 및 75,000건이고, 각각 700,000 및 500,000의 유병율을 갖는다. 당뇨병성 망막병증은 미합중국에서 매년 12,000건 내지 24,000건의 새로운 실명 사례를 발생시킨다. 망막병증은 심한 시력 상실을 감소시키는데 효과적인 외과적 방법으로 치료되지만, 망막의 레이저처리 부분은 비가역적으로 파괴된다. 이용할 수 있는 약물 치료제가 존재하지 않는다.
모세관, 당뇨병에 주로 영향을 미치는 미세혈관 질환은 결막, 망막 및 중추신경계의 혈관계를 파괴시킴으로써 눈에 영향을 미친다. 환자는 정상보다 큰 식욕(다식증)에도 불구하고 발생하는 체중 감소, 비정상적인 갈증(다음증) 및 비정상적인 빈뇨(다뇨증)의 전신 징후와 함께 장기간 주사되는 안구 결막 병력을 가질 수 있다.
불안정한 혈당에 부수되는 변동성 시력은 통상적인 눈 징후이다. 수정체내의 팽윤은 갑작스러운 커다란 굴절 이동 뿐만 아니라 미숙아 백내장 형성을 발생시킨다. 시력 변화는 질환의 중증도 및 단계에 좌우된다.
망막에서 세동맥 및 모세관의 약화는 망막내 점적 출혈, 삼출물, 망막내 미세혈관 이상(IRMA) 동맥류, 부종 및 면화 경색증의 특징적인 외관을 발생시킬 수 있다. 증식성 당뇨병성 망막병증은 중증 혈관 손상의 결과이며, 시신경유두혈관신생(NVD), 상세불명 혈관신생(NVE) 및 홍채혈관신생(NVI, 홍채혈관신생)으로 알 수 있다. 신경계 합병증은 제3, 제4 및 제6 뇌신경의 마비 뿐만 아니라 당뇨병 유두염 및 안경신경마비를 포함한다.
당뇨병은 포도당 불내성을 공유하는 유전적으로 영향받는 질환 군이다. 이는 인슐린의 결핍 또는 기능장애, 또는 세포의 인슐린 수용체의 결핍 또는 기능장애의 결과로 인한 대사조절 장애를 특징으로 한다.
솔비톨 형성을 포함하는 생화학은 혈관 내피를 지지하는 세포인 주위 세포의 파괴에서 일정한 역할을 한다. 지지성 주위세포가 소멸함에 따라 모세관 내피는 손상되며, 혈액, 단백질 및 지질의 혈관 노출을 일으킨다. 이는 비후된 당-적재 혈액과 함께, 혈관부족, 모세관 비관류, 망막 저산소증, 변경된 구조 및 감소된 기능을 발생시킨다. 망막 혈관신생에서 일정한 역할을 하는 혈관증식 인자의 형성 및 방출은 잘 이해되어지지 않고 있다.
당뇨병의 대부분의 실명 위험 후유증은 의학적 관리후 수 주 내지 수 개월동 안에 자발적으로 해결된다. 큰 굴절 변화가 있는 경우에 환자는 굴절이 안정하게 될 때까지 일시적인 안경 처방을 필요로 할 수 있다. 망막병증이 황반을 위협하거나 신생 혈관이 증식할 때, 환자는 레이저 광응고를 처방받을 수 있다. 당뇨병성 신경병증 연구소(DRS)는 범망막 광응고가 위험요인이 높은 환자의 중증 실명 위험을 감소시키는데 성공적이었음을 결정적으로 증명하였다. 이는 위험 요인이 높은 특징을 (1) 시신경유두직경의 1/4 내지 1/3 크기의 시신경유두의 혈관신생(NVD) 및 (2) 임의의 유리체 출혈을 갖는 상세불명 혈관신생(NVE)으로 정의하였다.
당뇨병 황반 부종( DME )
DME는 망막 혈관에 영향을 미치는 질환인 당뇨병성 망막병증의 합병증이다. 당뇨병성 망막병증은 망막 비후 및 부종, 출혈, 저항 혈류, 혈관으로부터의 과도한 유체 누출, 및 최종 단계에서의 비정상적인 혈관 증식을 비롯하여 다수의 망막 이상을 일으킨다. 상기 혈관 증식은 많은 출혈 및 중증 망막 손상을 일으킬 수 있다. 당뇨병성 망막병증의 혈관 누출이 황반에서 팽윤을 일으킬 때, 이를 DME라고 부른다. DME의 주된 징후는 중심시력의 상실이다. DME와 관련된 위험 인자는 불충분하게 조절되는 혈당 수준, 고혈압, 유체 정체를 일으키는 이상 신장 기능, 고 콜레스테롤 수준 및 다른 일반적인 전신 요인을 포함한다.
세계보건기구(the World Health Organization)에 따르면, 당뇨병성 망막병증은 근로연령 성인의 주된 실명 원인이며, 당뇨병에서 주된 시력 상실 원인이다. 미국당뇨병협회(The American Diabetes Association)는 미합중국에 약 1천 8백만명의 당뇨병 환자가 있으며, 미합중국에 매년 당뇨병으로 진단받는 새로운 사례가 1 백 3십만건이 있다고 보고하고 있다. 미국실명예방협회 및 국립눈기관(the National Eye Institute)은 미합중국에 DME를 갖는 약 5십만명을 포함하여 당뇨병성 망막병증을 갖는 18세 이상의 사람이 5백 3십만명이 넘게 있다고 추정하고 있다. CDC는 미합중국에 매년 약 75,000건의 새로운 DME 사례가 있다고 추정하고 있다.
추가적인 신경병증
당뇨병 이외에, 신경병증의 보편적인 원인은 대상포진감염, 만성 또는 급성 외상(수술 포함) 및 다양한 신경독이다. 신경병증성 통증은 말초신경상의 암의 직접적인 결과(예컨대, 종양에 의한 압박)로서 및 많은 화학요법 약물의 부작용으로서 암에 있어서 보편적이다.
미세혈관 질환 - 혈관 및 신경 질환은 밀접하게 관련되어 있으며 얽혀있다. 혈관은 정상적인 신경 기능에 의존하고, 신경은 적절한 혈류에 의존한다. 미세혈관계내의 첫 번째 병적 변화는 혈관수축이다. 질환이 진행됨에 따라, 신경 기능장애는 산소분압 감소 및 저산소증을 일으키는 모세관 기저막 비대 및 내피세포 과다형성과 같은 혈관 이상 발현과 밀접하게 관련되어 있다. 혈관확장제(예컨대, 안지오텐신-전환-효소 억제제, α1-길항제)는 신경 혈류를 실질적으로 증가시킬 수 있고, 신경전도속도를 상응하게 증가시킬 수 있다.
임상 증상
신경병증은 모든 말초신경: 통증 섬유, 운동 뉴론, 자율 신경에 영향을 미친다. 따라서, 모든 기관과 계통이 신경 지배를 받기 때문에 이들 모두에 영향을 미 칠 수 있다. 영향을 받은 기관계 및 구성요소를 기준으로 여러 명확한 증후군이 있으나, 이들은 전혀 배타적이지 않다. 환자는 감각운동 및 자율 신경병증, 또는 임의의 다른 조합을 가질 수 있다.
신경병증의 대사원인 이해에 진전이 있었음에도 불구하고, 상기 병리현상 과정의 중단을 목적으로 하는 치료는 부작용 및 효능 부족으로 인해 제한되어 왔다. 따라서, 치료는 대증적이고, 근원적인 문제점을 해결하지 못한다. 감각운동 신경병증에 의해 발생하는 통증의 약제는 삼환계 항우울제(TCA), 세로토닌 재흡수 억제제(SSRI) 및 항경련제(AED)를 포함한다. 상기 약제는 모두 당뇨병성 신경병증으로 이끄는 병리학적 과정을 역전시키지 않으며, 어떠한 것도 병의 잔인한 경로를 변경시키지 않는다. 따라서, 상기 증상을 보다 잘 치료할 수 있고/거나 징후를 경감시킬 수 있는 약학 조성물을 갖는 것이 유용할 것이다.
추가적인 망막병증
망막 미세혈관병증( AIDS 망막병증 )
망막 미세혈관병증은 AIDS 환자의 100%에서 발견된다. 이는 망막내 출혈, 미세동맥류, 로트 반점, 면화반(신경섬유층의 미세경색) 및 혈관주위초 형성을 특징으로 한다. 망막병증의 병인은 알려지지 않았으나, 순환 면역복합체, 세포독성 물질의 국소적 방출, 이상 혈류현상 및 내피세포의 HIV 감염에 기인한 것으로 생각되어 왔다. AIDS 망막병증은 최근 보편적이어서, 당뇨병 또는 고혈압을 갖지 않지만 HIV 위험이 있는 환자의 면화반은 의사가 바이러스 검사를 고려하도록 촉구한다. AIDS 망막병증에 대한 구체적인 치료는 없으나, 그의 지속적인 존재는 의사가 HIV 요법의 효능 및 환자의 순응도를 재검사하도록 촉구할 수 있다.
골수이식( BMT ) 망막병증
골수이식 망막병증은 1983년에 처음으로 보고되었다. 이는 BMT 이후에 6개월 이내에 전형적으로 발생하지만, 62개월 이후에 발생할 수도 있다. 당뇨병 및 고혈압과 같은 위험인자는 허혈성 미세혈관병증을 증가시킴으로써 BMT 망막병증의 발현을 촉진시킬 수 있다. BMT 망막병증의 발현에 있어서 알려진 나이, 성별 또는 인종에 대한 편중은 없다. 환자는 시력 감퇴 및/또는 시야 결손을 갖는다. 안구뒷부분의 소견은 전형적으로 양쪽성이고 대칭적이다. 임상 증상은 다수의 면화반, 모세혈관확장, 미세동맥류, 황반부종, 경성 삼출물 및 망막 출혈을 포함한다. 형광물질 혈관조영술은 모세관 비관류 및 소실, 망막내 미세혈관 이상, 미세동맥류 및 황반부종을 증명한다. BMT 망막병증의 정확한 병인이 밝혀지지 않았으나, 여러 요인: 시클로스포린 독성, 전신방사선조사(TBI) 및 화학요법 치료제에 의해 영향을 받는 것으로 보인다. 시클로스포린은 이식편-대-숙주 면역 반응을 억제하는 강력한 면역조절제이다. 이는 내피 세포 손상 및 신경학적 부작용으로 이끌 수 있으며, 그 결과 BMT 망막병증의 원인으로 제시되어 왔다. 그러나, BMT 망막병증은 시클로스포린을 사용하지 않는 경우에도 발현할 수 있으며, 시클로스포린은 자가 또는 유전적동계 골수 수용자에서는 BMT 망막병증을 일으키는 것으로 나타나지 않았다. 따라서, 시클로스포린은 BMT 망막병증의 유일한 원인은 아닌 것으로 보인다. 전신방사선조사(TBI)가 또한 BMT 망막병증의 원인으로 포함되어 왔다. 방사선은 망막 미세혈관계를 손상시키고, 허혈성 혈관병증으로 이끈다. 전체 방사성 투여량 및 방사선과 골수 제거간 시간 간격과 같은 변수가 중요한 것으로 보인다. 그러나, BMT 망막병증은 TBI를 받지 않은 환자에게서 발생할 수 있으며, BMT 망막병증은 유사한 투여량의 방사선을 받은 고체 기관 이식 수용자에서는 관찰되지 않는다. 따라서, TBI는 유일한 원인은 아니지만, BMT 망막병증의 발현에서 또 다른 기여 인자가 된다. 화학요법 치료제는 BMT 망막병증에서 잠재적인 기여 인자로서 제시되어 왔다. 시스플라틴, 카무스틴 및 시클로포스파미드와 같은 약물은 시신경유두부종, 시신경염, 시야결손 및 피질실명을 비롯한 눈 부작용을 일으킬 수 있다. 상기 화학요법 약물로 인해 환자가 방사선-유도된 망막손상에 걸리기 쉬울 수 있으며, 방사선의 해로운 효과가 증가될 수 있는 것으로 제시되어 왔다. 일반적으로, BMT 망막병증을 갖는 환자는 좋은 예후를 갖는다. 망막병증은 일반적으로 시클로스포린 투약을 중지하거나 감소시킨 후 2달 내지 4달 이내에 해소된다. 한 보고서에서, 환자의 69%가 망막소견의 완전한 치료를 경험하였으며, 환자의 46%가 이들의 기저 시력을 완전히 회복하였다. BMT 망막병증의 유리한 예후 및 비교적 비진행성 특징으로 인해 일반적으로 공격적인 개입이 필요하지 않다.
허혈 증상
허혈은 2개 범주로 나누어질 수 있는데, 첫 번째는 당뇨병을 앓는 환자의 대퇴, 오금 및 후경골 동맥에서 통상적으로 발생하는 가속 죽상동맥경화증을 포함한다. 직경이 종종 단지 1 내지 2㎝인 상기 혈관은 혈류를 심하게 감소시키는 죽상경화판을 발현시킬 수 있다. 큰 혈관이 완전히 폐색된 후에, 뇌졸중, 심근경색, 허혈 및 치료되지 않은 당뇨병성 족부궤양이 발생할 수 있다. 상기 허혈 형태는 본질적으로 큰 혈관 질환이다.
뇌졸중후 치매
사람의 25%가 뇌졸중 이후에 치매를 가지며, 많은 다른 사람들은 이후 5 내지 10년에 걸쳐 치매를 발현한다. 또한, 많은 사람들은 고급 뇌기능(예컨대, 기획 능력 및 정보처리속도)의 보다 미세한 부전을 경험하며, 이후에 발현하는 치매에 걸릴 위험 요인이 매우 높아진다. 이 과정에서 뇌 심부내의 극소 뇌졸중(미세혈관 질환이라 함)은 뇌졸중후 치매에 특이적인 뇌 위축의 알려진 패턴에 이르게 하는 과정에서 필수적인 것으로 보인다.
눈 허혈 증후군
눈 허혈 증후군(OIS)을 겪는 환자는 일반적으로 50대 내지 80대의 노령이다. 남자가 여자에 비해 흔히 2배정도 걸리기 쉽다. 환자는 단지 드물게만 증상이 없다. 90% 사례에서 발병시에 시력 감퇴가 발생하며, 환자의 40%는 부수적인 눈 통증을 갖는다. 또한, 일시적인 허혈성 발작 또는 일과성 흑암시의 부수적인 또는 선행 병력이 있을 수 있다. 환자는 또한 발병시에 상당히 공지된 또는 미지의 전신 질환을 갖는다. 가장 보편적으로 걸리는 전신 질환은 고혈압, 당뇨병, 허혈성 심장 질환, 뇌졸중 및 말초혈관질환이다. 최소한의 정도로 환자는 거세포 동맥염(GCA)의 결과로서 OIS를 나타낸다.
편측 소견은 80% 사례에서 존재한다. 통상적인 소견은 진행 편측 백내장, 전방구역 염증, 무증상 전방 반응, 황반부종, 비사행성 확장 망막정맥, 중간-말초 점적 출혈, 면화반, 삼출물, 및 시신경유두 및 망막의 혈관신생을 포함할 수 있다. 또한, 자발적 동맥 박동, 안압상승, 및 혈관신생 녹내장(NVG)을 갖는 홍채 및 전방각의 혈관신생을 포함할 수 있다. 환자는 전방구역 혈관신생을 나타낼 수 있는 반면, 눈 저안압은 섬모체까지의 낮은 동맥 관류 때문에 일어날 수 있다. 때때로, 육안으로 보이는 망막색전증(홀렌호르스트 플라크)이 있다.
OIS에서의 소견은 내경동맥 분류성 궤양 및 통상적인 경동맥 분기 협착에 의해 일어난다. 내동맥 협착을 갖는 환자의 5%는 OIS를 발현시킨다. 그러나, OIS는 협착 정도가 90%를 넘는 경우에만 일어난다. 경동맥 협착은 눈에 대한 관류압을 낮추어서, 전술한 허혈 현상을 발생시킨다. 협착이 90%에 이르면, 중심망막동맥(CRA)내의 관류압은 단지 50%로 떨어진다. 종종, 감소된 동맥압은 CRA의 자발적인 박동으로 표현된다. 상기 소견은 변할 수 있고, 상기 소견중 임의의 것 또는 전부를 포함할 수 있다.
*OIS를 앓는 환자는 평가되어야 하는 상당한 전신 질환을 갖는다. 심장사는 OIS를 갖는 환자의 주된 사망 원인이다. 5년 사망률이 40%이다. 이러한 이유로 인해, OIS를 앓는 환자는 완전 혈청학, EKG, ECG 및 경동맥 평가에 대하여 심장전문의의 의견을 참조하여야 한다.
신장의 미세혈관 질환
신장은 전신 및 신장 미세혈관계에 영향을 미치는 수많은 조심스러운 임상병리학적 증상에 포함된다. 상기 증상중 일부는 하기와 같이 내피세포에 대한 일차 손상을 특징으로 한다.
· 용혈- 요독 증후군( HUS ) 및 혈전성 혈소판 감소성 자반증( TTP )
HUS와 TTP는 미세혈관병성 용혈성 빈혈 및 가변성 기관 부전을 특징으로 하는 밀접하게 관련된 질환이다. 전통적으로, 어린이에게서 통상적인 것처럼 신부전이 증후군의 주된 특징일 때 HUS 진단이 내려진다. 성인의 경우, 신경학적 부전이 종종 주를 이루며, 이 증후군을 TTP라고 부른다. 혈전성 미세혈관병증은 상기 두가지 증후군의 근원적인 병적 병변이며, HUS 또는 TTP를 앓는 환자에서의 임상적 및 실험실적 소견은 크게 중복된다. 이로 인해 여러 연구자들은 2개 증후군을 단일한 질환 단위의 연속체로 간주하게 되었다. 발병기전: 실험 데이터는 내피세포 손상이 HUS/TTP의 발병기전에서의 주된 현상임을 강력하게 시사한다. 내피 손상은 국소적인 혈관내 응혈, 피브린 침착, 및 혈소판 활성화 및 응집을 포함하는 연쇄 현상을 일으킨다. 최종 결과는 HUS/TTP 증후군의 상이한 형태에 공통된 혈전성 미세혈관병증의 조직병리학적 소견이다. HUS/TTP가 치료되지 않은채로 방치되는 경우, 사망율은 90%에 근접한다. 투석, 항고혈압 약물, 수혈 및 신경계 합병증 관리를 포함한 지지 요법이 HUS/TTP를 앓는 환자의 생존율 증가에 도움을 준다. 적절한 유체 균형 및 배변 휴식이 설사와 관련된 전형적인 HUS를 치료하는데 중요하다.
· 방사선 신염
2500라드(rad) 과량의 방사선을 신장에 장기 조사한 결과는 하기의 5개 임상적 증후군으로 나누어질 수 있다.
(i) 급성 방사선 신염은 6 내지 13개월의 잠복기 이후에 환자의 약 40%에서 발생한다. 이는 고혈압, 단백뇨, 부종, 및 대부분의 경우 말기 신장에 이르게 하 는 진행성 신부전의 갑작스러운 발병을 임상 특징으로 한다.
(ii) 이와 반대로, 만성 방사선 신염은 초기 손상 이후에 18개월 내지 14년에서 변하는 다양한 잠복기를 갖는다. 이는 발병시에는 잠행성이며, 고혈압, 단백뇨 및 점차적인 신장 기능 상실을 특징으로 한다.
(iii) 제 3 증후군은 방사선 노출한지 5 내지 19년후에 정상적인 신장 기능을 갖는 양성 단백뇨로서 표현된다.
(iv) 환자의 제 4 군은 2 내지 5년후에 양성 고혈압만을 나타내며, 가변성 단백뇨를 가질 수 있다. 후기 악성 고혈압은 만성 방사선 신염 또는 양성 고혈압과 함께 방사선 조사한지 18개월 내지 11년 후에 환자에게서 발생한다. 영향을 받은 신장의 제거는 고혈압을 역전시킨다. 후속적으로 신혈관 고혈압을 갖는 신동맥에 대한 방사선-유도된 손상이 보고되어 있다.
(v) 급성 방사성 신염에 유사한 신부전 증후군이 전신방사선조사(TBI)에 의해 치료받은 골수이식(BMT) 환자에게서 관찰되었다.
방사선 조사는 내피 기능이상을 일으키지만 초기 방사선조사후 단계에서 혈관 평활근 세포를 제공하는 것으로 보고되었다. 방사선은 직접적으로 DNA를 손상시킬 수 있으며, 상기 세포 재생을 감소시키고, 사구체 모세혈관 및 세관에서 기저막을 노출시킨다. 상기 초기 발병이 최종적으로 사구체 경화증, 세관 위축 및 사이질 섬유증에 어떻게 이르는지는 불분명하다. 내피세포층의 변성이 모세관 및 보다 작은 세동맥에서 혈관내 혈전증을 발생시킬 수 있는 것으로 추측된다. 이어서, 상기 신장내 혈관병증이 방사선 신염을 특징으로 하는 진행성 신장 섬유증 및 고혈 압을 설명한다. 방사선이 조사된 마우스 신장에 대한 최근 연구는 신장 피질내의 백혈구가 투약량-의존적으로 증가함을 보여주었으며, 이는 방사선-유도된 신염의 염증 과정에서의 일정한 역할을 시사하는 것이다.
다른 신장 질환에서, 신장의 미세혈관계는 전신경화증(경피증)과 같은 자가면역 장애에 관련된다. 전신 경화증에서의 신장 관련은 서서히 진행하는 만성 신장 질환, 또는 악성 고혈압 및 급성 질소혈증을 특징으로 경피 신발증(SRC)으로 표현된다. SRC는 신장에서 레이노-유사 현상에 의해 발생하는 것으로 추측된다. 중증 혈관경축은 피질 허혈에 이르게 하고, 레닌 및 안지오텐신 II의 생성을 증가시키며, 이는 그 결과 신장 혈관수축을 영속시킨다. 호르몬 변화(임신), 신체적 및 정서적 스트레스, 또는 저온은 레이노-유사 대동맥 혈관경축을 일으킬 수 있다. 신장 허혈을 영속시키는데 있어서 레닌-안지오텐신 시스템의 역할은 SCR을 치료하는데 있어서 ACE 억제제의 유의한 효과에 의해 강조된다. 항고혈압 치료에도 불구하고 중증 신장 부전으로 진행되는 SRC을 앓는 환자에 있어서 투석이 필요하게 된다. 복막투석 및 혈액투석 둘다가 이용되어 왔다. 1983년 내지 1985년 사이에 투석받은 전신 경화증-유도된 ESRD를 앓는 311명 환자에 대한 말기 신장질환(ESRD) 네트워크 보고서는 33%의 3년 생존율을 보고하였다.
신장 미세순환은 또한, 직혈관을 따르는 산소의 역류전달의 결과로서 신수질의 심부혈관에서 얻어지는 낮은 산소 분압 때문에 특히 걸리기 쉬운 낫적혈구 질환에서 영향을 받을 수도 있다. 보다 작은 신장 동맥 및 세동맥이 또한 큰 혈관벽으로부터 제거된 콜레스테롤-함유 물질로부터의 혈전색전성 손상 부위에 있을 수도 있다.
군으로 분류될 때, 신장 미세혈관계의 일시적 또는 영구적 폐쇄를 일으키는 질환은 사구체 관류의 파괴를 일으키고, 그 결과 사구체 여과 속도를 파괴시켜서 전신 항상성에 대한 심각한 위협이 될 수 있다.
급성 신부전( ARF )
ARF는 미세혈관 또는 큰혈관 질환(주요 신장 동맥의 폐색 또는 중증의 복부동맥질환)에 의해 발생할 수 있다. 전통적인 미세혈관 질환은 사구체 모세관 혈전증 또는 폐색 때문에 발생하는 미세혈관병증 용혈 및 급성 신부전을 종종 가지며, 종종 저혈소판증을 수반한다. 상기 질환의 전형적인 예는 다음을 포함한다.
a) 혈전성 혈소판 감소성 자반증 - 혈전성 혈소판 감소성 자반증의 전통적인 5개 증상은 열, 신경계 변화, 신부전, 미세혈관병증성 용혈 빈혈 및 혈소판 감소증을 포함한다.
b) 용혈 요독 증후군 - 용혈 요독 증후군은 혈전성 혈소판 감소성 자반증과 유사하지만 신경계 변화를 갖지 않는다.
c) HELLP 증후군(용혈, 상승된 간 효소 및 적은 혈소판) - HELLP는 아미노전이효소 상승제를 추가한 임신부에게서 발생하는 용혈 요독 증후군의 한 유형이다.
급성 신부전은 모든 의료 환경에서 존재할 수 있으나, 주로 병원에서 얻어진다. 상기 증상은 입원 환자의 5%에서 발현되며, 입원 환자의 약 0.5%는 투석을 필요로 한다. 지난 40년동안 급성 신부전의 생존률은 증가하지 않았는데, 주로 병에 걸린 환자가 최근에 더욱 고령이 되고 보다 많은 동반질환 조건을 갖기 때문이다. 감염은 급성 신부전을 갖는 환자 사망의 75%에 이르며, 심장-호흡 합병증은 두 번째로 가장 흔한 사망 원인이다. 신부전의 중증도에 따라, 사망율은 7% 내지 80% 범위일 수 있다. 급성 신부전은 3개의 범주: 전신성, 내생적 및 신후성 ARF로 나뉘어질 수 있다. 내생적 ARF는 4개의 범주: 관형 질환, 사구체 질환, 혈관 질환(미세혈관을 포함) 및 창자 질환으로 세부 분류될 수 있다.
진행성 신장 질환
진행성 신장 질환은 미세혈관계의 진행성 상실을 특징으로 한다는 증거가 있다. 미세혈관계의 상실은 사구체 및 세뇨관간질성 흉터형성의 발현과 직접적인 상관관계를 갖는다. 상기 메카니즘은 부분적으로는 내피 증식 반응 감소에 의해 매개되고, 이러한 모세관 복구 부전은 신장내의 혈관형성(혈관 내피 성장 인자) 및 항혈관형성(트롬보스폰딘 1) 인자 둘다의 국소 발현의 변경에 의해 매개된다. 혈관형성 성장 인자 균형의 변경은 포식세포-관련 시토카인(인터루킨-1β) 및 혈관활성 매개체 둘다에 의해 매개된다. 최종적으로, 혈관형성의 자극 및/또는 모세관 복구는 신기능 및 느린 진행을 안정화시킬 수 있으며, 상기 이점은 BP 또는 단백뇨에 대한 효과와 무관하게 발생한다는 흥미로운 증거가 있다.
추가의 정보를 위해서는 문헌[Brenner & Rector, The Kidney, 7th ed., Copyright c 2004, Elsevier: Chapter 33 - Microvascular diseases of the kidney; 및 Tiwari and Vikrant Journal of Indian Academy of Clinical Medicine Vol. 5, No. 1 Review Article - Sepsis and the Kidney]을 참고한다.
결과적으로, COPD, 황반변성 및 미세혈관 질환의 예방 및/또는 치료에 대한 현재의 치료방식은 만족스럽지 않으며, 따라서 상기 목적을 위한 신규한 화합물을 개발할 필요가 있다. 본원에서 상기 개시된 모든 질환 및 적응증 뿐만 아니라 MI와 같이 본원이 기재된 다른 질환 및 증상도 본 발명의 신규한 화합물에 의해 치료될 수도 있다.
RTP801
RTP801 유전자는 본 출원의 양수인에 의해 처음으로 보고되었다. 본 출원의 양수인에게 모두 양도된 미국특허 제6455674호, 제6555667호 및 제6740738호는 그 자체가 RTP801 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드, 및 폴리펩타이드에 대한 항체를 개시하고 청구하고 있다. RTP801은, VEGF와 같은 성장 인자와 무관한 저산소증-유도된 발병기전을 조절할 수 있는 저산소증-유도성 인자(HIF-1)에 대한 독특한 유전자 표적을 나타낸다.
본 발명의 발명자들은 다양한 호흡 장애를 개선시킬 목적으로 RTP801 유전자를 억제하는 신규한 개념에 이르는 발견을 하였다.
하기의 특허출원 및 공개공보는 배경기술에 대한 정보를 제공한다.
PCT 공개공보 WO 제2001/070979호는 난소암 세포에서 과발현되는 핵산 표지자에 관한 것이다.
미국 특허 US 제6,673,549호는 스테로이드 치료에 대하여 차등 발현되는 cDNA를 포함하는 조합물을 개시하고 있다.
미국 특허출원 US 제2003/165864호는 DNA 디메틸화제로 처리한 세포에서 차등 발현되는 cDNA에 관한 것이다.
미국 특허출원 US 제2003/108871호는 간 장애를 치료하는데 유용하다고 알려진, 치료받은 인간 C3A 간세포 배양물에서 차등 발현되는 여러 cDNA를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
미국 특허출원 US 제2002/119463호는 전립선 암에서 차등 발현되는 인간 cDNA를 포함하는, 전립선 암의 치료 및 진단에 유용한 신규한 조성물을 개시하고 있다.
PCT 공개공보 WO 제2004/018999호는 자궁경부암을 평가, 특징화, 관측, 예방 및 치료하는 방법을 개시하고 있다.
유럽 특허 EP 제1394274호는 피실험자의 생물학적 샘플중 표지자 유전자의 발현 수준을 건강한 피실험자 샘플에서의 유전자 발현 수준과 비교함으로써 기관지 천식 또는 만성폐색성 폐질환을 시험하는 방법에 관한 것이다.
PCT 공개공보 WO 제2002/101075호는 인간 자궁경부암의 검출, 특징화, 예방 및 치료에 유용한 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
PCT 공개공보 WO 제2003/010205호는 상처 치유, 망막병증, 허혈, 염증, 미세혈관병증, 골 치유 및 피부 염증을 치료하기 위한 혈관형성 억제에 관한 것이다.
PCT 공개공보 WO 제2002/046465호는 저산소증-조절된 증상을 치료하기 위한 질환-관련 유전자의 확인 방법에 관한 것이다.
PCT 공개공보 WO 제2002/031111호는 신규한 폴리펩타이드 및 그의 부호화된 단백질에 관한 것이고, 따라서 많은 용도가 제공되어 있다.
PCT 공개공보 WO 제2001/012659호는 재조합 DMA 방법론에서 유용한 핵산에 관한 것이다.
PCT 공개공보 WO 제2001/077289호는 다양한 인간 조직 공급원으로부터 유도된 623개 폴리뉴클레오타이드를 개시하고 있다.
PCT 공개공보 WO 제2003/101283호는 호흡 장애에서 차등 발현된 많은 cDNA와 단백질을 포함하는 조합물에 관한 것이다.
일본 특허출원 JP 제2003/259877호는 많은 간섬유증 질환 표지자에 관한 것이다.
문헌[Tzipora Shoshani 등, Identification of a Novel Hypoxia - Inducible Factor 1-Responsive Gene, RTP801, Involved in Apoptosis. MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Apr. 2002, p.2283-2293]은 본 발명의 발명자에 의해 공동 저술된 것으로, RTP801 유전자(이후에는 신규한 HIF-1-의존적 유전자)의 발견에 대하여 기술하고 있다.
문헌[Anat Brafman 등, Inhibition of Oxygen-Induced Retinopathy in RTP801-Deficient Mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004 Oct; 45(10): 3796-805] 역시 본 발명의 발명자에 의해 공동 저술된 것으로 RTP801 녹아웃 마우스에서 저산소증이 망막 모세관 그물구조의 변성을 일으키지 않음을 증명하고 있다.
문헌[Leif W. Ellisen 등, REDD1 , a Developmentally Regulated Transcriptional Target of p63 and p53, Links p63 to Regulation of Reactive Oxygen Species. Molecular Cell, Vol. 10, 995-1005, November, 2002]은 RTP801(상기 문헌에서는 REDD1이라고 함)의 과발현이 반응성 산소 종의 생성을 증 가시킴을 증명하였다.
문헌[Richard DR, Berra E, 및 Pouyssegur J. Non - hypoxic pathway mediates the induction of hypoxia-inducible factor 1 alpha in vascular smooth muscle cells. J Biol. Chem. 2000, Sep1; 275(35): 26765-71]은 HIF-1-의존적 전사가 반응성 산소 종의 과다한 생성에 의해 유도될 수 있음을 증명하고 있다.
문헌[Rangasami, T 등, Genetic ablation of Nrf2 enhances susceptibility to cigarette smoke-induced emphysema in mice, Journal of Clinical Investigation]은 손상된 산화방지 방어(상기 문헌에서는 Nrf2라고 부르는 RTP801의 배선 불활성화에 기인함)를 갖는 마우스에 관한 것이다.
발명의 요약
본 발명은 미세혈관 장애, 황반 변성, 호흡 장애, 및 척수 손상 또는 질환을 치료하기 위한 신규한 방법 및 조성물을 제공한다.
한 양태에서, RTP801을 억제하고 다양한 질환 및 적응증을 치료하는데 사용될 수 있는 신규한 분자가 제공되어 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 RTP801 억제제를 포함하는 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 큰혈관 장애, 황반 변성 또는 호흡 장애를 앓는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 치료적 유효량의 RTP801 억제제를 포함하는 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, COPD를 앓는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 상기 억제제는 siRNA 분자, 안티센스 분자, 항체(예컨대, 중화 항체), 우성 음성 펩타이드 또는 리보자임이다.
본 발명의 또 다른 양태는 치료적 유효량의 RTP801 억제제를 포함하는 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 황반 변성을 앓는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 상기 억제제는 siRNA 분자, 안티센스 분자, 항체(예컨대, 중화 항체), 우성 음성 펩타이드 또는 리보자임이다.
본 발명의 또 다른 양태는 치료적 유효량의 RTP801 억제제를 포함하는 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 미세혈관 장애를 앓는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 억제제는 siRNA 분자, 안티센스 분자, 항체(예컨대, 중화 항체), 우성 음성 펩타이드 또는 리보자임이다.
본 발명의 추가적인 양태는 호흡 장애를 앓는 환자의 회복을 촉진시키기 위한 약물의 제조에 있어서 치료적 유효량의 RTP801 억제제의 용도를 제공한다. 한 양태에서, 호흡 장애는 COPD이고, 억제제는 바람직하게는 siRNA이다.
본 발명의 추가적인 양태는 황반 변성을 앓는 환자의 회복을 촉진시키기 위한 약물의 제조에 있어서, 치료적 유효 투약량의 RTP801 억제제의 용도를 제공한다. 한 양태에서, 황반 변성은 AMD이고, 억제제는 바람직하게는 siRNA이다.
본 발명의 추가적인 양태는 미세혈관 장애를 앓는 환자의 회복을 촉진하기 위한 약물의 제조에 있어서 치료적 유효량의 RTP801 억제제의 용도를 제공한다. 한 양태에서, 미세혈관 장애는 당뇨병성 망막병증이고, 억제제는 바람직하게는 siRNA이다.
본 발명은 일부 양태에서는 특히 눈 질환, 호흡 장애 및 미세혈관 장애의 치료를 위한 RTP801 유전자 또는 폴리펩타이드의 억제에 관한 것이다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명에서 사용하기에 바람직한 억제제는 생물학적 분자이다.
이론에 제한됨없이, 본 발명의 발명자들은 RTP801이 미세혈관 장애, 눈 질환, 호흡 장애, 척수 손상 및 질환을 비롯한 다양한 질환 상태에 관련되어 있으며, 상기 임의의 질환 또는 장애를 치료하기 위하여 RTP801을 억제하는 것이 유리함을 밝혀냈다. RTP801을 억제하는 방법, 분자 및 조성물이 본원에서 충분히 검토되어 있으며, 상기 임의의 분자 및/또는 조성물은 상기 임의의 증상을 앓는 환자의 치료에서 유익하게 이용될 수 있다.
본 발명은 생체내에서 RTP801 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 일반적으로, 상기 방법은 특정한 mRNA에 대해 표적화되고 그에 하이브리드화(hybridization)되는 작은 간섭 RNA(즉, siRNA)와 같은 올리고뉴클레오타이드, 또는 세포에서 siRNA를 생성시킬 수 있는 핵산 물질을, RNA 간섭 메카니즘에 의해 표적 유전자를 하향-조절 발현시키기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 특히, 본 방법은 호흡 장애, 미세혈관 장애 또는 눈 장애를 치료하기 위해 RTP801 유전자의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 RTP801 억제제를 포함하는 약학 조성물을 환자에게 투여하고, 그에 의해 환자를 치료하는 것을 포함하는, 미세혈관 장애, 눈 질환 또는 호흡 장애를 앓는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 회복을 촉진시키기에 충분한 투약량 및 기간에 걸쳐 RTP801 억제제를 포함하는 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 미세혈관 장애, 눈 질환 또는 호흡 장애를 앓는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 눈 질환은 특히 노년기 황반 변성(AMD)과 같은 황반 변성일 수 있다. 미세혈관 장애는 특히 당뇨병성 망막병증 또는 급성 신부전일 수 있다. 호흡 장애는 특히 만성폐색성폐질환(COPD), 폐기종, 만성 기관지염, 천식 및 폐암일 수 있다. RTP801 억제제는 폴리뉴클레오타이드, AS 분절, 또는 리보자임이나 siRNA(예컨대, 표 A 내지 C의 siRNA, 특히 표 A의 제14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 및 50번의 siRNA)와 같은 RTP801 유전자 mRNA를 표적로 하는 RNA 분자, 또는 이들을 포함하는 발현 벡터; 우성 음성과 같은 폴리펩타이드, 항체(예컨대, 서열이 도 2에 기재되어 있는(SEQ ID No:2) 연속 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드내에 존재하는 항원결정인자(epitope)에 특이 결합하는 항체), 또는 몇몇 경우에는 효소와 같은 화합물을 비롯한(그러나, 이에 한정되는 것은 아니다) 광범위한 분자로부터 선택될 수 있다. 추가로, RTP801 억제제는 작은 분자, 예컨대 2000달톤 미만의 분자량을 갖는 저분자량을 갖는 화합물 분자와 같은 화합물 억제제일 수 있다. 특이적인 RTP801 억제제가 하기에 제공되어 있다.
본 발명은 RTP801 유전자로부터 전사되는 mRNA에 특이적으로 하이브리드화되고/거나 RTP801 유전자의 발현을 하향 조절하고, 그에 의해 환자를 치료하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 RTP801 억제제를 포함하는 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 황반 변성, COPD 또는 당뇨병성 망막병증 을 앓는 환자를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 폴리뉴클레오타이드는 표 A 내지 C에 기재된 임의의 서열(SEQ ID NOs:3 내지 344), 특히 표 A의 siRNA NOs:14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 및 50과 동일한 서열을 갖는 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 siRNA일 수 있다.
또한, 본 발명의 추가적인 양태는 siRNA, 임의로는 표 A 내지 C중 임의의 하나에 기재된 siRNA 분자를 포함하는 RTP801 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 약학 조성물을 환자에게 일정한 투약량 및 기간에 걸쳐 투여하고, 그에 의해 환자를 치료하는 것을 포함하는, 미세혈관 장애, 호흡 장애 또는 눈 질환을 앓는 환자의 치료 방법에 관한 것이다.
RTP801 유전자 mRNA를 표적로 하는 RNA 분자의 치료적 유효량을 포함하는 약학 조성물을 환자에게 일정한 투약량 및 기간에 걸쳐 투여하고, 그에 의해 환자를 치료하는 것을 포함하는, 미세혈관 장애, 호흡 장애 또는 눈 질환을 앓는 환자를 치료하는 추가적인 방법이 제공되어 있다. RNA 분자는 표 A 내지 C에 기재된 siRNA 분자, 특히 표 A의 siRNA NOs:14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 및 50과 같은 siRNA 분자, 또는 리보자임일 수 있다.
본 발명은 또한 RTP801 유전자 mRNA를 표적로 하는 siRNA 분자, 임의로는 표 A 내지 C에 기재된 siRNA 분자의 치료적 유효 투여량을 포함하는 약학 조성물을 일정한 투야량 및 기간에 걸쳐 환자에게 투여하고, 그에 의해 환자를 치료하는 것을 포함하는, 호흡 장애, 미세혈관 장애 또는 눈 질환, 또는 본원에 기재된 임의의 증상을 앓는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 눈 질환은 노년기 황반 변 성(AMD)과 같은 황반 변성일 수 있고; 미세혈관 장애는 당뇨병성 망막병증 또는 급성 신부전일 수 있으며; 호흡 장애는 COPD일 수 있고; 치료되는 COPD 양태는 폐기종, 만성 기관지염, 또는 이들 둘다를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"질환을 치료한다"란 질환과 관련된 징후를 개선시키거나, 중증도를 낮추거나, 질환을 치유하거나, 질환이 발생하지 않도록 하기에 유효한 치료적 물질을 투여하는 것을 말한다.
"치료적 유효 투약량"이란 증가된 생존률, 보다 신속한 회복, 또는 징후 및 당업계의 숙련자에 의해 적절한 결정 척도로서 선택되는 다른 지표의 개선 또는 제거를 포함한(그러나, 이에 한정되는 것은 아니다) 환자 또는 그의 생리 시스템에서의 개선을 이루기에 유효한 약학 화합물 또는 조성물의 양을 말한다.
본원에 개시되어 있고 본 발명에 포함되는 질환을 치료하는 방법은 RTP801 억제제를 추가적인 RTP801 억제제, 이하에 기재되는 바와 같이 활성 성분의 약리 특성을 개선시키는 물질, 또는 특히 황반 변성, COPD, ARF, DR과 같이 치료할 질환의 치료에 유효하다고 알려진 추가적인 화합물과 함께 투여하는 것을 포함할 수 있다. "과 함께"란 이전에, 동시에 또는 이후에를 의미한다. 예시적인 공동 치료법에 대한 추가적인 상세한 설명이 하기에 제시되어 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기에 기재된 바와 같은 황반 변성, COPD, ARF, DR, 또는 임의의 다른 눈 질환, 미세혈관 또는 호흡 증상을 앓는 환자의 회복을 촉진시키기 위한 약물을 제조하는데 있어서 RTP801 억제제의 치료적 유효 투약 량의 용도, 및 상기 질환 및 증상을 치료하기 위한 약물을 제조하는데 있어서 RTP801 억제제의 치료적 유효 투약량의 용도를 제공한다. 상기 양태에서, RTP801 억제제는 도 1에 기재된 서열(SEQ ID NO:1)에 대한 안티센스 서열을 포함하는 서열을 갖는 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 추가로, RTP801 억제제는 도 1에 기재된 서열(SEQ ID NO:1)에 대한 안티센스 서열인 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터일 수 있다. 상기 용도에 따르는 RTP801 억제제는 서열이 도 2에 기재되어 있는(SEQ ID No:2) 연속 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드내에 존재하는 항원결정인자에 특이적으로 결합하는 중화 항체와 같은 항체일 수도 있다. 추가적으로, RTP801 억제제는 RTP801 유전자 mRNA를 표적로 하는 RNA 분자, 임의로는 siRNA, 임의로는 표 A 내지 C에 기재된 임의의 하나의 서열(SEQ ID NO:3 내지 344), 특히 표 A의 siRNA NOs: 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 및 50과 동일한 서열을 갖는 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 siRNA, 또는 리보자임일 수 있다.
따라서, 본원에 개시된 정보에 따르면, 본원에 개시된 임의의 방법, 본원에 개시된 임의의 용도 및 본원에 개시된 임의의 약학 조성물에서 사용할 RT801 억제제는 siRNA 분자, siRNA 분자를 포함하는 벡터, siRNA 분자를 발현시킬 수 있는 벡터, 및 siRNA 분자로 내생적으로 프로세싱될 수 있는 임의의 분자를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 본원에 상세히 설명되는 바와 같이, 상기 siRNA 분자는 바람직하게는 표 A 내지 C에 기재된 임의의 하나의 서열(SEQ ID NO:3 내지 344), 특히 표 A의 siRNA NOs: 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 및 50과 동일한 서열 을 갖는 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 siRNA이다.
"호흡 장애"는 특히 만성폐색성폐질환(COPD), 폐기종, 만성 기관지염, 천식 및 폐암을 비롯한 모든 유형의 폐 장애를 포함한(그러나, 이에 한정되는 것은 아니다) 호흡계 증상, 질환 또는 증후군을 말한다. 폐기종 및 만성 기관지염은 COPD의 일부로서 또는 독립적으로 발생할 수 있다.
"미세혈관 장애"란 미세 모세관 및 림프관, 특히 혈관경축 질환, 혈관염 질환 및 림프관 폐색성 질환에 영향을 미치는 임의의 증상을 말한다. 미세혈관 장애의 예는 특히 일과성 흑암시(색전성 또는 SLE에 대하여 부수적), 무형성(apla) 증후군, Prot CS 및 ATIII 결핍, IV 약물 사용에 의해 발생하는 미세혈관 병리현상, 이상단백혈증, 측두 동맥염, 전방 허혈성 시신경병증, 시신경염(자가면역 질환에 대해 일차적 또는 이차적), 녹내장, 본히펠린다우 증후군, 각막질환, 각막이식거부 백내장, 일스 질환, 서리가지동맥염, 포위 버클링 오퍼레이션(encircling buckling operation), 주변포도막염을 포함한 포도막염, 맥락막 흑색종, 맥락막 혈관종, 시신경 무형성증과 같은 눈 장애; 망막동맥폐쇄, 망막정맥폐쇄, 미숙아 망막병증, HIV 망막병증, 푸르처 망막병증, 전신성혈관염 및 자가면역질환의 망막병증, 당뇨병성 망막병증, 고혈압 망막병증, 방사선 망막병증, 망막 동맥 또는 정맥 분지 폐쇄, 특발성 망막 혈관염, 동맥류, 시신경망막염, 망막색전증, 급성망막괴사, 버드샷(Birdshot) 망막맥락막증, 장기 망막박리와 같은 망막 증상; 당뇨병, 당뇨병성 망막병증(DR), 당뇨병 관련 미세혈관 병리현상(본원에 상세히 기재된 바와 같음), 과다점성 증후군, 대동맥궁 증후군 및 눈 허혈성 증후군, 경동맥 해면류, 다발경화 증, 전신홍반루푸스, SS-A 자가항체를 갖는 세동맥염, 급성 다초점 출혈 혈관염, 감염으로 인한 혈관염, 베체트 질환으로 인한 혈관염, 사르코이드증, 응고병증, 신경병증, 신장병증, 신장의 미세혈관 질환 및 허혈성 미세혈관 증상과 같은 전신 증상을 포함한다.
미세혈관 장애는 신생혈관 요소를 포함할 수 있다. "신생혈관 장애"란 용어는 혈관 형성(혈관 신생)이 환자에게 해로운 증상을 말한다. 눈 혈관신생의 예는 망막 질환(당뇨병성 망막병증, 당뇨병 황반부종, 만성 녹내장, 망막 박리 및 낫적혈구 망막병증); 홍채혈관신생; 증식성 유리체-망막병증; 염증 질환; 만성 포도막염; 신생물(망막모세포종, 가성신경교종 및 흑색종); 푹스 홍채이색 홍채모양체염; 신생혈관 녹내장; 각막 혈관신생(홍채의 염증, 이식 및 발달 형성저하증); 유리체절제술과 결합된 수정체절제술 이후의 혈관신생; 혈관 질환(망막 허혈, 맥락막 혈관 부전, 맥락막 혈전증 및 경동맥 허혈); 시신경의 혈관신생; 및 눈 관통 또는 눈 타박상 손상으로 인한 혈관신생을 포함한다. 상기 신생혈관형성 증상 전부는 본 발명의 화합물 및 약학 조성물을 사용하여 치료될 수 있다.
"눈 질환"이란 맥락막 혈관신생(CNV), 습식 및 건식 AMD, 눈 히스토플라스마증 증후군, 혈관무늬병증, 부르크막 파열, 근시변성, 눈 종양, 망막 변성 질환 및 망막 정맥 폐쇄(RVO)를 비롯한 임의의 증상을 포함한(그러나, 이에 한정되는 것은 아니다) 눈의 증상, 질환 또는 증후군을 말한다. 본 발명의 방법에 따라 처리될 수 있는 DR과 같이 본원에 개시된 일부 증상은 본원에 제시된 정의하에서 미세혈관장애 및 눈질환으로, 또는 둘다로서 간주되어 왔다.
"RTP801 유전자"는 도 1에 도시된 바와 같은 RTP801 부호화 서열 해독틀(SEQ ID NO:1) 또는 바람직하게는 70% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 80% 동일성, 더 더욱 바람직하게는 90% 또는 95% 동일성을 갖는 그의 임의의 상동성 서열을 말한다. 이는 본원에 기재된 바와 같은 돌연변이, 변경 또는 변형을 거친 SEQ ID NO:1로부터 유도된 임의의 서열을 포함한다. 따라서, 바람직한 양태에서 RTP801은 SEQ ID NO:1에 따른 핵산 서열에 의해 부호화된다. 바람직하게는 제 1 연신부(stretch) 및 제 1 가닥이 전형적으로는 본 발명에 따른 핵산보다 짧기 때문에 본 발명에 따른 핵산이 RTP801를 부호화하는 핵산의 일부와 단지 각각 상보적이고 동일한 것도 본 발명의 범위내에 있다. 또한, RTP801의 아미노산 서열에 근거하여 상기 아미노산 서열을 부호화하는 임의의 핵산 서열은 유전자 부호에 근거하여 당업계의 숙련자에게 인지될 수 있음을 인식하여야 한다. 그러나, 본 발명에 따른 핵산의 추측되는 작용 방식으로 인해, RT801, 바람직하게는 그의 mRNA를 부호화하는 핵산이 RTP801의 발현이 감소되어야 하는 생물, 조직 및/또는 세포 각각에 존재하는 것이 가장 바람직하다.
"RTP801 폴리펩타이드"란 RTP801 유전자의 폴리펩타이드를 말하고, 본 발명의 목적에 있어서 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상 또는 95% 상동성을 갖는 임의의 생물, 임의로는 사람, 스플라이스(splice) 변종 및 생체 활성을 보유한 그의 분절, 그의 상동체로부터 유도된 "RTP779", "REDD1", "Ddit4", "ELJ20500", "Dig2" 및 "PRF1" 용어를 포함하는 것으로 이해한다. 또한, 상기 용어는 결과로 발생한 폴리펩타이드 및 천연 RTP801사이 에서 몇몇 아미노산 차이를 일으킬 수 있는 특히 점 돌연변이, 치환, 결손 및 삽입과 같이 RTP801 부호화 서열의 미세한 변경으로부터 발생되는 폴리펩타이드를 포함하는 것으로 이해한다. 당업계에 충분히 공지되어 있는(예컨대, 문헌[Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1988), updated in 1995 and 1998] 참고) 매우 엄격한 하이브리드화 조건하에서 RTP801 부호화 서열 또는 게놈 서열에 결합하는 핵산 서열에 의해 부호화되는 폴리펩타이드가 또한 상기 용어에 포함된다. 화학적으로 변형된 RTP801 또는 화학적으로 변형된 RTP801 분절이 또한 생물학적 활성이 유지되는한 상기 용어에 포함된다. RTP801은 바람직하게는 SEQ.ID.NO.2에 따르는 아미노산 서열을 갖거나 또는 포함한다. 생물의 다양한 조직중에는 또한 하나의 종의 상이한 생물중에는, 또는 본 발명에 따르는 핵산이 본 발명의 다양한 양태에서 적용될 수 있는 다른 종중에는 아미노산 차이가 있을 수 있음을 인지한다. 그러나, 본원에 제공된 기술적 교지에 근거할 때, 본 발명에 따르는 임의의 핵산을 설계할 때 각각의 서열이 그에 따라 고려되어질 수 있다. RTP801의 특정한 분절은 도 2에 도시된 서열중 아미노산 1 내지 50, 51 내지 100, 101 내지 150, 151 내지 200 및 201 내지 232을 포함한다. RTP801의 추가적인 특정한 분절은 도 2에 도시된 서열중 아미노산 25 내지 74, 75 내지 124, 125 내지 174, 175 내지 224 및 225 내지 232를 포함한다.
본원에서 사용될 때 RTP801은 특히 PCT 공개공보 WO 제99/09046호에 기재된 단백질이다. RTP801이라고도 지칭되는 RTP801은 소사니 등의 문헌[Shoshani 등, 2002, Mol Cell Biol, 22, 2283-93]에서 HIF-1α의 전사적 표적으로서 기재되어 았 다. 또한, 엘리센 등의 문헌[Ellisen 등, Mol Cell, 10, 995-1005]은 RTP801을 p53-의존적 DNA 손상 반응 유전자 및 상피 분화에 관련된 p63-의존적 유전자로 확인하였다. 또한, RTP801은 p53계 구성원 p63의 조직-특이적 패턴을 반영하며, TP63과 유사하게 또는 그에 추가하여 효과적이며, 생체외 분화에 대한 억제제이며, 반응성 산소 종의 조절에 관련된다. 그와는 별도로, RTP801은 저산소증-반응성 전사 인자인 저산소증-유도성 인자 1(HIF-1)에 반응성이며, 허혈성 발작 동물 모델의 생체외 및 생체내 둘다에서 저산소증동안에 전형적으로 상향 조절된다. RTP801은 반응성 산소 종(ROS)의 조절에서 기능하는 것으로 보이며, ROS 수준 및 산화 스트레스에 대한 감소된 민감성 둘다는 이소(ectopic) 발현 RTP801 이후에 증가된다(문헌[Ellisen 등, 2002, 상기 참고; Soshani 등, 2002, 상기 참고). 바람직하게, RTP801은 바람직하게는 상기 특징중 하나 이상, 바람직하게는 둘 이상, 가장 바람직하게는 상기 임의의 특징 각각을 나타내는 생물학적 활성 RTP801 단백질이다.
RTP801의 관련 유전자는 "PEDD2"라고도 불리우는 RTP801L이며, 본 발명의 발명자들에 의해 발견되었다. RTP801L은 RTP801에 상동성이며, 산화 스트레스에 대하여 유사한 방식으로 반응한다. 따라서, RTP801L은 아마도 RTP801과 일부 유사한 기능을 가질 것이다.
이론에 제한됨없이, 스트레스-유도성 단백질(저산소증, 산화성 스트레스, 열적 스트레스, ER 스트레스에 반응)인 RTP801은 에너지 불균형에 대한 세포의 미세조율에 작용하는 인자이다. 그 자체로, 이는 스트레스성 조건(예컨대, 정상 세포사에 의해 수반되는 질환)에 기인한 세포자멸로부터 세포가 구제되어야 하거나 또 는 RTP801 발현 변화로 인한 스트레스성 조건에 적응한 세포(예컨대, 암세포)가 제거되어야 하는 임의의 질환 치료에 적합한 표적이다. 후자의 경우에, RTP801은 암세포에 대한 생존 인자로서 간주될 수 있으며, 그 억제제는 단일요법으로서, 또는 화학요법이나 방사선요법과 결합된 민감 약물로서 암을 치료할 수 있다.
"폴리뉴클레오타이드"란 용어는 DNA 뉴클레오타이드, RNA 뉴클레오타이드, 또는 특히 구아니딘, 시토신, 티미딘, 아데닌, 우라실 또는 이노신 염기중 둘 이상을 포함하는 두 유형의 조합물로 구성된 임의의 분자를 말한다. 폴리뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드, 화학 변형된 뉴클레오타이드 및 합성 뉴클레오타이드, 또는 그의 화합물 유사체를 포함할 수 있다. 상기 용어는 "올리고뉴클레오타이드"를 포함하며, "핵산"을 포함한다.
"아미노산"이란 용어는 20개의 천연 아미노산, 화학적으로 변형된 아미노산(하기 참고), 또는 합성 아미노산중 임의의 하나로 이루어진 분자를 말한다.
"폴리펩타이드"란 용어는 둘 이상의 아미노산 잔기로 구성된 분자를 말한다. 상기 용어는 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 및 펜타이드 모방물질(peptidomimetics)을 포함한다.
"펩타이드 모방물질"은 천연 부모 펩타이드의 생물학적 작용을 모방할 수 있는 비펩타이드 구조적 요소를 함유하는 화합물이다. 효소에 의해 분리가능한 펩타이드 결합과 같은 전통적인 펩타이드 특징중 일부가 펩타이드 모방물질에는 정상적으로 존재하지 않는다.
"우성 음성 펩타이드"란 용어는 단백질 일부를 부호화하는 cDNA 분절에 의해 부호화되는 폴리펩타이드를 의미한다(문헌[Herskowitz I.: Functional inactivation of genes by dominant negative mutations . Nature. 1987 Sep 17-23; 329(6136):219-22 Review; Roninson IB 등, Genetic suppressor elements : new tools for molecular oncology-thirteenth Cornelius P. Rhoads Memorial Award Lecture. Cancer Res. 1995 Sep 15; 55(18):4023] 참고). 상기 펩타이드는 이를 유도하는 단백질과는 상이한 기능을 가질 수 있다. 상기 펩타이드는 전체 단백질과 상호 작용하여 그의 활성을 억제할 수 있거나 또는 다른 단백질과 상호작용하여 전체-길이(부모) 단백질에 반응하는 활성을 억제할 수 있다. 우성 음성은 펩타이드가 천연 부호 단백질을 압도할 수 있고 그의 활성을 억제할 수 있어서 세포에 상이한 특징, 예컨대 세포사에 대한 내성 또는 민감성, 또는 임의의 관심있는 세포 표현형을 제공할 수 있음을 의미한다. 치료적 개입을 위하여, 펩타이드 그 자체가 약학 조성물의 활성 성분으로서 전달될 수 있거나, 또는 cDNA가 공지된 방법을 이용하여 세포에 전달될 수 있다.
펩타이드 및 폴리펩타이드의 제조
폴리펩타이드는 예컨대 하기와 같은 여러 방법을 통해 제조될 수 있다.
1) 합성 방법:
합성 폴리펩타이드는 RTP801의 공지된 서열 또는 그의 일부를 이용하여 시판되는 기계를 사용하여 제조될 수 있다.
2) 재조합 방법:
RTP 폴리펩타이드 또는 그의 분절을 제조하는 바람직한 방법은 RTP801 유전 자의 cDNA를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 발현 벡터에 클로닝하고, 상기 벡터를 포함한 세포를 배양하여서 부호화된 폴리펩타이드를 발현시키고, 이어서 생성된 폴리펩타이드를 정제시키는 것이며, 이들 전부는 예컨대 문헌[Marshak 등, Strategies for Protein Purification and Characterization . A laboratory course manual, CSHL Press(1996)]에 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 방법을 사용하여 실시하였다(추가로, 문헌[Bibl Haematol 1965; 23:1165-74 Appl Microbiol. 1967 Jul; 15(4):851-6; Can J Biochem. 1968 May; 46(5):441-4; Biochemistry. 1968 Jul; 7(7): 2574-80; Arch Biochem Biophys. 1968 Sep 10; 126(3):746-72; Biochem Biophys Res Commun. 1970 Feb 20; 38(4):825-30] 참고).
발현 벡터는 이종 물질의 전사를 억제하기 위한 촉진자(promoter)를 포함할 수 있으며, 선택적 전사를 허용하도록 하는 구성적 또는 유도성 촉진자일 수 있다. 필요한 전사 수준을 얻기 위하여 요구될 수 있는 증강자(enhancer)가 임의로 포함될 수 있다. 발현 벡터는 또한 선택 유전자를 포함될 수 있다.
벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법중 임의의 한 방법에 의해 세포 또는 조직내로 도입될 수 있다. 상기 방법은 문헌[Sambrook 등, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York(1989, 1992); Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989); Vega 등, Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor, MI(1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston MA(1988); 및 Gilboa 등(1986)]에 일반적으로 기재된 것을 찾을 수 있다.
3) 천연 공급원으로부터의 정제:
RTP801 폴리펩타이드 또는 그의 천연 분절은 예컨대, 항-RTP801 항체를 사용하는 면역-침전법, 또는 RTP를 결합시키는 것으로 알려진 임의의 분자를 사용하는 기질-결합된 친화성 크로마토그래피와 같은 당업계의 일반적인 숙련자들에게 공지된 많은 방법을 사용하여 천연 공급원(예컨대, 조직)으로부터 정제될 수 있다. 단백질 정제는 예컨대, 문헌[Marshak 등, Strategies for Protein Purification and Characterization. A laboratory course manual, CSHL Press(1996)]에 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 대로 실시한다.
"RTP801의 생물학적 효과" 또는 "RTP801 생물학적 활성"이란 직접적이거나 간접적일 수 있는 호흡 장애에서의 RTP801의 효과를 의미하며, 이론에 제한됨없이 저산소증 또는 고산소증 증상에 의해 유도되는 폐포세포의 세포자멸에 대한 RTP801의 효과를 포함한다. 간접적인 효과는 세포자멸에 이르게하는 신호전달 연쇄반응에 관련된 여러 분자중 하나에 결합하거나 그에 대해 효과를 갖는 RTP801를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"세포자멸"은 일부 세포 메카니즘의 활성화로부터 발생되는 세포사의 생리학적 유형, 즉 세포 기관(machinery)에 의해 조절되는 죽음을 말한다. 세포자멸은 예컨대 세포사에 이르게 하는 외부 유발인자, 예를 들면 시토카인 또는 항-FAS 항체, 또는 내부 신호에 의한 세포 기관 활성화의 결과일 수 있다. "예정된 세포사"란 용어는 또한 "세포자멸"과 서로 바꾸어 사용될 수 있다.
"세포자멸-관련 질환"이란 세포자멸 과정에 전체적으로 또는 부분적으로 관련된 병인을 갖는 질환을 말한다. 질환은 세포자멸 과정의 기능장애에 의해(예컨대, 암 또는 자가면역 질환에서) 또는 세포자멸 과정의 과활성에 의해(예컨대, 특정한 신경변성 질환에서) 일어날 수 있다. RTP801이 관련된 많은 질환은 세포자멸-관련 질환이다. 예컨대, 세포자멸은 건식 AMD의 중요한 메카니즘이며, 그 결과 주로 망막의 중심(황반) 영역내의 광수용체 및 색소상피세포의 느린 위축이 일어난다. 신경망막 세포자멸은 또한 당뇨병성 망막병증에서 중요한 메카니즘이 된다.
"억제제"는 목적하는 생물학적 또는 생리적 효과를 얻기에 충분한 정도로 유전자 또는 상기 유전자 생성물의 활성을 억제할 수 있는 화합물이다. "RTP801 억제제"는 RTP801 유전자 또는 RTP801 유전자 생성물, 특히 인간의 RTP801 유전자 또는 유전자 생성물을 억제할 수 있는 화합물이다. 상기 억제제는 유전자의 전사 또는 번역에 영향을 미치는 물질 뿐만 아니라 유전자 생성물의 활성에 영향을 미치는 물질을 포함한다. RTP801 억제제는 또한 RTP801 촉진자의 억제제일 수도 있다. 상기 억제제의 예는 특히 AS 분절, siRNA, 또는 이들을 포함하는 벡터와 같은 폴리뉴클레오타이드; 우성 음성, 항체 및 효소와 같은 폴리펩타이드; 리보자임과 같은 촉매적 RNA; 및 저분자량, 예컨대 2000달톤 미만의 분자량을 갖는 화합물 분자를 포함할 수 있다. 구체적인 RTP801 억제제가 하기에 제시되어 있다.
"발현 벡터"는 외래 세포에서 이종 DNA 분절을 혼입하여 발현할 수 있는 벡터를 말한다. 많은 원핵 및 진핵 발현 벡터가 알려져 있고/거나 시중에서 구입할 수 있다. 적절한 발현 벡터의 선택은 당업계의 숙련자들의 지식 범위내에 있다.
"항체"란 용어는 특히 IgG, IgM, IgD, IgA 및 IgE 항체를 말한다. 정의는 다클론 항체 또는 단일클론 항체를 포함한다. 상기 용어는 전체 항체, 또는 항원-결합 도메인을 포함하는 항체 분절, 예컨대 Fc 부분을 갖지 않는 항체, 단일 사슬 항체, 미니(mini)항체, 항체중 가변성 항원-결합 도메인만으로 본질적으로 이루어진 분절 등을 말한다. "항체"란 용어는 cDNA 백신화에 의해 수득된 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 항체를 말할 수 있다. 상기 용어는 또한 항원 또는 수용체와 선택적으로 결합할 수 있는 능력을 보유한 항체 분절을 포함하며, 특히 (1) 가벼운 사슬, 및 무거운 사슬의 일부를 생성시키도록 파파인 효소에 의해 전체 항체를 소화시켜서 생성될 수 있는 항체 분자의 일가 항원-결합 분절을 함유하는 분절인 Fab, (2) 후속적인 환원없이 펩신 효소에 의해 전체 항체를 처리함으로써 수득될 수 있는 항체 분절로서, 2개의 이황화 결합에 의해 고정된 2개의 Fab 분절의 이합체인 F(ab'2), (3) 가벼운 사슬의 가변 영역 및 2개 사슬로서 발현되는 무거운 사슬의 가변 영역을 함유하는 유전자 가공된 분절로 정의되는 Fv, 및 (4) 적합한 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된 가벼운 사슬의 가변 영역 및 무거운 사슬의 가변 영역을 유전적으로 융합된 단일 사슬 분자로서 함유하는 유전자 가공된 분자로서 정의되는 단일 사슬 항체(SCA)로 예시된다.
본 발명에서 사용될 때 "항원결정인자"란 용어는 항체가 결합하는 항원에 대한 항원의 결정인자를 의미한다. 항원 결정인자는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 기로 이루어지며, 일반적으로 특이적인 3차 원 구조적 특징 뿐만 아니라 특이적인 하전 특징을 갖는다.
항- RTP801 항체의 제조
RTP801 또는 그로부터 유도된 분절에 결합하는 항체는 면역 항원으로서 무손상(intact) 폴리펩타이드 또는 보다 작은 폴리펩타이드를 함유한 분절을 사용하여 제조될 수 있다. 예컨대, RTP801의 N- 또는 C-말단 또는 임의의 다른 적합한 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 동물을 면역시키는데 사용되는 폴리펩타이드는 번역된 cDNA 또는 화학적 합성으로부터 유도될 수 있으며, 필요시에는 운반 단백질에 접합될 수 있다. 폴리펩타이드에 화학적으로 커플링되는 상기 보편적으로 사용되는 운반체는 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌(KLH), 갑상샘 글로불린, 소혈청 알부민(BSA) 및 파상풍 톡소이드를 포함한다. 커플링된 폴리펩타이드는 이어서 동물을 면역화시키는데 사용된다.
필요시에, 다클론 또는 단일클론 항체는 예컨대 항체가 나타나는 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 결합되는 기질에 결합하거나 그로부터 용출됨으로써 추가로 정제될 수 있다. 당업계의 숙련자들은 다클론 뿐만 아니라 단일클론 항체를 정제 및/또는 농축시키기 위한 면역학에서 통상적인 다양한 기술을 알고 있다(문헌[Coligan 등, Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1994] 참고).
분절을 비롯한 모든 유형의 항체를 제조하는 방법이 당업계에 공지되어 있다(예컨대, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1988) 참고). 적합한 보조제(adjuvant)중에서 면역 원을 제조하는 모든 필요 단계를 포함한 면역화 방법, 항체 결합의 결정, 항체의 단리, 단일클론 항체의 수득 방법, 및 단일클론 항체의 인간화가 당업계의 숙련자들에게 전부 공지되어 있다.
항체는 인간화된 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 항체는 CDR-이식(유럽 특허 EP 제239,400호; PCT 공개공보 WO 제91/09967호; 미국 특허 US 제5,225,539호; 제5,530,101호; 및 제5,585,089호), 덧대기(veneering) 또는 표면화(resurfacing)(유럽 특허 EP 제592,106호; EP 제519,596호; 문헌[Padlan, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498(1991); Studnicka 등, Protein Engineering 7(6):805-814(1994); Roguska 등, PNAS 91:969-973(1994)] 및 사슬 셔플링(shuffling)(미국 특허 US 제5,565,332호)를 비롯하여 당업계에 공지된 각종 기술을 사용하여 인간화될 수 있다.
정의된 바와 같은 단일클론 항체는 한 종(예컨대, 뮤린(murine), 래빗, 염소, 래트, 인간 등)으로부터 유도된 항체 뿐만 아니라 키메라 및 인간화된 항체와 같이 2개(또는 그 이상)의 종으로부터 유도된 항체를 포함한다.
완전히 인간화된 항체는 인간 환자의 치료적 요법에 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유도된 항체 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 방법을 비롯한 당업계에 공지된 각종 방법에 의해 제조될 수 있다. 미국 특허 US 제4,444,887호 및 US 제4,716,111호; 및 PCT 공개공보 WO 제98/46645호, WO 제98/50433호, WO 제98/24893호, WO 제98/16654호, WO 제96/34096호, WO 제96/33735호 및 WO 제91/10741호를 참고하며, 상기 문헌 각각은 본원에서 전체적으 로 참고문헌으로 인용된다.
인간화된 항체, 인간 항체 및 항체 분절을 비롯한 모든 유형의 항체에 대한 추가적인 정보는 PCT 공개공보 WO 제01/05998호에서 찾을 수 있으며, 상기 문헌은 본원에서 전체적으로 참고문헌으로 인용된다.
중화 항체는 가능하게는 예컨대 생존률 어세이에 의해 중화 활성에 대한 추가적인 스크리닝 단계와 함께 상기 검토된 방법에 의해 제조될 수 있다.
"화합물", "작은 분자", "화합물 분자", "작은 화합물 분자" 및 "작은 화합물"이란 용어는 본원에서 서로 바꾸어 사용되며, 합성에 의해 생성되거나 천연 공급원으로부터 수득될 수 있고 일반적으로 2000 달톤 미만, 1000 달톤 미만, 더더욱 600 달톤 미만의 분자량을 갖는 임의의 특정한 유형의 화학적 잔기를 지칭하는 것으로 이해한다.
본 발명은 또한 이중가닥 구조를 포함하는 기능성 핵산, 약물 제조에 있어서 그의 용도, 상기 기능성 핵산을 포함하는 약학 조성물, 및 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
저산소증은 최적이하의 산소 이용가능성 및 저산소증 증상에 반응한 조직 손상과 관련된 뇌졸중, 폐기종 및 경색과 같은 수많은 질환의 병메카니즘에서 중요한 구성요소인 것으로 인지되어 왔다. 종양을 비롯하여 빠르게 증식하는 조직에서, 최적 이하의 산소 이용가능성은 바람직하지 않은 신생 혈관형성에 의해 보충된다. 따라서, 적어도 암 질환의 경우에 혈관계 증식은 바람직하지 않다.
이러한 측면에서, 혈관형성 및 혈관증식 각각의 억제가 집중적으로 연구되고 있다. 바람직하지 않은 혈관형성 및 혈관증식을 억제하는 몇몇 화합물이 이미 현재 시판중이다. 보다 유명한 일부 화합물은 VEGF 및 VEGF 수용체를 억제하는 것이다. 두 경우에서 VEGF의 효과는 예컨대 게넨테크 아바스틴(Genentech's AVASTIN)이 연구중인 VEGF에 대한 항체(VEGF에 특이적인 단일클론 AB)를 사용하여 VEGF 그 자체를 차단시키거나(문헌[Ferrara N.; Endocr Rev. 2004 Aug; 25(4):581-611] 참고), 또는 동종(corresponding) 수용체, 즉 VEGF 수용체를 차단시킴으로써(문헌[Traxler P; Cancer Res. 2004. Jul 15; 64(14): 4931-41; 또는 Stadler WM 등, Clin Cancer Res. 2004 May 15; 10(10): 3365-70] 참고) 방지된다.
그러나, 혈관형성 및 혈관증식이 임의의 동물 및 인간에 있어서 매우 기초적이고 중요한 과정이기 때문에 상기 화합물 종류의 효과는 혈관형성 및 혈관증식이 실제로 바람직하지 않아서 적절한 표적 또는 전달이 상기 치료적 접근 방법과 관련하여 중요한 현상이 되는 특정 부위에 집중되어야 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 바람직하지 않은 혈관계증식 및 혈관형성 각각을 포함한 질환의 치료에 대한 추가적인 방법을 제공하는 것이다.
"작은 간섭 RNA"(siRNA)는 그의 내생적 세포 대응물의 유전자/mRNA의 발현을 감소시키거나 침묵하게 하는(방지하는) RNA 분자를 의미한다. 상기 용어는 "RNA 간섭"(RNAi)를 포함하는 것으로 이해한다. RNA 간섭(RNAi)은 작은 간섭 RNA(siRNA)에 의해 매개되는 포유동물에서의 서열-특이적 전사후 유전자 침묵의 과정을 말한다(문헌[Fire 등, 1998, Nature 391, 806] 참고). 식물에서의 상응하는 과정을 흔히 특이적 전사후 유전자 침묵 또는 RNA 침묵이라고 하고, 또한 진균에서 는 억제라고도 한다. RNA 간섭 반응은 흔히 RNA-유도된 침묵 복합체(RISC)이라고 지칭하는 siRNA를 함유한 엔도뉴클레아제 복합체를 특징으로 할 수 있으며, 이는 siRNA 이중체(duplex)의 안티센스 가닥에 상보적인 서열을 갖는 단일가닥 RNA의 절단을 매개한다. 표적 RNA의 절단은 siRNA 이중체의 안티센스 가닥에 상보적인 영역 중간에서 발생할 수 있다(문헌[Elbashir 등, 2001, Genes Dev., 15, 188] 참고). 상기 용어 및 제시된 메카니즘에 대한 최근 정보에 대해서는 문헌[Bernstein E., Denli AM., Hannon GJ: The rest is silence . RNA. 2001 Nov; 7(11): 1509-21; 및 Nishikura K.: A short primer on RNAi : RNA directed RNA polymerase acts as a key catalyst. Cell. 2002 Nov 16; 107(4)415-8]을 참고한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 siRNA 분자의 예가 표 A 내지 C에 제시되어 있다.
최근 몇 해동안에 RNAi가 유전자 불활성화를 위한 가장 효율적인 방법의 하나로 나타났다(문헌[Nature Reviews, 2002, v.3, p.737-47; Nature, 2002, v.418, p.244-51]). 방법으로서, dsRNA 종이 특이적 단백질 착물에 도입될 수 있는 능력에 근거하며, 이어서 상보성 세포 RNA를 표적로 하고 이를 특이적으로 분해시킨다. 보다 상세하게, dsRNA는 III형 RNAses(다이세르(DICER), 드로샤(Drosha) 등)에 의해 짧은(17 내지 29bp) 억제 RNA(siRNA)로 소화된다(문헌[Nature, 2001, v.409, p.363-6; Nature, 2003, 425, p.415-9] 참고). 상기 분절 및 상보성 mRNA는 특이적 RISC 단백질 복합체에 의해 인식된다. 전체 과정은 표적 mRNA의 엔도뉴클레아제 절단에 의해 완결된다(문헌[Nature Reviews, 2002, v.3, p.737-47; Curr Opin Mol Ther. 2003 June; 5(3):217-24] 참고).
siRNA를 공지된 유전자로 설계하고 제조하는 방법에 대한 개시내용을 위해 예컨대, 문헌[Chalk AM, Wahlestedt C, Sonnhammer EL. Improved and automated prediction of effective siRNA Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004 Jun 18; 319(1):264-74; Sioud M, Leirdal M., Potential design rules and enzymatic synthesis of siRNAs, Methods Mol Biol. 2004; 252:457-69; Levenkova N, Gu Q, Rux JJ.: Gene specific siRNA selector Bioinformatics. 2004 Feb 12; 20(3):430-2 and Ui-Tei K, Naito Y, Takahashi F, Haraguchi T, Ohki-Hamazaki H, Juni A, Ueda R, Saigo K., Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference Nucleic Acids Res. 2004 Feb 9; 32(3):936-48]을 참고한다. 또한, 문헌[Liu Y, Braasch DA, Nulf CJ, Corey DR. Efficient and isoform - selective inhibition of cellular gene expression by peptide nucleic acids Biochemistry, 2004 Feb 24; 43(7): 1921-7]을 참고한다. 또한, 변형된/보다 안정한 siRNA의 제조를 위해서는 PCT 공개공보 WO 제2004/015107(아투겐(Atugen)), WO 제02/44321호(투슬(Tuschl) 등), 및 문헌[Chiu YL, Rana TM. siRNA function in RNA: a chemical modification analysis, RNA 2003 Sep; 9(9): 1034-48], 미국 특허 US 제5,898,031호 및 제6,107,094호(크룩(Crook))을 참고한다.
세포내에서 siRNA를 발생시킬 수 있는 DNA-함유 벡터가 개발되어 왔다. 방법은 일반적으로 세포내에서 siRNA를 형성하도록 효율적으로 프로세싱된 짧은 머리핀 RNA의 전사를 포함한다. 문헌[Paddison 등, PNAS 2002, 99:1443-1448; Paddison 등, Genes & Dev 2002, 16:948-958; Sui 등. PNAS 2002, 8:5515-5520; 및 Brummelkamp 등, Science 2002, 296:550-553]을 참고한다. 이들은 수많은 내생적으로 및 외생적으로 발현된 유전자를 특이적으로 표적으로 할 수 있는 siRNA를 생성시키는 방법을 기술하고 있다.
siRNA의 전달에 대하여는 예컨대, 문헌[Shen 등, FEBS letters 539:111-114(2003); Xia 등, Nature Biotechnology 20:1006-1010(2002), Reigh 등, Molecular Vision 9:210-216 (2003); Sorensen 등, J. Mol. Biol. 327:761-766(2003); Lewis 등, Nature Genetics 32:107-108(2002); 및 Simeoni 등, Nucleic Acids Research 31, 11:2717-2724(2003)]을 참고한다. siRNA가 최근에 영장류에서의 억제에 성공적으로 사용되었으며, 추가적인 상세한 설명에 대하여는 문헌[Tolentino 등, Retina 24(1) February 2004 pp 132-138]을 참고한다.
본 발명의 siRNA
본 발명의 siRNA 의 일반적인 설명
일반적으로, 본 발명에서 사용되는 siRNA는 이중가닥 구조를 포함하는 리보핵산을 포함하며, 여기에서 이중가닥 구조는 제 1 가닥과 제 2 가닥을 포함하고, 제 1 가닥은 접촉 뉴클레오타이드의 제 1 연신부를 포함하고, 상기 제 1 연신부는 표적 핵산에 적어도 부분적으로 상보적이며, 제 2 가닥은 접촉 뉴클레오타이드의 제 2 연신부를 포함하고, 상기 제 2 연신부는 표적 핵산에 적어도 부분적으로 동일하며, 상기 제 1 가닥 및/또는 상기 제 2 가닥은 2'-위치에서 변형이 이루어진 변형된 뉴클레오타이드 기 다수를 포함하고, 가닥내에서 각각의 변형된 뉴클레오타이 드 기는 뉴클레오타이드의 인접기(flanking group)에 의해 한면 또는 양쪽면에서 인접해있으며, 뉴클레오타이드의 인접 기를 형성하는 인접한 뉴클레오타이드는 비변형 뉴클레오타이드 또는 변형된 뉴클레오타이드의 변형과는 상이한 변형물을 갖는 뉴클레오타이드이다. 또한, 상기 제 1 가닥 및/또는 상기 제 2 가닥은 상기 다수의 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 상기 변형된 뉴클레오타이드 기 다수를 포함할 수 있다.
변형된 뉴클레오타이드 기 및/또는 인접 뉴클레오타이드 기는 수많은 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 여기에서 개수는 1개 내지 10개의 뉴클레오타이드를 포함하는 군으로부터 선택된다. 본원에서 명시한 임의의 범위와 관련하여, 각각의 범위는 상기 범위를 한정하는 상기 2개 숫자를 비롯하여, 범위를 한정하는데 사용되는 각각의 숫자 사이의 임의의 개별 정수를 기술하는 것으로 이해하여야 한다. 따라서, 본 경우에 상기 기는 1개 뉴클레오타이드, 2개 뉴클레오타이드, 3개 뉴클레오타이드, 4개 뉴클레오타이드, 5개 뉴클레오타이드, 6개 뉴클레오타이드, 7개 뉴클레오타이드, 8개 뉴클레오타이드, 9개 뉴클레오타이드 및 10개 뉴클레오타이드를 포함한다.
상기 제 1 가닥의 변형된 뉴클레오타이드의 패턴은 상기 제 2 가닥의 변형된 뉴클레오타이드의 패턴과 동일할 수 있으며, 상기 제 2 가닥의 패턴과 함께 정렬될 수 있다. 추가적으로, 상기 제 1 가닥의 패턴은 상기 제 2 가닥의 패턴에 대하여 하나 이상의 뉴클레오타이드만큼 이동할 수 있다.
상기 개시된 변형은 아미노, 플루오로, 메톡시, 알콕시 및 알킬을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
siRNA의 이중가닥 구조는 한측 또는 양측에서 둔단(blunt end)일 수 있다. 더욱 구체적으로, 이중가닥 구조는 제 1 가닥의 S'-말단 및 제 2 가닥의 3'-말단에 의해 정의되는 이중가닥 구조 측면에서 둔단이거나, 이중가닥 구조는 제 1 가닥의 3'-말단 및 제 2 가닥의 5'-말단에 의해 정의되는 이중가닥 구조 측면에서 둔단일 수 있다.
추가적으로, 2개 가닥중 하나 이상이 5'-말단에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 돌출물(overhang)을 가질 수 있으며, 상기 돌출물은 하나 이상의 디옥시리보뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다. 하나 이상의 가닥이 또한 3'-말단에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 돌출물을 임의로 가질 수 있다.
siRNA의 이중가닥 구조의 길이는 전형적으로 약 17 내지 약 21개, 더욱 바람직하게는 18 또는 19개 염기이다. 또한, 상기 제 1 가닥의 길이 및/또는 제 2 가닥의 길이는 서로 독립적으로 약 15 내지 약 23개 염기, 17 내지 21개 염기, 및 18 또는 19개 염기 범위를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
추가로, 상기 제 1 가닥과 표적 핵산간의 상보성은 완전할 수 있거나, 또는 제 1 가닥과 표적 핵산간에 형성된 이중체(duplex)는 상기 이중가닥 구조를 형성하는 상기 제 1 가닥과 표적 핵산 사이에는 1개의 불일치 또는 2개의 불일치가 있는 15개 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
몇몇 경우에 제 1 가닥과 제 2 가닥 둘다는 각각 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드 기 및 하나 이상의 뉴클레오타이드 인접 기를 포함할 수 있으며, 각각의 변형된 뉴클레오타이드 기는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하고, 각각의 뉴클레오타이드 인접 기는 제 1 가닥의 변형된 뉴클레오타이드 기 각각이 제 2 가닥상의 뉴클레오타이드의 인접 기와 정렬되어 있는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하며, 대부분의 제 1 가닥 말단 S' 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드 기의 뉴클레오타이드이며, 대부분의 제 2 가닥 말단 3' 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 인접 기의 뉴클레오타이드이다. 변형된 뉴클레오타이드 각각의 기는 단일 뉴클레오타이드로 이루어질 수 있고/있거나 뉴클레오타이드 각각의 인접 기는 단일 뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다.
추가로, 제 1 가닥상에서 뉴클레오타이드 인접 기를 형성하는 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드 기를 형성하는 뉴클레오타이드에 대하여 3' 방향으로 배열된 비변형 뉴클레오타이드이며, 제 2 가닥상에서 변형된 뉴클레오타이드 기를 형성하는 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 인접 기를 형성하는 뉴클레오타이드에 대하여 5' 방향으로 배열된 변형된 뉴클레오타이드인 것이 가능하다.
추가로, siRNA의 제 1 가닥은 변형된 뉴클레오타이드 기 8 내지 12개, 바람직하게는 9 내지 11개를 포함할 수 있고, 제 2 가닥은 변형된 뉴클레오타이드 기 7 내지 11개, 바람직하게는 8 내지 10개를 포함할 수 있다.
제 1 가닥과 제 2 가닥은 특히 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비핵산 중합체로 구성될 수 있는 고리(loop) 구조에 의해 연결될 수 있다. 다르게, 고리 구조는 핵산으로 구성될 수 있다.
또한, siRNA의 제 1 가닥의 5'-말단은 제 2 가닥의 3'-말단에 연결될 수 있 거나, 제 1 가닥의 3'-말단은 제 2 가닥의 5'-말단에 연결될 수 있으며, 상기 연결은 전형적으로 10 내지 2000개 핵염기 길이를 갖는 핵산 링커에 의한다.
본 발명의 siRNA 의 구체적인 설명
본 발명은 하기 구조식 1의 구조를 갖는 화합물을 제공한다:
[구조식 1]
5' (N)x-Z 3' (안티센스 가닥)
3' Z'-(N')y 5' (센스 가닥)
상기 식에서,
N 및 N'은 각각 당 잔기에서 변형되거나 변형되지 않을 수 있는 리보뉴클레오타이드이고;
(N)x 및 (N')y는 각각 각각의 연속적인 N 또는 N'이 공유 결합에 의해 다음 N 또는 N'에 연결된 올리고머이고;
x와 y는 각각 19 내지 40의 정수이고;
Z 및 Z'은 각각 존재하거나 존재하지 않을 수 있으나, 존재하는 경우에는 dTdT이고, 존재하는 경우에는 그 가닥의 3' 말단에서 공유 결합되고;
(N)x 서열은 RTP801 유전자의 cDNA에 대한 안티센스 서열을 포함한다.
구체적으로, 본 발명은 (N)x 서열이 표 A, B 및 C에서 제공하는 하나 이상의 안티센스 서열을 포함하는 상기 화합물을 제공한다.
특히, 본 발명은, 공유 결합이 포스포다이에스테르 결합이고, x와 y가 동일하고, 바람직하게 x 및 y가 19이고, Z 및 Z'가 둘다 존재하지 않고, 하나 이상의 리보뉴클레오타이드가 2' 위치의 당 잔기에서 변형되고, 2' 위치의 잔기가 메톡시(2'-O-메틸)이며, 교대로 있는 리보뉴클레오타이드가 안티센스 및 센스 가닥 둘다에서 변형되고, 안티센스 가닥의 5' 및 3' 말단의 리보뉴클레오타이드가 당 잔기에서 변형되고, 센스 가닥의 5' 및 3' 말단의 리보뉴클레오타이드가 당 잔기에서 변형되지 않은 상기 화합물을 제공한다.
특히, 본 발명에서 사용되는 siRNA는 하나의 가닥이 5'으로부터 3'으로 SEQ ID NOs:3 내지 52, SEQ ID NOs:103 내지 174 또는 SEQ ID NOs:247 내지 295(센스 가닥)에 기재된 서열을 가지며 다수의 염기가 바람직하게는 2'-O-메틸 변형에 의해 변형될 수 있는 연속된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고리보뉴클레오타이드, 또는 2개 이하의 뉴클레오타이드의 각각의 말단 영역에서 하나의 염기가 변경되는 상동체이다.
또한, 본 발명은 상기 구조식 1의 화합물(상기 언급된 임의의 특징을 가짐)을 포함하는 약학 조성물을 환자에게 치료적 유효량으로 투여하고, 그 결과 환자를 치료하는 것을 포함하는, 호흡 장애, 눈 질환, 미세혈관 장애, 또는 척수 손상 또는 질환을 앓는 환자의 치료 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 호흡 장애, 눈 질환, 미세혈관 장애, 또는 척수 손상 또는 질환을 앓는 환자의 회복을 촉진하기 위한 약물을 제조하는데 있어서 치료적 유효량의 상기 구조식 1의 화합물(상기 언급된 임의의 특징을 가짐)의 용도를 제공한다.
본 발명의 추가적인 측면은 본원에 언급된 임의의 질환 및 증상을 치료하기 위한 상기 구조식 1의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 또한, 상기 측면은, 본원에 언급된 임의의 질환 및 증상을 치료하기 위하여 상기 구조식 1의 화합물 둘 이상을 포함하고, 상기 2개 화합물이 동등하거나 또는 다르게 유리한 활성을 발생시키는 양으로 약학 조성물중에 물리적으로 혼합될 수 있거나 공유 결합 또는 비공유 결합되거나 2 내지 100개, 바람직하게는 2 내지 50개 또는 2 내지 30개 뉴클레오타이드에 이르는 길이의 핵산 링커에 의해 연결될 수 있는 약학 조성물을 제공한다. 따라서, 상기 siRNA 분자는 본원에 기재된 바와 같은 이중가닥 핵산 구조로 구성되고, 표 A 내지 C, 바람직하게는 표 A의 ID NOs: 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 및 50으로부터 선택된 2개의 siRNA 서열이 공유 또는 비공유 결합되거나 링커에 의해 연결되어서 일렬(tandem) siRNA 분자를 형성할 수 있다. 2개의 siRNA 서열을 포함하는 상기 일렬 siRNA 분자는 전형적으로 38개 내지 150개, 더욱 바람직하게는 38개 또는 40개 내지 60개 뉴클레오타이드 길이이며, 2개보다 많은 siRNA 서열이 일렬 분자에 포함되는 경우에는 더 길게 된다. 내부 세포 프로세싱에 의해 생성된 siRNA, 예컨대 긴 dsRNA를 부호화하는 2개 이상의 보다 긴 서열로 구성된 보다 긴 일렬 분자가 또한 2개 이상의 shRNA를 부호화하는 일렬 분자로서 착안된다. 상기 일렬 분자가 또한 본 발명의 일부인 것으로 간주되며, 이에 대한 추가적인 정보가 하기에 제시되어 있다.
상기 결합된 또는 일렬의 구조는 각각의 siRNA의 독성 및/또는 표적 이탈 효과가 최소화되는 반면 효능이 증가되는 이점을 갖는다.
특히, 실시예에서 사용되는 siRNA는 2'-O-Me 기가 안티센스 가닥의 제 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19번째 뉴클레오타이드에 존재하고, 아주 동일한 변형물인 2'-O-Me 기가 센스 가닥의 제 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 및 18번째 뉴클레오타이드에 존재하도록 변형되었다. 추가적으로, 본 발명에 따르는 특정한 핵산의 경우에는 제 1 연신부가 제 1 가닥과 동일하고 제 2 연신부가 제 2 가닥과 동일하며, 상기 핵산이 둔단임을 유념하도록 한다. siRNA는 인산화되지만, 인산화되지 않은 변형물이 대규모로 제조하기에 보다 간편할 것으로 추측되며, REDD-14NP라고 불리우는 상기 인산화되지 않은 REDD14는 CNV 모델에서 REDD-14만큼 생물학적 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다(실시예 6 참고). 실시예 6 내지 8의 실험에서 사용된 상기 siRNA의 서열은 내부 참조번호 14(표 A 참고)를 갖는 서열인 REDD14의 서열이다.
올리고뉴클레오타이드의 말단 영역은 19-mer 서열의 1 내지 4 및/또는 16 내지 19 염기(하기 표 A 및 B 참고), 및 21-mer 서열의 1 내지 4 및/또는 18 내지 21 염기(하기 표 C 참고)를 말한다.
추가적으로, 본 발명에서 사용되는 siRNA는 한 가닥이 5'으로부터 3'으로 SEQ ID NOs: 53 내지 102, SEQ ID NOs: 175 내지 246 또는 SEQ ID NOs: 296 내지 344(안티센스 가닥)에 기재된 서열을 갖는 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고리보뉴클레오타이드, 또는 각각의 말단 영역의 2개 이하의 뉴클레오타이드에서 하나의 염기가 변경된 상동체이다. 따라서, 특정한 측면에서, 올리고뉴클레오타이드는 이중가닥 구조를 포함하고, 상기 이중가닥 구조는 제 1 가닥과 제 2 가닥을 포 함하며, 제 1 가닥은 접촉 뉴클레오타이드의 제 1 연신부를 포함하고, 제 2 가닥은 접촉 뉴클레오타이드의 제 2 연신부를 포함하며, 제 1 연신부는 RTP801 유전자를 부호화하는 핵산 서열과 상보성이거나 동일하며 제 2 연신부는 RTP801을 부호화하는 핵산 서열과 동일하거나 상보성이다. 상기 제 1 연신부는 14개 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 18개 이상의 뉴클레오타이드, 더 더욱 바람직하게는 19개의 뉴클레오타이드, 심지어는 21개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 한 양태에서, 제 1 연신부는 약 14개 내지 40개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 약 18개 내지 30개 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 약 19개 내지는 27개 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 약 19개 내지 23개 뉴클레오타이드를 포함한다. 한 양태에서, 제 2 연신부는 약 14개 내지 40개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 약 18개 내지 30개 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 약 19개 내지 27개 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 약 19개 내지 23개 뉴클레오타이드, 심지어는 약 19개 내지 약 21개 뉴클레오타이드를 포함한다. 한 양태에서, 제 1 연신부의 제 1 뉴클레오타이드는 RTP801을 부호화하는 핵산 서열의 뉴클레오타이드에 상응하며, 제 1 연신부의 마지막 뉴클레오타이드는 RTP801을 부호화하는 핵산 서열의 뉴클레오타이드에 상응한다. 한 양태에서, 제 1 연신부는 올리고뉴클레오타이드의 14개 이상의 접촉 뉴클레오타이드의 서열을 포함하고, 상기 올리고뉴클레오타이드는 SEQ.ID.NOs:3 내지 344를 포함하는 군, 바람직하게는 표 A의 일련번호 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 및 50의 임의의 서열을 갖는 올리고리보뉴클레오타이드를 포함하는 군으로부터 선택된다. 추가적으로, 본 발명에 사용된 siRNA의 상세한 설명은 다이뉴클레 오타이드 dTdT가 3' 말단에 공유 결합되고/되거나 하나 이상의 뉴클레오타이드에서 당 잔기가 가능하게는 2'-O-메틸 변형을 포함한 변형물에 의해 변형된 올리고리보뉴클레오타이드를 제공할 수 있다. 추가로, 2'-OH 기는 -H-OCH3, -OCH2CH3, -OCH2CH2CH3, -NH2 및 F를 포함하는 군으로부터 선택된 기 또는 잔기에 의해 대체될 수 있다. 또한, 상기에 개시된 바와 같이 본 발명의 바람직한 화합물은 인산화되거나 인산화되지 않을 수 있다.
추가적으로, 본 발명에서 사용된 siRNA는 교대로 있는 뉴클레오타이드에서 변형된 당이 양쪽 가닥에 위치해 있는 올리고리보뉴클레오타이드일 수 있다. 특히, 올리고리보뉴클레오타이드는 당이 말단 5' 및 3' 뉴클레오타이드에서 변형되지 않는 센스 가닥 1개 또는 당이 5' 및 3' 뉴클레오타이드 말단에서 변형된 안티센스 가닥 1개를 포함할 수 있다.
추가적으로, 본 발명에서 사용하려는 그 밖의 핵산은 SEQ.ID.NOs. 3 내지 344중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 14개 이상, 더욱 바람직하게는 상기 기재된 바와 같이 제 1 연신부 및 제 2 연신부으로 구성된 이중가닥 구조의 임의의 말단에서 14개의 접촉 뉴클레오타이드 염기쌍을 포함한다. 본 발명에 따른 핵산의 가능한 길이, 특히 본 발명에 따른 상기 핵산을 형성하는 각각의 연신부의 가능한 길이가 주어지는 경우, 각 측면에 대해 SEQ.ID.NO:1에 기재된 바와 같이 RTP801 유전자의 부호화 서열에 대한 약간의 이동이 가능하고, 상기 이동은 양 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 및 6개 뉴클레오타이드까지만큼 일어날 수 있고, 이와 같이 생 성된 이중가닥 핵산 분자는 본 발명의 범위에 있음을 당업계의 숙련자들은 이해해야 한다.
본 발명의 추가적인 측면은 이중가닥 구조를 포함하는 기능성 핵산에 관한 것이고, 상기 이중가닥 구조는 제 1 가닥과 제 2 가닥을 포함하며, 제 1 가닥은 접촉 뉴클레오타이드의 제 1 연신부를 포함하고, 제 2 가닥은 접촉 뉴클레오타이드의 제 2 연신부를 포함하며, 제 1 연신부는 RTP801을 부호화하는 핵산 서열에 상보적이거나 동일하고, 제 2 연신부는 RTP801을 부호화하는 핵산 서열에 동일하거나 상보적이다.
한 양태에서, 상기 핵산은 RTP801을 하향 조절하고, RTP801의 하향 조절은 RTP801 기능의 하향 조절, RTP801 단백질의 하향 조절 및 RTP801 mRNA 발현의 하향 조절을 포함하는 군으로부터 선택된다.
한 양태에서 제 1 연신부는 14개 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 18개 이상의 뉴클레오타이드, 더 더욱 바람직하게는 19개의 뉴클레타이드를 포함한다.
한 양태에서, 제 1 연신부는 약 14개 내지 40개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 약 18개 내지 30개의 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 약 19개 내지 27개의 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 약 19개 내지 23개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
한 양태에서, 제 2 연신부는 약 14개 내지 40개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 약 18개 내지 30개의 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 약 19개 내지 27개의 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 약 19개 내지 23개의 뉴클레오타이드를 포 함한다.
한 양태에서, 제 1 연신부의 제 1 뉴클레오타이드는 RTP801을 부호화하는 핵산 서열의 뉴클레오타이드에 상응하고, 제 1 연신부의 마지막 뉴클레오타이드는 RTP801을 부호화하는 핵산 서열의 뉴클레오타이드에 상응한다.
한 양태에서, 하나의 연신부는 핵산 서열중 14개 이상의 접촉 뉴클레오타이드의 서열을 포함하고, 상기 핵산 서열은 표 A 내지 C에 기재된 서열, 바람직하게는 SEQ.ID.NOs: 53, 66, 67, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 91, 92, 93, 94, 96, 101 및 102를 포함하는 군, 더욱 바람직하게는 SEQ.ID.NOs: 66, 75, 79, 91, 94, 101 및 102를 포함하는 군, 가장 바람직하게는 SEQ.ID.NOs: 66, 74, 75 및 79를 포함하는 군으로부터 선택된다.
한 양태에서, 다른 연신부는 핵산 서열중 14개 이상의 접촉 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 핵산 서열은 표 A 내지 C에 기재된 서열, 바람직하게는 SEQ.ID.NOs: 3, 16, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 51 및 52를 포함하는 군, 더욱 바람직하게는 SEQ.ID.NOs: 16, 24, 25, 29, 41, 44, 51 및 52를 포함하는 군, 가장 바람직하게는 SEQ.ID.NOs: 16, 24, 25 및 29를 포함하는 군으로부터 선택된다.
한 양태에서, 제 1 연신부는 SEQ.ID.NO: 53에 따르는 서열을 갖고 제 2 연신부는 SEQ.ID.NO: 3에 따르는 서열을 가지며; 제 1 연신부는 SEQ.ID.NO: 66에 따르는 서열을 갖고 제 2 연신부는 SEQ.ID.NO: 16에 따르는 서열을 가지며; 제 1 연신부는 SEQ.ID.NO: 67에 따르는 서열을 갖고 제 2 연신부는 SEQ.ID.NO: 17에 따르는 서열을 가지며; 제 1 연신부는 SEQ.ID.NO: 72에 따르는 서열을 갖고 제 2 연신부는 SEQ.ID.NO: 22에 따르는 서열을 가지며; 제 1 연신부는 SEQ.ID.NO: 73에 따르는 서열을 갖고 제 2 연신부는 SEQ.ID.NO: 23에 따르는 서열을 가지며; 제 1 연신부는 SEQ.ID.NO: 74에 따르는 서열을 갖고 제 2 연신부는 SEQ.ID.NO: 24에 따르는 서열을 가지며; 제 1 연신부는 SEQ.ID.NO: 75에 따르는 서열을 갖고 제 2 연신부는 SEQ.ID.NO: 25에 따르는 서열을 가지며; 제 1 연신부는 SEQ.ID.NO: 76에 따르는 서열을 갖고 제 2 연신부는 SEQ.ID.NO: 26에 따르는 서열을 가지며; 제 1 연신부는 SEQ.ID.NO: 77에 따르는 서열을 갖고 제 2 연신부는 SEQ.ID.NO: 27에 따르는 서열을 가지며; 제 1 연신부는 SEQ.ID.NO: 79에 따르는 서열을 갖고 제 2 연신부는 SEQ.ID.NO: 29에 따르는 서열을 가지며; 제 1 연신부는 SEQ.ID.NO: 91에 따르는 서열을 갖고 제 2 연신부는 SEQ.ID.NO: 41에 따르는 서열을 가지며; 제 1 연신부는 SEQ.ID.NO: 92에 따르는 서열을 갖고 제 2 연신부는 SEQ.ID.NO: 42에 따르는 서열을 가지며; 제 1 연신부는 SEQ.ID.NO: 93에 따르는 서열을 갖고 제 2 연신부는 SEQ.ID.NO: 43에 따르는 서열을 가지며; 제 1 연신부는 SEQ.ID.NO: 94에 따르는 서열을 갖고 제 2 연신부는 SEQ.ID.NO: 44에 따르는 서열을 가지며; 제 1 연신부는 SEQ.ID.NO: 95에 따르는 서열을 갖고 제 2 연신부는 SEQ.ID.NO: 45에 따르는 서열을 가지며; 제 1 연신부는 SEQ.ID.NO: 96에 따르는 서열을 갖고 제 2 연신부는 SEQ.ID.NO: 46에 따르는 서열을 가지며; 제 1 연신부는 SEQ.ID.NO: 101에 따르는 서열을 갖고 제 2 연신부는 SEQ.ID.NO: 51에 따르는 서열을 가지며; 제 1 연신부는 SEQ.ID.NO: 102에 따르는 서열을 갖고 제 2 연신부는 SEQ.ID.NO: 52에 따르는 서열 을 갖는다.
한 양태에서, 제 1 연신부는 SEQ.ID.NOs: 53, 66, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 79, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 101 및 102를 포함하는 군으로부터 선택된 핵산 서열을 갖는다.
"제 1" 및 "제 2" 연신부란 용어는 본 발명의 핵산과 관련하여 사용되지만, 이들은 단지 편의상 사용되는 것이며, 하나의 연신부가 RTP801 유전자의 부호화 서열의 일부에 대하여 안티센스이어야 하는 안티센스 가닥에 포함되어 있고 다른 가닥이 안티센스 가닥에 상보성이어야 하는(비록 100% 상보성이 아니더라도) 센스 가닥에 포함되어 있기만 하다면, X 서열을 갖는 제 1 연신부 및 Y 서열을 갖는 제 2 연신부를 갖는 것으로 기재된 본 발명의 임의의 핵산 분자는 Y 서열을 갖는 제 1 연신부 및 X 서열을 갖는 제 2 연신부를 갖는 것으로도 마찬가지로 기재될 수 있음을 이해해야 하며, 이들 전부는 본원에 제공된 정의 및 설명을 따른다.
한 양태에서, 제 1 및/또는 제 2 가닥은 RTP801을 부호화하는 핵산 서열의 동종 뉴클레오타이드에 상보성이거나 동일한 하나 이상의 돌출 뉴클레오타이드를 3' 말단에서 포함한다.
한 양태에서, 제 1 및/또는 제 2 가닥은 3' 말단에서 1 내지 15개의 돌출 뉴클레오타이드를 포함하며, 바람직하게 제 1 및/또는 제 2 가닥은 3' 말단에서 1 내지 10개의 돌출 뉴클레오타이드를 포함하고, 더욱 바람직하게 제 1 및/또는 제 2 가닥은 3' 말단에서 1 내지 5개의 돌출 뉴클레오타이드를 포함하고, 가장 바람직하게 제 1 및/또는 제 2 가닥은 3' 말단에서 1개 또는 2개의 돌출 뉴클레오타이드를 포함한다.
한 양태에서, 제 1 및/또는 제 2 가닥은 RTP801을 부호화하는 핵산 서열의 동종 뉴클레오타이드와 상이한 하나 이상의 돌출 뉴클레오타이드를 포함한다.
한 양태에서, 제 1 가닥은 RTP801을 부호화하는 핵산 서열의 동종 뉴클레오타이드와 상이한 2개의 돌출 뉴클레오타이드를 포함한다.
한 양태에서, 제 1 가닥은 단지 제 1 연신부로만 이루어진다.
한 양태에서, 제 2 가닥은 단지 제 2 연신부로만 이루어진다.
한 양태에서, 제 1 연신부 및/또는 제 1 가닥은 리보뉴클레오타이드를 포함한다.
한 양태에서, 제 2 연신부 및/또는 제 2 가닥은 리보뉴클레오타이드를 포함한다.
한 양태에서, 제 1 연신부 및/또는 제 2 가닥은 리보뉴클레오타이드로 이루어진다.
한 양태에서, 뉴클레오타이드의 일부 또는 전부가 변형된다.
바람직한 양태에서, 상기 변형은 뉴클레오타이드의 핵염기 잔기, 뉴클레오타이드의 당 잔기 및/또는 뉴클레오타이드의 포스페이트 잔기에 관련된다.
더욱 바람직한 양태에서, 변형은 당 잔기의 변형이고, 변형은 2' 위치에서의 변형이고, 2'-OH 기는 -H-OCH3, -OCH2CH3, -OCH2CH2CH3, -NH2 및 F를 포함하는 군으로부터 선택된 기 또는 잔기에 의해 대체된다.
한 양태에서, 변형은 핵염기 잔기의 변형이고, 변형물 또는 변형된 핵 염기는 인오신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸, 2-프로필 및 다른 알킬아데닌, 5-할로 우라실, 5-할로시토신, 5-할로 시토신, 6-아자시토신, 6-아자 티민, 수도-우라실, 4-티오우라실, 8-할로 아데닌, 8-아미노아데닌, 8-티올 아데닌, 8-티오알킬 아데닌, 8-하이드록실 아데닌 및 다른 8-치환된 아데닌, 8-할로 구아닌, 8-아미노 구아닌, 8-티올 구아닌, 8-티오알킬 구아닌, 8-하이드록실구아닌 및 다른 치환된 구아닌, 다른 아자- 및 디아자 아데닌, 다른 아자- 및 디아자 구아닌, 5-트리플루오로메틸 우라실 및 5-트리플루오로 시토신을 포함하는 군으로부터 선택된다.
한 양태에서, 변형은 포스페이트 잔기의 변형이고, 이 때 변형된 포스페이트 잔기는 포스포티오에이트를 포함하는 군으로부터 선택된다.
한 양태에서, 제 1 연신부 및/또는 제 2 연신부는 2' 위치에서 변형을 갖는 변형된 뉴클레오타이드 기를 다수 포함하며, 이 때 연신부내에는 변형된 뉴클레오타이드 기 각각이 뉴클레오타이드의 인접 기에 의해 한측 또는 양측에 인접하게 되고, 뉴클레오타이드의 인접 기를 형성하는 인접 뉴클레오타이드는 비변형 뉴클레오타이드이거나 변형된 뉴클레오타이드의 변형과는 상이한 변형을 갖는 뉴클레오타이드이다.
바람직한 양태에서, 제 1 연신부 및/또는 제 2 연신부는 리보뉴클레오타이드로 이루어진다.
더욱 바람직한 양태에서, 제 1 및 제 2 연신부는 변형된 뉴클레오타이드 기 를 다수 포함한다.
한 양태에서, 제 1 연신부는 상기 변형된 뉴클레오타이드 기를 다수 포함한다.
한 양태에서, 제 2 연신부는 상기 변형된 뉴클레오타이드 기를 다수 포함한다.
한 양태에서, 변형된 뉴클레오타이드 기 각각 및/또는 접촉 뉴클레오타이드 기 각각은 수많은 뉴클레오타이드를 포함하고, 이 때 그 개수는 1개 뉴클레오타이드 내지 10개 뉴클레오타이드를 포함하는 군으로부터 선택된다.
한 양태에서, 제 1 연신부는 변형된 뉴클레오타이드의 제 1 패턴을 포함하고, 제 2 연신부는 변형된 뉴클레오타이드의 제 2 패턴을 포함한다.
한 양태에서, 제 1 패턴은 제 2 패턴과 동일한 패턴이다.
또 다른 양태에서, 제 1 패턴은 제 2 패턴과 정렬된다.
바람직한 양태에서, 제 1 패턴은 제 2 패턴에 대해 하나 이상의 뉴클레오타이드만큼 이동한다.
한 양태에서, 변형된 뉴클레오타이드 기 각각은 하나의 변형된 뉴클레오타이드로 이루어지고, 접촉 뉴클레오타이드 기 각각은 하나의 비변형 뉴클레오타이드, 또는 변형된 뉴클레오타이드의 변형과는 상이한 변형을 갖는 뉴클레오타이드로 이루어진다.
바람직한 양태에서, 변형된 뉴클레오타이드는 -OMe 기를 2'위치에서 갖는다.
바람직한 양태에서, 접촉 뉴클레오타이드는 2'-OH 기를 갖는 리보뉴클레오타 이드이다.
한 양태에서, 제 1 연신부는 5' 말단에서 변형된 뉴클레오타이드로 시작하고, 연신부중 하나 걸러 교대의 뉴클레오타이드가 또한 변형된 뉴클레오타이드인 반면, 제 2 뉴클레오타이드는 5' 말단에서 시작하며, 하나 걸러 교대의 뉴클레오타이드가 비변형 뉴클레오타이드, 또는 변형된 뉴클레오타이드의 변형과 상이한 변형을 갖는 뉴클레오타이드이다.
한 양태에서, 제 1 연신부는 RTP801을 부호화하는 핵산 서열에 대한 안티센스 배향으로 있다.
본 발명의 추가적인 측면은 본 발명의 제 1 측면에 따른 핵산 및/또는 본 발명의 제 2 측면에 따른 벡터, 및 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이고, 상기 조성물은 임의로는 전신 투여 또는 국소 투여용이다.
한 양태에서, 조성물은 종양 질환을 포함하는 군으로부터 선택되는 질환의 치료를 위한 것이다.
추가적인 측면에서, 본 발명의 근원을 이루는 문제점은 본 발명에 따른 핵산 및/또는 본 발명에 따른 벡터 및/또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자의 예방 및/또는 치료 방법에 의해 해결된다.
추가적인 양태에서, 본 발명에 따른 핵산 및/또는 본 발명에 따른 벡터는 약물의 제조를 위해 사용된다. 약물은 종양 질환을 포함하는 군으로부터 선택되는 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 것일 수 있다. 종양 질환은 고형 종양, PTEN 음성 종양을 포함한 전이 종양, 약물 내성을 갖는 종양, 및 RTP801 억제가 민감화를 위해 사용될 수 있는 종양을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 종양 질환은 후기 단계의 종양 질환일 수 있거나, 종양 억제제 음성인 세포를 포함할 수 있고, 상기 종양 억제제는 PTEN일 수 있다.
본 발명의 추가적인 측면은 a) RTP801을 하향 조절하는데 적합한 핵산을 설계 또는 스크리닝하는 단계; b) 본 발명의 상기 임의의 측면에 따른 핵산의 결함을 평가하는 단계, 및 c) a) 단계의 핵산 효과를 b) 단계의 핵산 효과와 비교하는 단계를 포함하는, RTP801을 하향 조절하는데 적합한 핵산을 설계 또는 스크리닝하는 방법에 의해 해결된다.
한 양태에서, 상기 효과는 RTP801의 하향 조절이다.
본 발명의 추가적인 측면은 본 발명에 따른 핵산의 민감제, 특히 질환 치료에 있어서 민감제로서의 용도이며, 상기 질환은 바람직하게는 종양을 포함하는 군, 더욱 특히는 화학요법 및/또는 방사선요법을 사용하는 치료에 대해 내성을 갖는 종양을 포함하는 군으로부터 선택된다. 본 발명의 핵산이 민감제로서 작용할 수 있는 추가적인 질환이 본원에 개시되어 있다.
본 출원은 RTP801에 특이적인 이중가닥 구조를 포함하는 핵산이 혈관형성/혈관계증식 및 혈관누출(기존의 혈관계 및 증식중인 혈관계 둘다로부터)을 억제하는 적합한 방법임을 기재하고 있다. 추가로, 본 출원은 (이론에 제한됨없이) 스트레스-유도성 단백질(저산소증, 산화 스트레성, 열 스트레스, ER 스트레스에 의한 유 도)인 RTP801이 에너지 불균형에 대한 세포의 미세-조율에 작용하는 인자라고 개시하고 있다. 따라서, 상기 이중가닥 핵산에 의한 RTP801의 억제는 스트레스성 조건에 기인한 세포자멸로부터 세포가 구제되어야 하는 임의의 질환(예컨대, 정상 세포사에 의해 수반되는 질환) 또는 RTP801 발현 변화에 기인한 스트레스성 조건에 적응한 세포(예컨대, 종양 세포)가 제거되어야 하는 임의의 질환의 치료에 적합하다. 후자의 경우에 상기 이중가닥 핵산을 통해 RTP801을 억제할 때, 저산소증 세포, 더욱 특히는 저산소증 암 세포에서 항-세포자멸 기능을 갖는 생존 인자는 비효과적으로 되며, RTP801-매개된 보호를 갖지 않는 세포는 세포자멸에 이르게 된다. 이는 다른 세포자멸 촉진 인자가 존재할 때에 추가로 발생할 수 있다. 상기 다른 세포자멸 촉진 인자는 특히 화학요법 및 방사선요법을 포함한다. 즉, 본 발명에 따른 이중가닥 핵산은 암 치료에서 단독으로 효과적일 수 있으며(단일 요법), 또한 보충 요법으로도 효과적일 수 있다.
상기 이중가닥 구조는 제 1 가닥과 제 2 가닥을 포함하며, 제 1 가닥은 접촉 뉴클레오타이드의 제 1 연신부를 포함하고, 제 2 가닥은 접촉 뉴클레오타이드의 제 2 연신부를 포함하며, 제 1 연신부는 RTP801을 부호화하는 핵산 서열에 상보적이거나 동일하며, 제 2 연신부는 RTP801을 부호화하는 핵산 서열에 동일하거나 상보적이다. 특히 RTP801을 상기 종류의 이중가닥 핵산에 대한 표적으로 사용함으로써, VEGF 항체와 같은 VEGF 억제제에 의해 사용된 경로와 비교할 때 다른 방식으로 혈관계 증식 및 발달, 및 혈관형성 각각에 관련된 연속 단계에서 표적을 즉각 어드레싱할 수 있다. 임의의 이론에 제한됨없이, 본 발명자들은 본 발명에 따른 핵산이 바람직하지 않은, 특히 저산소증-유도된 혈관형성 및/또는 혈관계의 증식 또는 발달이 발생하는 임의의 질환에 관련되거나 또는 그에 관련하여 관찰되는 배경을 제공하는 세포에서 그 기능을 발휘할 수 있다고 가정하였다. 이러한 이해는 RTP801 녹-아웃 마우스가 비-저산소증 증상하에서 야생형 마우스와 다른 임의의 표현형을 나타내지 않는다는 결과에 의해 지지된다. 예컨대, 종양 증식과 같은 질환에 걸린 조건에서 관찰되는 바와 같이 저산소증 유도시에만 RTP801 관련된 녹-아웃은 상기 종류의 질환을 앓는 인간에게서 관찰되는 것과 유사한 병리현상을 발생시킨다.
본 발명에 따른 핵산은 바람직하게는 기능성 핵산임을 이해한다. 본원에서 사용될 때 핵산이란 용어는 바람직하게는 임의의 hnRNA, mRNA 또는 임의의 다른 전사 생성물의 전사에 대한 주형으로서 세포에서 활성인 것과 상이한 기능을 갖는 핵산을 의미하고, 상기 hnRNA, mRNA 또는 임의의 다른 전사 생성물 각각, 또는 본 발명에 따른 핵산은 번역 과정, 바람직하게는 세포 번역 과정을 거쳐서 생물학적 활성 RTP801 단백질을 발생시킨다. 본원에서 바람직하게 사용될 때 기능성 핵산은 표적 핵산의 발현을 감소시킬 수 있는 것으로 인식하여야 한다. 더욱 바람직하게, 상기 감소는 표적 핵산의 전사후 유전자 침묵 과정에 근거한다. 더 더욱 바람직하게, 상기 감소는 RNA 간섭에 근거한다. 가장 바람직한 기능성 핵산의 형태는 siRNA 분자 또는 siRNA 분자와 동일한 효과를 갖는 그 밖의 임의의 분자이다. 상기 추가적인 분자는 siRNA, 합성 siRNA, shRNA 및 합성 shRNA를 포함하는 군으로부터 선택된다. 본원에서 사용될 때 siRNA는 추가적으로 발현벡터-유도된 siRNA를 포함할 수 있고, 이 때 발현 벡터는 바람직한 양태에서 아데노바이러스, 아데노관 련 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스와 같은 바이러스이다. 본원에서 사용될 때 shRNA는 바람직하게는 짧은 머리핀 RNA를 의미한다. 상기 shRNA는 합성으로 만들어질 수 있거나, 벡터 부호화된 발현 시스템, 바람직하게는 RNA 폴리머라아제 III 촉진자를 사용하여 생성될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에 따른 기능성 핵산은 바람직하게는 본원에서 표적이라고 지칭되는 RTP801, 및 표적 핵산으로서 상기 표적을 부호화하는 핵산에 관한 것임을 인식한다.
본원에서 바람직하게 사용될 때, 본 발명에 따른 핵산의 이중가닥 구조는 바람직하게는 염기성 설계를 갖는 핵산에 의해 제공된 제 1 연신부 및 제 2 연신부에 의해 생성되는 임의의 이중가닥 구조를 포함한다. 이중가닥 구조는 하나 이상의 불일치를 포함할 수 있다. 상기 이중가닥 구조는 왓슨-크릭-염기쌍 및/또는 훅스틴 염기쌍 및/또는 유사한 염기쌍 메카니즘에 의해 형성된다. 본 발명에 따른 핵산의 염기성 설계에 근거할 때, 하나의 연신부는 RTP801 또는 그의 일부를 부호화하는 핵산 서열에 대한 안티센스 배향으로 있는 반면, 다른 연신부는 RT801 또는 그의 일부를 부호화하는 핵산 서열에 대한 센스 배향으로 있는 것이 바람직하다. 이 때문에, 하나의 연신부는 RTP801 또는 그의 일부를 부호화하는 핵산 서열에 상보적이고, 다른 연신부는 RT801 또는 그의 일부를 부호화하는 핵산 서열에 동일하다. 이와 관련하여, 동일하다는 용어는 부분적으로 동일한 것도 당연히 의미하고, 상동성으로 표현될 때의 동일성은 80% 이상, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%임을 인식하여야 한다. 동일성의 정의와 유사하게, 상보성은 상동성의 측면에서 정의될 수 있으며, 상보성 가닥이 왓슨-크릭 염 기쌍 규칙에 따라 동일한 가닥으로 해독되는 경우에는 상기 상동성은 동일성과 동일한 범위에 있다. 다른 양태에서, 하나의 연신부는 RTP801 또는 그의 일부를 부호화하는 핵산 서열과 동일하고, 다른 연신부는 RTP801 또는 그의 일부를 부호화하는 핵산 서열과 상보적이다.
바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 핵산은 RTP801 기능을 하향 조절한다. RTP801 기능의 하향 조절은 바람직하게는 단백질 수준 및/또는 mRNA 수준에서의 발현 수준 감소에 의해 발생하며, 상기 감소된 발현 수준은 바람직하게는 단백질 수준에서 본 발명에 따른 핵산이 투여되지 않거나 기능적으로 활성화되지 않는 조건하에서의 발현에 비하여 5% 내지 100%일 수 있다. 바람직하게, 상기 조건은 발현 시스템, 바람직하게는 RTP801에 대한 발현 시스템의 조건 또는 그에 존재하는 조건이다. 상기 발현 시스템은 바람직하게는 생체외 번역 시스템일 수 있는 번역 시스템, 더욱 바람직하게는 세포, 기관 및/또는 생물이다. 생물이 다세포 생물, 더욱 바람직하게는 포유동물인 것이 더욱 바람직하며, 상기 포유동물은 바람직하게는 사람, 원숭이, 마우스, 래트, 기니아피그, 래빗, 고양이, 개, 양, 암소, 말, 소 및 돼지를 포함하는 군으로부터 선택된다. 하향 조절과 관련하여, 상기 하향 조절은 시간의 함수일 수 있어서, 즉, 하향 조절 효과는 본 발명에 따른 핵산 투여시 또는 그의 기능 활성화시에 반드시 즉시 관찰되어야 하는 것은 아니며, 시간 뿐만 아니라 공간에서도, 즉 다양한 세포, 조직 및/또는 기관에서 지연이 일어날 수 있음을 이해한다. 상기 지연은 5 내지 100%, 바람직하게는 10 내지 50% 범위일 수 있다. 당업계의 숙련자들은 장기간에서의 5% 감소는 단기간에서의 100% 감소만큼 효과적 일 수 있음을 인식할 것이다. 또한, 당업계의 숙련자들은 상기 지연이 실제로 사용되는 특정한 기능성 핵산 뿐만 아니라 표적 세포 모집단에도 크게 좌우되며, 따라서 궁극적으로는 본 출원의 기술적 교지에 따라 치료하고/거나 예방하려는 질환에 크게 좌우된다는 것을 인식할 것이다. 장기간에서의 5% 감소는 단기간에서의 100% 감소만큼 효과적일 수 있다. 또한, 당업계의 숙련자들은 상기 지연, 즉 RTP801에 의해 발휘되는 임의의 기능인 기능 지연, 단백질 발현의 지연 또는 mRNA 발현 수준에서의 지연이 상기 개략된 바와 같이 임의의 수준에서 발생할 수 있음을 인식하고 있다.
바람직한 양태에서, 제 1 연신부는 14개 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 14개의 접촉 뉴클레오타이드를 포함한다. 당업계의 숙련자들은 제 1 연신부가 RTP801을 부호화하는 핵산 서열, 더욱 구체적으로는 RTP801 발현이 감소되어야 하는 번역 시스템내에 존재하는 경우의 RTP801을 부호화하는 핵산에 특이적으로 어드레싱하기에 적합한 길이를 가짐을 인식할 것이다. 임의의 이론 또는 본 발명에 따르는 핵산의 임의의 작용 방식에 제한받으려는 것은 아니지만, 본 발명에 따른 핵산 및 RTP801을 부호화하는 핵산 서열간에 바람직하게는 전사 수준으로, 즉 RTP801을 부호화하는 각각의 핵산 서열로부터 mRNA의 발생시에 상호작용이 존재하는 것으로 보인다. 본 발명에 따르는 핵산의 임의의 서열이 번역 시스템의 게놈 또는 전사체에 포함된 서열과 동일하거나 상보적일 수 있는 가능성 때문에, RTP801을 부호화하는 핵산 및 본 발명에 따르는 핵산 가닥중 하나 사이에서 특정 종류의 염기 짝짓기가 실제로 발생한다는 가정하에서 제 1 연신부의 길이는 게놈 또는 전사체중에 서 다른 부호화 서열, 바람직하게는 다른 필수적인 부호화 서열이 아닌 RTP801을 부호화하는 서열만이 확실하게 상기 염기쌍에 대해 또는 그에 의해 어드레싱되도록 하는 길이이어야 한다. 상기 길이에 의해, 표적 이탈 효과의 발생이 감소될 수 있고, 바람직하게는 없어질 수 있다. 특이적으로 어드레싱하는 RTP801 및 그를 부호화하는 핵산 서열 종류의 엄격성을 증가시키기 위하여, 제 1 연신부는 바람직하게는 18개 또는 19개 이상의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 제 1 연신부 길이의 상한치는 바람직하게는 50개 미만의 뉴클레오타이드이지만, 길이는 상당히 더 길어질 수 있고, 100개, 200개 또는 심지어 500개 뉴클레오타이드 또는 그 사이의 임의의 길이를 포함할 수 있다. 이와는 별도로, 당업계의 숙련자들은 보다 짧은 제 1 연신부를 갖는 것을 선호하는데, 특히 본 발명에 따른 핵산이 화학적으로 합성되는 경우에는 서열이 보다 짧을수록 그의 합성에 소비되는 시간 및 원료가 감소되고, 부정확한 뉴클레오타이드가 각각의 서열에 삽입되는 비율이 더 낮아질 것이다. 제 1 연신부의 길이를 결정하는 것과 관련하여 고려해야할 또 다른 인자는 50개 이상의 뉴클레오타이드 길이에서는 전형적으로 비특이적인 인터페론 반응이 관찰될 수 있다는 사실이다. 상기 비특이적인 인터페론 반응 종류가 허용될 수 있는지 여부는 치료할 특정 증상에 따라 결정된다. 예컨대, 인터페론 반응 및/또는 인터페론 유전자의 발현이 병원성 세포로 제한될 수 있다면 인터페론 반응은 허용될 수 있다.
이러한 관점에서, 제 1 연신부의 더욱 바람직한 길이는 약 14개 내지 40개 뉴클레오타이드, 18개 내지 30개 뉴클레오타이드, 19개 내지 27개 뉴클레오타이드, 21개 내지 25개 뉴클레오타이드 및 19개 내지 23개 뉴클레오타이드이다.
제 1 연신부에 대해 상기 개략된 바와 같은 동일한 고려사항이 제 1 연신부와 관련하여 본원에 기재된 바와 같이 임의의 길이를 포함할 수 있는 제 2 연신부에 적용될 수 있다. 또한, 제 1 연신부의 길이가 제 2 연신부의 길이와 다른 경우도 본 발명의 범주내에 있으나, 연신부 둘다가 동일한 길이를 갖는 것이 바람직하다.
핵산의 염기성 설계에 따르면, 제 1 연신부와 제 2 연신부는 본 발명에 따르는 핵산의 제 1 가닥 및 제 2 가닥 각각의 일부이다. 각각의 말단, 즉 5' 말단 뿐만 아니라 3' 말단에서 제 1 가닥 및/또는 제 2 가닥은 하나 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 추가적인 뉴클레오타이드를 임의의 조합으로 포함할 수 있음을 인식하여야 한다.
이와 관련하여, 각각의 가닥에 상응하는 연신부의 말단을 지나가는 개별 가닥의 뉴클레오타이드가 사용되어서 연신부의 상보성 및 동일성 각각에 추가로 기여할 수 있으며, 그 결과 RTP801을 부호화하는 핵산 서열의 특이적 어드레싱에 추가로 기여할 수 있음을 인식한다.
기본적으로, 본원에서 제공된 기술적인 교지에 근거할 때, 본 발명에 따르는 핵산은 RTP801, 바람직하게는 RTP801의 발현이 감소되어야 하는 번역 시스템내의 RTP801을 부호화하는 핵산 서열의 임의의 부분에 어드레싱할 수 있음이 인식될 것이다. 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 특징을 갖는 임의의 핵산을 포함하며, 이 때 본 발명에 따르는 핵산의 상보적이고 동일한 가닥 및 연신부는 RTP801을 부 호화하는 핵산 서열의 임의의 뉴클레오타이드로부터 기본적으로 출발할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르는 핵산의 제 1 연신부가 RTP801을 부호화하는 핵산 서열에 상보적이라는 조건하에, 즉 그의 안티센스 가닥이거나 그에 대해 안티센스 배향으로 있다는 조건하에 상기 연신부의 제 1 뉴클레오타이드, 즉 대부분의 5' 말단 뉴클레오타이드는 3' 말단에서 RTP801을 부호화하는 서열의 마지막 뉴클레오타이드에 상응, 즉 정렬된다. 추가적인 양태에서, 안티센스 연신부의 길이가 주어진 경우 본 발명에 따르는 핵산의 안티센스 가닥이 RTP801을 부호화화는 핵산 서열에 상보적이 되도록 하는 마지막 위치에 도달할 때까지 상기 대부분의 5' 말단 뉴클레오타이드는 RTP801 등을 부호화화는 핵산의 끝에서 두 번째(penultimate) 뉴클레오타이드에 상응한다. 대부분의 5' 말단 뉴클레오타이드로부터 출발하여 RTP801을 부호화하는 핵산 서열을 스캐닝하고 본 발명에 따른 핵산의 염기성 설계에 추가하고 본 발명에 따르는 상기 핵산의 특징을 실현시킴으로써 생성될 수 있는 본 발명에 따르는 임의의 핵산이 본 발명의 범주내에 있다. 본 발명에 따르는 핵산의 상보성 및 동일성이 제 1 연신부 및 제 2 연신부 각각에 의해 제공되는 본원에 기재된 양태 뿐만 아니라 상기 상보성 및 동일성이 제 1 연신부 및 제 2 연신부를 각각 지나는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하여 각각 제 1 가닥 및 제 2 가닥의 일부가 되는 본원에 기재된 양태에도 동일한 고려사항이 적용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 본 발명에 따르는 다양한 핵산중에는 내부 참고번호 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 및 50(표 A 참고)을 갖는 것이 특히 바람직하다. 이와 관련하여, 인간, 및 래트 및/또는 마우스와 같은 동물 모델 둘다에 서 사용될 수 있는 본 발명에 따르는 핵산이 특히 유용함을 유념한다. 본 발명에 따르는 상기 특정한 핵산의 놀라운 이점은 인간 및 동물 모델 둘다에서 효과적이라는 사실에 있으며, 이는 동물 모델에서 얻어진 시험 결과가 즉시 동물 모델에서 인간으로 전해질 수 있으며, 더욱 특히는 본 발명에 따르는 핵산이 종 사이에서, 특히 동물 모델 시험에 사용된 종과 궁극적으로 바람직한 생물 또는 환자인 인간간에 차이를 갖는 서열을 포함하도록 설계된 경우에 달리 필요할 수 있는 인간 서열에 대한 임의의 변화를 줄 필요가 없음을 의미한다.
그러나, SEQ.ID.NOs. 3, 16 및 17, 22 내지 27, 29, 41 내지 46, 51 내지 53, 66 및 67, 72 내지 77, 79, 91 내지 96 및 101 및 102 및 내부 참고번호 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 및 50을 갖는 본 발명에 따르는 핵산 분자를 발생시키는 각각의 조합물에 따르는 임의의 서열이 본 발명에 따르는 추가적인 핵산에 단지 부분적으로 포함된 경우도 본 발명에 포함된다. 바람직하게, 본 발명에 따르는 추가적인 핵산은 SEQ.ID.NOs. 3, 16 및 17, 22 내지 27, 29, 41 내지 46, 51 내지 53, 66 및 67, 72 내지 77, 79, 91 내지 96 및 101 및 102의 14개 이상의 접촉 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 상기 표에 개략된 바와 같이 제 1 연신부 및 제 2 연신부으로 구성된 이중가닥 구조의 임의의 말단에 14개의 접촉 뉴클레오타이드 염기쌍을 포함한다. 당업계의 숙련자들은 본 발명에 따르는 핵산의 가능한 길이, 특히 본 발명에 따르는 상기 핵산을 형성하는 개개의 연신부의 가능한 길이가 일정한 경우에 각 측면으로 RTP801의 부호화 서열에 대한 약간의 이동이 가능하며, 이 때 상기 이동은 양 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 및 6개 뉴클레오타이드만 큼 이루어질 수 있으며, 이와 같이 생성된 이중가닥 핵산 분자도 본 발명의 범주내에 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 제 1 연신부 및 제 1 가닥은 동일한 길이를 갖는다. 마찬가지로, 제 2 가닥은 제 2 연신부와 동일한 길이를 갖는 것이 바람직하며, 제 1 연신부와 제 2 연신부가 동일한 길이를 갖는 것이 더 더욱 바람직하다. 더 더욱 바람직한 양태에서, 제 1 가닥은 단지 제 1 연신부만을 포함하며, 제 2 가닥은 단지 제 2 연신부만을 포함한다. 더 더욱 바람직한 양태에서, 제 1 연신부 및 그에 따른 제 1 가닥, 또는 제 2 연신부 및 그에 따른 제 2 가닥중 어떠한 것도 돌출물을 포함하지 않는다. 즉, 본 발명에 따르는 이중가닥 핵산은 둔단을 갖고, 바람직하게는 본 발명에 따르는 핵산의 이중가닥 구조의 각 말단에서 둔단을 갖는 것도 본 발명의 범주내에 포함된다. 상기 둔단 구조는 본 발명에 따르는 핵산의 임의의 다른 양태, 특히 본 발명에 따르는 핵산이 변형 패턴, 더욱 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 변형 패턴을 갖는 양태와 관련하여 이루어질 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명에 따르는 핵산은 본 발명에 따르는 핵산의 이중가닥 구조의 양쪽 말단에서 둔단을 제공하는 염기성 설계를 갖는다. 그러나, 돌출물, 즉 이중가닥 구조로부터 튀어나온 하나 이상의 뉴클레오타이드의 연신부가 있는 것도 본 발명의 범주내에 있다. 상기 돌출물은 대체로 안티센스 가닥의 5' 말단, 안티센스 가닥의 3' 말단, 센스 가닥의 5' 말단 및/또는 센스 가닥의 3' 말단에 있을 수 있다. 상기 선택사항중 임의의 하나 뿐만 아니라 이를 임의로 조합하여 실현시키는 것도 본 발명의 범주내에 있음을 유념한다. 돌출물이 안티센스 가 닥의 3' 말단 및 센스 가닥의 3' 말단에 위치한 조합이 더욱 바람직하다. 또한, 돌출물이 안티센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 5' 말단에 있는 것도 본 발명의 범주내에 있다. 또한, 돌출물이 이중가닥 구조의 안티센스 가닥에만 위치하고, 더욱 바람직하게는 이중가닥 구조의 안티센스 가닥의 3' 말단에만 위치하는 것도 본 발명의 범주내에 있다.
돌출물과 관련하여, 돌출물 및 연신부가 함께 바람직하게는 가닥을 형성하고, 본원의 연신부에 제공된 길이가 상기 양태에도 적용됨을 유념한다. 각각의 돌출물은 그 위치와 상관없이 하나 이상의 뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다. 그러나, 각각의 돌출물은 최대 10개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 바람직하게는 2개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 제 1 가닥이 RTP801을 부호화하는 상기 핵산 서열에 상보적이고 돌출물이 안티센스 가닥의 3' 및 5' 말단에 있는 경우에 돌출물을 형성하는 각각의 뉴클레오타이드가 또한 RTP801을 부호화하는 핵산 서열에 상보적인 것, 또는 제 1 가닥이 RTP801을 부호화하는 핵산 서열에 동일한 경우에 돌출물이 RTP801을 부호화화는 핵산 서열에 동일한 것도 본 발명의 범주내에 있다. 동일한 사항이 본 발명에 따르는 핵산의 염기성 설계의 제 2 연신부에 위치한 임의의 돌출물에 적용되며, 이 때 제 2 연신부에서의 돌출물 설계는 제 1 연신부의 돌출물 설계와 무관할 수 있음을 인식한다.
뉴클레오타이드를 형성하는 돌출물이 RTP801을 부호화하는 핵산 서열의 동종 뉴클레오타이드에 상보적이거나 동일하지 않는 것도 본 발명의 범주내에 있다. 본원에서 사용될 때, 또한 바람직하게는 상기 양태에서 "동종"은 RTP801을 부호화하 는 핵산에 대한 뉴클레오타이드 대응물을 갖는 연신부의 5' 말단 및/또는 3' 말단에서 뒤따르는 각각의 뉴클레오타이드를 의미한다.
바람직하게, 제 1 가닥은 3' 말단에서 2개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 디옥시뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 2개의 TT 및/또는 제 2 가닥은 3' 말단에서 상기 종류의 뉴클레오타이드를 포함하고, 이 때 더욱 바람직하게 제 1 연신부 및 제 2 연신부의 길이는 19개 뉴클레오타이드이다. 따라서, 가닥은 연신부와 돌출물로 구성된다. 상기 양태에서, 이중가닥 구조는 19개 염기쌍으로 이루어지고, 돌출물은 각각의 연신부의 3' 말단의 각 말단에서 2개 뉴클레오타이드로 이루어진다.
바람직한 양태에서, 제 1 연신부 및/또는 제 1 가닥은 리보뉴클레오타이드를 포함하고, 이 때 제 1 연신부가 전체적으로 리보뉴클레오타이드로 이루어진 것이 특히 바람직하다. 동일한 사항이 제 2 연신부 및 제 2 가닥 각각에 적용된다. 그러나, 이와 관련하여, 제 1 연신부 및 제 2 연신부 각각의 임의의 뉴클레오타이드 각각이 바람직한 양태에서 변형된다. 동일한 사항이 제 1 가닥 및 제 2 가닥 각각에 적용된다. 특히, 말단 뉴클레오타이드는 이들이 리보뉴클레오타이드 또는 디옥시리보뉴클레오타이드인지에 상관없이 그 자체로 변형될 수 있는 OH-기를 가질 수 있다. 상기 OH-기는 뉴클레오타이드의 당 잔기로부터, 더욱 바람직하게는 5'OH-기의 경우에는 5' 위치에서 및/또는 3'OH-기의 경우에는 3' 위치에서 비롯되거나, 또는 각각의 말단 뉴클레오타이드의 당 잔기에 부착된 포스페이트 기로부터 비롯될 수 있다. 포스페이트 기는 대체로 뉴클레오타이드의 당 잔기의 임의의 OH- 기에 부착될 수 있다. 바람직하게, 포스페이트 기는 유리 5'OH-기의 경우에는 당 잔기의 5'OH-기에 부착되고/거나 유리 3'OH-기의 경우에는 당 잔기의 3'OH-기에 부착되며, 본원에서 유리 5' 또는 3'OH-기라고 불리우는 것을 제공한다.
본원에 개시된 RNAi의 설계에 대한 임의의 계획 또는 RNAi의 임의의 양태와 관련하여 본원에서 사용될 때 말단 변형이란 용어는 제 1 및/또는 제 2 가닥의 대부분의 5' 또는 3' 뉴클레오타이드에 추가된 화합물 단위체를 의미한다. 상기 말단 변형의 예는 특히 유럽특허 EP 제0586520 B1호 또는 EP 제0618925 B1호에 기재된 바와 같이 3' 또는 5' 포스페이트, 역(inverted)(디옥시) 염기(abasics), 아미노, 플루오로, 클로로, 브로모, CN, CF, 메톡시, 이미다졸, 카복실레이트, 티오에이트, C1-C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴 또는 아르알킬, OCF3, OCN, O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알켄일; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2, N3; 헤테로시클로알킬; 헤테로시클로알크아릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노 또는 치환된 실릴을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용될 때 알킬 또는 "알킬"을 포함하는 임의의 용어는 바람직하게는 탄소원자 1 내지 12개, 바람직하게는 1 내지 6개, 더욱 바람직하게는 1개 또는 2개를 포함하는 임의의 탄소원자 사슬을 의미한다.
추가적인 말단 변형물은 비오틴 기이다. 상기 비오틴 기는 바람직하게는 제 1 및/또는 제 2 가닥의 대부분의 5' 또는 대부분의 3' 뉴클레오타이드에 또는 양쪽 말단에 부착될 수 있다. 더욱 바람직한 양태에서, 비오틴 기는 폴리펩타이드 또는 단백질에 커플링된다. 폴리펩타이드 또는 단백질이 임의의 다른 전술한 말단 변형물에 의해 부착되는 것도 본 발명의 범주내이다. 폴리펩타이드 또는 단백질은 본 발명에 따르는 핵산 분자에 추가적인 특징을 제공할 수 있다. 특히, 폴리펩타이드 또는 단백질은 다른 분자에 대해 리간드로서 작용할 수 있다. 상기 다른 분자가 수용체인 경우, 수용체의 기능 및 활성은 결합 리간드에 의해 활성화될 수 있다. 수용체는 본 발명에 따르는 리간드 결합된 핵산 분자의 효과적인 핵산전달감염을 허용하는 내재화 활성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 핵산 분자에 커플링될 리간드의 예는 VEGF이고, 동종 수용체는 VEGF 수용체이다.
상이한 종류의 말단 변형물을 갖는 본 발명의 RNAi의 다양한 가능한 양태가 하기 표 1에 제공되어 있다.
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본원에 개시된 바와 같은 다양한 말단 변형물이 바람직하게는 본 발명에 따르는 핵산의 뉴클레오타이드의 리보오스 잔기에 위치한다. 더욱 특히, 이와 같이 변형된 뉴클레오타이드가 말단 뉴클레오타이드인 경우, 말단 변형물은 2'-OH, 3'OH 및 5'OH 위치를 비롯하여(그러나, 이에 한정되는 것은 아니다) 리보오스 잔기중 임의의 OH-기에 부착되거나 이를 대체할 수 있다. 역 염기는 디옥시리보뉴클레오타이드, 또는 핵염기 잔기를 갖지 않는 리보뉴클레오타이드중 하나인 뉴클레오타이드이다. 상기 화합물 종류가 특히 문헌[Sternberger,M. Schmiedeknecht,A. Kretschmer,A. Gebhardt,F., Leenders,F., Czauderna,F., Von Carlowitz,I., Engle,M., Giese,K., Beigelman,L. 및 Klippel,A.(2002), Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 12, 131-43]에 기재되어 있다. 전술한 임의의 말단 변형물은 표 1에 제시된 RNAi의 다양한 양태와 관련하여 이용될 수 있다. 상기 언급한 5' 말단 변형물이 일반적으로 단지 siRNA 분자의 센스 가닥에 존재함을 유념한다.
또 다른 변형이 개개 뉴클레오타이드의 핵염기 잔기, 당 잔기 또는 포스페이트 잔기와 관련될 수 있다.
핵염기 잔기의 상기 변형은 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티미딘과 우라실 각각의 유도체가 변형되는 것일 수 있다. 특히 바람직한 변형된 핵염기는 인오신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸, 2-프로필 및 다른 알킬아데닌, 5-할로 우라실, 5-할로시토신, 5-할로 시토신, 6-아자시토신, 6-아자 티민, 수도-우라실, 4-티오우라실, 8-할로 아데닌, 8-아미노아데닌, 8-티올 아데닌, 8-티오알킬 아데닌, 8-하이드록실 아데닌 및 다른 8-치환된 아데닌, 8-할로 구아닌, 8-아미노 구아닌, 8-티올 구아닌, 8-티오알킬 구아닌, 8-하이드록실구아닌 및 다른 치환된 구아닌, 다른 아자- 및 디아자 아데닌, 다른 아자- 및 디아자 구아닌, 5-트리플루오로메틸 우라실 및 5-트리플루오로 시토신을 포함하는 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 양태에서, 뉴클레오타이드의 당 잔기는 변형되고, 이 때 상기 변형은 바람직하게는 뉴클레오타이드의 리보오스 및 디옥시리보오스 잔기 각각의 2' 위치에 있다. 더욱 바람직하게, 2'-OH 기는 아미노, 플루오로, 알콕시 및 알킬을 포함하는 군으로부터 선택된 기 또는 잔기로 대체된다. 바람직하게, 알콕시는 메톡시 또는 에톡시이다. 또한, 바람직하게 알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 이소부틸, 부틸 및 이소부틸을 의미한다. 변형 유형과 상관없이 뉴클레오타이드는 바람직하게는 리보뉴클레오타이드인 것이 더 더욱 바람직하다.
포스페이트 잔기의 변형은 바람직하게는 포스포티오에이트를 포함하는 군으로부터 선택된다.
당업계의 숙련자들은 다수의 뉴클레오타이드로 이루어진 본 발명의 핵산이 포스포다이에스테르 연결 또는 포스포티오에이트 연결에 의해 연결되는 뉴클레오타이드, 또는 각각의 가닥 및 연신부의 뉴클레오타이드 서열 길이를 따르는 둘다의 조합물에 의해 각각 형성될 수 있음을 인식할 것이다.
사용된 그 밖의 뉴클레오타이드 형태는 실제로 특히 PCT 공개공보 WO 제03/070918호에 기재된 siRNA일 수 있다.
본 발명에 따르는 핵산의 제 1 연신부 및 제 1 가닥을 각각 형성하는 뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 개개의 변형된 뉴클레오타이드는 바람직하게는 본원에 개시된 변형물을 갖는다. 특정한 변형물 이외에, 변형물은 화학발광 표지(label), 형광 표지 및 방사선 표지를 포함하는 군으로부터 선택된 일정 종류의 표지이거나, 이를 포함할 수 있다. 상기 표지 종류는 당업계의 숙련자들에게 공지되어 있고, 예컨대, 문헌[Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland, 1998]에 기재되어 있다. 본 발명에 따르는 이와 같이 표지된 핵산은 진단 목적으로 또는 작용 부위를 관측하기 위하여 사용될 수 있을 뿐만 아니라 바람직하게는 본원에 개시된 임의의 질환과 관련된 임의의 치료의 단계를 결정하기 위하여 사용될 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명에 따르는 핵산은 센스 연신부 또는 가닥내의 피리미딘 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 피리미딘 뉴클레오타이드가 되도록, 또한 추가로 또는 대안으로 센스 연신부 또는 가닥내의 퓨린 뉴클레오타이드가 2'-디옥시퓨린 뉴클레오타이드가 되도록 변형된다. 추가적인 양태에서, 센스 연신부 또는 센스 가닥내에 존재하는 피리미딘 뉴클레오타이드는 2'-디옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오타이드이다.
또 다른 양태에서, 변형은 뉴클레오타이드의 화학적 특성에 근거하지 않으며, 즉, 변형은 변형할 뉴클레오타이드가 퓨린 뉴클레오타이드인지 또는 피리미딘 뉴클레오타이드인지에 따라 결정되며, 본 발명에 따르는 핵산의 염기성 설계의 전체적인 이중가닥 구조내의 각각의 뉴클레오타이드의 공간 배열에 주로 근거한다.
더욱 특히, 제 1 가닥 및 제 1 연신부 각각, 또는 제 2 가닥 및 제 2 연신부 각각은 상기 연신부 및 가닥 각각을 형성하는 뉴클레오타이드 변형의 공간적 패턴을 나타낸다.
먼저 제 1 연신부를 집중적으로 살펴보면, 변형된 뉴클레오타이드 기 및 비변형 뉴클레오타이드 기의 패턴이 있다. 상기 비변형 뉴클레오타이드 기를 본원에서 뉴클레오타이드 인접 기라고 부른다. 더욱 바람직하게, 패턴은 변형된 뉴클레오타이드 및 비변형 뉴클레오타이드 기로 이루어진다. 더 더욱 바람직하게, 패턴은 규칙적인 패턴이고, 더 더욱 바람직하게 본 발명에 따르는 핵산의 제 1 연신부의 길이를 따라 교대로 있는 패턴이다. 변형된 뉴클레오타이드 기는 변형된 뉴클레오타이드, 바람직하게는 2' 위치에서 변형되어서 당 잔기에 변형물을 갖는 뉴클레오타이드 1개 또는 여러 개로 이루어질 수 있다. 더욱 바람직하게, 상기 변형물은 2'-O-Me 변형물이다.
비변형 뉴클레오타이드 기는 변형되지 않은 뉴클레오타이드 1개 또는 여러 개로 이루어질 수 있고, 이 때 변형되지 않은 뉴클레오타이드는 바람직하게는 리보뉴클레오타이드이거나, 또는 변형되지 않은 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드 기를 형성하는 뉴클레오타이드에서 나타나는 변형물과는 다른 변형물을 갖는 뉴클레오타이드이다. 더 더욱 바람직하게, 변형되지 않은 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드이다. 변형되지 않은 및 비변형 뉴클레오타이드란 용어는 달리 기재되지 않는 한 상호교환가능한 방식으로 사용됨을 유념한다. 본 발명에 따르는 핵산의 제 1 연신부는 변형된 뉴클레오타이드 기에서 시작하거나 또는 본원에 기재된 바와 같이 비변형 뉴클레오타이드 기에서 시작할 수 있다. 그러나, 제 1 연신부가 변형된 뉴클레오타이드 기에서 시작하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게, 변형된 뉴클레오타이드 기는 단일 뉴클레오타이드로 이루어진다. 상기 양태와 관련하여, 제 1 연신부는 바람직하게는 RTP801을 부호화하는 핵산에 대해 안티센스 배향으로 있다. 변형된 뉴클레오타이드 기를 형성하는 뉴클레오타이드에 의해 나타나는 변형물은 제 1 연신부에 존재하는 변형된 뉴클레오타이드의 모든 기에 대해 동일한 것도 본 발명의 범주내에 있다. 그러나, 변형된 뉴클레오타이드의 일부 기는 제 1 연신부에 존재하는 변형된 뉴클레오타이드 기 1개 또는 여러 개와는 상이한 변형물을 갖는 것도 본 발명의 범주내에 있다.
본 발명에 따르는 핵산의 제 2 가닥상에는 제 1 연신부에 기재된 것과 같은 패턴이 이루어질 수도 있다. 제 1 연신부와 관련하여 기재된 것과 동일한 특징이 제 2 연신부에 대한 양태에서도 이루어질 수 있으며, 이 때 제 2 연신부는 RTP801을 부호화하는 핵산 서열에 대해 센스 배향으로 있다는 조건하에서 본 발명에 따르는 핵산의 제 2 가닥은 비변형 뉴클레오타이드 기에서 시작하는 것이 바람직하다.
*이중가닥 구조를 포함하는 본 발명에 따르는 핵산은 본원에 기재된 바와 같은 변형 패턴을 갖는 제 1 연신부를 포함할 수 있다. 다르게, 본 발명에 따르는 이중가닥 핵산은 상기 개략된 바와 같은 변형 패턴을 갖는 제 2 연신부를 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르는 이중가닥 핵산이 제 1 연신부 및 제 2 연신부으로 이루어지고, 이 때 제 1 연신부와 제 2 연신부 둘다가 본원에 기재된 바와 같은 공간적 변형 패턴을 갖는 것이 가장 바람직하다.
공간적 변형 패턴의 특징이 변형된 뉴클레오타이드 기 및 비변형 뉴클레오타이드 기의 크기 및 실제로 사용된 변형물 종류에 있어 연신부 둘다에서 동일한 것도 본 발명의 범주내에 있다. 바람직하게, 제 1 연신부에 대한 공간적 변형 패턴은 제 1 연신부상의 변형된 뉴클레오타이드 기가 제 2 연신부상의 비변형 뉴클레오타이드 기를 마주보도록 이동하고, 또한 이와 역이 되도록 이동한다. 그러나, 패턴이 정확하게 정렬되어서 제 1 연신부상의 변형된 뉴클레오타이드 기가 제 2 연신부상의 비변형 뉴클레오타이드 기와 마주보고 제 1 연신부상의 비변형 뉴클레오타이드 기가 제 2 연신부상의 비변형 뉴클레오타이드 기와 마주보는 것도 본 발명의 범주내에 있다. 제 1 연신부 및 제 2 연신부상의 공간적 변형 패턴이 서로에 대해 이동하여서, 제 1 연신부상의 변형된 뉴클레오타이드 기의 제 1 부분만이 다른 연신부상의 비변형 뉴클레오타이드 기의 적어도 일부와 마주하는 반면 변형된 뉴클레오타이드 기의 제 2 부분이 변형된 뉴클레오타이드의 또 다른 기와 마주하게 되는 것도 본 발명의 범주내에 있다. 본 발명에 따르는 핵산의 연신부의 공간적 변형 패턴에 대하여 본원에 제공된 개시내용이 또한 본 발명에 따르는 핵산의 가닥에도 적용되는 것도 본 발명의 범주내에 있다. 그러나, 핵산의 연신부는 공간적 변형 패턴을 포함하고, 가닥은 본원에 개시된 바와 같이 상기 연신부 및 하나 이상의 돌출물을 포함하는 것이 바람직하다. 돌출물이 안티센스 가닥 또는 센스 가닥 또는 2개 가닥 둘다의 3' 말단에 있는 포스페이트 기인 것이 특히 바람직하고, 이 때 포스페이트 기가 안티센스 가닥과 센스 가닥 둘다의 3' 말단에 있는 것이 더욱 바람직하다. 더 더욱 바람직한 양태에서, 포스페이트 기는 본원에 정의된 바와 같은 포스페이트 기이다.
본 발명에 따르는 핵산이 제 1 및 제 2 가닥을 연결하는 링커를 나타낼 수 있는 것도 본 발명의 범주내에 있다. 상기 링커는 바람직하게는 중합체이다. 중합체는 임의의 합성 또는 천연 중합체일 수 있다. 가능한 합성 링커는 특히 PEG 또는 폴리뉴클레오타이드이다. 상기 연결기는 바람직하게는 제 2 연신부쪽으로 제 1 연신부를 완전히 또는 부분적으로 후방 절첩되도록 하거나 또는 그와 역이 되도록 설계된다.
마지막으로, 본 발명에 따르는 핵산이 합성 핵산, 화학적 합성 핵산, 단리된 핵산, 또는 예컨대 재조합 기술에 의해 제조된 것과 같은 임의의 천연 공급원으로부터 유도된 핵산인 것도 본 발명의 범주내에 있다. 본 발명에 따르는 임의의 핵산의 제조와 관련하여, 본원에 개시된 것과 같은 임의의 변형물이 본 발명에 따르는 각각의 핵산의 제조 이전에, 그 동안에 또는 그 이후에 당업계의 숙련자들에게 공지된 바와 같이 도입될 수 있다.
본 발명에 따르는 벡터는 본 발명에 따르는 핵산을 포함한다. 추가로, 벡터는 당업계에 공지된 바와 같이 상기 핵산의 표적화, 발현 및 전사를 세포 선택적인 방식으로 통제하기 위한 구성요소를 포함할 수 있다. 플라스미드는 이종 물질, 즉 본 발명에 따른 핵산의 전사를 억제하기 위하여 촉진자를 포함할 수 있으며, 플라스미드는 선택적 전사를 허용하는 구성 또는 유도성 촉진자일 수 있다. 필요한 전사 수준을 수득하는데 요구될 수 있는 증강자가 임의로 포함될 수 있다. 증강자는 일반적으로 부호화 서열과 접촉하여 작용하여서 동일 장소에서 촉진자에 의해 결정되는 기저 전사 수준을 변화시키는 임의의 비-번역된 DNA 서열이다. 상기 구성물의 발현은 당업계의 숙련자들에게 알려져 있으며, 예컨대 각각의 일렬 구성물을 제공하거나 또는 본 발명에 따르는 핵산의 제 1 및 제 2 가닥, 및 제 1 및 제 2 연신부를 각각 전사하는 상이한 촉진자를 가짐으로써 실시될 수 있다.
본 발명에 따르는 핵산이 제조되거나 발현될 때, 바람직하게는 생체내에서, 더욱 바람직하게는 본 발명에 따르는 핵산을 필요로 하는 환자에게서 발현될 때, 상기 제조 또는 발현은 발현 벡터, 바람직하게는 포유동물의 발현 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 발현 벡터는 당업계에 공지되어 있으며, 바람직하게는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 발현 시스템을 포함한다. 바람직한 바이러스 발현 시스템은 아데노바이러스, 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
벡터를 세포 또는 조직내로 도입시키는 방법이 당업계에 알려져 있다. 상기 방법은 문헌[Sambrook 등, Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbour Laboratory, New York(1983, 1992); Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland, 1998]에 일반적으로 기재된 것을 찾을 수 있다.
적합한 방법은 특히, 핵산전달감염, 리포펙션(lipofection), 전기천공, 및 재조합 바이러스 벡터에 의한 감염을 포함한다. 본 발명과 관련하여, 벡터의 추가적인 특징은 한 양태에서 목적하는 세포 유형에 특이적이어서 목적하는 발현을 허용하는 배경이 일단 제공된 경우에만 본 발명에 따르는 핵산 서열의 발현을 허용하는 촉진자 또는 조절 요소 각각과 같은 발현 제한 특징이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 핵산 및/또는 본 발명에 따르는 벡터, 및 임의로는 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 보조제 또는 다른 비히클을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 담체, 희석제, 보조제 및 비히클은 불활성이고 비독성이다. 약학 조성물은 다양한 양태에서 다양한 방식의 투여에 맞게 변형된다. 상기 투여는 전신 및 국소 투여 뿐만 아니라 경구, 피하내, 비경구, 정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내, 비강내 및 적산 투여를 포함한다.
당업계의 숙련자들은 약학 조성물 및 각각의 핵산과 벡터의 양이 각각 개개의 환자의 임상 증상, 투여 부위와 방법, 투여 스케줄, 환자의 나이, 성별, 체중 및 의료진에게 알려진 그 밖의 요인에 따라 결정됨을 인식하고 있다. 따라서, 예방 및/또는 치료를 목적으로 하는 약학적 유효량은 의료계에 알려진 바와 같은 상기 고려사항에 의해 결정된다. 바람직하게, 상기 양은 질환에 걸린 증상을 개선시키거나, 또는 징후 및 의료계의 숙련자들에 의해 적절한 척도로서 선택되어지는 다른 적응증을 보다 신속하게 회복, 개선 또는 제거하는 것을 비롯한(그러나, 이에 한정되는 것은 아니다) 개선을 이루기에 효과적이다.
바람직한 양태에서, 본 발명에 따르는 약학 조성물은 다른 약학적 활성 화합물을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 다른 약학적 활성 화합물은 세포내 세포 전달의 흡수를 허용하는 화합물, 적혈구내질 방출을 허용하는 화합물, 장시간의 순환을 허용하는 화합물, 및 내피 세포 또는 병원성 세포의 표적화를 허용하는 화합물을 포함하는 군으로부터 선택된다. 적혈구내질 방출에 바람직한 화합물은 클로로퀸, 및 ATP 의존적 H+ 펌프의 억제제이다.
약학 조성물은 바람직하게는 단일 투약량 투여 또는 여러회 투약량 투여로 제공되도록 제형화된다.
본 발명에 따르는 약학 조성물은 혈관형성을 포함한 혈관계의 바람직하지 않은 발달 또는 증식을 수반하는 임의의 질환 뿐만 아니라 본원에 기재된 임의의 질환 및 증상에 사용될 수 있음을 인식한다. 바람직하게, 상기 질환 종류는 종양 질환이다. 종양 질환중에는 하기 종양이 가장 바람직하다: 자궁내막암, 결정직장암, 신경아교종, 자궁내막암, 샘암종, 자궁내막 증식증, 코우덴 증후군, 유전적 비용종성 결장직장암, 리-푸라우메니 증후군, 유방-난소암, 전립선암(문헌[Ali, I.U., Journal of the National Cancer Institute, Vol.92, no.11, June 07, 2000, page 861-863]), 반나얀-조나나(Bannayan-Zonana) 증후군, LDD(레미테-듀클로스 증후군)(문헌[Macleod, K.], 상기 참고), 소 질환(CD)을 포함한 과오종-대두증 질환, 반나얀-루발카바(Ruvalcaba)-릴리(Rily) 증후군(BRR), 점막피부 병변(예컨대, 모종), 대두증, 정신지체, 위창자 과오종, 지방종, 갑상선선종, 유방 섬유낭 질환, 소뇌형성이상 신경절세포종, 및 유방 및 갑상선 악성종양(문헌[Vazquez, F., Sellers, W.R.], 상기 참고).
본 발명에 따른 약학 조성물에 의해 치료할 임의의 종양 질환은 바람직하게는 후기 단계의 종양 질환임을 인식한다. 또 다른 양태에서, 종양 질환은 종양 억제인자 음성인 세포를 포함하고, 더욱 바람직하게 종양 억제인자는 PTEN이다.
본 발명에 따르는 약학 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법에서 사용될 수도 있으며, 이 때 상기 방법은 본 발명에 따르는 핵산, 본 발명에 따르는 벡터 또는 본 발명에 따르는 약학 조성물 또는 약물을 본원에 기재된 임의의 질환을 위해 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 RTP801, 더욱 특히는 RTP801 기능을 하향 조절하는데 적합한 핵산을 설계 또는 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본원에 개시된 바와 같은 핵산 서열을 사용하고 적합한 어세이에서 상기 핵산을 평가하는 것을 포함한다. 상기 어세이가 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 본 출원의 실시예 부분에 기재되어 있다. 추가적인 단계에서, 이중가닥 핵산은 RTP801을 바람직하게는 RNA 간섭과 같은 전사후 유전자 침묵 메카니즘과 관련하여 하향조절하는데 적합한, 바람직하게는 본원에 제시된 바와 같은 설계 원리에 따라 설계된다. 이와 같이 수득된, 즉 설계되거나 스크리닝된 핵산은 각각의 어세이에서 평가되며, 결과, 즉 본 발명에 따르는 핵산 및 상기 어세이에서 신규하게 설계되거나 스크리닝된 핵산 둘다의 효과를 비교한다. 바람직하게, 상기 설계되거나 스크리닝된 핵산은 보다 안정하거나 보다 효과적인 경우에, 바람직하게는 둘다인 경우에 보다 적합하다. 본 발명에 따르는 임의의 핵산이 출발점으로 사용되는 경우에 상기 방법이 특히 효과적임을 인식한다. 따라서, 신규한 핵산 분자가 본원에 개시된 원리에 따라 설계되는 것이 본 발명의 범주내에 있으며, 여기에서 RTP801 mRNA상의 표적 서열은 본 발명에 따르는 동종 핵산에 대한 RTP801 mRNA상의 표적 서열에 대해 약간 이동하는 것이 본 발명의 범위내에 있다. 바람직하게, 신규한 핵산은 표적 mRNA상의 연신부에 대하여 하나 이상의 뉴클레오타이드만큼 RTP801을 부호화하는 mRNA의 5' 또는 3' 방향으로 이동한다. 그러나, 양 방향으로 자발적으로 이동이 일어나는 것도 본 발명의 범주에 속하는데, 이는 신규한 핵산이 출발점으로 사용된 본 발명에 따르는 핵산을 포함한다는 것을 의미한다. 본 발명에 따라 출발점으로 사용된 핵산의 연장이 3' 말단 또는 5' 말단으로 편향된 것도 본 발명의 범주내에 있다. 상기 편향의 경우에 신규한 핵산의 3' 말단 또는 5' 말단이 다른 말단보다 더 길어서, 즉 더 연장된다. 신규한 핵산 분자가 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단을 연장시킴으로써 생성되는 경우, 단계별 하기 서열이 전형적으로 적용된다. 이동이 RTP801의 mRNA의 5' 말단 방향이라면, 안티센스 가닥의 3' 말단은 RTP801의 mRNA의 5' 말단이 이동되는 만큼의 뉴클레오타이드 개수만큼 연장되어야 한다. 그 결과, 신규한 핵산의 안티센스 가닥의 3' 말단에 첨가되어야 할 뉴클레오타이드가 출발점으로써 사용된 본 발명에 따르는 핵산 분자에 사용된 RTP801 mRNA상의 표적 서열의 안티센스 가닥의 5' 말단에서 뒤따르는 뉴클레오타이드에 상보적이다. 동일한 내용이 센스 가닥에 대해서도 실시되어야 한다. 그러나, 센스 가닥에 첨가할 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 3' 말단에 새롭게 첨가되는 뉴클레오타이드에 상응해야, 즉 상보적이어야 하는데, 이는 이들이 센스 가닥의 5' 말단에 첨가되어야 함을 의미한다. 그러나, 센스 가닥에 대한 후자의 단계는 안티센스 가닥과는 별도로 센스 가닥이 이동되어지는 정도로만 실시되어야 하며, 이것이 본 발명의 바람직한 양태의 경우이다. 상기 이동이 당업계의 숙련자들에 의해 한정된 정도로 실시될 수 있으나, 더욱 바람직하게 상기 이동은 신규한 핵산이 14개 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 본원에 개시된 임의의 핵산 분자에 의해 나타나는 바와 같이 14개의 접촉 뉴클레오타이드를 함유하도록 실시된다.
본원에 기재된 임의의 핵산의 합성이 당업자의 기술범위내에 있다. 상기 합성은 특히 문헌[Beaucage S.L. 및 Iyer R.P., Tetrahedron 1992; 48: 2223-2311, Beaucage S.L. and Iyer R.P., Tetrahedron 1993; 49:6123-6194 및 Caruthers M.H. 등, Methods Enzymol. 1987; 154:287-313]에 기재되어 있으며, 티오에이트의 합성은 특히 문헌[Eckstein F., Annu. Rev. Biochem 1985; 54:367-401]에 기재되어 있으며, RNA 분자의 합성은 문헌[Sproat B. M Humana Press 2005 Edited by Herdewijn P.; Kap.2:17-31]에 기재되어 있고, 각각의 하지(downstream) 공정이 특히 문헌[Pingoud A. 등, IRL Press 1989 Edited by Oliver R.W.A.; Kap.7:183-208 및 Sproat B., Humana Press 2005 Edited by Herdewijn P.; Kap.2:17-31(상기 참고)]에 기재되어 있다.
RTP801에 대한 siRNA는 RTP801의 공지된 서열(SEQ ID NO:1)을 기준으로 상기 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있고, 상기 기재된 바와 같은 다양한 변형에 의해 안정하게 될 수 있다. 추가적인 정보에 대하여는 실시예 9를 참고한다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법과 관련하여, 추가적인 RNA 분자는 상기 방법과 함께 사용될 수 있으며, 예컨대 본 발명의 억제 RNA 분자는 바람직하게는 표 A 내지 C에 기재된 서열에 존재하는 7 내지 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드의 연신부를 포함하는 단일 가닥의 올리고리보뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 올리고리보뉴클레오타이드는 세포내 복합체에 의해 인식되는 특정한 입체형태의 이중가닥 영역을 형성(및/또는 포함)할 수 있고, 그 결과 동종 내생적 유전자를 억제할 수 있는 보다 작은 RNA 분자 및 상기 RNA 분자를 부호화하는 DNA 분자로 상기 올리고리보뉴클레오타이드를 분해시킨다. 동종 내생적 유전자는 바람직하게는 801 유전자이고, 추가로 VEGF 유전자 및/또는 VEGF-R1 유전자일 수 있다. 본 발명은 또한 담체, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체에 상기 단일 가닥 올리고리보뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가로, 본 발명은 본원에 개시된 모든 증상, 특히 맥락막 혈관신생을 포함한 특정 증상에 대한 혼합 요법(combination therapy)을 제공한다. 상기 혼합 요법에서는 처리할 질환의 징후를 개선시키기 위하여 RTP801 및 VEGFR 유전자 둘다가 억제된다. 상기 유전자는 siRNA 또는 항체(앱테이머(aptamer) 항체 포함)의 조합 또는 둘다에 의해 억제될 수 있다. 따라서, 본 발명은 RTP801 억제제 및 VEGF 또는 VEGFR-1 억제제를 포함하는 신규한 약학 조성물을 제공하고, RTP801 억제제는 바람직하게는 siRNA, 더욱 바람직하게는 표 A 내지 C에 기재된 siRNA, 특히 표 A의 siRNA Nos: 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 및 50이고, VEGF/VEGFR-1 억제제는 임의로는 항체 또는 앱테이머이다. 약물 제조에서 상기 화합물의 결합된 사용(즉, RTP801 siRNA 및 VEGF 항체 또는 본원에 개시된 임의의 다른 결합된 실시예)도 본 발명의 일부이다.
표 A 내지 C에 기재된 siRNA, 특히 표 A의 siRNA Nos: 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 및 50와 같은 RTP801 siRNA는 VEGF 또는 VEGF 수용체 1(VEGFR 1)을 표적으로 하는 약제와 함께 투여될 수 있다. 상기 약제는 현재 시판되고 있거나 다양한 승인 단계에 있으며, 다른 메카니즘을 통해 작용한다. 라니비즈맵(ranibizumab)(루센티스(Lucentis), 게넨테크(Genentech))과 같은 항체 및 항체 분절이 방출된 VEGF에 부착되어서 활성 수용체에 대한 VEGF의 결합을 억제한다. 리간드/항체와 같이 작용할 수 있는 앱테이머(매큐겐(Macugen), 아이테크/화이자(Eyetech/Pfizer), 습식 AMD에 대해 FDA로부터 최근 승인받음)가 또한 가능성이 있다. 매큐겐은 세포외 VEGF와 결합하여서 그 활성을 차단시킨다. 상기 약물은 유리체내 주사에 의해 국소 투여된다. 항-VEGF siRNA를 함유한 화합물(예컨대, VEGF의 어큐이티스 캔드5(Acuity's Cand5) 억제제 또는 VEGFR-1의 SIRNA's 027 억제제)이 또한 구입가능하다. 추가로, 전신 투여되는 소분자 아미노스테롤 스쿠알라민(Squalamine: 제네라(Genaera))은 보고에 따르면 VEGF, 및 내피세포내에서 신호하는 다른 성장인자를 억제하는 것을 포함하여 혈관형성 과정의 여러 면을 간섭한다.
RTP801 억제제, 바람직하게는 siRNA, 및 상기 임의의 VEGF/VEGFR-1 억제제의 동시 투여는 상승 효과를 가질 수 있으며, 이 때 상기 혼합 요법은 단일 요법 채택에서의 투약량에 상관없이 상기 임의의 개별 조성물에 의한 치료보다 더욱 효과적이다. 상기 상승 효과는 또한 실시예 6에 기재된 바와 같이 양수인에 의해 수득된 예비 실험에 의해 뒷받침된다.
RTP801i은 상이한 작용 메카니즘을 가지며, VEGF-VEGFR 억제제와 함께 상승될 수 있다. RTP801 KO 마우스에 대한 연구는 눈에서의 VEGF mRNA의 발현이 WT 마우스에서만큼 높다는 사실에도 불구하고 KO 마우스에서의 방어 표현형이 지속됨을 나타낸다. 추가적인 예비실험 데이터는 RTP801의 억제가 망막 병리현상의 치료에서 VEGF-VEGFR 조절축의 억제와 함께 상승적으로 될 수 있음을 나타낸다. 본 발명의 발명자들은 적절한 실험에 의해 AMD 모델에서 RTP801에 대한 siRNA의 투여(하기 실시예 6 참고)는 RTP801 그 자체를 하향 조절할 뿐만 아니라 그 결과 혈관형성 및 신경방어 인자 PEDF를 상향 조절시키고, 포식세포의 화학유인물질 단백질인 MCP1의 발현을 하향 조절시킴을 밝혀냈다. 따라서, RTP801의 억제는 혈관형성, 신경방어 및 항염증 효과를 동시에 제공한다.
본 발명과 관련하여 본원에 개시된 임의의 siRNA 분자, 또는 본원에 개시된 siRNA 분자를 형성하도록 내생적 세포 복합체(예컨대, 다이세르-상기 참조)에 의해 프로세싱된 임의의 긴 이중가닥 RNA 분자(전형적으로 25 내지 500개 뉴클레오타이드 길이), 또는 본원에 개시된 siRNA 분자를 포함하는 분자가 본원에 개시된 질환 또는 장애의 치료에 이용될 수 있다.
본 발명의 분자 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 추가적인 장애는, 습식 AMD에서 뿐만 아니라 눈 히스토플라스마증 증후군, 혈관무늬병증, 브루크막 파열, 근시 변성, 눈 종양 및 일부 망막 변성 질환과 같은 다른 눈 병리현상에서도 발생하는 모든 유형의 맥락막 혈관신생(CNV)을 포함한다.
본 발명의 추가적인 측면은 세포자멸-관련된 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 억제되지 않는 병적 세포 증식, 예컨대 특히 암, 건선, 자가면역 질환과 관련된 질환 또는 장애의 치료방법, 및 허혈 및 적절한 혈류 부족과 관련된 질환, 예컨대 심근경색(MI) 및 뇌줄중의 치료 방법이 제공된다. "암" 또는 "종양"은 비정상적인 세포가 억제되지 않게 증식한 덩어리를 말한다. 상기 용어는 양성 또는 악성일 수 있는 원발종양 뿐만 아니라 신체내의 다른 부위로 퍼진 2차 종양 또는 전이 둘다를 포함한다. 암 유형의 질환의 예는 특히 암종(예컨대, 유방, 결장 및 폐), B 세포 백혈병과 같은 백혈병, B-세포 림프종과 같은 림프종, 신경모세포종 및 흑색종과 같은 모세포종을 포함한다.
본 발명은 또한 담체, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체중에 본 발명의 화합물 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 상이한 유전자에 대해 둘 이상의 siRNA의 혼합물, 또는 동일한 유전자에 대해 상이한 siRNA를 포함할 수 있다. RTP801 유전자에 대한 siRNA 및 VEGF 유전자 및/또는 VEGFR-1 유전자에 대한 siRNA를 포함하는 조성물이 예상된다.
본 발명의 또 다른 화합물은 본 발명의 하나 이상의 화합물(구조식 1)에 공유 또는 비공유 결합된 본 발명의 상기 화합물(구조식 1)을 포함한다. 상기 화합물은 담체, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체에서 전달될 수 있으며, 본 발명의 하나 이상의 siRNA를 생성하도록 내생적 세포 복합체에 의해 세포내에서 프로세싱될 수 있다. 본 발명의 또 다른 화합물은 또 다른 유전자, 특히 VEGF 유전자 및/또는 VEGFR-1 유전자에 대한 siRNA에 공유 또는 비공유 결합된 본 발명의 상기 화합물(구조식 1)을 포함한다.
본 발명은 또한 상기 임의의 VEGF/VEGFR-1 억제제에 대해 화학적으로 결합되거나 공유 또는 비공유 결합된 RTP801 억제제, 바람직하게는 siRNA인 신규한 화학적 단위체를 포함한다. 예상되는 특정한 화학적 단위체는 VEGF 또는 VEGF 수용체-1에 대한 항체에 공유 결합된 siRNA RTP801 억제제이다. 상기 신규한 화학적 단위체의 제조방법은 당업계의 숙련자들에게 공지되어 있다.
본 발명은 또한 하나는 801을 억제하고 다른 하나는 VEGF/VEGFR-1을 억제하는 둘 이상의 상이한 siRNA을 형성하도록 세포내에서 프로세싱되는 siRNA 서열 둘 이상을 포함하는 일렬 이중가닥 구조를 포함한다. 관련된 측면에서, 본 발명은 또한 둘다 801을 억제하는 둘 이상의 상이한 siRNA를 형성하도록 세포내에서 분해되는 siRNA 서열 둘 이상을 포함하는 일렬 이중가닥 구조를 포함한다.
특히, 하나 이상의 줄기 및 고리 구조를 포함하고, 이 때 줄기 영역은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 긴 올리고뉴클레오타이드(전형적으로 약 80개 내지 500개 뉴클레오타이드 길이)가 담체, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체에서 전달될 수 있고, 내생적 세포 복합체(예컨대, 전술한바와 같은 드로사(DROSHA) 또는 다이세르)에 의해 세포내에서 프로세싱되어서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드인 보다 작은 하나 이상의 이중가닥 올리고뉴클레오타이드(siRNA)를 생성할 수 있는 것으로 예측된다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 일렬 shRNA 구조물이라고 부를 수 있다. 상기 긴 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 줄기 및 고리 구조를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드라고 예측되며, 이 때 줄기 영역 각각은 801 유전자의 센스 및 동종 안티센스 iRNA 서열을 포함한다. 특히, 상기 올리고뉴클레오타이드는 표 A 내지 C중 임의의 하나에 기재된 바와 같은 센스 및 안티센스 siRNA 서열을 포함하는 것으로 예측된다. 다르게, 일렬 shRNA 구조는 801 유전자의 센스 및 동종 안티센스 siRNA 서열, 및 추가적으로는 VEGF 또는 VEGF-R1과 같은 상이한 유전자의 센스 및 동종 안티센스 siRNA 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, RTP801에 대한 siRNA는 약학 조성물중에서 주된 활성 성분일 수 있거나, 또는 둘 이상의 siRNA(또는 둘 이상의 siRNA를 부호화하거나 내생적으로 생성시키는 분자, 또는 분자의 혼합물, 또는 둘 이상의 siRNA를 부호화하는 하나 이상의 일렬 분자)를 함유하는 약학 조성물의 하나의 활성 구성성분일 수 있고, 상기 약학 조성물은 그 밖에 하나 이상의 추가적인 유전자를 표적으로 하는 하나 이상의 추가적인 siRNA 분자로 구성된다. RTP801 및 상기 추가적인 유전자의 동시 억제는 하기 내용에 따라 본원에 개시된 질환의 치료에 추가적인 또는 상승적인 효과를 가질 것이다.
급성 신부전(ARF) 및 다른 미세혈관 장애:
ARF 치료를 위한 약학 조성물은 하기 화합물 조합으로 구성될 수 있다: 1) RTP801 siRNA 및 p53 siRNA의 이합체; 2) RTP801 및 Fas siRNA의 이합체; 3) RTP801 및 Bax siRNA의 이합체; 4) p53 및 Fas siRNA의 이합체; 5) RTP801 및 Bax siRNA의 이합체; 6) RTP801 및 Noxa siRNA의 이합체; 7) RTP801 및 Puma siRNA의 이합체; 8) RTP801(REDD1) 및 RTP801L(REDD2) siRNA의 이합체; 9) 삼합체 또는 중합체(즉, 3개의 siRNA를 부호화하는 일렬 분자)를 형성하는 RTP801 siRNA, Fas siRNA 및 임의의 RTP801L siRNA p53 siRNA, Bax siRNA, Noxa siRNA 또는 Puma siRNA.
황반변성(MD), 당뇨병성 망막병증(DR), 척수 손상:
MD, DR 및 척수 손상을 치료하기 위한 약학 조성물은 하기 화합물 조합으로 구성될 수 있다: 1) VEGF siRNA, VEGF-R1 siRNA, VEGF R2 siRNA, PKCbeta siRNA, MCP1 siRNA, eNOS siRNA, KLF2 siRNA, RTP801L siRNA중 하나와 조합된 RTP801 siRNA(물리적으로 혼합되거나 일렬 분자내에); 2) 상기 목록중 둘 이상의 siRNA와 조합된 RTP801 siRNA(물리적으로 혼합되거나 3개의 siRNA을 부호화하는 일렬 분자내에, 또는 이들의 조합물내에).
COPD 및 호흡 장애:
호흡 장애를 치료하기 위한 약학 조성물은 하기 화합물 조합으로 구성될 수 있다: 1) 엘라스타아제, 기질 금속프로테아제, 포스포리파아제, 카스파아제, 스핑고마이엘린나아제 및 세라마이드 합성효소 유전자중 하나 이상에 대한 siRNA와 조합된 RTP801 siRNA.
추가적으로, 하기에 따라 본원에 개시된 질환의 치료를 위해 표적화를 증가시키기 위하여 RTP801 siRNA, 또는 RTP801 siRNA을 포함하거나 부호화하는 임의의 핵산 분자가 항체에 연결(공유 또는 비공유적으로)될 수 있다.
ARF: 항-Fas 항체(바람직하게는, 중화 항체)
황반 변성, 당뇨병성 망막병증, 척수 손상: 항-Fas 항체, 항-MCP1 항체, 항-VEGFR1 및 항-VEGFR2 항체. 항체는 바람직하게는 중화 항체이어야 한다.
예컨대, 본원에 개시된 siRNA 서열을 포함하는 안티센스 DNA 분자(적절한 핵산 변형물을 가짐)가 특히 바람직하고, 본원에 개시된 모든 용도 및 방법에 대하여 동종 siRNA와 동일한 수용능으로 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 치료적으로 유효한 투약량으로 상기 조성물 또는 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 그 결과 환자를 치료하는 것을 포함하는, 본원에 기재된 장애와 같은 장애를 앓는 환자를 치료하는 방법을 포함한다.
"안티센스"(AS) 또는 "안티센스 분절"이란 용어는 억제 안티센스 활성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분절(디옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드 또는 이들 둘의 혼합물을 포함)을 의미하며, 상기 활성은 동종 유전자(이 경우에는 RTP801)의 내생적 게놈 복제의 발현을 감소시키는 것이다. RTP801 AS 폴리뉴클레오타이드는 충분한 길이 및 SEQ.ID.NO:1에 기재된 RTP801 유전자의 서열내에 존재하는 서열과의 동종성을 갖는 연속 뉴클레오타이드를 포함하여서 유전자에 대해 AS가 하이브리드화되도록 허용하는 폴리뉴클레오타이드이다. AS의 서열은 관심대상인 표적 mRNA을 보충하고 RNA:AS 이중체를 형성하도록 설계된다. 상기 이중체 형성은 관련 mRNA의 프로세싱, 스플라이싱, 운반 또는 번역을 방지할 수 있다. 또한, 특정한 AS 뉴클레오타이드 서열은 표적 mRNA와 하이브리드화될 때 세포의 RNase H 활성을 유도하여서 mRNA 분해를 발생시킬 수 있다(문헌[Calabretta 등, 1996: Antisense strategies in the treatment of leukemias. Semin Oncol. 23(l):78-8]). 이 경우, RNase H는 이중체의 RNA 구성성분을 절단하고, AS를 방출하여서 표적 RNA의 추가적인 분자와 더 하이브리드화될 수 있다. 추가적인 작용 방식은 전사적으로 불활성일 수 있는 삼중 나선형을 형성시키는 AS와 게놈 DNA의 상효작용으로부터 발생된다. 특정한 AS 분절은 본원에 기재된 RT801의 특정한 분절을 부호화하는 DNA의 AS이다.
많은 초록들이 안티센스(AS) 기술의 주된 측면 및 그의 치료적 효능에 대하여 다루어 왔다(문헌[Wright & Anazodo, 1995. Antisense Molecules and Their Potential For The Treatment Of Cancer and AIDS . Cancer J. 8:185-189]참고). 본 기술의 화합물(문헌[Crooke, 1995. Progress in antisense therapeutics , Hematol. Pathol . 2:59; Uhlmann and Peyman , 1990. Antisense Oligonucleotides : A New Therapeutic Principle . Chem Rev 90(4):543-584]), 세포(문헌[Wagner, 1994. Gene inhibition using antisense oligodeoxynucleotides . Nature 372:333]), 및 치료(문헌[Hanania 등, 1995. Recent advances in the application of gene therapy to human disease . Am . J. Med. 99:537; Scanlon 등, 1995. Oligonucleotides-mediated modulation of mammalian gene expression . FASEB J. 9:1288; Gewirtz, 1993. Oligodeoxynucleotide-based therapeutics for human leukemias, Stem Cells Dayt. 11:96]) 관점에 대한 초록이 있다.
특이적인 유전자의 발현에서 안티센스의 개입은 합성 AS 올리고뉴클레오타이드 서열의 사용에 의해 이루어질 수 있다(문헌[Lefebvre-d'Hellencourt 등, 1995. Immunomodulation by cytokine antisense oligonucleotides . Eur . Cytokine New . 6:7; Agrawal, 1996. Antisense oligonucleotides : towards clinical trials, TIBTECH, 14:376; Lev-Lehman 등, 1997. Antisense Oligomers in vitro and in vivo. In Antisense Therapeutics, A. Cohen and S. Smicek, eds(Plenum Press, New York] 참고). AS 올리고뉴클레오타이드 서열은 관심대상인 표적 mRNA을 보충하고 RNA:AS 이중체를 형성하도록 설계된다. 상기 이중체 형성은 관련 mRNA의 프로세싱, 스플라이싱, 운반 또는 번역을 방지할 수 있다. 또한, 특정한 AS 뉴클레오타이드 서열은 표적 mRNA와 하이브리드화될 때 세포의 RNase H 활성을 유도하여서 mRNA 분해를 발생시킬 수 있다(문헌[Calabretta 등, 1996: Antisense strategies in the treatment of leukemias . Semin Oncol. 23:78]). 이 경우, RNase H는 이중체의 RNA 구성성분을 절단하고, AS를 가능하게 방출하여서 표적 RNA의 추가적인 분자와 더 하이브리드화될 수 있다. 추가적인 작용 방식은 전사적으로 불활성일 수 있는 삼중 나선형을 형성시키는 AS와 게놈 DNA의 상효작용으로부터 비롯된다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대한 서열 표적 구역은, 서열이 상보적인 주형과 함께 올리고뉴클레오타이드 이중체 형성에 중요한 적합한 에너지 관련 특징을 나타내고, 또한 자기-이합체 또는 자기-상보화에 대해 낮은 가능성을 나타내도록 선택된다(문헌[Anazodo 등, 1996]). 예컨대, 컴퓨터 프로그램 OLIGO(프라이머 아날리시스 소프트웨어(Primer Analysis Software), 버전 3.4)은 안티센스 서열 용융 온도, 유리 에너지 특성을 결정하는데 사용될 수 있고, 또한 잠재적인 자기-이합체 형성 및 자기-상보화 특성을 평가하는데 사용될 수 있다. 상기 프로그램은 이들 2개 변수(잠재적인 자기-이합체 형성 및 자기-상보화)의 정성적인 추정치를 결정할 수 있게 하며, "가능성 없음" 또는 "약간 가능함" 또는 "본질적으로 완전히 가능함"이라는 표시를 제공한다. 상기 프로그램을 사용하여 상기 변수에서 가능성 없음 추정치를 갖는 표적 구역이 일반적으로 선택된다. 그러나, 한 범주에서는 "약간 가능함"을 갖는 구역이 사용될 수 있다. 변수의 균형은 당업계에서 공지된 바와 같이 선택에서 사용된다. 또한, 올리고뉴클레오타이드는 유사체 치환이 실질적으로 기능에 영향을 주지 않도록 필요시에 선택된다.
포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 효과적이고 동물에서 충분한 약역학적 반감기를 나타내는 농도에서 일반적으로 그다지 큰 독성을 나타내지 않으며(문헌[Agrawal, 1996. Antisense oligonucleotides : towards clinical trials, TIBTECH, 14:376]), 핵산분해효소에 내성을 갖는다. 세포 발달과 관련하여 안티센스-유도된 기능상실 표현형이 신경교원섬유 산 단백(GFAP)에 대하여, 수두 덮개판 형성의 확립에 대하여(문헌[Galileo 등, 1991. J. Cell. Biol., 112:1285]) 및 신경외배엽 배양물에서의 세포 이질성 보존을 책임지는 N-myc 단백질에 대하여(콜로니 형성능력, 종양발생 및 부착성에서 차이나는 내피 대 신경모세포)(문헌[Rosolen 등, 1990. Cancer Res. 50:6316; Whitesell 등, 1991. Episome -generated N- myc antisense RNA restricts the differentiation potential of primitive neuroectodermal cell lines. Mol. Cell. Biol. 11:1360]) 나타났다. 분열촉진 및 혈관형성 특성을 갖는 염기성 섬유모세포 성장인자(bFgF)의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 억제는 포화가능한 특이적 방식으로 신경아교종의 증식을 80% 억제하였다(문헌[Morrison, 1991. Suppression of basic fibroblast growth factor expression by antisense oligonucleotide inhibits the growth of transformed human astrocytes. J. Biol. Chem. 266:728]). 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 소수성이기 때문에 인지질 막과 충분히 상호작용한다(문헌[Akhter 등, 1991. Interactions of antisense DNA oligonucleotides analogs with phospholipid membranes ( liposomes ) Nuc. Res. 19:5551-5559]). 세포 혈장막과의 상호작용 이후에 이들은 특이적 수용체를 포함하도록 예측된 포화가능한 메카니즘에서(문헌[Yakubov 등, 1989. PNAS USA 86:6454]) 살아있는 세포내로 적극적으로(또는 수동적으로) 운반된다(문헌[Loke 등, 1989. Characterization of oligonucleotide transport into living cells. PNAS USA 86:3474]).
"리보자임"은, RNA 촉매능(개요에 대하여는 문헌[Cech] 참고)을 갖고 표적 RNA에서 특이적 부위를 절단하는 RNA 분자이다.
본 발명에 따르면, RTP801 mRNA를 절단하는 리보자임이 RTP801 억제제로서 이용될 수 있다. 이는 안티센스 치료가 화학량론적 고려사항에 의해 제한되는 경우에 필요할 수 있다(문헌[Sarver 등, 1990, Gene Regulation and Aids. pp. 305-325]). 이어서, RTP801 서열을 표적으로 하는 리보자임이 사용될 수 있다. 리보자임에 의해 절단되는 RNA 분자의 개수는 화학량론에 의해 예측되는 개수보다 더 크다(문헌[Hampel 및 Tritz, 1989; Uhlenbeck, 1987]).
리보자임은 RNA의 포스포다이에스테르 결합 절단을 촉진시킨다. I군 인트론, RNase P, 델타간염 바이러스 리보자임, 망치머리형 리보자임 및 담배 윤점 바이러스 위성 RNA(sTRSV)의 음성 가닥으로부터 본래 유도된 머리핀 리보자임을 비롯한 여러 리보자임 구조 계통이 확인되었다(문헌[Sullivan, 1994; 미국특허 제5,225,347호, 제 4 내지 5 컬럼). 마지막 2개 계통은 리보자임이 회전환복제 동안에 발생하는 올리고머로부터 모노머를 분리시키는 것으로 보이는 바이로이드 및 마이루소이드로부터 유도된다(문헌[Symons, 1989 및 1992]). 망치머리형 및 머리핀 리보자임 주요소(motif)는 유전자 치료를 위해 mRNA의 관통-절단되도록 가장 보편적으로 변형된다(문헌[Sullivan, 1994]). 본 발명에서 이용되는 리보자임 유형은 당업계에 공지된 바와 같이 선택된다. 머리핀 리보자임이 현재 임상시험중이며, 바람직한 유형이다. 일반적으로, 리보자임은 30개 내지 100개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 리보자임 전달은 AS 분절 및/또는 siRNA 분자의 경우와 유사하다.
본 발명에서 사용되는 모든 폴리뉴클레오타이드는 향상된 치료적 특성을 갖도록 변형될 수 있음을 유념한다. 뉴클레오타이드의 변형물 또는 유사체가 폴리뉴클레오타이드의 치료적 특성을 향상시키기 위하여 도입될 수 있다. 향상된 특성은 증가된 핵산분해효소 내성 및/또는 증가된 세포막 투과능을 포함한다. 핵산분해효소 내성은 사용 방법 및 전달 방법에 있어 필요할 때 AS 폴리뉴클레오타이드, siRNA, cDNA 및/또는 리보자임의 생물학적 활성을 방해하지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 필요에 따라 제공된다(문헌[Iyer 등, 1990; Eckstein, 1985; Spitzer and Eckstein, 1988; Woolf 등, 1990; Shaw 등, 1991] 참고). 핵산분해효소 내성을 증가시키기 위하여 올리고뉴클레오타이드에 대해 이루어질 수 있는 변형물은 포스페이트 주쇄내의 인 또는 산소 헤테로원자를 변형시키는 것을 포함한다. 이들은 메틸 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트 및 모폴린오 올리고머를 제조하는 것을 포함한다. 한 양태에서, 이는 4개 내지 6개의 3' 말단 뉴클레오타이드 염기 사이를 연결하는 포스포로티오에이트 결합을 가짐으로써 제공된다. 다르게, 포스포로티오에이트 결합은 모든 뉴클레오타이드 염기를 연결한다. 생물학적 활성이 남아있고 핵산분해효소에 대한 안정성이 실질적으로 증가되는 경우에는 당업계에 공지된 다른 변형물이 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드의 모든 유사체 또는 변형체가 폴리뉴클레오타이드의 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는다면, 폴리뉴클레오타이드의 모든 유사체 또는 변형물이 본 발명에서 이용될 수 있다. 뉴클레오타이드는 천연 또는 합성 변형된 염기로부터 선택될 수 있다. 천연 염기는 아데닌, 구아닌, 시토닌, 티민 및 우라실을 포함한다. 뉴클레오타이드의 변형된 염기는 인오신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸, 2-프로필 및 다른 알킬 아데닌, 5-할로 우라실, 5-할로 시토신, 6-아자시토신, 6-아자 티민, 수도우라실, 4-티오우라실, 8-할로 아데닌, 8-아미노아데닌, 8-티올 아데닌, 8-티오알킬 아데닌, 8-하이드록실 아데닌 및 다른 8-치환된 아데닌, 8-할로 구아닌, 8-아미노 구아닌, 8-티올 구아닌, 8-티오알킬 구아닌, 8-하이드록실 구아닌 및 다른 치환된 구아닌, 다른 아자- 및 디아자 아데닌, 다른 아자- 및 디아자 구아닌, 5-트리플루오로메틸 우라실 및 5-트리플루오로 시토신을 포함한다.
또한, 뉴클레오타이드의 구조가 기본적으로 변경되고 치료제 또는 실험 시약으로서 보다 적합한 폴리뉴클레오타이드의 유사체가 제조될 수 있다. 뉴클레오타이드 유사체의 한 예는 DNA(또는 RNA)내의 디옥시리보오스(또는 리보오스) 주쇄가 펩타이드에서 발견되는 것과 유사한 폴리아마이드 주쇄로 대체된 펩타이드 핵산(PNA)이다. PNA 유사체는 효소 분해에 내성을 갖고 생체내 및 생체외에서 연장된 수명을 갖는 것으로 보인다. 또한, PNA는 DNA 분자보다 상보적인 DNA 서열에 보다 강하게 결합하는 것으로 보인다. 이러한 결과는 PNA 가닥과 DNA 가닥 사이에서 전하 반발력 부족때문이다. 올리고뉴클레오타이드에 가해질 수 있는 다른 변형은 중합체 주쇄, 환형 주쇄 및 비환형 주쇄를 포함한다.
본 발명에서 이용되는 폴리펩타이드는 또한 치료적 활성을 향상시키기 위하여 변형될 수 있고, 임의로는 화학적으로 변형될 수 있다. 폴리펩타이드에 대하여 언급되어질 때에 "화학적으로 변형"이란 하나 이상의 아미노산 잔기가 자연 과정, 예컨대 프로세싱 또는 다른 전사후 변형에 의하거나 또는 당업계에 충분히 공지된 화학적 변형법에 의해 변형된 폴리펩타이드를 의미한다. 수많은 공지된 변형중에서 배타적이지는 않으나 전형적인 예에는 아세틸화, 아실화, 아미드화, ADP-리보실화, 당화, GPI 고정 형성, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 메틸화, 미리스틸화, 페길화, 프레닐화, 인산화, 유비퀸화 또는 임의의 유사한 공정을 포함한다.
추가적인 가능한 폴리펩타이드 변형(예컨대, 핵산 서열 변경으로부터 발생된 것)은 다음을 포함한다:
"보존적 치환"이란 한 종류의 아미노산이 동일한 종류의 아미노산에 의해 치환되는 것을 의미하고, 여기서 한 종류는 예컨대, 표준 데이호프(Dayhoff) 빈도교환기질 또는 블로섬(BLOSUM) 기질에 의해 결정될 때 자연에서 발견되는 상동 폴리펩타이드에서의 통상적인 물리화학적 아미노산 측쇄 특성 및 높은 치환 빈도에 의해 정의된다. 6개 일반적인 종류의 아미노산 측쇄가 분류되어 왔으며, I 종류(Cys); II 종류(Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); III 종류(Asn, Asp, Gln, Glu); IV 종류(His, Arg, Lys); V 종류(Ile, Leu, Val, Met) 및 VI 종류(Phe, Tyr, Trp)를 포함한다. 예컨대, Asp를 Asn, Gln, Glu와 같은 또 다른 III 종류 잔기로 치환하는 것은 보존적 치환이다. "비보존적 치환"이란 한 종류의 아미노산을 다른 종류의 아미노산으로 치환하는 것, 예컨대, II 종류 잔기인 Ala를 III 종류 잔기인 Asp, Asn, Glu 또는 Gln으로 치환하는 것을 말한다. "결손"은 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 각각 존재하지 않는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 변화이다. "삽입" 또는 "첨가"는 천연 서열과 비교할 때 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 각각의 첨가를 발생시키는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 서열의 변화이다. "치환"은 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 상이한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 각각으로 대체하는 것을 말한다. 아미노산 서열에 있어서 치환은 보존적이거나 비보존적일 수 있다.
본 발명의 추가적인 양태에서, RTP801 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 피실험자의 황반 변성을 진단하거나 검출하는데 사용될 수 있다. 검출 방법은 피실험자로부터 유도된 샘플내의 RTP801 mRNA 또는 RTP801 폴리펩타이드에 대해 어세이하는 것을 전형적으로 포함한다.
"검출"이란 질환의 검출 방법을 말한다. 상기 용어는 질환의 소인 검출 또는 질환의 중증도 검출을 지칭할 수 있다.
본 발명에서 이용될 때 "상동/상동성"이란 약 70% 이상, 바람직하게는 약 75% 이상의 상동성, 유리하게는 약 80% 이상의 상동성, 더욱 유리하게는 약 90% 이상의 상동성, 더 더욱 유리하게는 약 95% 이상의 상동성, 예컨대 약 97% 이상, 약 98%, 약 99% 또는 심지어 약 100% 상동성을 의미한다. 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드가 본원에서 또는 전술한 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드에서와 동일한 유형으로 이용될 수 있음을 이해한다. 다르게 또는 추가적으로 서열과 관련하여 "상동성"은 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기를 갖는 위치의 개수를 2개의 서열중 보다 짧은 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 개수로 나눈 것을 말할 수 있고, 2개 서열의 일치는 윌버(Wilbur) 및 립만(Lipman)의 알고리즘(문헌[1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726])에 따라 결정할 수 있으며, 예컨대 20개 뉴클레오타이드의 창 크기, 4개 뉴클레오타이드의 단어 길이 및 4의 갭 페널티를 사용하여 일치를 비롯한 서열 데이터의 컴퓨터 분석 및 해독을 시판중인 프로그램(예컨대, 인텔리제네틱스 스위트(IntelligeneticsTM Suite), 인텔리제네틱스 인코포레이티드, 캐나다 소재)을 사용하여 편리하게 실시될 수 있다. RNA 서열이 DNA 서열과 유사하거나 일정한 정도의 서열 동일성 또는 상동성을 갖는다고 할 때, DNA 서열내의 티미딘(T)은 RNA 서열내의 우라실(U)과 동일한 것으로 간주된다. 본 발명의 범주내의 RNA 서열은 DNA 서열내의 티미딘(T)을 우라실(U)로 치환시킴으로써 DNA 서열 또는 그의 상보물로부터 유도될 수 있다.
추가적으로 또는 다르게, 아미노산 서열의 유사성 또는 상동성은 예컨대 NCBI에서 구입가능한 블라스트피(BlastP) 프로그램을 사용하여(문헌[Altschul 등, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402]) 결정할 수 있다. 하기 문헌은 2개 폴리펩타이드의 아미노산 잔기의 상대적인 동일성 또는 상동성을 비교하기 위한 알고리즘을 제공하고, 추가적으로 또는 대안적으로 전술한 내용과 관련하여 하기 문헌의 교지내용이 상동성 비율을 결정하기 위하여 사용될 수 있다(문헌[Smith 등(1981), Adv. Appl. Math. 2:482-489; Smith 등, (1983) Nucl. Acids Res. 11:2205-2220; Devereux 등, (1984) Nucl. Acids Res. 12:387-395; Feng 등, (1987) J. Molec. Evol. 25:351-360; Higgins 등, (1989) CABIOS 5:151-153; 및 Thompson 등, (1994) Nucl. Acids Res. 22: 4673-4680]). 2개의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열과 관련하여 "X% 이상의 상동성을 갖는다"라는 것은 서열이 임의로 정렬될 때 2개의 서열에서 동일한 잔기의 비율을 말한다. 따라서, 90% 아미노산 서열 동일성이란 2개 이상의 임의로 정렬된 폴리펩타이드 서열내의 아미노산 90%가 동일하다는 것을 의미한다.
본 발명의 추가적인 양태는 활성 성분으로서 치료적 유효량의 RTP801 억제제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 억제제는 생물학적 억제제, 유기 분자, 화합물 분자 등일 수 있으며, 상기 약학 조성물은 도 1에 기재된 서열(SEQ ID NO:1)에 대한 안티센스 서열인 서열을 갖는 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드인 RTP801 억제제를 포함할 수 있다. 또한, RTP801 억제제는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터일 수 있다. 추가적으로, RTP801 억제제는 도 2에 기재된 4 내지 25 아미노산(SEQ ID NO:2)을 포함하는 항원결정인자에 특이적으로 결합되는 단일클론 항체, 또는 siRNA 분자(임의로는 표 A 내지 C에 기재된 것, 특히 표 A의 siRNA Nos: 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 및 50) 또는 리보자임과 같은 RTP801 유전자 mRNA를 표적으로 하는 RNA 분자일 수 있다.
약학 조성물의 활성 성분은 본 발명의 실시에 필요한 핵산분해효소 내성을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 또는 적절한 서열 및/또는 리보자임에 대해 표적화되어 동일한 효과를 갖는 것으로 알려진 그의 분절을 포함할 수 있다. 안티센스 서열의 조합을 비롯하여 본 발명에 개시된 바와 같은 활성 성분의 조합물이 사용될 수 있다.
본 발명의 추가적인 양태는 척수 질환 또는 손상을 앓는 환자의 회복을 촉진시키기 위한 약물을 제조하는데 있어서 RTP801 억제제의 치료적 유효 투약량의 용도를 제공한다.
본 발명은 예시적인 방식으로 기재되었으며, 사용된 용어는 제한보다는 설명의 특성을 갖는 것으로 이해하여야 한다.
명확하게, 본 발명의 많은 변형 및 변화가 상기 교지의 측면에서 가능하다. 따라서, 첨부된 청구의 범위내에서 본 발명은 구체적으로 기재된 것과 달리 실시될 수 있음을 이해하여야 한다.
본 출원 전체에서 미국특허를 비롯한 다양한 공개공보가 저자, 년도, 특허번호에 대하여 언급되었다. 본 발명과 관련된 기술 내용을 보다 완전하게 설명하기 위하여 상기 공개공보, 특허 및 특허출원의 전체적인 개시내용이 본 출원에서 참고문헌으로 인용된다.
추가적인 노력없이도 당업계의 숙련자들은 전술한 설명을 이용하여 본 발명을 완전하게 이용할 수 있을 것이라고 보인다. 따라서, 하기의 바람직한 구체적인 양태는 청구된 본 발명을 단지 예시하기 위한 것이며 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 간주되지 않는다.
본원에 구체적으로 개시되어 있지 않으나, 당업계에 공지된 표준 분자 생물학 방법은 일반적으로 문헌[Sambrook 등, Molecular cloning : A laboratory manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York(1989, 1992); 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1988)]에 본질적으로 따른다.
본원에 구체적으로 개시되어 있지 않으나 당업계에 공지된 표준 유기합성 방법은 일반적으로 문헌[Organic syntheses : Vol .1-79, 편집자 다수, J. Wiley, New York, (1941-2003); Gewert 등, Organic synthesis workbook, Wiley-VCH, Weinheim (2000); Smith & March, Advanced Organic Chemistry, Wiley-Interscience; 5th edition (2001)]에 본질적으로 따른다.
본원에 구체적으로 개시되어 있지 않으나 당업계에 공지된 표준 의화학 방법은 일반적으로는 문헌[Comprehensive Medicinal Chemistry 시리즈, 저자 및 편집자 다수, Pergamon Press]에 본질적으로 따른다.
상세한 설명, 청구의 범위 및/또는 도면에 개시된 본 발명의 특징은 별도로 또는 임의로 조합되어서 본 발명을 다양한 형태로 인식하기 위한 자료가 될 수 있다.
실시예 1
일반적인 물질 및 방법
달리 기재되어 있지 않는 한, 하기의 물질 및 방법을 실시예 1 내지 5에서 사용하였다.
세포 배양물
제 1 인간 세포주, 즉 HeLa 세포(미국균주보존센터(American Type Culture Collection))를 하기와 같이 배양하였다: Hela 세포(미국균주보존센터)를 문헌[Czauderna, F., Fechtner, M., Aygun, H., Arnold, W., Klippel, A., Giese, K. Kaufmann, J.(2003). Nucleic Acids Res, 31, 670-82]에 기재된 바와 같이 배양하였다.
제 2 인간 세포주는 하기와 같이 배양한 인간 각질세포주이었다: 인간 각질세포를 10% FCS를 함유한 들베코의 변형 이글(Dulbecco's modified Eagle: DMEM) 배지중에서 37℃에서 배양하였다. 마우스 세포주는 10% FCS를 함유한 들베코의 변형 이글 배지(DMEM)중에서 37℃에서 배양한 B16V(미국균주보존센터)이었다. 배양 조건은 문헌[Methods Find Exp Clin Pharmacol. 1997 May; 19(4): 231-9]에 기재된 바와 같았다. 각 경우에 세포를 웰당 약 50,000개 세포의 밀도로 본원에 기재된 바와 같이 실험하고, 본 발명에 따르는 이중가닥 핵산을 20nM으로 첨가하였고, 이 때 이중가닥 핵산은 독점적인 지질 1㎍/ml을 사용하여 복합화하였다.
저산소증-유사 증상의 유도
하기와 같이 저산소증-유사 증상을 유도하기 위하여 세포를 CoCl2로 처리하였다: siRNA 핵산전달감염을 문헌[Czauderna 등, 2003; Kretschmer 등, 2003]에 기재된 바와 같이 10㎝ 플레이트(30 내지 50% 합류도(confluency))에서 실시하였다. 즉, 무혈청 배지중 미리 형성된 10 X 농축된 GB 및 지질 복합체를 완전 배지중 세포에 첨가함으로써 siRNA을 핵산전달감염시켰다. 전체적인 핵산전달감염 부피는 10ml이었다. 최종 지질 농도는 1.0㎍/ml이었다. 최종 siRNA 농도는 달리 기재되지 않는 한 20nM이었다. 용해(lysis) 24시간 전에 조직 배양물 배지에 CoCl2(100μM)을 직접 첨가함으로써 저산소증 반응을 유도하였다.
세포 추출물의 제조 및 면역 블롯팅
세포 추출물의 제조 및 면역 블롯팅 분석은 문헌[Klippel, A., Escobedo, M.A., Wachowicz, M.S., Apell, G., Brown, T.W., Giedlin, M.A., Kavanaugh, W.M. & Williams, L.T. (1998). Mol Cell Biol. 18, 5699-711; Klippel, A,. Reinhard, C., Kavanaugh, W.M., Apell, G., Escobedo, M.A.. & Williams, L.T.(1996). Mol Cell Biol, 16, 4117-27]에 기재된 바와 본질적으로 동일하게 실시하였다. pET19-b 발현 벡터(머크 바이오사이언스이즈 게엠베하(Merck Biosciences GmbH) 독일 슈발바흐 소재)로부터 박테리아를 생성시키는 재조합 RTP801 단백질에 의해 래빗을 면역화시킴으로써 전체 길이 RTP801에 대한 다클론 항체를 발생시켰다. 마우스의 단일클론 항-p110a 및 항-p85 항체가 상기 문헌[Klippel 등, 상기 참고]에 기재되어 있다.
실시예 2
제 1 인간 세포주에서의 RTP801 발현 감소
다양한 이중가닥 핵산을 제조하였다. 인간 RTP801(데이타뱅크 접근번호 NM_019058)을 부호화하는 핵산내의 mRNA 및 CDS 뿐만 아니라 인간 SNP에 대한 위치를 도 3에 도시하였다. 제 1 인간 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 상기 이중가닥 핵산과 접촉시켰다. 저산소증-유사 증상의 유도 및 상기 이중가닥 핵산에 의한 처리시에 세포를 용해시키고, P13-키나아제의 촉매적 단위인 p110a, 및 p85을 면역 블롯팅시킨 세포 용해물을 부하 대조군으로 사용하였다. RTP801 다클론 항체를 사용하여 시각화된 RTP801 띠의 강도는 RTP801의 발현 수준을 감소시키는 측면 에서 각각의 이중가닥 핵산의 활성의 척도이다.
2'-O-Me 기가 안티센스 가닥의 제 1, 제 3, 제 5, 제 7, 제 9, 제 11, 제 13, 제 15, 제 17 및 제 19 번째 뉴클레오타이드에 존재하고 매우 동일한 변형물, 즉 2'-O-Me 기가 센스 가닥의 제 2, 제 4, 제 6, 제 8, 제 10, 제 12, 제 14, 제 16 및 제 18번째 뉴클레오타이드에 존재하도록 임의의 이중가닥 핵산 각각을 변형시켰다. 추가적으로, 본 발명에 따르는 상기 특정한 핵산의 경우에는 제 1 연신부가 제 1 가닥과 동일하고 제 2 연신부가 제 2 가닥과 동일하며, 상기 핵산이 둔단임을 유념한다.
실험을 2회 실시하였고, 각각의 결과를 도 4a, 4b 및 4c의 A 내지 H에 도시하였고, 여기에서 이들을 각각 실험 1 및 실험 2라고 지칭하였다.
도 4a, 4b 및 4c의 A 내지 H에서 h, hr 및 hmr 표현은 인간 RTP801 mRNA에 특이적인 RTP801 mRNA의 구역을 어드레싱하도록(h), 인간과 레트 RTP801 mRNA에 특이적인 RTP801 mRNA의 구역을 어드레싱하도록(hr), 및 인간, 마우스 및 레트 RTP801 mRNA에 특이적인 RTP801 mRNA의 구역을 어드레싱하도록(hmr) 각각의 이중가닥 핵산이 설계되었음을 나타낸다. 40.1이라고 지칭한 이중가닥 핵산을 양성 대조군으로 사용하였고, 미처리 세포(UT+)를 음성 대조군으로 사용하였다.
결과에 따르면, 하기의 이중가닥 핵산이 RTP801의 발현을 하향 조절하는데 특히 유용한 것으로 판명되었다: 제 14, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 49 및 50번(표 A 참고).
실시예 3
제 2 인간 세포주에서의 RTP801 발현의 감소
실시예 2와 관련하여 기재된 바와 같은 실험을 실시예 1에 명시된 바와 같은 제 2 인간 세포주를 사용하여 반복하였고, 그 결과를 도 5a 및 5b의 A 내지 F에 도시하였다.
상기 도면으로부터 유추될 수 있는 바와 같이, 실시예 2에 기재된 실험에 따라 수득된 바와 같은 결과를 상기 제 2 인간 세포주를 사용하여 확인하였다.
실시예 4
RTP801 -특이적 이중가닥 핵산의 투약 효과
상기 실험에서, RTP801-특이적 이중가닥 핵산의 투약 효과를 연구하였다.
상기 목적을 위해 HeLa 세포를 실시예 2 및 3에서와 같이 처리하였고, 이 때 배양물 액체배지중 이중가닥 핵산의 농도는 10nM, 5nM 및 1nM이었다. 양성 대조군으로서 이중가닥 핵산 40.1번을 사용하였고, 음성 대조군으로서 미처리 세포(UT+)를 사용하였다. 판독은 실시예 2 및 3에 기재된 바와 동일하게 실시하였다. 사용된 특정한 이중가닥 핵산은 인간, 마우스 및 래트에 의해 공유된 RTP801 mRNA상의 연신부에 관련된 내부 참고번호 14, 22, 23 및 27을 갖는 것, 및 인간 RTP801에 특이적인 RTP801 mRNA의 연신부에 관련된 내부 참고번호 39 및 42을 갖는 이중가닥 핵산이었다.
결과가 도 6의 A 내지 C에 도시되어 있다. 상기 도면으로부터, RTP801에 특이적인 이중가닥 핵산의 효과의 명백한 농도 의존성이 있음을 알 수 있으며, 이 때 내부 참고번호 1, 15, 20, 21, 24, 40, 41, 43, 44, 22, 23, 27, 39, 42, 40.1, 44.1 및 14을 갖고, 바람직하게는 22, 23, 27, 39, 42, 40.1 및 44.1을 가지며, 더욱 바람직하게는 14, 23 및 27을 갖는 핵산 분자, 및 바람직하게 본원의 실시예 부분에 기재된 바와 같이 특정한 변형 패턴을 갖는 상기 핵산 분자 각각이 특별히 효과적이다.
실시예 5
RTP801 -특이적 이중가닥 핵산의 종 특이성
본 발명에 따르는 이중가닥 핵산은 다양한 종에서 동일하거나 상이한 RTP801 mRNA의 연신부에 대하여 설계되었다. RTP801-특이적인 이중가닥 핵산의 종 특이성 여부를 시험하기 위하여, 실시예 1 및 2에 명시된 바와 동일한 접근방법 및 판독방법을 사용하여서 인간, 마우스 및 래트의 RTP801 mRNA중에서 보존되는 RTP801 mRNA의 연신부를 어드레싱하는 내부 참고번호 14, 22, 23 및 27을 갖는 이중가닥 핵산, 및 인간 RTP801 mRNA에 특이적인 RTP801 mRNA의 연신부를 어드레싱하는, 즉, 그 자체로는 마우스 또는 래트에 존재하지 않는 연신부를 어드레싱하는 내부 참고번호 39 및 42를 갖는 이중가닥 핵산을 RTP801의 하향 조절과 관련하여 비교하였다.
사용된 이중가닥 핵산 전부는 대체로 인간 mRNA에 대한 활성이고 선행 실시예에서 알 수 있는 바와 같이 RTP801의 발현을 하향 조절하는데 적합하지만, 마우스 세포주를 사용할 때에는 마우스 RTP801 mRNA에도 특이적인 이중가닥 핵산, 즉 이중가닥 핵산 Nos: 14, 22, 23 및 27만이 효과적으로 RTP801 발현을 감소시켰다.
상기 결과로부터 하나 이상의 종에 특이적인 이중가닥 핵산을 어드레싱하는 RTP801을 설계할 수 있다고 결론지을 수 있다. 이로써 인간에서 뿐만 아니라 동물 모델에서도 아주 동일한 분자를 사용할 수 있다.
실시예 6
황반 변성에 관한 실험 모델, 방법 및 결과
본 발명의 화합물을 하기의 맥락막 혈관신생(CNV)의 동물모델에서 시험하였다. 레이저 처리에 의해 동물 모델에서 습식 AMD의 상기 특징을 유도하였다.
A) 마우스 모델
맥락막 혈관신생( CNV ) 유도
약물 군 배당을 모르는 한 사람이 0일째에 각각의 마우스 양안에 레이저 광응고(532nm, 200mW, 100ms, 75㎛)(오쿠라이트 지엘(OcuLight GL), 아이리덱스(Iridex), 캐나다 마운틴 뷰 소재)를 실시하여 습식 AMD의 특징인 맥락막 혈관신생(CNV)을 일으켰다. 레이저 반점을 세극등, 및 콘택트렌즈로서 덮개유리를 사용하여 시신경 주위에서 표준화 방식으로 적용시켰다.
치료군
하기 마우스 군(6 내지 8주된 수컷)에서 CNV를 유도하였다.
(1) WT 마우스 12마리;
(2) RTP801 녹-아웃 마우스 12마리;
(3) 0일 및 7일째에 한 눈에 합성 안정화된 활성 항-RTP801 siRNA(REDD14) 및 다른 눈에 불활성 항-RTP801 siRNA(REDD8-음성 대조군) 0.25㎍을 주사한 WT 마우스 12마리;
(4) 0일 및 7일째에 한 눈에 합성 안정화된 활성 항-RTP801 siRNA(REDD14) 및 다른 눈에 불활성 항-GFP siRNA(음성 대조군) 0.25㎍을 주사한 WT 마우스 12마리;
(5) 0일 및 7일째에 한 눈에 합성 안정화된 활성 항-RTP801 siRNA(REDD14) 및 다른 눈에 PBS(음성 대조군) 0.1㎍을 주사한 WT 마우스 12마리;
(6) 0일 및 7일째에 한 눈에 합성 안정화된 활성 항-RTP801 siRNA(REDD14) 및 다른 눈에 PBS(음성 대조군) 0.05㎍을 주사한 WT 마우스 12마리.
각 마우스의 양쪽 눈을 레이저 처리하였다. 주사된 부피는 2㎕이었다.
평가
1. 실험을 14일째에 종결하였다. 평가를 위해 눈을 적출하고, 30분동안 4℃에서 4% 파라포름알데하이드에 의해 고정시켰다. 감각신경 망막을 박리하고 시신경으로부터 절단하였다. 나머지 RPE-맥락막-공막 복합체를 임뮤-마운트(Immu-Mount)(벡타실드 마운팅 미듐(Vectashield Mounting Medium), 벡터(Vector))에서 평편하게 표본제작하고, 덮개로 덮었다. 평면 표본을 스캐닝 레이저 동초점 현미경(TCS SP, 레이카(Leica), 독일 소재)에 의해 검사하였다. 청색 아르곤 레이저에 의해 여기시켜서 혈관을 시각화하였다. RPE-맥락막-공막 복합체 표면으로부터 수평의 광학절편(1㎕ 단계)을 수득하였다. 병변과 연결된 주위 맥락막 혈관 그물구조가 확인될 수 있는 최심부 초점면을 병변 바닥이라고 판단하였다. 상기 기준면에 대한 표면인 레이저 처리된 영역내의 임의의 혈관을 CNV라고 판단하였다. 각 절편의 이미지를 디지털로 보관하였다. 레이카(Leica) TCS SP 소프트웨어를 사용하는 컴퓨터처리 이미지 분석에 의해 CNV-관련 형광 영역을 측정하였다. 각 수평 절편내의 전체 형광 면적의 총합을 CNV 부피에 대한 지표로서 사용하였다.
2. RPE/맥락막 또는 감각신경망막으로부터 추출된 RNA에 대하여 실시간 PCR을 사용하여 CNV중 RTP801 mRNA 발현(및 AMD와 관련된 다른 유전자 발현)(미처리 및 siRNA에 의한 처리)을 평가하기 위하여 별도의 WT 마우스(1개군 당 5개 눈)를 사용하였다.
결과
1. RTP801 KO 마우스는 WT 마우스와 비교시 CNV 유도 이후에 30% 미만의 혈관 누출을 나타내었다; 도 8 참고.
2. RTP801, REDD14에 대한 합성 안정화 siRNA는 CNV 부피의 투약량-의존적 감소를 도출하였다. PBS-주사된 눈에 비해 각 눈당 REDD14(표 1의 14번 서열, SEQ ID Nos: 16(센스) 및 66(안티센스)) 0.25㎍ 투약량에서 최대 ∼70% 억제가 이루어졌다. 동일 투약량에서 음성 대조군 siRNA, REDD8 및 항-GFP siRNA 둘다는 단지 각각 27% 및 33%의 CNV 부피 감소를 나타내었으며, 이는 REDD14D의 우수한 효능 및 그 효과 특이성을 뒷받침하는 것이다.
B) 비-인간 영장류 모델
CNV 모델
2 내지 6년된 수컷 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이(마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)) 8마리를 연구에 사용하였다. 투약 투여이전에 양쪽 눈의 황반주위의 레이저 처리에 의해 맥락막 혈관신생(CNV)을 유도하였다. 레이저(아이리스 메디칼(IRIS Medical: 등록상표) 포터블 슬릿 램프 어댑터(Portable Slit Lamp Adaptor)를 갖는 오큐라이트 지엘(532nm) 레이저 포토-코아귤레이터(LaserPhoto-coagulator))에 의해 병변 9개가 황반에 생겼고, 오른쪽 눈의 레이저 반점은 왼쪽 눈의 위치의 거울상이었다. 대략의 레이저 변수는 반점 크기 50 내지 100㎛ 직경, 레이저 전력: 300 내지 700 밀리와트 노출 시간 0.1초이었다.
치료
레이저 처리 직후에 모든 동물의 양쪽 눈에 일회 유리체내 주사를 실시하였다. 왼쪽 눈에 RTP801에 대한 합성 안정화된 siRNA(마우스 연구에서 사용된 것과 동일한 것) 350㎍을 최종 부피 50㎕으로 투약하고, 반대편 눈은 PBS(비히클) 50㎕를 수용받도록 하였다.
평가
1. 모든 동물을 음식 소비 및 체중 측정에 대하여 매일 검사하였다.
2. 원숭이 2마리를 CNV 유도후 6일째에 안락사시켰다. 눈을 적출하고, 후극을 편평하게 하였다. 이어서, 오목한 영역을 잘라내고, 맥락막과 감각신경망막으로 분리하고, 이후에 RNA 추출 및 RTP801 발현의 실시간 PCR 평가에 사용되도록 액체 질소에 따로(모든 동물마다) 동결시켰다.
3. 형광물질 혈관조영상을 연구전 및 CNV 유도후 1주, 2주 및 3주의 마지막에 실시하였다. 눈바닥 사진기(TRC-50EX 레티나 카메라(Retina Camera))를 사용하여 사진을 찍었다. 탑콘 이미지넷(TOPCON IMAGEnet)TM 시스템을 사용하여 이미지를 포착하였다. 형광물질 염료(10% 형광물질 나트륨, 약 0.1ml/kg)를 혈관접근부를 통해 주사하였다. 혈관신생을 평가하고 CNV 병변과 관련된 형광물질 누출을 관측하기 위하여 동맥기, 초기 동정맥기 및 여러 후기 동정맥기를 포함하도록 염료 주사후에 여러 시점에서 사진을 찍었다. 2명의 안과의사가 독립적으로 형광물질 혈관조영상의 해독 및 분석을 실시하였다.
혈관신생(NV)은 초기 혈관조영술에서 평가하였고, 모든 반점은 하기 분류에 따라 등급을 정하였다: 0 - NV 징후가 없음, 0.5 - 반점이 의심됨, 1 - "열"점, 2 - 레이저 화상에서의 NV, 3 - 명백한 NV.
누출은 하기 분류에 따라 평가하였다: 0 - 누출이 없음, 0.5 - 반점이 의심됨, 1 - 명백한 작은 반점 누출, 2 - 시간 경과에 따라 누출 증가, 3 - 이전 경계보다 (명백히) 큰 누출.
또한, 모든 반점의 크기를 초기 및 후기 혈관조영술 사이에서 형태계측학적 측정법을 사용하여 비교하였고, 누출로부터 발생된 반점 크기의 증가를 계산하였다.
4. 갠즈필드(Ganzfield) 장치의 사용을 포함하여 시에라(Sierra) SOP 및 연구-특이적인 SOP에 따르는 에픽(Epic) 망막전위계를 사용하여 연구전 및 3주 마지막에 망막전위도(ERG)를 기록하였다. 수의학 안과의사가 도표화된 ERG 데이터를 평가하였다.
연구를 CNV 유도 경과후 21일째에 종결하였다. 눈을 포함한 기관 및 조직에 대하여 육안 검시 및 조직학 검사를 실시하였다.
결과
1. RTP801에 대한 siRNA는 CNV 유도후 6일째에 실시간 PCR에 의해 측정될 때 레이저-처리된 동물의 RPE/맥락막내의 RTP801 발현을 감소시켰다(도 10 참고).
2. 각각의 개별 원숭이의 다른쪽 눈간의 누출 및 혈관신생에 대한 반점 등급화의 비교에 의해 이들 병리학적 특징 둘다가 대조군에 비해 RTP801 siRNA을 주입한 눈에서 감소하였음이 판명되었다(누출 결과에 대하여는 도 11 참고; 혈관신생 결과에 대하여는 도 12 참고).
3. 모든 PBS-주사한 눈에 비해 모든 siRNA-주사한 눈에서 누출 및 혈관신생의 보다 높은 임상-관련 등급(2 및 3)을 갖는 총 반점 수를 계산하여 siRNA-주사한 눈이 덜 영향을 받았음이 판명되었다(도 13a 및 13b 참고).
4. 반점 누출 및 혈관신생에 대한 전체적인 등급화 데이터를 통계적으로 평가하였다. siRNA 및 대조군 처리간의 차이 존재를 대조군 오른쪽(R) 눈 및 siRNA- 주사한 왼쪽(L) 눈의 평균 반점 순위간의 델타(델타=R-L)를 계산하여서 분석하였다. 차이의 유의성을 비-매개 통계적 방법인 윌콘슨 부호 순위 검정(Wilcoxon signed ranks test)-단측 검정을 사용하여 계산하였다. 혈관조영상의 상이한 시기(초기 동맥기, 동맥-정맥기 및 후기 정맥기)를 매주(1주, 2주 및 3주)동안 별도로 분석하였다.
표 2는 각각의 군에 대해 0으로부터 누출 순위 차이의 유의성(단측 검정)을 나타낸다(0.05 미만의 p값에는 밑줄을 그었다). 후기 혈관조영상에서는 2주 및 3주후에 오른쪽 눈(플라시보 처리)에 비해 왼쪽 눈(siRNA 처리)에서 유의한 누출 순위 감소가 발견되었다.
Figure 112009065460497-pat00002
후기 혈관조영상은 일반적으로 누출 변수 평가를 위해 이용됨을 유념한다.
표 3은 각각의 군에서 0으로부터 혈관신생(NV) 순위 차이의 유의성(단측검정)을 나타낸다(0.05 미만의 p값에는 밑줄을 그었다).
Figure 112009065460497-pat00003
유의한 NV 순위 감소는 초기 2주 및 3주후 및 정맥-동맥기 2주후에 오른쪽에 대한 왼쪽 눈에서 발견되었다.
초기 혈관조영상은 혈관신생 변수 평가를 위해 일반적으로 이용됨을 유념한다.
5. 누출로 인한 초기(동맥기) 및 후기(정맥기) 혈관조영상 사이에서 발생하는 반점 영역의 증가를 정량적 형태계측학적으로 평가한 결과, 상기 변수는 대조군(오른쪽 눈, OD)에 비해 siRNA-주사한 눈(왼쪽 눈, OS)내의 레이저 반점에서 유의하게 감소되었음이 판명되었다. 2개의 실시예가 도 14에 도시되어 있다. 그래프는 #3315 및 3300 동물의 왼쪽 및 오른쪽 눈에서 모든 반점 영역의 상대적 증가(%)를 증명하였다.
추가적으로, 상기 모든 연구에서 항-RTP801 siRNA가 망막전위도(ERG), 눈 조직학, 또는 다른 기관 및 계통의 구조와 기능에 대하여 부작용을 갖지 않았음을 유념한다.
상기 실험 및 결과의 요약:
1. 습식 노년기 황반변성(습식 AMD)의 레이저-유도된 CNV 모델에서 RTP801 발현의 유전적(RTP801-/-) 및 치료적 siRNA 억제 둘다는 CNV 부피를 유의하게 감소시켰다.
2. 마우스 및 비-인간 영장류 모델에서 양성 결과가 얻어졌다.
3. 원숭이의 병리학적 및 EGR 검사는 눈에서 또는 임의의 다른 기관 또는 계통에서 임의의 siRNA-매개된 독성을 증명하지 못하였다.
C) RTP801 siRNA(REDD14) 및 항-VEGF 항체의 병용 요법의 효능
CNV가 발생한 질환의 치료에서 RTP801 siRNA(REDD14) 및 항-VEGF 항체의 병용 요법의 효능을 상기 마우스 CNV 모델에서 시험하였다.
A) CNV 부피 연구
레이저 손상 3주후의 맥락막 혈관신생(CNV)의 부피를 상기 기재된 바와 같이 공초점 형광 현미경에 의해 실시하였다(문헌[Sakurai 등, IOVS 2003; 44: 3578-85 & Sakurai 등, IOVS 2003; 44:2743-2749]).
이전 연구에서 항-VEGF-A 항체(Ab)는 투약량 의존적인 방식으로 CNV 부피를 감소시킴을 밝혀냈다. VEGF-A Ab 1ng의 투약량을 REDD14 + VEGF-A Ab 조합 연구에 대해 선택하였는데, 이는 상기 투약량이 중간 억제 효과, 즉 VEGF-A Ab(1ng)이 CNV 크기를 26±6% 감소시켰기 때문이다.
REDD14 + VEGF-A 항체(Ab)의 주요 결론은 0.05㎍ 적은 투약량에서 REDD14의 첨가는 VEGF-A Ab 단독에 비해 CNV의 크기를 27±4% 감소시키고, 0.25㎍ 높은 투약량에서 REDD14의 첨가는 VEGF-A Ab 단독에 비해 CNV의 크기를 55±3% 감소시킨다는 것이다.
B) CNV 누출 연구
실험 1
본 실험은 마우스의 레이저-유도된 맥락막 혈관신생 모델에서 VEGF 및 RTP801 억제의 잠재적인 추가 또는 상승 치료적 효과를 확인하기 위하여 설계되었다.
물질은 REDD14(RTP siRNA), REDD8(음성 대조군), 항-VEGF 항체 및 비-특이적 IgG(음성 대조군)이었다.
CNV는 전술한 바와 같이 0일째에 유도되었고, 시험 물질은 0일 및 7일째에 피실험자에게 주사되었다.
결과는 형광물질 혈관조영술에 의해 1주, 2주 및 3주째에, 또한 CNV 부피 측정에 의해 3주째에 평가하였다. 각각의 시험 군은 10개의 눈으로 구성되었다.
실험 군은 VEGF Ab 0.5ng/눈, VEGF Ab 1ng/눈, VEGF Ab 2ng/눈, VEGF Ab 4ng/눈, REDD14 0.05㎍/눈, REDD14 0.1㎍/눈, REDD14 0.25㎍/눈, REDD14 0.05㎍/눈 + VEGF Ab 1ng/눈, REDD14 0.1㎍/눈 + VEGF Ab 1ng/눈, REDD14 0.25㎍/눈 + VEGF Ab 1ng/눈이고, 대조군은 PBS, 비특이적 IgG 2ng/눈, REDD8 0.1㎍/눈, REDD8 0.1㎍/눈 + VEGF Ab 1ng/눈이었다.
결과
상기 실험의 결과가 도 23 및 24에 제시되어 있다. 상기 결과는 VEGF Ab 및 REDD14의 유리체내 동시 투여는 4등급 반점 발병률의 감소와 1등급 반점 발병률의 증가로 표현되는 것처럼 맥락막 혈관신생 및 맥락막 혈관 누출의 증가된, 투약량-의존적 억제에 이르게 한다는 것을 나타낸다. 혈관조영상은 이전에 발표된 변형된 반(semi)-정량적 등급화(1 내지 4) 분류를 사용하여 등급을 정하였다(문헌[Sakurai 등, IOVS 2003; 44:2743-2749]). 1등급 병변은 아예 형성되지 않은 것으로, 즉 완전히 예방된 것에 대응하는 것으로 간주한다. 4등급 병변은 병리학적으로 유의한 것으로, 즉 환자에게서 치료해야 하는 병변에 해당하는 것으로 간주한다. VEGF-A Ab(1ng)은 눈당 4등급 병변의 발병률을 38±8% 감소시켰으며, 눈당 1등급 병변의 발병률을 66±43% 증가시켰다.
REDD14 + VEGF-A Ab 조합 누출 연구의 주요 결과는 0.05㎍ 적은 투약량에서 REDD14의 첨가는 VEGF-A Ab 단독에 비해 4등급 병변의 발병률을 66±12% 감소시켰고, 0.25㎍ 높은 투약량에서 REDD14의 첨가는 VEGF-A Ab 단독에 비해 4등급 병변의 발병률을 60±12% 감소시켰으며, 0.25㎍ 높은 투약량에서 REDD14의 첨가는 VEGF-A Ab 단독에 비해 1등급 병변의 발병률을 두 배(100±34%)로 하였다.
실험 2
본 실험은 RPE 및 감각신경망막에서 유전자 발현에 대한 REDD14의 효과를 연구하기 위하여 설계되었다.
실험 설계
군은 PBS 및 REDD14 0.25mg이었다.
군 크기는 5개 눈이었다. CNV는 0일째에 전술한 바와 같이 레이저 처리에 의해 유도하였고, 시험 물질을 또한 0일째에 주사하였고, 그 효과를 0일째 및 5일째에 RPE 및 감각신경망막에서의 유전자 발현을 qPCR 분석하여서 평가하였다.
결과
상기 실험의 결과를 도 25에 제시하였다. 상기 결과는 REDD14의 투여가 RPE 및 감각신경 망막 둘다에서 RTP801 발현을 기저선 아래로 ∼40% 하향조절시키고(또한, 도 26 참고); 감각신경 망막에서 PEDF 발현을 기저선 위로 ∼70% 상향 조절시키고(유의: PBS-주사된 눈에서 PEDF 발현은 기저선 아래로 40% 하향 조절된다); RPE에서 VEGF164 발현을 기저선 아래로 40% 하향 조절시키고(유의: PBS-주사된 눈에서 VEGF164의 발현이 20% 하향 조절된다); RPE/맥락막내의 MCP1 발현을 ∼50% 감소시킨다(도 26 참고)는 것을 나타낸다.
실험 둘다로부터의 일반적인 결론
·RTP801 및 VEGF의 동시 억제는 맥락막 혈관신생 및 신생혈관 누출에 대해 증가된 억제 효과를 갖는다.
·REDD14에 의한 RTP 발현의 억제는 CNV 모델에서 PEDF 하향 조절을 방지할 뿐만 아니라 기저선에 비해 그 발현을 증가시킨다.
·RTP801 발현의 억제는 항-염증 효과를 갖는 MCP1의 부수적인 하향 조절에 이르게 한다.
·이론에 제한되려는 것은 아니나, REDD14에 의한 PEDF 발현의 증가는 VEGF 및 RTP801 동시 억제의 관찰된 협조적 효과의 기초가 될 수 있다(유의: PEDF는 충분히 공지된 혈관형성 및 신경보호 인자이다).
·이론에 제한되려는 것은 아니나, REDD14에 의한 MCP1 발현의 감소는 VEGF 및 RTP801 동시 억제의 관찰된 협조적 효과의 기초가 될 수 있다(유의: MCP1은 AMD의 발병기전에 관련된 공지된 염증전 케모카인이다).
본 발명의 방법을 시험하기 위해 사용될 수 있는 추가적인 AMD 모델은 Ccl-2 또는 Ccr-2 결핍 동물로서, 상기 단백질중 하나의 결핍은 AMD의 주된 특징의 일부를 발현시킨다. 상기 단백질이 결핍된 동물을 본 발명의 방법을 시험하기 위하여 사용할 수 있다.
AMD 동물 모델에 대한 추가적인 정보에 대하여 문헌[Chader, Vision research 42(2002) 393-399; Ambati 등, Nature Medicine 9(11)(2003) 1390-1397; Tolentino 등, Retina 24(2004) 132-138]을 참고한다.
D) 각각의 가닥에 3' 포스페이트 기를 갖는 REDD14 항 RTP801 siRNA 및 레이저-유도된 CNV 모델에서 3'포스페이트-결핍된 동일 분자(REDD14NP)의 활성 비교
실험을 전술한 바와 같이 일반적으로 실시하고 평가하였다. 각 마우스(군당 12마리)의 한 눈에 REDD14 siRNA 0.25㎍을 주사하고, 다른 눈에 REDD14NP siRNA를 주사하였다.
결과
siRNA 둘다는 동등하게 효율적으로 CNV 부피를 감소시켰다(도 27).
실시예 7
COPD 및 폐기종에 관한 모델 및 결과
본 발명의 화합물을 하기 동물 모델에서 시험하였다:
· 흡연-유도된 폐기종 모델: 흡연에 대한 만성 노출은 특히 마우스, 기니아피그와 같은 여러 동물에서 폐기종을 일으킨다
· 폐기종 유발인자로서 폐 프로테아제 활성
· 폐기종의 VEGFR 억제 모델
· 인간 중성구/설치류에서의 췌장 엘라스타제의 기관지 점적
· MMP(기질 금속프로테아제)-유도된 폐기종
· 염증-유도된 폐기종
추가적으로, 폐기종 모델은 유전자 방법(예컨대, TSK 돌연변이를 갖는 마우스)를 통해 발생시킬 수 있으며, 기종성 동물은 특히, 폐 손상, 폐포 형성저하증, 고산소혈증, 당질코르티코이드 처리 및 영양과 같은 폐기종에 걸리기쉬운 것으로 알려진 변형인자에 의해 발생될 수 있다.
A. 폐기종 마우스 모델( RTP801 녹아웃 마우스 사용)에서의 질환 발생에 대한 RTP801 결핍 영향의 평가
(1) RTP801 KO 5마리 및 대조군 야생형 5마리의 4개월된 수컷 마우스에서 흡연(CS) 유도된 염증 및 세포자멸을 개시하였다. 마우스를 강한 CS(문헌[Rangasamy 등, 상기 참고])에 7일동안 적용시켰다. 상기 VEGFR 억제 실험으로부터의 KO 및 WT 비처리된 마우스가 본 실험에서 비처리된 대조군으로 기능할 수 있다. 이어서, 폐를 아가로즈-팽창시키고, 고정시키고, 파라핀에 함몰시키고, KO 마우스에서의 산화 스트레스의 발현을 다음과 같이 평가하였다:
a) 폐 절편에서 8-옥소-dG의 면역조직화학적 편재 및 정량;
b) 특이적 항체를 사용하여 폐 절편에서 활성 카스파제 3의 면역조직화학적 편재 및 정량, 또는 TUNEL-양성 세포 개수의 정량적 평가;
c) 폐 추출물에서 세라마이드 농도의 측정;
d) 폐 추출물에서 카스파제 활성의 측정.
(2) KO 마우스에서 장기 흡연
KO 6마리 및 나이를 일치시킨 WT 암컷 마우스 6마리를 6개월동안 강한 흡연(1일 5시간)에 적용시켰다. 이어서, 상기 마우스를 죽이고, 형태계측학적 방법을 사용하여 평균 중격간 직경(폐기종 발현 변수)를 평가하였다.
B. 폐내 전달 RTP801 -불활성화 siRNA 를 사용하는 내생적 RTP801 억제에 의한 폐기종 마우스 모델내의 질환 진행에 대한 RTP801 결핍 영향의 평가
각 군을 마우스 10마리로 하여, C57BL6 마우스 2군에서 7일간 흡연에 의해 CS-유도된 염증을 유도하였다. 1군은 CS + 대조군 siRNA(REDD8) 전달이고; 2군은 CS + RTP801 siRNA(REDD14)이다. 대조군 마우스를 실내 공기 조건에서 유지하면서 siRNA중 한 유형으로 점적하였다. 녹아웃 마우스를 사용한 상기 실험에서처럼 동물을 평가하였다.
방법
흡연( CS )에 대한 노출
흡연 기계(모델 TE-10, 티그 엔터프라이즈이즈(Teague Enterprises), 미국 캘리포니아주 데이비스 소재)를 사용하여 2R4F 참고번호 담배(담배당 2.45mg 니코틴, 켄터키 대학(University of Kentucky), 토바코 리서치 인스티튜트(the Tobacco Research Institute)로부터 구입, 미국 켄터키주 렉싱톤 소재)를 연소시킴으로써 노출(7시간/1일, 7일/1주)을 실시하였다. 각각의 연기나는 담배를 2초동안 흡입시키고, 1.05ℓ/분의 유속으로 매분당 총 8회 흡입하여서 표준 흡입량 35㎤을 제공하였다. 한번에 5개의 담배를 연소시켜서 부류연(sidestream smoke)(89%) 및 주류연(mainstream smoke)(11%)으로 이루어진 혼합물을 생성시키도록 흡연 기계를 조정하였다. 각각 90mg/㎥ 및 350ppm의 농도를 갖는 전체 부유 미립자 및 일산화탄소에 대하여 챔버 분위기를 관측하였다.
형태학적 및 형태계측학적 분석
마우스를 CS에 노출시키거나 또는 RTP801 발현 플라스미드를 점적한 이후에 마우스를 할로탄으로 마취시키고, 폐를 상기 기재된 바와 같이 25cm 일정압에서 0.5% 저용융 아가로즈에 의해 팽윤시켰다. 팽윤된 폐를 10% 완충 포르말린에 고정시키고, 파라핀에 함몰시켰다. 절편(5㎛)을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색시켰다. 평균 폐포 직경, 폐포 길이 및 평균 선형 차단물(mean linear intercept)을 이미지 프로 플러스(Image Pro Plus) 소프트웨어(미디어 사이버네틱스(Media Cybernetics), 실버 스프링(Silver Spring), 미국 메릴랜드주 소재)를 사용하여 컴퓨터에 의한 형태계측법에 의해 결정하였다. 각 군내의 폐 절편을 부호화하고, 슬라이드의 정체를 모르는 연구자가 니콘(Nikon) E800 현미경, 20X 렌즈를 사용하여 대표적인 이미지(폐 절편당 15개)를 획득하였다.
기관지폐포세척액 ( BAL ) 및 표현형 결정
CS에 노출시키거나 또는 RTP801 발현 플라스미드를 점적한 이후에 마우스를 소듐 펜토바비탈으로 마취시켰다. 마우스의 폐로부터 수거한 BAL 유체를 원심분리(4℃에서 500 x g)하고, 세포 펠릿을 포스페이트 완충 염수에 재현탁하였다. 세척 유체중 세포의 총 수를 결정하고, 2 x 104 세포를 유리 슬라이드상에서 세포원심분리(샨돈 서던 프로덕츠(Shandon Southern Products), 미국 펜실베이니아주 피츠버그 소재)시키고, 라이트-김자(Wright-Giemsa) 염색으로 염색시켰다. 표준 세포학적 기술에 따라 300개 세포에 대하여 차등 세포 계수를 실시하였다.
폐내의 폐포 세포자멸 세포 모집단의 확인
폐에서 세포자멸되는 상이한 폐포 세포 유형을 확인하기 위하여, 활성 카스파제 3의 면역조직화학적 염색을 실온 공기(RA) 및 CS 노출된 마우스의 폐 절편에서 실시하였다. 폐내의 세포자멸성 II형 상피세포를 확인하기 위하여 활성 카스파제 3을 표지한 후에 폐 절편을 항-마우스 계면활성제 단백질 C(SpC) 항체로 우선 배양하고, 이어서 항-래빗 텍사스(Texas) 적색 항체에 의해 배양하였다. 우선 항-마우스 CD31 항체에 의해 상기 절편을 배양하고, 이어서 비오틴화 래빗 항-마우스 이차 항체로 배양함으로써 세포자멸성 내피세포를 확인하였다. 폐 절편을 PBS에서 세정하고, 이어서 스트렙타비딘-텍사스 적색 결합된 복합체와 함께 배양하였다. 우선 래트의 항-마우스 Mac-3 항체에 의해 절편을 배양하고 이어서 항-래트 텍사스 적색 항체에 의해 배양함으로써 폐내의 세포자멸성 포식세포를 확인하였다. 최종적으로, DAPI를 모든 폐 절편에 적용하고, 5분동안 배양하고, 벡타실드 하드셋(Vectashield Hardset) 봉입제로 고정시켰다. DAPI 및 형광물질을 각각 330 내지 380nm 및 465 내지 495nm에서 시각화하였다. 폐 절편의 이미지를 니콘 E800 현미경, 40X 렌즈를 사용하여 획득하였다.
활성 카스파제 -3의 면역조직화학적 편재
활성 카스파제-3 어세이의 면역조직화학적 염색은 항-활성 카스파제-3 항체를 사용하여 실시하였고, 활성 카스파제-3-양성 세포를 이미지 프로 플러스 프로그램을 사용하는 매크로에 의해 계수하였다. 계수를 본원에서 폐포 길이라고 명명한 폐포 프로필(㎛ 단위로 표기)을 합하여 표준화하였다. 폐포 길이는 평균 선형 차단물과 반비계 상관관계를 가져서, 즉 폐포 중격이 파괴될 때, 전체 폐포 길이, 즉 전체 폐포 중격 길이가 감소함에 따라 평균 선형 차단물이 증가한다.
카스파제 3 활성 어세이
카스파제-3/7 활성은 제조업체 안내에 따라 형광계측법을 사용하여 폐 조직 추출물에서 측정하였다. 급속 동결된 폐 조직(1개군당 n=3)을 어세이 완충제를 사용하여 균질화시키고, 이어서 초음파처리 및 800 x g에서의 원심분리를 실시하였다. 핵 및 세포파편을 제거한 후에, 상청액(300㎍ 단백질)을 실온에서 1시간동안 형광전(profluorescent) 기질과 함께 배양하고, 타이푼 포스포이미저(Typhoon phosphoimager)(아머샴 바이오사이언스이즈, 인코포레이티드(Amersham Biosciences, Inc.), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 사용하여 형광 강도를 측정하였다. 결과는, 전체 단백질 농도에 의해 표준화되며 카스파제 3 효소 활성 단위로 표기된 특이적 카스파제-3 기질 절단의 속도로 표기된다. 활성 재조합 카스파제 3은 어세이 표준(0 내지 4 U)으로 이용하였다. 기질을 포함하지 않은 조직 용해물, 어세이 완충제 단독, 및 카스파제 3 억제제를 포함한 용해물을 음성 대조군으로 이용하였다.
8-옥소- dG 의 면역조직화학적 편재
8-옥소-dG의 면역조직화학적 편재 및 정량화를 위해, CS 노출되거나 RTP801 발현 플라스미드로 점적한 마우스의 폐 절편을 항-8-옥소-dG 항체와 함께 배양하고, 마우스 항체를 사용하는 인노게넥스(InnoGenex)TM 이소(Iso)-IHC DAB 키트를 사용하여 염색하였다. 8-옥소-dG-양성 세포를 매크로(이미지 프로 플러스를 사용함)에 의해 계수하고, 계수는 기재된 바와 같이 폐포 길이에 의해 표준화하였다.
플라스미드 DNA 의 마우스 폐로의 점적
RTP801 발현의 플라스미드 DNA 및 대조군 벡터를 내독소를 함유하지 않은 DNA 분리 키트에서 제조하였다. 기관내 점적을 위해 플라스미드 DNA 50㎍을 무균 퍼플루오로카본 80㎕중에서 전달하였다. 퍼플루오로카본의 산소 운반 특성은 상기 부피에서 충분히 허용되는 반면, 그 물리-화학적 특성은 기관내에 점적될 때에 극히 효율적인 원위 폐 전달이 되도록 한다. 마우스를 순간적인 할로탄 흡입 노출에 의해 마취시키고, 겸자집게에 의해 혀를 적당히 앞으로 꺼내고, 둔단 혈관카테터를 통해 혓바닥에 적용되는 퍼플루오로카본 용액을 기관에 점적하였다.
siRNA 의 마우스 폐로의 점적
케타민/크실라진(115/22mg/kg)을 복강내 주사하여 마우스를 마취시켰다. siRNA 50㎍을 5회의 연속된 10㎕ 분획을 전달하여서 0.9% NaCl 50㎕ 부피로서 비강내 점적시켰다. 비강내 점적의 마지막에 마우스 두부를 1분동안 위로 곧게 고정시켜서 점적된 용액 전부가 내부로 확실히 흘러들어가게 하였다.
추가적인 정보를 위해서는 문헌[Rangasamy T, Cho CY, Thimmulappa, RK, Zhen L, Srisuma SS, Kensler TW, Yamamoto M, Petrache I, Tuder RM, Biswal S. Genetic ablation of Nrf2 enhances susceptibility to cigarette smoke - induced emphysema in mice . Journal of Clinical Investigation; Yasunori Kasahara, Rubin M. Tuder, Carlyne D. Cool, David A. Lynch, Sonia C. Flores, and Norbert F. Voelkel. Endothelial Cell Death and Decreased Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 in Emphysema . Am. J. Respir Crit Care Med Vol 163. pp 737-744, 2001; Yasunori Kasahara, Rubin M, Tuder, Laimute Taraseviciene-Stewart, Timothy D. Le Cras, Steven Abman, Peter K. Hirth, Johannes Waltenberger, and Norbert F. Voelkel. Inhibition of VEGF receptors causes lung cell apoptosis and emphysema . J. Clin. Invest. 106:1311-1319(2000); 및 a review on the topic: Robin M. Tuder, Sharon McGrath and Enid Neptune, The pathological mechanisms of emphysema models: what do they have in common ? Pulmonary Pharmacology & Therapeutics 2002]을 참고한다.
결과
1. RTP801 발현 플라스미드의 점적은 (1) 기관지폐포 세척액 세포 계수의 증가(도 15a), (2) 폐 중격 세포의 세포자멸(표 15b) 및 폐포직경의 증가(도 15c)로써 명백해지는 폐기종-유사 표현형을 마우스 폐에서 발생시켰다.
2. RTP801 siRNA(REDD14)의 점적은 폐에서 RTP801 발현을 감소시켰다(도 17b).
3. RTP801 KO 마우스는 폐포 직경 확대가 없는 것으로 증명되는 바와 같이 6개월 흡연이후에 폐기종 발현으로부터 보호되었다(도 18).
4. RTP801 KO 마우스는 1주일 흡연 이후에 염증성 기관지폐포 세포의 수 감소로 증명되는 바와 같이 흡연으로 유도된 염증으로부터 보호되었다(도 16a 및 16b).
5. RTP801 KO 마우스는 활성화된 카스파제에 대한 폐 절편 염색으로 증명되는 바와 같이 폐 중격 세포의 흡연으로 유도된 세포자멸로부터 보호되었다(도 16c).
6. REDD14-점적된 마우스는 1주일 흡연 이후에 염증성 기관지폐포 세포의 수 감소에 의해 증명되는 바와 같이 흡연으로 유도된 염증으로부터 부분적으로 보호되었다(도 17a).
7. REDD14-점적된 마우스는 활성화된 카스파제에 대한 폐 절편의 염색 및 항-활성화된 카스파제 3 항체에 의한 폐 추출물의 면역블롯팅에 의해 증명되는 바와 같이 폐 중격 세포의 흡연으로 유도된 세포자멸로부터 부분적으로 보호되었다(도 17c).
실시예 8
미세혈관 장애에 관한 모델 및 결과
본 발명의 화합물을 하기에 기재된 일정 범위의 미세혈관 장애의 동물 모델에서 시험하였다.
1. 당뇨병성 망막병증
RTP801은 뉴런 세포의 세포자멸 및 생체외의 반응성 산소 종 생성을 촉진시킨다. 본 발명의 발명자들은 또한 미숙아 망막병증(RPO) 모델을 적용시킨 RTP801 녹아웃(KO) 마우스에서 VEGF 증가에도 불구하고 병적 혈관신생(NV)이 저산소증 증상에서 감소된 반면, 상기 유전자의 결핍은 병적 신생아 망막 NV에 영향을 미치지 않음을 밝혀냈다. 또한, 상기 모델에서 RTP801의 결핍은 저산소증 뉴런 세포자멸 및 고산소혈증 혈관폐색에 대하여도 보호되었다.
실험 1
8주된 RTP801 KO 및 C57/129sv 야생형(WT) 한배새끼 마우스에서 STZ 복강내 주사하여 당뇨병을 유도하였다. 4주후에 암순응 1시간후에 왼쪽 눈으로부터 ERG(1회의 백색 플래시, 1.4 x 104 ftc, 5ms)를 수득하였다. 에반스청 알부민 투과법을 사용하여 양쪽 눈에서 RVP를 평가하였다.
결과
혈당은 당뇨병(DM) WT 및 DM KO(495±109 대 513±76mg/dl)사이에서 또는 비당뇨병(NDM) WT 및 KO(130±10 대 135±31mg/dl, 각각) 사이에서 다르지 않았다. DM WT 군의 RVP는 NDM WT(21.5±18.8㎕/g/hr, n=9, p=0.055)에 비해 138%(51.2±37.9㎕/g/hr, n=8) 증가하였다. 이와 반대로, RVP는 DM WT 마우스에 비해 DM KO(9.5±8.5㎕/g/hr, n=6, p=0.023)에서 80% 감소하여서 당뇨병-유도된 RVP를 140% 감소시켰다. NDM WT에 비할 때 DM WT 마우스에서는 OP2(11%), OP3(12%) 및 OP4(14%) 및 B-파(23%)에 대하여 진동소파 전위 내재 시간의 연장(p<0.05)이 있었다. A-파는 그다지 크게 변하지 않았다. 상기 변화는 NDM KO에 비해 OP3 및 OP4의 경우 DM KO 마우스에서 ∼100%로 정상화되었고, B-파의 경우 65% 정상화되었다. 결론: RTP801의 녹아웃은 마우스에서 당뇨병-유도된 RVP 및 ERG 이상을 개선시키며, 이는 저산소증-유도성 유전자가 초기 당뇨병성 망막 질환의 발병기전에서 중요한 역할을 수행할 수 있음을 시사한다.
실험 2
당뇨병을 유전적 배후가 일치하는 RTP801 녹아웃 및 대조군 야생형 마우스에서 유도하였다. 또한, 이를 C57B16 마우스에서 유도하고, 이어서 항-RTP801 및 대조군 siRNA의 유리체내 주사를 위해 사용하였다. 당뇨병 유도의 경우, 마우스를 스트렙토조토신(야간 공복후 2일동안 STZ 90mg/kg/d)을 주사하였다. 동물 생리현상을 혈당, 체중 및 적혈구 용적율의 변화에 대해 연구내내 관측하였다. 비히클-주사된 마우스를 대조군으로 사용하였다. 적절한 동물을 REDD14 항-RTP801 siRNA 1㎍ 또는 항-GFP 대조군 siRNA 1㎍을 유리체내 주사하여서 처리하였다. siRNA를 연구동안에 2회, 즉 처음 STZ 주사할 때에는 0일째에 및 STZ 주사후에는 14일째에 주사하였다. 당뇨병이 지속된지 4주후에 동물에 대해 에반스청(EB) 염색법을 사용하여 망막 혈관 노출을 측정하였다. 에반스청(EB) 측정하기 24시간전에 마우스의 우측 목정맥에 카테터를 이식하였다. 각 동물의 양쪽 눈에서의 망막 투과성은 표준 에반스청 방법에 따라 측정하였다.
결과
1. 망막혈관누출은 야생형 당뇨병 마우스에 비해 RTP801 KO 당뇨병 마우스에서 70%만큼 감소하였다(도 20 참고).
2. RTP801의 녹아웃은 마우스내의 ERG 이상을 정상화시켰다. DM WT 마우스에서 NDM WT에 비할 때 OP2(11%), OP3(12%) 및 OP4(14%) 및 B-파(23%)에 대한 진동소파 전위 내재 시간의 연장(p<0.05)이 있었다. A-파는 그다지 크게 변하지 않았다. 상기 변화는 NDM RTP801 KO에 비해 OP3 및 OP4의 경우 DM RTP801 KO 마우스에서 ∼100% 정상화되었고, B-파의 경우 65% 정상화되었다(도 21 참고).
3. KO 마우스에서의 결과와 유사하게, 망막 혈관 누출은 GFP에 대한 대조군 siRNA으로 유리체내에 주사한 당뇨병 마우스에 비해 RTP801에 대한 REDD14 siRNA으로 유리체내에 주사한 당뇨병 마우스에서 50% 감소하였다(도 22 참고).
2. 미숙아 망막병증
미숙아 망막병증은 시험 동물을 저산소증 및 고산소혈증 증상에 노출시키고, 이어서 망막에 대해 효과를 시험함으로써 유도하였다. 결과는 RTP801 KO 마우스가 미숙아 망막병증으로부터 보호되고, 그 결과 RTP801 억제의 보호 효과를 유효하게 함을 보여주었다.
3. 심근경색증
심근경색증은 마우스에서 단기 및 장기 둘다의 좌전하행동맥결찰에 의해 유도하였다. 그 결과, 혈액에서 경색후 24시간째에 TnT 및 CPK-MB 분율 수준이 감소하였고 RTP801 KO 마우스에서 경색후 28일째에 보다 양호한 심초음파도(박출계수 부피)가 얻어졌다.
4. 미세혈관 허혈성 증상
허혈성 증상을 평가하기 위한 동물 모델은 다음을 포함한다:
1. 폐쇄성 두부 손상(CHI) - 실험 TBI는 신경계 및 신경대사 연쇄반응에 기여하는 일련의 현상을 발생시키며, 이는 어느 정도 행동 결핍에 관련된다. CHI는 마취하에서 유도되며, 그 동안 중앙관상면(midcoronal plane)에서 좌측 반구를 덮는 노출된 두개골상에 미리결정한 높이로부터 추를 자유낙하시켰다(문헌[Chen 등, J. Neurotrauma 13, 557, 1996] 참고).
2. 일시적 중간대뇌동맥 폐색(MCAO) - 300 내지 370gr의 다자란 수컷 스프라그 둘리(Sprague Dawley) 래트에서 90 내지 120분의 일시적 국소 허혈을 실시하였다. 사용된 방법은 관내 봉합 MCAO이다(문헌[Longa 등, Stroke, 30, 84, 1989, 및 Dogan 등, J. Neurochem. 72, 765, 1999]). 즉, 할로탄 마취하에서 폴리-L-라이신으로 피복된 3-0 나일론 봉합 물질을 외부 경동맥 구멍을 통해 우측 내경동맥(ICA)에 삽입하였다. 나일론 실을 ICA에 넣어서 우측 MCA 기점까지 넣었다(20 내지 23mm). 90 내지 120분후에 실을 꺼내고, 동물을 봉합하고 회복시켰다.
3. 영구 중간대뇌동맥 폐색(MCAO) - MCA의 전기응고법에 의해 폐색은 영구, 편측-유도되었다. 두 방법은 뇌피질의 동측의 국소 뇌 허혈을 일으키고, 반대쪽은 손상시키지 않게 놔두었다(대조군). 문헌[Tamura A. 등, J. Cereb Blood Flow Metab. 1981; 1:53-60]에서 래트에 대해 기재된 바와 같이 관자 두개절제술을 통해 좌측 MCA를 노출시켰다. MCA 및 그의 렌즈핵선조체(lenticulostriatal) 분지는 미세양극성 응집을 갖는 후각로 내측 모서리에 근접하게 폐색된다. 상처를 봉합하고, 동물을 26 내지 28℃로 따뜻하게 한 방의 우리에 돌려보냈다. 동물의 체온을 자동온도조절기를 사용하여 항상 유지하였다.
5. 급성 신부전( ARF )
ARF를 치료하기 위한 활성 siRNA의 시험은 패혈증-유도된 ARF 또는 허혈성 재관류-유도된 ARF를 사용하여 실시할 수 있다.
1. 패혈증 유도된 ARF
패혈증 유도된 ARF의 예측가능한 동물 모델 2가지가 문헌[Miyaji T, Hu X, Yuen PS, Muramatsu Y, Iyer S, Hewitt SM, Star RA, 2003, Ethyl pyruvate decreases sepsis - induced acute renal failure and multiple organ damage in aged mice, Kidney Int. Nov; 64(5): 1620-31]에 기재되어 있다. 상기 두 모델은 마우스, 바람직하게는 나이든 마우스에서 리포다당질 투여 및 맹장결찰천공이다.
2. 허혈성- 재관류 -유도된 ARF
상기 예측가능한 동물 모델이 문헌[Kelly KJ, Plotkin Z, Vulgamott SL, Dagher PC, 2003 January, P53 mediates the apoptotic response to GTP depletion after renal ischemia-reperfusion: protective role of a p53 inhibitor, J Am Soc Nephrol,; 14(1): 128-38]에 기재되어 있다.
양측 신장 동맥을 45분동안 클램핑하고 이어서 클램프를 풀고 24시간동안 재관류를 허용하여서 허혈성-재관류 손상을 유도하였다. REDD14 또는 GFP siRNA(음성 대조군) 250㎍을 클램핑하기 2시간전 및 클램핑한지 30분후에 목정맥에 주사하였다. 추가적인 siRNA 250㎍을 클램핑한지 4시간 및 8시간째에 꼬리 정맥을 통해 공급하였다. GFP에 대한 siRNA를 음성 대조군으로 사용하였다. ARF 진행을 수술전 및 수술후 24시간째에 혈청 크레아티닌 수준을 측정하여 관측하였다. 실험 마지막에 래트에 내재 대퇴선을 통해 따뜻한 PBS 및 이어서 4% 파라포름알데하이드를 주입하였다. 좌측 신장을 제거하고, 후속적인 조직학적 분석을 위해 4% 파라포름알데하이드에서 보관하였다. 급성 신부전은 혈청 크레아티닌 수준이 기저선으로부터 급속하게 증가하는 것으로 종종 정의된다. 혈청 크레아티닌 0.5mg/dl 이상 또는 44.2μmol/ℓ 이상의 증가가 급성 신부전의 지표로 간주된다. 혈청 크레아티닌은 수술전 0시 및 ARF 수술후 24시간째에 측정하였다.
래트 신장내의 siRNA의 분포를 연구하기 위하여, 당 잔기에서 O-메틸 변형이 교대로 있는 Cy3-표지된 19-mer 둔단 siRNA 분자(2mg/kg)을 3 내지 5분동안 정맥내 투여하고, 그 이후에 2개의 광자 공초점 현미경을 사용하여 생체내 조영을 실시하였다. 공초점 현미경 분석은 신장내의 siRNA의 대부분이 근위 관상세포의 엔도솜 구역에 집중되어있음을 밝혀냈다. 엔도솜 및 세포질 siRNA 형광물질 둘다는 전달후 처음 2시간동안에는 비교적 안정하였으며, 24시간만에 사라졌다.
도 19로부터 증명되는 바와 같이, 신장의 양측 동맥 클램핑 처리(PBS 처리)한지 45분 이후에 혈청 크레아티닌 수준이 10배 증가하였다. 801 siRNA(REDD14, SEQ ID NOs: 16 및 66)의 4회 주사(클램핑하기 2시간전, 클램핑한후 30분, 4시간 및 8시간이후)는 혈청중 크레아티닌 수준을 40%만큼 크게 감소시켰다(p<0.02). 상기 결과는 801 siRNA가 허혈성-재관류 손상 효과로부터 신 조직을 보호할 수 있고, 따라서 ARF의 중증도를 감소시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 9
siRNA 의 제조
독점적인 알고리즘 및 유전자 RTP801의 공지된 서열(SEQ ID NO:1)을 사용하여 많은 가능한 siRNA의 서열을 생성시켰다. 상기 상세한 설명에 따라 siRNA 분자를 본질적으로 본원에 기재된 바에 따라 제조하였다.
본 발명의 siRNA는 리보핵산(또는 디옥시리보핵산) 올리고뉴클레오타이드의 합성에 대해 당업계에 충분히 공지된 임의의 방법에 의해 합성할 수 있다. 예컨대, 시판중인 기계(특히, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터 구입가능)를 사용할 수 있으며, 올리고뉴클레오타이드는 본원에 개시된 서열에 따라 제조하였다. 화학적으로 합성된 분절의 중복된 쌍을 당업계에 충분히 공지된 방법을 사용하여 결찰시킬 수 있다(예컨대, 미국특허 제6,121,426호 참고). 가닥을 별도로 합성하고, 이어서 관내에서 서로에 어닐링시켰다. 이어서, 어닐링되지 않은(이들중 하나가 과량이기 때문) 단일가닥 올리고뉴클레오타이드로부터 이중가닥 siRNA를 HPLC에 의해 분리하였다. 본 발명의 siRNA 또는 siRNA 분절과 관련하여 상기 서열 둘 이상을 합성할 수 있고, 본 발명에서 사용하기 위해 연결할 수 있다.
본 발명의 siRNA 분자는 당업계에 공지된 절차, 예컨대 문헌[Usman 등, 1987, J. Am. Chem. Soc., 109, 7845; Scaringe 등, 1990, Nucleic Acids Res ., 18, 5433; Wincott 등, 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684; 및 Wincott 등, 1997, Methods Mol . Bio., 74, 59]에 기재된 절차에 의해 합성될 수 있으며, 5'-말단의 다이메톡시트리틸 및 3'-말단의 포스포아미디티스와 같은 통상적인 핵산 보호 및 커플링 기를 사용할 수 있다. 변형된(예컨대, 2'-O-메틸화) 뉴클레오타이드 및 변형되지 않은 뉴클레오타이드가 필요시에 혼입된다. 다르게, 본 발명의 핵산 분자는 별도로 합성될 수 있고, 합성후 예컨대 결찰에 의해(문헌[Moore 등, 1992, Science 256, 9923; Draper 등, PCT 공개공보 WO 제93/23569호; Shabarova 등, 1991, Nucleic Acids Research 19, 4247; Bellon 등, 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951; Bellon 등, 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204]), 또는 합성 및/또는 탈보호 이후의 하이브리드화에 의해 연결될 수 있다. 또한, 본 발명의 siRNA 분자는, siRNA 가닥 둘다가 단일 접촉 올리고뉴클레오타이드 분절로서, 또는 이후에 절단되어서 siRNA 이중체를 하이브리드화하고 정제되는 분리된 siRNA 분절 또는 가닥을 제공하는 절단가능한 링커에 의해 분리된 가닥으로서 합성되는 미국 특허출원 US 제2004/0019001호(맥스위겐(McSwiggen))에 기재된 바와 같이 일렬 합성 방법론에 의해 합성될 수 있다. 링커는 폴리뉴클레오타이드 링커 또는 비-뉴클레오타이드 링커일 수 있다. 추가적인 정보를 위해서는 PCT 공개공보 WO 제2004/015107호(아투겐(ATUGEN))를 참고한다.
전술한 바와 같이, 표 A(하기)의 siRNA는 교대로 있는 당이 2'-O-메틸 변형물을 갖도록, 즉 교대로 있는 뉴클레오타이드가 그에 따라 변형되도록 제작된다. 상기 바람직한 양태에서, siRNA의 한 가닥에서 변형된 뉴클레오타이드는 제 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19번이고, 반대 가닥에서 변형된 뉴클레오타이드는 제 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 및 18번이다. 따라서, 상기 siRNA는 상기 기재된 바와 같이 2'-O-메틸 변형물이 교대로 있는 둔단 19-mer RNA 분자이다. 또한, 표 2 및 3의 siRNA(하기 참고)가 상기 방식으로 제작되고; 표 B의 siRNA는 2'-O-메틸 변형물이 교대로 있는 둔단 19-mer RNA 분자이다; 표 C의 siRNA는 2'-O-메틸 변형물이 교대로 있는 둔단 21-mer RNA 분자이다.
표 A는, 생성되어서 이후에 RTP801 유전자에 대해 합성되는 다양한 신규한 siRNA 분자를 설명하고 있다. 2개의 최종 컬럼은 신규한 분자의 활성을 검사하기 위해 실시한 2개 실험 결과를 나타내고 있다. 즉, HeLa 또는 Hacat 세포를 시험할 신규한 특이적 siRNA으로 핵산전달감염시켰다. 이어서, RTP801 폴리펩타이드의 발현은 RTP801 폴리펩타이드에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 결정하였다. 표 A의 오른쪽 2개 컬럼에 있어서, "-"는 불활성 또는 저활성 분자(RTP801 유전자의 발현을 실질적으로 억제하지 않음)을 나타내고; "+"는 (RTP801 유전자 발현의) 일정한 억제 활성을 갖는 siRNA 분자를 의미하며; "++"는 보다 높은 억제 활성을 갖는 분자 등을 의미한다. 본원에 개시된 siRNA 분자중 임의의 하나, 특히 표 A에 기재된 활성 분자는 신규하며, 또한 본 발명의 일부로 간주된다.
[표 A]
Figure 112009065460497-pat00004
Figure 112009065460497-pat00005
상기 표 A에서, siRNA 1 내지 50의 센스 가닥은 각각 SEQ ID NOs:3 내지 52를 갖고, siRNA 1 내지 50의 안티센스 가닥은 각각 SEQ ID NOs:53 내지 102를 가짐을 유념한다. REDD14로 지칭된 분자는 SEQ ID NOs: 16(센스 가닥) 및 66(안티센스 가닥)을 갖는다.
[표 B]
Figure 112009065460497-pat00006
Figure 112009065460497-pat00007
상기 표 B에서, siRNA 51 내지 122의 센스 가닥은 각각 SEQ ID NOs:103 내지 174를 갖고, siRNA 51 내지 122의 안티센스 가닥은 각각 SEQ ID NOs:172 내지 246를 가짐을 유념한다.
[표 C]
Figure 112009065460497-pat00008
Figure 112009065460497-pat00009
상기 표 C에서, siRNA 123 내지 171의 센스 가닥은 각각 SEQ ID NOs:247 내지 295를 갖고, siRNA 123 내지 171의 안티센스 가닥은 각각 SEQ ID NOs:296 내지 344를 가짐을 유념한다.
실시예 10
약리학 및 약물 전달
본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 직접적으로 또는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터에 의해 전달될 수 있다. 직접 전달될 때 서열은 일반적으로 핵산분해효소 내성을 갖게 된다. 다르게, 본원에서 하기에 검토되는 바와 같이 세포내에서 서열이 발현되도록 서열은 발현 카세트(cassette) 또는 구조물에 혼입될 수 있다. 일반적으로 구조물은 적절한 조절 서열 또는 촉진자를 함유하여서 서열이 표적화된 세포내에서 발현되도록 한다.
본 발명의 화합물 또는 약학 조성물은 개별 환자의 임상 증상, 치료할 질환, 투여 부위와 방식, 투여 스케쥴, 환자의 나이, 성별, 체중 및 의료진에게 알려진 다른 인자를 고려하여 의약품의료관리기준에 따라 투여되고 투약된다.
따라서, 본원의 목적에 있어 약학적 "유효량"은 당업계에 공지된 바와 같은 상기 고려사항에 의해 결정된다. 상기 양은 증가된 생존률 또는 보다 신속한 회복, 또는 징후 및 당업계의 숙련자에 의해 적절한 척도로서 선택되는 다른 지표의 개선 또는 제거를 비롯한(그러나, 이에 한정되는 것은 아니다) 개선을 이루기에 효과적이어야 한다.
치료는 일반적으로 질환 진행 기간, 약물 유효성, 및 치료되는 환자 종에 따라 비례하는 기간을 갖는다. 인간은 일반적으로 마우스 또는 본원에 예시된 다른 실험 동물에 비해 오랫동안 치료됨을 유의한다.
본 발명의 화합물은 임의의 통상적인 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 화합물은 화합물로서 또는 약학적으로 허용가능한 염으로서 투여될 수 있으며, 단독으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체, 용매, 희석제, 부형제, 보조제 및 비히클과 함께 투여될 수 있음을 유의해야 한다. 화합물은 경구, 피하내, 또는 정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내 및 비강내 투여 뿐만 아니라 경막내 및 주입 기술을 포함한 비경구적으로 투여될 수 있다. 화합물의 이식이 또한 유용하다. 액체 형태는 피하내, 진피내, 정맥내, 근육내, 경막내 및 다른 비경구적인 투여 경로를 포함하는 용어인 주사용으로 제조될 수 있다. 액체 조성물은 유기 보조용매를 포함하거나 포함하지 않는 수용액, 수성 또는 유성 현탁액, 식용 오일을 포함한 에멀젼 뿐만 아니라 유사한 약학적 비히클을 포함한다. 또한, 특정한 환경하에서 본 발명의 신규한 치료에 사용하기 위한 조성물은 비강내 투여 등의 투여를 위하여 에어로졸로서 형성될 수 있다. 치료되는 환자는 온혈 동물이고, 특히 인간을 비롯한 포유동물이다. 약학적으로 허용가능한 담체, 용매, 희석제, 부형제, 보조제 및 비히클 뿐만 아니라 이식물 담체는 일반적으로 불활성, 비독성 고체, 또는 본 발명의 활성 성분과 반응하지 않는 액체 충진제, 희석제 또는 피막재(encapsulating material)이다.
본 발명의 화합물을 비경구적으로 투여할 때 일반적으로 단위 투약량 주사가능한 형태(용액, 현탁액, 에멀젼)로 제형화된다. 주사에 적합한 약학 제제는 무균수용액 또는 분산액, 또는 무균 주사액 또는 분산액으로 재구성하기 위한 무균 분말을 포함한다. 담체는 예컨대, 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 그의 적합한 혼합물, 및 식물성 기름을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.
적절한 유동성이 예컨대 레시틴과 같은 피복물을 사용하여, 분산액의 경우에는 필요한 입경 유지에 의해, 또한 계면활성제를 사용하여 유지될 수 있다. 면실유, 참깨유, 올리브유, 대두유, 옥수수유, 해바라기유, 땅콩유 및 에스테르, 예컨대 이소프로필 미리스테이트와 같은 비수성 비히클이 또한 화합물 조성물에 대한 용매 시스템으로 사용될 수도 있다. 추가적으로, 항균 보존제, 산화방지제, 킬레이트제 및 완충제를 비롯해서 조성물의 안정성, 무균성 및 등장성을 증가시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등에 의해 확보될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예컨대, 당, 염화나트륨 등을 포함하는 것이 바람직하다. 주사가능한 약학 형태의 지속적인 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용하여서 발생시킬 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르면, 사용된 임의의 비히클, 희석제 및 첨가제가 본 화합물과 상용되어야 한다.
멸균 주사액이 본 발명의 실시에 이용되는 화합물을 적절한 용매의 필요량중에, 필요시에는 다른 다양한 성분과 함께 혼입시킴으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 약리적 제제는 다양한 비히클, 보조제, 첨가제 및 희석제와 같은 임의의 상용가능한 담체를 함유하는 주사가능한 제제로 환자에게 투여될 수 있거나; 또는 본 발명에서 이용되는 화합물은 서방성 피하내 이식물, 또는 단일클론 항체, 벡터화된 전달, 이온삼투적 중합체 기질, 리포좀 및 미세구와 같은 표적화된 전달 시스템의 형태로 비경구적으로 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명에서 유용한 전달 시스템의 예는 미국특허 US 제5,225,182호, US 제5,169,383호, US 제5,167,616호, US 제4,959,217호, US 제4,925,678호, US 제4,487,603호, US 제4,486,194호, US 제4,447,233호, US 제4,447,224호, US 제4,439,196호 및 US 제4,475,196호를 포함한다. 많은 다른 상기 이식물, 전달 시스템 및 기본단위(module)가 당업계의 숙련자들에게 충분히 공지되어 있다.
본 발명에서 이용되는 화합물의 약리적 제제가 환자에게 경구 투여될 수 있다. 정제, 현탁액, 액제, 에멀젼, 캡슐, 분말, 시럽 등중에서 화합물을 투여하는 것과 같은 통상적인 방법이 이용가능하다. 화합물을 경구적으로 또는 정맥내로 전달하고 생물학적 활성을 보유하는 공지된 기술이 바람직하다. 한 양태에서, 본 발명의 화합물은 정맥내 주사에 의해 초기에 투여되어서 혈액 수준을 적절한 수준으로 만들 수 있다. 이어서, 환자의 수준을 경구 투약 형태로 유지하지만, 환자의 증상에 따라 상기 기재된 바와 같이 다른 투여 형태가 이용될 수 있다.
일반적으로, 인간에 대한 화합물의 활성 투약량은 1 내지 2주 또는 그 이상동안, 바람직하게는 24 내지 48시간동안 1일에 1회 투약, 또는 1일에 2회 또는 3회 이상 투약하는 섭생법으로, 또는 1 내지 2주 또는 그 이상동안 연속 주입에 의하여 1일에 1ng/체중kg 내지 약 20 내지 100mg/체중kg, 바람직하게는 1일에 약 0.01mg 내지 약 2 내지 10mg/체중kg 범위이다.
본 발명의 화합물의 눈 투여
본 발명의 화합물을 국소적으로 또는 주사, 예컨대 유리체내 주사, 망막하 주사, 또는 양측 주사의 형태로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물의 투여에 대한 추가적인 정보를 문헌[Tolentino 등, Retina 24(2004) 132-138; Reich 등, Molecular vision 9(2003) 210-216]에서 찾을 수 있다.
본 발명의 화합물의 폐 투여
본 발명의 치료적 조성물은 바람직하게는 상기 조성물/화합물을 함유하는 에어로졸의 흡입, 또는 상기 조성물의 비강내 또는 기관내 점적에 의해 폐로 투여된다. 리포솜으로 조성물을 제형화하는 것이 흡수에 유익할 수 있다. 추가적으로, 조성물은 퍼플루브론(perflubron)과 같은 PFC 액체를 포함할 수 있으며, 조성물은 폴리에틸렌이민(PEI)과 본 발명의 화합물의 복합체로서 제형화될 수 있다.
약학 조성물의 폐 전달에 대한 추가적인 정보에 대하여는 문헌[Weiss 등, Human gene therapy 10:2287-2293(1999); Densmore 등, Molecular therapy 1:180-188 (1999); Gautam 등, Molecular therapy 3:551-556(2001); 및 Shahiwala 및 Misra, AAPS PharmSciTech 5(2004)]을 참고한다. 추가적으로, siRNA에 대한 호흡기 제제가 데이비스(Davis) 등의 미국특허출원 제2004/0063654호에 기재되어 있다.
본 발명의 화합물의 개선된 전달을 위한 추가적인 제형은 비-제형화된 화합물, 콜레스테롤에 공유 결합된 화합물, 및 표적 항체에 결합된 화합물을 포함할 수 있다(문헌[Song 등, Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors, Nat Biotechnol. 2005 Jun; 23(6):709-17]).
도 1은 RTP801 유전자의 부호화 서열(SEQ ID NO:1)을 나타낸다.
도 2는 RTP801 폴리펩타이드의 아미노산 서열(SEQ ID NO:2)을 나타낸다.
도 3은 인간에 특이적이거나 인간, 마우스 및 래트에 동시에 특이적인 다양한 핵산 분자의 엑손, CDS, 인간 SNP 및 위치를 나타낸 다이아그램이다.
도 4a, 4b 및 4c에서 A 내지 H는 본 발명에 따르는 다양한 이중가닥(double-strand) 핵산을 제 1 인간 세포주에 적용할 때에 얻어지는 웨스턴-블롯 분석 결과의 도면이고, 여기에서 실험은 실험 1 및 2이라고 지칭하여 2회 실시하였고, p110a 및 p85의 발현 수준은 부하(loading) 대조군으로 표시되며 RTP801 띠의 강도(밀도)는 적용된 특정한 이중가닥 핵산의 억제 활성에 대한 척도이다.
도 5a 및 5b에서 A 내지 F는 본 발명에 따르는 다양한 이중가닥 핵산을 제 2 인간 세포주에 적용할 때에 얻어지는 웨스턴-블롯 분석 결과의 도면을 나타내고, 여기에서 실험은 실험 1 및 2라고 지칭되어 2회 실시하였고, p110a 및 p85의 발현 수준은 부하 대조군으로 표시되며 RTP801 띠의 밀도는 적용된 특정한 이중가닥 핵산의 억제 활성에 대한 척도이다.
도 6에서 A 내지 C는 본 발명에 따르는 다양한 이중가닥 핵산을 다양한 농도, 즉 10nM(5A), 5nM(5B) 및 1nM(5C)로 제 1 인간 세포주에 적용할 때에 수득되는 웨스턴-블롯 분석 결과의 도면을 나타내고, 여기에서 실험은 실험 1 및 2라고 지칭하여 2회 실시하였고, p110a 및 p85의 발현 수준은 부하 대조군으로 표시되며 RTP801 띠의 밀도는 적용된 특정한 이중가닥 핵산의 억제 활성에 대한 척도이다.
도 7은 본 발명에 따르는 다양한 이중가닥 핵산을 마우스 세포주에 적용하여 수득된 웨스턴-블롯 분석 결과의 도면을 나타내고, 여기에서 실험은 실험 1 및 2이라고 지칭하여 2회 실시하였고, p110a 및 p85의 발현 수준은 부하 대조군으로 표시되며 RTP801 띠의 밀도는 적용된 특정한 이중가닥 핵산의 억제 활성에 대한 척도이다.
도 8은 마우스 AMD 모델 시스템에서의 실험 결과를 나타낸다.
도 9는 마우스 AMD 모델 시스템에서의 추가적인 실험 결과를 나타낸다.
도 10은 비-인간 영장류 AMD 모델 시스템에서의 실험 결과를 나타낸다.
도 11a 및 b는 비-인간 영장류 AMD 모델 시스템에서의 추가적인 실험 결과를 나타낸다.
도 12a 및 b는 비-인간 영장류 AMD 모델 시스템에서의 그 밖의 추가적인 실험 결과를 나타낸다.
도 13a 및 b는 비-인간 영장류 AMD 모델에서 얻어진 실험 결과의 분석을 나타낸다.
도 14는 비-인간 영장류 AMD 모델에서 얻어진 추가적인 실험 결과의 분석을 나타낸다.
도 15a 내지 c는 RTP801 발현 플라스미드를 마우스에 점적주입하는 것을 포함한 실험 결과를 나타낸다.
도 16a 내지 c는 RTP801 KO 및 WT 마우스에서 단기(7일) 흡연 모델의 결과를 나타낸다.
도 17a 내지 c는 활성 항-RTP801(REDD14) 및 대조군(REDD18) siRNA을 점적시킨 WT 마우스에서 단기 흡연 모델의 결과를 나타낸다.
도 18은 장기 CS 모델에서 RTP801 KO 마우스를 사용한 실험 결과를 나타낸다.
도 19는 마우스 ARF 모델 시스템에서의 실험 결과를 나타낸다.
도 20은 마우스 당뇨병성 망막병증 모델 시스템에서의 실험 결과를 나타낸다.
도 21은 마우스 당뇨병성 망막병증 모델 시스템에서의 추가적인 실험 결과를 나타낸다.
도 22는 마우스 당뇨병성 망막병증 모델 시스템에서의 그 밖의 추가적인 실험 결과를 나타낸다.
도 23은 마우스 CNV 모델 시스템에서 조합 RTP801/VEGF 억제 실험의 결과를 나타낸다.
도 24는 마우스 CNV 모델 시스템에서 추가적인 조합 RTP801/VEGF 억제 실험의 결과를 나타낸다.
도 25는 RPE 및 감각신경망막에서 유전자 발현에 대한 RTP801 siRNA의 효과를 연구한 실험 결과를 나타낸다.
도 26a 및 b는 RPE 및 감각신경망막에서 유전자 발현에 대한 RTP801 siRNA의 효과를 연구한 추가적인 실험 결과를 나타낸다.
도 27은 RTP801NP가 RTP801만큼 활성임을 증명한 실험 결과를 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Quark Pharmaceuticals, Inc. and Silence Therapeutics AG <120> THERAPEUTIC USES OF INHIBITORS OF RTP801 <130> FPL/200910-0122 <140> PCT/US05/029236 <141> 2005-08-16 <150> EP 04019405.2 <151> 2004-08-16 <150> US 60/601983 <151> 2004-08-17 <150> US 60/604668 <151> 2004-08-25 <150> US 60/609786 <151> 2004-09-14 <150> US 60/638659 <151> 2004-12-22 <150> US 60/664236 <151> 2005-03-22 <150> US 60/688943 <151> 2005-06-08 <160> 344 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1782 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tttggccctc gaggccaaga attcggcacg agggggggag gtgcgagcgt ggacctggga 60 cgggtctggg cggctctcgg tggttggcac gggttcgcac acccattcaa gcggcaggac 120 gcacttgtct tagcagttct cgctgaccgc gctagctgcg gcttctacgc tccggcactc 180 tgagttcatc agcaaacgcc ctggcgtctg tcctcaccat gcctagcctt tgggaccgct 240 tctcgtcgtc gtccacctcc tcttcgccct cgtccttgcc ccgaactccc accccagatc 300 ggccgccgcg ctcagcctgg gggtcggcga cccgggagga ggggtttgac cgctccacga 360 gcctggagag ctcggactgc gagtccctgg acagcagcaa cagtggcttc gggccggagg 420 aagacacggc ttacctggat ggggtgtcgt tgcccgactt cgagctgctc agtgaccctg 480 aggatgaaca cttgtgtgcc aacctgatgc agctgctgca ggagagcctg gcccaggcgc 540 ggctgggctc tcgacgccct gcgcgcctgc tgatgcctag ccagttggta agccaggtgg 600 gcaaagaact actgcgcctg gcctacagcg agccgtgcgg cctgcggggg gcgctgctgg 660 acgtctgcgt ggagcagggc aagagctgcc acagcgtggg ccagctggca ctcgacccca 720 gcctggtgcc caccttccag ctgaccctcg tgctgcgcct ggactcacga ctctggccca 780 agatccaggg gctgtttagc tccgccaact ctcccttcct ccctggcttc agccagtccc 840 tgacgctgag cactggcttc cgagtcatca agaagaagct gtacagctcg gaacagctgc 900 tcattgagga gtgttgaact tcaacctgag ggggccgaca gtgccctcca agacagagac 960 gactgaactt ttggggtgga gactagaggc aggagctgag ggactgattc ctgtggttgg 1020 aaaactgagg cagccaccta aggtggaggt gggggaatag tgtttcccag gaagctcatt 1080 gagttgtgtg cgggtggctg tgcattgggg acacataccc ctcagtactg tagcatgaaa 1140 caaaggctta ggggccaaca aggcttccag ctggatgtgt gtgtagcatg taccttatta 1200 tttttgttac tgacagttaa cagtggtgtg acatccagag agcagctggg 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<210> 263 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 263 uguguagcau guaccuuauu a 21 <210> 264 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 264 caacaaggcu uccagcugga u 21 <210> 265 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 265 cacuugggau cuuugacacu u 21 <210> 266 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 266 caucacuacu gaccuguugu a 21 <210> 267 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 267 guguguguag cauguaccuu a 21 <210> 268 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 268 gcaugaaugu aagaguagga a 21 <210> 269 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 269 gacagcagca acaguggcuu c 21 <210> 270 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 270 ugaugcagcu gcugcaggag a 21 <210> 271 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 271 ugaauacacu ugauguucaa g 21 <210> 272 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 272 caugaauaca cuugauguuc a 21 <210> 273 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 273 ggacagcagc aacaguggcu u 21 <210> 274 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 274 guucaugaau acacuugaug u 21 <210> 275 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 275 ucaugaauac acuugauguu c 21 <210> 276 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 276 ucccuggaca gcagcaacag u 21 <210> 277 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 277 agucccugga cagcagcaac a 21 <210> 278 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 278 gaauacacuu gauguucaag u 21 <210> 279 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 279 cuagaacugu uuacaugaag a 21 <210> 280 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 280 ccaucuagaa cuguuuacau g 21 <210> 281 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 281 cuuccaucua gaacuguuua c 21 <210> 282 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 282 ucuuccaucu agaacuguuu a 21 <210> 283 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 283 caucuagaac uguuuacaug a 21 <210> 284 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 284 gggucuucca ucuagaacug u 21 <210> 285 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 285 uccaucuaga acuguuuaca u 21 <210> 286 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 286 ucuagaacug uuuacaugaa g 21 <210> 287 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 287 uuccaucuag aacuguuuac a 21 <210> 288 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 288 gucuuccauc uagaacuguu u 21 <210> 289 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 289 ugauguucaa guauuaagac c 21 <210> 290 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 290 guucaaguau uaagaccuau g 21 <210> 291 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 291 ucaaguauua agaccuaugc a 21 <210> 292 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 292 gauguucaag uauuaagacc u 21 <210> 293 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 293 uucaaguauu aagaccuaug c 21 <210> 294 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 294 cugggucuuc caucuagaac u 21 <210> 295 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 295 ugggucuucc aucuagaacu g 21 <210> 296 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 296 acaacucaau gagcuuccug g 21 <210> 297 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 297 cuagauggaa gacccagaug g 21 <210> 298 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 298 guacaugcua cacacacauc c 21 <210> 299 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 299 aacaaacaac aaacacacuu g 21 <210> 300 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 300 uuccaugcua caguacugag g 21 <210> 301 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 301 aaacaacaaa cacacuuggu c 21 <210> 302 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 302 ucuucuugau gacucggaag c 21 <210> 303 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 303 aaacacuauu cccccaccuc c 21 <210> 304 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 304 uuguuccaug cuacaguacu g 21 <210> 305 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 305 acuugaacau caaguguauu c 21 <210> 306 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 306 uugcauaggu cuuaauacuu g 21 <210> 307 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 307 uagucuccac cccaaaaguu c 21 <210> 308 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 308 aguacugagg gguauguguc c 21 <210> 309 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 309 uaagauacac aaaccaccuc c 21 <210> 310 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 310 uuuuucaagu gucaaagauc c 21 <210> 311 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 311 aacaguucua gauggaagac c 21 <210> 312 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 312 uaauaaggua caugcuacac a 21 <210> 313 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 313 auccagcugg aagccuuguu g 21 <210> 314 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 314 aagugucaaa gaucccaagu g 21 <210> 315 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 315 uacaacaggu caguagugau g 21 <210> 316 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 316 uaagguacau gcuacacaca c 21 <210> 317 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 317 uuccuacucu uacauucaug c 21 <210> 318 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 318 gaagccacug uugcugcugu c 21 <210> 319 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 319 ucuccugcag cagcugcauc a 21 <210> 320 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 320 cuugaacauc aaguguauuc a 21 <210> 321 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 321 ugaacaucaa guguauucau g 21 <210> 322 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 322 aagccacugu ugcugcuguc c 21 <210> 323 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 323 acaucaagug uauucaugaa c 21 <210> 324 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 324 gaacaucaag uguauucaug a 21 <210> 325 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 325 acuguugcug cuguccaggg a 21 <210> 326 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 326 uguugcugcu guccagggac u 21 <210> 327 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 327 acuugaacau caaguguauu c 21 <210> 328 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 328 ucuucaugua aacaguucua g 21 <210> 329 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 329 cauguaaaca guucuagaug g 21 <210> 330 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 330 guaaacaguu cuagauggaa g 21 <210> 331 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 331 uaaacaguuc uagauggaag a 21 <210> 332 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 332 ucauguaaac aguucuagau g 21 <210> 333 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 333 acaguucuag auggaagacc c 21 <210> 334 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 334 auguaaacag uucuagaugg a 21 <210> 335 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 335 cuucauguaa acaguucuag a 21 <210> 336 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 336 uguaaacagu ucuagaugga a 21 <210> 337 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 337 aaacaguucu agauggaaga c 21 <210> 338 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 338 ggucuuaaua cuugaacauc a 21 <210> 339 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 339 cauaggucuu aauacuugaa c 21 <210> 340 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 340 ugcauagguc uuaauacuug a 21 <210> 341 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 341 aggucuuaau acuugaacau c 21 <210> 342 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 342 gcauaggucu uaauacuuga a 21 <210> 343 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 343 aguucuagau ggaagaccca g 21 <210> 344 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 344 caguucuaga uggaagaccc a 21

Claims (17)

  1. 하기 구조식 1의 화합물:
    구조식 1
    5' (N)x-Z 3'(안티센스 가닥)
    3' Z'-(N')y 5'(센스 가닥)
    상기 식에서,
    N 및 N'은 각각 당 잔기, 염기 또는 둘 모두에서 변형되거나 변형되지 않을 수 있는 리보뉴클레오타이드이고;
    (N)x 및 (N')y는 각각 각각의 연속적인 N 또는 N'이 공유 결합에 의해 다음 N 또는 N'에 연결된 올리고머이고;
    x와 y는 각각 19 내지 40의 정수이고;
    Z 및 Z'은 각각 존재하거나 존재하지 않을 수 있으나, 존재하는 경우에는 dTdT이고, 존재하는 그 가닥의 3' 말단에서 공유 결합되고,
    (N)x 서열은 SEQ ID NOs: 74, 75, 77, 79 또는 91에 해당하는 mRNA에 대한 안티센스 서열을 포함한다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    공유 결합이 포스포다이에스테르 결합이고;
    x와 y가 동일하고;
    Z 및 Z'가 둘다 존재하지 않고;
    안티센스 및 센스 가닥 각각에 교대로 있는 리보뉴클레오타이드의 당 잔기에 2'-OCH3 변형이 존재하고;
    안티센스 가닥의 5' 및 3' 말단 각각의 리보뉴클레오타이드가 당 잔기에 2'-OCH3 변형을 포함하고;
    센스 가닥의 5' 및 3' 말단 각각의 리보뉴클레오타이드가 당 잔기에서 변형되지 않은 화합물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    x 및 y가 둘다 19인 화합물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    말단 포스페이트가 결핍된 화합물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    (N)x 가 5'으로부터 3'으로 SEQ ID NOs: 74, 77, 79 또는 91에 기재된 서열을 갖는 연속 뉴클레오타이드 또는 이들의 상동체를 포함하고, 각 말단 영역의 2개 이하의 뉴클레오타이드에서 하나의 염기가 변경된 화합물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    안티센스 가닥의 제 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19번째 뉴클레오타이드 및 센스 가닥의 제 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 및 18번째 뉴클레오타이드에서 당 잔기의 2' 위치의 -OH가 -OCH3로 대체되어 변형된 화합물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    인산화되거나 인산화되지 않은 화합물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    다이뉴클레오타이드 dTdT가 안티센스 가닥 또는 센스 가닥의 3' 말단에 공유 결합된 화합물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    하나 이상의 뉴클레오타이드에서 당 잔기가 변형된 화합물.
  10. 제 1 항에 있어서,
    당 잔기가 2' 위치의 -OH를 -H, -OCH3, -OCH2CH3, -OCH2CH2CH3, -NH2 또는 -F로 대체함으로써 변형된 화합물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    당 잔기가 2' 위치의 -OH를 -OCH3로 대체함으로써 변형된 화합물.
  12. (a) 만성폐색성폐질환(COPD), 폐기종, 만성 기관지염 및 천식으로 이루어진 군으로부터 선택된 호흡 장애;
    (b) 맥락막 혈관신생(CNV), 습식 및 건식 AMD, 눈 히스토플라스마증 증후군, 혈관무늬병증, 부르크막 파열, 근시변성, 눈 종양, 망막 변성 질환 및 망막 정맥 폐쇄(RVO)로 이루어진 군으로부터 선택된 눈 질환; 또는
    (c) 일과성 흑암시, 무형성(apla) 증후군, Prot CS 및 ATIII 결핍, IV 약물 사용에 의해 발생하는 미세혈관 병리현상, 이상단백혈증, 측두 동맥염, 전방 허혈성 시신경병증, 시신경염, 녹내장, 본히펠린다우 증후군, 각막질환, 각막이식거부 백내장, 일스 질환, 서리가지동맥염, 포위 버클링 오퍼레이션, 포도막염, 주변포도막염, 맥락막 혈관종, 시신경 무형성증, 망막동맥폐쇄, 망막정맥폐쇄, 미숙아 망막병증, HIV 망막병증, 푸르처 망막병증, 전신성혈관염 및 자가면역질환의 망막병증, 고혈압 망막병증, 방사선 망막병증, 망막 동맥 또는 정맥 분지 폐쇄, 특발성 망막 혈관염, 동맥류, 시신경망막염, 망막색전증, 급성망막괴사, 버드샷(Birdshot) 망막맥락막증, 장기 망막박리, 당뇨병, 당뇨병성 망막병증(DR), 당뇨병 황반 부종(DME), 당뇨병 관련 미세혈관 병리현상, 과다점성 증후군, 대동맥궁 증후군 및 눈 허혈성 증후군, 경동맥 해면류, 다발경화증, 전신홍반루푸스, SS-A 자가항체를 갖는 세동맥염, 급성 다초점 출혈 혈관염, 감염으로 인한 혈관염, 베체트 질환으로 인한 혈관염, 사르코이드증, 응고병증, 신경병증, 신장병증, 신장의 미세혈관 질환, 허혈성 미세혈관 증상 및 급성 신부전으로 이루어진 군으로부터 선택된 미세혈관 장애
    를 치료하기 위한, 제 1 항 내지 제 11 항중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는 약학 조성물.
  13. (a) 만성폐색성폐질환(COPD), 폐기종, 만성 기관지염 및 천식으로 이루어진 군으로부터 선택된 호흡 장애;
    (b) 맥락막 혈관신생(CNV), 습식 및 건식 AMD, 눈 히스토플라스마증 증후군, 혈관무늬병증, 부르크막 파열, 근시변성, 눈 종양, 망막 변성 질환 및 망막 정맥 폐쇄(RVO)로 이루어진 군으로부터 선택된 눈 질환; 또는
    (c) 일과성 흑암시, 무형성(apla) 증후군, Prot CS 및 ATIII 결핍, IV 약물 사용에 의해 발생하는 미세혈관 병리현상, 이상단백혈증, 측두 동맥염, 전방 허혈성 시신경병증, 시신경염, 녹내장, 본히펠린다우 증후군, 각막질환, 각막이식거부 백내장, 일스 질환, 서리가지동맥염, 포위 버클링 오퍼레이션, 포도막염, 주변포도막염, 맥락막 혈관종, 시신경 무형성증, 망막동맥폐쇄, 망막정맥폐쇄, 미숙아 망막병증, HIV 망막병증, 푸르처 망막병증, 전신성혈관염 및 자가면역질환의 망막병증, 고혈압 망막병증, 방사선 망막병증, 망막 동맥 또는 정맥 분지 폐쇄, 특발성 망막 혈관염, 동맥류, 시신경망막염, 망막색전증, 급성망막괴사, 버드샷(Birdshot) 망막맥락막증, 장기 망막박리, 당뇨병, 당뇨병성 망막병증(DR), 당뇨병 황반 부종(DME), 당뇨병 관련 미세혈관 병리현상, 과다점성 증후군, 대동맥궁 증후군 및 눈 허혈성 증후군, 경동맥 해면류, 다발경화증, 전신홍반루푸스, SS-A 자가항체를 갖는 세동맥염, 급성 다초점 출혈 혈관염, 감염으로 인한 혈관염, 베체트 질환으로 인한 혈관염, 사르코이드증, 응고병증, 신경병증, 신장병증, 신장의 미세혈관 질환, 허혈성 미세혈관 증상 및 급성 신부전으로 이루어진 군으로부터 선택된 미세혈관 장애
    를 치료하기 위한, 유리한 활성을 발생시키는 양으로 물리적으로 혼합된, 제 1 항 내지 제 11 항중 어느 한 항에 따른 2개의 화합물을 포함하는 약학 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    2개의 화합물이 서로 공유 결합 또는 비공유 결합되는 약학 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    2개의 화합물이 2 내지 100개의 뉴클레오타이드 길이의 핵산 링커에 의해 함께 연결되는 약학 조성물.
  16. 제 12 항에 있어서,
    당뇨병 황반 부종(DME), 만성폐색성폐질환(COPD), 습식 및 건식 AMD, 당뇨병성 망막병증, 급성 신부전 또는 녹내장을 치료하기 위한 약학 조성물.
  17. 제 13 항에 있어서,
    당뇨병 황반 부종(DME), 만성폐색성폐질환(COPD), 습식 및 건식 AMD, 당뇨병성 망막병증, 급성 신부전 또는 녹내장을 치료하기 위한 약학 조성물.
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