HU221818B1

HU221818B1 - Új eljárás humán antigén elleni receptorok előállítására, és azok alkalmazása

Info

Publication number: HU221818B1
Application number: HU0100794A
Authority: HU
Inventors: Peter Kufer; Tobias Raum
Original assignee: Micromet Ag
Priority date: 1997-04-14
Filing date: 1998-04-14
Publication date: 2003-01-28
Also published as: BR9809391A; EP0970126B1; AU7643198A; CN1252076A; CU23268A3; TR199902553T2; HUP0100794A3; DE69800716T2; KR20010006340A; US7227002B1; DE69800716D1; JP3876002B2; CZ361499A3; CZ294425B6; NO994983L; AU742045B2; PL193780B1; EP0970126A2; CN100387621C; IL132062A0

Abstract

A találmány tárgyát eljárás képezi olyan, humán antigén ellenireceptor előállítására, amely emberben kismértékben immunogén vagyegyáltalán nem immunogén, amely eljárás szerint funkcionálisanújrarendeződött VH- és VL-im- munglobulin-láncok kombinációjátszelektálják, amelyben legalább a VH-lánc lényegében naiv, érett,humán B-limfo- citákból vagy lényegében anergiás humán B-sejtekből, aVL-lánc pedig természetben előforduló humán B-sejt-- repertoárbólszármazik. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerintieljárással előállítandó humán an- tigének elleni receptorok, amelyekemberben kismértékben immunogének vagy egyáltalán nem immunogének.Ezek előnyösen ellenanyagok vagy azok fragmentumai, vagy az ellenanyagVH/VL láncait tartalmazó immunkonjugá- tumok. Előnyösen a találmánytárgyát képezik tumorantigének, előnyösen a 17–1A jelzésű humántumorantigén ellen irányuló receptorok. Végül, a találmány tárgyátképezik a találmány szerinti eljárás kivitelezésére alkalmas rea-genskészletek, és a receptorokat tartalmazó gyógyászati készítmények.A találmány szerinti megoldás alkalmazható emberi szervezetbenexpresszálódó antigénekkel szembeni ellenanyag-- terápia során. ŕ

Description

A találmány tárgyát eljárás képezi olyan, humán antigén elleni receptor előállítására, amely emberben kismértékben immunogén vagy egyáltalán nem immunogén, amely eljárás szerint funkcionálisan újrarendeződött VH- és VL-immunglobulin-láncok kombinációját szelektáljuk, amely kombinációban legalább a VH-lánc naiv, („unprimed”) érett, humán B-limfocitákból, a VL-lánc pedig természetben előforduló humán B-sejtrepertoárból származik; és amely láncok rekombináns vektorról és humán antigénhez való kötődés érdekében egy in vitro prezentáló rendszer alkalmazásával expresszálódnak, ahol a szelekciós lépés végrehajtása előtt vagy a VH-láncot vagy a VL-láncot szelektálják az antigénre való kötésre nézve, egy helyettesítő V-lánccal együtt.

A találmány tárgyát képezik továbbá humán antigének elleni receptorok, amelyek emberben kismértékben immunogének vagy egyáltalán nem immunogének, és amelyek a találmány szerinti eljárással állíthatók elő. A találmány szerinti receptorok 17-1A jelzésű, natív humán tumorantigén, más néven EpCAM, EGP-40 vagy GA733-2 antigén ellen irányulnak.

Az emlős immunrendszer, például a humán immunrendszer kiszűrik a saját antigének elleni specifikus immunkompetens sejteket és molekulákat. Ebben a vonatkozásban, az immunrendszer szabályozásában bekövetkező rendellenesség autoimmun betegségek, például reumatoid arthritis kifejlődéséhez vezethet. Általában igen kedvező tehát, hogy az immunrendszer a megfigyelése alatt tartja az autoreaktív antitesteket és Tsejteket. Előfordulnak azonban olyan esetek, amikor előnyös lenne, ha emlősben, elsősorban az emberi szervezetben expresszálódó antigénekkel szembeni autoreaktív ellenanyagok állnának rendelkezésünkre. Ilyen antigének például a tumorok jelenlétével kapcsolatos (tumorasszociált) antigének. Például, a humán 17-1A vagy EpCAM antigénről - egy egyszerű epitelsejteken vagy azokból származó malignus tumorsejteken expresszálódó sejtfelszíni glikoproteinről - kimutatták, hogy az ígéretes célpontja karcinómák monoklonális ellenanyag-terápiájának, különösen olyan betegek esetében, akiknél tumorsejtek disszeminációjának (szóródásának) következtében minimális elváltozás maradt vissza, amely visszamaradó sejtek később szolid áttétek keletkezéséhez vezethetnek, és ily módon ronthatják a beteg gyógyulási vagy életkilátásait. Olyan, colorectalis (vastagbelet és végbelet érintő) karcinómában szenvedő betegek esetében, akiknél az elsődleges tumor sebészi úton történő eltávolítását követően igen csekély elváltozás maradt vissza, a humán 17-1A antigénre specifikus egéreredetű monoklonális ellenanyag négy hónapon át, öt adagban szisztémásán adagolva 30%-kal csökkentette az 5 éves mortalitást a kezeletlen betegekhez képest; a kezelés során mindegyik beteg az első tumorműtétét követő 4 hónapban 5 alkalommal összesen 900 mg ellenanyagot kapott [Riethmüler: Láncét 343, 1177 (1994)]. Az ellenanyag-kezelés során azonban a betegeknél erős ellenanyagválasz lépett fel az egéreredetű immunglobulinokkal szemben. Ilyen, humán eredetű egér elleni ellenanyagok („humán antimouse antibodies HAMA) jelenléte nagymértékben korlátozza az ellenanyag-terápia folyamatos alkalmazását, és a kezelés előrehaladtával egyre nagyobb mértékben rontja annak hatékonyságát. Ezenfelül, korábbi ellenanyag-kezeléssel vagy egér-immunglobulinnal egyéb úton történt találkozással kiváltott HAMA-k jelenléte erősen gátolhatja a későbbi ellenanyag-kezelések sikerét.

A fenti problémák áthidalására előnyös lenne, ha minimális immunogenitású terápiás ellenanyagok állnának rendelkezésünkre. Ezt elérhetjük például úgy, hogy aminosavszekvenciájukat tekintve teljesen humán terápiás ellenanyagokat vagy ellenanyag-származékokat állítunk elő, és a humán ellenanyag-idiotípus immunogén sajátságát úgy minimalizáljuk, hogy humán lg variábilis régiókat alkalmazunk, amelyeket a humán immunrendszer várhatóan tolerál.

Humán antigénekkel szemben irányuló humán ellenanyagok előállítása azonban két jelentős problémát vet fel:

(1) a hibridómatechnológia vagy más, folyamatos szaporodású sejtek létrehozásán alapuló technológiák kevéssé bizonyultak hatékonynak humán ellenanyagtermelő sejtvonalak előállítására, mint az egér-hibridómatechnológia;

(2) az autoreaktív ellenanyagokat a természetes ellenanyag-repertoár viszonylag hatékonyan eltávolítja, a „sajáttolerancia” jelenségét eredményező mechanizmuson keresztül.

Humán ellenanyagok általánosságban sokkal könnyebben hozzáférhetők azóta, hogy humán ellenanyagokat termelő transzgenikus egereket sikerült létrehozni [Brüggemann: Immunoi. Today 17, 391 (1996)], valamint azóta, hogy kombinatorikus ellenanyagkönyvtárak és fágprezentációs technológia állnak rendelkezésünkre, amelyek lehetővé teszik, hogy immunglobulin (lg) nehéz- és könnyűláncok variábilis régióit (VH és VL) in vitro kombináltassuk egymással, és a kombinációkat a megfelelő antigénkötő specifitásra in vitro szelektáljuk [Winter: Annu. Rév. Immunoi. 12, 433 (1994)]. A fágprezentációs eljárás alkalmazásával könnyen izolálhatok ritka események, például 10⁷-10⁹ különböző VL/VH vagy VH/VL párból egy specifikus kötődést eredményező kombinációk, azaz kötődési egységek („binding entity”); ez különösen igaz akkor, ha a variábilis régiók repertoárját specifikus kötődési egységekre nézve feldúsítjuk úgy, hogy a repertoár klónozását immunizált gazdából származó B-limfocitákból kiindulva végezzük.

Specifikus kötődési egységek gyakorisága azonban természetesen előforduló ellenanyag-repertoárokban gyakran lényegesen csökkent. Ez különösen érvényes saját antigéneket kötő ellenanyagosztályokra. A fágprezentációs eljárás alkalmazásakor, saját antigénekkel szemben toleráns gazdából származó VL- és VH-régiók véletlenszerű kombinációjával nyert, szokásos méretű (10⁷-10⁹ független kiónt tartalmazó) kombinatorikus ellenanyagkönyvtár legtöbbször nem elegendő autoreaktív ellenanyagok sikeres in vitro szelekciójához.

A fenti probléma áthidalására irányuló egyik stratégia szerint, nagyon nagy méretű kombinatorikus ellen2

HU 221 818 Β1 anyagkönyvtárakat alkalmazunk, hogy a génkönyvtár méretével ellensúlyozzuk az autoreaktív ellenanyagok előfordulásának kis gyakoriságát a természetes repertoárokban. Több mint 10⁹ független kiónt tartalmazó kombinatorikus ellenanyagkönyvtárakat azonban nehéz létrehozni, mivel a transzformációs eljárások hatékonysága, amelyekkel plazmid-DNS-ek E. coli sejtekbe juttathatók, korlátozott.

A természetes ellenanyag-repertoárokban megfigyelhető, a sajáttolerancia mechanizmusa által közvetített egyensúly-eltolódás ahhoz vezet, hogy az ilyen repertoárokban az autoreaktív ellenanyagok kisebb gyakorisággal képviseltetik magukat. Ez jelentősen csökkenti saját antigéneket specifikusan felismerő ellenanyagok izolálásának esélyét. Ennek elkerülése érdekében olyan megközelítési módokat dolgoztak ki, amelyek félszintetikus vagy teljesen szintetikus VH- és/vagy VL-lánc-repertoárok előállításán alapulnak. Például, átrendeződésektől mentes humán V-génszegmensek csaknem teljes repertoárját klónozták genomi DNS alapján, és azokat in vitro, variábilis régió funkcionális génjeivel rekombináltatták, az in vivő végbemenő V-J- vagy V-D-Jrekombinációhoz hasonlóan [Hoogeboom: J. Mól. Bioi. 227, 381 (1992); Nissim: EMBO J. 13, 692 (1994); Griffiths: EMBO J. 13, 3245 (1994)]. Általánosságban, a teljesen szintetikus és félszintetikus eljárásokban úgy járnak el, hogy az elsősorban a V-D/D-J kapcsolódásnál és a D-szegmensben megfigyelhető sokféleséget (diverzitást), amely nagyrészt felelőssé tehető a nehézlánc CDR3-régió rendkívüli hosszáért és szekvenciavariabilitásáért, valamint a V-J-kapcsolódásnál megfigyelhető, a könnyűlánc CDR3-régió szekvenciavariabilitásához hozzájáruló diverzitást degenerált oligonukleotidok alkalmazásával előállított véletlenszerű szekvenciák közbeiktatásával utánozzák [Hoogeboom: lásd fent (1994); Nissim: lásd fent; Griffiths: lásd fent; Barbas: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89, 4457 (1992)].

Fennáll azonban a veszély, hogy az ilyen, humán V-génszekvenciák alapján előállított félszintetikus vagy teljesen szintetikus repertoárokból humán antigénhez történő kötődés alapján szelektált VL/VH vagy VH/VL párok immunogén epitópokat képeznek, amelyek nem kívánt immunválaszt válthatnak ki emberben [Hoogeboom: TIBTECH 15, 62 (1997)]; különösen a teljesen randomizált szekvenciarepertoárokból származó CDR3-régiók hajlamosak potenciálisan immunogén epitópok kialakítására, mivel ezeknek sosem kellett a humán immunrendszer ellenőrzését elkerülniük úgy, hogy az ne ismeije fel azokat idegen antigénekként, és ez ahhoz vezet, hogy az ilyen régiókat tartalmazó ellenanyagokat az immunrendszer eliminálja. Ugyanez érvényes a humán ellenanyagokat expresszáló transzgenikus egerekből származó humán ellenanyagokra is, mivel ezek az immunglobulin-molekulák úgy lettek szelektálva, hogy azokat az egérimmunrendszer tolerálja, de nem voltak kitéve a humán immunrendszer szelektáló hatásának.

A WO 97/00271 számú nemzetközi közzétételi irat tumorantigének ellen magas affinitást mutató emberi antitesteket tár fel, különösen c-erbB-2-höz specifikusan kötődő antitesteket. Az antitestek a leírás szerint használhatók önmagukban vagy alkalmazhatók c-erbB2-t túlexpresszáló sejteket célzó vagy ilyen sejtekhez effektormolekulákat eljuttató kiméra molekulák összetevőiként.

Egy további szabadalmi bejelentésben (WO 93/11236) eljárásokat tárunk fel saját elleni antitestek és antitestfragmensek előállítására. A saját elleni antitestfragmenseket a kiválasztott emlősből származó saját antigénhez való kötődésre szelektálták.

Az előttünk álló műszaki probléma tehát az volt, hogy olyan eljárást dolgozzunk ki, amely lehetővé teszi emberben alacsony immunogenitású, vagy emberben imunogenitást egyáltalán nem mutató receptorok előállítását, és amely alkalmazható antigének célzott elérésére az emberi szervezetben. A fenti technológiai probléma megoldását a találmánynak csatolt igénypontokban megfogalmazott megvalósítási módjaival értük el.

A találmány tárgyát képezi tehát eljárás humán antigén elleni receptor előállítására, amely emberben kismértékben immunogén vagy egyáltalán nem immunogén, amely eljárás szerint az 1. igénypontban meghatározott lépéseket hajtjuk végre, nevezetesen (b) funkcionálisan újrarendeződött VH- és VL-immunglobulinláncok kombinációját szelektáljuk, amely kombinációban legalább a VH-lánc naiv, érett, humán B-limfocitákból, a VL-lánc pedig természetben előforduló humán B-sejt-repertoárból származik, és a láncok rekombináns vektorról expresszálódnak, és (c) humán antigénhez való kötődés megvalósítására in vitro prezentáló rendszert („display system”) alkalmazunk, és ahol a (b) szelekciós lépés végrehajtása előtt (a) lépésben vagy a VH-láncot vagy a VL-láncot szelektáljuk az antigénre való kötődésre, egy nem humán, célantigén-specifikus ellenanyag V-láncával együttesen. A találmány szerinti eljárás különösen előnyösen alkalmazható olyan receptorok előállítására, amelyek antigének célzott elérésére alkalmazhatók emberben anélkül, hogy maguk akár a legkisebb mértékben is, vagy jelentősebb mértékben immunogének lennének. Ilyen receptorok előnyösen alkalmazhatók különböző betegségek, például tumorok vagy autoimmun betegségek kezelésére; transzplantációt követően „graft” kilökődésének megelőzésére; fertőző betegségekben sejtreceptorok célzott elérésére; valamint allergiás, gyulladásos, endokrin és degeneratív betegségek kezelésére, a fenti patológiás folyamatok létrejöttében szerepet játszó kulcsmolekulák célzott elérésével.

A találmány szerinti receptorok VH/VL immunglobulinláncai természetesen tovább vizsgálhatók azok nukleinsavszekvenciáira vagy aminosavszekvenciáira vonatkozólag, a technika állása szerint jól ismert eljárásokkal [lásd például Sambrook: „Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Miután a nukleinsavszekvenciát vagy aminosavszekvenciát meghatároztuk, a találmány szerinti receptorok más eljárásokkal is előállíthatok, például szintetikus vagy félszintetikus eljárásokkal, miáltal szintetikus vagy félszintetikus receptorokat kapunk; vagy előállíthatok humán im3

HU 221 818 Β1 munglobulin-receptorokat expresszáló transzgenikus egerekben; az ilyen, a fentiekben már ismertetett jellemzőkkel bíró, szintetikus vagy félszintetikus eljárásokkal vagy transzgenikus egerekben előállított receptorok ugyancsak a találmány tárgyát képezik.

Miután a receptor a humán antigénhez kötődött, az tovább tisztítható. Például, az antigénspecifitást nem mutató, nem kötődött receptorok mosással eltávolíthatók. A kötődött receptorok a humán antigénekről eluálhatók és tovább tisztíthatok, míg a kívánt receptor expresszióját, kötését és szelekcióját magában foglaló további lépések sorozatára lehet szükség ahhoz, hogy a kívánt receptort és/vagy a megfelelő rekombináns vektort tiszta, izolált formában megkapjuk.

A találmány szerinti eljárás lg variábilis régiók humán immunrendszer általi előzetes szelekcióján alapul. A receptorok humán kombinatorikus ellenanyagkönyvtárakból in vitro szelektált repertoárból származnak, amelyeket kizárólag vagy főként, a naiv érett, humán B-limfociták által expresszált, természetesen előforduló ellenanyag-repertoár alapján állítunk elő.

Az lg variábilis domének származhatnak azonban más forrásokból is, amelyek ilyen, előszelektált B-sejtpopulációkat képviselnek.

A VH- vagy VL-láncok fonásául szolgáló B-sejtek eredetére vonatkozó elmélet tudományos hátterét a következőben ismertetjük:

IgD- és IgM-ellenanyagokat membrán-antigénreceptorokként expresszáló érett, naiv B-limfociták - másodlagos limfoid szervek közötti és azok fele vezető útjuk során - az elsődleges tüszőkbe (follikulusokba) jutnak, hacsak nem találkoznak klonális deléciót okozó multivalens saját antigénekkel vagy szolubilis monovalens saját antigénekkel, ami viszont azzal a következménnyel jár, hogy ezek a sejtek anergiásak és rövid élettartamúak lesznek az elsődleges tüszőkből történő kirekesztődésük miatt.

Kizárólag IgM-ellenanyagokat expresszáló éretlen B-sejtek saját antigénnel történő érintkezése a csontvelőben klonális delécióhoz vagy energiához vezet, az antigén valenciájától függően. Anergiás B-sejtek, bár felszíni IgD-t expresszálnak, nem képesek az antigén jelentérére megfelelő válaszreakciót adni ezeken a receptorokon keresztül; az elsődleges tüszőkbe történő belépés és T-sejtek segítsége nélkül ezen sejtek féléletideje rövid, csupán néhány nap.

Ezzel szemben, saját antigénnel nem találkozott érett, naiv B-limfociták féléletideje, amelyek bejutnak az elsődleges tüszőkbe, hosszú, akár több hét. A sajáttolerancia jelenségének kialakulását magyarázó fenti mechanizmus ellenére, a hosszú élettartamú érett, naiv Blimfociták ezen populációja még mindig tartalmaz potenciálisan autoreaktív B-sejteket, amelyek azonban a T-sejtes tolerancia következtében kevéssé valószínű, hogy specifikus segítő T-sejteket találnak, ami megakadályozza, hogy azok proliferálódjanak és ellenanyagokat szekretáljanak. Úgy tűnik, hogy a B-sejtek válaszképtelenségét számos, kis mennyiségben jelen lévő saját antigénre a fenti mechanizmus magyarázza, a tolerancia tehát a segítő („helper”) T-sejteket érinti és nem elsősorban a B-sejteket. A találmány szerinti megoldással összhangban, ezeket a hosszú élettartamú, válaszképtelen, potenciálisan autoreaktív, érett, naiv B-sejteket azonosítottuk a természetben előforduló humán ellenanyag-repertoár legígéretesebb forrásaként, és alkalmaztuk olyan kombinatorikus ellenanyagkönyvtárak előállítására, amelyek különösen alkalmasak humán antigénekkel szemben irányuló humán ellenanyagok szelekciójára, például a fágprezentációs eljárás alkalmazásával.

A találmány szerinti megoldással összhangban alkalmazott, nagymértékben szelektált ellenanyag-repertoár főként hosszú in vivő élettartamú B-sejtekből származott, amelyek ekként hosszabb ideig ki voltak téve a humán immunrendszerrel történő érintkezésnek, és amelyeknél így várhatóan jelentősen csökkent azon ellenanyag-molekulák előfordulási aránya, amelyek - elsősorban a hipervariábilis CDR3-régiókban - a humán immunrendszerre nézve immunogén epitópokat hordoznak. Ilyen ellenanyag-repertoárból szelektált humán ellenanyagok várhatóan kevésbé immunogének emberben, mint félszintetikus vagy teljes egészében szintetikus humán ellenanyagkönyvtárakból szelektált humán ellenanyagok.

Azok az érett, naiv B-sejtek, amelyek idegen antigénnel találkozva aktiválódtak, nem expresszálnak többé IgD-t, klonális proliferációba kezdenek, és szolubilis immunglobulinokat szekretáló plazmasejtekké differenciálódnak; az ellenanyagválasz korai szakaszában főként IgM-ellenanyagok, míg később elsősorban IgGés IgA-izotípusok vannak jelen; az IgE-ellenanyagok viszonylag kis, de biológiailag el nem hanyagolható mértékben járulnak hozzá az ellenanyagválaszhoz.

Az IgM-, IgG-, IgA- vagy IgE-ellenanyagokat expresszáló IgD-negatív érett antigénelkötelezett B-limfocitákkal ellentétben, az IgD-pozitív érett, naiv B-sejtek még nem mentek át klonális proliferáción, kombinatorikus IgD-génkönyvtárakban tehát nem képviseltetik magukat nagy arányban olyan ellenanyag-specifitások, amelyeknek - a rendszerint idegen antigének által kiváltott - immunválasz létrejöttében aktuálisan szerepe van, abban a korábbiakban szerepe volt; ezáltal nem csökkentik a repertoár sokféleségét, és nem foglalják el a génkönyvtár egy részét feleslegesen saját antigénhez várhatóan nem kötődő ellenanyagjelöltek. Ez nyilvánvalóan eltér a technika állása szerint eddig alkalmazott megoldásoktól, amelyek humán IgM kombinatorikus ellenanyagkönyvtárak alkalmazását javasolták humán antigénekkel szemben irányuló humán ellenanyagok, természetben előforduló humán ellenanyag-repertoárokból történő in vitro szelekciójára [Hoogeboom: lásd fent (1977)].

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, antigénreceptorként immunglobulint vagy immunglobulin-fragmentumot alkalmazunk.

Az immunglobulin fragmentuma lehet bármely, a technika állása szerint ismert fragmentum, például Fabvagy F(ab)2-ffagmentum.

A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint, immunglobulin-fragmentumként Fvffagmentumot alkalmazunk.

HU 221 818 Β1

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, legalább a VH-, és adott esetben, a VL-immunglobulin-lánc is humán IgD-repertoárból származik.

Arra a következtetésre jutottunk, hogy ez a receptor, és alacsony immunogenitásra szelektálódott, előnyösen alkalmazható ellenanyag-repertoár leginkább humán IgD-ellenanyagkönyvtárban van képviseltetve. Az IgD membránantigén-receptorként expresszálódik felszíni IgM-ellenanyagokkal együtt érett, naiv B-limfocitákon, amelyek - miközben másodlagos limfoid szervekbe kerülnek, vagy egyik ilyen szervből a másikba kerülnek át - elsődleges nyiroktüszőkbe jutnak, hacsak nem találkoznak klonális delécióját eredményező multivalens saját antigénekkel vagy szolubilis monovalens saját antigénekkel, ami viszont azzal a következménnyel jár, hogy ezek a sejtek anergiásak és rövid élettartamúak lesznek az elsődleges tüszőkből történő kirekesztődésük miatt. A humán IgD-könyvtárakban, az érett, naiv B-limfociták ellenanyag-repertoárján felül csupán azon rövid életű B-sejtek ellenanyag-repertoárja van képviseltetve, amelyek szolubilis monovalens saját antigénekkel történt találkozásuk következtében anergiássá váltak, de csupán kis valószínűséggel járulnak hozzá multivalens saját antigénekhez hasonló humán sejtfelszíni molekulákhoz kötődő specifikus kötőhelyek létrehozásához. Ez utóbbi antigének inkább klonális deléciót eredményeznek, mint B-sejtes anergiát.

A találmány szerinti eljárás egy további előnyös megvalósítási módja szerint, in vitro megjelenítő rendszerként fágprezentációs rendszert alkalmazunk.

A fágprezentációs rendszert a korábbiakban általában specifikus célpontokhoz kötődő peptidek és proteinek szelektálására alkalmazták. Az így összegyűlt tapasztalatok alapján, az immunglobulin VH- és VL-láncok viszonylag egyszerűen klónozhatok olyan vektorokba, amelyek fágprezentációs rendszerek létrehozására is alkalmas molekulákat tartalmaznak. Ilyen molekulák és vektorok a technika állása szerint jól ismertek [Winter: lásd fent; Barbas: METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 2, 119-124. (1991)], és szükségtelennek tartjuk azok részletesebb magyarázatába bocsátkozni.

A találmány szerinti eljárás egy további előnyös megvalósítási módja szerint, az átrendeződött láncok kombinációit egy vagy több különböző génkönyvtárról expresszáltatjuk.

Az utóbbi megközelítési mód alkalmazása különösen akkor előnyös, ha specifikus célponthoz kötődő VHvagy VH-lánc rendelkezésünkre áll, és olyan megfelelő második V-láncot kívánunk szelektálni, amely helyreállítja a kötőfunkciót vagy javítja azt.

A találmány szerinti eljárás egy még további előnyös megvalósítási módja szerint, a humán antigén, amellyel szemben receptort állítunk elő, tumorantigén.

Amennyiben a humán antigén tumorantigén, az előnyösen a tumor felszínén expresszálódó antigén. Ebben az esetben előnyösen a VH- és VL-láncokat valamilyen toxinhoz kötjük. Az összekapcsolás történhet nukleinsavszinten, géntechnológiai eljárással; vagy proteinszinten, például kémiai úton történő összekapcsolással.

A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint, a tumorantigén 17-1A antigén.

A találmány egy további különösen előnyös megvalósítási módja szerint, a VH-lánc a 7. ábrán (lásd 1-381. nukleotidok) vagy 8. ábrán (lásd 1-339. nukleotidok) bemutatott szekvenciát tartalmaz; és /vagy a VL-lánc a

6. ábrán (lásd 1-321. nukleotidok) vagy 9. ábrán (lásd 1-321. nukleotidok) bemutatott szekvenciát tartalmaz. A fenti specifikus VH- és VL-régiókat tartalmazó receptorok, amelyekben a VL-régió mindkét VH-régióval kombinálódhat, az első olyan humán ellenanyagok, amelyek specifikusak a humán 17-1A antigénre.

A találmány szerinti eljárás egy további előnyös megvalósítási módja szerint a szelekciós lépésben :

(i) az antigénreceptort expresszáló, azt megjelenítő (prezentáló) hordozót a következők valamelyikéhez kötjük:

(a) immobilizált célantigénhez vagy annak fragmentumaihoz;

(b) a célantigént vagy annak fragmentumait expresszáló, adott esetben jelölt sejtekhez; vagy (c) szolubilis, előnyösen jelölt célantigénhez vagy annak fragmentumaihoz;

(ii) a nem specifikus módon kötődött prezentáló hordozókat mosással eltávolítjuk (a és b), majd a specifikus módon kötődött prezentáló hordozókat nem specifikus módon (például alacsony pH-jú pufferrel) vagy specifikus módon (például célantigén-specifikus ellenanyaggal) eluáljuk; vagy (fii) a célantigénnel kötődött, a receptort prezentáló hordozót a célantigént tartalmazó oldatból vagy a célantigént expresszáló sejtek szuszpenziójából kényszerdúsítjuk („positive enrichment) (b és c), például jelölt célantigénhez vagy a célantigént expresszáló jelölt sejtekhez kötődő mágneses gyöngyök alkalmazásával; ily módon antigénreceptorokat tartalmazó prezentáló hordozókat izolálunk, amelyeket adott esetben replikációval megsokszorozhatunk, és további in vitro szelekciós lépéseknek vethetünk alá.

A két lépésből álló, az 1. igénypontban meghatározott eljárást végezhetjük eltérő fajból származó, célantigén-specifikus templátellenanyag, például a humán célantigénnel szemben irányuló egér monoklonális ellenanyag alkalmazásával. Először, a humán VL- vagy VH-repertoárt egyetlen, az egér templátellenanyagból származó kisegítő VH- vagy VL-lánccal kombináltatjuk; például filamentózus fág felszínén prezentáltatjuk, és in vitro antigénkötődésre szelektáljuk. A fenti módon, a teljes génkönyvtár rendelkezésünkre áll a humán VL- vagy VH-repertoár számára, és olyan humán VLvagy VH-láncok izolálhatok, amelyek várhatóan képesek a humán célantigénhez történő specifikus kötődés létrehozásában közreműködni. A második lépésben, a templátellenanyag kisegítő variábilis régióját a megfelelő humán variábilis régió repertoárral helyettesítjük, majd egy második in vitro szelekciót végzünk; ebben az esetben is, a teljes génkönyvtár kizárólagosan rendelkezésre áll egyetlen VH- vagy VL-régió repertoár számára; a két lépésből álló eljárással tehát sokkal nagyobb számú VL- és VH-régió jelöltet szűrhetünk an5

HU 221 818 Β1 tigénkötő aktivitásra korlátozott méretű génkönyvtár alkalmazása mellett, mint amennyit egy egylépéses eljárással szűrhetnénk.

A fenti, humán IgD kombinatorikus ellenanyagkönyvtárak fágprezentációs rendszer alkalmazásával történő szűrésén alapuló, két lépésből álló szelekciós eljárást sikeresen alkalmaztuk a humán 17-1A antigénhez specifikusan kötődő humán ellenanyagok variábilis régióját kódoló DNS-szekvenciák klónozására. Először, az M79 egér monoklonális ellenanyag [Göttlinger: Int. J. Cancer 38, 47 (1986)] Fd-nehézlánc-szegmensét (VH+CH1), amely specifikus módon kötődik a humán 17-1A antigénhez, humán kappa- és lambdakönnyűlánc repertoárokkal kombináltattuk. A kapott génkönyvtárakat filamentózus fágon prezentáltattuk (jelenítettük meg), és in vitro, immobilizált rekombináns humán 17-1A antigénen kikötéssel és mosással végzett dúsítással („panning” eljárással) szelektáltuk. Mindegyik dúsítási kört követően szolubilis Fab-fragmentumokat expresszáltattunk több kiónból, és azokat ELISA-eljárással antigénkötődésre teszteltük. Szekvenciaanalízis szerint, a dúsítási eljárás során feldúsult valamennyi erős kötődési egység ugyanazt a humán kappa-könnyűláncot tartalmazta. Ezt a humán könnyűláncot, amelyet a továbbiakban K8-láncnak nevezünk, humán IgD-nehézlánc-génkönyvtárral kombináltattuk, ezt ismét filamentózus fágon prezentáltattuk, és in vitro, immobilizált rekombináns humán 17-1A antigénen, dúsításos eljárással szelektáltuk. Mindegyik dúsítási lépést követően szolubilis Fab-fragmentumokat expresszáltattunk több klónból, és azokat ugyancsak ELISA-eljárással teszteltük antigénkötődésre nézve. A dúsítási eljárás során feldúsult kötődési egységek szekvenciaanalízise két különböző nehézlánc variábilis régióra derített fényt, amelyeket D4.5- és D7.2-régióknak neveztünk, és amelyek a K8-könnyűlánccal kombinálódva egymástól különböző, a humán 17-1A antigénre specifikus humán antigénkötő helyeket alakítanak ki. A humán könnyű- és nehézlánc repertoárokat több, humán donoroktól származó vérből és csontvelőmintákból izolált teljes RNS-készítményből klónoztuk kappa- vagy lambda-könnyűláncra specifikus, valamint IgD-nehézláncra specifikus RT-PCR-eljárás alkalmazásával. Mivel az IgD-nehézláncokkal in vivő kombinálódott könnyűlánc-repertoárt nem tudjuk szelektív módon amplifikálni - hacsak nem tisztítunk IgD-pozitív B-sejteket RNS-készítmény előállítására -, a könnyűlánc-génkönyvtárak nem korlátozódtak érett, naiv, vagy anergiás B-limfociták ellenanyag-repertoárjára. A nehézlánc antigénfelismerésben betöltött domináns szerepét tekintve azonban nem vonhatók kétségbe az IgD-repertoár alkalmazásának előnyei saját antigének ellen irányuló humán ellenanyagok szelektálására. További, és lényegesebb szempont, hogy mivel az ilyen könnyűláncok ki vannak téve a humán immunrendszer szelekciós hatásának, mégis garantált, hogy azok alacsony immunogenitást mutatnak emberben.

A találmány szerinti eljárás egy még további előnyös megvalósítási módja szerint, a kisegítő lánc egér VH- vagy VL-lánc.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a megfelelő kombinációt a következők szerint eljárva szelektáljuk:

(a) egy és ugyanazon VH-láncot számos különböző VL-lánccal kombinálódva tesztelünk a humán antigénhez történő kötődésre; vagy (b) egy és ugyanazon VL-láncot számos különböző VH-lánccal kombinálódva tesztelünk a humán antigénhez történő kötődésre.

A fenti megoldás előnyösen alkalmazható akkor is, ha a VL- vagy VH-láncról tudjuk, hogy az specifikus kölcsönhatásba lép a humán célmolekulával. Ezután, megfelelő második láncot szelektálunk a célmolekulához történő - előnyösen javított - kötődés alapján.

A találmány szerinti eljárás egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a szelekciót követőn izoláljuk a humán VH- és VL-láncokat vagy azoknak megfelelő nukleinsavszekvenciákat, és azokat ugyanazon vagy más VH- és VL-láncokkal fúzionáltatjuk, vagy immunglobulin nehézlánc-konstansrégiókkal (CH) vagy könnyűlánc-konstansrégiókkal (CL) vagy azok részeivel vagy más biológiailag aktív molekulával, például peptidekkel, proteinekkel, nukleinsavakkal, kisméretű szerves vegyületekkel, hormonokkal, neurotranszmitterekkel (idegi átvivőanyagokkal), peptido-mimetikumokkal, PNA-kal fúzionáltatjuk [Milner: Natúré Medicine 1, 879 (1995); Hupp: Cell 83, 237 (1995); Gibbs és Oliff: Cell 79, 193 (1994)]. A másik funkcionális molekulát hozzákapcsolhatjuk a VH- és VL-láncokhoz úgy, hogy azok közt fizikai kapcsolat jöjjön létre, például kémiai eljárásokkal; vagy azok fúzionáltathatók a technika állása szerint ismert rekombináns DNS-technológiákkal.

A találmány fenti megvalósítási módja különösen akkor alkalmazható előnyösen, ha a humán szervezetben kívánt antigéneket megcélzó specifikus gyógyszereket kívánunk kifejleszteni. Például, ha tumorantigéneket kívánunk célzottan elérni, a VH- és VL-láncokat nukleinsavszekvencia vagy aminosavszinten toxinegységgel fúzionáltathatjuk, miáltal immunotoxint kapunk; vagy sejtreceptor extracelluláris részével; vagy szolubilis citokinnel vagy azok részeivel fúzionáltathatjuk, miáltal a tumor elleni immunitást fokozó konstrukciókat nyerünk; vagy ellenanyag Fv-fragmentumával fúzionáltathatjuk, miáltal bispecifikus ellenanyag-származékhoz jutunk.

A találmány szerinti eljárás egy még további előnyös megvalósítási módja szerint, a konstansrégiók láncai humán IgGl- vagy IgG3-ellenanyagból származnak.

Előnyösen, humán IgGl- vagy IgG3-ellenanyag alosztályokból származó konstansrégióláncokat alkalmazunk akkor, ha a célantigént expresszáló sejteket el kívánjuk pusztítani a humán szervezetben. A technika állása szerint jól ismert, hogy ezek az IgG-alosztályok hatékony közvetítői az ellenanyagfuggő sejtközvetített citotoxikus reakciónak („Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity”; ADCC), és hozzájárulnak a fenti alosztályok által felismert és megkötött sejtek elpusztításához.

A találmány szerinti eljárás egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a VH- és/vagy VL-láncokat előnyösen alacsony molekulatömegű, nem protein6

HU 221 818 Β1 természetű gyógyászati anyagokkal, például radioizotópokkal, vagy kemoterápiás célra alkalmazott vegyületekkel kapcsoljuk össze; miáltal a fenti gyógyszerek sokkal specifikusabb in vivő célba juttatását érjük el.

A találmány szerinti eljárás egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a VH- vagy VL-láncokat lényegében naiv, érett, humán B-limfocitákból nyert mRNS alapján, RT-PCR-amplifikációs technológiával nyert nukleinsavszekvenciákról expresszáltatjuk.

A VH- vagy VL-láncokat előnyösen RT-PCR-eljárással amplifikáljuk, miután azoknak megfelelő kiindulási anyagot azonosítottunk és izoláltunk. Előnyösen a humán csontvelőből, vagy előnyösebben, humán vérből származó, maggal rendelkező sejtekből izolált mRNS-t alkalmazunk VH- vagy VL-láncok RT-PCR-eljárással történő amplifikálására, mivel emberben ez a két szövetféleség képezi azt a legegyszerűbben hozzáférhető forrást, ahonnét B-sejtek izolálhatok. Az RNS-izolálást megelőzően előnyösen érett, naiv B-limfocitákat izolálunk a fenti szövetféleségek maggal rendelkező sejtjeiből, például mágneses gyöngyök alkalmazásával vagy áramlásos citometriás technológián alapuló sejtosztályozással. Ezzel biztosítjuk, hogy az RT-PCR-technológiával amplifikált VH- és VL-láncok a megfelelő B-sejt-populációból származzanak. Más eljárás szerint, amennyiben a fenti szövetféleségekből származó, maggal rendelkező sejtek teljes Aukciójából nyert mRNS-t alkalmazunk VHvagy VL-láncok RT-PCR-technológiával történő amplifikálására, a VH-régiót előnyösen humán IgD-nehézlánc Fd-fragmentum (VH-CH1) felének megfelelő fragmentumként amplifikáljuk IgD-specifikus 3’-végi PCR láncindító alkalmazásával, például az 1. táblázatban felsorolt láncindítók bármelyikének alkalmazásával, amelyek kizárólag a humán IgD-nehézláncnak megfelelő PCRtermékek keletkezését eredményezik, amiről viszont tudjuk, hogy csak érett, naiv humán B-limfocitákban és anergiás humán B-sejtekben expresszálódik.

A találmány szerinti eljárás megvalósításakor, az emberi szervezetben kismértékben immunogén vagy egyáltalán nem immunogén, humán antigén elleni receptort állítunk elő. A receptor funkcionálisan átrendeződött VH- és VL-láncok kombinációját tartalmazza, amely láncok előnyösen, naiv, érett, humán B-limfocitákból származnak, és előállíthatok a találmány szerinti eljárással, a fenti ismertetettek szerint.

A találmány szerinti eljárással előállítható ellenanyagok alkalmazásának előnyeit a fentiekben már vázoltuk. Hangsúlyozzuk, hogy ilyen, humán antigénekkel szemben irányuló és humán eredetű, emberi szervezetben kismértékben immunogén vagy egyáltalán nem immunogén ellenanyagokat a technika állása szerint még nem izoláltak. A találmány szerinti ellenanyagok tehát ellenanyagok kifejlesztésének teljesen új útját nyitják meg, amely ellenanyagok az orvostudomány és gyógyszerészet különböző területein alkalmazhatók.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a receptor ellenanyag vagy annak fragmentuma.

A találmány szerinti eljárás egy további előnyös megvalósítási módja szerint, az a receptor humán tumorantigénre, legelőnyösebben a humán 17-1A antigénre specifikus,

A találmány tárgyát képezi továbbá receptor, amelyben a VH-lánc a 7. ábrán (lásd 1-381. nukleotidok) vagy 8. ábrán (lásd 1-339. nukleotidok) bemutatott szekvenciát tartalmaz; és/vagy a VL-lánc a 6. ábrán (lásd 1-321. nukleotidok) vagy 9. ábrán (lásd 1-321. nukleotidok) bemutatott szekvenciát tartalmaz.

Az említetteken felül, a leírásban adott kitanítás alapján előállítható egy reagenskészlet, amely funkcionálisan átrendeződött VH- és VL-immunglobulin-láncok kombinációját tartalmazza, amelyben a VH- és VL-láncok legalább egyike naiv, érett, humán B-limfocitákból, és amely láncok in vitro prezentáló rendszer részét képező rekombináns vektorokról expresszáltathatók.

A reagenskészletet előnyösen a találmány szerinti megoldás kivitelezésére, ezáltal a kívánt specifitású receptorok izolálására alkalmazzuk.

Előnyösen, a reagenskészletben in vitro megjelenítő rendszerként fágprezentációs rendszert alkalmazunk.

A találmány tárgyát képezi továbbá ellenanyag, amely humán szekvenciákból származik, és a natív humán 17-1A antigénre specifikus.

A találmány szerinti eljárás alkalmazásával elsőként fejlesztettünk ki olyan humán ellenanyagot, amely specifikus a natív humán 17-1A antigénre. Amint azt a korábbiakban már hangsúlyoztuk, ez nem volt csekély vállalkozás, mivel humán tumorasszociált antigénekkel szemben irányuló humán ellenanyagok rendszerint az immunrendszer sajáttolerancia-jelenségét közvetítő mechanizmusainak vannak alávetve, ami in vivő az autoreaktív ellenanyagokat expresszáló B-limfociták eliminációját eredményezi. Az ismert tumorasszociált antigének közül, a 17-1A antigén - epiteliális eredetű tumorokon történő expresszálódásán felül - más tumorantigéneknél sokkal elteijedtebben expresszálódik normális epiteliális szövetek széles skáláján, mint más tumorantigének. A korábbi kísérletek natív, humán 17-1A antigénre specifikus, alacsony immunogenitású antitestek előállítására vagy egéreredetű variábilis régiókat továbbra is hordozó egér/humán kiméra antitestek előállítására korlátozódtak [LoBuglio és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4220-4224 (1989)] vagy kudarcot vallottak, mivel olyan humán antitesteket nyertek, amelyek kizárólag a rekombináns 17-1A antigén mesterséges epitópjaival reagáltak [Hoess és munkatársai, Proc. Am. Áss. Cancer Rés., 38, 30 (1997), de Kruif és munkatársai, J. Mól. Bioi., 248, 97-105 (1995)]. Ezért, a 17-1A antigént inkább pánepiteliális antigénnek (minden epiteliális sejten előforduló antigénnek) tekintjük, mint tumorantigénnek, amelynek azt első leírásakor vélték. Ezzel szemben, más, epiteliális tumorokon előforduló úgynevezett tumorantigének, például az erb-B2(Her 2/neu), Muc-1- (PEM) vagy a Thomson-Friedenreich-antigén, rendszerint sokkal korlátozottabb mértékben expresszálódnak normális epiteliális szöveteken. Ennek megfelelően azt vártuk, hogy a sajáttolerancia mechanizmusa révén, a 17-lA-reaktív ellenanyagokat expresszáló B-limfocitákra ható negatív szelekciós nyomás7

HU 221 818 Β1 nak - még alacsony affinitású ellenanyagok esetében is - kivételesen erősen kell érvényesülnie, mivel az antigén előfordulásának általános volta miatt csaknem lehetetlen, hogy az ilyen B-sejtek tartósan elkerüljék a 17-1A antigénnel történő találkozást. Meglepő volt tehát, amikor azt találtuk, hogy 17-lA-specifikus ellenanyagok, vagy legalábbis a megfelelő nehézláncok humán B-sejtek, például érett, naiv B-limfociták ellenanyag-repertoáijából izolálhatok. Ezekről a B-sejtekről ismert, hogy azok féléletideje in vivő hosszú, és azoknak már sikerült elkerülniük az eliminálódást érésüket megelőzően, ennek ellenére, hogy a 17-1A antigén még érésük helyén is jelen van; a 17-1A antigén esetében anergia nem jön létre, mivel ezt a típusú B-sejt-toleranciát csak szolubilis saját antigének váltják ki. Csak azok a hosszú életű B-sejtek, amelyeknek potenciális 17-1Areaktivitásuk ellenére sikerült életben maradniuk, képviselik humán immunglobulin variábilis régiók azon repertoárját, amelynek alkalmazásával olyan humán ellenanyagok és ellenanyag-származékok állíthatók elő, amelyeket szisztémás úton, emberi szervezetbe történő ismételt adagolást követően a humán immunrendszer várhatóan jól tolerál, mivel azokat az immunrendszer ellenőrző funkciója immunogén szekvenciákra már szűrte, és azokból az immunogén szekvenciákat már eltávolította. Ugyancsak a találmány tárgyát képezik tehát natív 17-1A antigénre specifikus humán ellenanyagok, amelyek alkalmasak ismételt in vivő adagolásra, függetlenül attól, hogy milyen eljárással lettek előállítva, mivel az említett magas in vivő kompatibilitással jellemzett humán ellenanyag-szekvenciák nagyon valószínű, hogy jelen vannak egészséges emberek B-sejt-repertoáijában is; azok előállíthatók például a találmány szerinti eljárással. Összefoglalva, elsőként fejlesztettünk ki olyan humán ellenanyagot, amely előnyösen alkalmazható a 17-1A antigént hordozó tumorsejtek kimutatására és/vagy elpusztítására.

A találmány szerinti ellenanyag előnyösen kismértékben immunogén vagy egyáltalán nem immunogén emberben. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, az ellenanyagot a fent ismertetett eljárással állítjuk elő. A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti ellenanyag a 17-1A antigén extracelluláris doménjának egy epitópját ismeri fel; előnyösen, a 8., 11., 13., 14., 59., 60., 77. vagy 79. számú peptidek legalább egyikének megfelelő aminosavszekvenciát tartalmazó epitópot ismer fel. Előnyösen, a találmány szerinti ellenanyag VH-lánca legalább egy, a 7. ábrán (lásd 1-381. nukleotidok) vagy

8. ábrán (lásd 1-339. nukleotidok) bemutatott szekvenciák szerinti CDR-t tartalmaz, és/vagy a VL-lánc legalább egy, a 6. ábrán (lásd 1-321. nukleotidok) vagy

9. ábrán (lásd 1-321. nukleotidok) bemutatott szekvenciák szerinti CDR-t tartalmaz. Különösen előnyösen olyan ellenanyagot állítunk elő, amelyben a VH-lánc a

7. ábrán (lásd 1-381. nukleotidok) vagy 8. ábrán (lásd 1-339. nukleotidok) bemutatott szekvenciát tartalmaz, és/vagy a VL-lánc a 6. ábrán (lásd 1-321. nukleotidok) vagy 9. ábrán (lásd 1-321. nukleotidok) bemutatott szekvenciát tartalmaz.

Arra a következtetésre jutottunk, hogy ez a receptor és alacsony immunogenitásra szelektált előnyös ellenanyag-repertoár legjobban humán IgD-ellenanyagkönyvtáron jeleníthető meg. Az IgD membrán-antigénreceptorként expresszálódik felszíni IgM-ellenanyagokkal együtt érett, naiv B-limfocitákon, amelyek - másodlagos limfoid szervekbe, vagy egyik ilyen szervből a másikba történő vándorlásuk során - elsődleges tüszőkbe jutnak be, hacsak nem találkoznak multivalens saját antigénekkel, ami azok klonális delécióját eredményezi; vagy szolubilis monovalens saját antigénekkel, ami viszont azzal a következménnyel jár, hogy ezek a sejtek anergiásak és rövid élettartamúak lesznek az elsődleges tüszőkből történő kirekesztődésük miatt. A humán IgD-génkönyvtárakban, az érett, naiv B-limfociták ellenanyag-repertoárján felül csupán azon rövid életű B-sejtek ellenanyag-repertoárja van képviseltetve, amelyek szolubilis monovalens saját antigénekkel történt találkozásuk következtében anergiássá váltak, de kis valószínűséggel hordoznak multivalens saját antigénekhez hasonló humán sejtfelszíni molekulákhoz történő specifikus kötődést közvetítő kötőhelyeket, amely utóbbi antigének inkább klonális deléciót eredményeznek, mint B-sejtes anergiát.

A már említetteken felül, a találmány tárgyát képezi gyógyászati készítmény, amely a találmány szerinti receptorok legalább egyikét tartalmazza egymagában vagy kombinációban - adott esetben -, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal vagy kötőanyaggal együtt. Gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagok a technika állása szerint jól ismertek, ilyenek például a következők: foszfátpufferes fiziológiás sóoldatok, víz, emulziók, például olaj/víz emulziók, különböző típusú nedvesítőanyagok, steril oldatok stb. Ilyen hordozóanyagokat tartalmazó készítmények jól ismert eljárásokkal formulázhatók. Ezek a gyógyászati készítmények megfelelő dózisban adagolhatok az egyénnek. A megfelelő készítményt különböző úton adhatjuk be, például intravénásán, intraperitoneálisan, bőr alá, izomba, lokálisan vagy a bőrbe.

így a találmány szerinti receptorok vagy a receptorok részeinek alkalmazhatók gyógyászati készítmény előállítására, amely alkalmas tumor, előnyösen epiteliális eredetű tumor kezelésére, kialakulásának megelőzésére és/vagy növekedésének lassítására valamely egyedben.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.

Az 1. ábrán a pComb3H-plazmid klónozórégióját ábrázoltuk, a fontosabb restrikciós helyekkel együtt. Az ábrán a következő rövidítéseket alkalmaztuk: P: promoter; VL: variábilis könnyűláncdomén; CL: konstans könnyűláncdomén; VH: variábilis nehézláncdomén; CH1: konstans nehézláncdomén 1; Ll/2: prokarióta vezetőszekvenciák. A pCOMB3H-vektorban gén-III-régió filamentózus fágok, például a VSCM13-fág gén-III génjének megfelelő terméket kódol.

HU 221 818 Β1

A 2. ábrán a pComb3H-plazmid, és a teljesen expresszálódott M13-fág vázlatos térképe látható. A pComb3H-plazmid térképén ábrázoltuk az ompA-vezetőszekvencia (L), könnyűlánc, pelB-vezetőszekvencia (L), nehézlánc és gén-IIIrégiókat. A teljesen expresszálódott M13-fág fenotípusosan meghatározott Fab-ellenanyag-fragmentumot jelenít meg felszínén, amely könnyűláncot és nehézlánc Fd-szegmenst (VH+CH1) tartalmaz a gén-III-termék fertőzést nem közvetítő részével kapcsoltan, és a megfelelő genotípust a prezentált Fab-fragmentum nehéz- és könnyűláncát kódoló egyszálú DNS-ként foglalja magában. A fertőző gén-III-proteint a VCSM13 segítő fág (helper phage) szolgáltatja.

A 3. ábrán szolubilis Fab-fragmentumok ELISAvizsgálatának eredményét szemléltettük szolubilis Fab-fragmentumokat tartalmazó periplazmatikus készítményeket vizsgáltunk, amelyben a fragmentumok mindegyike kiméra M79-ellenanyag Fd-szegmensét és egyetlen humán kappa-láncot tartalmazott kiónonként. ELISA-lemezeket egy éjszakán át szolubilis 17-1A antigénnel inkubáltunk. A kötődött Fab-ellenanyagfragmentumokat peroxidázzal konjugált poliklonális, humán immunglobulinnal szemben irányuló ellenanyaggal mutattuk ki. Végül, az ELISA-reakciót ABTS-szubsztrátoldat hozzáadásával hívtuk elő [ABTS=2,2 azino-bisz(3-etil-benztiazolin-6-szulfonsav)], és a szubsztrát átalakulását 405 nm hullámhosszon mértük (y tengely). A kiónokat az x tengely mentén jelöltük, az első szám azt jelöli, hogy a klón hányadik dúsítási lépésből származik, a második pedig a klón azonosító száma. Az 1.5-9 kiónok kiméra Fd-szegmenst tartalmaznak egy véletlenszerűen kiválasztott kappa-lánccal kombinálódva, és negatív kontrolokként szolgáltak.

A 4. ábrán szolubilis Fab-fragmentumok ELISAvizsgálatának eredményeit ábrázoltuk. Szolubilis Fab-fragmentumokat tartalmazó periplazmatikus készítményeket vizsgáltunk, amelyben fragmentumok mindegyike a k8-könnyűláncot és egyetlen humán Ig-delta-lánc Fd-fragmentumot tartalmazott. ELISA-lemezeket egy éjszakán át szolubilis 17-1A antigénnel inkubáltunk. A kötődött F ab-ellenanyag-fragmentumokat biotinezett poliklonális, humán kappa-könnyűlánccal szemben irányuló ellenanyag, majd peroxidázkonjugált streptavidin hozzáadásával mutattuk ki. Végül, az ELISA-reakciót ABTS-szubsztrátoldat hozzáadásával hívtuk elő [ABTS=2,2 azino-bisz(3etil-benztiazolin-6-szulfonsav)], és a szubsztrát átalakulását 405 nm hullámhosszon mértük (y tengely). A kiónokat az x tengely mentén jelöltük, az első szám azt jelöli, hogy a klón hányadik dúsítási lépésből származik, a második pedig a klón azonosító száma. Az 1.2-6 kiónok k8-könnyűláncot tartalmaztak egy véletlenszerűen kiválasztott Ig-delta-nehézlánc Fd-szegmenssel kombinálódva, és negatív kontrolokként szolgáltak.

Az 5. ábrán szolubilis Fab-fragmentumok ELISAvizsgálatának eredményeit ábrázoltuk. Szolubilis Fab-fragmentumokat tartalmazó periplazmatikus készítményeket vizsgáltunk, amelyben a fragmentumok mindegyike a D4.5 Fd-szegmenst és egyetlen humán kappa-láncot tartalmazott kiónonként. ELISA-lemezeket egy éjszakán át szolubilis 17-1A antigénnel inkubáltunk. A kötődött Fab-ellenanyag-fragmentumokat biotinezett poliklonális, humán kappakönnyűlánccal szemben irányuló ellenanyag, majd peroxidázkonjugált streptavidin hozzáadásával mutattuk ki. Végül, az ELISA-reakciót ABTS-szubsztrátoldat hozzáadásával hívtuk elő [ABTS=2,2 azino-bisz(3-etil-benztiazolin-6-szulfonsav)], és a szubsztrát átalakulását 405 nm hullámhosszon mértük (y tengely). A kiónokat az x tengely mentén jelöltük; az első szám azt jelöli, hogy a klón hányadik dúsítási lépésből származik, a második pedig a klón azonosító száma; S betűvel azokat a kiónokat jelöltük, amelyeket az első szelekciós kört megelőzően vizsgáltunk. Az S. 1-3 kiónok k8-könnyűláncot tartalmaztak egy véletlenszerűen kiválasztott Ig-delta-nehézlánc Fdszegmenssel kombinálódva, és negatív kontroliokként szolgáltak.

A 6. ábrán a humán kappa-8 könnyűlánc variábilis régiójának DNS- és proteinszekvenciáját mutatjuk be. A számok a nukleotidpozíciókat (nt) jelölik; az aminosavakat azok egybetűs kódjaival adtuk meg. A CDRl-régiót a 70-102., a CDR2-régiót a 148-168., a CDR3-régiót pedig a 265-294. nukleotidpozícióknak megfelelő szegmens képviseli.

HU 221 818 Β1

A 7. ábrán humán D4.5 nehézlánc variábilis régió DNS-szekvenciáját mutatjuk be. A számok a nukleotidpozíciókat (nt) jelölik; az aminosavakat azok egybetűs kódjaival adtuk meg. A CDR1-régiót a 91-105., a CDR2-régiót a 148-198., a CDR3-régiót pedig a 292-351. nukleotidpozícióknak megfelelő szegmens képviseli. A nehézlánc variábilis régió és az Ig-delta konstansrégió CHl-doménja közti határt a 382. és

383. nukleotidok képviselik, a deltakonstansrégió proteinszekvenciája a

384. nukleotidnál kezdődik.

A 8. ábrán humán D7.2 nehézlánc variábilis régió DNS-szekvenciáját mutatjuk be. A számok a nukleotidpozíciókat (nt) jelölik; az aminosavakat azok egybetűs kódjaival adtuk meg. A CDRl-t a 91-105. nukleotidoknak, a CDR2-régiót a 148-198., a CDR3-régiót pedig a 292-309. nukleotidpozícióknak megfelelő régió képviseli. A nehézlánc variábilis régió és az Ig-delta konstansrégió CHl-doménja közti határt a 340. és 341. nukleotidok képviselik, a delta-konstansrégió proteinszekvenciája a 343. nukleotidnál kezdődik.

A 9. ábrán a humán kappa-5.1 könnyűlánc variábilis régió DNS- és proteinszekvenciáját mutatjuk be. A számok a nukleotidpozíciókat (nt) jelölik; az aminosavakat azok egybetűs kódjaival adtuk meg. A CDR1-régiót a 70-102., a CDR2-régiót a 148-168., a CDR3-régiót pedig a 265-294. nukleotidpozícióknak megfelelő szegmens képviseli.

A 10. ábrán Fab-ellenanyag-fragmentumok és M79 kontroll ellenanyag áramlásos citometriás analízisének eredményét ábrázoltuk; a vizsgálatot 17-lA-pozitív Kato-sejteken végeztük, k8-D4.5Fab-ffagmentumot tartalmazó periplazmatikus készítmény kötőaktivitásának tesztelésére. Kato-sejteket: I) semleges periplazmatikus készítménnyel; II) 10 pg/ml kiméra (bivalens!) M79ellenanyaggal; III) k8-D4.5 periplazmatikus extraktummal; és IV) k8-D4.5 periplazmatikus extraktum 1:10 hígításával inkubáltuk. A relatív sejtszámokat az Y tengely, a relatív fluoreszcenciaintenzitást az X tengely mentén vettük fel.

A 11. ábrán Fab-ellenanyag-fragmentumok és teljes ellenanyagok áramlásos citometriás analízisének eredményeit ábrázoltuk; a vizsgálatot 17-lA-pozitív Kato-sejteken, valamint 17-lA-transzfektált és nem transzfektált CHO-sejteken végeztük, a k8-D4.5, k5.1-D4.5 vagy egy semleges k-D4.5 Fab-fragmentumot tartalmazó periplazmatikus készítmények („periplasma preparations”, pp) kötőaktivitásának tesztelésére. Kato-sejteket inkubáltunk: I) semleges periplazmatikus extraktummal (szaggatott vonal) vagy k5.1-D4.5-pp készítménnyel (folyamatos vonal); vagy II) 20 pg/ml, M79ellenanyaggal (folyamatos vonal) vagy a megfelelő egér IgG2a-izotípuskontrollal (szaggatott vonal). 17-1Atranszfektált CHO-sejteket inkubáltunk III) semleges periplazmatikus készítménnyel (szaggatott vonal) vagy k5.1-D4.5-pp készítménnyel (folyamatos vonal); IV) semleges periplazmatikus készítménnyel (szaggatott vonal) vagy k8-D4.5-pp készítménnyel (folyamatos vonal); vagy λ/) 20 pg/ml M79-ellenanyaggal (folyamatos vonal) vagy a megfelelő egér IgG2aizotípuskontrollal (szaggatott vonal). A III., IV. és V. ábrarészleteken ábrázolt kísérletekben a vizsgálat tárgyát képező periplazmatikus készítményekkel (k5.1-D4.5 Fab-pp és k8-D4.5 Fab-pp), valamint az M79 egér ellenanyaggal történő inkubálást és a fragmentumok, illetve ellenanyagok kimutatását nem transzformált CHO-sejtek alkalmazásával is elvégeztük (pontozott vonalak). A relatív sejtszámokat az Y tengely, a relatív fluoreszcenciaintenzitást az X tengely mentén vettük fel.

A 12. ábrán a pEF-AD A-vektor klónozórégióját ábrázoltuk, a fontosabb restrikciós helyek feltüntetésével. Az ábrán a következő rövidítéseket alkalmaztuk: P: promoter; VL: variábilis könnyűláncdomén; CL: konstans könnyűláncdomén; Leuc: eukarióta vezetőszekvencia.

A 13. ábrán a pEFDHFR-vektor klónozórégióját ábrázoltuk, a fontosabb restrikciós helyek feltüntetésével. Az ábrán a következő rövidítéseket alkalmaztuk: P: promoter; VH: variábilis nehézláncdomén; CH1/2/3: 1., 2. és 3. konstans nehézláncdoménok; Leuc: eukarióta vezetőszekvencia.

A 14. ábrán a H79 humán ellenanyag-készítmények SDS-PAGE-analízisének eredményét mutatjuk be. Az egyes ellenanyag-készítmények mintegy 10 pg mennyiségét futtattuk 12,5%-os denaturáló poliakrilamid-gélen reduká10

HU 221 818 Β1 ló és nem redukáló körülmények mellett, majd a géleket Coomassie-blue festékkel megfestettük.

1. sáv: molekulatömeg-marker (MW [kDa];

az egyes csíkok molekulatömegét a gél bal oldalán tüntettük fel);

2. sáv: H79 humán IgGl-változat (nem redukáló);

3. sáv: H79 humán IgGl-változat redukáló körülmények mellett;

4. sáv: H79 egér IgGl-változat (nem redukáló);

5. sáv: H79 egér IgG 1 -változat redukáló körülmények mellett.

A 15. ábrán a H79 és HD70 humán ellenanyagkészítmények SDS-PAGE-analízisének eredményét mutatjuk be. Tíz (10) pg H79- és 3,5 pg HD70-ellenanyagot futtattunk 12,5%-os denaturáló poliakrilamid-gélen nem redukáló (1. gél) és redukáló (2. gél) körülmények mellett, majd a géleket Coomassie-blue festékkel megfestettük.

1- gél:

1. sáv: molekulatömeg-marker (MW [kDa], az egyes csíkok molekulatömegét a gél bal oldalán tüntettük fel);

2. sáv: H79 humán IgGl-változat (nem redukáló);

3. sáv: HD70 humán IgG 1 -változat (nem redukáló);

2. gél:

4. sáv: molekulatömeg-marker (MW [kDa], az egyes csíkok molekulatömegét a gél bal oldalán tüntettük fel);

5. sáv: H79 humán IgGl-változat redukáló körülmények mellett;

6. sáv: HD70 humán IgGl-változat redukáló körülmények mellett.

Aló. ábrán 17-1 A-pozitív Kato-sejtek áramlásos citometriás analízisének eredményeit szemléltetjük; a vizsgálatot tisztított H79 humán IgGl és tisztított H79 egér IgGl kötőaktivitásának tesztelésére végeztük. Kato-sejteket IgGl-izotípuskontrollal (10 pg/ml humán IgGl és egér IgGl), pozitív kontrollokkal (10 pg/ml M79-ellenanyaggal és kiméra M74-ellenanyaggal) (azaz két 17-1Aspecifikus ellenanyaggal); és H79 humán IgGl-ellenanyaggal vagy H79 egér IgGl-ellenanyaggal (10 pg/ml és 1 pg/ml) inkubáltunk. A relatív sejtszámokat az Y tengely, a relatív fluoreszcenciaintenzitást az X tengely mentén vettük fel.

A 17. ábrán ellenanyagok (20-20 pg/ml) áramlásos citometriás analízisének eredményeit szemléltetjük; a vizsgálatot 17-1Apozitív Kato-sejteken, 17-1 A-transzfektált és nem transzfektált CHO-sejteken végeztük, a tisztított H79 humán IgGl, H79 egér IgGl, HD70, D7.2, M79, Panorex és izotípuskontroll (humán IgGl, egér IgGl és IgG2a) ellenanyagok kötőaktivitásának tesztelésére. I: H79 humán IgGl (folyamatos vonal) és humán IgGl-izotípuskontroll (szaggatott vonal) Kato-sejteken tesztelve; II: H79 egér IgGl (folyamatos vonal) és egér IgGl-izotípuskontroll (szaggatott vonal) Kato-sejteken tesztelve; III: HD70 (folyamatos vonal) és humán IgGl-izotípuskontroll (szaggatott vonal) Kato-sejteken tesztelve; IV: D7.2 (folyamatos vonal) és humán IgGl-izotípuskontroll (szaggatott vonal) Katosejteken tesztelve; V: M79-ellenanyag (folyamatos vonal) és egér IgG2aizotípuskontroll (szaggatott vonal) Kato-sejteken tesztelve; VI: Panorex (folyamatos vonal) és egér IgG2aizotípuskontroll (szaggatott vonal) Kato-sejteken tesztelve; VII: H79 humán IgGl (folyamatos vonal) és humán IgGl-izotípuskontroll (szaggatott vonal) 17-1 A-transzfektált CHO-sejteken tesztelve; VIII: H79 egér IgGl (folyamatos vonal) és egér IgGl-izotípuskontroll (szaggatott vonal) 17-1 A-transzfektált CHO-sejteken tesztelve; IX: HD70 (folyamatos vonal) és humán IgGlizotípuskontroll (szaggatott vonal) 17-1 A-transzfektált CHO-sejteken tesztelve; X: D7.2 (folyamatos vonal) és humán IgGl-izotípuskontroll (szaggatott vonal) 17-1 A-transzfektált CHO-sejteken tesztelve; XI: M79 (folyamatos vonal) és egér IgG2a-izotípuskontroll (szaggatott vonal) 17-lA-transzfektált CHO-sejteken tesztelve; XII: Panorex (folyamatos vonal) és egér IgG2aizotípuskontroll (szaggatott vonal) 17-1 A-transzfektált CHO-sejteken tesztelve. A VII-XII. ábrarészleteken olyan kísérletek eredményeit is ábrázoltuk, amelyekben a vizsgálat tárgyát képező ellenanyagokat nem transzformált CHO-sejtekkel inkubáltuk, és azt követően mutattuk ki (pontozott vonal).

A 18. ábrán ⁵¹Cr-felszabadulás mérésen alapuló, ellenanyagfuggő sejtközvetített citotoxicitási vizsgálat eredményeit mutatjuk be. A ⁵¹Cr-felszabadulás meghatározásán alapuló vizsgálathoz nem stimulált, humán perifériás véreredetű mononukleáris sejteket (PBMC-ket; 5 x 10⁵ sejtet) inkubáltunk - effektorsejtekként - jelölt célsejtekkel (2 órán át ⁵¹Cr-mal jelölt Kato-sejtekkel) kü11

HU 221 818 Β1 lönböző ellenanyag-koncentrációk jelenlétében, 4 vagy 20 órán át, 37 °Con. Megfelelő nem kötő izotípusokat (h-IgG=humán IgGl, m-IgG2a=egér IgG2a) alkalmaztunk negatív kontroliokként (H79=H79huIgGl). A specifikus lízis mértékét a következő képlet szerint számítottuk: (adott ellenanyag alkalmazásával végzett kísérletben mért cpm)-(spontán felszabadulás eredményezte cpm)/(maximális felszabaduláskor mérhető cpm)-(spontán felszabadulás eredményezte cpm) (cpm=co«nt per minute, percenkénti beütésszám).

A 19. ábrán M79-ellenanyaggal (pozitív kontroll) megfestett egészséges humán vastagbélszövet fénymikroszkópos képének fényképe látható. Normális nyálkahártyaszövetből készített 5 nm vastag kriometszeteket az M79 egér ellenanyaggal (IgG2a) inkubáltunk (az ellenanyagot 10 pg/ml koncentrációban alkalmazva) pozitív kontrollként. A kötődött egér ellenanyag kimutatását peroxidázzal konjugált poliklonális, egér immunglobulinnal szemben irányuló ellenanyag hozzáadásával, és karbazollal történő festéssel végeztük (barna). A hátteret hemalaunnal festettük (kék). A fekete-fehér ábrákon a barna színnek a sötétszürke (de nem fekete), a kéknek a közepesen világosszürke felel meg, amely elüt az egészen világosszürke, egybemosódó háttértől.

A 20. ábrán H79 jelzésű egér IgGl-ellenanyaggal megfestett egészséges humán vastagbélszövet fénymikroszkópos képének fényképe látható. Normális nyálkahártyaszövetből készített 5 nm vastag kriometszeteket a H79-ellenanyag egér IgG-változatával inkubáltuk (az ellenanyagot 10 pg/ml koncentrációban alkalmazva). A kötődött egér IgGl-ellenanyagok kimutatását peroxidázzal konjugált poliklonális, egér immunglobulinnal szemben irányuló ellenanyag hozzáadásával, és karbazollal történő festéssel végeztük (barna). A hátteret hemalaunnal festettük (kék).

A 21. ábrán M79 (pozitív kontroll) ellenanyaggal megfestett humán vastagbél-karcinóma fénymikroszkópos képének fényképe látható. Vastagbél-karcinómából készített 5 nm vastag kriometszeteket pozitív kontrollként M79 egér ellenanyaggal (IgG2a) inkubáltunk (az ellenanyagot 10 pg/ml koncentrációban alkalmazva). A kötődött egér ellenanyagok kimutatását peroxidázzal konjugált poliklonális, egér immunglobulinnal szemben irányuló ellenanyag hozzáadásával, és karbazollal történő festéssel végeztük (barna). A hátteret hemalaunnal festettük meg (kék).

A 22. ábrán H79 egér IgGl-ellenanyaggal megfestett vastagbél-karcinóma fénymikroszkópos képének fényképe látható. Vastagbél-karcinómából készített 5 nm vastag kriometszeteket a H79ellenanyag egér IgGl-változatával inkubáltuk (az ellenanyagot 10 pg/ml koncentrációban alkalmazva). A kötődött egér IgGl-ellenanyagok kimutatását peroxidázzal konjugált poliklonális, egér immunglobulinnal szemben irányuló ellenanyag hozzáadásával, és karbazollal történő festéssel végeztük (barna). A hátteret hemalaunnal festettük meg (kék).

A 23. ábrán egér IgG2a-izotípuskontrollal megfestett egészséges humán vastagbélszövet fénymikroszkópos képének fényképe látható. Normális nyálkahártyaszövetből készített 5 nm vastag kriometszeteket negatív kontrollként semleges egér IgG2a-ellenanyaggal inkubáltunk (az ellenanyagot 10 pg/ml koncentrációban alkalmazva). A kötődött egér IgGl-ellenanyagok kimutatását peroxidázzal konjugált poliklonális, egér immunglobulinnal szemben irányuló ellenanyag hozzáadásával, és karbazollal történő festéssel végeztük (barna). A hátteret hemalaunnal festettük (kék).

A 24. ábrán IgGl-izotípuskontrollal megfestett egészséges humán vastagbélszövet fénymikroszkópos képének fényképe látható. Normális nyálkahártyaszövetből készített 5 nm vastag kriometszeteket negatív kontrollként semleges egér IgGl-ellenanyaggal inkubáltunk (az ellenanyagot 10 pg/ml koncentrációban alkalmazva). A kötődött egér IgGl-ellenanyagok kimutatását peroxidázzal konjugált poliklonális, egér immunglobulinnal szemben irányuló ellenanyag hozzáadásával, és karbazollal történő festéssel végeztük (barna). A hátteret hemalaunnal festettük meg (kék).

A 25. ábrán egér IgG2a-izotípuskontrollal megfestett humán vastagbélkarcinóma-szövet fénymikroszkópos képének fényképe látható. Normális nyálkahártyaszövetből készített 5 nm vastag kriometszeteket negatív kontrollként semleges,

HU 221 818 Β1 egéreredetű IgG2a-ellenanyaggal inkubáltunk (az ellenanyagot 10 pg/ml koncentrációban alkalmazva). A kötődött egéreredetű ellenanyagok kimutatását peroxidázzal konjugált poliklonális, egér immunglobulinnal szemben irányuló ellenanyag hozzáadásával, és karbazollal történő festéssel végeztük (barna). A hátteret hemalaunnal festettük (kék).

A 26. ábrán IgGl-izotípuskontrollal megfestett humán vastagbélkarcinóma-szövet fénymikroszkópos képének fényképe látható. Normális nyálkahártyaszövetből készített 5 nm vastag kriometszeteket negatív kontrollként semleges, egéreredetű IgGl-ellenanyaggal inkubáltunk (az ellenanyagot 10 pg/ml koncentrációban alkalmazva). A kötődött egéreredetű ellenanyagok kimutatását peroxidázzal konjugált poliklonális, egér immunglobulinnal szemben irányuló ellenanyag hozzáadásával, és karbazollal történő festéssel végeztük (barna). A hátteret hemalaunnal festettük meg (kék).

A 27. ábrán a humán 17-1A antigénre specifikus M79 egér ellenanyag és ugyancsak az említett antigénre specifikus H79 humán ellenanyag epitópanalízisének eredményeit mutatjuk be. Ellenanyagokat négyzetes elrendezésben membránra felvitt peptidekkel, közelebbről 119, egyenként 13 tagú, egymáshoz képest két aminosavval eltolt, összességükben a humán 17-1A antigén teljes extracelluláris aminosavszekvenciáját átfedő polipeptiddel inkubáltunk. A peptideket C-terminális végükön, kovalens módon Pép Spots membránhoz (Jerini Biotools, Berlin) kötöttük úgy, hogy azok különálló foltokat képezzenek. A kötődött egér M79-ellenanyagokat direkt eljárással mutattuk ki a Pép Spots membránon úgy, hogy a membránt tormaperoxidázzal (horse radish peroxidase, HPR) konjugált, egér immunglobulin elleni ellenanyaggal érintkeztettük, majd a kötődött ellenanyagokat kemolumineszcens eljárással mutattuk ki. Az egyes foltok esetében megfigyelhető, csak a másodlagos ellenanyag reaktivitásának köszönhető jeleket a Pép Spots membrán kontrollfestésével tettük láthatóvá. Az elsősorban a 87. peptid esetében megfigyelhető háttérfestődést figyelmen kívül hagyva, a 38. és 95. peptidfoltok az M79 egér ellenanyaghoz specifikus módon kötődő foltokat képviseltek.

Mivel a HRP-konjugált, humán immunglobulin elleni másodlagos ellenanyag néhány peptidfolt esetében jelentős mértékű keresztreaktivitást mutatott, a kötődött H79 és HD70 humán ellenanyagok tesztelésére azokat a Pép Spots membránról elektrotranszfereljárással blottmembránra vittük át, majd a fent említett humán immunglobulin elleni másodlagos ellenanyaggal és kemolumineszcenciával mutattuk ki. A H79 jelzésű humán ellenanyag specifikus kötődését elsősorban a 8., 11., 13., 14., 59-60., 77. és 79. foltok esetében észleltük; a HD70-ellenanyag esetében azonban kötődés nem volt kimutatható.

A találmány szerinti megoldást az alábbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni.

1. példa

A kombinatorikus ellenanyagkönyvtárak előállítása és fágprezentáció

Humán immunglobulin- (lg-) könnyűlánc könyvtárat és Ig-nehézlánc Fd-DNS-fragmentum könyvtárat RT-PCR-eljárással állítottunk elő kappa-, lamda- és Fd-delta-specifikus láncindító oligonukleotidkombinációk alkalmazásával, négy humán donortól származó, perifériás véreredetű limfocitákból („peripherial blood lymphocytes ”, PBL) és tíz humán donor csontvelőmintáiból izolált teljes RNS alapján, Chomczynski eljárása szerint [Analytical Biochemistry 162, 156 (1987)]. cDNS-t ismert eljárások szerint szintetizáltunk [Sambrook: Cold Spring Harbor Laboratory Press, második kiadás (1989)].

A következő, a nehézláncfragmentumok esetében 5’-végi Xhol és 3’-végi Spel, a könnyűláncok esetében 5’-végi SacI és 3’-végi Xbal felismerőhelyeket eredményező láncindító oligonukleotidkombinációkat választottuk.

A delta-Fd cDNS-ffagmentumok PCR-amplifikációjához öt különböző 5’-VH-család-specifikus láncindítót kombináltunk egy 3’-CHl-delta láncindítóval; a kappa (K) könnyűlánc-fragmentumok PCR-amplifikációjához öt különböző 5’-VK-család-specifikus láncindítót kombináltunk egy 3’-CK láncindítóval, és a lambda (L) könnyűlánc-fragmentumok PCR-amplifikációjához nyolc különböző 5’-VL-család-specifikus láncindítót kombináltunk egy 3’-CL láncindítóval.

Az Fab-DNS-ffagmentumok amplifikációjára alkalmazott láncindító oligonukleotidkombinációkat az alábbi, 1. táblázatban mutatjuk be (5’-3’ irányban).

Az amplifikációs reakciót a következő PCR-program szerint végeztük:

Negyven 40 cikluson át, denaturáció 94 °C-on 15 másodpercig; láncindító hibridizáltatás 52 °C-on 50 másodpercig; és láncnövelés 72 °C-on 90 másodpercig; majd egy utolsó láncnövelés 72 °C-on, 10 percig.

HU 221 818 Β1

1. táblázat

A PCR-reakcióban az alábbi láncindító oligonukleotidkombinációkat alkalmaztuk

Nehézlánc Fd-fragmentum:

5’-végi láncindító oligonukleotidok:

VH1,3,5,7: AGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGG; VH2: CAG(AG) TCACCTTGCTCGAGTCTGG; VH4: CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGG;

VH4B: CAGGTGCAGCTACTCGAGTGGGG;

VH6: CAGGTACAGCTGCTCGAGTCAGG.

3’-végi láncindító oligonukleotid:

CDI: TGCCTTACTAGTCTCTGGCCAGCGGAAGAT.

Kappa-lánc-fragmentum:

5’-végi láncindító oligonukleotidok:

VK1: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCC;

VK3: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTG(AT)TGAC(AG)CAGTCTCC;

VK2/4: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGATGAC(CT)CAGTCTCC;

VK5: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCACACTCACGCAGTCTCC;

VK6: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGCTGACTCAGTCTCC.

3’-végi láncindító oligonukleotid:

CK1D:GCGCCGTCTAGAATTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAAC TCAG;

Lambda- lánc-fragmentum;

5’-végi láncindító oligonukleotidok:

VL1: AATTTTGAGCTCACTCAGCCCCAC;

VL2: TCTGCCGAGCTCCAGCCTGCCTCCGTG; VL3: TCTGTGGAGCTCCAGCCGCCCTCAGTG; VL4: TCTGAAGAGCTCCAGGACCCTGTTGTGTCTGTG;

VL5: CAGTCTGAGCTCACGCAGCCGCCC;

VL6: CAGACTGAGCTCACTCAGGAGCCC;

VL7: CAGGTTGAGCTCACTCAACCGCCC;

VL8: CAGGCTGAGCTCACTCAGCCGTCTTCC. 3’-végi láncindító oligonukleotid :

CL2: CGCCGTCTAGAATTATGAACATTCTGTAGG.

450 ng kappa-könnyűlánc-fragmentumot ligáltunk (SacI- és Xbal-emésztést követően) 1400 ng pComb3Hfagemiddel (amelyet előzőleg SacI- és Xbal-enzimekkel emésztettünk; nagy DNS-fragmentum), amely utóbbi pComb3-fagemidből [Barbas: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88, 7978 (1991)] származott, amelyben a nehézláncpozíciót már a 17-lA-protein extracelluláris része ellen irányuló M79 jelzésű kiméra egér ellenanyag Fd-fragmentuma (humán IgGl CHl-régiót tartalmazó fragmentum) foglalta el (a pComb3H klónozó helyeit lásd az 1. ábrán).

A fentiek szerint kapott kombinatorikus ellenanyag

DNS-könyvtárat elektroporációs eljárással (2,5 kV, 0,2 cm réstávolságú küvetta; 25 FD, 200 Ohm; Biorad gene-pulser) 300 μΐ, elektrokompetens E. coli XL1Blue-szuszpenzió sejtjeibe juttattuk; a fenti módon eljárva 4χ 10⁷ független kiónt tartalmazó génkönyvtárat nyertünk. Egyórás expresszáltatást követően pozitív transzformánsokat szelektáltunk a pComb-vektor által kódolt karbenicillinrezisztencia alapján. A fenti adaptációt követően, ezeket a kiónokat 1 χ 10¹² VCSM13 segítő fágrészecskével fertőztük, miáltal olyan filamentózus M13-fágok termelődését és szekretálódását értük el, amelyek mindegyike egyetlen humán könnyűláncot és a kiméra M79-ellenanyag Fd-szegmensét magában foglaló egyszálú pComb3H-DNS-t tartalmazott, és amelyek a megfelelő Fab-fragmentumokat a fágfelszínen jelenítették meg (prezentálták) III. fágburokprotein fertőzést nem közvetítő részével transzlációsán fuzionáltatva (fágprezentáció); (lásd 2. ábra).

Ezt, a klónozott Fab-repertoárt hordozó fággénkönyvtárat a tenyészet felülúszójából PEG8000/NaClprecipitációval és centrifugálással kinyertük, 1% BSAjj tartalmazó TBS-pufferben szuszpendáltuk, és 96 lyukú ELISA-lemezeken immobilizált rekombináns sl7-lA antigénnel inkubáltuk. S17-1A antigént a szakirodalomban ismertetettek szerint állítottunk elő [Mack: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92, 7021 (1995)]. A célantigénhez specifikus módon nem kötődött Fab-fágokat 0,5% Tweent tartalmazó TBS-pufferrel, tizet elérő számú mosási lépés alkalmazásával távolítottuk el. A kötődő Fab-fágokat HCl-Glicin-pufferrel (pH=2,2) eluáltuk, majd az eluátum 2 mol/1 Tris-pufferrel (pH=12) történő neutralizálását követően, azzal új, még nem fertőzött E. coli XLl-Blue-tenyészetet fertőztünk. Antigénkötő Fab-fragmentumokat kódoló pComb-fagemidkópiákkal sikeresen transzdukált sejteket karbenicillinrezisztencia alapján szelektáltunk, VCSM13 segítő fággal fertőztünk, majd megkezdtük az ellenanyag-prezentáltatás és in vitro szelekció második szakaszát.

Miután az antigénkötő Fab-fágok termeltetését és szelekcióját ötször megismételtük, a szelektált Fab-repertoárt tartalmazó plazmid-DNS-eket izoláltuk.

Szolubilis Fab-proteineket úgy nyertünk, hogy a gén-III DNS-fragmentumot a plazmidokból kivágtuk, ezáltal az Fd-nehézlánc-szegmens és a gén-III-protein közti transzlációs fúziót megszüntettük. Miután a plazmid-DNS-eket újból ligáltuk, ezzel a plazmid-DNS készlettel 100 μΐ, hősokk-kezeléssel kompetenssé tett E. coli XLl-Blue-tenyészetet transzformáltunk, és a sejteket karbenicillinnel (Carb) kiegészített LB-agarlemezekre oltottuk ki. Különálló telepeket oltottunk át 1010 ml, 20 mmol/1 MgCl₂-ot tartalmazó LB-Carbtápközegbe, és hat óra elteltével Fab-expressziót indukáltunk 1 mmol/1 izopropil-p-D-tiogalaktozid (IPTG) hozzáadásával. Az in vitro szelekciót és a szolubilis Fab-fragmentumok expresszáltatását Burton eljárása szerint végeztük [Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88, 10 134 (1991)]. A sejteket 20 óra múlva összegyűjtöttük; periplazmatikus extraktumot készítettünk úgy, hogy a készítmény fagyasztását (etanol/szárazjég ágyon) és olvasztását (37 °C-on) négyszer ismételtük, majd azt ELISA-eljárással teszteltük S17-1A antigénhez kötődő Fab-fragmentumok jelenlétére. Huszonhét klónból 23 mutatott kötőaktivitást. Szekvenálást követően, a legerősebb jelet adó két klónról (lásd 3. ábra) megállapí14

HU 221 818 Β1 tottuk, hogy azok azonos kappa-láncokat tartalmaznak, és ezt a láncot k8-láncnak neveztük; (lásd 6. ábra).

Ezután, ezt a humán k8-kappa-láncot alkalmaztuk a humán Ig-delta-nehézlánc-készlet kötőpartnereként; 2250 ng humán delta-nehézlánc Fd-DNS-fragmentamot ligáltunk (Xhol- és Spel-emésztést követően) 7000 ng, a könnyűláncpozícióban a k8-DNS-fragmentumot tartalmazó pComb3H-fagemidvektorral (amelyet előzőleg Xhol- és Spel-enzimekkel emésztettünk; nagy DNS-fragmentum).

A k8-könnyűlánccal történő kombináltatást követően, a 17-1A antigénhez specifikus módon kötődő nehézlánc variábilis régiók klónozására legelőnyösebbnek tűnt a humán delta-lánc-repertoár alkalmazása. Deltaláncok csak érett, naiv, valamint saját antigénre specifikus anergiás B-sejtekben termelődnek, amelyek még nem mentek át proliferáción, vagy egyáltalán nem fognak proliferálódni; ezért, azok nehézlánc-repertoáijának diverzitása nagyobb fokú, mint más immunglobulin-izotípusok repertoárjáé, és azokban az egyes specifitások száma kisebb, mint egyéb immunglobulinizotípusok repertoárjában.

A pComb-vektorba klónozott k8-delta-Fd-fragmentum könyvtárat öt részletben, elektroporációs eljárással (2,5 kV, 0,2 cm réstávolságú küvetta; 25 FD, 200 Ohm), összesen 1500 μΐ térfogatú E. coli XL1Blue-tenyészet sejtjeibe juttattuk, miáltal 1,1 χ 10⁹ független kiónt kaptunk.

A fenti kombinatorikus ellenanyagkönyvtár in vitro szelekcióját a humán könnyűlánc-repertoár esetében ismertetettek szerint végeztük. Négyszeri dúsítást követően, szolubilis Fab-ftagmentumokat állítottunk elő nyolc klónból.

A periplazmatikus készítményeket ELISA-eljárással teszteltük. A kiónok egyikénél erős antigénkötő aktivitást tapasztaltunk (lásd 4. ábra). Ezt a kiónt D4.5klónnak neveztük, és az Fd-delta-fragmentumnak megfelelő DNS-t reverz delta-CHl-specifikus láncindító oligonukleotid alkalmazásával szekvenáltuk (lásd

7. ábra).

További dúsításokat követően, még egy sl7-lAkötő Fab-fragmentumot izoláltunk; az ennek megfelelő klón jelenlétét először a hetedik dúsítási lépésnél észleltük, és az az ELISA-tesztben lényegesen gyengébb jelet eredményezett, mint a D4.5-klón (lásd 4. ábra). Ezt a kiónt D7.2-klónnak neveztük, és annak DNS-szekvenciáját ismét csak a delta-specifikus láncinditó alkalmazásával határoztuk meg (lásd 8. ábra).

További könnyűláncpartnerek izolálására, amelyek a D4.5-klón delta-nehézlánc Fd-fragmentumával kombinálódva 17-lA-specifikus Fab-fragmentumokat eredményeznek, olyan kísérletet végeztünk („reshuffling experiment”), amelynek során újabb, véletlenszerű kombinációkat hoztunk létre.

Négyszázötven (450) ng humán kappa-könnyűláncfragmentumot és 450 ng humán lambda-könnyűláncfragmentumot (mindkettőt SacI- és Xbal-enzimekkel történő emésztést követően) 1400 ng olyan pComb3Hfagemiddel ligáltunk (szintén SacI- és Xbal-enzimekkel történő emésztést követően; nagy DNS-fragmentum), amelyben a nehézláncpozíciót már a D4.5-Fdfragmentum foglalta el.

Az ily módon kapott kombinatorikus ellenanyagkönyvtárakat (kappa és lamda) elektroporációs eljárással (2,5 kV, 0,2 cm réstávolságú küvetta; 25 FD, 200 Ohm; Biorad gene-pulser) 300 μΐ térfogatú elektrokomponens Escherichia coli XLl-Blue-tenyészet sejtjeibe (az XLl-Blue-sejtek beszerezhetők a Stratagene cégtől) juttattuk; a fenti módon eljárva a kappakönyvtár esetében 0,5 χ 10⁷, a lambda-könyvtár esetében pedig 1,4 xlO⁷ független kiónt tartalmazó génkönyvtárat nyertünk. Miután egy órát hagytunk a fenotípus kifejeződésére, pozitív transzformánsokat szelektáltunk a pComb-vektor által kódolt karbenicillinrezisztencia alapján. A fenti adaptációt követően, ezeket a kiónokat lxlO¹² VCSM13 segítő fágrészecskével fertőztük, miáltal olyan filamentózus M13-fágok termelődését és szekretálódását értük el, amelyek mindegyike egyetlen humán könnyűláncot és a D4.5-klón nehézlánc Fd-szegmensét magában foglaló egyszálú pComb3H-DNS-t tartalmazott, és amelyek a megfelelő Fab-fragmentumokat a fágfelszínen jelenítették meg (prezentálták) III. fágburokprotein-fertőzést nem közvetítő részével transzlációsán fuzionáltatva.

A klónozott Fab-repertoárokat (kappa és lambda) hordozó fággénkönyvtárakat PEG8000/NaCl-precipitációval és centrifugálással a tenyészetek felülúszójából kinyertük, 1% BSA-t tartalmazó TBS-pufferben szuszpendáltuk, és 96 lyukú ELISA-lemezeken immobilizált rekombináns S17-1A antigénnel inkubáltuk. A célantigénhez specifikus módon nem kötődött Fab-fágokat 0,5% Tween-detergenst tartalmazó TBS-pufferrel, tizet elérő számú mosási lépés alkalmazásával távolítottak el. Mindkét génkönyvtárból (kappa és lambda) származó kötődő fágokat HCl-Glicin-pufferrel (pH=2,2) eluáltuk, majd az eluátum 2 mol/1 Tris-pufferrel (pH=12) történő neutralizálását követően, azzal új, még nem fertőzött E. coli XLl-Blue-tenyészetet fertőztünk. Antigénkötő Fab-fragmentumokat kódoló pComb-fagemidkópiákkal sikeresen transzdukált sejteket karbenicillinrezisztencia alapján szelektáltunk, VCSM13 segítő fággal fertőztünk, majd megkezdtük az ellenanyag-prezentáltatás és in vitro szelekció második szakaszát.

Miután az antigénkötő Fab-fágok termeltetését és szelekcióját magában foglaló eljárást ötször ismételtük, az egyes dúsítási lépéseket követően a szelektált Fab-repertoárt tartalmazó plazmid-DNS-eket izoláltunk.

Szolubilis Fab-proteineket úgy nyertünk, hogy a gén-III DNS-fragmentumot a plazmidokból kivágtuk, ezáltal az Fd-nehézlánc-szegmens és a gén-III-protein közti transzlációs fúziót megszüntettük. Miután a plazmid-DNS-eket újból ligáltuk, ezzel a plazmid-DNS készlettel 100 μΐ, hősokk-kezeléssel kompetenssé tett E. coli XLl-Blue-tenyészetet transzformáltunk, és a sejteket karbenicillinnel (Carb) kiegészített LB-agarlemezekre oltottuk ki. Különálló telepeket oltottunk át 1010 ml, 20 mmol/1 MgCl₂-ot tartalmazó LB-Carbtápközegbe, és hat óra elteltével Fab-expressziót indukáltunk 1 mmol/1 izopropil-P-D-tiogalaktozid (IPTG)

HU 221 818 Β1 hozzáadásával. A sejteket 20 óra múlva összegyűjtöttük; a készítmény ismételt fagyasztásával és olvasztásával periplazmatikus extraktumot készítettünk, majd azt ELISA-eljárással teszteltük sl7- 1A antigénhez kötődő Fab-ff agmentumok jelenlétére.

Összesen, 45 kappa- és 45 lambda-génkönyvtáreredetű - elsősorban az ötödik, de kisebb mértékben más dúsítási lépésekből is származó - kiónt teszteltünk a 17-1A antigénhez történő kötődésre. Csak egyetlen, az ötödik dúsítási lépést követően észlelt klón - a k5.1klón (kappa-génkönyvtárból származó klón) - esetében tapasztaltunk kötőaktivitást (lásd 5. ábra). A k5.1klón kappa-V-régiójának DNS-szekvenciáját meghatároztuk (lásd 9. ábra).

2. példa

Bakteriális expresszió E. coli XLl-Blue-sejtekben

Amint azt az 1. példában említettük, egy könnyűláncot és egy nehézlánc Fd-szegmenst tartalmazó pComb3H-vektorral transzformált E. coli XLl-Bluesejtek a gén-III-fragmentum kihasítását és IPTG-reagenssel történő indukciót követően megfelelő mennyiségű szolubilis Fab-fragmentumot termelnek. A nehézlánc Fd-ffagmentum és a könnyűlánc a periplazmatikus térbe jut, ahol azok funkcionális Fab-ffagmentumokká épülnek össze.

Ahhoz, hogy megfelelőbb periplazmatikus készítményeket kapjunk, a sejteket 20 mmol/1 MgCl₂-dal kiegészített SB-tápközegben tenyésztettük, és ülepítést követően PBS-ben szuszpendáltuk. Miután azokat -70 °C-on négyszer fagyasztottuk, és a fagyasztásokat követően 37 °C-on olvasztottuk, a baktériumok külső membránját hősokk-kezeléssel roncsoltuk, ezáltal a szolubilis periplazmatikus proteinek, köztük az Fab-fragmentumok felülúszóba történő kiszabadulását idéztük elő. Miután az ép sejteket és sejttörmelékeket centrifúgálással eltávolítottuk, az Fab-ellenanyag-fragmentumokat tartalmazó felülúszót összegyűjtöttük, és azt további vizsgálatokban alkalmaztuk.

Először, a k8-D4.5-Fab- és k5.1-D4.5-Fab-ffagmentumokat tartalmazó periplazmatikus készítményeket immobilizált S17-1A antigénhez történő kötődésre teszteltük; mindkét készítmény esetében erős kötődést tapasztaltunk (lásd 1. példa).

Immobilizált sl7-lA antigénhez kötődött k8-D4.5-Fab- és k5.1-D4.5-Fab-ffagmentumok kimutatását poliklonális, biotinezett, humán kappa-könnyűlánccal szemben irányuló ellenanyag (1 pg/ml, PBSben) alkalmazásával, majd tormaperoxidáz-konjugált Avidine (1 pg/ml, PBS-ben) hozzáadásával végeztük. A jelet 2,2 azino-bisz(3-etil-benztiazolin-6-szulfonsav) reagenst és Na-perborátot tartalmazó szubsztrátoldat hozzáadásával hívtuk elő, és a szubsztrát átalakulását 405 nm hullámhosszon mértük.

A két 17-lA-pozitív humán Fab-fragmentum (k8-D4.5-Fab és k5.1-D4.5-Fab) kötődését Kato-sejtekhez (egy 17-1A antigént expresszáló gyomorkarcinóma-sejtvonalhoz), 17-lA-transzfektált CHO-sejtekhez (CHO/17-1A) és nem transzfektált CHO-sejtekhez szintén a periplazmatikus készítmények alkalmazásával teszteltük. Transzfektált CHO-sejtvonalakat úgy állítottunk elő, hogy a 17-1A antigén, más néven GA733-2 [Szala: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87, 3542 (1990)] teljes aminosavszekvenciáját kódoló DNS-fragmentumot a pEF-DHFR eukarióta expressziós vektorba [Mack: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92, 7021 (1995)] szubklónoztuk, ismert eljárások szerint [Sambrook: „Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbour, NY (1989)]. A kapott plazmidot Ndel-enzimmel linearizáltuk, és DHFR-deficiens CHO-sejtekbe transzfektáltuk, ahol azok stabil módon expresszálódtak. A transzmembrán 17-1A antigén expresszióját lépcsőzetes génamplifíkációval fokoztuk, amelyet növekvő koncentrációjú DHFR-inhibitor, Methotrexat (MTX) hozzáadásával váltottunk ki úgy, hogy a kísérlet végén 500 mol/1 DHFR-koncentrációt, a megelőző lépésekben pedig 20 mol/1, és 100 mol/1 DHFR-koncentrációkat alkalmaztunk [Kaufmann: Methods Enzymol. 185, 537 (1990)].

Kétszázezer (200 000) sejtet (Kató-, CHO/17-1Avagy CHO-sejtet) inkubáltunk a kötő vagy nem kötő Fab-fragmentumokat tartalmazó periplazmatikus készítmények egyikével, majd biotinezett, poliklonális, humán kappa-könnyűlánccal szemben irányuló ellenanyag (20 pg/ml, PBS-ben) és FITC-konjugált Streptavidine jelenlétében. Jelölt sejteket áramlásos citometriával analizáltunk.

A k8-D4.5-Fab- és k5.1-D4.5-Fab-fragmentumokat tartalmazó periplazmatikus készítmények jól kivehető jeleket eredményeztek a nem kötő (semleges) periplazmatikus készítményekhez (negatív kontrollokhoz) képest, de nem észleltünk festődést a nem transzfektált CHO-sejteken, ami arra utal, hogy a fragmentumok 17-1A antigénre specifikusak. Az M79 jelzésű anti-17-ΙΑ ellenanyagot [Göttlinger: Int. J. Cancer 38, 47 (1986)] alkalmaztuk pozitív kontrollként a 17-1A antigént expresszáló sejtek pozitivitásának igazolására, és egy egéreredetű IgG2a-ellenanyagot alkalmaztunk izotípuskontrollként (lásd 10. és 11. ábrák).

3. példa

Eukarióta expresszió CHO-sejtekben

Baktériumok általában nem képesek teljes funkcionális immunglobulinok termelésére, bár funkcionális Fab-fragmentumokat expresszálnak.

Ahhoz, hogy teljes funkcionális immunglobulinokat állíthassunk elő, emlőssejteket kellett alkalmaznunk, ezért, a k8-könnyűláncot és a D4.5-klón nehézlánc variábilis doménját emlős expressziós vektorokba szubklónoztuk.

a) Könnyűláncok (k8 és k5.1): Megfelelő terminális restrikciós helyeket úgy hoztunk létre, hogy a k8 és k5.1 jelzésű DNS-fragmentumokat PCR-eljárással módosított formában amplifikáltuk, miáltal olyan kappafragmentumokat kaptunk, amelyek 5’-végükön Bsu361-helyet, 3’-végükön Sáli- és Notl-helyeket tartalmaztak. Ezeket a fragmentumokat Bsu361- és Notlenzimekkel emésztett BSPOLL-plazmidba szubklónoztuk, ezáltal a fragmentumhoz emlőseredetű vezetőszekvenciát adtunk hozzá; és a kapott fragmentumokat szek16

HU 221 818 Β1 venáltuk, hogy a PCR-eljárással esetleg létrehozott mutációk előfordulását kivédjük.

EcoRI- és Sall-enzimek alkalmazásával a k8- és k5.1-fragmentumokat a BSPOLL-plazmidból kivágtuk, és a pEF-ADA eukarióta expressziós vektorba (lásd

12. ábra) szubklónoztuk, amely utóbbit a pEF-DHFR expressziós vektorból [Mack: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92, 7021 (1995)] származtattunk úgy, hogy abban az egér dihidrofolát-reduktáz (DHFR) enzimet kódoló cDNS-t egér adenozin-dezamináz (ADA) enzimet kódoló cDNS-sel helyettesítettük.

Mindegyik könnyűlánc (k8 és k5.1) esetében 10⁷CHO-sejtet transzfektáltunk 100 pg linearizált plazmidDNS-sel, majd a sejteket az expressziós vektor által kódolt adenozin-dezamináz (ADA) aktivitásra szelektáló körülmények mellett tenyésztettük. Túlélő ADA-pozitív sejteket tenyésztettünk, hogy azokat újból transzfektáljuk, ezúttal a D4.5- vagy D7.2-klón-eredetű variábilis domént hordozó nehézláncokat kódoló DNS-sel.

b) Nehézlánc D4.5 variábilis dómén: a D4.5-klóneredetű delta-Fd-fragmentumból a variábilis régiót PCR-eljárással módosított formában amplifikáltuk, miáltal olyan fragmentumokat kaptunk, amelyek mindkét végükön Bsu361 restrikciós felismerőhelyet hordoztak. A kapott V-D4.5 DNS-fragmentumokat a fenti restrikciós helyek alkalmazásával a pEF-DHFR eukarióta expressziós vektorba szubklónoztuk, amely már eukarióta vezetőszekvenciát és humán IgGl-nehézlánc konstansrégiót kódoló DNS-fragmentumot tartalmazott (lásd 13. ábra). A fenti módon eljárva, a D4.5 nehézlánc variábilis régiót a vezetőszekvencia és a nehézlánc-konstansrégió közé inszertáltuk. A variábilis régiót szekvenáltuk, és a teljes kiónt H79V-D4.5 hu IgGl-kiónnak neveztük.

A későbbi szövetfestési kísérletekhez, a humán IgGl-nehézlánc konstansrégiót az egér IgGl-nehézlánc konstansrégióval helyettesítettük, Xbal-klónozó hely alkalmazásával. Az így kapott plazmidot H79V-D4.5 M IgGl-plazmidnak neveztük.

A D4.5-nehézlánc humán és egér IgGl-változatával 10⁷, a k8-könnyűláncot már expresszáló CHO-sejtet transzfektáltunk. Ezenfelül, a humán IgGl-változattal a k5.1-könnyűláncot expresszáló CHO-sejteket is transzfektáltunk. A nehézlánc-transzfekciós kísérletekhez 100100 pg linearizált plazmid-DNS-t alkalmaztunk.

A D7.2-klón-eredetű nehézlánc Fd-fragmentum variábilis régióját pEF-DHFR-vektorba is szubklónoztuk, miáltal a VD4.5-fragmentumok esetében ismertetettekhez hasonló módon, humán IgGl-nehézláncot expresszáló plazmidot kaptunk. Ezzel az expressziós plazmiddal a k8-könnyűláncot már expresszáló CHOsejteket transzfektáltunk, a H79V-D4.5 hu IgGl-plazmiddal kapcsolatban már leírtak szerint.

A transzfektált sejteket ADA- és DHFR-aktivitásra szelektáltuk, a szakirodalomban ismertetettek szerint eljárva [Kaufman: Methods in Enzymol. 185, 537 (1990)].

A kapott sejtvonalakat H79-huIgGl(VD4.5huIgGl-k8), H79-MIgGl- (VD4.5MIgGl-k8), D7.2- (VD7.2huIgGl-k8) és HD70(VD4.5huIgGl-k5.1) vonalaknak neveztük.

Négy különböző, a négy anti-17-ΙΑ ellenanyag egyikét termelő, háromnapos, 30 ml térfogatú egyrétegű sejttenyészet (H79-huIgGl, H79-MIgGl D7.2 és HD70) felülúszóját ELISA-eljárással teszteltük immobilizált sl7-lA antigénhez történő kötődésre. A D7.2tenyészettől eltérően, amely gyenge ELISA-jelet adott, a három másik ellenanyag erős jelet eredményezett, amely az M79 egér ellenanyag kötőaffinitásának megfelelő nagyságrendbe esett.

Ellenanyagok nagy mennyiségben történő előállítását görgő palackokban végeztük, 500 ml tápközeg alkalmazásával.

A H79-huIgGl-, D7.2- és HD70-ellenanyagokatprotein-A affinitásos oszlopon tisztítottuk. A H79-MIgGlellenanyagot antiegér-IgG affinitásos kromatográfiával tisztítottuk.

A rekombináns ellenanyagok tisztaságát SDS-PAGE-eljárással ellenőriztük, és azok molekulatömegét a fenti eljárással határoztuk meg, redukáló és nem-körülmények mellett (14. és 15. ábrák).

A proteintisztítást és SDS-PAGE-eljárást ismert módszerek szerint végeztük.

4. példa

A H79- és HD70-ellenanyagokfunkcionális analízise

IV. 1. Tesztelés immobilizált antigénen

Humán és egéreredetű IgGl-változatot expresszáló transzfektánsok 30 ml térfogatú egyrétegű sejttenyészetének felülúszóját, valamint a megfelelő tisztított ellenanyagokat ELISA-eljárással teszteltük immobilizált sl7-lA antigénhez történő kötődésre, és az eredményeket egér M79 anti-17-ΙΑ ellenanyagok vizsgálatának eredményeivel hasonlítottuk össze.

A kimutatást a 2. példában ismertetettek szerint végeztük.

A H79-ellenanyagok (hulgGI- és MIgGI-változatok) és a HD70-ellenanyag igen hasonló kötőaffinitást mutatott, amely az M79 egér ellenanyag kötőaffinitásának megfelelő nagyságrendbe esett.

IV.2. Affinitásmeghatározások

Felszíni plazmonrezonancia-méréseket végeztünk BIACORE2000-készülék alkalmazásával (Biacore AB, Freiburg, Németország). Rekombináns szolubilis 17-1A antigén immobilizálását az egyes áramlási kamrákban, és a kölcsönhatás analizálását automatikus módon, BIACORE2000-készülékben végeztük. Az antigént kovalens módon CM5-szenzorchiphez kötöttük az elsődleges aminocsoportokon keresztül. Miután a karboxilezett dextránmátrixot oly módon aktiváltuk, hogy mind a négy áramlási kamrán keresztül egyetlen alkalommal 80 pl, 0,1 mol/1 N-hidroxi-szukcinimid/ 0,4 mol/1 N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid (NHS/EDC9) összetételű oldatot áramoltattunk át, a készülékbe s 17-1A antigént injektáltunk [60 pg/ml, 10 mmol/1 nátrium-acetát-pufferben (pH=4,7)], miközben az 1., 2., 3. és 4. áramlási kamrákat egymást után az áramlás útjába iktattuk. A 17-1A antigén eltérő érintkezési ideje az aktivált felszínnel körülbelül 2500 rezonanciaegységet (RU) eredményezett (RU9 az 1. áramlási kamrában; 14 000 RU a 2. áramlási

HU 221 818 Β1 kamrában; 780 RU a 3. áramlási kamrában; és 290 RU a 4. áramlási kamrában). A feleslegben lévő aktivált észtereket úgy blokkoltuk, hogy 85 pl, 1 mol/1 etanol-amint (pH=5) injektáltunk mind a négy áramlási kamrán keresztül. A kötődésvizsgálati kísérleteket 25 °C-on végeztük, az alábbi összetételű pufferben: 10 mmol/1 HEPES; 150 mmol/1 NaCl; 3 mmol/1 EDTA; és 0,005% P20-surfactant (felületaktív anyag) (pH=7,4). Az ellenanyagok kötődési kinetikáját immobilizált rekombináns 17-1A antigén vonatkozásában oly módon határoztuk meg, hogy 0,5-2 pmol/1 koncentrációjú ellenanyagmintákat injektáltunk a kamrákba. Az egyes futtatások közt a szenzorchipet az alábbi összetételű pufferrel regeneráltuk: 100 mmol/1 glicin; 500 mmol/1 NaCl; 0,005% Tween (pH=3). Az asszociációs- és disszociációssebesség-konstansokat (Kon és Kofí) a Biacore AB cégtől származó BIA-értékelő programcsomaggal analizáltuk, Karlsson által leírtak szerint [J. Immunoi. Meth. 145, 229 (1991)].

Az affinitásmeghatározást két kísérletsorozatban végeztük (1. sorozat: M79, H79; D7.2, Panorex; 2. sorozat: Panorex; HD70); az egér Panorexet belső referenciaként a 2. sorozatba is beiktattuk.

A D7.2 K_D-értéke a kimutathatóság szintje, azaz 10”⁴ mol/1 alatt maradt, ezért azt a 2. táblázatban nem tüntettük fel.

2. táblázat

Az alábbi táblázatban humán és a megfelelő egér

17-1A ellenanyagok K_D-, K^,- és K^fl-értékeit foglaltuk össze

1 Ellenanyag	Kon [M-’s-¹]	Koals-’l	K_d[M]
] 1. sorozat:
j egér M79	6,0x10·	4,5 xlO”²	7,5 xlO-⁷
\| humán H79	2,1x10·	7,2x10-3	3,4 xlO-⁷
j egér Panorex	1,1x105	2,2 xlO-²	2,0 xl0~⁷
\| 2. sorozat:
\| humán HD70	0,9x105	3,5xl0-²	3,9xl0-⁷
\| egér Panorex	1,0x105	2,7xl0-²	2,7xl0'⁷

IV.3. 17-1A antigént expresszáló eukarióta sejtek áramlásos citometriás analízise

H79 (humán és egér IgGl-változatok), HD70 (humán IgGl) és D7.2 (humán IgGl) tisztított ellenanyagkészítményeket FACS-analízissel teszteltünk 17-1A antigént expresszáló Kato-sejteken, 17-1A antigént kódoló DNS-sel transzfektált CHO-sejteken és nem transzfektált CHO-sejteken. 2xl0⁵ sejtet inkubáltunk tisztított H79-huIgGl, H79-MIgGl, HD70, D7.2, M79, Panorex, M74ch (azaz, az M74) jelzésű egéreredetű anti17- 1A ellenanyag humán CHIgGl-humán Ckappa változata; Göttinger: Int. J. Cancer 38, (1986)] ellenanyagokkal (minden esetben 20 pg/ml ellenanyaggal). A sejtekhez kötődött ellenanyagokat FITC-jelölt, egér vagy humán IgG elleni ellenanyagok (20 pg/ml) alkalmazásával mutattuk ki. Az inkubációt 45-60 percig végeztük, jégen.

A H79 humán IgGl, H79 egér IgGl és HD70 ellenanyagok egyértelműen kötődtek a 17-lA-pozitív sejtekhez, csakúgy, mint az M79- és Panorex-ellenanyagok. A D7.2-ellenanyag esetében gyenge, de szignifikáns kötődést tapasztaltunk. Az ellenanyagok egyike sem kötődött nem transzfektált CHO-sejtekhez, és az IgG-kontrollok alkalmazásával negatív eredményt kaptunk Kato-sejteken, CHO/17-lA-sejteken és nem transzfektált CHO-sejteken (lásd 16. és 17. ábrák).

IV.4. Ellenanyagfüggő sejtközvetített citotoxicitás meghatározása (⁵¹Cr-felszabadulás alapján)

A ⁵¹Cr-felszabadulás meghatározásán alapuló vizsgálathoz humán perifériás véreredetű mononukleáris sejteket (PBMC-ket) izoláltunk egészséges donorok véréből készített friss álhártyás bőrszövetéből („buffy coat”). A PBMC-ket Ficoll sűrűséggradiens-centrifugálással, majd 100 xg mellett végzett centrifugálással izoláltuk. Száz (100) pl, 10% FCS-sel kiegészített RPMI-1640tápközegben szuszpendált, nem stimulált PBMC-ket (5xl0⁵ sejtet) adtunk lapos fenekű mikrotitráló lemez lyukaihoz, és a lemezeket egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk. Célsejteket 2 órán át ⁵¹Cr-mal jelöltünk. Jelölt célsejteket (100 pl) és különböző koncentrációjú ellenanyagmintákat (50 pl) adtunk a PBMC-khez, és azokat 18 órán át, 37 °C-on inkubáltuk. Megfelelő nem kötő izotípusokat alkalmaztunk negatív kontrollokként. A specifikus lízist a következő képlet szerint számítottuk: (adott ellenanyag alkalmazásával végzett kísérletben mért cpm)-(spontán felszabadulás eredményezte cpm)/(maximális felszabaduláskor mérhető cpm)-(spontán felszabadulás eredményezte cpm) (cpm=count per minute, percenkénti beütésszám).

A fentiek szerint végzett ⁵¹Cr-felszabadulási vizsgálatban, a H79 és HD70 jelzésű humán anti-17-1A ellenanyagok nagymértékben képesnek bizonyultak citotoxicitási reakció közvetítésére 17-lA-pozitív KATÓ gyomorkarcinóma-sejtvonalon. Az M79 jelzésű és Panorex elnevezésű egéreredetű anti-17-1A ellenanyagok lényegesen kisebb mértékben bizonyultak képesnek sejtpusztulás előidézésére (18. ábra).

IV.5. Teszt humán szöveteken

Vastagbél-karcinómából és normális vastagbélszövetből készített 5 nm vastag kriometszeteket inkubáltunk a H79-ellenanyag egér IgG-változatával (az ellenanyagot 10 pg/ml koncentrációban alkalmazva). Ebben a kísérletben a H79-ellenanyag egér IgGl-változatát alkalmaztuk, hogy a humán szövetben jelen lévő humán immunglobulinok okozta nem specifikus festődést kivédjük. A kötődött H79-MIgGl-ellenanyagok kimutatását peroxidázzal konjugált, poliklonális, egér immunglobulinnal szemben irányuló ellenanyag hozzáadásával és karbazollal történő festéssel végeztük (barna). A hátteret hemalaunnal festettük.

Eredményeink értékelését fénymikroszkópos vizsgálattal végeztük.

A H79-MIgGl, valamint M79 jelzésű egér monoklonális ellenanyag (pozitív kontroll) erős festődést eredményezett normális vastagbélnyálkahártya-sejteken (M79: lásd 19. ábra; H79-MIgGl: lásd 20. ábra), és gyengébb festődést vastagbélkarcinóma-sejteken (M79:

HU 221 818 Β1 lásd 21. ábra; H79-MIgGl: lásd 22. ábra). Ezzel szemben, izotópkontrollok alkalmazásával nem észleltünk festődést sem vastagbélnyálkahártya-, sem vastagbélkarcinóma-szöveteken (M79: lásd 23. ábra; H79-MIgGl: lásd 24. és 26. ábrák).

5. példa

H79- és HD70-ellenanyagok epitópanalízise A H79 és HD70 jelzésű humán ellenanyagok által, és a templátként szolgáló M79 jelzésű egér ellenanyag által 10 felismert 17-lA-epitópok összehasonlítására a 17-1A antigén extracelluláris részének aminosavszekvenciája alapján 13 tagú (13mer) peptideket szintetizáltunk különálló foltokként Pép Spots membránon. Ezek a peptidek összességükben a 17-1A antigén teljes extracelluláris 5 aminosavszekvenciáját fedték [lásd Szala: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87, 3542 (1990)]; a szomszédos peptidek 11 aminosav tekintetében átfedő aminosavakat tartalmaztak, az 1. peptid első aminosava megegyezett a 17-1A antigén N-terminális aminosavával, a 119. peptid utolsó aminosava pedig megegyezett a 17-1A antigén extracelluláris részének C-terminális aminosavával (3. táblázat).

3. táblázat

Az epitópanalízishez a következő peptideket szintetizáltuk (a számok az egyes peptidfoltok pozícióját jelölik)

1. TATFAAAQEECVC 3. AAAQEECVCENYK

5. EECVCENYKLAVN 7. CENYKLAVNCFVN 9. KLAVNCFVNNNRQ

11. NCFVNNNRQCQCT

13. NNNRQCQCTSVGA

15. QCQCTSVGAQNTV 17. TSVGAQNTVICSK 19. AQNTVICSKLAAK 21. VICSKLAAKCLVM 23. KLAAKCLVMKAEM 25. KCLVMKAEMNGSK 27. MKAEMNGSKLGRR 29. MNGSKLGRRAKPE 31. KLGRRAKPEGALQ 33. RAKPEGALQNNDG 35. EGALQNNDGLYDP 37. QNNDGLYDPDCDE 39. GLYDPDCDESGLF 41. PDCDESGLFKAKQ 43. ESGLFKAKQCNGT 45. FKAKQCNGTSTCW 47. QCNGTSTCWCVNT 49. TSTCWCVNTAGVR 51. WCVNTAGVRRTDK 53. TAGVRRTDKDTEI 55. RRTDKDTEITCSE 57. KDTEITCSERVRT 59. ITCSERVRTYWII 61. ERVRTYWIIIELK 63. TYWIIIELKHKAR 65. IIELKHKAREKPY 67. KHKAREKPYDSKS 69. REKPYDSKSLRTA 71. YDSKSLRTALQKE 73. SLRTALQKEITTR 75. ALQKEITTRYQLD 77. EITTRYQLDPKFI 79. RYQLDPKFITSIL 81. DPKFITSILYENN 83. ITSILYENNVITI 85. LYENNVITIDLVQ 87. NVITIDLVQNSSQ

89. IDLVQNSSQKTQN

2. TFAAAQEECVCEN

4. AQEECVCENYKLA

6. CVCENYKLAVNCF

8. NYKLAVNCFVNNN 10. AVNCFVNNNRQCQ 12. FVNNNRQCQCTSV

14. NRQCQCTSVGAQN

16. QCTSVGAQNTVIC 18. VGAQNTVICSKLA 20. NTVICSKLAAKCL 22. CSKLAAKCLVMKA 24. AAKCLVMKAEMNG 26. LVMKAEMNGSKLG 28. AEMNGSKLGRRAK 30. GSKLGRRAKPEGA 32. GRRAKPEGALQNN 34. KPEGALQNNDGLY 36. ALQNNDGLYDPDC 38. NDGLYDPDCDESG 40. YDPDCDESGLFKA 42. CDESGLFKAKQCN 44. GLFKAKQCNGTST 46. AKQCNGTSTCWCV 48. NGTSTCWCVNTAG 50. TCWCVNTAGVRRT 52. VNTAGVRRTDKDT 54. GVRRTDKDTEITC 56. TDKDTEITCSERV 58. TEITCSERVRTYW 60. CSERVRTYWIIIE 62. VRTYWIIIELKHK 64. WIIIELKHKAREK 66. ELKHKAREKPYDS 68. KAREKPYDSKSLR 70. KPYDSKSLRTALQ 72. SKSLRTALQKEIT 74. RTALQKEITTRYQ 76. QKEITTRYQLDPK 78. TTRYQLDPKFITS 80. QLDPKFITSILYE 82. KFITSILYENNVI 84. SILYENNVITIDL 86. ENNVITIDLVQNS 88. ITIDLVQNSSQKT

90. LVQNSSQKTQNDV

HU 221 818 Β1

3. táblázat (folytatás)

91. QNSSQKTQNDVDI 93. QKTQNDVDIADVA 95. NDVDIADVAYYFE 97. IADVAYYFEKDVK 99. AYYFEKDVKGESL 101. EKDVKGESLFHSK 103. KGESLFHSKKMDL 105. LFHSKKMDLTVNG 107. KKMDLTVNGEQLD 109. LTVNGEQLDLDPG

111. GEQLDLDPGQTLI 113. DLDPGQTLIYYVD 115. GQTLIYYVDEKAP 117. IYYVDEKAPEFSM 119. DEKAPEFSMQGLK

92. SSQKTQNDVDIAD

94. TQNDVDIADVAYY 96. VDIADVAYYFEKD

98. DVAYYFEKDVKGE 100. YFEKDVKGESLFH 102. DVKGESLFHSKKM 104. ESLFHSKKMDLTV 106. HSKKMDLTVNGEQ 108. MDLTVNGEQLDLD 110. VNGEQLDLDPGQT 112. QLDLDPGQTLIYY 114. DPGQTLIYYVDEK 116. TLIYYVDEKAPEF 118. YVDEKAPEFSMQG

A szintetizált peptideket hordozó Pép Spots membránt tíz percig metanolban rázattuk, majd háromszor 20 tíz-tíz percig TBS-pufferrel (pH=8) mostuk. Ezután, a membránt egy órán át kazeinalapú, 0,05 g/ml szacharózt tartalmazó blokkolóoldatban blokkoltuk, majd 0,05% Tween-20-detergenst tartalmazó TBS-pufferben (TBS-T) egyszer mostuk. Az egyes anti-17-ΙΑ ellen- 25 anyagokat három órán át, szobahőmérsékleten blokkolóoldatban (1 μ g/ml ellenanyag) inkubáltuk a membránnal. Miután a membránt háromszor tíz-tíz percig TBS-T-pufferben mostuk, azt két órán át, szobahőmérsékleten, a tormaperoxidáz-. (HRP-) konjugált másodla- 30 gos ellenanyaggal (1 pg/ml antiegér/antihumán ellenanyag, blokkolóoldatban) inkubáltuk. Ezt követően, a membránt TBS-t-pufferben háromszor mostuk. A kötődött ellenanyagokat az M79-ellenanyag esetében közvetlenül Pép Spots membránon mutattuk ki, a kérni- 35 lumineszcens reagenskészletet gyártó cég (Boehringer) utasításai szerint. Az előhívott filmet a 27. ábrán mutatjuk be. Miután a biottot TBS-T-pufferrel háromszor (10-10 percig) mostuk, azt 50 mmol/1 Tris-HCl (pH=6,7); 100 mmol/1 2-merkaptoetanol; és 2 ve- 40 gyes% SDS összetételű oldatban 30 tormaperoxidáz(HRP-) konjugált másodlagos ellenanyaggal (1 pg/ml antiegér/antihumán ellenanyag, blokkolóoldatban) inkubáltuk. Ezt követően, a membránt TBS-t-pufferben háromszor mostuk. A kötődött ellenanyagokat az M79- 45 ellenanyag esetében közvetlenül Pép Spots membránon mutattuk ki, a kemilumineszcens reagenskészletet gyártó cég (Boehringer) utasításai szerint. Az előhívott filmet a 27. ábrán mutatjuk be. Miután a biottot TBS-Tpufferrel háromszor (10-10 percig) mostuk, azt 50 mmol/1 Tris-HCl (pH=6,7); 100 mmol/1 2-merkaptoetanol; és 2 vegyes% SDS összetételű oldatban 30 percig, 50 °C-on regeneráltuk, majd azt újból felhasználtuk a következő ellenanyag epitóptérképezésére.

Mivel a humán immunglobulin elleni másodlagos ellenanyag alkalmazásakor jelentős mértékű nem specifikus kötődést észleltünk a membránon található polipeptidfoltoknak megfelelően, a kötődött HD70- és H79-ellenanyagok tesztelésére azokat a Pép Spots membránról frakcionált elektrotranszfereljárással egy második blottmembránra vittük át, majd a humán immunoglobulin elleni másodlagos ellenanyaggal kimutatást végeztünk Rüdiger eljárása szerint [EMBO 16, 1501 (1997)]. A másodlagos ellenanyaggal történő inkubálást és az ellenanyag-kimutatást a biottokon a fent leírtak szerint végeztük. Az előhívott filmeket a 27. ábrán mutatjuk be.

Amint az az ábrán (27. ábrán) látható, a peptidalapú epitóptérképezés eredményei arra utalnak, hogy az M79 jelzésű egéreredetű templátellenanyag által felismert epitóp, amelyet elsősorban a 38. és 95. peptidfoltok képviselnek, jelentős mértékben különbözik a H79 jelzésű humán ellenanyag által felismert epitóptól, amelyet főként a 8., 11., 13., 14., 59-60., 77. és 79. peptidfoltok képviselnek. Mivel a HD70 jelzésű humán ellenanyag esetében kötődés egyáltalán nem volt kimutatható, arra következtethetünk, hogy az általa felismert epitóp szintén eltér az M79 jelzésű egér ellenanyag által felismert epitóptól, továbbá arra, hogy a H79 és HD70 humán ellenanyagok nem ugyanazt az epitópot ismerik fel.

Annak magyarázata, hogy a HD70 jelzésű humán ellenanyag esetében kötődésre utaló jelet nem észleltünk, lehet az, hogy az konformációs, folyamatos vagy meg50 szakított epitópot ismer fel; vagy részben, vagy teljes egészében szénhidrátból felépülő epitópot ismer fel; egyik említett esetben sem várható, hogy ilyen epitópoknak megfelelő rövid peptideket sikerül előállítani.

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI :

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 22 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ : egy

HU 221 818 Β1

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyébnukleinsav

LEÍRÁS: /desc=„láncindító”

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGGTGCAGCT GCTCGAGTCT GG 22

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 24bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁS: /desc=„láncindító”

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CAGAGTCACC TTGCTCGAGT CTGG 24

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 23 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁS: /desc=„láncindító”

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CAGGTGCAGC TGCTCGAGTC GGG 23

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 23 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁS: /desc=„láncindító”

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CAGGTGCAGC TACTCGAGTG GGG 23

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 23 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁS: /desc=„láncindító”

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CAGGTACAGC TGCTCGAGTC AGG 23

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 30bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁS: /desc=„láncindító”

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TGCCTTACTA GTCTCTGGCC AGCGGAAGAT 30

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 38 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

HU 221 818 Β1

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁS: /desc=„láncindító”

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CCAGATGACC CAGTCTCC 38

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 40 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁS: /desc=„láncindító”

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATTGAC AGCAGTCTCC 40

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 39 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁS: /desc=„láncindító”

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATGACC TCAGTCTCC 39

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 38 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁS: /desc=„láncindító”

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CACACTCACG CAGTCTCC 38

All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 38bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁS: /desc=„láncindító”

All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGCTGACT CAGTCTCC 38

A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 58bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁS: /desc=„láncindító”

A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA :

GCGCCGTCTA GAATTAACAC TCTCCCCTGT TGAAGCTCTT TGTGACGGGC GAACTCAG 58

A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 24 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

HU 221 818 Β1

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyébnukleinsav

LEÍRÁS: /desc=„láncindító”

A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AATTTTGAGC TCACTCAGCC CCAC 24

A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 27 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁS: /desc=„láncindító”

A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TCTGCCGAGC TCCAGCCTGC CTCCGTG 27

A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 27 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁS: /desc=„láncindító”

A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TCTGTGGAGC TCCAGCCGCC CTCAGTG 27

A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁS: /desc=„láncindító”

A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TCTGAAGAGC TCCAGGACCC TGTTGTGTCT GTG 33

A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 24 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁS: /desc=„láncindító”

A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CAGTCTGAGC TCACGCAGCC GCCC 24

A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 24 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁS: /desc=„láncindító”

A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CAGACTGAGC TCACTCAGGA GCCC 24

A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 24 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

HU 221 818 Β1

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyébnukleinsav

LEÍRÁS: /desc=„láncindító”

A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CAGGTTGAGC TCACTCAACC GCCC 24

A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 27bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁS: /desc=„láncindító”

A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CAGGCTGAGC TCACTCAGCC GTCTTCC 27

A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 30bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁS: /desc=„láncindító”

A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCCGTCTAG AATTATGAAC ATTCTGTAGG 30

A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: pepiid

A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Thr Alá Thr Phe Alá Alá Alá Gin Glu Glu Cys Val Cys 1 5 10

A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Tbr Phe Alá Alá Alá Gin Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn 1 5 10

A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Alá Alá Alá Gin Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys

5 10

HU 221 818 Β1

A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Alá Gin Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Alá 1 5 10

A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Alá Val Asn 1 5 10

A 27. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 27. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Alá Val Asn Cys Phe 1 5 10

A 28. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 28. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Alá Val Asn Cys Phe Val Asn 1 5 10

A 29. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 29. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asn Tyr Lys Leu Alá Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn 1 5 10

A 30. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

HU 221 818 Β1

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 30. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Lys Leu Alá Val Asn Cys Phe Va1 Asn Asn Asn Arg Gin 1 5 10

A 31. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 31. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Alá Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin 1 5 10

A 32. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 32. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr 1 5 10

A 33. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 33. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Phe Val Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr Ser Val 1 5 10

A 34. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ : egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 34. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr Ser Val Gly Alá 1 5 10

A 35. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 35. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr Ser Val Gly Alá Gin Asn

5 10

HU 221 818 Β1

A 36. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 36. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Cys Gin Cys Thr Ser Val Gly Alá Gin Asn Thr Val 1 5 10

A 37. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 37. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Cys Thr Ser Val Gly Alá Gin Asn Thr Val Ile Cys 1 5 10

A 38. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 38. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Thr Ser Val Gly Alá Gin Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys 1 5 10

A 39. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 39. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Val Gly Alá Gin Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Alá 1 5 10

A 40. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 40. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Alá Gin Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Alá Alá Lys 1 5 10

A 41. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

HU 221 818 Β1

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 41. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asn Thr Val I le Cys Ser Lys Leu Alá Alá Lys Cys Leu 1 5 10

A 42. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 42. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Val I le Cys Ser Lys Leu Alá Alá Lys Cys Leu Val Me t 1 5 10

A 43. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 43. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Cys Ser Lys Leu Alá Alá Lys Cys Leu Val Me t Lys Alá 1 5 10

A 44. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 44. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Lys Leu Alá Alá Lys Cys Leu Val Me t Lys Alá Glu Me t 1 5 10

A 45. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 45. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Alá Alá Lys Cys Leu Val Met Lys Alá Glu Me t Asn Gly 1 5 10

A 46. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 46. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA :

Lys Cys Leu Val Me t Lys Alá Glu Met Asn Gly Ser Lys

5 10

HU 221 818 Β1

A 47. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: pepiid

A 47. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Leu Val Me t Lys Alá Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly 1 5 10

A 48. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: pepiid

A 48. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA :

Me t Lys Alá Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg 1 5 10

A 49. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: pepiid

A 49. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Alá Glu Me t Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg Alá Lys 1 5 10

AZ 50. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

AZ 50. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg Alá Lys Pro Glu 1 5 10

AZ 51. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

AZ 51. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg Alá Lys Pro Glu Gly Alá 1 5 10

AZ 52. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

HU 221 818 Β1

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

AZ 52. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Lys Leu Gly Arg Arg Alá Lys Pro Glu Gly Alá

5 10

Leu Gin

AZ 53. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav TÍPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: peptid

AZ 53. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gly Arg Arg Alá Lys Pro Glu Gly Alá Leu

5 10

Gin Asn

Asn

AZ 54. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

AZ 54. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Arg Alá Lys Pro Glu Gly Alá Leu Gin Asn Asn Asp Gly 1 5 10

AZ 55. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

AZ 55. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Lys Pro Glu Gly Alá Leu Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr 1 5 10

AZ 56. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

AZ 56. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu Gly Alá Leu Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp 1 5 10

Pro

AZ 57. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

AZ 57. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Alá Leu Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys

5 10

HU 221 818 Β1

AZ 58. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS : peptid

AZ 58. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu 1 5 10

AZ 59. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

AZ 59. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly 1 5 10

A 60. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 60. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe 1 5 10

A 61. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 61. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Alá 1 5 10

A 62. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 62. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Alá Lys Gin 1 5 10

A 63. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

HU 221 818 Β1

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 63. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Alá Lys Gin Cys Asn 1 5 10

A 64. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ : egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 64. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu Ser Gly Leu Phe Lys Alá Lys Gin Cys Asn Gly Thr 1 5 10

A 65. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 65. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gly Leu Phe Lys Alá Lys Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr 1 5 10

A 66. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 66. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Phe Lys Alá Lys Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp 1 5 10

A 67. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 67. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Alá Lys Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val 1 5 10

A 68. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 68. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val Asn Thr

5 10

HU 221 818 Β1

A 69. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: pepiid

A 69. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp Cys Va1 Asn Thr Alá Gly 1 5 10

A 70. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 70. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Thr Ser Thr Cys Trp Cys Va1 Asn Thr Alá Gly Va 1 Arg 1 5 10

A 71. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 71. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Thr Cys Trp Cys Va1 Asn Thr Alá Gly Va1 Arg Arg Thr 1 5 10

A 72. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 72. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Trp Cys Va1 Asn Thr Alá Gly Va1 Arg Arg Thr Asp Lys 1 5 10

A 73. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 73. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Va 1 Asn Thr Alá Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr 1 5 10

A 74. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

HU 221 818 Β1

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 74. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Thr Alá Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr Glu I le 1 5 10

A 75. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 75. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr Glu I le Thr Cys 1 5 10

A 76. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 76. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr Glu I le Thr Cys Ser Glu 1 5 10

A 77. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 77. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Thr Asp Lys Asp Thr Glu I le Thr Cys Ser Glu Arg Val 1 5 10

A 78. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 78. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Lys Asp Thr Glu I le Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr 1 5 10

A 79. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 79. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Thr Glu I le Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp

5 10

HU 221 818 Β1

A 80. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: pepiid

A 80. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

I le Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp I le I le 1 5 10

A 81. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 81. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp I le I le I le Glu 1 5 10

A 82. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 82. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp I le I le I le Glu Leu Lys 1 5 10

A 83. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 83. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Val Arg Thr Tyr Trp I le I le I le Glu Leu Lys His Lys 1 5 10

A 84. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 84. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Thr Tyr Trp Ile I le I le Glu Leu Lys His Lys Alá Arg 1 5 10

A 85. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

HU 221 818 Β1

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 85. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Trp Ile Ile Ile Glu Leu Lys His Lys Alá Arg Glu Lys 1 5 10

A 86. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 86. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ile Ile Glu Leu Lys His Lys Alá Arg Glu Lys Pro Tyr 1 5 10

A 87. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS : peptid

A 87. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu Leu Lys His Lys Alá Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser 1 5 10

A 88. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 88. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Lys His Lys Alá Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys Ser 1 5 10

A 89. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 89. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Lys Alá Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg 1 5 10

A 90. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 90. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg Thr Alá

5 10

HU 221 818 Β1

A 91. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 91. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Lys Pro Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg Thr Alá Leu Gin 1 5 10

A 92. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 92. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg Thr Alá Leu Gin Lys Glu 1 5 10

A 93. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 93. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ser Lys Ser Leu Arg Thr Alá Leu Gin Lys Glu I le Thr 1 5 10

A 94. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 94. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ser Leu Arg Thr Alá Leu Gin Lys Glu I le Thr Thr Arg 1 5 10

A 95. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 95. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Arg Thr Alá Leu Gin Lys Glu I le Thr Thr Arg Tyr Gin 1 5 10

A 96. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

HU 221 818 Β1

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 96. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Alá Leu Gin Lys Glu I le Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp 1 5 10

A 97. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 97. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Lys Glu I le Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys 1 5 10

A 98. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 98. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu I le Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys Phe I le 1 5 10

A 99. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 99. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys Phe I le Thr Ser 1 5 10

A 100. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS : peptid

A 100. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys Phe I le Thr Ser I le Leu 1 5 10

A 101. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS : peptid

A 101. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Leu Asp Pro Lys Phe I le Thr Ser I le Leu Tyr Glu

5 10

HU 221 818 Β1

A 102. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 102. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asp Pro Lys Phe I le Thr Ser I le Leu Tyr Glu Asn Asn 1 5 10

A 103. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 103. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Lys Phe I le Thr Ser I le Leu Tyr Glu Asn Asn Val I le 1 5 10

A 104. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 104. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

I le Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val I le Thr I le 1 5 10

A 105. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 105. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile Asp Leu 1 5 10

A 106. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 106. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile Asp Leu Val Gin 1 5 10

A 107. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

HU 221 818 Β1

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 107. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu Asn Asn Val I le Thr I le Asp Leu Val Gin Asn Ser 1 5 10

A 108. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 108. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asn Val I le Thr I le Asp Leu Val Gin Asn Ser Ser Gin 1 5 10

A 109. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 109. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

I le Thr I le Asp Leu Val Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr 1 5 10

A 110. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 110. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

I le Asp Leu Val Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn 1 5 10

Alii. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

Alii. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Leu Val Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn Asp Val 1 5 10

A 112. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 112. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn Asp Val Asp I le

5 10

HU 221 818 Β1

A 113. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

A 113. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn Asp Va1 Asp

5 10

I1e Alá Asp

A 114. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

A 114. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Lys Thr Gin Asn Asp Va1 Asp I le Alá

5 10

Asp Val

A1 a

A 115. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 115. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Thr Gin Asn Asp Val Asp I le Alá Asp Val Alá Tyr 1 5 10

Tyr

A 116. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

A 116. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asn Asp Val Asp I le Alá Asp Val Alá Tyr Tyr

5 10

Phe Glu

A 117. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

A 117. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Val Asp I le Alá Asp Val Alá Tyr Tyr

5

Phe

Glu Lys Asp

A 118. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

HU 221 818 Β1

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 118. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

I le Alá Asp Val Alá Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys 1 5 10

A 119. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 119. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asp Val Alá Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu 1 5 10

A 120. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 120. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Alá Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser Leu 1 5 10

A 121. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 121. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser Leu Phe His 1 5 10

A 122. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 122. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser Leu Phe His Ser Lys 1 5 10

A 123. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 123. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asp Val Lys Gly Glu Ser Leu Phe His Ser Lys Lys Me t

5 10

HU 221 818 Β1

A 124. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 124. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Lys Gly Glu Ser Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu 1 5 10

A 125. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 125. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu Ser Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val 1 5 10

A 126. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 126. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly 1 5 10

A 127. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 127. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gin 1 5 10

A 128. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 128. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Lys Lys Me t Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gin Leu Asp 1 5 10

A 129. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

HU 221 818 Β1

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 129. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp 1 5 10

A 130. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 130. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Leu Thr Val Asn Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp Pro Gly 1 5 10

A 131. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 131. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Val Asn Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp Pro Gly Gin Thr 1 5 10

A 132. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 132. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp Pro Gly Gin Thr Leu Ile 1 5 10

A 133. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 133. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Leu Asp Leu Asp Pro Gly Gin Thr Leu Ile Tyr Tyr 1 5 10

A 134. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 134. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asp Leu Asp Pro Gly Gin Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp 1 5 10

HU 221 818 Β1

A 135. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 135. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asp Pro Gly Gin Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys 1 5 10

A 136. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 136. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gly Gin Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Alá Pro 1 5 10

A 137. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 137. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Alá Pro Glu Phe 1 5 10

A 138. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 138. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Alá Pro Glu Phe Ser Me t 1 5 10

A 139. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 139. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Tyr Val Asp Glu Lys Alá Pro Glu Phe Ser Met Gin Gly 1 5 10

A 140. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

HU 221 818 Β1

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 140. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asp Glu Lys Alá Pro Glu Phe Ser Me t Gin Gly Leu Lys 1 5 10

A 141. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 321 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: cdss

ELHELYEZKEDÉS: 1...321

A 141. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAG Glu 1

CTC CAG

ATG ACC CAG

TCT CCA

TCC Ser

TCC Ser 10

CTG Leu

TCT Ser

GCT A1 a

TCT Ser

GTG Val 15

GGA Gly

48

Leu

Gin

Me t

Thr 5

Gin

Ser

Pro

GAC

AGA

GTC

ACC

ATC

ACT

TGT

CGG

ACA

AGT

CAG

AGC

ATT

AGC

TAT

96

Asp

Arg

Val

Thr

I le

Thr

Cys

Arg

Thr

Ser

Gin

Ser

I le

Ser

Tyr

20

25

30

TTA

AAT

TGG

TAT

CAG

AAA

CCA

GGA

CAG

CCT

AAG

CTG

CTC

ATT

144

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Lys

Leu

I le

35

40

45

TAC

TGG

GCA

TCT

ACC

CGG

GAA

TCC

GGG

GTC

CCT

GAC

CGA

TTC

AGT

GGC

192

Tyr

Trp

A1 a

Ser

Thr

Arg

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

AGC

GGG

TCT

GGG

ACA

GAT

TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

AGT

CTA

CAA

CCT

240

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

As p

Phe

Thr

Leu

Thr

I le

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

GAA

GAT

TCT

GCA

ACT

TAC

TGT

CAG

AGT

TAC

GAC

ATC

CCG

TAC

288

Glu

Asp

Ser

A1 a

Thr

Tyr

Cy s

Gin

Ser

Tyr

As p

I le

Pro

Tyr

85

90

95

ACT

TTT

GGC

CAG

GGG

ACC

AAG

CTG

GAG

ATC

AAA

321

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

I le

Lys

100 105

A 142. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 107 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 142. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu 1

Leu

Gin

Me t

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

A1 a

Ser

Val 15

Gly

As p

Arg

Val

Thr

I le

Thr

Cys

Arg

Thr

Ser

Gin

Ser

I le

Ser

Tyr

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Ly s

Pro

Gly

Gin

Pro

Lys

Leu

I le

35

40

45

HU 221 818 Β1

Tyr

Trp

A1 a

Ser

Thr

Arg

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

As p

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

11 e

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Ser

A1 a

Thr

Tyr

Cy s

Gin

Ser

Tyr

Asp

I le

Pro

Tyr

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

I le

Ly s

100 105

A 143. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 414 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kettős TOPOLÓGIÁJA: lineáris SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: cds

ELHELYEZKEDÉS: 1...414

A 143. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAG GTG CAG CTG

CTC GAG

TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG

48

Glu

Val

Gin 110

Leu

Glu

Ser

Gly 115

Gly

Va 1

Val

Gin 120

Pro

Gly

Arg

TCC

CTG

AGA

CTC

TCC

TGT

GCA

GCC

TCT

GGA

TTC

ACC

TTC

AGT

AGC

TAT

96

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cy s

A1 a

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Tyr

125

130

135

GGC

ATG

CAC

TGG

GTC

CGC

CAG

GCT

CCA

GGC

AAG

GGG

CTG

GAG

TGG

GTG

144

Gly

Me t

Hi s

Trp

Va 1

Arg

Gin

A1 a

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

140

145

150

155

GCA

GTT

ATA

TCA

TAT

GAT

GGA

AGT

AAT

AAA

TAC

TAT

GCA

GAC

TCC

GTG

192

A1 a

Va 1

I le

Ser

Tyr

As p

Gly

Ser

Asn

Lys

Tyr

A1 a

As p

Ser

Val

160

165

170

AAG

GGC

CGA

TTC

ACC

ATC

TCC

AGA

GAC

AAT

TCC

AAG

AAC

ACG

CTG

TAT

240

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

I le

Ser

Arg

As p

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

175

180

185

CTG

CAA

ATG

AAC

AGC

CTG

AGA

GCT

GAG

GAC

ACG

GCT

GTG

TAT

TAC

TGT

288

Leu

Gin

Me t

Asn

Ser

Leu

Arg

A1 a

Glu

Asp

Thr

A1 a

Val

Tyr

Cy s

190

195

200

GCG

AAA

GAT

ATG

GGG

TGG

GGC

AGT

GGC

TGG

AGA

CCC

TAC

336

A1 a

Lys

Asp

Me t

Gly

Trp

Gly

Se r

Gly

Trp

Arg

Pro

Tyr

205

210

215

GGT

ATG

GAC

GTC

TGG

GGC

CAA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

GCA

384

Gly

Me t

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

A1 a

220

225

230

235

ccc

ACC

AAG

GCT

CCG

GAT

GTG

TTC

CCT

CTA

414

Pro

Thr

Lys

A1 a

Pro

Asp

Val

Phe

Pro

Leu

240 245

A 144. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 138 aminosav

HU 221 818 Β1

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 144. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu 1

Val

Gin

Leu

Leu Glu 5

Ser

Gly

Gly 10

Val

Gin

Pro

Gly 15

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu 20

Ser

Cy s

A1 a

Ser 25

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser 30

Ser

Tyr

Gly

Me t

Hi s 35

Trp

Val

Arg

Gin

Alá 40

Pro

Gly

Ly s

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Val

A1 a

Val 50

I le

Ser

Tyr

Asp

Gly 55

Ser

Asn

Lys

Tyr

Tyr 60

A1 a

As p

Ser

Val

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Thr

I le 70

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser 75

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr 80

Leu

Gin

Me t

Asn

Ser 85

Leu

Arg

A1 a

Glu

As p 90

Thr

A1 a

Va 1

Tyr

Tyr 95

Cy s

A1 a

Lys

Asp

Me t 100

Gly

Trp

Gly

Ser

Gly 105

Trp

Arg

Pro

Tyr

Tyr 110

Tyr

Gly

Me t

Asp 115

Val

Trp

Gly

Gin

Gly 120

Thr

Val

Thr

Val 125

Ser

A1 a

Pro

Thr

Ly s

A1 a

Pro

Asp

Val

Phe

Pro

Leu

130 135

A 145. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :

HOSSZA: 372 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: cds

ELHELYEZKEDÉS: 1...372 A 145. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA

GTC Val

GTG Val

GTA Val 150

CAG Gin

CCT Pro

GGG Gly

48

GAG GTG Glu Val 140

CAG Gin

CTG Leu

CTC GAG Leu Glu

TCT Ser 145

GGG GGA Gly Gly

TCC CTG

AGA

CTC

TCC TGT

GCA

GCC TCT

GGA

TTC

ACC

TTT

GAT

TAT

96

Ser Leu

Arg

Leu

Ser Cys

A1 a

Alá Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

As p

Asp

Tyr

155

160

165

170

GCC ATG

CAC

TGG

GTC CGC

CAG

GCT CCA

GGC

AAG

GGG

CTG

GAG

TGG

GTG

144

A1 a Me t

Hi s

Trp

Val Arg

Gin

Alá Pro

Gly

Ly s

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

175

180

185

GCA GTT

ATA

TCA

TAT GAT

GGA

AGT AAT

AAA

TAC

TAT

GCA

GAC

TCC

GTG

192

Alá Val

I le

Ser

Tyr Asp

Gly

Ser Asn

Lys

Tyr

A1 a

As p

Ser

Val

190

195

200

AAG GGC

CGA

TTC

ACC ATC

TCC

AGA GAC

AAT

TCC

AAG

AAC

ACG

CTG

TAT

240

Lys Gly

Arg

Phe

Thr Ile

Ser

Arg Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

205

210

215

HU 221 818 Β1

CTG CAA ATG

AAC AGC

CTG AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC

TGT Cys

288

Leu

G1 n Me t 220

Asn

Ser

Leu

Arg 225

A1 a

Glu Asp

Thr

A1 a 230

Val

Tyr

GCG

AAA

AAG

GAA

GGC

TAC

TGG

GGC

CAG

GGA

ACC

CTG

GTC

ACC

GTC

TCC

336

A1 a

Ly s

Lys

Glu

Gly

Tyr

Trp

Gly

Gin

G1 y

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

235

240

245

250

TCA

GCA

ccc

ACC

AAG

GCT

CCG

GAT

GTG

TTC

CCT

CTA

Ser

A1 a

Pro

Thr

Lys

A1 a

Pro

Asp

Val

Phe

Pro

Leu

255 260

A 146. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 124 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 146. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu

Val

Gin

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Gin

Pro

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

A1 a

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

As p

Asp

Tyr

20

25

30

A1 a

Me t

Hi s

Trp

Val

Arg

Gin

A1 a

Pro

Gly

Ly s

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

A1 a

Va 1

Ile

Ser

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

Tyr

A1 a

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Me t

Asn

Ser

Leu

Arg

A1 a

Glu

Asp

Thr

A1 a

Val

Tyr

Cys

85

90

95

A1 a

Ly s

Glu

Gly

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

100

105

110

Ser

A1 a

Pro

Thr

Ly s

A1 a

Pro

Asp

Va 1

Phe

Pro

Leu

115

120

A 147. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 321 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kettős TOPOLÓGIÁJA: lineáris SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: cds

ELHELYEZKEDÉS: 1...321

A 147. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAG CTC CAG ATG ACC

CAG Gin 130

TCT Ser

CCA Pro

TCC Ser

TCC CTG TCT

GCA A1 a

TCT Ser

GTA Val

GGA Gly 140

Glu 125

Leu Gin

Me t

Thr

Ser

Leu 135

Ser

GAC

AGA

GTC

ACC

ATC

ACT

TGC

CGG

GCA

AGT

CAG

AGC

ATT

AGC

TAT

As p

Arg

Va 1

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

A1 a

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Tyr

145

150

155

HU 221 818 Β1

TTA Leu

AAT TGG

TAT Tyr 160

CAG Gin

AAA Ly s

CCA GGA CAG

CCT Pro

AAG Lys

CTG Leu 170

CTC Leu

ATT Ile

144

Asn

Trp

Pro

Gly 165

Gin

TAC

TGG

GCA

TCT

ACC

CGG

GAA

TCC

GGG

GTC

CCT

GAC

CGA

TTC

AGC

GGC

192

Tyr

Trp

A1 a

Ser

Thr

Arg

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

As p

Arg

Phe

Ser

Gly

175

180

185

AGT

GAA

TCT

GGG

ACA

AAT

TAC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

CTG

CAG

CCT

240

Ser

Glu

Ser

Gly

Thr

Asn

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gin

Pro

190

195

200

GAA

GAT

TTT

GCT

ACT

TAC

TTT

TGT

CAA

CAG

TCT

GAC

AGT

TTG

CCG

ATC

288

Glu

As p

Phe

A1 a

Thr

Tyr

Phe

Cys

Gin

Ser

Asp

Ser

Leu

Pro

Ile

205

210

215

220

ACC

TTC

GGC

CAA

GGG

ACA

CGA

CTG

GAC

ATT

CAA

321

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Arg

Leu

As p

Ile

Gin

225 230

A 148. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

A 148. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu 1

Leu

Gin

Me t

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

A1 a

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

A1 a

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Tyr

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Trp

A1 a

Ser

Thr

Arg

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Glu

Ser

Gly

Thr

Asn

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

A1 a

Thr

Tyr

Phe

Cy s

Gin

Ser

Asp

Ser

Leu

Pro

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Arg

Leu

Asp

Ile

Gin

100

105

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás humán antigén elleni receptor előállítására, azzal jellemezve, hogy 0)) funkcionálisan átrendeződött VH- és VL-immunglobulin-láncok kombinációját szelektáljuk, amely kombinációban legalább a VH-lánc naiv, érett, humán B-limfocitákból, a VL-lánc pedig természetben előforduló humán B-sejt-repertoárból származik, és a láncok rekombináns vektorról expresszálódnak, és (c) humán antigénhez való kötődés megvalósítására in vitro prezentáló rendszert alkalmazunk, és ahol

50 a (b) szelekciós lépés végrehajtása előtt (a) lépésben vagy a VH-láncot vagy a VL-láncot szelektáljuk az antigénre való kötődésre, egy nem humán, célantigénspecifikus ellenanyag V-láncával együttesen.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,

55 hogy receptorként immunglobulint vagy immunglobulin-fragmentumot, célszerűen Fv-fragmentumot alkalmazunk.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább a VH-, adott esetben pedig a

60 VL-immunglobulin-láncként is humán IgD-repertoár50

HU 221 818 Β1 bői származó VH- és VL-láncok kombinációját szelektáljuk.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy in vitro prezentáló rendszerként fágprezentációs rendszert alkalmazunk.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a láncok kombinációjaként egy vagy több különböző génkönyvtárból expresszáltatott, átrendeződött láncok kombinációját szelektáljuk.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán antigénként tumorantigén, előnyösebben a humán 17-1A antigén elleni receptort állítunk elő.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy VH-láncként a 7. ábrán megadott 1-381. nukleotidok vagy a 8. ábrán megadott 1-339. nukleotidok formájában bemutatott szekvenciát; és/vagy VL-láncként a 6. ábrán megadott 1-321. nukleotidok vagy a 9. ábrán megadott 1-321. nukleotidok formájában bemutatott szekvenciát tartalmazó láncok kombinációját szelektáljuk.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (b) szelekciós lépést az alábbi lépések végrehajtásával végezzük:

(i) az antigénreceptort expresszáló, azt prezentáló hordozót a felsoroltak bármelyikéhez kötjük:

(a) immobilizált célantigénhez vagy annak fragmentumaihoz;

(b) a célantigént vagy annak fragmentumait expresszáló, adott esetben jelölt sejtekhez; vagy (c) szolubilis, előnyösen jelölt célantigénhez vagy annak fragmentumaihoz;

(ii) a nem specifikus módon kötődött prezentáló hordozókat mosással eltávolítjuk (a és b), majd a specifikus módon kötődött prezentáló hordozókat eluáljuk; vagy (ifi) a célantigénhez kötődött prezentáló hordozót a célantigént tartalmazó oldatból vagy a célantigént expresszáló sejtek szuszpenziójából kényszerdúsítjuk (b ésc);

az ily módon izolált, a megfelelő antigénreceptorokat tartalmazó prezentáló hordozókat adott esetben replikációval megsokszorozzuk, és további in vitro szelekciós ciklusoknak vetjük alá az (i)-től (iii)-ig terjedő lépések szerint.
9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nem humán célantigénspecifikus ellenanyag láncaként egéreredetű VH- vagy VL-lánccal kombinálva szelektálunk az antigénhez történő kötődésre.
10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kombinációt a következő lépéseket is végrehajtva szelektáljuk:

(a) egy és ugyanazon VH-láncot számos különböző VL-lánccal kombinálva tesztelünk humán antigénhez történő kötődésre; vagy (b) egy és ugyanazon VL-láncot számos különböző VH-lánccal kombinálva tesztelünk humán antigénhez történő kötődésre.
11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szelekciót követően a humán VH- és VL-láncokat vagy az azoknak megfelelő nukleinsavakat kinyerjük, és a láncokat ugyanazon vagy más VH- és VL-láncokkal, immunglobulin nehézlánc-konstansrégiókkal (CH) vagy könnyűlánc-konstansrégiókkal (CL) vagy ezek részeivel, vagy nem immunglobulin láncokkal fuzionáltatjuk; vagy a nukleinsavszekvenciákat rendre a fentiek bármelyikét kódoló nukleinsavszekvenciával fuzionáltatjuk.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a konstansrégióláncokként emberi IgGl-ből vagy IgG3-ból származó konstansrégióval vagy azt kódoló nukleinsavval valósítjuk meg a fúziót.
13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szelekció után, a humán VH- és VL-láncokat kinyerjük és fizikailag nem fehérje jellegű gyógyhatású anyaghoz és/vagy más, biológiailag aktív molekulához kapcsoljuk.
14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VH- vagy a VL-láncokat olyan nukleinsavszekvenciákról expresszáltatjuk, amelyek naiv, érett, humán B-limfocitákból származó mRNS RT-PCR-amplifikálásának eredményei.
15. Humán ellenanyag, amely natív, humán 17-1A antigénre specifikus.
16. A 15. igénypont szerinti ellenanyag, amely az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárással állítható elő.
17. A 15. vagy 16. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag, amely a 17-1A antigén extracelluláris doménje egyik epitópján ismeri fel és előnyösen legalább egy aminosavszekvenciát tartalmaz az alábbi peptidek szekvenciái közül: 8., 11., 13., 14., 59., 60., 77. és 79. szekvencia.
18. A 15-17. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag, amelynek VH-lánca legalább egy, a 7. ábrán megadott 1-381. nukleotidok vagy a 8. ábrán megadott 1-339. nukleotidok formájában bemutatott szekvenciák szerinti CDR-t tartalmaz; és/vagy amelynek VL-lánca legalább egy, a 6. ábrán megadott 1-321. nukleotidok vagy a 9. ábrán megadott 1-321. nukleotidok formájában bemutatott szekvenciák szerinti CDR-t tartalmaz.
19. Gyógyászati készítmény, amely 15-18. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyagot és adott esetben gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.