KR102207859B1 - 고 친화도 항-gd2 항체 - Google Patents

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Abstract

본 출원은 고 친화도 항-GD2 항체 작용제, 및 예를 들어 GD2-관련 질환, 특히 신경아세포종의 검출, 예방 및/또는 치료적 치료를 위한 것을 비롯한 다양한 방법 및 그와 관련된 시약을 기재한다.

Description

고 친화도 항-GD2 항체 {HIGH AFFINITY ANTI-GD2 ANTIBODIES}
<관련 출원에 대한 상호 참조>
본 출원은 2013년 3월 15일자로 출원된 미국 특허 가출원 제61/801,287호를 35 U.S.C.§119(e) 하에 우선권으로 주장하며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
<서열 목록>
본 명세서는 2014년 3월 14일에 ascii .txt 파일 (파일명: "2003080-0638_ST25")로서 전자적 형태로 제출된 서열 목록을 참조한다. 상기 .txt 파일은 2014년 3월 12일에 생성되었으며 크기가 94 kb이다.
모노클로날 항체 (MoAb) 요법은 암에 대해 허용된 치료 방식으로, 5개의 MoAb가 결장직장암 및 유방암, 비소세포폐암, 편평상피 세포 암종, 및 흑색종을 비롯한 성인에서의 고형 종양에 대해 FDA 승인을 받았다 (문헌 [Boyiadzis et al., 2008, Expert Opin Biol Ther 8, 1151-8]; [Yan et al., 2008, Cancer J 14, 178-83]).
다른 것들 중에서, 본원발명은 MoAb 요법이 소아 암의 치료에 대해 여전히 부적절하게 활용되고 있다는 통찰을 제공한다. 화학요법 또는 방사선과는 달리, MoAb 요법은 골수저하성 및 유전자독성이 없으며, 일반적으로 장기 독성이 거의 없다. 이는 어린 아동을 위해 중요한 고려사항이다. 보다 중요하게는, MoAb는 고위험 신경아세포종 (NB)에서 전형적으로 발견되는, 혈액, 골수 및 골에서의 전이성 암에 대하여 효과적이다. 소정 부류의 작용제로서, 인간 또는 인간화 IgG1 항체의 약동학 및 독성이 광범위하게 연구되어 왔다. 게다가, 항체는 면역 기반이든, 방사성 동위원소이든, 독소이든 또는 효소이든 세포독성 페이로드(payload)를 지닐 수 있고, 이에 따라 표적화된 요법에 대한 선택권을 증가시킨다.
<요약>
본원발명은 참조 3F8 항체에서 발견되지 않으며 본원에서 기재된 하나 이상의 특정 구조적 특징을 갖는다는 점에서 참조 3F8 항체의 변이체이며 GD2에 결합하는 항체 작용제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 제공되는 항체 작용제는 본원에서 기재된 하나 이상의 구조적 특징이 결여되어 있으며 다른 부분은 동일한 3F8 항체에 비하여 개선된 안정성 및/또는 감소된 면역원성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 제공되는 항체 작용제는 의약학, 예를 들어 NB의 진단 및/또는 치료에 유용하다. 일부 실시양태에서, 제공되는 항체 작용제는 하나 이상의 페이로드 (예를 들어, 검출가능한 페이로드 및/또는 치료 페이로드)와 관련되어 있고/거나, 이를 포함하고/거나, 이를 전달한다. 이러한 항체 작용제의 식별, 특성화, 제조 및/또는 사용을 위한 다양한 방법론 또한 본원발명에 의해 제공된다.
본 출원에서, 감소된 면역원성을 갖지만 향상된 안정성을 갖도록 설계된 신규 hu3F8 프레임워크인 hu3F8V5를 갖는 고 친화도 항-GD2 항체가 구체적으로 기재되어 있다. hu3F8V5 항체는 컴퓨터 방법을 기초로 감소된 면역원성에 대하여 hu3F8V1의 프레임워크 구조를 최적화하여 설계되었다 (WO 2011/160119 및 문헌 [Cheung et al., 2012, Oncoimmunology 1: 477-486]에 기재되어 있음). 첫째로, hu3F8V1 중쇄 및 경쇄 서열을 각각 인간 생식세포 서열 humIGHV199 및 humIGKV025와 비교하였다 (EMBL 데이타베이스). CHARMm (CHemistry at Harvard Molecular mechanics) 역장 (문헌 [B. R. Brooks et al., J. Comp. Chem. 30, 1545-1615 (2009)])을 사용한 분자 시뮬레이션을 뮤린 3F8의 결정 구조 (단백질 데이터 뱅크 수탁번호 3VFG)를 기초로 각각의 잠재적 인간화 돌연변이에 대하여 시행하여 돌연변이가 구조적으로 허용되는지를 측정하였다. 추가적으로, hu3F8V1에서의 MHC 클래스 II T-세포 에피토프를 면역 에피토프 데이타베이스(Immune Epitope Database) 상에서의 NN-정렬(NN-align) 방법을 사용하여 식별하고, 구조적으로 허용되는 돌연변이를 기초로 최소화시켰다. 3F8 결정 구조에 도킹된 GD2의 컴퓨터 모델을 기초로 (CDOCKER 및 디스커버리 스튜디오 소프트웨어즈 (CDOCKER and Discovery Studio softwares; 캘리포니아주 샌 디에고 애컬리(Accelrys, San Diega, CA) 소재)를 사용하여 구축됨), GD2 항원과 직접 상호작용하도록 모델링되지 않은 CDR 잔기를 인간화 돌연변이에 대해 고려하였다.
잠재적 면역원성을 감소시키기 위해 9개의 점 돌연변이를 hu3F8V1에서 제조하여 hu3F8V5를 제조하였다 (표 2 참조). 9개의 돌연변이 모두 그의 항원 GD2에 결합된 3F8의 컴퓨터 모델에서 구조적으로 허용되는 것으로 발견되었다. 돌연변이 모두는 3F8에 대한 인간화에서 남아있는 뮤린 잔기의 인간 생식세포 서열로의 변화와 연관된다. (LC:K24R, LC:S56T, LC:V58I, HC:I20L, HC:M92V)는 프레임워크 잔기와 연관된다. 본 발명자들은 인실리코(in silico) 방법에 의해 확인되는 것과 같은 강한 T-세포 에피토프를 제거한 CDR H2에서의 4개 돌연변이 (HC:A62S, HC:F63V, HC:M64K, HC:S56G)를 추가로 발견하였다. 본 발명자들은 GD2에 결합된 3F8의 본 발명자의 컴퓨터 모델이 CDR 영역에서의 시사된 돌연변이를 가능하도록 하였다는 놀라운 사실을 발견하였는데, 이는 CDR 잔기를 변경하는 것이 그래프팅 방법에 의한 항체 인간화 분야의 통상의 기술자들에게는 일반적이지 않기 때문이다.
효모 디스플레이 방법을 기초로 한 친화도 성숙을 수행하기 위하여, 본 발명자들은 선별에 사용하기 위한 신규 바이오티닐화 GD2 유도체를 최초로 합성하였다. 이전에, 본 발명자들은 표준 바이오티닐화 GD2 항원 (기능성 글리코믹스에 대한 컨소시움(Consortium for functional glycomics)으로부터 수득됨)을 사용하여 성공하지 못했었다. 유동세포계수법으로 GD2를 관찰하기 위해, PEG 스페이서를 융합하여 신규한 합성 GD2-아지도 유도체 (도 2)를 생성하였다. 이러한 신규 유사체를 사용하여, 본 발명자들은 효모의 표면에 디스플레이되는 hu3F8 ScFv의 무작위 라이브러리로부터 2개의 돌연변이를 선별하였으며, 이는 합성 GD2 유사체에 대한 결합이 향상되었다. 첫 번째 것은 LC:D32H이며, 이는 CDR L1 상에 위치되어 있고, 두 번째 것은 LC:E1K이며, 이는 프레임워크 잔기에 있다. 2개의 돌연변이 (LC:E1K 및 LC:D32H)를 재조합 발현된 hu3F8V1 ScFv 및 hu3F8V5 ScFv 구축물에서 시험하였으며, 천연 GD2에 대한 결합 친화도를 비아코어(Biacore) 분석을 사용하여 측정하였다. 구조 모델링을 기초로, 모든 hu3F8 ScFv는 VL-VH 형식으로 제조되었는데, 이는 항원 결합 포켓에의 보다 덜 제한된 접근을 가능하게 하기 때문이다. 이는 VH-VL 형식으로 구축되는 가장 통상적인 ScFv와는 반대이다. 여러 변이체 또한 전장 IgG1 형식에서 시험하였다.
따라서, 본원발명은 특정 구조적 특징 (3F8 및/또는 hu3F8V1에 대한 돌연변이)을 갖는 원형 항체, 단일 쇄 가변 단편 (scFv) 및 다른 형식을 비롯한 신규 고 친화도 항-GD2 항체 작용제를 제공하며, 이는 면역원성을 감소시키고, GD2에 대한 항체의 친화도를 증가시킨다.
한 실시양태에서, 본원발명은 특정 구조적 특징 (3F8 및/또는 hu3F8V1에 대한 돌연변이)을 갖는 항-GD2 3F8 항체에 대한 신규 프레임워크, 즉 hu3F8V5를 제공하며, 이는 그의 면역원성을 감소시키며 T-세포 에피토프를 제거한다.
또 다른 실시양태에서, 본원발명은 경쇄 (LC)에 특정 구조적 특징인 CDR L1 상에 위치된 D32H 및 E1K 프레임워크 잔기를 갖는 항체 작용제인 GD2에 대한 증가된 친화도를 갖는 항-GD2 항체 작용제를 제공한다.
또한, 중쇄 (HV)에 특정 구조적 특징인 G54I를 갖는 항-GD2 항체 작용제가 제공된다.
본원발명의 항체 작용제는 상기 기재된 단일 구조적 특징을 갖거나, 또는 이중 특징으로서 2개의 구조적 특징을 임의의 조합으로 갖거나, 또는 삼중 특징으로서 2개 초과의 구조적 특징을 임의의 조합으로 가질 수 있다. 일부 실시양태에서 이들 구조적 특징을 임의의 형태의 3F8 항체, 예를 들어 hu3F8V1에 도입하거나, 또는 유사하거나 또는 또 다른 목적을 위해 3F8 분자, 예를 들어 hu3F8V5에 이미 존재하는 다른 구조적 특징과 조합할 수 있다. hu3F8V1 및 hu3F8V5 둘 다에 이러한 구조적 특징을 갖는 항체 및 단일 쇄 가변 단편 (scFv)이 본원에 기재되어 있지만, 향상된 친화도 효과를 나타내기 위해 돌연변이가 임의의 3F8 항체 서열에 도입될 수 있는 것으로 이해된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1개의 구조적 특징인 E1K 또는 D32H 중 하나를 갖거나, 또는 2개의 구조적 특징인 E1K 및 D32H를 갖는 경쇄 (LC) 및/또는 G54I 구조적 특징을 갖는 중쇄 (HC)를 갖는 3F8 항-GD2 항체뿐만 아니라, 항체 조성물, 항체의 글리코형, 안정성이 향상된 항체, Fc 수용체에의 결합이 향상된 항체, GD2에 대한 친화도가 향상된 항체, 제2의 별개의 결합 부위를 발현하기 위해 조작된 이중특이성 항체, 또는 이중특이성 T-세포 결합체(engager)를 제공하거나, 또는 T-세포를 결합하는 텐덤 scFv 이중특이성 항체 (BiTE)인 이중특이성 항체, 삼중특이성 또는 다중특이성 항체에 대한 모듈성 IgG 구성에서의 본 발명의 임의의 항체의 Fv 단편의 용도를 제공한다. 상기 항체 및 이를 코딩하거나 상보적인 핵산, 벡터, 숙주 세포, 조성물, 제제, 장치, 트랜스제닉 동물, 이와 관련된 트랜스제닉 식물, 및 관련 기술 분야에 공지된 것과 조합하여, 본원에 기재되고 이를 가능하게 하는, 이의 제조 방법 및 사용 방법은 본원발명의 일부이다. 놀랍게도, 구조적 특징 E1K, D32H 및 G54I의 임의의 조합을 갖는 hu3F8은 유의하게 보다 큰 GD2에 대한 친화도를 나타내고, 낮은 보체 매개 세포독성 (CMC)을 갖는 모 hu3F8V1에 비해 유의하게 보다 높은 PMN-ADCC 및 PBMC-ADCC 활성을 갖는다. 낮은 CMC가 바람직한데, 항-GD2 면역치료와 관련된 통증 부작용을 매개하는 것으로 여겨지기 때문이다. 이러한 우수성은 ADCC 검정에서, 공여체에 무관하게, 또는 인간 CD16 또는 CD32로 형질감염된 NK92가 킬러로 사용되는 경우, 지속적으로 관찰된다. 이는 ADCC가 일반적으로 환자에서 MoAb의 항-종양 효과에 대해 입증된 메카니즘이기 때문에 중요하다.
한 실시양태에서, 본 발명은 hu3F8V1 또는 hu3F8V5를 기초로 하는 경쇄 및 중쇄를 포함하되 본원에서 기재된 하나 이상의 구조적 특징의 존재가 상이한 3F8 항체 작용제에 관한 것으로서, 상기 항체 작용제는 GD2에 고 친화도로 결합하며 원하는 효과, 몇 가지 예로서 시험관내 세포 성장의 억제, 항-GD2 항체 요법으로 인한 통증 부작용의 차단을 매개한다.
한 측면에서, 본 발명의 항체 작용제에는 본원에 기재된 단일 구조적 특징을 갖는 hu3F8V1 IgG, 예를 들어 hu3F8V1-E1K, hu3F8V1-D32H, hu3F8V1-G54I; 본원에 기재된 것과 같은 이중 구조적 특징을 갖는 hu3F8V1 IgG, 예를 들어 hu3F8V1-E1KD32H, hu3F8V1-E1KG54I 및 hu3F8V1-D32HG54I; 본원에 기재된 것과 같은 삼중 구조적 특징을 갖는 hu3F8V1 IgG, 예를 들어 hu3F8V1-E1KD32HG54I; hu3F8V5 IgG; 본원에 기재된 것과 같은 단일 구조적 특징을 갖는 hu3F8V5 IgG, 예를 들어 hu3F8V5-E1K, hu3F8V5-D32H, hu3F8V5-G54I; 본원에 기재된 것과 같은 이중 구조적 특징을 갖는 hu3F8V5 IgG, 예를 들어 hu3F8V5-E1KD32H, hu3F8V5-E1KG54I 및 hu3F8V5-D32HG54I; 및 본원에 기재된 것과 같은 삼중 구조적 특징을 갖는 hu3F8V5 IgG, 예를 들어 hu3F8V5-E1KD32HG54I가 포함된다.
또한, 본 발명에는 항체 사슬의 하나 이상의 부분, 예컨대 중쇄의 불변 영역, 연결 영역, 다양성 영역 또는 가변 영역, 또는 경쇄의 불변 영역, 연결 영역 또는 가변 영역과 같은 상기 항체의 단편 또는 유도체가 포함된다. 항체는 IgG, IgM 또는 IgA와 같은 임의의 부류, 또는 IgG1, IgG2a, IgG4 및 관련 기술 분야에 공지된 다른 하위부류와 같은 임의의 하위부류 중 하나일 수 있다. 또한, 본원발명에 유용한 항체에는 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일쇄 가변 단편 (scFv), 단일쇄 항체, 디술피드-연결 Fv 또는 디술피드-안정화 Fv (sdFv 또는 dsFv)를 비제한적으로 비롯한 본원발명의 항체의 항원-결합 항체 단편이 포함된다.
본원발명의 단일 쇄 가변 단편에는 hu3F8V1-E1K scFv, hu3F8V1-D32H scFv, hu3F8V1-G54I scFv; 본원에 기재된 것과 같은 이중 구조적 특징을 갖는 hu3F8V1 scFv, 예를 들어 hu3F8V1-E1KD32H scFv, hu3F8V1-E1KG54I scFv 및 hu3F8V1-D32HG54I scFv; 본원에 기재된 것과 같은 삼중 구조적 특징을 갖는 hu3F8V1 scFv, 예를 들어 hu3F8V1-E1KD32HG54I scFv; hu3F8V5 scFv; 본원에 기재된 것과 같은 단일 구조적 특징을 갖는 hu3F8V5 scFv, 예를 들어 hu3F8V5-E1K scFv, hu3F8V5-D32H scFv, hu3F8V5-G54I scFv; 본원에 기재된 것과 같은 이중 구조적 특징을 갖는 hu3F8V5 scFv, 예를 들어 hu3F8V5-E1KD32H scFv, hu3F8V5-E1KG54I scFv 및 hu3F8V5-D32HG54I scFv; 본원에 기재된 것과 같은 삼중 구조적 특징을 갖는 hu3F8V5 scFv, 예를 들어 hu3F8V5-E1KD32HG54I scFv; 및 이들의 조합이 포함된다.
또한, 본 발명에는 VL 또는 VH 도메인 중 하나를 포함하는 단일-도메인 항체가 포함된다. 추가로, 항체는 파지 디스플레이와 같은 임의의 방법에 의해 생산되거나, 또는 박테리아, 곤충, 효모 (균류), 포유동물 또는 목적하는 특징을 가진 항체, 예컨대 인간화 항체를 생산하는 다른 유형의 세포 또는 세포주를 비롯하여, 임의의 유기체, 난류(egg) 또는 세포주에서 생산될 수 있다. 또한, 항체는 상이한 종으로부터 Fab 부분과 Fc 영역을 조합하거나, 또는 상보성-결정 영역을 유지하고 또 다른 종의 것에 대한 프레임워크 영역을 변형함으로써 형성될 수 있다.
본원발명의 바람직한 항-GD2 항체는 하기 펩티드 서열 중 어느 하나를 포함한다:
서열식별번호:1로 식별되는 D32H 구조적 특징을 갖는 hu3F8V1 경쇄,
서열식별번호:2로 식별되는 E1K 구조적 특징을 갖는 hu3F8V1 경쇄,
서열식별번호:3으로 식별되는 D32H 및 E1K의 이중 구조적 특징을 갖는 hu3F8V1 경쇄,
서열식별번호:4로 식별되는 G54I 구조적 특징을 갖는 hu3F8V1 중쇄,
서열식별번호:5로 식별되는 hu3F8V5 중쇄 감마 1,
서열식별번호:6으로 식별되는 hu3F8V5 경쇄 카파,
서열식별번호:7로 식별되는 D32H 구조적 특징을 갖는 hu3F8V5 경쇄,
서열식별번호:8로 식별되는 E1K 구조적 특징을 갖는 hu3F8V5 경쇄,
서열식별번호:9로 식별되는 이중 구조적 특징 E1K 및 D32H를 갖는 hu3F8V5 경쇄,
서열식별번호:10으로 식별되는 G54I 구조적 특징을 갖는 hu3F8V5 중쇄,
서열식별번호:11로 식별되는 D32H 구조적 특징을 갖는 경쇄 가변 영역을 갖는 hu3F8V1 단일 쇄 가변 단편 (scFv),
서열식별번호:12로 식별되는 D32H 구조적 특징을 갖는 경쇄 가변 영역 및 G54I 구조적 특징을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖는 hu3F8V1 scFv,
서열식별번호:13으로 식별되는 E1K 구조적 특징을 갖는 경쇄 가변 영역을 갖는 hu3F8V1 scFv,
서열식별번호:14로 식별되는 E1K 구조적 특징을 갖는 경쇄 가변 영역 및 G54I 구조적 특징을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖는 hu3F8V1 scFv,
서열식별번호:15로 식별되는 E1K 및 D32H 이중 구조적 특징을 갖는 경쇄 가변 영역을 갖는 hu3F8V1 scFv,
서열식별번호:16으로 식별되는 E1K 및 D32H 이중 구조적 특징을 갖는 경쇄 가변 영역 및 G54I 구조적 특징을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖는 hu3F8V1 scFv,
서열식별번호:17로 식별되는 G54I 구조적 특징을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖는 hu3F8V1 scFv,
서열식별번호:18로 식별되는 hu3F8V5 scFv,
서열식별번호:19로 식별되는 D32H 구조적 특징을 갖는 경쇄 가변 영역을 갖는 hu3F8V5 scFv,
서열식별번호:20으로 식별되는 G54I 구조적 특징을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖는 hu3F8V5 scFv,
서열식별번호:21로 식별되는 D32H 구조적 특징을 갖는 경쇄 가변 영역 및 G54I 구조적 특징을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖는 hu3F8V5 scFv,
서열식별번호:22로 식별되는 E1K 구조적 특징을 갖는 경쇄 가변 영역을 갖는 hu3F8V5 scFv,
서열식별번호:23으로 식별되는 E1K 구조적 특징을 갖는 경쇄 가변 영역 및 G54I 구조적 특징을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖는 hu3F8V5 scFv,
서열식별번호:24로 식별되는 E1K 및 D32H 이중 구조적 특징을 갖는 경쇄 가변 영역을 갖는 hu3F8V5 scFv, 및
서열식별번호:25로 식별되는 E1K 및 D32H 이중 구조적 특징을 갖는 경쇄 가변 영역 및 G54I 구조적 특징을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖는 hu3F8V5 scFv.
또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 단일 쇄 가변 단편은 링커 또는 스페이서의 존재 또는 부재 하에 또 다른 항원에 대해 특이성을 갖는 다른 scFv에 연결되어 2가 또는 이중특이성 항-GD2 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 서열식별번호:26으로 식별되는 링커 및 스페이서를 갖는 huOKT3에 대한 scFv 서열 또는 서열식별번호:27로 식별되는 스페이서를 갖지 않는 huOKT3에 대한 scFv 서열이 서열식별번호:11-25에 기재된 scFv 중 어느 하나에 뒤이을 수 있다. 다르게는, 서열식별번호:28로 식별되는 항-DOTA인 C825에 대한 scFv 서열이 서열식별번호:11-25로 식별되는 scFv 중 어느 하나에 뒤이을 수 있다. 이중특이성 항체의 몇몇 예에는 다음이 포함된다:
서열식별번호:29로 식별되는 ADTKGP 스페이서를 갖는 hu3F8V1 scFv-링커-huOKT3 scFv,
서열식별번호:30으로 식별되는 스페이서를 갖지 않는 hu3F8V1 scFv-링커-huOKT3 scFv, 및
서열식별번호:31로 식별되는 hu3F8V1 scFv-C825 scFv.
본원발명의 몇몇 실시양태에서, 제공되는 항체 작용제는 hu3F8V1의 중쇄에서의 특정 삼중 잔기 특징인 DEL (S239D/A330L/I332E), 증가된 안정성을 위한 VH-VL Ala43Ser 경계면 및/또는 중쇄에서의 하나 이상의 구조적 특징, 및/또는 이들의 조합을 갖는 탄수화물 조성물로 추가로 변형되어 예를 들어 이펙터 기능을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 항체 작용제는 인간 GD2와 결합하고, 목적하는 기능, 즉 이펙터 기능, 통증의 차단, 또는 세포 성장의 억제를 수행하는 항체 작용제이다. 경쟁적 억제에 의한 모노클로날 항체 특이성 및 친화도를 측정하기 위한 소정의 대표적인 방법은 문헌 [Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988]에서 찾아볼 수 있고, 이는 본원에 참조로 포함된다. 본 발명의 적어도 하나의 항체는 인간 GD2, 그의 서브유닛, 단편, 일부 또는 임의의 조합에 특이적인 적어도 하나의 특정 에피토프에 결합한다. 에피토프는 적어도 하나의 항체 결합 영역을 포함할 수 있고, 바람직하게는 1 내지 5개 이상의 당 잔기, 또는 GD2 중 적어도 한 부분의 세라마이드로 이루어진다.
한 측면에서, 본원발명은 본원에서 정의된 구조적 특징 중 어느 하나를 임의의 조합으로 갖는 LC 또는 HV 중 어느 하나를 포함하는 하나 이상의 본원발명의 단리된 hu3F8 항-GD2 항체 및 상기를 코딩하는 핵산 서열을 제공하며, 여기서:
단일 구조적 특징 D32H를 갖는 hu3F8V1 경쇄는 서열식별번호:32로 식별되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고,
이중 구조적 특징 E1K 및 D32H를 갖는 hu3F8V1 경쇄는 서열식별번호:33으로 식별되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고,
hu3F8V5 중쇄는 서열식별번호:34로 식별되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고,
hu3F8V5 경쇄는 서열식별번호:35로 식별되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고,
hu3F8V5 단일 구조적 특징 D32H 경쇄는 서열식별번호:36으로 식별되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고,
hu3F8V5 이중 구조적 특징 E1K 및 D32H 경쇄는 서열식별번호:37로 식별되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고,
hu3F8V5 단일 구조적 특징 G54I 중쇄는 서열식별번호:38로 식별되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고,
경쇄 영역에서 단일 구조적 특징 D32H를 갖는 hu3F8V1 scFv는 서열식별번호:39로 식별되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고,
경쇄 영역에서 이중 구조적 특징 E1K 및 D32H를 갖는 hu3F8V1 scFv는 서열식별번호:40으로 식별되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고,
경쇄 영역에서 E1K 및 D32H 구조적 특징 및 중쇄 영역에서 G54I 구조적 특징을 갖는 삼중 구조적 특징을 갖는 hu3F8V1 scFv는 서열식별번호:41로 식별되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고,
hu3F8V5 scFv는 서열식별번호:42로 식별되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고,
경쇄 영역에서 단일 구조적 특징 D32H를 갖는 hu3F8V5 scFv는 서열식별번호:43으로 식별되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고,
경쇄 영역에서 이중 구조적 특징 E1K 및 D32H를 갖는 hu3F8V5 scFv는 서열식별번호:44로 식별되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고,
경쇄 영역에서 E1K 및 D32H, 및 중쇄 영역에서 G54I의 삼중 구조적 특징을 갖는 hu3F8V5 scFv는 서열식별번호:45로 식별되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
일부 측면에서, 본원발명은 본원발명의 3F8 MoAb 또는 이의 단편 중 어느 하나를 포함하는 항체 성분, 또는 본 발명의 3F8 항체 또는 이의 단편 중 어느 하나를 포함하는 항체 융합 단백질 또는 이의 단편을 포함하는, 진단/검출 또는 치료 면역접합체를 제공하고, 여기서 항체 성분은 적어도 하나의 진단/검출 작용제 또는 적어도 하나의 치료제에 결합된다.
일부 측면에서, 본원발명은 방사성핵종, 붕소, 가돌리늄 또는 우라늄 원자, 면역조절제, 예컨대 사이토카인, 줄기 세포 성장 인자, 림포톡신, 예컨대 종양 괴사 인자 (TNF), 조혈기관관련 인자, 예컨대 인터류킨 (IL), 콜로니 자극 인자 (CSF), 예컨대 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF) 또는 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터페론 (IFN), 예컨대 인터페론-알파, 인터페론-베타 또는 인터페론-감마, 및 줄기 세포 성장 인자, 조혈기관관련 인자, 에리스로포이에틴, 트롬보포이에틴, 항체, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 효소 억제제, 광활성 치료제, 세포독성 약물, 예컨대 항유사분열제, 알킬화제, 항대사물질 작용제, 혈관신생-억제제, 세포사멸성 작용제, 알칼로이드 작용제, COX-2-억제제 및 항생제, 세포독성 독소, 예컨대 식물, 미생물 및 동물 독소, 및 이들의 합성 변이체, 혈관신생 억제제, 상이한 항체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료제를 포함하는 치료 면역접합체를 제공한다.
일부 측면에서, 본원발명은 또한 3F8 항체에 의해 인식되는 항원에 대한 친화성을 갖는 하나 이상의 항원-결합 부위, 및 GD2 이외에 에피토프 또는 합텐에 대한 친화성을 갖는 하나 이상의 합텐 결합 부위를 포함하는, 다가의 다중특이성 항체 또는 그의 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 다가의 다중특이성 항체 또는 그의 단편은 진단/검출 작용제 또는 치료제를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본원발명은 (i) 본원발명의 다가의 다중특이성 항체 또는 그의 단편을 대상체에게 투여하는 단계; (ii) 소정량의 비결합 단백질이 대상체의 혈액 흐름에서 제거되도록 충분한 시간을 기다리는 단계; 및 (iii) 상기 항체의 결합 부위에 결합하는, 진단/검출 작용제, 치료제, 또는 그의 조합물을 포함하는 담체 분자를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 진단/검출 작용제, 치료제, 또는 그의 조합물을 표적에 전달하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 진단/검출 작용제 또는 치료제는 동위원소, 염료, 크로마젠, 조영제, 약물, 독소, 사이토카인, 효소, 효소 억제제, 호르몬, 호르몬 길항제, 성장 인자, 방사성핵종, 금속, 리포좀, 나노입자, RNA, DNA, 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다. 또한, 제2 특이성에는 기재된 작용제의 군으로부터의 임의의 작용제에 접합된 합텐(들)이 포함된다. 상기 합텐에는 바이오틴 및 그의 유도체, DOTA 및 그의 유도체, DTPA 및 그의 유도체, 플루오레세인 및 그의 유도체, 히스타민 및 그의 유도체, 데페록사민 및 그의 유도체가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 임의의 방법에서, 대상체는 바람직하게는 포유동물, 예컨대 인간 또는 가정용 애완동물이다.
일부 실시양태에서, 본원발명은 (A) 3F8 MoAb에 의해 인식되는 항원인 질환 조직-회합 표지에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 아암(arm) 및 표적가능한 접합체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 다른 아암을 갖는 이중특이성 항체 또는 항체 단편을 대상체에게 투여하는 단계; (B) 임의로, 제거 조성물(clearing composition)을 대상체에게 투여하고, 상기 조성물이 비국소화 항체 또는 항체 단편을 순환으로부터 제거하도록 하는 단계; 및 (C) 상기 이중특이성 항체 또는 항체 단편의 상기 다른 아암 중 하나 이상에 의해 인식가능한 적어도 하나의 에피토프를 포함하거나 갖는 담체 부분을 포함하는 제1 표적가능한 접합체, 및 하나 이상의 접합된 치료제 또는 진단제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 조직을 치료하거나 확인하는 방법이다. 바람직하게는, 표적화된 조직에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 아암은 본원발명의 항-GD2 항체 또는 항-GD2 항체의 단편이다.
일부 측면에서, 본원발명은 (A) 표적화된 조직에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 아암 (여기서, 이는 본원발명의 3F8 항체 또는 그의 단편임), 및 표적가능한 접합체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 다른 아암을 포함하는 유효량의 이중특이성 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계; 및 (B) 표적가능한 접합체를 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 3F8 MoAb에 의해 인식되는 항원을 발현하는 종양의 검출 또는 치료 방법을 제공한다. 표적가능한 접합체는 (i) DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2; (ii) Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2; (iii) DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2; (iv) DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (v) DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (vi) DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (vii) DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2; (viii) Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH2; (ix) Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2; (x) Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2; (xi) Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2; (xii) DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2; (xiii) (Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2; (xiv) Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (xv) (Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (xvi) Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2; (xvii) Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2; (xviii) Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2; (xix) Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2; 플루오레세인 및 그의 유도체; 데스페리옥사민 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 측면에서, 본원발명은 (A) 이중특이성 항체 F(ab)2 또는 F(ab')2 단편, 또는 단일쇄 Fv 단편을 그러한 절차를 겪어야 하는 대상체에게 주사하고 (여기서, 이중특이성 항체 또는 단편은 본원발명의 3F8 MoAb에 의해 인식되는 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항체 결합 부위를 갖고, 합텐에 특이적으로 결합하는 제2 항체 결합 부위를 가짐), 항체 단편이 표적 부위에 부착되도록 하는 단계; (B) 임의로, 이중특이성 단편이 주사 후 약 24시간 이내에 순환으로부터 대체로 제거되지 않은 경우, 제거제(clearing agent)를 사용하여 비표적화된 항체 단편을 제거하고, 분해를 위해 비표적화된 항체 또는 단편을 간으로 빠르게 제거하는 합텐-변형 덱스트란 또는 덴드리머 또는 중합체를 주사하는 단계; (C) 제1 주사 후 수시간 이내에, 스캐너 또는 프로브를 사용한, 표적 부위에서의 상승된 수준의 부착된 표지의 핵 영상법 또는 근거리 검출에 의해 합텐의 존재를 검출하고, 상기 절차를 수행하는 단계 (여기서, 상기 검출은 조영제 또는 공제제 (subtraction agent)를 사용하지 않고 수행됨)를 포함하는 표적화 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 합텐은 진단/검출 방사성 동위원소, MRI 영상-향상제, 형광 표지 또는 화학발광 표지로 표지된다. 형광 표지에는 로다민, 플루오레세인, 레노그라핀, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드 및 플루오레스카민이 포함될 수 있다. 화학발광 표지에는 루미놀, 이소루미놀, 방향족 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르가 포함될 수 있다. MRI 영상-향상제에는 가돌리늄 및 강자성 물질이 포함된다. 항체-합텐 국소화 영상법은 종양 시기결정, 치료에 반응하는 종양의 측정, 조기 재발의 검출 및 종양 감시에 중요한 GD2를 갖는 원형 종양 세포를 검출한다. 암에 대한 치유 요법의 일부로서 완전한 외과 절제술이 가능하도록, 항체-합텐 국소화의 검출은 수술 중에 종양의 정확한 위치를 제공하고, 질환의 잠재 부위를 밝혀낸다.
또한, 본원발명에서, 3F8 항체에 의해 인식되는 항원에 대한 친화성을 갖는 하나 이상의 항원-결합 부위, 및 세포 (림프구, 자연 살해 세포, 호중구, 골수성 세포, 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 백혈병 세포, 세포독성 림프구 및 B-림프구) 상의 에피토프 또는 합텐에 대한 친화성을 갖는 하나 이상의 합텐 결합 부위를 포함하는, 다가의 다중특이성 항체 또는 그의 단편이 고려된다. 이러한 이중특이성 항체 또는 단편은, 항원 GD2를 갖는 부위 또는 조직 또는 세포에서 내인성 세포 또는 외인성으로 주입된 세포를 표적하기 위해, 정맥내, 협막내 및 종양내를 비롯한 다양한 경로를 통하여, 인간을 비롯한 포유동물 내로 투여될 수 있다. 대안적으로, 세포는 인간을 비롯한 포유동물 내로의 투여 전에 상기 이중특이성 항체 또는 단편을 사용하여 생체외 무장될 수 있다.
또한, 본원발명에서, 진단 적용 및 치료 적용 둘 모두를 위해, 유전자 방법을 사용하여 GD2에 특이적인 키메라 표면 수용체를 만들어내고 세포 (림프구, 자연 살해 세포, 호중구, 골수성 세포, 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 백혈병 세포, 세포독성 림프구 및 B-림프구)를 GD2를 갖는 조직, 장기 또는 종양으로 재전송하기 위한 3F8의 서열 또는 그의 단편의 용도가 고려된다.
한 측면에서, 본원발명은, 적어도 하나의 특정 서열, 도메인, 그의 부분 또는 변이체를 포함하는 상기 언급한 특정 항-GD2 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 상보적이거나, 또는 혼성화하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
추가로, 본원발명은 상기 항-GD2 항체 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 이러한 핵산 및/또는 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포뿐만 아니라, 이러한 항체 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포의 제조 방법 및/또는 사용 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은, 적어도 하나의 단리된 포유동물 항-GD2 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 단리된 핵산, 단리된 핵산을 포함하는 단리된 핵산 벡터, 및/또는 단리된 핵산을 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 포함한다. 숙주 세포는 COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, CHO-S, DG44, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, 골수종, 또는 림프종 세포, 또는 그의 임의의 유도체, 불멸화된 세포 또는 변형된 세포로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 또한, dhfr (디히드로폴레이트 리덕타제) 또는 GS (글루타민 신타제)가 포함되나 이에 한정되지는 않는 효소, 또는 대사 경로의 조절하에 성장 및 생존 선별로 단백질 발현의 증폭이 가능하도록 하는 벡터의 사용 방법을 비롯하여, 항체가 검출가능한 또는 회수가능한 양으로 발현되도록, 시험관내, 생체내 또는 동일계내의 조건하에 항체 코딩 핵산을 번역하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 항-GD2 항체의 생산 방법이 제공된다.
또한, 본원발명은, 적어도 하나의 항-GD2 항체가 검출가능한 또는 회수가능한 양으로 발현되는 조건하에서, 본원에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 적어도 하나의 상기 언급한 항-GD2 항체를 발현하기 위한 하나 이상의 방법을 제공한다.
또한, 본원발명은, (a) 본원에 기재된 단리된 항-GD2 항체 코딩 핵산 및/또는 항체; 및 (b) 적합한 담체 또는 희석제를 포함하는 적어도 하나의 조성물을 제공한다. 공지된 담체 또는 희석제에 따라, 담체 또는 희석제는 임의로 제약상 허용될 수 있다. 임의로, 조성물은 적어도 하나의 추가 화합물, 단백질 또는 조성물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 몇몇 조성물에서, 키메라 또는 인간화 항체는 세포독성 약물, 독소 또는 방사성핵종과 같은 세포독성제 (즉, 세포의 생존능 및/또는 기능을 손상시키는 작용제)에 접합된다.
본원발명은, 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에서 적어도 하나의 GD2 관련 병태를 조절 또는 치료하기 위해, 및/또는 관련 기술 분야에 공지되고/거나 본원에 기재된 바와 같은 관련 병태 전에, 후에 또는 중에, 치료 유효량을 투여하기 위한, 하나 이상의 항-GD2 항체 방법 또는 조성물을 추가로 제공한다. 따라서, 본원발명은, 본 발명의 유효량의 하나 이상의 단리된 항-GD2 항체 또는 그의 단편을 포함하는 조성물을, 세포, 조직, 장기 또는 동물에 접촉시키거나 투여하는 단계를 포함하는, 세포, 조직, 장기 또는 동물에서의 GD2 관련 병태의 진단 또는 치료 방법을 제공한다. 임의로, 상기 방법은 0.001-50 mg/킬로그램의 유효량의 본 발명의 항-GD2 항체를 세포, 조직, 장기 또는 동물에 사용하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 임의로, 상기 방법은 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내(intracelial), 소뇌내, 뇌실내(intracerebroventricular), 대장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복강내, 흉강내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 수강내, 경막내, 옴마야내(intra-Ommaya), 유리체내, 안내, 윤활막내, 흉곽내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질내, 직장, 구강내, 설하, 비내 또는 경피로부터 선택된 적어도 하나의 방식에 의해 접촉시키거나 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 임의로, 상기 방법은, 검출가능한 표지 또는 리포터, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약제, 비-스테로이드성 소염성 약물 (NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항미생물제, 항건선제, 코르티코스테로이드, 동화작용성 스테로이드, 에리스로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 항체 또는 항체 유도 접합체, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성의약품, 항우울제, 항정신병제, 자극제, 천식 약물, 베타 효능제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 그의 유사체, 세포독성 또는 다른 항암 작용제, 항대사제, 예컨대 메토트렉세이트, 항증식성 작용제, 사이토카인, 인터류킨, 성장 인자, 사이토카인 길항제, 및 항-TNFα, 백혈구, T-세포, LAK 세포, TIL 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 단핵구, NKT 세포, 조작된 T 세포 또는 NK 세포 또는 단핵구 또는 과립구 중 적어도 하나로부터 선택된 유효량의 하나 이상의 화합물, 단백질 또는 세포를 포함하는 적어도 하나의 조성물을, 항체가 접촉하거나 투여되기 이전에, 동시에 또는 이후에 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본원발명은 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에서 적어도 하나의 GD2 관련 병태를, 및/또는 관련 기술 분야에 공지되고/거나 본원에 기재된 바와 같은 관련 병태 전에, 후에 또는 중에 진단하기 위한, 적어도 하나의 항-GD2 항체 방법을 추가로 제공한다.
또한, 본원발명은, 본원발명에 따른 적어도 하나의 항-GD2 항체 병태를 진단하기 위한, 하나 이상의 조성물, 장치 및/또는 전달 방법을 제공한다.
또한, 본원발명의 적어도 하나의 단리된 인간화 항-GD2 항체 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물이 제공된다. 임의로, 상기 조성물은 검출가능한 표지 또는 리포터, 세포독성 또는 다른 항암 작용제, 항대사제, 예컨대 메토트렉세이트, 항증식성 작용제, 사이토카인, 또는 사이토카인 길항제, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약제, 비-스테로이드성 소염성 약물 (NTHE), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항미생물제, 항건선제, 코르티코스테로이드, 동화작용성 스테로이드, 에리스로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성의약품, 항우울제, 항정신병제, 자극제, 천식 약물, 베타 효능제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체 중 적어도 하나로부터 선택된 유효량의 하나 이상의 화합물 또는 단백질을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 적어도 하나의 단리된 포유동물 항-GD2 항체를 포함하는 의료 장치가 제공되고, 여기서 상기 장치는 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 경막내, 옴마야내, 유리체내, 안내, 대장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복강내, 흉강내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 수강내, 윤활막내, 흉곽내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질내, 직장, 구강내, 설하, 비내, 또는 경피로부터 선택된 방식 중 하나 이상에 의해, 적어도 하나의 항-GD2 항체를 접촉시키거나 투여하는데 적합하다.
추가의 측면에서, 본 개시내용은, 제1 용기에서의 동결건조된 형태의 본 개시내용의 하나 이상의 키메라 또는 인간화 항-GD2 항체 또는 단편, 및 멸균수, 멸균 완충수, 또는 수성 희석제 중의 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 질산 페닐수은산, 페녹시에탄올, 포름알데히드, 클로로부탄올, 염화마그네슘, 알킬파라벤, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 소듐 데히드로아세테이트 및 티메로살, 만니톨, 수크로스, 만노스, 다른 당, 트윈(TWEEN) 80, 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 보존제를 포함하는 임의의 제2 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 한 측면에서, 키트 중 제1 용기에서의 항-GD2 항체 또는 특정 부분 또는 변이체의 농도는 제2 용기의 내용물을 사용하여 약 0.1 mg/ml 내지 약 500 mg/ml의 농도로 재구성된다. 또 다른 측면에서, 제2 용기는 등장제를 추가로 포함한다. 또 다른 측면에서, 제2 용기는 생리학상 허용되는 완충액을 추가로 포함한다. 한 측면에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 GD2를 특징으로 하는 병태의 치료를 필요로 하는 환자에게, 키트에서 제공되고 투여 전에 재구성되는 제제를 투여하는 것을 포함하는, 적어도 하나의 GD2를 특징으로 하는 병태의 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 적어도 하나의 단리된 키메라 또는 인간화 항-GD2 항체의 용액 또는 동결건조된 형태를 포함하는 패키징 물질 및 용기를 포함하는, 인간 제약학적 용도 또는 진단 용도를 위한 제조품이 제공된다. 상기 제조품은 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 경막내, 옴마야내, 유리체내, 안내, 대장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복강내, 흉강내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 수강내, 윤활막내, 흉곽내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질내, 직장, 구강내, 설하, 비내, 또는 경피 전달 장치 또는 시스템의 구성요소로서의 용기를 갖는 것을 임의로 포함할 수 있다.
하기 도로 구성되는 본원에 포함되는 도면은 예시를 목적으로 하며 제한하려고 하지는 않는다.
도 1은 hu3F8V1 scFv를 갖는 다양한 종양 유형의 염색도(staining intensity)의 강도를 나타낸다.
도 2는 클릭 화학(Click Chemistry)을 사용하여 바이오틴-(PEG)4-알킨과 반응된 아지도-GD2-올리고사카라이드로부터 제조된 바이오틴-PEG-GD2의 화학 구조를 나타낸다.
도 3은 예시적인 hu3F8V1 IgG의 해리 속도의 비아코어 센서그램을 나타낸다.
<정의>
재조합 DNA 및 면역학에서 사용되는 다수의 용어가 하기 설명에서 광범위하게 사용되었다. 이러한 용어가 제공되는 범위를 비롯한 명세서 및 청구항의 보다 명확하고 일관적인 이해를 제공하기 위해, 하기 정의가 제공된다.
성인: 본원에서 사용되는 용어 "성인"은 18세 이상의 인간을 의미한다. 성인에서의 체중은 90 파운드 내지 250 파운드의 통상적인 범위로 다양할 수 있다.
친화도: 관련 기술분야에서 알려진 것과 같이, "친화도"는 특정 리간드 (예를 들어, 항체)가 그의 파트너 (예를 들어, 에피토프)에 결합하는 견고도(tightness)의 측정값이다. 친화도는 다양한 방법으로 측정할 수 있다.
아미노산: 본원에서 사용되는 용어 "아미노산"은 가장 넓은 의미로서 폴리펩티드 쇄에 도입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 의미한다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 H2N-C(H)(R)-COOH의 화학식을 갖는다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 천연 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 합성 아미노산이고; 일부 실시양태에서, 아미노산은 d-아미노산이고; 일부 실시양태에서, 아미노산은 l-아미노산이다. "표준 아미노산"은 천연 펩티드에서 통상 발견되는 20개의 표준 l-아미노산 중 어느 하나를 지칭한다. "비표준 아미노산"은 합성에 의해 제조되는지 또는 천연 공급원으로부터 얻어지는지와는 무관하게 표준 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지칭한다. 본원에서 사용되는 "합성 아미노산"은 염, 아미노산 유도체 (예컨대, 아미드) 및/또는 치환체를 비제한적으로 비롯한 화학적 변형된 아미노산을 포괄한다. 펩티드에서의 카르복시- 및/또는 아미노-말단 아미노산을 비롯한 아미노산은 메틸화, 아미드화, 아세틸화, 보호기, 및/또는 그의 활성에의 악영향 없이 펩티드의 순환 반감기를 변화시킬 수 있는 다른 화학기로의 치환에 의해 변형될 수 있다. 아미노산은 디술피드 결합에 참여할 수 있다. 아미노산은 하나 이상의 번역후 변형, 예컨대 하나 이상의 화학적 개체 (예를 들어, 메틸기, 아세테이트기, 아세틸기, 포스페이트기, 포르밀 모이어티, 이소프레노이드기, 술페이트기, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 지질 모이어티, 탄수화물 모이어티, 바이오틴 모이어티 등)와의 회합을 포함할 수 있다. 용어 "아미노산"은 "아미노산 잔기"와 상호교환적으로 사용되며, 유리 아미노산 및/또는 펩티드의 아미노산 잔기를 지칭할 수 있다. 용어가 사용되는 문맥으로부터 유리 아미노산을 나타내는지 펩티드의 잔기를 지칭하는지가 명백할 것이다.
동물: 본원에서 사용되는 용어 "동물"은 동물 계의 임의의 구성원을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "동물"은 남녀 중 하나 및 임의 성장 단계의 인간을 나타낸다. 일부 실시양태에서, "동물"은 임의 성장 단계의 비-인간 동물을 나타낸다. 소정 실시양태에서, 비-인간 동물은 포유동물 (예를 들어, 설치류, 마우스, 래트, 래빗, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류 및/또는 돼지)이다. 일부 실시양태에서, 동물에는 포유동물, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충 및/또는 기생충(worm)이 포함되지만, 이들로 제한되지는 않는다. 소정 실시양태에서, 동물은 DV에 의해 감염되기 쉽다. 일부 실시양태에서, 동물은 트랜스제닉 동물, 유전자 조작된 동물 및/또는 클론일 수 있다.
항체: 용어 "항체"는 관련 기술 분야에서 인식된 용어이고, 공지된 항원에 결합하는 분자 또는 분자의 활성 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 공지된 항원에 결합하는 분자의 활성 단편의 예에는 Fab 및 F(ab')2 단편이 포함된다. 이러한 활성 단편은 많은 기술에 의해 본원발명의 항체로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 정제된 모노클로날 항체를 펩신과 같은 효소로 절단하고, HPLC 겔 여과시킬 수 있다. 이어서, Fab 단편을 함유하는 적절한 분획을 막 여과 등에 의해 수집하고 농축시킬 수 있다. 항체의 활성 단편의 단리를 위한 일반적인 기술의 추가 설명을 위해, 예를 들어 문헌 [Khaw, B. A. et al. J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982)]을 참조한다. 또한, 용어 "항체"에는 이중특이성 및 키메라 항체, 및 다른 가능한 형식이 포함된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 전장 면역글로불린 분자 (예를 들어, IgG 항체), 또는 항체 단편과 같은 면역글로불린 분자의 면역 활성 (즉, 특이적 결합) 부분을 지칭한다.
항체 단편은 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, sFv 등과 같은 항체의 일부이다. 구조와 상관없이, 항체 단편은 원형 항체에 의해 인식되는 동일한 항원과 결합한다. 예를 들어, 3F8 모노클로날 항체 단편은 3F8에 의해 인식되는 에피토프와 결합한다. 또한, 용어 "항체 단편"에는 항원-결합 구조를 포함하고 복합체를 형성하기 위해 특이성 항원에 결합함으로써 항체처럼 작용하는 임의의 합성 단백질 또는 유전자 조작된 단백질이 포함된다. 예를 들어, 항체 단편에는 가변 영역으로 이루어진 단리된 단편, 예컨대 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 이루어진 "Fv" 단편, 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단일쇄 폴리펩티드 분자 ("scFv 단백질"), 및 초가변 영역이거나 이를 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위가 포함된다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 항체 단편은 모 항체의 중쇄 또는 경쇄에서 발견되는 상보성 결정 영역 (CDR)을 하나 이상, 일부 실시양태에서 모두 포함한다. 일부 실시양태에서, 및 항체 단편은 CDR에 인접한 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 모 원형 항체의 일부분과 동일한 서열을 포함하며; 일부 실시양태에서, 일부분은 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하며; 일부 실시양태에서, 일부분은 전장 쇄에 해당한다. 일부 실시양태에서, 일부분은 길이가 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50개 또는 그 이상의 아미노산이다.
용어 "모노클로날 항체"는 관련 기술 분야에서 인식된 용어이다. 모노클로날 항체는 모두 고유한 모 세포의 클론인 한 유형의 면역 세포에 의해 제조되기 때문에, 이들은 동일한 단일특이성 항체이다.
모노클로날 항체의 생산을 위해 관련 기술 분야에는 다양한 방법이 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 문맥에서, 용어 "모노클로날 항체"는 단일 진핵, 파지 또는 원핵 클론으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 절차를 사용하여 (예를 들어, 쥐과 동물 항체의 중쇄 및 경쇄, 또는 인간, 인간화, 또는 다른 공급원으로부터의 상기 쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 쉽게 단리되고 서열이 밝혀질 수 있다. 단리되고 나면, DNA는 발현 벡터 내로 배치되고 이어서 NS0 세포, 시미안(Simian) COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 효모 세포, 조류 세포, 난류 또는 골수종 세포 (면역글로불린 단백질을 달리 생산하지 않음)와 같은 숙주 세포 내로 형질전환되어, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 얻을 수 있다. 또한, DNA는, 예를 들어 동종 인간 서열 대신에 목적하는 종의 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써 (미국 특허 제4,816,567호; 상기 문헌 [Morrison et al.]), 또는 비면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유결합적으로 연결함으로써 변형될 수 있다. 이러한 비면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 도메인에 대해 치환될 수 있거나, 또는 키메라 2가 항체를 만들어내기 위해 본 발명의 항체의 하나의 항원-조합 부위의 가변 도메인에 대해 치환될 수 있다.
일부 실시양태에서, "항체 작용제"는 항체 또는 그의 단편, 또는 이러한 항체 또는 그의 단편을 포함하거나 이들로 이루어진 작용제이거나 또는 이들을 포함한다.
유사한: 용어 "유사한"은 얻어진 결과 또는 관찰된 현상의 비교가 가능하도록 서로 충분히 유사한 2개 (또는 그 이상)의 세트의 조건 또는 상황을 기재하기 위해 본원에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 유사한 세트의 조건 또는 상황은 복수개의 실질적으로 동일한 특징 및 1개 또는 소수의 다른 특징으로 특성화된다. 통상의 기술자들은 충분한 수 및 종류의 실질적으로 동일한 특징으로 특성화되는 경우에 조건 세트가 서로 유사하여 다양한 세트의 조건 또는 상황 하에 얻어진 결과 또는 관찰된 현상에서의 차이가 이러한 변화된 특징에서의 변화에 의해 유발되거나 변화의 지표라는 합리적인 결론을 타당하도록 한다는 것을 알 것이다.
상응하는: 본원에서 사용되는 용어 "상응하는"은 관심 폴리펩티드에서의 아미노산 잔기의 위치/정체를 나타내기 위해 종종 사용된다. 통상의 기술자들은 간결함을 목적으로 폴리펩티드에서의 잔기를 폴리펩티드와 관련된 참고 문헌을 기초로 한 표준 위치번호 시스템을 사용하여 종종 표기하여, 예를 들어 위치 190에서의 잔기에 "상응하는" 아미노산은 실제로 특정 아미노산 쇄에서 190번째 아미노산일 필요는 없고 대신에 참조 폴리펩티드에서 190번째에 발견되는 잔기에 해당하도록 한다는 점을 이해할 것이며, 통상의 기술자들은 "상응하는" 아미노산을 식별하는 방법을 쉽게 이해한다.
투여 형태: 본원에서 사용되는 용어 "투여 형태" 및 "단위 투여 형태"는 치료되는 환자를 위한 치료 단백질 (예를 들어, 항체)의 물리적으로 분리된 단위를 지칭한다. 각 단위는 원하는 치료 효과를 생성하기 위해 계산된 미리 측정된 양의 활성 물질을 함유한다. 그러나, 조성물의 전체 투여량은 합리적인 의학적 판단의 범주 내에서 담당의에 의해 결정되는 것으로 이해될 것이다.
투여 요법: 본원에서 사용되는 용어로서의 "투여 요법" (또는 "치료 요법")은 통상적으로 일정 기간에 의해 분리되어 대상체에게 개별적으로 투여되는 한 세트 (통상적으로 하나 이상)의 단위 용량이다. 일부 실시양태에서, 주어진 치료제는 추천 투여 요법을 가지며, 이는 하나 이상의 용량을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 요법은 이들 각각이 동일한 간격의 기간에 의해 서로 분리되는 복수의 용량을 포함하며; 일부 실시양태에서, 투여 요법은 복수의 용량 및 개개 용량을 분리하는 2개 이상의 상이한 기간을 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여 요법 내의 모든 용량은 동일한 단위 투여량이다. 일부 실시양태에서, 투여 요법 내의 상이한 용량은 상이한 양이다. 일부 실시양태에서, 투여 요법은 제1 투여량에서의 제1 용량, 이어서 제1 투여량과는 상이한 제2 투여량에서의 하나 이상의 추가의 용량을 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여 요법은 제1 투여량에서의 제1 용량, 이어서 제1 투여량과 동일한 제2 투여량에서의 하나 이상의 추가의 용량을 포함한다.
에피토프 : 용어 "에피토프"는 관련 기술 분야에 인식되어 있다. 일반적으로, 이는 항체와 상호작용하는 항원 또는 항원들의 영역을 지칭하는 것으로 통상의 기술자에 의해 이해된다. 펩티드 또는 단백질 또는 당 항원의 에피토프는 선형 또는 입체형태적일 수 있거나, 또는 인접한 또는 비인접한 아미노산 및/또는 항원의 당 서열에 의해 형성될 수 있다. 많은 탄수화물과 같은 GD2 분자는 많은 에피토프를 함유한다. 통상의 기술자는 일부 실시양태에서 제공되는 항체 작용제가 예를 들어 하나 이상의 아미노산 또는 당 잔기의 치환, 변형, 부가, 결실 또는 화학적 모방체를 함유할 수 있는 그의 표적 에피토프의 변이체와 결합 (예를 들어, 교차 반응)할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 제공되는 항체 작용제에 부합하는 이러한 변이체 에피토프 및 그의 사용은 본원발명의 범주 내에 있다. 항-이디오타입 항체는 본원발명의 소정 실시양태이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 또는 당 에피토프, 또는 모방체 펩티드/화학 물질, 또는 항-이디오타입 항체는 면역친화도 컬럼 상에서 MoAb로부터 GD2를, 또는 GD2로부터 MoAb를 용리시키는데 편리한 방법을 제공한다. 추가로, 상기 에피토프의 말단절단(truncation)이 가능할 수 있다.
동일성: 본원에서 사용되는 용어 "동일성"은 중합체 분자, 예를 들어 핵산 분자 (예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자), 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 종합적인 관련성(relatedness)을 나타낸다. 2개 핵산 서열의 동일성％의 계산은 예를 들어 최적 비교 목적을 위한 2개 서열의 정렬에 의해 수행될 수 있다 (예를 들어, 최적 정렬을 위해 갭(gap)을 제1 및 제2 핵산 서열 중 하나 또는 모두에 도입하고, 비교 목적을 위해 비-동일성 서열을 무시할 수 있음). 소정 실시양태에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30％, 적어도 40％, 적어도 50％, 적어도 60％, 적어도 70％, 적어도 80％, 적어도 90％, 적어도 95％, 또는 실질적으로 100％이다. 이후, 상응하는 뉴클레오티드 위치에서의 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 뉴클레오티드에 의해 점유되어 있는 경우에, 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열 사이의 동일성％는 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 서열의 비교 및 두 서열 사이의 동일성％의 측정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 두 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성％는 마이어 및 밀러 (Meyers and Miller)의 알고리즘 (문헌 [CABIOS, 1989, 4: 11-17])을 사용하여 측정할 수 있으며, 이는 PAM120 중량 잔기 테이블(weight residue table), 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 도입된다. 다르게는, 두 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성％는 NWSgapdna.CMP 매트릭스를 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지에서의 GAP 프로그램을 사용하여 측정할 수 있다.
단리된 : 본원에서 사용되는 것과 같은, 용어 "단리된"은 (1) (천연적으로 및/또는 실험 설정에 의해) 최초 생성될 때 회합되는 성분 중 적어도 일부로부터 분리되고/거나, (2) 인간에 의해 생성, 제조 및/또는 제작된 물질 및/또는 개체를 지칭한다. 단리된 물질 및/또는 개체는 최초 회합된 다른 성분 중 약 10％, 약 20％, 약 30％, 약 40％, 약 50％, 약 60％, 약 70％, 약 80％, 약 90％, 약 91％, 약 92％, 약 93％, 약 94％, 약 95％, 약 96％, 약 97％, 약 98％, 약 99％, 또는 약 99％ 초과로 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 작용제는 약 80％, 약 85％, 약 90％, 약 91％, 약 92％, 약 93％, 약 94％, 약 95％, 약 96％, 약 97％, 약 98％, 약 99％, 또는 약 99％ 초과로 순수하다. 본원에서 사용되는 것과 같이, 물질은 다른 성분이 실질적으로 없는 경우에 "순수"하다. 본원에서 사용되는 것과 같이, 단리된 물질 및/또는 개체의 순도％의 계산에는 부형제 (예를 들어, 완충액, 용매, 물 등)가 포함되지 않아야 한다.
네이키드 ( naked ): 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 페이로드 (예를 들어, 진단제 또는 치료제)에 접합되지 않는 경우에 "네이키드"로 지칭될 수 있다. 이러한 네이키드 항체 작용제는 항체 분자의 Fc 부분이 보체 고정 및 ADCC (항체-의존 세포독성)와 같은 이펙터 기능을 제공하기 때문인 것을 비롯하여 다양한 문맥에서 유용하며, 이는 세포 용균을 초래할 수 있는 작용으로 메카니즘을 설정한다. 네이키드 항체에는 폴리클로날 및 모노클로날 항체 둘 다뿐만 아니라, 키메라, 인간화 또는 인간 항체와 같은 소정의 재조합 항체가 포함된다. 그러나, Fc 부분은 치료 기능에 대해 요구되지 않고, 오히려 항체는 세포 주기 휴지기 및 아폽토시스의 유도와 같은 다른 메카니즘을 통해 그의 치료 효과를 발휘하는 것이 가능하다. 이러한 경우에서, 네이키드 항체에는 또한 상기 정의된 접합되지 않은 항체 단편이 포함된다.
키메라 : "키메라" 항체는 하나의 종으로부터 유래된 항체, 바람직하게는 설치류 항체의 상보성-결정 영역 (CDR)을 포함하는 가변 도메인을 함유하면서도 항체 분자의 불변 도메인은 인간 항체의 것으로부터 유래된 재조합 단백질이다. 수의학적 적용을 위해, 키메라 항체의 불변 도메인은 고양이 또는 개와 같은 다른 종의 것으로부터 유래될 수 있다.
인간화: "인간화" 항체는, 하나의 종으로부터의 항체, 예를 들어 설치류 항체로부터의 CDR이 설치류 항체의 가변 중쇄 및 경쇄로부터 인간 중쇄 및 경쇄 가변 도메인으로 옮겨진 것인 재조합 단백질이다. 항체 분자의 불변 도메인은 인간 항체의 것으로부터 유래된다.
인간: 용어 "인간"은 항원 시험접종에 대한 반응에서 특이성 인간 항체를 생산하도록 "조작된" 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 항체를 지칭하기 위해 종종 사용된다. 상기 기술에서, 인간 중쇄 및 경쇄 좌위(locus)의 요소가, 내인성 중쇄 및 경쇄 좌위의 표적화된 파괴를 함유하는 배아 줄기 세포주로부터 유래된 마우스의 균주에 도입된다. 트랜스제닉 마우스는 인간 항원에 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있고, 마우스는 인간 항체-분비성 하이브리도마를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 트랜스제닉 마우스로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법은 문헌 [Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994)], 문헌 [Lonberg et al., Nature 368:856 (1994)] 및 [Taylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994)]에 기재되어 있다. 또한, 완전한 인간 항체는 유전자 또는 염색체 형질감염 방법뿐만 아니라 파지 디스플레이 기술에 의해 구축될 수 있으며, 이들은 모두 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 비면역화된 공여체로부터의 면역글로불린 가변 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 그의 단편의 시험관내 생산에 대하여 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)]을 참조한다. 상기 기술에서, 항체 가변 도메인 유전자는 필라멘트형 박테리오파지의 주 또는 부 코트 단백질 유전자 내로 인-프레임 클로닝되고, 파지 입자의 표면상에 기능성 항체 단편으로서 디스플레이된다. 필라멘트형 입자는 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 기초한 선별은 또한 상기 특성을 보이는 항체를 코딩하는 유전자의 선별을 초래한다. 상기 방식에서, 파지는 B-세포의 특성 중 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 형식으로 수행될 수 있고, 그들의 검토를 위해서는 예를 들어 문헌 [Johnson and Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571 (1993)]을 참조한다.
또한, 인간 항체는 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다. 미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호를 참조하고, 이들은 그 전문이 참조로 포함된다.
치료제: 치료제는 특정 요법에 따라 투여되는 경우에 원하는 치료 이점을 달성하는 경향이 있는 개체이다. 일부 실시양태에서, 치료제는 항체 모이어티와 별도로, 동시에 또는 순차적으로 투여되거나, 항체 모이어티, 즉 항체 또는 항체 단편, 또는 하위단편에 접합될 수 있고, 질환의 치료에 유용하다. 치료제의 예에는 항체, 항체 단편, 약물, 독소, 뉴클레아제, 호르몬, 면역조절제, 킬레이터, 붕소 화합물, 광활성 작용제 또는 염료 및 방사성 동위원소가 포함된다.
진단제 : 진단제는 투여되는 경우에 검출가능한 개체이다. 일부 실시양태에서, 진단제는 항체 모이어티, 즉 항체 또는 항체 단편 또는 하위단편에 접합되어 투여되며, 항원을 함유하는 세포를 찾아냄으로써 질환을 진단하거나 검출하는데 유용하다. 유용한 진단제에는 방사성 동위원소, 염료 (예컨대, 바이오틴-스트렙타비딘 복합체와 함께), 조영제, 형광 화합물 또는 분자, 및 자기 공명 영상법 (MRI)을 위한 향상제 (예컨대, 상자성 이온)가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 미국 특허 제6,331,175호는 MRI 기술 및 MRI 향상제에 접합된 항체의 제조를 기재하며, 이는 그 전문이 참조로 포함된다. 바람직하게는, 진단제는 방사성 동위원소, 자기 공명 영상법에 사용하기 위한 향상제, 및 형광 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 진단제는 방사성 또는 비-방사성 표지, 조영제 (예컨대, 자기 공명 영상법, 전산화 단층촬영 또는 초음파용)를 포함할 수 있으며, 방사성 표지는 감마-, 베타-, 알파-, 오제 전자- 또는 양전자-방출 동위원소일 수 있다. 방사성 금속 또는 상자성 이온을 갖는 항체 성분을 로딩하기 위해서, 이온에 결합하기 위한 다수의 킬레이팅 기에 부착된 긴 테일을 갖는 시약과 항체 성분을 반응시키는 것이 필수적일 수 있다. 이러한 테일은, 폴리리신, 다당류, 또는 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 포르피린, 폴리아민, 크라운 에테르, 비스-티오세미카르바존, 폴리옥심, 및 상기 목적에 유용한 것으로 공지된 유사한 기와 같이 킬레이팅 기에 결합될 수 있는 팬던트 기를 갖는 다른 유도체화된 또는 유도체화할 수 있는 쇄와 같은 중합체 일 수 있다. 킬레이트는 표준 화학을 이용하여 항체와 커플링될 수 있다. 보통, 킬레이트는 최소의 면역 반응성 손실 및 최소의 응집과 함께 분자로 결합되고/거나, 보다 흔치 않게는 다른 내부 가교의 형성을 가능하게 하는 기에 의해 항체에 연결되며, 킬레이트를 항체에 접합시키기 위한 방법 및 시약은 국 특허 제4,824,659호 (호손(Hawthorne), 발명의 명칭 "Antibody Conjugates", 1989년 4월 25일 허여)에 개시되어 있으며, 그의 개시내용 전문이 본원에 참조로 포함된다. 특히, 유용한 금속-킬레이트 조합물에는 방사성-영상법을 위한 진단 동위원소와 함께 사용되는 2-벤질-DTPA 및 그의 모노메틸 및 시클로헥실 유사체가 포함된다. 망간, 철 및 가돌리늄과 같은 비방사성 금속과 복합체화되는 경우, 동일한 킬레이트는 본 발명의 항체와 함께 사용되는 경우 MRI에 유용하다. NOTA, DOTA 및 TETA와 같은 마크로시클릭 킬레이트는 다양한 금속 및 방사성금속, 가장 특히 갈륨, 이트륨 및 구리의 방사성핵종과 함께 각각 사용된다. 이러한 금속-킬레이트 복합체는 관심있는 금속에 대해 고리 크기를 맞춤화함으로써 매우 안정하게 제조될 수 있다. RAIT를 위한 223Ra와 같은 핵종에 안정하게 결합하는 것에 대해 관심있는 다른 고리형 킬레이트, 예컨대 마크로시클릭 폴리에테르가 본원에 포함된다.
면역접합체: "면역접합체"는 페이로드 (예를 들어, 치료제 또는 진단제)와 항체 성분과의 접합체 (즉, 공유 연결)이다.
면역조절제: "면역조절제"는 존재하는 경우 전형적으로 대식세포, B-세포 및/또는 T 세포와 같은 면역 반응 캐스케이드에서 증식하거나 활성화되기 위해 면역 세포를 자극하는 작용제이다. 본원에 기재된 면역조절제의 예에는 사이토카인이 있다. 통상의 기술자는 특정 인터류킨 및 인터페론이 T 세포 또는 다른 면역 세포 증식을 자극하는 사이토카인의 예임을 이해할 것이다.
발현 벡터: "발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현되는 유전자를 포함하는 DNA 분자이다. 전형적으로, 유전자 발현은 구성적 또는 유도가능 프로모터, 조직-특이적 조절 요소 및 증진제를 비롯한 특정 조절 요소의 조절 하에 있다. 이러한 유전자는 상기 조절 요소에 "작동가능하게 연결"된 것으로 언급된다.
숙주 세포: 재조합 "숙주 세포"는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 함유하는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 또한, 상기 용어에는 상기 원핵 또는 진핵 세포뿐만 아니라, 숙주 세포의 염색체 또는 게놈 또는 숙주 세포의 세포에서 클로닝된 유전자(들)을 함유하기 위해 유전학적으로 조작된 트랜스제닉 동물이 포함된다.
돌연변이체: 본원에서 사용된 용어 "돌연변이체"는 참조 개체와 상당한 구조적 동일성을 나타내지만 참조 개체와 비교시 하나 이상의 화학적 모이어티의 존재 또는 수준이 참고 개체와 구조적으로 상이한 개체를 나타낸다. 많은 실시양태에서, 돌연변이체는 또한 그의 참조 개체와 기능적으로 상이하다. 일반적으로, 특정 개체가 참조 개체의 "돌연변이체"로 적절히 고려되는지 여부는 참조 개체와의 구조적 동일성의 정도에 기초한다. 통상의 기술자가 알고 있는 바와 같이, 임의의 생물학적 또는 화학적 참조 개체는 소정의 특징적 구조 요소를 갖는다. 정의상 돌연변이체는 하나 이상의 이러한 특징적 구조 요소를 공유하는 별개의 화학적 개체이다. 몇몇 예로서, 소분자는, 소분자의 돌연변이체가 코어 구조 요소 및 특징적인 펜던트 모이어티를 공유하지만 코어 내부에 존재하는 다른 펜던트 모이어티 및/또는 결합 유형 (단일 대 이중, E 대 Z 등)이 상이하도록 특징적인 코어 구조 요소 (예를 들어, 대환식 코어) 및/또는 하나 이상의 특징적인 펜던트 모이어티를 가질 수 있고, 폴리펩티드는, 서로에 대해 선형 또는 3차원 공간으로 지정된 위치를 갖고/거나 특정 생물학적 기능에 기여하는 복수의 아미노산으로 이루어진 특징적인 서열 요소를 가질 수 있고, 핵산은 서로에 대해 선형 또는 3차원 공간으로 지정된 위치를 갖는 복수의 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 특징적인 서열 요소를 가질 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 폴리펩티드는 1종 이상의 아미노산 서열의 차이 및/또는 폴리펩티드 골격에 공유결합으로 부착된 1종 이상의 화학적 모이어티 (예를 들어, 탄수화물, 지질 등)의 차이의 결과로서 참조 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드와 적어도 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％ 또는 99％의 전체 서열 동일성을 나타낸다. 다르게는 또는 부가적으로, 일부 실시양태에서, 돌연변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드와 하나 이상의 특징적인 서열 요소를 공유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 참조 폴리펩티드는 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드의 생물학적 활성 중 하나 이상을 공유한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 폴리펩티드에는 참조 폴리펩티드의 생물학적 활성 중 하나 이상이 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드와 비교시 하나 이상의 생물학적 활성의 감소된 수준을 나타낸다.
다중특이성: "다중특이성" 항체는 상이한 구조를 갖는 적어도 2종의 표적, 예를 들어 2종의 상이한 항원, 동일한 항원 상의 2종의 상이한 에피토프, 또는 합텐 및 항원 또는 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 항체이다. 한 특이성은, 예를 들어 B-세포, T-세포, 골수성-, 플라즈마-, 또는 비만-세포 항원 또는 에피토프에 대한 특이성일 것이다. 또 다른 특이성은 B-세포 상의 CD20, CD19, CD21, CD23, CD46, CD80, HLA-DR, CD74 또는 CD22와 같은 동일한 세포 유형의 상이한 항원에 대한 특이성일 수 있다. 다가의 다중특이성 항체는 하나 초과의 결합 부위를 갖는 구축물이고, 결합 부위는 상이한 특이성을 갖는다. 예를 들어, 하나의 결합 부위가 하나의 항원과 반응하고 다른 결합 부위가 또 다른 항원과 반응하는 이중특이성 디아바디(diabody)가 있다.
이중특이성 : "이중특이성" 항체는 상이한 구조를 갖는 2종의 표적에 동시에 결합할 수 있는 항체이다. 이중특이성 항체 (bsAb) 및 이중특이성 항체 단편 (bsFab)은, 예를 들어 GD2에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 아암, 및 치료제 또는 진단제를 갖는 표적가능한 접합체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 다른 아암을 갖는다. 다양한 이중특이성 융합 단백질은 분자 공학을 이용하여 생산될 수 있다. 한 형태에서, 이중특이성 융합 단백질은, 예를 들어 하나의 항원에 대해 단일 결합 부위를 갖는 scFv 및 제2 항원에 대해 단일 결합 부위를 갖는 Fab 단편으로 이루어진 2가이다. 또 다른 형태에서, 이중특이성 융합 단백질은, 예를 들어 하나의 항원에 대해 2개의 결합 부위를 갖는 IgG 및 제2 항원에 대한 2개의 동일한 scFv로 이루어진 4가이다.
최근 이중특이성 MoAb의 생산 방법에는, 보다 흔한 면역글로불린 이소형보다 더 강하게 가교되도록 추가의 시스테인 잔기를 갖는, 조작된 재조합 MoAb가 포함된다. 예를 들어, 문헌 [FitzGerald et al., Protein Eng. 10(10):1221-1225, 1997]을 참조한다. 또 다른 접근은, 요구되는 이중특이성을 가진 2개 이상의 상이한 단일쇄 항체 또는 항체 단편 세그먼트를 연결하는 재조합 융합 단백질을 조작하는 것이다. 예를 들어, 문헌 [Coloma et al., Nature Biotech. 15:159-163, 1997]을 참조한다. 다양한 이중특이성 융합 단백질이 분자 공학을 이용하여 생산될 수 있다.
2개 이상의 상이한 단일쇄 항체 또는 항체 단편을 연결하는 이중특이성 융합 단백질은 유사한 방식으로 생산된다. 재조합 방법이 다양한 융합 단백질을 생산하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가요성 링커는 scFv를 3F8 항체의 중쇄 불변 영역으로 연결한다. 대안적으로, scFv는 또 다른 인간화 항체의 경쇄 불변으로 연결될 수 있다. 중쇄 Fd를 scFv로 인-프레임 연결하는데 필요한 적절한 링커 서열은 PCR 반응을 통해 VL 및 Vkappa 도메인으로 도입된다. 이어서, scFv를 코딩하는 DNA 단편은 CH1 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 스테이징 벡터 내로 라이게이션된다. 생성된 scFv-CH1 구축물은 절단되고, hu3F8 항체의 VH 영역을 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 벡터로 라이게이션된다. 생성된 벡터는 이중특이성 융합 단백질의 발현을 위해 포유동물 세포와 같은 적절한 숙주 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 hu3F8 항체 및 그의 단편은 또한 기능성 이중특이성 단일쇄 항체 (bscAb) (디아바디로도 명명됨)를 제조하는 데 사용될 수 있고, 재조합 방법을 이용하여 포유동물 세포에서 생산될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 문헌 [Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 7021-7025, 1995]을 참고한다. 예를 들어, bscAb는 재조합 방법을 이용하여 글리신-세린 링커를 통해 2개의 단일쇄 Fv 단편을 연결함으로써 생산된다. 관심있는 2개의 항체의 V 경쇄 및 V 중쇄 도메인은 관련 기술분야에 공지된 표준 PCR 방법을 이용하여 단리된다. 이중특이성 단일쇄 항체 및 이중특이성 융합 단백질은 본 발명의 범주 내에 포함된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이중특이성 디아바디의 궁극적인 용도는 진단제/검출제 또는 치료제의 후속적인 특이적 전달을 위한, GD2 양성 세포의 예비표적화를 위한 것이다. 이러한 디아바디는 증가된 친화도 및 목적하는 위치에서의 보다 장기간의 체류 시간을 가능하게 하는 표적화된 항원에 선택적으로 결합한다. 게다가, 비-항원 결합 디아바디는 신체로부터 빠르게 제거되고, 정상 조직의 노출이 최소화된다. 소정의 특정 실시양태에서, 본원에서 사용하기 위한 디아바디에는 하나 이상의 진단제/검출제 및/또는 치료제, 예컨대 동위원소, 약물, 독소, 사이토카인, 호르몬, 성장 인자, 접합체, 방사성핵종 및 금속을 포함하거나 또는 이들과 접합될 수 있다. 예를 들어, 가돌리늄 금속은 자기 공명 영상법 (MRI)을 위해 사용된다. 또한, 특히 60 내지 4,000 keV의 에너지 범위에 있는 방사성핵종은 (디아바디와 함께 또는 이와 달리) 진단제 및 치료제로서 사용가능하다.
표적가능한 구축물은 다양한 구조를 가질 수 있으나, 면역 반응을 유발하는 것을 피하기 위해서, 및 또한 bsAb 표적화 방법에서 사용되는 경우 빠른 생체내 제거를 위해서 선별된다. 소수성 작용제는 강한 면역 반응을 유발하는데 최상인 반면, 친수성 작용제는 빠른 생체내 제거를 위해 바람직하기 때문에, 소수성 및 친수성의 균형이 확립될 필요가 있다. 이것은, 부분적으로 다수의 유기 모이어티의 고유 소수성을 상쇄시키기 위한 친수성 킬레이팅제를 사용하여 달성된다. 또한, 반대 용액 특성을 갖는 표적가능한 구축물의 서브유닛, 예를 들어 아미노산 중 일부는 소수성이고 아미노산 중 일부는 친수성인 아미노산을 함유하는 펩티드가 선택될 수 있다. 펩티드 이외에, 탄수화물이 사용될 수 있다.
펩티드: 2개 정도의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드가 사용될 수 있으며, 일부 실시양태에서 또한 킬레이팅제와 같은 다른 모이어티와 결합하는 경우, 2개 내지 10개의 잔기를 갖는 펩티드가 바람직하다.
폴리펩티드: 용어 "폴리펩티드"는 폴리펩티드 서열의 천연 단백질, 단편 또는 유사체를 나타내는 일반 용어로서 본원에서 사용된다. 따라서, 천연 단백질, 단편 및 유사체는 폴리펩티드 속의 종이다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 서열식별번호:4, 5, 10으로 나타낸 중쇄 면역글로불린 분자 및 서열식별번호:1, 2, 3, 6, 7, 8, 9로 나타낸 경쇄 면역글로불린 분자, 및 또한 중쇄 면역글로불린 분자와 경쇄 면역글로붙린 분자, 예컨대 카파 경쇄 면역글로불린 분자를 포함하는 조합 및 그 반대에 의해 형성된 항체 분자, 및 이들의 단편 및 유사체를 포함한다.
링커: 일부 실시양태에서, 접합체에서 사용된 "링커"는 접합체에 비해 저분자량, 바람직하게는 킬레이트 중에 있을 수 있는 금속 이온을 포함하여 50,000 달톤 미만, 및 유리하게는 약 20,000 달톤, 10,000 달톤 또는 5,000 달톤 미만의 분자량을 가져야 한다. 일부 실시양태에서, 링커 모이어티 상의 친수성 킬레이트 모이어티의 존재는 신속한 생체내 제거를 도울 수 있다. 킬레이터는 친수성 뿐만 아니라 그의 금속-결합 특성에 대해 선택될 수 있으며, 적어도 링커의 bsAb 에피토프가 펩티드의 일부이거나 비-킬레이트 화학 합텐인 경우에는 금속-킬레이트 착체의 인식이 더 이상 문제가 되지 않으므로, 임의로 교체될 수 있다.
돌연변이체: 본원에서 사용된 용어 "돌연변이체"는 참조 개체와 상당한 구조적 동일성을 나타내지만 참조 개체와 비교시 하나 이상의 화학적 모이어티의 존재 또는 수준이 참고 개체와 구조적으로 상이한 개체를 나타낸다. 많은 실시양태에서, 돌연변이체는 또한 그의 참조 개체와 기능적으로 상이하다. 일반적으로, 특정 개체가 참조 개체의 "돌연변이체"로 적절히 고려되는지 여부는 참조 개체와의 구조적 동일성의 정도에 기초한다. 통상의 기술자가 알고 있는 바와 같이, 임의의 생물학적 또는 화학적 참조 개체는 소정의 특징적 구조 요소를 갖는다. 정의상 돌연변이체는 하나 이상의 이러한 특징적 구조 요소를 공유하는 별개의 화학적 개체이다. 몇몇 예로서, 소분자는, 소분자의 돌연변이체가 코어 구조 요소 및 특징적인 펜던트 모이어티를 공유하지만 코어 내부에 존재하는 다른 펜던트 모이어티 및/또는 결합 유형 (단일 대 이중, E 대 Z 등)이 상이하도록 특징적인 코어 구조 요소 (예를 들어, 대환식 코어) 및/또는 하나 이상의 특징적인 펜던트 모이어티를 가질 수 있고, 폴리펩티드는, 서로에 대해 선형 또는 3차원 공간으로 지정된 위치를 갖고/거나 특정 생물학적 기능에 기여하는 복수의 아미노산으로 이루어진 특징적인 서열 요소를 가질 수 있고, 핵산은 서로에 대해 선형 또는 3차원 공간으로 지정된 위치를 갖는 복수의 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 특징적인 서열 요소를 가질 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 폴리펩티드는 1종 이상의 아미노산 서열의 차이 및/또는 폴리펩티드 골격에 공유결합으로 부착된 1종 이상의 화학적 모이어티 (예를 들어, 탄수화물, 지질 등)의 차이의 결과로서 참조 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드와 적어도 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％ 또는 99％의 전체 서열 동일성을 나타낸다. 다르게는 또는 부가적으로, 일부 실시양태에서, 돌연변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드와 하나 이상의 특징적인 서열 요소를 공유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 참조 폴리펩티드는 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드의 생물학적 활성 중 하나 이상을 공유한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 폴리펩티드에는 참조 폴리펩티드의 생물학적 활성 중 하나 이상이 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드와 비교시 하나 이상의 생물학적 활성의 감소된 수준을 나타낸다.
킬레이터: 킬레이터, 예컨대 DTPA, DOTA, TETA 또는 NOTA가 접합체를 포함한 임의의 다양한 환경에서 사용될 수 있다. 동일한 킬레이터가 비-방사성 금속, 예컨대 Mn, Fe 및 Gd와 착체를 형성하는 경우, 본 발명의 bsAb와 함께 사용시 MRI에 이용될 수 있다. 대환식 킬레이터, 예컨대 NOTA (1,4,7-트리아자-시클로노난-N,N',N''-트리아세트산), DOTA 및 TETA (p-브로모아세트아미도-벤질-테트라에틸아민테트라아세트산)가 다양한 금속 및 방사금속, 가장 특히 Ga, Y 및 Cu 각각의 방사성핵종과 함께 사용된다.
접합체: 일부 실시양태에서, 제공된 항체 작용제는 접합체에서 사용된다. 일부 특정 실시양태에서, 검출가능한 표지, 예컨대 형광 분자, 또는 세포독성제, 예컨대 중금속 또는 방사성핵종을 킬레이터, 예컨대 DTPA, DOTA, TETA 또는 NOTA, 또는 적합한 펩티드에 접합시킬 수 있다. 예를 들어, 치료상 유용한 면역접합체는 광활성제 또는 염료를 항체 융합 단백질에 접합시켜 얻어질 수 있다. 형광 조성물, 예컨대 형광색소, 및 다른 발색체 또는 염료, 예컨대 가시광선에 민감한 포르피린을 사용하여 적합한 광선을 병변에 조사함으로써 병변을 검출 및 치료하였다. 요법상 이는 광방사(photoradiation), 광요법 또는 광역동요법으로 명명된다 (문헌 [Jori et al. (eds.), PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES (Libreria Progetto 1985)]; [van den Bergh, Chem. Britain 22:430 (1986)]). 또한, 광요법을 달성하기 위해서 모노클로날 항체를 광활성 염료와 커플링시켰다 (문헌 [Mew et al., J. Immunol. 130:1473 (1983)]; [idem., Cancer Res. 45:4380 (1985)]; [Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8744 (1986)]; [idem., Photochem. Photobiol. 46:83 (1987)]; [Hasan et al., Prog. Clin. Biol. Res. 288:471 (1989)]; [Tatsuta et al., Lasers Surg. Med. 9:422 (1989)]; [Pelegrin et al., Cancer 67:2529 (1991)]). 그러나, 이러한 선행 연구는, 특히 항체 단편 또는 하위단편을 사용하는 내시경 요법 적용의 이용을 포함하지 않았다. 따라서, 본 발명은 광활성제 또는 염료를 포함하는 면역접합체의 치료 용도를 고려한다.
예방: 본원에서 사용된 용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"은 예방제 또는 치료제 투여의 결과로서 대상체에서 장애의 하나 이상의 증상의 재발 또는 발병의 예방을 나타낸다.
조합: 본원에서 사용된 용어 "조합하여"는 하나 초과의 예방제 및/또는 치료제의 사용을 나타낸다. 용어 "조합하여"의 사용은 예방제 및/또는 치료제가 장애를 가진 대상체에게 투여되는 순서를 제한하지 않는다. 제1 예방제 또는 치료제는 제2 예방제 또는 치료제의 투여 전에 (예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주 또는 12주 전에), 이와 동시에 또는 투여 후에 (예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주 또는 12주 후에) 장애를 가진 대상체에게 투여될 수 있다.
이펙터 기능: 본원에서 사용된 "이펙터 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용으로 인한 생화학적 사건을 의미한다. 이펙터 기능에는, 이들로 한정되지는 않지만, 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC), 항체 의존성 세포 매개된 식세포작용 (ADCP) 및 보체 매개 세포독성 (CMC)이 포함된다. 이펙터 기능에는 항원의 결합 후에 작동하는 것과 항원 결합과 무관하게 작동하는 것 둘 다가 포함된다.
이펙터 세포: 본원에서 사용된 "이펙터 세포"는, 하나 이상의 Fc 수용체를 발현하고 하나 이상의 이펙터 기능을 매개하는 면역계의 세포를 의미한다. 이펙터 세포에는, 이들로 한정되지는 않지만, 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 호산구, 비만 세포, 혈소판, 대형 과립 림프구, 랑게르한스 세포(Langerhans' cell), 자연 살해 (NK) 세포, T-림프구, B-림프구가 포함되고, 이들로 한정되지는 않지만, 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이를 포함한 임의의 유기체로부터의 것일 수 있다.
Fc 리간드: 본원에서 사용된 "Fc 리간드"는, 항체의 Fc 영역과 결합하여 Fc-리간드 복합체를 형성하는, 임의의 유기체로부터의 분자, 바람직하게는 폴리펩티드를 의미한다. Fc 리간드에는, 이들로 한정되지는 않지만, FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16A), FcγRIIIB (CD16B), FcγRI (CD64), FcεRII (CD23), FcRn, C1q, C3, 포도상구균 단백질 A, 포도상구균 단백질 G 및 바이러스 FcγR이 포함된다. Fc 리간드는 Fc와 결합하는 발견되지 않은 분자를 포함할 수 있다.
유도체: 본원에서 폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여 사용된 용어 "유도체"는 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가의 도입으로 인해 변경된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 또한, 본원에서 사용된 용어 "유도체"는, 즉, 임의 유형의 분자의 폴리펩티드 또는 단백질로의 공유 부착에 의해 변형된 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 예를 들어, 이들로 한정되지는 않지만, 항체는 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질가수분해성 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질과의 연결 등에 의해 변형될 수 있다. 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은, 이들로 한정되지는 않지만, 특정한 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 대사 합성 등을 비롯한 관련 기술분야에 공지된 기술을 이용한 화학적 변형으로 생성될 수 있다. 또한, 유도체 폴리펩티드 또는 단백질 유도체는 이를 유도한 폴리펩티드 또는 단백질과 유사하거나 동일한 기능을 갖는다.
단편: 본원에서 사용된 용어 "단편"은 또 다른 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 적어도 5개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 10개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 15개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 20개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 25개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 40개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 50개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 60개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 70개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 80개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 90개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 100개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 125개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 150개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 175개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 200개의 연속 아미노산 잔기 또는 적어도 250개의 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드의 단편은 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능을 보유한다.
유효량: 본원에서 사용된 용어 "유효량"은 소정의 화합물, 접합체 또는 조성물의 목적하는 생물학적 효과를 얻는 데 필요하거나 충분한 양을 나타낸다. 본 발명의 방법에 따른 소정의 화합물, 접합체 또는 조성물의 유효량은 이러한 선택된 결과를 달성하는 양이며, 이러한 양은 과도한 실험을 필요로 하지 않으면서 관련 기술분야에 공지되고/거나 본원에 기재된 검정을 이용하여 통상의 기술자가 일반적으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 암 전이를 치료 또는 예방하기 위한 유효량은 생체내 기저막 또는 내피층을 가로지르는 종양 세포의 이동 및 침습을 방지하는 데 필요한 양일 수 있다. 또한, 상기 용어는 "충분량"과 동의어이다. 임의의 특정 용도에 있어서 유효량은 치료할 질환, 장애 또는 병태, 투여할 특정 조성물, 투여 경로, 대상체의 크기 및/또는 질환 또는 병태의 중증도와 같은 요인에 따라 다양할 수 있다. 통상의 기술자는 과도한 실험을 필요로 하지 않으면서 본원에서 제공된 안내에 따라 본 발명의 특정 화합물, 접합체 또는 조성물의 유효량을 실증적으로 결정할 수 있다.
약: 측정량과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "약"은 측정의 객관성 및 사용된 측정 기기의 정확도에 비례하여 측정 및 어느 수준의 관리를 수행하는 통상의 기술자에 의해 예상되는 측정량에서의 일반적인 변화량을 나타낸다. 달리 명시하지 않는 한, "약"은 제공된 값의 +/-10％의 변화량을 나타낸다.
단리된: "단리된" 폴리펩티드, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체는 그의 자연 환경에서는 존재하지 않는 폴리펩티드를 의미한다. 특정 수준의 정제가 요구되지 않는다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 그의 천연 또는 자연 환경으로부터 꺼내어질 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합으로 생성된 폴리펩티드 및 단백질은 임의의 적합한 기술에 의해 분리, 분획, 또는 일부 또는 상당히 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드와 같이 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 고려된다.
소분자: 일반적으로, "소분자"는 크기가 약 5 킬로달톤 (kD) 미만인 분자이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 약 4 kD, 3 kD, 약 2 kD 또는 약 1 kD 미만이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 약 800 달톤 (D), 약 600 D, 약 500 D, 약 400 D, 약 300 D, 약 200 D 또는 약 100 D 미만이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 약 2000 g/mol 미만, 약 1500 g/mol 미만, 약 1000 g/mol 미만, 약 800 g/mol 미만 또는 약 500 g/mol 미만이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 비-중합성이다. 일부 실시양태에서, 본원발명에 따라, 소분자는 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리사카라이드, 당단백질, 프로테오글리칸 등이 아니다.
실질적으로: 본원에서 사용된 용어 "실질적으로"는 관심있는 특징 또는 특성의 전체 또는 거의-전체 범위 또는 정도를 나타내는 정성적 조건을 나타낸다. 생물 기술분야의 통상의 기술자는 생물학적 및 화학적 현상이 설령 완료되고/거나 완료를 위해 진행되거나 절대적 결과를 달성하거나 피하더라도 이는 극히 드물다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 및 화학적 현상에서 고유한 완료의 잠재적 결여를 나타내기 위해 본원에서 사용된다.
치료 유효량: 본원에서 사용된 용어 "치료 유효량"은 임의의 의학적 치료에 적용가능한 합당한 유익/위험 비로 치료 대상체에게 치료 효과를 제공하는 치료 단백질의 양을 나타낸다. 치료 효과는 객관적이거나 (즉, 일부 시험 또는 마커로 측정가능함) 또는 주관적일 수 있다 (즉, 대상체가 효과의 징후를 제공하거나 효과를 느낌). 특히, "치료 유효량"은 목적하는 질환 또는 병태를 치료, 완화 또는 예방하거나, 또는 예컨대 질환과 관련된 증상을 완화시키고/거나 질환 발생을 예방 또는 지연시키고/거나 또한 질환 증상의 중증도 또는 빈도를 감소시킴으로써 검출가능한 치료 또는 예방 효과를 나타내는 데 효과적인 치료 단백질 또는 조성물의 양을 나타낸다. 치료 유효량은 다수의 단위 용량을 포함할 수 있는 투여 처방계획에서 통상 투여된다. 임의의 특정 치료 단백질의 경우, 치료 유효량 (및/또는 효과적인 투여 처방계획 내 적합한 단위 용량)은 예를 들어 투여 경로, 다른 제약 제제와의 조합에 따라 달라질 수 있다. 또한, 임의의 특정 환자에 대한 구체적인 치료 유효량 (및/또는 단위 용량)은 치료할 장애 및 장애의 중증도; 사용된 구체적인 제약 제제의 활성; 사용된 구체적인 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반 건강, 성별 및 식이; 투여 시간, 투여 경로 및/또는 사용된 구체적인 융합 단백질의 배출 또는 대사 속도; 치료 기간; 및 의학 기술분야에 널리 공지된 것과 같은 기타 요인을 비롯한 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.
치료: 본원에서 사용된 용어 "치료", "치료하다", "치료된" 또는 "치료하는"은 예방 및/또는 요법을 나타내고, 여기서 특히, 바람직하지 않은 생리학적 변화 또는 장애, 예컨대 다발성 경화증의 진행을 예방하거나 지연 (감소) 시키는 것이 목적이다. 유익한 또는 목적하는 임상적 결과에는, 이들로 한정되지는 않지만, 검출가능 여부에 상관없이 증상의 경감, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 지체, 질환 상태의 완화 또는 일시적 완화, 및 (일부 또는 완전한) 차도가 포함된다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않은 경우의 예상 생존률에 비해 연장된 생존률을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 이들에는 이미 병태 또는 장애를 가진 이들 뿐만 아니라, 병태 또는 장애를 갖기 쉬운 이들, 또는 병태 또는 장애를 예방할 이들이 포함된다. "대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후 또는 요법을 원하는 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체를 의미한다. 포유동물 대상체에는 인간 및 다른 영장류, 가축, 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소(cattle, cow) 등이 포함된다.
단위 용량: 본원에서 사용된 표현 "단위 용량"은 단일 용량으로서 및/또는 제약 조성물의 물리적 분리 단위로 투여되는 양을 나타낸다. 많은 실시양태에서, 단위 용량은 미리 결정된 양의 활성제를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 전체 단일 용량의 작용제를 함유한다. 일부 실시양태에서, 하나 초과의 단위 용량을 투여하여 총 단일 용량을 달성한다. 일부 실시양태에서, 의도된 효과를 달성하기 위해 다수의 단위 용량의 투여가 필요하거나 필요할 것으로 예상된다. 단위 용량은 예를 들어 미리 결정된 양의 하나 이상의 치료제를 함유하는 한 부피의 액체 (예를 들어, 허용되는 담체), 미리 결정된 양의 하나 이상의 고체 형태의 치료제, 미리 결정된 양의 하나 이상의 치료제를 함유하는 지속 방출 제제 또는 약물 전달 장치 등일 수 있다. 단위 용량이 치료제 뿐만 아니라 임의의 다양한 성분을 포함하는 제제로 존재할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 허용되는 담체 (예컨대, 제약상 허용되는 담체), 희석제, 안정화제, 완충제, 보존제 등이 하기 기재된 바와 같이 포함될 수 있다. 통상의 기술자는, 많은 실시양태에서 특정 치료제의 총 적합한 일일 투여량이 일부의 또는 복수의 단위 용량을 포함할 수 있고, 이는 예를 들어 타당한 의학적 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 임의의 특정 대상체 또는 유기체에 대한 구체적인 유효 용량 수준은 치료할 장애 및 장애의 중증도; 사용된 구체적인 활성 화합물의 활성; 사용되는 구체적인 조성물; 대상체의 연령, 체중, 일반 건강, 성별 및 식이; 투여 시간, 및 사용된 구체적인 활성 화합물의 배출 속도; 치료 기간; 사용된 구체적인 화합물과 조합하여 또는 동시에 사용되는 약물 및/또는 추가 요법, 및 의학 기술분야에 널리 공지된 기타 요인을 비롯한 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.
신경모세포종
신경모세포종 (NB)은 아동의 가장 일반적인 두개외 고형 종양이다. 약 50％의 사례에서, 치유 전략은 골수 (BM)에서의 연조직 질량 및 전이를 모두 다루어야 한다. 용량-집중 화학요법은 종양의 절제가능성을 개선시키고, 수술후 조사는 원발성 부위에서의 재발 위험성을 10％ 미만으로 감소시킨다 (문헌 [Kushner et al., 2001, J Clin Oncol 19, 2821-8]). 그러나, BM 질환은 조직학 또는 메타아이오도벤질구아니딘 (MIBG) 스캔에 의해 입증된 바와 같이, 종종 치명적인 결과를 지속시키고 예감하게 한다 (문헌 [Matthay et al., 2003, J Clin Oncol 21, 2486-91]; [Schmidt et al., 2008, Eur J Cancer 44, 1552-8]). 또한, 유도 요법 후 거의 완전 관해의 달성에도 불구하고, 골수질의 재발은 흔하다. 치료 강화의 시도는 젊은 환자에 대한 심각한 우려인 급성 및 장기 부작용 둘 다에 직면하였다. 여러 유망한 단서가 계속 축적됨에도 불구하고, 지금까지 유망한 신규 작용제가 부족하며 임의의 표적/경로-특이적 소분자가 NB 환자에서 주요 임상적 이점을 나타낸 적은 거의 없었다. 18개월령 초과에서 진단된 단계 4 환자 중 독성 한계에서의 30％ 미만의 치유율과 함께 실질적인 개선의 여지가 존재한다 (문헌 [Pearson et al., 2008, Lancet Oncol 9, 247-56]).
본원발명은 몇몇 인자가 NB를 MoAb 표적화된 면역요법에 상당히 적합하게 한다는 것을 포함한다. 첫째, MoAb는 인간 백혈구의 존재 하에 매우 효율적인 NB의 항체-의존 세포 독성 (ADCC)을 매개한다. 둘째, MoAb는 붕괴촉진인자 CD55 (문헌 [Cheung et al., 1988, J Clin Invest 81, 1122-8]) 및 상동제한인자 CD59 (문헌 [Chen et al., 2000, Cancer Res 60, 3013-8])가 부족한 NB 세포의 보체-매개된 세포독성 (CMC)을 유도한다. NB 세포 상의 보체 침착은 호중구에 대한 iC3b 수용체의 활성화를 통하여 ADCC를 증진시키고 (문헌 [Kushner and Cheung, 1992, Blood 79, 1484-90], [Metelitsa et al., 2002, Blood 99, 4166-73]), 이는 콜로니 자극 인자가 주어지는 경우에 용량-집중 또는 골수형성 화학요법 및 줄기 세포 이식 후에도 이용가능하다 (문헌 [Mackall, CL, 2000, Stem Cells 18, 10-8)]). 셋째, 임상 관해를 달성하기 위한 집중 화학요법 (NB에 대한 표준 진료)의 이용이 장기 림프구감소증 및 면역억제를 유발하여 (문헌 [Mackall et al., 2000, Blood 96, 754-762]), 환자가 뮤린, 키메라 또는 인간화 MoAb를 거부할 가능성이 거의 없다 (문헌 [Kushner et al., 2007, Pediatr Blood Cancer 48, 430-4]).
참조 항-GD2 항체
GD2는 정상 조직에서 고도로 제한적으로 발현되며, 신경아세포종 및 흑색종을 비롯한 신경외배엽 기원의 종양에 풍부한 디시알로강글리오사이드(disialoganglioside)이다. 적어도 2종의 항-GD2 항체 패밀리, 즉, 3F8 (문헌 [Cheung et al., 1985, Cancer Res 45, 2642-9] 및 14.18 (문헌 [Mujoo et al., 1989, Cancer Res 49, 2857-61])를 NB 치료에 대해 임상적으로 시험하였다.
키메라 ch14.18은 뮤린 MoAb 14.18의 가변 영역 및 인간 IgG1-K의 불변 영역으로 이루어져 있다 (문헌 [Gillies et al., 1989, J Immunol Methods 125, 191-202]). 이는 생체내에서 NB 및 흑색종 세포의 ADCC 및 CMC를 입증한다 (문헌 [Barker et al., 1991, Cancer Res 51, 144-9]; [Barker and Reisfeld, 1993, Cancer Res. 52, 362-7]; [Mueller et al., 1990, PNAS USA 87, 5702-05]). 제I상 연구에서 임상 반응을 고무시키는 것에 기초하여, ch14.18을 단계 4 NB를 위한 공고 요법으로서의 대규모 제II상 연구 (게르만(German) NB90 및 NB97 연구)에서 시험하였다. 진단시 12개월 초과인 166명의 환자에 대해, 유지 화학요법 중인 환자와 비교시 ch14.18을 수여받은 환자에서 무사건 생존율 (EFS)은 유사할지라도, 전체 생존율 (OS)이 개선되었으며, BM 재발율은 ch14.18로 치료받은 환자에서 감소하였다 (문헌 [Simon et al., 2004, J Clin Oncol 22, 3549-57]).
2001년에, 아동암협회 (Children's Oncology Group (COG))는, 자가 줄기 세포 이식 (ASCT) 후 완전 관해 (CR) 환자에서 NB 재발을 예방하는 데 있어서의 GMCSF 및 IL-2와 ch14.18의 조합의 효능을 연구하기 위해서, 무작위 제III상 시험을 착수하였고 (ClinicalTrials.gov NCT00026312) (문헌 [Gilman et al., J Clin Oncol 27:85-91, 2009]), 여기서 2년의 무진행 생존율 (PFS) 및 OS에서의 유의한 개선이 밝혀졌다 (문헌 [Yu et al., N Engl J Med 363:1324-1334, 2010]).
GD2에 대해 특이적인 뮤린 IgG3 MoAb인 3F8은 세포 사망을 유도하고, 시험관내 NB에 대하여 효율적인 ADCC 및 CMC를 매개한다 (상기 문헌 [Cheung et al., 2007]). 용량-집중 유도 및 적극적인 구조 요법에도 불구하고, 화학내성 골수 질환을 갖는 환자 중에서 80％가 일반적으로 5일의 항체 및 GM-CSF 요법 1 내지 2 주기 후에 BM 차도를 달성하였다 (문헌 [Kushner et al., 2007, Proc Amer Soc Clin Oncol 25, 526s]). 화학내성 골수 질환에 대한 m3F8의 활성에 근거하여, 고무적인 결과를 갖는 제1 차도의 환자로 m3F8의 사용이 확대되었다. m3F8이 가장 높은 재발 위험의 처음 3-5년에 걸쳐 유지 요법으로서 제공되는 경우에, 아동에서의 상기 유리한 임상적 결과가 개선될 수 있었다. 그러나, 화학요법 종료시 면역계가 회복되는 경우, 인간 항-마우스 항체 반응 (HAMA)은 제한 인자이다. HAMA를 감소시키기 위한 하나의 전략은 3F8을 키메라화 또는 인간화하는 것이다.
본 발명자들은 이전에 인간화 3F8 (hu3F8-IgG1 H1L1, 이후 hu3F8V1)의 조작 및 단리를 기술하였다 (그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO 2011/160119 및 문헌 [Cheung et al., 2012, Oncoimmunology 1: 477-486]에 기재됨). 이들 항체는 표준 재조합 방법으로 제조되었고, 무혈청 배지에서의 CHO-DG44 세포주에 의한 높은 발현에 대해 선별되었다. 비아코어(Biacore) 시스템에 의해 사용된 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 측정된 경우, 인간화 3F8은 m3F8의 KD와 유사한 KD를 유지하였다. 다른 항-GD2 항체와는 대조적으로, hu3F8V1은 실질적으로 더 느린 koff (이는 시험관내의 더 느린 워시 오프(wash off)로 번역됨)를 가졌다. m3F8과 유사하게, 인간화 3F8은 시험관내의 세포 성장을 억제하였고, 이는 다른 항-GD2 항체에 대해 전형적이지 않다. hu3F8V1의 혈액 단핵 세포 (PBMC)-ADCC 및 호중구 (PMN)-ADCC는 모두 m3F8의 것보다 더 우수한 (10 내지 >1000배) 반면에, CMC는 더 열등했다. 이러한 우수성은 ADCC 검정에서 공여체에 무관하게, 또는 인간 CD16 또는 CD32로 형질감염된 NK92가 킬러로 사용된 경우에 지속적으로 관찰되었다. hu3F8V1은 m3F8과 비교시 NB 이종이식에 대해 우수한 항-종양 효과를 나타내었다.
제공된 항체 작용제
본원발명은 치료 효율을 강화시키기 위해 친화도가 향상된, 항체의 새로운 인간화 형태가 필요하다는 인식을 포함한다. 본원발명은 3F8 및/또는 hu3F8V1의 변이체인 항체 (또는 다른 항체 작용제)를 개발하는 것이 바람직하다는 인식을 포함한다. 본원발명은 특히 이러한 항체 및 항체 작용제를 제공한다. 즉, 본원발명은, 3F8 및/또는 hu3F8V1과 상당한 구조적 동일성을 나타내면서 또한 3F8 및/또는 hu3F8V1을 사용하여 관찰된 것에 비해 개선된 기능적 특성 (예를 들어, 안정성 및/또는 친화도 또는 특이성)을 나타내는 다양한 항체 작용제를 제공한다. 바람직한 특정 실시양태에서, 본 발명은 변이체 Fc 영역을 포함하는 분자를 포함하고, 여기서 상기 변이체 Fc 영역은 야생형 Fc 영역에 비해 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하여 상기 분자가 FcγR에 대해 변경된 친화도를 갖게 하되, 단, 상기 변이체 Fc 영역은 문헌 [Sondermann et al., 2000 (Nature, 406: 267-273)] (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 바와 같이 Fc-FcγR 상호작용의 결정학적 및 구조적 분석에 기초하여 FcγR과 직접 접촉하는 위치에서의 치환을 갖지는 않는다. FcγR과 직접 접촉하는 Fc 영역 내의 위치의 예는 아미노산 234-239 (힌지 영역), 아미노산 265-269 (B/C 루프), 아미노산 297-299 (C'/E 루프) 및 아미노산 327-332 (F/G) 루프이다. 몇몇 실시양태에서, 변이체 Fc 영역을 포함하는 본 발명의 분자는 구조적 및 결정학적 분석에 기초하여 FcγR과 직접 접촉하는 적어도 하나의 잔기의 변형을 포함한다.
본 발명의 한 측면은, 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는, 활성 및/또는 억제 수용체에 대해 변경된 친화도를 갖는 hu3F8 항체를 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 위치 239에서의 아스파르트산으로의 치환, 위치 330에서의 류신으로의 치환 및 위치 332에서의 글루탐산으로의 치환이다.
본 발명은, 참조 항체 (예를 들어, 참조 3F8 항체) Fc 영역에 비해 본 발명의 항체의 Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산에 대해 부가, 결실 및/또는 치환을 가져, 예를 들어 이펙터 기능을 변경하거나 또는 FcR에 대한 제공된 Fc의 친화도를 향상 또는 감소시킨, 변이체 Fc 영역을 포함하는 분자를 포함한다. 이러한 변이체 Fc 영역을 제조하고 사용하는 것은 본원에서 제공된 안내 하에 관련 기술분야의 범위 내에 있다. 따라서, 본 발명은 보다 높은 친화도로 하나 이상의 FcγR과 결합하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 분자를 포함한다. 이러한 분자는 바람직하게는 하기에서 논의되는 바와 같이 보다 효과적으로 이펙터 기능을 매개한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 참조 항체 (예를 들어, 참조 3F8 항체) Fc 영역보다 약한 친화도로 하나 이상의 FcγR과 결합하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 분자를 포함한다. 이펙터 기능의 감소 또는 제거는 특정 사례에서, 예를 들어 작용 메카니즘이 표적 항원을 가진 세포를 차단하거나 길항하지만 사멸시키지는 않는 것을 포함하는 항체의 사례에서 바람직하다. 이펙터 기능의 감소 또는 제거는 이펙터 세포에서 FcγR 활성 수용체를 차단하는 자가면역질환의 사례에서 바람직할 것이다 (상기 유형의 기능은 숙주 세포에서 존재함). 일반적으로, 증가된 이펙터 기능은 종양 및 외래 세포를 향할 것이다.
소정 실시양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는, 이들로 한정되지는 않지만, 이펙터 기능을 변경하는 변이체를 포함한 다른 Fc 변이체와 조합될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 Fc 변이체를 다른 Fc 변이체와 조합하여 항체 또는 Fc 융합체에 부가, 상승 또는 신규 특성을 제공하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 Fc 변이체는 이들과 조합하는 변이체의 표현형을 향상시킨다. 예를 들어, 본 발명의 Fc 변이체가, 야생형 Fc 영역을 포함하는 비교가능한 분자보다 높은 친화도로 FcγRIIIA와 결합하는 것으로 공지된 돌연변이체와 조합하는 경우, 본 발명의 돌연변이체와의 조합물은 FcγRIIIA 친화도를 보다 큰 배수로 향상시킨다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 하나 이상의 조작된 글리코형, 즉, Fc 영역을 포함하는 분자에 공유 부착된 탄수화물 조성물을 포함하는 항체 작용제 (예를 들어, 항체 또는 Fc 융합체)로 혼입되고, 여기서 상기 탄수화물 조성물은 Fc 영역을 포함하는 모 분자의 것과 화학적으로 상이하다.
본 발명은 바람직하게는 항체의 기능, 예를 들어 GD2 결합 활성을 변경시키지 않고 변형된 당화 부위를 갖는 항체를 포함한다. 본원에 사용된 "당화 부위"는 올리고사카라이드 (즉, 함께 연결된 2개 이상의 단순 당을 함유하는 탄수화물)가 특이적으로 및 공유적으로 부착하는, 항체에서의 임의의 특정한 아미노산 서열을 포함한다. 올리고사카라이드 측쇄는 전형적으로 N- 또는 O-연결을 통해 항체의 주쇄에 연결된다. N-연결된 당화는 아스파라긴 잔기의 측쇄에 올리고사카라이드 모이어티가 부착된 것을 나타낸다. O-연결된 당화는 히드록시아미노산, 예를 들어 세린, 트레오닌에 올리고사카라이드 모이어티가 부착된 것을 나타낸다. 특정 올리고사카라이드 (푸코스 및 말단 N-아세틸글루코사민 포함)가 결여된 Fc-글리코폼인 hu3F8-H1L1-IgG1n은 특정한 CHO 세포에서 생산되었고 향상된 ADCC 이펙터 기능을 나타내었다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 당화 부위를 부가 또는 결실시킴으로써 본 발명의 항체의 탄수화물 함량을 변형시키는 방법을 포함한다. 항체의 탄수화물 함량을 변형시키는 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있으며 본 발명 내에 포함된다 (예를 들어, 미국 특허 제6,218,149호; EP 0 359 096 B1; 미국 공보 US 2002/0028486; WO 03/035835; 미국 공보 2003/0115614; 미국 특허 제6,218,149호; 미국 특허 제6,472,511호를 참고하며, 이들 모두 그의 전문이 본원에 참고로 포함됨). 다른 실시양태에서, 본 발명은 항체의 하나 이상의 내인성 탄수화물 모이어티를 결실시킴으로써 본 발명의 항체의 탄수화물 함량을 변형시키는 방법을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 본 발명은 297 위치를 아스파라긴에서 알라닌으로 변형시킴으로써 항체의 Fc 영역의 당화 부위를 결실시키는 것을 포함한다.
조작된 글리코형은, 이들로 한정되지는 않지만, 이펙터 기능의 향상 또는 감소를 포함한 다양한 목적에 유용할 수 있다. 조작된 글리코형은 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해서, 예를 들어 조작되거나 변이된 발현 균주를 이용하거나, 하나 이상의 효소, 예컨대 DI N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTI11)과 함께 발현시키거나, 다양한 유기체 또는 다양한 유기체로부터의 세포주에서 Fc 영역을 포함하는 분자를 발현시키거나, Fc 영역을 포함하는 분자가 발현된 후 탄수화물을 변형시켜 생성될 수 있다. 조작된 글리코형을 생성하는 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있으며, 이들로 한정되지는 않지만, 문헌 [Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180]; [Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294]; [Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740]; [Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473]; 미국 특허 제6,602,684호; 미국 일련번호 제10/277,370호; 미국 일련번호 제10/113,929호; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; 포틸레전트(POTILLEGENT)™ 기술 (바이오와, 인크.(Biowa, Inc. 미국 뉴저지주 프린스톤 소재)); 글리코마브(GLYCOMAB)™ 당화 조작 기술 (글리카트 바이오테크놀러지 아게(GLYCART biotechnology AG, 스위스 취리히 소재)) (이들 각각은 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것들을 포함한다. 예를 들어, WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; 문헌 [Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49] (이들 각각은 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
또한, 상기 폴리펩티드의 단편, 유도체, 유사체 또는 변이체, 및 이들의 임의의 조합이 본 발명의 폴리펩티드로서 포함된다. 항-GD2 항체 또는 항체 폴리펩티드를 나타낼 때 용어 "단편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"는 상응하는 천연 항체 또는 폴리펩티드의 항원-결합 특성 중 적어도 일부를 보유하는 임의의 폴리펩티드, 즉, GD2 상의 하나 이상의 에피토프와 결합하는 능력을 보유하는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드의 단편은 본원에서 논의되는 특정 항체 단편 뿐만 아니라 단백질가수분해성 단편 및 결실 단편을 포함한다.
본 발명에 따라 유용한 항-GD2 항체 및 항체 폴리펩티드의 변이체는 상기 기재된 바와 같은 단편, 및 또한 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 자연 발생 또는 비-자연 발생일 수 있다. 비-자연 발생 변이체는 관련 기술 분야에 공지된 돌연변이유발 기술 또는 비천연 아미노산을 이용하여 생성될 수 있다. 변이 폴리펩티드는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 유용한 항-GD2 항체 및 항체 폴리펩티드의 유도체는 천연 폴리펩티드에서는 발견되지 않는 부가적인 특징을 나타내도록 변경된 폴리펩티드이다. 그 예에는 융합 단백질이 포함된다. 변이체 폴리펩티드는 또한 본원에서 "폴리펩티드 유사체"로도 언급될 수 있다. 본원에서 사용된 항-GD2 항체 또는 항체 폴리펩티드의 "유도체"는 관능성 측쇄의 반응으로 화학적으로 유도된 하나 이상의 잔기를 갖는 본 발명의 폴리펩티드를 나타낸다. 또한, 20개의 표준 아미노산 중 하나 이상의 자연 발생 아미노산 유도체를 함유하는 펩티드가 "유도체"로서 포함된다. 예를 들어, 4-히드록시프롤린이 프롤린 대신 사용될 수 있고; 5-히드록시리신이 리신 대신 사용될 수 있으며; 3-메틸히스티딘이 히스티딘 대신 사용될 수 있고; 호모세린이 세린 대신 사용될 수 있으며; 오르니틴이 리신 대신 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제공된 항체 작용제는 본원 실시예에 기재된 기능적 특성을 나타낸다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제공된 작용제는 모 3F8 항체 및/또는 그의 인간화 버전 (예를 들어, hu3F8V1)에 비해 개선된 결합을 나타낸다. 예시적인 인간화 버전에는 본원에 기재된 하나 이상의 구조적 특징을 갖는 것들이 포함된다. 일부 특정 실시양태에서, 구조적 특징에는 면역글로불린 가변 영역 서열의 인간 프레임워크 영역에서 나타나는 서열에 상응하는 하나 이상의 아미노산 치환이 포함된다. 일부 특정 실시양태에서, 구조적 특징에는 면역글로불린 가변 영역 서열의 인간 CDR 영역에서 나타나는 서열에 상응하는 하나 이상의 아미노산 치환이 포함된다. 일부 특정 실시양태에서, 구조적 특징에는 모 항체에 비해 제공된 작용제의 면역원성을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환이 포함된다. 일부 특정 실시양태에서, 구조적 특징에는 모 항체에 비해 제공된 작용제의 T-세포 에피토프를 감소시키거나, 경감시키거나 또는 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 포함된다. 일부 실시양태에서, 제공된 작용제는 표 2에 나타낸 것들을 포함하는 구조적 특징을 갖는다.
일부 실시양태에서, 제공된 항체 작용제는 GD2와 결합하는 상이한 항체의 친화도보다 적어도 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％ 또는 그보다 더 큰 친화도로 GD2에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제공된 항체 작용제는 GD2에 대한 상이한 항체의 친화도보다 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배 또는 적어도 20배 더 큰 친화도로 GD2에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제공된 항체 작용제는 GD2에 결합하는 상이한 상체의 친화도보다 20배 초과, 30배 초과, 40배 초과, 50배 초과, 60배 초과, 70배 초과, 80배 초과, 90배 초과 또는 100배 초과로 더 큰 친화도로 GD2에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제공된 항체 작용제는 상이한 강글리오시드, 예컨대 GD1b에 대해 2배 이내, 3배 이내, 4배 이내, 5배 이내, 6배 이내, 7배 이내, 8배 이내, 9배 이내 또는 10배 이내의 친화도로 서로 결합하는 결합 친화도를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 제공된 항체 작용제는 ADCC 또는 CMC 검정에서 본원에 기재되고/거나 예시된 범위 내의 상대적인 효력 (예를 들어, 3F8 EC50/항체 EC50 또는 hu3F8V1 EC50/항체 EC50의 비)을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 제공된 항체 작용제는 GD2에 결합하는 모 항체에 비해 적어도 1.0, 적어도 1.5, 적어도 2.0, 적어도 2.5, 적어도 3.0, 적어도 3.5, 적어도 4.0, 적어도 4.5, 적어도 5.0, 적어도 5.5, 적어도 6.0, 적어도 6.5, 적어도 7.0, 적어도 7.5, 적어도 8.0, 적어도 8.5, 적어도 9.0, 적어도 9.5, 적어도 10.0, 적어도 10.5, 적어도 11.0, 적어도 11.5, 적어도 12.0, 적어도 12.5, 적어도 13.0, 적어도 13.5, 적어도 14.0, 적어도 14.5, 적어도 15.0, 적어도 15.5, 적어도 16.0, 적어도 16.5, 적어도 17.0, 적어도 17.5, 적어도 18.0, 적어도 18.5, 적어도 19.0, 적어도 19.5, 적어도 20.0, 적어도 20.5, 적어도 21.0, 적어도 21.5, 적어도 22.0, 적어도 22.5, 적어도 23.0, 적어도 23.5, 적어도 24.0, 적어도 24.5, 적어도 25.0, 적어도 25.5, 적어도 26.0, 적어도 26.5, 적어도 27.0, 적어도 27.5, 적어도 28.0, 적어도 28.5, 적어도 29.0, 적어도 29.5 또는 적어도 30.0의 상대적인 효력을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 제공된 항체 작용제는 100 nM 미만, 90 nM 미만, 80 nM 미만, 70 nM 미만, 60 nM 미만, 50 nM 미만, 40 nM 미만, 30 nM 미만, 20 nM 미만 또는 10 nM 미만의 KD (nM)로 GD2에 결합함을 나타낸다. 일부 특정 실시양태에서, 제공된 항체 작용제는 9 nM 미만, 8 nM 미만, 7 nM 미만, 6 nM 미만, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만 또는 1 nM 미만의 KD (nM)로 GD2에 결합함을 나타낸다. 일부 특정 실시양태에서, 제공된 항체 작용제는 약 0.2 nM, 약 0.3 nM, 약 0.4 nM, 약 0.5 nM, 약 0.6 nM, 약 0.7 nM, 약 0.8 nM, 약 0.9 nM, 약 1.0 nM, 약 1.1 nM, 약 1.2 nM, 약 1.3 nM, 약 1.4 nM, 약 1.5 nM, 약 1.6 nM, 약 1.7 nM, 약 1.8 nM, 약 1.9 nM, 약 2.0 nM, 약 2.1 nM, 약 2.2 nM, 약 2.3 nM, 약 2.4 nM, 약 2.5 nM, 약 2.6 nM, 약 2.7 nM, 약 2.8 nM, 약 2.9 nM, 또는 약 3.0 nM의 KD (nM)로 GD2에 결합함을 나타낸다. 일부 특정 실시양태에서, 제공된 항체 작용제는 약 1 nM, 약 2 nM, 약 3 nM, 약 4 nM, 약 5 nM, 약 6 nM, 약 7 nM, 약 8 nM, 또는 약 9 nM의 KD (nM)로 GD2에 결합함을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 제공된 항체 작용제는 하계가 약 2.0x10-4 s-1이고 상계가 약 20.0x10-4 s-1의 Koff (s-1)로 GD2에 결합함을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 제공된 항체 작용제는 하계가 2x10-4 s-1, 3x10-4 s-1, 4x10-4 s-1, 5x10-4 s-1, 6x10-4 s-1, 7x10-4 s-1, 8x10-4 s-1, 9x10-4 s-1 이상으로 이루어진 군으로부터 선택되고 상계가 10x10-4 s-1, 11x10-4 s-1, 12x10-4 s-1, 13x10-4 s-1, 14x10-4 s-1, 15x10-4 s-1, 16x10-4 s-1, 17x10-4 s-1, 18x10-4 s-1, 19x10-4 s-1, 20x10-4 s-1 이상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 Koff (s-1)로 GD2에 결합함을 나타낸다. 일부 특정 실시양태에서, 제공된 항체 작용제는 약 2.9x10-4 s-1, 5.1x10-4 s-1, 6.9x10-4 s-1, 8.8x10-4 s-1 또는 18.5x10-4 s-1의 Koff (s-1)로 GD2에 결합함을 나타낸다.
인간화 항체 작용제
한 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공된 항체는 모노클로날 항체이고, 바람직한 실시양태에서 이는 다른 종으로부터 유래된 동족 항-GD2 항체의 인간화 버전이다. 인간화 항체는, 항원 결합을 필요로 하지 않는 인간 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 (예를 들어, 불변 영역, 및 가변 도메인의 프레임워크 영역)의 일부 또는 모든 아미노산을 동족의 비인간 항체의 경쇄 또는 중쇄로부터의 상응하는 아미노산 대신 사용하는 재조합 DNA 기술에 의해 생성된 항체이다. 예로서, 소정의 항원에 대한 뮤린 항체의 인간화 버전은 그의 중쇄 및 경쇄 모두에 (1) 인간 항체의 불변 영역; (2) 인간 항체의 가변 도메인으로부터의 프레임워크 영역; 및 (3) 뮤린 항체로부터의 CDR을 갖는다. 필요한 경우, 인간 프레임워크 영역 내 하나 이상의 잔기를 뮤린 항체 내 상응하는 위치의 잔기로 교체하여 항원에 대한 인간화 항체의 결합 친화도를 보존할 수 있다. 이러한 변화를 종종 "복귀 돌연변이"라 칭한다. 유사하게, 전진 돌연변이는 원하는 이유, 예를 들어 안정성 또는 항원 친화도를 위해 뮤린 서열로의 복귀를 다시 되돌릴 수 있다. 예를 들어, hu3F8-H1L1 (또는 hu3F8V1)의 경우, 시험관내 결합 친화도를 유지하기 위해서 중쇄 서열의 19 위치 및 경쇄의 17 위치에서의 복귀 돌연변이가 필요하였다. 일반적으로, 인간화 항체는 키메라 인간 항체보다 상당히 적은 비-인간 구성요소를 함유하므로 키메라 인간 항체에 비해 인간에서 면역 반응을 유발할 가능성이 적다.
본 발명의 인간화 항체의 적합한 제조 방법은, 예를 들어 문헌 [Winter EP 0 239 400]; [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)]; [Queen et al., Proc. Nat. Acad. ScL USA 86:10029 (1989)]; 미국 특허 6,180,370; 및 [Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA 86:3833 (1989)] (이들 모두의 개시내용의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 일반적으로, 뮤린 (또는 다른 비-인간) CDR의 인간 항체로의 이식은 다음과 같이 이루어진다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 cDNA를 하이브리도마로부터 단리한다. CDR을 포함한 가변 도메인의 DNA 서열을 염기서열결정법으로 결정한다. 목적하는 이소형의 인간 불변 영역 유전자 절편 (예를 들어, CH의 경우 γl 및 CL의 경우 κ)에 부착된, 인간 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 코딩 서열의 상응하는 영역에 삽입된 CDR을 코딩하는 DNA를 유전자 합성하였다. 인간화 중쇄 및 경쇄 유전자를 포유동물 숙주 세포 (예를 들어, CHO 또는 NSO 세포)에서 함께 발현시켜 적합한 인간화 항체를 생성하였다. 항체의 대규모 생산을 용이하게 하기 위해, 생산자 세포주에서 DHFR 유전자 또는 GS 유전자를 사용하는 고 발현체(high expressor)를 선택하는 것이 종종 바람직하다. 이러한 생산자 세포주를 생물반응기 또는 중공 섬유 배양 시스템에서 또는 웨이브 기술(WAVE technology)로 배양하여 가용성 항체의 대량 배양물을 생산하거나 또는 밀크(milk)에서 항체를 발현하는 트랜스제닉 포유동물 (예를 들어, 염소, 소 또는 양)을 생산한다 (예를 들어, 미국 특허 5,827,690 참조).
상술한 접근법을 이용하여 3F8 항체의 인간화 및 키메라 버전을 생성하였다. 상기 기재된 바와 같이, 경쇄 및 중쇄의 뮤린 3F8 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 사용하여, 뮤린 3F8 가변 영역이 인간 IgG1 (중쇄의 경우) 및 인간 카파 (경쇄의 경우) 불변 영역에 연결된, 뮤린-인간 키메라의 발현을 위한 벡터를 구축하였다. 또한, 다양한 글리코실화를 갖는 신규한 형태의 hu3F8을 만들어 Fc 수용체와의 결합을 향상시키고, 항원 친화도를 향상시켰다.
인간화 3F8 항체를 생성하기 위해서, 인간 수용자 프레임워크 도메인을 인간 생식세포 서열에 대한 상동성 매칭으로 선택하였다. 이러한 선택된 인간 수용자 프레임워크를 이용하여, 하기 실시예에 기재된 바와 같이 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 고안하고, 이들 각각의 다수의 변이체/버전을 생성 및 발현하였다.
완전 인간 항체는 인간 환자의 치유적 치료에 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 이용하여 상기 기재된 파지 디스플레이 방법을 비롯한 관련 기술 분야에 공지된 다양한 방법으로 생성될 수 있다. 또한, 미국 특허 제4,444,887호 및 동 제4,716,111호; 및 PCT 공보 WO 98/46645, WO 98/60433, WO 98/24893, WO 98/16664, WO 96/34096, WO 96/33735 및 WO 91/10741 (이들 각각은 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 또한, 콜(Cole) 등 및 뵈더(Boerder) 등의 기술도 인간 모노클로날 항체의 제조에 이용가능하다 (문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Riss, (1985)]; 및 [Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95, (1991)]).
다른 기술을 이용하여 생성되지만 본 발명의 항-GD2 항체의 가변 영역을 보유하는 인간 항체는 본 발명의 일부이다. 인간 항체는 또한, 기능성 내인성 마우스 면역글로불린은 발현시킬 수 없지만 인간 면역글로불린 유전자는 발현시킬 수 있는 트랜스제닉 마우스를 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체를 마우스 배아 줄기 세포에 무작위로 또는 상동 재조합에 의해 도입할 수 있다. 다르게는, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 뿐만 아니라, 인간 가변 영역, 불변 영역 및 다양성 영역을 마우스 배아 줄기 세포에 도입할 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동 재조합에 의한 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과 별개로 또는 동시에 비기능화될 수 있다. 특히, JH 영역의 동형 결실은 내인성 항체 생성을 막는다. 변형된 배아 줄기 세포를 팽창시키고, 배세포로 미세주입하여 키메라 마우스를 생성한다. 이어서, 상기 키메라 마우스를 번식시켜 인간 항체를 발현하는 동형 자손을 생산한다. 트랜스제닉 마우스를 선택된 항원, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 이용하여 통상의 방식으로 면역화한다. 항원에 대해 지정된 모노클로날 항체를 통상적인 하이브리도마 기술을 이용하여 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터 얻을 수 있다. 트랜스제닉 마우스에 의해 제공된 인간 면역글로불린 트랜스진은 B 세포 분화 중에 재배열되고, 이어서 종류 변환 및 체세포 돌연변이가 수행된다. 따라서, 이러한 기술을 이용하여 치료상 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생성하는 것이 가능하다. 인간 항체를 생성하는 상기 기술의 개관을 위해 문헌 [Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)]을 참조한다. 인간 항체 및 인간 모노클로날 항체를 생성하는 상기 기술 및 이러한 항체를 생성하는 프로토콜에 대한 자세한 논의는, 예를 들어 PCT 공보 WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; 유럽 특허 제0 598 877호; 미국 특허 제5,413,923호; 동 제5,625,126호; 동 제5,633,425호; 동 제5,569,825호; 동 제5,661,016호; 동 제5,545,806호; 동 제5,814,318호; 동 제5,886,793호; 동 제5,916,771호; 및 동 제5,939,598호 (이들의 전문은 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 또한, 아브제닉스, 인크.(Abgenix, Inc., 미국 캘리포니아주 프리몬트 소재), 젠팜(Genpharm, 미국 캘리포니아주 산 호세 소재) 및 메다렉스, 인크.(Medarex, Inc., 미국 뉴저지주 프린스톤 소재)와 같은 회사가 상기 기재된 바와 유사한 기술을 이용하여, 선택된 항원에 대해 지정된 인간 항체를 제공하기로 계약할 수 있다.
또한, 인간 MoAb는 인간 말초 혈액 백혈구, 비장세포 또는 골수가 이식된 면역화 마우스에 의해 생성될 수 있다 (예를 들어, XTL의 트리오마(Trioma) 기술). 선택된 에피토프를 인식하는 완전 인간 항체는 "안내된 선별"이라 불리는 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 상기 접근법에서, 선별된 비-인간 모노클로날 항체, 예를 들어 마우스 항체를 이용하여 동일한 에피토프를 인식하는 완전 인간 항체의 선별을 안내할 수 있다 (문헌 [Jespers et al., Bio/technology 12:899-903 (1988)]).
본원에서 사용된 "항-GD2 항체", "항-GD2 항체 부분" 또는 "항-GD2 항체 단편" 및/또는 "항-GD2 항체 변이체" 등은, 본원에 기재된 임의의 모노클로날 항체로부터 유래된 중쇄 또는 경쇄 중 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 그의 리간드 결합 부분을, 비-뮤린 기원, 바람직하게는 인간 기원의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 영역, 또는 이들의 임의의 부분과 조합하여 함유하는 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함하고, 이는 본 발명의 항체에 혼입될 수 있다. 다르게는, 용어 "항-GD2 항체"는 집합적으로 또는 개별적으로 단일 돌연변이를 갖는 hu3F8V1 IgG, 예를 들어 hu3F8V1-E1K, hu3F8V1-D32H, hu3F8V1-G54I; 이중 돌연변이를 갖는 hu3F8V1 IgG, 예를 들어 hu3F8V1-E1KD32H, hu3F8V1-E1KG54I, 및 hu3F8V1-D32HG54I; 삼중 돌연변이를 갖는 hu3F8V1 IgG, 예를 들어 hu3F8V1-E1KD32HG54I; hu3F8V5 IgG; 단일 돌연변이를 갖는 hu3F8V5 IgG, 예를 들어 hu3F8V5-E1K, hu3F8V5-D32H, hu3F8V5-G54I; 이중 돌연변이를 갖는 hu3F8V5 IgG, 예를 들어 hu3F8V5-E1KD32H, hu3F8V5-E1KG54I, 및 hu3F8V5-D32HG54I; 및 삼중 돌연변이를 갖는 hu3F8V5 IgG, 예를 들어 hu3F8V5-E1KD32HG54I 항체, 및 이들의 조합, 또한 이들의 단편 및 영역, 예컨대 본 발명의 단일 쇄 가변 단편, 예컨대 hu3F8V1-E1K scFv, hu3F8V1-D32H scFv, hu3F8V1-G54I scFv; 이중 돌연변이를 갖는 hu3F8V1 scFv, 예를 들어 hu3F8V1-E1KD32H scFv, hu3F8V1-E1KG54I scFv, 및 hu3F8V1-D32HG54I scFv; 삼중 돌연변이를 갖는 hu3F8V1 scFv, 예를 들어 hu3F8V1-E1KD32HG54I scFv; hu3F8V5 scFv; 단일 돌연변이를 갖는 hu3F8V5 scFv, 예를 들어 hu3F8V5-E1K scFv, hu3F8V5-D32H scFv, hu3F8V5-G54I scFv; 이중 돌연변이를 갖는 hu3F8V5 scFv, 예를 들어 hu3F8V5-E1KD32H scFv, hu3F8V5-E1KG54I scFv, 및 hu3F8V5-D32HG54I scFv; 삼중 돌연변이를 갖는 hu3F8V5 scFv, 예를 들어 hu3F8V5-E1KD32HG54I scFv, 및 이들의 조합을 나타낸다. 이러한 항체는 시험관내, 동일계내 및/또는 생체내 적어도 하나의 세포 기능을 조정, 감소, 길항, 진정, 경감, 차단, 억제, 완화 및/또는 방해할 수 있고, 여기서 상기 세포는 GD2를 발현한다. 비제한적인 예로서, 본 발명의 적합한 항-GD2 항체, 특정 부분 또는 변이체는 인간 GD2의 에피토프와 고친화도로 결합할 수 있다.
용어 "항체"는 항체, 그의 소화 단편, 특정 부분 및 변이체, 예컨대 항체 모방체, 또는 항체 또는 그의 특정 단편 또는 부분의 구조 및/또는 기능을 모방한 항체의 부분, 예컨대 단일쇄 항체 및 그의 단편을 추가로 포함하고, 이들 각각은 항-GD2 항체로부터 유래된 적어도 하나의 CDR을 함유한다. 기능성 단편은 포유동물 GD2와 결합하는 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들어, GD2와 결합할 수 있는 항체 단편 또는 그의 부분, 예컨대 이들로 한정되지는 않지만, Fab (예를 들어, 파파인 소화에 의해 생성됨), Fab' (예를 들어, 펩신 소화 및 일부 환원에 의해 생성됨) 및 F(ab')2 (예를 들어, 펩신 소화에 의해 생성됨), facb (예를 들어, 플라스민 소화에 의해 생성됨), pFc' (예를 들어, 펩신 또는 플라스민 소화에 의해 생성됨), Fd (예를 들어, 펩신 소화, 일부 환원 및 재결합에 의해 생성됨), Fv 또는 scFv (예를 들어, 분자 생물학 기술에 의해 생성됨) 단편이 본 발명에 포함된다 (예를 들어, 상기 문헌 [Colligan, Immunology] 참조).
항체 단편은 관련 기술 분야에 공지되고/거나 본원에 기재된 효소 절단, 합성 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 항체는 또한 하나 이상의 정지 코돈이 본래의 정지 코돈의 상류에 도입된 항체 유전자를 이용하여 다양한 말단절단형으로 생성될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 중쇄 부분을 코딩하는 조합 유전자가 중쇄의 CH1 도메인 및/또는 힌지 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하도록 고안될 수 있다. 항체의 다양한 부분을 통상의 기술에 의해 화학적으로 함께 결합할 수 있거나, 또는 유전자 조작 기술을 이용하여 연속 단백질로 제조할 수 있다.
본원에서 사용된 "키메라" 항체 또는 "인간화" 항체 또는 "CDR-그래프팅된"은 비-뮤린, 바람직하게는 인간 항체로부터 유래된 하나 이상의 단백질 또는 펩티드와 조합한 본원에 기재된 항-GD2 Ab 또는 이로부터 유래한 임의의 CDR의 임의의 조합을 포함한다. 본 발명에 따라, 키메라 또는 인간화 항체는, CDR이 본원에 기재된 항-GD2 Ab 및 적어도 하나의 부분 중 하나 이상으로부터 유래하거나 또는 항체의 나머지가 하나 이상의 인간 항체로부터 유래한 것들을 포함한다. 따라서, 항체의 인간 부분은 인간에서 실질적으로 비-면역원성인 프레임워크, CL, CH 도메인 (예를 들어, CH1, CH2, CH3), 힌지, (VL, VH) 영역을 포함할 수 있다. 인간 항체로부터 유래된 항체의 영역은 인간 항체와 100％ 동일성을 가질 필요는 없다. 바람직한 실시양태에서, 면역원성이 무시되도록 가능한 많은 인간 아미노산 잔기를 보유하지만, 필요에 따라 항체의 인간화를 최대화함과 동시에 CDR에 의해 형성된 항원 결합 부위를 지지하도록 인간 잔기를 변형할 수 있다. 이러한 변화 또는 변동은 임의로 및 바람직하게는 비-변형 항체에 비해 인간 또는 다른 종에서 면역원성을 유지 또는 감소시킨다. 인간화 항체가, 기능상 재배열된 인간 면역글로불린 (예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄) 유전자를 발현할 수 있는 비-인간 동물 또는 원핵 또는 진핵 세포에 의해 생산될 수 있다는 점에 주목한다. 또한, 항체가 단일쇄 항체인 경우, 천연 인간 항체에서는 발견되지 않는 링커 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fv는 링커 펩티드, 예컨대 2 내지 약 20개의 글리신 또는 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 8 내지 15개의 글리신 또는 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 이는 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역을 연결한다. 이러한 링커 펩티드는 인간 기원인 것으로 고려된다.
항체 인간화는, 예를 들어 개별 인간 프레임워크의 풀에 인 프레임 융합된 비-인간 표적 모노클로날 항체의 6개의 CDR을 포함하는 조합 라이브러리를 합성하여 수행될 수 있다. 모든 공지된 중쇄 및 경쇄 인간 생식세포 유전자를 대표하는 유전자를 함유하는 인간 프레임워크 라이브러리를 이용할 수 있다. 이어서, 생성된 조합 라이브러리를 관심 있는 항원과의 결합에 대해 스크리닝할 수 있다. 상기 접근법은 모 항체에 대한 결합 활성을 유지한다는 점에서 전체 인간 프레임워크의 가장 유리한 조합의 선택을 가능하게 한다. 이어서, 인간화 항체를 다양한 기술로 추가로 최적화할 수 있다.
항체 인간화를 이용하여 마우스 또는 다른 비-인간 항체를 "완전 인간" 항체로 변화시킬 수 있다. 생성된 항체는 오직 인간 서열만을 함유하고, 마우스 또는 비-인간 항체 서열은 함유하지 않으면서 출발 항체와 유사한 결합 친화도 및 특이성을 유지한다.
전장 항체 분자의 경우, 면역글로불린 유전자는 하이브리도마 세포주의 게놈 DNA 또는 mRNA로부터 얻어질 수 있다. 항체 중쇄 및 경쇄를 포유동물 벡터 시스템에서 클로닝한다. 어셈블리는 이중 가닥 서열 분석으로 증명된다. 항체 구축물은 다른 인간 또는 포유동물 숙주 세포주에서 발현될 수 있다. 이어서, 구축물을 관심 있는 발현 항체의 일시적 형질감염 검정 및 웨스턴 블럿 분석으로 확인할 수 있다. 생산성이 가장 높은 안정한 세포주를 단리하고, 급속 검정 방법을 이용하여 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 적어도 하나의 항-GD2 항체는 관련 기술 분야에 널리 공지된 바와 같이 세포주, 혼합 세포주, 불멸 세포 또는 불멸 세포의 클론 집단에 의해 임의로 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001)]; [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.sup.nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]; [Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]; [Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001)]; [Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)] (이들 각각은 완전히 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
한 접근법에서, 하이브리도마는 적합한 불멸 세포주 (예를 들어, 골수종 세포주, 예컨대 이들로 한정되지는 않지만, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A 등), 또는 헤테로골수종(heteromyeloma), 이들의 융합 생성물, 또는 이로부터 유래된 임의의 세포 또는 융합 세포, 또는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 다른 적합한 세포주 (예를 들어, www.atcc.org, www.lifetech.com 참조) 등을, 내인성 또는 이종 핵산으로서, 재조합 또는 내인성, 바이러스, 박테리아, 조류, 원핵, 양서류, 곤충, 파충류, 어류, 포유동물, 설치류, 말류, 양류, 염소, 양, 영장류, 진핵, 게놈 DNA, cDNA, rDNA, 미토콘드리아 DNA 또는 RNA, 엽록체 DNA 또는 RNA, hnRNA, mRNA, tRNA, 단일, 이중 또는 삼중 가닥, 혼성화 등, 또는 이들의 임의의 조합으로서 중쇄 또는 경쇄 불변 또는 가변 또는 프레임워크 또는 CDR 서열을 발현하는 항체 생산 세포, 예컨대 이들로 한정되지는 않지만, 단리 또는 클로닝된 비장, 말초 혈액, 림프, 편도선, 또는 다른 면역 또는 B 세포 함유 세포, 또는 임의의 다른 세포와 융합하여 생산된다. 예를 들어, 완전히 본원에 참조로 포함된 상기 문헌 [Ausubel] 및 [Colligan, Immunology], 챕터 2를 참조한다.
또한, 임의의 다른 적합한 숙주 세포를 이용하여 본 발명의 항체, 그의 특정 단편 또는 변이체를 코딩하는 이종 또는 내인성 핵산을 발현할 수 있다. 융합 세포 (하이브리도마) 또는 재조합 세포를 선택적 배양 조건 또는 다른 적합한 공지된 방법을 이용하여 단리할 수 있고, 한계 희석 또는 세포 선별, 또는 다른 공지된 방법으로 클로닝할 수 있다. 목적하는 특이성을 갖는 항체를 생산하는 세포를 적합한 검정 (예를 들어, ELISA)으로 선별할 수 있다.
본 발명의 항체는 또한, 적어도 하나의 항-GD2 항체를 코딩하는 핵산을 이용하여 밀크에서 이러한 항체를 생산하는 트랜스제닉 동물 또는 포유동물, 예컨대 염소, 소, 말, 양 등을 제공함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물은 공지된 방법을 이용하여 제공될 수 있다. 예를 들어, 이들로 한정되지는 않지만, 미국 특허 제5,827,690호; 동 제5,849,992호; 동 제4,873,316호; 동 제5,849,992호; 동 제5,994,616호; 동 제5,565,362호; 동 제5,304,489호 등 (이들 각각은 완전히 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
본 발명의 항체는 또한, 적어도 하나의 항-GD2 항체를 코딩하는 핵산을 이용하여 식물의 일부 또는 이로부터 배양된 세포에서 이러한 항체, 특정 부분 또는 변이체를 생산하는 트랜스제닉 식물 및 배양된 식물 세포 (예를 들어, 이들로 한정되지는 않지만, 담배 및 옥수수)를 제공함으로써 제조될 수 있다. 비제한적인 예로서, 재조합 단백질을 발현하는 트랜스제닉 담뱃잎이, 예를 들어 유도성 프로모터를 이용하여 다량의 재조합 단백질을 제공하는 데 성공적으로 사용되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 (1999)] 및 여기서 언급된 참고문헌을 참조한다. 또한, 트랜스제닉 옥수수를 사용하여, 다른 재조합 시스템에서 생산되거나 또는 자연 공급원으로부터 정제된 것과 동일한 생물학적 활성을 갖는 포유동물 단백질을 상업적 생산 수준으로 발현시켰다. 예를 들어, 문헌 [Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 (1999)] 및 여기서 언급된 참고문헌을 참조한다. 또한, 항체 단편, 예컨대 단일쇄 항체 (scFv's)를 포함하는 트랜스제닉 식물 종자, 예컨대 담배 종자 및 감자 덩이줄기로부터 항체를 다량 생산하였다. 예를 들어, 문헌 [Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101-109 (1998)] 및 여기서 언급된 참고문헌을 참조한다. 따라서, 본 발명의 항체는 또한 공지된 방법에 따라 트렌스제닉 식물을 사용하여 생산될 수 있다. 또한, 예를 들어 문헌 [Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (October, 1999)], [Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995)]; [Ma et al., Plant Physiol. 109:341-6 (1995)]; [Whitelam et al., Biochem Soc. Trans. 22:940-944 (1994)]; 및 여기서 언급된 참고문헌을 참조한다. 상기 참고문헌은 각각 완전히 본원에 참조로 포함된다.
항-GD2 항체는 널리 공지된 방법, 예컨대 이들로 한정되지는 않지만, 단백질 A 정제, 단백질 G 정제, 암모늄 술페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 또한, 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC")를 정제용으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)], 예컨대 챕터 1, 4, 6, 8, 9 및 10 (이들 각각은 완전히 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
본 발명의 항체는 천연 정제된 산물, 화학적 합성 절차의 산물, 및 진핵 숙주, 예컨대 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포로부터 재조합 기술에 의해 생산된 산물을 포함한다. 재조합 생산 절차에서 이용되는 숙주에 따라 본 발명의 항체는 글리코실화될 수 있거나 또는 비-글리코실화될 수 있는데, 글리코실화되는 것이 바람직하다. 이러한 방법은 많은 표준 실험 지침서, 예컨대 상기 Sambrook의 문헌, 섹션 17.37-17.42; 상기 Ausubel의 문헌, 챕터 10, 12, 13, 16, 18 및 20, 상기 Colligan의 문헌, Protein Science, 챕터 12-14 (이들 모두는 완전히 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다
정제된 항체를, 예를 들어 ELISA, ELISPOT, 유동세포계수법, 면역세포학, 비아코어(BIACORE)™ 분석, 사피다인 킨엑사(SAPIDYNE KINEXA)™ 운동 배제 검정, SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿, 또는 HPLC 분석, 뿐만 아니라 본원에 개시된 다수의 다른 기능 검정에 의해 특성화할 수 있다.
전형적인 포유동물 발현 벡터는 mRNA의 전사 개시를 매개하는 적어도 하나의 프로모터 요소, 항체 코딩 서열, 및 전사 종결 및 전사체의 폴리아데닐화에 필요한 신호를 함유한다. 추가 요소에는 인핸서, 코자크 서열, 및 RNA 스플라이싱을 위해 공여 및 수용 부위에 의해 플랭킹된 개재 서열이 포함된다. SV40으로부터의 전기 및 후기 프로모터, 레트로바이러스, 예를 들어 RSV, HTLVI, HIVI로부터의 장형 반복 말단 (LTRS), 및 거대세포바이러스 (CMV)의 전기 프로모터를 이용하여 높은 효율의 전사를 달성할 수 있다. 그러나, 또한 세포 요소 (예를 들어, 인간 액틴 프로모터)를 사용할 수도 있다. 본 발명의 수행시 사용하기에 적합한 발현 벡터에는, 예를 들어 pIRES1neo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN 또는 pLNCX (클론테크 랩스(Clonetech Labs, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) 또는 pcDNA3.1/Hygro (+/-) (인비트로겐), PSVL 및 PMSG (파마시아, 스웨덴 웁살라 소재), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) 및 pBC12MI (ATCC 67109)와 같은 벡터가 포함된다. 사용될 수 있는 포유동물 숙주 세포에는 인간 Hela 293, H9 및 Jurkat 세포, 마우스 NIH3T3 및 C127 세포, Cos 1, Cos 7 및 CV 1, 메추리 QC1-3 세포, 마우스 L 세포 및 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포가 포함된다.
다르게는, 유전자는 염색체로 통합되는 유전자를 함유한 안정한 세포주에서 발현될 수 있다. 선별가능한 마커, 예컨대 DHFR, GPT, 네오마이신 또는 하이그로마이신을 이용한 공동-형질감염은 형질감염된 세포의 확인 및 단리를 가능하게 한다.
또한, 형질감염된 유전자를 증폭시켜 다량의 코딩된 항체를 발현시킬 수 있다. DHFR (디히드폴레이트 리덕타제) 마커가 수백 또는 심지어 수천 개의 관심 유전자 카피를 갖는 세포주를 나타나게 하는 데 유용하다. 또 다른 유용한 선별 마커는 효소 글루타민 신타제 (GS)이다 (문헌 [Murphy, et al., Biochem. J. 227:277-279(1991)]; [Bebbington, et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992)]). 이들 마커를 사용하여, 포유동물 세포를 선별 배지에서 성장시키고, 가장 높은 내성을 갖는 세포를 선별한다. 이들 세포주는 염색체로 통합된 증폭된 유전자를 함유한다. 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 및 NSO 세포를 항체 생산을 위해 종종 사용한다.
본 발명에 따르면, 항-GD2 항체는 hu3F8V1-E1K, hu3F8V1-D32H, hu3F8V1-G54I; 이중 돌연변이를 갖는 hu3F8V1, 예를 들어 hu3F8V1-E1KD32H, hu3F8V1-E1KG54I, 및 hu3F8V1-D32HG54I; 삼중 돌연변이를 갖는 hu3F8V1, 예를 들어 hu3F8V1-E1KD32HG54I; hu3F8V5 IgG; 단일 돌연변이를 갖는 hu3F8V5, 예를 들어 hu3F8V5-E1K, hu3F8V5-D32H, hu3F8V5-G54I; 이중 돌연변이를 갖는 hu3F8V5, 예를 들어 hu3F8V5-E1KD32H, hu3F8V5-E1KG54I, 및 hu3F8V5-D32HG54I; 및 삼중 돌연변이를 갖는 hu3F8V5 IgG, 예를 들어 hu3F8V5- E1KD32HG54I 항체, 또는 가변 영역 또는 CDR이 hu3F8V1-E1K, hu3F8V1-D32H, hu3F8V1-G54I; 이중 돌연변이를 갖는 hu3F8V1, 예를 들어 hu3F8V1-E1KD32H, hu3F8V1-E1KG54I, 및 hu3F8V1-D32HG54I; 삼중 돌연변이를 갖는 hu3F8V1, 예를 들어 hu3F8V1-E1KD32HG54I; hu3F8V5 IgG; 단일 돌연변이를 갖는 hu3F8V5, 예를 들어 hu3F8V5-E1K, hu3F8V5-D32H, hu3F8V5-G54I; 이중 돌연변이를 갖는 hu3F8V5, 예를 들어 hu3F8V5-E1KD32H, hu3F8V5-E1KG54I, 및 hu3F8V5-D32HG54I; 및 삼중 돌연변이를 갖는 hu3F8V5, 예를 들어 hu3F8V5-E1KD32HG54I 항체 중 어느 하나로부터 유래하고 항체의 프레임워크 및 불변 영역이 하나 이상의 인간 항체로부터 유래한 항체 중 어느 하나를 포함한다. 상기 항체로부터 유래된 가변 영역 또는 CDR은, 항체가 GD2와 결합하는 능력을 유지하는 한 자연 돌연변이 또는 인간 조작에 의한 치환, 부가 및 결실을 포함하는 임의의 및 모든 변형이 고려되더라도, 바람직하게는 hu3F8V1-E1K, hu3F8V1-D32H, hu3F8V1-G54I; 이중 돌연변이를 갖는 hu3F8V1, 예를 들어 hu3F8V1-E1KD32H, hu3F8V1-E1KG54I, 및 hu3F8V1-D32HG54I; 삼중 돌연변이를 갖는 hu3F8V1, 예를 들어 hu3F8V1-E1KD32HG54I; hu3F8V5; 단일 돌연변이를 갖는 hu3F8V5, 예를 들어 hu3F8V5-E1K, hu3F8V5-D32H, hu3F8V5-G54I; 이중 돌연변이를 갖는 hu3F8V5, 예를 들어 hu3F8V5-E1KD32H, hu3F8V5-E1KG54I, 및 hu3F8V5-D32HG54I; 및 삼중 돌연변이를 갖는 hu3F8V5, 예를 들어 hu3F8V5-E1KD32HG54I 중 어느 하나의 가변 영역 또는 CDR과 약 90％ 내지 약 100％의 동일성을 갖는다. 인간 항체로부터 유래된 키메라, 인간화 또는 CDR-그래프팅된 항체의 영역은 인간 항체와 100％ 동일성을 가질 필요는 없다. 바람직한 실시양태에서, 면역원성이 무시되도록 가능한 많은 인간 아미노산 잔기가 보유되지만, 인간 잔기, 특히 프레임워크 영역의 잔기는 본 발명에 따라 하기 본원에서 요구 및 교시되는 바와 같이 치환된다. 본원에 개시된 이러한 변형은 항체의 인간화를 최대화함과 동시에 CDR에 의해 형성된 항원 결합 부위를 지지하는 데 필요하다.
본원에 기재된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 보존적 아미노산 치환, 뿐만 아니라 아미노산 결실 및/또는 부가를 포함한 서열을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 제1 아미노산을 제1 아미노산과 유사한 화학적 및/또는 물리적 특성 (예를 들어, 전하, 구조, 극성, 소수성/친수성)을 갖는 제2 아미노산으로 대체하는 것을 나타낸다. 보존적 치환은 하기 군에 속하는 하나의 아미노산을 또 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함한다: 리신 (K), 아르기닌 (R) 및 히스티딘 (H); 아스파르테이트 (D) 및 글루타메이트 (E); 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q), 세린 (S), 트레오닌 (T), 티로신 (Y), K, R, H, D 및 E; 알라닌 (A), 발린 (V), 류신 (L), 이소류신 (I), 프롤린 (P), 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 메티오닌 (M), 시스테인 (C) 및 글리신 (G); F, W 및 Y; C, S 및 T.
물론, 아미노산 치환의 수는 상기 기재된 것들을 포함한 여러 요소에 따라 통상의 기술자가 결정할 것이다. 일반적으로 말해서, 임의의 소정의 항-GD2 항체, 단편 또는 변이체에 대한 아미노산 치환, 부가 또는 결실의 수는 본원에서 명시된 바와 같이 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 이하, 예컨대 1-30, 또는 이들 중 임의의 범위 또는 값일 것이다.
기능에 필수적인 본 발명의 항-GD2 항체 내 아미노산을 관련 기술 분야에 공지된 방법, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발에 의해 확인할 수 있다 (예를 들어, 상기 문헌 [Ausubel], 챕터 8, 15; 문헌 [Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)]). 알라닌-스캐닝 돌연변이유발 절차는 분자의 모든 잔기에 하나의 알라닌 돌연변이를 도입한다. 이어서, 생성된 돌연변이체 분자를 생물학적 활성, 예컨대 이들로 한정되지는 않지만 적어도 GD2와의 결합에 대해 시험한다. 또한, 항체 결합에 중요한 부위를 결정화, 핵 자기 공명 또는 광친화도 표지법과 같은 구조 분석으로 확인할 수 있다 (문헌 [Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992)] 및 [de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)]).
항-GD2 항체는 추가로 본원에 기재된 서열 중 적어도 하나로부터 유래된 CDR의 연속 아미노산의 70-100％ 중 적어도 하나의 폴리펩티드를 임의로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 면역글로불린쇄 또는 그의 일부 (예를 들어, 가변 영역, CDR)의 아미노산 서열은 표 1 내지 4 중 적어도 하나의 서열의 아미노산 서열에 대해 약 70-100％ (예를 들어, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 이들 중 임의의 범위 또는 값)의 동일성을 갖는다.
예시적인 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열이 본원에서 제공된다. 본원발명의 항체 또는 그의 특정 변이체는 본원발명의 항체로부터의 임의의 수의 연속 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 여기서 상기 수는 항-GD2 항체 내 연속 잔기의 수의 10-100％로 이루어진 정수의 군으로부터 선택된다. 임의로, 이러한 연속 아미노산의 하위서열은 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 또는 그 초과의 아미노산 길이, 또는 이들 중 임의의 범위 또는 값의 아미노산 길이이다. 또한, 이러한 하위서열의 수는 1 내지 20, 예컨대 적어도 2, 3, 4 또는 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 정수일 수 있다.
본원발명에 따라, 핵산 서열은 서열식별번호:32-45로 명시되고, 항-GD2 항체의 추정 아미노산 서열은 서열식별번호:1-31로 명시된다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각, 조합하여 항원 결합 부위를 형성하는 3개의 CDR을 함유한다. 3개의 CDR은 주로 CDR을 지지하는 기능을 하는 4개의 프레임워크 영역으로 둘러싸여 있다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 서열 내 CDR의 서열은 문헌 [Kabat et al. (1987) in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed., United States Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, Washington, D.C.]에 따른 컴퓨터-지원 정렬에 의해서 또는 예를 들어 문헌 [Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168:595]에 기재된 바와 같이 ENCAD 프로그램을 이용한 가변 영역의 분자 모델링에 의해서 확인할 수 있다.
본원발명의 인간화 항체, 단편 및 영역의 불변 (C) 영역을 코딩하는 인간 유전자는 공지된 방법에 의해 인간 태아 간 라이브러리로부터 유래될 수 있다. 인간 C 영역 유전자는 인간 면역글로불린을 발현 및 생산하는 인간 세포를 비롯하여 임의의 인간 세포로부터 유래될 수 있다. 인간 CH 영역은 감마, 뮤, 알파, 델타, 엡실론을 포함한 인간 H 쇄의 공지된 부류 또는 이소형, 및 이들의 하위유형, 예컨대 G1, G2, G3 및 G4 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. H 쇄 이소형은 항체의 다양한 이펙터 기능의 역할을 하므로, CH 영역의 선택은 목적하는 이펙터 기능, 예컨대 보체 고정 또는 항체-의존성 세포 독성 (ADCC)에서의 활성에 의해 좌우될 것이다. 바람직하게는, CH 영역은 감마 1 (IgG1) 또는 감마 4 (IgG4)로부터 유래된다.
인간 CL 영역은 인간 L 쇄 이소형인 카파 또는 람다, 바람직하게는 카파로부터 유래될 수 있다.
인간 면역글로불린 C 영역을 코딩하는 유전자는 표준 클로닝 기술 (문헌 [Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.sup.nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] 및 [Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology (1987-1993)])에 의해 인간 세포로부터 얻어진다. 인간 C 영역 유전자는 2가지 부류의 L 쇄, 5가지 부류의 H 쇄 및 이들의 하위부류를 나타내는 유전자를 함유하는 공지된 클론으로부터 용이하게 이용가능하다.
항체의 가변 영역의 서열은, 키메라 항체가 인간 GD2와 결합하는 능력을 유지하는 정도로 삽입, 치환 및 결실에 의해 변형될 수 있다. 통상의 기술자는 하기 기재된 기능 검정을 수행하여 상기 활성의 유지를 알 수 있다. 가변 영역은, 예를 들어 하기에서 확인된 가변 영역과 약 50％ 내지 약 100％ 상동성을 가질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체의 가변 영역은 하기에서 확인된 가변 영역과 약 80％ 내지 약 100％ 상동성을 갖는다. 보다 바람직한 실시양태에서, 가변 영역은 하기에서 확인된 가변 영역과 약 90％ 내지 약 100％ 상동성을 갖는다.
한 특정 측면에서, 본 개시내용의 바람직한 항-GD2 Mab는 본원에서 확인된 서열과 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 아미노산 서열 상동성을 갖는 가변 경쇄 영역을 포함하고, 추가로 본원에서 확인된 서열과 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 아미노산 서열 상동성을 갖는 가변 중쇄 영역을 포함한다.
바람직하게는, 본원발명의 항체 또는 항체의 항원-결합 단편 또는 그의 특정 부분 또는 변이체는 인간 GD2와 결합하여 하나의 GD2 단백질 또는 단편을 부분적으로 또는 실질적으로 중화함으로써 GD2를 통해 매개된 활성을 억제한다. 본원에서 사용된 용어 "중화 항체"는 GD2-의존성 활성을 검정에 따라 약 20-120％, 바람직하게는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100％ 또는 그 초과만큼 억제할 수 있는 항체를 나타낸다. 항-GD2 항체의 GD2-의존성 활성을 억제하는 능력은 바람직하게는 본원에 기재되고/거나 관련 기술 분야에 공지된 하나 이상의 적합한 검정에 의해 평가된다.
상술한 바와 같이, 본원발명은 또한 실질적으로 본원에 기재된 아미노산 서열과 동일한 서열의 아미노산을 포함하는 항체, 항원-결합 단편, 면역글로불린쇄 및 CDR에 관한 것이다. 이러한 항-GD2 항체는 본원에 명시된 바와 같이 자연 돌연변이 또는 인간 조작으로부터 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 항체 또는 항원-결합 단편, 및 이러한 쇄 또는 CDR을 포함하는 항체는 높은 친화도로 인간 GD2와 결합할 수 있다.
통상의 기술자는 본원발명이 본원발명의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 항체를 포함한다는 것을 알 것이다. 생물학적으로 활성인 항체는 천연 (비-합성), 내인성 또는 관련 및 공지된 항체의 특이적 활성의 적어도 20％, 30％, 또는 40％, 및 바람직하게는 적어도 50％, 60％, 또는 70％, 및 가장 바람직하게는 적어도 80％, 90％, 또는 95％-100％의 특이적 활성을 갖는다. 효소 활성 및 기질 특이성의 측정을 검정 및 정량화하는 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다.
또다른 측면에서, 본원발명은 유기 잔기의 공유 부착에 의해 변형된 본원에 기재된 인간 항체 및 항원-결합 단편에 관한 것이다. 이러한 변형은 개선된 약동학적 특성 (예를 들어, 생체내 혈청 반감기 증가)을 갖는 항체 또는 항원-결합 단편을 생성할 수 있다. 유기 잔기는 선형 또는 분지형 친수성 중합성 기, 지방산 기 또는 지방산 에스테르 기일 수 있다. 특정 실시양태에서, 친수성 중합성 기는 약 800 내지 약 120,000 달톤의 분자량을 가질 수 있으며, 폴리알칸 글리콜 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG)), 탄수화물 중합체, 아미노산 중합체 또는 폴리비닐 피롤리돈일 수 있으며, 지방산 또는 지방산 에스테르 기는 약 8 내지 약 40개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
본원발명의 변형된 항체 및 항원-결합 단편은 항체에 직접 또는 간접적으로 공유 결합된 하나 이상의 유기 잔기를 포함할 수 있다. 본원발명의 항체 또는 항원-결합 단편에 결합된 각각의 유기 잔기는 독립적으로 친수성 중합성 기, 지방산 기 또는 지방산 에스테르 기일 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "지방산"은 모노-카르복실산 및 디-카르복실산을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "친수성 중합성 기"는 옥탄에서보다는 물에서 보다 가용성인 유기 중합체, 예를 들어 폴리리신을 나타낸다. 따라서, 폴리리신의 공유 부착으로 변형된 항체가 본원발명에 포함된다. 본원발명의 항체를 변형시키기에 적합한 친수성 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 예를 들어 폴리알칸 글리콜 (예를 들어, PEG, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜 (mPEG), PPG 등), 탄수화물 (예를 들어, 덱스트란, 셀룰로스, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드 등), 친수성 아미노산의 중합체 (예를 들어, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리아스파르테이트 등), 폴리알칸 옥시드 (예를 들어, 폴리에틸렌 옥시드, 폴리프로필렌 옥시드 등) 및 폴리비닐 피롤리돈을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본원발명의 항체를 변형시키는 친수성 중합체는 각각의 분자 물질로서 약 800 내지 약 150,000 달톤의 분자량을 갖는다. 예를 들어, PEG5000 및 PEG20,000 (여기서, 아래첨자는 중합체의 평균 분자량 (달톤)임)이 사용될 수 있다. 친수성 중합성 기는 1 내지 약 6개의 알킬, 지방산 또는 지방상 에스테르 기로 치환될 수 있다. 지방산 또는 지방산 에스테르 기로 치환된 친수성 중합체는 적합한 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 아민 기를 포함하는 중합체는 지방산 또는 지방산 에스테르의 카르복실레이트와 커플링할 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르 상의 활성화된 카르복실레이트 (예를 들어, N,N-카르보닐 디이미다졸로 활성화됨)는 중합체 상의 히드록실 기와 커플링될 수 있다.
본원발명의 항체를 변형시키기에 적합한 지방산 및 지방산 에스테르는 포화될 수 있거나 또는 하나 이상의 불포화 단위를 함유할 수 있다. 본원발명의 항체를 변형시키기에 적합한 지방산에는, 예를 들어 n-도데카노에이트, n-테트라데카노에이트, n-옥타데카노에이트, n-에이코사노에이트, n-도코사노에이트, n-트리아콘타노에이트, n-테트라콘타노에이트, 시스-.델타.9-옥타데카노에이트, 모든 시스-.델타.5,8,11,14-에이코사테트라에노에이트, 옥탄디오산, 테트라데칸디오산, 옥타데칸디오산, 도코산디오산 등이 포함된다. 적합한 지방산 에스테르에는 선형 또는 분지형 저급 알킬 기를 포함하는 디카르복실산의 모노-에스테르가 포함된다. 저급 알킬 기는 1 내지 약 12개, 바람직하게는 1 내지 약 6개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
변형된 인간 항체 및 항원-결합 단편은 적합한 방법을 이용하여, 예컨대 하나 이상의 변형제와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "변형제"는 활성화 기를 포함하는 적합한 유기 기 (예를 들어, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)를 나타낸다. "활성화 기"는 적합한 조건 하에 제2 화학 기와 반응하여 변형제와 제2 화학 기 사이에 공유 결합을 형성할 수 있는 화학 기 또는 관능성 기이다. 예를 들어, 아민-반응성 활성화 기에는 친전자성 기, 예컨대 토실레이트, 메실레이트, 할로 (클로로, 브로모, 플루오로, 아이오도), N-히드록시숙신이미딜 에스테르 (NHS) 등이 포함된다. 티올과 반응할 수 있는 활성화 기에는, 예를 들어 말레이미드, 아이오도아세틸, 아크릴로일, 피리딜 디술피드, 5-티올-2-니트로벤조산 티올 (TNB-티올) 등이 포함된다. 알데히드 관능성 기는 아민- 또는 히드라지드-함유 분자와 커플링할 수 있고, 아지드 기는 3가 인 기와 반응하여 포스포르아미데이트 또는 포스포르이미드 연결기를 형성할 수 있다. 활성화 기를 분자에 도입하는 적합한 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Hernanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996)] 참조). 활성화 기는 유기 기 (예를 들어, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)와 직접 또는 링커 잔기, 예를 들어 2가 C1-C12 기 (여기서, 하나 이상의 탄소 원자는 헤테로원자, 예컨대 산소, 질소 또는 황으로 대체될 수 있음)를 통해 결합할 수 있다. 적합한 링커 잔기에는 몇 가지 예로서 테트라에틸렌 글리콜, -(CH2)3-, -NH-가 포함된다. 링커 잔기를 포함하는 변형제는, 예를 들어 모노-Boc-알킬디아민 (예를 들어, 모노-Boc-에틸렌디아민, 모노-Boc-디아미노헥산)을 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC)의 존재 하에 지방산과 반응시켜 유리 아민 및 지방산 카르복실레이트 사이에 아미드 결합을 형성함으로써 생성될 수 있다. Boc 보호기를 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 처리하여 생성물로부터 제거함으로써 1차 아민을 노출시킬 수 있고, 이를 기재된 바와 같이 또 다른 카르복실레이트와 커플링시킬 수 있거나 또는 말레산 무수물 및 고리화된 수득 생성물과 반응시켜 지방산의 활성화된 말레이미도 유도체를 생성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Thompson, et al., WO 92/16221] (그의 전체 교시내용은 본원에 참조로 포함됨) 참조).
본원발명의 변형된 항체는 인간 항체 또는 항원-결합 단편을 변형제와 반응시켜 생성할 수 있다. 예를 들어, 유기 잔기를 아민-반응성 변형제, 예를 들어 PEG의 NHS 에스테르를 사용하여 비-부위 특이적 방식으로 항체와 결합시킬 수 있다. 변형된 인간 항체 또는 항원-결합 단편은 또한 항체 또는 항원-결합 단편의 디술피드 결합 (예를 들어, 쇄내 디술피드 결합)을 환원시켜 제조할 수 있다. 이어서, 환원된 항체 또는 항원-결합 단편을 티올-반응성 변형제와 반응시켜 본원발명의 변형된 항체를 생성할 수 있다. 본원발명의 항체의 특정 부위와 결합한 유기 잔기를 포함하는 변형된 인간 항체 및 항원-결합 단편은 적합한 방법, 예컨대 역 단백질가수분해 (문헌 [Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992)]; [Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994)]; [Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997)]; [Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996)]; [Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)]), 및 문헌 [Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996)]에 기재된 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
본원발명의 항체는 하기에 나타낸 바와 같은 광범위한 친화도 (KD)로 인간 GD2와 결합할 수 있다.
항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합활성은 임의의 적합한 방법을 이용하여 실험상 측정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984)]; [Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992)]; 및 여기에 기재된 방법 참조). 특정 항체-항원 상호작용의 측정된 친화도는 다양한 조건 (예를 들어, 염 농도, pH) 하에 측정시 달라질 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 항원-결합 파라미터의 측정은 바람직하게는 항체 및 항원, 및 표준화된 완충제, 예컨대 본원에 기재된 완충제의 표준화된 용액을 사용하여 이루어진다.
본원발명의 방법 및 조성물에서 유용한 항-GD2 항체는 GD2와의 결합 및 바람직하게는 낮은 독성을 갖는 것으로 특성화된다. 특히, 본원발명의 항체, 특정 단편 또는 변이체 (여기서, 각 구성요소, 예컨대 가변 영역, 불변 영역 및 프레임워크는 개별적으로 및/또는 집합적으로, 임의로 및 바람직하게는 낮은 면역원성을 가짐)는 본원발명에서 유용하다. 임의로, 본원발명에서 사용될 수 있는 항체는 증상의 측정가능한 경감 및 낮은 및/또는 허용가능한 독성과 함께 연장된 기간 동안 환자를 치료하는 그의 능력을 특징으로 한다. 낮은 또는 허용가능한 면역원성 및/또는 높은 친화도, 및 또한 다른 적합한 특성은 달성된 치료 결과에 기여할 수 있다. "낮은 면역원성"은 치료를 받은 환자의 약 75％ 미만, 또는 바람직하게는 약 50％ 미만에서 유의한 HAHA, HACA 또는 HAMA 반응을 일으키고/거나 치료를 받은 환자에서 낮은 역가를 일으키는 것으로 본원에서 정의된다 (문헌 [Elliott et al., Lancet 344:1125-1127 (1994)], 완전히 본원에 참조로 포함됨).
2가지 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날, 인간화, 항체인 이중특이성, 이종특이성 이종접합체 또는 유사 항체가 또한 사용될 수 있다. 본원발명에서, 결합 특이성 중 하나는 적어도 하나의 GD2 단백질에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 이중특이성 항체의 제조 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 통상, 이중특이성 항체의 재조합 생성은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현에 기초하고, 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305:537 (1983)]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 임의 배열로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10개의 다양한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하고, 이들 중 단 하나만이 정확한 이중특이성 구조를 갖는다. 일반적으로 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 오히려 번거로우며, 생산 수율이 낮다. 유사한 절차가, 예를 들어 WO 93/08829, 미국 특허 제6,210,668호, 동 제6,193,967호, 동 제6,132,992호, 동 제6,106,833호, 동 제6,060,285호, 동 제6,037,453호, 동 제6,010,902호, 동 제5,989,530호, 동 제5,959,084호, 동 제5,959,083호, 동 제5,932,448호, 동 제5,833,985호, 동 제5,821,333호, 동 제5,807,706호, 동 제5,643,759호, 동 제5,601,819호, 동 제5,582,996호, 동 제5,496,549호, 동 제4,676,980호, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, 문헌 [Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991)], [Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)]; [Chan and Carter, 2010, Nature Rev. 10, 301-316]; [Weiner et al., 2010, Nature Rev. 10, 317-327] (각각은 완전히 본원에 참조로 포함됨)에 개시되어 있다.
특정 실시양태에서, GD2와 결합한 항체는 비접합된 형태로 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, GD2와 결합한 항체는 예를 들어 검출가능한 표지, 약물, 전구약물 또는 이소형과 접합될 수 있다.
하기 보다 자세히 기재된 본원발명의 특정 방법, 예컨대 종양 세포의 전이 가능성의 측정으로서 세포 또는 조직 내 GD2 발현을 검출하는 방법 또는 조직 내 제자리(in situ) 암종 (예를 들어, DCIS 또는 LCIS)을 확인하는 방법에서 항-GD2 항체를 하나 이상의 검출가능한 표지에 접합시킨다. 이러한 사용에서, 항체는 색원체, 효소, 방사성동위원소, 동위원소, 형광, 독성, 화학발광, 핵 자기 공명 조영제 또는 다른 표지의 공유 또는 비-공유 부착으로 검출가능하게 표지될 수 있다.
적합한 색원체 표지의 예에는 디아미노벤지딘 및 4-히드록시아조-벤젠-2-카르복실산이 포함된다.
적합한 효소 표지의 예에는 말레이트 데히드로게나제, 스타필로코칼 뉴클레아제, Δ-5-스테로이드 이소머라제, 효모-알콜 데히드로게나제, α-글리세롤 포스페이트 데히드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, β-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린 에스테라제가 포함된다.
적합한 방사성동위원소 표지의 예에는 3H, 111In, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, 67Cu, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd 등이 포함된다. 111In은 125I 또는 131I-표지된 GD2-결합 항체의 간에 의한 탈할로겐화 문제를 피할 수 있으므로, 생체내 영상화의 이용시 바람직한 동위원소이다. 또한, 상기 방사성뉴클레오티드는 영상화를 위한 보다 유리한 감마 방출 에너지를 갖는다 (문헌 [Perkins et al, Eur. J. Nucl. Med. 70:296-301 (1985)]; [Carasquillo et al, J. Nucl. Med. 25:281-287 (1987)]). 예를 들어, 1-(P-이소티오시아네이토벤질)-DPTA를 갖는 모노클로날 항체와 커플링된 111In은 비-종양 조직, 특히 간에서 거의 흡수되지 않는 것으로 나타났고, 이에 따라 종양 위치의 특이성을 향상시킨다 (문헌 [Esteban et al., J. Nucl. Med. 28:861-870 (1987)).
적합한 비-방사성 동위원소 표지의 예에는 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Tr 및 56Fe가 포함된다.
적합한 형광 표지의 예에는 152Eu 표지, 플루오레세인 표지, 이소티오시아네이트 표지, 로다민 표지, 피코에리트린 표지, 피코시아닌 표지, 알로피코시아닌 표지, 녹색 형광 단백질 (GFP) 표지, o-프탈데히드 표지 및 플루오레스카민 표지가 포함된다.
적합한 독소 표지의 예에는 디프테리아 독소, 리신 및 콜레라 독소가 포함된다.
화학발광 표지의 예에는 루미놀 표지, 이소루미놀 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디늄 염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 루시페린 표지, 루시퍼라제 표지 및 에쿼린 표지가 포함된다.
핵 자기 공명 조영제의 예에는 중금속 핵, 예컨대 Gd, Mn 및 철이 포함된다.
상기 기재된 표지와 항-GD2 항체와의 결합을 위한 통상적인 기법은 문헌 [Kennedy et al., Clin. CMm. Acta 70:1-31 (1976)] 및 [Schurs et al, Clin. CMm. Acta 81:1-40 (1977)]에 의해 제공된다. 후자에서 언급되는 커플링 기법은 글루타르알데히드 방법, 페리오데이트 방법, 디말레이미드 방법, m-말레이미도벤질-N-히드록시-숙신이미드 에스테르 방법이며, 이들 방법 모두는 본원에 참조로 포함된다.
본원발명의 소정의 치료 방법, 예컨대 수술 후의 잔류 종양 세포의 제거 또는 전이의 예방에서 사용하기 위하여, 항-GD2 항체를 하나 이상의 약물, 전구약물 또는 동위원소와 접합시킬 수 있다. 바람직한 이러한 접합체는 하나 이상의 세포독성제와 접합된, GD2에 결합하는 하나 이상의 리간드, 예를 들어 적어도 하나의 항체, 또는 그의 단편, 유도체 또는 변형체를 포함하며, 이러한 접합체는 본원발명에 의해 제공되는 종양 전이의 치료 또는 예방 방법에서 유용하다. 본원발명의 소정의 이러한 실시양태에 따르면, 항-GD2 항체는 세포독성제와 접합된다. 항-GD2 항체-세포독성제 접합체의 생성에 유용한 세포독성제, 예를 들어 화학요법제는 관련 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 멜팔란, 독소루비신, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 에토포시드, 메클로르에타민, 시클로포스파미드, 블레오마이신, 미세소관 독 및 안노나세오스 아세토게닌(annonaceous acetogenin)이 포함되지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본원발명의 이러한 측면에 따라 사용하기에 적합한 다른 화학요법제는 잘 알려져 있으며, 통상의 기술자들에게 친숙할 것이다.
하나 이상의 항-GD2 항체 및 하나 이상의 소형 분자 독소, 예컨대 칼리키마이신, 메이탄신 (미국 특허 제5,208,020호), 트리코텐(trichothene) 및 CC1065의 접합체의 사용 또한 본원에서 고려된다. 본원발명의 한 실시양태에서, 항-GD2 항체는 하나 이상의 메이탄신 분자 (예를 들어, 1개의 항-GD2 항체 당 약 1개 내지 약 10개의 메이탄신 분자)와 접합된다. 예를 들어, 메이탄신은 May-SS-Me로 전환될 수 있으며, 이는 May-SH3으로 환원되고 변형된 항-GD2 항체와 반응하여 (문헌 [Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)]), 메이탄시노이드-항-GD2 항체 접합체를 생성한다.
다르게는, 항-GD2 항체는 하나 이상의 칼리키마이신 분자와 접합될 수 있다. 칼리키마이신 군의 항생제는 피코몰 이하 농도에서 이중 나선 DNA 손상을 생성할 수 있다. 칼리키마이신의 구조적 유사체를 사용할 수 있다 (문헌 [Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993)] 및 [Lode et al. Cancer Research 58: 2925- 2928 (1998)]).
하나 이상의 항-GD2 항체와의 접합체를 생성하는데 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (프세우도모나스 아이루기노사(Pseudomonas aeruginosa)), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모덱신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토락카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신(curcin), 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린(mitogellin), 레스트릭톡신(restrictocin), 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다. 예를 들어, 1993년 10월 28일자로 영문으로 공개된 WO 93/21232를 참조하며, 그 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 마이탄시노이드(Mytansinoid) 또한 하나 이상의 항-GD2 항체에 접합될 수 있다.
추가적으로, 본원발명은 핵산분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제; DNase)과 접합된 항-GD2 항체를 고려한다.
예시적 대안의 형태
일부 특정 실시양태에서, 제공된 항-GD2 항체 작용제 또는 그의 서열은 다중특이성 (예를 들어, 이중특이성) 형태로 사용된다. 일부 실시양태에서, 이중특이성 MoAb는 이중 가변 도메인 (하나의 도메인은 항-3F8 가변 도메인을 가지며, 다른 도메인은 종양 세포독성의 경우 T 세포를 재표적화하기 위한 항-OKT3, 또는 다단계 전표적화를 위한 DOTA-금속, C8.2.5, 또는 작용제로서 항-41BB-scFv를 이용하는 ADCC를 위한 클론 35, CD137, 또는 작용제로서 41 BBL를 이용하는 ADC를 위한 41BBL (CD137과 함께)로 이루어진 군으로부터 선택됨)으로 이루어질 수 있다. CH2 도메인에서의 N297A 돌연변이로 비당화가 일어나며, 이는 FcR 또는 C1q 결합의 부재로 이어진다. 링커 및 스페이서를 갖는 (hu3F8V1-scFv)-(huOKT3-scFv)의 아미노산 서열은 서열식별번호:29에 나타내고, 스페이서를 갖지 않는 것은 서열식별번호:30에 나타낸다. hu3F8V1 scFv)-(C8.2.5-scFv)의 아미노산 서열 (문헌 [Orcutt et al., 2010, Protein Eng Design and Selection 23, 221]을 기재로 함)은 서열식별번호:31로 나타낸다.
이중특이성 항체 (항-GD2 및 항-DOTA)는 다단계 전표적화의 제1 단계에 사용될 수 있으며, 이어서 세정 작용제로서 DOTA(금속)-덱스트란을 사용하는 혈액 청소가 이어지며, DOTA(금속)-접합된 치료제, 예컨대 DOTA(금속)-방사성 금속, DOTA(금속)-나노입자, DOTA(금속)-리포좀, DOTA(금속)-약물, DOTA(금속)-DNA, DOTA(금속)-RNA 및 DOTA(금속)-독소를 도입하는 제3 단계가 이어진다. C8.2.5가 DOTA-금속 복합체의 각각의 유형에 대해 상이한 친화도를 갖기 때문에, 세정 작용제 및 DOTA-리간드에 대한 전표적화된 C8.2.5의 친화도는 정밀하게 제어될 수 있다.
본원발명에 제공된 hu3F8 및 이의 변형체의 아미노산 서열은, 다른 항-GD2 항체에 대해 이전에 나타낸 바와 같이 키메라 항원 수용체 (CAR)의 구성에 사용될 수 있다 (문헌 Krause et al., 1998, J Exp Med 188, 619-626]). 면역 이펙터 세포의 재표적화에 대한 CAR 전략은 MHC-펩티드-TCR 상호작용에 독립적이며, 이는 세포가 매우 다양한 세포 표면 항원에 대해 반응할 수 있도록 한다 (문헌 [Davies and Maher, 2010, Achivum immunologiae et therapiae experimentalis 58, 165-178]). 여러 방법이 CAR의 디자인에 사용되었으며, 이들 대부분은 항원 인식을 위해, 단일-쇄 가변 단편 (scFv)의 형태인 모노클로날 항체의 항원 결합 도메인을 이용한다. 초기 T 세포 활성화 수용체는, 연구자들이 CD3ζ 쇄 (문헌 [Irving and Weiss, 1991, Cell 64, 891-901]; [Romeo et al., 1992, Cell 68, 889-897])의 역할을 설명하도록 한 연구로부터 기원하였다. 후속의 연구에서, 흥미있는 scFv를 CD3ζ 쇄 (문헌 [Eshhar et al., 1993, PNAS USA 90, 720-724]) 또는 FcεRIγ (문헌 [Weijtens et al., 1996, J Immunol 157, 836-843])에 융합시켰고, 둘 모두는 T 세포 활성화에 충분한 것으로 밝혀졌다. 이는 CAR 구성을 위한 청사진을 나타냈지만, 제1 세대 CAR이 2 내지 3회의 세포 분열까지만 T 세포 증식을 유도한 후 신속하게 세포 사멸로 이어질 수 있다 (문헌 [Gong et al., 1999, Neoplasia 1, 123-127])고 밝혀진 후에, 보조-자극 분자의 혼입이 일어나게 되었다. CD80을 표적 종양 세포 상에 발현시킴으로써, 연구자들은 CAR 발현 세포가 다시 자극될 수 있으며, 이는 T 세포 수에서의 추가적 증가로 이어질 수 있음을 보여줄 수 있었다. CD3ζ 쇄와 함께 CD28 보조-자극 분자를 혼입한 제1 CAR은 CD3ζ 쇄만을 발현시킨 것보다 광대한 개선점을 나타냈으며 (상기 문헌 [Krause et al., 1998]; [Haynes et al., 2002, Blood 100, 3155-3163]; 및 [Maher et al., 2002, Nature Biotech 20, 70-75]), 이에는 T 세포 수에서의 엄청난 증가뿐만 아니라 IL-2 생성의 증가가 포함되었다. 이 이후로, 여러 다른 군들이 다른 보조-자극 분자를 단독의 CD3ζ와 함께, 또는 CD3ζ 및 CD28 둘 모두와 함께 사용하기 시작하였다. 이러한 추가적인 신호전달 분자에는 4-1BB (문헌 [Wang et al., 2007, Human Gene Ther 18, 712-725]; [Brentjens et al., 2007, Clin Cncer Res 13, 5426-5432]; [Imai et al., 2004, Leukemia 18, 676-684]; 및 [Finney et al., 2004, J Immunol 172, 104-113]), DAP10 (상기 문헌 [Brentjens et al., 2007]), OX40 (상기 문헌 [Brentjens et al., 2007]; [Finney et al., 2004]; [Wilkie et al., 2008, J Immunol 180, 4901-4909]; [Nguyen and Geiger, 2003, Gene Therapy 10, 594-604]; [Pule et al., 2005, Mol Ther 12, 933-941]) 및 ICOS (상기 문헌 [Finney et al.,2004])가 포함되며, 이들은 T 세포뿐만 아니라 NK 세포의 문맥에서도 적용되었다 (문헌 [Daldrup-Link et al., 2005, Eropean radiology 15, 4-13]; [Imai and Campana, 2004, J Biol Reg Homeostatic Ag 18, 62-71]; [Roberts et al., 1998, J Immunol 375-384]; [Kruschinski et al., 2008, PNAS USA 105, 17481-17486]; 및 [Pegram et al., 2008, J Immunol 181, 3449-3455]). 제1 세대 CAR만이 현재 시점까지 유일하게 임상 시험되었지만, 제2 및 제3 세대 CAR을 이용한 시험관내 및 생체내 비교 둘 모두는 분명한 우수성을 입증하였다 (상기 문헌 [Haynes et al., 2002]; [Brentjens et al., 2007]; [Teng et al., 2004, Human Gene Ther 15, 699-708]; [Haynes et al., 2002, J Immunol 169, 5780-5786]; [Kowolik et al., 2006, Cancer Res 66, 10995-11004]; [Loskog et al., 2006, Leukemia 20, 1819-1928]; [Moeller et al., 2004, Cancer Gene Therapy 11, 371-379]; 및 [Vera et al., 2006, Blood 108, 3890-3897]).
현재, 대부분의 연구자들은 벌크한 인간 말초 T 세포를 사용하지만, 다른 연구자들은 최근에 EBV-특이성 T 세포 (문헌 [Rossig et al., 2002, Blood 99, 2009-2016]), 림프계 전구 세포 (문헌 [Zakrzewski et al., 2006, Nature Med 12, 1039-1047]; 및 [Zakrzewski et al., 2008, Nature Biotech 26, 453-461]), 및 비분획화된 골수 세포 (문헌 [Papapetrou et al., 2009, J clin Invest 119, 157-168]; 및 [Wang et al., 1998, Nature Med 4, 168-172])를 사용하기 시작하였다. 세포용해성이며 배양하기에 쉬운 백혈병 살해 세포주 (예를 들어, NK92, NK92MI, KHYG-1)는 또한 전-임상 시험 및 임상 시험을 위한 CAR 발현 이펙터 세포의 지속적인 공급을 제공할 수 있다. NK92MI는 비-호지킨(non-Hodgkin) 림프종으로부터 유래하여 인간 IL-2 cDNA로 형질도입된 인간 NK 세포주이며, 이전의 연구는 마우스 모델에서 이의 강력한 세포독성 능력을 입증하였다 (문헌 [Tam et al., 1999, J Hematol 8, 281-290]; 및 [Korbelik and Sun, 2001, Inter J Cancer 93, 269-274]). 또한, NK92 세포는 임상적 세팅에도 사용되었으며, 이는 신장 세포 암종 및 흑색종을 가진 환자에서의 다수의 제I상 연구 후에 안전한 것으로 증명되었다 (문헌 [Arai et al., 2008, Cytotherapy 10, 625-632]). 시험관내 유지의 용이성 및 비교적 짧은 배가 시간으로 인해, 이들 세포는 다양한 표적화 접근법을 시험하는 다양한 세포독성 검정을 위한 이상적인 이펙터이다. 본래의 IL-2-의존성 NK92 세포주를 이용한 연구가 마우스 및 인간 둘 모두에서 최소의 독성을 나타낸 반면, IL-2-형질도입된 NK92MI 세포는 보다 큰 백혈병유발 잠재력을 가질 수 있다. 연구자들이 NK92 세포를 이용하면서도 SCID 마우스에서 시도하여 백혈병유발을 피한 하나의 방법은 이펙터를 3000 cGy로 방사능 처리한 후에 접종하는 것에 의한 것이다. 제I상 임상 시험에서, 이는 면역력이 약화된 환자 내부에서 NK92MI 세포가 비제어적으로 증식하는 것을 방지함에 있어 충분하다. 또다른 안전 메카니즘은 자멸 유전자의 이용을 포함하는 것이다. 하나의 흔한 예는 헤르페스바이러스 티미딘 키나제 유전자를 사용하는 것이며, 이는 아시클로비어(acyclovir) 또는 간시클로비어(ganciclovir)를 투여하여, 상기 유전자를 발현하는 세포를 사멸시킴으로써 작용한다 (문헌 [Helene et al., 1997, J Immunol 5079-5082]).
핵산
본원발명의 MoAb의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 본 출원에 기재되어 있다. 본원발명은 또한 본원발명의 항체 및 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한, 본원발명은 엄격한 또는 보다 낮은 엄격 혼성화 조건 하에 본원발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 혼성화한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 이제 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법으로 얻어질 수 있다. 예를 들어, 항체의 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있으므로, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 어셈블리할 수 있는데 (예를 들어, 문헌 [Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994)]에 기재된 바와 같음), 요컨대 이는, 항체를 코딩하는 서열의 부분들을 함유하는 오버래핑 올리고뉴클레오티드의 합성, 상기 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 라이게이션, 및 이어서 라이게이션된 올리고뉴클레오티드의 PCR에 의한 증폭을 포함한다.
별법으로, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적합한 공급원으로부터의 핵산으로부터 생성할 수 있다. 특정 항체를 코딩하는 핵산을 함유한 클론은 이용불가능하지만 항체 분자의 서열은 공지되어 있는 경우, 면역글로불린을 코딩하는 핵산은, 서열의 3' 및 5' 말단과 혼성화가능한 합성 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해서, 또는 예를 들어 항체를 코딩하는 cDNA 라이브러리로부터 cDNA 클론을 확인하는 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한 클로닝에 의해서 화학적으로 합성되거나 적합한 공급원 (예를 들어, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포, 예컨대 본원발명의 항체를 발현하기 위해 선택된 하이브리도마 세포로부터 단리된 핵산, 바람직하게는 폴리 A+ RNA로부터 만들어진 cDNA 라이브러리)으로부터 얻어질 수 있다. 이어서, PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산을 관련 기술 분야에 널리 공지된 임의의 방법을 이용하여 복제가능한 클로닝 벡터로 클로닝할 수 있다.
항체의 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열은 결정되어 있으므로, 항체의 뉴클레오티드 서열을 뉴클레오티드 서열의 조작에 관한 관련 기술 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어 재조합 DNA 기술, 부위 지정 돌연변이유발, PCR 등 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.] 및 [Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.] (이는 둘 다 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 기술 참조)을 이용하여 조작함으로써, 예를 들어 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입이 일어난 다양한 아미노산 서열을 갖는 항체를 생성할 수 있다.
본원발명의 핵산 분자는 RNA의 형태, 예컨대 mRNA, hnRNA, tRNA 또는 임의의 다른 형태, 또는 DNA의 형태, 예컨대 이들로 한정되지는 않지만, 클로닝으로 얻어지거나 합성으로 생성된 cDNA 및 게놈 DNA, 또는 이들의 임의의 조합의 형태일 수 있다. DNA는 삼중-가닥, 이중-가닥 또는 단일-가닥, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. DNA 또는 RNA의 적어도 하나의 가닥 중 임의의 부분이 센스 가닥으로도 알려진 코딩 가닥일 수 있거나 또는 안티-센스 가닥으로도 불리는 비-코딩 가닥일 수 있다.
본원발명의 단리된 핵산 분자는, 임의로 하나 이상의 인트론을 갖는 오픈 리딩 프레임 (ORF), 예를 들어 이들로 한정되지는 않지만, 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3과 같은 적어도 하나의 CDR의 적어도 하나의 명시된 부분을 포함하는 핵산 분자; 항-GD2 항체 또는 가변 영역에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자; 및 상술한 바와 실질적으로 상이하지만, 유전자 코드의 동의성으로 인해 본원에 기재되고/거나 관련 기술 분야에 공지된 적어도 하나의 항-GD2 항체를 여전히 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함할 수 있다.
본원발명은 선택적 혼성화 조건 하에 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 단리된 핵산을 제공한다. 따라서, 상기 실시양태의 폴리뉴클레오티드는 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 단리, 검출 및/또는 정량화하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원발명의 폴리뉴클레오티드를 사용하여 기탁된 라이브러리에서 일부 또는 전장 클론을 확인, 단리 또는 증폭시킬 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 인간 또는 포유동물의 핵산 라이브러리로부터 단리되거나 또는 다르게는 이로부터의 cDNA와 상보적인 게놈 또는 cDNA 서열이다.
핵산은 본원발명의 폴리뉴클레오티드 이외의 서열을 편리하게 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함한 다중-클로닝 부위를 핵산에 삽입하여 폴리뉴클레오티드의 단리를 도울 수 있다. 또한, 번역가능한 서열을 삽입하여 번역된 본원발명의 폴리뉴클레오티드의 단리를 도울 수 있다. 예를 들어, 헥사-히스티딘 마커 서열이 본원발명의 단백질을 정제하는 편리한 방법을 제공한다. 본원발명의 핵산 (코딩 서열 제외)은 임의로 본원발명의 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 어댑터 또는 링커이다.
이러한 클로닝 및/또는 발현 서열에 추가 서열을 부가하여 클로닝 및/또는 발현에서 이들의 기능을 최적화하거나, 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕거나, 폴리뉴클레오티드의 세포로의 도입을 개선시킬 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터 및 링커의 사용은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 상기 문헌 [Ausubel] 또는 [Sambrook] 참조).
상술한 단리된 또는 정제된 핵산 분자 또는 그의 단편 중 임의의 것을 포함하는 벡터가 본원발명에 의해 추가로 제공된다. 상기 핵산 분자 또는 그의 단편 중 임의의 것을 임의의 적합한 벡터로 클로닝할 수 있고, 이를 사용하여 임의의 적합한 숙주를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있다. 벡터를 선택하고 구축하는 방법은 관련 기술 분야에 통상 공지되어 있으며, 일반 기술 문헌 (일반적으로, 문헌 ["Recombinant DNA Part D," Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu and Grossman, eds., Academic Press (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 바람직하게는, 벡터는 적합한 경우에 및 벡터가 DNA인지 또는 RNA인지를 고려하여, 벡터가 도입될 숙주의 유형 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물)에 특이적인 조절 서열, 예컨대 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 포함한다. 바람직하게는, 벡터는 숙주의 속에 특이적인 조절 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, 벡터는 숙주의 종에 특이적인 조절 서열을 포함한다.
복제 시스템 및 삽입될 핵산 뿐만 아니라, 구축물도 하나 이상의 마커 유전자를 포함하여 형질전환 또는 형질감염된 숙주의 선택을 가능하게 할 수 있다. 마커 유전자는 살생제 내성, 예를 들어 항생제, 중금속 등에 대한 내성, 원영양성(prototrophy)을 제공하는 영양요구성 숙주에서의 보완 등을 포함한다.
적합한 벡터는 증식 및 팽창을 위해서 또는 발현을 위해서 또는 이들 둘 다를 위해서 고안된 것을 포함한다. 예를 들어, 클로닝 벡터는 pUC 시리즈, pBluescript 시리즈 (스트라타진(Stratagene, 미국 캘리포니아주 라호야 소재)), pET 시리즈 (노바겐(Novagen, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)), pGEX 시리즈 (파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech, 스웨덴 웁살라 소재)) 및 pEX 시리즈 (클론테크(Clontech, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재))로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 박테리오파지 벡터, 예컨대 λGT10, λGT11, λZapII (스트라타진), λEMBL4 및 λNM1149를 사용할 수 있다. 식물 발현 벡터의 예에는 pBI110, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19 (클론테크)가 포함된다. 동물 발현 벡터의 예에는 pEUK-C1, pMAM 및 pMAMneo (클론테크)가 포함된다. 또한, 제조업자의 권유에 따라 TOPO 클로닝 시스템 (인비트로겐(Invitrogen, 미국 캘리포이나주 칼스배드 소재))을 사용할 수 있다.
발현 벡터는 상기 기재된 바와 같이 단리 또는 정제된 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 천연 또는 비천연 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터, 예를 들어 강, 약, 유도성, 조직-특이적 및 발생-특이적 프로모터의 선택은 관련 기술 분야의 기술 범위 내에 있다. 유사하게, 상기 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 그의 단편과 프로모터의 조합도 또한 관련 기술 분야의 기술 범위 내에 있다.
적합한 바이러스 벡터에는, 예를 들어 레트로바이러스 벡터, 파보바이러스-기재 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스 (AAV)-기재 벡터, AAV-아데노바이러스 키메라 벡터 및 아데노바이러스-기재 벡터, 및 렌티바이러스 벡터, 예컨대 단순포진바이러스 (HSV)-기재 벡터가 포함된다. 이러한 바이러스 벡터는, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]; 및 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994)]에 기재된 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스로부터 유래한다. 레트로바이러스는 다양한 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 RNA 바이러스이다. 감염 후, 레트로바이러스 게놈은 그의 숙주 세포의 게놈에 통합되어 숙주 세포 DNA와 함께 복제됨으로써, 레트로바이러스 게놈에 혼입되는 바이러스 RNA 및 임의의 핵산 서열을 지속적으로 생산한다. 따라서, 레트로바이러스의 사용시 치료 인자의 장기 발현을 달성할 수 있다. 병원성 레트로바이러가 존재하기는 하지만, 유전자 요법에서 사용이 고려되는 레트로바이러스는 비교적 비-병원성이다. 병원성 레트로바이러스, 예를 들어 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 또는 인간 T-세포 림프영양성 바이러스 (HTLV)를 사용하는 경우, 바이러스 게놈을 변경하여 숙주에 대한 독성을 제거하는 관리가 수행되어야 한다. 또한, 레트로바이러스 벡터는 바이러스 복제가 결핍되도록 조작될 수 있다. 따라서, 레트로바이러스 벡터는 생체내 안정한 유전자 도입에 특히 유용한 것으로 고려된다. 렌티바이러스 벡터, 예컨대 HIV-기재 벡터는 유전자 전달에 사용되는 레트로바이러스 벡터의 전형이다. 다른 레트로바이러스와 달리, HIV-기재 벡터는 그의 외래 유전자를 비-분열 세포로 혼입하여 질환의 지속적인 형태를 치료하는 데 사용될 수 있는 것으로 공지되어 있다.
임의로, 단리 또는 정제된 핵산 분자 또는 그의 단편이 또 다른 핵산 분자와 연결된 후 융합 단백질을 코딩할 수 있다. 융합 단백질의 생성은 관련 기술 분야의 통상의 기술 범위 내에 있으며, 제한 효소 또는 재조합 클로닝 기술의 이용을 포함할 수 있다 (예를 들어, 상표명 게이트웨이(Gateway.TM. (인비트로겐)) 참조). 또한, 미국 특허 제5,314,995호를 참조한다.
상술한 바를 고려하여, 본원발명은 또한 상기 기재된 단리 또는 정제된 핵산 분자를 임의로 벡터의 형태로 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 본원에 추가 기재된 다른 구성요소를 포함할 수 있다.
또한, 다양한 방사성 동위원소가 본원발명의 치료 방법에서 사용하기 위한 방사선-접합된 항-GD2 항체의 생산에 이용가능하다. 예에는 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다.
항-GD2 항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-I-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 히스-아지도 화합물 (예컨대, 비스-(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨릴렌-2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)]에 기재된 것과 같이 제조할 수 있다. 14탄소-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성뉴클레오티드와 항-GD2 항체와의 접합을 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO 94/11026을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다아제-민감성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커를 사용할 수 있다 (문헌 [Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992)]).
다르게는, 항-GD2 항체 리간드 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질을 예를 들어 재조합 기법 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다.
조성물
본원발명의 항-GD2 항체 조성물은 이러한 조절, 치료 또는 요법이 필요한 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에게 제공된 항체 작용제를 전달하는데 사용하기 위한, 1종 이상의 임의의 적합하며 유효한 양의 적어도 하나의 항-GD2 항체를 포함하는 조성물 또는 제약 조성물을 포함한다.
또한, 본원발명은 비-자연 발생 조성물, 혼합물 또는 형태로 제공되는, 본원에 기재된 것과 같고/거나 관련 기술 분야에 알려진 것과 같은 적어도 하나, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 또는 그보다 많은 그의 항-GD2 항체를 포함하는, 하나 이상의 항-GD2 항체 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 본원에 기재된 항체 또는 그의 특정 단편, 도메인 또는 변형체의 CDR 영역의 70-100％의 연속 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-GD2 항체 아미노산 서열의 적어도 1개 또는 2개의 전장, C- 및/또는 N-말단 결실된 변형체, 도메인, 단편 또는 특정 변형체를 포함하는 비-자연 발생 조성물을 포함한다. 바람직한 항-GD2 항체 조성물은 본원에 기재된 항-GD2 항체 서열의 하나 이상의 CDR 또는 LBR 함유 부분과 같은 적어도 1개 또는 2개의 전장, 단편, 도메인 또는 변형체를 포함한다. 추가의 바람직한 조성물은 40-99％의 본원에서 기재된 항-GD2 Ab의 CDR 영역의 70-100％ 중 적어도 하나를 포함한다. 이러한 조성 백분율은 관련 기술 분야에 알려져 있거나 본원에 기재된 것과 같은 액체, 또는 건조 용액, 혼합물, 현탁액, 에멀젼 또는 콜로이드로서의 중량, 부피, 농도, 몰농도 또는 몰랄농도 기준이다.
추가적으로, 본원발명의 항-GD2 항체 화합물, 조성물 또는 조합물은 하나 이상의 임의의 적합한 보조제, 예컨대 희석제, 결합제, 안정화제, 완충액, 염, 친유성 용매, 보존제, 보조제 등 (이들로 제한되지는 않음)을 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 보조제가 바람직하다. 이러한 멸균 용액 및 그의 제조 방법의 비제한적인 예는 문헌 [Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990] (이로 제한되지는 않음)과 같이 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 통상적으로, 항-GD2 항체, 단편 또는 변형체 조성물의 투여 방식, 용해도 및/또는 안정성에 적합한 제약상 허용되는 담체는 관련 기술 분야에 잘 알려져 있거나 또는 본원에 기재된 것과 같이 선택할 수 있다.
본 조성물에 유용한 제약학적 부형제 및 첨가제에는 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질 및 탄수화물 (예를 들어, 모노사카라이드, 디-, 트리-, 테트라-, 및 올리고사카라이드를 비롯한 당; 유도체화된 당, 예컨대 알디톨, 알돈산, 에스테르화 당 등; 및 폴리사카라이드 또는 당 중합체)이 포함되지만, 이들로 제한되지는 않으며, 이들은 단독으로 또는 조합하여 존재할 수 있으며, 단독으로 또는 조합하여 1-99.99 중량％ 또는 부피％를 차지한다. 예시적인 단백질 부형제에는 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민 (HSA), 재조합 인간 알부민 (rHA), 젤라틴, 카세인 등이 포함된다. 대표적인 아미노산/항체 성분에는 알라닌, 글리신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 리신, 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파탐 등이 포함되며, 이는 또한 완충 능력의 기능을 할 수 있다. 한 바람직한 아미노산은 글리신이다.
본원발명에서 사용하기에 적합한 탄수화물 부형제에는 예를 들어 모노사카라이드, 예컨대 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등; 디사카라이드, 예컨대 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등; 폴리사카라이드, 예컨대 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 및 알디톨, 예컨대 만니톨, 크실리톨, 말티톨, 락티톨, 크실리톨 소르비톨 (글루시톨), 미오이노시톨 등이 포함된다. 본원발명에서 사용하기에 바람직한 탄수화물 부형제는 만니톨, 트레할로스 및 라피노스이다.
또한, 항-GD2 항체 조성물은 완충액 또는 pH 조절제를 포함할 수 있으며, 통상적으로 완충액은 유기산 또는 염기로부터 제조된 염이다. 대표적인 완충액에는 유기산 염, 예컨대 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 탄산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산 또는 프탈산의 염; 트리스(Tris), 트로메트아민 히드로클로라이드 또는 포스페이트 완충액이 포함된다. 본 조성물에서 사용하기에 바람직한 완충액은 유기산 염, 예컨대 시트레이트이다.
추가적으로, 본원발명의 항-GD2 항체 조성물은 중합체성 부형제/첨가제, 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 피콜 (중합체성 당), 덱스트레이트 (예를 들어, 시클로덱스트린, 예컨대 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 향미제, 항미생물제, 감미제, 항산화제, 대전방지제, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트, 예컨대 "트윈 20" 및 "트윈 80"), 지질 (예를 들어, 인지질, 지방산), 스테로이드 (예를 들어, 콜레스테롤) 및 킬레이트제 (예를 들어, EDTA)를 포함할 수 있다.
본원발명에 따른 항-GD2 항체, 부분 또는 변형체 조성물에서 사용하기에 적합한 이들 및 추가의 알려진 제약학적 부형제 및/또는 첨가제는 예를 들어 문헌 ["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995)] 및 ["Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (1998)]에서 열거된 것과 같이 관련 기술 분야에 알려져 있으며, 이들 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 바람직한 담체 또는 부형제 물질은 탄수화물 (예를 들어, 사카라이드 및 알디톨) 및 완충액 (예를 들어, 시트레이트) 또는 중합체성 작용제이다.
상기 언급된 것과 같이, 본원발명은 제약상 허용되는 제제 내에 적어도 하나의 항-GD2 항체를 포함하는, 안정한 제제 (이는 바람직하게는 염수 또는 선택된 염과의 포스페이트 완충액임), 및 또한 보존제를 함유하는 보존 용액 및 제제, 및 또한 제약학적 또는 수의학적 용도에 적합한 다용도 보존 제제를 제공한다. 보존 제제는 수성 희석제 중 하나 이상의 알려진 보존제, 또는 하나 이상의 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 페닐머큐릭 니트라이트, 페녹시에탄올, 포름알데히드, 클로로부탄올, 염화마그네슘 (예를 들어, 헥사히드레이트), 알킬파라벤 (메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 나트륨 데히드로아세테이트 및 티메로살 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 임의로 선택되는 것을 함유한다. 임의의 적합한 농축물 또는 혼합물은 예컨대 0.001-5％, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값, 예컨대 0.001, 0.003, 0.005, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.3, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값 (이들로 제한되지는 않음)으로 관련 기술 분야에 알려진 것과 같이 사용될 수 있다. 비제한적인 예로는, 보존제 없음, m-크레졸 0.1-2％ (예를 들어, 0.2, 0.3. 0.4, 0.5, 0.9, 1.0％), 벤질 알콜 0.1-3％ (예를 들어, 0.5, 0.9, 1.1, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5％), 티메로살 0.001-0.5％ (예를 들어, 0.005, 0.01), 페놀 0.001-2.0％ (예를 들어, 0.05, 0.25, 0.28, 0.5, 0.9, 1.0％), 알킬파라벤(들) 0.0005-1.0％ (예를 들어, 0.00075, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01, 0.02, 0.05, 0.075, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0.9, 1.0％) 등이 포함된다.
상기 언급된 것과 같이, 본원발명은 패키징 재료, 및 임의로 수성 희석제 중에서의 적어도 하나의 항-GD2 항체와 소정의 완충액 및/또는 보존제와의 용액을 포함하는 적어도 하나의 바이알을 포함하는 제조품을 제공하며, 여기서 상기 패키징 재료는 이러한 용액이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72시간 이상의 기간에 걸쳐 유지될 수 있음을 언급하는 표지를 포함한다. 추가적으로, 본원발명은 패키징 재료, 동결건조된 적어도 하나의 항-GD2 항체를 포함하는 제1 바이알, 및 소정의 완충액 또는 보존제의 수성 희석제를 포함하는 제2 바이알을 포함하는 제조품을 포함하며, 여기서 상기 패키징 재료는 수성 희석제에 적어도 하나의 항-GD2 항체를 재구성하여 24시간 이상의 기간에 걸쳐 유지될 수 있는 용액을 형성하도록 환자에게 알려주는 표지를 포함한다.
비록 보다 낮은 농도 또는 높은 농도가 사용될 수 있지만, 본원발명의 생산에서의 적어도 하나의 항-GD2 항체의 범위는 습윤/건조 시스템에서인 경우에 재구성시 약 1.0 마이크로그램/ml 내지 약 1000 mg/ml의 농도를 수득하는 양을 포함하며, 이는 원하는 전달 비히클에 의존적이고, 예를 들어 용액 제제는 경피 패치, 폐, 경점막, 또는 삼투압 또는 마이크로 펌프 방법과는 다를 것이다.
바람직하게는, 수성 희석제는 임의로 제약상 허용되는 보존제를 추가로 포함한다. 바람직한 보존제는 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 알킬파라벤 (메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 소듐 데히드로아세테이트 및 티메로살, 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함한다. 제제에서 사용되는 보존제의 농도는 항-미생물 작용을 수득하기에 충분한 농도이다. 이러한 농도는 선택되는 보존제에 따라 다르며, 통상의 기술자들에 의해 쉽게 결정된다.
임의로 및 바람직하게는, 다른 부형제, 예를 들어 등장제, 완충제, 항산화제, 보존 증진제가 희석제에 첨가될 수 있다. 등장제, 예컨대 글리세린이 알려진 농도로 흔히 사용된다. 바람직하게는, 생리학상 허용되는 완충제가 개선된 pH 제어를 제공하도록 첨가된다. 제제는 광범위한 pH, 예건대 약 pH 4 내지 약 pH 10, 바람직하게는 약 pH 5 내지 약 pH 9, 가장 바람직하게는 약 6.0 내지 약 8.0의 범위를 포괄할 수 있다. 바람직하게는 본원발명의 제제는 약 6.8 내지 약 7.8의 pH를 갖는다. 바람직한 완충제는 포스페이트 완충액, 가장 바람직하게는 나트륨 포스페이트, 특히 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 포함한다.
임의로, 다른 첨가제, 예컨대 트윈 20 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트), 트윈 40 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노팔미테이트), 트윈 80 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트), 플루로닉(Pluronic) F68 (폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체) 및 PEG (폴리에틸렌 글리콜)와 같은 제약상 허용되는 가용화제, 또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 80, 또는 폴록사머 184 또는 188, 플루로닉® 폴리올, 다른 블록 공중합체, 및 킬레이터, 예컨대 EDTA 및 EGTA를 제제 또는 조성물에 첨가하여 응집을 감소시킬 수 있다. 특히, 이들 첨가제는 펌프 또는 플라스틱 용기가 제제의 투여에 사용되는 경우에 유용하다. 제약상 허용되는 계면활성제의 존재는 단백질이 응집하는 성향을 완화시킨다.
본원발명의 제제는 적어도 하나의 항-GD2 항체, 및 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 알킬파라벤 (메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 소듐 데히드로아세테이트 및 티메로살, 또는 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 보존제를 수성 희석제 중에서 혼합하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있다. 적어도 하나의 항-GD2 항체 및 보존제를 수성 희석제 중에서 혼합하는 것은 통상적인 용해 및 혼합 절차를 사용하여 수행된다. 적합한 제제를 제조하기 위하여, 예를 들어 측정된 양의 완충된 용액 중의 적어도 하나의 항-GD2 항체를 완충된 용액 중의 원하는 보존제와 단백질 및 보존제를 원하는 농도로 제공하기에 충분한 양으로 합한다. 이러한 방법의 변형은 통상의 기술자들에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 성분이 첨가되는 순서, 추가의 성분이 사용되는지의 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH는 모두 사용되는 농도 및 투여 수단에 대하여 최적화될 수 있는 요인이다.
청구되는 제제는 투명한 용액으로서, 또는 수성 희석제 중 물, 보존제 및/또는 부형제, 바람직하게는 포스페이트 완충액 및/또는 염수 및 선택된 염을 함유하는 제2 바이알로 재구성되는 동결건조된 적어도 하나의 항-GD2 항체의 바이알을 포함하는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 용액 바이알 또는 재구성을 요구하는 이중 바이알 중 어느 하나는 수회 재사용될 수 있으며, 단일 또는 다수 주기의 환자 치료에 충분할 수 있으며, 따라서 현재 이용가능한 것에 비해 보다 편리한 치료 요법을 제공할 수 있다.
본 청구되는 제조품은 즉시 내지 24시간 이상의 기간에 걸친 투여에 유용하다. 따라서, 본 청구되는 제조품은 환자에게 상당한 이점을 제공한다. 임의로, 본원발명의 제제는 약 2℃ 내지 약 40℃의 온도에서 안전하게 보관될 수 있으며, 연장된 기간 동안 단백질의 생물학적 활성을 유지하여, 용액이 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 또는 96시간 이상의 기간에 걸쳐 유지 및/또는 사용될 수 있다는 것을 나타내는 패키지 표지가 가능하도록 한다. 보존 희석제가 사용되는 경우, 이러한 표지는 최대 1 내지 12개월, 6개월, 1년 6개월 및/또는 2년까지의 사용을 포함할 수 있다.
본 발명에서의 적어도 하나의 항-GD2 항체의 용액은 적어도 하나의 항체를 수성 희석제 중에서 혼합하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있다. 혼합은 통상적인 용해 및 혼합 절차를 사용하여 수행된다. 적합한 희석제를 제조하기 위하여, 예를 들어 측정된 양의 물 또는 완충액 중의 적어도 하나의 항체를 단백질 및 임의로 보존제 또는 완충액을 원하는 농도로 제공하기에 충분한 양으로 합한다. 이러한 방법의 변형은 통상의 기술자들에게 이해될 것이다. 예를 들어, 성분이 첨가되는 순서, 추가의 첨가제가 사용되는지의 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH는 모두 사용되는 농도 및 투여 수단에 대해 최적화될 수 있는 요인이다.
청구되는 제품은 투명한 용액으로서, 또는 수성 희석제를 함유하는 제2 바이알로 재구성되는 동결건조된 적어도 하나의 항-GD2 항체의 바이알을 포함하는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 용액 바이알 또는 재구성을 요구하는 이중 바이알 중 어느 하나는 수회 재사용될 수 있으며, 단일 또는 다수 주기의 환자 치료에 충분할 수 있으며, 따라서 현재 이용가능한 것에 비해 보다 편리한 치료 요법을 제공할 수 있다.
청구되는 제품은 투명한 용액으로서, 또는 수성 희석제를 함유하는 제2 바이알로 재구성되는 동결건조된 적어도 하나의 항-GD2 항체의 바이알을 포함하는 이중 바이알을 약국, 병원 또는 다른 이러한 기관 및 시설에 제공하여 환자에게 간접적으로 제공될 수 있다. 이 경우에서의 투명한 용액은 크기가 최대 1 리터이거나 또는 그보다 더 커서, 보다 큰 저장기를 제공하며, 이로부터 보다 적은 부분의 적어도 하나의 항체 용액이 보다 작은 바이알로의 수송을 위해 1회 또는 수회 인출되고, 약국 또는 병원에서 그의 소비자 및/또는 환자에게 제공될 수 있다.
이러한 단일 바이알 시스템을 포함하는 알려져 있는 장치에는 예를 들어 벡톤 딕킨슨(Becton Dickensen; 뉴저지주 프랭클린 레이크(Franklin Lakes, N.J.)), 디세트로닉(Disetronic; 스위스 부르그도르프(Burgdorf, Switzerland)), 바이오젝트(Bioject; 오레건주 포틀랜드(Portland, Oreg.)), 네셔널 메디컬 프로덕츠(National Medical Products), 웨스톤 메디컬(Weston Medical; 영국 페테르보로우(Peterborough, UK)), 메디-젝트 코프(Medi-Ject Corp; 미네소타주 미네아폴리스(Minneapolis, Minn.))에서 제조되거나 또는 개발된 것들과 같은 용액의 전달을 위한 펜-주입기 장치, 예컨대 BD 펜, BD 오토젝터(AUTOJECTOR)®, 휴마젝트(HUMAJECT)®가 포함된다. 이중 바이알 시스템을 포함하는 알려져 있는 장치에는 재구성된 용액의 전달을 위한 카트리지에서의 동결건조된 약물의 재구성을 위한 펜-주입기 시스템, 예컨대 휴마트로펜(HUMATROPEN)®이 포함된다.
본원에서 청구되는 제품에는 패키징 물질이 포함된다. 패키징 물질은 관리 기관에 의해 요구되는 정보 이외에, 제품이 사용될 수 있는 병태를 제공한다. 본원발명의 패키징 물질은 적어도 하나의 항-GD2 항체를 수성 희석제 중에서 재구성하여 용액을 형성하고, 2개 바이알, 습윤/건조 제품에 대하여 2 내지 24시간 또는 그 이상의 기간에 걸쳐 용액을 사용하는 것에 대하여 환자에게 지시사항을 제공한다. 단일 바이알, 용액 제품에 대하여, 표지는 이러한 용액이 2 내지 24시간 또는 그 이상의 기간에 걸쳐 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 본원에서 청구되는 제품은 인간 의약품 용도에 유용하다.
본원발명의 제제는 적어도 하나의 항-GD2 항체, 및 염수 또는 선택된 염을 함유하는 선택된 완충액, 바람직하게는 포스페이트 완충액을 혼합하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 수성 희석제 중에서의 적어도 하나의 항체 및 완충액의 혼합은 통상적인 용해 및 혼합 절차를 사용하여 수행된다. 적합한 제제를 제조하기 위하여, 예를 들어 측정된 양의 물 또는 완충액 중의 적어도 하나의 항체를 물 중의 원하는 완충제와 단백질 및 완충액을 원하는 농도로 제공하기에 충분한 양으로 합한다. 이러한 방법의 변형은 통상의 기술자들에게 이해될 것이다. 예를 들어, 성분이 첨가되는 순서, 추가의 첨가제가 사용되는지의 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH는 모두 사용되는 농도 및 투여 수단에 대해 최적화될 수 있는 요인이다.
청구되는 안정한 또는 보존된 제제는 투명한 용액으로서, 또는 수성 희석제 중에 보존제 또는 완충액 및 부형제를 함유하는 제2 바이알로 재구성되는 동결건조된 적어도 하나의 항-GD2 항체의 바이알을 포함하는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 용액 바이알 또는 재구성을 요구하는 이중 바이알 중 어느 하나는 수회 재사용될 수 있으며, 단일 또는 다수 주기의 환자 치료에 충분할 수 있으며, 따라서 현재 사용되는 것에 비해 보다 편리한 치료 요법을 제공할 수 있다.
본원에 기재된 안정한 또는 보존된 제제 또는 용액 중 어느 하나에서의 적어도 하나의 항-GD2 항체는, 관련 기술 분야에 잘 알려진 것과 같이, SC 또는 IM 주사; 경피, 폐, 경점막, 임플란트, 삼투압 펌프, 카트리지, 마이크로 펌프, 또는 통상의 기술자들에게 이해되는 다른 수단을 비롯한 다양한 전달 방법을 통해 본원발명에 따라서 환자에게 투여될 수 있다.
본원발명의 한 실시양태에서, 명세서의 항-GD2 항체를 포함하는 제약 조성물은 인간화 항체의 유기체, 바람직하게는 동물, 바람직하게는 포유동물에의 투여를 용이하게 한다. 바람직한 포유동물에는 소과, 개과, 말과, 고양이과, 양과 및 돼지과 동물, 비-인간 영장류, 및 인간이 포함된다. 특히, 인간이 바람직하다.
일반적으로, 내부 투여에 적합한 투여 형태 (조성물)는 단위 또는 용기 당 약 0.1 밀리그램 내지 약 500 밀리그램의 활성 성분을 함유한다. 이러한 제약 조성물에서, 활성 성분은 조성물의 총 중량을 기준으로 보통 약 0.5-99.999 중량％의 양으로 존재할 것이다.
비경구 투여에 대하여, 항체는 제약상 허용되는 비경구 비히클과 함께 (또는 별도로 제공됨) 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결건조된 분말로 제제화될 수 있다. 이러한 비히클의 예는 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 용액 및 1-10％ 인간 혈청 알부민이다. 또한, 리포좀 및 비수성 비히클, 예컨대 불휘발성 오일을 사용할 수 있다. 비히클 또는 동결건조된 분말은 등장성을 유지시키는 첨가제 (예를 들어, 염화나트륨, 만니톨) 및 화학적 안정성을 유지시키는 첨가제 (예를 들어, 완충액 및 보존제)를 함유할 수 있다. 제제는 알려진 기법 또는 적합한 기법에 의해 멸균된다.
적합한 제약 담체는 그 분야에서의 표준 참조 문서인 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol]의 최신판에 기재되어 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 통상의 부형제, 멸균수 또는 염수, 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 식물 기원의 오일, 수소화 나프탈렌 등을 함유할 수 있다. 주사용 수성 또는 오일성 현탁액은 알려진 방법에 따라 적합한 에멀션화제 또는 보습제(humidifier) 및 현탁화제를 사용하여 제조할 수 있다. 주사용 작용제는 비독성 비경구 투여용 희석제, 예컨대 수용액, 또는 용매 중 멸균 주사용 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용가능한 비히클 또는 용매로서, 물, 링거액, 등장성 염수 등이 허용되며; 일반적인 용매 또는 현탁화 용매로서, 멸균 비휘발성 오일을 사용할 수 있다. 이러한 목적을 위하여, 천연 또는 합성 또는 반합성 지방 오일 또는 지방산; 천연 또는 합성 또는 반합성 모노- 또는 디- 또는 트리글리세리드를 비롯한, 임의의 종류의 비휘발성 오일 및 지방산을 사용할 수 있다. 비경구 투여는 관련 기술 분야에 알려져 있으며, 통상적인 주사 수단, 미국 특허 제5,851,198호에 기재된 것과 같은 가스 압력 무바늘 주사 장치, 및 미국 특허 제5,839,446호에 기재된 것과 같은 레이저 천공기 장치가 포함되지만 이들로 제한되지는 않으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
조합 요법
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-GD2 항체는 임의로 1종 이상의 TNF 길항제 (예를 들어, TNF 항체 또는 단편, 가용성 TNF 수용체 또는 단편, 그의 융합 단백질, 또는 소형 분자 TNF 길항제 (이들로 제한되지는 않음)), 항류마티스제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 오라노핀, 오로티오글루코스, 아자티오프린, 에타너셉트, 금 나트륨 티오말레이트, 히드록시클로로퀸 술페이트, 레플루노미드, 술파살라진), 근육 이완제, 마약제, 비-스테로이드성 소염성 약물 (NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항미생물제 (예를 들어, 아미노글리코시드, 항진균제, 항기생충제, 항바이러스제, 카르바페넴, 세팔로스포린, 플루오로퀴놀론, 마크롤리드, 페니실린, 술폰아미드, 테트라시클린, 또 다른 항미생물제), 항건선제, 코르티코스테로이드, 동화작용성 스테로이드, 당뇨병 관련 작용제, 미네랄, 영양제, 갑상선 작용제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 진해제, 항구토제, 항궤양제, 설사제, 항응고제, 에리스로포이에틴 (예를 들어, 에포에틴 알파), 필그라스팀 (예를 들어, G-CSF, 뉴포겐), 사르그라모스팀 (GM-CSF, 류킨(Leukine)), 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제 (예를 들어, 바실릭시맙, 시클로스포린, 다클리주맙), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 수용체 조절제, 동공확대제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사제, 유사분열 억제제, 방사성의약품, 항우울제, 항조증제, 항정신병제, 항불안제, 수면제, 교감신경 흥분제, 자극제, 도네페질, 타크린, 천식 약물, 베타 효능제, 흡입용 스테로이드, 류코트리엔 억제제, 메틸크산틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도마제 알파 (플모자임), 사이토카인 또는 사이토카인 길항제, 및 세포 요법제로부터 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하여 투여된다. 이러한 사이토카인의 비제한적인 예에는 IL-1 내지 IL-34 중 어느 하나가 포함되지만, 이들로 제한되지는 않는다. 적합한 투여량은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000)]을 참조하며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
또한, 이러한 항암 또는 항감염제는 본원발명의 적어도 하나의 항체와 회합, 결합, 공동-제제화 또는 공동-투여되는 독소 분자를 포함할 수 있다. 임의로, 독소는 병리 세포 또는 조직을 선택적으로 사멸시키도록 작용할 수 있다. 병리 세포는 암 또는 다른 세포일 수 있다. 이러한 독소는, 예를 들어 리신, 디프테리아 독소, 독 독소 또는 박테리아 독소 중 하나 이상으로부터 선택되는 하나 이상의 기능성 세포독성 도메인을 포함하는 정제 또는 재조합 독소 또는 독소 단편일 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 또한, 용어 독소에는 독소 쇼크를 비롯한 인간 또는 다른 포유동물에서 임의의 병리 증상을 유발할 수 있는 임의의 천연, 돌연변이체 또는 재조합 박테리아 또는 바이러스에 의해 생성된 내독소 및 외독소 둘 모두가 포함되며, 이는 사망을 유발할 수 있다. 이러한 독소에는 장독소생성 이. 콜라이 열-불안정성 장독소 (LT), 열-안정성 장독소 (ST), 시겔라 세포독소, 아이로모나스 장독소, 독소성 쇼크 증후군 독소-1 (TSST-1), 스타필로콕쿠스 장독소 A (SEA), B (SEB) 또는 C (SEC), 스트렙토콕쿠스 장독소 등이 포함될 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 박테리아에는 장독소생성 이. 콜라이 (ETEC) 종, 장출혈성 이. 콜라이 종 (예를 들어, 혈청형 0157:H7의 균주), 스타필로콕쿠스 종 (예를 들어, 스타필로콕쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로콕쿠스 피오게네스(Staphylococcus pyogenes)), 시겔라 종 (예를 들어, 시겔라 디센테리아이(Shigella dysenteriae), 시겔라 플레크스네리(Shigella flexneri), 시겔라 보이디이(Shigella boydii) 및 시겔라 손네이(Shigella sonnei)), 살모넬라 종 (예를 들어, 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 콜레라-수스(Salmonella cholera-suis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)), 클로스티리디움 종 (예를 들어, 클로스티리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens), 클로스티리디움 디피킬레(Clostridium difficile), 클로스티리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)), 캄필로박테르 종 (예를 들어, 캄필로박테르 예유니(Campylobacter jejuni), 캄필로박테르 페투스(Campylobacter fetus)), 헬리코박테르 종 (예를 들어, 헬리코박테르 파일로리(Helicobacter pylori)), 아이로모나스 종 (예를 들어, 아이로모나스 소브리아(Aeromonas sobria), 아이로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila), 아이로모나스 카비아이(Aeromonas caviae)), 플레시오모나스 시겔로이데스(Plesiomonas shigelloides), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 비브리오 종 (예를 들어, 비브리오 콜레라이(Vibrio cholerae), 비브리오 파라하이몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)), 클렙시엘라 종, 프세우도모나스 아이루기노사 및 스트렙토콕쿠스 종의 균주가 포함되지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3rd ed., pp 1-13, Little, Brown and Co., Boston, (1990)]; [Evans et al., eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2d. Ed., pp 239-254, Plenum Medical Book Co., New York (1991)]; [Mandell et al, Principles and Practice of Infectious Diseases, 3d. Ed., Churchill Livingstone, N.Y. (1990)]; [Berkow et al, eds., The Merck Manual, 16th edition, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992]; [Wood et al, FEMS Microbiology Immunology, 76:121-134 (1991)]; [Marrack et al, Science, 248:705-711 (1990)]을 참조하며, 이들 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
생산
본원발명에 따라 사용되는 적어도 하나의 항-GD2 항체는 본원에서 기재되거나 또는 관련 기술 분야에 알려진 것과 같이 포유동물 세포로부터를 비롯한 재조합 수단 또는 트랜스제닉 제조에 의해 생산될 수 있거나, 또는 다른 생물학적 공급원으로부터 정제될 수 있다.
또한, 상술한 바를 고려하여, 본원발명은 상기 기재된 단리 또는 정제된 핵산 분자를 임의로 벡터의 형태로 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본원발명의 세포가 벡터를 발현시켜 올리고뉴클레오티드 또는 그의 단편이 세포에 의해 효율적으로 전사 및 번역되도록 하는 것이 가장 바람직하다. 세포의 예에는, 이들로 한정되지는 않지만, 인간 세포, 인간 세포주, 이. 콜라이(E. coli) (예를 들어, 이. 콜라이 TB-1, TG-2, DH5α, XL-Blue MRF' (스트라타진), SA2821 및 Y1090), 비. 서브틸리스(B. subtilis), 피. 애루기노사(P. aeruginosa), 에스. 세레비지애(S. cerevisiae), 엔. 크라사(N. crassa), 곤충 세포 (예를 들어, Sf9, Ea4) 및 하기 본원에 명시된 기타 집합이 포함된다. 숙주 세포는 동물, 예컨대 포유동물, 특히 인간일 수 있는 숙주에 존재할 수 있다.
특정 실시양태에서, 통상의 재조합 DNA 기술을 이용하여 본원에서 확인된 CDR 중 하나 이상을 프레임워크 영역 내로 삽입할 수 있다. 프레임워크 영역은 천연 또는 컨센서스(consensus) 프레임워크 영역, 및 바람직하게는 인간 프레임워크 영역일 수 있다 (예를 들어, 인간 프레임워크 영역의 열거에 대해서는 문헌 [Chothia et al., J. Mol. Biol. 278: 457-479 (1998)] 참조). 바람직하게는, 프레임워크 영역과 CDR의 조합으로 생성된 폴리뉴클레오티드는 GD2와 특이적으로 결합하는 항체를 코딩한다. 하나 이상의 아미노산 치환이 프레임워크 영역 내에서 일어날 수 있고, 바람직하게는 아미노산 치환은 항체와 그의 항원의 결합을 개선시킨다. 또한, 이러한 방법을 이용하여 쇄내 디술피드 결합에 참여하는 하나 이상의 가변 영역 시스테인 잔기의 아미노산 치환 또는 결실을 수행함으로써, 하나 이상의 쇄내 디술피드 결합이 결여된 항체 분자를 생성할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 다른 변경도 본원발명 및 관련 기술 분야의 기술 범위 내에 포함된다.
적용
높은 친화도의 GD2에 대한 중화 키메라 또는 인간 항체는 GD2가 발현되는 질환에서 사용되는 것이 바람직할 것이며, 예를 들어 GD2는 50％ 초과의 흑색종에서 발현되며 (문헌 [Zhang et al., 1997, Int. J. Cancer. 73, 42-49]), 88％의 골육종에서 발현되며 (문헌 [Heiner et al., 1987, Cancer Res. 47, 5377-5388]), 93％의 지방육종, 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종, 평활근육종 및 방추상 세포육종을 비롯한 연조직 육종에서 발현되며 (문헌 [Chang et al., 1992, Cancer 70, 633-638]), 뇌종양에서 발현된다 (문헌 [Longee et al., 1991, Acta Neuropathol. 82, 45-54]). 항-GD2 항체는, 흑색종 (문헌 [Saleh et al, 1992, Hum. Antibody Hybridomas 3, 19-24]; [Cheung et al., 1987, J. Clin. Oncol. 5, 1430-1440]; [Choi et al., 2006, Cancer Immunol. Immunother. 55, 761-774]), 육종 (문헌 [Choi et al., 2006, supra]; [Yeh et al., 1992, The fifth Asia and Oceania Congress of Nuclear Medicine and Biology Proceedings, p. 104]), 소세포폐암 (문헌 [Grant et al., 1996, Eur. J. Nucl. Med. 23, 145-149]), 뇌종양 (문헌 [Arbit et al., 1995, Eur. J. Nucl. Med. 22, 419-426])을 갖는 환자에서 iv 주사 및 또한 옴마야(Ommaya) 저장기를 사용한 구획화 요법(compartmental therapy)에 의해 시험되었다 (문헌 [Kramer et al., 2007, J. Clin. Oncol. 25, 5465-5470]). 또한, GD2는 망막아세포종 (문헌 [Chantada et al., 2006, J. Pediatr. Hematol. Oncol. 28, 369-373]) 및 HTLV-1 감염된 T 세포 백혈병 세포 (문헌 [Furukawa et al., 1993, PNAS USA 90, 1972-1976])에 대한 종양 표적이다. 한 바람직한 측면에서, 명세서의 항-GD2 항체를 사용하여 신경아세포종을 치료할 수 있다. 항-GD2 항체 또는 그의 유도체는 단일 작용제로서 또는 다른 치료제와 함께 사용할 수 있다. 추가적으로, 이러한 Mab를 화학민감제(chemosensitizer)로서 사용하여, 이에 의해 그의 사용이 세포독성제의 치료 효능을 증가시킬 수 있다. 이러한 항체를 방사선민감제(radiosensitizer)로서 사용하여, 이에 의해 그의 사용이 방사선의 효능을 개선시킬 수 있다. 또한, 이들은 다른 종양-면역조절 작용제, 예컨대 IL-2, IL-12 및/또는 IFN알파와 함께 사용할 수 있다. 추가적으로, 항-GD2 항체는 다른 모노클로날 항체, 예컨대 항-TNF-알파, IL-12/IL-23, IL-2, GpIIb/IIIa 수용체, CD52, CD20, RSV 단백질, HER2/neu 수용체 등; 및 또한 리툭산(Rituxan), 헤르셉틴(Herceptin), 밀로타르그(Mylotarg), 캄파스(Campath), 제발린(Zevalin), 벡사르(Bexxar), 에르비툭스(Erbitux), 아바스틴(Avastin) 및 벡티빅스(Vectibix)를 비롯한 시판 승인된 항체와 함께 사용할 수 있다.
따라서, 본원발명은 또한 본원발명의 적어도 하나의 항-GD2 항체를 사용하여 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에서 관련 기술 분야에 알려져 있거나 또는 본원에 기재된 것과 같은 적어도 하나의 GD2 관련 질환을 조절하거나 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.
림포카인-활성화된 살해 세포 (LAK) 및 종양 침투 림프구 (TIL)를 사용한 1986년의 후천성 면역요법의 시험에서, 때때로 환자 내 종양 반응이 보고되었다. 공여자 림프구 주입은, 동종이계 줄기 세포 이식 후 만성 골수성 백혈병을 가진 환자에서 또는 이식후 EBV-연관 림프증식성 질환 (PTLD)을 가진 환자에서 더욱 성공적인 것으로 나타났다. 고형 종양에서, CTL은 악성 흑색종의 치료에서 성공적이었고, 그 동안 고용량 화학요법에 의해 림프구감소가 생성되었다. 2개의 결합 부위를 갖는 하이브리드 면역 글로불린 분자를 생성하기 위해 2가지 하이브리도마를 융합하여, 이중특이성 항체를 생성하였다. 항체는 종양을 T-세포에 구속시킬 뿐만 아니라, 이들은 CD3을 T-세포 상에 가교결합시키고, 활성화 캐스케이드를 개시한다. 이러한 방식으로 TCR-기재 세포독성은, MHC 제한을 우회하는 목적하는 종양 표적으로 다시 향하게 한다. 항-CD3 x 항-TAA (BsAb 또는 BiTE 항체)를 이용한 폴리클로날 활성화된 T 세포 (ATC)의 무장은 MoAb (예를 들어, TAA가 GD2인 hu3F8)의 표적화 특이성과 T 세포의 MHC-비제한 퍼포린/그랜자임 매개된 세포독성이 합쳐지게 한다. BsAb 또는 BiTE는 늘어난 활성화된 T 세포를 생체외에서 무장시킨 후, 환자에 주입할 수 있다. 이러한 전략은 모든 ATC를 특이적 CTL로 전환시킨다 (문헌 [Thakur and Lum, 2010, Curr Opin Mol Ther 12, 340-349; 및 [Grabert et al., 2006, Clin Cancer Res 12, 569-576]).
종양은 다수의 메카니즘: (예를 들어, NB에서) MHC의 저발현 또는 무발현, T 세포 신호전달의 탈선, MHC 상의 종양 펩티드 표시의 감소, 보조-자극 분자의 부재, 및 CTL 및 체액성 반응을 억제하는 조절 T-세포의 유도에 의해, T 세포를 피한다. BsAb 또는 BiTE 무장된 ATC에 의해 수행되는 사멸이 MHC-비제한적이기 때문에, 이러한 전략은 이러한 종양 회피 메카니즘 중 일부를 극복해야 한다. 종양은 T-세포 면역 반응을 Th2 유형으로 전환시키는 TGF-β를 분비하고, 인터류킨 2 (IL-2) 및 IFN-γ 분비를 하향조절하는 반면, IL-10 및 IL-6은 상향조절하고, 이 모든 것은 면역 억제로 이어진다. BsAb 또는 BiTE에 의해 방향재설정된 T-세포는, 무장된 ATC가 IL-2 비의존성 방식으로 종양 표적을 용해시키기 때문에, 조절 사이토카인의 이러한 부정적 효과를 피할 수 있다. 이들의 종양을 향하는 BsAb 또는 BiTE 무장된 T 세포로 치료받은 환자는 증가된 수준의 TNF-α 및 IFN-γ를 가지며, 이는 T-세포를 Th1 반응을 향하도록 전환시켜야 한다. 또한, 세포독성 T 세포는 종양 세포 상의 Fas 수용체 (CD95)와 결합하는 이들의 Fas 리간드 (FasL)를 통해 사멸된다. 불행하게도, 종양 세포 상의 FasL은 또한 T 세포의 아폽토시스를 유도할 수 있다. CD3 캐스케이드를 통한 TCR 자극은 CD8+ 세포를 CD95-매개된 자살로부터 보호한다. 무장된 ATC는 TCR의 BsAb 또는 BiTE와의 가교결합을 통해, CD95-유도된 세포 사멸에 저항한다. 연속적으로 사멸시키고 (즉, 하나의 T-세포가 연이은 종양 표적을 사멸시킴), 상기 과정 동안 증식하며, 림프 조직 및 연조직 내로 이동하는 T-세포의 능력은, NB 세포가 골수 공간 밖으로 전이되어 종양 덩어리를 형성하는 동안 이를 포획하는 기회를 증가시켰다. 인간 암을 표적화하는 BsAb 또는 BiTE를 이용한 최근의 연구는 유망한 것으로 나타났다.
특히 동종 조혈기관관련 세포 이식을 받은 환자에 대한 분석으로부터 부상하는 증거가 있는데, 이는 림프종 및 특정 형태의 백혈병을 억제하거나 또는 제거하는 T-세포의 잠재력을 지지한다 (문헌 [O'reilly et al., 2010, Semin Immunol 22, 162-172]). 하지만, 소아 내 고형 종양의 제어에서의 T-세포의 역할을 지지하는 확실한 데이터는 존재하지 않는다. 이는, 이러한 종양의 절단이 유전 클래스 I 또는 II HLA 대립유전자를 발현시키지 않거나 (예를 들어, 신경아세포종) (문헌 [Raffaghello et al., 2005, Oncogene 24, 4634-4644]; 및 [Wolfl et al., 2005, Cancer Immunol Immunother 54, 400-406]) 또는 클래스 I 대립유전자만을 저수준으로 발현시킨다 (예를 들어, 횡문근육종) (문헌 [Prados et al., 2006, Neoplasma 53, 226-231])는 사실과 일관성이 있다. 더욱이, 중요한 보조-자극 분자, 예컨대 B7.1 및 ICAM-1의 발현은 대체로 저조하거나 또는 검출불가능하다. 결과적으로, 이러한 종양의 T-세포 반응을 이끌어 내는 능력은 불량하고, T-세포 수용체를 통해 HLA 대립유전자로 나타낸 종양 항원과 결합함으로써 종양과 결합하는 이펙터 T-세포의 잠재력은 제한된다. 또한, 신경아세포종, 횡문근육종, 유잉(Ewing) 육종 및 결합조직형성 원형 소세포 종양에 대해 현재 이용가능한 가장 효과적인 치료요법은 심각한 T-림프구 감소증을 유도하는 용량에서 면역억제성 알킬화 작용제, 특히 시클로포스파미드를 이용한다. 이중작용성 항체는, 이들의 항원-특이적 HLA-제한된 TCR보다는 HLA-비-제한된 CD3-매개된 활성화를 통한 이들의 이펙터 기능의 이용 및 T-세포의 표적화된 결합을 허용한다. CD3 및 종양 항원 (예컨대, CD-19, HER-2 NEU 또는 CEA)에 대해 특이적인 특정 이중작용성 모노클로날 항체의 연구는, 세포독성 T-세포를 다른 표적화된 항원을 발현시키는 종양 세포에 연결하는 이들 항체의 능력을 입증하였다 (문헌 [Bargou et al., 2008, Science 321, 974-977]; [Topp et al., 2009, Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 114, 840]; [Kiewe et al., 2006, Clin Cancer Res 12, 3085-3091]; 및 [Lutterbuese et al., 2009, J Immnother 32, 341-352]). 일단 항체 수용체 둘 모두가 결합하면, 세포독성 T-세포 반응이 종양 세포에 대해 개시된다. T-세포 반응은 T-세포 수용체 및 종양 세포 간의 세포독성 시냅스의 형성뿐만 아니라, 종양 세포 아폽토시스의 퍼포린 및 그랜자임 매개된 유도에 관여한다 (문헌 [Offner et al., 2006, Mol Immunol 43, 763-771]; 및 [Brischwein et al., 2006, Mol Immunol 43, 1129-1143]). CD3의 결합은 또한 T-세포를 활성화시켜, 항종양 효과를 강력하게 하는 이펙터 사이토카인의 증식 및 생성을 유도한다 (상기 문헌 [Brischwein et al., 2006]; 및 [Brischwein et al., 2007, J Immunother 30, 798-807]). 두드러지게는, 활성화된 T-세포는 T-세포 활성화 동안 생성된 TNF 및 Fas 리간드의 세포독성 효과로부터 이들을 보호하는 항-세포사멸성 단백질 c-FLIP를 상향조절한다 (문헌 [Dreir et al., 2002, Int J Cancer 100, 690-697]). 결과적으로, T-세포 반응은 확대된다. 결과적으로, 이중작용성 항체의 피코그램 수준은 전임상적 동물 모델, 및 특히 B-세포 림프종 및 ALL의 치료에 이중특이적인 CD3/CD19의 초기 임상 시험의 결과에서 나타난 바와 같이 (상기 문헌 [Topp et al., 2009]; 및 [Kiewe et al., 2006]), 시험관내에서 (상기 문헌 [Lutterbuese et al., 2009]; 및 [Brandl et al., 2007, Cancer Immunol Immunother 56, 1551-1563]) 그리고 생체내에서 유의한 항종양 효과를 가할 수 있다. 유도된 T-세포 반응이 천연 T-세포를 동원하여 종양 부위에서 종양-특이적 T-세포의 생성을 자극할 수 있다는 가설이 세워졌다 (문헌 [Koehne et al., 2002, Blood 99, 1730-1740]). 이중특이성 항체는 또한 T-림프구 외의 다른 이펙터 세포를 재표적화하는 데에 사용될 수 있다. GD2를 발현하는 세포, 조직 또는 기관에 대한 이러한 이펙터 세포에는 NK 세포, B-림프구, 수지상 세포, 단핵세포, 대식세포, 호중구, 중간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포 및 다른 줄기 세포가 포함된다. 조직이 종양인 경우, 이러한 이펙터 세포를 이용하여, 진단 또는 치료요법을 위한 방사성 동위원소, 단백질 (예를 들어, 사이토카인, 항체, 효소 또는 독소)을 사멸시키거나 또는 침전시킬 수 있다. 조직이 정상 기관인 경우, 이펙터 세포를 유사하게 이용하여, 진단 또는 치료요법을 위한 동위원소 또는 단백질을 전달할 수 있다.
본원발명은, 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에서, 다발성 골수종, 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프모세포성 백혈병 (ALL), B-세포, T-세포 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수구성 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모발상 세포 백혈병, 골수형성이상 증후군 (MDS), 림프종, 호지킨 질환, 악성 림프종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 다발성 골수종, 카포시 육종, 결장직장 암종, 신장 세포 암종, 췌장의 암종, 전립선 암종, 비인두 암종, 악성 조직구증, 악성 종양의 부신생물 증후군/과칼슘혈증, 고형 종양, 선암종, 육종, 악성 흑색종, 혈관종, 전이성 질환, 암 관련 골 흡수, 암 관련 골 통증; 암 전이의 억제; 암 악액질의 개선; 및 염증성 질환, 예컨대 혈관간 증식성 사구체신염의 치료 등 중 하나 이상을 비롯한 (이들로 제한되지는 않음), 하나 이상의 악성 질환을 조절 또는 치료하기 위한 방법을 포함한다. 임의로, 이러한 방법은 이러한 GD2 항체의 투여 전, 동시 또는 투여 이후의 방사선 치료, 항맥관형성제, 화학요법제, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제 등과 함께 사용할 수 있다.
또한, 본원발명은, 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에서, 류마티스성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 전신 발병 소아 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 위궤양, 음성혈청반응성 관절병증, 골관절염, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 전신성 홍반성 루푸스, 항-인지질 증후군, 홍체섬모체염/포도막염/시신경염, 특발성 폐 섬유증, 전신성 맥관염/베게네 육아종증, 사르코이드증, 고환염/정관수술 복원(vasectomy reversal) 절차, 알레르기성/아토피성 질환, 천식, 알레르기성 비염, 습진, 알레르기성 접촉성 피부염, 알레르기성 결막염, 과민성 폐렴, 이식, 장기 이식 거부, 이식편 대 숙주 질환, 전신성 염증성 반응 증후군, 패혈증 증후군, 그램 양성 패혈증, 그램 음성 패혈증, 배앙 음성 패혈증, 진균 패혈증, 호중구감소성 발열, 요로성 패혈증, 수막구균혈증, 외상/출혈, 화상, 이온화 방사선 노출, 급성 췌장염, 성인 호흡 곤란 증후군, 류마티스성 관절염, 알콜-유발 간염, 만성 염증성 병리 증상, 사르코이드증, 크론 병리 증상, 겸상 적혈구 빈혈증, 당뇨병, 신장증, 아토피성 질환, 과민 반응, 알레르기성 비염, 고초열, 통년성 비염, 결막염, 자궁내막증, 천식, 두드러기, 전신성 아나필락시스, 피부염, 악성 빈혈증, 용혈성 질환, 혈소판감소증, 임의의 장기 또는 조직의 이식편 거부, 신장 이식 거부, 심장 이식 거부, 간 이식 거부, 췌장 이식 거부, 폐 이식 거부, 골수 이식 (BMT) 거부, 피부 동종이식편 거부, 연골 이식 거부, 골 이식편 거부, 소장 이식 거부, 태아 흉선 임플란트 거부, 부갑상선 이식 거부, 임의의 장기 또는 조직의 이종이식편 거부, 동종이식편 거부, 항-수용체 과민 반응, 그레이브스 질환, 레이노 질환, B형 인슐린-저항성 당뇨병, 천식, 중증 근무력증, 항체-매개 세포독성, 제III형 과민 반응, 전신성 홍반성 루푸스, POEMS 증후군 (다발신경병증, 장기비대증, 내분비병증, 모노클로날 김마글로불린병증 및 피부 변화 증후군), 다발신경병증, 장기비대증, 내분비병증, 모노클로날 김마글로불린병증, 피부 변화 증후군, 항-인지질 증후군, 천포창, 경피증, 혼합 결합 조직 질환, 특발성 애디슨 질환, 당뇨병, 만성 활동 간염, 원발성 담관 경화증, 백반증, 맥관염, MI 심장절개 후 증후군, 제IV형 과민증, 접촉성 피부염, 과민성 폐렴, 동종이식편 거부, 세포내 유기체로 인한 육아종, 약물 민감성, 대사성/특발성, 윌슨 질환, 혈색소침착증, 알파-1-항트립신 결핍, 당뇨병성 망막병증, 하시모토 갑상선염, 골다공증, 시상하부-뇌하수체-부신 축 평가, 원발성 담관 경화증, 갑상선염, 뇌척수염, 악액질, 낭성 섬유증, 신생아 만성 폐 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 가족성 혈구포식성 림프조직구증, 피부 병태, 건선, 탈모증, 신장 증후군, 신장염, 사구체 신장염, 급성 신부전, 혈액투석, 요독증, 독성, 자간전증, okt3 요법, 항-cd3 요법, 사이토카인 요법, 화학요법, 방사선 요법 (예를 들어, 무력증, 빈혈증, 악액질 등을 포함하지만 이들로 제한되지는 않음), 만성 살리실레이트 중독, 수면 무호흡증, 비만증, 심부전, 동염, 염증성 장 질환 등 중 하나 이상을 비롯한 (이들로 제한되지는 않음), 적어도 하나의 GD2 매개 면역 관련 질환을 조절 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 문헌 [the Merck Manual, 12th-17th Editions, Merck & Company, Rahway, N.J. (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999)], [Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., eds., Second Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000)]을 참조하며, 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
또한, 본원발명은, 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에서, 박테리아, 바이러스 및 진균 감염, HIV 감염/HIV 신경병증, 수막염, 간염 (A, B 또는 C 등), 패혈성 관절염, 복막염, 폐렴, 후두개염, 이. 콜라이 0157:h7, 용혈성 요독 증후군/혈전용해 혈소판 감소성 자색반증, 말라리아, 뎅기 출혈열, 리슈만편모충증, 나병, 독소성 쇼크 증후군, 스트렙토콕쿠스 근육염, 가스 괴저, 미코박테륨 투베르쿨로시스(mycobacterium tuberculosis), 세포내 미코박테륨 아비움(mycobacterium avium), 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii) 폐렴, 골반 염증성 질환, 고환염/부고환염, 레기오넬라, 라임 질환, 인플루엔자 a, 엡스타인-바 바이러스, 바이러스 관련 혈구탐식 증후군, 바이러스성 뇌염/무균 수막염 등을 비롯한 급성 또는 만성 박테리아 감염, 급성 및 만성 기생 또는 감염 과정 중 적어도 하나를 비롯한 (이들로 제한되지는 않음), 하나 이상의 감염성 질환을 조절 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.
임의로, 이러한 방법 중 어느 하나는 유효량의 적어도 하나의 항-GD2 항체를 포함하는 하나 이상의 조성물 또는 제약 조성물을 이러한 조절, 치료 또는 요법이 필요한 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본원발명의 임의의 방법은 유효량의 적어도 하나의 항-GD2 항체를 포함하는 조성물 또는 제약 조성물을 이러한 조절, 치료 또는 요법이 필요한 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 임의로, 이러한 방법은 이러한 면역 질환 또는 악성 질환의 치료를 위한 공동-투여 또는 조합 요법을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 적어도 하나의 항-GD2 항체, 그의 특정 부분 또는 변이체의 투여는 하나 이상의 TNF 길항제 (예를 들어, TNF 항체 또는 단편, 가용성 TNF 수용체 또는 단편, 이들의 융합 단백질, 또는 소형 분자 TNF 길항제 (이들로 제한되지는 않음)), IL-18 항체 또는 단편, 소형 분자 IL-18 길항제 또는 IL-18 수용체 결합 단백질, IL-1 항체 (IL-1 알파 및 IL-1 베타 둘 다 포함함) 또는 단편, 가용성 IL-1 수용체 길항제, 항류마티스제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 오라노핀, 오로티오글루코스, 아자티오프린, 에타너셉트, 금 나트륨 티오말레이트, 히드록시클로로퀸 술페이트, 레플루노미드, 술파살라진, 방사선 요법, 항맥관형성제, 화학요법제, 탈리도미드 근육 이완제, 마약성 약물, 비-스테로이드성 소염성 약물 (NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항미생물제 (예를 들어, 아미노글리코시드, 항진균제, 구충제, 항바이러스제, 카르바페넴, 세팔로스포린, 플루오로퀴놀론, 마크롤리드, 페니실린, 술폰아미드, 테트라시클린, 또 다른 항미생물제), 항건선제, 코르티코스테로이드, 동화작용성 스테로이드, 당뇨병 관련 작용제, 미네랄, 영양제, 갑상선 작용제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 에리스로포이에틴 (예를 들어, 에포에틴 알파), 필그라스팀 (예를 들어, G-CSF, 뉴포겐), 사르그라모스팀 (GM-CSF, 류킨), 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제 (예를 들어, 바실릭시맙, 시클로스포린, 다클리주맙), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 수용체 조절제, 동공확대제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사제, 유사분열 억제제, 방사성의약품, 항우울제, 항조증제, 항정신병제, 항불안제, 수면제, 교감신경 흥분제, 자극제, 도네페질, 타크린, 천식 약물, 베타 효능제, 흡입 스테로이드, 류코트리엔 억제제, 메틸크산틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도마제 알파 (플모자임), 사이토카인 또는 사이토카인 길항제로부터 선택되는 하나 이상을 이전에, 동시에 및/또는 이후에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 적합한 투여량은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (2000)]; [PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000)]을 참조하며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원발명의 조성물, 조합 요법, 공동-투여, 장치 및/또는 방법에 적합한 TNF 길항제 (본원발명의 적어도 하나의 항체, 그의 특정 부분 및 변이체를 추가로 포함함)에는 항-TNF 항체, 그의 항원-결합 단편, 및 TNF에 특이적으로 결합하는 수용체 분자; TNF 합성, TNF 방출 또는 표적 세포에서의 그의 작용을 방지 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 탈리도미드, 테니댑, 포스포디에스테라제 억제제 (예를 들어, 펜톡시필린 및 롤리프람), A2b 아데노신 수용체 효능제 및 A2b 아데노신 수용체 증진제; TNF 수용체 신호전달을 방지 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 미토겐 활성화 단백질 (MAP) 키나제 억제제; 막 TNF 절단을 차단 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 메탈로프로테이나제 억제제; TNF 활성을 차단 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제 (예를 들어, 캅토프릴); 및 TNF 생성 및/또는 합성을 차단 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 MAP 키나제 억제제가 포함되지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본원발명의 임의의 방법은, 유효량의 적어도 하나의 항-GD2 항체를 포함하는 조성물 또는 제약 조성물을 이러한 조절, 치료 또는 요법이 필요한 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, GD2 매개 장애 또는 GD2 발현을 특징으로 하는 장애를 치료하기 위한 방법을 포함할 수 있다. 임의로, 이러한 방법은 이러한 면역 질환의 치료를 위한 공동-투여 또는 조합 요법을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 적어도 하나의 항-GD2 항체, 그의 특정 부분 또는 변이체의 투여는 상기 기재된 것과 같은 하나 이상의 작용제를 이전에, 동시에 및/또는 이후에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
통상적으로, 병리 증상의 치료는 조성물에 함유된 것의 특이적 활성에 따라서, 평균적으로 범위가 용량 당 환자 1 킬로그램 당 적어도 약 0.01 내지 500 밀리그램의 적어도 하나의 항-GD2 항체, 바람직하게는 단일 또는 다중 투여 당 환자 1 킬로그램 당 적어도 약 0.1 내지 100 밀리그램의 항체인 유효량 또는 투여량의 적어도 하나의 항-GD2 항체 조성물의 투여에 의해 수행된다. 다르게는, 유효한 혈청 농도는 단일 또는 다중 투여 당 0.1-5000 ug/ml 혈청 농도를 포함할 수 있다. 적합한 투여량은 의학 시술자에게 알려져 있으며, 물론 특정 질환 상태, 투여되는 조성물의 특이적 활성, 및 몇몇 경우에서 치료를 받는 특정 환자에 따를 것이며, 원하는 치료 양을 달성하기 위하여, 반복 투여, 즉 특정한 모니터링 또는 계량된 용량의 반복 개별 투여를 제공하는 것이 필요할 수 있으며, 여기서 개별 투여는 원하는 일일 용량 또는 효과가 달성될 때까지 반복된다.
바람직한 용량에는 임의로 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 및/또는 100-500 mg/kg/투여, 그 안의 임의의 범위, 값 또는 분수가 포함될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여 당 0.1, 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5, 2.9, 3.0, 3.5, 3.9, 4.0, 4.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10, 10.5, 10.9, 11, 11.5, 11.9, 20, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14.0, 14.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10, 10.5, 10.9, 11, 11.5, 11.9, 12, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14, 14.5, 15, 15.5, 15.9, 1.6, 16.5, 16.9, 17, 17.5, 17.9, 18, 18.5, 18.9, 19, 19.5, 19.9, 20, 20.5, 20.9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 및/또는 5000 .mu.g/ml 혈청 농도, 또는 그 안의 임의의 범위, 값 또는 분수의 혈청 농도가 달성된다.
다르게는, 투여되는 투여량은 알려진 요인, 예컨대 특정 작용제의 약력학적 특성, 및 그의 투여 방식 및 경로; 수용자의 연령, 건강 및 체중; 증상의 성질 및 정도, 동시 치료의 종류, 치료의 빈도, 및 원하는 효과에 따라 변할 수 있다. 일반적으로, 활성 성분의 투여량은 체중 1 킬로그램 당 약 0.1 내지 100 밀리그램일 수 있다. 투여 당 체중 1 킬로그램 당 보통 0.1 내지 50, 바람직하게는 0.1 내지 10 밀리그램 또는 지속 방출 형태가 원하는 결과를 얻기에 효과적이다.
비제한적인 예로서, 인간 또는 동물의 치료는, 단일, 주입 또는 반복 용량을 사용하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40일차 중 하나 이상, 또는 다르게는 또는 추가적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 또는 52주차 중 하나 이상, 또는 다르게는 또는 추가적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20년차 중 하나 이상에서 1일 당 0.1 내지 100 mg/kg, 예컨대 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/kg의 본원발명의 적어도 하나의 항체 또는 그의 임의의 조합물의 1회 또는 주기적 투여로서 제공될 수 있다.
추가적으로, 본원발명은 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 경막내, 옴마야내, 안내, 유리체내, 대장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복강내, 흉강내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 수강내, 윤활막내, 흉곽내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질내, 직장, 구강내, 설하, 비내 또는 경피 수단에 의한 적어도 하나의 항-GD2 항체의 투여에 관한 것이다. 적어도 하나의 항-GD2 항체 조성물은, 특히 액체 용액 또는 현탁액 형태의 비경구 (피하, 근육내 또는 정맥내) 또는 임의의 다른 투여에 대한 사용; 특히 반고체 형태, 예컨대 크림 및 좌제 (이들로 제한되지는 않음)의 질내 또는 직장내 투여에서의 사용; 구강내 또는 설하 투여, 예컨대 정제 또는 캡슐 형태 (이들로 제한되지는 않음)를 위해; 또는 비내, 예컨대 분말, 점비액 또는 에어로졸 또는 소정의 작용제 형태 (이들로 제한되지는 않음); 또는 경피, 예컨대 겔, 연고, 로션, 피부 구조를 변화시키거나 또는 경피 패치에서 약물 농도를 증가시키기 위한 화학적 증진제, 예컨대 디메틸 술폭시드 (문헌 [Junginger, et al. In "Drug Permeation Enhancement"; Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90, Marcel Dekker, Inc. New York 1994]; 전문이 본원에 참조로 포함됨) 또는 피부 상에 단백질 및 펩티드를 함유하는 제제의 적용을 가능하게 하는 산화제 (WO 98/53847)를 갖는 패치 전달 시스템, 또는 전기천공법과 같은 일시적인 수송 경로를 생성하기 위한 전기장의 적용, 또는 이온영동(iontophoresis)과 같은 하전된 약물의 피부를 통한 이동을 증가시키기 위한 전기장의 적용, 또는 초음파영동(sonophoresis)과 같은 초음파의 적용 (미국 특허 제4,309,989호 및 제4,767,402호)을 위해 제조할 수 있다 (상기 공보 및 특허는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
폐 투여를 위하여, 바람직하게는 적어도 하나의 항-GD2 항체 조성물이 폐 또는 부비강의 하 기도에 도달하기에 효과적인 입자 크기로 전달된다. 본 발명에 따르면, 적어도 하나의 항-GD2 항체는 흡입에 의한 치료제의 투여에 대하여 관련 기술 분야에 알려진 다양한 흡입 또는 비내 장치 중 어느 하나에 의해 전달될 수 있다. 환자의 부비동 또는 폐포에의 에어로졸화된 제제의 분사를 가능하게 하는 이러한 장치에는 계량식 흡입기, 네뷸라이저, 건조 분말 발생기, 분무기 등이 포함된다. 또한, 항체가 폐 또는 비내 투여되도록 하는데 적합한 다른 장치가 관련 기술 분야에 알려져 있다. 이러한 장치 모두는 에어로졸로의 항체의 분사를 위한 투여에 적합한 제제를 사용할 수 있다. 이러한 에어로졸은 용액 (수성 및 비-수성 둘 다) 또는 고체 입자 중 하나로 구성되어 있을 수 있다. 통상적으로, 벤톨린(Ventolin)® 계량식 흡입기와 같은 계량식 흡입기는 추진체 가스를 사용하며 흡기 동안의 발동을 요구한다 (예를 들어, WO 94/16970, WO 98/35888 참조). 몇가지 예를 들면, 튜브할러(TURBUHALER)™ (아스트라(Astra)), 로타할러(ROTAHALER)® (글락소(Glaxo)), 디스쿠스(DISKUS)® (글락소), 인헤일 테라뷰틱스(Inhale Therapeutics)에 의해 판매되는 장치와 같은 건조 분말 흡입기는 혼합된 분말의 호흡-발동을 사용한다 (미국 특허 제4,668,218호 (아스트라), EP 237507 (아스트라), WO 97/25086 (글락소), WO 94/08552 듀라(Dura), 미국 특허 제5,458,135호 (인헤일), WO 94/06498 (피존즈(Fisons)); 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 울트라벤트(ULTRAVENT)® 네뷸라이저(말린크로드트(Mallinckrodt)) 및 아코른 II(ACORN II)® 네뷸라이저 (마르퀘스트 메디컬 프로덕츠(Marquest Medical Products)) (미국 특허 제5,404,871호 (아라디즘), WO 97/22376)와 같은 네뷸라이저 (이들 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)는 용액으로부터 에어로졸을 생성하지만, 반면 계량식 흡입기, 건조 분말 흡입기 등은 소립자 에어로졸을 생성한다. 이러한 시판되는 흡입 장치의 특정 예는 본 발명의 실시에 적합한 특정 장치를 대표하려고 하며, 본 발명의 범주를 제한하려고 하는 것은 아니다. 바람직하게는, 적어도 하나의 항-GD2 항체를 포함하는 조성물은 건조 분말 흡입기 또는 분무기에 의해 전달된다. 본원발명의 적어도 하나의 항체의 투여를 위한 흡입 장치의 여러 바람직한 특징이 있다. 예를 들어, 흡입 장치에 의한 전달은 유리하게는 신뢰성 있고, 재현가능하고, 정확하다. 임의로, 흡입 장치는 앙호한 호흡가능성(respirability)을 위해 예를 들어 약 10 um 미만, 바람직하게는 약 1-5 um의 소형 건조 입자를 전달할 수 있다.
GD2 항체 조성물 단백질을 포함하는 스프레이는 적어도 하나의 항-GD2 항체의 현탁액 또는 용액을 가압 하에 노즐을 통과하도록 하여 제조할 수 있다. 노즐 크기 및 형태, 적용되는 압력 및 액체 공급 속도를 원하는 방출량 및 입자 크기를 달성하도록 선택할 수 있다. 전기스프레이는 예를 들어 모세관 또는 노즐 장치와 관련된 전기장에 의해 제조할 수 있다. 유리하게는, 분무기에 의해 전달되는 적어도 하나의 항-GD2 항체 조성물 단백질의 입자는 약 10 um 미만, 바람직하게는 약 1 um 내지 약 5 um, 가장 바람직하게는 약 2 um 내지 약 3 um 범위의 입자 크기를 갖는다.
통상적으로, 분무기로의 사용에 적합한 적어도 하나의 항-GD2 항체 조성물 단백질의 제제는 용액 1 ml 당 약 0.1 mg 내지 약 100 mg 또는 mg/gm, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값, 예를 들어 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/ml 또는 mg/gm (이들로 제한되지는 않음)의 적어도 하나의 항-GD2 항체 조성물 단백질의 농도로 수용액 중에서 항체 조성물 단백질을 포함한다. 제제는 작용제, 예컨대 부형제, 완충액, 등장제, 보존제, 계면활성제, 및 바람직하게는 아연을 포함할 수 있다. 또한, 제제는 항체 조성물 단백질의 안정화를 위한 부형제 또는 작용제, 예컨대 완충액, 환원제, 벌크 단백질 또는 탄수화물을 포함할 수 있다. 항체 조성물 단백질의 제제화에 유용한 벌크 단백질에는 알부민, 프로타민 등이 포함된다. 항체 조성물 단백질의 제제화에 유용한 통상적인 탄수화물에는 수크로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 글루코스 등이 포함된다. 또한, 항체 조성물 단백질 제제는 계면활성제를 포함할 수 있으며, 이는 에어로졸의 형성에서의 용액의 원자화에 의해 유발되는 항체 조성물 단백질의 표면-유발 응집을 감소 또는 방지할 수 있다. 여러 통상적인 계면활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 알콜, 및 폴리옥시 에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르가 이용될 수 있다. 일반적으로, 양은 제제의 0.001 내지 14 중량％ 범위일 것이다. 본 발명의 목적에 특히 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 등이다. 또한, 단백질, 예컨대 GD2 항체 또는 특정 부분 또는 변이체의 제제화를 위한 관련 기술 분야에 알려진 추가의 작용제가 제제에 포함될 수 있다.
항체 조성물 단백질은 네뷸라이저, 예컨대 제트 네뷸라이저 또는 초음파 네뷸라이저에 의해 투여될 수 있다. 통상적으로, 제트 네뷸라이저에서, 압축 공기 공급원을 사용하여 오리피스(orifice)를 통해 고속 공기 제트를 생성한다. 가스가 노즐을 넘어서 팽창되기 때문에, 저압 영역이 생성되며, 이는 항체 조성물 단백질의 용액을 액체 저장기에 연결된 모세관을 통해 빨아들인다. 튜브에 존재하기 때문에, 모세관으로부터의 액체 스트림은 불안정한 필라멘트 및 액적으로 잘려져, 에어로졸을 생성한다. 일련의 형태, 유속 및 배플(baffle) 유형을 이용하여 소정의 제트 네뷸라이저로부터의 원하는 성능 특성을 달성할 수 있다. 초음파 네뷸라이저에서, 고주파 전기 에너지를 사용하여 진동, 기계적 에너지를 생성할 수 있으며, 통상적으로 압전 변환기를 이용한다. 이 에너지는 직접적으로 또는 커플링 유체를 통해 항체 조성물 단백질의 제제에 전달되어, 항체 조성물 단백질을 포함하는 에어로졸을 생성한다. 유리하게는, 네뷸라이저에 의해 전달되는 항체 조성물 단백질의 입자는 약 10 um 미만, 바람직하게는 약 1 um 내지 약 5 um, 가장 바람직하게는 약 2 um 내지 약 3 um 범위의 입자 크기를 갖는다.
통상적으로, 제트 또는 초음파 네뷸라이저로의 사용에 적합한 적어도 하나의 항-GD2 항체의 제제는 용액 1 ml 당 약 0.1 mg 내지 약 100 mg의 적어도 하나의 항-GD2 항체 단백질의 농도를 포함한다. 제제는 작용제, 예컨대 부형제, 완충액, 등장제, 보존제, 계면활성제, 및 바람직하게는 아연을 포함할 수 있다. 또한, 제제는 적어도 하나의 GD2 항체 조성물 단백질의 안정화를 위한 부형제 또는 작용제, 예컨대 완충액, 환원제, 벌크 단백질 또는 탄수화물을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 항-GD2 항체 조성물 단백질의 제제화에 유용한 벌크 단백질에는 알부민, 프로타민 등이 포함된다. 적어도 하나의 항-GD2 항체의 제제화에 유용한 통상적인 탄수화물에는 수크로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 글루코스 등이 포함된다. 또한, 적어도 하나의 항-GD2 항체 제제는 계면활성제를 포함할 수 있으며, 이는 에어로졸의 형성에서의 용액의 원자화에 의해 유발되는 적어도 하나의 항-GD2 항체의 표면-유발 응집을 감소 또는 방지할 수 있다. 여러 통상적인 계면활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 알콜, 및 폴리옥시에틸렌 소르비탈 지방산 에스테르를 이용할 수 있다. 일반적으로, 양은 제제의 0.001 내지 4 중량％ 범위일 것이다. 본 발명의 목적상 특히 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노-올레에이트, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 등이다. 또한, 단백질, 예컨대 항체 단백질의 제제화를 위한 관련 기술 분야에 알려진 추가의 작용제가 제제에 포함될 수 있다.
계량식 흡입기 (MDI)에서, 추진제, 적어도 하나의 항-GD2 항체, 및 임의의 부형제 또는 다른 첨가제가 액화 압축 가스를 포함하는 혼합물로서 캐니스터(canister)에 함유된다. 계량 투입 벨브의 작동은 바람직하게는 약 10 um 미만, 바람직하게는 약 1 um 내지 약 5 um, 가장 바람직하게는 약 2 um 내지 약 3 um의 크기 범위의 입자를 함유하는 에어로졸로서 다이 혼합물을 방출한다. 원하는 에어로졸 입자 크기는 제트-밀링, 스프레이 건조, 임계점 응축 등을 비롯한 통상의 기술자들에게 알려진 다양한 방법에 의해 생성되는 항체 조성물 단백질의 제제화를 이용하여 얻을 수 있다. 바람직한 계량식 흡입기에는 3M 또는 글락소에 의해 제조되며 히드로플루오로카본 추진체를 이용하는 것들이 포함된다.
일반적으로, 계량식 흡입기 장치와 함께 사용하기 위한 적어도 하나의 항-GD2 항체의 제제는 예를 들어 계면활성제의 도움으로 추진체 내에 현탁화된, 비-수성 매질 중 현탁액으로서 적어도 하나의 항-IL-6 항체를 함유하는 미분 분말을 포함할 것이다. 추진체는 이 목적상 이용되는 임의의 통상적인 물질, 예컨대 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, HFA-134a (히드로플루오로알칸-134a), HFA-227 (히드로플루오로알칸-227) 등을 비롯한 클로로플루오로카본, 히드로클로로플루오로카본, 히드로플루오로카본 또는 탄화수소일 수 있다. 바람직하게는, 추진체는 히드로플루오로카본이다. 계면활성제는 추진체에서의 현탁액으로서 적어도 하나의 항-GD2 항체를 안정화시키며, 화학적 분해에 대하여 활성제를 보호하는 것 등을 위해 선택될 수 있다. 적합한 계면활성제에는 소르비탄 트리올레에이트, 대두 레시틴, 올레산 등이 포함된다. 몇몇 경우에서, 용매, 예컨대 에탄올을 사용하는 용액 에어로졸이 바람직하다. 또한, 단백질의 제제화를 위한 관련 기술 분야에 알려진 추가의 작용제가 제제에 포함될 수 있다.
통상의 기술자들은 본 발명의 방법이 본원에 기재되지 않은 장치를 통한 적어도 하나의 항-GD2 항체 조성물의 폐 투여에 의해 달성될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
경구 투여용 제제는 장 벽의 투과성을 인공적으로 증가시키기 위한 보조제 (예를 들어, 레조르시놀 및 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 및 n-헥사데실폴리에틸렌 에테르)의 공동-투여, 및 또한 효소적 분해의 억제를 위한 효소적 억제제 (예를 들어, 췌장의 트립신 억제제, 디이소프로필플루오로포스페이트 (DFF) 및 트라실올)의 공동-투여에 의존한다. 경구 투여를 위한 고체-형 투여 형태의 활성 성분 화합물을 수크로스, 락토스, 셀룰로스, 만니톨, 트레할로스, 라피노스, 말티톨, 덱스트란, 전분, 한천, 아르기네이트(arginate), 키틴, 키토산, 펙틴, 트래거캔스 검, 아라비아 검, 젤라틴, 콜라겐, 카세인, 알부민, 합성 또는 반합성 중합체, 및 글리세리드를 비롯한 1종 이상의 첨가제와 혼합할 수 있다. 또한, 이러한 투여 형태는 다른 유형의 첨가제, 예를 들어 불활성 희석제, 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 파라벤, 보존제, 예컨대 소르브산, 아스코르브산, 알파.-토코페롤, 항산화제, 예컨대 시스테인, 붕해제, 결합제, 증점제, 완충제, 감미제, 향미제, 부향제(perfuming agent) 등을 함유할 수 있다.
추가적으로, 정제 및 환제는 장용 코팅된 제제로 가공될 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 제제에는 의료용으로 허용되는 에멀션, 시럽, 엘릭시르, 현탁액 및 용액 제제가 포함된다. 이러한 제제는 상기 분야에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들어 물을 함유할 수 있다. 또한, 리포좀은 인슐린 및 헤파린에 대한 약물 전달 시스템으로 기재되어 있다 (미국 특허 제4,239,754호). 보다 최근에, 혼합된 아미노산의 인공 중합체 (프로티노이드(proteinoid))의 마이크로구체를 사용하여 약제를 전달한다 (미국 특허 제4,925,673호). 추가적으로, 미국 특허 제5,879,681호 및 미국 특허 제5,5,871,753호에 기재된 담체 화합물이 관련 기술 분야에 알려져 있는 생물학적 활성제를 경구로 전달하기 위해 사용된다.
점막 표면을 통한 흡수, 조성물 및 투여 방법에 대하여, 적어도 하나의 항-GD2 항체는 복수개의 마이크로미터 이하의 입자, 점막접착성 거대분자, 생활성 펩티드 및 수성 연속 상을 포함하는 에멀션을 포함하며, 이는 에멀션 입자의 점막접착을 달성하여 점막 표면을 통한 흡수를 촉진한다 (미국 특허 제5,514,670호). 본 발명의 에멀션의 적용에 적합한 점액질 표면은 각막, 결막, 구강내, 설하, 비내, 질내, 폐, 위, 장 및 직장내 투여 경로를 포함한다. 질내 또는 직장내 투여용 제제, 예를 들어 좌제는 부형제로서 예를 들어 폴리알킬렌글리콜, 바셀린, 코코아 버터 등을 함유할 수 있다. 비내 투여용 제제는 고체일 수 있으며, 부형제로서 예를 들어 락토스를 함유할 수 있거나, 또는 점비액의 수성 또는 오일성 용액일 수 있다. 구강내 투여에 대하여, 부형제에는 당, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 전호화 전분 등이 포함된다 (미국 특허 제5,849,695호).
경피 투여를 위해서, 적어도 하나의 항-GD2 항체는 전달 장치, 예컨대 리포좀 또는 중합체성 나노입자, 마이크로입자, 마이크로캡슐 또는 마이크로구체 (달리 명시하지 않는다면 집합적으로 마이크로입자로 지칭됨)에 캡슐화될 수 있다. 합성 중합체, 예컨대 폴리히드록시산, 예컨대 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 이들의 공중합체, 폴리오르토에스테르, 폴리무수물(polyanhydride), 및 폴리포스파젠, 및 천연 중합체, 예컨대 콜라겐, 폴리아미노산, 알부민 및 다른 단백질, 알기네이트 및 다른 폴리사카라이드, 및 이들의 조합물로 제조된 마이크로입자를 비롯하여 여러 적합한 장치가 알려져 있다 (미국 특허 제5,814,599호).
본 발명의 화합물을 단일 투여로부터 연장된 기간에 걸쳐, 예를 들어 1주 내지 1년 또는 그 이상의 기간 동안 대상체에게 전달하는 것이 때때로 바람직할 수 있다. 다양한 서방형, 데포 또는 임플란트 투여 형태를 이용할 수 있다. 예를 들어, 투여 형태는 체액에서 낮은 용해도를 갖는 화합물의 제약상 허용되는 비독성 염, 예를 들어 (a) 다염기성 산, 예컨대 인산, 황산, 시트르산, 타르타르산, 탄닌산, 파모산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌 모노- 또는 디-술폰산, 폴리갈락투론산 등과의 산 부가염; (b) 다가 금속 양이온, 예컨대 아연, 칼슘, 비스무트, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 등, 또는 예를 들어 N,N'-디벤질-에틸렌디아민 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 유기 양이온과의 염; 또는 (c) (a) 및 (b)의 조합물, 예를 들어 아연 탄네이트 염을 함유할 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 화합물, 또는 바람직하게는 상대적으로 불용성인 염, 예컨대 기재된 것들을 주사에 적합한 것, 예를 들어 참깨 오일과 함께 겔, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 겔에서 제제화할 수 있다. 특히 바람직한 염은 아연 염, 아연 탄네이트 염, 파모에이트 염 등이다. 또 다른 유형의 주사용 서방형 데포 제제는 예를 들어 미국 특허 제3,773,919호에 기재된 것과 같이 서서히 분해되는 비독성 비항원 중합체, 예컨대 폴리락트산/폴리글리콜산 중합체에의 캡슐화를 위해 분산되는 화합물 또는 염을 함유할 수도 있다. 또한, 화합물, 또는 바람직하게는 상대적으로 불용성인 염, 예컨대 상기 기재된 것들은 특히 동물에서 사용하기 위해 콜레스테롤 매트릭스 실라스틱 펠렛에서 제제화될 수 있다. 추가의 서방형, 데포 또는 임플란트 제제, 예를 들어 기체 또는 액체 리포좀은 문헌에서 알려져 있다 (미국 특허 제5,770,222호 및 문헌 ["Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978]).
본 출원을 통해 인용된 모든 인용 참증 (참조 문헌, 등록 특허, 특허 출원 공보 및 동시 계류중인 특허 출원 포함)의 내용은 이에 의해 명백히 참조로 포함된다.
본 발명의 다른 특징은 본 발명의 예시를 위해 주어지며 그를 제한하려고 하지 않는 하기 예시적 실시양태의 설명 과정에서 명백하게 될 것이다.
실시예
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 예시될 것이다. 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 나타내는 것이며, 임의의 방식으로 그의 범위를 제한하려는 의도는 아니고, 이로 제한되어서도 안된다. 실시예는 통상의 기술자가 익히 공지된 통상적인 방법 (분자 클로닝 기술 등)의 상세 설명을 포함하지 않는다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이고, 온도는 섭씨로 나타내며, 압력은 대기압 또는 그 근방이다.
뮤린 3F8의 항체의 정제 및 Fab 단편 제조
뮤린 항-GD2 MoAb 3F8 (IgG3)를, 이전에 기재된 바와 같이 [문헌 (Cheung et al., 1985, Cancer Res 45, 2642-2649)], 농축 하이브리도마 상청액으로부터 정제하였다. m3F8의 Fab 단편을 표준 Fab 제조 키트 (피어스 바이오테크놀로지(Pierce Biotechnology); 미국 일리노이주 락포드 소재)를 사용하여 파파인 소화(papain digestion)에 의해 생성하였다.
결정화 및 데이터 수집
정제된 3F8 Fab 단편을 20mM HEPES (pH 6.5) 중 12 mg/ml로 농축시키고, 0.1M 비스-트리스(Bis-Tris) (pH 6.5), 25％ PEG 3350 (미국 캘리포니아주 알리소 비에호 소재 햄튼 리서치)를 함유하는 햄튼(Hampton) 인덱스 시약 D7을 함유하는 저장소에 대해, 16℃에서 증기 확산에 의해 현적(hanging drop)으로 결정화하였다. 1 μl의 단백질 용액 및 1 μl의 저장 용액을 혼합하여 액적을 형성하였다. 25％ 글리세롤, 0.1M 비스-트리스 (pH 6.5), 25％ PEG 3350을 함유하는 동해방지제에 의해 결정을 보호하였다. 데이터를 아르곤 어드밴스드 포톤 소스 빔라인(Argonne Advanced Photon Source beamline) 24IDC에서 수집하였다. 결정은 공간군 C2에 속하며, 1.65 Å 분해능으로 회절하였다.
구조 결정 및 정제
페이저(Phaser) (CCP4 스위트(suite)) (문헌 [Mccoy, et al., 2007, j. Appl. Crystallogr 40, 658-674])를 사용하여, 조사 모델 PDB 엔트리 2AJU로의 분자 대체에 의해 Fab 구조를 알아내었다. 가장 양호한 분자 대체 모델을 Refmac5 (문헌 [Murshudov et al., 1997, Acta Crystallogr D 53, 240-255])를 사용하여 개선하고, 수동 피팅을 0으로 실행하고 (문헌 [Bailey, S., 1994, Acta Crystallogr D 50, 760-763]), Arp-Warp (문헌 [Lamzin and Wildon, 1993, Acta Crystallogr D 49, 129-147])를 사용하여 용매를 첨가하였다. 최종 모델은 m3F8 Fab의 2개의 폴리펩티드 쇄 및 585개의 용매 분자를 함유하였다. 최종 모델은 단백질 데이터 뱅크에 기탁되었다 (액세스 코드 3VFG).
분자 도킹 시뮬레이션 및 인실리코 돌연변이유발
글라이드 도킹은 슈뢰딩거 스위트 2009 플랫폼(Schrodinger Suite 2009 platform) (미국 뉴욕주 뉴욕 소재 슈뢰딩거)를 이용하여 실행하였다. OPLS 역장(force field)을 사용하여 단백질 및 리간드를 파라미터로 나타내었다. 상위 리간드 포즈를 2.0 Å의 제곱평균제곱근 편차 내에서 클러스터화하였으며, 글라이드스코어(GlideScore)에 의해 점수를 매겼다. 디스커버리 스튜디오 3.0 (미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재 엑셀리스)을 사용하여 씨도커(CDOCKER) 도킹 및 상호작용 에너지 측정을 실행하였다. CHARMm 역장을 이용하여 단백질 및 리간드를 파라미터로 나타내었다. 상위 리간드 포즈를 2.0 Å의 제곱평균제곱근 편차 내에서 클러스터화하였으며, 씨도커 상호작용 에너지에 의해 점수를 매겼다. GD2와 연관되는 모든 도킹 연구에 대해, 세라미드 테일은 메틸기로 대체된다 (데이터는 나타내지 않음). 도킹 시뮬레이션은 리간드 입체형태가 강직한 측쇄를 가진 단백질/항체 상에 도킹된 것인 강직체 상태 하에서 행하였다. 최종 도킹 복합체는 디스커버리 스튜디오 3.0 (엑셀리스; 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)의 스마트 미니마이저 알고리즘(Smart Minimizer algorithm)을 이용하여 CHARMm으로 최소화된 에너지이다. CHARMm 역장 및 디스커버리 스튜디오 3.0 (엑셀리스; 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)의 캘큘레이트 뮤테이션 에너지 프로토콜(Calculate Mutation Energy protocol)을 이용하여 도킹 항체:항원 모델의 결합 자유 에너지를 계산함으로써 인실리코 돌연변이유발을 행하였다.
영상 렌더링(rendering)
　분자 구조 영상은, 도킹 연구에 대한 피몰(Pymol) (미국 뉴욕주 뉴욕 슈뢰딩거 소재)을 이용하거나 또는 정전기 가능성 표면에 대해 디스커버리 스튜디오 3.0 (엑셀리스; 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)를 이용하여 랜더링하였다.
노출된 소수성 표면 영역의 모델링
MoAb 3F8 및 MoAb 3F8 H:Gly54Ile의 항원 결합 부위는 디스커버리 스튜디오 3.0 (엑셀리스; 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재) 상에서 모델링되었다. 노출된 소수성 표면은 켄남세티 등(Chennamsetty et al.) (문헌 [Chennamsetty et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106, 11937-99842])에 의해 개발된 스페이셜 애그리게이션 프로펜서티 알고리즘(Spatial Aggregation Propensity algorithm)을 이용하여 랜더링되었으며, 이는 단백질 표면 상에 역동적으로 노출된 소수성의 효과적인 패치는 정량되어 빨간색으로 나타났다.
세포 배양물
인간 신경아세포종 세포주 LAN-1은 로버츠 시거 박사(Dr. Robert Seeger) (칠드런즈 호스피탈 오브 로스 앤젤스(Children's Hospital of Los Angeles; 캘리포니아주 로스 앤젤스(Los Angeles, CA)))에 의해 제공되었다. 데이비드 코브리닉 박사(칠드런즈 호스피탈 오브 로스 앤젤스)로부터의 흑색종 세포주 M14 및 OCM-1. 모든 세포주를, 5％ CO2 인큐베이터에서의 37℃에서 10％ 소 태아 혈청 (하이클론(Hyclone; 유타주 사우스 로간(South Logan, UT))), 2mM 글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 F10 RPMI 1640 배지 중에 성장시켰다.
hu3F8 및 변이체의 구축
이전에 기재된 바와 같이(문헌 [Cheung et al., 2012, Oncoimmunology 1, 477-486]) CHO 세포 (블루 헤론 바이오테크놀로지(Blue Heron Biotechnology) 또는 겐스크립트(Genscript))에 대해 인간화 3F8 유전자를 합성하였다. 블루스크립트 벡터 (유레카(Eureka; 캘리포니아주))를 사용하여, 이들 hu3F8의 중쇄 및 경쇄 유전자를 DG44 세포에 형질감염시키고, G418 (인비트로겐(InVitrogen; 캘리포니아주))로 선별하였다.
항체의 정제
이전에 기재된 바와 같이 (Cheung et al., 2012, 상기 문헌) hu3F8 및 키메라 3F8 생산 세포주를 옵티초(Opticho) 무혈청 배지 (인비트로겐)에서 배양하고, 성숙한 상층액을 수확하였다. 단백질 A 친화도 컬럼을 pH 8.2의 0.15 M NaCl를 갖는 25 mM 나트륨 시트레이트 완충액으로 예비-평형화시켰다. 결합된 hu3F8을 0.1 M 시트르산/나트륨 시트레이트 완충액 (pH 3.9)으로 용리시키고, 25 mM 나트륨 시트레이트 (pH 8.5)에서 알칼리화시켰다 (1:10 v/v 비율). 이를 사르토바인드(Sartobind)-Q 막에 통과시키고, pH 8.2의 25 mM 나트륨 시트레이트, 0.15 M NaCl 중에서 5 내지 10 mg/ml로 농축시켰다.
ELISA 및 유동세포계수법에 의한 GD2 결합의 정량
ELISA를 이전에 기재된 바와 같이 (Cheung et al., 2012, 상기 문헌) 실행하였다. 미량역가 플레이트를 웰 당 20 ng의 GD2로 코팅하였다. 웰 당 150 μl의 PBS (희석제) 중 0.5％ BSA를 주위 온도에서 적어도 30분 동안 각 플레이트에 첨가하여 과도한 결합 부위를 차단하였다. 100 μl의 표준 및 샘플 (2배 희석됨)을 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 세척한 후, 100 μL의 염소 항 인간-IgG (H+L) (잭슨 리서치 래보라토리(Jackson Research Laboratory))를 희석제 중에 1:3500으로 희석시키고, 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 색 반응을 주위 온도에서 30분 동안 암실에서 기질 과산화수소와 함께 크로모겐(chromogen) OPD (시그마)로 전개시켰다. 상기 반응을 5N H2SO4로 중지시키고, 광학 밀도(OD)를 490 nm에서 ELISA 플레이트 리더 MRX (다이넥스(Dynex))로 판독하였다.
MoAb의 세포 함유 항원에 대한 결합의 유지를 측정하기 위해, 항체를 흑색종 M14 세포와 인큐베이션하고, 연속적으로 세척하여 제거하였다. 초기에, 세포를 둥근 바닥 튜브 당 1x106 세포로 수집하고, 원심분리하고, PBS로 세정하고, 검정 튜브 당 100 μL PBS 중에 재현탁시켰다. 세포를 MoAb hu3F8 또는 hu3F8-Ile ((1μg MoAb/1x106 세포)와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 3 mM EDTA를 함유한 5 ml PBS를 사용하여 세포를 연속적으로 세척한 다음, 상청액 및 재현탁액을 버리면서 펠릿화하였다. 각각의 연속적인 세척을 하고, 샘플을 R-피코에리트린 (R-PE) 접합 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이성 제2 항체 (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))와 함께 암실의 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 이어서 BD FACS 캘리버(Calibur) 기구를 이용하여 유동세포계수법으로 분석하였다. 샘플을 3벌 제조하였다.
51크로뮴 방출에 의한 항체-의존성 세포-매개 독성 (ADCC)
이전에 기재된 바와 같이 (Cheung et al., 2012, 상기 문헌) 인간 CD16 Fc 수용체로 안정하게 형질감염시킨 NK-92MI 세포를 사용하여 ADCC 검정을 실행하였다. ADCC 검정용 51Cr로 방사선표지하기 전에, LAN1-1, M14, OCM-1, U2OS, CRL1427, NCI-H345 표적 세포를 Ca2+ Mg2+ 무함유 PBS 중의 2 mM EDTA를 사용하여 떼어내고, F10으로 세척하였다.
통계학적 분석
곡선 맞춤 및 통계학적 분석은 그래프패드 프리즘 5.0(GraphPad Prism 5.0)을 이용하여 실행하였다. 유의성 보정을 위해 스튜던츠 T-검정을 이용하였다.
실시예 1
3F8:GD2 모델의 인실리코 스캐닝 돌연변이유발
도킹 3F8:GD2 모델 (L:Tyr37, L:Lys55, L:Val99, L:Leu102, H:Gly40, H:Tyr31, H:Asn32, H:Asn34, H:Ser56, H:Ser58, H:Gly97, 및 H:Met98)에서 GD2와 직접적으로 상호작용하는 12개의 잔기를 취하여, 단일점 돌연변이가 각각의 부위에서 미치는 영향의 모든 가능성을 분석하여, 인실리코(In silico) 스캐닝 돌연변이유발을 실행하였다. 상기 모델은 CHARMm 역장을 이용하여 최소화된 에너지이고, 이어서 상호작용 에너지 (정전기, 반 데르 발스, 엔트로피)에서의 변화에 대해 분석하였다. 최고의 돌연변이를 표 1에 나타내었다. 단지 4개의 돌연변이가 1 kcal/mol 초과로 결합 복합체의 상호작용 에너지를 증가시킨다는 것을 발견하였다 (표 1). 오로지 1개의 점 돌연변이가 가중된 돌연변이 에너지 -8 kcal/mol에 의해 실질적으로 더 큰 상호작용 에너지 (H:Gly54Ile)를 갖는 것으로 예측되었다. 상호작용 에너지에서의 대부분의 이러한 증가는 항원과의 반 데르 발스 접촉의 증가 때문이다. 또한, 12개의 상호작용 잔기와 연관되는 이중 점 돌연변이 및 삼중 점 돌연변이의 효과를 계산하였지만, 상호작용 에너지를 증가시키는 돌연변이의 추가의 조합은 전혀 발견되지 않았다. 표 1은 도킹 GD2 항원과 직접적으로 상호작용하는 CDR 잔기의 인실리코 스캐닝 돌연변이유발의 결과를 나타낸다. 에너지는 단위 kcal/mol로 나타낸다.
Figure 112015099260769-pct00001
3F8 및 3F8-Ile (H:Gly54Ile)의 항원 결합 부위의 분석
인실리코 스캐닝 돌연변이유발 시뮬레이션 (H:Gly54Ile, 3F8-Ile로 칭함)으로부터 유도되는 단일 점 돌연변이를 3F8의 항원 결합 부위로 모델링하였다 (데이터는 나타내지 않음). H:Gly54Ile 돌연변이의 소수성 특성으로 인하여, 스페이셜 애그리게이션 프로펜서티 알고리즘 (ials 및 방법)-이는 소수성 용매 노출 패치의 측정을 제공함)-을 이용하여, 항원 결합 부위의 소수성 분석을 행하였다. MoAb 3F8은, H:Ile56를 중심으로 주위를 둘러싸고 GD2 결합 부위에서 소수성 패치를 갖는다 (데이터는 나타내지 않음). H:Ile56은 결합 공간(binding cavity)으로 돌출되어 있어서, GD2 헤드기를 둘러싸고 있는 막 표면과의 항체 상호작용을 도울 수 있다. H:Gly54의 Ile로의 치환은 항원 결합 부위의 노출된 소수성 표면 영역을 증가시키고, 또한 도킹 모델에서 GD2와의 반 데르 발스 접촉을 증가시킨다 (데이터는 나타내지 않음).
hu3F8 및 hu3F8-Ile H:Gly54Ile의 결합 및 종양 세포 사멸 특성
H:Gly54Ile 돌연변이가 종양 세포의 GD2 및 ADCC에 대한 친화도를 증가시키는지를 시험하기 위하여, 상기 돌연변이를 최근에 개시된 인간화 3F8 (hu3F8) (Cheung et al., 2012, 상기 문헌)으로 유전자조작시켰다. Hu3F8은 뮤린 3F8보다 면역원성이 더 적고, 본 조사에서 발견된 뮤린 3F8의 구조적 특징을 가지며, 현재 제I 기 임상 실험 중에 있다. Hu3F8 및 hu3F8 H:Gly54Ile (hu3F8-Ile)을 구축하고, 발현시키고, 정제하여, GD2 결합 및 ADCC에 대해 시험하였다. GD2에 대한 ELISA 검정은 hu3F8-Ile가 hu3F8에 비해 결합 효력에서의 증가는 무시할 만하다는 것을 나타냈다 (GD2 결합의 EC50: hu3F8 48 ± 13 ng/mL, hu3F8-Ile 38 ± 11 ng/mL) (데이터는 나타내지 않음). 종양 세포의 표면에 대한 그의 자생 환경에서의 GD2에 결합하는 이들 항체의 결합능을 시험하기 위하여, M14, 즉 GD2(+) 흑색종 세포주의 표면에 결합되는 항체를 PBS-EDTA로의 일련의 세척 사이클에 적용하는 세척 실험을 실행하였다 (재료 및 방법 참조). Hu3F8-Ile는 종양 세포를 세척하여 제거하는 데 견디는 능력이 더 큰 것으로 나타났다 (hu3F8-Ile의 t1/2 = 3회 세척, hu3F8의 t1/2 = 2회 세척) (데이터는 나타내지 않음). 다른 어떤 돌연변이도 항원 결합을 향상시키는 것으로 나타나지 않았다.
이어서, hu3F8 및 hu3F8-Ile는, 인간 CD16 Fc 수용체로 형질감염된 자연 살해 세포주 NK-92MI의 존재 하에서 신경모세포종 LAN-1의 ADCC를 매개하는 데 있어서의 그의 효력을 위해 검정하였다 (데이터는 나타내지 않음). Hu3F8-Ile는 hu3F8에 비교하여 세포독성 효력이 일관되게 약 9-배 증가하였다는 것을 나타냈다 (IC50 세포 사멸: hu3F8 1.35 ± 0.15 ng/mL, hu3F8-Ile 0.15 ± 0.01 ng/mL). 흑색종 M14 및 OCM-1 세포에 대한 ADCC 효력에서의 6 내지 7 배 증가가 또한 관찰되었다 (M14 세포의 IC50 세포 사멸: hu3F8 25 ± 2.2 ng/mL, hu3F8-Ile 3.7 ± 1.1 ng/mL; OCM-1 세포의 IC50 세포 사멸: hu3F8 8.5 ± 0.8 ng/mL, hu3F8-Ile 1.5 ± 0.1 ng/mL). hu3F8에 비해 hu3F8-Ile에 대한 ADCC 효력의 이러한 증가는 고도로 유의미하였다 (p<0.001).
인간화 3F8의 잠재적인 임상 효력을 추가로 최적화하기 위하여, 본 발명자는 3F8:GD2 도킹 모델에서 핵심적으로 상호작용하는 잔기 상에서의 인실리코 스캐닝 돌연변이유발에서의 고도의 처리량을 채용하였다. 본 발명자는 GD2-ELISA 검정으로 결합 친화도가 중간으로 증가하고, hu3F8-Ile가 세포 표면 상의 GD2에 결합하는 것을 유지하는 능력을 증가시키는 것으로 나타난 단일 점 돌연변이 (H:Gly54Ile)를 확인하였다. 보다 두드러지게는, 본 발명자는 hu3F8이 신경모세포종, 흑색종, 골육종 및 소세포 폐암을 비롯한 GD2-양성 종양 세포주의 ADCC에서의 증가가 약 6 내지 9 배인 것을 보여줬다. H:Gly54Ile 돌연변이의 특성은 항원 결합 부위에서 노출된 소수성 표면 영역을 증가시킨다. GD2가 세라미드 모이어티에 의해 막 표면으로 포매되기 때문에, 항원-결합 부위에서의 Ile의 첨가는, 세포 세척 실험에서 관찰한 바와 같이 막 표면에 결합되어 유지되는 MoAb 3F8의 능력을 향상시킴으로써, ADCC 효력을 증가시킬 수 있다.
탄수화물 항원은 수가지의 생물학적 경로에서 중요한 역할을 한다. 탄수화물을 표적화하는 항체의 개발은 박테리아, 종양, 혈액형, 세포-세포 부착 상호작용; 바이러스, 호르몬 및 독소 수용체; 및 재조합 단백질의 당화를 조사하는 데 중요하다 (문헌 [Heimburg-Molinaro and Rittenhouse-Olson, 2009, Methods Mol. Biol. 534,341-357]). 당류에 대한 면역 반응이 T-세포 비의존성이기 때문에, 탄수화물 항원에 대해 생성된 항체는 낮은 친화도 IgM 항체로 종종 생성된다 (Heimburg-Molinaro and Rittenhouse-Olson, 2009, 상기 문헌). 암 면역요법의 경우로서 치료용의 더 높은 친화도 항체를 생성시키기 위해, 친화도 성숙 기술은 자주 치료 효과를 향상시키기 위해 채용될 필요가 있다. 효모/파지/리보솜 디스플레이와 같은 항체 친화도 성숙의 전통적인 방법은, 항체의 CDR의 각 아미노산의 전체 범위의 다양성을 제공할 수 없는 오류 유발 PCR에 의존한다. 이러한 조사에서, 본 발명자는 고도의 분해능 공-복합체 구조를 이용할 수 없다고 할지라도 인실리코 스캐닝 돌연변이유발을 사용할 수 있다는 것을 보여준다. 본 발명자는 추가로 친화도가 중간으로 증가하는 것은 종양 항원 GD2에 대한 치료적 표적화를 위해 MoAb 3F8의 기능적 특성을 향상시킬 수 있다는 것을 입증한다. ADCC의 향상이 개선된 효력으로 번역된다는 것을 예측할 수 있지만, 이는 환자에게서 추가의 임상 실험에서 증명되어야 할 것이다. 이러한 인실리코 기술의 사용은, 탄수화물 에피토프가 약물가능한 표적인 암 뿐만 아니라 다른 인간 장애의 진단 또는 치료를 위한 MoAb의 다음 세대 개발에 있어서, 전통적인 실험 방법에 귀중한 부가적인 방법을 제공할 수 있다.
신규 프레임워크 hu3F8 ver5의 고안
hu3F8 V1의 프레임워크 구조 (WO 2011/160119, Cheung et al., 2012, 상기 문헌)는 컴퓨터 방법에 기초하여 감소된 면원원성에 최적화하였다. 먼저, hu3F8V1 중쇄 및 경쇄 서열을 각각 인간 생식세포 서열 humIGHV199 및 humIGKV025 (EMBL 데이타베이스, www.vbase2.org)과 비교하였다. CHARMm 역장 (문헌 [Brooks et al, 2009, J. Comp. Chem. 30, 1545-1615])을 사용한 분자 시뮬레이션을 뮤린 3F8의 결정 구조 (단백질 데이터 뱅크 수탁번호 3VFG, http://www.pdb.org)를 기초로 각각의 잠재적 인간화 돌연변이에 대하여 실행하여, 상기 돌연변이가 구조적으로 허용되는지를 측정하였다. 추가로, hu3F8 V1의 MHC 클래스 II T-세포 에피토프를 면역 에피토프 데이타베이스 (http://www.iedb.org/) 상의 NN-정렬 방법을 사용하여 식별하고, 구조적으로 허용되는 돌연변이를 기초로 최소화시켰다. 3F8 결정 구조에 도킹된 GD2의 컴퓨터 모델을 기초로 (CDOCKER 및 디스커버리 스튜디오 소프트웨어즈 (캘리포니아주 샌 디에고 애컬리 소재)를 사용하여 구축됨), GD2 항원과 직접 상호작용하도록 모델링되지 않은 CDR 잔기를 인간화 돌연변이에 대해 고려하였다.
효모 라이브러리로부터의 hu3F8 돌연변이체의 선별
더 높은 친화도 돌연변이체를 생성시키고 분리하기 위한 방법론은 참고문헌 (Zhao et al., Mol. Cancer Ther. 2011, 10, 1677-1685)에 기재되어 있는 바와 같다. FACS 선별 전에, 효모 세포 (1×109)를 PBSA 완충액 (PBS 중 0.1％ BSA) 중에서 10 μg-GD2-접합 자기 비드와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 자기 스탠드로 분리하였다. 분리된 비드를 PBSA 완충액으로 3회 세척하고, SDCAA (합성 덱스트로스 카사미노산) 배지 10 ml에 넣고, 30℃ 진탕기에서 250 rpm으로 밤새 성장시켰다. 자기 비드로부터 회수된 효모 세포를 SG/RCAA (합성 갈락토스 라피노스 카사미노산) 배지 중에서 20℃에서 18시간 동안 250 rpm으로 교반하면서 유도하였다. 대략 1 × 108 효모 세포를 펠렛화하고, PBSA 완충액으로 2회 세척하고, 바이오티닐화 GD2 및 1:100 희석의 마우스 항-c-myc 항체 (인비트로겐)를 함유한 1 ml PBSA 완충액 중에 재현탁시켰다. 인큐베이션한 후에, 효모 세포를 3회 세척하고, 이어서 1 ml PBSA 완충액 중에 재현탁시켰다. 1:100 희석의 R-피코에리트린 접합 스트렙타비딘 (인비트로겐) 및 알렉사 플루오르 488 접합 염소 항-마우스 IgG 항체 (인비트로겐) 둘다를 효모 세포에 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, PBSA 완충액으로 다시 3회 세척하고, 이어서 분류를 위해 PBSA 완충액 중에 재현탁시켰다. 분류 게이트를 결정하여 더 높은 항원 결합 신호를 갖는 집단만을 선별하였다. 수집된 세포를 SDCAA 배지 중에서 30℃에서 밤새 성장시키고, 다음 분류를 위해 SG/RCAA 중에서 유도시켰다. 다음 3회의 선별을 위해, 대략 1-2×107 효모 세포를 각각 바이오티닐화 IGF-1로 염색하기 위해 사용하였다. 자이모프렙(Zymoprep) 효모 플라스미드 미니프렙 II 키트 (자이모 리서치(Zymo Research))를 이용하여 제작자의 지시에 따라 효모 플라스미드를 분리하고, 라이브러치 구축의 템플레이트로 사용하였다. 4번째 회차의 플라스미드를 제조하고, 서열을 밝히고, 특징을 규명하였다.
hu3F8 scFv 및 IgG1의 발현
ScFv를 이전에 기재된 바와 같이 (Zhao et al., 2011, 상기 문헌) 발현시키고, 정제하였다. HB2151 세포를 scFv 서열을 함유한 pComb3x 플라스미드로 형질전환시켰다. 100 μg/mL 암피실린 및 0.2％ 글루코스를 함유한 2YT 배지로 단일 신선한 콜로니를 접종시켰다. 배양물을 이소프로필-L-티오-h-D-갈락토피라노시드 (최종 농도 0.5 mM)로 유도시켰다. 밤새 30℃에서 성장시킨 후에, 박테리아를 15분 동안 5,000×g로 원심분리하였다. 가용성 scFv를 30℃에서 30분 동안 인큐베이션함으로써 세포질로부터 배출시켰다. 깨끗한 상청액을 정제를 위해 Ni-NTA 컬럼 상에 회수하였다. 재조합 scFv는 플래그(FLAG) 및 His 태그를 갖는다. IgG는 이전에 기재된 바와 같이 (Cheung et al., 2012, 상기 문헌) CHO 현탁액 세포 중에서 발현되었다. Hu3F8 V5 IgG는 HEK293 세포 (인비트로겐 프리스타일 익스프렌션 시스템(Ivitrogen Freestyle Expression system))를 이용하여 일시적으로 발현시켰다. IgG는 단백질 G 컬럼 상에서 정제하였다.
ELISA
다른 강글리오시드와의 교차 반응성의 경우. GD2, GD1a, GD1b를 90％ 에탄올 중 웰 당 20 ng으로 폴리비닐 미량역가 플레이트 상에서 코팅하였다. 공기 건조한 이후, 웰을 실온에서 1시간 동안 웰 당 150 μl의 PBS 중 0.5％ BSA로 차단하였다. 항체를 0.5％ BSA 중에서 1 mg/ml (웰 당 100 ml)로 3벌로 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBS로 세척한 후, IgG 항체에 대하여 1:5000 희석의 HRP-염소 항-인간 IgG 또는 scFv 항체에 대하여 1:5000 희석의 HRP-염소 항-플래그 IgG를 첨가하였다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 추가로 세척한 후에, 색 반응을 실행하고, OD를 490 nm에서 ELISA 플레이트 리더를 이용하여 판독하였다.
표면 플라즈몬 공명에 의한 친화도 결정
비아코어(Biacore) T100을 이용하여 친화도를 측정하였다. 간단히 말해서, 강글리오시드는 소수성 상호작용을 통해 CM5 센서 칩 상에 직접 고정화시켰다. 참조 표면을 GM1로 고정화시켰다. 활성 표면을 GD2 및 GM1과 1:1 비율로 또는 GD1b 단독과 고정화시켰다. GD2 및 GM1의 희석 혼합물 (50 μg/ml) 또는 GD1b을 20분에 걸쳐 15 μl/분의 유속으로 주입하였다 (300 μl). 그 후 안정한 기준이 얻어질 때까지 10 mM NaOH (전형적으로, 5 μl/분의 유속으로 20 μl의 5회 세척)로 철저히 세척하였다.
보체 매개 세포독성 (CMC) 검정
인간 혈청 또는 인간 이펙터 세포의 부재하에서 종양 세포 성장 및 생존에 대한 항체의 직접적인 영향에 대해 시험하였다. 종양 표적을 2 mM EDTA 또는 트립신-EDTA로 해리시키고, 세척하고, 인간 혈청을 함유한 96-웰 편평형 바닥 플레이트 상에 플레이팅하였다. 37℃의 5％ CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션한후, F10 중의 항체의 농도를 증가시키며 각 웰에 첨가하였다. 대조군 웰은 F10만을 단독으로 수용하였다. 5％ CO2의 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한 후, WST-8 시약(사이만 케미칼 컴퍼니(Cayman Chemical Co.))을 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 2 내지 6시간 동안 CO2 인큐베이터 내 암흑 속에서 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 450 nm 및 690 nm에서 OD를 판독하였다. 트립판 블루(Trypan Blue) (시그마) 또는 베크만 코울터(Beckman Coulter) 계수기를 사용하는 직접 세포 계수법을 이용하여 WST-8 검정을 입증하였다.
51크로뮴 방출에 의한 항체-의존성 세포-매개 독성 (ADCC)
표적 세포를 Ca2+ Mg2+ 무함유 PBS 중 2 mM EDTA를 사용하여 떼어내고, F10으로 세척하였다. 제작자의 지시서 (뱅즈 래보라토리즈, 인크(Bangs Laboratories, Inc.))에 따라 퀀텀 심플리 셀룰러(Quantum Simply Cellular) 항-마우스 IgG 비드를 이용하여 항원 밀도를 추산하였다. 세포독성 검정을 위해, 100 μCi의 51Cr을 106개의 표적 세포와 함께 최종 부피 250 μl로 인큐베이션하고, 37℃에서 1시간 동안 펠렛을 15분 간격으로 부드럽게 재현탁시키며 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 250 μl F10 중에 재현탁시키고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 세포를 계수하고, 트립판 블루를 사용하여 생존능을 측정하고, 96웰 U형-바닥 플레이트 상에 신속하게 플레이팅하였다. 정상 지원자로부터의 말초 혈액을 헤파린 처리된 튜브 내에 수집하였다. 혈액을 3％ 덱스트란/PBS와 혼합하고, 실온에서 20분 동안 유지하여 적혈구를 침전시켰다. 이어서, 백혈구를 피콜(ficoll) 처리하고, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)-ADCC에 대해 PBMC로 분리하였다. 세포를 F10 중에서 세척하고, 계수하고, 생존능을 측정하였다. PBMC-ADCC는 10 U/ml의 IL-2의 존재하에 일어났다. 항체를 F10 중에서 1 μg/ml로부터 10 배 희석물로 희석하였다. 플레이트를 37℃, 5％ CO2 인큐베이터에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. ADCC 상청액 중의 방출된 51Cr을 감마 계수용으로 수집하였다. 총 방출량을 10％ 소듐 도데실 술페이트(SDS)를 사용하여 측정하고, 배경의 자연발생적 방출량은 이펙터 없이 F10만을 사용하여 측정하였다. 50:1의 이펙터:표적(E:T) 비율이 일반적으로 사용되었다. 유사하게는, 인간 CD16 또는 인간 CD32 Fc 수용체로 안정하게 형질감염시킨 NK-92MI 세포를 사용하여 ADCC 검정을 실행하였다. PBMC와는 다르게, 사이토카인이 검정에 전혀 필요하지 않았다. E:T 비율은 20:1로 유지하였다.
면역조직화학 (IHC)
종양 및 정상 조직은 제도적 검토 위원회 승인(institutional review board approval)으로 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)에서 입수하였다. 스냅-동결 조직의 5개 내지 7개의 마이크로미터 섹션을 아세톤 중에 -20℃에서 30분 동안 고정시켰다. 아비딘 및 바이오틴 (벡터 아비딘-바이오틴 차단 키트; 인비트로겐)로 각각 20분 동안 연속 처리함으로써 내인성 바이오틴-결합 활성을 차단하였다. 섹션을 3 μg/ml scFv-플래그와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후에, 섹션을 HRP 항-플래그 항체와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고, 다음으로 3,3-디아미노벤지딘과 함께 5분 동안 인큐베이션하였다. 또한, H&E 염색을 실행하였다.
실시예 2
hu3F8V5의 구축
잠재적인 면역원성을 감소시키기 위해 9개의 점 돌연변이를 hu3F8 V1에서 제조하여 hu3F8 V5를 제조하였다 (표 2 참조). 9개 돌연변이 모두 그의 항원 GD2에 결합된 3F8의 컴퓨터 모델에서 구조적으로 허용되는 것으로 발견되었다. 돌연변이 모두는 3F8에 대한 인간화에서 남아있는 뮤린 잔기의 인간 생식세포 서열로의 변화와 연관된다. 5개의 돌연변이 (LC:K24R, LC:S56T, LC:V58I, HC:I20L, HC:M92V)는 프레임워크 잔기와 연관된다. 본 발명자는 인실리코 방법에 의해 확인되는 것과 같이 강한 T-세포 에피토프를 제거한 CDR H2에서의 4개의 돌연변이 (HC:A62S, HC:F63V, HC:M64K, HC:S56G)를 추가로 발견하였다. 이는 CDR 잔기를 변경하는 것이 그래프팅 방법에 의한 항체 인간화 분야의 통상의 기술자들에게는 일반적이지 않지만, 본 발명자의 GD2에 결합된 3F8의 컴퓨터 모델은 이러한 추가적인 인간화 돌연변이를 유전자조작하도록 허용하였다.
hu3F8의 친화도 성숙
효모 디스플레이 방법을 기초로 한 친화도 성숙을 수행하기 위하여, 본 발명자는 선별에 사용하기 위한 신규 바이오티닐화 GD2 유도체를 합성하였다. 이전에, 본 발명자는 표준 바이오티닐화 GD2 항원을 사용하여 성공하지 못했다. 합성 GD2-아지도 유도체 (도 2)를 이용하여, 본 발명자는 이를 PEG 스페이서 (하기 실시예 7 참조)에 융합시켰다. 이러한 신규 GD2 유사체를 사용하여, 본 발명자는 효모의 표면에 디스플레이되는 hu3F8 ScFv의 무작위 라이브러리로부터 2개의 돌연변이를 선별하였으며, 이는 합성 GD2 유사체와의 결합이 향상되었다. 첫 번째 것은 LC:D32H이며, 이는 CDR L1 상에 위치되어 있고, 두 번째 것은 LC:E1K이며, 이는 프레임워크 잔기에 있다.
2개의 돌연변이 (LC:E1K 및 LC:D32H)를 재조합 발현된 hu3F8V1 ScFv 및 hu3F8V5 ScFv 구축물에서 시험하고, 천연 GD2에 대한 결합 친화도를 비아코어 분석을 사용하여 측정하였다. 구조 모델링을 기초로, 모든 hu3F8 scFv가 VL-VH 형식으로 제조되었는데, 이는 항원 결합 포켓에 덜 제한된 접근을 가능하게 하기 때문이다. 이는 VH-VL 형식으로 구축되는 가장 통상적인 ScFv와는 반대이다. 여러 변이체 또한 전체 IgG1 형식에서 시험하였다. 표 2는 hu3F8V5의 고안물을 나타낸다.
Figure 112015099260769-pct00002
실시예 3
결합 친화도
ScFv 형식 (표 3 참조)으로 시험된 hu3F8 변이체의 결합 친화도는 다수의 관심있는 발견을 보여준다. 첫째는, 오로지 hu3F8V1보다 면역원성이 더 적도록 고안된 hu3F8V5는, hu3F8V1보다 GD2에 대해 결합 친화도가 조금 더 강하다. 별도로 발현되는 경우 2개의 친화도 성숙 돌연변이 (LC: E1K 및 LC:D32H)는 GD2에 대한 결합이 향상된다는 것을 보여준다. hu3F8V1 또는 hu3F8V5 scFv 형식으로 함께 발현되는 경우, 결합 친화도가 더 많이 향상된 것으로 관찰된다 (7-12 배 더 낮은 KD). 이중 돌연변이 (LC:E1K + LC:D32H)가 HC:G54I (인실리코 모델링에 기초함, 참고문헌 오리지날 특허)과 조합되는 경우, 결합 친화도는 이중 돌연변이 단독만큼 강하지 않지만, 여전히 hu3F8V1보다 높은 친화도를 갖는다. hu3F8 G54I는 GD2 양성 종양 세포주에 대해 ADCC에서 7 내지 10 배 증가를 갖는 것으로 나타났다.
전체 IgG1 형식의 hu3F8 변이체에 대한 결합 친화도는 표 4에 나타나 있다. ScFv 데이터와 유사하게, 이중 돌연변이 LC:E1K + LC:D32H는 hu3F8 V1 및 hu3F8 V5 형식 둘다에서 단일 돌연변이 LC:D32H보다 더 우수한 친화도를 나타낸다. LC:E1K + LC:D32H 이중 돌연변이 대 모체의 총체적인 향상은 hu3F8 V1 및 hu3F8 V5 형식 둘다에서 8 내지 10배이다. 결합 향상에 대한 LC:E1K의 공헌은 원형의 CDR 잔기가 아니기 때문에 예측되지 않았다. hu3F8 V5 구축물이 HEK 293 세포 내에서 일시적으로 발현되어 결합에 영향을 끼칠 수 있는 구조 특성을 변경시켰기 때문에, hu3F8 V1과 hu3F8 V5 IgG 구축물과의 결합 친화도의 직접 비교는 할 수 없었다. 표 3은 비아코어에 의해 측정된 GD2에 대한 hu3F8 scFv의 결합 친화도를 나타낸다. 표 4는 비아코어에 의해 측정된 GD2에 대한 hu3F8 IgG의 결합 친화도를 나타낸다.
Figure 112015099260769-pct00003
Figure 112015099260769-pct00004
실시예 4
다른 강글리오시드와의 교차-반응성
교차-반응성 연구에서 (표 5, 및 데이터는 나타내지 않음), 모든 hu3F8 변이체는 GD1b (신경모세포종 종양 세포 상에 또한 존재하는 강글리오사이드)와의 비교가능한 교차-반응성을 가졌고, 시험된 다른 강글리오시드 (GD1a, GD1b, GD3)와는 유의적인 교차-반응성을 가지지 않았으며, 이는 hu3F8 변이체가 모 hu3F8V1의 동일한 특이성을 보유한다는 것을 입증한다. 표 5는 비아코어에 의해 측정된 바와 같은 GD1b에 대한 hu3F8 IgG의 결합 친화도를 나타낸다.
Figure 112015099260769-pct00005
실시예 5
ADCC 및 CMC에서의 항체 효력
이펙터로서 PBMC (말초 혈액 단핵 세포) 또는 NK92-CD16 (CD16 양성 배양 NK 세포), 및 표적으로서 신경모세포종 LAN-1 세포를 사용하여 항-GD2 IgG1 항체를 ADCC 검정으로 비교하였다 (데이터는 나타내지 않음). 이들 항체의 ADCC 효력은 (3F8에 대한 EC50)/(MoAb에 대한 EC50)의 비로서 계산하였다. 모 hu3F8 V1 IgG에 비해, hu3F8 V1 LC:D32H 및 hu 3F8 V1 LC:E1K + LC:D32H는 PBMC-ADCC에서 대략 20배 더 강력했고, NK92-CD16-ADCC에서는 7배 더 강력했다 (표 6 참조). 표 6은 hu3F8V1 IgG를 사용한 ADCC 검정의 요약을 나타낸다.
Figure 112015099260769-pct00006
이펙터로서 인간 혈청 및 표적으로서 LAN-1을 사용하여 CMC를 유도하는 능력에 대해 동일한 항체를 시험하였다 (표 7 및 데이터는 나타내지 않음). hu3F8 V1 LC:D32H는 CMC에서 작게 향상된 것을 나타낸 반면, hu3F8 V1 LC:E1K + LC:D32H는 잠재적 hu3F8 V1으로서 상대적으로 동일한 양의 CMC를 나타낸다. 보체 활성화는 항-GD2 면역요법에 관련되는 통증 부작용을 매개하는 것으로 생각되기 때문에, 상대적으로 낮은 보체 활성화가 바람직하다. 표 7은 hu3F8V1 IgG을 사용한 CMC 검정의 요약을 나타낸다.
Figure 112015099260769-pct00007
실시예 6
정상 조직 및 종양에 대한 면역조직화학
인간 신경모세포종, 골육종, 횡문근육종, 유잉 육종, 결합조직형성 원형 소세포 종양 및 정상 인간 조직에 대한 IHC에 의해 hu3F8 V1, hu3F8 V1 LC:D32H, 및 hu3F8 LC:E1K + LC:D32H의 scFv 버전을 조직 특이성에 대해 시험하였다 (도 1 참조). 12개의 정상 조직을 또한 시험하였다 (표 8 참조). GD2가 뉴런 조직 상에 존재한다는 것이 공지되어 있기 때문에, 예측된 바와 같이, 전두엽, 뇌교, 소뇌 및 척수 모두는 모 클론 (hu3F8 V1)을 제외하고 친화도-성숙 클론 둘다 (hu3F8 V1 LC:D32H 및 hu3F8 LC:E1K + LC:D32H)로 양성으로 염색되었다. 상이한 종양 샘플의 IHC를 보면, 친화도-성숙 클론 (hu3F8 V1 LC:D32H, 및 hu3F8 LC:E1K + LC:D32H)은 모 항체 (hu3F8 V1)에 비해 GD2 양성 종양에 대한 더 높은 수준으로 염색되는 것으로 나타난다. 표 8은 hu3F8V1 scFv로 염색한 조직의 강도를 나타낸다.
Figure 112015099260769-pct00008
실시예 7
GD2 바이오티닐화
소규모 반응의 경우, 물 25 μl 중 GD2-아지도 100 μg 및 DBCO-PEG4-바이오틴 (클릭 케미스트리 툴즈(Click Chemistry Tools)) 50 μg을 완만하게 회전시키면서 4℃에서 밤새 반응시켰다. 그 다음 날에, 아지도-PEG-아지도 (클릭 화학 툴즈) 30μg을 첨가함으로써 과도한 DBCO-PEG4-바이오틴을 불활성화시키고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 생성물의 농도가 0.5 mg/ml가 되도록 희석시켜서 -80℃에서 보관하였다.
FACS 분석
Hu3F8 scFv를 디스플레이하는 효모 세포를 성장시켜서 FACS 분석을 위해 유도하였다. 효모 세포 (1 × 106)를 2 μg/ml 바이오티닐화 GD2-아지도-PEG4-바이오틴 또는 GD2-바이오틴 1:100 희석의 마우스 항-c-myc 항체와 함께 PBS/0.1％BSA 완충액 중의 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 1회 세척 후에, 세포를 1:50 희석의 R-피코에리트린 접합 스트렙타비딘 알렉사 플루오르 488 접합 염소 항-마우스 항체와 함께 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하고, 이어서 다시 세척하고, 0.5 ml PBSA 완충액 중에 재현탁시켰다. BD 바이오사이언스(Bioscience) FACS를 이용하여 분석을 실행하였다.
결과
효모 세포는 세포 표면 상에 cmyc 태그를 갖는 Hu3F8 scFv를 디스플레이하였으며, 이를 PEG 스페이서와 접합시키거나 접합시키지 않은 GD2 바이오틴 접합체와 결합하기 위해 사용하였다. 유동 세포 분석에서, Hu3F8 scFv의 발현 및 GD2 결합을 각각 X- 및 Y-축으로 검출하였다. 본 발명자는 스페이서가 없는 GD2와 비교함으로써 PEG4 스페이서의 존재가 유동 세포 분석에서 GD2 관찰에 필요하다는 것을 발견하였다 (데이터는 나타내지 않음). 바이오틴-PEG-GD2 화학 구조에 대해 도 2를 참조한다.
실시예 8
표면 플라즈몬 공명에 의한 MoAb 해리 속도의 측정
고밀도 GD2 모델을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (비아코어 T100)에 의해 친화도 개선 돌연변이를 갖는 hu3F8 IgG의 해리 속도를 측정하였다.
간단히 말하면, 소수성 상호작용을 통해 CM5 센서 칩 상에 강글리오시드를 직접 고정화시켰다. 참조 표면을 GM1로 고정화시켰다. 활성 표면을 순수한 GD2와 고정화시켰다. GD2 (50 μg/ml)를 20분에 걸쳐 15 μl/분의 유속으로 주입하였다 (300 μl). 그 후 안정한 기준이 얻어질 때까지 10 mM NaOH (전형적으로, 5 μl/분의 유속으로 20 μl의 5회 세척)로 철저히 세척하였다. 결과를 표 9 및 도 3에 나타낸다.
Figure 112015099260769-pct00009
표 9 및 도 3에 나타낸 바와 같이, hu3F8 이중 돌연변이체 (hu3F8V1 LC:D32H HC:G54I 및 hu3F8V1 LC:E1K LC:D32H)는 가장 느린 해리 속도를 입증하며, 이는 hu3F8V1보다 3.6 내지 6.4 배 느렸다. 단일 돌연변이체 (hu3F8 V1 LC:D32H) 및 3중 돌연변이체 (hu3F8V1 LC:E1K LC:D32H HC:G54I)는 각각 2.7 배 및 2.1 배 더 늦은 해리 속도를 입증하였다.
추가의 종양 세포주를 갖는 ADCC에 있어서의 항체 효력
이펙터로서 NK92-CD16 (CD16 양성 배양 NK 세포), 및 표적으로서 신경모세포종 IMR-32 또는 흑색종 M14를 사용하여 항-GD2 IgG1 항체를 ADCC 검정으로 비교하였다 (상기한 바와 같음). ADCC 효력은 hu3F8V1 EC50/항체 EC50의 비로서 계산하였다. 결과를 표 10에 나타낸다.
Figure 112015099260769-pct00010
상기 결과는, 모 hu3F8 V1 IgG에 비해, 이중 돌연변이체 (hu3F8V1 LC:D32H HC:G54I 및 hu3F8V1 LC:E1K)가 IMR-32 세포의 ADCC에서 100 내지 140 배 증가를, M14 세포의 ADCC에서 22 내지 25 배 증가를 입증하였다. 단일 돌연변이체 (hu3F8V1 LC:D32H)가 IMR-32 세포의 ADCC에서 25-배 증가를, M14 세포의 ADCC에서 5-배 증가를 입증하였다. 삼중 돌연변이체 (hu3F8V1 LC:E1K LC:D32H HC:G54I)가 IMR-32 세포의 ADCC에서 15.6 배 증가를, M14 세포의 ADCC에서 3.6 배 증가를 입증하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Memorial Sloan Kettering Cancer Center <120> High Affinity Anti-GD2 Antibodies <130> 2003080-0638 <150> 61/801287 <151> 2013-03-15 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 211 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 1 Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn His 20 25 30 Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Phe Gly 85 90 95 Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val 100 105 110 Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 115 120 125 Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln 130 135 140 Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 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Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu Glu Met 325 330 335 Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg 340 345 350 Gly Ser Tyr Pro Tyr Asn Tyr Phe Asp Ala Trp Gly Cys Gly Thr Thr 355 360 365 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 370 375 380 Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Ile Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala 405 410 415 Val Thr Ala Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His 420 425 430 Cys Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly His Asn Asn Arg Pro Pro Gly Val 435 440 445 Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr 450 455 460 Ile Ala Gly Thr Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu 465 470 475 480 Trp Tyr Ser Asp His Trp Val Ile Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val 485 490 495 Leu Gly <210> 32 <211> 633 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 32 gaaatcgtca tgactcagac tcctgctact ctgtccgtct ccgctgggga aagggtcact 60 atcacttgta aggcatcaca gtccgtgagt aaccacgtga cttggtacca gcagaagcca 120 ggacaggcac ccaggctgct gatctactca gcctccaata gatatagcgg agtgccagca 180 cgcttcagcg ggtctggtta tggcaccgag ttcaccttta caatttccag cgtgcagtct 240 gaagacttcg ctgtctactt ttgccagcag gattattcta gttttggaca ggggacaaag 300 ctggagatca aacgaaccgt ggccgccccc tccgtgttca tcttcccccc ctccgacgag 360 cagctgaagt ccggcaccgc ctccgtggtg tgcctgctga acaacttcta cccccgggag 420 gccaaggtgc agtggaaggt ggacaacgcc ctgcagtccg gcaactccca ggagtccgtg 480 accgagcagg actccaagga ctccacctac tccctgtcct ccaccctgac cctgtccaag 540 gccgactacg agaagcacaa ggtgtacgcc tgcgaggtga cccaccaggg cctgtcctcc 600 cccgtgacca agtccttcaa ccggggcgag tgc 633 <210> 33 <211> 633 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 33 aaaatcgtca tgactcagac tcctgctact ctgtccgtct ccgctgggga aagggtcact 60 atcacttgta aggcatcaca gtccgtgagt aaccacgtga cttggtacca gcagaagcca 120 ggacaggcac ccaggctgct gatctactca gcctccaata gatatagcgg agtgccagca 180 cgcttcagcg ggtctggtta tggcaccgag ttcaccttta caatttccag cgtgcagtct 240 gaagacttcg ctgtctactt ttgccagcag gattattcta gttttggaca ggggacaaag 300 ctggagatca aacgaaccgt ggccgccccc tccgtgttca tcttcccccc ctccgacgag 360 cagctgaagt ccggcaccgc ctccgtggtg tgcctgctga acaacttcta cccccgggag 420 gccaaggtgc agtggaaggt ggacaacgcc ctgcagtccg gcaactccca ggagtccgtg 480 accgagcagg actccaagga ctccacctac tccctgtcct ccaccctgac cctgtccaag 540 gccgactacg agaagcacaa ggtgtacgcc tgcgaggtga cccaccaggg cctgtcctcc 600 cccgtgacca agtccttcaa ccggggcgag tgc 633 <210> 34 <211> 1347 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 34 caggtccagc tggtcgaatc tggtcctggg gtcgtgcagc ctgggaggtc tctgcgtctg 60 agttgtgccg tgtccgggtt ttccgtgact aactacggag tgcactgggt cagacagcca 120 cctgggaagg gtctggagtg gctgggagtg atctgggcag gcggaattac caactacaat 180 tccagcgtca aaggcaggct gaccatctct aaggacaaca gtaaaaatac agtgtatctg 240 cagatgaatt ccctgagggc cgaagataca gctgtctact attgcgcctc tcggggcggt 300 cattatggct acgcactgga ttactgggga cagggaactc tggtcaccgt ctcatcagcc 360 tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ccgtcctaca gtcctcagga 540 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa 660 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347 <210> 35 <211> 633 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 35 gaaatcgtca tgactcagac tcctgctacc ctgtccgtgt cagctgggga gcgtgtcact 60 attacttgtc gggcttcaca gagcgtgtct aacgacgtga catggtacca gcagaagccc 120 ggtcaggccc ctagactgct gatctactct gctagtaata ggtatactgg cattccagca 180 cggttctcag gctccggata tgggaccgag ttcaccttta caatctccag cgtgcagagc 240 gaagactttg ccgtctattt ttgccagcag gattattcat cattcggcca gggaactaaa 300 ctggaaatca agagaaccgt ggccgccccc tccgtgttca tcttcccccc ctccgacgag 360 cagctgaagt ccggcaccgc ctccgtggtg tgcctgctga acaacttcta cccccgggag 420 gccaaggtgc agtggaaggt ggacaacgcc ctgcagtccg gcaactccca ggagtccgtg 480 accgagcagg actccaagga ctccacctac tccctgtcct ccaccctgac cctgtccaag 540 gccgactacg agaagcacaa ggtgtacgcc tgcgaggtga cccaccaggg cctgtcctcc 600 cccgtgacca agtccttcaa ccggggcgag tgc 633 <210> 36 <211> 633 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 36 gaaatcgtca tgactcagac tcctgctacc ctgtccgtgt cagctgggga gcgtgtcact 60 attacttgtc gggcttcaca gagcgtgtct aaccacgtga catggtacca gcagaagccc 120 ggtcaggccc ctagactgct gatctactct gctagtaata ggtatactgg cattccagca 180 cggttctcag gctccggata tgggaccgag ttcaccttta caatctccag cgtgcagagc 240 gaagactttg ccgtctattt ttgccagcag gattattcat cattcggcca gggaactaaa 300 ctggaaatca agagaaccgt ggccgccccc tccgtgttca tcttcccccc ctccgacgag 360 cagctgaagt ccggcaccgc ctccgtggtg tgcctgctga acaacttcta cccccgggag 420 gccaaggtgc agtggaaggt ggacaacgcc ctgcagtccg gcaactccca ggagtccgtg 480 accgagcagg actccaagga ctccacctac tccctgtcct ccaccctgac cctgtccaag 540 gccgactacg agaagcacaa ggtgtacgcc tgcgaggtga cccaccaggg cctgtcctcc 600 cccgtgacca agtccttcaa ccggggcgag tgc 633 <210> 37 <211> 633 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 37 aaaatcgtca tgactcagac tcctgctacc ctgtccgtgt cagctgggga gcgtgtcact 60 attacttgtc gggcttcaca gagcgtgtct aaccacgtga catggtacca gcagaagccc 120 ggtcaggccc ctagactgct gatctactct gctagtaata ggtatactgg cattccagca 180 cggttctcag gctccggata tgggaccgag ttcaccttta caatctccag cgtgcagagc 240 gaagactttg ccgtctattt ttgccagcag gattattcat cattcggcca gggaactaaa 300 ctggaaatca agagaaccgt ggccgccccc tccgtgttca tcttcccccc ctccgacgag 360 cagctgaagt ccggcaccgc ctccgtggtg tgcctgctga acaacttcta cccccgggag 420 gccaaggtgc agtggaaggt ggacaacgcc ctgcagtccg gcaactccca ggagtccgtg 480 accgagcagg actccaagga ctccacctac tccctgtcct ccaccctgac cctgtccaag 540 gccgactacg agaagcacaa ggtgtacgcc tgcgaggtga cccaccaggg cctgtcctcc 600 cccgtgacca agtccttcaa ccggggcgag tgc 633 <210> 38 <211> 1404 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 38 caggtccagc tggtcgaatc tggtcctggg gtcgtgcagc ctgggaggtc tctgcgtctg 60 agttgtgccg tgtccgggtt ttccgtgact aactacggag tgcactgggt cagacagcca 120 cctgggaagg gtctggagtg gctgggagtg atctgggcaa tcggaattac caactacaat 180 tccagcgtca aaggcaggct gaccatctct aaggacaaca gtaaaaatac agtgtatctg 240 cagatgaatt ccctgagggc cgaagataca gctgtctact attgcgcctc tcggggcggt 300 cattatggct acgcactgga ttactgggga cagggaactc tggtcaccgt ctcatcacat 360 tatggctacg cactggatta ctggggacag ggaactctgg tcaccgtctc atcagcctcc 420 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggccg tcctacagtc ctcaggactc 600 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct 720 tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 780 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 900 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 960 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1020 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1080 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1140 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1200 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1260 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1320 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1380 agcctctccc tgtctccggg taaa 1404 <210> 39 <211> 717 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 39 gaaatcgtca tgactcagac tcctgctact ctgtccgtct ccgctgggga aagggtcact 60 atcacttgta aggcatcaca gtccgtgagt aaccacgtga cttggtacca gcagaagcca 120 ggacaggcac ccaggctgct gatctactca gcctccaata gatatagcgg agtgccagca 180 cgcttcagcg ggtctggtta tggcaccgag ttcaccttta caatttccag cgtgcagtct 240 gaagacttcg ctgtctactt ttgccagcag gattattcta gttttggaca ggggacaaag 300 ctggagatca aacgaggagg aggaggtagc ggaggaggag gttctggcgg agggggtagt 360 caggtgcagc tggtcgaatc cggtcctgga gtggtccagc caggcaggtc cctgcggatt 420 agctgtgcag tgagtggttt ctcagtcaca aactacggag tgcactgggt caggcagcca 480 cctggaaaag ggctggagtg gctgggagtg atctgggctg gcggaattac taactacaat 540 tccgccttca tgagtagact gactatctca aaggacaact ccaaaaatac cgtgtatctg 600 cagatgaatt cactgcgagc cgaagataca gctatgtact attgcgcttc ccgtggcggt 660 cattacggtt acgctctgga ttactggggt cagggaactc tggtcactgt ctcctcc 717 <210> 40 <211> 717 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 40 aaaatcgtca tgactcagac tcctgctact ctgtccgtct ccgctgggga aagggtcact 60 atcacttgta aggcatcaca gtccgtgagt aaccacgtga cttggtacca gcagaagcca 120 ggacaggcac ccaggctgct gatctactca gcctccaata gatatagcgg agtgccagca 180 cgcttcagcg ggtctggtta tggcaccgag ttcaccttta caatttccag cgtgcagtct 240 gaagacttcg ctgtctactt ttgccagcag gattattcta gttttggaca ggggacaaag 300 ctggagatca aacgaggagg aggaggtagc ggaggaggag gttctggcgg agggggtagt 360 caggtgcagc tggtcgaatc cggtcctgga gtggtccagc caggcaggtc cctgcggatt 420 agctgtgcag tgagtggttt ctcagtcaca aactacggag tgcactgggt caggcagtca 480 cctggaaaag ggctggagtg gctgggagtg atctgggctg gcggaattac taactacaat 540 tccgccttca tgagtagact gactatctca aaggacaact ccaaaaatac cgtgtatctg 600 cagatgaatt cactgcgagc cgaagataca gctatgtact attgcgcttc ccgtggcggt 660 cattacggtt acgctctgga ttactggggt cagggaactc tggtcactgt ctcctcc 717 <210> 41 <211> 717 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 41 aaaatcgtca tgactcagac tcctgctact ctgtccgtct ccgctgggga aagggtcact 60 atcacttgta aggcatcaca gtccgtgagt aaccacgtga cttggtacca gcagaagcca 120 ggacaggcac ccaggctgct gatctactca gcctccaata gatatagcgg agtgccagca 180 cgcttcagcg ggtctggtta tggcaccgag ttcaccttta caatttccag cgtgcagtct 240 gaagacttcg ctgtctactt ttgccagcag gattattcta gttttggaca ggggacaaag 300 ctggagatca aacgaggagg aggaggtagc ggaggaggag gttctggcgg agggggtagt 360 caggtgcagc tggtcgaatc cggtcctgga gtggtccagc caggcaggtc cctgcggatt 420 agctgtgcag tgagtggttt ctcagtcaca aactacggag tgcactgggt caggcagtca 480 cctggaaaag ggctggagtg gctgggagtg atctgggcta tcggaattac taactacaat 540 tccgccttca tgagtagact gactatctca aaggacaact ccaaaaatac cgtgtatctg 600 cagatgaatt cactgcgagc cgaagataca gctatgtact attgcgcttc ccgtggcggt 660 cattacggtt acgctctgga ttactggggt cagggaactc tggtcactgt ctcctcc 717 <210> 42 <211> 717 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 42 gaaatcgtca tgactcagac tcctgctacc ctgtccgtgt cagctgggga gcgtgtcact 60 attacttgtc gggcttcaca gagcgtgtct aacgacgtga catggtacca gcagaagccc 120 ggtcaggccc ctagactgct gatctactct gctagtaata ggtatactgg cattccagca 180 cggttctcag gctccggata tgggaccgag ttcaccttta caatctccag cgtgcagagc 240 gaagactttg ccgtctattt ttgccagcag gattattcat cattcggcca gggaactaaa 300 ctggaaatca agagaggagg aggaggtagc ggaggaggag gttctggcgg agggggtagt 360 caggtccagc tggtcgaatc tggtcctggg gtcgtgcagc ctgggaggtc tctgcgtctg 420 agttgtgccg tgtccgggtt ttccgtgact aactacggag tgcactgggt cagacagcca 480 cctgggaagg gtctggagtg gctgggagtg atctgggcag gcggaattac caactacaat 540 tccagcgtca aaggcaggct gaccatctct aaggacaaca gtaaaaatac agtgtatctg 600 cagatgaatt ccctgagggc cgaagataca gctgtctact attgcgcctc tcggggcggt 660 cattatggct acgcactgga ttactgggga cagggaactc tggtcaccgt ctcatca 717 <210> 43 <211> 717 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 43 gaaatcgtca tgactcagac tcctgctacc ctgtccgtgt cagctgggga gcgtgtcact 60 attacttgtc gggcttcaca gagcgtgtct aaccacgtga catggtacca gcagaagccc 120 ggtcaggccc ctagactgct gatctactct gctagtaata ggtatactgg cattccagca 180 cggttctcag gctccggata tgggaccgag ttcaccttta caatctccag cgtgcagagc 240 gaagactttg ccgtctattt ttgccagcag gattattcat cattcggcca gggaactaaa 300 ctggaaatca agagaggagg aggaggtagc ggaggaggag gttctggcgg agggggtagt 360 caggtccagc tggtcgaatc tggtcctggg gtcgtgcagc ctgggaggtc tctgcgtctg 420 agttgtgccg tgtccgggtt ttccgtgact aactacggag tgcactgggt cagacagcca 480 cctgggaagg gtctggagtg gctgggagtg atctgggcag gcggaattac caactacaat 540 tccagcgtca aaggcaggct gaccatctct aaggacaaca gtaaaaatac agtgtatctg 600 cagatgaatt ccctgagggc cgaagataca gctgtctact attgcgcctc tcggggcggt 660 cattatggct acgcactgga ttactgggga cagggaactc tggtcaccgt ctcatca 717 <210> 44 <211> 717 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 44 aaaatcgtca tgactcagac tcctgctacc ctgtccgtgt cagctgggga gcgtgtcact 60 attacttgtc gggcttcaca gagcgtgtct aaccacgtga catggtacca gcagaagccc 120 ggtcaggccc ctagactgct gatctactct gctagtaata ggtatactgg cattccagca 180 cggttctcag gctccggata tgggaccgag ttcaccttta caatctccag cgtgcagagc 240 gaagactttg ccgtctattt ttgccagcag gattattcat cattcggcca gggaactaaa 300 ctggaaatca agagaggagg aggaggtagc ggaggaggag gttctggcgg agggggtagt 360 caggtccagc tggtcgaatc tggtcctggg gtcgtgcagc ctgggaggtc tctgcgtctg 420 agttgtgccg tgtccgggtt ttccgtgact aactacggag tgcactgggt cagacagcca 480 cctgggaagg gtctggagtg gctgggagtg atctgggcag gcggaattac caactacaat 540 tccagcgtca aaggcaggct gaccatctct aaggacaaca gtaaaaatac agtgtatctg 600 cagatgaatt ccctgagggc cgaagataca gctgtctact attgcgcctc tcggggcggt 660 cattatggct acgcactgga ttactgggga cagggaactc tggtcaccgt ctcatca 717 <210> 45 <211> 717 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 45 aaaatcgtca tgactcagac tcctgctacc ctgtccgtgt cagctgggga gcgtgtcact 60 attacttgtc gggcttcaca gagcgtgtct aaccacgtga catggtacca gcagaagccc 120 ggtcaggccc ctagactgct gatctactct gctagtaata ggtatactgg cattccagca 180 cggttctcag gctccggata tgggaccgag ttcaccttta caatctccag cgtgcagagc 240 gaagactttg ccgtctattt ttgccagcag gattattcat cattcggcca gggaactaaa 300 ctggaaatca agagaggagg aggaggtagc ggaggaggag gttctggcgg agggggtagt 360 caggtccagc tggtcgaatc tggtcctggg gtcgtgcagc ctgggaggtc tctgcgtctg 420 agttgtgccg tgtccgggtt ttccgtgact aactacggag tgcactgggt cagacagcca 480 cctgggaagg gtctggagtg gctgggagtg atctgggcaa tcggaattac caactacaat 540 tccagcgtca aaggcaggct gaccatctct aaggacaaca gtaaaaatac agtgtatctg 600 cagatgaatt ccctgagggc cgaagataca gctgtctact attgcgcctc tcggggcggt 660 cattatggct acgcactgga ttactgggga cagggaactc tggtcaccgt ctcatca 717 <210> 46 <211> 239 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 46 Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Phe Gly 85 90 95 Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 115 120 125 Pro Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Val 130 135 140 Ser Gly Phe Ser Val Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro 145 150 155 160 Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile 165 170 175 Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp 180 185 190 Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 195 200 205 Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Gly Gly His Tyr Gly Tyr 210 215 220 Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235

Claims (46)

  1. 카바트(Kabat)에 따라 번호매김할 때 D32H 돌연변이, 카바트에 따라 번호매김할 때 E1K 돌연변이, 또는 이것들의 조합을 포함하는 경쇄를 갖고,
    서열식별번호:1, 2, 3, 7, 8, 및 9 중 어느 하나에 기재된 경쇄 가변 영역 서열, 및 서열식별번호:4, 5, 및 10 중 어느 하나에 기재된 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는,
    고 친화도 항-GD2 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열식별번호:1, 2, 7 또는 8로 식별되는 경쇄 서열을 포함하는 하나의 구조적 특징을 갖는 고 친화도 항-GD2 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 카바트에 따라 번호매김할 때 중쇄 G54I 돌연변이를 포함하는 고 친화도 항-GD2 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 서열식별번호:4, 5 또는 10으로 식별되는 중쇄 서열을 포함하는 하나의 구조적 특징을 갖는 고 친화도 항-GD2 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 서열식별번호:3 또는 9로 식별되는 경쇄 서열을 포함하는 고 친화도 항-GD2 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 서열식별번호:3 또는 9로 식별되는 경쇄 서열 및 서열식별번호:4, 5 또는 10으로 식별되는 중쇄 서열을 포함하는 고 친화도 항-GD2 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, 서열식별번호:3 또는 9로 식별되는 경쇄 서열 및 서열식별번호:4 또는 10으로 식별되는 중쇄 서열을 포함하는 고 친화도 항-GD2 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, 단일 쇄 가변 단편 (scFv)인 고 친화도 항-GD2 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  9. 제8항에 있어서, scFv가 서열식별번호:11, 13, 19, 또는 22로 식별되는 것인 고 친화도 항-GD2 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  10. 제8항에 있어서, scFv가 서열식별번호:12, 14, 15, 21, 23 또는 24로 식별되는 것인 고 친화도 항-GD2 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  11. 제8항에 있어서, scFv가 서열식별번호:16 또는 25로 식별되는 것인 고 친화도 항-GD2 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  12. 서열식별번호:11-16, 18-19, 및 21-25로 식별되는 scFv 중 어느 하나를 포함하는 제1 결합 부위, 및 제2 결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체.
  13. 제12항에 있어서, 제2 결합 부위가 서열식별번호:26 또는 27로 식별되는 huOKT3에 대한 scFv를 포함하는 것인 이중특이성 항체.
  14. 제12항에 있어서, 제2 결합 부위가 서열식별번호:28로 식별되는 scFv C825를 포함하는 것인 이중특이성 항체.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터에 의해 생성된 것인 고 친화도 항-GD2 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 고 친화도 항-GD2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  17. 제16항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  18. 제17항의 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  19. 제18항에 따른 숙주 세포를 고 친화도 항-GD2 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 발현을 가능하게 하는 조건 하에 배양 배지에서 배양하는 단계, 및
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 배양 배지로부터 분리시키는 단계
    를 포함하는, 고 친화도 항-GD2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 생성하는 방법.
  20. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 고 친화도 항-GD2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, GD2 발현을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 세포독성제에 접합된 것인 조성물.
  22. 제20항의 조성물의 고 친화도 항-GD2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하고, 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 추가로 포함하는, GD2 발현을 특징으로 하는 암 치료용 제약 조성물.
  23. 제12항에 있어서, 제2 결합 부위가 T-림프구, NK 세포, B-림프구, 수지상 세포, 단핵세포, 대식세포, 호중구, 중간엽 줄기 세포, 및 신경 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 세포와 연관된 것인 이중특이성 항체.
  24. 제12항에 있어서, 제2 결합 부위가 CD3에 특이적인 것인 이중특이성 항체.
  25. 제20항에 있어서, 바이오틴-PEG-알킨과 반응된 아지도-GD2-올리고사카라이드를 포함하는 분자를 추가로 포함하는 조성물.
  26. 제12항의 이중특이성 항체를 포함하는, GD2 발현을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
  27. 제12항에 있어서, 제2 결합 부위가 합텐에 결합된 것인 이중특이성 항체.
  28. 제27항에 있어서, 합텐이 진단 검출 표지로 표지된 것인 이중특이성 항체.
  29. 제12항에 있어서, 제2 결합 부위가 사이토카인 또는 세포증식억제제에 결합된 것인 이중특이성 항체.
  30. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성 표지된 고 친화도 항-GD2 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  31. 제30항의 고 친화도 항-GD2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, GD2 발현을 특징으로 하는 암 치료용 치료 조성물.
  32. 제30항의 고 친화도 항-GD2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, GD2 발현을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.
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