KR20200117997A - Cd19 변이체 - Google Patents

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KR20200117997A
KR20200117997A KR1020207020341A KR20207020341A KR20200117997A KR 20200117997 A KR20200117997 A KR 20200117997A KR 1020207020341 A KR1020207020341 A KR 1020207020341A KR 20207020341 A KR20207020341 A KR 20207020341A KR 20200117997 A KR20200117997 A KR 20200117997A
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로이 롭
폴 레너트
벤자민 해켈
저스틴 클레스미스
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알레타 바이오쎄라퓨틱스, 인크.
리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미네소타
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Abstract

CD19 변이체, CD19 변이체를 확인하는 방법, 및, 예를 들어, 암을 치료하기 위해 상기 CD19 변이체를 사용하는 방법이 기재된다.

Description

CD19 변이체
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2017년 12월 15일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/599,211호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다.
CD19(분화 클러스터 19)로도 공지된 B-림프구 항원 CD19는 인간에서 CD19 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. CD19는 CD19 CAR T-세포를 포함하는 다양한 면역요법의 표적이다.
본 발명의 개시는 항-CD19 항체에 결합하는 능력 및/또는 개선된 안정성과 같은 특정한 기능적 속성을 갖는 CD19 변이체를 확인하는 방법을 제공한다. 따라서, 일부 양태에서, 본 발명의 개시는 안정한 CD19 변이체를 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 복수의 CD19 폴리펩티드를 획득하거나 제공하는 단계로서, 각각의 CD19 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는, 단계; b) 복수의 CD19 폴리펩티드가 항-CD19 항체 또는 이의 단편에 의해 결합되는지 결정하는 단계; c) 복수의 CD19 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 프로테아제 절단에 대해 더 내성이 있는지 결정하는 단계; 및/또는 d) 복수의 CD19 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 열적으로 더 안정적인지 결정하는 단계를 포함하며; 여기서, 폴리펩티드가 (i) 항-CD19 항체 또는 이의 단편에 의해 결합되고/되거나, (ii) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 프로테아제 절단에 대해 더 내성이 있고/있거나, (iii) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 열적으로 더 안정적인 경우 CD19 폴리펩티드는 안정적인 CD19 변이체이다. 일부 구현예에서, 항-CD19 항체는 FMC63 또는 4G7이다.
일부 구현예에서, 복수의 CD19 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 위치 2, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 38, 39, 45, 47, 49, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 66, 68, 70, 72, 84, 90, 93, 94, 99, 100, 105, 108, 111, 113, 114, 115, 122, 123, 124, 125, 127, 130, 131, 132, 135, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 148, 149, 154, 167, 169, 171, 185, 189, 193, 194, 196, 198, 202, 204, 206, 207, 209, 211, 212, 213, 215, 216, 217, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 228, 229, 230, 232, 235, 240, 243, 247, 249, 250, 251, 252, 253, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 264, 265, 269 또는 271에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 CD19 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치의 다음 세트 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함한다: 5/7/9; 14/16/18; 29/31; 29/31/33; 35/37/39; 45/47/49; 52/54/56; 59/61/63; 62/64/66; 76/78/80; 86/88/90; 167/169/171; 175/177/179; 193/195/197; 206/208/210; 207/209/211; 219/221/223; 240/243; 224/226/228; 247/249/251; 253/255/256; 255/256; 또는 261/262/264/265.
다른 양태에서, 본 발명의 개시는 CD19 변이체, CD19 변이체를 포함하는 융합 단백질, CD19 변이체(또는 융합 단백질)를 인코딩하는 핵산, 및 상기 CD19 변이체 또는 융합 단백질을 인코딩하는 세포 치료제를 제공한다. 상기 조성물은 암을 치료하고/하거나 면역 반응을 개시시키거나 조절하는 데 유용하다.
일부 구현예에서, CD19 변이체는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 것보다 적어도 20%, 40%, 60%, 80%, 100%, 120%, 140%, 160%, 180%, 200%, 250%, 300%, 400% 또는 500% 더 큰 안정성의 측정 수준을 갖는다. 일부 구현예에서, CD19 변이체는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 프로테아제 절단에 대해 더 내성이 있다. 일부 구현예에서, CD19 변이체는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 열적으로 더 안정적이다.
일부 구현예에서, CD19 변이체는 표 1A, 표 1B, 표 2A, 표 2B, 표 3, 표 6, 도 8b, 도 11, 도 12b, 도 14a, 도 14b, 도 14c, 도 14d 또는 도 15b에 나열된 SEQ ID NO:2의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, CD19 변이체는 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치의 다음 세트 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함한다: 5/7/9; 14/16/18; 29/31; 29/31/33; 35/37/39; 45/47/49; 52/54/56; 59/61/63; 62/64/66; 76/78/80; 86/88/90; 167/169/171; 175/177/179; 193/195/197; 206/208/210; 207/209/211; 219/221/223; 240/243; 224/226/228; 247/249/251; 253/255/256; 255/256; 또는 261/262/264/265. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 표 1B, 표 2B, 표 3, 표 6, 도 8b, 도 11, 도 14a, 도 14b, 도 14c, 도 14d 또는 도 15b에 제시된 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, CD19 변이체는 항-CD19 항체에 결합한다. 일부 구현예에서, CD19 변이체는 종양 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 MART-1/MelanA(MART-I), gp100(Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15, CEA, p53, Ras, HER-2/neu, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, 엡스타인 바 바이러스 항원 EBVA, 인간 유두종바이러스(HPV) 항원 E6 또는 E7, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, erbB, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백질, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733＼EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린 C-관련 단백질, TAAL6, TAG72, TLP, MUC16, IL13Rα2, FRα, VEGFR2, 루이스 Y, FAP, EphA2, CEACAM5, EGFR, CA6, CA9, GPNMB, EGP1, FOLR1, 내피 수용체, STEAP1, SLC44A4, 넥틴-4, AGS-16, 구아날릴 사이클라제 C, MUC-1, CFC1B, 인테그린 알파 3 사슬(a3b1의 것, 라미닌 수용체 사슬), TPS, CD19, CD20, CD22, CD30, CD72, CD180, CD171(L1CAM), CD123, CD133, CD138, CD37, CD70, CD79a, CD79b, CD56, CD74, CD166, CD71, CLL-1/CLEC12A, ROR1, 글리피칸 3(GPC3), 메소텔린, CD33/IL3Ra, c-Met, PSCA, PSMA, 당지질 F77, EGFRvIII, BCMA, GD-2, MY-ESO-1 또는 MAGE A3이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 (a) 항원에 결합하는 항체 또는 스캐폴드 폴리펩티드, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 (b) CD19 변이체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 항원은 자가면역 장애와 관련된 항원이다. 일부 구현예에서, 항원은 감염원 항원이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 스캐폴드 폴리펩티드, 또는 이의 항원 결합 단편은 scFv 또는 VHH 또는 타입 III 섬유결합소 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 변이체는 단편 항체의 경쇄의 C-말단 또는 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, CD19 변이체는 단편 항체의 중쇄의 C-말단 또는 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, CD19 변이체는 단편 항체의 경쇄의 C-말단에 융합된다.
일부 구현예에서, VHH는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, VHH는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분(예를 들어, CLL-1 결합 부분)를 포함하며, 상기 부분은 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS 중 하나 이상이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, VHH는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분(예를 들어, CLL-1 결합 부분)를 포함하며, 상기 부분은 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS 전부가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, VHH는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분(예를 들어, CLL-1 결합 부분)를 포함하며, 상기 부분은 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS 중 하나 이상이 결여되어 있고, 상기 부분은 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상)의 추가 아미노산이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, VHH는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분(예를 들어, CLL-1 결합 부분)를 포함하며, 상기 부분은 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS 전부가 결여되어 있고, 상기 부분은 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상)의 추가 아미노산이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, VHH는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 상기 부분은 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS 중 하나 이상이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, VHH는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 상기 부분은 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS 전부가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, VHH는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 상기 부분은 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS 중 하나 이상이 결여되어 있고, 상기 부분은 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상)의 추가 아미노산이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, VHH는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 상기 부분은 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS 전부가 결여되어 있고, 상기 부분은 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상)의 추가 아미노산이 결여되어 있다.
일부 구현예에서, VHH는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나에 도시된 적어도 하나의 CDR(예를 들어, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3)을 포함한다. 일부 구현예에서, VHH는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나에 도시된 CDR(예를 들어, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3)과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, VHH는 표 5A 및/또는 표 5B에 도시된 그룹 1 내지 13 중 어느 하나의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3를 포함한다. 일부 구현예에서, VHH는 표 5A 및/또는 표 5B에 도시된 그룹 1 내지 13 중 어느 하나의 (i) CDR1 및 CDR2; (ii) CDR2 및 CDR3; (iii) CDR1 및 CDR3; 또는 (iv) CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한다. 일부 구현예에서, VHH는 표 5A 및/또는 표 5B에 도시된 그룹 1의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 2의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 3의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 4의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 5의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 6의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 7의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 8의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 9의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 10의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는 그룹 13의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 본원에 기재된 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 (a) 항원에 결합하는 항체 또는 스캐폴드 폴리펩티드, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 (b) CD19 변이체를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 (a) 항원에 결합하는 항체 또는 스캐폴드 폴리펩티드, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 (b) CD19 변이체를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 (a) 항원에 결합하는 항체 또는 스캐폴드 폴리펩티드, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 (b) CD19 변이체를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터 또는 키메라 AAV/파지(AAVP) 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 (a) 항원에 결합하는 항체 또는 스캐폴드 폴리펩티드, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 (b) CD19 변이체를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 종양용해성 바이러스 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 종양용해성 바이러스 벡터는 자율 파르보바이러스 벡터, 점액종 바이러스 벡터, 파라믹소바이러스 벡터, 레오바이러스 벡터, 피코르나바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 벡터, 또는 소수포구내염 바이러스 벡터이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 (a) 항원에 결합하는 항체 또는 스캐폴드 폴리펩티드, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 (b) CD19 변이체를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 이러한 세포는 종양 세포이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 (a) 항원에 결합하는 항체 또는 스캐폴드 폴리펩티드, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 (b) CD19 변이체를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터는 CAR을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 (a) 항원에 결합하는 항체 또는 스캐폴드 폴리펩티드, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 (b) CD19 변이체를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 (a) 항원에 결합하는 항체 또는 스캐폴드 폴리펩티드, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 (b) CD19 변이체를 포함하는 융합 단백질, (a) 항원에 결합하는 항체 또는 스캐폴드 폴리펩티드, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 (b) CD19 변이체를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 벡터를 포함하는 세포, 또는 (a) 항원에 결합하는 항체 또는 스캐폴드 폴리펩티드, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 (b) CD19 변이체를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 종양을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 치료 방법은 항체, 항체 약물 컨쥬게이트, 또는 CAR-T 세포를 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 항체, 항체 약물 컨쥬게이트, 또는 CAR-T 세포는 CD19 변이체에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 안정한 CD19 변이체를 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 복수의 CD19 폴리펩티드를 획득하는 단계로서, 각각의 CD19 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는, 단계; b) 복수의 CD19 폴리펩티드가 항-CD19 항체 또는 이의 단편에 의해 결합되는지 결정하는 단계; c) 복수의 CD19 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 프로테아제 절단에 대해 더 내성이 있는지 결정하는 단계; 및/또는 d) 복수의 CD19 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 열적으로 더 안정적인지 결정하는 단계를 포함하며; 여기서, 폴리펩티드가 (i) 항-CD19 항체 또는 이의 단편에 의해 결합되고/되거나, (ii) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 프로테아제 절단에 대해 더 내성이 있고/있거나, (iii) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 열적으로 더 안정적인 경우 CD19 폴리펩티드는 안정적인 CD19 변이체이다. 일부 구현예에서, 항-CD19 항체는 FMC63 또는 4G7이다. 일부 구현예에서, 복수의 CD19 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 위치 2, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 38, 39, 45, 47, 49, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 66, 68, 70, 72, 84, 90, 93, 94, 99, 100, 105, 108, 111, 113, 114, 115, 122, 123, 124, 125, 127, 130, 131, 132, 135, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 148, 149, 154, 167, 169, 171, 185, 189, 193, 194, 196, 198, 202, 204, 206, 207, 209, 211, 212, 213, 215, 216, 217, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 228, 229, 230, 232, 235, 240, 243, 247, 249, 250, 251, 252, 253, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 264, 265, 269 또는 271에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 CD19 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치의 다음 세트 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함한다: 5/7/9; 14/16/18; 29/31; 29/31/33; 35/37/39; 45/47/49; 52/54/56; 59/61/63; 62/64/66; 76/78/80; 86/88/90; 167/169/171; 175/177/179; 193/195/197; 206/208/210; 207/209/211; 219/221/223; 240/243; 224/226/228; 247/249/251; 253/255/256; 255/256; 또는 261/262/264/265.
본 발명의 기타 특징, 목적, 및 장점은 하기 상세한 설명에서 명백하다. 그러나, 발명의 상세한 설명은 본 발명의 구현예를 나타내는 한편, 단지 예시로서만 제공되며 제한은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범위 내에서 각종 변화 및 변경은 발명의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
도면의 도는 단지 예시 목적을 위한 것이며, 제한하기 위한 것이 아니다.
도 1a는 CD19 단백질의 개략도이다(문헌[Tedder, Nat. Rev. Rheumatol. 5:572-577 (2009)]로부터 재현됨). 도 1b는 HHPred 서버에 의해 예측된 CD19의 세포외 부분의 구조의 리본 다이어그램이다(문헌[Soding et al., Nucl. Acid Res. 33:244-248 (2005)]).
도 2는 트리플렛 라이브러리 설계를 제시하는 표이다. 2개 또는 3개의 아미노산이 27개의 상이한 조합으로 동시에 다양화되었다. 부위는 상동성 모델링(도 1) 및 비-극성에 의해 결정된 잠재적 구조적 중요성에 기초하여 선택되었다.
도 3은 흐름세포측정법에 의한 효모-디스플레이 야생형 CD19에 대한 항체 결합의 분석을 도시한다. 효모는 CD19를 Aga2p에 대한 C-말단(상단) 또는 N-말단(하단) 융합으로 디스플레이하도록 유도되었다. 디스플레이된 CD19를 갖는 효모는 실온에서 유지되거나, 30분 동안 70℃에서 인큐베이션된 후, 냉각되고, 표시된 항체 및 항-cMYC 항체로 표지되어 전장 CD19 디스플레이를 검출하였다. 결합은 흐름세포측정법을 통해 이차 항체로 검출되었다.
도 4는 흐름세포측정법에 의해 항체 FMC63에 결합하도록 진화된 CD19 변이체의 분석을 도시한다. 표시된 조합 라이브러리를 디스플레이하는 효모(분류되지 않거나 FMC63 결합에 대해 농축됨)는 FMC63 및 FITC-컨쥬게이션된 항-cMYC 항체(전장 CD19를 나타내기 위해 C-말단 에피토프를 표지하기 위함) 및 이후 항-마우스-AlexaFluor647과 함께 인큐베이션되고, 흐름세포측정법에 의해 평가되었다.
도 5a는 효모-디스플레이된 야생형 CD19의 프로테이나제 K 절단을 도시하는 그래프이다. 야생형 CD19를 디스플레이하는 효모는 10분 동안 37℃에서 표시된 양의 PBSA 중 프로테이나제 K와 함께 인큐베이션되었다. 효모는 세척되고, N-말단 HA 및 C-말단 MYC 에피토프가 항체로 표지되고, 흐름세포측정법에 의해 평가되었다. 0.002 및 0.02 단위의 프로테이나제 K는 Aga2p-HA 디스플레이를 유지하면서 CD19 절단을 제공하였다. 도 5b는 표시된 에피토프를 갖는 효모-디스플레이된 CD19의 개략도있다.
도 6은 흐름세포측정법에 의한 개선된 CD19 변이체의 선택의 분석을 도시한다. CD19 라이브러리를 디스플레이하는 효모는 37℃에서 10분 동안 PBSA 중 0.002 단위의 프로테이나제 K와 함께 인큐베이션되었다. 효모는 세척되고, N-말단 HA 및 C-말단 MYC 에피토프가 항체로 표지되고, 흐름세포측정법에 의해 평가되었다. 가장 높은 MYC/HA 비를 갖는 변이체가 수집되었다.
도 7은 흐름세포측정법을 이용한 열 선택에 의한 CD19 변이체의 분석을 도시한다. 타일(tile) 1에서 단일 돌연변이를 갖는 CD19 변이체를 디스플레이하는 효모는 37℃에서 CD19 디스플레이를 위해 유도되고, FITC-컨쥬게이션된 항-MYC로 디스플레이를 위해 표지되고, 흐름세포측정법에 의해 분석되었다. 분석을 위해 상위 5%를 수집하였다.
도 8a는 측쇄 및 색으로 제시된 다양화된 위치를 갖는 CD19의 개략도이다. 도 8b는 조합된 라이브러리 설계에서 허용되는 서열의 예시적인 세트를 제시하는 표이다. 예를 들어, (제1 열) 야생형 서열에서 N, V 및 Q인 부위 14, 16 및 18은 T, A 및 W; E, W 및 P; D, W 및 R; T, V 및 P; 또는 T, W 및 P가 되도록 허용된다.
도 9는 흐름세포측정법을 이용한 다중-돌연변이체 라이브러리로부터의 개선된 CD19 변이체의 선택을 도시한다. 표시된 CD19 집단(야생형 클론, 2회 분류된 3중 라이브러리, 또는 2회 분류된 조합된 라이브러리)을 디스플레이하는 효모는 FMC63 및 FITC-컨쥬게이션된 항-MYC 항체(전장 CD19를 나타내기 위해 C-말단 에피토프를 표지하기 위함) 및 이후 항-마우스-AlexaFluor647과 함께 인큐베이션되고, 흐름세포측정법에 의해 평가되었다.
도 10a 및 도 10b는 흐름세포측정법에 의한 다중-돌연변이체의 특성규명을 도시한다. 야생형 CD19 또는 분류된 CD19 집단을 디스플레이하는 효모는 (i) FMC63 및 FITC-컨쥬게이션된 항-MYC 항체(전장 CD19를 나타내기 위해 C-말단 에피토프를 표지하기 위함) 및 이후 항-마우스-AlexaFluor647과 함께 인큐베이션되고, 흐름세포측정법에 의해 평가되거나(도 10a); (ii) 37℃에서 10분 동안 PBSA 중 0.002 단위의 프로테이나제 K와 함께 인큐베이션되었다(도 10b). 효모는 세척되고, N-말단 HA 및 C-말단 MYC 에피토프가 항체로 표지되고, 흐름세포측정법에 의해 평가되었다.
도 11은 다중-돌연변이체 라이브러리로부터의 개선된 CD19 변이체의 서열 분석을 도시한다. FMC63 결합 및 프로테아제 내성에 대한 선택으로부터 출현한 CD19 변이체가 시퀀싱되었다. 다양화된 위치의 아미노산은 다수의 클론에 대해 표시된다. 설계로부터 분류된 집단으로의 빈도에서의 상대적 변화가 하단 표에 제시된다.
도 12a는 결합 리간드를 생성하기 위한 다양성에 대한 잠재적 영역을 강조하는 CD19의 세포외 도메인의 리본 다이어그램이다. 오렌지색: Ig 도메인 1 루프; 청색: Ig 도메인 2 루프; 적색: Ig 도메인 2 시트. 도 12b는 예시적인 다양성 설계의 표를 도시한다. 상동성 모델은 다음과 같이 결정되었다. N-말단 도메인, 도메인 링커 및 C-말단 도메인을 포함하는 CD19의 258개의 잔기의 아미노산 서열은 디폴트 파라미터를 사용하여 HHPred(
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et al., Nucleic Acids Res. 33:244-248 (2005))에 제공되었다. 이후, 자동 선택 최적 주형 옵션을 사용하여 MODELLER에 대한 모델(Eswar et al., Curr. Protoc. Bioinforma. 5.6.1-32 (2006) doi:10.1002/0471250953.bi0506s4711)을 제조하기 위해 HHPpred makemodel이 사용되었다. MODELLER에 최적 단일 주형(1qz1)이 선택되었다(주: 다수의 최적 주형을 선택하기 위한 옵션도 1qz1과 유사한 구조를 출력한다). 이후, 출력 구조는 측쇄 리패킹 및 전체 구조 최소화에 의해 독립형 Foldit(Cooper et al, Nature 466:756-760 (2010))에서 개선되었다.
도 13은 흐름세포측정법을 이용한 개선된 CD19-리간드 변이체의 선택을 도시한다. 표적 결합 및 FMC63 결합에 대해 2회 농축된 CD19-Fn(항-EGFR) 또는 CD19-scFv(항-HER2) 집단을 디스플레이하는 효모는 FMC63 및 비오틴-컨쥬게이션된 EGFR 또는 HER2 엑토도메인 및 이후 항-마우스-AlexaFluor647 및 스트렙타비딘-AlexaFluor488과 함께 인큐베이션되고, 흐름세포측정법에 의해 평가되었다.
도 14a는 다중-돌연변이체 라이브러리로부터의 CD19/EGFR-결합 섬유결합소 도메인 변이체의 서열 분석을 도시하고; FMC63 결합 및 EGFR 결합에 대한 선택으로부터 출현한 돌연변이체가 시퀀싱되었다. 다양화된 위치의 아미노산은 다수의 클론에 대해 표시된다. 설계로부터 분류된 집단으로의 빈도에서의 상대적 변화가 하단 표에 제시된다.
도 14b는 다중-돌연변이체 라이브러리로부터의 CD19/항-HER2 scFv 변이체의 서열 분석을 도시하고; FMC63 결합 및 HER2 결합에 대한 선택으로부터 출현한 돌연변이체가 시퀀싱되었다. 다양화된 위치의 아미노산은 다수의 클론에 대해 표시된다. 설계로부터 분류된 집단으로의 빈도에서의 상대적 변화가 하단 표에 제시된다.
도 14c는 다중-돌연변이체 라이브러리로부터의 CD19/항-HER2 scFv 변이체의 추가의 서열 분석을 도시하고; FMC63 결합 및 HER2 결합에 대한 선택으로부터 출현한 돌연변이체가 시퀀싱되었다. 다양화된 위치의 아미노산은 다수의 클론에 대해 표시된다.
도 14d는 다중-돌연변이체 라이브러리로부터의 CD19/EGFR-결합 섬유결합소 도메인 변이체의 서열 분석을 도시하고; FMC63 결합 및 EGFR 결합에 대한 선택으로부터 출현한 돌연변이체가 시퀀싱되었다. 다양화된 위치의 아미노산은 다수의 클론에 대해 표시된다. 도 15a는 흐름세포측정법에 의한 개선된 리간드-CD19 변이체의 선택을 도시한다. 표적 결합 및 FMC63 결합에 대해 농축된 Fn(항-EGFR)-CD19 또는 scFv(항-HER2)-CD19 집단을 디스플레이하는 효모는 FMC63 및 비오틴-컨쥬게이션된 EGFR 또는 HER2 엑토도메인 및 이후 항-마우스-AlexaFluor647 및 스트렙타비딘-AlexaFluor488과 함께 인큐베이션되고, 흐름세포측정법에 의해 평가되었다.
도 15b는 다중-돌연변이체 라이브러리로부터의 CD19/항-HER2 scFv 변이체의 서열 분석을 도시하고; FMC63 결합 및 HER2 결합에 대한 선택으로부터 출현한 돌연변이체가 시퀀싱되었다 다양화된 위치의 아미노산은 다수의 클론에 대해 표시된다.
도 15c는 딥 시퀀싱에 의해 확인된 커플링된 다중 돌연변이(상단의 상단) 또는 단일 돌연변이(상단의 하단)의 상대적 아미노산 빈도 변화를 도시한다. 하단은 3개의 융합 단백질 컨텍스트("CT FnEGFR"= CD19-Fn3/EGFR; "CT scFvHER2"= CD19-scFv/Her2; "NT scFvHER2"= scFv/Her2-CD19)에 대한 분류되지 않은 라이브러리로부터 기능적으로 분류된 돌연변이체로의 상대적 아미노산 빈도 변화를 도시한다.
도 16은 분비된 N-말단 CD19 변이체-Fn3/EGFR 융합 단백질의 검출을 도시한다.
도 17은 분비된 N-말단 CD19 변이체-scFv/Her2 융합 단백질의 검출을 도시한다.
도 18은 분비된 C-말단 scFv/Her2 - CD19 변이체 융합 단백질의 검출을 도시한다.
도 19는 Her2 양성 세포에 대한 C-말단 scFv/Her2 - CD19 변이체 융합 단백질의 결합을 도시한다.
도 20은 C-말단 scFv/Her2 - CD19 변이체 융합 단백질에 의한 브릿징으로 인한 CAR19에 의한 Her2 양성 세포의 사멸을 도시한다.
도 21은 분비된 C-말단 scFv/CD20 - CD19 변이체 융합 단백질의 검출을 도시한다.
도 22는 CD20 양성 세포에 대한 C-말단 scFv/CD20 - CD19 변이체 융합 단백질의 결합을 도시한다.
도 23은 C-말단 scFv/CD20 - CD19 변이체 융합 단백질에 의한 브릿징으로 인한 CAR19에 의한 CD20 양성 세포의 사멸을 도시한다.
도 24는 분비된 마스킹된 및 마스킹되지 않은 C-말단 세툭시맙-CD19변이체 융합 단백질의 검출을 도시한다.
도 25는 uPA의 존재하에서 마스킹되지 않은 C-말단 세툭시맙-CD19 변이체 융합 단백질 및 마스킹된 C-말단 세툭시맙-CD19 변이체 융합 단백질에 의한 브릿징으로 인한 CAR19에 의한 EGFR 양성 세포의 사멸을 도시한다.
도 26은 CD19 변이체 단백질을 포함하는 분비된 이중특이적 융합 단백질의 검출을 도시한다.
도 27은 Her2 양성 세포에 대한 C-말단 트라스투주맙-CD19 변이체 융합 단백질의 결합을 도시한다.
도 28은 C-말단 트라스투주맙-CD19 변이체 융합 단백질에 의한 브릿징으로 인한 CAR19에 의한 Her2 양성 세포의 사멸을 도시한다.
도 29는 CD20 양성 세포에 대한 C-말단 리툭시맙-CD19 변이체 융합 단백질의 결합을 도시한다.
도 30은 C-말단 리툭시맙-CD19 변이체 융합 단백질에 의한 브릿징으로 인한 CAR19에 의한 CD20 양성 세포의 사멸을 도시한다.
도 31은 Her2 양성 세포에 대한 아글리코실 C-말단 트라스투주맙-CD19 변이체 융합 단백질의 결합을 도시한다.
도 32는 CD20 양성 세포에 대한 아글리코실 C-말단 리툭시맙-CD19 변이체 융합 단백질의 결합을 도시한다.
도 33은 아글리코실 C-말단 리툭시맙-CD19 변이체 융합 단백질에 의한 브릿징으로 인한 CAR19에 의한 CD20 양성 세포의 사멸을 도시한다.
도 34는 N-말단 트렁케이션된 CD19 변이체-scFv/Her2 융합 단백질에 의한 브릿징으로 인한 CAR19에 의한 Her2 양성 세포의 사멸을 도시한다.
도 35는 U937 세포에 대한 다양한 CD19 돌연변이체-VHH/Clec12A 및 VHH/Clec12A-CD19 돌연변이체 작제물의 결합을 도시한다.
도 36은 U937 세포에 대한 다양한 CD19 돌연변이체-VHH/Clec12A 및 VHH/Clec12A-CD19 돌연변이체 작제물의 결합을 도시한다.
도 37은 다양한 CD19 돌연변이체-VHH/Clec12A 및 VHH/Clec12A-CD19 돌연변이체 작제물의 EC50의 결정을 도시한다.
도 38은 다양한 CD19 돌연변이체-VHH/Clec12A 및 VHH/Clec12A-CD19 돌연변이체 작제물의 역가를 도시한다.
도 39는 다양한 CD19 돌연변이체-VHH/Clec12A 및 VHH/Clec12A-CD19 돌연변이체 작제물의 역가를 도시한다.
도 40은 CLEC12a에 대한 다양한 CD19 돌연변이체-VHH/Clec12A 및 VHH/Clec12A-CD19 돌연변이체 작제물의 결합을 도시한다.
도 41은 CLEC12a에 대한 다양한 CD19 돌연변이체-VHH/Clec12A 및 VHH/Clec12A-CD19 돌연변이체 작제물의 결합을 도시한다.
도 42는 다양한 CD19 돌연변이체-VHH/Clec12A 및 VHH/Clec12A-CD19 돌연변이체 작제물에 의한 브릿징으로 인한 CAR19에 의한 CLEC12a 양성 세포의 사멸을 도시한다.
도 43은 다양한 CD19 돌연변이체-VHH/Clec12A 및 VHH/Clec12A-CD19 돌연변이체 작제물에 의한 브릿징으로 인한 CAR19에 의한 CLEC12a 양성 세포의 사멸을 도시한다.
도 44는 다양한 CD19 돌연변이체-VHH/Clec12A 및 VHH/Clec12A-CD19 돌연변이체 작제물에 의한 브릿징으로 인한 CAR19에 의한 CLEC12a 양성 세포의 사멸의 용량 곡선을 도시한다.
도 45는 다양한 CD19 돌연변이체-VHH/Clec12A 및 VHH/Clec12A-CD19 돌연변이체 작제물에 의한 브릿징으로 인한 CAR19에 의한 CLEC12a 양성 세포의 사멸의 EC50을 도시한다.
도 46a 및 46b는 작제물 #186의 VH 및 VL 도메인, 항-CLEC12a VHH(클론 2H3) 및 CD19 돌연변이체를 포함하는 이중특이적 작제물에 대한 결합 EC50을 도시한다.
도 47a 및 47b는 작제물 #186의 VH 및 VL 도메인, 항-CLEC12a VHH(클론 2H3) 및 CD19 돌연변이체를 포함하는 이중특이적 작제물에 의한 브릿징으로 인한 CAR19에 의한 CLEC12a 양성 세포의 사멸을 도시한다.
도 48은 CAR19; CD19; 및 항-CLEC12a scFv를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 감염된 세포로부터의 융합 작제물의 발현 및 분비를 도시한다.
도 49는 CAR19; CD19; 및 항-CLEC12a scFv를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 감염된 세포에 의한 U937 및 NALM6 세포의 사멸을 도시한다.
도 50은 효모에서 발현된 CD19 또는 펩티드에 대한 mab 3B10의 적정을 도시한다.
정의
본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여, 특정 용어들이 하기에 먼저 정의된다. 하기 용어 및 기타 용어에 대한 추가의 정의는 본 명세서를 통하여 기술된다.
투여: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "투여"는 대상체 또는 계에 대한 조성물의 투여를 지칭한다. 동물 대상체(예를 들어, 인간)에 대한 투여는 임의의 적합한 경로에 의할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 투여는 기관지(기관지 점적주입에 의한 경우 포함), 구강, 장, 피부간, 동맥내, 피부내, 위내, 골수내, 근육내, 비강내, 복강내, 척추강내, 정맥내, 심실내, 특정 장기내(예를 들어, 간내), 점막, 비강, 경구, 직장, 피하, 설하, 국소, 기관(기관내 점적주입에 의한 경우 포함), 경피, 질 및 유리체일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 종양내 또는 종양주변일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 간헐적 투여를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 적어도 선택된 기간 동안의 연속적 투여(예를 들어, 관류)를 포함할 수 있다.
입양 세포 치료: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, "입양 세포 치료" 또는 "ACT"는 항종양 활성을 갖는 면역 세포의 암 환자 내로의 수송을 포함한다. 일부 구현예에서, ACT는 항종양 활성을 갖는 림프종의 이용, 이들 세포의 많은 수로의 시험관 내 확장 및 암-포함 숙주로의 이들의 주입을 포함하는 치료 시도이다.
친화성: 본원에서 사용되는 용어 "친화성"은 항원 결합 모이어티(예를 들어, 본원에 기재된 항체)와 항원 표적(예를 들어, CLL-1) 사이의 결합 상호작용의 특징을 지칭하며, 이는 결합 상호작용의 강도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 친화성의 척도는 해리 상수(KD)로 표현된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 항원 표적에 대한 높은 친화성을 갖는다(예를 들어, 약 10-7 M 미만, 약 10-8 M 미만, 또는 약 10-9 M 미만의 KD).
개선: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, "개선"은 상태의 예방, 감소 및/또는 완화, 또는 대상체의 상태의 개선을 지칭한다. 개선은 질병, 질환 또는 상태의 완전한 회복 또는 완전한 예방을 포함하지만, 그를 필요로 하지는 않는다.
아미노산: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 그의 가장 넓은 의미에서의 용어 "아미노산"은, 폴리펩티드 사슬 내로 혼입될 수 있는 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 아미노산은 일반 구조식 H2N-C(H)(R)-COOH를 갖는다. 일부 구현예에서, 아미노산은 자연발생 아미노산이다. 일부 구현예에서, 아미노산은 합성 아미노산이다; 일부 구현예에서, 아미노산은 d-아미노산이다; 일부 구현예에서, 아미노산은 l-아미노산이다. "표준 아미노산"은 자연발생 펩티드에서 흔히 발견되는 20개의 표준 l-아미노산 중 임의의 것을 지칭한다. "비표준 아미노산"은, 합성 제조되거나 자연 공급원으로부터 수득되었는지의 여부에 관계없이, 표준 아미노산 외의 임의의 아미노산을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은, "합성 아미노산"은, 염, 아미노산 유도체(예컨대 아미드), 및/또는 치환체를 포함하지만 이로 한정되지는 않는, 화학적으로 변경된 아미노산을 포함한다. 펩티드 내에 카르복시 말단 및/또는 아미노 말단 아미노산을 포함하는 아미노산은, 메틸화, 아미드화, 아세틸화, 보호기 및/또는 펩티드의 활성에 불리한 영향 없이 펩티드의 순환 반감기를 변화시킬 수 있는 다른 화학기로의 치환에 의해 변경될 수 있다. 아미노산은 이황화물 결합에 참여할 수 있다. 아미노산은 하나의 또는 번역 후 변경, 예컨대 하나 이상의 화학 독립체(예를 들어, 메틸 기, 아세테이트 기, 아세틸 기, 포스페이트 기, 포르밀 모이어티, 이소프레노이드 기, 설페이트 기, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 지질 모이어티, 탄수화물 모이어티, 비오틴 모이어티, 등)와의 연결을 포함할 수 있다. 용어 "아미노산"은 "아미노산 잔기"와 상호교환가능하게 사용되며, 자유 아미노산 및/또는 펩티드의 아미노산 잔기를 지칭할 수 있다. 이 용어가 자유 아미노산을 지칭하는지 펩티드의 잔기를 지칭하는지의 여부는 그 용어가 사용된 문맥으로부터 명백할 것이다.
항체: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "항체"는 특정 표적 항원에 대한 특이적 결합을 부여하기에 충분한 정규 면역글로불린 서열 요소를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 당 분야에 알려진 바와 같이, 자연에서 생산된 바와 같은 온전한 항체는 대략 150 kD 4량체 작용 물질로서, 두 개의 동일한 중쇄 폴리펩티드(각각 약 50 kD) 및 두 개의 동일한 경쇄 폴리펩티드(각각 약 25 kD)로 구성되며, 이들은 서로 연결되어 흔히 "Y-형" 구조로 지칭되는 것으로 연결된다. 각각의 중쇄는 적어도 4개의 도메인(각각 약 110개 아미노산 길이)- 아미노-말단 가변(VH) 도메인(Y 구조의 끝단에 위치)에 이어, 3개의 불변 도메인: CH1, CH2, 및 카르복시-말단 CH3(Y의 줄기의 기부에 위치)으로 구성된다. "스위치(switch)"로서 알려진 짧은 영역은 중쇄 가변 및 불변 영역을 연결한다. "힌지(hinge)"는 CH2와 CH3 도메인을 항체의 나머지 부분에 연결한다. 이러한 힌지 영역 내의 두 개의 이황화물 결합은 온전한 항체 내에서 두 개의 중쇄 폴리펩티드를 서로 연결한다. 각각의 경쇄는 두 개의 도메인 -아미노-말단 가변(VL) 도메인에 이어, 카르복시-말단 불변(CL) 도메인으로 구성되며, 이들은 또 다른 "스위치"에 의해 서로 구분된다. 온전한 항체 4량체는 두 개의 중쇄-경쇄 이량체로 구성되며, 여기서 중쇄 및 경쇄는 하나의 이황화물 결합에 의해 서로 결합되고; 두 개의 다른 이황화물 결합은 중쇄 힌지 영역을 서로 연결하여, 이량체가 서로 연결되어 4량체가 형성되도록 한다. 자연에서 생성되는 항체는 또한 전형적으로 CH2 도메인 상에서 글리코실화된다. 자연 항체에서 각각의 도메인은 압착된 역평행 베타 배럴(beta barrel)에서 서로에 대해 밀집된 두 개의 베타 시트(예를 들어, 3-, 4-, 또는 5-가닥 시트)로부터 형성된 "면역글로불린 접힘"에 의해 특징화되는 구조를 갖는다. 각각의 가변 도메인은 "상보성 결정 영역"으로서 알려진 3개의 과가변성 루프(hypervariable loop)(CDR1, CDR2, 및 CDR3) 및 4개의 다소 불변성인 "프레임워크" 영역(FR1, FR2, FR3, 및 FR4)을 함유한다. 자연 항체가 접힌 경우, FR 영역은 도메인에 구조적 프레임워크를 제공하는 베타 시트를 형성하고, 중쇄 및 경쇄 모두로부터의 CDR 루프 영역은 3차원 공간으로 함께 모아져서 이들이 Y 구조물의 끝단에 위치된 단일한 과가변성 항원 결합 부위를 창출하도록 한다. 자연발생 항체의 Fc 영역은 보체계의 요소에 결합하고, 또한 예를 들어 세포독성을 매개하는 이펙터 세포를 포함하는, 이펙터 세포 상에서 수용체에 결합한다. 당 분야에 알려진 바와 같이, Fc 수용체에 대한 Fc 영역의 친화도 및/또는 기타 결합 특성은 글리코실화 또는 기타 변경을 통하여 조절될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시에 따라 생성되고/생성되거나 사용된 항체는 글리코실화된 Fc 도메인을 포함하며, 변경되거나 엔지니어링된 그러한 글리코실화를 갖는 Fc 도메인을 포함한다. 본 개시의 목적을 위하여, 특정 구현예에서, 자연 항체에서 발견되는 바와 같은 충분한 면역글로불린 도메인 서열을 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 복합체는, 그러한 폴리펩티드가 자연적으로 생성되거나(예를 들어, 항원에 반응하여 생물에 의해 생성), 또는 재조합 엔지니어링, 화학 합성, 또는 기타 인공 시스템 또는 방법론에 의해 생성되는지의 여부에 관계없이, "항체"로서 지칭되고/지칭되거나 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 다클론성이고; 일부 구현예에서, 항체는 단일클론성이다. 일부 구현예에서, 항체는 마우스, 토끼, 영장류, 또는 인간 항체의 특징인 불변 영역 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체 서열 요소는 완전히 인간이거나, 당 분야에 알려진 바와 같이, 인간화, 영장류화, 키메라성, 등이다. 나아가, 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "항체"는, 적절한 구현예에서(달리 언급되거나 문맥으로부터 명백하지 않는 한), 항체 구조적 및 기능적 특징을 대안적인 제시로 이용하기 위한 당 분야에서 알려지거나 개발된 임의의 구축물 또는 포맷을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 개시에 따라 사용된 항체는 온전한 IgG, IgE 및 IgM, 2-특이적 또는 다중-특이적 항체(예를 들어, Zybodies®, 등), 단일 사슬 Fv, 폴리펩티드-Fc 융합물, Fab, 카멜리드 항체, 마스킹된 항체(예를 들어, Probodies®), 소형 모듈 면역제제(Small Modular ImmunoPharmaceuticals)("SMIPsTM"), 단일 사슬 또는 탠덤 디아바디(Tandem diabodies)(TandAb®), VHH, Anticalins®, Nanobodies®, 미니바디(minibodies), BiTE®, 안키린 반복 단백질 또는 DARPINs®, Avimers®, DART, TCR-유사 항체, Adnectins®, Affilins®, Trans-bodies®, Affibodies®, TrimerX®, MicroProteins®, Fynomers®, Centyrins®, 및 KALBITOR®로부터 선택된 포맷이지만, 이로 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 항체는 자연적으로 생성된 경우라면 공유결합 변경(예를 들어, 글리칸의 부착)이 없을 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 공유결합 변경(예를 들어, 글리칸의 부착, 페이로드(payload)(예를 들어, 검출가능한 모이어티, 치료 모이어티, 촉매 모이어티, 등), 또는 다른 현수기(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 등))을 함유할 수 있다.
항체 단편: 본원에서 사용되는 "항체 단편"은 온전한 항체의 부분, 예를 들어, 항체의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 트리아바디(triabodies); 테트라바디(tetrabodies); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 예를 들어, 항체 단편은 분리된 단편, "Fv" 단편(중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 구성됨), 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단일쇄 폴리펩티드 분자("scFv 단백질"), 및 과가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 구성된 최소 인지 단위를 포함한다. 많은 구현예에서, 항체 단편은 부모 항체가 결합하는 것과 같이 동일한 항원에 결합하는 부모 항체의 단편의 충분한 서열을 함유한다; 일부 구현예에서, 단편은 부모 항체의 친화성에 필적하는 친화성으로 항원에 결합하고/결합하거나 항원에의 결합에 대하여 부모 항체와 경쟁한다. 항체의 항원 결합 단편의 예는, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, Fv 단편, dsFv 디아바디, dAb 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 영역을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 항체의 항원 결합 단편은 임의의 수단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체의 항원 결합 단편은 온전한 항체의 단편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생산될 수 있고/있거나 부분 항체 서열을 암호화하는 유전자로부터 재조합적으로 생산될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체의 항원 결합 단편은 전체적으로 또는 부분적으로 합성적으로 생산될 수 있다. 항체의 항원 결합 단편은 단일 사슬 항체 단편을 선택적으로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체의 항원 결합 단편은 예를 들어 이황화물 결합에 의해 함께 결합되는 다중 사슬을 포함할 수 있다. 항체의 항원 결합 단편은 다중분자 복합체를 선택적으로 포함할 수 있다. 기능성 항체 단편은 전형적으로 적어도 약 50개의 아미노산을 포함하고, 더욱 전형적으로는 적어도 약 200개의 아미노산을 포함한다.
항원: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "항원"은 면역 반응을 끌어내는 작용 물질; 및/또는 T 세포 수용체에 결합하는 작용 물질(예를 들어, MHC 분자에 의해 제시된 경우) 또는 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. 일부 구현예에서, 항원은 체액성 반응을 끌어내고(예를 들어, 항원 특이적 항체의 생산을 포함); 일부 구현예에서, 항원은 세포성 반응을 끌어낸다(예를 들어, 그의 수용체가 항원과 특이적으로 상호작용하는 T-세포를 포함). 일부 구현예에서, 항원은 항체에 결합하고, 생물에서 특정 생리학적 반응을 유도할 수 있거나 유도할 수 없다. 일반적으로, 항원은 예를 들어 소분자, 핵산, 폴리펩티드, 탄수화물, 지질, 중합체(일부 구현예에서 생물학적 중합체 외(예를 들어, 핵산 또는 아미노산 중합체 외)) 등과 같은 임의의 화학적 독립체일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 폴리펩티드이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 글리칸이거나 이를 포함할 수 있다. 당업자는 일반적으로, 항원이 분리된 또는 순수한 형태로 제공될 수 있거나, 대안적으로 조생의 형태(예를 들어, 예를 들어 세포 추출물과 같은 추출물 내에 또는 항원-함유 공급원의 비교적 조생의 다른 제제에서 다른 물질과 함께)로 제공될 수 있거나, 대안적으로 세포 상 또는 세포 내에 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 항원은 재조합 항원이다.
대략 또는 약: 관심 대상의 하나 이상의 값에 적용된 바와 같은, 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "대략" 또는 "약"은 언급된 기준 값에 유사한 값을 지칭한다. 특정 구현예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은, 달리 언급되거나 문맥으로부터 명백하지 않은 한, 언급된 기준 값의 어느 한 방향(초과 또는 미만)으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 이하 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다(그러한 수가 가능한 값의 100%를 초과할 수 있는 경우 제외).
결합: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "결합"은 둘 이상의 독립체간의 비공유결합적 연결을 전형적으로 지칭하는 것으로 이해되어야 할 것이다. "직접" 결합은 독립체 또는 모이어티 사이의 물리적 접촉을 포함하며; 간접 결합은 하나 이상의 중간 독립체와 물리적 접촉을 통한 물리적 상호작용을 포함한다. 둘 이상의 독립체 사이의 결합은 임의의 다양한 문맥에서 전형적으로 평가될 수 있으며 - 이는 상호작용하는 독립체 또는 모이어티가 단독으로 또는 더욱 복잡한 시스템(예를 들어, 공유결합적으로 또는 다르게는 담체 독립체와 및/또는 생물학적 계 또는 세포 내에 연결된 채로)의 맥락에서 연구되는 경우를 포함한다.
암: 용어 "암", "악성종양", "신생물", "종양", 및 "암종"은 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며, 비교적 비정상의, 제어되지 않는, 그리고/또는 자율적인 성장을 나타내어, 세포 증식 제어를 현저하게 상실하는 것으로 특징화되는 일탈적인 성장 표현형을 나타내도록 하는 세포를 지칭한다. 일반적으로 본 출원에서의 검출 및 치료를 위한 관심 대상의 세포는 전암성(예를 들어, 양성), 악성, 전-전이성, 전이성 및 비-전이성 세포를 포함한다. 본 개시의 교시는 임의의 암 및 모든 암과 관련될 수 있다. 소수의 비제한적인 예를 제공하기 위하여, 일부 구현예에서, 본 개시의 교시는 예를 들어, 백혈병, 림프종(호지킨성 및 비-호지킨성), 골수성 백혈병, 골수종 및 골수증식성 질환을 포함하는 조혈세포성 암; 육종, 흑색종, 선종, 고형 조직의 암종, 입, 인후, 후두, 및 폐의 편평상피 세포 암종, 간암, 비뇨생식기 암 예컨대 전립선, 자궁경부, 방광, 자궁, 및 자궁내막 암 및 신장 세포 암종, 골 암, 췌장 암, 피부 암, 피부 또는 안내(intraocular) 흑색종, 내분비계 암, 갑상선 암, 부갑상선 암, 두경부 암, 유방암, 위장관 암 및 신경계 암, 유두종과 같은 양성 병변 등과 같은 하나 이상의 암에 적용된다.
병용 요법: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "병용 요법"은 대상체가 둘 이상의 치료 방식(예를 들어, 둘 이상의 치료제)에 동시에 노출된 상황을 지칭한다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 작용제는 동시에 투여될 수 있고; 일부 구현예에서, 그러한 작용제는 순차적으로 투여될 수 있고; 일부 구현예에서, 그러한 작용제는 중복되는 투여 방식으로 투여된다.
도메인: 용어 "도메인"은 본 명세서에서 독립체의 구역 또는 일부를 지칭하는 것으로 사용된다. 일부 구현예에서, "도메인"은 독립체의 특정 구조적 특징 및/또는 기능적 특징과 연관되어, 도메인이 그의 부모 독립체의 나머지 부분으로부터 물리적으로 분리된 경우, 그 특정 구조적 특징 및/또는 기능적 특징을 실질적으로 또는 완전히 보유하도록 한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 도메인은 그(부모) 독립체로부터 분리되고 상이한(수령체) 독립체와 결합되는 경우, 부모 독립체에서 그를 특징화한 구조적 특징 및/또는 기능적 특징의 하나 이상을 수령체 독립체 상에서 실질적으로 보유 및/또는 부여하는, 독립체의 일부일 수 있거나 또는 그를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 도메인은 분자(예를 들어, 소분자, 탄수화물, 지질, 핵산 또는 폴리펩티드)의 구역 또는 일부이다. 일부 구현예에서, 도메인은 폴리펩티드의 구역이며; 그러한 일부 구현예에서, 도메인은 특정 구조적 요소(예를 들어, 특정 아미노산 서열 또는 서열 모티프, α-나선 특징, β-시트 특징, 코일링된-코일 특징, 랜덤 코일 특징, 등) 및/또는 특정 기능적 특징(예를 들어, 결합 활성, 효소 활성, 접힘 활성, 신호 활성, 등)에 의해 특징화된다.
투여 형태: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "투여 형태" 및 "단위 투여 형태"는 치료될 환자에 대한 치료제의 물리적으로 분리된 단위를 지칭한다. 각각의 단위는, 바람직한 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 물질의 예정된 양을 함유한다. 그러나, 조성물의 총 투여량은 건전한 의학적 판단의 범주 내에서 담당의에 의해 결정될 것이다.
투여 방식: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "투여 방식"은, 대상체에게, 전형적으로 시기에 의해 구분되는, 개별적으로 투여되는 단위 용량의 세트(전형적으로 일회 초과)를 지칭한다. 일부 구현예에서, 소정의 치료제는 권장된 투여 방식을 가지며, 이는 하나 이상의 용량을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 투여 방식은 동일한 기간에 의해 서로 분리되는 각각의 복수의 용량을 포함하며; 일부 구현예에서, 투여 방식은 복수의 용량들 및 개별적인 용량을 분리하는 둘 이상의 상이한 기간을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여 방식 내에서 모든 용량은 동일한 단위 용량 양이다. 일부 구현예에서, 투여 방식 내에서 상이한 용량은 상이한 양이다. 일부 구현예에서, 투여 방식은 제1 용량 양의 제1 용량에 이어, 제1 용량 양과 상이한 제2 용량 양으로 하나 이상의 추가의 용량을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여 방식은 제1 용량 양의 제1 용량에 이어, 제1 용량 양과 동일한 제2 용량 양의 하나 이상의 추가의 용량을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여 방식은 관련 개체군에 걸쳐 투여되는 경우 원하는 또는 유리한 결과와 관련된다(즉, 이는 치료적 투여 방식임).
발현: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 핵산 서열의 "발현"은 하기 경우 중 하나 이상을 지칭한다: (1) DNA 서열로부터 RNA 주형의 생산(예를 들어, 전사에 의해); (2) RNA 전사물의 가공(예를 들어, 스플라이싱, 편집, 5' 캡 형성, 및/또는 3' 말단 형성에 의해); (3) RNA의 폴리펩티드 또는 단백질로의 번역; 및/또는 (4) 폴리펩티드 또는 단백질의 번역후 변경.
융합 단백질: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "융합 단백질"은, 둘 이상의 절편을 포함하고, 이들 각각은 (1) 자연에서 발생하는 및/또는 (2) 폴리펩티드의 기능성 도메인을 나타내는 펩티드 모이어티에 대해, 고도의 아미노산 동일성을 나타내는 폴리펩티드를 일반적으로 지칭한다. 전형적으로, 둘 이상의 그러한 단편을 함유하는 폴리펩티드는, 그 두 절편이 (1) 자연적으로 동일한 펩티드 내에 포함되지 않고/않거나, (2) 단일한 폴리펩티드에서 서로 미리 결합되지 않고/않거나, (3) 사람의 수작업을 통해 서로 결합된 모이어티인 경우, 융합 단백질로 여겨진다.
유전자: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "유전자"는 당 분야에서 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 용어 "유전자"는 유전자 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 증진제, 등) 및/또는 인트론 서열을 포함할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 유전자의 정의는 단백질을 암호화하기보다는 tRNA, RNAi-유도제, 등과 같은 기능성 RNA 분자를 암호화하는 핵산에 대한 지칭을 포함한다는 것이 추가로 이해될 것이다. 명료성을 위해, 본 발명자들은 본 출원에 사용된 바와 같은, 용어 "유전자"가 단백질을 암호화하는 핵산의 일부를 일반적으로 지칭하고; 당업자에게는 맥락으로부터 명백한 것과 같이, 이 용어는 조절 서열을 선택적으로 포함할 수 있음에 유의한다. 이러한 정의는 "유전자"라는 용어를 비-단백질-코딩 발현 단위에의 적용을 배제하는 것으로 의도되지는 않지만, 이러한 문헌에 사용된 바와 같은 용어는 대부분의 경우에, 단백질-코딩 핵산을 지칭함을 명확하게 하고자 하는 것이다.
유전자 산물 또는 발현 산물: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "유전자 산물" 또는 "발현 산물"은 유전자(가공 전 및/또는 가공 후)로부터 전사된 RNA 또는 유전자로부터 전사된 RNA에 의해 암호화된 폴리펩티드(변경 전 및/또는 변경 후)를 일반적으로 지칭한다.
동일성: 본원에서 사용되는 용어 "동일성"은 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이 및/또는 폴리펩티드 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 일부 구현예에서, 핵산 또는 폴리펩티드는 이의 서열이 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경우 서로 "실질적으로 동일"한 것으로 간주된다. 예를 들어, 2개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 동일성 백분율의 계산은 최적 비교 목적을 위해 2개의 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다(예를 들어, 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있고, 비교 목적을 위해 동일하지 않은 서열은 무시될 수 있다). 특정 구현예에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 실질적으로 100%이다. 이후, 상응하는 위치의 뉴클레오티드가 비교된다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 잔기(예를 들어, 뉴클레오티드 또는 아미노산)에 의해 점유되는 경우, 분자는 상기 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 동일성 백분율은 2개 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 2개의 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 백분율 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 백분율은 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 마이어스 및 밀러(Meyers and Miller)(1989)의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 예시적 구현예에서, ALIGN 프로그램으로 이루어진 핵산 서열 비교는 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용한다. 대안적으로, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 백분율은 NWSgapdna.CMP 매트릭스를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다.
면역글로불린 단일 가변 도메인: 본원에서 사용되는 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인" 또는 "단일 가변 도메인"은 추가 가변 면역글로불린 도메인과 쌍을 이루지 않고 항원의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 가변 도메인을 의미한다. 본 발명의 의미에서 면역글로불린 단일 가변 도메인의 한 예는 면역글로불린 단일 가변 도메인 VH 및 VL(VH 도메인 및 VL 도메인)과 같은 "도메인 항체"이다. 면역글로불린 단일 가변 도메인의 또 다른 예는 본원에 기재된 바와 같은 카멜리드로부터의 "VHH 도메인"(또는 간단히 "VHH")이다.
면역글로불린 가변 도메인: 본원에서 사용되는 용어 "면역글로불린 가변 도메인" 또는 "가변 도메인"은 4개의 "프레임워크 영역"(당 분야 및 본원에서 "프레임워크 영역 1" 또는 "FR1"; "프레임워크 영역 2" 또는 "FR2"; "프레임워크 영역 3" 또는 "FR3"; 및 "프레임워크 영역 4" 또는 "FR4"로 각각 언급됨)이거나 이를 포함하는 면역글로불린 도메인을 의미하며; 상기 프레임워크 영역은 3개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"(당 분야 및 본원에서 "상보성 결정 영역 1" 또는 "CDR1"; "상보성 결정 영역 2" 또는 "CDR2"; 및 "상보성 결정 영역 3" 또는 "CDR3"로 각각 언급됨)에 의해 중단된다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 가변 도메인의 일반 구조 또는 서열은 다음과 같이 나타낼 수 있다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
개선하다, 증가하다 또는 감소하다: 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "개선하다", "증가하다" 또는 "감소하다", 또는 문법적 균등물은, 기선 측정, 예컨대 본 명세서에서 설명된 치료의 개시 전에 동일한 개인에서의 측정, 또는 본 명세서에서 설명된 치료의 부재 하에서 대조군 개인(또는 다수의 대조군 개인들)에서의 측정에 대해 상대적인 값을 표시한다.
개인, 대상체, 환자: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "대상체", "개인" 또는 "환자"는 인간 또는 비-인간 포유동물 대상체를 지칭한다. 치료되는 개인("환자" 또는 "대상체"로서도 지칭됨)은 질병, 예를 들어 암으로 고통받고 있는 개인(태아, 유아, 아동, 청소년 또는 성인)이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
K a : 본원에서 사용되는 "Ka"는 항원 결합 모이어티/항원 표적 복합체를 형성하기 위한 특정 항원 결합 모이어티 및 항원 표적의 회합 속도를 지칭한다.
K d : 본원에서 사용되는 "Kd"는 특정 항원 결합 모이어티/항원 표적 복합체의 해리 속도를 지칭한다.
K D : 본원에서 사용되는 "KD"는 해리 상수를 지칭하며, 이는 Kd 대 Ka의 비(즉, Kd/Ka)로부터 획득되고, 몰 농도(M)로 표현된다. KD 값은 당 분야에 잘 확립된 방법, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명을 이용하거나, Biacore® 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 이용하여 결정될 수 있다.
링커: 본원에서 사용되는 용어 "링커"는, 예를 들어, 융합 단백질에서, 자연 단백질의 특정 위치에 나타나는 것 이외의 적절한 길이의 아미노산 서열을 지칭하며, 이는 일반적으로 가요성이 되고/되거나, 2개의 단백질 모이어티 사이에 a-헬릭스와 같은 구조를 개재하도록 설계된다. 일반적으로, 링커는 융합 단백질의 2개 이상의 도메인이 도메인 각각의 생물학적 활성의 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상을 보유하는 것을 가능하게 한다. 링커는 또한 스페이서로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 링커는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 이상의 아미노산 길이이다. 당 분야에 공지된 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)를 조작하는 경우에 적절하게 사용될 수 있는 다양한 상이한 링커 요소(예를 들어, 문헌[Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123)] 참조).
핵산: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, "핵산"은 그의 가장 넓은 의미에서, 올리고뉴클레오티드 사슬 내로 포함되거나 포함될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 핵산은 인산이에스테르 결합을 통해 올리고뉴클레오티드 사슬 내로 포함되거나 포함될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 문맥으로부터 명백한 것과 같이, 일부 구현예에서, "핵산"은 개별적인 핵산 잔기(예를 들어, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭하고; 일부 구현예에서, "핵산"은 개별적인 핵산 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 사슬을 지칭한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 RNA거나 또는 그를 포함한다; 일부 구현예에서, "핵산"은 DNA 거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 자연 핵산 잔기 이거나, 그를 포함하거나, 그로 이루어진다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 핵산 유사체이거나, 그를 포함하거나, 그로 이루어진다. 일부 구현예에서, 핵산 유사체는, 인산이에스테르 골격을 이용하지 않는다는 점에서 핵산과 상이하다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 핵산은, 당 분야에 알려져 있으며, 골격 내에 인산이에스테르 결합 대신 펩티드 결합을 갖는, 하나 이상의 "펩티드 핵산"이거나, 그를 포함하거나, 그로 이루어지며, 이는 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 여겨진다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, 핵산은 인산이에스테르 결합보다는 하나 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 5'-N-포스포아미다이트 결합을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 자연 뉴클레오시드(예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 유리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시 구아노신 및 데옥시시티딘)이거나, 그를 포함하거나 그로 이루어진다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-유리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모유리딘, C5-플루오로유리딘, C5-요오도유리딘, C5-프로피닐-유리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, 0(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 메틸화 염기, 개재된(intercalated) 염기, 및 이들의 조합)이거나, 그를 포함하거나 그로 이루어진다. 일부 구현예에서, 핵산은 자연 핵산에서의 당류에 비교하여 하나 이상의 변경된 당류(예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스, 및 헥소스)를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 RNA 또는 단백질과 같은 기능성 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 자연 공급원으로부터의 하나 이상의 분리, 상보적 주형(생체 내 또는 시험관 내)에 기초한 중합에 의한 효소적 합성, 재조합 세포 또는 계 내에서의 복제, 및 화학적 합성에 의해 제조된다. 일부 구현예에서, 핵산은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 이상 길이의 잔기이다. 일부 구현예에서, 핵산은 단일 가닥이다; 일부 구현예에서, 핵산은 이중 가닥이다. 일부 구현예에서, 핵산은 폴리펩티드를 암호화하는 적어도 하나의 요소를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖거나, 폴리펩티드를 암호화하는 서열의 상보체이다. 일부 구현예에서, 핵산은 효소 활성을 갖는다.
작동적으로 결합된: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, "작동적으로 결합된"은, 기재된 성분들이 그들이 그의 의도된 방식으로 기능할 수 있게 하는 관계로 존재하는 병렬 배치를 지칭한다. 코딩 서열에 "작동적으로 결합된" 제어 서열은 코딩 서열의 발현이 제어 서열과 양립가능한 조건 하에서 달성되도록 하는 방식으로 결찰된다. "작동적으로 결합된" 서열은 관심 대상의 유전자(들)과 인접한 발현 제어 서열 및 관심 대상의 유전자(들)을 제어하기 위하여 반대쪽에서(in trans) 또는 멀리에서 작용하는 발현 제어 서열 모두를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "발현 제어 서열"은 그들이 결찰되는 코딩 서열의 발현 및 가공을 달성하는 데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 발현 제어 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호와 같은 효율적인 RNA 가공 신호; 세포질성 mRNA를 안정화하는 서열; 번역 효율을 증진시키는 서열(즉, 코작(Kozak) 공통 서열); 단백질 안정성을 증진시키는 서열; 및 바람직한 경우, 단백질 분비를 증진시키는 서열을 포함한다. 그러한 제어 서열의 성질은 숙주 생물에 따라 달라진다. 예를 들어, 원핵 생물에서, 그러한 제어 서열은 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 일반적으로 포함하는 한편, 진핵 생물에서는 전형적으로 그러한 제어 서열이 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "제어 서열"은 그 존재가 발현 및 가공에 필수적인 성분을 포함하는 것으로 의도되며, 이는 또한 그의 존재가 유리한 추가의 성분, 예를 들어 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
펩티드: 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "펩티드"는 전형적으로 비교적 짧은, 예를 들어 약 100개 미만의 아미노산, 약 50개 미만의 아미노산, 20개 미만의 아미노산, 또는 10개 미만의 아미노산의 길이를 갖는 펩티드를 지칭한다.
약학적으로 허용 가능한: 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 건전한 의학적 판단의 범주 내에서, 적절한 이익/위험 비에 상응하여, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 기타 문제 또는 합병증 없이, 인간 및 동물의 조직과 접촉 사용되기 적합한 물질을 지칭한다.
폴리펩티드: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, "폴리펩티드"는 일반적으로 말하면, 펩티드 결합에 의해 서로 부착된 둘 이상의 일련의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 적어도 3 내지 5개의 아미노산을 포함할 수 있으며, 이들 각각은 적어도 하나의 펩티드 결합을 통하여 다른 것들에 부착된다. 당업자는 폴리펩티드가 때때로 "비-자연" 아미노산 또는 그렇지 않으면 선택적으로 폴리펩티드 사슬 내로 통합될 수 있는 다른 독립체를 포함함을 이해할 것이다.
프로모터: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, "프로모터"는 세포의 합성 기구, 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는, 폴리뉴클레오티드 서열의 특이적 전사를 개시하는 데 요구되는 DNA 서열이다. "항시성" 프로모터는, 유전자 산물을 암호화하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 결합된 경우, 유전자 산물이 세포의 대부분의 또는 모든 생리학적 조건 하에서 세포 내에서 생산되도록 유발하는 뉴클레오티드 서열이다. "유도성" 프로모터는, 유전자 산물을 암호화하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 결합된 경우, 유전자 산물이, 프로모터-특이적 유도제가 세포 내에 존재하는 경우에만 실질적으로 세포 내에서 생산되도록 유발하는 뉴클레오티드 서열이다.
단백질: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "단백질"은 폴리펩티드(즉, 펩티드 결합에 의해 서로 결합된 적어도 둘 이상의 일련의 아미노산)를 지칭한다. 단백질은 아미노산 외의 모이어티(예를 들어, 당단백질, 프로테오글리칸, 등일 수 있음)를 포함할 수 있고/있거나, 다르게는 가공되거나 변경될 수 있다. 당업자는 "단백질"이 세포에 의해 생산된 바와 같이 완전한 폴리펩티드 사슬(신호 서열과 함께 또는 신호 서열 없이)일 수 있거나, 또는 그의 일부일 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는 단백질이 예를 들어 하나 이상의 이황화물 결합에 의해 결합되거나 다른 수단에 의해 연결된 하나 초과의 폴리펩티드 사슬을 종종 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 폴리펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 이들 모두를 함유할 수 있으며, 당 분야에서 알려진 임의의 각종 아미노산 변경 또는 유사체를 함유할 수 있다. 유용한 변경은 예를 들어, 말단 아세틸화, 아미드화, 메틸화, 등이 포함된다. 일부 구현예에서, 단백질은 자연 아미노산, 비-자연 아미노산, 합성 아미노산, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
참조: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, "참조"는 그에 대한 비교가 수행된 기준 또는 대조군을 설명한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 관심 대상의 작용 물질, 동물, 개인, 개체군, 샘플, 서열 또는 값은 참조 또는 대조군 작용 물질, 동물, 개인, 개체군, 샘플, 서열 또는 값에 비교된다. 일부 구현예에서, 참조 또는 대조군은 관심 대상의 시험 또는 결정과 실질적으로 동시에 시험되고/시험되거나 결정된다. 일부 구현예에서, 참조 또는 대조군은 역사적인 참조 또는 대조군으로, 선택적으로 유형 매체에서 구현된다. 전형적으로, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 참조 또는 대조군은 평가 하에 있는 것들에 필적하는 조건 또는 환경 하에서 결정되거나 특징화된다. 당업자는 특정의 가능한 참조 또는 대조군에 대한 의존성 및/또는 비교를 정당화하기에 충분한 유사성이 존재하는 경우 인정할 것이다.
선택적 결합: 본원에서 사용되는 "선택적 결합", "선택적으로 결합하는", "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 항원 결합 모이어티 및 항원 표적과 관련하여 항원 표적이 아닌 독립체는 아닌 항원 표적에 대한 항원 결합 모이어티의 우선적 회합을 지칭한다. 항원 결합 모이어티와 비-표적 사이에 특정한 정도의 비특이적 결합이 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티와 항원 표적 사이의 결합이 항원 결합 모이어티와 비-표적의 결합과 비교하여 2배 초과, 5배 초과, 10배 초과 또는 100배 초과인 경우 항원 결합 모이어티는 항원 표적에 선택적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 결합 친화성이 약 10-5 M 미만, 약 10-6 M 미만, 약 10-7 M 미만, 약 10-8 M 미만, 또는 약 10-9 M 미만인 경우 항원 결합 모이어티는 항원 표적에 선택적으로 결합한다.
대상체: "대상체"는 포유동물을 의미한다(예를 들어, 인간, 일부 구현예에서는 태아도 포함). 일부 구현예에서, 대상체는 관련 질병, 질환 또는 상태로 고통받고 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 질병, 질환 또는 상태에 걸리기 쉽다. 일부 구현예에서, 대상체는 질병, 질환 또는 상태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 나타낸다. 일부 구현예에서, 대상체는 질병, 질환 또는 상태의 어떤 증상 또는 특징도 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 대상체는 질병, 질환 또는 상태에 대한 감수성 또는 위험성을 특징으로 하는 하나 이상의 특징을 갖는 사람이다. 일부 구현예에서, 대상체는 환자이다. 일부 구현예에서, 대상체는 진단 및/또는 치료가 투여되고/투여되거나 투여되어 왔던 개인이다.
고통받는: 질병, 질환, 또는 상태(예를 들어, 암)로 "고통받는" 개인은 질병, 질환 또는 상태의 하나 이상의 증상을 나타내고/나타내거나 진단받았다.
증상이 감소된다: 본 발명에 따라, "증상이 감소된다"는, 특정 질병, 질환 또는 상태 중 하나 이상의 증상이 크기(예를 들어, 강도, 심각도, 등) 또는 빈도에서 감소된 경우이다. 명확성을 위해, 특정 증상의 발병에서의 지연은 그 증상의 빈도의 감소의 한 형태로 여겨진다. 본 발명은 증상이 제거된 경우에만 한정되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명은 특히 하나 이상의 증상이 완전히 제거되지 않더라도, 감소되도록 하는 치료(및 대상체의 상태가 그에 따라 "개선된다")를 고려한다.
치료제: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 어구 "치료제"는 생물에 투여되었을 때 원하는 약학적 효과를 끌어내는 임의의 작용 물질을 일반적으로 지칭한다. 일부 구현예에서, 작용 물질은, 그것이 적절한 개체군에 걸쳐 통계적으로 유의한 효과를 나타낸 경우, 치료제로 여겨진다. 일부 구현예에서, 적절한 개체군은 모델 생물의 개체군일 수 있다. 일부 구현예에서, 적절한 개체군은 특정 연령군, 성별, 유전학적 배경, 기존의 임상적 상태, 등과 같은 각종 기준에 의해 정의될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료제는 질병, 질환 및/또는 상태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 완화하고/하거나, 개선하고/하거나, 경감시키고/시키거나, 억제하고/하거나, 예방하고/하거나, 그의 발병을 지연시키고/시키거나, 그의 심각도를 감소시키고/시키거나, 그의 발생률을 감소시키는 데 사용될 수 있는 물질이다. 일부 구현예에서, "치료제"는 인간에 투여하기 위해 시판될 수 있기 전에 정부 관계 기관에 의해 승인받았거나 승인이 필요한 작용 물질이다. 일부 구현예에서, "치료제"는 인간에 투여하기 위해 처방전이 필요한 작용 물질이다. 일부 구현예에서, 치료제는 본원에 기재된 세포 치료제(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 유도성 발현 작제물에 의해 인코딩된 항원 결합 수용체를 포함하거나 이로 구성되는 면역 세포)이다.
치료 유효량: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "치료 유효량"은 치료 투여 방식에 따라 질병, 질환 및/또는 상태로 고통받거나 그에 걸리기 쉬운 개체군에게 투여된 경우, 질병, 질환, 및/또는 상태를 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 일부 구현예에서, 치료 유효량은 질병, 질환, 및/또는 상태의 하나 이상의 증상의 발생률 및/또는 심각도를 감소시키고, 그의 하나 이상의 특징을 안정화하고/안정화하거나, 그의 발병을 지연시키는 양이다. 당업자는, "치료 유효량"이라는 용어가 특정 개인에서 성공적인 치료가 달성되는 것을 사실상 요구하지는 않음을 이해할 것이다. 그보다는, 치료 유효량은 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여된 경우 상당수의 대상체에서 특정의 원하는 약학적 반응을 제공하는 양일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, "치료 유효량"은 본 발명의 치료의 맥락에서 그를 필요로 하는 개인에게 투여된 경우, 상기 개인에서 나타나는 암-지지 과정을 차단, 안정화, 약화 또는 역전시키거나, 상기 개인에서 암-저해 과정을 증진 또는 증가시킬 양을 지칭한다. 암 치료의 맥락에서, "치료 유효량"은 암을 진단받은 개인에게 투여된 경우, 그 개인에서 암이 추가로 발달하는 것을 방지하거나, 안정화하거나, 억제하거나 감소시킬 양이다. 본 명세서에 기재된 조성물의 특히 바람직한 "치료 유효량"은 악성 종양의 발달을 역전하거나(치료 처리에서), 악성 종양의 차도를 달성하거나 연장하는 것을 돕는다. 개인에서 암을 치료하기 위해 그 개인에게 투여된 치료 유효량은, 전이의 차도를 촉진하거나 전이를 억제하도록 투여된 치료 유효량과 동일하거나 상이할 수 있다. 대부분의 암 치료에서와 같이, 본 명세서에 기재된 치료 방법은 암에 대한 "치유"로서 해석되거나, 치유로 제한되거나 다르게는 치유로 한정되지 않으며; 그보다는 치료 방법은 암을 "치료"하기 위한, 즉 암을 가진 개인의 건강에 바람직하거나 유리한 변화를 일으키기 위한 기재된 조성물의 이용에 관한 것이다. 그러한 이익은 종양학 분야에서 숙련된 의료인에 의해 인지되며, 환자 상태의 안정화, 종양 크기에서의 감소(종양 퇴행), 생활 기능에서의 개선(예를 들어, 암성 조직 또는 기관의 개선된 기능), 추가 전이의 감소 또는 억제, 기회 감염의 감소, 증가된 생존성, 통증의 감소, 개선된 운동 기능, 개선된 인지 기능, 개선된 에너지의 느낌(활력, 감소된 불쾌감), 개선된 웰빙의 느낌, 정상적인 입맛의 회복, 건강한 체중 증가의 회복, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 추가적으로, 개인에서 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 치료의 결과로서) 특정 종양의 퇴행은, 췌장 선암종과 같은 종양의 부위로부터 (예를 들어 치료 과정에 걸쳐서) 암 세포의 샘플을 취함으로써, 그리고 암세포가 덜 악성인 표현형으로 퇴행하는 것을 분자적 수준에서 입증하기 위하여 암세포의 상태를 모니터하기 위한 대사 마커 및 신호 마커의 수준에 대해 암세포를 시험함으로써 또한 평가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 이용하여 유도된 종양 퇴행은 하나 이상의 혈관형성촉진(pro-angiogenic) 마커에서의 감소, 항-혈관형성 마커에서의 증가, 대사 경로의 정상화(즉, 암으로 고통받고 있지 않은 정상의 개인에서 발견되는 상태로의 변화), 세포간 신호 경로, 또는 암으로 진단받은 개인에서 비정상 활성을 나타내는 세포내 신호 경로를 확인함으로써 나타낼 수 있다. 당업자는 일부 구현예에서, 치료 유효량은 단일 용량으로 조제되고/조제되거나 투여될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 치료 유효량은 예를 들어, 투여 방식의 일부로서 복수의 용량으로 조제되고/조제되거나 투여될 수 있다.
형질도입: 본원에서 사용되는 "형질도입"은 바이러스 벡터에 의해 핵산이 세포에 도입되는 과정이다. 일부 구현예에서, 형질도입은 세포 치료제의 생성을 위해 핵산 서열의 림프구로의 바이러스 벡터 매개 도입을 기재한다.
형질전환: 본원에서 사용되는 "형질전환"은 외인성 DNA가 숙주 세포 내로 도입되는 임의의 과정을 지칭한다. 형질전환은 당 분야에 널리 공지된 다양한 방법을 이용하여 자연 또는 인공 조건하에서 발생할 수 있다. 형질전환은 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포 내로 외래 핵산 서열의 삽입을 위한 임의의 공지된 방법에 의존할 수 있다. 일부 구현예에서, 특정 형질전환 방법론은 형질전환되는 숙주 세포에 기초하여 선택되며, 이는 바이러스 감염, 전기천공, 메이팅(mating), 리포펙션을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바이러스 벡터 매개 형질전환은 "형질도입"으로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, "형질전환된" 세포는 삽입된 DNA가 자율 복제 플라스미드 또는 숙주 염색체의 일부로서 복제할 수 있다는 점에서 안정적으로 형질전환된다. 일부 구현예에서, 형질전환된 세포는 제한된 기간 동안 도입된 핵산을 일시적으로 발현한다.
치료: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "치료"(또한 "치료하다" 또는 "치료하는")는 특정 질병, 질환 및/또는 상태(예를 들어, 암)의 하나 이상의 증상, 특징, 및/또는 원인을, 부분적으로 또는 완전히 완화하고/하거나, 개선하고/하거나, 경감하고/하거나, 억제하고/하거나, 그의 발병을 지연시키고/시키거나, 그의 심각성을 감소시키고/시키거나, 그의 발생률을 감소시키는 물질을 임의로 투여하는 것을 지칭한다. 그러한 치료는 관련 질병, 질환 및/또는 상태의 징후를 나타내지 않는 대상체, 및/또는 질병, 질환, 및/또는 상태의 초기 징후만을 나타내는 대상체에서일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 그러한 치료는 관련 질병, 질환 및/또는 상태의 하나 이상의 수립된 징후를 나타내는 대상체에서일 수 있다. 일부 구현예에서, 관련 질병, 질환 및/또는 상태를 앓는 것으로 진단된 대상체에서일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 관련 질병, 질환 및/또는 상태의 발생 증가 위험과 통계적으로 상관된 하나 이상의 감수성 인자를 갖는 것으로 알려진 대상체에서일 수 있다.
종양 침윤 림프구: 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어, "종양-침윤 림프구"는 혈류에 남아서 종양으로 되는, 암(예컨대 흑색종)으로 고통받는 대상체의 백혈구 세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 종양 침윤 림프구는 종양 특이성을 갖는다.
변이체: 본원에서 사용되는 용어 "변이체"는 참조 독립체와 비교하여 하나 이상의 화학 모이어티의 존재 또는 수준에서 참조 독립체와 유의한 구조적 동일성을 나타내지만 참조 독립체와 구조적으로 상이한 독립체를 지칭한다. 용어 "변이체" 및 "돌연변이체"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 많은 구현예에서, 변이체는 또한 이의 참조 독립체와 기능적으로 상이하다. 일반적으로, 특정 독립체가 참조 독립체의 "변이체"인 것으로 적절하게 고려되는지의 여부는 참존 독립체와의 구조적 동일성의 정도에 기초한다. 당업자에 의해 인지될 바와 같이, 임의의 생물학적 또는 화학적 참조 독립체는 특정한 특징적인 구조적 요소를 갖는다. 정의에 따르면, 변이체는 하나 이상의 상기 특징적 구조적 요소를 공유하는 별개의 화학적 독립체이다. 폴리펩티드는 선형 또는 3차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖고/갖거나 특정 생물학적 기능에 기여하는 복수의 아미노산으로 구성된 특징적인 서열 요소를 가질 수 있다. 예를 들어, 변이체 폴리펩티드는 아미노산 서열에서의 하나 이상의 차이 및/또는 폴리펩티드 백본에 공유적으로 부착된 화학 모이어티(예를 들어, 탄수화물, 지질 등)에서의 하나 이상의 차이의 결과로서 참조 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체 폴리펩티드는 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 99%인 참조 폴리펩티드와의 전체 서열 동일성을 나타낸다. 대안적으로 또는 추가로, 일부 구현예에서, 변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드와 적어도 하나의 특징적인 서열 요소를 공유하지 않는다. 일부 구현예에서, 참조 폴리펩티드는 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드의 생물학적 활성 중 하나 이상을 공유한다. 일부 구현예에서, 변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드의 생물학적 활성 중 하나 이상이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 생물학적 활성의 감소되거나 증가된 수준을 나타낸다. 많은 구현예에서, 폴리펩티드가 부모의 것과 동일한 아미노산을 갖지만 특정 위치에서 적은 수의 서열 변경을 갖는 경우에 폴리펩티드는 부모 또는 참조 폴리펩티드의 "변이체"인 것으로 간주된다. 전형적으로, 변이체에서 잔기의 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만이 부모와 비교하여 치환된다. 일부 구현예에서, 변이체는 모와 비교하여 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 치환된 잔기를 갖는다. 종종, 변이체는 매우 적은 수(예를 들어, 5, 4, 3, 2 또는 1개 미만)의 치환된 기능성 잔기(즉, 특정 생물학적 활성에 참여하는 잔기)를 갖는다. 더욱이, 변이체는 전형적으로 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 첨가 또는 결실을 가지며, 종종 부모와 비교하여 첨가 또는 결실을 갖지 않는다. 또한, 임의의 첨가 또는 결실은 전형적으로 약 25, 약 20, 약 19, 약 18, 약 17, 약 16, 약 15, 약 14, 약 13, 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6개 미만이며, 일반적으로 약 5, 약 4, 약 3 또는 약 2개 미만의 잔기이다. 일부 구현예에서, 부모 또는 참조 폴리펩티드는 자연에서 발견된 것이다.
벡터: 본 명세서에서 사용된 바와 같은, "벡터"는 그에 연결되는 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 벡터는 이들이 진핵 세포 및/또는 원핵 세포와 같은 숙주 세포 내에서 결합되는 핵산의 발현 및/또는 염색체외 복제를 할 수 있다. 작동적으로 결합된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
상세한 설명
무엇보다도, 본 발명의 개시는 CD19 변이체를 확인하는 방법, 및 이러한 CD19 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다. 스캐폴드 기반 결합 단백질은, 예를 들어, 항체와 유사한 특정 항원 표적에 결합하는 이의 잠재성이 공지되어 있다. 일부 스캐폴드 결합 단백질은 안정한 프레임워크 코어를 포함하고, 추정 항원 결합 영역은 다수의 치환을 허용할 수 있다. 따라서, 스캐폴드 프레임워크 코어는 합성적으로 조작될 수 있고, 이로부터 상이한 서열 변이체의 라이브러리가 구축될 수 있다. 서열 다양성은 전형적으로 잠재적 항원 결합 영역으로 작용할 수 있는 루프 구조 또는 다른 외부 표면과 같은 단백질의 외부 표면에 존재한다. 본 발명의 개시는 항원 결합 및/또는 안정성을 나타내는 CD19 변이체를 스크리닝하고 확인하는 것을 포함한다.
CD19
CD19는 B 세포 발달의 바이오마커로서 사용되는 95 kDa 타입 I 막횡단 당단백질이다(Wang et al., Exp. Hematol. Oncol. 1:36 (2012)). 림프종 및 백혈병에서의 CD19 발현은 이를 특히 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법에 효과적인 치료 표적으로 만들었다(Maude et al., Blood 125:4017-4024 (2015)). CAR-T 세포 요법에서 CD19의 유일하게 효과적인 성능에 기초하여, 항체-CD19 융합체 또는 종양 바이오마커에 직접 결합하도록 조작된 CD19 변이체를 사용하여 CD19- 종양을 CD19+ 종양으로 "전환시키는"것을 포함하는 치료 접근법이 기재되었다(예를 들어, WO2017/075537호 및 WO2017/075533호 참조). 이러한 맥락에서, CD19 세포외 영역의 적절한 폴딩, 생물학적 에피토프의 제시 및 안정성을 포함하는 구조적 온전성은 분자 요법의 수행에 중요할 수 있다.
CD19의 세포외 영역은 2개의 C2-유사 면역글로불린 도메인을 함유하는 것으로 가정되었다(예를 들어, 문헌[Wang et al., Exp. Hematol. Oncol. 1:36 (2012); Tedder et al., Nat. Rev. Rheumatol. 5:572-577 (2009)] 참조). 이는 상동성 모델링에 의해 지원된다(
Figure pct00002
et al., Nucleic Acids Res. 33:244-248 (2005))(도 1 참조). 그러나, 최근에 공개된 구조는 CD19가 C2-유사 면역글로불린 도메인을 포함하지 않음을 입증하였다(Teplyakov et al., Proteins 86:495-500 (2018)).
인간 CD19의 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 CD19의 특정 도메인의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있다(Genbank Accession No. M84371.1 참조). 예를 들어, CD19의 세포외 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:
Figure pct00003
CD19의 세포외 도메인의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00004
본원에 논의된 바와 같이, 본 발명의 개시는 CD19 변이체를 제공한다. 일부 구현예에서, CD19 변이체는 본원에 기재된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 전장 CD19 폴리펩티드 또는 이의 일부이거나 이들을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 변이체는 본원에 기재된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 CD19 세포외 도메인 또는 이의 일부이거나 이들을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 변이체는 하나 또는 둘 모두의 CD19 C2-유사 Ig 도메인(또는 하나 또는 둘 모두의 Ig 도메인의 일부)이거나 이들을 포함하며, 이 중 하나 또는 둘 모두는 본원에 기재된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 변이체는 C-말단에 하나 이상의 아미노산이 결여되고, 둘 모두의 C2-유사 Ig 도메인을 포함하는 CD19 세포외 도메인이거나 이를 포함하며, 본원에 기재된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 변이체는 C-말단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 아미노산이 결여되고 둘 모두의 C2-유사 Ig 도메인을 포함하는 CD19 세포외 도메인이거나 이를 포함하며, 본원에 기재된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
CD19 변이체를 확인하는 방법
CD19 변이체는 특정한 표적화된 세포외 도메인 치환을 갖는 변이체(예를 들어, 변이체의 라이브러리)를 스크리닝하여 확인될 수 있다. 상기 접근법을 이용하여, 비-면역원성 치환을 최소화하면서 전체 CD19 안정성이 최대화될 수 있는 것으로 생각된다. 또한, CD19 변이체 라이브러리의 크기는 하나 이상의 시스템에서 전체 다양성이 스크리닝될 수 있도록 맞춤화될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, CD19의 세포외 도메인(ECD) 및/또는 문헌[Teplyakov et al., Proteins 86:495-500 (2018)]에 기재된 루프 또는 시트를 포함하는 C2-유사 Ig 도메인 중 하나 또는 둘 모두가 돌연변이유발을 위한 스캐폴드로 사용되며, 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 CD19 변이체(예를 들어, CD19 또는 이의 일부(예를 들어, ECD, 하나 또는 둘 모두의 C2-유사 Ig 도메인, 문헌[Teplyakov et al., Proteins 86:495-500 (2018)]에 기재된 하나 이상의 루프, 및/또는 이의 일부)가 발현 및/또는 본원에 기재된 하나 이상의 기능적 특징(예를 들어, 항-CD19 항체에 대한 결합, 표적 항원에 대한 결합, 및/또는 안정성)에 기초하여 스크리닝되고 선택될 수 있다.
CD19 변이체를 인코딩하는 변이체 핵산 서열을 제공하기 위해, 당 분야에 공지된 다수의 방법이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD19 항체에 결합하고/하거나 특정 항원에 결합하는 CD19 변이체를 인코딩하는 핵산의 확인 및/또는 분리를 가능하게 하는 스크리닝 절차가 사용된다. 예시적 방법은 파지 디스플레이(Kang, A. S. et al. 1991. Proc Natl Acad Sci USA 88, 4363-4366), 리보솜 디스플레이(Schaffitzel, C. et al. 1999. J. Immunol. Methods 231, 119-135), DNA 디스플레이(Cull, M. G. et al. 1992. Proc Natl Acad Sci USA 89, 1865-1869), RNA-펩티드 디스플레이(Roberts, R. W., Szostak, J. W., 1997. Proc Natl Acad Sci USA 94, 12297-12302), 공유 디스플레이(WO 98/37186), 박테리아 표면 디스플레이(Fuchs, P. et al. 1991. Biotechnology 9, 1369-1372), 효모 표면 디스플레이(Boder, E. T., Wittrup, K. D., 1997. Nat Biotechnol 15, 553-557) 및 진핵생물 바이러스 디스플레이(Grabherr, R., Ernst, W., 2001. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 4, 185-192)와 같은 기술로부터 공지된 소위 바이오패닝 단계를 포함한다. FACS 및 자기 비드 분류가 또한 표지된 항-CD19 항체 또는 표지된 항원을 사용한 농축(패닝) 목적에 적용 가능하다. ELISA(Dreher, M. L. et al. 1991. J. Immunol. Methods 139, 197-205) 및 ELISPOT(Czerkinsky, C. C. et. al. 1983. J Immunol Methods. 65, 109-21)과 같은 면역검출 검정이 또한 바이오패닝 단계 후에 또는 단독으로 사용될 수 있다.
라이브러리
일부 구현예에서, CD19 변이체는 CD19의 정의된 영역(예를 들어, ECD 또는 이의 일부)을 인코딩하고, 소정의 아미노산에 대한 하나 이하의 코돈을 갖는 개별 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 스크리닝을 위해 생성된다. 이는, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 내의 각각의 코돈 위치에 야생형 폴리펩티드의 합성에 필요한 코돈 또는 소정의 아미노산에 대한 코돈을 포함시킴으로써 달성될 수 있다(예를 들어, 미국 공개 번호 20050136428호 참조). 또 다른 구현예에서, 워크-쓰루 돌연변이유발(walk-through mutagenesis; WTM)이 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 6,649,340호; 5,830,650호; 및 5,798,208호 참조). WTM은 최소 수의 올리고뉴클레오티드로 다수의 돌연변이가 이루어지도록 하며, 이는, 예를 들어, 도핑 기술을 사용하여 개별적으로 배치(batch)로 생성된 후, 원하는 대로 혼합되거나 푸울링될 수 있다.
라이브러리의 생성을 위한 올리고뉴클레오티드의 혼합물은 공지된 방법에 의해 합성될 수 있다. 합성된 폴리뉴클레오티드는 표준 유전 공학 기술을 사용하여 적합한 벡터로 삽입될 수 있다. 적절한 벡터(예를 들어, 파지 벡터, 플라스미드를 포함함)에 의해 유전자는 섬유결합소 결합 도메인 분자의 발현에 적합한 세포 비함유 추출물, 파지, 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포로 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, CD19 핵산 서열은 단일 가닥 플라스미드에 도입된다. 예를 들어, 유전자는 파지 벡터 또는 헬퍼 파지의 사용으로 단일 가닥 분자의 증식을 가능하게 하는 실모양 파지 복제 기점을 갖는 벡터로 클로닝될 수 있다. 단일 가닥 주형은 원하는 돌연변이를 나타내는 축퇴성 폴리뉴클레오티드의 세트로 어닐링되고, 신장되고, 라이게이션될 수 있으며, 이에 따라 각각의 유사체 가닥을 적절한 숙주 내로 도입될 수 있는 분자 집단에 통합시킬 수 있다(예를 들어, 문헌[Sayers, J. R. et al., Nucleic Acids Res. 16: 791-802 (1988)] 참조). 중합효소 연쇄 반응(PCR) 방법론이 또한 폴리뉴클레오티드를 유전자에 포함시키기 위해 사용될 수 있다.
라이브러리의 크기는 CD19의 표적화된 영역(예를 들어, CD19 ECD 또는 이의 일부) 및 원하는 서열 다양성의 양에 따라 변할 수 있다. 일부 구현예에서, 라이브러리는 1015, 1014, 1013, 1012, 1011, 1010, 109, 108, 107 또는 106개 미만의 CD19 변이체를 함유하도록 설계된다. 일부 구현예에서, 라이브러리는 마이크로칩과 같은 고체 지지체에 부착될 수 있고, 바람직하게는 당 분야에 인정된 기술을 사용하여 배열될 수 있다.
일부 구현예에서, CD19 변이체는 더 나은 항원 결합 특성 및/또는 개선된 화학-물리학적 특성, 예를 들어, 용해도 또는 안정성을 갖는 것으로 확인될 수 있다. 일부 구현예에서, 확인된 CD19 변이체는 표적 항원에 대한 결합 분자의 친화성/결합성을 증가시키기 위해 친화성 성숙에 적용된다.
발현 및 스크리닝
임의의 상기 기술 또는 다른 적합한 기술에 의해 생성된 폴리뉴클레오티드의 라이브러리는 원하는 구조 및/또는 활성을 갖는 CD19 변이체를 확인하기 위해 발현되고 스크니링될 수 있다. CD19 변이체의 발현은 세포 비함유 추출(및, 예를 들어, 리포솜 디스플레이), 파지 디스플레이, 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포(예를 들어, 효모 디스플레이)를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물 발현 및 디스플레이 시스템은 CD19 변이체 라이브러리를 발현시키고 스크리닝하는 데 사용된다. 전형적으로, 본원에 기재된 CD19 폴리펩티드 또는 이의 일부는 또 다른 표면 분자에 링커 펩티드에 의해 연결되어 융합 단백질을 생성한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 세포 비함유 추출물에서 발현될 수 있는 주형으로서 작용하도록 조작된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,324,637호; 5,492,817호; 5,665,563호에 기재된 바와 같은 벡터 및 추출물이 사용될 수 있다. 폴리펩티드(즉, 표현형)에 폴리뉴클레오티드(즉, 유전자형)를 연결하기 위한 리보솜 디스플레이 및 다른 세포 비함유 기술이 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 6,348,315호; 6,261,804호; 6,258,558호 참조).
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 E. 콜리 발현 시스템에서 발현되고(예를 들어, 문헌[Pluckthun et al., Meth. Enzymol. 178:476-515 (1989); Skerra et al., Biotechnology 9:273-278 (1991)] 참조), CD19 변이체는 박테리아의 배지 및/또는 세포질에서의 분비를 위해 발현된다(예를 들어, 문헌[Better et al., Meth. Enzymol. 178:476 (1989)] 참조). 일부 구현예에서, CD19 변이체는 ompA, phoA 또는 pelB 신호 서열과 같은 신호 서열을 인코딩하는 서열의 3' 말단에 부착된다(예를 들어, 문헌[Lei et al., J. Bacteriol. 169:4379 (1987)] 참조).
일부 구현예에서, CD19 변이체는, 예를 들어, US20040072740A1호; US20030100023A1호; 및 US20030036092A1호에 기재된 바와 같이 분비 신호 및 지질화 모이어티를 사용하여 원핵생물, 예를 들어, E. 콜리의 막 표면에서 발현된다.
또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,423,538호; 6,331,391호; 및 6,300,065호에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 효모 디스플레이를 사용하여 진핵생물 세포(예를 들어, 효모)에서 발현된다. 효모 디스플레이 시스템은 세포 표면에 단백질을 디스플레이하기 위해 a-아글루티닌 효모 부착 수용체를 이용한다. CD19 변이체 라이브러리는 Aga2 단백질A와의 융합 파트너로서 발현되고, CD19 변이체의 라이브러리는 표준 기술을 사용하여 수용자 효모 숙주로 형질감염될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 링커는 CD19 폴리펩티드(또는 부분) 및 Aga2 단백질 A 사이에 포함된다. 발현된 융합 단백질은 세포로부터 분비되고, 효모 세포벽에 부착된 Aga1 단백질에 연결된 이황화물이 된다(문헌[Invitrogen, pYD1 Yeast Display product literature] 참조). 이후, 효모 세포는 흐름세포측정법 및 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 자기 비드와 같은 공지된 방법을 이용하여 스크리닝되고 분리될 수 있다.
CD19 변이체의 발현을 위한 더 고등한 진핵생물 세포, 예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 골수종 세포(예를 들어, NS/0 세포), 하이브리도마 세포, HEK-293 세포 또는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포가 또한 사용될 수 있다. CD19 변이체는 배양 배지로 발현되거나, 상기 세포의 표면에서 발현되도록 설계될 수 있다.
발현된 CD19 변이체의 스크리닝은 임의의 적절한 수단에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 결합 활성은 표준 면역검정 및/또는 친화성 크로마토그래피에 의해 평가될 수 있다. 결합 활성은 또한, 예를 들어, Biacore 기구를 사용하여 시험관 내에서 검정될 수 있다. 일부 구현예에서, CD19 변이체는 야생형 CD19의 것보다 적어도 20%, 40%, 60%, 80%, 100%, 120%, 140%, 160%, 180%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500% 이상 더 큰 수준으로 표적(예를 들어, 본원에 기재된 표적 항원)에 결합하는 것으로 확인된다.
일부 구현예에서, CD19 변이체의 안정성은 상승된 온도에 노출된 후 단백질 수준을 측정하고/하거나, 효소적 및/또는 화학적 처리 후 단백질 수준을 측정하는 것과 같은 공지된 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, CD19 변이체는 상승된 온도, 효소 및/또는 화학적 처리에 대한 노출 후 동일 조건에 노출된 야생형 CD19의 것보다 적어도 3%, 5%, 7%, 9%, 10%, 15%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%, 120%, 140%, 160%, 180%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500% 이상 더 큰 측정된 단백질 수준을 갖는 것으로 확인된다. 예를 들어, CD19 변이체는 동일 조건에 노출된 야생형 CD19의 상응하는 용융 온도보다 약 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10℃ 더 높은 용융 온도를 가질 수 있다.
본원에 기재된 예시적 방법에서, 역치 수준의 안정성 및/또는 개선된 수준의 안정성(예를 들어, 야생형 CD19 또는 또 다른 CD19 변이체에 비함)을 나타내는 CD19 변이체가 확인된다. 예를 들어, CD19 ECD를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 체계적으로 돌연변이되어 제1 CD19 돌연변이체 라이브러리를 생성할 수 있으며, 이는 안정성을 나타내는 CD19 변이체에 대해 스크리닝될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 라이브러리("서브-라이브러리")는 제1 CD19 돌연변이체 라이브러리로부터 확인된 안정한 CD19 변이체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로부터 생성될 수 있으며, 이는 또한 안정성을 나타내는 CD19 변이체에 대해서도 스크니링될 수 있다. 안정성을 나타내는 CD19 변이체(예를 들어, 제1 및/또는 제2 라이브러리로부터 확인됨)는 본원에 기재된 하나 이상의 조성물 및/또는 방법에서 사용될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 안정성을 나타내는 CD19 변이체(예를 들어, 제1 및/또는 제2 라이브러리로부터 확인됨)는 특정 항원, 예를 들어, 본원에 기재된 항원에 결합하는 능력에 대해 추가로 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 야생형 CD19에 비해 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 안정한 CD19 변이체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 특정 항원, 예를 들어, 본원에 기재된 항원에 결합하는 안정한 CD19 변이체에 대해 이후에 스크리닝될 수 있는 새로운 라이브러리를 생성시키기 위해 체계적으로 돌연변이화(즉, 안정성을 부여하는 것으로 확인된 것 이외의 아미노산을 인코딩하는 코돈에서 돌연변이화)될 수 있다.
항원
일부 구현예에서, CD19 변이체는 임의의 표적 항원에 선택적으로 결합하는 것으로 확인된다. 예시적 표적 항원은, 예를 들어, MART-1/MelanA(MART-I), gp100(Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15, CEA, p53, Ras, HER-2/neu, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, 엡스타인 바 바이러스 항원 EBVA, 인간 유두종바이러스(HPV) 항원 E6 또는 E7, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, erbB, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백질, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733＼EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린 C-관련 단백질, TAAL6, TAG72, TLP, MUC16, IL13Rα2, FRα, VEGFR2, 루이스 Y, FAP, EphA2, CEACAM5, EGFR, CA6, CA9, GPNMB, EGP1, FOLR1, 내피 수용체, STEAP1, SLC44A4, 넥틴-4, AGS-16, 구아날릴 사이클라제 C, MUC-1, CFC1B, 인테그린 알파 3 사슬(a3b1의 것, 라미닌 수용체 사슬), TPS, CD19, CD20, CD22, CD30, CD72, CD180, CD171(L1CAM), CD123, CD133, CD138, CD37, CD70, CD79a, CD79b, CD56, CD74, CD166, CD71, CLL-1/CLEC12A, ROR1, 글리피칸 3(GPC3), 메소텔린, CD33/IL3Ra, c-Met, PSCA, PSMA, 당지질 F77, EGFRvIII, BCMA, GD-2, MY-ESO-1 또는 MAGE A3을 포함한다.
예시적 CD19 변이체
본원에 기재된 방법을 이용하여, 야생형 CD19에 비해 증가된 안정성 수준을 나타내는 CD19 변이체가 확인되었다. 따라서, 일부 구현예에서, CD19 변이체는 표 1A, 표 1B, 표 2A, 표 2B, 표 3, 표 6, 도 8b, 도 11, 도 12b, 도 14a-도 14b, 또는 도 15b에 나열된 SEQ ID NO:2의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, CD19 변이체는 SEQ ID NO:2의 다음 아미노산 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함한다: 2, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 38, 39, 45, 47, 49, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 66, 68, 70, 72, 84, 90, 93, 94, 99, 100, 105, 108, 111, 113, 114, 115, 122, 123, 124, 125, 127, 130, 131, 132, 135, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 148, 149, 154, 167, 169, 171, 185, 189, 193, 194, 196, 198, 202, 204, 206, 207, 209, 211, 212, 213, 215, 216, 217, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 228, 229, 230, 232, 235, 240, 243, 247, 249, 250, 251, 252, 253, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 264, 265, 269, 또는 271. 이들 위치에서의 예시적 아미노산 치환은 표 1A, 표 2A, 표 3, 표 6, 도 11, 도 12b, 도 14a-도 14d, 또는 도 15b에 제시된다.
일부 구현예에서, CD19 변이체는 표 6에 제시된 바와 같이 하기 위치 중 하나 이상에서 하기 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다:
[표 6]
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
일부 구현예에서, CD19 변이체는 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치의 다음 세트 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함한다: 5/7/9; 14/16/18; 29/31; 29/31/33; 35/37/39; 45/47/49; 52/54/56; 59/61/63; 62/64/66; 76/78/80; 86/88/90; 167/169/171; 175/177/179; 193/195/197; 206/208/210; 207/209/211; 219/221/223; 240/243; 224/226/228; 247/249/251; 253/255/256; 255/256; 또는 261/262/264/265. 이들 세트의 위치에서의 예시적 아미노산 치환은 표 1B, 표 2B, 표 3, 표 6, 도 8b, 도 11, 도 14a, 도 14b, 도 14c, 도 14d 또는 도 15b에 제시된다.
본 발명의 개시의 방법을 이용하여 추가의 CD19 변이체가 확인될 수 있다.
CD19 변이체를 사용하는 방법
융합 단백질
WO2017/075537호 및 WO2017/075533호는 부분적으로 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 단편, 또는 스캐폴드 폴리펩티드 또는 단편) 및 CD19 또는 이의 단편을 포함하거나 이로 구성되는 융합 단백질, 또는 상기 융합 단백질을 인코딩하는 발현 작제물을 기재한다. 본원에 기재된 CD19 변이체 또는 본 발명의 개시의 방법을 이용하여 확인된 CD19 변이체는 WO2017/075537호 및 WO2017/075533호에 기재된 임의의 CD19-기반 작제물에 포함될 수 있다. WO2017/075537호 및 WO2017/075533호에 기재된 바와 같이, 상기 작제물은 암의 치료에 유용하다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CD19 변이체는 융합 단백질, 예를 들어, CD19 변이체 및 본원에 기재된 항체, 항체 단편, 스캐폴드 폴리펩티드 또는 스캐폴드 폴리펩티드 단편을 포함하는 융합 단백질의 일부로서 포함된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 또 다른 단백질의 아미노(N) 말단에 융합된 CD19 변이체, 예를 들어, 항원 결합 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 항체 또는 항체 단편, 또는 스캐폴드 폴리펩티드 또는 단편)의 아미노(N) 말단에 융합된 CD19 변이체이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 항체 또는 이의 단편의 경쇄의 아미노 말단에 융합된 CD19 변이체이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 항체 또는 이의 일부의 중쇄의 아미노 말단에 융합된 CD19 변이체이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 변이체 융합 단백질은 본원에 기재된 링커를 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 또 다른 단백질의 카르복실(C) 말단에 융합된 CD19 변이체, 예를 들어, 항원 결합 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 항체 또는 항체 단편, 또는 스캐폴드 폴리펩티드 또는 단편)의 카르복실(C) 말단에 융합된 CD19 변이체이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 항체 또는 이의 단편의 경쇄의 카르복실 말단에 융합된 CD19 변이체이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 항체 또는 이의 일부의 중쇄의 카르복실 말단에 융합된 CD19 변이체이거나 이를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 개시는 WO2017/075537호 및 WO2017/075533호에 기재된 바와 같은 항시성 또는 유도성 발현 작제물을 포함하며, 상기 발현 작제물은 본원에 기재된 CD19 변이체 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 결합된 적어도 하나의 프로모터를 포함하는 핵산 서열을 포함한다.
항체
본원에 기재된 바와 같이, 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 CD19 변이체 및 항체 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 임의의 항체는 상기 융합 단백질에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 항-종양 항체이다. 유용한 항-종양 항체를 기재하는 다양한 검토 논문이 공개되었다(예를 들어, 문헌[Adler et al., Hematol. Oncol. Clin. North Am. 26:447-81 (2012); Li et al., Drug Discov. Ther. 7:178-84 (2013); Scott et al., Cancer Immun. 12:14 (2012); 및 Sliwkowski et al., Science 341:1192-1198 (2013)] 참조). 표 4는 공지된 이용 가능한 항체 제제의 의해 표적화된 특정 인간 폴리펩티드 항원의 포괄적이지 않은 목록을 제시하며, 항체 제제가 유용할 것으로 제안된 특정 암 적응증을 기재한다.
[표 4]
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 CD19 변이체 및, 예를 들어, 온전한 IgG, IgE 또는 IgM, 이중특이적 또는 다중특이적 항체(예를 들어, Zybodies® 등), 단일쇄 Fvs, 폴리펩티드-Fc 융합체, Fabs, 카멜리드 항체, 마스킹된 항체(예를 들어, Probodies®), 소형 모듈형 면역약제("SMIPsTM"), 단일쇄 또는 탠덤 디아바디(Tandem diabodies)(TandAb®), VHH, Anticalins®, Nanobodies®, 미니바디(minibodies), BiTE®s, 안키린 반복 단백질 또는 DARPINs®, Avimers®, DART, TCR-유사 항체, Adnectins®, Affilins®, Trans-bodies®, Affibodies®, TrimerX®, MicroProteins, Fynomers®, Centyrins®, 및 KALBITOR®을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 포함한다.
일부 예에서, 본원에 기재된 CD19 변이체는 본원에 기재된 항체(또는 단편)의 C-말단 및/또는 N-말단에 배치(예를 들어, 융합)될 수 있다. 예를 들어, CD19 변이체는 경쇄 또는 일부(예를 들어, VL)의 C-말단 및/또는 N-말단; 및/또는 중쇄 또는 일부(예를 들어, VH)의 C-말단 및/또는 N-말단에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CD19 변이체는 항체(또는 단편) 내 또는 본원에 기재된 항체 도메인(예를 들어, scFv) 사이에 배치(예를 들어, 융합)될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 다양한 구성으로 항-EGFR scFv, 항-Her2 scFv 및 돌연변이체 CD19를 포함할 수 있다. 상기 융합 파트너는 다양한 구성, 예를 들어, 항-EGFR scFv / CD19 돌연변이체 / 항-Her2 scFv; 항-Her2scFv / CD19 돌연변이체 / 항-EGFR scFv; CD19 돌연변이체 / 항-EGFR scFv / 항-Her2 scFv; CD19 돌연변이체 / 항-Her2 scFv / 항-EGFR scFv; 항-EGFR scFv / 항-Her2 scFv / CD19 돌연변이체; 및/또는 항-Her2 scFv / 항-EGFR scFv / CD19 돌연변이체로 상기 융합 단백질 내에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는 본원에 기재된 항원을 표적으로 한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항체는 PD-1, TIM-3, LAG-3, IDO, A2AR, TGF베타, CD47, 또는 면역억제 경로에 관련되 또 다른 단백질을 표적으로 한다. 예시적인 비제한적 융합 단백질은 항-PD1 scFv; 항-PD-L1 scFv; 항-CD39 scFv; 또는 항-CD73 scFv를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는 하나 이상의 감염원을 표적으로 한다. 예를 들어, 항체는 CD163을 표적으로 할 수 있다(예를 들어, 문헌[Svendsen et al., Mol. Ther.: Methods & Clin. Dev. 4:50-61 (2017)] 참조). 일부 구현예에서, 항체는 박테리아, 예를 들어, 박테리아 O25b 항원(예를 들어, 문헌[Guachalla et al., Antimicrob. Agents Chemother. 61:e01428-17 (2017)] 참조); β-배럴 조립 기계(BAM)의 하나 이상의 성분, 예를 들어, BamA, BamB, BamC, BamD, 또는 BamE(예를 들어, MAB1 항체)(예를 들어, 문헌[Storek et al., PNAS 115:3692-3697 (2018)] 참조); 또는 S. 아우레우스(S. aureus)(예를 들어, 문헌[Zhou et al., mAbs 8:1612-1619 (2016)]에 기재된 항-S. 아우레우스 항체)를 표적으로 한다.
항체 또는 단편은 항체를 합성하기 위한 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50]; WO 92/22324호; WO 98/46645호 참조). 키메라 항체는, 예를 들어, 문헌[Morrison, 1985, Science 229:1202]에 기재된 방법, 및, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,180,370호에 기재된 방법에 의해 인간화된 항체를 사용하여 생성될 수 있다.
단일 도메인 항체
단일 도메인 항체는 상보성 결정 영역이 단일 도메인 폴리펩티드의 일부인 항체이다. 예는 중쇄 항체, 경쇄가 자연적으로 결여된 항체, 통상적인 4-사슬 항체로부터 유래된 단일 도메인 항체, 조작된 항체 및 항체로부터 유래된 것 이외의 단일 도메인 스캐폴드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 단일 도메인 항체는 당 분야에 공지된 임의의 것, 또는 임의의 미래의 단일 도메인 항체일 수 있다. 단일 도메인 항체는 마우스, 인간, 낙타, 라마, 염소, 토끼, 소를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 개시의 일 양태에 따르면, 본원에서 사용되는 단일 도메인 항체는 경쇄가 결여된 중쇄 항체로 공지된 자연 발생 단일 도메인 항체이다. 상기 단일 도메인 항체는, 예를 들어, WO 94/04678호에 개시되어 있다. 경쇄가 자연적으로 결여된 중쇄 항체로부터 유래된 이러한 가변 도메인은 본원에서 "VHH" 또는 "나노바디"로 지칭된다. 상기 VHH 분자는 낙타과(Camelidae) 종, 예를 들어, 낙타, 단봉 낙타, 라마, 비쿠나, 알파카 및 과나코에서 발생된 항체로부터 유래될 수 있다. 낙타과 이외의 다른 종(예를 들어, 호모 사피엔스(Homo sapiens))은 자연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 항체를 생성할 수 있고; 상기 VHH는 본 발명의 개시 범위 내이다.
카멜리드로부터의 VHH 도메인의 아미노산 잔기는 케이뱃 등(Kabat et al.)의 문헌["Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH (Bethesda, MD), Publication No 91-3242 (1991)]에 의해 제공된 VH 도메인의 일반적인 넘버링에 따라 넘버링되며; 또한 문헌[Riechmann et al., J. Immunol. Methods 231:25-38 (1999)]을 참조한다. 이러한 넘버링에 따르면, FR1은 위치 1 내지 30의 아미노산 잔기를 포함하고, CDR1은 위치 31 내지 35의 아미노산 잔기를 포함하고, FR2는 위치 36 내지 49의 아미노산을 포함하고, CDR2는 위치 50 내지 65의 아미노산 잔기를 포함하고, FR3은 위치 66 내지 94의 아미노산 잔기를 포함하고, CDR3은 위치 95 내지 102의 아미노산 잔기를 포함하고, FR4는 위치 103 내지 113의 아미노산 잔기를 포함한다.
그러나(VH 도메인 및 VHH 도메인에 대해 당 분야에 널리 공지된 바와 같이), 각각의 CDR에서 아미노산 잔기의 전체 수는 변할 수 있고, 케이뱃 넘버링에 의해 표시된 아미노산 잔기의 전체 수와 상응하지 않을 수 있음(즉, 케이뱃 넘버링에 따른 하나 이상의 위치는 실제 서열에서 점유되지 않을 수 있거나, 실제 서열은 케이뱃 넘버링에 의해 허용된 수보다 많은 아미노산 잔기를 함유할 수 있음)이 유의되어야 한다. 이는 일반적으로 케이뱃에 따른 넘버링이 실제 서열에서 아미노산 잔기의 실제 넘버링에 상응하거나 상응하지 않을 수 있음을 의미한다.
VH 도메인의 아미노산 잔기를 넘버링하기 위한 대안적 방법이 당 분야에 공지되어 있으며, 상기 방법은 또한 VHH 도메인과 유사한 방식으로 적용될 수 있다. 그러나, 본 발명의 개시, 청구항 및 도면에서, 달리 지시되지 않는 한 상기 기재된 바와 같이 케이뱃에 따르고 VHH 도메인에 적용되는 넘버링이 후속될 것이다.
항-CLL-1 단일 도메인 항체
MICL 또는 CLEC12A로도 공지된 인간 C-타입 렉틴-유사 분자-1(CLL-1)은 타입 II 막횡단 당단백질이며, 면역 조절에 관여하는 C-타입 렉틴-유사 수용체의 큰 패밀리의 구성원이다. CLL-1은 이전에 골수-유래 세포로부터 확인되었다. CLL-1의 세포내 도메인은 면역티로신계 억제 모티프(ITIM) 및 YXXM 모티프를 함유한다. 다양한 세포에서 ITIM 함유 수용체의 인산화는 단백질 티로신 포스파타제 SHP-1, SHP-2 및 SHIP의 동원을 통해 활성화 경로의 억제를 발생시킨다. YXXM 모티프는 세포 활성화 경로와 관련된 PI-3 키나제,13의 p85 서브유닛에 대한 잠재적 SH2 도메인 결합 부위를 가지며, 이는 골수성 세포에서 억제 또는 활성화 분자로서의 CLL-1의 잠재적 이중 역할을 나타낸다. 실제로, CLL-1과 SHP-1 및 SHP-2의 회합은 형질감염 및 골수-유래 세포주에서 실험적으로 입증되었다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VHH이거나 이를 포함하는 CLL-1 결합 항체 또는 이의 단편(예를 들어, 이의 CLL-1 결합 단편)을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 본원에 제공된 서열 목록에 표시된 바와 같이, SEQ ID No:203 내지 225 각각은 N-말단에서 VHH 아미노산, 및 C-말단에서 다음의 아미노산을 포함한다: (i) 9개 아미노산의 링커(TSGPGGQGA), (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커(GA), (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS). 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분(예를 들어, CLL-1 결합 부분)을 갖는 VHH이거나 이를 포함하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 상기 부분은 (i) 내지 (v) 중 하나 이상이 결여(및/또는 (i) 내지 (v) 중 하나 이상의 일부가 결여)되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분(예를 들어, CLL-1 결합 부분)을 갖는 VHH이거나 이를 포함하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 상기 부분은 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS 중 하나 이상이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분(예를 들어, CLL-1 결합 부분)을 갖는 VHH이거나 이를 포함하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 상기 부분은 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS의 전부가 결여되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분(예를 들어, CLL-1 결합 부분)을 갖는 VHH이거나 이를 포함하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 상기 부분은 (i) 내지 (v) 중 하나 이상이 결여(및/또는 (i) 내지 (v) 중 하나 이상의 일부가 결여)되어 있고, 상기 부분은 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상)의 추가 아미노산(즉, (i) 내지 (v)에 포함된 아미노산 이외)이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분(예를 들어, CLL-1 결합 부분)을 갖는 VHH이거나 이를 포함하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 상기 부분은 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS 중 하나 이상이 결여되어 있고, 상기 부분은 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상)의 추가 아미노산이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분(예를 들어, CLL-1 결합 부분)을 갖는 VHH이거나 이를 포함하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 상기 부분은 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS의 전부가 결여되어 있고, 상기 부분은 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상)의 추가 아미노산이 결여되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분(예를 들어, CLL-1 결합 부분)과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VHH이거나 이를 포함하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 상기 부분은 (i) 내지 (v) 중 하나 이상이 결여(및/또는 (i) 내지 (v) 중 하나 이상의 일부가 결여)되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분(예를 들어, CLL-1 결합 부분)과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VHH이거나 이를 포함하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 상기 부분은 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS 중 하나 이상이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분(예를 들어, CLL-1 결합 부분)과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VHH이거나 이를 포함하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 상기 부분은 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS의 전부가 결여되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분(예를 들어, CLL-1 결합 부분)과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VHH이거나 이를 포함하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 상기 부분은 (i) 내지 (v) 중 하나 이상이 결여(및/또는 (i) 내지 (v) 중 하나 이상의 일부가 결여)되어 있고, 상기 부분은 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상)의 추가 아미노산(즉, (i) 내지 (v)에 포함된 아미노산 이외)이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분(예를 들어, CLL-1 결합 부분)과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VHH이거나 이를 포함하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 상기 부분은 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS 중 하나 이상이 결여되어 있고, 상기 부분은 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상)의 추가 아미노산이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분(예를 들어, CLL-1 결합 부분)과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VHH이거나 이를 포함하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 상기 부분은 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS의 전부가 결여되어 있고, 상기 부분은 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상)의 추가 아미노산이 결여되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나에 도시된 적어도 하나의 CDR(예를 들어, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3)을 포함하는 VHH이거나 이를 포함하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나에 도시된 적어도 하나의 CDR(예를 들어, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3)의 부분을 포함하는 VHH이거나 이를 포함하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 상기 부분은 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나에 도시된 CDR의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나에 도시된 CDR(예를 들어, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3)과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 적어도 하나의 CDR을 포함하는 VHH이거나 이를 포함하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나에 도시된 적어도 하나의 CDR(예를 들어, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3)의 부분과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VHH이거나 이를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 상기 부분은 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나에 도시된 CDR의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산이 결여되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 표 5A 및/또는 표 5B에 도시된 그룹 1 내지 13 중 어느 하나의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3를 포함하는 VHH이거나 이를 포함하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 표 5A 및/또는 표 5B에 도시된 그룹 1 내지 13 중 어느 하나의 (i) CDR1 및 CDR2; (ii) CDR2 및 CDR3; (iii) CDR1 및 CDR3; 또는 (iv) CDR1, CDR2 및 CDR3(예를 들어, CDR은 하나의 특정 그룹으로부터 유래되거나, CDR은 2개 이상의 상이한 그룹으로부터 선택됨)를 포함하는 VHH이거나 이를 포함하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 표 5A 및/또는 표 5B에 도시된 바와 같이, 그룹 1의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 2의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 3의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 4의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 5의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 6의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 7의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 8의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 9의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 10의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 11의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 12의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는 그룹 13의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VHH이거나 이를 포함하는 항체를 제공한다.
[표 5A]
Figure pct00016
[표 5B]
IMGT 넘버링 및 ANARCI 소프트웨어(http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/sabdab-sabpred/ANARCI.php)에 기초하여 확인된 CDR
Figure pct00017
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 임의의 상기 CDR 서열은, 예를 들어, 본원에 개시되거나 당 분야에서 달리 공지된 임의의 포맷의 항체 또는 결합 분자로 존재할 수 있는 바와 같은 본원에 개시되거나 당 분야에서 달리 공지된 바와 같은 임의의 프레임워크 영역, CDR 또는 불변 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 본원에 제공되거나 당 분야에서 달리 공지된 임의의 다른 항체 서열 또는 도메인과 함께 분자생물학 기술을 사용하여 용이하게 조합될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 하나 이상의 항-CLEC12a 항체(또는 이의 일부), 및 본원에 기재된 하나 이상의 CD19 돌연변이체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 예를 들어, 융합 단백질은 다양한 구성으로 항-Clec12a scFv, 돌연변이체 CD19 및 항-Clec12a VHH를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 별개의 항-Clec12a VHH는 다양한 구성으로 돌연변이체 CD19와 조합될 수 있다. 또 다른 예에서, 별개의 항-Clec12a VHH는 다양한 구성으로 돌연변이체 CD19와 함께 골수성 백혈병 세포 상에 존재하는 하나 이상의 항원을 표적으로 하는 scFv 또는 VHH와 조합될 수 있다.
항원(예를 들어, CLL-1)에 대한 본원에 기재된 항체의 결합 특성은 당 분야에 공지된 방법, 예를 들어, BIACORE 분석, 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), x-선 결정학, 서열 분석 및 스캐닝 돌연변이유발의 방법 중 하나에 의해 측정될 수 있다. 항체 및 항원(예를 들어, CLL-1)의 결합 상호작용은 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 이용하여 분석될 수 있다. SPR 또는 분자 상호작용 분석(BIA)은 임의의 상호작용체를 표지하지 않고 실시간으로 생체 특이적 상호작용을 검출한다. BIA 칩의 결합 표면에서의 질량의 변화(결합 사건을 나타냄)는 표면 근처의 빛의 굴절률을 변경시킨다. 굴절률의 변화는 검출 가능한 신호를 발생시키며, 이는 생물학적 분자 사이의 실시간 반응의 지표로서 측정된다. SPR을 이용하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,641,640호; 문헌[Raether (1988) Surface Plasmons Springer Verlag; Sjolander and Urbaniczky (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345; Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705] 및 BIAcore International AB (Uppsala, Sweden)에 의해 제공되는 온-라인 리소스]에 기재되어 있다. 또한, Sapidyne Instruments(Boise, Id.)로부터 이용 가능한 KinExA®(Kinetic Exclusion Assay) 검정이 또한 사용될 수 있다.
SPR로부터의 정보는 항원(예를 들어, CLL-1)에 대한 항체의 결합에 대한 평형 해리 상수(KD), 및 Kon 및 Koff를 포함하는 동역학 파라미터의 정확한 정량적 측정을 제공하는 데 사용될 수 있다. 상기 데이터는 상이한 분자를 비교하는 데 사용될 수 있다. SPR로부터의 정보는 또한 구조-활성 관계(SAR)를 개발하는 데 사용될 수 있다. 제공된 위치에서의 변이체 아미노산은 특정 결합 파라미터, 예를 들어, 높은 친화성과 상관 관계가 있는 것으로 확인될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 항원(예를 들어, CLL-1) 결합에 대해 높은 친화성을 나타낸다. 다양한 구현예에서, 항원(예를 들어, CLL-1)에 대한 본원에 기재된 바와 같은 항체의 KD는 약 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14 또는 10-15 M 미만이다. 특정 예에서, 항원(예를 들어, CLL-1)에 대한 본원에 기재된 바와 같은 항체의 KD는 0.001 내지 1 nM, 예를 들어, 0.001 nM, 0.005 nM, 0.01 nM, 0.05 nM, 0.1 nM, 0.5 nM 또는 1 nM이다.
스캐폴드 폴리펩티드
일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 본원에 기재된 CD19 변이체 및 스캐폴드 폴리펩티드(또는 이의 단편)를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 스캐폴드 폴리펩티드(또는 단편)는, 예를 들어, 종양 항원(예를 들어, 본원에 기재된 종양 항원)에 결합하도록 선택될 수 있다. 상기 스캐폴드 폴리펩티드(또는 단편)는, 예를 들어, 섬유결합소 도메인(예를 들어, 타입 III 섬유결합소 도메인), DARPin, 어드히론(adhiron), 리포칼린/안티칼린, 단백질 A, 어피바디(affibody), 티오레독신 등을 포함한다. 예를 들어, 융합 단백질은 타입 III 섬유결합소 도메인-CD19 변이체 융합 단백질이거나 이를 포함할 수 있다.
마스킹된 작제물
일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 본원에 기재된 항원 결합 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 항체)의 마스킹된 버전을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 융합 단백질은 본원에 기재된 항체 또는 항체 단편의 마스킹된 버전을 포함한다(예를 들어, 문헌[Sandersjoo et al. Cell. Mol. Life Sci. (2015) 72:1405-1415]; US 2015/0183875호; US 8,513,390호; 및 US 9,120,853호에 기재된 바와 같은 Probody®). 일부 구현예에서, 마스킹된 작제물은 항체 또는 이의 단편, 마스킹 모이어티, 절단 가능한 모이어티 및/또는 링커를 포함한다.
일부 구현예에서, 마스킹된 작제물은 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편) 및 마스킹 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 마스킹 모이어티는 항원-결합 단백질에 커플링된 아미노산 서열이고, 이는 단백질이 그의 표적에 특이적으로 결합하는 능력을 감소시키도록 배치된다(항원-결합 단백질을 "마스킹"). 일부 구현예에서, 마스킹 모이어티는 링커를 통하여 항원-결합 단백질에 커플링된다. 일부 구현예에서, 마스킹된 항원-결합 단백질의 그의 표적에 대한 특이적 결합은, "마스킹되지 않은" 항원-결합 단백질의 표적에 대한 특이적 결합에 비하여, 또는 부모 항원-결합 단백질의 표적에 대한 특이적 결합에 비하여 감소되거나 억제된다. 일부 구현예에서, 마스킹된 항원-결합 단백질은 표적에 대한 측정가능하지 않은 결합 또는 실질적으로 측정가능하지 않은 결합을 보여주고/보여주거나, 예를 들어 적어도 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, 96시간, 또는 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 달 이상 동안, 예를 들어 생체 내 또는 시험관 내 면역흡수 분석에서 표적 전위(Target Displacement)(US 8,513,390에 기재됨)에서 측정된 경우, 마스킹되지 않은 항원-결합 단백질의 표적에 대한 결합과 비교하여, 또는 부모 항원-결합 단백질의 표적에 대한 결합과 비교하여, 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50% 이하의 표적에 대한 결합을 보여준다.
일부 구현예에서, 마스킹된 항원-결합 단백질의 그의 표적에 대한 특이적 결합은, 마스킹되지 않은 항원-결합 단백질의 표적에 대한 특이적 결합과 비교하여, 또는 부모 항원-결합 단백질의 표적에 대한 특이적 결합과 비교하여 감소 또는 억제된다. 마스킹된 항원-결합 단백질의 표적에 대한 Kd는, 마스킹되지 않은 항원-결합 단백질의 Kd 또는 부모 항원-결합 단백질의 Kd보다, 적어도 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000 이상 또는 5-10, 10-100, 10-1,000, 10-10,000, 10-100,000, 10-1,000,000, 10-10,000,000, 100-1,000, 100-10,000, 100-100,000, 100-1,000,000, 100-10,000,000, 1,000-10,000, 1,000-100,000, 1,000-1,000,000, 1000-10,000,000, 10,000-100,000, 10,000-1,000,000, 10,000-10,000,000, 100,000-1,000,000, 또는 100,000-10,000,000배 크다. 역으로, 마스킹된 항원-결합 단백질의 표적에 대한 결합 친화도는 마스킹되지 않은 항원-결합 단백질의 결합 친화도, 또는 부모 항원-결합 단백질의 결합 친화도보다 적어도 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000 이상, 또는 5-10, 10-100, 10-1,000, 10-10,000, 10-100,000, 10-1,000,000, 10-10,000,000, 100-1,000, 100-10,000, 100-100,000, 100-1,000,000, 100-10,000,000, 1,000-10,000, 1,000-100,000, 1,000-1,000,000, 1000-10,000,000, 10,000-100,000, 10,000-1,000,000, 10,000-10,000,000, 100,000-1,000,000, 또는 100,000-10,000,000배 낮다.
마스킹 모이어티는 당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어 항체, 또는 그의 단편의 알려진 결합 파트너를 포함한다. 일부 구현예에서, 마스킹 모이어티는 항원-결합 단백질의 N-말단에서, C-말단에서 및/또는 내부 위치(예를 들어 항원 결합 루프) 내에서의 아미노산 서열이다. 일부 구현예에서, 마스킹 모이어티는, 시스테인 잔기의 하나 이상의 쌍이거나 그를 포함하여, 예를 들어 시스테인 쌍 사이의 이황화물 결합의 형태를 초래한다. 그러한 일부 구현예에서, 이황화물 결합은 입체구조적으로 제한된 구조를 초래하며, 이는 예를 들어 환원제에 의해 이황화물 결합의 분열에 의해 "마스킹되지 않을" 수 있다. 예시적인 마스킹 모이어티는, 예를 들어 문헌[Sandersjoo et al. Cell. Mol. Life Sci. (2015) 72:1405-1415]; US 2015/0183875호; US 8,513,390호; 및 US 9,120,853호에 기재되어 있다.
세포 치료제
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CD19 변이체를 인코딩하거나, 본원에 기재된 CD19 변이체를 포함하거나 이로 구성되는 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 세포 치료제로 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 치료제는 면역 세포, 예를 들어, 입양 세포 치료에 유용하거나 사용할 수 있는 세포로부터 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 치료제는 TIL, T-세포, CD8+ 세포, CD4+ 세포, NK-세포, 델타-감마 T-세포, 조절성 T-세포 또는 말초 혈액 단핵 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 유형으로부터 생성된다. 본원에서 사용되는 "종양 침윤 림프구" 또는 TIL은 혈류를 떠나 종양으로 이동한 백혈구 세포를 지칭한다. 림프구는 B 세포, T 세포 및 자연 살해 세포를 포함하는 3개의 그룹으로 나뉠 수 있다. 본원에서 사용되는 "T-세포"는 CD4+ 헬퍼 세포, CD8+ 세포독성 T-세포 및 델타-감마 T 세포를 포함하는 CD3+ 세포를 지칭한다.
특정 구현예에서, 세포 치료제는 본원에 기재된 CD19 변이체를 인코딩하는 핵산 또는 본원에 기재된 CD19 변이체를 포함하거나 이로 구성되는 융합 단백질로 세포, 예를 들어, 면역 세포를 유전적으로 변형(예를 들어, 형질전환)시킴으로써 생성된다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 재조합 발현 벡터에 포함된다. 재조합 발현 벡터는 DNA 및 RNA를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 유형의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 이는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있고, 합성되거나 자연 공급원으로부터 부분적으로 획득될 수 있고, 자연, 비-자연 또는 변경된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 자연 발생 또는 비-자연 발생 뉴클레오티드간 결합 또는 둘 모두의 유형의 결합을 포함할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있다. 적합한 벡터는 증식 및 확장에 대해, 또는 발현 또는 이들 모두에 대해 설계된 것들, 예컨대 플라스미드 및 바이러스를 포함한다. 예를 들어, 벡터는 pUC 시리즈(Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, Md.), pBluescript 시리즈(Stratagene, LaJolla, Calif.), pET 시리즈(Novagen, Madison, Wis.), pGEX 시리즈(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), 및 pEX 시리즈(Clontech, Palo Alto, Calif.)로부터 선택될 수 있다. 박테리오파지 벡터, 예컨대 λGT10, λGT11, λZapII(Stratagene), λEMBL4, 및 λNM1149 또한 사용될 수 있다. 본 개시의 맥락에 유용한 식물 발현 벡터의 예는 pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19(Clontech)가 포함된다. 본 개시의 맥락에서 유용한 동물 발현 벡터의 예로는 pcDNA, pEUK-Cl, pMAM, 및 pMAMneo(Clontech)가 포함된다. 일부 구현예에서, 비시스트로닉(bicistronic) IRES 벡터(예를 들어, Clontech의)는 항원 결합 수용체를 암호화하는 핵산 및 본 명세서에 기재된 유도성 발현 구축물 모두를 포함하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 적합한 바이러스 벡터는 제한 없이, 레트로바이러스 벡터, 알파바이러스, 우두(vaccinial), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 계두 바이러스 벡터를 포함하고, 바람직하게는 고유 또는 조작된 면역 세포(예를 들어, T 세포)를 형질전환하는 능을 갖는다.
세포 요법과 같은 생체 외 적용에서, 뮤린 백혈병 바이러스(MLV)로부터 유래된 감마 레트로바이러스 벡터가 먼저 개발되었고, 여전히 사용된다. 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 기초한 렌티바이러스 벡터가 널리 사용된다. 렌티바이러스 벡터를 설계하는 일반적 전략은 복제-적격 바이러스의 생성을 방지하기 위해 고유 바이러스 서열의 결실 및 변경에 기초한다. 따라서, 렌티바이러스 성분은 완전 복제 적격 렌티바이러스(RCL)로의 완전한 재조합의 가능성을 방지하기 위해 3개 또는 4개의 상이한 플라스미드 작제물로 분리된다. 바이러스 벡터 유전체는 최소한 트랜스진 발현 카세트, 긴 말단 반복(LTR) 및 패키징 신호를 함유한다. 대부분의 경우, 3개의 추가 플라스미드는 바이러스 생성 및 패키징에 필요한 인자(예를 들어, gag, pol, env)를 제공한다. 3' LTR로부터의 프로모터-인핸서 영역이 또한 결실되어, 상기 영역으로부터의 전사 및 후속 바이러스 복제(자가 비활성화 벡터(SIN)로 언급됨)를 방지한다. 생체 외 세포 형질전환 또는 형질도입의 필수 단계는 세포가 바이러스 벡터로 형질도입되기 전 또는 후에 선택, 확장 및 분화를 허용하도록 세포 분리 및 원하는 세포 유형의 배양을 포함한다. 조혈 세포의 경우, 이들 단계 대부분은 단일-용도 혈액 수집 및 처리 백을 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행된다. CAR T 세포 요법의 경우, 환자 혈액 세포가 수확되고, 원하는 T 세포 집단이 선택되고 필요한 수준으로 성장된다. 이후, 이들은 원하는 유전자 카세트를 갖는 바이러스 벡터로 형질도입된 후, CAR T 세포가 10억개 세포 수준으로 확장된다. 렌티바이러스 벡터는 T 세포를 효율적으로 형질도입시키는 것으로 나타났으며, 따라서 환자 표적 세포 내로 CAR을 도입하기에 바람직한 벡터이다. 확장된 세포는 이후 환자에게 재도입된다.
일부 구현예에서, CD19 단백질을 인지하는 키메라 항원 수용체(CAR)는 T 세포를 형질도입시킨 벡터에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, CD19 단백질을 인지하는 CAR이 발현되고, 융합 단백질은 T 세포를 형질도입시킨 벡터에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 2개의 벡터가 T 세포를 형질도입시키는 데 사용되며, 하나는 CAR을 발현하고, 하나는 융합 단백질을 발현한다.
재조합 발현 벡터는, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001; 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994]에 기재된 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 원형 또는 선형인, 발현 벡터의 구축물은 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포에서 복제계 기능성을 함유하도록 제조될 수 있다. 복제계는 예를 들어 예를 들어, ColEl, 2μ 플라스미드, λ, SV40, 소 유두종 바이러스, 등으로부터 유도될 수 있다.
재조합 발현 벡터는, 형질전환된 또는 형질감염된 숙주의 선택을 가능하게 하는, 하나 이상의 마커 유전자를 포함할 수 있다. 마커 유전자는 살생물제 내성, 예를 들어 항생제, 중금속, 등에 대한 내성, 자가영양성 등을 제공하기 위한 영양요구주에서의 상보성, 등을 포함한다. 재조합 발현 벡터에 대한 적합한 마커 유전자는 예를 들어, 네오마이신/G418 내성 유전자, 푸로마이신 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 히스티디놀 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 및 암피실린 내성 유전자를 포함한다.
본 개시의 맥락에서 유용한 벡터는 "네이키드" 핵산 벡터(즉, 그를 캡슐화하는 단백질, 당, 및/또는 지질이 적거나 없는 벡터), 또는 다른 분자와 복합체화된 벡터일 수 있다. 벡터와 적합하게 조합될 수 있는 다른 분자는 바이러스성 코트, 양이온성 지질, 리포좀, 폴리아민, 금 입자, 및 세포 분자를 표적화하는 항체, 수용체, 또는 리간드와 같은 표적 모이어티를 제한 없이 포함한다.
벡터 DNA는 통상의 형질전환 또는 형질감염 기술을 통하여, 세포, 예를 들어 면역 세포(예를 들어, T 세포) 내로 도입될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "형질전환" 및 "형질감염" 및 "형질도입"은 외래 핵산(예를 들어, DNA)을 세포 내로 도입하기 위한 각종 기술-인지된 기술을 지칭하고자 의도되며, 인산칼슘 또는 염화칼슘 공침전, DEAE-덱스트란-매개된 형질감염, 리포펙션, 유전자총 또는 전기천공법을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 면역 세포(예를 들어, T 세포)는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 특이적 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 통합 벡터로 형질도입된다. 일부 구현예에서, 통합 발현 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 발현 작제물은 트랜스포존 기술을 이용하여 도입된다. 일부 구현예에서, 발현 작제물은 전기천공, 예를 들어, 메신저 RNA(mRNA)의 전기천공을 사용하여 도입된다. 일부 구현예에서, 통합 벡터는 다수의 요소, 예를 들어, CAR 서열 및 하나 이상의 추가 요소를 발현한다. 일부 구현예에서, 추가 요소는 융합 단백질, 항체 또는 이의 단편, 자연 단백질, 사이토카인 및 펩티드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, CAR 서열은 절단 가능한 요소, 예를 들어, P2A 또는 T2A 서열에 의해 추가 요소 또는 요소들로부터 분리된다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 발현된 생성물은 CAR19 서열; 2A 절단 가능한 서열; CD19 또는 이의 도메인 또는 변이체; 추가 요소 1; 추가 요소 2를 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 발현된 생성물은 CD19 또는 이의 도메인 또는 변이체; 추가 요소 1; 추가 요소 2; 2A 절단 가능한 서열; 및 CAR19 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 발현된 생성물은 CAR19 서열; 2A 절단 가능한 서열; 추가 요소 1; 추가 요소 2; 및 CD19 또는 이의 도메인 또는 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 발현된 생성물은 추가 요소 1; CD19 또는 이의 도메인 또는 변이체; 추가 요소 2; 2A 절단 가능한 서열; 및 CAR19 서열을 포함한다.
단백질 치료제
일부 양태에서, 본원에 기재된 CD19 변이체, 또는 CD19 변이체를 포함하거나 이로 구성되는 융합 단백질은 본원에 기재된 세포 치료제에 의해 생성되는 것 대신 또는 생성되는 것에 더하여 치료제로서 생성되고 사용될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 조성물, 예를 들어, 약학적 조성물에 포함될 수 있고, 단백질 치료제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, CD19 변이체를 포함하는 단백질 치료제는 CD19를 표적으로 하는 세포 치료제, 예를 들어, CAR-T 세포 또는 ADC와 조합하여 투여될 수 있다.
폴리펩티드의 각종 제조 방법은 당 분야에 알려져 있으며, 폴리펩티드가 단백질 치료제에 포함되도록 만드는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 발현하도록 엔지니어링된 숙주 세포계를 이용하여 재조합적으로 생산될 수 있다. 유전자의 재조합 발현은 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 발현 벡터의 구축을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 일단 수득되면, 폴리펩티드의 생산을 위한 벡터는 당 분야에서 알려진 기술을 이용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 알려진 방법은 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하는 발현 벡터 및 적절한 전사 및 번역 제어 서열을 구축하는 데 사용될 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어 시험관 내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체 내 유전학적 재조합을 포함한다.
발현 벡터는 통상의 기술에 의해 숙주 세포에 전달될 수 있고, 형질감염된 세포는 폴리펩티드를 생산하기 위해 통상의 기술에 의해 이후 배양될 수 있다.
각종 숙주 발현 벡터 시스템이 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,807,715호). 그러한 숙주-발현계는 폴리펩티드를 생산하는 데 사용될 수 있으며, 바람직한 경우, 이후 정제된다. 그러한 숙주 발현계는 미생물을 포함하며, 예컨대 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하는 코스미드 DNA 발현 벡터 박테리아(예를 들어, 대장균 및 B. 서브틸리스(B. subtilis)); 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예를 들어, 사카로마이세스 및 피키아); 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포계; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염된 또는 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질감염된 식물 세포계; 또는 포유동물 세포의 유전체로부터 유래된 프로모터(예를 들어 메탈로시아닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구축물을 운반하는 포유동물 세포계(예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, NS0, 및 3T3 세포)가 있다.
박테리아계의 경우, 다수의 발현 벡터가 사용될 수 있으며, 대장균 발현 벡터 pUR278(문헌[Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791]); pIN 벡터(문헌[Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509]); 등을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. pGEX 벡터는 글루타티온 5-트랜스퍼라제(GST)를 갖는 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현하는 데 사용될 수도 있다.
포유동물 숙주 세포에서의 발현을 위해, 바이러스-기반 발현계가 사용될 수 있다(예를 들어 문헌[Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359] 참조). 발현의 효능은 적절한 전사 증진제 성분, 전사 종결자, 등의 포함에 의해 증진될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544] 참조).
추가적으로, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 요구된 특정 방식으로 유전자 산물을 변형하고 가공하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 상이한 숙주 세포는 특징적이고, 단백질 및 유전자 산물의 번역후 가공 및 변경을 위한 특징적이고 특이적 메커니즘을 갖는다. 발현된 폴리펩티드의 정확한 변경 및 가공을 보장하기 위하여 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 그러한 세포는 예를 들어 확립된 포유동물 세포주 및 곤충 세포주, 동물 세포, 진균 세포, 및 효모 세포를 포함한다. 포유동물 숙주 세포는 예를 들어, BALB/c 마우스 골수종주(NSO/l, ECACC No: 85110503); 인간 망막아세포(PER.C6, CruCell, Leiden, The Netherlands); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장주(현탁액 배양에서의 성장을 위해 부클로닝된 293 또는 293 세포, 문헌[Graham et al., J. Gen Virol., 36:59,1977]); 인간 섬유육종 세포주(예를 들어, HT1080); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포 +/-DHFR(CHO, 문헌[Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980]); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 초록 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1 587); 인간 자궁경부 암종 세포(HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 쥐 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양주(Hep G2)를 포함한다.
재조합 단백질의 장기간, 고수율 생산을 위해, 숙주 세포는 폴리펩티드를 안정하게 발현하도록 엔지니어링된다. 숙주 세포는 당 분야에서 알려진 적절한 발현 제어 요소에 의해 제어된 DNA로 형질전환될 수 있으며, 이는 프로모터, 증진제, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위, 및 선택성 마커를 포함한다. 재조합 DNA 기술 분야에서 일반적으로 알려진 방법은 원하는 재조합 클론을 선택하도록 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 단백질이 재조합 발현에 의해 일단 생산되면, 이는 당 분야에서 알려진 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화도, 및 크기분별(sizing) 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도에 의해, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 항체는 Protein A 컬럼과 같은 친화도 컬럼을 크로마토그래피 컬럼과 적절히 선택 및 조합하고, 여과, 초여과, 염석(salting-out) 및 투석 절차에 의해 분리 및 정제될 수 있다(문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 참조). 추가로 본 명세서에 기재된 바와 같이, 폴리펩티드는 이종성 폴리펩티드 서열에 융합될 수 있어서 정제를 촉진한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 폴리펩티드는 화학 합성에 의해 부분적으로 또는 전체적으로 제조될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 폴리펩티드 또는 융합 단백질은 자연 공급원으로부터 정제될 수 있다.
바이러스 전달
일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 CD19 변이체 융합 단백질)을 인코딩하는 핵산은 바이러스 벡터에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 바이러스 벡터는 융합 단백질을 암세포(예를 들어, 종양 세포)에 도입시키는 데 사용될 수 있다. 상기 융합 단백질의 도입은 대상체의 면역계 및/또는 하나 이상의 추가 치료제에 대한 감수성을 증가시킬 수 있다(예를 들어, WO2017/075533호 참조).
벡터 설계
본원에 기재된 CD19 변이체 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 다수의 유형의 벡터로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드로 클로닝될 수 있다. 다른 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 시퀀싱 벡터 및 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 벡터는 스푸마바이러스로부터 제조된 레트로바이러스 벡터의 유형인 포미 바이러스(foamy virus; FV) 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터 설계 및 기술은 문헌[Sambrook et al, (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2001)], 및 다른 바이러스학 및 분자생물학 메뉴얼에 기재된 바와 같이 당 분야에 널리 공지되어 있다.
바이러스 형질도입
바이러스는 감염된 숙주 면역계에 의한 검출을 종종 피하면서 특성 세포 유형으로의 핵산 전달에 매우 효율적이다. 이들 특징은 특정 바이러스를 세포 요법 표적의 암 세포, 예를 들어, 고형 종양 세포로의 도입을 위한 비히클로서 매력적인 후보로 만든다. 다수의 바이러스 기반 시스템이 포유동물 세포로의 유전자 전달을 위해 개발되어 왔다. 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 헤르페스 1 바이러스, 헤르페스 바이러스, 온코바이러스(예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능성인 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선택 가능한 마커를 함유한다(예를 들어, WO 01/96584호; WO 01/29058호; 및 미국 특허 번호 6,326,193호).
렌티바이러스 및 레트로바이러스 형질도입은 레트로바이러스 형질도입의 효율을 증가시키는 데 사용되는 양이온성 중합체인 폴리브렌(SantaCruz sc-134220; Millipore TR-1003-G; Sigma 107689)(헥사메트린 브로마이드로도 공지됨)의 첨가에 의해 향상될 수 있다.
예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템에 대한 플랫폼을 제공한다. 레트로바이러스는 레트로바이러스과의 바이러스 과에 속하는 외피 바이러스이다. 일단 숙주의 세포에서, 바이러스는 이의 RNA를 DNA로 전사하기 위해 바이러스 역전사효소를 사용하여 복제된다. 레트로바이러스 DNA는 숙주 유전체의 일부로서 복제되며, 이는 프로바이러스로 지칭된다. 선택된 유전자는 당 분야에 공지된 기술을 이용하여 벡터로 삽입될 수 있고, 레트로바이러스 입자로 패키징될 수 있다. 이후, 재조합 바이러스는 생체 내에서서 분리되고, 대상체의 세포로 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,994,136호, 6,165,782호 및 6,428,953호 참조).
레트로바이러스는 알파레트로바이러스의 속(예를 들어, 조류 백혈증 바이러스), 베타레트로바이러스의 속(예를 들어, 마우스 유암 바이러스), 델타레트로바이러스의 속(예를 들어, 소 백혈병 바이러스 및 인간 T-림프친화성 바이러스), 엡실론레트로바이러스의 속(예를 들어, 각막백반 피부 육종 바이러스), 및 렌티바이러스의 속을 포함한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는, 예를 들어, 긴 인큐베이션 기간을 특징으로 하는 레트로바이러스과의 바이러스속인 렌티바이러스이다. 렌티바이러스는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 점에서 레트로바이러스 중에서 독특하며; 이들은 숙주 세포의 DNA로 유의한 양의 유전 정보를 전달할 수 있어, 효율적인 유전자 전달 벡터로 사용될 수 있다. 일부 예에서, 렌티바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1 및 HIV-2), 원숭이 면역결핍 바이러스(S1V), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 말 감염 빈혈(EIA), 및 비스나 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 생체 내에서 유의한 수준의 유전자 전달을 달성하는 수단을 제공한다.
일부 구현예에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 아데노바이러스는 이중 가닥 DNA를 함유하는 바이러스의 큰 과이다. 이들은 숙주 세포의 DNA를 복제하는 한편, 숙주의 세포 기구를 사용하여 바이러스 RNA DNA 및 단백질을 합성한다. 아데노바이러스는 복제 및 비-복제 세포 둘 모두에 영향을 미치고, 큰 트랜스진을 수용하고, 숙주 세포 유전체로 통합되지 않고 단백질을 코딩하는 것으로 당 분야에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, AAVP 벡터가 사용된다. AAVP 벡터는 재조합 아데노-관련 바이러스 및 파지의 유전적 시스-요소의 키메라인 원핵생물-진핵생물 벡터의 하이브리드이다. AAVP는 파지 및 AAV 벡터 시스템 둘 모두의 선택된 요소를 조합하여 박테리아에서 생성하기에 간단하고 패키징 한계가 거의 없거나 없는 벡터를 제공하는 한편, 숙주 염색체로의 통합과 조합된 포유동물 세포의 감염을 허용한다. 많은 적절한 요소를 함유하는 벡터가 상업적으로 이용 가능하며, 필요한 서열을 포함하도록 표준 방법론에 의해 추가로 변형될 수 있다. 무엇보다도, AAVP는 헬퍼 바이러스 또는 트랜스-작용 요소를 필요로 하지 않는다. 또한, AAV 캡시드 형성이 없으므로 포유동물 세포에 대한 AAV의 고유 향성이 제거된다. 다른 방법 및 세부사항은 미국 특허 8,470,528호 및 문헌[Hajitou A. et al., Cell, 125: 358-398]에 있다.
일부 구현예에서, 인간 유두종(HPV) 슈도바이러스가 사용된다. DNA 플라스미드는 유두종바이러스 L1 및 L2 캡시드 단백질로 패키징되어 DNA를 효율적으로 전달할 수 있는 슈도비리온을 생성할 수 있다. 캡슐화는 뉴클레아제로부터 DNA를 보호할 수 있고, 높은 수준의 안정성으로 표적화된 전달을 제공할 수 있다. 바이러스 벡터의 사용과 관련된 많은 안전성 우려는 HPV 슈도바이러스로 완화될 수 있다. 다른 방법 및 예는 문헌[Hung, C., et al.,Plos One, 7:7(e40983); 2012, 미국 특허 8,394,411호, 및 Kines, R., et al Int J of Cancer, 2015]에 있다.
일부 구현예에서, 종양용해성 바이러스가 사용된다. 종양용해성 바이러스 요법은 암 세포에서 바이러스를 선택적으로 복제할 수 있으며, 이후, 예를 들어, 정상 조직에 영향을 미치지 않으면서 종양 내에 퍼질 수 있다. 대안적으로, 종양용해성 바이러스는 정상 조직에 손상을 야기시키지 않고 세포를 우선적으로 감염시키고 사멸시킬 수 있다. 종양용해성 바이러스는 또한 자신뿐만 아니라 감염된 종양 세포에 대한 면역 반응을 효과적으로 유도할 수 있다. 전형적으로, 종양용해성 바이러스는 2개의 부류에 해당한다: (I) 암 세포에서 자연적으로 우선적으로 복제하고, 인간에서 비병원성인 바이러스. 예시적 부류 (I) 종양용해성 바이러스는 자율 파르보바이러스, 점액종 바이러스(폭스바이러스), 뉴캐슬병 바이러스(NDV; 파라믹소바이러스), 레오바이러스 및 세네카 밸리 바이러스(피코르나바이러스)를 포함한다. 제2 부류(II)는 홍역 바이러스(파라믹소바이러스), 폴리오바이러스(피코르나바이러스) 및 백시니아 바이러스(폭스바이러스)를 포함하는 백신 벡터로서 사용하기 위해 유전적으로 조작된 바이러스를 포함한다. 또한, 종양용해성 바이러스는 정상 세포에서는 복제에 필요하나 아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 및 소수포구내염 바이러스를 포함하는 암 세포에서는 그렇지 않은 유전자에서의 돌연변이/결실로 유전적으로 조작된 것을 포함할 수 있다. 종양용해성 바이러스는 다수의 경로를 표적화하고 종양 선택적 방법으로 복제할 수 있으므로 이의 낮은 유전적 유전적 저항성의 가능성으로 인해 바이러스 형질도입 방법으로서 사용될 수 있다. 종양 내의 바이러스 용량은 제자리 바이러스 증폭으로 인해 시간이 지남에 따라 증가할 수 있으며(시간이 지남에 따라 감소하는 소분자 요법에 비함), 안전성 특징이 내장될 수 있다(즉, 약물 및 면역 민감성).
투여
본 개시의 특정 구현예는, 본 명세서에 기재된 세포 치료제(또는 그의 개체군), 본 명세서에 기재된 단백질 치료제, 세포 치료제를 포함하는 조성물, 및/또는 단백질 치료제를 포함하는 조성물을 예를 들어 대상체를 치료하는 데 효과적인 양으로 대상체에게 투여하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에서 암을 효과적으로 치료한다.
일부 구현예에서, 세포 치료제는 면역 세포를 획득한 동일한 대상체에 투여되는 자가 세포를 포함한다. 대안적으로, 면역 세포는 대상체로부터 획득되고, 본원에 기재된 발현 작제물로 형질전환, 예를 들어, 형질도입되어 또 다른 대상체로 동종으로 전달되는 세포 치료제를 획득한다.
일부 구현예에서, 세포 치료제는 대상체에 대해 자가이며, 대상체는 면역학적으로 나이브, 면역화된, 질병에 걸린, 또는 대상체로부터의 면역 세포의 분리 전의 또 다른 상태일 수 있다.
일부 구현예에서, 추가 단계는 대상체로의 투여 전에 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포 치료제는 대상체로의 투여 전에 면역 세포를 본원에 기재된 발현 작제물과 접촉(예를 들어, 형질도입 또는 형질감염)시킨 후에 시험관 내에서 확장될 수 있다. 시험관 내 확장은 대상체로의 투여 전에 1일 이상, 예를 들어, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 6일 이상 또는 8일 이상 동안 진행될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 시험관 내 확장은 대상체로의 투여 전에 21일 이하, 예를 들어, 18일 이하, 16일 이하, 14일 이하, 10일 이하, 7일 이하 또는 5일 이하 동안 진행될 수 있다. 예를 들어, 시험관 내 확장은 대상체로의 투여 전에 1 내지 7일, 2 내지 10일, 3 내지 5일 또는 8 내지 14일 동안 진행될 수 있다.
일부 구현예에서, 시험관 내 확장 동안, 세포 치료제는 항원(예를 들어, TCR 항원)으로 자극될 수 있다. 항원 특이적 확장은 선택적으로 비-특이적으로 림프구 증식, 예컨대 예를 들어, 항-CD3 항체, 항-Tac 항체, 항-CD28 항체, 또는 식물성응집소(PHA)를 자극하는 조건 하에서 확장으로 보충될 수 있다. 확장된 세포 치료제는 대상체 내로 직접 투여될 수 있거나, 미래의 사용, 즉 대상체로의 이후의 투여를 위해 냉동될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 치료제는 암환자 내로의 주입 전에, 인터류킨-2(IL-2)로 생체 외 치료되고, 암환자는 주입 전에 IL-2로 치료된다. 나아가, 일부 구현예에서, 암환자는 세포 치료제의 투여 전에 예비 림프구 고갈(면역계의 일시적 제거)에 처한다. IL-2 치료 및 예비 림프구 고갈의 조합은 세포 치료제의 지속성을 증진시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 치료제는 사이토카인을 암호화하는 핵산으로 형질도입 또는 형질감염되며, 상기 핵산은 사이토카인의 항시적, 조절성, 또는 일시-제어된 발현을 제공하도록 엔지니어링될 수 있다. 적합한 사이토카인은, 예를 들어 기억 T 림프구의 형성 및 생존을 촉진할 수 있는 수축기 동안 T 림프구의 생존을 증진시키는 작용을 하는 사이토카인을 포함한다.
특정 구현예에서, 세포 치료제는 암 치료제와 같은 다른 치료제의 투여 전, 실질적으로 동시에, 또는 투여 후에 투여된다. 암 치료제는 예를 들어 화학 치료제, 생물학제, 또는 방사선치료일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 치료제를 수령하는 대상체는 림프구고갈 화학요법 또는 방사선 치료법과 같이 면역 세포의 고갈을 유발하기에 충분한 치료를 투여받지 않는다.
본 명세서에 기재된 세포 치료제는 조성물, 예를 들어 세포 치료제 및 약학적으로 허용 가능한 담체로서 형성될 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 세포 치료제 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물이다. 본 명세서에 기재된 약학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어 비히클, 보조제, 부형제, 및 희석제는 널리 알려져 있으며, 당업자가 쉽게 이용가능하다. 바람직하게는, 약학적으로 허용 가능한 담체는 활성제(들), 예를 들어 세포 치료제에 대해 화학적으로 불활성이며, 사용 조건에서 어떤 유해한 부작용 또는 독성도 일으키지 않는다.
조성물은, 예를 들어 정맥내, 종양 내, 동맥내, 근육내, 복강내, 경막내, 경막외, 및/또는 피하 투여 경로와 같은 임의의 적합한 경로에 의한 투여를 위해 조제될 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 비경구 경로 투여를 위해 조제될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 수성 또는 비수성, 등장성 멸균 주사 용액일 수 있으며, 이는 예를 들어 조성물이 의도된 수령자의 혈액과 등장성이 되도록 하는, 항산화제, 완충제, 정균제, 및 용질을 함유할 수 있다. 수성 또는 비수성 멸균 현탁액은 하나 이상의 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 및 보존제를 함유할 수 있다.
대상체, 특히 인간에게 투여되는 투여량은 특정 구현예, 사용되는 조성물, 투여 방법, 및 치료되는 특정 부위 및 대상체에 따라 변할 것이다. 그러나, 용량은 치료 반응을 제공하기에 충분해야 한다. 당업자는 특정 의학적 상태를 치료하거나 예방하기 위해 인간 또는 다른 대상체에 투여될 조성물의 치료적 유효량을 결정할 수 있다. 치료적으로 효과적인 데 필요한 조성물의 정확한 양은 많은 대상체 특이적 고려사항에 더하여 다수의 요인, 예를 들어, 세포 치료제의 특정 활성, 및 투여 경로, 종양 세포(예를 들어, 종양 벌크 또는 종양 버더(burder)의 정도의 결과로서) 및/또는 정상 세포 상의 이용 가능한 항원 또는 항원들의 양에 의존할 것이며, 이는 당 분야의 기술 내에 속한다. 일부 구현예에서, 특정 암 적응증 또는 적응증들에 대한 세포 치료제에 대한 적절한 용량은 용량-증가 임상 시험에서 정의될 수 있다.
임의의 적합한 수의 세포 치료제 세포가 대상체에게 투여될 수 있다. 본 명세서에 기재된 단일한 세포 치료제는 치료 이익을 확장 및 제공할 수 있는 한편, 일부 구현예에서, 102 이상, 예를 들어, 103 이상, 104 이상, 105 이상 또는 108 이상의 세포 치료제 세포가 투여된다. 대안적으로 또는 추가적으로 1012 이하, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 1011 이하, 109 이하, 107 이하, 또는 105 이하의 세포 치료제 세포가 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 102-105, 104-107, 103-109, 또는 105-1010 세포 치료제 세포가 투여된다.
본 명세서에 기재된 세포 치료제의 용량은 포유동물에게 1회, 또는 적합한 기간에 걸쳐 일련의 하위용량으로, 예를 들어 필요에 따라, 매일, 주 2회, 매주, 격주, 월 2회, 격월, 년 2회, 또는 년 단위로 투여될 수 있다. 유효량의 세포 치료제를 포함하는 투여량 단위는 1일 1회로 투여될 수 있거나, 총 1일 투여량은 2, 3, 4 이상 나누어진 용량으로 필요에 따라 매일 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 폴리펩티드는 약학 조성물(예를 들어, 단백질 치료제로서의 이용) 내에 포함될 수 있다. 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물은 당업자에게 알려진 방법에 의해 조제될 수 있다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences pp. 1447-1676(Alfonso R. Gennaro, ed., 19th ed. 1995)] 참조). 약학 조성물은 물이나 다른 약학적으로 허용 가능한 액체 중 현탁액 또는 멸균 용액을 포함하는 주사 가능한 제형의 형태로 비경구적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 약학 조성물은 폴리펩티드를 약학적으로 허용 가능한 비히클 또는 배지, 예컨대 멸균수 및 생리학적 식염수, 식물성유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정화제, 착향 부형제, 희석제, 비히클, 보존제, 결합제와 적절히 조합하고, 이어서 일반적으로 허용되는 약학적 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼합함으로써 조제될 수 있다. 약학 제제 내에 포함된 활성 성분의 양은, 지정된 범위 내의 적합한 용량이 제공되도록 하는 양이다.
주입을 위한 멸균 조성물은 비히클로서 주입용 증류수를 이용하여 통상의 약학적 실시에 따라 조제될 수 있다. 예를 들어, 생리학적 식염수 또는 글루코오스 함유 등장성 용액 및 D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨 및 염화나트륨과 같은 기타 보충제는 주입을 위해 수용액으로서 사용될 수 있으며, 선택적으로 적합한 가용화제, 예를 들어 에탄올과 같은 알코올 및 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 다가알코올, 및 폴리소르베이트 80™, HCO-50 등과 같은 비이온성 계면활성제와 조합하여 사용될 수 있다.
오일성 액체의 비제한적인 예는 참기름 및 대두유를 포함하며, 이는 가용화제로서 벤질 벤조에이트 또는 벤질 알코올과 조합될 수 있다. 포함될 수 있는 기타 아이템으로 포스페이트 완충액과 같은 완충액 또는 나트륨 아세테이트 완충액, 염산 프로카인과 같은 수딩제(soothing agent), 벤질 알코올 또는 페놀과 같은 안정화제, 및 항산화제가 있다. 제형화된 주사는 적합한 앰플 내로 포장될 수 있다.
투여 경로는 비경구적 투여일 수 있으며, 예를 들어 주사, 경비성(transnasal) 투여, 경폐성 투여, 또는 경피성 투여가 있다. 투여는 정맥 주사, 근육내 주사, 복막내 주사, 피하 주사에 의한 전신 또는 국소적일 수 있다.
투여의 적합한 방식은 대상체의 연령 및 상황에 기반하여 선택될 수 있다. 폴리펩티드를 함유하는 약학 조성물의 단일 용량은 0.001 내지 1000 ㎎/㎏의 체중 범위로부터 선택될 수 있다. 한편, 용량은 0.001 내지 100000 ㎎/체중의 범위 내에서 선택될 수 있지만, 본 개시는 그러한 범위로 한정되지 않는다. 투여의 용량 및 방법은 대상체의 체중, 연령, 상태 등에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에 의해 필요에 따라 적합하게 선택될 수 있다.
종양
본 개시는 임의의 종양의 치료에 유용한 기술을 제공한다. 일부 구현예에서, 종양은 혈액학적 악성 종양이거나 그를 포함하며, 이는 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 모발세포 백혈병, AIDS-관련 림프종, 호지킨성 림프종, 비-호지킨성 림프종, 랑게르한스 세포 조직구증, 다발성 골수종, 또는 골수증식성 신생물을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 종양은 고형 종양이거나 그를 포함하며, 이는 유방암종, 편평상피 세포 암종, 결장암, 두경부 암, 난소암, 폐암, 중피종, 비뇨생식기 암, 직장암, 위암 또는 식도암을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다.
일부 특정 구현예에서, 종양은 진행된 종양, 및/또는 난치성(refractory) 종양이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 종양은 특정 병상이 종양에서 관찰되는 경우(예를 들어, 생검 샘플과 같이, 종양으로부터 수득된 조직 샘플에서), 및/또는 그러한 종양을 갖는 암 환자가 통상의 화학요법에 대한 후보자가 아닌 것으로 전형적으로 간주되는 경우, 진행된 것으로서 특징화된다. 일부 구현예에서, 진행된 것으로서 종양을 특징화하는 병상은 종양 크기, 유전학적 마커의 변경된 발현, 종양 세포에 의한 인접 기관 및/또는 림프절의 침입을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 종양은 그러한 종양을 갖는 환자가 하나 이상의 알려진 치료 방식에 대해 내성을 갖는 경우(예를 들어, 하나 이상의 통상의 화학치료 방식) 및/또는 하나 이상의 그러한 알려진 치료 방식에 대해 특정 환자가 증명된 내성(예를 들어, 반응성 결여)을 갖는 경우 난치성인 것으로서 특징화된다.
병용 요법
본 명세서에 기재된 바와 같이, 일부 구현예에서, 세포 치료제 및/또는 단백질 치료제는 제2 세포 치료제, 항체-약물 컨쥬게이트, 항체 및/또는 폴리펩티드와 조합되어 투여된다. 일부 구현예에서, 제2 세포 치료제(예를 들어, CAR-T 세포)에 의한 종양 표적 및/또는 사멸의 정도는 본 명세서에 기재된 세포 치료제 또는 단백질 치료제를 이용한 병용 요법 부재 하에서 관찰되거나 측정된 수준보다 높다(예를 들어, 부가적 또는 상승작용적).
본 명세서에 기재된 세포 치료제 및/또는 단백질 치료제를 포함하는 약학 조성물은 하나 이상의 추가적인 치료제, 예컨대 암 치료제, 예를 들어 화학치료제 또는 생물제를 선택적으로 함유 및/또는 그와 조합되어 투여될 수 있다. 본 명세서에 기재된 세포 치료제와 조합되어 사용될 수 있는 화학치료제의 예로는 백금 화합물(예를 들어, 시스플라틴, 카보플라틴, 및 옥살리플라틴), 알킬화제(예를 들어, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 클로람부실, 질소 머스타드, 티오테파, 멜팔란, 부설판, 프로카바진, 스트렙토조신, 테모졸로미드, 다카르바진, 및 벤다무스틴), 항종양 항생제(예를 들어, 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 블레오마이신, 마이토마이신 C, 플리카마이신, 및 닥티노마이신), 탁산(예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀), 항대사물질(예를 들어, 5-플루오로우라실, 시타라빈, 프리메트렉시드, 티오구아닌, 플록수리딘, 카페시타빈, 및 메토트렉세이트), 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 플루다라빈, 클로파라빈, 클라드리빈, 펜토스타틴, 및 넬라라빈), 토포아이소머라제 억제제(예를 들어, 토포테칸 및 이리노테칸), 하이포메틸화제(예를 들어, 아자시티딘 및 데시타빈), 프로테오솜 억제제(예를 들어, 보르테조밉), 에피포도필로톡신(예를 들어, 에토포시드 및 테니포시드), DNA 합성 억제제(예를 들어, 히드록시우레아), 빈카 알칼로이드(예를 들어, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 및 빈블라스틴), 티로신 키나아제 억제제(예를 들어, 이마티닙, 다사티닙, 닐로티닙, 소라페닙, 및 수니티닙), 니트로소우레아(예를 들어, 카르무스틴, 포테무스틴, 및 로무스틴), 헥사메틸멜라민, 미토탄, 혈관형성 억제제(예를 들어, 탈리도미드 및 레날리도미드), 스테로이드(예를 들어, 프레드니손, 덱사메타손, 및 프레드니솔론), 호르몬제(예를 들어, 타목시펜, 랄록시펜, 류프롤리드, 바이칼루아트미드, 그래니세트론, 및 플루타미드), 아로마타제 억제제(예를 들어, 레트로졸 및 아나스트로졸), 3산화 비소, 트레티노인, 비선택적 시클로옥시게나제 억제제(예를 들어, 비스테로이드성 소염제, 살리실레이트, 아스피린, 피록시캄, 이부프로펜, 인도메타신, 나프로신, 디클로페낙, 톨메틴, 케토프로펜, 나부메톤, 및 옥사프로진), 선택적 시클로옥시게나아제-2(COX-2) 억제제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 생물제의 예는 단일클론성 항체(예를 들어, 리툭시맙, 세툭시맙, 파네투누맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, 알렘투주맙, 젬투주맙 오조가마이신, 베바시주맙, 카투막소맙, 데노수맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 라무시루맙, 퍼투주맙, 이필리무맙, 니볼루맙, 니모투주맙, 람브롤리주맙, 피딜리주맙, 실툭시맙, BMS-936559, RG7446/MPDL3280A, MEDI4736, 트레멜리무맙, 또는 본 명세서의 표 1에 열거된 것들), 효소(예를 들어, L-아스파라기나제), 사이토카인(예를 들어, 인터페론 및 인터류킨), 성장 인자(예를 들어, 콜로니 자극 인자 및 에리트로포이에틴), 암 백신, 유전자 치료 벡터 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 치료 방법은, 다른 질병의 치료가 실패했거나 다른 수단을 통한 치료에서 덜 성공적이었던 대상체 상에서 수행된다. 추가적으로, 본 명세서에 기재된 치료 방법은 질병의 하나 이상의 추가의 치료와 함께 수행될 수 있다. 예를 들어, 방법은 암 치료방식, 예를 들어 비골수파괴성 화학요법, 외과적 수술, 호르몬 요법, 및/또는 방사선을, 본 명세서에 기재된 세포 치료제 및/또는 단백질 치료제, 또는 이의 조성물의 투여 전, 실질적으로 동시에, 또는 투여 후에, 투여하는 것을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 세포 치료제 및/또는 단백질 치료제가 투여되는 대상체는 항생제 및/또는 하나 이상의 추가의 약제로 치료될 수도 있다.
본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 이들의 전체내용이 참조로서 포함된다. 또한, 물질, 방법, 및 예는 단지 예시이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 이용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질이 본원에 기재된다.
본 발명의 개시의 예시적 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 하기 표에 나열되어 있다:
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
본 발명의 개시는 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 개시의 범위 또는 내용을 제한하는 것으로 해석되어선 안 된다.
실시예
실시예 1 - CD19 조합 라이브러리
개선된 구조적 온전성을 갖는 CD19의 세포외 도메인(이하 CD19로 언급됨; SEQ ID NO:2)을 효모 표면 디스플레이(Boder et al., Nat. Biotechnol. 15: 553-557 (1997)) 및 형광-활성화 세포 분류(Chao et al., Nat. Protoc. 1:755-768 (2006))를 이용한 선택을 통해 조합 라이브러리로부터 확인하였다. 2개의 조합 라이브러리를 생성시켰다. 첫 번째 라이브러리에서, 모든 아미노산은 20개 모두의 정규 아미노산으로 독립적으로 다양화되었고, 즉, 모든 단일-잔기 돌연변이가 포함되었다. 유일한 예외는 다양화에서 제외된 L165 및 S166, 및 NNC 축퇴성 코돈을 사용하여 15개의 아미노산으로 다양화된 S164였으며, 둘 모두는 단백질 인코딩 유전자 서열 내에 닉킹 엔도뉴클레아제 인지 DNA 서열을 포함시키는 요건이었다. 두 번째 라이브러리에서, 2개 또는 3개의 아미노산의 선택 조합을 동시에 돌연변이시켜 부가적 및 상승작용적 돌연변이를 확인하였다(도 2).
돌연변이체 CD19 유전자를 각각의 다양화된 부위에서 NNK 코돈과 함께 닉킹 돌연변이유발(Wrenbeck et al., Nat. Methods 13:928-930 (2016))을 이용하여 생성시키고, pCT-Aga2p-CD19-MYC 효모 디스플레이 벡터에 도입하고, 효모로 형질전환시켰다. 단일 및 삼중 돌연변이 라이브러리를 이들의 다양화 위치에 기초하여 각각 3개 내지 2개의 푸울로 분할하여, 이들의 돌연변이가 Illumina 딥 시퀀싱을 통해 확인될 수 있도록 하였다(하나의 판독으로 전체 CD19 유전자를 효율적으로 시퀀싱할 수 없음). 단일 1은 SEQ ID NO:2의 부위 1P 내지 92W 에 해당한다. 단일 2는 SEQ ID NO:2의 부위 93T 내지 156P에 해당한다. 단일 3은 SEQ ID NO:2의 부위 157P 내지 272K에 해당한다. 삼중 1은 도메인 1의 세트(도 2의 첫 15행)에 해당하고, 삼중 2는 도메인 2의 세트(도 2의 뒤의 12행)에 해당한다. 105 내지 106개의 고유 라이게이션 형질전환체를 각각의 라이브러리에 대해 획득하였고, 이는 싱글렛 라이브러리에서 가능한 서열의 29 내지 98배 오버샘플링 및 트리플렛 라이브러리에서 1.1 내지 2.4배 오버샘플링을 제공하였다.
CD19 변이체를 실시예 2 내지 4에 기재된 바와 같이 3개의 선택 모드를 통해 각각의 라이브러로부터 확인하였다: (1) 입체형태 의존적 항체 FMC63 및 4G7에 결합하는 능력; (2) 프로테이나제 K에 노출시 절단에 대한 내성; 및 (3) 열 스트레스(37℃) 하에서 유도시 효모 표면 디스플레이의 정도.
실시예 2. 항체 결합
항체 FMC63 및 4G7은 포유동물 세포 배양에서 생성된 야생형 CD19에 결합하지만, 효모 디스플레이된 야생형 CD19에는 그렇지 않은 것으로 나타났다(도 3). 대조적으로, 항체 UmAb103 및 3B10은 효모 디스플레이된 야생형 CD19에 효과적으로 결합하였다(도 3). 특히, UmAb103 및 3B10은 CD19의 상승된 열 처리 후에도 효모 디스플레이된 야생형 CD19에 결합할 수 있었다(도 3). 이들 결과는 UmAb103 및 3B10이 효모 디스플레이된 야생형 CD19 상에 용이하게 제시되는 비-입체형태 에피토프에 결합하는 반면, FMC63 및 4G7은 야생형 CD19의 효모 디스플레이된 버전에 적절하게 재현되지 않는 에피토프에 결합하는 것을 시사한다.
따라서, FMC63 및/또는 4G7에 대한 결합을 회복하는 CD19 변이체는 구조적으로 개선된 CD19 변이체로 확인되었다. 기능적 돌연변이체는 분류되지 않은 라이브러리에서는 드물지만 존재한다(도 4). 흐름세포측정법 분류는 이들 개선된 변이체를 분리하였고(도 4), 이는 Illumina MiSeq 딥 시퀀싱을 통해 확인되었다. 통계 분석은 유의하게 농축된 변이체를 나타내었다(표 1A 및 표 1B).
[표 1A]
FMC63 및 4G7에 대한 개선된 결합을 갖는 단일 돌연변이체:
Figure pct00023
[표 1B]
FMC63 및 4G7에 대한 개선된 결합을 갖는 삼중 돌연변이체:
Figure pct00024
실시예 3. 프로테아제 내성
프로테이나제 K를 이용한 효모 디스플레이된 야생형 CD19의 처리는 인큐베이션 시간, 프로테아제 농도 및 CD19 안정성에 따라 단백질의 부분적 절단을 발생시켰다. 이는 N-말단 HA 에피토프 신호를 상대적으로 유지하면서 C-말단 MYC 에피토프 신호의 감소에 의해 용이하게 측정될 수 있다(도 5). 단일 및 삼중 돌연변이체 조합 라이브러리는 프로테이나제 K 절단에 대한 개선된 내성을 갖는 돌연변이체를 확인하기 위해 분류되었다(도 6). Illumina MiSeq 딥 시퀀싱은 분리된 개선된 변이체를 나타내었다(표 2A 및 표 2B).
[표 2A]
단백질분해에 대한 개선된 내성을 갖는 단일 돌연변이체
Figure pct00025
[표 2B]
단백질분해에 대한 개선된 내성을 갖는 삼중 돌연변이체
Figure pct00026
실시예 4. 열 스트레스
조합 라이브러리는 또한 유도된 디스플레이 동안 열 스트레스에 견디는 돌연변이체의 능력에 대해 분류되었다. 효모는 감소된 열 안정성의 단백질 변이체의 감소된 디스플레이를 발생시키는 것으로 밝혀진 조건인 37℃에서 유도되었다(Shusta et al., J. Mol. Biol. 292:949-956 (1999); Hackel et al., J. Mol. Biol. 401:84-96 (2010)). 증가된 디스플레이를 갖는 CD19 돌연변이체를 선택하고(도 7), 시퀀싱하였다(표 3).
[표 3]
열 스트레스 하에서 개선된 발현을 갖는 돌연변이체
Figure pct00027
실시예 5. 2세대 CD19 ECD 조합 하위-라이브러리
개선된 항체 결합, 프로테아제 내성 및/또는 열 내성을 갖는 CD19 변이체의 선택은 고유한 기능을 갖는 분자를 확인할 뿐만 아니라 기능을 더욱 발전시키기 위해 조합될 수 있는 돌연변이체를 확인한다. 초기 CD19 조작으로부터 13개 세트의 매우 유익한 돌연변이(CD19 ECD에서 291개 중 39개 부위에서의 돌연변이)를 조합하였다. 초기 스크린은 돌연변이로부터 가장 이점을 갖는 39개의 부위를 확인하였으며, 이는 서열 공간의 다른 방대한 검색을 한정시켰다. 또한, 39개 부위에서 가능한 모든 아미노산 돌연변이는 2039 = 1050 변이체를 수반할 것이다. 이들 부위에서의 기능적 돌연변이의 확인은 조합 라이브러리가 7x107개의 변이체로 제한되는 것을 가능하게 하였다(도 8).
이러한 조합 라이브러리의 분석은 야생형 CD19 또는 삼중 돌연변이체에 비해 실질적으로 상승된 FMC63 결합을 나타내었다(도 9 및 도 15c).
실시예 6. 조작된 CD19 돌연변이체의 선택
향상된 프로테아제 내성 및 FMC63 결합을 갖는 CD19 다중-돌연변이체의 선택은 개선된 FMC63 결합(도 10a) 및 상승된 프로테아제 내성(도 10b)을 갖는 집단을 생성시켰다.
실시예 7. CD19 리간드 라이브러리의 생성
CD19 ECD는 짧은 링커 영역에 의해 분리된 2개의 Ig 도메인으로 구성된다(도 12). CD19 ECD는 다양한 분자 표적에 대한 새로운 결합 기능성을 생성하도록 다양화된다. 예를 들어, CD19 리간드 라이브러리를 생성시키기 위해, Ig 도메인 1 또는 Ig 도메인 2에 용매 노출 루프, 또는 Ig 도메인 2에 베타 시트 표면이 다양화된다(도 12). 다른 표면 및 다른 특정 아미노산도 또한 다양화된다. 라이브러리는 유전적 수준(1x108 초과의 효모 형질전환체)으로 작제된다(Woldring et al., PLoS One 10, e0138956 (2015)).
이들 돌연변이는 안정성 조작 CD19 도메인의 맥락 내에서 구현된다(실시예 6 참조). 특히, 도 12의 예시적 라이브러리 설계는 CD19의 구조적 온전성을 개선시키는 것으로 관찰된 특정 부위에서의 특정 아미노산의 빈도를 증가시키고(실시예 2 내지 6), 구조적 온전성을 방해하는 부위에서의 아미노산의 빈도를 감소시킴으로써 추가로 안내된다.
실시예 8. CD19 기반 리간드의 발견 및 진화
라이브러리는 자기 및 흐름세포측정법 선택(Hackel et al., J. Mol. Biol. 401:84-96 (2010); Woldring et al., PLoS One 10, e0138956 (2015); Ackerman et al., Biotechnol. Prog. 25:774-783 (2009)) 및 이후 세제-가용화된 EGFR+ 세포 용해질을 사용한 흐름세포측정법 선택과 함께 재조합 EGFR 엑토도메인을 사용하여 분자 표적, 예를 들어, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 대한 결합제에 대해 분류된다. 특이성은 대조군 단백질 및 EGFR- 용해질에 대한 고갈 분류를 사용하여 진화된다. CD19 Ig 도메인의 다양성 및 온전성을 평가하기 위해 특이적 결합을 위해 농축된 집단의 유전자를 효모로부터 분리하고 시퀀싱하였다. 유전자는 오류-빈발 PCR 및 루프 셔플링(Wrenbeck et al., Nat. Methods 13:928-930 (2016)) 및 이후 더욱 엄격한 분류를 사용하여 진화된다.
실시예 9. N-말단 CD19―리간드 융합체
고도로 기능적인 서열 공간의 집중 검색을 제공한 조합 돌연변이 라이브러리(실시예 5)를 CD19―리간드 융합체(리간드에 대해 N-말단에 배치된 CD19를 가짐)에서 모듈성(즉, 단백질 융합체의 구성원으로서 기능하는 능력)을 갖는 CD19 돌연변이체를 확인하기 위해 사용하였다. 조합된 돌연변이 라이브러리를 EGFR-결합 섬유결합소 또는 HER2-결합 단일쇄 항체 단편의 N-말단에 유전적으로 융합시켰다. FMC63 결합 및 표적(EGFR, HER2) 결합 둘 모두를 가능하게 하는 돌연변이체가 수집된 이중-기능 스크리닝을 사용하여 라이브러리를 2회 분류하였다. 2회의 이중 분류 후, 이중 기능성 CD19-리간드 융합체의 별개의 집단을 획득하였다(도 13). 서열 분석은 전장 CD19 변이체가 표시된 부위에서 진화한 것을 나타내었다(도 14).
실시예 10. 리간드-C-T 말단 CD19 융합체
고도로 기능적인 서열 공간의 집중 검색을 제공한 조합 돌연변이 라이브러리(실시예 5)를 리간드-CD19 융합체(리간드에 대해 C-말단에 배치된 CD19를 가짐)에서 모듈성(즉, 단백질 융합체의 구성원으로서 기능하는 능력)을 갖는 CD19 돌연변이체를 확인하기 위해 사용하였다. 조합된 돌연변이 라이브러리를 EGFR-결합 섬유결합소 또는 HER2-결합 단일쇄 항체 단편의 C-말단에 유전적으로 융합시켰다. FMC63 결합 및 표적(EGFR, HER2) 결합 둘 모두를 가능하게 하는 돌연변이체가 수집된 이중-기능 스크리닝을 사용하여 라이브러리를 분류하였다. 1회 분류 후, 이중 기능성 리간드-CD19 융합체의 별개의 집단을 획득하였다(도 15).
실시예 11. N-말단 CD19-리간드 융합체의 기능
융합 단백질, 예를 들어, N-말단 CD19-리간드 융합체의 구성원으로서 기능하는 CD19 돌연변이체의 능력을 추가로 입증하기 위해, 실시예 9에서 확인된 4개의 CD19 돌연변이체를 추가로 시험하였다. 도 14에 제시된 바와 같이 JRK2, JRK5, JRK14 및 JRK15에 상응하는 아미노산 치환을 갖는 CD19 돌연변이체를 EGFR-결합 섬유결합소(CD19-Fn3/EGFR; 작제물 # 227, 228, 229 및 230; 각각 SEQ ID No 3, 4, 5 및 6)의 N-말단에 유전적으로 융합시켰다. 이들 작제물 중 2개(#228 및 #230)의 HEK293 세포로의 형질감염은 EGFR-결합 섬유결합소의 N-말단에 융합된 야생형 CD19(작제물 #160, SEQ ID No. 7)에 비해 상층액으로 융합 단백질의 증가된 분비를 발생시켰다(도 16). 4개 모두의 작제물을 EGFR 양성 세포에 결합하는 이의 능력, 및 이들 세포의 사멸에 대해 분석하였다. 4개 모두의 작제물은 잘 결합하였고, 모두 또한 세포를 사멸시켰다. 분비 수준, 결합 또는 사멸 능력에 있어서 4개의 작제물 사이에서 유의한 차이는 관찰되지 않았다(데이터는 제시하지 않음).
또한, CD19 돌연변이체 JRK15가 HER2-결합 단일쇄 항체 단편의 N-말단에 유전적으로 융합된 융합 단백질을 시험하였다(CD19-scFv/Her2 작제물 #311; SEQ ID NO 8). 야생형 CD19-scFv/Her2 융합 단백질(#42, SEQ ID NO. 9)과 비교하는 경우 scFv/Her2에 대해 N-말단에 배치된 CD19 돌연변이체 JRK15로 약 8배의 분비 증가를 또한 관찰하였다(도 17).
실시예 12. 리간드-C-말단 CD19 융합체의 기능
단백질 융합체(예를 들어, 리간드-C-말단 CD19 융합체)의 구성원으로서 기능하는 CD19 돌연변이체의 능력을 추가로 입증하기 위해, 3개의 CD19 돌연변이체를 추가로 시험하였다. CD19 돌연변이체를 HER2-결합 단일쇄 항체 단편의 C-말단에 유전적으로 융합시켰다(scFv/Her2-CD19)(작제물 # 263, 264 및 265; 각각 SEQ ID No 10, 11 및 12). HEK293 세포로 형질감염된 HER2-결합 단일쇄 항체 단편의 C-말단에 융합된 야생형 CD19 D1+2 도메인을 포함하는 융합 단백질(작제물 #40; SEQ ID NO:38)은 분비에 실패하였다. 그러나, C-말단 CD19 돌연변이체를 갖는 3개의 작제물은 잘 분비되었다(도 18).
scFv/Her2-CD19 융합 단백질 각각(작제물 263, 264 및 265)을 정제하고, Her2 양성 SKOV3 세포에 대한 결합 및 이의 사멸 둘 모두에 대해 적정하였다. 도 19는 FACS 분석에 의해 SKOV3 세포에 결합된 3개의 scFv/Her2-CD19 작제물의 검출을 제시한다. 작제물은 항-His-PE 및 FMC63-PE 항체 둘 모두에 의해 검출되었다. 도 20은 CAR19 세포와 브릿징되어 Her2 양성 SKOV3 세포의 사멸을 발생시키는 3개의 scFv/Her2-CD19 작제물 각각의 능력을 제시한다.
C-말단에서 돌연변이체 CD19를 포함하는 융합 단백질의 활성의 추가 증거를 제공하기 위해, 돌연변이체 CD19를 항-CD20 mAb Leu16으로부터 scFv에 대해 C-말단에 배치하였다(작제물 #302, SEQ ID NO. 13). 융합 단백질의 우수한 분비가 관찰되었다(도 21). 이 작제물을 또한 CD20으로 형질감염된 293T 세포에 결합하고 이를 사멸시키는 능력에 대해 시험하였다. 도 22는 FMC63-PE에 의해 검출된 바와 같이 Leu16 항-CD20 scFv에 대해 N-말단에 배치된 야생형 CD19 D1+D2를 포함하는 융합 단백질(작제물 #83, SEQ ID NO. 14)에 비한 CD20에 대한 작제물 #302의 결합을 제시한다. 도 23은 CAR19 세포와 브릿징되어 CD20 양성 293T 세포를 사멸시키는 작제물 #302의 능력을 제시한다. 실제로, 작제물 #302는 야생형 CD19 D1+D2 융합 단백질(작제물 #83)에 비해 증가된 사멸을 나타내었고, 이는 도 22에 제시된 개선된 결합이 증가된 사멸을 발생시킬 수 있음을 시사한다.
이들 데이터는 C-말단에서 CD19 돌연변이체를 포함하는 융합 단백질의 기능적 능력을 추가로 입증한다.
실시예 13. 마스킹된 CD19-리간드 융합체의 기능
본 실시예는 N-말단 마스킹된 scFv의 C-말단에 유전적으로 융합된 CD19 돌연변이체의 활성을 평가함으로써 CD19 돌연변이체 단백질의 기능적 능력을 추가로 입증한다. CD19 돌연변이체는 문헌[Desnoyers LR et al., Science Translational Medicine (2013)]에 공개된 바와 같이 다수의 프로테아제(예를 들어, 우로키나제-유형 플라스미노겐 활성제, uPA)에 의해 절단 가능한 프로테아제 기질을 함유하는 세툭시맙으로부터의 항-EGFR scFv의 마스킹된 형태의 C-말단에 융합되었다. 먼저, 마스킹된 세툭시맙 scFv를 생성시키고, 프로테아제의 부재하에서 EGFR에 결합하지 않지만 프로테아제, 예를 들어, uPA에 의한 활성화 후에 결합하는 것을 확인하기 위해 시험하여, 공개된 데이터(제시하지 않음)를 완전히 검증하였다. 다음으로, 마스킹되지 않은(작제물 # 307 및 #308, 각각 SEQ ID NO. 15 및 16) 및 마스킹된(작제물 #309 및 310, 각각 SEQ ID NO. 17 및 18) 세툭시맙-CD19 작제물을 생성시켰다. ELISA에서 HRP-항-His에 의한 FMC63 결합 및 검출에 의해 검출되고, 도 24에 제시된 바와 같이, 이들 작제물은 마스킹되거나 마스킹되지 않건 간에 잘 분비되었다.
마스킹된 작제물의 기능성을 입증하기 위해, 마스킹된(작제물 #309) 및 마스킹되지 않은(작제물 #307) 세툭시맙-CD19 작제물을 EGFR 양성 H292 세포의 사멸을 브릿징하는 이의 능력에 대해 시험하였다. 도 25는 마스킹되지 않은 scFv/세툭시맙-CD19 작제물 #307이 CART140(CAR19-T세포)에 의한 EGFR 양성 세포의 사멸을 브릿징할 수 있음을 제시한다. 대조적으로, 마스킹된 scFv/세툭시맙-CD19 작제물 #309는 uPA의 존재하에서만 유의한 사멸을 나타내었다. 따라서, 이는 안정하고 기능적인 마스킹된 항원 결합 단백질과의 CD19 돌연변이체 C-말단 융합을 입증한다.
실시예 14. CD19- 다중-리간드 융합체의 기능
본 실시예는 CD19 돌연변이체가 2개의 다른 도메인 사이에 위치될 수 있고, N- 또는 C-말단 융합에 제한되지 않음을 입증한다. 구체적으로, 본 실시예는 2개의 scFv 사이에 중심에 위치한 CD19 돌연변이체의 활성을 입증한다. 이러한 개념을 시험하기 위해 마스킹된 scFv/세툭시맙-CD19-scFv/Her2 작제물(작제물 # 354, SEQ ID NO. 19)을 제조하였다. 도 26은 형질감염되는 경우 작제물 #354가 잘 분비되었음을 제시한다.
실시예 15. 항체 경쇄-CD19 융합체의 기능
본 발명자는 다음으로 항체의 경쇄에 돌연변이체 CD19를 포함하는 융합 단백질이 기능성 mAb-CD19 융합 단백질을 생성할 수 있는지의 여부를 평가하였다. 이러한 개념은 2개의 융합 단백질과 관련하여 시험되었다. 첫 번째 융합 단백질의 경우, 돌연변이체 CD19를 트라스투주맙 항체의 경쇄에 C-말단에 융합시켰다(경쇄-CD19 융합체: 작제물 #375, SEQ ID NO. 20; 중쇄: 작제물 # 376, SEQ ID NO. 21). 두 번째 융합 단백질의 경우, 돌연변이체 CD19를 리툭시맙 항체의 경쇄에 C-말단에 융합시켰다(경쇄-CD19 융합체: 작제물 #377, SEQ ID NO. 22; 중쇄: 작제물 # 378, SEQ ID NO. 23).
트라스투주맙-CD19 작제물(#375/376)은 형질감염된 세포로부터 용이하게 분비되고, FMC63-PE 및 항-인간 Fc-FITC에 의해 FACS에서 검출된 바와 같이 Her2 양성 SKOV3 세포에 강력하게 결합되고(도 27), CART 254(CAR19 T-세포)에 의한 Her2 양성 SKOV3 세포의 사멸을 강력하게 브릿징하였다(도 28). 야생형 CD19-scFv/Her2 작제물이 비교를 위해 제공된다. 하기 실시예 16에 기재된 트라스투주맙 항체의 중쇄에 당화 부위가 결여된 작제물이 또한 도 28에 포함된다.
리툭시맙-CD19 작제물(#377/378)은 또한 형질감염된 세포로부터 용이하게 분비되고, CD20 양성 HEK293 세포에 강력하게 결합되고(도 29), CD20 양성 HEK293 세포의 사멸을 강력하게 브릿징하였다(도 30). Leu16scFv-CD19 작제물(작제물 #302, SEQ ID NO. 13)을 비교를 위해 포함시켰다. Leu16scFv-CD19 작제물은 약 3nm의 Kd를 갖는 반면, 리툭시맙-기반 작제물, 즉, 전체 리툭시맙 mAb는 약 16 pM의 Kd를 가졌다.
실시예 16. 아글리코실 mAb-CD19 융합체
CD19 돌연변이체가 경쇄의 C-말단에 유전적으로 융합된 트라스투주맙-CD19 및 리툭시맙-CD19 작제물을 생성시키고, 단일 당화 부위를 제거하기 위해 N297A 돌연변이를 중쇄에서 제조하였다. 아글리코실 트라스투주맙-CD19 작제물(경쇄-CD19 융합체: 작제물 #375, SEQ ID NO. 20; 아글리코실 중쇄: 작제물 # 393, SEQ ID NO. 24)은 야생형 트라스투주맙-CD19 작제물(경쇄-CD19 융합체: 작제물 #375, SEQ ID NO. 20; 중쇄: 작제물 # 376, SEQ ID NO. 21)의 것과 동등한 세포 결합을 나타내었다(도 31). 도 28은 야생형 및 아글리코실 트라스투주맙-CD19 작제물이 사멸에 대해 동등한 EC50을 갖는 것을 입증한다. 아글리코실 리툭시맙-CD19 작제물(경쇄-CD19 융합체: 작제물 #377, SEQ ID NO. 22; 아글리코실 중쇄: 작제물 # 394, SEQ ID NO. 25)은 야생형 리툭시맙-CD19 작제물(경쇄-CD19 융합체: 작제물 #377, SEQ ID NO. 22; 중쇄: 작제물 # 378, SEQ ID NO. 23)에 비해 개선된 결합(약 2배)을 나타내었다(도 32). 결합에서 관찰된 증가는 야생형 작제물에 비해 아글리코실 리툭시맙-CD19 작제물에 의한 세포 사멸의 증가로 해석되었다(도 33).
실시예 17. 다양한 CD19 트렁케이션을 갖는 융합 단백질
특정 CD19 작제물, 예를 들어, 작제물 #42는 약간 트렁케이션된 CD19 ECD를 포함하였고, 최종 11개 아미노산이 제거되었다(본원에서 "D1+D2" 또는 "D1+2"로 언급됨). 전장 CD19 ECD가 사용될 수 있는지 평가하기 위해, 추가 작제물을 평가하였다. 구체적으로, 야생형 CD19-scFv/Her2(작제물 #42, "D1+D2" CD19를 함유함)의 활성을 NsCD19-scFv/Her2(즉, CD19 ECD N 말단 돌연변이체 #2-트라스투주맙 scFv; 작제물 #311; SEQ ID NO:8) 및 트렁케이션된 NsCD19-scFv/Her2(즉, CD19 D1+2 N 말단 돌연변이체 #2-트라스투주맙 scFv; 작제물 #340; SEQ ID NO:31)와 비교하였다. Her2 양성 SKOV3 세포에 대한 결합은 분비 또는 효능의 차이 없음 및 Her2 양성 SKOV3 세포의 동등한 사멸로 본질적으로 동일하였다(데이터는 제시하지 않음)(도 34). 이는 이러한 트렁케이션이 안정한 CD19 돌연변이체에서 동등하게 효과적인 것을 입증한다.
실시예 18. VHH CD19 융합체
Clec12A를 인지하는 다양한 CD19 돌연변이체 및 라마 VHH의 융합 단백질을 생성시켰다. VHH는 하기 표에 명시된 하기 클론 번호 및 서열에 의해 기재된다:
Figure pct00028
생성되고 시험된 융합 단백질은 작제물 # 186, 289, 290, 291, 292, 293, 320, 321, 323, 327, 328, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338 및 357(각각 SEQ ID No: 52, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 26, 45, 28, 46, 47, 27, 48, 49, 50, 51, 30, 29 및 53)을 포함하였다.
작제물 # 289, 291, 292, 293, 321 및 330(N 말단에서 CD19 돌연변이체 #2 및 C 말단에서 다양한 VHH를 포함함)을 U937 세포에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 도 35 및 36에 제시된 바와 같이, 작제물 # 289, 291, 292 및 293은 3 내지 5 nM의 유사한 EC50으로 U937 세포에 결합할 수 있었다. 도 37에 제시된 바와 같이, CD19-VHH1B12/Clec12A(작제물 #321, SEQ ID NO. 26) 및 VHH1A10/Clec12A-CD19(작제물 #330, SEQ ID NO. 27) 작제물 둘 모두는 1 내지 3nM 범위로 Clec12A 발현 U937 세포에 결합하였다.
N 말단에 CD19 돌연변이체 및 C 말단에 VHH를 포함하는 다양한 작제물, 또는 C 말단에 CD19 돌연변이체 및 N 말단에 VHH 서열을 포함하는 작제물을 293T 세포에서의 발현 후 항-CD19 항체 FMC63에 결합하는 능력에 대해 검정하였다. 도 38 및 39는 다양한 작제물의 역가를 제시한다. 이들 작제물은 또한 CLEC12a에 결합하는 이들의 능력에 대해 검정되었다. 결과는 도 40 및 41에 도시되어 있다.
다음으로, 작제물을 CAR-T254 세포에 의한 CLEC12a-발현 U937 세포의 사멸을 매개하는 이들의 능력에 대해 검정하였다. 간단히, 1X104 U937 세포를 RPMI 배지에서 둥근 바닥 96 웰 플레이트의 웰에서 인큐베이션하였다. 1 ㎍/㎖ 및 20 ng/㎖ 작제물을 웰 당 전체 25 ㎕로 첨가하였다. CAR-T254 세포를 U937 세포에 대해 1:10의 비로 첨가하였다. 48시간 후, 세포를 회전시키고, 용해시키고, 루시페라제 수준을 측정하였다. 도 42는 루시페라제 수준을 제시하고, 도 43은 다양한 작제물에 대한 사멸의 %를 제시하며, 이는 C 말단 융합이 N 말단 융합보다 더 강력함을 나타낸다. 4개의 C 말단 작제물(# 327, 337, 338 및 330) 및 1개의 N-말단 작제물(#321)에 대해 용량 사멸 곡선을 수행하였다. 간단히, 1X104 U937 세포를 RPMI 배지에서 둥근 바닥 96 웰 플레이트의 웰에서 인큐베이션하였다. 작제물을 웰 당 25 ㎕로 1 ㎍/㎖에서 1 ng/㎖로 적정하였다. CAR-T254 세포(CAR19 T-세포)를 U937 세포에 대해 1:10의 비로 첨가하였다. 48시간 후, 세포를 회전시키고, 용해시키고, 루시페라제 수준을 측정하였다. 도 44에 제시된 바와 같이, 최대 U937 세포 사멸은 모든 작제물로 달성되었다. 도 45에 제시된 바와 같이 EC50을 생성시켰다.
또한, 이중특이적 작제물을 생성시키고 검정하였다. 이중특이적 작제물은 문헌[Wiersma et al., MAbs 7:321-30 (2015)]에 기재된 항-CLEC12a scFv를 포함하였다. 작제물 #186은 CD19 도메인 1+2 및 항-CLL1 VH 및 VL 도메인을 포함하였다(문헌[Wiersma et al.]에 의해 기재됨). 작제물 #186의 VH 및 VL 도메인, 항-CLEC12a VHH(클론 2H3) 및 CD19 돌연변이체 #2를 포함하는 이중특이적 작제물(작제물 #357)을 생성시켰다. 이들 작제물을 U937 세포에 대한 결합에 대해 검정하였다. 간단히, U937 세포(5x104)를 Fc 차단하고, 회전시키고, 펠렛화시키고, 융합 단백질의 100 ㎕의 3X 연속 희석액(7.5 ㎍/㎖에서 시작함)을 첨가하고, 4C에서 30분 인큐베이션하고, 회전시키고, 2회 세척하고, 펠렛에 항-FMC63-PE를 첨가하고, 4C에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 회전시키고, 2회 세척하고, 고정시키고, FACS에 의해 분석하였다. 도 46a 및 46b에 제시된 바와 같이, 작제물 357의 결합 EC50은 작제물 #330(대조군)보다 작았으며, 이는 작제물 #186의 EC50보다 작았다. 이들 작제물을 또한 CAR-T254 세포에 의한 CLEC12a-발현 U937 세포의 사멸을 매개하는 이들의 능력에 대해 검정하였다. 간단히, 1X104 U937 세포를 RPMI 배지에서 둥근 바닥 96 웰 플레이트의 웰에서 인큐베이션하였다. 1X105 CAR-T254 세포를 U937 세포에 대해 1:10의 비로 첨가하였다. 작제물의 100 ㎕의 3X 연속 희석액(시작 농도는 최종적으로 1 ㎍/㎖임)을 사용하였다. 48시간 인큐베이션 후, 루시페라제 수준을 측정하였다. 도 47a 및 47b에 제시된 바와 같이, 작제물 #357의 사멸 EC50은 작제물 #186 또는 #330보다 훨씬 적었다.
최종적으로, (i) CD19 CAR 및 (ii) 작제물 #186을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터(작제물 #221)를 생성시켰다. 상기 렌티바이러스 벡터를 사용하여 CD19 CAR을 발현하고 작제물 #186의 융합 단백질을 분비하는 CAR T 세포를 생성시켰다. 상기 T 세포는 "CAR221" 세포로 지칭된다. 작제물 #142, 173 및 174도 대조군으로서 생성시켰다. 도 48에 제시된 바와 같이, 활성화된 CAR221 세포로부터 작제물 #221의 발현은 낮았다. ("LG142", "LG221", "LG173" 및 "LG174"는 각각 #142, 221, 173 및 174와 동일 작제물이나, 벤더에 의해 제조된 것임을 참고한다). 도 49는 작제물 #221 및 LG221에 의한 U937 및 NALM6 세포의 사멸을 입증한다.
실시예 19. CD19 에피토프
FMC63 및 3B10 결합의 손실을 발생시키는 것으로 확인(상기 기재된 체계적 돌연변이유발 라이브러리를 사용함)된 아미노산 위치를 CD19의 구조 상에 맵핑하였다(Teplyakov et al., Proteins 86:495-500 (2018)). 둘 모두의 mAb의 에피토프는 중첩되고, N- 및 C-말단으로부터 떨어져 있고, 이는 형질막에 가깝다. FMC63 에피토프는 선형이 아니지만, 3B10 에피토프는 CD19에서 선형 펩티드 서열과 정렬되며, 이는 3B10 에피토프가 온도 저항성인 것과 일치한다(실시예 2에 기재됨; 도 3). 이러한 펩티드가 효모 디스플레이틀 통해 발현되는 경우, mAb 3B10은 잘 결합하였다. 놀랍게도, mAb 3B10은 효모에서 발현된 CD19 ECD에 덜 잘 결합하였다. 도 50 참조.
균등물
당업자는 본원에 기재된 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 균등물을 인지하거나, 일상적인 것을 넘어서지 않는 실험을 이용하여 이를 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기 기재에 제한되는 것으로 의도되지 않으며, 하기 청구항에 기재된 바와 같다.
서열 목록
Figure pct00029
Figure pct00030
작제물 아미노산 서열의 목록
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작제물 뉴클레오티드 서열의 목록
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Figure pct00140
VHH 클론 서열
SEQ ID NO:203 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄 )
Figure pct00141
SEQ ID NO:204 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고 ; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄 )
Figure pct00142
SEQ ID NO:205 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고 ; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄 )
Figure pct00143
SEQ ID NO:206 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고 ; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄 ):
Figure pct00144
SEQ ID NO:207 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고 ; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄) ):
Figure pct00145
SEQ ID NO:208 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고 ; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄 ):
Figure pct00146
SEQ ID NO:209 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고 ; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄 ):
Figure pct00147
SEQ ID NO:210 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고 ; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄 ):
Figure pct00148
SEQ ID NO:211 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고 ; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄 ):
Figure pct00149
SEQ ID NO:212 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고 ; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄 ):
Figure pct00150
SEQ ID NO:213 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고 ; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄 ):
Figure pct00151
SEQ ID NO:214 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고 ; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄 ):
Figure pct00152
SEQ ID NO:215 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고 ; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄 ):
Figure pct00153
SEQ ID NO:216 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고 ; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄 ):
Figure pct00154
SEQ ID NO:217 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고 ; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄 ):
Figure pct00155
SEQ ID NO:218 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고 ; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄 ):
Figure pct00156
SEQ ID NO:219 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고 ; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄 ):
Figure pct00157
SEQ ID NO:220 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고 ; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄 ):
Figure pct00158
SEQ ID NO:221 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고 ; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄 ):
Figure pct00159
SEQ ID NO:222 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고 ; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄 ):
Figure pct00160
SEQ ID NO:223 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고 ; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄 ):
Figure pct00161
SEQ ID NO:224 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고 ; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄 ):
Figure pct00162
SEQ ID NO:225 ( 밑줄은 CDR1, CDR2, CDR3을 순차적으로 나타내고 ; C-말단의 굵은 글씨의 이탤릭체는 (i) 9개의 아미노산(TSGPGGQGA)의 링커, (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개의 아미노산(GA)의 링커, (iv) 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가 3개의 아미노산(GAS)을 나타냄 ):
Figure pct00163
SEQUENCE LISTING <110> ALETA BIOTHERAPEUTICS INC. THE BOARD OF REGENTS OF THE UNIVERSITY OF MINNESOTA <120> CD19 VARIANTS <130> 2012106-0056 <140> PCT/US2018/065835 <141> 2018-12-14 <150> 62/599,211 <151> 2017-12-15 <160> 284 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 816 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cccgaggaac ctctagtggt gaaggtggaa gagggagata acgctgtgct gcagtgcctc 60 aaggggacct cagatggccc cactcagcag ctgacctggt ctcgggagtc cccgcttaaa 120 cccttcttaa aactcagcct ggggctgcca ggcctgggaa tccacatgag gcccctggcc 180 atctggcttt tcatcttcaa cgtctctcaa cagatggggg gcttctacct gtgccagccg 240 gggcccccct ctgagaaggc ctggcagcct ggctggacag tcaatgtgga gggcagcggg 300 gagctgttcc ggtggaatgt ttcggaccta ggtggcctgg gctgtggcct gaagaacagg 360 tcctcagagg gccccagctc cccttccggg aagctcatga gccccaagct gtatgtgtgg 420 gccaaagacc gccctgagat ctgggaggga gagcctccgt gtctcccacc gagggacagc 480 ctgaaccaga gcctcagcca ggacctcacc atggcccctg gctccacact ctggctgtcc 540 tgtggggtac cccctgactc tgtgtccagg ggccccctct cctggaccca tgtgcacccc 600 aaggggccta agtcattgct gagcctagag ctgaaggacg atcgcccggc cagagatatg 660 tgggtaatgg agacgggtct gttgttgccc cgggccacag ctcaagacgc tggaaagtat 720 tattgtcacc gtggcaacct gaccatgtca ttccacctgg agatcactgc tcggccagta 780 ctatggcact ggctgctgag gactggtggc tggaag 816 <210> 2 <211> 272 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val 1 5 10 15 Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr 20 25 30 Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly 35 40 45 Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe 50 55 60 Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro 65 70 75 80 Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val 85 90 95 Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly 100 105 110 Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro 115 120 125 Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg 130 135 140 Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser 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<400> 59 atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60 gaggagcccc tggtggtgaa ggtggaggag ggcgacaccg ccgtgctgcc ctgcctgaag 120 ggcaccagcg acggccccac ccagcagctg acctggagca gggagagccc cctgaagccc 180 ttcctgaagt acagcctggg cgtgcccggc ctgggcgtgc acgtgaggcc cgacgccatc 240 agcgtggtga tcaggaacgt gagccagcag atgggcggct tctacctgtg ccagcccggc 300 ccccccagcg agaaggcctg gcagcccggc tggaccgtga acgtggaggg cagcggcgag 360 ctgttcaggt ggaacgtgag cgacctgggc ggcctgggct gcggcctgaa gaacaggagc 420 agcgagggcc ccagcagccc cagcggcaag ctgatgagcc ccaagctgta cgtgtgggcc 480 aaggacaggc ccgagatctg ggagggcgag cccccctgcc tgccccccag ggacagcctg 540 aaccagagcc tgagccagga cctgaccatg gcccccggca gcaccctgtg gctgagctgc 600 ggcgtgcccc ccgacagcgt gagcaggggc cccctgagct ggacccacgt gcaccccaag 660 ggccccaaga gcctgctgag cctggagctg aaggacgaca ggcccgccag ggagatgatc 720 gtggacgaga ccggcctgct gctgcccagg gccaccgccc aggacgccgg caagtggtac 780 tgcagcaggg gcaacgtgac caccagctac cacctggaga tcaccgccag gcccgtgaag 840 gcccacagcg 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tggaccgtga acgtggaggg cagcggcgag 360 ctgttcaggt ggaacgtgag cgacctgggc ggcctgggct gcggcctgaa gaacaggagc 420 agcgagggcc ccagcagccc cagcggcaag ctgatgagcc ccaagctgta cgtgtgggcc 480 aaggacaggc ccgagatctg ggagggcgag cccccctgcc tgccccccag ggacagcctg 540 aaccagagcc tgagcaggga catgaccgtg gcccccggca gcaccctgtg gctgagctgc 600 ggcgtgcccc ccgacagcgt gagcaggggc cccctgagct ggacccacgt gcaccccaag 660 ggccccaaga gcctgctgag cctggagctg aaggacgaca ggcccgccag ggacatgtgg 720 gtgatgggca ccagcctgat cctgcccagg gccaccgccc aggacgccgg caagtactac 780 tgccacaggg gcaacctgac catgagcttc cacctggagg tggtggccag gcccgtgaag 840 gcccacagcg acctgaggac cggcggctgg aagggaggag gtgggtctgg aggtggagga 900 tctggtggag gtgggtctgg aggaggtggg tctgtgagcg acgtgcccag ggacctggag 960 gtggtggccg ccacccccac cagcctgctg atcagctggt tcgactacgc cgtgacctac 1020 tacaggatca cctacggcga gaccggcggc aacagccccg tgcaggagtt caccgtgccc 1080 ggctggatca gcaccgccac catcagcggc ctgaagccgg cgtggactac accatcaccg 1140 tgtacgccgt gaccgacaac agccactggc ccttcaggag cacccccatc agcaccaact 1200 acaggaccga gatcgacaag cccccccagc atcatcacca tcaccat 1247 <210> 61 <211> 1248 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 61 atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60 gaggagcccc tggtggtgaa ggtggaggag ggcgacaccg ccgccctgtg gtgcctgaag 120 ggcaccagcg acggccccac ccagcagctg acctggagca gggagagccc cctgaagccc 180 ttcctgaagt acagcctggg cgtgcccggc atgggcgtgc acgtgaggcc caacgccgtg 240 agcctggtga tcagcaacgt gagccagcag atgggcggct tctacctgtg ccagcccggc 300 ccccccagcg agaaggcctg gcagcccggc tggaccgtga acgtggaggg cagcggcgag 360 ctgttcaggt ggaacgtgag cgacctgggc ggcctgggct gcggcctgaa gaacaggagc 420 agcgagggcc ccagcagccc cagcggcaag ctgatgagcc ccaagctgta cgtgtgggcc 480 aaggacaggc ccgagatctg ggagggcgag cccccctgcc tgccccccag ggacagcctg 540 aaccagagcc tgagcaggga catgaccgtg gcccccggca gcaccctgtg gctgagctgc 600 ggcgtgcccc ccgacagcgt gagcaggggc cccctgagct ggacccacgt gcaccccaag 660 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cccccctgcc tgccccccag ggacagcctg 540 aaccagagcc tgagccagga cctgaccatg gcccccggca gcaccctgtg gctgagctgc 600 ggcgtgcccc ccgacagcgt gagcaggggc cccctgagct ggacccacgt gcaccccaag 660 ggccccaaga gcctgctgag cctggagctg aaggacgaca ggcccgccag ggagatgatc 720 gtggacgaga ccggcctgct gctgcccagg gccaccgccc aggacgccgg caagtggtac 780 tgcagcaggg gcaacgtgac caccagctac cacctggaga tcaccgccag gcccgtgaag 840 gcccacagcg acctgaggac cggcggctgg aagggaggag gtgggtctgg aggtggagga 900 tctggtggag gtgggtctgg aggaggtgga tccgaggtgc agctggtgga gtctggtggt 960 ggtcttgttc aacctggtgg ttctcttcgt ctttcttgtg ctgcttctgg ttttaatatt 1020 aaagatactt atattcattg ggttcgtcaa gctcctggta aaggtcttga atgggttgct 1080 cgtatttatc ctactaatgg ttatactcgt tatgctgatt ctgttaaagg tcgttttact 1140 atttctgctg atacttctaa aaatactgct tatcttcaaa tgaactctct tcgtgctgaa 1200 gatactgctg tttattattg ttctcgttgg ggtggtgatg gtttttatgc tatggattat 1260 tggggtcaag gtactcttgt caccgtctcc tcagctagca ccgggggagg tgggtctgga 1320 ggtggaggat ctggtggagg tgggtctgac atccagatga cccagtctcc ttcttctctt 1380 tctgcttctg ttggtgatcg tgttactatt acttgtcgtg cttctcaaga tgttaatact 1440 gctgttgctt ggtatcaaca aaaacctggt aaagctccta aacttcttat ttattctgct 1500 tcttttcttt attctggtgt tccttctcgt ttttctggtt ctcgttctgg tactgatttt 1560 actcttacta tttcttctct tcaacctgaa gattttgcta cttattattg tcaacaacat 1620 tatactactc ctcctacttt tggtcaaggt accaaggtgg agatcaaacg tacgcatcat 1680 caccatcacc at 1692 <210> 64 <211> 1665 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 64 atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60 gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataacg ctgtgctgca gtgcctcaag 120 gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 180 ttcttaaaac tcagcctggg gctgccaggc ctgggaatcc acatgaggcc cctggccatc 240 tggcttttca tcttcaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 300 cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 360 ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt 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tcaccgtctc ctcagctagc 1260 accgggggag gtgggtctgg aggtggagga tctggtggag gtgggtctga catccagatg 1320 acccagtctc cttcttctct ttctgcttct gttggtgatc gtgttactat tacttgtcgt 1380 gcttctcaag atgttaatac tgctgttgct tggtatcaac aaaaacctgg taaagctcct 1440 aaacttctta tttattctgc ttcttttctt tattctggtg ttccttctcg tttttctggt 1500 tctcgttctg gtactgattt tactcttact atttcttctc ttcaacctga agattttgct 1560 acttattatt gtcaacaaca ttatactact cctcctactt ttggtcaagg taccaaggtg 1620 gagatcaaac gtacgtctag agggccccat catcaccatc accat 1665 <210> 65 <211> 1659 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 65 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg tggtggtctt gttcaacctg gtggttctct tcgtctttct 120 tgtgctgctt ctggttttaa tattaaagat acttatattc attgggttcg tcaagctcct 180 ggtaaaggtc ttgaatgggt tgctcgtatt tatcctacta atggttatac tcgttatgct 240 gattctgtta aaggtcgttt tactatttct gctgatactt ctaaaaatac tgcttatctt 300 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gcagcgggga gctgttccgg tggaatgttt cggacctagg tggcctgggc 1200 tgtggcctga agaacaggtc ctcagagggc cccagctccc cttccgggaa gctcatgagc 1260 cccaagctgt atgtgtgggc caaagaccgc cctgagatct gggagggaga gcctccgtgt 1320 ctcccaccga gggacagcct gaaccagagc ctcagccggg acctcaccgt tgcccctggc 1380 tccacactct ggctgtcctg tggggtaccc cctgactctg tgtccagggg ccccctctcc 1440 tggacccatg tgcaccccaa ggggcctaag tcattgctga gcctagagct gaaggacgat 1500 cgcccggcca gagatatgtg ggtaatgggc acgagcctga tgttgccccg ggccacagct 1560 caagacgctg gaaagtggta ttgtcaccgt ggcaacctga ccatgtcatt ccacctggag 1620 atcactgctc ggccatctag acatcatcac catcaccat 1659 <210> 66 <211> 1659 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 66 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg tggtggtctt gttcaacctg gtggttctct tcgtctttct 120 tgtgctgctt ctggttttaa tattaaagat acttatattc attgggttcg tcaagctcct 180 ggtaaaggtc ttgaatgggt tgctcgtatt tatcctacta 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ctggttttaa tattaaagat acttatattc attgggttcg tcaagctcct 180 ggtaaaggtc ttgaatgggt tgctcgtatt tatcctacta atggttatac tcgttatgct 240 gattctgtta aaggtcgttt tactatttct gctgatactt ctaaaaatac tgcttatctt 300 caaatgaact ctcttcgtgc tgaagatact gctgtttatt attgttctcg ttggggtggt 360 gatggttttt atgctatgga ttattggggt caaggtactc ttgtcaccgt ctcctcagct 420 agcaccgggg gaggtgggtc tggaggtgga ggatctggtg gaggtgggtc tgacatccag 480 atgacccagt ctccttcttc tctttctgct tctgttggtg atcgtgttac tattacttgt 540 cgtgcttctc aagatgttaa tactgctgtt gcttggtatc aacaaaaacc tggtaaagct 600 cctaaacttc ttatttattc tgcttctttt ctttattctg gtgttccttc tcgtttttct 660 ggttctcgtt ctggtactga ttttactctt actatttctt ctcttcaacc tgaagatttt 720 gctacttatt attgtcaaca acattatact actcctccta cttttggtca aggtaccaag 780 gtggagatca aacgtacggg aggaggtggg tctggaggtg gaggatctgg tggaggtggg 840 tctggaggag gtggatcccc cgaggaacct ctagtggtga aggtggaaga gggagatacc 900 gctgccctgt ggtgcctcaa ggggacctca gatggcccca ctgagcaggt tacctggtct 960 cgggagtccc cgcttaaacc 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tgtccagtgt 60 caggtcaaac tacaggagtc aggggctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatg 120 tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata tgcactgggt aaagcagaca 180 cctggacagg gcctggaatg gattggagct atttatccag gaaatggtga tacttcctac 240 aatcagaagt tcaaaggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 300 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggact attactgtgc aagatctaat 360 tattacggta gtagctactg gttcttcgat gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 420 tcctcagcca gcaccggtgg aggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg 480 gacatcgagc tcactcagtc tccaacaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 540 atgacttgca gggccagctc aagtgtaaat tacatggact ggtaccagaa gaagccagga 600 tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 660 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 720 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agttttaatc cacccacgtt cggagggggg 780 acaaagttgg aaataaaacg ggccgccgct ggaggaggtg ggtctggagg tggaggatct 840 ggtggaggtg ggtctggagg aggtggatcc cccgaggaac ctctagtggt gaaggtggaa 900 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 69 atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60 gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataacg ctgtgctgca gtgcctcaag 120 gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 180 ttcttaaaac tcagcctggg gctgccaggc ctgggaatcc acatgaggcc cctggccatc 240 tggcttttca tcttcaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 300 cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 360 ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc 420 tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc 480 aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag cctccgtgtc tcccaccgag ggacagcctg 540 aaccagagcc tcagccagga cctcaccatg gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt 600 ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag 660 gggcctaagt cattgctgag cctagagctg aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg 720 gtaatggaga cgggtctgtt gttgccccgg gccacagctc aagacgctgg aaagtattat 780 tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc 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1659 <210> 70 <211> 1647 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 70 atggacttcg gcctgatctt cttcatcgtg gccctgctga agggcgtgca gtgccagatc 60 ctgctgaccc agagccccgt gatcctgagc gtgagccccg gcgagagggt gagcttcagc 120 tgcagggcca gccagagcat cggcaccaac atccactggt accagcagag gaccaacggc 180 agccccaggc tgctgatcaa gtacgccagc gagagcatca gcggcatccc cagcaggttc 240 agcggcagcg gcagcggcac cgacttcacc ctgagcatca acagcgtgga gagcgaggac 300 atcgccgact actactgcca gcagaacaac aactggccca ccaccttcgg cgccggcacc 360 aagctggagc tgaagggcag caccagcggc agcggcaagc ccggcagcgg cgagggcagc 420 accaagggcc aggtgcagct gaagcagagc ggccccggcc tggtgcagcc cagccagagc 480 ctgagcatca cctgcaccgt gagcggcttc agcctgacca actacggcgt gcactgggtg 540 aggcagagcc ccggcaaggg cctggagtgg ctgggcgtga tctggagcgg cggcaacacc 600 gactacaaca cccccttcac cagcaggctg agcatcaaca aggacaacag caagagccag 660 gtgttcttca agatgaacag cctgcagagc aacgacaccg ccatctacta ctgcgccagg 720 gccctgacct 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gtgttcttca agatgaacag cctgcagagc aacgacaccg ccatctacta ctgcgccagg 720 gccctgacct actacgacta cgagttcgcc tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 780 agcgccggag gaggtgggtc cggaggtgga ggatctggtg gaggtgggtc tggaggaggt 840 ggatcccccg aggaacctct agtggtgaag gtggaagagg gagataccgc tgccctgtgg 900 tgcctcaagg ggacctcaga tggccccact gagcaggtta cctggtctcg ggagtccccg 960 cttaaaccct tcttaaaact cagcctgggg ctcccaggcg gcggaggtca cgtgaggccc 1020 aacgccgtga gcctcgttat ccggaacgtc tctcaacaga tggggggctt ctacctgtgc 1080 cagccggggc ccccctctga gaaggcctgg cagcctggct ggacagtcaa tgtggagggc 1140 agcggggagc tgttccggtg gaatgtttcg gacctaggtg gcctgggctg tggcctgaag 1200 aacaggtcct cagagggccc cagctcccct tccgggaagc tcatgagccc caagctgtat 1260 gtgtgggcca aagaccgccc tgagatctgg gagggagagc ctccgtgtct cccaccgagg 1320 gacagcctga accagagcct cagccgggac ctcaccgttg cccctggctc cacactctgg 1380 ctgtcctgtg gggtaccccc tgactctgtg tccaggggcc ccctctcctg gacccatgtg 1440 caccccaagg ggcctaagtc attgctgagc ctagagctga aggacgatcg cccggccaga 1500 gatatgtggg taaccgagac gggtctgctc ttgccccggg ccacagctca agacgctgga 1560 aagtggtatt gtcaccgtgg caacctgacc atgtcattcc acctggagat cactgctcgg 1620 ccatctagac atcatcacca tcaccat 1647 <210> 72 <211> 1788 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 72 atggacttcg gcctgatctt cttcatcgtg gccctgctga agggcgtgca gtgccagggc 60 cagagcggcc agtgcatcag ccccaggggc tgccccgacg gcccctacgt gatgtacggc 120 agcagcggcg gcagcggcgg cagcggcggc agcggcctga gcggcaggag cgacaaccac 180 ggcagcagcg gcacccagat cctgctgacc cagagccccg tgatcctgag cgtgagcccc 240 ggcgagaggg tgagcttcag ctgcagggcc agccagagca tcggcaccaa catccactgg 300 taccagcaga ggaccaacgg cagccccagg ctgctgatca agtacgccag cgagagcatc 360 agcggcatcc ccagcaggtt cagcggcagc ggcagcggca ccgacttcac cctgagcatc 420 aacagcgtgg agagcgagga catcgccgac tactactgcc agcagaacaa caactggccc 480 accaccttcg gcgccggcac caagctggag ctgaagggca gcaccagcgg cagcggcaag 540 cccggcagcg gcgagggcag caccaagggc caggtgcagc tgaagcagag cggccccggc 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<400> 75 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgtgac 60 atccagatga cccagagccc cagcagcctg agcgccagcg tgggcgacag ggtgaccatc 120 acctgcaggg ccagccagga cgtgaacacc gccgtggcct ggtaccagca gaagcccggc 180 aaggccccca agctgctgat ctacagcgcc agcttcctgt acagcggcgt gcccagcagg 240 ttcagcggca gcaggagcgg caccgacttc accctgacca tcagcagcct gcagcccgag 300 gacttcgcca cctactactg ccagcagcac tacaccaccc cccccacctt cggccagggc 360 accaaggtgg agatcaagag gaccgtggcc gcccccagcg tgttcatctt cccccccagc 420 gacgagcagc tgaagagcgg caccgccagc gtggtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc 480 agggaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agagcggcaa cagccaggag 540 agcgtgaccg agcaggacag caaggacagc acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg 600 agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aggtgaccca ccagggcctg 660 agcagccccg tgaccaagag cttcaacagg ggcgagtgcg gaggaggtgg gtctggaggt 720 ggaggatctg gtggaggtgg gtctggagga ggtggatccc ccgaggaacc tctagtggtg 780 aaggtggaag agggagatac cgctgccctg tggtgcctca aggggacctc agatggcccc 840 actcagcagc 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ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg tggtggtctt gttcaacctg gtggttctct tcgtctttct 120 tgtgctgctt ctggttttaa tattaaagat acttatattc attgggttcg tcaagctcct 180 ggtaaaggtc ttgaatgggt tgctcgtatt tatcctacta atggttatac tcgttatgct 240 gattctgtta aaggtcgttt tactatttct gctgatactt ctaaaaatac tgcttatctt 300 caaatgaact ctcttcgtgc tgaagatact gctgtttatt attgttctcg ttggggtggt 360 gatggttttt atgctatgga ttattggggt caaggtactc ttgtcaccgt ctcctcagct 420 agcaccaagg gtcctagcgt ttttccattg gctcccagca gcaagagcac cagcggcggc 480 accgccgccc tgggctgcct ggtgaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgagctgg 540 aacagcggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttccccg ccgtgctgca gagcagcggc 600 ctgtacagcc tgagcagcgt ggtgaccgtg cccagcagca gcctgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaggt ggagcccccc 720 aagagctgcg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc 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gtgcaggctg gggggtccct tagactctcc 120 tgtgtagcct ctggaagcat cagaagtatc aatgtcatgg gctggtaccg ccaggctcca 180 gggaagcagc gcgagttggt cgcagcttgt gctagtgatg gcaacacata ctatgcggac 240 tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaacgccg agaaaacggt gtatctgcag 300 atgaacaacc tgaaacctga cgacacagcc gtctattact gtgatgcgaa ttcgaggggg 360 aattattatt cgggccaggg gacccaggtc accgtttcct caactagtgg cccgggaggc 420 caaggcgcag gaggaggtgg gtctggaggt ggaggatctg gtggaggtgg gtctggagga 480 ggtggatccc ccgaggaacc tctagtggtg aaggtggaag agggagatac cgctgccctg 540 tggtgcctca aggggacctc agatggcccc actcagcagc tgacctggtc tcgggagtcc 600 ccgcttaaac ccttcttaaa atacagcctg ggggtgccag gcctgggagt gcacgtgagg 660 cccgacgcca tcagcgtggt tatccggaac gtctctcaac agatgggggg cttctacctg 720 tgccagccgg ggcccccctc tgagaaggcc tggcagcctg gctggacagt caatgtggag 780 ggcagcgggg agctgttccg gtggaatgtt tcggacctag gtggcctggg ctgtggcctg 840 aagaacaggt cctcagaggg ccccagctcc ccttccggga agctcatgag ccccaagctg 900 tatgtgtggg ccaaagaccg ccctgagatc tgggagggag 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gggccagggg acccaggtca ccgtttcctc aactagtggc 420 ccgggaggcc aaggcgcagg aggaggtggg tctggaggtg gaggatctgg tggaggtggg 480 tctggaggag gtggatcccc cgaggaacct ctagtggtga aggtggaaga gggagatacc 540 gctgccctgt ggtgcctcaa ggggacctca gatggcccca ctcagcagct gacctggtct 600 cgggagtccc cgcttaaacc cttcttaaaa tacagcctgg gggtgccagg cctgggagtg 660 cacgtgaggc ccgacgccat cagcgtggtt atccggaacg tctctcaaca gatggggggc 720 ttctacctgt gccagccggg gcccccctct gagaaggcct ggcagcctgg ctggacagtc 780 aatgtggagg gcagcgggga gctgttccgg tggaatgttt cggacctagg tggcctgggc 840 tgtggcctga agaacaggtc ctcagagggc cccagctccc cttccgggaa gctcatgagc 900 cccaagctgt atgtgtgggc caaagaccgc cctgagatct gggagggaga gcctccgtgt 960 ctcccaccga gggacagcct gaaccagagc ctcagccggg acctcaccgt tgcccctggc 1020 tccacactct ggctgtcctg tggggtaccc cctgactctg tgtccagggg ccccctctcc 1080 tggacccatg tgcaccccaa ggggcctaag tcattgctga gcctagagct gaaggacgat 1140 cgcccggcca gagatatgtg ggtaatgggc acgagcctga tgttgccccg ggccacagct 1200 caagacgctg gaaagtggta ttgtcaccgt ggcaacctga ccatgtcatt ccacctggag 1260 atcactgctc ggccatctag acatcatcac catcaccat 1299 <210> 84 <211> 1299 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 84 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgc aggagtctgg gggaggcttg gtgcaggctg gggggtctct gagactctcc 120 tgtgcagcct caggaagcat cttcgctatt aatgaaatca atcttatggg gtggtaccgc 180 caggctccag ggaagcagcg cgagttggtc gcagcttgtg ctagtgatgg caacacatac 240 tatgcggact ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaacgccga gaaaacggtg 300 tatctgcaga tgaacaacct gaaacctgac gacacagccg tctattactg tgatgcgaat 360 tcgaggggga attattattc gggccagggg acccaggtca ccgtctcctc aactagtggc 420 ccgggaggcc aaggcgcagg aggaggtggg tctggaggtg gaggatctgg tggaggtggg 480 tctggaggag gtggatcccc cgaggaacct ctagtggtga aggtggaaga gggagatacc 540 gctgccctgt ggtgcctcaa ggggacctca gatggcccca ctcagcagct gacctggtct 600 cgggagtccc cgcttaaacc cttcttaaaa tacagcctgg gggtgccagg cctgggagtg 660 cacgtgaggc ccgacgccat cagcgtggtt atccggaacg tctctcaaca gatggggggc 720 ttctacctgt gccagccggg gcccccctct gagaaggcct ggcagcctgg ctggacagtc 780 aatgtggagg gcagcgggga gctgttccgg tggaatgttt cggacctagg tggcctgggc 840 tgtggcctga agaacaggtc ctcagagggc cccagctccc cttccgggaa gctcatgagc 900 cccaagctgt atgtgtgggc caaagaccgc cctgagatct gggagggaga gcctccgtgt 960 ctcccaccga gggacagcct gaaccagagc ctcagccggg acctcaccgt tgcccctggc 1020 tccacactct ggctgtcctg tggggtaccc cctgactctg tgtccagggg ccccctctcc 1080 tggacccatg tgcaccccaa ggggcctaag tcattgctga gcctagagct gaaggacgat 1140 cgcccggcca gagatatgtg ggtaatgggc acgagcctga tgttgccccg ggccacagct 1200 caagacgctg gaaagtggta ttgtcaccgt ggcaacctga ccatgtcatt ccacctggag 1260 atcactgctc ggccatctag acatcatcac catcaccat 1299 <210> 85 <211> 1290 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 85 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgc aggagtctgg gggaggcttg gtgcaggtcg gggagtctct gagactctcc 120 tgtgtagtct ctggagatac gaggagtatc aatctcatgg ggtggtaccg ccaggctcca 180 gggaagcagc gcgagttggt cgcagcttgt gctagtgatg gcaacacata ctatgcggac 240 tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaacgccg agaaaacggt gtatctgcag 300 atgaacaacc tgaaacctga cgacacagcc gtctattact gtgatgcgaa ttcgaggggg 360 aattattatt cgggccaggg gaccctggtc accgtctcct caactagtgg cccgggaggc 420 caaggcgcag gaggaggtgg gtctggaggt ggaggatctg gtggaggtgg gtctggagga 480 ggtggatccc ccgaggaacc tctagtggtg aaggtggaag agggagatac cgctgccctg 540 tggtgcctca aggggacctc agatggcccc actcagcagc tgacctggtc tcgggagtcc 600 ccgcttaaac ccttcttaaa atacagcctg ggggtgccag gcctgggagt gcacgtgagg 660 cccgacgcca tcagcgtggt tatccggaac gtctctcaac agatgggggg cttctacctg 720 tgccagccgg ggcccccctc tgagaaggcc tggcagcctg gctggacagt caatgtggag 780 ggcagcgggg agctgttccg gtggaatgtt tcggacctag gtggcctggg ctgtggcctg 840 aagaacaggt cctcagaggg ccccagctcc ccttccggga agctcatgag ccccaagctg 900 tatgtgtggg ccaaagaccg ccctgagatc tgggagggag 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cgacctgggc ggcctgggct gcggcctgaa gaacaggagc 420 agcgagggcc ccagcagccc cagcggcaag ctgatgagcc ccaagctgta cgtgtgggcc 480 aaggacaggc ccgagatctg ggagggcgag cccccctgcc tgccccccag ggacagcctg 540 aaccagagcc tgagccagga cctgaccatg gcccccggca gcaccctgtg gctgagctgc 600 ggcgtgcccc ccgacagcgt gagcaggggc cccctgagct ggacccacgt gcaccccaag 660 ggccccaaga gcctgctgag cctggagctg aaggacgaca ggcccgccag ggagatgatc 720 gtggacgaga ccggcctgct gctgcccagg gccaccgccc aggacgccgg caagtggtac 780 tgcagcaggg gcaacgtgac caccagctac cacctggaga tcaccgccag gcccggagga 840 ggtgggtctg gaggtggagg atctggtgga ggtgggtctg gaggaggtgg atccgaggtg 900 cagctggtgg agtctggtgg tggtcttgtt caacctggtg gttctcttcg tctttcttgt 960 gctgcttctg gttttaatat taaagatact tatattcatt gggttcgtca agctcctggt 1020 aaaggtcttg aatgggttgc tcgtatttat cctactaatg gttatactcg ttatgctgat 1080 tctgttaaag gtcgttttac tatttctgct gatacttcta aaaatactgc ttatcttcaa 1140 atgaactctc ttcgtgctga agatactgct gtttattatt gttctcgttg gggtggtgat 1200 ggtttttatg ctatggatta ttggggtcaa 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ccccccagcg agaaggcctg gcagcccggc tggaccgtga acgtggaggg cagcggcgag 360 ctgttcaggt ggaacgtgag cgacctgggc ggcctgggct gcggcctgaa gaacaggagc 420 agcgagggcc ccagcagccc cagcggcaag ctgatgagcc ccaagctgta cgtgtgggcc 480 aaggacaggc ccgagatctg ggagggcgag cccccctgcc tgccccccag ggacagcctg 540 aaccagagcc tgagccagga cctgaccatg gcccccggca gcaccctgtg gctgagctgc 600 ggcgtgcccc ccgacagcgt gagcaggggc cccctgagct ggacccacgt gcaccccaag 660 ggccccaaga gcctgctgag cctggagctg aaggacgaca ggcccgccag ggagatgatc 720 gtggacgaga ccggcctgct gctgcccagg gccaccgccc aggacgccgg caagtggtac 780 tgcagcaggg gcaacgtgac caccagctac cacctggaga tcaccgccag gcccgtgaag 840 gcccacagcg acctgaggac cggcggctgg aagggaggag gtgggtctgg aggtggagga 900 tctggtggag gtgggtctgg aggaggtggg tctcaggtca aactacagga gtcaggggct 960 gagctggtga agcctggggc ctcagtgaag atgtcctgca aggcttctgg ctacacattt 1020 accagttaca atatgcactg ggtaaagcag acacctggac agggcctgga atggattgga 1080 gctatttatc caggaaatgg tgatacttcc tacaatcaga agttcaaagg caaggccaca 1140 ttgactgcag 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180 ttcctgaagt acagcctggg cgtgcccggc ctgggcgtgc acgtgaggcc cgacgccatc 240 agcgtggtga tcaggaacgt gagccagcag atgggcggct tctacctgtg ccagcccggc 300 ccccccagcg agaaggcctg gcagcccggc tggaccgtga acgtggaggg cagcggcgag 360 ctgttcaggt ggaacgtgag cgacctgggc ggcctgggct gcggcctgaa gaacaggagc 420 agcgagggcc ccagcagccc cagcggcaag ctgatgagcc ccaagctgta cgtgtgggcc 480 aaggacaggc ccgagatctg ggagggcgag cccccctgcc tgccccccag ggacagcctg 540 aaccagagcc tgagccagga cctgaccatg gcccccggca gcaccctgtg gctgagctgc 600 ggcgtgcccc ccgacagcgt gagcaggggc cccctgagct ggacccacgt gcaccccaag 660 ggccccaaga gcctgctgag cctggagctg aaggacgaca ggcccgccag ggagatgatc 720 gtggacgaga ccggcctgct gctgcccagg gccaccgccc aggacgccgg caagtggtac 780 tgcagcaggg gcaacgtgac caccagctac cacctggaga tcaccgccag gcccgtgaag 840 gcccacagcg acctgaggac cggcggctgg aagggaggag gtgggtctgg aggtggagga 900 tctggtggag gtgggtctgg aggaggtggg tctgtgagcg acgtgcccag ggacctggag 960 gtggtggccg ccacccccac cagcctgctg atcagctggt gcaggcagag gtgcgccgac 1020 agctacagga 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cccccctgcc tgccccccag ggacagcctg 540 aaccagagcc tgagcaggga catgaccgtg gcccccggca gcaccctgtg gctgagctgc 600 ggcgtgcccc ccgacagcgt gagcaggggc cccctgagct ggacccacgt gcaccccaag 660 ggccccaaga gcctgctgag cctggagctg aaggacgaca ggcccgccag ggacatgtgg 720 gtgatggaga ccggcctggt gctgcccagg gccaccgccc aggacgccgg caagtggtac 780 tgccacaggg gcaacgtgac caccagctac cacctggaga tcaccgccag gcccgtgagc 840 gcccacaccc ccctgaggac cggcggctgg aagggaggag gtgggtctgg aggtggagga 900 tctggtggag gtgggtctgg aggaggtggg tctgtgagcg acgtgcccag ggacctggag 960 gtggtggccg ccacccccac cagcctgctg atcagctggt gcaggcagag gtgcgccgac 1020 agctacagga tcacctacgg cgagaccggc ggcaacagcc ccgtgcagga gttcaccgtg 1080 cccggcagct ggaagaccgc caccatcagc ggcctgaagc ccggcgtgga ctacaccatc 1140 accgtgtacg tggtgaccca ctactacggc tgggacaggt acagccaccc catcagcatc 1200 aactacagga ccgagatcga caagcccagc cagcatcatc accatcacca t 1251 <210> 90 <211> 1692 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 90 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg tggtggtctt gttcaacctg gtggttctct tcgtctttct 120 tgtgctgctt ctggttttaa tattaaagat acttatattc attgggttcg tcaagctcct 180 ggtaaaggtc ttgaatgggt tgctcgtatt tatcctacta atggttatac tcgttatgct 240 gattctgtta aaggtcgttt tactatttct gctgatactt ctaaaaatac tgcttatctt 300 caaatgaact ctcttcgtgc tgaagatact gctgtttatt attgttctcg ttggggtggt 360 gatggttttt atgctatgga ttattggggt caaggtactc ttgtcaccgt ctcctcagct 420 agcaccgggg gaggtgggtc tggaggtgga ggatctggtg gaggtgggtc tgacatccag 480 atgacccagt ctccttcttc tctttctgct tctgttggtg atcgtgttac tattacttgt 540 cgtgcttctc aagatgttaa tactgctgtt gcttggtatc aacaaaaacc tggtaaagct 600 cctaaacttc ttatttattc tgcttctttt ctttattctg gtgttccttc tcgtttttct 660 ggttctcgtt ctggtactga ttttactctt actatttctt ctcttcaacc tgaagatttt 720 gctacttatt attgtcaaca acattatact actcctccta cttttggtca aggtaccaag 780 gtggagatca aacgtacggg aggaggtggg tctggaggtg gaggatctgg tggaggtggg 840 tctggaggag gtgggtctcc cgaggagccc ctggtggtga aggtggagga gggcgacacc 900 gccgtgctgc cctgcctgaa gggcaccagc gacggcccca cccagcagct gacctggagc 960 agggagagcc ccctgaagcc cttcctgaag tacagcctgg gcgtgcccgg cctgggcgtg 1020 cacgtgaggc ccgacgccat cagcgtggtg atcaggaacg tgagccagca gatgggcggc 1080 ttctacctgt gccagcccgg cccccccagc gagaaggcct ggcagcccgg ctggaccgtg 1140 aacgtggagg gcagcggcga gctgttcagg tggaacgtga gcgacctggg cggcctgggc 1200 tgcggcctga agaacaggag cagcgagggc cccagcagcc ccagcggcaa gctgatgagc 1260 cccaagctgt acgtgtgggc caaggacagg cccgagatct gggagggcga gcccccctgc 1320 ctgcccccca gggacagcct gaaccagagc ctgagccagg acctgaccat ggcccccggc 1380 agcaccctgt ggctgagctg cggcgtgccc cccgacagcg tgagcagggg ccccctgagc 1440 tggacccacg tgcaccccaa gggccccaag agcctgctga gcctggagct gaaggacgac 1500 aggcccgcca gggagatgat cgtggacgag accggcctgc tgctgcccag ggccaccgcc 1560 caggacgccg gcaagtggta ctgcagcagg ggcaacgtga ccaccagcta ccacctggag 1620 atcaccgcca ggcccgtgaa ggcccacagc gacctgagga ccggcggctg gaagcatcat 1680 caccatcacc at 1692 <210> 91 <211> 1380 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 91 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgtcag 60 gttcagctgg tgcagtctgg tgctgaggtg aagaagcctg gtgcctcagt gaaggtctcc 120 tgcaaggctt ctggttacac attcactgac tactacatgc actgggtgcg tcaggcccct 180 ggtcaaggtc ttgagtggat gggtcgtgtt aatcctaacc ggaggggtac tacctacaac 240 cagaaattcg agggccgtgt caccatgacc acagacacat ccacgagcac agcctacatg 300 gagctgcgta gcctgcgttc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgcg tgcgaactgg 360 cttgactact ggggccaggg caccaccgtc accgtctcct ccgcctccac caagggccca 420 tcggtcttcc cgctagcgcc ctgctccagg agcacctccg agagcacagc cgccctgggc 480 tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 540 accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 600 agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacgaaga cctacacctg caacgtagat 660 cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag agagttgagt ccaaatatgg tcccccatgc 720 ccaccctgcc cagcacctga ggccgccggg ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa 780 cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg 840 agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat 900 gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 960 accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1020 ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagagcca 1080 caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1140 tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggaaag caatgggcag 1200 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1260 tacagcaggc taaccgtgga caagagcagg tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc 1320 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctctgggt 1380 <210> 92 <211> 1539 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 92 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120 atcacttgca gtgtcagctc aagtgtatcc tccatttact tgcactggta tcagcagaaa 180 ccagggaaag cccctaagct cctgatctat agcacatcca acttggcttc tggagtccca 240 tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa 300 cctgaagatt ttgcaactta ctactgtcaa gtctacagtg gttacccgct cacgttcggc 360 ggagggacca aggtggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgcgacaa aactcacaca 720 tcgccaccgt ccccagcacc tgaagccgcg gggggaccgt cacccgagga acctctagtg 780 gtgaaggtgg aagagggaga taacgctgtg ctgcagtgcc tcaaggggac ctcagatggc 840 cccactcagc agctgacctg gtctcgggag tccccgctta aacccttctt aaaactcagc 900 ctggggctgc caggcctggg aatccacatg aggcccctgg ccatctggct tttcatcttc 960 aacgtctctc aacagatggg gggcttctac ctgtgccagc cggggccccc ctctgagaag 1020 gcctggcagc ctggctggac agtcaatgtg gagggcagcg gggagctgtt ccggtggaat 1080 gtttcggacc taggtggcct gggctgtggc ctgaagaaca ggtcctcaga gggccccagc 1140 tccccttccg ggaagctcat gagccccaag ctgtatgtgt gggccaaaga ccgccctgag 1200 atctgggagg gagagcctcc gtgtctccca ccgagggaca gcctgaacca gagcctcagc 1260 caggacctca ccatggcccc tggctccaca ctctggctgt cctgtggggt accccctgac 1320 tctgtgtcca ggggccccct ctcctggacc catgtgcacc ccaaggggcc taagtcattg 1380 ctgagcctag agctgaagga cgatcgcccg gccagagata tgtgggtaat ggagacgggt 1440 ctgttgttgc cccgggccac agctcaagac gctggaaagt attattgtca ccgtggcaac 1500 ctgaccatgt cattccacct ggagatcact gctcggcca 1539 <210> 93 <211> 1662 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 93 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg tggtggtctt gttcaacctg gtggttctct tcgtctttct 120 tgtgctgctt ctggttttaa tattaaagat acttatattc attgggttcg tcaagctcct 180 ggtaaaggtc ttgaatgggt tgctcgtatt tatcctacta atggttatac tcgttatgct 240 gattctgtta aaggtcgttt tactatttct gctgatactt ctaaaaatac tgcttatctt 300 caaatgaact ctcttcgtgc tgaagatact gctgtttatt attgttctcg ttggggtggt 360 gatggttttt atgctatgga ttattggggt caaggtactc ttgtcaccgt ctcctcagct 420 agcaccgggg gaggtgggtc tggaggtgga ggatctggtg gaggtgggtc tgacatccag 480 atgacccagt ctccttcttc tctttctgct tctgttggtg atcgtgttac tattacttgt 540 cgtgcttctc aagatgttaa tactgctgtt gcttggtatc aacaaaaacc tggtaaagct 600 cctaaacttc ttatttattc tgcttctttt ctttattctg gtgttccttc tcgtttttct 660 ggttctcgtt ctggtactga ttttactctt actatttctt ctcttcaacc tgaagatttt 720 gctacttatt attgtcaaca acattatact actcctccta cttttggtca aggtaccaag 780 gtggagatca aacgtacgga caaaactcac acatcgccac cgtccccagc acctgaagcc 840 gcggggggac cgtcacccga ggaacctcta gtggtgaagg tggaagaggg agataacgct 900 gtgctgcagt gcctcaaggg gacctcagat ggccccactc agcagctgac ctggtctcgg 960 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cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60 gaggagcccc tggtggtgaa ggtggaggag ggcgacaccg ccgtgctgcc ctgcctgaag 120 ggcaccagcg acggccccac ccagcagctg acctggagca gggagagccc cctgaagccc 180 ttcctgaagt acagcctggg cgtgcccggc ctgggcgtgc acgtgaggcc cgacgccatc 240 agcgtggtga tcaggaacgt gagccagcag atgggcggct tctacctgtg ccagcccggc 300 ccccccagcg agaaggcctg gcagcccggc tggaccgtga acgtggaggg cagcggcgag 360 ctgttcaggt ggaacgtgag cgacctgggc ggcctgggct gcggcctgaa gaacaggagc 420 agcgagggcc ccagcagccc cagcggcaag ctgatgagcc ccaagctgta cgtgtgggcc 480 aaggacaggc ccgagatctg ggagggcgag cccccctgcc tgccccccag ggacagcctg 540 aaccagagcc tgagccagga cctgaccatg gcccccggca gcaccctgtg gctgagctgc 600 ggcgtgcccc ccgacagcgt gagcaggggc cccctgagct ggacccacgt gcaccccaag 660 ggccccaaga gcctgctgag cctggagctg aaggacgaca ggcccgccag ggagatgatc 720 gtggacgaga ccggcctgct gctgcccagg gccaccgccc aggacgccgg caagtggtac 780 tgcagcaggg gcaacgtgac caccagctac cacctggaga tcaccgccag gcccgtgaag 840 gcccacagcg acctgaggac cggcggctgg aagggaggag gtgggtctgg aggtggagga 900 tctggtggag gtgggtctgg aggaggtgga tcccaggtgc agctgcagca gtctggggga 960 ggcttggtgc aggctggggg gtctctgaga ctctcctgtg cagcctcagg aagcatcttc 1020 gctattaatg aaatcaatct tatggggtgg taccgccagg ctccagggaa gcagcgcgag 1080 ttggtcgcag cttgtgctag tgatggcaac acatactatg cggactccgt gaagggccga 1140 ttcaccatct ccagagacaa cgccgagaaa acggtgtatc tgcagatgaa caacctgaaa 1200 cctgacgaca cagccgtcta ttactgtgat gcgaattcga gggggaatta ttattcgggc 1260 caggggaccc aggtcaccgt ttcctcaact agtggcccgg gaggccaagg cgcagaacaa 1320 aaactcatct cagaagagga tctgggcgca caccatcacc accatcatgg cgcatct 1377 <210> 95 <211> 1401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 95 atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60 gaggagcccc tggtggtgaa ggtggaggag ggcgacaccg ccgtgctgcc ctgcctgaag 120 ggcaccagcg acggccccac ccagcagctg acctggagca gggagagccc cctgaagccc 180 ttcctgaagt acagcctggg cgtgcccggc ctgggcgtgc acgtgaggcc cgacgccatc 240 agcgtggtga tcaggaacgt gagccagcag atgggcggct tctacctgtg ccagcccggc 300 ccccccagcg agaaggcctg gcagcccggc tggaccgtga acgtggaggg cagcggcgag 360 ctgttcaggt ggaacgtgag cgacctgggc ggcctgggct gcggcctgaa gaacaggagc 420 agcgagggcc ccagcagccc cagcggcaag ctgatgagcc ccaagctgta cgtgtgggcc 480 aaggacaggc ccgagatctg ggagggcgag cccccctgcc tgccccccag ggacagcctg 540 aaccagagcc tgagccagga cctgaccatg gcccccggca gcaccctgtg gctgagctgc 600 ggcgtgcccc ccgacagcgt gagcaggggc cccctgagct ggacccacgt gcaccccaag 660 ggccccaaga gcctgctgag cctggagctg aaggacgaca ggcccgccag ggagatgatc 720 gtggacgaga ccggcctgct gctgcccagg gccaccgccc aggacgccgg caagtggtac 780 tgcagcaggg gcaacgtgac caccagctac cacctggaga tcaccgccag gcccgtgaag 840 gcccacagcg acctgaggac cggcggctgg aagggaggag gtgggtctgg aggtggagga 900 tctggtggag gtgggtctgg aggaggtgga tcccaggtgc agctgcagga gtctggggga 960 ggcttggtgc aacctggggg gtctctgaga ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttc 1020 aatagctatg ctatgacctg ggtccgccag gctccaggaa aggggctcga gtgggtctca 1080 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<400> 98 atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60 gaggagcccc tggtggtgaa ggtggaggag ggcgacaccg ccgtgctgcc ctgcctgaag 120 ggcaccagcg acggccccac ccagcagctg acctggagca gggagagccc cctgaagccc 180 ttcctgaagt acagcctggg cgtgcccggc ctgggcgtgc acgtgaggcc cgacgccatc 240 agcgtggtga tcaggaacgt gagccagcag atgggcggct tctacctgtg ccagcccggc 300 ccccccagcg agaaggcctg gcagcccggc tggaccgtga acgtggaggg cagcggcgag 360 ctgttcaggt ggaacgtgag cgacctgggc ggcctgggct gcggcctgaa gaacaggagc 420 agcgagggcc ccagcagccc cagcggcaag ctgatgagcc ccaagctgta cgtgtgggcc 480 aaggacaggc ccgagatctg ggagggcgag cccccctgcc tgccccccag ggacagcctg 540 aaccagagcc tgagccagga cctgaccatg gcccccggca gcaccctgtg gctgagctgc 600 ggcgtgcccc ccgacagcgt gagcaggggc cccctgagct ggacccacgt gcaccccaag 660 ggccccaaga gcctgctgag cctggagctg aaggacgaca ggcccgccag ggagatgatc 720 gtggacgaga ccggcctgct gctgcccagg gccaccgccc aggacgccgg caagtggtac 780 tgcagcaggg gcaacgtgac caccagctac cacctggaga tcaccgccag gcccgtgaag 840 gcccacagcg 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gctccaggga agcagcgcga gttggtcgca 1080 gcgattacta gtggtggtac cacaaattat gcacagtccg tgaagggccg agtcaccatc 1140 tccagggaca gcgccaagaa cacggtgtat ctacagatga acagcctgaa acctgaggac 1200 acagccgtct atttctgtaa agcagatacg cgttggggtg ggatgtactg gggcccgggg 1260 acccaggtca ccgtttcctc aactagtggc ccgggaggcc aaggcgcaga acaaaaactc 1320 atctcagaag aggatctggg cgcacaccat caccaccatc atggcgcatc t 1371 <210> 100 <211> 1395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 100 atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60 gaggagcccc tggtggtgaa ggtggaggag ggcgacaccg ccgtgctgcc ctgcctgaag 120 ggcaccagcg acggccccac ccagcagctg acctggagca gggagagccc cctgaagccc 180 ttcctgaagt acagcctggg cgtgcccggc ctgggcgtgc acgtgaggcc cgacgccatc 240 agcgtggtga tcaggaacgt gagccagcag atgggcggct tctacctgtg ccagcccggc 300 ccccccagcg agaaggcctg gcagcccggc tggaccgtga acgtggaggg cagcggcgag 360 ctgttcaggt ggaacgtgag cgacctgggc ggcctgggct gcggcctgaa 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gaatatgact actggggccg ggggaccctg gtcaccgtct cctcaactag tggcccggga 1320 ggccaaggcg cagaacaaaa actcatctca gaagaggatc tgggcgcaca ccatcaccac 1380 catcatggcg catct 1395 <210> 101 <211> 1323 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 101 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgc aggagtctgg gggaggcttg gtgcaacctg gggggtctct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac cttcaatagc tatgctatga cctgggtccg ccaggctcca 180 ggaaaggggc tcgagtgggt ctcagacatt aatagtggtg gtggtagcac aaactatgca 240 gactccgtga agggccgctt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgac cgagcttcgg 360 ggtagtgact actaccgggg tccgattcgt gagtatgcct attggggcca ggggaccctg 420 gtcaccgtct cctcaactag tggcccggga ggccaaggcg caggaggagg tgggtctgga 480 ggtggaggat ctggtggagg tgggtctgga ggaggtggat cccccgagga acctctagtg 540 gtgaaggtgg aagagggaga taccgctgcc ctgtggtgcc tcaaggggac ctcagatggc 600 cccactcagc agctgacctg gtctcgggag tccccgctta aacccttctt aaaatacagc 660 ctgggggtgc caggcctggg agtgcacgtg aggcccgacg ccatcagcgt ggttatccgg 720 aacgtctctc aacagatggg gggcttctac ctgtgccagc cggggccccc ctctgagaag 780 gcctggcagc ctggctggac agtcaatgtg gagggcagcg gggagctgtt ccggtggaat 840 gtttcggacc taggtggcct gggctgtggc ctgaagaaca ggtcctcaga gggccccagc 900 tccccttccg ggaagctcat gagccccaag ctgtatgtgt gggccaaaga ccgccctgag 960 atctgggagg gagagcctcc gtgtctccca ccgagggaca gcctgaacca gagcctcagc 1020 cgggacctca ccgttgcccc tggctccaca ctctggctgt cctgtggggt accccctgac 1080 tctgtgtcca ggggccccct ctcctggacc catgtgcacc ccaaggggcc taagtcattg 1140 ctgagcctag agctgaagga cgatcgcccg gccagagata tgtgggtaat gggcacgagc 1200 ctgatgttgc cccgggccac agctcaagac gctggaaagt ggtattgtca ccgtggcaac 1260 ctgaccatgt cattccacct ggagatcact gctcggccat ctagacatca tcaccatcac 1320 cat 1323 <210> 102 <211> 1299 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 102 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagttgc agcagtctgg gggaggcttg gcgcagaccg gggggtctct gatactctcc 120 tgtgcagcct caggaagcat cttcgctatt aatgaaatca atcttatggg gtggtaccgc 180 caggctccag ggaagcagcg cgagttggtc gcagcttgtg ctagtgatgg caacacatac 240 tatgcggact ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaacgccga gaaaacggtg 300 tatctgcaga tgaacaacct gaaacctgac gacacagccg tctattactg tgatgcgaat 360 tcgaggggga attattattc gggccagggg acccaggtca ccgtttcctc aactagtggc 420 ccgggaggcc aaggcgcagg aggaggtggg tctggaggtg gaggatctgg tggaggtggg 480 tctggaggag gtggatcccc cgaggaacct ctagtggtga aggtggaaga gggagatacc 540 gctgccctgt ggtgcctcaa ggggacctca gatggcccca ctcagcagct gacctggtct 600 cgggagtccc cgcttaaacc cttcttaaaa tacagcctgg gggtgccagg cctgggagtg 660 cacgtgaggc ccgacgccat cagcgtggtt atccggaacg tctctcaaca gatggggggc 720 ttctacctgt gccagccggg gcccccctct gagaaggcct ggcagcctgg ctggacagtc 780 aatgtggagg gcagcgggga gctgttccgg tggaatgttt cggacctagg tggcctgggc 840 tgtggcctga agaacaggtc ctcagagggc cccagctccc cttccgggaa gctcatgagc 900 cccaagctgt atgtgtgggc caaagaccgc cctgagatct gggagggaga gcctccgtgt 960 ctcccaccga gggacagcct gaaccagagc ctcagccggg acctcaccgt tgcccctggc 1020 tccacactct ggctgtcctg tggggtaccc cctgactctg tgtccagggg ccccctctcc 1080 tggacccatg tgcaccccaa ggggcctaag tcattgctga gcctagagct gaaggacgat 1140 cgcccggcca gagatatgtg ggtaatgggc acgagcctga tgttgccccg ggccacagct 1200 caagacgctg gaaagtggta ttgtcaccgt ggcaacctga ccatgtcatt ccacctggag 1260 atcactgctc ggccatctag acatcatcac catcaccat 1299 <210> 103 <211> 1317 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 103 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgc agcagtcagg gggaggattg gtgcaggctg ggggctctct gacactctcc 120 tgtgcagcca cgggacgcac aatcgataac ggcgccatgg cctggttccg ccaggctcca 180 gggaagcagc gtgagcttgt agctgccatt aactggagtg gtggtgccac attctataca 240 gactccgtca agtaccgttt caccatctcc cgagacaacg tcaggcacac 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ctagagctga aggacgatcg cccggccaga gatatgtggg taatgggcac gagcctgatg 1200 ttgccccggg ccacagctca agacgctgga aagtggtatt gtcaccgtgg caacctgacc 1260 atgtcattcc acctggagat cactgctcgg ccatctagac atcatcacca tcaccat 1317 <210> 104 <211> 1368 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 104 atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60 gaggagcccc tggtggtgaa ggtggaggag ggcgacaccg ccgtgctgcc ctgcctgaag 120 ggcaccagcg acggccccac ccagcagctg acctggagca gggagagccc cctgaagccc 180 ttcctgaagt acagcctggg cgtgcccggc ctgggcgtgc acgtgaggcc cgacgccatc 240 agcgtggtga tcaggaacgt gagccagcag atgggcggct tctacctgtg ccagcccggc 300 ccccccagcg agaaggcctg gcagcccggc tggaccgtga acgtggaggg cagcggcgag 360 ctgttcaggt ggaacgtgag cgacctgggc ggcctgggct gcggcctgaa gaacaggagc 420 agcgagggcc ccagcagccc cagcggcaag ctgatgagcc ccaagctgta cgtgtgggcc 480 aaggacaggc ccgagatctg ggagggcgag cccccctgcc tgccccccag ggacagcctg 540 aaccagagcc tgagccagga 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 105 atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60 gaggagcccc tggtggtgaa ggtggaggag ggcgacaccg ccgtgctgcc ctgcctgaag 120 ggcaccagcg acggccccac ccagcagctg acctggagca gggagagccc cctgaagccc 180 ttcctgaagt acagcctggg cgtgcccggc ctgggcgtgc acgtgaggcc cgacgccatc 240 agcgtggtga tcaggaacgt gagccagcag atgggcggct tctacctgtg ccagcccggc 300 ccccccagcg agaaggcctg gcagcccggc tggaccgtga acgtggaggg cagcggcgag 360 ctgttcaggt ggaacgtgag cgacctgggc ggcctgggct gcggcctgaa gaacaggagc 420 agcgagggcc ccagcagccc cagcggcaag ctgatgagcc ccaagctgta cgtgtgggcc 480 aaggacaggc ccgagatctg ggagggcgag cccccctgcc tgccccccag ggacagcctg 540 aaccagagcc tgagccagga cctgaccatg gcccccggca gcaccctgtg gctgagctgc 600 ggcgtgcccc ccgacagcgt gagcaggggc cccctgagct ggacccacgt gcaccccaag 660 ggccccaaga gcctgctgag cctggagctg aaggacgaca ggcccgccag ggagatgatc 720 gtggacgaga ccggcctgct gctgcccagg gccaccgccc aggacgccgg caagtggtac 780 tgcagcaggg gcaacgtgac caccagctac cacctggaga tcaccgccag gcccgtgaag 840 gcccacagcg acctgaggac cggcggctgg aagggaggag gtgggtctgg aggtggagga 900 tctggtggag gtgggtctgg aggaggtgga tcccaggtgc agctgcaaga gtctggggga 960 ggcttggtgc aggctggggg gtctctgaga ctctcctgtg cagcctcagg aagcatcttc 1020 gctattaatg aaatcaatct tatggggtgg taccgccagg ctccagggaa gcagcgcgag 1080 ttggtcgcag cttgtgctag tgatggcaac acatactatg cggactccgt gaagggccga 1140 ttcaccatct ccagagacaa cgccgagaaa acggtgtatc tgcagatgaa caacctgaaa 1200 cctgacgaca cagccgtcta ttactgtgat gcgaattcga gggggaatta ttattcgggc 1260 caggggaccc aggtcaccgt ctcctcaact agtggcccgg gaggccaagg cgcagaacaa 1320 aaactcatct cagaagagga tctgggcgca caccatcacc accatcatgg cgcatct 1377 <210> 106 <211> 1377 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 106 atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60 gaggagcccc tggtggtgaa ggtggaggag ggcgacaccg ccgtgctgcc ctgcctgaag 120 ggcaccagcg 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gtctctgaga ctctcctgtg cagcctcagg aagcatcttc 1020 gctattaatg aaatcaatct tatggggtgg taccgccagg ctccagggaa gcagcgcgag 1080 ttggtcgcag cttgtgctag tgatggcaac acatactatg cggactccgt gaagggccga 1140 ttcaccatct ccagagacaa cgccgagaaa acggtgtatc tgcagatgaa caacctgaaa 1200 cctgacgaca cagccgtcta ttactgtgat gcgaattcga gggggaatta ttattcgggc 1260 caggggaccc tggtcaccgt ctcctcaact agtggcccgg gaggccaagg cgcagaacaa 1320 aaactcatct cagaagagga tctgggcgca caccatcacc accatcatgg cgcatct 1377 <210> 107 <211> 1647 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 107 atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60 gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataacg ctgtgctgca gtgcctcaag 120 gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 180 ttcttaaaac tcagcctggg gctgccaggc ctgggaatcc acatgaggcc cctggccatc 240 tggcttttca tcttcaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 300 cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc 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gagcagggtg accatcagcg tggacaagag caggaaccag 300 ttcagcctga agctgagcag cgtgaccgcc gccgacaccg ccgtgtacta ctgcgccaag 360 gtgagcaccg gcggcttctt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 420 ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcgagat cgagctgacc 480 cagagcccca gcagcctgag cgccagcgtg ggcgacaggg tgaccatcac ctgcagggcc 540 agccagagca tcagcagcta cctgaactgg taccagcaga agcccggcaa ggcccccaag 600 ctgctgatct acgccgccag cagcctgcag agcggcgtgc ccagcaggtt cagcggcagc 660 ggcagcggca ccgacttcac cctgaccatc agcagcctgc agcccgagga cttcgccacc 720 tactactgcc agcagagcta cagcaccccc cccaccttcg gccccggcac caaggtggag 780 atcaagagga ccggcggcgg aggatctggc ggaggtggaa gcggaggcgg aggaagcggt 840 ggcggcggat ctcaggtgca gctgcaggag tctgggggag gcttggtgca ggctgggggg 900 tcccttagac tctcctgtgt agcctctgga agcatcagaa gtatcaatgt catgggctgg 960 taccgccagg ctccagggaa gcagcgcgag ttggtcgcag cttgtgctag tgatggcaac 1020 acatactatg cggactccgt gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa cgccgagaaa 1080 acggtgtatc tgcagatgaa caacctgaaa cctgacgaca cagccgtcta ttactgtgat 1140 gcgaattcga gggggaatta ttattcgggc caggggaccc aggtcaccgt ttcctcaact 1200 agtggcccgg gaggccaagg tgcaggagga ggggggtctg ggggtggagg atctggtgga 1260 ggtgggtctg gaggaggtgg atcccccgag gaacctctag tggtgaaggt ggaagaggga 1320 gataccgctg ccctgtggtg cctcaagggg acctcagatg gccccactca gcagctgacc 1380 tggtctcggg agtccccgct taaacccttc ttaaaataca gcctgggggt gccaggcctg 1440 ggagtgcacg tgaggcccga cgccatcagc gtggttatcc ggaacgtctc tcaacagatg 1500 gggggcttct acctgtgcca gccggggccc ccctctgaga aggcctggca gcctggctgg 1560 acagtcaatg tggagggcag cggggagctg ttccggtgga atgtttcgga cctaggtggc 1620 ctgggctgtg gcctgaagaa caggtcctca gagggcccca gctccccttc cgggaagctc 1680 atgagcccca agctgtatgt gtgggccaaa gaccgccctg agatctggga gggagagcct 1740 ccgtgtctcc caccgaggga cagcctgaac cagagcctca gccgggacct caccgttgcc 1800 cctggctcca cactctggct gtcctgtggg gtaccccctg actctgtgtc caggggcccc 1860 ctctcctgga cccatgtgca ccccaagggg cctaagtcat tgctgagcct agagctgaag 1920 gacgatcgcc cggccagaga tatgtgggta 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600 accacatact acaactcagc tctcaaatcc agactgacca tcatcaagga caactccaag 660 agccaagttt tcttaaaaat gaacagtctg caaactgatg acacagccat ttactactgt 720 gccaaacatt attactacgg tggtagctat gctatggact actggggtca aggaacctca 780 gtcaccgtct cctcagacta caaagacgat gacgacaaga ttgaagttat gtatcctcct 840 ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt 900 tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt 960 ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtccgc 1020 agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 1080 cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 1140 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1200 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 1260 gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1320 cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1380 cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1440 ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1500 ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1560 aaggacacct acgacgccct tcacatgcaa gccctgcccc ctcgccgcgc gaaacgcagc 1620 ggcagcggcg cgaccaactt tagcctgctg aaacaggcgg gcgatgtgga agaaaacccg 1680 ggcccgatgc cacctcctcg cctcctcttc ttcctcctct tcctcacccc catggaagtc 1740 aggcccgagg aacctctagt ggtgaaggtg gaagagggag ataacgctgt gctgcagtgc 1800 ctcaagggga cctcagatgg ccccactcag cagctgacct ggtctcggga gtccccgctt 1860 aaacccttct taaaactcag cctggggctg ccaggcctgg gaatccacat gaggcccctg 1920 gccatctggc ttttcatctt caacgtctct caacagatgg ggggcttcta cctgtgccag 1980 ccggggcccc cctctgagaa ggcctggcag cctggctgga cagtcaatgt ggagggcagc 2040 ggggagctgt tccggtggaa tgtttcggac ctaggtggcc tgggctgtgg cctgaagaac 2100 aggtcctcag agggccccag ctccccttcc gggaagctca tgagccccaa gctgtatgtg 2160 tgggccaaag accgccctga gatctgggag ggagagcctc cgtgtctccc accgagggac 2220 agcctgaacc agagcctcag ccaggacctc accatggccc ctggctccac actctggctg 2280 tcctgtgggg taccccctga ctctgtgtcc cgcggccccc tctcctggac ccatgtgcac 2340 cccaaggggc ctaagtcatt gctgagccta gagctgaagg acgatcgccc ggccagagat 2400 atgtgggtaa tggagacggg tctgttgttg ccccgggcca cagctcaaga cgctggaaag 2460 tattattgtc accgtggcaa cctgaccatg tcattccacc tggagatcac tgctcggcct 2520 ggcggcggcg ggtctggagg tggaggatct ggtggtggcg ggtctggtgg cggcgggtct 2580 gacatggccc aggtgcagct gcaggagagc ggccccggcc tggtgaagcc cagcgagacc 2640 ctgagcctga cctgcgtggt gagcggcggc agcatcagca gcagcaactg gtggagctgg 2700 gtgaggcagc cccccggcaa gggcctggag tggatcggcg agatctacca cagcggcagc 2760 cccgactaca accccagcct gaagagcagg gtgaccatca gcgtggacaa gagcaggaac 2820 cagttcagcc tgaagctgag cagcgtgacc gccgccgaca ccgccgtgta ctactgcgcc 2880 aaggtgagca ccggcggctt cttcgactac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 2940 agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcga gatcgagctg 3000 acccagagcc ccagcagcct gagcgccagc gtgggcgaca gggtgaccat cacctgcagg 3060 gccagccaga gcatcagcag ctacctgaac tggtaccagc agaagcccgg caaggccccc 3120 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tacccgacta tggtgtaagc 540 tggattcgcc agcctccacg aaagggtctg gagtggctgg gagtaatatg gggtagtgaa 600 accacatact acaactcagc tctcaaatcc agactgacca tcatcaagga caactccaag 660 agccaagttt tcttaaaaat gaacagtctg caaactgatg acacagccat ttactactgt 720 gccaaacatt attactacgg tggtagctat gctatggact actggggtca aggaacctca 780 gtcaccgtct cctcagacta caaagacgat gacgacaaga ttgaagttat gtatcctcct 840 ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt 900 tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt 960 ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtccgc 1020 agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 1080 cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 1140 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1200 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 1260 gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1320 cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1380 cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1440 ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1500 ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1560 aaggacacct acgacgccct tcacatgcaa gccctgcccc ctcgccgcgc gaaacgcagc 1620 ggcagcggcg cgaccaactt tagcctgctg aaacaggcgg gcgatgtgga agaaaacccg 1680 ggcccgatgc cacctcctcg cctcctcttc ttcctcctct tcctcacccc catggaagtc 1740 aggcccgagg aacctctagt ggtgaaggtg gaagagggag ataacgctgt gctgcagtgc 1800 ctcaagggga cctcagatgg ccccactcag cagctgacct ggtctcggga gtccccgctt 1860 aaacccttct taaaactcag cctggggctg ccaggcctgg gaatccacat gaggcccctg 1920 gccatctggc ttttcatctt caacgtctct caacagatgg ggggcttcta cctgtgccag 1980 ccggggcccc cctctgagaa ggcctggcag cctggctgga cagtcaatgt ggagggcagc 2040 ggggagctgt tccggtggaa tgtttcggac ctaggtggcc tgggctgtgg cctgaagaac 2100 aggtcctcag agggccccag ctccccttcc gggaagctca tgagccccaa gctgtatgtg 2160 tgggccaaag accgccctga gatctgggag ggagagcctc cgtgtctccc accgagggac 2220 agcctgaacc agagcctcag ccaggacctc accatggccc ctggctccac actctggctg 2280 tcctgtgggg taccccctga ctctgtgtcc cgcggccccc tctcctggac ccatgtgcac 2340 cccaaggggc ctaagtcatt gctgagccta gagctgaagg acgatcgccc ggccagagat 2400 atgtgggtaa tggagacggg tctgttgttg ccccgggcca cagctcaaga cgctggaaag 2460 tattattgtc accgtggcaa cctgaccatg tcattccacc tggagatcac tgctcggcct 2520 ggcggcggcg ggtctggagg tggaggatct ggtggtggcg ggtctggtgg cggcgggtct 2580 gaggtgcagc tggtggagtc tggtggtggt cttgttcaac ctggtggttc tcttcgtctt 2640 tcttgtgctg cttctggttt taatattaaa gatacttata ttcattgggt tcgtcaagct 2700 cctggtaaag gtcttgaatg ggttgctcgt atttatccta ctaatggtta tactcgttat 2760 gctgattctg ttaaaggtcg ttttactatt tctgctgata cttctaaaaa tactgcttat 2820 cttcaaatga actctcttcg tgctgaagat actgctgttt attattgttc tcgttggggt 2880 ggtgatggtt tttatgctat ggattattgg ggtcaaggta ctcttgtcac cgtctcctca 2940 gctagcaccg ggggcggcgg gtctggaggt ggaggatctg gtggcggcgg gtctgacatc 3000 cagatgaccc agtctccttc ttctctttct gcttctgttg gtgatcgtgt tactattact 3060 tgtcgtgctt ctcaagatgt taatactgct gttgcttggt atcaacaaaa acctggtaaa 3120 gctcctaaac ttcttattta ttctgcttct tttctttatt ctggtgttcc ttctcgtttt 3180 tctggttctc gttctggtac tgattttact cttactattt cttctcttca acctgaagat 3240 tttgctactt attattgtca acaacattat actactcctc ctacttttgg tcaaggtacc 3300 aaggtggaga tcaaacgtac gtctagacat catcaccatc accat 3345 <210> 111 <211> 3342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 111 atgaggcttc tggtgcttct ttggggttgc ttgctgttgc ccggttacga agcagacatc 60 cagatgacac agactacatc ctccctgtct gcctctctgg gagacagagt caccatcagt 120 tgcagggcaa gtcaggacat tagtaaatat ttaaattggt atcagcagaa accagatgga 180 actgttaaac tcctgatcta ccatacatca agattacact caggagtccc atcaaggttc 240 agtggcagtg ggtctggaac agattattct ctcaccatta gcaacctgga gcaagaagat 300 attgccactt acttttgcca acaaggtaat acgcttccgt acacgttcgg aggggggact 360 aagttggaaa taacaggagg cggcgggtct ggaggtggag gatctggtgg tggcgggtct 420 ggaggcggcg ggtctgaggt gaaactgcag gagtcaggac ctggcctggt ggcgccctca 480 cagagcctgt ccgtcacatg cactgtctca ggggtctcat tacccgacta tggtgtaagc 540 tggattcgcc agcctccacg aaagggtctg gagtggctgg gagtaatatg gggtagtgaa 600 accacatact acaactcagc tctcaaatcc agactgacca tcatcaagga caactccaag 660 agccaagttt tcttaaaaat gaacagtctg caaactgatg acacagccat ttactactgt 720 gccaaacatt attactacgg tggtagctat gctatggact actggggtca aggaacctca 780 gtcaccgtct cctcagacta caaagacgat gacgacaaga ttgaagttat gtatcctcct 840 ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt 900 tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt 960 ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtccgc 1020 agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 1080 cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 1140 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1200 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 1260 gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1320 cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1380 cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1440 ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1500 ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1560 aaggacacct acgacgccct tcacatgcaa gccctgcccc ctcgccgcgc gaaacgcagc 1620 ggcagcggcg cgaccaactt tagcctgctg aaacaggcgg gcgatgtgga agaaaacccg 1680 ggcccgatgc cacctcctcg cctcctcttc ttcctcctct tcctcacccc catggaagtc 1740 aggcccgagg aacctctagt ggtgaaggtg gaagagggag ataacgctgt gctgcagtgc 1800 ctcaagggga cctcagatgg ccccactcag cagctgacct ggtctcggga gtccccgctt 1860 aaacccttct taaaactcag cctggggctg ccaggcctgg gaatccacat gaggcccctg 1920 gccatctggc ttttcatctt caacgtctct caacagatgg ggggcttcta cctgtgccag 1980 ccggggcccc cctctgagaa ggcctggcag cctggctgga cagtcaatgt ggagggcagc 2040 ggggagctgt tccggtggaa tgtttcggac ctaggtggcc tgggctgtgg cctgaagaac 2100 aggtcctcag agggccccag ctccccttcc gggaagctca tgagccccaa gctgtatgtg 2160 tgggccaaag accgccctga gatctgggag ggagagcctc cgtgtctccc accgagggac 2220 agcctgaacc agagcctcag ccaggacctc accatggccc ctggctccac actctggctg 2280 tcctgtgggg taccccctga ctctgtgtcc cgcggccccc tctcctggac ccatgtgcac 2340 cccaaggggc ctaagtcatt gctgagccta gagctgaagg acgatcgccc ggccagagat 2400 atgtgggtaa tggagacggg tctgttgttg ccccgggcca cagctcaaga cgctggaaag 2460 tattattgtc accgtggcaa cctgaccatg tcattccacc tggagatcac tgctcggcca 2520 ggaggaggtg ggtctggagg tggaggatct ggtggaggtg ggtctggagg aggtgggtct 2580 gaggtgcagc tgctggagag cggcggcggc caggtgcagc ccggcggcag cctgaggctg 2640 agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacccca tgagctgggt gaggcaggcc 2700 cccggcaagg gcctggagtg ggtgagcgcc atcggcggca gcggcggcag cctgccctac 2760 gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 2820 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caggtactgg 2880 cccatggaca tctggggcca gggcaccctg gtgaccgtga gcagcgccag caccggcggc 2940 ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagcgagatc 3000 gtgctgaccc agagccccgg caccctgagc ctgagccccg gcgagagggc caccctgagc 3060 tgcagggcca gccagagcgt gagcagcagc tacctggcct ggtaccagca gaagcccggc 3120 caggccccca ggctgctgat gtacgacgcc agcatcaggg ccaccggcat ccccgacagg 3180 ttcagcggca gcggcagcgg caccgacttc accctgacca tcagcaggct ggagcccgag 3240 gacttcgccg tgtactactg ccagcagtac cagagctggc ccctgacctt cggccagggc 3300 accaaggtgg agaccaagag gacccatcat caccatcacc at 3342 <210> 112 <211> 3318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 112 atgaggcttc tggtgcttct ttggggttgc ttgctgttgc ccggttacga agcagacatc 60 cagatgacac agactacatc ctccctgtct gcctctctgg gagacagagt caccatcagt 120 tgcagggcaa gtcaggacat tagtaaatat ttaaattggt atcagcagaa accagatgga 180 actgttaaac tcctgatcta ccatacatca agattacact caggagtccc atcaaggttc 240 agtggcagtg ggtctggaac agattattct ctcaccatta gcaacctgga gcaagaagat 300 attgccactt acttttgcca acaaggtaat acgcttccgt acacgttcgg 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gacctaggtg gcctgggctg tggcctgaag aacaggtcct cagagggccc cagctcccct 2100 tccgggaagc tcatgagccc caagctgtat gtgtgggcca aagaccgccc tgagatctgg 2160 gagggagagc ctccgtgtct cccaccgagg gacagcctga accagagcct cagccaggac 2220 ctcaccatgg cccctggctc cacactctgg ctgtcctgtg gggtaccccc tgactctgtg 2280 tccaggggcc ccctctcctg gacccatgtg caccccaagg ggcctaagtc attgctgagc 2340 ctagagctga aggacgatcg cccggccaga gatatgtggg taatggagac gggtctgttg 2400 ttgccccggg ccacagctca agacgctgga aagtattatt gtcaccgtgg caacctgacc 2460 atgtcattcc acctggagat cactgctcgg ccaggaggag gtgggtctgg aggtggagga 2520 tctggtggag gtgggtctgg aggaggtggg tctatggccc aggtcaaact acaggagtca 2580 ggggctgagc tggtgaagcc tggggcctca gtgaagatgt cctgcaaggc ttctggctac 2640 acatttacca gttacaatat gcactgggta aagcagacac ctggacaggg cctggaatgg 2700 attggagcta tttatccagg aaatggtgat acttcctaca atcagaagtt caaaggcaag 2760 gccacattga ctgcagacaa atcctccagc acagcctaca tgcagctcag cagcctgaca 2820 tctgaggact ctgcggacta ttactgtgca agatctaatt attacggtag tagctactgg 2880 ttcttcgatg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctcaggtgg aggcggttca 2940 ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg gacatcgagc tcactcagtc tccaacaatc 3000 ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca atgacttgca gggccagctc aagtgtaaat 3060 tacatggact ggtaccagaa gaagccagga tcctccccca aaccctggat ttatgccaca 3120 tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac 3180 tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg 3240 agttttaatc cacccacgtt cggagggggg acaaagttgg aaataaaacg ggccgccgct 3300 catcatcacc atcaccat 3318 <210> 113 <400> 113 000 <210> 114 <400> 114 000 <210> 115 <400> 115 000 <210> 116 <400> 116 000 <210> 117 <400> 117 000 <210> 118 <400> 118 000 <210> 119 <400> 119 000 <210> 120 <400> 120 000 <210> 121 <400> 121 000 <210> 122 <400> 122 000 <210> 123 <400> 123 000 <210> 124 <400> 124 000 <210> 125 <400> 125 000 <210> 126 <400> 126 000 <210> 127 <400> 127 000 <210> 128 <400> 128 000 <210> 129 <400> 129 000 <210> 130 <400> 130 000 <210> 131 <400> 131 000 <210> 132 <400> 132 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 213 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ala Ile Asn 20 25 30 Glu Ile Asn Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg 35 40 45 Glu Leu Val Ala Ala Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Lys Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Asp Ala Asn Ser Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu 115 120 125 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His His His His 130 135 140 His Gly Ala Ser 145 <210> 214 <211> 145 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 214 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Val Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg 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125 Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp 130 135 140 Leu Gly Ala His His His His His His Gly Ala Ser 145 150 155 <210> 218 <211> 151 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 218 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ile Trp Val Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Trp Asn Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Ile 50 55 60 Val Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Met Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Gly Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Lys Leu Val Asp Ser Gly Trp Tyr Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln 115 120 125 Gly Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His 130 135 140 His His His His Gly Ala Ser 145 150 <210> 219 <211> 150 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 219 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Ala Thr Ser Asn Val Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Arg Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Gln Asp Trp Ala Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly 115 120 125 Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His His 130 135 140 His His His Gly Ala Ser 145 150 <210> 220 <211> 144 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 220 Gln Val Gln Leu Gln Ala Phe Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Thr Met Phe Ser Gly Lys 20 25 30 Asp Val Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys His Val Glu Val Val 35 40 45 Ala Thr Val Ser Ser Asp Gly Gly Thr Asp Tyr Ala Asp Phe Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val Asn Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Met Cys His 85 90 95 Phe Leu Trp Gly Arg His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu Gln Lys Leu Ile 115 120 125 Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His His His His His Gly Ala Ser 130 135 140 <210> 221 <211> 156 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 221 Gln Val Gln Leu Gln Ala Phe Gly Gly Gly Met Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Asn Asp Ile Ser Gly Ser 20 25 30 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Ala His Leu Gly Ala Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Val Asp Ala Pro Arg Glu Arg Pro Phe Tyr Ile Asp Pro Val Ile 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Arg Asn Lys Met Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Asp Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Trp Cys Gly 85 90 95 Pro Ser Leu Arg Thr Phe His Gly Arg Glu Trp Tyr Arg Pro Pro Trp 100 105 110 Phe Thr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser 115 120 125 Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp 130 135 140 Leu Gly Ala His His His His His His Gly Ala Ser 145 150 155 <210> 222 <211> 150 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 222 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Met Val 35 40 45 Ala Val Val Ser Arg Phe Gly Glu Thr Thr Tyr Thr Gly Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ile Asn Arg Asn Asn Thr Val Phe Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Arg Ile Arg Gly Asn Tyr Gly Ser Arg Ile Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly 115 120 125 Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His His 130 135 140 His His His Gly Ala Ser 145 150 <210> 223 <211> 137 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 223 Gln Val Gln Leu Gln Glu Phe Gly Gly Gly Leu Val Gln Leu Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Asn Met Leu Asp Leu Asn 20 25 30 Thr Met Ala Trp Tyr Arg Gln Gly Glu Leu Val Ala Ala Leu Gly Ile 35 40 45 Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 50 55 60 Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser 65 70 75 80 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Asn Phe Glu Ser 85 90 95 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly 100 105 110 Gly Gln Gly Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala 115 120 125 His His His His His His Gly Ala Ser 130 135 <210> 224 <211> 146 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 224 Ala Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Asp Arg Ser Ile Asn 20 25 30 Val Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Lys 85 90 95 Ala Asp Thr Arg Trp Gly Gly Met Tyr Trp Gly Pro Gly Thr Gln Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu Gln Lys 115 120 125 Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His His His His His Gly 130 135 140 Ala Ser 145 <210> 225 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 225 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Arg Thr Ile Asp Asn Gly 20 25 30 Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Trp Ser Gly Gly Ala Thr Phe Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Tyr Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Arg His Thr Leu Asp 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Thr Ile Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Arg Arg Gly Val Asp Leu Arg Arg Asn Ser Tyr Glu Tyr Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro 115 120 125 Gly Gly Gln Gly Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly 130 135 140 Ala His His His His His His Gly Ala Ser 145 150 <210> 226 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 226 Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu 1 5 10 15 Glu Asp Leu Gly Ala His His His His His His Gly Ala Ser 20 25 30 <210> 227 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 227 Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala 1 5 <210> 228 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 228 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 229 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 229 His His His His His His 1 5 <210> 230 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 230 Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ala Ile Asn Glu Ile 1 5 10 <210> 231 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 231 Cys Val Val Ser Gly Asp Thr Arg Ser Ile 1 5 10 <210> 232 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 232 Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Arg Ser Ile 1 5 10 <210> 233 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 233 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr Ala 1 5 10 <210> 234 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 234 Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asn Tyr Ala 1 5 10 <210> 235 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 235 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asp Asp Tyr Ala 1 5 10 <210> 236 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 236 Cys Val Val Ser Gly Ala Thr Ser Asn Val Asn Ala 1 5 10 <210> 237 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 237 Cys Val Val Ser Gly Thr Met Phe Ser Gly Lys Asp 1 5 10 <210> 238 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 238 Cys Val Ala Ser Gly Asn Asp Ile Ser Gly Ser Ala 1 5 10 <210> 239 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 239 Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn Ala 1 5 10 <210> 240 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 240 Cys Val Val Ser Gly Asn Met Leu Asp Leu Asn Thr 1 5 10 <210> 241 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 241 Gly Ser Asp Arg Ser Ile Asn Val 1 5 <210> 242 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 242 Gly Arg Thr Ile Asp Asn Gly Ala 1 5 <210> 243 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 243 Val Ala Ala Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 244 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 244 Trp Val Ser Asp Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Asn 1 5 10 <210> 245 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 245 Ala Ile Asn Trp Ser Gly Gly Thr Thr Asp 1 5 10 <210> 246 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 246 Trp Val Ser Ser Ile Ser Trp Asn Gly Gly Gly Thr Tyr 1 5 10 <210> 247 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 247 Leu Val Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser 1 5 10 <210> 248 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 248 Val Ala Thr Val Ser Ser Asp Gly Gly Thr Asp 1 5 10 <210> 249 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 249 Val Ala Val Asp Ala Pro Arg Glu Arg Pro Phe 1 5 10 <210> 250 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 250 Val Ala Val Val Ser Arg Phe Gly Glu Thr Thr 1 5 10 <210> 251 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 251 Leu Val Ala Ala Leu Gly Ile Ser Thr Tyr 1 5 10 <210> 252 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 252 Ile Thr Ser Gly Gly Thr Thr 1 5 <210> 253 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 253 Ile Asn Trp Ser Gly Gly Ala Thr 1 5 <210> 254 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 254 Asp Ala Asn Ser Arg Gly Asn Tyr Tyr 1 5 <210> 255 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 255 Ala Thr Glu Leu Arg Gly Ser Asp Tyr Tyr Arg Gly Pro Ile Arg Glu 1 5 10 15 Tyr Ala Tyr <210> 256 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 256 Ala Ala Ser Tyr Arg Leu Arg Ile Thr Val Val Val Thr Pro Asp Glu 1 5 10 15 Tyr His Tyr <210> 257 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 257 Val Lys Leu Val Asp Ser Gly Trp Tyr Ser Ala Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 258 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 258 Ala Ala Gln Asp Trp Ala Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 259 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 259 His Phe Leu Trp Gly Arg His Tyr 1 5 <210> 260 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 260 Gly Pro Ser Leu Arg Thr Phe His Gly Arg Glu Trp Tyr Arg Pro Pro 1 5 10 15 Trp Phe Thr Ser 20 <210> 261 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 261 Asn Ala Arg Ile Arg Gly Asn Tyr Gly Ser Arg Ile Asp Tyr 1 5 10 <210> 262 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 262 Ala Arg Asp Tyr Asn Phe Glu Ser 1 5 <210> 263 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 263 Lys Ala Asp Thr Arg Trp Gly Gly Met Tyr 1 5 10 <210> 264 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 264 Ala Ser Arg Arg Gly Val Asp Leu Arg Arg Asn Ser Tyr Glu Tyr Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 265 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 265 Gly Ser Ile Phe Ala Ile Asn Glu Ile Asn Leu 1 5 10 <210> 266 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 266 Gly Asp Thr Arg Ser Ile Asn Leu 1 5 <210> 267 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 267 Gly Ser Ile Arg Ser Ile Asn Val 1 5 <210> 268 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 268 Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr Ala 1 5 <210> 269 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 269 Gly Leu Thr Phe Ser Asn Tyr Ala 1 5 <210> 270 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 270 Gly Phe Ala Phe Asp Asp Tyr Ala 1 5 <210> 271 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 271 Gly Ala Thr Ser Asn Val Asn Ala 1 5 <210> 272 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 272 Gly Thr Met Phe Ser Gly Lys Asp 1 5 <210> 273 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 273 Gly Asn Asp Ile Ser Gly Ser Ala 1 5 <210> 274 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 274 Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn Ala 1 5 <210> 275 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 275 Gly Asn Met Leu Asp Leu Asn Thr 1 5 <210> 276 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 276 Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr 1 5 <210> 277 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 277 Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 278 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 278 Ile Asn Trp Ser Gly Gly Thr Thr 1 5 <210> 279 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 279 Ile Ser Trp Asn Gly Gly Gly Thr 1 5 <210> 280 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 280 Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 281 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 281 Val Ser Ser Asp Gly Gly Thr 1 5 <210> 282 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 282 Val Asp Ala Pro Arg Glu Arg Pro 1 5 <210> 283 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 283 Val Ser Arg Phe Gly Glu Thr 1 5 <210> 284 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 284 Leu Gly Ile Ser Thr 1 5

Claims (48)

  1. SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 CD19 변이체로서, SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드보다 더 안정적인, CD19 변이체.
  2. 제1항에 있어서, CD19 변이체가 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 것보다 적어도 20%, 40%, 60%, 80%, 100%, 120%, 140%, 160%, 180%, 200%, 250%, 300%, 400% 또는 500% 더 큰 안정성의 측정 수준을 갖는 CD19 변이체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, CD19 변이체가 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 프로테아제 절단에 대해 더 내성이 있는 CD19 변이체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, CD19 변이체가 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 열적으로 더 안정한 CD19 변이체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CD19 변이체가 표 1A, 표 1B, 표 2A, 표 2B, 표 3, 표 6, 도 8b, 도 11, 도 12b, 도 14a, 도 14b, 도 14c, 도 14d 또는 도 15b에 나열된 SEQ ID NO:2의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 CD19 변이체.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CD19 변이체가 5/7/9; 14/16/18; 29/31; 29/31/33; 35/37/39; 45/47/49; 52/54/56; 59/61/63; 62/64/66; 76/78/80; 86/88/90; 167/169/171; 175/177/179; 193/195/197; 206/208/210; 207/209/211; 219/221/223; 240/243; 224/226/228; 247/249/251; 253/255/256; 255/256; 또는 261/262/264/265의 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치의 세트 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 CD19 변이체.
  7. 제6항에 있어서, 아미노산 치환이 표 1B, 표 2B, 표 3, 표 6, 도 8b, 도 11, 도 14a, 도 14b, 도 14c, 도 14d 또는 도 15b에 제시된 치환을 포함하는 CD19 변이체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, CD19 변이체가 항-CD19 항체에 결합하는 CD19 변이체.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, CD19 변이체가 종양 항원에 결합하는 CD19 변이체.
  10. 제9항에 있어서, 종양 항원이 MART-1/MelanA(MART-I), gp100(Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15, CEA, p53, Ras, HER-2/neu, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, 엡스타인 바 바이러스 항원 EBVA, 인간 유두종바이러스(HPV) 항원 E6 또는 E7, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, erbB, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백질, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733＼EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린 C-관련 단백질, TAAL6, TAG72, TLP, MUC16, IL13Rα2, FRα, VEGFR2, 루이스 Y, FAP, EphA2, CEACAM5, EGFR, CA6, CA9, GPNMB, EGP1, FOLR1, 내피 수용체, STEAP1, SLC44A4, 넥틴-4, AGS-16, 구아날릴 사이클라제 C, MUC-1, CFC1B, 인테그린 알파 3 사슬(a3b1의 것, 라미닌 수용체 사슬), TPS, CD19, CD20, CD22, CD30, CD72, CD180, CD171(L1CAM), CD123, CD133, CD138, CD37, CD70, CD79a, CD79b, CD56, CD74, CD166, CD71, CLL-1/CLEC12A, ROR1, 글리피칸 3(GPC3), 메소텔린, CD33/IL3Ra, c-Met, PSCA, PSMA, 당지질 F77, EGFRvIII, BCMA, GD-2, MY-ESO-1 또는 MAGE A3인 CD19 변이체.
  11. (a) 항원에 결합하는 항체 또는 스캐폴드 폴리펩티드, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 (b) 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항의 CD19 변이체를 포함하는 융합 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 항원이 자가면역 장애와 관련된 항원인 융합 단백질.
  13. 제11항에 있어서, 항원이 감염원 항원인 융합 단백질.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 스캐폴드 폴리펩티드, 또는 이의 항원 결합 단편이 scFv 또는 VHH 또는 타입 III 섬유결합소 도메인을 포함하는 융합 단백질.
  15. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, CD19 변이체가 단편 항체의 경쇄의 C-말단 또는 N-말단에 융합된 융합 단백질.
  16. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, CD19 변이체가 단편 항체의 중쇄의 C-말단 또는 N-말단에 융합된 융합 단백질.
  17. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, CD19 변이체가 단편 항체의 경쇄의 C-말단에 융합된 융합 단백질.
  18. 제14항에 있어서, VHH가 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질.
  19. 제14항에 있어서, VHH가 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분(예를 들어, CLL-1 결합 부분)를 포함하고, 상기 부분이 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS 중 하나 이상이 결여되어 있는, 융합 단백질.
  20. 제14항에 있어서, VHH가 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분(예를 들어, CLL-1 결합 부분)를 포함하고, 상기 부분이 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS의 전부가 결여되어 있는, 융합 단백질.
  21. 제14항에 있어서, VHH가 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분(예를 들어, CLL-1 결합 부분)를 포함하고, 상기 부분이 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS 중 하나 이상이 결여되어 있고, 상기 부분이 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상)의 추가 아미노산이 결여되어 있는, 융합 단백질.
  22. 제14항에 있어서, VHH가 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분(예를 들어, CLL-1 결합 부분)를 포함하고, 상기 부분이 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS의 전부가 결여되어 있고, 상기 부분이 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상)의 추가 아미노산이 결여되어 있는, 융합 단백질.
  23. 제14항에 있어서, VHH가 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 부분이 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS 중 하나 이상이 결여되어 있는, 융합 단백질.
  24. 제14항에 있어서, VHH가 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 부분이 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS의 전부가 결여되어 있는, 융합 단백질.
  25. 제14항에 있어서, VHH가 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 부분이 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS 중 하나 이상이 결여되어 있고, 상기 부분이 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상)의 추가 아미노산이 결여되어 있는, 융합 단백질.
  26. 제14항에 있어서, VHH가 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 부분이 SEQ ID No:203 내지 225 각각에 도시된 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS의 전부가 결여되어 있고, 상기 부분이 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상)의 추가 아미노산이 결여되어 있는, 융합 단백질.
  27. 제14항에 있어서, VHH가 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나에 도시된 적어도 하나의 CDR(예를 들어, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3)을 포함하는 융합 단백질.
  28. 제14항에 있어서, VHH가 SEQ ID No:203 내지 225 중 어느 하나에 도시된 CDR(예를 들어, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3)과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 적어도 하나의 CDR을 포함하는 융합 단백질.
  29. 제14항에 있어서, VHH가 표 5A 및/또는 표 5B에 도시된 그룹 1 내지 13 중 어느 하나의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3를 포함하는 융합 단백질.
  30. 제14항에 있어서, VHH가 표 5A 및/또는 표 5B에 도시된 그룹 1 내지 13 중 어느 하나의 (i) CDR1 및 CDR2; (ii) CDR2 및 CDR3; (iii) CDR1 및 CDR3; 또는 (iv) CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 융합 단백질.
  31. 제14항에 있어서, VHH가 표 5A 및/또는 표 5B에 도시된 그룹 1의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 2의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 3의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 4의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 5의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 6의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 7의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 8의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 9의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 그룹 10의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는 그룹 13의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 융합 단백질.
  32. 제11항 내지 제31항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산.
  33. 제32항의 핵산을 포함하는 세포.
  34. 제32항의 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터 또는 키메라 AAV/파지(AAVP) 벡터.
  35. 제32항의 핵산을 포함하는 종양용해성 바이러스 벡터.
  36. 제35항에 있어서, 종양용해성 바이러스 벡터가 자율 파르보바이러스 벡터, 점액종 바이러스 벡터, 파라믹소바이러스 벡터, 레오바이러스 벡터, 피코르나바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 벡터, 또는 소수포구내염 바이러스 벡터인 종양용해성 바이러스 벡터.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 세포.
  38. 제37항에 있어서, 세포가 종양 세포인 세포.
  39. 제32항의 핵산을 포함하는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터.
  40. 제39항에 있어서, CAR을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터.
  41. 제39항 또는 제40항의 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 포함하는 세포.
  42. 제41항에 있어서, 세포가 T 세포인 세포.
  43. 제11항 내지 제31항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 또는 제41항 또는 제42항의 세포, 또는 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항의 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 종양을 갖는 대상체를 치료하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 항체, 항체 약물 컨쥬게이트 또는 CAR-T 세포를 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 항체, 항체 약물 컨쥬게이트 또는 CAR-T 세포가 CD19 변이체에 결합하는, 방법.
  45. 안정한 CD19 변이체를 확인하는 방법으로서, 상기 방법이,
    a) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 치환을 각각 갖는 복수의 CD19 폴리펩티드를 획득하는 단계;
    b) 복수의 CD19 폴리펩티드가 항-CD19 항체 또는 이의 단편에 의해 결합되는지 결정하는 단계;
    c) 복수의 CD19 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 프로테아제 절단에 대해 더 내성이 있는지 결정하는 단계; 및/또는
    d) 복수의 CD19 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 열적으로 더 안정적인지 결정하는 단계를 포함하고;
    상기 폴리펩티드가 (i) 항-CD19 항체 또는 이의 단편에 의해 결합되고/되거나; (ii) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 프로테아제 절단에 대해 더 내성이 있고/있거나; (iii) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 열적으로 더 안정적인 경우 CD19 폴리펩티드가 안정한 CD19 변이체인, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 항-CD19 항체가 FMC63 또는 4G7인 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 복수의 CD19 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2의 위치 2, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 38, 39, 45, 47, 49, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 66, 68, 70, 72, 84, 90, 93, 94, 99, 100, 105, 108, 111, 113, 114, 115, 122, 123, 124, 125, 127, 130, 131, 132, 135, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 148, 149, 154, 167, 169, 171, 185, 189, 193, 194, 196, 198, 202, 204, 206, 207, 209, 211, 212, 213, 215, 216, 217, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 228, 229, 230, 232, 235, 240, 243, 247, 249, 250, 251, 252, 253, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 264, 265, 269 또는 271에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 방법.
  48. 제45항 또는 제46항에 있어서, 복수의 CD19 폴리펩티드가 5/7/9; 14/16/18; 29/31; 29/31/33; 35/37/39; 45/47/49; 52/54/56; 59/61/63; 62/64/66; 76/78/80; 86/88/90; 167/169/171; 175/177/179; 193/195/197; 206/208/210; 207/209/211; 219/221/223; 240/243; 224/226/228; 247/249/251; 253/255/256; 255/256; 또는 261/262/264/265의 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치의 세트 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 방법.
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