CN116390941A - 多特异性嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

多特异性嵌合抗原受体及其用途 Download PDF

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Abstract

本公开提供了靶向CD20、CD19和/或CD22的嵌合抗原受体。进一步提供了包含所述嵌合抗原受体的工程化免疫效应细胞(如T细胞)。还提供了治疗疾病或病症的药物组合物、试剂盒和方法。

Description

多特异性嵌合抗原受体及其用途
交叉引用
本申请要求2020年7月16日提交的第PCT/CN2020/102470号国际专利申请的优先权权益，该国际专利申请的内容以全文引用的方式并入本文。
序列表
本申请以引用的方式并入随同本申请一起提交的序列表，该序列表为文本文件，标题为14651-028-228_SEQ_LISTING.txt，创建于2021年7月14日，且大小为536,002字节。
技术领域
本公开涉及靶向CD19、CD20和/或CD22的嵌合抗原受体，包含所述嵌合抗原受体的工程化免疫效应细胞，以及它们的使用方法。本公开进一步涉及用于治疗用途的细胞的激活和扩增，特别涉及基于嵌合抗原受体的T细胞免疫疗法。
背景技术
CD20是在B细胞分化的某些阶段表达的表面抗原。用治疗性单克隆抗体(mAb)靶向CD20阳性B细胞一直是治疗血液系统恶性肿瘤如非霍奇金淋巴瘤(NHL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)的有效策略。采用利妥昔单抗(RTX)的初步成功促进了更有效的基于CD20的治疗剂的创造和开发。然而，使用常规mAb的治疗不足以克服诸如难治性/复发性疾病的问题(Shanehbandi等人，Current Cancer Drug Targets,17(5):423-444(2007))。
CD19在正常B细胞上表达并且被包括大多数B细胞恶性肿瘤在内的各种疾病和病状的细胞和组织表达。CD19通过调节B细胞受体依赖性和非依赖性信号传导两者而关键性地参与建立内在B细胞信号传导阈值。CD19充当成熟B细胞表面上的多分子复合物的主要信号传导组分，并且在维持体液、抗原诱导的反应与耐受性诱导之间的平衡方面发挥关键作用。参见Wang等人，Exp Hematol Oncol.1:36(2012)。
CD22也称为BL-CAM、B3、Leu-14、Lyb-8和Siglec-2，是唾液酸粘附素家族的细胞表面I型糖蛋白。CD22已被证明由B淋巴细胞特异性表达，并且作为B淋巴细胞激活的负调控剂在功能上很重要(Nitschke，Curr.Opin.Immunol.,17:290-297(2005))。CD22是下调BCR信号传导并阻断B细胞过度刺激的抑制性共受体，并且在维持边缘区中的B细胞群体、优化B细胞抗原受体诱导的增殖和B细胞更新等方面发挥重要作用。大多数B细胞恶性肿瘤表达CD22，这使CD22成为有希望的癌症治疗的靶标。此外，已经提出通过靶向CD22选择性调节B细胞活性来治疗自身免疫性疾病(参见，例如，Steinfeld and Youinou,Expert.Opin.Biol.Ther.,6:943-949(2006))。
嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞疗法是一种新兴且有效的癌症免疫疗法，特别是在血液系统恶性肿瘤中。然而，CAR-T细胞的应用受到诸如细胞因子释放综合征和结合非肿瘤组织里的靶标而产生的毒性(on-target off-tumor toxicity)的副作用的阻碍(Yu等人，Molecular Cancer 18(1):125(2019))。
需要改进的结合分子及工程化细胞。例如，需要开发稳定且治疗有效的CD20、CD19和/或CD22结合分子以用于更有效或高效的CAR-T疗法。
发明内容
一方面，本文提供一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：(a)包含抗CD20单结构域抗体(sdAb)、抗CD19 sdAb和抗CD22 sdAb的细胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)细胞内信号传导结构域，其中所述抗CD20 sdAb靠近所述跨膜结构域的程度比所述抗CD19sdAb或所述抗CD22 sdAb靠近所述跨膜结构域的程度更高。在一些实施方案中，所述抗CD19sdAb在所述抗CD22 sdAb的N-末端。在其它实施方案中，所述抗CD19 sdAb在所述抗CD22sdAb的C-末端。
另一方面，本文提供一种CAR，其包含：(a)包含抗CD20 sdAb、抗CD19 sdAb和抗CD22 sdAb的细胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)细胞内信号传导结构域，其中所述抗CD19 sdAb靠近所述跨膜结构域的程度比所述抗CD20 sdAb或所述抗CD22 sdAb靠近所述跨膜结构域的程度更高。在一些实施方案中，所述抗CD20 sdAb位于所述抗CD22 sdAb的N-末端。在其它实施方案中，所述抗CD20sdAb位于所述抗CD22 sdAb的C-末端。
在又一方面，本文提供一种CAR，其包含：(a)包含抗CD20 sdAb、抗CD19 sdAb和抗CD22 sdAb的细胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)细胞内信号传导结构域，其中所述抗CD22 sdAb靠近所述跨膜结构域的程度比所述抗CD19 sdAb或所述抗CD20 sdAb靠近所述跨膜结构域的程度更高。在一些实施方案中，所述抗CD19 sdAb位于所述抗CD20 sdAb的N-末端。在其它实施方案中，所述抗CD19sdAb位于所述抗CD20 sdAb的C-末端。
在一些实施方案中，所述抗CD20 sdAb、所述抗CD19 sdAb和所述抗CD22 sdAb直接或经由一个或多个肽接头彼此融合；且其中所述一个或多个肽接头包含不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸。在一些实施方案中，所述一个或多个肽接头是(GGGGS)n，n是1、2、3或4。
在又一方面，文提供一种CAR，其包含：(a)包含抗CD20单结构域抗体(sdAb)、抗CD19 sdAb和抗CD22 sdAb的细胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)细胞内信号传导结构域；其中所述抗CD20 sdAb、所述抗CD19 sdAb和所述抗CD22 sdAb直接或经由一个或多个肽接头彼此融合；且其中所述一个或多个肽接头包含不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸。在一些实施方案中，所述一个或多个肽接头是(GGGGS)n，n是1、2、3或4。
在一些实施方案中，所述抗CD20 sdAb包含：(i)包含SEQ ID NO:1或310的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3；(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR3；(iii)包含SEQ ID NO:1或310的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3；(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR3；(v)包含SEQ ID NO:11或311的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3；(vi)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:10的氨基酸序列的CDR3；(vii)包含SEQ ID NO:14或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；(viii)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:19的氨基酸序列的CDR3；(ix)包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；(x)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:19的氨基酸序列的CDR3；(xi)包含SEQ ID NO:24或313的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR3；(xii)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:29的氨基酸序列的CDR3；(xiii)包含SEQ ID NO:14或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；(xiv)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:19的氨基酸序列的CDR3；(xv)包含SEQ ID NO:1或310的氨基酸序列的CDR1；包含SEQID NO:32的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3；(xvi)包含SEQID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR3；(xvii)包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:34的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；(xviii)包含SEQID NO:22的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ IDNO:19的氨基酸序列的CDR3；(xix)包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQID NO:36的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；(xx)包含SEQID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:16的氨基酸序列的CDR3；或(xxi)包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；(xxii)包含SEQ ID NO:283或314的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:284的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:285的氨基酸序列的CDR3；(xxiii)包含SEQ ID NO:286的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:287的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:288的氨基酸序列的CDR3；(xxiv)包含SEQ ID NO:289或315的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:290的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:291的氨基酸序列的CDR3；(xxv)包含SEQ ID NO:292的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:294的氨基酸序列的CDR3；(xxiv)包含SEQ ID NO:295或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:296的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:297的氨基酸序列的CDR3；或(xxvii)包含SEQ IDNO:298的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:299的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:300的氨基酸序列的CDR3；所述抗CD19 sdAb包含：(i)包含SEQ ID NO:73或316的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR3；(ii)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3；(iii)包含SEQ ID NO:79或317的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR3；(iv)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的CDR3；(v)包含SEQ ID NO:73或316的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:307的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR3；或(vi)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3；且所述抗CD22 sdAb包含：(i)包含SEQ IDNO:93或318的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ IDNO:95的氨基酸序列的CDR3；(ii)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR3；(iii)包含SEQ ID NO:99或319的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ IDNO:101的氨基酸序列的CDR3；(iv)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:103的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR3；(v)包含SEQ IDNO:105或320的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:107的氨基酸序列的CDR3；(vi)包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR1；包含SEQID NO:109的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的CDR3；(vii)包含SEQ ID NO:111或321的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR3；(viii)包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR3；(ix)包含SEQ ID NO:117或322的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR3；(x)包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR3；(xi)包含SEQ ID NO:123或323的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR3；或(xii)包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR3。
在又一方面，本文提供一种CAR，其包含：(a)包含抗CD20 sdAb、抗CD19 sdAb和抗CD22 sdAb中的至少两者的细胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)细胞内信号传导结构域，其中所述抗CD20sdAb包含：(i)包含SEQ ID NO:1或310的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3；(ii)包含SEQID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR3；(iii)包含SEQ ID NO:1或310的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3；(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR3；(v)包含SEQ ID NO:11或311的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3；(vi)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR3；(vii)包含SEQ ID NO:14或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；(viii)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3；(ix)包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；(x)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3；(xi)包含SEQ ID NO:24或313的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR3；(xii)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR3；(xiii)包含SEQ ID NO:14或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；(xiv)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3；(xv)包含SEQ ID NO:1或310的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3；(xvi)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR3；(xvii)包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；(xviii)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3；(xix)包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；(xx)包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；(xxi)包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；(xxii)包含SEQ ID NO:283或314的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:284的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:285的氨基酸序列的CDR3；(xxiii)包含SEQ ID NO:286的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:287的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:288的氨基酸序列的CDR3；(xxiv)包含SEQ IDNO:289或315的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:290的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:291的氨基酸序列的CDR3；(xxv)包含SEQ ID NO:292的氨基酸序列的CDR1；包含SEQID NO:293的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:294的氨基酸序列的CDR3；(xxvi)包含SEQ ID NO:295或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:296的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:297的氨基酸序列的CDR3；或(xxvii)包含SEQ ID NO:298的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:299的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:300的氨基酸序列的CDR3；所述抗CD19 sdAb包含：(i)包含SEQ ID NO:73或316的氨基酸序列的CDR1；包含SEQID NO:74的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR3；(ii)包含SEQID NO:76的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ IDNO:78的氨基酸序列的CDR3；(iii)包含SEQ ID NO:79或317的氨基酸序列的CDR1；包含SEQID NO:80的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR3；或(iv)包含SEQID NO:82的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ IDNO:84的氨基酸序列的CDR3；或(v)包含SEQ ID NO:73或316的氨基酸序列的CDR1；包含SEQID NO:307的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR3；且所述抗CD22sdAb包含：(i)包含SEQ ID NO:93或318的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR3；(ii)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR3；(iii)包含SEQ ID NO:99或319的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR3；(iv)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR3；(v)包含SEQ ID NO:105或320的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR3；(vi)包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的CDR3；(vii)包含SEQ ID NO:111或321的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR3；(viii)包含SEQ IDNO:114的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR3；(ix)包含SEQ ID NO:117或322的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:118的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR3；(x)包含SEQ IDNO:120的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR3；(xi)包含SEQ ID NO:123或323的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:124的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR3；或(xii)包含SEQID NO:126的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ IDNO:128的氨基酸序列的CDR3。
在又一方面，本文提供一种CAR，其包含：(a)包含抗CD20 sdAb、抗CD19 sdAb和抗CD22 sdAb中的至少两者的细胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)细胞内信号传导结构域，其中所述抗CD20sdAb包含(i)分别具有如SEQ ID NO:39中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(ii)分别具有如SEQ ID NO:40中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(iii)分别具有如SEQ ID NO:41中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(iv)分别具有如SEQ ID NO:42中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(v)分别具有如SEQ ID NO:43中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(vi)分别具有如SEQ ID NO:44中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(vii)分别具有如SEQ ID NO:45中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(viii)分别具有如SEQ IDNO:46中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(ix)分别具有如SEQID NO:47中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(x)分别具有如SEQID NO:48中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(xi)分别具有如SEQ ID NO:49中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(xii)分别具有如SEQ ID NO:50中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(xiii)分别具有如SEQ ID NO:51中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(xiv)分别具有如SEQ ID NO:52中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(xv)分别具有如SEQ ID NO:53中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(xvi)分别具有如SEQ ID NO:54中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(xvii)分别具有如SEQ ID NO:55中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(xviii)分别具有如SEQ ID NO:301中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(xix)分别具有如SEQ ID NO:302中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；或(xx)分别具有如SEQ ID NO:303中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；所述抗CD19 sdAb包含：(i)分别具有如SEQ ID NO:85中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(ii)分别具有如SEQ IDNO:86中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(iii)分别具有如SEQID NO:87中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；或(iv)分别具有如SEQ ID NO:88中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；或(v)分别具有如SEQ ID NO:308中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；且所述抗CD22 sdAb包含：(i)分别具有如SEQ ID NO:129中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(ii)分别具有如SEQ ID NO:130中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(iii)分别具有如SEQ ID NO:131中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(iv)分别具有如SEQ ID NO:132中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(v)分别具有如SEQ ID NO:133中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(vi)分别具有如SEQ ID NO:134中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；或(vii)分别具有如SEQ ID NO:135中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，CDR1、CDR2或CDR3根据Kabat编号方案、IMGT编号方案、AbM编号方案、Chothia编号方案、Contact编号方案或它们的组合来确定。
在一些实施方案中，所述CAR包含：(1)所述抗CD20 sdAb和所述抗CD19 sdAb；(2)所述抗CD20 sdAb和所述抗CD22 sdAb；(3)所述抗CD19 sdAb和所述抗CD22 sdAb；或(4)所述抗CD20 sdAb、所述抗CD19 sdAb和所述抗CD22 sdAb。
在一些实施方案中，所述抗CD20 sdAb、所述抗CD19 sdAb和所述抗CD22 sdAb各自独立地为骆驼科sdAb或人源化sdAb。
在一些实施方案中，所述抗CD20 sdAb包含SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:301、SEQ ID NO:302或SEQ ID NO:303的氨基酸序列；所述抗CD19 sdAb包含SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ IDNO:88或SEQ ID NO:308的氨基酸序列；且所述抗CD22 sdAb包含SEQ ID NO:129、SEQ IDNO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134或SEQ ID NO:135的氨基酸序列。
在其它实施方案中，所述抗CD20 sdAb包含与SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:301、SEQ ID NO:302或SEQ ID NO:303的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的氨基酸序列；所述抗CD19 sdAb包含与SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQID NO:88或SEQ ID NO:308的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的氨基酸序列；且所述抗CD22 sdAb包含与SEQ ID NO:129、SEQID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134或SEQ ID NO:135的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述跨膜结构域来源于选自CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1的分子。在一些实施方案中，所述跨膜结构域来源于CD8α。
在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述初级细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ。
在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域进一步包含共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域来源于选自由CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组的共刺激分子。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域来源于CD137。
在一些实施方案中，本文提供的CAR进一步包含位于所述细胞外抗原结合结构域的C-末端与所述跨膜结构域的N-末端之间的铰链结构域。在一些实施方案中，所述铰链结构域来源于CD8α。
在一些实施方案中，本文提供的CAR进一步包含位于多肽的N-末端的信号肽。在一些实施方案中，所述信号肽来源于CD8α。
另一方面，本文提供一种CAR，其包含(i)选自由SEQ ID NO:174-226组成的组的氨基酸序列；或(ii)与选自由SEQ ID NO:174-226组成的组的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的氨基酸序列。
在又一方面，本文提供一种分离的核酸，其包含编码本文提供的CAR的核酸序列。另一方面，本文提供包含编码本文提供的CAR的核酸的载体。
在又一方面，本文提供一种工程化免疫效应细胞，其包含本文提供的CAR、分离的核酸或载体。在一些实施方案中，所述工程化免疫效应细胞是T细胞或B细胞。
另一方面，本文提供一种药物组合物，其包含本文提供的工程化免疫效应细胞或载体，和药学上可接受的赋形剂。
在又一方面，本文提供治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括对所述受试者施用有效量的本文提供的工程化免疫效应细胞或药物组合物。在一些实施方案中，所述疾病或病症是B细胞相关疾病或病症、CD19相关疾病或病症、CD20相关疾病或病症和/或CD22相关疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在其它实施方案中，所述疾病或病症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述B细胞恶性肿瘤是B细胞白血病或B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，所述疾病或病症选自由以下组成的组：边缘区淋巴瘤(例如，脾边缘区淋巴瘤)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B细胞幼淋巴细胞性白血病(B-PLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、伯基特淋巴瘤、原发性眼内淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞白血病(HCL)、前体B成淋巴细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、高级B细胞淋巴瘤(HGBL)和多发性骨髓瘤(MM)。在其它实施方案中，所述疾病或病症是自身免疫和/或炎性疾病。在一些实施方案中，所述自身免疫和/或炎性疾病与不适当或增高的B细胞数目和/或激活相关。
在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括在对所述受试者施用有效量的所述工程化免疫效应细胞之前检测和/或测量在获自所述受试者的癌细胞上表达的CD19、CD20和/或CD22的水平。在一些实施方案中，在获自所述受试者的癌细胞上表达的CD19、CD20和/或CD22的水平决定了对表达适合于治疗所述癌症的CAR的工程化免疫效应细胞的选择。
附图说明
图1A-1B显示示例单特异性VHH CAR-T细胞(图1A)和三特异性VHH CAR-T细胞(图1B)的转导效率。UnT是指未用CAR转导的T细胞。
图2A-2I示出三特异性VHH CAR-T细胞对以下细胞系的体外细胞毒性与单特异性VHH CAR-T细胞或单特异性scFv CAR-T细胞对以下细胞系的体外细胞毒性的比较：Raji.Luc(图2A、2G和2J)、Nalm.6.Luc(图2B、2I和2K)、K562-CD19.Luc(图2C)、K562-CD20.Luc(图2D)、K562-CD22.Luc(图2E)、K562.Luc(图2F)和Daudi.Luc(图2H)。
图3A-3B示出在与Raji.Luc或K562.Luc细胞一起以不同的E:T比率共培养24小时后三特异性VHH CAR-T细胞的IFN-γ释放水平和细胞毒性与单特异性VHH CAR-T细胞的IFN-γ释放水平和细胞毒性的比较。使用T检验分析P值。
图4A-4G示出三特异性VHH CAR-T细胞在Raji异种移植NCG小鼠模型中的体内抗肿瘤功效。定期评估用不同剂量的三特异性VHH CAR-T细胞处理的小鼠，以通过生物发光成像(图4A-4F)和体重(图4G)监测肿瘤生长。
图5A-5B示出示例单特异性人源化VHH CAR-T细胞(图5A)和三特异性人源化VHHCAR-T细胞(图5B)的转导效率。UnT是指未用CAR转导的T细胞。
图6A-6F示出三特异性人源化VHH CAR-T细胞对表达三阳性抗原的淋巴瘤细胞系-Raji.Luc(图6A、图6C和图6E)和表达双阳性抗原的白血病细胞系-Nalm.6.Luc(图6B、图6D和图6F)的体外细胞毒性。
图7A-7F示出三特异性人源化VHH CAR-T细胞对表达单抗原的细胞系-K562-CD19.Luc(图7A和图7D)、K562-CD20.Luc(图7B和图7E)和K562-CD22.Luc(图7C和图7F)的体外细胞毒性。
图8示出在与Raji.Luc或K562.Luc细胞一起以不同的E:T比率共培养24小时后三特异性人源化VHH CAR-T细胞的IFN-γ释放水平与单特异性scFv CAR-T细胞的IFN-γ释放水平的比较。
图9示出在与Raji.Luc、单核细胞或者靶细胞和单核细胞两者共培养24小时后的三特异性人源化VHH CAR-T细胞的IL-6释放水平。
图10A-10F示出三特异性人源化VHH CAR-T细胞对具有CD19基因敲除的Raji细胞的体外细胞毒性。
图11A-11D示出三特异性人源化VHH CAR-T细胞在Raji异种移植NCG小鼠模型中的体内抗肿瘤功效。定期评估小鼠以通过生物发光成像(图11A和图11B)、体重(图11C)和存活率(图11D)监测肿瘤生长。
图12A-12C示出来自评估AIO-huIgG1Fc mAb或huAIO-huIgG1Fc mAb的结合亲和力的研究的结果。MFI＝平均荧光强度。
具体实施方式
本公开部分地基于与CD20、CD19和/或CD22结合的新型多特异性嵌合抗原受体或包含该新型多特异性嵌合抗原受体的工程化细胞以及它们的改进的性质。
几种重要的疾病牵涉B淋巴细胞。例如，B细胞的恶性转化导致癌症，包括但不限于淋巴瘤，例如多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤。B细胞恶性肿瘤对各种形式的治疗的反应是混合型的。由于毒副作用的原因，治疗B细胞恶性肿瘤的传统方法(包括化学疗法和放射疗法)的效用有限。利用抗CD19、抗CD20、抗CD22、抗CD23和抗CD80治疗性抗体的免疫疗法取得的成功有限，这部分由于药代动力学分布差、抗体通过血清蛋白酶和肾小球过滤快速消除，以及向肿瘤部位中的渗透和靶抗原在癌细胞上的表达水平有限。使用表达嵌合抗原受体(CAR)的经遗传修饰的细胞的尝试取得的成功也有限，这是由于CAR T细胞的体内扩增差、输注之后细胞快速消失、细胞因子释放综合征(CRS)、肿瘤抗原逃逸等原因。
人CD19抗原是属于免疫球蛋白超家族的95kDa跨膜糖蛋白。CD20是具有四个跨膜区以及细胞内氨基和羧基末端的33-kDa至37-kDa的非糖基化磷蛋白。CD19和CD20都广泛表达于从早期前B细胞直到成熟B细胞阶段的B细胞发育中，但在分化成浆细胞时流失。CD22也是130～150kDa的B细胞谱系限制性细胞表面磷酸糖蛋白。细胞质CD22在B细胞分化的最早期阶段与CD19一起表达，并且在CD20表达之前存在。CD19、CD20和CD22在所有B细胞恶性肿瘤上均表达。
尽管靶向B细胞表面抗原一直是有吸引力的治疗策略，但在肿瘤学领域中长期存在的挑战是出现该靶抗原的流失或下调的肿瘤。抗原流失或抗原低逃逸可能会作为取得成功的甚至更大的障碍出现在实体瘤中，这是由于靶抗原表达的异质性更高。
当在癌细胞上遇到足够量的肿瘤相关表面抗原(TAA)时，CAR-T细胞是强效的。肿瘤细胞可以通过“抗原逃逸”(表达缺乏CAR识别的细胞外表位的TAA的替代形式)或“抗原下调”(将TAA表达水平降低到触发CAR-T细胞激活的阈值以下)来逃避CAR-T的杀伤。例如，据报告有30～60％的ALL或BCL患者在CD19 CAR治疗后复发，这可能是由于CD19抗原的逃逸或下调。类似地，无论是采用博纳吐单抗(CD19xCD3双特异性抗体)还是靶向CD19或CD22的CAR-T细胞，所报告的ALL的缓解率均在40％与94％之间变化，这可能是由于CD19表达的流失和CD22下调。
本公开部分地旨在通过工程化的CAR和具有多特异性的CAR-T细胞来解决现有疗法的上面提到的问题，以对TAA的较低表达水平作出反应，以抵消抗原逃逸和抗原下调，并且以在CAR-T细胞激活、增殖、细胞毒性和细胞因子释放方面更高效。
然而，如许多研究所指示示，产生有效的多特异性CAR也具有挑战性。例如，目前可用的CAR-T疗法是基于scFv，然而，串联CAR方法极其不太可能用于超过两个scFv。由于具有三个或更多个scFv的串联CAR将是非常大的分子，并且scFv可能会相互回折，从而遮蔽抗原结合位点，并且可导致VH-VL结构域的错配以及功能失常。此外，与跨膜结构域相隔两个或多个scFv的最远端scFv与肿瘤抗原的特异性结合将无法触发T细胞活化和扩增。
本发明的CAR解决了这些问题，并且它们不仅满足了在免疫细胞的表面上产生有效的三个或更多个串联CAR特异性部分的未得到满足的需求，而且还对“抗原逃逸抗原”和/或“抗原下调”的肿瘤学疗法挑战提供了有效的解决方案。
一方面，本公开开发了新型CAR，其包含串联的三个VHH(一个对CD19有特异性，一个对CD20有特异性，且一个对CD22有特异性)，以试图产生同时靶向多种B细胞特异性标志物的单个CAR(三特异性CAR或全合一(AlO)CAR)。AIO CAR的细胞外结构域包含任选地通过一个或多个Gly-Ser接头联接的串联的三个抗原结合特异性部分(例如，VHH)，该三个抗原结合特异性部分与单个跨膜部分连接(一个VHH位于该膜的近位，一个VHH位于中间，且另一个VHH位于远端位置)。
如下文第6节中所述，本文提供的AIO CAR被证明能诱导针对B细胞上的CD19、CD20和CD22抗原的不同T细胞反应性。VHH顺序排列可基于CD19(20-291aa)、CD20(79-84aa和142-188aa)和CD22(20-687aa)的细胞外结构域的各自的长度来选择，该长度使它们自身适合于特定的空间排列。为了提高空间灵活性，设计并筛选了不同长度的一个或多个Gly-Ser接头。还已经研究了近位、中间和远端位置VHH的不可接近或阻断效应。
如所示出的，本发明的多特异性CAR-T可以解决复发或难治性B细胞淋巴瘤和白血病的未得到满足的医疗需求。本公开意外地发现，在CAR的细胞外结构域中串联排列的三个VHH结构域会产生优异的效果而不会在结构上相互干扰。
5.1.定义
本文描述或引用的技术和程序包括本领域技术人员使用常规方法通常充分理解和/或通常采用的那些，举例如以下文献中描述的广泛利用的方法：Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版，2001)；Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人编，2003)；Therapeutic Monoclonal Antibodies:FromBe nch to Clinic(An编，2009)；Monoclonal Antibodies:Methodsand Protocols(Albitar编，2010)；和Antibody Engineering第1和2卷(Kontermann和Dübel编，第2版，2010)。除本文另有定义外，本说明书中使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。出于解释本说明书的目的，以下对术语的描述将适用，并且在适当的情况下，以单数形式使用的术语也将包括复数，反之亦然。在所陈述的术语的任何描述与以引用的方式并入本文的任何文献冲突的情况下，应以下文对所陈述的术语的描述为准。
术语“抗体”、“免疫球蛋白”或“Ig”在本文中可互换使用，并且以最广泛的含义使用，并且具体地涵盖例如单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长或完整单克隆抗体)，具有多表位或单表位特异性的抗体组合物，多克隆或单价抗体，多价抗体，由至少两种完整抗体、单链抗体及其片段(例如，结构域抗体)形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们表现出所需的生物活性即可)，如下所述。抗体可以是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和/或亲和力成熟抗体，以及来自其它物种(例如来自小鼠、兔、美洲驼等)的抗体。术语“抗体”旨在包括免疫球蛋白类多肽内的B细胞的多肽产物，该多肽产物能够与特定分子抗原结合，并且由两个同一的多肽链对组成，其中每对具有一条重链(约50-70kDa)和一条轻链(约25kDa)，每条链的每个氨基末端部分包括约100至约130或更多个氨基酸的可变区，并且每条链的每个羧基末端部分包括恒定区。参见例如Antibody En gineering(Borrebaeck编，第2版1995)；和Kuby，Immunology(第3版1997)。抗体还包括但不限于合成抗体、重组产生的抗体、包括来自骆驼科物种(例如，美洲驼或羊驼)的单结构域抗体在内的单结构域抗体或其人源化变体、细胞内抗体、抗独特型(抗Id)抗体以及上述任一者的功能片段(例如，抗原结合片段)，该功能片段是指抗体重链或轻链多肽的一部分，该部分保留了该片段所来源自的抗体的一些或全部结合活性。功能性片段(例如，抗原结合片段)的非限制性实例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性、双特异性等)、Fab片段、F(ab’)片段、F(ab)2片段、F(ab’)2片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和微型抗体。特别地，本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如抗原结合结构域或含有与抗原结合的抗原结合位点的分子(例如，抗体的一个或多个CDR)。此类抗体片段可见于例如Harlow和Lane，Antibodies:A Laboratory Manual(1989)；Mol.Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference(Myers编，1995)；Huston等人，1993，Cell Biophysics 22:189-224；Plückthun和Skerra，1989，Meth.Enzymol.178:497-515；和Day，Advanced Immunoche mistry(第2版1990)。本文提供的抗体可以属于任何类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)的免疫球蛋白分子。抗体可以是激动性抗体或拮抗性抗体。抗体可以既不是激动性的也不是拮抗性的。
“抗原”是抗体可以与其选择性结合的结构。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物。在一些实施方案中，靶抗原是多肽。在某些实施方案中，抗原与细胞相关，例如存在于细胞上或细胞中。
“完整”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定区CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可包括人恒定区或其氨基酸序列变体。在某些实施方案中，完整抗体具有一种或多种效应子功能。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽进一步包含在VH与VL结构域之间的多肽接头，该多肽接头使得sFv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun的ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)。
术语“仅有重链的抗体”或“HCAb”是指这样的功能性抗体，其包含重链，但缺少通常见于4-链抗体中的轻链。已知骆驼科动物(如骆驼、美洲驼或羊驼)产生HCAb。
如本文所用的“单结构域抗体”或“sdAb”是指单个单体可变抗体结构域，并且能够进行抗原结合(例如，与CD20、CD19或CD22结合的单结构域抗体)。单结构域抗体包括如本文所述的VHH结构域。单结构域抗体的实例包括但不限于天然缺乏轻链的抗体(如来自骆驼科物种(例如，美洲驼)的抗体)、来源于常规4-链抗体的单结构域抗体、工程化抗体和除来源于抗体的单结构域支架以外的单结构域支架。单结构域抗体可来源于任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。例如，单结构域抗体可来源于骆驼科物种中产生的抗体，例如骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼和原驼中产生的抗体，如本文所述。骆驼科以外的其它物种可产生天然缺乏轻链的重链抗体；来源于这类其它物种的VHH在本公开的范围内。在一些实施方案中，本文提供的单结构域抗体(例如，VHH)具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的结构。如本文所述，单结构域抗体可与另一种分子(例如，药剂)遗传融合或化学缀合。单结构域抗体可以是更大的结合分子(例如，多特异性抗体或嵌合抗原受体)的一部分。
术语“结合(bind/binding)”是指分子之间的相互作用，包括例如用于形成复合物的相互作用。相互作用可以是例如非共价相互作用，包括氢键、离子键、疏水相互作用和/或范德华相互作用。复合物还可以包括通过共价或非共价键、相互作用或力保持在一起的两个或更多个分子的结合。抗体上的单个抗原结合位点与靶分子(如抗原)的单个表位之间的总非共价相互作用的强度是抗体或功能片段对该表位的亲和力。结合分子(例如，抗体)与单价抗原的解离速率(koff)与结合速率(kon)的比率(koff/kon)是解离常数KD，该解离常数与亲和力成反比。KD值越低，抗体的亲和力越高。KD的值因抗体和抗原的不同复合物而异，并且取决于kon和koff两者。可使用本文提供的任何方法或本领域技术人员熟知的任何其它方法来确定本文提供的抗体的解离常数KD。在一个结合位点处的亲和力并不总是反映抗体与抗原之间的相互作用的真实强度。当含有多个重复抗原决定簇的复合抗原(如多价抗原)与含有多个结合位点的抗体发生接触时，抗体与抗原在一个位点处的相互作用将增加在第二个位点处发生反应的可能性。多价抗体与抗原之间的此类多重相互作用的强度被称为亲合力(avidity)。
关于本文所述的结合分子，诸如“与……结合”、“与……特异性结合”的术语及类似术语在本文中也可互换使用，并且是指与抗原特异性结合的抗原结合结构域的结合分子，如多肽。与抗原结合或特异性结合的结合分子或抗原结合结构域可例如通过免疫测定、
Figure BDA0004113828030000231
Figure BDA0004113828030000232
或本领域技术人员已知的其它技术来鉴定。在一些实施方案中，当如使用诸如放射免疫测定法(RIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)的实验技术所测定，结合分子或抗原结合结构域以比与任何交叉反应性抗原结合更高的亲和力与抗原结合时，该结合分子或抗原结合结构域与抗原结合或特异性结合通常，特异性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍，并且可以背景的超过10倍。关于结合特异性的讨论，参见例如Fundamental Immunology 332-36(Paul编，第2版1989)。在某些实施方案中，例如如通过荧光激活细胞分选(FACS)分析或RIA测定，结合分子或抗原结合结构域与“非靶”蛋白的结合的程度小于结合分子或抗原结合结构域与其特定靶抗原的结合的约10％。与抗原结合的结合分子或抗原结合结构域包括能够以足够的亲和力结合所述抗原以使得结合分子可在靶向所述抗原中用作例如治疗和/或诊断剂的结合分子或抗原结合结构域。在某些实施方案中，与抗原结合的结合分子或抗原结合结构域具有小于或等于1μM、800nM、600nM、550nM、500nM、300nM、250nM、100nM、50nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM的解离常数(KD)。在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域与在来自不同物种的抗原当中保守的抗原的表位结合。
在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域可包含“嵌合”序列，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列同一或同源，而该一条或多条链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段(只要它们表现出所需的生物活性即可)中的相应序列同一或同源(参见4,816,567号美国专利；和Morrison等人，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-55)。嵌合序列可包括人源化序列。
在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域可包含非人(例如，骆驼科、鼠、非人灵长类动物)抗体的“人源化”形式的部分，其包括来自人免疫球蛋白(例如，受体抗体)的序列，其中原生CDR残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(例如，供体抗体)如骆驼科、小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的相应CDR的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白序列的一个或多个FR区残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含不见于受体抗体中或供体抗体中的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。人源化抗体重链或轻链可包含实质上所有的至少一个或多个可变区，其中所有或实质上所有的CDR对应于非人免疫球蛋白的CDR，并且所有或实质上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。在某些实施方案中，人源化抗体将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。关于进一步的细节，参见Jones等人，Nature 321:522-25(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-29(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-96(1992)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-89(1992)；美国专利号6,800,738、6,719,971、6,639,055、6,407,213和6,054,297。
在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域可包含“完全人抗体”或“人抗体”的部分，其中所述术语在本文中可互换使用，并且是指包含人可变区和例如人恒定区的抗体。结合分子可包含单结构域抗体序列。在具体实施方案中，所述术语是指包含人源的可变区和恒定区的抗体。“完全人”抗体在某些实施方案中还可以涵盖结合多肽并由作为人种系免疫球蛋白核酸序列的天然存在的体细胞变体的核酸序列编码的抗体。术语“完全人抗体”包括具有对应于如Kabat等人(参见Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication第91-3242号)描述的人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。“人抗体”是具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列和/或已经使用任何用于制备人抗体的技术制备的氨基酸序列的抗体。人抗体的这一定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域中已知的各种技术产生人抗体，该技术包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227:381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222:581(1991))和酵母展示文库(Chao等人，Nature Protocols 1:755-68(2006))。以下文献中描述的方法也可用于制备人单克隆抗体：Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77(1985)；Boerner等人，J.Immunol.147(1):86-95(1991)；以及van Dijk和vande Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)。人抗体可通过将抗原施用于转基因动物来制备，该转基因动物已被修饰成响应于抗原攻击而产生此类抗体，但该转基因动物的内源基因座已被禁用，例如小鼠(关于XENOMOUSETM技术，参见例如Jakobovits，Curr.Opin.Biotechnol.6(5):561-66(1995)；Brüggemann和Taussing，Curr.Opin.Biotechnol.8(4):455-58(1997)；以及6,075,181和6,150,584号美国专利)。关于经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体，还参见例如Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:3557-62(2006)。
在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域可包含“重组人抗体”的部分，其中该短语包括通过重组手段制备、表达、创造或分离的人抗体，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组的组合人抗体文库中分离的抗体、从针对人免疫球蛋白基因进行转基因和/或转染色体的动物(例如，小鼠或母牛)中分离的抗体(参见例如Taylor,L.D.等人，Nucl.Acids Res.20:6287-6295(1992))或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它手段制备、表达、创造或分离的抗体。此类重组人抗体可具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(参见Kabat，E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department ofHealth and Human Services，NIH公布第91-3242号)。然而，在某些实施方案中，对此类重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用针对人Ig序列转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，该序列虽然来源于人种系VH和VL序列并与其有关，但可能不天然存在于体内人抗体种系库内。
在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域可包含“单克隆抗体”的一部分，其中如本文所用的该术语是指获自实质上同质的抗体的群体的抗体，例如，除了有少量存在的可能的天然存在的突变或熟知的翻译后修饰如氨基酸异构化或脱酰胺化、甲硫氨酸氧化或天冬酰胺或谷氨酰胺脱酰胺化之外，构成所述群体的单个抗体是同一的，每种单克隆抗体通常将识别抗原上的单个表位。在具体实施方案中，如本文所用的“单克隆抗体”是由单个杂交瘤或其它细胞产生的抗体。术语“单克隆”不限于用于制备抗体的任何特定方法。例如，可用于本公开的单克隆抗体可通过由Kohler等人，Nature 256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可使用重组DNA方法在细菌或真核动物或植物细胞中制备(参见例如4,816,567号美国专利)。也可以使用例如Clackson等人，Nature 352:624-28(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-97(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其它方法是本领域中熟知的。参见例如Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编，第5版2002)。
典型的4-链抗体单元是由两条同一的轻(L)链和两条同一的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。在IgG的情况下，4-链单元通常为约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键与H链相连，而两条H链通过一个或多个二硫键彼此相连，这取决于H链同种型。每条H链和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条H链在N-末端具有可变结构域(VH)，接着对于α和γ链中的每一者具有三个恒定结构域(CH)，且对于μ和ε同种型具有四个CH结构域。每条L链在N-末端具有可变结构域(VL)，接着在其另一端具有恒定结构域(CL)。将VL与VH比对，且将CL与重链的第一恒定结构域(CH1)比对。据信特定的氨基酸残基形成轻链可变结构域与重链可变结构域之间的界面。VH与VL的配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别的抗体的结构和性质，参见例如Basic and Clinical Immunology 71(Stites等人编，第8版1994)；和Immunobiology(Janeway等人编，第5版2001)。
术语“Fab”或“Fab区”是指与抗原结合的抗体区。常规的IgG通常包含两个Fab区，每个Fab区均驻存于Y形IgG结构的两个臂之一上。每个Fab区通常由重链和轻链中的每一者的一个可变区和一个恒定区组成。更具体地，Fab区中重链的可变区和恒定区是VH和CH1区，且Fab区中轻链的可变区和恒定区是VL和CL区。Fab区中的VH、CH1、VL和CL可以按各种方式排列以赋予根据本公开的抗原结合能力。例如，VH和CH1区可以在一个多肽上，且VL和CL区可以在分开的多肽上，类似于常规IgG的Fab区。替代地，VH、CH1、VL和CL区可以都在相同的多肽上，并且以不同的顺序定向，如下文部分中更详细描述的。
术语“可变区”、“可变结构域”、“V区”或“V结构域”是指抗体的轻链或重链的一部分，该部分通常位于轻链或重链的氨基末端，并且具有在重链中约120至130个氨基酸和在轻链中约100至110个氨基酸的长度，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。重链的可变区可以被称为“VH”。轻链的可变区可以被称为“VL”。术语“可变的”是指可变区的某些区段在抗体之间的序列上有广泛差异的事实。V区介导抗原结合，并定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在可变区的110个氨基酸跨度上不是均匀分布的。相反，V区由通过各自是9-12个氨基酸长的被称为“高变区”的较大可变性(例如，极端可变性)的较短区分隔的约15-30个氨基酸的被称为框架区(FR)的较小可变性(例如，相对不变)的延伸段组成。重链和轻链的可变区各自包含四个FR，该四个FR主要采取β折叠构型，由三个高变区连接，该三个高变区形成连接β折叠结构的环，并且在一些情况下形成β折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密地保持在一起，并且与来自其他链的高变区一起为抗体的抗原结合位点的形成作出贡献(参见例如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，如使抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。可变区在不同抗体之间的序列上有广泛的差异。在具体实施方案中，可变区是人可变区。
术语“根据Kabat的可变区残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变化形式是指Kabat等人(同上)中的抗体汇编中针对重链可变区或轻链可变区所使用的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可含有较少或另外的氨基酸，该较少或另外的氨基酸对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或者向可变结构域的FR或CDR中的插入。例如，重链可变结构域可包括在残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和在残基82之后的三个插入的残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。对于给定的抗体，残基的kabat编号可通过在所述抗体的序列的同源区与“标准”Kabat编号序列进行比对来确定。当提到可变结构域中的残基(近似为轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如，Kabat等人，同上)。当提到免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如，Kabat等人，同上中报道的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG 1EU抗体的残基编号。其它编号系统已经例如由AbM、Chothia、Contact、IMGT和AHon描述。
当在提及抗体时被使用时，术语“重链”是指约50-70kDa的多肽链，其中氨基末端部分包含约120至130或更多个氨基酸的可变区，且羧基末端部分包含恒定区。基于重链恒定区的氨基酸序列，恒定区可以是被称为alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)的五种不同类型(例如，同种型)之一。不同的重链大小不同：α、δ和γ含有近似450个氨基酸，而μ和ε含有近似550个氨基酸。当与轻链组合时，这些不同类型的重链分别产生五种熟知类别(例如，同种型)的抗体，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG的四个亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
当在提及抗体时被使用时，术语“轻链”是指约25kDa的多肽链，其中氨基末端部分包含约100至约110或更多个氨基酸的可变区，且羧基末端部分包含恒定区。轻链的近似长度为211至217个氨基酸。基于恒定结构域的氨基酸序列，存在被称为kappa(κ)或lambda(λ)的两种不同类型。
如本文所用，术语“高变区”、“HVR”、“互补决定区”和“CDR”可互换使用。“CDR”是指免疫球蛋白(Ig或抗体)VHβ-折叠框架的非框架区内的三个高变区(H1、H2或H3)之一，或抗体VLβ-折叠框架的非框架区内的三个高变区(L1、L2或L3)之一。因此，CDR是散布在框架区序列内的可变区序列。
CDR区是本领域技术人员熟知的，并且已经由熟知的编号系统定义。例如，kabat互补决定区(CDR)是基于序列可变性，并且是最常用的(参见例如Kabat等人，同上)。Chothia代之以指结构环的位置(参见例如Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-17(1987))。当使用Kabat编号惯例编号时，Chothia CDR-H1环的末端在H32与H34之间变化，这取决于该环的长度(这是因为Kabat编号方案将插入物置于H35A和H35B处；如果35A和35B都不存在，则该环在32处结束；如果仅35A存在，则该环在33处结束；如果35A和35B都存在，则该环在34处结束)。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，并被Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用(参见例如，Antibody Engineering第2卷(Kontermann和Dübel编，第2版2010))。“Contact”高变区是基于对可用的复杂晶体结构的分析。已经开发并广泛采用的另一种通用编号系统是ImMunoGeneTics(IMGT)Information
Figure BDA0004113828030000301
(Lafranc等人，Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77(2003))。IMGT是一个综合信息系统，该系统专门研究人和其它脊椎动物的免疫球蛋白(IG)、T细胞受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHC)。在本文中，CDR是根据氨基酸序列和在轻链或重链中的位置二者来提及的。由于CDR在免疫球蛋白可变结构域的结构内的“位置”在物种之间是保守的，并且存在于称为环的结构中，因此通过使用根据结构特征比对可变结构域序列的编号系统，很容易鉴定CDR和框架残基。在将来自一个物种的免疫球蛋白的CDR残基移植和替换到来自通常人抗体的受体框架中时可使用这种信息。Honegge r和Plückthun，J.Mol.Biol.309:657-70(2001)已经开发了另外的编号系统(AHon)。包括例如Kabat编号和IMGT独特编号系统在内的编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(参见例如Kabat，同上；Chothia和Lesk，同上；Martin，同上；Lefranc等人，同上)。下表1中例示了来自这些高变区或CDR中的每一个高变区或CDR的残基。
表1.根据各种编号系统的示例性CDR
Figure BDA0004113828030000302
Figure BDA0004113828030000311
给定CDR的边界可根据用于鉴定的方案而变化。因此，除另有规定外，术语给定抗体或其区域(如可变区)的“CDR”和“互补决定区”以及抗体或其区域的单个CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2)应被理解为涵盖由如本文上文所述的任何已知方案所定义的互补决定区。在一些情况下，指定了用于鉴定特定的一个或多个CDR的方案，如由IMGT、Kabat、Chothia或Contact方法定义的CDR。在一些情况下，根据Kabat编号的一个或多个位置可能在实际序列未中被占据，或者实际序列可能含有比Kabat编号所允许的数目更多的氨基酸残基。关于根据Kabat的VHH结构域的示例性编号，参见例如Deschacht等人，2010.J Immunol 184:5696-704。在其它情况下，给出了CDR的特定氨基酸序列。应该注意的是，CDR区也可由各种编号系统的组合，例如Kabat和Chothia编号系统的组合或Kabat和IMGT编号系统的组合来定义。因此，诸如“如特定VH或VHH中所示的CDR”的术语包括由上述示例性CDR编号系统定义的任何CDR1，但不限于此。一旦给出可变区(例如，VHH、VH或VL)，本领域技术人员将理解的是，该区域内的CDR可由不同的编号系统或其组合来定义。
高变区可包含如下“扩展高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)以及VH中的26-35或26-35A(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。
术语“恒定区”或“恒定结构域”是指轻链和重链的不直接参与抗体与抗原的结合、但表现出各种效应子功能(如与Fc受体相互作用)的羧基末端部分。该术语是指免疫球蛋白分子的一部分，该部分相对于免疫球蛋白的另一部分(即含有抗原结合位点的可变区)具有更保守的氨基酸序列。恒定区可含有重链的CH1、CH2和CH3区以及轻链的CL区。
术语“框架”或“FR”是指侧接CDR的那些可变区残基。FR残基存在于例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、结构域抗体(例如，单结构域抗体)、双抗体、线性抗体和双特异性抗体中。FR残基是除高变区残基或CDR残基之外的那些可变结构域残基。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区域，包括例如原生序列Fc区、重组Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能会变化，但人IgG重链Fc区通常被定义为从位置Cys226或从Pro230处的氨基酸残基延伸到其羧基末端。可例如在抗体的产生或纯化期间或通过以重组的方式将编码抗体的重链的核酸工程化来移除Fc区的C-末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)。因此，完整抗体的组合物可包含移除了所有K447残基的抗体群体、没有移除K447残基的抗体群体以及具有含和不含K447残基的抗体的混合物的抗体群体。“功能性Fc区”具有原生序列Fc区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调等。此类效应子功能通常需要Fc区与结合区或结合结构域(例如，抗体可变区或结构域)组合，并且可使用本领域技术人员已知的各种测定法进行评估。“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰(例如，取代、添加或缺失)而不同于原生序列Fc区的氨基酸序列的氨基酸序列。在某些实施方案中，变体Fc区与原生序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸取代，例如，在原生序列Fc区中或亲本多肽的Fc区中的约一至约十个氨基酸取代或约一至约五个氨基酸取代。本文的变体Fc区可与原生序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％的同源性，或者与其具有至少约90％的同源性，例如与其具有至少约95％的同源性。
如本文所用，“表位”是本领域中的术语，并且是指结合分子(例如，包含单结构域抗体序列的抗体)可与之特异性结合的抗原的局部区域。表位可以是线性表位或构象、非线性或不连续表位。例如在多肽抗原的情况下，表位可以是多肽的连续氨基酸(“线性”表位)，或者表位可包含来自多肽的两个或更多个非连续区域的氨基酸(“构象”、“非线性”或“不连续”表位)。本领域技术人员将理解的是，一般来说，线性表位可依赖或可不依赖于二级、三级或四级结构。例如，在一些实施方案中，结合分子与一组氨基酸结合，而不管它们是否在天然三维蛋白质结构中折叠。在其它实施方案中，结合分子需要构成表位的氨基酸残基呈现出特定的构象(例如，弯曲、扭曲、翻转或折叠)，以便识别并结合表位。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其所结合的抗原的生物活性的抗体。在一些实施方案中，阻断抗体或拮抗剂抗体实质性地或完全地抑制抗原的生物活性。
“激动剂”或激活抗体是增强或启动其所结合的抗原的信号传导的抗体。在一些实施方案中，激动剂抗体在不存在天然配体的情况下引起或激活信号传导。
关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”被定义为在对候选序列和特定肽或多肽序列进行比对并且在必要的情况下引入空位以实现最大序列同一性百分比并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分之后，该候选序列中与该特定肽或多肽序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。为了确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以按本领域技术范围内的各种方式(例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件)实现。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
术语“特异性”是指抗原结合蛋白(如CAR或sdAb)对抗原的特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。如本文所用的术语“多特异性”表示抗原结合蛋白(如CAR或sdAb)具有两个或更多个抗原结合位点，其中的至少两个抗原结合位点结合不同的抗原。如本文所用的术语“双特异性”表示抗原结合蛋白(如CAR或sdAb)具有两种不同的抗原结合特异性。如本文中所用的术语“单特异性”CAR表示具有一个或多个结合位点的抗原结合蛋白(例如，CAR或sdAb)，所述结合位点中的每一个结合位点均结合相同的抗原。
如本文所用的术语“价”表示在抗原结合蛋白(如CAR或sdAb)中存在指定数目的结合位点。例如天然抗体或全长抗体具有两个结合位点并且是二价的。因此，术语“三价”、“四价”、“五价”和“六价”分别表示在抗原结合蛋白(如CAR或sdAb)中存在两个结合位点、三个结合位点、四个结合位点、五个结合位点和六个结合位点。
如本文所用的“嵌合抗原受体”或“CAR”是指基因工程化受体，该基因工程化受体可被用于将一种或多种抗原特异性地移植到免疫效应细胞如T细胞上。一些CAR也被称为“人工T细胞受体”、“嵌合T细胞受体”或“嵌合免疫受体”。在一些实施方案中，CAR包含对一种或多种抗原(如肿瘤抗原)具有特异性的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和T细胞和/或其它受体的细胞内信号传导结构域。“CAR-T细胞”是指表达CAR的T细胞。
术语“多肽”和“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合物。所述聚合物可以是直链或支链的，它可包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已经天然或通过干预(例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵或修饰)修饰的氨基酸聚合物。该定义中还包括例如含有氨基酸的一种或多种类似物(包括但不限于非天然氨基酸以及本领域中已知的其它修饰形式)的多肽。要理解的是，因为本公开的多肽可基于抗体或免疫球蛋白超家族的其它成员，所以在某些实施方案中，“多肽”可作为单链或作为两条或更多条相关链出现。
如本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入到聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸及其类似物。如本文所用的“寡核苷酸”是指短的、通常是单链的合成多核苷酸，该多核苷酸长度通常但不一定少于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不相互排斥。上文针对多核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。产生本公开的结合分子的细胞可包括亲本杂交瘤细胞以及已经引入了编码抗体的核酸的细菌和真核宿主细胞。除另有说明外，本文公开的任何单链多核苷酸序列的左手端是5’端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5’方向。新生RNA转录物的从5’到3’添加的方向称为转录方向；DNA链上与RNA转录物具有相同序列的在RNA转录物的5’端的5’的序列区称为“上游序列”；DNA链上的与RNA转录物具有相同序列的在RNA转录物的3’端的3’的序列区称为“下游序列”。
“分离的核酸”是这样的核酸(例如RNA、DNA或混合核酸)，该核酸实质上与天然伴随原生序列的其它基因组DNA序列以及蛋白质或复合物如核糖体和聚合酶分离。“分离的”核酸分子是这样的核酸分子，该核酸分子与该核酸分子的天然来源中存在的其它核酸分子分离。此外，“分离的”核酸分子，诸如cDNA分子，在通过重组技术产生时可以实质上不含其它细胞材料或培养基，或者在化学合成时实质上不含化学前体或其它化学品。在具体的实施方案中，分离或纯化一种或多种编码单结构域抗体或如本文所述的抗体的核酸分子。该术语包括已经从其天然存在的环境中移出的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。实质上纯的分子可包括该分子的经分离形式。具体地，编码本文所述的CAR或sdAb的“分离的”核酸分子是这样的核酸分子，该核酸分子被鉴定出来并且与在产生该核酸分子的环境中通常与该核酸分子缔合的至少一种污染核酸分子分离。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如适用于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多聚腺苷酸化信号和增强子。
如本文所用，术语“可操作地连接(的)”和类似的短语(例如，基因融合(的))在提及核酸或氨基酸时被使用时分别是指被放置成彼此处于功能关系的核酸序列或氨基酸序列的可操作连接。例如，可操作连接的启动子、增强子元件、开放阅读框、5’和3’UTR以及终止子序列导致核酸分子(例如，RNA)的准确产生。在一些实施方案中，可操作连接的核酸元件导致开放阅读框的转录，并最终导致多肽的产生(即，开放阅读框的表达)。作为另一实例，可操作连接的肽是其中功能结构域以彼此适当的距离被放置以赋予每个结构域的预期功能的肽。
术语“载体”是指用于携带或包含核酸序列(包括例如编码如本文所述的结合分子(例如，抗体)的核酸序列)以便将该核酸序列引入到宿主细胞中的物质。适用的载体包括例如表达载体、质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体，它们可以包括可用于稳定整合到宿主细胞的染色体中的选择序列或标志物。另外，载体可包含一种或多种可选择的标志基因和适当的表达控制序列。可以包含的可选择的标志基因例如提供对抗生素或毒素的抗性、补充营养缺陷型不足或提供培养基中没有的关键营养素。表达控制序列可包括本领域中熟知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当要共表达两种或更多种核酸分子(例如，抗体重链和轻链或抗体VH和VL)时，可以将这两种核酸分子例如插入到单个表达载体或分开的表达载体中。对于单一载体表达，编码核酸可以可操作地连接到一个共同的表达控制序列或连接到不同的表达控制序列，如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。可使用本领域中熟知的方法确认将核酸分子引入到宿主细胞中。此类方法包括例如核酸分析，如Northern印迹或mRNA的聚合酶链式反应(PCR)扩增、用于基因产物表达的免疫印迹或用于测试引入的核酸序列或其相应基因产物的表达的其它合适的分析方法。本领域技术人员要理解的是，核酸分子以足以产生所需产物的量表达，并且进一步要理解的是，可使用本领域中熟知的方法优化表达水平以获得足够的表达。
如本文所用的术语“宿主”是指动物，如哺乳动物(例如，人)。
如本文所用的术语“宿主细胞”是指可以用核酸分子转染的特定受试者细胞和此种细胞的子代或潜在子代。由于在后续世代中可能发生的突变或环境影响或者核酸分子向宿主细胞基因组中的整合，此种细胞的子代可能与用核酸分子转染的亲本细胞不是同一的。
如本文所用的术语“自体的”意指任何这样的材料，该材料来源于该材料后来要被重新引入到的同一个体中。
“同种异体的”是指来源于相同物种的不同个体的移植物。
如本文所用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指外源核酸被转移或引入到宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代受试细胞及其子代。
如本文所用的术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府监管机构批准的或者在美国药典、欧洲药典或其它公认的药典中列出用于动物，并且更具体地用于人。
“赋形剂”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、溶剂或包封材料。赋形剂包括例如包封材料或添加剂，如吸收促进剂、抗氧化剂、粘结剂、缓冲剂、载剂、包衣剂、着色剂、稀释剂、崩解剂、乳化剂、增量剂、填充剂、调味剂、保湿剂、润滑剂、香料、防腐剂、推进剂、释放剂、杀菌剂、甜味剂、增溶剂、润湿剂及其混合物。术语“赋形剂”还可以指稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全或不完全)或媒介物。
在一些实施方案中，赋形剂是药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂的实例包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(例如，少于约10个氨基酸残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、聚乙二醇(PE G)和PLURONICSTM。在Remington和Gennaro，Remington’s Pharm aceutical Sciences(第18版1990)中描述了药学上可接受的赋形剂的其它实例。
在一个实施方案中，每种组分在与药物制剂的其它成分相容的意义上是“药学上可接受的”，并且适于与人和动物的组织或器官接触使用而没有过度毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相称。参见例如LippincottWilliams&Wilkins:Philadelphia，PA，2005；Handbook of Pharmaceutical Excipients，第6版；Rowe等人编；The Pharmaceutical Press and the American Ph armaceuticalAssociation:2009；Handbook of Pharmaceutical Additive s，第3版；Ash和Ash编；GowerPublishing Company:2007；Phar maceutical Preformulation and Formulation，第2版；Gibson编；CR C Press LLC:Boca Raton，FL，2009。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂在所采用的剂量和浓度下对暴露其中的细胞或哺乳动物是无毒的。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是水性pH缓冲溶液。
在一些实施方案中，赋形剂是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用组合物(例如，药物组合物)时，水是示例性赋形剂。盐水溶液以及右旋糖水溶液和甘油水溶液也可用作液体赋形剂，特别是用于可注射溶液。赋形剂还可以包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇(propylene,glycol)、水、乙醇等。如果需要的话，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。组合物可采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等形式。包括制剂在内的口服组合物可包含标准赋形剂，如药用级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
包括药物化合物的组合物可含有例如分离或纯化形式的结合分子(例如，抗体)连同合适量的赋形剂。
如本文所用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以产生所需结果的本文提供的单结构域抗体或包含剂和单结构域抗体的治疗分子或药物组合物的量。
术语“受试者”和“患者”可互换使用。如本文所用，在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，如非灵长类动物或灵长类动物(例如，人)。在具体实施方案中，受试者是人。在一个实施方案中，受试者是被诊断为患有疾病或病症的哺乳动物，例如人。在另一实施方案中，受试者是处于发展疾病或病症的风险中的哺乳动物，例如人。
“施用(administer/administration)”是指例如通过粘膜、皮内、静脉内、肌肉内递送和/或本文所述或本领域中已知的任何其它物理递送方法，将存在于体外的物质注射或以其它方式物理递送到患者体内的动作。
如本文所用，术语“治疗(treat/treatment/treating)”是指由施用一种或多种疗法引起的疾病或病状的进展、严重程度和/或持续时间的减少或改善。可以通过评估与潜在病症相关的一种或多种症状是否已经减少、缓和和/或纾缓从而使得在患者身上观察到改进来确定治疗，尽管患者可能仍然受到潜在病症的折磨。术语“治疗”包括控制和改善疾病。术语“管控(manage/managing/management)”是指受试者从疗法中获得的有益效果，该疗法不一定导致疾病的治愈。
术语“预防(prevent/preventing/prevention)”是指降低疾病、病症、病状或相关症状(例如，糖尿病或癌症)发作(或复发)的可能性。
如本文所用，“延迟”癌症的发展意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或推延所述疾病的发展。这种延迟可能有不同的时间长度，这取决于病史和/或正在接受治疗的个体。正如本领域技术人员显而易见的，充分或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会发展该疾病。“延迟”癌症的发展的方法是当与不使用该方法相比时，在给定的时间框架内降低疾病发展的可能性和/或在给定的时间框架内降低疾病程度的方法。这种比较通常基于临床研究，使用统计学上显著数量的个体。癌症的发展可使用标准方法检测，该方法包括但不限于计算机化轴向断层摄影术(CAT扫描)、磁共振成像(MRI)、腹部超声、凝血测试、动脉造影术或活组织检查。发展也可以指最初可能检测不到的癌症进展，并且包括出现、复发和发作。
如本文所用的“B细胞相关疾病或病症”是指由B细胞介导或由异常B细胞功能(如B细胞功能的失调)赋予的疾病或病症。如本文所用的“B细胞相关疾病或病症”包括但不限于B细胞恶性肿瘤，如B细胞白血病或B细胞淋巴瘤。它还包括边缘区淋巴瘤(例如，脾边缘区淋巴瘤)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B细胞幼淋巴细胞性白血病(B-PLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、伯基特淋巴瘤、原发性眼内淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞白血病(HCL)、前体B成淋巴细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、高级B细胞淋巴瘤(HGBL)和多发性骨髓瘤(MM)。“B细胞相关疾病或病症”还包括某些自身免疫性和/或炎性疾病，如与不适当或增高的B细胞数目量和/或激活相关的那些。
如本文所用的“CD20相关疾病或病症”是指包含CD20表达在其中的细胞或组织的疾病或病症。在一些实施方案中，CD20相关疾病或病症包含CD20异常表达在其上的细胞。在其它实施方案中，CD20相关疾病或病症包含在其中或其上缺乏CD20的细胞。
如本文所用的“CD19相关疾病或病症”是指包含CD19表达在其中的细胞或组织的疾病或病症。在一些实施方案中，CD19相关疾病或病症包含CD19异常表达(例如表达高于正常细胞)在其上的细胞。在其它实施方案中，CD19相关疾病或病症包含在其中或其上缺乏CD19的细胞。
如本文所用的“CD22相关疾病或病症”是指包含CD22表达在其中的细胞或组织的疾病或病症。在一些实施方案中，CD22相关疾病或病症包含CD22异常表达在其上的细胞。在其它实施方案中，CD22相关疾病或病症包含在其中或其上缺乏CD22的细胞。
术语“约”和“近似”意指在给定值或范围的20％以内、15％以内、10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、1％以内或更少。
除上下文另有明确规定外，如本公开和权利要求中所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数形式。
要理解的是，每当本文用术语“包含”来描述实施方案时，也提供了按照“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的另外类似的实施方案。还要理解的是，每当本文用短语“基本上由……组成”来描述实施方案时，也提供了按照“由……组成”描述的另外类似的实施方案。
如在诸如“A与B之间”或“A-B之间”的短语中所用的术语“之间”是指包括A和B两者的范围。
如本文在诸如“A和/或B”的短语中所用的术语“和/或”旨在包括：A和B两者；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样地，如在诸如“A、B和/或C”的短语中所用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
5.2.嵌合抗原受体
一方面，本文提供多特异性嵌合抗原受体(CAR)，该多特异性嵌合抗原受体包含有包含以下的多肽：(a)包含本文提供的抗CD20单结构域抗体(sdAb)、抗CD19 sdAb和抗CD22sdAb中的两者或三者的细胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)细胞内信号传导结构域。如下文第6节中所证实的，本发明的多特异性CAR提供了优于现有CAR构建体的优点。
在一些实施方案中，本文提供的CAR是与CD20和CD19结合的双特异性CAR。在其它实施方案中，本文提供的CAR是与CD20和CD22结合的双特异性CAR。在其它实施方案中，本文提供的CAR是与CD19和CD22结合的双特异性CAR。在又其它实施方案中，本文提供的CAR是结合CD20、CD19和CD22的全部的三特异性CAR。
下面更详细地描述每种组分和另外的区域。
5.2.1.细胞外抗原结合结构域
本文所述的CAR的细胞外抗原结合结构域包含两种、三种或更多种单结构域抗体。单结构域抗体可直接经由肽键或经由肽接头彼此融合。
5.2.1.1.单结构域抗体
本公开的CAR包含有包含多种单结构域抗体的细胞外抗原结合结构域。sdAb可具有相同或不同的来源，并且可具有相同或不同的大小。示例性sdAb包括但不限于来自仅有重链的抗体的重链可变结构域(例如，VHH或VNAR)、天然缺乏轻链的结合分子、来源于常规4-链抗体的单结构域(如VH或VL)、人源化的仅有重链的抗体、由表达人重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人单结构域抗体，以及工程化结构域和除来源于抗体的单结构域支架之外的单结构域支架。本领域中已知或通过本公开开发的任何sdAb(包括本公开中上面描述的单结构域抗体)可被用于构建本文所述的CAR。sdAb可来源于任何物种，包括但不限于小鼠、大鼠、人、骆驼、美洲驼、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。本文考虑的单结构域抗体还包括来自除骆驼科和鲨鱼之外的物种的天然存在的单结构域抗体分子。
在一些实施方案中，sdAb来源于称为缺乏轻链的重链抗体(本文中也称为“仅有重链的抗体”)的天然存在的单结构域抗原结合分子。例如WO 94/04678和Hamers-Casterman,C.等人，Nature 363:446-448(1993)中公开了此类单结构域分子。为清楚起见，来源于天然缺乏轻链的重链分子的可变结构域在本文中被称为VHH，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区别开来。此种VHH分子可来源于在骆驼科物种(例如骆驼、美洲驼、骆马、单峰骆驼、羊驼和原驼)中产生的抗体。除骆驼科以外的其它物种可产生天然缺乏轻链的重链分子，并且此类VHH在本公开的范围内。此外，VHH的人源化形式以及其它修饰和变体也被考虑并且在本公开的范围内。
来自骆驼科动物的VHH分子比IgG分子小约10倍。它们是单一多肽，并且可以是非常稳定的，能抵抗极端的pH和温度条件。此外，它们可以抵抗蛋白酶的作用，而常规4-链抗体则不然。此外，VHH的体外表达产生高产量、正确折叠的功能性VHH。此外，在骆驼科动物中产生的抗体可以识别除了由通过使用抗体文库或经由对除骆驼科动物以外的哺乳动物进行免疫而在体外产生的抗体所识别的表位之外的表位(参见例如WO9749805)。因此，包含一个或多个VHH结构域的多特异性或多价CAR可以比包含来源于常规4-链抗体的抗原结合片段的多特异性或多价CAR更高效地与靶标相互作用。由于已知VHH结合到“不寻常”的表位(如腔或沟)中，因此包含此类VHH的CAR的亲和力可能比常规多特异性多肽更适合用于治疗性治疗。
在一些实施方案中，sdAb来源于在软骨鱼中所见的免疫球蛋白的可变区。例如，sdAb可来源于在鲨鱼血清中所见的被称为新型抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型。WO03/014161和Streltsov，Pro tein Sci.14:2901-2909(2005)中描述了产生来源于NAR(“IgNAR”)的可变区的单结构域分子的方法。
在一些实施方案中，sdAb是重组的、CDR移植的、人源化的、骆驼化的、去免疫的和/或体外产生的(例如，通过噬菌体展示选择)。在一些实施方案中，框架区的氨基酸序列可通过框架区中特定氨基酸残基的“骆驼化”而改变。骆驼化是指将来自常规4-链抗体的(天然存在的)VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基用在重链抗体的VHH结构域中一个或多个相应位置处存在的氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基替换或取代。这可以按本领域中已知的方式进行，这对于本领域技术人员是清楚的。此类“骆驼化”取代优选被插入在形成VH-VL界面和/或存在于所述界面处的氨基酸位置处，和/或在所谓的骆驼科标志残基处，如本文所定义(参见例如WO 94/04678；Davies和Riechmann FEBS Letters 339:285-290(1994)；Davies和Riechmann，Protein Engineering 9(6):531-537(1996)；Riechmann，J.Mol.Biol.259:957-969(1996)；以及Riechmann和Muyldermans，J.Immunol.Meth.231:25-38(1999))。
在一些实施方案中，sdAb是由表达人重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人单结构域抗体。参见例如US20090307787、8,754,287号美国专利、US20150289489、US20100122358和WO2004049794。在一些实施方案中，sdAb是亲和力成熟的。
在一些实施方案中，针对特定抗原或靶标的天然存在的VHH结构域可获自骆驼科VHH序列的(原初或免疫)文库。此类方法可涉及或可不涉及使用所述抗原或靶标或其至少一部分、片段、抗原决定簇或表位，使用本领域中已知的一种或多种筛选技术来筛选此类文库。WO 99/37681、WO 01/90190、WO 03/025020和WO 03/035694中描述了此类文库和技术。可替代地，可以使用来源于(原初或免疫)VHH文库的改进的合成或半合成文库，如通过诸如随机诱变和/或CDR改组的技术获自(原初或免疫)VHH文库的VHH文库，例如WO 00/43507中所述。
在一些实施方案中，单结构域抗体由常规的四链抗体产生。参见例如EP 0 368684；Ward等人，Nature，341(6242):544-6(1989)；Holt等人，Trends Biotechnol.，21(11):484-490(2003)；WO 06/030220；和WO 06/003388。
表2中列出了本文提供的CAR中的示例性单结构域抗体。
表2.示例性单结构域抗体
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与CD20结合的单结构域抗体
在一些实施方案中，本文提供的CAR中的抗CD20单结构域抗体(例如，VHH)与人CD20结合。在一些实施方案中，本文提供的抗CD20单结构域抗体调节一种或多种CD20活性。在一些实施方案中，本文提供的抗CD20单结构域抗体是拮抗剂抗体。
在一些实施方案中，本文提供的抗CD20单结构域抗体以≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(KD)与CD20(例如，人CD20)结合。测量结合亲和力的多种方法是本领域中已知的，其中的任何一种方法都可用于本公开的目的，包括通过RIA，其例如用感兴趣的抗体的Fab型式及其抗原进行(Chen等人，1999，J.Mol Biol 293:865-81)；通过生物层干涉度量法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)测定法，其通过使用例如
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Red96系统的
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或通过使用例如/>
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TM-2000或/>
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来进行。“结合速率(on-rate)”或“缔合的速率(rate of association)”或“缔合速率(associationrate)”或“kon”也可用上述相同的生物层干涉度量法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)技术使用例如/>
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Red96、/>
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TM-2000或/>
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TM-3000系统来测定。
在一些实施方案中，本文提供的CAR中的抗CD20单结构域抗体是VHH结构域。本文提供的示例性VHH结构域如下文第6节中所述的那样产生，并且也如上表2中所示，这些VHH结构域被称为VHH-273、VHH-283、VHH-313、VHH-440、VHH-466、VHH-496、VHH-653、VHH-623、VHH-640、VHH-657、huVHH-253、huVHH-256、huVHH-260、huVHH-746、huVHH-750、huVHH-753、huVHH-836、huVHH-840、huVHH-843和huVHH-846。
因此，在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含VHH-273、VHH-283、VHH-313、VHH-440、VHH-466、VHH-496、VHH-653、VHH-623、VHH-640、VHH-657、huVHH-253、huVHH-256、huVHH-260、huVHH-746、huVHH-750、huVHH-753、huVHH-836、huVHH-840、huVHH-843和/或huVHH-846中的任一者的一个或多个CDR序列。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中所述CDR序列选自VHH-273、VHH-283、VHH-313、VHH-440、VHH-466、VHH-496、VHH-653、VHH-623、VHH-640、VHH-657、huVHH-253、huVHH-256、huVHH-260、huVHH-746、huVHH-750、huVHH-753、huVHH-836、huVHH-840、huVHH-843和huVHH-846中的那些。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含SEQID NO:40的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含SEQID NO:44的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含SEQID NO:48的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含SEQID NO:52的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含SEQID NO:301的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含SEQ ID NO:302的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含SEQ ID NO:303的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:39中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:39中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:39中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:39中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:39中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:39中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:39中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:40中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:40中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:40中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:40中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:40中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:40中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:40中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:41中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:41中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:41中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:41中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:41中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:41中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:41中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:42中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:42中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:42中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:42中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:42中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:42中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:42中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:43中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:43中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:43中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:43中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:43中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:43中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:43中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:44中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:44中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:44中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:44中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:44中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:44中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:44中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:45中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:45中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:45中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:45中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:45中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:45中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:45中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:46中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:46中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:46中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:46中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:46中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:46中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:46中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:47中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:47中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:47中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:47中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:47中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:47中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:47中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:48中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:48中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:48中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:48中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:48中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:48中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:48中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:49中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:49中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:49中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:49中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:49中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:49中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:49中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:50中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:50中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:50中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:50中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:50中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:50中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:50中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:51中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:51中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:51中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:51中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:51中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:51中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:51中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:52中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:52中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:52中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:52中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:52中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:52中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:52中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:53中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:53中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:53中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:53中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:53中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:53中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:53中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:54中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:54中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:54中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:54中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:54中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:54中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:54中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:55中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:55中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:55中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:55中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:55中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:55中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:55中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:301中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:301中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:301中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:301中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:301中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:301中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:301中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:302中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:302中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:302中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:302中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:302中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:302中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:302中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:303中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:303中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:303中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:303中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:303中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:303中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:303中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中(i)所述CDR1包含SEQ ID NO:1或310、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11或311、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或312、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20或312、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:24或313、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:283或314、SEQ ID NO:286、SEQ IDNO:289或315、SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:295或312、SEQ ID NO:298的氨基酸序列；(ii)所述CDR2包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:290、SEQID NO:293、SEQ ID NO:296或SEQ ID NO:299的氨基酸序列；并且/或者(iii)所述CDR3包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:285、SEQ ID NO:288、SEQ ID NO:291、SEQ IDNO:294、SEQ ID NO:297或SEQ ID NO:300的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在其它实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中(i)所述CDR1包含与SEQ ID NO:1或310、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:11或311、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或312、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20或312、SEQID NO:22、SEQ ID NO:24或313、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:283或314、SEQ ID NO:286、SEQID NO:289或315、SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:295或312、SEQ ID NO:298具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；(ii)所述CDR2包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:284、SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:293、SEQ ID NO:296或SEQ ID NO:299具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；并且/或者(iii)所述CDR3包含与SEQID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:285、SEQ ID NO:288、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:294、SEQ ID NO:297或SEQ ID NO:300具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:1或310的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:310的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:1或310的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:310的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:11或311的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:14或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ IDNO:312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ IDNO:312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:24或313的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ IDNO:313的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:14或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ IDNO:312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:1或310的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:310的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ IDNO:312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ IDNO:312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ IDNO:312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ IDNO:312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:283或314的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:284的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:285的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ IDNO:283的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:284的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:285的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQID NO:314的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:284的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ IDNO:285的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:286的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:287的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:288的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:289或315的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:290的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:291的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ IDNO:289的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:290的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:291的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQID NO:315的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:290的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ IDNO:291的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:292的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:294的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:295或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:296的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:297的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ IDNO:295的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:296的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:297的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQID NO:312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:296的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ IDNO:297的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含：包含SEQ ID NO:298的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:299的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:300的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD20单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20单结构域抗体进一步包含VHH-273、VHH-283、VHH-313、VHH-440、VHH-466、VHH-496、VHH-653、VHH-623、VHH-640、VHH-657、huVHH-253、huVHH-256、huVHH-260、huVHH-746、huVHH-750、huVHH-753、huVHH-836、huVHH-840、huVHH-843和/或huVHH-846的一个或多个框架区。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:39的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:40的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:41的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:42的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:43的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:44的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:45的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:46的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQID NO:47的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:48的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:49的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:50的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:51的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:52的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:53的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:54的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:55的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ IDNO:301的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:302的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:303的序列的VHH结构域的一个或多个框架。
在一些实施方案中，本文提供的单结构域抗体是人源化单结构域抗体。在一些实施方案中，可使用下文第6节中所例示的方法或下节中描述的方法来产生人源化单结构域抗体。
本文所述的构架区是基于CDR编号系统的边界确定的。换言之，如果通过例如Kabat、IMGT或Chothia确定CDR，则框架区是可变区中围绕CDR的氨基酸残基，格式为从N-末端到C-末端：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。例如，FR1被定义为如通过例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义的CDR1氨基酸残基的N-末端的氨基酸残基，FR2被定义为如通过例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义的CDR1与CDR2氨基酸残基之间的氨基酸残基，FR3被定义为如通过例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义的CDR2与CDR3氨基酸残基之间的氨基酸残基，且FR4被定义为如通过例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义的CDR3氨基酸残基的C-末端的氨基酸残基。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含具有SEQ IDNO:40的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20sdAb包含具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20sdAb包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20sdAb包含具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20sdAb包含具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20sdAb包含具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20sdAb包含具有SEQ ID NO:301的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含具有SEQ ID NO:302的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含具有SEQ ID NO:303的氨基酸序列的VHH结构域。
在某些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含相对于抗体VHH-273、VHH-283、VHH-313、VHH-440、VHH-466、VHH-496、VHH-653、VHH-623、VHH-640、VHH-657、huVHH-253、huVHH-256、huVHH-260、huVHH-746、huVHH-750、huVHH-753、huVHH-836、huVHH-840、huVHH-843和huVHH-846中的任一者具有一定百分比同一性的氨基酸序列。
可使用数学算法来确定两个序列(例如，氨基酸序列或核酸序列)之间的同一性百分比。用于比较两个序列的数学算法的一个非限制性实例是如Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873 5877(1993)中那样进行修改的Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264 2268(1990)的算法。此种算法被并入到Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST核苷酸程序参数集(例如对于得分＝100，字长＝12)进行，以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序参数集(例如针对得分50，字长＝3)进行，以获得与本文所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的带有空位的比对，可以如Altschul等人，Nucleic Acids Res.25:3389 3402(1997)中所述的那样利用Gapped BLAST。可替代地，PSI BLAST可被用于执行检测分子之间的远距离关系的迭代搜索(同上)。当利用BLAST、Gapped BLAST和PSI Blast程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST的相应程序)的默认参数(参见例如万维网上的National Center forBiotechnology Information(NCBI)，ncbi.nlm.nih.gov)。用于序列比较的数学算法的另一非限制性实例是Myers和Miller，CABIOS 4:11-17(1998)的算法。此种算法被并入在ALIGN程序(2.0版)中，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分。在允许或不允许空位的情况下，可使用与上面描述的技术类似的技术来确定两个序列之间的同一性百分比。在计算同一性百分比时，通常只计算精确匹配。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb包含与选自SEQ ID NO:39-55和301-303的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一百分比的序列同一性的VHH结构域。在一些实施方案中，具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一百分比的同一性的VHH序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗CD20单结构域抗体保留了与CD20结合的能力。在一些实施方案中，在选自SEQ ID NO:39-55和301-303的氨基酸序列中总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗CD20单结构域抗体包含选自SEQ ID NO:39-55和301-303的氨基酸序列，包括该序列的翻译后修饰。
在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD20结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ IDNO:40的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD20结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD20结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:42的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD20结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD20结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD20结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD20结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD20结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD20结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD20结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD20结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD20结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD20结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD20结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD20结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD20结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD20结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD20结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD20结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD20结合。
在一些实施方案中，可例如通过组合丙氨酸扫描对功能性表位作图，以鉴定CD20蛋白中与本文提供的抗CD20单结构域抗体相互作用所必需的氨基酸。在一些实施方案中，与CD20结合的抗CD20单结构域抗体的构象和晶体结构可被用于鉴定表位。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb和本文提供的抗CD20单结构域抗体中的任何一种抗CD20单结构域抗体与相同的表位特异性结合。例如，在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb和包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb和包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb和包含SEQID NO:43的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb和包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb和包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20sdAb和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb和包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb和包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb和包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb和包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb和包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb和包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb和包含SEQ ID NO:301的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20sdAb和包含SEQ ID NO:302的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb和包含SEQ ID NO:303的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体与相同的表位结合。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb与本文所述的抗CD20单结构域抗体中的任何一种抗CD20单结构域抗体竞争性地与CD20特异性结合。在一些实施方案中，可使用ELISA测定法来确定竞争性结合。例如，在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20sdAb与包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体竞争性地与CD20特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb与包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体竞争性地与CD20特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb与包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体竞争性地与CD20特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb与包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体竞争性地与CD20特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb与包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体竞争性地与CD20特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb与包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体竞争性地与CD20特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb与包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体竞争性地与CD20特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb与包含SEQID NO:46的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体竞争性地与CD20特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb与包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体竞争性地与CD20特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb与包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体竞争性地与CD20特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb与包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体竞争性地与CD20特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20sdAb与包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体竞争性地与CD20特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb与包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体竞争性地与CD20特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb与包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体竞争性地与CD20特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb与包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体竞争性地与CD20特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb与包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体竞争性地与CD20特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb与包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体竞争性地与CD20特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb与包含SEQ ID NO:301的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体竞争性地与CD20特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb与包含SEQID NO:302的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体竞争性地与CD20特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb与包含SEQ ID NO:303的氨基酸序列的抗CD20单结构域抗体竞争性地与CD20特异性结合。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD20 sdAb可单独或组合地并入如下文5.2.1.2至5.2.1.4节中所描述的任何特征。
与CD19结合的单结构域抗体
在一些实施方案中，本文提供的CAR中的抗CD19单结构域抗体(例如，VHH)与人CD19结合。在一些实施方案中，本文提供的抗CD19单结构域抗体调节一种或多种CD19活性。在一些实施方案中，本文提供的抗CD19单结构域抗体是拮抗剂抗体。
在一些实施方案中，本文提供的抗CD19单结构域抗体以≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(KD)与CD19(例如，人CD19)结合。
在一些实施方案中，本文提供的CAR中的抗CD19单结构域抗体是VHH结构域。本文提供的示例性VHH结构域如下文第6节中所描述的那样产生，且这些VHH结构域被称为VHH-083、VHH-111、VHH-131、huVHH-773和huVHH-776，也如上表2中所示。
因此，在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含VHH-083、VHH-111、VHH-131、huVHH-773和/或huVHH-776中的任一者的一个或多个CDR序列。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中CDR序列选自VHH-083、VHH-111、VHH-131、huVHH-773和huVHH-776中的那些。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含SEQID NO:86的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含SEQ ID NO:308的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:85中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:85中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:85中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:85中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:85中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:85中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:85中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:86中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:86中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:86中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:86中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:86中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:86中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:86中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:87中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:87中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:87中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:87中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:87中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:87中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:87中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:88中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:88中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:88中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:88中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:88中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:88中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:88中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:308中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:308中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:308中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:308中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:308中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:308中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:308中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中(i)所述CDR1包含SEQ ID NO:73或316、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:79或317或者SEQ ID NO:82的氨基酸序列；(ii)所述CDR2包含SEQ ID NO:74、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:307的氨基酸序列；并且/或者(iii)所述CDR3包含SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:84的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中(i)所述CDR1包含与SEQ ID NO:73或316、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:79或317或者SEQ ID NO:82具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；(ii)所述CDR2包含与SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:307具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；并且/或者(iii)所述CDR3包含与SEQID NO:75、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:84具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含：包含SEQ ID NO:73或316的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含：包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含：包含SEQ IDNO:316的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含：包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含：包含SEQ ID NO:79或317的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含：包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含：包含SEQ IDNO:317的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含：包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含：包含SEQ ID NO:73或316的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:307的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含：包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:307的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含：包含SEQ IDNO:316的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:307的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含：包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD19单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19单结构域抗体进一步包含VHH-083、VHH-131、VHH-111、huVHH-773和/或huVHH-776的一个或多个框架区。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:85的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:86的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:87的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:88的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:308的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，本文提供的单结构域抗体是人源化单结构域抗体。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含具有SEQ IDNO:86的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19sdAb包含具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19sdAb包含具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含具有SEQ ID NO:308的氨基酸序列的VHH结构域。
在某些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含相对于抗体VHH-083、VHH-111、VHH-131、huVHH-773和/或huVHH-776中的任一者具有一定百分比同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb包含与选自SEQ ID NO:85-88和308的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一百分比的序列同一性的VHH结构域。在一些实施方案中，具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一百分比的同一性的VHH序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗CD19单结构域抗体保留了与CD19结合的能力。在一些实施方案中，在选自SEQ ID NO:85-88和308的氨基酸序列中总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗CD19单结构域抗体包含选自SEQ ID NO:85-88和308的氨基酸序列，包括该序列的翻译后修饰。
在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:85的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD19结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ IDNO:86的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD19结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:87的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD19结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:88的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD19结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:308的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD19结合。
在一些实施方案中，可例如通过组合丙氨酸扫描对功能性表位作图，以鉴定CD19蛋白中与本文提供的抗CD19单结构域抗体相互作用所必需的氨基酸。在一些实施方案中，与CD19结合的抗CD19单结构域抗体的构象和晶体结构可被用于鉴定表位。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb和本文提供的抗CD19单结构域抗体中任何一种抗CD19单结构域抗体与相同的表位特异性结合。例如，在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19sdAb和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的抗CD19单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb和包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的抗CD19单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb和包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的抗CD19单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb和包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的抗CD19单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb和包含SEQ IDNO:308的氨基酸序列的抗CD19单结构域抗体与相同的表位结合。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb与本文所述的抗CD19单结构域抗体中的任何一种抗CD19单结构域抗体竞争性地与CD19特异性结合。在一些实施方案中，可使用ELISA测定法来确定竞争性结合。例如，在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19sdAb与包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的抗CD19单结构域抗体竞争性地与CD19特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb与包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的抗CD19单结构域抗体竞争性地与CD19特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb与包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的抗CD19单结构域抗体竞争性地与CD19特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb与包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的抗CD19单结构域抗体竞争性地与CD19特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb与包含SEQ ID NO:308的氨基酸序列的抗CD19单结构域抗体竞争性地与CD19特异性结合。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD19 sdAb可单独或组合地并入如下文5.2.1.2至5.2.1.4节中所描述的任何特征。
与CD22结合的单结构域抗体
在一些实施方案中，本文提供的CAR中的抗CD22单结构域抗体(例如，VHH)与人CD22结合。在一些实施方案中，本文提供的抗CD22单结构域抗体调节一种或多种CD22活性。在一些实施方案中，本文提供的抗CD22单结构域抗体是拮抗剂抗体。
在一些实施方案中，本文提供的抗CD22单结构域抗体以≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(KD)与CD22(例如，人CD22)结合。
在一些实施方案中，本文提供的CAR中的抗CD22单结构域抗体是VHH结构域。本文提供的示例性VHH结构域如下文第6节中所述的那样产生，且这些VHH结构域被称为VHH-18、VHH-66、VHH-87、VHH-90、VHH-102、VHH-105和huVHH-077，也如上表2中所示。
因此，在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含VHH-18、VHH-66、VHH-87、VHH-90、VHH-102、VHH-105和/或huVHH-077中的任一者的一个或多个CDR序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中CDR序列选自VHH-18、VHH-66、VHH-87、VHH-90、VHH-102、VHH-105和huVHH-077中的那些。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22sdAb包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22sdAb包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的一个、两个或所有三个CDR。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:129中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:129中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:129中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:129中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:129中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:129中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:129中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:130中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:130中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:130中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:130中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:130中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:130中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:130中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:131中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:131中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:131中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:131中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:131中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ IDNO:131中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:131中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:132中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:132中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:132中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:132中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:132中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:132中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:132中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:133中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:133中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:133中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:133中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:133中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:133中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:133中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:134中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:134中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:134中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:134中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:134中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:134中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:134中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1，所述CDR1具有如SEQ ID NO:135中所示的CDR1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2，所述CDR2具有如SEQ ID NO:135中所示的CDR2的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR3，所述CDR3具有如SEQ ID NO:135中所示的CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR2，所述CDR1和CDR2具有如SEQ ID NO:135中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1和CDR3，所述CDR1和CDR3具有如SEQ ID NO:135中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR2和CDR3，所述CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:135中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3具有如SEQ ID NO:135中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。可以根据熟知的编号系统来确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中(i)所述CDR1包含SEQ ID NO:93或318、SEQ ID NO:96、SEQ IDNO:99或319、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:105或320、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111或321、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:117或322、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:123或323或者SEQ IDNO:126的氨基酸序列；(ii)所述CDR2包含SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:115、SEQ IDNO:118、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:127的氨基酸序列；并且和/或者(iii)所述CDR3包含SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:104、SEQ IDNO:107、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:125或SEQ ID NO:128的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中(i)所述CDR1包含与SEQ ID NO:93或318、SEQ ID NO:96、SEQ IDNO:99或319、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:105或320、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111或321、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:117或322、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:123或323或者SEQ IDNO:126具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；(ii)所述CDR2包含与SEQ IDNO:94、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:124或SEQ IDNO:127具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；并且/或者(iii)所述CDR3包含与SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:107、SEQ IDNO:110、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:125或SEQ ID NO:128具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQ ID NO:93或318的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQ IDNO:318的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQ ID NO:99或319的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQ IDNO:99的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQID NO:319的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ IDNO:101的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQ ID NO:105或320的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQ IDNO:105的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQID NO:320的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ IDNO:107的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQ ID NO:111或321的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQ IDNO:111的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQID NO:321的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ IDNO:113的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQ ID NO:117或322的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQ IDNO:117的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQID NO:322的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ IDNO:119的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQ ID NO:123或323的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQ IDNO:123的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQID NO:323的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ IDNO:125的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含：包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD22单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22单结构域抗体进一步包含VHH-18、VHH-66、VHH-87、VHH-90、VHH-102、VHH-105和/或huVHH-077的一个或多个框架区。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:129的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:130的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQID NO:131的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:132的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:133的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ ID NO:134的序列的VHH结构域的一个或多个框架。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包含来源于包含SEQ IDNO:135的序列的VHH结构域的一个或多个框架。
在一些实施方案中，本文提供的单结构域抗体是人源化单结构域抗体。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含具有SEQ IDNO:130的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含具有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22sdAb包含具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含具有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的VHH结构域。
在某些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含相对于抗体VHH-18、VHH-66、VHH-87、VHH-90、VHH-102、VHH-105和huVHH-077中的任一者具有一定百分比同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb包含与选自SEQ ID NO:129-135的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一百分比的序列同一性的VHH结构域。在一些实施方案中，具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一百分比的同一性的VHH序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗CD22单结构域抗体保留了与CD22结合的能力。在一些实施方案中，在选自SEQ ID NO:129-135的氨基酸序列中总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗CD22单结构域抗体包含选自SEQ ID NO:129-135的氨基酸序列，包括该序列的翻译后修饰。
在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:129的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD22结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQID NO:130的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD22结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:131的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD22结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:132的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD22结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:133的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD22结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:134的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD22结合。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:135的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VHH结构域，其中所述单结构域抗体与CD22结合。
在一些实施方案中，可例如通过组合丙氨酸扫描对功能性表位作图，以鉴定CD22蛋白中与本文提供的抗CD22单结构域抗体相互作用所必需的氨基酸。在一些实施方案中，与CD22结合的抗CD22单结构域抗体的构象和晶体结构可被用于鉴定表位。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb和本文提供的抗CD22单结构域抗体中的任何一种抗CD22单结构域抗体与相同的表位特异性结合。例如，在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb和包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的抗CD22单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb和包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的抗CD22单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22sdAb和包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的抗CD22单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb和包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的抗CD22单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb和包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的抗CD22单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb和包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的抗CD22单结构域抗体与相同的表位结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb和包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的抗CD22单结构域抗体与相同的表位结合。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb与本文所述的抗CD22单结构域抗体中的任何一种抗CD22单结构域抗体竞争性地与CD22特异性结合。在一些实施方案中，可使用ELISA测定法来确定竞争性结合。例如，在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22sdAb与包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的抗CD22单结构域抗体竞争性地与CD22特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb与包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的抗CD22单结构域抗体竞争性地与CD22特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb与包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的抗CD22单结构域抗体竞争性地与CD22特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb与包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的抗CD22单结构域抗体竞争性地与CD22特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb与包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的抗CD22单结构域抗体竞争性地与CD22特异性结合。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb与包含SEQ IDNO:134的氨基酸序列的抗CD22单结构域抗体竞争性地特异性地结合地CD22。在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb与包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的抗CD22单结构域抗体竞争性地与CD22特异性结合。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的抗CD22 sdAb可单独或组合地并入如下文5.2.1.2至5.2.1.4节中所述的任何特征。
编码上述sdAb(VHH)的核酸序列(包括SEQ ID NO:56-72、89-92、136-142和304-306和309)包括在本公开中。
5.2.1.2.人源化单结构域抗体
本文所述的单结构域抗体包括人源化单结构域抗体。用于将来自骆驼科物种的单结构域抗体人源化的一般策略已经被描述(参见例如，Vincke等人，J.Biol.Chem.,284(5):3273-3284(2009))，并且可用于产生如本文所公开的人源化VHH结构域。来自骆驼科物种的人源化单结构域抗体的设计可包括VHH中的标志残基，如残基11、37、44、45和47(残基根据Kabat编号)(Muyldermans，Reviews Mol Biotech74:277-302(2001)。
也可使用本领域中已知的多种技术来产生人源化抗体，如本文公开的人源化单结构域抗体，这些技术包括但不限于CDR移植(欧洲专利号EP 239,400；国际公布号WO 91/09967；以及美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)、镶饰(veneering)或表面重塑(resurfacing)(欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan，Molecular Immun ology28(4/5):489-498(1991)；Studnicka等人，Protein Engineering7(6):805-814(1994)；和Roguska等人，PNAS 91:969-973(1994))、链改组(chain shuffling)(美国专利号5,565,332)以及例如以下中公开的技术：美国专利号6,407,213；美国专利号5,766,886；WO9317105；Tan等人，J.Immunol.169:1119 25(2002)；Caldas等人，Protei n Eng.13(5):353-60(2000)；Morea等人，Methods 20(3):267 79(2000)；Baca等人，J.Biol.Chem.272(16):10678-84(1997)；Roguska等人，Protein Eng.9(10):895 904(1996)；Couto等人，Cancer Res.55(23增刊):5973s-5977s(1995)；Couto等人，Cancer Res.55(8):1717-22(1995)；Sandhu JS，Gene 150(2):409-10(1994)；和Pedersen等人，J.Mol.Biol.235(3):959-73(1994)。还参见美国专利公布号US 2005/0042664A1(2005年2月24日)，其中的每一者均以全文引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，本文提供的单结构域抗体可以是与CD20、CD19或CD22结合的人源化单结构域抗体。例如，本公开的人源化单链抗体可包含SEQ ID NO:39-55、85-88、129-135、301-303和308中所示的一个或多个CDR。用于将非人抗体人源化的各种方法是本领域中已知的。例如，人源化抗体可具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，该“输入”残基通常取自“输入”可变结构域。例如可以按照以下方法，通过用高变区序列取代人抗体的相应序列进行人源化：Jones等人，Nature 321:522-25(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-27(1988)；和Verhoeyen等人，Science 239:1534-36(1988))。在具体的实施方案中，如下文第6节中所述的那样进行本文提供的单结构域抗体的人源化。
在一些情况下，通过CDR移植来构建人源化抗体，其中亲本非人抗体的CDR的氨基酸序列被移植到人抗体框架上。例如，Padlan等人确定，CDR中只有约三分之一的残基实际接触抗原，并将这些称为“特异性决定残基”或SDR(Padlan等人，FASEB J.9:133-39(1995))。在SDR移植的技术中，只有SDR残基被移植到人抗体框架上(参见例如Kashmiri等人，Methods 36:25-34(2005))。
用于制备人源化抗体的人可变结构域的选择对于降低抗原性来说可能是很重要的。例如，根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选非人抗体的可变结构域的序列。可以选择与非人抗体最靠近的人序列作为人源化抗体的人框架(Sims等人，J.Immunol.151:2296-308(1993)；和Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-17(1987))。另一种方法使用来源于轻链或重链的特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定构架。相同的框架可被用于几种不同的人源化抗体(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285-89(1992)；和Presta等人，J.Immunol.151:2623-32(1993))。在一些情况下，所述框架来源于最丰富的人亚类VL6亚组I(VL6I)和VH亚组III(VHIII)的共有序列。在另一种方法中，人种系基因用作框架区的来源。
在称为超级人源化的基于CDR比较的替代范式中，FR同源性是无关紧要的。该方法由将非人序列与功能性人种系基因库进行比较组成。然后选择那些编码与鼠序列相同或密切相关的规范结构的基因。接下来，在与非人抗体共享规范结构的基因之内选择在CDR内具有最高同源性的基因作为FR供体。最后，将非人CDR移植到这些FR上(参见例如Tan等人，J.Immunol.169:1119-25(2002))。
通常进一步期望在保留对抗原的亲和力和其它有利的生物学特性的情况下将抗体人源化。为了实现这一目标，根据一种方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是通常可用的，并且为本领域技术人员所熟悉。计算机程序可用于说明和显示选定候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。这些包括例如WAM(Whitelegg和Rees，Protein Eng.13:819-24(2002))、Modeller(Sali和Blundell，J.Mol.Biol.234:779-815(1993))和SwissPDB Viewer(Guex和Peitsch，Electrophoresis 18:2714-23(1997))。对这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，例如分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从接受者和输入序列中选择和组合FR残基，从而实现所需的抗体特征，如对一种或多种靶抗原的亲和力增加。一般来说，高变区残基直接且最实质性地参与影响抗原结合。
用于将抗体人源化的另一种方法是基于称为人串含量(Human String Content，HSC)的抗体人性度量。该方法将小鼠序列与人种系基因库进行比较，并将差异评分为HSC。然后通过最大化靶序列的HSC而不是使用全局同一性量度产生多种不同的人源化变体来使靶序列人源化(Lazar等人，Mol.Immunol.44:1986-98(2007))。
除了上述方法之外，经验方法可用于产生和选择人源化抗体。这些方法包括基于产生大型人源化变体文库和使用富集技术或高通量筛选技术选择最佳克隆的方法。抗体变体可以从噬菌体、核糖体和酵母展示文库以及通过细菌菌落筛选来分离(参见例如Hoogenboom，Nat.Biotechnol.23:1105-16(2005)；Dufner等人，Trends Biotechnol.24:523-29(2006)；Feldhaus等人，Nat.Biotechnol.21:163-70(2003)；和Schlapschy等人，Protein Eng.Des.Sel.17:847-60(2004))。
在FR文库方法中，在FR中的特定位置引入一系列残基变体，随后筛选文库以选择最能支持所移植的CDR的FR。要取代的残基可包括一些或所有被鉴定为可能有助于CDR结构(参见例如，Foote和Winter，J.Mol.Biol.224:487-99(1992))，或来自Baca等人J.Biol.Chem.272:10678-84(1997)鉴定的更有限的一组靶残基的“游标(Vernier)”残基。
在FR改组中，将整个FR与非人CDR组合，而不是创建选定残基变体的组合文库(参见例如Dall’Acqua等人，Methods 36:43-60(2005))。可使用一步FR改组过程。此种过程已被证明是有效的，因为所得抗体表现出改进的生物化学和物理化学性质，包括增强的表达、增加的亲和力和热稳定性(参见例如Damschroder等人，Mol.Immunol.44:3049-60(2007))。
“人工程化(humaneering)”方法基于对基本最小特异性决定簇(MSD)的实验鉴定，并基于将非人片段顺序替换到人FR文库中并评估结合。这种方法通常导致表位保留以及来自具有不同人V区段CDR的多个亚类的抗体的鉴定。
“人类工程化”方法包括通过对抗体的氨基酸序列进行特异性改变来改变非人抗体或抗体片段，从而产生在人中具有降低的免疫原性，但仍保留了原始非人抗体的期望结合特性的修饰抗体。通常，该技术涉及将非人抗体的氨基酸残基分类为“低风险”、“中等风险”或“高风险”残基。使用全局风险/回报计算进行分类，该全局风险/回报计算评价进行特定取代的预测益处(例如，对于人中的免疫原性)与该取代将影响所得抗体折叠的风险。可以通过将来自非人抗体可变区的氨基酸序列与特定或共有人抗体序列的相应区域进行比对来选择在非人抗体序列的给定位置(例如，低风险或中等风险)处要被取代的特定人氨基酸残基。可以根据比对将非人序列中低风险或中等风险位置处的氨基酸残基用人抗体序列中的相应残基取代。以下中更详细地描述了制备人工程化蛋白质的技术：Studnicka等人，Protein Engineering 7:805-14(1994)；5,766,886、5,770,196、5,821,123和5,869,619号美国专利；以及PCT公布WO 93/11794。
可使用例如Composite Human AntibodyTM技术(Antitope Ltd.，Cambridge，United Kingdom)产生复合人抗体。为了产生复合人抗体，以避开T细胞表位的方式由多个人抗体可变区序列的片段设计可变区序列，从而使所得抗体的免疫原性最小化。
去免疫化抗体是其中已经移除了T细胞表位的抗体。已经描述了制备去免疫化抗体的方法。参见例如Jones等人，Methods Mol Biol.525:405-23(2009)，xiv和De Groot等人，Cell.Immunol.244:148-153(2006))。去免疫化抗体包含T细胞表位耗尽的可变区和人恒定区。简言之，对抗体的可变区进行克隆，且随后通过在T细胞增殖测定中测试来源于抗体的可变区的重叠肽来鉴定T细胞表位。经由电脑模拟(in silico)方法鉴定T细胞表位以鉴定与人II类MHC结合的肽。在可变区中引入突变以消除与人II类MHC的结合。然后利用突变的可变区来产生去免疫化抗体。
5.2.1.3.单结构域抗体变体
在一些实施方案中，考虑了本文所述的CAR中的单结构域抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能需要优化抗体的结合亲和力和/或其它生物学性质，包括但不限于特异性、热稳定性、表达水平、效应子功能、糖基化、降低的免疫原性或溶解度。因此，除了本文所述的单结构域抗体之外，预期可制备本文所述的单结构域抗体的变体。例如，可通过将适当的核苷酸改变引入到编码DNA中以及/或者通过合成所需的抗体或多肽来制备单结构域抗体变体。理解氨基酸改变的本领域技术人员可以改变单结构域抗体的翻译后过程。
变异可以是编码单结构域抗体或多肽的一个或多个密码子的取代、缺失或插入，该取代、缺失或插入导致与原始抗体或多肽相比氨基酸序列的改变。用于取代诱变的感兴趣的位点包括CDR和FR。
氨基酸取代可以是将一种氨基酸用具有类似结构和/或化学性质的另一种氨基酸替换的结果，如用丝氨酸替换亮氨酸，例如保守氨基酸替换。本领域技术人员已知的标准技术可被用于在编码本文提供的分子的核苷酸序列中引入突变，该突变包括例如导致氨基酸取代的定点诱变和PCR介导的诱变。插入或缺失可任选在约1至5个氨基酸的范围内。在某些实施方案中，相对于原始分子，取代、缺失或插入包括少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。在具体的实施方案中，取代是在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行的保守氨基酸取代。允许的变异可通过在序列中系统地进行氨基酸的插入、缺失或取代并对所得变体测试亲本抗体表现出的活性来确定。
氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有多个残基的多肽范围内的氨基末端和/或羧基末端融合体，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰基残基的抗体。
通过保守氨基酸取代产生的单结构域抗体包括在本公开中。在保守氨基酸取代中，氨基酸残基被具有带类似电荷的侧链的氨基酸残基替换。如上所述，本领域中已经定义了具有带类似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。可替代地，可诸如通过饱和诱变，沿全部或部分编码序列随机引入突变，并且可针对生物活性筛选所得突变体以鉴定出保留活性的突变体。在诱变之后，可以使编码的蛋白质表达，并且可以确定该蛋白质的活性。可以进行保守(例如，在具有类似性质和/或侧链的氨基酸基团内的)取代，以维持或不显著改变该性质。示例性取代示于下表3中。
表3.氨基酸取代
Figure BDA0004113828030001221
氨基酸可以根据其侧链性质的相似性进行分组(参见例如Lehninger，Biochemistry 73-75(第2版1975)):(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电荷的极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；和(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。可替代地，天然存在的残基可基于共同的侧链性质分组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。例如，任何不参与维持单结构域抗体正确构象的半胱氨酸残基也可以用例如另一种氨基酸如丙氨酸或丝氨酸取代，以提高分子的氧化稳定性并防止异常交联。非保守取代将需要将这些类别之一的成员换成另一类别。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，被选择用于进一步研究的一种或多种所得变体相对于亲本抗体将具有某些生物学性质的改变(例如，改进)(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)以及/或者将具有实质上保留的亲本抗体的某些生物学性质。示例性的取代变体是亲和力成熟抗体，该亲和力成熟抗体可以方便地例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如本文所述的技术)产生。简言之，使一个或多个CDR残基突变，并将变体抗体展示在噬菌体上，并针对特定的生物学活性(例如结合亲和力)对该变体抗体进行筛选。
可以在CDR中作出改变(例如，取代)，例如以改进抗体亲和力。可以在CDR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间经历高频率突变的密码子编码的残基(参见例如Chowdhury，Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)中作出此类改变，并对所得变异抗体或其片段的结合亲和力进行测试。例如Hoogenboom等人，Met hods in MolecularBiology 178:1-37(O’Brien等人编，Human Press，Totowa，NJ，(2001))中已经描述了通过从二级文库构建和重新选择的亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任何一种将多样性引入到被选择用于成熟的可变基因中。然后创建二级文库。然后筛选该文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及CDR定向方法，其中将几个CDR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性地鉴定参与抗原结合的CDR残基。以下章节中提供了关于亲和力成熟的更详细描述。
在一些实施方案中，取代、插入或缺失可以在一个或多个CDR内发生，只要此类改变不实质性地降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可以在CDR中作出不实质性地降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守取代)。在本文提供的变体VHH序列的一些实施方案中，每个CDR是未改变的，或者含有不超过一个、两个或三个的氨基酸取代。
一种用于鉴定抗体中可以作为诱变靶标的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells，Science，244:1081-1085(1989)所述。在这一方法中，鉴定残基或一组靶残基(例如，带电荷的残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并且将该残基或一组靶残基用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始取代展现出功能敏感性的氨基酸位置处引入进一步的取代。可替代地或另外地，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原之间的接触点。此类接触残基和邻近残基可以作为用于取代的候选者被靶向或被消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所需性质。
氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有一百或更多个残基的多肽范围内的氨基末端和/或羧基末端融合体，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N-末端或C-末端与酶(例如，对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合。
可使用本领域中已知的方法(如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变)作出变异。可以对克隆的DNA进行定点诱变(参见例如Carter，Biochem J.237:1-7(1986)；和Zoller等人，Nucl.Acids Res.10:6487-500(1982))、盒式诱变(参见例如Wells等人，Gene34:315-23(1985))或其它已知的技术以产生单结构域抗体变体DNA。
5.2.1.4.体外亲和力成熟
在一些实施方案中，可通过体外亲和力成熟来制备与亲本抗体相比具有改进的性质(如亲和力、稳定性或表达水平)的抗体变体。与天然原型一样，体外亲和力成熟是基于突变和选择的原理。抗体文库展示在生物体(例如，噬菌体、细菌、酵母或哺乳动物细胞)的表面上或者与该抗体文库的编码mRNA或DNA缔合(例如，共价或非共价)。所展示抗体的亲和力选择允许分离携带编码抗体的遗传信息的生物体或复合物。使用诸如噬菌体展示的展示方法进行两轮或三轮突变和选择通常会产生亲和力在低纳摩尔范围内的抗体片段。亲和力成熟的抗体可以对靶抗原具有纳摩尔甚至皮摩尔的亲和力。
噬菌体展示是用于展示和选择抗体的普遍方法。抗体作为与噬菌体外壳蛋白的融合体展示在Fd或M13噬菌体的表面上。选择涉及暴露于抗原以允许噬菌体展示的抗体结合其靶标，这一过程被称为“淘选”。与抗原结合的噬菌体被回收，并被用于感染细菌以产生用于进一步的轮次的选择的噬菌体。关于综述，参见例如Hoogenboom，Methods.Mol.Biol.178:1-37(2002)；以及Bradbury和Marks，J.Immunol.Methods 290:29-49(2004)。
在酵母展示系统(参见例如，Boder等人，Nat.Biotech.15:553–57(1997)；和Chao等人，Nat.Protocols 1:755-68(2006))中，抗体可与酵母凝集素蛋白Aga2p的粘附亚基融合，该亚基通过与Aga1p的二硫键附接至酵母细胞壁。经由Aga2p展示蛋白质将蛋白质从细胞表面投射开，从而最大限度地减少与酵母细胞壁上其它分子的潜在相互作用。磁分离和流式细胞术被用于筛选文库以选择具有改进的亲和力或稳定性的抗体。通过用生物素化抗原和与荧光团缀合的二级试剂(如链霉亲和素)标记酵母来确定与感兴趣的可溶性抗原的结合。可以通过免疫荧光标记侧接单链抗体(例如，scFv)的血凝素或c-Myc表位标签来测量抗体的表面表达的变化。表达已被证明与所展示的蛋白质的稳定性相关，因此可以针对改进的稳定性以及亲和力来选择抗体(参见例如Shusta等人，J.Mol.Biol.292:949-56(1999))。酵母展示的另外的优点是利用内质网伴侣蛋白和质量控制机制，所展示的蛋白质在真核酵母细胞的内质网中折叠。一旦成熟完成，就可以在展示于酵母表面上的同时方便地“滴定”抗体亲和力，从而消除了对每种克隆的表达和纯化的需要。酵母表面展示的理论限制是功能文库的大小可能比其它展示方法的小；然而，最近的方法使用酵母细胞的交配系统来产生大小估计为1014的组合多样性(参见例如美国专利公布2003/0186374；和Blaise等人，Gene 342:211-18(2004))。
在核糖体展示中，产生抗体-核糖体-mRNA(ARM)复合物以在无细胞系统中进行选择。编码特定抗体文库的DNA文库与缺乏终止密码子的间隔序列进行基因融合。此间隔序列在被翻译时仍附接于肽基tRNA，并占据核糖体隧道，从而使感兴趣的蛋白质从核糖体中突出并折叠。由此产生的mRNA、核糖体和蛋白质的复合物可以与表面结合的配体结合，从而允许通过用配体进行亲和捕获同时分离抗体及其编码mRNA。然后核糖体结合的mRNA被逆转录回cDNA，然后可以经受诱变，并且被用于下一轮选择(参见例如Fukuda等人，Nucleic AcidsRes.34:e127(2006))。在mRNA展示中，使用嘌呤霉素作为衔接分子在抗体与mRNA之间建立共价键(Wilson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:3750-55(2001))。
由于这些方法完全在体外进行，因此它们与其它选择技术相比具有两个主要优势。首先，文库的多样性不受细菌细胞转化效率的限制，而仅受试管中存在的核糖体和不同mRNA分子的数目限制。其次，在每一轮选择之后例如通过非校对聚合酶可以很容易地引入随机突变，因为在任何多样化步骤之后都不需要转化文库。
在一些实施方案中，可以使用哺乳动物展示系统。
也可以以靶向方式或经由随机引入将多样性引入到抗体文库的CDR中。前一种方法包括经由高水平或低水平的诱变依次靶向抗体的所有CDR，或靶向孤立的体细胞超突变热点(参见例如Ho等人，J.Biol.Chem.280:607-17(2005))或基于实验或结构原因怀疑影响亲和力的残基。也可经由DNA改组或类似技术替换天然多样化的区域来引入多样性(参见例如Lu等人，J.Biol.Chem.278:43496-507(2003)；美国专利号5,565,332和6,989,250)。替代技术靶向延伸到框架区残基中的高变环(参见例如Bond等人，J.Mol.Biol.348:699-709(2005))，在CDR中采用环缺失和插入，或使用基于杂交的多样化(参见例如美国专利公布号2004/0005709)。在CDR中产生多样性的另外的方法公开于例如美国专利号7,985,840中。可用于产生抗体文库和/或抗体亲和力成熟的进一步的方法公开于例如美国专利号8,685,897和8,603,930以及美国公布号2014/0170705、2014/0094392、2012/0028301、2011/0183855和2009/0075378中，其中的每一者以引用的方式并入本文。
文库的筛选可通过本领域中已知的各种技术来完成。例如，单结构域抗体可以被固定在固体支持物、柱、针或纤维素/聚(偏二氟乙烯)膜/其它过滤器上，在附着于吸附板或用于细胞分选的宿主细胞上表达，或与生物素缀合以用链霉亲和素包被的珠粒捕获，或被用于任何其它淘选展示文库的方法中。
关于体外亲和力成熟方法的综述，参见例如Hoogenboom，Nature Biotechnology23:1105-16(2005)；Quiroz和Sinclair，Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51(2010)；以及其中的参考文献。
5.2.2.CD20 x CD19双特异性CAR
另一方面，本文提供靶向CD20和CD19的双特异性CAR，该双特异性CAR包含位于细胞外抗原结合结构域中的本文提供的抗CD20 sdAb(例如，如5.2.1节中所描述)和本文提供的抗CD19 sdAb(例如，如5.2.1节中所描述)。在一些实施方案中，抗CD20 sdAb(例如，抗CD20 VHH)靠近跨膜结构域的程度比抗CD19 sdAb(例如，抗CD19 VHH)靠近跨膜结构域的程度更高。在其它实施方案中，抗CD19sdAb(例如，抗CD19 VHH)靠近跨膜结构域的程度比抗CD20 sdAb(例如，抗CD20 VHH)靠近跨膜结构域的程度更高。
在一些实施方案中，本文提供的双特异性CAR包含：(a)包含抗CD20 sdAb和抗CD19sdAb的细胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)细胞内信号传导结构域，其中所述抗CD20 sdAb包含与SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:301、SEQ ID NO:302或SEQ ID NO:303的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列；且其中所述抗CD19sdAb包含与SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:308的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。
在某些具体实施方案中，本文提供的双特异性CAR包含下表4中例示的一对抗CD20VHH和抗CD19 VHH。在其它具体实施方案中，本文提供的双特异性CAR包含下表4中例示的一对抗CD20 VHH和抗CD19 VHH的抗CD20 VHH的CDR和抗CD19 VHH的CDR。
表4.示例性CD20 x CD19双特异性CAR
Figure BDA0004113828030001281
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Figure BDA0004113828030001291
/>
Figure BDA0004113828030001301
5.2.3.CD20 x CD22双特异性CAR
另一方面，本文提供靶向CD20和CD22的双特异性CAR，该双特异性CAR包含位于细胞外抗原结合结构域中的本文提供的抗CD20 sdAb(例如，如5.2.1节中所描述)和本文提供的抗CD22 sdAb(例如，如5.2.1节中所描述)。在一些实施方案中，抗CD20 sdAb(例如，抗CD20 VHH)靠近跨膜结构域的程度比抗CD22 sdAb(例如，抗CD22 VHH)靠近跨膜结构域的程度更高。在其它实施方案中，抗CD22sdAb(例如，抗CD22 VHH)靠近跨膜结构域的程度比抗CD20 sdAb(例如，抗CD20 VHH)靠近跨膜结构域的程度更高。
在一些实施方案中，本文提供的双特异性CAR包含：(a)包含抗CD20 sdAb和抗CD22sdAb的细胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)细胞内信号传导结构域，其中所述抗CD20 sdAb包含与SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:301、SEQ ID NO:302或SEQ ID NO:303的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列；且其中所述抗CD22sdAb包含与SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134或SEQ ID NO:135的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。
在某些具体实施方案中，本文提供的双特异性CAR包含下表5中例示的一对抗CD20VHH和抗CD22 VHH。在其它具体实施方案中，本文提供的双特异性CAR包含下表5中例示的一对抗CD20 VHH和抗CD22 VHH的抗CD20 VHH的CDR和抗CD19 VHH的CDR。
表5.示例性CD20 x CD22双特异性CAR
Figure BDA0004113828030001311
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Figure BDA0004113828030001321
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Figure BDA0004113828030001331
5.2.4.CD19 x CD22双特异性CAR
另一方面，本文提供靶向CD19和CD22的双特异性CAR，该双特异性CAR包含位于细胞外抗原结合结构域中的本文提供的抗CD19 sdAb(例如，如5.2.1节中所描述)和本文提供的抗CD22 sdAb(例如，如5.2.1节中所描述)。在一些实施方案中，抗CD19 sdAb(例如，抗CD19 VHH)靠近跨膜结构域的程度比抗CD22 sdAb(例如，抗CD22 VHH)靠近跨膜结构域的程度更高。在其它实施方案中，抗CD22sdAb(例如，抗CD22 VHH)靠近跨膜结构域的程度比抗CD19 sdAb(例如，抗CD19 VHH)靠近跨膜结构域的程度更高。
在一些实施方案中，本文提供的双特异性CAR包含：(a)包含抗CD19 sdAb和抗CD22sdAb的细胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)细胞内信号传导结构域，其中所述抗CD19 sdAb包含与SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88或SEQ IDNO:308的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列；且其中所述抗CD22 sdAb包含与SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134或SEQ ID NO:135的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。
在某些具体实施方案中，本文提供的双特异性CAR包含下表6中例示的一对抗CD19VHH和抗CD22 VHH。在其它具体实施方案中，本文提供的双特异性CAR包含下表6中例示的一对抗CD19 VHH和抗CD22 VHH的抗CD19 VHH的CDR和抗CD22 VHH的CDR。
表6.示例性CD19 x CD22双特异性CAR
Figure BDA0004113828030001341
5.2.5.CD20 x CD19 x CD22三特异性CAR
在又一方面，本文提供靶向CD20、CD19和CD22的三特异性CAR，该三特异性CAR包含位于细胞外抗原结合结构域中的本文提供的抗CD20 sdAb(例如，如5.2.1节中所描述)、本文提供的抗CD19sdAb(例如，如5.2.1节中所描述)和本文提供的抗CD22 sdAb(例如，如5.2.1节中所描述)。
在一些实施方案中，抗CD20 sdAb靠近跨膜结构域的程度比抗CD19 sdAb或抗CD22sdAb靠近跨膜结构域的程度更高。在一些实施方案中，所述抗CD19 sdAb在所述抗CD22sdAb的N-末端。在其它实施方案中，所述抗CD19 sdAb在所述抗CD22 sdAb的C-末端。在一些实施方案中，本文提供的CAR中的三个sdAb从N-末端到C-末端的顺序是抗CD19 sdAb、抗CD22 sdAb和抗CD20 sdAb。在其它实施方案中，所述CAR中的三个sdAb从N-末端到C-末端的顺序是抗CD22 sdAb、抗CD19 sdAb和抗CD20 sdAb。
在其它实施方案中，抗CD19 sdAb靠近跨膜结构域的程度比抗CD20 sdAb或抗CD22sdAb靠近跨膜结构域的程度更高。在一些实施方案中，所述抗CD20 sdAb位于所述抗CD22sdAb的N-末端。在其它实施方案中，所述抗CD20 sdAb位于所述抗CD22 sdAb的C-末端。在一些实施方案中，所述CAR中的三个sdAb从N-末端到C-末端的顺序是抗CD20 sdAb、抗CD22sdAb和抗CD19 sdAb。在其它实施方案中，所述CAR中的三个sdAb从N-末端到C-末端的顺序是抗CD22 sdAb、抗CD20 sdAb和抗CD19 sdAb。
在又其它实施方案中，抗CD22 sdAb靠近跨膜结构域的程度比抗CD19 sdAb或抗CD20 sdAb靠近跨膜结构域的程度更高。在一些实施方案中，所述抗CD19 sdAb位于所述抗CD20 sdAb的N-末端。在其它实施方案中，所述抗CD19 sdAb位于所述抗CD20 sdAb的C-末端。在一些实施方案中，所述CAR中的三个sdAb从N-末端到C-末端的顺序是抗CD19 sdAb、抗CD20 sdAb和抗CD22 sdAb。在其它实施方案中，所述CAR中的三个sdAb从N-末端到C-末端的顺序是抗CD20 sdAb、抗CD19 sdAb和抗CD22 sdAb。
在一些实施方案中，本文提供的三特异性CAR包含：(a)包含抗CD20 sdAb、抗CD19sdAb和抗CD22 sdAb的细胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)细胞内信号传导结构域，其中所述抗CD20sdAb包含与SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:301、SEQ ID NO:302或SEQ ID NO:303的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列；其中所述抗CD19 sdAb包含与SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:308的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列；且其中所述抗CD22 sdAb包含与SEQ ID NO:129、SEQ IDNO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134或SEQ ID NO:135的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。
在某些具体实施方案中，本文提供的三特异性CAR包含下表7中例示的抗CD20VHH、抗CD19 VHH和抗CD22 VHH的组合。在其它具体实施方案中，本文提供的三特异性CAR包含下表7中例示的抗CD20 VHH、抗CD19 VHH和抗CD22 VHH的组合的抗CD20VHH的CDR、抗CD19VHH的CDR和抗CD22 VHH的CDR。
表7.示例性CD20 x CD19 x CD22三特异性CAR
Figure BDA0004113828030001361
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Figure BDA0004113828030001371
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Figure BDA0004113828030001381
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Figure BDA0004113828030001391
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Figure BDA0004113828030001401
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Figure BDA0004113828030001411
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Figure BDA0004113828030001421
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Figure BDA0004113828030001431
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Figure BDA0004113828030001441
在一些具体实施方案中，本文提供的CAR包含表9和表12中的VHH结构域组合。具体地，在一些实施方案中，本文提供的CAR包含VHH-496、VHH-66和VHH-083。在一些实施方案中，本文提供的CAR包含VHH-273、VHH-66和VHH-083。
在其它实施方案中，本文提供的CAR包含huVHH-746、huVHH-773和huVHH-077。在其它实施方案中，本文提供的CAR包含huVHH-750、huVHH-773和huVHH-077。在其它实施方案中，本文提供的CAR包含huVHH-753、huVHH-773和huVHH-077。在其它实施方案中，本文提供的CAR包含huVHH-253、huVHH-773和huVHH-077。在其它实施方案中，本文提供的CAR包含huVHH-256、huVHH-773和huVHH-077。在其它实施方案中，本文提供的CAR包含huVHH-253、huVHH-776和huVHH-077。在其它实施方案中，本文提供的CAR包含huVHH-256、huVHH-776和huVHH-077。在其它实施方案中，本文提供的CAR包含huVHH-746、huVHH-776和huVHH-077。在其它实施方案中，本文提供的CAR包含huVHH-750、huVHH-776和huVHH-077。在其它实施方案中，本文提供的CAR包含huVHH-753、huVHH-776和huVHH-077。
5.2.6.其它多特异性CAR
在一些实施方案中，本文提供的多特异性CAR进一步包含与一种或多种另外的抗原结合的一个或多个另外的结合结构域(如sdAb)。在一些实施方案中，由本公开的CAR靶向的一种或多种另外的抗原是细胞表面分子。可以选择单结构域抗体以识别充当与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物的抗原。在一些实施方案中，所述抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原与B细胞恶性肿瘤相关。肿瘤表达许多可用作免疫反应(尤其是T细胞介导的免疫反应)的靶抗原的蛋白质。CAR靶向的抗原可以是单个患病细胞上的抗原，或是在各自都会促成疾病的不同细胞上表达的抗原。CAR靶向的抗原可直接或间接参与疾病。
肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白质，该蛋白质可引发免疫反应，特别是T细胞介导的免疫反应。本公开的另外靶向的抗原的选择将取决于要治疗的癌症的特定类型。示例性肿瘤抗原包括但不限于神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、前列腺素(prostein)、PSMA、HER2/neu、存活素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
在一些实施方案中，肿瘤抗原包含一种或多种与恶性肿瘤相关的抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达许多可作为免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，如黑色素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和gp100，以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其它靶分子属于转化相关分子(诸如癌基因HER2/Neu/ErbB-2)的组。又一组靶抗原是癌胚胎抗原，如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成了真正的肿瘤特异性免疫球蛋白抗原，该肿瘤特异性免疫球蛋白抗原是单个肿瘤所独有的。除了CD20之外，B细胞分化抗原如CD22和CD37也是B细胞淋巴瘤中的靶抗原的其它候选者。
在一些实施方案中，肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA对于肿瘤细胞是独特的，并且在身体内的其它细胞上不会出现。TAA相关抗原不是肿瘤细胞所独有的，而是也在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下在正常细胞上表达。该抗原在肿瘤上的表达可发生在使免疫系统能够对抗原作出反应的条件下。TAA可以是在胎儿发育过程中，当免疫系统不成熟且无法响应时在正常细胞上表达的抗原，或者它们可以是正常细胞上通常以极低水平存在但以高得多的水平在肿瘤细胞上表达的抗原。
TSA或TAA抗原的非限制性实例包括：分化抗原，如MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原，如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5；过表达的胚胎抗原，如CEA；过表达的致癌基因和突变的肿瘤抑制基因，如p53、Ras、HER2/neu；由染色体易位产生的独特肿瘤抗原；如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，如艾巴氏病毒(Epstein Barr virus)抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。
其它基于蛋白质的大抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
在一些更具体的实施方案中，所述一种或多种另外的抗原选自由CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77组成的组。
除了本文提供的(多个)结合结构域之外，本文提供的CAR可进一步包含以下中的一者或多者：接头(例如，肽接头)、跨膜结构域、铰链区、信号肽、细胞内信号传导结构域、共刺激信号传导结构域，其中的每一者在下文中有更详细的描述。
例如，在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(如T细胞)的初级细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述初级细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域来源于选自由CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组的共刺激分子。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域来源于CD137。在一些实施方案中，所述CAR进一步包含位于细胞外抗原结合结构域的C-末端与跨膜结构域的N-末端之间的铰链结构域(如CD8α铰链结构域)。在一些实施方案中，所述CAR进一步包含位于多肽的N-末端的信号肽(如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，所述多肽从N-末端到C-末端包含：CD8α信号肽、细胞外抗原结合结构域、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、来源于CD137的共刺激信号传导结构域和来源于CD3ζ的初级细胞内信号传导结构域。
5.2.7.肽接头
本文所述的多特异性CAR中的各种单结构域抗体可经由肽接头彼此融合。在一些实施方案中，单结构域抗体直接彼此融合而没有任何肽接头。连接不同单结构域抗体(例如，VHH)的肽接头可以是相同或不同的。CAR的不同结构域也可经由肽接头彼此融合。
CAR中的每个肽接头可具有相同或不同的长度和/或序列，这取决于单结构域抗体和/或各种结构域的结构和/或功能特征。可以独立地选择并优化每个肽接头。CAR中使用的一个或多个肽接头的长度、柔性程度和/或其它性质可能对包括但不限于对一种或多种特定抗原或表位的亲和力、特异性或亲合力在内的性质有一些影响。例如，可以选择较长的肽接头以确保两个相邻的结构域不会在空间上相互干扰。在一些实施方案中，短肽接头可设置在CAR的跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间。在一些实施方案中，肽接头包含柔性残基(如甘氨酸和丝氨酸)，以使得相邻结构域可相对于彼此自由移动。例如，甘氨酸-丝氨酸双联体可以是合适的肽接头。
如下文第6节中所证实的，sdAb之间的肽接头的长度对CAR-T细胞的作用有影响，且较短的接头比较长的接头产生更好的作用。因此，在一些实施方案中，肽接头长度不超过约100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5个或更少氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，肽接头的长度为约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸长、约30个氨基酸至约50个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，肽接头的长度不超过30个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头的长度不超过25个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头的长度不超过20个氨基酸(如长度为19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5个或更少氨基酸中的任一者)。在一些实施方案中，肽接头的长度不超过15个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头的长度不超过10个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头的长度不超过5个氨基酸。
肽接头可具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，来源于仅有重链的抗体的铰链区的序列可用作接头。参见例如WO1996/34103。在一些实施方案中，肽接头是柔性接头。示例性柔性接头包括但不限于甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n和(GGGGS)n，其中n是至少一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域中已知的其它柔性接头。示例性肽接头列于下表中。在具体的实施方案中，连接本文提供的两个或更多个抗CD20 VHH结构域的肽接头是(GGGGS)n(SEQ IDNO:147)，其中n任选为1、2、3、4、5或6。
表8.示例性肽接头
序列 SEQ ID NO
(GS)n，n是包括例如1、2、3、4、5和6的整数。 SEQ ID NO:143
(GSGGS)n，n是包括例如1、2、3、4、5和6的整数。 SEQ ID NO:144
(GGGS)n，n是包括例如1、2、3、4、5和6的整数。 SEQ ID NO:145
GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO:146
(GGGGS)n，n是包括例如1、2、3、4、5和6的整数。 SEQ ID NO:147
DGGGS SEQ ID NO:148
TGEKP SEQ ID NO:149
GGRR SEQ ID NO:150
GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGS SEQ ID NO:151
EGKSSGSGSESKVD SEQ ID NO:152
KESGSVSSEQLAQFRS SEQ ID NO:153
GGRRGGGS SEQ ID NO:154
LRQRDGERP SEQ ID NO:155
LRQKDGGGSERP SEQ ID NO:156
LRQKDGGGSGGGSERP SEQ ID NO:157
GSTSGSGKPGSGEGST SEQ ID NO:158
GSTSGSGKSSEGKG SEQ ID NO:159
KESGSVSSEQLAQFRSLD SEQ ID NO:160
例如，如以下中所述的本领域已知的其它接头也可以包括在本文提供的CAR中：WO2016014789、WO2015158671、WO2016102965、US20150299317、WO2018067992、US7741465；Colcher等人，J.Nat.Cancer Inst.82:1191-1197(1990)和Bird等人，Science 242:423-426(1988)中所述，上述中的每一者的公开内容以引用的方式并入本文。
5.2.8.跨膜结构域
本公开的CAR包含可直接或间接与细胞外抗原结合结构域融合的跨膜结构域。该跨膜结构域可来源于天然来源或合成来源。如本文所用，“跨膜结构域”是指在细胞膜、优选真核细胞膜中热力学稳定的任何蛋白质结构。适用于本文所述的CAR的跨膜结构域可以从天然存在的蛋白质中获得。可替代地，它可以是合成的非天然存在的蛋白质区段，例如在细胞膜中热力学稳定的疏水性蛋白质区段。
跨膜结构域基于跨膜结构域的三维结构进行分类。例如，跨膜结构域可形成α螺旋、多于一个α螺旋的复合物、β-桶状结构或能够跨越细胞的磷脂双层的任何其它稳定结构。此外，跨膜结构域也可以或可替代地基于跨膜结构域拓扑结构(包括跨膜结构域穿过膜的次数和蛋白质的取向)进行分类。例如，单程膜蛋白穿过细胞膜一次，多程膜蛋白穿过细胞膜至少两次(例如，2、3、4、5、6、7或更多次)。膜蛋白可以被定义为I型、II型或III型，这取决于它们的末端和一个或多个穿膜区段相对于细胞内部和外部的拓扑结构。I型膜蛋白具有单个跨膜区，并且被定向成使得蛋白质的N-末端存在于细胞的脂质双层的细胞外侧，而蛋白质的C-末端存在于细胞质侧。II型膜蛋白也具有单个跨膜区，但被定向成使得蛋白质的C-末端存在于细胞的脂质双层的细胞外侧，而蛋白质的N-末端存在于细胞质侧。III型膜蛋白具有多个跨膜区段，并且可基于跨膜区段的数目以及N-末端和C-末端的位置进一步细分。
在一些实施方案中，本文所述的CAR的跨膜结构域来源于I型单程膜蛋白。在一些实施方案中，来自多程膜蛋白的跨膜结构域也可适用于本文所述的CAR。多程膜蛋白可包含复合(至少2、3、4、5、6、7个或更多)α螺旋或β折叠结构。在一些实施方案中，多程膜蛋白的N-末端和C-末端存在于脂质双层的相对侧上，例如，蛋白质的N-末端存在于脂质双层的细胞质侧上，且蛋白质的C-末端存在于细胞外侧上。
在一些实施方案中，CAR的跨膜结构域包含选自以下的跨膜结构域的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154，KIRDS2，OX40，CD2，CD27，LFA-1(CDl la、CD18)，ICOS(CD278)，4-1BB(CD137)，GITR，CD40，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRFl)，CD160，CD19，IL-2Rβ，IL-2Rγ，IL-7R a，ITGA1，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CDl ld，ITGAE，CD103，ITGAL，CDl la，LFA-1，ITGAM，CDl lb，ITGAX，CDl lc，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244、2B4)，CD84，CD96(Tactile)，CEACAM1，CRT AM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CDIOO(SEMA4D)，SLAMF6(NTB-A，Lyl08)，SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46，NKG2D和/或NKG2C。在一些实施方案中，跨膜结构域来源于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。
在一些具体实施方案中，跨膜结构域来源于CD8α。在一些实施方案中，跨膜结构域是包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的CD8α的跨膜结构域。
用于本文所述的CAR的跨膜结构域还可以包含合成的非天然存在的蛋白质区段的至少一部分。在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的非天然存在的α螺旋或β折叠。在一些实施方案中，蛋白质区段是至少近似20个氨基酸，例如至少18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个氨基酸。合成跨膜结构域的实例是在本领域中，例如在美国专利号7,052,906和PCT公布号WO 2000/032776中已知的，所述美国专利和PCT公布的相关公开内容以引用的方式并入本文。
本文提供的跨膜结构域可包含跨膜区和位于跨膜结构域的C-末端侧的细胞质区。跨膜结构域的胞质区可包含三个或更多个氨基酸，并且在一些实施方案中，有助于在脂质双层中对跨膜结构域进行定向。在一些实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的跨膜区中。在一些实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的细胞质区中。在一些实施方案中，跨膜结构域的细胞质区包含带正电荷的氨基酸。在一些实施方案中，跨膜结构域的细胞质区包含氨基酸精氨酸、丝氨酸和赖氨酸。
在一些实施方案中，跨膜结构域的跨膜区包含疏水性氨基酸残基。在一些实施方案中，本文提供的CAR的跨膜结构域包含人工疏水序列。例如，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体可存在于跨膜结构域的C末端。在一些实施方案中，跨膜区主要包含疏水性氨基酸残基，例如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或缬氨酸。在一些实施方案中，跨膜区是疏水性的。在一些实施方案中，跨膜区包含聚亮氨酸-丙氨酸序列。可通过本领域中已知的任何方法，例如Kyte和Doolittle亲水性分析来评估蛋白质或蛋白质区段的亲水性或疏水性或亲水特征。
5.2.9.细胞内信号传导结构域
本公开的CAR包含细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域负责激活表达CAR的免疫效应细胞的正常效应子功能中的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的特殊功能。例如，T细胞的效应功能可以是溶细胞活性或包括分泌细胞因子在内的辅助活性。因此术语“细胞质信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞执行特殊功能的蛋白质部分。虽然通常可以采用整个细胞质信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整条链。就使用细胞质信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可用于代替完整链，只要其转导效应子功能信号即可。因此术语细胞质信号传导结构域意在包括足以转导效应子功能信号的细胞质信号传导结构域的任何截短部分。
在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含基本上由免疫效应细胞的初级细胞内信号传导结构域组成的细胞内信号传导结构域。“初级细胞内信号传导结构域”是指以刺激方式起作用以诱导免疫效应子功能的细胞质信号传导序列。在一些实施方案中，初级细胞内信号传导结构域含有称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。如本文所用，“ITAM”是通常存在于在许多免疫细胞中表达的信号传导分子的尾部的保守蛋白质基序。所述基序可包含由6-8个氨基酸分隔的氨基酸序列YxxL/I的两个重复序列，其中每个x独立地是产生保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I的任何氨基酸。信号传导分子内的ITAM对于细胞内的信号转导很重要，这至少部分由信号传导分子激活后ITAM中酪氨酸残基的磷酸化介导。ITAM还可以用作其它参与信号传导通路的蛋白质的对接位点。示例性的含有ITAM的初级细胞质信号传导序列包括来源于CD3ζ、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。
在一些实施方案中，所述初级细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域由CD3ζ的细胞质信号传导结构域组成。在一些实施方案中，初级细胞内信号传导结构域是野生型CD3ζ的细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3ζ的初级细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列。在一些实施方案中，野生型CD3ζ的初级细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导结构域是含有一种或多种突变(诸如Q65K)的CD3ζ的胞质信号传导结构域的功能突变体。
5.2.10.共刺激信号传导结构域
许多免疫效应细胞除了刺激抗原特异性信号外还需要共刺激，以促进细胞增殖、分化和存活，以及激活细胞的效应子功能。在一些实施方案中，CAR包含至少一个共刺激信号传导结构域。如本文所用的术语“共刺激信号传导结构域”是指介导细胞内的信号转导以诱导诸如效应子功能的免疫反应的蛋白质的至少一部分。本文所述的嵌合受体的共刺激信号传导结构域可以是来自共刺激蛋白的细胞质信号传导结构域，该细胞质信号传导结构域转导信号并调节由免疫细胞如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞介导的反应。“共刺激信号传导结构域”可以是共刺激分子的细胞质部分。术语“共刺激分子”是指免疫细胞(如T细胞)上的同源结合配偶体，该同源结合配偶体与共刺激配体特异性结合，从而介导免疫细胞的共刺激反应，如但不限于增殖和存活。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含单个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含两个或更多个(如约2个、3个、4个或更多个中的任一者)共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含两个或更多个相同的共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含来自不同共刺激蛋白的两个或更多个共刺激信号传导结构域，如本文所述的任何两种或更多种共刺激蛋白。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含初级细胞内信号传导结构域(如CD3ζ的细胞质信号传导结构域)和一个或多个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个共刺激信号传导结构域和初级细胞内信号传导结构域(如CD3ζ的细胞质信号传导结构域)经由任选的肽接头彼此融合。初级细胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导结构域可以按任意合适的顺序排列。在一些实施方案中，一个或多个共刺激信号传导结构域位于跨膜结构域与初级细胞内信号传导结构域(如CD3ζ的细胞质信号传导结构域)之间。多个共刺激信号传导结构域可提供累加或协同的刺激作用。
宿主细胞(例如，免疫细胞)中的共刺激信号传导结构域的激活可诱导细胞增加或减少细胞因子的产生和分泌、吞噬性质、增殖、分化、存活和/或细胞毒性。任何共刺激分子的共刺激信号传导结构域适用于本文所述的CAR中。基于诸如将表达效应分子的免疫效应细胞的类型(例如，T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞)和所需免疫效应子功能(例如，ADCC效应)的因素选择共刺激信号传导结构域的一种或多种类型。用于CAR的共刺激信号传导结构域的实例可以是共刺激蛋白的细胞质信号传导结构域，所述共刺激蛋白包括但不限于B7/CD28家族的成员(例如，B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC和PDCD6)；TNF超家族的成员(例如，4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α和TNF RII/TNFRSF1B)；SLAM家族的成员(例如，2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD 229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6和SLAM/CD150)；以及任何其它共刺激分子，如CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD 90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I类、HL A-DR、Ikaros、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和NKG2C。
在一些实施方案中，所述一个或多个共刺激信号传导结构域选自由以下组成的组：CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
在一些实施方案中，本公开的CAR中的细胞内信号传导结构域包含来源于CD137的共刺激信号传导结构域(即，4-1BB)。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的细胞质信号传导结构域和CD137的共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD137的包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的共刺激信号传导结构域。
也在本公开的范围内的是本文所述的任何共刺激信号传导结构域的变体，使得共刺激信号传导结构域能够调节免疫细胞的免疫反应。在一些实施方案中，与野生型对应共刺激信号传导结构域相比，所述共刺激信号传导结构域包含最多10个氨基酸残基变异(例如，1个、2个、3个、4个、5个或8个)。包含一个或多个氨基酸变异的这类共刺激信号传导结构域可以被称为变体。相对于不包含突变的共刺激信号传导结构域，共刺激信号传导结构域的氨基酸残基的突变可能导致信号转导增加和免疫反应刺激增强。相对于不包含突变的共刺激信号传导结构域，共刺激信号传导结构域的氨基酸残基的突变可能导致信号转导减少和免疫反应刺激降低。
5.2.11.铰链区
本公开的CAR可包含位于细胞外抗原结合结构域与跨膜结构域之间的铰链结构域。铰链结构域是通常见于蛋白质的两个结构域之间的氨基酸区段，并且可允许该蛋白质的柔性以及该结构域中的一者或两者相对于彼此的移动。可以使用提供此种柔性以及细胞外抗原结合结构域相对于效应分子的跨膜结构域的移动的任何氨基酸序列。
铰链结构域可含有约10-100个氨基酸，例如约以下中的任一者：15-75个氨基酸、20-50个氨基酸或30-60个氨基酸。在一些实施方案中，铰链结构域的长度可以是至少约以下中的任一者：10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个或75个氨基酸。
在一些实施方案中，铰链结构域是天然存在的蛋白质的铰链结构域。本领域已知的包含铰链结构域的任何蛋白质的铰链结构域适用于本文所述的嵌合受体。在一些实施方案中，铰链结构域是天然存在的蛋白质的铰链结构域的至少一部分，并且赋予嵌合受体柔性。在一些实施方案中，所述铰链结构域来源于CD8α。在一些实施方案中，铰链结构域是CD8α的铰链结构域的一部分，例如，含有CD8α的铰链结构域的至少约15个(例如，20个、25个、30个、35个或40个)连续氨基酸的片段。在一些实施方案中，CD8α的铰链结构域包含SEQ IDNO:162的氨基酸序列。
抗体(如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体)的铰链结构域也适用于本文所述的pH依赖性嵌合受体系统。在一些实施方案中，铰链结构域是联接抗体的恒定结构域CH1和CH2的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域是抗体的，并且包含所述抗体的铰链结构域和所述抗体的一个或多个恒定区。在一些实施方案中，铰链结构域包含抗体的铰链结构域和所述抗体的CH3恒定区。在一些实施方案中，铰链结构域包含抗体的铰链结构域和所述抗体的CH2和CH3恒定区。在一些实施方案中，所述抗体是IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体。在一些实施方案中，所述抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区和CH2和CH3恒定区。在一些实施方案中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区和CH3恒定区。
非天然存在的肽也可用作本文所述的嵌合受体的铰链结构域。在一些实施方案中，Fc受体的细胞外配体结合结构域的C-末端与跨膜结构域的N-末端之间的铰链结构域是肽接头，如(GxS)n接头，其中x和n独立地可以为3与12之间的整数，包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更大。
5.2.12.信号肽
本公开的CAR可以在多肽的N-末端包含信号肽(也称为信号序列)。一般来说，信号肽是使多肽靶向细胞中所需位点的肽序列。在一些实施方案中，信号肽使效应分子靶向细胞的分泌通路，并将允许效应分子整合和锚定到脂质双层中。本领域技术人员将显而易见适用于本文所述的CAR中的包括天然存在的蛋白质的信号序列或合成的非天然存在的信号序列的信号肽。在一些实施方案中，信号肽源自选自由CD8α、GM-CSF受体α和IgG1重链组成的组的分子。在一些实施方案中，所述信号肽来源于CD8α。在一些实施方案中，CD8α的信号肽包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列。
5.2.13.示例性CAR
示例性多特异性CAR如下文第6节中所示出的那样产生(参见表9和表12)。
在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列或由SEQ IDNO:174的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列或由SEQ ID NO:175的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列或由SEQ ID NO:176的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列或由SEQ ID NO:177的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列或由SEQ IDNO:178的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列或由SEQ ID NO:179的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列或由SEQ ID NO:180的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列或由SEQ ID NO:181的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列或由SEQ IDNO:182的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列或由SEQ ID NO:183的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列或由SEQ ID NO:184的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:185的氨基酸序列或由SEQ ID NO:185的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列或由SEQ IDNO:186的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列或由SEQ ID NO:187的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列或由SEQ ID NO:188的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列或由SEQ ID NO:189的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列或由SEQ IDNO:190的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列或由SEQ ID NO:191的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列或由SEQ ID NO:192的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列或由SEQ ID NO:193的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列或由SEQ IDNO:194的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列或由SEQ ID NO:195的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列或由SEQ ID NO:196的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列或由SEQ ID NO:197的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列或由SEQ IDNO:198的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列或由SEQ ID NO:199的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列或由SEQ ID NO:200的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列或由SEQ ID NO:201的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列或由SEQ IDNO:202的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列或由SEQ ID NO:203的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列或由SEQ ID NO:204的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列或由SEQ ID NO:205的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列或由SEQ IDNO:206的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:207的氨基酸序列或由SEQ ID NO:207的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列或由SEQ ID NO:208的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列或由SEQ ID NO:209的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列或由SEQ IDNO:210的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:211的氨基酸序列或由SEQ ID NO:211的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列或由SEQ ID NO:212的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列或由SEQ ID NO:213的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列或由SEQ IDNO:214的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列或由SEQ ID NO:215的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列或由SEQ ID NO:216的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:217的氨基酸序列或由SEQ ID NO:217的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列或由SEQ IDNO:218的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:219的氨基酸序列或由SEQ ID NO:219的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:220的氨基酸序列或由SEQ ID NO:220的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列或由SEQ ID NO:221的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列或由SEQ IDNO:222的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列或由SEQ ID NO:223的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:224的氨基酸序列或由SEQ ID NO:224的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列或由SEQ ID NO:225的氨基酸序列组成的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:226的氨基酸序列或由SEQ IDNO:226的氨基酸序列组成的CAR。
在某些实施方案中，本文提供的CAR包含相对于下文第6节中例示的CAR中的任何一种CAR具有一定百分比同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:174的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:175的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:176的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:177的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:178的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:179的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:180的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:181的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:182的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:183的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:184的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:185的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:186的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:187的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:188的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:189的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:190的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:191的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:192的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:193的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:194的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:195的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:196的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:197的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:198的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:199的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:200的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:201的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:202的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:203的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:204的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:205的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:206的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:207的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:208的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:209的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:210的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:211的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:212的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:213的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:214的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:215的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:216的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:217的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:218的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:219的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:220的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:221的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:222的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:223的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:224的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:225的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽或由多肽组成的CAR，所述多肽与SEQ ID NO:226的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，本文提供了编码本文提供的CAR中任何一种CAR的分离的核酸。下面提供关于核酸序列和载体的更详细的描述。
5.3.工程化免疫效应细胞
在又一方面，本文提供了包含本文所述的多特异性CAR中的任何一种多特异性CAR的宿主细胞(如免疫效应细胞)。
因此，在一些实施方案中，本文提供了包含多特异性CAR的工程化免疫效应细胞(如T细胞)，所述CAR包含有包含以下的多肽：(a)包含抗CD20 sdAb、抗CD19 sdAb和抗CD22sdAb中的至少两者的细胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)细胞内信号传导结构域，其中所述抗CD20 sdAb、抗CD19 sdAb和抗CD22 sdAb各自如上文第5.2.1节中所述，包括例如表2中的VHH结构域和具有表2中的那些VHH结构域中任一个VHH结构域中的一个、两个或所有三个CDR的那些。在一些实施方案中，所述sdAb是骆驼科的、嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，跨膜结构域选自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(如T细胞)的初级细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述初级细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域来源于选自由CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组的共刺激分子。在一些实施方案中，所述CAR进一步包含位于细胞外抗原结合结构域的C-末端与跨膜结构域的N-末端之间的铰链结构域(如CD8α铰链结构域)。在一些实施方案中，所述CAR进一步包含位于多肽的N-末端的信号肽(如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，所述多肽从N-末端到C-末端包含：CD8α信号肽、细胞外抗原结合结构域、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、来源于CD137的共刺激信号传导结构域和来源于CD3ζ的初级细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文提供了工程化免疫效应细胞(如T细胞)，其包含如上文第5.2节中所述的CAR，包括例如表4-7、9和12中所述的多特异性CAR以及具有选自由SEQ IDNO:174-226组成的组的氨基酸序列的CAR。在一些实施方案中，本文提供了包含CAR的工程化免疫效应细胞(如T细胞)，所述CAR包含与选自由SEQ ID NO:174-226组成的组的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，工程化免疫效应细胞是T细胞、NK细胞、外周血单核细胞(PBMC)、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞。在一些实施方案中，工程化免疫效应细胞是自体的。在一些实施方案中，工程化免疫效应细胞是同种异体的。
还提供了包含(或表达)两种或更多种不同CAR的工程化免疫效应细胞。本文所述的任何两种或更多种CAR可以组合表达。CAR可以靶向不同的抗原，从而提供协同或累加效应。两种或更多种CAR可以在相同的载体或不同的载体上编码。
工程化免疫效应细胞可进一步表达一种或多种治疗性蛋白质和/或免疫调节剂，如免疫检查点抑制剂。参见例如国际专利申请号PCT/CN2016/073489和PCT/CN2016/087855，其以全文引用的方式并入本文。
5.3.1.载体
本公开提供了用于克隆和表达本文所述的CAR中的任何一种CAR的载体。在一些实施方案中，所述载体适合在真核细胞如哺乳动物细胞中复制和整合。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘载体、单纯疱疹病毒载体和它们的衍生物。病毒载体技术是本领域中熟知的，并且例如描述于Sambrook等人(2001，Molecular Cloning:A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)以及其它病毒学和分子生物学手册中。
许多基于病毒的系统已被开发用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可使用本领域中已知的技术将异源核酸插入到载体中，并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒，并在体外或离体地将该重组病毒递送至工程化哺乳动物细胞。许多逆转录病毒系统是本领域中已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域中已知的。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。在一些实施方案中，使用自灭活慢病毒载体。例如，可用本领域中已知的方案来包装携带免疫调节剂(如免疫检查点抑制剂)编码序列的自灭活慢病毒载体和/或携带嵌合抗原受体的自灭活慢病毒载体。可使用本领域中已知的方法将所得慢病毒载体用于转导哺乳动物细胞(如原代人T细胞)。来源于逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合以及该转基因在子代细胞中的繁殖。慢病毒载体还具有低免疫原性，并且可转导非增殖细胞。
在一些实施方案中，所述载体包含编码本文所述的CAR的核酸中的任何一种核酸。可使用本领域中任何已知的分子克隆方法将核酸克隆到载体中，所述方法包括例如使用限制性核酸内切酶位点和一种或多种可选择标记。在一些实施方案中，核酸与启动子可操作地连接。已经对用于使基因在哺乳动物细胞中表达的启动子种类进行了探索，并且本领域中已知的启动子中的任何一种启动子都可用于本公开。启动子可大致分类为组成型启动子或调控型启动子，如诱导型启动子。
在一些实施方案中，编码CAR的核酸与组成型启动子可操作地连接。组成型启动子允许异源基因(也称为转基因)在宿主细胞中组成型地表达。本文考虑的示例性组成型启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、人延伸因子-1α(hEF1α)、泛素C启动子(UbiC)、磷酸甘油激酶启动子(PGK)、猿病毒40早期启动子(SV40)以及与CMV早期增强子偶联的鸡β-肌动蛋白启动子(CAGG)。这类组成型启动子在驱动转基因表达方面的效率已在大量研究中进行了广泛比较。例如，Michael C.Milone等人比较了CMV、hEF1α、UbiC和PGK驱动原代人T细胞中的嵌合抗原受体表达的效率，并得出结论，即hEF1α启动子不仅诱导最高水平的转基因表达，而且还在CD4和CD8人T细胞中得到最佳保持(Molecular Therapy，17(8):1453-1464(2009))。在一些实施方案中，编码CAR的核酸与hEF1α启动子可操作地连接。
在一些实施方案中，编码CAR的核酸与诱导型启动子可操作地连接。诱导型启动子属于调控型启动子类别。诱导型启动子可由一种或多种条件诱导，所述条件例如工程化免疫效应细胞的物理条件、微环境，或工程化免疫效应细胞的生理状态、诱导物(即，诱导剂)或它们的组合。
在一些实施方案中，诱导条件不诱导工程化哺乳动物细胞中和/或接受药物组合物的受试者中的内源基因的表达。在一些实施方案中，诱导条件选自由以下组成的组：诱导物、辐照(如电离辐射、光)、温度(如热)、氧化还原状态、肿瘤环境和工程化哺乳动物细胞的激活状态。
在一些实施方案中，载体还含有可选择的标志基因或报告基因以从通过慢病毒载体转染的宿主细胞群中选择表达CAR的细胞。可选择的标志物和报告基因均可侧接有适当的调控性序列，以能够在宿主细胞中表达。例如，载体可含有可用于调控核酸序列的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
在一些实施方案中，载体包含多于一种编码CAR的核酸。在一些实施方案中，载体包含有包含编码第一CAR的第一核酸序列和编码第二CAR的第二核酸序列的核酸，其中第一核酸经由编码自切割肽的第三核酸序列与第二核酸可操作地连接。在一些实施方案中，自切割肽选自由T2A、P2A和F2A组成的组。
5.3.2.免疫效应细胞
“免疫效应细胞”是可执行免疫效应子功能的免疫细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的免疫效应细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
在一些实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+、CD4-/CD8-或它们的组合。在一些实施方案中，T细胞在表达CAR并与靶细胞如CD20+、CD19+和/或CD22+肿瘤细胞结合后产生IL-2、TFN和/或TNF。在一些实施方案中，CD8+T细胞在表达CAR并与靶细胞结合后裂解抗原特异性靶细胞。
在一些实施方案中，免疫效应细胞是NK细胞。在其它实施方案中，免疫效应细胞可以是已建立的细胞系，例如NK-92细胞。
在一些实施方案中，免疫效应细胞从干细胞如造血干细胞、多能干细胞、iPS或胚胎干细胞分化而来。
工程化免疫效应细胞是通过将CAR引入到免疫效应细胞(如T细胞)中来制备的。在一些实施方案中，通过转染上文所述的分离的核酸中的任何一种分离的核酸或者上文所述的载体中的任何一种载体将CAR引入到免疫效应细胞中。在一些实施方案中，通过将蛋白质插入到细胞膜中，同时使细胞通过微流体系统如CELL
Figure BDA0004113828030001721
(参见例如美国专利申请公布20140287509号)来将CAR引入到免疫效应细胞中。
将载体或分离的核酸引入到哺乳动物细胞中的方法是本领域中已知的。可以通过物理、化学或生物学方法将所述载体转移到免疫效应细胞中。
将载体引入到免疫效应细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域中熟知的。参见例如Sambrook等人(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Labo ratory，New York。在一些实施方案中，通过电穿孔将载体引入到细胞中。
将载体引入到免疫效应细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体已成为最广泛使用的将基因插入到哺乳动物(例如，人)细胞中的方法。
将载体引入到免疫效应细胞中的化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统(包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。
在一些实施方案中，可以通过常规方法(例如，体外转录)制备编码本文所述的CAR中的任何一种CAR的RNA分子，然后经由已知方法如mRNA电穿孔将该RNA分子引入到免疫效应细胞中。参见例如Rabinovich等人，Human Gene Therapy 17:1027-1035(2006)。
在一些实施方案中，转导或转染的免疫效应细胞在引入载体或分离的核酸后离体增殖。在一些实施方案中，转导或转染的免疫效应细胞被培养成繁殖至少约以下中的任一者：1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天。在一些实施方案中，进一步评价或筛选转导或转染的免疫效应细胞以选择工程化哺乳动物细胞。
报告基因可被用于鉴定潜在转染的细胞和评价调控性序列的功能性。一般来说，报告基因是这样的基因，该基因不存在于接受者生物体或组织中或不由接受者生物体或组织表达并且编码其表达能通过一些易于检测的性质(例如酶活性)显现出来的多肽。在已将DNA引入到接受者细胞中后，在合适的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人FEBS Letters 479:79-82(2000))。合适的表达系统是熟知的，并且可以采用已知技术制备或商购获得。用于确认工程化免疫效应细胞中存在编码CAR的核酸的其它方法包括例如本领域技术人员熟知的分子生物学测定，如Southern印迹和Northern印迹、RT-PCR和PCR；生物化学测定，如例如通过免疫学方法(如ELISA和Western印迹)检测特定肽的存在或不存在。
5.3.3.T细胞来源
在一些实施方案中，在T细胞的扩增和遗传修饰之前，从受试者获得T细胞来源。T细胞可获自多种来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施方案中，可以使用多种本领域可用的T细胞系。在一些实施方案中，可以使用多种本领域技术人员已知的技术例如FicollTM分离从采集自受试者的血液单位获得T细胞。在一些实施方案中，通过单采血液成分术获得来自个体循环血液的细胞。单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施方案中，可洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以除去血浆级分，并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中以用于后续处理步骤。在一些实施方案中，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在一些实施方案中，洗涤溶液缺少钙，并且可以缺少镁，或者可以缺少许多(如果不是全部的话)二价阳离子。在没有钙的情况下的初始激活步骤可导致放大的激活。如本领域普通技术人员将容易理解的那样，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法，例如通过按照制造商的说明书使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics CellSaver 5)来完成。洗涤后，可将细胞重悬在多种生物相容性缓冲液(例如，不含Ca2+、不含Mg2 +的PBS、PlasmaLyte A或其它含或不含缓冲剂的盐水溶液)中。可替代地，可以除去单采血液成分术样品中不需要的组分，并将细胞直接重悬在培养基中。
在一些实施方案中，通过裂解红细胞并耗竭单核细胞，例如通过经由PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析，从外周血淋巴细胞中分离T细胞。可以通过正选择或负选择技术进一步分离T细胞诸如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞的特定亚群。例如，在一些实施方案中，通过将T细胞与缀合有抗CD3/抗CD28(即，3×28)的珠粒，如
Figure BDA0004113828030001751
M-450 CD3/CD28 T一起温育足以进行正选择所需T细胞的时间段来分离该T细胞。在一些实施方案中，所述时间段为约30分钟。在进一步的实施方案中，所述时间段的范围是30分钟至36小时或更长，以及介于其间的所有整数值。在另一实施方案中，所述时间段是至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。在一些实施方案中，所述时间段是10至24小时。在一些实施方案中，温育时间段为24小时。为了从白血病患者中分离T细胞，使用较长的温育时间(如24小时)可增加细胞产量。在与其它细胞类型相比T细胞很少的任何情况下，可以使用更长的温育时间来分离T细胞，如从肿瘤组织或免疫受损个体中分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。进一步地，使用较长的温育时间可提高捕获CD8+T细胞的效率。因此，在一些实施方案中，通过简单地缩短或延长允许T细胞与CD3/CD28珠粒结合的时间和/或通过增加或减少珠粒与T细胞的比率，可以在培养开始时或在所述过程中的其它时间点优先选择或排除T细胞亚群。另外，通过增加或减少珠粒或其它表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可以在培养开始时或其它所需时间点优先选择或排除T细胞亚群。技术人员将认识到也可以使用多轮选择。在一些实施方案中，可能需要执行选择程序，并在激活和扩增过程中使用“未选择的”细胞。也可对“未选择的”细胞进行更多轮的选择。
通过负选择富集T细胞群可以用针对负选择的细胞特有的表面标志物的抗体组合来完成。一种方法是经由使用针对负选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体混合液(cocktail)的负磁性免疫粘附或流式细胞术进行的细胞分选和/或选择。例如，为了通过负选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合液通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，可能需要富集或正选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调控性T细胞。可替代地，在某些实施方案中，用缀合有抗C25的珠粒或其它类似的选择方法耗竭T调控性细胞。
为了通过正选择或负选择分离所需的细胞群，可以改变细胞和表面(例如，颗粒，如珠粒)的浓度。在某些实施方案中，可能需要显著减少珠粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠粒的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用20亿个细胞/毫升的浓度。在一个实施方案中，使用10亿个细胞/毫升的浓度。在进一步的实施方案中，使用大于1亿个细胞/毫升。在进一步的实施方案中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/毫升的浓度。在又一个实施方案中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/毫升的浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/毫升的浓度。使用高浓度可以引起细胞产量增加、细胞激活和细胞扩增。进一步地，高细胞浓度的使用可允许更高效地捕获可能微弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，诸如CD28阴性T细胞，或来自存在许多肿瘤细胞的样品(即，白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。这类细胞群可具有治疗价值并且期望获得。在一些实施方案中，使用高浓度细胞允许更高效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施方案中，可能需要使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒，如珠粒)的混合物，使颗粒与细胞之间的相互作用最小化。这会选择表达大量要与颗粒结合的所需抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达更高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更高效地被捕获。在一些实施方案中，使用的细胞浓度为5×106/ml。在一些实施方案中，使用的浓度可以为约1×105/ml至1×106/ml，以及介于其间的任何整数值。
在一些实施方案中，可将细胞在2-10℃下或室温下以不同的速度在旋转器上温育不同的时间长度。
也可以在洗涤步骤后冷冻用于刺激的T细胞。不受理论的束缚，冷冻和随后的解冻步骤可通过除去细胞群中的粒细胞和一定程度上的单核细胞来提供更均一的产品。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域中已知的，并且在本上下文中是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有31.25％plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其它合适的细胞冷冻介质。然后将细胞以1°/分钟的速度冷冻至-80℃并储存在液氮储存罐的蒸气相中。可使用其它受控冷冻方法以及立即在-20℃下或液氮中进行非受控冷冻。
在一些实施方案中，如本文所述，将冷冻保存的细胞解冻和洗涤，并使其在室温下静置一小时，然后进行激活。
本公开还考虑在可能需要如本文所述的扩增细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采血液成分术产物。因此，可以在任何必要的时间点收集要扩增的细胞来源，分离和冷冻所需细胞，如T细胞，以供以后用于T细胞疗法，用于治疗多种将受益于T细胞疗法的疾病或病状，如本文所述的那些。在一个实施方案中，血液样品或单采血液成分取自一般健康受试者。在某些实施方案中，血液样品或单采血液成分取自有发展疾病的风险但尚未发展疾病的一般健康受试者，并分离和冷冻感兴趣的细胞以备后用。在某些实施方案中，T细胞可以被扩增、冷冻并在以后使用。在某些实施方案中，在如本文所述诊断出特定疾病后不久但在任何治疗之前从患者收集样品。在进一步的实施方案中，在多种相关治疗方式之前，从受试者的血液样品或单采血液成分中分离细胞，所述治疗方式包括但不限于用例如那他珠单抗(natalizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、抗病毒剂、化学疗法、放射、免疫抑制剂(例如环孢菌素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤、麦考酚酸酯和FK506)、抗体或其它免疫消融剂，例如CAMPATH、抗CD3抗体、癌得星(cytoxan)、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素(rapamycin)、麦考酚酸、类固醇、FR901228和辐照。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导很重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人，Cell 66:807-815(1991)；Henderson等人，Immun 73:316-321(1991)；Bierer等人，Curr.Opin.Immun.5:763-773(1993))。在进一步的实施方案中，将细胞分离用于患者以及冷冻用于以后与骨髓或干细胞移植、使用化学治疗剂如氟达拉滨的T细胞消融疗法、外部-射束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体如OKT3或CAMPATH结合(例如，在所述疗法之前、与其同时或在其之后)使用。在另一实施方案中，在B细胞消融疗法如与CD20反应的剂(例如利妥昔单抗(Rituxan))之前分离细胞，并可冷冻细胞以便以后在B细胞消融疗法之后用于治疗。
在一些实施方案中，在治疗后直接从患者获得T细胞。在这方面，已经观察到在某些癌症治疗后，特别是使用损害免疫系统的药物进行治疗后，在患者通常从治疗中恢复期间的治疗后不久，所获得的T细胞的质量可能是最佳的或者其离体扩增的能力得到改进。同样，在使用本文所述的方法进行离体操作后，这些细胞可能处于用于增强植入和体内扩增的优选状态。因此，在本公开的上下文中考虑在该恢复阶段收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其它细胞。进一步地，在某些实施方案中，动员(例如，用GM-CSF的动员)和调理方案可用于在受试者中产生其中有利于特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增的条件，特别是在治疗后的限定时间窗期间。示例性细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其它细胞。
5.3.4.T细胞的激活和扩增
在一些实施方案中，在用本文所述的CAR对T细胞进行基因修饰之前或之后，T细胞通常可使用如例如6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041号美国专利和20060121005号美国专利申请公布中所述的方法进行激活和扩增。
通常，可通过将T细胞与其上附着有剂和配体的表面接触来扩增所述T细胞，所述剂刺激CD3/TCR复合物相关信号，所述配体刺激T细胞表面上的共刺激分子。特别地，T细胞群可以如本文所述进行刺激，如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或者通过与蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑素)和钙离子载体结合来进行。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适合刺激T细胞增殖的条件下，将T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD3抗体的实例包括UCHT1、OKT3、HIT3a(BioLegend，San Diego，US)，可以像本领域公知的其它方法一样使用(Graves J等人，J.Immunol.146:2102(1991)；Li B等人，Immunology 116:487(2005)；Rivollier A等人，Blood 104:4029(2004))。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besancon，法国)，可以像本领域公知的其它方法一样使用(Berg等人，Transplant Proc.30(8):3975-3977(1998)；Haanen等人，J.Exp.Med.190(9):13191328(1999)；Garland等人，J.ImmunolMeth.227(1-2):53-63(1999))。
在一些实施方案中，T细胞的主要刺激信号和共刺激信号可以由不同方案提供。例如，提供每种信号的剂可以在溶液中或与表面偶联。当与表面偶联时，所述剂可与同一个表面偶联(即，呈“顺式”形态)或与分开的表面偶联(即，呈“反式”形态)。可替代地，一种剂可以与表面偶联，而另一种剂在溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的剂与细胞表面结合，且提供初级激活信号的剂在溶液中或与表面偶联。在某些实施方案中，两种剂都可以在溶液中。在另一个实施方案中，所述剂可呈可溶形式，然后被交联至表面，诸如表达将与所述剂结合的Fc受体或抗体或其它结合剂的细胞。在这方面，关于被考虑用于在本公开中某些实施方案中激活和扩增T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，参见例如美国专利申请公布20040101519和20060034810号。
在一些实施方案中，将T细胞与剂包被的珠粒组合，随后将珠粒与细胞分离，然后培养细胞。在替代实施方案中，在培养之前，不分离剂包被的珠粒和细胞，而是将它们一起培养。在进一步的实施方案中，首先通过施加力如磁力而浓缩珠粒和细胞，从而导致细胞表面标志物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
举例来说，可通过使附着有抗CD3和抗CD28的顺磁珠(3×28个珠粒)接触T细胞来连接细胞表面蛋白。在一个实施方案中，在缓冲液，优选PBS(不含诸如钙和镁的二价阳离子)中组合细胞(例如，104至4×108个T细胞)和珠粒(例如，推荐滴度为1:100的抗CD3/CD28MACSiBead颗粒)。本领域普通技术人员可以容易地理解可以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可能非常稀少，并且仅占样品的0.01％，或者整个样品(即，100％)可能包含感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数目都在本公开的上下文的范围内。在某些实施方案中，可能需要显著减少颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用约20亿个细胞/毫升的浓度。在另一实施方案中，使用大于1亿个细胞/毫升。在进一步的实施方案中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/毫升的浓度。在又一个实施方案中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/毫升的浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/毫升的浓度。使用高浓度可以引起细胞产量增加、细胞激活和细胞扩增。进一步地，使用高细胞浓度可允许更高效地捕获可能微弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，如CD28阴性T细胞。这类细胞群可具有治疗价值并且可期望在某些实施方案中获得。例如，使用高浓度细胞允许更高效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施方案中，可将混合物培养数小时(约3小时)至约14天或介于其间的任何以小时计的整数值。在另一实施方案中，可将混合物培养21天。在一个实施方案中，将珠粒和T细胞一起培养约八天。在另一实施方案中，将珠粒和T细胞一起培养2-3天。也可能需要几个周期的刺激，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适合于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小基本培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(Lonza))，其可含有增殖和成活所必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂，如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo15和X-Vivo 20、优化剂，添加氨基酸、丙酮酸钠和维生素，不含血清或补充有适量的血清(或血浆)或确定的激素组，和/或足以使T细胞生长和扩增的量的一种或多种细胞因子。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包括在实验培养物中，而不包括在要输注到受试者中的细胞培养物中。在支持生长所需的条件，例如适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)下维持靶细胞。暴露于不同刺激时间的T细胞可表现出不同的特征。例如，典型的血液或单采的外周血单核细胞产物具有大于细胞毒性或抑制性T细胞群(TC，CD8)的辅助性T细胞群(TH，CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体对T细胞进行的离体扩增在约第8-9天之前产生主要由TH细胞组成的T细胞群，而在约第8-9天之后，T细胞群包含越来越多的TC细胞群。因此，根据治疗目的，将主要包含TH细胞的T细胞群输注给受试者可能是有利的。类似地，如果已经分离出TC细胞的抗原特异性亚组，则将该亚组扩大至更大的程度可能是有益的。
进一步地，除了CD4和CD8标志物之外，其它表型标志物也有显著差异，但在很大程度上，在细胞扩增过程中可重现。因此，这种可重现性使得能够为特定目的定制激活的T细胞产品。
5.4.多核苷酸
在某些实施方案中，本公开提供了编码本文提供的多特异性CAR的多核苷酸。本公开的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；并且可以是双链或单链(如果单链可以是编码链或非编码(反义)链)。在一些实施方案中，多核苷酸是cDNA的形式。在一些实施方案中，多核苷酸是合成多核苷酸。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:174的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:175的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:176的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:177的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:178的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:179的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:180的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:181的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:182的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:183的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:184的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:185的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ IDNO:186的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQID NO:187的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:188的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:189的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:190的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:191的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:192的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:193的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:194的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:195的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:196的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:197的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:198的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:199的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:200的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:201的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:202的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:203的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:204的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:205的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ IDNO:206的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQID NO:207的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:208的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:209的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:210的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:211的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:212的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:213的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:214的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:215的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:216的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:217的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:218的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:219的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:220的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:221的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:222的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:223的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:224的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:225的序列的CAR的序列。在示例性实施方案中，本文提供的核酸分子包含编码具有SEQ IDNO:226的序列的CAR的序列。
在具体实施方案中，本文提供了具有选自由SEQ ID NO:227-279组成的组的序列的核酸。
本公开进一步涉及本文所述的多核苷酸的变体，其中所述变体编码例如本公开的单结构域抗体或CAR的片段、类似物和/或衍生物。在某些实施方案中，本公开提供了一种多核苷酸，该多核苷酸包含具有与编码本公开的单结构域抗体或CAR的多核苷酸至少约75％同一、至少约80％同一、至少约85％同一、至少约90％同一、至少约95％同一并且在一些实施方案中至少约96％、97％、98％或99％同一的核苷酸序列的多核苷酸。如本文所用，短语“具有与参考核苷酸序列至少例如95％“同一”的核苷酸序列的多核苷酸”旨在表示该多核苷酸的核苷酸序列与参考序列是同一的，但该多核苷酸序列可包括最多五个点突变每100个参考核苷酸序列的核苷酸。换句话说，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列的多核苷酸，可以使参考序列中最多5％的核苷酸缺失或者将参考序列中最多5％的核苷酸用另一种核苷酸取代，或可以将占参考序列中总核苷酸最多5％的数目的核苷酸插入到参考序列中。参考序列的这些突变可以发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或这些末端位置之间的任何位置处，单独散布在参考序列中的核苷酸之间或散布在参考序列中的一个或多个连续基团中。
多核苷酸变体可含有位于编码区、非编码区或两者中的改变。在一些实施方案中，多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加或缺失但不改变所编码多肽的性质或活性的改变。在一些实施方案中，多核苷酸变体包含不会引起多肽的氨基酸序列发生改变(由于遗传密码的简并性)的沉默取代。可以出于多种原因产生多核苷酸变体，例如，以优化特定宿主的密码子表达(即，将人mRNA中的密码子改变为细菌宿主(如大肠杆菌)偏好的密码子)。在一些实施方案中，多核苷酸变体在序列的非编码区或编码区中包含至少一个沉默突变。
在一些实施方案中，产生多核苷酸变体以调节或改变所编码多肽的表达(或表达水平)。在一些实施方案中，生产多核苷酸变体以增加所编码多肽的表达。在一些实施方案中，生产多核苷酸变体以减少所编码多肽的表达。在一些实施方案中，与亲本多核苷酸序列相比，多核苷酸变体具有增加的所编码多肽的表达。在一些实施方案中，与亲本多核苷酸序列相比，多核苷酸变体具有减少的所编码多肽的表达。
还提供了包含本文所述的核酸分子的载体。在一个实施方案中，可以将核酸分子掺入到重组表达载体中。本公开提供了包含本公开的核酸中的任何一种核酸的重组表达载体。如本文所用，术语“重组表达载体”意指经遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，当该构建体包含编码mRNA、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列并且该载体在足以使该mRNA、蛋白质、多肽或肽在宿主细胞内表达的条件下与该细胞接触时，该构建体允许该细胞表达该mRNA、蛋白质、多肽或肽。本文所述的载体作为一个整体不是天然存在的；然而，该载体的各个部分可以是天然存在的。所描述的重组表达载体可以包含任何类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，它们可以是单链或双链的、合成的或部分从天然来源获得的，并且可以含有天然、非天然或改变的核苷酸。重组表达载体可以包含天然存在的或非天然存在的核苷酸间键，或两种类型的键。非天然存在或改变的核苷酸或核苷酸间键不阻碍载体的转录或复制。
在一个实施方案中，本公开的重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括那些设计用于繁殖和扩增或用于表达或用于这两者目的的载体，如质粒和病毒。该载体可选自由以下组成的组：pUC系列(Fermentas Life Sciences，Glen Burnie，Md.)、pBluescript系列(Stratagene，LaJolla，Calif.)、pET系列(Novagen，Madison，Wis.)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)和pEX系列(Clontech，Palo Alto，Calif.)。可以使用噬菌体载体，如λGT10、λGT11、λEMBL4和λNM1149、λZapII(Stratagene)。植物表达载体的实例包括pBI01、pBI01.2、pBI121、pBI101.3和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的实例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。重组表达载体可以是病毒载体，例如逆转录病毒载体，例如γ逆转录病毒载体。
在一个实施方案中，使用例如Sambrook等人，同上和Ausubel等人，同上中描述的标准重组DNA技术制备重组表达载体。环状或线性的表达载体构建体可以被制备成含有在原核或真核宿主细胞中起作用的复制系统。复制系统可来源于例如ColE1、SV40、2μ质粒、λ、牛乳头状瘤病毒等。
视情况而定并考虑载体是基于DNA还是基于RNA，重组表达载体可以包含调控性序列(诸如转录和翻译起始密码子和终止密码子)，该调控性序列对载体将被引入到其中的宿主类型(例如，细菌、植物、真菌或动物)有特异性。
重组表达载体可以包括一种或多种标志基因，该标志基因允许选择转化或转染的宿主。标志基因包括杀生物剂抗性，例如对抗生素、重金属等的抗性；在营养缺陷型宿主中的用于提供原养型的互补(complementation)，等等。用于所描述的表达载体的合适标志基因包括例如新霉素/G418抗性基因、组氨醇x抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。
重组表达载体可以包含与本公开的核苷酸序列可操作地连接的原生或规范启动子。启动子(例如强启动子、弱启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子和发育特异性启动子)的选择在技术人员的普通技能范围内。类似地，核苷酸序列与启动子的组合也在技术人员的技能范围内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、RSV启动子、SV40启动子或在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。
重组表达载体可被设计用于瞬时表达、用于稳定表达或用于这两者目的。此外，重组表达载体可以被制备用于组成型表达或用于诱导型表达。
进一步地，重组表达载体可以被制备成包括自杀基因。如本文所用，术语“自杀基因”是指导致表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是这样的基因，该基因赋予表达该基因的细胞对剂(例如，药物)的敏感性，并且在该细胞与该剂接触或暴露于剂时导致该细胞死亡。自杀基因是本领域中已知的，并且包括例如单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基还原酶。
在某些实施方案中，多核苷酸是经分离的。在某些实施方案中，多核苷酸是实质上纯的。
还提供了包含本文所述的核酸分子的宿主细胞。宿主细胞可以是任何含有异源核酸的细胞。异源核酸可以是载体(例如，表达载体)。例如，宿主细胞可以是来自任何生物体的细胞，该细胞以任何方式被选择、修饰、转化、生长、使用或操纵，以由该细胞产生物质，例如由该细胞表达基因、DNA或RNA序列、蛋白质或酶。可以确定适当的宿主。例如，可基于载体骨架和所需结果来选择宿主细胞。举例来说，可以将质粒或粘粒引入到原核宿主细胞中以复制几种类型的载体。细菌细胞，如但不限于DH5α、JM109和KCB、
Figure BDA0004113828030001881
感受态细胞和SOLOPACK Gold细胞，可用作用于载体复制和/或表达的宿主细胞。此外，细菌细胞如大肠杆菌LE392可用作噬菌体病毒的宿主细胞。可用作宿主细胞的真核细胞包括但不限于酵母(例如，YPH499、YPH500和YPH501)、昆虫和哺乳动物。用于载体的复制和/或表达的哺乳动物真核宿主细胞的实例包括但不限于HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、COS、Saos、PC12、SP2/0(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，Manassas，VA，CRL-1581)、NS0(欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC)，Salisbury，Wiltshire，UK，ECACC号85110503)、FO(ATCC CRL-1646)和Ag653(ATCC CRL-1580)鼠细胞系。示例性人骨髓瘤细胞系是U266(ATCC CRL-TIB-196)。其它有用的细胞系包括来源于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的细胞系，例如CHO-K1SV(Lonza Biologics，Walkersville，MD)、CHO-K1(ATCC CRL-61)或DG44。
5.5.药物组合物
一方面，本公开进一步提供了包含本公开的工程化免疫效应细胞的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的本公开的工程化免疫效应细胞和药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，本文提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的包含本文提供的CAR的治疗分子和药学上可接受的赋形剂。
在其它实施方案中，本文提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的本文提供的核酸(例如，在载体中的治疗有效量的本文提供的核酸)和药学上可接受的赋形剂(例如，适用于基因疗法的药学上可接受的赋形剂)。
在具体的实施方案中，术语“赋形剂”还可以指稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全或不完全)、载剂或媒介物。药物赋形剂可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐水溶液以及右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体赋形剂。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要的话，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等形式。Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.，Easton，PA中描述了合适的药物赋形剂的实例。这类组合物将含有防治或治疗有效量的本文提供的活性成分(诸如呈纯化形式的本文提供的活性成分)，以及合适量的赋形剂，以便提供用于适当地施用给患者的形式。制剂应适合于施用方式。
在一些实施方案中，赋形剂的选择部分地由特定细胞、结合分子和/或抗体，和/或施用方法决定。因此，有多种合适的制剂。
通常，可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲剂，包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、焦亚硫酸钠在内的抗氧化剂；防腐剂、等渗剂、稳定剂、金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；螯合剂如EDTA和/或非离子表面活性剂。
缓冲剂可被用于将pH值控制在优化治疗效果的范围内，特别是在稳定性取决于pH值的情况下。适用于本公开的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐。例如，柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、乙酸盐。另外，缓冲剂可包含组氨酸和三甲胺盐，如Tris。
可以添加防腐剂以阻止微生物生长。适用于本公开的防腐剂包括如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；卤化(例如，氯化、溴化、碘化)苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵；硫柳汞、苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚。
张力剂，有时称为“稳定剂”，可用于调节或维持组合物中液体的张力。当与大的带电荷的生物分子(如蛋白质和抗体)一起使用时，它们通常被称为“稳定剂”，因为它们可以与氨基酸侧链的带电荷的基团相互作用，从而降低分子间和分子内相互作用的可能性。示例性张力剂包括多元糖醇，三元或更高级的糖醇，如甘油、赤藓糖醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
另外的示例性赋形剂包括：(1)填充剂，(2)溶解度增强剂，(3)稳定剂和(4)防止变性或粘附到容器壁上的剂。这类赋形剂包括：多元糖醇(上面列举的)；氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌糖(myoinisitose)、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环醇(例如，肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖(例如，乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖，如棉子糖；以及多糖，如糊精或葡聚糖。
可存在非离子表面活性剂或去污剂(也称为“润湿剂”)以帮助溶解治疗剂并保护治疗性蛋白质免于搅拌诱导的聚集，这也允许制剂暴露于剪切表面应力而不会导致活性治疗性蛋白质或抗体变性。合适的非离子表面活性剂包括例如聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(184、188等)、
Figure BDA0004113828030001911
多元醇、/>
Figure BDA0004113828030001912
聚氧乙烯山梨醇单醚(
Figure BDA0004113828030001913
-20、/>
Figure BDA0004113828030001914
-80等)、聚桂醇400、硬脂酸聚烃氧40酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。可使用的阴离子去污剂包括十二烷基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子去污剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
为了将药物组合物用于体内施用，它们优选是无菌的。可以通过无菌过滤膜过滤使药物组合物无菌。通常可将本文的药物组合物放到具有无菌进入端口的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶中。
施用途径是根据已知和公认的方法，如通过单次或多次团注(bolus)或以合适的方式长时间输注，例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、病灶内或关节内途径注射或输注，外用施用，吸入，或通过持续释放或延长释放方式施用。
在另一实施方案中，药物组合物可以作为受控释放或持续释放系统提供。在一个实施方案中，可以使用泵来实现受控或持续释放(参见例如Sefton，Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201-40(1987)；Buchwald等人，Surgery 88:507-16(1980)；和Saudek等人，N.Engl.J.Med.321:569-74(1989))。在另一实施方案中，聚合材料可用于实现本文提供的防治剂或治疗剂(例如，如本文所述的融合蛋白)或组合物的受控或持续释放(参见例如，Medical Applications of Controlled Release(Langer和Wise编，1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance(Smolen和Ball编，1984)；Ranger和Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61-126(1983)；Levy等人，Science 228:190-92(1985)；During等人，Ann.Neurol.25:351-56(1989)；Howard等人，J.Neurosurg.71:105-12(1989)；美国专利号5,679,377、5,916,597、5,912,015、5,989,463和5,128,326；PCT公布号WO 99/15154和WO 99/20253)。用于持续释放制剂的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一个实施方案中，用于持续释放制剂的聚合物是惰性的，不含可浸出杂质，储存稳定，无菌且可生物降解。在又一个实施方案中，受控或持续释放系统可以放置在特定靶组织，例如鼻部通道或肺的附近，因此只需要全身剂量的一小部分(参见例如Goodson，Medical Applications of Controlled Release第2卷，115-38(1984))。例如Langer,Science 249:1527-33(1990)讨论了受控释放系统。本领域技术人员已知的任何技术都可用于产生包含一种或多种如本文所述的剂的持续释放制剂(参见例如4,526,938号美国专利；WO 91/05548和WO 96/20698号PCT公布；Ning等人，Radiotherapy&Oncology 39:179-89(1996)；Song等人，PDA J.of Pharma.Sci.&Tech.50:372-97(1995)；Cleek等人，Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-54(1997)；和Lam等人，Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-60(1997))。
本文所述的药物组合物还可以含有正在被治疗的特定适用症所必需的多于一种活性化合物或剂。可替代地或另外地，组合物可包含细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂或生长抑制剂。这类分子以有效达成预期目的的量适当地组合存在。
活性成分还可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或包埋在粗乳液中。Remington'sPharmaceutical Sciences第18版中公开了这类技术。
各种组合物和递送系统是已知的，并且可以与本文提供的治疗剂一起使用，包括但不限于包封在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达本文提供的单结构域抗体或治疗分子的重组细胞中，构建作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸等。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物含有有效治疗或预防疾病或病症的量(如治疗有效量或防治有效量)的结合分子和/或细胞。在一些实施方案中，治疗或防治功效通过对所治疗的受试者的定期评估来监测。对于几天或更长时间内的重复施用(这取决于疾患)，维持治疗直到疾病症状得到所需的抑制。然而，其它的给药方案是可用的，并且可以确定这些给药方案。
5.6.方法和用途
另一方面，本文提供了嵌合抗原受体(CAR)和/或表达该重组受体的工程化细胞的使用方法和用途。
这类方法和用途包括例如涉及以下的治疗方法和用途：对患有表达CD20、CD19和/或CD22表达或者与CD20、CD19和/或CD22表达相关并且/或者其中细胞或组织表达CD20、CD19和/或CD22的疾病、病状或病症的受试者施用所述分子、细胞或含有它们的组合物。在一些实施方案中，以有效实现所述疾病或病症的治疗的量施用所述分子、细胞和/或组合物。用途包括所述CAR和细胞在这类方法和治疗中的用途，以及在制备药物以实施这类治疗方法中的用途。在一些实施方案中，通过对患有或怀疑患有所述疾病或病状的受试者施用所述CAR或细胞或包含它们的组合物来实施所述方法。在一些实施方案中，所述方法由此治疗所述受试者的疾病或病症。
在一些实施方案中，本文提供的治疗使疾病或病症或与其相关的症状、副作用或结果或表型完全或部分改善或减轻。理想的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓和症状、缩减疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速度、改善或减缓疾病状态以及缓解或改进预后。该术语包括但不暗示疾病的完全治愈或任何症状的完全消除或对所有症状或结果的影响。
如本文所用，在一些实施方案中，本文提供的治疗延迟疾病或病症的发展，例如延缓、阻碍、减慢、阻滞、稳定、抑制和/或推迟疾病(如癌症)的发展。这种延迟可能具有不同的时间长度，这取决于病史和/或正在接受治疗的个体。正如本领域技术人员显而易见的，充分或显著的延迟实际上可涵盖预防，因为个体没有发展疾病或病症。例如，可以延迟晚期癌症，如转移的发展。在其它实施方案中，本文提供的方法或用途预防疾病或病症。
在一些实施方案中，所述疾病或病症是CD20相关的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是CD19相关的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是CD22相关的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是B细胞相关的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述B细胞恶性肿瘤是B细胞白血病或B细胞淋巴瘤。在具体的实施方案中，所述疾病或病症是边缘区淋巴瘤(例如，脾边缘区淋巴瘤)。在具体的实施方案中，所述疾病或病症是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是套细胞淋巴瘤(MCL)。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是B细胞幼淋巴细胞性白血病(B-PLL)。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是滤泡性淋巴瘤(FL)。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是伯基特淋巴瘤。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是原发性眼内淋巴瘤。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是毛细胞白血病(HCL)。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是前体B成淋巴细胞性白血病。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是高级B细胞淋巴瘤(HGBL)。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是多发性骨髓瘤(MM)。在其它实施方案中，所述疾病或病症是复发或难治性B细胞恶性肿瘤，如复发或难治性ALL(R/R ALL)。
在其它实施方案中，所述疾病或病症是自身免疫性和炎性疾病，包括例如与不适当的或增高的B细胞数目和/或激活相关的那些。
在一些实施方案中，所述方法包括过继细胞疗法，由此对受试者施用表达所提供的多特异性CAR的基因工程化细胞。这种施用可以按CD20-、CD19-和/或CD22-靶向方式促进细胞的激活(例如，T细胞激活)，使得所述疾病或病症的细胞被靶向破坏。
在一些实施方案中，所述方法包括对受试者、组织或细胞(如患有所述疾病或病症、有患所述疾病或病症的风险或怀疑患有所述疾病或病症的受试者、组织或细胞)施用所述细胞或含有所述细胞的组合物。在一些实施方案中，例如经由过继细胞疗法(如过继T细胞疗法)对患有待治疗的特定疾病或病症的受试者施用所述细胞、群体和组合物。在一些实施方案中，对所述受试者(如患有所述疾病或病症或有患所述疾病或病症的风险的受试者)施用所述细胞或组合物。在一些实施方案中，所述方法由此治疗，例如改善所述疾病或病症的一种或多种症状，如通过减轻表达CD20、CD19和/或CD22的癌症中的肿瘤负荷来治疗，例如改善所述疾病或病症的一种或多种症状。
用于过继细胞疗法的细胞的施用方法是已知的，如例如以下文献中所描述：美国专利申请公布号2003/0170238；美国专利号4,690,915；Rosenberg，Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85(2011)；Themeli等人，Nat Biotechnol.31(10):928-933(2013)；Tsukahara等人，Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9(2013)；和Davila等人，PLoS ONE 8(4):e61338(2013)。这些方法可以与本文提供的方法和组合物结合使用。
在一些实施方案中，通过自体转移进行细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)，其中从要接受细胞疗法的受试者或从来源于这种受试者的样品分离和/或以其他方式制备细胞。因此，在一些方面，该细胞来源于需要治疗的受试者，并且该细胞在分离和加工之后被施用给同一受试者。在其它实施方案中，通过同种异体转移进行细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)，其中从要接受或最终接受细胞疗法的受试者(例如，第一受试者)以外的受试者分离和/或以其它方式制备细胞。在这类实施方案中，然后对同一物种的不同受试者(例如，第二受试者)施用该细胞。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是类似的。在一些实施方案中，第二受试者表达与第一受试者相同的HLA类别或超类型。
在一些实施方案中，施用所述细胞、细胞群或组合物的受试者是灵长类动物，如人。受试者可以是男性或女性，并且可以是任意合适年龄的，包括婴儿、少年、青少年、成年和老年受试者。在一些实施例中，受试者是用于疾病、过继细胞疗法和/或用于评估毒性结果的经过验证的动物模型。
本文提供的组合物可通过任何合适的方式，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、结膜下注射(subconjectval injection)、结膜下注射、眼球筋膜下注射(sub-Tenon's injection)、眼球后注射、眼球周注射或后巩膜旁递送来施用。在一些实施方案中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内施用，并且如果需要局部治疗，则通过病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。
可通过标准临床技术确定本文提供的防治或治疗剂的有效预防和/或治疗疾病或病状的量。可以由来源于体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线来外推有效剂量。对于疾病的预防或治疗，结合分子或细胞的适当剂量可取决于要治疗的疾病或病症的类型、结合分子的类型、疾病或病症的严重程度和病程、施用治疗剂是出于预防目的还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床病史和对剂的反应以及主治医师的判断。在一些实施方案中，一次或经一系列治疗将所述组合物、分子和细胞合适地施用给患者。可以间歇地施用多个剂量。可以施用初始较高的负载剂量，接着是一个或多个较低的剂量。
在含有结合分子的基因工程化细胞的背景下，在一些实施方案中，受试者可被施用约一百万至约1000亿个细胞和/或该量的细胞/千克体重。在其中药物组合物包含本文所述的工程化免疫细胞中的任何一种工程化免疫细胞的一些实施方案中，药物组合物以至少约104、105、106、107、108或109个细胞/kg个体体重中的任一者的剂量施用。剂量可根据疾病或病症和/或患者和/或其它治疗的特定属性而变化。
在一些实施方案中，单次施用药物组合物。在一些实施方案中，多次施用药物组合物(如2、3、4、5、6次或更多次中的任一者)。在一些实施方案中，在给药周期中一次或多次施用药物组合物。给药周期可以是例如1、2、3、4、5周或更多周，或者1、2、3、4、5个月或更多个月。医学领域的技术人员可以通过监测患者的疾病体征并相应地调整治疗来确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。
在一些实施方案中，本文提供的组合物作为组合治疗的一部分施用，如与另一种治疗干预(如另一种抗体或工程化细胞或受体或剂，如细胞毒性剂或治疗剂)同时或按任何顺序依次施用。
在一些实施方案中，本文提供的组合物与一种或多种另外的治疗剂一起地或与另一种治疗干预相结合地同时或按任何顺序依次共同施用。在一些情形下，所述细胞与另一种疗法在时间上足够靠近地共同施用，使得细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的效果，反之亦然。在一些实施方案中，本文提供的组合物在所述一种或多种另外的治疗剂之前施用。在一些实施方案中，本文提供的组合物在所述一种或多种另外的治疗剂之后施用。
在某些实施方案中，一旦对哺乳动物(例如，人)施用所述细胞，则通过多种已知方法中的任何一种已知方法测量工程化细胞群和/或结合分子的生物活性。用于评估的参数包括工程化或天然T细胞或其它免疫细胞与抗原在体内(例如，通过成像)或离体(例如，通过ELIS A或流式细胞术)的特异性结合。在某些实施方案中，可使用本领域中已知的任何合适的方法(如在例如Kochenderfer等人，J.Immunoth erapy,32(7):689-702(2009)和Herman等人J.Immunological Metho ds,285(1):25-40(2004)中描述的细胞毒性测定法)来测量工程化细胞破坏靶细胞的能力。在某些实施方案中，还可以通过测定某些细胞因子如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF的表达和/或分泌来测量所述细胞的生物活性。在一些方面，通过评估临床结果如肿瘤负担或负荷的减少来测量生物活性。
在某些具体实施方案中，本文提供了治疗疾病或病症的方法，其包括向受试者施用如5.3节中提供的工程化免疫效应细胞(如T细胞)，包括例如包含5.2节中提供的CAR的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用的工程化免疫细胞包含CAR，所述CAR包含有包含以下的多肽：(a)包含抗CD20 sdAb、抗CD19 sdAb和抗CD22 sdAb中的至少两者(例如，所有三者)的细胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)细胞内信号传导结构域，其中所述抗CD20sdAb、所述抗CD19sdAb和所述抗CD22 sdAb如上文5.2.1节中所描述，包括例如具有表2中的CDR的那些。在一些实施方案中，向受试者施用的工程化免疫细胞包含表4-7、9和12中列出的CAR。在其它实施方案中，向受试者施用的工程化免疫细胞包含具有表4-7、9和12中所列出的CAR的CDR的CAR。在其它实施方案中，向受试者施用的工程化免疫细胞包含CAR，所述CAR包含选自SEQ ID NO:174-226的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:174-226的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述疾病或病症是CD20相关的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是CD19相关的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是CD22相关的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是B细胞相关的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述B细胞恶性肿瘤是B细胞白血病或B细胞淋巴瘤。在具体的实施方案中，所述疾病或病症是边缘区淋巴瘤(例如，脾边缘区淋巴瘤)。在具体的实施方案中，所述疾病或病症是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是套细胞淋巴瘤(MCL)。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是B细胞幼淋巴细胞性白血病(B-PLL)。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是滤泡性淋巴瘤(FL)。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是伯基特淋巴瘤。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是原发性眼内淋巴瘤。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是毛细胞白血病(HCL)。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是前体B成淋巴细胞性白血病。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是高级B细胞淋巴瘤(HGBL)。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症是多发性骨髓瘤(MM)。在其它实施方案中，所述疾病或病症是复发或难治性B细胞恶性肿瘤，如复发或难治性ALL(R/R ALL)。在其它实施方案中，所述疾病或病症是自身免疫性和炎性疾病，包括例如与不适当的或增高的B细胞数目和/或激活相关的那些。
在一些实施方案中，本文提供了治疗疾病或病症的方法，其包括向受试者施用表达CAR的工程化免疫效应细胞，所述CAR包含抗CD20 sdAb、抗CD19 sdAb和抗CD22 sdAb，其中的每一者均选自上文5.2.1节中所描述的相应sdAb，并且在所述三种sdAb之中，抗CD20sdAb最靠近所述CAR的跨膜结构域，且其中所述疾病或病症包含表达比CD19或CD22更高水平的CD20的细胞(例如，癌细胞)。
在其它实施方案中，本文提供了治疗疾病或病症的方法，其包括向受试者施用表达CAR的工程化免疫效应细胞，所述CAR包含抗CD20 sdAb、抗CD19 sdAb和抗CD22 sdAb，其中的每一者均选自上文5.2.1节中所描述的相应sdAb，并且在所述三种sdAb之中，抗CD19sdAb最靠近所述CAR的跨膜结构域，且其中所述疾病或病症包含表达比CD20或CD22更高水平的CD19的细胞(例如，癌细胞)。
在又其它实施方案中，本文提供了治疗疾病或病症的方法，其包括向受试者施用表达CAR的工程化免疫效应细胞，所述CAR包含抗CD20 sdAb、抗CD19 sdAb和抗CD22 sdAb，其中的每一者均选自上文5.2.1节中所描述的相应sdAb，并且在所述三种sdAb之中，抗CD22sdAb最靠近所述CAR的跨膜结构域，且其中所述疾病或病症包含表达比CD20或CD19更高水平的CD22的细胞(例如，癌细胞)。
在某些实施方案中，本文提供的方法包括同时或依次施用两种或更多种本文提供的CAR-T细胞，例如，如由细胞表面抗原表达水平所指导。
另一方面，本文提供了利用具有以最适合于特定受试者的顺序排列的CD19、CD20和CD22结合VHH结构域的定制CAR-T的个性化CAR-T疗法。例如，在一些实施方案中，本文提供的方法包括从受试者获得癌症样品的步骤以及确定CD19、CD20和CD22的水平的步骤，基于所述CD19、CD20和CD22的水平，向受试者施用表达具有以特定顺序排列的CD19、CD20和CD22结合VHH结构域的CAR的CAR-T。所述方法还可以包括在整个治疗过程中连续监测这些抗原的表达水平并相应地调整治疗。
5.7.试剂盒和制品
进一步提供了包含本文所述的嵌合抗原受体或工程化免疫效应细胞中的任一者的试剂盒、单位剂量和制品。在一些实施方案中，提供了一种试剂盒，该试剂盒含有本文所述的药物组合物中的任何一种药物组合物，并优选提供了它的使用说明书。
本申请的试剂盒采用合适的包装。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、软包装(例如，密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。试剂盒可任选提供另外的组成部分，如缓冲剂和解释性信息。本申请因此还提供了制品，该制品包括小瓶(如密封小瓶)、瓶子、广口瓶、软包装等。
制品可包括容器和位于容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。所述容器可由诸如玻璃或塑料的各种材料制成。通常，容器装有有效治疗本文所述的疾病或病症(如癌症)的组合物，并且可具有无菌进入端口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装插页指示组合物用于治疗个体的特定病状。标签或包装插页将进一步包括对个体施用组合物的说明。标签可指示关于重构和/或使用的指导。容纳药物组合物的容器可以是多用途小瓶，该小瓶允许经重构制剂的重复施用(例如2-6次施用)。包装插页是指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，该说明书含有关于使用这类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。此外，制品可进一步包括第二容器，该第二容器包含药学上可接受的缓冲液，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。制品可进一步包括在商业和使用者看来所需的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
试剂盒或制品可包括多个单位剂量的药物组合物和使用说明书，其以足以在药房例如医院药房和配制药房中储存和使用的量包装。
为了简明起见，本文使用某些缩写。一个实例是代表氨基酸残基的单字母缩写。氨基酸及其相应的三字母和单字母缩写如下：
氨基酸 三字母 单字母 氨基酸 三字母 单字母
丙氨酸 Ala (A) 亮氨酸 Leu (L)
精氨酸 Arg (R) 赖氨酸 Lys (K)
天冬酰胺 Asn (N) 甲硫氨酸 Met (M)
天冬氨酸 Asp (D) 苯丙氨酸 Phe (F)
半胱氨酸 Cys (C) 脯氨酸 Pro (P)
谷氨酸 Glu (E) 丝氨酸 Ser (S)
谷氨酰胺 Gln (Q) 苏氨酸 Thr (T)
甘氨酸 Gly (G) 色氨酸 Trp (W)
组氨酸 His (H) 酪氨酸 Tyr (Y)
异亮氨酸 Ile (I) 缬氨酸 Val (V)
本公开在本文中通常使用肯定性语言来描述众多实施方案来公开。本公开还具体包括全部或部分排除特定主题，例如物质或材料、方法步骤和条件、方案、程序、测定或分析的实施方案。因此，即使本公开在本文中通常未根据本公开不包括的内容来表达，但未明确包括在本公开中的方面仍然在本文中公开。
已经描述了本公开的多个实施方案。然而，将要理解的是，在不脱离本公开的实质和范围的情况下可以进行各种修改。因此，以下实施例旨在说明但不限制权利要求中描述的公开范围。
6.实施例
以下是对研究中使用的各种方法和材料的描述，并且是为了为本领域普通技术人员提供如何进行和使用本公开的完整公开和描述而提供的，并且不旨在限制发明人认为是其公开的范围，也不旨在表示执行了以下实验以及以下实验是可以执行的所有实验。要理解的是，不一定执行以现在时态撰写的示例性描述，而是可以执行这些描述以产生与本公开的教导相关联的数据等。已经努力确保关于所使用的数值(例如，量、百分比等)的准确性，但要考虑一些实验误差和偏差。
6.1.实施例1—抗CD20、抗CD19和抗CD22 VHH的制备
为了开发对CD19、CD20和CD22抗原具有高结合亲和力的VHH，分别用表达人CD19、CD20或CD22蛋白或CD19、CD20或CD22单抗原的细胞系免疫骆驼科动物。然后构建噬菌体展示文库以鉴定VHH前导序列。结合后挑选出不同的克隆，并根据VHH互补决定区(CDR)(特别是扩大抗原识别谱系和结合的CDR3)对该克隆进行分类。
下面描述产生抗CD22 VHH的过程作为产生针对每种抗原的VHH的实例。采用与如下所述类似的过程执行抗CD19 VHH和抗CD20 VHH的产生。已经描述了制备单结构域抗体的其它方案。参见例如Els Pardon等人，Nature Protocol，9(3):674(2014)。
6.1.1.细胞系构建
K562.huCD22.Luc细胞系是按照下文简述的方法在内部开发的。合成人CD22编码序列(NM_001771.3)，并将其亚克隆到EcoRI与BamHI限制性位点之间的pLVX-puro(Clontech，目录号632164)以获得质粒pLVX-huCD22.Luc.Puro。通过用含有psPAX2、pMD.2G和pLVX-huCD22.Luc.Puro的质粒的混合物瞬时转染Lenti-X 293T宿主细胞来包装慢病毒。通过用100μL的LV-huCD22.Luc.PuroR慢病毒感染来转导0.5×106个K562细胞(ATCC#CRL-243)。通过每2-3天给细胞培养物补充嘌呤霉素选择培养基(RPMI1640、10％FBS和5μg/mL嘌呤霉素)来选择转导的细胞。3轮选择后，通过离心收获细胞池。将收获的细胞等分并冷冻保存，以备进一步使用。
使用缀合有PE缀合的抗人CD22抗体(Miltenyi Biotec，目录号130-105-086)，通过流式细胞术验证人CD22在K562.huCD22.Luc细胞系上的表达水平。简言之，将2×105个K562.huCD22.Luc细胞或K562细胞与缀合有PE的抗人CD22抗体一起在4℃下温育30分钟，接着洗涤三次，并重悬于200μL含0.5％FBS的DPBS中以用于在Attune NXT流式细胞仪(ThermoFisher)上进行FACS分析，以检测人CD22抗原的表达水平。K562.huCD22.Luc的平均荧光强度(MFI)比K562细胞(阴性对照)高641.59倍。
6.1.2.动物免疫和免疫反应测试
以两周间隔将一头成年雄性骆驼(双峰驼Camelus bactrian))用人CD22蛋白(ACRO，目录号CD2-H52H8)皮下免疫五次。在免疫前日(Pre)和最后一次免疫日(TB)采集血液。通过ELISA评估骆驼的免疫反应，其中测试血清样品与固定抗原之间的结合。在向动物注射CD22抗原后诱导了强烈的免疫反应，血清滴度达到>1:729k。数据表明抗体滴度随着CD22抗原免疫显著增加。
在最后一次免疫后三至五天，从颈静脉采集100mL血液作为生产性放血(production bleed)。根据淋巴细胞制备(lymphoprep)程序从血液中分离外周血淋巴细胞(PBL)。
6.1.3.抗体噬菌体文库构建
根据制造商的说明使用
Figure BDA0004113828030002051
试剂(Thermofisher，目录号15596026)从分离的淋巴细胞中提取总RNA，并使用PrimeScriptTM第1链cDNA合成试剂盒(Takara，目录号6110A)根据制造商的方案，用寡(dT)20引物将该总RNA逆转录成cDNA。正向和反向特异性简并引物(参见中国专利CN105555310B)被设计用于扩增引入了两个SfiI限制性位点的VHH片段。通过使用两步聚合酶链式反应(PCR)扩增VHH片段，并将第二PCR产物用SfiI消化并用凝胶纯化，然后插入到噬菌粒载体-pFL249中，将该噬菌粒载体-pFL249电转移到大肠杆菌细胞中以产生噬菌体展示VHH免疫文库。
将一小部分转化的细胞稀释，并在补充有100μg/mL氨苄青霉素的2×YT板上画线。对菌落进行计数以计算文库大小。随机挑选阳性克隆并对该阳性克隆进行测序以评估文库的质量。将剩余的转化细胞画线到补充有100μg/mL氨苄青霉素和2％葡萄糖的245-mm平方的2×YT-琼脂培养皿上。从培养皿上刮下菌苔。将一小等份细胞用于文库质粒分离。在剩余部分中补加甘油，并将该剩余部分作为储备液在-80℃下储存。
6.1.4.噬菌体展示淘选
在用辅助噬菌体感染后，产生了在表面上展示VHH结构域作为基因III融合蛋白的重组噬菌体颗粒。根据标准方法制备噬菌体颗粒，并将该噬菌体颗粒在4℃下过滤灭菌后储存用于进一步研究。
噬菌体文库被用于不同的淘选策略。在第一轮和第二轮淘选中，将生物素化人CD22抗原(用Sulfo-NHS-LC-Biotin试剂盒标记的生物素)与噬菌体文库一起温育，并随后捕获在Streptavidin Dynabeads(Invitogen)上。接着进行充分洗涤，用三乙胺洗脱结合的噬菌体。两轮淘选后，观察到噬菌体富集。
6.1.5.ELISA筛选
接种单个文库克隆，并诱导该单个文库克隆在96孔深孔板中表达。进行ELISA筛选以筛选特异性识别人CD22抗原的VHH克隆。
为了鉴定与单一抗原特异性细胞系结合的VHH克隆，将K562.huCD22.Luc和K562.Luc细胞用3％BSA缓冲液在室温下封闭1小时。从输出文库中随机挑选单个克隆，并将其在96孔深孔板中培养。当细菌培养物的OD600达到0.6-0.8之内时，添加IPTG，以便过夜诱导表达。通过离心收获细菌，并将该细菌接种到微孔板中。选择本公开的示例性抗CD22 VHH结构域并对其进行测序。
使用上述方法获得抗CD19和抗CD20 VHH。示例性VHH的VHH序列汇总在表2和本文提供的序列表中。
6.2.实施例2—CAR的构建及其在免疫细胞中的表达
6.2.1.CAR的构建
化学合成编码从N-末端到C-末端包含CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、CD137细胞质结构域和CD3ζ细胞质结构域的CAR主链多肽的核酸序列，并将该核酸序列克隆到下游的预修饰慢病毒载体中，并与hEF1α启动子可操作地连接。该载体中的多克隆位点(MCS)允许插入包含Kozak序列(GCCGCCACC(SEQ ID NO:166)的核酸序列，且上游与CAR主链序列可操作地连接，所述Kozak序列与编码与一个或多个VHH结构域的N-末端融合的CD8α信号肽的核酸序列可操作地连接)。
为了使用CAR主链载体构建多特异性VHH CAR，将编码经由一个或多个肽接头彼此融合的多个不同的VHH结构域的核酸序列与编码CD8α信号肽的核酸序列的3'可操作地连接。可以通过将来自CD19 VHH结构域之一、CD20 VHH结构域之一或CD22 VHH结构域之一(包括各种VHH顺序和组合)的两个VHH结构域与一系列甘氨酸-丝氨酸肽接头((G4S)n)融合来制备双特异性VHH CAR构建体。通过将来自抗CD19 VHH结构域之一、抗CD20 VHH结构域之一和抗CD22 VHH结构域之一(包括各种VHH顺序和组合)的三个VHH结构域与一系列甘氨酸-丝氨酸肽接头((G4S)n)融合来制备三特异性VH H CAR(AIO CAR)构建体。化学合成与Kozak-CD8α信号肽核酸序列组合的融合核酸序列，并将该融合核酸序列通过本领域中已知的分子克隆技术经由EcoRI(5'-GAATTC-3'(SEQ ID NO:167))和SpeI(5'-ACTAGT-3'(SEQ ID NO:168))限制性位点克隆到CAR主链中。还使用CAR主链构建了具有表2中所示的VHH的单特异性CAR。此外，也分别将抗CD19 scFv(FMC63 scFv(SEQ ID NO:280))、抗CD20 scFv(Leu16scFv(SEQ ID NO:281))和抗CD22 scFv(m971scFv(SEQ ID NO:282))克隆到CAR主链中，以作为阳性对照。
示例性双特异性骆驼科CD19×CD20 VHH CAR、CD19×CD22VHH CAR、CD20×CD22VHH CAR构建体(包括各种VHH顺序)和三特异性骆驼科CD19×CD20×CD22 VHH CAR(AIOCAR)构建体(包括各种VHH顺序)列于表4-7和9中。
表9.示例性多特异性骆驼科VHH CAR
Figure BDA0004113828030002071
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Figure BDA0004113828030002081
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Figure BDA0004113828030002091
注：
1表9中的构建体中使用的接头是(GGGGS)n，n是包括例如1、2、3、4、5和6的整数(SEQID NO:147)，其中在接头X1中，n＝1；在接头X2中，n＝2；在接头X3中，n＝3；在接头X4中，n＝4；并且在接头X5中，n＝5。
2CT SD代表共刺激信号传导结构域。
3PI SD代表初级细胞内信号传导结构域。
上述多特异性VHH CAR的核酸序列示于序列表中的SEQ ID NO:227-259中。在这些示例性CAR构建体中，CD8α信号肽、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、CD137细胞质结构域和CD3ζ细胞质结构域的序列分别示于SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163、SEQID NO:164和SEQ ID NO:165中。
6.2.2.慢病毒载体的包装
将含有pMDLg.pRRE(Addgene，目录号12251)、pRSV-REV(Addgene，目录号12253)和pMD2.G(Addgene，目录号12259)的慢病毒包装质粒混合物与表达CAR构建体的载体以预优化比率与聚醚酰亚胺(PEI)预混合。将转染混合物滴加到HEK293T细胞中并轻轻混合，接着在6-8小时后更换培养基。在48小时和72小时时收集含有病毒的上清液，然后将其在3000g、4℃下离心10分钟。慢病毒浓缩后，小心弃去上清液，并用D10培养基(DMEM、10％FBS、1mM丙酮酸钠和2mM L-谷氨酰胺)重悬病毒颗粒。将收获的病毒等分，并立即在-80℃下储存。通过CHO哺乳动物细胞转导效率评估和测定病毒滴度。VHH CAR的LV滴度达到0.8×108～4×108的范围内。
6.2.3.T细胞分离和激活
从健康供体中收集人PBMC。使用Miltenyi Pan T细胞分离试剂盒(目录号130-096-535)，根据如下所述的制造商方案从PBMC中纯化人T细胞。计数细胞数目，并将细胞悬浮液在4℃下以300g离心10分钟。然后吸出上清液，并将细胞团块重悬于每107个总细胞40μL的缓冲液中。每107个总细胞添加10μL的Pan T细胞生物素-抗体混合液，充分混合，并在4℃下温育5分钟。然后每107个总细胞添加30μL缓冲液。每107个细胞添加20μL的Pan T细胞微珠混合液。将细胞悬浮液混合物充分混合，并在4℃下再温育10分钟。磁分离需要500μL的最小体积(vol.)。在磁分离中，将LS柱置于合适的MACS分离器的磁场中。将LS柱用3mL缓冲液冲洗。将细胞悬浮液施加到柱上，收集含有未标记的细胞的流出物，其代表富集的T细胞级分。通过用3mL缓冲液洗涤柱并收获通过的未标记的细胞来收集另外的T细胞。这些未标记的细胞再次代表了富集的T细胞，并将这些未标记的细胞与来自前一步骤的流出物组合在一起。然后将汇集的富集T细胞离心，并用T细胞培养基(RPMI1640、10％热灭活胎牛血清(FBS)和300IU/mL的IL-2)重悬。根据制造商的方案，通过在T细胞培养基中添加抗CD3/CD28MACSiBead颗粒(Miltenyi，目录号130-111-160)来激活新鲜分离的T细胞。
6.2.4.三特异性骆驼科VHH CAR-T细胞的产生
基于通过体外和体内研究对数百种新型骆驼科CD19 VHH CAR-T细胞、CD20 VHHCAR-T细胞和CD22 VHH CAR-T细胞的广泛筛选和验证以及抗CD19 VHH-huIgG1Fc mAb、抗CD20VHH-huIgG1Fc mAb和抗CD22 VHH-huIgG1Fc mAb的单克隆抗体表征，以各种VHH顺序/组合选择、设计和构建针对CD19、CD20或CD22抗原的顶端骆驼科VHH前导序列，以便在人原代T细胞中通过慢病毒转导产生多特异性骆驼科VHH CAR-T细胞以用于通过体外和体内研究进行功效和安全性评估。示例性多特异性VHH CAR(包括AIO CAR)构建体示于表9中。还产生了骆驼科单特异性VHH CAR-T细胞、CD19 scFv CAR-T细胞、CD20 scFv CAR-T细胞和CD22scFv CAR-T细胞作为对照。
在24孔板的每孔0.5mL培养基中以0.5×106个细胞培养激活的T细胞。24小时后，当T细胞爆破时，添加0.5mL非浓缩或较小体积浓缩的病毒上清液；通过在32℃下以1200g离心1.5小时来以10或15的感染复数(MOI)转导T细胞。然后将转导的T细胞转移到细胞培养物温育箱中以用于在合适的条件下进行转基因表达。T细胞开始以对数生长模式分裂，这通过测量细胞数目(能成活的细胞/每mL)和成活率(％)来进行监测。每两天给T细胞培养物补充新鲜培养基。随着T细胞在近似7-9天后开始静息，它们就准备好了被收获并被冷冻保存以供以后分析。
在冷冻保存之前，通过流式细胞术分析确定转导的细胞(在T细胞表面上表达一个或多个VHH结构域或scFv结构域)的百分比。将T细胞用LIVE/DEADTM可固定死细胞染色试剂盒(Invitrogen，目录号L34976)染色，将基于VHH的CAR-T细胞用山羊抗美洲驼IgG FITC缀合物(Bethyl，目录号A160-100F)染色，并将基于scFv的CAR-T细胞(阳性对照)用FITC标记的重组蛋白L(Acro，目录号RPL-PF141)在4℃下染色30分钟，接着洗涤三次，并重悬于200μL含0.5％FBS的DPBS中，以用于在NovoCyte流式细胞仪(ACEA Biosciences)上进行FACS分析。通过Novoexpress软件分析FACS数据。
在8天的培养中，示例性单特异性骆驼科VHH CAR-T细胞的成活率为约92％～96％，CAR+％为约37％～42％，且细胞扩增倍数在75～83倍以内。在8天的培养中，示例性三特异性骆驼科VHH CAR-T细胞的成活率为约92％～96％，CAR+％为约7％～32％，且细胞扩增倍数在75～92倍以内(图1A-1B)。数据表明，当与未转导的T细胞(UnT)相比时，三特异性VHH CAR与单特异性VHH CAR相比对T细胞的增殖和扩增能力没有可检测的负面影响，如表10中所示。
转导的T细胞表现出不同的CAR表达水平(％)，且三特异性VHH CAR阳性率(CAR+％)通常低于单特异性VHH CAR+％和单特异性scFv CAR+％，表明转导效率(转导的细胞百分比)可能与CAR的结构和长度相关。
表10.示例性VHH CAR-T细胞的CAR表达水平和细胞扩增倍数
Figure BDA0004113828030002121
Figure BDA0004113828030002131
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6.3.实施例3—体外表达CAR的免疫细胞的表征
6.3.1.CD19、CD20和/或CD22抗原在靶细胞表面上的表达
为了评价CD19、CD20和CD22在所评估的靶细胞表面上的表达水平，将每孔5×105个细胞分别与PE标记的抗CD19、抗CD20或抗CD22 mAb(BioLegend，目录号302208、302306或302506)一起温育，并用QUANTI-BRITE PE珠(BD Bioscience，目录号340495)通过流式细胞术进行评估。按照制造商的说明进行测定和数据分析。“每个细胞的受体数”表示指示的细胞系中的每一个细胞系上每个细胞的受体的近似绝对数目(表11)。
表11.每个靶细胞的CD19、CD20和CD22受体数目
Figure BDA0004113828030002132
Figure BDA0004113828030002141
6.3.2.三特异性VHH CAR-T细胞的功效评价
为了评估三特异性VHH CAR-T细胞(或AIO CAR-T细胞)对肿瘤细胞的细胞毒性，对如上所述的那样产生的细胞进行计数，并将该细胞与抗原特异性癌细胞共培养以读出杀伤效力。亲本单特异性骆驼科VHH CAR-T细胞、CD19 scFv CAR-T细胞、CD20 scFv CAR-T细胞和/或CD22 scFv CAR-T细胞用作阳性对照。将未转导的T细胞(UnT)用作非靶向性T细胞对照。对表达CD19+CD20+CD22+三阳性抗原的B淋巴瘤细胞系-Raji(ATCC号CCL-86)和Daudi(ATCC号CCL-213)、表达CD19+CD20-CD22低双阳性抗原的B白血病细胞系Nalm.6(ATCC号CRL-3273)、表达单抗原的细胞系-K562-CD19、K562-CD20或K562-CD22，和阴性细胞系-K562(ATCC号CCL-243)进行三特异性VHH CAR-T细胞杀伤。所有细胞系都在内部被工程化成表达作为细胞成活/杀伤的报告子的萤火虫荧光素酶。用嘌呤霉素选择转导的细胞，并且每2-3天用选择培养基(补加有10％FBS和2μg/mL嘌呤霉素的伊格尔最低必需培养基)进行更新。在三轮选择后，收获选择的细胞克隆，并将其保存以供进一步使用。以效应细胞与靶细胞比率为20:1、15:1、10:1、5:1、2.5:1、1.25:1、0.625:1或0.3125:1持续24小时测量三特异性VHH CAR-T细胞的细胞毒性。通过将相应数目的T细胞与恒定数目的靶细胞混合来启动测定。通过ONE-Glo萤光素酶测定(Promega，目录号E6110)评估每孔剩余的荧光素酶活性，以定量每孔剩余的能成活的靶细胞。在三特异性VHH CAR中构建抗CD19 VHH、抗CD20 VHH和抗CD22 VHH连同(G4S)n接头(n＝1～4)的顶端前导序列(top lead)的各种顺序/组合，并产生三特异性VHH CAR-T细胞，并利用体外细胞毒性测定对该细胞进行筛选。
示例性三特异性VHH AIO CAR-T细胞的数据示于图2A-2K中。AIO CAR-T细胞用编码一个CAR开放阅读框的慢病毒载体进行工程化，并由串联的CD19、CD20和CD22靶向结合剂组成。评价了抗CD19 VHH、抗CD20 VHH和抗CD22 VHH结构域的多种组合，并在体外鉴定了能强效地杀伤淋巴瘤和白血病肿瘤细胞的最佳AIO CAR-T细胞。就三个串联VHH结构域的共同效应(co-effect)而言，数据显示一些AIO CAR-T细胞对CD19+CD20+CD22+淋巴瘤细胞系-Raji.Luc和Daudi.Luc表现出协同效应和优于阳性对照(单VHH CAR-T细胞或单scFv CAR-T细胞)的抗肿瘤效力，并且表现出剂量依赖性杀伤能力(图2A、图2G、图2H和图2J)。一些AIOCAR-T细胞对CD19+CD20-CD22低白血病细胞系-Nalm.6.Luc表现出较高的细胞毒性(图2B、图2I和图2K)。在靶向表达单抗原的细胞-K562-CD19.Luc、K562-CD20.Luc或K562-CD22.Luc时，一些AIO CAR-T细胞增强或维持效力，并证实了单一靶抗原足以引发肿瘤细胞裂解(图2C-2E)。基于对表达三阳性或双阳性抗原的细胞的协同效应和对表达单抗原的细胞的维持效力，表明串联VHH结构域中的每一个均折叠并在T细胞表面上表达，与不同的表位结合，彼此不阻断，并且没有干扰与CD19、CD20和CD22抗原的结合的空间位阻效应。图2A和2B的示例性数据显示，连接每个VHH的(G4S)接头的长度越短，AIO CAR-T细胞杀伤中靶肿瘤细胞的效力越高。这一观察结果表明，接头长度对T细胞效应子功能具有有益的影响。图2G和2I的示例性数据显示，在相同的接头长度下，三特异性VHH结构域的不同组合显示出针对淋巴瘤和白血病细胞-Raji.Luc、Daudi.Luc或Nalm.6.Luc细胞系的不同杀伤效力。基于接头长度和三VHH组合的结果，但不受任何理论的束缚，杀伤效力的差异可能与突触形成的间隔和CAR-T细胞与肿瘤细胞之间的距离相关。免疫突触(IS)是淋巴细胞(例如，效应T细胞)经由与APC或肿瘤细胞的细胞-细胞相互作用进行沟通的核心作用机制。肿瘤靶标接合导致CD8+T细胞经一段时间分化并激活成抗原特异性杀伤T细胞，该细胞负载有充满细胞因子、颗粒酶和穿孔素的颗粒。如所预期的，与UnT对照相比，三特异性VHH AIO CAR-T细胞和单特异性VHHCAR-T细胞缺乏对阴性细胞系-K562.Luc的杀伤效力(图2F)，这是由于在K562.Luc细胞的表面上缺乏可靶向的抗原。
上述观察结果表明，三特异性VHH CAR经由特异性识别靶向性细胞上的CD19、CD20和/或CD22抗原诱导T细胞激活，激活T细胞内源性信号传导通路，诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活，并增强协同抗肿瘤反应。
6.3.3.三特异性VHH CAR-T细胞的IFN-γ释放评价
为了测量响应于表达CD19、CD20和CD22抗原的细胞的三特异性VHH CAR-T细胞的细胞因子产生，将CAR-T细胞与表达CD19+CD20+CD22+三阳性抗原的B淋巴瘤细胞系-Raji(ATCC号CCL-86)和阴性细胞系-K562(ATCC号CCL-243)以E:T比率为5:1或2.5:1共培养24小时，之后收获培养基以用于使用人IFN-γ试剂盒(Cisbio，目录号62HIFNGPEG)进行细胞因子释放定量和分析，并通过多模式微板读取器(Tecan Spark)读取每个孔的吸光度(每个测试制品重复三次)。
图3A的示例性数据显示，对于三特异性VHH结构域的相同组合，连接每个VHH的(G4S)接头的长度越短，AIO CAR-T细胞释放的IFN-γ就越多。图3A和3B的示例性数据显示，IFN-γ释放的水平与AIO CAR-T细胞的杀伤效力一致。
相比之下，在与未转导的T细胞(UnT)对照或靶阴性细胞系-K562.Luc的共培养中，IFN-γ释放检测不到或极低(图3A)。AIO CAR-T细胞缺乏IFN-γ释放与没有K562.Luc的杀伤一致(图3B)，这表明经一种或多种特异性抗原刺激的CAR-T细胞激活是三特异性VHH CAR-T细胞的中靶杀伤和一种或多种细胞因子分泌所需的。数据显示，VHH顺序相同的情况下，(G4S)接头越短，AIO CAR-T细胞释放的IFN-γ就越多。IFN-γ释放的趋势与具有不同(G4S)接头的AIO CAR-T细胞的细胞毒性一致。例如，VHH顺序相同的情况下，具有一个(G4S)单元接头(n＝1)的AIO-8C1 CAR-T细胞比具有三个(G4S)单元接头(n＝3)的AIO-8C3 CAR-T细胞释放更多的IFN-γ，且AIO-8C3CAR-T细胞比具有四个(G4S)单元接头(n＝4)的AIO-8C4 CAR-T释放更多的IFN-γ(图3)。同时，在(G4S)n接头相同的情况下，具有不同VHH顺序的AIO CAR-T细胞释放的IFN-γ水平显著不同，示例性数据显示，与由其中抗CD20 VHH结构域远离T细胞膜的AIO-7C1CAR-T细胞释放的IFN-γ相比，其中抗CD20 VHH结构域更靠近T细胞膜的AIO-8C1 CAR-T细胞释放几乎两倍量的IFN-γ(图3)。相比之下，在含有未转导的T细胞(UnT)或阴性对照细胞系-K562.Luc的共培养物中，IFN-γ释放检测不到或极低，表明AIO CAR-T细胞的抗原特异性识别和刺激是对CD19、CD20和/或CD22表达细胞的反应性所需的(图3)。
6.4.实施例4—三特异性VHH CAR-T细胞在肿瘤异种移植小鼠中的体内功效
在Raji异种移植NCG小鼠模型中体内评估三特异性VHH CAR-T细胞的抗肿瘤活性，并评价了作为对照的CD19 scFv CAR-T细胞和未转导的T细胞(UnT)。
细胞系：Raji(ATCC号CCL-86)是成淋巴细胞样细胞系，由Pulvertaft在1963年根据11岁男性的伯基特淋巴瘤建立。使Raji细胞在含有10％胎牛血清的RMPI培养基中生长。此细胞系在组织培养瓶中悬浮生长。当被静脉内植入时，此细胞系在小鼠中持续存在并扩增。Raji细胞已被修饰成表达荧光素酶，使得肿瘤细胞生长也可以通过对小鼠进行成像来监测。Raji模型内源性表达高水平的CD19、CD20和CD22，且因此可被用于测试CD19、CD20和/或CD22导向的工程化AIO CAR-T细胞的体内功效。
小鼠：5-6周龄的NCG(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju)雌性小鼠接收自南京大学的模型动物研究中心，体重相似(大约20g)。在实验之前使动物在动物设施中适应7天。按照ACUC条例和指南处置动物。
6.4.1.三特异性VHH CAR-T细胞功效的体内测试和结果
为了产生肿瘤异种移植物，给NCG小鼠静脉内注射Raji.Luc。在Raji.Luc肿瘤细胞植入后4天用T细胞处理小鼠。经由尾静脉给小鼠静脉内注射400μL的T细胞。将每组5只小鼠用分别每只小鼠1M、每只小鼠0.5M或每只小鼠0.25M的CAR-T细胞剂量的AIO CAR-T细胞或CD19 scFv CAR-T细胞(阳性对照)，400μL的单独HBSS和作为对照的未转导的T细胞(UnT)处理。所有T细胞均由同一供体平行制备。
每周两次监测动物健康状态，包括体重测量。每周通过生物发光成像(BLI)监测肿瘤生长，直至动物达到终点。所有处理组的平均生物发光曲线绘制在图4A-4F中。未接受任何T细胞的HBSS处理组(媒介物)在经静脉内注射的NCG小鼠中展现出基线Raji肿瘤生长动力学。UnT处理组接受作为工程化T细胞的阴性对照的非转导的T细胞。HBSS和UnT处理组在整个此项研究中均表现出持续的侵袭性肿瘤进展，并在第17天被安乐死(图4A-4G)。如由平均生物发光和生物发光的图像所示，在每只小鼠1M的CAR-T细胞剂量下，AIO CAR-T细胞和CD19 scFv CAR-T的功效相当，并且当与UnT处理相比时，所有的CAR-T细胞均显著抑制肿瘤生长，且在28天的体内功效研究期间均表现出完全的肿瘤抑制(图4A和图4B)；在每只小鼠0.5M的CAR-T细胞剂量下，AIO CAR-T细胞在肿瘤抑制方面比CD19scFv CAR-T细胞更有效(图4C和图4D)；并且在每只小鼠0.25M的CAR-T细胞剂量下，AIO CAR-T细胞在肿瘤抑制方面比CD19 scFv CAR-T细胞显著更加有效，并且由于侵袭性肿瘤生长，经CD19 scFv CAR-T细胞处理的小鼠在第19天被安乐死(图4E和图4F)。AIO CAR-T细胞对淋巴瘤细胞系-Raji表现出剂量依赖性杀伤能力(图4A-4F)。此外，在整个28天的体内研究中，在AIO CAR-T细胞处理组(每只小鼠1M和0.5M的CAR-T细胞)中每两周监测的小鼠健康状态正常，并且体重稳定(图4G)。
6.5.实施例5—三特异性人源化VHH CAR的产生和表征
为了产生三特异性人源化VHH CAR-T细胞(或人源化AIO CAR-T细胞)，通过应用序列分析、人受体选择、电脑模拟CDR移植、同源结构建模、序列比对和基于结构的反向突变设计将骆驼科VHH结构域人源化。人源化VHH CAR-T细胞通过人原代T细胞中的慢病毒转导产生，并通过体外功效研究进行评估。利用各种VHH顺序/组合选择、设计和构建人源化VHHCAR的顶端前导序列，然后通过人原代T细胞中的慢病毒转导产生三特异性人源化VHH CAR-T细胞用于功效评估。
6.5.1VHH的人源化
为了降低在人中的免疫原性，将骆驼科VHH抗体人源化，因为大部分免疫反应是针对非人抗体恒定区发生的。当不同的框架区与骆驼科CDR组合时，对同一抗原具有特异性的嵌合人和骆驼科抗体可引发不同的效应子功能，从而扩大它们的治疗益处。通过使用基于序列的方法和框架改组将骆驼科VHH人源化为最同源的人种系序列或相关支架。通过电脑模拟CDR移植、同源结构建模(三级构象和折叠)、序列比对、基于结构的反向突变设计和重新引入关键构象残基解决了由非原生人框架支架支持的骆驼科CDR的不相容性和关键构象残基的消除。抗体人源化过程不仅消除空间冲突，而且还恢复与其抗原的结合亲和力有关的功能。
基于序列同源性的人源化设计采用Cécile Vincke等人设计的通用人源化VHH框架h-NbBcII10FGLA(蛋白质数据库，PDB代码：3EAK，https://www.rcsb.org/structure/3EAK)。使用建模软件MODELL ER进行骆驼科VHH的同源建模。根据与人种系基因的比对，选择IGHV3-64*04作为抗CD19 VHH、抗CD20 VHH和抗CD22 VHH的一种人受体。根据蛋白质的三维结构计算氨基酸的相对溶剂可及性。如果VHH的氨基酸中的一种氨基酸暴露于溶剂中，则它将被原始氨基酸替换。本文产生的示例性人源化VHH结构域示于表2中，且相应的序列提供于本文提供的序列表中。
6.5.2.人源化VHH CAR的制备
使用实施例2中所述的方法产生单特异性人源化VHH CAR(靶向CD19、CD20或CD22抗原)和多特异性人源化VHH CAR(包括各种VHH顺序)。多特异性人源化VHH CAR的构建体示于表12中。
表12.示例性多特异性人源化CAR
Figure BDA0004113828030002201
/>
Figure BDA0004113828030002211
注：
1表12中的构建体中使用的接头是(GGGGS)1。
2CT SD代表共刺激信号传导结构域。
3PI SD代表初级细胞内信号传导结构域。
上述多特异性VHH CAR的核酸序列示于序列表中的SEQ ID NO:260-279中。在这些示例性CAR构建体中，CD8α信号肽、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、CD137细胞质结构域和CD3ζ细胞质结构域的序列分别示于SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163、SEQID NO:164和SEQ ID NO:165中。
包装携带CAR构建体中的每一种CAR构建体的慢病毒载体，并按照如实施例2中所述的方案对该慢病毒载体进行滴定。使用实施例2中所述的方案，由来自健康供体的外周血样品制备人PBMC，以用于使用Miltenyi Pan T细胞分离试剂盒进一步分离原代人T细胞。如实施例2中所述，使用Miltenyi抗CD3/CD28微珠预激活和扩增纯化的T细胞。
然后通过在32℃下以1200g离心1.5h来用慢病毒储备液转导预激活的T细胞。然后将转导的细胞转移到细胞培养物温育箱中，以用于在合适的条件下进行转基因表达。T细胞开始以对数生长模式分裂，这通过测量细胞数目(能成活的细胞/每mL)和成活率(％)来进行监测。每两天给T细胞培养物补充新鲜培养基。随着T细胞在近似7-9天后开始静息，它们就准备好了被收获并被冷冻保存以供以后分析。
在冷冻保存之前，通过流式细胞术分析确定转导的细胞(在T细胞表面上表达一个或多个VHH结构域或scFv结构域)的百分比。将T细胞用LIVE/DEADTM可固定死细胞染色试剂盒(Invitrogen，目录号L34976)染色，将基于VHH的CAR-T细胞用山羊抗美洲驼IgG FITC缀合物(Bethyl，目录号A160-100F)染色，并将基于scFv的CAR-T细胞(阳性对照)用FITC标记的重组蛋白L(Acro，目录号RPL-PF141)在4℃下染色30分钟，接着洗涤三次，并重悬于200μL含0.5％FBS的DPBS中，用于在NovoCyte流式细胞仪(ACEA Biosciences)上进行FACS分析。通过Novoexpress软件分析FACS数据。
在7天的培养中，示例性单特异性人源化VHH CAR-T细胞的成活率为92％～96％，CAR+％为约10％～43％，且扩增倍数在60～80以内。在7天的培养中，示例性三特异性人源化VHH CAR-T细胞的成活率为90％～98％，CAR+％为约5％～21％，且扩增倍数在36～86以内(图5A-5B)。数据表明，当与未转导的T细胞(UnT)相比时，单特异性/三特异性VHH CAR的人源化对T细胞的增殖和扩增能力没有可检测的负面影响。
6.6.实施例6—表达三特异性人源化CAR的免疫细胞的体外表征
6.6.1.三特异性人源化VHH CAR-T细胞的细胞毒性评价
示例性三特异性人源化VHH AIO CAR-T细胞(huAIO CAR-T细胞)的数据示于图6A-6F和图7A-7F中。huAIO CAR-T细胞用编码一个CAR开放阅读框的慢病毒载体进行工程化，并且是由筛选和优化的人源化抗CD19 VHH、抗CD20 VHH和抗CD22 VHH结构域组成的。评价了人源化抗CD19 VHH结构域、抗CD20 VHH结构域和抗CD22 VHH结构域的多种组合，并通过体外细胞毒性评估鉴定了能强效地杀伤淋巴瘤和白血病肿瘤细胞的最佳人源化AIO CAR-T细胞(huAIO CAR-T细胞)。数据显示，所述huAIO CAR-T细胞中的一些huAIO CAR-T细胞对表达CD19+CD20+CD22+抗原的淋巴瘤细胞–Raji.Luc和表达CD19+CD20-CD22低抗原的白血病细胞–Nalm.6.Luc表现出协同效应和比阳性对照(单特异性VHH CAR-T细胞或单特异性scFvCAR-T细胞)优异的抗肿瘤效力，并表现出剂量依赖性杀伤能力(图6A-6F)。另外，huAIOCAR-T细胞中的一些huAIO CAR-T细胞增强或维持对表达单抗原的细胞系-K562-CD19.Luc、K562-CD20.Luc或K562-CD22.Luc的效力，并证实了单一靶抗原引发肿瘤细胞裂解的充分性(图7A-7F)。基于对表达三阳性或双阳性抗原的细胞的协同效应和对表达单抗原的细胞的维持效力，表明串联人源化VHH结构域中的每一个均折叠并在T细胞表面上表达，与不同的表位结合，彼此不阻断，并且没有干扰与CD19、CD20和CD22抗原的结合的空间位阻效应。
上述观察结果表明，huAIO CAR经由特异性识别靶向性细胞上的CD19、CD20和/或CD22抗原诱导T细胞激活，激活T细胞内源性信号传导通路，诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活，并增强协同抗肿瘤反应。
6.6.2.三特异性人源化CAR-T细胞的IFN-γ释放评价
为了测量表达响应于CD19、CD20和CD22抗原的细胞的三特异性人源化VHH CAR-T细胞的细胞因子产生，将CAR-T细胞与表达CD19+CD20+CD22+三阳性抗原的B淋巴瘤细胞系-Raji(ATCC号CCL-86)和阴性细胞系-K562(ATCC号CCL-243)以E:T比率为5:1或2.5:1共培养24小时，之后收获培养基以用于使用人IFN-γ试剂盒(Cisbio，目录号62HIFNGPEG)进行细胞因子释放定量和分析，并通过多模式微板读取器(Tecan Spark)读取每个孔的吸光度(每个测试制品重复三次)。
数据显示，在与Raji细胞的共培养物中，示例性huAIO CAR-T细胞比阳性对照-CD19 scFv CAR-T细胞、CD20 scFv CAR-T细胞或CD22 scFv CAR-T细胞释放更多的IFN-γ，表明VHH的人源化不负面影响三特异性VHH CAR-T细胞的功能性(图8)。相比之下，在与UnT对照或阴性对照细胞系-K562的共培养物中，IFN-γ释放极低，表明huAIO CAR-T细胞的CD19、CD20和/或CD22抗原特异性是与表达抗原的靶细胞的反应性所需的(图8)。IFN-γ在T细胞效应功能中起主要作用，并且是巨噬细胞的重要激活剂和抗原呈递细胞(APC)上的MHC-II分子表达的诱导剂。
6.6.3.三特异性人源化VHH CAR-T细胞的IL-6释放评价
CRS(细胞因子释放综合征)是由于响应于CAR-T细胞分泌IFN-γ和可能的另外的细胞因子而发生的主要来自巨噬细胞/单核细胞的促炎性细胞因子的大量分泌而引起的。单核细胞被发现是通过释放IL-6介导CRS的主要细胞，因此评估了单核细胞共培养物的IL-6释放。根据制造商的方案，通过CD14微珠(Miltenyi，目录号130-050-201)从同一健康供体的PBMC中分离单核细胞用于CAR-T细胞产生。单独接种huAIO CAR-T细胞作为对照，将huAIOCAR-T细胞与Raji细胞一起以10:1的E:T比率共培养，或与单核细胞一起以2:3的E:M比率共培养，或与Raji细胞加单核细胞一起以10:1:15的E:T:M比率共培养24小时(每个测试制品重复三次)，之后收获培养基以用于使用人IL-6试剂盒(Cisbio，目录号62HIL06PEG)进行细胞因子定量和分析。
在CAR-T细胞、Raji细胞和单核细胞的共培养物中，huAIO CAR-T细胞比阳性对照scFv CAR-T细胞诱导略多的IL-6释放。在huAIO CAR-T细胞和单核细胞的共培养物中，IL-6释放极低，表明在没有抗原特异性刺激的情况下，单独的huAIO CAR-T细胞不诱导单核细胞释放IL-6(图9)。
6.6.4.三特异性VHH CAR-T细胞对具有CD19基因敲除的Raji细胞(Raji19KO)的体外细胞毒性
临床研究表明，CAR-T疗法的失败和50％以上的R/R NHL及ALL复发是由于靶B细胞抗原逃逸，该抗原逃逸包括抗原下调、突变、同种型转换和胞啃作用(trogocytosis)。三特异性VHH CAR-T细胞可以强效地抑制具有异质抗原表达的肿瘤，并在单一靶抗原表达充分的情况下引发肿瘤裂解。为了测试三特异性VHH CAR-T细胞是否可以抵消抗原逃逸，在体外评估了三特异性VHH CAR-T细胞对CD19敲除(KO)Raji淋巴瘤克隆(Raji19KO)的细胞毒性。经由成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas9基因编辑从亲本Raji.Luc(Raji-荧光素酶)细胞系产生缺乏CD19的表达的Raji19KO细胞克隆。将Raji和Raji19KO细胞用与CD19、CD20和CD22结合的抗体(Biolegend，PE抗人CD19，目录号302208，PE抗人CD20，目录号302306，和PE抗人CD22，目录号302506)染色，以通过FACS验证靶表达(图10A)。
测试模型模拟由于抗原逃逸而可能出现的抗原阴性肿瘤细胞长出。通过人原代T细胞中的慢病毒转导产生CAR-T细胞，并将该细胞与Raji或Raji19KO细胞一起以10:1、5:1或2.5:1的E:T比率共培养24小时。采用ONE-Glo萤光素酶测定(Promega，目录号E6110)通过生物发光测量特异性肿瘤裂解。示例性三特异性VHH AIO CA R-T细胞对Raji和Raji19KO的数据示于图10B和10C中。当与CD 19-CD20+CD22+Raji19KO细胞一起共培养时，AIO CAR-T细胞表现出高百分比的肿瘤细胞裂解，该裂解在量级上与亲本CD19+CD20+CD22+Raji细胞(ATCC号CCL-86)的裂解相当。相比之下，当与Raji19KO细胞一起共培养时，对CD19 scFvCAR-T细胞没有观察到明显的肿瘤细胞裂解(图10C)。此外，所有CD19 scFv CAR-T细胞、CD20 scFv CAR-T细胞和CD22 scFv CAR-T细胞均可强效地杀伤亲本CD19+CD20+CD22+Raji细胞，且CD20 scFv CAR-T细胞和CD22scFv CAR-T细胞也可强效地杀伤CD19-CD20+CD22+Raji19KO细胞(图10B和10C)。
为了表征CAR-T细胞响应于表达抗原的靶细胞的细胞因子产生，从以上与Raji或Raji19KO共培养24小时的细胞中收获上清液，并用人IFN-γ试剂盒(Cisbio，目录号62HIFNGPEG)测量分泌的IFN-γ。如所预期的那样，UnT细胞不产生或产生极低的IFN-γ，展现出CAR依赖性细胞因子分泌。三特异性VHH AIO CAR-T细胞与UnT对照相比响应于Raji或Raji19KO显著地诱导了IFN-γ，并且与CD19 scFv CAR-T细胞、CD20 scFv CAR-T细胞或CD22scFv CAR-T细胞相比在中靶激活中被维持在最高水平的IFN-γ下(图10D和10E)，这表明当抗原逃逸时，AIO CAR-T细胞仍然可以强效地抑制具有异质抗原表达的肿瘤，抵消抗原逃逸，并且不允许抗原阴性肿瘤细胞长出。相比之下，在CD19 scFv CAR-T细胞与Raji19KO的共培养物中，由于缺乏CD19抗原表达和缺乏CAR依赖性中靶激活，没有产生或产生极低的IFN-γ(图10E)。与Raji19KO细胞一起共培养的CD19 scFv CAR-T细胞的细胞毒性和细胞因子产生均表明，由于肿瘤细胞的表面上缺乏可靶向的抗原，因此单一CAR-T细胞允许肿瘤逃逸。
CD25是三聚体IL-2受体的α链，其在TCR/CD3复合物刺激24小时内上调，并持续数天保持升高。为了评价与Raji或Raji19KO一起以1:1的E:T比率共培养连续四天的CAR-T细胞的细胞激活水平，将CAR-T细胞上的晚期激活标志物–CD25用小鼠APC抗人CD25(Biolegend，目录号302610)染色，并用LIVE/DEADTM可固定死细胞染色试剂盒(Invitrogen，目录号L34976)和山羊FITC抗羊驼IgG(Jackson ImmunoResearch，目录号128-095-230)在4℃下共染色30分钟，接着洗涤三次，并重悬于200μL含0.5％FBS的DPBS中以用于在NovoCyte流式细胞仪(ACEA Biosciences)上进行FACS分析。通过Novoexpress软件分析FACS数据。示例性三特异性VHH AIO CAR-T细胞的数据显示，当与Raji或Raji19KO一起共培养时，AIOCAR-T细胞通过识别B细胞表面抗原而被强效地激活，并且T细胞的CD25+/CAR+％增加，并在四天内达到平台期(～99％)。同时，与Raji细胞一起共培养的CD19 scFv CAR-T细胞也被强效地激活，并且T细胞的CD25+/CAR+％增加，并在四天内达到平台期(～99％)。相比之下，在缺乏CD19抗原识别的情况下将CD19 scFv CAR-T细胞与Raji19KO细胞共培养时，T细胞的CD25+/CAR+％在24小时内下降，并且从第2天到第4天维持在60～70％，这可能由T细胞的TCR和Raji19KO细胞的细胞表面MHC-II分子的识别单独介导的(图10F)。
6.7.实施例7—三特异性人源化VHH CAR-T细胞在肿瘤异种移植小鼠中的体内功效
在Raji异种移植NCG小鼠模型中体内评估三特异性人源化VHH CAR-T细胞的抗肿瘤活性，并评价了作为对照的CD19 scFv CAR-T细胞、CD20 scFv CAR-T细胞、CD22 scFvCAR-T细胞和未转导的T细胞(UnT)。
细胞系：Raji(ATCC号CCL-86)是成淋巴细胞样细胞系，由Pulvertaft在1963年根据11岁男性的伯基特淋巴瘤建立。使Raji细胞在含有10％胎牛血清的RMPI培养基中生长。此细胞系在组织培养瓶中悬浮生长。当被静脉内植入时，此细胞系在小鼠中持续存在并扩增。Raji细胞已被修饰成表达荧光素酶，使得肿瘤细胞生长也可以通过对小鼠进行成像来监测。Raji模型内源性表达高水平的CD19、CD20和CD22，且因此可被用于测试CD19、CD20和/或CD22导向的工程化AIO CAR-T细胞的体内功效。
小鼠：5-6周龄的NCG(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju)雌性小鼠接收自南京大学的模型动物研究中心，体重相似(大约20g)。在实验之前使动物在动物设施中适应7天。按照ACUC条例和指南处置动物。
6.7.1.三特异性人源化VHH CAR-T细胞体内功效测试和结果
为了产生肿瘤异种移植物，给NCG小鼠静脉内注射Raji.Luc。在Raji.Luc肿瘤细胞植入4天后用T细胞处理小鼠。经由尾静脉给小鼠静脉内注射400μL的T细胞。将每组6只小鼠用每只小鼠0.3MCAR-T细胞的剂量的huAIO CAR-T细胞或阳性对照-CD19 scFv CAR-T细胞、CD20 scFv CAR-T细胞和CD22 scFv CAR-T细胞处理，并将400μL的单独HBSS(媒介物)和UnT组用作非靶向性T细胞对照。
每周两次监测动物健康状态，包括体重测量。每周通过生物发光成像(BLI)监测肿瘤生长，直至动物达到图11A中的终点。所有处理组的平均生物发光曲线绘制在图11B中。未接受任何T细胞的经HBSS处理组(媒介物)在经静脉内植入的NCG小鼠中展现出基线Raji肿瘤生长动力学。接受非转导的T细胞的UnT处理组用作huAIO CAR-T细胞的阴性对照。HBSS和UnT处理组在整个此项研究中均展现出持续侵袭性肿瘤进展，并在第14天被安乐死(图11A-11B)。如由平均生物发光和生物发光的图像所示，在每只小鼠0.3M CAR-T细胞的剂量下，示例性huAIO CAR-T细胞(huAIO-133CAR-T细胞、huAIO-467 CAR-T细胞、huAIO-180 CAR-T细胞和huAIO-227 CAR-T细胞)在肿瘤抑制方面比CD22 scFv CAR-T细胞显著更加有效；huAIO-133 CAR-T细胞和huAIO-180 CAR-T细胞在肿瘤抑制方面比CD19 scFv CAR-T细胞显著更加有效；且huAIO-180 CAR-T细胞在肿瘤抑制方面比CD20 scFv CAR-T细胞显著更加有效。经huAIO-180 CAR-T细胞处理组中的小鼠中的一只小鼠表现出肿瘤迁移至腹腔，该小鼠在终点被安乐死(图11A-11B)。此外，在用huAIO CAR-T细胞处理的无肿瘤小鼠中，大多数健康状态是正常的，并且体重是稳定的(图11C)。huAIO CAR-T细胞和阴性/阳性对照处理的小鼠的存活率曲线示于图11D中。总之，与单特异性CAR-T细胞相比，三特异性VHH huAIO CAR-T细胞展现出显著增强的疾病控制能力，并直接相当于延长了健康生存期。
6.8.实施例8—三特异性骆驼科VHH-huIgG1Fc mAb(AIO-hu IgG1Fc mAb)和三特异性人源化VHH-huIgG1Fc mAb(huAIO-huI gG1Fc mAb)细胞表面体外结合的表征
6.8.1.AIO-huIgG1Fc mAb和huAIO-huIgG1Fc mAb与Raji细胞的中靶结合和EC50
三特异性骆驼科VHH和三特异性人源化VHH构建体是如表9和表12中所示的相应CAR的细胞外抗原结合结构域。将具有人IgG1Fc片段序列(SEQ ID NO:169)的三特异性骆驼科VHH序列或三特异性人源化VHH序列克隆到哺乳动物表达载体-pcDNA3.4中，以促进重组蛋白质表达。进一步优化DNA密码子以在哺乳动物宿主细胞-Expi293F中获得最佳表达。从细胞培养物的上清液中收获抗体，将该抗体通过MabSelect SuRe LX一步纯化，并经由0.2μm过滤器灭菌。纯化的抗体浓度是通过A280测定的，并且达到0.23～1.88mg/mL以内，纯度为80％～95％。将抗CD20 Fab-huIgG1Fc mAb中的两个(利妥昔单抗Fab-huIgG1Fc mAb和Leu16 Fab-huIgG1Fc mAb(参见SEQ ID NO:170-173))用作细胞表面结合测定的阳性对照，并将huIgG1Fc同种型对照mAb(Genscript，目录号C2867DL280-2)用作细胞表面结合测定的阴性对照。将表达CD19+CD20+CD22+三阳性抗原的B淋巴瘤细胞-Raji(ATCC号CCL-86)重悬于完全培养基中，将细胞浓度稀释到1×106个细胞/毫升，并以每孔2×105个细胞进行染色。根据实验计划和方案将mAb从最大浓度连续稀释(3倍减少)并添加到细胞中。将mAb和Raji细胞在4℃下共温育1小时，然后将该细胞用200μL含0.5％FBS的DPBS洗涤两次，并在4℃下以300g旋转5分钟。将该细胞用检测抗体-缀合有PE的小鼠抗人IgG1Fc(BioLegend，目录号409304，1:100)在4℃下染色40分钟。然后将细胞洗涤两次，并用200μL含0.5％FBS的DPBS重悬，以用于在NovoCyte流式细胞仪(ACEA Biosciences)上进行流式细胞术分析。通过Novoexpress软件分析FACS数据，并且通过GraphPad PRISM 6.0版分析MFI(中值荧光强度)。细胞表面结合数据显示，示例性三特异性骆驼科VHH-huIgG1Fc mAb(AIO-huIgG1FcmAb)和三特异性人源化VHH-huIgG1Fc mAb(huAIO-huIgG1Fc mAb)以剂量依赖性方式与Raji细胞特异性结合，并且列出了结合的EC50(图12A-12C)。
6.8.2.huAIO-huIgG1Fc mAb脱靶结合评估
为了验证脱靶结合，用各种人细胞系评估huAIO-huIgG1Fc mAb。示例性测试细胞系列于表13中。将mAb与每孔1×105个细胞一起在4℃下温育1小时。然后，将该细胞用200μL的DPBS和0.5％FBS洗涤，并在4℃下以300g旋转5分钟。将该细胞用检测抗体-缀合有PE的小鼠抗人IgG1 Fc(BioLegend，目录号409304，1:100)在4℃下染色30分钟。然后再次洗涤细胞，并用200μL的DPBS+0.5％FBS重悬以用于在NovoCyte流式细胞仪(ACEA Biosciences)上进行流式细胞术分析，并用Novoexpress软件分析FACS直方图数据。至于示例性huAIO-huIgG1Fc mAb，在与Raji细胞结合达到EC50的浓度下未观察到与脱靶细胞的非特异性结合(表13)。
表13.huAIO-huIgG1Fc mAb与中/脱靶细胞系的结合
Figure BDA0004113828030002311
本文引用的所有专利、公布的申请和参考文献的教导内容均以引用的方式全文并入。虽然已经具体示出和描述了示例实施方案，但本领域技术人员将要理解的是，在不脱离由所附权利要求涵盖的实施方案的范围的情况下，可以对其中的形式和细节进行各种改变。
由前述内容将会理解的是，虽然本文为了说明的目的已经描述了具体实施方案，但在不脱离本文提供的实质和范围的情况下可以进行各种修改。上面提到的所有参考文献均以全文引用的方式并入本文。
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<220>
<223> VHH-273、VHH-283、huVHH-253、huVHH-256的CDR1 (IMGT)
<400> 4
Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Asn
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-273的CDR2 (IMGT)
<400> 5
Val Val Asp Trp Ser Gly Gly Ser Pro
1 5
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-273、huVHH-253、huVHH-256的CDR3 (IMGT)
<400> 6
Ala Gly Arg Val Gln Tyr Gly Ser Ser Trp Ser Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-283的CDR2 (Kabat)
<400> 7
Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Ser Ser Val Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-283、VHH-313和huVHH-260的CDR3 (Kabat)
<400> 8
Pro Ile Glu Tyr Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-283、VHH-313和huVHH-260的CDR2 (IMGT)
<400> 9
Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Pro
1 5
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-283、VHH-313和huVHH-260的CDR3 (IMGT)
<400> 10
Ala Ala Pro Ile Glu Tyr Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Tyr
1 5 10
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-313和huVHH-260的CDR1 (Kabat)
<400> 11
Gly Arg Thr Ile Ser Ser Tyr Ser Met Gly
1 5 10
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-313和huVHH-260的CDR2 (Kabat)
<400> 12
Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-313和huVHH-260的CDR1 (IMGT)
<400> 13
Gly Arg Thr Ile Ser Ser Tyr Ser
1 5
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-440和VHH-653的CDR1 (Kabat)
<400> 14
Ala Tyr Ile Arg Val Phe Tyr Leu Met Gly
1 5 10
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-440的CDR2 (Kabat)
<400> 15
Arg Val Thr Ala Asp Gly Phe Thr Asn His Ala Ala Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-440、VHH-466、VHH-653、huVHH-836、huVHH-840、
huVHH-843和huVHH-846的CDR3 (Kabat)
<400> 16
Gly Arg Thr Trp Asn Ser Gly Phe Glu Tyr
1 5 10
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-440和VHH-653的CDR1 (IMGT)
<400> 17
Ala Tyr Ile Arg Val Phe Tyr Leu
1 5
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-440的CDR2 (IMGT)
<400> 18
Val Thr Ala Asp Gly Phe Thr
1 5
<210> 19
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-440、VHH-466、VHH-653、huVHH-836、huVHH-840、
huVHH-843和huVHH-846的CDR3 (IMGT)
<400> 19
Ala Ala Gly Arg Thr Trp Asn Ser Gly Phe Glu Tyr
1 5 10
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-466、huVHH-836、huVHH-840、huVHH-843和
huVHH-846的CDR1 (Kabat)
<400> 20
Ala Asp Ile Arg Leu Phe Tyr Leu Met Gly
1 5 10
<210> 21
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-466的CDR2 (Kabat)
<400> 21
Arg Val Asn Ala Asp Asp Ser Ile Asn Tyr Val Ala Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-466、huVHH-836、huVHH-840、huVHH-843和
huVHH-846的CDR1 (IMGT)
<400> 22
Ala Asp Ile Arg Leu Phe Tyr Leu
1 5
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-466、huVHH-840和huVHH-843、huVHH-846的CDR2 (IMGT)
<400> 23
Val Asn Ala Asp Asp Ser Ile
1 5
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-496、huVHH-746和huVHH-750、huVHH-753的CDR1 (Kabat)
<400> 24
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Pro Met Thr
1 5 10
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-496、huVHH-746、huVHH-750和huVHH-753的CDR2 (Kabat)
<400> 25
Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asp Arg Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-496、huVHH-746、huVHH-750和huVHH-753的CDR3 (Kabat)
<400> 26
Trp Asp Arg Thr Leu
1 5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-496、huVHH-746、huVHH-750和huVHH-753的CDR1 (IMGT)
<400> 27
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Pro
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-496、huVHH-746、huVHH-750和huVHH-753的CDR2 (IMGT)
<400> 28
Ile Thr Ser Gly Gly Asp Arg Pro
1 5
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-496、huVHH-746、huVHH-750和huVHH-753的CDR3 (IMGT)
<400> 29
Ala Thr Trp Asp Arg Thr Leu
1 5
<210> 30
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-653的CDR2 (Kabat)
<400> 30
Arg Val Asn Ala Asp Gly Ile Thr Asn His Ala Ala Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-653的CDR2 (IMGT)
<400> 31
Val Asn Ala Asp Gly Ile Thr
1 5
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-253的CDR2 (Kabat)
<400> 32
Ala Val Asp Trp Ser Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-253、huVHH-256的CDR2 (IMGT)
<400> 33
Val Asp Trp Ser Gly Gly Ser Pro
1 5
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-836的CDR2 (Kabat)
<400> 34
Arg Val Asn Ala Asp Asp Ser Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-836的CDR2 (IMGT)
<400> 35
Val Asn Ala Asp Asp Ser Ile Ser
1 5
<210> 36
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-840的CDR2 (Kabat)
<400> 36
Phe Val Asn Ala Asp Asp Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 37
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-843的CDR2 (Kabat)
<400> 37
Arg Val Asn Ala Asp Asp Ser Ile Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 38
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-846的CDR2 (Kabat)
<400> 38
Phe Val Asn Ala Asp Asp Ser Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 39
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-273 (氨基酸)
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Val Val Asp Trp Ser Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Arg Val Gln Tyr Gly Ser Ser Trp Ser Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 40
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-283 (氨基酸)
<400> 40
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Ser Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Pro Ile Glu Tyr Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 41
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-313 (氨基酸)
<400> 41
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Arg Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Pro Ile Glu Tyr Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-440 (氨基酸)
<400> 42
Gln Val His Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gln Ala Ser Ala Tyr Ile Arg Val Phe Tyr
20 25 30
Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val
35 40 45
Ala Arg Val Thr Ala Asp Gly Phe Thr Asn His Ala Ala Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Ser Met Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Arg Thr Trp Asn Ser Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-466 (氨基酸)
<400> 43
Gln Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gln Ala Ser Ala Asp Ile Arg Leu Phe Tyr
20 25 30
Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val
35 40 45
Ala Arg Val Asn Ala Asp Asp Ser Ile Asn Tyr Val Ala Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Arg Thr Trp Asn Ser Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 44
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-496 (氨基酸)
<400> 44
Gln Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Pro Met Thr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ser Val
35 40 45
Ser Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asp Arg Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Trp Asp Arg Thr Leu Thr Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 45
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-653 (氨基酸)
<400> 45
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gln Ala Ser Ala Tyr Ile Arg Val Phe Tyr
20 25 30
Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val
35 40 45
Ala Arg Val Asn Ala Asp Gly Ile Thr Asn His Ala Ala Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Arg Thr Trp Asn Ser Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 46
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-253 (氨基酸)
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Val Asp Trp Ser Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Arg Val Gln Tyr Gly Ser Ser Trp Ser Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 47
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-256 (氨基酸)
<400> 47
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val
35 40 45
Ala Val Val Asp Trp Ser Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Arg Val Gln Tyr Gly Ser Ser Trp Ser Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 48
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-260 (氨基酸)
<400> 48
Asp Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Pro Ile Glu Tyr Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 49
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-746 (氨基酸)
<400> 49
Gln Ile Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Pro Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ser Val
35 40 45
Ser Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asp Arg Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Trp Asp Arg Thr Leu Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 50
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-750 (氨基酸)
<400> 50
Gln Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Pro Met Thr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ser Val
35 40 45
Ser Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asp Arg Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Trp Asp Arg Thr Leu Thr Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 51
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-753 (氨基酸)
<400> 51
Gln Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Pro Met Thr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ser Val
35 40 45
Ser Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asp Arg Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Trp Asp Arg Thr Leu Thr Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 52
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-836 (氨基酸)
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Asp Ile Arg Leu Phe Tyr
20 25 30
Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
35 40 45
Ala Arg Val Asn Ala Asp Asp Ser Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Arg Thr Trp Asn Ser Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 53
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-840 (氨基酸)
<400> 53
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Asp Ile Arg Leu Phe Tyr
20 25 30
Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Val Asn Ala Asp Asp Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Arg Thr Trp Asn Ser Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 54
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-843 (氨基酸)
<400> 54
Gln Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gln Ala Ser Ala Asp Ile Arg Leu Phe Tyr
20 25 30
Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
35 40 45
Ala Arg Val Asn Ala Asp Asp Ser Ile Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Arg Thr Trp Asn Ser Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 55
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-846 (氨基酸)
<400> 55
Gln Val His Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gln Ala Ser Ala Asp Ile Arg Leu Phe Tyr
20 25 30
Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Val Asn Ala Asp Asp Ser Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Arg Thr Trp Asn Ser Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 56
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-273 (核酸)
<400> 56
gaagtccagc tggtggaatc cgggggaggc ctggtgcagg caggaggctc cctgcggctg 60
tcttgcgcag caagcggaag gaccttcagc tcctacaaca tgggctggtt taggcaggca 120
ccaggcaagg agagggagtt cgtggcagtg gtggactggt ctggaggcag cccttactat 180
gccgattccg tgaagggccg gtttaccatc agccgggaca acggcaagaa tacagtgtat 240
ctgcagatga acagcctgaa gcccgaggat acagccgtgt actattgtgc cggccgggtg 300
cagtacgggt caagctggtc tggggattat tgggggcagg ggactcaggt cactgtctca 360
tca 363
<210> 57
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-283 (核酸)
<400> 57
caggtcaaac tggaggaatc tgggggaggc agcgtgcagg caggaggcag cctgcggctg 60
tcctgcgccg cctctggcag gaccttcagc tcctacaaca tgggctggtt taggcaggca 120
ccaggcaagg agagggagtt cgtggcagca atctcctggt ctggaggcag cccctactat 180
gcctctagcg tgcggggccg gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa tacagtgtat 240
ctgcagatga acagcctgaa gcccgaggat acagccgtgt actattgtgc cgcccctatc 300
gagtacggct cttcttggtc agcagattat tggggacagg gcactcaggt cacagtctca 360
tca 363
<210> 58
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-313 (核酸)
<400> 58
gatgtgcagc tggtggagag cggcggcggg ttggtgcaag ccggtggttc gctgcggttg 60
tcatgcgccg cttccggacg tacaatctct agctactcca tgggctggtt ccgccaggcc 120
cctggtaagg agcgcaggtt tgtcgcggcc atctcctggt ctggagggtc gccctattac 180
gcggacagcg tgaagggccg cttcaccatc agccgtgaca acgccaagaa cacggtttac 240
ctgcagatga actccctcaa acctgaagac accgccgtgt actactgtgc tgcaccaatt 300
gagtacggct ccagttggtc tgcggactat tggggccagg gcacccaggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 59
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-440 (核酸)
<400> 59
caggtccacc tgatggagag cggaggcggc tccgtgcagg ccggaggtag tctgcgcctg 60
tcatgccagg cctccgccta cattcgagtg ttctacctga tgggctggtt ccgccaggcc 120
ccggggaagg agcgcgagga ggtggctcgt gtcactgcgg acggcttcac caaccatgca 180
gcttctgtga agggccgctt caccatctcc aaggacaacg cgaagaacac gctgtacttg 240
cagatggatt ctatgaaaag cgaagacact gccgtgtact actgtgccgc tgggcggacc 300
tggaactccg gttttgagta ttggggccag ggcacccagg tcaccgtgtc gtcc 354
<210> 60
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-466 (核酸)
<400> 60
caggtccact tggtggagag cggtggaggc tccgtgcagg ccggaggttc tctccgtctc 60
tcatgccagg cctccgcgga catccgcctg ttttacctga tgggctggtt ccgccaagca 120
cccgggaagg agcgcgagga ggtggctcgg gttaacgcgg atgacagcat taactacgtg 180
gcgagtgtaa agggccgctt caccatctcc aaggacaacg ccaagaacac gctgtacttg 240
cagatggatt ctcttaaacc ggaagacacc gccacttact actgtgctgc tgggcgaacc 300
tggaactccg gcttcgagta ttggggccag ggcacccagg tcaccgtgag ctcg 354
<210> 61
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-496 (核酸)
<400> 61
cagatccagc tggtggagag tggaggcggc ttggtgcagc cagggggctc cctacgcctg 60
tcatgcgctg cttctggctt cacgttcagc aactacccga tgacctggct ccgccaggcc 120
cccgggaaag gcctcgagag cgtgtccgac atcacctccg gtggtgatcg gccctattac 180
gcggactcgg tgaagggcag gtttacaatt tctcgcgaca acgccaagaa tatgctgtac 240
ctggagatga actccctgaa gactgaagac accgccgtgt actactgtgc cacctgggat 300
cgcaccctga cgggacaagg cacccaggtc accgttagct cg 342
<210> 62
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-653 (核酸)
<400> 62
caggtgaagc tggtggagag cggtgggggc tccgtgcagg ccggaggtag ccttcgcctg 60
tcatgccagg cctccgccta cattcgggtg ttttacctga tgggctggtt ccgccaggcc 120
ccggggaagg agcgcgagga ggtggcacga gtcaacgcgg acggcatcac caaccatgca 180
gcttccgtaa aaggccgctt caccatctcc aaggacaacg ccaagaacac gctatacctc 240
cagatggatt ctctgaagcc cgaggacacc gccgtgtact actgtgctgc gggacgtact 300
tggaactccg gcttcgaata ttggggccag ggcacccagg tcactgtcag ttcc 354
<210> 63
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-253 (核酸)
<400> 63
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggt ttggtgcagc caggaggctc cctccgcctg 60
tcatgcgccg cttccggccg caccttcagc agctacaaca tgggctggtt ccgccaggcc 120
cccggcaaag gcctggagtg ggtcgcggcc gtggattggt ctggcggttc cccctattac 180
gcggactccg tgaagggccg cttcaccatc tcccgcgaca actccaagaa cacggtgtac 240
ctgcagatga actctctgcg cgccgaggac accgccgtct actactgtgc cggccgagtg 300
cagtacggct ccagttggtc tggggactat tggggccagg gcaccctggt gaccgtgtcg 360
tcc 363
<210> 64
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-256 (核酸)
<400> 64
gaggtgcagc tggtggagag cggaggcggt ttggtgcagc cagggggttc tctgcgcctg 60
agctgtgctg cttccggtcg tacgttcagc agctacaaca tgggctggtt ccgccaggcc 120
cccggcaaag gcctggagtt cgtcgccgtg gtggactggt ctggcggctc cccctattac 180
gcggactccg tgaagggccg cttcaccatc tcccgcgaca actccaagaa cacggtgtac 240
ctgcagatgt cttctcttcg cgccgaggac accgccgtct actactgcgc cggccgagtg 300
cagtacggct ccagttggtc tggtgattat tggggccagg gcaccctggt gaccgtgtcg 360
tcc 363
<210> 65
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-260 (核酸)
<400> 65
gacgtgcagc tgctggagag cggaggcggg ctggtgcagc cagggggttc tcttcgcctg 60
tcatgcgccg cttccggtcg caccatctct agctactcca tgggctggtt ccgccaggcc 120
cccggcaaag gcctcgagtt cgtcgcggcc atcagttggt ctggcggctc cccctattac 180
gcggactccg tgaagggccg cttcaccatc tcccgcgaca acgccaagaa cacggtctac 240
ctgcagatga actccctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgtgc tgctcctatt 300
gagtacggct ccagttggtc tgcggactat tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcg 360
tcc 363
<210> 66
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-746 (核酸)
<400> 66
cagatccagc tgctggagag tggcggcggg ctggtgcagc cgggaggctc cctgcgcctg 60
tcatgcgccg cttccggctt cacgttcagc aactacccaa tgacctggat ccgccaggcc 120
cccggcaaag gcctcgagag cgtgtccgac atcacctccg gtggtgatag gccctattac 180
gcggactccg tgaagggccg cttcaccatc tctcgcgaca acgccaagaa catgctgtac 240
ctgcagatga actccctccg cgccgaggac accgccgtgt actactgtgc cacctgggac 300
cgcacccttt ggggccaggg caccatggtg accgtgagct cc 342
<210> 67
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-750 (核酸)
<400> 67
cagatccagc tggtggagag cggaggcggt ttggtgcagc cgggcggctc cctgcgcctg 60
agctgtgctg cttccggctt cacattttca aattatccaa tgacctggct ccgccaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtc cgtgtccgac atcacctccg gtggggacag gccctattac 180
gcggacagcg tcaaaggccg cttcaccatc tctcgcgaca acgccaagaa catgctgtac 240
ctgcagatga actccttacg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc cacctgggac 300
cgcaccctga ccggccaggg caccatggtg accgtgagct cc 342
<210> 68
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-753 (核酸)
<400> 68
cagatccagc tggtggagag cggcggcggt ttggtgcagc cgggaggctc cctgcgcctg 60
tcatgcgccg cttccggctt caccttttca aattacccaa tgacctggct ccgccaggcc 120
cccggcaaag gcctggagtc cgtgtccgac atcacctccg gtggggacag gccctattac 180
gcggacagcg tgaagggccg cttcaccatc tctcgcgaca acgccaagaa catgctttac 240
ctgcagatga actccttacg cgccgaggac accgccgtgt actactgtgc cacctgggac 300
cgcaccctca ctggacaggg caccctggtc accgtgtcgt cc 342
<210> 69
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-836 (核酸)
<400> 69
gaggtgcagc tggtggagag cggtggcggt ctggtgcagc cgggaggctc cttgcgtcta 60
tcatgcgccg cttccgcgga catccgcctg ttttacctga tgggctggtt ccgccaggcc 120
cccgggaaag ggttggtttg ggtcgcccga gtcaacgcgg atgacagcat ttcttacgcg 180
gatagtgtga agggccgctt caccatctcc cgcgacaacg ccaagaacac gctctacctc 240
cagatgaact ccctgcgcgc cgaggacacc gccgtatact actgtgctgc aggacggacc 300
tggaactccg gcttcgagta ctggggccag ggcactcttg tcaccgtgag ctcg 354
<210> 70
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-840 (核酸)
<400> 70
caggtgcagc tgcaggagag cggaggaggt gtggtgcagc caggcggctc cttgcgcctg 60
tcatgcgccg ctagtgcgga catccgactc ttttacctga tgggctggtt ccgccaggcc 120
ccggggaaag gtctcgagtg ggtcgccttc gtgaacgcag atgacagcat ttactacgcg 180
gattccgtaa agggccgctt caccatctct cgggacaact ccaagaacac gctgtacctc 240
cagatgaaca gcctacgtgc cgaggacact gccgtgtact actgtgccgc tgggcgcacc 300
tggaactccg gcttcgagta ctggggccaa ggcaccctgg tgaccgtgtc gtct 354
<210> 71
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-843 (核酸)
<400> 71
caggtccact tggtggagag cggaggtggt ctggtgcagc cagggggctc cctacgcctg 60
tcatgccagg cctccgcgga catccgactc ttttacctaa tgggctggtt ccgccaggcc 120
cccgggaaag gccttgtttg ggtcgcacgg gtcaacgcgg atgacagcat taactacgtg 180
gattctgtga agggccgctt caccatctcc aaggacaacg ccaagaacac gctgtacctg 240
cagatgaact ccctgcgcgc cgaggacacc gccgtgtact actgtgctgc tggacgtacc 300
tggaactccg gcttcgagta ttggggccag ggcaccctgg taacagtgtc gtcg 354
<210> 72
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-846 (核酸)
<400> 72
caggtccact tgcaggagag cggcgggggt gtggtgcagc cgggaggctc ccttcgtctc 60
tcatgccaag cctcggcgga catccggctt ttttacctga tgggctggtt ccgccaggcc 120
cccgggaagg gactggagtg ggttgccttc gtgaacgctg atgacagcat taactacgcg 180
gattccgtga agggccgctt caccatctct aaggacaaca gcaaaaacac tctgtacctc 240
cagatgaact ccctgcgcgc tgaagacacc gccgtgtact actgtgctgc aggtcgcacc 300
tggaactccg gcttcgagta ttggggccag ggcaccctgg tgacggtgtc cagt 354
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-083、huVHH-773、huVHH-776、VHH-131的CDR1 (Kabat)
<400> 73
Gly Asn Ile Asn Ser Arg Asn Cys Met Gly
1 5 10
<210> 74
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-083、huVHH-773、huVHH-776的CDR2 (Kabat)
<400> 74
Ala Ile Gly Gln Val Thr Gly Arg Ser Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 75
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-083、huVHH-773、huVHH-776、VHH-131的CDR3 (Kabat)
<400> 75
Ala Pro Gly Cys Leu Leu Ser Ala Leu Arg Ser Ala Asp Tyr Arg Asn
1 5 10 15
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-083、huVHH-773、huVHH-776、VHH-131的CDR1 (IMGT)
<400> 76
Gly Asn Ile Asn Ser Arg Asn Cys
1 5
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-083、huVHH-773、huVHH-776、VHH-131的CDR2 (IMGT)
<400> 77
Ile Gly Gln Val Thr Gly Arg Ser
1 5
<210> 78
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-083、huVHH-773、huVHH-776、VHH-131的CDR3 (IMGT)
<400> 78
Ala Ala Ala Pro Gly Cys Leu Leu Ser Ala Leu Arg Ser Ala Asp Tyr
1 5 10 15
Arg Asn
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-111的CDR1 (Kabat)
<400> 79
Gly Asp Thr Leu Ser Asn Lys Trp Met Gly
1 5 10
<210> 80
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-111的CDR2 (Kabat)
<400> 80
Thr Ile Arg Thr Asp His Ala Gly Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 81
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-111的CDR3 (Kabat)
<400> 81
Ser Tyr Ser Gly Ala Thr Thr Phe Arg Tyr
1 5 10
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-111的CDR1 (IMGT)
<400> 82
Gly Asp Thr Leu Ser Asn Lys Trp
1 5
<210> 83
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-111的CDR2 (IMGT)
<400> 83
Ile Arg Thr Asp His Ala Gly Thr
1 5
<210> 84
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-111的CDR3 (IMGT)
<400> 84
Ala Ala Ser Tyr Ser Gly Ala Thr Thr Phe Arg Tyr
1 5 10
<210> 85
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-083 (氨基酸)
<400> 85
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gly Ala Ser Gly Asn Ile Asn Ser Arg Asn
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Gln Val Thr Gly Arg Ser Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Pro Gly Cys Leu Leu Ser Ala Leu Arg Ser Ala Asp Tyr
100 105 110
Arg Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 86
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-111 (氨基酸)
<400> 86
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Leu Ser Asn Lys
20 25 30
Trp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Arg Thr Asp His Ala Gly Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys Asn Met Ile Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ser Tyr Ser Gly Ala Thr Thr Phe Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 87
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-773 (氨基酸)
<400> 87
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Asn Ser Arg Asn
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Gln Val Thr Gly Arg Ser Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Pro Gly Cys Leu Leu Ser Ala Leu Arg Ser Ala Asp Tyr
100 105 110
Arg Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 88
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-776 (氨基酸)
<400> 88
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Asn Ser Arg Asn
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Gln Val Thr Gly Arg Ser Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Pro Gly Cys Leu Leu Ser Ala Leu Arg Ser Ala Asp Tyr
100 105 110
Arg Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 89
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-083 (核酸)
<400> 89
caggtgcagc tggtggagag cggaggtggc tctgtgcagg ctggtgggtc gctcaggctg 60
tcatgcgggg cgtccggcaa cattaactcc cgcaactgca tgggctggtt ccgtcaagcc 120
ccaggcaagg agcgcgaggg cgtagccgct atcggtcagg tcaccggccg cagctactac 180
gtggattctg ttaaaggccg cttcaccatc tcgttggaca acgcgaagaa cacgctgtac 240
ctgcagatga acacactgaa gcccgaagac accgccatgt attactgtgc tgcagccccg 300
gggtgtctgc tgtccgctct gcgctccgcg gactaccgga attggggcca gggcacccag 360
gtcaccgtgt ccagt 375
<210> 90
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-111 (核酸)
<400> 90
gaggtgcagc tggtggagag cggaggggga tccgtgcaag ccggcggctc cttgcgcctg 60
tcatgcgccg cttccggtga tactcttagc aacaaatgga tgggctggtt ccgccaggcc 120
cccggcaagg agcgcgattg ggtcgcgacg attcgtaccg accacgccgg gacctacgcg 180
gacagtgtga agggccgctt caccatctcg cgggacaact ttaagaatat gatctacctg 240
cagatgaaca acctgaagcc tgaagacacc gccatgtatt actgtgctgc tagctactcc 300
ggtgcaacca ccttcagata ctggggccag ggcacccagg tcaccgtttc ttct 354
<210> 91
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-773 (核酸)
<400> 91
caggtgcagc tggtggagag cggaggcggg ctggtgcagc cgggcggctc cctccgcctg 60
tcatgcgccg cttccggcaa cattaattcc cgcaactgca tgggctggtt ccgccaggcc 120
cccggcaagg gcagggaggg cgtggcggcc atcggtcagg tcaccggccg cagctattac 180
gtggattctg tgaagggacg cttcaccatc tctctggaca actccaagaa cacgctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgtgc cgcggcgcca 300
gggtgcctgc tgtccgccct gcgctcggcg gactacagga actggggcca gggcaccctg 360
gttaccgtgt cctcc 375
<210> 92
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-776 (核酸)
<400> 92
caggtgcagc tggtggagag cggaggcggt gtggtgcagc cagggcgatc tcttcgcctg 60
tcatgcgccg cttccggcaa cattaattcc cgcaactgca tgggctggtt ccgccaggcc 120
cccggcaaag gcagggaggg cgtggcggcc atcggtcagg tcaccggccg cagctattac 180
gtggattctg tgaagggccg cttcaccatc tctctggaca actccaagaa cacgctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgtgc tgcggctccc 300
gggtgcctgc tgtccgccct gcgctcggcg gactaccgga actggggcca gggcaccctg 360
gtgaccgtgt cctcc 375
<210> 93
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-18 CDR1 (Kabat)
<400> 93
Gly Gly Ser Phe Arg Ser Val Ser Met Gly
1 5 10
<210> 94
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-18 CDR2 (Kabat)
<400> 94
Leu Leu Thr Ala Gly Met Arg Ser Asp Val Tyr Ala Asp Pro Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 95
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-18 CDR3 (Kabat)
<400> 95
Gly Arg Arg Phe Arg Ser Asp His Trp Tyr Leu Asp Asp Tyr Glu Tyr
1 5 10 15
<210> 96
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-18 CDR1 (IMGT)
<400> 96
Gly Gly Ser Phe Arg Ser Val Ser
1 5
<210> 97
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-18 CDR2 (IMGT)
<400> 97
Leu Thr Ala Gly Met Arg Ser Asp
1 5
<210> 98
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-18 CDR3 (IMGT)
<400> 98
Ala Ala Gly Arg Arg Phe Arg Ser Asp His Trp Tyr Leu Asp Asp Tyr
1 5 10 15
Glu Tyr
<210> 99
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-66和huVHH-077 CDR1 (Kabat)
<400> 99
Gly Ala Ser Ile Thr Thr Gly Glu Phe Tyr Trp Asn
1 5 10
<210> 100
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-66和huVHH-077 CDR2 (Kabat)
<400> 100
Ile Ala Ala Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Phe Glu Ser
1 5 10 15
<210> 101
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-66和huVHH-077 CDR3 (Kabat)
<400> 101
Ser Phe Gly Val Ala Ala Val Thr Thr Gly Gln Asn
1 5 10
<210> 102
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-66和huVHH-077 CDR1 (IMGT)
<400> 102
Gly Ala Ser Ile Thr Thr Gly Glu Phe Tyr
1 5 10
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-66和huVHH-077 CDR2 (IMGT)
<400> 103
Ile Ala Ala Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 104
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-66和huVHH-077 CDR3 (IMGT)
<400> 104
Gly Arg Ser Phe Gly Val Ala Ala Val Thr Thr Gly Gln Asn
1 5 10
<210> 105
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-87 CDR1 (Kabat)
<400> 105
Val Tyr Thr Trp Gly Thr Tyr Cys Met Gly
1 5 10
<210> 106
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-87 CDR2 (Kabat)
<400> 106
Thr Ile Asp Pro Ala Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asn Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 107
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-87 CDR3 (Kabat)
<400> 107
Arg Ala Tyr Asp Ala Pro Trp Ala Cys Trp Thr Gly Ala Val Phe Arg
1 5 10 15
Asp
<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-87 CDR1 (IMGT)
<400> 108
Val Tyr Thr Trp Gly Thr Tyr Cys
1 5
<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-87 CDR2 (IMGT)
<400> 109
Ile Asp Pro Ala Gly Thr Thr
1 5
<210> 110
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-87 CDR3 (IMGT)
<400> 110
Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Ala Pro Trp Ala Cys Trp Thr Gly Ala Val
1 5 10 15
Phe Arg Asp
<210> 111
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-90 CDR1 (Kabat)
<400> 111
Gly Ser Met Tyr Ser Arg Tyr Cys Met Gly
1 5 10
<210> 112
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-90 CDR2 (Kabat)
<400> 112
Thr Ile Asp Pro Ala Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asn Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 113
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-90 CDR3 (Kabat)
<400> 113
Arg Ala Tyr Asp Ala Pro Trp Ser Cys Trp Thr Gly Ala Val Phe Gly
1 5 10 15
Asp
<210> 114
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-90 CDR1 (IMGT)
<400> 114
Gly Ser Met Tyr Ser Arg Tyr Cys
1 5
<210> 115
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-90 CDR2 (IMGT)
<400> 115
Ile Asp Pro Ala Gly Thr Thr
1 5
<210> 116
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-90 CDR3 (IMGT)
<400> 116
Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Ala Pro Trp Ser Cys Trp Thr Gly Ala Val
1 5 10 15
Phe Gly Asp
<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-102 CDR1 (Kabat)
<400> 117
Gly Tyr Thr Tyr Arg Gly Tyr Cys Leu Ala
1 5 10
<210> 118
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-102 CDR2 (Kabat)
<400> 118
Thr Ile Asp Ser Asp Gly Tyr Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 119
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-102 CDR3 (Kabat)
<400> 119
Arg Gly Gly Trp Cys Tyr Ser Leu Ser Lys Glu Tyr Asn Tyr
1 5 10
<210> 120
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-102 CDR1 (IMGT)
<400> 120
Gly Tyr Thr Tyr Arg Gly Tyr Cys
1 5
<210> 121
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-102 CDR2 (IMGT)
<400> 121
Ile Asp Ser Asp Gly Tyr Ile
1 5
<210> 122
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-102 CDR3 (IMGT)
<400> 122
Ala Ala Arg Gly Gly Trp Cys Tyr Ser Leu Ser Lys Glu Tyr Asn Tyr
1 5 10 15
<210> 123
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-105 CDR1 (Kabat)
<400> 123
Leu Ser Leu Asn Arg Val Ser Ile Ala
1 5
<210> 124
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-105 CDR2 (Kabat)
<400> 124
Thr Gln Ser Phe Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 125
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-105 CDR3 (Kabat)
<400> 125
Gly Arg Thr Tyr Ser Ser Arg Asp Pro Leu Ala Asp Glu Tyr Asn Tyr
1 5 10 15
<210> 126
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-105 CDR1 (IMGT)
<400> 126
Leu Ser Leu Asn Arg Val Ser
1 5
<210> 127
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-105 CDR2 (IMGT)
<400> 127
Gln Ser Phe Thr Gly Asp Thr
1 5
<210> 128
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-105 CDR3 (IMGT)
<400> 128
Ala Ala Gly Arg Thr Tyr Ser Ser Arg Asp Pro Leu Ala Asp Glu Tyr
1 5 10 15
Asn Tyr
<210> 129
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-18 (氨基酸)
<400> 129
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Glu Ile Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Lys Tyr Ser Gly Gly Ser Phe Arg Ser Val
20 25 30
Ser Met Gly Trp Leu Arg Gln Ala Val Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Leu Leu Thr Ala Gly Met Arg Ser Asp Val Tyr Ala Asp Pro Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Ile Asp Lys Asn Thr Met Tyr
65 70 75 80
Leu Asp Met Asn Ala Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Arg Phe Arg Ser Asp His Trp Tyr Leu Asp Asp Tyr
100 105 110
Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 130
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-66 (氨基酸)
<400> 130
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Ile Thr Thr Gly
20 25 30
Glu Phe Tyr Trp Asn Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Met Gly Ala Ile Ala Ala Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Phe Glu Ser Arg Thr Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Glu Asn Gln Phe
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Gly Arg Ser Phe Gly Val Ala Ala Val Thr Thr Gly Gln Asn Arg
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 131
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-87 (氨基酸)
<400> 131
Gln Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Val Tyr Thr Trp Gly Thr Tyr
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asp Pro Ala Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asn Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Asp Asp Asn Ala Gln Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Arg Ala Tyr Asp Ala Pro Trp Ala Cys Trp Thr Gly Ala Val Phe
100 105 110
Arg Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 132
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-90 (氨基酸)
<400> 132
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Met Tyr Ser Arg Tyr
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asp Pro Ala Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asn Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ala Gln Asn Thr Met Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Arg Ala Tyr Asp Ala Pro Trp Ser Cys Trp Thr Gly Ala Val Phe
100 105 110
Gly Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 133
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-102 (氨基酸)
<400> 133
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Arg Gly Tyr
20 25 30
Cys Leu Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asp Ser Asp Gly Tyr Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Thr Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Glu Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Trp Cys Tyr Ser Leu Ser Lys Glu Tyr Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 134
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-105 (氨基酸)
<400> 134
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Glu Ser Leu Ser Leu Asn Arg Val Ser
20 25 30
Ile Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
35 40 45
Thr Gln Ser Phe Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu Ser
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Tyr Cys Ala Ala
85 90 95
Gly Arg Thr Tyr Ser Ser Arg Asp Pro Leu Ala Asp Glu Tyr Asn Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 135
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-077 (氨基酸)
<400> 135
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Ile Thr Thr Gly
20 25 30
Glu Phe Tyr Trp Asn Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Met Gly Ala Ile Ala Ala Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Phe Glu Ser Arg Thr Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Gly Arg Ser Phe Gly Val Ala Ala Val Thr Thr Gly Gln Asn Arg
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 136
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-18 (核酸)
<400> 136
caggttaagc tggtggagag cggaggcggc tccgtggaga tcggtggctc cctacgcctg 60
gcctgcaagt actccggtgg ttccttccgc tcggtatcta tgggctggct ccgccaggcc 120
gtggggaagg agcgcgaggg cgtcgctctg cttactgctg gaatgcgtag cgacgtgtac 180
gcggacccgg tgaagggccg cttcaccatc tcacaggata ttgacaaaaa cacgatgtac 240
ctggacatga acgcgctgaa gcccgaagac accgccatgt attactgtgc cgcagggcga 300
aggtttcgga gtgaccactg gtacttggat gactacgagt attggggcca gggcacccag 360
gtcaccgtga gctct 375
<210> 137
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-66 (核酸)
<400> 137
gaggtgcagc tggtggagag tgggcccggg ttggtgaagc cctctcagac tctgtctctg 60
acctgcaccg tgtccggtgc ttccatcacc accggcgagt tctattggaa ttggttccgc 120
cagccgcctg gcaagggcct ggagtggatg ggcgccatcg cggcttctgg ctccacgacc 180
tactccccat ccttcgagag ccgcaccagc atctctcgcg acacctccga gaaccagttc 240
tacctgcagc tgagctccgt gactccggaa gataccgccg tgtactactg cgggcgcagc 300
ttcggcgtgg cggccgtcac cacaggccag aaccgcggac agggcaccca ggtcaccgtg 360
tcgtcc 366
<210> 138
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-87 (核酸)
<400> 138
caaatccagc tggtggagag tggtggtgga tcggtgcaga gcggaggctc cctccgcctg 60
tcatgcaagg cctccgtgta cacctggggc acctactgta tgggctggtt ccgccaggcc 120
cccgggaagg agcgcgaggg cgtcgcaact attgacccag ctgggaccac aacttacgcc 180
aactccgtta agggccgctt caccatcagc gatgacaacg cgcagaacac gctgtacctg 240
cagatgaact ccttgaggcc tgaagacacc gccatgtatt actgtgctgc gcgggcctac 300
gacgctccgt gggcgtgctg gacgggtgcc gtgtttcgtg attggggcca gggcacccag 360
gtcaccgtgt cctct 375
<210> 139
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-90 (核酸)
<400> 139
caagtgcagc tggtggagag cggaggcggc tccgtgcaga gcggtggcag tctcaagctg 60
agctgcgccg cttccggttc tatgtactcc cgctactgca tgggctggtt ccgccaggcc 120
cccgggaagg agagggaggg cgtcgcaact attgaccctg ctggaacaac cacctacgcg 180
aactccgtta aaggccgctt caccatctct ggggacaacg cgcagaacac gatgtacctg 240
cagatgaact ccttgcggcc cgaagacacc gccatgtatt actgtgctgc tcgtgcctac 300
gacgccccgt ggtcttgttg gactggggcg gtgtttggtg attggggcca gggcacccag 360
gtcaccgtgt cgtcg 375
<210> 140
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-102 (核酸)
<400> 140
gaggtgcagc tggtggagag cggaggtggg tctgtgcaaa gcggcggctc cctccgcctg 60
tcatgcgccg cttccggata cacctacagg ggctactgcc tggcgtggtt ccgccaggcc 120
cccgggaaag agcgcgagcg ggtcgccact attgacagcg atggctacat ctcgtacgcg 180
gactccgtga agggccgctt taccatctct caggacaaca ctaagaacac gttgtacctg 240
gagatgaata cactgaagcc tgaagacacc gccatgtatt actgtgctgc acgtggtggt 300
tggtgttact ccctttccaa ggagtacaac tattggggcc agggcaccca ggtcaccgtt 360
tcgagt 366
<210> 141
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-105 (核酸)
<400> 141
caagtgcagc tggtggagag cggaggcggc tccgtgcagg ccggtggttc tcttcgattg 60
tcatgcgccg aaagtctatc tctcaaccgc gtcagcattg catggttccg ccaggctcct 120
ggcaaggaga gggagggcgt agctacccag agctttacag gggacaccgc gtacgcggat 180
tctgttaaag ggcgcttcac catctcccgc gacaacacta agaacacggt gtacctgtcc 240
atgaactccc tgaagctgga ggacagcgcc aagtactact gtgccgctgg acgtacttac 300
tcctcccggg atcccctggc ggacgagtac aactattggg gccagggcac ccaggtcacc 360
gtgtcgtcg 369
<210> 142
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huVHH-077 (核酸)
<400> 142
caggtgcagc tgcaggagag tgggcccggg ttggtgaagc cctctcagac tctttctctg 60
acctgcaccg tgtccggtgc ttccatcacc accggcgagt tctattggaa ttggttccgc 120
cagccgcccg gcaagggcct ggagtggatg ggcgccatcg cggcttctgg ctccacgacc 180
tactccccat ccttcgagag ccgcaccagc atctcccgcg acacctccaa gaaccagttt 240
tcactgaagc tgagctccgt gacggccgcg gacaccgccg tgtactactg cgggcgctcc 300
ttcggcgtgg cggccgtcac cacaggccag aaccgcggac agggcaccct ggtgaccgtg 360
agctcg 366
<210> 143
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> 可以重复n次，其中n是整数，包括例如
1、2、3、4、5和6
<400> 143
Gly Ser
1
<210> 144
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> 可以重复n次，其中n是整数，包括例如
1、2、3、4、5和6
<400> 144
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 145
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(4)
<223> 可以重复n次，其中n是整数，包括例如
1、2、3、4、5和6
<400> 145
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 146
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头4
<400> 146
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser
<210> 147
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头5
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> 可以重复n次，其中n是整数，包括例如
1、2、3、4、5和6
<400> 147
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 148
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头6
<400> 148
Asp Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 149
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头7
<400> 149
Thr Gly Glu Lys Pro
1 5
<210> 150
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头8
<400> 150
Gly Gly Arg Arg
1
<210> 151
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头9
<400> 151
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 152
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头10
<400> 152
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp
1 5 10
<210> 153
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头11
<400> 153
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
<210> 154
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头12
<400> 154
Gly Gly Arg Arg Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 155
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头13
<400> 155
Leu Arg Gln Arg Asp Gly Glu Arg Pro
1 5
<210> 156
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头14
<400> 156
Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro
1 5 10
<210> 157
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头15
<400> 157
Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro
1 5 10 15
<210> 158
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头16
<400> 158
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
<210> 159
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头17
<400> 159
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly
1 5 10
<210> 160
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头18
<400> 160
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 161
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 信号肽 (CD8α)
<400> 161
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 162
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 铰链 (CD8α)
<400> 162
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 163
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 跨膜结构域 (CD8α)
<400> 163
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 164
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 共刺激信号传导结构域 (CD137)
<400> 164
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 165
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 初级细胞内信号传导结构域 (CD3ζ)
<400> 165
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 166
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Kozak序列
<400> 166
gccgccacc 9
<210> 167
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> EcoRI限制位点
<400> 167
gaattc 6
<210> 168
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SpeI限制位点
<400> 168
actagt 6
<210> 169
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人IgG1 Fc片段序列
<400> 169
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 170
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 利妥昔单抗VH-CH1
<400> 170
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 171
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 利妥昔单抗VL-CL
<400> 171
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 172
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Leu16 VH-CH1
<400> 172
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys
225
<210> 173
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Leu16 VL-CL
<400> 173
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 174
<211> 617
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AIO-2C1 CAR (氨基酸)
<400> 174
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Phe Ser Asn Tyr Pro Met Thr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Ser Val Ser Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asp Arg Pro Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
Lys Asn Met Leu Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Arg Thr Leu Thr Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
130 135 140
Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu
145 150 155 160
Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Ile Thr Thr Gly Glu Phe Tyr Trp
165 170 175
Asn Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala
180 185 190
Ile Ala Ala Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Phe Glu Ser Arg
195 200 205
Thr Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Glu Asn Gln Phe Tyr Leu Gln Leu
210 215 220
Ser Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Arg Ser
225 230 235 240
Phe Gly Val Ala Ala Val Thr Thr Gly Gln Asn Arg Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val
260 265 270
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
275 280 285
Cys Gly Ala Ser Gly Asn Ile Asn Ser Arg Asn Cys Met Gly Trp Phe
290 295 300
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Gly Gln
305 310 315 320
Val Thr Gly Arg Ser Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
325 330 335
Ile Ser Leu Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr
340 345 350
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Pro Gly
355 360 365
Cys Leu Leu Ser Ala Leu Arg Ser Ala Asp Tyr Arg Asn Trp Gly Gln
370 375 380
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro
385 390 395 400
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
405 410 415
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
420 425 430
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
435 440 445
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
450 455 460
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
465 470 475 480
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
485 490 495
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
500 505 510
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
515 520 525
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
530 535 540
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
545 550 555 560
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
565 570 575
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
580 585 590
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
595 600 605
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
610 615
<210> 175
<211> 627
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AIO-2C2 CAR (氨基酸)
<400> 175
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<223> AIO-8C2 CAR (氨基酸)
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<220>
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<220>
<223> AIO-11C1 CAR (氨基酸)
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<220>
<223> AIO-12C1 CAR (氨基酸)
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405 410 415
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435 440 445
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Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
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Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
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595 600 605
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
610 615 620
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<211> 624
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huAIO-203 CAR (氨基酸)
<400> 211
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
275 280 285
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
290 295 300
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370 375 380
Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
435 440 445
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
530 535 540
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
545 550 555 560
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
565 570 575
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
580 585 590
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
595 600 605
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
610 615 620
<210> 217
<211> 624
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huAIO-243 CAR (氨基酸)
<400> 217
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala
35 40 45
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65 70 75 80
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Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Arg Ser Phe Gly Val Ala Ala Val Thr
115 120 125
Thr Gly Gln Asn Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
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420 425 430
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<212> PRT
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<220>
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<400> 223
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1 5 10 15
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Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ser Lys
210 215 220
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Pro Gly Cys Leu Leu Ser Ala Leu Arg
245 250 255
Ser Ala Asp Tyr Arg Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
275 280 285
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
290 295 300
Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Pro Met Thr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly
305 310 315 320
Lys Gly Leu Glu Ser Val Ser Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asp Arg Pro
325 330 335
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
340 345 350
Ala Lys Asn Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
355 360 365
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Arg Thr Leu Thr Gly Gln
370 375 380
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro
385 390 395 400
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
405 410 415
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
420 425 430
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
435 440 445
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
450 455 460
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
465 470 475 480
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
485 490 495
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
500 505 510
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
515 520 525
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
530 535 540
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
545 550 555 560
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565 570 575
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
580 585 590
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
595 600 605
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
610 615
<210> 224
<211> 617
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huAIO-600 CAR (氨基酸)
<400> 224
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Ala Ala Ser Gly Ser Thr
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Asn Ser Arg Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Pro Gly Cys Leu Leu Ser Ala Leu Arg
245 250 255
Ser Ala Asp Tyr Arg Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly
275 280 285
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
290 295 300
Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Pro Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly
305 310 315 320
Lys Gly Leu Glu Ser Val Ser Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asp Arg Pro
325 330 335
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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405 410 415
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420 425 430
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
435 440 445
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450 455 460
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500 505 510
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515 520 525
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580 585 590
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<211> 617
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huAIO-633 CAR (氨基酸)
<400> 225
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
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20 25 30
Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala
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Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Pro Gly Cys Leu Leu Ser Ala Leu Arg
245 250 255
Ser Ala Asp Tyr Arg Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
275 280 285
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
290 295 300
Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Pro Met Thr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly
305 310 315 320
Lys Gly Leu Glu Ser Val Ser Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asp Arg Pro
325 330 335
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
340 345 350
Ala Lys Asn Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
355 360 365
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370 375 380
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405 410 415
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
420 425 430
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
435 440 445
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450 455 460
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Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
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515 520 525
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
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Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
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565 570 575
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580 585 590
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
595 600 605
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
610 615
<210> 226
<211> 617
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huAIO-667 CAR (氨基酸)
<400> 226
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala
35 40 45
Ser Ile Thr Thr Gly Glu Phe Tyr Trp Asn Trp Phe Arg Gln Pro Pro
50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Ala Ala Ser Gly Ser Thr
65 70 75 80
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85 90 95
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
100 105 110
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115 120 125
Thr Gly Gln Asn Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val
145 150 155 160
Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile
165 170 175
Asn Ser Arg Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
180 185 190
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195 200 205
Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ser Lys
210 215 220
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Pro Gly Cys Leu Leu Ser Ala Leu Arg
245 250 255
Ser Ala Asp Tyr Arg Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
275 280 285
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
290 295 300
Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Pro Met Thr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly
305 310 315 320
Lys Gly Leu Glu Ser Val Ser Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asp Arg Pro
325 330 335
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
340 345 350
Ala Lys Asn Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
355 360 365
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Arg Thr Leu Thr Gly Gln
370 375 380
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro
385 390 395 400
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
405 410 415
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
420 425 430
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
435 440 445
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
450 455 460
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
465 470 475 480
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
485 490 495
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
500 505 510
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
515 520 525
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
530 535 540
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
545 550 555 560
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
565 570 575
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
580 585 590
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
595 600 605
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
610 615
<210> 227
<211> 1854
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AIO-2C1 CAR (核酸)
<400> 227
atggcgcttc cggtgacggc actgctgctg cccctggctt tgctactaca cgccgcccgc 60
cctcagatcc agctggtgga gagcggcggc ggactggtgc agccgggagg ctcgctgcgt 120
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gcccccggga agggcctcga gagcgtttcc gacatcactt ctggagggga caggccctat 240
tacgcggaca gcgtcaaggg aaggtttacc atctcgcgcg acaacgcgaa gaacatgctg 300
tacctggaga tgaatagtct gaagaccgaa gatactgcgg tgtactactg tgctacctgg 360
gaccgcaccc tgactggaca gggcacccag gtcacagtct cctctggcgg cggcgggtcg 420
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acctgcactg tatcgggtgc ttctatcacc acaggcgagt tctattggaa ttggttcaga 540
cagccacctg gcaaaggtct ggagtggatg ggcgccatcg cagctagcgg ctccaccacc 600
tactccccct cttttgagag ccgtaccagc atctctcggg acacctccga gaaccagttc 660
tacctgcagc tgtcctcggt cactcccgag gacacagccg tgtactattg tgggcgctcc 720
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tcgtccggtg gtggtggctc ccaggttcaa ttggtggaga gtggtggcgg ctctgtgcag 840
gccggcggtt ctctgcgcct gtcatgcggg gcctcgggca acattaactc ccgcaactgc 900
atggggtggt tccgccaggc cccgggcaag gagcgcgagg gcgtcgctgc tatcggtcag 960
gtcaccggtc gcagctacta cgtggattct gttaaaggcc gcttcacgat ttctctcgat 1020
aacgccaaga acacgctcta cttgcagatg aacacgctca agcctgaaga caccgcgatg 1080
tattactgtg ccgcagcgcc ggggtgcctg ctgtccgccc tgcgtagtgc cgactaccgg 1140
aactggggcc aggggaccca ggtgaccgtg tcctccacta gtaccacgac gccagcgccg 1200
cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg 1260
tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc 1320
tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc 1380
ctttactgca aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga 1440
ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 1500
ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 1560
ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1620
gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 1680
gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1740
atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 1800
gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ctaa 1854
<210> 228
<211> 1884
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AIO-2C2 CAR (核酸)
<400> 228
atggcccttc cggtgactgc tctgctgctg cccctggcgc tgctgctcca cgccgctcgc 60
cctcagatcc agctggtgga gagcggaggc ggcttggtgc agccgggcgg ctccctgcgc 120
ctgtcatgcg ccgcttccgg cttcaccttt tcaaactacc cgatgacctg gctacgacag 180
gcccccggca aaggcctgga gagcgtgtct gacatcactt cgggggggga caggccctat 240
tacgcggaca gcgtcaaagg tcgcttcacc atctctcgcg acaacgccaa gaacatgctg 300
tacctcgaga tgaactccct gaagaccgag gacacggcag tctactactg tgccacctgg 360
gaccgcaccc tgaccggaca gggcacgcag gtcactgtct cctccggtgg cggaggatct 420
ggtggtggtg gctccgaggt gcaactggtg gagagtgggc cgggcttagt taagcccagt 480
cagactctga gcctcacctg taccgtgtcc ggtgcgagca tcaccaccgg cgagttctat 540
tggaactggt tccgccagcc acccggtaag ggcctggaat ggatgggcgc cattgcagcg 600
tctgggtcta ctacctactc cccatccttc gagagccgta caagtatctc gcgggacacc 660
tccgagaacc agttctactt gcagctttct tctgtgacac ctgaggacac cgccgtgtac 720
tactgtgggc gcagttttgg cgttgctgcc gttacgaccg gtcagaaccg cggacagggt 780
acccaggtaa ccgtctcctc cggcggtggg ggctccggag gcggaggctc ccaggtgcaa 840
ctggtggagt ctggtggagg gtcggtgcag gccggcggca gcttgcgttt gtcatgcggg 900
gcctcgggca acattaactc ccgcaactgc atggggtggt tcagacaggc tcctggcaag 960
gagcgcgagg gcgtggcggc catcggccag gtcaccggcc gctcgtacta cgtggattct 1020
gtgaagggtc gttttaccat cagcctggat aacgctaaga atactcttta cctgcagatg 1080
aacacactca agcctgaaga tacggctatg tattactgtg ctgctgcgcc cgggtgcctg 1140
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tcgtccacta gtaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 1260
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ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca aacggggcag aaagaaactc 1440
ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1500
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aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1620
ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1680
gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1740
aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1800
cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1860
atgcaggccc tgccccctcg ctaa 1884
<210> 229
<211> 1914
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AIO-2C3 CAR (核酸)
<400> 229
atggctctgc ccgtgacggc cttgctgctg ccacttgcac tgctgctgca cgccgcacgg 60
cctcagatcc agctggtaga gtctggaggg ggtctggtgc agccgggagg ctccctgcgt 120
ttgtcttgtg ccgcatcggg cttcacgttc agcaactacc ctatgacctg gctgcgtcag 180
gctccgggca aaggccttga gagcgtttcc gacatcacgt cgggggggga ccgcccctat 240
tacgcggaca gcgtgaaggg ccgtttcacc atctcccggg acaacgccaa gaatatgctg 300
tacctggaga tgaactccct caagaccgag gacaccgccg tctactactg tgctacctgg 360
gatcgaactc tgaccggcca gggcacccag gtcaccgtct cttctggtgg cggcggcagt 420
ggcggcggtg gttccggagg cggcggcagc gaggtgcagt tggtggagtc tggccctggc 480
ctggttaagc ccagtcagac tctttccctc acctgcaccg tgtccggcgc ctcaattacc 540
acaggcgagt tctattggaa ttggttccgc cagcccccag gaaaggggct ggagtggatg 600
ggcgccatcg cggcctccgg ctctacgacc tactccccct cttttgagag ccggaccagc 660
atctctcgcg acacctcgga gaaccagttt tatctccagc tctcctctgt aactccggaa 720
gatacagccg tgtactactg cgggaggtcc ttcggtgtgg cggcggtgac tacaggacag 780
aaccgcggtc agggcaccca ggtcactgtc tcctcgggtg ggggcggctc cggtggaggc 840
ggtagcggag gcgggggcag ccaggtgcag ctggtggaaa gtggtggcgg ctccgtgcaa 900
gccggaggtt cattacgcct gtcctgtggc gcttccggca acattaactc ccgcaactgc 960
atgggctggt tccgccaggc tcccgggaag gagagagagg gcgtggctgc gatcggtcaa 1020
gtgaccggtc gcagctacta cgtggattct gtcaaaggga ggtttaccat ctcgctggac 1080
aacgctaaga acacgcttta cttgcagatg aacactctga agcctgaaga caccgccatg 1140
tattactgtg cggcggcccc ggggtgcctg ctctctgctc tacgctcggc ggactaccgc 1200
aactgggggc agggaaccca ggtcaccgtg agcagcacta gtaccacgac gccagcgccg 1260
cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg 1320
tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc 1380
tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc 1440
ctttactgca aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga 1500
ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 1560
ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 1620
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gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 1740
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AIO-6C1 CAR (核酸)
<400> 243
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cctgaagtgc agttggtgga gtctgggggc ggcttagtgc aggctggcgg ttctctccgc 120
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gccccaggta aggagaggga gttcgtcgcg gtggtggatt ggtctggagg gtcgccctat 240
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tacctacaga tgaactccct taaacctgaa gatactgccg tgtactactg tgctggccgc 360
gttcaatacg gctcaagttg gtctggtgat tattggggcc agggcaccca ggtgactgtg 420
agcagcggcg gaggcggaag ccaggtccag ctggtggaga gcgggggggg ctcggttcag 480
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atgggctggt tccgccaggc cccgggcaag gagcgcgagg gcgtcgcagc tatcggtcag 600
gtcaccggcc ggtcttacta cgtggacagt gtgaaaggcc gttttacaat ctccctggac 660
aacgcgaaga acactctgta cttgcagatg aacacgctga agccggaaga cactgccatg 720
tattactgtg ccgctgctcc ggggtgcctg ctgtccgccc tgcgcagcgc ggactaccgg 780
aactggggcc aaggcaccca ggttaccgtg tcctcaggtg gtggtgggag cgaggtgcag 840
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ttcaaacaac catttatgag accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc 1500
cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt gaactgagag tgaagttcag caggagcgca 1560
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agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 1680
ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 1740
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ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 1860
ctgccccctc gctaa 1875
<210> 244
<211> 1905
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AIO-6C2 CAR (核酸)
<400> 244
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<210> 245
<211> 1935
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AIO-6C3 CAR (核酸)
<400> 245
atggccctcc cggtgactgc gctgctgctg cccctggccc tactgcttca cgccgctagg 60
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<210> 246
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AIO-6C4 CAR (核酸)
<400> 246
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<210> 247
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AIO-7C1 CAR (核酸)
<400> 247
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gacacggccg tgtactactg tgccacctgg gaccgcacac ttaccggtca ggggacccag 780
gtcaccgtgt cgtcgggcgg cggcggttct gaggtgcagc tggtagagag tggtcctggt 840
ctagtcaagc cttcacagac gctatccctg acctgcaccg tgtccggtgc ttctatcacc 900
accggcgagt tctattggaa ttggttccgc cagccgccgg gaaagggcct cgagtggatg 960
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<210> 248
<211> 1884
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AIO-7C2 CAR (核酸)
<400> 248
atggccctgc cggtgactgc tctacttctg cccctggcgc tgctgctcca cgccgcccgc 60
cctcaggtgc agctggtgga gagcggagga ggttctgtgc aggccggcgg ttctctgcgc 120
ctgagttgtg gtgcatcggg caacattaac agccggaact gcatgggatg gttcagacag 180
gcccccggca aggagcgcga gggcgtggct gctatcggtc aggtcaccgg tcgcagctac 240
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<210> 249
<211> 1914
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AIO-7C3 CAR (核酸)
<400> 249
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ctgtcatgcg gggcctcggg caacattaac agccgcaact gcatggggtg gttccgccag 180
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gaccgcaccc tgactggaca aggcacccag gttaccgtgt ccagcggggg tggaggaagc 840
ggtggtggcg gtagcggcgg cggcggctcg gaggtgcagc tggtggagtc tggccctgga 900
ctcgttaaac cgtcccagac gctttctctg acctgcactg tatctggagc atctatcacc 960
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tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc 1440
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ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 1560
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gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 1740
gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1800
atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 1860
gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ctaa 1914
<210> 250
<211> 1944
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AIO-7C4 CAR (核酸)
<400> 250
atggccctgc cggtgacggc cctacttctg cccctggcgc tgctgctgca cgccgccagg 60
cctcaggtcc aactggtgga gagcggcggc ggttccgtgc aggccggcgg ctcgttgcgt 120
ctgagctgtg gggcttccgg caacattaac tcccgcaact gcatggggtg gttccgccag 180
gctcccggca aggagcgcga gggcgtcgca gctatcggtc aggtcactgg tcggagctac 240
tacgtggact ccgtaaaagg ccgttttacc atctctttgg acaacgccaa gaacacgctg 300
tacctgcaga tgaacactct caagcctgag gataccgcca tgtattactg tgccgcggcg 360
cccgggtgcc tgctgtccgc tctgcgctcg gccgattacc ggaattgggg ccagggcacc 420
caggtcaccg tgagctcggg tggcggaggc tccgggggtg gaggctccgg cggagggggc 480
tctgggggcg gtggatctca aattcagttg gtggagagcg gcggtgggct ggtgcagcca 540
gggggtagcc tgcgcttgtc ttgcgccgcg tctggcttca cattttcaaa ctaccccatg 600
acctggttac gacaggcccc tggcaagggc ctcgagagcg tgtccgacat cacgagcggt 660
ggggacaggc cctattacgc ggactctgtg aagggccgct tcaccatctc tcgtgacaat 720
gctaaaaaca tgctttacct ggagatgaac tccttgaaga ccgaggacac cgccgtgtac 780
tactgtgcta cctgggaccg caccctcacc ggccagggca cccaggtgac tgtatcctcc 840
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> huAIO-267 CAR (核酸)
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<220>
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gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 1680
gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1740
atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 1800
gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ctaa 1854
<210> 279
<211> 1854
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huAIO-667 CAR (核酸)
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atggccctgc ctgtgactgc gctcctgctg cccctggccc tgcttttgca cgccgctcgt 60
cctcaggtgc agttgcagga gagcgggccc gggctggtaa agcccagcca gactctgtcc 120
ttgacctgca ctgtatctgg tgcttccatc acgaccggcg agttctattg gaactggttc 180
cgccagccac ccggcaaggg ccttgaatgg atgggcgcca tcgcggcttc tggctcgacc 240
acctactccc cctcttttga gagccgcacc agcatctccc gggacacctc caaaaaccag 300
ttctcgctga agctgagttc cgtgacggcc gcggacactg ccgtgtacta ctgcgggcgc 360
tccttcggcg tcgcagccgt caccacagga cagaaccgcg gacagggaac tctggttacg 420
gtaagctcgg gaggcggtgg ctcccaggtc cagctggtgg agagcggagg tggtgtggtg 480
cagccgggac gcagccttcg cctttcgtgt gctgcgtccg gcaacattaa ttcccgcaac 540
tgcatgggct ggttcagaca ggccccagga aaaggcaggg agggcgtggc tgccatcggt 600
caggtcactg gccggagcta ctacgtggat tctgtgaagg gtagattcac catctctctg 660
gacaactcca agaacacgct ttacctgcag atgaactccc tgcgcgccga agataccgcc 720
gtgtactact gtgcggcggc ccctgggtgc ctgctctcgg cgctgcgctc tgcggactac 780
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cagctggtgg agagtggggg cggcctagtg cagccgggcg gctccctgcg cctgtcatgc 900
gccgcttcgg gcttcacgtt ctcgaactac ccgatgacct ggctccgcca ggccccgggc 960
aaaggtctgg agtccgtgtc cgacatcacc agtgggggtg ataggcccta ttacgcggac 1020
agtgtcaagg gccgcttcac catctcgcgc gacaacgcca agaatatgct gtacctccag 1080
atgaactcct tacgggccga ggacacagcg gtgtactact gtgccacctg ggacaggacc 1140
ctgaccggcc agggcaccct ggtgaccgtg agctccacta gtaccacgac gccagcgccg 1200
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tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc 1320
tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc 1380
ctttactgca aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga 1440
ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 1500
ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 1560
ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1620
gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 1680
gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1740
atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 1800
gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ctaa 1854
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
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Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
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Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
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Ser Ser
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Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser
115 120 125
Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys
130 135 140
Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln
145 150 155 160
Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn
165 170 175
Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr
180 185 190
Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr
195 200 205
Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly
210 215 220
Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser
180 185 190
Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-623的CDR1 (Kabat)
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Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr Ala
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-623的CDR2 (Kabat)
<400> 284
Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ala Val Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 285
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-623的CDR3 (Kabat)
<400> 285
Gly Ile Tyr Tyr Gly Ser Asn Trp Ser Ser Glu Asn
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-623的CDR1 (IMGT)
<400> 286
Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Ala Gly
1 5 10
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-623的CDR2 (IMGT)
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Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Pro
1 5
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-623的CDR3 (IMGT)
<400> 288
Ala Ala Gly Ile Tyr Tyr Gly Ser Asn Trp Ser Ser Glu Asn
1 5 10
<210> 289
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-640的CDR1 (Kabat)
<400> 289
Gly Tyr Thr Trp Gln Thr Tyr Cys Met Ala
1 5 10
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-640的CDR2 (Kabat)
<400> 290
Val Ala Thr Gly Ser Arg Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 291
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-640的CDR3 (Kabat)
<400> 291
Asp Pro Arg Arg Tyr Gly Ser Cys Pro Leu Ser Ala Ala Asn Phe Asn
1 5 10 15
Asn
<210> 292
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-640的CDR1 (IMGT)
<400> 292
Gly Tyr Thr Trp Gln Thr Tyr Cys
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-640的CDR2 (IMGT)
<400> 293
Val Ala Thr Gly Ser Arg Thr Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-640的CDR3 (IMGT)
<400> 294
Ala Ala Asp Pro Arg Arg Tyr Gly Ser Cys Pro Leu Ser Ala Ala Asn
1 5 10 15
Phe Asn Asn
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-657的CDR1 (Kabat)
<400> 295
Ala Asn Ile Arg Val Phe Tyr Leu Met Gly
1 5 10
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-657的CDR2 (Kabat)
<400> 296
Arg Val Asn Ala Asp Gly Ile Thr Asn His Ala Ala Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-657的CDR3 (Kabat)
<400> 297
Gly Arg Thr Trp Asn Ser Gly Phe Glu Tyr
1 5 10
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-657的CDR1 (IMGT)
<400> 298
Ala Asn Ile Arg Val Phe Tyr Leu
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-657的CDR2 (IMGT)
<400> 299
Val Asn Ala Asp Gly Ile Thr
1 5
<210> 300
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-657的CDR3 (IMGT)
<400> 300
Ala Thr Gly Arg Thr Trp Asn Ser Gly Phe Glu Tyr
1 5 10
<210> 301
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-623 (氨基酸)
<400> 301
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ile Tyr Tyr Gly Ser Asn Trp Ser Ser Glu Asn Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 302
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-640 (氨基酸)
<400> 302
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Trp Gln Thr Tyr
20 25 30
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Val Ala Thr Gly Ser Arg Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Tyr Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Pro Arg Arg Tyr Gly Ser Cys Pro Leu Ser Ala Ala Asn Phe
100 105 110
Asn Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 303
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-657 (氨基酸)
<400> 303
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gln Ala Ser Ala Asn Ile Arg Val Phe Tyr
20 25 30
Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val
35 40 45
Ala Arg Val Asn Ala Asp Gly Ile Thr Asn His Ala Ala Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Glu Asp Ser Pro Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Thr Gly Arg Thr Trp Asn Ser Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 304
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-623 (核酸)
<400> 304
caggtaaagc tggaggagag cggaggtggt ctggtgcaag ccggcggctc cctccgtctt 60
tcatgcgccg cttccggacg aacattttca aattatgcgg ctgggtggtt ccgccaggcc 120
ccgggcaagg agcgcgagtt cgtcgcagcc attagctggt ctggtggctc cccctattac 180
gcggacgccg tgcgcgggcg cttcaccatc tctcgggaca acgcgaaaaa cacggtgtac 240
ctgcagatga actccctgaa gccagaagat accgccgttt actactgtgc tgcaggcatc 300
tactacggca gcaactggtc ttcggagaac tggggccagg gcacccaggt caccgtgtcg 360
tcc 363
<210> 305
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-640 (核酸)
<400> 305
caggtgaagc tggtggagag cggagggggt tccgtgcagg ccggcggatc gctgcggttg 60
tcctgtgccg cttctggcta cacctggcaa acgtactgca tggcttggtt ccgccaggct 120
cccgggaagg agagggaggg cgtagctgtg gcgactggtt cccgcaccac aagctacgcg 180
gacagtgtta aaggccgttt taccatctcc aaggactatg ccaagaatac tctgtacctg 240
cagatgtctt ctctggagcc tgaagatacc gccatgtatt actgtgctgc ggacccgcgc 300
cgctacggct catgcccact cagcgcagcc aacttcaaca actggggcca gggcacccag 360
gtcaccgtgt cctcg 375
<210> 306
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-657 (核酸)
<400> 306
caggtgcagc tggtggagag cggagggggc tccgctcagg ccggaggctc gctgcgccta 60
tcatgccagg cctccgccaa cattcgagtg ttctacttga tgggctggtt ccgccaggcg 120
ccggggaagg agagggagga ggtggctcgc gtcaacgcgg acggcatcac caaccatgca 180
gcctccgtaa agggccgctt caccatctct gaggacagtc caaaaaacac tctttatctg 240
cagatggatt ctctgaagcc tgaagacacc gccgtgtact actgtgccac gggtcggacc 300
tggaactccg gttttgagta ctggggccag ggcacccagg tcactgtgag ctcg 354
<210> 307
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-131的CDR2 (Kabat)
<400> 307
Gly Ile Gly Gln Val Thr Gly Arg Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 308
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-131 (氨基酸)
<400> 308
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gly Ala Ser Gly Asn Ile Asn Ser Arg Asn
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Gln Val Thr Gly Arg Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ala Lys Asn Met Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Pro Gly Cys Leu Leu Ser Ala Leu Arg Ser Ala Asp Tyr
100 105 110
Arg Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 309
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-131 (核酸)
<400> 309
caggtgcagc tggtggagag cggaggaggc tccgtgcagg ccggcggctc cctgcgcctg 60
tcatgcgggg cttccggcaa cattaactcc cgcaactgca tgggctggtt ccgccaggcc 120
cccggcaagg agcgcgaggg cgtggctggc atcggtcagg tcaccggccg cagctactac 180
gcggacagcg tgaagggccg cttcaccatc tctctggaca acgccaagaa catgctgtac 240
ctgcagatga acacgctgaa gcctgaagac accgccatgt attactgtgc cgcggctccc 300
gggtgcctgc tgagcgcgct ccgtagtgcg gactacagga attggggcca gggcacccag 360
gtcaccgtgt cgtcc 375
<210> 310
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-273,VHH-283、huVHH-253、huVHH-256的CDR1 (具有5aa的Kabat)
<400> 310
Ser Tyr Asn Met Gly
1 5
<210> 311
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-313和huVHH-260的CDR1 (具有5aa的Kabat)
<400> 311
Ser Tyr Ser Met Gly
1 5
<210> 312
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-440、VHH-653、VHH-466、huVHH-836、
huVHH-840、huVHH-843、huVHH-846和VHH-657的CDR1 (具有5aa的Kabat)
<400> 312
Phe Tyr Leu Met Gly
1 5
<210> 313
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-496、huVHH-746和huVHH-750、
huVHH-753的CDR1 (具有5aa的Kabat)
<400> 313
Asn Tyr Pro Met Thr
1 5
<210> 314
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-623的CDR1 (具有5aa的Kabat)
<400> 314
Asn Tyr Ala Ala Gly
1 5
<210> 315
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-640的CDR1 (具有5aa的Kabat)
<400> 315
Thr Tyr Cys Met Ala
1 5
<210> 316
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-083和VHH-131的CDR1 (具有5aa的Kabat)
<400> 316
Arg Asn Cys Met Gly
1 5
<210> 317
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-111的CDR1 (具有5aa的Kabat)
<400> 317
Asn Lys Trp Met Gly
1 5
<210> 318
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-18 CDR1 (具有5aa的Kabat)
<400> 318
Ser Val Ser Met Gly
1 5
<210> 319
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-66 CDR1 (具有31-35的Kabat)
<400> 319
Thr Gly Glu Phe Tyr Trp Asn
1 5
<210> 320
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-87 CDR1 (具有5aa的Kabat)
<400> 320
Thr Tyr Cys Met Gly
1 5
<210> 321
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-90 CDR1 (具有5aa的Kabat)
<400> 321
Arg Tyr Cys Met Gly
1 5
<210> 322
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-102 CDR1 (具有5aa的Kabat)
<400> 322
Gly Tyr Cys Leu Ala
1 5
<210> 323
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH-105 CDR1 (具有31-35的Kabat)
<400> 323
Val Ser Ile Ala
1

Claims (48)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
(a)包含抗CD20单结构域抗体(sdAb)、抗CD19 sdAb和抗CD22sdAb的细胞外抗原结合结构域；
(b)跨膜结构域；和
(c)细胞内信号传导结构域，
其中所述抗CD20 sdAb靠近所述跨膜结构域的程度比所述抗CD19 sdAb或所述抗CD22sdAb靠近所述跨膜结构域的程度更高。
2.如权利要求1所述的CAR，其中所述抗CD19 sdAb在所述抗CD22 sdAb的N-末端。
3.如权利要求1所述的CAR，其中所述抗CD19 sdAb在所述抗CD22 sdAb的C-末端。
4.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
(a)包含抗CD20单结构域抗体(sdAb)、抗CD19 sdAb和抗CD22sdAb的细胞外抗原结合结构域；
(b)跨膜结构域；和
(c)细胞内信号传导结构域，
其中所述抗CD19 sdAb靠近所述跨膜结构域的程度比所述抗CD20 sdAb或所述抗CD22sdAb靠近所述跨膜结构域的程度更高。
5.如权利要求4所述的CAR，其中所述抗CD20 sdAb在所述抗CD22 sdAb的N-末端。
6.如权利要求4所述的CAR，其中所述抗CD20 sdAb在所述抗CD22 sdAb的C-末端。
7.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
(a)包含抗CD20单结构域抗体(sdAb)、抗CD19 sdAb和抗CD22sdAb的细胞外抗原结合结构域；
(b)跨膜结构域；和
(c)细胞内信号传导结构域，
其中所述抗CD22 sdAb靠近所述跨膜结构域的程度比所述抗CD19 sdAb或所述抗CD20sdAb靠近所述跨膜结构域的程度更高。
8.如权利要求7所述的CAR，其中所述抗CD19 sdAb在所述抗CD20 sdAb的N-末端。
9.如权利要求7所述的CAR，其中所述抗CD19 sdAb在所述抗CD20 sdAb的C-末端。
10.如权利要求1至9中任一项所述的CAR，其中所述抗CD20sdAb、所述抗CD19 sdAb和所述抗CD22 sdAb直接或经由一个或多个肽接头彼此融合；且其中所述一个或多个肽接头包含不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸。
11.如权利要求10所述的CAR，其中所述一个或多个肽接头是(GGGGS)n，n是1、2、3或4。
12.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
(a)包含抗CD20单结构域抗体(sdAb)、抗CD19 sdAb和抗CD22sdAb的细胞外抗原结合结构域；
(b)跨膜结构域；和
(c)细胞内信号传导结构域；
其中所述抗CD20 sdAb、所述抗CD19 sdAb和所述抗CD22 sdAb直接或经由一个或多个肽接头彼此融合；且
其中所述一个或多个肽接头包含不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸。
13.如权利要求12所述的CAR，其中所述一个或多个肽接头是(GGGGS)n，n是1、2、3或4。
14.如权利要求1至13中任一项所述的CAR，其中：
(I)所述抗CD20 sdAb包含：
(i)包含SEQ ID NO:1或310的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3；
(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR3；
(iii)包含SEQ ID NO:1或310的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3；
(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR3；
(v)包含SEQ ID NO:11或311的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3；
(vi)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR3；
(vii)包含SEQ ID NO:14或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；
(viii)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3；
(ix)包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；
(x)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3；
(xi)包含SEQ ID NO:24或313的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR3；
(xii)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:28的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR3；
(xiii)包含SEQ ID NO:14或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；
(xiv)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:31的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3；
(xv)包含SEQ ID NO:1或310的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3；
(xvi)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:33的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR3；
(xvii)包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；
(xviii)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3；
(xix)包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；
(xx)包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；或
(xxi)包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；
(xxii)包含SEQ ID NO:283或314的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:284的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:285的氨基酸序列的CDR3；
(xx)包含SEQ ID NO:286的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:287的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:288的氨基酸序列的CDR3；
(xxi)包含SEQ ID NO:289或315的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:290的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:291的氨基酸序列的CDR3；
(xxii)包含SEQ ID NO:292的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:293的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:294的氨基酸序列的CDR3；
(xxiii)包含SEQ ID NO:295或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:296的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:297的氨基酸序列的CDR3；或
(xxiv)包含SEQ ID NO:298的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:299的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:300的氨基酸序列的CDR3；
(II)所述抗CD19 sdAb包含：
(i)包含SEQ ID NO:73或316的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR3；
(ii)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3；
(iii)包含SEQ ID NO:79或317的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR3；
(iv)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:83的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的CDR3；
(v)包含SEQ ID NO:73或316的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:307的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR3；或
(vi)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:77的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3；
(III)所述抗CD22 sdAb包含：
(i)包含SEQ ID NO:93或318的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR3；
(ii)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR3；
(iii)包含SEQ ID NO:99或319的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR3；
(iv)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:103的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR3；
(v)包含SEQ ID NO:105或320的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR3；
(vi)包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:109的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的CDR3；
(vii)包含SEQ ID NO:111或321的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR3；
(viii)包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:115的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR3；
(ix)包含SEQ ID NO:117或322的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR3；
(x)包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:121的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR3；
(xi)包含SEQ ID NO:123或323的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR3；或
(xii)包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:127的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR3。
15.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
(a)包含抗CD20单结构域抗体(sdAb)、抗CD19 sdAb和抗CD22sdAb中的至少两者的细胞外抗原结合结构域；
(b)跨膜结构域；和
(c)细胞内信号传导结构域，
其中：
(I)所述抗CD20 sdAb包含：
(i)包含SEQ ID NO:1或310的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3；
(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR3；
(iii)包含SEQ ID NO:1或310的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3；
(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR3；
(v)包含SEQ ID NO:11或311的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3；
(vi)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR3；
(vii)包含SEQ ID NO:14或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；
(viii)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3；
(ix)包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；
(x)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3；
(xi)包含SEQ ID NO:24或313的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR3；
(xii)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:28的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR3；
(xiii)包含SEQ ID NO:14或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；
(xiv)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:31的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3；
(xv)包含SEQ ID NO:1或310的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3；
(xvi)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:33的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR3；
(xvii)包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；
(xviii)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3；
(xix)包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；
(xx)包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；
(xxi)包含SEQ ID NO:20或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；或
(xxii)包含SEQ ID NO:283或314的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:284的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:285的氨基酸序列的CDR3；
(xx)包含SEQ ID NO:286的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:287的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:288的氨基酸序列的CDR3；
(xxi)包含SEQ ID NO:289或315的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:290的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:291的氨基酸序列的CDR3；
(xxii)包含SEQ ID NO:292的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:293的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:294的氨基酸序列的CDR3；
(xxiii)包含SEQ ID NO:295或312的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:296的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:297的氨基酸序列的CDR3；或
(xxiv)包含SEQ ID NO:298的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:299的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:300的氨基酸序列的CDR3；
(II)所述抗CD19 sdAb包含：
(i)包含SEQ ID NO:73或316的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR3；
(ii)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3；
(iii)包含SEQ ID NO:79或317的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR3；
(iv)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:83的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的CDR3；
(v)包含SEQ ID NO:73或316的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:307的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR3；或
(vi)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:77的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3；
(III)所述抗CD22 sdAb包含：
(i)包含SEQ ID NO:93或318的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR3；
(ii)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR3；
(iii)包含SEQ ID NO:99或319的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR3；
(iv)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:103的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR3；
(v)包含SEQ ID NO:105或320的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR3；
(vi)包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:109的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的CDR3；
(vii)包含SEQ ID NO:111或321的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR3；
(viii)包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:115的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR3；
(ix)包含SEQ ID NO:117或322的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR3；
(x)包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:121的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR3；
(xi)包含SEQ ID NO:123或323的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR3；或
(xii)包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:127的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR3。
16.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
(a)包含抗CD20单结构域抗体(sdAb)、抗CD19 sdAb和抗CD22sdAb中的至少两者的细胞外抗原结合结构域；
(b)跨膜结构域；和
(c)细胞内信号传导结构域，
其中：
(I)所述抗CD20 sdAb包含：
(i)分别具有如SEQ ID NO:39中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(ii)分别具有如SEQ ID NO:40中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(iii)分别具有如SEQ ID NO:41中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(iv)分别具有如SEQ ID NO:42中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(v)分别具有如SEQ ID NO:43中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(vi)分别具有如SEQ ID NO:44中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(vii)分别具有如SEQ ID NO:45中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(viii)分别具有如SEQ ID NO:46中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(ix)分别具有如SEQ ID NO:47中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(x)分别具有如SEQ ID NO:48中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(xi)分别具有如SEQ ID NO:49中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(xii)分别具有如SEQ ID NO:50中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(xiii)分别具有如SEQ ID NO:51中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(xiv)分别具有如SEQ ID NO:52中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(xv)分别具有如SEQ ID NO:53中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(xvi)分别具有如SEQ ID NO:54中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(xvii)分别具有如SEQ ID NO:55中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(xviii)分别具有如SEQ ID NO:301中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(xix)分别具有如SEQ ID NO:302中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；或
(xx)分别具有如SEQ ID NO:303中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(II)所述抗CD19 sdAb包含：
(i)分别具有如SEQ ID NO:85中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(ii)分别具有如SEQ ID NO:86中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(iii)分别具有如SEQ ID NO:87中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(iv)分别具有如SEQ ID NO:88中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；或
(v)分别具有如SEQ ID NO:308中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；且
(III)所述抗CD22 sdAb包含：
(i)分别具有如SEQ ID NO:129中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(ii)分别具有如SEQ ID NO:130中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(iii)分别具有如SEQ ID NO:131中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(iv)分别具有如SEQ ID NO:132中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(v)分别具有如SEQ ID NO:133中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(vi)分别具有如SEQ ID NO:134中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；或
(vii)分别具有如SEQ ID NO:135中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
17.如权利要求16所述的CAR，其中所述CDR1、CDR2或CDR3是根据Kabat编号方案、IMGT编号方案、AbM编号方案、Chothia编号方案、Contact编号方案或它们的组合确定的。
18.如权利要求15至17中任一项所述的CAR，其中所述CAR包含：(1)所述抗CD20 sdAb和所述抗CD19 sdAb；(2)所述抗CD20sdAb和所述抗CD22 sdAb；(3)所述抗CD19 sdAb和所述抗CD22sdAb；或(4)所述抗CD20 sdAb、所述抗CD19 sdAb和所述抗CD22sdAb。
19.如权利要求1至18中任一项所述的CAR，其中所述抗CD20sdAb、所述抗CD19 sdAb和所述抗CD22 sdAb各自独立地为骆驼科sdAb或人源化sdAb。
20.如权利要求1至19中任一项所述的CAR，其中：
(I)所述抗CD20 sdAb包含SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:301、SEQ ID NO:302或SEQ ID NO:303的氨基酸序列；
(II)所述抗CD19 sdAb包含SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:308的氨基酸序列；且
(III)所述抗CD22 sdAb包含SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ IDNO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134或SEQ ID NO:135的氨基酸序列。
21.如权利要求1至19中任一项所述的CAR，其中：
(I)所述抗CD20 sdAb包含与SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:301、SEQ ID NO:302或SEQ ID NO:303的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的氨基酸序列；
(II)所述抗CD19 sdAb包含与SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ IDNO:88或SEQ ID NO:308的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的氨基酸序列；且
(III)所述抗CD22 sdAb包含与SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134或SEQ ID NO:135的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的氨基酸序列。
22.如权利要求1至21中任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域来源于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。
23.如权利要求22所述的CAR，其中所述跨膜结构域来源于CD8α。
24.如权利要求1至23中任一项所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级细胞内信号传导结构域。
25.如权利要求24所述的CAR，其中所述初级细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ。
26.如权利要求24或权利要求25所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域进一步包含共刺激信号传导结构域。
27.如权利要求26所述的CAR，其中所述共刺激信号传导结构域来源于选自由CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组的共刺激分子。
28.如权利要求27所述的CAR，其中所述共刺激信号传导结构域来源于CD137。
29.如权利要求1至28中任一项所述的CAR，其进一步包含位于所述细胞外抗原结合结构域的C-末端与所述跨膜结构域的N-末端之间的铰链结构域。
30.如权利要求29所述的CAR，其中所述铰链结构域来源于CD8α。
31.如权利要求1至30中任一项所述的CAR，其进一步包含位于多肽的N-末端的信号肽。
32.如权利要求31所述的CAR，其中所述信号肽来源于CD8α。
33.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含(i)选自由SEQ ID NO:174-226组成的组的氨基酸序列；或(ii)与选自由SEQ ID NO:174-226组成的组的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的氨基酸序列。
34.一种分离的核酸，其包含编码权利要求1至33中任一项所述的CAR的核酸序列。
35.一种载体，其包含权利要求34所述的分离的核酸。
36.一种工程化免疫效应细胞，其包含权利要求1至33中任一项所述的CAR、权利要求34所述的分离的核酸或权利要求35所述的载体。
37.如权利要求36所述的工程化免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞是T细胞或B细胞。
38.一种药物组合物，其包含权利要求36或权利要求37所述的工程化免疫效应细胞或权利要求35所述的载体和药学上可接受的赋形剂。
39.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，其包括对所述受试者施用有效量的权利要求36或权利要求37所述的工程化免疫效应细胞或权利要求38所述的药物组合物。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述疾病或病症是B细胞相关疾病或病症、CD19相关疾病或病症、CD20相关疾病或病症和/或CD22相关疾病或病症。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述疾病或病症是B细胞恶性肿瘤。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤是B细胞白血病或B细胞淋巴瘤。
44.如权利要求39所述的方法，其中所述疾病或病症选自由以下组成的组：边缘区淋巴瘤(例如，脾边缘区淋巴瘤)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B细胞幼淋巴细胞性白血病(B-PLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、伯基特淋巴瘤、原发性眼内淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞白血病(HCL)、前体B成淋巴细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、高级B细胞淋巴瘤(HGBL)和多发性骨髓瘤(MM)。
45.如权利要求39所述的方法，其中所述疾病或病症是自身免疫和/或炎性疾病。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述自身免疫和/或炎性疾病与不适当或增高的B细胞数目和/或激活相关。
47.如权利要求39至46中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在对所述受试者施用有效量的所述工程化免疫效应细胞之前检测和/或测量在获自所述受试者的癌细胞上表达的CD19、CD20和/或CD22的水平。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述在获自所述受试者的癌细胞上表达的CD19、CD20和/或CD22的水平决定了对表达适合于治疗所述癌症的CAR的工程化免疫效应细胞的选择。
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