JP2023546764A - Ｃｄ１９結合分子及びその使用 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ＣＤ１９に結合する単一ドメイン抗体、及びそれを含むキメラ抗原受容体を提供する。さらに、キメラ抗原受容体を含む操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）が提供される。疾患または障害を処置する医薬組成物、キット、及び方法も提供される。【選択図】なし

Description

相互参照
本出願は、２０２０年７月１６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１０２４５７号の優先権の恩典を主張し、その内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、２０２１年７月９日に作成された、８５，７２８バイトのサイズを有する「１４６５１－０２５－２２８＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ」という名称の、本出願と共にテキスト形式で提出された配列表を参照により組み込む。
１．分野
本開示は、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体、キメラ抗原受容体、操作された免疫エフェクター細胞、及びそれらの使用方法に関する。本開示は、さらに、治療的使用のための細胞の活性化及び増大、特に、キメラ抗原受容体ベースのＴ細胞免疫療法に関する。
２．背景
ＣＤ１９は、正常なＢ細胞上において、ならびに、大半のＢ細胞悪性腫瘍を含む様々な疾患及び状態の細胞及び組織により、発現される。ＣＤ１９は、Ｂ細胞受容体依存性及び非依存性シグナル伝達の両方を調節することにより、固有のＢ細胞シグナル伝達閾値の確立に大いに関与する。ＣＤ１９は、成熟Ｂ細胞の表面にある多分子複合体の主要なシグナル伝達コンポーネントとして機能し、体液性抗原誘導応答及び寛容誘導間のバランスを維持する上で重要な役割を果たす。以下を参照：Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．１：３６（２０１２）（非特許文献１）。
抗ＣＤ１９抗体、及び抗ＣＤ１９抗体部分を含有するキメラ抗原受容体、及びそのようなキメラ受容体を発現する細胞を含む様々なＣＤ１９結合分子が利用可能である。キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞療法は、新興の効果的ながん免疫療法である。特に、血液悪性腫瘍では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、有望な結果を達成している。抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖベースの２つのＣＡＲ－Ｔ療法が、ＣＤ１９陽性の白血病またはリンパ腫の処置用に承認されている。しかし、ＣＡＲ－Ｔ細胞の適用は、サイトカイン放出症候群及びオンターゲットオフ腫瘍毒性などの副作用により阻まれる（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ １８（１）：１２５（２０１９）（非特許文献２））。改善されたＣＤ１９結合分子及び操作されたＣＤ１９標的指向性細胞が必要である。例えば、より効果的または効率的なＣＡＲ－Ｔ療法に使用される、安定で小さいサイズのＣＤ１９結合分子を開発する必要がある。
Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．１：３６（２０１２） Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ １８（１）：１２５（２０１９）
３．概要
一態様では、以下を含む、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）が本明細書で提供される：（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（ｉｉ）配列番号２２もしくは１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号２３もしくは１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（ｖ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（ｖｉ）配列番号２４もしくは１１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（ｖｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（ｖｉｉｉ）配列番号２５もしくは１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（ｉｘ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（ｘ）配列番号２６もしくは１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（ｘｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（ｘｉｉ）配列番号２７もしくは１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（ｘｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（ｘｉｖ）配列番号２８もしくは１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または（ｘｖ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または（ｘｖｉ）配列番号２２もしくは１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３。
別の態様では、以下を含む、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）が、本明細書で提供される：（ｉ）配列番号４３に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、（ｉｉ）配列番号４４に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、（ｉｉｉ）配列番号４５に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４６に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、（ｖ）配列番号４７に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、（ｖｉ）配列番号４８に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、（ｖｉｉ）配列番号４９に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、（ｖｉｉｉ）配列番号５１に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、（ｉｘ）配列番号５２に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、（ｘ）配列番号５３に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、（ｘｉ）配列番号５４に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、（ｘｉｉ）配列番号５５に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、（ｘｉｉｉ）配列番号５６に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、または、（ｘｉｖ）配列番号１０４に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔナンバリングスキーム、ＩＭＧＴナンバリングスキーム、ＡｂＭナンバリングスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングスキーム、またはそれらの組み合わせに従って決定される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂは、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び／または配列番号１０４に記載の１つ以上のＦＲ領域をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂは、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、または配列番号１０４のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂは、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、または配列番号１０４の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂは、ラマまたはラクダ科動物のｓｄＡｂである。他の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂは、ヒト化ｓｄＡｂである。特定の実施形態では、抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂは、薬剤に、遺伝子的に融合または化学的にコンジュゲートされる。
別の態様では、（ａ）本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、１つ以上の追加の抗原結合ドメイン（複数可）をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、１つの追加の抗原結合ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、２つの追加の抗原結合ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の抗原結合ドメイン（複数可）は、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１２３、ＩＬ－１３Ｒ、ＣＤ１３８、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ Ａ３、及び糖脂質Ｆ７７からなる群より選択される１つ以上の抗原（複数可）に結合する。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来する。
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド及びその組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの特定の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７に由来する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメインをさらに含む。いくつかの特定の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αに由来する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８αに由来する。
別の態様では、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、及び配列番号１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が本明細書で提供される。別の態様では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂをコードする核酸配列を含む単離核酸が本明細書で提供される。
別の態様では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂをコードする核酸配列を含む単離核酸を含むベクターが本明細書で提供される。さらに別の態様では、本明細書で提供されるＣＡＲをコードする核酸配列を含む単離核酸が本明細書で提供される。さらに別の態様では、本明細書で提供されるＣＡＲをコードする核酸配列を含む単離核酸を含むベクターが本明細書で提供される。
さらに別の態様では、本明細書で提供されるＣＡＲ、単離核酸、またはベクターを含む、操作された免疫エフェクター細胞が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞またはＢ細胞である。
さらに別の態様では、抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂ、操作された免疫エフェクター細胞、または本明細書で提供されるベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が、本明細書で提供される。
さらに別の態様では、対象の疾患または障害を処置する方法が本明細書で提供され、方法は、有効量の本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂ、操作された免疫エフェクター細胞、または医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、ＣＤ１９関連の疾患または障害である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、Ｂ細胞関連の疾患または障害である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、がんである。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、Ｂ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、Ｂ細胞白血病またはＢ細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、辺縁帯リンパ腫（例えば、脾辺縁帯リンパ腫）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病（Ｂ－ＰＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、バーキットリンパ腫、原発性眼内リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、前駆Ｂリンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫（ＨＧＢＬ）、及び多発性骨髄腫（ＭＭ）からなる群より選択される。他の実施形態では、疾患または障害は、自己免疫及び／または炎症性疾患である。いくつかの実施形態では、自己免疫及び／または炎症性疾患は、不適切なまたは増加したＢ細胞数及び／または活性化と関連する。
４．図面の簡単な説明
Ａ～Ｃは、ＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞（図１Ａ及び１Ｂ）ならびにｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞（図１Ｃ）の形質導入効率を示す。ＵｎＴは、ＣＡＲで形質導入されていないＴ細胞を指す。 Ａ～Ｃは、ＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞（図１Ａ及び１Ｂ）ならびにｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞（図１Ｃ）の形質導入効率を示す。ＵｎＴは、ＣＡＲで形質導入されていないＴ細胞を指す。 Ａ～Ｃは、ＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞（図１Ａ及び１Ｂ）ならびにｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞（図１Ｃ）の形質導入効率を示す。ＵｎＴは、ＣＡＲで形質導入されていないＴ細胞を指す。 ＣＤ１９陽性細胞株（図２Ａ～２Ｄ）またはＣＤ１９陰性細胞株（図２Ｅ～２Ｇ）に対する、ｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。 ＣＤ１９陽性細胞株（図２Ａ～２Ｄ）またはＣＤ１９陰性細胞株（図２Ｅ～２Ｇ）に対する、ｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。 ＣＤ１９陽性細胞株（図２Ａ～２Ｄ）またはＣＤ１９陰性細胞株（図２Ｅ～２Ｇ）に対する、ｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。 ＣＤ１９陽性細胞株（図２Ａ～２Ｄ）またはＣＤ１９陰性細胞株（図２Ｅ～２Ｇ）に対する、ｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。 ＣＤ１９陽性細胞株（図２Ａ～２Ｄ）またはＣＤ１９陰性細胞株（図２Ｅ～２Ｇ）に対する、ｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。 ＣＤ１９陽性細胞株（図２Ａ～２Ｄ）またはＣＤ１９陰性細胞株（図２Ｅ～２Ｇ）に対する、ｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。 ＣＤ１９陽性細胞株（図２Ａ～２Ｄ）またはＣＤ１９陰性細胞株（図２Ｅ～２Ｇ）に対する、ｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。 ＣＤ１９陽性細胞株（図３Ａ～３Ｄ、３Ｆ、及び３Ｇ）またはＣＤ１９陰性細胞株（図３Ｅ、３Ｈ、及び３Ｉ）に対する、ｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。 ＣＤ１９陽性細胞株（図３Ａ～３Ｄ、３Ｆ、及び３Ｇ）またはＣＤ１９陰性細胞株（図３Ｅ、３Ｈ、及び３Ｉ）に対する、ｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。 ＣＤ１９陽性細胞株（図３Ａ～３Ｄ、３Ｆ、及び３Ｇ）またはＣＤ１９陰性細胞株（図３Ｅ、３Ｈ、及び３Ｉ）に対する、ｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。 ＣＤ１９陽性細胞株（図３Ａ～３Ｄ、３Ｆ、及び３Ｇ）またはＣＤ１９陰性細胞株（図３Ｅ、３Ｈ、及び３Ｉ）に対する、ｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。 ＣＤ１９陽性細胞株（図３Ａ～３Ｄ、３Ｆ、及び３Ｇ）またはＣＤ１９陰性細胞株（図３Ｅ、３Ｈ、及び３Ｉ）に対する、ｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。 ＣＤ１９陽性細胞株（図３Ａ～３Ｄ、３Ｆ、及び３Ｇ）またはＣＤ１９陰性細胞株（図３Ｅ、３Ｈ、及び３Ｉ）に対する、ｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。 ＣＤ１９陽性細胞株（図３Ａ～３Ｄ、３Ｆ、及び３Ｇ）またはＣＤ１９陰性細胞株（図３Ｅ、３Ｈ、及び３Ｉ）に対する、ｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。 ＣＤ１９陽性細胞株（図３Ａ～３Ｄ、３Ｆ、及び３Ｇ）またはＣＤ１９陰性細胞株（図３Ｅ、３Ｈ、及び３Ｉ）に対する、ｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。 ＣＤ１９陽性細胞株（図３Ａ～３Ｄ、３Ｆ、及び３Ｇ）またはＣＤ１９陰性細胞株（図３Ｅ、３Ｈ、及び３Ｉ）に対する、ｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。 異なるＥ：Ｔ比のＤａｕｄｉ．Ｌｕｃ、Ｎａｌｍ．６．Ｌｕｃ、Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ、Ｋ５６２－ＣＤ２０．Ｌｕｃ、またはＫ５６２－ＣＤ２２．Ｌｕｃ細胞と２４時間共培養した後の、ｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γ放出レベルを示す。 異なるＥ：Ｔ比のＤａｕｄｉ．Ｌｕｃ、Ｎａｌｍ．６．Ｌｕｃ、Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ、Ｋ５６２－ＣＤ２０．Ｌｕｃ、またはＫ５６２－ＣＤ２２．Ｌｕｃ細胞と２４時間共培養した後の、ｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γ放出レベルを示す。 異なるＥ：Ｔ比のＤａｕｄｉ．Ｌｕｃ、Ｎａｌｍ．６．Ｌｕｃ、Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ、Ｋ５６２－ＣＤ２０．Ｌｕｃ、またはＫ５６２－ＣＤ２２．Ｌｕｃ細胞と２４時間共培養した後の、ｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γ放出レベルを示す。 Ｒａｊｉ異種移植片ＮＣＧマウスモデルにおける例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す。生物発光イメージング（図５Ａ～５Ｂ）及び体重（図５Ｃ）により、腫瘍増殖を監視するために、マウスを定期的に評価した。 Ｒａｊｉ異種移植片ＮＣＧマウスモデルにおける例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す。生物発光イメージング（図５Ａ～５Ｂ）及び体重（図５Ｃ）により、腫瘍増殖を監視するために、マウスを定期的に評価した。 Ｒａｊｉ異種移植片ＮＣＧマウスモデルにおける例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す。生物発光イメージング（図５Ａ～５Ｂ）及び体重（図５Ｃ）により、腫瘍増殖を監視するために、マウスを定期的に評価した。 抗ＣＤ１９ ＶＨＨ－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂの結合親和性を評価する研究からの例示的な結果を示す。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。 抗ＣＤ１９ ＶＨＨ－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂの結合親和性を評価する研究からの例示的な結果を示す。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。 抗ＣＤ１９ ＶＨＨ－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂの結合親和性を評価する研究からの例示的な結果を示す。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。 ２０：１、１５：１、１０：１、５：１、または２．５：１の異なるエフェクター細胞対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）の４つの細胞株への例示的なヒト化ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔの細胞傷害性を示す。 ２０：１、１５：１、１０：１、５：１、または２．５：１の異なるエフェクター細胞対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）の４つの細胞株への例示的なヒト化ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔの細胞傷害性を示す。 ２０：１、１５：１、１０：１、５：１、または２．５：１の異なるエフェクター細胞対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）の４つの細胞株への例示的なヒト化ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔの細胞傷害性を示す。 ２０：１、１５：１、１０：１、５：１、または２．５：１の異なるエフェクター細胞対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）の４つの細胞株への例示的なヒト化ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔの細胞傷害性を示す。
５．詳細な説明
本開示は、部分的には、ＣＤ１９、キメラ抗原受容体、またはそれを含む操作された細胞に結合する新規単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨドメイン）、及びそれらの改善された特性に基づく。
５．１．定義
本明細書に記載または参照される手法及び手順は、例えば、当業者らによる通常の方法論、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｄ ｅｄ．２００１）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，２００３）；Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ（Ａｎ ｅｄ．２００９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｌｂｉｔａｒ ｅｄ．２０１０）；及びＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌｓ １ ａｎｄ ２（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ ｅｄｓ．，２ｄ ｅｄ．２０１０）に記載の幅広く利用された方法論などを使用して、一般に十分に理解及び／または一般に用いられるものを含む。本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者らにより一般に理解される意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の用語の説明が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は、複数形も含み、その逆も同様である。記載の用語のいずれかの説明が、参照により本明細書に組み込まれるいずれかの文書と矛盾する場合は、以下に記載の用語の説明が優先されるものとする。
「抗体」、「免疫グロブリン」、または「Ｉｇ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、最も広い意味で使用され、具体的には、例えば、モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、中和抗体、全長またはインタクトモノクローナル抗体を含む）、ポリエピトープまたはモノエピトープ特異性を有する抗体組成物、ポリクローナルまたは一価抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、所望の生物学的活性を示す限り、二重特異性抗体）を網羅し、以下に記載されるように、少なくとも２つのインタクト抗体、単鎖抗体、及びそのフラグメント（例えば、ドメイン抗体）から形成される。抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、及び／または親和性成熟、ならびに他の種、例えば、マウス、ウサギ、ラマなどに由来する抗体であり得る。「抗体」という用語は、特定の分子抗原に結合することができ、ポリペプチド鎖の２つの同一のペアから構成されるポリペプチドの免疫グロブリンクラス内のＢ細胞のポリペプチド産物を含むことが意図され、各ペアが、１つの重鎖（約５０～７０ｋＤａ）及び１つの軽鎖（約２５ｋＤａ）であり、各鎖の各アミノ末端部分が、約１００～約１３０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含み、各鎖の各カルボキシ末端部分が、定常領域を含む。例えば、以下を参照：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ ｅｄ．，２ｄ ｅｄ．１９９５）；及びＫｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（３ｄ ｅｄ．１９９７）。抗体は、合成抗体、組み換え産生抗体、ラクダ科種（例えば、ラマもしくはアルパカ）またはそれらのヒト化バリアントを含む単一ドメイン抗体、イントラボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び上のいずれかの機能的フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）も含むが、これらに限定されず、これは、フラグメントが由来する抗体の結合活性の一部または全部を保持する抗体の重鎖または軽鎖ポリペプチドの一部を指す。機能的フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）の非限定例としては、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、単一特異性、二重特異性などを含む）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及びミニボディが挙げられる。特に、本明細書で提供される抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、抗原結合ドメインまたは抗原に結合する抗原結合部位を含む分子（例えば、抗体の１つ以上のＣＤＲ）を含有する。そのような抗体フラグメントは、例えば、以下に見出すことができる：Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）；Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｍｙｅｒｓ ｅｄ．，１９９５）；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ２２：１８９－２２４；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，１９８９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７－５１５；及びＤａｙ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２ｄ ｅｄ．１９９０）。本明細書で提供される抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）または任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）のものであり得る。抗体は、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体であってよい。抗体は、アゴニストでもアンタゴニストでもないことがある。
「抗原」は、抗体が選択的に結合できる構造である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、または他の天然に存在するまたは合成化合物であってよい。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ポリペプチドである。特定の実施形態では、抗原は、細胞と会合し、例えば、細胞上または細胞内に存在する。
「インタクト」抗体は、抗原結合部位ならびにＣＬ及び少なくとも重鎖定常領域、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常領域は、ヒト定常領域またはそのアミノ酸配列バリアントを含んでもよい。特定の実施形態では、インタクト抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有する。
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に連結されたＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能になる。ｓＦｖのレビューについては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照のこと。
「重鎖のみの抗体」または「ＨＣＡｂ」という用語は、重鎖を含むが、４鎖抗体に通常見られる軽鎖を欠く機能的抗体を指す。ラクダ科動物（例えば、ラクダ、ラマ、またはアルパカ）は、ＨＣＡｂを生成することが知られる。
本明細書で使用される「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」は、単一の単量体可変抗体ドメインを指し、これは、抗原結合が可能である（例えば、ＣＤ１９に結合する単一ドメイン抗体）。単一ドメイン抗体は、本明細書に記載のＶＨＨドメインを含む。単一ドメイン抗体の例としては、ラクダ科種（例えば、ラマ）由来のものなどの軽鎖を天然に欠く抗体、従来の４鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体、及び抗体由来のもの以外の単一ドメイン骨格が挙げられるが、これらに限定されない。単一ドメイン抗体は、限定されないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、及びウシを含む任意の種に由来し得る。例えば、単一ドメイン抗体は、本明細書に記載されるように、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、及びグアナコなどのラクダ科種で生じた抗体に由来することができる。ラクダ科以外の他の種は、軽鎖を天然に欠く重鎖抗体を産生し得、そのような他の種に由来するＶＨＨは、本開示の範囲内である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の構造を有する。単一ドメイン抗体は、本明細書に記載の別の分子（例えば、薬剤）に遺伝的に融合または化学的にコンジュゲートさせてもよい。単一ドメイン抗体は、より大きな結合分子（例えば、多重特異性抗体またはキメラ抗原受容体）の一部であってよい。
「結合」または「結合」という用語は、例えば、複合体を形成することを含む、分子間の相互作用を指す。相互作用は、例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、及び／またはファンデルワールス相互作用を含む非共有相互作用であり得る。複合体は、共有もしくは非共有結合、相互作用、または力により一緒に保持された２つ以上の分子の結合も含み得る。抗体上の単一の抗原結合部位と、抗原などの標的分子の単一エピトープとの間の全非共有相互作用の強度は、そのエピトープに対する抗体または機能的フラグメントの親和性である。結合分子（例えば、抗体）対一価抗原の、解離速度（ｋｏｆｆ）対結合速度（ｋｏｎ）の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）は、解離定数ＫＤであり、これは、親和性に反比例する。ＫＤ値が低いほど、抗体の親和性が高くなる。ＫＤの値は、抗体及び抗原の複合体により異なり、ｋｏｎ及びｋｏｆｆの両方に依存する。本明細書で提供される抗体の解離定数ＫＤは、本明細書で提供される任意の方法または当業者らに周知の任意の他の方法を使用して決定することができる。１つの結合部位での親和性は、抗体及び抗原間の相互作用の真の強さを常に反映しない。多価抗原などの複数の繰り返し抗原決定基を含有する複合抗原が、複数の結合部位を含有する抗体と接触する場合、１つの部位での抗体と抗原の相互作用により、２番目の部位での反応の可能性が増加するであろう。そのような多価抗体及び抗原間の複数の相互作用の強さは結合力と呼ばれる。
本明細書に記載の結合分子に関連して、「に結合する」、「に特異的に結合する」などの用語、及び類似の用語も本明細書では互換的に使用され、抗原、例えば、ポリペプチド、に特異的に結合する抗原結合ドメインの結合分子を指す。抗原に結合するか、または特異的に結合する結合分子または抗原結合ドメインは、例えば、イムノアッセイ、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）、または当業者らに既知の他の手法により同定することができる。いくつかの実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、任意の交差反応性抗原よりも高い親和性（ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの実験手法を使用して測定）で抗原に結合する場合、抗原に結合または特異的に結合する。通常、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドのシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、バックグラウンドの１０倍を超える場合もある。結合特異性に関する考察については、例えば、以下を参照のこと：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３３２－３６（Ｐａｕｌ ｅｄ．，２ｄｅｄ．１９８９）。特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインの「非標的」タンパク質への結合の程度は、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析またはＲＩＡで決定される場合、結合分子または抗原結合ドメインの、その特定の標的抗原への結合の約１０％未満である。抗原に結合する結合分子または抗原結合ドメインは、結合分子が、例えば、抗原を標的とする治療薬及び／または診断薬として有用であるように、十分な親和性で抗原に結合可能なものを含む。特定の実施形態では、抗原に結合する結合分子または抗原結合ドメインは、１μＭ、８００ｎＭ、６００ｎＭ、５５０ｎＭ、５００ｎＭ、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、または０．１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）を有する。特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、異なる種由来の抗原間で保存されている抗原のエピトープに結合する。
特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、重鎖及び／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体に属する抗体の耐硫黄する配列と同一または相同である「キメラ」配列を含み得るが、所望の生物学的活性を示す限り、鎖（複数可）の残りの部分は、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにそのような抗体のフラグメントの対応する配列と同一または相同である（以下を参照：米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１－５５）。キメラ配列は、ヒト化配列を含んでもよい。
特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、ヒト免疫グロブリン（例えば、レシピエント抗体）由来の配列を含む非ヒト（例えば、ラクダ科動物、マウス、非ヒト霊長類）抗体の「ヒト化」形態の部分を含み得、天然のＣＤＲ残基は、非ヒト種（例えば、ドナー抗体）、例えば、ラクダ科動物、マウス、ラット、ウサギ、または所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト哺乳類動物の対応するＣＤＲ由来の残基で置換される。いくつかの場合では、ヒト免疫グロブリン配列の１つ以上のＦＲ領域残基が、対応する非ヒト残基で置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基をさらに含み得る。これらの修飾は、さらに、抗体の性能を向上させるために行われる。ヒト化抗体の重鎖または軽鎖は、少なくとも１つ以上の可変領域の実質的に全てを含み得、ＣＤＲの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のものである。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通常、ヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含むであろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－９６（１９９２）；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５－８９（１９９２）；米国特許第６，８００，７３８号；同第６，７１９，９７１号；同第６，６３９，０５５号；同第６，４０７，２１３号；及び同第６，０５４，２９７号を参照のこと。
特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、「完全ヒト抗体」または「ヒト抗体」の一部を含み得、用語は、本明細書では互換的に使用され、ヒト可変領域、例えば、ヒト定常領域を含む抗体を指す。結合分子は、単一ドメイン抗体配列を含んでもよい。特定の実施形態では、用語は、ヒト起源の可変領域及び定常領域を含む抗体を指す。特定の実施形態では、「完全ヒト」抗体は、ポリペプチドに結合し、ヒト生殖系列免疫グロブリン核酸配列の天然に存在する体細胞バリアントである核酸配列にコードされる抗体も包含し得る。「完全ヒト抗体」という用語は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に記載されるヒト生殖系列免疫グロブリンに対応する可変及び定常領域を有する抗体を含む（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２を参照）。「ヒト抗体」は、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列に対応するものを有し、及び／またはヒト抗体を作製するための手法のいずれかを使用して作製されているものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））及び酵母ディスプレイライブラリー（Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １：７５５－６８（２００６））を含む、当該技術分野で既知の様々な手法を使用して産生することができる。さらに、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６－９５（１９９１）；及びｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１）に記載の方法が、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である。ヒト抗体は、抗原投与に応答して、そのような抗体を産生するように改変されているが、その内因性遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物、例えば、マウス、に抗原を投与することにより調製することができる（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６（５）：５６１－６６（１９９５）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｎｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（４）：４５５－５８（１９９７）；ならびに、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関しては、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号）。例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体に関しては、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：３５５７－６２（２００６）も参照のこと。
特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、「組み換えヒト抗体」の一部を含み得、この表現は、組み換え手段により調製、発現、作成、または単離されるヒト抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを使用して発現される抗体、組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニック及び／またはトランス染色体である動物（例えば、マウスもしくはウシ）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５（１９９２）を参照）、または、他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の他の手段で調製、発現、作製、もしくは単離された抗体、を含む。そのような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有し得る（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２を参照）。しかし、特定の実施形態では、そのような組み換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ変異導入（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物が使用される場合、ｉｎ ｖｉｖｏ体細胞変異導入）を実施され、従って、組み換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来及び関連しているが、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在しないことがある配列である。
特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、「モノクローナル抗体」の一部を含み得、本明細書で使用される用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、例えば、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能な天然に存在する変異、または周知の翻訳後修飾、例えば、アミノ酸イオメリゼーションまたは脱アミド化、メチオニン酸化またはアスパラギンもしくはグルタミン脱アミド化を除いて同一であり、各モノクローナル抗体は、通常、抗原上の単一のエピトープを認識するであろう。特定の実施形態では、本明細書で使用される「モノクローナル抗体」は、単一のハイブリドーマまたは他の細胞により産生される抗体である。「モノクローナル」という用語は、抗体を作製する特定の方法に限定されない。例えば、本開示において有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ方法論で調製されても、細菌または真核動物または植物細胞における組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）を使用して作製されてもよい。「モノクローナル抗体」は、また、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－９７（１９９１）に記載の手法を使用してファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。クローン細胞株及びそれにより発現されるモノクローナル抗体を調製するための他の方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，５ｔｈ ｅｄ．２００２）を参照のこと。
典型的な４鎖抗体ユニットは、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＧの場合、４鎖ユニットは、一般に、約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合でＨ鎖に連結されているが、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合で互いに連結されている。各Ｈ鎖及びＬ鎖は、規則的な間隔で配置された鎖内ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に、可変ドメイン（ＶＨ）、続いて、α鎖及びγ鎖のそれぞれの場合、３つの定常ドメイン（ＣＨ）、ならびに、μ及びεアイソタイプの場合、４つのＣＨドメイン、を有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に、可変ドメイン（ＶＬ）、続いて、他端に、定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬは、ＶＨとアラインされ、ＣＬは、重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）とアラインされる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖及び重鎖の可変ドメイン間に界面を形成すると考えられる。ＶＨ及びＶＬのペアリングにより、単一の抗原結合部位が形成される。種々のクラスの抗体の構造及び特性については、例えば、以下を参照のこと：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７１（Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，８ｔｈ ｅｄ．１９９４）；及びＩｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，５ｔｈ ｅｄ．２００１）。
「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」という用語は、抗原に結合する抗体領域を指す。通常、従来のＩｇＧは、２つのＦａｂ領域を含み、それぞれが、Ｙ字型のＩｇＧ構造の２つのアームの１つに存在する。各Ｆａｂ領域は、通常、重鎖及び軽鎖のそれぞれの１つの可変領域及び１つの定常領域から構成される。より具体的には、Ｆａｂ領域における重鎖の可変領域及び定常領域は、ＶＨ及びＣＨ１領域であり、Ｆａｂ領域における軽鎖の可変領域及び定常領域は、ＶＬ及びＣＬ領域である。Ｆａｂ領域内のＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬは、本開示による抗原結合能力を付与するために、様々な方法で配置することができる。例えば、従来のＩｇＧのＦａｂ領域と同様に、ＶＨ及びＣＨ１領域は、１つのポリペプチド上にあり得、ＶＬ及びＣＬ領域は、別のポリペプチド上にあり得る。あるいは、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬ領域は全て、以下のセクションでより詳細に説明するように、全て同じポリペプチド上にあり、異なる順序で配向することができる。
「可変領域」、「可変ドメイン」、「Ｖ領域」、または「Ｖドメイン」という用語は、抗体の軽鎖または重鎖のアミノ末端に一般に位置し、重鎖に約１２０～１３０アミノ酸、軽鎖に約１００～１１０アミノ酸の長さを有し、特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性に使用される抗体の軽鎖または重鎖の一部を指す。重鎖の可変領域は、「ＶＨ」と呼ばれることがある。軽鎖の可変領域は、「ＶＬ」と呼ばれることがある。「可変」という用語は、可変領域の特定のセグメントが、抗体間で配列が大きく異なるという事実を指す。Ｖ領域は、抗原結合を媒介し、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定義する。しかし、可変性は、可変領域の１１０アミノ酸スパン全体に均等に分散されていない。その代わりに、Ｖ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる約１５～３０アミノ酸の可変性の少ない（例えば、比較的不変の）ストレッチからなり、これは、それぞれが約９～１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれるより大きい可変性（例えば、極端な変動性）のより短い領域に隔てられている。重鎖及び軽鎖の可変領域は、それぞれ、４つのＦＲを含み、それは、主に、βシート構造を採用し、３つの超可変領域で連結され、一部の場合では、βシート構造を連結するループを形成し、いくつかの場合では、βシート構造の一部を形成する。各鎖の超可変領域は、ＦＲにより近接して一緒に保持され、他の鎖由来の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（例えば、以下を参照：Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（５ｔｈ ｅｄ．１９９１））。定常領域は、抗体の抗原への結合において直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）への抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。可変領域は、異なる抗体間で配列が大きく異なる。特定の実施形態では、可変領域は、ヒト可変領域である。
「Ｋａｂａｔによる可変領域残基ナンバリング」または「Ｋａｂａｔによるアミノ酸位置ナンバリング」という用語、及びそれらの変形形態は、上掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．における抗体の編集物の重鎖可変領域または軽鎖可変領域に使用されるナンバリングシステムを指す。このナンバリングシステムを使用して、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮または挿入に対応するより少ないまたは追加のアミノ酸を含有してもよい。例えば、重鎖可変ドメインは、残基５２の後に単一のアミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）及び残基８２の後に３つの挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含んでもよい。残基のＫａｂａｔナンバリングは、「標準」Ｋａｂａｔナンバリング配列を有する抗体の配列の相同領域におけるアラインメントにより、所与の抗体について決定されてもよい。Ｋａｂａｔナンバリングシステムは、可変ドメイン中の残基（およそ、軽鎖の残基１～１０７及び重鎖の残基１～１１３）（例えば、上掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．）を指す場合に、一般に使用される。「ＥＵナンバリングシステム」または「ＥＵインデックス」は、免疫グロブリン重鎖定常領域中の残基を指す場合に、一般に使用される（例えば、上掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．で報告されたＥＵインデックス）。「ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基ナンバリングを指す。他のナンバリングシステムは、例えば、ＡｂＭ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃｏｎｔａｃｔ、ＩＭＧＴ、及びＡＨｏｎにより記述されている。
抗体に関して使用される場合、「重鎖」という用語は、アミノ末端部分が約１２０～１３０個以上のアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分が定常領域を含む、約５０～７０ｋＤａのポリペプチド鎖を指す。定常領域は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、及びミュー（μ）と呼ばれる５つの異なるタイプ（例えば、アイソタイプ）のうちの１つであり得る。異なる重鎖は、サイズが異なる：α、δ、及びγは、約４５０個のアミノ酸を含有するが、μ及びεは、約５５０のアミノ酸を含有する。軽鎖と組み合わせる場合、これらの異なるタイプの重鎖は、ＩｇＧの４つのサブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む、抗体の５つの周知のクラス（例えば、アイソタイプ）である、それぞれ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭを生じさせる。
抗体に関して使用される場合、「軽鎖」という用語は、アミノ末端部分が約１００～約１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分が定常領域を含む、約２５ｋＤａのポリペプチド鎖を指す。軽鎖のおおよその長さは、２１１～２１７アミノ酸である。定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）またはラムダ（λ）と呼ばれる２つの異なるタイプがある。
本明細書で使用される場合、「超可変領域」、「ＨＶＲ」、「相補性決定領域」、及び「ＣＤＲ」という用語は、互換的に使用される。「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン（Ｉｇまたは抗体）ＶＨβシートフレームワークの非フレームワーク領域内の３つの超可変領域（Ｈ１、Ｈ２、もしくはＨ３）のうちの１つ、または抗体ＶＬ βシートフレームワークの非フレームワーク領域内の３つの超可変領域（Ｌ１、Ｌ２、もしくはＬ３）の１つを指す。従って、ＣＤＲは、フレームワーク領域配列内に散在する可変領域配列である。
ＣＤＲ領域は、当業者らに周知であり、周知のナンバリングシステムで定義されている。例えば、Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づいており、最も一般に使用される（例えば、上掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．を参照）。Ｃｈｏｔｈｉａは、むしろ、構造ループの位置を指す（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－１７（１９８７）を参照）。Ｋａｂａｔナンバリング規則を使用してナンバリングされた場合の、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１ループの終わりは、ループの長さに応じてＨ３２及びＨ３４間で変動する（これは、Ｋａｂａｔナンバリングスキームが、Ｈ３５ＡとＨ３５Ｂに挿入物を配置するためであり；３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、ループは３２で終了し；３５Ａしか存在しない場合、ループは３３で終了し；ループは３５Ａ及び３５Ｂの両方が存在する場合、ループは３４で終了する）。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ及びＣｈｏｔｈｉａ構造ループの間の中間物を表し、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．２（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ ｅｄｓ．，２ｄ ｅｄ．２０１０）を参照）。「接触」超可変領域は、利用可能な複雑な結晶構造の分析に基づいている。開発され広く採用されている別の普遍的なナンバリングシステムは、ＩｍｍｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）情報システム（登録商標）（Ｌａｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５－７７（２００３））である。ＩＭＧＴは、免疫グロブリン（ＩＧ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ならびにヒト及び他の脊椎動物の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に特化した統合情報システムである。本明細書において、ＣＤＲは、アミノ酸配列及び軽鎖または重鎖内の位置の両方に関して言及される。免疫グロブリン可変ドメインの構造内のＣＤＲの「位置」が、種間で保存され、ループと呼ばれる構造に存在するので、構造的特徴に従って可変ドメイン配列をアラインさせるナンバリングシステムを使用することにより、ＣＤＲ及びフレームワーク残基は、容易に同定される。１つの種の免疫グロブリン由来のＣＤＲ残基を、通常は、ヒト抗体由来のアクセプターフレームワークに移植及び置換する際に、この情報を使用することができる。追加のナンバリングシステム（ＡＨｏｎ）が、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７－７０（２００１）により開発されている。例えば、Ｋａｂａｔナンバリング及びＩＭＧＴ固有のナンバリングシステムを含むナンバリングシステム間の対応は、当業者に周知である（例えば、上掲のＫａｂａ；上掲のＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ；上掲のＭａｒｔｉｎ；上掲のＬｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．を参照）。これらの超可変領域またはＣＤＲのそれぞれに由来する残基が、以下の表１に例示される。
（表１）様々なナンバリングシステムによる例示的なＣＤＲ
Figure 2023546764000001
特定のＣＤＲの境界は、識別に使用されるスキームに応じて変動し得る。従って、別途明記のない限り、所与の抗体またはその領域、例えば、可変領域、の「ＣＤＲ」及び「相補性決定領域」という用語、ならびに抗体またはその領域の個々のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２）は、上の本明細書に記載の既知のスキームのいずれかで定義される相補性決定領域を包含すると理解されるべきである。いくつかの場合では、ＩＭＧＴ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＣｏｎｔａｃｔ法により定義されるＣＤＲなどの、特定のＣＤＲまたは複数のＣＤＲを同定するためのスキームが指定される。いくつかの場合では、Ｋａｂａｔナンバリングによる１つ以上の位置が、実際の配列で占められていないことがあるか、または、実際の配列が、Ｋａｂａｔナンバリングで許可される数よりも多くのアミノ酸残基を含有してもよい。例えば、以下を参照：Ｄｅｓｃｈａｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８４：５６９６－７０４（ＫａｂａｔによるＶＨＨドメインの例示的なナンバリングについて）。他の場合では、ＣＤＲの特定のアミノ酸配列が与えられる。ＣＤＲ領域は、また、様々なナンバリングシステムの組み合わせ、例えば、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａナンバリングシステムの組み合わせ、またはＫａｂａｔ及びＩＭＧＴナンバリングシステムの組み合わせで定義され得ることに留意すべきである。従って、「特定のＶＨまたはＶＨＨに記載のＣＤＲ」などの用語は、上記の例示的なＣＤＲナンバリングシステムで定義される任意のＣＤＲ１を含むが、それにより限定されない。可変領域（例えば、ＶＨＨ、ＶＨ、またはＶＬ）が与えられると、領域内のＣＤＲが異なるナンバリングシステムまたはそれらの組み合わせにより定義することができると、当業者らは理解するであろう。
超可変領域は、以下のような「拡張された超可変領域」を含んでもよい：ＶＬ中の２４～３６または２４～３４（Ｌ１）、４６～５６または５０～５６（Ｌ２）、及び８９～９７または８９～９６（Ｌ３）、及びＶＨ中の２６～３５または２６～３５Ａ（Ｈ１）、５０～６５または４９～６５（Ｈ２）、及び９３～１０２、９４～１０２、または９５～１０２（Ｈ３）。
「定常領域」または「定常ドメイン」という用語は、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体との相互作用を示す軽鎖及び重鎖のカルボキシ末端部分を指す。この用語は、抗原結合部位を含有する免疫グロブリンの他の部分である可変領域と比較して、より保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常領域は、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域、ならびに軽鎖のＣＬ領域を含有してもよい。
「フレームワーク」または「ＦＲ」という用語は、ＣＤＲに隣接する可変領域残基を指す。ＦＲ残基は、例えば、キメラ、ヒト化、ヒト、ドメイン抗体（例えば、単一ドメイン抗体）、ダイアボディ、線状抗体、及び二重特異性抗体に存在する。ＦＲ残基は、超可変領域残基またはＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用され、例えば、天然配列Ｆｃ領域、組み換えＦｃ領域、及びバリアントＦｃ領域を含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は異なり得ることがあるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、多くの場合、位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端まで伸びると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムによる残基４４７）は、例えば、抗体の産生もしくは精製中に、または抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え操作することにより、除去され得る。従って、インタクト抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、及びＫ４４７残基の有り無しの両方で抗体の混合物を有する抗体集団を含んでもよい。「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」は、Ｃ１ｑ結合；ＣＤＣ；Ｆｃ受容体結合；ＡＤＣＣ；食作用；細胞表面受容体の下方調節（例えば、Ｂ細胞受容体）などが挙げられる。そのようなエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ領域が結合領域または結合ドメイン（例えば、抗体可変領域またはドメイン）と組み合わされることを必要とし、当業者らに既知の様々なアッセイを使用して評価することができる。「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾（例えば、置換、付加、または欠失）により天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異なるものを含む。特定の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域における、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、約１～約１０個のアミノ酸置換、または約１～約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書におけるバリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域及び／または親ポリペプチドのＦｃ領域と、少なくとも約８０％の相同性、またはそれと少なくとも約９０％の相同性、例えば、それと少なくとも約９５％の相同性を有し得る。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」は、当該技術分野の用語であり、結合分子（例えば、単一ドメイン抗体配列を含む抗体）が特異的に結合し得る抗原の局在領域を指す。エピトープは、線状エピトープもしくは立体配座の、非線状、または不連続エピトープであり得る。ポリペプチド抗原の場合、例えば、エピトープは、ポリペプチドの連続したアミノ酸（「線状」エピトープ）であり得るか、またはエピトープは、ポリペプチドの２つ以上の非連続領域からのアミノ酸を含み得る（「立体配座」、「非線形」、もしくは「不連続」エピトープ）。一般に、線状エピトープは、２次、３次、または４次構造に依存しても、依存しないこともあると、当業者は理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、結合分子は、アミノ酸基が天然の３次元タンパク質構造に折りたたまれるかどうかに関わらず、アミノ酸基に結合する。他の実施形態では、結合分子は、エピトープを認識して結合するために、エピトープを構成するアミノ酸残基が特定の立体配座（例えば、曲がり、ねじれ、回転、または折りたたみ）を示すことを必要とする。
「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または低減させるものである。いくつかの実施形態では、遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する。
「アゴニスト」または活性化抗体は、それが結合する抗原によるシグナル伝達を増強または開始するものである。いくつかの実施形態では、アゴニスト抗体は、天然リガンドの存在なしでシグナル伝達を引き起こすか、または活性化する。
ペプチド、ポリペプチド、または抗体配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」及び「相同性」は、配列をアラインし、必要に応じて、最大パーセントの配列同一性を達成するためにギャップを導入した後の、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない特定のペプチドまたはポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、例えば、公的に入手可能なコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、当業者の範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者らは、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定し得る。
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞に１つ以上の抗原特異性を移植するために使用できる遺伝子操作された受容体を指す。いくつかのＣＡＲは、「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラＴ細胞受容体」、または「キメラ免疫受容体」としても既知である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の抗原（例えば、腫瘍抗原）に特異的な細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびにＴ細胞及び／または他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「ＣＡＲ－Ｔ細胞」は、ＣＡＲを発現するＴ細胞を指す。
「ポリペプチド」及び「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状または分枝状であってもよく、それは、改変アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸により中断されてもよい。この用語は、自然にまたは介入、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは改変により改変されているアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、限定されないが、非天然アミノ酸を含むアミノ酸の１つ以上のアナログを含有するポリペプチド、ならびに当該技術分野で既知の他の改変も定義内に含まれる。本開示のポリペプチドは、抗体または免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーに基づいてもよく、特定の実施形態では、「ポリペプチド」は、単鎖として、または２つ以上の関連鎖として生じ得ることが理解される。
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変ヌクレオチドもしくは塩基、及び／またはそれらのアナログ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼまたは合成反応によりポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド及びそれらのアナログを含んでもよい。本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、必ずしも必要ではないが、一般に長さが約２００ヌクレオチド未満である、短い、一般に一本鎖の合成ポリヌクレオチドを指す。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、相互に排他的ではない。ポリヌクレオチドに関する上記の説明は、オリゴヌクレオチドにも等しく完全に適用可能である。本開示の結合分子を産生する細胞は、親ハイブリドーマ細胞、ならびに抗体をコードする核酸が導入されている細菌及び真核宿主細胞を含んでもよい。別途明記のない限り、本明細書に開示の任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は、５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写産物の５’から３’への付加の方向は、転写方向と呼ばれ；ＲＮＡ転写物の５’から５’末端にある、ＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれ；ＲＮＡ転写物の３’から３’末端にある、ＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。
「単離核酸」は、他のゲノムＤＮＡ配列、ならびにタンパク質または複合体、例えば、リボソーム及びポリメラーゼから実質的に分離される核酸、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合核酸であり、これは、天然配列を天然に伴う。「単離」核酸分子は、核酸分子の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離されるものである。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離」核酸分子は、組み換え手法で産生される場合に、他の細胞材料、もしくは培地を実質的に含まない可能性があるか、または、化学的に合成された場合、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない可能性がある。特定の実施形態では、単一ドメイン抗体または本明細書に記載の抗体をコードする１つ以上の核酸分子が単離または精製される。この用語は、天然に存在する環境から除去されている核酸配列を包含し、組み換えまたはクローン化されたＤＮＡ単離物及び化学的に合成されたアナログまたは異種系により生物学的に合成されたアナログを含む。実質的に純粋な分子は、分子の単離形態を含んでもよい。具体的には、本明細書に記載のＣＡＲまたはｓｄＡｂをコードする「単離」核酸分子は、それが産生された環境で通常会合している少なくとも１つの混入核酸分子から同定及び分離される核酸分子である。
「制御配列」という用語は、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適する制御配列は、例えば、プロモーター、任意に、オペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語及び類似の語句（例えば、遺伝子融合された）は、核酸またはアミノ酸に関して使用される場合、それぞれ、互いに機能的な関係で配置される核酸配列またはアミノ酸配列の作動可能結合を指す。例えば、作動可能に連結されたプロモーター、エンハンサーエレメント、オープンリーディングフレーム、５’及び３’ＵＴＲ、ならびにターミネーター配列は、核酸分子（例えば、ＲＮＡ）の正確な産生をもたらす。いくつかの実施形態では、作動可能に連結された核酸エレメントは、オープンリーディングフレームの転写をもたらし、最終的にポリペプチドの産生（すなわち、オープンリーディングフレームの発現）をもたらす。別の例として、作動可能に連結されたペプチドは、機能ドメインが互いに適切な距離を置いて配置されて、各ドメインの意図された機能を付与するものである。
「ベクター」という用語は、宿主細胞に核酸配列を導入するために、例えば、本明細書に記載の結合分子（例えば、抗体）をコードする核酸配列を含む核酸配列を保有または包含するために使用される物質を指す。使用に適用可能なベクターは、例えば、発現ベクター、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソーム、及び人工染色体を含み、これは、宿主細胞の染色体への安定な組み込みのために実施可能な選択配列またはマーカーを含み得る。さらに、ベクターは、１つ以上の選択マーカー遺伝子及び適切な発現制御配列を含み得る。含み得る選択可能なマーカー遺伝子は、例えば、抗生物質または毒素に対する耐性を提供し、栄養要求性欠乏を補完し、または培地にない重要な栄養素を供給する。発現制御配列は、構成的及び誘導可能なプロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含み得、これらは、当該技術分野で周知である。２つ以上の核酸分子が共発現される場合（例えば、抗体重鎖及び軽鎖の両方、または抗体ＶＨ及びＶＬ）、両方の核酸分子を、例えば、単一発現ベクターに挿入するか、または別々の発現ベクターに挿入することができる。単一ベクター発現の場合、コード核酸は、１つの共通の発現制御配列に作動可能に連結するか、または１つの誘導性プロモーター及び１つの構成的プロモーターなどの異なる発現制御配列に連結することができる。宿主細胞への核酸分子の導入は、当該技術分野で周知の方法を使用して確認することができる。そのような方法には、核酸分析、例えば、ノーザンブロットまたはｍＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、遺伝子産物の発現のためのイムノブロッティング、または導入された核酸配列もしくはその対応する遺伝子産物の発現を試験するための他の好適な分析方法、を含む。核酸分子が所望の産物を産生するのに十分な量で発現されることは、当業者らに理解され、発現レベルは、当該技術分野で周知の方法を使用して十分な発現を得るために最適化することができることがさらに理解される。
本明細書で使用される「宿主」という用語は、動物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）を指す。
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、核酸分子でトランスフェクトされ得る特定の対象細胞、及びそのような細胞の子孫または潜在的な子孫を指す。そのような細胞の子孫は、変異または続く宿主ゲノムへの核酸分子の生成もしくは組み込みにおいて生じ得る環境の影響により、核酸分子でトランスフェクトされた親細胞と同一ではないことがある。
本明細書で使用される場合、「自己由来」と用語は、後で個体に再導入される同じ個体に由来する任意の物質を指すことを意味する。
「同種異系」は、同じ種の異なる個体に由来する移植片を指す。
本明細書で使用される「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換、または形質導入されているものである。細胞は、初代対象細胞及びその子孫を含む。
本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府もしくは州政府の規制機関により承認されていること、または、動物、特に、ヒトでの使用が米国薬局方、欧州薬局方、または他の一般に認められている薬局方に記載されることを意味する。
「賦形剤」は、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、溶媒、または封入材料などの薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。賦形剤は、例えば、封入材料または添加剤、例えば、吸収促進剤、酸化防止剤、結合剤、緩衝剤、担体、コーティング剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、増量剤、充填剤、香味剤、湿潤剤、潤滑剤、香料、防腐剤、噴射剤、放出剤、殺菌剤、甘味料、可溶化剤、湿潤剤、及びそれらの混合物を含む。「賦形剤」という用語は、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントのアジュバント（完全もしくは不完全））またはビヒクルも指し得る。
いくつかの実施形態では、賦形剤は、薬学的に許容される賦形剤である。薬学的に許容される賦形剤の例としては、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（例えば、約１０アミノ酸残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール；塩形成カウンターイオン、例えば、ナトリウム；及び／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）が挙げられる。薬学的に許容される賦形剤の他の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈｅｄ．１９９０）に記載されている。
一実施形態では、各構成成分は、医薬製剤の他の成分と適合するという意味で「薬学的に許容される」ものであり、合理的な利益／リスク比に見合った過度の毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、または他の問題もしくは合併症がなく、ヒト及び動物の組織または臓器と接触して使用するのに適する。例えば、以下を参照：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００５；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，６ｔｈ ｅｄ．；Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．；Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：２００９；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，３ｒｄ ｅｄ．；Ａｓｈ ａｎｄ Ａｓｈ Ｅｄｓ．；Ｇｏｗｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ：２００７；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，２ｎｄ ｅｄ．；Ｇｉｂｓｏｎ Ｅｄ．；ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＬＣ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００９。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、用いられる投薬量及び濃度で曝露される細胞または哺乳動物に対して無毒である。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、ｐＨ緩衝水溶液である。
いくつかの実施形態では、賦形剤は、滅菌液体、水と、例えば、石油、動物、植物、または合成起源、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む油である。水は、組成物（例えば、医薬組成物）が静脈内投与される場合の例示的な賦形剤である。食塩水ならびに水性デキストロース及びグリセロール水溶液も液体賦形剤として、特に、注射用溶液として用いることができる。賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアラート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなども含み得る。組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有し得る。組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの形態をとり得る。製剤を含む経口組成物は、標準的な賦形剤、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含み得る。
薬学的化合物を含む組成物は、例えば、適量の賦形剤と共に、単離または精製された形態で、結合分子（例えば、抗体）を含有してもよい。
本明細書で使用される「有効量」または「治療有効量」という用語は、所望の結果をもたらすのに十分な、本明細書で提供される薬剤及び単一ドメイン抗体または医薬組成物を含む、単一ドメイン抗体または治療用分子の量を指す。
「対象」及び「患者」という用語は、交換可能に使用されてもよい。本明細書で使用される場合、特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、非霊長類または霊長類（例えば、ヒト）である。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。一実施形態では、対象は、疾患または障害と診断された、哺乳動物、例えば、ヒトである。別の実施形態では、対象は、疾患または障害を発症するリスクのある、哺乳動物、例えば、ヒト、である。
「投与する」または「投与」は、体外に存在する物質を患者に注射するか、または別の方法で物理的に送達する行為、例えば、粘膜、皮内、静脈内、筋肉内送達、及び／または本明細書に記載もしくは当該技術分野で既知の物理的送達の任意の他の方法、を指す。
本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置」、及び「処置すること」という用語は、１つ以上の療法の投与に起因する疾患または状態の進行、重症度、及び／または期間の軽減または改善を指す。処置は、患者が依然として基礎疾患に罹患していることがあるにもかかわらず、改善が患者に観察されるように、基礎疾患と関連する１つ以上の症状の減少、緩和、及び／または軽減があったかどうかを評価することにより決定されてもよい。「処置すること」という用語は、疾患の管理及び改善の両方を含む。「管理する」、「管理すること」、及び「管理」という用語は、必ずしも疾患の治癒をもたらすとは限らない療法から対象が受ける有益な効果を指す。
「予防する」、「予防すること」、及び「予防」という用語は、疾患、障害、状態、または関連症状（複数可）（例えば、糖尿病またはがん）の発症（または再発）の可能性を低減させることを指す。
本明細書で使用される場合、がんの発症を「遅延させること」は、疾患の発症を遅延、妨害、減速、阻止、安定化、及び／または延期することを意味する。この遅延は、疾患の病歴及び／または処置される個体に応じて、様々な時間のものとなり得る。当業者には明らかであるように、十分なまたは有意な遅延は、個体が疾患を発症しないという点で、事実上、予防を包含し得る。がんの発症を「遅延させる」方法は、その方法を使用しない場合と比較して、所与の時間枠での疾患の発症の可能性を低減する方法、及び／または所与の時間枠での疾患の程度を低減する方法である。そのような比較は、通常、統計的に有意な個体数を使用した臨床研究に基づく。限定されないが、コンピューター断層撮影法（ＣＡＴスキャン）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、腹部超音波検査、凝固検査、動脈造影、または生検を含む標準的な方法を使用して、がんの発症を検出することができる。発症は、最初は検出できないことがあるがんの進行を指すこともあり、発生、再発、及び発症を含む。
本明細書で使用される「Ｂ細胞関連疾患または障害」は、Ｂ細胞により媒介されるか、または異常なＢ細胞機能（例えば、Ｂ細胞機能の調節不全）により付与される疾患または障害を指す。本明細書で使用される「Ｂ細胞関連疾患または障害」は、Ｂ細胞悪性腫瘍、例えば、Ｂ細胞白血病またはＢ細胞リンパ腫を含むが、これらに限定されない。それは、辺縁帯リンパ腫（例えば、脾辺縁帯リンパ腫）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病（Ｂ－ＰＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、バーキットリンパ腫、原発性眼内リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、前駆Ｂリンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫（ＨＧＢＬ）、及び多発性骨髄腫（ＭＭ）も含む。「Ｂ細胞関連疾患または障害」は、不適切なまたは増加したＢ細胞数及び／または活性化と関連するような、特定の自己免疫及び／または炎症性疾患も含む。
本明細書で使用される「ＣＤ１９関連疾患または障害」は、ＣＤ１９が発現されている細胞または組織を含む疾患または障害を指す。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９関連の疾患または障害は、ＣＤ１９が異常に発現している細胞、例えば、正常または健常細胞と比較してＣＤ１９の発現が高い細胞を含む。
「約」及び「およそ」という用語は、２０％以内、１５％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、またはそれ以下の特定の値または範囲を意味する。
本開示及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈に別途明示のない限り、複数形を含む。
実施形態が「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を用いて本明細書に記載される場合、「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／または「から本質的になること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」に関して記載される別の点で類似の実施形態も提供されることが理解される。実施形態が「から本質的になること」という表現を用いて本明細書に記載される場合、「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」に関して記載される別の点で類似の実施形態も提供されることも理解される。
「Ａ及びＢ間」または「ＡＢ間」などの表現で使用される「間」という用語は、Ａ及びＢの両方を含む範囲を指す。
本明細書の「Ａ及び／またはＢ」などの表現で使用される「及び／または」という用語は、Ａ及びＢの両方；ＡまたはＢ；Ａ（単独）；及びＢ（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などの表現で使用される「及び／または」という用語は、以下の実施形態のそれぞれを包含することが意図される：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）。
５．２．単一ドメイン抗体
５．２．１．ＣＤ１９に結合する単一ドメイン抗体
一態様では、ＣＤ１９に結合可能な単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨドメイン）が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨドメイン）は、ヒトＣＤ１９に結合する。ヒトＣＤ１９抗原は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属する９５ｋｄの膜貫通型糖タンパク質である。Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｃｕｒｒ Ｄｉｒ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．７：４－３２（２００４）。ＣＤ１９は、１６番染色体の短腕、１６ｐ１１．２に位置する７．４１キロバイトのｃｄ１９遺伝子にコードされる。Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．３５（２）：１０２－１１（１９９２）。ＣＤ１９は、正常及び腫瘍性Ｂ細胞、ならびに濾胞性樹状細胞で特異的に発現される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、１つ以上のＣＤ１９活性を調節する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アンタゴニスト抗体である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）で、ＣＤ１９（例えば、ヒトＣＤ１９）に結合する。結合親和性を測定する様々な方法が当該技術分野で既知であり、それらのいずれかを本開示の目的のために使用することができ、これは、例えば、目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原を用いて実施されるＲＩＡ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３：８６５－８１）によるもの、；バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）もしくは例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）Ｒｅｄ９６システムを使用したＯｃｔｅｔ（登録商標）による表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによるもの、または、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－２０００もしくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－３０００を使用したＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）によるものを含む。「オンレート」または「会合の速度」または「会合速度」または「ｋｏｎ」は、また、例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）Ｒｅｄ９６、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－２０００、またはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－３０００システムを使用した上記のバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で決定されてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ＶＨＨドメインである。本明細書で提供される例示的なＶＨＨドメインは、以下のセクション６に記載されるように生成され、これらのＶＨＨドメインは、以下の表２にも示されるＶＨＨ－０８３、ＶＨＨ－１１１、ＶＨＨ－１３１、７７ＬＩＣＡ５４２、７７ＬＩＣＡ５１９、７７ＬＩＣＡ６０２、ＬＩＣ１１５７、ＬＩＣ１１５９、ｈｕＶＨＨ－７７３、ｈｕＶＨＨ－７７６、Ａ５９２Ｈ１、Ａ５９２Ｈ２、Ａ５９２Ｈ３、及びＡ５９２Ｈ４と呼ばれる。
従って、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体は、ＶＨＨ－０８３、ＶＨＨ－１１１、ＶＨＨ－１３１、７７ＬＩＣＡ５４２、７７ＬＩＣＡ５１９、７７ＬＩＣＡ６０２、ＬＩＣ１１５７、ＬＩＣ１１５９、ｈｕＶＨＨ－７７３、ｈｕＶＨＨ－７７６、Ａ５９２Ｈ１、Ａ５９２Ｈ２、Ａ５９２Ｈ３、及びＡ５９２Ｈ４のうちのいずれか１つの、１つ以上のＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、以下の構造：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含むＣＤ１９に結合する単一ドメイン抗体が本明細書に提供され、ＣＤＲ配列は、ＶＨＨ－０８３、ＶＨＨ－１１１、ＶＨＨ－１３１、７７ＬＩＣＡ５４２、７７ＬＩＣＡ５１９、７７ＬＩＣＡ６０２、ＬＩＣ１１５７、ＬＩＣ１１５９、ｈｕＶＨＨ－７７３、ｈｕＶＨＨ－７７６、Ａ５９２Ｈ１、Ａ５９２Ｈ２、Ａ５９２Ｈ３、及び／またはＡ５９２Ｈ４中のものから選択される。
（表２）例示的な単一ドメイン抗体
Figure 2023546764000002
いくつかの実施形態では、配列番号４３のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４４のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４５のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４６のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４７のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４８のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４９のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５１のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５２のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５３のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５４のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５５のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５６のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１０４のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４３に記載のＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４３に記載のＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４３に記載のＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３（例えば、配列番号１５または３６）を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４３に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４３に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４３に記載のＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４３に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。ＣＤＲ配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＡｂＭナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４４に記載のＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４４に記載のＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４４に記載のＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３（例えば、配列番号１６または３７）を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４４に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４４に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４４に記載のＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４４に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。ＣＤＲ配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＡｂＭナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４５に記載のＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４５に記載のＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４５に記載のＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３（例えば、配列番号１７または３８）を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４５に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４５に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４５に記載のＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４５に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。ＣＤＲ配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＡｂＭナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４６に記載のＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４６に記載のＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４６に記載のＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３（例えば、配列番号１８または３９）を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４６に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４６に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４６に記載のＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４６に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。ＣＤＲ配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＡｂＭナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４７に記載のＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４７に記載のＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４７に記載のＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３（例えば、配列番号１９または４０）を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４７に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４７に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４７に記載のＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４７に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。ＣＤＲ配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＡｂＭナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４８に記載のＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４８に記載のＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４８に記載のＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３（例えば、配列番号２０または４１）を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４８に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４８に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４８に記載のＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４８に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。ＣＤＲ配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＡｂＭナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４９に記載のＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４９に記載のＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４９に記載のＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３（例えば、配列番号２１または４２）を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４９に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４９に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４９に記載のＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４９に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。ＣＤＲ配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＡｂＭナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５１に記載のＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５１に記載のＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５１に記載のＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３（例えば、配列番号１５または３６）を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５１に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５１に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５１に記載のＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５１に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。ＣＤＲ配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＡｂＭナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５２に記載のＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５２に記載のＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５２に記載のＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３（例えば、配列番号１５または３６）を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５２に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５２に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５２に記載のＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５２に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。ＣＤＲ配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＡｂＭナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５３に記載のＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５３に記載のＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５３に記載のＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３（例えば、配列番号１５または３６）を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５３に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５３に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５３に記載のＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５３に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。ＣＤＲ配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＡｂＭナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５４に記載のＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５４に記載のＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５４に記載のＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３（例えば、配列番号５０または３６）を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５４に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５４に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５４に記載のＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５４に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。ＣＤＲ配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＡｂＭナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５５に記載のＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５５に記載のＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５５に記載のＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３（例えば、配列番号１５または３６）を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５５に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５５に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５５に記載のＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５５に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。ＣＤＲ配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＡｂＭナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５６に記載のＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５６に記載のＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５６に記載のＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３（例えば、配列番号１５または３６）を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５６に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５６に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５６に記載のＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５６に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。ＣＤＲ配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＡｂＭナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号１０４に記載のＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号１０４に記載のＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号１０４に記載のＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３（例えば、配列番号１５または３６）を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号１０４に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号１０４に記載のＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号１０４に記載のＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号１０４に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。ＣＤＲ配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＡｂＭナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従う。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、以下の構造：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含むＣＤ１９に結合する単一ドメイン抗体が本明細書で提供され、（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号２２もしくは１０８、配列番号２３もしくは１０９、配列番号２４もしくは１１０、配列番号２５もしくは１１１、配列番号２６もしくは１１２、配列番号２７もしくは１１３、または配列番号２８もしくは１１４のアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）ＣＤＲ２は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、もしくは配列番号１０３のアミノ酸配列を含み、及び／あるいは、（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、もしくは配列番号５０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
他の実施形態では、以下の構造：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含むＣＤ１９に結合する単一ドメイン抗体が本明細書で提供され、（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号２２もしくは１０８、配列番号２３もしくは１０９、配列番号２４もしくは１１０、配列番号２５もしくは１１１、配列番号２６もしくは１１２、配列番号２７もしくは１１３、または配列番号２８もしくは１１４と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）ＣＤＲ２は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、または配列番号１０３と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／あるいは、（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、または配列番号５０と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号８のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号２２または１０８のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号１０８のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号２３または１０９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号２３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号１０９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号２４または１１０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号２４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号１１０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号２５または１１１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号１１１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
他の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
他の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号２６または１１２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号１１２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
他の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
他の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号２７または１１３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
他の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
他の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号２８または１１４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号２８のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
他の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号８のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号５０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
他の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号２２または１０８のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号１０３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号１０３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂにおいて、ＣＤＲ１は、配列番号１０８のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号１０３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、ＶＨＨ－０８３、ＶＨＨ－１１１、ＶＨＨ－１３１、７７ＬＩＣＡ５４２、７７ＬＩＣＡ５１９、７７ＬＩＣＡ６０２、ＬＩＣ１１５７、ＬＩＣ１１５９、ｈｕＶＨＨ－７７３、ｈｕＶＨＨ－７７６、Ａ５９２Ｈ１、Ａ５９２Ｈ２、Ａ５９２Ｈ３、及び／またはＡ５９２Ｈ４の１つ以上のフレームワーク領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４３の配列を含むＶＨＨドメインに由来する１つ以上のフレームワーク（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４４の配列を含むＶＨＨドメインに由来する１つ以上のフレームワーク（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４５の配列を含むＶＨＨドメインに由来する１つ以上のフレームワーク（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４６の配列を含むＶＨＨドメインに由来する１つ以上のフレームワーク（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４７の配列を含むＶＨＨドメインに由来する１つ以上のフレームワーク（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４８の配列を含むＶＨＨドメインに由来する１つ以上のフレームワーク（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号４９の配列を含むＶＨＨドメインに由来する１つ以上のフレームワーク（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５１の配列を含むＶＨＨドメインに由来する１つ以上のフレームワーク（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５２の配列を含むＶＨＨドメインに由来する１つ以上のフレームワーク（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５３の配列を含むＶＨＨドメインに由来する１つ以上のフレームワーク（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５４の配列を含むＶＨＨドメインに由来する１つ以上のフレームワーク（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５５の配列を含むＶＨＨドメインに由来する１つ以上のフレームワーク（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号５６の配列を含むＶＨＨドメインに由来する１つ以上のフレームワーク（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号１０４の配列を含むＶＨＨドメインに由来する１つ以上のフレームワーク（複数可）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体は、ヒト化単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、ヒト化単一ドメイン抗体は、以下のセクション６で例示される方法または以下のセクションに記載の方法を使用して生成することができる。
本明細書に記載のフレームワーク領域は、ＣＤＲナンバリングシステムの境界に基づいて決定される。換言すれば、ＣＤＲが、例えば、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、またはＣｈｏｔｈｉａで決定される場合、フレームワーク領域は、Ｎ末端からＣ末端までの形式の可変領域内のＣＤＲを取り囲むアミノ酸残基である：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。例えば、ＦＲ１は、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステム、ＩＭＧＴナンバリングシステム、またはＣｈｏｔｈｉａナンバリングシステムで定義されるＣＤＲ１アミノ酸残基のＮ末端側のアミノ酸残基として定義され、ＦＲ２は、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステム、ＩＭＧＴナンバリングシステム、またはＣｈｏｔｈｉａナンバリングシステムで定義されるＣＤＲ１及びＣＤＲ２アミノ酸残基の間のアミノ酸残基として定義され、ＦＲ３は、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステム、ＩＭＧＴナンバリングシステム、またはＣｈｏｔｈｉａナンバリングシステムで定義されるＣＤＲ２及びＣＤＲ３アミノ酸残基間のアミノ酸残基として定義され、ＦＲ４は、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステム、ＩＭＧＴナンバリングシステム、またはＣｈｏｔｈｉａナンバリングシステムで定義されるＣＤＲ３アミノ酸残基のＣ末端側のアミノ酸残基として定義される。
いくつかの実施形態では、配列番号４３のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４３のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４４のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４４のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４５のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４５のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４６のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４６のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４７のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４７のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４８のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４８のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４９のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４９のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５１のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５１のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５２のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５２のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５３のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５３のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５４のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５４のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５５のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５５のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５６のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５６のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１０４のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１０４のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体ＶＨＨ－０８３、ＶＨＨ－１１１、ＶＨＨ－１３１、７７ＬＩＣＡ５４２、７７ＬＩＣＡ５１９、７７ＬＩＣＡ６０２、ＬＩＣ１１５７、ＬＩＣ１１５９、ｈｕＶＨＨ－７７３、ｈｕＶＨＨ－７７６、Ａ５９２Ｈ１、Ａ５９２Ｈ２、Ａ５９２Ｈ３、及びＡ５９２Ｈ４のいずれか１つに対して特定のパーセント同一性を有するアミノ酸配列を含む。
２つの配列（例えば、アミノ酸配列または核酸配列）間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定例は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２２６４ ２２６８（１９９０）のアルゴリズムであり、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３ ５８７７（１９９３）のように修正される。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。本明細書に記載の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、例えば、スコア＝１００、ワード長＝１２に設定されたＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメーターで実施することができる。本明細書に記載のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、例えば、スコア５０、ワード長＝３に設定されたＸＢＬＡＳＴプログラムパラメーターで実施することができる。比較目的のギャップアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９ ３４０２（１９９７）に記載のギャップＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、分子間の遠い関係を検出する反復検索を実施するために、ＰＳＩ ＢＬＡＳＴを使用することができる（同上）。ＢＬＡＳＴ、ギャップＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる（例えば、ワールドワイドウェブｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖの国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）を参照）。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の非限定例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７（１９９８）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを使用することができる。ギャップを許容してまたは許容せずに、上記のものと同様の手法を使用して、２つの配列間のパーセント同一性を決定することができる。パーセント同一性の計算では、通常、完全一致のみがカウントされる。
いくつかの実施形態では、配列番号４３～４９、５１～５６、及び１０４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のいずれか１つの配列同一性を有するＶＨＨドメインを含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性のいずれか１つを有するＶＨＨ配列は、参照配列に対する置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、その配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、ＣＤ１９に結合する能力を保持する。いくつかの実施形態では、配列番号４３～４９、５１～５６、及び１０４から選択されるアミノ酸配列において、合計１～１０のアミノ酸が置換、挿入及び／または欠失している。いくつかの実施形態では、置換、挿入、または欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ）で生じる。任意に、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体は、配列番号４３～４９、５１～５６、及び１０４から選択されるアミノ酸配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、単一ドメイン抗体が、ＣＤ１９に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、単一ドメイン抗体が、ＣＤ１９に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、単一ドメイン抗体が、ＣＤ１９に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号４６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、単一ドメイン抗体が、ＣＤ１９に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、単一ドメイン抗体が、ＣＤ１９に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、単一ドメイン抗体が、ＣＤ１９に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、単一ドメイン抗体が、ＣＤ１９に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、単一ドメイン抗体が、ＣＤ１９に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、単一ドメイン抗体が、ＣＤ１９に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、単一ドメイン抗体が、ＣＤ１９に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、単一ドメイン抗体が、ＣＤ１９に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、単一ドメイン抗体が、ＣＤ１９に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、単一ドメイン抗体が、ＣＤ１９に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号１０４のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、単一ドメイン抗体が、ＣＤ１９に結合する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体との相互作用に必要なＣＤ１９タンパク質中のアミノ酸を同定するために、機能的エピトープを、例えば、コンビナトリアルアラニンスキャニングでマッピングすることができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９に結合している抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体の立体構造及び結晶構造は、エピトープを同定するために用いられてもよい。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で提供される抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体のいずれかと同じエピトープに特異的に結合する抗体を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、配列番号４３のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４４のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４６のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４８のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４９のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５１のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５２のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５３のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５４のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５５のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５６のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体のいずれか１つと競合して、ＣＤ１９に特異的に結合する抗ＣＤ１９抗体またはその抗原結合フラグメントが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、競合的結合は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、配列番号４３のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と競合して、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４４のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と競合して、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と競合して、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４６のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と競合して、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と競合して、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４８のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と競合して、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４９のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と競合して、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５１のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と競合して、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５２のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と競合して、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５３のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と競合して、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５４のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と競合して、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５５のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と競合して、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５６のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と競合して、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体と競合して、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、上記の抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体のいずれか１つを含むＣＤ１９結合タンパク質が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９結合タンパク質は、ラクダ科動物、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、抗体フラグメント、例えば、ＶＨＨフラグメントである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４などの任意の抗体クラスまたはアイソタイプのＦｃ領域を含む全長重鎖のみの抗体である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、エフェクター機能が低下または最小化されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９結合タンパク質は、本明細書で提供される抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体を含む融合タンパク質である。他の実施形態では、ＣＤ１９結合タンパク質は、本明細書で提供される抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体を含む多重特異性抗体である。他の例示的なＣＤ１９結合分子は、以下のセクションでより詳細に記載される。
いくつかの実施形態では、上記の実施形態のいずれかによる抗ＣＤ１９抗体（例えば、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体）または抗原結合タンパク質は、以下のセクション５．２．２～５．２．７に記載されるように、特徴のいずれかを、単独でまたは組み合わせて組み込んでもよい。
５．２．２．ヒト化単一ドメイン抗体
本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、ヒト化単一ドメイン抗体を含む。ラクダ科種由来の単一ドメイン抗体をヒト化するための一般的な方策が記載されており（例えば、Ｖｉｎｃｋｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４（５）：３２７３－３２８４（２００９）を参照）、本明細書に開示のヒト化ＶＨＨドメインの産生に有用であってよい。ラクダ科種由来のヒト化単一ドメイン抗体の設計は、残基１１、３７、４４、４５、及び４７（Ｋａｂａｔによる残基ナンバリング）などのＶＨＨの特徴的な残基を含んでもよい（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ ７４：２７７－３０２（２００１））。
限定されないが、以下を含む当該技術分野で既知の種々の手法を使用して、本明細書に開示のヒト化単一ドメイン抗体などのヒト化抗体を作製することもできる：ＣＤＲ移植（欧州特許第ＥＰ２３９，４００号；国際公開第ＷＯ９１／０９９６７号；ならびに米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、及び同第５，５８５，０８９号）、ベニアリングまたは再表面化（欧州特許第ＥＰ５９２，１０６号及び同第ＥＰ５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９－４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５－８１４（１９９４）；及びＲｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９１：９６９－９７３（１９９４））、鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）、ならびに、例えば、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、ＷＯ９３１７１０５、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９ ２５（２００２）、Ｃａｌｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３（５）：３５３－６０（２０００）、Ｍｏｒｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０（３）：２６７ ７９（２０００）、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８－８４（１９９７）、Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１０）：８９５ ９０４（１９９６）、Ｃｏｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（２３ Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ－５９７７ｓ（１９９５）、Ｃｏｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（８）：１７１７－２２（１９９５），Ｓａｎｄｈｕ ＪＳ，Ｇｅｎｅ １５０（２）：４０９－１０（１９９４）、及びＰｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５（３）：９５９－７３（１９９４）に開示の手法。米国特許公開第２００５／００４２６６４Ａ１号（２００５年２月２４日）（これらのそれぞれは、全体が参照により本明細書に組み込まれる）も参照のこと。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体は、ヒトＣＤ１９を含むＣＤ１９に結合するヒト化単一ドメイン抗体であり得る。例えば、本開示のヒト化単鎖抗体は、配列番号４３～４９、５１～５６、及び１０４に記載の１つ以上のＣＤＲを含んでもよい。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が当該技術分野で既知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「移入」残基と呼ばれ、これは、通常は「移入」可変ドメインから取得される。ヒト化は、例えば、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列に置換することによる、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－２７（１９８８）；及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－３６（１９８８）の方法に従って実施されてもよい。特定の実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体のヒト化は、以下のセクション６に記載されるように実施される。
いくつかの場合では、ヒト化抗体は、ＣＤＲ移植で構築され、親非ヒト抗体のＣＤＲのアミノ酸配列がヒト抗体フレームワークに移植される。例えば、Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．により、ＣＤＲ中の残基の約３分の１のみが、実際に抗原と接触することが決定され、これらを「特異性決定残基」またはＳＤＲと呼ぶ（Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３－３９（１９９５））。ＳＤＲ移植の手法では、ＳＤＲ残基のみが、ヒト抗体フレームワークに移植される（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）を参照）。
ヒト化抗体の作製に使用されるヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減させるために重要であり得る。例えば、いわゆる「ベストフィット」法に従って、非ヒト抗体の可変ドメインの配列が、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。非ヒト抗体のヒト配列に最も近いものが、ヒト化抗体のヒトフレームワークとして選択されてもよい（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６－３０８（１９９３）；及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－１７（１９８７））。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体に使用されてもよい（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５－８９（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３－３２（１９９３））。いくつかの場合では、フレームワークは、最も豊富なヒトサブクラスＶＬ６サブグループＩ（ＶＬ６Ｉ）、及びＶＨサブグループＩＩＩ（ＶＨＩＩＩ）のコンセンサス配列に由来する。別の方法では、ヒト生殖系列遺伝子は、フレームワーク領域の供給源として使用される。
超ヒト化と呼ばれるＣＤＲの比較に基づく別のパラダイムでは、ＦＲの相同性は、無関係である。方法は、非ヒト配列と機能的なヒト生殖系列遺伝子レパートリーとの比較からなる。次に、マウス配列と同じまたは密接に関連するカノニカル構造をコードする遺伝子が選択される。次に、非ヒト抗体と、カノニカル構造を共有する遺伝子中で、ＣＤＲ内で相同性が最も高い遺伝子がＦＲドナーとして選択される。最後に、非ヒトＣＤＲをこれらのＦＲに移植する（例えば、以下を参照：Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９－２５（２００２））。
さらに一般には、抗原に対する親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持して、抗体がヒト化されることが望ましい。この目標を達成するために、ある方法によれば、親及びヒト化配列の３次元モデルを使用した、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析プロセスにより、ヒト化抗体を調製する。３次元免疫グロブリンモデルは、一般に、入手可能であり、当業者らによく知られる。選択された候補免疫グロブリン配列の予想される３次元立体配座構造を図示及び表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらは、例えば、ＷＡＭ（Ｗｈｉｔｅｌｅｇｇ ａｎｄ Ｒｅｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３：８１９－２４（２００２））、Ｍｏｄｅｌｌｅｒ（Ｓａｌｉ ａｎｄ Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４：７７９－８１５（１９９３））、及びＳｗｉｓｓ ＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒ（Ｇｕｅｘ ａｎｄ Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：２７１４－２３（１９９７））を含む。これらの表示を調査することにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性がある役割の分析、例えば、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析、が可能になる。このようにして、標的抗原（複数可）に対する親和性の増加などの所望の抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択して組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合への影響に直接且つ最も実質的に関与する。
抗体をヒト化する別の方法は、ヒト鎖含量（Ｈｕｍａｎ Ｓｔｒｉｎｇ Ｃｏｎｔｅｎｔ）（ＨＳＣ）と呼ばれる抗体のヒト性の測定基準に基づいている。この方法は、マウス配列をヒト生殖系列遺伝子のレパートリーと比較し、その違いがＨＳＣとして点数化される。次に、標的配列は、複数の多様なヒト化バリアントを生成するためにグローバル同一性尺度を使用する代わりに、ＨＳＣを最大化することにより、ヒト化される（Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：１９８６－９８（２００７））。
上記の方法に加えて、実験的方法は、ヒト化抗体を生成及び選択するために使用されてもよい。これらの方法は、ヒト化バリアントの大規模ライブラリーの生成及び濃縮技術またはハイスループットスクリーニング手法を使用した最良のクローンの選択に基づくものを含む。抗体バリアントは、ファージ、リボソーム、及び酵母ディスプレイライブラリーから、ならびに細菌コロニースクリーニングにより単離され得る（例えば、以下を参照：Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１０５－１６（２００５）；Ｄｕｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：５２３－２９（２００６）；Ｆｅｌｄｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：１６３－７０（２００３）；及びＳｃｈｌａｐｓｃｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１７：８４７－６０（２００４））。
ＦＲライブラリーアプローチでは、残基バリアントのコレクションがＦＲの特定の位置に導入され、続いて、移植されたＣＤＲを最もよくサポートするＦＲを選択するために、ライブラリーをスクリーニングする。置換されるべき残基は、ＣＤＲ構造に潜在的に寄与すると確認された「Ｖｅｒｎｉｅｒ」残基の一部または全部（例えば、以下を参照：Ｆｏｏｔｅ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７－９９（１９９２））、またはＢａｃａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－８４（１９９７）により同定された標的残基のより制限されたセット由来のものを含み得る。
ＦＲシャッフリングでは、選択された残基バリアントのコンビナトリアルライブラリーを作成する代わりに、ＦＲ全体が非ヒトＣＤＲと組み合わされる（例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）を参照）。１ステップＦＲシャッフルプロセスが、使用されてもよい。得られた抗体は、発現の増強、親和性の増加、及び熱安定性を含む改善された生化学的及び物理化学的特性を示したので、そのようなプロセスは、効率的であることが示されている（例えば、Ｄａｍｓｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：３０４９－６０（２００７）を参照）。
「ヒューマニアリング」法は、必須最小特異性決定因子（ＭＳＤ）の実験的同定に基づいており、非ヒトフラグメントをヒトＦＲのライブラリーに順次置換し、結合を評価することに基づいている。この方法論は、通常、異なるヒトＶセグメントＣＤＲを有する複数のサブクラスからの抗体のエピトープ保持及び同定をもたらす。
「ヒト工学」法は、ヒトの免疫原性を低減させた（それにもかかわらず、元の非ヒト抗体のその望ましい結合特性を保持する）改変抗体を産生するために、抗体のアミノ酸配列に特定の変更を加えることにより、非ヒト抗体または抗体フラグメントを変更することを含む。一般に、この手法は、非ヒト抗体のアミノ酸残基を、「低リスク」、「中リスク」、または「高リスク」残基として分類することを含む。置換が結果として生じる抗体の折りたたみに影響を与えるリスクに対して、特定の置換（例えば、ヒトの免疫原性）を行うことの予測される利益を評価する全体的なリスク／リワード計算を使用して、分類が行われる。非ヒト抗体の可変領域由来のアミノ酸配列を、特定のまたはコンセンサスヒト抗体配列の対応する領域とアラインすることにより、非ヒト抗体配列の所与の位置（例えば、低リスクまたは中リスク）で置換されるべき特定のヒトアミノ酸残基を選択することができる。アラインメントに従って、非ヒト配列の低リスクまたは中リスク位置のアミノ酸残基を、ヒト抗体配列の対応する残基と置換することができる。ヒト操作されたタンパク質の作製手法は、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：８０５－１４（１９９４）；米国特許第５，７６６，８８６号；同第５，７７０，１９６号；同第５，８２１，１２３号；及び同第５，８６９，６１９号；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１１７９４号に詳細に記載される。
例えば、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）技術（ＡｎｔｉｔｏｐｅＬｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して、複合ヒト抗体を生成することができる。複合ヒト抗体を生成するために、可変領域配列は、Ｔ細胞エピトープを回避する方法で複数のヒト抗体可変領域配列のフラグメントから設計され、それにより、得られる抗体の免疫原性が最小限に抑えられる。
脱免疫化抗体は、Ｔ細胞エピトープが除去されている抗体である。脱免疫化抗体を作製する方法が記載されている。例えば、以下を参照：Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．５２５：４０５－２３（２００９），ｘｉｖ、及び Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４４：１４８－１５３（２００６）。脱免疫化抗体は、Ｔ細胞エピトープ枯渇可変領域及びヒト定常領域を含む。要約すると、抗体の可変領域がクローン化され、その後、Ｔ細胞エピトープが、Ｔ細胞増殖アッセイで抗体の可変領域に由来する重複ペプチドを試験することにより同定される。Ｔ細胞エピトープは、ヒトＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドを同定するｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法により同定される。ヒトＭＨＣクラスＩＩへの結合を無効にするために、変異が可変領域に導入される。次に、変異可変領域は、脱免疫化抗体を生成するために利用される。
５．２．３．単一ドメイン抗体バリアント
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ１９に結合する単一ドメイン抗体のアミノ酸配列修飾（複数可）が企図される。例えば、限定されないが、特異性、熱安定性、発現レベル、エフェクター機能、グリコシル化、免疫原性の低減、または溶解性を含む、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を最適化することが望ましいことある。従って、本明細書に記載のＣＤ１９に結合する単一ドメイン抗体に加えて、本明細書に記載のＣＤ１９に結合する単一ドメイン抗体のバリアントを調製することができることが企図される。例えば、適切なヌクレオチド変化をコードＤＮＡに導入することにより、及び／または所望の抗体もしくはポリペプチドの合成により、単一ドメイン抗体バリアント調製することができる。当業者らは、アミノ酸変化が単一ドメイン抗体の翻訳後プロセスを変化させ得ることを認識する。
化学修飾
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体は、例えば、単一ドメイン抗体への任意のタイプの分子の共有結合により、化学修飾される。抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドもしくは他のタンパク質への結合、または１つ以上の免疫グロブリンドメイン（例えば、ＦｃまたはＦｃの一部）へのコンジュゲーションにより化学修飾された抗体を含んでもよい。多数の化学修飾のいずれもが、限定されないが、特定の化学的切断、アセチル化、製剤化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む既知の手法により実施され得る。抗体は、１つ以上の非古典的アミノ酸をさらに含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように変更される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作成または除去されるようにアミノ酸配列を変更することにより都合よく達成され得る。
本明細書で提供される単一ドメイン抗体がＦｃ領域に融合される場合、それに結合する炭水化物が変更され得る。哺乳動物細胞により産生される天然抗体は、通常は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合で一般に結合している分岐、二分岐オリゴ糖を含む。例えば、以下を参照：Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」内のＧｌｃＮＡｃに結合しているフコースを含んでもよい。いくつかの実施形態では、特定の改善された特性を有するバリアントを作成するために、本明細書で提供される結合分子中のオリゴ糖の修飾がなされ得る。
他の実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体がＦｃ領域に融合している場合、本明細書で提供される抗体バリアントは、該Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）結合しているフコースを欠く炭水化物構造を有してもよい。例えば、そのような抗体中のフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％、または２０％～４０％であり得る。例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されるように、Ａｓｎ２９７に結合している全ての糖構造（例えば、複合、ハイブリッド、及び高マンノース構造）の合計に対する、Ａｓｎ２９７の糖鎖内のフコースの平均量を計算することにより、フコースの量を決定した（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法で測定）。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域内の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７は、抗体のわずかな配列変動により、２９７位の上流または下流の約±３アミノ酸、すなわち、２９４～３００位間、に位置する可能性もある。このようなフコシル化バリアントは、ＡＤＣＣ機能を改善していることがある。例えば、米国特許公開第ＵＳ２００３／０１５７１０８号及び第ＵＳ２００４／００９３６２１号を参照のこと。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体バリアントに関連する刊行物の例としては、ＵＳ２００３／０１５７１０８；ＷＯ２０００／６１７３９；ＷＯ２００１／２９２４６；ＵＳ２００３／０１１５６１４；ＵＳ２００２／０１６４３２８；ＵＳ２００４／００９３６２１；ＵＳ２００４／０１３２１４０；ＵＳ２００４／０１１０７０４；ＵＳ２００４／０１１０２８２；ＵＳ２００４／０１０９８６５；ＷＯ２００３／０８５１１９；ＷＯ２００３／０８４５７０；ＷＯ２００５／０３５５８６；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；ＷＯ２００２／０３１１４０；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９－１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生可能な細胞株の例としては、以下が挙げられる：タンパク質のフコシル化が欠損したＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８号；及びＷＯ２００４／０５６３１２、特に、実施例１１）、ならびに、ノックアウト細胞株、例えば、α－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、以下を参照：Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）；及びＷＯ２００３／０８５１０７）。
本明細書で提供される単一ドメイン抗体を含む結合分子は、さらに、バイセクト型オリゴ糖と共に提供され、例えば、Ｆｃ領域に結合している二分岐オリゴ糖が、ＧｌｃＮＡｃによりバイセクティングされる。そのようなバリアントは、フコシル化の低減及び／またはＡＤＣＣ機能の改善を有することがある。そのようなバリアントの例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．）米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）；及びＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）に記載される。Ｆｃ領域に結合しているオリゴ糖中の少なくとも１つのガラクトース残基を有するバリアントも提供される。そのようなバリアントは、ＣＤＣ機能を改善していることがある。そのようなバリアントは、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７、ＷＯ１９９８／５８９６４、及びＷＯ１９９９／２２７６４に記載される。
本単一ドメイン抗体及びＦｃ領域を含む分子では、１つ以上のアミノ酸修飾は、Ｆｃ領域に導入され、それにより、Ｆｃ領域バリアントが生成され得る。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本出願は、全てではないがいくつかのエフェクター機能を保有するバリアントについて検討し、これにより、それが、ｉｎ ｖｉｖｏでの結合分子の半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（例えば、補体及びＡＤＣＣ）が不要または有害である用途のための望ましい候補になる。ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認するために、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイを行うことができる。例えば、結合分子が、ＦｃγＲ結合を欠く（従って、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確認するために、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行うことができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの非限定例は、以下に記載される：米国特許第５，５００，３６２号（例えば、以下を参照：Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６））及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（以下を参照：Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７））。あるいは、非放射性アッセイ法が使用されてもよい（例えば、以下を参照：フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的または追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）で開示されるような動物モデルで評価され得る。抗体がＣ１ｑに結合できず、従って、ＣＤＣ活性を欠くことを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイも行われ得る。例えば、以下を参照：ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡ。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイが実施され得る（例えば、以下を参照：Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４））。当該技術分野で既知の方法を使用して、ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期の決定も実施することができる（例えば、以下を参照：Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６））。
エフェクター機能が低減した結合分子は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ以上の置換を有するものを含む（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７の２つ以上の置換を有するＦｃ変異体を含み、これは、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
ＦｃＲへの結合が改善または減少した特定のバリアントが記載される。（例えば、以下を参照：米国特許第６，７３７，０５６号；ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１））。
いくつかの実施形態では、バリアントは、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位、及び／または３３４位（残基のＥＵナンバリング）の置換、を有するＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されるように、Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の変更（すなわち、改善または減少）をもたらす変更がＦｃ領域でなされる。
母体のＩｇＧの胎児への移行に関与する、半減期が増加し且つ胎児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された結合分子（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）に記載される。これらの分子は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つ以上の置換を含むＦｃ領域を含む。そのようなＦｃバリアントとしては、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上に置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するもの、が挙げられる（米国特許第７，３７１，８２６号）。Ｆｃ領域バリアントの他の例については、Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及びＷＯ９４／２９３５１。
いくつかの実施形態では、システイン操作された抗体を作製することが望ましいことがあり、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換される。いくつかの実施形態では、置換残基は、抗体の接近可能な部位に存在する。さらに本明細書で記載されるように、イムノコンジュゲートを作成するために、これらの残基をシステインで置換し、それにより、反応性チオール基が抗体のアクセス可能な部位に配置され、これは、他の部分、例えば、薬物部分またはリンカー－薬物部分、に抗体をコンジュゲートするために使用されてもよい。
置換、欠失、または挿入
変化は、元の抗体またはポリペプチドと比較してアミノ酸配列の変化をもたらす、単一ドメイン抗体またはポリペプチドをコードする１つ以上のコドンの置換、欠失、または挿入であってよい。置換変異導入の目的の部位は、ＣＤＲ及びＦＲを含む。
アミノ酸置換は、あるアミノ酸を、類似の構造的及び／または化学的性質を有する別のアミノ酸で置換すること、例えば、ロイシンをセリンで置換すること、例えば、保存的アミノ酸置換、の結果であり得る。本明細書で提供される分子をコードするヌクレオチド配列に変異を導入するために、例えば、アミノ酸置換をもたらす部位特異的変異導入及びＰＣＲ媒介変異導入を含む当業者らに既知の標準的手法を使用することができる。挿入または欠失は、任意に、約１～５個のアミノ酸の範囲であり得る。特定の実施形態では、置換、欠失、または挿入は、元の分子と比較して、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換、または２未満のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、置換は、１つ以上の予測される非必須アミノ酸残基で行われる保存的アミノ酸置換である。配列中のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を体系的に行い、得られたバリアントを親抗体により示される活性について試験することにより、許容された変化が決定されてもよい。
アミノ酸配列の挿入は、１残基から、複数の残基を含むポリペプチドまでの長さのアミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。
保存的アミノ酸置換で生成された単一ドメイン抗体は、本開示に含まれる。保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基は、同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置換される。上記のように、同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。あるいは、例えば、飽和変異導入などにより、コード配列の全部または一部に沿ってランダムに、変異を導入することができ、活性を保持する変異体を同定するために、生物学的活性についてスクリーニングすることができる。変異導入後、コードされたタンパク質を発現させることができ、タンパク質の活性を決定することができる。特性を維持するか、または有意に変化させないように、保存的（例えば、類似の特性及び／または側鎖を有するアミノ酸群内で）置換が行われてもよい。例示的置換が以下の表３に示される。
（表３）アミノ酸置換
Figure 2023546764000003
アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性に従ってグループ化されてもよい（例えば、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７３－７５（２ｄ ｅｄ．１９７５）を参照）：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；及び、（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、以下の群に分けられてもよい：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び、（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。例えば、単一ドメイン抗体の適切な立体配座の維持に関与していない任意のシステイン残基は、また、分子の酸化安定性を改善し且つ異常な架橋を防ぐために、別のアミノ酸、例えば、アラニンまたはセリン、で置換されてもよい。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを、別のクラスに交換する必要がある。
置換バリアントの１つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる研究のために選択された得られたバリアント（複数可）は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性（例えば、親和性の増加、免疫原性の減少）において改変（例えば、改善）を有し、及び／または、親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持することになる。例示的な置換バリアントは、親和性成熟抗体であり、これは、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイベースの親和性成熟手法を使用して、簡便に生成されてもよい。要約すると、１つ以上のＣＤＲ残基が、変異し、バリアント抗体が、ファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
例えば、抗体親和性を改善するために、ＣＤＲにおいて、改変（例えば、置換）が行われてもよい。そのような改変は、ＣＤＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９－１９６（２００８）を参照）、及び／またはＳＤＲ（α－ＣＤＲ）において行われてもよく、得られたバリアント抗体またはそのフラグメントは、結合親和性について試験される。２次ライブラリーの構築及び再選択による親和性成熟は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））のＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド特異的変異導入）のいずれかにより、成熟について選択された可変遺伝子に多様性が導入される。次に、２次ライブラリーが作成される。次に、ライブラリーは、所望の親和性を有する任意の抗体バリアントを同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＣＤＲ残基（例えば、一度に４～６残基）がランダム化されるＣＤＲ特異的アプローチを含む。抗原結合に関与するＣＤＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異導入またはモデリングを使用して、特異的に同定されてもよい。親和性成熟に関するより詳細な説明は、以下のセクションで提供される。
いくつかの実施形態では、抗体が抗原に結合する能力を、そのような改変が実質的に低減させない限り、置換、挿入、または欠失は、１つ以上のＣＤＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書で提供される保存的置換）がＣＤＲで行われてもよい。本明細書で提供されるバリアントＶＨＨ配列のいくつかの実施形態では、各ＣＤＲは、変更されていないか、または１つ、２つもしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有する。
変異導入の標的となり得る抗体の残基または領域の同定に有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５（１９８９）に記載される「アラニンスキャニング変異導入」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基または群（例えば、荷電残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕ）が同定され、抗原の抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判定するために、中性または負荷電アミノ酸（例えば、アラニンもしくはポリアラニン）で置換される。最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置にさらなる置換が導入されてもよい。代替的または追加的に、抗体及び抗原間の接触点を同定するための抗原－抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされるかまたは排除されてもよい。バリアントは、それらが所望の特性を含有するかどうかを決定するためにスクリーニングされてもよい。
アミノ酸配列の挿入には、１残基から、１００残基以上を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントには、抗体のＮ末端またはＣ末端に酵素（例えば、ＡＤＥＰＴの場合）または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドを融合することを含む。
オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）変異導入、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ変異導入などの当該技術分野で既知の方法を使用して、変化をもたらすことができる。単一ドメイン抗体バリアントＤＮＡを生成するために、部位特異的変異導入（例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２３７：１－７（１９８６）；及びＺｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７－５００（１９８２）を参照）、カセット変異導入（例えば、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３４：３１５－２３（１９８５）を参照）、または他の既知の手法を、クローン化ＤＮＡに実施することができる。
５．２．４．ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟
いくつかの実施形態では、親抗体と比較して、親和性、安定性、または発現レベルなどの特性が改善された抗体バリアントが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟により調製されてもよい。自然のプロトタイプと同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟は、変異及び選択の原則に基づく。抗体のライブラリーは、生物（例えば、ファージ、細菌、酵母、もしくは哺乳動物細胞）の表面上に、またはそれらのコードｍＲＮＡまたはＤＮＡと（例えば、共有結合的または非共有結合的に）会合して提示される。表示された抗体の親和性選択により、抗体をコードする遺伝情報を運ぶ生物または複合体の分離が可能になる。ファージディスプレイなどのディスプレイ法を使用した２回または３回の変異及び選択により、通常、低ナノモル範囲の親和性を有する抗体フラグメントがもたらされる。親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモルまたはさらにピコモルの親和性を有し得る。
ファージディスプレイは、抗体のディスプレイ及び選択のための広範な方法である。抗体は、バクテリオファージコートタンパク質への融合物としてＦｄまたはＭ１３バクテリオファージの表面に表示される。選択は、ファージに提示された抗体の標的への結合を可能にする抗原への曝露（「パニング」と呼ばれるプロセス）を含む。さらなる選択ラウンドのためのファージを生成するために、抗原に結合したファージが回収されて、使用される。概説については、例えば、以下を参照のこと：Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：１－３７（２００２）；及びＢｒａｄｂｕｒｙ ａｎｄ Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９０：２９－４９（２００４）。
酵母ディスプレイシステム（例えば、Ｂｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：５５３－５７（１９９７）；及びＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １：７５５－６８（２００６）を参照）では、抗体は、酵母凝集素タンパク質Ａｇａ２ｐの接着サブユニットに融合されてもよく、これは、Ａｇａ１ｐへのジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に結合する。Ａｇａ２ｐを介したタンパク質のディスプレイは、タンパク質を細胞表面から突出し、酵母細胞壁上の他の分子との潜在的な相互作用を最小限に抑える。磁気分離及びフローサイトメトリーは、ライブラリーをスクリーニングし、親和性または安定性が向上した抗体を選択するために使用される。目的の可溶性抗原への結合は、ビオチン化抗原及び蛍光体にコンジュゲートされた２次試薬、例えば、ストレプトアビジンで、酵母を標識することにより決定される。抗体の表面発現の変化は、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）に隣接するヘマグルチニンまたはｃ－Ｍｙｃエピトープタグのいずれかの免疫蛍光標識で測定することができる。発現は、提示されたタンパク質の安定性と相関することが示されており、それにより、安定性及び親和性を改善するために、抗体を選択することができる（例えば、Ｓｈｕｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２：９４９－５６（１９９９）を参照）。酵母ディスプレイの追加の利点は、小胞体シャペロン及び品質管理機序を利用して、提示されたタンパク質が真核酵母細胞の小胞体で折りたたまれることである。成熟が完了すると、酵母の表面に提示される間、抗体親和性を簡便に「滴定」することができ、これにより、各クローンの発現及び精製の必要がなくなる。酵母の表面提示の理論的な制限は、機能ライブラリーサイズが他の提示方法のサイズよりも小さい可能性があるが、最近のアプローチは、酵母細胞の配偶システムを使用して、サイズが１０１４であると推定されるコンビナトリアル多様性が生じる（例えば、米国特許公開第２００３／０１８６３７４号；及びＢｌａｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３４２：２１１－１８（２００４）を参照）。
リボソームディスプレイでは、無細胞系での選択のために抗体－リボソーム－ｍＲＮＡ（ＡＲＭ）複合体が生成される。抗体の特定のライブラリーをコードするＤＮＡライブラリーは、終止コドンを欠くスペーサー配列に遺伝的に融合される。このスペーサー配列は、翻訳された場合、依然として、ペプチジルｔＲＮＡに結合しており、リボソームトンネルを占有し、それにより、目的のタンパク質がリボソームから突き出て、折りたたまれることが可能になる。得られたｍＲＮＡ、リボソーム、及びタンパク質の複合体は、表面に結合したリガンドに結合し得、これにより、リガンドを用いるアフィニティーキャプチャーにより、抗体及びそのコードｍＲＮＡを同時に単離することが可能である。次に、リボソーム結合ｍＲＮＡは、逆転写されてｃＤＮＡに戻り、次に、変異導入を受け、次の選択ラウンドで使用することができる（例えば、Ｆｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４：ｅ１２７（２００６）を参照）。ｍＲＮＡディスプレイでは、ピューロマイシンをアダプター分子として使用して、抗体及びｍＲＮＡ間の共有結合が確立される（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：３７５０－５５（２００１））。
これらの方法は、完全にｉｎ ｖｉｔｒｏで実施されるので、他の選択技術に優る２つの主な利点がある。まず、ライブラリーの多様性は、細菌細胞の形質転換効率により制限されるのではなく、試験管内に存在するリボソーム及び異なるｍＲＮＡ分子の数によってのみ制限される。次に、任意の多様化ステップの後にライブラリーを変換する必要がないため、例えば、非校正ポリメラーゼにより、各選択ラウンドの後にランダムな変異を簡単に導入することができる。
いくつかの実施形態では、哺乳動物のディスプレイシステムが使用されてもよい。
多様性は、また、標的指向性の方法で、またはランダムな導入を介して、抗体ライブラリーのＣＤＲに導入され得る。前者のアプローチは、高レベルまたは低レベルの変異導入を介して抗体の全てのＣＤＲを連続的に標的にすること、あるいは体細胞超変異の単離されたホットスポット（例えば、Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：６０７－１７（２００５））または実験的根拠もしくは構造上の理由で親和性に影響を与えると疑われる残基を連続して標的にすることを含む。多様性は、また、ＤＮＡシャッフリングまたは同様の手法を介して自然に多様である領域の置換により導入され得る（例えば、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４３４９６－５０７（２００３）；米国特許第５，５６５，３３２号及び同第６，９８９，２５０号を参照）。代替手法は、フレームワーク領域残基に伸びる超可変ループを標的とし（例えば、Ｂｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４８：６９９－７０９（２００５）を参照）、ＣＤＲ内のループ欠失及び挿入を用いるか、または、ハイブリダイゼーションベースの多様性を使用する（例えば、米国特許公開第２００４／０００５７０９号を参照）。ＣＤＲにおいて多様性を生成する追加の方法は、例えば、米国特許第７，９８５，８４０号に開示される。抗体ライブラリー及び／または抗体親和性成熟を生成するために使用することができるさらなる方法は、例えば、米国特許第８，６８５，８９７号及び同第８，６０３，９３０号、ならびに米国公開第２０１４／０１７０７０５号、同第２０１４／００９４３９２号、同第２０１２／００２８３０１号、同第２０１１／０１８３８５５号、及び同第２００９／００７５３７８号に開示され、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
ライブラリーのスクリーニングは、当該技術分野で既知の様々な技術により達成することができる。例えば、単一ドメイン抗体を、固体支持体、カラム、ピン、もしくはセルロース／ポリ（フッ化ビニリデン）膜／他のフィルターに固定するか、吸着プレートに固定された宿主細胞上で発現させるか、または細胞選別に使用するか、または、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズを用いた捕捉のためにビオチンにコンジュゲートするか、またはディスプレイライブラリーをパニングするための任意の他の方法で使用することができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟方法の概説については、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１０５－１６（２００５）；Ｑｕｉｒｏｚ ａｎｄ Ｓｉｎｃｌａｉｒ，Ｒｅｖｉｓｔａ Ｉｎｇｅｎｅｒｉａ Ｂｉｏｍｅｄｉａ ４：３９－５１（２０１０）；及びそれらの中の参考文献を参照のこと。
５．２．５．単一ドメイン抗体の修飾
単一ドメイン抗体の共有結合修飾は、本開示の範囲内に含まれる。共有結合修飾は、単一ドメイン抗体の標的アミノ酸残基を、有機誘導体化剤と反応させることを含む。この有機誘導体化剤は、選択された側鎖または単一ドメイン抗体のＮもしくはＣ末端残基と反応可能である。他の修飾は、それぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基へのグルタミニル及びアスパラギニル残基の脱アミド化、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα－アミノ基のメチル化（例えば、以下を参照：Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ７９－８６（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化、を含む。
本開示の範囲内に含まれる単一ドメイン抗体の他のタイプの共有結合修飾は、以下を含む：上記の抗体またはポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更（例えば、以下を参照：Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４８２－５０１（２００８）；及びＷａｌｓｈ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ １５：７７３－８０（２０１０））、ならびに、例えば、米国特許第４，６４０，８３５号、第４，４９６，６８９号、第４，３０１，１４４号、第４，６７０，４１７号、第４，７９１，１９２号、または第４，１７９，３３７号に記載の方法で、様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンのうちの１つに抗体を結合させること。本開示のＣＤ１９に結合する単一ドメイン抗体はまた、半減期を延長し、及び／または既知のＦｃ媒介性エフェクター機能を付与するために、１つ以上の免疫グロブリン定常領域またはその一部（例えば、Ｆｃ）に遺伝的に融合またはコンジュゲートされ得る。
本開示のＣＤ１９に結合する単鎖抗体はまた、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列、例えば、エピトープタグ（例えば、以下を参照：Ｔｅｒｐｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０：５２３－３３（２００３））またはＩｇＧ分子のＦｃ領域（例えば、以下を参照：Ａｒｕｆｆｏ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２２１－４２（Ｃｈａｍｏｗ ａｎｄ Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｄｓ．，１９９９））、に融合したＣＤ１９に結合する単鎖抗体を含むキメラ分子を形成するように改変され得る。ＣＤ１９に結合する単鎖抗体は、また、以下でより詳細に記載されるように、ＣＤ１９結合キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を得るために使用されてもよい。
また、本開示のＣＤ１９に結合する単鎖抗体及び異種ポリペプチドを含む融合タンパク質も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗体が遺伝子的に融合または化学的にコンジュゲートされる異種ポリペプチドは、細胞表面発現ＣＤ１９を有する細胞へ抗体を向けるのに有用である。
ＣＤ１９抗原に結合する抗体のパネルも本明細書で提供される。特定の実施形態では、抗体のパネルは、異なる会合速度、異なる解離速度、ＣＤ１９抗原に対する異なる親和性、及び／またはＣＤ１９抗原に対する異なる特異性を有する。いくつかの実施形態では、パネルは、約１０～約１０００以上の抗体を含むか、またはそれらからなる。抗体のパネルを、例えば、９６ウェルまたは３８４ウェルプレートでの、ＥＬＩＳＡなどのアッセイに使用することができる。
５．２．６．単一ドメイン抗体の調製
単一ドメイン抗体を調製する方法が記載されている。例えば、Ｅｌｓ Ｐａｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，９（３）：６７４（２０１４）を参照のこと。単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）は、当該技術分野で既知の方法を使用して、例えば、ラクダ科動物種（例えば、ラクダもしくはラマ）に免疫をして、そこからハイブリドーマを取得することにより、または当該技術分野で既知分子生物学的手法を使用して単一ドメイン抗体のライブラリーをクローニングし、続いて、選択されていないライブラリーの個々のクローンを用いたＥＬＩＳＡ、もしくはファージディスプレイの使用より選択することにより、取得され得る。
本明細書で提供される単一ドメイン抗体は、単一ドメイン抗体をコードする核酸を含有するベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を培養することにより産生されてもよい。本開示の抗体のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組み換え手法を使用して取得することができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞またはＢ細胞などの抗体産生細胞から単離及びシーケンシングされてもよい。あるいは、ヌクレオチドシンセサイザーまたはＰＣＲ技術を使用して、ポリヌクレオチドを合成することができる。ポリペプチドをコードする配列は、得られると、宿主細胞において異種ポリヌクレオチドを複製し且つ発現させることができる組み換えベクターに挿入される。当該技術分野で入手可能及び既知の多くのベクターを、本開示の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入される核酸のサイズ、及びベクターで形質転換されるべき特定の宿主細胞に依存するであろう。本開示の抗体を発現するのに適する宿主細胞は、グラム陰性またはグラム陽性生物を含む古細菌及び真正細菌などの原核生物、糸状菌または酵母などの真核微生物、昆虫または植物細胞などの無脊椎動物細胞、及び哺乳類宿主細胞株などの脊椎動物細胞を含む。宿主細胞を上記の発現ベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変された従来の栄養培地で培養する。当該技術分野で既知の標準的なタンパク質精製を使用して、宿主細胞により産生された抗体を精製する。
ベクターの構築、発現、及び精製を含む抗体産生の方法は、さらに、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：Ｆｒｏｍ ＰＣＲ ｔｏ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ２０３－５２（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，１９９６）；Ｋｗｏｎｇ ａｎｄ Ｒａｄｅｒ，Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｂ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）；Ｔａｃｈｉｂａｎａ ａｎｄ Ｔａｋｅｋｏｓｈｉ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆａｂ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（Ａｌ－Ｒｕｂｅａｉ ｅｄ．，２０１１）；及びＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ（Ａｎ ｅｄ．，２００９）に記載される。
当該技術分野で周知の別の方法は、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体を調製するために使用され得ることができると、当然考えられる。例えば、適切なアミノ酸配列またはその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成により生成されてもよい（例えば、以下を参照：Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９６９）；及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９－５４（１９６３））。ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成は、手動手法の使用または自動化により実施され得る。所望の抗ＣＤ１９抗体を得るために、抗ＣＤ１９抗体の様々な部分が、別々に化学合成され、化学的または酵素的方法を使用して組み合わされてもよい。あるいは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号及び第５，８２７，６９０号に記載されるように、抗体は、抗体を発現するように操作されたトランスジェニック動物の細胞またはミルクなどの体液から精製されてもよい。
具体的には、ラマを免疫し、単一Ｂ細胞選別を実施し、Ｖ遺伝子抽出を行い、ＶＨＨ－Ｆｃ融合などのＣＤ１９結合剤をクローニングし、次に、小さなスケール表現及び精製を実施することにより、本明細書で提供される単一ドメイン抗体または他のＣＤ１９結合剤を生成することができる。ＥＬＩＳＡ陽性、ＢＬＩ陽性、及び１００ｎＭ未満のＫＤについての選択のうちの１つ以上を含む、ＣＤ１９に結合する単一ドメイン抗体及び他の分子の追加のスクリーニングを実施することができる。以下のセクション６に記載されるように、これらの選択基準を組み合わせることができる。さらに、ＣＤ１９を発現する細胞に結合する能力について、個々のＶＨＨ結合剤（及びＣＤ１９に結合する他の分子）をアッセイすることができる。ＣＤ１９を発現する細胞を用いたＦＡＣＳ分析を使用して、蛍光標識されたＶＨＨ分子の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定することにより、このようなアッセイを実施することができる。上述の様々な態様は、以下でより詳細に記載される。
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、一般に、関連抗原及びアジュバントを複数回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射することにより動物で産生される。二官能性または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ１は、独立して、低級アルキル基である）を使用して、免疫されるべき種、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシチログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤、において免疫原性であるタンパク質に関連抗原をコンジュゲートすることが有用であってよい。用いられ得るアジュバントの例としては、フロイントの完全アジュバント及びＭＰＬ－ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート）が挙げられる。免疫化プロトコールは、過度の実験をすることなく当業者が選択し得る。
例えば、例えば、１００μｇまたは５μｇのタンパク質またはコンジュゲート（それぞれ、ウサギまたはマウスに対し）を３体積のフロイント完全アジュバントと組み合わせ、複数の部位に溶液を皮内注射することにより、動物を抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、複数の部位に皮下注射することにより、フロイント完全アジュバント中の元の量の１／５～１／１０のペプチドまたはコンジュゲートで動物を追加免疫する。７～１４日後、動物から採血し、血清を抗体力価についてアッセイする。力価が安定するまで、動物を追加免疫する。コンジュゲートを、タンパク質融合体として組み換え細胞培養で作成することもできる。また、ミョウバンなどの凝集剤は、免疫応答を高めるのに適する。
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得られ、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、可能な天然に存在する突然変異及び／または微量で存在し得る翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。従って、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。
例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して作製されても、組み換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）により作製されてもよい。
ハイブリドーマ法では、免疫に使用されるタンパク質に特異的に結合することになる抗体を産生するか、またはそれを産生可能なリンパ球を誘発するように、適切な宿主動物を免疫する。あるいは、リンパ球は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫され得る。次に、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用して、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９－１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
免疫剤は、通常、抗原タンパク質またはその融合バリアントを含むであろう。Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８６），ｐｐ．５９－１０３。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞である。従って、調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、未融合の親ミエローマ細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する好適な培地に播種し、成長させる。好ましい不死化骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性があるものである。
ハイブリドーマ細胞が成長している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞が培養される培地は、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。そのような技術及びアッセイは、当該技術分野で既知である。例えば、結合親和性は、Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ解析により決定され得る。
所望の特異性、親和性、及び／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界希釈手順によりサブクローニングし、標準的な方法により成長させてもよい（Ｇｏｄｉｎｇ、上掲）。この目的に好適な培地は、例えば、Ｄ－ＭＥＭまたはＲＰＭＩ－１６４０培地を含む。加えて、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物において腫瘍としてｉｎ ｖｉｖｏで成長し得る。
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ－セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーにより、培地、腹水、または血清から適切に分離される。
モノクローナル抗体はまた、組み換えＤＮＡ法、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるものにより、及び上述のように、行われてもよい。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離及びシーケンシングされる。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。単離されたＤＮＡは、発現ベクターに配置されてもよく、次に、そのような組み換え宿主細胞においてモノクローナル抗体を合成するために、宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他の方法では免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞にトランスフェクトされる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組み換え発現に関する総説は、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６－２６２（１９９３）及びＰｌｉｉｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１－１８８（１９９２）を含む。
さらなる実施形態では、抗体は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２－５５４（１９９０）に記載の手法を使用して生成された抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）。後続の刊行物は、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９－７８３（１９９２））、ならびに、非常に大きなファージライブラリーの構築の方策としてのコンビナトリアル感染及びｉｎ ｖｉｖｏ組み換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１：２２６５－２２６６（１９９３））について記載する。従って、これらの技術は、モノクローナル抗体を分離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ手法の現実的な代替物である。
また、例えば、コード配列を置換することにより（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））、または、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部もしくは一部をコード配列に共有結合させることにより、ＤＮＡが改変され得る。抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位及び異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作製するために、そのような非免疫グロブリンポリペプチドを置換することができる。
キメラ抗体またはハイブリッド抗体は、また、架橋剤を含むものを含む、合成タンパク質化学における既知の方法を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで調製され得る。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することにより構築され得る。この目的に適する試薬の例としては、イミノチオラート及びメチル－４－メルカプトブチルイミダートが挙げられる。
原核細胞における組み換え産生
本開示の抗体をコードするポリ核酸配列は、標準的な組み換え手法を使用して得ることができる。所望のポリ核酸配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離及びシーケンシングされてもよい。あるいは、ヌクレオチドシンセサイザーまたはＰＣＲ技術を使用して、ポリヌクレオチドを合成することができる。ポリペプチドをコードする配列は、得られると、原核宿主において異種ポリヌクレオチドを複製及び発現可能な組み換えベクターに挿入される。当該技術分野で入手可能及び既知の多くのベクターを、本開示の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入される核酸のサイズ、及びベクターで形質転換されるべき特定の宿主細胞に依存するであろう。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはその両方）及び存在する特定の宿主細胞との適合性に応じて、様々な構成要素を含有する。ベクター構成要素は、一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸挿入物、及び転写終結配列を含むが、これらに限定されない。
一般に、宿主細胞と適合する種に由来するレプリコン及び制御配列を含有するプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して使用される。ベクターは、通常、複製部位、ならびに形質転換細胞において表現型選択を提供可能なマーキング配列を有する。例えば、大腸菌は、通常、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例としては、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，６４８，２３７号に詳細に記載される。
加えて、宿主微生物と適合するレプリコン及び制御配列を含有するファージベクターを、これらの宿主に関連する形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、ＧＥＭ（商標）－１１などのバクテリオファージは、大腸菌ＬＥ３９２などの感受性宿主細胞を形質転換するために使用することができる組み換えベクターを作製することに、利用されてもよい。
本出願の発現ベクターは、ポリペプチド構成要素のそれぞれをコードする２つ以上のプロモーター－シストロン対を含んでもよい。プロモーターは、その発現を調節するシストロンの上流（５’）に位置する非翻訳調節配列である。原核生物のプロモーターは、通常、誘導性及び構成性の２つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の変化、例えば、栄養素の有無または温度変化に応答して、その制御下で、増加した転写レベルのシストロンを開始するプロモーターである。
様々な潜在的な宿主細胞に認識される多数のプロモーターが周知される。選択されたプロモーターは、制限酵素消化によりソースＤＮＡからプロモーターを除去し、単離されたプロモーター配列を本出願のベクターに挿入することにより、本抗体をコードするシストロンＤＮＡに作動可能に連結することができる。天然のプロモーター配列及び多くの異種プロモーターの両方は、標的遺伝子の増幅及び／または発現を誘導するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、異種プロモーターは、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、より多くの転写及びより高収量の発現された標的遺伝子を一般に可能にするので、利用される。
原核生物宿主での使用に適するプロモーターとしては、ＰｈｏＡプロモーター、β－ガラクタマーゼ及びラクトースプロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、ならびにｔａｃまたはｔｒｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかし、細菌で機能する他のプロモーター（例えば、他の既知の細菌プロモーターまたはファージプロモーター）も同様に適する。それらの核酸配列は、公開されており、それにより、任意の必要な制限部位を提供するために、リンカーまたはアダプターを使用して、当業者が、標的ペプチドをコードするシストロンにそれらを作動可能にライゲーションすることが可能になる（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２０：２６９（１９８０））。
一態様では、組み換えベクター内の各シストロンは、膜を通貨する発現されたポリペプチドの移動を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列は、ベクターの構成要素であっても、ベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であってもよい。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞に認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものでなければならない。異種ポリペプチドに固有のシグナル配列を認識及びプロセシングしない原核宿主細胞の場合、シグナル配列を、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、及びＭＢＰからなる群より選択される原核生物シグナル配列により置換することができる。
いくつかの実施形態では、本開示による抗体の産生は、宿主細胞の細胞質で生じ得、従って、各シストロン内の分泌シグナル配列の存在を必要としない。特定の宿主株（例えば、大腸菌ｔｒｘＢ－株）は、ジスルフィド結合の形成に有利な細胞質条件を提供し、それにより、発現されたタンパク質サブユニットの適切な折りたたみ及びアセンブリが可能になる。
本開示の抗体を発現するのに適する原核宿主細胞としては、古細菌及び真正細菌、例えば、グラム陰性生物またはグラム陽性生物が挙げられる。有用な細菌の例としては、エシェリキア（例えば、大腸菌）、バチルス（例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、腸内細菌、シュードモナス属（例えば、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、クレブシエラ、プロテウス、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ、またはパラコッカスが挙げられる。いくつかの実施形態では、グラム陰性細胞が使用される。一実施形態では、大腸菌細胞が宿主として使用される。大腸菌株の例としては、Ｗ３１１０株（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７），ｐｐ．１１９０－１２１９；ＡＴＣＣ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｏ．２７，３２５）及びそれらの誘導体（遺伝子型Ｗ３１１０ ＡｆｈｕＡ（ＡｔｏｎＡ）ｐｔｒ３ ｌａｃ Ｉｑ ｌａｃＬ８ ＡｏｍｐＴ Ａ（ｎｍｐｃ－ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１ ｋａｎＲを有する３３Ｄ３株を含む）（米国特許第５，６３９，６３５号）が挙げられる。他の株及びその誘導体、例えば、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）、大腸菌Ｂ、大腸菌１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、及び大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ３１，６０８）も好適である。これらの例は、限定ではなく例示である。規定された遺伝子型を有する上述の細菌のいずれかの誘導体を構築する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９－３１４（１９９０）に記載される。一般に、細菌の細胞内でのレプリコンの複製可能性を考慮して、適切な細菌を選択する必要がある。周知のプラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、またはｐＫＮ４１０がレプリコンを供給するために使用される場合、大腸菌、セラチア、またはサルモネラ種を宿主として適切に使用することができる。
通常、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきであり、追加のプロテアーゼ阻害剤は、望ましくは、細胞培養に組み込まれ得る。
宿主細胞を上記の発現ベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変された従来の栄養培地で培養する。形質転換は、ＤＮＡが染色体外エレメントとして、または染色体インテグラントにより、複製可能になるように、原核生物の宿主にＤＮＡを導入することを意味する。使用される宿主細胞に応じて、そのような細胞に適する標準的な手法を使用して、形質転換を行う。塩化カルシウムを用いるカルシウム処置は、一般に、実質的な細胞壁バリアを含有する細菌細胞に使用される。形質転換のための別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用されるさらに別の手法は、エレクトロポレーションである。
本出願の抗体を産生するために使用される原核細胞を、当該技術分野の、及び選択された宿主細胞の培養に適する培地中で成長させた。好適な培地の例としては、ルリアブロス（ＬＢ）と必要な栄養補助食品が挙げられる。いくつかの実施形態では、培地は、発現ベクターを含有する原核細胞の成長を選択的に可能にするために、発現ベクターの構築に基づいて選択される選択剤も含有する。例えば、アンピシリンは、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の成長のために培地に添加される。
炭素、窒素、及び無機リン酸源以外の必要なサプリメントは、また、単独で、または複合窒素源などの別の補助剤または培地との混合物として、適切な濃度で含まれ得る。任意に、培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコラート、ジチオエリスリトール、及びジチオスレイトールからなる群より選択される１つ以上の還元剤を含有してもよい。原核宿主細胞は、好適な温度及びｐＨで培養される。
誘導性プロモーターが本出願の発現ベクターで使用される場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に適する条件下で誘導される。本出願の一態様では、ＰｈｏＡプロモーターは、ポリペプチドの転写を制御するために使用される。従って、形質転換された宿主細胞は、誘導のためにリン酸制限培地中で培養される。好ましくは、リン酸制限培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えば、以下を参照：Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３：１３３－１４７（２００２））。当該技術分野で既知の、用いられるベクター構築物に応じて、様々な他の誘導因子が使用されてもよい。
本開示の発現された抗体は、宿主細胞のペリプラズムに分泌され、そこから回収される。タンパク質の回収は、一般に、浸透圧ショック、超音波処理、または溶解のような手段により、微生物を破壊することを通常含む。細胞が破砕されると、細胞破片または細胞全体は、遠心分離または濾過により除去され得る。タンパク質は、例えば、アフィニティー樹脂クロマトグラフィーにより、さらに、精製されてもよい。あるいは、タンパク質を培地に移し、その中で単離することができる。細胞を、培養物から除去し、培養上清を濾過し、産生されたタンパク質をさらに精製するために濃縮してもよい。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウェスタンブロットアッセイなどの一般的に既知の方法を使用して、発現されたポリペプチドを、さらに分離及び同定することができる。
あるいは、タンパク質産生は、発酵プロセスにより大量に行われる。様々な大規模流加回分発酵手順が、組み換えタンパク質の産生に利用可能である。本開示の抗体の産生収量及び品質を改善するために、様々な発酵条件を改変することができる。例えば、シャペロンタンパク質は、細菌宿主細胞で産生される異種タンパク質の適切な折りたたみ及び溶解性を促進することが実証されている。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ ２７４：１９６０１－１９６０５（１９９９）；米国特許第６，０８３，７１５号；米国特許第６，０２７，８８８号；Ｂｏｔｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００－１７１０５（２０００）；Ｒａｍｍ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６－１７１１３（２０００）；Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９－２１０（２００１）。
例えば、米国特許第５，２６４，３６５号；米国特許米第５，５０８，１９２号；Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２：６３－７２（１９９６）に記載されるように、発現された異種タンパク質（特に、タンパク質分解感受性のもの）のタンパク質分解を最小限に抑えるために、タンパク質分解酵素を欠損する特定の宿主株を、本発明に使用することができる。タンパク質分解酵素を欠損し、１つ以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換された大腸菌株は、本出願の抗体をコードする発現系において宿主細胞として使用されてもよい。
さらなるアッセイ及び使用のために実質的に均一な調製物を得るために、本明細書で産生された抗体を、さらに精製することができる。当該技術分野で既知の標準的なタンパク質精製法を用いることができる。以下の手順は、適切な精製手順の例である：イムノアフィニティーまたはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカまたはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、及び、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５を使用するゲル濾過。例えば、固相上に固定化されたプロテインＡを、本開示の結合分子のイムノアフィニティー精製のためのいくつかの実施形態に使用することができる。プロテインＡが固定化される固相は、好ましくは、ガラスまたはシリカ表面を含むカラムであり、より好ましくは、制御細孔ガラスカラムまたはケイ酸カラムである。いくつかの実施形態では、カラムは、汚染物質の非特異的付着を防ぐために、グリセロールなどの試薬でコーティングされている。次に、固相を洗浄して、固相に非特異的に結合している汚染物質を除去する。最後に、目的の抗体を、溶出により固相から回収する。
真核細胞における組み換え産生
真核発現の場合、ベクター構成要素は、一般に、以下の、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、及びエンハンサーエレメント、プロモーター、ならびに転写終結配列のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。
真核生物宿主で使用されるベクターは、また、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドをコードする挿入物であってよい。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞に認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。哺乳動物細胞の発現では、哺乳動物のシグナル配列と、ウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。そのような前駆体領域のＤＮＡは、本出願の抗体をコードするＤＮＡにリーディングフレームでライゲーションすることができる。
一般に、複製起点構成要素は、哺乳類の発現ベクターには必要ない（ＳＶ４０起点は、通常、初期プロモーターを含有するので、使用されてもよい）。
発現及びクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有してもよい。選択遺伝子は、抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか；栄養要求性欠乏症を補完するか；複合培地から入手できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードし得る。
選択スキームの一例は、薬物を利用して宿主細胞の成長を阻止する。異種遺伝子で効率よく形質転換された細胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を産生し、それにより、選択レジメンの後も存続する。そのような優性選択の例は、ネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシンという薬剤を使用する。
哺乳動物細胞に適する選択マーカーの別の例は、本出願の抗体をコードする核酸を取り込む能力がある細胞の同定を可能にするものである。例えば、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培地中で、全ての形質転換体を培養することにより、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞を、最初に同定する。野生型ＤＨＦＲが用いられる場合の適切な宿主細胞の例は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。あるいは、アミノグリコシド系抗生物質などの選択マーカーの選択剤を含有する培地中での細胞成長により、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及び別の選択マーカー、例えば、アミノグリコシド３’－ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）で形質転換または同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）を選択することができる。
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物に認識され、所望のポリペプチド配列をコードする核酸に作動可能に連結されるプロモーターを含有する。真核生物の遺伝子は、転写が開始される部位の約２５～３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始の７０～８０塩基上流に見出される別の配列が含まれてもよい。ほとんどの真核生物の３’末端は、コード配列の３’末端にポリＡテールを付加するためのシグナルであってよい。これらの配列は全て、真核発現ベクターに挿入され得る。
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからのポリペプチド転写を、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから入手されるプロモーターにより、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから、制御することができる。但し、そのようなプロモーターは、宿主細胞系と適合性がある。
高等真核生物による本開示の抗体をコードするＤＮＡの転写は、多くの場合、エンハンサー配列をベクターに挿入することで増加する。現在、哺乳類の遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン、及びインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が既知である。例としては、複製起点の後半側（ｂｐ１００－２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核プロモーターの活性化のための促進エレメントについては、以下も参照：Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ２９７：１７－１８（１９８２）。エンハンサーは、ポリペプチドをコードする配列に対して５’または３’の位でベクターにスプライシングされ得るが、好ましくは、プロモーターからの５’の部位に位置する。
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物の有核細胞）で使用される発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有する。そのような配列は、一般に、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’、場合により、３’の非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。有用な転写終結構成要素の１つは、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化領域である。
本明細書のベクターでＤＮＡをクローニングまたは発現するのに好適な宿主細胞としては、脊椎動物宿主細胞を含む、本明細書に記載の高等真核生物細胞が挙げられる。培養（組織培養）中の脊椎動物細胞の増殖は、日常的な手順になっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児腎細胞株（浮遊培養での成長のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒトヘパトーム株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
宿主細胞を、抗体産生のための上記の発現またはクローニングベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に改変された従来の栄養培地で培養することができる。
本出願の抗体を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地で培養されてもよい。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が、宿主細胞の培養に適する。加えて、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；もしくは同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国再発行特許第３０，９８５号に記載の培地のいずれかが、宿主細胞の培地として使用されてもよい。これらの培地のいずれかは、必要に応じて、ホルモン及び／または他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義）、及びグルコースまたは同等のエネルギー源を補充されてもよい。他の必要な補充剤は、また、当業者らに既知となる適切な濃度で含まれてもよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現について選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。
組み換え技術を使用する場合、抗体を、細胞内で、細胞周辺腔に産生するか、または培地に直接分泌することができる。抗体が細胞内で産生される場合、最初のステップとして、宿主細胞または溶解フラグメントのいずれかである微粒子状破片を、例えば、遠心分離または限外濾過で除去する。抗体が培地に分泌される場合、一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して、そのような発現系の上清を、最初に濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するために上述のステップのいずれかに含まれてもよく、抗生物質は、偶発的な汚染物質の成長を防ぐために含まれてもよい。
例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィー（アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である）を用いて、細胞から調製されたタンパク質組成物を精製することができる。アフィニティーリガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定したマトリックス、例えば、細孔制御ガラスまたはポリ（スチレン－ジビニル）ベンゼンは、アガロースで達成できるよりも、速い流速及び短い処理時間を可能にする。回収されるべき抗体に応じて、タンパク質精製のための他の手法、例えば、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）でのヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー、クロマト分画、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿も利用可能である。任意の予備精製ステップ（複数可）の後、目的の抗体及び汚染物質を含む混合物を、低ｐＨの疎水性相互作用クロマトグラフィーに供してもよい。
５．２．７．単一ドメイン抗体を含む結合分子
別の態様では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体（例えば、ＣＤ１９に対するＶＨＨドメイン）を含む結合分子が本明細書で提供される。以下のセクション５．３に記載の本明細書で提供されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に加えて、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ１９に対する単一ドメイン抗体は、他の結合分子の一部である。本開示の例示的な結合分子は、本明細書に記載される。
融合タンパク質
様々な実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体は、別の薬剤、例えば、タンパク質ベースの実体と遺伝子的に融合または化学的にコンジュゲートすることができる。単一ドメイン抗体は、薬剤に化学的にコンジュゲートされても、別の方法で、薬剤に非共有結合的にコンジュゲートされてもよい。薬剤は、ペプチドもしくは抗体（またはそのフラグメント）であり得る。
従って、いくつかの実施形態では、融合タンパク質を生成するための、異種タンパク質またはポリペプチド（またはそのフラグメントに、例えば、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、もしくは約５００アミノ酸、または５００を超えるアミノ酸のポリペプチドに）組み換え融合または化学的にコンジュゲート（共有結合的にまたは非共有結合的にコンジュゲート）される単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨドメイン）、及びその使用が本明細書で提供される。特に、本明細書で提供される単一ドメイン抗体の抗原結合フラグメント（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３）ならびに異種タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを含む融合タンパク質が本明細書で提供される。
さらに、精製を容易にするために、本明細書で提供される抗体を、ペプチドなどのマーカーまたは「タグ」配列に融合させることができる。特定の実施形態では、マーカーまたはタグのアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチド、ヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ、及び「ＦＬＡＧ」タグである。
部分（ポリペプチドを含む）を抗体に融合またはコンジュゲートする方法は既知である（例えば、以下を参照：Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２４３－５６（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ６２３－５３（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，２ｄ ｅｄ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ４７５－５０６（Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，１９８５）；Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ３０３－１６（Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９－５８（１９８２）；米国特許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，７２３，１２５号；同第５，７８３，１８１号；同第５，９０８，６２６号；同第５，８４４，０９５；及び同第５，１１２，９４６号；ＥＰ３０７，４３４；ＥＰ３６７，１６６；ＥＰ３９４，８２７；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０６５７０、ＷＯ９６／０４３８８、ＷＯ９６／２２０２４、ＷＯ９７／３４６３１、及びＷＯ ９９／０４８１３；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１０５３５－３９（１９９１）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４－８６（１９８８）；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０－６００（１９９５）；ならびにＶｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１１３３７－４１（１９９２））。
融合タンパク質は、例えば、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフリング、及び／またはコドンシャッフリング（一括して、「ＤＮＡシャッフリング」と呼ばれる）の技術により生成され得る。ＤＮＡシャッフリングは、例えば、より高い親和性及びより低い解離速度を有する抗体を含む、本明細書で提供される単一ドメイン抗体の活性を変更するために用いられてもよい（例えば、以下を参照：米国特許第５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２１号；同第５，８３４，２５２号；及び同第５，８３７，４５８；Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４－３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６－８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５－７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ ａｎｄ Ｂｌａｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８－１３（１９９８））。抗体、またはコード化された抗体は、組み換えの前に、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法によるランダム変異導入を受けることにより改変されてもよい。本明細書で提供される抗体をコードするポリヌクレオチドは、１つ以上の異種分子の１つ以上の構成要素、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメントなどで組み換えられてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨドメイン）は、二次抗体にコンジュゲートされて、抗体ヘテロコンジュゲートを形成する。
様々な実施形態では、単一ドメイン抗体は、薬剤に遺伝的に融合される。単一ドメイン抗体と薬剤との間にリンカー（例えば、ポリペプチド）を配置することにより、遺伝子融合が達成されてもよい。リンカーは、柔軟なリンカーであってよい。
種々の実施形態では、単一ドメイン抗体は、単一ドメイン抗体を治療用分子に連結するヒンジ領域を用いて、治療用分子に遺伝的にコンジュゲートされる。
本明細書で提供される様々な融合タンパク質を作製する方法も本明細書で提供される。上記のセクション５．２．６に記載される様々な方法もまた、本明細書で提供される融合タンパク質を作製するために利用されてもよい。
特定の実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質は、組み換え発現される。本明細書で提供される融合タンパク質の組み換え発現は、タンパク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とし得る。本明細書で提供されるタンパク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドが得られると、分子の産生のためのベクターは、当該技術分野で周知の手法を使用する組み換えＤＮＡ技術で生成されてもよい。従って、コードヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を調製するための方法が本明細書に記載される。コード配列ならびに適切な転写及び翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するために、当業者らに周知の方法を使用することができる。これらの方法は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換えＤＮＡ手法、合成手法、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組み換えを含む。プロモーターに作動可能に連結された、本明細書で提供される融合タンパク質、またはそのフラグメント、またはＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターも提供される。
発現ベクターは、従来の手法により宿主細胞に移入することができ、次に、トランスフェクトされた細胞を、従来の技術で培養して、本明細書で提供される融合タンパク質を産生する。従って、異種プロモーターに作動可能に連結された、本明細書で提供される融合タンパク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞も本明細書で提供される。
本明細書で提供される融合タンパク質を発現させるために、様々な宿主発現ベクター系が利用されてもよい。そのような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、続いて、精製され得るビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合、本明細書で提供される融合タンパク質をｉｎ ｓｉｔｕで発現し得る細胞も表す。これらは、微生物、例えば、コード配列を含有する組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌及び枯草菌）；コード配列を含有する組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、ピキア酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｐｉｃｈｉａ））；コード配列を含有する組み換えウイルス発現ベクターに感染させた昆虫細胞系（例えば、バキュロウイルス）；コード配列を含有する組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させるか、もしくは組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期型プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組み換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳ０、及び３Ｔ３細胞）を含むが、これらに限定されない。細菌細胞、例えば、大腸菌または真核細胞は、特に、組み換え抗体分子全体の発現のために、組み換え融合タンパク質の発現に使用することができる。例えば、ヒトサイトメガロウイルスの主要中間初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと組み合わせた、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳類細胞は、抗体またはそのバリアントの効果的な発現系である。特定の実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターで調節される。
細菌系では、発現される融合タンパク質を意図する用途に応じて、多数の発現ベクターが有利に選択されてもよい。例えば、融合タンパク質の医薬組成物の生成のために、大量のそのような融合タンパク質を産生する場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を誘導するベクターが望ましいことがある。そのようなベクターとしては、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（コード配列は、融合タンパク質が産生されるように、ｌａｃＺコード領域とフレーム内でベクターに個別にライゲーションされ得る）（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ１２：１７９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１－３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３－５５０９（１９８９））などが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターはまた、外来ポリペプチドをグルタチオン５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために使用されてもよい。一般に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、マトリックスのグルタチオンアガロースビーズに吸着及び結合させ、続いて、遊離グルタチオンの存在下で溶出することにより、溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローン化された標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出することができるように、トロンビンまたは因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系が利用されてもよい。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的のコード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーター及び三部分リーダー配列にライゲーションされてもよい。次に、このキメラ遺伝子が、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ組み換えにより、アデノウイルスゲノムに挿入されてもよい。ウイルスゲノムを非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）に挿入すると、生存可能な、感染宿主において融合タンパク質を発現可能な組み換えウイルスがもたらされるであろう（例えば、Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８ １：３５５－３５９（１９８４））。挿入されたコード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと一致していなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成の両方の様々な起源のものであり得る。適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含むことにより、発現効率が高められ得る（例えば、以下を参照：Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１－５４４（１９８７））。
加えて、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の特定の様式で遺伝子産物を改変及びプロセシングする宿主細胞株が選択されてもよい。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）及び加工（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。様々な宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾に特徴的且つ特定の機序を有する。発現した外来タンパク質の正確な修飾及び処理を確実にするために、適切な細胞株または宿主系を選択することができる。この目的のために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、及びリン酸化のための細胞機序を保有する真核宿主細胞が使用されてもよい。そのような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２Ｏ、及びＴ４７Ｄ、ＮＳ０（任意の免疫グロブリン鎖を内因的に産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、及びＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞を含むが、これらに限定されない。
組み換えタンパク質の長期的且つ高収量の産生のために、安定した発現を利用することができる。例えば、融合タンパク質を安定して発現する細胞株が操作され得る。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用する代わりに、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）及び選択マーカーにより制御されるＤＮＡで宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後に、操作された細胞を、濃縮培地で１～２日間成長させてもよく、次に、選択培地に切り替える。組み換えプラスミドの選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドを染色体に安定的に組み込み、成長して病巣を形成することを可能にし、これを、順次、細胞株にクローニング及び増大させることができる。本方法は、融合タンパク質を発現する細胞株を操作するために有利に使用されてもよい。そのような操作された細胞株は、結合分子と直接的または間接的に相互作用する組成物のスクリーニング及び評価において特に有用であり得る。
限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２（１９９２））、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２２：８－１７（１９８０））遺伝子を含む多数の選択システムが使用されてもよく、それぞれ、ｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞、またはａｐｒｔ細胞で用いることができる。また、代謝拮抗薬耐性は、以下の遺伝子の選択の基礎として使用することができる：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７（１９８１））；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ－４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７－９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３－５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６－９３２（１９９３）；及びＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１－２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：ｌ５５－２ １５（１９９３））；ならびに、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。組み換えＤＮＡ技術の分野で一般に既知の方法が、所望の組み換えクローンを選択するために日常的に適用されてもよく、そのような方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；及びｉｎ Ｃｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載され、これは、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
融合タンパク質の発現レベルは、ベクター増幅により増加させることができる（概説については、以下を参照：Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。融合タンパク質を発現するベクター系のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルが増加すると、マーカー遺伝子のコピー数が増加するであろう。増幅された領域が融合タンパク質遺伝子と会合するので、融合タンパク質の産生も増加するであろう（Ｃｒｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
宿主細胞は、本明細書で提供される複数の発現ベクターで同時トランスフェクトされてもよい。ベクターは、それぞれのコード化ポリペプチドの同等の発現を可能にする同一の選択マーカーを含有してもよい。あるいは、複数のポリペプチドをコードし、発現することが可能な単一ベクターが使用されてもよい。コード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含んでもよい。
本明細書で提供される融合タンパク質が組み換え発現により産生されると、それは、ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン分子）の精製のための当該技術分野で既知の任意の方法で、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特に、プロテインＡ後の特定の抗原に対する親和性、サイジングカラムクロマトグラフィー、及びカッパセレクトアフィニティークロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質の精製のための他の標準的な手法で精製されてもよい。さらに、本明細書で提供される融合タンパク質分子は、精製を容易にするために、本明細書に記載の、または別途、当該技術分野で既知の異種ポリペプチド配列に融合することができる。
イムノコンジュゲート
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の細胞傷害剤、例えば、化学療法剤または薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらのフラグメント）、あるいは放射性同位体、にコンジュゲートされている本明細書に記載の抗体（例えば、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体）のうちのいずれかを含むイムノコンジュゲートも提供する。
いくつかの実施形態では、イムノコンジュゲートは、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）（抗体が、限定されないが、メイタンシノイドを含む１つ以上の薬物にコンジュゲートされている）（以下を参照：米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号、及び欧州特許０４２５２３５Ｂ１）；アウリスタチン、例えば、モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（以下を参照：米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号、ならびに同第７，４９８，２９８号）；ドラスタチン；カリケアミシンまたはその誘導体（以下を参照：米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、及び同第５，８７７，２９６号；Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６－３３４２（１９９３）；ならびにＬｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２５－２９２８（１９９８））；アントラサイクリン、例えば、ダウノマイシンまたはドキソルビシン（以下を参照：Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７－５２３（２００６）；Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １６：３５８－３６２（２００６）；Ｔｏｒｇｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７－７２１（２００５）；Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８２９－８３４（２０００）；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １２：１５２９－１５３２（２００２）；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６－４３４３（２００２）；及び米国特許第６，６３０，５７９号）；メトトレキサート；ビンデシン；タキサン、例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセル；トリコテセン；ならびにＣＣ１０６５である。
いくつかの実施形態では、イムノコンジュゲートは、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α－サルシン、アリューライト・フォルディタンパク質、ダイアンチンタンパク質、フィトラッカ・アメリカーナタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、モモルディカ・チャランティア阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス阻害剤、ゲロニン、マイトジェリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンを含む、酵素的に活性な毒素またはそのフラグメントにコンジュゲートされている、本明細書に記載の抗体を含む。
いくつかの実施形態では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされて、放射性コンジュゲートを形成する、本明細書に記載の抗体を含む。様々な放射性同位元素は、放射性コンジュゲートの生成に利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位元素が挙げられる。放射性コンジュゲートは、検出に使用される場合、シンチグラフィ研究用の放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても既知）用のスピン標識、例えば、ヨウ素－１２３、さらに、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄を含んでもよい。
抗体及び細胞傷害剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアナート）、及びビス活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を使用して行われてもよい。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。炭素１４標識１－イソシアナトベンゾイル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲートさせるための例示的なキレート剤である。以下を参照：ＷＯ９４／１１０２６。
リンカーは、細胞内で、コンジュゲートされた薬剤の放出を促進する「切断可能なリンカー」であってよいが、切断不可能なリンカーも本明細書で企図される。本開示のコンジュゲートで使用されるリンカーは、酸に不安定なリンカー（例えば、ヒドラゾンリンカー）、ジスルフィド含有リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー（例えば、バリン及び／またはシトルリン、例えば、シトルリン－バリンまたはフェニルアラニン－リジン、のアミノ酸を含むペプチドリンカー）、光解離性リンカー、ジメチルリンカー、チオエーテルリンカー、または多剤輸送体媒介耐性を回避するように設計された親水性リンカーを含むが、これらに限定されない。
イムノコンジュゲートまたはＡＤＣは、本明細書では、架橋試薬（限定されないが、市販されるＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、及びスルホ－ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾアート）を含む）で調製された、そのようなコンジュゲートを企図するが、これらに限定されず、これは、（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．、Ｕ．Ｓ．Ａから）市販されている。
他の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、例えば、診断用分子にコンジュゲートまたは組み換え融合される。例えば、限定されないが、限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどの様々な酵素；限定されないが、ストレプトアビジン／ビオチンまたはアビジン／ビオチンなどの補欠分子族；限定されないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンなどの蛍光材料；限定されないが、ルミノールなどの発光材料；限定されないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、またはエクオリンなどの生物発光材料；２２５Ａｃγ放出、オージェ放出、β放出、α放出、または陽電子放出放射性同位元素などの化学発光材料、を含む検出可能な物質に抗体をカップリングすることにより、そのような診断及び検出を達成することができる。
５．３．キメラ抗原受容体
別の態様では、ＣＤ１９に結合する本明細書で提供される単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）を含む細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が本明細書で提供される。本ＶＨＨドメインを含む例示的なＣＡＲ（すなわち、ＶＨＨベースのＣＡＲ）が示され、以下のセクション６に記載されるように、ｓｃＦｖを含む従来のＣＡＲ（すなわち、ｓｃＦｖベースのＣＡＲ）と比較される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、（ａ）本明細書で提供される、ＣＤ１９に特異的に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、及び、任意に、１つ以上の追加の結合ドメイン（複数可）を含む細胞外抗原結合ドメイン；（ｂ）膜貫通ドメイン；ならびに（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むポリペプチドを含む。各コンポーネント及び追加の領域は、以下により詳細に記載される。
５．３．１．細胞外抗原結合ドメイン
本明細書に記載のＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のうちのいずれか１つ）の単一ドメイン抗体を含む。ペプチド結合を介して直接、またはペプチドリンカーを介して、単一ドメイン抗体を互いに融合させることができる。
単一ドメイン抗体
本開示のＣＡＲは、１つ以上の単一ドメイン抗体を含む細胞外抗原結合ドメインを含む。ｓｄＡｂは、同じまたは異なる起源のもの、及び、同じまたは異なるサイズのものであってよい。例示的なｓｄＡｂとしては、重鎖のみの抗体由来の重鎖可変ドメイン（例えば、ＶＨＨまたはＶＮＡＲ）、軽鎖を天然に欠く結合分子、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウスまたはラットにより産生された従来の４鎖抗体、ヒト化重鎖のみの抗体、ヒト単一ドメイン抗体に由来する単一ドメイン（例えば、ＶＨまたはＶＬ）、ならびに抗体に由来するもの以外の操作されたドメイン及び単一ドメイン足場が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載のＣＡＲを構築するために、本開示の上記の単一ドメイン抗体を含む、当該技術分野で既知の、または本開示により開発された任意のｓｄＡｂが、使用されてもよい。ｓｄＡｂは、限定されないが、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、及びウシを含む任意の種に由来し得る。本明細書で企図される単一ドメイン抗体は、ラクダ科及びサメ以外の種に由来する天然に存在する単一ドメイン抗体分子も含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、軽鎖を欠く重鎖抗体（本明細書では「重鎖のみの抗体」とも呼ばれる）として既知の天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子に由来する。そのような単一ドメイン分子は、例えば、ＷＯ９４／０４６７８及びＨａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－４４８（１９９３）に開示される。明確にするために、軽鎖を天然に欠く重鎖分子に由来する可変ドメインは、４鎖免疫グロブリンの従来のＶＨと区別するために、本明細書ではＶＨＨとして既知である。そのようなＶＨＨ分子は、ラクダ科種、例えば、ラクダ、ラマ、ビキューナ、ヒトコブラクダ、アルパカ、及びグアナコで生じた抗体に由来し得る。ラクダ科以外の他の種は、軽鎖を天然に欠く重鎖分子を産生し得、そのようなＶＨＨは、本開示の範囲内である。加えて、ＶＨＨのヒト化バージョンならびに他の改変及びバリアントも企図され、本開示の範囲内である。
ラクダ科動物由来のＶＨＨ分子は、ＩｇＧ分子の約１０分の１である。それらは、単一のポリペプチドであり、非常に安定する可能性があり、これは、極端なｐＨ及び温度条件に耐性がある。さらに、それらは、従来の４鎖抗体用の問題ではないプロテアーゼの作用に耐性があり得る。さらに、ＶＨＨのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現により、高収率の、適切に折りたたまれた機能的なＶＨＨが生成される。加えて、ラクダ科動物で生成された抗体は、抗体ライブラリーの使用により、またはラクダ科動物以外の哺乳動物の免疫により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成された抗体により認識されるエピトープ以外のエピトープを認識し得る（例えば、ＷＯ９７４９８０５を参照）。従って、１つ以上のＶＨＨドメインを含む多重特異性または多価ＣＡＲは、従来の４鎖抗体に由来する抗原結合フラグメントを含む多重特異性または多価ＣＡＲよりも効率的に標的と相互作用し得る。ＶＨＨは、「珍しい」エピトープ、例えば、空洞または溝に結合することが既知であるため、そのようなＶＨＨを含むＣＡＲの親和性は、従来の多重特異性ポリペプチドよりも治療的処置に、より適することがある。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、軟骨魚に見られる免疫グロブリンの可変領域に由来する。例えば、ｓｄＡｂは、サメの血清に見られる新規抗原受容体（ＮＡＲ）として既知の免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。ＮＡＲの可変領域に由来する単一ドメイン分子（「ＩｇＮＡＲ」）を生成する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１及びＳｔｒｅｌｔｓｏｖ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１４：２９０１－２９０９（２００５）に記載される。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、組み換え、ＣＤＲ移植、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化、及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ生成（例えば、ファージディスプレイにより選択）である。いくつかの実施形態では、フレームワーク領域のアミノ酸配列は、フレームワーク領域内の特定のアミノ酸残基の「ラクダ化」により改変されてもよい。ラクダ化は、重鎖抗体のＶＨＨドメインに、対応する位置（複数可）に存在するアミノ酸残基のうちの１つ以上による、従来の４鎖抗体由来の（天然に存在する）ＶＨドメインのアミノ酸配列における１つ以上のアミノ酸残基の置き換えまたは置換を指す。当業者には明らかである当分野で既知の方法で、これを実施することができる。そのような「ラクダ化」置換は、好ましくは、本明細書で定義されるように、ＶＨ－ＶＬ境界面に、及び／またはいわゆるラクダ科のホールマーク残基に形成及び／または存在するアミノ酸位置に挿入される（例えば、ＷＯ９４／０４６７８、Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３３９：２８５－２９０（１９９４）；Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９（６）：５３１－５３７（１９９６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５９：９５７－９６９（１９９６）；及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：２５－３８（１９９９）を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウスまたはラットにより産生されるヒト単一ドメイン抗体である。例えば、ＵＳ２００９０３０７７８７、米国特許第８，７５４，２８７号、ＵＳ２０１５０２８９４８９、ＵＳ２０１００１２２３５８、及びＷＯ２００４０４９７９４を参照のこと。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、親和性成熟している。
いくつかの実施形態では、特定の抗原または標的に対する天然に存在するＶＨＨドメインは、ラクダ科動物ＶＨＨ配列の（ナイーブまたは免疫）ライブラリーから得ることができる。そのような方法は、当該分野で既知の１つ以上のスクリーニング手法を使用して、該抗原もしくは標的、またはその少なくとも一部、フラグメント、抗原決定基、またはエピトープを使用して、そのようなライブラリーをスクリーニングすることを含んでも含まなくてもよい。そのようなライブラリー及び手法は、例えば、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ０１／９０１９０、ＷＯ０３／０２５０２０、及びＷＯ０３／０３５６９４に記載される。あるいは、（ナイーブまたは免疫）ＶＨＨに由来する改良された合成または半合成ライブラリー、例えば、ランダム変異導入及び／またはＣＤＲシャッフリングなどの手法で、（ナイーブまたは免疫）ＶＨＨライブラリーから得られたＶＨＨライブラリーは、例えば、ＷＯ００／４３５０７に記載されるように、使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、従来の四本鎖抗体から生成される。例えば、以下を参照：ＥＰ０３６８６８４；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４１（６２４２）：５４４－６（１９８９）；Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１（１１）：４８４－４９０（２００３）；ＷＯ０６／０３０２２０；及びＷＯ０６／００３３８８。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞外抗原結合ドメインは、少なくとも１つの結合ドメインを含み、少なくとも１つの結合ドメインは、本明細書で提供されるＣＤ１９に結合する単一ドメイン抗体、例えば、上記のセクション５．２に記載される抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体、を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むポリペプチドを含むＣＡＲが本明細書で提供され、抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂは、例えば、表２のＶＨＨドメイン、及び表２のそれらのＶＨＨドメインのいずれかに１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを有するものを含む、上記のセクション５．２に記載の抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂは、ラクダ科動物、キメラ、ヒト、またはヒト化のものである。
いくつかの実施形態では、（ａ）抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むポリペプチドを含むＣＡＲが本明細書で提供され、抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂが、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、または配列番号１０４のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、（ａ）抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むポリペプチドを含むＣＡＲが本明細書で提供され、抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂが、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、または配列番号１０４のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、２つ以上の抗原結合ドメインを含む。これらの２つ以上の抗原結合ドメインのうち、少なくとも１つは、本明細書で提供されるＣＤ１９に結合するＶＨＨ、及び１つ以上の追加の抗原（複数可）に結合する１つ以上の追加の結合ドメイン（複数可）、例えば、１つ以上の追加の抗原（複数可）を標的とする１、２、３、４、またはそれ以上の追加の単一ドメイン抗体結合領域（ｓｄＡｂ）である。
従って、いくつかの実施形態では、（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合する第１の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む細胞外抗原結合ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むポリペプチドを含む多重特異性（例えば、二重特異性及び三重特異性）ＣＡＲが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、第２の抗原（例えば、第２の腫瘍抗原）に特異的に結合する第２の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、第２の抗原（例えば、第２の腫瘍抗原）に特異的に結合する第２の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、及び第３の抗原（例えば、第３の腫瘍抗原）に特異的に結合する第３の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲにより標的とされる追加の抗原（複数可）は、細胞表面分子である。単一ドメイン抗体は、特定の疾患状態と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用する抗原を認識するように選択されてもよい。いくつかの実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、Ｂ細胞悪性腫瘍と関連する。腫瘍は、免疫応答、特に、Ｔ細胞媒介性免疫応答の標的抗原として機能し得る多数のタンパク質を発現する。ＣＡＲにより標的とされる抗原は、単一の疾患細胞上の抗原、またはそれぞれが疾患に寄与する異なる細胞上で発現される抗原であってよい。ＣＡＲにより標的とされる抗原は、疾患に直接的または間接的に関与することがある。
腫瘍抗原は、免疫応答、特に、Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘発し得る腫瘍細胞により産生されるタンパク質である。本開示の追加の標的抗原の選択は、処置されるべき特定のタイプのがんに依存するであろう。例示的な腫瘍抗原としては、神経膠腫関連抗原、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺がん腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ならびにメソテリンが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍と関連する１つ以上の抗原性がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原として機能し得る多数のタンパク質を発現する。これらの分子は、組織特異的抗原、例えば、黒色腫のＭＡＲＴ－１、チロシナーゼ、及びｇｐ１００、ならびに、前立腺がんの前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）及び前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を含むが、これらに限定されない。他の標的分子は、がん遺伝子ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ－２などの形質転換関連分子の群に属する。標的抗原のさらに別の群は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）などのがん胎児性抗原である。Ｂ細胞リンパ腫では、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンが、個々の腫瘍に固有の真の腫瘍特異的免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９に加えて、Ｂ細胞分化抗原、例えば、ＣＤ２０及びＣＤ３７は、Ｂ細胞リンパ腫の標的抗原の他の候補である。
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。ＴＳＡは、腫瘍細胞に固有のものであり、体内の他の細胞には発生しない。ＴＡＡ関連抗原は、腫瘍細胞に固有のものではなく、代わりに、抗原に対する免疫寛容の状態を誘導できない条件下で正常細胞にも発現される。腫瘍上での抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で起こり得る。ＴＡＡは、免疫系が未熟で応答できない場合、胎児の発育中に正常細胞に発現する抗原であっても、通常は正常細胞に非常に低いレベルで存在する抗原であってもよいが、これは、腫瘍細胞にはるかに高いレベルで発現される。
ＴＳＡまたはＴＡＡ抗原の非限定例としては、分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－１）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、及び腫瘍特異的多系統抗原、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐｌ５；過剰発現胚性抗原、例えば、ＣＥＡ；過剰発現がん遺伝子及び変異がん抑制遺伝子、例えば、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ；染色体転座に起因する固有の腫瘍抗原、例えば、ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ；ならびに、ウイルス抗原、例えば、エプスタインバーウイルス抗原ＥＢＶＡ及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７が挙げられる。
他の大きなタンパク質ベースの抗原としては、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３ＨＩ、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ １９－９、ＣＡ ７２－４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ベータ－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１５、ｐ１６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ－フェトプロテイン、ベータ－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ １２５、ＣＡ １５－３＼ＣＡ ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ １９５、ＣＡ ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０＼Ｍａｃ－２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、及びＴＰＳが挙げられる。
いくつかのより具体的な実施形態では、１つ以上の追加の抗原（複数可）は、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１２３、ＩＬ－１３Ｒ、ＣＤ１３８、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ Ａ３、及び糖脂質Ｆ７７からなる群から選択される。
特定の実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＣＤ１９に結合するＶＨＨ及びＣＤ２０に結合するＶＨＨを含む。別の特定の実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＣＤ１９に結合するＶＨＨ及びＣＤ２２に結合するＶＨＨを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｓｄＡｂは、ラクダ科動物、キメラ、ヒト、またはヒト化である。
本明細書で提供される１つ以上の抗原結合ドメイン（複数可）に加えて、本明細書で提供されるＣＡＲは、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）、膜貫通ドメイン、ヒンジ領域、シグナルペプチド、細胞内シグナル伝達ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメインのうちの１つ以上をさらに含んでもよく、これらのそれぞれは、以下により詳細に記載される。
例えば、いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド及びその組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端及び膜貫通ドメインのＮ末端間に位置するヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αヒンジドメイン）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチド（例えば、ＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、単一特異性である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、一価である。
ペプチドリンカー
本明細書に記載の多重特異性または多価ＣＡＲにおける様々な単一ドメイン抗体は、ペプチドリンカーを介して互いに融合され得る。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、任意のペプチドリンカーなしで互いに直接融合される。異なる単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）を連結するペプチドリンカーは、同じであっても異なっていてもよい。ＣＡＲの異なるドメインは、また、ペプチドリンカーを介して互いに融合されてもよい。
ＣＡＲ内の各ペプチドリンカーは、単一ドメイン抗体及び／または様々なドメインの構造的及び／または機能的特徴に応じて、同じまたは異なる長さ及び／または配列を有してもよい。各ペプチドリンカーは、独立して、選択及び最適化されてもよい。ＣＡＲで使用されるペプチドリンカー（複数可）の長さ、柔軟性の程度、及び／または他の特性は、限定されないが、１つ以上の特定の抗原またはエピトープに対する親和性、特異性、または結合力を含む特性に何らかの影響を与え得る。例えば、より長いペプチドリンカーは、隣接する２つのドメインが互いに立体的に干渉しないようにするために選択されてもよい。いくつかの実施形態では、短いペプチドリンカーは、ＣＡＲの膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメイン間に配置されてもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、隣接するドメインが互いに自由に移動できるように、柔軟な残基（例えば、グリシン及びセリン）を含む。例えば、グリシン－セリンダブレットは、好適なペプチドリンカーであり得る。
ペプチドリンカーは、任意の好適な長さであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、またはそれ以上のアミノ酸長のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約１００、７５、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、またはそれ以下のアミノ酸長のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーの長さは、約１アミノ酸～約１０アミノ酸、約１アミノ酸～約２０アミノ酸、約１アミノ酸～約３０アミノ酸、約５アミノ酸～約１５アミノ酸、約１０アミノ酸～約２５アミノ酸、約５アミノ酸～約３０アミノ酸、約１０アミノ酸～約３０アミノ酸長、約３０アミノ酸～約５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１００アミノ酸、または約１アミノ酸～約１００アミノ酸のうちのいずれかである。
ペプチドリンカーは、天然に存在する配列、または非天然に存在する配列を有してもよい。例えば、重鎖のみの抗体のヒンジ領域に由来する配列は、リンカーとして使用されてもよい。例えば、ＷＯ１９９６／３４１０３を参照。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、柔軟なリンカーである。例示的な柔軟なリンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、ｎは、少なくとも１の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び当該技術分野で既知の他の柔軟なリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なペプチドリンカーは、以下の表に列挙される。
（表４）例示的なペプチドリンカー
Figure 2023546764000004
例えば、ＷＯ２０１６０１４７８９、ＷＯ２０１５１５８６７１、ＷＯ２０１６１０２９６５、ＵＳ２０１５０２９９３１７、ＷＯ２０１８０６７９９２、ＵＳ７７４１４６５、Ｃｏｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：１１９１－１１９７（１９９０）、及びＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６（１９８８）に記載の当該技術分野で既知の他のリンカーは、また、本明細書で提供されるＣＡＲに含まれ得、これらのそのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
５．３．２．膜貫通ドメイン
本開示のＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインに直接的または間接的に融合することができる膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然または合成の供給源のいずれかに由来し得る。本明細書で使用される場合、「膜貫通ドメイン」は、細胞膜、好ましくは、真核細胞膜において熱力学的に安定している任意のタンパク質構造を指す。本明細書に記載のＣＡＲでの使用に適合する膜貫通ドメインは、天然に存在するタンパク質から得られてもよい。あるいは、それは、合成の非天然タンパク質セグメント、例えば、細胞膜中で熱力学的に安定している疎水性タンパク質セグメント、であり得る。
膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインの３次元構造に基づいて分類される。例えば、膜貫通ドメインは、アルファへリックス、複数のアルファへリックスの複合体、ベータ－バレル、または細胞のリン脂質二重層にまたがることが可能な任意の他の安定構造を形成し得る。さらに、膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインが膜を横切る通過回数及びタンパク質の配向を含む膜貫通ドメイントポロジーに基づいて分類されてもよい。例えば、シングルパス膜タンパク質は、細胞膜を１回横切り、マルチパス膜タンパク質は、細胞膜を少なくとも２回（例えば、２、３、４、５、６、７回またはそれ以上）横切る。膜タンパク質は、細胞の内側及び外側に対するそれらの末端及び膜通過セグメント（複数可）のトポロジーに応じて、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型として定義されてもよい。Ｉ型膜タンパク質は、単一の膜貫通領域を有し、タンパク質のＮ末端が、細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、タンパク質のＣ末端が、細胞質側に存在するように配向されている。ＩＩ型膜タンパク質は、単一の膜貫通領域も有するが、タンパク質のＣ末端が、細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、タンパク質のＮ末端が、細胞質側に存在するように配向されている。ＩＩＩ型膜タンパク質は、複数の膜貫通セグメントを有し、さらに、膜貫通セグメントの数ならびにＮ末端及びＣ末端の位置に基づいて細分類されてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲの膜貫通ドメインは、Ｉ型シングルパス膜タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、マルチパス膜タンパク質由来の膜貫通ドメインは、また、本明細書に記載のＣＡＲでの使用に適合し得る。マルチパス膜タンパク質は、複合（少なくとも２、３、４、５、６、７またはそれ以上）アルファヘリックスまたはベータシート構造を含んでもよい。いくつかの実施形態では、マルチパス膜タンパク質のＮ末端及びＣ末端は、脂質二重層の反対側に存在し、例えば、タンパク質のＮ末端は、脂質二重層の細胞質側に存在し、タンパク質のＣ末端は、細胞外側に存在する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（触覚）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤＩＯＯ（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及び／またはＮＫＧ２Ｃから選択される膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する。
いくつかの特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤ８αの膜貫通ドメインである。
本明細書に記載のＣＡＲに使用される膜貫通ドメインは、合成の非天然タンパク質セグメントの少なくとも一部も含み得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、合成の非天然アルファヘリックスまたはベータシートである。いくつかの実施形態では、タンパク質セグメントは、少なくとも約２０アミノ酸、例えば、少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のアミノ酸である。合成膜貫通ドメインの例は、例えば、米国特許第７，０５２，９０６号及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０００／０３２７７６号において、当該技術分野で既知であり、これらの関連開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で提供される膜貫通ドメインは、膜貫通領域及び膜貫通ドメインのＣ末端側に位置する細胞質領域を含み得る。膜貫通ドメインの細胞質領域は、３つ以上のアミノ酸を含んでもよく、いくつかの実施形態では、脂質二重層において膜貫通ドメインを配向させるのに役立つ。いくつかの実施形態では、１つ以上のシステイン残基は、膜貫通ドメインの膜貫通領域に存在する。いくつかの実施形態では、１つ以上のシステイン残基は、膜貫通ドメインの細胞質領域に存在する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインの細胞質領域は、正荷電アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインの細胞質領域は、アミノ酸のアルギニン、セリン、及びリジンを含む。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインの膜貫通領域は、疎水性アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲの膜貫通ドメインは、人工疎水性配列を含む。例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットは、膜貫通ドメインのＣ末端に存在してもよい。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、ほとんどが疎水性のアミノ酸残基、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはバリンを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、疎水性である。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、ポリロイシンアラニン配列を含む。タンパク質またはタンパク質セグメントのハイドロパシーまたは疎水性もしくは親水性の特性は、当該技術分野で既知ある任意の方法、例えば、カイト及びドゥーリトルのハイドロパシー分析で評価することができる。
５．３．３．細胞内シグナル伝達ドメイン
本開示のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。従って、「細胞質シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特定の機能を実行するように指示するタンパク質の部分を指す。通常、細胞質シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞質シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される限りにおいて、そのような切断部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクト鎖の代わりに使用されてもよい。従って、細胞質シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞質シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインから本質的になる細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「一次細胞内シグナル伝達ドメイン」は、免疫エフェクター機能を誘導するように、刺激的に作用する細胞質シグナル伝達配列を指す。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ、またはＩＴＡＭとして既知のシグナル伝達モチーフを含有する。本明細書で使用される「ＩＴＡＭ」は、多くの免疫細胞で発現されるシグナル伝達分子のテール部分に一般に存在する、保存されたタンパク質モチーフである。モチーフは、６～８個のアミノ酸により分離されたアミノ酸配列ＹｘｘＬ／Ｉの２つのリピートを含んでもよく、各ｘは、独立して、任意のアミノ酸であり、これは、保存されたモチーフＹｘｘＬ／Ｉｘ（６～８）ＹｘｘＬ／Ｉを生成する。シグナル伝達分子内のＩＴＡＭは、細胞内のシグナル伝達にとって重要であり、これは、ＩＴＡＭのチロシン残基のリン酸化、続いて、シグナル伝達分子の活性化により少なくとも部分的に媒介される。ＩＴＡＭは、シグナル伝達経路に関与する他のタンパク質のドッキング部位としても機能し得る。例示的なＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナル伝達配列は、ＣＤ３ζ、ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲベータ（Ｆｃイプシロンリブ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものを含む。
いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインからなる。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζの一次細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、野生型ＣＤ３ζの一次細胞内シグナル伝達ドメイン。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｑ６５Ｋなどの１つ以上の変異を含むＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインの機能的変異体である。
５．３．４．共刺激シグナル伝達ドメイン
多くの免疫エフェクター細胞は、抗原特異的シグナルの刺激に加えて、細胞増殖、分化、及び生存を促進し、細胞のエフェクター機能を活性化するために共刺激を必要とする。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される「共刺激シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能などの免疫応答を誘導するために細胞内でシグナル伝達を媒介するタンパク質の少なくとも一部を指す。本明細書に記載のキメラ受容体の共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激タンパク質由来の細胞質シグナル伝達ドメインであり得、これは、シグナルを伝達し、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球を媒介した応答を調節する。「共刺激シグナル伝達ドメイン」は、共刺激分子の細胞質部分であり得る。「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、限定されないが、増殖及び生存を含む免疫細胞で共刺激応答を媒介する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）上に同族結合パートナーを指す。
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、単一の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つ以上（例えば、約２、３、４、またはそれ以上のうちのいずれか）の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、同じ共刺激シグナル伝達ドメインの２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載の任意の２つ以上の共刺激タンパク質などの、異なる共刺激タンパク質からの２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン）及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン及び一次細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン）は、任意のペプチドリンカーを介して互いに融合される。一次細胞内シグナル伝達ドメイン、及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の好適な順序で配置されてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメイン及び一次細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン）間に位置する。複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、相加的または相乗的な刺激効果を提供し得る。
宿主細胞（例えば、免疫細胞）における共刺激シグナル伝達ドメインの活性化は、サイトカインの産生及び分泌、食作用特性、増殖、分化、生存、及び／または細胞傷害性を増加または減少させるように細胞を誘導し得る。任意の共刺激分子の共刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載のＣＡＲでの使用に適合し得る。共刺激シグナル伝達ドメインのタイプ（複数可）は、エフェクター分子が発現される免疫エフェクター細胞のタイプ（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球）、ならびに、所望の免疫エフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ効果）などの要因に基づいて選択される。ＣＡＲに使用される共刺激シグナル伝達ドメインの例としては、限定されないが、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバー（例えば、Ｂ７－１／ＣＤ８０、Ｂ７－２／ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７－Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２／Ｂ７－ＤＣ、及びＰＤＣＤ６）；ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（例えば、４－１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４－１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン－アルファ／ＴＮＦ－ベータ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ－アルファ、及びＴＮＦＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）；ＳＬＡＭファミリーのメンバー（例えば、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ－３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６、及びＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）；ならびに、任意の他の共刺激分子、例えば、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、Ｄ８２／Ｋａｉ－１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ－ＤＲ、Ｉｋａｒｏｓ、インテグリンアルファ４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンアルファ４ベータ１、インテグリンアルファ４ベータ７／ＬＰＡＭ－１、ＬＡＧ－３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、デクチン－１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ－１／ＫＩＭ－１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ－４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ Ｒ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、及びＮＫＧ２Ｃを含む、共刺激タンパク質の細胞質シグナル伝達ドメインであり得る。
いくつかの実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドからなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７（すなわち、４－１ＢＢ）に由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン及びＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
共刺激シグナル伝達ドメインが免疫細胞の免疫応答を調節可能であるように、本明細書に記載の共刺激シグナル伝達ドメインのいずれかのバリアントも本開示の範囲内である。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、野生型対応物と比較して、最大１０（例えば、１、２、３、４、５、または８つ）のアミノ酸残基の変化を含む。１つ以上のアミノ酸の変化を含むそのような共刺激シグナル伝達ドメインは、バリアントと呼ばれることがある。共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の変異は、変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比較して、シグナル伝達の増加及び免疫応答の刺激の増強をもたらし得る。共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の変異は、変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比較して、シグナル伝達の減少及び免疫応答の刺激の低減をもたらし得る。
５．３．５．ヒンジ領域
本開示のＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン及び膜貫通ドメイン間に位置するヒンジドメインを含んでもよい。ヒンジドメインは、一般に、タンパク質の２つのドメイン間に見られるアミノ酸セグメントであり、タンパク質の柔軟性と、互いに対する、ドメインの一方または両方の移動を可能にすることがある。エフェクター分子の膜貫通ドメインに対する、細胞外抗原結合ドメインのそのような柔軟性及び移動を提供する任意のアミノ酸配列を使用することができる。
ヒンジドメインは、約１０～１００個のアミノ酸、例えば、約１５～７５個のアミノ酸、２０～５０個のアミノ酸、または３０～６０個のアミノ酸のうちのいずれか１つを含有してもよい。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、または７５アミノ酸長のうちのいずれか１つであってよい。
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインである。ヒンジドメインを含むことが当該技術分野で知られている任意のタンパク質のヒンジドメインは、本明細書に記載のキメラ受容体での使用に適合性がある。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインの少なくとも一部であり、キメラ受容体に柔軟性を付与する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αのヒンジドメインの一部、例えば、ＣＤ８αのヒンジドメインの少なくとも１５個（例えば、２０、２５、３０、３５、または４０個）の連続するアミノ酸を含有するフラグメントである。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αのヒンジドメインは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。
ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体などの抗体のヒンジドメインも、本明細書に記載のｐＨ依存性キメラ受容体システムでの使用に適合する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体の定常ドメインＣＨ１及びＣＨ２を連結するヒンジドメインである。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のものであり、抗体のヒンジドメイン及び抗体の１つ以上の定常領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメイン及び抗体のＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメイン、ならびに、抗体のＣＨ２及びＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域ならびにＣＨ２及びＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域及びＣＨ３定常領域を含む。
非天然ペプチドは、本明細書に記載のキメラ受容体のヒンジドメインとしても使用されてもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端と、膜貫通ドメインのＮ末端との間のヒンジドメインは、（ＧｘＳ）ｎリンカーなどのペプチドリンカーであり、ｘ及びｎは、独立して、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上を含む、３～１２の整数であり得る。
５．３．６．シグナルペプチド
本開示のＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端にシグナルペプチド（シグナル配列としても既知）を含んでもよい。一般に、シグナルペプチドは、ポリペプチドを細胞内の所望の部位に向けるペプチド配列である。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、エフェクター分子を細胞の分泌経路に向け、脂質二重層へのエフェクター分子の組み込み及び固定を可能にする。天然に存在するタンパク質のシグナル配列または合成の非天然シグナル配列を含むシグナルペプチド（本明細書に記載のＣＡＲでの使用に適合）は、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８α、ＧＭ－ＣＳＦ受容体α、及びＩｇＧ１重鎖からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αのシグナルペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。
５．３．７．例示的なＣＡＲ
ＶＨＨ－０８３ ＣＡＲ、ＶＨＨ－１１１ ＣＡＲ、ＶＨＨ－１３１ ＣＡＲ、７７ＬＩＣＡ５４２ ＣＡＲ、７７ＬＩＣＡ５１９ ＣＡＲ、７７ＬＩＣＡ６０２ ＣＡＲ、ｈｕＶＨＨ－７７３ ＣＡＲ、及びｈｕＶＨＨ－７７６ ＣＡＲなどの例示的なＣＡＲは、以下のセクション６に示されるように生成される。
いくつかの実施形態では、配列番号５７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるＣＡＲが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５８のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるＣＡＲが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるＣＡＲが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号６０のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるＣＡＲが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号６１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるＣＡＲが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号６２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるＣＡＲが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号６３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるＣＡＲが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１０５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるＣＡＲが本明細書で提供される。
特定の実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、以下のセクション６に例示されるＣＡＲのいずれか１つと比較して、特定のパーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＣＤ１９ ＣＡＲが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＣＤ１９ ＣＡＲが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＣＤ１９ ＣＡＲが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＣＤ１９ ＣＡＲが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＣＤ１９ ＣＡＲが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＣＤ１９ ＣＡＲが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＣＤ１９ ＣＡＲが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１０５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＣＤ１９ ＣＡＲが本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ１９ ＣＡＲのいずれかをコードする単離核酸が本明細書で提供される。核酸配列及びベクターに関する、より詳細な説明が以下に提供される。
５．４．操作された免疫エフェクター細胞
さらに別の態様では、本明細書に記載のＣＡＲのいずれか１つを含む宿主細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）が本明細書で提供される。
従って、いくつかの実施形態では、（ａ）抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むポリペプチドを含むＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）が本明細書で提供され、抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂは、例えば、表２のＶＨＨドメイン、及び表２のそれらのＶＨＨドメインのうちのいずれかに１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを有するものを含む、上記セクション５．２に記載の抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂは、ラクダ科動物、キメラ、ヒト、またはヒト化のものである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド及びその組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端及び膜貫通ドメインのＮ末端間に位置するヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αヒンジドメイン）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチド（例えば、ＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むポリペプチドを含むＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）が本明細書で提供され、抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂが、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、または配列番号１０４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むポリペプチドを含むＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）が本明細書で提供され、抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂが、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、または配列番号１０４のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド及びその組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端及び膜貫通ドメインのＮ末端間に位置するヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αヒンジドメイン）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチド（例えば、ＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、及び配列番号１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＡＲを含む、操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、及び配列番号１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＣＡＲを含む、操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）が本明細書で提供される。
他の実施形態では、ＣＤ１９に特異的に結合する第１の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）及び１つ以上の追加の抗原結合ドメイン（複数可）を含む細胞外抗原結合ドメイン；（ｂ）膜貫通ドメイン；及び（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むポリペプチドを含む多特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）が提供される。いくつかの実施形態では、追加の抗原結合ドメインは、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１２３、ＩＬ－１３Ｒ、ＣＤ１３８、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ Ａ３、及び糖脂質Ｆ７７からなる群より選択される抗原に結合する。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または追加のｓｄＡｂは、ラクダ科動物、キメラ、ヒト、またはヒト化のものである。いくつかの実施形態では、第１の単一ドメイン抗体及び追加の単一ドメイン抗体は、ペプチド結合またはペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約５０以下（例えば、約３５、２５、２０、１５、１０、または５のうちのいずれか１つ以下）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド及びその組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態では、多重特異性ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端及び膜貫通ドメインのＮ末端間に位置するヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αヒンジドメイン）をさらに含む。いくつかの実施形態では、多重特異性ＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチド（例えば、ＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、または胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、自己由来である。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、同種異系である。
２つ以上の異なるＣＡＲを含む（または発現する）操作された免疫エフェクター細胞も提供される。本明細書に記載のＣＡＲの任意の２つ以上を組み合わせて発現させてもよい。ＣＡＲは、異なる抗原を標的とし、それにより、相乗効果または相加効果を提供し得る。２つ以上のＣＡＲは、同じベクターまたは異なるベクター上でコードされてもよい。
操作された免疫エフェクター細胞は、１つ以上の治療用タンパク質及び／または免疫チェックポイント阻害薬などの免疫調節薬をさらに発現し得る。例えば、以下を参照：国際出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０７３４８９号及び同第ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０８７８５５号（全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
５．４．１．ベクター
本開示は、本明細書に記載のＣＡＲのいずれか１つをクローニング及び発現するためのベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳動物細胞などの真核細胞における複製及び組み込みに適する。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、及びそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ならびに、他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載される。
多数のウイルスベースのシステムは、哺乳動物細胞への遺伝子導入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムの便利なプラットフォームを提供する。当該技術分野で既知の技術を使用して、異種核酸をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次に、組み換えウイルスを単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、操作された哺乳動物細胞に送達することができる。多くのレトロウイルス系が、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターが、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。いくつかの実施形態では、自己不活化レンチウイルスベクターが使用される。例えば、免疫調節因子（例えば、免疫チェックポイント阻害薬）コード配列を担持する自己不活化レンチウイルスベクター及び／またはキメラ抗原受容体を担持する自己不活化レンチウイルスベクターは、当該技術分野で既知のプロトコールでパッケージングすることができる。得られたレンチウイルスベクターは、当該技術分野で既知の方法を使用して哺乳動物細胞（例えば、初代ヒトＴ細胞）に形質導入するために使用することができる。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期的で安定した統合及び子孫細胞での増殖を可能にするので、長期的な遺伝子導入を達成するのに好適なツールである。レンチウイルスベクターも免疫原性が低く、非増殖細胞に形質導入し得る。
いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸のいずれか１つを含む。例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位及び１つ以上の選択マーカーを使用することを含む、当該技術分野で既知の任意の分子クローニング法を使用して、核酸をベクターにクローニングすることができる。いくつかの実施形態では、核酸は、プロモーターに作動可能に連結される。哺乳動物細胞における遺伝子発現のために様々なプロモーターが調査されており、当該技術分野で既知のプロモーターのいずれかが本開示で使用されてもよい。プロモーターは、構成的プロモーターまたは調節プロモーター、例えば、誘導性プロモーターとして大まかに分類されてもよい。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、構成的プロモーターに作動可能に連結される。構成的プロモーターは、異種遺伝子（導入遺伝子とも呼ばれる）が宿主細胞内で構成的に発現されることを可能にする。本明細書で企図される例示的な構成的プロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ヒト伸長因子－１アルファ（ｈＥＦ１α）、ユビキチンＣプロモーター（ＵｂｉＣ）、ホスホグリセロキナーゼプロモーター（ＰＧＫ）、シミアンウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）、及びＣＭＶ初期エンハンサー（ＣＡＧＧ）と結合したニワトリβ－アクチンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。導入遺伝子発現を引き起こす、そのような構成的プロモーターの効率は、膨大な数の研究で広く比較されている。例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃ．Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌは、初代ヒトＴ細胞のキメラ抗原受容体の発現を促進するＣＭＶ、ｈＥＦ１α、ＵｂｉＣ、及びＰＧＫの効率を比較し、ｈＥＦ１αプロモーターは、最高レベルの導入遺伝子発現を誘導しただけでなく、ＣＤ４及びＣＤ８ヒトＴ細胞で最適に維持された（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（８）：１４５３－１４６４（２００９））。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、ｈＥＦ１αプロモーターに作動可能に連結される。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、誘導性プロモーターに作動可能に連結される。誘導性プロモーターは、調節プロモーターのカテゴリーに属する。１つ以上の条件、例えば、物理的状態、操作された免疫エフェクター細胞の微小環境、または操作された免疫エフェクター細胞の生理学的状態、誘導因子（すなわち、誘導作用物質）、またはその組み合わせにより、誘導性プロモーターを誘導することができる。
いくつかの実施形態では、この誘導条件は、操作された哺乳動物細胞において、及び／または医薬組成物を投与される対象において、内因性遺伝子の発現を誘導しない。いくつかの実施形態では、この誘導条件は、誘導因子、照射（例えば、電離放射線、光）、温度（例えば、熱）、レドックス状態、腫瘍環境、及び操作された哺乳動物細胞の活性化状態からなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターを介してトランスフェクトされた宿主細胞の集団からＣＡＲを発現する細胞を選択するための選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子も含有する。宿主細胞での発現を可能にするために、選択マーカー及びレポーター遺伝子の両方は、適切な調節配列に隣接していてもよい。例えば、ベクターは、核酸配列の発現の調節に有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、及びプロモーターを含有してもよい。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣＡＲをコードする２つ以上の核酸を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、第１のＣＡＲをコードする第１の核酸配列及び第２のＣＡＲをコードする第２の核酸配列を含む核酸を含み、第１の核酸は、自己切断ペプチドをコードする第３の核酸配列を介して第２の核酸に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、及びＦ２Ａからなる群より選択される。
５．４．２．免疫エフェクター細胞
「免疫エフェクター細胞」は、免疫エフェクター機能を実施することができる免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実施する。ＡＤＣＣを媒介する免疫エフェクター細胞の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、好中球、及び好酸球が挙げられる。
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８－、ＣＤ４－／ＣＤ８＋、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋、ＣＤ４－／ＣＤ８－、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＩＬ－２、ＴＦＮ、及び／またはＴＮＦは、ＣＡＲを発現し、ＣＤ１９＋腫瘍細胞などの標的細胞に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＡＲの発現時及び標的細胞への結合時に、抗原特異的標的細胞を溶解させる。
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞である。他の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、確立された細胞株、例えば、ＮＫ－９２細胞であり得る。
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、幹細胞、例えば、造血幹細胞、多能性幹細胞、ｉＰＳ、または胚性幹細胞から分化する。
操作された免疫エフェクター細胞は、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞にＣＡＲを導入することにより調製される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、上記の単離核酸のいずれか１つまたはベクターのいずれか１つをトランスフェクトすることにより、免疫エフェクター細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＥＬＬ ＳＱＵＥＥＺＥ（登録商標）などのマイクロ流体システムを細胞に通過させながら、タンパク質を細胞膜に挿入することにより、免疫エフェクター細胞に導入される（例えば、米国特許出願公開第２０１４０２８７５０９号を参照）。
ベクターまたは単離核酸を哺乳動物細胞に導入する方法は、当該技術分野で既知である。記載のベクターを、物理的、化学的、または生物学的方法で免疫エフェクター細胞に移すことができる。
ベクターを免疫エフェクター細胞に導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを含む。ベクター及び／または外因性核酸を含む細胞を作製する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、以下を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。いくつかの実施形態では、ベクターは、エレクトロポレーションにより細胞に導入される。
ベクターを免疫エフェクター細胞に導入するための生物学的方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物、例えば、ヒト細胞、に挿入するための最も広く使用される方法になっている。
ベクターを免疫エフェクター細胞に導入するための化学的手段は、コロイド分散システム、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに、水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースのシステムを含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲのいずれかをコードするＲＮＡ分子は、従来の方法（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写）で調製され、次に、ｍＲＮＡエレクトロポレーションなどの既知の方法により免疫エフェクター細胞に導入されてもよい。例えば、Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：１０２７－１０３５（２００６）を参照のこと。
いくつかの実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた免疫エフェクター細胞は、ベクターまたは単離核酸の導入後に、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖される。いくつかの実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた免疫エフェクター細胞は、増殖するために、少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、または１４日間のうちのいずれかで培養される。いくつかの実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた免疫エフェクター細胞は、操作された哺乳動物細胞を選択するためにさらに評価またはスクリーニングされる。
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を特定するため、及び調節配列の機能を評価するために使用されてもよい。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在しないか、または発現しない、且つ、いくつかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により発現が明示されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の好適な時点でアッセイされる。好適なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が挙げられてもよい（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２（２０００））。好適な発現系は、周知であり、既知の手法を使用して調製されても、商業的に入手されてもよい。操作された免疫エフェクター細胞におけるＣＡＲをコードする核酸の存在を確認するための他の方法は、例えば、当業者らに周知の分子生物学的アッセイ、例えば、サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲ；生化学的アッセイ、例えば、免疫学的方法（例えば、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）による、例えば、特定のペプチドの有無の検出、を含む。
５．４．３．Ｔ細胞の供給源
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の増大及び遺伝子改変の前に、Ｔ細胞の供給源が対象から得られる。末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む多くの供給源から、Ｔ細胞を得ることができる。いくつかの実施形態では、当該技術分野で利用可能な任意数のＴ細胞株が使用されてもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの当業者に既知の任意数の手法を使用して、対象から収集された血液の単位から、Ｔ細胞を得ることができる。いくつかの実施形態では、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスにより得られる。アフェレーシス製品は、通常、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含むリンパ球を含有する。いくつかの実施形態では、アフェレーシスにより収集された細胞は、血漿画分を除去し、その後の処理ステップのために細胞を適切な緩衝液または培地に入れるために、洗浄されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムを欠いており、マグネシウムを欠き得るか、または全てではないが、多くの二価カチオンを欠き得る。カルシウムの不存在下での最初の活性化ステップは、活性化の拡大につながり得る。当業者らが容易に理解するように、洗浄ステップは、例えば、半自動「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ２９９１セルプロセッサ、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ５）を製造者の使用説明書に従って使用することにより、当業者らに既知の方法で達成されてもよい。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ２＋不含、Ｍｇ２＋不含ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、または、緩衝剤を含むかもしくは含まない他の生理食塩水、に再懸濁させてもよい。あるいは、アフェレーシスサンプルの望ましくない構成成分を除去し、細胞を培地に直接再懸濁させてもよい。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離または向流遠心エルトリエーションで、赤血球を溶解させ、単球を枯渇させることにより、末梢血リンパ球から単離される。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などのＴ細胞の特定の亜集団を、正または負の選択手法でさらに分離することができる。例えば、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞の正の選択に十分な時間に、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）コンジュゲートビーズ、例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔとインキュベーションすることにより単離される。いくつかの実施形態では、期間は、約３０分である。さらなる実施形態では、期間は、３０分～３６時間以上、及びその間の全ての整数値の範囲である。さらなる実施形態では、期間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。いくつかの実施形態では、期間は、１０～２４時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間は、２４時間である。白血病患者由来のＴ細胞の単離では、２４時間などの長いインキュベーション時間を使用すると、細胞収量が増加し得る。より長いインキュベーション時間は、例えば、腫瘍組織または免疫不全の個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離することにおいて、他の細胞型と比較してＴ細胞がほとんどない任意の状況で、Ｔ細胞を単離するために使用されてもよい。さらに、より長いインキュベーション時間を使用すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉効率を増加し得る。従って、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させる時間を単純に短縮または延長することにより、及び／またはビーズ対Ｔ細胞の比を増加または減少させることにより、培養の開始時またはプロセス中の他の時点で、Ｔ細胞の亜集団を優先的に選択することができる。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３及び／または抗ＣＤ２８抗体の比を増加または減少させることにより、培養開始時または他の所望の時点で、Ｔ細胞の亜集団を、優先的に選択することができる。複数ラウンドの選択も使用することができることを、当業者は認識するであろう。いくつかの実施形態では、選択手順を実行し、「選択されていない」細胞を活性化及び増大プロセスで使用することが望ましい場合がある。「選択されていない」細胞も、さらなる選択ラウンドに供することができる。
負の選択された細胞に固有の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせを用いて、負の選択によるＴ細胞集団の濃縮を実施することができる。１つの方法は、負の選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用するネガティブ磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞選別及び／または選択である。例えば、負の選択によりＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、通常、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。特定の実施形態では、通常、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、及びＦｏｘＰ３＋を発現する制御性Ｔ細胞を濃縮または正の選択することが望ましいことがある。あるいは、特定の実施形態では、制御性Ｔ細胞は、抗Ｃ２５コンジュゲートビーズまたは他の同様の選択方法により枯渇される。
正または負の選択による所望の細胞集団の単離のために、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変動させることができる。特定の実施形態では、細胞及びビーズの最大の接触を確保するために、ビーズ及び細胞が、一緒に混合される体積を大幅に減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましいことがある。例えば、一実施形態では、２０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。一実施形態では、１０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。さらなる実施形態では、１億細胞／ｍｌ超が使用される。さらなる実施形態では、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、または５千万細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。さらに別の実施形態では、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０千万細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。さらなる実施形態では、１億２５００万または１億５０００万細胞／ｍｌの濃度を使用することができる。高濃度を使用すると、細胞収量、細胞活性化、及び細胞増大が増加することがある。さらに、高濃度細胞の使用は、目的の標的抗原、例えば、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞を弱く発現し得る細胞、または、多くの腫瘍細胞が存在するサンプル（すなわち、白血病の血液、腫瘍組織など）由来の細胞を、より効率的に捕捉可能であり得る。そのような細胞集団は、治療効果を有し得、取得することが望ましいだろう。いくつかの実施形態では、高濃度の細胞を使用することにより、通常、より弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択が可能になる。
いくつかの実施形態では、より低い濃度の細胞を使用することが望ましいことがある。Ｔ細胞及び表面の混合物（例えば、ビーズなどの粒子）を大幅に希釈することにより、粒子及び細胞間の相互作用が最小限に抑えられる。これにより、粒子に結合されるべき所望の抗原を大量に発現する細胞が選択される。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度のＣＤ８＋Ｔ細胞よりも効率的に捕捉される。いくつかの実施形態では、使用される細胞の濃度は、５×１０６／ｍｌである。いくつかの実施形態では、使用される濃度は、約１×１０５／ｍｌ～１×１０６／ｍｌ、及びその間の任意の整数値であり得る。
いくつかの実施形態では、細胞は、２～１０℃または室温のいずれかで、様々な速度で、様々な時間、回転装置上でインキュベートされてもよい。
刺激用のＴ細胞を、洗浄ステップ後に凍結することもできる。理論に束縛されるものではないが、凍結及びその後の解凍ステップは、細胞集団中の顆粒球及びある程度までの単球を除去することにより、より均一な生成物を提供し得る。血漿及び血小板を除去する洗浄ステップの後、細胞が凍結溶液に懸濁されてもよい。多くの凍結溶液及びパラメーターが当該技術分野で既知であり、この文脈で有用となるが、１つの方法は、２０％のＤＭＳＯ及び８％のヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または１０％のデキストラン４０及び５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン及び７．５％のＤＭＳＯ、または３１．２５％のプラズマライトＡ、３１．２５％のデキストロース５％、０．４５％のＮａＣｌ、１０％のデキストラン４０及び５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン、及び７．５％のＤＭＳＯ、または例えば、Ｈｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含有する他の好適な細胞凍結培地を使用することを含む。次に、細胞は、毎分１度の速度で－８０℃まで凍結され、液体窒素貯蔵タンクの蒸気相で貯蔵される。制御された凍結の他の方法が使用されてもよく、－２０℃で、または液体窒素中で直に制御されていない凍結が使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、凍結保存された細胞は、本明細書に記載されるように解凍及び洗浄され、活性化前に室温で１時間静置させる。
本明細書に記載の増大細胞が必要となり得る前の期間の対象由来の血液サンプルまたはアフェレーシス製品の収集も本開示で企図される。そのようなものであるから、増大されるべき細胞の供給源は、必要な任意の時点で収集し、Ｔ細胞などの所望の細胞を、本明細書に記載されるようなＴ細胞療法から恩恵を受ける任意数の疾患または状態に対するＴ細胞療法において後で使用するために単離して凍結することができる。一実施形態では、血液サンプルまたはアフェレーシスは、一般に、正常対象から採取される。特定の実施形態では、血液サンプルまたはアフェレーシスは、一般に、疾患を発症するリスクがあるが、まだ疾患を発症していない正常対象から採取され、目的の細胞が単離され、後で使用するために凍結される。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、後で、増大、凍結、及び使用され得る。特定の実施形態では、サンプルは、本明細書に記載の特定の疾患の診断直後で、任意の処置の前に、患者から収集される。さらなる実施形態では、細胞は、任意数の関連する治療モダリティ前に対象由来の血液サンプルまたはアフェレーシスから単離され、これは、薬剤、例えば、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス薬、化学療法、放射線、免疫抑制薬、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノラート、及びＦＫ５０６、抗体、または他の免疫除去薬、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、サイトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、及び照射を用いる処置を含むが、これらに限定されない。これらの薬剤は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリン（シクロスポリン及びＦＫ５０６）を阻害するか、または、成長因子誘導シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼ（ラパマイシン）を阻害する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６６：８０７－８１５（１９９１）；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎ ７３：３１６－３２１（１９９１）；Ｂｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．５：７６３－７７３（１９９３））。さらなる実施形態では、細胞は、患者のために単離され、骨髄もしくは幹細胞移植、いずれかの化学療法薬、例えば、フルダラビンの、外部ビーム放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、または、抗体、例えば、ＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨのいずれかを使用するＴ細胞除去療法と共に（例えば、この前に、これと同時に、またはこの後に）、後の併用のために凍結される。別の実施形態では、細胞は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンなどのＢ細胞除去療法の前に単離され、それの後に、後の処置用の使用ために凍結することができる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、処置直後の患者から得られる。この点に関して、以下の特定のがん処置、特に、免疫系に損傷を与える薬物による処置は、患者が通常処置から回復する期間中の処置直後に、得られたＴ細胞の品質が、最適であり得るか、またはｅｘ ｖｉｖｏで増大する能力が改善され得ることが観察されている。同様に、本明細書に記載の方法を使用するｅｘ ｖｉｖｏ操作の後に、これらの細胞は、生着の促進及びｉｎ ｖｉｖｏでの増大にとって好ましい状態になり得る。従って、本開示の文脈内で、この回復期中にＴ細胞、樹状細胞、または造血系統の他の細胞を含む血球を収集することが企図される。さらに、特定の実施形態では、動員（例えば、ＧＭ－ＣＳＦによる動員）及びコンディショニングレジメンを、対象に状態を生じさせるために使用することができ、特に、処置後の規定された期間中の特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、及び／または増大が好まれる。例示的な細胞型としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及び免疫系の他の細胞が挙げられる。
５．４．４．Ｔ細胞の活性化及び増大
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲを用いるＴ細胞の遺伝子改変の前または後に、例えば、一般に、米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；同第６，８６７，０４１号；及び米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載の方法を使用して、Ｔ細胞を活性化及び増大することができる。
一般に、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する作用物質及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを、それが結合している表面で接触させることにより、Ｔ細胞を増大させることができる。特に、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載されるように、例えば、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または表面に固定化された抗ＣＤ２抗体と接触させることにより、あるいは、カルシウムイオノフォアと組み合わせたプロテインキナーゼＣアクチベーター（例えば、ブリオスタチン）と接触させることにより刺激され得る。Ｔ細胞表面のアクセサリー分子の共刺激には、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、Ｔ細胞の集団を、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激するための、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ３抗体の例としては、ＵＣＨＴ１、ＯＫＴ３、ＨＩＴ３ａ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、米国サンディエゴ）が挙げられ、当該技術分野で一般に既知の他の方法と同様に使用することができる（Ｇｒａｖｅｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２１０２（１９９１）；Ｌｉ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１６：４８７（２００５）；Ｒｉｖｏｌｌｉｅｒ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０４：４０２９（２００４））。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、当該技術分野で一般に既知の他の方法と同様に使用することができる（Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５－３９７７（１９９８）；Ｈａａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８（１９９９）；Ｇａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．２２７（１－２）：５３－６３（１９９９））。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞に対する一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコールで提供され得る。例えば、各シグナルを提供する作用物質は、溶液中にあっても、表面に結合していてもよい。表面に結合する場合、作用物質は、同じ表面に（すなわち、「シス」形成で）結合していても、別の表面に（すなわち、「トランス」形成で）結合していてもよい。あるいは、一方の作用物質を表面に結合しており、他方の作用物質を溶液中に存在し得る。一実施形態では、共刺激シグナルを提供する作用物質は、細胞表面に結合しており、一次活性化シグナルを提供する作用物質は、溶液中に存在するか、または表面に結合している。特定の実施形態では、両方の作用物質は、溶液中にあり得る。別の実施形態では、作用物質、例えば、Ｆｃ受容体もしくは抗体を発現する細胞、または作用物質に結合することになる他の結合物質は、可溶型であり、次に、表面に架橋され得る。この点に関しては、例えば、本開示の特定の実施形態では、Ｔ細胞を活性化及び増大する際の使用が企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）については、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号及び同第２００６００３４８１０号を参照のこと。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、薬剤コーティングされたビーズと結合され、ビーズ及び細胞が、その後、分離され、次に、細胞が培養される。別の実施形態では、培養前に、薬剤でコーティングされたビーズ及び細胞は、分離されないが、一緒に培養される。さらなる実施形態では、ビーズ及び細胞は、磁力などの力の適用により最初に濃縮され、その結果、細胞表面マーカーのライゲーションが増加し、それにより、細胞刺激が誘導される。
例として、細胞表面タンパク質は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８が結合している常磁性ビーズ（３×２８ビーズ）をＴ細胞と接触させることによりライゲーションされてもよい。一実施形態では、細胞（例えば、１０４～４×１０８のＴ細胞）及びビーズ（例えば、１：１００の推奨力価の抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ＭＡＣＳｉＢｅａｄ粒子）を緩衝液中、好ましくは、ＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムなどの二価陽イオンを含まず）中で組み合わせる。任意の細胞濃度が使用されてもよいことを、当業者らは容易に理解し得る。例えば、標的細胞が、サンプル中で非常にまれであり、サンプルの０．０１％のみを含んでも、サンプル全体（すなわち、１００％）が、目的の標的細胞を含んでもよい。従って、任意の細胞数が、本開示の文脈内にある。特定の実施形態では、細胞及び粒子の最大の接触を確保するために、粒子及び細胞が、一緒に混合される体積を大幅に減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましいことがある。例えば、一実施形態では、約２０億細胞／ｍＬの濃度が使用される。別の実施形態では、１億細胞／ｍＬ超が使用される。さらなる実施形態では、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、または５千万細胞／ｍＬの細胞濃度が使用される。さらに別の実施形態では、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０千万細胞／ｍＬの細胞濃度が使用される。さらなる実施形態では、１億２５００万または１億５０００万細胞／ｍＬの濃度を使用することができる。高濃度を使用すると、細胞収量、細胞活性化、及び細胞増大が増加することがある。さらに、高細胞濃度を使用すると、目的の標的抗原、例えば、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞、をわずかに発現し得る細胞をより効率的に捕捉できることがある。そのような細胞集団は、治療効果を有し得、特定の実施形態では、取得することが望ましいであろう。例えば、高濃度の細胞を使用することにより、通常、より弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択が可能になる。
いくつかの実施形態では、混合物は、数時間（約３時間）～約１４日間、またはその間の任意の整数値の時間単位で培養され得る。別の実施形態では、混合物が、２１日間培養されてもよい。一実施形態では、ビーズ及びＴ細胞は、一緒に約８日間培養される。別の実施形態では、ビーズ及びＴ細胞は、一緒に２～３日間培養される。Ｔ細胞の培養時間が６０日以上になり得るように、数サイクルの刺激が望ましいこともある。Ｔ細胞培養に適切な条件としては、増殖及び生存率に必要とされる要因を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地もしくはＲＰＭＩ培地１６４０、またはＸ－ｖｉｖｏ １５、（Ｌｏｎｚａ））が挙げられ、これらは、血清（例えば、ウシ胎児またはヒト胎児血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ及びＴＮＦ－α、または当業者に既知の細胞の成長のための任意の他の添加剤を含む。細胞の成長のための他の添加剤としては、界面活性剤、プラズマネート、及び還元剤、例えば、Ｎ－アセチル－システイン及び２－メルカプトエタノール、が挙げられるが、これらに限定されない。培地は、無血清か、あるいは、適切な量の血清（もしくは血漿）または規定の一連のホルモン、及び／またはＴ細胞の成長及び増大に十分な量のサイトカイン（複数可）が補充された、添加されたアミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンを含むＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５、及びＸ－Ｖｉｖｏ ２０、オプティマイザーを含み得る。抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンは、対象に注入されるべき細胞の培養物ではなく、実験培養物にのみ含まれる。標的細胞は、成長を支持するのに必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）及び雰囲気（例えば、空気及び５％のＣＯ２）で維持される。様々な刺激時間にさらされているＴ細胞は、異なる特性を示し得る。例えば、代表的な血液またはアフェレーシスされた末梢血単核細胞製品は、細胞傷害性またはサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８）よりも多いヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３及びＣＤ２８受容体を刺激することによるＴ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増大は、約８～９日前には、主にＴＨ細胞からなるＴ細胞の集団を生じるが、約８～９日後には、Ｔ細胞の集団は、ますます多くのＴＣ細胞の集団を含む。従って、処置の目的に応じて、主に、ＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することが、有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットは、単離されている場合、このサブセットを、より大きい程度までに増大することが有益であることがある。
さらに、ＣＤ４及びＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーは、大幅に変動するが、大部分では、細胞増大プロセスの過程で再現可能である。従って、そのような再現性により、特定の目的のために活性化Ｔ細胞産物を調整する能力が可能になる。
５．５．ポリヌクレオチド
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ１９に結合する単一ドメイン抗体をコードするポリヌクレオチド、及び本明細書に記載のＣＤ１９に結合する単一ドメイン抗体を含む融合タンパク質を提供する。本開示のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態をとり得る。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡを含み；二本鎖または一本鎖であり得、一本鎖である場合、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡの形態をとる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチドである。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号４３の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な核酸は、配列番号６４を有する。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号４４の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な核酸は、配列番号６５を有する。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号４５の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号４６の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号４７の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号４８の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号４９の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号５１の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な核酸は、配列番号６６を有する。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号５２の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な核酸は、配列番号６７を有する。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号５３の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号５４の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号５５の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号５６の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号１０４の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な核酸は、配列番号１０６を有する。
特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供されるＣＤ１９ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを提供する。本開示のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態をとり得る。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡを含み；二本鎖または一本鎖であり得、一本鎖である場合、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡの形態をとる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチドである。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号５７の配列を有するＣＡＲをコードする配列を含む。例示的な核酸は、配列番号６８を有する。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号５８の配列を有するＣＡＲをコードする配列を含む。例示的な核酸は、配列番号６９を有する。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号５９の配列を有するＣＡＲをコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号６０の配列を有するＣＡＲをコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号６１の配列を有するＣＡＲをコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号６２の配列を有するＣＡＲをコードする配列を含む。例示的な核酸は、配列番号７０を有する。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号６３の配列を有するＣＡＲをコードする配列を含む。例示的な核酸は、配列番号７１を有する。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号１０５の配列を有するＣＡＲをコードする配列を含む。例示的な核酸は、配列番号１０７を有する。
本開示は、さらに、本明細書に記載のポリヌクレオチドのバリアントに関し、バリアントは、例えば、本開示のＣＤ１９に結合する単一ドメイン抗体またはＣＡＲのフラグメント、アナログ、及び／または誘導体をコードする。特定の実施形態では、本開示は、本開示のＣＤ１９に結合する単一ドメイン抗体またはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、及び、いくつかの実施形態では、少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。本明細書で使用される時、「参照ヌクレオチド配列」と少なくとも、例えば、９５％「同一である」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」という語句は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意味するものである。但し、ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり最大５つの点変異を含み得る。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの最大５％を欠失させるか、もしくは別のヌクレオチドで置換することができ、または参照配列中の総ヌクレオチドの最大５％の多数のヌクレオチドは、参照配列に挿入することができる。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置に、またはそれらの末端位置の間の至るところ生じ得、参照配列内のヌクレオチド間に個別に、または参照配列内の１つ以上の隣接基内に点在する。
ポリヌクレオチドバリアントは、コード領域、非コード領域、またはその両方に変更を含有し得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、サイレント置換、付加、または欠失をもたらす変化を含有するが、コードされたポリペプチドの特性または活性を変化させない。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、（遺伝コードの縮重による）ポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさないサイレント置換を含む。ポリヌクレオチドバリアントは、様々な理由で、例えば、特定の宿主のコドン発現を最適化する（すなわち、ヒトｍＲＮＡのコドンをＥ． ｃｏｌｉなどの細菌宿主が好むコドンに変更する）ように生成することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、配列の非コード領域またはコード領域に少なくとも１つのサイレント変異を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、コードされたポリペプチドの発現（または発現レベル）を調節または変更するように生成される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、コードされたポリペプチドの発現を増加させるように生成される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、コードされたポリペプチドの発現を減少させるように生成される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、親ポリヌクレオチド配列と比較して、コードされたポリペプチドの発現が増加している。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、親ポリヌクレオチド配列と比較して、コードされたポリペプチドの発現が減少している。
本明細書に記載の核酸分子を含むベクターも提供される。一実施形態では、核酸分子を組み換え発現ベクターに組み込むことができる。本開示は、本開示の核酸のいずれかを含む組み換え発現ベクターを提供する。本明細書で使用される場合、構築物が、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、細胞内で発現する、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを有するのに十分な条件下で、ベクターを細胞と接触させる場合の、「組み換え発現ベクター」という用語は、宿主によりｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの発現を可能にする遺伝子改変されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド構築物を意味する。本明細書に記載のベクターは、全体として天然に存在するものではないが、ベクターの一部は、自然に存在し得る。記載された組み換え発現ベクターは、限定されないが、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む任意のタイプのヌクレオチドを含み得、これらは、一本鎖または二本鎖であり、天然の供給源から部分的に合成または取得することができ、これは、天然の、非天然、または改変されたヌクレオチドを含有し得る。組み換え発現ベクターは、天然に存在するまたは天然に存在しないヌクレオチド間結合、または両方のタイプの結合を含み得る。天然に存在しないまたは改変ヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合は、ベクターの転写または複製を妨げない。
一実施形態では、本開示の組み換え発現ベクターは、任意の好適な組み換え発現ベクターであり得、任意の好適な宿主に形質転換またはトランスフェクトするために使用することができる。好適なベクターとしては、増殖及び増大のために、または発現もしくはその両方のために設計されるもの、例えば、プラスミド及びウイルス、が挙げられる。ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ、Ｍｄ．）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、ｐＧＥＸシリーズ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）からなる群より、ベクターを選択することができる。バクテリオファージベクター、例えば、λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭ１１４９、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用することができる。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ０１．２、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１．３、及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ－Ｃ１、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。組み換え発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクターであってよい。
一実施形態では、組み換え発現ベクターは、例えば、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．及び上掲のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．に記載の標準的な組み換えＤＮＡ技術を使用して調製される。環状または線状である発現ベクターの構築物は、原核または真核宿主細胞で機能する複製系を含有するように調製することができる。例えば、ＣｏｌＥ１、ＳＶ４０、２μのプラスミド、λ、ウシパピローマウイルスなどから、複製系を誘導することができる。
組み換え発現ベクターは、調節配列、例えば、転写及び翻訳の開始コドン及び終結コドンを含んでもよく、これは、宿主のタイプ（例えば、細菌、植物、菌類、または動物）に特異的であり、この中に、適宜、ベクターが導入され、これは、ベクターがＤＮＡベースであるか、ＲＮＡベースであるかを考慮に入れる。
組み換え発現ベクターは、形質転換またはトランスフェクトされた宿主の選択を可能にする１つ以上のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性、原栄養体を提供するための栄養要求性宿主における相補性などを含む。記載された発現ベクターに好適なマーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ヒスチジノールｘ耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
組み換え発現ベクターは、本開示のヌクレオチド配列に作動可能に連結された天然または標準プロモーターを含み得る。例えば、強い、弱い、組織特異的、誘導可能及び発生特異的な、プロモーターの選択は、当業者の通常の技術の範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列とプロモーターとの組み合わせも当業者の技術範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはマウス幹細胞ウイルスの長末端反復に見られるプロモーターであり得る。
組み換え発現ベクターは、一過性発現、安定発現、またはその両方のために設計することができる。また、組み換え発現ベクターは、構成的発現または誘導的発現のために作製することができる。
さらに、組み換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製することができる。本明細書で使用される場合、「自殺遺伝子」という用語は、自殺遺伝子を発現する細胞を死滅させる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、遺伝子が発現される細胞に、作用物質、例えば、薬物、に対する感受性を与え、細胞が作用物質と接触または曝露される時、細胞を死滅させる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該技術分野で知られており、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、及びニトロレダクターゼを含む。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドが、単離される。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、実質的に純粋である。
本明細書に記載の核酸分子を含む宿主細胞もまた提供される。宿主細胞は、異種核酸を含有する任意の細胞であってよい。異種核酸は、ベクター（例えば、発現ベクター）であり得る。例えば、宿主細胞は、細胞による物質の産生用、例えば、遺伝子、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列、タンパク質、または酵素の細胞による発現用の、任意の方法で選択、改変、形質転換、成長、使用、または操作される任意の生物由来の細胞であり得る。適切な宿主が決定されてもよい。例えば、宿主細胞は、ベクターバックボーン及び所望の結果に基づいて選択されてもよい。例として、プラスミドまたはコスミドは、いくつかのタイプのベクターの複製のために原核宿主細胞に導入することができる。限定されないが、ＤＨ５α、ＪＭ１０９、及びＫＣＢ、ＳＵＲＥ（登録商標）形質転換受容性細胞、及びＳＯＬＯＰＡＣＫ Ｇｏｌｄ細胞などの細菌細胞を、ベクター複製及び／または発現用の宿主細胞として使用することができる。さらに、大腸菌ＬＥ３９２などの細菌細胞は、ファージウイルスの宿主細胞として使用することができた。宿主細胞として使用することができる真核細胞は、酵母（例えば、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００、及びＹＰＨ５０１）、昆虫、ならびに哺乳動物を含むが、これらに限定されない。ベクターの複製及び／または発現用の哺乳動物真核宿主細胞の例としては、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、ＣＯＳ、Ｓａｏｓ、ＰＣ１２、ＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＣＲＬ－１５８１）、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ、ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８０）マウス細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なヒト骨髄腫細胞株は、Ｕ２６６（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－ＴＩＢ－１９６）である。他の有用な細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するもの、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－６１）、またはＤＧ４４、が挙げられる。
５．６．医薬組成物
一態様では、本開示は、さらに、本開示の単一ドメイン抗体、または操作された免疫エフェクター細胞を含む、単一ドメイン抗体、結合分子、もしくは治療用分子を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療有効量の単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体を含む結合分子もしくは治療用分子、または本開示の操作された免疫エフェクター細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む。
いくつかの実施形態では、治療有効量の本明細書で提供される単一ドメイン抗体と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が、本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体と薬学的に許容される賦形剤とを含む治療有効量の治療用分子（例えば、融合タンパク質、イムノコンジュゲート、及び多重特異性結合分子）を含む医薬組成物が、本明細書で提供される。
他の実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体と薬学的に許容される賦形剤とを含む治療有効量のＣＡＲを含む医薬組成物が、本明細書で提供される。
他の実施形態では、治療有効量の本明細書で提供される操作された免疫エフェクター細胞と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が、本明細書で提供される。
他の実施形態では、例えば、ベクター中の、治療有効量の本明細書で提供される核酸と、例えば、遺伝子療法に適する、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が、本明細書で提供される。
特定の実施形態では、「賦形剤」という用語は、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントのアジュバント（完全または不完全））、担体またはビヒクル）も指し得る。医薬賦形剤は、滅菌液体、例えば、水及び、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む油であり得る。生理食塩水ならびに水性デキストロース及びグリセロール溶液も液体賦形剤として用いることができる。好適な医薬品賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアラート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有し得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、エマルション剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの形態をとり得る。好適な医薬品賦形剤の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ．に記載される。そのような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するために、好適な量の賦形剤と共に、例えば、精製形態で、予防的または治療的に有効な量の本明細書で提供される活性成分を含有するであろう。製剤は、投与方法に適合する必要がある。
いくつかの実施形態では、賦形剤の選択は、部分的には、特定の細胞、結合分子、及び／もしくは抗体により、ならびに／または投与方法により決定される。従って、様々な好適な製剤が存在する。
通常、許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、緩衝液、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、メタ重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；防腐剤、等張化剤、安定剤、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ＥＤＴＡなどのキレート剤、及び／または非イオン性界面活性剤を含む。
緩衝液は、特に、安定性がｐＨに依存する場合、治療効果を最適化する範囲にｐＨを制御するために使用されてもよい。本開示で使用される好適な緩衝剤としては、有機酸及び無機酸の両方、ならびにそれらの塩が挙げられる。例えば、シトラート、ホスファート、スクシナート、タータラート、フマラート、グルコナート、オキサラート、ラクタート、アセタート。緩衝液は、ヒスチジン及びトリメチルアミン塩、例えば、トリスをさらに含んでもよい。
防腐剤は、微生物の成長を遅らせるために添加されてもよい。本開示で使用される好適な防腐剤としては、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム；ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、塩化ベンゼトニウム；チメロサール、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾールが挙げられる。
多くの場合「安定剤」として既知の等張化剤は、組成物中の液体の張性を調整または維持するために存在し得る。大きな荷電生体分子、例えば、タンパク質及び抗体と共に使用される場合、それらは、アミノ酸側鎖の荷電基と相互作用し、それにより、分子間及び分子内相互作用の可能性を減らすことができるので、多くの場合、「安定剤」と呼ばれる。例示的な等張化剤としては、多価糖アルコール、三価以上の糖アルコール、例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールが挙げられる。
さらなる例示的な賦形剤としては、（１）増量剤、（２）溶解促進剤、（３）安定剤、及び（４）変性または容器壁への付着を防止する作用物質、が挙げられる。そのような賦形剤にとしては、以下が挙げられる：多価糖アルコール（上に列挙）；アミノ酸、例えば、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど；有機糖または糖アルコール、例えば、スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース、ミオイニシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール；硫黄含有還元剤、例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α－モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウム；低分子量タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは他の免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；単糖類、例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；二糖類（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）；三糖類、例えば、ラフィノース；ならびに多糖類、例えば、デキストリンまたはデキストラン。
非イオン性界面活性剤または界面活性剤（「湿潤剤」としても既知）は、治療薬の可溶化を助けるために、及び撹拌による凝集から治療用タンパク質を保護するために、存在することがあり、これにより、活性な治療用タンパク質または抗体の変性を引き起こすことなく、製剤をせん断表面応力にさらすこともできる。好適な非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリソルベート（２０、４０、６０、６５、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０など）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０、及び６０、グリセロールモノステアラート、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースが挙げられる。使用することができるアニオン性界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、及びスルホン酸ジオクチルナトリウムが挙げられる。カチオン性界面活性剤は、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムを含む。
医薬組成物がｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用されるために、それらは、無菌であることが好ましい。医薬組成物は、無菌濾過膜による濾過により無菌にされ得る。本明細書の医薬組成物は、一般に、無菌のアクセスポートを有する容器、例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針が穿刺可能な栓を有するバイアルに入れることができる。
投与経路は、既知で許容されている方法、例えば、好適な方法、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内、または関節内経路による注射もしくは注入、局所投与、吸入で、長期間にわたる単回または複数回のボーラスまたは注入または持続放出、または拡張された放出手段に従うものである。
別の実施形態では、医薬組成物を、制御放出または持続放出システムとして提供することができる。一実施形態では、ポンプは、制御または持続放出を達成するために使用されてもよい（例えば、以下を参照：Ｓｅｆｔｏｎ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１－４０（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７－１６（１９８０）；及びＳａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５６９－７４（１９８９））。別の実施形態では、予防薬もしくは治療薬（例えば、本明細書に記載の融合タンパク質）または本明細書で提供される組成物、の制御放出または持続放出を達成するために、ポリマー材料を使用することができる（例えば、以下を参照：Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ ｅｄｓ．，１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ ｅｄｓ．，１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１－１２６（１９８３）；Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０－９２（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１－５６（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５－１２（１９８９）；米国特許第５，６７９，３７７号；同第５，９１６，５９７号；同第５，９１２，０１５号；同第５，９８９，４６３号；ならびに同第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／１５１５４号及び同第ＷＯ９９／２０２５３号）。持続放出製剤に使用されるポリマーの例としては、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリラート）、ポリ（メチルメタクリラート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン－コ－ビニルアセタート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、及びポリオルトエステルが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、持続放出製剤に使用されるポリマーは、不活性で、浸出性不純物がなく、貯蔵安定性、無菌、及び生分解性である。さらに別の実施形態では、制御放出または持続放出システムを、特定の標的組織、例えば、鼻腔または肺の近くに配置することができ、それにより、全身用量のほんの一部しか必要とされない（例えば、以下に参照：Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｖｏｌ．２，１１５－３８（１９８４））。制御放出システムは、例えば、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－３３（１９９０）により議論される。本明細書に記載の１つ以上の薬剤を含む持続放出製剤を製造するために、当業者に既知の任意の手法を使用することができる（例えば、以下を参照：米国特許第４，５２６，９３８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０５５４８号及び同第ＷＯ９６／２０６９８号、Ｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３９：１７９－８９（１９９６）；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＤＡ Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．＆ Ｔｅｃｈ．５０：３７２－９７（１９９５）；Ｃｌｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：８５３－５４（１９９７）；ならびに、Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：７５９－６０（１９９７））。
本明細書に記載の医薬組成物は、処置される特定の適応症に必要な場合、複数の活性化合物または薬剤も含んでもよい。代わりに、または加えて、組成物は、細胞傷害薬、化学療法薬、サイトカイン、免疫抑制薬、または成長阻害薬を含んでもよい。そのような分子は、意図される目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
活性成分は、また、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）中、またはマクロエマルション中で、例えば、コアセルベーション手法により、または、界面重合により、それぞれ、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリラート）マイクロカプセルにより、調製されたマイクロカプセル中に封入されてもよい。そのような手法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎに開示される。
様々な組成物及び送達系が既知であり、本明細書で提供される治療薬と共に使用することができ、これらは、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセルへのカプセル化、本明細書で提供される単一ドメイン抗体または治療用分子を発現することが可能な組み換え細胞、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築などを含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、疾患または障害を処置または予防するのに有効な量、例えば、治療有効量または予防有効量で結合分子及び／または細胞を含有する。いくつかの実施形態における治療効果または予防効果は、処置対象の定期的な評価により監視される。状態に応じて、数日以上にわたって反復投与する場合、所望の疾患症状の抑制が起こるまで、処置を繰り返す。しかし、他の投薬計画が有用であり、決定することができる。
５．７．方法及び用途
別の態様では、抗ＣＤ１９ ＶＨＨ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及び／または組み換え受容体を発現する操作された細胞を含む、本明細書で提供されるＣＤ１９結合分子の使用方法及び用途が本明細書で提供される。
５．７．１．治療方法及び用途
そのような方法及び用途は、ＣＤ１９発現を発現するか、もしくはそれに関連する、及び／または細胞もしくは組織がＣＤ１９を発現する、疾患、状態、または障害を有する対象に、例えば、分子、細胞、またはそれを含有する組成物を投与することを含む、治療方法及び用途を含む。いくつかの実施形態では、分子、細胞、及び／または組成物は、疾患または障害の処置を行うのに有効な量で投与される。使用は、そのような方法及び処置における、ならびにそのような治療方法を実施するための薬品の調製における、抗体及び細胞の使用を含む。いくつかの実施形態では、方法は、疾患または状態を有するか、またはそれを有すると疑われる対象に、抗体もしくは細胞、またはそれらを含む組成物を投与することにより実施される。いくつかの実施形態では、それにより、方法は、対象の疾患または障害を処置する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される処置は、疾患もしくは障害、または症状、有害作用もしくは転帰、またはそれに関連する表現型の完全または部分的な改善または低減を引き起こす。処置の望ましい効果は、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾患の進行速度の減少、病状の改善または緩和、及び予後の寛解または改善が含まれるが、これらに限定されない。これらの用語は、疾患の完全治癒、または、全ての症状もしくは転帰における任意の症状もしくは効果（複数可）の完全な排除を含むが、それらを意味しない。
本明細書で使用される場合、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される処置は、疾患または障害の発症を遅らせ、例えば、疾患（例えば、がん）の発症を遅延、妨害、減速、阻止、安定化、抑制、及び／または延期する。この遅延は、疾患の病歴及び／または処置される個体に応じて、様々な時間のものとなり得る。当業者には明らかであるように、十分なまたは有意な遅延は、個体が疾患または障害を発症しないという点で、事実上、予防を包含し得る。例えば、転移の発症などの末期がんは、遅延され得る。
他の実施形態では、本明細書で提供される方法または使用は、疾患または障害を予防する。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、ＣＤ１９関連の疾患または障害である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、Ｂ細胞関連の疾患または障害である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、Ｂ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、Ｂ細胞白血病またはＢ細胞リンパ腫である。特定の実施形態では、疾患または障害は、辺縁帯リンパ腫（例えば、脾辺縁帯リンパ腫）である。特定の実施形態では、疾患または障害は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、Ｂ細胞前リンパ球性白血病（Ｂ－ＰＬＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、バーキットリンパ腫である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、原発性眼内リンパ腫である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、前駆Ｂリンパ芽球性白血病である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫（ＨＧＢＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、多発性骨髄腫（ＭＭ）である。他の実施形態では、疾患または障害は、再発性または難治性Ｂ細胞悪性腫瘍、例えば、再発性または難治性ＡＬＬ（Ｒ／Ｒ ＡＬＬ）である。
他の実施形態では、疾患または障害は、例えば、不適切なまたは増加したＢ細胞数及び／または活性化と関連するものを含む、自己免疫疾患及び炎症性疾患である。
いくつかの実施形態では、方法は、養子細胞療法を含み、それにより、提供されたＣＤ１９標的指向性ＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞が対象に投与される。そのような投与は、疾患または障害の細胞が破壊の標的となるように、ＣＤ１９を標的とする方法で細胞の活性化（例えば、Ｔ細胞の活性化）を促進し得る。
いくつかの実施形態では、方法は、対象、組織、または細胞、例えば、疾患または障害を有するか、これらのリスクがあるか、またはこれらを有すると疑われるものへの、細胞または細胞を含有する組成物の投与を含む。いくつかの実施形態では、細胞、集団、及び組成物は、例えば、養子細胞療法、例えば、養子Ｔ細胞療法を介して、処置されるべき特定の疾患または障害を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、細胞または組成物は、対象、例えば、疾患または障害を有するか、またはそれらのリスクがある対象、に投与される。いくつかの実施形態では、方法は、それにより、例えば、ＣＤ１９発現がんにおける腫瘍量を低減させることにより、例えば、疾患または障害の１つ以上の症状を処置し、例えば、改善する。
例えば、米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号；米国特許第４，６９０，９１５号；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．８（１０）：５７７－８５（２０１１）；Ｔｈｅｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（１０）：９２８－９３３（２０１３）；Ｔｓｕｋａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ４３８（１）：８４－９（２０１３）；及びＤａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（４）：ｅ６１３３８（２０１３）に記載される養子細胞療法のための細胞の投与方法が既知である。これらの方法は、本明細書で提供される方法及び組成物と関連して使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、細胞療法（例えば、養子Ｔ細胞療法）は、自己移植で実施され、細胞が、細胞治療を受けるべき対象から、またはそのような対象に由来するサンプルから、単離及び／または別の方法で調製される。従って、いくつかの態様では、細胞は、処置を必要とする対象に由来し、細胞は、単離及び処理後に、同じ対象に投与される。他の実施形態では、細胞療法（例えば、養子Ｔ細胞療法）は、同種異系移植で実施され、細胞は、細胞療法を受けるべき、または最終的に受ける対象以外の対象、例えば、第１の対象、から単離及び／または別の方法で調製される。そのような実施形態では、次に、細胞は、同じ種の異なる対象、例えば、第２の対象、に投与される。いくつかの実施形態では、第１及び第２の対象は、遺伝的に同一である。いくつかの実施形態では、第１及び第２の対象は、遺伝的に類似している。いくつかの実施形態では、第２の対象は、第１の対象と同じＨＬＡクラスまたはスーパータイプを発現する。
いくつかの実施形態では、細胞、細胞集団、または組成物が投与される対象は、霊長類、例えば、ヒトである。対象は、男性または女性であり得、幼児、少年、青年、成人、及び高齢者対象を含む任意の好適な年齢であり得る。いくつかの例では、対象は、疾患、養子細胞療法、及び／または毒作用の評価について検証された動物モデルである。
ＣＤ１９結合分子、例えば、ＶＨＨ及びＶＨＨを含有するキメラ受容体、ならびにそれを発現する細胞は、任意の好適な手段により、例えば、注射、例えば、静脈内または皮下注射、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、結膜下（ｓｕｂｃｏｎｊｅｃｔｖａｌ）注射、結節下注射、テノン嚢下注射、眼球後注射、眼球周囲注射、または強膜傍後部送達により、投与することができる。いくつかの実施形態では、それらは、非経口、肺内、及び鼻腔内、局所処置に望ましい場合、病巣内投与で投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与を含む。
疾患または状態の予防及び／または処置に有効となる本明細書で提供される予防薬または治療薬の量は、標準的な臨床手法で決定することができる。有効用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から導出された用量反応曲線から外挿されてもよい。疾患の予防または処置のために、結合分子または細胞の適切な投薬量は、処置されるべき疾患または障害のタイプ、結合分子のタイプ、疾患または障害の重症度及び経過、治療薬が予防または治療目的のために投与されるかどうか、以前の治療、患者の病歴及び薬剤に対する応答、ならびに主治医の判断に依存し得る。組成物、分子、及び細胞は、いくつかの実施形態では、一度にまたは一連の処置にわたって患者に適切に投与される。
例えば、疾患の種類及び重症度に応じて、抗体の投薬量は、約１０μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ以上を含んでもよい。断続的に複数回用量が投与されてもよい。最初に高負荷用量、続いて、１つ以上の低用量が投与されてもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の単一ドメイン抗体のいずれか１つを含み、医薬組成物は、投与経路に応じて、１日当たり約１０ｎｇ／ｋｇ個体体重～約１００ｍｇ／ｋｇ個体体重以上の投薬量で、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ／日～１０ｍｇ／ｋｇ／日で投与される。特定の投与量及び送達方法に関する手引きは、文献に提供される（例えば、以下を参照：米国特許第４，６５７，７６０号；同第５，２０６，３４４号；及び同第５，２２５，２１２号）。
結合分子を含有する遺伝子操作された細胞との関連で、いくつかの実施形態では、対象は、約１００万～約１０００億個の範囲の細胞及び／または体重１キログラム当たりの細胞の量を投与されてもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の操作された免疫細胞のいずれか１つを含み、医薬組成物は、少なくとも約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、または１０９細胞／個体体重ｋｇのうちのいずれかの投薬量で投与される。投薬量は、疾患もしくは障害及び／または患者及び／または他の処置に特有の属性に応じて変動し得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１回投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、複数回（例えば、２、３、４、５、６回、またはそれ以上のうちのいずれか）投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、投与サイクル中に１回または複数回投与される。投与サイクルは、例えば、１、２、３、４、５週間もしくはそれ以上、または１、２、３、４、５ヶ月もしくはそれ以上であり得る。特定の患者に対する最適な投与量及び処置計画は、疾患の徴候について患者を監視し、それに応じて処置を調整することにより、医療の当業者により決定することができる。
いくつかの実施形態では、細胞または抗体は、併用療法の一部として、例えば、別の治療的介入、例えば、別の抗体または操作された細胞または受容体または作用物質、例えば、細胞傷害性または治療薬と同時または任意の順序で逐次的に、投与される。
いくつかの実施形態では、細胞または抗体は、１つ以上の追加の治療薬と同時に、または別の治療的介入と関連して、同時にまたは任意の順序で逐次的に、共投与される。いくつかの状況では、細胞集団が１つ以上の追加の治療薬の効果を高めるか、またはその逆も同様に、細胞は、十分に近い時間に別の療法と同時投与される。いくつかの実施形態では、細胞または抗体は、１つ以上の追加の治療薬の前に投与される。いくつかの実施形態では、細胞または抗体は、１つ以上の追加の治療剤の後に投与される。
特定の実施形態では、細胞が哺乳動物（例えば、ヒト）に投与されると、操作された細胞集団及び／または抗体の生物学的活性が、多数の既知の方法のいずれかで測定される。評価するパラメーターは、ｉｎ ｖｉｖｏでの、例えば、イメージングにより、または、例えば、ｅｘ ｖｉｖｏでの、例えば、ＥＬＩＳＡもしくはフローサイトメトリーにより、操作されたまたは天然のＴ細胞または他の免疫細胞の抗原への特異的結合を含む。特定の実施形態では、例えば、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，３２（７）：６８９－７０２（２００９），及びＨｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８５（１）：２５－４０（２００４）に記載の細胞傷害性アッセイなどの当該技術分野で既知の任意の好適な方法を使用して、操作された細胞が標的細胞を破壊する能力を測定することができる。特定の実施形態では、特定のサイトカイン、例えば、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ、の発現及び／または分泌をアッセイすることにより、細胞の生物学的活性を測定することもできる。いくつかの態様では、生物学的活性は、臨床転帰、例えば、腫瘍量または負荷の低減、を評価することにより測定される。
いくつかの特定の実施形態では、対象の疾患または障害を処置するための方法が本明細書で提供され、方法は、上記のセクション５．２に記載のＣＤ１９に結合する単一ドメイン抗体を含む結合分子を対象に投与することを含み、これは、例えば、表２のＣＤＲを有するもの、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、または配列番号１０４のアミノ酸配列を含むもの、及び、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、または配列番号１０４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むもの、を含む。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、ＣＤ１９関連の疾患または障害である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、Ｂ細胞関連の疾患または障害である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、Ｂ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、Ｂ細胞白血病またはＢ細胞リンパ腫である。特定の実施形態では、疾患または障害は、辺縁帯リンパ腫（例えば、脾辺縁帯リンパ腫）である。特定の実施形態では、疾患または障害は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、Ｂ細胞前リンパ球性白血病（Ｂ－ＰＬＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、バーキットリンパ腫である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、原発性眼内リンパ腫である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、前駆Ｂリンパ芽球性白血病である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫（ＨＧＢＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、多発性骨髄腫（ＭＭ）である。他の実施形態では、疾患または障害は、再発性または難治性Ｂ細胞悪性腫瘍、例えば、再発性または難治性ＡＬＬ（Ｒ／Ｒ ＡＬＬ）である。他の実施形態では、疾患または障害は、例えば、不適切なまたは増加したＢ細胞数及び／または活性化と関連するものを含む、自己免疫疾患及び炎症性疾患である。
他の実施形態では、疾患または障害を処置するための方法が本明細書で提供され、この方法は、例えば、セクション５．３で提供されるＣＡＲを含む細胞を含む、セクション５．４で提供される操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象に投与される操作された免疫細胞は、（ａ）抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むポリペプチドを含むＣＡＲを含み、抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂは、例えば、表２のＣＤＲを有するもの；配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、または配列番号１０４のアミノ酸配列を含むもの；及び配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、または配列番号１０４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むもの、を含む、上記のセクション５．２に記載のものである。いくつかの実施形態では、対象に投与される操作された免疫細胞は、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、及び配列番号１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、及び配列番号１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、ＣＤ１９関連の疾患または障害である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、Ｂ細胞関連の疾患または障害である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、Ｂ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、Ｂ細胞白血病またはＢ細胞リンパ腫である。特定の実施形態では、疾患または障害は、辺縁帯リンパ腫（例えば、脾辺縁帯リンパ腫）である。特定の実施形態では、疾患または障害は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、Ｂ細胞前リンパ球性白血病（Ｂ－ＰＬＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、バーキットリンパ腫である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、原発性眼内リンパ腫である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、前駆Ｂリンパ芽球性白血病である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫（ＨＧＢＬ）である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、多発性骨髄腫（ＭＭ）である。他の実施形態では、疾患または障害は、再発性または難治性Ｂ細胞悪性腫瘍、例えば、再発性または難治性ＡＬＬ（Ｒ／Ｒ ＡＬＬ）である。他の実施形態では、疾患または障害は、例えば、不適切なまたは増加したＢ細胞数及び／または活性化と関連するものを含む、自己免疫疾患及び炎症性疾患である。
５．７．２．診断及び検出の方法及び用途
別の態様では、本明細書で提供される結合分子、例えば、ＣＤ１９に結合するＶＨＨ、ならびに、１つ以上の組織もしくは細胞型に対する特定の処置の結合の検出、予測、診断、病期分類、決定、ならびに／または対象の処置決定の告知、例えば、ＣＤ１９及び／もしくは抗体に認識されるそのエピトープの存在の検出のための、そのようなＶＨＨを含有する分子（例えば、コンジュゲート及び複合体）の使用を含む方法が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、診断または検出の方法で使用される抗ＣＤ１９抗体（例えば、本明細書に記載の抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体のいずれか１つ）が提供される。さらなる態様では、生体試料中のＣＤ１９の存在を検出する方法が提供される。特定の実施形態では、方法は、生物学的サンプル中のＣＤ１９タンパク質の存在を検出することを含む。特定の実施形態では、ＣＤ１９は、ヒトＣＤ１９である。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ１９発現疾患または障害に関連する診断及び／または予測方法である。いくつかの実施形態における方法は、生物学的サンプルを抗体と共にインキュベート及び／もしくはプローブすること、ならびに／または対象に抗体を投与することを含む。特定の実施形態では、生物学的サンプルは、細胞または組織またはその一部、例えば、腫瘍またはがん組織または生検またはその切片を含む。特定の実施形態では、接触は、サンプル中に存在するＣＤ１９への抗ＣＤ１９抗体の結合を許容する条件下である。いくつかの実施形態では、方法は、複合体がサンプル中の抗ＣＤ１９抗体及びＣＤ１９間で形成されるかどうかを検出すること、例えば、そのような結合の有無またはレベルを検出すること、をさらに含む。そのような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの方法であってよい。一実施形態では、例えば、ＣＤ１９が、患者選択のためのバイオマーカーである場合、抗ＣＤ１９抗体は、抗ＣＤ１９抗体または操作された抗原受容体を用いる治療に適格な対象を選択するために使用される。
いくつかの実施形態では、サンプル、例えば、細胞、組織サンプル、溶解物、組成物、またはそれらに由来する他のサンプルを、抗ＣＤ１９抗体と接触させ、抗体及びサンプル間の複合体（例えば、サンプル中のＣＤ１９）の結合または形成が決定または検出される。試験サンプル中の結合が同じ組織タイプの参照細胞と比較して実証または検出される場合、それは、関連疾患または障害の存在、及び／または、抗体を含有する治療薬が、サンプルが由来する組織または細胞または他の生体物質と同じあるか、または、それと同じタイプのものである組織または細胞に特異的に結合するであろうこと、を示し得る。いくつかの実施形態では、サンプルは、ヒト組織由来であり、罹患及び／もしくは正常組織由来、例えば、処置されるべき疾患もしくは障害を有する対象由来、及び／またはそのような対象と同じ種の対象由来であってよいが、それは、処置されるべき疾患または障害を有していない。いくつかの場合では、正常な組織または細胞、例えば、投与された対象に存在するがんと同じまたは異なる器官由来の正常細胞は、処置されるべき疾患または障害を有する対象に由来するが、それ自体は、罹患細胞または組織ではない。
特異的な抗体－抗原結合を検出するための当該技術分野で既知の様々な方法を使用することができる。イムノアッセイの例としては、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、比濁阻害イムノアッセイ（ＮＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。指標部分または標識基は、多くの場合、アッセイ装置及び適合するイムノアッセイ手順の入手可能性により決定される方法の様々な用途の必要性を満たすように使用することができる。例示的な標識としては、放射性核種（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、または３２Ｐ及び／またはクロム（５１Ｃｒ）、コバルト（５７Ｃｏ）、フッ素（１８Ｆ）、ガドリニウム（１５３Ｇｄ、１５９Ｇｄ）、ゲルマニウム（６８Ｇｅ）、ホルミウム（１６６Ｈｏ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、ランタン（１４０Ｌａ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、マンガン（５４Ｍｎ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、リン（３２Ｐ）、プラセオジム（１４２Ｐｒ）、プロメチウム（１４９Ｐｍ）、レニウム（１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ）、ロジウム（１０５Ｒｈ）、ルテリウム（９７Ｒｕ）、サマリウム（１５３Ｓｍ）、スカンジウム（４７Ｓｃ）、セレン（７５Ｓｅ）、（８５Ｓｒ）、硫黄（３５Ｓ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、スズ（１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ）、トリチウム（３Ｈ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、イッテルビウム（１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ）、イットリウム（９０Ｙ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはβ－ガラクトシダーゼ）、蛍光部分またはタンパク質（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、ＧＦＰ、またはＢＦＰ）、または発光部分（例えば、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）が供給するＱｄｏｔ（商標）ナノ粒子）が挙げられる。上記の様々なイムノアッセイの実施に使用されるべき様々な一般的な手法が既知である。
特定の実施形態では、標識抗体（例えば、抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体）が提供される。標識は、例えば、酵素反応または分子相互作用により、直接検出される標識または部分（例えば、蛍光、発色団、高電子密度、化学発光、及び放射性標識）、ならびに、間接的に検出される酵素またはリガンドなどの部分を含むが、これらに限定されない。他の実施形態では、抗体は、標識されず、その存在は、抗体のいずれかに結合する標識抗体を使用して検出することができる。
５．８．キット及び製造物品
本明細書に記載の単一ドメイン抗体、キメラ抗原受容体、または操作された免疫エフェクター細胞のいずれかを含むキット、単位投薬量、及び製造物品がさらに提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物のいずれか１つを含有し、且つ、好ましくは、その使用説明書を提供するキットが提供される。
本願のキットは、好適なパッケージ中にある。好適なパッケージングとしては、バイアル、ボトル、ジャー、フレキシブル包装（例えば、密閉マイラーまたはビニール袋）などが挙げられるが、これらに限定されない。キットは、任意に、緩衝液及び説明情報などの追加の構成要素を提供してもよい。従って、本出願は、製造物品も提供し、これは、バイアル（例えば、密閉バイアル）、ボトル、ジャー、フレキシブルパッケージなどを含む。
製造物品は、容器、及び、容器上または容器に付属するラベルまたは添付文書を含み得る。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器などが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。一般に、容器は、本明細書に記載の疾患または障害（例えば、がん）を処置するのに有効な組成物を保持し、無菌のアクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針により穿刺可能な栓を有するバイアルであってよい）。ラベルまたは添付文書は、組成物が個体の特定の状態を処置するために使用されることを示す。ラベルまたは添付文書は、個体に組成物を投与するための説明書をさらに含むであろう。ラベルは、再構成及び／または使用のための注意書きを示し得る。医薬組成物を保持する容器は、再構成された製剤の反復投与（例えば、２～６回の投与）を可能にする多目的バイアルであってもよい。添付文書は、治療用製品の市販パッケージに通常含まれる使用説明書を指し、これは、そのような治療用製品の使用に関する適応症、使用法、投薬量、投与、禁忌、及び／または警告に関する情報を含有する。さらに、製造物品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液、をさらに含む第２の容器を含んでもよい。それは、さらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及び注射器を含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料を含んでもよい。
キットまたは製造物品は、複数の単位用量の医薬組成物及び使用説明書を含み、薬局、例えば、病院薬局及び調剤薬局、で保管及び使用するのに十分な量でパッケージングされてもよい。
簡潔にするために、特定の略語が、本明細書で使用される。一例は、アミノ酸残基を表す１文字の略語である。アミノ酸及びそれに対応する３文字及び１文字の略語は以下の通りである。
Figure 2023546764000005
本開示は、多数の実施形態を記載するために肯定的な言葉を使用して、一般に、本明細書に開示される。本開示は、また、具体的には、特定の対象が、完全にまたは部分的に除外される実施形態、例えば、物質もしくは材料、方法のステップ及び条件、プロトコール、手順、アッセイ、または分析を含む。従って、本開示は、一般に、本開示が含まないものに関して、本明細書で表現されていないが、それにもかかわらず、本開示に明示的に含まれていない態様は、本明細書に開示される。
本開示のいくつかの実施形態が説明されている。それでもなお、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な修正がなされてもよいことを理解されるであろう。従って、以下の実施例は、特許請求の範囲に記載された開示の範囲を説明するが、限定しないことが意図される。
６．実施例
以下は、研究で使用される様々な方法及び材料の説明であり、本開示の作成方法及び使用方法の完全な開示及び説明を当業者らに提供するために記載され、本発明者らが本開示としてみなすものの範囲に制限することが意図されないか、以下の実験が実施され、実施され得る実験の全てであることを表すことが意図されない。現在時制で書かれた例示的な説明は、必ずしも実行されたわけではなく、むしろ、この説明は、本開示の教示に関連するデータなどを生成するために実施することができることを理解すべきである。使用される数値（例えば、量、パーセンテージなど）に関して正確性を確保するための取り組みがなされているが、いくつかの実験誤差及び偏差は、考慮されるべきである。
６．１．実施例１－抗ＣＤ１９ ＶＨＨの調製
ＣＤ１９抗原に対し高い結合親和性を有するＶＨＨを開発するために、ラクダを、ヒトＣＤ１９タンパク質で免疫した。次に、ＶＨＨリードをスクリーニングするために、ファージディスプレイライブラリーを構築した。固有のクローンを、特異的結合に基づいて選択し、ＶＨＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）、特に、抗原認識レパートリー及び結合を拡大するＣＤＲ３に従ってランク付けした。
６．１．１．細胞株の構築
Ｋ５６２．ｈｕＣＤ１９．Ｌｕｃ細胞株は、以下に簡単に記載される方法に従って社内で開発された。ヒトＣＤ１９コード配列（ＮＭ＿００１７７０．５）を合成し、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩの制限部位間のｐＬＶＸ－ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３２１６４）にサブクローニングして、プラスミドｐＬＶＸ－ｈｕＣＤ１９．Ｌｕｃ．Ｐｕｒｏを得た。ｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ．２Ｇ、及びｐＬＶＸ－ｈｕＣＤ１９．Ｌｕｃ．Ｐｕｒｏを含有するプラスミドの混合物を用いるＬｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ宿主細胞の一過性トランスフェクションにより、レンチウイルスをパッケージングした。０．５×１０６のＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－２４３）に、１００μＬのＬＶ－ｈｕＣＤ１９．Ｌｕｃ．ＰｕｒｏＲレンチウイルスを感染させることにより形質導入した。形質導入されたＫ５６２．ｈｕＣＤ１９．Ｌｕｃ細胞を選択し、ピューロマイシン選択培地（１０％のＦＢＳ及び５μｇ／ｍＬのピューロマイシンが補充されたＲＰＭＩ１６４０）で２～３日毎に生成した。３回の選択の後、遠心分離により細胞プールを回収した。採取された細胞を分注し、凍結保存し、さらなる使用のために準備した。
Ｋ５６２．ｈｕＣＤ１９．Ｌｕｃ細胞株におけるヒトＣＤ１９の発現を、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＣＤ１９抗体で検証した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－１０５－０８６）。要約すると、２×１０５のＫ５６２．ｈｕＣＤ１９．Ｌｕｃ細胞またはＫ５６２細胞をＰＥコンジュゲート抗ヒトＣＤ１９抗体と共に４℃で３０分間インキュベートし、その後、３回洗浄し、ヒトＣＤ１９抗原の発現レベルを検出するために、Ａｔｔｕｎｅ ＮＸＴフローサイトメトリー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でのＦＡＣＳ分析の場合、０．５％のＦＢＳを含むＤＰＢＳ ２００μＬに再懸濁した。Ｋ５６２．ｈｕＣＤ１９．Ｌｕｃの平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、Ｋ５６２細胞（陰性対照）よりも２４３．０６倍高かった。
６．１．２．動物の免疫及び免疫応答試験
成体の雄ラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａｎ）１頭に、ヒトＣＤ１９タンパク質（ＡＣＲＯ、カタログ番号ＣＤ９－Ｈ５２Ｈ２）を２週間間隔で５回免疫した。免疫前日（Ｐｒｅ）及び最終免疫日（ＴＢ）に採血した。ラクダの免疫応答をＥＬＩＳＡで評価し、血清サンプル及び固定化抗原間の結合を試験した。動物へのＣＤ１９抗原の注射により、強力な免疫応答が誘導され、血清力価は、＞１：２４３ｋに達した。このデータは、抗体力価がＣＤ１９抗原免疫により著しく増加したことを示唆した。
最後の免疫から３～５日後に、産生血として頸静脈から、１００ｍＬの血液を採取した。リンホプレップの手順に従って、血液から末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を分離した。
６．１．３．抗体ファージライブラリーの構築
製造者のプロトコールに従い、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１５５９６０２６）を使用して、単離されたリンパ球から総ＲＮＡを抽出し、製造者の使用説明書に従い、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）１ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号６１１０Ａ）を使用して、オリゴ（ｄＴ）２０プライマーで、ｃＤＮＡに逆転写した。２つのＳｆｉＩ制限部位を導入したＶＨＨフラグメントを増幅するように、フォワード及びリバース特異的縮重プライマー（中国特許第ＣＮ１０５５５５３１０Ｂ号を参照）を設計した。２段階のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ＶＨＨフラグメントを増幅し、第２のＰＣＲ産物をＳｆｉＩで消化し、ゲル精製し、次に、ファージミドベクター－ｐＦＬ２４９に挿入し、これを、大腸菌細胞に電気的に導入して、ファージディスプレイＶＨＨ免疫ライブラリーを得た。
形質転換された細胞のごく一部を希釈し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンが補充された２ｘＹＴプレートに塗り広げた。コロニーを計数して、ライブラリーサイズを算出した。ライブラリーの品質を評価するために、陽性クローンをランダムに選択し、シーケンシングした。１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び２％のグルコースが補充された２４５ｍｍ平方の２×ＹＴ寒天皿に、残りの形質転換された細胞を塗り広げた。コロニーの菌叢を、皿からこすり落とした。細胞の少量のアリコートを、ライブラリープラスミド分離に使用した。次に、残りの細胞に、グリセロールを補充し、ストックとして－８０℃で保存した。
６．１．４．ファージディスプレイパニング
ヘルパーファージによる感染後、表面にＶＨＨドメインを遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質として提示する組み換えファージ粒子が産生された。ファージ粒子を標準的な方法に従って調製し、フィルター滅菌後に、さらなる研究のために４℃で保存した。様々なパニング方策で、ファージライブラリーを使用した。１回目及び２回目のパニングでは、ビオチン化ヒトＣＤ１９抗原（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ Ｋｉｔで標識されたビオチン）をファージライブラリーと共にインキュベートし、続いて、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）で捕捉した。多数回洗浄した後、結合したファージをトリエチルアミンで溶出させた。２回のパニング後に、ファージの濃縮が観察された。
６．１．５．ＥＬＩＳＡスクリーニング
個々のライブラリークローンをインキュベートし、９６ディープウェルプレートで発現を誘導した。ヒトＣＤ１９抗原を特異的に認識するＶＨＨクローンをスクリーニングするために、ＥＬＩＳＡスクリーニングを実施した。
抗原特異的細胞に結合するＶＨＨクローンを特定するために、Ｋ５６２．ｈｕＣＤ１９．Ｌｕｃ細胞、Ｋ５６２．ｈｕＣＤ１９．Ｌｕｃ細胞、及びＫ５６２．Ｌｕｃ細胞（陰性対照）を、３％のＢＳＡバッファーで、室温で１時間ブロックした。出力ライブラリーから単一のクローンをランダムに選択し、９６ディープウェルプレートで培養した。細菌培養のＯＤ６００が０．６～０．８に達した時、ＩＰＴＧを加えて一晩発現を誘導した。遠心分離で細菌を収集し、次に、マイクロウェルプレートに播種した。
本開示の例示的な抗ＣＤ１９ ＶＨＨドメイン（すなわち、ＶＨＨ－０８３、ＶＨＨ－１１１、ＶＨＨ－１３１、７７ＬＩＣＡ５４２、７７ＬＩＣＡ５１９、７７ＬＩＣＡ６０２、ＬＩＣ１１５７、及びＬＩＣ１１５９）を選択し、シーケンシングした。ＣＤＲ（例えば、ＫａｂａｔまたはＩＭＧＴナンバリングスキームで定義）及びＶＨＨ配列は、本明細書で提供される表２及び配列表にまとめられる。
６．２．実施例２－ＶＨＨキメラ受容体ポリペプチドの構築物及び免疫細胞発現
６．２．１．ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲの構築
Ｎ末端からＣ末端にかけて、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７細胞質ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞質ドメインを含む、ＣＡＲバックボーンポリペプチドをコードする核酸配列を、化学的に合成し、下流でｈＥＦ１αプロモーターに作動可能に連結されている事前改変されたレンチウイルスベクターにクローニングした。ベクター内のマルチクローニング部位（ＭＣＳ）は、ＶＨＨフラグメント（複数可）のＮ末端に融合されたＣＤ８αシグナルペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されたＫｏｚａｋ配列（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号７８））を含む核酸配列の挿入を可能にし、上流をＣＡＲバックボーン配列に作動可能に連結した。
ＣＡＲ骨格ベクターを使用して、一価のＶＨＨベースのＣＡＲを構築するために、抗ＣＤ１９ ＶＨＨドメインをコードする核酸配列を、ＫｏｚａｋＣＤ８αシグナルペプチドをコードする核酸配列の３’に作動可能に連結した。融合核酸配列を化学的に合成し、当該技術分野で既知の分子クローニング手法により、ＥｃｏＲＩ（５’－ＧＡＡＴＴＣ－３’（配列番号９７））及びＳｐｅＩ（５’－ＡＣＴＡＧＴ－３’（配列番号９８））制限部位を介して、ＣＡＲ骨格にクローニングした。
例示的なＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ構築物が表５に示される。抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖ）（配列番号９９）構築物も、陽性対照として機能するようにＣＡＲ骨格にクローン化し、これも表５に示される。
（表５）例示的なＣＤ１９ ＣＤＲ構築物
Figure 2023546764000006
ＶＨＨ－０８３ ＣＡＲ、ＶＨＨ－１１１ ＣＡＲ、及びＶＨＨ－１３１ ＣＡＲの核酸配列は、配列表に示されるように、それぞれ配列番号６８、配列番号６９、及び配列番号１０７である。これらの例示的なＣＡＲ構築物において、ＣＤ８α由来のシグナルペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を有し、ＣＤ８α由来のヒンジは、配列番号７３のアミノ酸配列を有し、ＣＤ８α由来の膜貫通ドメインは、配列番号７４のアミノ酸配列を有し、ＣＤ１３７由来の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７５のアミノ酸配列を有し、ＣＤ３ζ由来の一次細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７６のアミノ酸配列を有する。
６．２．２．レンチウイルスベクターのパッケージング
ｐＭＤＬｇ．ｐＲＲＥ（Ａｄｄｇｅｎｅ、＃１２２５１）、ｐＲＳＶ－ＲＥＶ（Ａｄｄｇｅｎｅ、＃１２２５３）、及びｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ、＃１２２５９）を含有するレンチウイルスパッケージングプラスミド混合物を、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）との事前に最適化された比で、ＣＡＲ構築物を発現するベクターと予め混合した。次に、トランスフェクション混合物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に滴加し、穏やかに混合し、続いて、６～８時間後に培地を交換した。ウイルス含有上清を、４８時間及び７２時間で回収し、次に、４℃で１０分間、３０００ｇで遠心分離した。レンチウイルス濃縮後、上清を注意深く捨て、ウイルスペレットをＤ１０培地（ＤＭＥＭ、１０％のＦＢＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び２ｍＭのＬ－グルタミン）で再懸濁させた。採取されたウイルスを分注し、直ちに、－８０℃で保存した。ＣＨＯ哺乳動物細胞の形質導入効率により、ウイルス力価を評価及び決定した。ＣＤ１９ ＣＡＲのＬＶ力価は、１×１０８～２×１０８の範囲内に達した。
６．２．３．Ｔ細胞の分離及び活性化
ヒトＰＢＭＣを、健康なドナーから収集した。以下に記載される製造者プロトコールに従い、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｐａｎ Ｔ細胞単離キット（カタログ番号１３０－０９６－５３５）を使用して、ＰＢＭＣからヒトＴ細胞を精製した。細胞数を計数し、細胞懸濁液を４℃、３００ｇで１０分間遠心分離した。次に、上清を吸引除去し、細胞ペレットを総細胞１０７個当たり４０μＬの緩衝液に再懸濁させた。総細胞１０７個当たり１０μＬのＰａｎ Ｔ細胞ビオチン抗体カクテルを添加し、十分に混合し、４℃で５分間インキュベートした。次に、全細胞１０７個当たり３０μＬの緩衝液を添加した。細胞１０７個当たり２０μＬのＰａｎ Ｔ細胞ＭｉｃｒｏＢｅａｄカクテルを添加した。細胞懸濁液混合物を完全に混合し、４℃でさらに１０分間インキュベートした。磁気分離には、５００μＬの最小量（体積）が必要であった。磁気分離では、ＬＳカラムを好適なＭＡＣＳセパレーターの磁場に配置した。ＬＳカラムを、３ｍＬの緩衝液ですすいだ。次に、細胞懸濁液をカラムに適用し、濃縮されたＴ細胞画分を表した非標識細胞を含有するフロースルーを収集した。３ｍＬの緩衝液でカラムを洗浄して、通過した非標識細胞を収集することで、追加のＴ細胞を収集した。これらの非標識細胞は、濃縮されたＴ細胞を再び表し、前のステップからのフロースルーと組み合わせた。次に、プールされた濃縮Ｔ細胞を遠心分離し、Ｔ細胞培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２）で再懸濁させた。製造者プロトコールに従って、Ｔ細胞培地に抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ＭＡＣＳｉＢｅａｄ粒子（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－１１１－１６０）を添加することにより、新たに単離されたＴ細胞を活性化した。
６．２．４．ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞の産生
ＲＮＡエレクトロポレーションで生成され、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでスクリーニングされたＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の予備結果に基づいて、ヒト初代Ｔ細胞における有効性分析のためにレンチウイルスの形質導入により、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を選択し、設計し、生成した。さらに、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、陽性対照として評価した。２４ウェルプレートのウェル当たり０．５ｍＬの培地中、０．５×１０６細胞で、活性化Ｔ細胞を培養した。２４時間後、Ｔ細胞が破裂している場合、０．５ｍＬの非濃縮ウイルス上清または少量の濃縮ウイルス上清を添加し、Ｔ細胞を、１２００ｇで１．５時間、３２℃で遠心分離することにより、感染多重度（ＭＯＩ）１５で形質導入した。次に、形質導入された細胞を、好適な条件下で、導入遺伝子発現のために細胞培養インキュベーターに移した。Ｔ細胞は、対数成長パターンで分割し始め、細胞数（生細胞／ｍＬ）及び生存率（％）を測定することにより、これを監視した。Ｔ細胞培養物を、２日毎に新鮮な培地で補充した。Ｔ細胞は、約７～９日後に休止し始めたので、後で分析するために採取して凍結保存するために、それらを準備した。
凍結保存前に、（Ｔ細胞表面にＶＨＨドメインまたはｓｃＦｖドメインを発現する）形質導入された細胞のパーセンテージをフローサイトメトリー分析で決定した。Ｔ細胞を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ死細胞染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ３４９７６）を用いて、ＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞をヤギ抗ラマＩｇＧ ＦＩＴＣコンジュゲート（Ｂｅｔｈｙｌ、カタログ番号Ａ１６０－１００Ｆ）を用いて、及びｓｃＦｖベースのＣＡＲ－Ｔ細胞をＦＩＴＣ標識組み換えタンパク質Ｌ（Ａｃｒｏ、カタログ番号ＲＰＬ－ＰＦ１４１）を用いて、４℃で３０分間染色し、続いて、３回洗浄し、ＮｏｖｏＣｙｔｅフローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのＦＡＣＳ分析のために、０．５％のＦＢＳを含むＤＰＢＳ ２００μＬに再懸濁した。Ｎｏｖｏｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアで、ＦＡＣＳデータを分析した。
形質導入の９日後、例示的なＶＨＨベースのＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ＋発現レベル（％）は、約１８％～２７％に達した（図１を参照）。ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、約５０～７０倍に増大した。ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞培養の細胞数及び生存率（９２％～９８％）は、表６に示されるように、非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）と比較した場合、Ｔ細胞の増殖及び増大能力に対するＶＨＨ（複数可）の検出可能な負の影響がないことを示した。
（表６）ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の生存率及び増大
Figure 2023546764000007
６．３．実施例３－ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ１９キメラ受容体ポリペプチドを発現する免疫細胞の特性評価
６．３．１．細胞表面でのＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ２２抗原の発現
評価された標的細胞表面上のＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ２２の発現レベルを評価するために、１ウェルあたり５ｘ１０５の細胞を、それぞれ、ＰＥ標識抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、及び抗ＣＤ２２ ｍＡｂとインキュベートし（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、それぞれ、カタログ番号３０２２０８、番号３０２３０６、及び番号３０２５０６）、ＱＵＡＮＴＩ－ＢＲＩＴＥ ＰＥビーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号３４０４９５）を用いるフローサイトメトリーで評価した。アッセイ及びデータ分析を、製造者の使用説明書に従って実施した。「細胞毎の受容体数」は、示された細胞株のそれぞれにおける細胞あたりの分子のおおよその絶対数を示し、表７に示される。
（表７）標的細胞毎のＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ２２受容体数
Figure 2023546764000008
６．３．２．ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性評価
腫瘍細胞に対するＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を評価するために、上記のように産生された細胞を計数し、抗原特異的がん細胞と共培養して、殺傷力を読み取った。アッセイの変動を比較し、及び／または内部対照として機能させるために、全てのアッセイで、対照ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用した。非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）を、非標的指向性Ｔ細胞対照として使用した。ＣＡＲ－Ｔ細胞殺傷アッセイは、ＣＤ１９陽性細胞株－ヒトリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－８６）、Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－２１３）、Ｎａｌｍ．６（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－３２７３）、及びＫ５６２－ＣＤ１９（ＣＤ１９遺伝子の安定的な過剰発現）、及びＣＤ１９陰性細胞株－Ｋ５６２－ＣＤ２０（ＣＤ２０遺伝子の安定的な過剰発現）、Ｋ５６２－ＣＤ２２（ＣＤ２２遺伝子の安定的な過剰発現）、及びＫ５６２（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－２４３）に対して実施した。全ての細胞株を設計して、細胞の生存率／死滅のレポーターとしてホタルルシフェラーゼを発現した。形質導入された細胞をピューロマイシンで選択し、選択培地（１０％のＦＢＳ及び２μｇ／ｍＬのピューロマイシンが補充されたイーグル最小必須培地）で２～３日毎にリフレッシュした。３回の選択後、選択された細胞クローンを採取し、さらなる使用のために保存した。ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を、１５：１、１０：１、５：１、または２：１のエフェクター対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）で２４時間測定した。それぞれの数のＴ細胞を一定数の標的細胞と混合することにより、アッセイを開始した。ＯＮＥ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１１０）により、ウェル当たりの残りのルシフェラーゼ活性を評価して、１ウェル当たりの残りの生存可能な標的細胞を定量化した。
ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞を構築し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイでスクリーニングした。結果は、ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ、Ｄａｕｄｉ．Ｌｕｃ、Ｎａｌｍ．６．Ｌｕｃ、及びＫ５６２－ＣＤ１９．Ｌｕｃ細胞に対して異なるレベルの細胞傷害性を示すことを示した（図２Ａ～２Ｄに示される例示的なデータを参照）。ＵｎＴ対照と比較して、ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞による陰性細胞株に対する有意な細胞傷害性効果は検出されなかった（図２Ｅ～２Ｇ及び図３Ｅ～３Ｉ）。
１つの代表的なＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＶＨＨ－０８３ ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、Ｒａｊｉ．Ｌｕｃに対するＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも効力が低く、その効力は、Ｄａｕｄｉ．Ｌｕｃ、Ｎａｌｍ．６．Ｌｕｃ、及びＫ５６２－ＣＤ１９に対するＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲ－Ｔ細胞と同等である（図３Ａ～３Ｄを参照）。１つの例示的なＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＶＨＨ－１３１ ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、Ｄａｕｄｉ．Ｌｕｃ及びＫ５６２－ＣＤ１９．Ｌｕｃに対して、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも強力であった（図３Ｆ～３Ｇを参照）。全てのＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、オンターゲット細胞に対して用量依存的な死滅を示した（図３Ａ及び３Ｆを参照）。
観察結果は、本明細書で提供されるＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲが、ＣＤ１９発現細胞を特異的に認識することにより、Ｔ細胞の活性化を誘導し、Ｔ細胞の内因性シグナル伝達経路を活性化し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化を誘導し、抗腫瘍反応を増強することを示す。
６．３．３．ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γ放出評価
ＣＤ１９発現細胞に応答したＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞のサイトカイン産生を測定するために、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＣＤ１９陽性細胞株－Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ、Ｄａｕｄｉ．ＬｕｃもしくはＮａｌｍ．６．Ｌｕｃ、またはＣＤ１９陰性細胞株－Ｋ５６２－ＣＤ２０．ＬｕｃもしくはＫ５６２－ＣＤ２２．Ｌｕｃと、Ｅ：Ｔ比１５：１、１０：１、５：１、または２：１で２４時間共培養した後に、サイトカイン定量用のヒトＩＦＮ－γキット（Ｃｉｓｂｉｏ、カタログ＃６２ＨＩＦＮＧＰＥＧ）を使用して、培地を、サイトカイン分析のために採取した。マルチモードマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ）で、各ウェルの吸光度（試験物品毎に３回ずつ）を読み取った。
ＩＦＮ－γ放出データは、例示的なＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＶＨＨ－０８３ ＣＡＲ－Ｔ細胞）が、Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ（Ｅ：Ｔ＝１５：１または１０：１）と共培養される場合、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも多くのＩＦＮ－γを産生し（図４Ｃに示される例示的なデータを参照）、また、Ｄａｕｄｉ．Ｌｕｃ及びＮａｌｍ．６．Ｌｕｃと共培養された場合、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも多くのＩＦＮ－γを産生した（図４Ａ～４Ｂ参照）。対照的に、ＩＦＮ－γ放出は、非形質導入Ｔ細胞または陰性対照細胞Ｋ５６２－ＣＤ２０．Ｌｕｃ及びＫ５６２－ＣＤ２２．Ｌｕｃ（図４Ｃを参照）のいずれかを含有する培養物において、検出されないか、または非常に低かった。これにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＤ１９特異性が、ＣＤ１９発現細胞に対する反応性には必要であることが確認される。
６．４．実施例４－腫瘍異種移植マウスにおけるＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
Ｒａｊｉ異種移植片ＮＣＧマウスモデルにおいて、産生されたＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性をｉｎ ｖｉｖｏ評価し、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲ－Ｔ細胞及び非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）を、対照として評価した。
細胞株：Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ－８６）は、１１歳の男性のバーキットリンパ腫から１９６３年にＰｕｌｖｅｒｔａｆｔにより確立されたリンパ芽球様細胞株である。１０％のウシ胎児血清を含有するＲＭＰＩ培地で、Ｒａｊｉ細胞を成長させた。この細胞株は、組織培養フラスコの懸濁液中で成長する。この細胞株は、静脈内に移植された場合、マウスにおいて持続及び増大する。Ｒａｊｉ細胞は、ルシフェラーゼを発現するように改変されており、従って、マウスをイメージングすることにより、腫瘍細胞の成長も監視することができた。Ｒａｊｉモデルは、高レベルのＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ２２を内因的に発現し、それにより、ＣＤ１９特異的操作されたＴ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を試験するために使用することができる。
マウス：同等の体重（約２０ｇ）の５～６週齢のＮＣＧ（ＮＯＤ－Ｐｒｋｄｃｅｍ２６Ｃｄ５２Ｉｌ２ｒｇｅｍ２６Ｃｄ２２／Ｎｊｕ）雌マウスは、Ｍｏｄｅｌ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから受領した。動物を、実験前の７日間、動物施設で順応させた。動物を、ＡＣＵＣの規制及びガイドラインに従って処理した。
６．４．１．ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性のｉｎ ｖｉｖｏ試験及び結果
腫瘍異種移植片を作成するために、ＮＣＧマウスに、Ｒａｊｉ．Ｌｕｃを静脈内注射した。Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ腫瘍細胞移植の４日後に、マウスをＴ細胞で処置した。マウス１匹当たり、１×１０６Ｔ細胞の用量で、尾静脈を介して、４００μＬのＴ細胞をマウスに静脈内注射した。各グループの４匹のマウスを、ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれか、４００μＬのＨＢＳＳ単独、及び対照として非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）で処理した。全てのＴ細胞を、同じドナーから並行して調製した。体重測定を含む動物の健康状態を、週に２回監視した。動物がエンドポイントに達するまで、腫瘍成長を生物発光イメージング（ＢＬＩ）により毎週監視した。
いずれのＴ細胞も投与されなかったＨＢＳＳ処置群（ビヒクル）は、静脈内注射されたＮＣＧマウスにおいてベースラインＲａｊｉ腫瘍成長動態を示した。ＵｎＴ処置群は、操作されたＴ細胞の陰性対照として非形質導入Ｔ細胞を投与された。ＨＢＳＳ及びＵｎＴ処置群の両方は、この研究を通じて持続的な浸潤性腫瘍進行を示し、１６日目に安楽死させた。ＶＨＨ－０８３ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＵｎＴ処置と比較して腫瘍成長を大幅に抑制し、平均生物発光及び生物発光の画像から示されるように、３５日間のｉｎ ｖｉｖｏ有効性試験中に完全な腫瘍抑制を示した（図５Ａ～５Ｂ）。加えて、週に２回監視されたマウスの健康状態は、正常であり、３５日間のｉｎ ｖｉｖｏ試験を通して、ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞処置群の体重が増加した（図５Ｃを参照）。
６．５．実施例５－Ｉｎ Ｖｉｔｒｏでの抗ＣＤ１９ ＶＨＨ－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃモノクローナル抗体（ｍＡｂ）結合及びオン／オフターゲット活性の特性評価
６．５．１．抗ＣＤ１９ ＶＨＨ－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂのＣＤ１９受容体陽性細胞へのオンターゲット結合及びＥＣ５０
組み換えタンパク質の発現を促進するために、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメント配列（配列番号７７）を含む抗ＣＤ１９ ＶＨＨ配列を、哺乳類の発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．４にクローニングした。哺乳動物宿主細胞（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ）における最適な発現のために、ＤＮＡコドンをさらに最適化した。抗体を、細胞培養上清から採取し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸで１ステップ精製し、０．２μｍのフィルターで滅菌した。精製された抗体濃度をＡ２８０により決定し、約９０％の純度で、２～３ｍｇ／ｍＬに達した。配列番号１０１及び配列番号１０２に示されるＦＭＣ６３ ＶＨ－ＣＨ１及びＦＭＣ６３ ＶＬ－ＣＬのアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９ Ｆａｂ－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂを、細胞表面結合アッセイの陽性対照として使用した。ＣＤ１９陽性細胞株－Ｒａｊｉ及び陰性細胞株（Ｋ５６２）を完全培地に再懸濁し、細胞濃度を、１×１０６細胞／ｍＬに希釈し、１ウェル当たり２×１０５細胞で染色を実施した。ｍＡｂを最大濃度段階希釈し（３分の１に低減）、実験計画及びプロトコールに従って添加した。ｍＡｂ及び細胞を、４℃で１時間共培養した。次に、細胞を、２００μＬのＤＰＢＳ＋０．５％のＦＢＳで洗浄し、４℃で５分間、３００ｇで回転させた。細胞を、検出抗体（ＰＥ結合マウス抗ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４０９３０４、１：１００）で、４℃で４０分間染色した。次に、細胞を再度洗浄し、ＮｏｖｏＣｙｔｅフローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのフローサイトメトリー分析のために、２００μＬのＤＰＢＳ＋０．５％のＦＢＳで再懸濁させた。ＦＡＣＳデータをＮｏｖｏｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアで分析し、ＭＦＩ（蛍光強度の中央値）をＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭバージョン６．０により分析した。
細胞表面結合データは、例示的な抗ＣＤ１９ ＶＨＨ－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂ（ＶＨＨ－０８３－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂ及びＶＨＨ－１３１－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂ）が用量依存的にＣＤ１９陽性細胞（すなわち、Ｒａｊｉ）に特異的に結合したことを示し、ＶＨＨ－０８３－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂは、標的細胞上で抗ＣＤ１９ Ｆａｂ－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂより強い結合を示した（図６Ａを参照）。ＶＨＨ－０８３－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂのＥＣ５０は、０．１４ｎＭであり、陽性対照である抗ＣＤ１９ Ｆａｂ－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂのＥＣ５０は、０．４５ｎＭであった。ＶＨＨ－０８３－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂ及び抗ＣＤ１９ Ｆａｂ－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂは、陰性細胞株－Ｋ５６２に対して有意な結合を示さなかった（図６Ｂを参照）。ＶＨＨ－１３１－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂは、ＶＨＨ－０８３－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂと同等のＲａｊｉへの結合を示した（図６Ｃを参照）。最大有効濃度の半分としても既知の「ＥＣ５０」という用語は、特定の曝露時間後にベースライン及び最大値の中間で応答を誘発する抗体の濃度を指す。
６．５．２．抗ＣＤ１９ ＶＨＨ－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂオフターゲット結合
上記の方法を使用して、オフターゲット結合を検証するために、抗ＣＤ１９ ＶＨＨ－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂを様々なヒト細胞株で評価した。例示的な試験細胞株が表８に列挙される。ｍＡｂを１ウェル当たり１×１０５細胞で、インキュベートした。試験されたＶＨＨ－０８３－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂ及びＶＨＨ－１３１－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂでは、最大のＲａｊｉ細胞への結合を得る濃度で、オフターゲット細胞への非特異的結合は観察されなかった（表８）。
（表８）オフターゲット細胞への抗ＣＤ１９ ＶＨＨ－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂの結合
Figure 2023546764000009
６．５．３．抗ＣＤ１９ ＶＨＨ－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂエピトープビニング
抗ＣＤ１９ ＶＨＨのＣＤ１９抗原への結合を特性評価するために、例示的な抗ＣＤ１９ ＶＨＨ－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂ及び抗ＣＤ１９ Ｆａｂ－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂを対で試験して、それらが、ＣＤ１９抗原の特定の部位への互いの結合をブロックするかどうかを評価した。ＣＤ１９抗原は、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで、０．５μｇ／ｍＬの濃度で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）のコーティングバッファーでプレートにコーティングした。最適な条件下で、競合ｍＡｂをビオチンとコンジュゲートさせ、滴定して、ｍＡｂ競合試験に最適な濃度（最良のシグナル対ノイズ比）を見つけた。ストレプトアビジン－ＨＲＰとして二次抗体を用いた標準プロトコールに従って、ＥＬＩＳＡ法を適用した。データは、例示的なＶＨＨ－０８３－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂが、抗ＣＤ１９ Ｆａｂ－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂの同じエピトープへの結合をブロックし、２つのｍＡｂを一緒に「ビニング」したことを示した（表９の例示的なデータを参照）。
（表９）抗ＣＤ１９ ＶＨＨ－ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ ｍＡｂエピトープビニング
Figure 2023546764000010
６．６．実施例６－ヒト化ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲの生成及び特性評価
６．６．１．抗ＣＤ１９ ＶＨＨ抗体のヒト化
ヒトにおける免疫原性を低減させるために、ラクダ科動物ＶＨＨ抗体をヒト化した。これは、免疫応答の多くが非ヒト抗体定常領域に対して生じるからである。異なるフレームワーク領域をラクダ科動物のＣＤＲと組み合わせると、同じ抗原に特異的なヒト及びラクダ科動物のキメラ抗体が、異なるエフェクター機能を誘発し得、これにより、治療上の利点が拡大する。配列ベースのアプローチと、最も相同なヒト生殖系列配列または関連足場へのフレームワークシャッフリングを使用して、単一特異的ラクダ科動物ＶＨＨをヒト化した。非ネイティブなヒトフレームワーク足場によりサポートされているラクダ科動物のＣＤＲの非互換性及び重要な立体配座残基の除去は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのＣＤＲ移植、相同構造モデリング（３次立体配座及び折りたたみ）、配列アラインメント、構造ベースの復帰変異設計及びラクダ科動物ＶＨＨ抗体由来の重要な配座残基の再導入により解決された。抗体のヒト化プロセスは、立体的な衝突を排除するだけでなく、抗原への結合親和性に関する機能を回復させることがある。
Ｃｅｃｉｌｅ Ｖｉｎｃｋｅ ｅｔ ａｌ．により設計されたユニバーサルヒト化ＶＨＨフレームワークｈ－ＮｂＢｃＩＩ１０ＦＧＬＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ、ＰＤＢコード：３ＥＡＫ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／３ＥＡＫ）は、配列相同性に基づくヒト化設計に採用された。モデリングソフトウェアＭＯＤＥＬＬＥＲを使用して、ラクダ科動物ＶＨＨの相同モデリングを実施した。ヒト生殖系列遺伝子とのアラインメントに従って、ＩＧＨＶ３－６４＊０４が、抗ＣＤ１９ ＶＨＨの１つのヒトアクセプターとして選択された。アミノ酸の相対的な溶媒接近可能性を、タンパク質の３次元構造に従って算出した。ＶＨＨのアミノ酸の１つは、溶媒に曝露された場合、元のアミノ酸に置き換えられるであろう。本明細書で作製された例示的なヒト化ＶＨＨドメイン（すなわち、ｈｕＶＨＨ－７７３、ｈｕＶＨＨ－７７６、Ａ５９２Ｈ１、Ａ５９２Ｈ２、Ａ５９２Ｈ３、及びＡ５９２Ｈ４）は表２に示され、対応する配列は、本明細書に提供される配列表で提供される。
６．６．２．ヒト化ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞の特性評価
上記の方法を使用して、例示的なヒト化ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ（ｈｕＶＨＨ－７７３ ＣＡＲ及びｈｕＶＨＨ－７７６ ＣＡＲを含む）を生成した。ｈｕＶＨＨ－７７３ ＣＡＲのアミノ酸配列は、配列番号６２である。ｈｕＶＨＨ－７７６ ＣＡＲのアミノ酸配列は、配列番号６３である。ｈｕＶＨＨ－７７３ ＣＡＲの核酸配列は、配列番号７０である。ｈｕＶＨＨ－７７６ ＣＡＲの核酸配列は、配列番号７１である。
次いで、ヒト初代Ｔ細胞へのレンチウイルス形質導入により、ヒト化ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成し、標準的な方法に従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性研究で評価した。形質導入されたＴ細胞は、ヒト化ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲで異なるＣＡＲ発現レベル（％）を示した。例示的なヒト化ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞の生存率は、約８６％～９２％であり、ＣＡＲ陽性（ＣＡＲ＋）は、約１４％～１７％であり、７日間の培養で増大倍数は１７～２０以内であった。これは、非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）と比較した場合に、Ｔ細胞の増殖及び増大する能力に対するヒト化ＶＨＨの検出可能な負の効果がないことを示す。
上記のように生成されたヒト化ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞を計数し、抗原特異的がん細胞株と共培養して、殺傷力を評価し、親ラクダ科動物ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲ－Ｔ細胞を対照として使用し、非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）を、非標的指向性Ｔ細胞対照として使用した。ＣＤ１９陽性細胞株－Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－８６）、Ｎａｌｍ．６（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－３２７３）及びＫ５６２－ＣＤ１９、ならびに陰性細胞株－Ｋ５６２（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－２４３）に対して、ヒト化ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞殺傷アッセイを行った。全ての細胞株を社内で設計して、細胞の生存率／死滅のレポーターとしてホタルルシフェラーゼを発現した。形質導入された細胞をピューロマイシンで選択し、選択培地（１０％のＦＢＳ及び２μｇ／ｍＬのピューロマイシンが補充されたイーグル最小必須培地）で２～３日毎にリフレッシュした。３回の選択後、選択された細胞クローンを採取し、さらなる使用のために保存した。ヒト化ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、または２．５：１のエフェクター細胞対標的細胞の比（Ｅ：Ｔ）で２４時間測定した。それぞれの数のＴ細胞を一定数の標的細胞と混合することにより、アッセイを開始した。ＯＮＥ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１１０）により、ウェル当たりの残りのルシフェラーゼ活性を評価して、１ウェル当たりの残りの生存可能な標的細胞を定量化した。
ヒト化ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ｈｕＶＨＨ－７７３ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びｈｕＶＨＨ－７７６ ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む）のデータは、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、抗原特異的標的細胞の溶解を誘導し、標的細胞に対して、より高い効力または効力の維持を表したことを示した（図７Ａ～７Ｃに示される例示的なデータを参照）。ＵｎＴ対照と比較して、ヒト化ＣＤ１９ ＶＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞による、陰性細胞株－Ｋ５６２．Ｌｕｃに対する著しい細胞傷害性効果は検出されなかった（図７Ｄ）。
本明細書に引用された全ての特許、公開された出願、及び参考文献の教示は、全体が参照により組み込まれる。
例示的な実施形態が特に示され、説明されているが、添付の特許請求の範囲に包含される実施形態の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細に様々な変更が行われ得ることは、当業者らには理解されるであろう。
上記から、例示の目的で特定の実施形態が本明細書に記載されているが、本明細書で提供されるものの趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な修正を行うことができることが理解されるであろう。上で言及された全ての参考文献は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (41)

  1. 抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）であって、
    （ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
    （ｉｉ）配列番号２２もしくは１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
    （ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
    （ｉｖ）配列番号２３もしくは１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
    （ｖ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
    （ｖｉ）配列番号２４もしくは１１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
    （ｖｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
    （ｖｉｉｉ）配列番号２５もしくは１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
    （ｉｘ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
    （ｘ）配列番号２６もしくは１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
    （ｘｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
    （ｘｉｉ）配列番号２７もしくは１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
    （ｘｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
    （ｘｉｖ）配列番号２８もしくは１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または
    （ｘｖ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または
    （ｘｖｉ）配列番号２２もしくは１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
    を含む、前記抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂ。
  2. 抗ＣＤ１９単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）であって、
    （ｉ）配列番号４３に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、
    （ｉｉ）配列番号４４に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、
    （ｉｉｉ）配列番号４５に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、
    （ｉｖ）配列番号４６に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、
    （ｖ）配列番号４７に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、
    （ｖｉ）配列番号４８に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、
    （ｖｉｉ）配列番号４９に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、
    （ｖｉｉｉ）配列番号５１に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、
    （ｉｘ）配列番号５２に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、
    （ｘ）配列番号５３に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、
    （ｘｉ）配列番号５４に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、
    （ｘｉｉ）配列番号５５に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、
    （ｘｉｉｉ）配列番号５６に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、または、
    （ｘｉｖ）配列番号１０４に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３
    を含む、前記抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂ。
  3. 前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３が、Ｋａｂａｔナンバリングスキーム、ＩＭＧＴナンバリングスキーム、ＡｂＭナンバリングスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングスキーム、またはそれらの組み合わせに従って決定される、請求項２に記載の抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂ。
  4. 配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び／または配列番号１０４に記載の１つ以上のＦＲ領域をさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂ。
  5. 配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、または配列番号１０４のアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂ。
  6. 配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、または配列番号１０４の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂ。
  7. ラクダ科動物のｓｄＡｂである、請求項１または請求項２に記載の抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂ。
  8. ヒト化ｓｄＡｂである、請求項１または請求項２に記載の抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂ。
  9. 薬剤に遺伝子的に融合されているかまたは化学的にコンジュゲートされている、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂ。
  10. （ａ）請求項１～９のいずれか１項に記載の抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメイン；
    （ｂ）膜貫通ドメイン；及び
    （ｃ）細胞内シグナル伝達ドメイン
    を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
  11. 前記細胞外抗原結合ドメインが、１つ以上の追加の抗原結合ドメイン（複数可）をさらに含む、請求項１０に記載のＣＡＲ。
  12. 前記細胞外抗原結合ドメインが、１つの追加の抗原結合ドメインをさらに含む、請求項１１に記載のＣＡＲ。
  13. 前記細胞外抗原結合ドメインが、２つの追加の抗原結合ドメインをさらに含む、請求項１１に記載のＣＡＲ。
  14. 前記１つ以上の追加の抗原結合ドメイン（複数可）が、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１２３、ＩＬ－１３Ｒ、ＣＤ１３８、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ Ａ３、及び糖脂質Ｆ７７からなる群より選択される１つ以上の抗原（複数可）に結合する、請求項１１～１３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  15. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する、請求項１０～１４のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  16. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８αに由来する、請求項１５に記載のＣＡＲ。
  17. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１０～１６のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  18. 前記一次細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζに由来する、請求項１７に記載のＣＡＲ。
  19. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項１７または請求項１８に記載のＣＡＲ。
  20. 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、及びその組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する、請求項１９に記載のＣＡＲ。
  21. 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１３７に由来する、請求項２０に記載のＣＡＲ。
  22. 前記細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と前記膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメインをさらに含む、請求項１０～２１のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  23. 前記ヒンジドメインが、ＣＤ８αに由来する、請求項２２に記載のＣＡＲ。
  24. ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチドをさらに含む、請求項１０～２３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  25. 前記シグナルペプチドが、ＣＤ８αに由来する、請求項２４に記載のＣＡＲ。
  26. 配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、及び配列番号１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
  27. 請求項１～９のいずれか１項に記載の抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂをコードする核酸配列を含む、単離核酸。
  28. 請求項２７に記載の単離核酸を含む、ベクター。
  29. 請求項１０～２６のいずれか１項に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を含む、単離核酸。
  30. 請求項２９に記載の単離核酸を含む、ベクター。
  31. 請求項１０～２６のいずれか１項に記載のＣＡＲ、請求項２９に記載の単離核酸、または請求項３０に記載のベクターを含む、操作された免疫エフェクター細胞。
  32. Ｔ細胞またはＢ細胞である、請求項３１に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
  33. 請求項１～９のいずれか１項に記載の抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂ、請求項３１もしくは請求項３２に記載の操作された免疫エフェクター細胞、または請求項２８もしくは請求項３０に記載のベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
  34. 対象の疾患または障害を処置する方法であって、有効量の、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂ、請求項３１もしくは請求項３２に記載の操作された免疫エフェクター細胞、または請求項３３に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
  35. 前記疾患または障害が、Ｂ細胞関連疾患もしくは障害及び／またはＣＤ１９関連疾患もしくは障害である、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記疾患または障害が、がんである、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記疾患または障害が、Ｂ細胞悪性腫瘍である、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記Ｂ細胞悪性腫瘍が、Ｂ細胞白血病またはＢ細胞リンパ腫である、請求項３７記載の方法。
  39. 前記疾患または障害が、辺縁帯リンパ腫（例えば、脾辺縁帯リンパ腫）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病（Ｂ－ＰＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、バーキットリンパ腫、原発性眼内リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、前駆Ｂリンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫（ＨＧＢＬ）、及び多発性骨髄腫（ＭＭ）からなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
  40. 前記疾患または障害が、自己免疫及び／または炎症性疾患である、請求項３４に記載の方法。
  41. 前記自己免疫及び／または炎症性疾患が、不適切なまたは増加したＢ細胞数及び／または活性化と関連する、請求項４０に記載の方法。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3293199B1 (en) * 2016-09-08 2021-01-13 Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Chimeric antigen receptors
CN108276493B (zh) * 2016-12-30 2023-11-14 南京传奇生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
CN112351997B (zh) * 2018-07-20 2023-05-26 坦尼奥第二公司 与cd19结合的重链抗体
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