KR20230038707A - Cd20 결합 분자 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20230038707A
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수 팡
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민 웨이
지안루이 주
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Abstract

본 개시내용은 CD20에 결합하는 단일 도메인 항체 및 이를 포함하는 키메라 항원 수용체를 제공한다. 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)가 추가로 제공된다. 질환 또는 장애를 치료하는 약제학적 조성물, 키트 및 방법이 또한 제공된다.

Description

CD20 결합 분자 및 이의 용도
상호참조
본 출원은 2020년 7월 16일자로 출원된 국제특허출원 PCT/CN2020/102463의 우선권의 유익을 주장하며, 이의 내용은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
서열목록
본 출원은 2021년 7월 9일자로 생성된 파일명 14651-026-228_SEQ_LISTING.txt로서 본 출원과 함께 제출된 참조 서열목록을 원용하며, 이는 용량이 236,191 바이트이다.
기술분야
본 개시내용은 항-CD20 단일 도메인 항체, 키메라 항원 수용체, 조작된 면역 효과기 세포 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 추가로 치료 용도를 위한 세포의 활성화 및 확장, 특히 키메라 항원 수용체-기반 T 세포 면역요법에 관한 것이다.
CD20은 B-세포 분화의 특정 단계에서 발현되는 표면 항원이다. 치료적 단클론성 항체(mAb)로 CD20-양성 B 세포를 표적화하는 것은 혈액 악성종양, 예컨대, 비호지킨 림프종(NHL) 및 만성 림프구성 백혈병(CLL)의 치료에서 효과적인 전략이었다. 리툭시맙(RTX)에 의한 초기 성장은 더 효과적인 CD20 기반 치료의 생성 및 개발을 조장하였다. 그러나, 통상적인 mAb에 의한 치료는 난치성/재발성 질환과 같은 문제를 극복하는 데 적합하지 않았다(Shanehbandi et al., Current Cancer Drug Targets, 17(5): 423-444 (2007)).
키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포 요법은 최근에 만들어졌고, 효과적인 암 면역요법이다. 특히 혈액 악성종양에서, CAR-T 세포는 흥미로운 결과를 달성하였다. CD20 CAR-T 세포의 초기 임상 연구가 수행되었고, 이는 CD20 CAR-T 세포가 B-세포 NHL에서 치료 잠재력을 조장한다는 것을 나타낸다(Brudno and Kochenderfer, Nature Reviews Clinical Oncology, 15: 31-46 (2018)). 그러나, CAR-T 세포의 적용은 유해효과, 예컨대, 사이토카인 방출 증후군 및 종양 표적 외 독성(on-target off-tumor toxicity)에 의해 분명하게 방해된다(Yu et al., Molecular Cancer, 18 (1): 125 (2019)).
따라서, 개선된 CD20-결합 분자 및 조작된 CD20-표적화 세포가 요구된다. 예를 들어, 더 효과적 또는 효율적인 CAR-T 요법에서 사용하기 위한 안정적이고 소형 CD20 결합 분자를 개발할 필요가 있다.
일 양상에서, (i) 서열번호 1 또는 195 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (ii) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (iii) 서열번호 1 또는 195의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (iv) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (v) 서열번호 11 또는 196의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (vi) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (vii) 서열번호 14 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (viii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (ix) 서열번호 20 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (x) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (xi) 서열번호 24 또는 198의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (xii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (xiii) 서열번호 14 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (xiv) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (xv) 서열번호 1 또는 195의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (xvi) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (xvii) 서열번호 20 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (xviii) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (xix) 서열번호 20 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (xx) 서열번호 20 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (xxi) 서열번호 20 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (xxii) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (xxiii) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (xxiv)서열번호 165 또는 199의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 166의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 167의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (xxv) 서열번호 168의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 169의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 170의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (xxvi)서열번호 171 또는 200의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (xxvii) 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (xxviii) 서열번호 177 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 (xxix) 서열번호 180의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 181의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 182의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다.
다른 양상에서, (i) 서열번호 41에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (ii) 서열번호 42에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (iii) 서열번호 43에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (iv) 서열번호 44에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (v) 서열번호 45에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (vi) 서열번호 46에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (vii) 서열번호 47에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (viii) 서열번호 48에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (ix) 서열번호 49에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (x) 서열번호 50에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (xi) 서열번호 51에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (xii) 서열번호 52에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (xiii) 서열번호 53에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (xiv) 서열번호 54에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (xv) 서열번호 55에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (xvi) 서열번호 56에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (xvii) 서열번호 57에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (xviii) 서열번호 58에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (xix) 서열번호 59에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (xx) 서열번호 60에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (xxi) 서열번호 61에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (xxii) 서열번호 62에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는 (xxiii) 서열번호 63에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (xxiv) 서열번호 183에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (xxv) 서열번호 184에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는 (xxvi) 서열번호 185에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, CDR1, CDR2 또는 CDR3은 Kabat 넘버링 체계, IMGT 넘버링 체계, AbM 넘버링 체계, Chothia 넘버링 체계, Contact 넘버링 체계 또는 이들의 조합에 따라 결정된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항-CD20 sdAb는 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호　50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 183, 서열번호 184 및/또는 서열번호 185에 제시된 바와 같은 하나 이상의 FR 영역을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항-CD20 sdAb는 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 183, 서열번호 184 또는 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항-CD20 sdAb는 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 183, 서열번호 184 또는 서열번호 185의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 항-CD20 sdAb는 낙타과 sdAb이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 sdAb는 인간화된 sdAb이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 sdAb는 VHH 도메인이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 sdAb는 인간화된 VHH 도메인이다.
일부 실시형태에서, 항-CD20 sdAb는 제제에 유전적으로 융합되거나 또는 화학적으로 접합된다.
다른 양상에서, (a) 본 명세서에 제공된 항-CD20 sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 하나 이상의 추가적인 항원 결합 도메인(들)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 하나의 추가적인 항원 결합 도메인을 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 2개의 추가적인 항원 결합 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가적인 항원 결합 도메인(들)은 CD20, CD19, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 및 당지질 F77로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원(들)에 결합한다. 일부 실시형태에서, CD20 CAR은 단일특이성이다. 일부 실시형태에서, CD20 CAR은 1가이다. 일부 실시형태에서, CD20 CAR은 다가이다. 일부 실시형태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 본 명세서에 제공된 적어도 2개의 항-CD20 sdAb를 포함한다.
일부 실시형태에서, (a) CD20에 특이적으로 결합하는 둘 이상의 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 다가(예컨대, 2가 및 3가) CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 본 명세서에 제공된 CD20에 특이적으로 결합하는 2개의 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 본 명세서에 제공된 CD20에 특이적으로 결합하는 3개의 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다.
상기 기재한 CAR 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α로부터 유래된다.
상기 기재한 CAR 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 효과기 세포의 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다.
상기 기재한 CAR 중 어느 하나에 따른 다른 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공자극 신호전달 도메인을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 공자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 공자극 신호전달 도메인은 CD137로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치된 힌지 도메인을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 CAR은 폴리펩타이드의 N-말단에 위치된 신호 펩타이드를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 신호 펩타이드는 CD8α로부터 유래된다.
특정 실시형태에서, (i) 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 189, 서열번호 190 및 서열번호 191로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열; 또는 (ii) 서열번호: 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 189, 서열번호 190 또는 서열번호 191의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)가 본 명세서에 제공된다.
다른 양상에서, 본 명세서에 제공된 항-CD20 sdAb를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산이 본 명세서에 제공된다. 다른 양상에서, 본 명세서에 제공된 항-CD20 sdAb를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터가 본 명세서에 제공된다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에 제공된 CAR을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산이 본 명세서에 제공된다. 다른 양상에서, 본 명세서에 제공된 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터가 본 명세서에 제공된다.
또 다른 양상에서, CAR, 단리된 핵산 또는 본 명세서에 제공된 벡터를 포함하는, 조작된 면역 효과기 세포가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 효과기 세포는 T 세포 또는 B 세포이다.
다른 양상에서, 항-CD20 sdAb, 조작된 면역 효과기 세포 또는 본 명세서에 제공된 벡터 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다.
또 다른 양상에서, 유효량의 항-CD20 sdAb, 조작된 면역 효과기 세포, 또는 본 명세서에 제공된 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 B 세포 연관 질환 또는 장애 및/또는 CD20 연관 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 암이다. 다른 실시형태에서, 질환 또는 장애는 B 세포 악성종양이다. 일부 실시형태에서, B 세포 악성종양은 B 세포 백혈병 또는 B 세포 림프종이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 가장자리구역 림프종(예를 들어, 비장 가장자리구역 림프종), 광범위 큰 B 세포 림프종(DLBCL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 원발성 중추 신경계(CNS) 림프종, 원발성 종격동 B 세포 림프종(PMBL), 소형 림프구성 림프종(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병(B-PLL), 소포 림프종(FL), 버킷 림프종, 원발성 안구내 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 모발세포 백혈병(HCL), 전구 B 세포 림프모구 백혈병, 비호지킨 림프종(NHL), 고등급 B-세포 림프종(HGBL) 및 다발성 골수종(MM)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 질환 또는 장애는 자가면역 및/또는 염증성 질환이다. 일부 실시형태에서, 자가면역 및/또는 염증성 질환은 부적절한 또는 향상된 B 세포수 및/또는 활성화와 연관된다.
도 1A 내지 도 1B는 VHH-기반 CAR-T 세포(도 1A) 및 scFv-기반 CAR-T 세포(도 1B)의 예시적인 형질도입 효율을 도시한 도면. UnT는 CAR에 의해 형질도입되지 않은 T 세포를 지칭한다.
도 2A 내지 도 2F는 CD20 양성 세포주(도 2A 내지 도 2B 및 도 2E 내지 도 2F) 또는 CD20 음성 세포주(도 2C 내지 도 2D)에 대한 scFv-기반 CAR-T 세포와 비교되는 VHH-기반 CAR-T 세포의 시험관내 세포독성을 도시한 도면.
도 3A 내지 도 3D는 CD20 양성 세포주(도 3A 내지 도 3B) 또는 CD20 음성 세포주(도 3C 내지 도 3D)에 대한 CD20 scFv CAR-T 세포와 비교되는 모노-, 바이(bi)- 및 트라이(tri)-VHH CAR-T 세포의 시험관내 세포독성을 도시한 도면.
도 4A 내지 도 4B는 Raji.Luc 세포에 대해 상이한 길이의 펩타이드 링커를 갖는 Bi-VHH CAR-T 세포의 시험관내 세포독성을 도시한 도면.
도 5A 내지 도 5B는 24시간 동안 상이한 E:T 비에서 Raji.Luc 또는 K562-CD20.Luc 세포와 함께 공동배양한 후에 scFv-기반 CAR-T 세포와 비교되는 VHH-기반 CAR-T 세포의 IFN-γ 방출 수준을 도시한 도면.
도 6은 24시간 동안 Raji.Luc 또는 K562.Luc 세포와 공동배양 후 CD20 scFv CAR-T 세포와 비교되는 모노-, 바이- 및 트라이-VHH CAR-T 세포의 IFN-γ 방출 수준을 도시한 도면.
도 7A 내지 도 7D는 항원 특이적 자극이 있는 CD20 scFv CAR-T 세포 또는 자극이 없는 이러한 세포와 비교되는 예시적인 CD20 VHH CAR-T 세포의 증식 능력 및 CAR 양성 비를 도시한 도면.
도 8은 예시적인 CD20 VHH CAR-T 세포 및 CD20 scFv CAR-T 세포의 소모(exhaustion) 마커 평가의 결과를 도시한 도면.
도 9A 내지 도 9D는 예시적인 CD20 VHH CAR-T 세포 및 CD20 scFv CAR-T 세포의 기억 마커 평가의 결과를 도시한 도면.
도 10A 내지 도 10F는 Raji 이종이식 NCG 마우스 모델에서 VHH-273 CAR-T 세포 및 VHH-496 CAR-T 세포의 생체내 항-종양 및 재시험감염 효능을 도시한 도면. 생물발광 영상화에 의한 종양 성장(도 10A 내지 도 10B), 및 체중(도 10C)뿐만 아니라 마우스 말초 혈액 중 CAR 복제물(도 10D)을 모니터링하기 위해 마우스를 정기적으로 평가하였다. 이어서, 재시험감염 검정을 위해 PBMC 중 검출 불가능한 CAR 복제수(복제물/게놈 DNA(ng))를 갖는 적어도 5주 무종양인 마우스를 선택하였다. Raji 종양을 생물발광 영상화에 의해 매주 모니터링하였고(도 10E) 마우스 체중을 측정하였다(도 10F).
도 11A 내지 도 11F는 Raji 이종이식 NCG 마우스 모델에서 모노-, 바이- 및 트라이-VHH CAR-T 세포의 생체내 항-종양 및 재시험감염 효능을 나타낸 도면. 생물발광 영상화에 의한 종양 성장(도 11A 내지 도 11B) 및 체중(도 11C)뿐만 아니라 마우스 말초 혈액 중 CAR 복제물(도 11D 내지 도 11E; 도 11D는 도 11E로부터 채택되고, Y-축의 규모는 복제수/게놈 DNA(ng)의 분해능을 향상시키도록 조정됨)을 모니터링하기 위해 마우스를 정기적으로 평가하였다. 이어서, 재시험감염 검정을 위해 적어도 6주 무종양 마우스를 선택하였다. Raji 종양을 생물발광 영상화에 의해 매주 모니터링하였다(도 11F).
도 12A 내지 도 12E는 항-CD20 VHH-huIgG1Fc mAb의 결합 친화도를 평가하는 연구로부터의 결과를 도시한 도면.　MFI=평균 형광 강도.
도 13A 내지 도 13K는 15:1, 10:1, 5:1 또는 2.5:1의 상이한 효과기 세포 대 표적 세포 비(E:T)에서 Raji.Luc 세포, K652-CD20.Luc 세포, K562.Luc 세포 및 Nalm.6.Luc에 대한 예시적인 인간화된 CD20 VHH CAR-T 세포의 세포독성을 도시한 도면. 도 13A 내지 도 13C는 huVHH-746 CAR-T 세포, huVHH-750 CAR-T 세포 및 huVHH-753 CAR-T 세포의 세포독성을 나타내고; 도 13D 내지 도 13G는 huVHH-253 CAR-T 세포 및 huVHH-256 CAR-T 세포의 세포독성을 나타내며; 도 13H 내지 도 13K는 huVHH-260 CAR-T 세포의 세포독성을 나타낸 도면.
본 개시내용은 CD20에 결합하는 신규한 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH 도메인), 키메라 항원 수용체 또는 이를 포함하는 조작된 세포, 및 이들의 개선된 특성에 부분적으로 기반한다.
5.1. 정의
본 명세서에 기재되거나 언급된 기법 및 절차는 당업자에 의한 통상적인 방법, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3d ed. 2001); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 2003); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An ed. 2009); Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Albitar ed. 2010); 및 Antibody Engineering Vols 1 and 2 (Kontermann and
Figure pct00001
eds., 2d ed. 2010)]에 기재된 널리 이용되는 방법을 이용하여 일반적으로 잘 이해되고/되거나 통상적으로 사용되는 것을 포함한다. 본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 설명에서 사용되는 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본 명세서를 해석하는 목적을 위해, 용어의 다음의 설명을 적용할 것이며, 적절한 경우 언제든지, 단수로 사용되는 용어는 또한 복수를 포함할 것이고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 용어의 임의의 설명이 본 명세서에 참조로 원용되는 임의의 문헌과 상충되는 경우에, 아래에 제시하는 용어의 설명으로 조절할 것이다.
용어 "항체", "면역글로불린" 또는 "Ig"는 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되고, 가장 넓은 범위로 사용되며, 구체적으로는, 예를 들어, 단클론성 항체(작용제, 길항제, 중화 항체, 전장 또는 무손상 단클론성 항체를 포함), 폴리에피토프 또는 모노에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다클론성 또는 1가 항체, 다가 항체, 다중특이성 항체(예를 들어, 목적하는 생물학적 활성을 나타낸다면 이중특이성 항체)를 아우르며, 아래에 기재하는 바와 같이, 적어도 2개의 무손상 항체, 단일쇄 항체 및 이들의 단편(예를 들어, 도메인 항체)으로부터 형성된다. 항체는 인간, 인간화, 키메라 및/또는 친화도 성숙뿐만 아니라 다른 종, 예를 들어, 마우스, 토끼, 라마 등으로부터의 항체일 수 있다. 용어 "항체"는 특정 분자 항원에 결합할 수 있고 폴리펩타이드 쇄의 2개의 동일한 쌍으로 구성된 폴리펩타이드의 면역글로불린 부류 내의 B 세포의 폴리펩타이드 생성물을 포함하는 것으로 의도되되, 각각의 쌍은 1개의 중쇄(약 50 내지 70kDa) 및 1개의 경쇄(약 25kDa)를 갖고, 각 쇄의 각 아미노-말단 부분은 약 100 내지 약 130개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하고, 각 쇄의 각 카복시-말단 부분은 불변 영역을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Antibody Engineering (Borrebaeck ed., 2d ed. 1995); 및 Kuby, Immunology (3d ed. 1997)]을 참조한다. 항체는 또한 합성 항체, 재조합적으로 생성된 항체, 낙타과 종(예를 들어, 라마 또는 알파카)을 포함하는 단일 도메인 항체 또는 이들의 인간화된 변이체, 인트라바디, 항-유전자형(항-Id) 항체 및 상기 중 어느 것의 기능성 단편(예를 들어, 항원-결합 단편)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 이런 기능성 단편은 단편이 유래된 항체의 결합 활성 중 일부 또는 모두를 보유하는 항체 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드의 일부를 지칭한다. 기능성 단편(예를 들어, 항원-결합 단편)의 비제한적 예는 단일쇄 Fv(scFv)(예를 들어, 단일특이성, 이중특이성 등을 포함), Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab)2 단편, F(ab')2 단편, 이황화연결된 Fv(dsFv), Fd 단편, Fv 단편, 다이어바디, 트라이어바디, 테트라바디 및 미니바디를 포함한다. 특히, 본 명세서에 제공된 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 예를 들어, 항원에 결합하는 항원 결합 부위(예를 들어, 항체의 하나 이상의 CDR)를 포함하는 항원-결합 도메인 또는 분자를 포함한다. 이러한 항체 단편은, 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1989); Mol. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers ed., 1995); Huston et al., 1993, Cell Biophysics 22:189-224;
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and Skerra, 1989, Meth. Enzymol. 178:497-515; 및 Day, Advanced Immunochemistry (2d ed. 1990)]에서 찾을 수 있다. 본 명세서에 제공된 항체는 임의의 부류(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA) 또는 임의의 하위부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)의 면역글로불린 분자를 가질 수 있다. 항체는 작용성 항체 또는 길항성 항체일 수 있다. 항체는 작용성도 또는 길항성도 아닐 수 있다.
"항원"은 항체가 선택적으로 결합하는 구조이다. 표적 항원은 폴리펩타이드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐 또는 기타 천연 유래 또는 합성 화합물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, 항원은 세포와 연관되며, 예를 들어, 세포 상에 또는 세포에 존재한다.
"무손상" 항체는 항원-결합 부위뿐만 아니라 CL 및 적어도 중쇄 불변 영역, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 영역은 인간 불변 영역 또는 이의 아미노산 서열 변이체를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 무손상 항체는 하나 이상의 효과기 기능을 갖는다.
"sFv" 또는 "scFv"로도 약칭되는 "단일쇄 Fv"는 단일 폴리펩타이드 쇄에 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩타이드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함하는데 이는 sFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성하는 것을 가능하게 한다. sFv의 검토를 위해, 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "중쇄-단독 항체" 또는 "HCAb"는 중쇄를 포함하지만, 4-쇄 항체에서 보통 발견되는 경쇄를 결여하는 기능성 항체를 지칭한다. 낙타과 동물(예컨대, 낙타, 라마 또는 알파카)은 HCAb를 생성하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "단일 도메인 항체" 또는 "sdAb"는 항원 결합할 수 있는 단일 단량체 가변 항체 도메인을 지칭한다(예를 들어, CD20에 결합하는 단일 도메인 항체). 단일 도메인 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 VHH 도메인을 포함한다. 단일 도메인 항체의 예는 자연적으로 경쇄가 결핍된 항체, 예컨대, 낙타과 종(예를 들어, 라마)으로부터의 항체, 통상적인 4-쇄 항체로부터 유래된 단일 도메인 항체, 조작된 항체 및 항체로부터 유래된 것 이외의 단일 도메인 스캐폴드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 단일 도메인 항체는 마우스, 인간, 낙타, 라마, 염소, 토끼 및 소를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 단일 도메인 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 낙타과 종, 예를 들어, 낙타, 라마, 단봉 낙타, 알파카 및 과나코에서 상승된 항체로부터 유래될 수 있다. 낙타과 이외의 다른 종은 자연적으로 경쇄가 결핍된 중쇄 항체를 생성할 수 있고; 이러한 다른 종으로부터 유래된 VHH는 본 개시내용의 범주 이내이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH)는 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 구조를 갖는다. 단일 도메인 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 다른 분자(예를 들어, 제제)에 유전적으로 융합되거나 화학적으로 접합될 수 있다. 단일 도메인 항체는 더 큰 결합 분자(예를 들어, 다중특이성 항체 또는 키메라 항원 수용체)의 부분일 수 있다.
용어 "결합하다" 또는 "결합하는"은, 예를 들어, 복합체 형성을 포함하는, 분자 사이의 상호작용을 지칭한다. 상호작용은, 예를 들어, 수소 결합, 이온 결합, 소수성 상호작용 및/또는 반데르 발스 상호작용을 비롯한, 비공유 상호작용일 수 있다. 복합체는 또한 공유 또는 비공유 결합, 상호작용 또는 힘에 의해 함께 보유되는 2개 이상의 분자의 결합을 포함할 수 있다. 항체 상의 단일 항원-결합 부위와 표적 분자, 예컨대, 항원의 단일 에피토프 사이의 총 비공유 상호작용 강도는 해당 에피토프에 대한 항체 또는 단편의 친화도이다. 1가 항원에 대한 결합 분자(예를 들어, 항체)의 해리 속도(koff) 대 결합 속도(kon)의 비(koff/kon)는 친화도와 반비례 관계가 있는 해리 상수 KD이다. KD 값이 낮을수록, 항체 친화도는 높다. KD의 값은 항체와 항원의 상이한 복합체에 대해 다르며, kon과 koff 둘 다에 따른다. 본 명세서에 제공된 항체에 대한 해리 상수 KD는 본 명세서에 제공된 임의의 방법 또는 당업자에게 잘 공지된 임의의 다른 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 하나의 결합 부위에서 친화도는 항체와 항원 사이의 상호작용의 진정한 강도를 항상 반영하지는 않는다. 다중, 반복 항원 결정인자, 예컨대, 다가 항원을 포함하는 복잡한 항원이 다중 결합 부위를 포함하는 항체와 접촉할 때, 하나의 부위에서 항체와 항원의 상호작용은 제2 부위에서의 반응 가능성을 증가시킬 것이다. 다가 항체와 항원 사이의 이러한 다중 상호작용 강도는 결합활성으로 불린다.
본 명세서에 기재된 결합 분자와 관련하여, "~에 결합하다", "~에 특이적으로 결합하다" 및 유사한 용어와 같은 용어는 또한 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되며, 폴리펩타이드와 같은 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인의 결합 분자를 지칭한다. 항원에 결합하거나 특이적으로 결합하는 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 면역분석, Octet®, Biacore® 또는 당업자에게 공지된 다른 기법에 의해 확인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은, 방사면역측정법(RIA) 및 효소결합면역흡착측정법(ELISA)과 같은 실험 기법을 이용하여 결정되는 바와 같은 임의의 교차-반응 항원보다 높은 친화도로 항원에 결합할 때, 항원에 결합 또는 특이적으로 결합한다. 전형적으로, 특정 또는 선택적 반응은 적어도 2회의 배경 신호 또는 노이즈이고, 10회 초과의 배경일 수 있다. 예를 들어, 결합 특이성에 관한 논의를 위해 문헌[Fundamental Immunology 332-36 (Paul ed., 2d ed. 1989)]을 참조한다. 특정 실시형태에서, "비-표적" 단백질에 대한 결합 분자 또는 항원 결합 도메인의 결합 정도는, 예를 들어, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석 또는 RIA에 의해 결정되는 바와 같이, 특정 표적 항원에 대한 결합 분자 또는 항원 결합 도메인 결합의 약 10% 미만이다. 항원에 결합하는 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은, 결합 분자가, 예를 들어, 항원을 표적으로 함에 있어서 치료제 및/또는 진단제로서 유용하도록, 충분한 친화도로 항원에 결합할 수 있는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항원에 결합하는 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 해리상수(KD)가 1μM, 800nM, 600nM, 550nM, 500nM, 300nM, 250nM, 100nM, 50nM, 10nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM 또는 0.1nM 이하이다. 특정 실시형태에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 상이한 종으로부터의 항원에서 보존된 항원의 에피토프에 결합한다.
특정 실시형태에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은, 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타낸다면, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래된 항체에서 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이거나 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 한편, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체에서 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이거나, 또는 다른 항체 부류 또는 하위부류, 이러한 항체의 단편에 속하는 "키메라" 서열을 포함한다(미국 특허 제4,816,567호; 문헌[Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-55] 참조). 키메라 서열은 인간화된 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 인간 면역글로불린으로부터의 서열을 포함하는 비인간(예를 들어, 낙타과, 뮤린, 비인간 영장류) 항체(예를 들어, 수용자 항체)의 "인간화된" 형태의 일부를 포함할 수 있으며, 이때 천연 CDR 잔기는 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비인간 종(예를 들어, 공여자 항체), 예컨대, 낙타과, 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 대응하는 CDR로부터의 잔기로 대체된다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린 서열의 하나 이상의 FR 영역 잔기는 대응하는 비인간 잔기로 대체된다. 더 나아가, 인간화된 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개선시키도록 만들어진다. 인간화된 항체 중쇄 또는 경쇄는 적어도 하나 이상의 가변 영역의 실질적으로 모두를 포함할 수 있으며, 이때 CDR의 모두 또는 실질적으로 모두가 비인간 면역글로불린에 대응하고, FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 면역글로불린 서열에 대응한다. 특정 실시형태에서, 인간화된 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 추가적인 상세한 설명을 위해, 문헌[Jones et al., Nature 321:522-25 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-29 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-96 (1992); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-89 (1992)]; 미국 특허 제6,800,738호; 제6,719,971호; 제6,639,055호; 제6,407,213호; 및 제6,054,297호를 참조한다.
특정 실시형태에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 "완전 인간 항체" 또는 "인간 항체"의 일부를 포함할 수 있되, 상기 용어는 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되고, 인간 가변 영역 및, 예를 들어, 인간 불변 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. 결합 분자는 단일 도메인 항체 서열을 포함할 수 있다. 구체적 실시형태에서, 상기 용어는 인간 유래의 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. "완전 인간" 항체는, 특정 실시형태에서, 또한 폴리펩타이드에 결합하고 인간 생식계열 면역글로불린 핵산 서열의 천연 유래 체세포 변이체인 핵산 서열에 의해 암호화되는 항체를 포함할 수 있다. 용어 "완전 인간 항체"는 Kabat 등에 의해 기재되는 바와 같이 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 대응하는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다(문헌[Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조). "인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체에 대응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 인간 항체의 제조를 위한 임의의 기법을 이용하여 생성된 항체이다. 인간 항체의 이런 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 구체적으로 제외한다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)) 및 효모 디스플레이 라이브러리(Chao et al., Nature Protocols 1: 755-68 (2006))를 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기법을 이용하여 생성될 수 있다. 또한 인간 단클론성 항체의 제조를 위해 문헌[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95 (1991); 및 van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)]에 기재된 방법을 이용 가능하다. 인간 항체는 항원 시험감염에 반응하여 이러한 항체를 생성하도록 변형되었지만, 내인성 좌위는 이용할 수 없는 유전자이식 동물, 예를 들어, 마우스에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다(예를 들어, XENOMOUSE™ 기술에 관해 문헌[Jakobovits, Curr. Opin. Biotechnol. 6(5):561-66 (1995);
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and Taussing, Curr. Opin. Biotechnol. 8(4):455-58 (1997)]; 및 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호 참조). 또한, 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관해, 예를 들어, 문헌[Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-62 (2006)]을 참조한다.
특정 실시형태에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 "재조합 인간 항체"의 일부를 포함할 수 있되, 상기 어구는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 인간 항체, 예컨대, 숙주 세포에 형질감염된 재조합 발현 벡터를 이용하여 발현된 항체, 재조합체로부터 단리된 항체, 조합 인간 항체 라이브러리, 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자이식 및/또는 염색체 이식인 동물(예를 들어, 마우스 또는 소)로부터 단리된 항체(예를 들어, 문헌[Taylor, L. D. et al., Nucl. Acids Res. 20:6287-6295 (1992)] 참조) 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 가질 수 있다(문헌[Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조). 특정 실시형태에서, 그러나, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는 인간 Ig 서열에 대한 동물 유전자이식이 사용될 때, 생체내 체세포 돌연변이유발) 처리되며, 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되거나 관련되지만, 생체내 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에서 자연적으로 존재하지 않을 수도 있는 서열이다.
특정 실시형태에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 "단클론성 항체"의 일부를 포함할 수 있되, 본 명세서에서 사용되는 용어는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 얻으며, 예를 들어, 집단을 포함하는 개개 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 유래 돌연변이 및/또는 번역 후 변형(예를 들어, 이성질체화, 아미드화) 또는 잘 알려진 번역 후 변형, 예컨대, 아미노산 이성질체화 또는 탈아마이드화, 메티오닌 산화 또는 아스파라긴 또는 글루타민 탈아마이드화를 제외하고 동일하며, 각각의 단클론성 항체는 전형적으로 항원 상의 단일 에피토프를 인식할 것이다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "단클론성 항체"는 단일 하이브리도마 또는 기타 세포에 의해 생성되는 항체이다. 용어 "단클론성"은 항체의 제조를 위해 임의의 특정 방법으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 개시내용에서 유용한 단클론성 항체는 문헌[Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 의해 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 박테리아 또는 진핵 동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법을 이용하여 제조될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조). "단클론성 항체"는, 예를 들어, 문헌[Clackson et al., Nature 352:624-28 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-97 (1991)]에 기재된 기법을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 클론 세포주 및 이에 의해 발현된 단클론성 항체의 제조를 위한 다른 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 5th ed. 2002)]을 참조한다.
전형적인 4-쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경(L) 쇄 및 2개의 동일한 중(H) 쇄로 구성된 이형이량체 당단백질이다. IgG의 경우에, 4-쇄 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 H 쇄에 연결되는 한편, 2개의 H 쇄는 H 쇄 아이소타입에 따라서 하나 이상의 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. 각각의 H 및 L 쇄는 또한 규칙적으로 간격을 둔 쇄내 이황화 브리지를 가진다. 각각의 H 쇄는 N-말단에서, α 및 γ 쇄 각각에 대해 가변 도메인(VH) 다음에 3개의 불변 도메인(CH) 및 μ 및 ε 아이소타입에 대해 4개의 CH 도메인을 가진다. 각각의 L 쇄는 N-말단에서, 가변 도메인(VL) 다음에 이의 다른 말단에서 불변 도메인(CL)을 가진다. VL은 VH와 함께 정렬되고, CL은 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 함께 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 여겨진다. VH와 VL의 쌍은 함께 단일 항원-결합 부위를 형성한다. 상이한 부류의 항체의 구조 및 특성에 대해, 예를 들어, 문헌[Basic and Clinical Immunology 71 (Stites et al. eds., 8th ed. 1994); 및 Immunobiology (Janeway et al. eds., 5th ed. 2001)]을 참조한다.
용어 "Fab" 또는 "Fab 영역"은 항원에 결합하는 항체 영역을 지칭한다. 통상적인 IgG는 보통 2개의 Fab 영역을 포함하며, 각각은 Y-형 IgG 구조의 2개 아암 중 하나에 존재한다. 각각의 Fab 영역은 전형적으로 중쇄 및 경쇄 각각의 하나의 가변 영역 및 하나의 불변 영역으로 구성된다. 더 구체적으로는, Fab 영역에서 중쇄의 가변 영역 및 불변 영역은 VH 및 CH1 영역이고, Fab 영역에서 경쇄의 가변 영역 및 불변 영역은 VL 및 CL 영역이다. Fab 영역에서 VH, CH1, VL 및 CL은 본 개시내용에 따른 항원 결합 능력을 부여하기 위해 다양한 방법으로 배열될 수 있다. 예를 들어, VH 및 CH1 영역은 하나의 폴리펩타이드 상에 있을 수 있고, VL 및 CL 영역은 통상적인 IgG의 Fab 영역과 유사하게 별도의 폴리펩타이드 상에 있을 수 있다. 대안적으로, VH, CH1, VL 및 CL 영역은 모두 동일한 폴리펩타이드 상에 있을 수 있고, 아래 부문에서 더욱 상세하게 기재되는 바와 같이 상이한 순서로 배향된다.
용어 "가변 영역", "가변 도메인", "V 영역" 또는 "V 도메인"은 경쇄 또는 중쇄의 아미노 말단에 일반적으로 위치되고 중쇄에서 약 120 내지 130개의 아미노산 및 경쇄에서 약 100 내지 110개의 아미노산 길이를 갖는 항체의 경쇄 또는 중쇄 부분을 지칭하며, 특정 항원에 대해 각 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용된다. 중쇄의 가변 영역은 "VH"로서 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 영역은 "VL"로서 지칭될 수 있다. 용어 "가변"은 가변 영역의 특정 세그먼트가 항체 중에서 서열이 광범위하게 다르다는 사실을 지칭한다. V 영역은 항원 결합을 매개하고, 특정 항원에 대해 특정 항체의 특이성을 정한다. 그러나, 가변성은 가변 영역의 110개 아미노산 스팬(span)에 걸쳐 균일하게 분포되지 않는다. 대신에, V 영역은 각각 약 9 내지 12개의 아미노산 길이인 "초가변 영역"으로 불리는 더 큰 가변성(예를 들어, 극도의 가변성)의 보다 짧은 영역에 의해 분리되는 약 15 내지 30개 아미노산의 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 덜 가변성(예를 들어, 상대적으로 비변이체)인 신장부로 이루어진다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은, 루프 연결을 형성하고, 일부 경우에 β 시트 구조의 부분을 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결되는 β 시트 입체배치를 대부분 채택하는, 4개의 FR을 각각 포함한다. 각각의 쇄에서 초가변 영역은 FR에 의해 근위에서 함께 보유되고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역과 함께, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(예를 들어, 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th ed. 1991)]을 참조한다). 불변 영역은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 관련되지는 않지만, 다양한 효과기 기능, 예컨대, 항체 의존적 세포의 세포독성(ADCC) 및 보체 의존적 세포독성(CDC)에의 항체 참여를 나타낸다. 가변 영역은 상이한 항체 사이에서 서열이 광범위하게 다르다. 구체적 실시형태에서, 가변 영역은 인간 가변 영역이다.
용어 "Kabat에 따른 가변 영역 잔기 넘버링" 또는 "Kabat에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 이들의 변형은 문헌[Kabat et al., 상기 참조]에서 항체 편집본의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역에 대해 사용한 넘버링 시스템을 지칭한다. 이 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 삽입에 대응하는 소수의 또는 추가적인 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 잔기 52 다음의 단일 아미노산 삽입(Kabat에 따라 잔기 52a) 및 잔기 82 다음에 3개의 삽입된 잔기(예를 들어, Kabat에 따라 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 넘버링은 "표준" Kabat 넘버링된 서열과 항체 서열의 상동성 영역에서 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다. Kabat 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인의 잔기(대략 경쇄의 잔기 1 내지 107 및 중쇄의 잔기 1 내지 113)를 지칭할 때 사용된다(예를 들어, 문헌[Kabat et al., 상기 참조]). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 지표"는 일반적으로 면역글로불린 중쇄 불변 영역에서 잔기를 지칭할 때 일반적으로 사용된다(예를 들어, 문헌[Kabat et al., 상기 참조]에서 보고된 EU 색인). "Kabat에서와 같은 EU 색인"은 인간 IgG 1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다. 다른 넘버링 시스템, 예를 들어, AbM, Chothia, Contact, IMGT 및 AHon이 기재되었다.
항체와 관련하여 사용될 때 용어 "중쇄"는 약 50 내지 70kDa의 폴리펩타이드 쇄를 지칭하되, 아미노-말단의 부분은 약 120 내지 130개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하고, 카복시-말단의 부분은 불변 영역을 포함한다. 불변 영역은 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 기반하여, 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 및 뮤(μ)로서 지칭되는 5개의 별개의 유형(예를 들어, 아이소타입) 중 하나일 수 있다. 별도의 중쇄은 크기가 상이하며: α, δ 및 γ는 대략 450개의 아미노산을 포함하는 반면, μ 및 ε은 대략 550개의 아미노산을 포함한다. 경쇄와 조합할 때, 중쇄의 이들 별도의 유형은 IgG의 4개의 하위 부류, 즉, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는, 5가지의 잘 알려진 부류(예를 들어, 아이소타입)의 항체인 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 생성한다.
항체와 관련하여 사용될 때 용어 "경쇄"는 약 25kDa의 폴리펩타이드 쇄를 지칭하되, 아미노-말단의 부분은 약 100 내지 약 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하고, 카복시-말단의 부분은 불변 영역을 포함한다. 경쇄의 대략적인 길이는 211 내지 217개의 아미노산이다. 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여 카파(κ) 또는 람다(λ)로서 지칭되는 2개의 별개의 유형이 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "초가변 영역", "HVR", "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 상호 호환적으로 사용된다. "CDR"은 면역글로불린(Ig 또는 항체) VH β-시트 프레임워크의 비-프레임워크 영역 내의 3개의 초가변 영역(H1, H2 또는 H3) 중 하나, 또는 항체 VL β-시트 프레임워크의 비프레임워크 영역 내에서 3개의 초가변 영역(L1, L2 또는 L3) 중 하나를 지칭한다. 따라서, CDR은 프레임워크 영역 서열 내에 배치되는 가변 영역 서열이다.
CDR 영역은 당업자에게 잘 공지되어 있고, 잘 공지된 넘버링 시스템에 의해 규정되었다. 예를 들어, Kabat 상보성 결정 영역(CDR)은 서열 가변성에 기반하며, 가장 통상적으로 사용된다(예를 들어, 문헌[Kabat et al., 상기 참조] 참조). Chothia는 대신에 구조적 루프의 위치를 언급한다(예를 들어, 문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-17 (1987)] 참조). Kabat 넘버링 체계를 이용하여 넘버링될 때 Chothia CDR-H1 루프의 단부는 루프 길이에 따라서 H32 내지 H34로 변한다(이는 Kabat 넘버링 체계가 H35A 및 H35B에서 삽입을 위치시키기 때문이며; 35A도 35B도 존재하지 않는 경우, 루프는 32에서 종결되고; 35A만이 존재한다면, 루프는 33에서 종결되고; 35A와 35B가 둘 다 존재한다면, 루프는 34에서 종결된다). AbM 초가변 영역은 Kabat CDR과 Chothia 구조적 루프 사이의 절충을 나타내며, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다(예를 들어, 문헌[Antibody Engineering Vol. 2(Kontermann and
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eds., 2d ed. 2010)] 참조). "Contact" 초가변 영역은 이용 가능한 복합체 결정 구조의 분석에 기반한다. 개발되고 널리 채택되는 다른 보편적인 넘버링 시스템은 ImMunoGeneTics(IMGT) Information System®(Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77 (2003))이다. IMGT는 인간 및 기타 척추동물의 면역글로불린(IG), T-세포 수용체(TCR) 및 주조직적합 복합체(MHC)에서 전문화되는 통합된 정보 시스템이다. 본 명세서에서, CDR은 경쇄와 중쇄 내의 아미노산 서열과 위치 둘 다에 관해 지칭된다. 면역글로불린 가변 도메인 구조 내에서 CDR의 "위치"는 종 간에 보존되고 루프로 불리는 구조로 존재하기 때문에, 구조적 특징에 따라 가변 도메인 서열을 정렬하는 넘버링 시스템을 이용함으로써, CDR 및 프레임워크 잔기는 용이하게 확인된다. 이 정보는 CDR 잔기를 하나의 종의 면역글로불린으로부터 전형적으로 인간 항체로부터의 수용자(acceptor) 프레임워크에 이식하고 대체하는 데 사용될 수 있다. 추가적인 넘버링 시스템(AHon)은 문헌[Honegger and
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, J. Mol. Biol. 309: 657-70 (2001)]에 의해 발생되었다. 예를 들어, Kabat 넘버링 및 IMGT 고유 넘버링 시스템을 비롯한 넘버링 시스템 사이의 대응도는 당업자에게 잘 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Kabat, 상기 참조; Chothia and Lesk, 상기 참조; Martin, 상기 참조; Lefranc et al., 상기 참조] 참조). 이들 초가변 영역 또는 CDR 각각으로부터의 잔기를 아래의 표 1에서 예시한다.
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주어진 CDR의 경계는 식별을 위해 사용되는 체계에 따라 다를 수 있다. 따라서, 달리 명시되지 않는 한, 주어진 항체 또는 이의 영역, 예컨대, 가변 영역의 "CDR" 및 "상보성 결정 영역"이라는 용어뿐만 아니라 항체 또는 이의 영역의 개개 CDR(예를 들어, CDR-H1, CDR-H2)은 본 명세서에서 상기 기재된 임의의 알려진 체계에 의해 정의된 바와 같은 상보성 결정 영역을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 예에서, IMGT, Kabat, Chothia 또는 Contact 방법에 의해 정의된 바와 같은 CDR과 같이 특정 CDR 또는 CDR들의 식별을 위한 체계가 명시된다. 일부 예에서, Kabat 넘버링에 따른 하나 이상의 위치는 실제 서열에서는 점유되지 않을 수도 있고, 또는 실제 서열은 Kabat 넘버링에 의해 가능하게 되는 수보다 더 많은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어, Kabat에 따른 VHH 도메인에 대한 예시적인 넘버링에 대해 문헌[Deschacht et al., 2010. J Immunol 184: 5696-704]을 참조한다. 다른 경우에, CDR의 특정 아미노산 서열이 주어진다. CDR 영역은 또한 다양한 넘버링 시스템의 조합, 예를 들어, Kabat와 Chothia 넘버링 시스템의 조합, 또는 Kabat와 IMGT 넘버링 시스템의 조합에 의해 정의될 수 있다는 것이 언급되어야 한다. 따라서, "특정 VH 또는 VHH에 제시된 바와 같은 CDR"과 같은 용어는 상기 기재된 예시적인 CDR 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 임의의 CDR1을 포함하지만, 이에 의해 제한되지는 않는다. 일단 가변 영역(예를 들어, VHH, VH 또는 VL)이 주어진다면, 당업자는 영역 내의 CDR이 상이한 넘버링 시스템 또는 이들의 조합에 의해 정의될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
초가변 영역은 다음과 같이 "연장된 초가변 영역"을 포함할 수 있다: VL에서 24 내지 36 또는 24 내지 34 (L1), 46 내지 56 또는 50 내지 56 (L2), 및 89 내지 97 또는 89 내지 96(L3), 및 VH에서 26 내지 35 또는 26 내지 35A(H1), 50 내지 65 또는 49 내지 65(H2), 및 93 내지 102, 94 내지 102, 또는 95 내지 102(H3).
용어 "불변 영역" 또는 "불변 도메인"은 항원에 대한 항체 결합에 직접 관련되지 않지만 Fc 수용체와의 상호작용과 같이 다양한 효과기 기능을 나타내는 경쇄 및 중쇄의 카복시 말단 부분을 지칭한다. 상기 용어는 면역글로불린의 다른 부분, 즉, 항원 결합 부위를 함유하는 가변 영역에 비해 더 보존된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 불변 영역은 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 영역 및 경쇄의 CL 영역을 함유할 수 있다.
용어 "프레임워크" 또는 "FR"은 CDR에 측접하는 해당 가변 영역 잔기를 지칭한다. FR 잔기는, 예를 들어, 키메라, 인간화, 인간, 도메인 항체(예를 들어, 단일 도메인 항체), 다이어바디, 선형 항체 및 이중특이성 항체에 존재한다. FR 잔기는 초가변 영역 잔기 또는 CDR 잔기 이외의 해당 가변 도메인 잔기이다.
본 명세서에서 용어 "Fc 영역"은, 예를 들어, 천연 서열 Fc 영역, 재조합 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다를 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 종종 위치 Cys226에서 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230으로부터 이의 카복실-말단까지 신장되는 것으로 정의된다. Fc 영역의 C-말단의 리신(EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은, 예를 들어, 항체의 생성 또는 정제 동안, 또는 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산을 재조합적으로 조작함으로써 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기가 있는 항체와 없는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다. "기능성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "효과기 기능"을 갖는다. 예시적인 "효과기 기능"은 C1q 결합; CDC; Fc 수용체 결합; ADCC; 식세포작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체)의 하향조절 등을 포함한다. 이러한 효과기 기능은 일반적으로 결합 영역 또는 결합 도메인(예를 들어, 항체 가변 영역 또는 도메인)과 조합될 Fc 영역을 필요로 하며, 당업자에게 공지된 다양한 검정을 이용하여 평가될 수 있다. "변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 첨가 또는 결실)으로 인해 천연 서열 Fc 영역의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역에서 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역에서 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 1개의 아미노산 치환, 예를 들어, 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 또는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본 명세서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 적어도 약 80% 상동성, 또는 이와 적어도 약 90% 상동성, 예를 들어, 이와 적어도 약 95% 상동성을 가질 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "에피토프"는 당업계의 용어이며, 결합 분자(예를 들어, 단일 도메인 항체 서열을 포함하는 항체)가 특이적으로 결합하는 항원의 국재화된 영역을 지칭한다. 에피토프는 선형 에피토프 또는 입체구조적, 비선형 또는 불연속 에피토프일 수 있다. 폴리펩타이드 항원의 경우에, 예를 들어, 에피토프는 폴리펩타이드의 인접한 아미노산("선형" 에피토프)일 수 있거나 또는 에피토프는 폴리펩타이드의 둘 이상의 비인접 영역으로부터의 아미노산을 포함할 수 있다("입체구조적", "비선형" 또는 "불연속" 에피토프). 당업자는, 일반적으로, 선형 에피토프가 2차, 3차 또는 4차 구조에 따를 수도 있고 따르지 않을 수도 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 결합 분자는, 이들이 천연 3차원 단백질 구조에서 폴딩되는지의 여부와 상관없이 아미노산 기에 결합한다. 다른 실시형태에서, 결합 분자는 에피토프를 인식하고 결합하기 위해 특정 입체구조(예를 들어, 굽힘, 트위스트, 턴 또는 폴딩)을 나타내도록 에피토프를 구성하는 아미노산 잔기를 필요로 한다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 저해하거나 감소시키는 것이다. "일부 실시형태에서, 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 저해한다.
"작용제" 또는 활성화 항체는 이것이 결합하는 항원에 의해 신호전달을 향상시키거나 개시하는 것이다. 일부 실시형태에서, 작용제 항체는 천연 리간드의 존재 없이 신호전달을 야기하거나 활성화시킨다.
펩타이드, 폴리펩타이드 또는 항체 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 백분율(%)" 및 "상동성"은, 필요하다면, 최대 서열 동일성 백분율을 달성하기 위해, 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고, 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후에, 특정 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열 내 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하는 목적을 위한 정렬은, 예를 들어, 공중이 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGN™(DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 당업계의 기술 내인 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.
용어 "특이성"은 항원의 특정 에피토프에 대한 항원 결합 단백질(예컨대, CAR 또는 sdAb)의 선택적 인식을 지칭한다. 천연 항체는, 예를 들어, 단일특이성이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "다중특이성"은 항원 결합 단백질(예컨대, CAR 또는 sdAb)이 둘 이상의 항원-결합 부위를 갖고, 이 중 적어도 둘은 상이한 항원에 결합한다는 것을 나타낸다. 본 명세서에 사용된 "이중특이성"은 항원 결합 단백질(예컨대, CAR 또는 sdAb)이 2개의 상이한 항원-결합 특이성을 가진다는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "단일특이성" CAR은 하나 이상의 결합 부위를 갖고 이들 각각이 동일한 항원에 결합하는 항원 결합 단백질(예컨대, CAR 또는 sdAb)을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "~가"는 항원 결합 단백질(예컨대, CAR 또는 sdAb) 내 결합 부위의 특정된 수의 존재를 의미한다. 예를 들어, 천연 항체 또는 전장 항체는 2개의 결합 부위를 가지며, 2가이다. 이렇게 해서, 용어 "3가", "4가", "5가" 및 "6가"는 항원 결합 단백질(예컨대, CAR 또는 sdAb) 내 각각 2개의 결합 부위, 3개의 결합 부위, 4개의 결합 부위, 5개의 결합부위 및 6개의 결합 부위의 존재를 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 하나 이상의 항원을 면역 효과기 세포, 예컨대, T 세포 상에 특이적으로 접합시키는 데 사용될 수 있는 유전적으로 조작된 수용체를 지칭한다. 일부 CAR은 "인공 T-세포 수용체", "키메라 T 세포 수용체" 또는 "키메라 면역 수용체"로도 알려져 있다. 일부 실시형태에서, CAR은 하나 이상의 항원(예컨대, 종양 항원)에 특이적인 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 T 세포 및/또는 다른 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. "CAR-T 세포"는 CAR을 발현시키는 T 세포를 지칭한다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "펩타이드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되고, 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 가로막힐 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개입; 예를 들어, 이황화결합 형성, 글리코실화, 결찰, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한, 예를 들어, 비천연 아미노산뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 아미노산의 하나 이상의 유사체를 포함하는 폴리펩타이드가 정의 내에 포함된다. 본 개시내용의 폴리펩타이드는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 항체 또는 다른 구성원에 기반할 수 있기 때문에, 특정 실시형태에서, "폴리펩타이드"는 단일쇄로서 또는 둘 이상의 연관된 쇄로서 발생할 수 있다는 것이 이해된다.
본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되는 바와 같은 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체에 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 메틸화된 뉴클레오타이드 및 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "올리고뉴클레오타이드"는 반드시는 아니지만 일반적으로 약 200개 미만 뉴클레오타이드 길이인 짧은, 일반적으로 단일 가닥의, 합성 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 상호 배타적이 아니다. 폴리뉴클레오타이드에 대한 위의 설명은 동일하며, 올리고뉴클레오타이드에 완전히 적용 가능하다. 본 개시내용의 결합 분자를 생성하는 세포는 모 하이브리도마 세포뿐만 아니라 항체를 암호화하는 핵산이 도입된 박테리아 및 진핵 숙주 세포를 포함할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 개시된 임의의 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 좌편 단부는 5' 단부이고; 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 좌편 방향은 5' 방향으로서 지칭된다. 초기 RNA 전사체의 5'에서 3'으로의 첨가 방향은 전사 방향으로서 지칭되고; RNA 전사체의 5'에서 5' 단부인 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥의 서열 영역은 "상류 서열"로서 지칭되고; RNA 전사체의 3'에서 3' 단부인 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "하류의 서열"로서 지칭된다.
"단리된 핵산"은 핵산, 예를 들어, RNA, DNA, 또는 다른 게놈 DNA 서열로부터 실질적으로 분리되는 혼합된 핵산뿐만 아니라 단백질 또는 복합체, 예컨대, 천연 서열을 자연적으로 수반하는 리보솜 또는 중합효소이다. "단리된" 핵산 분자는 핵산 분자의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 분자이다. 게다가, "단리된" 핵산 분자, 예컨대, cDNA 분자는 재조합 기법에 의해 생성될 때 다른 세포 물질 또는 배양물 배지가 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성될 때 화학물질 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 구체적 실시형태에서, 단일 도메인 항체 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자는 단리 또는 정제된다. 상기 용어는 이들의 천연 유래 환경으로부터 제거되고, 재조합 또는 클로닝된 DNA 단리물 및 화학적으로 합성된 유사체 또는 이종 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 유사체를 포함하는, 핵산 서열을 포함한다. 실질적으로 순수한 분자는 분자의 단리된 형태를 포함할 수 있다. 구체적으로는, 본 명세서에 기재된 CAR 또는 sdAb를 암호화하는 "단리된" 핵산 분자는 이것이 생성된 환경과 보통 연관되는 적어도 하나의 오염 핵산 분자로부터 확인되고 분리되는 핵산 분자이다.
용어 "조절 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 암호 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 조절 서열은, 예를 들어, 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "작동 가능하게 연결된" 및 유사한 어구(예를 들어, 유전적으로 융합된)는, 핵산 또는 아미노산과 관련하여 사용될 때, 서로 기능적 관계에 놓인 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 작동적 결합을 각각 지칭한다. 예를 들어, 작동 가능하게 연결된 프로모터, 인핸서 요소, 오픈 리딩 프레임, 5' 및 3' UTR, 및 종결자 서열은 핵산 분자(예를 들어, RNA)의 정확한 생성을 초래한다. 일부 실시형태에서, 작동 가능하게 연결된 핵산 요소는 오픈 리딩 프레임의 전사 및 궁극적으로는 폴리펩타이드의 생성(즉, 오픈 리딩 프레임의 발현)을 초래한다. 다른 예로서, 작동 가능하게 연결된 펩타이드는 기능성 도메인이 각 도메인의 의도된 기능을 부여하기 위해 서로로부터 적절한 거리에 위치된 것이다.
용어 "벡터"는, 예를 들어, 핵산 서열을 숙주 세포에 도입하기 위해, 본 명세서에 기재된 바와 같은 결합 분자(예를 들어, 항체)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 서열을 운반하거나 포함하기 위해 사용되는 물질을 지칭한다. 사용에 적용 가능한 벡터는, 예를 들어, 발현 벡터, 플라스미드, 파지 벡터, 바이러스 벡터, 에피솜 및 인공 염색체를 포함하고, 이들은 숙주 세포의 염색체에 안정한 통합을 위해 작동 가능한 선택 서열 또는 마커를 포함할 수 있다. 추가적으로, 벡터는 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자 및 적절한 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 포함될 수 있는 선택 가능한 마커 유전자는, 예를 들어, 항생제 또는 독소에 대한 내성, 보체 영양요구성 결핍증을 제공하거나, 배양 배지에 존재하지 않는 중요한 영양소를 공급한다. 발현 조절 서열은 당업계에 잘 공지된 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서, 전사 종결자 등을 포함할 수 있다. 둘 이상의 핵산 분자가 공동 발현될 때(예를 들어, 항체 중쇄와 경쇄 둘 다 또는 항체 VH와 VL), 핵산 분자는 둘 다, 예를 들어, 단일 발현 벡터에 또는 별도의 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 단일 벡터 발현에 대해, 암호화 핵산은 하나의 공통 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되거나 또는 상이한 발현 조절 서열, 예컨대, 하나의 유도성 프로모터 및 하나의 구성적 프로모터에 연결될 수 있다. 숙주 세포 내로 핵산 분자의 도입은 당업계에 잘 공지된 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 핵산 분석, 예컨대, mRNA의 노던 블롯 또는 중합효소 연쇄반응(PCR) 증폭, 유전자 산물의 발현을 위한 면역블롯팅, 또는 도입된 핵산 서열 또는 이의 대응하는 유전자 산물 발현을 시험하기 위한 다른 적합한 분석 방법을 포함한다. 당업자라면 핵산 분자가 목적하는 생성물을 생성하기 위한 충분한 양으로 발현된다는 것을 이해하며, 추가로 발현 수준이 당업계에 잘 공지된 방법을 이용하여 충분한 발현을 얻도록 최적화될 수 있다는 것을 이해한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "숙주"는 동물, 예컨대, 포유류(예를 들어, 인간)를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"는 핵산 분자 및 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손으로 형질감염될 수 있는 특정 대상체 세포를 지칭한다. 이러한 세포의 자손은 숙주 세포 게놈 내로의 핵산 분자의 계속되는 생성 또는 통합에서 일어날 수 있는 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 핵산 분자로 형질감염된 모 세포와 동일하지 않을 수도 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "자가(autologous)"는 이후에 개체에 재도입될 동일 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭하는 것으로 의도된다.
"동종이계"는 동일한 종의 상이한 개체로부터 유래된 접합물을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 내인성 핵산이 전달되거나 숙주 세포 내로 도입된 공정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 내인성 핵산으로 형질감염되거나, 형질전환되거나 형질도입된 것이다. 세포는 1차 대상 세포 및 이의 자손을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 연방 또는 주정부의 규제기관에 의해 승인되거나, 미국 약전, 유럽 약전 또는 동물용, 더 구체적으로는 인간용으로 다른 일반적으로 인식되는 약전에 열거된 것을 의미한다.
"부형제"는 약제학적으로-허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 부형제는, 예를 들어, 캡슐화 물질 또는 첨가제, 예컨대, 흡수 촉진제, 항산화제, 결합제, 완충제, 담체, 코팅제, 착색제, 희석제, 붕해제, 유화제, 증량제, 충전제, 향미제, 보습제, 윤활제, 향료, 보존제, 추진제, 이형제, 멸균제, 감미제, 가용화제, 습윤제 및 이들의 혼합물을 포함한다. 용어 "부형제"는 또한 희석제, 아쥬반트(예를 들어, 프로인트 아쥬반트(Freunds' adjuvant)(완전 또는 불완전) 또는 비히클을 지칭할 수 있다.
일부 실시형태에서, 부형제는 약제학적으로 허용 가능한 부형제이다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제의 예는 완충제, 예컨대, 인산염, 시트르산염 및 다른 유기산; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10개 미만의 아미노산 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 알기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 글리코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대, EDTA; 당 알코올, 예컨대, 만니톨 또는 솔비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대, 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, TWEEN™, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PLURONICS™를 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제의 다른 예는 문헌[Remington and Gennaro, Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed. 1990)]에 기재되어 있다.
일 실시형태에서, 각 성분은 약제학적 제형의 다른 성분과 양립 가능하고, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 면역원성 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 합리적인 유해/유익비에 비례하는, 인간 및 동물의 조직 또는 기관과 접촉하여 사용하기에 적합하다는 의미에서 "약제학적으로 허용 가능"하다. 예를 들어, 문헌[Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6th ed.; Rowe et al., Eds.; The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2009; Handbook of Pharmaceutical Additives, 3rd ed.; Ash and Ash Eds.; Gower Publishing Company: 2007; Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 2nd ed.; Gibson Ed.; CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2009]을 참조한다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제은 사용되는 투약량 및 농도에서 이에 노출 중인 세포 또는 포유류에 대해 비독성이다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 수성 pH 완충 용액이다.
일부 실시형태에서, 부형제는 물, 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 유래의 오일, 예컨대, 땅콩유, 광유, 참깨유 등과 같은 멸균 액체이다. 물은 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)이 정맥내로 투여될 때 예시적인 부형제이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 특히 주사용 용액에 대해 액체 부형제로서 사용될 수 있다. 부형제는 또한 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 벼, 밀가루, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함할 수 있다. 조성물은, 원한다면, 또한 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 조성물은 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지속 방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 제형을 포함하는 경구 조성물은 표준 부형제, 예컨대, 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰롤스, 탄산마그네슘 등을 포함할 수 있다.
약제학적 화합물을 포함하는 조성물은 적합한 양의 부형제와 함께 결합 분자(예를 들어, 항체)를, 예를 들어, 단리 또는 정제된 형태로 함유할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 목적하는 결과를 초래하기에 충분한, 본 명세서에 제공된 제제 및 단일 도메인 항체 또는 약제학적 조성물을 포함하는 단일 도메인 항체 또는 치료 분자의 양을 지칭한다.
용어 "대상체"와 "환자"는 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 특정 실시형태에서, 대상체는 포유류, 예컨대, 비영장류 또는 영장류(예를 들어, 인간)이다. 구체적 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일 실시형태에서, 대상체는 질환 또는 장애로 진단된 포유류, 예를 들어, 인간이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 질환 또는 장애가 발생할 위험에 있는 포유류, 예를 들어, 인간이다.
"투여하다" 또는 "투여"는 점막, 진피내, 정맥내, 근육내 전달에 의해, 및/또는 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 임의의 다른 물리적 전달 방법에 의해 신체 외부에 존재하는 물질을 환자에게 주사하거나 다르게는 물리적으로 전달하는 행동을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 1회 이상의 요법의 투여로부터 초래되는 질환 또는 병태의 진행, 중증도 및/또는 지속기간의 감소 또는 개선을 지칭한다. 치료는 환자가 여전히 기저 장애를 앓고 있을 수도 있지만, 환자에 의해 개선이 관찰되도록 기저 장애와 연관된 한 가지 이상의 증상의 감소, 경감 및/또는 완화가 있는지의 여부를 평가함으로써 결정될 수 있다. 용어 "치료하는"은 질환을 관리하고 호전시키는 것을 포함한다. 용어 "관리하다", "관리하는" 및 "관리"는 대상체가 질환의 치유를 반드시 초래하지는 않는 요법으로부터 얻는 유리한 효과를 지칭한다.
용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"은 질환, 장애, 병태 또는 연관된 증상(들)(예를 들어, 당뇨병 또는 암)의 발병(또는 재발) 가능성을 감소시키는 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 암 발생을 "지연시키는"은 질환 발생을 연기시키고/시키거나, 방해하고/하거나, 늦추고/늦추거나, 지연시키고/시키거나 안정화시키고/시키거나, 연장시키는 것을 의미한다. 이 지연은 치료 중인 질환 및/또는 개체의 병력에 따라서 시간 길이가 다를 수 있다. 당업자에게 분명할 바와 같이, 충분한 또는 유의미한 지연은, 사실상, 개체에서 질환이 발생되지 않는다는 점에서 예방을 포함할 수 있다. 암 발생을 "지연시키는" 방법은, 방법을 이용하지 않을 때에 비해, 주어진 시간 틀에 질환 발생 가능성을 감소시키고/시키거나 주어진 시간틀에 질환 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 전형적으로 통계학적으로 유의한 수의 개체를 이용하는 임상 연구에 기반한다. 암 발생은 컴퓨터 축 단층촬영술(CAT 스캔), 자기 공명 영상(MRI), 복부 초음파, 응고 검사, 동맥조영법 또는 생검을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 표준 방법을 이용하여 검출 가능하다. 개발은 또한 초기에 검출 가능하지 않을 수 있고, 발생, 재발 및 개시를 포함하는 암 진행을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "B 세포 연관 질환 또는 장애"는 B 세포에 의해 매개되거나 또는 비정상 B 세포 기능(예컨대, B-세포 기능의 조절장애)에 의해 부여되는 질환 또는 장애를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "B 세포 연관 질환 또는 장애"는 B 세포 악성종양, 예컨대, B 세포 백혈병 또는 B 세포 림프종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이는 또한 가장자리구역 림프종(예를 들어, 비장 가장자리구역 림프종), 광범위 큰 B 세포 림프종(DLBCL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 원발성 중추 신경계(CNS) 림프종, 원발성 종격동 B 세포 림프종(PMBL), 소형 림프구성 림프종(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병(B-PLL), 소포 림프종(FL), 버킷 림프종, 원발성 안구내 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 모발세포 백혈병(HCL), 전구 B 세포 림프모구 백혈병, 비호지킨 림프종(NHL), 고등급 B-세포 림프종(HGBL) 및 다발성 골수종(MM)을 포함한다. "B 세포 연관 질환 또는 장애"는 또한 특정 자가면역 및/또는 염증성 질환, 예컨대, 부적절한 또는 향상된 B 세포수 및/또는 활성화와 연관된 것을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "CD20 연관 질환 또는 장애"는 CD20이 발현되는 세포 또는 조직을 포함하는 질환 또는 장애를 지칭한다. 일부 실시형태에서, CD20 연관 질환 또는 장애는 CD20이 비정상적으로 발현되는 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, CD20 연관 질환 또는 장애는 CD20이 결핍된 세포를 포함한다.
용어 "약" 및 "대략"은 20% 이내, 15% 이내, 10% 이내, 9% 이내, 8% 이내, 7% 이내, 6% 이내, 5% 이내, 4% 이내, 3% 이내, 2% 이내, 1% 이내 또는 주어진 값 또는 범위 미만을 의미한다.
본 개시내용 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 달리 분명하게 나타내지 않는 한 복수의 형태를 포함한다.
"포함하는"이라는 용어와 함께 실시형태가 설명되는 경우 "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"에 관해 기재된 다른 유사한 실시형태가 또한 제공된다는 것이 이해된다. 또한 "본질적으로 이루어진"이라는 어구와 함께 실시형태가 설명되는 경우 "이루어진"에 관해 기재된 다른 유사한 실시형태가 또한 제공된다는 것이 이해된다.
"A와 B 사이" 또는 "A에서 B 사이"와 같은 어구에서 사용되는 "사이"라는 용어는 A와 B를 둘 다 포함하는 범위를 지칭한다.
본 명세서의 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"은 A와 B 둘 다; A 또는 B; A(단독); 및 B(단독)을 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"은 다음의 실시형태 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B (단독); 및 C(단독).
5.2. 단일 도메인 항체
5.2.1. CD20에 결합하는 단일 도메인 항체
일 양상에서, CD20에 결합할 수 있는 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH 도메인)가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH 도메인)는 인간 CD20에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항-CD20 단일 도메인 항체는 하나 이상의 CD20 활성을 조절한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항-CD20 단일 도메인 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항-CD20 단일 도메인 항체는 1μM 이하, 100nM 이하, 10nM 이하, 1nM 이하, 0.1nM 이하, 0.01nM 이하 또는 0.001nM 이하(예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8M 내지 10-13M, 예를 들어, 10-9M 내지 10-13M)의 해리상수(KD)로 CD20(예를 들어, 인간 CD20)에 결합한다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 이 중 어느 것은, 예를 들어, 관심 항체 및 이의 항원의 Fab 형태에 의해 수행되는 RIA에 의해(Chen et al., 1999, J. Mol Biol 293:865-81); 예를 들어, Octet®Red96 시스템을 이용하는 Octet®에 의해 또는, 예를 들어, Biacore®TM-2000 또는 Biacore®TM-3000을 이용하는, Biacore®에 의해, 생물층 간섭계(BLI) 또는 표면 플라스몬 공명(SPR) 검정에 의하는 것을 포함하여, 본 개시내용의 목적을 위해 사용될 수 있다. "온 속도(on-rate)" 또는 "결합 속도" 또는 "회합 속도" 또는 "kon"은 또한, 예를 들어, Octet®Red96, Biacore®TM-2000, 또는 Biacore®TM-3000 시스템을 이용하여, 위에 기재한 동일한 생물층 간섭계(BLI) 또는 표면 플라스몬 공명(SPR) 기법에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항-CD20 단일 도메인 항체는 VHH 도메인이다. 본 명세서에 제공된 예시적인 VHH 도메인은 아래의 부문 6에 기재된 바와 같이 생성되고, 이들 VHH 도메인은 아래의 표 2에 또한 나타내는 바와 같이, VHH-273, VHH-283, VHH-313, VHH-440, VHH-466, VHH-496, VHH-653, huVHH-253, huVHH-256, huVHH-260, huVHH-746, huVHH-750, huVHH-753, huVHH-836, huVHH-840, huVHH-843, huVHH-846, 2082H1, 2082H2, 2082H3, 2082H4, 2082H5, 2082H6, VHH-623, VHH-640 및/또는 VHH-657로 지칭된다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체는 VHH-273, VHH-283, VHH-313, VHH-440, VHH-466, VHH-496, VHH-653, huVHH-253, huVHH-256, huVHH-260, huVHH-746, huVHH-750, huVHH-753, huVHH-836, huVHH-840, huVHH-843, huVHH-846, 2082H1, 2082H2, 2082H3, 2082H4, 2082H5, 2082H6, VHH-623, VHH-640 및/또는 VHH-657 중 어느 하나의 하나 이상의 CDR 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다음의 구조: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 CD20에 결합하는 단일 도메인 항체가 본 명세서에 제공되되, CDR 서열은 VHH-273, VHH-283, VHH-313, VHH-440, VHH-466, VHH-496, VHH-653, huVHH-253, huVHH-256, huVHH-260, huVHH-746, huVHH-750, huVHH-753, huVHH-836, huVHH-840, huVHH-843, huVHH-846, 2082H1, 2082H2, 2082H3, 2082H4, 2082H5, 2082H6, VHH-623, VHH-640 및/또는 VHH-657로부터 선택된다.
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일부 실시형태에서, 서열번호 41의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 42의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 43의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 44의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 45의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 46의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 47의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 48의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 49의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 50의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 51의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 52의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 53의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 54의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 55의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 56의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 57의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 58의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 59의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 60의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 61의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 62의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 63의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 183의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 184의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 185의 아미노산 서열의 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 41에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 41에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 41에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 3 또는 6)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 41에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 41에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 41에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 41에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 42에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 42에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 42에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 8 또는 10)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 42에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 42에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 42에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 42에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 43에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 43에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 43에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 8 또는 10)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 43에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 43에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 43에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 43에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 44에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 44에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 44에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 16 또는 19)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 44에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 44에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 44에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 44에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 45에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 45에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 45에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 16 또는 19)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 45에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 45에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 45에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 45에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 46에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 46에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 46에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 26 또는 29)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 46에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 46에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 46에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 46에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 47에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 47에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 47에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 16 또는 19)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 47에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 47에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 47에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 47에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 48에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 48에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 48에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 3 또는 6)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 48에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 48에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 48에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 48에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 49에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 49에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 49에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 3 또는 6)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 49에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 49에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 49에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 49에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 50에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 50에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 50에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 8 또는 10)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 50에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 50에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 50에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 50에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 51에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 51에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 51에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 26 또는 29)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 51에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 51에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 51에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 51에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 52에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 52에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 52에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 26 또는 29)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 52에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 52에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 52에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 52에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 53에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 53에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 53에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 26 또는 29)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 53에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 53에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 53에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 53에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 54에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 54에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 54에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 16 또는 19)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 54에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 54에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 54에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 54에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 55에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 55에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 55에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 16 또는 19)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 55에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 55에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 55에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 55에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 56에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 56에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 56에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 16 또는 19)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 56에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 56에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 56에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 56에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 57에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 57에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 57에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 16 또는 19)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 57에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 57에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 57에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 57에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 58에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 58에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 58에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 3 또는 6)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 58에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 58에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 58에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 58에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 59에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 59에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 59에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 3 또는 39)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 59에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 59에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 59에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 59에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 60에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 60에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 60에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 3 또는 6)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 60에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 60에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 60에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 60에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 61에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 61에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 61에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 3 또는 40)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 61에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 61에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 61에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 61에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 62에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 62에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 62에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 3 또는 39)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 62에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 62에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 62에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 62에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 63에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 63에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 63에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 3 또는 6)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 63에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 63에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 63에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 63에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 183에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 183에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 183에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 167 또는 170)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 183에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 183에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 183에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 183에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 184에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 184에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 184에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 173 또는 176)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 184에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 184에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 184에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 184에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 185에 제시된 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 185에 제시된 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 185에 제시된 CDR3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 179 또는 182)을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 185에 제시된 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 185에 제시된 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 185에 제시된 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 185에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 공지된 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 다음의 구조: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 CD20에 결합하는 단일 도메인 항체가 본 명세서에 제공되되, (i) CDR1은 서열번호 1 또는 195, 서열번호 4, 서열번호 11 또는 196, 서열번호 13, 서열번호 14 또는 197, 서열번호 17, 서열번호 20 또는 197, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 198, 서열번호 27; 서열번호 165 또는 199, 서열번호 168, 서열번호 171 또는 200, 서열번호 174, 서열번호 177 또는 197, 또는 서열번호 180의 아미노산 서열을 포함하고; (ii) CDR2는 서열번호:2, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 18, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 166, 서열번호 169, 서열번호 172, 서열번호 175, 서열번호 178 또는 서열번호 181의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고/또는 (iii) CDR3은 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 16, 서열번호 19, 서열번호 26, 서열번호 29, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 167, 서열번호 170, 서열번호 173, 서열번호 176, 서열번호 179 또는 서열번호 182의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
다른 실시형태에서, 다음의 구조: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 CD20에 결합하는 단일 도메인 항체가 본 명세서에 제공되되, (i) CDR1은 서열번호 1 또는 195, 서열번호 4, 서열번호 11 또는 196, 서열번호 13, 서열번호 14 또는 197, 서열번호 17, 서열번호 20 또는 197, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 198, 서열번호 27; 서열번호 165 또는 199, 서열번호 168, 서열번호 171 또는 200, 서열번호 174, 서열번호 177 또는 197, 또는 서열번호 180의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; (ii) CDR2는 서열번호:2, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 18, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 166, 서열번호 169, 서열번호 172, 서열번호 175, 서열번호 178 또는 서열번호 181의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고/또는 (iii) CDR3은 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 16, 서열번호 19, 서열번호 26, 서열번호 29, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 167, 서열번호 170, 서열번호 173, 서열번호 176, 서열번호 179 또는 서열번호 182에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 1 또는 195의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 195의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 1 또는 195의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 195의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 11 또는 196의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 196의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 14 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 20 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 24 또는 198의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 198의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 14 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 1 또는 195의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 195의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 20 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 20 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 20 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 20 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 165 또는 199의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 166의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 167의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 165의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 166의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 167의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 199의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 166의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 167의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 168의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 169의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 170의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 171 또는 200의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 200의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 177 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 177의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 180의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 181의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 182의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 VHH-273, VHH-283, VHH-313, VHH-440, VHH-466, VHH-496, VHH-653, huVHH-253, huVHH-256, huVHH-260, huVHH-746, huVHH-750, huVHH-753, huVHH-836, huVHH-840, huVHH-843, huVHH-846, 2082H1, 2082H2, 2082H3, 2082H4, 2082H5, 2082H6, VHH-623, VHH-640 및/또는 VHH-657의 하나 이상의 프레임워크 영역(들)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　41의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　42의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　43의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　44의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　45의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　46의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　47의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　48의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　49의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　50의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　51의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　52의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　53의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　54의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　55의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　56의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　57의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　58의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　59의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　60의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　61의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　62의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　63의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　183의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　184의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호　185의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체는 인간화된 단일 도메인 항체이다. 일부 실시형태에서, 인간화된 단일 도메인 항체는 아래의 부문 6에 예시된 방법 또는 아래의 부문에 기재된 방법을 이용하여 생성될 수 있다.
본 명세서에 기재된 프레임워크 영역은 CDR 넘버링 시스템의 경계에 기반하여 결정된다. 다시 말해서, CDR이, 예를 들어, Kabat, IMGT 또는 Chothia에 의해 결정되는 경우, 프레임워크 영역은, N-말단에서 C-말단까지: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 형식으로 가변 영역에서 CDR을 둘러싸는 아미노산 잔기이다. 예를 들어, FR1은, 예를 들어, Kabat 넘버링 시스템, IMGT 넘버링 시스템 또는 Chothia 넘버링 시스템에 의해 정의되는 바와 같이 CDR1 아미노산 잔기에 대해 N-말단의 아미노산 잔기로서 정의되고, FR2는, 예를 들어, Kabat 넘버링 시스템, IMGT 넘버링 시스템, 또는 Chothia 넘버링 시스템에 의해 정의되는 바와 같이 CDR1과 CDR2 아미노산 잔기 사이의 아미노산 잔기로서 정의되며, FR3은, 예를 들어, Kabat 넘버링 시스템, IMGT 넘버링 시스템 또는 Chothia 넘버링 시스템에 의해 정의되는 바와 같이 CDR2와 CDR3 아미노산 잔기 사이의 아미노산 잔기로서 정의되고, FR4는, 예를 들어, Kabat 넘버링 시스템, IMGT 넘버링 시스템 또는 Chothia 넘버링 시스템에 의해 정의되는 바와 같이 CDR3 아미노산 잔기에 대해 C-말단의 아미노산 잔기로서 정의된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 44의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 48의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 49의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 50의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 55의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　63의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 183의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 183의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 184의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 184의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 185의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 VHH-273, VHH-283, VHH-313, VHH-440, VHH-466, VHH-496, VHH-653, huVHH-253, huVHH-256, huVHH-260, huVHH-746, huVHH-750, huVHH-753, huVHH-836, huVHH-840, huVHH-843, huVHH-846, 2082H1, 2082H2, 2082H3, 2082H4, 2082H5, 2082H6, VHH-623, VHH-640 및 VHH-657 중 어느 하나에 대해 특정 동일성 백분율을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
두 서열(예를 들어, 아미노산 서열 또는 핵산 서열) 사이의 동일성 백분율 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 두 서열의 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 비제한적 예는 문헌[Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873 5877 (1993)]에서와 같이 변형된 문헌[Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264 2268 (1990)]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 혼입된다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 NBLAST 뉴클레오타이드 프로그램 파라미터 세트에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어, 점수=100의 경우, 본 명세서에 기재된 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 얻기 위해 단어 길이=12이다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램 파라미터 세트에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어, 점수 50에 대해, 본 명세서에 기재된 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 얻기 위해 단어 길이=3이다. 비교 목적을 위한 갭핑 정렬을 얻기 위해, 갭핑 BLAST는 문헌[Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389 3402 (1997)]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 대안적으로, PSI BLAST는 분자 사이의 먼 관계를 검출하는 반복 검색을 수행하기 위해 사용될 수 있다(이하 참조). BLAST, 갭핑된 BLAST 및 PSI Blast 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다(예를 들어, 월드 와이드 웹, ncbi.nlm.nih.gov 상의 미국 국립생물정보센터(NCBI)). 서열 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 다른 비제한적 예는 문헌[Myers and Miller, CABIOS 4:11-17 (1998)]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 부분인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 혼입된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 이용할 때, PAM120 가중치 잔기표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티가 사용될 수 있다. 두 서열 사이의 동일성 백분율은 허용되는 갭의 유무와 상관없이 상기 기재한 것과 유사한 기법을 이용하여 결정될 수 있다. 동일성 백분율을 계산함에 있어서, 전형적으로 정확한 매칭만이 계수된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 41 내지 63 및 183 내지 185로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성 중 적어도 약 어느 하나를 갖는 VHH 도메인을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 중 적어도 약 어느 하나를 갖는 VHH 서열은 참조 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 해당 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체는 CD20에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 실시형태에서, 서열번호 41 내지 63 및 183 내지 185로부터 선택된 아미노산 서열에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-CD20 단일 도메인 항체는, 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하여 서열번호 41 내지 63 및 183 내지 185로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 41의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 42의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 43의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 44의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 45의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 46의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 47의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 48의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 49의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 50의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 51의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 52의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 53의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 54의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 55의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 56의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 57의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 58의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 59의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 60의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 61의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 62의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 63의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 183의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 184의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 185의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 CD20에 결합한다.
일부 실시형태에서, 기능성 에피토프는 본 명세서에 제공된 항-CD20 단일 도메인 항체와의 상호작용에 필수적인 CD20 단백질의 아미노산을 확인하기 위해, 예를 들어, 조합 알라닌 스캐닝에 의해, 맵핑될 수 있다. 일부 실시형태에서, CD20에 결합된 항-CD20 단일 도메인 항체의 입체구조적 및 결정 구조는 에피토프를 확인하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 제공된 임의의 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 183의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 184의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-CD20 단일 도메인 항체 중 어느 하나와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항-CD20 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 경쟁적 결합은 ELISA 검정을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 183의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 184의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.
일부 실시형태에서, 상기 기재한 항-CD20 단일 도메인 항체 중 어느 하나를 포함하는 CD20 결합 단백질이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, CD20 결합 단백질은 낙타과, 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하는 단클론성 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 항체는 항체 단편, 예를 들어, VHH 단편이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 항체는 임의의 항체 부류 또는 아이소타입의 Fc 영역, 예컨대, IgG1 또는 IgG4를 포함하는 전장 중쇄 단독 항체이다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 감소 또는 최소화된 효과기 기능을 갖는다. 일부 실시형태에서, CD20 결합 단백질은 본 명세서에 제공된 항-CD20 단일 도메인 항체를 포함하는 융합 단백질이다. 다른 실시형태에서, CD20 결합 단백질은 본 명세서에 제공된 항-CD20 단일 도메인 항체를 포함하는 다중특이성 항체이다. 다른 예시적인 CD20 결합 분자는 다음의 부문에 더욱 상세하게 기재된다.
일부 실시형태에서, 상기 실시형태 중 어느 것에 따른 항-CD20 항체(예컨대, 항-CD20 단일 도메인 항체) 또는 항원 결합 단백질은 아래의 부문 5.2.2 내지 5.2.7에 기재한 바와 같이 단독으로 또는 조합하여 임의의 특징을 혼입할 수 있다.
5.2.2. 인간화된 단일 도메인 항체
본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 인간화된 단일 도메인 항체를 포함한다. 낙타과 종으로부터 단일 도메인 항체를 인간화시키기 위한 일반적인 전략이 기재되었고(예를 들어, 문헌[Vincke et al., J. Biol. Chem., 284(5):3273-3284 (2009)] 참조), 본 명세서에 개시된 바와 같이 인간화된 VHH 도메인을 생성하는 데 유용할 수 있다. 낙타과 종으로부터의 인간화된 단일 도메인 항체의 설계는 VHH에서 특징 잔기, 예컨대, 잔기 11, 37, 44, 45 및 47(Kabat에 따라 잔기 넘버링)을 포함할 수 있다(Muyldermans, Reviews Mol Biotech 74:277-302 (2001).
인간화된 항체, 예컨대, 본 명세서에 개시된 인간화된 단일 도메인 항체는 또한 CDR-접합(유럽 특허 제239,400호; 국제 특허 출원 공개 WO 91/09967; 및 미국 특허 제5,225,539호, 제5,530,101호 및 제5,585,089호), 베니어링(veneering) 또는 리서페이싱(resurfacing)(유럽 특허 EP 592,106호 및 EP 519,596호; 문헌[Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); 및 Roguska et al., PNAS 91:969-973 (1994)]), 쇄 셔플링(미국 특허 제5,565,332호), 및 예를 들어, 미국 특허 제6,407,213호, 미국 특허 제5,766,886호, WO 9317105, 문헌[Tan et al., J. Immunol. 169:1119 25 (2002), Caldas et al., Protein Eng. 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods 20(3):267 79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895 904 (1996), Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s- 5977s (1995), Couto et al., Cancer Res. 55(8):1717-22 (1995), Sandhu JS, Gene 150(2):409-10 (1994), 및 Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235(3):959-73 (1994)]에 개시된 기법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 기법을 이용하여 생성될 수 있다. 또한 미국 특허 공개 제2005/0042664 A1호(2005년 2월 24일)를 참조하며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체는 인간 CD20을 포함하는 CD20에 결합하는 인간화된 단일 도메인 항체일 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 인간화된 단일쇄 항체는 서열번호 41 내지 63 및 183 내지 185에 제시된 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 비인간 항체를 인간화하는 다양한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 일반적으로, 인간화된 항체는 비인간인 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 전형적으로 "이입" 가변 도메인으로부터 취해지는 "이입" 잔기로서 종종 지칭된다. 인간화는, 인간 항체의 대응하는 서열을 초가변 영역 서열로 치환함으로써, 예를 들어, 문헌[Jones et al., Nature 321:522-25 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-27 (1988); 및 Verhoeyen et al., Science 239:1534-36 (1988))]의 방법에 따라 수행될 수 있다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체의 인간화는 아래의 부문 6에 기재된 바와 같이 수행된다.
일부 경우에, 인간화된 항체는 CDR 접합에 의해 작제되고, 이때, 모 비-인간 항체의 CDR의 아미노산 서열은 인간 항체 프레임워크 상에 접합된다. 예를 들어, Padlan 등은 CDR에서 잔기의 약 1/3만이 실제로 항원과 접촉되고, 이들을 "특이성 결정 잔기" 또는 SDR로 지칭한다는 것을 결정하였다(Padlan et al., FASEB J. 9:133-39 (1995)). SDR 접합 기법에서, SDR 잔기만이 인간 항체 프레임워크 상에 접합된다(예를 들어, 문헌[Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)] 참조).
인간화된 항체를 제조하는 데 사용될 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는 데 중요할 수 있다. 예를 들어, 소위 "최적-적합" 방법에 따르면, 비인간 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 선별된다. 비-인간 항체의 서열에 가장 가까운 인간 서열은 인간화된 항체에 대한 인간 프레임워크로서 선택될 수 있다(Sims et al., J. Immunol. 151:2296-308 (1993); 및 Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-17 (1987)). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위그룹의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크는 몇몇 상이한 인간화된 항체에 대해 사용될 수 있다(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-89 (1992); 및 Presta et al., J. Immunol. 151:2623-32 (1993)). 일부 경우에, 프레임워크는 가장 흔한 인간 하위부류인 VL6 하위집단 I(VL6I) 및 VH 하위집단 III (VHIII)의 공통 서열로부터 유래된다. 다른 방법에서, 인간 생식계열 유전자는 프레임워크 영역의 공급원으로서 사용된다.
초인간화(superhumanization)로 불리는 CDR의 비교에 기반한 대안의 패러다임에서, FR 상동성은 관련없다. 상기 방법은 기능성 인간 생식계열 유전자 레퍼토리와 비인간 서열의 비교로 이루어진다. 이어서, 이를 암호화하는 해당 유전자 또는 뮤린 서열과 밀접하게 관련된 표준 구조가 선택된다. 다음에, 비-인간 항체와 표준 구조를 공유하는 유전자 내에서, CDR 내에서 가장 큰 상동성을 갖는 것이 FR 공여자로서 선택된다. 최종적으로, 비인간 CDR은 이들 FR 상에 접합된다(예를 들어, 문헌[Tan et al., J. Immunol. 169:1119-25 (2002)] 참조).
추가로 항체는 항원 및 다른 바람직한 생물학적 특성에 대해 이들의 친화도를 보유하면서 인간화된다는 것이 일반적으로 바람직하다. 이 목적을 달성하기 위해, 한 가지 방법에 따르면, 모 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 이용하는 모 서열 및 다양한 개념 인간화 산물의 분석 과정에 의해 인간화된 항체가 제조된다. 3차원 면역글로불린 방법은 통상적으로 이용 가능하며, 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능성 있는 3차원 입체구조를 도시하고 나타내는 컴퓨터 프로그램을 이용 가능하다. 이들은, 예를 들어, WAM(Whitelegg and Rees, Protein Eng. 13:819-24 (2002)), Modeller(Sali and Blundell, J. Mol. Biol. 234:779-815 (1993)) 및 Swiss PDB Viewer(Guex and Peitsch, Electrophoresis 18:2714-23 (1997))를 포함한다. 이들 디스플레이의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능화에서 잔기의 가능성 있는 역할의 분석, 예를 들어, 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이런 방법에서, 목적하는 항체 특징, 예컨대, 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 FR 잔기는 수용자 및 이입 서열로부터 선택되고 조합될 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 영향을 미침에 있어서 직접적으로 그리고 가장 실질적으로 연루된다.
항체 인간화를 위한 다른 방법은 인간 스트링 내용(Human String Content: HSC)으로 불리는 항체 인간성(humanness)의 측정 기준에 기반한다. 이 방법은 마우스 서열을 인간 생식계열 유전자의 레퍼토리와 비교하고, 치이를 HSC로서 점수화한다. 이어서, 표적 서열은 여러 다양한 인간화된 변이체를 생성하기 위해 전반적 식별(global identity) 척도를 이용하기보다는 HSC를 최대화함으로써 인간화된다(Lazar et al., Mol. Immunol. 44:1986-98 (2007)).
위에서 기재한 방법에 추가로, 경험적 방법을 사용하여 인간화된 항체를 생성 및 선택할 수 있다. 이들 방법은 풍부화 기술 또는 고속대량 선별 기법(high throughput screening technique)을 이용하여 인간화된 변이체의 대형 라이브러리의 생성 및 최고 클론의 선택에 기반하는 것을 포함한다. 항체 변이체는 파지, 리보솜 및 효모 디스플레이 라이브러리로부터 뿐만 아니라 박테리아 콜로니 선별에 의해 단리될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hoogenboom, Nat. Biotechnol. 23:1105-16 (2005); Dufner et al., Trends Biotechnol. 24:523-29 (2006); Feldhaus et al., Nat. Biotechnol. 21:163-70 (2003); 및 Schlapschy et al., Protein Eng. Des. Sel. 17:847-60 (2004)] 참조).
FR 라이브러리 접근에서, FR 내 특정 위치에 잔여 변이체의 수집이 도입된 후에, 접합된 CDR을 가장 잘 뒷받침하는 FR을 선택하기 위해 라이브러리의 선별이 이어진다. 치환될 잔기는 CDR 구조에 잠재적으로 기여하는 것으로 확인되거나(예를 들어, 문헌[Foote and Winter, J. Mol. Biol. 224:487-99 (1992)] 참조), 또는 문헌[Baca et al. J. Biol. Chem. 272:10678-84 (1997)]에 의해 확인되는 표적 전가의 더 제한된 세트로부터의 "베니어(Vernier)" 잔기의 일부 또는 모두를 포함할 수 있다.
FR 셔플링에서, 전체 FR은 선택된 잔기 변이체의 조합 라이브러리를 생성하는 대신에 비인간 CDR과 조합된다(예를 들어, 문헌[Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)] 참조). 1단계 FR 셔플링 공정이 사용될 수 있다. 이러한 공정은, 얻어진 항체가 향상된 발현, 증가된 친화도 및 열 안정성을 포함하는 개선된 생화학적 및 물리화학적 특성을 나타냈기 때문에, 효율적인 것으로 나타났다(예를 들어, 문헌[Damschroder et al., Mol. Immunol. 44:3049-60 (2007)] 참조).
"휴머니어링(humaneering)" 방법은 필수 최소 특이성 결정인자(MSD)의 실험적 식별에 기반하며, 비인간 단편의 인간 FR의 라이브러리로의 서열 대체 및 결합 평가에 기반한다. 이 방법은 전형적으로 에피토프 보유, 및 별도의 인간 V-세그먼트 CDR을 갖는 여러 하위부류로부터의 항체의 식별을 초래한다.
"인간 조작" 방법은 본래의 비-인간 항체의 바람직한 결합 특성을 보유한다고 해도, 인간에서 면역원성이 감소된 변형된 항체를 생성하기 위해 항체의 아미노산 서열에 대한 특정 변화를 생성함으로써 비-인간 항체 또는 항체 단편을 변경시키는 것을 수반한다. 일반적으로, 상기 기법은 비-인간 항체의 아미노산 잔기를 "저위험", "중간 위험" 또는 "고위험" 잔기로서 분류하는 것을 수반한다. 분류는 얻어진 항체의 폴딩에 치환이 영향을 미칠 위험에 대해 (예를 들어, 인간에서의 면역원성에 대해) 특정 치환을 생성하는 예측된 유익을 평가하는 전반적 위험/보상 계산을 이용하여 수행된다. 비-인간 항체 서열의 주어진 위치(예를 들어, 저위험 또는 중간 위험)에서 치환될 특정 인간 아미노산 잔기는 특정 또는 공통 인간 항체 서열의 대응하는 영역을 갖는 비-인간 항체의 가변 영역으로부터 아미노산 서열을 정렬함으로써 선택될 수 있다. 비인간 서열에서 저위험 또는 중간 위험의 아미노산 잔기는 정렬에 따라 인간 항체 서열에서 대응하는 잔기를 치환할 수 있다. 인간 조작 단백질을 제조하기 위한 기법은 문헌[Studnicka et al., Protein Engineering 7:805-14 (1994)]; 미국 특허 제5,766,886호; 제5,770,196호; 5,821,123호; 및 제5,869,619호; 및 PCT 공개 WO 93/11794에 더 상세하게 기재되어 있다.
복합 인간 항체는, 예를 들어, Composite Human Antibody™ 기술(Antitope Ltd., 영국 캠브리지 소재)을 이용하여 생성될 수 있다. 복합 인간 항체를 생성하기 위해, 가변 영역은 T 세포 에피토프를 피하는 방식으로 다중 인간 항체 가변 영역 서열의 단편으로부터 설계되고, 이에 의해 얻어진 항체의 면역원성을 최소화한다.
탈면역화 항체는 T-세포 에피토프가 제거된 항체이다. 탈면역화 항체의 제조 방법이 기재되었다. 예를 들어, 문헌[Jones et al., Methods Mol Biol. 525:405-23 (2009), xiv, 및 De Groot et al., Cell. Immunol. 244:148-153(2006))]을 참조한다. 탈면역화된 항체는 T-세포 에피토프-고갈 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함한다. 간략히 말해서, 항체의 가변 영역은 클로닝되고, T-세포 에피토프는 후속적으로 T 세포 증식 검정에서 항체의 가변 영역으로부터 유래된 중복 펩타이드를 시험함으로써 확인된다. T 세포 에피토프는 인간 MHC 클래스 II에 대한 펩타이드 결합을 확인하기 위해 인실리코 방법을 통해 확인된다. 돌연변이는 인간 MHC 클래스 II에 대한 결합을 없애기 위해 가변 영역에 도입된다. 이어서, 돌연변이된 가변 영역은 탈면역화된 항체를 생성하는 데 이용된다.
5.2.3. 단일 도메인 항체 변이체
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CD20에 결합하는 단일 도메인 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 상정된다. 예를 들어, 특이성, 열 안정성, 발현 수준, 효과기 기능, 글리코실화, 감소된 면역원성 또는 용해도를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 최적화하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 CD20에 결합하는 단일 도메인 항체에 추가로, 본 명세서에 기재된 CD20에 결합하는 단일 도메인 항체의 변이체가 제조될 수 있다는 것이 상정된다. 예를 들어, 단일 도메인 항체 변이체는 적절한 뉴클레오타이드 변화를 암호화 DNA에 도입함으로써, 그리고/또는 목적하는 항체 또는 폴리펩타이드의 합성에 의해 제조될 수 있다. 당업자는 아미노산 변화가 단일 도메인 항체의 번역 후 과정을 변경시킬 수 있다는 것을 인식한다.
화학적 변형
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체는, 예를 들어, 단일 도메인 항체에 대한 임의의 유형의 분자의 공유 부착에 의해 화학적으로 변형된다. 항체 유도체는, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 포스포릴화, 아마이드화, 알려진 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 대한 결합, 또는 하나 이상의 면역글로불린 도메인(예를 들어, Fc 또는 Fc의 일부)에 대한 접합에 의해, 화학적으로 변형된 항체를 포함할 수 있다. 특정 화학적 절단, 아세틸화, 제형화, 튜니카마이신의 대사 합성 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다수의 기법에 의해 임의의 수많은 화학적 변형이 수행될 수 있다. 추가로, 항체는 하나 이상의 비고전적 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성될 수 있다.
본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체가 Fc 영역에 융합될 때, 이에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 대한 N-결합에 의해 일반적으로 부착되는 분지된, 2안테나 올리고당을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)] 참조. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스 및 시알산뿐만 아니라 2안테나 올리고당 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 프럭토스를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 특정 개선된 특성을 갖는 변이체를 생성하기 위해 본 명세서에 제공된 결합 분자에서의 올리고당 변형이 이루어질 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체가 Fc 영역에 융합될 때, 본 명세서에 제공된 항체 변이체는 상기 Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스를 결여하는 탄수화물 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, 이러한 항체에서 프럭토스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 프럭토스의 양은, 예를 들어 WO　2008/077546에 기재된 바와 같은 MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정된 바와 같은 Asn 297에 부착된 모든 글리코구조(예를 들어, 복합체, 혼성체 및 고 만노스 구조)의 합계에 대한, Asn297에서 당 쇄 내의 프럭토스의 평균량을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역에서 약 297번 위치(Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치된 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; 그러나, Asn297은 또한 항체 내 주요 서열 변형에 기인하여 297번 위치, 즉, 294번 위치와 300번 위치의 상류 또는 하류의 약 ± 3개의 아미노산에 위치될 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 US 2003/0157108호 및 US 2004/0093621호를 참조한다. "탈푸코실화된" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 관련된 간행물의 예는 미국 특허 제2003/0157108호; WO 2000/61739; WO 2001/29246; 미국 특허 제2003/0115614호; 미국 특허 제2002/0164328호; 미국 특허 제2004/0093621호; 미국 특허 제2004/0132140호; 미국 특허 제2004/0110704호; 미국 특허 제2004/0110282호; 미국 특허 제2004/0109865호; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌[Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]을 포함한다. 탈푸코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국 특허 출원 제2003/0157108; 및 WO　2004/056312, 특히 실시예 11), 및 넉아웃 세포주, 예컨대, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포(예를 들어, 문헌[Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688(2006)]; 및 WO2003/085107)를 포함한다.
본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체를 포함하는 결합 분자는 추가로 이등분된 올리고당이 제공되며, 예를 들어, 이때 Fc 영역에 부착된 2안테나 올리고당은 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 변이체의 예는, 예를 들어, WO 2003/011878(Jean-Mairet et al.); 미국 특허 제6,602,684호(Umana et al.); 및 미국 특허 제2005/0123546호(Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고당에서 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 변이체가 또한 제공된다. 이러한 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 변이체는, 예를 들어, WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에 기재되어 있다.
본 단일 도메인 항체 및 Fc 영역을 포함하는 분자에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 Fc 영역에 도입되어, Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 출원은 생체내 결합 분자의 반감기가 중요하지만 특정 효과기 기능(예컨대, 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 유해한 적용을 위한 바람직한 후보가 되게 하는 효과기 기능의 전부는 아니지만 일부를 갖는 변이체를 상정한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정은 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 결합 분자가 FcγR 결합(따라서 ADCC 활성을 결여할 가능성이 있음)을 결여하지만, FcRn 결합 능력을 보유한다는 것을 보장하기 위해 Fc 수용체(FcR) 결합 검정이 수행될 수 있다. 관심 대상의 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예는 미국 특허 출원 제5,500,362호(예를 들어, 문헌[Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)] 참조) 및 문헌[Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)]; 제5,821,337호(문헌Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비방사성 검정 방법(예를 들어, 유세포분석을 위한 ACTI™ 비-방사성 세포독성 검정(캘리포니아주 마운틴 뷰에 소재한 셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.); 및 CytoTox 96® 비-방사성 세포독성 검정(위스콘신주 메디슨에 소재한 프로메가(Promega))이 사용될 수 있다. 이러한 검정을 위한 유용한 효과기 세포는 말초혈액 단핵구 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 관심 대상 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, 문헌[Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. 항체가 C1q에 결합할 수 없으며 따라서 CDC 활성을 결여한다는 것을 확인하기 위한 C1q 결합 검정이 또한 수행될 수 있다. 예를 들어, WO　2006/029879 및 WO　2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA. 상보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). 당업계에 공지된 방법을 이용하여 FcRn 결합 및 생체내 클리어런스/반감기 결정이 또한 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
감소된 효과기 기능을 갖는 결합 분자는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것(미국 특허 제6,737,056호)을 포함한다. 이러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하는, 아미노산 265, 269, 270, 297 및 327번 위치 중 2 이상에서 돌연변이를 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다(미국 특허 제7,332,581호).
FcR에 대해 개선된 또는 감소된 결합을 갖는 특정 변이체가 기재된다. (예를 들어, 미국 특허 제6,737,056호; WO 2004/056312, 및 문헌[Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조)
일부 실시형태에서, 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, Fc 영역의 298, 333 및/또는 334번 위치에서의 치환(잔기의 EU 넘버링)을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 미국 특허 제6,194,551호, WO　99/51642, 및 문헌[Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 변경된(즉, 개선 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 초래하는 Fc 영역에서의 변형이 이루어진다.
태아에게 모체의 IgG 전달을 담당하는 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대해 개선된 결합 및 증가된 반감기를 갖는 결합 분자(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249(1994))가 US 2005/0014934A1(Hinton et al.)에 기재되어 있다. 해당 분자는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어, Fc 영역 잔기 434의 치환(미국 특허 제7,371,826호)을 갖는 것을 포함한다. 또한 Fc 영역 변이체의 다른 예에 관해 문헌[Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호; 및 WO 94/29351을 참조한다.
일부 실시형태에서, 시스테인 조작된 항체를 생성하는 것이 바람직할 수 있으며, 이때, 항체의 하나 이상의 잔기는 시스테인 잔기로 치환된다. 일부 실시형태에서, 치환된 잔기는 항체의 접근 가능한 부위에서 생긴다. 해당 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올기는 이에 의해 항체의 접근 가능한 부위에 위치되고, 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같은 면역접합체를 생성하기 위해, 다른 모이어티, 예컨대, 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 항체를 접합시키는 데 사용될 수 있다.
치환, 결실 또는 삽입
변이는 본래 항체 또는 폴리펩타이드에 비해서 아미노산 서열의 변화를 초래하는 단일 도메인 항체 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 대상 부위는 CDR 및 FR을 포함한다.
아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것, 예컨대, 류신의 세린으로의 대체, 예를 들어, 보존적 아미노산 대체의 결과일 수 있다. 당업자에게 공지된 표준 기법은, 예를 들어, 아미노산 치환을 초래하는 부위 지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발을 포함하는, 본 명세서에 제공된 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 돌연변이를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 삽입 또는 결실은 선택적으로 약 1 내지 5개의 아미노산 범위일 수 있다. 특정 실시형태에서, 치환, 결실 또는 삽입은 본래 분자에 비해서 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환 또는 2개 미만의 아미노산 치환을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 치환은 하나 이상의 예측된 비필수 아미노산 잔기에서 생성된 보존적 아미노산 치환이다. 허용되는 변이는 서열 내 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 생성하고, 얻어진 변이체를 모 항체에 의해 나타나는 활성에 대해 시험함으로써 결정될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 1개의 잔기 내지 다수 잔기를 함유하는 폴리펩타이드의 범위로 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단의 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다.
보존적 아미노산 치환에 의해 생성되는 단일 도메인 항체가 본 개시내용에 포함된다. 보존적 아미노산 치환에서, 아미노산 잔기는 유사한 전하를 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된다. 상기 기재한 바와 같이, 유사한 전하를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당업계에서 정의되었다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 알기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 대안적으로, 돌연변이는 암호화 서열의 모두 또는 일부를 따라서, 예컨대, 포화 돌연변이유발에 의해 무작위로 도입될 수 있고, 얻어진 돌연변이체는 활성을 보유하는 돌연변이체를 확인하기 위해 생물학적 활성에 대해 선별될 수 있다. 돌연변이유발 후에, 암호화된 단백질은 발현될 수 있고, 단백질의 활성은 결정될 수 있다. 특성을 유지하기 위해 또는 특성을 유의미하게 변화시키지 않기 위해 보존적(예를 들어, 유사한 특성을 갖는 아미노산기 및/또는 측쇄 내의) 치환이 이루어질 수 있다. 예시적인 치환을 아래의 표 3에 나타낸다.
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아미노산은 이들의 측쇄 특성의 유사성에 따라 그룹화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Lehninger, Biochemistry 73-75 (2d ed. 1975)] 참조): (1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) 비하전 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q); (3) 산성: Asp (D), Glu (E); 및 (4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H). 대안적으로, 천연 유래 잔기는 통상적인 측쇄 특성에 기반한 그룹으로 나눌 수 있다: (1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및 (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe. 예를 들어, 단일 도메인 항체의 적절한 구조를 유지하는 데 수반되지 않는 임의의 시스테인 잔기는 또한 다른 아미노산, 예컨대, 알라닌 또는 세린으로 치환되어, 분자의 산화적 안정성을 개선시키고 비정상적 가교를 방지한다. 비보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 가지 유형은 모 항체(예를 들어, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 얻어진 변이체(들)는 모 항체에 비해 특정 생물학적 특성(예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형(예를 들어, 개선)을 가질 것이고/이거나 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환 변이체는, 예를 들어, 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기법, 예컨대, 본 명세서에 기재된 것을 이용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게, 하나 이상의 CDR 잔기는 돌연변이되고, 변이체 항체는 파지 상에서 나타나며, 특정 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화도)에 대해 선별된다.
변경(예를 들어, 치환)은, 예를 들어, 항체 친화도를 개선시키기 위해 CDR에서 생성될 수 있다. 이러한 변경은 CDR "핫스팟(hotspot)", 즉, 체세포 돌연변이 과정 동안 고친화도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의하 암호화된 잔기(예를 들어, 문헌[Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조) 및/또는 SDR(a-CDR)에서 생성될 수 있으며, 얻어진 변이체 항체 또는 이의 단편은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터 작제하고 재선택하는 것에 의한 친화도 성숙은, 예를 들어, 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., 인간 Press, Totowa, NJ, (2001))]에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시형태에서, 다양성은 임의의 다양한 방법(예를 들어, 실수 유발 PCR, 쇄 셔플링(chain shuffling) 또는 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내로 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리가 생성된다. 이어서, 목적하는 친화도로 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 라이브러리가 선별된다. 다양성을 도입하기 위한 다른 방법은 몇몇 CDR 잔기(예를 들어, 한 번에 4 내지 6개의 잔기)가 무작위화되는 CDR-유도 접근을 수반한다. 항원 결합에 수반된 CDR 잔기는, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 특이적으로 확인될 수 있다. 친화도 성숙에 관한 더 상세한 설명은 아래 부문에 제공된다.
일부 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은, 이러한 변경은 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 CDR 내에서 생길 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 보존적 치환)은 CDR에서 이루어질 수 있다. 본 명세서에 제공된 변이체 VHH 서열의 일부 실시형태에서, 각각의 CDR은 비변경되거나, 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 문헌[Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 그룹(예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu)이 확인되고, 항체의 항원과의 상호작용이 영향 받는지의 여부를 결정하기 위해 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체된다. 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 입증하는 아미노산 위치에 추가적인 치환이 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 항체와 항원 사이의 접촉 지점을 확인하기 위해 항원-항체의 결정 구조는 복합체화된다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 목적하는 특성을 함유하는지의 여부를 결정하기 위해 선별될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드의 범위인 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단의 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 (예를 들어, ADEPT에 대한) 효소 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드의 N- 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.
변이는 올리고뉴클레오타이드-매개(부위-지정) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이유발과 같은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 이루어질 수 있다. 부위-지정 돌연변이유발(예를 들어, 문헌[Carter, Biochem J. 237:1-7 (1986); 및 Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10:6487-500 (1982)] 참조), 카세트 돌연변이유발(예를 들어, 문헌[Wells et al., Gene 34:315-23 (1985)] 참조) 또는 다른 공지된 기법은 단일 도메인 항체 변이체 DNA를 생산하기 위해 클로닝된 DNA 상에서 수행될 수 있다.
5.2.4. 시험관내 친화도 성숙
일부 실시형태에서, 모 항체에 비해 개선된 특성, 예컨대, 친화도, 안정성 또는 발현 수준을 갖는 항체 변이체는 시험관내 친화도 성숙에 의해 제조될 수 있다. 천연 원형과 같이, 시험관내 친화도 성숙은 돌연변이 및 선택 원칙에 기반한다. 항체의 라이브러리는 유기체(예를 들어, 파지, 박테리아, 효모 또는 포유류 세포) 표면 상에서 또는 이들의 암호화 mRNA 또는 DNA와 결합하여(예를 들어, 공유 또는 비공유로) 나타난다. 디스플레이된 항체의 친화도 선택은 항체를 암호화하는 유전자 정보를 운반하는 유기체 또는 복합체의 단리를 가능하게 한다. 파지 디스플레이와 같은 디스플레이 방법을 이용하는 2 또는 3회 라운드의 돌연변이 및 선택은 보통 낮은 나노몰 범위의 친화도로 항체 단편을 생성한다. 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화도를 가질 수 있다.
파지 디스플레이는 항체의 디스플레이 및 선택에 대해 널리 퍼져 있는 방법이다. 항체는 박테리오파지 외피 단백질에 대한 융합체로서 Fd 또는 M13 박테리오파지의 표면 상에서 나타난다. 선택은 "패닝(panning)"으로 지칭되는 과정인 파지-디스플레이 항체가 이들의 표적에 결합하는 것을 가능하게 하기 위해 항원에 대한 노출을 수반한다. 항원에 결합된 파지는 회수되고, 추가적인 선택 라운드를 위한 파지를 생성하기 위해 박테리아를 감염시키는 데 사용된다. 검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Hoogenboom, Methods. Mol. Biol. 178:1-37 (2002); 및 Bradbury and Marks, J. Immunol. Methods 290:29-49 (2004)]을 참조한다.
효모 디스플레이 시스템에서(예를 들어, 문헌[Boder et al., Nat. Biotech. 15:553-57 (1997); 및 Chao et al., Nat. Protocols 1:755-68 (2006)] 참조), 항체는 Aga1p에 대한 이황화결합을 통해 효모 세포벽에 부착되는 효모 응집소 단백질 Aga2p의 접착 서브유닛에 융합될 수 있다. Aga2p를 통한 단백질의 디스플레이는 세포 표면으로부터 단백질을 돌출시켜, 효모 세포벽 상에서 다른 분자와의 잠재적 상호작용을 최소화한다. 개선된 친화도 또는 안정성을 갖는 항체를 선택하도록 라이브러리를 선별하기 위해 자기 분리 및 유세포분석이 사용된다. 관심의 가용성 항원에 대한 결합은 바이오틴일화된 항원 및 2차 시약, 예컨대, 형광단에 접합된 스트렙타비딘에 의한 효모의 표지에 의해 결정된다. 항체의 표면 발현에서의 변이는 단일쇄 항체(예를 들어, scFv)에 측접하는 혈구응집소 또는 c-Myc 에피토프 태그의 면역형광 표지를 통해 측정될 수 있다. 발현은 디스플레이된 단백질의 안정성과 상관관계가 있는 것으로 나타났고, 따라서 항체는 개선된 안정성뿐만 아니라 친화도에 대해 선택될 수 있다(예를 들어, 문헌[Shusta et al., J. Mol. Biol. 292:949-56 (1999)] 참조). 효모 디스플레이의 추가적인 이점은 디스플레이된 단백질이 진핵 효모 세포의 소포체에서 폴딩되어, 소포체 샤페론 및 품질 관리 기작을 이용한다는 것이다. 일단 성숙이 완료되면, 항체 친화도는 편리하게 "적정"될 수 있는 한편, 효모 표면 상에서 디스플레이되어, 각 클론의 발현 및 정제에 대한 필요를 제거한다. 효모 표면 디스플레이의 이론적 제거는 다른 디스플레이 방법보다 잠재적으로 더 작은 기능성 라이브러리 크기이지만; 그러나, 최근의 접근은 크기가 1014인 것으로 추정되는 조합 다양성을 생성하기 위해 효모 세포 교배 시스템을 사용한다(예를 들어, 미국 특허 공개 제2003/0186374호; 및 문헌[Blaise et al., Gene 342:211-18 (2004)] 참조).
리보솜 디스플레이에서, 항체-리보솜-mRNA(ARM) 복합체는 무세포 시스템에서 선택을 위해 생성된다. 항체의 특정 라이브러리에 대해 암호화하는 DNA 라이브러리는 정지 코돈이 없는 스페이서 서열에 유전적으로 융합된다. 이런 스페이서 서열은, 번역될 때, 여전히 펩타이딜 tRNA에 부착되고, 리보솜 터널을 점유하며, 따라서 관심 단백질이 리보솜 외부로 돌출되고 폴딩되는 것을 가능하게 한다. mRNA, 리보솜 및 단백질의 얻어진 복합체는 표면-결합 리간드에 결합되어, 리간드에 의한 친화도 포착을 통해 항체 및 이의 암호화 mRNA의 자발적 단리를 가능하게 할 수 있다. 이어서, 리보솜-결합 mRNA는 cDNA로 다시 역전사되고, 이어서, 돌연변이유발을 겪을 수 있고, 다음 선택 라운드에서 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Fukuda et al., Nucleic Acids Res. 34:e127 (2006)] 참조). mRNA 디스플레이에서, 항체와 mRNA 사이의 공유 결합은 어댑터 분자로서 퓨로마이신을 이용하여 확립된다(Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:3750-55 (2001)).
이들 방법은 전적으로 시험관내에서 수행되기 때문에, 이들은 다른 선택 기술보다 2가지의 주된 이점을 더 제공한다. 첫째로, 라이브러리의 다양성은 박테리아 세포의 형질전환 효율에 의해서는 제한되지 않지만, 시험관에 존재하는 리보솜 수 및 상이한 mRNA 분자에 의해서는 제한된다. 둘째로, 임의의 다양화 단계 후에 형질전환되는 라이브러리는 없기 때문에, 무작위 돌연변이는 각 선택 라운드 후에, 예를 들어, 비-프루프리딩 중합효소에 의해 용이하게 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 포유류 디스플레이 시스템이 사용될 수 있다.
또한 표적화된 방식으로 또는 무작위 도입을 통해 항체 라이브러리의 CDR에 다양성이 도입될 수 있다. 전자의 접근은 높은 또는 낮은 수준의 돌연변이유발을 통해 항체의 모든 CDR을 순차적으로 표적화하는 것 또는 체세포 초돌연변이의 단리된 핫 스팟(예를 들어, 문헌[Ho et al., J. Biol. Chem. 280:607-17 (2005)] 참조) 또는 실험 기반 또는 구조적 이유로 친화도에 영향을 미치는 것으로 의심되는 잔기를 표적화하는 것을 포함한다. 또한 DNA 셔플링 또는 유사한 기법을 통해 자연적으로 다양한 영역의 대체에 의해 다양성이 도입될 수 있다(예를 들어, 문헌[Lu et al., J. Biol. Chem. 278:43496-507 (2003)]; 미국 특허 제5,565,332호 및 제6,989,250호 참조). 대안의 기법으로서, 프레임워크-영역 잔기로 연장되는 표적 초가변 루프(예를 들어, 문헌[Bond et al., J. Mol. Biol. 348:699-709 (2005)] 참조)는 CDR에서 루프 결실 및 삽입을 사용하거나, 또는 혼성-기반 다양화를 사용한다(예를 들어, 미국 특허 공개 제2004/0005709호 참조). CDR에서 다양성을 생성하는 추가적인 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제7,985,840호에 개시되어 있다. 항체 라이브러리 및/또는 항체 친화도 성숙을 생성하기 위해 사용될 수 있는 추가적인 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제8,685,897호 및 제8,603,930호 및 미국 특허 공개 제2014/0170705호, 제2014/0094392호, 제2012/0028301호, 제2011/0183855호 및 제2009/0075378호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
라이브러리의 선별은 당업계에 공지된 다양한 기법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 단일 도메인 항체는 고체 지지체, 칼럼, 핀 또는 셀룰로스/폴리(비닐리덴 플루오라이드) 막/기타 필터 상에 고정되거나, 흡착 플레이트에 고정된 숙주 세포 상에서 발현되거나, 또는 세포 분류에서 사용되거나, 스트렙타비딘-코팅 비드에 의한 포획을 위해 바이오틴에 접합되거나, 또는 디스플레이 라이브러리를 패닝하는 임의의 다른 방법에서 사용될 수 있다.
시험관내 친화도 성숙 방법의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Hoogenboom, Nature Biotechnology 23:1105-16 (2005); Quiroz and Sinclair, Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51 (2010)]; 및 이들의 참고문헌을 참조한다.
5.2.5. 단일 도메인 항체의 변형
단일 도메인 항체의 공유 변형은 본 개시내용의 범주 내에 포함된다. 공유 변형은 단일 도메인 항체의 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 단일 도메인 항체의 표적화된 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 다른 변형은 글루타민일 및 아스파라긴일 잔기의 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파틸 잔기로의 탈아마이드화, 프로필 및 라이신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실기의 포스포릴화, 라이신, 알기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화(예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties 79-86 (1983)]), N-말단 아민의 아세틸화 및 임의의 C-말단 카복실기의 아마이드화를 포함한다.
이런 본 개시내용의 범주 내에 포함된 단일 도메인 항체의 다른 유형의 공유 변형은 상기 기재한 바와 같은 항체 또는 폴리펩타이드의 천연 글리코실화 패턴의 변경(예를 들어, 문헌[Beck et al., Curr. Pharm. Biotechnol. 9:482-501 (2008); 및 Walsh, Drug Discov. Today 15:773-80 (2010)]), 및 예를 들어, 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호; 또는 제4,179,337호에 제시된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 대한 항체의 연결을 포함한다. 본 개시내용의 CD20에 결합하는 단일 도메인 항체는 또한 반감기를 연장시기키 위해 그리고/또는 알려진 Fc-매개 효과기 기능을 부여하기 위해 하나 이상의 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부(예를 들어, Fc)에 유전적으로 융합 또는 접합될 수 있다.
본 개시내용의 CD20에 결합하는 단일 쇄 항체는 또한 다른 이종성 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열, 예를 들어, 에피토프 태그(예를 들어, 문헌[Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:523-33 (2003)]) 또는 IgG 분자의 Fc 영역(예를 들어, 문헌[Aruffo, Antibody Fusion Proteins 221-42 (Chamow and Ashkenazi eds., 1999)] 참조)에 융합된 CD20에 결합하는 단일 쇄 항체를 포함하는 키메라 분자를 형성하도록 변형될 수 있다. CD20에 결합하는 단일 쇄 항체는 또한 아래에 더욱 상세하게 기재하는 바와 같이 CD20 결합 키메라 항원 수용체(CAR)를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
또한 본 개시내용 및 이종성 폴리펩타이드의 CD20에 결합하는 단일 쇄 항체를 포함하는 융합 단백질이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항체가 유전적으로 융합 또는 화학적으로 접합된 이종성 폴리펩타이드는 세포 표면-발현된 CD20을 갖는 세포에 항체를 표적화하는 데 유용하다.
또한 본 명세서에서 CD20 항원에 결합하는 항체의 패널이 제공된다. 구체적 실시형태에서, 항체의 패널은 상이한 회합 속도, 상이한 해리 속도, CD20 항원에 대한 상이한 친화도 및/또는 CD20 항원에 대한 상이한 특이성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 패널은 약 10 내지 약 1000개 이상의 항체를 포함하거나, 이들로 이루어진다. 항체의 패널은 ELISA와 같은 검정을 위해, 예를 들어, 96-웰 또는 384-웰 플레이트에서 사용될 수 있다.
5.2.6. 단일 도메인 항체의 제조
단일 도메인 항체의 제조 방법이 기재되었다. 예를 들어, 문헌[Els Pardon et al, Nature Protocol, 9(3): 674 (2014)]을 참조한다. 당업계에 공지된 방법을 이용하여, 예컨대, 낙타과 종(예컨대, 낙타 또는 라마)을 면역화시키고, 이로부터 하이브리도마를 얻음으로써, 또는 당업계에 공지된 분자 생물학 기법 및 비선택 라이브러리의 개개 클론으로 ELISA에 의한 후속적 선택을 이용하여 단일 도메인 항체의 라이브러리를 클로닝시킴으로써 또는 파지 디스플레이를 이용함으로써 단일 도메인 항체(예컨대, VHH)가 얻어질 수 있다.
본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체는 단일 도메인 항체-암호화 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 생산될 수 있다. 본 개시내용의 항체의 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 표준 재조합 기법을 이용하여 얻을 수 있다. 목적하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 항체 생성 세포, 예컨대, 하이브리도마 세포 또는 B 세포로부터 단리되고 서열분석될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 합성기 또는 PCR 기법을 이용하여 합성될 수 있다. 일단 얻어지면, 숙주 세포에서 이종성 폴리뉴클레오타이드를 복제하고 발현시킬 수 있는 재조합 벡터 내로 폴리펩타이드를 암호화하는 서열이 삽입된다. 당업계에서 이용 가능하고 공지되어 있는 다수의 벡터는 본 개시내용의 목적을 위해 사용될 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 벡터 내로 삽입될 핵산의 크기 및 벡터에 의해 형질전환될 특정 숙주 세포에 주로 의존할 것이다. 본 개시내용의 항체를 발현시키는 데 적합한 숙주 세포는 그램-음성 또는 그램-양성 유기체를 비롯한 고세균 및 진정세균과 같은 원핵 생물, 진핵 미생물, 예컨대, 섬유성 진균 또는 효모, 무척추동물 세포, 예컨대, 곤충 또는 식물 세포, 및 척추동물 세포, 예컨대, 포유류 숙주 세포주를 포함한다. 숙주 세포는 상기 기재한 발현 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나 형질전환체를 선택하거나 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키는 데 적절한 바와 같이 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다. 숙주 세포에 의해 생성된 항체는 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 정제된다.
벡터 작제, 발현 및 정제를 포함하는 항체 생산을 위한 방법은 문헌[
Figure pct00011
et al., Antibody Engineering: Producing antibodies in Escherichia coli: From PCR to fermentation 203-52 (McCafferty et al. eds., 1996); Kwong and Rader, E. coli Expression and Purification of Fab Antibody Fragments, in Current Protocols in Protein Science (2009); Tachibana and Takekoshi, Production of Antibody Fab Fragments in Escherichia coli, in Antibody Expression and Production (Al-Rubeai ed., 2011); 및 Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An ed., 2009)]에 추가로 기재된다.
물론, 당업계에 잘 공지된 대안의 방법이 항-CD20 단일 도메인 항체를 준비하는 데 사용될 수 있다는 것이 상정된다. 예를 들어, 적절한 아미노산 서열 또는 이의 일부는 고체상 기법을 이용하여 직접 펩타이드 합성에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1969); 및 Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-54(1963)] 참조). 시험관내 단백질 합성은 수동 기법을 이용하여 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 항-CD20 항체의 다양한 부분은 화학적으로 별도로 합성될 수 있고, 목적하는 항-CD20 항체를 생성하기 위해 화학적 또는 효소적 방법을 이용하여 조합될 수 있다. 대안적으로, 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제5,545,807호 및 제5,827,690호에 개시된 바와 같이, 세포 또는 체액, 예컨대, 항체를 발현시키도록 조작된 유전자이식 동물의 유즙으로부터 정제될 수 있다.
구체적으로, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체, 또는 다른 CD20 결합제는 라마 면역화, 단일 B-세포 분류의 수행, V-유전자 추출 착수, CD20 결합제, 예컨대, VHH-Fc 융합체 클로닝 및 이어서, 소규모 발현 및 정제의 수행에 의해 생성될 수 있다. ELISA-양성, BLI-양성 및 100nM 미만의 KD 선택 중 하나 이상을 포함하는, CD20에 결합하는 단일 도메인 항체 및 다른 분자의 추가적인 선별이 수행될 수 있다. 이들 선택 기준은 아래의 부문 6에 기재되는 바와 같이 조합될 수 있다. 추가적으로, 개개 VHH 결합제(및 CD20에 결합하는 다른 분자)는 CD20을 발현시키는 세포에 이들이 결합하는 능력에 대해 검정될 수 있다. 이러한 검정은 CD20을 발현시키는 세포에 의한 FACS 분석을 이용하고, 형광-표지된 VHH 분자의 평균 형광 강도(MFI)를 측정하여 수행될 수 있다. 상기 언급한 다양한 양상은 아래에 더욱 상세하게 기재된다.
다클론성 항체
다클론성 항체는 일반적으로 적절한 항원 및 아주반트의 다회 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사에 의해 동물에서 상승된다. 면역화될 종에서 2작용성 또는 유도체화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스터(시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시석신이미드(라이신 잔기를 통해), 글루타르알데하이드, 석신 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR(R 및 R1은 독립적으로 저급 알킬기임)을 이용하여 면역원성인 단백질, 예를 들어, 키홀 림펫 헤모사이아닌(keyhole limpet hemocyanin: (KLH), 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 저해제에 적절한 항원을 접합시키는 데 유용할 수 있다. 사용될 수 있는 아주반트의 예는 프로인트 완전 아주반트 및 MPL-TDM 아주반트(모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 다이코리노미오콜레이트)를 포함한다. 면역화 프로토콜은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 선택될 수 있다.
예를 들어, 동물은, 예를 들어, 100㎍ 또는 5㎍의 단백질 또는 접합체(각각 토끼 또는 마우스에 대해)를 3용적의 프로인트 완전 아주반트와 조합하고, 다중 부위에서 진피내로 용액을 주사함으로써 항원, 면역원성 접합체, 또는 유도체에 대해 면역화된다. 1개월 후에, 동물은 다중 부위에서 피하 주사에 의해 프로인트 완전 아주반트에서 펩타이드 또는 접합체의 본래의 양의 1/5 또는 1/10로 부스팅된다. 7 내지 14일 후에, 동물을 방혈시키고, 항체 역가에 대해 혈청이 검정된다. 동물은 역가 안정기까지 부스팅된다. 접합체는 또한 융합 단백질로서 재조합 세포 배양물에서 생성될 수 있다. 또한, 응집제, 예컨대, 명반은 면역 반응을 향상시키는 데 적합하다.
단클론성 항체
단클론성 항체는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 얻으며, 즉, 집단을 포함하는 개개 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 유래 돌연변이 및/또는 번역 후 변형(예를 들어, 이성질체화, 아미드화)을 제외하고 동일하다. 따라서, 수식어 "단클론성"은 항체의 특징을 별개의 항체의 혼합물로서 나타낸다.
예를 들어, 단클론성 항체는 문헌[Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 의해 처음 기재된 하이브리도마 방법을 이용하여 생성될 수 있거나, 재조합 DNA 방법에 의해 생성될 수 있다(미국 특허 제4,816,567호).
하이브리도마 방법에서, 적절한 숙주 동물은 면역화를 위해 사용되는 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유발하기 위해 면역화된다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 이어서, 림프구는 적합한 융합제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986).
면역화제는 전형적으로 항원성 단백질 또는 이의 융합 변이체를 포함할 것이다. 문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103]. 불멸 세포주는 보통 형질전환된 포유류 세포이다. 이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 파종되고, 바람직하게는 비융합, 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 성장된다. 바람직한 불멸 골수종 세포는 효율적으로 융합하며, 선택된 항체-생성 세포에 의해 항체의 안정적인 고수준 생성을 뒷받침하고, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 것이다.
하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지는 항원으로 향하는 단클론성 항체의 생성에 대해 검정된다. 혼성 세포가 배양되는 배양 배지는 목적하는 항원으로 향하는 단클론성 항체의 존재에 대해 검정될 수 있다. 이러한 기법 및 검정은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 결합 친화도는 문헌[Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐처드 분석에 의해 결정될 수 있다.
목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인된 후에, 클론은 희석 절차를 제한함으로써 서브클로닝될 수 있고, 표준 방법(Goding, 상기 참조)에 의해 성장된다. 이런 목적에 대한 적합한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 추가로, 하이브리도마 세포는 포유류에서 생체내에서 종양으로서 성장될 수 있다.
서브클론에 의해 분비되는 단클론성 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예컨대, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
단클론성 항체는 또한 재조합 DNA 방법, 예컨대, 미국 특허 제4,816,567호에 기재되어 있고, 상기 기재된 바와 같은 방법에 의해 생성될 수 있다. 단클론성 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여(예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용함으로써) 용이하게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터 내로 위치되고, 이어서, 숙주 세포, 예컨대, 이콜라이(E. coli) 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염되어, 이러한 숙주 세포에서 단클론성 항체를 합성한다. 항체를 암호화하는 DNA의 박테리아에서 재조합 발현에 대한 검토 논문은 문헌[Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) 및 Pliickthun, Immunol. Revs. 130:151-188(1992)]을 포함한다.
추가 실시형태에서, 항체는 문헌[McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기법을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 문헌[Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol.,222:581-597(1991)]. 후속 간행물은 쇄 셔플링에 의한 고친화도(nM 범위) 인간 항체의 생성(Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992))뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 작제하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합(Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993))을 기재한다. 따라서, 이들 기법은 단클론성 항체의 단리를 위한 전통적인 단클론성 항체 하이브리도마 기법에 대한 실행 가능한 대안이다.
DNA는 또한, 예를 들어, 암호화 서열을 치환함으로써(미국 특허 제4,816,567호; 문헌[Morrison, et al., Proc. NatlAcad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]), 또는 비-면역글로불린 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열의 모두 또는 일부를 암호화 서열에 공유 결합함으로써, 변형될 수 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩타이드는 항원에 대해 특이성을 갖는 하나의 항원-조합 부위 및 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 다른 항원-조합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성하도록 치환될 수 있다.
키메라 또는 혼성 항체는 또한 가교제를 수반하는 것을 포함하는 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 이용하여 시험관내에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역독소는 이황화물-교환 반응을 이용하여 또는 티오에터 결합을 형성함으로써 작제될 수 있다. 이 목적을 위한 적합한 시약의 예는 이미노티오에이트 및 메틸-4-머캅토뷰티르이미데이트를 포함한다.
원핵 세포에서의 재조합체 생성
본 개시내용의 항체를 암호화하는 폴리핵산 서열은 표준 재조합 기법을 이용하여 얻을 수 있다. 목적하는 폴리핵산 서열은 항체 생성 세포, 예컨대, 하이브리도마 세포로부터 단리되고 서열분석될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 합성기 또는 PCR 기법을 이용하여 합성될 수 있다. 일단 얻어지면, 원핵 숙주에서 이종성 폴리뉴클레오타이드를 복제하고 발현시킬 수 있는 재조합 벡터 내로 폴리펩타이드를 암호화하는 서열이 삽입된다. 당업계에서 이용 가능하고 공지되어 있는 다수의 벡터는 본 개시내용의 목적을 위해 사용될 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 벡터 내로 삽입될 핵산의 크기 및 벡터에 의해 형질전환될 특정 숙주 세포에 주로 의존할 것이다. 각각의 벡터는 이의 기능(이종성 폴리뉴클레오타이드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 다) 및 이것이 존재하는 특정 숙주 세포와의 양립 가능성에 따라서 다양한 성분을 함유한다. 벡터 성분은 일반적으로 복제 기점, 선택 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위(ribosome binding site: RBS), 신호 서열, 이종성 핵산 삽입물 및 전사 종결 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일반적으로, 숙주 세포와 양립 가능한 종으로부터 유래된 레플리콘 및 조절 서열을 함유하는 플라스미드 벡터는 이들 숙주와 관련하여 사용된다. 벡터는 보통 복제 부위뿐만 아니라 형질전환 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 서열을 운반한다. 예를 들어, 이콜라이는 전형적으로 이콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 이용하여 형질전환된다. 특정 항체의 발현을 위해 사용되는 pBR322 유도체의 예는 카터(Carter) 등의 미국 특허 제5,648,237호에 상세하게 기재되어 있다.
추가로, 숙주 미생물과 양립 가능한 레플리콘 및 조절 서열을 함유하는 파지 벡터는 이들 숙주와 관련하여 형질전환 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 박테리오파지, 예컨대, GEM™-11은 이콜라이 LE392와 같은 감수성 있는 숙주 세포를 형성전환시키기 위해 사용될 수 있는 재조합 벡터를 제조하는 데 이용될 수 있다.
본 출원의 발현 벡터는 폴리펩타이드 성분 각각을 암호화하는 둘 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 이의 발현을 조절하는 시스트론에 대해 상류에(5') 위치된 비번역 조절 서열이다. 원핵 프로모터는 전형적으로 2개의 부류, 즉, 유도성 및 구성적 부류에 속한다. 유도성 프로모터는 배양 조건에서의 변화, 예를 들어, 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도의 변화에 반응하여 제어 하에 시스트론의 전사 수준 증가를 개시하는 프로모터이다.
다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터는 잘 공지되어 있다. 선택된 프로모터는 제한 효소 분해를 통해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고 삽입된 프로모터 서열을 본 출원의 벡터 내로 삽입함으로써 본 항체를 암호화하는 시스트론 DNA에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열과 다수의 이종성 프로모터는 둘 다 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종성 프로모터가 이용되는데, 이들은 일반적으로 천연 표적 폴리펩타이드 프로모터에 비해 더 큰 전사 및 고수율의 발현된 표적 유전자를 허용하기 때문이다.
원핵 세포와 함께 사용하는 데 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, -갈락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템 및 혼성 프로모터, 예컨대, tac 또는 trc 프로모터를 포함한다. 그러나, 박테리아(예컨대, 다른 공지된 박테리아 또는 파지 프로모터)에서 기능성인 다른 프로모터도 적합하다. 이들의 핵산 서열은 공개되어 있고, 이에 의해 당업자는 임의의 필요한 제한 부위를 공급하기 위해 링커 또는 어댑터를 이용하여 표적 펩타이드를 암호화하는 시스트론에 작동 가능하게 연결할 수 있다(Siebenlist et al. Cell 20: 269 (1980)).
일 양상에서, 재조합 벡터 내의 각각의 시스트론은 막에 걸쳐 발현된 폴리펩타이드의 전위를 지시하는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터 성분일 수 있거나, 또는 벡터 내로 삽입된 표적 폴리펩타이드 DNA의 부분일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택된 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 가공되는(즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이어야 한다. 이종성 폴리펩타이드에 대해 천연인 신호 서열을 인식하거나 가공하지 않는 원핵 숙주 세포에 대해, 신호 서열은, 예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, Ipp 또는 열-안정 엔테로톡신 II(STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어진 군으로부터 선택되는 원핵 신호 서열로 치환될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 항체의 생산은 숙주 세포의 세포질에서 일어날 수 있고, 따라서 각각의 시스트론 내의 분비 신호 서열의 존재를 필요로 하지 않는다. 특정 숙주 균주(예를 들어, 이콜라이 trxB- 균주)는 이황화결합 형성에 바람직한 세포질 조건을 제공하여, 발현된 단백질 소단위의 적절한 폴딩 및 조립을 허용한다.
본 개시내용의 항체를 발현시키는 데 적합한 원핵 숙주 세포는 원시세균(Archaebacteria) 및 진정세균(Eubacteria), 예컨대, 그램-음성 또는 그램-양성 유기체를 포함한다. 유용한 박테리아의 예는 에스케리키아(Escherichia)(예를 들어, 이콜라이), 바실리(Bacilli)(예를 들어, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)), 엔테로박테리아(Enterobacteria), 슈도모나스 종(Pseudomonas species)(예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa)), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세칸스(Serratia marcescans), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 쉬겔라(Shigella), 리조비아(Rhizobia), 비트레오실라(Vitreoscilla) 또는 파라코커스(Paracoccus)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 그램-음성 세포가 사용된다. 일 실시형태에서, 이콜라이 세포는 숙주로서 사용된다. 이콜라이 균주의 예는 유전자형 W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc-fepE) degP41 kanR을 갖는 균주 33D3을 포함하는, 균주 W3110(Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposit No. 27,325) 및 이의 유도체를 포함한다(미국 특허 제5,639,635호). 다른 균주 및 이의 유도체, 예컨대, 이콜라이 294(ATCC 31,446), 이콜라이 B, 이콜라이 1776(ATCC 31,537) 및 이콜라이 RV308(ATCC 31,608)이 또한 적합하다. 이들 예는 제한이라기 보다는 예시적이다. 정해진 유전자형을 갖는 임의의 상기 언급한 박테리아의 유도체를 작제하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)]에 기재되어 있다. 일반적으로 박테리아의 세포 내로의 레플리콘의 복제능력을 고려하여 적절한 박테리아를 선택할 필요가 있다. 레플리콘을 공급하기위해 잘 공지되어 있는 플라스미드, 예컨대, pBR322, pBR325, pACYC177 또는 pKN410이 사용될 때, 예를 들어, 이콜라이, 세라티아 또는 살모넬라 종이 숙주로서 적합하게 사용될 수 있다.
전형적으로 숙주 세포는 최소량의 단백질분해 효소를 분비하여야 하고, 추가적인 프로테아제 저해제는 세포 배양물에 바람직하게 혼입될 수 있다.
숙주 세포는 상기 기재한 발현 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나 형질전환체를 선택하거나 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키는 데 적절한 바와 같이 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다. 형질전환은 DNA가 복제 가능하도록 염색체 요소로서 또는 염색체 구성성분에 의해 원핵 숙주 내로 DNA를 도입하는 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 따라서, 형질전환은 이러한 세포에 적절한 표준 기법을 이용하여 행해진다. 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리는 실질적인 세포벽 장벽을 함유하는 박테리아 세포에 대해 일반적으로 사용된다. 형질전환을 위한 다른 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 사용되는 또 다른 기법은 전기천공법이다.
본 출원의 항체를 생성하기 위해 사용되는 원핵 세포는 당업계에 공지된 배지에서 성장되고, 선택된 숙주 세포의 배양에 적합하다. 적합한 배지의 예는 루리아 브로스(luria broth: LB) + 필수 영양 보충물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 또한 발현 벡터를 함유하는 원핵 세포의 성장을 선택적으로 허용하기 위해 발현 벡터의 작제에 기반하여 선택된 선택제를 함유한다. 예를 들어, 암피실린은 암피실린 내성 유전자를 발현시키는 세포의 성장을 위한 배지에 첨가된다.
탄소, 질소 및 무기 인산염 공급원 이외의 임의의 필수적인 공급원은 또한 단독으로서 또는 다른 보충물 또는 배지, 예컨대, 복합 질소 공급원과의 혼합물로서 적절한 농도로 포함될 수 있다. 선택적으로 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 다이티오에리트리톨 및 다이티오트레이톨로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 환원제를 함유할 수 있다. 원핵 숙주 세포는 적합한 온도 및 pH에서 배양된다.
유도성 프로모터가 본 출원의 발현 벡터에서 사용된다면, 프로모터의 활성화에 적합한 조건 하에 단백질 발현이 유도된다. 본 출원의 일 양상에서, PhoA 프로모터는 폴리펩타이드의 전사를 제어하기 위해 사용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 유도를 위해 인산염-제한 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 인산염-제한 배지는 C.R.A.P 배지이다(예를 들어, 문헌[Simmons et al., J. Immunol. Methods 263:133-147 (2002)] 참조). 벡터 작제물에 따라 당업계에 공지된 바와 같은 다양한 다른 유도제가 사용될 수 있다.
본 개시내용의 발현된 항체는 숙주 세포 내로 분비되고, 숙주 세포의 주변세포질로부터 회수된다. 단백질 회수는 전형적으로 일반적으로 삼투압 충격, 음파처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 미생물을 분해하는 것을 수반한다. 일단 세포가 붕괴되면, 세포 파편 또는 전체 세포는 원심분리 또는 여과에 의해 제거될 수 있다. 단백질은, 예를 들어, 친화도 수지 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다. 대안적으로, 단백질은 배양 배지로 운반되고 단리될 수 있다. 세포는 배양물로부터 제거될 수 있고, 배양물 상청액은 여과되며, 생성된 단백질의 추가적인 정제를 위해 농축된다. 발현된 폴리펩타이드는 통상적으로 공지된 방법, 예컨대, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis: PAGE) 및 웨스턴 블롯 검정을 이용하여 추가로 단리되고 확인될 수 있다.
대안적으로, 단백질 생성은 발효 공정에 의해 대량으로 수행된다. 다양한 대규모 유가식 발효 절차는 재조합 단백질의 생성을 위해 이용 가능하다. 본 개시내용의 항체의 생성 수율 및 품질을 개선시키기 위해, 다양한 발효 조건이 변형될 수 있다. 샤페론 단백질은 박테리아 숙주 세포에서 생성된 이종성 단백질의 적절한 폴딩 및 용해도를 용이하게 하는 것으로 입증되었다. 문헌[Chen et al. J Bio Chem 274:19601-19605 (1999)]; 미국 특허 제6,083,715호; 미국 특허 제6,027,888호; 문헌[Bothmann and Pluckthun, J. Biol. Chem. 275:17100-17105 (2000); Ramm and Pluckthun, J. Biol. Chem. 275:17106-17113 (2000); Arie et al., Mol. Microbiol. 39:199-210 (2001)].
예를 들어, 미국 특허 제5,264,365호; 미국 특허 제5,508,192호; 문헌[Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)]에 기재된 바와 같이, 발현된 이종성 단백질(특히 단백질 분해에 민감한 것)의 단백질 분해를 최소화하기 위해, 단백질 분해 효소를 결여하는 특정 숙주 균주가 본 발명에 사용될 수 있다. 단백질 분해 효소를 결여하며 하나 이상의 샤페론 단백질을 과발현시키는 플라스미드로 형질전환된 이콜라이 균주는 본 출원의 항체를 암호화하는 발현 시스템에서 숙주 세포로서 사용될 수 있다.
본 명세서에서 생성된 항체는 추가적인 검정 및 용도를 위해 실질적으로 균질한 제제를 얻도록 추가로 정제될 수 있다. 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법이 사용될 수 있다. 다음의 절차는 적합한 정제 절차의 예시이다: 면역친화도 또는 이온-교환 칼럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피 또는 양이온-교환 수지, 예컨대, DEAE 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 및, 예를 들어, 세파덱스(Sephadex) G-75를 이용하는 겔 여과. 고체상에 고정된 단백질 A는, 예를 들어, 본 개시내용의 결합 분자의 면역친화도 정제를 위해 일부 실시형태에서 사용될 수 있다. 단백질 A가 고정된 고체상은 바람직하게는 유리 또는 실리카 표면을 포함하는 칼럼, 더 바람직하게는 조절 공극 유리 칼럼 또는 실리카겔 칼럼이다. 일부 실시형태에서, 칼럼은 오염물질의 비특이적 접착을 방지하기 위한 시도에서 시약, 예컨대, 글리세롤로 코팅되었다. 이어서, 고체상은 고체상에 비특이적으로 결합된 오염물질을 제거하기 위해 세척된다. 최종적으로 관심대상의 항체는 용리에 의해 고체상으로부터 회수된다.
진핵 세포에서의 재조합체 생성
진핵생물 발현을 위해, 벡터 성분은 일반적으로 다음의 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 및 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
진핵 숙주에서 사용하기 위한 벡터는 또한 성숙 단백질 또는 폴리펩타이드의 N-말단에서 특정 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩타이드를 암호화하는 삽입일 수 있다. 선택된 이종성 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식되고 가공되는(즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이다. 포유류 세포 발현에서, 포유류 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 단순 포진 gD 신호를 이용 가능하다. 이러한 전구체 영역에 대한 DNA는 본 출원의 항체를 암호화하는 DNA에 대해 리딩 프레임에서 결찰될 수 있다.
일반적으로, 복제기점 성분은 포유류 발현 벡터에 필요하지 않다(SV40 기점은 단지 초기 프로모터를 함유하기 때문에 전형적으로 사용될 수 있다).
발현 및 클로닝 벡터는 선택 가능한 마커로도 지칭되는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, 영양요구성 결핍증을 보완하거나, 또는 복합 배지로부터 이용 가능하지 않은 중요한 영양분을 공급하는 단백질을 암호화할 수 있다.
선택 계획의 일례는 숙주 세포의 성장을 저지하는 약물을 이용한다. 이종성 유전자로 성공적으로 형질전환된 해당 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성하고 따라서 선택 요법에서 생존한다. 이러한 우세한 선택의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 사용한다.
포유류 세포에 대한 적합한 선택 가능 마커의 다른 예는 본 출원의 항체를 암호화하는 핵산을 취하기 위해 세포 적격의 식별을 가능하게 하는 것이다. 예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 메토트렉세이트(Mtx), DHFR의 경쟁적 길항제를 함유하는 배양 배지에서 형질전환체 모두를 배양시킴으로써 처음 확인된다. 야생형 DHFR이 사용될 때 예시적인 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주이다. 대안적으로, 폴리펩타이드 암호화-DNA 서열, 야생형 DHFR 단백질, 및 다른 선택 가능한 마커, 예컨대, 아미노글리코사이드 3'-포스포트랜스퍼라제(APH)로 형질전환되거나 공동형질전환된 숙주 세포(특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 선택 가능한 마커에 대한 선택제, 예컨대, 아미노글리코시드 항생제를 함유하는 배지에서 세포 성장에 의해 선택될 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터는 보통 숙주 유기체에 의해 인식되고 목적하는 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 상류를 기준으로 대략 25 내지 30번에 위치된 AT-풍부 영역을 가진다. 다수 유전자의 전사의 시작으로부터 상류의 70 내지 80개 염기로 발견되는 다른 서열이 포함될 수 있다. 대부분의 진핵의 3' 말단에 암호화 서열의 3' 말단에 대한 폴리 A 꼬리의 첨가를 위한 신호일 수 있다. 이들 서열은 모두 진핵 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다.
포유류 숙주 세포에서 벡터로부터의 폴리펩타이드 전사는, 예를 들어, 바이러스, 예컨대, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(예컨대, 아데노바이러스 2), 소유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 거대세포바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 유인원 바이러스 40(SV40)의 게놈으로부터 얻은 프로모터에 의해, 이종성 포유류 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열-충격 프로모터로부터 제어될 수 있으며, 단, 이러한 프로모터는 숙주 세포 시스템에 적합하다.
보다 고등 진핵생물에 의해 본 개시내용의 항체를 암호화하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 다수의 인핸서 서열은 이제 포유류 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 알려져 있다. 예는 복제기점의 후기 측(100 내지 270bp) 상의 SV40 인핸서, 거대세포바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제기점의 후기 측 상의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 요소를 향상시킴에 대해서는 문헌[Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 폴리펩타이드 암호화 서열에 대해 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터의 부위 5'에 위치된다.
진핵 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 또한 전사 종결을 위해 그리고 mRNA의 안정화를 위해 필요한 서열을 함유한다. 이러한 서열은 5' 및, 때때로 3', 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 비번역 영역으로부터 통상적으로 입수 가능하다. 이들 영역은 폴리펩타이드-암호화 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오타이드 세그먼트를 함유한다. 하나의 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다.
본 명세서의 벡터에서 DNA를 클로닝 또는 발현시키기 위한 적합한 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포를 포함하는, 본 명세서에 기재된 더 고등 진핵 세포를 포함한다. 배양물(조직 배양물)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 계통(293 또는 현탁 배양물에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, 문헌[Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TR1 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암(Hep G2)이다.
숙주 세포는 항체 생성을 위해 상기 기재한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환될 수 있고, 프로모터를 유도하거나 형질전환체를 선택하거나 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키는 데 적절한 바와 같이 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
본 출원의 항체를 생성하기 위해 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 배지, 예컨대, Ham's F10(시그마(Sigma)), 최소 필수 배지((Minimal Essential Medium: MEM)(시그마), RPMI-1640(시그마), 및 둘베코 변형 배지((DMEM), 시그마)는 숙주 세포를 배양시키는 데 적합하다. 추가로, 문헌[Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기재된 임의의 배지는 숙주 세포에 대한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예컨대, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피세포증식인자), 염(예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제(예컨대, HEPES), 뉴클레오타이드(예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예컨대, GENTAMYCIN™ 약물), 미량원소(최종 농도에서 마이크로몰 범위로 보통 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수 보충물은 또한 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대, 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이며, 당업자에게 명백할 것이다.
재조합 기법을 이용할 때, 항체는 세포내로, 주변세포질 공간에서 생성되거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 제1 단계로서 항체가 세포내로 생성된다면, 특정 파편, 즉, 숙주 세포 또는 용해된 단편은, 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우에, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액은 일반적으로 상업적으로 입수 가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 이용하여 처음 농축된다. 프로테아제 저해제, 예컨대, PMSF는 단백질 분해를 저해하기 위해 임의의 앞서 언급한 단계에 포함될 수 있고, 항생제는 우연한 오염물질의 성장을 방지하도록 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 단백질 조성물은, 예를 들어, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동법, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있으며, 친화도 크로마토그래피는 바람직한 정제 기법이다. 친화도 리간드에 부착되는 기질은 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 기질을 이용 가능하다. 메커니즘이 안정한 기질, 예컨대, 조절 공극 유리 또는 폴리(스타이렌-다이비닐)벤젠은 더 빠른 유속을 가능하게 하며, 더 짧은 가공 시간은 아가로스에 의해 달성될 수 있다. 회수될 항체에 따라 단백질 정제를 위한 다른 기법, 예컨대, 이온-교환 칼럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE™ 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예컨대, 폴리아스파르트산 칼럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전에 대한 다른 기법이 또한 이용 가능하다. 임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 대상의 항체 및 오염물질을 포함하는 혼합물에 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피가 실시될 수 있다.
5.2.7. 단일 도메인 항체를 포함하는 결합 분자
다른 양상에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체(예를 들어, CD20에 대한 VHH 도메인)를 포함하는 결합 분자가 본 명세서에 제공된다. 아래의 부문 5.3에 기재된 바와 같이 본 명세서에 제공된 키메라 항원 수용체(CAR)에 추가로, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 CD20에 대한 단일 도메인 항체는 다른 결합 분자의 일부이다. 본 개시내용의 예시적인 결합 분자는 본 명세서에 기재된다.
융합 단백질
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체는 다른 제제, 예를 들어, 단백질-기반 독립체에 유전적으로 융합 또는 화학적으로 접합될 수 있다. 단일 도메인 항체는 제제에 화학적으로 접합되거나, 또는 다르게는 제제에 비공유적으로 접합될 수 있다. 제제는 펩타이드 또는 항체(또는 이의 단편)일 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 융합 단백질을 생성하기 위해 이종성 단백질 또는 폴리펩타이드에(또는 이의 단편, 예를 들어, 약 10, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450 또는 약 500개의 아미노산 또는 500개 이상의 아미노산의 폴리펩타이드에) 재조합적으로 또는 화학적으로 접합된(공유 또는 비공유 접합) 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH 도메인)뿐만 아니라 이의 용도가 본 명세서에 제공된다. 특히, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체의 항원-결합 단편(예를 들어, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3) 및 이종성 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함하는 융합 단백질이 본 명세서에 제공된다.
게다가, 본 명세서에 제공된 항체는 정제를 용이하게 하기 위해 마커 또는 "태그" 서열, 예컨대, 펩타이드에 융합될 수 있다. 구체적 실시형태에서, 마커 또는 태그 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩타이드, 혈구응집소("HA") 태그 및 "FLAG" 태그이다.
항체에 모이어티(폴리펩타이드를 포함)를 융합 또는 접합시키기 위한 방법은 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Arnon et al., Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 243-56 (Reisfeld et al. eds., 1985); Hellstrom et al., Antibodies for Drug Delivery, in Controlled Drug Delivery 623-53 (Robinson et al. eds., 2d ed. 1987); Thorpe, Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review, in Monoclonal Antibodies: Biological and Clinical Applications 475-506 (Pinchera et al. eds., 1985); Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy 303-16 (Baldwin et al. eds., 1985); Thorpe et al., Immunol. Rev. 62:119-58 (1982)]; 미국 특허 제5,336,603호; 제5,622,929호; 제5,359,046호; 제5,349,053호; 제5,447,851호; 제5,723,125호; 제5,783,181호; 제5,908,626호; 제5,844,095호; 및 제5,112,946호; EP 307,434; EP 367,166; EP 394,827; PCT 공개 WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631, 및 WO 99/04813; 문헌[Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-39 (1991); Traunecker et al., Nature, 331:84-86 (1988); Zheng et al., J. Immunol. 154:5590-600 (1995); 및 Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-41 (1992)] 참조).
융합 단백질은, 예를 들어, 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링 및/또는 코돈-셔플링(총괄적으로 "DNA 셔플링"으로 지칭됨) 기법을 통해, 생성될 수 있다. DNA 셔플링은, 예를 들어, 보다 높은 친화도 및 보다 낮은 해리 속도를 갖는 항체를 포함하는, 본 명세서에 제공된 바와 같은 단일 도메인 항체의 활성을 변경하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,605,793호; 제5,811,238호; 제5,830,721호; 제5,834,252호; 및 제5,837,458호; 문헌[Patten et al., Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33 (1997); Harayama, Trends Biotechnol. 16(2):76-82 (1998); Hansson et al., J. Mol. Biol. 287:265-76 (1999); 및 Lorenzo and Blasco, Biotechniques 24(2):308-13 (1998)] 참조). 항체 또는 암호화된 항체는 오류 유발 PCR에 의한 무작위 돌연변이유발, 무작위 뉴클레오타이드 삽입, 또는 재조합 전 다른 방법을 실시함으로써 변경될 수 있다. 본 명세서에 제공된 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 이종성 분자의 하나 이상의 성분, 모티프, 부문, 부분, 도메인, 단편 등에 의해 재조합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH 도메인)는 제2 항체에 접합되어 항체 이형접합체를 형성한다.
다양한 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 제제에 유전적으로 융합된다. 유전적 융합은 단일 도메인 항체와 제제 사이에 링커(예를 들어, 폴리펩타이드)를 위치시킴으로써 달성될 수 있다. 링커는 가요성 링커일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 치료 분자에 유전적으로 접합되며, 힌지 영역은 단일 도메인 항체를 치료 분자에 연결한다.
또한 본 명세서에 제공된 다양한 융합 단백질의 제조 방법이 본 명세서에 제공된다. 위의 부문 5.2.6에 기재된 다양한 방법은 또한 본 명세서에 제공된 융합 단백질을 제조하기 위해 이용될 수 있다.
구체적 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 융합 단백질은 재조합적으로 발현된다. 본 명세서에 제공된 융합 단백질의 재조합 발현은 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터의 작제가 필요할 수 있다. 일단 본 명세서에 제공된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 단편이 얻어졌고, 분자 생산을 위한 벡터는 당업계에 잘 공지된 기법을 이용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 암호화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시킴으로써 단백질을 제조하는 방법이 본 명세서에 기재된다. 당업자에게 잘 공지된 방법은 암호화 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 포함하는 발현 벡터를 작제하는 데 사용될 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어, 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 또한 본 명세서에 제공된 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편 또는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 CDR을 포함하는 복제 가능한 벡터가 제공된다.
발현 벡터 통상적인 기법에 의해 숙주 세포에게 전달될 수 있고, 이어서, 형질감염 세포는 본 명세서에 제공된 융합 단백질을 생산하기 위해 통상적인 기법에 의해 배양된다. 따라서, 또한 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 명세서에 제공된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 단편을 함유하는 숙주 세포가 본 명세서에 제공된다.
본 명세서에 제공된 융합 단백질을 발현시키기 위해 다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 이용될 수 있다. 이러한 숙주 발현 시스템은 관심의 암호화 서열이 생성되고 후속적으로 정제되는 비히클을 나타낼 뿐만 아니라, 적절한 뉴클레오타이드 암호화 서열로 형질전환 또는 형질감염될 때, 원 위치에서 본 명세서에 제공된 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 미생물, 예컨대, 암호화 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(예를 들어, 이콜라이 및 바실러스 서브틸리스); 암호화 서열을 함유하는 재조합 효소 발현 벡터로 형질전환된 효모(예를 들어, 사카로마이세스 피키아(Saccharomyces Pichia)); 암호화 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 컬리플라워 모자이크 바이러스, CaMV, 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 또는 암호화 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유류 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 작제물을 보유하는 포유류 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, NS0 및 3T3 세포)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위한 박테리아 세포, 예컨대, 에스케리키아 콜라이 또는 진핵 세포는 재조합 융합 단백질의 발현을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 거대세포바이러스로부터의 주요 급초기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 함께 포유류 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소 세포(CHO)는 항체 또는 이의 변이체를 위한 효과적인 발현 시스템이다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현은 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
박테리아 시스템에서, 발현되는 융합 단백질에 대해 의도된 용도에 따라 다수의 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 다량의 이러한 융합 단백질이 생성될 때, 융합 단백질의 약제학적 조성물의 생성을 위해, 용이하게 정제되는 고수준의 융합 단백질 산물의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터는 암호화 서열이 융합 단백질이 생산되도록 lac Z 암호화 영역과 프레임 내에서 벡터에 개별적으로 결찰될 수 있는 이콜라이 발현 벡터 pUR278(Ruther et al., EMBO 12:1791 (1983)); pIN 벡터(Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109(1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)); 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. pGEX 벡터는 또한 글루타티온 5-트랜스퍼라제(GST)에 의해 융합 단백질로서 외래 폴리펩타이드를 발현시키는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이고, 기질 글루타티온 아가로스 비드에 대한 흡착 및 결합 다음에 자유 글루타티온의 존재 하의 용리에 의해 용리된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 산물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계된다.
포유류 숙주 세포에서, 다수의 바이러스-기반 발현 시스템이 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우에, 관심의 암호화 서열은 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어, 후기 프로모터 및 삼중 리더 서열에 결찰될 수 있다. 이어서, 이 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 영역(예를 들어, 영역 El 또는 E3)에서의 삽입은 독자 생존 가능하고 감염 숙주에서 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 재조합 바이러스를 초래할 것이다(예를 들어, 문헌[Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359(1984)] 참조). 삽입된 암호화 서열의 효율적인 번역을 위해 특정 개시 신호가 필요할 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접한 서열을 포함한다. 더 나아가, 개시 코돈은 전체 삽입의 번역을 보장하기 위해 목적하는 암호화 서열의 리딩 프레임이 있는 상에 있어야 한다. 이들 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 다양한 유래, 천연과 합성 둘 다 있을 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등의 포함에 의해 향상될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544(1987)] 참조).
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 목적하는 특정 방식으로 유전자 산물을 변형 및 가공하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 단백질 산물의 이러한 변형(예를 들어, 글리코실화) 및 가공(예를 들어, 절단)은 단백질 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 가공 및 단백질 및 유전자 산물의 번역 후 가공 및 변형에 대해 특징 및 구체적 메커니즘을 갖는다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현되는 외래 단백질의 올바른 변형 및 가공을 보장하기 위해 선택될 수 있다. 이를 위하여, 유전자 산물의 1차 전사체, 글리코실화 및 포스포릴화의 적절한 가공을 위해 세포 기작을 갖는 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유류 숙주 세포는 CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O 및 T47D, NS0(임의의 면역글로불린 쇄를 내인성으로 생산하지 않는 뮤린 골수종 세포주), CRL7O3O 및 HsS78Bst 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
장기간 동안, 재조합 단백질의 고수율 생산, 안정적인 발현이 이용될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질을 안정하게 발현시키는 세포주가 조작될 수 있다. 바이러스 복제기점을 함유하는 발현 벡터를 이용하기 보다는, 숙주 세포는 적절한 발현 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택 가능한 마커에 의해 제어되는 DNA로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후에, 조작된 세포는 농축 배지에서 1 내지 2일 동안 성장될 수 있고, 이어서, 선택 배지로 전환된다. 재조합 플라스미드에서 선택 가능한 마커는 선택에 내성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 이들의 염색체 내로 안정적으로 통합시키고 성장시켜 병소를 형성하고, 이는 결국 클로닝되고 세포주로 확장될 수 있다. 이 방법은 유리하게는 융합 단백질을 발현시키는 세포주를 조작하는 데 사용될 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 결합 분자와 직접적 또는 간접적으로 상호 작용하는 조성물의 선별 및 평가에서 특히 유용할 수 있다.
단순포진 바이러스 티미딘 키나제(Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), 하이포잔틴구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy et al., Cell 22:8-17 (1980))를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다수의 선택 시스템이 사용될 수 있으며, 유전자는 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서 사용될 수 있다. 또한, 다음의 유전자에 대한 선택의 기초로서 대사길항물질 내성이 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); 아미노글리코사이드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); 및 Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, TIB TECH 11(5):l55-2 15 (1993)); 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro(Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). 재조합 DNA 기술 분야에 통상적으로 공지된 방법은 목적하는 재조합 클론을 선택하는 데 일상적으로 적용될 수 있고, 이러한 방법은, 예를 들어, 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용되는 문헌[Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); 및 Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)]에 기재되어 있다.
융합 단백질의 발현 수준은 벡터 증식에 의해 증가될 수 있다(검토를 위해, 문헌[Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)] 참조). 융합 단백질을 발현시키는 벡터 시스템에서 마커가 증폭 가능할 때, 숙주 세포 배양물에 존재하는 저해제 수준의 증가는 마커 유전자의 복제물 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역이 융합 단백질 유전자와 연관되기 때문에, 융합 단백질의 생산은 또한 증가될 것이다(Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257(1983)).
숙주 세포는 본 명세서에 제공된 다중 발현 벡터와 공동 형질감염될 수 있다. 벡터는 각각의 암호화 폴리펩타이드의 동일한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택 가능 마커를 포함할 수 있다. 대안적으로, 다중 폴리펩타이드를 암호화하고, 이를 발현시킬 수 있는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 암호화 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
일단 본 명세서에 제공된 융합 단백질이 재조합 발현에 의해 생산되었다면, 이는 폴리펩타이드(예를 들어, 면역글로불린 분자)의 정제에 대해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 다음에 특정 항원에 대한 친화도, 사이징 칼럼 크로마토그래피, 및 카파 선택 친화도 크로마토그래피), 원심분리, 차별적 용해도에 의해, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기법에 의해 정제될 수 있다. 추가로, 본 명세서에 제공된 융합 단백질 분자는 정제를 용이하게 하기 위해 본 명세서에 기재된 이종성 폴리펩타이드 서열 또는 당업계에 공지된 다른 것에 융합될 수 있다.
면역접합체
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예컨대, 화학치료제 또는 약물, 성장 저해제, 독소(예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 유래의 효소적을 활성인 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된 본 명세서에 기재된 임의의 항체(예컨대, 항-CD20 단일 도메인 항체)를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
일부 실시형태에서, 면역접합체는 항체가 메이탄시노이드(미국 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1); 아우리스타틴, 예컨대, 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국 특허 제5,635,483호 및 제5,780,588호 및 제7,498,298호 참조); 돌라스타틴; 칼리케아마이신 또는 이의 유도체(미국 특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호 및 제5,877,296; 문헌[Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라사이클린, 예컨대, 다우노마이신 또는 독소루비신(문헌[Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721(2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국 특허 제6,630,579호); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예컨대, 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트라이코테센; 및 CC1065를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 1종 이상의 약물에 접합되는 항체-약물 접합체(ADC)이다.
일부 실시형태에서, 면역접합체는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모덱신 A 쇄, 알파-사르신, 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질(Phytolaca americana protein)(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 여주(momordica charantia) 저해제, 쿠르킨, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 저해제, 게로닌, 미토겔린, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센(tricothecene)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 효소적으로 활성인 독소 또는 이의 단편에 접합된 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역접합체는 방사성접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소는 방사성접합체의 생산에 이용 가능하다. 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성접합체가 검출을 위해 사용될 때, 이는 신티그래피 연구를 위한 방사성 원소, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명(NMR) 영상화(자기 공명 영상화로도 알려짐, mri)에 대한 스핀 표지, 예컨대, 아이오딘-123 거기에, 아이오딘-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이작용성 단백질 결합제, 예컨대, N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이티오) 프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 이작용성 유도체(예컨대, 다이메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스터(예컨대, 다이석신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예컨대, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스(p-아지도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소사이아네이트(예컨대, 톨루엔 2,6-다이아이소사이아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물(예컨대, 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌[Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-아이소티오사이아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오타이드를 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO94/11026을 참조한다.
링커는 세포에서 접합된 제제의 방출을 용이하게 하는 "절단 가능한 링커"일 수 있지만, 비-절단성 링커가 또한 본 명세서에 상정된다. 본 개시내용의 접합체에서 사용하기 위한 링커는 산 불안정 링커(예를 들어, 하이드라존 링커), 이황화물-함유 링커, 펩티다제-민감성 링커(예를 들어, 아미노산, 예를 들어, 발린 및/또는 시트룰린을 포함하는 펩타이드 링커, 예컨대, 시트룰린-발린 또는 페닐알라닌-라이신), 광불안정 링커, 다이메틸 링커, 티오에터 링커 또는 다제약물 수송체-매개 내성을 피하도록 설계된 친수성 링커를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서의 면역접합체 또는 ADC는 상업적으로 입수 가능한(예를 들어, 미국 일리노이주 락포드 소재의 Pierce Biotechnology제) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC 및 설포-SMPB, 및 SVSB(석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 가교 시약에 의해 제조된 이러한 접합체를 상정하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는, 예를 들어, 진단 분자에 접합 또는 재조합적으로 융합된다. 이러한 진단 및 검출은, 예를 들어, 다양한 효소(예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 겨자무과산화효소, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스터라제); 보결원자단(예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 스트렙타비딘/바이오틴 또는 아비딘/바이오틴); 형광 물질(예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, 로다민, 다이클로로트라이아진일아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드 또는 피코에리트린); 발광 물질(예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 루미놀); 생발광 물질, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 루시퍼라제, 루시페린 또는 에쿠오린; 화학발광 물질, 예컨대, 225Acγ-방출, Auger-방출, β-방출, 알파-방출 또는 양전자-방출 방사성 동위원소를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 검출 가능한 물질에 항체를 결합시킴으로써, 달성될 수 있다.
5.3. 키메라 항원 수용체
다른 양상에서, CD20에 결합하는 본 명세서에 제공된 적어도 하나의 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)가 본 명세서에 제공된다. 본 VHH 도메인(즉, VHH-기반 CAR)을 포함하는 예시적인 CAR이 예시되며, 아래의 부문 6에 기재된 바와 같은 scFv(즉, scFv-기반 CAR)를 포함하는 통상적인 CAR과 비교된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 키메라 항원 수용체(CAR)는 (a) 본 명세서에 제공된 바와 같은 CD20에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인, 및 선택적으로 하나 이상의 추가적인 결합 도메인(들); (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함한다. 각 성분 및 추가 영역은 아래에 더욱 상세하게 기재한다.
5.3.1. 세포외 항원 결합 도메인
본 명세서에 기재된 CAR의 세포외 항원 결합 도메인은 하나 이상의(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상 중 어느 하나의) 단일 도메인 항체를 포함한다. 단일 도메인 항체는 펩타이드 결합을 통해, 또는 펩타이드 링커를 통해 서로 직접 융합될 수 있다.
단일 도메인 항체
본 개시내용의 CAR은 하나 이상의 단일 도메인 항체를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다. sdAb는 동일 또는 상이한 유래를 가질 수 있고, 동일 또는 상이한 크기를 가질 수 있다. 예시적인 sdAb는 중쇄 단독 항체로부터의 중쇄 가변 도메인(예를 들어, VHH 또는 VNAR), 경쇄가 자연적으로 결여된 결합 분자, 통상적인 4-쇄 항체로부터 유래된 단일 도메인(예컨대, VH 또는 VL), 인간화된 중쇄 단독 항체, 인간 중쇄 세그먼트를 발현시키는 유전자이식 마우스 또는 래트에 의해 생성된 인간 단일 도메인 항체, 및 항체로부터 유래된 것 이외의 조작된 도메인 및 단일 도메인 스캐폴드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시내용에서 위에 기재된 단일 도메인 항체를 포함하는 당업계에 공지되거나 본 개시내용에 의해 개발된 임의의 sdAb는 본 명세서에 기재된 CAR을 작제하는 데 사용될 수 있다. sdAb는 마우스, 래트, 인간, 낙타, 라마, 칠성장어, 어류, 상어, 염소, 토끼 및 소를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에 상정된 단일 도메인 항체는 또한 낙타과 및 상어 이외의 종으로부터 유래된 천연 유래 단일 도메인 항체 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, sdAb는 경쇄가 없는 중쇄 항체(또한 본 명세서에서 "중쇄-단독 항체"로서 지칭됨)로서 알려진 천연 유래 단일 도메인 항원 결합 분자로부터 유래된다. 이러한 단일 도메인 분자는, 예를 들어, WO 94/04678 및 문헌[Hamers-Casterman, C. et al., Nature 363:446-448 (1993)]에 개시되어 있다. 명확성을 위해, 자연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 분자로부터 유래된 가변 도메인은 이를 4 쇄 면역글로불린의 통상적인 VH와 구별하기 위해 본 명세서에서 VHH로서 알려져 있다. 이러한 VHH 분자는 낙타과 종, 예를 들어, 낙타, 라마, 비쿠나, 단봉 낙타, 알파카 및 과나코에서 상승된 항체로부터 유래될 수 있다. 낙타과 이외의 다른 종은 자연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 분자를 생성할 수 있으며, 이러한 VHH는 본 개시내용의 범주 내에 있다. 또한, VHH의 인간화된 형태뿐만 아니라 다른 변형 및 변이체가 또한 상정되며, 본 개시내용의 범주 이내이다.
낙타과로부터의 VHH 분자는 IgG 분자보다 약 10배 더 작다. 이들은 단일 폴리펩타이드이고, 매우 안정하여, 극도의 pH 및 온도 조건에 저항할 수 있다. 게다가, 이들은 통상적인 4-쇄 항체에 대한 경우가 아닌 프로테아제의 작용에 대해 저항성이 있을 수 있다. 더 나아가, VHH의 시험관내 발현은 고수율의, 적절하게 폴딩된 기능성 VHH를 생성한다. 추가로, 낙타과에서 생성된 항체는 항체 라이브러리의 사용을 통해 또는 낙타과 이외의 포유류의 면역화를 통해 시험관내에서 생성된 항체에 의해 인식된 것 이외의 에피토프를 인식할 수 있다(예를 들어, WO9749805 참조). 이렇게 해서, 하나 이상의 VHH 도메인을 포함하는 다중특이성 또는 다가 CAR은 통상적인 4-쇄 항체로부터 유래된 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이성 또는 다가 CAR보다 표적과 더 효율적으로 상호작용할 수 있다. VHH는 "흔치 않은" 에피토프, 예컨대, 공동(cavity) 또는 홈(groove)에 결합하는 것으로 알려져 있기 때문에, 이러한 VHH를 포함하는 CAR의 친화도는 통상적인 다중특이성 폴리펩타이드보다 치료적 처치에 더 적합할 수 있다.
일부 실시형태에서, sdAb는 연골어류에서 발견되는 면역글로불린의 가변 영역으로부터 유래된다. 예를 들어, sdAb는 상어 혈청에서 발견되는 신규한 항원 수용체(NAR)로서 알려진 면역글로불린 아이소타입으로부터 유래될 수 있다. NAR의 가변 영역으로부터 유래된 단일 도메인 분자("IgNAR")의 생성 방법은 WO 03/014161 및 문헌[Streltsov, Protein Sci. 14:2901-2909(2005)]에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, sdAb는 재조합, CDR-접합, 인간화, 낙타화, 탈면역화 및/또는 시험관내 생성된다(예를 들어, 파지 디스플레이에 의해 선택됨). 일부 실시형태에서, 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 프레임워크 영역 내 특정 아미노산 잔기의 "낙타화"에 의해 변경될 수 있다. 낙타화는 통상적인 4-쇄 항체로부터의 (천연 유래) VH 도메인의 아미노산 서열 내 하나 이상의 아미노산 잔기의 중쇄 항체의 VHH 도메인 내 대응하는 위치(들)에서 생기는 아미노산 잔기 중 하나 이상에 의한 대체 또는 치환을 지칭한다. 이는 당업자에게 분명한 당업계에 공지된 방식으로 수행될 수 있다. 이러한 "낙타화" 치환은 바람직하게는 본 명세서에 정의된 바와 같은 VH-VL 계면에서, 그리고/또는 소위 낙타과 특징 잔기에서 형성되고/되거나 존재하는 아미노산 위치에 삽입된다(예를 들어, WO 94/04678, 문헌[Davies and Riechmann FEBS Letters 339: 285-290 (1994); Davies and Riechmann, Protein Engineering 9 (6): 531-537 (1996); Riechmann, J. Mol. Biol. 259: 957-969 (1996); 및 Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Meth. 231: 25-38 (1999)] 참조).
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 인간 중쇄 세그먼트를 발현시키는 유전자이식 마우스 또는 래트에 의해 생성되는 인간 sdAb이다. 예를 들어, US20090307787, 미국 특허 제8,754,287호, US20150289489, US20100122358 및 WO2004049794를 참조한다. 일부 실시형태에서, sdAb는 친화도 성숙이다.
일부 실시형태에서, 특정 항원 또는 표적에 대한 천연 유래 VHH 도메인은 낙타과 VHH 서열의 (미경험 또는 면역) 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 공지된 하나 이상의 선별 기법을 이용하여 상기 항원 또는 표적, 또는 이의 적어도 하나의 부분, 단편, 항원 결정소 또는 에피토프를 이용하는 이러한 라이브러리의 선별을 수반할 수도 있고 수반하지 않을 수도 있다. 이러한 라이브러리 및 기법은, 예를 들어, WO 99/37681, WO 01/90190, WO 03/025020 및 WO 03/035694에 기재되어 있다. 대안적으로, (미경험 또는 면역) VHH 라이브러리로부터 유래된 개선된 합성 또는 반합성 라이브러리, 예를 들어, WO 00/43507에 기재된 바와 같은 무작위 돌연변이유발 및/또는 CDR 셔플링과 같은 기법에 의해 (미경험 또는 면역) VHH 라이브러리로부터 얻은, 예컨대, VHH 라이브러리가 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 통상적인 4-쇄 항체로부터 생성된다. 예를 들어, 유럽 특허 제0 368 684호, 문헌[Ward et al., Nature, 341 (6242): 544-6 (1989); Holt et al., Trends Biotechnol., 21(11):484-490 (2003)]; WO 06/030220; 및 WO 06/003388 참조.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 세포외 항원 결합 도메인은 적어도 하나의 결합 도메인을 포함하고, 적어도 하나의 결합 도메인은 본 명세서에 제공된 바와 같은 CD20에 결합하는 단일 도메인 항체, 예를 들어, 상기 부문 5.2에 기재된 항-CD20 단일 도메인 항체를 포함한다.
일부 실시형태에서, (a) 항-CD20 sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 항-CD20 sdAb는, 예를 들어, 표 2의 VHH 도메인 및 표 2의 해당 VHH 도메인 중 어느 것 중 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 갖는 것을 포함하는, 위의 부문 5.2에 기재된 바와 같은 항-CD20 sdAb이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 sdAb는 낙타과, 키메라, 인간 또는 인간화된다.
일부 실시형태에서, (a) 항-CD20 sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 항-CD20 sdAb는 서열번호: 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 183, 서열번호 184 또는 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, (a) 항-CD20 sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 항-CD20 sdAb는 서열번호: 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 183, 서열번호 184 또는 서열번호 185의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시형태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 둘 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 이들 둘 이상의 항원 결합 도메인 중에서, 적어도 하나는 본 명세서에 제공된 바와 같은 CD20에 결합하는 VHH이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가적인 결합 도메인(들)은 또한 CD20에 결합하는 VHH(들)이다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 추가적인 결합 도메인(들)은 하나 이상의 추가적인 상이한 항원(들), 예를 들어, 하나 이상의 추가적인 상이한 항원(들)을 표적으로 하는 1, 2, 3, 4개 이상의 추가적인 단일 도메인 항체 결합 영역(sdAb)에 결합한다.
일부 실시형태에서, (a) CD20에 특이적으로 결합하는 둘 이상의 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 다가(예컨대, 2가 및 3가) CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 본 명세서에 제공된 CD20에 특이적으로 결합하는 2개의 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 본 명세서에 제공된 CD20에 특이적으로 결합하는 3개의 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 둘 이상의 항-CD20 sdAb는, 예를 들어, 표 2의 VHH 도메인 및 표 2의 해당 VHH 도메인 중 어느 것에서 1, 2 또는 3개 모두의 CDR을 갖는 것을 포함하는, 위의 부문 5.2에 기재된 해당 항-CD20 sdAb로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 sdAb는 낙타과, 키메라, 인간 또는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 둘 이상의 항-CD20 sdAb는 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 183, 서열번호 184 및 서열번호 185의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 sdAb로부터 각각 독립적으로 선택된다.
다른 실시형태에서, (a) CD20에 특이적으로 결합하는 제1 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 다중특이성(예컨대, 이중특이성 및 삼중특이성) CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, CAR은 제2 항원(예컨대, 제2 종양 항원)에 특이적으로 결합하는 2 단일 도메인 항체(sdAb)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 제2 항원(예컨대, 제2 종양 항원)에 특이적으로 결합하는 제2 단일 도메인 항체(sdAb); 및 제3 항원(예컨대, 제3 종양 항원)에 특이적으로 결합하는 제3 단일 도메인 항체(sdAb)를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CAR에 의해 표적화되는 추가적인 항원(들)은 세포 표면 분자이다. 단일 도메인 항체는 특별한 질환 상태와 연관된 표적 세포 상의 세포 표면 마커로서 작용하는 항원을 인식하도록 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 종양 항원이다. 일부 실시형태에서, 종양 항원은 B 세포 악성종양과 연관된다. 종양은 면역 반응, 특히 T 세포 매개 면역 반응에 대해 표적 항원으로서 작용할 수 있는 다수의 단백질을 발현시킨다. CAR에 의해 표적화되는 항원은 단일 질환 세포 상의 항원 또는 각각 질환에 기여하는 상이한 세포 상에서 발현되는 항원일 수 있다. CAR에 의해 표적화되는 항원은 질환에 직접적으로 또는 간접적으로 관련될 수 있다.
종양 항원은 면역 반응, 특히 T-세포 매개 면역 반응을 유발할 수 있는 종양 세포에 의해 생성된 단백질이다. 본 개시내용의 추가적인 표적화된 항원의 선택은 치료될 특정 암 유형에 따를 것이다. 예시적인 종양 항원은 신경교종-연관 항원, 암배 항원(CEA), β-인간 융모성 성선 자극 호르몬, 알파태아단백질(AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CAIX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장 카복실 에스터라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제, 전립선-특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, 프로스테인, PSMA, HER2/neu, 서비빈 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린B2, CD19, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 종양 항원은 악성 종양과 연관된 하나 이상의 항원성 암 에피토프를 포함한다. 악성 종양은 면역 공격을 위한 표적 항원으로서 작용할 수 있는 다수의 단백질을 발현시킨다. 이들 분자는 조직-특이적 항원, 예컨대, 흑색종에서 MART-1, 타이로시나제 및 gp100 및 전립선암에서 전립선산인산효소(prostatic acid phosphatase: PAP) 및 전립선-특이적 항원(PSA)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 표적 분자는 형질전환-관련 분자, 예컨대, 종양유전자 HER2/Neu/ErbB-2의 그룹에 속한다. 표적 항원의 또 다른 그룹은 종양-태아 항원, 예컨대, 암배 항원(CEA)이다. B-세포 림프종에서, 종양-특이적 이디오타이프(idiotype) 면역글로불린은 개개 종양에 독특한 진정한 종양-특이적 면역글로불린 항원을 구성한다. CD20에 추가로, B-세포 분화 항원, 예컨대, CD22 및 CD37은 B-세포 림프종에서 표적 항원에 대한 다른 후보이다.
일부 실시형태에서, 종양 항원은 종양-특이적 항원(TSA) 또는 종양-연관 항원(TAA)이다. TSA는 종양 세포에 독특하며, 신체 내 다른 세포 상에서 일어나지 않는다. TAA 연관 항원은 종양 세포에 독특하지 않으며, 대신에 또한 항원에 대한 면역학적 관용 상태를 유도하지 못한 조건 하에 정상 세포 상에서 발현된다. 종양 상에서 항원의 발현은 면역계가 항원에 반응하는 것을 가능하게 하는 조건 하에서 일어날 수 있다. TAA는 면역계가 미숙일 때, 태아 발생 동안 정상 세포 상에서 발현되거나 반응할 수 없는 항원일 수 있거나, 정상 세포 상에서 극도로 낮은 수준으로 정상적으로 존재하거나, 종양 세포 상에서 훨씬 더 고수준에서 발현되는 항원일 수 있다.
TSA 또는 TAA 항원의 비제한적 예는 분화 항원, 예컨대, MART-1/MelanA(MART-I), gp 100(Pmel 17), 타이로시나제, TRP-1, TRP-2 및 종양-특이적 다계통 항원, 예컨대, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5; 과발현된 배아 항원, 예컨대, CEA; 과발현된 종양유전자 및 돌연변이된 종양-억제 유전자, 예컨대, p53, Ras, HER2/neu; 염색체 전좌로부터 초래되는 독특한 종양 항원; 예컨대, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 및 바이러스 항원, 예컨대, 바이러스 항원, 예컨대, 엡스타인 바르 바이러스 항원 EBVA 및 인유두종바이러스(HPV) 항원 E6 및 E7을 포함한다.
다른 거대, 단백질 기반 항원은 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, nm-23HI, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백질, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733＼EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS 1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합 단백질\사이클로필린 C-결합 단백질, TAAL6, TAG72, TLP 및 TPS를 포함한다.
일부 더 구체적인 실시형태에서, 하나 이상의 추가적인 항원(들)은 CD20, CD19, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 및 당지질 F77로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구체적 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 CAR은 CD20에 결합하는 VHH 및 CD19에 결합하는 VHH를 포함한다. 다른 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 CAR은 CD20에 결합하는 VHH 및 CD22에 결합하는 VHH를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 sdAb는 낙타과, 키메라, 인간 또는 인간화된다.
본 명세서에 제공된 하나 이상의 결합 도메인(들)에 추가로, 본 명세서에 제공된 CAR은, 링커(예를 들어, 펩타이드 링커), 막관통 도메인, 힌지 영역, 신호 펩타이드, 세포내 신호전달 도메인, 공자극 신호전달 도메인 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있으며, 이들 각각은 아래에서 더 상세하게 설명된다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)의 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 공자극 신호전달 도메인은 CD137로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CD20 CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치된 힌지 도메인(예컨대, CD8α 힌지 도메인)을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, CD20 CAR은 폴리펩타이드의 N-말단에 위치된 신호 펩타이드(예컨대, CD8α 신호 펩타이드)를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 N-말단에서 C-말단까지: CD8α 신호 펩타이드, 세포외 항원-결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137로부터 유래된 공자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ로부터 유래된 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD20 CAR은 단일특이성이다. 일부 실시형태에서, CD20 CAR은 1가이다. 다른 실시형태에서, CD20 CAR은 다가이다.
펩타이드 링커
본 명세서에 기재된 다중특이성 또는 다가 CAR에서 다양한 단일 도메인 항체는 펩타이드 링커를 통해 서로 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 임의의 펩타이드 링커 없이 서로 직접 융합된다. 상이한 단일 도메인 항체를 연결하는 펩타이드 링커(예를 들어, VHH)는 동일 또는 상이할 수 있다. CAR의 상이한 도메인은 또한 펩타이드 링커를 통해 서로 융합될 수 있다.
CAR에서 각 펩타이드 링커는 단일 도메인 항체 및/또는 다양한 도메인은 구조적 및/또는 기능적 특징에 따라서 동일 또는 상이한 길이 및/또는 서열을 가질 수 있다. 각 펩타이드 링커는 선택되고 독립적으로 최적화될 수 있다. CAR에서 사용되는 펩타이드 링커(들)의 길이, 가요성 정도 및/또는 다른 특성은 하나 이상의 특정 항원 또는 에피토프에 대한 친화도, 특이성 또는 결합활성을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 특성에 대한 일부 영향을 가질 수 있다. 예를 들어, 더 긴 펩타이드 링커는 2개의 인접한 도메인이 서로 입체적으로 방해하지 않는다는 것을 보장하도록 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 짧은 펩타이드 링커는 CAR의 막관통 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 배치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 가요성 잔기는 가요성 잔기(예컨대, 글리신 및 세린)를 포함하고, 따라서 인접한 도메인은 서로에 대해 움직임이 자유롭다. 예를 들어, 글리신-세린 이중선은 적합한 펩타이드 링커일 수 있다.
펩타이드 링커는 임의의 적합한 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100개 이상의 아미노산 길이 중 어느 하나이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 약 100, 75, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5개 이하의 아미노산 길이 중 어느 하나 이하이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커의 길이는 약 1개의 아미노산 내지 약 10개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산 길이, 약 30개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 또는 약 1개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산 중 어느 하나이다.
펩타이드 링커는 천연 유래 서열, 또는 비-천연 유래 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 중쇄 단독 항체의 힌지 영역으로부터 유래된 서열은 링커로서 사용될 수 있다. 예를 들어, WO1996/34103 참조. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 가요성 링커이다. 예시적인 가요성 링커는 글리신 중합체(G)n, 글리신-세린 중합체(예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n 및 (GGGGS)n을 포함하며, 여기서, n은 적어도 1의 정수임), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 당업계에 공지된 기타 가요성 링커를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 펩타이드 링커는 아래의 표에 열거한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 둘 이상의 항-CD20 VHH 도메인을 연결하는 펩타이드 링커는 (GGGGS)n (서열번호 138)이되, n은 선택적으로 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
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예를 들어, WO2016014789, WO2015158671, WO2016102965, US20150299317, WO2018067992, US7741465, 문헌[Colcher et al., J. Nat. Cancer Inst. 82:1191-1197 (1990), 및 Bird et al., Science 242:423-426 (1988)]에 기재된 바와 같은 당업계에 공지된 다른 링커는 또한 본 명세서에 제공된 CAR에 포함될 수 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
5.3.2. 막관통 도메인
본 개시내용의 CAR은 세포외 항원 결합 도메인에 직접적으로 또는 간접적으로 융합될 수 있는 막관통 도메인을 포함한다. 막관통 도메인은 천연으로부터 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "막관통 도메인"은 세포막, 바람직하게는 진핵 세포막에서 열역학적으로 안정한 임의의 단백질 구조를 지칭한다. 본 명세서에 기재된 CAR에서 사용하기에 적합한 막관통 도메인은 천연 유래 단백질로부터 얻을 수 있다. 대안적으로, 이는 합성, 비천연 유래 단백질 세그먼트, 예를 들어, 세포막에서 열역학적으로 안정한 소수성 단백질 세그먼트일 수 있다.
막관통 도메인은 막관통 도메인의 3차원 구조에 기반하여 분류된다. 예를 들어, 막관통 도메인은 알파 나선, 하나 초과의 알파 나선의 복합체, 베타-배럴 또는 세포의 인지질 이중층에 걸칠 수 있는 임의의 다른 안정한 구조를 형성할 수 있다. 더 나아가, 막관통 도메인은 또한 또는 대안적으로 막관통 도메인이 막을 가로지르는 통과의 수 및 단백질의 배향을 포함하는 막관통 도메인 위상에 기반하여 분류될 수 있다. 예를 들어, 단일-통과 막 단백질(single-pass membrane protein)은 세포막을 한 번 가로지르며, 다회-통과 막 단백질은 세포막을 적어도 2회(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7회 이상) 가로지른다. 막 단백질은 세포 내부 및 외부에 대해 말단 및 막-통과 세그먼트(들)의 위상학에 따라서 I형, II형 또는 III형으로서 정의될 수 있다. I형 막 단백질은 단일 막 스패닝 영역을 갖고, 단백질의 N-말단이 세포의 지질 이중층의 세포외 측면 상에 존재하고 단백질의 C-말단이 세포질 측면 상에 존재하도록 배향된다. II형 막 단백질도 단일 막 스패닝 영역을 갖지만, 단백질의 C-말단이 세포의 지질 이중층의 세포외 측면 상에 존재하고 단백질의 N-말단이 세포질 측면 상에 존재하도록 배향된다. III형 막 단백질은 다중 막-스패닝 세그먼트를 갖고, 추가로 막관통 세그먼트의 수 및 N- 및 C-말단의 위치에 기반하여 다시 분류될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CAR의 막관통 도메인은 I형 단일-통과 막 단백질로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 다회통과 막 단백질로부터의 막관통 도메인은 또한 본 명세서에 기재된 CAR에서 사용하기에 적합할 수 있다. 다회-통과 막 단백질은 복잡한 (적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7개 이상의) 알파 나선 또는 베타 시트 구조를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 다회-통과 막 단백질의 N-말단 및 C-말단은 지질 이중층의 반대측 상에 존재하며, 예를 들어, 단백질의 N-말단은 지질 이중층의 세포질 측면 상에 존재하고, 단백질의 C-말단은 세포외 측면 상에 존재한다.
일부 실시형태에서, CAR의 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄의 막관통 도메인, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1(CDl la, CD18), ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRFl), CD160, CD19, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CDIOO(SEMA4D), SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D 및/또는 NKG2C로부터 선택된 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다.
일부 구체적 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 서열번호 154의 아미노산 서열을 포함하는 CD8α의 막관통 도메인이다.
본 명세서에 기재된 CAR에서 사용하기 위한 막관통 도메인은 또한 합성, 비천연 유래 단백질 세그먼트의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 합성, 비천연 유래 알파 나선 또는 베타 시트이다. 일부 실시형태에서, 단백질 세그먼트는 적어도 대략 20개의 아미노산, 예를 들어, 적어도 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 이상의 아미노산이다. 합성 막관통 도메인의 예는, 예를 들어, 미국 특허 제7,052,906호 및 PCT 공개 번호 WO 2000/032776에 공지되어 있으며, 이의 관련 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 명세서에 제공된 막관통 도메인은 막관통 도메인의 C-말단 측면 상에 위치된 막관통 영역 및 세포질 영역을 포함할 수 있다. 막관통 도메인의 세포질 영역은 3개 이상의 아미노산을 포함할 수 있고, 일부 실시형태에서, 지질 이중층에서 막관통 도메인의 배향을 돕는다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 시스테인 잔기는 막관통 도메인의 막관통 영역에 존재한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 시스테인 잔기는 막관통 도메인의 세포질 영역에 존재한다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인의 세포질 영역은 양으로 하전된 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인의 세포질 영역은 아미노산 아르기닌, 세린 및 라이신을 포함한다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인의 막관통 영역은 소수성 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 CAR의 막관통 도메인은 인공 소수성 서열을 포함한다. 예를 들어, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체는 막관통 도메인의 C-말단에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 막관통 영역은 주로 소수성 아미노산 잔기, 예컨대, 알라닌, 류신, 아이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 발린을 포함한다. 일부 실시형태에서, 막관통 영역은 소수성이다. 일부 실시형태에서, 막관통 영역은 폴리-류신-알라닌 서열을 포함한다. 단백질 또는 단백질 세그먼트의 소수친수(hydropathy) 또는 소수성 또는 친수성 특징은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, Kyte와 Doolittle의 소수친수 분석에 의해 평가될 수 있다.
5.3.3. 세포내 신호전달 도메인
본 개시내용의 CAR은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 CAR을 발현시키는 면역 효과기 세포의 정상 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 용어 "효과기 기능"은 세포의 특수화된 기능을 지칭한다. T 세포의 효과기 기능은, 예를 들어, 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서 용어 "세포질 신호전달 도메인"은 효과기 기능 신호를 전달하고 세포가 특수화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 보통 전체 세포질 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 다수의 경우에, 전체 쇄를 사용하는 것이 필수적이지는 않다. 세포질 신호전달 도메인의 절단 부분이 사용되는 정도로, 이러한 절단 부분은 효과기 기능 신호를 전달하는 한, 무손상 쇄 대신에 사용될 수 있다. 따라서 세포질 신호전달 도메인이라는 용어는 효과기 기능 신호를 전달하는 데 충분한 세포질 신호전달 도메인의 임의의 절단 부분을 포함하는 것으로 의도된다.
일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 효과기 세포의 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 면역 효과기 세포의 1차 세포내 신호전달 도메인으로 본질적으로 이루어진 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. "1차 세포내 신호전달 도메인"은 면역 효과기 기능을 유도하기 위해 자극 방식으로 작용하는 세포질 신호전달 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호전달 모티프를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "ITAM"은 다수 면역 세포에서 발현되는 신호전달 분자의 꼬리 부분에 일반적으로 존재하는 보존된 단백질 모티프이다. 모티프는 6 내지 8개 아미노산에 의해 분리되는 아미노산 서열 YxxL/I의 2개 반복부를 포함하여, 보존된 모티프 YxxL/Ix(6-8)YxxL/I를 생성할 수 있되, 각각의 x는 독립적으로 임의의 아미노산이다. 신호전달 분자 내의 ITAM은 세포 내에서 신호전달에 중요하며, 이는 신호 분자의 활성화 후에 ITAM에서 타이로신 잔기의 인산화에 의해 적어도 부분적으로 매개된다. ITAM은 또한 신호전달 경로에 관련된 다른 단백질에 대한 도킹 부위로서 작용할 수 있다. 예시적인 ITAM-포함 1차 세포질 신호전달 서열은 CD3ζ, FcR 감마(FCER1G), FcR 베타(Fc Epsilon Rib), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 야생형 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인이다. 일부 실시형태에서, CD3ζ의 1차 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 156의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 야생형 CD3ζ의 1차 세포내 신호전달 도메인. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 돌연변이, 예컨대, Q65K를 포함하는 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인의 기능성 돌연변이체이다.
5.3.4. 공자극 신호전달 도메인
다수의 면역 효과기 세포는 세포 증식, 분화 및 생존을 촉진시킬 뿐만 아니라 세포의 효과기 기능을 활성화시키기 위해 항원-특이적 신호의 자극에 추가로 공자극을 필요로 한다. 일부 실시형태에서, CAR은 적어도 하나의 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "공자극 신호전달 도메인"은 효과기 기능과 같은 면역 반응을 유도하기 위해 세포 내에서 신호 전달을 매개하는 단백질의 적어도 일부를 지칭한다. 본 명세서에 기재된 키메라 수용체의 공자극 신호전달 도메인은 신호를 전달하고 면역 세포, 예컨대, T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구 또는 호산구에 의해 매개되는 반응을 조절하는 공자극 단백질로부터의 세포질 신호전달 도메인일 수 있다. "공자극 신호전달 도메인"은 공자극 분자의 세포질 부분일 수 있다. 용어 "공자극 분자"는 공자극 리간드와 특이적으로 결합하고, 이에 의해, 면역 세포에 의한 공자극 반응, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 증식 및 생존을 매개하는 면역 세포(예컨대, T 세포) 상의 동족 결합 상대를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 단일 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 둘 이상의(예컨대, 약 2, 3, 4개 이상 중 어느 것의) 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 동일한 공자극 신호전달 도메인 중 둘 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 상이한 공자극 단백질로부터의 둘 이상의 공자극 신호전달 도메인, 예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 둘 이상의 공자극 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 세포내 신호전달 도메인(예컨대, CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인) 및 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인 및 1차 세포내 신호전달 도메인(예컨대, CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인)은 선택적 펩타이드 링커를 통해 서로 융합된다. 1차 세포내 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인은 임의의 적합한 순서로 배열될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인은 막관통 도메인과 1차 세포내 신호전달 도메인(예컨대, CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인) 사이에 위치된다. 다중 공자극 신호전달 도메인은 상가적 또는 상승적 자극 효과를 제공할 수 있다.
숙주 세포(예를 들어, 면역 세포)에서 공자극 신호전달 도메인의 활성화는 세포가 사이토카인의 생산 및 분비, 식세포 특성, 증식, 분화, 생존 및/또는 세포독성을 증가 또는 감소시키는 것을 유도할 수 있다. 임의의 공자극 분자의 공자극 신호전달 도메인은 본 명세서에 기재된 CAR에서 사용하기에 적합할 수 있다. 공자극 신호전달 도메인의 유형(들)은 면역 효과기 세포 유형과 같은 인자에 기반하여 선택되며, 이때, 효과기 분자는 (예를 들어, T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구 또는 호산구) 및 목적하는 면역 효과기 기능(예를 들어, ADCC 효과)이 발현될 것이다. CAR에서 사용하기 위한 공자극 신호전달 도메인의 예는 B7/CD28 패밀리의 구성원(예를 들어, B7-1/CD80, B7-2/CD86, B7-H1/PD-L1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7-H7, BTLA/CD272, CD28, CTLA-4, Gi24/VISTA/B7-H5, ICOS/CD278, PD- 1, PD-L2/B7-DC 및 PDCD6); TNF 슈퍼패밀리의 구성원(예를 들어, 4- 1BB/TNFSF9/CD137, 4-1BB 리간드/TNFSF9, BAFF/BLyS/TNFSF13B, BAFF R/TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, CD27 리간드/TNFSF7, CD30/TNFRSF8, CD30 리간드/TNFSF8, CD40/TNFRSF5, CD40/TNFSF5, CD40 리간드/TNFSF5, DR3/TNFRSF25, GITR/TNFRSF18, GITR 리간드/TNFSF18, HVEM/TNFRSF14, LIGHT/TNFSF14, 림포톡신-알파/TNF-베타, OX40/TNFRSF4, OX40 리간드/TNFSF4, RELT/TNFRSF19L, TACI/TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNF-알파 및 TNF RII/TNFRSF1B); SLAM 패밀리의 구성원(예를 들어, 2B4/CD244/SLAMF4, BLAME/SLAMF8, CD2, CD2F-10/SLAMF9, CD48/SLAMF2, CD58/LFA-3, CD84/SLAMF5, CD229/SLAMF3, CRACC/SLAMF7, NTB-A/SLAMF6 및 SLAM/CD150); 및 임의의 다른 공자극 분자, 예컨대, CD2, CD7, CD53, CD82/Kai-1, CD90/Thy1, CD96, CD160, CD200, CD300a/LMIR1, HLA 클래스 I, HLA- DR, Ikaros, 인테그린 알파 4/CD49d, 인테그린 알파 4 베타 1, 인테그린 알파 4 베타 7/LPAM-1, LAG-3, TCL1A, TCL1B, CRTAM, DAP12, Dectin-1/CLEC7A, DPPIV/CD26, EphB6, TIM-1/KIM-1/HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLP R, 림프구 기능 연관 항원-1(LFA-1) 및 NKG2C를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 공자극 단백질의 세포질 신호전달 도메인일 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CAR에서 세포내 신호전달 도메인은 CD137로부터 유래된 공자극 신호전달 도메인(즉, 4-1BB)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인 및 CD137의 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 155의 아미노산 서열을 포함하는 CD137의 공자극 신호전달 도메인을 포함한다.
또한 공자극 신호전달 도메인이 면역 세포의 면역 반응을 조절할 수 있도록 본 명세서에 기재된 임의의 공자극 신호전달 도메인의 변이체는 본 개시내용의 범위 이내이다. 일부 실시형태에서, 공자극 신호전달 도메인은 야생형 상대에 비해서 최대 10개의 아미노산 잔기 변이(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 8개)를 포함한다. 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 이러한 공자극 신호전달 도메인은 변이체로 지칭될 수 있다. 공자극 신호전달 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이는 돌연변이를 포함하지 않는 공자극 신호전달 도메인에 비해서 신호전달의 증가 및 향상된 면역 반응 자극을 초래할 수 있다. 공자극 신호전달 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이는 돌연변이를 포함하지 않는 공자극 신호전달 도메인에 비해서 신호전달의 감소 및 감소된 면역 반응 자극을 초래할 수 있다.
5.3.5. 힌지 영역
본 개시내용의 CAR은 세포외 항원 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치된 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 힌지 도메인은 단백질의 두 도메인 사이에서 일반적으로 발견되는 아미노산 세그먼트이고, 단백질의 가요성 및 서로에 대해 도메인 중 하나 또는 둘 다의 움직임을 가능하게 할 수 있다. 효과기 분자의 막관통 도메인에 비해 세포외 항원 결합 도메인의 이러한 가요성 및 움직임을 제공하는 임의의 아미노산 서열이 사용될 수 있다.
힌지 도메인은 약 10 내지 100개의 아미노산, 예를 들어, 약 15 내지 75개의 아미노산 중 어느 하나, 20 내지 50개의 아미노산, 또는 30 내지 60개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 또는 75개의 아미노산 길이 중 어느 하나일 수 있다.
일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 천연 유래 단백질의 힌지 도메인이다. 힌지 도메인을 포함하기 위해 당업계에 공지된 임의의 단백질의 힌지 도메인은 본 명세서에 기재된 키메라 수용체에서 사용하는 데 적합하다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 천연 유래 단백질의 힌지 도메인의 적어도 일부이고, 키메라 수용체에 가요성을 부여한다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8α의 힌지 도메인의 일부, 예를 들어, CD8α의 힌지 도메인의 적어도 15(예를 들어, 20, 25, 30, 35 또는 40)개의 연속적 아미노산을 포함하는 단편이다. 일부 실시형태에서, CD8α의 힌지 도메인은 서열번호 153의 아미노산 서열을 포함한다.
항체, 예컨대, IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD 항체의 힌지 도메인은 또한 본 명세서에 기재된 pH-의존적 키메라 수용체 시스템에서 사용하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 항체의 불변 도메인 CH1 및 CH2에 결합하는 힌지 도메인이다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인이고, 항체의 힌지 도메인 및 항체의 하나 이상의 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인 및 항체의 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인 및 항체의 CH2 및 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체이다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 IgG1 항체의 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 IgG1 항체의 힌지 영역 및 CH3 불변 영역을 포함한다.
비천연 유래 펩타이드가 또한 본 명세서에 기재된 키메라 수용체에 대한 힌지 도메인으로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N- 말단 사이의 힌지 도메인은 펩타이드 링커, 예컨대, (GxS)n 링커이되, x 및 n은 독립적으로 3 내지 12의 정수일 수 있고, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 이상을 포함한다.
5.3.6. 신호 펩타이드
본 개시내용의 CAR은 폴리펩타이드의 N-말단에서 신호 펩타이드(신호 서열로도 알려짐)를 포함할 수 있다. 일반적으로, 신호 펩타이드는 세포 내 목적하는 부위에 폴리펩타이드를 표적화하는 펩타이드 서열이다. 일부 실시형태에서, 신호 펩타이드는 효과기 분자를 세포의 분비 경로에 표적화하고, 효과기 분자를 지질 이중층에 통합 및 고정시킬 것이다. 본 명세서에 기재된 CAR에서 사용하기에 적합한 천연 유래 단백질 또는 합성의 신호 서열, 비천연 유래 신호 서열을 포함하는 신호 펩타이드는 당업자에게 자명할 것이다. 일부 실시형태에서, 신호 펩타이드는 CD8α, GM-CSF 수용체 α 및 IgG1 중쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 신호 펩타이드는 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CD8α의 신호 펩타이드는 서열번호 152의 아미노산 서열을 포함한다.
5.3.7. 예시적인 CAR
예시적인 1가 CAR, 예컨대, VHH-273 CAR, VHH-283 CAR, VHH-313 CAR, VHH-440 CAR, VHH-466 CAR, VHH-496 CAR, VHH-653 CAR, huVHH-253 CAR, huVHH-256 CAR, huVHH-260 CAR, huVHH-746 CAR, huVHH-750 CAR, huVHH-753 CAR, huVHH-836 CAR, huVHH-840 CAR, huVHH-843 CAR, huVHH-846 CAR 및 VHH-623 CAR, VHH-640 CAR 및/또는 VHH-657 CAR은 아래의 부문 6에 나타낸 바와 같이 생성된다.
또한, Bi-VHH1 CAR, Bi-VHH2 CAR, Bi-VHH3 CAR, Bi-VHH4(G4S)1 CAR, Bi-VHH4(G4S)2 CAR, Bi-VHH4(G4S)3 CAR, Bi-VHH4(G4S)4 CAR, Bi-VHH4 (G4S)5 CAR 및 Tri-VHH CAR을 포함하는, 예시적인 다가 CAR, 예컨대, 2가 및 3가 CAR은 부문 6에 나타낸 바와 같이 생성된다.
일부 실시형태에서, 서열번호　81의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　82의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　93의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 98의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　99의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　103의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　104의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　189의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　190의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　191의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에서 제공된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 CAR은 아래의 부문 6에 예시된 CAR 중 어느 하나에 대해서 특정 동일성 백분율로 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호　81의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　82의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　83의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　84의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　85의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　86의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　87의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　88의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　89의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 90의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 91의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 92의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 93의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　94의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　95의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　96의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　97의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　98의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　99의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　100의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　101의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 102의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　103의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　104의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　105의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　106의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　189의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　190의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호　191의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CD20 CAR이 본 명세서에서 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 임의의 CD20 CAR을 암호화하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공된다. 핵산 서열 및 벡터에 관한 더 상세한 설명을 아래에 제공한다.
5.4. 조작된 면역 효과기 세포
또 다른 양상에서, 본 명세서에 기재된 CAR 중 어느 하나를 포함하는 숙주 세포(예컨대, 면역 효과기 세포)가 본 명세서에서 제공된다.
따라서, 일부 실시형태에서, (a) 하나 이상의 항-CD20 sdAb(들)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)가 본 명세서에 제공되되, 항-CD20 sdAb는, 예를 들어, 표 2의 VHH 도메인 및 표 2의 해당 VHH 도메인 중 어느 것 중 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 갖는 것을 포함하는, 위의 부문 5.2에 기재된 바와 같은 항-CD20 sdAb이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 sdAb는 낙타과, 키메라, 인간 또는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)의 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치된 힌지 도메인(예컨대, CD8α 힌지 도메인)을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 폴리펩타이드의 N-말단에 위치된 신호 펩타이드(예컨대, CD8α 신호 펩타이드)를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 N-말단에서 C-말단까지: CD8α 신호 펩타이드, 세포외 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137로부터 유래된 공자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ로부터 유래된 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, (a) 하나 이상의 항-CD20 sdAb(들)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)가 본 명세서에 제공되되, 항-CD20 sdAb는 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 183, 서열번호 184 또는 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, (a) 하나 이상의 항-CD20 sdAb(들)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)가 본 명세서에 제공되되, 항-CD20 sdAb는 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 183, 서열번호 184 또는 서열번호 185의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)의 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치된 힌지 도메인(예컨대, CD8α 힌지 도메인)을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 폴리펩타이드의 N-말단에 위치된 신호 펩타이드(예컨대, CD8α 신호 펩타이드)를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 N-말단에서 C-말단까지: CD8α 신호 펩타이드, 세포외 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137로부터 유래된 공자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ로부터 유래된 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 189, 서열번호 190 및 서열번호 191로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 189, 서열번호 190 및 서열번호 191로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)가 본 명세서에 제공된다.
다른 실시형태에서, (a) CD20에 특이적으로 결합하는 제1 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인 및 하나 이상의 추가적인 항원 결합 도메인(들); (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 다중특이성(예컨대, 이중특이성 또는 삼중특이성) 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 추가적인 항원 결합 도메인은 CD22, CD19, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 및 당지질 F77로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 결합한다. 일부 실시형태에서, 제1 sdAb 및/또는 추가적인 sdAb는 낙타과, 키메라, 인간 또는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 제1 단일 도메인 항체 및 추가적인 단일 도메인 항체는 펩타이드 결합 또는 펩타이드 링커를 통해 서로 융합된다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 약 50개 이하(예컨대, 약 35, 25, 20, 15, 10 또는 5개 중 어느 하나 이하)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)의 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 다중특이성 CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치된 힌지 도메인(예컨대, CD8α 힌지 도메인)을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 다중특이성 CAR은 폴리펩타이드의 N-말단에 위치된 신호 펩타이드(예컨대, CD8α 신호 펩타이드)를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 N-말단에서 C-말단까지: CD8α 신호 펩타이드, 세포외 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137로부터 유래된 공자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ로부터 유래된 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 효과기 세포는 T 세포, NK 세포, 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC), 조혈 줄기 세포, 다능성 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 효과기 세포는 자가이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 효과기 세포는 동종이계이다.
또한 둘 이상의 상이한 CAR을 포함하는(또는 발현시키는) 조작된 면역 효과기 세포가 제공된다. 본 명세서에 기재된 CAR 중 임의의 둘 이상은 조합하여 발현될 수 있다. CAR은 상이한 항원을 표적으로 할 수 있고, 이에 의해 상승적 또는 상가적 효과를 제공할 수 있다. 둘 이상의 CAR이 동일한 벡터 또는 상이한 벡터 상에서 암호화될 수 있다.
조작된 면역 효과기 세포는 하나 이상의 치료 단백질 및/또는 면역조절제, 예컨대, 면역 관문 저해제를 추가로 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 PCT/CN2016/073489 및 PCT/CN2016/087855를 참조하며, 이들은 본 명세서에 이들의 전문이 참조에 의해 원용된다.
5.4.1. 벡터
본 개시내용은 본 명세서에 기재된 CAR 중 어느 하나를 클로닝 및 발현시키기 위한 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 진핵 세포, 예컨대, 포유류 세포에서의 복제 및 통합에 적합하다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 백시니아 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터 및 이들의 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)] 및 기타 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다.
포유류 세포에 유전자 전달을 위한 다수의 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 이종성 핵산은 벡터에 삽입될 수 있고, 당업계에 공지된 기법을 이용하여 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 이어서, 재조합 바이러스는 단리되고, 시험관내 또는 생체외에서 조작된 포유류 세포에 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템은 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 일부 실시형태에서, 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 예를 들어, 면역조절제(예컨대, 면역 관문 저해제) 암호화 서열을 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터 및/또는 키메라 항원 수용체를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터는 당업계에 공지된 프로토콜로 패키징될 수 있다. 얻어진 렌티바이러스 벡터는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 포유류 세포(예컨대, 1차 인간 T 세포)를 형질도입하는 데 사용될 수 있다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는 장기간 유전자 전달을 달성하기 위한 적합한 도구인데, 이들이 이식유전자의 장기간, 안정적인 통합 및 자손 세포에서 이의 증식을 가능하게 하기 때문이다. 렌티바이러스 벡터는 또한 낮은 면역원성을 갖고, 비증식 세포를 형질도입할 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 본 명세서에 기재된 CAR을 암호화하는 핵산 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 핵산은, 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선택 가능한 마커를 이용하는 것을 포함하는 당업계의 임의의 공지된 분자 클로닝 방법을 이용하여 벡터에 클로닝될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 포유류 세포에서의 유전자 발현을 위한 다양한 프로모터가 탐구되었고, 당업계에 공지된 임의의 프로모터가 본 개시내용에서 사용될 수 있다. 프로모터는 구성적 프로모터 또는 조절된 프로모터, 예컨대, 유도성 프로모터로서 대략적으로 범주화될 수 있다.
일부 실시형태에서, CAR을 암호화하는 핵산은 구성적 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 구성적 프로모터는 이종성 유전자(이식유전자로도 지칭됨)가 숙주 세포에서 구성적으로 발현되는 것을 가능하게 한다. 본 명세서에 상정된 예시적인 구성적 프로모터는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 인간 인간 연장 인자-1 알파(hEF1α), 유비퀴틴 C 프로모터(UbiC), 포스포글리세로키나제 프로모터(PGK), 유인원 바이러스 40 초기 프로모터(SV40) 및 CMV 초기 인핸서(CAGG)와 결합된 닭 β-액틴 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이식유전자 발현을 유도함에 있어서 이러한 구성적 프로모터의 효율은 엄청난 수의 연구에서 널리 비교되었다. 예를 들어, Michael C. Milone 등은 1차 인간 T 세포에서 키메라 항원 수용체 발현을 유도하는 CMV, hEF1α, UbiC 및 PGK의 효율을 비교하였고, hEF1α 프로모터가 가장 높은 수준의 이식유전자 발현을 유도할 뿐만 아니라, CD4 및 CD8 인간 T 세포에서 최적으로 유지되었다는 결론을 내렸다(Molecular Therapy, 17(8): 1453-1464 (2009)). 일부 실시형태에서, CAR을 암호화하는 핵산은 hEF1α 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, CAR을 암호화하는 핵산은 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 유도성 프로모터는 조절된 프로모터의 범주에 속한다. 유도성 프로모터는 한 가지 이상의 조건, 예컨대, 물리적 상태, 조작된 면역 효과기 세포의 미세환경 또는 조작된 면역 효과기 세포의 생리적 상태, 유도물질(즉, 유도제), 또는 이들의 조합에 의해 유도될 수 있다.
일부 실시형태에서, 유도 조건은 조작된 포유류 세포에서, 그리고/또는 약제학적 조성물을 받는 대상체에서 내인성 유전자의 발현을 유도하지 않는다. 일부 실시형태에서, 유도 조건은 유도물질, 방사선조사(예컨대, 이온화 방사선, 광), 온도(예컨대, 열), 산화환원 상태, 종양 환경 및 조작된 포유류 세포의 활성화 상태로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 벡터는 또한 렌티바이러스 벡터를 통해 형질감염된 숙주 세포 집단으로부터 CAR을 발현시키는 세포를 선택하기 위해 선택 가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자를 포함한다. 선택 가능한 마커와 리포터 유전자는 둘 다 숙주 세포에서의 발현을 가능하게 하기 위해 적절한 조절 서열에 측접될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 핵산 서열의 발현 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열 및 프로모터를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 CAR를 암호화하는 하나 초과의 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 제1 CAR을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 제2 CAR을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하는 핵산을 포함하되, 제1 핵산은 자기-절단성 펩타이드를 암호화하는 제3 핵산 서열을 통해 제2 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 자기-절단성 펩타이드는 T2A, P2A 및 F2A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
5.4.2. 면역 효과기 세포
"면역 효과기 세포"는 면역 효과기 기능을 수행할 수 있는 면역 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 적어도 FcγRIII을 발현시키고, ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 면역 효과기 세포의 예는 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC), 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포, 호중구 및 호산구를 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, CD4+/CD8+, CD4-/CD8- 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 CAR을 발현시키고, 표적 세포, 예컨대, CD20+ 종양 세포에 결합할 때, IL-2, TFN 및/또는 TNF를 생산한다. 일부 실시형태에서, CD8+ T 세포는 CAR을 발현시키고 표적 세포에 결합할 때, 항원-특이적 표적 세포를 용해시킨다.
일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 NK 세포이다. 다른 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 확립된 세포주, 예를 들어, NK-92 세포일 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 줄기 세포, 예컨대, 조혈 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, iPS 또는 배아 줄기 세포로부터 분화될 수 있다.
조작된 면역 효과기 세포는 면역 효과기 세포, 예컨대, T 세포에 CAR을 도입함으로써 제조된다. 일부 실시형태에서, CAR은 단리된 핵산 중 어느 하나 또는 위에 기재한 벡터 중 어느 하나를 형질감염시킴으로써 면역 효과기 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, CAR은 단백질을 세포막에 삽입하는 한편, CELL SQUEEZE®와 같은 미세유동 시스템을 통해 세포를 통과시킴으로써, 면역 효과기 세포에 도입된다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제20140287509호 참조).
벡터 또는 단리된 핵산을 포유류 세포에 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 기재된 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 방법에 의해 면역 효과기 세포에 전달될 수 있다.
면역 효과기 세포에 벡터를 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 유전자총, 미량주사법, 전기천공법 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]을 참조한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 전기천공법에 의해 세포에 도입된다.
벡터를 면역 효과기 세포에 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터는 포유류, 예를 들어, 인간 세포에 유전자를 삽입하기 위해 가장 널리 이용되는 방법이 되었다.
면역 효과기 세포에 벡터를 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드 분산 시스템, 예컨대, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드 및 수중유 에멀션, 마이셀, 혼합 마이셀 및 리포솜을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 시험관내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포솜(예를 들어, 인공 막 소포)이다.
일부 실시형태에서, 임의의 본 명세서에 기재된 CAR을 암호화하는 RNA 분자는 통상적인 방법(예를 들어, 시험관내 전사)에 의해 제조될 수 있고, mRNA 전기천공법과 같은 공지되는 방법을 통해 면역 효과기 세포에 도입된다. 예를 들어, 문헌[Rabinovich et al., Human Gene Therapy 17:1027-1035 (2006)]을 참조한다.
일부 실시형태에서, 형질도입 또는 형질감염된 면역 효과기 세포는 벡터 또는 단리된 핵산의 도입 후에 생체외에서 증식된다. 일부 실시형태에서, 형질도입 또는 형질감염된 면역 효과기 세포는 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일 또는 14일 중 어느 것 동안에 증식을 위해 배양된다. 일부 실시형태에서, 형질도입 또는 형질감염된 면역 효과기 세포는 조작된 포유류 세포를 선택하기 위해 추가로 평가 또는 선별된다.
형질감염된 세포를 잠재적으로 확인하고 조절 서열의 기능성을 평가하기 위해 리포터 유전자가 사용될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용자 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 발현되지 않고 발현이 일부 용이하게 검출 가능한 특성, 예를 들어, 효소 활성에 의해 나타나는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포에 도입된 후 적합한 때에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제를 암호화하는 유전자 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ui-Tei et al. FEBS Letters 479: 79-82 (2000)]). 적합한 발현 시스템은 잘 공지되어 있고, 공지된 기법을 이용하여 제조되거나 상업적으로 얻을 수 있다.
조작된 면역 효과기 세포에서 CAR을 암호화하는 핵산 존재를 확인하는 다른 방법은, 예를 들어, 당업자에게 잘 공지된 분자 생물학 검정, 예컨대, 서던 및 노던 블롯, RT-PCR 및 PCR; 생화학적 검정, 예컨대, 면역학적 방법(예컨대, ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의한 특정 펩타이드의 존재 또는 부재의 검출을 포함한다.
5.4.3. T 세포의 공급원
일부 실시형태에서, T 세포의 확장 및 유전자 변형 전에, T 세포의 공급원을 대상체로부터 얻는다. T 세포는 말초 혈액 단핵구 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 당업계에서 이용 가능한 다수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포는 당업자에게 공지된 다수의 기법, 예컨대, Ficoll™ 분리를 이용하여 대상체로부터 수집한 혈액 단위로부터 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 개체의 순환 혈액으로부터 세포는 성분채집술에 의해 얻는다. 성분채집술 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하는, 림프구를 함유한다. 일부 실시형태에서, 성분채집술에 의해 수집되는 세포는 혈장 분획을 제거하기 위해 그리고 후속 가공 단계를 위해 적절한 완충제 또는 배지에 세포를 위치시키기 위해 세척될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 일부 실시형태에서, 세포 용액은 칼슘이 없고, 마그네슘이 없을 수 있거나 2가 양이온이 모두는 아니더라도 많이 부족할 수 있다. 칼슘이 존재하지 않을 때 초기 활성화 단계는 확대된 활성화를 야기할 수 있다. 당업자가 용이하게 인식할 바와 같이, 세척 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예컨대, 제조업자의 지침에 따라 반자동화된 "통과액" 원심분리(예를 들어, Cobe 2991 세포 처리기, Baxter CytoMate, 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 이용함으로써 달성될 수 있다. 세척 후에, 세포는 다양한 생체적합성 완충제, 예를 들어, 무 Ca2+, 무 Mg2+ PBS, PlasmaLyte A, 또는 완충제 유무와 상관없이 다른 식염수 용액에서 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분채집술 샘플의 바람직하지 않은 성분은 제거되고, 세포는 배양 배지에서 직접적으로 재현탁될 수 있다.
일부 실시형태에서, T 세포는, 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써, 예를 들어, PERCOLL™ 구배를 통해 또는 역류 원심성 세포분리에 의해 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. T 세포의 특정 하위집단, 예컨대, CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및 CD45RO+T 세포는 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, T 세포는 목적하는 T 세포의 양성 선택을 위한 충분한 시간 동안에 항-CD3/항-CD28(즉, 3Х28)-접합 비드, 예컨대, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와의 인큐베이션에 의해 단리된다. 일부 실시형태에서, 시간은 약 30분이다. 추가 실시형태에서, 시간은 30분에서 36시간 이상의 및 그 사이의 모든 정수 값의 범위이다. 추가 실시형태에서, 시간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간이다. 일부 실시형태에서, 시간은 10 내지 24시간이다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션 시간은 24시간이다. 백혈병 환자로부터의 T 세포의 단리를 위해, 더 긴 인큐베이션 시간, 예컨대, 24시간은 세포 수율을 증가시킬 수 있다. 종양 조직으로부터 또는 면역-손상 개체로부터 종양 침윤성 림프구(TIL)를 단리시킴에 있어서, 다른 세포 유형과 비교할 때 소수의 T 세포가 있는 임의의 상황에서 T 세포를 단리시키기 위해 더 긴 인큐베이션 시간이 사용될 수 있다. 추가로, 더 긴 인큐베이션 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 단순히 시간을 단축 또는 증가시킴으로써, T 세포는 CD3/CD28 비드에 결합되도록 허용되고/되거나 비드 대 T 세포 비를 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단은 배양 개시 시 또는 공정 동안의 다른 시점에 우선적으로 선택될 수 있다. 추가적으로, 비드 또는 다른 표면에 대한 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비를 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단은 배양 개시 시 또는 공정 동안의 다른 시점에 우선적으로 선택될 수 있다. 당업자는 다회의 선택 라운드가 또한 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 선택 절차를 수행하고 활성화 및 확장 공정에서 "비선택" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "비선택된" 세포는 또한 추가 선택 라운드가 실시될 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 풍부화는 음성 선택된 세포에 고유한 표면 마커로 향하는 항체의 조합에 의해 달성될 수 있다. 한 가지 방법은 음성 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커로 향하는 단클론성 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역흡착 또는 유세포분석을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부화하기 위해, 단클론성 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ 및 FoxP3+을 발현시키는 조절 T 세포를 풍부화하거나 또는 양성 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 특정 실시형태에서, T 조절 세포는 항-C25 접합 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 고갈된다.
양성 또는 음성 선택에 의한 목적하는 세포 집단의 단리를 위해, 세포 농도 및 표면(예를 들어, 입자, 예컨대, 비드)은 달라질 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포와 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해, 비드 및 세포가 함께 혼합된 용적을 유의미하게 감소시키는 것(즉, 세포 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 2십억개의 세포/㎖ 농도가 사용된다. 일 실시형태에서, 1십억개 세포/㎖ 농도가 사용된다. 추가 실시형태에서, 1억개 초과의 세포/㎖가 사용된다. 추가 실시형태에서, 1천만, 1천 5백만, 2천만, 2천 5백만, 3천만, 3천 5백만, 4천만, 4천 5백만 또는 5천만개의 세포/㎖의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 7천 5백만, 8천만, 8천 5백만, 9천만, 9천 5백만 또는 1억개의 세포/㎖의 세포 농도가 사용된다. 추가 실시형태에서, 1억 2천 5백만 또는 1억 5천만개의 세포/㎖ 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 이용하는 것은 증가된 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장을 초래할 수 있다. 추가로, 높은 세포 농도의 사용은 관심의 표적 항원을 약하게 발현시킬 수 있는 세포, 예컨대, CD28-음성 T 세포, 또는 다수의 종양 세포가 존재하는 샘플(즉, 백혈병 혈액, 종양 조직 등)의 더 효율적인 포획을 가능하게 할 수 있다. 이러한 세포 집단은 치료 가치를 가질 수 있고 얻는 것이 바람직할 것이다. 일부 실시형태에서, 고농도의 세포를 이용하여, 정상적으로는 더 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 더 효율적인 선택을 가능하게 한다.
일부 실시형태에서, 보다 저농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포와 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)의 혼합물을 유의미하게 희석시킴으로써, 입자와 세포 사이의 상호작용은 최소화된다. 이는 입자에 결합될 다량의 목적하는 항원을 발현시키는 세포를 선택한다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 보다 고수준의 CD28을 발현시키고, 묽은 농도에서 CD8+ T 세포보다는 더 효율적으로 포획된다. 일부 실시형태에서, 사용되는 세포 농도는 5×106/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사용되는 농도는 약 1×105/㎖ 내지 1×106/㎖, 및 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 2 내지 10℃, 또는 실온에서 다양한 속도로 다양한 시간 길이 동안 회전자 상에서 인큐베이션될 수 있다.
자극을 위해 T 세포는 또한 세척 단계 후에 냉동될 수 있다. 이론에 구속되는 일 없이, 냉동 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도의 단핵구를 제거함으로써 더욱 균일한 생성물을 제공할 수 있다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후에, 세포는 냉동 용액에서 현탁될 수 있다. 다수의 냉동 용액 및 파라미터가 당업계에 알려져 있고 본 문맥에서 유용할 것이지만, 한 가지 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% plasmalyte-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO를 함유하는 배양 배지 또는 예를 들어, Hespan 및 PlasmaLyte A를 함유하는 기타 적합한 세포 냉동 배지를 수반한다. 이어서, 세포를 분당 1°의 속도로 -80℃까지 냉동시키고, 기상(vapor phase)의 액체 질소 보관 탱크에 보관한다. 제어된 냉동의 다른 방법뿐만 아니라 -20℃에서 또는 액체 질소에서 즉시 제어되지 않는 냉동이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 동결보존된 세포는 해동되고, 본 명세서에 기재된 바와 같이 세척되고, 활성화 전에 실온에서 1시간 동안 둔다.
또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 확장 세포가 필요하기 전의 시기에 대상체로부터의 혈액 샘플 수집 또는 성분채집 생성물이 본 개시내용에 상정된다. 이렇게 해서, 확장될 세포의 공급원은 필요한 임의의 시점에, 목적하는 세포, 예컨대, T 세포가 수집되고, T 세포 요법, 예컨대, 본 명세서에 기재된 것으로부터 유익을 얻는 다수의 질환 또는 병태에 대해 T 세포 요법에서 이후의 사용을 위해 단리되고 냉동될 수 있다. 일 실시형태에서, 혈액 샘플 또는 성분채집은 일반적으로 건강한 대상체로부터 취해진다. 특정 실시형태에서, 혈액 샘플 또는 성분채집은 일반적으로 질환이 발생할 위험에 있지만 아직 질환이 발생되지 않은 건강한 대상체로부터 취하며, 관심 세포는 단리되고 이후 사용을 위해 냉동된다. 특정 실시형태에서, T 세포는 이후에 확장, 냉동 및 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 샘플은 본 명세서에 기재된 바와 같은 특정 질환의 진단 직후에 그러나 임의의 치료 전에 환자로부터 수집된다. 추가 실시형태에서, 세포는 나탈리주맙, 에팔리주맙, 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트, 및 FK506, 항체 또는 기타 면역절제제, 예컨대, CAMPATH, 항-CD3 항체, 사이톡산, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228와 같은 제제 및 방사선조사에 의한 치료를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다수의 관련 치료 양상 전에 대상체로부터의 혈액 샘플 또는 성분채집으로부터 단리된다. 이들 약물은 칼슘 의존적 포스파타제 칼시뉴린(사이클로스포린 및 FK506)을 저해하거나, 성장 인자 유도 신호전달(라파마이신)에 중요한 p70S6 키나제를 저해한다(Liu et al., Cell 66:807-815 (1991); Henderson et al., Immun 73:316-321 (1991); Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773 (1993)). 추가 실시형태에서, 세포는 환자에 대해 단리되고, 골수 또는 줄기 세포 이식, 화학요법제, 예컨대, 플루다라빈, 외부 방사선 치료(XRT), 사이클로포스파마이드 또는 OKT3 또는 CAMPATH와 같은 항체를 이용하는 T 세포 절제적 요법(ablative therapy)과 함께(예를 들어, 전에, 동시에 또는 후에) 이후의 사용을 위해 냉동된다. 다른 실시형태에서, 세포는 사전에 단리되고, CD20과 반응하는 제제, 예를 들어, 리툭산과 같은 B-세포 절제적 요법 후의 치료를 위한 이후의 사용을 위해 냉동될 수 있다.
일부 실시형태에서, T 세포는 치료 후에 환자로부터 직접 얻는다. 이와 관련하여, 특정 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물에 의한 치료 후에, 환자가 치료로부터 정상적으로 회복되는 기간 동안 치료 직후에, 얻어진 T 세포의 품질은 생체외에서 이들이 확장하는 능력에 대해 최적이거나 개선될 수 있다는 것이 관찰되었다. 마찬가지로, 본 명세서에 기재된 방법을 이용하는 생체외 조작 후에, 이들 세포는 향상된 생착 및 생체내 확장을 위한 바람직한 상태일 수 있다. 따라서, 이 회복기 동안에 T 세포, 수지상 세포, 또는 조혈계통의 다른 세포를 포함하는 혈액 세포를 수집하는 것이 본 개시내용의 내용에 상정된다. 추가로, 특정 실시형태에서, 동원(mobilization)(예를 들어, GM-CSF에 의한 동원) 및 컨디셔닝 요법은 대상체에서의 병태를 생성하는 데 사용될 수 있되, 특히 요법 후 정해진 시간 창 동안에 특정 세포 유형의 재증식, 재순환, 재생 및/또는 확장이 선호된다. 예시적인 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 기타 면역계 세포를 포함한다.
5.4.4. T 세포의 활성화 및 확장
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CAR에 의한 T 세포의 유전적 변형 전 또는 후에, T 세포는 활성화될 수 있고, 일반적으로, 예를 들어, 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 특허 출원 공개 제20060121005호에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 확장된다.
일반적으로, T 세포는 CD3/TCR 복합체 연관 신호를 자극하는 제제 및 T 세포 표면 상에서 공자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장될 수 있다. 특히, T 세포 집단은, 예컨대, 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 표면 상에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 운반체와 함께 단백질 키나제 C 활성체(예를 들어, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해, 본 명세서에 기재된 바와 같이 자극될 수 있다. T 세포 표면 상의 부속 분자의 공자극을 위해, 부속 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포의 집단은, T 세포의 증식을 자극하는 데 적절한 조건 하에서, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포 중 하나의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 항-CD3 항체의 예는 UCHT1, OKT3, HIT3a(BioLegend, 미국 샌디에이고 소재)를 포함하며, 당업계에서 통상적으로 알려진 다른 방법과 같이 사용될 수 있다(Graves J, et al., J.Immunol. 146:2102 (1991); Li B, et al., Immunology 116:487 (2005); Rivollier A, et al., Blood 104:4029 (2004)). 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28(Diaclone, 프랑스 브장송 소재)을 포함하고, 당업계에서 통상적으로 알려진 다른 방법과 같이 사용될 수 있다(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977 (1998); Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328 (1999); Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63 (1999)).
일부 실시형태에서, T 세포에 대한 1차 자극 신호 및 공자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각 신호를 제공하는 제제는 용해되거나 표면에 결합될 수 있다. 표면에 결합될 때, 제제는 동일한 표면에(즉, "시스" 형성으로) 또는 별도의 표면에(즉, "트랜스" 형성으로) 결합될 수 있다. 대안적으로, 한 가지 제제는 표면에 결합될 수 있고, 다른 하나의 제제는 용해될 수 있다. 일 실시형태에서, 공자극 신호를 제공하는 제제는 세포 표면에 결합되고, 1차 활성화 신호를 제공하는 제제는 용해되거나 표면에 결합된다. 특정 실시형태에서, 제제는 둘 다 용해될 수 있다. 다른 실시형태에서, 제제는 가용성 형태일 수 있고, 이어서, 표면, 예컨대, Fc 수용체를 발현시키는 세포 또는 제제에 결합할 항체 또는 다른 결합제에 가교된다. 이와 관련하여, 특정 실시형태에서, 본 개시내용에서 T 세포를 활성화 및 확장시키는 데 사용하기 위한 것으로 고려되는 인공 항원 제시 세포(aAPC)에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제20040101519호 및 제20060034810호를 참조한다.
일부 실시형태에서, T 세포는 제제-코팅 비드와 조합되고, 비드 및 세포는 후속적으로 분리되며, 이어서, 세포는 배양된다. 대안의 실시형태에서, 배양 전에, 제제-코팅 비드 및 세포는 분리되지 않지만, 함께 배양된다. 추가 실시형태에서, 비드 및 세포는 자기력과 같은 힘의 적용에 의해 처음 농축되고, 세포 표면 마커의 증가된 결찰을 초래하여, 세포 자극을 유도한다.
예로서, 세포 표면 단백질은 항-CD3 및 항-CD28이 부착되어(3Х28개의 비드) T 세포와 접촉되는 상자성 비드를 허용함으로써 결찰될 수 있다. 일 실시형태에서, 세포(예를 들어, 104 내지 4×108개의 T 세포) 및 비드(예를 들어, 1:100의 권장 역가에서의 항-CD3/CD28 MACSiBead 입자)는 완충제, 바람직하게는 PBS에서 (칼슘 및 마그네슘과 같은 2가 양이온 없이) 조합된다. 당업자는 임의의 세포 농도가 사용될 수 있다는 것을 용이하게 인식할 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 샘플에서 매우 드물 수 있고, 샘플의 0.01%만을 포함하거나 또는 전체 샘플(즉, 100%)은 관심의 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포 수는 본 개시내용의 내용 내이다. 특정 실시형태에서, 세포와 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해, 입자 및 세포가 함께 혼합된 용적을 유의미하게 감소시키는 것(즉, 세포 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 약 2십억개의 세포/㎖ 농도가 사용된다. 다른 실시형태에서, 1억개 초과의 세포/㎖가 사용된다. 추가 실시형태에서, 1천만, 1천 5백만, 2천만, 2천 5백만, 3천만, 3천 5백만, 4천만, 4천 5백만 또는 5천만개의 세포/㎖의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 7천 5백만, 8천만, 8천 5백만, 9천만, 9천 5백만 또는 1억개의 세포/㎖의 세포 농도가 사용된다. 추가 실시형태에서, 1억 2천 5백만 또는 1억 5천만개의 세포/㎖ 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 이용하는 것은 증가된 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장을 초래할 수 있다. 추가로, 높은 세포 농도의 사용은 관심의 표적 항원을 약하게 발현시킬 수 있는 세포, 예컨대, CD28-음성 T 세포의 더 효율적인 포획을 가능하게 할 수 있다. 이러한 세포 집단은 치료 가치를 가질 수 있고, 특정 실시형태에서 얻는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 고농도의 세포를 이용하여, 정상적으로는 더 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 더 효율적인 선택을 가능하게 한다.
일부 실시형태에서, 혼합물은 몇 시간(약 3시간) 내지 약 14일 동안 또는 그 사이의 임의의 매시간의 정수 값 동안에 배양될 수 있다. 다른 실시형태에서, 혼합물은 21일 동안 배양될 수 있다. 일 실시형태에서, 비드 및 T 세포는 약 8일 동안 함께 배양된다. 다른 실시형태에서, 비드 및 T 세포는 2 내지 3일 동안 함께 배양된다. T 세포의 배양 시간이 60일 이상일 수 있도록 몇 주기의 자극이 또한 요망될 수 있다. T 세포 배양에 적절한 조건은 혈청(예를 들어, 소태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ 및 TNF-α 또는 당업자에게 공지된 세포 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하는, 증식 및 생존에 필요한 인자를 함유할 수 있는 적절한 배지(예를 들어, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는 X-vivo 15(Lonza))를 포함한다. 세포 성장을 위한 다른 첨가제는 계면활성제, 플라스마네이트, 및 환원제, 예컨대, N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 배지는 아미노산, 피루브산나트륨 및 비타민이 첨가되거나, 무혈청이거나 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 정해진 호르몬 세트 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 사이토카인(들)의 양이 보충된, RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, 및 X-Vivo 20, 옵티마이저를 포함할 수 있다. 항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험 배양물에만 포함되며, 대상체에 주입될 세포 배양물에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지원하는 데 필요한 조건, 예를 들어, 적절한 온도(예를 들어, 37℃) 및 분위기(예를 들어, 공기+5% CO2) 하에 유지된다. 다양한 자극 시간에 노출된 T 세포는 상이한 특징을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 전형적인 혈액 또는 성분채집된 말초 혈액 단핵구 세포 생성물은 세포독성 또는 억제인자 T 세포 집단(TC, CD8)보다 큰 헬퍼 세포 집단(TH, CD4+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체를 자극하는 것에 의한 T 세포의 생체외 확장은 약 8 내지 9일 전에 주로 TH 세포로 이루어진 T 세포 집단을 생성하는 반면, 약 8 내지 9일 후에, T 세포의 집단은 TC 세포의 점점 더 큰 집단을 포함한다. 따라서, 치료 목적에 따라서, 우세하게 TH 세포를 포함하는 T 세포 집단을 대상체에게 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게, TC 세포의 항원-특이적 서브세트가 단리되었지만, 이 서브세트를 더 큰 정도로 확장시키는 것이 유리할 수 있다.
추가로, CD4 및 CD8 마커에 추가로, 다른 표현형 마커는 유의미하게 다르지만, 대부분 세포 확장 과정 동안에 재현 가능하다. 따라서, 이러한 재현 가능성은 특정 목적을 위해 활성화된 T 세포 생성물을 맞추는 능력을 가능하게 한다.
5.5. 폴리뉴클레오타이드
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 CD20에 결합하는 단일 도메인 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 본 명세서에 기재된 CD20에 결합하는 단일 도메인 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드는 RNA 형태 또는 DNA 형태일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA를 포함하고; 이중-가닥 또는 단일 가닥일 수 있고, 단일 가닥의 경우 암호화 가닥 또는 비암호화(안티센스) 가닥일 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 cDNA의 형태이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 합성 폴리뉴클레오타이드의 형태이다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 41의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 64를 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 42의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 65를 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 43의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 66을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 44의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 67을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 45의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 68을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 46의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 69를 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 47의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 70을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 48의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 71을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 49의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 72를 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 50의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 73을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 51의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 74를 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 52의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 75를 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 53의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 76를 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 54의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 77을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 55의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 78을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 56의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 79를 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 57의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 80을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 58의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 59의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 60의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 61의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 62의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 63의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 183의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 186을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 184의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 187을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 185의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 188을 갖는 핵산을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 제공된 CD20 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드는 RNA 형태 또는 DNA 형태일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA를 포함하고; 이중-가닥 또는 단일 가닥일 수 있고, 단일 가닥의 경우 암호화 가닥 또는 비암호화(안티 센스) 가닥일 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 cDNA의 형태이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 합성 폴리뉴클레오타이드의 형태이다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 81의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 108을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 82의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 109를 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 83의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 110을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 84의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 111을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 85의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 112를 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 86의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 113을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 87의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 114를 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 88의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 115를 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 89의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 116을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 90의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 117을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 91의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 118을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 92의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 119를 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 93의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 120을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 94의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 121을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 95의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 122를 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 96의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 123을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 97의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 124를 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 98의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 125를 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 99의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 126을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 100의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 127을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 101의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 128을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 102의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 129를 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 103의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 130을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 104의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 131을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 105의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 132를 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 106의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 133을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 189의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 192를 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 190의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 193을 갖는 핵산을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 191의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열, 예컨대, 서열번호 194를 갖는 핵산을 포함한다.
본 개시내용은 추가로 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드의 변이체에 관한 것이되, 변이체는, 예를 들어, 본 개시내용의 CD20에 결합하는 단일 도메인 항체 또는 CAR의 단편, 유사체 및/또는 유도체를 암호화한다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 단일 도메인 항체 또는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 대해 적어도 약 75% 동일, 적어도 약 80% 동일, 적어도 약 85% 동일, 적어도 약 90% 동일, 적어도 약 95% 동일하고, 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CD20에 결합하는 단일 도메인 항체 또는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 대해 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 어구 "참조 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도, 예를 들어, 95% "동일한" 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드"는 폴리뉴클레오타이드 서열이 참조 뉴클레오타이드 서열의 각 100개의 뉴클레오타이드당 최대 5개의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 참조 서열과 동일하다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 다시 말해서, 참조 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 얻기 위해, 참조 서열에서 뉴클레오타이드의 최대 5%는 결실되거나 다른 뉴클레오타이드로 치환될 수 있거나, 또는 참조 서열에서 총 뉴클레오타이드의 최대 5%의 뉴클레오타이드 수는 참조 서열에 삽입될 수 있다. 참조 서열의 이들 돌연변이는 참조 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치 또는 말단 위치 사이의 어느 곳에서나 생길 수 있으며, 참조 서열의 뉴클레오타이드 중에서 개개로 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 인접한 기에 배치된다.
폴리뉴클레오타이드 변이체는 암호화 영역, 비암호화 영역 또는 둘 다에서의 변경을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 침묵 치환, 첨가 또는 결실을 생성하지만, 암호화된 폴리펩타이드의 특성 또는 활성을 변경시키지 않는 변경을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 (유전자 암호의 축중으로 인해) 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 대한 변화를 초래하지 않는 침묵 치환을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는 다양한 이유로, 예를 들어, 특정 숙주에 대한 코돈 발현을 최적화하기 위해(즉, 인간 mRNA의 코돈을 박테리아 숙주, 예컨대, 이콜라이(E. coli)에 의해 선호되는 것으로 바꿈) 생산될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 서열의 비암호화 또는 암호화 영역에 적어도 하나의 침묵 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 암호화된 폴리펩타이드의 발현(또는 발현 수준을)을 조절 또는 변경시키도록 생산된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 증가시키도록 생산된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 감소시키도록 생산된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 모 폴리뉴클레오타이드 서열에 비해서 암호화된 폴리펩타이드의 증가된 발현을 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 모 폴리뉴클레오타이드 서열에 비해서 암호화된 폴리펩타이드의 감소된 발현을 갖는다.
또한 본 명세서에 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터가 제공된다. 실시형태에서, 핵산 분자는 재조합 발현 벡터에 혼입될 수 있다. 본 개시내용은 본 개시내용의 임의의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "재조합 발현 벡터"는 숙주 세포에 의해 mRNA, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 발현을 허용하는 유전자 변형된 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 작제물을 의미하며, 작제물이 mRNA, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 때, 벡터는 세포 내에서 발현되는 mRNA, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 갖기에 충분한 조건 하에 세포와 접촉된다. 본 명세서에 기재된 벡터는 전체로서 천연 유래가 아니지만; 그러나, 벡터의 일부는 천연 유래일 수 있다. 기재된 재조합 발현 벡터는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, 천연 공급원으로부터 부분적으로 합성되거나 얻고, 자연적, 비자연적 또는 변경된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있는, DNA 및 RNA를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 유형의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 천연-유래 또는 비천연 유래 뉴클레오타이드간 결합 또는 결합 유형 둘 다를 포함할 수 있다. 비천연 유래 또는 변경된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드간 결합은 전사 또는 벡터의 복제를 방해하지 않는다.
실시형태에서, 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있으며, 임의의 적합한 숙주를 형질전환 또는 형질감염시키기 위해 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 플라스미드 및 바이러스와 같이 증식 및 확장을 위해 또는 발현 또는 둘 다를 위해 설계된 것을 포함한다. 벡터는 pUC 시리즈(Fermentas Life Sciences, 메릴랜드주 글렌 버니 소재), pBluescript 시리즈(Stratagene, 캘리포니아주 라호야 소재), pET 시리즈(Novagen, 위스콘신주 메디슨 소재), pGEX 시리즈(Pharmacia Biotech, 스웨덴 웁살라 소재) 및 pEX 시리즈(Clontech, 캘리포니아주 팔로알토 소재)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 박테리오파지 벡터, 예컨대, λGT10, λGT11, λEMBL4 및 λNM1149, λZapII(Stratagene)가 사용될 수 있다. 식물 발현 벡터의 예는 pBI01, pBI01.2, pBI121, pBI101.3 및 pBIN19(Clontech)를 포함한다. 동물 발현 벡터의 예는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo(Clontech)를 포함한다. 재조합 발현 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 예를 들어, 감마 레트로바이러스 벡터일 수 있다.
실시형태에서, 재조합 발현 벡터는, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 상기 참조 및 Ausubel et al., 상기 참조]에 기재된 표준 재조합 DNA 기법을 이용하여 제조된다. 원형 또는 선형인 발현 벡터의 작제물은 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 기능성인 복제 시스템을 포함하도록 제조될 수 있다. 복제 시스템은, 예를 들어, ColE1, SV40, 2μ 플라스미드, λ, 소 유두종 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다.
재조합 발현 벡터는, 벡터가 도입될 숙주 유형(예를 들어, 박테리아, 식물, 진균 또는 동물)에 특이적인 조절 서열, 예컨대, 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 포함하여, 적절하다면, 벡터가 DNA-기반인지 또는 RNA-기반인지의 여부를 고려할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 형질전환 또는 형질감염된 숙주의 선택을 가능하게 하는 하나 이상의 마커 유전자를 포함할 수 있다. 마커 유전자는 살생제 내성, 예를 들어, 항생제, 중금속 등에 대한 내성, 원영양성을 제공하기 위한 영양요구성 숙주에서의 상보성 등을 포함한다. 기재된 발현 벡터에 대한 적합한 마커 유전자는, 예를 들어, 네오마이신/G418 내성 유전자, 히스티딘올 x 내성 유전자, 히스티딘올 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자 및 암피실린 내성 유전자를 포함한다.
재조합 발현 벡터는 본 개시내용의 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 천연 또는 규범적인 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터의 선택, 예를 들어, 강, 약, 조직-특이적, 유도성 및 발생-특이적은 당업자의 보통의 기술 이내이다. 유사하게, 뉴클레오타이드 서열을 프로모터와 조합하는 것은 또한 당업자의 기술 이내이다. 프로모터는 비-바이러스 프로모터 또는 바이러스 프로모터, 예를 들어, 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, RSV 프로모터, SV40 프로모터 또는 뮤린 줄기 세포 바이러스의 긴-말단 반복부에서 발견되는 프로모터일 수 있다.
재조합 발현 벡터는 일시적 발현을 위해, 안정적인 발현을 위해 또는 둘 다를 위해 설계될 수 있다. 또한, 재조합 발현 벡터는 구성적 발현을 위해 또는 유도성 발현을 위해 생성될 수 있다.
추가로, 재조합 발현 벡터는 자살유전자를 포함하도록 생성될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "자살유전자"는 자살유전자를 발현시키는 세포가 사멸되게 하는 유전자를 지칭한다. 자살유전자는 유전자가 발현되는 세포에 대해 제제, 예를 들어, 약물에 대한 민감성을 부여하고, 세포가 제제와 접촉되거나 제제에 노출될 때 세포가 사멸되게 하는 유전자일 수 있다. 자살유전자는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 단순포진 바이러스(HSV) 티미딘 키나제(TK) 유전자, 사이토신 데아미나제, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 및 나이트로환원효소를 포함한다.
특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 단리된다. 특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 실질적으로 순수하다.
또한 본 명세서에 기재된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 숙주 세포는 이종성 핵산을 포함하는 임의의 세포일 수 있다. 이종성 핵산은 벡터(예를 들어, 발현 벡터)일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는, 세포에 의한 물질의 생산, 예를 들어, 유전자, DNA 또는 RNA 서열, 단백질 또는 효소의 세포에 의한 발현을 위해 임의의 방법으로 선택, 변형, 형질전환, 성장, 사용 또는 조작된 임의의 유기체로부터의 세포일 수 있다. 적절한 숙주가 결정될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 벡터 골격 및 목적하는 결과에 기반하여 선택될 수 있다. 예로서, 플라스미드 또는 코스미드는 몇몇 벡터 유형의 복제를 위해 원핵 숙주 세포에 도입될 수 있다. 박테리아 세포, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, DH5α, JM109 및 KCB, SURE® 컴피턴트 세포(Competent Cell), 및 SOLOPACK Gold 세포는 벡터 복제 및/또는 발현을 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 추가적으로, 박테리아 세포, 예컨대, 이콜라이 LE392는 파지 바이러스에 대한 숙주 세포로서 사용될 수 있었다. 숙주 세포로서 사용될 수 있는 진핵 세포는 효모(예를 들어, YPH499, YPH500 및 YPH501), 곤충 및 포유류를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 벡터의 복제 및/또는 발현을 위한 포유류 진핵 숙주 세포의 예는 HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, COS, Saos, PC12, SP2/0(미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection: ATCC), 버지니아주 매너서스 소재, CRL-1581), NS0(European Collection of Cell Cultures(ECACC), 영국 윌트셔 솔즈베리 소재, UK, ECACC No. 85110503), FO (ATCC CRL-1646) 및 Ag653(ATCC CRL-1580) 뮤린세포주를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 인간 골수종 세포주는 U266(ATCC CRL-TIB-196)이다. 다른 유용한 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대, CHO-K1SV(Lonza Biologics, 메릴랜드주 워커스빌 소재), CHO-K1(ATCC CRL-61) 또는 DG44로부터 유래된 것을 포함한다.
5.6. 약제학적 조성물
일 양상에서, 본 개시내용은 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체를 포함하는 결합 분자 또는 치료 분자 또는 본 개시내용의 조작된 면역 효과기 세포를 포함하는, 약제학적 조성물을 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 치료적 유효량의 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체를 포함하는 결합 분자 또는 치료 분자, 또는 본 개시내용의 조작된 면역 효과기 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 치료적 유효량의 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 치료적 유효량의 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체를 포함하는 치료 분자(예컨대, 융합 단백질, 면역접합체 및 다중특이성 결합 분자) 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다.
다른 실시형태에서, 치료적 유효량의 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체를 포함하는 CAR 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다.
다른 실시형태에서, 치료적 유효량의 본 명세서에 제공된 조작된 면역 효과기 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다.
다른 실시형태에서, 예를 들어, 벡터에서 치료적 유효량의 본 명세서에 제공된 핵산, 및, 예를 들어, 유전자요법에 적합한, 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다.
구체적 실시형태에서, 용어 "부형제"는 또한 희석제, 아쥬반트(예를 들어, 프로인트 아쥬반트(완전 또는 불완전), 담체 또는 비히클을 지칭할 수 있다. 약제학적 부형제는 물, 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 유래의 오일, 예컨대, 땅콩유, 광유, 참깨유 등과 같은 멸균 액체일 수 있다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 액체 부형제로서 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 벼, 밀가루, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함할 수 있다. 조성물은, 원한다면, 또한 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지속 방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 적합한 약제학적 부형제의 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA]에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 예방적 또는 치료적 유효량의 본 명세서에 제공된 활성 성분을, 예컨대, 정제된 형태로, 환자에 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 적합한 양의 부형제와 함께 함유할 것이다. 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
일부 실시형태에서, 부형제의 선택은 부분적으로 특정 세포, 결합 분자, 및/또는 항체에 의해 및/또는 투여 방법에 의해 결정된다. 따라서, 다양한 적합한 제형이 있다.
전형적으로, 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 안정제는 사용되는 투약량 및 농도로 수용자에 대해 비독성이며, 완충제, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E, 메타중아황산나트륨을 포함하는 항산화제; 보존제, 등장제, 안정제, 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 킬레이트제, 예컨대, EDTA 및/또는 비이온성 계면활성제를 포함한다.
완충제는 특히 안정성이 pH 의존성인 경우, 치료적 유효성을 최적화하는 범위로 pH를 조절하는 데 사용될 수 있다. 본 개시내용과 함께 사용하기 위한 적합한 완충제는 유기산과 무기산 및 이들의 염을 포함한다. 예를 들어, 시트레이트, 포스페이트, 석시네이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 옥살레이트, 락테이트, 아세테이트. 추가적으로, 완충제는 히스티딘 및 트라이메틸아민 염, 예컨대, Tris를 포함할 수 있다.
보존제는 미생물 성장을 지연시키기 위해 첨가될 수 있다. 본 개시내용과 함께 사용하기 위한 적합한 보존제는 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 할라이드(예를 들어, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드), 벤제토늄클로라이드; 티메로살, 페놀, 뷰틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레솔을 포함한다.
때때로 "안정제"로 알려진 긴장제는 조성물 중 액체의 긴장도를 조절 또는 유지하기 위해 제공될 수 있다. 거대한, 하전된 생체분자, 예컨대, 단백질 및 항체와 함께 사용될 때, 이들이 아미노산 측쇄의 하전된 기와 상호작용하여, 분자내 및 분자간 상호작용에 대한 잠재력을 줄일 수 있기 때문에, 이들은 종종 "안정제"로 지칭된다. 예시적인 긴장제는 다가 당 알코올, 삼가 또는 고급의 당 알코올, 예컨대, 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 솔비톨 및 만니톨을 포함한다.
추가적인 예시적 부형제는 하기를 포함한다: (1) 증량제, (2) 용해도 향상제, (3) 안정제 및 (4) 변성 또는 용기 벽에 대한 흡착을 방지하는 제제. 이러한 부형제는 다가 당 알코올(위에서 열거함); 아미노산, 예컨대, 알라닌, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알기닌, 라이신, 오르니틴, 류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등; 유기당 또는 당 알코올, 예컨대, 수크로스, 락토스, 락티톨, 트레할로스, 스타키오스, 만노스, 솔보스, 자일로스, 리보스, 리비톨, 마이오이니시토스, 마이오이니시톨, 갈락토스, 갈락티톨, 글리세롤, 사이클리톨(예를 들어, 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜; 황 함유 환원제, 예컨대, 유레아, 글루타티온, 티옥트산, 티오글리콜산나트륨, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 티오황산나트륨; 저분자량 단백질, 예컨대, 인간 혈청 알부민, 소혈청 알부민, 젤라틴 또는 기타 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 단당류(예를 들어, 자일로스, 만노스, 프럭토스, 글루코스; 이당류(예를 들어, 락토스, 말토스, 수크로스); 삼당류, 예컨대, 라피노스; 및 다당류, 예컨대, 덱스트린 또는 덱스트란을 포함한다.
비이온성 계면활성제 또는 세정제("습윤제"로도 알려짐)는 치료제를 용해시키기 위해서 뿐만 아니라 교반-유도 응집에 대해 치료 단백질을 보호하기 위해 제공될 수 있으며, 이는 또한 활성 치료 단백질 또는 항체의 변성을 야기하지 않고 전단 표면 응력에 제형이 노출되게 한다. 적합한 비이온성 계면활성제는, 예를 들어, 폴리솔베이트(20, 40, 60, 65, 80 등), 폴록사머(184, 188 등), PLURONIC® 폴리올, TRITON®, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노에터(TWEEN®-20, TWEEN®-80 등), 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화된 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 수크로스 지방산 에스터, 메틸 셀룰로스 및 카복시메틸셀룰로스를 포함한다. 사용될 수 있는 음이온성 세정제는 라우릴황산나트륨, 다이옥틸 소듐 설포석시네이트 및 다이옥틸 소듐 설포네이트를 포함한다. 양이온성 세정제는 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤제토늄 클로라이드를 포함한다.
약제학적 조성물이 생체내 투여를 위해 사용되도록, 이들은 바람직하게는 멸균이다. 약제학적 조성물은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 멸균으로 제공될 수 있다. 본 명세서의 약제학적 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어, 정맥내 용액 백(bag) 또는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알 내로 투입될 수 있다.
투여 경로는 적합한 방법, 예를 들어, 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 병변내 또는 관절내 경로에 의한 주사 또는 주입, 국소 투여, 흡입에서 또는 지속 방출 또는 연장된 방출 수단에 의해 장기간의 시간에 걸쳐 단일 또는 다회 볼루스 또는 주입에 의하는 것과 같은 공지되고 허용된 방법에 따른다.
다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 제어된 방출 또는 지속 방출 시스템으로서 제공될 수 있다. 일 실시형태에서, 제어 또는 지속 방출을 달성하기 위해 펌프가 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sefton, Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201-40 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507-16 (1980); 및 Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:569-74 (1989)] 참조). 다른 실시형태에서, 예방적 또는 치료적 제제(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 융합 단백질) 또는 본 명세서에 제공된 조성물의 제어 또는 지속 방출을 달성하기 위해 중합체 물질이 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., 1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61-126 (1983); Levy et al., Science 228:190-92 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351-56 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105-12 (1989)]; 미국 특허 제5,679,377호; 제5,916,597호; 제5,912,015호; 제5,989,463호; 및 제5,128,326호; PCT 공개 번호 WO 99/15154 및 WO 99/20253). 지속 방출 제형에서 사용되는 중합체의 예는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜라이드(PLG), 폴리산무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아마이드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락타이드(PLA), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA) 및 폴리오쏘에스터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 지속 방출 제형에서 사용되는 중합체는 비활성의, 누출 가능한 불순물이 없이, 보관 시 안정하고, 멸균 및 생체 분해성이다. 또 다른 실시형태에서, 제어 또는 지속 방출 시스템은 특히 표적 조직, 예를 들어, 비강 통과 또는 폐 근위에 위치되어, 전신 용량의 일부만을 필요로 할 수 있다(예를 들어, 문헌[Goodson, Medical Applications of Controlled Release Vol. 2, 115-38 (1984)] 참조). 제어 방출 시스템은, 예를 들어, 문헌[Langer, Science 249:1527-33 (1990)]에서 논의된다. 당업자에게 공지된 임의의 기법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 1종 이상의 제제를 포함하는 지속 방출 제형을 생성하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,526,938호, PCT 공개 WO 91/05548 및 WO 96/20698, 문헌[Ning et al., Radiotherapy & Oncology 39:179-89 (1996); Song et al., PDA J. of Pharma. Sci. & Tech. 50:372-97 (1995); Cleek et al., Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-54 (1997); 및 Lam et al., Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-60 (1997)] 참조).
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 또한 치료 중인 특정 적응증에 필요하다면 1종 이상의 활성 화합물 또는 제제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 조성물은 세포독성제, 화학치료제, 사이토카인, 면역억제제 또는 성장 저해제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합하여 적합하게 존재한다.
활성 성분은 또한 제조된 마이크로캡슐에서, 예를 들어, 코아세르베이션 기법에 의해 또는 계면 중합, 예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해, 콜로이드 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마이크로에멀션에서 포집될 수 있다. 이러한 기법은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition]에 개시되어 있다.
다양한 조성물 및 전달 시스템은 공지되어 있고, 리포좀 내 캡슐화, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체 또는 치료 분자를 발현시킬 수 있는 재조합 세포, 레트로바이러스의 부분으로서 핵산의 작제 또는 기타 벡터 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 본 명세서에 제공된 치료제와 함께 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 약제학적 조성물은 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 유효량, 예컨대, 치료적 유효량 또는 예방적 유효량으로 결합 분자 및/또는 세포를 함유한다. 치료적 또는 예방적 효능은, 일부 실시형태에서, 치료되는 대상체의 주기적 평가에 의해 모니터링된다. 며칠 이상에 걸친 반복된 투여를 위해, 병태에 따라서, 질환 증상의 목적하는 억제가 생길 때까지 치료가 반복된다. 그러나, 다른 투약 요법이 유용할 수 있고, 결정될 수 있다.
5.7. 방법 및 용도
다른 양상에서, 항-CD20 VHH, 키메라 항원 수용체(CAR) 및/또는 재조합 수용체를 발현시키는 조작된 세포를 포함하는, 본 명세서에 제공된 CD20 결합 분자를 이용하는 방법 및 용도가 본 명세서에 제공된다.
5.7.1. 치료 방법 및 용도
이러한 방법 및 용도는 CD20 발현을 발현시키거나 이와 연관되고/되거나 세포 또는 조직이 CD20을 발현시키는 질환, 병태 또는 장애를 갖는 대상체에 대한 분자, 세포 또는 이를 함유하는 조성물의 투여를 수반하는 치료 방법 및 용도를 포함한다. 일부 실시형태에서, 분자, 세포 및/또는 조성물은 질환 또는 장애의 치료를 달성하기 위한 유효량으로 투여된다. 용도는 이러한 방법 및 치료에서, 그리고 이러한 치료 방법을 수행하기 위한 의약의 제조에서의 항체의 용도를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 질환 또는 병태를 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 항체 또는 세포, 또는 이를 포함하는 조성물을 투여함으로써 수행된다. 일부 실시형태에서, 이에 의해 방법은 대상체에서의 질환 또는 장애를 치료한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 치료는 질환 또는 장애, 또는 증상, 유해효과 또는 결과, 또는 이와 연관된 표현형의 완전한 또는 부분적 개선 또는 감소를 야기한다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 상기 용어는 질환의 완전한 치유 또는 모든 증상 또는 결과에 대한 임의의 증상 또는 효과(들)의 완전한 제거를 포함하지만, 이들을 시사하지는 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 치료는 질환 또는 장애의 발생을 지연시키고, 예를 들어, 질환(예컨대, 암)의 발생을 연기하고/하거나, 방해하고/하거나, 늦추고/늦추거나, 지연시키고/시키거나, 안정화시키고/시키거나 억제하고/하거나, 지체시킨다. 이 지연은 치료 중인 질환 및/또는 개체의 병력에 따라서 시간 길이가 다를 수 있다. 당업자에게 분명할 바와 같이, 충분한 또는 유의미한 지연은, 사실상, 개체에서 질환 또는 장애가 발생되지 않는다는 점에서 예방을 포함할 수 있다. 예를 들어, 말기 암, 예컨대, 전이 발생이 지연될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법 또는 용도는 질환 또는 장애를 예방한다.
일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 CD20 연관 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 B 세포 연관 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 B 세포 악성종양이다. 일부 실시형태에서, B 세포 악성종양은 B 세포 백혈병 또는 B 세포 림프종이다. 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 가장자리구역 림프종(예를 들어, 비장 가장자리구역 림프종)이다. 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 광범위 큰 B 세포 림프종(DLBCL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 맨틀 세포 림프종(MCL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 원발성 중추 신경계(CNS) 림프종이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 원발성 종격동 B 세포 림프종(PMBL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 소형 림프구성 림프종(SLL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 B 세포 전림프구성 백혈병(B-PLL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 소포 림프종(FL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 버킷 림프종이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 원발성 안구내 림프종이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 급성 림프구성 백혈병(ALL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 모발세포 백혈병(HCL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 전구 B 세포 림프모구 백혈병이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 비호지킨 림프종(NHL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 고등급 B-세포 림프종(HGBL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 다발성 골수종(MM)이다. 다른 실시형태에서, 질환 또는 장애는 재발성 또는 난치성 B 세포 악성종양, 예컨대, 재발성 또는 난치성 ALL(R/R ALL)이다.
다른 실시형태에서, 질환 또는 장애는, 예를 들어, 부적절한 또는 향상된 B 세포수 및/또는 활성화와 연관된 것을 포함하는, 자가면역 및 염증성 질환이다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 입양 세포 요법을 포함하여, 제공된 CD20-표적화된 CAR을 발현시키는 유전자 조작된 세포는 대상체에게 투여된다. 이러한 투여는, 질환 또는 장애 세포가 파괴에 대한 표적이 되도록, CD20-표적화된 방식으로 세포의 활성화(예를 들어, T 세포 활성화)를 촉진시킨다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 질환 또는 장애를 갖거나, 가질 위험에 있거나, 갖는 것으로 의심되는 대상체, 조직 또는 세포에 대한 세포 또는 세포를 함유하는 조성물의 투여를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포, 집단 및 조성물은, 예를 들어, 입양 세포 요법, 예컨대, 입양 T 세포 요법을 통해, 치료될 특정 질환 또는 장애를 갖는 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 세포 또는 조성물은 대상체, 예컨대, 질환 또는 장애를 갖거나 또는 질환 또는 장애의 위험에 있는 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 이에 의해 CD20-발현 암의 종양 부담을 줄임으로써, 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료, 예를 들어, 개선시킨다.
입양 세포 요법을 위한 세포 투여 방법은, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2003/0170238호; 미국 특허 제4,690,915호; 문헌[Rosenberg, Nat Rev Clin Oncol. 8 (10):577-85 (2011); Themeli et al., Nat Biotechnol. 31(10): 928-933 (2013); Tsukahara et al., Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9 (2013); 및 Davila et al., PLoS ONE 8(4): e61338 (2013)]에 기재된 바와 같이 공지되어 있다. 이들 방법은 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물과 관련하여 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포 요법(예를 들어, 입양 T 세포 요법)은, 세포가 세포 요법을 받는 대상체로부터, 또는 이러한 대상체로부터 유래된 샘플로부터 단리되고/되거나 다르게 제조되는 자가 전달에 의해 수행된다. 따라서, 일부 양상에서, 세포는 치료를 필요로 하는 대상체로부터 유래되고, 세포는 단리 및 가공 후에 동일한 대상체에게 투여된다. 다른 실시형태에서, 세포 요법(예를 들어, 입양 T 세포 요법)은 세포 요법을 받거나 궁극적으로 받는 대상체, 예를 들어, 제1 대상체 이외의 대상체로부터 세포가 단리되고/되거나 다르게 제조되는 동종이계 전달에 의해 수행된다. 이러한 실시형태에서, 이어서, 세포는 동일한 종의 상이한 대상체, 예를 들어, 제2 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 제1 대상체와 제2 대상체는 유전적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 대상체와 제2 대상체는 유전적으로 유사하다. 일부 실시형태에서, 제2 대상체는 제1 대상체와 동일한 HLA 부류 또는 하위유형을 발현시킨다.
일부 실시형태에서, 세포, 세포 집단 또는 조성물이 투여되는 대상체는 영장류, 예컨대, 인간이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있고, 영아, 소아, 청소년, 성인 및 노인 대상체를 포함하는 임의의 적합한 연령일 수 있다. 일부 예에서, 대상체는 질환, 입양 세포 요법에 대한, 그리고/또는 독성 결과를 평가하기 위한 입증된 동물 모델이다.
CD20-결합 분자, 예컨대, VHH 및 VHH를 함유하는 키메라 수용체 및 이를 발현시키는 세포는 임의의 적합한 수단, 예를 들어, 주사, 예를 들어, 정맥내 또는 피하 주사, 안구내 주사, 안구주위 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 경격막 주사, 공막하 주사, 맥락막하 주사, 전방내 주사, 결막밑 주사, 결막하 주사, 테논낭밑 주사, 안구 후부 주사, 안구주위 주사 또는 공막 후부 전달에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들은 국소 치료, 병변내 투여를 위해 요망되는 경우, 비경구, 폐내 및 비강내에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다.
질환 또는 병태의 예방 및/또는 치료에 효과적일 본 명세서에 제공된 예방적 제제 또는 치료제의 양은 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 도출된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다. 질환의 예방 또는 치료를 위해, 결합 분자 또는 세포의 적절한 투약량은 치료될 질환 또는 장애, 결합 분자의 유형, 질환 또는 장애의 중증도 및 과정, 치료제가 예방적 또는 치료적 목적을 위해 투여되는지의 여부, 이전의 요법, 환자의 임상 이력 및 제제에 대한 반응, 및 담당 의사의 재량에 따를 수 있다. 조성물, 분자 및 세포는 일부 실시형태에서 1회로 또는 일련의 치료에 걸쳐 적합하게 투여된다.
예를 들어, 질환 유형 및 중증도에 따라서, 항체의 투약량은 약 10㎍/㎏ 내지 100㎎/㎏ 이상을 포함할 수 있다. 다회 용량은 간헐적으로 투여될 수 있다. 초기의 부하 용량이 클수록, 이후에 1회 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체 중 어느 하나를 포함하되, 약제학적 조성물은 투여 경로에 따라서, 1일당 약 10 ng/㎏ 내지 최대 약 100㎎/㎏ 이상의 개체 체중, 예를 들어, 약 1㎎/㎏/일 내지 10㎎/㎏/일의 투약량으로 투여된다. 특정 투약량 및 전달 방법에 관한 가이드는 문헌에 제공된다(예를 들어, 미국 특허 제4,657,760호; 제5,206,344호; 및 제5,225,212호).
결합 분자를 함유하는 유전자 조작된 세포와 관련하여, 일부 실시형태에서, 대상체는 약 1백만개 내지 약 1천억개의 세포 범위 및/또는 체중의 킬로그램당 세포의 양으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 조작된 면역 세포 중 어느 하나를 포함하되, 약제학적 조성물은 적어도 약 104, 105, 106, 107, 108 또는 109개의 세포/개체의 체중(㎏) 중 어느 것의 투약량으로 투여된다. 투약량은 특정 질환 또는 장애 및/또는 환자 및/또는 다른 치료에 대한 속성에 따라 다를 수 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 1회 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 다회(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6회 이상 중 어느 하나) 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 투약 주기 동안 1회 또는 다회 투여된다. 투약 주기는, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5주 이상(들), 또는 1, 2, 3, 4, 5개월 이상(들)일 수 있다. 특정 환자를 위한 최적의 투약량 및 치료 요법은 질환 징후 동안 환자를 모니터링하고 그에 따라 치료를 조절함으로써 의학 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포 또는 항체는 조합 치료의 부분으로서, 예컨대, 다른 치료적 개입, 예컨대, 다른 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체, 예컨대, 세포독성제 또는 치료제와 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 세포 또는 항체는 1종 이상의 추가적인 치료제와 함께 또는 다른 치료적 개입과 함께 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 공동 투여된다. 일부 내용에서, 세포 집단이 1종 이상의 치료제의 효과를 향상시키거나 또는 그 반대가 되도록, 세포는 충분히 가까운 시간 내에 다른 요법과 공동 투여된다. 일부 실시형태에서, 세포 또는 항체는 1종 이상의 추가적인 치료제 전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 세포 또는 항체는 1종 이상의 추가적인 치료제 후에 투여된다.
특정 실시형태에서, 일단 세포가 포유류(예를 들어, 인간)에 투여되면, 조작된 세포 집단 및/또는 항체의 생물학적 활성은 다수의 공지된 방법에 의해 측정된다. 평가를 위한 파라미터는, 생체내에서, 예를 들어, 영상화에 의해, 또는 생체외에서, 예를 들어, ELISA 또는 유세포분석에 의해, 항원에 대한 조작 또는 천연 T 세포 또는 기타 면역 세포의 특이적 결합을 포함한다. 특정 실시형태에서, 조작된 세포가 표적 세포를 파괴하는 능력은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법, 예컨대, 문헌[Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), 및 Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)]에 기재된 세포독성 검정을 이용하여 측정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포의 생물학적 활성은 또한 특정 사이토카인, 예컨대, CD107a, IFNγ, IL-2 및 TNF의 발현 및/또는 분비를 검정함으로써 측정될 수 있다. 일부 양상에서, 생물학적 활성은 임상 결과, 예컨대, 종양 부담 또는 부하의 감소를 평가함으로써 측정된다.
일부 구체적 실시형태에서, 예를 들어, 표 2의 CDR을 갖는 것, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 183, 서열번호 184 또는 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 것; 및 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 183, 서열번호 184 또는 서열번호: 185에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 포함하는, 위의 부문 5.2에 기재된 바와 같이 CD20에 결합하는 단일 도메인 항체를 포함하는 결합 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서의 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 CD20 연관 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 B 세포 연관 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 B 세포 악성종양이다. 일부 실시형태에서, B 세포 악성종양은 B 세포 백혈병 또는 B 세포 림프종이다. 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 가장자리구역 림프종(예를 들어, 비장 가장자리구역 림프종)이다. 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 광범위 큰 B 세포 림프종(DLBCL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 맨틀 세포 림프종(MCL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 원발성 중추 신경계(CNS) 림프종이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 원발성 종격동 B 세포 림프종(PMBL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 소형 림프구성 림프종(SLL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 B 세포 전림프구성 백혈병(B-PLL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 소포 림프종(FL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 버킷 림프종이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 원발성 안구내 림프종이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 급성 림프구성 백혈병(ALL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 모발세포 백혈병(HCL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 전구 B 세포 림프모구 백혈병이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 비호지킨 림프종(NHL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 고등급 B-세포 림프종(HGBL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 다발성 골수종(MM)이다. 다른 실시형태에서, 질환 또는 장애는 재발성 또는 난치성 B 세포 악성종양, 예컨대, 재발성 또는 난치성 ALL(R/R ALL)이다. 다른 실시형태에서, 질환 또는 장애는, 예를 들어, 부적절한 또는 향상된 B 세포수 및/또는 활성화와 연관된 것을 포함하는, 자가면역 및 염증성 질환이다.
다른 실시형태에서, 예를 들어, 부문 5.3에 제공된 CAR을 포함하는 세포를 포함하는, 부문 5.4에 제공된 바와 같은 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애의 치료 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 조작된 면역 세포는 (a) 하나 이상의 항-CD20 sdAb(들)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR을 포함하되, 항-CD20 sdAb는, 예를 들어, 표 2의 CDR을 갖는 것, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 183, 서열번호 184 또는 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 것; 및 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 183, 서열번호 184 또는 서열번호 185에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 포함하는, 위의 부문 5.2에 기재된 바와 같다. 일부 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 조작된 면역 세포는 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 189, 서열번호 190 및 서열번호 191로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 189, 서열번호 190 및 서열번호 191로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는, CAR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 CD20 연관 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 B 세포 연관 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 B 세포 악성종양이다. 일부 실시형태에서, B 세포 악성종양은 B 세포 백혈병 또는 B 세포 림프종이다. 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 가장자리구역 림프종(예를 들어, 비장 가장자리구역 림프종)이다. 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 광범위 큰 B 세포 림프종(DLBCL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 맨틀 세포 림프종(MCL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 원발성 중추 신경계(CNS) 림프종이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 원발성 종격동 B 세포 림프종(PMBL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 소형 림프구성 림프종(SLL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 B 세포 전림프구성 백혈병(B-PLL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 소포 림프종(FL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 버킷 림프종이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 원발성 안구내 림프종이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 급성 림프구성 백혈병(ALL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 모발세포 백혈병(HCL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 전구 B 세포 림프모구 백혈병이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 비호지킨 림프종(NHL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 고등급 B-세포 림프종(HGBL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 다발성 골수종(MM)이다. 다른 실시형태에서, 질환 또는 장애는 재발성 또는 난치성 B 세포 악성종양, 예컨대, 재발성 또는 난치성 ALL(R/R ALL)이다. 다른 실시형태에서, 질환 또는 장애는, 예를 들어, 부적절한 또는 향상된 B 세포수 및/또는 활성화와 연관된 것을 포함하는, 자가면역 및 염증성 질환이다.
5.7.2. 진단 및 검출 방법 및 용도
다른 양상에서, CD20 및/또는 항체에 의해 인식되는 이의 에피토프 존재의 검출에 의한 하나 이상의 조직 또는 세포 유형에 대한 특정 치료의 결합, 및/또는 대상체에서의 치료 결정 통보의 검출, 예후, 진단, 병기화, 결정을 위해, 본 명세서에 제공된 결합 분자, 예를 들어, CD20에 결합하는 VHH 및 이러한 VHH를 포함하는 분자(예컨대, 접합체 및 복합체)의 사용을 수반하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 진단 또는 검출 방법에서 사용하기 위한 항-CD20 항체(예컨대, 본 명세서에 기재된 항-CD20 단일 도메인 항체 중 어느 하나)가 제공된다. 추가 양상에서, 생물학적 샘플에서 CD20의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플에서 CD20 단백질의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, CD20은 인간 CD20이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 CD20-발현 질환 또는 장애와 연관된 진단 및/또는 예후 방법이다. 일부 실시형태에서 상기 방법은 생물학적 샘플을 항체와 함께 인큐베이션 및/또는 항체로 프로빙하는 단계 및/또는 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직 또는 이들의 일부, 예컨대, 종양 또는 암 조직 또는 생검 또는 이들의 부문을 포함한다. 특정 실시형태에서, 접촉시키는 단계는 샘플에 존재하는 CD20에 대한 항-CD20 항체의 결합을 허용하는 조건 하에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 샘플 중 항-CD20 항체와 CD20 사이에 복합체가 형성되는지의 여부를 검출하는 단계, 예컨대, 이러한 결합의 존재 또는 부재 또는 수준을 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 일 실시형태에서, 항-CD20 항체는 항-CD20 항체 또는 조작된 항원 수용체를 이용하는 요법에 적격인 대상체를 선택하기 위해 사용되며, 예를 들어, CD20은 환자의 선택을 위한 바이오마커이다.
일부 실시형태에서, 샘플, 예컨대, 세포, 조직 샘플, 용해물, 조성물 또는 이들로부터 유래된 다른 샘플은 항-CD20 항체와 접촉되고, 항체와 샘플(예를 들어, 샘플 중 CD20) 사이의 복합체의 결합 또는 형성이 결정 또는 검출된다. 동일한 조직 유형의 참조 세포와 비교할 때 시험 샘플에서의 결합이 입증되거나 검출될 때, 이는 연관된 질환 또는 장애의 존재를 나타낼 수 있고/있거나 항체를 함유하는 치료제는 샘플이 유래된 조직 또는 세포 또는 다른 생물학적 물질과 동일한 조직 또는 세포에 특이적으로 결합할 것이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 인간 조직으로부터 유래되고, 질환 조직 및/또는 정상 조직으로부터, 예를 들어, 치료될 질환 또는 장애를 갖는 대상체로부터 및/또는 이러한 대상체와 동일하지만 치료될 질환 또는 장애를 갖지 않는 종의 대상체로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 정상 조직 또는 세포는 치료될 질환 또는 장애를 갖지만 질환 세포 또는 조직 그 자체는 아닌 대상체, 예컨대, 주어진 대상체에 존재하는 암과 동일 또는 상이한 기관으로부터의 정상 조직으로부터 유래된다.
특정 항체-항원 결합을 검출하기 위한 당업계에 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예시적인 면역분석은 형광 편광 면역분석법(FPIA), 형광 면역분석법(FIA), 효소 면역분석법(EIA), 비탁면역 저해 면역분석법(NIA), 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 및 방사면역분석법(RIA)을 포함한다. 분석 기기 및 양립 가능한 면역분석법 절차의 이용 가능성에 의해 종종 지시되는 방법의 다양한 사용의 요구를 충족시키기 위해 지표 모이어티 또는 표지 기가 사용될 수 있다. 예시적인 표지는 방사성핵종(예를 들어, 125I,　131I,　35S,　3H 또는　32P 및/또는 크로뮴(51Cr), 코발트(57Co), 플루오린(18F), 가돌리늄(153Gd,　159Gd), 저마늄(68Ge), 홀뮴(166Ho), 인듐(115In,　113In,　112In,　111In), 아이오딘(125I,　123I,　121I), 란타늄(140La), 루테튬(177Lu), 망간(54Mn), 몰리브데넘(99Mo), 팔라듐(103Pd), 인(32P), 프라세오디뮴 (142Pr), 프로메튬(149Pm), 레늄(186Re, 188Re), 로듐(105Rh), 루테늄(97Ru), 사마륨(153Sm), 스칸듐(47Sc), 셀레늄(75Se), (85Sr), 황(35S), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti) 주석(113Sn,　117Sn), 삼중수소(3H), 제논(133Xe), 이터븀(169Yb,　175Yb), 이트륨(90Y)), 효소(예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 겨자무과산화효소, 루시퍼라제 또는 β-갈락토시다제), 형광 모이어티 또는 단백질(예를 들어, 플루오레세인, 로다민, 피코에리트린, GFP 또는 BFP), 또는 발광 모이어티(예를 들어, 캘리포니아주 팔로알토 소재의 Quantum Dot Corporation에 의해 공급된 Qdot™ 나노입자)를 포함한다. 상기 언급한 다양한 면역분석법을 수행하는 데 사용될 다양한 일반적 기법은 공지되어 있다.
특정 실시형태에서, 표지된 항체(예컨대, 항-CD20 단일 도메인 항체)가 제공된다. 표지는 직접 검출된 표지 또는 모이어티(예컨대, 형광, 발색단, 전자-밀도, 화학발광 및 방사성 표지)뿐만 아니라 간접적으로, 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 모이어티, 예컨대, 효소 또는 리간드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 실시형태에서, 항체는 표지되지 않고, 이의 존재는 임의의 항체에 결합하는 표지된 항체를 이용하여 검출될 수 있다.
5.8. 키트 및 제조 물품
본 명세서에 기재된 임의의 단일 도메인 항체, 키메라 항원 수용체 또는 조작된 면역 효과기 세포를 포함하는 키트, 단위 투약량 및 제조 물품이 추가로 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물 중 어느 하나를 포함하며 바람직하게는 이의 사용을 위한 설명서를 제공하는 키트가 제공된다.
본 출원의 키트는 적합한 패키징에 있다. 적합한 패키징은 바이알, 보틀, 단지, 가요성 패키징(예를 들어, 밀봉 마일러(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 키트는 선택적으로 추가적인 구성 성분, 예컨대, 완충제 및 설명 정보를 제공할 수 있다. 따라서 본 출원은 또한 바이알(예컨대, 밀봉 바이알), 보틀, 단지, 가요성 패키징 등을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
제조 물품은 용기 및 라벨 또는 용기 상의 또는 용기와 관련된 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기는, 예를 들어, 보틀, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 일반적으로, 용기는 본 명세서에 기재된 질환 또는 장애(예컨대, 암)를 치료하는 데 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 개체에서 특정 병태를 치료하기 위해 사용된다는 것을 나타낸다. 라벨 또는 포장 삽입물은 개체에게 조성물을 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함할 것이다. 라벨은 재구성 및/또는 사용을 위한 지시사항을 나타낼 수 있다. 약제학적 조성물을 보유하는 용기는 재구성 제형의 반복 투여(예를 들어, 2 내지 6회 투여)를 가능하게 하는 다회용 바이알일 수 있다. 포장 삽입물은 적응증, 용법, 투약량, 투여, 금기 사항 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 대한 문제에 관한 정보를 포함하는 치료 제품의 상업적 패키지에 관례적으로 포함되는 설명서를 지칭한다. 추가적으로, 제조물품은 약제학적으로-허용 가능한 완충제, 예컨대, 주사용정균수(BWFI), 인산염-완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하는 상업적 및 사용자 견지로부터 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
키트 또는 제조물품은 약국, 예를 들어, 병원 약국 및 조제 약국에서 저장하고 사용하기에 충분한 양으로 포장된 다회 단위 용량의 약제학적 조성물 및 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다.
간결함을 위해, 특정 약어가 본 명세서에서 사용된다. 일례는 아미노산 잔기를 나타내기 위한 한 글자 약어이다. 아미노산 및 이들의 대응하는 세 글자 및 한 글자 약어는 다음과 같다:
Figure pct00013
본 개시내용은 일반적으로 수많은 실시형태를 기재하기 위해 긍정적인 언어를 이용하여 본 명세서에 개시된다. 본 개시내용은 또한 구체적으로, 특정 대상이 제외되는 실시형태, 완전히 또는 부분적으로, 예컨대, 물질 또는 재료, 방법 단계 및 조건, 프로토콜, 절차, 검정 또는 분석을 포함한다. 따라서, 본 개시내용이 본 개시내용이 포함하지 않는 것에 관해 본 명세서에서 일반적으로 표현되지 않는다고 해도, 그럼에도 불구하고 본 개시내용에 분명하게 포함되지 않는 양상이 본 명세서에 개시된다.
본 개시내용의 다수의 실시형태가 기재되었다. 그럼에도 불구하고, 본 개시내용의 사상과 범주로부터 벗어나는 일 없이 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 다음의 실시예는 청구범위에 기재된 개시내용의 범주를 예시하기 위한 의도이며 제한하는 것이 아니다.
6. 실시예
다음은 본 연구에서 사용되는 다양한 방법 및 물질의 설명이며, 본 개시내용을 제조하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명과 함께 당업자에게 제공하기 위해 제시하며, 본 발명자가 본 개시내용으로서 간주하는 것의 범주를 제한하는 것으로 의도되지도 않고, 아래의 실험이 수행되고 수행될 수 있는 모든 실험이라는 것을 나타내는 것으로 의도되지도 않는다. 현재 시제로 기재된 예시적인 설명이 반드시 수행된 것은 아니며, 오히려 설명은 본 개시내용의 교시와 관련하여 데이터 등을 생성하기 위해 수행될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 사용한 수(예를 들어, 양, 백분율 등)에 대해 정확성을 보장하기 위한 노력을 하였지만, 일부 실험 오차 및 편차를 설명하여야 한다.
6.1. 실시예 1- 항-CD20 VHH의 제조
CD20 항원에 대해 높은 결합 친화도를 갖는 VHH를 개발하기 위해, 인간 CD20 단백질로 낙타를 면역화시켰다. 이어서, 파지-디스플레이 라이브러리를 작제하여 VHH 리드를 선별하였다. 특이적 결합에 기반하여 고유 클론을 선별하고, VHH 상보성 결정 영역(CDR), 특히 항원 인식 레퍼토리 및 결합이 확장된 CDR3에 따라 랭크하였다.
6.1.1. 세포주 작제
GenScript에 의해 플라스미드 PLVX-puro(Clontech, #632164)에 인간 막 스패닝 4-도메인 A1(MS4A1) 암호화 cDNA(NM_021950.3)를 합성하고, 플라스미드를 PLVX-CD20로 명명하였다. 고역가 재조합 렌티바이러스를 바이러스 패키징 시스템에서 생산하고, K562 세포(ATCC, #CRL-24), CHO 세포(ATCC, #CCL-61) 및 Dubca 세포(ATCC, #CRL2276)에 형질도입하였다. 퓨로마이신-함유 세포 배양 배지에 의한 3라운드의 선택 후에, PE 접합 항-인간 CD20 특이적 단클론성 항체(MILTENYI, #130098084)를 이용하여 유세포분석에 의해 형질도입된 세포주에 대한 인간 CD20의 표면 발현을 입증하였다. 간략히 말해서, 2×105개의 형질도입된 세포 또는 모 세포를 PE 접합된 항-인간 CD20 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후에, 3회 세척하고, Attune NXT 유세포분석(Thermo Fisher)에 대한 FACS 분석을 위해 0.5% FBS와 함께 200㎕의 DPBS에서 재현탁시켜 인간 CD20 항원의 발현수준을 검출하였다. CHO-CD20의 평균 형광 강도(MFI)는 비형질도입 CHO 세포보다 1067.44배 더 높았고, Dubca-CD20의 평균 형광 강도(MFI)는 비형질도입 Dubca 세포보다 1621.21배 더 높았다.
6.1.2. 동물 면역화 및 면역 반응 시험
1마리의 성체 수컷 알파카(비쿠냐 파코스(Vicugna pacos))를 인간 CD20 단백질로 5회(제1일, 제21일, 제35일, 제49일 및 제63일) 피하로 면역화시켰다. 각각 제1, 제2 내지 제4 및 제5 면역화를 위해 완전 프로인트 아쥬반트, 불완전 프로인트 아쥬반트를 사용하거나 아쥬반트를 사용하지 않았다. 사전 면역 10㎖ 혈청 샘플 및 백신화 절차 동안의 혈청 샘플을 수집하여 항원 특이적 체액 반응을 모니터링하였다. 유세포분석을 통해 CD20 형질감염 대 비형질감염 세포의 차별적 염색에 대해 묽은 사전 면역 샘플(Pre) 및 최종 면역 혈청 샘플(TB)에 존재하는 알파카 면역글로불린의 결합을 점수화하였다. 검출 항체로서 FITC 접합 항-라마 IgG 중쇄 및 경쇄 항체(BETHYL, #A160100F)를 사용하였다. 최종 시험-채혈 혈청(TB) 중 항체는 사전 면역화에서의 0.16% 결합에서 시작해서 TB에서의 86.8% 결합까지 CHO-CD20 세포에 대한 결합의 유의미한 증가를 나타냈다. 데이터는 동물 면역화가 성공적이었다는 것을 시사하였다.
동시에 1마리의 성체 수컷 낙타(카멜루스 박트리안(Camelus bactrian))를 2주 간격으로 5회 동안 인간 CD20 단백질로 피하로 면역화하였다. 면역 전날(Pre) 및 최종 면역일(TB)에 혈액을 수집하였다. 낙타의 면역 반응을 고정 항원에 대한 결합에 대해 혈청 샘플을 시험한 ELISA에 의해 평가하였다. 일련의 희석된 혈청을 플레이트에 첨가하였다. HRP-접합 항-라마 lgG 2차 항체(BETHYL, #A160100P)를 검출을 위한 2차 항체로서 첨가하였다. ELISA 결과는 동물에 CD20 항원 주사 시 강한 면역 반응이 유도되었고, 혈청 역가는 1:729 k 초과에 도달되었으며, 이는 동물 면역화가 또한 성공적이었다는 것을 시사하였다.
최종 면역화의 3 내지 5일 후에, 생산 출혈로서 경정맥에서 100㎖의 혈액을 수집하였다. 림포프렙(lymphoprep) 절차에 따라 혈액으로부터 말초 혈액 림프구(PBL)를 단리시켰다.
6.1.3. 항체 파지 라이브러리 작제
TRIzol® 시약(Thermofisher, #15596026)의 매뉴얼에 따라 단리된 림프구로부터 총 RNA를 추출하였다. 품질 검사 후에, PrimeScript™ 제1 가닥 cDNA 합성 키트(Takara, #6110A)의 매뉴얼에 따라 올리고(dT)20 프라이머를 이용하여 총 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. VHH 단편의 증폭을 위해 네스티드 PCR 프라이머(CN105555310B에 기재된 바와 같음)를 설계하고, 2개의 SfiI 제한 부위를 도입하였다. 2단계 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 VHH 단편을 증폭시키고, PCR 산물을 SfiI로 분해하고, 겔 정제하고, 이어서, 파지미드 벡터 - pFL249에 삽입하고, 이를 이콜라이 세포에 전기 전달하여 파지 디스플레이 VHH 면역 라이브러리를 생성하였다.
형질전환 세포의 적은 부분을 희석시키고, 100㎍/㎖ 암피실린으로 보충한 2×YT 플레이트 상에 도말하였다. 콜로니를 계수하여 라이브러리 크기를 계산하였다. 양성 클론을 무작위로 선별하고, 서열분석하여 라이브러리 품질을 평가하였다. 100㎍/㎖ 암피실린 및 2% 글루코스로 보충한 245㎟ 2×YT-한천 접시 상에 형질전환 세포의 나머지를 도말하였다. 콜로니의 론(Lawn)을 접시에서 벗겨내었다. 라이브러리 플라스미드 단리를 위해 세포의 작은 분취액을 사용하였다. 나머지를 글리세롤로 보충하고, 저장액으로서 -80℃에서 보관하였다.
6.1.4. 파지-디스플레이 패닝
헬퍼 파지에 의한 감염 후에, 유전자 III 융합 단백질로서 표면 상에 VHH 도메인을 디스플레이하는 재조합 파지 입자를 생성하였다. 파지 입자를 표준 방법에 따라 제조하고, 추가 연구를 위해 4℃에서 멸균 여과 후 보관하였다. 패닝의 각 라운드 전에, VHH-디스플레이 파지 입자를 구조하고, 헬퍼 파지를 첨가함으로써 증폭시켰다.
상이한 패닝 전략으로 파지 라이브러리를 사용하였다. 단백질 수준에 기반하여, 제1 및 제2 라운드에서, 바이오틴일화된 인간 CD20(설포-NHS-LC-바이오틴 키트를 이용하여 제조업자의 지침에 따라 사내에서 바이오틴일화)을 파지 라이브러리와 함께 인큐베이션시키고, 후속적으로 Streptavidin Dynabeads(Invitogen) 상에서 포획하였다. 이어서, 광범위 세척이 이어지고, 결합된 파지를 트라이에틸아민으로 용리시켰다.
세포 수준에 기반하여, 제1 선택에서, CHO-CD20 세포, Dubca-CD20 세포 또는 Raji 세포(ATCC, #CCL-86) 발현 인간 CD20 항원을 파지 라이브러리와 함께 인큐베이션시켰다. 광범위 세척 후에, 1㎎/㎖ 트립신 중 재현탁에 의해 세포로부터 결합된 파지를 용리시켰다. 제2 선택에서, 파지 라이브러리를 CHO-CD20 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 광범위 세척 후에, 결합된 파지를 앞서 기재한 바와 같이 용리시켰다.
6.1.5. ELISA 선별
개개 라이브러리 클론을 접종하고, 96-딥-웰 플레이트에서 발현을 위해 유도하였다. 인간 CD20 항원을 특이적으로 인식하는 VHH 클론을 단리시키기 위해 ELISA 선별을 수행하였다.
단일 클론을 생산 라이브러리로부터 무작위로 선별하고, 96-딥-웰 플레이트에서 배양하였다. 박테리아 배양물의 OD600이 0.6 내지 0.8에 도달되었을 때, 밤새 발현을 유도하기 위해 IPTG를 첨가하였다. 원심분리에 의해 박테리아를 수집하고, 마이크로웰 플레이트에 파종하였다.
본 개시내용의 예시적인 항-CD20 VHH 도메인(즉, VHH-273, VHH-283, VHH-313, VHH-440, VHH-466, VHH-496, VHH-653, VHH-623, VHH-640 및 VHH-657)을 선택하고 서열분석하였다. CDR(예를 들어, Kabat 또는 IMGT 넘버링 체계에 정의된 바와 같음) 및 VHH 서열을 표 2 및 본 명세서에 제공된 서열목록에서 요약한다.
6.2. 실시예 2 - VHH 키메라 수용체 폴리펩타이드의 작제 및 면역 세포 발현
6.2.1. CD20 VHH CAR의 작제
N-말단에서 C-말단까지: CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137 세포질 도메인 및 CD3ζ 세포질 도메인을 포함하는 CAR 골격 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 화학적으로 합성하고 하류의 사전 변형 렌티바이러스 벡터에 클로닝하고, hEF1α 프로모터에 작동 가능하게 연결하였다. 벡터에서 다중-클로닝 부위(multi-cloning site: MCS)는 VHH 단편(들)의 N-말단에 융합된 CD8α 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 Kozak 서열(GCCGCCACC (서열번호 160))을 포함하는 핵산 서열의 삽입을 가능하게 하였고, 상류는 CAR 골격 서열에 작동 가능하게 연결되었다.
CAR 골격 벡터를 이용하여 1가 VHH-기반 CAR을 작제하기 위해, VHH 도메인을 암호화하는 핵산 서열을, CD8α 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열의 3'에 작동 가능하게 연결시켰다. 융합 핵산 서열을 화학적으로 합성하고 당업계에 공지된 분자 클로닝 기법에 의해 EcoRI(5' -GAATTC-3' (서열번호 161)) 및 SpeI(5' -ACTAGT-3'(서열번호 162)) 제한 부위 제한 부위를 통해 CAR 골격에 클로닝시켰다. 예시적인 단일특이성 및 1가 CD20 VHH CAR 작제물을 표 5에 열거한다. 항-CD20 scFv(Leu16 scFv)(서열번호 157) 작제물을 또한 양성 대조군으로서 작용하도록 CAR 골격에 클로닝하고, 표 5에도 열거한다.
Figure pct00014
다가 VHH-기반 CAR을 작제하기 위해, VHH의 다중 복제물 또는 펩타이드 링커를 통해 서로 융합된 다중 상이한 VHH를 암호화하는 핵산 서열을 CAR 골격 벡터에 클로닝하였다. 2 또는 3개의 항-CD20 VHH 도메인을 일련의 글리신-세린 펩타이드 링커와 융합시킨 후에, Kozak-CD8α 신호 펩타이드 핵산 서열과 조합하여 이 융합 서열을 직접 합성하고, EcoRI 및 SpeI 제한 부위를 통해 CAR 골격에 클로닝함으로써 이들 작제물을 제조하였다. 예시적인 단일특이성 및 다가 CD20 VHH CAR 작제물을 표 6에 열거한다.
Figure pct00015
상기 기재한 1가 및 다가 CD20 VHH CAR의 핵산 서열은 서열목록에서 서열번호 108 내지 133 및 192 내지 194에 나타낸다. 이들 예시적인 CAR 작제물에서, CD8α 신호 펩타이드, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137 세포질 도메인 및 CD3ζ 세포질 도메인의 서열을 각각 서열번호 152, 서열번호 153, 서열번호 154, 서열번호 155 및 서열번호 156에 나타낸다.
6.2.2. 렌티바이러스 벡터의 패키징
pMDLg.pRRE(Addgene, #12251), pRSV-REV(Addgene, #12253) 및 pMD2.G(Addgene, #12259)를 포함하는 플라스미드 혼합물을 패키징하는 렌티바이러스를 폴리에터이미드(PEI)와의 사전 최적화된 비로 CAR 작제물을 발현시키는 벡터와 사전혼합하였다. 이어서, 형질감염 혼합물을 HEK293T 세포에 적가하고, 부드럽게 혼합한 후에, 6 내지 8시간 후 배지를 대체하였다. 바이러스-함유 상청액을 48시간 및 72시간에 수집하고, 이어서, 3000g, 4℃에서, 10분 동안 원심분리시켰다. 렌티바이러스 농축 후에, 상청액을 조심해서 버리고, 바이러스 펠릿을 D10 배지(DMEM, 10% FBS, 1mM 피루브산나트륨 및 2mM L-글루타민)로 재현탁시켰다. 채취한 바이러스를 분취시키고, -80℃에서 즉시보관하였다. 바이러스 역가를 평가하고, CHO 포유류 세포 형질도입 효율에 의해 결정하였다. CD20 모노-/바이-/트라이-VHH-기반 CAR의 LV 역가는 1×108 내지 4.5×108의 범위 내에 도달되었다.
6.2.3. T 세포 단리 및 활성화
인간 PBMC를 건강한 공여자로부터 수집하였다. 인간 T 세포를 아래에 기재한 바와 같이 제조업자의 프로토콜에 따라 Miltenyi Pan T 세포 단리 키트(카탈로그 번호 130-096-535)를 이용하여 PBMC로부터 정제하였다. 세포수를 계수하고 세포 현탁액을 300g으로 10분 동안 4℃에서 원심분리시켰다. 이어서, 상청액을 흡인하고, 세포 펠릿을 총 107개의 세포당 40㎕의 완충제에서 재현탁시켰다. 총 107개의 세포당 10㎕의 Pan T 세포 바이오틴-항체 칵테일을 첨가하고, 철저히 혼합하고 4℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 총 107개의 세포당 30㎕의 완충제를 첨가하였다. 107개의 세포당 20㎕의 Pan T 세포 마이크로비드 칵테일을 첨가하였다. 세포 현탁액 혼합물을 철저히 혼합하고 추가 10분 동안 4℃에서 인큐베이션시켰다. 자기 분리를 위해 500㎕의 최소 용적(vol.)이 필요하였다. 자기 분리에서, 적합한 MACS 분리기의 자기장에 LS 칼럼을 위치시켰다. LS 칼럼을 3㎖의 완충제로 린스하였다. 이어서, 세포 현탁액을 칼럼에 적용하고, 풍부화된 T 세포 분획을 나타내는 비표지 세포를 함유하는 통과액을 수집하였다. 칼럼을 3㎖의 완충제로 세척하고 통과된 비표지 세포를 수집함으로써 추가 T 세포를 수집하였다. 이들 비표지 세포는 다시 풍부화된 T 세포를 나타냈고, 이전 단계로부터의 통과액과 합하였다. 이어서, 풀링한 풍부화된 T 세포를 원심분리시키고, T 세포 배양 배지(RPMI1640, 10% 열 비활성화된 소 태아 혈청(FBS) 및 300 IU/㎖의 IL-2)로 재현탁시켰다.
후속적으로, 단리시킨 T 세포를 제조업자의 프로토콜에 따라 인간 T 세포 TransAct™(Miltenyi, 카탈로그 번호 130-111-160)와 함께 48시간 동안 사전 활성화시켰다. 제조업자의 프로토콜에 따라 T 세포 배양 배지에서 항-CD3/CD28 MACSiBead 입자(Miltenyi, 카탈로그 번호 130-111-160)의 첨가에 의해 새로 단리된 T 세포를 활성화시켰다.
6.2.4. CD20 VHH CAR-T 세포의 생성
RNA 전기천공법에 의해 생성되고 시험관내 검정에 의해 선별된 CD20 CAR-T 세포의 예비 결과에 기반하여, 인간 1차 T 세포에서의 효능 분석을 위해 모노-, 바이- 및 트라이-VHH CAR-T 세포를 선택, 설계하고, 렌티바이러스 형질도입에 의해 생성하였다. 추가적으로, CD20 scFv CAR-T 세포를 양성 대조군으로서 생성하였다. 24-웰 플레이트의 웰당 0.5㎖ 배지 중 0.5×106개의 세포로 활성화된 T 세포를 배양시켰다. 24시간 후에, T 세포가 블라스팅(blasting)되었을 때, 0.5㎖의 비농축 또는 더 작은 용적의 농축된 바이러스 상청액을 첨가하였다. T 세포를 1200 g에서 1.5시간 동안 32℃에서 원심분리에 의해 10의 감염다중도(MOI)로 T 세포를 형질도입하였다. 이어서, 형질도입 세포를 적합한 조건 하에 이식유전자 발현을 위한 세포 배양 인큐베이터에 옮겼다. T 세포는 로그 성장 패턴으로 나누어지기 시작하고, 이를 세포수(생세포/㎖) 및 생존도(%)를 측정함으로써 모니터링하였다. T 세포 배양물을 2일마다 신선한 배지로 보충하였다. 대략 6 내지 7일 후에 T 세포가 휴지 상태로 되기 시작함에 따라, 이부 분석을 위해 채취 및 동결보존할 준비를 하였다.
동결보존 전에, 형질도입된 세포의 백분율(T 세포 표면 상의 VHH 도메인 또는 scFv 도메인을 발현시킴)을 유세포분석에 의해 결정하였다. T 세포를 LIVE/DEAD™ Fixable Dead 세포 염색 키트(Invitrogen, 카탈로그 번호 L34976)로 염색하고, VHH-기반 CAR-T 세포를 염소 항-라마 IgG FITC 접합체(Bethyl, 카탈로그 번호 A160-100F)로 염색하고, scFv-기반 CAR-T 세포를 FITC-표지 재조합 단백질 L(Acro, 카탈로그 번호 RPL-PF141)로 30분 동안 4℃에서 염색한 후에, 3회 세척하고, NovoCyte 유세포분석기(ACEA Biosciences) 상에서 FACS 분석을 위해 0.5% FBS와 함께 200㎕의 DPBS에서 재현탁시켰다.
형질도입된 T 세포는 모노-, 바이- 및 트라이-VHH 도메인과 상이한 CAR 발현 수준을 나타냈고, 이는 형질도입 효율(형질도입 세포 백분율)이 CAR의 크기 및 구조와 관련된다는 것을 나타낸다. 모노-VHH CAR-T 세포는 바이- 또는 트라이-VHH CAR-T 세포보다 유의미하게 더 높은 형지로입 효율을 나타냈고, scFv CAR-T 세포와 비슷하였다. CD20 VHH CAR-T 세포는 1주에 약 20 내지 30배 확장되었다. CD20 VHH CAR-T 세포 배양물의 세포 계수 및 생존도(82% 내지 96%)는 표 7에 나타낸 바와 같이, 비형질도입 T 세포(UnT)와 비교할 때 증식 및 확장하는 T 세포 능력에 대해 VHH(들)의 검출 가능한 음성 효과는 없었다는 것을 나타냈다.
Figure pct00016
6.3. 실시예 3-시험관내 키메라 수용체 폴리펩타이드를 발현시키는 면역 세포의 특성규명
6.3.1. 표적 세포 표면 상의 CD19, CD20 및 CD22 항원의 발현
평가한 표적 세포 표면에 대한 CD19, CD20 및 CD22의 발현 수준을 평가하기 위해, 웰당5×105 개의 세포를 PE-표지 항-CD19, 항-CD20 및 항-CD22 mAb와 함께 각각 인큐베이션시키고(BioLegend, 각각 카탈로그 번호 302208, 카탈로그 번호 302306 및 카탈로그 번호 302506), QUANTI-BRITE PE 비드(BD Bioscience, 카탈로그 번호 340495)와 함께 유세포 분석에 의해 평가하였다. 제조업자의 지침에 따라 검정 및 데이터 분석을 수행하였다. "세포당 수용체 수"는 표시된 세포주 각각에 대한 분자 절대 수의 근사치를 나타내고, 표 8에 나타낸다.
Figure pct00017
6.3.2. CD20 VHH CAR-T 세포의 효능 평가
종양 세포에 대한 CD20 VHH CAR-T 세포의 세포독성을 평가하기 위해, 위에 기재한 바와 같이 생성한 세포를 계수하고, 항원 특이적 암 세포와 함께 공동배양시켜 사멸 효력을 판독하였다. 검정 변형을 비교하고/하거나 내부 대조군으로서 작용하도록 모든 검정에서 대조군 CD20 scFv CAR-T 세포를 사용하였다. 비형질도입 T 세포(UnT)를 비-표적화 T 세포 대조군으로서 사용하였다. CD20 양성 세포주 - 인간 림프종 세포주 Raji(ATCC, #CCL-86) 및 K562-CD20; 및 CD20 음성 세포주 - K562-CD19 및 K562(ATCC, #CCL-243)에 대해 CAR-T 세포 사멸 검정을 수행하였다. 세포 생존/사멸에 대한 리포터로서 반딧불이 루시퍼라제를 발현시키기 위해 모든 세포주를 사내에서 조작하였다. 형질도입된 세포를 퓨로마이신으로 선택하고, 2 내지 3일마다 선택 배양 배지(10% FBS 및 2㎍/㎖ 퓨로마이신으로 보충한 이글 최소 필수 배지)에 의해 리프레쉬시켰다. 3회의 선택 라운드 후에, 선택한 세포 클론을 채취하고, 추가 사용을 위해 보존하였다. 24시간 동안 15:1, 10:1 또는 5:1의 효과기 대 표적 세포비(E:T)에서 CD20 VHH CAR-T 세포의 세포독성을 측정하였다. 각각의 수의 T 세포를 일정한 수의 표적 세포와 혼합함으로써 분석을 개시하였다. 웰당 남아있는 루시퍼라제 활성을 ONE-Glo 루시퍼라제 검정(Promega, 카탈로그 번호 E6110)에 의해 평가하여 웰당 남아있는 생 표적 세포를 정량화하였다.
수백개의 1가 VHH CAR-T 세포 표적화 CD20을 작제하고, 시험관내 세포독성 검정에 의해 선별하였다. 예시적인 데이터를 도 1A 내지 도 1B 및 도 2A 내지 도 2F에 나타낸다. T 세포를 LIVE/DEAD™ Fixable Dead Cell 염색 키트(Invitrogen, 카탈로그 번호 L34976)로 염색하고, VHH-기반 CAR-T 세포를 염소 항-라마 IgG FITC 접합체(Bethyl, 카탈로그 번호 A160-100F)로 염색하고, scFv-기반 CAR-T 세포를 FITC-표지 재조합 단백질 L(Acro, 카탈로그 번호 RPL-PF141)로 염색하였다. CAR+ 예시적인 VHH CAR-T 세포의 발현 수준(%)은 채취일에 대략 30%에 도달되었다(도 1A). 예시적인 CD20 VHH CAR-T 세포는 모두 Raji.Luc 세포(E:T=10:1)에 대해 양성 대조군(즉, CD20 scFv CAR-T 세포)보다 더 높은 세포독성을 나타냈고(도 2A, 및 도 2E 내지 도 2F), K562-CD20.Luc 세포에 대해 CD20 scFv CAR-T 세포와 비슷하였다(도 2B, 및 도 2E 내지 도 2F). UnT 대조군과 비교할 때 CD20 VHH CAR-T 세포에 의해 CD20 음성 세포주에 대해 유의미한 세포독성 효과는 검출되지 않았다(도 2C 내지 도 2D).
다가 VHH CAR-T 세포 효력을 평가하기 위해, 모노-, 바이- 및 트라이-VHH CAR-T 세포를 작제하고, 생성하고, CAR-T 세포의 세포독성을 평가하였다. 예시적인 데이터는 다가 CD20 VHH CAR-T 세포가 Raji.Luc 및 K562-CD20.Luc 세포에 대해 상이한 수준의 세포독성을 나타낸다는 것을 나타냈다(도 3A 내지 도 3B). 24시간의 시험관내 사멸 검정에서, 모노-VHH CAR-T 세포 및 Bi-VHH CAR-T 세포는 Raji.Luc 세포에 대해 Tri-VHH CAR-T 세포보다 더 높은 사멸을 나타냈다. UnT 대조군과 비교할 때 CD20-음성 세포주에 대해 세포독성 효과를 나타낸 CD20 VHH CAR-T 세포는 없었다(도 3C 내지 도 3D).
VHH 사이의 (G4S) 링커(들) 효과를 평가하기 위해, (G4S)n(n=1 내지 5)(서열번호 138) 펩타이드와 연관된 2개의 예시적 VHH를 작제하고, Bi-VHH4 CAR-T 세포 중 5개를 생성하였다(표 6). 예시적인 데이터는 두 VHH 도메인 사이의 (G4S) 링커가 짧을수록, Bi-VHH CAR-T 세포가 표적 세포- Raji.Luc 세포를 사멸시키는 것이 더 강력하고, (G4S)1로서 링커를 갖는 Bi-VHH CAR-T 세포는 20:1 및 10:1의 E:T 비에서 Raji.Luc에 대해 가장 높은 세포독성을 나타냈다는 것을 나타냈다(도 4A 내지 도 4B).
위의 관찰은 본 명세서에 제공된 CD20 VHH CAR이 CD20 수용체 발현 세포의 특이적 인식을 통해서 T 세포 활성화를 유도하고, T 세포 내인성 신호전달 경로를 활성화시키고, 세포독성 T 림프구(CTL)의 활성화를 유도하고, 항-종양 반응을 향상시킨다는 것을 나타낸다.
6.3.3. CD20 VHH CAR-T 세포의 IFN-γ 방출 평가
CD20-발현 세포에 반응한 CD20 VHH CAR-T 세포의 사이토카인 생산을 측정하기 위해, CAR-T 세포를 24시간 동안 15:1, 10:1 또는 5:1의 E:T 비로 CD20 양성 세포주 - Raji.Luc 또는 K562-CD20.Luc 및 CD20 음성 세포주 - K562.Luc와 함께 공동배양시키고, 이후에 사이토카인 정량화를 위해 인간 IFN-γ 키트(Cisbio, 카탈로그 번호 62HIFNGPEG)를 이용하여 사이토카인 분석을 위해 배지를 채취하고, 각 웰의 흡광도(시험 항목당 3회)를 다중모드 마이크로플레이트 판독기(Tecan Spark)에 의해 판독하였다.
데이터는 Raji.Luc 세포와 함께 공동 배양할 때 예시적인 세포 VHH-273 CAR-T 세포 및 VHH-496 CAR-T 세포가 CD20 scFv CAR-T 세포보다 IFN-γ를 더 적게 생산하였고(도 5A), K562-CD20.Luc 세포와 함께 공동배양할 때 비슷한 IFN-γ to CD20 scFv CAR-T 세포를 생산하였다(도 5B)는 것을 나타냈다. 모노-VHH CAR-T 세포, Bi-VHH CAR-T 세포 및 Tri-VHH CAR-T 세포는 Raji.Luc 세포에 대해 상이한 수준의 IFN-γ 방출을 나타냈다(도 6). 대조적으로, IFN-γ 방출은 비형질도입 T 세포 또는 음성 대조군 세포 - K562.Luc 중 하나를 함유하는 배양물에서 검출 가능하지 않거나 극도로 낮았고, CAR-T 세포의 CD20-특이성이 CD20 발현 세포에 대한 반응성에 필요하였다는 것을 확인하였다(도 6).
6.3.4. CD20 VHH CAR-T 세포 증식 능력
CD20 VHH CAR-T 세포의 증식 능력을 평가하기 위해, T 세포를 2:1의 E:T 비로 방사선조사된 K562-CD20 세포 또는 K562 세포로 자극하고, 40일 동안 (시험 항목당 3회) 공동배양시켰다. 4일마다, T 세포를 계수하고, LIVE/DEAD™ Fixable Dead 세포 염색 키트(Invitrogen, 카탈로그 번호 L34976)로 염색하고, CD3+ 및 CAR+를 FACS에 의해 평가하였다. CD3 수용체를 FITC-항-인간 CD3(Biolegend, 카탈로그 번호 300306)로 염색하였다. VHH-기반 CAR-T 세포를 염소 항-라마 IgG FITC 접합체(Bethyl, 카탈로그 번호 A160-100F)로 염색하고, scFv-기반 CAR-T 세포를 FITC-표지 재조합 단백질 L(ACRO, 카탈로그 번호 RPL-PF141)로 30분 동안 4℃에서 염색한 후에, 3회 세척하고, NovoCyte 유세포분석기(ACEA Biosciences) 상에서 FACS 분석을 위해 0.5% FBS와 함께 200㎕의 DPBS에서 재현탁시켰다. Novoexpress 소프트웨어에 의해 FACS 데이터를 분석하였다.
CD20 특이적 항원(K562-CD20 세포와 함께 공동 배양)에 의해 자극한 확장에서, VHH-273 CAR-T 세포는 제20일 내지 제40일에 CD20 scFv CAR-T 세포와 비교되는 극적으로 향상된 CD3+ T 세포 및 CAR+ T 세포 증식을 나타냈고, 제28일 내지 제40일의 CD3+ 또는 CAR+T 세포 증식에서 CD20 scFv CAR-T 세포보다 대략 1.6 내지 2배 더 높게 나타났다(도 7A 내지 도 7B). 음성 대조군 세포 - K562를 함유하는 공동 배양물에서 향상된 CD3+ T 세포 또는 CAR+ T 세포 증식이 관찰되지 않았다(도 7A 내지 도 7B). CD20 VHH CAR-T 세포와 CD20 scFv CAR-T 세포는 둘 다 CAR+ 발현 백분율이 처음 20일에 시간-의존적 방식으로 증가되고, 20일 후에 안정기가 되었다는 것을 입증하였다(도 7C). 또한, CD20 VHH CAR-T 세포는 CD20 scFv CAR-T 세포보다 CAR+ 발현의 유의미하게 더 높은 백분율을 나타냈다(도 7C). CD20 항원 자극 CD20 VHH CAR-T 세포 또는 CD20 scFv CAR-T 세포는 각각의 비자극 CD20 VHH CAR-T 세포 또는 CD20 scFv CAR-T 세포보다 40일 증식 검정에서 유의미하게 더 높은 생존도를 유지하였다(FIG.7D). 데이터는 CD20 VHH CAR-T 세포가 종양 연관 항원 의존적 방식으로 강하고 지속적인 T 세포 활성화 및 증식을 유도한다는 것을 나타낸다.
6.3.5. CD20 VHH CAR-T 세포 소모 마커 및 기억 마커 평가
CD20 VHH CAR-T 세포의 소모 마커 및 기억 마커를 평가하기 위해, T 세포를 2:1의 E:T 비로 방사선조사된 K562-CD20 세포로 자극하고, 28일 동안 (시험 항목당 3회) 공동배양시켰다. 4일마다, T 세포를 live/dead 염색으로 계수하고, 멀티-컬러 FACS 염색에 의해 CAR+, T 세포 소모 마커 및 T 세포 기억 마커를 평가하였다. T 세포 소모 마커를 형광 색소 접합 항-인간 CD279(PD-1), 항-인간 CD223(LAG-3) 및 항-인간 CD366(Tim-3)으로 공동 염색하였다. T 세포 기억 마커를 형광색소 접합 항-인간 CD45RA 및 항-인간 CD197(CCR7)로 공동염색하였다. BD LSRFortessa 유세포분석기(BD Biosciences)로 FACS 분석을 실행하였다.
소모 마커 평가의 FACS 데이터는 VHH-273 CAR-T 세포와 CD20 scFv CAR-T 세포 둘 다의 소모 마커가 항원 특이적 자극 후 제4일에 최대가 되었고, 이후에 극적으로 하락되었다는 것을 나타냈다. 제8일 후에, CD20 VHH CAR-T 세포와 CD20 scFv CAR-T 세포 둘 다의 소모 마커의 발현 수준을 제28일까지 낮게 유지하였다(도 8). 데이터는 T 세포 소모가 종양 연관 항원에 노출되고 정상적으로는 활성화 후 발현이 기준선까지 복귀될 때까지 초기에만 강한 T 세포 활성화에 의해 유발된다는 것을 시사한다.
기억 마커 평가의 FACS 데이터는 VHH-273 CAR-T 세포 및 CD20 scFv CAR-T 세포가 항원-특이적 자극 후 중심 기억 T 세포(TCM) 및 효과기 기억 T 세포(TEM)의 유사한 시간-의존적 패턴을 입증하였다는 것을 나타냈다. 또한, CAR-T 세포는 초기에 TCM으로 분화되는데, 이는 제4일에 최대가 되었고, 이어서, 점진적으로 TEM 또는 TEMRA로 분화되고, 각각 제8일 또는 제16일에 최대가 되었다(도 9A 내지 도 9C). UnT의 TCM 및 TEM/TEMRA를 기준선에서 유지하였다(도 9A 내지 도 9C). 조작된 제2 생성 CAR-T 세포는 효과기 및 기억 프로그램의 균형을 맞춤으로써 T 세포를 이들의 운명으로 보낸다.
6.4. 실시예 4- 종양 이종이식 마우스에서 CD20 VHH CAR-T 세포의 생체내 효능
CD20 VHH CAR-T 세포의 항-종양 활성을 Raji 이종이식 NCG 마우스 모델에서 생체내에서 평가하였고, CD20 scFv CAR-T 세포 및 비형질도입 세포(UnT)를 양성 또는 음성 대조군으로서 평가하였다.
세포주: Raji(ATCC #CCL-86)는 Pulvertaft가 1963년에 11세 남성의 버킷 림프종으로부터 확립한 림프아구-유사 세포주이다. Raji 세포를 10% 소 태아 혈청을 함유하는 RMPI 배지에서 성장시켰다. 이 세포주는 조직 배양 플라스크에서 현탁액 중에서 성장시킨다. 이 세포주는 정맥내로 이식될 때 마우스에서 지속되고 확장된다. Raji 세포는 루시퍼라제를 발현시키도록 변형되었고, 따라서 종양 세포 성장은 마우스를 영상화함으로써 모니터링할 수 있었다. Raji 모델은 고수준의 CD19, CD20 및 CD22를 내인성으로 발현시키고, 따라서, CD20-지시 조작된 T 세포의 생체내 효능을 시험하기 위해 사용할 수 있다.
마우스: 유사한 체중(대략 20g)을 갖는 5 내지 6주령의 NCG(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju) 암컷 마우스를 난징 대학교의 동물 모델 연구 센터(Model Animal Research Center of Nanjing University)로부터 받았다. 실험 전 7일 동안 동물을 동물 시설에 적응시켰다. ACUC 규제 및 가이드라인에 따라 동물을 처리하였다.
6.4.1. CD20 모노-VHH CAR-T 세포 효능 및 재시험감염 생체내 시험
6.4.1.1. CD20 모노-VHH CAR-T 세포내 효능 생체내 시험
종양 이종이식을 생성하기 위해, NCG 마우스에 Raji.Luc를 정맥내로 주사하였다. Raji.Luc 종양 세포 이식 4일 후에 마우스를 T 세포로 처리하였다. 마우스당 1×106개의 T 세포의 용량을 위해 400㎕의 T 세포로 꼬리 정맥을 통해 마우스에 정맥내로 주사하였다. 그룹당 4마리의 마우스를 CD20 모노-VHH CAR-T 세포(VHH-273 CAR-T 세포 또는 VHH-496 CAR-T 세포) 또는 CD20 scFv CAR-T 세포 중 하나로 처리하고, 400㎕의 HBSS 단독 및 비형질도입 T 세포(UnT)를 대조군으로서 사용하였다. 모든 T 세포는 동일한 공여자로부터 병행해서 준비하였다. 체중 측정을 포함하는 동물 건강 상태를 주당 2회 모니터링하였다. 동물이 종점을 달성할 때까지 생물발광 영상화(BLI)에 의해 매주 종양을 모니터링하였다.
모든 처리군에 대한 평균 생물발광을 도 10A 내지 도 10F에 플롯팅한다. 임의의 T 세포를 받지 않은 HBSS 처리군(비히클)은 정맥내로 주사한 NCG 마우스에서 기준선 Raji 종양 성장 동력학을 입증하였다. UnT 처리군은 조작된 T 세포에 대한 음성 대조군으로서 비-형질도입 T 세포를 받았다. HBSS와 UnT 처리군은 둘 다 본 연구 내내 지속적인 공격성 종양 진행을 입증하였고, 제16일에 안락사시켰다. CD20 모노-VHH CAR-T 세포는 UnT 치료와 비교할 때 종양 성장을 유의미하게 저해하였고, 평균 생물발광 및 생물발광 영상으로부터 나타나는 바와 같이, 생체내 효능 연구의 35일 동안 완전한 종양 저해를 나타냈다(도 10A 내지 도 10B). 또한, 주당 2회 모니터링한 마우스 건강 상태는 정상이었고, 체중은 생체내 연구의 35일 내내 CD20 모노-VHH CAR-T 세포 처리군에서 증가되었다(도 10C).
6.4.1.2. PK 연구 - 마우스 말초 혈액에서의 CAR의 검출 복제물
마우스에서 CD20 VHH CAR-T 세포의 약물동태학을 평가하고 순환 CAR-T 세포 증식 및 지속성을 모니터링하기 위해, QIAamp-DNA-미니 혈액 키트(Qiagen, 카탈로그 번호 51106)로 마우스 말초 혈액의 게놈 DNA를 추출하였고, Nanodrop One(ThermoFisher, 카탈로그 번호 ND-ONE-W)에 의해 농도를 측정하였다. (그룹당 3마리 마우스의) 게놈 DNA를 ddH2O에 의해 50ng/㎕의 농도로 희석시키고, CAR 골격 상에 결합하는 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 포함하는 PCR 반응 시약과 혼합하였다. 이어서, 혼합물을 디지털 PCR로 평가하고, QX200 Droplet 판독기(Bio Rad, 카탈로그 번호 1864003) 상에서 실행하였다. VHH-273 CAR의 복제물/게놈 DNA(ng)는 피크 수준(제14일)에 관찰된 CD20 scFv CAR보다 2배 더 높았다(도 10D).
6.4.1.3. Raji.Luc 종양 세포 재시험감염 생체내 연구
추가적인 종양 부담 하에 적어도 5주 무종양 마우스에 대한 CAR-T 세포 효능을 연구하기 위해, 재시험감염 검정을 위해 PBMC 중 검출 불가능한 CAR 복제수(복제물/게놈 DNA(ng))를 갖는 해당 마우스를 선택하였다. 선택 마우스에 Raji.Luc 종양 세포의 절반의 양으로 정맥내로 주사하였다. 체중 측정을 포함하는 동물 건강 상태를 주당 2회 모니터링하였다. 동물이 종점을 달성할 때까지 생물발광 영상화(BLI)에 의해 매주 Raji 종양을 모니터링하였다.
대조군으로서 Raji.Luc를 주사한 미경험 마우스(Raji.Luc 세포를 이식하지 않았거나 이전에 CAR-T 세포로 처리하지 않음)는 지속적 응집 종양 진행을 입증하였고, 제19일에 안락사시켰다. VHH-273 CAR-T 세포는 재시험감염 후 28일 동안 완전한 종양 저해를 나타냈다. CD20 VHH CAR-T 세포와 CD20 scFv CAR-T 세포 처리군은 둘 다 평균 생물발광으로부터 나타낸 바와 같이 제12일에 재발되었다(도 10E). 또한, VHH-273 CAR-T 세포 처리 하에 주당 2회 모니터링한 마우스 건강 상태 및 체중은 제28일 재시험감염 생체내 연구 내내 정상이었다(도 10F).
6.4.2. CD20 모노-VHH, 바이-VHH 및 트라이-VHH CAR-T 세포 효능 및 재시험감염 생체내 시험
6.4.2.1. CD20 모노-VHH, 바이-VHH 및 트라이-VHH CAR-T 세포 효능 생체내 시험
종양 이종이식을 생성하기 위해, NCG 마우스에 Raji.Luc를 정맥내로 주사하였다. Raji.Luc 종양 세포 이식 4일 후에 마우스를 T 세포로 처리하였다. 마우스당 1×106개의 T 세포의 용량을 위해 400㎕의 T 세포로 꼬리 정맥을 통해 마우스에 정맥내로 주사하였다. 그룹당 6마리 마우스를 CD20 모노-VHH CAR-T 세포(VHH-313 CAR-T 세포), Bi-VHH CAR-T 세포(Bi-VHH3 CAR-T 세포) 또는 Tri-VHH CAR-T 세포로 처리하고, CD20 scFv CAR-T 세포, 400㎕의 HBSS 단독 및 비형질도입 T 세포(UnT)를 대조군으로서 사용하였다. 모든 T 세포는 동일한 공여자로부터 병행해서 준비하였다. 체중 측정을 포함하는 동물 건강 상태를 주당 2회 모니터링하였다. 동물이 종점을 달성할 때까지 생물발광 영상화(BLI)에 의해 매주 종양을 모니터링하였다.
임의의 T 세포를 받지 않은 HBSS 처리군(비히클)은 정맥내로 주사한 NCG 마우스에서 기준선 Raji 종양 성장 동력학을 입증하였다. UnT 처리군은 조작된 T 세포에 대한 음성 대조군으로서 비-형질도입 T 세포를 받았다. HBSS와 UnT 처리군은 둘 다 본 연구 내내 지속적인 공격성 종양 진행을 입증하였고, 제14일에 안락사시켰다. VHH-313 CAR-T 세포, Bi-VHH3 CAR-T 세포 및 Tri-VHH CAR-T 세포는 모두 UnT 치료와 비교할 때 종양 성장을 유의미하게 저해하였고, 평균 생물발광 및 생물발광 영상으로부터 나타나는 바와 같이, 생체내 효능 연구의 42일 동안 완전한 종양 저해를 나타냈다(도 11A 내지 도 11B). Tri-VHH CAR-T 세포는 Raji 종양 저해에서 모노-VHH CAR-T 세포 및 Bi-VHH CAR-T 세포보다 약간 더 효능이 있었다. CD20 scFv CAR-T 세포 처리군은 제28일에 재발되었다(도 11A 내지 도 11B). 또한, 주당 2회 모니터링한 마우스 건강 상태는 정상이었고, 체중은 생체내 연구 내내 CD20 모노-VHH, Bi-VHH 및 Tri-VHH CAR-T 세포 처리군에서 증가되었다(도 11C).
6.4.2.2. PK 연구 - 마우스 말초 혈액에서의 CAR의 검출 복제물
마우스에서 CD20 모노-VHH, Bi-VHH 및 Tri-VHH CAR-T 세포의 약물동태학을 평가하고 순환 CAR-T 세포 증식 및 지속성을 모니터링하기 위해, QIAamp-DNA-미니 혈액 키트(Qiagen, 카탈로그 번호 51106)로 마우스 말초 혈액의 게놈 DNA를 추출하였고, Nanodrop One(ThermoFisher, 카탈로그 번호 ND-ONE-W)에 의해 농도를 측정하였다. (그룹당 3마리 마우스의) 게놈 DNA를 ddH2O에 의해 50ng/㎕의 농도로 희석시키고, CAR 골격 상에 결합하는 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 포함하는 PCR 반응 시약과 혼합하였다. 이어서, 혼합물을 디지털 PCR로 평가하고, QX200 Droplet 판독기(Bio Rad, 카탈로그 번호 1864003) 상에서 실행하였다. VHH-313 CAR 복제물과 Bi-VHH3 CAR 복제물은 둘 다 제7일에 최대로 되었고, CD20 scFv CAR 복제물은 제21일에 최대가 되었다(도 11D, 이를 도 11E로부터 채택하고, 복제물/게놈 DNA(ng)의 분해능을 향상시키도록 Y-축 규모를 조정함). 또한, Tri-VHH CAR-T 세포는 더 큰 확장 능력을 입증하였고, 제21일에 최대가 되었고, 이어서, 종점(제35일)까지 점진적으로 하락되었다(도 11E).
6.4.2.3. Raji.Luc 종양 세포 재시험감염 생체내 연구
추가적인 종양 부담 하에 적어도 6주 무종양 마우스에 대한 CD20 모노-VHH, Bi-VHH 및 Tri-VHH CAR-T 세포 효능을 연구하기 위해, 재시험감염 검정을 위해 마우스를 선택하였다. 선택 마우스에 Raji.Luc 세포의 절반의 양으로 정맥내로 주사하였다. 체중 측정을 포함하는 동물 건강 상태를 매주 모니터링하였다. 동물이 종점을 달성할 때까지 생물발광 영상화(BLI)에 의해 매주 Raji 종양을 모니터링하였다.
평균 생물발광에 의해 나타난 바와 같이, CD20 scFv CAR-T 세포 처리군은 지속적인 관해 및 재발을 나타냈고, VHH-313 CAR-T 세포 또는 Bi-VHH3 CAR-T 세포 처리 마우스는 대략 제11일 내지 제18일에 재발되었고, Tri-VHH CAR-T 세포 처리 마우스는 Raji.Luc 세포 재시험감염 후 32일 동안 유의미한 종양 저해를 나타냈다(도 11F).
6.5. 실시예 5- 항-CD20 VHH-huIgG1Fc 단클론성 항체(mAb) 결합 및 시험관내 표적 상의 활성/비표적 활성의 특성규명
6.5.1. CD20 수용체 발현 세포에 대한 항-CD20 VHH-huIgG1Fc mAb 표적 상의 결합 및 EC 50
인간 IgG1 Fc 단편 서열(서열번호 159)을 갖는 3가지의 항-CD20 VHH서열(클론 ID: VHH-273, VHH-466 및 VHH-496) 각각을 포유류 발현 벡터 - pcDNA3.4에 클로닝하여, 재조합 단백질 발현을 용이하게 하였다. 포유류 숙주 세포 - Expi293F에서 최적의 발현을 위해 DNA 코돈을 추가로 최적화하였다. 세포 배양물의 상청액으로부터 항체를 채취하고, MabSelect SuRe LX에 의해 1단계 정제하고, 0.2㎛ 필터를 통해 멸균시켰다. A280에 의해 정제된 항체 농도를 결정하고, 대략 90%의 순도로 2 내지 6㎎/㎖에 도달되었다. 서열번호 158에 나타낸 리툭시맙(C2B8) scFv의 아미노산 서열을 갖는 항-CD20 scFv-huIgG1Fc mAb 및 서열번호 163 및 서열번호 164에 나타낸 Leu16 VH-CH1 및 VL-CL의 아미노산 서열을 갖는 항-CD20 Fab-huIgG1Fc mAb를 세포 표면 결합 검정을 위한 양성 대조군으로서 사용하였다. CD20 양성 세포주 - Raji, K562-CD20 및 음성 세포주 - K562를 완전 배양 배지에 재현탁시켰고, 세포 농도를 1×106개의 세포/㎖까지 희석시키고, 웰당 2×105개의 세포로 염색을 수행하였다. 2000 nM의 최대 농도로부터 mAb를 연속 희석시켰고(3배 감소, 12 pts), 실험 계획 및 프로토콜에 따라 첨가하였다. mAb 및 세포를 1시간 동안 4℃에서 공동배양시켰다. 이어서, 세포를 200㎕의 DPBS + 0.5% FBS로 세척하고 300g에서 5분 동안 4℃에서 교반하였다. 세포를 검출 항체 - PE-접합 마우스 항-인간 IgG1 Fc(BioLegend, 카탈로그 번호 409304, 1:100)로 40분 동안 4℃에서 염색하였다. 이어서, 세포를 다시 세척하고, NovoCyte 유세포분석기(ACEA Biosciences) 상의 유세포분석을 위해 200㎕의 DPBS + 0.5% FBS로 재현탁시켰다. FACS 데이터를 Novoexpress 소프트웨어에 의해 분석하고, MFI(중앙값 형광 강도)를 GraphPad PRISM 버전 6.0에 의해 분석하였다.
세포 표면 결합 데이터는 항-CD20 VHH-huIgG1Fc mAb가 CD20 양성 세포 - Raji 세포 및 K562-CD20 세포에 용량-의존적 방식으로 특이적으로 결합하였고, 표적 세포 둘 다에 대해 항-CD20 scFv-huIgG1Fc mAb보다 유의미하게 더 강한 결합이라는 것을 나타냈다(도 12A 내지 도 12B). 항-CD20 VHH-huIgG1Fc mAb는 표적 세포 상의 항-CD20 Fab-huIgG1Fc mAb에 대해 비슷한 결합을 나타내고 더 높은 mAb 농도에서 Raji에 대해 더 강한 경랍을 나타냈다(도 12D). CD20 음성 세포주 - K562에 대해 유의미한 결합을 나타낸 항체는 없었다(도 12C 및 도 12E). 항-CD20 VHH-huIgG1Fc mAb 대 양성 대조군 mAb의 EC50을 표 9 및 표 10에 나타낸다. 최대 유효 농도의 절반으로도 알려진 용어 "EC50"은 명시된 노출 시간 후 기준선과 최대값 중간의 반응을 유도하는 항체 농도를 지칭한다.
Figure pct00018
Figure pct00019
6.5.2. 항-CD20 VHH-huIgG1Fc mAb 비표적 결합 평가
비표적 결합을 입증하기 위해, 다양한 인간 세포주로 항-CD20 VHH-huIgG1Fc mAb를 평가하였다. 예시적인 시험 세포주를 표 11에 열거한다. mAb를 1시간 동안 4℃에서 웰당 1×105개의 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 200㎕의 DPBS 및 0.5% FBS로 세척하고 300g에서 5분 동안 4℃에서 교반하였다. 세포를 검출 항체 - PE-접합 마우스 항-인간 IgG1 Fc(BioLegend, 카탈로그 번호 409304, 1:100)로 30분 동안 4℃에서 염색하였다. 이어서, 세포를 다시 세척하고, NovoCyte 유세포분석기(ACEA Biosciences) 상의 유세포분석을 위해 200㎕의 DPBS + 0.5% FBS로 재현탁시키고, FACS 히스토그램 데이터를 Novoexpress 소프트웨어로 분석하였다. 상기 3개의 예시적인 항-CD20 VHH-huIgG1Fc mAb(VHH 클론 ID: VHH-273, VHH-466 및 VHH-496)에 관해, Raji 세포에 대한 최대 결합을 수득하는 농도에서 비표적 세포에 대한 비특이적 결합이 관찰되지 않았다(표 11).
Figure pct00020
6.6. 실시예 6 - 인간화된 CD20 VHH CAR의 생성 및 특성규명
6.6.1. 항-CD20 VHH 항체의 인간화
인간에서 면역원성을 감소시키기 위해, 면역 반응의 대부분은 비-인간 항체 불변 영역에 대해 일어나기 때문에 낙타과 VHH 항체를 인간화시켰다. 상이한 프레임워크 영역을 낙타과 CDR과 조합할 때, 동일한 항원에 특이적인 키메라 인간 및 낙타과 항체는 상이한 효과기 기능을 유발하여, 이들의 치료적 이점을 연장시킬 수 있다. 대부분의 상동성 인간 생식계열 서열 또는 관련 스캐폴드에 대해 서열-기반 접근 및 프레임워크 셔플링을 이용함으로써 단일-특이성 낙타과 VHH를 인간화시켰다. 인실리코 CDR-접합, 상동성 구조적 모델링(3차 입체구조 및 폴딩), 서열 정렬, 구조 기반-역 돌연변이 설계 및 중요한 입체구조 잔기의 재도입에 의해 비천연 인간 프레임워크 스캐폴드에 의해 지지되고 있는 낙타과 CDR의 비-적합성 및 낙타과 VHH 항체로부터의 중요한 입체구조 잔기의 제거를 해결하였다. 항체 인간화 과정은 입체적 충돌(steric clash)을 제거할 뿐만 아니라 항원에 대한 결합 친화도에 관해 기능을 회복시킬 수 있다.
서열 상동성에 기반한 인간화 설계를 위해
Figure pct00021
Vincke 등에 의해 설계된 보편적인 인간화된 VHH 프레임워크 h-NbBcII10FGLA(Protein Data Bank, PDB code: 3EAK, https://www.rcsb.org/structure/3EAK)을 채택하였다. 모델링 소프트웨어 MODELLER을 이용하여 낙타과 VHH의 상동성 모델링을 수행하였다. 인간 생식계열 유전자에 의한 정렬에 따라, 항-CD20 VHH 도메인에 대한 하나의 인간 수용자로서 IGHV3-64*04를 선택하였다. 아미노산의 상대 용매 접근 가능성을 단백질의 3차원 구조에 따라 계산하였다. VHH의 아미노산 중 하나가 용매에 노출되었다면, 이는 본래의 아미노산으로 대체될 것이다. 본 명세서에 생성된 예시적인 인간화된 VHH 도메인(예를 들어, huVHH-253, huVHH-256, huVHH-260, huVHH-746, huVHH-750, huVHH-753, huVHH-836, huVHH-840, huVHH-843, huVHH-846, 2082H1, 2082H2, 2082H3, 2082H4, 2082H5 및 2082H6)을 표 2에 나타내고, 본 명세서에 제공된 서열목록에서 대응하는 서열을 제공한다.
6.6.2. 인간화된 CD20 VHH CAR-T 세포의 특성규명
위에 기재한 방법을 이용하여 예시적인 인간화된 CD20 VHH CAR(표 12 참조)을 생성하였다.
Figure pct00022
인간 1차 T 세포에서 렌티바이러스 형질도입에 의해 인간화된 VHH CD20 CAR-T 세포를 생성하였고, 표준 방법에 따라 시험관내 효능 연구에 의해 평가하였다. 형질도입 T 세포는 인간화된 CD20 VHH CAR과 상이한 CAR 발현 수준(%)을 나타냈다. 예시적인 인간화된 CD20 VHH CAR-T 세포의 생존도는 약 90% 내지 96%였고, CAR+(%)는 약 12% 내지 43%였고, 확장 배수는 7일 배양에서 35 내지 74 이내였고, 이는 비형질도입 T 세포(UnT)와 비교할 때 증식 및 확장하는 T 세포의 능력에 대해 인간화된 VHH의 검출 가능한 음성 효과가 없다는 것을 나타낸다.
상기 기재한 바와 같이 생성된 인간화된 CD20 VHH CAR-T 세포를 계수하고, 항원 특이적 암 세포주와 함께 공동배양시켜 사멸 효력을 평가하고, 모 낙타과 CD20 VHH CAR-T 세포 및 CD20 scFv CAR-T 세포를 대조군으로서 사용하고, 비형질도입 T 세포(UnT)를 비-표적화 T 세포 대조군으로서 사용하였다. CD20 양성 세포주 - Raji(ATCC #CCL-86), K562-CD20 및 음성 세포주 - K562(ATCC #CCL-243)에 대해 인간화된 CD20 VHH CAR-T 세포 사멸 분석을 수행하였다. 세포 생존/사멸에 대한 리포터로서 반딧불이 루시퍼라제를 발현시키기 위해 모든 세포주를 사내에서 조작하였다. 형질도입된 세포를 퓨로마이신으로 선택하고, 2 내지 3일마다 선택 배양 배지(10% FBS 및 2㎍/㎖ 퓨로마이신으로 보충한 이글 최소 필수 배지)에 의해 리프레쉬시켰다. 3회의 선택 라운드 후에, 선택한 세포 클론을 채취하고, 추가 사용을 위해 보존하였다. 인간화된 CD20 VHH CAR-T 세포의 세포독성을 15:1, 10:1, 5:1 또는 2.5:1의 효과기 세포 대 표적 세포비(E:T)로 24시간 동안 측정하였다. 각각의 수의 T 세포를 일정한 수의 표적 세포와 혼합함으로써 분석을 개시하였다. 웰당 남아있는 루시퍼라제 활성을 ONE-Glo 루시퍼라제 검정(Promega, 카탈로그 번호 E6110)에 의해 평가하여 웰당 남아있는 생 표적 세포를 정량화하였다.
결과는 인간화된 CD20 VHH CAR-T 세포(huVHH-746 CAR-T 세포, huVHH-750 CAR-T 세포, huVHH-753 CAR-T 세포, huVHH-253 CAR-T 세포, huVHH-256 CAR-T 세포 및 huVHH-260 CAR-T 세포를 포함)가 항원 특이적 표적 세포의 용해를 유도하고, 더 높은 효력을 나타내고 표적 세포에 대해 효력을 유지하였다는 것을 나타냈다(도 13A 내지 도 13B, 도 13D 내지 도 13E 및 도 13H 내지 도 13I). UnT 대조군과 비교할 때 인간화된 CD20 VHH CAR-T 세포에 의해 음성 세포주 - K562.Luc 또는 Nalm.6.Luc에 대해 유의미한 세포독성 효과는 검출되지 않았다(도 13C, 도 13F 내지 도 13G 및 도 13J 내지 도 13K).
본 명세서에 인용된 모든 특허, 공개된 출원 및 참고문헌의 교시는 이들의 전문이 참조에 의해 원용된다.
예시적 실시형태를 구체적으로 나타내고 기재하였지만, 당업자라면 첨부하는 청구범위에 의해 포함되는 실시형태의 범주로부터 벗어나는 일 없이 형태 및 상세한 설명의 다양한 변화가 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.
앞서 언급한 것으로부터, 본 발명의 목적을 위해 구체적 실시형태가 기재되었지만, 본 명세서에 제공된 것의 사살과 범주로부터 벗어나는 일 없이 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 위에 언급한 모든 참고문헌은 본 명세서에 이들의 전문이 참조에 의해 원용된다.
SEQUENCE LISTING <110> NANJING LEGEND BIOTECH CO., LTD. <120> CD20 BINDING MOLECULES AND USES THEREOF <130> WO/2022/012680 <140> PCT/CN2021/106886 <141> 2021-07-16 <150> PCT/CN2020/102463 <151> 2020-07-16 <160> 200 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 (Kabat) of VHH-273, VHH-283, huVHH-253, huVHH-256, 2082H1, 2082H2, 2082H3, 2082H4, 2082H5, and 2082H6 <400> 1 Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Asn Met Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 (Kabat) of VHH-273, huVHH-256, 2082H1, 2082H2, 2082H3, 2082H4, 2082H5, and 2082H6 <400> 2 Val Val Asp Trp Ser Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 (Kabat) of VHH-273, huVHH-253, huVHH-256, 2082H1, 2082H2, 2082H3, 2082H4, 2082H5, and 2082H6 <400> 3 Arg Val Gln Tyr Gly Ser Ser Trp Ser Gly Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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VHH-466 <400> 21 Arg Val Asn Ala Asp Asp Ser Ile Asn Tyr Val Ala Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 (IMGT) of VHH-466, huVHH-836, huVHH-840, huVHH-843, and huVHH-846 <400> 22 Ala Asp Ile Arg Leu Phe Tyr Leu 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 (IMGT) of VHH-466, huVHH-840, and huVHH-843, huVHH-846 <400> 23 Val Asn Ala Asp Asp Ser Ile 1 5 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 (Kabat) of VHH-496, huVHH-746, and huVHH-750, huVHH-753 <400> 24 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Pro Met Thr 1 5 10 <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 (Kabat) of VHH-496, huVHH-746, huVHH-750, and huVHH-753 <400> 25 Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asp Arg Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 (Kabat) of VHH-496, huVHH-746, huVHH-750, and huVHH-753 <400> 26 Trp Asp Arg Thr Leu 1 5 <210> 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gaccttcagc tcctacaaca tgggctggtt taggcaggca 120 ccaggcaagg agagggagtt cgtggcagca atctcctggt ctggaggcag cccctactat 180 gcctctagcg tgcggggccg gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa tacagtgtat 240 ctgcagatga acagcctgaa gcccgaggat acagccgtgt actattgtgc cgcccctatc 300 gagtacggct cttcttggtc agcagattat tggggacagg gcactcaggt cacagtctca 360 tca 363 <210> 66 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-313 (nucleic acid) <400> 66 gatgtgcagc tggtggagag cggcggcggg ttggtgcaag ccggtggttc gctgcggttg 60 tcatgcgccg cttccggacg tacaatctct agctactcca tgggctggtt ccgccaggcc 120 cctggtaagg agcgcaggtt tgtcgcggcc atctcctggt ctggagggtc gccctattac 180 gcggacagcg tgaagggccg cttcaccatc agccgtgaca acgccaagaa cacggtttac 240 ctgcagatga actccctcaa acctgaagac accgccgtgt actactgtgc tgcaccaatt 300 gagtacggct ccagttggtc tgcggactat tggggccagg gcacccaggt caccgtgtcc 360 tct 363 <210> 67 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-440 (nucleic acid) <400> 67 caggtccacc tgatggagag cggaggcggc tccgtgcagg ccggaggtag tctgcgcctg 60 tcatgccagg cctccgccta cattcgagtg ttctacctga tgggctggtt ccgccaggcc 120 ccggggaagg agcgcgagga ggtggctcgt gtcactgcgg acggcttcac caaccatgca 180 gcttctgtga agggccgctt caccatctcc aaggacaacg cgaagaacac gctgtacttg 240 cagatggatt ctatgaaaag cgaagacact gccgtgtact actgtgccgc tgggcggacc 300 tggaactccg gttttgagta ttggggccag ggcacccagg tcaccgtgtc gtcc 354 <210> 68 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-466 (nucleic acid) <400> 68 caggtccact tggtggagag cggtggaggc tccgtgcagg ccggaggttc tctccgtctc 60 tcatgccagg cctccgcgga catccgcctg ttttacctga tgggctggtt ccgccaagca 120 cccgggaagg agcgcgagga ggtggctcgg gttaacgcgg atgacagcat taactacgtg 180 gcgagtgtaa agggccgctt caccatctcc aaggacaacg ccaagaacac gctgtacttg 240 cagatggatt ctcttaaacc ggaagacacc gccacttact actgtgctgc tgggcgaacc 300 tggaactccg gcttcgagta ttggggccag ggcacccagg tcaccgtgag ctcg 354 <210> 69 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-496 (nucleic acid) <400> 69 cagatccagc tggtggagag tggaggcggc ttggtgcagc cagggggctc cctacgcctg 60 tcatgcgctg cttctggctt cacgttcagc aactacccga tgacctggct ccgccaggcc 120 cccgggaaag gcctcgagag cgtgtccgac atcacctccg gtggtgatcg gccctattac 180 gcggactcgg tgaagggcag gtttacaatt tctcgcgaca acgccaagaa tatgctgtac 240 ctggagatga actccctgaa gactgaagac accgccgtgt actactgtgc cacctgggat 300 cgcaccctga cgggacaagg cacccaggtc accgttagct cg 342 <210> 70 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-653 (nucleic acid) <400> 70 caggtgaagc tggtggagag cggtgggggc tccgtgcagg ccggaggtag ccttcgcctg 60 tcatgccagg cctccgccta cattcgggtg ttttacctga tgggctggtt ccgccaggcc 120 ccggggaagg agcgcgagga ggtggcacga gtcaacgcgg acggcatcac caaccatgca 180 gcttccgtaa aaggccgctt caccatctcc aaggacaacg ccaagaacac gctatacctc 240 cagatggatt ctctgaagcc cgaggacacc gccgtgtact actgtgctgc gggacgtact 300 tggaactccg gcttcgaata ttggggccag ggcacccagg tcactgtcag ttcc 354 <210> 71 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> huVHH-253 (nucleic acid) <400> 71 gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggt ttggtgcagc caggaggctc cctccgcctg 60 tcatgcgccg cttccggccg caccttcagc agctacaaca tgggctggtt ccgccaggcc 120 cccggcaaag gcctggagtg ggtcgcggcc gtggattggt ctggcggttc cccctattac 180 gcggactccg tgaagggccg cttcaccatc tcccgcgaca actccaagaa cacggtgtac 240 ctgcagatga actctctgcg cgccgaggac accgccgtct actactgtgc cggccgagtg 300 cagtacggct ccagttggtc tggggactat tggggccagg gcaccctggt gaccgtgtcg 360 tcc 363 <210> 72 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> huVHH-256 (nucleic acid) <400> 72 gaggtgcagc tggtggagag cggaggcggt ttggtgcagc cagggggttc tctgcgcctg 60 agctgtgctg cttccggtcg tacgttcagc agctacaaca tgggctggtt ccgccaggcc 120 cccggcaaag gcctggagtt cgtcgccgtg gtggactggt ctggcggctc cccctattac 180 gcggactccg tgaagggccg cttcaccatc tcccgcgaca actccaagaa cacggtgtac 240 ctgcagatgt cttctcttcg cgccgaggac accgccgtct actactgcgc cggccgagtg 300 cagtacggct ccagttggtc tggtgattat tggggccagg gcaccctggt gaccgtgtcg 360 tcc 363 <210> 73 <211> 363 <212> DNA 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ggaagggact ggagagcgtg 600 agtgacatca ccagcggtgg ggacaggccc tattacgcgg acagcgtgaa gggccgcttc 660 accatctctc gtgacaatgc taagaatatg ctgtacctgg agatgaacag cctgaagaca 720 gaggacaccg cggtgtacta ctgtgctacc tgggaccgca ctctgaccgg tcagggcacc 780 caggttacag tcagctccgg aggcggcggc tccggcgggg gtggctccca ggtccacctg 840 atggagagcg gcggaggctc agtgcaggct gggggttctc ttcgcctgag ctgtcaggcc 900 agtgcctaca tccgcgtgtt ctacctgatg gggtggttcc gccaggcgcc aggtaaagag 960 cgcgaggagg tggctcgggt aacagcggac ggcttcacca accatgccgc tagcgtgaaa 1020 ggccgtttta ctatctccaa ggacaacgcc aagaacacgc tgtatctgca gatggattct 1080 atgaagtccg aagatactgc cgtgtactac tgcgctgctg gccgcacctg gaactccggc 1140 ttcgagtact ggggccaggg gacccaggtc accgtgtcgt ccactagtac cacgacgcca 1200 gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 1260 gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 1320 gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt 1380 atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa 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<213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 (Kabat) of VHH-657 <400> 179 Gly Arg Thr Trp Asn Ser Gly Phe Glu Tyr 1 5 10 <210> 180 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 (IMGT) of VHH-657 <400> 180 Ala Asn Ile Arg Val Phe Tyr Leu 1 5 <210> 181 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 (IMGT) of VHH-657 <400> 181 Val Asn Ala Asp Gly Ile Thr 1 5 <210> 182 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 (IMGT) of VHH-657 <400> 182 Ala Thr Gly Arg Thr Trp Asn Ser Gly Phe Glu Tyr 1 5 10 <210> 183 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-623 (amino acid) <400> 183 Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ala Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Ile Tyr Tyr Gly Ser Asn Trp Ser Ser Glu Asn Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 184 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-640 (amino acid) <400> 184 Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Trp Gln Thr Tyr 20 25 30 Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ala Val Ala Thr Gly Ser Arg Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Tyr Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Asp Pro Arg Arg Tyr Gly Ser Cys Pro Leu Ser Ala Ala Asn Phe 100 105 110 Asn Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 185 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-657 (amino acid) <400> 185 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gln Ala Ser Ala Asn Ile Arg Val Phe Tyr 20 25 30 Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val 35 40 45 Ala Arg Val Asn Ala Asp Gly Ile Thr Asn His Ala Ala Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Glu Asp Ser Pro Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Gly Arg Thr Trp Asn Ser Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 186 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-623 (nucleic acid) <400> 186 caggtaaagc tggaggagag cggaggtggt ctggtgcaag ccggcggctc cctccgtctt 60 tcatgcgccg cttccggacg aacattttca aattatgcgg ctgggtggtt ccgccaggcc 120 ccgggcaagg agcgcgagtt cgtcgcagcc attagctggt ctggtggctc cccctattac 180 gcggacgccg tgcgcgggcg cttcaccatc tctcgggaca acgcgaaaaa cacggtgtac 240 ctgcagatga actccctgaa gccagaagat accgccgttt actactgtgc tgcaggcatc 300 tactacggca gcaactggtc ttcggagaac tggggccagg gcacccaggt caccgtgtcg 360 tcc 363 <210> 187 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-640 (nucleic acid) <400> 187 caggtgaagc tggtggagag cggagggggt tccgtgcagg ccggcggatc gctgcggttg 60 tcctgtgccg cttctggcta cacctggcaa acgtactgca tggcttggtt ccgccaggct 120 cccgggaagg agagggaggg cgtagctgtg gcgactggtt cccgcaccac aagctacgcg 180 gacagtgtta aaggccgttt taccatctcc aaggactatg ccaagaatac tctgtacctg 240 cagatgtctt ctctggagcc tgaagatacc gccatgtatt actgtgctgc ggacccgcgc 300 cgctacggct catgcccact cagcgcagcc aacttcaaca actggggcca gggcacccag 360 gtcaccgtgt cctcg 375 <210> 188 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-657 (nucleic acid) <400> 188 caggtgcagc tggtggagag cggagggggc tccgctcagg ccggaggctc gctgcgccta 60 tcatgccagg cctccgccaa cattcgagtg ttctacttga tgggctggtt ccgccaggcg 120 ccggggaagg agagggagga ggtggctcgc gtcaacgcgg acggcatcac caaccatgca 180 gcctccgtaa agggccgctt caccatctct gaggacagtc caaaaaacac tctttatctg 240 cagatggatt ctctgaagcc tgaagacacc gccgtgtact actgtgccac gggtcggacc 300 tggaactccg gttttgagta ctggggccag ggcacccagg tcactgtgag ctcg 354 <210> 189 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-623 CAR (amino acid) <400> 189 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg 35 40 45 Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Pro Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Asp Ala Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 85 90 95 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Ile Tyr Tyr Gly Ser Asn Trp Ser 115 120 125 Ser Glu Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser 130 135 140 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 145 150 155 160 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 165 170 175 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile 180 185 190 Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val 195 200 205 Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 210 215 220 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 225 230 235 240 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg 245 250 255 Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln 260 265 270 Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp 275 280 285 Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro 290 295 300 Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp 305 310 315 320 Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg 325 330 335 Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr 340 345 350 Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 355 360 365 <210> 190 <211> 371 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-640 CAR (amino acid) <400> 190 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Trp Gln Thr Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Glu Arg Glu Gly Val Ala Val Ala Thr Gly Ser Arg Thr Thr Ser Tyr 65 70 75 80 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Tyr Ala Lys 85 90 95 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala 100 105 110 Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Pro Arg Arg Tyr Gly Ser Cys Pro Leu 115 120 125 Ser Ala Ala Asn Phe Asn Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 130 135 140 Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala 145 150 155 160 Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg 165 170 175 Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys 180 185 190 Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu 195 200 205 Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu 210 215 220 Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln 225 230 235 240 Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly 245 250 255 Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 260 265 270 Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 275 280 285 Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 290 295 300 Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 305 310 315 320 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 325 330 335 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 340 345 350 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 355 360 365 Pro Pro Arg 370 <210> 191 <211> 364 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-657 CAR (amino acid) <400> 191 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Ala Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gln Ala Ser Ala Asn 35 40 45 Ile Arg Val Phe Tyr Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Glu Arg Glu Glu Val Ala Arg Val Asn Ala Asp Gly Ile Thr Asn His 65 70 75 80 Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Glu Asp Ser Pro Lys 85 90 95 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Arg Thr Trp Asn Ser Gly Phe Glu Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr 130 135 140 Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro 145 150 155 160 Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val 165 170 175 His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro 180 185 190 Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu 195 200 205 Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro 210 215 220 Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys 225 230 235 240 Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe 245 250 255 Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu 260 265 270 Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp 275 280 285 Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys 290 295 300 Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala 305 310 315 320 Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys 325 330 335 Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr 340 345 350 Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 355 360 <210> 192 <211> 1104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-623 CAR (nucleic acid) <400> 192 atggcgctgc ctgtgactgc tctgctgctc cccctggcct tgcttctaca cgccgctagg 60 cctcaggtaa agctggagga gagcggaggt ggtctggtgc aagccggcgg ctccctccgt 120 ctttcatgcg ccgcttccgg acgaacattt tcaaattatg cggctgggtg gttccgccag 180 gccccgggca aggagcgcga gttcgtcgca gccattagct ggtctggtgg ctccccctat 240 tacgcggacg ccgtgcgcgg gcgcttcacc atctctcggg acaacgcgaa aaacacggtg 300 tacctgcaga tgaactccct gaagccagaa gataccgccg tttactactg tgctgcaggc 360 atctactacg gcagcaactg gtcttcggag aactggggcc agggcaccca ggtcaccgtg 420 tcgtccacta gtaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 480 tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 540 acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 600 ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca aacggggcag aaagaaactc 660 ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 720 tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 780 aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 840 ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 900 gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 960 aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1020 cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1080 atgcaggccc tgccccctcg ctaa 1104 <210> 193 <211> 1116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-640 CAR (nucleic acid) <400> 193 atggcgcttc ccgtcacggc ccttttgctg cccctggcgc tgctgctcca cgccgcccga 60 cctcaggtga agctggtgga gagcggaggg ggttccgtgc aggccggcgg atcgctgcgg 120 ttgtcctgtg ccgcttctgg ctacacctgg caaacgtact gcatggcttg gttccgccag 180 gctcccggga aggagaggga gggcgtagct gtggcgactg gttcccgcac cacaagctac 240 gcggacagtg ttaaaggccg ttttaccatc tccaaggact atgccaagaa tactctgtac 300 ctgcagatgt cttctctgga gcctgaagat accgccatgt attactgtgc tgcggacccg 360 cgccgctacg gctcatgccc actcagcgca gccaacttca acaactgggg ccagggcacc 420 caggtcaccg tgtcctcgac tagtaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 480 cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 540 ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 600 gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg caaacggggc 660 agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 720 gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 780 gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 840 aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 900 gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 960 ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1020 aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1080 gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgctaa 1116 <210> 194 <211> 1095 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-657 CAR (nucleic acid) <400> 194 atggcgctgc ccgttacagc tctgctgctc cccctggcac ttttgctcca cgccgcgcgt 60 cctcaggtgc agctggtgga gagcggaggg ggctccgctc aggccggagg ctcgctgcgc 120 ctatcatgcc aggcctccgc caacattcga gtgttctact tgatgggctg gttccgccag 180 gcgccgggga aggagaggga ggaggtggct cgcgtcaacg cggacggcat caccaaccat 240 gcagcctccg taaagggccg cttcaccatc tctgaggaca gtccaaaaaa cactctttat 300 ctgcagatgg attctctgaa gcctgaagac accgccgtgt actactgtgc cacgggtcgg 360 acctggaact ccggttttga gtactggggc cagggcaccc aggtcactgt gagctcgact 420 agtaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 480 ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 540 ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt 600 ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc aaacggggca gaaagaaact cctgtatata 660 ttcaaacaac catttatgag accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc 720 cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt gaactgagag tgaagttcag caggagcgca 780 gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga 840 agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 900 ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 960 gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 1020 ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 1080 ctgccccctc gctaa 1095 <210> 195 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 (Kabat with 5aa) of VHH-273, VHH-283, huVHH-253, huVHH-256, 2082H1, 2082H2, 2082H3, 2082H4, 2082H5, and 2082H6 <400> 195 Ser Tyr Asn Met Gly 1 5 <210> 196 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 (Kabat with 5aa) of VHH-313 and huVHH-260 <400> 196 Ser Tyr Ser Met Gly 1 5 <210> 197 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 (Kabat with 5aa) of VHH-440, VHH-653, VHH-466, huVHH-836, huVHH-840, huVHH-843, huVHH-846 and VHH-657 <400> 197 Phe Tyr Leu Met Gly 1 5 <210> 198 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 (Kabat with 5aa) of VHH-496, huVHH-746, and huVHH-750, huVHH-753 <400> 198 Asn Tyr Pro Met Thr 1 5 <210> 199 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 (Kabat with 5aa) of VHH-623 <400> 199 Asn Tyr Ala Ala Gly 1 5 <210> 200 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 (Kabat with 5aa) of VHH-640 <400> 200 Thr Tyr Cys Met Ala 1 5

Claims (41)

  1. 항-CD20 단일 도메인 항체(single domain antibody: sdAb)로서,
    (i) 서열번호 1 또는 195의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (ii) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (iii) 서열번호 1 또는 195의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (iv) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (v) 서열번호 11 또는 196의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (vi) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (vii) 서열번호 14 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (viii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (ix) 서열번호 20 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (x) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (xi) 서열번호 24 또는 198의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (xii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (xiii) 서열번호 14 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (xiv) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (xv) 서열번호 1 또는 195의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (xvi) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (xvii) 서열번호 20 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (xviii) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (xix) 서열번호 20 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (xx) 서열번호 20 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (xxi) 서열번호 20 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (xxii) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (xxiii) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (xxiv) 서열번호 165 또는 199의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 166의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 167의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (xxv) 서열번호 168의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 169의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 170의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (xxvi) 서열번호 171 또는 200의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (xxvii) 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (xxviii) 서열번호 177 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는
    (xxix) 서열번호 180의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 181의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 182의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
    을 포함하는, 항-CD20 단일 도메인 항체.
  2. 항-CD20 단일 도메인 항체(sdAb)로서,
    (i) 서열번호 41에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (ii) 서열번호 42에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (iii) 서열번호 43에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (iv) 서열번호 44에 제시된 바와 같이 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (v) 서열번호 45에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (vi) 서열번호 46에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (vii) 서열번호 47에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (viii) 서열번호 48에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (ix) 서열번호 49에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (x) 서열번호 50에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (xi) 서열번호 51에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (xii) 서열번호 52에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (xiii) 서열번호 53에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (xiv) 서열번호 54에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (xv) 서열번호 55에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (xvi) 서열번호 56에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (xvii) 서열번호 57에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (xviii) 서열번호 58에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (xix) 서열번호 59에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (xx) 서열번호 60에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (xxi) 서열번호 61에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (xxii) 서열번호 62에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (xxiii) 서열번호 63에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (xxiv) 서열번호 183에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (xxv) 서열번호 184에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는
    (xxvi) 서열번호 185에 제시된 바와 같이 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3
    을 포함하는, 항-CD20 단일 도메인 항체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 CDR1, CDR2 또는 CDR3은 Kabat 넘버링 체계, IMGT 넘버링 체계, AbM 넘버링 체계, Chothia 넘버링 체계, Contact 넘버링 체계 또는 이들의 조합에 따라 결정되는, 항-CD20 sdAb.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 183, 서열번호 184 및/또는 서열번호 185에 제시된 바와 같은 하나 이상의 FR 영역을 더 포함하는, 항-CD20 sdAb.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 183, 서열번호 184 또는 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는, 항-CD20 sdAb.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD20 sdAb는 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 183, 서열번호 184 또는 서열번호 185의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진, 항-CD20 sdAb.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-CD20 sdAb는 낙타과 sdAb인, 항-CD20 sdAb.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-CD20 sdAb는 인간화된 sdAb인, 항-CD20 sdAb.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD20 sdAb는 제제에 유전적으로 융합되거나 또는 화학적으로 접합된, 항-CD20 sdAb.
  10. 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)로서,
    (a) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항-CD20 sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인;
    (b) 막관통 도메인; 및
    (c) 세포내 신호전달 도메인
    을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 하나 이상의 추가적인 항원 결합 도메인(들)을 더 포함하는, CAR.
  12. 제11항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 1개의 추가적인 항원 결합 도메인을 더 포함하거나; 또는 상기 세포외 항원 결합 도메인은 2개의 추가적인 항원 결합 도메인을 더 포함하는, CAR.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 항원 결합 도메인(들)은 CD20, CD19, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 및 당지질 F77로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원(들)에 결합하는, CAR.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항-CD20 sdAb 중 둘 또는 셋을 포함하는, CAR.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된, CAR.
  16. 제15항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD8α로부터 유래된, CAR.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 면역 효과기 세포의 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, CAR.
  18. 제17항에 있어서, 상기 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된, CAR.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공자극 신호전달 도메인을 더 포함하는, CAR.
  20. 제19항에 있어서, 상기 공자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 분자로부터 유래된, CAR.
  21. 제20항에 있어서, 상기 공자극 신호전달 도메인은 CD137로부터 유래된, CAR.
  22. 제10항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인의 C-말단과 상기 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치된 힌지 도메인을 더 포함하는, CAR.
  23. 제22항에 있어서, 상기 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된, CAR.
  24. 제10항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 N-말단에 위치된 신호 펩타이드를 더 포함하는, CAR.
  25. 제24항에 있어서, 상기 신호 펩타이드는 CD8α로부터 유래된, CAR.
  26. 키메라 항원 수용체(CAR)로서, (i) 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 189, 서열번호 190 및 서열번호 191로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열; 또는 (ii) 서열번호: 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 189, 서열번호 190 또는 서열번호 191의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  27. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항-CD20 sdAb를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 단리된 핵산.
  28. 제27항의 단리된 핵산을 포함하는, 벡터.
  29. 제10항 내지 제26항 중 어느 한 항의 CAR을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 단리된 핵산.
  30. 제29항의 단리된 핵산을 포함하는, 벡터.
  31. 제10항 내지 제26항 중 어느 한 항의 CAR, 제29항의 단리된 핵산 또는 제30항의 벡터를 포함하는, 조작된 면역 효과기 세포.
  32. 제31항에 있어서, 상기 면역 효과기 세포는 T 세포 또는 B 세포인, 조작된 면역 효과기 세포.
  33. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항-CD20 sdAb, 제31항 또는 제32항의 조작된 면역 효과기 세포 또는 제28항 또는 제30항의 벡터 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  34. 대상체의 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항-CD20 sdAb, 제31항 또는 제32항의 조작된 면역 효과기 세포 또는 제33항의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 B 세포 연관 질환 또는 장애 및/또는 CD20 연관 질환 또는 장애인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 암인, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 B 세포 악성종양인, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 B 세포 악성종양은 B 세포 백혈병 또는 B 세포 림프종인, 방법.
  39. 제34항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 가장자리구역 림프종(예를 들어, 비장 가장자리구역 림프종), 광범위 큰 B 세포 림프종(DLBCL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 원발성 중추 신경계(CNS) 림프종, 원발성 종격동 B 세포 림프종(PMBL), 소형 림프구성 림프종(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병(B-PLL), 소포 림프종(FL), 버킷 림프종, 원발성 안구내 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 모발세포 백혈병(HCL), 전구 B 세포 림프모구 백혈병, 비호지킨 림프종(NHL), 고등급 B-세포 림프종(HGBL) 및 다발성 골수종(MM)으로 이루어진 군으로부터 선택된, 방법.
  40. 제34항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 자가면역 및/또는 염증성 질환인, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 자가면역 및/또는 염증성 질환은 부적절한 또는 향상된 B 세포수 및/또는 활성화와 연관된, 방법.
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