JP2023546765A - Cd20結合分子及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本開示は、CD20に結合する単一ドメイン抗体、及びそれを含むキメラ抗原受容体を提供する。さらに、キメラ抗原受容体を含む操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)が提供される。疾患または障害を処置する医薬組成物、キット、及び方法も提供される。【選択図】なし
Description
相互参照
本出願は、2020年7月16日に出願された国際特許出願第PCT/CN2020/102463号の優先権の恩典を主張し、その内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2020年7月16日に出願された国際特許出願第PCT/CN2020/102463号の優先権の恩典を主張し、その内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、2021年7月9日に作成された14651-026-228_SEQ_LISTING.txtという名称のテキストファイルとして、本出願と共に提出された配列表を参照により組み込み、サイズが236,191バイトである。
本出願は、2021年7月9日に作成された14651-026-228_SEQ_LISTING.txtという名称のテキストファイルとして、本出願と共に提出された配列表を参照により組み込み、サイズが236,191バイトである。
1.分野
本開示は、抗CD20単一ドメイン抗体、キメラ抗原受容体、操作された免疫エフェクター細胞、及びそれらの使用方法に関する。本開示は、さらに、治療的使用のための細胞の活性化及び増大、特に、キメラ抗原受容体ベースのT細胞免疫療法に関する。
本開示は、抗CD20単一ドメイン抗体、キメラ抗原受容体、操作された免疫エフェクター細胞、及びそれらの使用方法に関する。本開示は、さらに、治療的使用のための細胞の活性化及び増大、特に、キメラ抗原受容体ベースのT細胞免疫療法に関する。
2.背景
CD20は、B細胞分化の特定の段階で発現する表面抗原である。治療用モノクローナル抗体(mAb)を用いてCD20陽性B細胞を標的とすることは、血液悪性腫瘍、例えば、非ホジキンリンパ腫(NHL)及び慢性リンパ性白血病(CLL)、の処置において効果的な方策となっている。リツキシマブ(RTX)の初期の成功により、より効果的なCD20ベースの治療法の作成及び開発が促進されている。しかし、従来のmAbによる処置は、難治性/再発性疾患などの障害を克服するのに十分ではなかった(Shanehbandi et al.,Current Cancer Drug Targets,17(5):423-444(2007)(非特許文献1))。
CD20は、B細胞分化の特定の段階で発現する表面抗原である。治療用モノクローナル抗体(mAb)を用いてCD20陽性B細胞を標的とすることは、血液悪性腫瘍、例えば、非ホジキンリンパ腫(NHL)及び慢性リンパ性白血病(CLL)、の処置において効果的な方策となっている。リツキシマブ(RTX)の初期の成功により、より効果的なCD20ベースの治療法の作成及び開発が促進されている。しかし、従来のmAbによる処置は、難治性/再発性疾患などの障害を克服するのに十分ではなかった(Shanehbandi et al.,Current Cancer Drug Targets,17(5):423-444(2007)(非特許文献1))。
キメラ抗原受容体T(CAR-T)細胞療法は、新興の効果的ながん免疫療法である。特に、血液悪性腫瘍では、CAR-T細胞は、興味深い結果を達成している。CD20 CAR-T細胞の初期の臨床研究が行われており、これは、CD20 CAR-T細胞がB細胞NHLにおいて有望な治療の可能性を有することを示す(Brudno and Kochenderfer,Nature Reviews Clinical Oncology,15:31-46(2018)(非特許文献2))。しかし、CAR-T細胞の適用は、当然、サイトカイン放出症候群及びオンターゲットオフ腫瘍毒性などの副作用により阻まれる(Yu et al.,Molecular Cancer 18(1):125(2019)(非特許文献3))。
従って、改善されたCD20結合分子及び操作されたCD20標的指向性細胞が必要である。例えば、より効果的または効率的なCAR-T療法に使用される、安定で治療効果のある小さいサイズのCD20結合分子を開発する必要がある。
Shanehbandi et al.,Current Cancer Drug Targets,17(5):423-444(2007)
Brudno and Kochenderfer,Nature Reviews Clinical Oncology,15:31-46(2018)
Yu et al.,Molecular Cancer 18(1):125(2019)
3.概要
一態様では、以下を含む、抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される:(i)配列番号1もしくは195のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR3、(ii)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR3、(iii)配列番号1もしくは195のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR3、(iv)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR3、(v)配列番号11もしくは196のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR3、(vi)配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR3、(vii)配列番号14もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3、(viii)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR3、(ix)配列番号20もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号21のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3、(x)配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号23のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR3、(xi)配列番号24もしくは198のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号25のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号26のアミノ酸配列を含むCDR3、(xii)配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR3、(xiii)配列番号14もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3、(xiv)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR3、(xv)配列番号1もしくは195のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR3、(xvi)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR3、(xvii)配列番号20もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3、(xviii)配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR3、(xix)配列番号20もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3、(xx)配列番号20もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3、(xxi)配列番号20もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3、(xxii)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR3、(xxiii)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR3、(xxiv)配列番号165もしくは199のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号166のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号167のアミノ酸配列を含むCDR3、(xxv)配列番号168のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号169のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号170のアミノ酸配列を含むCDR3、(xxvi)配列番号171もしくは200のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号172のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号173のアミノ酸配列を含むCDR3、(xxvii)配列番号174のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号175のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号176のアミノ酸配列を含むCDR3、(xxviii)配列番号177もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号178のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号179のアミノ酸配列を含むCDR3、または(xxix)配列番号180のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号181のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号182のアミノ酸配列を含むCDR3。
一態様では、以下を含む、抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される:(i)配列番号1もしくは195のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR3、(ii)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR3、(iii)配列番号1もしくは195のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR3、(iv)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR3、(v)配列番号11もしくは196のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR3、(vi)配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR3、(vii)配列番号14もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3、(viii)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR3、(ix)配列番号20もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号21のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3、(x)配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号23のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR3、(xi)配列番号24もしくは198のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号25のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号26のアミノ酸配列を含むCDR3、(xii)配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR3、(xiii)配列番号14もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3、(xiv)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR3、(xv)配列番号1もしくは195のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR3、(xvi)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR3、(xvii)配列番号20もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3、(xviii)配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR3、(xix)配列番号20もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3、(xx)配列番号20もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3、(xxi)配列番号20もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3、(xxii)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR3、(xxiii)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR3、(xxiv)配列番号165もしくは199のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号166のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号167のアミノ酸配列を含むCDR3、(xxv)配列番号168のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号169のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号170のアミノ酸配列を含むCDR3、(xxvi)配列番号171もしくは200のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号172のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号173のアミノ酸配列を含むCDR3、(xxvii)配列番号174のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号175のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号176のアミノ酸配列を含むCDR3、(xxviii)配列番号177もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号178のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号179のアミノ酸配列を含むCDR3、または(xxix)配列番号180のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号181のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号182のアミノ酸配列を含むCDR3。
別の態様では、以下を含む、抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される:(i)配列番号41に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(ii)配列番号42に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(iii)配列番号43に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(iv)配列番号44に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(v)配列番号45に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(vi)配列番号46に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(vii)配列番号47に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(viii)配列番号48に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(ix)配列番号49に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(x)配列番号50に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(xi)配列番号51に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(xii)配列番号52に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(xiii)配列番号53に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(xiv)配列番号54に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(xv)配列番号55に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(xvi)配列番号56に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(xvii)配列番号57に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(xviii)配列番号58に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(xix)配列番号59に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(xx)配列番号60に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(xxi)配列番号61に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(xxii)配列番号62に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、または、(xxiii)配列番号63に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(xxiv)配列番号183に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、(xxv)配列番号184に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、または、(xxvi)配列番号185に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3。
いくつかの実施形態では、CDR1、CDR2、またはCDR3は、Kabatナンバリングスキーム、IMGTナンバリングスキーム、AbMナンバリングスキーム、Chothiaナンバリングスキーム、Contactナンバリングスキーム、またはそれらの組み合わせに従って決定される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗CD20 sdAbは、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号183、配列番号184、及び/または配列番号185に記載の1つ以上のFR領域をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗CD20 sdAbは、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号183、配列番号184、または配列番号185のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、本明細書で提供される抗CD20 sdAbは、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号183、配列番号184、または配列番号185の配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、抗CD20 sdAbは、ラクダ科動物sdAbである。いくつかの実施形態では、抗CD20 sdAbは、ヒト化sdAbである。いくつかの実施形態では、抗CD20 sdAbは、VHHドメインである。いくつかの実施形態では、抗CD20 sdAbは、ヒト化VHHドメインである。
いくつかの実施形態では、抗CD20 sdAbは、薬剤に、遺伝子的に融合または化学的にコンジュゲートされる。
別の態様では、のは、(a)本明細書で提供される抗CD20 sdAbを含む細胞外抗原結合ドメイン、(b)膜貫通ドメイン、及び(c)細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むキメラ抗原受容体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、1つ以上の追加の抗原結合ドメイン(複数可)をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、1つの追加の抗原結合ドメインをさらに含む。他の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、2つの追加の抗原結合ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の追加の抗原結合ドメイン(複数可)は、CD20、CD19、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3、及び糖脂質F77からなる群より選択される1つ以上の抗原(複数可)に結合する。いくつかの実施形態では、CD20 CARは、単一特異性である。いくつかの実施形態では、CD20 CARは、一価である。いくつかの実施形態では、CD20 CARは、多価である。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、本明細書で提供される少なくとも2つの抗CD20 sdAbを含む。
いくつかの実施形態では、(a)CD20に特異的に結合する2つ以上の単一ドメイン抗体(sdAb)を含む細胞外抗原結合ドメイン、(b)膜貫通ドメイン、及び(c)細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むポリペプチドを含む多価(例えば、二価及び三価)のCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、本明細書で提供されるCD20に特異的に結合する2つの単一ドメイン抗体(sdAb)を含む。他の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、本明細書で提供されるCD20に特異的に結合する3つの単一ドメイン抗体(sdAb)を含む。
上記のCARのいずれか1つによるいくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152、及びPD1からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、CD8αに由来する。
上記のCARのいずれか1つによるいくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζに由来する。
上記のCARのいずれか1つによる他の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83のリガンド及びその組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、CD137に由来する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるCARは、細胞外抗原結合ドメインのC末端と膜貫通ドメインのN末端との間に位置するヒンジドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、CD8αに由来する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるCARは、ポリペプチドのN末端に位置するシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、CD8αに由来する。
特定の実施形態では、(i)配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号189、配列番号190、及び配列番号191からなる群より選択されるアミノ酸配列、または、(ii)配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号189、配列番号190、もしくは配列番号191の配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むキメラ抗原受容体(CAR)が本明細書で提供される。
別の態様では、本明細書で提供される抗CD20 sdAbをコードする核酸配列を含む単離核酸が本明細書で提供される。別の態様では、本明細書で提供される抗CD20 sdAbをコードする核酸を含むベクターが本明細書で提供される。
さらに別の態様では、本明細書で提供されるCARをコードする核酸配列を含む単離核酸が本明細書で提供される。別の態様では、本明細書で提供されるCARをコードする核酸を含むベクターが本明細書で提供される。
さらに別の態様では、本明細書で提供されるCAR、単離核酸、またはベクターを含む、操作された免疫エフェクター細胞が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、T細胞またはB細胞である。
別の態様では、抗CD20 sdAb、操作された免疫エフェクター細胞、または本明細書で提供されるベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が、本明細書で提供される。
さらに別の態様では、対象の疾患または障害を処置する方法が本明細書で提供され、方法は、有効量の本明細書で提供される抗CD20 sdAb、操作された免疫エフェクター細胞、または医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、B細胞関連疾患もしくは障害及び/またはCD20関連疾患もしくは障害である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、がんである。他の実施形態では、疾患または障害は、B細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、B細胞悪性腫瘍は、B細胞白血病またはB細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、辺縁帯リンパ腫(例えば、脾辺縁帯リンパ腫)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、原発性中枢神経系(CNS)リンパ腫、原発性縦隔B細胞リンパ腫(PMBL)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、B細胞前リンパ球性白血病(B-PLL)、濾胞性リンパ腫(FL)、バーキットリンパ腫、原発性眼内リンパ腫、慢性リンパ球性白血病(CLL)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、有毛細胞白血病(HCL)、前駆Bリンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫(NHL)、高悪性度B細胞リンパ腫(HGBL)、及び多発性骨髄腫(MM)からなる群より選択される。他の実施形態では、疾患または障害は、自己免疫及び/または炎症性疾患である。いくつかの実施形態では、自己免疫及び/または炎症性疾患は、不適切なまたは増加したB細胞数及び/または活性化と関連する。
4.図面の簡単な説明
VHHベースのCAR-T細胞の例示的な形質導入効率を示す。UnTは、CARで形質導入されていないT細胞を指す。
scFvベースのCAR-T細胞の例示的な形質導入効率を示す。UnTは、CARで形質導入されていないT細胞を指す。
CD20陽性細胞株(図2A~2B及び図2E~2F)またはCD20陰性細胞株(図2C~2D)に対する、scFvベースのCAR-T細胞と比較した、VHHベースのCAR-T細胞のin vitro細胞傷害性を示す。
CD20陽性細胞株(図2A~2B及び図2E~2F)またはCD20陰性細胞株(図2C~2D)に対する、scFvベースのCAR-T細胞と比較した、VHHベースのCAR-T細胞のin vitro細胞傷害性を示す。
CD20陽性細胞株(図2A~2B及び図2E~2F)またはCD20陰性細胞株(図2C~2D)に対する、scFvベースのCAR-T細胞と比較した、VHHベースのCAR-T細胞のin vitro細胞傷害性を示す。
CD20陽性細胞株(図2A~2B及び図2E~2F)またはCD20陰性細胞株(図2C~2D)に対する、scFvベースのCAR-T細胞と比較した、VHHベースのCAR-T細胞のin vitro細胞傷害性を示す。
CD20陽性細胞株(図2A~2B及び図2E~2F)またはCD20陰性細胞株(図2C~2D)に対する、scFvベースのCAR-T細胞と比較した、VHHベースのCAR-T細胞のin vitro細胞傷害性を示す。
CD20陽性細胞株(図2A~2B及び図2E~2F)またはCD20陰性細胞株(図2C~2D)に対する、scFvベースのCAR-T細胞と比較した、VHHベースのCAR-T細胞のin vitro細胞傷害性を示す。
CD20陽性細胞株(図3A~3B)またはCD20陰性細胞株(図3C~3D)に対するCD20 scFv CAR-T細胞と比較した、モノ-、バイ-、及びトリ-VHH CAR-T細胞のin vitro細胞傷害性を示す。
CD20陽性細胞株(図3A~3B)またはCD20陰性細胞株(図3C~3D)に対するCD20 scFv CAR-T細胞と比較した、モノ-、バイ-、及びトリ-VHH CAR-T細胞のin vitro細胞傷害性を示す。
CD20陽性細胞株(図3A~3B)またはCD20陰性細胞株(図3C~3D)に対するCD20 scFv CAR-T細胞と比較した、モノ-、バイ-、及びトリ-VHH CAR-T細胞のin vitro細胞傷害性を示す。
CD20陽性細胞株(図3A~3B)またはCD20陰性細胞株(図3C~3D)に対するCD20 scFv CAR-T細胞と比較した、モノ-、バイ-、及びトリ-VHH CAR-T細胞のin vitro細胞傷害性を示す。
Raji.Luc細胞に対する異なる長さのペプチドリンカーを有するバイ-VHH CAR-T細胞のin vitro細胞傷害性を示す。
Raji.Luc細胞に対する異なる長さのペプチドリンカーを有するバイ-VHH CAR-T細胞のin vitro細胞傷害性を示す。
異なるE:T比でのRaji.LucまたはK562-CD20.Luc細胞との24時間の共培養後のscFvベースのCAR-T細胞と比較した、VHHベースのCAR-T細胞のIFN-γ放出レベルを示す。
異なるE:T比でのRaji.LucまたはK562-CD20.Luc細胞との24時間の共培養後のscFvベースのCAR-T細胞と比較した、VHHベースのCAR-T細胞のIFN-γ放出レベルを示す。
Raji.LucまたはK562.Luc細胞と24時間共培養した後の、CD20 scFv CAR-T細胞と比較した、モノ-、バイ-、及びトリ-VHH CAR-T細胞のIFN-γ放出レベルを示す。
抗原特異的刺激を伴うまたは伴わないCD20 scFv CAR-T細胞と比較した、例示的なCD20 VHH CAR-T細胞の増殖能力及びCAR陽性率を示す。
抗原特異的刺激を伴うまたは伴わないCD20 scFv CAR-T細胞と比較した、例示的なCD20 VHH CAR-T細胞の増殖能力及びCAR陽性率を示す。
抗原特異的刺激を伴うまたは伴わないCD20 scFv CAR-T細胞と比較した、例示的なCD20 VHH CAR-T細胞の増殖能力及びCAR陽性率を示す。
抗原特異的刺激を伴うまたは伴わないCD20 scFv CAR-T細胞と比較した、例示的なCD20 VHH CAR-T細胞の増殖能力及びCAR陽性率を示す。
例示的なCD20 VHH CAR-T細胞及びCD20 scFv CAR-T細胞の疲弊マーカー評価の結果を示す。
例示的なCD20 VHH CAR-T細胞及びCD20 scFv CAR-T細胞のメモリーマーカー評価の結果を示す。
例示的なCD20 VHH CAR-T細胞及びCD20 scFv CAR-T細胞のメモリーマーカー評価の結果を示す。
例示的なCD20 VHH CAR-T細胞及びCD20 scFv CAR-T細胞のメモリーマーカー評価の結果を示す。
例示的なCD20 VHH CAR-T細胞及びCD20 scFv CAR-T細胞のメモリーマーカー評価の結果を示す。
Raji異種移植片NCGマウスモデルにおけるVHH-273 CAR-T細胞及びVHH-496 CAR-T細胞のin vivoでの抗腫瘍及び再免疫効果を示す。マウスを定期的に評価して、生物発光イメージング(図10A~10B)、及び体重(図10C)、ならびにマウス末梢血中のCARコピー(図10D)で腫瘍成長を監視した。次に、再免疫アッセイのために、少なくとも5週間腫瘍がなく、PBMCでCARコピー数(ゲノムDNAのコピー/ng)が検出されないマウスを再免疫アッセイ選択した。Raji腫瘍を、生物発光イメージングで週1回監視し(図10E)、マウスの体重を測定した(図10F)。
Raji異種移植片NCGマウスモデルにおけるVHH-273 CAR-T細胞及びVHH-496 CAR-T細胞のin vivoでの抗腫瘍及び再免疫効果を示す。マウスを定期的に評価して、生物発光イメージング(図10A~10B)、及び体重(図10C)、ならびにマウス末梢血中のCARコピー(図10D)で腫瘍成長を監視した。次に、再免疫アッセイのために、少なくとも5週間腫瘍がなく、PBMCでCARコピー数(ゲノムDNAのコピー/ng)が検出されないマウスを再免疫アッセイ選択した。Raji腫瘍を、生物発光イメージングで週1回監視し(図10E)、マウスの体重を測定した(図10F)。
Raji異種移植片NCGマウスモデルにおけるVHH-273 CAR-T細胞及びVHH-496 CAR-T細胞のin vivoでの抗腫瘍及び再免疫効果を示す。マウスを定期的に評価して、生物発光イメージング(図10A~10B)、及び体重(図10C)、ならびにマウス末梢血中のCARコピー(図10D)で腫瘍成長を監視した。次に、再免疫アッセイのために、少なくとも5週間腫瘍がなく、PBMCでCARコピー数(ゲノムDNAのコピー/ng)が検出されないマウスを再免疫アッセイ選択した。Raji腫瘍を、生物発光イメージングで週1回監視し(図10E)、マウスの体重を測定した(図10F)。
Raji異種移植片NCGマウスモデルにおけるVHH-273 CAR-T細胞及びVHH-496 CAR-T細胞のin vivoでの抗腫瘍及び再免疫効果を示す。マウスを定期的に評価して、生物発光イメージング(図10A~10B)、及び体重(図10C)、ならびにマウス末梢血中のCARコピー(図10D)で腫瘍成長を監視した。次に、再免疫アッセイのために、少なくとも5週間腫瘍がなく、PBMCでCARコピー数(ゲノムDNAのコピー/ng)が検出されないマウスを再免疫アッセイ選択した。Raji腫瘍を、生物発光イメージングで週1回監視し(図10E)、マウスの体重を測定した(図10F)。
Raji異種移植片NCGマウスモデルにおけるVHH-273 CAR-T細胞及びVHH-496 CAR-T細胞のin vivoでの抗腫瘍及び再免疫効果を示す。マウスを定期的に評価して、生物発光イメージング(図10A~10B)、及び体重(図10C)、ならびにマウス末梢血中のCARコピー(図10D)で腫瘍成長を監視した。次に、再免疫アッセイのために、少なくとも5週間腫瘍がなく、PBMCでCARコピー数(ゲノムDNAのコピー/ng)が検出されないマウスを再免疫アッセイ選択した。Raji腫瘍を、生物発光イメージングで週1回監視し(図10E)、マウスの体重を測定した(図10F)。
Raji異種移植片NCGマウスモデルにおけるVHH-273 CAR-T細胞及びVHH-496 CAR-T細胞のin vivoでの抗腫瘍及び再免疫効果を示す。マウスを定期的に評価して、生物発光イメージング(図10A~10B)、及び体重(図10C)、ならびにマウス末梢血中のCARコピー(図10D)で腫瘍成長を監視した。次に、再免疫アッセイのために、少なくとも5週間腫瘍がなく、PBMCでCARコピー数(ゲノムDNAのコピー/ng)が検出されないマウスを再免疫アッセイ選択した。Raji腫瘍を、生物発光イメージングで週1回監視し(図10E)、マウスの体重を測定した(図10F)。
Raji異種移植片NCGマウスモデルにおけるモノ-、バイ-、及びトリ-VHH CAR-T細胞のin vivoでの抗腫瘍及び再免疫効果を示す。マウスを定期的に評価して、生物発光イメージング(図11A~11B)、及び体重(図11C)、ならびにマウス末梢血中のCARコピー(図11D~11E;図11Dが図11Eから採用され、Y軸のスケールは、コピー/ngのゲノムDNAの解像度を高めるために調整される)で腫瘍成長を監視した。次に、再免疫アッセイのために、少なくとも6週間腫瘍のないマウスを選択した。Raji腫瘍を、生物発光イメージングで週1回監視した(図11F)。
Raji異種移植片NCGマウスモデルにおけるモノ-、バイ-、及びトリ-VHH CAR-T細胞のin vivoでの抗腫瘍及び再免疫効果を示す。マウスを定期的に評価して、生物発光イメージング(図11A~11B)、及び体重(図11C)、ならびにマウス末梢血中のCARコピー(図11D~11E;図11Dが図11Eから採用され、Y軸のスケールは、コピー/ngのゲノムDNAの解像度を高めるために調整される)で腫瘍成長を監視した。次に、再免疫アッセイのために、少なくとも6週間腫瘍のないマウスを選択した。Raji腫瘍を、生物発光イメージングで週1回監視した(図11F)。
Raji異種移植片NCGマウスモデルにおけるモノ-、バイ-、及びトリ-VHH CAR-T細胞のin vivoでの抗腫瘍及び再免疫効果を示す。マウスを定期的に評価して、生物発光イメージング(図11A~11B)、及び体重(図11C)、ならびにマウス末梢血中のCARコピー(図11D~11E;図11Dが図11Eから採用され、Y軸のスケールは、コピー/ngのゲノムDNAの解像度を高めるために調整される)で腫瘍成長を監視した。次に、再免疫アッセイのために、少なくとも6週間腫瘍のないマウスを選択した。Raji腫瘍を、生物発光イメージングで週1回監視した(図11F)。
Raji異種移植片NCGマウスモデルにおけるモノ-、バイ-、及びトリ-VHH CAR-T細胞のin vivoでの抗腫瘍及び再免疫効果を示す。マウスを定期的に評価して、生物発光イメージング(図11A~11B)、及び体重(図11C)、ならびにマウス末梢血中のCARコピー(図11D~11E;図11Dが図11Eから採用され、Y軸のスケールは、コピー/ngのゲノムDNAの解像度を高めるために調整される)で腫瘍成長を監視した。次に、再免疫アッセイのために、少なくとも6週間腫瘍のないマウスを選択した。Raji腫瘍を、生物発光イメージングで週1回監視した(図11F)。
Raji異種移植片NCGマウスモデルにおけるモノ-、バイ-、及びトリ-VHH CAR-T細胞のin vivoでの抗腫瘍及び再免疫効果を示す。マウスを定期的に評価して、生物発光イメージング(図11A~11B)、及び体重(図11C)、ならびにマウス末梢血中のCARコピー(図11D~11E;図11Dが図11Eから採用され、Y軸のスケールは、コピー/ngのゲノムDNAの解像度を高めるために調整される)で腫瘍成長を監視した。次に、再免疫アッセイのために、少なくとも6週間腫瘍のないマウスを選択した。Raji腫瘍を、生物発光イメージングで週1回監視した(図11F)。
Raji異種移植片NCGマウスモデルにおけるモノ-、バイ-、及びトリ-VHH CAR-T細胞のin vivoでの抗腫瘍及び再免疫効果を示す。マウスを定期的に評価して、生物発光イメージング(図11A~11B)、及び体重(図11C)、ならびにマウス末梢血中のCARコピー(図11D~11E;図11Dが図11Eから採用され、Y軸のスケールは、コピー/ngのゲノムDNAの解像度を高めるために調整される)で腫瘍成長を監視した。次に、再免疫アッセイのために、少なくとも6週間腫瘍のないマウスを選択した。Raji腫瘍を、生物発光イメージングで週1回監視した(図11F)。
抗CD20 VHH-huIgG1Fc mAbの結合親和性を評価する研究からの結果を示す。MFI=平均蛍光強度。
抗CD20 VHH-huIgG1Fc mAbの結合親和性を評価する研究からの結果を示す。MFI=平均蛍光強度。
抗CD20 VHH-huIgG1Fc mAbの結合親和性を評価する研究からの結果を示す。MFI=平均蛍光強度。
抗CD20 VHH-huIgG1Fc mAbの結合親和性を評価する研究からの結果を示す。MFI=平均蛍光強度。
抗CD20 VHH-huIgG1Fc mAbの結合親和性を評価する研究からの結果を示す。MFI=平均蛍光強度。
15:1、10:1、5:1、または2.5:1の異なるエフェクター細胞対標的細胞比(E:T)のRaji.Luc細胞、K652-CD20.Luc細胞、K562.Luc細胞、及びNalm.6.Lucに対する例示的なヒト化CD20 VHH CAR-Tの細胞傷害性を示す。huVHH-746 CAR-T細胞、huVHH-750 CAR-T細胞、及びhuVHH-753 CAR-T細胞の細胞傷害性を示す。
15:1、10:1、5:1、または2.5:1の異なるエフェクター細胞対標的細胞比(E:T)のRaji.Luc細胞、K652-CD20.Luc細胞、K562.Luc細胞、及びNalm.6.Lucに対する例示的なヒト化CD20 VHH CAR-Tの細胞傷害性を示す。huVHH-746 CAR-T細胞、huVHH-750 CAR-T細胞、及びhuVHH-753 CAR-T細胞の細胞傷害性を示す。
15:1、10:1、5:1、または2.5:1の異なるエフェクター細胞対標的細胞比(E:T)のRaji.Luc細胞、K652-CD20.Luc細胞、K562.Luc細胞、及びNalm.6.Lucに対する例示的なヒト化CD20 VHH CAR-Tの細胞傷害性を示す。huVHH-746 CAR-T細胞、huVHH-750 CAR-T細胞、及びhuVHH-753 CAR-T細胞の細胞傷害性を示す。
15:1、10:1、5:1、または2.5:1の異なるエフェクター細胞対標的細胞比(E:T)のRaji.Luc細胞、K652-CD20.Luc細胞、K562.Luc細胞、及びNalm.6.Lucに対する例示的なヒト化CD20 VHH CAR-Tの細胞傷害性を示す。huVHH-253 CAR-T細胞及びhuVHH-256 CAR-T細胞の細胞傷害性を示す。
15:1、10:1、5:1、または2.5:1の異なるエフェクター細胞対標的細胞比(E:T)のRaji.Luc細胞、K652-CD20.Luc細胞、K562.Luc細胞、及びNalm.6.Lucに対する例示的なヒト化CD20 VHH CAR-Tの細胞傷害性を示す。huVHH-253 CAR-T細胞及びhuVHH-256 CAR-T細胞の細胞傷害性を示す。
15:1、10:1、5:1、または2.5:1の異なるエフェクター細胞対標的細胞比(E:T)のRaji.Luc細胞、K652-CD20.Luc細胞、K562.Luc細胞、及びNalm.6.Lucに対する例示的なヒト化CD20 VHH CAR-Tの細胞傷害性を示す。huVHH-253 CAR-T細胞及びhuVHH-256 CAR-T細胞の細胞傷害性を示す。
15:1、10:1、5:1、または2.5:1の異なるエフェクター細胞対標的細胞比(E:T)のRaji.Luc細胞、K652-CD20.Luc細胞、K562.Luc細胞、及びNalm.6.Lucに対する例示的なヒト化CD20 VHH CAR-Tの細胞傷害性を示す。huVHH-253 CAR-T細胞及びhuVHH-256 CAR-T細胞の細胞傷害性を示す。
15:1、10:1、5:1、または2.5:1の異なるエフェクター細胞対標的細胞比(E:T)のRaji.Luc細胞、K652-CD20.Luc細胞、K562.Luc細胞、及びNalm.6.Lucに対する例示的なヒト化CD20 VHH CAR-Tの細胞傷害性を示す。huVHH-260 CAR-T細胞の細胞傷害性を示す。
15:1、10:1、5:1、または2.5:1の異なるエフェクター細胞対標的細胞比(E:T)のRaji.Luc細胞、K652-CD20.Luc細胞、K562.Luc細胞、及びNalm.6.Lucに対する例示的なヒト化CD20 VHH CAR-Tの細胞傷害性を示す。huVHH-260 CAR-T細胞の細胞傷害性を示す。
15:1、10:1、5:1、または2.5:1の異なるエフェクター細胞対標的細胞比(E:T)のRaji.Luc細胞、K652-CD20.Luc細胞、K562.Luc細胞、及びNalm.6.Lucに対する例示的なヒト化CD20 VHH CAR-Tの細胞傷害性を示す。huVHH-260 CAR-T細胞の細胞傷害性を示す。
15:1、10:1、5:1、または2.5:1の異なるエフェクター細胞対標的細胞比(E:T)のRaji.Luc細胞、K652-CD20.Luc細胞、K562.Luc細胞、及びNalm.6.Lucに対する例示的なヒト化CD20 VHH CAR-Tの細胞傷害性を示す。huVHH-260 CAR-T細胞の細胞傷害性を示す。
5.詳細な説明
本開示は、部分的には、CD20、キメラ抗原受容体、またはそれを含む操作された細胞に結合する新規単一ドメイン抗体(例えば、VHHドメイン)、及びそれらの改善された特性に基づく。
本開示は、部分的には、CD20、キメラ抗原受容体、またはそれを含む操作された細胞に結合する新規単一ドメイン抗体(例えば、VHHドメイン)、及びそれらの改善された特性に基づく。
5.1.定義
本明細書に記載または参照される手法及び手順は、例えば、当業者らによる通常の方法論、例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3d ed.2001);Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.eds.,2003);Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic(An ed.2009);Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols(Albitar ed.2010);及びAntibody Engineering Vols 1 and 2(Kontermann and Dubel eds.,2d ed.2010)に記載の幅広く利用された方法論などを使用して、一般に十分に理解及び/または一般に用いられるものを含む。本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者らにより一般に理解される意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の用語の説明が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は、複数形も含み、その逆も同様である。記載の用語のいずれかの説明が、参照により本明細書に組み込まれるいずれかの文書と矛盾する場合は、以下に記載の用語の説明が優先されるものとする。
本明細書に記載または参照される手法及び手順は、例えば、当業者らによる通常の方法論、例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3d ed.2001);Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.eds.,2003);Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic(An ed.2009);Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols(Albitar ed.2010);及びAntibody Engineering Vols 1 and 2(Kontermann and Dubel eds.,2d ed.2010)に記載の幅広く利用された方法論などを使用して、一般に十分に理解及び/または一般に用いられるものを含む。本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者らにより一般に理解される意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の用語の説明が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は、複数形も含み、その逆も同様である。記載の用語のいずれかの説明が、参照により本明細書に組み込まれるいずれかの文書と矛盾する場合は、以下に記載の用語の説明が優先されるものとする。
「抗体」、「免疫グロブリン」、または「Ig」という用語は、本明細書では互換的に使用され、最も広い意味で使用され、具体的には、例えば、モノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、中和抗体、全長またはインタクトモノクローナル抗体を含む)、ポリエピトープまたはモノエピトープ特異性を有する抗体組成物、ポリクローナルまたは一価抗体、多価抗体、多重特異性抗体(例えば、所望の生物学的活性を示す限り、二重特異性抗体)を網羅し、以下に記載されるように、少なくとも2つのインタクト抗体、単鎖抗体、及びそのフラグメント(例えば、ドメイン抗体)から形成される。抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、及び/または親和性成熟、ならびに他の種、例えば、マウス、ウサギ、ラマなどに由来する抗体であり得る。「抗体」という用語は、特定の分子抗原に結合することができ、ポリペプチド鎖の2つの同一のペアから構成されるポリペプチドの免疫グロブリンクラス内のB細胞のポリペプチド産物を含むことが意図され、各ペアが、1つの重鎖(約50~70kDa)及び1つの軽鎖(約25kDa)であり、各鎖の各アミノ末端部分が、約100~約130またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含み、各鎖の各カルボキシ末端部分が、定常領域を含む。例えば、以下を参照:Antibody Engineering(Borrebaeck ed.,2d ed.1995);及びKuby,Immunology(3d ed.1997)。抗体は、合成抗体、組み換え産生抗体、ラクダ科種(例えば、ラマもしくはアルパカ)またはそれらのヒト化バリアントを含む単一ドメイン抗体、イントラボディ、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、及び上のいずれかの機能的フラグメント(例えば、抗原結合フラグメント)も含むが、これらに限定されず、これは、フラグメントが由来する抗体の結合活性の一部または全部を保持する抗体の重鎖または軽鎖ポリペプチドの一部を指す。機能的フラグメント(例えば、抗原結合フラグメント)の非限定例としては、単鎖Fv(scFv)(例えば、単一特異性、二重特異性などを含む)、Fabフラグメント、F(ab’)フラグメント、F(ab)2フラグメント、F(ab’)2フラグメント、ジスルフィド連結Fv(dsFv)、Fdフラグメント、Fvフラグメント、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及びミニボディが挙げられる。特に、本明細書で提供される抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、抗原結合ドメインまたは抗原に結合する抗原結合部位を含む分子(例えば、抗体の1つ以上のCDR)を含有する。そのような抗体フラグメントは、例えば、以下に見出すことができる:Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(1989);Mol.Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference(Myers ed.,1995);Huston et al.,1993,Cell Biophysics 22:189-224;Pluckthun and Skerra,1989,Meth.Enzymol.178:497-515;及びDay,Advanced Immunochemistry(2d ed.1990)。本明細書で提供される抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、及びIgA)または任意のサブクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)のものであり得る。抗体は、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体であってよい。抗体は、アゴニストでもアンタゴニストでもないことがある。
「抗原」は、抗体が選択的に結合できる構造である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、または他の天然に存在するまたは合成化合物であってよい。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ポリペプチドである。特定の実施形態では、抗原は、細胞と会合し、例えば、細胞上または細胞内に存在する。
「インタクト」抗体は、抗原結合部位ならびにCL及び少なくとも重鎖定常領域、CH1、CH2及びCH3を含むものである。定常領域は、ヒト定常領域またはそのアミノ酸配列バリアントを含んでもよい。特定の実施形態では、インタクト抗体は、1つ以上のエフェクター機能を有する。
「sFv」または「scFv」とも略される「単鎖Fv」は、単一のポリペプチド鎖に連結されたVH及びVL抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。好ましくは、sFvポリペプチドは、さらに、VHドメイン及びVLドメイン間にポリペプチドリンカーを含み、これにより、sFvが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能になる。sFvのレビューについては、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)を参照のこと。
「重鎖のみの抗体」または「HCAb」という用語は、重鎖を含むが、4鎖抗体に通常見られる軽鎖を欠く機能的抗体を指す。ラクダ科動物(例えば、ラクダ、ラマ、またはアルパカ)は、HCAbを生成することが知られる。
本明細書で使用される「単一ドメイン抗体」または「sdAb」は、単一の単量体可変抗体ドメインを指し、これは、抗原結合が可能である(例えば、CD20に結合する単一ドメイン抗体)。単一ドメイン抗体は、本明細書に記載のVHHドメインを含む。単一ドメイン抗体の例としては、ラクダ科種(例えば、ラマ)由来のものなどの軽鎖を天然に欠く抗体、従来の4鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体、及び抗体由来のもの以外の単一ドメイン骨格が挙げられるが、これらに限定されない。単一ドメイン抗体は、限定されないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、及びウシを含む任意の種に由来し得る。例えば、単一ドメイン抗体は、本明細書に記載されるように、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、及びグアナコなどのラクダ科種で生じた抗体に由来することができる。ラクダ科以外の他の種は、軽鎖を天然に欠く重鎖抗体を産生し得、そのような他の種に由来するVHHは、本開示の範囲内である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体(例えば、VHH)は、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の構造を有する。単一ドメイン抗体は、本明細書に記載の別の分子(例えば、薬剤)に遺伝的に融合または化学的にコンジュゲートさせてもよい。単一ドメイン抗体は、より大きな結合分子(例えば、多重特異性抗体またはキメラ抗原受容体)の一部であってよい。
「結合」または「結合」という用語は、例えば、複合体を形成することを含む、分子間の相互作用を指す。相互作用は、例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、及び/またはファンデルワールス相互作用を含む非共有相互作用であり得る。複合体は、共有もしくは非共有結合、相互作用、または力により一緒に保持された2つ以上の分子の結合も含み得る。抗体上の単一の抗原結合部位と、抗原などの標的分子の単一エピトープとの間の全非共有相互作用の強度は、そのエピトープに対する抗体または機能的フラグメントの親和性である。結合分子(例えば、抗体)対一価抗原の、解離速度(koff)対結合速度(kon)の比(koff/kon)は、解離定数KDであり、これは、親和性に反比例する。KD値が低いほど、抗体の親和性が高くなる。KDの値は、抗体及び抗原の複合体により異なり、kon及びkoffの両方に依存する。本明細書で提供される抗体の解離定数KDは、本明細書で提供される任意の方法または当業者らに周知の任意の他の方法を使用して決定することができる。1つの結合部位での親和性は、抗体及び抗原間の相互作用の真の強さを常に反映しない。多価抗原などの複数の繰り返し抗原決定基を含有する複合抗原が、複数の結合部位を含有する抗体と接触する場合、1つの部位での抗体と抗原の相互作用により、2番目の部位での反応の可能性が増加するであろう。そのような多価抗体及び抗原間の複数の相互作用の強さは結合力と呼ばれる。
本明細書に記載の結合分子に関連して、「に結合する」、「に特異的に結合する」などの用語、及び類似の用語も本明細書では互換的に使用され、抗原、例えば、ポリペプチド、に特異的に結合する抗原結合ドメインの結合分子を指す。抗原に結合するか、または特異的に結合する結合分子または抗原結合ドメインは、例えば、イムノアッセイ、Octet(登録商標)、Biacore(登録商標)、または当業者らに既知の他の手法により同定することができる。いくつかの実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、任意の交差反応性抗原よりも高い親和性(ラジオイムノアッセイ(RIA)及び酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)などの実験手法を使用して測定)で抗原に結合する場合、抗原に結合または特異的に結合する。通常、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドのシグナルまたはノイズの少なくとも2倍であり、バックグラウンドの10倍を超える場合もある。結合特異性に関する考察については、例えば、を参照:Fundamental Immunology332-36(Paul ed.,2ded.1989)。特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインの「非標的」タンパク質への結合の程度は、例えば、蛍光活性化細胞選別(FACS)分析またはRIAで決定される場合、結合分子または抗原結合ドメインの、その特定の標的抗原への結合の約10%未満である。抗原に結合する結合分子または抗原結合ドメインは、結合分子が、例えば、抗原を標的とする治療薬及び/または診断薬として有用であるように、十分な親和性で抗原に結合可能なものを含む。特定の実施形態では、抗原に結合する結合分子または抗原結合ドメインは、1μM、800nM、600nM、550nM、500nM、300nM、250nM、100nM、50nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、または0.1nM以下の解離定数(KD)を有する。特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、異なる種由来の抗原間で保存されている抗原のエピトープに結合する。
特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、重鎖及び/または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である「キメラ」配列を含み得るが、所望の生物学的活性を示す限り、鎖(複数可)の残りの部分は、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにそのような抗体のフラグメントの対応する配列と同一または相同である(以下を参照:米国特許第4,816,567号;及びMorrison et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-55)。キメラ配列は、ヒト化配列を含んでもよい。
特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、ヒト免疫グロブリン(例えば、レシピエント抗体)由来の配列を含む非ヒト(例えば、ラクダ科動物、マウス、非ヒト霊長類)抗体の「ヒト化」形態の部分を含み得、天然のCDR残基は、非ヒト種(例えば、ドナー抗体)、例えば、ラクダ科動物、マウス、ラット、ウサギ、または所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト哺乳類動物の対応するCDR由来の残基で置換される。いくつかの場合では、ヒト免疫グロブリン配列の1つ以上のFR領域残基が、対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含み得る。これらの修飾は、さらに、抗体の性能を向上させるために行われる。ヒト化抗体の重鎖または軽鎖は、少なくとも1つ以上の可変領域の実質的に全てを含み得、CDRの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FRの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のものである。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域(Fc)、通常、ヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含むであろう。さらなる詳細については、Jones et al.,Nature 321:522-25(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323-29(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-96(1992);Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-89(1992);米国特許第6,800,738号;同第6,719,971号;同第6,639,055号;同第6,407,213号;及び同第6,054,297号を参照のこと。
特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、「完全ヒト抗体」または「ヒト抗体」の一部を含み得、用語は、本明細書では互換的に使用され、ヒト可変領域、例えば、ヒト定常領域を含む抗体を指す。結合分子は、単一ドメイン抗体配列を含んでもよい。特定の実施形態では、用語は、ヒト起源の可変領域及び定常領域を含む抗体を指す。特定の実施形態では、「完全ヒト」抗体は、ポリペプチドに結合し、ヒト生殖系列免疫グロブリン核酸配列の天然に存在する体細胞バリアントである核酸配列にコードされる抗体も包含し得る。「完全ヒト抗体」という用語は、Kabat et al.に記載されるヒト生殖系列免疫グロブリンに対応する可変及び定常領域を有する抗体を含む(Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242を参照)。「ヒト抗体」は、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列に対応するものを有し、及び/またはヒト抗体を作製するための手法のいずれかを使用して作製されているものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー(Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991);Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581(1991))及び酵母ディスプレイライブラリー(Chao et al.,Nature Protocols 1:755-68(2006))を含む、当該技術分野で既知の様々な手法を使用して産生することができる。さらに、Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77(1985);Boerner et al.,J.Immunol.147(1):86-95(1991);及びvan Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)に記載の方法が、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である。ヒト抗体は、抗原投与に応答して、そのような抗体を産生するように改変されているが、その内因性遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物、例えば、マウス、に抗原を投与することにより調製することができる(例えば、Jakobovits,Curr.Opin.Biotechnol.6(5):561-66(1995);Bruggemann and Taussing,Curr.Opin.Biotechnol.8(4):455-58(1997);ならびに、XENOMOUSE(商標)技術に関しては、米国特許第6,075,181号及び同第6,150,584号)。例えば、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体に関しては、Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:3557-62(2006)も参照のこと。
特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、「組み換えヒト抗体」の一部を含み得、この表現は、組み換え手段により調製、発現、作成、または単離されるヒト抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを使用して発現される抗体、組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニック及び/またはトランス染色体である動物(例えば、マウスもしくはウシ)から単離された抗体(例えば、Taylor,L.D.et al.,Nucl.Acids Res.20:6287-6295(1992)を参照)、または、他のDNA配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の他の手段で調製、発現、作製、もしくは単離された抗体、を含む。そのような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有し得る(Kabat,E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242を参照)。しかし、特定の実施形態では、そのような組み換えヒト抗体は、in vitro変異導入(または、ヒトIg配列についてトランスジェニックな動物が使用される場合、in vivo体細胞変異導入)を実施され、従って、組み換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VH及びVL配列に由来及び関連しているが、in vivoでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在しないことがある配列である。
特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、「モノクローナル抗体」の一部を含み得、本明細書で使用される用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、例えば、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能な天然に存在する変異、または周知の翻訳後修飾、例えば、アミノ酸イオメリゼーションまたは脱アミド化、メチオニン酸化またはアスパラギンもしくはグルタミン脱アミド化を除いて同一であり、各モノクローナル抗体は、通常、抗原上の単一のエピトープを認識するであろう。特定の実施形態では、本明細書で使用される「モノクローナル抗体」は、単一のハイブリドーマまたは他の細胞により産生される抗体である。「モノクローナル」という用語は、抗体を作製する特定の方法に限定されない。例えば、本開示において有用なモノクローナル抗体は、Kohler et al.,Nature 256:495(1975)に最初に記載されたハイブリドーマ方法論で調製されても、細菌または真核動物または植物細胞における組み換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号を参照)を使用して作製されてもよい。「モノクローナル抗体」は、また、例えば、Clackson et al.,Nature 352:624-28(1991)及びMarks et al.,J.Mol.Biol.222:581-97(1991)に記載の手法を使用してファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。クローン細胞株及びそれにより発現されるモノクローナル抗体を調製するための他の方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.eds.,5th ed.2002)を参照のこと。
典型的な4鎖抗体ユニットは、2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖で構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。IgGの場合、4鎖ユニットは、一般に、約150,000ダルトンである。各L鎖は、1つの共有ジスルフィド結合でH鎖に連結されているが、2つのH鎖は、H鎖アイソタイプに応じて1つ以上のジスルフィド結合で互いに連結されている。各H鎖及びL鎖は、規則的な間隔で配置された鎖内ジスルフィド架橋も有する。各H鎖は、N末端に、可変ドメイン(VH)、続いて、α鎖及びγ鎖のそれぞれの場合、3つの定常ドメイン(CH)、ならびに、μ及びεアイソタイプの場合、4つのCHドメイン、を有する。各L鎖は、N末端に、可変ドメイン(VL)、続いて、他端に、定常ドメイン(CL)を有する。VLは、VHとアラインされ、CLは、重鎖の最初の定常ドメイン(CH1)とアラインされる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖及び重鎖の可変ドメイン間に界面を形成すると考えられる。VH及びVLのペアリングにより、単一の抗原結合部位が形成される。種々のクラスの抗体の構造及び特性については、例えば、以下を参照:Basic and Clinical Immunology 71(Stites et al.eds.,8th ed.1994);及びImmunobiology(Janeway et al.eds.,5th ed.2001)。
「Fab」または「Fab領域」という用語は、抗原に結合する抗体領域を指す。通常、従来のIgGは、2つのFab領域を含み、それぞれが、Y字型のIgG構造の2つのアームの1つに存在する。各Fab領域は、通常、重鎖及び軽鎖のそれぞれの1つの可変領域及び1つの定常領域から構成される。より具体的には、Fab領域における重鎖の可変領域及び定常領域は、VH及びCH1領域であり、Fab領域における軽鎖の可変領域及び定常領域は、VL及びCL領域である。Fab領域内のVH、CH1、VL、及びCLは、本開示による抗原結合能力を付与するために、様々な方法で配置することができる。例えば、従来のIgGのFab領域と同様に、VH及びCH1領域は、1つのポリペプチド上にあり得、VL及びCL領域は、別のポリペプチド上にあり得る。あるいは、VH、CH1、VL、及びCL領域は全て、以下のセクションでより詳細に説明するように、全て同じポリペプチド上にあり、異なる順序で配向することができる。
「可変領域」、「可変ドメイン」、「V領域」、または「Vドメイン」という用語は、抗体の軽鎖または重鎖のアミノ末端に一般に位置し、重鎖に約120~130アミノ酸、軽鎖に約100~110アミノ酸の長さを有し、特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性に使用される抗体の軽鎖または重鎖の一部を指す。重鎖の可変領域は、「VH」と呼ばれることがある。軽鎖の可変領域は、「VL」と呼ばれることがある。「可変」という用語は、可変領域の特定のセグメントが、抗体間で配列が大きく異なるという事実を指す。V領域は、抗原結合を媒介し、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定義する。しかし、可変性は、可変領域の110アミノ酸スパン全体に均等に分散されていない。その代わりに、V領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる約15~30アミノ酸の可変性の少ない(例えば、比較的不変の)ストレッチからなり、これは、それぞれが約9~12アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれるより大きい可変性(例えば、極端な変動性)のより短い領域に隔てられている。重鎖及び軽鎖の可変領域は、それぞれ、4つのFRを含み、それは、主に、βシート構造を採用し、3つの超可変領域で連結され、一部の場合では、βシート構造を連結するループを形成し、いくつかの場合では、βシート構造の一部を形成する。各鎖の超可変領域は、FRにより近接して一緒に保持され、他の鎖由来の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(例えば、以下を参照:Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th ed.1991))。定常領域は、抗体の抗原への結合において直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害(ADCC)及び補体依存性細胞傷害(CDC)への抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。可変領域は、異なる抗体間で配列が大きく異なる。特定の実施形態では、可変領域は、ヒト可変領域である。
「Kabatによる可変領域残基ナンバリング」または「Kabatによるアミノ酸位置ナンバリング」という用語、及びそれらの変形形態は、上掲のKabat et al.における抗体の編集物の重鎖可変領域または軽鎖可変領域に使用されるナンバリングシステムを指す。このナンバリングシステムを使用して、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのFRまたはCDRの短縮または挿入に対応するより少ないまたは追加のアミノ酸を含有してもよい。例えば、重鎖可変ドメインは、残基52の後に単一のアミノ酸挿入物(Kabatによる残基52a)及び残基82の後に3つの挿入された残基(例えば、Kabatによる残基82a、82b、及び82cなど)を含んでもよい。残基のKabatナンバリングは、「標準」Kabatナンバリング配列を有する抗体の配列の相同領域におけるアラインメントにより、所与の抗体について決定されてもよい。Kabatナンバリングシステムは、可変ドメイン中の残基(およそ、軽鎖の残基1~107及び重鎖の残基1~113)(例えば、上掲のKabat et al.)を指す場合に、一般に使用される。「EUナンバリングシステム」または「EUインデックス」は、免疫グロブリン重鎖定常領域中の残基を指す場合に、一般に使用される(例えば、上掲のKabat et al.で報告されたEUインデックス)。「KabatにおけるEUインデックス」は、ヒトIgG1 EU抗体の残基ナンバリングを指す。他のナンバリングシステムは、例えば、AbM、Chothia、Contact、IMGT、及びAHonにより記述されている。
抗体に関して使用される場合、「重鎖」という用語は、アミノ末端部分が約120~130個以上のアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分が定常領域を含む、約50~70kDaのポリペプチド鎖を指す。定常領域は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて、アルファ(α)、デルタ(δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、及びミュー(μ)と呼ばれる5つの異なるタイプ(例えば、アイソタイプ)のうちの1つであり得る。異なる重鎖は、サイズが異なる:α、δ、及びγは、約450個のアミノ酸を含有するが、μ及びεは、約550のアミノ酸を含有する。軽鎖と組み合わせる場合、これらの異なるタイプの重鎖は、IgGの4つのサブクラス、すなわち、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4を含む、抗体の5つの周知のクラス(例えば、アイソタイプ)である、それぞれ、IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMを生じさせる。
抗体に関して使用される場合、「軽鎖」という用語は、アミノ末端部分が約100~約110個以上のアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分が定常領域を含む、約25kDaのポリペプチド鎖を指す。軽鎖のおおよその長さは、211~217アミノ酸である。定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)またはラムダ(λ)と呼ばれる2つの異なるタイプがある。
本明細書で使用される場合、「超可変領域」、「HVR」、「相補性決定領域」、及び「CDR」という用語は、互換的に使用される。「CDR」は、免疫グロブリン(Igまたは抗体)VHβシートフレームワークの非フレームワーク領域内の3つの超可変領域(H1、H2、もしくはH3)のうちの1つ、または抗体VL βシートフレームワークの非フレームワーク領域内の3つの超可変領域(L1、L2、もしくはL3)の1つを指す。従って、CDRは、フレームワーク領域配列内に散在する可変領域配列である。
CDR領域は、当業者らに周知であり、周知のナンバリングシステムで定義されている。例えば、Kabat相補性決定領域(CDR)は、配列可変性に基づいており、最も一般に使用される(例えば、上掲のKabat et al.を参照)。Chothiaは、むしろ、構造ループの位置を指す(例えば、Chothia and Lesk、J.Mol.Biol.196:901-17(1987)を参照)。Kabatナンバリング規則を使用してナンバリングされた場合の、Chothia CDR-H1ループの終わりは、ループの長さに応じてH32及びH34間で変動する(これは、Kabatナンバリングスキームが、H35AとH35Bに挿入物を配置するためであり;35Aも35Bも存在しない場合、ループは32で終了し;35Aしか存在しない場合、ループは33で終了し;ループは35A及び35Bの両方が存在する場合、ループは34で終了する)。AbM超可変領域は、Kabat CDR及びChothia構造ループの間の中間物を表し、Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェアにより使用される(例えば、Antibody Engineering Vol.2(Kontermann and Dubel eds.,2d ed.2010)を参照)。「接触」超可変領域は、利用可能な複雑な結晶構造の分析に基づいている。開発され広く採用されている別の普遍的なナンバリングシステムは、ImMunoGeneTics(IMGT)情報システム(登録商標)(Lafranc et al.,Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77(2003))である。IMGTは、免疫グロブリン(IG)、T細胞受容体(TCR)、ならびにヒト及び他の脊椎動物の主要組織適合複合体(MHC)に特化した統合情報システムである。本明細書において、CDRは、アミノ酸配列及び軽鎖または重鎖内の位置の両方に関して言及される。免疫グロブリン可変ドメインの構造内のCDRの「位置」が、種間で保存され、ループと呼ばれる構造に存在するので、構造的特徴に従って可変ドメイン配列をアラインさせるナンバリングシステムを使用することにより、CDR及びフレームワーク残基は、容易に同定される。1つの種の免疫グロブリン由来のCDR残基を、通常は、ヒト抗体由来のアクセプターフレームワークに移植及び置換する際に、この情報を使用することができる。追加のナンバリングシステム(AHon)が、Honegger and Pluckthun,J.Mol.Biol.309:657-70(2001)により開発されている。例えば、Kabatナンバリング及びIMGT固有のナンバリングシステムを含むナンバリングシステム間の対応は、当業者に周知である(例えば、上掲のKaba;上掲のChothia and Lesk;上掲のMartin;上掲のLefranc et al.を参照)。これらの超可変領域またはCDRのそれぞれに由来する残基が、以下の表1に例示される。
特定のCDRの境界は、識別に使用されるスキームに応じて変動し得る。従って、別途明記のない限り、所与の抗体またはその領域、例えば、可変領域、の「CDR」及び「相補性決定領域」という用語、ならびに抗体またはその領域の個々のCDR(例えば、CDR-H1、CDR-H2)は、上の本明細書に記載の既知のスキームのいずれかで定義される相補性決定領域を包含すると理解されるべきである。いくつかの場合では、IMGT、Kabat、Chothia、またはContact法により定義されるCDRなどの、特定のCDRまたは複数のCDRを同定するためのスキームが指定される。いくつかの場合では、Kabatナンバリングによる1つ以上の位置が、実際の配列で占められていないことがあるか、または、実際の配列が、Kabatナンバリングで許可される数よりも多くのアミノ酸残基を含有してもよい。例えば、以下を参照:Deschacht et al.,2010.J Immunol 184:5696-704(KabatによるVHHドメインの例示的なナンバリングについて)。他の場合では、CDRの特定のアミノ酸配列が与えられる。CDR領域は、また、様々なナンバリングシステムの組み合わせ、例えば、Kabat及びChothiaナンバリングシステムの組み合わせ、またはKabat及びIMGTナンバリングシステムの組み合わせで定義され得ることに留意すべきである。従って、「特定のVHまたはVHHに記載のCDR」などの用語は、上記の例示的なCDRナンバリングシステムで定義される任意のCDR1を含むが、それにより限定されない。可変領域(例えば、VHH、VH、またはVL)が与えられると、領域内のCDRが異なるナンバリングシステムまたはそれらの組み合わせにより定義することができると、当業者らは理解するであろう。
超可変領域は、以下のような「拡張された超可変領域」を含んでもよい:VL中の24~36または24~34(L1)、46~56または50~56(L2)、及び89~97または89~96(L3)、及びVH中の26~35または26~35A(H1)、50~65または49~65(H2)、及び93~102、94~102、または95~102(H3)。
「定常領域」または「定常ドメイン」という用語は、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば、Fc受容体との相互作用を示す軽鎖及び重鎖のカルボキシ末端部分を指す。この用語は、抗原結合部位を含有する免疫グロブリンの他の部分である可変領域と比較して、より保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常領域は、重鎖のCH1、CH2、及びCH3領域、ならびに軽鎖のCL領域を含有してもよい。
「フレームワーク」または「FR」という用語は、CDRに隣接する可変領域残基を指す。FR残基は、例えば、キメラ、ヒト化、ヒト、ドメイン抗体(例えば、単一ドメイン抗体)、ダイアボディ、線状抗体、及び二重特異性抗体に存在する。FR残基は、超可変領域残基またはCDR残基以外の可変ドメイン残基である。
本明細書における「Fc領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用され、例えば、天然配列Fc領域、組み換えFc領域、及びバリアントFc領域を含む。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は異なり得ることがあるが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、多くの場合、位置Cys226のアミノ酸残基から、またはPro230から、そのカルボキシル末端まで伸びると定義される。Fc領域のC末端リジン(EUナンバリングシステムによる残基447)は、例えば、抗体の産生もしくは精製中に、または抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え操作することにより、除去され得る。従って、インタクト抗体の組成物は、全てのK447残基が除去された抗体集団、K447残基が除去されていない抗体集団、及びK447残基の有り無しの両方で抗体の混合物を有する抗体集団を含んでもよい。「機能的Fc領域」は、天然配列Fc領域の「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」は、C1q結合;CDC;Fc受容体結合;ADCC;食作用;細胞表面受容体の下方調節(例えば、B細胞受容体)などが挙げられる。そのようなエフェクター機能は、一般に、Fc領域が結合領域または結合ドメイン(例えば、抗体可変領域またはドメイン)と組み合わされることを必要とし、当業者らに既知の様々なアッセイを使用して評価することができる。「バリアントFc領域」は、少なくとも1つのアミノ酸修飾(例えば、置換、付加、または欠失)により天然配列Fc領域のアミノ酸配列とは異なるものを含む。特定の実施形態では、バリアントFc領域は、天然配列Fc領域または親ポリペプチドのFc領域における、天然配列Fc領域または親ポリペプチドのFc領域と比較して、少なくとも1つのアミノ酸置換、例えば、約1~約10個のアミノ酸置換、または約1~約5個のアミノ酸置換を有する。本明細書におけるバリアントFc領域は、天然配列Fc領域及び/または親ポリペプチドのFc領域と、少なくとも約80%の相同性、またはそれと少なくとも約90%の相同性、例えば、それと少なくとも約95%の相同性を有し得る。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」は、当該技術分野の用語であり、結合分子(例えば、単一ドメイン抗体配列を含む抗体)が特異的に結合し得る抗原の局在領域を指す。エピトープは、線状エピトープもしくは立体配座、非線状、または不連続エピトープであり得る。ポリペプチド抗原の場合、例えば、エピトープは、ポリペプチドの連続したアミノ酸(「線状」エピトープ)であり得るか、またはエピトープは、ポリペプチドの2つ以上の非連続領域からのアミノ酸を含み得る(「立体配座」、「非線形」、もしくは「不連続」エピトープ)。一般に、線状エピトープは、2次、3次、または4次構造に依存しても、依存しないこともあると、当業者は理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、結合分子は、アミノ酸基が天然の3次元タンパク質構造に折りたたまれるかどうかに関わらず、アミノ酸基に結合する。他の実施形態では、結合分子は、エピトープを認識して結合するために、エピトープを構成するアミノ酸残基が特定の立体配座(例えば、曲がり、ねじれ、回転、または折りたたみ)を示すことを必要とする。
「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または低減させるものである。いくつかの実施形態では、遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する。
「アゴニスト」または活性化抗体は、それが結合する抗原によるシグナル伝達を増強または開始するものである。いくつかの実施形態では、アゴニスト抗体は、天然リガンドの存在なしでシグナル伝達を引き起こすか、または活性化する。
ペプチド、ポリペプチド、または抗体配列に関する「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」及び「相同性」は、配列をアラインし、必要に応じて、最大パーセントの配列同一性を達成するためにギャップを導入した後の、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない特定のペプチドまたはポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、例えば、公的に入手可能なコンピューターソフトウェア、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、またはMEGALIGN(商標)(DNASTAR)ソフトウェアを使用して、当業者の範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者らは、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定し得る。
「特異性」という用語は、抗原の特定のエピトープに対する抗原結合タンパク質(例えば、CARまたはsdAb)の選択的認識を指す。例えば、天然の抗体は、単一特異性である。本明細書で使用される「多重特異性」という用語は、抗原結合タンパク質(例えば、CARまたはsdAb)が、少なくとも2つが異なる抗原に結合する2つ以上の抗原結合部位を有することを意味する。本明細書で使用される「二重特異性」は、抗原結合タンパク質(例えば、CARまたはsdAb)が2つの異なる抗原結合特異性を有することを意味する。本明細書で使用される「単一特異性」CARという用語は、1つ以上の結合部位を有する抗原結合タンパク質(例えば、CARまたはsdAb)を意味し、これらのそれぞれが、同じ抗原に結合する。
本明細書で使用される「価」という用語は、抗原結合タンパク質(例えば、CARまたはsdAb)における特定数の結合部位の存在を意味する。例えば、天然抗体または全長抗体は、2つの結合部位を有し、二価である。このように、「三価」、「四価」、「五価」、及び「六価」という用語は、抗原結合タンパク質(例えば、CARまたはsdAb)における、それぞれ、2つの結合部位、3つの結合部位、4つの結合部位、5つの結合部位、及び6つの結合部位の存在を意味する。
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」または「CAR」は、T細胞などの免疫エフェクター細胞に1つ以上の抗原特異性を移植するために使用できる遺伝子操作された受容体を指す。いくつかのCARは、「人工T細胞受容体」、「キメラT細胞受容体」、または「キメラ免疫受容体」としても既知である。いくつかの実施形態では、CARは、1つ以上の抗原(例えば、腫瘍抗原)に特異的な細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびにT細胞及び/または他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「CAR-T細胞」は、CARを発現するT細胞を指す。
「ポリペプチド」及び「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状または分枝状であってもよく、それは、改変アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸により中断されてもよい。この用語は、自然にまたは介入、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは改変により改変されているアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、限定されないが、非天然アミノ酸を含むアミノ酸の1つ以上のアナログを含有するポリペプチド、ならびに当該技術分野で既知の他の改変も定義内に含まれる。本開示のポリペプチドは、抗体または免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーに基づいてもよく、特定の実施形態では、「ポリペプチド」は、単鎖として、または2つ以上の関連鎖として生じ得ることが理解される。
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNA及びRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変ヌクレオチドもしくは塩基、及び/またはそれらのアナログ、またはDNAもしくはRNAポリメラーゼまたは合成反応によりポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド及びそれらのアナログを含んでもよい。本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、必ずしも必要ではないが、一般に長さが約200ヌクレオチド未満である短い、一般に一本鎖の合成ポリヌクレオチドを指す。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、相互に排他的ではない。ポリヌクレオチドに関する上記の説明は、オリゴヌクレオチドにも等しく完全に適用可能である。本開示の結合分子を産生する細胞は、親ハイブリドーマ細胞、ならびに抗体をコードする核酸が導入されている細菌及び真核宿主細胞を含んでもよい。別途明記のない限り、本明細書に開示の任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は、5’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、5’方向と呼ばれる。新生RNA転写産物の5’から3’への付加の方向は、転写方向と呼ばれ;RNA転写物の5’から5’末端にある、RNA転写物と同じ配列を有するDNA鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれ;RNA転写物の3’から3’末端にある、RNA転写物と同じ配列を有するDNA鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。
「単離核酸」は、他のゲノムDNA配列、ならびにタンパク質または複合体、例えば、リボソーム及びポリメラーゼから実質的に分離される核酸、例えば、RNA、DNA、または混合核酸であり、これは、天然配列を天然に伴う。「単離」核酸分子は、核酸分子の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離されるものである。さらに、cDNA分子などの「単離」核酸分子は、組み換え手法で産生される場合に、他の細胞材料、もしくは培地を実質的に含まない可能性があるか、または、化学的に合成された場合、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない可能性がある。特定の実施形態では、単一ドメイン抗体または本明細書に記載の抗体をコードする1つ以上の核酸分子が単離または精製される。この用語は、天然に存在する環境から除去されている核酸配列を包含し、組み換えまたはクローン化されたDNA単離物及び化学的に合成されたアナログまたは異種系により生物学的に合成されたアナログを含む。実質的に純粋な分子は、分子の単離形態を含んでもよい。具体的には、本明細書に記載のCARまたはsdAbをコードする「単離」核酸分子は、それが産生された環境で通常会合している少なくとも1つの混入核酸分子から同定及び分離される核酸分子である。
「制御配列」という用語は、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なDNA配列を指す。原核生物に適する制御配列は、例えば、プロモーター、任意に、オペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語及び類似の語句(例えば、遺伝子融合された)は、核酸またはアミノ酸に関して使用される場合、それぞれ、互いに機能的な関係で配置される核酸配列またはアミノ酸配列の作動可能結合を指す。例えば、作動可能に連結されたプロモーター、エンハンサーエレメント、オープンリーディングフレーム、5’及び3’UTR、ならびにターミネーター配列は、核酸分子(例えば、RNA)の正確な産生をもたらす。いくつかの実施形態では、作動可能に連結された核酸エレメントは、オープンリーディングフレームの転写をもたらし、最終的にポリペプチドの産生(すなわち、オープンリーディングフレームの発現)をもたらす。別の例として、作動可能に連結されたペプチドは、機能ドメインが互いに適切な距離を置いて配置されて、各ドメインの意図された機能を付与するものである。
「ベクター」という用語は、宿主細胞に核酸配列を導入するために、例えば、本明細書に記載の結合分子(例えば、抗体)をコードする核酸配列を含む核酸配列を保有または包含するために使用される物質を指す。使用に適用可能なベクターは、例えば、発現ベクター、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソーム、及び人工染色体を含み、これは、宿主細胞の染色体への安定な組み込みのために実施可能な選択配列またはマーカーを含み得る。さらに、ベクターは、1つ以上の選択マーカー遺伝子及び適切な発現制御配列を含み得る。含み得る選択可能なマーカー遺伝子は、例えば、抗生物質または毒素に対する耐性を提供し、栄養要求性欠乏を補完し、または培地にない重要な栄養素を供給する。発現制御配列は、構成的及び誘導可能なプロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含み得、これらは、当該技術分野で周知である。2つ以上の核酸分子が共発現される場合(例えば、抗体重鎖及び軽鎖の両方、または抗体VH及びVL)、両方の核酸分子を、例えば、単一発現ベクターに挿入するか、または別々の発現ベクターに挿入することができる。単一ベクター発現の場合、コード核酸は、1つの共通の発現制御配列に作動可能に連結するか、または1つの誘導性プロモーター及び1つの構成的プロモーターなどの異なる発現制御配列に連結することができる。宿主細胞への核酸分子の導入は、当該技術分野で周知の方法を使用して確認することができる。そのような方法には、核酸分析、例えば、ノーザンブロットまたはmRNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、遺伝子産物の発現のためのイムノブロッティング、または導入された核酸配列もしくはその対応する遺伝子産物の発現を試験するための他の好適な分析方法、を含む。核酸分子が所望の産物を産生するのに十分な量で発現されることは、当業者らに理解され、発現レベルは、当該技術分野で周知の方法を使用して十分な発現を得るために最適化することができることがさらに理解される。
本明細書で使用される「宿主」という用語は、動物、例えば、哺乳動物(例えば、ヒト)を指す。
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、核酸分子でトランスフェクトされ得る特定の対象細胞、及びそのような細胞の子孫または潜在的な子孫を指す。そのような細胞の子孫は、変異または続く宿主ゲノムへの核酸分子の生成もしくは組み込みにおいて生じ得る環境の影響により、核酸分子でトランスフェクトされた親細胞と同一ではないことがある。
本明細書で使用される場合、「自己由来」と用語は、後で個体に再導入される同じ個体に由来する任意の物質を指すことを意味する。
「同種異系」は、同じ種の異なる個体に由来する移植片を指す。
本明細書で使用される「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換、または形質導入されているものである。細胞は、初代対象細胞及びその子孫を含む。
本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府もしくは州政府の規制機関により承認されていること、または、動物、特に、ヒトでの使用が米国薬局方、欧州薬局方、または他の一般に認められている薬局方に記載されることを意味する。
「賦形剤」は、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、溶媒、または封入材料などの薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。賦形剤は、例えば、封入材料または添加剤、例えば、吸収促進剤、酸化防止剤、結合剤、緩衝剤、担体、コーティング剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、増量剤、充填剤、香味剤、湿潤剤、潤滑剤、香料、防腐剤、噴射剤、放出剤、殺菌剤、甘味料、可溶化剤、湿潤剤、及びそれらの混合物を含む。「賦形剤」という用語は、希釈剤、アジュバント(例えば、フロイントのアジュバント(完全もしくは不完全))またはビヒクルも指し得る。
いくつかの実施形態では、賦形剤は、薬学的に許容される賦形剤である。薬学的に許容される賦形剤の例としては、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸;アスコルビン酸を含む酸化防止剤;低分子量(例えば、約10アミノ酸残基未満)のポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン;単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物;キレート剤、例えば、EDTA;糖アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール;塩形成カウンターイオン、例えば、ナトリウム;及び/または非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN(商標)、ポリエチレングリコール(PEG)、及びPLURONICS(商標)が挙げられる。薬学的に許容される賦形剤の他の例は、Remington and Gennaro,Remington’s Pharmaceutical Sciences(18thed.1990)に記載されている。
一実施形態では、各構成成分は、医薬製剤の他の成分と適合するという意味で「薬学的に許容される」ものであり、合理的な利益/リスク比に見合った過度の毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、または他の問題もしくは合併症がなく、ヒト及び動物の組織または臓器と接触して使用するのに適する。例えば、以下を参照:Lippincott Williams & Wilkins:Philadelphia,PA,2005;Handbook of Pharmaceutical Excipients,6th ed.;Rowe et al.,Eds.;The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association:2009;Handbook of Pharmaceutical Additives,3rd ed.;Ash and Ash Eds.;Gower Publishing Company:2007;Pharmaceutical Preformulation and Formulation,2nd ed.;Gibson Ed.;CRC Press LLC:Boca Raton,FL,2009。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、用いられる投薬量及び濃度で曝露される細胞または哺乳動物に対して無毒である。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、pH緩衝水溶液である。
いくつかの実施形態では、賦形剤は、滅菌液体、水と、例えば、石油、動物、植物、または合成起源、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む油である。水は、組成物(例えば、医薬組成物)が静脈内投与される場合の例示的な賦形剤である。食塩水ならびに水性デキストロース及びグリセロール水溶液も液体賦形剤として、特に、注射用溶液として用いることができる。賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアラート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなども含み得る。組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤または乳化剤、またはpH緩衝剤も含有し得る。組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの形態をとり得る。製剤を含む経口組成物は、標準的な賦形剤、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含み得る。
薬学的化合物を含む組成物は、例えば、適量の賦形剤と共に、単離または精製された形態で、結合分子(例えば、抗体)を含有してもよい。
本明細書で使用される「有効量」または「治療有効量」という用語は、所望の結果をもたらすのに十分な、本明細書で提供される薬剤及び単一ドメイン抗体または医薬組成物を含む単一ドメイン抗体または治療用分子の量を指す。
「対象」及び「患者」という用語は、交換可能に使用されてもよい。本明細書で使用される場合、特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、非霊長類または霊長類(例えば、ヒト)である。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。一実施形態では、対象は、疾患または障害と診断された、哺乳動物、例えば、ヒトである。別の実施形態では、対象は、疾患または障害を発症するリスクのある、哺乳動物、例えば、ヒト、である。
「投与する」または「投与」は、体外に存在する物質を患者に注射するか、または別の方法で物理的に送達する行為、例えば、粘膜、皮内、静脈内、筋肉内送達、及び/または本明細書に記載もしくは当該技術分野で既知の物理的送達の任意の他の方法、を指す。
本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置」、及び「処置すること」という用語は、1つ以上の療法の投与に起因する疾患または状態の進行、重症度、及び/または期間の軽減または改善を指す。処置は、患者が依然として基礎疾患に罹患していることがあるにもかかわらず、改善が患者に観察されるように、基礎疾患と関連する1つ以上の症状の減少、緩和、及び/または軽減があったかどうかを評価することにより決定されてもよい。「処置すること」という用語は、疾患の管理及び改善の両方を含む。「管理する」、「管理すること」、及び「管理」という用語は、必ずしも疾患の治癒をもたらすとは限らない療法から対象が受ける有益な効果を指す。
「予防する」、「予防すること」、及び「予防」という用語は、疾患、障害、状態、または関連症状(複数可)(例えば、糖尿病またはがん)の発症(または再発)の可能性を低減させることを指す。
本明細書で使用される場合、がんの発症を「遅延させること」は、疾患の発症を遅延、妨害、減速、阻止、安定化、及び/または延期することを意味する。この遅延は、疾患の病歴及び/または処置される個体に応じて、様々な時間のものとなり得る。当業者には明らかであるように、十分なまたは有意な遅延は、個体が疾患を発症しないという点で、事実上、予防を包含し得る。がんの発症を「遅延させる」方法は、その方法を使用しない場合と比較して、所与の時間枠での疾患の発症の可能性を低減する方法、及び/または所与の時間枠での疾患の程度を低減する方法である。そのような比較は、通常、統計的に有意な個体数を使用した臨床研究に基づく。限定されないが、コンピューター断層撮影法(CATスキャン)、磁気共鳴画像法(MRI)、腹部超音波検査、凝固検査、動脈造影、または生検を含む標準的な方法を使用して、がんの発症を検出することができる。発症は、最初は検出できないことがあるがんの進行を指すこともあり、発生、再発、及び発症を含む。
本明細書で使用される「B細胞関連疾患または障害」は、B細胞により媒介されるか、または異常なB細胞機能(例えば、B細胞機能の調節不全)により付与される疾患または障害を指す。本明細書で使用される「B細胞関連疾患または障害」は、B細胞悪性腫瘍、例えば、B細胞白血病またはB細胞リンパ腫を含むが、これらに限定されない。それは、辺縁帯リンパ腫(例えば、脾辺縁帯リンパ腫)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、原発性中枢神経系(CNS)リンパ腫、原発性縦隔B細胞リンパ腫(PMBL)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、B細胞前リンパ球性白血病(B-PLL)、濾胞性リンパ腫(FL)、バーキットリンパ腫、原発性眼内リンパ腫、慢性リンパ球性白血病(CLL)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、有毛細胞白血病(HCL)、前駆Bリンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫(NHL)、高悪性度B細胞リンパ腫(HGBL)、及び多発性骨髄腫(MM)も含む。「B細胞関連疾患または障害」は、不適切なまたは増加したB細胞数及び/または活性化と関連するような、特定の自己免疫及び/または炎症性疾患も含む。
本明細書で使用される「CD20関連疾患または障害」は、CD20が発現されている細胞または組織を含む疾患または障害を指す。いくつかの実施形態では、CD20関連疾患または障害は、CD20が異常に発現されている細胞を含む。他の実施形態では、CD20関連疾患または障害は、内側または上にCD20が欠損している細胞を含む。
「約」及び「およそ」という用語は、20%以内、15%以内、10%以内、9%以内、8%以内、7%以内、6%以内、5%以内、4%以内、3%以内、2%以内、1%以内、またはそれ以下の特定の値または範囲を意味する。
本開示及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」は、文脈に別途明示のない限り、複数形を含む。
実施形態が「含むこと(comprising)」という用語を用いて本明細書に記載される場合、「からなること(consisting of)」及び/または「から本質的になること(consisting essentially of)」に関して記載される別の点で類似の実施形態も提供されることが理解される。実施形態が「から本質的になること」という表現を用いて本明細書に記載される場合、「からなること(consisting of)」に関して記載される別の点で類似の実施形態も提供されることも理解される。
「A及びB間」または「AB間」などの表現で使用される「間」という用語は、A及びBの両方を含む範囲を指す。
本明細書の「A及び/またはB」などの表現で使用される「及び/または」という用語は、A及びBの両方;AまたはB;A(単独);及びB(単独)を含むことが意図される。同様に、「A、B、及び/またはC」などの表現で使用される「及び/または」という用語は、以下の実施形態のそれぞれを包含することが意図される:A、B、及びC;A、B、またはC;AまたはC;AまたはB;BまたはC;A及びC;A及びB;B及びC;A(単独);B(単独);及びC(単独)。
5.2.単一ドメイン抗体
5.2.1.CD20に結合する単一ドメイン抗体
一態様では、CD20に結合可能な単一ドメイン抗体(例えば、VHHドメイン)が本明細書で提供される。
5.2.1.CD20に結合する単一ドメイン抗体
一態様では、CD20に結合可能な単一ドメイン抗体(例えば、VHHドメイン)が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体(例えば、VHHドメイン)は、ヒトCD20に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗CD20単一ドメイン抗体は、1つ以上のCD20活性を調節する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗CD20単一ドメイン抗体は、アンタゴニスト抗体である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗CD20単一ドメイン抗体は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、または≦0.001nM(例えば、10-8M以下、例えば、10-8M~10-13M、例えば、10-9M~10-13M)の解離定数(KD)で、CD20(例えば、ヒトCD20)に結合する。結合親和性を測定する様々な方法が当該技術分野で既知であり、それらのいずれかを本開示の目的のために使用することができ、これは、例えば、目的の抗体のFabバージョン及びその抗原を用いて実施されるRIA(Chen et al.,1999,J.Mol Biol 293:865-81)によるもの、;バイオレイヤー干渉法(BLI)もしくは例えば、Octet(登録商標)Red96システムを使用したOctet(登録商標)による表面プラズモン共鳴(SPR)アッセイによるもの、または、例えば、Biacore(登録商標)TM-2000もしくはBiacore(登録商標)TM-3000を使用したBiacore(登録商標)によるものを含む。「オンレート」または「会合の速度」または「会合速度」または「kon」は、また、例えば、Octet(登録商標)Red96、Biacore(登録商標)TM-2000、またはBiacore(登録商標)TM-3000システムを使用した上記のバイオレイヤー干渉法(BLI)または表面プラズモン共鳴(SPR)で決定されてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗CD20単一ドメイン抗体は、VHHドメインである。以下のセクション6に記載されるように、本明細書で提供される例示的なVHHドメインが生成され、以下の表2にも示されるように、これらのVHHドメインが、VHH-273、VHH-283、VHH-313、VHH-440、VHH-466、VHH-496、VHH-653、huVHH-253、huVHH-256、huVHH-260、huVHH-746、huVHH-750、huVHH-753、huVHH-836、huVHH-840、huVHH-843、huVHH-846、2082H1、2082H2、2082H3、2082H4、2082H5、2082H6、VHH-623、VHH-640、及び/またはVHH-657と呼ばれる。
従って、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体は、VHH-273、VHH-283、VHH-313、VHH-440、VHH-466、VHH-496、VHH-653、huVHH-253、huVHH-256、huVHH-260、huVHH-746、huVHH-750、huVHH-753、huVHH-836、huVHH-840、huVHH-843、huVHH-846、2082H1、2082H2、2082H3、2082H4、2082H5、2082H6、VHH-623、VHH-640、及び/またはVHH-657のうちのいずれか1つの、1つ以上のCDR配列を含む。いくつかの実施形態では、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の構造を含むCD20に結合する単一ドメイン抗体が本明細書で提供され、CDR配列は、VHH-273、VHH-283、VHH-313、VHH-440、VHH-466、VHH-496、VHH-653、huVHH-253、huVHH-256、huVHH-260、huVHH-746、huVHH-750、huVHH-753、huVHH-836、huVHH-840、huVHH-843、huVHH-846、2082H1、2082H2、2082H3、2082H4、2082H5、2082H6、VHH-623、VHH-640、及び/またはVHH-657のものから選択される。
いくつかの実施形態では、配列番号41のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号42のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号43のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号44のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号45のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号46のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号47のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号48のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号49のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号50のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号51のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号52のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号53のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号54のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号55のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号56のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号57のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号58のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号59のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号60のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号61のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号62のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号63のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号183のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号184のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号185のアミノ酸配列の1つ、2つ、または3つ全てのCDRを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号41に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号41に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号41に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号3または6)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号41に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号41に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号41に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号41に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号42に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号42に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号42に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号8または10)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号42に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号42に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号42に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号42に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号43に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号43に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号43に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号8または10)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号43に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号43に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号43に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号43に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号44に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号44に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号44に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号16または19)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号44に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号44に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号44に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号44に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号45に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号45に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号45に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号16または19)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号45に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号45に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号45に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号45に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号46に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号46に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号46に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号26または29)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号46に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号46に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号46に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号46に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号47に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号47に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号47に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号16または19)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号47に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号47に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号47に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号47に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号48に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号48に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号48に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号3または6)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号48に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号48に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号48に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号48に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号49に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号49に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号49に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号3または6)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号49に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号49に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号49に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号49に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号50に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号50に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号50に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号8または10)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号50に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号50に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号50に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号50に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号51に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号51に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号51に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号26または29)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号51に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号51に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号51に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号51に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号52に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号52に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号52に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号26または29)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号52に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号52に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号52に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号52に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号53に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号53に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号53に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号26または29)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号53に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号53に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号53に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号53に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号54に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号54に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号54に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号16または19)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号54に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号54に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号54に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号54に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号55に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号55に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号55に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号16または19)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号55に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号55に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号55に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号55に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号56に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号56に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号56に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号16または19)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号56に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号56に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号56に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号56に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号57に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号57に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号57に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号16または19)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号57に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号57に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号57に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号57に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号58に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号58に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号58に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号3または6)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号58に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号58に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号58に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号58に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号59に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号59に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号59に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号3または39)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号59に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号59に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号59に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号59に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号60に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号60に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号60に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号3または6)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号60に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号60に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号60に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号60に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号61に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号61に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号61に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号3または40)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号61に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号61に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号61に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号61に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号62に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号62に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号62に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号3または39)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号62に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号62に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号62に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号62に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号63に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号63に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号63に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号3または6)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号63に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号63に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号63に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号63に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号183に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号183に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号183に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号167または170)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号183に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号183に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号183に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号183に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号184に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号184に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号184に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号173または176)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号184に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号184に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号184に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号184に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号185に記載のCDR1のアミノ酸配列を有するCDR1を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号185に記載のCDR2のアミノ酸配列を有するCDR2を有する。他の実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号185に記載のCDR3のアミノ酸配列を有するCDR3(例えば、配列番号179または182)を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号185に記載のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR2を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号185に記載のCDR1及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号185に記載のCDR2及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR2及びCDR3を有する。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号185に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。CDR配列は、周知のナンバリングシステムに従って決定することができる。いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、Kabatナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、CDRは、AbMナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Chothiaナンバリングに従う。他の実施形態では、CDRは、Contactナンバリングに従う。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の構造を含むCD20に結合する単一ドメイン抗体が本明細書で提供され、(i)CDR1は、配列番号1もしくは195、配列番号4、配列番号11もしくは196、配列番号13、配列番号14もしくは197、配列番号17、配列番号20もしくは197、配列番号22、配列番号24もしくは198、配列番号27、配列番号165もしくは199、配列番号168、配列番号171もしくは200、配列番号174、配列番号177もしくは197、配列番号180のアミノ酸配列を含み、(ii)CDR2は、配列番号2、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号12、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号28、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号166、配列番号169、配列番号172、配列番号175、配列番号178、もしくは配列番号181のアミノ酸配列を含み、及び/または、(iii)CDR3は、配列番号3、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号16、配列番号19、配列番号26、配列番号29、配列番号39、配列番号40、配列番号167、配列番号170、配列番号173、配列番号176、配列番号179、もしくは配列番号182のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
他の実施形態では、本CAR内の抗CD20 sdAbは、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の構造を含み、(i)CDR1は、配列番号1もしくは195、配列番号4、配列番号11もしくは196、配列番号13、配列番号14もしくは197、配列番号17、配列番号20もしくは197、配列番号22、配列番号24もしくは198、配列番号27、配列番号165もしくは199、配列番号168、配列番号171もしくは200、配列番号174、配列番号177もしくは197、配列番号180と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、(ii)CDR2は、配列番号2、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号12、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号28、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号166、配列番号169、配列番号172、配列番号175、配列番号178、もしくは配列番号181と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び/または、(iii)CDR3は、配列番号3、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号16、配列番号19、配列番号26、配列番号29、配列番号39、配列番号40、配列番号167、配列番号170、配列番号173、配列番号176、配列番号179、もしくは配列番号182と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号1または195のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号1のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号195のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号1または195のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号1のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号195のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号11または196のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号11のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号196のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号14または197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号20または197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号21のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号21のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号21のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号23のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号24または198のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号25のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号26のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号24のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号25のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号26のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号198のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号25のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号26のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号14または197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号1または195のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号1のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号195のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号20または197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号20または197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号20または197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号20または197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号165または199のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号166のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号167のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号165のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号166のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号167のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号199のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号166のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号167のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号168のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号169のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号170のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号171または200のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号172のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号173のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号171のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号172のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号173のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号200のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号172のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号173のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号174のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号175のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号176のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号177または197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号178のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号179のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号177のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号178のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号179のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号178のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号179のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号180のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号181のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号182のアミノ酸配列を含むCDR3を含む抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物である。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗CD20単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、VHH-273、VHH-283、VHH-313、VHH-440、VHH-466、VHH-496、VHH-653、huVHH-253、huVHH-256、huVHH-260、huVHH-746、huVHH-750、huVHH-753、huVHH-836、huVHH-840、huVHH-843、huVHH-846、2082H1、2082H2、2082H3、2082H4、2082H5、2082H6、VHH-623、VHH-640、及び/またはVHH-657のうちの1つ以上のフレームワーク領域(複数可)をさらに含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号41の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号42の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号43の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号44の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号45の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号46の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号47の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号48の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号49の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号50の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号51の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号52の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号53の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号54の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号55の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号56の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号57の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号58の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号59の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号60の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号61の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号62の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号63の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号183の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号184の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、配列番号185の配列を含むVHHドメインに由来する1つ以上のフレームワーク(複数可)を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体は、ヒト化単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、ヒト化単一ドメイン抗体は、以下のセクション6で例示される方法または以下のセクションに記載の方法を使用して生成することができる。
本明細書に記載のフレームワーク領域は、CDRナンバリングシステムの境界に基づいて決定される。換言すれば、CDRが、例えば、Kabat、IMGT、またはChothiaで決定される場合、フレームワーク領域は、N末端からC末端までの形式の可変領域内のCDRを取り囲むアミノ酸残基である:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。例えば、FR1は、例えば、Kabatナンバリングシステム、IMGTナンバリングシステム、またはChothiaナンバリングシステムで定義されるCDR1アミノ酸残基のN末端側のアミノ酸残基として定義され、FR2は、例えば、Kabatナンバリングシステム、IMGTナンバリングシステム、またはChothiaナンバリングシステムで定義されるCDR1及びCDR2アミノ酸残基の間のアミノ酸残基として定義され、FR3は、例えば、Kabatナンバリングシステム、IMGTナンバリングシステム、またはChothiaナンバリングシステムで定義されるCDR2及びCDR3アミノ酸残基間のアミノ酸残基として定義され、FR4は、例えば、Kabatナンバリングシステム、IMGTナンバリングシステム、またはChothiaナンバリングシステムで定義されるCDR3アミノ酸残基のC末端側のアミノ酸残基として定義される。
いくつかの実施形態では、配列番号41のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号41のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号42のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号42のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号43のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号43のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号44のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号44のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号45のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号45のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号46のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号46のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号47のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号47のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号48のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号48のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号49のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号49のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号50のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号50のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号51のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号51のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号52のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号52のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号53のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号53のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号54のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号54のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号55のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号55のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号56のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号56のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号57のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号57のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号58のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号58のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号59のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号59のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号60のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号60のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号61のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号61のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号62のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号62のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号63のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号63のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号183のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号183のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号184のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号184のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号185のアミノ酸配列を有するVHHドメインを含む、単離された抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号185のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体VHH-273、VHH-283、VHH-313、VHH-440、VHH-466、VHH-496、VHH-653、huVHH-253、huVHH-256、huVHH-260、huVHH-746、huVHH-750、huVHH-753、huVHH-836、huVHH-840、huVHH-843、huVHH-846、2082H1、2082H2、2082H3、2082H4、2082H5、2082H6、VHH-623、VHH-640、及びVHH-657のいずれか1つと比較して、特定のパーセント同一性を有するアミノ酸配列を含む。
2つの配列(例えば、アミノ酸配列または核酸配列)間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。2つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定例は、Karlin and Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264 2268(1990)のアルゴリズムであり、Karlin and Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873 5877(1993)のように修正される。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403(1990)のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれる。本明細書に記載の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、BLASTヌクレオチド検索を、例えば、スコア=100、ワード長=12に設定されたNBLASTヌクレオチドプログラムパラメーターで実施することができる。本明細書に記載のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、BLASTタンパク質検索を、例えば、スコア50、ワード長=3に設定されたXBLASTプログラムパラメーターで実施することができる。比較目的のギャップアラインメントを得るために、Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25:3389 3402(1997)に記載のギャップBLASTを利用することができる。あるいは、分子間の遠い関係を検出する反復検索を実施するために、PSI BLASTを使用することができる(同上)。BLAST、ギャップBLAST、及びPSI Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(例えば、XBLAST及びNBLAST)のデフォルトパラメーターを使用することができる(例えば、ワールドワイドウェブncbi.nlm.nih.govの国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)を参照)。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の非限定例は、Myers and Miller,CABIOS 4:11-17(1998)のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120重量残基表、12のギャップ長ペナルティ、及び4のギャップペナルティを使用することができる。ギャップを許容してまたは許容せずに、上記のものと同様の手法を使用して、2つの配列間のパーセント同一性を決定することができる。パーセント同一性の計算では、通常、完全一致のみがカウントされる。
いくつかの実施形態では、配列番号41~63及び183~185から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%のいずれか1つを有するVHHドメインを含む抗CD20単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも約75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性のいずれか1つを有するVHH配列は、参照配列に対する置換(例えば、保存的置換)、挿入、または欠失を含有するが、その配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体は、CD20に結合する能力を保持する。いくつかの実施形態では、配列番号41~63及び183~185から選択されるアミノ酸配列において、合計1~10のアミノ酸が置換、挿入及び/または欠失している。いくつかの実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、FR)で生じる。任意に、抗CD20単一ドメイン抗体は、配列番号41~63及び183~185から選択されるアミノ酸配列(その配列の翻訳後修飾を含む)を含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号41のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号43のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号45のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号46のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号48のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号49のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号50のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号51のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号52のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号53のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号54のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号56のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号57のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号58のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号59のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号60のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号61のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号62のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号63のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号183のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号184のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、配列番号185のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85
%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。
%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するVHHドメインを含み、単一ドメイン抗体が、CD20に結合する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗CD20単一ドメイン抗体との相互作用に必要なCD20タンパク質中のアミノ酸を同定するために、機能的エピトープを、例えば、コンビナトリアルアラニンスキャニングでマッピングすることができる。いくつかの実施形態では、CD20に結合している抗CD20単一ドメイン抗体の立体構造及び結晶構造は、エピトープを同定するために用いられてもよい。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で提供される抗CD20単一ドメイン抗体のいずれかと同じエピトープに特異的に結合する抗体を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、配列番号41のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号42のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号43のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号44のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号45のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号46のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号47のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号48のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号49のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号50のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号51のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号52のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号53のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号54のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号55のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号56のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号57のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号58のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号59のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号60のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号61のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号62のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号63のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号183のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号184のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号185のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗CD20単一ドメイン抗体のいずれかと競合して、CD20に特異的に結合する抗CD20抗体またはその抗原結合フラグメントが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、競合的結合は、ELISAアッセイを使用して決定されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、配列番号41のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号42のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号43のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号44のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号45のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号46のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号47のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号48のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号49のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号50のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号51のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号52のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号53のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号54のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号55のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号56のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号57のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号58のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号59のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号60のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号61のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号62のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号63のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号183のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号184のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号185のアミノ酸配列を含む抗CD20単一ドメイン抗体と競合して、CD20に特異的に結合する抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、上記の抗CD20単一ドメイン抗体のいずれか1つを含むCD20結合タンパク質が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、CD20結合タンパク質は、ラクダ科動物、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗CD20抗体は、抗体フラグメント、例えば、VHHフラグメントである。いくつかの実施形態では、抗CD20抗体は、IgG1またはIgG4などの任意の抗体クラスまたはアイソタイプのFc領域を含む全長重鎖のみの抗体である。いくつかの実施形態では、Fc領域は、エフェクター機能が低下または最小化されている。いくつかの実施形態では、CD20結合タンパク質は、本明細書で提供される抗CD20単一ドメイン抗体を含む融合タンパク質である。他の実施形態では、CD20結合タンパク質は、本明細書で提供される抗CD20単一ドメイン抗体を含む多重特異性抗体である。他の例示的なCD20結合分子は、以下のセクションでより詳細に記載される。
いくつかの実施形態では、上記の実施形態のいずれかによる抗CD20抗体(例えば、抗CD20単一ドメイン抗体)または抗原結合タンパク質は、以下のセクション5.2.2~5.2.7に記載されるように、特徴のいずれかを、単独でまたは組み合わせて組み込んでもよい。
5.2.2.ヒト化単一ドメイン抗体
本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、ヒト化単一ドメイン抗体を含む。ラクダ科種由来の単一ドメイン抗体をヒト化するための一般的な方策が記載されており(例えば、Vinckeetal.,J.Biol.Chem.,284(5):3273-3284(2009)を参照)、本明細書に開示のヒト化VHHドメインの産生に有用であってよい。ラクダ科種由来のヒト化単一ドメイン抗体の設計は、残基11、37、44、45、及び47(Kabatによる残基ナンバリング)などのVHHの特徴的な残基を含んでもよい(Muyldermans,Reviews Mol Biotech 74:277-302(2001))。
本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、ヒト化単一ドメイン抗体を含む。ラクダ科種由来の単一ドメイン抗体をヒト化するための一般的な方策が記載されており(例えば、Vinckeetal.,J.Biol.Chem.,284(5):3273-3284(2009)を参照)、本明細書に開示のヒト化VHHドメインの産生に有用であってよい。ラクダ科種由来のヒト化単一ドメイン抗体の設計は、残基11、37、44、45、及び47(Kabatによる残基ナンバリング)などのVHHの特徴的な残基を含んでもよい(Muyldermans,Reviews Mol Biotech 74:277-302(2001))。
限定されないが、以下を含む当該技術分野で既知の種々の手法を使用して、本明細書に開示のヒト化単一ドメイン抗体などのヒト化抗体を作製することもできる:CDR移植(欧州特許第EP239,400号;国際公開第WO91/09967号;ならびに米国特許第5,225,539号、同第5,530,101号、及び同第5,585,089号)、ベニアリングまたは再表面化(欧州特許第EP592,106号及び同第EP519,596号;Padlan,Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991);Studnicka et al.,Protein Engineering 7(6):805-814(1994);及びRoguska et al.,PNAS 91:969-973(1994))、チェーンシャッフリング(米国特許第5,565,332号)、ならびに、例えば、米国特許第6,407,213号、米国特許第5,766,886号、WO9317105、Tan et al.,J.Immunol.169:1119 25(2002)、Caldas et al.,Protein Eng.13(5):353-60(2000)、Morea et al.,Methods 20(3):267 79(2000)、Baca et al.,J.Biol.Chem.272(16):10678-84(1997)、Roguska et al.,Protein Eng.9(10):895 904(1996)、Couto et al.,Cancer Res.55(23 Supp):5973s-5977s(1995)、Couto et al.,Cancer Res.55(8):1717-22(1995),Sandhu JS,Gene 150(2):409-10(1994)、及びPedersen et al.,J.Mol.Biol.235(3):959-73(1994)に開示の手法。米国特許公開第2005/0042664A1号(2005年2月24日)(これらのそれぞれは、全体が参照により本明細書に組み込まれる)も参照のこと。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体は、ヒトCD20を含むCD20に結合するヒト化単一ドメイン抗体であり得る。例えば、本開示のヒト化単鎖抗体は、配列番号41~63及び183~185に記載の1つ以上のCDRを含んでもよい。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が当該技術分野で既知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された1つ以上のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「移入」残基と呼ばれ、これは、通常は「移入」可変ドメインから取得される。ヒト化は、例えば、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列に置換することによる、Jones et al.,Nature 321:522-25(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323-27(1988);及びVerhoeyen et al.,Science 239:1534-36(1988)の方法に従って実施されてもよい。特定の実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体のヒト化は、以下のセクション6に記載されるように実施される。
いくつかの場合では、ヒト化抗体は、CDR移植で構築され、親非ヒト抗体のCDRのアミノ酸配列がヒト抗体フレームワークに移植される。例えば、Padlan et al.により、CDR中の残基の約3分の1のみが、実際に抗原と接触することが決定され、これらを「特異性決定残基」またはSDRと呼ぶ(Padlan et al.,FASEB J.9:133-39(1995))。SDR移植の手法では、SDR残基のみが、ヒト抗体フレームワークに移植される(例えば、Kashmiri et al.,Methods 36:25-34(2005)を参照)。
ヒト化抗体の作製に使用されるヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減させるために重要であり得る。例えば、いわゆる「ベストフィット」法に従って、非ヒト抗体の可変ドメインの配列が、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。非ヒト抗体のヒト配列に最も近いものが、ヒト化抗体のヒトフレームワークとして選択されてもよい(Sims et al.,J.Immunol.151:2296-308(1993);及びChothia et al.,J.Mol.Biol.196:901-17(1987))。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体に使用されてもよい(Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-89(1992);及びPresta et al.,J.Immunol.151:2623-32(1993))。いくつかの場合では、フレームワークは、最も豊富なヒトサブクラスVL6サブグループI(VL6I)、及びVHサブグループIII(VHIII)のコンセンサス配列に由来する。別の方法では、ヒト生殖系列遺伝子は、フレームワーク領域の供給源として使用される。
超ヒト化と呼ばれるCDRの比較に基づく別のパラダイムでは、FRの相同性は、無関係である。方法は、非ヒト配列と機能的なヒト生殖系列遺伝子レパートリーとの比較からなる。次に、マウス配列と同じまたは密接に関連するカノニカル構造をコードする遺伝子が選択される。次に、非ヒト抗体と、カノニカル構造を共有する遺伝子中で、CDR内で相同性が最も高い遺伝子がFRドナーとして選択される。最後に、非ヒトCDRをこれらのFRに移植する(例えば、以下を参照:Tan et al.,J.Immunol.169:1119-25(2002))。
さらに一般には、抗原に対する親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持して、抗体がヒト化されることが望ましい。この目標を達成するために、ある方法によれば、親及びヒト化配列の3次元モデルを使用した、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析プロセスにより、ヒト化抗体を調製する。3次元免疫グロブリンモデルは、一般に、入手可能であり、当業者らによく知られる。選択された候補免疫グロブリン配列の予想される3次元立体配座構造を図示及び表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらは、例えば、WAM(Whitelegg and Rees,Protein Eng.13:819-24(2002))、Modeller(Sali and Blundell,J.Mol.Biol.234:779-815(1993))、及びSwiss PDB Viewer(Guex and Peitsch,Electrophoresis 18:2714-23(1997))を含む。これらの表示を調査することにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性がある役割の分析、例えば、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析、が可能になる。このようにして、標的抗原(複数可)に対する親和性の増加などの所望の抗体特性が達成されるように、FR残基をレシピエント及び移入配列から選択して組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合への影響に直接且つ最も実質的に関与する。
抗体をヒト化する別の方法は、ヒト鎖含量(Human String Content)(HSC)と呼ばれる抗体のヒト性の測定基準に基づいている。この方法は、マウス配列をヒト生殖系列遺伝子のレパートリーと比較し、その違いがHSCとして点数化される。次に、標的配列は、複数の多様なヒト化バリアントを生成するためにグローバル同一性尺度を使用する代わりに、HSCを最大化することにより、ヒト化される(Lazar et al.,Mol.Immunol.44:1986-98(2007))。
上記の方法に加えて、実験的方法は、ヒト化抗体を生成及び選択するために使用されてもよい。これらの方法は、ヒト化バリアントの大規模ライブラリーの生成及び濃縮技術またはハイスループットスクリーニング手法を使用した最良のクローンの選択に基づくものを含む。抗体バリアントは、ファージ、リボソーム、及び酵母ディスプレイライブラリーから、ならびに細菌コロニースクリーニングにより単離され得る(例えば、以下を参照:Hoogenboom,Nat.Biotechnol.23:1105-16(2005);Dufner et al.,Trends Biotechnol.24:523-29(2006);Feldhaus et al.,Nat.Biotechnol.21:163-70(2003);及びSchlapschy et al.,Protein Eng.Des.Sel.17:847-60(2004))。
FRライブラリーアプローチでは、残基バリアントのコレクションがFRの特定の位置に導入され、続いて、移植されたCDRを最もよくサポートするFRを選択するために、ライブラリーをスクリーニングする。置換されるべき残基は、CDR構造に潜在的に寄与すると確認された「Vernier」残基の一部または全部(例えば、以下を参照:Foote and Winter,J.Mol.Biol.224:487-99(1992))、またはBaca et al.J.Biol.Chem.272:10678-84(1997)により同定された標的残基のより制限されたセット由来のものを含み得る。
FRシャッフリングでは、選択された残基バリアントのコンビナトリアルライブラリーを作成する代わりに、FR全体が非ヒトCDRと組み合わされる(例えば、Dall’Acqua et al.,Methods 36:43-60(2005)を参照)。ワンステップFRシャッフルプロセスが、使用されてもよい。得られた抗体は、発現の増強、親和性の増加、及び熱安定性を含む改善された生化学的及び物理化学的特性を示したので、そのようなプロセスは、効率的であることが示されている(例えば、Damschroder et al.,Mol.Immunol.44:3049-60(2007)を参照)。
「ヒューマニアリング」法は、必須最小特異性決定因子(MSD)の実験的同定に基づいており、非ヒトフラグメントをヒトFRのライブラリーに順次置換し、結合を評価することに基づいている。この方法論は、通常、異なるヒトVセグメントCDRを有する複数のサブクラスからの抗体のエピトープ保持及び同定をもたらす。
「ヒト工学」法は、ヒトの免疫原性を低減させた(それにもかかわらず、元の非ヒト抗体のその望ましい結合特性を保持する)改変抗体を産生するために、抗体のアミノ酸配列に特定の変更を加えることにより、非ヒト抗体または抗体フラグメントを変更することを含む。一般に、この手法は、非ヒト抗体のアミノ酸残基を、「低リスク」、「中リスク」、または「高リスク」残基として分類することを含む。置換が結果として生じる抗体の折りたたみに影響を与えるリスクに対して、特定の置換(例えば、ヒトの免疫原性)を行うことの予測される利益を評価する全体的なリスク/リワード計算を使用して、分類が行われる。非ヒト抗体の可変領域由来のアミノ酸配列を、特定のまたはコンセンサスヒト抗体配列の対応する領域とアラインすることにより、非ヒト抗体配列の所与の位置(例えば、低リスクまたは中リスク)で置換されるべき特定のヒトアミノ酸残基を選択することができる。アラインメントに従って、非ヒト配列の低リスクまたは中リスク位置のアミノ酸残基を、ヒト抗体配列の対応する残基と置換することができる。ヒト操作されたタンパク質の作製手法は、Studnicka et al.Protein Engineering 7:805-14(1994);米国特許第5,766,886号;同第5,770,196号;同第5,821,123号;及び同第5,869,619号;ならびにPCT公開WO93/11794に詳細に記載される。
例えば、Composite Human Antibody(商標)技術(AntitopeLtd.、Cambridge、United Kingdom)を使用して、複合ヒト抗体を生成することができる。複合ヒト抗体を生成するために、可変領域配列は、T細胞エピトープを回避する方法で複数のヒト抗体可変領域配列のフラグメントから設計され、それにより、得られる抗体の免疫原性が最小限に抑えられる。
脱免疫化抗体は、T細胞エピトープが除去されている抗体である。脱免疫化抗体を作製する方法が記載されている。例えば、Jones et al.,Methods Mol Biol.525:405-23(2009),xiv,and De Groot et al.,Cell.Immunol.244:148-153(2006)を参照のこと。脱免疫化抗体は、T細胞エピトープ枯渇可変領域及びヒト定常領域を含む。要約すると、抗体の可変領域がクローン化され、その後、T細胞エピトープが、T細胞増殖アッセイで抗体の可変領域に由来する重複ペプチドを試験することにより同定される。T細胞エピトープは、ヒトMHCクラスIIに結合するペプチドを同定するインシリコ法により同定される。ヒトMHCクラスIIへの結合を無効にするために、変異が可変領域に導入される。次に、変異可変領域は、脱免疫化抗体を生成するために利用される。
5.2.3.単一ドメイン抗体バリアント
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のCD20に結合する単一ドメイン抗体のアミノ酸配列修飾(複数可)が企図される。例えば、限定されないが、特異性、熱安定性、発現レベル、エフェクター機能、グリコシル化、免疫原性の低減、または溶解性を含む、抗体の結合親和性及び/または他の生物学的特性を最適化することが望ましいことある。従って、本明細書に記載のCD20に結合する単一ドメイン抗体に加えて、本明細書に記載のCD20に結合する単一ドメイン抗体のバリアントを調製することができることが企図される。例えば、適切なヌクレオチド変化をコードDNAに導入することにより、及び/または所望の抗体もしくはポリペプチドの合成により、単一ドメイン抗体バリアント調製することができる。当業者らは、アミノ酸変化が単一ドメイン抗体の翻訳後プロセスを変化させ得ることを認識する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のCD20に結合する単一ドメイン抗体のアミノ酸配列修飾(複数可)が企図される。例えば、限定されないが、特異性、熱安定性、発現レベル、エフェクター機能、グリコシル化、免疫原性の低減、または溶解性を含む、抗体の結合親和性及び/または他の生物学的特性を最適化することが望ましいことある。従って、本明細書に記載のCD20に結合する単一ドメイン抗体に加えて、本明細書に記載のCD20に結合する単一ドメイン抗体のバリアントを調製することができることが企図される。例えば、適切なヌクレオチド変化をコードDNAに導入することにより、及び/または所望の抗体もしくはポリペプチドの合成により、単一ドメイン抗体バリアント調製することができる。当業者らは、アミノ酸変化が単一ドメイン抗体の翻訳後プロセスを変化させ得ることを認識する。
化学修飾
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体は、例えば、単一ドメイン抗体への任意のタイプの分子の共有結合により、化学修飾される。抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護/遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドもしくは他のタンパク質への結合、または1つ以上の免疫グロブリンドメイン(例えば、FcまたはFcの一部)へのコンジュゲーションにより化学修飾された抗体を含んでもよい。多数の化学修飾のいずれもが、限定されないが、特定の化学的切断、アセチル化、製剤化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む既知の手法により実施され得る。さらに、抗体は、1つ以上の非古典的アミノ酸を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体は、例えば、単一ドメイン抗体への任意のタイプの分子の共有結合により、化学修飾される。抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護/遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドもしくは他のタンパク質への結合、または1つ以上の免疫グロブリンドメイン(例えば、FcまたはFcの一部)へのコンジュゲーションにより化学修飾された抗体を含んでもよい。多数の化学修飾のいずれもが、限定されないが、特定の化学的切断、アセチル化、製剤化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む既知の手法により実施され得る。さらに、抗体は、1つ以上の非古典的アミノ酸を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように変更される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、1つ以上のグリコシル化部位が作成または除去されるようにアミノ酸配列を変更することにより都合よく達成され得る。
本明細書で提供される単一ドメイン抗体がFc領域に融合される場合、それに結合する炭水化物が変更され得る。哺乳動物細胞により産生される天然抗体は、通常は、Fc領域のCH2ドメインのAsn297にN結合で一般に結合している分岐、二分岐オリゴ糖を含む。例えば、以下を参照:Wright et al.TIBTECH 15:26-32(1997)。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース、及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」内のGlcNAcに結合しているフコースを含んでもよい。いくつかの実施形態では、特定の改善された特性を有するバリアントを作成するために、本明細書で提供される結合分子中のオリゴ糖の修飾がなされ得る。
他の実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体がFc領域に融合している場合、本明細書で提供される抗体バリアントは、該Fc領域に(直接的または間接的に)結合しているフコースを欠く炭水化物構造を有してもよい。例えば、そのような抗体中のフコースの量は、1%~80%、1%~65%、5%~65%、または20%~40%であり得る。例えば、WO2008/077546に記載されるように、Asn297に結合している全ての糖構造(例えば、複合、ハイブリッド、及び高マンノース構造)の合計に対する、Asn297の糖鎖内のフコースの平均量を計算することにより、フコースの量を決定した(MALDI-TOF質量分析法で測定)。Asn297は、Fc領域内の約297位(Fc領域残基のEUナンバリング)に位置するアスパラギン残基を指すが、Asn297は、抗体のわずかな配列変動により、297位の上流または下流の約±3アミノ酸、すなわち、294~300位間、に位置する可能性もある。このようなフコシル化バリアントは、ADCC機能を改善していることがある。例えば、米国特許公開第US2003/0157108号及び第US2004/0093621号を参照のこと。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体バリアントに関連する刊行物の例としては、US2003/0157108;WO2000/61739;WO2001/29246;US2003/0115614;US2002/0164328;US2004/0093621;US2004/0132140;US2004/0110704;US2004/0110282;US2004/0109865;WO2003/085119;WO2003/084570;WO2005/035586;WO2005/035778;WO2005/053742;WO2002/031140;Okazaki et al.J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614(2004)が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生可能な細胞株の例としては、以下が挙げられる:タンパク質のフコシル化が欠損したLec13 CHO細胞(Ripka et al.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986);米国特許出願第US2003/0157108号;及びWO2004/056312、特に、実施例11)、ならびに、ノックアウト細胞株、例えば、α-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、FUT8、ノックアウトCHO細胞(例えば、以下を参照:Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614(2004);Kanda,Y.et al.,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006);及びWO2003/085107)。
本明細書で提供される単一ドメイン抗体を含む結合分子は、さらに、バイセクト型オリゴ糖と共に提供され、例えば、Fc領域に結合している二分岐オリゴ糖が、GlcNAcによりバイセクティングされる。そのようなバリアントは、フコシル化の低減及び/またはADCC機能の改善を有することがある。そのようなバリアントの例は、例えば、WO2003/011878(Jean-Mairet et al.)米国特許第6,602,684号(Umana et al.);及びUS2005/0123546(Umana et al.)に記載される。Fc領域に結合しているオリゴ糖中の少なくとも1つのガラクトース残基を有するバリアントも提供される。そのようなバリアントは、CDC機能を改善していることがある。そのようなバリアントは、例えば、WO1997/30087、WO1998/58964、及びWO1999/22764に記載される。
本単一ドメイン抗体及びFc領域を含む分子では、1つ以上のアミノ酸修飾は、Fc領域に導入され、それにより、Fc領域バリアントが生成され得る。Fc領域バリアントは、1つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾(例えば、置換)を含むヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4Fc領域)を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本出願は、全てではないがいくつかのエフェクター機能を保有するバリアントについて検討し、これにより、それが、in vivoでの結合分子の半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能(例えば、補体及びADCC)が不要または有害である用途のための望ましい候補になる。CDC及び/またはADCC活性の低減/枯渇を確認するために、In vitro及び/またはin vivo細胞傷害性アッセイを行うことができる。例えば、結合分子が、FcγR結合を欠く(従って、ADCC活性を欠いている可能性が高い)が、FcRn結合能力を保持することを確認するために、Fc受容体(FcR)結合アッセイを行うことができる。目的の分子のADCC活性を評価するためのin vitroアッセイの非限定例は、以下に記載される:米国特許第5,500,362号(例えば、以下を参照:Hellstrom,I.et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))及びHellstrom,I et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985);5,821,337(以下を参照:Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。あるいは、非放射性アッセイ法が使用されてもよい(例えば、以下を参照:フローサイトメトリーのためのACTI(商標)非放射性細胞傷害性アッセイ(CellTechnology,Inc.、ウィスコンシン州マディソン)及びCytoTox96(登録商標)非放射性細胞傷害性アッセイ(Promega、ウィスコンシン州マディソン))。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(PBMC)及びナチュラルキラー(NK)細胞を含む。代替的または追加的に、目的の分子のADCC活性は、in vivoで、例えば、Clynes et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)で開示されるような動物モデルで評価され得る。抗体がC1qに結合できず、従って、CDC活性を欠くことを確認するために、C1q結合アッセイも行われ得る。例えば、以下を参照:WO2006/029879及びWO2005/100402のC1q及びC3c結合ELISA。補体活性化を評価するために、CDCアッセイが実施され得る(例えば、以下を参照:Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996);Cragg,M.S.et al.,Blood 101:1045-1052(2003);及びCragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。当該技術分野で既知の方法を使用して、FcRn結合及びin vivoクリアランス/半減期の決定も実施することができる(例えば、以下を参照:Petkova,S.B.et al.,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
エフェクター機能が低減した結合分子は、Fc領域残基238、265、269、270、297、327、及び329のうちの1つ以上の置換を有するものを含む(米国特許第6,737,056号)。そのようなFc変異体は、アミノ酸位置265、269、270、297、及び327の2つ以上の置換を有するFc変異体を含み、これは、残基265及び297のアラニンへの置換を有する、いわゆる「DANA」Fc変異体を含む(米国特許第7,332,581号)。
FcRへの結合が改善または減少した特定のバリアントが記載される。(例えば、以下を参照:米国特許第6,737,056号;WO2004/056312、及びShields et al.,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
いくつかの実施形態では、バリアントは、ADCCを改善する1つ以上のアミノ酸置換、例えば、Fc領域の298位、333位、及び/または334位(残基のEUナンバリング)の置換、を有するFc領域を含む。いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第6,194,551号、WO99/51642及びIdusogie et al.J.Immunol.164:4178-4184(2000)に記載されるように、C1q結合及び/または補体依存性細胞傷害(CDC)の変更(すなわち、改善または減少)をもたらす変更がFc領域でなされる。
母体のIgGの胎児への移行に関与する、半減期が増加し且つ新生児Fc受容体(FcRn)への結合が改善された結合分子(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)及びKim et al.,J.Immunol.24:249(1994))は、US2005/0014934A1(Hinton et al.)に記載される。これらの分子は、FcRnへのFc領域の結合を改善する1つ以上の置換を含むFc領域を含む。そのようなFcバリアントとしては、Fc領域残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、または434のうちの1つ以上に置換、例えば、Fc領域残基434の置換を有するもの、が挙げられる(米国特許第7,371,826号)。Fc領域バリアントの他の例については、Duncan & Winter,Nature 322:738-40(1988);米国特許第5,648,260号、米国特許第5,624,821号、及びWO94/29351。
いくつかの実施形態では、システイン操作された抗体を作製することが望ましいことがあり、抗体の1つ以上の残基がシステイン残基で置換される。いくつかの実施形態では、置換残基は、抗体の接近可能な部位に存在する。さらに本明細書で記載されるように、イムノコンジュゲートを作成するために、これらの残基をシステインで置換し、それにより、反応性チオール基が抗体のアクセス可能な部位に配置され、これは、他の部分、例えば、薬物部分またはリンカー-薬物部分、に抗体をコンジュゲートするために使用されてもよい。
置換、欠失、または挿入
変化は、元の抗体またはポリペプチドと比較してアミノ酸配列の変化をもたらす、単一ドメイン抗体またはポリペプチドをコードする1つ以上のコドンの置換、欠失、または挿入であってよい。置換変異導入の目的の部位は、CDR及びFRを含む。
変化は、元の抗体またはポリペプチドと比較してアミノ酸配列の変化をもたらす、単一ドメイン抗体またはポリペプチドをコードする1つ以上のコドンの置換、欠失、または挿入であってよい。置換変異導入の目的の部位は、CDR及びFRを含む。
アミノ酸置換は、あるアミノ酸を、類似の構造的及び/または化学的性質を有する別のアミノ酸で置換すること、例えば、ロイシンをセリンで置換すること、例えば、保存的アミノ酸置換、の結果であり得る。本明細書で提供される分子をコードするヌクレオチド配列に変異を導入するために、例えば、アミノ酸置換をもたらす部位特異的変異導入及びPCR媒介変異導入を含む当業者らに既知の標準的手法を使用することができる。挿入または欠失は、任意に、約1~5個のアミノ酸の範囲であり得る。特定の実施形態では、置換、欠失、または挿入は、元の分子と比較して、25未満のアミノ酸置換、20未満のアミノ酸置換、15未満のアミノ酸置換、10未満のアミノ酸置換、5未満のアミノ酸置換、4未満のアミノ酸置換、3未満のアミノ酸置換、または2未満のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、置換は、1つ以上の予測される非必須アミノ酸残基で行われる保存的アミノ酸置換である。配列中のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を体系的に行い、得られたバリアントを親抗体により示される活性について試験することにより、許容された変化が決定されてもよい。
アミノ酸配列の挿入は、1残基から、複数の残基を含むポリペプチドまでの長さのアミノ末端及び/またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、N末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。
保存的アミノ酸置換で生成された単一ドメイン抗体は、本開示に含まれる。保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基は、同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置換される。上記のように、同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。あるいは、例えば、飽和変異導入などにより、コード配列の全部または一部に沿ってランダムに、変異を導入することができ、活性を保持する変異体を同定するために、生物学的活性についてスクリーニングすることができる。変異導入後、コードされたタンパク質を発現させることができ、タンパク質の活性を決定することができる。特性を維持するか、または有意に変化させないように、保存的(例えば、類似の特性及び/または側鎖を有するアミノ酸群内で)置換が行われてもよい。例示的置換が以下の表3に示される。
アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性に従ってグループ化されてもよい(例えば、Lehninger,Biochemistry 73-75(2d ed.1975)を参照):(1)非極性:Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M);(2)非荷電極性:Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q);(3)酸性:Asp(D)、Glu(E);及び、(4)塩基性:Lys(K)、Arg(R)、His(H)。あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、以下の群に分けられてもよい:(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;(3)酸性:Asp、Glu;(4)塩基性:His、Lys、Arg;(5)鎖の配向に影響を与える残基:Gly、Pro;及び、(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。例えば、単一ドメイン抗体の適切な立体配座の維持に関与していない任意のシステイン残基は、また、分子の酸化安定性を改善し且つ異常な架橋を防ぐために、別のアミノ酸、例えば、アラニンまたはセリン、で置換されてもよい。非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを、別のクラスに交換する必要がある。
置換バリアントの1つのタイプは、親抗体(例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体)の1つ以上の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる研究のために選択された得られたバリアント(複数可)は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性(例えば、親和性の増加、免疫原性の減少)において改変(例えば、改善)を有し、及び/または、親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持することになる。例示的な置換バリアントは、親和性成熟抗体であり、これは、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイベースの親和性成熟手法を使用して、簡便に生成されてもよい。要約すると、1つ以上のCDR残基が、変異し、バリアント抗体が、ファージ上に提示され、特定の生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。
例えば、抗体親和性を改善するために、CDRにおいて、改変(例えば、置換)が行われてもよい。そのような改変は、CDR「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされる残基(例えば、Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008)を参照)、及び/またはSDR(α-CDR)において行われてもよく、得られたバリアント抗体またはそのフラグメントは、結合親和性について試験される。2次ライブラリーの構築及び再選択による親和性成熟は、例えば、Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,(2001))のHoogenboom et al.に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、様々な方法(例えば、エラープローンPCR、チェーンシャッフリング、またはオリゴヌクレオチド特異的変異導入)のいずれかにより、成熟について選択された可変遺伝子に多様性が導入される。次に、2次ライブラリーが作成される。次に、ライブラリーは、所望の親和性を有する任意の抗体バリアントを同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法は、いくつかのCDR残基(例えば、一度に4~6残基)がランダム化されるCDR特異的アプローチを含む。抗原結合に関与するCDR残基は、例えば、アラニンスキャニング変異導入またはモデリングを使用して、特異的に同定されてもよい。親和性成熟に関するより詳細な説明は、以下のセクションで提供される。
いくつかの実施形態では、抗体が抗原に結合する能力を、そのような改変が実質的に低減させない限り、置換、挿入、または欠失は、1つ以上のCDR内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変(例えば、本明細書で提供される保存的置換)がCDRで行われてもよい。本明細書で提供されるバリアントVHH配列のいくつかの実施形態では、各CDRは、変更されていないか、または1つ、2つもしくは3つ以下のアミノ酸置換を含有する。
変異導入の標的となり得る抗体の残基または領域の同定に有用な方法は、Cunningham and Wells,Science,244:1081-1085(1989)に記載される「アラニンスキャニング変異導入」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基または群(例えば、荷電残基、例えば、Arg、Asp、His、Lys、及びGlu)が同定され、中性または、抗原の抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判定するために、負荷電アミノ酸(例えば、アラニンもしくはポリアラニン)で置換される。最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置にさらなる置換が導入されてもよい。代替的または追加的に、抗体及び抗原間の接触点を同定するための抗原-抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされてもまたは排除されてもよい。バリアントは、それらが所望の特性を含有するかどうかを決定するためにスクリーニングされてもよい。
アミノ酸配列の挿入には、1残基から、100残基以上を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び/またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、N末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントには、抗体のN末端またはC末端に酵素(例えば、ADEPTの場合)または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドを融合することを含む。
オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)変異導入、アラニンスキャニング、及びPCR変異導入などの当該技術分野で既知の方法を使用して、変化をもたらすことができる。単一ドメイン抗体バリアントDNAを生成するために、部位特異的変異導入(例えば、Carter,Biochem J.237:1-7(1986);及びZoller et al.,Nucl.Acids Res.10:6487-500(1982)を参照)、カセット変異導入(例えば、Wells et al.,Gene 34:315-23(1985)を参照)、または他の既知の手法を、クローン化DNAに実施することができる。
5.2.4.in vitro親和性成熟
いくつかの実施形態では、親抗体と比較して、親和性、安定性、または発現レベルなどの特性が改善された抗体バリアントが、in vitro親和性成熟により調製されてもよい。自然のプロトタイプと同様に、in vitro親和性成熟は、変異及び選択の原則に基づく。抗体のライブラリーは、生物(例えば、ファージ、細菌、酵母、もしくは哺乳動物細胞)の表面上に、またはそれらのコードmRNAまたはDNAと(例えば、共有結合的または非共有結合的に)会合して提示される。表示された抗体の親和性選択により、抗体をコードする遺伝情報を運ぶ生物または複合体の分離が可能になる。ファージディスプレイなどのディスプレイ法を使用した2回または3回の変異及び選択により、通常、低ナノモル範囲の親和性を有する抗体フラグメントがもたらされる。親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモルまたはさらにピコモルの親和性を有し得る。
いくつかの実施形態では、親抗体と比較して、親和性、安定性、または発現レベルなどの特性が改善された抗体バリアントが、in vitro親和性成熟により調製されてもよい。自然のプロトタイプと同様に、in vitro親和性成熟は、変異及び選択の原則に基づく。抗体のライブラリーは、生物(例えば、ファージ、細菌、酵母、もしくは哺乳動物細胞)の表面上に、またはそれらのコードmRNAまたはDNAと(例えば、共有結合的または非共有結合的に)会合して提示される。表示された抗体の親和性選択により、抗体をコードする遺伝情報を運ぶ生物または複合体の分離が可能になる。ファージディスプレイなどのディスプレイ法を使用した2回または3回の変異及び選択により、通常、低ナノモル範囲の親和性を有する抗体フラグメントがもたらされる。親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモルまたはさらにピコモルの親和性を有し得る。
ファージディスプレイは、抗体のディスプレイ及び選択のための広範な方法である。抗体は、バクテリオファージコートタンパク質への融合物としてFdまたはM13バクテリオファージの表面に表示される。選択は、ファージに提示された抗体が標的に結合できるようにするための抗原への曝露を含み、このプロセスは、「パニング」と呼ばれる。さらなる選択ラウンドのために、抗原に結合しているファージを回収し、これを使用し、バクテリアに感染させて、ファージを得る。概説については、例えば、以下を参照:Hoogenboom,Methods.Mol.Biol.178:1-37(2002);及びBradbury and Marks,J.Immunol.Methods 290:29-49(2004)。
酵母ディスプレイシステム(例えば、Boder et al.,Nat.Biotech.15:553-57(1997);及びChao et al.,Nat.Protocols 1:755-68(2006)を参照)では、抗体は、酵母凝集素タンパク質Aga2pの接着サブユニットに融合されてもよく、これは、Aga1pへのジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に結合する。Aga2pを介したタンパク質のディスプレイは、タンパク質を細胞表面から突出し、酵母細胞壁上の他の分子との潜在的な相互作用を最小限に抑える。磁気分離及びフローサイトメトリーは、ライブラリーをスクリーニングし、親和性または安定性が向上した抗体を選択するために使用される。目的の可溶性抗原への結合は、ビオチン化抗原及び蛍光体にコンジュゲートされた2次試薬、例えば、ストレプトアビジンで、酵母を標識することにより決定される。抗体の表面発現の変化は、単鎖抗体(例えば、scFv)に隣接するヘマグルチニンまたはc-Mycエピトープタグのいずれかの免疫蛍光標識で測定することができる。発現は、提示されたタンパク質の安定性と相関することが示されており、それにより、安定性及び親和性を改善するために、抗体を選択することができる(例えば、Shusta et al.,J.Mol.Biol.292:949-56(1999)を参照)。酵母ディスプレイの追加の利点は、小胞体シャペロン及び品質管理機序を利用して、提示されたタンパク質が真核酵母細胞の小胞体で折りたたまれることである。成熟が完了すると、酵母の表面に提示される間、抗体親和性を簡便に「滴定」することができ、これにより、各クローンの発現及び精製の必要がなくなる。酵母の表面提示の理論的な制限は、機能ライブラリーサイズが他の提示方法のサイズよりも小さい可能性があるが、最近のアプローチは、酵母細胞の配偶システムを使用して、サイズが1014であると推定されるコンビナトリアル多様性が生じる(例えば、米国特許公開第2003/0186374号;及びBlaise et al.,Gene 342:211-18(2004)を参照)。
リボソームディスプレイでは、無細胞系での選択のために抗体-リボソーム-mRNA(ARM)複合体が生成される。抗体の特定のライブラリーをコードするDNAライブラリーは、終止コドンを欠くスペーサー配列に遺伝的に融合される。このスペーサー配列は、翻訳された場合、依然として、ペプチジルtRNAに結合しており、リボソームトンネルを占有し、それにより、目的のタンパク質がリボソームから突き出て、折りたたまれることが可能になる。得られたmRNA、リボソーム、及びタンパク質の複合体は、表面に結合したリガンドに結合し得、これにより、リガンドを用いるアフィニティーキャプチャーにより、抗体及びそのコードmRNAを同時に単離することが可能である。次に、リボソーム結合mRNAは、逆転写されてcDNAに戻り、次に、変異導入を受け、次の選択ラウンドで使用することができる(例えば、Fukuda et al.,Nucleic Acids Res.34:e127(2006)を参照)。mRNAディスプレイでは、ピューロマイシンをアダプター分子として使用して、抗体及びmRNA間の共有結合が確立される(Wilson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:3750-55(2001))。
これらの方法は、完全にin vitroで実施されるので、他の選択技術に優る2つの主な利点がある。まず、ライブラリーの多様性は、細菌細胞の形質転換効率により制限されるのではなく、試験管内に存在するリボソーム及び異なるmRNA分子の数によってのみ制限される。次に、任意の多様化ステップの後にライブラリーを変換する必要がないため、例えば、非校正ポリメラーゼにより、各選択ラウンドの後にランダムな変異を簡単に導入することができる。
いくつかの実施形態では、哺乳動物のディスプレイシステムが使用されてもよい。
多様性は、また、標的指向性の方法で、またはランダムな導入を介して、抗体ライブラリーのCDRに導入され得る。前者のアプローチは、高レベルまたは低レベルの変異導入を介して抗体の全てのCDRを連続的に標的にすること、あるいは体細胞超変異の単離されたホットスポット(例えば、Ho et al.,J.Biol.Chem.280:607-17(2005))または実験的根拠もしくは構造上の理由で親和性に影響を与えると疑われる残基を標的にすることを含む。多様性は、また、DNAシャッフリングまたは同様の手法を介して自然に多様である領域の置換により導入され得る(例えば、Lu et al.,J.Biol.Chem.278:43496-507(2003);米国特許第5,565,332号及び同第6,989,250号を参照)。代替手法は、フレームワーク領域残基に伸びる超可変ループを標的とし(例えば、Bond et al.,J.Mol.Biol.348:699-709(2005)を参照)、CDR内のループ欠失及び挿入を用いるか、または、ハイブリダイゼーションベースの多様性を使用する(例えば、米国特許公開第2004/0005709号を参照)。CDRにおいて多様性を生成する追加の方法は、例えば、米国特許第7,985,840号に開示される。抗体ライブラリー及び/または抗体親和性成熟を生成するために使用することができるさらなる方法は、例えば、米国特許第8,685,897号及び同第8,603,930号、ならびに米国公開第2014/0170705号、同第2014/0094392号、同第2012/0028301号、同第2011/0183855号、及び同第2009/0075378号に開示され、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
ライブラリーのスクリーニングは、当該技術分野で既知の様々な技術により達成することができる。例えば、単一ドメイン抗体を、固体支持体、カラム、ピン、もしくはセルロース/ポリ(フッ化ビニリデン)膜/他のフィルターに固定するか、吸着プレートに固定された宿主細胞上で発現させるか、または細胞選別に使用するか、または、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズを用いた捕捉のためにビオチンにコンジュゲートするか、またはディスプレイライブラリーをパニングするための任意の他の方法で使用することができる。
in vitro親和性成熟方法の概説については、例えば、Hoogenboom,Nature Biotechnology 23:1105-16(2005);Quiroz and Sinclair,Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51(2010);及びそれらの中の参考文献を参照のこと。
5.2.5.単一ドメイン抗体の修飾
単一ドメイン抗体の共有結合修飾は、本開示の範囲内に含まれる。共有結合修飾は、単一ドメイン抗体の標的アミノ酸残基を、有機誘導体化剤と反応させることを含む。この有機誘導体化剤は、選択された側鎖または単一ドメイン抗体のNもしくはC末端残基と反応可能である。他の修飾は、それぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基へのグルタミニル及びアスパラギニル残基の脱アミド化、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化(例えば、以下を参照:Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties 79-86(1983))、N末端アミンのアセチル化、ならびに任意のC末端カルボキシル基のアミド化、を含む。
単一ドメイン抗体の共有結合修飾は、本開示の範囲内に含まれる。共有結合修飾は、単一ドメイン抗体の標的アミノ酸残基を、有機誘導体化剤と反応させることを含む。この有機誘導体化剤は、選択された側鎖または単一ドメイン抗体のNもしくはC末端残基と反応可能である。他の修飾は、それぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基へのグルタミニル及びアスパラギニル残基の脱アミド化、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化(例えば、以下を参照:Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties 79-86(1983))、N末端アミンのアセチル化、ならびに任意のC末端カルボキシル基のアミド化、を含む。
本開示の範囲内に含まれる単一ドメイン抗体の他のタイプの共有結合修飾は、以下を含む:上記の抗体またはポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更(例えば、以下を参照:Beck et al.,Curr.Pharm.Biotechnol.9:482-501(2008);及びWalsh,Drug Discov.Today 15:773-80(2010))、ならびに、例えば、米国特許第4,640,835号、第4,496,689号、第4,301,144号、第4,670,417号、第4,791,192号、または第4,179,337号に記載の方法で、様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンのうちの1つに抗体を結合させること。本開示のCD20に結合する単一ドメイン抗体はまた、半減期を延長し、及び/または既知のFc媒介性エフェクター機能を付与するために、1つ以上の免疫グロブリン定常領域またはその一部(例えば、Fc)に遺伝的に融合またはコンジュゲートされ得る。
本開示のCD20に結合する単鎖抗体は、また、以下に融合されたCD20に結合する単鎖抗体を含むキメラ分子を形成するように修飾され得る:別の異種ポリペプチドもしくはアミノ酸配列、例えば、エピトープタグ(例えば、以下を参照:Terpe,Appl.Microbiol.Biotechnol.60:523-33(2003))またはIgG分子のFc領域(例えば、以下を参照:Aruffo,Antibody Fusion Proteins 221-42(Chamow and Ashkenazi eds.,1999)。CD20に結合する単鎖抗体は、また、以下でより詳細に記載されるように、CD20結合キメラ抗原受容体(CAR)を得るために使用されてもよい。
また、本開示のCD20に結合する単鎖抗体及び異種ポリペプチドを含む融合タンパク質も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗体が遺伝子的に融合または化学的にコンジュゲートされる異種ポリペプチドは、細胞表面発現CD20を有する細胞へ抗体を標的指向させるのに有用である。
CD20抗原に結合する抗体のパネルも本明細書で提供される。特定の実施形態では、抗体のパネルは、異なる会合速度、異なる解離速度、CD20抗原に対する異なる親和性、及び/またはCD20抗原に対する異なる特異性を有する。いくつかの実施形態では、パネルは、約10~約1000以上の抗体を含むか、またはそれらからなる。抗体のパネルを、例えば、96ウェルまたは384ウェルプレートでの、ELISAなどのアッセイに使用することができる。
5.2.6.単一ドメイン抗体の調製
単一ドメイン抗体を調製する方法が記載されている。例えば、Els Pardon et al,Nature Protocol,9(3):674(2014)を参照のこと。単一ドメイン抗体(例えば、VHH)は、当該技術分野で既知の方法を使用して、例えば、ラクダ科動物種(例えば、ラクダもしくはラマ)に免疫をして、そこからハイブリドーマを取得することにより、または当該技術分野で既知分子生物学的手法を使用して単一ドメイン抗体のライブラリーをクローニングし、続いて、選択されていないライブラリーの個々のクローンを用いたELISA、もしくはファージディスプレイの使用より選択することにより、取得され得る。
単一ドメイン抗体を調製する方法が記載されている。例えば、Els Pardon et al,Nature Protocol,9(3):674(2014)を参照のこと。単一ドメイン抗体(例えば、VHH)は、当該技術分野で既知の方法を使用して、例えば、ラクダ科動物種(例えば、ラクダもしくはラマ)に免疫をして、そこからハイブリドーマを取得することにより、または当該技術分野で既知分子生物学的手法を使用して単一ドメイン抗体のライブラリーをクローニングし、続いて、選択されていないライブラリーの個々のクローンを用いたELISA、もしくはファージディスプレイの使用より選択することにより、取得され得る。
本明細書で提供される単一ドメイン抗体は、単一ドメイン抗体をコードする核酸を含有するベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を培養することにより産生されてもよい。本開示の抗体のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組み換え手法を使用して取得することができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞またはB細胞などの抗体産生細胞から単離及びシーケンシングされてもよい。あるいは、ヌクレオチドシンセサイザーまたはPCR技術を使用して、ポリヌクレオチドを合成することができる。ポリペプチドをコードする配列は、得られると、宿主細胞において異種ポリヌクレオチドを複製し且つ発現させることができる組み換えベクターに挿入される。当該技術分野で入手可能及び既知の多くのベクターを、本開示の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入される核酸のサイズ、及びベクターで形質転換されるべき特定の宿主細胞に依存するであろう。本開示の抗体を発現するのに適する宿主細胞は、グラム陰性またはグラム陽性生物を含む古細菌及び真正細菌などの原核生物、糸状菌または酵母などの真核微生物、昆虫または植物細胞などの無脊椎動物細胞、及び哺乳類宿主細胞株などの脊椎動物細胞を含む。宿主細胞を上記の発現ベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変された従来の栄養培地で培養する。当該技術分野で既知の標準的なタンパク質精製を使用して、宿主細胞により産生された抗体を精製する。
ベクターの構築、発現、及び精製を含む抗体産生の方法は、さらに、Pluckthun et al.,Antibody Engineering:Producing antibodies in Escherichia coli:From PCR to fermentation 203-52(McCafferty et al.eds.,1996);Kwong and Rader,E.coli Expression and Purification of Fab Antibody Fragments,in Current Protocols in Protein Science(2009);Tachibana and Takekoshi,Production of Antibody Fab Fragments in Escherichia coli,in Antibody Expression and Production(Al-Rubeai ed.,2011);及びTherapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic(An ed.,2009)に記載される。
当該技術分野で周知の別の方法は、抗CD20単一ドメイン抗体を調製するために使用され得ることができると、当然考えられる。例えば、適切なアミノ酸配列またはその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成により生成されてもよい(例えば、以下を参照:Stewart et al.,Solid-Phase Peptide Synthesis(1969);及びMerrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-54(1963))。in vitroタンパク質合成は、手動手法の使用または自動化により実施され得る。所望の抗CD20抗体を得るために、抗CD20抗体の様々な部分が、別々に化学合成され、化学的または酵素的方法を使用して組み合わされてもよい。あるいは、例えば、米国特許第5,545,807号及び第5,827,690号に記載されるように、抗体は、抗体を発現するように操作されたトランスジェニック動物の細胞またはミルクなどの体液から精製されてもよい。
具体的には、ラマを免疫し、単一B細胞選別を実施し、V遺伝子抽出を行い、VHH-Fc融合などのCD20結合剤をクローニングし、次に、小さなスケール表現及び精製を実施することにより、本明細書で提供される単一ドメイン抗体または他のCD20結合剤を生成することができる。ELISA陽性、BLI陽性、及び100nM未満のKDについての選択のうちの1つ以上を含む、CD20に結合する単一ドメイン抗体及び他の分子の追加のスクリーニングを実施することができる。以下のセクション6に記載されるように、これらの選択基準を組み合わせることができる。さらに、CD20を発現する細胞に結合する能力について、個々のVHH結合剤(及びCD20に結合する他の分子)をアッセイすることができる。CD20を発現する細胞を用いたFACS分析を使用して、蛍光標識されたVHH分子の平均蛍光強度(MFI)を測定することにより、このようなアッセイを実施することができる。上述の様々な側面は、以下でより詳細に記載される。
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、一般に、関連抗原及びアジュバントを複数回皮下(sc)または腹腔内(ip)注射することにより動物で産生される。二官能性または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介したコンジュゲーション)、N-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、またはR1N=C=NR(式中、R及びR1は、独立して、低級アルキル基である)を使用して、免疫されるべき種、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、血清アルブミン、ウシチログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤、において免疫原性であるタンパク質に関連抗原をコンジュゲートすることが有用であってよい。用いられ得るアジュバントの例としては、フロイントの完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリル脂質A、合成トレハロースジコリノミコラート)が挙げられる。免疫化プロトコールは、過度の実験をすることなく当業者が選択し得る。
ポリクローナル抗体は、一般に、関連抗原及びアジュバントを複数回皮下(sc)または腹腔内(ip)注射することにより動物で産生される。二官能性または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介したコンジュゲーション)、N-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、またはR1N=C=NR(式中、R及びR1は、独立して、低級アルキル基である)を使用して、免疫されるべき種、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、血清アルブミン、ウシチログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤、において免疫原性であるタンパク質に関連抗原をコンジュゲートすることが有用であってよい。用いられ得るアジュバントの例としては、フロイントの完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリル脂質A、合成トレハロースジコリノミコラート)が挙げられる。免疫化プロトコールは、過度の実験をすることなく当業者が選択し得る。
例えば、例えば、100μgまたは5μgのタンパク質またはコンジュゲート(それぞれ、ウサギまたはマウスに対し)を3体積のフロイント完全アジュバントと組み合わせ、複数の部位に溶液を皮内注射することにより、動物を抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して免疫する。1ヶ月後、複数の部位に皮下注射することにより、フロイント完全アジュバント中の元の量の1/5~1/10のペプチドまたはコンジュゲートで動物を追加免疫する。7~14日後、動物から採血し、血清を抗体力価についてアッセイする。力価が安定するまで、動物を追加免疫する。コンジュゲートを、タンパク質融合体として組み換え細胞培養で作成することもできる。また、ミョウバンなどの凝集剤は、免疫応答を高めるのに適する。
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得られ、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、可能な天然に存在する突然変異及び/または微量で存在し得る翻訳後修飾(例えば、異性化、アミド化)を除いて同一である。従って、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得られ、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、可能な天然に存在する突然変異及び/または微量で存在し得る翻訳後修飾(例えば、異性化、アミド化)を除いて同一である。従って、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。
例えば、モノクローナル抗体は、Kohler et al.,Nature,256:495(1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して作製されても、組み換えDNA法(米国特許第4,816,567号)により作製されてもよい。
ハイブリドーマ法では、免疫に使用されるタンパク質に特異的に結合することになる抗体を産生するか、またはそれを産生可能なリンパ球を誘発するように、適切な宿主動物を免疫する。あるいは、リンパ球は、in vitroで免疫され得る。次に、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用して、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))。
免疫剤は、通常、抗原タンパク質またはその融合バリアントを含むであろう。Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press(1986),pp.59-103。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞である。従って、調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、未融合の親ミエローマ細胞の成長または生存を阻害する1つ以上の物質を含有する好適な培地に播種し、成長させる。好ましい不死化骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を支持し、HAT培地などの培地に感受性があるものである。
ハイブリドーマ細胞が成長している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞が培養される培地は、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。そのような技術及びアッセイは、当該技術分野で既知である。例えば、結合親和性は、Munson et al.,Anal.Biochem.,107:220(1980)のScatchard解析により決定され得る。
所望の特異性、親和性、及び/または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界希釈手順によりサブクローニングし、標準的な方法により成長させてもよい(Goding、上掲)。この目的に好適な培地は、例えば、D-MEMまたはRPMI-1640培地を含む。加えて、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物において腫瘍としてin vivoで成長し得る。
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインA-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーにより、培地、腹水、または血清から適切に分離される。
モノクローナル抗体はまた、組み換えDNA法、例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるものにより、及び上述のように、行われてもよい。モノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手順を使用して(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)容易に単離及びシーケンシングされる。ハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの好ましい供給源として役立つ。単離されたDNAは、発現ベクターに配置されてもよく、次に、そのような組み換え宿主細胞においてモノクローナル抗体を合成するために、宿主細胞、例えば、大腸菌(E.coli)細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または他の方法では免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞にトランスフェクトされる。抗体をコードするDNAの細菌における組み換え発現に関する総説は、Skerra et al.,Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)及びPliickthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)を含む。
さらなる実施形態では、抗体は、McCafferty et al.,Nature,348:552-554(1990)に記載の手法を使用して生成された抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)及びMarks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)。後続の刊行物は、チェーンシャッフリングによる高親和性(nM範囲)のヒト抗体の産生(Marks et al.,Bio/Technology,10:779-783(1992))、ならびに、非常に大きなファージライブラリーの構築の方策としてのコンビナトリアル感染及びin vivo組み換え(Waterhouse et al.,Nucl.Acids Res.,21:2265-2266(1993))について記載する。従って、これらの技術は、モノクローナル抗体を分離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ手法の現実的な代替物である。
また、例えば、コード配列を置換することにより(米国特許第4,816,567号;Morrison,et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA,81:6851(1984))、または、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部もしくは一部をコード配列に共有結合させることにより、DNAが改変され得る。抗原に対する特異性を有する1つの抗原結合部位及び異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作製するために、そのような非免疫グロブリンポリペプチドを置換することができる。
キメラ抗体またはハイブリッド抗体は、また、架橋剤を含むものを含む、合成タンパク質化学における既知の方法を使用して、in vitroで調製され得る。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することにより構築され得る。この目的に適する試薬の例としては、イミノチオラート及びメチル-4-メルカプトブチルイミダートが挙げられる。
原核細胞における組み換え産生
本開示の抗体をコードするポリ核酸配列は、標準的な組み換え手法を使用して得ることができる。所望のポリ核酸配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離及びシーケンシングされてもよい。あるいは、ヌクレオチドシンセサイザーまたはPCR技術を使用して、ポリヌクレオチドを合成することができる。ポリペプチドをコードする配列は、得られると、原核宿主において異種ポリヌクレオチドを複製及び発現可能な組み換えベクターに挿入される。当該技術分野で入手可能及び既知の多くのベクターを、本開示の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入される核酸のサイズ、及びベクターで形質転換されるべき特定の宿主細胞に依存するであろう。各ベクターは、その機能(異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはその両方)及び存在する特定の宿主細胞との適合性に応じて、様々な構成要素を含有する。ベクター構成要素は、一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、シグナル配列、異種核酸挿入物、及び転写終結配列を含むが、これらに限定されない。
本開示の抗体をコードするポリ核酸配列は、標準的な組み換え手法を使用して得ることができる。所望のポリ核酸配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離及びシーケンシングされてもよい。あるいは、ヌクレオチドシンセサイザーまたはPCR技術を使用して、ポリヌクレオチドを合成することができる。ポリペプチドをコードする配列は、得られると、原核宿主において異種ポリヌクレオチドを複製及び発現可能な組み換えベクターに挿入される。当該技術分野で入手可能及び既知の多くのベクターを、本開示の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入される核酸のサイズ、及びベクターで形質転換されるべき特定の宿主細胞に依存するであろう。各ベクターは、その機能(異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはその両方)及び存在する特定の宿主細胞との適合性に応じて、様々な構成要素を含有する。ベクター構成要素は、一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、シグナル配列、異種核酸挿入物、及び転写終結配列を含むが、これらに限定されない。
一般に、宿主細胞と適合する種に由来するレプリコン及び制御配列を含有するプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して使用される。ベクターは、通常、複製部位、ならびに形質転換細胞において表現型選択を提供可能なマーキング配列を有する。例えば、大腸菌は、通常、大腸菌種由来のプラスミドであるpBR322を使用して形質転換される。特定の抗体の発現に使用されるpBR322誘導体の例としては、Carter et al.、米国特許第5,648,237号に詳細に記載される。
加えて、宿主微生物と適合するレプリコン及び制御配列を含有するファージベクターを、これらの宿主に関連する形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、GEM(商標)-11などのバクテリオファージは、大腸菌LE392などの感受性宿主細胞を形質転換するために使用することができる組み換えベクターを作製することに、利用されてもよい。
本出願の発現ベクターは、ポリペプチド構成要素のそれぞれをコードする2つ以上のプロモーター-シストロン対を含んでもよい。プロモーターは、その発現を調節するシストロンの上流(5’)に位置する非翻訳調節配列である。原核生物のプロモーターは、通常、誘導性及び構成性の2つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の変化、例えば、栄養素の有無または温度変化に応答して、その制御下で、増加した転写レベルのシストロンを開始するプロモーターである。
様々な潜在的な宿主細胞に認識される多数のプロモーターが周知される。選択されたプロモーターは、制限酵素消化によりソースDNAからプロモーターを除去し、単離されたプロモーター配列を本出願のベクターに挿入することにより、本抗体をコードするシストロンDNAに作動可能に連結することができる。天然のプロモーター配列及び多くの異種プロモーターの両方は、標的遺伝子の増幅及び/または発現を誘導するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、異種プロモーターは、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、より多くの転写及びより高収量の発現された標的遺伝子を一般に可能にするので、利用される。
原核生物宿主での使用に適するプロモーターとしては、PhoAプロモーター、β-ガラクタマーゼ及びラクトースプロモーターシステム、トリプトファン(trp)プロモーターシステム、ならびにtacまたはtrcプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかし、細菌で機能する他のプロモーター(例えば、他の既知の細菌プロモーターまたはファージプロモーター)も同様に適する。それらの核酸配列は、公開されており、それにより、任意の必要な制限部位を提供するために、リンカーまたはアダプターを使用して、当業者が、標的ペプチドをコードするシストロンにそれらを作動可能にライゲーションすることが可能になる(Siebenlist et al.Cell 20:269(1980))。
一態様では、組み換えベクター内の各シストロンは、膜を通貨する発現されたポリペプチドの移動を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列は、ベクターの構成要素であっても、ベクターに挿入される標的ポリペプチドDNAの一部であってもよい。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞に認識され、プロセシングされる(すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される)ものでなければならない。異種ポリペプチドに固有のシグナル配列を認識及びプロセシングしない原核宿主細胞の場合、シグナル配列を、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ipp、または熱安定エンテロトキシンII(STII)リーダー、LamB、PhoE、PelB、OmpA、及びMBPからなる群より選択される原核生物シグナル配列により置換することができる。
いくつかの実施形態では、本開示による抗体の産生は、宿主細胞の細胞質で生じ得、従って、各シストロン内の分泌シグナル配列の存在を必要としない。特定の宿主株(例えば、大腸菌trxB-株)は、ジスルフィド結合の形成に有利な細胞質条件を提供し、それにより、発現されたタンパク質サブユニットの適切な折りたたみ及びアセンブリが可能になる。
本開示の抗体を発現するのに適する原核宿主細胞としては、古細菌及び真正細菌、例えば、グラム陰性生物またはグラム陽性生物が挙げられる。有用な細菌の例としては、エシェリキア(例えば、大腸菌)、バチルス(例えば、枯草菌(B.subtilis))、腸内細菌、シュードモナス属(例えば、緑膿菌(P.aeruginosa))、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescans)、クレブシエラ、プロテウス、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ、またはパラコッカスが挙げられる。いくつかの実施形態では、グラム陰性細胞が使用される。一実施形態では、大腸菌細胞が宿主として使用される。大腸菌株の例としては、W3110株(Bachmann,Cellular and Molecular Biology,vol.2(Washington,D.C.:American Society for Microbiology,1987),pp.1190-1219;ATCC Deposit No.27,325)及びそれらの誘導体(遺伝子型W3110 AfhuA(AtonA)ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc-fepE)degP41 kanRを有する33D3株を含む)(米国特許第5,639,635号)が挙げられる。他の株及びその誘導体、例えば、大腸菌294(ATCC31,446)、大腸菌B、大腸菌1776(ATCC31,537)、及び大腸菌RV308(ATCC31,608)も好適である。これらの例は、限定ではなく例示である。規定された遺伝子型を有する上述の細菌のいずれかの誘導体を構築する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Bass et al.,Proteins,8:309-314(1990)に記載される。一般に、細菌の細胞内でのレプリコンの複製可能性を考慮して、適切な細菌を選択する必要がある。周知のプラスミド、例えば、pBR322、pBR325、pACYC177、またはpKN410がレプリコンを供給するために使用される場合、大腸菌、セラチア、またはサルモネラ種を宿主として適切に使用することができる。
通常、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきであり、追加のプロテアーゼ阻害剤は、望ましくは、細胞培養に組み込まれ得る。
宿主細胞を上記の発現ベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変された従来の栄養培地で培養する。形質転換は、DNAが染色体外エレメントとして、または染色体インテグラントにより、複製可能になるように、原核生物の宿主にDNAを導入することを意味する。使用される宿主細胞に応じて、そのような細胞に適する標準的な手法を使用して、形質転換を行う。塩化カルシウムを用いるカルシウム処置は、一般に、実質的な細胞壁バリアを含有する細菌細胞に使用される。形質転換のための別の方法は、ポリエチレングリコール/DMSOを用いる。使用されるさらに別の手法は、エレクトロポレーションである。
本出願の抗体を産生するために使用される原核細胞を、当該技術分野の、及び選択された宿主細胞の培養に適する培地中で成長させた。好適な培地の例としては、ルリアブロス(LB)と必要な栄養補助食品が挙げられる。いくつかの実施形態では、培地は、発現ベクターを含有する原核細胞の成長を選択的に可能にするために、発現ベクターの構築に基づいて選択される選択剤も含有する。例えば、アンピシリンは、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の成長のために培地に添加される。
炭素、窒素、及び無機リン酸源以外の必要なサプリメントは、また、単独で、または複合窒素源などの別の補助剤または培地との混合物として、適切な濃度で含まれ得る。任意に、培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコラート、ジチオエリスリトール、及びジチオスレイトールからなる群より選択される1つ以上の還元剤を含有してもよい。原核宿主細胞は、好適な温度及びpHで培養される。
誘導性プロモーターが本出願の発現ベクターで使用される場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に適する条件下で誘導される。本出願の一態様では、PhoAプロモーターは、ポリペプチドの転写を制御するために使用される。従って、形質転換された宿主細胞は、誘導のためにリン酸制限培地中で培養される。好ましくは、リン酸制限培地は、C.R.A.P培地である(例えば、以下を参照:Simmons et al.,J.Immunol.Methods 263:133-147(2002))。当該技術分野で既知の、用いられるベクター構築物に応じて、様々な他の誘導因子が使用されてもよい。
本開示の発現された抗体は、宿主細胞のペリプラズムに分泌され、そこから回収される。タンパク質の回収は、一般に、浸透圧ショック、超音波処理、または溶解のような手段により、微生物を破壊することを通常含む。細胞が破砕されると、細胞破片または細胞全体は、遠心分離または濾過により除去され得る。タンパク質は、例えば、アフィニティー樹脂クロマトグラフィーにより、さらに、精製されてもよい。あるいは、タンパク質を培地に移し、その中で単離することができる。細胞を、培養物から除去し、培養上清を濾過し、産生されたタンパク質をさらに精製するために濃縮してもよい。ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)及びウェスタンブロットアッセイなどの一般的に既知の方法を使用して、発現されたポリペプチドを、さらに分離及び同定することができる。
あるいは、タンパク質産生は、発酵プロセスにより大量に行われる。様々な大規模流加回分発酵手順が、組み換えタンパク質の産生に利用可能である。本開示の抗体の産生収量及び品質を改善するために、様々な発酵条件を改変することができる。例えば、シャペロンタンパク質は、細菌宿主細胞で産生される異種タンパク質の適切な折りたたみ及び溶解性を促進することが実証されている。Chen et al.J Bio Chem 274:19601-19605(1999);米国特許第6,083,715号;米国特許第6,027,888号;Bothmann and Pluckthun,J.Biol.Chem.275:17100-17105(2000);Ramm and Pluckthun,J.Biol.Chem.275:17106-17113(2000);Arie et al.,Mol.Microbiol.39:199-210(2001)。
例えば、米国特許第5,264,365号;米国特許米第5,508,192号;Hara et al.,Microbial Drug Resistance,2:63-72(1996)に記載されるように、発現された異種タンパク質(特に、タンパク質分解感受性のもの)のタンパク質分解を最小限に抑えるために、タンパク質分解酵素を欠損する特定の宿主株を、本発明に使用することができる。タンパク質分解酵素を欠損し、1つ以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換された大腸菌株は、本出願の抗体をコードする発現系において宿主細胞として使用されてもよい。
さらなるアッセイ及び使用のために実質的に均一な調製物を得るために、本明細書で産生された抗体を、さらに精製することができる。当該技術分野で既知の標準的なタンパク質精製法を用いることができる。以下の手順は、適切な精製手順の例である:イムノアフィニティーまたはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカまたはDEAEなどの陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、硫酸アンモニウム沈殿、及び、例えば、Sephadex G-75を使用するゲル濾過。例えば、固相上に固定化されたプロテインAを、本開示の結合分子のイムノアフィニティー精製のためのいくつかの実施形態に使用することができる。プロテインAが固定化される固相は、好ましくは、ガラスまたはシリカ表面を含むカラムであり、より好ましくは、制御細孔ガラスカラムまたはケイ酸カラムである。いくつかの実施形態では、カラムは、汚染物質の非特異的付着を防ぐために、グリセロールなどの試薬でコーティングされている。次に、固相を洗浄して、固相に非特異的に結合している汚染物質を除去する。最後に、目的の抗体を、溶出により固相から回収する。
真核細胞における組み換え産生
真核発現の場合、ベクター構成要素は、一般に、以下の、シグナル配列、複製起点、1つ以上のマーカー遺伝子、及びエンハンサーエレメント、プロモーター、ならびに転写終結配列のうちの1つ以上を含むが、これらに限定されない。
真核発現の場合、ベクター構成要素は、一般に、以下の、シグナル配列、複製起点、1つ以上のマーカー遺伝子、及びエンハンサーエレメント、プロモーター、ならびに転写終結配列のうちの1つ以上を含むが、これらに限定されない。
真核生物宿主で使用されるベクターは、また、成熟タンパク質またはポリペプチドのN末端に特異的な切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドをコードする挿入物であってよい。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞に認識され、プロセシングされる(すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される)ものである。哺乳動物細胞の発現では、哺乳動物のシグナル配列と、ウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスgDシグナルが利用可能である。そのような前駆体領域のDNAは、本出願の抗体をコードするDNAにリーディングフレームでライゲーションすることができる。
一般に、複製起点構成要素は、哺乳類の発現ベクターには必要ない(SV40起点は、通常、初期プロモーターを含有するので、使用されてもよい)。
発現及びクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有してもよい。選択遺伝子は、抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか;栄養要求性欠乏症を補完するか;複合培地から入手できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードし得る。
選択スキームの一例は、薬物を利用して宿主細胞の成長を阻止する。異種遺伝子で効率よく形質転換された細胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を産生し、それにより、選択レジメンの後も存続する。そのような優性選択の例は、ネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシンという薬剤を使用する。
哺乳動物細胞に適する選択マーカーの別の例は、本出願の抗体をコードする核酸を取り込む能力がある細胞の同定を可能にするものである。例えば、DHFRの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート(Mtx)を含有する培地中で、全ての形質転換体を培養することにより、DHFR選択遺伝子で形質転換された細胞を、最初に同定する。野生型DHFRが用いられる場合の適切な宿主細胞の例は、DHFR活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株である。あるいは、アミノグリコシド系抗生物質などの選択マーカーの選択剤を含有する培地中での細胞成長により、ポリペプチドをコードするDNA配列、野生型DHFRタンパク質、及び別の選択マーカー、例えば、アミノグリコシド3’-ホスホトランスフェラーゼ(APH)で形質転換または同時形質転換された宿主細胞(特に、内因性DHFRを含有する野生型宿主)を選択することができる。
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物に認識され、所望のポリペプチド配列をコードする核酸に作動可能に連結されるプロモーターを含有する。真核生物の遺伝子は、転写が開始される部位の約25~30塩基上流に位置するATリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始の70~80塩基上流に見出される別の配列が含まれてもよい。ほとんどの真核生物の3’末端は、コード配列の3’末端にポリAテールを付加するためのシグナルであってよい。これらの配列は全て、真核発現ベクターに挿入され得る。
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからのポリペプチド転写を、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス2)、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、及びシミアンウイルス40(SV40)などのウイルスのゲノムから入手されるプロモーターにより、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから、制御することができる。但し、そのようなプロモーターは、宿主細胞系と適合性がある。
高等真核生物による本開示の抗体をコードするDNAの転写は、多くの場合、エンハンサー配列をベクターに挿入することで増加する。現在、哺乳類の遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン、及びインスリン)由来の多くのエンハンサー配列が既知である。例としては、複製起点の後半側(bp100-270)のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核プロモーターの活性化のための促進エレメントについては、以下も参照:Yaniv,Nature297:17-18(1982)。エンハンサーは、ポリペプチドをコードする配列に対して5’または3’の位でベクターにスプライシングされ得るが、好ましくは、プロモーターからの5’の部位に位置する。
真核宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物の有核細胞)で使用される発現ベクターは、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列も含有する。そのような配列は、一般に、真核生物またはウイルスのDNAまたはcDNAの5’、場合により、3’の非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、ポリペプチドをコードするmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。有用な転写終結構成要素の1つは、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化領域である。
本明細書のベクターでDNAをクローニングまたは発現するのに好適な宿主細胞としては、脊椎動物宿主細胞を含む、本明細書に記載の高等真核生物細胞が挙げられる。培養(組織培養)中の脊椎動物細胞の増殖は、日常的な手順になっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、SV40で形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7、ATCC CRL1651);ヒト胎児腎細胞株(浮遊培養での成長のためにサブクローニングされた293または293細胞、Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977));ベビーハムスター腎細胞(BHK、ATCC CCL10);チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO、Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980));マウスセルトリ細胞(TM4、Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));サル腎細胞(CV1 ATCC CCL70);アフリカミドリザル腎細胞(VERO-76、ATCC CRL-1587);ヒト子宮頸がん細胞(HELA、ATCC CCL2);イヌ腎細胞(MDCK、ATCC CCL34);バッファローラット肝細胞(BRL3A、ATCC CRL1442);ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL75);ヒト肝細胞(Hep G2、HB8065);マウス乳腺腫瘍(MMT060562,ATCC CCL51);TR1細胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982));MRC5細胞;FS4細胞;及びヒトヘパトーム株(Hep G2)である。
宿主細胞を、抗体産生のための上記の発現またはクローニングベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に改変された従来の栄養培地で培養することができる。
本出願の抗体を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地で培養されてもよい。Ham’s F10(Sigma)、最小必須培地((MEM)、(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、及びダルベッコ改変イーグル培地((DMEM)、Sigma)などの市販の培地が、宿主細胞の培養に適する。加えて、Ham et al.,Meth.Enz.58:44(1979),Barnes et al.,Anal.Biochem.102:255(1980)、米国特許第4,767,704号;同第4,657,866号;同第4,927,762号;同第4,560,655号;もしくは同第5,122,469号;WO90/03430;WO87/00195;または米国再発行特許第30,985号に記載の培地のいずれかが、宿主細胞の培地として使用されてもよい。これらの培地のいずれかは、必要に応じて、ホルモン及び/または他の成長因子(例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子)、塩(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩)、緩衝液(例えば、HEPES)、ヌクレオチド(例えば、アデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCIN(商標)薬)、微量元素(通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義)、及びグルコースまたは同等のエネルギー源を補充されてもよい。他の必要な補充剤は、また、当業者らに既知となる適切な濃度で含まれてもよい。温度、pHなどの培養条件は、発現について選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。
組み換え技術を使用する場合、抗体を、細胞内で、細胞周辺腔に産生するか、または培地に直接分泌することができる。抗体が細胞内で産生される場合、最初のステップとして、宿主細胞または溶解フラグメントのいずれかである微粒子状破片を、例えば、遠心分離または限外濾過で除去する。抗体が培地に分泌される場合、一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットを使用して、そのような発現系の上清を、最初に濃縮する。PMSFなどのプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するために上述のステップのいずれかに含まれてもよく、抗生物質は、偶発的な汚染物質の成長を防ぐために含まれてもよい。
例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィー(アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である)を用いて、細胞から調製されたタンパク質組成物を精製することができる。アフィニティーリガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定したマトリックス、例えば、細孔制御ガラスまたはポリ(スチレン-ジビニル)ベンゼンは、アガロースで達成できるよりも、速い流速及び短い処理時間を可能にする。回収されるべき抗体に応じて、タンパク質精製のための他の手法、例えば、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカでのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂(例えば、ポリアスパラギン酸カラム)でのヘパリンSEPHAROSE(商標)クロマトグラフィー、クロマト分画、SDS-PAGE、及び硫酸アンモニウム沈殿も利用可能である。任意の予備精製ステップ(複数可)の後、目的の抗体及び汚染物質を含む混合物を、低pHの疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけてもよい。
5.2.7.単一ドメイン抗体を含む結合分子
別の態様では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体(例えば、CD20に対するVHHドメイン)を含む結合分子が本明細書で提供される。以下のセクション5.3に記載の本明細書で提供されるキメラ抗原受容体(CAR)に加えて、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるCD20に対する単一ドメイン抗体は、他の結合分子の一部である。本開示の例示的な結合分子は、本明細書に記載される。
別の態様では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体(例えば、CD20に対するVHHドメイン)を含む結合分子が本明細書で提供される。以下のセクション5.3に記載の本明細書で提供されるキメラ抗原受容体(CAR)に加えて、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるCD20に対する単一ドメイン抗体は、他の結合分子の一部である。本開示の例示的な結合分子は、本明細書に記載される。
融合タンパク質
様々な実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体は、別の薬剤、例えば、タンパク質ベースの実体と遺伝子的に融合または化学的にコンジュゲートすることができる。単一ドメイン抗体は、薬剤に化学的にコンジュゲートされても、別の方法で、薬剤に非共有結合的にコンジュゲートされてもよい。薬剤は、ペプチドもしくは抗体(またはそのフラグメント)であり得る。
様々な実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体は、別の薬剤、例えば、タンパク質ベースの実体と遺伝子的に融合または化学的にコンジュゲートすることができる。単一ドメイン抗体は、薬剤に化学的にコンジュゲートされても、別の方法で、薬剤に非共有結合的にコンジュゲートされてもよい。薬剤は、ペプチドもしくは抗体(またはそのフラグメント)であり得る。
従って、いくつかの実施形態では、融合タンパク質を生成するための、異種タンパク質またはポリペプチド(またはそのフラグメントに、例えば、約10、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約150、約200、約250、約300、約350、約400、約450、もしくは約500アミノ酸、または500を超えるアミノ酸のポリペプチドに)組み換え融合または化学的にコンジュゲート(共有結合的にまたは非共有結合的にコンジュゲート)される単一ドメイン抗体(例えば、VHHドメイン)、及びその使用が本明細書で提供される。特に、本明細書で提供される単一ドメイン抗体の抗原結合フラグメント(例えば、CDR1、CDR2、及び/またはCDR3)ならびに異種タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを含む融合タンパク質が本明細書で提供される。
さらに、精製を容易にするために、本明細書で提供される抗体を、ペプチドなどのマーカーまたは「タグ」配列に融合させることができる。特定の実施形態では、マーカーまたはタグのアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチド、ヘマグルチニン(「HA」)タグ、及び「FLAG」タグである。
部分(ポリペプチドを含む)を抗体に融合またはコンジュゲートする方法は既知である(例えば、以下を参照:Arnon et al.,Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy,in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 243-56(Reisfeld et al.eds.,1985);Hellstrom et al.,Antibodies for Drug Delivery,in Controlled Drug Delivery 623-53(Robinson et al.eds.,2d ed.1987);Thorpe,Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy:A Review,in Monoclonal Antibodies:Biological and Clinical Applications 475-506(Pinchera et al.eds.,1985);Analysis,Results,and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy,in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy 303-16(Baldwin et al.eds.,1985);Thorpe et al.,Immunol.Rev.62:119-58(1982);米国特許第5,336,603号;同第5,622,929号;同第5,359,046号;同第5,349,053号;同第5,447,851号;同第5,723,125号;同第5,783,181号;同第5,908,626号;同第5,844,095;及び同第5,112,946号;EP307,434;EP367,166;EP394,827;PCT公開WO91/06570、WO96/04388、WO96/22024、WO97/34631、及びWO 99/04813;Ashkenazi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:10535-39(1991);Traunecker et al.,Nature,331:84-86(1988);Zheng et al.,J.Immunol.154:5590-600(1995);ならびにVil et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337-41(1992))。
融合タンパク質は、例えば、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフリング、及び/またはコドンシャッフリング(一括して、「DNAシャッフリング」と呼ばれる)の技術により生成され得る。DNAシャッフリングは、例えば、より高い親和性及びより低い解離速度を有する抗体を含む、本明細書で提供される単一ドメイン抗体の活性を変更するために用いられてもよい(例えば、以下を参照:米国特許第5,605,793号;同第5,811,238号;同第5,830,721号;同第5,834,252号;及び同第5,837,458;Patten et al.,Curr.Opinion Biotechnol.8:724-33(1997);Harayama,Trends Biotechnol.16(2):76-82(1998);Hansson et al.,J.Mol.Biol.287:265-76(1999);ならびにLorenzo and Blasco,Biotechniques 24(2):308-13(1998))。抗体、またはコード化された抗体は、組み換えの前に、エラープローンPCR、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法によるランダム変異導入を受けることにより改変されてもよい。本明細書で提供される抗体をコードするポリヌクレオチドは、1つ以上の異種分子の1つ以上の構成要素、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメントなどで組み換えられてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体(例えば、VHHドメイン)は、二次抗体にコンジュゲートされて、抗体ヘテロコンジュゲートを形成する。
様々な実施形態では、単一ドメイン抗体は、薬剤に遺伝的に融合される。単一ドメイン抗体及び薬剤間にリンカー(例えば、ポリペプチド)を配置することにより、遺伝子融合が達成されてもよい。リンカーは、柔軟なリンカーであってよい。
種々の実施形態では、単一ドメイン抗体は、単一ドメイン抗体を治療用分子に連結するヒンジ領域を用いて、治療用分子に遺伝的にコンジュゲートされる。
本明細書で提供される様々な融合タンパク質を作製する方法も本明細書で提供される。上記のセクション5.2.6に記載される様々な方法もまた、本明細書で提供される融合タンパク質を作製するために利用されてもよい。
特定の実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質は、組み換え発現される。本明細書で提供される融合タンパク質の組み換え発現は、タンパク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とし得る。本明細書で提供されるタンパク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドが得られると、分子の産生のためのベクターは、当該技術分野で周知の手法を使用する組み換えDNA技術で生成されてもよい。従って、コードヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を調製するための方法が本明細書に記載される。コード配列ならびに適切な転写及び翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するために、当業者らに周知の方法を使用することができる。これらの方法は、例えば、in vitro組み換えDNA手法、合成手法、及びin vivo遺伝子組み換えを含む。プロモーターに作動可能に連結された、本明細書で提供される融合タンパク質、またはそのフラグメント、またはCDRをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターも提供される。
発現ベクターは、従来の手法により宿主細胞に移入することができ、次に、トランスフェクトされた細胞を、従来の技術で培養して、本明細書で提供される融合タンパク質を産生する。従って、異種プロモーターに作動可能に連結された、本明細書で提供される融合タンパク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞も本明細書で提供される。
本明細書で提供される融合タンパク質を発現させるために、様々な宿主発現ベクター系が利用されてもよい。そのような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、続いて、精製され得るビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合、本明細書で提供される融合タンパク質をin situで発現し得る細胞も表す。これらは、微生物、例えば、コード配列を含有する組み換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、もしくはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、大腸菌及び枯草菌);コード配列を含有する組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、ピキア酵母(Saccharomyces Pichia));コード配列を含有する組み換えウイルス発現ベクターに感染させた昆虫細胞系(例えば、バキュロウイルス);コード配列を含有する組み換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV、タバコモザイクウイルス、TMV)に感染させるか、もしくは組み換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系;または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター(例えば、アデノウイルス後期型プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含有する組み換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、NS0、及び3T3細胞)を含むが、これらに限定されない。細菌細胞、例えば、大腸菌または真核細胞は、特に、組み換え抗体分子全体の発現のために、組み換え融合タンパク質の発現に使用することができる。例えば、ヒトサイトメガロウイルスの主要中間初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと組み合わせた、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳類細胞は、抗体またはそのバリアントの効果的な発現系である。特定の実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターで調節される。
細菌系では、発現される融合タンパク質を意図する用途に応じて、多数の発現ベクターが有利に選択されてもよい。例えば、融合タンパク質の医薬組成物の生成のために、大量のそのような融合タンパク質を産生する場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を誘導するベクターが望ましいことがある。そのようなベクターとしては、大腸菌発現ベクターpUR278(コード配列は、融合タンパク質が産生されるように、lacZコード領域とフレーム内でベクターに個別にライゲーションされ得る)(Ruther et al.、EMBO12:1791(1983));pINベクター(Inouye & Inouye,Nucleic Acids Res.13:3101-3109(1985);Van Heeke & Schuster,J.Biol.Chem.24:5503-5509(1989))などが挙げられるが、これらに限定されない。pGEXベクターはまた、外来ポリペプチドをグルタチオン5-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させるために使用されてもよい。一般に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、マトリックスのグルタチオンアガロースビーズに吸着及び結合させ、続いて、遊離グルタチオンの存在下で溶出することにより、溶解細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、クローン化された標的遺伝子産物がGST部分から放出することができるように、トロンビンまたは因子Xaプロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系が利用されてもよい。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的のコード配列は、アデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーター及び三部分リーダー配列にライゲーションされてもよい。次に、このキメラ遺伝子が、in vitroまたはin vivo組み換えにより、アデノウイルスゲノムに挿入されてもよい。ウイルスゲノムを非必須領域(例えば、領域E1またはE3)に挿入すると、生存可能な、感染宿主において融合タンパク質を発現可能な組み換えウイルスがもたらされるであろう(例えば、Logan & Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8 1:355-359(1984))。挿入されたコード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要とされ得る。これらのシグナルは、ATG開始コドン及び隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと一致していなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成の両方の様々な起源のものであり得る。適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含むことにより、発現効率が高められ得る(例えば、以下を参照:Bittner et al.,Methods in Enzymol.153:51-544(1987))。
加えて、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の特定の様式で遺伝子産物を改変及びプロセシングする宿主細胞株が選択されてもよい。タンパク質産物のそのような修飾(例えば、グリコシル化)及び加工(例えば、切断)は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。様々な宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾に特徴的且つ特定の機序を有する。発現した外来タンパク質の正確な修飾及び処理を確実にするために、適切な細胞株または宿主系を選択することができる。この目的のために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、及びリン酸化のための細胞機序を保有する真核宿主細胞が使用されてもよい。そのような哺乳動物宿主細胞は、CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O、及びT47D、NS0(任意の免疫グロブリン鎖を内因的に産生しないマウス骨髄腫細胞株)、CRL7O3O、及びHsS78Bst細胞を含むが、これらに限定されない。
組み換えタンパク質の長期的且つ高収量の産生のために、安定した発現を利用することができる。例えば、融合タンパク質を安定して発現する細胞株が操作され得る。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用する代わりに、適切な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)及び選択マーカーにより制御されるDNAで宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAの導入後に、操作された細胞を、濃縮培地で1~2日間成長させてもよく、次に、選択培地に切り替える。組み換えプラスミドの選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドを染色体に安定的に組み込み、成長して病巣を形成することを可能にし、これを、順次、細胞株にクローニング及び増殖することができる。本方法は、融合タンパク質を発現する細胞株を操作するために有利に使用されてもよい。そのような操作された細胞株は、結合分子と直接的または間接的に相互作用する組成物のスクリーニング及び評価において特に有用であり得る。
限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler et al.,Cell 11:223(1977))、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202(1992))、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy et al.,Cell 22:8-17(1980))遺伝子を含む多数の選択システムが使用されてもよく、それぞれ、tk細胞、hgprt細胞、またはaprt細胞で用いることができる。また、代謝拮抗薬耐性は、以下の遺伝子の選択の基礎として使用することができる:メトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr(Wigler et al.,Natl.Acad.Sci.USA 77:357(1980);O’Hare et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527(1981));ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt(Mulligan & Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072(1981));アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo(Wu and Wu,Biotherapy 3:87-95(1991);Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596(1993);Mulligan,Science 260:926-932(1993);及びMorgan and Anderson,Ann.Rev.Biochem.62:191-217(1993);May,TIB TECH 11(5):l55-2 15(1993));ならびに、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygro(Santerre et al.,Gene 30:147(1984))。組み換えDNA技術の分野で一般に既知の方法が、所望の組み換えクローンを選択するために日常的に適用されてもよく、そのような方法は、例えば、Ausubel et al.(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY(1993);Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990);及びin Chapters 12 and 13,Dracopoli et al.(eds.),Current Protocols in Human Genetics,John Wiley & Sons,NY(1994);Colberre-Garapin et al.,J.Mol.Biol.150:1(1981)に記載され、これは、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
融合タンパク質の発現レベルは、ベクター増幅により増加させることができる(概説については、以下を参照:Bebbington and Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning,Vol.3(Academic Press,New York,1987))。融合タンパク質を発現するベクター系のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルが増加すると、マーカー遺伝子のコピー数が増加するであろう。増幅された領域が融合タンパク質遺伝子と会合するので、融合タンパク質の産生も増加するであろう(Crouse et al.,Mol.Cell.Biol.3:257(1983))。
宿主細胞は、本明細書で提供される複数の発現ベクターで同時トランスフェクトされてもよい。ベクターは、それぞれのコード化ポリペプチドの同等の発現を可能にする同一の選択マーカーを含有してもよい。あるいは、複数のポリペプチドをコードし、発現することが可能な単一ベクターが使用されてもよい。コード配列は、cDNAまたはゲノムDNAを含んでもよい。
本明細書で提供される融合タンパク質が組み換え発現により産生されると、それは、ポリペプチド(例えば、免疫グロブリン分子)の精製のための当該技術分野で既知の任意の方法で、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、特に、プロテインA後の特定の抗原に対する親和性、サイジングカラムクロマトグラフィー、及びカッパセレクトアフィニティークロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質の精製のための他の標準的な手法で精製されてもよい。さらに、本明細書で提供される融合タンパク質分子は、精製を容易にするために、本明細書に記載の、または別途、当該技術分野で既知の異種ポリペプチド配列に融合することができる。
イムノコンジュゲート
いくつかの実施形態では、本開示は、1つ以上の細胞傷害剤、例えば、化学療法剤または薬物、成長阻害剤、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらのフラグメント)、あるいは放射性同位体、にコンジュゲートされている本明細書に記載の抗体(例えば、抗CD20単一ドメイン抗体)のうちのいずれかを含むイムノコンジュゲートも提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、1つ以上の細胞傷害剤、例えば、化学療法剤または薬物、成長阻害剤、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらのフラグメント)、あるいは放射性同位体、にコンジュゲートされている本明細書に記載の抗体(例えば、抗CD20単一ドメイン抗体)のうちのいずれかを含むイムノコンジュゲートも提供する。
いくつかの実施形態では、イムノコンジュゲートは、抗体薬物コンジュゲート(ADC)(抗体が、限定されないが、メイタンシノイドを含む1つ以上の薬物にコンジュゲートされている)(以下を参照:米国特許第5,208,020号、同第5,416,064号、及び欧州特許0425235B1);アウリスタチン、例えば、モノメチルアウリスタチン薬物部分DE及びDF(MMAE及びMMAF)(以下を参照:米国特許第5,635,483号及び同第5,780,588号、ならびに同第7,498,298号);ドラスタチン;カリケアミシンまたはその誘導体(以下を参照:米国特許第5,712,374号、同第5,714,586号、同第5,739,116号、同第5,767,285号、同第5,770,701号、5,770,710号、同第5,773,001号、及び同第5,877,296号;Hinman et al.,Cancer Res.53:3336-3342(1993);ならびにLode et al.,Cancer Res.58:2925-2928(1998));アントラサイクリン、例えば、ダウノマイシンまたはドキソルビシン(以下を参照:Kratz et al.,Current Med.Chem.13:477-523(2006);Jeffrey et al.,Bioorganic & Med.Chem.Letters 16:358-362(2006);Torgov et al.,Bioconj.Chem.16:717-721(2005);Nagy et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000);Dubowchik et al.,Bioorg.& Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002);King et al.,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002);及び米国特許第6,630,579号);メトトレキサート;ビンデシン;タキサン、例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセル;トリコテセン;ならびにCC1065である。
いくつかの実施形態では、イムノコンジュゲートは、限定されないが、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素A鎖(緑膿菌由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、アリューライト・フォルディタンパク質、ダイアンチンタンパク質、フィトラッカ・アメリカーナタンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカ・チャランティア阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス阻害剤、ゲロニン、マイトジェリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンを含む、酵素的に活性な毒素またはそのフラグメントにコンジュゲートされている、本明細書に記載の抗体を含む。
いくつかの実施形態では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされて、放射性コンジュゲートを形成する、本明細書に記載の抗体を含む。様々な放射性同位元素は、放射性コンジュゲートの生成に利用可能である。例としては、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、及びLuの放射性同位元素が挙げられる。放射性コンジュゲートは、検出に使用される場合、シンチグラフィ研究用の放射性原子、例えば、tc99mもしくはI123、または核磁気共鳴(NMR)イメージング(磁気共鳴イメージング、mriとしても既知)用のスピン標識、例えば、ヨウ素-123、さらに、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガンまたは鉄を含んでもよい。
抗体及び細胞傷害剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(例えば、ジメチルアジピミデートHCl)、アルデヒド(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビスジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアナート(例えば、トルエン2,6-ジイソシアナート)、及びビス活性フッ素化合物(例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)を使用して行われてもよい。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al.,Science 238:1098(1987)に記載されるように調製することができる。炭素14標識1-イソシアナトベンゾイル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸(MX-DTPA)は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲートさせるための例示的なキレート剤である。以下を参照:WO94/11026。
リンカーは、細胞内で、コンジュゲートされた薬剤の放出を促進する「切断可能なリンカー」であってよいが、切断不可能なリンカーも本明細書で企図される。本開示のコンジュゲートで使用されるリンカーは、酸に不安定なリンカー(例えば、ヒドラゾンリンカー)、ジスルフィド含有リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー(例えば、バリン及び/またはシトルリン、例えば、シトルリン-バリンまたはフェニルアラニン-リジン、のアミノ酸を含むペプチドリンカー)、光解離性リンカー、ジメチルリンカー、チオエーテルリンカー、または多剤輸送体媒介耐性を回避するように設計された親水性リンカーを含むが、これらに限定されない。
本明細書におけるイムノコンジュゲートまたはADCは、限定されないが、市販されるBMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、及びスルホ-SMPB、ならびにSVSB(スクシンイミジル-(4-ビニルスルホン)ベンゾアート)を含む架橋試薬で調製された、そのようなコンジュゲートを検討するが、これらに限定されない(例えば、Pierce Biotechnology,Inc.、米国イリノイ州ロックフォード)。
他の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、例えば、診断用分子にコンジュゲートまたは組み換え融合される。例えば、限定されないが、限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどの様々な酵素;限定されないが、ストレプトアビジン/ビオチンまたはアビジン/ビオチンなどの補欠分子族;限定されないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンなどの蛍光材料;限定されないが、ルミノールなどの発光材料;限定されないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、またはエクオリンなどの生物発光材料;225Acγ放出、オージェ放出、β放出、α放出、または陽電子放出放射性同位元素などの化学発光材料、を含む検出可能な物質に抗体をカップリングすることにより、そのような診断及び検出を達成することができる。
5.3.キメラ抗原受容体
別の態様では、CD20に結合する本明細書で提供される少なくとも1つの単一ドメイン抗体(例えば、VHH)を含む細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)が本明細書で提供される。本VHHドメインを含む例示的なCAR(すなわち、VHHベースのCAR)が示され、以下のセクション6に記載されるように、scFvを含む従来のCAR(すなわち、scFvベースのCAR)と比較される。
別の態様では、CD20に結合する本明細書で提供される少なくとも1つの単一ドメイン抗体(例えば、VHH)を含む細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)が本明細書で提供される。本VHHドメインを含む例示的なCAR(すなわち、VHHベースのCAR)が示され、以下のセクション6に記載されるように、scFvを含む従来のCAR(すなわち、scFvベースのCAR)と比較される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキメラ抗原受容体(CAR)は、(a)本明細書で提供される、CD20に特異的に結合する少なくとも1つの単一ドメイン抗体(sdAb)、及び、任意に、1つ以上の追加の結合ドメイン(複数可)を含む細胞外抗原結合ドメイン;(b)膜貫通ドメイン;ならびに(c)細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むポリペプチドを含む。各コンポーネント及び追加の領域は、以下により詳細に記載される。
5.3.1.細胞外抗原結合ドメイン
本明細書に記載のCARの細胞外抗原結合ドメインは、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、またはそれ以上のうちのいずれか1つ)の単一ドメイン抗体を含む。ペプチド結合を介して直接、またはペプチドリンカーを介して、単一ドメイン抗体を互いに融合させることができる。
本明細書に記載のCARの細胞外抗原結合ドメインは、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、またはそれ以上のうちのいずれか1つ)の単一ドメイン抗体を含む。ペプチド結合を介して直接、またはペプチドリンカーを介して、単一ドメイン抗体を互いに融合させることができる。
単一ドメイン抗体
本開示のCARは、1つ以上の単一ドメイン抗体を含む細胞外抗原結合ドメインを含む。sdAbは、同じまたは異なる起源のもの、及び、同じまたは異なるサイズのものであってよい。例示的なsdAbとしては、重鎖のみの抗体由来の重鎖可変ドメイン(例えば、VHHまたはVNAR)、軽鎖を天然に欠く結合分子、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウスまたはラットにより産生された従来の4鎖抗体、ヒト化重鎖のみの抗体、ヒト単一ドメイン抗体に由来する単一ドメイン(例えば、VHまたはVL)、ならびに抗体に由来するもの以外の操作されたドメイン及び単一ドメイン足場が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載のCARを構築するために、本開示の上記の単一ドメイン抗体を含む、当該技術分野で既知の、または本開示により開発された任意のsdAbが、使用されてもよい。sdAbは、限定されないが、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、及びウシを含む任意の種に由来し得る。本明細書で企図される単一ドメイン抗体は、ラクダ科及びサメ以外の種に由来する天然に存在する単一ドメイン抗体分子も含む。
本開示のCARは、1つ以上の単一ドメイン抗体を含む細胞外抗原結合ドメインを含む。sdAbは、同じまたは異なる起源のもの、及び、同じまたは異なるサイズのものであってよい。例示的なsdAbとしては、重鎖のみの抗体由来の重鎖可変ドメイン(例えば、VHHまたはVNAR)、軽鎖を天然に欠く結合分子、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウスまたはラットにより産生された従来の4鎖抗体、ヒト化重鎖のみの抗体、ヒト単一ドメイン抗体に由来する単一ドメイン(例えば、VHまたはVL)、ならびに抗体に由来するもの以外の操作されたドメイン及び単一ドメイン足場が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載のCARを構築するために、本開示の上記の単一ドメイン抗体を含む、当該技術分野で既知の、または本開示により開発された任意のsdAbが、使用されてもよい。sdAbは、限定されないが、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、及びウシを含む任意の種に由来し得る。本明細書で企図される単一ドメイン抗体は、ラクダ科及びサメ以外の種に由来する天然に存在する単一ドメイン抗体分子も含む。
いくつかの実施形態では、sdAbは、軽鎖を欠く重鎖抗体(本明細書では「重鎖のみの抗体」とも呼ばれる)として既知の天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子に由来する。そのような単一ドメイン分子は、例えば、WO94/04678及びHamers-Casterman,C.et al.,Nature 363:446-448(1993)に開示される。明確にするために、軽鎖を天然に欠く重鎖分子に由来する可変ドメインは、4鎖免疫グロブリンの従来のVHと区別するために、本明細書ではVHHとして既知である。そのようなVHH分子は、ラクダ科種、例えば、ラクダ、ラマ、ビキューナ、ヒトコブラクダ、アルパカ、及びグアナコで生じた抗体に由来し得る。ラクダ科以外の他の種は、軽鎖を天然に欠く重鎖分子を産生し得、そのようなVHHは、本開示の範囲内である。加えて、VHHのヒト化バージョンならびに他の改変及びバリアントも企図され、本開示の範囲内である。
ラクダ科動物由来のVHH分子は、IgG分子の約10分の1である。それらは、単一のポリペプチドであり、非常に安定する可能性があり、これは、極端なpH及び温度条件に耐性がある。さらに、それらは、従来の4鎖抗体用の問題ではないプロテアーゼの作用に耐性があり得る。さらに、VHHのin vitro発現により、高収率の、適切に折りたたまれた機能的なVHHが生成される。加えて、ラクダ科動物で生成された抗体は、抗体ライブラリーの使用により、またはラクダ科動物以外の哺乳動物の免疫により、in vitroで生成された抗体により認識されるエピトープ以外のエピトープを認識し得る(例えば、WO9749805を参照)。従って、1つ以上のVHHドメインを含む多重特異性または多価CARは、従来の4鎖抗体に由来する抗原結合フラグメントを含む多重特異性または多価CARよりも効率的に標的と相互作用し得る。VHHは、「珍しい」エピトープ、例えば、空洞または溝に結合することが既知であるため、そのようなVHHを含むCARの親和性は、従来の多重特異性ポリペプチドよりも治療的処置に、より適することがある。
いくつかの実施形態では、sdAbは、軟骨魚に見られる免疫グロブリンの可変領域に由来する。例えば、sdAbは、サメの血清に見られる新規抗原受容体(NAR)として既知の免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。NARの可変領域に由来する単一ドメイン分子(「IgNAR」)を生成する方法は、WO03/014161及びStreltsov,Protein Sci.14:2901-2909(2005)に記載される。
いくつかの実施形態では、sdAbは、組み換え、CDR移植、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化、及び/またはin vitro生成(例えば、ファージディスプレイにより選択)である。いくつかの実施形態では、フレームワーク領域のアミノ酸配列は、フレームワーク領域内の特定のアミノ酸残基の「ラクダ化」により改変されてもよい。ラクダ化は、重鎖抗体のVHHドメインに、対応する位置(複数可)に存在するアミノ酸残基のうちの1つ以上による、従来の4鎖抗体由来の(天然に存在する)VHドメインのアミノ酸配列における1つ以上のアミノ酸残基の置き換えまたは置換を指す。当業者には明らかである当分野で既知の方法で、これを実施することができる。そのような「ラクダ化」置換は、好ましくは、本明細書で定義されるように、VH-VL境界面に、及び/またはいわゆるラクダ科のホールマーク残基に形成及び/または存在するアミノ酸位置に挿入される(例えば、WO94/04678、Davies and Riechmann FEBS Letters 339:285-290(1994);Davies and Riechmann,Protein Engineering 9(6):531-537(1996);Riechmann,J.Mol.Biol.259:957-969(1996);及びRiechmann and Muyldermans,J.Immunol.Meth.231:25-38(1999)を参照のこと)。
いくつかの実施形態では、sdAbは、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウスまたはラットにより産生されるヒト単一ドメイン抗体である。例えば、US20090307787、米国特許第8,754,287号、US20150289489、US20100122358、及びWO2004049794を参照のこと。いくつかの実施形態では、sdAbは、親和性成熟している。
いくつかの実施形態では、特定の抗原または標的に対する天然に存在するVHHドメインは、ラクダ科動物VHH配列の(ナイーブまたは免疫)ライブラリーから得ることができる。そのような方法は、当該分野で既知の1つ以上のスクリーニング手法を使用して、該抗原もしくは標的、またはその少なくとも一部、フラグメント、抗原決定基、またはエピトープを使用して、そのようなライブラリーをスクリーニングすることを含んでも含まなくてもよい。そのようなライブラリー及び手法は、例えば、WO99/37681、WO01/90190、WO03/025020、及びWO03/035694に記載される。あるいは、(ナイーブまたは免疫)VHHに由来する改良された合成または半合成ライブラリー、例えば、ランダム変異導入及び/またはCDRシャッフリングなどの手法で、(ナイーブまたは免疫)VHHライブラリーから得られたVHHライブラリーは、例えば、WO00/43507に記載されるように、使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、従来の四本鎖抗体から生成される。例えば、以下を参照:EP0368684;Ward et al.,Nature,341(6242):544-6(1989);Holt et al.,Trends Biotechnol.,21(11):484-490(2003);WO06/030220;及びWO06/003388。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞外抗原結合ドメインは、少なくとも1つの結合ドメインを含み、少なくとも1つの結合ドメインは、本明細書で提供されるCD20に結合する単一ドメイン抗体、例えば、上記のセクション5.2に記載される抗CD20単一ドメイン抗体、を含む。
いくつかの実施形態では、(a)抗CD20 sdAbを含む細胞外抗原結合ドメイン、(b)膜貫通ドメイン、及び(c)細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むポリペプチドを含むCARが本明細書で提供され、抗CD20 sdAbは、例えば、表2のVHHドメイン、及び表2のそれらのVHHドメインのいずれかに1つ、2つ、または3つ全てのCDRを有するものを含む、上記のセクション5.2に記載の抗CD20 sdAbである。いくつかの実施形態では、抗CD20 sdAbは、ラクダ科動物、キメラ、ヒト、またはヒト化のものである。
いくつかの実施形態では、(a)抗CD20 sdAbを含む細胞外抗原結合ドメイン、(b)膜貫通ドメイン、及び(c)細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むポリペプチドを含むCARが本明細書で提供され、抗CD20 sdAbが、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号配列54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号183、配列番号184、または配列番号185のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、(a)抗CD20 sdAbを含む細胞外抗原結合ドメイン、(b)膜貫通ドメイン、及び(c)細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むポリペプチドを含むCARが本明細書で提供され、抗CD20 sdAbが、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号183、配列番号184、または配列番号185のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、2つ以上の抗原結合ドメインを含む。これらの2つ以上の抗原結合ドメインのうち、少なくとも1つは、本明細書で提供されるCD20に結合するVHHである。いくつかの実施形態では、1つ以上の追加の結合ドメインは、CD20に結合するVHHでもある。他の実施形態では、1つ以上の追加の結合ドメイン(複数可)は、1つ以上の追加の異なる抗原(複数可)、例えば、1つ以上の追加の異なる抗原(複数可)を標的とする、1、2、3、4、またはそれ以上の追加の単一ドメイン抗体結合領域(sdAb)、に結合する。
いくつかの実施形態では、(a)CD20に特異的に結合する2つ以上の単一ドメイン抗体(sdAb)を含む細胞外抗原結合ドメイン、(b)膜貫通ドメイン、及び(c)細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むポリペプチドを含む多価(例えば、二価及び三価)のCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、本明細書で提供されるCD20に特異的に結合する2つの単一ドメイン抗体(sdAb)を含む。他の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、本明細書で提供されるCD20に特異的に結合する3つの単一ドメイン抗体(sdAb)を含む。いくつかの実施形態では、2つ以上の抗CD20 sdAbは、例えば、表2のVHHドメイン、及び表2のそれらのVHHドメインのいずれかに、1つ、2つ、または3つ全てのCDRを有するものを含む、上記のセクション5.2に記載の抗CD20 sdAbから選択される。いくつかの実施形態では、抗CD20 sdAbは、ラクダ科動物、キメラ、ヒト、またはヒト化のものである。いくつかの実施形態では、2つ以上の抗CD20 sdAbは、それぞれ、独立して、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号183、配列番号184、及び配列番号185のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗CD20 sdAbから選択される。
他の実施形態では、(a)CD20に特異的に結合する第1の単一ドメイン抗体(sdAb)を含む細胞外抗原結合ドメイン、(b)膜貫通ドメイン、及び(c)細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むポリペプチドを含む多重特異性(例えば、二重特異性及び三重特異性)CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、CARは、第2の抗原(例えば、第2の腫瘍抗原)に特異的に結合する第2の単一ドメイン抗体(sdAb)をさらに含む。いくつかの実施形態では、CARは、第2の抗原(例えば、第2の腫瘍抗原)に特異的に結合する第2の単一ドメイン抗体(sdAb)、及び第3の抗原(例えば、第3の腫瘍抗原)に特異的に結合する第3の単一ドメイン抗体(sdAb)をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のCARにより標的とされる追加の抗原(複数可)は、細胞表面分子である。単一ドメイン抗体は、特定の疾患状態と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用する抗原を認識するように選択されてもよい。いくつかの実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、B細胞悪性腫瘍と関連する。腫瘍は、免疫応答、特に、T細胞媒介性免疫応答の標的抗原として機能し得る多数のタンパク質を発現する。CARにより標的とされる抗原は、単一の疾患細胞上の抗原、またはそれぞれが疾患に寄与する異なる細胞上で発現される抗原であってよい。CARにより標的とされる抗原は、疾患に直接的または間接的に関与することがある。
腫瘍抗原は、免疫応答、特に、T細胞媒介性免疫応答を誘発し得る腫瘍細胞により産生されるタンパク質である。本開示の追加の標的抗原の選択は、処置されるべき特定のタイプのがんに依存するであろう。例示的な腫瘍抗原としては、神経膠腫関連抗原、がん胎児性抗原(CEA)、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、チログロブリン、RAGE-1、MN-CAIX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、プロスターゼ、前立腺特異抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、プロステイン、PSMA、HER2/neu、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺がん腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、CD19、インスリン成長因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受容体及びメソテリンが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍と関連する1つ以上の抗原性がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原として機能し得る多数のタンパク質を発現する。これらの分子は、組織特異的抗原、例えば、黒色腫のMART-1、チロシナーゼ、及びgp100、ならびに、前立腺がんの前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)及び前立腺特異的抗原(PSA)を含むが、これらに限定されない。他の標的分子は、がん遺伝子HER2/Neu/ErbB-2などの形質転換関連分子の群に属する。標的抗原のさらに別の群は、がん胎児性抗原(CEA)などのがん胎児性抗原である。B細胞リンパ腫では、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンが、個々の腫瘍に固有の真の腫瘍特異的免疫グロブリン抗原を構成する。CD20に加えて、B細胞分化抗原、例えば、CD22及びCD37は、B細胞リンパ腫の標的抗原の他の候補である。
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍特異抗原(TSA)または腫瘍関連抗原(TAA)である。TSAは、腫瘍細胞に固有のものであり、体内の他の細胞には発生しない。TAA関連抗原は、腫瘍細胞に固有のものではなく、代わりに、抗原に対する免疫寛容の状態を誘導できない条件下で正常細胞にも発現される。腫瘍上での抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で起こり得る。TAAは、免疫系が未熟で応答できない場合、胎児の発育中に正常細胞に発現する抗原であっても、通常は正常細胞に非常に低いレベルで存在する抗原であってもよいが、これは、腫瘍細胞にはるかに高いレベルで発現される。
TSAまたはTAA抗原の非限定例としては、分化抗原、例えば、MART-1/MelanA(MART-1)、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、及び腫瘍特異的多系統抗原、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5;過剰発現胚性抗原、例えば、CEA;過剰発現がん遺伝子及び変異がん抑制遺伝子、例えば、p53、Ras、HER2/neu;染色体転座に起因する固有の腫瘍抗原、例えば、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR;ならびに、ウイルス抗原、例えば、エプスタインバーウイルス抗原EBVA及びヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6及びE7が挙げられる。
他の大きなタンパク質ベースの抗原としては、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、ベータ-カテニン、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、アルファ-フェトプロテイン、ベータ-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2結合タンパク質\シクロフィリンC関連タンパク質、TAAL6、TAG72、TLP、及びTPSが挙げられる。
いくつかのより具体的な実施形態では、1つ以上の追加の抗原(複数可)は、CD20、CD19、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3、及び糖脂質F77からなる群から選択される。
特定の実施形態では、本明細書で提供されるCARは、CD20に結合するVHH及びCD19に結合するVHHを含む。別の特定の実施形態では、本明細書で提供されるCARは、CD20に結合するVHH及びCD22に結合するVHHを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるsdAbは、ラクダ科動物、キメラ、ヒト、またはヒト化である。
本明細書で提供される1つ以上の抗原結合ドメイン(複数可)に加えて、本明細書で提供されるCARは、リンカー(例えば、ペプチドリンカー)、膜貫通ドメイン、ヒンジ領域、シグナルペプチド、細胞内シグナル伝達ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメインのうちの1つ以上をさらに含んでもよく、これらのそれぞれは、以下により詳細に記載される。
例えば、いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζに由来する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83のリガンド及びその組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、CD137に由来する。いくつかの実施形態では、CD20 CARは、細胞外抗原結合ドメインのC末端及び膜貫通ドメインのN末端間に位置するヒンジドメイン(例えば、CD8αヒンジドメイン)をさらに含む。いくつかの実施形態では、CD20 CARは、ポリペプチドのN末端に位置するシグナルペプチド(例えば、CD8αシグナルペプチド)をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、N末端からC末端まで、CD8αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、CD8αヒンジドメイン、CD8α膜貫通ドメイン、CD137に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、及びCD3ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、CD20 CARは、単一特異性である。いくつかの実施形態では、CD20 CARは、一価である。他の実施形態では、CD20 CARは、多価である。
ペプチドリンカー
本明細書に記載の多重特異性または多価CARにおける様々な単一ドメイン抗体は、ペプチドリンカーを介して互いに融合され得る。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、任意のペプチドリンカーなしで互いに直接融合される。異なる単一ドメイン抗体(例えば、VHH)を連結するペプチドリンカーは、同じであっても異なっていてもよい。CARの異なるドメインは、また、ペプチドリンカーを介して互いに融合されてもよい。
本明細書に記載の多重特異性または多価CARにおける様々な単一ドメイン抗体は、ペプチドリンカーを介して互いに融合され得る。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、任意のペプチドリンカーなしで互いに直接融合される。異なる単一ドメイン抗体(例えば、VHH)を連結するペプチドリンカーは、同じであっても異なっていてもよい。CARの異なるドメインは、また、ペプチドリンカーを介して互いに融合されてもよい。
CAR内の各ペプチドリンカーは、単一ドメイン抗体及び/または様々なドメインの構造的及び/または機能的特徴に応じて、同じまたは異なる長さ及び/または配列を有してもよい。各ペプチドリンカーは、独立して、選択及び最適化されてもよい。CARで使用されるペプチドリンカー(複数可)の長さ、柔軟性の程度、及び/または他の特性は、限定されないが、1つ以上の特定の抗原またはエピトープに対する親和性、特異性、または結合力を含む特性に何らかの影響を与え得る。例えば、より長いペプチドリンカーは、隣接する2つのドメインが互いに立体的に干渉しないようにするために選択されてもよい。いくつかの実施形態では、短いペプチドリンカーは、CARの膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメイン間に配置されてもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、隣接するドメインが互いに自由に移動できるように、柔軟な残基(例えば、グリシン及びセリン)を含む。例えば、グリシン-セリンダブレットは、好適なペプチドリンカーであり得る。
ペプチドリンカーは、任意の好適な長さであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100、またはそれ以上のアミノ酸長のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、またはそれ以下のアミノ酸長のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーの長さは、約1アミノ酸~約10アミノ酸、約1アミノ酸~約20アミノ酸、約1アミノ酸~約30アミノ酸、約5アミノ酸~約15アミノ酸、約10アミノ酸~約25アミノ酸、約5アミノ酸~約30アミノ酸、約10アミノ酸~約30アミノ酸長、約30アミノ酸~約50アミノ酸、約50アミノ酸~約100アミノ酸、または約1アミノ酸~約100アミノ酸のうちのいずれかである。
ペプチドリンカーは、天然に存在する配列、または非天然に存在する配列を有してもよい。例えば、重鎖のみの抗体のヒンジ領域に由来する配列は、リンカーとして使用されてもよい。例えば、WO1996/34103を参照。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、柔軟なリンカーである。例示的な柔軟なリンカーとしては、グリシンポリマー(G)n、グリシン-セリンポリマー(例えば、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n、及び(GGGGS)nを含み、nは、少なくとも1の整数である)、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、及び当該技術分野で既知の他の柔軟なリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なペプチドリンカーは、以下の表に列挙される。特定の実施形態では、本明細書で提供される2つ以上の抗CD20 VHHドメインを連結するペプチドリンカーは、(GGGGS)n(配列番号138)であり、nは、任意に1、2、3、4、または5である。
例えば、WO2016014789、WO2015158671、WO2016102965、US20150299317、WO2018067992、US7741465、Colcher et al.,J.Nat.Cancer Inst.82:1191-1197(1990)、及びBird et al.,Science 242:423-426(1988)に記載の当該技術分野で既知の他のリンカーは、また、本明細書で提供されるCARに含まれ得、これらのそのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
5.3.2.膜貫通ドメイン
本開示のCARは、細胞外抗原結合ドメインに直接的または間接的に融合することができる膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然または合成の供給源のいずれかに由来し得る。本明細書で使用される場合、「膜貫通ドメイン」は、細胞膜、好ましくは、真核細胞膜において熱力学的に安定している任意のタンパク質構造を指す。本明細書に記載のCARでの使用に適合する膜貫通ドメインは、天然に存在するタンパク質から得られてもよい。あるいは、それは、合成の非天然タンパク質セグメント、例えば、細胞膜中で熱力学的に安定している疎水性タンパク質セグメント、であり得る。
本開示のCARは、細胞外抗原結合ドメインに直接的または間接的に融合することができる膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然または合成の供給源のいずれかに由来し得る。本明細書で使用される場合、「膜貫通ドメイン」は、細胞膜、好ましくは、真核細胞膜において熱力学的に安定している任意のタンパク質構造を指す。本明細書に記載のCARでの使用に適合する膜貫通ドメインは、天然に存在するタンパク質から得られてもよい。あるいは、それは、合成の非天然タンパク質セグメント、例えば、細胞膜中で熱力学的に安定している疎水性タンパク質セグメント、であり得る。
膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインの3次元構造に基づいて分類される。例えば、膜貫通ドメインは、アルファへリックス、複数のアルファへリックスの複合体、ベータ-バレル、または細胞のリン脂質二重層にまたがることが可能な任意の他の安定構造を形成し得る。さらに、膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインが膜を横切る通過回数及びタンパク質の配向を含む膜貫通ドメイントポロジーに基づいて分類されてもよい。例えば、シングルパス膜タンパク質は、細胞膜を1回横切り、マルチパス膜タンパク質は、細胞膜を少なくとも2回(例えば、2、3、4、5、6、7回またはそれ以上)横切る。膜タンパク質は、細胞の内側及び外側に対するそれらの末端及び膜通過セグメント(複数可)のトポロジーに応じて、I型、II型、またはIII型として定義されてもよい。I型膜タンパク質は、単一の膜貫通領域を有し、タンパク質のN末端が、細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、タンパク質のC末端が、細胞質側に存在するように配向されている。II型膜タンパク質は、単一の膜貫通領域も有するが、タンパク質のC末端が、細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、タンパク質のN末端が、細胞質側に存在するように配向されている。III型膜タンパク質は、複数の膜貫通セグメントを有し、さらに、膜貫通セグメントの数ならびにN末端及びC末端の位置に基づいて細分類されてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のCARの膜貫通ドメインは、I型シングルパス膜タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、マルチパス膜タンパク質由来の膜貫通ドメインは、また、本明細書に記載のCARでの使用に適合し得る。マルチパス膜タンパク質は、複合(少なくとも2、3、4、5、6、7またはそれ以上)アルファヘリックスまたはベータシート構造を含んでもよい。いくつかの実施形態では、マルチパス膜タンパク質のN末端及びC末端は、脂質二重層の反対側に存在し、例えば、タンパク質のN末端は、脂質二重層の細胞質側に存在し、タンパク質のC末端は、細胞外側に存在する。
いくつかの実施形態では、CARの膜貫通ドメインは、T細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖の膜貫通ドメイン、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL-2Rベータ、IL-2Rガンマ、IL-7Ra、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触覚)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、及び/またはNKG2Cから選択される膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152、及びPD1からなる群より選択される分子に由来する。
いくつかの特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、CD8αに由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号154のアミノ酸配列を含むCD8αの膜貫通ドメインである。
本明細書に記載のCARに使用される膜貫通ドメインは、合成の非天然タンパク質セグメントの少なくとも一部も含み得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、合成の非天然アルファヘリックスまたはベータシートである。いくつかの実施形態では、タンパク質セグメントは、少なくとも約20アミノ酸、例えば、少なくとも18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、またはそれ以上のアミノ酸である。合成膜貫通ドメインの例は、例えば、米国特許第7,052,906号及びPCT公開第WO2000/032776号において、当該技術分野で既知であり、これらの関連開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で提供される膜貫通ドメインは、膜貫通領域及び膜貫通ドメインのC末端側に位置する細胞質領域を含み得る。膜貫通ドメインの細胞質領域は、3つ以上のアミノ酸を含んでもよく、いくつかの実施形態では、脂質二重層において膜貫通ドメインを配向させるのに役立つ。いくつかの実施形態では、1つ以上のシステイン残基は、膜貫通ドメインの膜貫通領域に存在する。いくつかの実施形態では、1つ以上のシステイン残基は、膜貫通ドメインの細胞質領域に存在する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインの細胞質領域は、正荷電アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインの細胞質領域は、アミノ酸アルギニン、セリン、及びリジンを含む。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインの膜貫通領域は、疎水性アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるCARの膜貫通ドメインは、人工疎水性配列を含む。例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットは、膜貫通ドメインのC末端に存在してもよい。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、ほとんどが疎水性のアミノ酸残基、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはバリンを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、疎水性である。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、ポリロイシンアラニン配列を含む。タンパク質またはタンパク質セグメントのハイドロパシーまたは疎水性もしくは親水性の特性は、当該技術分野で既知ある任意の方法、例えば、カイト及びドゥーリトルのハイドロパシー分析で評価することができる。
5.3.3.細胞内シグナル伝達ドメイン
本開示のCARは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、CARを発現する免疫エフェクター細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも1つの活性化に関与する。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。T細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。従って、「細胞質シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特定の機能を実行するように指示するタンパク質の部分を指す。通常、細胞質シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞質シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される限りにおいて、そのような切断部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクト鎖の代わりに使用されてもよい。従って、細胞質シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞質シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。
本開示のCARは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、CARを発現する免疫エフェクター細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも1つの活性化に関与する。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。T細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。従って、「細胞質シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特定の機能を実行するように指示するタンパク質の部分を指す。通常、細胞質シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞質シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される限りにおいて、そのような切断部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクト鎖の代わりに使用されてもよい。従って、細胞質シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞質シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、CARは、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインから本質的になる細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「一次細胞内シグナル伝達ドメイン」は、刺激的な方法で作用して、免疫エフェクター機能を誘導する細胞質シグナル伝達配列を指す。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ、またはITAMとして既知のシグナル伝達モチーフを含有する。本明細書で使用される「ITAM」は、多くの免疫細胞で発現されるシグナル伝達分子のテール部分に一般に存在する、保存されたタンパク質モチーフである。モチーフは、6~8個のアミノ酸により分離されたアミノ酸配列YxxL/Iの2つのリピートを含んでもよく、各xは、独立して、任意のアミノ酸であり、これは、保存されたモチーフYxxL/Ix(6~8)YxxL/Iを生成する。シグナル伝達分子内のITAMは、細胞内のシグナル伝達にとって重要であり、これは、ITAMのチロシン残基のリン酸化、続いて、シグナル伝達分子の活性化により少なくとも部分的に媒介される。ITAMは、シグナル伝達経路に関与する他のタンパク質のドッキング部位としても機能し得る。例示的なITAMを含有する主要な細胞質シグナル伝達配列は、CD3ζ、FcRガンマ(FCER1G)、FcRベータ(Fcイプシロンリブ)、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、及びCD66dに由来するものを含む。
いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζに由来する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζの細胞質シグナル伝達ドメインからなる。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型CD3ζの細胞質シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態では、CD3ζの一次細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号156のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、野生型CD3ζの一次細胞内シグナル伝達ドメイン。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、Q65Kなどの1つ以上の変異を含むCD3ζの細胞質シグナル伝達ドメインの機能的変異体である。
5.3.4.共刺激シグナル伝達ドメイン
多くの免疫エフェクター細胞は、抗原特異的シグナルの刺激に加えて、細胞増殖、分化、及び生存を促進し、細胞のエフェクター機能を活性化するために共刺激を必要とする。いくつかの実施形態では、CARは、少なくとも1つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される「共刺激シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能などの免疫応答を誘導するために細胞内でシグナル伝達を媒介するタンパク質の少なくとも一部を指す。本明細書に記載のキメラ受容体の共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激タンパク質由来の細胞質シグナル伝達ドメインであり得、これは、シグナルを変換し、免疫細胞、例えば、T細胞、NK細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球、により媒介された応答を調節する。「共刺激シグナル伝達ドメイン」は、共刺激分子の細胞質部分であり得る。「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、限定されないが、増殖及び生存を含む免疫細胞で共刺激応答を媒介する免疫細胞(例えば、T細胞)上に同族結合パートナーを指す。
多くの免疫エフェクター細胞は、抗原特異的シグナルの刺激に加えて、細胞増殖、分化、及び生存を促進し、細胞のエフェクター機能を活性化するために共刺激を必要とする。いくつかの実施形態では、CARは、少なくとも1つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される「共刺激シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能などの免疫応答を誘導するために細胞内でシグナル伝達を媒介するタンパク質の少なくとも一部を指す。本明細書に記載のキメラ受容体の共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激タンパク質由来の細胞質シグナル伝達ドメインであり得、これは、シグナルを変換し、免疫細胞、例えば、T細胞、NK細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球、により媒介された応答を調節する。「共刺激シグナル伝達ドメイン」は、共刺激分子の細胞質部分であり得る。「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、限定されないが、増殖及び生存を含む免疫細胞で共刺激応答を媒介する免疫細胞(例えば、T細胞)上に同族結合パートナーを指す。
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、単一の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、2つ以上(例えば、約2、3、4、またはそれ以上のうちのいずれか)の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、同じ共刺激シグナル伝達ドメインの2つ以上を含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載の任意の2つ以上の共刺激タンパク質などの、異なる共刺激タンパク質からの2つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、CD3ζの細胞質シグナル伝達ドメイン)及び1つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン及び一次細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、CD3ζの細胞質シグナル伝達ドメイン)は、任意のペプチドリンカーを介して互いに融合される。一次細胞内シグナル伝達ドメイン、及び1つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の好適な順序で配置されてもよい。いくつかの実施形態では、1つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメイン及び一次細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、CD3ζの細胞質シグナル伝達ドメイン)間に位置する。複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、相加的または相乗的な刺激効果を提供し得る。
宿主細胞(例えば、免疫細胞)における共刺激シグナル伝達ドメインの活性化は、サイトカインの産生及び分泌、食作用特性、増殖、分化、生存、及び/または細胞傷害性を増加または減少させるように細胞を誘導し得る。任意の共刺激分子の共刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載のCARでの使用に適合し得る。共刺激シグナル伝達ドメインのタイプ(複数可)は、エフェクター分子が発現される免疫エフェクター細胞のタイプ(例えば、T細胞、NK細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球)、ならびに、所望の免疫エフェクター機能(例えば、ADCC効果)などの要因に基づいて選択される。CARに使用される共刺激シグナル伝達ドメインの例としては、限定されないが、B7/CD28ファミリーのメンバー(例えば、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC、及びPDCD6);TNFスーパーファミリーのメンバー(例えば、4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BBリガンド/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27リガンド/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30リガンド/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40リガンド/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITRリガンド/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、リンホトキシン-アルファ/TNF-ベータ、OX40/TNFRSF4、OX40リガンド/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-アルファ、及びTNFRII/TNFRSF1B);SLAMファミリーのメンバー(例えば、2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6、及びSLAM/CD150);ならびに、任意の他の共刺激分子、例えば、CD2、CD7、CD53、D82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLAクラスI、HLA-DR、Ikaros、インテグリンアルファ4/CD49d、インテグリンアルファ4ベータ1、インテグリンアルファ4ベータ7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、デクチン-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、及びNKG2Cを含む、共刺激タンパク質の細胞質シグナル伝達ドメインであり得る。
いくつかの実施形態では、1つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、及びCD83に特異的に結合するリガンドからなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、本開示のCARにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、CD137(すなわち、4-1BB)に由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζの細胞質シグナル伝達ドメイン及びCD137の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号155のアミノ酸配列を含むCD137の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
共刺激シグナル伝達ドメインが免疫細胞の免疫応答を調節可能であるように、本明細書に記載の共刺激シグナル伝達ドメインのいずれかのバリアントも本開示の範囲内である。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、野生型対応物と比較して、最大10(例えば、1、2、3、4、5、または8つ)のアミノ酸残基の変化を含む。1つ以上のアミノ酸の変化を含むそのような共刺激シグナル伝達ドメインは、バリアントと呼ばれることがある。共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の変異は、変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比較して、シグナル伝達の増加及び免疫応答の刺激の増強をもたらし得る。共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の変異は、変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比較して、シグナル伝達の減少及び免疫応答の刺激の低減をもたらし得る。
5.3.5.ヒンジ領域
本開示のCARは、細胞外抗原結合ドメイン及び膜貫通ドメイン間に位置するヒンジドメインを含んでもよい。ヒンジドメインは、一般に、タンパク質の2つのドメイン間に見られるアミノ酸セグメントであり、タンパク質の柔軟性と、互いに対する、ドメインの一方または両方の移動を可能にすることがある。エフェクター分子の膜貫通ドメインに対する、細胞外抗原結合ドメインのそのような柔軟性及び移動を提供する任意のアミノ酸配列を使用することができる。
本開示のCARは、細胞外抗原結合ドメイン及び膜貫通ドメイン間に位置するヒンジドメインを含んでもよい。ヒンジドメインは、一般に、タンパク質の2つのドメイン間に見られるアミノ酸セグメントであり、タンパク質の柔軟性と、互いに対する、ドメインの一方または両方の移動を可能にすることがある。エフェクター分子の膜貫通ドメインに対する、細胞外抗原結合ドメインのそのような柔軟性及び移動を提供する任意のアミノ酸配列を使用することができる。
ヒンジドメインは、約10~100個のアミノ酸、例えば、約15~75個のアミノ酸、20~50個のアミノ酸、または30~60個のアミノ酸のうちのいずれか1つを含有してもよい。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、または75アミノ酸長のうちのいずれか1つであってよい。
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインである。ヒンジドメインを含むことが当該技術分野で知られている任意のタンパク質のヒンジドメインは、本明細書に記載のキメラ受容体での使用に適合性がある。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインの少なくとも一部であり、キメラ受容体に柔軟性を付与する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、CD8αに由来する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、CD8αのヒンジドメインの一部、例えば、CD8αのヒンジドメインの少なくとも15個(例えば、20、25、30、35、または40個)の連続するアミノ酸を含有するフラグメントである。いくつかの実施形態では、CD8αのヒンジドメインは、配列番号153のアミノ酸配列を含む。
IgG、IgA、IgM、IgE、またはIgD抗体などの抗体のヒンジドメインも、本明細書に記載のpH依存性キメラ受容体システムでの使用に適合する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体の定常ドメインCH1及びCH2を連結するヒンジドメインである。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のものであり、抗体のヒンジドメイン及び抗体の1つ以上の定常領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメイン及び抗体のCH3定常領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメイン、ならびに、抗体のCH2及びCH3定常領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、IgG、IgA、IgM、IgE、またはIgD抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、IgG抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4抗体である。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、IgG1抗体のヒンジ領域ならびにCH2及びCH3定常領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、IgG1抗体のヒンジ領域及びCH3定常領域を含む。
天然に存在しないペプチドは、本明細書に記載のキメラ受容体のヒンジドメインとしても使用されてもよい。いくつかの実施形態では、Fc受容体の細胞外リガンド結合ドメインのC末端と、膜貫通ドメインのN末端との間のヒンジドメインは、(GxS)nリンカーなどのペプチドリンカーであり、x及びnは、独立して、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、またはそれ以上を含む、3~12の整数であり得る。
5.3.6.シグナルペプチド
本開示のCARは、ポリペプチドのN末端にシグナルペプチド(シグナル配列としても既知)を含んでもよい。一般に、シグナルペプチドは、ポリペプチドを細胞内の所望の部位に向けるペプチド配列である。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、エフェクター分子を細胞の分泌経路に向け、脂質二重層へのエフェクター分子の組み込み及び固定を可能にする。天然に存在するタンパク質のシグナル配列または合成の天然に存在しないシグナル配列を含むシグナルペプチド(本明細書に記載のCARでの使用に適合)は、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、CD8α、GM-CSF受容体α、及びIgG1重鎖からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、CD8αに由来する。いくつかの実施形態では、CD8αのシグナルペプチドは、配列番号152のアミノ酸配列を含む。
本開示のCARは、ポリペプチドのN末端にシグナルペプチド(シグナル配列としても既知)を含んでもよい。一般に、シグナルペプチドは、ポリペプチドを細胞内の所望の部位に向けるペプチド配列である。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、エフェクター分子を細胞の分泌経路に向け、脂質二重層へのエフェクター分子の組み込み及び固定を可能にする。天然に存在するタンパク質のシグナル配列または合成の天然に存在しないシグナル配列を含むシグナルペプチド(本明細書に記載のCARでの使用に適合)は、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、CD8α、GM-CSF受容体α、及びIgG1重鎖からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、CD8αに由来する。いくつかの実施形態では、CD8αのシグナルペプチドは、配列番号152のアミノ酸配列を含む。
5.3.7.例示的なCAR
以下のセクション6に示されるように、例示的な一価CAR、例えば、VHH-273 CAR、VHH-283 CAR、VHH-313 CAR、VHH-440 CAR、VHH-466 CAR、VHH-496 CAR、VHH-653 CAR、huVHH-253 CAR、huVHH-256 CAR、huVHH-260 CAR、huVHH-746 CAR、huVHH-750 CAR、huVHH-753 CAR、huVHH-836 CAR、huVHH-840 CAR、huVHH-843 CAR、huVHH-846 CAR、及びVHH-623 CAR、VHH-640 CAR、ならびに/またはVHH-657 CARを生成した。
以下のセクション6に示されるように、例示的な一価CAR、例えば、VHH-273 CAR、VHH-283 CAR、VHH-313 CAR、VHH-440 CAR、VHH-466 CAR、VHH-496 CAR、VHH-653 CAR、huVHH-253 CAR、huVHH-256 CAR、huVHH-260 CAR、huVHH-746 CAR、huVHH-750 CAR、huVHH-753 CAR、huVHH-836 CAR、huVHH-840 CAR、huVHH-843 CAR、huVHH-846 CAR、及びVHH-623 CAR、VHH-640 CAR、ならびに/またはVHH-657 CARを生成した。
加えて、セクション6に示されるように、例示的な多価CAR、例えば、Bi-VHH1 CAR、Bi-VHH2 CAR、Bi-VHH3 CAR、Bi-VHH4(G4S)1 CAR、Bi-VHH4(G4S)2 CAR、Bi-VHH4(G4S)3 CAR、Bi-VHH4(G4S)4 CAR、Bi-VHH4(G4S)5 CAR、及びTri-VHH CARを含む二価及び三価CARが生成される。
いくつかの実施形態では、配列番号81のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号82のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号83のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号84のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号85のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号86のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号87のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号88のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号89のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号90のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号91のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号92のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号93のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号94のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号95のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号96のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号97のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号98のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号99のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号100のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号101のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号102のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号103のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号104のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号105のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号106のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号189のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号190のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号191のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるCARが本明細書で提供される。
特定の実施形態では、本明細書で提供されるCARは、以下のセクション6に例示されるCARのいずれか1つと比較して、特定のパーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号81のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号82のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号83のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号84のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号85のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号86のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号87のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号88のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号89のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号90のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号91のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号92のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号93のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号94のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号95のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号96のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号97のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号98のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号99のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号100のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号101のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号102のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号103のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号104のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号105のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号106のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号189のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号190のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号191のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCD20 CARが本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるCD20 CARのいずれかをコードする単離核酸が本明細書で提供される。核酸配列及びベクターに関する、より詳細な説明が以下に提供される。
5.4.操作された免疫エフェクター細胞
さらに別の態様では、本明細書に記載のCARのいずれか1つを含む宿主細胞(例えば、免疫エフェクター細胞)が本明細書で提供される。
さらに別の態様では、本明細書に記載のCARのいずれか1つを含む宿主細胞(例えば、免疫エフェクター細胞)が本明細書で提供される。
従って、いくつかの実施形態では、(a)1つ以上の抗CD20 sdAb(複数可)を含む細胞外抗原結合ドメイン、(b)膜貫通ドメイン(複数可)、及び(c)細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むポリペプチドを含むCARを含む操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)が本明細書で提供され、抗CD20 sdAbは、例えば、表2のVHHドメイン、及び表2のそれらのVHHドメインのうちのいずれかに1つ、2つ、または3つ全てのCDRを有するものを含む、上記セクション5.2に記載の抗CD20 sdAbである。いくつかの実施形態では、抗CD20 sdAbは、ラクダ科動物、キメラ、ヒト、またはヒト化のものである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152、及びPD1からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζに由来する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83のリガンド及びその組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態では、CARは、細胞外抗原結合ドメインのC末端及び膜貫通ドメインのN末端間に位置するヒンジドメイン(例えば、CD8αヒンジドメイン)をさらに含む。いくつかの実施形態では、CARは、ポリペプチドのN末端に位置するシグナルペプチド(例えば、CD8αシグナルペプチド)をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、N末端からC末端まで、CD8αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、CD8αヒンジドメイン、CD8α膜貫通ドメイン、CD137に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、及びCD3ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、(a)1つ以上の抗CD20 sdAb(複数可)を含む細胞外抗原結合ドメイン、(b)膜貫通ドメイン、及び(c)細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むポリペプチドを含むCARを含む操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)が本明細書で提供され、抗CD20 sdAbが、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号183、配列番号184、または配列番号185のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、(a)1つ以上の抗CD20 sdAb(複数可)を含む細胞外抗原結合ドメイン、(b)膜貫通ドメイン、及び(c)細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むポリペプチドを含むCARを含む操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)が本明細書で提供され、抗CD20 sdAbが、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号183、配列番号184、または配列番号185のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152、及びPD1からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζに由来する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83のリガンド及びその組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態では、CARは、細胞外抗原結合ドメインのC末端及び膜貫通ドメインのN末端間に位置するヒンジドメイン(例えば、CD8αヒンジドメイン)をさらに含む。いくつかの実施形態では、CARは、ポリペプチドのN末端に位置するシグナルペプチド(例えば、CD8αシグナルペプチド)をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、N末端からC末端まで、CD8αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、CD8αヒンジドメイン、CD8α膜貫通ドメイン、CD137に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、及びCD3ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号189、配列番号190、及び配列番号191からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCARを含む、操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号189、配列番号190、及び配列番号191からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドを含むCARを含む、操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)が本明細書で提供される。
他の実施形態では、CD20に特異的に結合する第1の単一ドメイン抗体(sdAb)及び1つ以上の追加の抗原結合ドメイン(複数可)を含む細胞外抗原結合ドメイン;(b)膜貫通ドメイン;及び(c)細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むポリペプチドを含む多特異性(例えば、二重特異性または三重特異性)のキメラ抗原受容体(CAR)を含む、操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)が提供される。いくつかの実施形態では、追加の抗原結合ドメインは、CD22、CD19、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3、及び糖脂質F77からなる群より選択される抗原に結合する。いくつかの実施形態では、第1のsdAb及び/または追加のsdAbは、ラクダ科動物、キメラ、ヒト、またはヒト化のものである。いくつかの実施形態では、第1の単一ドメイン抗体及び追加の単一ドメイン抗体は、ペプチド結合またはペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約50以下(例えば、約35、25、20、15、10、または5のうちのいずれか1つ以下)のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152、及びPD1からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζに由来する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83のリガンド及びその組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態では、多重特異性CARは、細胞外抗原結合ドメインのC末端及び膜貫通ドメインのN末端間に位置するヒンジドメイン(例えば、CD8αヒンジドメイン)をさらに含む。いくつかの実施形態では、多重特異性CARは、ポリペプチドのN末端に位置するシグナルペプチド(例えば、CD8αシグナルペプチド)をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、N末端からC末端まで、CD8αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、CD8αヒンジドメイン、CD8α膜貫通ドメイン、CD137に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、及びCD3ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、T細胞、NK細胞、末梢血単核細胞(PBMC)、造血幹細胞、多能性幹細胞、または胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、自己由来である。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、同種異系である。
2つ以上の異なるCARを含む(または発現する)操作された免疫エフェクター細胞も提供される。本明細書に記載のCARの任意の2つ以上を組み合わせて発現させてもよい。CARは、異なる抗原を標的とし、それにより、相乗効果または相加効果を提供し得る。2つ以上のCARは、同じベクターまたは異なるベクター上でコードされてもよい。
操作された免疫エフェクター細胞は、さらに、1つ以上の治療用タンパク質及び/または免疫チェックポイント阻害薬などの免疫調節薬を発現し得る。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許第PCT/CN2016/073489号及び同第PCT/CN2016/087855号を参照のこと。
5.4.1.ベクター
本開示は、本明細書に記載のCARのいずれか1つをクローニング及び発現するためのベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳動物細胞などの真核細胞における複製及び組み込みに適する。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、及びそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al.(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)、ならびに、他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載される。
本開示は、本明細書に記載のCARのいずれか1つをクローニング及び発現するためのベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳動物細胞などの真核細胞における複製及び組み込みに適する。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、及びそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al.(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)、ならびに、他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載される。
多数のウイルスベースのシステムは、哺乳動物細胞への遺伝子導入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムの便利なプラットフォームを提供する。当該技術分野で既知の技術を使用して、異種核酸をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次に、組み換えウイルスを単離し、in vitroまたはex vivoで、操作された哺乳動物細胞に送達することができる。多くのレトロウイルス系が、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターが、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。いくつかの実施形態では、自己不活化レンチウイルスベクターが使用される。例えば、免疫調節因子(例えば、免疫チェックポイント阻害薬)コード配列を担持する自己不活化レンチウイルスベクター及び/またはキメラ抗原受容体を担持する自己不活化レンチウイルスベクターは、当該技術分野で既知のプロトコールでパッケージングすることができる。得られたレンチウイルスベクターは、当該技術分野で既知の方法を使用して哺乳動物細胞(例えば、初代ヒトT細胞)に形質導入するために使用することができる。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期的で安定した統合及び子孫細胞での増殖を可能にするので、長期的な遺伝子導入を達成するのに好適なツールである。レンチウイルスベクターも免疫原性が低く、非増殖細胞に形質導入し得る。
いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に記載のCARをコードする核酸のいずれか1つを含む。例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位及び1つ以上の選択マーカーを使用することを含む、当該技術分野で既知の任意の分子クローニング法を使用して、核酸をベクターにクローニングすることができる。いくつかの実施形態では、核酸は、プロモーターに作動可能に連結される。哺乳動物細胞における遺伝子発現のために様々なプロモーターが調査されており、当該技術分野で既知のプロモーターのいずれかが本開示で使用されてもよい。プロモーターは、構成的プロモーターまたは調節プロモーター、例えば、誘導性プロモーターとして大まかに分類されてもよい。
いくつかの実施形態では、CARをコードする核酸は、構成的プロモーターに作動可能に連結される。構成的プロモーターは、異種遺伝子(導入遺伝子とも呼ばれる)が宿主細胞内で構成的に発現されることを可能にする。本明細書で企図される例示的な構成的プロモーターとしては、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ヒト伸長因子-1アルファ(hEF1α)、ユビキチンCプロモーター(UbiC)、ホスホグリセロキナーゼプロモーター(PGK)、シミアンウイルス40初期プロモーター(SV40)、及びCMV初期エンハンサー(CAGG)と結合したニワトリβ-アクチンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。導入遺伝子発現を引き起こす、そのような構成的プロモーターの効率は、膨大な数の研究で広く比較されている。例えば、Michael C.Milone et alは、初代ヒトT細胞のキメラ抗原受容体の発現を促進するCMV、hEF1α、UbiC、及びPGKの効率を比較し、hEF1αプロモーターは、最高レベルの導入遺伝子発現を誘導しただけでなく、CD4及びCD8ヒトT細胞で最適に維持された(Molecular Therapy,17(8):1453-1464(2009))。いくつかの実施形態では、CARをコードする核酸は、hEF1αプロモーターに作動可能に連結される。
いくつかの実施形態では、CARをコードする核酸は、誘導性プロモーターに作動可能に連結される。誘導性プロモーターは、調節プロモーターのカテゴリーに属する。1つ以上の条件、例えば、物理的状態、操作された免疫エフェクター細胞の微小環境、または操作された免疫エフェクター細胞の生理学的状態、誘導因子(すなわち、誘導作用物質)、またはその組み合わせにより、誘導性プロモーターを誘導することができる。
いくつかの実施形態では、この誘導条件は、操作された哺乳動物細胞において、及び/または医薬組成物を投与される対象において、内因性遺伝子の発現を誘導しない。いくつかの実施形態では、この誘導条件は、誘導因子、照射(例えば、電離放射線、光)、温度(例えば、熱)、レドックス状態、腫瘍環境、及び操作された哺乳動物細胞の活性化状態からなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターを介してトランスフェクトされた宿主細胞の集団からCARを発現する細胞を選択するための選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子も含有する。宿主細胞での発現を可能にするために、選択マーカー及びレポーター遺伝子の両方は、適切な調節配列に隣接していてもよい。例えば、ベクターは、核酸配列の発現の調節に有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、及びプロモーターを含有してもよい。
いくつかの実施形態では、ベクターは、CARをコードする2つ以上の核酸を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、第1のCARをコードする第1の核酸配列及び第2のCARをコードする第2の核酸配列を含む核酸を含み、第1の核酸は、自己切断ペプチドをコードする第3の核酸配列を介して第2の核酸に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、T2A、P2A、及びF2Aからなる群より選択される。
5.4.2.免疫エフェクター細胞
「免疫エフェクター細胞」は、免疫エフェクター機能を実施することができる免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、少なくともFcγRIIIを発現し、ADCCエフェクター機能を実施する。ADCCを媒介する免疫エフェクター細胞の例としては、末梢血単核細胞(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、細胞傷害性T細胞、好中球、及び好酸球が挙げられる。
「免疫エフェクター細胞」は、免疫エフェクター機能を実施することができる免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、少なくともFcγRIIIを発現し、ADCCエフェクター機能を実施する。ADCCを媒介する免疫エフェクター細胞の例としては、末梢血単核細胞(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、細胞傷害性T細胞、好中球、及び好酸球が挙げられる。
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、T細胞である。いくつかの実施形態では、T細胞は、CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+、CD4-/CD8-、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、T細胞は、IL-2、TFN、及び/またはTNFは、CARを発現し、CD20+腫瘍細胞などの標的細胞に結合する。いくつかの実施形態では、CD8+T細胞は、CARの発現時及び標的細胞への結合時に、抗原特異的標的細胞を溶解させる。
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、NK細胞である。他の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、確立された細胞株、例えば、NK-92細胞であり得る。
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、幹細胞、例えば、造血幹細胞、多能性幹細胞、iPS、または胚性幹細胞から分化する。
操作された免疫エフェクター細胞は、免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞にCARを導入することにより調製される。いくつかの実施形態では、CARは、上記の単離核酸のいずれか1つまたはベクターのいずれか1つをトランスフェクトすることにより、免疫エフェクター細胞に導入される。いくつかの実施形態では、CARは、CELL SQUEEZE(登録商標)などのマイクロ流体システムを細胞に通過させながら、タンパク質を細胞膜に挿入することにより、免疫エフェクター細胞に導入される(例えば、米国特許出願公開第20140287509号を参照)。
ベクターまたは単離核酸を哺乳動物細胞に導入する方法は、当該技術分野で既知である。記載のベクターを、物理的、化学的、または生物学的方法で免疫エフェクター細胞に移すことができる。
ベクターを免疫エフェクター細胞に導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを含む。ベクター及び/または外因性核酸を含む細胞を作製する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、以下を参照のこと:Sambrook et al.(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York。いくつかの実施形態では、ベクターは、エレクトロポレーションにより細胞に導入される。
ベクターを免疫エフェクター細胞に導入するための生物学的方法は、DNA及びRNAベクターの使用を含む。ウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物、例えば、ヒト細胞、に挿入するための最も広く使用される方法になっている。
ベクターを免疫エフェクター細胞に導入するための化学的手段は、コロイド分散システム、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに、水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースのシステムを含む。in vitroで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のCARのいずれかをコードするRNA分子は、従来の方法(例えば、in vitro転写)で調製され、次に、mRNAエレクトロポレーションなどの既知の方法により免疫エフェクター細胞に導入されてもよい。例えば、Rabinovich et al.,Human Gene Therapy 17:1027-1035(2006)を参照のこと。
いくつかの実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた免疫エフェクター細胞は、ベクターまたは単離核酸の導入後に、ex vivoで増殖される。いくつかの実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた免疫エフェクター細胞は、増殖するために、少なくとも約1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、10日、12日、または14日間のうちのいずれかで培養される。いくつかの実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた免疫エフェクター細胞は、操作された哺乳動物細胞を選択するためにさらに評価またはスクリーニングされる。
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を特定するため、及び調節配列の機能を評価するために使用されてもよい。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在しないか、または発現しない、且つ、いくつかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により発現が明示されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、DNAがレシピエント細胞に導入されている後の好適な時点でアッセイされる。好適なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含んでもよい(例えば、Ui-Tei et al.FEBS Letters 479:79-82(2000))。好適な発現系は、周知であり、既知の手法を使用して調製されても、商業的に入手されてもよい。操作された免疫エフェクター細胞におけるCARをコードする核酸の存在を確認するための他の方法は、例えば、当業者らに周知の分子生物学的アッセイ、例えば、サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、RT-PCR及びPCR;生化学的アッセイ、例えば、免疫学的方法(例えば、ELISA及びウェスタンブロット)による、例えば、特定のペプチドの有無の検出、を含む。
5.4.3.T細胞の供給源
いくつかの実施形態では、T細胞の増殖及び遺伝子改変の前に、T細胞の供給源が対象から得られる。末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む多くの供給源から、T細胞を得ることができる。いくつかの実施形態では、当該技術分野で利用可能な任意数のT細胞株が使用されてもよい。いくつかの実施形態では、Ficoll(商標)分離などの当業者に既知の任意数の手法を使用して、対象から収集された血液の単位から、T細胞を得ることができる。いくつかの実施形態では、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスにより得られる。アフェレーシス製品は、通常、T細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含むリンパ球を含有する。いくつかの実施形態では、アフェレーシスにより収集された細胞は、血漿画分を除去し、その後の処理ステップのために細胞を適切な緩衝液または培地に入れるために、洗浄されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄される。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムを欠いており、マグネシウムを欠き得るか、または全てではないが、多くの二価カチオンを欠き得る。カルシウムの不存在下での最初の活性化ステップは、活性化の拡大につながり得る。当業者らが容易に理解するように、洗浄ステップは、例えば、半自動「フロースルー」遠心分離機(例えば、Cobe2991セルプロセッサ、Baxter CytoMate、またはHaemonetics Cell Saver5)を製造者の使用説明書に従って使用することにより、当業者らに既知の方法で達成されてもよい。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ca2+不含、Mg2+不含PBS、PlasmaLyte A、または、緩衝剤を含むかもしくは含まない他の食塩水、に再懸濁させてもよい。あるいは、アフェレーシスサンプルの望ましくない構成成分を除去し、細胞を培地に直接再懸濁させてもよい。
いくつかの実施形態では、T細胞の増殖及び遺伝子改変の前に、T細胞の供給源が対象から得られる。末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む多くの供給源から、T細胞を得ることができる。いくつかの実施形態では、当該技術分野で利用可能な任意数のT細胞株が使用されてもよい。いくつかの実施形態では、Ficoll(商標)分離などの当業者に既知の任意数の手法を使用して、対象から収集された血液の単位から、T細胞を得ることができる。いくつかの実施形態では、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスにより得られる。アフェレーシス製品は、通常、T細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含むリンパ球を含有する。いくつかの実施形態では、アフェレーシスにより収集された細胞は、血漿画分を除去し、その後の処理ステップのために細胞を適切な緩衝液または培地に入れるために、洗浄されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄される。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムを欠いており、マグネシウムを欠き得るか、または全てではないが、多くの二価カチオンを欠き得る。カルシウムの不存在下での最初の活性化ステップは、活性化の拡大につながり得る。当業者らが容易に理解するように、洗浄ステップは、例えば、半自動「フロースルー」遠心分離機(例えば、Cobe2991セルプロセッサ、Baxter CytoMate、またはHaemonetics Cell Saver5)を製造者の使用説明書に従って使用することにより、当業者らに既知の方法で達成されてもよい。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ca2+不含、Mg2+不含PBS、PlasmaLyte A、または、緩衝剤を含むかもしくは含まない他の食塩水、に再懸濁させてもよい。あるいは、アフェレーシスサンプルの望ましくない構成成分を除去し、細胞を培地に直接再懸濁させてもよい。
いくつかの実施形態では、T細胞は、例えば、PERCOLL(商標)勾配による遠心分離または向流遠心エルトリエーションで、赤血球を溶解させ、単球を枯渇させることにより、末梢血リンパ球から単離される。CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、及びCD45RO+T細胞などのT細胞の特定の亜集団を、正または負の選択手法でさらに分離することができる。例えば、いくつかの実施形態では、T細胞は、所望のT細胞の正の選択に十分な時間に、抗CD3/抗CD28(すなわち、3×28)コンジュゲートビーズ、例えば、DYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 Tとインキュベーションすることにより単離される。いくつかの実施形態では、期間は、約30分である。さらなる実施形態では、期間は、30分~36時間以上、及びその間の全ての整数値の範囲である。さらなる実施形態では、期間は、少なくとも1、2、3、4、5、または6時間である。いくつかの実施形態では、期間は、10~24時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間は、24時間である。白血病患者由来のT細胞の単離では、24時間などの長いインキュベーション時間を使用すると、細胞収量が増加し得る。より長いインキュベーション時間は、例えば、腫瘍組織または免疫不全の個体から腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を単離することにおいて、他の細胞型と比較してT細胞がほとんどない任意の状況で、T細胞を単離するために使用されてもよい。さらに、より長いインキュベーション時間を使用すると、CD8+T細胞の捕捉効率を増加し得る。従って、いくつかの実施形態では、T細胞をCD3/CD28ビーズに結合させる時間を単純に短縮または延長することにより、及び/またはビーズ対T細胞の比を増加または減少させることにより、培養の開始時またはプロセス中の他の時点で、T細胞の亜集団を優先的に選択することができる。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗CD3及び/または抗CD28抗体の比を増加または減少させることにより、培養開始時または他の所望の時点で、T細胞の亜集団を、優先的に選択することができる。複数ラウンドの選択も使用することができることを、当業者は認識するであろう。いくつかの実施形態では、選択手順を実行し、活性化及び拡張プロセスで「選択されていない」細胞を使用することが望ましいことがある。「選択されていない」細胞を、さらなる選択ラウンドにかけることもできる。
負の選択された細胞に固有の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせを用いて、負の選択によるT細胞集団の濃縮を実施することができる。1つの方法は、負の選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用するネガティブ磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞選別及び/または選択である。例えば、負の選択によりCD4+細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、通常、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、及びCD8に対する抗体を含む。特定の実施形態では、通常、CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+、及びFoxP3+を発現する制御性T細胞を濃縮または正の選択することが望ましいことがある。あるいは、特定の実施形態では、制御性T細胞は、抗C25コンジュゲートビーズまたは他の同様の選択方法により枯渇される。
正または負の選択による所望の細胞集団の単離のために、細胞及び表面(例えば、ビーズなどの粒子)の濃度を変動させることができる。特定の実施形態では、細胞及びビーズの最大の接触を確保するために、ビーズ及び細胞が、一緒に混合される体積を大幅に減少させる(すなわち、細胞の濃度を増加させる)ことが望ましいことがある。例えば、一実施形態では、20億細胞/mlの濃度が使用される。一実施形態では、10億細胞/mlの濃度が使用される。さらなる実施形態では、1億細胞/ml超が使用される。さらなる実施形態では、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、または5千万細胞/mlの細胞濃度が使用される。さらに別の実施形態では、7.5、8、8.5、9、9.5、または10千万細胞/mlの細胞濃度が使用される。さらなる実施形態では、1億2500万または1億5000万細胞/mlの濃度を使用することができる。高濃度を使用すると、細胞収量、細胞活性化、及び細胞増殖が増加することがある。さらに、高濃度細胞の使用は、目的の標的抗原、例えば、CD28陰性T細胞を弱く発現し得る細胞、または、多くの腫瘍細胞が存在するサンプル(すなわち、白血病の血液、腫瘍組織など)由来の細胞を、より効率的に捕捉可能であり得る。そのような細胞集団は、治療効果を有し得、取得することが望ましいだろう。いくつかの実施形態では、高濃度の細胞を使用することにより、通常、より弱いCD28発現を有するCD8+T細胞のより効率的な選択が可能になる。
いくつかの実施形態では、より低い濃度の細胞を使用することが望ましいことがある。T細胞及び表面の混合物(例えば、ビーズなどの粒子)を大幅に希釈することにより、粒子及び細胞間の相互作用が最小限に抑えられる。これにより、粒子に結合されるべき所望の抗原を大量に発現する細胞が選択される。例えば、CD4+T細胞は、高レベルのCD28を発現し、希釈濃度のCD8+T細胞よりも効率的に捕捉される。いくつかの実施形態では、使用される細胞の濃度は、5×106/mlである。いくつかの実施形態では、使用される濃度は、約1×105/ml~1×106/ml、及びその間の任意の整数値であり得る。
いくつかの実施形態では、細胞は、2~10℃または室温のいずれかで、様々な速度で、様々な時間、回転装置上でインキュベートされてもよい。
刺激用のT細胞を、洗浄ステップ後に凍結することもできる。理論に束縛されるものではないが、凍結及びその後の解凍ステップは、細胞集団中の顆粒球及びある程度までの単球を除去することにより、より均一な生成物を提供し得る。血漿及び血小板を除去する洗浄ステップの後、細胞が凍結溶液に懸濁されてもよい。多くの凍結溶液及びパラメーターが当該技術分野で既知であり、この文脈で有用となるが、1つの方法は、20%のDMSO及び8%のヒト血清アルブミンを含有するPBS、または10%のデキストラン40及び5%のデキストロース、20%のヒト血清アルブミン及び7.5%のDMSO、または31.25%のプラズマライトA、31.25%のデキストロース5%、0.45%のNaCl、10%のデキストラン40及び5%のデキストロース、20%のヒト血清アルブミン、及び7.5%のDMSO、または例えば、Hespan及びPlasmaLyte Aを含有する他の好適な細胞凍結培地を使用することを含む。次に、細胞は、毎分1度の速度で-80℃まで凍結され、液体窒素貯蔵タンクの蒸気相で貯蔵される。制御された凍結の他の方法が使用されてもよく、-20℃で、または液体窒素中で直に制御されていない凍結が使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、凍結保存された細胞は、本明細書に記載されるように解凍及び洗浄され、活性化前に室温で1時間静置させる。
本明細書に記載の増殖細胞が必要となり得る前の期間の対象由来の血液サンプルまたはアフェレーシス製品の収集も本開示で企図される。そのようなものであるから、増殖されるべき細胞の供給源は、必要な任意の時点で収集し、T細胞などの所望の細胞を、本明細書に記載されるようなT細胞療法から恩恵を受ける任意数の疾患または状態に対するT細胞療法において後で使用するために単離して凍結することができる。一実施形態では、血液サンプルまたはアフェレーシスは、一般に、正常対象から採取される。特定の実施形態では、血液サンプルまたはアフェレーシスは、一般に、疾患を発症するリスクがあるが、まだ疾患を発症していない正常対象から採取され、目的の細胞が単離され、後で使用するために凍結される。特定の実施形態では、T細胞は、後で、増殖、凍結、及び使用され得る。特定の実施形態では、サンプルは、本明細書に記載の特定の疾患の診断直後で、任意の処置の前に、患者から収集される。さらなる実施形態では、細胞は、任意数の関連する治療モダリティ前に対象由来の血液サンプルまたはアフェレーシスから単離され、これは、薬剤、例えば、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス薬、化学療法、放射線、免疫抑制薬、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノラート、及びFK506、抗体、または他の免疫除去薬、例えば、CAMPATH、抗CD3抗体、サイトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、及び照射を用いる処置を含むが、これらに限定されない。これらの薬剤は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリン(シクロスポリン及びFK506)を阻害するか、または、成長因子誘導シグナル伝達に重要なp70S6キナーゼ(ラパマイシン)を阻害する(Liu et al.,Cell 66:807-815(1991);Henderson et al.,Immun 73:316-321(1991);Bierer et al.,Curr.Opin.Immun.5:763-773(1993))。さらなる実施形態では、細胞は、患者のために単離され、骨髄もしくは幹細胞移植、いずれかの化学療法薬、例えば、フルダラビンの、外部ビーム放射線療法(XRT)、シクロホスファミド、または、抗体、例えば、OKT3もしくはCAMPATHのいずれかを使用するT細胞除去療法と共に(例えば、この前に、これと同時に、またはこの後に)、後の併用のために凍結される。別の実施形態では、細胞は、CD20と反応する薬剤、例えば、リツキサンなどのB細胞除去療法の前に単離され、それの後に、後の処置用の使用ために凍結することができる。
いくつかの実施形態では、T細胞は、処置直後の患者から得られる。この点に関して、以下の特定のがん処置、特に、免疫系に損傷を与える薬物による処置は、患者が通常処置から回復する期間中の処置直後に、得られたT細胞の品質が、最適であり得るか、またはex vivoで増殖する能力が改善され得ることが観察されている。同様に、本明細書に記載の方法を使用するex vivo操作の後に、これらの細胞は、生着の促進及びin vivoでの増殖にとって好ましい状態になり得る。従って、本開示の文脈内で、この回復期中にT細胞、樹状細胞、または造血系統の他の細胞を含む血球を収集することが企図される。さらに、特定の実施形態では、動員(例えば、GM-CSFによる動員)及びコンディショニングレジメンを、対象に状態を生じさせるために使用することができ、特に、処置後の規定された期間中の特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、及び/または増殖が好まれる。例示的な細胞型としては、T細胞、B細胞、樹状細胞、及び免疫系の他の細胞が挙げられる。
5.4.4.T細胞の活性化及び増殖
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のCARを用いるT細胞の遺伝子改変の前または後に、例えば、一般に、米国特許第6,352,694号;同第6,534,055号;同第6,905,680号;同第6,692,964号;同第5,858,358号;同第6,887,466号;同第6,905,681号;同第7,144,575号;同第7,067,318号;同第7,172,869号;同第7,232,566号;同第7,175,843号;同第5,883,223号;同第6,905,874号;同第6,797,514号;同第6,867,041号;及び米国特許出願公開第20060121005号に記載の方法を使用して、T細胞を活性化及び増大することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のCARを用いるT細胞の遺伝子改変の前または後に、例えば、一般に、米国特許第6,352,694号;同第6,534,055号;同第6,905,680号;同第6,692,964号;同第5,858,358号;同第6,887,466号;同第6,905,681号;同第7,144,575号;同第7,067,318号;同第7,172,869号;同第7,232,566号;同第7,175,843号;同第5,883,223号;同第6,905,874号;同第6,797,514号;同第6,867,041号;及び米国特許出願公開第20060121005号に記載の方法を使用して、T細胞を活性化及び増大することができる。
一般に、CD3/TCR複合体関連シグナルを刺激する薬剤及びT細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを、それが結合している表面で接触させることにより、T細胞を増殖させることができる。特に、T細胞集団は、本明細書に記載されるように、例えば、抗CD3抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または表面に固定化された抗CD2抗体と接触させることにより、あるいは、カルシウムイオノフォアと組み合わせたプロテインキナーゼCアクチベーター(例えば、ブリオスタチン)と接触させることにより刺激され得る。T細胞表面のアクセサリー分子の共刺激には、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、T細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、T細胞の集団を、抗CD3抗体及び抗CD28抗体と接触させることができる。CD4+T細胞またはCD8+T細胞の増殖を刺激するための、抗CD3抗体及び抗CD28抗体。抗CD3抗体の例としては、UCHT1、OKT3、HIT3a(BioLegend、米国サンディエゴ)が挙げられ、当該技術分野で一般に既知の他の方法と同様に使用することができる(Graves J,et al.,J.Immunol.146:2102(1991);Li B,et al.,Immunology 116:487(2005);Rivollier A,et al.,Blood 104:4029(2004))。抗CD28抗体の例としては、9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone、Besancon、France)が挙げられ、当該技術分野で一般に既知の他の方法と同様に使用することができる(Berg et al.,Transplant Proc.30(8):3975-3977(1998);Haanen et al.,J.Exp.Med.190(9):13191328(1999);Garland et al.,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63(1999))。
いくつかの実施形態では、T細胞に対する一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコールで提供され得る。例えば、各シグナルを提供する作用物質は、溶液中にあっても、表面に結合していてもよい。表面に結合する場合、作用物質は、同じ表面に(すなわち、「シス」形成で)結合していても、別の表面に(すなわち、「トランス」形成で)結合していてもよい。あるいは、一方の薬剤を表面に結合しており、他方の薬剤を溶液中に存在し得る。一実施形態では、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面に結合しており、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中に存在するか、または表面に結合している。特定の実施形態では、両方の薬剤は、溶液中にあり得る。別の実施形態では、物質、例えば、Fc受容体もしくは抗体を発現する細胞、または物質に結合することになる他の結合物質は、可溶型であり、次に、表面に架橋され得る。この点に関しては、例えば、本開示の特定の実施形態では、T細胞を活性化及び増大する際の使用が企図される人工抗原提示細胞(aAPC)については、米国特許出願公開第20040101519号及び同第20060034810号を参照のこと。
いくつかの実施形態では、T細胞は、薬剤コーティングされたビーズと結合され、ビーズ及び細胞が、その後、分離され、次に、細胞が培養される。別の実施形態では、培養前に、薬剤でコーティングされたビーズ及び細胞は、分離されないが、一緒に培養される。さらなる実施形態では、ビーズ及び細胞は、磁力などの力の適用により最初に濃縮され、その結果、細胞表面マーカーのライゲーションが増加し、それにより、細胞刺激が誘導される。
例として、細胞表面タンパク質は、抗CD3及び抗CD28が結合している常磁性ビーズ(3×28ビーズ)をT細胞と接触させることによりライゲーションされてもよい。一実施形態では、細胞(例えば、104~4×108のT細胞)及びビーズ(例えば、1:100の推奨力価の抗CD3/CD28 MACSiBead粒子)を緩衝液中、好ましくは、PBS(カルシウム及びマグネシウムなどの二価陽イオンを含まず)中で組み合わせる。任意の細胞濃度が使用されてもよいことを、当業者らは容易に理解し得る。例えば、標的細胞が、サンプル中で非常にまれであり、サンプルの0.01%のみを含んでも、サンプル全体(すなわち、100%)が、目的の標的細胞を含んでもよい。従って、任意の細胞数が、本開示の文脈内にある。特定の実施形態では、細胞及び粒子の最大の接触を確保するために、粒子及び細胞が、一緒に混合される体積を大幅に減少させる(すなわち、細胞の濃度を増加させる)ことが望ましいことがある。例えば、一実施形態では、約20億細胞/mLの濃度が使用される。別の実施形態では、1億細胞/mL超が使用される。さらなる実施形態では、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、または5千万細胞/mLの細胞濃度が使用される。さらに別の実施形態では、7.5、8、8.5、9、9.5、または10千万細胞/mLの細胞濃度が使用される。さらなる実施形態では、1億2500万または1億5000万細胞/mLの濃度を使用することができる。高濃度を使用すると、細胞収量、細胞活性化、及び細胞増殖が増加することがある。さらに、高細胞濃度を使用すると、目的の標的抗原、例えば、CD28陰性T細胞、をわずかに発現し得る細胞をより効率的に捕捉できることがある。そのような細胞集団は、治療効果を有し得、特定の実施形態では、取得することが望ましいであろう。例えば、高濃度の細胞を使用することにより、通常、より弱いCD28発現を有するCD8+T細胞のより効率的な選択が可能になる。
いくつかの実施形態では、混合物は、数時間(約3時間)~約14日間、またはその間の任意の整数値の時間単位で培養され得る。別の実施形態では、混合物が、21日間培養されてもよい。一実施形態では、ビーズ及びT細胞は、一緒に約8日間培養される。別の実施形態では、ビーズ及びT細胞は、一緒に2~3日間培養される。T細胞の培養時間が60日以上になり得るように、数サイクルの刺激が望ましいこともある。T細胞培養に適切な条件としては、増殖及び生存率に必要とされる要因を含有し得る適切な培地(例えば、最小必須培地もしくはRPMI培地1640、またはX-vivo 15、(Lonza))が挙げられ、これらは、血清(例えば、ウシ胎児またはヒト胎児血清)、インターロイキン-2(IL-2)、インスリン、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ及びTNF-α、または当業者に既知の細胞の成長のための任意の他の添加剤を含む。細胞の成長のための他の添加剤としては、界面活性剤、プラズマネート、及び還元剤、例えば、N-アセチル-システイン及び2-メルカプトエタノール、が挙げられるが、これらに限定されない。培地は、無血清か、あるいは、適切な量の血清(もしくは血漿)または規定の一連のホルモン、及び/またはT細胞の成長及び増大に十分な量のサイトカイン(複数可)が補充された、添加されたアミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンを含むRPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、及びX-Vivo 20、オプティマイザーを含み得る。抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンは、対象に注入されるべき細胞の培養物ではなく、実験培養物にのみ含まれる。標的細胞は、成長を支持するのに必要な条件下、例えば、適切な温度(例えば、37℃)及び雰囲気(例えば、空気及び5%のCO2)で維持される。様々な刺激時間にさらされているT細胞は、異なる特性を示し得る。例えば、代表的な血液またはアフェレーシスされた末梢血単核細胞製品は、細胞傷害性またはサプレッサーT細胞集団(TC、CD8)よりも多いヘルパーT細胞集団(TH、CD4+)を有する。CD3及びCD28受容体を刺激することによるT細胞のex vivo増大は、約8~9日前には、主にTH細胞からなるT細胞の集団を生じるが、約8~9日後には、T細胞の集団は、ますます多くのTC細胞の集団を含む。従って、処置の目的に応じて、主に、TH細胞を含むT細胞集団を対象に注入することが、有利であり得る。同様に、TC細胞の抗原特異的サブセットは、単離されている場合、このサブセットを、より大きい程度までに増大することが有益であることがある。
さらに、CD4及びCD8マーカーに加えて、他の表現型マーカーは、大幅に変動するが、大部分では、細胞増大プロセスの過程で再現可能である。従って、そのような再現性により、特定の目的のために活性化T細胞産物を調整する能力が可能になる。
5.5.ポリヌクレオチド
特定の実施形態では、本開示は、CD20に結合する単一ドメイン抗体をコードするポリヌクレオチド、及び本明細書に記載のCD20に結合する単一ドメイン抗体を含む融合タンパク質を提供する。本開示のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNAの形態をとり得る。DNAは、cDNA、ゲノムDNA、及び合成DNAを含み;二本鎖または一本鎖であり得、一本鎖である場合、コード鎖または非コード(アンチセンス)鎖であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、cDNAの形態をとる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチドである。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号41の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号64を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号42の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号65を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号43の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号66を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号44の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号67を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号45の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号68を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号46の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号69を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号47の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号70を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号48の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号71を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号49の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号72を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号50の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号73を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号51の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号74を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号52の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号75を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号53の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号76を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号54の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号77を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号55の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号78を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号56の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号79を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号57の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号80を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号58の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号59の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号60の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号61の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号62の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号63の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号183の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号186を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号184の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号187を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号185の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号188を有する核酸、を含む。
特定の実施形態では、本開示は、CD20に結合する単一ドメイン抗体をコードするポリヌクレオチド、及び本明細書に記載のCD20に結合する単一ドメイン抗体を含む融合タンパク質を提供する。本開示のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNAの形態をとり得る。DNAは、cDNA、ゲノムDNA、及び合成DNAを含み;二本鎖または一本鎖であり得、一本鎖である場合、コード鎖または非コード(アンチセンス)鎖であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、cDNAの形態をとる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチドである。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号41の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号64を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号42の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号65を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号43の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号66を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号44の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号67を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号45の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号68を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号46の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号69を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号47の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号70を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号48の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号71を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号49の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号72を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号50の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号73を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号51の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号74を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号52の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号75を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号53の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号76を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号54の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号77を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号55の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号78を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号56の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号79を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号57の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号80を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号58の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号59の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号60の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号61の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号62の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号63の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号183の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号186を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号184の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号187を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号185の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号188を有する核酸、を含む。
特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供されるCD20 CARをコードするポリヌクレオチドを提供する。本開示のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNAの形態をとり得る。DNAは、cDNA、ゲノムDNA、及び合成DNAを含み;二本鎖または一本鎖であり得、一本鎖である場合、コード鎖または非コード(アンチセンス)鎖であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、cDNAの形態をとる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチドである。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号81の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号108を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号82の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号109を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号83の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号110を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号84の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号111を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号85の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号112を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号86の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号113を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号87の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号114を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号88の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号115を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号89の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号116を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号90の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号117を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号91の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号118を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号92の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号119を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号93の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号120を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号94の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号121を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号95の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号122を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号96の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号123を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号97の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号124を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号98の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号125を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号99の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号126を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号100の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号127を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号101の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号128を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号102の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号129を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号103の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号130を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号104の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号131を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号105の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号132を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号106の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号133を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号189の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号192を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号190の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号193を有する核酸、を含む。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号191の配列を有するCARをコードする配列、例えば、配列番号194を有する核酸、を含む。
本開示は、さらに、本明細書に記載のポリヌクレオチドのバリアントに関し、バリアントは、例えば、本開示のCD20に結合する単一ドメイン抗体またはCARのフラグメント、アナログ、及び/または誘導体をコードする。特定の実施形態では、本開示は、本開示のCD20に結合する単一ドメイン抗体またはCARをコードするポリヌクレオチドと、少なくとも約75%同一、少なくとも約80%同一、少なくとも約85%同一、少なくとも約90%同一、少なくとも約95%同一、及び、いくつかの実施形態では、少なくとも約96%、97%、98%、または99%同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。本明細書で使用される時、「参照ヌクレオチド配列」と少なくとも、例えば、95%「同一である」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」という語句は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意味するものである。但し、ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチド当たり最大5つの点変異を含み得る。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの最大5%を欠失させるか、もしくは別のヌクレオチドで置換することができ、または参照配列中の総ヌクレオチドの最大5%の多数のヌクレオチドは、参照配列に挿入することができる。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5’もしくは3’末端位置に、またはそれらの末端位置の間の至るところ生じ得、参照配列内のヌクレオチド間に個別に、または参照配列内の1つ以上の隣接基内に点在する。
ポリヌクレオチドバリアントは、コード領域、非コード領域、またはその両方に変更を含有し得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、サイレント置換、付加、または欠失をもたらす変化を含有するが、コードされたポリペプチドの特性または活性を変化させない。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、(遺伝コードの縮重による)ポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさないサイレント置換を含む。ポリヌクレオチドバリアントは、様々な理由で、例えば、特定の宿主のコドン発現を最適化する(すなわち、ヒトmRNAのコドンをE. coliなどの細菌宿主が好むコドンに変更する)ように生成することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、配列の非コード領域またはコード領域に少なくとも1つのサイレント変異を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、コードされたポリペプチドの発現(または発現レベル)を調節または変更するように生成される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、コードされたポリペプチドの発現を増加させるように生成される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、コードされたポリペプチドの発現を減少させるように生成される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、親ポリヌクレオチド配列と比較して、コードされたポリペプチドの発現が増加している。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、親ポリヌクレオチド配列と比較して、コードされたポリペプチドの発現が減少している。
本明細書に記載の核酸分子を含むベクターも提供される。一実施形態では、核酸分子を組み換え発現ベクターに組み込むことができる。本開示は、本開示の核酸のいずれかを含む組み換え発現ベクターを提供する。本明細書で使用される場合、構築物が、mRNA、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、細胞内で、mRNA、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを有するのに十分な条件下で、ベクターを細胞と接触させる場合の、「組み換え発現ベクター」という用語は、宿主によりmRNA、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの発現を可能にする遺伝子改変されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド構築物を意味する。本明細書に記載のベクターは、全体として天然に存在するものではないが、ベクターの一部は、自然に存在し得る。記載された組み換え発現ベクターは、限定されないが、DNA及びRNAを含む任意のタイプのヌクレオチドを含み得、これらは、一本鎖または二本鎖であり、天然の供給源から部分的に合成または取得することができ、これは、天然の、非天然、または改変されたヌクレオチドを含有し得る。組み換え発現ベクターは、天然に存在するまたは天然に存在しないヌクレオチド間結合、または両方のタイプの結合を含み得る。天然に存在しないまたは改変ヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合は、ベクターの転写または複製を妨げない。
一実施形態では、本開示の組み換え発現ベクターは、任意の好適な組み換え発現ベクターであり得、任意の好適な宿主に形質転換またはトランスフェクトするために使用することができる。好適なベクターとしては、増殖及び増大のために、または発現もしくはその両方のために設計されるもの、例えば、プラスミド及びウイルス、が挙げられる。pUCシリーズ(Fermentas Life Sciences、メリーランド州グレンバーニー)、pBluescriptシリーズ(Stratagene、カリフォルニア州ラホーヤ)、pETシリーズ(Novagen、ウィスコンシン州マディソン。)、pGEXシリーズ(PharmaciaBiotech、スウェーデン・ウプサラ)、及びpEXシリーズ(Clontech、カリフォルニア州パロアルト)からなる群より、ベクターを選択することができる。バクテリオファージベクター、例えば、λGT10、λGT11、λEMBL4、及びλNM1149、λZapII(Stratagene)を使用することができる。植物発現ベクターの例としては、pBI01、pBI01.2、pBI121、pBI101.3、及びpBIN19(Clontech)が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、pEUK-C1、pMAM、及びpMAMneo(Clontech)が挙げられる。組み換え発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクターであってよい。
一実施形態では、組み換え発現ベクターは、例えば、上掲のSambrook et al.及び上掲のAusubel et al.に記載の標準的な組み換えDNA技術を使用して調製される。環状または線状である発現ベクターの構築物は、原核または真核宿主細胞で機能する複製系を含有するように調製することができる。例えば、ColE1、SV40、2μのプラスミド、λ、ウシパピローマウイルスなどから、複製系を誘導することができる。
組み換え発現ベクターは、調節配列、例えば、転写及び翻訳の開始コドン及び終結コドンを含んでもよく、これは、宿主のタイプ(例えば、細菌、植物、菌類、または動物)に特異的であり、この中に、適宜、ベクターが導入され、これは、ベクターがDNAベースであるか、RNAベースであるかを考慮に入れる。
組み換え発現ベクターは、形質転換またはトランスフェクトされた宿主の選択を可能にする1つ以上のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性、原栄養体を提供するための栄養要求性宿主における相補性などを含む。記載された発現ベクターに好適なマーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン/G418耐性遺伝子、ヒスチジノールx耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
組み換え発現ベクターは、本開示のヌクレオチド配列に作動可能に連結された天然または標準プロモーターを含み得る。例えば、強い、弱い、組織特異的、誘導可能及び発生特異的な、プロモーターの選択は、当業者の通常の技術の範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列とプロモーターとの組み合わせも当業者の技術範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、RSVプロモーター、SV40プロモーター、またはマウス幹細胞ウイルスの長末端反復に見られるプロモーターであり得る。
組み換え発現ベクターは、一過性発現、安定発現、またはその両方のために設計することができる。また、組み換え発現ベクターは、構成的発現または誘導的発現のために作製することができる。
さらに、組み換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製することができる。本明細書で使用される場合、「自殺遺伝子」という用語は、自殺遺伝子を発現する細胞を死滅させる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、遺伝子が発現される細胞に、薬剤、例えば、薬物に対する感受性を与え、細胞が薬剤と接触または曝露される時、細胞を死滅させる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該技術分野で知られており、例えば、単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼ(TK)遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、及びニトロレダクターゼを含む。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドが、単離される。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、実質的に純粋である。
本明細書に記載の核酸分子を含む宿主細胞もまた提供される。宿主細胞は、異種核酸を含有する任意の細胞であってよい。異種核酸は、ベクター(例えば、発現ベクター)であり得る。例えば、宿主細胞は、細胞による物質の産生用、例えば、遺伝子、DNAもしくはRNA配列、タンパク質、または酵素の細胞による発現用の、任意の方法で選択、改変、形質転換、成長、使用、または操作される任意の生物由来の細胞であり得る。適切な宿主が決定されてもよい。例えば、宿主細胞は、ベクターバックボーン及び所望の結果に基づいて選択されてもよい。例として、プラスミドまたはコスミドは、いくつかのタイプのベクターの複製のために原核宿主細胞に導入することができる。限定されないが、DH5α、JM109、及びKCB、SURE(登録商標)形質転換受容性細胞、及びSOLOPACK Gold細胞などの細菌細胞を、ベクター複製及び/または発現用の宿主細胞として使用することができる。さらに、大腸菌LE392などの細菌細胞は、ファージウイルスの宿主細胞として使用することができた。宿主細胞として使用することができる真核細胞は、酵母(例えば、YPH499、YPH500、及びYPH501)、昆虫、ならびに哺乳動物を含むが、これらに限定されない。ベクターの複製及び/または発現用の哺乳動物真核宿主細胞の例としては、HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、COS、Saos、PC12、SP2/0(American Type Culture Collection(ATCC)、バージニア州マナッサス、CRL-1581)、NS0(European Collection of Cell Cultures(ECACC)、英国ウィルトシャー・ソールズベリー、ECACC番号85110503)、FO(ATCC CRL-1646)及びAg653(ATCC CRL-1580)マウス細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なヒト骨髄腫細胞株は、U266(ATCC CRL-TIB-196)である。他の有用な細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に由来するもの、例えば、CHO-K1SV(Lonza Biologics、メリーランド州ウォーカーズビル)、CHO-K1(ATCC CRL-61)、またはDG44、が挙げられる。
5.6.医薬組成物
一態様では、本開示は、さらに、本開示の単一ドメイン抗体、または操作された免疫エフェクター細胞を含む、単一ドメイン抗体、結合分子、もしくは治療用分子を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療有効量の単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体を含む結合分子もしくは治療用分子、または本開示の操作された免疫エフェクター細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む。
一態様では、本開示は、さらに、本開示の単一ドメイン抗体、または操作された免疫エフェクター細胞を含む、単一ドメイン抗体、結合分子、もしくは治療用分子を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療有効量の単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体を含む結合分子もしくは治療用分子、または本開示の操作された免疫エフェクター細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む。
いくつかの実施形態では、治療有効量の本明細書で提供される単一ドメイン抗体と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が、本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体と薬学的に許容される賦形剤とを含む治療有効量の治療用分子(例えば、融合タンパク質、イムノコンジュゲート、及び多重特異性結合分子)を含む医薬組成物が、本明細書で提供される。
他の実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体と薬学的に許容される賦形剤とを含む治療有効量のCARを含む医薬組成物が、本明細書で提供される。
他の実施形態では、治療有効量の本明細書で提供される操作された免疫エフェクター細胞と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が、本明細書で提供される。
他の実施形態では、例えば、ベクター中の、治療有効量の本明細書で提供される核酸と、例えば、遺伝子療法に適する、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が、本明細書で提供される。
特定の実施形態では、「賦形剤」という用語は、希釈剤、アジュバント(例えば、フロイントのアジュバント(完全または不完全))、担体またはビヒクル)も指し得る。医薬賦形剤は、滅菌液体、例えば、水及び、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む油であり得る。食塩水ならびに水性デキストロース及びグリセロール溶液も液体賦形剤として用いることができる。好適な医薬品賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアラート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤または乳化剤、またはpH緩衝剤も含有し得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、エマルション剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの形態をとり得る。好適な医薬品賦形剤の例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.(ペンシルベニア州イーストン)に記載される。そのような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するために、好適な量の賦形剤と共に、例えば、精製形態で、予防的または治療的に有効な量の本明細書で提供される活性成分を含有するであろう。製剤は、投与方法に適合する必要がある。
いくつかの実施形態では、賦形剤の選択は、部分的には、特定の細胞、結合分子、及び/もしくは抗体により、ならびに/または投与方法により決定される。従って、様々な好適な製剤が存在する。
通常、許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、緩衝液、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンE、メタ重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤;防腐剤、等張化剤、安定剤、金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);EDTAなどのキレート剤、及び/または非イオン性界面活性剤を含む。
緩衝液は、特に、安定性がpHに依存する場合、治療効果を最適化する範囲にpHを制御するために使用されてもよい。本開示で使用される好適な緩衝剤としては、有機酸及び無機酸の両方、ならびにそれらの塩が挙げられる。例えば、シトラート、ホスファート、スクシナート、タータラート、フマラート、グルコナート、オキサラート、ラクタート、アセタート。さらに、緩衝液は、ヒスチジン及びトリメチルアミン塩、例えば、トリスを含んでもよい。
防腐剤は、微生物の成長を遅らせるために添加されてもよい。本開示で使用される好適な防腐剤としては、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム;ハロゲン化ベンザルコニウム(例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物)、塩化ベンゼトニウム;チメロサール、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール、3-ペンタノール、及びm-クレゾールが挙げられる。
多くの場合「安定剤」として既知の等張化剤は、組成物中の液体の張性を調整または維持するために存在し得る。大きな荷電生体分子、例えば、タンパク質及び抗体と共に使用される場合、それらは、アミノ酸側鎖の荷電基と相互作用し、それにより、分子間及び分子内相互作用の可能性を減らすことができるので、多くの場合、「安定剤」と呼ばれる。例示的な等張化剤としては、多価糖アルコール、三価以上の糖アルコール、例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールが挙げられる。
さらなる例示的な賦形剤としては、(1)増量剤、(2)溶解促進剤、(3)安定剤、及び(4)変性または容器壁への付着を防止する薬剤、が挙げられる。そのような賦形剤にとしては、以下が挙げられる:多価糖アルコール(上に列挙);アミノ酸、例えば、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、2-フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど;有機糖または糖アルコール、例えば、スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース、ミオイニシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール(例えば、イノシトール);硫黄含有還元剤、例えば、ポリエチレングリコールなどの;尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α-モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウム;低分子量タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは他の免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;単糖類、例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース;二糖類(例えば、ラクトース、マルトース、スクロース);三糖類、例えば、ラフィノース;ならびに多糖類、例えば、デキストリンまたはデキストラン。
非イオン性界面活性剤または界面活性剤(「湿潤剤」としても既知)は、治療薬の可溶化を助けるために、及び撹拌による凝集から治療用タンパク質を保護するために、存在することがあり、これにより、活性な治療用タンパク質または抗体の変性を引き起こすことなく、製剤をせん断表面応力にさらすこともできる。好適な非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリソルベート(20、40、60、65、80など)、ポリオキサマー(184、188など)、PLURONIC(登録商標)ポリオール、TRITON(登録商標)、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル(TWEEN(登録商標)-20、TWEEN(登録商標)-80など)、ラウロマクロゴール400、ステアリン酸ポリオキシル40、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油10、50、及び60、グリセロールモノステアラート、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースが挙げられる。使用することができるアニオン性界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、及びスルホン酸ジオクチルナトリウムが挙げられる。カチオン性界面活性剤は、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムを含む。
医薬組成物がin vivo投与に使用されるために、それらは、無菌であることが好ましい。医薬組成物は、無菌濾過膜による濾過により無菌にされ得る。本明細書の医薬組成物は、一般に、無菌のアクセスポートを有する容器、例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針が穿刺可能な栓を有するバイアルに入れることができる。
投与経路は、既知で許容されている方法、例えば、好適な方法、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内、または関節内経路で、長期間にわたる単回または複数回のボーラスまたは注入、局所投与、吸入もしくは持続放出、または拡張された放出手段に従うものである。
別の実施形態では、医薬組成物を、制御放出または持続放出システムとして提供することができる。一実施形態では、ポンプは、制御または持続放出を達成するために使用されてもよい(例えば、以下を参照:Sefton,Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201-40(1987);Buchwald et al.,Surgery 88:507-16(1980);及びSaudek et al.,N.Engl.J.Med.321:569-74(1989))。別の実施形態では、予防薬もしくは治療薬(例えば、本明細書に記載の融合タンパク質)または本明細書で提供される組成物、の制御放出または持続放出を達成するために、ポリマー材料を使用することができる。(例えば、以下を参照:Medical Applications of Controlled Release(Langer and Wise eds.,(1974);Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance(Smolen and Ball eds.,1984);Ranger and Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61-126(1983);Levy et al.,Science 228:190-92(1985);During et al.,Ann.Neurol.25:351-56(1989);Howard et al.,J.Neurosurg.71:105-12(1989);米国特許第5,679,377号;同第5,916,597号;同第5,912,015号;同第5,989,463号;ならびに同第5,128,326号;PCT公開第WO99/15154号及び同第WO99/20253号)。持続放出製剤に使用されるポリマーの例としては、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリラート)、ポリ(メチルメタクリラート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-コ-ビニルアセタート)、ポリ(メチルメタクリ酸)、ポリグリコリド(PLG)、ポリ無水物、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド(PLA)、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)(PLGA)、及びポリオルトエステルが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、持続放出製剤に使用されるポリマーは、不活性で、浸出性不純物がなく、貯蔵安定性、無菌、及び生分解性である。さらに別の実施形態では、制御放出または持続放出システムを、特定の標的組織、例えば、鼻腔または肺の近くに配置することができ、それにより、全身用量のほんの一部しか必要とされない(例えば、以下に参照:Goodson,Medical Applications of Controlled Release Vol.2,115-38(1984))。制御放出システムは、例えば、Langer,Science 249:1527-33(1990)により議論される。本明細書に記載の1つ以上の薬剤を含む持続放出製剤を製造するために、当業者に既知の任意の手法を使用することができる(例えば、以下を参照:米国特許第4,526,938号、PCT公開第WO91/05548号及び同第WO96/20698号、Ning et al.,Radiotherapy & Oncology 39:179-89(1996);Song et al.,PDA J.of Pharma.Sci.& Tech.50:372-97(1995);Cleek et al.,Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-54(1997);ならびに、Lam et al.,Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-60(1997))。
本明細書に記載の医薬組成物は、処置される特定の適応症に必要な場合、複数の活性化合物または薬剤も含んでもよい。代わりに、または加えて、組成物は、細胞傷害薬、化学療法薬、サイトカイン、免疫抑制薬、または成長阻害薬を含んでもよい。そのような分子は、意図される目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
活性成分は、また、コロイド薬物送達システム(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル)中、またはマクロエマルション中で、例えば、コアセルベーション手法により、または、界面重合により、それぞれ、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリラート)マイクロカプセルにより、調製されたマイクロカプセル中に封入されてもよい。そのような手法は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 18th editionに開示される。
様々な組成物及び送達系が既知であり、本明細書で提供される治療薬と共に使用することができ、これらは、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセルへのカプセル化、本明細書で提供される単一ドメイン抗体または治療用分子を発現することが可能な組み換え細胞、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築などを含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、疾患または障害を処置または予防するのに有効な量、例えば、治療有効量または予防有効量で結合分子及び/または細胞を含有する。いくつかの実施形態における治療効果または予防効果は、処置対象の定期的な評価により監視される。状態に応じて、数日以上にわたって反復投与する場合、所望の疾患症状の抑制が起こるまで、処置を繰り返す。しかし、他の投薬計画が有用であり、決定することができる。
5.7.方法及び用途
別の態様では、抗CD20 VHH、キメラ抗原受容体(CAR)、及び/または組み換え受容体を発現する操作された細胞を含む、本明細書で提供されるCD20結合分子の使用方法及び用途が本明細書で提供される。
別の態様では、抗CD20 VHH、キメラ抗原受容体(CAR)、及び/または組み換え受容体を発現する操作された細胞を含む、本明細書で提供されるCD20結合分子の使用方法及び用途が本明細書で提供される。
5.7.1.治療方法及び用途
そのような方法及び使用は、CD20発現を発現するか、もしくはそれに関連する、及び/または細胞もしくは組織がCD20を発現する、疾患、状態、または障害を有する対象に、例えば、分子、細胞、またはそれを含有する組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、分子、細胞、及び/または組成物は、疾患または障害の処置を行うのに有効な量で投与される。使用は、そのような方法及び処置における、ならびにそのような治療方法を実施するための薬品の調製における、抗体及び細胞の使用を含む。いくつかの実施形態では、方法は、疾患または状態を有するか、またはそれを有すると疑われる対象に、抗体もしくは細胞、またはそれらを含む組成物を投与することにより実施される。いくつかの実施形態では、それにより、方法は、対象の疾患または障害を処置する。
そのような方法及び使用は、CD20発現を発現するか、もしくはそれに関連する、及び/または細胞もしくは組織がCD20を発現する、疾患、状態、または障害を有する対象に、例えば、分子、細胞、またはそれを含有する組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、分子、細胞、及び/または組成物は、疾患または障害の処置を行うのに有効な量で投与される。使用は、そのような方法及び処置における、ならびにそのような治療方法を実施するための薬品の調製における、抗体及び細胞の使用を含む。いくつかの実施形態では、方法は、疾患または状態を有するか、またはそれを有すると疑われる対象に、抗体もしくは細胞、またはそれらを含む組成物を投与することにより実施される。いくつかの実施形態では、それにより、方法は、対象の疾患または障害を処置する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される処置は、疾患もしくは障害、または症状、有害作用もしくは転帰、またはそれに関連する表現型の完全または部分的な改善または低減を引き起こす。処置の望ましい効果は、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾患の進行速度の減少、病状の改善または緩和、及び予後の寛解または改善が含まれるが、これらに限定されない。これらの用語は、疾患の完全治癒、または、全ての症状もしくは転帰における任意の症状もしくは効果(複数可)の完全な排除を含むが、それらを意味しない。
本明細書で使用される場合、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される処置は、疾患または障害の発症を遅らせ、例えば、疾患(例えば、がん)の発症を遅延、妨害、減速、阻止、安定化、抑制、及び/または延期する。この遅延は、疾患の病歴及び/または処置される個体に応じて、様々な時間のものとなり得る。当業者には明らかであるように、十分なまたは有意な遅延は、個体が疾患または障害を発症しないという点で、事実上、予防を包含し得る。例えば、転移の発症などの末期がんは、遅延され得る。他の実施形態では、本明細書で提供される方法または使用は、疾患または障害を予防する。
いくつかの実施形態では、疾患または障害は、CD20関連の疾患または障害である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、B細胞関連の疾患または障害である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、B細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、B細胞悪性腫瘍は、B細胞白血病またはB細胞リンパ腫である。特定の実施形態では、疾患または障害は、辺縁帯リンパ腫(例えば、脾辺縁帯リンパ腫)である。特定の実施形態では、疾患または障害は、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、マントル細胞リンパ腫(MCL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、原発性中枢神経系(CNS)リンパ腫である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、原発性縦隔B細胞リンパ腫(PMBL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、小リンパ球性リンパ腫(SLL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、B細胞前リンパ球性白血病(B-PLL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、濾胞性リンパ腫(FL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、バーキットリンパ腫である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、原発性眼内リンパ腫である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、慢性リンパ性白血病(CLL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、急性リンパ芽球性白血病(ALL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、有毛細胞白血病(HCL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、前駆Bリンパ芽球性白血病である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、非ホジキンリンパ腫(NHL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、高悪性度B細胞リンパ腫(HGBL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、多発性骨髄腫(MM)である。他の実施形態では、疾患または障害は、再発性または難治性B細胞悪性腫瘍、例えば、再発性または難治性ALL(R/R ALL)である。
他の実施形態では、疾患または障害は、例えば、不適切なまたは増加したB細胞数及び/または活性化と関連するものを含む、自己免疫疾患及び炎症性疾患である。
いくつかの実施形態では、方法は、養子細胞療法を含み、それにより、提供されたCD20標的指向性CARを発現する遺伝子操作された細胞が対象に投与される。そのような投与は、疾患または障害の細胞が破壊の標的となるように、CD20を標的とする方法で細胞の活性化(例えば、T細胞の活性化)を促進し得る。
いくつかの実施形態では、方法は、対象、組織、または細胞、例えば、疾患または障害を有するか、これらのリスクがあるか、またはこれらを有すると疑われるものへの、細胞または細胞を含有する組成物の投与を含む。いくつかの実施形態では、細胞、集団、及び組成物は、例えば、養子細胞療法、例えば、養子T細胞療法を介して、処置されるべき特定の疾患または障害を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、細胞または組成物は、対象、例えば、疾患または障害を有するか、またはそれらのリスクがある対象、に投与される。いくつかの実施形態では、方法は、それにより、例えば、CD20発現がんにおける腫瘍量を低減させることにより、例えば、疾患または障害の1つ以上の症状を処置し、例えば、改善する。
例えば、米国特許出願公開第2003/0170238号;米国特許第4,690,915号;Rosenberg,Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85(2011);Themeli et al.,Nat Biotechnol.31(10):928-933(2013);Tsukahara et al.,Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9(2013);及びDavila et al.,PLoS ONE 8(4):e61338(2013)に記載される養子細胞療法のための細胞の投与方法が既知である。これらの方法は、本明細書で提供される方法及び組成物と関連して使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、細胞療法(例えば、養子T細胞療法)は、自己移植で実施され、細胞が、細胞治療を受けるべき対象から、またはそのような対象に由来するサンプルから、単離及び/または別の方法で調製される。従って、いくつかの態様では、細胞は、処置を必要とする対象に由来し、細胞は、単離及び処理後に、同じ対象に投与される。他の実施形態では、細胞療法(例えば、養子T細胞療法)は、同種異系移植で実施され、細胞は、細胞療法を受けるべき、または最終的に受ける対象以外の対象、例えば、第1の対象、から単離及び/または別の方法で調製される。そのような実施形態では、次に、細胞は、同じ種の異なる対象、例えば、第2の対象、に投与される。いくつかの実施形態では、第1及び第2の対象は、遺伝的に同一である。いくつかの実施形態では、第1及び第2の対象は、遺伝的に類似している。いくつかの実施形態では、第2の対象は、第1の対象と同じHLAクラスまたはスーパータイプを発現する。
いくつかの実施形態では、細胞、細胞集団、または組成物が投与される対象は、霊長類、例えば、ヒトである。対象は、男性または女性であり得、幼児、少年、青年、成人、及び高齢者対象を含む任意の好適な年齢であり得る。いくつかの例では、対象は、疾患、養子細胞療法、及び/または毒作用の評価について検証された動物モデルである。
CD20結合分子、例えば、VHH及びVHHを含有するキメラ受容体、ならびにそれを発現する細胞は、任意の好適な手段により、例えば、注射、例えば、静脈内または皮下注射、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、結膜下(subconjectval)注射、結節下注射、テノン嚢下注射、眼球後注射、眼球周囲注射、または強膜傍後部送達により、投与することができる。いくつかの実施形態では、それらは、非経口、肺内、及び鼻腔内、局所処置に望ましい場合、病巣内投与で投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与を含む。
疾患または状態の予防及び/または処置に有効となる本明細書で提供される予防薬または治療薬の量は、標準的な臨床手法で決定することができる。有効用量は、in vitroまたは動物モデル試験系から導出された用量反応曲線から外挿されてもよい。疾患の予防または処置のために、結合分子または細胞の適切な投薬量は、処置されるべき疾患または障害のタイプ、結合分子のタイプ、疾患または障害の重症度及び経過、治療薬が予防または治療目的のために投与されるかどうか、以前の治療、患者の病歴及び薬剤に対する応答、ならびに主治医の判断に依存し得る。組成物、分子、及び細胞は、いくつかの実施形態では、一度にまたは一連の処置にわたって患者に適切に投与される。
例えば、疾患の種類及び重症度に応じて、抗体の投薬量は、約10μg/kg~100mg/kg以上を含んでもよい。断続的に複数回用量が投与されてもよい。最初に高負荷用量、続いて、1つ以上の低用量が投与されてもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の単一ドメイン抗体のいずれか1つを含み、医薬組成物は、投与経路に応じて、1日当たり約10ng/kg個体体重~約100mg/kg個体体重以上の投薬量で、例えば、約1mg/kg/日~10mg/kg/日で投与される。特定の投与量及び送達方法に関する手引きは、文献に提供される(例えば、以下を参照:米国特許第4,657,760号;同第5,206,344号;及び同第5,225,212号)。
結合分子を含有する遺伝子操作された細胞との関連で、いくつかの実施形態では、対象は、約100万~約1000億個の範囲の細胞及び/または体重1キログラム当たりの細胞の量を投与されてもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の操作された免疫細胞のいずれか1つを含み、医薬組成物は、少なくとも約104、105、106、107、108、または109細胞/個体体重kgのうちのいずれかの投薬量で投与される。投薬量は、疾患もしくは障害及び/または患者及び/または他の処置に特有の属性に応じて変動し得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、1回投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、複数回(例えば、2、3、4、5、6回、またはそれ以上のうちのいずれか)投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、投与サイクル中に1回または複数回投与される。投与サイクルは、例えば、1、2、3、4、5週間もしくはそれ以上、または1、2、3、4、5ヶ月もしくはそれ以上であり得る。特定の患者に対する最適な投与量及び処置計画は、疾患の徴候について患者を監視し、それに応じて処置を調整することにより、医療の当業者により決定することができる。
いくつかの実施形態では、細胞または抗体は、併用療法の一部として、例えば、別の治療的介入、例えば、別の抗体または操作された細胞または受容体または作用物質、例えば、細胞傷害性または治療薬と同時または任意の順序で逐次的に、投与される。
いくつかの実施形態では、細胞または抗体は、1つ以上の追加の治療薬と同時に、または別の治療的介入と関連して、同時にまたは任意の順序で逐次的に、共投与される。いくつかの状況では、細胞集団が1つ以上の追加の治療薬の効果を高めるか、またはその逆も同様に、細胞は、十分に近い時間に別の療法と同時投与される。いくつかの実施形態では、細胞または抗体は、1つ以上の追加の治療薬の前に投与される。いくつかの実施形態では、細胞または抗体は、1つ以上の追加の治療剤の後に投与される。
特定の実施形態では、細胞が哺乳動物(例えば、ヒト)に投与されると、操作された細胞集団及び/または抗体の生物学的活性が、多数の既知の方法のいずれかで測定される。評価するパラメーターは、in vivoでの、例えば、イメージングにより、例えば、ex vivoでの、例えば、ELISAまたはフローサイトメトリーにより、操作されたまたは天然のT細胞または他の免疫細胞の抗原への特異的結合を含む。特定の実施形態では、例えば、Kochenderfer et al.,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009),及びHerman et al.J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)に記載の細胞傷害性アッセイなどの当該技術分野で既知の任意の好適な方法を使用して、操作された細胞が標的細胞を破壊する能力を測定することができる。特定の実施形態では、特定のサイトカイン、例えば、CD107a、IFNγ、IL-2、及びTNF、の発現及び/または分泌をアッセイすることにより、細胞の生物学的活性を測定することもできる。いくつかの態様では、生物学的活性は、臨床転帰、例えば、腫瘍量または負荷の低減、を評価することにより測定される。
いくつかの特定の実施形態では、対象の疾患または障害を処置するための方法が本明細書で提供され、方法は、上記のセクション5.2に記載のCD20に結合する単一ドメイン抗体を含む結合分子を対象に投与することを含み、これは、例えば、表2のCDRを有するもの、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号183、配列番号184、または配列番号185のアミノ酸配列を含むもの、及び、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号183、配列番号184、または配列番号185と少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むもの、を含む。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、CD20関連の疾患または障害である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、B細胞関連の疾患または障害である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、B細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、B細胞悪性腫瘍は、B細胞白血病またはB細胞リンパ腫である。特定の実施形態では、疾患または障害は、辺縁帯リンパ腫(例えば、脾辺縁帯リンパ腫)である。特定の実施形態では、疾患または障害は、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、マントル細胞リンパ腫(MCL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、原発性中枢神経系(CNS)リンパ腫である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、原発性縦隔B細胞リンパ腫(PMBL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、小リンパ球性リンパ腫(SLL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、B細胞前リンパ球性白血病(B-PLL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、濾胞性リンパ腫(FL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、バーキットリンパ腫である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、原発性眼内リンパ腫である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、慢性リンパ性白血病(CLL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、急性リンパ芽球性白血病(ALL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、有毛細胞白血病(HCL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、前駆Bリンパ芽球性白血病である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、非ホジキンリンパ腫(NHL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、高悪性度B細胞リンパ腫(HGBL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、多発性骨髄腫(MM)である。他の実施形態では、疾患または障害は、再発性または難治性B細胞悪性腫瘍、例えば、再発性または難治性ALL(R/R ALL)である。他の実施形態では、疾患または障害は、例えば、不適切なまたは増加したB細胞数及び/または活性化と関連するものを含む、自己免疫疾患及び炎症性疾患である。
特定の実施形態では、疾患または障害を処置するための方法が本明細書で提供され、この方法は、例えば、セクション5.3で提供されるCARを含む細胞を含む、セクション5.4で提供される操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象に投与される操作された免疫細胞は、(a)1つ以上の抗CD20 sdAb(複数可)、(b)膜貫通ドメイン、及び(c)細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むポリペプチドを含むCARを含み、抗CD20 sdAbは、例えば、表2のCDRを有するもの;配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号183、配列番号184、または配列番号185のアミノ酸配列を含むもの;及び配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号183、配列番号184、または配列番号185と少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むもの、を含む、上記のセクション5.2に記載のものである。いくつかの実施形態では、対象に投与される操作された免疫細胞は、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号189、配列番号190、及び配列番号191からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号189、配列番号190、及び配列番号191からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、CARを含む。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、CD20関連の疾患または障害である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、B細胞関連の疾患または障害である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、B細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、B細胞悪性腫瘍は、B細胞白血病またはB細胞リンパ腫である。特定の実施形態では、疾患または障害は、辺縁帯リンパ腫(例えば、脾辺縁帯リンパ腫)である。特定の実施形態では、疾患または障害は、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、マントル細胞リンパ腫(MCL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、原発性中枢神経系(CNS)リンパ腫である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、原発性縦隔B細胞リンパ腫(PMBL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、小リンパ球性リンパ腫(SLL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、B細胞前リンパ球性白血病(B-PLL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、濾胞性リンパ腫(FL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、バーキットリンパ腫である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、原発性眼内リンパ腫である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、慢性リンパ性白血病(CLL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、急性リンパ芽球性白血病(ALL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、有毛細胞白血病(HCL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、前駆Bリンパ芽球性白血病である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、非ホジキンリンパ腫(NHL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、高悪性度B細胞リンパ腫(HGBL)である。別の特定の実施形態では、疾患または障害は、多発性骨髄腫(MM)である。他の実施形態では、疾患または障害は、再発性または難治性B細胞悪性腫瘍、例えば、再発性または難治性ALL(R/R ALL)である。他の実施形態では、疾患または障害は、例えば、不適切なまたは増加したB細胞数及び/または活性化と関連するものを含む、自己免疫疾患及び炎症性疾患である。
5.7.2.診断及び検出の方法及び用途
別の態様では、本明細書で提供される結合分子、例えば、CD20に結合するVHH、ならびに、1つ以上の組織もしくは細胞型に対する特定の処置の結合の検出、予測、診断、病期分類、決定、ならびに/または対象の処置決定の告知、例えば、CD20及び/もしくは抗体に認識されるそのエピトープの存在の検出のための、そのようなVHHを含有する分子(例えば、コンジュゲート及び複合体)の使用を含む方法が本明細書で提供される。
別の態様では、本明細書で提供される結合分子、例えば、CD20に結合するVHH、ならびに、1つ以上の組織もしくは細胞型に対する特定の処置の結合の検出、予測、診断、病期分類、決定、ならびに/または対象の処置決定の告知、例えば、CD20及び/もしくは抗体に認識されるそのエピトープの存在の検出のための、そのようなVHHを含有する分子(例えば、コンジュゲート及び複合体)の使用を含む方法が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、診断または検出の方法で使用される抗CD20抗体(例えば、本明細書に記載の抗CD20単一ドメイン抗体のいずれか1つ)が提供される。さらなる態様では、生体試料中のCD20の存在を検出する方法が提供される。特定の実施形態では、方法は、生物学的サンプル中のCD20タンパク質の存在を検出することを含む。特定の実施形態では、CD20は、ヒトCD20である。いくつかの実施形態では、方法は、CD20発現疾患または障害に関連する診断及び/または予測方法である。いくつかの実施形態における方法は、生物学的サンプルを抗体と共にインキュベート及び/もしくはプローブすること、ならびに/または対象に抗体を投与することを含む。特定の実施形態では、生物学的サンプルは、細胞または組織またはその一部、例えば、腫瘍またはがん組織または生検またはその切片を含む。特定の実施形態では、接触は、サンプル中に存在するCD20への抗CD20抗体の結合を許容する条件下である。いくつかの実施形態では、方法は、さらに、複合体がサンプル中の抗CD20抗体及びCD20間で形成されるかどうかを検出すること、例えば、そのような結合の有無またはレベルを検出すること、を含む。そのような方法は、in vitroまたはin vivoの方法であってよい。一実施形態では、例えば、CD20が、患者選択のためのバイオマーカーである場合、抗CD20抗体は、抗CD20抗体または操作された抗原受容体を用いる治療に適格な対象を選択するために使用される。
いくつかの実施形態では、サンプル、例えば、細胞、組織サンプル、溶解物、組成物、またはそれらに由来する他のサンプルを、抗CD20抗体と接触させ、抗体及びサンプル間の複合体(例えば、サンプル中のCD20)の結合または形成が決定または検出される。試験サンプル中の結合が同じ組織タイプの参照細胞と比較して実証または検出される場合、それは、関連疾患または障害の存在、及び/または、抗体を含有する治療薬が、サンプルが由来する組織または細胞または他の生体物質と同じあるか、または、それと同じタイプのものである組織または細胞に特異的に結合するであろうこと、を示し得る。いくつかの実施形態では、サンプルは、ヒト組織由来であり、罹患及び/もしくは正常組織由来、例えば、処置されるべき疾患もしくは障害を有する対象由来、及び/またはそのような対象と同じ種の対象由来であってよいが、それは、処置されるべき疾患または障害を有していない。いくつかの場合では、正常な組織または細胞、例えば、投与された対象に存在するがんと同じまたは異なる器官由来の正常細胞は、処置されるべき疾患または障害を有する対象に由来するが、それ自体は、罹患細胞または組織ではない。
特異的な抗体-抗原結合を検出するための当該技術分野で既知の様々な方法を使用することができる。イムノアッセイの例としては、蛍光偏光イムノアッセイ(FPIA)、蛍光イムノアッセイ(FIA)、酵素イムノアッセイ(EIA)、比濁阻害イムノアッセイ(NIA)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、及びラジオイムノアッセイ(RIA)が挙げられる。指標部分または標識基は、多くの場合、アッセイ装置及び適合するイムノアッセイ手順の入手可能性により決定される方法の様々な用途の必要性を満たすように使用することができる。例示的な標識としては、放射性核種(例えば、125I、131I、35S、3H、または32P及び/またはクロム(51Cr)、コバルト(57Co)、フッ素(18F)、ガドリニウム(153Gd、159Gd)、ゲルマニウム(68Ge)、ホルミウム(166Ho)、インジウム(115In、113In、112In、111In)、ヨウ素(125I、123I、121I)、ランタン(140La)、ルテチウム(177Lu)、マンガン(54Mn)、モリブデン(99Mo)、パラジウム(103Pd)、リン(32P)、プラセオジム(142Pr)、プロメチウム(149Pm)、レニウム(186Re、188Re)、ロジウム(105Rh)、ルテリウム(97Ru)、サマリウム(153Sm)、スカンジウム(47Sc)、セレン(75Se)、(85Sr)、硫黄(35S)、テクネチウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、スズ(113Sn、117Sn)、トリチウム(3H)、キセノン(133Xe)、イッテルビウム(169Yb、175Yb)、イットリウム(90Y)、酵素(例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはβ-ガラクトシダーゼ)、蛍光部分またはタンパク質(例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、GFP、またはBFP)、または発光部分(例えば、Quantum Dot Corporation(カリフォルニア州パロアルト)が供給するQdot(商標)ナノ粒子)が挙げられる。上記の様々なイムノアッセイの実施に使用されるべき様々な一般的な手法が既知である。
特定の実施形態では、標識抗体(例えば、抗CD20単一ドメイン抗体)が提供される。標識は、例えば、酵素反応または分子相互作用により、直接検出される標識または部分(例えば、蛍光、発色団、高電子密度、化学発光、及び放射性標識)、ならびに、間接的に検出される酵素またはリガンドなどの部分を含むが、これらに限定されない。他の実施形態では、抗体は、標識されず、その存在は、抗体のいずれかに結合する標識抗体を使用して検出することができる。
5.8.キット及び製造物品
さらに、本明細書に記載の単一ドメイン抗体、キメラ抗原受容体、または操作された免疫エフェクター細胞のいずれかを含むキット、単位投薬量、及び製造物品が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物のいずれか1つを含有し、且つ、好ましくは、その使用説明書を提供するキットが提供される。
さらに、本明細書に記載の単一ドメイン抗体、キメラ抗原受容体、または操作された免疫エフェクター細胞のいずれかを含むキット、単位投薬量、及び製造物品が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物のいずれか1つを含有し、且つ、好ましくは、その使用説明書を提供するキットが提供される。
本願のキットは、好適なパッケージ中にある。好適なパッケージングとしては、バイアル、ボトル、ジャー、フレキシブル包装(例えば、密閉マイラーまたはビニール袋)などが挙げられるが、これらに限定されない。キットは、任意に、緩衝液及び説明情報などの追加の構成要素を提供してもよい。従って、本出願は、製造物品も提供し、これは、バイアル(例えば、密閉バイアル)、ボトル、ジャー、フレキシブルパッケージなどを含む。
製造物品は、容器、及び、容器上または容器に付属するラベルまたは添付文書を含み得る。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器などが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。一般に、容器は、本明細書に記載の疾患または障害(例えば、がん)を処置するのに有効な組成物を保持し、無菌のアクセスポートを有していてもよい(例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針により穿刺可能な栓を有するバイアルであってよい)。ラベルまたは添付文書は、組成物が個体の特定の状態を処置するために使用されることを示す。ラベルまたは添付文書は、個体に組成物を投与するための説明書をさらに含むであろう。ラベルは、再構成及び/または使用のための注意書きを示し得る。医薬組成物を保持する容器は、再構成された製剤の反復投与(例えば、2~6回の投与)を可能にする多目的バイアルであってもよい。添付文書は、治療用製品の市販パッケージに通常含まれる使用説明書を指し、これは、そのような治療用製品の使用に関する適応症、使用法、投薬量、投与、禁忌、及び/または警告に関する情報を含有する。さらに、製造物品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液、をさらに含む第2の容器を含んでもよい。それは、さらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及び注射器を含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料を含んでもよい。
キットまたは製造物品は、複数の単位用量の医薬組成物及び使用説明書を含み、薬局、例えば、病院薬局及び調剤薬局、で保管及び使用するのに十分な量でパッケージングされてもよい。
本開示は、多数の実施形態を記載するために肯定的な言葉を使用して、一般に、本明細書に開示される。本開示は、また、具体的には、特定の対象が、完全にまたは部分的に除外される実施形態、例えば、物質もしくは材料、方法のステップ及び条件、プロトコール、手順、アッセイ、または分析を含む。従って、本開示は、一般に、本開示が含まないものに関して、本明細書で表現されていないが、それにもかかわらず、本開示に明示的に含まれていない態様は、本明細書に開示される。
本開示のいくつかの実施形態が説明されている。それでもなお、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な修正がなされてもよいことを理解されるであろう。従って、以下の実施例は、特許請求の範囲に記載された開示の範囲を説明するが、限定しないことが意図される。
6.実施例
以下は、研究で使用される様々な方法及び材料の説明であり、本開示の作成方法及び使用方法の完全な開示及び説明を当業者らに提供するために記載され、本発明者らが本開示としてみなすものの範囲に制限することが意図されないか、以下の実験が実施され、実施され得る実験の全てであることを表すことが意図されない。現在時制で書かれた例示的な説明は、必ずしも実行されたわけではなく、むしろ、この説明は、本開示の教示に関連するデータなどを生成するために実施することができることを理解すべきである。使用される数値(例えば、量、パーセンテージなど)に関して正確性を確保するための取り組みがなされているが、いくつかの実験誤差及び偏差は、考慮されるべきである。
以下は、研究で使用される様々な方法及び材料の説明であり、本開示の作成方法及び使用方法の完全な開示及び説明を当業者らに提供するために記載され、本発明者らが本開示としてみなすものの範囲に制限することが意図されないか、以下の実験が実施され、実施され得る実験の全てであることを表すことが意図されない。現在時制で書かれた例示的な説明は、必ずしも実行されたわけではなく、むしろ、この説明は、本開示の教示に関連するデータなどを生成するために実施することができることを理解すべきである。使用される数値(例えば、量、パーセンテージなど)に関して正確性を確保するための取り組みがなされているが、いくつかの実験誤差及び偏差は、考慮されるべきである。
6.1.実施例1-抗CD20 VHHの調製
CD20抗原に対し高い結合親和性を有するVHHを開発するために、ラクダを、ヒトCD20タンパク質で免疫した。次に、VHHリードをスクリーニングするために、ファージディスプレイライブラリーを構築した。固有のクローンを、特異的結合に基づいて選択し、VHH相補性決定領域(CDR)、特に、抗原認識レパートリー及び結合を拡大するCDR3に従ってランク付けした。
CD20抗原に対し高い結合親和性を有するVHHを開発するために、ラクダを、ヒトCD20タンパク質で免疫した。次に、VHHリードをスクリーニングするために、ファージディスプレイライブラリーを構築した。固有のクローンを、特異的結合に基づいて選択し、VHH相補性決定領域(CDR)、特に、抗原認識レパートリー及び結合を拡大するCDR3に従ってランク付けした。
6.1.1.細胞株の構築
cDNA(NM_021950.3)をコードする4ドメインA1(MS4A1)にまたがるヒト膜を、GenScriptによりプラスミドPLVX-puro(Clontech、#632164)に合成し、プラスミドは、PLVX-CD20と名付けられた。高力価組み換えレンチウイルスを、ウイルスパッケージングシステムで作製し、K562細胞(ATCC、#CRL-24)、CHO細胞(ATCC、#CCL-61)、及びDubca細胞(ATCC、#CRL2276)に形質導入した。ピューロマイシン含有細胞培地で3ラウンドの選択後、PEコンジュゲート抗ヒトCD20特異的モノクローナル抗体(MILLTENYI、#130098084)を使用したフローサイトメトリーにより、形質導入された細胞株のヒトCD20の表面発現を検証した。要約すると、2×105の形質導入された細胞または親細胞をPEコンジュゲート抗ヒトCD20抗体と共に4℃で30分間インキュベートし、その後、3回洗浄し、ヒトCD20抗原の発現レベルを検出するために、Attune NXTフローサイトメトリー(Thermo Fisher)でのFACS分析の場合、0.5%のFBSを含むDPBS 200μLに再懸濁した。CHO-CD20の平均蛍光強度(MFI)は、形質導入されていないCHO細胞よりも1067.44倍高く、Dubca-CD20の平均蛍光強度(MFI)は、形質導入されていないDubca細胞よりも1621.21倍高かった。
cDNA(NM_021950.3)をコードする4ドメインA1(MS4A1)にまたがるヒト膜を、GenScriptによりプラスミドPLVX-puro(Clontech、#632164)に合成し、プラスミドは、PLVX-CD20と名付けられた。高力価組み換えレンチウイルスを、ウイルスパッケージングシステムで作製し、K562細胞(ATCC、#CRL-24)、CHO細胞(ATCC、#CCL-61)、及びDubca細胞(ATCC、#CRL2276)に形質導入した。ピューロマイシン含有細胞培地で3ラウンドの選択後、PEコンジュゲート抗ヒトCD20特異的モノクローナル抗体(MILLTENYI、#130098084)を使用したフローサイトメトリーにより、形質導入された細胞株のヒトCD20の表面発現を検証した。要約すると、2×105の形質導入された細胞または親細胞をPEコンジュゲート抗ヒトCD20抗体と共に4℃で30分間インキュベートし、その後、3回洗浄し、ヒトCD20抗原の発現レベルを検出するために、Attune NXTフローサイトメトリー(Thermo Fisher)でのFACS分析の場合、0.5%のFBSを含むDPBS 200μLに再懸濁した。CHO-CD20の平均蛍光強度(MFI)は、形質導入されていないCHO細胞よりも1067.44倍高く、Dubca-CD20の平均蛍光強度(MFI)は、形質導入されていないDubca細胞よりも1621.21倍高かった。
6.1.2.動物の免疫及び免疫応答試験
成体の雄アルパカ1頭(Vicugna pacos)を、ヒトCD20タンパク質を皮下に5回(1、21、35、49、及び63日目)免疫した。を1回目の免疫化に、完全フロイントアジュバント使用し、2回目~4回目の免疫化に、完全フロイントアジュバントを使用し、5回目の免疫化に、アジュバントを使用しなかった。抗原特異的な体液性応答を監視するために、10mLの免疫前の血清サンプル及びワクチン接種手順中の血清サンプルを収集した。希釈された免疫前サンプル(Pre)及び最終免疫血清サンプル(TB)に存在するアルパカ免疫グロブリンの結合を、フローサイトメトリーを介して、CD20トランスフェクト細胞 対 非トランスフェクト細胞の示差染色について記録した。FITCコンジュゲート抗ラマIgG重鎖及び軽鎖抗体(BETHYL、#A160100F)を検出抗体として使用した。最終試験採血血清(TB)中の抗体は、CHO-CD20細胞への結合の大幅な増加を示し、これは、免疫前の結合0.16%から開始し、TBの結合86.8%になる。データは、動物の免疫化が成功したことを示唆した。
成体の雄アルパカ1頭(Vicugna pacos)を、ヒトCD20タンパク質を皮下に5回(1、21、35、49、及び63日目)免疫した。を1回目の免疫化に、完全フロイントアジュバント使用し、2回目~4回目の免疫化に、完全フロイントアジュバントを使用し、5回目の免疫化に、アジュバントを使用しなかった。抗原特異的な体液性応答を監視するために、10mLの免疫前の血清サンプル及びワクチン接種手順中の血清サンプルを収集した。希釈された免疫前サンプル(Pre)及び最終免疫血清サンプル(TB)に存在するアルパカ免疫グロブリンの結合を、フローサイトメトリーを介して、CD20トランスフェクト細胞 対 非トランスフェクト細胞の示差染色について記録した。FITCコンジュゲート抗ラマIgG重鎖及び軽鎖抗体(BETHYL、#A160100F)を検出抗体として使用した。最終試験採血血清(TB)中の抗体は、CHO-CD20細胞への結合の大幅な増加を示し、これは、免疫前の結合0.16%から開始し、TBの結合86.8%になる。データは、動物の免疫化が成功したことを示唆した。
同時に、1頭の成体雄ラクダ(Camelus bactrian)に、ヒトCD20タンパク質を2週間隔で5回皮下免疫した。免疫前日(Pre)及び最終免疫日(TB)に採血した。ラクダの免疫応答をELISAで評価し、血清サンプルを、固定化抗原への結合について試験した。一連の希釈血清を、プレートに添加した。HRPコンジュゲート抗ラマIgG二次抗体(BETHYL、#A160100P)を、検出用の二次抗体として添加した。ELISAの結果は、動物へのCD20抗原の注射時に、強力な免疫応答を誘導し、血清力価が、>1:729kに達することを示唆し、これは、動物の免疫化も成功したことを示す。
最後の免疫から3~5日後に、産生血として頸静脈から、100mLの血液を採取した。リンホプレップの手順に従って、血液から末梢血リンパ球(PBL)を分離した。
6.1.3.抗体ファージライブラリーの構築
TRIzol(登録商標)試薬(Thermofisher、#15596026)のマニュアルに従って、全RNAを単離リンパ球から抽出した。品質検査後、PrimeScript(商標)第1鎖cDNA合成キット(Takara、#6110A)のマニュアルに従い、oligo(dT)20プライマーを使用して、全RNAをcDNAに逆転写した。VHHフラグメントの増幅用に、ネスティッドPCRプライマー(CN105555310Bに記載)を設計し、2つのSfiI制限部位が導入された。2段階のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、VHHフラグメントを増幅し、第2のPCR産物をSfiIで消化し、ゲル精製し、次に、ファージミドベクター-pFL249に挿入し、これを、大腸菌細胞に電気的に導入して、ファージディスプレイVHH免疫ライブラリーを得た。
TRIzol(登録商標)試薬(Thermofisher、#15596026)のマニュアルに従って、全RNAを単離リンパ球から抽出した。品質検査後、PrimeScript(商標)第1鎖cDNA合成キット(Takara、#6110A)のマニュアルに従い、oligo(dT)20プライマーを使用して、全RNAをcDNAに逆転写した。VHHフラグメントの増幅用に、ネスティッドPCRプライマー(CN105555310Bに記載)を設計し、2つのSfiI制限部位が導入された。2段階のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、VHHフラグメントを増幅し、第2のPCR産物をSfiIで消化し、ゲル精製し、次に、ファージミドベクター-pFL249に挿入し、これを、大腸菌細胞に電気的に導入して、ファージディスプレイVHH免疫ライブラリーを得た。
形質転換された細胞のごく一部を希釈し、100μg/mLのアンピシリンが補充された2xYTプレートに塗り広げた。コロニーを計数して、ライブラリーサイズを算出した。ライブラリーの品質を評価するために、陽性クローンをランダムに選択し、シーケンシングした。100μg/mLのアンピシリン及び2%のグルコースが補充された245mm平方の2xYT寒天皿に、残りの形質転換された細胞を塗り広げた。コロニーの菌叢を、皿からこすり落とした。細胞の少量のアリコートを、ライブラリープラスミド分離に使用した。残りに、グリセロールを補充し、ストックとして-80℃で保存した。
6.1.4.ファージディスプレイパニング
ヘルパーファージによる感染後、表面にVHHドメインを遺伝子III融合タンパク質として提示する組み換えファージ粒子が産生された。ファージ粒子を標準的な方法に従って調製し、フィルター滅菌後に、さらなる研究のために4℃で保存した。パニングの各ラウンドの前に、VHHを表示するファージ粒子をレスキューし、ヘルパーファージを追加することにより増幅させた。
ヘルパーファージによる感染後、表面にVHHドメインを遺伝子III融合タンパク質として提示する組み換えファージ粒子が産生された。ファージ粒子を標準的な方法に従って調製し、フィルター滅菌後に、さらなる研究のために4℃で保存した。パニングの各ラウンドの前に、VHHを表示するファージ粒子をレスキューし、ヘルパーファージを追加することにより増幅させた。
様々なパニング方策で、ファージライブラリーを使用した。タンパク質レベルに基づいて、1回目及び2回目のラウンドで、ビオチン化ヒトCD20(Sulfo-NHS-LC-Biotin Kitを使用して製造者の使用説明書に従って、社内でビオチン化)をファージライブラリーと共にインキュベートし、続いて、ストレプトアビジンDynabeads(Invitogen)で捕捉した。多数回洗浄した後、結合したファージをトリエチルアミンで溶出させた。
細胞レベルに基づいて、最初の選択では、ヒトCD20抗原を発現するCHO-CD20細胞、Dubca-CD20細胞、またはRaji細胞(ATCC、#CCL-86)をファージライブラリーと共にインキュベートした。十分に洗浄した後、1mg/mLのトリプシンに再懸濁することにより、結合したファージを細胞から溶出させた。2番目の選択では、ファージライブラリーを、CHO-CD20細胞とインキュベートした。十分に洗浄した後、結合しているファージを、上述のように溶出させた。
6.1.5.ELISAスクリーニング
個々のライブラリークローンをインキュベートし、96ディープウェルプレートで発現を誘導した。ヒトCD20抗原を特異的に認識するVHHクローンを単離するために、ELISAスクリーニングを実施した。
個々のライブラリークローンをインキュベートし、96ディープウェルプレートで発現を誘導した。ヒトCD20抗原を特異的に認識するVHHクローンを単離するために、ELISAスクリーニングを実施した。
出力ライブラリーから単一のクローンをランダムに選択し、96ディープウェルプレートで培養した。細菌培養のOD600が0.6~0.8に達した時、IPTGを加えて一晩発現を誘導した。遠心分離で細菌を収集し、マイクロウェルプレートに播種した。
本開示の例示的な抗CD20 VHHドメイン(すなわち、VHH-273、VHH-283、VHH-313、VHH-440、VHH-466、VHH-496、VHH-653、VHH-623、VHH-640、及びVHH-657)を選択し、シーケンシングした。CDR(例えば、KabatまたはIMGTナンバリングスキームで定義)及びVHH配列は、本明細書で提供される表2及び配列表にまとめられる。
6.2.実施例2-VHHキメラ受容体ポリペプチドの構築物及び免疫細胞発現
6.2.1.CD20 VHH CARの構築
N末端からC末端にかけて、CD8αヒンジドメイン、CD8α膜貫通ドメイン、CD137細胞質ドメイン、及びCD3ζ細胞質ドメインを含む、CARバックボーンポリペプチドをコードする核酸配列を、化学的に合成し、下流でhEF1αプロモーターに作動可能に連結されている事前改変されたレンチウイルスベクターにクローニングした。ベクター内のマルチクローニング部位(MCS)は、VHHフラグメント(複数可)のN末端に融合されたCD8αシグナルペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されたKozak配列(GCCGCCACC(配列番号160))を含む核酸配列の挿入を可能にし、上流をCARバックボーン配列に作動可能に連結した。
6.2.1.CD20 VHH CARの構築
N末端からC末端にかけて、CD8αヒンジドメイン、CD8α膜貫通ドメイン、CD137細胞質ドメイン、及びCD3ζ細胞質ドメインを含む、CARバックボーンポリペプチドをコードする核酸配列を、化学的に合成し、下流でhEF1αプロモーターに作動可能に連結されている事前改変されたレンチウイルスベクターにクローニングした。ベクター内のマルチクローニング部位(MCS)は、VHHフラグメント(複数可)のN末端に融合されたCD8αシグナルペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されたKozak配列(GCCGCCACC(配列番号160))を含む核酸配列の挿入を可能にし、上流をCARバックボーン配列に作動可能に連結した。
CAR骨格ベクターを使用して、一価のVHHベースのCARを構築するために、VHHドメインをコードする核酸配列を、CD8αシグナルペプチドをコードする核酸配列の3’に作動可能に連結した。融合核酸配列を化学的に合成し、当該技術分野で既知の分子クローニング手法により、EcoRI(5’-GAATTC-3’(配列番号161))及びSpeI(5’-ACTAGT-3’(配列番号162))制限部位を介して、CAR骨格にクローニングした。例示的な単一特異性及び一価のCD20 VHH CAR構築物が表5に示される。抗CD20 scFv(Leu16 scFv)(配列番号157)構築物も、陽性対照として機能するようにCAR骨格にクローン化し、これも表5に示される。
多価VHHベースのCARを構築するために、VHHの複数のコピー、またはペプチドリンカーを介して互いに融合した複数の異なるVHHをコードする核酸配列を、CAR骨格ベクターにクローニングした。2つまたは3つの抗CD20 VHHドメインを一連のグリシン-セリンペプチドリンカーと融合させ、続いて、この融合配列をKozak-CD8αシグナルペプチド核酸配列と組み合わせて直接合成し、EcoRI及びSpeI制限部位を介してCAR骨格にクローニングすることで、これらの構築物を調製した。例示的な単一特異性及び多価のCD20 VHH CAR構築物が表6に示される。
(表6)例示的な単一特異性及び多価CD20 CAR構築物
注記:
1表6の構築物で使用されるリンカーは、(GGGGS)n、nは、例えば、1、2、3、4、5、及び6を含む整数である(配列番号138)、リンカーX1では、n=1;リンカーX2では、n=2;リンカーX3では、n=3;リンカーX4では、n=4;及びリンカーX5では、n=5。
2CD SDは、共刺激シグナル伝達ドメインを表す。
3PI SDは、主要な細胞内シグナル伝達ドメインを表す。
注記:
1表6の構築物で使用されるリンカーは、(GGGGS)n、nは、例えば、1、2、3、4、5、及び6を含む整数である(配列番号138)、リンカーX1では、n=1;リンカーX2では、n=2;リンカーX3では、n=3;リンカーX4では、n=4;及びリンカーX5では、n=5。
2CD SDは、共刺激シグナル伝達ドメインを表す。
3PI SDは、主要な細胞内シグナル伝達ドメインを表す。
上記の一価及び多価CD20 VHH CARの核酸配列が、配列表の配列番号108~133及び192~194に示される。これらの例示的なCAR構築物では、CD8αシグナルペプチド、CD8αヒンジドメイン、CD8α膜貫通ドメイン、CD137細胞質ドメイン、及びCD3ζ細胞質ドメインの配列は、それぞれ、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、及び配列番号156に示される。
6.2.2.レンチウイルスベクターのパッケージング
pMDLg.pRRE(Addgene、#12251)、pRSV-REV(Addgene、#12253)、及びpMD2.G(Addgene、#12259)を含有するレンチウイルスパッケージングプラスミド混合物を、ポリエーテルイミド(PEI)との事前に最適化された比でCAR構築物を発現するベクターと予め混合した。次に、トランスフェクション混合物を、HEK293T細胞に滴加し、穏やかに混合し、続いて、6~8時間後に培地を交換した。ウイルス含有上清を、48時間及び72時間で回収し、次に、4℃で10分間、3000gで遠心分離した。レンチウイルス濃縮後、上清を注意深く捨て、ウイルスペレットをD10培地(DMEM、10%のFBS、1mMのピルビン酸ナトリウム、及び2mMのL-グルタミン)で再懸濁させた。採取されたウイルスを分注し、直ちに、-80℃で保存した。CHO哺乳動物細胞の形質導入効率により、ウイルス力価を評価及び決定した。CD20モノ-/バイ-/トリ-VHHベースのCARのLV力価は、1×108~4.5×108の範囲内に達した。
pMDLg.pRRE(Addgene、#12251)、pRSV-REV(Addgene、#12253)、及びpMD2.G(Addgene、#12259)を含有するレンチウイルスパッケージングプラスミド混合物を、ポリエーテルイミド(PEI)との事前に最適化された比でCAR構築物を発現するベクターと予め混合した。次に、トランスフェクション混合物を、HEK293T細胞に滴加し、穏やかに混合し、続いて、6~8時間後に培地を交換した。ウイルス含有上清を、48時間及び72時間で回収し、次に、4℃で10分間、3000gで遠心分離した。レンチウイルス濃縮後、上清を注意深く捨て、ウイルスペレットをD10培地(DMEM、10%のFBS、1mMのピルビン酸ナトリウム、及び2mMのL-グルタミン)で再懸濁させた。採取されたウイルスを分注し、直ちに、-80℃で保存した。CHO哺乳動物細胞の形質導入効率により、ウイルス力価を評価及び決定した。CD20モノ-/バイ-/トリ-VHHベースのCARのLV力価は、1×108~4.5×108の範囲内に達した。
6.2.3.T細胞の分離及び活性化
ヒトPBMCを、健康なドナーから収集した。以下に記載される製造者プロトコールに従い、Miltenyi Pan T細胞単離キット(カタログ番号130-096-535)を使用して、PBMCからヒトT細胞を精製した。細胞数を計数し、細胞懸濁液を4℃、300gで10分間遠心分離した。次に、上清を吸引除去し、細胞ペレットを総細胞107個当たり40μLの緩衝液に再懸濁させた。総細胞107個当たり10μLのPan T細胞ビオチン抗体カクテルを添加し、十分に混合し、4℃で5分間インキュベートした。次に、全細胞107個当たり30μLの緩衝液を添加した。細胞107個当たり20μLのPan T細胞MicroBeadカクテルを添加した。細胞懸濁液混合物を完全に混合し、4℃でさらに10分間インキュベートした。磁気分離には、500μLの最小量(vol.)が必要であった。磁気分離では、LSカラムを好適なMACSセパレーターの磁場に配置した。LSカラムを、3mLの緩衝液ですすいだ。次に、細胞懸濁液をカラムに適用し、濃縮されたT細胞画分を表した非標識細胞を含有するフロースルーを収集した。3mLの緩衝液でカラムを洗浄して、通過した非標識細胞を収集することで、追加のT細胞を収集した。これらの非標識細胞は、濃縮されたT細胞を再び表し、前のステップからのフロースルーと組み合わせた。次に、プールされた濃縮T細胞を遠心分離し、T細胞培地(RPMI1640、10%の熱不活化ウシ胎児血清(FBS)及び300IU/mLのIL-2)で再懸濁させた。
ヒトPBMCを、健康なドナーから収集した。以下に記載される製造者プロトコールに従い、Miltenyi Pan T細胞単離キット(カタログ番号130-096-535)を使用して、PBMCからヒトT細胞を精製した。細胞数を計数し、細胞懸濁液を4℃、300gで10分間遠心分離した。次に、上清を吸引除去し、細胞ペレットを総細胞107個当たり40μLの緩衝液に再懸濁させた。総細胞107個当たり10μLのPan T細胞ビオチン抗体カクテルを添加し、十分に混合し、4℃で5分間インキュベートした。次に、全細胞107個当たり30μLの緩衝液を添加した。細胞107個当たり20μLのPan T細胞MicroBeadカクテルを添加した。細胞懸濁液混合物を完全に混合し、4℃でさらに10分間インキュベートした。磁気分離には、500μLの最小量(vol.)が必要であった。磁気分離では、LSカラムを好適なMACSセパレーターの磁場に配置した。LSカラムを、3mLの緩衝液ですすいだ。次に、細胞懸濁液をカラムに適用し、濃縮されたT細胞画分を表した非標識細胞を含有するフロースルーを収集した。3mLの緩衝液でカラムを洗浄して、通過した非標識細胞を収集することで、追加のT細胞を収集した。これらの非標識細胞は、濃縮されたT細胞を再び表し、前のステップからのフロースルーと組み合わせた。次に、プールされた濃縮T細胞を遠心分離し、T細胞培地(RPMI1640、10%の熱不活化ウシ胎児血清(FBS)及び300IU/mLのIL-2)で再懸濁させた。
続いて、メーカーのプロトコールに従って、ヒトT細胞TransAct(商標)(Miltenyi、カタログ番号130-111-160)を用いて、単離T細胞を48時間予め活性化した。製造者プロトコールに従って、T細胞培地に抗CD3/CD28 MACSiBead粒子(Miltenyi、カタログ番号130-111-160)を添加することにより、新たに単離されたT細胞を活性化した。
6.2.4.CD20 VHH CAR-T細胞の産生
RNAエレクトロポレーションで生成され、in vitroアッセイでスクリーニングされたCD20 CAR-T細胞の予備結果に基づいて、ヒト初代T細胞における有効性分析のためにレンチウイルスの形質導入により、モノ-、バイ-、及びトリ-VHH CAR-T細胞を選択し、設計し、生成した。さらに、CD20 scFv CAR-T細胞を、陽性対照として生成した。24ウェルプレートのウェル当たり0.5mLの培地中、0.5×106細胞で、活性化T細胞を培養した。24時間後、T細胞が破裂している場合、0.5mLの非濃縮ウイルス上清または少量の濃縮ウイルス上清を添加した。32℃で1.5時間、1200gで遠心分離することにより、感染多重度(MOI)10でT細胞を形質導入した。次に、形質導入された細胞を、好適な条件下で、導入遺伝子発現のために細胞培養インキュベーターに移した。T細胞は、対数成長パターンで分割し始め、細胞数(生細胞/mL)及び生存率(%)を測定することにより、これを監視した。T細胞培養物を、2日毎に新鮮な培地で補充した。T細胞は、約6~7日後に休止し始めたので、後で分析するために採取して凍結保存するために、それらを準備した。
RNAエレクトロポレーションで生成され、in vitroアッセイでスクリーニングされたCD20 CAR-T細胞の予備結果に基づいて、ヒト初代T細胞における有効性分析のためにレンチウイルスの形質導入により、モノ-、バイ-、及びトリ-VHH CAR-T細胞を選択し、設計し、生成した。さらに、CD20 scFv CAR-T細胞を、陽性対照として生成した。24ウェルプレートのウェル当たり0.5mLの培地中、0.5×106細胞で、活性化T細胞を培養した。24時間後、T細胞が破裂している場合、0.5mLの非濃縮ウイルス上清または少量の濃縮ウイルス上清を添加した。32℃で1.5時間、1200gで遠心分離することにより、感染多重度(MOI)10でT細胞を形質導入した。次に、形質導入された細胞を、好適な条件下で、導入遺伝子発現のために細胞培養インキュベーターに移した。T細胞は、対数成長パターンで分割し始め、細胞数(生細胞/mL)及び生存率(%)を測定することにより、これを監視した。T細胞培養物を、2日毎に新鮮な培地で補充した。T細胞は、約6~7日後に休止し始めたので、後で分析するために採取して凍結保存するために、それらを準備した。
凍結保存前に、(T細胞表面にVHHドメインまたはscFvドメインを発現する)形質導入された細胞のパーセンテージをフローサイトメトリー分析で決定した。T細胞を、LIVE/DEAD(商標)Fixable死細胞染色キット(Invitrogen、カタログ番号L34976)を用いて、VHHベースのCAR-T細胞を、ヤギ抗ラマIgG FITCコンジュゲート(Bethyl、カタログ番号A160-100F)を用いて、及びscFvベースのCAR-T細胞を、FITC標識組み換えタンパク質L(Acro、カタログ番号RPL-PF141)を用いて、4℃で30分間染色し、続いて、3回洗浄し、NovoCyteフローサイトメーター(ACEA Biosciences)でのFACS分析のために、0.5%のFBSを含むDPBS 200μLに再懸濁した。
形質導入されたT細胞は、モノ-、バイ-、及びトリ-VHHドメインで異なるCAR発現レベルを示した。これは、形質導入効率(形質導入されたパーセント細胞)がCARのサイズ及び構造に関連したことを示す。モノ-VHH CAR-T細胞は、バイ-またはトリ-VHH CAR-T細胞よりも大幅に高い形質導入効率を示し、scFv CAR-T細胞と同等であった。CD20 VHH CAR-T細胞は、1週間で約20~30倍に増大した。CD20 VHH CAR-T細胞培養の細胞数及び生存率(82%~96%)は、表7に示されるように、非形質導入T細胞(UnT)と比較した場合、T細胞の増殖及び増大能力に対するVHH(複数可)の検出可能な負の影響がないことを示した。
6.3.実施例3-in vitroでキメラ受容体ポリペプチドを発現する免疫細胞の特性評価
6.3.1.標的細胞表面でのCD19、CD20、及びCD22抗原の発現
評価された標的細胞表面上のCD19、CD20、及びCD22の発現レベルを評価するために、1ウェルあたり5x105の細胞を、それぞれ、PE標識抗CD19、抗CD20、及び抗CD22 mAbとインキュベートし(BioLegend、それぞれ、カタログ番号302208、カタログ番号302306、及びカタログ番号302506)、QUANTI-BRITE PEビーズ(BD Bioscience、カタログ番号340495)を用いるフローサイトメトリーで評価した。アッセイ及びデータ分析を、製造者の使用説明書に従って実施した。「細胞毎の受容体数」は、示された細胞株のそれぞれにおける細胞あたりの分子のおおよその絶対数を示し、表8に示される。
6.3.1.標的細胞表面でのCD19、CD20、及びCD22抗原の発現
評価された標的細胞表面上のCD19、CD20、及びCD22の発現レベルを評価するために、1ウェルあたり5x105の細胞を、それぞれ、PE標識抗CD19、抗CD20、及び抗CD22 mAbとインキュベートし(BioLegend、それぞれ、カタログ番号302208、カタログ番号302306、及びカタログ番号302506)、QUANTI-BRITE PEビーズ(BD Bioscience、カタログ番号340495)を用いるフローサイトメトリーで評価した。アッセイ及びデータ分析を、製造者の使用説明書に従って実施した。「細胞毎の受容体数」は、示された細胞株のそれぞれにおける細胞あたりの分子のおおよその絶対数を示し、表8に示される。
6.3.2.CD20 VHH CAR-T細胞の有効性評価
腫瘍細胞に対するCD20 VHH CAR-T細胞の細胞傷害性を評価するために、上記のように産生された細胞を計数し、抗原特異的がん細胞と共培養して、殺傷力を読み取った。アッセイの変動を比較し、及び/または内部対照として機能させるために、全てのアッセイで、対照CD20 scFv CAR-T細胞を使用した。非形質導入T細胞(UnT)を、非標的指向性T細胞対照として使用した。CD20陽性細胞株-ヒトリンパ腫細胞株Raji(ATCC、#CCL-86)及びK562-CD20、ならびに、CD20陰性細胞株-K562-CD19及びK562(ATCC、#CCL-243)に対して、CAR-T細胞殺傷アッセイを行った。全ての細胞株を社内で設計して、細胞の生存率/死滅のレポーターとしてホタルルシフェラーゼを発現した。形質導入された細胞をピューロマイシンで選択し、選択培地(10%のFBS及び2μg/mLのピューロマイシンが補充されたイーグル最小必須培地)で2~3日毎にリフレッシュした。3回の選択後、選択された細胞クローンを採取し、さらなる使用のために保存した。CD20 VHH CAR-T細胞の細胞傷害性を、15:1、10:1、または5:1のエフェクター対標的細胞比(E:T)で24時間測定した。それぞれの数のT細胞を一定数の標的細胞と混合することにより、アッセイを開始した。ONE-Gloルシフェラーゼアッセイ(Promega、カタログ番号E6110)により、ウェル当たりの残りのルシフェラーゼ活性を評価して、1ウェル当たりの残りの生存可能な標的細胞を定量化した。
腫瘍細胞に対するCD20 VHH CAR-T細胞の細胞傷害性を評価するために、上記のように産生された細胞を計数し、抗原特異的がん細胞と共培養して、殺傷力を読み取った。アッセイの変動を比較し、及び/または内部対照として機能させるために、全てのアッセイで、対照CD20 scFv CAR-T細胞を使用した。非形質導入T細胞(UnT)を、非標的指向性T細胞対照として使用した。CD20陽性細胞株-ヒトリンパ腫細胞株Raji(ATCC、#CCL-86)及びK562-CD20、ならびに、CD20陰性細胞株-K562-CD19及びK562(ATCC、#CCL-243)に対して、CAR-T細胞殺傷アッセイを行った。全ての細胞株を社内で設計して、細胞の生存率/死滅のレポーターとしてホタルルシフェラーゼを発現した。形質導入された細胞をピューロマイシンで選択し、選択培地(10%のFBS及び2μg/mLのピューロマイシンが補充されたイーグル最小必須培地)で2~3日毎にリフレッシュした。3回の選択後、選択された細胞クローンを採取し、さらなる使用のために保存した。CD20 VHH CAR-T細胞の細胞傷害性を、15:1、10:1、または5:1のエフェクター対標的細胞比(E:T)で24時間測定した。それぞれの数のT細胞を一定数の標的細胞と混合することにより、アッセイを開始した。ONE-Gloルシフェラーゼアッセイ(Promega、カタログ番号E6110)により、ウェル当たりの残りのルシフェラーゼ活性を評価して、1ウェル当たりの残りの生存可能な標的細胞を定量化した。
数百の、CD20を標的とする一価VHH CAR-T細胞を構築し、in vitro細胞傷害性アッセイでスクリーニングした。例示的なデータが、図1A~1B及び図2A~2Fに示される。T細胞をLIVE/DEAD(商標)Fixable死細胞染色キット(Invitrogen、カタログ番号L34976)、VHHベースのCAR-T細胞を、ヤギ抗ラマIgG FITCコンジュゲート(Bethyl、カタログ番号A160-100F)、及びscFvベースのCAR-T細胞を、FITC標識組み換えプロテインLで染色した(Acro、カタログ番号RPL-PF141)。例示的なVHH CAR-T細胞のCAR+発現レベル(%)は、採取日に約30%に達した(図1A)。代表的なCD20 VHH CAR-T細胞の全てが、Raji.Luc細胞(E:T=10:1)に対して陽性対照(すなわち、CD20 scFv CAR-T細胞)よりも高い細胞傷害性を示した(図2A、及び図2E~2F)、K562-CD20.Luc細胞に対するCD20 scFv CAR-T細胞と同等であった(図2B、及び図2E~2F)。UnT対照と比較して、CD20 VHH CAR-T細胞によるCD20陰性細胞株に対する有意な細胞傷害性効果は検出されなかった(図2C~2D)。
多価VHH CAR-T細胞の効力を評価するために、モノ-、バイ-、及びトリ-VHH CAR-T細胞を構築及び生成し、CAR-T細胞の細胞傷害性を評価した。例示的なデータは、多価CD20 VHH CAR-T細胞が、Raji.Luc細胞及びK562-CD20.Luc細胞に対して異なるレベルの細胞傷害性を示すことを示した(図3A~3B)。24時間のin vitro殺傷アッセイでは、モノ-VHH CAR-T細胞及びバイ-VHH CAR-T細胞は、Raji.Luc細胞に対してTri-VHH CAR-T細胞よりも高い殺傷を示した。UnT対照と比較して、CD20 VHH CAR-T細胞はいずれも、CD20陰性細胞株に対して細胞傷害性効果を示さなかった(図3C~3D)。
VHH間の(G4S)リンカー(複数可)の効果を評価するために、(G4S)n(n=1~5)(配列番号138)ペプチドで連結された2つの例示的なVHHを構築し、5つのバイ-VHH4 CAR-T細胞を生成させた(表6)。例示的なデータは、2つのVHHドメイン間の(G4S)リンカーが短いほど、バイ-VHH CAR-T細胞が標的細胞-Raji.Luc細胞をより強力に殺傷することを示し、(G4S)1としてのリンカーを有するバイ-VHH CAR-T細胞は、20:1及び10:1のE:T比で、Raji.Lucに対する最高の細胞傷害性を示した(図4A~4B)。
上記の観察結果は、本明細書で提供されるCD20 VHH CARが、CD20受容体発現細胞を特異的に認識することにより、T細胞の活性化を誘導し、T細胞の内因性シグナル伝達経路を活性化し、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の活性化を誘導し、抗腫瘍反応を増強することを示す。
6.3.3.CD20 VHH CAR-T細胞のIFN-γ放出評価
CD20発現細胞に応答したCD20 VHH CAR-T細胞のサイトカイン産生を測定するために、CAR-T細胞を、15:1、10:1、または5:1のE:T比で、CD20陽性細胞株-Raji.LucまたはK562-CD20.Luc及びCD20陰性細胞株-K562.Lucと24時間共培養した。その後、サイトカイン定量化のためのヒトIFN-γキット(Cisbio、カタログ番号62HIFNGPEG)を使用して、サイトカイン分析のために、培地を採取し、各ウェルの吸光度(被験物質毎に3回ずつ)をマルチモードマイクロプレートリーダー(Tecan Spark)で読み取った。
CD20発現細胞に応答したCD20 VHH CAR-T細胞のサイトカイン産生を測定するために、CAR-T細胞を、15:1、10:1、または5:1のE:T比で、CD20陽性細胞株-Raji.LucまたはK562-CD20.Luc及びCD20陰性細胞株-K562.Lucと24時間共培養した。その後、サイトカイン定量化のためのヒトIFN-γキット(Cisbio、カタログ番号62HIFNGPEG)を使用して、サイトカイン分析のために、培地を採取し、各ウェルの吸光度(被験物質毎に3回ずつ)をマルチモードマイクロプレートリーダー(Tecan Spark)で読み取った。
代表的な細胞であるVHH-273 CAR-T細胞及びVHH-496 CAR-T細胞が、Raji.Luc細胞と共培養した時、CD20 scFv CAR-T細胞よりも少ないIFN-γを産生し(図5A)、K562-CD20.Luc細胞と共培養した時、CD20 scFv CAR-T細胞と同等のIFN-γを産生した(図5B)ことを、データは示した。モノ-VHH CAR-T細胞、バイ-VHH CAR-T細胞、及びトリ-VHH CAR-T細胞は、Raji.Luc細胞に対して異なるレベルのIFN-γ放出を示した(図6)。対照的に、IFN-γ放出は、非形質導入T細胞または陰性対照細胞-K562.Lucのいずれかを含有する培養物において、検出されないか、または非常に低かった。これにより、CAR-T細胞のCD20特異性が、CD20発現細胞に対する反応性には必要であることが確認される(図6)。
6.3.4.CD20 VHH CAR-T細胞の増殖能力
CD20 VHH CAR-T細胞の増殖能を評価するために、T細胞を照射したK562-CD20細胞またはK562細胞でE:T比2:1で刺激し、40日間共培養した(被験物質毎に3回ずつ)。4日毎に、T細胞を計数し、LIVE/DEAD(商標)Fixable死細胞染色キット(Invitrogen、カタログ番号L34976)、CD3+及びCAR+を、FACSで評価した。CD3受容体を、FITC-抗ヒトCD3(Biolegend、カタログ番号300306)で染色した。VHHベースのCAR-T細胞を、ヤギ抗ラマIgG FITCコンジュゲート(Bethyl、カタログ番号A160-100F)、scFvベースのCAR-T細胞を、FITC標識組み換えプロテインL(ACRO、カタログ番号RPL-PF141)で、4℃で30分間染色し、続いて、3回洗浄し、NovoCyteフローサイトメーター(ACEA Biosciences)でのFACS分析のために、0.5%のFBSを含むDPBS 200μLに再懸濁した。Novoexpressソフトウェアで、FACSデータを分析した。
CD20 VHH CAR-T細胞の増殖能を評価するために、T細胞を照射したK562-CD20細胞またはK562細胞でE:T比2:1で刺激し、40日間共培養した(被験物質毎に3回ずつ)。4日毎に、T細胞を計数し、LIVE/DEAD(商標)Fixable死細胞染色キット(Invitrogen、カタログ番号L34976)、CD3+及びCAR+を、FACSで評価した。CD3受容体を、FITC-抗ヒトCD3(Biolegend、カタログ番号300306)で染色した。VHHベースのCAR-T細胞を、ヤギ抗ラマIgG FITCコンジュゲート(Bethyl、カタログ番号A160-100F)、scFvベースのCAR-T細胞を、FITC標識組み換えプロテインL(ACRO、カタログ番号RPL-PF141)で、4℃で30分間染色し、続いて、3回洗浄し、NovoCyteフローサイトメーター(ACEA Biosciences)でのFACS分析のために、0.5%のFBSを含むDPBS 200μLに再懸濁した。Novoexpressソフトウェアで、FACSデータを分析した。
CD20特異的抗原(K562-CD20細胞との共培養)により刺激された増殖では、VHH-273 CAR-T細胞は、20日目~40日目に、CD20 scFv CAR-T細胞と比較して、CD3+T細胞及びCAR+T細胞増殖を劇的に増強したことを示し、28日目~40日目に、CD3+またはCAR+T細胞増殖において、CD20 scFv CAR-T細胞よりも約1.6~2倍高いことを示した(図7A~7B)。増強されたCD3+T細胞またはCAR+T細胞の増殖は、陰性対照細胞-K562を含有する共培養物では観察されなかった(図7A~7B)。CD20 VHH CAR-T細胞及びCD20 scFv CAR-T細胞の両方は、CAR+発現のパーセンテージが、最初の20日間で時間依存的に増加し、20日後に横ばいになったことを示した(図7C)。さらに、CD20 VHH CAR-T細胞は、CD20 scFv CAR-T細胞よりも大幅に高いパーセンテージのCAR+発現を示した(図7C)。CD20抗原で刺激されたCD20 VHH CAR-T細胞またはCD20 scFv CAR-T細胞は、それぞれの未刺激CD20 VHH CAR-T細胞またはCD20 scFv CAR-T細胞よりも、40日間の増殖アッセイにおいて大幅に高い生存率を維持した(図7D)。このデータは、CD20 VHH CAR-T細胞が、腫瘍関連抗原に依存して、強力且つ持続的なT細胞の活性化及び増殖を誘導することを示す。
6.3.5.CD20 VHH CAR-T細胞の疲弊マーカー及びメモリーマーカーの評価
CD20 VHH CAR-T細胞の疲弊マーカー及びメモリーマーカーを評価するために、T細胞を照射したK562-CD20細胞でE:T比2:1で刺激し、28日間共培養した(被験物質毎に3回ずつ)。4日毎に、T細胞を、live/dead染色で計数し、CAR+、T細胞疲弊マーカー、及びT細胞メモリーマーカーを、多色FACS染色で評価した。T細胞疲弊マーカーを、蛍光色素コンジュゲート抗ヒトCD279(PD-1)、抗ヒトCD223(LAG-3)、及び抗ヒトCD366(Tim-3)で共染色した。T細胞メモリーマーカーを、蛍光色素コンジュゲート抗ヒトCD45RA及び抗ヒトCD197(CCR7)で共染色した。BD LSRFortessaフローサイトメーター(BD Biosciences)を用いて、FACS分析を行った。
CD20 VHH CAR-T細胞の疲弊マーカー及びメモリーマーカーを評価するために、T細胞を照射したK562-CD20細胞でE:T比2:1で刺激し、28日間共培養した(被験物質毎に3回ずつ)。4日毎に、T細胞を、live/dead染色で計数し、CAR+、T細胞疲弊マーカー、及びT細胞メモリーマーカーを、多色FACS染色で評価した。T細胞疲弊マーカーを、蛍光色素コンジュゲート抗ヒトCD279(PD-1)、抗ヒトCD223(LAG-3)、及び抗ヒトCD366(Tim-3)で共染色した。T細胞メモリーマーカーを、蛍光色素コンジュゲート抗ヒトCD45RA及び抗ヒトCD197(CCR7)で共染色した。BD LSRFortessaフローサイトメーター(BD Biosciences)を用いて、FACS分析を行った。
疲弊マーカー評価のFACSデータは、VHH-273 CAR-T細胞及びCD20 scFv CAR-T細胞の両方の疲弊マーカーが、抗原特異的刺激後4日目にピークに達し、その後、劇的に低下したことを示した。8日目後、CD20 VHH CAR-T細胞及びCD20 scFv CAR-T細胞の両方の疲弊マーカーの発現レベルは、28日目まで低く保たれた(図8)。データは、T細胞の疲弊が、腫瘍関連抗原に曝露された初期段階でのみ、強力なT細胞活性化により駆動され、通常は、活性化後に発現がベースラインに戻ることを示唆する。
メモリーマーカー評価のFACSデータは、VHH-273 CAR-T細胞及びCD20 scFv CAR-T細胞が、抗原特異的刺激後の抗原後のセントラルメモリーT細胞(TCM)及びエフェクターメモリーT細胞(TEM)の同様の時間依存パターンを示したことを示した。加えて、CAR-T細胞は、最初にTCMに分化し、これは、4日目にピークに達し、その後、徐々にTEMまたはTEMRAに分化し、これは、8日目または16日目にピークに達した(図9A~9C)。UnTのTCM及びTEM/TEMRAは、ベースラインで維持された(図9A~9C)。操作された第2世代のCAR-T細胞は、エフェクター及びメモリープログラムのバランスを取ることにより、T細胞を運命に誘導する。
6.4.実施例4-腫瘍異種移植マウスにおけるCD20 VHH CAR-T細胞のin vivo有効性
Raji異種移植片NCGマウスモデルにおいて、CD20 VHH CAR-T細胞の抗腫瘍活性をin vivo評価し、CD20 scFv CAR-T細胞及び非形質導入細胞(UnT)を、陽性または陰性対照として評価した。
Raji異種移植片NCGマウスモデルにおいて、CD20 VHH CAR-T細胞の抗腫瘍活性をin vivo評価し、CD20 scFv CAR-T細胞及び非形質導入細胞(UnT)を、陽性または陰性対照として評価した。
細胞株:Raji(ATCC番号CCL-86)は、11歳の男性のバーキットリンパ腫から1963年にPulvertaftにより確立されたリンパ芽球様細胞株である。10%のウシ胎児血清を含有するRMPI培地で、Raji細胞を成長させた。この細胞株は、組織培養フラスコの懸濁液中で成長する。この細胞株は、静脈内に移植された場合、マウスに持続及び増殖する。Raji細胞は、ルシフェラーゼを発現するように改変しており、従って、マウスをイメージングすることにより、腫瘍細胞の成長も監視することができた。Rajiモデルは、高レベルのCD19、CD20、及びCD22を内因的に発現し、それにより、CD20特異的操作されたT細胞のin vivoでの有効性を試験するために使用することができる。
マウス:同等の体重(約20g)の5~6週齢のNCG(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju)雌マウスは、Model Animal Research Center of Nanjing Universityから受領した。動物を、実験前の7日間、動物施設で順応させた。動物を、ACUCの規制及びガイドラインに従って処理した。
6.4.1.CD20モノ-VHH CAR-T細胞の有効性、及びin vivo試験での再免疫
6.4.1.1.CD20モノ-VHH CAR-T細胞の有効性in vivo試験
腫瘍異種移植片を作成するために、NCGマウスに、Raji.Lucを静脈内注射した。Raji.Luc腫瘍細胞移植の4日後に、マウスをT細胞で処置した。マウス1匹当たり、1×106T細胞の用量で、尾静脈を介して、400μLのT細胞をマウスに静脈内注射した。1群当たり4匹のマウスを、CD20モノ-VHH CAR-T細胞(VHH-273CAR-T細胞もしくはVHH-496CAR-T細胞)またはCD20 scFv CAR-T細胞のいずれかで処置し、400μLのHBSS単独及び非形質導入T細胞(UnT)を対照として使用した。全てのT細胞を、同じドナーから並行して調製した。体重測定を含む動物の健康状態を、週に2回監視した。動物がエンドポイントに達するまで、腫瘍を生物発光イメージング(BLI)により毎週監視した。
6.4.1.1.CD20モノ-VHH CAR-T細胞の有効性in vivo試験
腫瘍異種移植片を作成するために、NCGマウスに、Raji.Lucを静脈内注射した。Raji.Luc腫瘍細胞移植の4日後に、マウスをT細胞で処置した。マウス1匹当たり、1×106T細胞の用量で、尾静脈を介して、400μLのT細胞をマウスに静脈内注射した。1群当たり4匹のマウスを、CD20モノ-VHH CAR-T細胞(VHH-273CAR-T細胞もしくはVHH-496CAR-T細胞)またはCD20 scFv CAR-T細胞のいずれかで処置し、400μLのHBSS単独及び非形質導入T細胞(UnT)を対照として使用した。全てのT細胞を、同じドナーから並行して調製した。体重測定を含む動物の健康状態を、週に2回監視した。動物がエンドポイントに達するまで、腫瘍を生物発光イメージング(BLI)により毎週監視した。
全ての処置群の平均生物発光を、図10A~10Fにプロットする。いずれのT細胞も投与されなかったHBSS処置群(ビヒクル)は、静脈内注射されたNCGマウスにおいてベースラインRaji腫瘍成長動態を示した。UnT処置群は、操作されたT細胞の陰性対照として非形質導入T細胞を投与された。HBSS及びUnT処置群の両方は、この研究を通じて持続的な浸潤性腫瘍進行を示し、16日目に安楽死させた。CD20モノ-VHH CAR-T細胞は、UnT処置と比較して腫瘍成長を大幅に抑制し、平均生物発光及び生物発光の画像から示されるように、35日間のin vivo有効性試験中に完全な腫瘍抑制を示した(図10A~10B)。加えて、週に2回監視されたマウスの健康状態は、正常であり、35日間のin vivo試験を通して、CD20モノVHH CAR-T細胞処置群の体重が増加した(図10C)。
6.4.1.2.PK研究-マウス末梢血中のCARのコピーの検出
CD20 VHH CAR-T細胞の薬物動態を評価し、マウスにおける循環CAR-T細胞の増殖及び持続性を監視するために、マウス末梢血のゲノムDNAを、QIAamp-DNA-mini Blood Kit(Qiagen,カタログ番号51106)で抽出し、濃度を、Nanodrop One(ThermoFisher、カタログ番号ND-ONE-W)で測定した。ゲノムDNA(1群当たり3匹)を、ddH2Oで50ng/μLの濃度に希釈し、CAR骨格に結合するフォワード及びリバースプライマーセットを含む、PCR反応試薬と混合した。次に、混合物をデジタルPCRで評価し、QX200 Droplet Reader(BioRad、カタログ番号1864003)で行った。VHH-273 CARのコピー/ngゲノムDNAは、ピークレベル(14日目)で観察されたCD20 scFv CARよりも2倍高かった(図10D)。
CD20 VHH CAR-T細胞の薬物動態を評価し、マウスにおける循環CAR-T細胞の増殖及び持続性を監視するために、マウス末梢血のゲノムDNAを、QIAamp-DNA-mini Blood Kit(Qiagen,カタログ番号51106)で抽出し、濃度を、Nanodrop One(ThermoFisher、カタログ番号ND-ONE-W)で測定した。ゲノムDNA(1群当たり3匹)を、ddH2Oで50ng/μLの濃度に希釈し、CAR骨格に結合するフォワード及びリバースプライマーセットを含む、PCR反応試薬と混合した。次に、混合物をデジタルPCRで評価し、QX200 Droplet Reader(BioRad、カタログ番号1864003)で行った。VHH-273 CARのコピー/ngゲノムDNAは、ピークレベル(14日目)で観察されたCD20 scFv CARよりも2倍高かった(図10D)。
6.4.1.3.Raji.Luc腫瘍細胞の再免疫in vivo研究
追加の腫瘍量で、それらの少なくとも5週間の無腫瘍マウスに対するCAR-T細胞の有効性を調査するために、PBMCでCARコピー数(ゲノムDNAのコピー/ng)が検出されないそれらのマウスを、再免疫アッセイ用に選択しました。選択されたマウスに、半量のRaji.Luc腫瘍細胞を静脈内注射した。体重測定を含む動物の健康状態を、週に2回監視した。動物がエンドポイントに達するまで、生物発光イメージング(BLI)により、Raji腫瘍を毎週監視した。
追加の腫瘍量で、それらの少なくとも5週間の無腫瘍マウスに対するCAR-T細胞の有効性を調査するために、PBMCでCARコピー数(ゲノムDNAのコピー/ng)が検出されないそれらのマウスを、再免疫アッセイ用に選択しました。選択されたマウスに、半量のRaji.Luc腫瘍細胞を静脈内注射した。体重測定を含む動物の健康状態を、週に2回監視した。動物がエンドポイントに達するまで、生物発光イメージング(BLI)により、Raji腫瘍を毎週監視した。
対照としてRaji.Lucを注射したナイーブマウス(Raji.Luc細胞を移植していない、または以前にCAR-T細胞で処置していない)は、持続的な浸潤性腫瘍進行を示し、19日目に安楽死させた。VHH-273 CAR-T細胞は、再免疫後の28日間、完全な腫瘍抑制を示した。CD20 VHH CAR-T細胞及びCD20 scFv CAR-T細胞処置群の両方が、平均生物発光から示されるように、12日目頃に再発した(図10E)。加えて、VHH-273 CAR-T細胞処置下で週2回監視されたマウスの健康状態及び体重は、28日間の再免疫in vivo研究を通じて正常であった(図10F)。
6.4.2.CD20モノ-VHH、バイ-VHH、及びトリ-VHH CAR-T細胞の有効性及び再免疫のin vivo試験
6.4.2.1.CD20モノ-VHH、バイ-VHH、及びトリ-VHH CAR-T細胞の有効性のin vivo試験
腫瘍異種移植片を作成するために、NCGマウスに、Raji.Lucを静脈内注射した。Raji.Luc腫瘍細胞移植の4日後に、マウスをT細胞で処置した。マウス1匹当たり、1×106T細胞の用量で、尾静脈を介して、400μLのT細胞をマウスに静脈内注射した。1群当たり6匹のマウスを、CD20モノ-VHH CAR-T細胞(VHH-313 CAR-T細胞)、バイ-VHH CAR-T細胞(Bi-VHH3 CAR-T細胞)、またはTri-VHH CAR-T細胞で処置し、CD20 scFv CAR-T細胞、400μLのHBSSのみ、及び非形質導入T細胞(UnT)を対照として使用した。全てのT細胞を、同じドナーから並行して調製した。体重測定を含む動物の健康状態を、週に2回監視した。動物がエンドポイントに達するまで、腫瘍を生物発光イメージング(BLI)により毎週監視した。
6.4.2.1.CD20モノ-VHH、バイ-VHH、及びトリ-VHH CAR-T細胞の有効性のin vivo試験
腫瘍異種移植片を作成するために、NCGマウスに、Raji.Lucを静脈内注射した。Raji.Luc腫瘍細胞移植の4日後に、マウスをT細胞で処置した。マウス1匹当たり、1×106T細胞の用量で、尾静脈を介して、400μLのT細胞をマウスに静脈内注射した。1群当たり6匹のマウスを、CD20モノ-VHH CAR-T細胞(VHH-313 CAR-T細胞)、バイ-VHH CAR-T細胞(Bi-VHH3 CAR-T細胞)、またはTri-VHH CAR-T細胞で処置し、CD20 scFv CAR-T細胞、400μLのHBSSのみ、及び非形質導入T細胞(UnT)を対照として使用した。全てのT細胞を、同じドナーから並行して調製した。体重測定を含む動物の健康状態を、週に2回監視した。動物がエンドポイントに達するまで、腫瘍を生物発光イメージング(BLI)により毎週監視した。
いずれのT細胞も投与されなかったHBSS処置群(ビヒクル)は、静脈内注射されたNCGマウスにおいてベースラインRaji腫瘍成長動態を示した。UnT処置群は、操作されたT細胞の陰性対照として非形質導入T細胞を投与された。HBSS及びUnT処置群の両方は、この研究を通じて持続的な浸潤性腫瘍進行を示し、14日目に安楽死させた。平均生物発光及び生物発光の画像から示されるように、VHH-313 CAR-T細胞、バイ-VHH3 CAR-T細胞、及びトリ-VHH CAR-T細胞は、全て、UnT処置と比較して、腫瘍成長を大幅に抑制し、42日間のin vivo有効性試験中に、完全な腫瘍抑制を示した(図11A~11B)。Tri-VHH CAR-T細胞は、モノVHH CAR-T細胞及びバイ-VHH CAR-T細胞よりも、Raji腫瘍抑制において、わずかにより効果的であった。CD20 scFv CAR-T細胞の処置群は、28日目に再発した(図11A~11B)。加えて、in vivo研究を通して、週2回監視されたマウスの健康状態は、正常であり、CD20モノ-VHH、バイ-VHH及びTri-VHH CAR-T細胞処置群の体重が増加した(図11C)。
6.4.2.2.PK研究-マウス末梢血中のCARのコピーの検出
CD20モノ-VHH、バイ-VHH、及びトリ-VHH CAR-T細胞の薬物動態を評価し、マウスにおける循環CAR-T細胞の増殖及び持続性を監視するために、マウス末梢血のゲノムDNAを、QIAamp-DNA-mini Bloodキット(Qiagen、カタログ番号51106)で抽出し、濃度を、Nanodrop One(ThermoFisher、カタログ番号ND-ONE-W)で測定した。ゲノムDNA(1群当たり3匹)を、ddH2Oで50ng/μLの濃度に希釈し、CAR骨格に結合するフォワード及びリバースプライマーセットを含む、PCR反応試薬と混合した。次に、混合物をデジタルPCRで評価し、QX200 Droplet Reader(BioRad、カタログ番号1864003)で行った。VHH-313 CARコピー及びBi-VHH3 CARコピーの両方が、7日目にピークに達し、CD20 scFv CARコピーが、21日目にピークに達した(図11Eから採用された図11D、Y軸のスケールは、コピー/ngのゲノムDNAの解像度を高めるように調整される)。加えて、Tri-VHH CAR-T細胞は、より高い増殖能力を示し、21日目にピークに達し、その後、エンドポイント(35日目)まで徐々に低下した(図11E)。
CD20モノ-VHH、バイ-VHH、及びトリ-VHH CAR-T細胞の薬物動態を評価し、マウスにおける循環CAR-T細胞の増殖及び持続性を監視するために、マウス末梢血のゲノムDNAを、QIAamp-DNA-mini Bloodキット(Qiagen、カタログ番号51106)で抽出し、濃度を、Nanodrop One(ThermoFisher、カタログ番号ND-ONE-W)で測定した。ゲノムDNA(1群当たり3匹)を、ddH2Oで50ng/μLの濃度に希釈し、CAR骨格に結合するフォワード及びリバースプライマーセットを含む、PCR反応試薬と混合した。次に、混合物をデジタルPCRで評価し、QX200 Droplet Reader(BioRad、カタログ番号1864003)で行った。VHH-313 CARコピー及びBi-VHH3 CARコピーの両方が、7日目にピークに達し、CD20 scFv CARコピーが、21日目にピークに達した(図11Eから採用された図11D、Y軸のスケールは、コピー/ngのゲノムDNAの解像度を高めるように調整される)。加えて、Tri-VHH CAR-T細胞は、より高い増殖能力を示し、21日目にピークに達し、その後、エンドポイント(35日目)まで徐々に低下した(図11E)。
6.4.2.3.Raji.Luc腫瘍細胞の再免疫in vivo研究
追加の腫瘍量で、それらの少なくとも6週間の無腫瘍マウスに対するCD20モノ-VHH、バイ-VHH、及びトリ-VHH CAR-T細胞の有効性を調査するために、マウスを再免疫アッセイ用に選択した。選択されたマウスに、半量のRaji.Luc細胞を静脈内注射した。体重測定を含む、動物の健康状態を毎週監視した。動物がエンドポイントに達するまで、生物発光イメージング(BLI)により、Raji腫瘍を毎週監視した。
追加の腫瘍量で、それらの少なくとも6週間の無腫瘍マウスに対するCD20モノ-VHH、バイ-VHH、及びトリ-VHH CAR-T細胞の有効性を調査するために、マウスを再免疫アッセイ用に選択した。選択されたマウスに、半量のRaji.Luc細胞を静脈内注射した。体重測定を含む、動物の健康状態を毎週監視した。動物がエンドポイントに達するまで、生物発光イメージング(BLI)により、Raji腫瘍を毎週監視した。
CD20 scFv CAR-T細胞処置群は、継続的な寛解及び再発を示し、VHH-313 CAR-T細胞またはBi-VHH3 CAR-T細胞で処置されたマウスは、約11日目~18日目に再発し、Tri-VHH CAR-T細胞で処置されたマウスは、平均生物発光で示されるように、Raji.Luc細胞の再免疫後32日間の大幅の腫瘍抑制を示した(図11F)。
6.5.実施例5-In Vitroでの抗CD20 VHH-huIgG1Fcモノクローナル抗体(mAb)結合及びオン/オフターゲット活性の特性評価
6.5.1.抗CD20 VHH-huIgG1Fc mAbのCD20受容体発現細胞へのオンターゲット結合及びEC50
組み換えタンパク質の発現を促進するために、ヒトIgG1 Fcフラグメント配列(配列番号159)を含む3つの例示的な抗CD20 VHH配列(クローンID:VHH-273、VHH-466、及びVHH-496)のそれぞれを、哺乳類の発現ベクターであるpcDNA3.4にクローニングした。哺乳動物宿主細胞(Expi293F)における最適な発現のために、DNAコドンをさらに最適化した。抗体を、細胞培養上清から採取し、MabSelect SuRe LXで1ステップ精製し、0.2μmのフィルターで滅菌した。精製された抗体濃度をA280により決定し、約90%の純度で、2~6mg/mLに達した。配列番号158に示されるリツキシマブ(C2B8)scFvのアミノ酸配列を有する抗CD20 scFv-huIgG1Fc mA、ならびに、配列番号163及び配列番号164に示されるLeu16 VH-CH1及びVL-CLのアミノ酸配列を有する抗CD20 Fab-huIgG1Fc mAbを、細胞表面結合アッセイの陽性対照として使用した。CD20陽性細胞株-Raji、K562-CD20、及び陰性細胞株-K562を完全培地に再懸濁し、細胞濃度を、1×106細胞/mLに希釈し、1ウェル当たり2×105細胞で染色を実施した。mAbを最大濃度2000nMから段階希釈し(3分の1に低減、12pts)、実験計画及びプロトコールに従って添加した。mAb及び細胞を、4℃で1時間共培養した。次に、細胞を、200μLのDPBS+0.5%のFBSで洗浄し、4℃で5分間、300gで回転させた。細胞を、検出抗体(PE結合マウス抗ヒトIgG1 Fc)(BioLegend、カタログ番号409304、1:100)で、4℃で40分間染色した。次に、細胞を再度洗浄し、NovoCyteフローサイトメーター(ACEA Biosciences)でのフローサイトメトリー分析のために、200μLのDPBS+0.5%のFBSで再懸濁させた。FACSデータをNovoexpressソフトウェアで分析し、MFI(蛍光強度の中央値)をGraphPad PRISMバージョン6.0により分析した。
6.5.1.抗CD20 VHH-huIgG1Fc mAbのCD20受容体発現細胞へのオンターゲット結合及びEC50
組み換えタンパク質の発現を促進するために、ヒトIgG1 Fcフラグメント配列(配列番号159)を含む3つの例示的な抗CD20 VHH配列(クローンID:VHH-273、VHH-466、及びVHH-496)のそれぞれを、哺乳類の発現ベクターであるpcDNA3.4にクローニングした。哺乳動物宿主細胞(Expi293F)における最適な発現のために、DNAコドンをさらに最適化した。抗体を、細胞培養上清から採取し、MabSelect SuRe LXで1ステップ精製し、0.2μmのフィルターで滅菌した。精製された抗体濃度をA280により決定し、約90%の純度で、2~6mg/mLに達した。配列番号158に示されるリツキシマブ(C2B8)scFvのアミノ酸配列を有する抗CD20 scFv-huIgG1Fc mA、ならびに、配列番号163及び配列番号164に示されるLeu16 VH-CH1及びVL-CLのアミノ酸配列を有する抗CD20 Fab-huIgG1Fc mAbを、細胞表面結合アッセイの陽性対照として使用した。CD20陽性細胞株-Raji、K562-CD20、及び陰性細胞株-K562を完全培地に再懸濁し、細胞濃度を、1×106細胞/mLに希釈し、1ウェル当たり2×105細胞で染色を実施した。mAbを最大濃度2000nMから段階希釈し(3分の1に低減、12pts)、実験計画及びプロトコールに従って添加した。mAb及び細胞を、4℃で1時間共培養した。次に、細胞を、200μLのDPBS+0.5%のFBSで洗浄し、4℃で5分間、300gで回転させた。細胞を、検出抗体(PE結合マウス抗ヒトIgG1 Fc)(BioLegend、カタログ番号409304、1:100)で、4℃で40分間染色した。次に、細胞を再度洗浄し、NovoCyteフローサイトメーター(ACEA Biosciences)でのフローサイトメトリー分析のために、200μLのDPBS+0.5%のFBSで再懸濁させた。FACSデータをNovoexpressソフトウェアで分析し、MFI(蛍光強度の中央値)をGraphPad PRISMバージョン6.0により分析した。
細胞表面結合データは、抗CD20 VHH-huIgG1Fc mAbがCD20陽性細胞-Raji細胞及びK562-CD20細胞に、用量依存的に特異的に結合したことを示し、両方の標的細胞において、抗CD20 scFv-huIgG1Fc mAbより大幅に強い結合を示した(図12A~12B)。抗CD20 VHH-huIgG1Fc mAbは、標的細胞上の抗CD20Fab-huIgG1FcmAbに対する同等の結合、及び、より高いmAb濃度でRajiに対してより強い結合を示した(図12D)。いずれの抗体も、CD20陰性細胞株-K562への著しい結合を示さなかった(図12C及び図12E)。抗CD20 VHH-huIgG1Fc mAb 対 陽性対照mAbのEC50が、表9及び表10に示される。最大有効濃度の半分としても既知の「EC50」という用語は、特定の曝露時間後にベースライン及び最大値の中間で応答を誘発する抗体の濃度を指す。
6.5.2.抗CD20 VHH-huIgG1Fc mAbオフターゲット結合の評価
オフターゲット結合を検証するために、抗CD20 VHH-huIgG1Fc mAbを様々なヒト細胞株で評価した。例示的な試験細胞株が表11に列挙される。mAbを1ウェル当たり1×105細胞で、4℃で1時間インキュベートした。次に、細胞を200μLのDPBS及び0.5%のFBSで洗浄し、4℃で5分間、300gで遠心した。細胞を、検出抗体(PE結合マウス抗ヒトIgG1 Fc)(BioLegend、カタログ番号409304、1:100)で、4℃で30分間染色した。次に、細胞を再度洗浄し、NovoCyteフローサイトメーター(ACEA Biosciences)でのフローサイトメトリー分析のために200μLのDPBS+0.5%のFBSで再懸濁させ、FACSヒストグラムデータをNovoexpressソフトウェアで分析した。上記の3つの例示的な抗CD20 VHH-huIgG1Fc mAb(VHHクローンID:VHH-273、VHH-466、及びVHH-496)に関して、オフターゲット細胞への非特異的結合は、Raji細胞への最大結合を生じる濃度で観察されなかった(表11)。
オフターゲット結合を検証するために、抗CD20 VHH-huIgG1Fc mAbを様々なヒト細胞株で評価した。例示的な試験細胞株が表11に列挙される。mAbを1ウェル当たり1×105細胞で、4℃で1時間インキュベートした。次に、細胞を200μLのDPBS及び0.5%のFBSで洗浄し、4℃で5分間、300gで遠心した。細胞を、検出抗体(PE結合マウス抗ヒトIgG1 Fc)(BioLegend、カタログ番号409304、1:100)で、4℃で30分間染色した。次に、細胞を再度洗浄し、NovoCyteフローサイトメーター(ACEA Biosciences)でのフローサイトメトリー分析のために200μLのDPBS+0.5%のFBSで再懸濁させ、FACSヒストグラムデータをNovoexpressソフトウェアで分析した。上記の3つの例示的な抗CD20 VHH-huIgG1Fc mAb(VHHクローンID:VHH-273、VHH-466、及びVHH-496)に関して、オフターゲット細胞への非特異的結合は、Raji細胞への最大結合を生じる濃度で観察されなかった(表11)。
6.6.実施例6-ヒト化CD20 VHH CARの生成及び特性評価
6.6.1.抗CD20 VHH抗体のヒト化
ヒトにおける免疫原性を低減させるために、ラクダ科動物VHH抗体をヒト化した。これは、免疫応答の多くが非ヒト抗体定常領域に対して生じるからである。異なるフレームワーク領域をラクダ科動物のCDRと組み合わせると、同じ抗原に特異的なヒトとラクダ科動物のキメラ抗体が、異なるエフェクター機能を誘発し得、これにより、治療上の利点が拡大する。配列ベースのアプローチと、最も相同なヒト生殖系列配列または関連足場へのフレームワークシャッフリングを使用して、単一特異的ラクダ科動物VHHをヒト化した。非ネイティブなヒトフレームワーク足場によりサポートされているラクダ科動物のCDRの非互換性及び重要な立体配座残基の除去は、インシリコCDR移植、相同構造モデリング(3次立体配座及び折りたたみ)、配列アラインメント、構造ベースの復帰変異設計及びラクダ科動物VHH抗体由来の重要な配座残基の再導入により解決された。抗体のヒト化プロセスは、立体的な衝突を排除するだけでなく、抗原への結合親和性に関する機能を回復させることがある。
6.6.1.抗CD20 VHH抗体のヒト化
ヒトにおける免疫原性を低減させるために、ラクダ科動物VHH抗体をヒト化した。これは、免疫応答の多くが非ヒト抗体定常領域に対して生じるからである。異なるフレームワーク領域をラクダ科動物のCDRと組み合わせると、同じ抗原に特異的なヒトとラクダ科動物のキメラ抗体が、異なるエフェクター機能を誘発し得、これにより、治療上の利点が拡大する。配列ベースのアプローチと、最も相同なヒト生殖系列配列または関連足場へのフレームワークシャッフリングを使用して、単一特異的ラクダ科動物VHHをヒト化した。非ネイティブなヒトフレームワーク足場によりサポートされているラクダ科動物のCDRの非互換性及び重要な立体配座残基の除去は、インシリコCDR移植、相同構造モデリング(3次立体配座及び折りたたみ)、配列アラインメント、構造ベースの復帰変異設計及びラクダ科動物VHH抗体由来の重要な配座残基の再導入により解決された。抗体のヒト化プロセスは、立体的な衝突を排除するだけでなく、抗原への結合親和性に関する機能を回復させることがある。
Cecile Vinckeらにより設計されたユニバーサルヒト化VHHフレームワークh-NbBcII10FGLA(Protein Data Bank、PDBコード:3EAK、https://www.rcsb.org/structure/3EAK)は、配列相同性に基づくヒト化設計に採用された。モデリングソフトウェアMODELLERを使用して、ラクダ科動物VHHの相同モデリングを実施した。ヒト生殖系列遺伝子とのアラインメントに従って、IGHV3-64*04が、抗CD20 VHHドメインの1つのヒトアクセプターとして選択された。アミノ酸の相対的な溶媒接近可能性を、タンパク質の3次元構造に従って算出した。VHHのアミノ酸の1つは、溶媒に曝露された場合、元のアミノ酸に置き換えられるであろう。本明細書で生成された例示的なヒト化VHHドメイン(例えば、huVHH-253、huVHH-256、huVHH-260、huVHH-746、huVHH-750、huVHH-753、huVHH-836、huVHH-840、huVHH-843、huVHH-846、2082H1、2082H2、2082H3、2082H4、2082H5、及び2082H6)は、表2に示され、対応する配列は、本明細書で提供する配列表で提供される。
6.6.2.ヒト化CD20 VHH CAR-T細胞の特性評価
上記の方法を使用して、例示的なヒト化CD20 VHH CAR(表12を参照)を生成した。
上記の方法を使用して、例示的なヒト化CD20 VHH CAR(表12を参照)を生成した。
ヒト初代T細胞へのレンチウイルス形質導入により、ヒト化CD20 VHH CAR-T細胞を生成し、標準的な方法に従って、in vitro有効性研究で評価した。形質導入されたT細胞は、ヒト化CD20 VHH CARで異なるCAR発現レベル(%)を示した。例示的なヒト化CD20 VHH CAR-T細胞の生存率は、約90%~96%であり、CAR+(%)は、約12%~43%であり、7日間の培養で増殖倍数は35~74以内であった。これは、非形質導入T細胞(UnT)と比較した場合に、T細胞の増殖及び増殖する能力に対するヒト化VHHの検出可能な負の効果がないことを示す。
上記のように生成されたヒト化CD20 VHH CAR-T細胞を計数し、抗原特異的がん細胞株と共培養して、殺傷能力を評価し、親ラクダ科動物CD20 VHH CAR-T細胞及びCD20 scFv CAR-T細胞を対照として使用し、非形質導入T細胞(UnT)を、非標的指向性T細胞対照として使用した。CD20陽性細胞株-Raji(ATCC#CCL-86)、K562-CD20、及び陰性細胞株-K562(ATCC#CCL-243)に対して、ヒト化CD20 VHH CAR-T細胞殺傷アッセイを行った。全ての細胞株を社内で設計して、細胞の生存率/死滅のレポーターとしてホタルルシフェラーゼを発現した。形質導入された細胞をピューロマイシンで選択し、選択培地(10%のFBS及び2μg/mLのピューロマイシンが補充されたイーグル最小必須培地)で2~3日毎にリフレッシュした。3回の選択後、選択された細胞クローンを採取し、さらなる使用のために保存した。ヒト化CD20 VHH CAR-T細胞の細胞傷害性を、15:1、10:1、5:1、または2.5:1のエフェクター細胞対標的細胞の比(E:T)で24時間測定した。それぞれの数のT細胞を一定数の標的細胞と混合することにより、アッセイを開始した。ONE-Gloルシフェラーゼアッセイ(Promega、カタログ番号E6110)により、ウェル当たりの残りのルシフェラーゼ活性を評価して、1ウェル当たりの残りの生存可能な標的細胞を定量化した。
ヒト化CD20 VHH CAR-T細胞(huVHH-746 CAR-T細胞、huVHH-750 CAR-T細胞、huVHH-753 CAR-T細胞、huVHH-253 CAR-T細胞、huVHH-256 CAR、及びhuVHH-260 CAR-T細胞を含む)が、抗原特異的標的細胞の溶解を誘導し、標的細胞に対して、より高い効力を示すか、または効力の維持を表した(図13A~13B、図13D~13E、及び図13H~13I)ことを、結果は示した。UnT対照と比較して、ヒト化CD20 VHH CAR-T細胞による、陰性細胞株-K562.LucまたはNalm.6.Lucに対する著しい細胞傷害性効果は検出されなかった(図13C、図13F~13G、及び図13J~13K)。
本明細書に引用された全ての特許、公開された出願、及び参考文献の教示は、全体が参照により組み込まれる。
例示的な実施形態が特に示され、説明されているが、添付の特許請求の範囲に包含される実施形態の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細に様々な変更が行われ得ることは、当業者らには理解されるであろう。
上記から、例示の目的で特定の実施形態が本明細書に記載されているが、本明細書で提供されるものの趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な修正を行うことができることが理解されるであろう。上で言及趣旨された全ての参考文献は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (41)
- 抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)であって、
(i)配列番号1もしくは195のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR3、
(ii)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR3、
(iii)配列番号1もしくは195のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR3、
(iv)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR3、
(v)配列番号11もしくは196のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR3、
(vi)配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR3、
(vii)配列番号14もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3、
(viii)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR3、
(ix)配列番号20もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号21のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3、
(x)配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号23のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR3、
(xi)配列番号24もしくは198のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号25のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号26のアミノ酸配列を含むCDR3、
(xii)配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR3、
(xiii)配列番号14もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3、
(xiv)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR3、
(xv)配列番号1もしくは195のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR3、
(xvi)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR3、
(xvii)配列番号20もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3、
(xviii)配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR3、
(xix)配列番号20もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3、
(xx)配列番号20もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3、
(xxi)配列番号20もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR3、
(xxii)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR3、
(xxiii)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR3、
(xxiv)配列番号165もしくは199のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号166のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号167のアミノ酸配列を含むCDR3、
(xxv)配列番号168のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号169のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号170のアミノ酸配列を含むCDR3、
(xxvi)配列番号171もしくは200のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号172のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号173のアミノ酸配列を含むCDR3、
(xxvii)配列番号174のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号175のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号176のアミノ酸配列を含むCDR3、
(xxviii)配列番号177もしくは197のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号178のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号179のアミノ酸配列を含むCDR3、または
(xxix)配列番号180のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号181のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号182のアミノ酸配列を含むCDR3、
を含む、前記抗CD20 sdAb。 - 抗CD20単一ドメイン抗体(sdAb)であって、
(i)配列番号41に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(ii)配列番号42に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(iii)配列番号43に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(iv)配列番号44に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(v)配列番号45に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(vi)配列番号46に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(vii)配列番号47に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(viii)配列番号48に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(ix)配列番号49に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(x)配列番号50に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(xi)配列番号51に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(xii)配列番号52に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(xiii)配列番号53に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(xiv)配列番号54に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(xv)配列番号55に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(xvi)配列番号56に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(xvii)配列番号57に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(xviii)配列番号58に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(xix)配列番号59に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(xx)配列番号60に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(xxi)配列番号61に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(xxii)配列番号62に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(xxiii)配列番号63に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(xxiv)配列番号183に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、
(xxv)配列番号184に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3、または
(xxvi)配列番号185に記載のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3
を含む、前記抗CD20 sdAb。 - 前記CDR1、CDR2、またはCDR3が、Kabatナンバリングスキーム、IMGTナンバリングスキーム、AbMナンバリングスキーム、Chothiaナンバリングスキーム、Contactナンバリングスキーム、またはそれらの組み合わせに従って決定される、請求項2に記載の抗CD20 sdAb。
- 配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号183、配列番号184、及び/または配列番号185に記載の1つ以上のFR領域をさらに含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の抗CD20 sdAb。
- 配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号183、配列番号184、または配列番号185のアミノ酸配列を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の抗CD20 sdAb。
- 配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号183、配列番号184、または配列番号185の配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項1~4のいずれか1項に記載の抗CD20 sdAb。
- ラクダ科動物のsdAbである、請求項1または請求項2に記載の抗CD20 sdAb。
- ヒト化sdAbである、請求項1または請求項2に記載の抗CD20 sdAb。
- 薬剤に遺伝子的に融合されているかまたは化学的にコンジュゲートされている、請求項1~8のいずれか1項に記載の抗CD20 sdAb。
- (a)請求項1~9のいずれか1項に記載の抗CD20 sdAbを含む細胞外抗原結合ドメイン;
(b)膜貫通ドメイン;及び
(c)細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む、キメラ抗原受容体(CAR)。 - 前記細胞外抗原結合ドメインが、1つ以上の追加の抗原結合ドメイン(複数可)をさらに含む、請求項10に記載のCAR。
- 前記細胞外抗原結合ドメインが、1つの追加の抗原結合ドメインをさらに含むか、または、前記細胞外抗原結合ドメインが、2つの追加の抗原結合ドメインをさらに含む、請求項11に記載のCAR。
- 前記1つ以上の追加の抗原結合ドメイン(複数可)が、CD20、CD19、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3、及び糖脂質F77からなる群より選択される1つ以上の抗原(複数可)に結合する、請求項11~12のいずれか1項に記載のCAR。
- 前記細胞外抗原結合ドメインが、請求項1~9のいずれか1項に記載の抗CD20 sdAbのうちの2つまたは3つを含む、請求項11~13のいずれか1項に記載のCAR。
- 前記膜貫通ドメインが、CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152、及びPD1からなる群より選択される分子に由来する、請求項10~14のいずれか1項に記載のCAR。
- 前記膜貫通ドメインが、CD8αに由来する、請求項15に記載のCAR。
- 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項10~16のいずれか1項に記載のCAR。
- 前記一次細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3ζに由来する、請求項17に記載のCAR。
- 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項17または請求項18に記載のCAR。
- 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83のリガンド、及びその組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する、請求項19に記載のCAR。
- 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、CD137に由来する、請求項20に記載のCAR。
- 前記細胞外抗原結合ドメインのC末端と前記膜貫通ドメインのN末端との間に位置するヒンジドメインをさらに含む、請求項10~21のいずれか1項に記載のCAR。
- 前記ヒンジドメインが、CD8αに由来する、請求項22に記載のCAR。
- ポリペプチドのN末端に位置するシグナルペプチドをさらに含む、請求項10~23のいずれか1項に記載のCAR。
- 前記シグナルペプチドが、CD8αに由来する、請求項24に記載のCAR。
- (i)配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号189、配列番号190、及び配列番号191からなる群より選択されるアミノ酸配列、または
(ii)配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号189、配列番号190、もしくは配列番号191の配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、キメラ抗原受容体(CAR)。 - 請求項1~9のいずれか1項に記載の抗CD20 sdAbをコードする核酸配列を含む、単離核酸。
- 請求項27に記載の単離核酸を含む、ベクター。
- 請求項10~26のいずれか1項に記載のCARをコードする核酸配列を含む、単離核酸。
- 請求項29に記載の単離核酸を含む、ベクター。
- 請求項10~26のいずれか1項に記載のCAR、請求項29に記載の単離核酸、または請求項30に記載のベクターを含む、操作された免疫エフェクター細胞。
- T細胞またはB細胞である、請求項31に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
- 請求項1~9のいずれか1項に記載の抗CD20 sdAb、請求項31もしくは請求項32に記載の操作された免疫エフェクター細胞、または請求項28もしくは請求項30に記載のベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
- 対象の疾患または障害を処置する方法であって、有効量の、請求項1~9のいずれか1項に記載の抗CD20 sdAb、請求項31もしくは請求項32に記載の操作された免疫エフェクター細胞、または請求項33に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
- 前記疾患または前記障害が、B細胞関連疾患もしくは障害及び/またはCD20関連疾患もしくは障害である、請求項34に記載の方法。
- 前記疾患または前記障害が、がんである、請求項35に記載の方法。
- 前記疾患または前記障害が、B細胞悪性腫瘍である、請求項36に記載の方法。
- 前記B細胞悪性腫瘍が、B細胞白血病またはB細胞リンパ腫である、請求項37記載の方法。
- 前記疾患または前記障害が、辺縁帯リンパ腫(例えば、脾辺縁帯リンパ腫)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、原発性中枢神経系(CNS)リンパ腫、原発性縦隔B細胞リンパ腫(PMBL)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、B細胞前リンパ球性白血病(B-PLL)、濾胞性リンパ腫(FL)、バーキットリンパ腫、原発性眼内リンパ腫、慢性リンパ球性白血病(CLL)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、有毛細胞白血病(HCL)、前駆Bリンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫(NHL)、高悪性度B細胞リンパ腫(HGBL)、及び多発性骨髄腫(MM)からなる群より選択される、請求項34に記載の方法。
- 前記疾患または前記障害が、自己免疫及び/または炎症性疾患である、請求項34に記載の方法。
- 前記自己免疫及び/または前記炎症性疾患が、不適切なまたは増加したB細胞数及び/または活性化と関連する、請求項40に記載の方法。
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