CN116964195A - 表达外源引入的细胞因子的工程化免疫效应细胞 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种免疫效应细胞，该免疫效应细胞表达：外源引入的IL‑12的p40亚基；外源引入的CCR7的配体(诸如CCL‑19和CCL‑21)；和功能性外源受体(诸如嵌合抗原受体)，该功能性外源受体包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。

Description

表达外源引入的细胞因子的工程化免疫效应细胞
1.相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年2月26日提交的国际专利申请号PCT/CN2021/078227的优先权权益，其内容通过援引以其全文并入本文。
2.序列表
本申请通过援引并入了与本申请一起提交的序列表，该序列表为文本格式，标题为“14651-039-228_SEQ_LISTING.txt”，创建于2022年2月18日，大小为145,395字节。
技术领域
本披露涉及包含功能性外源受体(诸如嵌合抗原受体)的多肽、工程化免疫效应细胞、及其使用方法。本披露进一步涉及用于治疗用途的细胞的活化和扩增，特别涉及基于嵌合抗原受体的T细胞免疫疗法。
背景技术
工程化免疫效应细胞的过继转移代表一种新兴的创新治疗策略。例如，用嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞诱导血癌患者产生有效的临床反应，证明了与常规疗法相比具有良好的预后。然而，体内存活效率低、内源免疫细胞活化不足、免疫抑制微环境、T细胞耗竭和难以浸润疾病组织是CAR-T细胞对某些疾病而言具有挑战性的常见原因。因此，本领域仍然需要改进的构建体或工程化免疫效应细胞，例如，CAR-T细胞，以治疗疾病或病症。
发明内容
在一方面，本文提供了一种免疫效应细胞，该免疫效应细胞表达：外源引入的IL-12的p40亚基；外源引入的CCR7的配体(例如CCL-19和CCL-21)；和功能性外源受体，该功能性外源受体包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，本文提供了一种免疫效应细胞，该免疫效应细胞表达：外源引入的IL-12的p40亚基；外源引入的CCL-19；和功能性外源受体，该功能性外源受体包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，本文提供了一种免疫效应细胞，该免疫效应细胞表达：外源引入的IL-12的p40亚基；外源引入的CCL-21；和功能性外源受体，该功能性外源受体包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，p40是人p40或其片段或变体。在一些实施例中，p40包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列。在其他实施例中，p40包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供的p40多肽是分泌的多肽。在一些实施例中，本文提供的p40多肽是膜结合的多肽(例如，MB12)。
在一些实施例中，CCL-19是人CCL-19或其片段或变体。在一些实施例中，CCL-19包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在其他实施例中，CCL-19包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，CCL-21是人CCL-21或其片段或变体。在一些实施例中，CCL-21包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在其他实施例中，CCL-21包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，功能性外源受体是T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、嵌合TCR(cTCR)、或T细胞抗原偶联物(TAC)样嵌合受体。在一些实施例中，功能性外源受体是CAR。
在一些实施例中，跨膜结构域源自选自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。在一些实施例中，跨膜结构域来自CD8α或CD28。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该初级胞内信号传导结构域来自CD3ζ。
在一些实施例中，该胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，该共刺激信号传导结构域源自共刺激分子，该共刺激分子选自由CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组。在一些实施例中，该共刺激信号传导结构域包含CD28的胞内结构域和/或CD137的胞内结构域。
在一些实施例中，功能性外源受体进一步包含位于胞外抗原结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，该铰链结构域来自CD8α。
在一些实施例中，功能性外源受体包含位于多肽的N末端的信号肽。在一些实施例中，该信号肽来自CD8α。
在一些实施例中，免疫效应细胞是T细胞。
在另一方面，本文提供了多肽，该多肽包含：外源引入的IL-12的p40亚基；外源引入的CCR7的配体(诸如CCL-19和CCL-21)；和功能性外源受体，该功能性外源受体包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，本文提供了多肽，该多肽包含：外源引入的IL-12的p40亚基；外源引入的CCL-19；和功能性外源受体，该功能性外源受体包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
在其他实施例中，本文提供了多肽，该多肽包含：外源引入的IL-12的p40亚基；外源引入的CCL-21；和功能性外源受体，该功能性外源受体包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，p40是人p40或其片段或变体。在一些实施例中，p40包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列。在其他实施例中，p40包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供的p40多肽是分泌的多肽。在一些实施例中，本文提供的p40多肽是膜结合的多肽(例如，MB12)。
在一些实施例中，CCL-19是人CCL-19或其片段或变体。在一些实施例中，CCL-19包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在其他实施例中，CCL-19包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，CCL-21是人CCL-21或其片段或变体。在一些实施例中，CCL-21包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在其他实施例中，CCL-21包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，功能性外源受体是T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、嵌合TCR(cTCR)、或T细胞抗原偶联物(TAC)样嵌合受体。在一些实施例中，功能性外源受体是CAR。
在一些实施例中，跨膜结构域源自选自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。在一些实施例中，跨膜结构域来自CD8α或CD28。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该初级胞内信号传导结构域来自CD3ζ。
在一些实施例中，该胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，该共刺激信号传导结构域源自共刺激分子，该共刺激分子选自由CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组。在一些实施例中，该共刺激信号传导结构域包含CD28的胞内结构域和/或CD137的胞内结构域。
在一些实施例中，功能性外源受体包含位于胞外抗原结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，该铰链结构域来自CD8α。
在一些实施例中，功能性外源受体进一步包含位于多肽的N末端的信号肽。在一些实施例中，该信号肽来自CD8α。
在一些实施例中，p40、CCL-19和功能性外源受体通过肽接头彼此连接。在一些实施例中，p40、CCL-21和功能性外源受体通过肽接头彼此连接。在一些实施例中，该肽接头为2A自切割肽，该2A自切割肽任选地选自由F2A、E2A、P2A、T2A或其变体组成的组。在一些特定实施例中，该2A自切割肽是包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的P2A片段。在一些特定实施例中，该2A自切割肽是包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的T2A片段。
在一些实施例中，p40和CCL-19存在于包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的结构域中。在其他实施例中，p40和CCL-19存在于结构域中，该结构域包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，p40和CCL-21存在于包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的结构域中。在其他实施例中，p40和CCL-21存在于结构域中，该结构域包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在又一方面，本文提供了一种分离的核酸，该分离的核酸包含编码本文提供的多肽的核酸序列。
在又一方面，本文提供了一种分离的核酸，该分离的核酸包含：编码外源引入的IL-12的p40亚基的第一区；编码外源引入的CCR7的配体(诸如CCL-19和CCL-21)的第二区；以及编码功能性外源受体的第三区，该功能性外源受体包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。在一些实施例中，CCR7的配体是CCL-19。在其他实施例中，CCR7的配体是CCL-21。
在又一方面，本文提供了一种包含本文提供的分离的核酸的载体。
在又一方面，本文提供了一种制备免疫效应细胞的方法，该方法包括向免疫细胞中引入：(i)本文提供的核酸或载体；或(ii)包含两种或更多种核酸的组合物，该两种或更多种核酸各自编码如下项中的一项或两项：IL-12的p40亚基、CCL-19；和功能性外源受体，或包含两种或更多种核酸的组合物，该两种或更多种核酸各自编码如下项中的一项或两项：IL-12的p40亚基、CCL-21；和功能性外源受体。
在另一方面，本文提供了一种根据本文提供的方法产生的免疫效应细胞。
在又一方面，本文提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本文提供的免疫效应细胞、多肽、核酸、或载体，以及药学上可接受的载剂。
在又一方面，本文提供了一种治疗受试者疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文提供的药物组合物。
附图说明
图1显示了H93 CAR、H93M CAR、和H93P CAR的结构。SP是指信号肽。TM是指跨膜结构域。TAA结合蛋白是指肿瘤相关抗原的抗原结合结构域或结合蛋白(即抗GPC3 scFv)。
图2显示了表达人源化抗GPC3 scFv CAR的H93 CAR-T细胞和H93M CAR-T细胞的阳性率。UnT是指未用CAR转导的T细胞。
图3A-3B显示了在正常条件(RPMI-1640+300IU/mL IL-2)下培养的CAR-T细胞的IL-23(图3A)和CCL-19(图3B)蛋白的产生。
图4A-4B显示了在再攻击测定中CAR-T细胞的扩增。每2天用PLC/PRF/5细胞以1:1E/T比率刺激细胞过夜。在每轮结束时记录T细胞的扩增倍数(图4A)和活力(图4B)。
图5A-5C显示了在再攻击测定中在用不同刺激轮数处理后在1:1E/T比率下CAR-T细胞针对GPC3阳性细胞系的体外细胞毒性(图5A)、TNF-α释放水平(图5B)和IFN-γ释放水平(图5C)。
图6显示了在再攻击测定中在用不同刺激轮数处理后CAR-T细胞的阳性率。
图7A-7D显示了在再攻击测定中在每个刺激轮次后24小时CAR-T细胞中PD-1(图7A和图7B)和LAG3(图7C和图7D)的表达。
图8A-8B显示了通过96孔transwell小室进行的CAR-T细胞的细胞迁移测定。将不同的CAR-T细胞与PLC/PRF/5细胞以1:1E/F比率共培养30小时，收集细胞培养上清液并添加到下室。对4、6、8小时后从上室迁移的下室的T细胞数(图8A)，以及共培养上清液中CCL-19的浓度(图8B)进行定量。
图9A-9D显示了CAR-T细胞在NCG小鼠异种移植模型中的抗肿瘤作用。向NCG小鼠皮下接种Huh7细胞，并用0.2M剂量和0.6M剂量的CAR-T细胞处理(i.v.)(n＝4只小鼠每组)。评估肿瘤体积(图9A和图9B)和NCG小鼠外周血的基因组DNA中的CAR拷贝数(图9C和图9D)。
图10A-10B显示了在NCG小鼠异种移植模型中，用0.2M(图10A)和0.6M(图10B)剂量的CAR-T细胞处理的小鼠(n＝4只小鼠每组)的体重变化。
图11A-11D显示了在用0.2M或0.6M剂量的CAR-T细胞处理后NCG小鼠外周血中IL-23蛋白(图11A和图11B)和IFN-γ蛋白(图11C和图11D)的水平(n＝3只小鼠每组)。
图12显示了在NCG小鼠异种移植模型中在动物实验终点(n＝3)用0.2M UnT、H93CAR-T细胞或H93M CAR-T细胞处理的小鼠的肿瘤组织中T细胞的浸润情况。肿瘤组织用福尔马林固定，包埋在石蜡中并用于免疫组织化学(IHC)以检测用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)染色的T细胞的浸润情况。通过3D HISTECH(DRNJIER)获得图像。右列显示了黑色矩形的放大区域。
图13显示了在NCG小鼠异种移植模型中用0.2M UnT、H93 CAR-T细胞或H93M CAR-T细胞处理后，小鼠巨噬细胞和小鼠树突状细胞在肿瘤组织中的募集情况。在动物实验的终点，肿瘤组织用福尔马林固定，包埋在石蜡中并用于免疫组织化学(IHC)。用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)染色具有CD68的巨噬细胞(左列)和具有CD11c的树突状细胞(右列)。通过3DHISTECH(DRNJIER)获得图像。
图14显示了表达人源化抗GPC3 scFv CAR的H93 CAR-T细胞、H93M CAR-T细胞和H93P CAR-T细胞的阳性率。
图15A-15B显示了再攻击测定的结果。在每一轮结束时记录CAR-T细胞的扩增倍数(图15A)。图15B显示了在再攻击测定中，在用不同刺激轮数处理后，在总T细胞与靶细胞的比率为1:2的情况下，CAR-T细胞针对GPC3阳性细胞系的体外细胞毒性。
图16显示了通过96孔transwell小室进行的CAR-T细胞的细胞迁移测定。将不同的CAR-T细胞与PLC/PRF/5细胞以1:1E/T比率共培养30小时，收集细胞培养上清液并添加到下室。对2、4和6小时后从上室迁移的下室的T细胞数量进行定量。
图17A-17B显示了CAR-T细胞在NCG小鼠异种移植模型中的抗肿瘤作用。向NCG小鼠皮下接种GPC3+Hep3B细胞，并输注两种剂量的CAR-T细胞：0.3M CAR+T细胞/小鼠和0.8MCAR+T细胞/小鼠(i.v.)(n＝4只小鼠每组)。
图18A-18C显示了CAR-T细胞在NCG小鼠异种移植模型中的抗肿瘤作用。向NCG小鼠皮下接种Hep3B细胞，并用0.3M剂量的H93 CAR-T细胞、H93M CAR-T细胞，H93IL12p40 CAR-T细胞或H93CCL19 CAR-T细胞处理(i.v.)(n＝4只小鼠每组)。评估肿瘤体积(图18A)、NCG小鼠外周血中的CD3阳性细胞率(图18B)和体重(图18C)。
图19A-19D显示了CAR-T细胞在C57BL/6小鼠异种移植模型中的抗肿瘤作用。向C57BL/6小鼠皮下接种LL/2-hGPC3细胞，并分别用10M、6M、6M和6M剂量的musH93 CAR-T细胞、musH93M CAR-T细胞、musH93IL12p40 CAR-T细胞和musH93CCL19 CAR-T细胞处理(i.v.)(n＝5只小鼠每组)。评估肿瘤体积(图19A)、C57BL/6小鼠外周血中CAR+CD3+的比率(图19B)和体重(图19C)，并计算存活百分比(％)(图19D)。
图20A-20B显示了261CAR-T细胞和261M CAR-T细胞在与CLDN18.2+NUGC4细胞共培养过夜后IL-23(图20A)和CCL-19(图20B)蛋白的产生。
图21A-21C显示了261CAR-T细胞和261M CAR-T细胞的再攻击测定的结果。CAR-T细胞在传统条件下(10％1640+300IU IL-2)(图21A)和在再攻击测定中(图21B)的扩增倍数的比较表明，261M CAR-T细胞经NUGC4细胞多次攻击后显示抗原依赖性扩增。图21C显示了在再攻击测定中在用多个刺激轮数处理后CAR-T细胞的细胞活力。
图22A-22D显示了261CAR-T细胞和261M CAR-T细胞在NCG小鼠异种移植模型中的抗肿瘤作用。向NCG小鼠皮下接种NUGC4细胞，并用0.5M剂量的CAR-T细胞处理(i.v.)(n＝4只小鼠每组)。评估肿瘤体积(图22A和B)、NCG小鼠外周血中CD3阳性细胞的比率(图22C)和体重(图22D)。
图23A-23B显示了mus261M CAR-T细胞和mus261-719 CAR-T细胞在C57BL/6小鼠异种移植模型中的抗肿瘤作用。向C57BL/6小鼠皮下接种LL/2-hCLDN18.2细胞，并用10M剂量的小鼠CAR-T细胞处理(i.v.)(n＝4只小鼠每组)。评估肿瘤体积(图23A)和体重(图23B)。
图24A-24B显示了H93 CAR-T细胞、H93M CAR-T细胞和H93M-MB12CAR-T细胞的CAR阳性率(图24A)和IL12p40阳性率(图24B)。
图25A-25B显示了用抗CD3/CD28珠刺激过夜后H93 CAR-T细胞、H93M CAR-T细胞和H93M-MB12 CAR-T细胞的IL12p40(图25A)、IL-23(图25B)、CCL-19(图25C)、IL-12(图25D)蛋白的产生。
图26A-26B显示了通过96孔transwell小室进行的H93 CAR-T细胞、H93M CAR-T细胞和H93M-MB12 CAR-T细胞的细胞迁移测定。将不同的CAR-T细胞与PLC/PRF/5细胞以1:1E/F比率共培养24小时，收集细胞培养上清液并添加到下室。对2、4、6小时后从上室迁移的下室的T细胞数(图26A)，以及共培养上清液中CCL-19的浓度(图26B)进行定量。
图27A-27C显示了H93 CAR-T细胞、H93M CAR-T细胞和H93M-MB12CAR-T细胞的再攻击测定的结果。图27A和图27B显示了CAR-T细胞在传统条件下(10％1640+300IU IL-2)和在再攻击测定中的扩增倍数。图27C显示了在再攻击测定中在用多个刺激轮数处理后CAR-T细胞的CAR阳性变化。
图28A-28B显示了在再攻击测定中在用不同刺激轮数处理后，H93CAR-T细胞、H93MCAR-T细胞和H93M-MB12 CAR-T细胞的体外细胞因子分泌、TNF-α释放水平(图28A)和IFN-γ释放水平(图28B)。
具体实施方式
本披露部分基于令人惊讶的发现，即表达一种或多种功能性外源受体(诸如CAR)和外源引入的p40和CCR7配体(诸如CCL-19和CCL-21)的工程化免疫细胞的功能和性质得到了改善。
7.1.定义
本文描述或参考的技术和程序包括本领域技术人员使用常规方法总体上很好地理解和/或通常采用的那些，例如像，在以下中描述的广泛使用的方法：Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版2001)；Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人编辑,2003)；Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic(An编辑2009)；Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols(Albitar编辑2010)；和Antibody Engineering第1卷和第2卷(Kontermann和Dübel编辑,第2版2010)。除非本文另外定义，否则，本发明中使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下对术语的描述，并且在任何适当的时候，以单数形式使用的术语也将包括复数，反之亦然。在所陈述的术语的任何描述与通过援引并入本文的任何文献冲突的情况下，应以下文所陈述的术语的描述为准。
术语“抗体”、“免疫球蛋白”或“Ig”在本文中可互换使用，并以最广泛的含义使用，并且特别涵盖例如单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长或完整单克隆抗体)、具有多表位或单表位特异性的抗体组合物、多克隆或单价抗体、多价抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们表现出所需的生物活性)、单链抗体、单域抗体(例如，VHH)及其片段(例如，结构域抗体)。抗体可以是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和/或亲和力成熟抗体，以及来自其他物种(例如，小鼠、兔、美洲驼等)的抗体。术语“抗体”旨在包括免疫球蛋白类多肽中的B细胞的多肽产物，其能够结合特定分子抗原并且由两对相同的多肽链组成，其中每对多肽链具有一条重链(约50-70kDa)和一条轻链(约25kDa)，每条链的每个氨基末端部分包括约100至约130或更多个氨基酸的可变区，并且每条链的每个羧基末端部分包括恒定区。参见例如，Antibody Engineering(Borrebaeck编辑,第2版1995)；以及Kuby,Immunology(第3版1997)。抗体还包括但不限于合成抗体、重组产生的抗体、包括来自骆驼科物种(例如，美洲驼或羊驼)的单域抗体或它们的人源化变体、内抗体、抗独特型(抗Id)抗体，以及上述任一种的功能片段(例如抗原结合片段)，这些功能片段是指抗体重链或轻链多肽的一部分，其保留了该片段所来源的抗体的一些或全部结合活性。功能片段(例如，抗原结合片段)的非限制性实例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性、双特异性等)、Fab片段、F(ab')片段、F(ab)2片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和微型抗体。特别地，本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如，抗原结合结构域或含有结合抗原的抗原结合位点的分子(例如，抗体的一个或多个CDR)。此类抗体片段可见于例如Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(1989)；Mol.Biology and Biotechnology:AComprehensive Desk Reference(Myers编辑,1995)；Huston等人,1993,CellBiophysics22:189-224；Plückthun和Skerra,1989,Meth.Enzymol.178:497-515；以及Day,Advanced Immunochemistry(第2版,1990)。本文提供的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。抗体可以是激动性抗体或拮抗性抗体。抗体可以既不是激动性的也不是拮抗性的。
“抗原”是抗体可以选择性结合的结构。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在的或合成的化合物。在一些实施例中，靶抗原是多肽。在某些实施例中，抗原与细胞相关，例如，存在于细胞上或细胞中。
“完整”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定区CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可以包括人恒定区或其氨基酸序列变体。在某些实施例中，完整抗体具有一种或多种效应子功能。
“单链Fv”(也缩写为“sFv”或“scFv”)是包含连接到单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽进一步包含在VH与VL结构域之间的多肽接头，该多肽接头使得sFv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
如本文所用，“单域抗体”或“sdAb”是指单个单体可变抗体结构域并且能够结合抗原。单域抗体包括如本文所述的VHH结构域。单域抗体的实例包括但不限于天然缺乏轻链的抗体，例如来自骆驼科物种(例如，美洲驼)的抗体、源自常规4链抗体的单域抗体、工程化抗体和除源自抗体的那些以外的单域支架。单域抗体可源自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。例如，如本文所述，单域抗体可以源自骆驼科物种，例如骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼和原驼中产生的抗体。除骆驼科外的其他物种可产生天然缺乏轻链的重链抗体；源自这类其他物种的VHH在本披露的范围内。在一些实施例中，本文提供的单域抗体(例如，VHH)具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的结构。单域抗体可以与如本文所述的另一种分子(例如，剂)进行基因融合或化学缀合。单域抗体可能是较大的结合分子(例如，多特异性抗体或嵌合抗原受体)的一部分。
术语“结合(binds或binding)”是指分子之间的相互作用，包括例如形成复合物。相互作用可以是例如非共价相互作用，包括氢键、离子键、疏水相互作用和/或范德华相互作用(van der Waals interactions)。复合物还可以包括通过共价或非共价键、相互作用或力结合在一起的两个或更多个分子的结合。抗体上的单个抗原结合位点与靶分子(诸如抗原)的单个表位之间的总非共价相互作用的强度是抗体或功能片段对该表位的亲和力。结合分子(例如，抗体)与单价抗原的解离速率(koff)与缔合速率(kon)的比率(koff/kon)是解离常数KD，它与亲和力成反比。KD值越低，抗体的亲和力越高。KD值因抗体和抗原的不同复合物而异，并且取决于kon和koff。本文提供的抗体的解离常数KD可以使用本文提供的任何方法或本领域技术人员熟知的任何其他方法来确定。在一个结合位点处的亲和力并不总是反映抗体与抗原之间相互作用的真实强度。当含有多个重复抗原决定簇的复合抗原(诸如多价抗原)与含有多个结合位点的抗体接触时，抗体与抗原在一个位点处的相互作用将增加在第二个位点处发生反应的可能性。多价抗体与抗原之间的这种多重相互作用的强度称为亲合力。
关于本文所述的结合分子，术语诸如“结合”、“特异性结合”和类似术语在本文中也可互换使用，并且是指特异性结合抗原(诸如多肽)的抗原结合结构域的结合分子。结合或特异性结合抗原的结合分子或抗原结合结构域可以例如通过免疫测定、或本领域技术人员已知的其他技术来鉴定。在一些实施例中，当结合分子或抗原结合结构域以比结合任何交叉反应性抗原更高的亲和力结合抗原时，结合分子或抗原结合结构域结合或特异性结合抗原，如使用实验技术诸如放射免疫测定法(RIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)所测定的。典型地，特异性或选择性反应将至少为背景信号或噪声的两倍，并且可以是背景的10倍以上。参见例如，Fundamental Immunology 332-36(Paul编辑,第2版1989)关于结合特异性的讨论。在某些实施例中，结合分子或抗原结合结构域与“非靶”蛋白的结合程度小于结合分子或抗原结合结构域与其特定靶抗原的结合的约10％，例如，如通过FACS分析或RIA所测定的。结合抗原的结合分子或抗原结合结构域包括能够以足够的亲和力结合抗原以使得结合分子可用作例如靶向抗原的治疗剂和/或诊断剂的结合分子或抗原结合结构域。在某些实施例中，结合抗原的结合分子或抗原结合结构域具有小于或等于1μM、800nM、600nM、550nM、500nM、300nM、250nM、100nM、50nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM的解离常数(KD)。在某些实施例中，结合分子或抗原结合结构域结合来自不同物种的抗原中保守的抗原表位。
在某些实施例中，结合分子或抗原结合结构域可以包含“嵌合”序列，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出所需的生物活性(参见美国专利号4,816,567和Morrison等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-55)。嵌合序列可以包括人源化序列。
在某些实施例中，结合分子或抗原结合结构域可以包含非人(例如，骆驼科动物、鼠、非人灵长类动物)抗体的“人源化”形式的部分，这些非人抗体包括来自人免疫球蛋白(例如，受体抗体)的序列，其中天然CDR残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(例如，供体抗体)诸如骆驼科动物、小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的相应CDR的残基取代。在一些情况下，人免疫球蛋白序列的一个或多个FR区残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。人源化抗体重链或轻链可以包含基本上所有的至少一个或多个可变区，其中所有或基本上所有的CDR对应于非人免疫球蛋白的CDR，并且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。在某些实施例中，人源化抗体将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。关于进一步细节，参见Jones等人,Nature321:522-25(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-29(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-96(1992)；Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285-89(1992)；美国专利号：6,800,738、6,719,971、6,639,055、6,407,213、以及6,054,297。
在某些实施例中，结合分子或抗原结合结构域可以包含“完全人抗体”或“人抗体”的部分，其中这些术语在本文中可互换使用并且是指包含人可变区和例如人恒定区的抗体。结合分子可以包含单域抗体序列。在特定实施例中，该术语是指包含人来源的可变区和恒定区的抗体。在某些实施例中，“完全人”抗体还可以涵盖结合多肽并且由核酸序列编码的抗体，这些核酸序列是人种系免疫球蛋白核酸序列的天然存在的体细胞变体。术语“完全人抗体”包括具有对应于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体，如Kabat等人(参见Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开号91-3242)描述的。“人抗体”是这样一种抗体，其具有对应于由人类产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列和/或已经使用任何用于制造人抗体的技术来产生。人抗体的此定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术产生人抗体，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581(1991))和酵母展示文库(Chao等人,Nature Protocols 1:755-68(2006))。此外，Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77(1985)；Boerner等人,J.Immunol.147(1):86-95(1991)；以及van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)中描述的方法也可用于制备人单克隆抗体。人抗体可以通过将抗原施用至已被修饰以响应抗原攻击而产生此类抗体但其内源基因座已失效的转基因动物(例如，小鼠)来制备(参见例如，Jakobovits,Curr.Opin.Biotechnol.6(5):561-66(1995)；Brüggemann和Taussing,Curr.Opin.Biotechnol.8(4):455-58(1997)；以及关于XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584)。关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体，还参见例如Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:3557-62(2006)。
在某些实施例中，结合分子或抗原结合结构域可以包含“重组人抗体”的部分，其中该短语包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的人抗体，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组的组合人抗体文库中分离的抗体、从对于人免疫球蛋白基因是转基因的和/或转染色体的动物(例如，小鼠或牛)中分离的抗体(参见例如,Taylor,L.D.等人,Nucl.Acids Res.20:6287-6295(1992))或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体可以具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(参见Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department ofHealth and Human Services,NIH公开号91-3242)。然而，在某些实施例中，对此类重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列：它们虽然源自人种系VH和VL序列并与其相关，但在体内可能不天然存在于人抗体种系库中。
在某些实施例中，结合分子或抗原结合结构域可以包含“单克隆抗体”的一部分，其中如本文所用的术语是指从基本上同质的抗体的群体中获得的抗体，例如，除了可能以少量存在的可能的天然存在的突变或熟知的翻译后修饰(诸如氨基酸异构化或脱酰胺、甲硫氨酸氧化或者天冬酰胺或谷氨酰胺脱酰胺)之外，构成该群体的各个抗体是相同的，每种单克隆抗体通常将识别抗原上的单个表位。在特定实施例中，如本文所用的“单克隆抗体”是由单个杂交瘤或其他细胞产生的抗体。术语“单克隆”不限于用于制备抗体的任何特定方法。例如，可用于本披露的单克隆抗体可以通过由Kohler等人,Nature 256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以使用重组DNA方法在细菌或真核动物或植物细胞中制备(参见例如，美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson等人,Nature352:624-28(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-97(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离出来。制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其他方法是本领域熟知的。参见例如，Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑,第5版,2002)。
典型的4-链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。在IgG的情况下，4-链单元通常为约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键连接到H链，而两条H链根据H链同种型通过一个或多个二硫键彼此连接。每条H链和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条H链在N末端处具有一个可变结构域(VH)，对于α链和γ链中的每一个，其后面是三个恒定结构域(CH)，而对于μ同种型和ε同种型，其后面是四个CH结构域。每条L链在N末端处具有一个可变结构域(VL)，在其另一端处具有一个恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别抗体的结构和性质，参见例如Basic and Clinical Immunology 71(Stites等人编辑,第8版,1994)和Immunobiology(Janeway等人编辑,第5版,2001)。
术语“Fab”或“Fab区”是指结合抗原的抗体区。常规的IgG通常包含两个Fab区，每个Fab区位于Y形IgG结构的两个臂之一上。每个Fab区通常由重链和轻链各自的一个可变区和一个恒定区组成。更特别而言，Fab区中重链的可变区和恒定区是VH区和CH1区，并且Fab区中轻链的可变区和恒定区是VL区和CL区。Fab区中的VH、CH1、VL和CL可以按各种方式排列以赋予根据本披露的抗原结合能力。例如，VH区和CH1区可以在一个多肽上，并且VL区和CL区可以在单独的多肽上，类似于常规IgG的Fab区。替代性地，VH区、CH1区、VL区和CL区可以都在相同的多肽上，并且以不同的顺序定向，如下文部分中更详细描述的。
术语“可变区”、“可变结构域”、“V区”或“V结构域”是指抗体的轻链或重链的一部分，其通常位于轻链或重链的氨基末端，并且具有在重链中约120至130个氨基酸和在轻链中约100至110个氨基酸的长度，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。重链的可变区可以称为“VH”。轻链的可变区可以称为“VL”。术语“可变”是指抗体中可变区的某些区段在序列上存在很大不同的事实。V区介导抗原结合并定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性并不是均匀分布在可变区的110个氨基酸范围内。而是，V区由约15-30个氨基酸的称为框架区(FR)的变化较小(例如，相对不变)的区段组成，这些区段由每个为约9-12个氨基酸长的称为“高变区”的变化较大(例如，极端变化)的较短区域隔开。重链和轻链的可变区各自包含主要采用β折叠构型的四个FR，它们通过三个高变区连接，这三个高变区形成环连接，并且在一些情况下形成β折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密靠近地结合在一起，并且与来自另一条链的高变区一起，有助于形成抗体的抗原结合位点(参见例如，Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版,1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。不同抗体之间的可变区在序列上存在很大不同。在特定实施例中，可变区是人可变区。
术语“根据Kabat的可变区残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变型是指上述Kabat等人中用于抗体汇编的重链可变区或轻链可变区的编号系统。使用这个编号系统，实际线性氨基酸序列可以含有对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入的更少的或另外的氨基酸。例如，重链可变结构域可以包含在残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)以及在残基82之后的三个插入残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可以通过在抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源性区域进行比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。当提及可变结构域中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用kabat编号系统(例如，上述Kabat等人)。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如，上述Kabat等人报道的EU索引)。“Kabat中的EU索引”是指人IgG 1EU抗体的残基编号。其他编号系统已例如由AbM、Chothia、Contact、IMGT和AHon描述。
当用于提及抗体时，术语“重链”是指约50-70kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约120至130或更多个氨基酸的可变区，羧基末端部分包括恒定区。基于重链恒定区的氨基酸序列，恒定区可以是被称为阿尔法(α)、德尔塔(δ)、艾普斯龙(ε)、伽马(γ)和缪(μ)的五种不同类型(例如同种型)中的一种。不同的重链大小不同：α、δ和γ含有约450个氨基酸，而μ和ε含有约550个氨基酸。当与轻链组合时，这些不同类型的重链分别产生五个熟知类别(例如同种型)的抗体，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG的四个亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
当用于提及抗体时，术语“轻链”是指约25kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约100至约110或更多个氨基酸的可变区，羧基末端部分包括恒定区。轻链的大致长度为211至217个氨基酸。基于恒定结构域的氨基酸序列，存在两种不同类型，称为卡帕(κ)或兰布达(λ)。
如本文所用，术语“高变区”、“HVR”、“互补决定区”和“CDR”可互换使用。“CDR”是指免疫球蛋白(Ig或抗体)VHβ-折叠框架的非框架区内的三个高变区(H1、H2或H3)之一，或抗体VLβ-折叠框架的非框架区内的三个高变区(L1、L2或L3)之一。VH结构域中的CDR1、CDR2和CDR3也分别称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。VL结构域中的CDR1、CDR2和CDR3也分别称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。因此，CDR是散布在框架区序列内的可变区序列。
CDR区是本领域技术人员熟知的，并且已由熟知的编号系统定义。例如，Kabat互补决定区(CDR)基于序列可变性并且是最常用的(参见例如上述Kabat等人；Nick Deschacht等人,J Immunol 2010；184:5696-5704)。Chothia代之以指结构环的位置(参见例如Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-17(1987))。当使用Kabat编号规则编号时，ChothiaCDR-H1环的末端在H32与H34之间变化，这取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案将插入置于H35A和H35B处；如果35A和35B都不存在，则环在32处结束；如果只有35A存在，则环在33处结束；如果35A和35B都存在，则环在34处结束)。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折中，并且被Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用(参见例如AntibodyEngineering第2卷(Kontermann和Dübel编辑,第2版,2010))。“接触”高变区基于对可用复杂晶体结构的分析。已经开发并广泛采用的另一种通用编号系统是ImMunoGeneTics(IMGT)Information(Lafranc等人,Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77(2003))。IMGT是专门研究人和其他脊椎动物的免疫球蛋白(IG)、T细胞受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHC)的综合信息系统。在本文中，CDR是指轻链或重链内的氨基酸序列和位置。由于CDR在免疫球蛋白可变结构域的结构内的“位置”在物种之间是保守的并且存在于称为环的结构中，通过使用根据结构特征比对可变结构域序列的编号系统，很容易识别CDR和框架残基。该信息可用于将来自一个物种的免疫球蛋白的CDR残基移植和替换到通常来自人抗体的接受者框架中。Honegger和Plückthun,J.Mol.Biol.309:657-70(2001)开发了另外的编号系统(AHon)。包括例如Kabat编号和IMGT独特编号系统在内的编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(参见例如上述Kabat；上述Chothia和Lesk；上述Martin；上述Lefranc等人)。来自这些高变区或CDR中的每一个的残基在下表1中举例说明。
表1.根据各种编号系统的示例性CDR
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给定CDR的边界可以根据用于识别的方案而有所不同。因此，除非另有说明，否则术语给定抗体或其区(诸如可变区)的“CDR”和“互补决定区”以及抗体或其区的各个CDR(例如CDR-H1、CDR-H2)应理解为涵盖如上文所述的任何已知方案所定义的互补决定区。在一些情况下，指定用于识别一个或多个特定CDR的方案，例如通过IMGT、Kabat、Chothia或Contact方法定义的CDR。在其他情况下，给出了CDR的特定氨基酸序列。应当注意的是，CDR区也可以通过各种编号系统的组合来定义，例如Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。因此，术语诸如“如特定VH或VHH中阐述的CDR”包括由上述示例性CDR编号系统定义的任何CDR1，但不限于此。一旦给出可变区(例如，VHH、VH或VL)，本领域技术人员将理解该区内的CDR可以通过不同的编号系统或其组合来定义。
高变区可包括如下“扩展的高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)以及89-97或89-96(L3)，以及VH中的26-35或26-35A(H1)、50-65或49-65(H2)以及93-102、94-102或95-102(H3)。
术语“恒定区”或“恒定结构域”是指轻链和重链的羧基末端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应子功能，例如与Fc受体的相互作用。该术语是指免疫球蛋白分子的一部分，该免疫球蛋白分子的一部分相对于免疫球蛋白的另一部分，即可变区，具有更保守的氨基酸序列，该氨基酸序列含有抗原结合位点。恒定区可以含有重链的CH1、CH2和CH3区以及轻链的CL区。
术语“框架”或“FR”是指那些位于CDR两侧的可变区残基。FR残基存在于例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、结构域抗体(例如，单域抗体)、双抗体、线性抗体和双特异性抗体中。FR残基是高变区残基或CDR残基之外的那些可变结构域残基。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，包括例如天然序列Fc区、重组Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链Fc区的边界可能不同，但人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或Pro230位置的氨基酸残基延伸到其羧基末端。可以例如抗体的生产或纯化期间或通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程化来去除Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)。因此，完整抗体的组合物可以包含去除了所有K447残基的抗体群体，没有去除K447残基的抗体群体以及具有带有和不带有K447残基的抗体混合物的抗体群体。“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括C1q结合、CDC、Fc受体结合、ADCC、吞噬作用、细胞表面受体(例如，B细胞受体)下调等。此类效应子功能通常需要将Fc区与结合区或结合结构域(例如，抗体可变区或结构域)组合，并且可以使用本领域技术人员已知的各种测定法来评估。“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰(例如取代、添加或缺失)而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。在某些实施例中，变体Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸取代，例如，在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中约一至约十个氨基酸取代，或约一至约五个氨基酸取代。本文的变体Fc区可以与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区具有至少约80％的同源性，或与其具有至少约90％的同源性，例如与其具有至少约95％的同源性。
如本文所用，“表位”是本领域中的术语，并且是指结合分子(例如，包含单链抗体序列的抗体)可以特异性结合的抗原的局部区域。表位可以是线性表位或构象、非线性或不连续表位。在多肽抗原的情况下，例如，表位可以是多肽的连续氨基酸(“线性”表位)，或者表位可以包含来自多肽的两个或更多个非连续区域的氨基酸(“构象”、“非线性”或“不连续”表位)。本领域技术人员将理解，一般来讲，线性表位可以依赖于或不依赖于二级、三级或四级结构。例如，在一些实施例中，结合分子与一组氨基酸结合，而不管它们是否折叠成天然三维蛋白结构。在其他实施例中，结合分子需要构成表位的氨基酸残基以表现出特定构象(例如，弯曲、扭曲、转弯或折叠)以识别和结合表位。
关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”及“同源性”定义为在比对序列及必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比后且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分时，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。可根据所属领域技能内的多种方式，使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件，实现比对，以确定氨基酸序列同一性百分比。本领域技术人员可确定用于量测比对的适当参数，包括实现所比较的全长序列上的最大比对所需的任何算法。
如本文所用，术语“功能性外源受体”是指在引入免疫效应细胞(诸如T细胞)后保留其生物活性的外源受体(例如TCR，诸如重组或工程化TCR、cTCR、TAC样嵌合受体或CAR)。生物活性包括但不限于外源受体特异性结合分子、适当转导下游信号，诸如诱导细胞增殖、细胞因子产生和/或调节性或溶细胞效应子功能的执行的能力。
如本文所用，“嵌合抗原受体”或“CAR”是指可用于将一种或多种抗原特异性移植到免疫效应细胞诸如T细胞上的基因工程化受体。一些CAR也被称为“人工T细胞受体”、“嵌合T细胞受体”或“嵌合免疫受体”。在一些实施例中，CAR包含对一种或多种抗原(诸如肿瘤抗原)特异的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和T细胞和/或其他受体的胞内信号传导结构域。“CAR-T细胞”或“CAR-T”是指表达CAR的T细胞。
如本文所用的术语“重组或工程化TCR”作为本文提供的一种功能性外源受体包括在内，并且是指在免疫细胞中表达的肽。重组或工程化TCR的功能可以包括例如重定向免疫细胞针对所需类型细胞的免疫活性，这些细胞诸如表面具有特定标记的癌症细胞和感染细胞。它可以取代内源TCR或与内源TCR共表达。在一些实施例中，此类重组TCR是包含开放阅读框的单链TCR，其中可变Vα和Vβ结构域与蛋白质接头配对。这涉及到已知对所选择的抗原具有特异性的TCR基因的分子克隆。然后通常通过逆转录病毒载体将这些链引入T细胞。因此，克隆的TCRα和TCRβ基因的表达赋予转导的T细胞由这些新基因的配对确定的功能特异性。重组或工程化TCR的组分是TCR的任何功能亚基，如重组TCRα和TCRβ，由引入细胞中的外源多核苷酸序列编码。
在一些实施例中，本文提供的功能性外源受体是嵌合TCR(cTCR)，其同时具有抗原结合功能和T细胞活化功能。例如，cTCR可以包含：(a)胞外配体结合结构域，该胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如，GPC3、密蛋白18.2)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如，sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如，CD3ε)的任选的胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如，CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如，CD3ε)的胞内信号传导结构域的胞内信号传导结构域；其中第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施例中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的(例如，全都是CD3ε)。在一些实施例中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。在一些实施例中，cTCR进一步包含位于胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，该铰链结构域源自CD8α。在一些实施例中，cTCR进一步包含位于cTCR的N末端处的信号肽，诸如源自CD8α的信号肽。
在一些实施例中，功能性外源受体是T细胞抗原偶联物(TAC)，例如，包含：(a)胞外配体结合结构域，该胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如，GPC3、密蛋白18.2)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如，sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如，CD3ε)的胞外结构域的胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如，CD4)的任选的胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如，CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)包含第三TCR共受体(例如，CD4)的胞内信号传导结构域的任选的胞内信号传导结构域；其中该TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组。在一些实施例中，第一、第二和第三TCR共受体是相同的。在一些实施例中，第一、第二和第三TCR共受体是不同的。在一些实施例中，TAC进一步包含位于胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，该铰链结构域源自CD8α。在一些实施例中，TAC进一步包含位于TAC的N末端处的信号肽，诸如源自CD8α的信号肽。在一些实施例中，胞外配体结合结构域在胞外TCR结合结构域的N末端处。在一些实施例中，胞外配体结合结构域在胞外TCR结合结构域的C末端处。
在一些实施例中，功能性外源受体是TAC样嵌合受体，例如，包含：(a)胞外配体结合结构域，该胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如，GPC3、密蛋白18.2)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如，sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如，TCRα)的胞外结构域的胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如，CD3ε)的任选的胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如，CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)包含第四TCR亚基(例如，CD3ε)的胞内信号传导结构域的任选的胞内信号传导结构域；其中第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施例中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施例中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施例中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是不同的。在一些实施例中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的，但不同于第一TCR亚基。在一些实施例中，胞外配体结合结构域在胞外TCR结合结构域的N末端处。在一些实施例中，胞外配体结合结构域在胞外TCR结合结构域的C末端处。在一些实施例中，TAC样嵌合受体进一步包含位于胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，该铰链结构域源自CD8α。在一些实施例中，TAC样嵌合受体进一步包含位于TAC样嵌合受体的N末端处的信号肽，诸如源自CD8α的信号肽。
术语“多肽”和“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已被天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，形成二硫键、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵或修饰。该定义还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括但不限于非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。应当理解，由于本披露的多肽可以基于抗体或免疫球蛋白超家族的其他成员，因此在某些实施例中，“多肽”可以作为单链或作为两条或更多条相关链存在。
如在本文中可互换使用的，“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸及其类似物。如本文所用，“寡核苷酸”是指短的、通常单链的、合成的多核苷酸，其长度通常(但不一定)小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。产生本披露的结合分子的细胞可以包括亲本杂交瘤细胞，以及已经将编码抗体的核酸引入其中的细菌和真核宿主细胞。除非另有说明，否则本文披露的任何单链多核苷酸序列的左侧末端是5'端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5'方向。新生RNA转录物的5'至3'添加的方向称为转录方向；DNA链上具有与RNA转录物相同序列的在RNA转录物的5'至5'端的序列区域称为“上游序列”；DNA链上具有与RNA转录物相同序列的在RNA转录物的3'至3'端的序列区域称为“下游序列”。
“分离的核酸”是这样的核酸(例如RNA、DNA或混合核酸)：其基本上与天然伴随天然序列的其他基因组DNA序列以及蛋白或复合物诸如核糖体和聚合酶分离。“分离的”核酸分子是与存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。此外，“分离的”核酸分子，诸如cDNA分子，当通过重组技术产生时，可以基本上不含其他细胞物质或培养基，或者当化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学物质。在特定实施例中，一种或多种编码如本文所述单链抗体或抗体的核酸分子被分离或纯化。该术语包括已从其天然存在的环境中去除的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或由异源系统生物合成的类似物。基本上纯的分子可以包括该分子的分离形式。特别而言，本文所述的编码CAR的“分离的”核酸分子是从至少一种污染物核酸分子鉴定和分离的核酸分子，该核酸分子通常在其产生的环境中与该至少一种污染物核酸分子缔合。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
如本文所用，术语“可操作地连接的”和类似短语(例如，基因融合的)，当用于指核酸或氨基酸时，分别是指核酸序列或氨基酸序列的可操作连接，它们彼此处于功能关系。例如，可操作地连接的启动子、增强子元件、开放阅读框、5'和3'UTR以及终止子序列引起核酸分子(例如RNA)的准确产生。在一些实施例中，可操作地连接的核酸元件导致开放阅读框的转录并最终导致多肽的产生(即，开放阅读框的表达)。作为另一个实例，可操作地连接的肽是其中功能结构域以适当距离彼此放置以赋予每个结构域的预期功能的肽。
术语“载体”是指用于携带或包括核酸序列的物质，该核酸序列包括例如编码如本文所述的结合分子(例如抗体)的核酸序列，以便将核酸序列引入宿主细胞。适用的载体包括例如表达载体、质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体，其可以包括选择序列或可稳定整合入宿主细胞染色体的标记。此外，载体可以包括一种或多种选择性标记基因和适当的表达控制序列。可以被包括的选择性标记基因例如提供对抗生素或毒素的抗性、补充营养缺陷或供应培养基中没有的关键营养素。表达控制序列可以包括本领域熟知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当两个或更多个核酸分子待共表达时(例如抗体重链和轻链或抗体VH和VL)，可以将两个核酸分子插入，例如，单个表达载体或单独的表达载体中。对于单一载体表达，编码核酸可以可操作地连接至一种共同的表达控制序列或连接至不同的表达控制序列，比如一种诱导型启动子和一种组成型启动子。可以使用本领域熟知的方法来确认将核酸分子引入宿主细胞。此类方法包括例如核酸分析，诸如mRNA的RNA印迹或聚合酶链式反应(PCR)扩增、用于基因产物表达的免疫印迹或测试引入的核酸序列或其相应基因产物表达的其他合适的分析方法。本领域技术人员应理解，核酸分子以足以产生所需产物的量表达，并且应进一步理解，可以使用本领域熟知的方法来优化表达水平以获得充分表达。
如本文所用，术语“宿主”是指动物，诸如哺乳动物(例如，人)。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以用核酸分子转染的特定目标细胞以及这种细胞的子代或潜在子代。由于在后续世代中可能发生的突变或环境影响或核酸分子整合到宿主细胞基因组中，这种细胞的子代可能与用核酸分子转染的亲本细胞不相同。
如本文所用，术语“自体的”意在指源自同一个体的任何材料，其中该材料随后被重新引入该个体。
“同种异体的”是指源自相同物种的不同个体的移植物。
如本文所用的术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已使用外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代目标细胞及其子代。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的监管机构批准，或在美国药典、欧洲药典或其他公认的药典中列出用于动物，并且更特别地用于人。
“赋形剂”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、溶剂或包封材料。赋形剂包括例如包封材料或添加剂，诸如吸收促进剂、抗氧化剂、结合剂、缓冲剂、载剂、包衣剂、着色剂、稀释剂、崩解剂、乳化剂、增量剂、填充剂、调味剂、湿润剂、润滑剂、香料、防腐剂、推进剂、释放剂、灭菌剂、甜味剂、增溶剂、湿润剂以及它们的混合物。术语“赋形剂”还可以指稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全或不完全))或媒介物。
在一些实施例中，赋形剂是药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂的实例包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(例如，少于约10个氨基酸残基)多肽；蛋白，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。药学上可接受的赋形剂的其他实例在Remington和Gennaro,Remington’sPharmaceutical Sciences(第18版,1990)中进行了描述。
在一个实施例中，每种组分在与药物配制品的其他成分相容的意义上是“药学上可接受的”，并且适用于与人和动物的组织或器官接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称。参见例如，LippincottWilliams&Wilkins:Philadelphia,PA,2005；Handbook of Pharmaceutical Excipients,第6版；Rowe等人编辑；The Pharmaceutical Press and the American PharmaceuticalAssociation:2009；Handbook of Pharmaceutical Additives,第3版；Ash和Ash编辑；Gower Publishing Company:2007；Pharmaceutical Preformulation and Formulation,第2版；Gibson编辑；CRC Press LLC:Boca Raton,FL,2009。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂在所采用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂是水性pH缓冲溶液。
在一些实施例中，赋形剂是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用组合物(例如，药物组合物)时，水是示例性赋形剂。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体赋形剂，特别是用于可注射溶液。赋形剂还可以包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，该组合物还可以含有少量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释配制品等形式。口服组合物，包括配制品，可以包括标准赋形剂，诸如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
包括药物化合物的组合物可以含有例如分离或纯化形式的结合分子(例如抗体)以及适量的赋形剂。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以产生所需结果的工程化免疫效应细胞或包含药剂和本文提供的工程化免疫效应细胞或药物组合物的治疗分子的量。
术语“受试者”和“患者”可互换使用。如本文所用，在某些实施例中，受试者是哺乳动物，诸如非灵长类动物或灵长类动物(例如，人)。在特定实施例中，受试者是人。在一个实施例中，受试者是被诊断患有疾病或病症的哺乳动物，例如人。在另一个实施例中，受试者是处于发展疾病或病症的风险中的哺乳动物，例如人。
“施用(Administer或administration)”是指将存在于体外的物质注射或以其他方式物理递送到患者体内的行为，例如通过粘膜、皮内、静脉内、肌内递送和/或本文所述或本领域已知的任何其他物理递送方法。
如本文所用，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或改善由施用一种或多种疗法引起的疾病或病状的进展、严重程度和/或持续时间。治疗可以通过评估与潜在病症相关的一种或多种症状是否已经减少、缓解和/或减轻来确定，使得观察到患者的改善，尽管患者可能仍然患有潜在病症。术语“治疗”包括控制和改善疾病。术语“控制(manage、managing、和management)”是指受试者从不一定导致疾病治愈的疗法中获得的有益效果。
术语“预防(prevent、preventing、和prevention)”是指降低疾病、病症、病状或相关症状(例如，癌症)发作(或复发)的可能性。
如本文所用，“延迟”癌症的发展是指推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定和/或延缓疾病的发展。该延迟可以具有不同的时间长度，其取决于疾病的历史和/或被治疗的个体。对本领域技术人员显而易见的是，足够的或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为该个体没有患上该疾病。与不使用该方法相比，“延迟”癌症的发展的方法是在给定的时间范围内降低疾病发展的可能性和/或在给定的时间范围内降低疾病程度的方法。此类比较典型地基于使用统计学上显著数量的个体进行的临床研究。可以使用标准方法来检测癌症发展，这些标准方法包括但不限于计算机化轴向断层成像(CAT扫描)、磁共振成像(MRI)、腹部超声、凝血试验、动脉造影术或活检。发展也可以指最初可能无法检测到的癌症进展，并且包括发生、复发和发作。
术语“约”和“大约”是指在给定值或范围的20％内、15％内、10％内、9％内、8％内、7％内、6％内、5％内、4％内、3％内、2％内、1％内或更少。
如在本披露和权利要求中所使用的，单数形式“一个/种(a/an)”、和“该/所述”包括复数形式，除非上下文另外清楚地指明。
应当理解，在本文中任何地方用术语“包含”描述实施例，也提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的类似实施例。还应当理解，在本文中任何地方用短语“基本上由……组成”描述实施例，也提供了以“由……组成”描述的类似实施例。
在短语“在A和B之间”或“在A-B之间”中使用的术语“在…之间”是指包括A和B的范围。
如本文中在短语诸如“A和/或B”中使用的术语“和/或”旨在包括A和B；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样，在短语诸如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施例中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
7.2.工程化免疫效应细胞
如下文第8部分中显示，将IL-12的p40亚基和CCR7的配体(例如，CCL-19和CCL-21)的特定组合引入表达一种或多种功能性外源受体的免疫效应细胞中，可以显著改善免疫效应细胞的性质/功能。因此，在一方面，本文提供了宿主细胞(诸如免疫效应细胞)，该宿主细胞包含IL-12的外源引入的p40亚基和CCR7的配体(例如，CCL-19和CCL-21)，其中该宿主细胞表达一种或多种功能性外源受体。
CCR7(C-C趋化因子受体7型)是一种在人体中由CCR7基因编码的蛋白质。CCR7也称为BLR2、CC-CKR-7、CCR-7、CD197、CDw197、CMKBR7、EBI1和C-C基序趋化因子受体7。在一些实施例中，本文提供的CCR7明确为OMIM：600242；MGI：103011；HomoloGene：1387；和/或GeneCards：CCR7。已经为该受体明确了两种天然配体：CCL-19和CCL-21。本文提供的CCR7的配体可以是任何物种的CCR7的天然配体。在其他实施例中，本文提供的CCR7的配体可以是任何物种的CCR7的人工或合成配体。
功能性外源受体可以是例如嵌合抗原受体(CAR)、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合TCR(cTCR)、和T细胞抗原偶联物(TAC)样嵌合受体。在一些实施例中，功能性外源受体是CAR。在一些实施例中，功能性外源受体是TCR。在一些实施例中，功能性外源受体是cTCR。在其他实施例中，功能性外源受体是TAC。可以在本发明中使用任何能够执行免疫效应子功能的免疫效应细胞，包括但不限于外周血单个核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
在一些实施例中，本文提供了包含本文所述的(例如，如以下部分中提供的)多肽、多核苷酸或载体中的任一种的宿主细胞(诸如免疫效应细胞)。
在一些特定实施例中，本文提供了CAR-T细胞，该细胞表达外源引入的p40和CCL-19。在一些特定实施例中，本文提供了TCR-T细胞，该细胞表达外源引入的p40和CCL-19。在一些特定实施例中，本文提供了TAC-T细胞，该细胞表达外源引入的p40和CCL-19。
在一些特定实施例中，本文提供了CAR-T细胞，该细胞表达外源引入的p40和CCL-21。在一些特定实施例中，本文提供了TCR-T细胞，该细胞表达外源引入的p40和CCL-21。在一些特定实施例中，本文提供了TAC-T细胞，该细胞表达外源引入的p40和CCL-21。
7.2.1.P40、CCL-19和CCL-21
在一些实施例中，本发明的工程化免疫效应细胞包含外源引入的IL-12的p40亚基或其变体和CCL-19或其变体的特定组合。在其他实施例中，本发明的工程化免疫效应细胞包含外源引入的IL-12的p40亚基或其变体和CCL-21或其变体的特定组合。
如本文所用，p40是白介素12的亚基β，也称为IL-12B、自然杀伤细胞刺激因子2、细胞毒性淋巴细胞成熟因子p40或白介素-12亚基p40，并且是在人体中由IL12B基因编码的蛋白质。P40是白介素12和白介素23的常见亚基。在一些实施例中，p40明确为OMIM：161561、MGI：96540、HomoloGene：1648、和/或GeneCards：IL12B。如本文所用的p40包括来自任何物种的p40。如本文所用的p40还包括基本上保留其至少一种生物活性(例如，保留其生物活性中一种的至少80％)的任何p40变体。在一些实施例中，本文提供的p40是人p40或其片段或变体。在特定实施例中，本文提供的p40包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供的p40包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。例如，在一些实施例中，本文提供的p40包含与SEQ ID NO:5具有约80％序列同一性的氨基酸序列，并且保留了包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的p40的至少80％的生物活性。在一些实施例中，本文提供的p40多肽是分泌的多肽。在一些实施例中，本文提供的p40多肽是膜结合的多肽(例如，MB12)。
本文提供的p40多肽是通过本领域已知的任何技术形成的膜结合的多肽。在一些实施例中，p40多肽经由膜锚定结构域与膜结合。在一些实施例中，p40多肽经由跨膜结构域与膜结合。示例性跨膜结构域包括但不限于以下的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、B7、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CDl la、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CD19、IL-2Rβ、IL-2Rγ、CD8α、IL-7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C。在一些实施例中，p40多肽是膜结合的，其进一步包含第二多肽片段。在一些实施例中，第二多肽片段选自由CD28、CD8α、OX40和B7组成的组。在一些实施例中，p40片段和第二多肽片段通过肽接头彼此连接。在一些实施例中，该接头肽是柔性接头。示例性柔性接头包括但不限于甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GSGGS)n(SEQ ID NO:46)、(GGGS)n(SEQ ID NO:47)和(GGGGS)n(SEQ ID NO:48)，其中n是至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性接头。在一些实施例中，本文提供的膜结合的p40多肽从N末端到C末端包含：信号肽、p40、源自CD8α的铰链和跨膜结构域、以及任选地来自CD8α的胞内信号传导结构域。在特定实施例中，本文提供的膜结合的p40多肽包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些实施例中，膜结合的p40多肽进一步包含第三多肽片段。在一些实施例中，该第三多肽片段是显性负性受体(DNR)。在一些实施例中，该第三多肽片段是TGFβRⅡDNR。在一些实施例中，本文提供的膜结合的p40多肽从N末端到C末端包含：信号肽、p40、TGFβRⅡDNR、源自CD8α的铰链和跨膜结构域、以及任选地来自CD8α的胞内信号传导结构域。
趋化因子(C-C基序)配体19(CCL-19)是一种在人体中由CCL19基因编码的蛋白质，也被称为CKb11、ELC、MIP-3b、MIP3B、SCYA19和C-C基序趋化因子配体19。在一些实施例中，CCL-19明确为OMIM：602227；MGI：5434459；HomoloGene：4569；和/或GeneCards：CCL19。如本文所用的CCL-19包括来自任何物种的CCL-19。如本文所用的CCL-19还包括基本上保留其至少一种生物活性(例如，保留其生物活性中一种的至少80％)的任何CCL-19变体。在一些实施例中，本文提供的CCL-19是人CCL-19或其片段或变体。在特定实施例中，本文提供的CCL-19包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供的CCL-19包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。例如，在一些实施例中，本文提供的CCL-19包含与SEQ ID NO:6具有约80％序列同一性的氨基酸序列，并且保留了包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CCL-19的至少80％的生物活性。
趋化因子(C-C基序)配体21(CCL-21)是一种属于CC趋化因子家族的细胞因子。CCL-21也称为6Ckine、CKb9、ECL、SCYA21、SLC、TCA4和C-C基序趋化因子配体21。在一些实施例中，CCL-21明确为OMIM：602737；MGI：1349183；HomoloGene：2247；和/或GeneCards：CCL21。如本文所用的CCL-21包括来自任何物种的CCL-21。如本文所用的CCL-21还包括基本上保留其至少一种生物活性(例如，保留其生物活性中一种的至少80％)的任何CCL-21变体。在一些实施例中，本文提供的CCL-21是人CCL-21或其片段或变体。在特定实施例中，本文提供的CCL-21包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供的CCL-21包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。例如，在一些实施例中，本文提供的CCL-21包含与SEQ ID NO:22具有约80％序列同一性的氨基酸序列，并且保留了包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CCL-21的至少80％的生物活性。
在一些实施例中，本文提供的p40包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；并且本文提供的CCL-19包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在特定实施例中，本文提供的p40包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；并且本文提供的CCL-19包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文提供的p40包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；并且本文提供的CCL-21包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在特定实施例中，本文提供的p40包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；并且本文提供的CCL-21包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
可以使用数学算法来确定两个序列(例如，氨基酸序列或核酸序列)之间的同一性百分比。用于比较两个序列的数学算法的优选非限制性实例是Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264 2268(1990)的算法，修改为Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873 5877(1993)。这种算法被合并到Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST核苷酸程序参数集进行，例如，对于评分＝100，字长＝12，以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可以用XBLAST程序参数集进行，例如，对于评分50，字长＝3，以获得与本文所述的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以使用如Altschul等人,Nucleic Acids Res.25:3389 3402(1997)中所述的GappedBLAST。替代性地，PSI BLAST可用于进行检测分子间距离关系的迭代搜索(Id.)。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI Blast程序时，可以使用(例如，XBLAST和NBLAST的)相应程序的默认参数(参见例如，万维网上的美国国家生物技术信息中心(NCBI)，ncbi.nlm.nih.gov)。用于序列比较的数学算法的另一个非限制性实例是Myers和Miller,CABIOS 4:11-17(1998)的算法。这种算法被合并在ALIGN程序(2.0版)中，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序比对氨基酸序列时，可以使用PAM120重量残基表，空位长度罚分为12，并且空位罚分为4。
在一些实施例中，考虑了本文所述的p40、CCL-19和CCL-21的一个或多个氨基酸序列修饰或变异。变异可以是编码多肽的一个或多个密码子的取代、缺失或插入，导致与原始多肽相比氨基酸序列发生改变。
氨基酸取代可以是用具有相似结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸的结果，诸如用丝氨酸取代亮氨酸，例如保守氨基酸取代。本领域技术人员已知的标准技术可用于在编码本文提供的分子的核苷酸序列中引入突变，包括例如导致氨基酸取代的定点诱变和PCR介导的诱变。插入或缺失可任选地在约1至5个氨基酸的范围内。在某些实施例中，取代、缺失或插入包括相对于原始分子的少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。在特定实施例中，取代是在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行的保守氨基酸取代。所允许的变化可以通过在序列中系统地进行氨基酸的插入、缺失或取代并测试所得变体的亲本多肽表现出的活性来确定。
本披露包括通过保守氨基酸取代产生的多肽。在保守氨基酸取代中，氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基取代。如上所述，本领域已经定义了具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-支化侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。替代性地，可以沿着全部或部分编码序列随机引入突变，例如通过饱和诱变，并且可以筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体。诱变后，可以表达编码的蛋白并且可以确定蛋白的活性。可以进行保守(例如，在具有相似性质和/或侧链的氨基酸组内)取代，以便保持或不显著改变性质。
氨基酸可以根据它们的侧链的性质的相似性进行分组(参见例如Lehninger,Biochemistry 73-75(第2版,1975))：(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电的极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；和(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。替代性地，天然存在的残基可以根据共同的侧链性质进行分组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。例如，任何不参与维持肽的正确构象的半胱氨酸残基也可以例如用另一种氨基酸诸如丙氨酸或丝氨酸取代，以提高分子的氧化稳定性并防止异常交联。非保守取代将需要将这些类别中的一个的成员交换为另一个类别。
氨基酸序列插入包括氨基末端和/或羧基末端融合，长度在一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的范围内，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。可以使用本领域已知的方法诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变来进行变化。可以对克隆的DNA进行定点诱变(参见例如，Carter,Biochem J.237:1-7(1986)；以及Zoller等人,Nucl.Acids Res.10:6487-500(1982))、盒式诱变(参见例如，Wells等人,Gene 34:315-23(1985))或其他已知技术以产生多肽变体DNA。
7.2.2.嵌合抗原受体
本发明的工程化免疫效应细胞表达一种或多种功能性外源受体。任何功能性外源受体都包括在本披露中。嵌合抗原受体(CAR)在下文仅作为本文提供的示例性功能性外源受体进行更详细的描述，但不限制本披露的范围。
在一些实施例中，本发明的免疫效应细胞中的CAR包含多肽，该多肽包含：(a)胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内信号传导结构域，其每个和另外的区域在下文中更详细地描述。
胞外抗原结合结构域
本文所述CAR的胞外抗原结合结构域包含一个或多个抗原结合结构域。在一些实施例中，本文提供的CAR的胞外抗原结合结构域是单特异性的。在其他实施例中，本文提供的CAR的胞外抗原结合结构域是多特异性的。在其他实施例中，本文提供的CAR的胞外抗原结合结构域是单价的。在其他实施例中，本文提供的CAR的胞外抗原结合结构域是多价的。在一些实施例中，胞外抗原结合结构域包含两个或更多个抗原结合结构域，这些抗原结合结构域直接通过肽键或通过肽接头彼此融合。
在一些实施例中，该胞外抗原结合结构域包含抗体或其片段。例如，该结合结构域可以源自单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长或完整单克隆抗体)、具有多表位或单表位特异性的抗体、多克隆或单价抗体、多价抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们表现出所需的生物活性)、单链抗体、单域抗体及其片段(例如，结构域抗体)。抗体可以是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和/或亲和力成熟抗体，以及来自其他物种(例如，小鼠、兔、美洲驼等)的抗体。在一些实施例中，抗体包括免疫球蛋白类多肽中的B细胞的多肽产物，其能够结合特定分子抗原并且由两对相同的多肽链组成，其中每对多肽链具有一条重链(约50-70kDa)和一条轻链(约25kDa)，每条链的每个氨基末端部分包括约100至约130或更多个氨基酸的可变区，并且每条链的每个羧基末端部分包括恒定区。参见例如，Antibody Engineering(Borrebaeck编辑,第2版1995)；以及Kuby,Immunology(第3版1997)。抗体还包括但不限于合成抗体、重组产生的抗体、包括来自骆驼科物种(例如，美洲驼或羊驼)的单域抗体或它们的人源化变体、内抗体、抗独特型(抗Id)抗体，以及上述任一种的功能片段(例如抗原结合片段)，这些功能片段是指抗体重链或轻链多肽的一部分，其保留了该片段所来源的抗体的一些或全部结合活性。功能片段(例如，抗原结合片段)的非限制性实例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性、双特异性等)、Fab片段、F(ab')片段、F(ab)2片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和微型抗体。特别地，本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如，抗原结合结构域或含有结合抗原的抗原结合位点的分子(例如，抗体的一个或多个CDR)。此类抗体片段可见于例如Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratory Manual(1989)；Mol.Biology and Biotechnology:A Comprehensive DeskReference(Myers编辑,1995)；Huston等人,1993,Cell Biophysics 22:189-224；Plückthun和Skerra,1989,Meth.Enzymol.178:497-515；以及Day,Advanced Immunochemistry(第2版,1990)。本文提供的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。抗体可以是激动性抗体或拮抗性抗体。抗体可以既不是激动性的也不是拮抗性的。
在特定实施例中，本发明CAR的胞外抗原结合结构域包含单链Fv(sFv或scFv)。scFv是包含连接到单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，scFv多肽进一步包含在VH与VL结构域之间的多肽接头，该多肽接头使得sFv能够形成用于抗原结合的所需结构。参见Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
在另一个特定的实施例中，本发明CAR的胞外抗原结合结构域包含一种或多种单域抗体(sdAb)。sdAb可以具有相同或不同的来源，并且具有相同或不同的大小。示例性sdAb包括但不限于来自仅有重链的抗体的重链可变结构域(例如，VHH或VNAR)、天然缺乏轻链的结合分子、源自常规4链抗体的单域(诸如VH或VL)、人源化的仅有重链的抗体、由表达人重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人单域抗体，以及工程化结构域和除源自抗体的那些外的单域支架。本领域已知的或由本披露开发的任何sdAb，包括在本披露中上文所述的单域抗体在内，可用于构建本文所述的CAR。sdAb可以源自任何物种，这些物种包括但不限于小鼠、大鼠、人、骆驼、美洲驼、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。本文考虑的单域抗体还包括来自除骆驼科和鲨鱼外的物种的天然存在的单域抗体分子。
在一些实施例中，sdAb源自天然存在的单域抗原结合分子，其称为缺乏轻链的重链抗体(本文也称为“仅有重链的抗体”)。例如，此类单域分子披露于WO 94/04678和Hamers-Casterman,C.等人Nature 363:446-448(1993)中。为清楚起见，源自天然缺乏轻链的重链分子的可变结构域在本文中称为VHH，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区分开。这种VHH分子可以源自骆驼科物种，例如骆驼、美洲驼、骆马、单峰骆驼、羊驼和原驼中产生的抗体。骆驼科以外的其它物种可以产生天然缺乏轻链的重链分子，并且此类VHH在本披露的范围内。此外，还考虑VHH的人源化型式以及其它修饰和变体并在本披露的范围内。在一些实施例中，sdAb源自软骨鱼中发现的免疫球蛋白的可变区。例如，sdAb可源自鲨鱼血清中发现的称为新型抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型。产生源自NAR(“IgNAR”)的可变区的单域分子的方法描述于WO 03/014161和Streltsov,Protein Sci.14:2901-2909(2005)中。
在一些实施例中，天然存在的针对特定抗原或靶点的VHH结构域可以从骆驼科动物VHH序列的(原初或免疫)文库中获得。此类方法可以涉及或可以不涉及使用所述抗原或靶点、或其至少一部分、片段、抗原决定簇或表位，使用一种或多种本领域已知的筛选技术来筛选此类文库。此类文库和技术例如描述于WO 99/37681、WO 01/90190、WO 03/025020和WO 03/035694中。替代性地，可以使用源自(原初或免疫)VHH文库的改进的合成或半合成文库，诸如通过例如WO 00/43507中描述的技术诸如随机诱变和/或CDR改组从(原初或免疫)VHH文库获得的VHH文库。
在一些实施例中，sdAb是重组的、CDR移植的、人源化的、骆驼化的、去免疫的和/或体外产生的(例如，通过噬菌体展示选择的)。在一些实施例中，框架区的氨基酸序列可以通过框架区中特定氨基酸残基的“骆驼化”而改变。骆驼化是指来自常规4链抗体的(天然存在的)VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基被存在于重链抗体的VHH结构域中的一个或多个相应位置处的一个或多个氨基酸残基替换或取代。这可以以本领域已知的方式进行，该方式对于技术人员来说是清楚的。此类“骆驼化”取代优选被插入在形成VH-VL界面和/或存在于该VH-VL界面的氨基酸位置处，和/或在所称的骆驼科标志残基处，如本文所定义(参见例如，WO 94/04678；Davies和Riechmann FEBS Letters 339:285-290(1994)；Davies和Riechmann,Protein Engineering 9(6):531-537(1996)；Riechmann,J.Mol.Biol.259:957-969(1996)；以及Riechmann和Muyldermans,J.Immunol.Meth.231:25-38(1999))。
在一些实施例中，sdAb是由表达人重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人单域抗体。参见例如，US20090307787、美国专利号8,754,287、US20150289489、US20100122358、和WO 2004049794。
在一些实施例中，单域抗体由常规四链抗体产生。参见例如，EP 0 368684；Ward等人,Nature,341(6242):544-6(1989)；Holt等人,Trends Biotechnol.,21(11):484-490(2003)；WO 06/030220；以及WO 06/003388。
在一些实施例中，胞外抗原结合结构域包含人源化抗体或其片段。人源化抗体可以包含人框架区和人恒定区序列。
人源化抗体可以使用本领域已知的多种技术产生，包括但不限于CDR移植(欧洲专利号EP 239,400；国际公开号WO 91/09967；以及美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)、镶饰(veneering)或表面重塑(resurfacing)(欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka等人,1994,Protein Engineering 7(6):805-814；以及Roguska等人,1994,PNAS 91:969-973)、链改组(美国专利号5,565,332)以及例如以下中披露的技术：美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、WO 93/17105、Tan等人,J.Immunol.169:111925(2002)、Caldas等人,ProteinEng.13(5):353-60(2000)、Morea等人,Methods 20(3):26779(2000)、Baca等人,J.Biol.Chem.272(16):10678-84(1997)、Roguska等人,Protein Eng.9(10):895 904(1996)、Couto等人,Cancer Res.55(23增刊):5973s-5977s(1995)、Couto等人,CancerRes.55(8):1717-22(1995)、Sandhu JS,Gene 150(2):409-10(1994)、以及Pedersen等人,J.Mol.Biol.235(3):959-73(1994)。还参见美国专利公开号US 2005/0042664 A1(2005年2月24日)，其中每一个通过援引以其全文并入本文。
用于人源化非人抗体的各种方法是本领域已知的。例如，人源化抗体可以具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，这些残基典型地取自“输入”可变结构域。例如，可以按照以下的方法，通过用高变区序列取代人抗体的相应序列进行人源化：Jones等人,1986,Nature321:522-25；Riechmann等人,1988,Nature 332:323-27；以及Verhoeyen等人,1988,Science 239:1534-36。
在一些情况下，人源化抗体通过CDR移植构建，其中亲本非人抗体(例如，啮齿动物)的六个CDR的氨基酸序列被移植到人抗体框架上。例如，Padlan等人确定CDR中只有约三分之一的残基实际接触抗原，并将这些称为“特异性决定残基”或SDR(Padlan等人,1995,FASEB J.9:133-39)。在SDR移植技术中，仅SDR残基被移植到人抗体框架上(参见例如，Kashmiri等人,2005,Methods 36:25-34)。
选择用于制备人源化抗体的人(轻链和重链)可变结构域对于降低抗原性可能很重要。例如，根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选非人(例如，啮齿动物)抗体的可变结构域的序列。可以选择最接近啮齿动物的人序列作为人源化抗体的人框架(Sims等人,1993,J.Immunol.151:2296-308；以及Chothia等人,1987,J.Mol.Biol.196:901-17)。另一种方法使用源自轻链或重链的特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-89；以及Presta等人,1993,J.Immunol.151:2623-32)。在一些情况下，框架源自最丰富的人亚类VL6亚组I(VL6I)和VH亚组III(VHIII)的共有序列。在另一种方法中，使用人种系基因作为框架区的来源。
在基于CDR比较的替代范例中，称为超人源化，FR同源性是不相关的。该方法由将非人序列与功能性人种系基因库进行比较组成。然后选择那些编码与鼠序列相同或密切相关的规范结构的基因。接下来，在与非人抗体共有规范结构的基因中，选择那些在CDR内具有最高同源性的基因作为FR供体。最后，将非人CDR移植到这些FR上(参见例如，Tan等人,2002,J.Immunol.169:1119-25)。
通常还希望将抗体人源化以保留它们对抗原的亲和力和其他有利的生物学性质。为了实现该目标，根据一种方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是通常可获得的并且是本领域技术人员所熟悉的。可以获得说明和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。这些包括例如WAM(Whitelegg和Rees,2000,Protein Eng.13:819-24)、Modeller(Sali和Blundell,1993,J.Mol.Biol.234:779-815)和Swiss PDBViewer(Guex和Peitsch,1997,Electrophoresis 18:2714-23)。检查这些显示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，例如分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体和输入序列中选择并组合FR残基，从而获得所需的抗体特征，诸如对一个或多个靶抗原的亲和力增加。通常，高变区残基直接且最显著地参与影响抗原结合。
抗体人源化的另一种方法是基于称为Human String Content(HSC)的抗体人性度量。该方法将小鼠序列与人种系基因库进行比较，并将差异评分为HSC。然后通过最大化其HSC而不是使用全局同一性测量来将靶序列人源化以产生多种不同的人源化变体(Lazar等人,2007,Mol.Immunol.44:1986-98)。
除了上述方法之外，经验方法也可用于产生和选择人源化抗体。这些方法包括那些基于产生大型人源化变体文库和使用富集技术或高通量筛选技术选择最佳克隆的方法。抗体变体可以从噬菌体、核糖体和酵母展示文库以及通过细菌菌落筛选来分离(参见例如，Hoogenboom,2005,Nat.Biotechnol.23:1105-16；Dufner等人,2006,TrendsBiotechnol.24:523-29；Feldhaus等人,2003,Nat.Biotechnol.21:163-70；以及Schlapschy等人,2004,Protein Eng.Des.Sel.17:847-60)。
在FR文库方法中，在FR中的特定位置引入一批残基变体，然后筛选文库以选择最佳支持移植的CDR的FR。待取代的残基可以包括被鉴定为可能有助于CDR结构的“游标”残基中的一些或全部(参见例如，Foote和Winter,1992,J.Mol.Biol.224:487-99)，或来自Baca等人(1997,J.Biol.Chem.272:10678-84)鉴定的更有限的一组靶残基。
在FR改组中，整个FR与非人CDR组合而不是创建所选残基变体的组合文库(参见例如，Dall'Acqua等人,2005,Methods 36:43-60)。可以在两步过程(首先是VL人源化，然后是VH)中筛选文库以进行结合。替代性地，可以使用一步FR改组过程。这种方法已被证明比两步筛选更有效，因为所得抗体表现出改善的生物化学和物理化学性质，包括增强的表达、增加的亲和力和热稳定性(参见例如，Damschroder等人,2007,Mol.Immunol.44:3049-60)。
“人源化工程(humaneering)”方法基于基本最小特异性决定簇(minimumspecificity determinant，MSD)的实验鉴定，并基于将非人片段顺序替换到人FR文库中并评估结合。它从非人VH和VL链的CDR3区域开始，并逐渐取代非人抗体的其他区域进入人FR，包括VH和VL的CDR1和CDR2。该方法通常导致表位保留和鉴定来自具有不同人V区段CDR的多个亚类的抗体。人源化工程允许分离与人类种系基因抗体91％-96％同源的抗体(参见例如，Alfreito,Cambridge Healthtech Institute的第三届年度PEGS,The ProteinEngineering Summit,2007)。
“人工程化(human engineering)”方法涉及通过对抗体的氨基酸序列进行特异性改变来改变非人抗体或抗体片段(诸如小鼠或嵌合抗体或抗体片段)，从而产生在人中具有降低的免疫原性的经修饰的抗体，该经修饰的抗体仍然保留原始非人抗体的所需结合性质。通常，该技术涉及将非人(例如，小鼠)抗体的氨基酸残基分类为“低风险”、“中等风险”或“高风险”残基。使用总体风险/回报计算进行分类，该计算评估进行特定取代(例如，针对人的免疫原性)的预测益处与取代将影响所得抗体折叠的风险。可以通过将来自非人抗体可变区的氨基酸序列与特定或共有人抗体序列的相应区域进行比对来选择将在非人(例如，小鼠)抗体序列的给定位置(例如，低风险或中等风险)处被取代的特定人氨基酸残基。非人序列中低风险或中等风险位置的氨基酸残基可以根据比对取代人抗体序列中的相应残基。以下中更详细地描述了用于制备人工程化蛋白的技术：Studnicka等人,1994,Protein Engineering 7:805-14；美国专利号5,766,886、5,770,196、5,821,123和5,869,619；以及PCT公开WO 93/11794。
可以使用例如Composite Human AntibodyTM技术(Antitope Ltd.,Cambridge,United Kingdom)产生复合人抗体。为了产生复合人抗体，以避免T细胞表位的方式从多个人抗体可变区序列的片段设计可变区序列，从而使所得抗体的免疫原性最小化。此类抗体可包含人恒定区序列，例如，人轻链和/或重链恒定区。
去免疫化抗体是其中T细胞表位已被去除的抗体。已经描述了用于制备去免疫化抗体的方法。参见例如，Jones等人,Methods Mol Biol.2009；525:405-23,xiv和De Groot等人,Cell.Immunol.244:148-153(2006)。去免疫化抗体包含T细胞表位缺失的可变区和人恒定区。简言之，对抗体的VH和VL进行克隆，随后通过在T细胞增殖测定中测试源自抗体VH和VL的重叠肽来鉴定T细胞表位。通过计算机方法鉴定T细胞表位以鉴定与人MHC II类结合的肽。在VH和VL中引入突变以消除与人MHC II类的结合。然后使用突变的VH和VL来产生去免疫化抗体。
在某些实施例中，胞外抗原结合结构域包含多个结合结构域。在一些实施例中，胞外抗原结合结构域包含多特异性抗体或其片段，例如，胞外抗原结合结构域包含串联的多个结合结构域(例如，多个scFv)。在其他实施例中，胞外抗原结合结构域包含多价抗体或其片段。术语“特异性”是指抗原结合蛋白对抗原特定表位的选择性识别。如本文所用，术语“多特异性”表示抗原结合蛋白具有两个或更多个抗原结合位点，其中至少两个结合不同的抗原。如本文所用，术语“价”表示抗原结合蛋白中存在指定数目的结合位点。全长抗体具有两个结合位点并且是二价的。如此，术语“三价”、“四价”、“五价”和“六价”分别表示抗原结合蛋白中存在两个结合位点、三个结合位点、四个结合位点、五个结合位点和六个结合位点。
多特异性抗体诸如双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体。用于制备多特异性抗体的方法是本领域已知的，诸如通过共表达两个免疫球蛋白重链-轻链对，其中两个重链具有不同的特异性(参见例如，Milstein和Cuello,1983,Nature 305:537-40)。关于产生多特异性抗体(例如，双特异性抗体)的进一步细节，参见例如，双特异性抗体(Kontermann编辑,2011)。
抗体可以是具有两个或更多个抗原结合位点的多价抗体(例如，四价抗体)，可以通过编码抗体的多肽链的核酸的重组表达很容易地产生该抗体。在某些实施例中，多价抗体包含三个至约八个抗原结合位点(或由三个至约八个抗原结合位点组成)。在一个此类实施例中，多价抗体包含四个抗原结合位点(或由四个抗原结合位点组成)。多价抗体包含至少一条多肽链(例如，两条多肽链)，其中一条或多条多肽链包含两个或更多个可变结构域。例如，一条或多条多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2表示氨基酸或多肽，并且n是0或1。例如，一条或多条多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体可进一步包含至少两种(例如，四种)轻链可变结构域多肽。例如，本文中的多价抗体可包含约两种至约八种轻链可变结构域多肽。本文所考虑的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，并且任选地进一步包含CL结构域。
在本发明CAR的胞外抗原结合结构域中存在多个结合结构域的情况下。各种结构域可以通过肽接头彼此融合。在一些实施例中，结构域彼此直接融合而没有任何肽接头。肽接头可以相同或不同。取决于各种结构域的结构和/或功能特征，每个肽接头可以具有相同或不同的长度和/或序列。可以独立地选择和优化每个肽接头。CAR中使用的一个或多个肽接头的长度、柔性程度和/或其他性质可以对性质具有一些影响，包括但不限于对一种或多种特定抗原或表位的亲和力、特异性或亲合力。在一些实施例中，肽接头包含柔性残基(诸如甘氨酸和丝氨酸)，使得相邻结构域相对于彼此自由移动。例如，甘氨酸-丝氨酸双联体可以是合适的肽接头。
肽接头可具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，源自仅有重链的抗体的铰链区的序列可以用作接头。参见例如WO 1996/34103。在一些实施例中，肽接头是柔性接头。示例性柔性接头包括但不限于甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:46)、(GGGS)n(SEQ ID NO:47)和(GGGGS)n(SEQ ID NO:48)，其中n是至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性接头。例如，如以下中所述的本领域已知的其它接头也可以包括在本文提供的CAR中：WO2016014789、WO 2015158671、WO 2016102965、US20150299317、WO 2018067992、US7741465、Colcher等人,J.Nat.Cancer Inst.82:1191-1197(1990)、和Bird等人,Science242:423-426(1988)，其中每个的披露内容通过援引并入本文。
在一些实施例中，本发明CAR中提供的胞外抗原结合结构域识别充当与特殊疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记的抗原。在一些实施例中，抗原是肿瘤抗原。肿瘤表达多种可作为免疫应答(尤其是T细胞介导的免疫应答)的靶抗原的蛋白质。CAR靶向的抗原可以是单个病变细胞上的抗原，或是在各自都会影响疾病的不同细胞上表达的抗原。CAR靶向的抗原可能直接或间接牵涉到疾病中。
在一些实施例中，靶细胞的抗原是癌细胞表面上的抗原。在一些实施例中，该抗原是肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原或新生抗原。
在一些实施例中，靶细胞是癌细胞，例如以下癌症的细胞：肾上腺癌、肛门癌、阑尾癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食道癌、胆囊癌、妊娠滋养细胞癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、肠癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤(MM)、神经内分泌肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、窦癌、皮肤癌、软组织肉瘤、脊椎癌、胃癌、睾丸癌、咽喉癌、甲状腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌或外阴癌。在一些实施例中，癌症是肾上腺癌、肛门癌、阑尾癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食道癌、胆囊癌、妊娠滋养细胞癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、肠癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤(MM)、神经内分泌肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、窦癌、皮肤癌、软组织肉瘤、脊椎癌、胃癌、睾丸癌、咽喉癌、甲状腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌或外阴癌。在一些实施例中，癌症是肾上腺癌。在一些实施例中，癌症是肛门癌。在一些实施例中，癌症是阑尾癌。在一些实施例中，癌症是胆管癌。在一些实施例中，癌症是膀胱癌。在一些实施例中，癌症是骨癌。在一些实施例中，癌症是脑癌。在一些实施例中，癌症是乳腺癌。在一些实施例中，癌症是宫颈癌。在一些实施例中，癌症是结直肠癌。在一些实施例中，癌症是食道癌。在一些实施例中，癌症是胆囊癌。在一些实施例中，癌症是妊娠滋养细胞癌。在一些实施例中，癌症是头颈癌。在一些实施例中，癌症是霍奇金淋巴瘤。在一些实施例中，癌症是肠癌。在一些实施例中，癌症是肾癌。在一些实施例中，癌症是白血病。在一些实施例中，癌症是肝癌。在一些实施例中，癌症是肺癌。在一些实施例中，癌症是黑色素瘤。在一些实施例中，癌症是间皮瘤。在一些实施例中，癌症是多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施例中，癌症是神经内分泌肿瘤。在一些实施例中，癌症为非霍奇金淋巴瘤。在一些实施例中，癌症是口腔癌。在一些实施例中，癌症是卵巢癌。在一些实施例中，癌症是胰腺癌。在一些实施例中，癌症是前列腺癌。在一些实施例中，癌症是窦癌。在一些实施例中，癌症是皮肤癌。在一些实施例中，癌症是软组织肉瘤、脊椎癌。在一些实施例中，癌症是胃癌。在一些实施例中，癌症是睾丸癌。在一些实施例中，癌症是咽喉癌。在一些实施例中，癌症是甲状腺癌。在一些实施例中，癌症是子宫癌、子宫内膜癌。在一些实施例中，癌症是阴道癌。在一些实施例中，癌症是外阴癌。
在一些实施例中，肾上腺癌是肾上腺皮质癌(ACC)、肾上腺皮质癌、嗜铬细胞瘤或神经母细胞瘤。在一些实施例中，肛门癌是鳞状细胞癌、泄殖腔源性癌、腺癌、基底细胞癌或黑色素瘤。在一些实施例中，阑尾癌是神经内分泌肿瘤(NET)、黏液腺癌、杯状细胞类癌、肠型腺癌或印戒细胞腺癌。在一些实施例中，胆管癌是肝外胆管癌、腺癌、肝门部胆管癌、肝门周胆管癌、远端胆管癌或肝内胆管癌。在一些实施例中，膀胱癌是移行细胞癌(TCC)、乳头状癌、扁平癌、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌或肉瘤。在一些实施例中，骨癌是原发性骨癌、肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨巨细胞瘤、脊索瘤或转移性骨癌。在一些实施例中，脑癌是星形细胞瘤、脑干胶质瘤、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤、混合胶质瘤、垂体腺癌、垂体腺瘤、颅咽管瘤、生殖细胞肿瘤、松果体区肿瘤、髓母细胞瘤或原发性CNS淋巴瘤。在一些实施例中，乳腺癌是乳腺腺癌、浸润性乳腺癌、非浸润性乳腺癌、乳腺肉瘤、化生性癌、腺样囊性癌、叶状肿瘤、血管肉瘤、HER2阳性乳腺癌、三阴性乳腺癌或炎性乳腺癌。在一些实施例中，宫颈癌是鳞状细胞癌或腺癌。在一些实施例中，结直肠癌是结直肠腺癌、原发性结直肠淋巴瘤、胃肠道间质瘤、平滑肌肉瘤、类癌瘤、黏液腺癌、印戒细胞腺癌、胃肠道类癌瘤或黑色素瘤。在一些实施例中，食道癌是腺癌或鳞状细胞癌。在一些实施例中，胆囊癌是腺癌、乳头状腺癌、腺鳞癌、鳞状细胞癌、小细胞癌或肉瘤。在一些实施例中，妊娠滋养细胞疾病(GTD)是葡萄胎、妊娠滋养细胞肿瘤(GTN)、绒毛膜癌、胎盘部位滋养细胞肿瘤(PSTT)或上皮样滋养细胞肿瘤(ETT)。在一些实施例中，头颈癌是喉癌、鼻咽癌、下咽癌、鼻腔癌、鼻旁窦癌、唾液腺癌、口腔癌、口咽癌或扁桃体癌。在一些实施例中，霍奇金淋巴瘤是经典型霍奇金淋巴瘤，结节硬化型、混合细胞型、富于淋巴细胞型、淋巴细胞消减型或结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤(NLPHL)。在一些实施例中，肠癌是小肠癌(small intestine cancer)、小肠癌(small bowel cancer)、腺癌、肉瘤、胃肠道间质瘤、类癌瘤或淋巴瘤。在一些实施例中，肾癌是肾细胞癌(RCC)、透明细胞RCC、乳头状RCC、嫌色细胞RCC、集合管RCC、未分类RCC、移行细胞癌、尿路上皮癌、肾盂癌或肾肉瘤。在一些实施例中，白血病是急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓系白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)或骨髓增生异常综合征(MDS)。在特定实施例中，白血病是AML。在一些实施例中，肝癌是肝细胞癌(HCC)、纤维板层样HCC、胆管癌、血管肉瘤或肝转移。在一些实施例中，肺癌是小细胞肺癌、小细胞癌、组合小细胞癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状细胞肺癌、大细胞未分化癌、肺结节、转移性肺癌、腺鳞癌、大细胞神经内分泌癌、唾液腺型肺癌、肺类癌、间皮瘤、肺肉瘤样癌或恶性颗粒细胞肺肿瘤。在一些实施例中，黑色素瘤是浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、无色素性黑色素瘤、结缔组织增生性黑色素瘤、眼黑色素瘤或转移性黑色素瘤。在一些实施例中，间皮瘤是胸膜间皮瘤、腹膜间皮瘤、围心间皮瘤或睾丸间皮瘤。在一些实施例中，多发性骨髓瘤是活动性骨髓瘤或冒烟性骨髓瘤。在一些实施例中，神经内分泌肿瘤是胃肠道神经内分泌肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤或肺神经内分泌肿瘤。在一些实施例中，非霍奇金淋巴瘤是间变性大细胞淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、小细胞淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、前体T淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、成人T细胞淋巴瘤/白血病(ATLL)、毛细胞白血病、B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、结内边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、B细胞非霍奇金淋巴瘤、T细胞非霍奇金淋巴瘤、自然杀伤细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、Alibert-Bazin综合征、塞扎里综合征(Sezary syndrome)、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、全身性ALCL、肠病型T细胞淋巴瘤(EATL)或肝脾γ/δT细胞淋巴瘤。在一些实施例中，口腔癌是鳞状细胞癌、疣状癌、小唾液腺癌、淋巴瘤、良性口腔肿瘤、嗜酸性肉芽肿、纤维瘤、颗粒细胞瘤、角化棘皮瘤、平滑肌瘤、骨软骨瘤、脂肪瘤、神经鞘瘤、神经纤维瘤、乳头状瘤、尖锐湿疣、疣状黄瘤、化脓性肉芽肿、横纹肌瘤、牙源性肿瘤、白斑、红斑、鳞状细胞唇癌、基底细胞唇癌、口癌、牙龈癌或舌癌。在一些实施例中，卵巢癌是卵巢上皮癌、黏液性上皮卵巢癌、子宫内膜样上皮卵巢癌、透明细胞上皮卵巢癌、未分化上皮卵巢癌、卵巢低恶性潜能肿瘤、原发性腹膜癌、输卵管癌、生殖细胞瘤、畸胎瘤、无性细胞瘤、卵巢生殖细胞癌、内胚窦瘤、性索-间质瘤、性索-性腺间质瘤、卵巢间质瘤、颗粒细胞肿瘤、颗粒-卵泡膜细胞瘤、支持细胞-间质细胞瘤(Sertoli-Leydig tumor)、卵巢肉瘤、卵巢癌肉瘤、卵巢腺肉瘤、卵巢平滑肌肉瘤、卵巢纤维肉瘤、克鲁肯贝格瘤(Krukenberg tumor)或卵巢囊肿。在一些实施例中，胰腺癌是胰腺外泌腺癌、胰腺内分泌腺癌或胰腺腺癌、胰岛细胞瘤或神经内分泌肿瘤。在一些实施例中，前列腺癌是前列腺腺癌、前列腺肉瘤、移行细胞癌、小细胞癌或神经内分泌肿瘤。在一些实施例中，窦癌是鳞状细胞癌、粘膜细胞癌、腺样囊性细胞癌、腺泡细胞癌、鼻窦未分化癌、鼻腔癌、鼻旁窦癌、上颌窦癌、筛窦癌或鼻咽癌。在一些实施例中，皮肤癌是基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、默克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、卡波西肉瘤(KS)、光线性角化病、皮肤淋巴瘤或角化棘皮瘤。在一些实施例中，软组织癌是血管肉瘤、皮肤纤维肉瘤、上皮样肉瘤、尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma)、纤维肉瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、去分化脂肪肉瘤(DL)、黏液性/圆细胞脂肪肉瘤(MRCL)、高分化脂肪肉瘤(WDL)、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤(RMS)或滑膜肉瘤。在一些实施例中，脊椎癌是脊椎转移瘤。在一些实施例中，胃癌是胃腺癌、胃淋巴瘤、胃肠道间质瘤、类癌瘤、胃类癌瘤、I型ECL细胞类癌、II型ECL细胞类癌或III型ECL细胞类癌。在一些实施例中，睾丸癌是精原细胞瘤、非精原细胞瘤、胚胎癌、卵黄囊癌、绒毛膜癌、畸胎瘤、性腺间质瘤、睾丸间质细胞瘤或睾丸支持细胞瘤。在一些实施例中，咽喉癌是鳞状细胞癌、腺癌、肉瘤、喉癌、咽癌、鼻咽癌、口咽癌、下咽癌、喉癌、喉鳞状细胞癌、喉腺癌、淋巴上皮瘤、梭形细胞癌、疣状癌、未分化癌或淋巴结癌。在一些实施例中，甲状腺癌是乳头状癌、滤泡状癌、Hürthle细胞癌、甲状腺髓样癌或间变性癌。在一些实施例中，子宫癌是子宫内膜癌、子宫内膜腺癌、子宫内膜样癌、浆液性腺癌、腺鳞癌、子宫癌肉瘤、子宫肉瘤、子宫平滑肌肉瘤、子宫内膜间质肉瘤或未分化肉瘤。在一些实施例中，阴道癌是鳞状细胞癌、腺癌、黑色素瘤或肉瘤。在一些实施例中，外阴癌是鳞状细胞癌或腺癌。
肿瘤抗原是由可引发免疫应答、特别是T细胞介导的免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质。示例性肿瘤抗原包括但不限于胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、前列腺素、PSMA、HER2/neu、存活蛋白和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
在一些实施例中，癌抗原是CEA、未成熟的层粘连蛋白受体、TAG-72、HPV E6、HPVE7、BING-4、钙活化的氯化物通道2、周期蛋白-B1、9D7、EpCAM、EphA3、Her2/neu、端粒酶、间皮素、SAP-1、存活蛋白、BAGE家族抗原、CAGE家族抗原、GAGE家族抗原、MAGE家族抗原、SAGE家族抗原、XAGE家族抗原、NY-ESO-1/LAGE-1、PRAME、SSX-2、Melan-A、MART-1、Gp100、pmel17、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、P.多肽、MC1R、前列腺特异性抗原、β-连环蛋白、BRCA1、BRCA2、CDK4、CML66、纤连蛋白、MART-2、p53、Ras、TGF-βRII或MUC1。在一些实施例中，癌抗原是CEA。在一些实施例中，癌抗原是未成熟的层粘连蛋白受体。在一些实施例中，癌抗原是TAG-72。在一些实施例中，癌抗原是HPV E6。在一些实施例中，癌抗原是HPV E7。在一些实施例中，癌抗原是BING-4。在一些实施例中，癌抗原是钙活化的氯化物通道2。在一些实施例中，癌抗原是周期蛋白-B1。在一些实施例中，癌抗原是9D7。在一些实施例中，癌抗原是EpCAM。在一些实施例中，癌抗原是EphA3。在一些实施例中，癌抗原是Her2/neu。在一些实施例中，癌抗原是端粒酶。在一些实施例中，癌抗原是间皮素。在一些实施例中，癌抗原是SAP-1。在一些实施例中，癌抗原是存活蛋白。在一些实施例中，癌抗原是BAGE家族抗原。在一些实施例中，癌抗原是CAGE家族抗原。在一些实施例中，癌抗原是GAGE家族抗原。在一些实施例中，癌抗原是MAGE家族抗原。在一些实施例中，癌抗原是SAGE家族抗原。在一些实施例中，癌抗原是XAGE家族抗原。在一些实施例中，癌抗原是NY-ESO-1/LAGE-1。在一些实施例中，癌抗原是PRAME。在一些实施例中，癌抗原是SSX-2。在一些实施例中，癌抗原是Melan-A。在一些实施例中，癌抗原是MART-1。在一些实施例中，癌抗原是Gp100。在一些实施例中，癌抗原是pmel17。在一些实施例中，癌抗原是酪氨酸酶。在一些实施例中，癌抗原是TRP-1。在一些实施例中，癌抗原是TRP-2。在一些实施例中，癌抗原是P.多肽。在一些实施例中，癌抗原是MC1R。在一些实施例中，癌抗原是前列腺特异性抗原。在一些实施例中，癌抗原是β-连环蛋白。在一些实施例中，癌抗原是BRCA1。在一些实施例中，癌抗原是BRCA2。在一些实施例中，癌抗原是CDK4。在一些实施例中，癌抗原是CML66。在一些实施例中，癌抗原是纤连蛋白。在一些实施例中，癌抗原是MART-2。在一些实施例中，癌抗原是p53。在一些实施例中，癌抗原是Ras。在一些实施例中，癌抗原是TGF-βRII。在一些实施例中，癌抗原是MUC1。
在一些实施例中，该肿瘤抗原包含与恶性肿瘤相关的一个或多个抗原癌症表位。恶性肿瘤表达许多可用作免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，例如黑色素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和gp100，以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其他靶分子属于转化相关分子组，如癌基因HER2/Neu/ErbB-2。又一组靶抗原是癌胚胎抗原，如癌胚抗原(CEA)。
在一些实施例中，肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA是肿瘤细胞所特有的，并且不存在于体内的其他细胞上。TAA相关抗原不是肿瘤细胞所特有的，相反，它也可以在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可以在使免疫系统能够对抗原作出应答的条件下发生。TAA可能是在胚胎发育期间在正常细胞上表达的抗原，此时免疫系统不成熟且不能作出应答，或者它们可能是在正常细胞上通常以极低的水平正常存在但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。
TSA或TAA抗原的非限制性实例包括：分化抗原，如MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原，如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5；过表达的胚胎抗原，如CEA；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因，如p53、Ras、HER2/neu；由染色体易位产生的独特肿瘤抗原，如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，如爱泼斯坦-巴尔病毒抗原EBVA及人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。
其他基于蛋白质的大抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA15-3\CA27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环素C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
本文提供的CAR的其他非限制性示例性靶点包括GPC2、CD276、δ样蛋白配体3(DLL3)、NY-ESO-1、黑色素瘤相关抗原4；存活蛋白、滑膜肉瘤X断裂点蛋白2、CD3、表皮生长因子受体(EGFR)、erbb2酪氨酸激酶受体、HER2、CEA、CD66、CD66e、ROR1、ntrkr1酪氨酸激酶受体、GPC3、密蛋白18.2、间皮素、谷氨酸羧肽酶II、PMSA、PD-L1、叶酸受体α、PSCA、粘蛋白1、HLA抗原(诸如HLA I类抗原A-2α、HLA I类抗体A-11α和HLA II类抗原)、c-Met、肝细胞生长因子受体、K-Ras GTP酶(KRAS)、IL-15受体、Kit酪氨酸激酶、PDGF受体β、RET酪氨酸激酶受体；Raf 1蛋白激酶、Raf B蛋白激酶、胸苷酸合成酶、拓扑异构酶II、Brachyury蛋白、Flt3酪氨酸激酶、VEGF、VEGF受体(VEGF-1受体、VEGF-2受体和VEGF-3受体)、雌激素受体、新生抗原、人乳头瘤病毒E6和热休克蛋白。
在一些特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是CD19。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是CD20。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是CD22。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是BCMA。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是VEGFR2。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是FAP。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是EpCam。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是GPC3。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是密蛋白18.2。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是CD133。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是IL13Ra。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是EGFRIII。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是EphA2。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是Muc1。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是CD70。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是CD123。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是ROR1。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是PSMA。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是CD5。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是GD2。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是GAP。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是CD33。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是CEA。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是PSCA。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是Her2。在其他特定实施例中，本发明CAR的至少一种靶抗原是间皮素。
在一些实施例中，本文提供的CAR结合B细胞抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD2、CD5、CD6、CD9、CD11a、CD11b、CD11c、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD29、CD30、CD31、CD32a、CD32b、CD35、CD37、CD38、CD39、CD40、CD45、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RO、CD46、CD47、CD48、CD49b、CD49c、CD49d、CD50、CD52、CD53、CD54、CD55、CD58、CD60a、CD62L、CD63、CD68、CD69、CD70、CD72、CD73、CD74、CD75、CD75S、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85E、CD85I、CD85J、CD86、CD92、CD95、CD97、CD98、CD99、CD100、CD102、CD108、CD119、CD120a、CD120b、CD121b、CD122、CD124、CD125、CD126、CD130、CD132、CD137、CD138、CD139、CD147、CD148、CD150、CD152、CD162、CD164、CD166、CD167a、CD170、CD171、CD175、CD175s、CD180、CD184、CD185、CD192、CD196、CD197、CD200、CD205、CD201a、CDw210b、CD212、CD213a1、CD213a2、CD 215、CD217、CD218a、CD218b、CD220、CD221、CD222、CD224、CD225、CD226、CD227、CD229、CD230、CD232、CD252、CD252、CD254、CD255、CD256、CD257、CD258、CD259、CD260、CD261、CD262、CD263、CD264、CD267、CD268、CD269、CD270、CD272、CD274、CD275、CD277、CD279、CD283、CD289、CD290、CD295、CD298、CD300、CD300c、CD305、CD306、CD307a、CD307b、CD307c、CD307d、CD307e、CD314、CD215、CD316、CD317、CD319、CD321、CD327、CD328、CD329、CD338、CD351、CD352、CD353、CD354、CD355、CD356、CD357、CD358、CD360、CD361、CD362或CD363抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD1a抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD1b抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD1c抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD1d抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD2抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD5抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD6抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD9抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD11a抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD11b抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD11c抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD17抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD18抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD19抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD20抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD21抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD22抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD23抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD24抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD25抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD26抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD27抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD29抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD30抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD31抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD32a抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD32b抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD35抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD37抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD38抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD39抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD40抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD45抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD45RA抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD45RB抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD45RC抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD45RO抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD46抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD47抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD48抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD49b抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD49c抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD49d抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD50抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD52抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD53抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD54抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD55抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD58抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD60a抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD62L抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD63抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD68抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD69抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD70抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD72抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD73抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD74抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD75抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD75S抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD77抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD79a抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD79b抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD80抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD81抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD82抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD83抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD84抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD85E抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD85I抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD85J抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD86抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD92抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD95抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD97抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD98抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD99抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD100抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD102抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD108抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD119抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD120a抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD120b抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD121b抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD122抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD124抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD125抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD126抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD130抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD132抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD137抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD138抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD139抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD147抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD148抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD150抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD152抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD162抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD164抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD166抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD167a抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD170抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD171抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD175抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD175s抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD180抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD184抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD185抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD192抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD196抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD197抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD200抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD205抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD201a抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CDw210b抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD212抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD213a1抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD213a2抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD 215抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD217抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD218a抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD218b抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD220抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD221抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD222抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD224抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD225抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD226抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD227抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD229抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD230抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD232抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD252抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD252抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD254抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD255抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD256抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD257、CD258抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD259抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD260抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD261抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD262抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD263抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD264抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD267抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD268抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD269抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD270抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD272抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD274抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD275抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD277抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD279抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD283抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD289抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD290抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD295抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD298抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD300抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD300c抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD305抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD306抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD307a抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD307b抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD307c抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD307d抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD307e抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD314抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD215抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD316抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD317抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD319抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD321抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD327抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD328抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD329抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD338抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD351抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD352抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD353抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD354抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD355抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD356抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD357抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD358抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD360抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD361抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD362抗原。在一些实施例中，B细胞抗原是CD363抗原。
在一个实施例中，本发明CAR的靶点是病原体。在某些实施例中，靶细胞是包含病原体的细胞。
在一些实施例中，病原体引起选自由以下组成的组的感染性疾病：急性弛缓性脊髓炎(AFM)，边虫病，炭疽，巴贝西虫病(Babesiosis)，肉毒杆菌中毒(Botulism)，布鲁氏菌病(Brucellosis)，弯曲杆菌病(Campylobacteriosis)，耐碳青霉烯感染，软下疳，基孔肯亚病毒感染(Chikungunya Virus Infection)，衣原体疾病，鱼肉毒，艰难梭菌感染(Difficile Infection)，产气荚膜梭菌疾病、球孢子菌病真菌感染，冠状病毒感染，Covid-19(SARS-CoV-2)，克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jacob Disease)/传染性海绵状脑病，隐孢子虫病(Crypto)，环孢子虫病，1、2、3或4型登革热，白喉，大肠杆菌感染/产志贺毒素(STEC)，东方马脑炎，出血热(埃博拉)，埃立克体病，脑炎，虫媒病毒或副感染性疾病，非脊髓灰质炎肠道病毒，D68肠道病毒疾病(EV-D68)，贾第虫病，鼻疽病，淋球菌感染，腹股沟肉芽肿，B型流感嗜血杆菌病(Hib或H-流感)，汉坦病毒肺综合征(HPS)，溶血性尿毒症综合征(HUS)，甲型肝炎(Hep A)，乙型肝炎(Hep B)，丙型肝炎(Hep C)，丁型肝炎(Hep D)，戊型肝炎(Hep E)，疱疹，带状疱疹(Herpes Zoster/Shingles)，组织胞浆菌病感染，人类免疫缺陷病毒/艾滋病(HIV/AIDS)，人乳头瘤病毒(HPV)，流感(Flu)，军团杆菌病(军团病)，麻风(汉森氏病)，钩端螺旋体病，李斯特菌病(李斯特菌)，莱姆病，性病淋巴肉芽肿感染(LGV)，疟疾，麻疹，类鼻疽，脑膜炎(病毒性)，脑膜炎球菌病(脑膜炎(细菌性))，中东呼吸综合征冠状病毒疾病(MERS-CoV)，腮腺炎，诺如病毒疾病，虱病，盆腔炎性疾病(PID)，百日咳(顿咳)，鼠疫(腺鼠疫、败血病性鼠疫、肺炎性鼠疫)，肺炎球菌病(肺炎)，脊髓灰质炎(脊灰(Polio))，波瓦生，鹦鹉热，阴虱病(Pthiriasis)，脓疱疹病(天花、猴痘、牛痘)，Q热，狂犬病，立克次体病(落基山斑疹热)，风疹(Rubella/German Measles)，沙门氏菌胃肠炎(沙门氏菌)，疥疮，鲭鱼中毒(Scombroid)，脓毒症，严重急性呼吸综合征(SARS)，志贺菌病胃肠炎(志贺菌)，天花，耐甲氧西林葡萄球菌感染(MRSA)，葡萄球菌食物中毒肠毒素B中毒(葡萄球菌食物中毒)，万古霉素中度耐药性葡萄球菌感染(VISA)，万古霉素耐药性葡萄球菌感染(VRSA)，A组链球菌病(侵袭性)(Strep A(侵袭性))，B组链球菌病(Strep-B)，链球菌中毒性休克综合征STSS中毒性休克，梅毒(原发性、继发性、早期潜伏性、晚期潜伏性、先天性)，破伤风感染，滴虫病，旋毛虫病(Trichonosis)感染，结核病(TB)，潜伏性结核病(LTBI)，兔热病，D组伤寒症，阴道病，水痘(Varicella/Chickenpox)，霍乱弧菌疾病(霍乱)，弧菌病(弧菌)，埃博拉病毒出血热，拉沙病毒(Lasa Virus)出血热，马尔堡病毒出血热，西尼罗病毒，黄热病，耶尔森氏菌(Yersenia)疾病和寨卡病毒感染。在一些实施例中，感染性疾病是急性弛缓性脊髓炎(AFM)。在一些实施例中，感染性疾病是边虫病。在一些实施例中，感染性疾病是炭疽。在一些实施例中，感染性疾病是巴贝西虫病。在一些实施例中，感染性疾病是肉毒杆菌中毒。在一些实施例中，感染性疾病是布鲁氏菌病。在一些实施例中，感染性疾病是弯曲杆菌病。在一些实施例中，感染性疾病是耐碳青霉烯感染。在一些实施例中，感染性疾病是软下疳。在一些实施例中，感染性疾病是基孔肯亚病毒感染。在一些实施例中，感染性疾病是衣原体疾病。在一些实施例中，感染性疾病是鱼肉毒。在一些实施例中，感染性疾病是艰难梭菌感染。在一些实施例中，感染性疾病是产气荚膜梭菌。在一些实施例中，感染性疾病是球孢子菌病真菌感染。在一些实施例中，感染性疾病是冠状病毒疾病。在一些实施例中，感染性疾病是Covid-19(SARS-CoV-2)。在一些实施例中，感染性疾病是克罗伊茨费尔特-雅各布病/传染性海绵状脑病。在一些实施例中，感染性疾病是隐孢子虫病(Crypto)。在一些实施例中，感染性疾病是环孢子虫病。在一些实施例中，感染性疾病是1、2、3或4型登革热。在一些实施例中，感染性疾病是白喉。在一些实施例中，感染性疾病是大肠杆菌感染/产志贺毒素(STEC)。在一些实施例中，感染性疾病是东方马脑炎。在一些实施例中，感染性疾病是出血热(埃博拉)。在一些实施例中，感染性疾病是埃立克体病。在一些实施例中，感染性疾病是脑炎。在一些实施例中，感染性疾病是虫媒病毒或副感染性疾病。在一些实施例中，感染性疾病是非脊髓灰质炎肠道病毒。在一些实施例中，感染性疾病是D68肠道病毒疾病(EV-D68)。在一些实施例中，感染性疾病是贾第虫病。在一些实施例中，感染性疾病是鼻疽病。在一些实施例中，感染性疾病是淋球菌感染。在一些实施例中，感染性疾病是腹股沟肉芽肿。在一些实施例中，感染性疾病是B型流感嗜血杆菌病(Hib或H-流感)。在一些实施例中，感染性疾病是汉坦病毒肺综合征(HPS)。在一些实施例中，感染性疾病是溶血性尿毒症综合征(HUS)。在一些实施例中，感染性疾病是甲型肝炎(Hep A)。在一些实施例中，感染性疾病是乙型肝炎(Hep B)。在一些实施例中，感染性疾病是丙型肝炎(Hep C)。在一些实施例中，感染性疾病是丁型肝炎(Hep D)。在一些实施例中，感染性疾病是戊型肝炎(Hep E)。在一些实施例中，感染性疾病是疱疹。在一些实施例中，感染性疾病是带状疱疹(HerpesZoster/Shingles)。在一些实施例中，感染性疾病是组织胞浆菌病感染。在一些实施例中，感染性疾病是人类免疫缺陷病毒/艾滋病(HIV/AIDS)。在一些实施例中，感染性疾病是人乳头瘤病毒(HPV)。在一些实施例中，感染性疾病是流感(Flu)。在一些实施例中，感染性疾病是军团杆菌病(军团病)。在一些实施例中，感染性疾病是麻风(汉森氏病)。在一些实施例中，感染性疾病是钩端螺旋体病。在一些实施例中，感染性疾病是李斯特菌病(李斯特菌)。在一些实施例中，感染性疾病是莱姆病。在一些实施例中，感染性疾病是性病淋巴肉芽肿感染(LGV)。在一些实施例中，感染性疾病是疟疾。在一些实施例中，感染性疾病是麻疹。在一些实施例中，感染性疾病是类鼻疽。在一些实施例中，感染性疾病是脑膜炎(病毒性)。在一些实施例中，感染性疾病是脑膜炎球菌病(脑膜炎(细菌性))。在一些实施例中，感染性疾病是中东呼吸综合征冠状病毒疾病(MERS-CoV)。在一些实施例中，感染性疾病是腮腺炎。在一些实施例中，感染性疾病是诺如病毒疾病。在一些实施例中，感染性疾病是虱病。在一些实施例中，感染性疾病是盆腔炎性疾病(PID)。在一些实施例中，感染性疾病是百日咳(顿咳)。在一些实施例中，感染性疾病是鼠疫(腺鼠疫；在一些实施例中，感染性疾病是败血病性鼠疫；在一些实施例中，感染性疾病是肺炎性鼠疫)。在一些实施例中，感染性疾病是肺炎球菌病(肺炎)。在一些实施例中，感染性疾病是脊髓灰质炎(脊灰)。在一些实施例中，感染性疾病是波瓦生。在一些实施例中，感染性疾病是鹦鹉热。在一些实施例中，感染性疾病是阴虱病。在一些实施例中，感染性疾病是脓疱疹病(天花；在一些实施例中，感染性疾病是猴痘；在一些实施例中，感染性疾病是牛痘)。在一些实施例中，感染性疾病是Q热。在一些实施例中，感染性疾病是狂犬病。在一些实施例中，感染性疾病是立克次体病(落基山斑疹热)。在一些实施例中，感染性疾病是风疹(Rubella/German Measles)。在一些实施例中，感染性疾病是沙门氏菌胃肠炎(沙门氏菌)。在一些实施例中，感染性疾病是疥疮。在一些实施例中，感染性疾病是鲭鱼中毒。在一些实施例中，感染性疾病是脓毒症。在一些实施例中，感染性疾病是严重急性呼吸综合征(SARS)。在一些实施例中，感染性疾病是志贺菌病胃肠炎(志贺菌)。在一些实施例中，感染性疾病是天花。在一些实施例中，感染性疾病是耐甲氧西林葡萄球菌感染(MRSA)。在一些实施例中，感染性疾病是葡萄球菌食物中毒肠毒素B中毒(葡萄球菌食物中毒)。在一些实施例中，感染性疾病是万古霉素中度耐药性葡萄球菌感染(VISA)。在一些实施例中，感染性疾病是万古霉素耐药性葡萄球菌感染(VRSA)。在一些实施例中，感染性疾病是A组链球菌病(侵袭性)(Strep A(侵袭性))。在一些实施例中，感染性疾病是链球菌病。在一些实施例中，感染性疾病是B组疾病(Strep-B)。在一些实施例中，感染性疾病是链球菌中毒性休克综合征STSS中毒性休克。在一些实施例中，感染性疾病是梅毒(原发性；在一些实施例中，感染性疾病是继发性的；在一些实施例中，感染性疾病是早期潜伏性的；在一些实施例中，感染性疾病是晚期潜伏性的；在一些实施例中，感染性疾病是先天性的)。在一些实施例中，感染性疾病是破伤风感染。在一些实施例中，感染性疾病是滴虫病。在一些实施例中，感染性疾病是旋毛虫病感染。在一些实施例中，感染性疾病是结核病(TB)。在一些实施例中，感染性疾病是潜伏性结核病(LTBI)。在一些实施例中，感染性疾病是兔热病。在一些实施例中，感染性疾病是D组伤寒症。在一些实施例中，感染性疾病是阴道病。在一些实施例中，感染性疾病是水痘(Varicella/Chickenpox)、霍乱弧菌疾病(霍乱)。在一些实施例中，感染性疾病是弧菌病(弧菌)。在一些实施例中，感染性疾病是埃博拉病毒出血热。在一些实施例中，感染性疾病是拉沙病毒出血热。在一些实施例中，感染性疾病是马尔堡病毒出血热。在一些实施例中，感染性疾病是西尼罗病毒。在一些实施例中，感染性疾病是黄热病。在一些实施例中，感染性疾病是耶尔森氏菌疾病。在一些实施例中，感染性疾病是寨卡病毒感染。
在一些实施例中，病原体是细菌。在一些实施例中，细菌是芽孢杆菌属、巴尔通体属(bartonella)、鲍特菌属(bordetella)、包柔氏螺旋体属(borrelia)、布鲁氏菌属(brucella)、弯曲杆菌属、衣原体属、类衣原体属、梭菌属、棒状杆菌属、肠球菌属、埃希氏菌属、弗朗西丝菌属、嗜血杆菌属、螺杆菌属、军团杆菌属、钩端螺旋体属、李斯特菌属、分枝杆菌属、支原体属、奈瑟菌属、假单胞菌属、立克次氏体属、沙门氏菌属、志贺菌属、葡萄球菌属、链球菌属、密螺旋体属、脲原体属、弧菌属或耶尔森氏菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是芽孢杆菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是巴尔通体属的细菌。在一些实施例中，细菌是鲍特菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是包柔氏螺旋体属的细菌。在一些实施例中，细菌是布鲁氏菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是弯曲杆菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是衣原体属的细菌。在一些实施例中，细菌是类衣原体属的细菌。在一些实施例中，细菌是梭菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是棒状杆菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是肠球菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是埃希氏菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是弗朗西丝菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是嗜血杆菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是螺杆菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是军团杆菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是钩端螺旋体属的细菌。在一些实施例中，细菌是李斯特菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是分枝杆菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是支原体属的细菌。在一些实施例中，细菌是奈瑟菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是假单胞菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是立克次氏体属的细菌。在一些实施例中，细菌是沙门氏菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是志贺菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是葡萄球菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是链球菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是密螺旋体属的细菌。在一些实施例中，细菌是脲原体属的细菌。在一些实施例中，细菌是弧菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是耶尔森氏菌属的细菌。
在一些实施例中，病原体是寄生虫。在一些实施例中，寄生虫是原生动物、蠕虫或体外寄生虫。在一些实施例中，原生动物是内阿米巴虫、贾第虫、利什曼原虫、肠袋虫、疟原虫或隐孢子虫。在一些实施例中，蠕虫是吸虫、绦虫、棘头虫或蛔虫。在一些实施例中，体外寄生虫是节肢动物。
在一些实施例中，病原体是病毒。在一些实施例中，病毒是腺病毒科、沙粒病毒科、星状病毒科、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、杯状病毒科、冠状病毒科、丝状病毒科、黄病毒科、嗜肝DNA病毒科、肝炎病毒科、正黏液病毒科、乳头瘤病毒科、副黏液病毒科、细小病毒科、小核糖核酸病毒科、多瘤病毒科、痘病毒科、呼肠孤病毒科、逆转录病毒科、弹状病毒科或披膜病毒科的病毒。在一些实施例中，科。在一些实施例中，病毒是腺病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是沙粒病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是星状病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是布尼亚病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是杯状病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是冠状病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是丝状病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是黄病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是嗜肝DNA病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是肝炎病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是正黏液病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是乳头瘤病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是副黏液病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是细小病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是小核糖核酸病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是多瘤病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是痘病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是呼肠孤病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是逆转录病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是弹状病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是披膜病毒科的病毒。
在一些实施例中，病毒是腺病毒、冠状病毒、柯萨奇病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒2型、巨细胞病毒、人类疱疹病毒8型、人类免疫缺陷病毒、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒、副流感病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、风疹病毒或水痘-带状疱疹病毒。在一些实施例中，病毒是腺病毒。在一些实施例中，病毒是冠状病毒。在一些实施例中，冠状病毒是Covid-19(SARS-CoV-2)。在一些实施例中，病毒是柯萨奇病毒。在一些实施例中，病毒是爱泼斯坦-巴尔病毒。在一些实施例中，病毒是甲型肝炎病毒。在一些实施例中，病毒是乙型肝炎病毒。在一些实施例中，病毒是丙型肝炎病毒。在一些实施例中，病毒是单纯疱疹病毒2型。在一些实施例中，病毒是巨细胞病毒。在一些实施例中，病毒是人类疱疹病毒8型。在一些实施例中，病毒是人类免疫缺陷病毒。在一些实施例中，病毒是流感病毒。在一些实施例中，病毒是麻疹病毒。在一些实施例中，病毒是腮腺炎病毒。在一些实施例中，病毒是人乳头瘤病毒。在一些实施例中，病毒是副流感病毒。在一些实施例中，病毒是脊髓灰质炎病毒。在一些实施例中，病毒是狂犬病病毒。在一些实施例中，病毒是呼吸道合胞病毒。在一些实施例中，病毒是风疹病毒。在一些实施例中，病毒是水痘-带状疱疹病毒。
跨膜结构域
本披露的CAR包含可以直接或间接与胞外抗原结合结构域融合的跨膜结构域。跨膜结构域可源自天然或合成来源。如本文所用，“跨膜结构域”是指在细胞膜(优选地真核细胞膜)中热力学稳定的任何蛋白质结构。适用于本文所述的CAR的跨膜结构域可获自天然存在的蛋白。替代性地，其可以是合成的、非天然存在的蛋白区段，例如，在细胞膜中热力学稳定的疏水蛋白区段。
根据跨膜结构域的三维结构对跨膜结构域进行分类。例如，跨膜结构域可形成α螺旋、多于一个α螺旋的复合物、β-桶状结构或能够跨越细胞磷脂双层的任何其他稳定结构。另外，跨膜结构域也可以或替代性地根据跨膜结构域拓扑结构进行分类，包括跨膜结构域穿过膜的次数和蛋白的取向。例如，单途径膜蛋白穿过细胞膜一次，而多途径膜蛋白穿过细胞膜至少两次(例如，2、3、4、5、6、7或更多次)。膜蛋白可以被定义为I型、II型或III型，这取决于它们的末端和一个或多个穿膜区段相对于细胞内部和外部的拓扑结构。I型膜蛋白具有单个跨膜区，并且其定向为使得蛋白的N末端存在于细胞的脂质双层的胞外侧，而该蛋白的C末端存在于胞内侧。II型膜蛋白也具有单个跨膜区，但其定向为使得蛋白的C末端存在于细胞的脂质双层的胞外侧，而该蛋白的N末端存在于胞内侧。III型膜蛋白具有多个跨膜区段，并且可根据跨膜区段的数量和N末端和C末端的位置进一步分类。
在一些实施例中，本文所述的CAR的跨膜结构域源自I型单途径膜蛋白。在一些实施例中，来自多途径膜蛋白的跨膜结构域也可以与用于本文所述的CAR相容。多途径膜蛋白可以包含复合物(至少2、3、4、5、6、7或更多)α螺旋或β折叠结构。在一些实施例中，多途径膜蛋白的N末端和C末端存在于脂质双层的相对侧，例如，蛋白的N末端存在于脂质双层的胞内侧，而该蛋白的C末端存在于胞外侧。
用于本文所述的CAR的跨膜结构域还可以包含合成的、非天然存在的蛋白区段的至少一部分。在一些实施例中，跨膜结构域是合成的、非天然存在的α螺旋或β折叠。在一些实施例中，蛋白区段为至少约20个氨基酸，例如，至少18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸。合成的跨膜结构域的实例是本领域已知的，例如在美国专利号7,052,906和PCT公开号WO2000/032776中，其相关披露内容通过援引并入本文。
本文提供的跨膜结构域可以包含跨膜区和位于跨膜结构域的C末端侧的胞内区。跨膜结构域的胞内区可包含三个或更多个氨基酸，并且在一些实施例中，有助于使跨膜结构域在脂质双层中定向。在一些实施例中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的跨膜区中。在一些实施例中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的胞内区中。在一些实施例中，跨膜结构域的胞内区包含带正电荷的氨基酸。在一些实施例中，跨膜结构域的胞内区包含氨基酸精氨酸、丝氨酸和赖氨酸。
在一些实施例中，跨膜结构域的跨膜区包含疏水性氨基酸残基。在一些实施例中，本文提供的CAR的跨膜结构域包含人工疏水性序列。例如，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体可以存在于跨膜结构域的C末端处。在一些实施例中，跨膜区主要包含疏水性氨基酸残基，例如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或缬氨酸。在一些实施例中，跨膜区是疏水性的。在一些实施例中，跨膜区包含聚亮氨酸-丙氨酸序列。蛋白或蛋白区段的亲水性或者疏水性或亲水性特征可以通过本领域已知的任何方法来评估，例如Kyte和Doolittle亲水性分析。
在一些实施例中，CAR的跨膜结构域包含选自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CDl la、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CD19、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDlld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C的跨膜结构域。
在一些特定实施例中，跨膜结构域源自CD8α。在其他特定实施例中，跨膜结构域源自CD28α。
胞内信号传导结构域
本文提供的CAR内的胞内信号传导结构域负责活化表达CAR的免疫效应细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的特殊功能。例如，T细胞的效应子功能可以是溶细胞活性或辅助活性(包括细胞因子的分泌)。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞执行特定功能的蛋白部分。虽然通常可以使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下不需要使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，可以使用这种截短部分代替完整链，只要它转导效应子功能信号。因此，术语胞内信号传导结构域意指包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。在一些实施例中，CAR包含基本上由免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域组成的胞内信号传导结构域。“初级胞内信号传导结构域”是指以刺激方式起作用以诱导免疫效应子功能的胞内信号传导序列。在一些实施例中，初级胞内信号传导结构域含有称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。如本文所用，“ITAM”是保守蛋白基序，其通常存在于许多免疫细胞中表达的信号传导分子的尾部。基序可以包含由6-8个氨基酸分开的氨基酸序列YxxL/I的两个重复，其中每个x独立地为任何氨基酸，产生保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I。信号传导分子内的ITAM对于细胞内的信号转导很重要，该信号转导至少部分由信号传导分子活化后ITAM中的酪氨酸残基的磷酸化介导。ITAM也可以作为参与信号传导途径的其他蛋白的对接位点。示例性含有ITAM的初级胞内信号传导序列包括源自CD3z、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。
共刺激信号传导结构域
在一些实施例中，CAR包含至少一个共刺激信号传导结构域。如本文所用，术语“共刺激信号传导结构域”是指介导细胞内信号转导以诱导免疫应答(例如，效应子功能)的蛋白的至少一部分。除了刺激抗原特异性信号之外，许多免疫效应细胞还需要共刺激，以促进细胞增殖、分化和存活，以及活化细胞的效应子功能。
本文所述的嵌合受体的共刺激信号传导结构域可以是来自共刺激蛋白的胞内信号传导结构域，其转导信号并调节由免疫细胞诸如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞介导的反应。“共刺激信号传导结构域”可以是共刺激分子的胞内部分。术语“共刺激分子”是指免疫细胞(例如，T细胞)上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导免疫细胞的共刺激应答，例如但不限于增殖和存活。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含单个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含两个或更多个(例如，约2、3、4个或更多个中的任一个)共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含两个或更多个相同的共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含来自不同共刺激蛋白(例如，本文所述的任两个或更多个共刺激蛋白)的两个或更多个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含初级胞内信号传导结构域(诸如CD3z的胞内信号传导结构域)和一个或多个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，一个或多个共刺激信号传导结构域和初级胞内信号传导结构域(诸如CD3z的胞内信号传导结构域)通过任选的肽接头彼此融合。初级胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导结构域可以按任何合适的顺序排列。在一些实施例中，一个或多个共刺激信号传导结构域位于跨膜结构域与初级胞内信号传导结构域(诸如CD3z的胞内信号传导结构域)之间。多个共刺激信号传导结构域可提供累加或协同刺激作用。
宿主细胞(例如，免疫细胞)中共刺激信号传导结构域的活化可诱导细胞增加或减少细胞因子的产生和分泌、吞噬性质、增殖、分化、存活和/或细胞毒性。任何共刺激分子的共刺激信号传导结构域可适用于本文所述的CAR。共刺激信号传导结构域的一个或多个类型基于诸如效应分子将在其中表达的免疫效应细胞的类型(例如，T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞)和所需的免疫效应子功能(例如，ADCC效应)等因素来选择。用于CAR的共刺激信号传导结构域的实例可以是共刺激蛋白的胞内信号传导结构域，包括但不限于B7/CD28家族的成员(例如，B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC和PDCD6)；TNF超家族的成员(例如，4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α和TNF RII/TNFRSF1B)；SLAM家族的成员(例如，2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6和SLAM/CD150)；以及任何其他共刺激分子，例如CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I类、HLA-DR、Ikaros、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和NKG2C。在一些实施例中，一个或多个共刺激信号传导结构域选自由以下组成的组：CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性结合CD83的配体。
在一些实施例中，共刺激信号传导结构域是本文所述的任何共刺激信号传导结构域的变体，使得共刺激信号传导结构域能够调节免疫细胞的免疫应答。在一些实施例中，与野生型对照物相比，共刺激信号传导结构域包含多达10个氨基酸残基变异(例如，1个、2个、3个、4个、5个或8个)。包含一个或多个氨基酸变化的此类共刺激信号传导结构域可称为变体。相对于不包含突变的共刺激信号传导结构域，共刺激信号传导结构域的氨基酸残基的突变可导致信号转导的增加和增强的对免疫应答的刺激。相对于不包含突变的共刺激信号传导结构域，共刺激信号传导结构域的氨基酸残基的突变可导致信号转导的减少和降低的对免疫应答的刺激。
信号肽
在某些实施例中，本文提供的CAR可以包含多肽的N末端处的信号肽(也称为信号序列)。通常，信号肽是使多肽靶向细胞中所需位点的肽序列。在一些实施例中，信号肽将效应分子靶向细胞的分泌途径，并允许效应分子整合和锚定到脂质双层中。适用于本文所述的CAR且包含天然存在的蛋白的信号序列或合成的、非天然存在的信号序列的信号肽对于本领域技术人员将是显而易见的。在一些实施例中，信号肽源自选自由CD8α、GM-CSF受体α和IgG1重链组成的组的分子。
铰链区
在一些实施例中，本文提供的CAR可以包含位于胞外抗原结合结构域与跨膜结构域之间的铰链结构域。铰链结构域是通常在蛋白的两个结构域之间发现的氨基酸区段，并且可以允许蛋白的柔性和一个或两个结构域相对于彼此的运动。可以使用提供胞外抗原结合结构域相对于效应分子的跨膜结构域的这种柔性和运动的任何氨基酸序列。
抗体(诸如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体)的铰链结构域也适用于本文所述的pH依赖性嵌合受体系统。在一些实施例中，铰链结构域是连接抗体的恒定结构域CH1和CH2的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域是抗体的铰链结构域，并且包含抗体及该抗体的一个或多个恒定区的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域包含抗体及该抗体的CH3恒定区的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域包含抗体及该抗体的CH2和CH3恒定区的铰链结构域。在一些实施例中，抗体是IgG、IgA、IgM、IgE、或IgD抗体。在一些实施例中，抗体是IgG抗体。在一些实施例中，抗体是IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4抗体。在一些实施例中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区和CH2和CH3恒定区。在一些实施例中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区和CH3恒定区。
非天然存在的肽也可用作本文所述的嵌合受体的铰链结构域。在一些实施例中，Fc受体的胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域是肽接头，诸如(GxS)n接头，其中x和n可以独立地为介于3和12之间的整数，包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更大。
铰链结构域可以含有约10-100个氨基酸，例如，约15-75个氨基酸、20-50个氨基酸或30-60个氨基酸中的任一个。在一些实施例中，铰链结构域的长度可以是至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75个氨基酸中的任一个。
在一些实施例中，铰链结构域是天然存在的蛋白的铰链结构域。本领域已知的包含铰链结构域的任何蛋白的铰链结构域均适用于本文所述的嵌合受体。在一些实施例中，铰链结构域是天然存在的蛋白的铰链结构域的至少一部分，并且赋予嵌合受体柔性。
在一些特定实施例中，铰链结构域源自CD8α。在一些实施例中，铰链结构域是CD8α的铰链结构域的一部分，例如，含有CD8α的铰链结构域的至少15个(例如20、25、30、35或40个)连续氨基酸的片段。在其他实施例中，铰链结构域源自CD28α。在一些实施例中，铰链结构域是CD28α的铰链结构域的一部分，例如，含有CD28α的铰链结构域的至少15个(例如20、25、30、35或40个)连续氨基酸的片段。
示例性CAR
本披露中可以使用任何CAR，包括但不限于KymriaTM(tisagenlecel)、YescartTM(axicabtagene ciloleucel)、ALEXIS AIDT-2EOC(Kiromic Biopharma Inc)、CIK-CAR.PSMA(Formula Pharmaceuticals Inc)、ADI-002(Adicet Bio Inc)、TSC-200(TScanTherapeutics Inc)、TSC-100(TScan Therapeutics Inc)、RB-H21(RefugeBiotechnologies Inc)、ADP-A2AFP(Adapimmune Therapeunics plc)、CT-0729(CarismaTherapeustics)、CT-1119(Carisma Therapeutics)、CCT-301-59(EXUMA Biotech Corp)、BOXR-889(Unum Therapeutics Inc)、meso-CAR-T+PD-78(MirImmune LLC)、MAGE-A10C796T(Adaptimune Therapeunics plc)、NKG2D-DARIC T细胞(Bluebird Bio Inc)、AGENt-NY-ESO-1X(AgenTus Therapeutics Inc)、MB-105(City of Hope Medical Center)、P-MUC1C-101(Poseida Therapeustics Inc)、TT-16(Baylor College of Medicine)、ACTR-087(Unum Therapeutics Inc)、EGFR-806(Seattle Children's Hospital)、TAC01-ROR1(Triumvira Immunologics Inc)、CCT-301-38(EXUMA Biotech Corp)、MB-103(MustangBio Inc)、TAB-28z(OncoTab Inc)、ET-1402(Eureka Therapeutics Inc)、ITI-1000(DukeUniversity)、CIDeCAR(Bellicum Pharmaceuticals Inc)、MT-201(Myeloid TherapeunicsInc)、CT-0508(Carisma Therapeustics)、ADP-A2M4(Adapeimune Therapeutics plc)、AMG-119(Amgen Inc)、iCasp9M28z T细胞(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)、P-PSMA-101(Poseida Therapeutics Inc)、ACE-1702(Acepodia Inc)、AIC-100(CornellUniversity)、PRGN-3005(Precigen Inc)、UniCAR-T-PSMA(GEMoaB Monoclonals GmbH)、IMA-204(MD Anderson Cancer Center)、DSG3-CAART(University of Pennsylvania)、LXF-821(University of Pennsylvania)、MOv19-BBz CAR T细胞(University ofPennsylvania)、Tn MUC-1CAR-T(University of Pennsylvania)、huMesoCART(Universityof Pennsylvania)、IMA-203(Immatics NV)、IMA-202(Immatics NV)、XYP-317(XyphosInc)、CYAD-101(Celyad Oncology)、huMNC2-CAR44 T细胞(Minerva BiotechnologiesCorp)、HER2Bi-armed ATC(Roger Williams Medical Center)和CYAD-200系列(CeldaraMedical LLC)、Lisocabtagene Maralequel(liso-cel)、FT596(Fate Therapeutics)、KTE-C19(Kite Pharma Inc)、KTE-X19(Kite Pharma Inc)、KITE-718(Kite Pharma Inc)、KITE-439(Kite Pharma Inc)、JCAR-024(Fred Hutchinson Cancer Research Center)、JCAR-023(Juno Therapeutics Inc)、BPX-201(Bellicum Pharmaceuticals Inc)、BPX-601(Bellicus Pharmacueticals Inc)、BPX-603(Bellicom Pharmaceeticals Inc)、MCY-M11(MaxCyte Inc)、KUR-503(Baylor College of Medicine)、ICS-200(University ofAlabama at Birmingham)、ADP-A2M4CD8(Adapeimune Therapeutics plc)、GLYCAR(BaylorCollege of Medicine)。
在某些实施例中，本文提供的CAR包含相对于上述和下文第8部分中的示例性CAR中的任一种具有一定同一性百分比的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供了CAR，该CAR包含胞外结构域或由该胞外结构域组成，该胞外结构域与上述和下文第8部分中的CAR的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在一些实施例中，考虑了本文所述的CAR的一个或多个氨基酸序列修饰。例如，可能需要优化胞外结构域的结合亲和力和/或其他生物学性质，包括但不限于特异性、热稳定性、表达水平、效应子功能、糖基化、降低的免疫原性或溶解性。因此，除了本文所述的胞外结构域，预期还可以制备本文所述的结构域的变体。例如，可以通过将适当的核苷酸变化引入编码DNA中和/或通过合成所需的抗体或多肽来制备scFv变体。本领域技术人员理解氨基酸改变可改变抗体的翻译后过程。
变异可以是编码多肽的一个或多个密码子的取代、缺失或插入，导致与原始抗体或多肽相比氨基酸序列发生改变。取代诱变的目的位点包括CDR和FR。
氨基酸取代可以是用具有相似结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸的结果，诸如用丝氨酸取代亮氨酸，例如保守氨基酸取代。本领域技术人员已知的标准技术可用于在编码本文提供的分子的核苷酸序列中引入突变，包括例如导致氨基酸取代的定点诱变和PCR介导的诱变。插入或缺失可任选地在约1至5个氨基酸的范围内。在某些实施例中，取代、缺失或插入包括相对于原始分子的少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。在特定实施例中，取代是在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行的保守氨基酸取代。所允许的变化可以通过在序列中系统地进行氨基酸的插入、缺失或取代并测试所得变体的亲本多肽表现出的活性来确定。
本披露包括通过保守氨基酸取代产生的多肽。可以进行保守(例如，在具有相似性质和/或侧链的氨基酸组内)取代，以便保持或不显著改变性质。
一种类型的取代变体涉及在本发明CAR的胞外抗原结合结构域中取代亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基或其片段。通常，选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体在某些生物学性质(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)方面具有修饰(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学性质。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以方便地产生，例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，诸如本文所述的那些。简而言之，一个或多个CDR残基突变并且变体抗体在噬菌体上展示并针对特定的生物活性(例如，结合亲和力)来筛选。
可以在CDR中进行改变(例如取代)，例如以提高抗体亲和力。可在CDR“热点”，即由在体细胞成熟过程中经历高频突变的密码子编码的残基(参见例如，Chowdhury,MethodsMol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中进行此类改变，其中测试所得变体抗体或其片段的结合亲和力。通过从二级文库中构建和重新选择的亲和力成熟描述于例如，Hoogenboom等人Methods in Molecular Biology178:1-37中(O'Brien等人编辑,HumanPress,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施例中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建二级文库。然后筛选文库以鉴定具有所需的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及CDR导向的方法，其中将几个CDR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以特异性鉴定参与抗原结合的CDR残基，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模。
在一些实施例中，取代、插入或缺失可以发生在一个或多个CDR内，只要此类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在CDR中进行不显著降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守取代)。在一些实施例中，每个CDR是未改变的或者含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
如Cunningham和Wells,Science,244:1081-1085(1989)所述，用于鉴定可以靶向诱变的抗体的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”。替代性地，或另外地，可以确定抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体与抗原之间的接触点。此类接触残基和邻近残基可以作为取代候选物而被靶向或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的性质。
氨基酸序列插入包括氨基末端和/或羧基末端融合，长度在一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的范围内，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括将抗体的N末端或C末端与增加抗原结合结构域抗体的血清半衰期的酶(例如，对于ADEPT)或多肽融合。
可以使用本领域已知的方法诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变来进行变化。可以对克隆的DNA进行定点诱变(参见例如，Carter,Biochem J.237:1-7(1986)；以及Zoller等人,Nucl.Acids Res.10:6487-500(1982))、盒式诱变(参见例如，Wells等人,Gene 34:315-23(1985))或其他已知技术以产生抗体变体DNA。
本披露还包括免疫效应细胞，该免疫效应细胞包含两种或更多种功能性外源受体，诸如结合两个不同靶点的双CAR。
7.2.3.免疫效应细胞
“免疫效应细胞”是指能发挥免疫效应子功能的免疫细胞。在一些实施例中，该免疫效应细胞至少表达FcγRIII，并且发挥ADCC效应子功能。介导ADCC的免疫效应细胞的实例包括外周血单个核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞、嗜中性粒细胞、和嗜酸性粒细胞。
在一些实施例中，免疫效应细胞是T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+、CD4-/CD8-、或其组合。在一些实施例中，T细胞在表达CAR并与靶细胞结合后产生IL-2、TFN和/或TNF。在一些实施例中，CD8+T细胞在表达CAR并与靶细胞结合后裂解抗原特异性靶细胞。
在一些实施例中，免疫效应细胞是NK细胞。在其他实施例中，免疫效应细胞可以是已建立的细胞系，例如NK-92细胞。
在一些实施例中，免疫效应细胞是从干细胞(如造血干细胞、多能干细胞、iPS、或胚胎干细胞)分化而来的。
工程化免疫效应细胞通过将本文提供的多肽引入免疫效应细胞诸如T细胞来制备。在一些实施例中，通过转染任何一种分离的核酸或任何一种上述载体将多肽引入免疫效应细胞。
将载体或分离的核酸引入哺乳动物细胞的方法是本领域已知的。所描述的载体可以通过物理、化学或生物方法转移到免疫效应细胞中。
将载体引入免疫效应细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生含有载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见，例如，Sambrook等人(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York。在一些实施例中，通过电穿孔将载体引入细胞中。
将载体引入免疫效应细胞的生物方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体已成为用于将基因插入哺乳动物例如人细胞的最广泛使用的方法。
用于将载体引入免疫效应细胞的化学方法包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。
在一些实施例中，编码本文所述的任何多肽的RNA分子可以通过常规方法(例如，体外转录)制备，然后通过已知方法诸如mRNA电穿孔引入免疫效应细胞中。参见例如，Rabinovich等人,Human Gene Therapy 17:1027-1035(2006)。
在一些实施例中，将转导的或转染的免疫效应细胞在引入载体或分离的核酸后离体增殖。在一些实施例中，将转导的或转染的免疫效应细胞培养以繁殖至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中的任一个。在一些实施例中，进一步评估或筛选转导或转染的免疫效应细胞以选择工程化哺乳动物细胞。
报告基因可用于鉴定可能转染的细胞和评估调控序列的功能。通常，报告基因是在受体生物体或组织中不存在或不表达的基因，该报告基因编码多肽，该多肽的表达通过一些易于检测的特性(例如，酶活性)来表现。报告基因的表达在DNA被引入受体细胞后的合适的时间检测。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌性碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人FEBS Letters 479:79-82(2000))。合适的表达系统是熟知的，并且可以使用已知技术制备或从商业上获得。
证实工程化免疫效应细胞中存在编码多肽的核酸的其他方法包括例如本领域技术人员熟知的分子生物学测定，例如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；生物化学测定，如例如通过免疫学方法(如ELISA和蛋白印迹)来检测特定肽的存在或不存在。
7.2.4.T细胞来源
在一些实施例中，在对T细胞进行扩增和基因修饰之前，从受试者获得T细胞来源。T细胞可以获得自许多来源，包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施例中，可以使用本领域可用的多种T细胞系。在一些实施例中，可以使用本领域技术人员已知的多种技术(例如，FicollTM分离)来从受试者收集的血液中获得T细胞。在一些实施例中，来自个体循环血的细胞是通过单采(apheresis)获得的。单采产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施例中，可以洗涤通过单采收集的细胞以除去血浆部分，并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。在一些实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施例中，洗涤溶液缺乏钙，并且可能缺乏镁，或可能缺乏许多(如果不是全部)二价阳离子。在不存在钙的情况下的初始活化步骤可以导致放大的活化。本领域的普通技术人员很容易理解，洗涤步骤可以通过本领域已知的方法完成，如根据制造商的说明使用半自动化“流动”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，如例如，无Ca2+、无Mg2+的PBS，PlasmaLyte A或者含或不含缓冲液的其他盐水溶液。替代性地，可以除去单采样品的不良组分，并将细胞直接重悬浮于培养基中。
在一些实施例中，通过例如，通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析来裂解红细胞并且消耗单核细胞来从外周血淋巴细胞分离T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一些实施例中，通过与抗CD3/抗CD28(即，3×28)缀合的珠(如M-450CD3/CD28T)孵育足以对所需的T细胞进行阳性选择的一段时间而分离T细胞。在一些实施例中，该时间段为约30分钟。在另一个实施例中，该时间段为30分钟至36小时或更长以及其间的所有整数值。在另一个实施例中，该时间段为至少1、2、3、4、5或6小时。在一些实施例中，该时间段为10到24小时。在一些实施例中，该孵育时间段为24小时。对于白血病患者的T细胞的分离，使用较长的孵育时间(如24小时)可以增加细胞产量。与其他细胞类型相比，在T细胞较少的任何情况下，如在从肿瘤组织或免疫受损个体中分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的情况下，可以使用较长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用较长的孵育时间可以增加CD8+T细胞的捕获效率。因此，在一些实施例中，通过简单地缩短或延长允许T细胞与CD3/CD28珠结合的时间和/或增加或减少珠与T细胞的比率，可以在培养开始时或在培养过程中的其他时间点优先选择或不选择T细胞的亚群。另外地，通过增加或减小珠或其他表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可以在培养开始时或其他所需的时间点优先选择或不选择T细胞的亚群。本领域的技术人员会认识到，也可以使用多轮选择。在一些实施例中，可能希望进行选择程序，并在活化和扩增过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可以进行进一轮的选择。
通过阴性选择富集T细胞群可以通过结合针对阴性选择细胞特有的表面标记的抗体来实现。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该方法使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施例中，可能希望富集或阳性选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。替代性地，在某些实施例中，通过抗C25缀合的珠或其他类似的选择方法消耗T调节性细胞。
为了通过阳性或阴性选择而分离所需的细胞群，可以改变细胞和表面(例如，粒子(如珠))的浓度。在某些实施例中，可能希望显著减少珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施例中，使用20亿个细胞/mL的浓度。在一个实施例中，使用10亿个细胞/mL的浓度。在另一个实施例中，使用大于1亿个细胞/mL。在另一个实施例中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/mL的细胞浓度。在又一实施例中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/mL的细胞浓度。在其他实施例中，可以使用1.25或1.50亿个细胞/mL的浓度。使用高浓度可导致细胞产量、细胞活化和细胞扩增增加。此外，使用高浓度的细胞可允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)、或来自存在许多肿瘤细胞的样品(即，白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群可能具有治疗价值，并且期望能够获得。在一些实施例中，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施例中，可能需要使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒，诸如珠)的混合物，使颗粒与细胞之间的相互作用最小化。这选择了表达大量结合颗粒的所需抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达更高水平的CD28，并且比稀释浓度的CD8+T细胞更有效地被捕获。在一些实施例中，使用的细胞的浓度为5×106个/mL。在一些实施例中，使用的浓度可以为约1×105个/mL至1×106个/mL，以及介于两者之间的任何整数值。
在一些实施例中，细胞可以在旋转器上以不同的速度在2℃-10℃或在室温下孵育不同的时间长度。
用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不受理论的束缚，冷冻和随后的解冻步骤可以通过去除细胞群中的粒细胞和在某种程度上去除单核细胞来提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数在本领域中是已知的并且在这种情况下是有用的，但是一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO，或31.25％plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其他合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以1℃/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储存罐的气相中。可以使用其他受控冷冻方法以及立即在-20℃或在液氮中的不受控冷冻。
在一些实施例中，如本文所述将冷冻保存的细胞解冻和洗涤，并在活化前在室温下静置一小时。
在本披露中还考虑了在可能需要如本文所述的扩增的细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采产物。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩增的细胞来源，并分离和冷冻所需的细胞，诸如T细胞，以随后在T细胞疗法中用于将受益于T细胞疗法的多种疾病或病状，诸如本文所述的那些。在一个实施例中，血液样品或单采血液成分取自一般健康受试者。在某些实施例中，血液样品或单采血液成分取自处于患疾病风险但尚未患疾病的一般健康受试者，并且分离并冷冻目的细胞以备后用。在某些实施例中，T细胞可以扩增、冷冻并在以后使用。在某些实施例中，在诊断如本文所述的特定疾病之后不久但在任何治疗之前从患者收集样品。在另一个实施例中，在多种相关治疗模式之前从受试者的血液样品或单采血液成分分离细胞，这些相关治疗模式包括但不限于用药剂诸如那他珠单抗(natalizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、抗病毒剂、化学疗法、辐射、免疫抑制剂(诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体或其他免疫清除剂(immunoablativeagent)(诸如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺(cytoxan)、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228)和辐射进行治疗。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导很重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人,Cell 66:807-815(1991)；Henderson等人,Immun 73:316-321(1991)；Bierer等人,Curr.Opin.Immun.5:763-773(1993))。在另一个实施例中，分离患者的细胞并将其冷冻以供随后与骨髓或干细胞移植、使用化学治疗剂(诸如氟达拉滨)的T细胞清除疗法、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体(诸如OKT3或CAMPATH)结合使用(例如，之前、同时或之后)。在另一个实施例中，在B细胞清除疗法(如与CD20反应的药剂，如利妥昔单抗(Rituxan))之前分离细胞，并可冷冻用于以后治疗使用。
在一些实施例中，在治疗或直接从患者中获得T细胞。在这方面，已经观察到，在某些癌症治疗后，特别是用损害免疫系统的药物治疗后，在当患者通常从治疗中恢复的时期，治疗后不久，获得的T细胞的质量可能是最佳的，或改善其离体扩增的能力。同样，在使用本文所述方法进行离体操作后，这些细胞可以处于增强植入和体内扩增的优选状态。因此，在本披露的上下文中预期在该恢复阶段收集血细胞，包括T细胞、树突状细胞、或其他造血系的细胞。此外，在某些实施例中，动员(例如，用GM-CSF动员)和调理方案可用于在受试者中创造条件，其中特别是在治疗后定义的时间窗口期间，有利于细胞类型的再填充、再循环、再生和/或扩增。说明性的细胞类型包括T细胞、B细胞、树突状细胞、和免疫系统的其他细胞。
7.2.5.T细胞的活化和扩增
在一些实施例中，在具有本文所述的CAR的T细胞的基因修饰之前或之后，T细胞都可以通常使用例如以下中所述的方法来活化并扩增：美国专利号6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041，和美国专利申请公开号20060121005。
通常，可以通过与附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的药剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触来扩增T细胞。特别地，可以如本文所述诸如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体接触，或通过与钙离子载体结合的蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓抑素)来刺激T细胞群。为了共刺激T细胞表面的辅助分子，可使用结合辅助分子的配体。例如，在适合刺激T细胞增殖的条件下，可以将T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD3抗体的实例包括UCHT1、OKT3、HIT3a(BioLegend,San Diego,US)，可以如本领域公知的其他方法那样使用(Graves J等人,J.Immunol.146:2102(1991)；Li B等人,Immunology 116:487(2005)；Rivollier A等人,Blood 104:4029(2004))。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)，如本领域公知的其他方法那样(Berg等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977,(1998)；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63(1999))。
在一些实施例中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以通过不同的方案提供。例如，提供每个信号的药剂可以在溶液中或与表面偶联。当与表面偶联时，药剂可以与同一表面偶联(即，以“顺式”形式)或与单独的表面偶联(即，以“反式”形式)。替代性地，一种药剂可以在溶液中与表面和另一种药剂偶联。在一个实施例中，提供共刺激信号的药剂与细胞表面结合，提供初级活化信号的药剂在溶液中或与表面偶联。在某些实施例中，两种药剂都可以在溶液中。在另一个实施例中，药剂可以是可溶形式，然后交联到表面，诸如表达Fc受体的细胞或抗体或其他将结合药剂的结合剂。在这方面，参见例如美国专利申请公开号20040101519和20060034810的人工抗原呈递细胞(aAPC)，它们在本披露的某些实施例中被考虑用于活化和扩增T细胞。
在一些实施例中，将T细胞与包被药剂的珠组合，随后分离珠和细胞，然后培养细胞。在另一个实施例中，在培养之前，不分离包被药剂的珠和细胞，而是将它们一起培养。在另一个实施例中，首先通过施加力诸如磁力来浓缩珠和细胞，导致细胞表面标记的连接增加，从而诱导细胞刺激。
例如，细胞表面蛋白可以通过允许附着有抗CD3和抗CD28的顺磁珠(3×28珠)接触T细胞来连接。在一个实施例中，将细胞(例如，104至4×108个T细胞)和珠(例如，推荐滴度为1:100的抗CD3/CD28 MACSiBead颗粒)组合在缓冲液中，优选PBS(不含二价阳离子，诸如钙和镁)。本领域普通技术人员可以容易地理解，可以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可能非常少，并且仅占样品的0.01％，或者整个样品(即100％)可以包含目的靶细胞。因此，任何细胞数目都在本披露的范围内。在某些实施例中，可能希望显著减少颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施例中，使用约20亿个细胞/mL的浓度。在另一个实施例中，使用大于1亿个细胞/mL。在另一个实施例中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/mL的细胞浓度。在又一实施例中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/mL的细胞浓度。在其他实施例中，可以使用1.25或1.50亿个细胞/mL的浓度。使用高浓度可导致细胞产量、细胞活化和细胞扩增增加。此外，使用高细胞浓度可以允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞，诸如CD28阴性T细胞。此类细胞群可以具有治疗价值，并且在某些实施例中期望能够获得。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱的CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施例中，混合物可以培养数小时(约3小时)至约14天或两者之间的任何小时整数值。在另一个实施例中，混合物可以培养21天。在一个实施例中，珠和T细胞一起培养约八天。在另一个实施例中，珠和T细胞一起培养2-3天。还可能需要几个刺激周期，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适于T细胞培养的条件包括合适的培养基(例如，最低限度必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(Lonza))，其可以含有增殖和活力所必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。其他用于细胞生长的添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉和还原剂，诸如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、优化剂，添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或足以生长和扩增T细胞的量的细胞因子。抗生素(例如青霉素和链霉素)仅包含在实验培养物中，而不包含在待输注到受试者体内的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和气氛(例如空气加5％CO2)。已经暴露于不同刺激时间的T细胞可以表现出不同的特征。例如，典型的血液或单采血液成分的外周血单个核细胞产物具有比细胞毒性或抑制性T细胞群(TC、CD8)更多的辅助T细胞群(TH、CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体进行的T细胞离体扩增产生T细胞群，该T细胞群在约第8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约第8-9天之后，T细胞群包含越来越多的TC细胞群。因此，根据治疗目的，用主要包含TH细胞的T细胞群输注受试者可能是有利的。类似地，如果分离了TC细胞的抗原特异性亚群，则在更大程度上扩增该亚群可能是有益的。
此外，除了CD4和CD8标记之外，其他表型标记也有显著差异，但在很大程度上，在细胞扩增过程中可再现。因此，这种再现性使得能够为特定目的定制活化的T细胞产品。
7.3.包含功能性外源受体和一个或多个附加结构域的多肽
在另一方面，本文提供了一种多肽，该多肽包含至少一种功能性外源受体(诸如CAR、TCR和TAC)和IL-12的p40亚基和CCR7的配体(诸如CCL-19和CCL-21)中的至少一种。
在一些实施例中，本文提供了一种多肽，该多肽包含至少一种功能性外源受体(诸如CAR、TCR和TAC)和IL-12的p40亚基和CCL-19中的至少一种。
在一些实施例中，本文提供了包含CAR和p40的多肽。在一些实施例中，本文提供了包含CAR和CCL-19的多肽。在其他实施例中，本文提供了包含CAR以及p40和CCL-19的多肽。本发明的多肽中的CAR可以是上述第7.2部分中描述的任何一种。本发明的多肽中的p40和CCL-19可以是上述第7.2部分中描述的任何一种。
在一些实施例中，本文提供了包含TCR和p40的多肽。在一些实施例中，本文提供了包含TCR和CCL-19的多肽。在其他实施例中，本文提供了包含TCR以及p40和CCL-19的多肽。本发明的多肽中的p40和CCL-19可以是上述第7.2部分中描述的任何一种。
在一些实施例中，本文提供了包含TAC和p40的多肽。在一些实施例中，本文提供了包含TAC和CCL-19的多肽。在其他实施例中，本文提供了包含TAC以及p40和CCL-19的多肽。本发明的多肽中的p40和CCL-19可以是上述第7.2部分中描述的任何一种。
在一些实施例中，本文提供的p40是人p40或其片段或变体。在特定实施例中，本文提供的p40包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供的p40包含与SEQ IDNO:5的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供的p40多肽是分泌的多肽。在一些实施例中，本文提供的p40多肽是膜结合的多肽(例如，MB12)。
在一些实施例中，本文提供的CCL-19是人CCL-19或其片段或变体。在特定实施例中，本文提供的CCL-19包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供的CCL-19包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明的多肽中，CAR、p40和/或CCL-19可以按任何顺序排列。例如，在其中CAR、p40和CCL-19均存在于多肽中的情况下，在一些实施例中，本文提供的多肽从N末端到C末端包含：CAR、p40和CCL-19；在一些实施例中，本文提供的多肽从N末端到C末端包含：CAR、CCL-19和p40；在一些实施例中，本文提供的多肽从N末端到C末端包含：CCL-19、p40和CAR；在一些实施例中，本文提供的多肽从N末端到C末端包含：p40、CCL-19和CAR；在一些实施例中，本文提供的多肽从N末端到C末端包含：p40、CAR和CCL-19；并且在一些实施例中，本文提供的多肽从N末端到C末端包含：CCL-19、CAR和p40。
在本文提供的各种多肽的一些实施例中，CAR、p40和/或CCL-19通过肽接头彼此连接。在一些实施例中，肽接头是自切割肽，诸如2A自切割肽，使得CAR、p40和/或CCL-19在细胞中切割后变成单独的多肽。
在其他实施例中，本文提供了一种多肽，该多肽包含至少一种功能性外源受体(诸如CAR、TCR和TAC)和IL-12的p40亚基和CCL-21中的至少一种。
在一些实施例中，本文提供了包含CAR和p40的多肽。在一些实施例中，本文提供了包含CAR和CCL-21的多肽。在其他实施例中，本文提供了包含CAR以及p40和CCL-21的多肽。本发明的多肽中的CAR可以是上述第7.2部分中描述的任何一种。本发明的多肽中的p40和CCL-21可以是上述第7.2部分中描述的任何一种。
在一些实施例中，本文提供了包含TCR和p40的多肽。在一些实施例中，本文提供了包含TCR和CCL-21的多肽。在其他实施例中，本文提供了包含TCR以及p40和CCL-21的多肽。本发明的多肽中的p40和CCL-21可以是上述第7.2部分中描述的任何一种。
在一些实施例中，本文提供了包含TAC和p40的多肽。在一些实施例中，本文提供了包含TAC和CCL-21的多肽。在其他实施例中，本文提供了包含TAC以及p40和CCL-21的多肽。本发明的多肽中的p40和CCL-21可以是上述第7.2部分中描述的任何一种。
在一些实施例中，本文提供的p40是人p40或其片段或变体。在特定实施例中，本文提供的p40包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供的p40包含与SEQ IDNO:5的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供的p40多肽是分泌的多肽。在一些实施例中，本文提供的p40多肽是膜结合的多肽(例如，MB12)。
在一些实施例中，本文提供的CCL-21是人CCL-21或其片段或变体。在特定实施例中，本文提供的CCL-21包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供的CCL-21包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明的多肽中，CAR、p40和/或CCL-21可以按任何顺序排列。例如，在其中CAR、p40和CCL-21均存在于多肽中的情况下，在一些实施例中，本文提供的多肽从N末端到C末端包含：CAR、p40和CCL-21；在一些实施例中，本文提供的多肽从N末端到C末端包含：CAR、CCL-21和p40；在一些实施例中，本文提供的多肽从N末端到C末端包含：CCL-21、p40和CAR；在一些实施例中，本文提供的多肽从N末端到C末端包含：p40、CCL-21和CAR；在一些实施例中，本文提供的多肽从N末端到C末端包含：p40、CAR和CCL-21；并且在一些实施例中，本文提供的多肽从N末端到C末端包含：CCL-21、CAR和p40。
在本文提供的各种多肽的一些实施例中，CAR、p40和/或CCL-21通过肽接头彼此连接。在一些实施例中，肽接头是自切割肽，诸如2A自切割肽，使得CAR、p40和/或CCL-21在细胞中切割后变成单独的多肽。
2A肽的成员以首次描述它们的病毒命名。例如，首次描述的2A肽F2A源自口蹄疫病毒。自切割18-22个氨基酸长的2A肽介导脯氨酸与甘氨酸残基之间的“核糖体跳跃”并抑制肽键形成而不影响下游翻译。这些肽允许多种蛋白编码为多蛋白，这些多蛋白在翻译时解离成组分蛋白。自切割肽存在于小核糖核酸病毒科病毒家族的成员中，包括口蹄疫病毒(aphthovirus)，诸如口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)、马鼻炎A型病毒(ERAV)、明脉扁刺蛾病毒(TaV)和猪捷申病毒-1(PTV-1)(参见Donnelly等人,J.Gen.Virol.,82:1027-101(2001)；Ryan等人,J.Gen.Virol.,72:2727-2732(2001))，以及心脏病毒，诸如泰勒病毒(例如，泰勒鼠脑脊髓炎)和脑心肌炎病毒。源自FMDV、ERAV、PTV-1和TaV的2A肽有时分别称为“F2A”、“E2A”、“P2A”和“T2A”，并且包括在本披露内容中，例如，如以下文献中所述：Donnelly等人,J.Gen.Virol.,78:13-21(1997)；Ryan和Drew,EMBO J.,13:928-933(1994)；Szymczak等人,Nature Biotech.,5:589-594(2004)；Hasegawa等人,Stem Cells,25(7):1707-12(2007)。在其他实施例中，本文使用内含肽介导的蛋白剪接系统，如Shah和Muir,Chem Sci.,5(1):446-461(2014)以及Topilina和Mills,Mobile DNA,5(5)(2014)中所述。本领域已知的其他方法也可用于本发明的构建体。
在一些实施例中，2A自切割肽选自由F2A、E2A、P2A、T2A或其变体组成的组。在一些实施例中，自切割肽是包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的2A自切割肽P2A片段。在特定实施例中，自切割肽是包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的T2A片段。
在一些特定实施例中，p40和CCL-19通过第一自切割肽连接。在一些实施例中，第一自切割肽是包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的2A自切割肽T2A片段。在一些实施例中，本文提供的包含IL-12的p40亚基和CCL-19的结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供的包含IL-12的p40亚基和CCL-19的结构域包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，功能性外源受体(诸如CAR)通过第二自切割肽连接到结构域。在一些实施例中，第二自切割肽是包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的2A自切割肽P2A片段。
在其他特定实施例中，p40和CCL-21通过第一自切割肽连接。在一些实施例中，第一自切割肽是包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的2A自切割肽T2A片段。在一些实施例中，本文提供的包含IL-12的p40亚基和CCL-21的结构域包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供的包含IL-12的p40亚基和CCL-21的结构域包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，功能性外源受体(诸如CAR)通过第二自切割肽连接到结构域。在一些实施例中，第二自切割肽是包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的2A自切割肽P2A片段。
在另一方面，本文提供了一种编码上述多肽的核酸，该多肽包含本文提供的功能性外源受体(诸如CAR)、IL-12的p40亚基、和/或CCR7的配体(诸如CCL-19和CCL-21)，其在下文中更详细地描述。
7.4.多核苷酸
在另一方面，本披露提供了编码本文提供的多肽的多核苷酸，包括上述第7.2部分和第7.3部分中描述的那些。
更特别地，在一些实施例中，本文提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽包含嵌合抗原受体(CAR)、p40和CCL-19，其中该CAR、p40和CCL-19通过肽接头(诸如2A自切割肽接头)彼此融合。
在又一方面，本文提供了多核苷酸，该多核苷酸包含编码CAR的区域、编码p40的区域和/或编码CCL-19的区域。在一些实施例中，两个或更多个区域由同一启动子控制。例如，在一些实施例中，本文使用内部核糖体进入位点(IRES)来表达来自一个启动子的多个基因。在其他实施例中，这些区域由单独的启动子控制。
在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码CAR的第一多核苷酸、编码p40的第二多核苷酸、和编码CCL-19的第三多核苷酸。在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码CAR的第一多核苷酸、含有编码p40的区域和编码CCL-19的区域的第二多核苷酸。在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码p40的第一多核苷酸、含有编码CAR的区域和编码CCL-19的区域的第二多核苷酸。在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码CCL-19的第一多核苷酸、含有编码CAR的区域和编码p40的区域的第二多核苷酸。
在又一方面，本文提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽包含TCR(或其亚基)、p40和CCL-19，其中该TCR(或其亚基)、p40和CCL-19通过肽接头(诸如2A自切割肽接头)彼此融合。
在又一方面，本文提供了多核苷酸，该多核苷酸包含编码TCR(或其亚基)的区域、编码p40的区域、和/或编码CCL-19的区域。在一些实施例中，两个或更多个区域由同一启动子控制。例如，在一些实施例中，本文使用内部核糖体进入位点(IRES)来表达来自一个启动子的多个基因。在其他实施例中，这些区域由单独的启动子控制。
在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码TCR(或其亚基)的第一多核苷酸、编码p40的第二多核苷酸、和编码CCL-19的第三多核苷酸。在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码TCR(或其亚基)的第一多核苷酸、含有编码p40的区域和编码CCL-19的区域的第二多核苷酸。在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码p40的第一多核苷酸、含有编码TCR(或其亚基)的区域和编码CCL-19的区域的第二多核苷酸。在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码CCL-19的第一多核苷酸、含有编码TCR(或其亚基)的区域和编码p40的区域的第二多核苷酸。
在又一方面，本文提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽包含TAC(或其结构域)、p40和CCL-19，其中该TAC(或其结构域)、p40和CCL-19通过肽接头(诸如2A自切割肽接头)彼此融合。
在又一方面，本文提供了多核苷酸，该多核苷酸包含编码TAC(或其结构域)的区域、编码p40的区域、和/或编码CCL-19的区域。在一些实施例中，两个或更多个区域由同一启动子控制。例如，在一些实施例中，本文使用内部核糖体进入位点(IRES)来表达来自一个启动子的多个基因。在其他实施例中，这些区域由单独的启动子控制。
在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码TAC(或其结构域)的第一多核苷酸、编码p40的第二多核苷酸、和编码CCL-19的第三多核苷酸。在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码TAC(或其结构域)的第一多核苷酸、含有编码p40的区域和编码CCL-19的区域的第二多核苷酸。在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码p40的第一多核苷酸、含有编码TAC(或其结构域)的区域和编码CCL-19的区域的第二多核苷酸。在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码CCL-19的第一多核苷酸、含有编码TAC(或其结构域)的区域和编码p40的区域的第二多核苷酸。
在其他实施例中，本文提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽包含嵌合抗原受体(CAR)、p40和CCL-21，其中该CAR、p40和CCL-21通过肽接头(诸如2A自切割肽接头)彼此融合。
在又一方面，本文提供了多核苷酸，该多核苷酸包含编码CAR的区域、编码p40的区域和/或编码CCL-21的区域。在一些实施例中，两个或更多个区域由同一启动子控制。例如，在一些实施例中，本文使用内部核糖体进入位点(IRES)来表达来自一个启动子的多个基因。在其他实施例中，这些区域由单独的启动子控制。
在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码CAR的第一多核苷酸、编码p40的第二多核苷酸、和编码CCL-21的第三多核苷酸。在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码CAR的第一多核苷酸、含有编码p40的区域和编码CCL-21的区域的第二多核苷酸。在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码p40的第一多核苷酸、含有编码CAR的区域和编码CCL-21的区域的第二多核苷酸。在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码CCL-21的第一多核苷酸、含有编码CAR的区域和编码p40的区域的第二多核苷酸。
在又一方面，本文提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽包含TCR(或其亚基)、p40和CCL-21，其中该TCR(或其亚基)、p40和CCL-21通过肽接头(诸如2A自切割肽接头)彼此融合。
在又一方面，本文提供了多核苷酸，该多核苷酸包含编码TCR(或其亚基)的区域、编码p40的区域、和/或编码CCL-21的区域。在一些实施例中，两个或更多个区域由同一启动子控制。例如，在一些实施例中，本文使用内部核糖体进入位点(IRES)来表达来自一个启动子的多个基因。在其他实施例中，这些区域由单独的启动子控制。
在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码TCR(或其亚基)的第一多核苷酸、编码p40的第二多核苷酸、和编码CCL-21的第三多核苷酸。在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码TCR(或其亚基)的第一多核苷酸、含有编码p40的区域和编码CCL-21的区域的第二多核苷酸。在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码p40的第一多核苷酸、含有编码TCR(或其亚基)的区域和编码CCL-21的区域的第二多核苷酸。在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码CCL-21的第一多核苷酸、含有编码TCR(或其亚基)的区域和编码p40的区域的第二多核苷酸。
在又一方面，本文提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽包含TAC(或其结构域)、p40和CCL-21，其中该TAC(或其结构域)、p40和CCL-21通过肽接头(诸如2A自切割肽接头)彼此融合。
在又一方面，本文提供了多核苷酸，该多核苷酸包含编码TAC(或其结构域)的区域、编码p40的区域、和/或编码CCL-21的区域。在一些实施例中，两个或更多个区域由同一启动子控制。例如，在一些实施例中，本文使用内部核糖体进入位点(IRES)来表达来自一个启动子的多个基因。在其他实施例中，这些区域由单独的启动子控制。
在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码TAC(或其结构域)的第一多核苷酸、编码p40的第二多核苷酸、和编码CCL-21的第三多核苷酸。在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码TAC(或其结构域)的第一多核苷酸、含有编码p40的区域和编码CCL-21的区域的第二多核苷酸。在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码p40的第一多核苷酸、含有编码TAC(或其结构域)的区域和编码CCL-21的区域的第二多核苷酸。在又一方面，本文提供了组合物，该组合物包含编码CCL-21的第一多核苷酸、含有编码TAC(或其结构域)的区域和编码p40的区域的第二多核苷酸。
本披露的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；并且可以是双链或单链，并且如果是单链，则可以是编码链或非编码(反义)链。在一些实施例中，多核苷酸是cDNA的形式。在一些实施例中，多核苷酸是合成多核苷酸。
本披露进一步涉及本文所述的多核苷酸的变体，其中该变体编码例如本披露的多肽的片段、类似物和/或衍生物。在某些实施例中，本披露提供了一种多核苷酸，该多核苷酸包含具有与编码本披露的多肽的多核苷酸至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、并且在一些实施例中至少约96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列的多核苷酸。如本文所用，短语“具有与参考核苷酸序列至少例如95％“同一性”的核苷酸序列的多核苷酸”旨在表示除了以下方面外，该多核苷酸的核苷酸序列与参考序列具有同一性：在该参考核苷酸序列的每100个核苷酸中，该多核苷酸序列可以包括最多五个点突变。换句话说，为了获得具有与参考核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，可以删除或用另一个核苷酸取代参考序列中多达5％的核苷酸，或者可将参考序列中多达总核苷酸的5％的多个核苷酸插入参考序列中。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或那些末端位置之间的，散布在参考序列中的单个核苷酸之间或在参考序列内的一个或多个连续基团中的任何地方。
多核苷酸变体可以在编码区、非编码区或两者中含有改变。在一些实施例中，多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加或缺失但不改变编码的多肽的性质或活性的改变。在一些实施例中，多核苷酸变体包含沉默取代，其不导致多肽的氨基酸序列的改变(由于遗传密码的简并性)。可以出于多种原因产生多核苷酸变体，例如，为了优化特定宿主的密码子表达(即，将人mRNA中的密码子改变为细菌宿主如大肠杆菌所偏好的那些)。在一些实施例中，多核苷酸变体在序列的非编码或编码区中包含至少一个沉默突变。
在一些实施例中，产生了多核苷酸变体以调节或改变编码的多肽的表达(或表达水平)。在一些实施例中，产生了多核苷酸变体以增加编码的多肽的表达。在一些实施例中，产生了多核苷酸变体以减少编码的多肽的表达。在一些实施例中，与亲本多核苷酸序列相比，多核苷酸变体具有增加的编码的多肽的表达。在一些实施例中，与亲本多核苷酸序列相比，多核苷酸变体具有减少的编码的多肽的表达。
7.5.载体
还提供了包含本文所述的多核苷酸或核酸分子的载体。在一个实施例中，可以将核酸分子掺入重组表达载体中。
本披露提供了用于克隆和表达本文所述的多肽中的任一种的载体。在一些实施例中，载体适于在真核细胞诸如哺乳动物细胞中复制和整合。在一些实施例中，载体是病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘载体、单纯疱疹病毒载体及其衍生物。病毒载体技术是本领域熟知的，并且描述于例如Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,New York)以及其他病毒学和分子生物学手册中。
已经开发了用于将基因转移到哺乳动物细胞中的许多基于病毒的系统。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将异源核酸插入载体中并包装在逆转录病毒粒子中。然后可以分离重组病毒，并在体外或离体将其递送至工程化哺乳动物细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施例中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一些实施例中，使用慢病毒载体。在一些实施例中，使用自灭活的慢病毒载体。例如，携带免疫调节剂(诸如免疫检查点抑制剂)编码序列的自灭活慢病毒载体和/或携带嵌合抗原受体的自灭活慢病毒载体可以用本领域已知的方案包装。可以使用本领域已知的方法，将所得的慢病毒载体用于转导哺乳动物细胞(例如，原代人T细胞)。源自逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合及其在子代细胞中的繁殖。慢病毒载体还具有低免疫原性，并且可以转导非增殖细胞。
在一些实施例中，载体包含编码本文所述的多肽的核酸中的任一种。可以使用本领域任何已知的分子克隆方法将核酸克隆到载体中，包括例如使用限制性内切酶位点和一种或多种选择性标记。在一些实施例中，核酸可操作地连接到启动子。已经研究了用于哺乳动物细胞中的基因表达的多种启动子，并且本领域已知的任何启动子都可以用于本披露。启动子可大致分为组成型启动子或调节型启动子，如诱导型启动子。
在一些实施例中，编码多肽的核酸可操作地连接到组成型启动子。组成型启动子允许异源基因(也称为转基因)在宿主细胞中组成性地表达。本文考虑的示例性组成型启动子包括但不限于鼠干细胞病毒(MSCV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、人延伸因子-1α(hEF1α)、泛素C启动子(UbiC)、磷酸甘油激酶启动子(PGK)、猿猴病毒40早期启动子(SV40)以及与CMV早期增强子偶联的鸡β-肌动蛋白启动子(CAGG)。在许多研究中，已经广泛地比较了此类组成型启动子对驱动转基因表达的效率。例如，Michael C.Milone等人比较了CMV、hEF1α、UbiC和PGK驱动原代人T细胞中嵌合抗原受体表达的效率，并得出结论，hEF1α启动子不仅诱导了最高水平的转基因表达，并且最优地维持在CD4和CD8人T细胞中(MolecularTherapy,17(8):1453-1464(2009))。在一些实施例中，编码CAR的核酸可操作地连接到hEF1α启动子。在一些实施例中，编码CAR的核酸可操作地连接到MSCV启动子。
在一些实施例中，编码多肽的核酸可操作地连接到诱导型启动子。诱导型启动子属于调节型启动子的类别。诱导型启动子可以由一种或多种条件诱导，例如物理条件、工程化免疫效应细胞的微环境或工程化免疫效应细胞的生理状态、诱导物(即，诱导剂)或它们的组合。
在一些实施例中，诱导条件不诱导工程化哺乳动物细胞和/或接受药物组合物的受试者中内源基因的表达。在一些实施例中，该诱导条件选自由以下组成的组：诱导物、辐射(例如，电离辐射、光)、温度(例如，热)、氧化还原状态、肿瘤环境和工程化哺乳动物细胞的活化状态。
在一些实施例中，载体还含有选择性标记基因或报告基因以从通过慢病毒载体转染的宿主细胞群中选择表达多肽的细胞。选择性标记和报告基因都可以侧接有适当的调控序列，以使得能够在宿主细胞中表达。例如，载体可以含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调控核酸序列表达的启动子。
在一些特定实施例中，本文提供的载体包含MND启动子(骨髓增生性肉瘤病毒增强子，阴性对照区缺失，dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子)。在一些特定实施例中，本文提供的载体包含MSCV启动子。在其他特定实施例中，本文提供的载体包含EF1α。
7.6.制备方法
在又一方面，本文提供了一种用于制备工程化免疫效应细胞(例如，CAR-T细胞或TCR-T细胞或TAC-T细胞)的方法，该方法包括将本文提供的一种或多种多核苷酸或一种或多种载体(例如，如上述第7.4部分和第7.5部分所述)引入免疫效应细胞中(例如，T细胞)。
更特别地，在一些实施例中，表达外源引入的p40和CCL-19的CAR-T细胞可以通过将一种或多种编码第7.3部分所述多肽的核酸或一种或多种第7.4部分所述核酸引入细胞中来产生。
CAR、p40和CCL-19可以各自作为单独的多肽单独引入T细胞中。例如，将编码本文提供的CAR的核酸、编码p40的核酸和编码CCL-19的核酸分别引入T细胞中。替代性地，三者中的任何两者或它们中的所有三者可以通过一种核酸一起作为单一多肽引入T细胞中，该核酸将在细胞中翻译时裂解。例如，将编码包含本文提供的CAR和通过自切割肽接头连接的p40的多肽的核酸引入T细胞中，并单独地将编码CCL-19的核酸引入T细胞中。类似地，将编码包含本文提供的CAR和通过自切割肽接头连接的CCL-19的多肽的核酸引入T细胞中，并单独地将编码p40的核酸引入T细胞中。在一些实施例中，可以将编码包含通过自切割肽接头彼此连接的CAR、p40和CCL-19中的所有三者的多肽的核酸引入T细胞中。上文更详细地描述了自切割肽接头。在一些实施例中，2A自切割肽选自由F2A、E2A、P2A、T2A或其变体组成的组。在一些实施例中，自切割肽是包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的2A自切割肽P2A片段。在特定实施例中，自切割肽是包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的T2A片段。
替代性地，本文提供的CAR-T细胞可以由包含多个区域的多核苷酸产生，例如编码CAR的区域、编码p40的区域和/或编码CCL-19的区域。不同的区域可以由相同的启动子控制。例如，在一些实施例中，本文使用内部核糖体进入位点(IRES)来表达来自一个启动子的多个基因。在其他实施例中，不同的区域由单独的启动子控制。
在又一方面，本文提供了一种根据本文提供的方法产生的工程化免疫效应细胞(例如，CAR-T细胞)。除其他特性外，表达外源引入的p40和CCL-19的CAR-T细胞与没有外源引入的p40和CCL-19的CAR-T细胞相比具有更高水平的IL-23。在一些实施例中，IL-23的水平高至少20％。在一些实施例中，IL-23的水平高至少30％。在一些实施例中，IL-23的水平高至少40％。在一些实施例中，IL-23的水平高至少50％。在一些实施例中，IL-23的水平高至少60％。在一些实施例中，IL-23的水平高至少70％。在一些实施例中，IL-23的水平高至少80％。在一些实施例中，IL-23的水平高至少90％。在一些实施例中，IL-23的水平为至少2倍、3倍、4倍、5倍或更高。
在其他实施例中，表达外源引入的p40和CCL-21的CAR-T细胞可以通过将一种或多种编码第7.3部分所述多肽的核酸或一种或多种第7.4部分所述核酸引入细胞中来产生。
CAR、p40和CCL-21可以各自作为单独的多肽单独引入T细胞中。例如，将编码本文提供的CAR的核酸、编码p40的核酸和编码CCL-21的核酸分别引入T细胞中。替代性地，三者中的任何两者或它们中的所有三者可以通过一种核酸一起作为单一多肽引入T细胞中，该核酸将在细胞中翻译时裂解。例如，将编码包含本文提供的CAR和通过自切割肽接头连接的p40的多肽的核酸引入T细胞中，并单独地将编码CCL-21的核酸引入T细胞中。类似地，将编码包含本文提供的CAR和通过自切割肽接头连接的CCL-21的多肽的核酸引入T细胞中，并单独地将编码p40的核酸引入T细胞中。在一些实施例中，可以将编码包含通过自切割肽接头彼此连接的CAR、p40和CCL-21中的所有三者的多肽的核酸引入T细胞中。上文更详细地描述了自切割肽接头。在一些实施例中，2A自切割肽选自由F2A、E2A、P2A、T2A或其变体组成的组。在一些实施例中，自切割肽是包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的2A自切割肽P2A片段。在特定实施例中，自切割肽是包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的T2A片段。
替代性地，本文提供的CAR-T细胞可以由包含多个区域的多核苷酸产生，例如编码CAR的区域、编码p40的区域和/或编码CCL-21的区域。不同的区域可以由相同的启动子控制。例如，在一些实施例中，本文使用内部核糖体进入位点(IRES)来表达来自一个启动子的多个基因。在其他实施例中，不同的区域由单独的启动子控制。
在又一方面，本文提供了一种根据本文提供的方法产生的工程化免疫效应细胞(例如，CAR-T细胞)。除其他特性外，表达外源引入的p40和CCL-21的CAR-T细胞与没有外源引入的p40和CCL-21的CAR-T细胞相比具有更高水平的IL-23。在一些实施例中，IL-23的水平高至少20％。在一些实施例中，IL-23的水平高至少30％。在一些实施例中，IL-23的水平高至少40％。在一些实施例中，IL-23的水平高至少50％。在一些实施例中，IL-23的水平高至少60％。在一些实施例中，IL-23的水平高至少70％。在一些实施例中，IL-23的水平高至少80％。在一些实施例中，IL-23的水平高至少90％。在一些实施例中，IL-23的水平为至少2倍、3倍、4倍、5倍或更高。
上述在CAR-T细胞的背景下描述的方法也适用于产生其他免疫效应细胞(诸如TCR-T细胞和TAC-T细胞)。
7.7.药物组合物
在一方面，本披露进一步提供了包含本披露的工程化细胞的药物组合物。在一些实施例中，药物组合物包含治疗有效量的本披露的工程化T细胞，和药学上可接受的赋形剂。
在特定实施例中，术语“赋形剂”还可以指稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全或不完全))、载剂或媒介物。药物赋形剂可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐水溶液、右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体赋形剂。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，该组合物还可以含有少量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释配制品等形式。合适的药物赋形剂的实例在Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.,Easton,PA中进行了描述。此类组合物将含有预防或治疗有效量的本文提供的活性成分，诸如以纯化形式，以及合适量的赋形剂，以提供适合施用于患者的形式。该配制品应适合于施用方式。
在一些实施例中，赋形剂的选择部分地由特定细胞、和/或通过施用方法决定。因此，存在多种合适的配制品。
通常，可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对受体无毒，并且包括缓冲剂、抗氧化剂，包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、焦亚硫酸钠；防腐剂、等渗剂、稳定剂、金属复合物(例如，Zn-蛋白复合物)；螯合剂，诸如EDTA和/或非离子表面活性剂。
缓冲剂可用于将pH控制在优化治疗效果的范围内，特别是如果稳定性是pH依赖性的。适用于本披露的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐。例如，柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、乙酸盐。另外，缓冲液可以包含组氨酸和三甲胺盐，诸如Tris。
可以添加防腐剂以延缓微生物生长。适用于本披露的防腐剂包括十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎卤(例如，氯、溴、碘)、苄索氯铵；硫柳汞、苯酚、丁基或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇、3-戊醇和间甲酚。
可以存在张力剂(有时称为“稳定剂”)以调节或维持组合物中液体的张力。当与大的带电生物分子诸如蛋白和抗体一起使用时，它们通常被称为“稳定剂”，因为它们可以与氨基酸侧链的带电基团相互作用，从而降低分子间和分子内相互作用的可能性。示例性张力剂包括多羟糖醇、三羟或更高级糖醇，诸如甘油、赤藓糖醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。
另外的示例性赋形剂包括：(1)填充剂、(2)增溶剂、(3)稳定剂和(4)防止变性或粘附到容器壁的药剂。这种赋形剂包括：多羟糖醇(上文列举的)；氨基酸，诸如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，诸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌糖(myoinisitose)、肌糖醇(myoinisitol)、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环醇(例如，肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，诸如脲、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白，诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其他免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖)；二糖(例如，乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖，诸如棉子糖；以及多糖，诸如糊精或葡聚糖。
可以存在非离子表面活性剂或去污剂(也称为“湿润剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白免于搅动诱导的聚集，这也允许配制品暴露于剪切表面应力而不引起活性治疗蛋白或抗体的变性。合适的非离子表面活性剂包括例如聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(184、188等)、多元醇、/>聚氧乙烯脱水山梨醇单醚(-20、/>-80等)、聚桂醇400、硬脂酸聚烃氧40硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。可以使用的阴离子洗涤剂包括月桂基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子洗涤剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
施用途径根据已知的和可接受的方法，诸如通过单次或多次推注或以合适的方式长时间输注，例如，通过皮下、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、病灶内或关节内途径的注射或输注、局部施用、吸入或通过缓释或延释方式。
在另一个实施例中，药物组合物可以作为控释或缓释系统提供。在一个实施例中，可以使用泵来实现控释或缓释(参见例如，Sefton,Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201-40(1987)；Buchwald等人,Surgery 88:507-16(1980)；和Saudek等人,N.Engl.J.Med.321:569-74(1989))。在另一个实施例中，聚合材料可用于实现预防剂或治疗剂(例如，如本文所述的融合蛋白)或本文提供的组合物的控释或缓释(参见例如，Medical Applications ofControlled Release(Langer和Wise编辑,1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance(Smolen和Ball编辑,1984)；Ranger和Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61-126(1983)；Levy等人,Science 228:190-92(1985)；During等人,Ann.Neurol.25:351-56(1989)；Howard等人,J.Neurosurg.71:105-12(1989)；美国专利号5,679,377、5,916,597、5,912,015、5,989,463、和5,128,326；PCT公开号WO 99/15154和WO 99/20253)。用于缓释配制品的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一个实施例中，缓释配制品中使用的聚合物是惰性的、不含可浸出杂质、储存稳定、无菌且可生物降解的。在又一实施例中，可以将控释或缓释系统置于特定靶组织，例如鼻道或肺附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如，Goodson,Medical Applications of Controlled Release第2卷,115-38(1984))。控释系统例如由Langer,Science 249:1527-33(1990)讨论。本领域技术人员已知的任何技术可用于生产包含一种或多种如本文所述的药剂的缓释配制品(参见例如，美国专利号4,526,938、PCT公开号WO 91/05548和WO 96/20698、Ning等人,Radiotherapy&Oncology 39:179-89(1996)；Song等人,PDA J.of Pharma.Sci.&Tech.50:372-97(1995)；Cleek等人,Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-54(1997)；和Lam等人,Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-60(1997))。
本文所述的药物组合物还可以根据所治疗的特定适应症的需要含有多于一种活性化合物或活性剂。替代性地或另外，组合物可以包含细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂或生长抑制剂。这种分子适当地以对预期目的有效的量组合存在。
活性成分也可以包封在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，包封在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或包封在粗乳液中。此类技术披露于Remington's Pharmaceutical Sciences第18版中。
各种组合物和递送系统是已知的并且可以与本文提供的治疗剂一起使用，该组合物和递送系统包括但不限于包封在脂质体、微粒、微胶囊中，能够表达本文提供的单域抗体或治疗分子的重组细胞，构建作为逆转录病毒载体或其他载体的一部分的核酸等。
在一些实施例中，本文提供的药物组合物包含治疗或预防疾病或病症有效量的结合分子和/或细胞，诸如治疗有效量或预防有效量。在一些实施例中，治疗或预防功效通过定期评估治疗的受试者来监测。对于几天或更长的重复施用，取决于病状，重复进行治疗直至出现疾病症状的所需的遏制。然而，其他剂量方案可能是有用的并且可以确定。
7.8.方法和用途
在另一方面，本文提供了本文提供的工程化细胞(例如，CAR-T细胞)的使用方法以及用途。此类方法和用途包括治疗方法和用途，例如，涉及将细胞或含有细胞的组合物施用于患有疾病或病症的受试者。在一些实施例中，细胞以有效量施用以实现疾病或病症的治疗。用途包括细胞在此类方法和治疗中的用途，以及在制备药物以进行这些治疗方法中的用途。在一些实施例中，这些方法通过将细胞或包含这些细胞的组合物施用于患有或怀疑患有疾病或病状的受试者来进行。在一些实施例中，这些方法由此治疗受试者的疾病或病症。
在一些实施例中，本文提供的治疗导致疾病或病症或与其相关的症状、副作用或结果或表型的完全或部分改善或减少。治疗的理想效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。这些术语包括但不暗示完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结果的一个或多个影响。
如本文所用，在一些实施例中，本文提供的治疗延迟疾病或病症的发展，例如，延缓、阻碍、减缓、阻滞、稳定、抑制和/或推迟疾病(诸如癌症)的发展。该延迟可以具有不同的时间长度，其取决于疾病的历史和/或被治疗的个体。如本领域技术人员显而易见的，充分或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体没有患上疾病或病症。例如，可能延迟晚期癌症(例如转移的发展)。在其他实施例中，本文提供的方法或用途预防疾病或病症。
在一些实施例中，本发明CAR-T细胞疗法用于治疗实体瘤癌症。在其他实施例中，本发明CAR-T细胞疗法用于治疗血癌。在其他实施例中，疾病或病症是自身免疫性和炎症性疾病。在其他实施例中，疾病或病症是感染性疾病。
在一些实施例中，疾病或病症是异常细胞生长和/或细胞凋亡失调的疾病。此类疾病的实例包括但不限于癌症、间皮瘤、膀胱癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、骨癌、结肠癌、直肠癌、肛门区癌症、胃癌、胃肠(胃、结直肠和/或十二指肠)癌、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、肝细胞(肝和/或胆管)癌、原发性或继发性中枢神经系统肿瘤、原发性或继发性脑肿瘤、霍奇金病(Hodgkin's disease)、慢性或急性白血病、慢性髓系白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、淋巴母细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞来源的淋巴细胞恶性肿瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、口腔癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、肾和/或输尿管癌症、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、脊柱肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、肾上腺皮质癌、胆囊癌、脾脏癌、胆管癌、纤维肉瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤或其组合。
在一些实施例中，疾病或病症选自由以下组成的组：膀胱癌、脑癌、乳腺癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、结直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞来源的淋巴细胞恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌和脾脏癌。
在一些实施例中，该疾病或病症是血液学癌症，诸如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施例中，癌症选自由以下组成的组：霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、皮肤B细胞淋巴瘤、活化B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡中心性淋巴瘤、转化淋巴瘤、中度分化淋巴细胞性淋巴瘤、中间淋巴细胞性淋巴瘤(ILL)、弥漫性低分化淋巴细胞性淋巴瘤(PDL)、中心细胞淋巴瘤、弥漫性小裂解细胞淋巴瘤(DSCCL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、皮肤T细胞淋巴瘤、外套层淋巴瘤、低级别滤泡性淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性T细胞白血病、急性髓系白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性巨核细胞白血病、前体B急性淋巴母细胞性白血病、前体T急性淋巴母细胞性白血病、伯基特白血病(Burkitt’s leukemia)(伯基特淋巴瘤)、急性双表型白血病、慢性骨髓性淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病(CML)和慢性单核细胞白血病。在特定实施例中，该疾病或病症是骨髓增生异常综合征(MDS)。在另一特定实施例中，该疾病或病症是急性髓系白血病(AML)。在另一特定实施例中，该疾病或病症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在又一特定实施例中，该疾病或病症是多发性骨髓瘤(MM)。
在其他实施例中，该疾病或病症是实体瘤癌症。在一些实施例中，实体瘤癌症选自由以下组成的组：癌、腺癌、肾上腺皮质癌、结肠腺癌、结直肠腺癌、结直肠癌、导管细胞癌、肺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌、肝癌和肺癌。
在一些实施例中，癌症是肾上腺癌。在一些实施例中，癌症是肛门癌。在一些实施例中，癌症是阑尾癌。在一些实施例中，癌症是胆管癌。在一些实施例中，癌症是膀胱癌。在一些实施例中，癌症是骨癌。在一些实施例中，癌症是脑癌。在一些实施例中，癌症是乳腺癌。在一些实施例中，癌症是宫颈癌。在一些实施例中，癌症是结直肠癌。在一些实施例中，癌症是食道癌。在一些实施例中，癌症是胆囊癌。在一些实施例中，癌症是妊娠滋养细胞癌。在一些实施例中，癌症是头颈癌。在一些实施例中，癌症是霍奇金淋巴瘤。在一些实施例中，癌症是肠癌。在一些实施例中，癌症是肾癌。在一些实施例中，癌症是白血病。在一些实施例中，癌症是肝癌。在一些实施例中，癌症是肺癌。在一些实施例中，癌症是黑色素瘤。在一些实施例中，癌症是间皮瘤。在一些实施例中，癌症是多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施例中，癌症是神经内分泌肿瘤。在一些实施例中，癌症为非霍奇金淋巴瘤。在一些实施例中，癌症是口腔癌。在一些实施例中，癌症是卵巢癌。在一些实施例中，癌症是胰腺癌。在一些实施例中，癌症是前列腺癌。在一些实施例中，癌症是窦癌。在一些实施例中，癌症是皮肤癌。在一些实施例中，癌症是软组织肉瘤、脊椎癌。在一些实施例中，癌症是胃癌。在一些实施例中，癌症是睾丸癌。在一些实施例中，癌症是咽喉癌。在一些实施例中，癌症是甲状腺癌。在一些实施例中，癌症是子宫癌、子宫内膜癌。在一些实施例中，癌症是阴道癌。在一些实施例中，癌症是外阴癌。
在一些实施例中，肾上腺癌是肾上腺皮质癌(ACC)、肾上腺皮质癌、嗜铬细胞瘤或神经母细胞瘤。在一些实施例中，肛门癌是鳞状细胞癌、泄殖腔源性癌、腺癌、基底细胞癌或黑色素瘤。在一些实施例中，阑尾癌是神经内分泌肿瘤(NET)、黏液腺癌、杯状细胞类癌、肠型腺癌或印戒细胞腺癌。在一些实施例中，胆管癌是肝外胆管癌、腺癌、肝门部胆管癌、肝门周胆管癌、远端胆管癌或肝内胆管癌。在一些实施例中，膀胱癌是移行细胞癌(TCC)、乳头状癌、扁平癌、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌或肉瘤。在一些实施例中，骨癌是原发性骨癌、肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨巨细胞瘤、脊索瘤或转移性骨癌。在一些实施例中，脑癌是星形细胞瘤、脑干胶质瘤、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤、混合胶质瘤、垂体腺癌、垂体腺瘤、颅咽管瘤、生殖细胞肿瘤、松果体区肿瘤、髓母细胞瘤或原发性CNS淋巴瘤。在一些实施例中，乳腺癌是乳腺腺癌、浸润性乳腺癌、非浸润性乳腺癌、乳腺肉瘤、化生性癌、腺样囊性癌、叶状肿瘤、血管肉瘤、HER2阳性乳腺癌、三阴性乳腺癌或炎性乳腺癌。在一些实施例中，宫颈癌是鳞状细胞癌或腺癌。在一些实施例中，结直肠癌是结直肠腺癌、原发性结直肠淋巴瘤、胃肠道间质瘤、平滑肌肉瘤、类癌瘤、黏液腺癌、印戒细胞腺癌、胃肠道类癌瘤或黑色素瘤。在一些实施例中，食道癌是腺癌或鳞状细胞癌。在一些实施例中，胆囊癌是腺癌、乳头状腺癌、腺鳞癌、鳞状细胞癌、小细胞癌或肉瘤。在一些实施例中，妊娠滋养细胞疾病(GTD)是葡萄胎、妊娠滋养细胞肿瘤(GTN)、绒毛膜癌、胎盘部位滋养细胞肿瘤(PSTT)或上皮样滋养细胞肿瘤(ETT)。在一些实施例中，头颈癌是喉癌、鼻咽癌、下咽癌、鼻腔癌、鼻旁窦癌、唾液腺癌、口腔癌、口咽癌或扁桃体癌。在一些实施例中，霍奇金淋巴瘤是经典型霍奇金淋巴瘤，结节硬化型、混合细胞型、富于淋巴细胞型、淋巴细胞消减型或结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤(NLPHL)。在一些实施例中，肠癌是小肠癌(small intestine cancer)、小肠癌(small bowel cancer)、腺癌、肉瘤、胃肠道间质瘤、类癌瘤或淋巴瘤。在一些实施例中，肾癌是肾细胞癌(RCC)、透明细胞RCC、乳头状RCC、嫌色细胞RCC、集合管RCC、未分类RCC、移行细胞癌、尿路上皮癌、肾盂癌或肾肉瘤。在一些实施例中，白血病是急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓系白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)或骨髓增生异常综合征(MDS)。在特定实施例中，白血病是AML。在一些实施例中，肝癌是肝细胞癌(HCC)、纤维板层样HCC、胆管癌、血管肉瘤或肝转移。在一些实施例中，肺癌是小细胞肺癌、小细胞癌、组合小细胞癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状细胞肺癌、大细胞未分化癌、肺结节、转移性肺癌、腺鳞癌、大细胞神经内分泌癌、唾液腺型肺癌、肺类癌、间皮瘤、肺肉瘤样癌或恶性颗粒细胞肺肿瘤。在一些实施例中，黑色素瘤是浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、无色素性黑色素瘤、结缔组织增生性黑色素瘤、眼黑色素瘤或转移性黑色素瘤。在一些实施例中，间皮瘤是胸膜间皮瘤、腹膜间皮瘤、围心间皮瘤或睾丸间皮瘤。在一些实施例中，多发性骨髓瘤是活动性骨髓瘤或冒烟性骨髓瘤。在一些实施例中，神经内分泌肿瘤是胃肠道神经内分泌肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤或肺神经内分泌肿瘤。在一些实施例中，非霍奇金淋巴瘤是间变性大细胞淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、小细胞淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、前体T淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、成人T细胞淋巴瘤/白血病(ATLL)、毛细胞白血病、B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、结内边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、B细胞非霍奇金淋巴瘤、T细胞非霍奇金淋巴瘤、自然杀伤细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、Alibert-Bazin综合征、塞扎里综合征、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、全身性ALCL、肠病型T细胞淋巴瘤(EATL)或肝脾γ/δT细胞淋巴瘤。在一些实施例中，口腔癌是鳞状细胞癌、疣状癌、小唾液腺癌、淋巴瘤、良性口腔肿瘤、嗜酸性肉芽肿、纤维瘤、颗粒细胞瘤、角化棘皮瘤、平滑肌瘤、骨软骨瘤、脂肪瘤、神经鞘瘤、神经纤维瘤、乳头状瘤、尖锐湿疣、疣状黄瘤、化脓性肉芽肿、横纹肌瘤、牙源性肿瘤、白斑、红斑、鳞状细胞唇癌、基底细胞唇癌、口癌、牙龈癌或舌癌。在一些实施例中，卵巢癌是卵巢上皮癌、黏液性上皮卵巢癌、子宫内膜样上皮卵巢癌、透明细胞上皮卵巢癌、未分化上皮卵巢癌、卵巢低恶性潜能肿瘤、原发性腹膜癌、输卵管癌、生殖细胞瘤、畸胎瘤、无性细胞瘤、卵巢生殖细胞癌、内胚窦瘤、性索-间质瘤、性索-性腺间质瘤、卵巢间质瘤、颗粒细胞肿瘤、颗粒-卵泡膜细胞瘤、支持细胞-间质细胞瘤(Sertoli-Leydig tumor)、卵巢肉瘤、卵巢癌肉瘤、卵巢腺肉瘤、卵巢平滑肌肉瘤、卵巢纤维肉瘤、克鲁肯贝格瘤(Krukenberg tumor)或卵巢囊肿。在一些实施例中，胰腺癌是胰腺外泌腺癌、胰腺内分泌腺癌或胰腺腺癌、胰岛细胞瘤或神经内分泌肿瘤。在一些实施例中，前列腺癌是前列腺腺癌、前列腺肉瘤、移行细胞癌、小细胞癌或神经内分泌肿瘤。在一些实施例中，窦癌是鳞状细胞癌、粘膜细胞癌、腺样囊性细胞癌、腺泡细胞癌、鼻窦未分化癌、鼻腔癌、鼻旁窦癌、上颌窦癌、筛窦癌或鼻咽癌。在一些实施例中，皮肤癌是基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、默克尔细胞癌、卡波西肉瘤(KS)、光线性角化病、皮肤淋巴瘤或角化棘皮瘤。在一些实施例中，软组织癌是血管肉瘤、皮肤纤维肉瘤、上皮样肉瘤、尤因肉瘤、纤维肉瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、去分化脂肪肉瘤(DL)、黏液性/圆细胞脂肪肉瘤(MRCL)、高分化脂肪肉瘤(WDL)、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤(RMS)或滑膜肉瘤。在一些实施例中，脊椎癌是脊椎转移瘤。在一些实施例中，胃癌是胃腺癌、胃淋巴瘤、胃肠道间质瘤、类癌瘤、胃类癌瘤、I型ECL细胞类癌、II型ECL细胞类癌或III型ECL细胞类癌。在一些实施例中，睾丸癌是精原细胞瘤、非精原细胞瘤、胚胎癌、卵黄囊癌、绒毛膜癌、畸胎瘤、性腺间质瘤、睾丸间质细胞瘤或睾丸支持细胞瘤。在一些实施例中，咽喉癌是鳞状细胞癌、腺癌、肉瘤、喉癌、咽癌、鼻咽癌、口咽癌、下咽癌、喉癌、喉鳞状细胞癌、喉腺癌、淋巴上皮瘤、梭形细胞癌、疣状癌、未分化癌或淋巴结癌。在一些实施例中，甲状腺癌是乳头状癌、滤泡状癌、Hürthle细胞癌、甲状腺髓样癌或间变性癌。在一些实施例中，子宫癌是子宫内膜癌、子宫内膜腺癌、子宫内膜样癌、浆液性腺癌、腺鳞癌、子宫癌肉瘤、子宫肉瘤、子宫平滑肌肉瘤、子宫内膜间质肉瘤或未分化肉瘤。在一些实施例中，阴道癌是鳞状细胞癌、腺癌、黑色素瘤或肉瘤。在一些实施例中，外阴癌是鳞状细胞癌或腺癌。
在一些实施例中，疾病或病症是由病原体引起的。在一些实施例中，病原体引起选自由以下组成的组的感染性疾病：急性弛缓性脊髓炎(AFM)，边虫病，炭疽，巴贝西虫病，肉毒杆菌中毒，布鲁氏菌病，弯曲杆菌病，耐碳青霉烯感染，软下疳，基孔肯亚病毒感染，衣原体疾病，鱼肉毒，艰难梭菌感染，产气荚膜梭菌疾病、球孢子菌病真菌感染，冠状病毒感染，Covid-19(SARS-CoV-2)，克罗伊茨费尔特-雅各布病/传染性海绵状脑病，隐孢子虫病(Crypto)，环孢子虫病，1、2、3或4型登革热，白喉，大肠杆菌感染/产志贺毒素(STEC)，东方马脑炎，出血热(埃博拉)，埃立克体病，脑炎，虫媒病毒或副感染性疾病，非脊髓灰质炎肠道病毒，D68肠道病毒疾病(EV-D68)，贾第虫病，鼻疽病，淋球菌感染，腹股沟肉芽肿，B型流感嗜血杆菌病(Hib或H-流感)，汉坦病毒肺综合征(HPS)，溶血性尿毒症综合征(HUS)，甲型肝炎(Hep A)，乙型肝炎(Hep B)，丙型肝炎(Hep C)，丁型肝炎(Hep D)，戊型肝炎(Hep E)，疱疹，带状疱疹(Herpes Zoster/Shingles)，组织胞浆菌病感染，人类免疫缺陷病毒/艾滋病(HIV/AIDS)，人乳头瘤病毒(HPV)，流感(Flu)，军团杆菌病(军团病)，麻风(汉森氏病)，钩端螺旋体病，李斯特菌病(李斯特菌)，莱姆病，性病淋巴肉芽肿感染(LGV)，疟疾，麻疹，类鼻疽，脑膜炎(病毒性)，脑膜炎球菌病(脑膜炎(细菌性))，中东呼吸综合征冠状病毒疾病(MERS-CoV)，腮腺炎，诺如病毒疾病，虱病，盆腔炎性疾病(PID)，百日咳(顿咳)，鼠疫(腺鼠疫、败血病性鼠疫、肺炎性鼠疫)，肺炎球菌病(肺炎)，脊髓灰质炎(脊灰(Polio))，波瓦生，鹦鹉热，阴虱病，脓疱疹病(天花、猴痘、牛痘)，Q热，狂犬病，立克次体病(落基山斑疹热)，风疹(Rubella/German Measles)，沙门氏菌胃肠炎(沙门氏菌)，疥疮，鲭鱼中毒，脓毒症，严重急性呼吸综合征(SARS)，志贺菌病胃肠炎(志贺菌)，天花，耐甲氧西林葡萄球菌感染(MRSA)，葡萄球菌食物中毒肠毒素B中毒(葡萄球菌食物中毒)，万古霉素中度耐药性葡萄球菌感染(VISA)，万古霉素耐药性葡萄球菌感染(VRSA)，A组链球菌病(侵袭性)(Strep A(侵袭性))，B组链球菌病(Strep-B)，链球菌中毒性休克综合征STSS中毒性休克，梅毒(原发性、继发性、早期潜伏性、晚期潜伏性、先天性)，破伤风感染，滴虫病，旋毛虫病感染，结核病(TB)，潜伏性结核病(LTBI)，兔热病，D组伤寒症，阴道病，水痘(Varicella/Chickenpox)，霍乱弧菌疾病(霍乱)，弧菌病(弧菌)，埃博拉病毒出血热，拉沙病毒(Lasa Virus)出血热，马尔堡病毒出血热，西尼罗病毒，黄热病，耶尔森氏菌疾病和寨卡病毒感染。在一些实施例中，感染性疾病是急性弛缓性脊髓炎(AFM)。在一些实施例中，感染性疾病是边虫病。在一些实施例中，感染性疾病是炭疽。在一些实施例中，感染性疾病是巴贝西虫病。在一些实施例中，感染性疾病是肉毒杆菌中毒。在一些实施例中，感染性疾病是布鲁氏菌病。在一些实施例中，感染性疾病是弯曲杆菌病。在一些实施例中，感染性疾病是耐碳青霉烯感染。在一些实施例中，感染性疾病是软下疳。在一些实施例中，感染性疾病是基孔肯亚病毒感染。在一些实施例中，感染性疾病是衣原体疾病。在一些实施例中，感染性疾病是鱼肉毒。在一些实施例中，感染性疾病是艰难梭菌感染。在一些实施例中，感染性疾病是产气荚膜梭菌。在一些实施例中，感染性疾病是球孢子菌病真菌感染。在一些实施例中，感染性疾病是冠状病毒疾病。在一些实施例中，感染性疾病是Covid-19(SARS-CoV-2)。在一些实施例中，感染性疾病是克罗伊茨费尔特-雅各布病/传染性海绵状脑病。在一些实施例中，感染性疾病是隐孢子虫病(Crypto)。在一些实施例中，感染性疾病是环孢子虫病。在一些实施例中，感染性疾病是1、2、3或4型登革热。在一些实施例中，感染性疾病是白喉。在一些实施例中，感染性疾病是大肠杆菌感染/产志贺毒素(STEC)。在一些实施例中，感染性疾病是东方马脑炎。在一些实施例中，感染性疾病是出血热(埃博拉)。在一些实施例中，感染性疾病是埃立克体病。在一些实施例中，感染性疾病是脑炎。在一些实施例中，感染性疾病是虫媒病毒或副感染性疾病。在一些实施例中，感染性疾病是非脊髓灰质炎肠道病毒。在一些实施例中，感染性疾病是D68肠道病毒疾病(EV-D68)。在一些实施例中，感染性疾病是贾第虫病。在一些实施例中，感染性疾病是鼻疽病。在一些实施例中，感染性疾病是淋球菌感染。在一些实施例中，感染性疾病是腹股沟肉芽肿。在一些实施例中，感染性疾病是B型流感嗜血杆菌病(Hib或H-流感)。在一些实施例中，感染性疾病是汉坦病毒肺综合征(HPS)。在一些实施例中，感染性疾病是溶血性尿毒症综合征(HUS)。在一些实施例中，感染性疾病是甲型肝炎(Hep A)。在一些实施例中，感染性疾病是乙型肝炎(Hep B)。在一些实施例中，感染性疾病是丙型肝炎(HepC)。在一些实施例中，感染性疾病是丁型肝炎(Hep D)。在一些实施例中，感染性疾病是戊型肝炎(Hep E)。在一些实施例中，感染性疾病是疱疹。在一些实施例中，感染性疾病是带状疱疹(Herpes Zoster/Shingles)。在一些实施例中，感染性疾病是组织胞浆菌病感染。在一些实施例中，感染性疾病是人类免疫缺陷病毒/艾滋病(HIV/AIDS)。在一些实施例中，感染性疾病是人乳头瘤病毒(HPV)。在一些实施例中，感染性疾病是流感(Flu)。在一些实施例中，感染性疾病是军团杆菌病(军团病)。在一些实施例中，感染性疾病是麻风(汉森氏病)。在一些实施例中，感染性疾病是钩端螺旋体病。在一些实施例中，感染性疾病是李斯特菌病(李斯特菌)。在一些实施例中，感染性疾病是莱姆病。在一些实施例中，感染性疾病是性病淋巴肉芽肿感染(LGV)。在一些实施例中，感染性疾病是疟疾。在一些实施例中，感染性疾病是麻疹。在一些实施例中，感染性疾病是类鼻疽。在一些实施例中，感染性疾病是脑膜炎(病毒性)。在一些实施例中，感染性疾病是脑膜炎球菌病(脑膜炎(细菌性))。在一些实施例中，感染性疾病是中东呼吸综合征冠状病毒疾病(MERS-CoV)。在一些实施例中，感染性疾病是腮腺炎。在一些实施例中，感染性疾病是诺如病毒疾病。在一些实施例中，感染性疾病是虱病。在一些实施例中，感染性疾病是盆腔炎性疾病(PID)。在一些实施例中，感染性疾病是百日咳(顿咳)。在一些实施例中，感染性疾病是鼠疫(腺鼠疫；在一些实施例中，感染性疾病是败血病性鼠疫；在一些实施例中，感染性疾病是肺炎性鼠疫)。在一些实施例中，感染性疾病是肺炎球菌病(肺炎)。在一些实施例中，感染性疾病是脊髓灰质炎(脊灰)。在一些实施例中，感染性疾病是波瓦生。在一些实施例中，感染性疾病是鹦鹉热。在一些实施例中，感染性疾病是阴虱病。在一些实施例中，感染性疾病是脓疱疹病(天花；在一些实施例中，感染性疾病是猴痘；在一些实施例中，感染性疾病是牛痘)。在一些实施例中，感染性疾病是Q热。在一些实施例中，感染性疾病是狂犬病。在一些实施例中，感染性疾病是立克次体病(落基山斑疹热)。在一些实施例中，感染性疾病是风疹(Rubella/German Measles)。在一些实施例中，感染性疾病是沙门氏菌胃肠炎(沙门氏菌)。在一些实施例中，感染性疾病是疥疮。在一些实施例中，感染性疾病是鲭鱼中毒。在一些实施例中，感染性疾病是脓毒症。在一些实施例中，感染性疾病是严重急性呼吸综合征(SARS)。在一些实施例中，感染性疾病是志贺菌病胃肠炎(志贺菌)。在一些实施例中，感染性疾病是天花。在一些实施例中，感染性疾病是耐甲氧西林葡萄球菌感染(MRSA)。在一些实施例中，感染性疾病是葡萄球菌食物中毒肠毒素B中毒(葡萄球菌食物中毒)。在一些实施例中，感染性疾病是万古霉素中度耐药性葡萄球菌感染(VISA)。在一些实施例中，感染性疾病是万古霉素耐药性葡萄球菌感染(VRSA)。在一些实施例中，感染性疾病是A组链球菌病(侵袭性)(Strep A(侵袭性))。在一些实施例中，感染性疾病是链球菌病。在一些实施例中，感染性疾病是B组疾病(Strep-B)。在一些实施例中，感染性疾病是链球菌中毒性休克综合征STSS中毒性休克。在一些实施例中，感染性疾病是梅毒(原发性；在一些实施例中，感染性疾病是继发性的；在一些实施例中，感染性疾病是早期潜伏性的；在一些实施例中，感染性疾病是晚期潜伏性的；在一些实施例中，感染性疾病是先天性的)。在一些实施例中，感染性疾病是破伤风感染。在一些实施例中，感染性疾病是滴虫病。在一些实施例中，感染性疾病是旋毛虫病感染。在一些实施例中，感染性疾病是结核病(TB)。在一些实施例中，感染性疾病是潜伏性结核病(LTBI)。在一些实施例中，感染性疾病是兔热病。在一些实施例中，感染性疾病是D组伤寒症。在一些实施例中，感染性疾病是阴道病。在一些实施例中，感染性疾病是水痘(Varicella/Chickenpox)、霍乱弧菌疾病(霍乱)。在一些实施例中，感染性疾病是弧菌病(弧菌)。在一些实施例中，感染性疾病是埃博拉病毒出血热。在一些实施例中，感染性疾病是拉沙病毒出血热。在一些实施例中，感染性疾病是马尔堡病毒出血热。在一些实施例中，感染性疾病是西尼罗病毒。在一些实施例中，感染性疾病是黄热病。在一些实施例中，感染性疾病是耶尔森氏菌疾病。在一些实施例中，感染性疾病是寨卡病毒感染。
在一些实施例中，病原体是细菌。在一些实施例中，细菌是芽孢杆菌属、巴尔通体属、鲍特菌属、包柔氏螺旋体属、布鲁氏菌属、弯曲杆菌属、衣原体属、类衣原体属、梭菌属、棒状杆菌属、肠球菌属、埃希氏菌属、弗朗西丝菌属、嗜血杆菌属、螺杆菌属、军团杆菌属、钩端螺旋体属、李斯特菌属、分枝杆菌属、支原体属、奈瑟菌属、假单胞菌属、立克次氏体属、沙门氏菌属、志贺菌属、葡萄球菌属、链球菌属、密螺旋体属、脲原体属、弧菌属或耶尔森氏菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是芽孢杆菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是巴尔通体属的细菌。在一些实施例中，细菌是鲍特菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是包柔氏螺旋体属的细菌。在一些实施例中，细菌是布鲁氏菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是弯曲杆菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是衣原体属的细菌。在一些实施例中，细菌是类衣原体属的细菌。在一些实施例中，细菌是梭菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是棒状杆菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是肠球菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是埃希氏菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是弗朗西丝菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是嗜血杆菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是螺杆菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是军团杆菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是钩端螺旋体属的细菌。在一些实施例中，细菌是李斯特菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是分枝杆菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是支原体属的细菌。在一些实施例中，细菌是奈瑟菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是假单胞菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是立克次氏体属的细菌。在一些实施例中，细菌是沙门氏菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是志贺菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是葡萄球菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是链球菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是密螺旋体属的细菌。在一些实施例中，细菌是脲原体属的细菌。在一些实施例中，细菌是弧菌属的细菌。在一些实施例中，细菌是耶尔森氏菌属的细菌。
在一些实施例中，病原体是寄生虫。在一些实施例中，寄生虫是原生动物、蠕虫或体外寄生虫。在一些实施例中，原生动物是内阿米巴虫、贾第虫、利什曼原虫、肠袋虫、疟原虫或隐孢子虫。在一些实施例中，蠕虫是吸虫、绦虫、棘头虫或蛔虫。在一些实施例中，体外寄生虫是节肢动物。
在一些实施例中，病原体是病毒。在一些实施例中，病毒是腺病毒科、沙粒病毒科、星状病毒科、布尼亚病毒科、杯状病毒科、冠状病毒科、丝状病毒科、黄病毒科、嗜肝DNA病毒科、肝炎病毒科、正黏液病毒科、乳头瘤病毒科、副黏液病毒科、细小病毒科、小核糖核酸病毒科、多瘤病毒科、痘病毒科、呼肠孤病毒科、逆转录病毒科、弹状病毒科或披膜病毒科的病毒。在一些实施例中，科。在一些实施例中，病毒是腺病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是沙粒病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是星状病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是布尼亚病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是杯状病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是冠状病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是丝状病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是黄病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是嗜肝DNA病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是肝炎病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是正黏液病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是乳头瘤病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是副黏液病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是细小病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是小核糖核酸病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是多瘤病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是痘病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是呼肠孤病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是逆转录病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是弹状病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是披膜病毒科的病毒。
在一些实施例中，病毒是腺病毒、冠状病毒、柯萨奇病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒2型、巨细胞病毒、人类疱疹病毒8型、人类免疫缺陷病毒、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒、副流感病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、风疹病毒或水痘-带状疱疹病毒。在一些实施例中，病毒是腺病毒。在一些实施例中，病毒是冠状病毒。在一些实施例中，冠状病毒是Covid-19(SARS-CoV-2)。在一些实施例中，病毒是柯萨奇病毒。在一些实施例中，病毒是爱泼斯坦-巴尔病毒。在一些实施例中，病毒是甲型肝炎病毒。在一些实施例中，病毒是乙型肝炎病毒。在一些实施例中，病毒是丙型肝炎病毒。在一些实施例中，病毒是单纯疱疹病毒2型。在一些实施例中，病毒是巨细胞病毒。在一些实施例中，病毒是人类疱疹病毒8型。在一些实施例中，病毒是人类免疫缺陷病毒。在一些实施例中，病毒是流感病毒。在一些实施例中，病毒是麻疹病毒。在一些实施例中，病毒是腮腺炎病毒。在一些实施例中，病毒是人乳头瘤病毒。在一些实施例中，病毒是副流感病毒。在一些实施例中，病毒是脊髓灰质炎病毒。在一些实施例中，病毒是狂犬病病毒。在一些实施例中，病毒是呼吸道合胞病毒。在一些实施例中，病毒是风疹病毒。在一些实施例中，病毒是水痘-带状疱疹病毒。
在其他实施例中，该疾病或病症是免疫性或自身免疫性病症。此类病症包括自身免疫性大疱病、无β脂蛋白血症、获得性免疫缺陷相关疾病、与器官移植相关的急性免疫疾病、获得性手足发绀、急性和慢性寄生或感染过程、急性胰腺炎、急性肾衰竭、急性风湿热、急性横贯性脊髓炎、腺癌、心房异位搏动(aerial ectopic beat)、成人(急性)呼吸窘迫综合征、艾滋病痴呆综合征、酒精性肝硬化、酒精性肝损伤、酒精性肝炎、变应性结膜炎、变应性接触性皮炎、变应性鼻炎、变态反应和哮喘、同种异体移植排斥、α-l-抗胰蛋白酶缺乏症、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化、贫血、心绞痛、强直性脊柱炎相关肺病、前角细胞退化、抗体介导的细胞毒性、抗磷脂综合征、抗受体超敏反应、主动脉和外周动脉瘤、主动脉夹层、动脉高血压、动脉硬化、动静脉瘘、关节病、衰弱、哮喘、共济失调、特应性变态反应、心房颤动(持续或阵发性)、心房扑动、房室传导阻滞、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(典型自身免疫性或狼疮性肝炎)、自身免疫介导的低血糖、自身免疫中性粒细胞减少、自身免疫性血小板减少症、自身免疫性甲状腺疾病、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植物(BMT)排斥、闭塞性细支气管炎、束支传导阻滞、烧伤、恶病质、心律失常、心脏眩晕综合征、心脏肿瘤、心肌病、体外循环炎症反应、软骨移植排斥、小脑皮质退化、小脑病症、混乱或多灶性房性心动过速、化疗相关病症、衣原体、胆汁郁积(choleosatatis)、慢性酒精中毒、慢性活动性肝炎、慢性疲劳综合征、与器官移植相关的慢性免疫疾病、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、慢性炎症性疾病、慢性皮肤粘膜念珠菌病、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性水杨酸中毒、结直肠常见各种免疫缺陷(常见的可变性低丙种球蛋白血症)、结膜炎、结缔组织病-相关间质性肺病、接触性皮炎、Coombs阳性溶血性贫血、肺心病、克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)、隐源性自身免疫性肝炎、隐源性纤维化肺泡炎、培养阴性脓毒症、囊胞性纤维症、细胞因子治疗相关病症、克罗恩病(Crohn's disease)、拳击性痴呆、脱髓鞘疾病、登革出血热、皮炎、皮炎硬皮病、皮肤病、皮肌炎/多肌炎相关肺病、糖尿病(diabetes)、糖尿病动脉硬化症、糖尿病(diabetes mellitus)、弥漫性路易体病、扩张型心肌病、扩张型充血性心肌病、盘状红斑狼疮、基底神经节疾病、弥漫性血管内凝血、中年唐氏综合征、药物引起的间质性肺病、药物引起的肝炎、由阻断CNS多巴胺受体的药物引起的药物引起的运动障碍、药物敏感、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、肠病性滑膜炎、会厌炎、爱泼斯坦-巴尔病毒感染、红斑性肢痛症、锥体外系和小脑疾病、家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症、胎儿胸腺植入物排斥、弗里德赖希共济失调(Friedreich's ataxia)、功能性外周动脉疾病、女性不孕症、纤维化、纤维化肺病、真菌脓毒症、气性坏疽、胃溃疡、巨细胞动脉炎、肾小球肾炎、肾小球炎(glomerulonephritides)、古德帕斯丘综合征、甲状腺肿性自身免疫性甲状腺功能减退症(桥本氏病)、痛风性关节炎、任何器官或组织的移植物排斥、移植物抗宿主病、革兰氏阴性脓毒症、革兰氏阳性脓毒症、胞内生物引起的肉芽肿、B组链球菌(GBS)感染、格雷夫斯病、含铁血黄素沉着症相关的肺病、毛细胞白血病、哈勒沃登-施帕茨病、桥本甲状腺炎、花粉症、心脏移植排斥、血色病、造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、溶血性贫血、溶血性尿毒症综合征/溶栓性血小板减少性紫癜、出血、过敏性紫癜(Henoch-Schoenlein purpura)、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、HIV感染/HIV神经病变、霍奇金病、甲状旁腺功能减退、亨廷顿舞蹈症(Huntington's chorea)、运动增多性运动障碍、超敏反应、超敏反应性肺炎、甲状腺机能亢进、运动功能减退性运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评估、特发性艾迪生病(idiopathic Addison's disease)、特发白细胞减少症、特发性肺纤维化、特发性血小板减少症、特异性肝病、婴儿型脊髓性肌萎缩、感染性疾病、主动脉炎症、炎症性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、间质性肺炎、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血再灌注损伤、缺血性中风、幼年型恶性贫血、幼年型类风湿关节炎、幼年型脊髓性肌萎缩、卡波西肉瘤(Kaposi'ssarcoma)、川崎病、肾移植排斥、军团菌、利什曼病、麻风病、皮质脊髓系统病变、线性IgA病、脂性水肿(lipidema)、肝移植排斥、莱姆病(Lyme disease)、淋巴性水肿(lymphederma)、淋巴细胞浸润性肺病、疟疾、男性不育特发性或NOS、恶性组织细胞增多症、恶性黑色素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌败血症、肾脏显微镜下血管炎、偏头痛、线粒体多系统病症、混合性结缔组织病、混合性结缔组织病相关肺病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统退化(Mencel、Dejerine-Thomas、Shy-Drager和Machado-Joseph)、肌痛性脑炎/慢性疲劳综合征(Royal Free Disease)、重症肌无力、肾脏显微镜下血管炎、胞内鸟分枝杆菌、结核分枝杆菌、骨髓增生异常综合征、心肌梗死、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾病、肾病综合征、神经退行性疾病、神经源性I型肌肉萎缩、中性粒细胞低热、非酒精性脂肪性肝炎、腹主动脉及其分支闭塞、闭塞性动脉病症、器官移植排斥、睾丸炎/附睾炎(epidydimitis)、睾丸炎/输精管结扎术逆转术、器官肿大、骨关节炎、骨质疏松症、卵巢衰竭、胰腺移植排斥、寄生虫病、甲状旁腺移植排斥、帕金森病、盆腔炎性疾病、寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、类天疱疮、常年性鼻炎、心包疾病、外周动脉粥样硬化疾病、外周血管疾病、腹膜炎、恶性贫血、晶状体源性葡萄膜炎、卡氏肺孢子虫肺炎、肺炎、POEMS综合征(多发性神经病、器官肿大、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤变化综合征)、灌注后综合征、泵后综合征(post-pump syndrome)、MI后心切开术综合征、感染后间质性肺病、卵巢功能早衰、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性肝炎、原发性粘液性水肿、原发性肺动脉高压、原发性硬化性胆管炎、原发性血管炎、进行性核上性麻痹、银屑病、1型银屑病、2型银屑病、银屑病性关节病、结缔组织病继发的肺动脉高压、结节性多动脉炎的肺部表现、炎症后间质性肺病、放射纤维化、放射疗法、雷诺现象和疾病(Raynaud's phenomenon and disease)、雷诺病、雷弗素姆氏病(Refsum's disease)、规则窄QRS心动过速、莱特尔氏病(Reiter'sdisease)、肾病NOS、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、类风湿关节炎相关间质性肺病、类风湿性脊柱炎、结节病、施密特综合征(Schmidt's syndrome)、硬皮病、老年舞蹈病、路易体型老年痴呆、脓毒症综合征、脓毒性休克、血清阴性关节病、休克、镰状细胞性贫血、T细胞或FAB ALL、高安氏综合征(Takayasu's disease)/动脉炎、毛细血管扩张、Th2型和Thl型介导的疾病、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少症、甲状腺炎、毒性、中毒性休克综合征、移植、创伤/出血、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、B型胰岛素抵抗伴黑棘皮病、III型超敏反应、IV型超敏、溃疡性结肠炎关节病、溃疡性结肠炎、不稳定型心绞痛、尿毒症、尿脓毒症、荨麻疹、葡萄膜炎、心脏瓣膜病、静脉曲张、血管炎、血管炎性弥漫性肺病、静脉疾病、静脉血栓形成、心室颤动、白癜风急性肝病、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒性相关噬血细胞综合征、韦格纳肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、韦尼克-科尔萨科夫综合征(Wernicke-Korsakoff syndrome)、威尔逊氏症(Wilson's disease)、任何器官或组织的异种移植排斥、耶尔森菌和沙门氏菌相关关节病、获得性免疫缺陷病综合征(AIDS)、自身免疫性淋巴增殖综合征、溶血性贫血、炎症性疾病、血小板减少症、与器官移植相关的急性和慢性免疫疾病、艾迪生病、过敏性疾病、脱发、斑秃、动脉粥样化性疾病/动脉硬化、动脉粥样硬化、关节炎(包括骨关节炎、幼年型慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、银屑病性关节炎和反应性关节炎)、舍格伦病相关肺病(Sjogren's disease-associated lung disease)、舍格伦综合征(Sjogren's syndrome)、皮肤同种异体移植排斥、皮肤变化综合征(skin changes syndrome)、小肠移植排斥、精子自身免疫、多发性硬化(所有亚型)、脊柱共济失调、脊髓小脑退化、脊柱关节病、散发性多腺缺乏症I型、散发性多腺缺乏症II型、斯蒂尔氏病(Still's disease)、链球菌性肌炎、中风、小脑结构性病变、亚急性硬化性全脑炎、交感性眼炎、晕厥、心血管系统梅毒、全身性过敏反应、全身炎症反应综合征、全身性发作的幼年型类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、系统性红斑狼疮相关肺病、狼疮性肾炎、系统性硬化症和系统性硬化相关间质性肺病。
在一些实施例中，疾病或病症是炎症性疾病。炎症在宿主防御和免疫介导疾病的进展中起着重要作用。炎症反应是对损伤(例如，创伤、缺血和外来颗粒)和感染(例如，细菌或病毒感染)的反应，通过包括化学介质(例如，细胞因子和前列腺素)和炎症细胞(例如，白细胞)在内的复杂级联事件而启动的。炎症反应的特点是血流量增加、毛细血管通透性增加和吞噬细胞的大量涌入。这些事件导致受伤或感染部位肿胀、发红、发热(热模式改变)和脓形成。
细胞因子和前列腺素控制炎症反应，并以有序和自我限制的级联方式释放到血液或受影响的组织中。细胞因子和前列腺素的这种释放增加了流向受伤或感染区域的血流量，并可能导致发红和发热。其中一些化学物质导致液体泄漏到组织中，导致肿胀。这一保护过程可能刺激神经并导致疼痛。这些变化在相关区域内发生的时间有限时，对身体有益。
炎症反应中体液和细胞免疫元件之间的微妙平衡的相互作用能够消除有害药剂并启动受损组织的修复。当这种微妙平衡的相互作用被破坏时，炎症反应可能会对正常组织造成相当大的损害，并且可能比最初引发反应的损伤更有害。在这些炎症反应失控的情况下，需要进行临床干预以防止组织损伤和器官功能障碍。诸如银屑病、类风湿关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎、克罗恩病、哮喘、变态反应或炎症性肠病等疾病以慢性炎症为特征。炎症性疾病，诸如关节炎、相关关节炎病状(例如，骨关节炎、类风湿关节炎和银屑病性关节炎)、炎症性肠病(例如，克罗恩病和溃疡性结肠炎)、脓毒症、银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎和慢性阻塞性肺病、慢性炎症性肺病也很普遍，而且是有问题的疾病。
在一些实施例中，这些方法包括过继细胞疗法，由此将基因工程化细胞施用于受试者。这样的施用可以促进细胞的活化(例如，T细胞活化)，使得疾病或病症的细胞被靶向破坏。
在一些实施例中，这些方法包括将这些细胞或含有这些细胞的组合物施用于受试者、组织或细胞，诸如患有疾病或病症、处于疾病或病症的风险中或怀疑患有疾病或病症的受试者、组织或细胞。在一些实施例中，将细胞、群和组合物施用于患有待治疗的特定疾病或病症的受试者，例如，通过过继细胞疗法，诸如过继T细胞疗法。在一些实施例中，将细胞或组合物施用于受试者，诸如患有疾病或病症或处于疾病或病症的风险中的受试者。在一些实施例中，该方法由此治疗例如，改善疾病或病症的一种或多种症状。
用于过继细胞疗法的细胞施用方法是已知的，如例如，在以下中所述：美国专利申请公开号2003/0170238；美国专利号4,690,915；Rosenberg,Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85(2011)；Themeli等人,Nat Biotechnol.31(10):928-933(2013)；Tsukahara等人,Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9(2013)；及Davila等人,PLoS ONE 8(4):e61338(2013)。这些方法可以与本文提供的方法和组合物结合使用。
在一些实施例中，细胞疗法(例如过继T细胞疗法)通过自体转移进行，其中细胞从待接受细胞疗法的受试者或源自这样的受试者的样品分离和/或以其他方式制备。因此，在一些方面，细胞源自需要治疗的受试者，并且在分离和处理后，将细胞施用于同一受试者。在其他实施例中，细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过同种异体转移进行，其中细胞从待接受或最终接受细胞疗法的受试者之外的受试者(例如第一受试者)分离和/或以其他方式制备。在此类实施例中，然后将细胞施用于相同物种的不同受试者，例如，第二受试者。在一些实施例中，第一受试者和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施例中，第一受试者和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施例中，第二受试者表达与第一受试者相同的HLA类型或超型。
在一些实施例中，施用细胞、细胞群或组合物的受试者是灵长类动物，诸如人。受试者可以是男性或女性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、幼年、青少年、成人和老年受试者。在一些实例中，受试者是用于疾病、过继细胞疗法和/或用于评估毒性结果的经过验证的动物模型。
本文提供的组合物可以通过任何合适的方式施用，例如通过注射，例如，静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、结膜下注射、眼球筋膜下注射、眼球后注射、球周注射或后近巩膜递送。在一些实施例中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内施用，并且如果需要局部治疗，则通过病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。
有效预防和/或治疗疾病或病状的本文提供的预防剂或治疗剂的量可以通过标准临床技术确定。有效剂量可以从得自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推。对于疾病的预防或治疗，结合分子或细胞的适当剂量可以取决于待治疗的疾病或病症的类型、结合分子的类型、疾病或病症的严重程度和病程、施用治疗剂是否用于预防或治疗目的、先前疗法、患者的临床病史和对药剂的反应，以及主治医师的判断。在一些实施例中，组合物、分子和细胞在一次或在一系列治疗中适当地施用于患者。可以间歇地施用多个剂量。可以施用初始较高的负荷剂量，随后施用一个或多个较低的剂量。
在基因工程化细胞的情况下，在一些实施例中，可以向受试者施用约一百万至约1千亿个细胞和/或每千克体重该量的细胞。在一些实施例中，其中该药物组合物包含本文所述的工程化免疫细胞中任一个，该药物组合物以至少约104、105、106、107、108、或109个细胞/kg个体体重中任一的剂量施用。剂量可以根据疾病或病症和/或患者和/或其他治疗的特定属性而变化。
在一些实施例中，施用一次药物组合物。在一些实施例中，施用多次(例如2、3、4、5、6或更多次中的任一个)药物组合物。在一些实施例中，药物组合物在给药周期中施用一次或多次。给药周期可以是例如1、2、3、4、5或更多周，或1、2、3、4、5或更多个月。针对特定患者的最佳剂量和治疗方案可以由医学领域的技术人员通过监测患者的疾病体征并相应地调整治疗来确定。
在一些实施例中，本文提供的组合物作为组合治疗的一部分施用，诸如与另一种治疗干预(诸如另一种抗体或工程化细胞或受体或药剂，诸如细胞毒性剂或治疗剂)同时或以任何顺序依次施用。
在一些实施例中，本文提供的组合物与一种或多种另外的治疗剂共同施用或与另一种治疗干预联合施用，同时或以任何顺序依次施用。在一些实施例中，细胞与另一种疗法在足够接近的时间共同施用，使得细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的效果，或反之亦然。在一些实施例中，本文提供的组合物在一种或多种另外的治疗剂之前施用。在一些实施例中，本文提供的组合物在一种或多种另外的治疗剂之后施用。
在某些实施例中，在将细胞施用于哺乳动物(例如，人)后，通过多种已知方法中的任一种测量工程化细胞群的生物活性。评估的参数包括体内(例如，通过成像)或离体(例如，通过ELISA或流式细胞术)工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合。在某些实施例中，工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用本领域已知的任何合适的方法来测量，诸如在例如Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)以及Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)中描述的细胞毒性测定法。在某些实施例中，细胞的生物活性还可以通过测定某些细胞因子诸如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF的表达和/或分泌来测量。在一些方面，生物活性通过评估临床结果诸如肿瘤负荷或负荷的减少来测量。
7.9.套件(试剂盒)和制品
还提供了包含本文所述的工程化免疫效应细胞中任一种的套件、单位剂量和制品。在一些实施例中，提供了含有本文所述的药物组合物中的任一种的套件，并且优选提供了其使用说明书。
本申请的套件在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐子、柔性包装(例如，密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。套件可以任选地提供其他组成部分，如缓冲液和解释信息。因此本申请还提供了制品，其包括小瓶(如密封的小瓶)、瓶、罐子、柔性包装等。
制品可以包含容器和该容器上或与该容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如，瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料(如玻璃或塑料)形成。通常，容器容纳有效治疗本文所述的疾病或病症(例如，癌症)的组合物，并且可具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装插页指示组合物用于治疗个体的特定病状。标签或包装插页将进一步包含用于将组合物施用于个体的说明书。标签可指示用于重构和/或使用的指导。容纳药物组合物的容器可以是多次使用的小瓶，其允许重复施用(例如，2-6次施用)重构配制品。包装插页是指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，这些说明书含有关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。另外地，制品可进一步包含第二容器，该容器包含药学上可接受的缓冲液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。其可以进一步包括从商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
套件或制品可包括多个单位剂量的药物组合物和使用说明书，其包装的数量足以在药房(例如，医院药房和配药药房)中储存和使用。
为简明起见，本文使用了某些缩写。一个实例是表示氨基酸残基的单字母缩写。氨基酸及其相应的三字母和单字母缩写如下：
丙氨酸Ala(A)
精氨酸Arg(R)
天冬酰胺Asn(N)
天冬氨酸Asp(D)
半胱氨酸Cys(C)
谷氨酸Glu(E)
谷氨酰胺Gln(Q)
甘氨酸Gly(G)
组氨酸His(H)
异亮氨酸Ile(I)
亮氨酸Leu(L)
赖氨酸Lys(K)
甲硫氨酸Met(M)
苯丙氨酸Phe(F)
脯氨酸Pro(P)
丝氨酸Ser(S)
苏氨酸Thr(T)
色氨酸Trp(W)
酪氨酸Tyr(Y)
缬氨酸Val(V)
本披露在本文中总体上使用肯定性语言来描述多种实施例来披露。本披露还特别包括其中全部或部分排除特定主题的实施例，诸如物质或材料、方法步骤和条件、方案、程序、测定或分析。因此，即使本披露在本文中总体上未根据本披露不包括的内容来表达，但未明确包括在本披露中的方面仍然在本文中披露。
已经描述了本披露的多个实施例。然而，应当理解，在不脱离本披露的精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，以下实例旨在说明而非限制权利要求中描述的披露范围。
8.实例
本文所述的实例不意欲表示以下实验均进行或只进行这些实验。尽管已经努力确保关于所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另外指示，否则份为重量份，分子量为重量平均分子量，温度为摄氏度，并且压力为大气压或接近大气压。
8.1.实例1-表达外源引入的p40和CCL-19的CAR-T细胞的制备
构建并测试表达外源引入的p40和CCL-19的示例性CAR-T细胞。例如，在本实例和以下实例中，构建抗GPC3 CAR-T细胞以举例说明本发明。
8.1.1.嵌合抗原受体的构建
为了构建人源化抗GPC3 scFv CAR(即，H93 CAR)，化学合成从N末端到C末端包含CD8α铰链结构域(SEQ ID NO:8)、CD8α跨膜结构域(SEQ ID NO:9)、CD137共刺激信号传导结构域(SEQ ID NO:10)和CD3ζ胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:11)的编码CAR主链多肽的CAR主链序列，并将其克隆到下游预修饰的慢病毒载体(pLSINK-BBzBB)中，并可操作地连接到组成型hEF1α启动子用于体外转录。载体中的多克隆位点(MCS)允许将包含可操作地连接到编码与抗GPC3人源化scFv片段(即，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的scFv)的N末端融合的CD8α信号肽(SEQ ID NO:7)的核酸序列的Kozak序列的核酸序列插入CAR主链载体中，在CAR主链序列上游并可操作地连接到CAR主链序列。化学合成编码CD8α信号肽和抗GPC3人源化scFv片段的核酸序列，并通过本领域已知的分子克隆技术经由EcoRI(5'-GAATTC-3')(SEQ ID NO:15)和SpeI(5'-ACTAGT-3')(SEQ ID NO:16)限制性位点将其克隆到pLSINK-BBzBB CAR主链中。所得H93 CAR包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。CAR编码区显示在图1的顶部。
基于H93 CAR主链，H93M CAR载体中的MCS允许插入包含编码人IL12p40(SEQ IDNO:5)和人CCL-19(SEQ ID NO:6)的核酸序列的核酸序列，该核酸序列通过与另一个2A自切割肽(例如，SEQ ID NO:13所示的P2A片段)的C末端融合的2A自切割肽(例如，SEQ ID NO:14所示的T2A肽)连接，在CD3ζ胞内信号传导结构域的C末端上游并可操作地连接到CD3ζ胞内信号传导结构域的C末端。化学合成编码P2A肽和IL12p40-T2A-CCL-19肽的核酸序列，并通过HpaI(5'-GTTAAC-3')(SEQ ID NO:17)和MluI(5'-ACGCGT-3')(SEQ ID NO:23)限制性位点将其克隆到pLSINK-BBzBB CAR主链中。所得H93M CAR包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列、和SEQ ID NO:12的核酸序列。H93M的CAR编码区显示在图1的中部。不受任何理论束缚，H93MCAR-T细胞中过表达的IL12p40可以与内源性IL-23αp19亚基形成IL-23，据报道该内源性IL-23αp19亚基在TCR刺激后被T细胞上调。参见例如Ma等人,Interleukin-23engineeringimproves CAR T cell function in solid tumors.Nat Biotechnol.2020Apr；38(4):448-459。
将含有pMDLg.pRRE(Addgene#12251)、pRSV-REV(Addgene#12253)和pMD2.G(Addgene#12259)的慢病毒包装质粒混合物与表达CAR构建体的载体以预优化的比率与聚醚酰亚胺(PEI)预混合，然后在25℃下孵育5分钟。然后将HEK293细胞添加到转染混合物中。然后，将细胞在37℃下在含5％CO2的细胞孵育箱中孵育过夜。在4℃和3000g下离心15分钟后收集上清液，并通过0.45μm PES过滤器过滤，然后超速离心以进行慢病毒浓缩。小心弃去上清液，用预冷的DPBS小心冲洗病毒颗粒。将病毒适当地液化，并在-80℃下储存。通过转导CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系的滴定法测定病毒滴度。
8.1.2.CAR-T细胞制备
PBMC购自TPCS(#A19Z284097)。使用Pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi#130-096-535)，根据如下所述的制造商的方案从PBMC中纯化人T细胞。测定细胞数，并将细胞悬浮液以300g离心10分钟。然后完全吸出上清液，并每107个总细胞将细胞颗粒重悬于40μL缓冲液中。每107个总细胞添加10μL Pan T细胞生物素-抗体混合物，充分混合并在冰箱(2℃-8℃)中孵育约5分钟。然后每107个细胞添加30μL缓冲液。每107个细胞添加20μL Pan T细胞微珠混合物。将细胞悬浮液混合物充分混合并在冰箱(2℃-8℃)中再孵育10分钟。磁分离至少需要500μL。对于磁分离，将LS柱置于合适的MACS分离器的磁场中。通过用3mL缓冲液冲洗来制备柱。然后将细胞悬浮液施加到柱上，并收集含有未标记细胞的流出物，这代表富集的T细胞部分。通过用3mL缓冲液洗涤柱并收集通过的未标记细胞来收集另外的T细胞。这些未标记的细胞再次代表富集的T细胞，并与前一步骤的流出物组合。然后将收集的富集T细胞离心并重悬于RPMI-1640+300IU/mL IL-2中。
制备的T细胞随后用人T细胞TransAct试剂盒(Miltenyi#170-076-156)，根据制造商方案预先活化48小时，其中抗CD3/CD28 MACSiBead颗粒以40μL/百万的珠与细胞比率添加。
对于CAR-T细胞制备，将预先活化的T细胞以0.5×106个细胞/孔的密度铺板在24孔板中。然后，将纯化的病毒添加到孔中。过夜后，在收集、离心并用新鲜的RPMI-1640+300IU/mL IL-2重悬后，将转导的细胞置于24孔G-Rex(Wilson Wolf#80192M)中。未转导的T细胞(UnT)用作阴性对照。在第7天，裸H93 CAR-T细胞和H93M CAR-T细胞的CAR阳性率分别为39.3％和32.5％(图2)。
8.1.3.IL-23和CCL-19表达
为了验证H93M CAR的结构，在正常条件(RPMI-1640+300IU/mL IL-2)下培养CAR-T细胞，并分析IL-23和CCL-19的分泌情况。简言之，在6孔板中以1×106个细胞/mL培养细胞，并分别在第12、14和17天收获上清液。根据制造商的方案，使用人IL-23试剂盒(CISBIO#62HIL23PEG)和CCL-19ELISA试剂盒(Abcam#ab100601)测定IL-23和CCL-19的量。如图3中显示，与H93 CAR-T细胞和UnT相比，仅H93M CAR-T细胞分泌IL-23(286.9pg/106个细胞-570.3pg/106个细胞)和CCL-19(65.4pg/106个细胞-237.2pg/106个细胞)(既未检测到IL-23表达也未检测到CCL-19表达)。
8.2.实例2-表达外源引入的p40和CCL-19的CAR-T细胞的体外重复攻击测定
为了评估CAR-T细胞在体外的持久性和耗竭性，建立了CAR-T细胞重复攻击模型。通过GPC3阳性肿瘤细胞持续刺激CAR-T细胞数轮以获得CAR-T细胞的耗竭表型。在再攻击测定中有三组处理：H93 CAR-T组(初始CAR-T细胞是H93CAR-T细胞)、H93M CAR-T组(初始CAR-T细胞是H93M CAR-T细胞)和UnT(初始T细胞未用CAR转导)。对于第一轮(第1轮)再攻击，CAR-T细胞与肿瘤细胞以1:1E/T比率在6孔板中共培养。过夜后，轻轻收集孔中的CAR-T细胞，离心，并重悬于新鲜的CAR-T培养基(RPMI-1640+300IU/mL IL-2)。然后将CAR-T细胞添加到新板中再培养2天。然后，收集孔中的CAR-T细胞，再次重悬于新鲜培养基中并添加到接种有新鲜肿瘤细胞的新板中(第2轮)。通过在前一轮结束时CAR-T细胞的阳性率计算添加的新鲜肿瘤细胞的数目。根据剩余CAR-T细胞的细胞数目和活力，可以重复该过程几轮。在每轮肿瘤细胞再攻击后24小时分析CAR+T细胞中CD4+T细胞和CD8+T细胞的耗竭标志物PD-1和LAG3。在每轮结束时计数T细胞，并在刺激后72小时对GPC3阳性HCC细胞系PLC/PRF/5进行细胞毒性测定。
8.2.1.T细胞的扩增
为了确定H93M CAR-T细胞的扩增功能的益处，在每轮再攻击结束时记录总T细胞的细胞数和活力。
如图4A中显示，与H93 CAR-T组(第6轮10.5倍)和UnT组(第6轮0.2倍)相比，用PLC/PRF/5细胞重复刺激导致H93M CAR-T组细胞显著扩增(第6轮138.4倍)。同时，H93M CAR-T组的细胞活力仍然很高，作为比较，H93 CAR-T组和UnT组在每次刺激后逐渐降低(图4B)。
8.2.2.细胞毒性测定和细胞因子释放
还在CAR-T再攻击测定中在每两轮结束时评估了CAR-T细胞的细胞毒性，总T细胞:靶细胞比率为1:1。靶细胞是GPC3阳性PLC/PRF/5细胞，其通过本领域已知的技术工程化以表达萤火虫荧光素酶。每两轮结束收集细胞，混合靶细胞(2×103个细胞/孔)，在384孔板中培养24小时。为了测定CAR-T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性，根据制造商的方案制备One-glo发光荧光素酶测定试剂(Promega#E6110)，并添加到共培养的细胞中以检测孔中剩余的荧光素酶活性。由于荧光素酶仅在肿瘤细胞中表达，因此孔中剩余的荧光素酶活性与孔中活靶细胞的数量直接相关。通过在不存在效应细胞的情况下向靶细胞中添加培养基来获得最大荧光素酶活性。通过在开始细胞毒性测定时添加最终浓度为1％的Triton X-100来测定最小荧光素酶活性。通过以下公式计算特异性细胞毒性：特异性细胞毒性％＝100％×(1-(RLU样品-RLUmin)/(RLUmax-RLUmin))。
如图5A中显示，除了在第1轮之后显示出相同的细胞毒性(21.1％对22.4％)，在第3轮之后，H93M CAR-T组显示出比H93 CAR-T组更高的细胞毒性。具体而言，H93M CAR-T组在第3轮后表现出74.4％的平均细胞毒性，在第5轮(80.7％)和第7轮(83.4％)后略有增加。而在H93 CAR-T组中观察到相对较低的细胞毒性，平均细胞毒性分别为52.7％(第3轮)、57.9％(第5轮)和47.0％(第7轮)。表明H93M CAR-T组对GPC3阳性HCC细胞系PLC/PRF/5.Luc细胞具有持续高水平的细胞毒性。
为了进一步验证H93M CAR-T细胞与H93 CAR-T细胞相比在再攻击测定中针对GPC3阳性肿瘤细胞的持续细胞毒活性，在将CAR-T细胞与PLC/PRF/5.Luc细胞以1:1E/T比率(总T细胞:靶细胞)共培养24小时后，通过ELISA分析TNF-α和IFN-γ的产生。结果表明，与H93CAR-T组相比，H93M CAR-T组产生TNF-α和IFN-γ的能力显著更高，并且在所有轮次中均显示出与细胞毒性效力的显著相关性。如图5B和5C中显示，H93M CAR-T组细胞分泌的TNF-α和IFN-γ浓度在第3轮至第5轮后显著升高，分别在451.2-1151.1pg/mL(TNF-α)和18353.7-37072.7pg/mL(IFN-γ)的范围内，而H93 CAR-T组细胞分泌的TNF-α和IFN-γ浓度在第3轮至第7轮后逐渐降低，分别在197.1-129.2pg/mL(TNF-α)和4993.1-1672.1pg/mL(IFN-γ)的范围内。
8.2.3.阳性CAR-T细胞的比率变化
H93 CAR-T细胞和H93M CAR-T细胞的阳性率在每两轮后计算，其随着刺激轮数的增加几乎相同，在30％-86％的范围内。最后，在第5轮后H93 CAR-T细胞和H93M CAR-T细胞的阳性率没有增加(图6)。在第5轮再攻击后，H93M CAR-T细胞显示出高细胞毒性，与平坦CAR+％(图6)相比细胞毒性增加(图5A)。
8.2.4.T细胞的耗竭
在再攻击测定中，每轮后24小时评估T细胞耗竭。分别使用抗人PD-1抗体(Biolegend#329908)和抗LAG-3抗体(Invitrogen#17-2239-42)标记作为两种耗竭标志物的PD-1和LAG-3，并分析CD4+CAR+T细胞和CD8+CAR+T细胞双阳性亚群的表达水平。如图7中显示，与H93 CAR-T组相比，H93M CAR-T组在所有轮次中均显示出耗竭标志物PD-1和LAG3的表达降低。特别是在第3轮至第5轮中，H93M CAR-T组中CD4+CAR+双阳性亚群的PD-1表达在13％和18％之间，而H93CAR-T组高于30％(图7A)。在所有轮次(R2-R7)中，在CD4+CAR+双阳性亚群中H93M CAR-T组具有比H93 CAR-T组(30％-49％)显著更低的LAG-3表达(12％-25％)(图7C)。在CD8+CAR+双阳性亚群中，PD-1在H93M CAR-T组中的表达水平仍低于H93CAR-T组(第3轮至第7轮1.3％-4.1％对5.6％-9.4％)(图7B)，并且在第3轮至第5轮中，H93MCAR-T组的LAG3表达水平介于56.6％和82.9％之间，低于H93 CAR-T组(82.7％-88.1％)(图7D)，表明H93M CAR-T细胞具有抗耗竭能力。
8.3.实例3-表达外源引入的p40和CCL-19的CAR-T细胞的细胞迁移测定
为了评估CCL-19的趋化功能，进行了细胞迁移测定。通过迁移通过96孔transwell小室(Corning)中5-μm孔径的聚碳酸酯过滤器来测量应答T细胞的趋化性。用GPC3阳性人HCC细胞系PLC/PRF/5细胞刺激CAR-T细胞和UnT细胞，30小时后收集共培养上清液。然后将125μL上清液置于下室中，并将75μL未经处理的T细胞(0.075M)在上室中孵育。4、6和8小时后，通过血液计数室对从上室迁移到下室的T细胞进行计数。在细胞迁移测定中有三组处理：H93 CAR-T组(下室中的上清液取自与PLC/PRF/5细胞共培养的H93 CAR-T细胞)、H93MCAR-T组(下室中的上清液取自与PLC/PRF/5细胞共培养的H93M CAR-T细胞)和UnT组(下室中的上清液取自与PLC/PRF/5细胞共培养的UnT细胞)。
如图8A中显示，在不同时间点，与PLC/PRF/5细胞共培养的H93M CAR-T细胞(具有CCL-19的分泌)的上清液比与PLC/PRF/5细胞共培养的H93 CAR-T细胞和与PLC/PRF/5细胞共培养的UnT细胞的上清液吸引更多的T细胞(H93M CAR-T组与H93 CAR-T组：P<0.0001)。具体而言，H93M CAR-T组可以在6小时(0.104M)完全吸引上室的所有T细胞，而无CCL-19产生的H93 CAR-T组和UnT组即使在8小时也仅迁移较少的T细胞，分别为0.032M和0.026M。此外，通过CCL-19ELISA(Abcam#ab100601)测量共培养上清液中CCL-19的浓度。该结果表明取自与PLC/PRF/5细胞共培养的H93M CAR-T细胞的上清液分泌了CCL-19(4590.15±380.85pg/mL)，这进一步验证了H93M CAR-T细胞的趋化功能(图8B)。
8.4.实例4-体内过继转移后表达外源引入的p40和CCL-19的CAR-T细胞的抗肿瘤作用
按照实例1中披露的方法，还制备了表达人IL12p40和人IL-7的H93C CAR-T细胞。基于H93 CAR主链，H93C CAR载体中的MCS允许插入包含编码人IL12p40(SEQ ID NO:5)和人IL-7(SEQ ID NO:24)的核酸序列的核酸序列，该核酸序列通过与另一个2A自切割肽(例如，SEQ ID NO:13所示的P2A片段)的C末端融合的2A自切割肽(例如，SEQ ID NO:13所示的P2A肽)连接，在CD3ζ胞内信号传导结构域的C末端上游并可操作地连接到CD3ζ胞内信号传导结构域的C末端。化学合成编码P2A肽和IL12p40-P2A-IL-7肽的核酸序列，并通过HpaI(5'-GTTAAC-3')(SEQ ID NO:17)和MluI(5'-ACGCGT-3')(SEQ ID NO:23)限制性位点将其克隆到pLSINK-BBzBB CAR主链中。IL12p40-P2A-IL-7肽的氨基酸序列和核酸序列显示于SEQ IDNO:25和SEQ ID NO:26中。
在NCG小鼠异种移植模型中评估了CAR-T细胞的体内抗肿瘤功效。对于皮下异种移植模型，6-7周龄的NCG小鼠在右前腿皮下接种Huh7细胞(1.5×106个细胞/小鼠)。当平均肿瘤体积接近100mm3时(异种移植接种后第11天)，将小鼠随机分成几组，并通过尾静脉注射分别用H93 CAR-T细胞(0.2M或0.6M剂量)、H93M CAR-T细胞(0.2M或0.6M剂量)、H93C CAR-T细胞(0.2M剂量)、UnT(2.3M剂量，与CAR-T组相同的总T细胞的细胞数)和仅溶剂(媒介物)进行处理。每周两次用数字卡尺测量肿瘤大小。根据下式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝((长度)×(宽度)2)/2。也分别在过继转移后第0、7、14、21和28天通过数字PCR检测小鼠血液中CAR-T细胞的拷贝数。
由于动物伦理学，在第20天将用媒介物、UnT和H93 CAR-T细胞处理的小鼠处死，并且这三组的肿瘤体积达到2000mm3以上。继续记录用H93M CAR-T细胞处理的小鼠，直到第27天(剂量：0.2M)和第49天(剂量：0.6M)。如图9A中显示，与UnT和H93 CAR-T细胞组相比，在第20天观察到施用过继转移H93M CAR-T细胞的小鼠的肿瘤大小分别减小了76.8％和74.6％(584.3mm3对2514.7mm3，2297.3mm3)，并且在第20天之后，肿瘤大小仍然逐渐减小，这表明H93M CAR-T细胞在较低剂量(0.2M/小鼠)下具有比H93 CAR-T细胞更好的治疗潜力。同时，H93C CAR-T细胞组仅具有轻微的抗肿瘤作用，并且在第20天具有32.7％的生长抑制率(1546.8mm3对2297.3mm3)，这表明与表达外源引入的IL12p40和IL-7的H93C CAR-T细胞相比，表达外源引入的IL12p40和CCL-19的H93M CAR-T细胞在体内过继转移后具有更好的治疗潜力。当剂量增加到0.6M/小鼠时，如图9B中显示，施用H93M CAR-T细胞对肿瘤生长具有明显的抑制作用，在第20天与UnT相比生长抑制率为96.0％(101.6mm3对2514.7mm3)，但在H93M CAR-T细胞处理组和H93CAR-T细胞处理组中观察到类似的肿瘤消退(101.6mm3对137.3mm3)。在第34天，用H93M CAR-T细胞处理的小鼠几乎没有肿瘤。
通过数字PCR检测小鼠外周血细胞中的CAR基因拷贝数，并且H93M CAR-T细胞在0.2M剂量下在第21天表现出显著的扩增，随后减少，而在整个处理过程中，在用H93 CAR-T细胞和UnT处理的小鼠中没有明显的扩增(图9C)。在0.2M剂量下，H93M CAR-T细胞在第21天的拷贝数是第0天的335.6倍(133.4175个拷贝对0.3975个拷贝)，并在第28天降至184.7倍(73.4250个拷贝对0.3975个拷贝)。H93C CAR-T细胞在第14天之后表现出不可控制的扩增，并且在第28天达到4873.7倍(231.5350个拷贝对0.0475个拷贝)(图9C)。在0.6M剂量下，H93M CAR-T细胞和H93 CAR-T细胞在第7天后均显示出显著的扩增，并且H93M CAR-T细胞具有比H93 CAR-T细胞更好的扩增能力(第21天272.2850个拷贝对83.6275个拷贝)(图9D)。
在该实验期间，无论0.2M剂量还是0.6M剂量，在所有三组中均未观察到小鼠体重减轻(图10A和图10B)。但用H93 CAR-T细胞处理的小鼠在0.2M剂量下在第20天显示出诸如直毛、弓背和消瘦的症状，而用H93M CAR-T细胞处理的小鼠则正常。在0.6M剂量下，两组的小鼠外观均正常。过继转移H93C CAR-T细胞(0.2M剂量)的4只小鼠中，有2只在第24天被处死，出现诸如直毛、弓背、消瘦、呼吸短促的症状。使用H93M CAR-T细胞和H93C CAR-T细胞处理小鼠的数据比较表明，H93M CAR-T细胞比H93C CAR-T细胞具有更好的抗肿瘤潜力、可控制的扩增和体内安全性。
为了验证H93M CAR-T细胞中IL-23的活化依赖性产生，使用人IL-23试剂盒(CISBIO#62HIL23PEG)和人IFN-γ试剂盒(CISBIO#62HIFNGPEG)分析了用CAR-T细胞处理后NCG小鼠外周血中IL-23和IFN-γ的分泌水平。如图11A中显示，与H93 CAR-T细胞处理组相比，H93M CAR-T细胞处理组在低剂量(0.2M，第21天)下显示出高达3倍的更高IL-23分泌水平。在高剂量(0.6M)的H93M CAR-T细胞处理的小鼠和H93 CAR-T细胞处理的小鼠中观察到类似的低水平的IL-23(图11B)。同时，小鼠外周血中活化依赖性产生的IFN-γ的分泌行为与IL-23相似(图11C和11D)，表明H93M CAR-T细胞中IL-23的活化依赖性产生。
为了研究H93M CAR-T细胞在体内的抗肿瘤作用，使用免疫组织化学(IHC)研究T细胞的浸润情况和肿瘤部位巨噬细胞和树突状细胞(DC)的募集情况。简言之，将组织石蜡切片载玻片在60℃下加热60分钟，然后在二甲苯中脱蜡三次，每次10分钟，并在100％、100％、95％、90％、80％、70％酒精和水中再水合，每次5分钟。通过将载玻片在抗原修复缓冲液中煮沸20分钟来进行抗原修复，然后在将载玻片浸入抗原修复缓冲液中并冷却至室温(RT)后，用3％过氧化氢的甲醇溶液处理载玻片10分钟以破坏内源性过氧化物酶活性。为了减少非特异性背景染色，将载玻片与封闭缓冲液(用DPBS稀释的5％山羊血清)在2℃-8℃下孵育过夜。
过夜后，将载玻片在室温下孵育30分钟，然后与稀释的一抗在37℃下孵育2小时，并与二抗HRP缀合的抗小鼠IgG抗体(Fuzhou Maixin Biotech.Co.,Ltd.#KIT-5002)在暗处室温孵育15分钟。根据制造商的说明书制备DAB底物，并将200-500μL DAB底物添加到载玻片中并在暗处孵育2分钟。通过用蒸馏水洗涤5分钟停止染色。最后向载玻片添加中性香脂，并在苏木精复染、1％盐酸酒精分化、酒精脱水后封片。
为了阐明H93M CAR-T细胞在较低剂量(0.2M)下增强抗肿瘤能力的机制，使用TCRα(H-1)(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY#sc-515719)通过IHC在经处理小鼠的肿瘤组织中研究T细胞浸润。如图12所示，与H93 CAR-T细胞和UnT处理组相比，H93M CAR-T细胞处理组中所有三只小鼠的肿瘤部位的T细胞浸润均有所改善。在H93M CAR-T细胞处理组中，更多的T细胞浸润到中央肿瘤巢中，而在三只H93 CAR-T细胞处理的小鼠中，只有一只小鼠在肿瘤边缘区域有较少的T细胞浸润，其他小鼠在肿瘤部位的T细胞非常少。在UnT处理组中，三只小鼠的肿瘤部位没有观察到T细胞浸润。
此外，还研究了肿瘤组织中的巨噬细胞和DC募集。使用抗CD68抗体(Abcam#ab125212)和抗CD11c抗体(Cell signaling technology#97585S)检测肿瘤组织中的小鼠巨噬细胞和DC。如图13所示，CD68+巨噬细胞(左列)和CD11c+DC(右列)被DAB染色。巨噬细胞和DC向肿瘤部位的募集在H93M CAR-T细胞处理组中显著更高，而UnT和H93 CAR-T细胞处理组仅在肿瘤组织边缘有巨噬细胞募集。这些数据表明，与H93 CAR-T细胞和UnT相比，H93MCAR-T细胞可以在肿瘤组织中诱导更多的巨噬细胞和DC募集，并且更有效地在肿瘤组织中引发先天免疫应答。
8.5.实例5-表达外源引入的p40和CCL-21的CAR-T细胞的制备
PBMC购自TPCS(#A19K268037)。使用Pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi#130-096-535)，根据如上述第8.1.2部分所述的制造商的方案从PBMC中纯化人T细胞。
制备的T细胞随后用人T细胞TransAct试剂盒(Miltenyi#170-076-156)，根据制造商方案预先活化48小时，其中抗CD3/CD28 MACSiBead颗粒以40μL/百万的珠与细胞比率添加。对于CAR-T细胞制备，将预先活化的T细胞以0.5×106个细胞/孔的密度铺板在24孔板(BD)中。然后，将纯化的病毒添加到孔中。过夜后，在收集、离心并用新鲜的RPMI-1640+300IU/mL IL-2重悬后，将转导的细胞置于24孔G-Rex(Wilson Wolf#80192M)中。未转导的T细胞(UnT)用作阴性对照。如上所述制备H93 CAR-T细胞和H93M CAR-T细胞，以及具有H93PCAR的H93P CAR-T细胞(其编码区域呈现在图1底部)。H93P CAR包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列、和SEQ ID NO:19的核酸序列。在第6天，裸H93 CAR-T细胞、装甲的H93M CAR-T细胞(分泌IL-23和CCL-19)和装甲的H93P CAR-T细胞(分泌IL-23和CCL-21)的CAR阳性率分别为63.52％、48.59％和25.24％(图14)。
8.6.实例6-表达外源引入的p40和CCL-21的CAR-T细胞和表达外源引入的p40和CCL-19的CAR-T细胞的再攻击测定
按照上文实例2中所述建立CAR-T细胞重复攻击模型。使用GPC3阳性细胞系PLC/PRF/5细胞作为靶细胞。对于第一轮(第1轮)再攻击，CAR-T细胞与肿瘤细胞以1:1E/T比率在6孔板中共培养。过夜后，轻轻收集孔中的CAR-T细胞，离心，并重悬于新鲜的CAR-T培养基(RPMI-1640+300IU/mL IL-2)。然后将CAR-T细胞添加到新板中再培养2天。然后，收集孔中的CAR-T细胞，再次重悬于新鲜培养基中并添加到接种有新鲜肿瘤细胞的新板中(第2轮)。CAR-T细胞总共被刺激了8轮。每轮都计数了T细胞，并在每次刺激72小时后，通过使用GPC3阳性人肝细胞癌(HCC)细胞系PLC/PRF/5.Luc进行细胞毒性测定。使用总T细胞与靶细胞的比率进行细胞毒性测定。在再攻击测定中有四组处理：H93组(初始CAR-T细胞是H93CAR-T细胞)、H93M组(初始CAR-T细胞是H93M CAR-T细胞)、H93P组(初始CAR-T细胞是H93P CAR-T细胞)和UnT(初始T细胞是未用CAR转导的T细胞)。
8.6.1.T细胞的扩增
为了确定在再攻击测定中具有IL12p40表达的CAR-T细胞的扩增功能的益处，在每一轮结束时记录T细胞的数量，并计算扩增倍数。如图15A中显示，与H93 CAR-T组(第8轮时为109倍)和UnT组(第8轮时为7倍)相比，用PLC/PRF/5细胞重复刺激导致H93M CAR-T组显著扩增(第8轮时为2759倍)，并且H93P CAR-T组具有与H93M组类似的强扩增能力。
8.6.2.细胞毒性测定
还在再攻击测定中评估了CAR-T细胞的细胞毒性，总T细胞:靶细胞比率为1:2。靶细胞是GPC3阳性人肝细胞癌(HCC)细胞系PLC/PRF/5.Luc，其通过本领域已知的技术工程化以表达萤火虫荧光素酶。每两轮结束收集细胞，混合靶细胞(2×103个细胞/孔)，在384孔板中培养24小时。为了测定CAR-T对肿瘤细胞的细胞毒性，根据制造商的方案制备One-glo发光荧光素酶测定试剂(Promega#E6110)，并添加到共培养的细胞中以检测孔中剩余的荧光素酶活性。通过以下公式计算特异性细胞毒性：特异性细胞毒性％＝100％×(1-(RLU样品-RLUmin)/(RLUmax-RLUmin))。如图15B中显示，H93 CAR-T组、H93M CAR-T组和H93P CAR-T组在R0时(在PLC/PRF/5刺激之前)具有相似的细胞毒性。在PLC/PEF/5重复刺激后，H93M CAR-T组和H93P CAR-T组具有相似的细胞毒性(所有轮中为47％-68％)，并且显著高于H93 CAR-T组(所有轮中为24％-39％)，表明H93M CAR-T组和H93P CAR-T组对GPC3阳性HCC细胞系PLC/PRF/5.Luc细胞均具有持续高水平的细胞毒性。
8.7.实例7-表达外源引入的p40和CCL-21的CAR-T细胞和表达外源引入的p40和CCL-19的CAR-T细胞的细胞迁移测定
为了评估CCL-19和CCL-21的趋化功能，进行了细胞迁移测定。通过迁移通过96孔transwell小室(Corning)中5-μm孔径的聚碳酸酯过滤器来测量应答T细胞的趋化性。用GPC3阳性人HCC细胞系PLC/PRF/5细胞刺激CAR-T细胞和UnT细胞，30小时后收集共培养上清液。然后将125μL上清液置于下室中，并将75μL未经处理的T细胞(0.075M)在上室中孵育。2、4和6小时后，通过血液计数室对从上室迁移到下室的T细胞进行计数。有四个处理组：H93CAR-T组(下室中的上清液取自与PLC/PRF/5细胞共培养的H93 CAR-T细胞)、H93M CAR-T组(下室中的上清液取自与PLC/PRF/5细胞共培养的H93M CAR-T细胞)、H93P CAR-T组(下室中的上清液取自与PLC/PRF/5细胞共培养的H93P CAR-T细胞)和UnT组(下室中的上清液取自与PLC/PRF/5细胞共培养的UnT细胞)。
如图16中显示，在不同时间，同与PLC/PRF/5细胞共培养的H93 CAR-T细胞和与PLC/PRF/5细胞共培养的UnT细胞的上清液相比，与PLC/PRF/5细胞共培养的H93M CAR-T细胞(分泌CCL-19)和H93P(分泌CCL-21)CAR-T细胞的上清液吸引更多的T细胞。然而，H93MCAR-T组在体外诱导迁移的能力显著强于H93P CAR-T组(H93M CAR-T组与H93P CAR-T组，6小时时P<0.0001)。具体而言，H93M CAR-T组可以在6小时(0.095M)完全吸引上室的所有T细胞，而H93P CAR-T组能吸引大多数T细胞(0.065M)。而无CCL-19或CCL-21产生的H93 CAR-T组和UnT组即使在6小时也仅迁移较少的T细胞，分别为0.028M和0.025M。此外，分别通过CCL-19ELISA(Abcam#ab100601)和CCL-21ELISA(Thermo#EHCCL21)测量上清液中CCL-19和CCL-21的浓度。该结果表明取自与PLC/PRF/5细胞共培养的H93M和H93P CAR-T细胞的上清液分别分泌了CCL-19(2292.10±85.48pg/mL)和CCL-21(3481.08±193.11pg/mL)，这进一步验证了H93M和H93P CAR-T细胞的趋化功能。
8.8.实例8-体内过继转移后，表达外源引入的p40和CCL-21的CAR-T细胞和表达外源引入的p40和CCL-19的CAR-T细胞的抗肿瘤作用
在NCG小鼠异种移植模型中评估了CAR-T细胞的体内抗肿瘤功效。对于皮下异种移植模型，6-7周龄的NCG小鼠在右前腿皮下接种Hep3B细胞(4.0×106个细胞/小鼠)。当平均肿瘤体积接近150mm3时(异种移植接种后第5天)，将小鼠随机分成8组，并通过尾静脉注射分别用H93 CAR-T细胞(0.3M和0.8M剂量)、H93M CAR-T细胞(0.3M和0.8M剂量)、H93P CAR-T细胞(0.3M和0.8M剂量)、UnT(0.2M剂量)和仅溶剂(媒介物)进行处理。每周两次用数字卡尺测量肿瘤大小。根据下式计算肿瘤体积：在过继转移后第7、14、21和28天，也通过FACS染色抗人CD3(Biolegend#300316)检测小鼠血液中的T细胞的数量。
如图17A中显示，与UnT和H93 CAR-T细胞组相比，观察到过继转移H93M CAR-T细胞的小鼠在第32天的肿瘤大小分别减小98.2％和97.1％(52.0mm3对2942.0mm3、1766.5mm3)。这一结果表明，在较低剂量(0.3M/小鼠)下，H93M CAR-T细胞比H93 CAR-T细胞具有更好的治疗潜力。在第22天前，观察到H93P CAR-T细胞处理组与H93M CAR-T细胞处理组具有相似的抗肿瘤疗效，并且在第22天，肿瘤大小分别减小77.3％和65.7％(368.3mm3对1620.8mm3、1072.7mm3)，但随后肿瘤大小增加。当剂量增加到0.8M/小鼠时，如图17B中显示，H93 CAR-T细胞和H93M CAR-T细胞都对肿瘤生长具有明显的抑制作用，在第32天生长抑制率为100％，但施用H93P CAR-T细胞似乎没有明显的肿瘤体积抑制作用。然而，观察到H93P CAR-T组的异种移植组织是海绵状的，这与其他组不同，在第26天对小鼠实施安乐死，因为肿瘤大小超过2000mm3。
8.9.实例9-p40和CCL-19装甲的CAR与二者之一单独装甲的CAR的比较
8.9.1.在NCG小鼠异种移植模型中，p40和CCL-19装甲的CAR与二者之一单独装甲的CAR的比较
基于H93 CAR主链，H93IL12p40 CAR载体或H93CCL19 CAR载体中的MCS允许插入包含编码人IL12p40(SEQ ID NO:5)或人CCL-19(SEQ ID NO:6)的核酸序列的核酸序列，该核酸序列与2A自切割肽(例如，SEQ ID NO:13所示的P2A片段)的C末端融合，在CD3ζ胞内信号传导结构域的C末端上游并可操作地连接到CD3ζ胞内信号传导结构域的C末端。
为了阐明H93M CAR-T细胞中的协同作用，制备了H93M CAR-T细胞、H93IL12p40CAR-T细胞(分泌IL12p40)、H93CCL19 CAR-T细胞(分泌CCL-19)，并在NCG小鼠异种移植模型中进行了评估。如实例8所披露，6-7周龄的NCG小鼠在右前腿皮下接种Hep3B细胞(4.0×106个细胞/小鼠)。当平均肿瘤体积接近150mm3时(异种移植接种后第5天)，将小鼠随机分成6组，并通过尾静脉注射分别用H93CAR-T细胞(0.3M剂量)、H93M CAR-T细胞(0.3M剂量)、H93IL12p40 CAR-T细胞(0.3M剂量)、H93CCL19 CAR-T细胞(0.3M剂量)、UnT(3.5M剂量，与CAR-T组相同的总T细胞的细胞数)和仅溶剂(媒介物)进行处理。每周两次用数字卡尺测量肿瘤大小。根据下式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝((长度)×(宽度)2)/2。在过继转移后第7、14、21和28天，通过FACS染色抗人CD3(Biolegend#300316)检测小鼠血液中的T细胞的数量。
如图18A中显示，与UnT组相比，在第26天观察到过继转移H93M CAR-T细胞的小鼠的肿瘤大小减小92.0％(150.3mm3对1878.2mm3)，在第26天观察到过继转移H93IL12p40CAR-T细胞和H93CCL19 CAR-T细胞的小鼠的肿瘤大小分别减小72.9％和11.7％(508.7mm3对1878.2mm3和1658.7mm3对1878.2mm3)。这些结果表明，H93M CAR-T细胞比H93IL12p40CAR-T细胞和H93CCL19 CAR-T细胞具有更好的治疗潜力。
用CD3+％的FACS检测小鼠外周血细胞中CAR-T细胞的扩增。H93M CAR-T细胞在第21天之前表现出显著的扩增，并且随后减少。H93IL12p40 CAR-T细胞具有次优增殖能力，并且H93CCL19 CAR-T细胞与H93 CAR-T细胞相似并且没有明显的扩增(图18B)。具体而言，H93M组在第21天的CD3比率为40.2％，并且由于随后第28天肿瘤体积减小，CD3比率降至29.8％。H93IL12p40 CAR-T细胞组中CD3的比率在第21天为26.1％，并且在第28天升至38.5％。H93CCL19 CAR-T细胞组与H93 CAR-T细胞和UnT组相似，无明显扩增。
在该实验期间，在CAR-T组中没有观察到小鼠体重减轻，除了UnT组的小鼠体重减轻超过20％(图18C)，并且CAR-T细胞处理组的所有小鼠都具有正常外观。
8.9.2.在C57BL/6同基因模型中，p40和CCL-19装甲的CAR与二者之一单独装甲的CAR的比较
按照实例1中披露的方法，用抗GPC3 scFv(SEQ ID NO:1)和小鼠CAR主链多肽(SEQID NO:28)构建表达小鼠抗GPC3 scFv CAR(即，musH93 CAR，SEQ ID NO:27)的载体，该多肽从N末端到C末端包含：小鼠CD8α铰链结构域、小鼠CD8α跨膜结构域、小鼠CD137共刺激信号传导结构域、和小鼠CD3ζ胞内信号传导结构域。
基于musH93 CAR主链，musH93M CAR载体中的MCS允许插入包含编码小鼠IL12p40(SEQ ID NO:29)和小鼠CCL-19(SEQ ID NO:30)的核酸序列的核酸序列，该核酸序列通过与另一个2A自切割肽(例如，SEQ ID NO:13所示的P2A片段)的C末端融合的2A自切割肽(例如，SEQ ID NO:14所示的T2A肽)连接，在CD3ζ胞内信号传导结构域的C末端上游并可操作地连接到CD3ζ胞内信号传导结构域的C末端。化学合成编码P2A肽和小鼠IL12p40-T2A-CCL-19肽的核酸序列，并通过CloneEZ方法将其克隆到pMSCV BBzBB CAR主链中。所得musH93M CAR包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列、和SEQ ID NO:32的核酸序列。类似地，还构建了分别包含小鼠IL12p40和小鼠CCL-19的musH93IL12p40 CAR(SEQ ID NO:33)和musH93CCL19 CAR(SEQID NO:34)。
为了更好阐明musH93M CAR-T细胞中的协同作用，制备了musH93M CAR-T细胞、musH93IL12p40 CAR-T细胞、musH93CCL19 CAR-T细胞和musH93CAR-T细胞，并在C57BL/6同基因模型中进行了评估。对于皮下异种移植模型，6-7周龄的C57BL/6小鼠在右前腿皮下接种LL/2-hGPC3细胞(过表达hGPC3的LL/2细胞)(1.0×106个细胞/小鼠)。当平均肿瘤体积接近100mm3时(异种移植接种后第9天)，将小鼠随机分成5组，并通过尾静脉注射分别用musH93 CAR-T细胞(10M剂量)、musH93M CAR-T细胞(6M剂量)、musH93IL12p40 CAR-T细胞(6M剂量)、musH93CCL19 CAR-T细胞(6M剂量)、UnT(24.1M剂量，与CAR-T组相同的总T细胞的细胞数)进行处理。每周两次用数字卡尺测量肿瘤大小。根据下式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝((长度)×(宽度)2)/2。分别在过继转移后第1、7、14、21和28天，通过FACS染色抗小鼠CD3(Biolegend#100236)和CAR阳性率(Genscript#CP0001)检测外周血中CAR-T细胞的扩增。
如图19A和19D中显示，由于肿瘤体积大(>3000mm3)，裸musH93CAR-T组和UnT组的所有小鼠在第19天之前被处死。在第29天，过继转移musH93M CAR-T细胞的小鼠几乎没有肿瘤(91.5mm3)。在第15天，观察到过继转移musH93CCL19 CAR-T细胞的小鼠的肿瘤大小明显减小(437.2mm3)，但随后发生肿瘤复发。值得注意的是，过继转移musH93IL12p40 CAR-T细胞的小鼠在整个实验中没有明显的治疗效果。这些结果表明，musH93M CAR-T细胞比musH93IL12p40CAR-T细胞和musH93CCL19 CAR-T细胞具有更好的治疗潜力，这与上述NCG小鼠异种移植模型中的结果一致。
用FACS检测小鼠外周血细胞中CAR-T细胞的扩增。MusH93M CAR-T细胞在第28天之前表现出显著的扩增，而musH93CCL19 CAR-T细胞没有明显的增殖能力，并且musH93IL12p40 CAR-T细胞与扩增可忽略的musH93 CAR-T细胞相似(图19B)。具体而言，musH93M CAR-T细胞组中CD3和CAR阳性比率在第21天为17.0％，并且在第28天增加至21.9％。MusH93CCL19 CAR-T细胞组在第21天为6.9％，并且在第28天升至8.7％。
在该实验期间，在CAR-T组中没有观察到小鼠体重减轻(图19C)，并且CAR-T细胞处理组的所有小鼠都具有正常外观。
8.10.实例10—胃癌模型中p40和CCL-19装甲的CAR的验证。
8.10.1.表达外源引入的p40和CCL-19的261M CAR-T细胞的制备
根据实例1中披露的方法，构建PCT专利申请号PCT/CN2020/139143中披露的抗密蛋白18.2VHH CAR(即，261CAR，SEQ ID NO:41)，其包含抗密蛋白18.2VHH结构域(SEQ IDNO:40)和CAR主链多肽，该主链多肽从N末端到C末端包含：CD8α铰链结构域(SEQ ID NO:8)、CD8α跨膜结构域(SEQ ID NO:9)、CD137共刺激信号传导结构域(SEQ ID NO:10)和CD3ζ胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:11)。还构建了261M CAR(SEQ ID NO:42)的结构，其与H93MCAR相同，包含IL12p40-T2A-CCL-19。
使用实例1中描述的方法制备261CAR-T细胞和261M CAR-T细胞(分泌IL12p40和CCL-19)。在第5天，转导后，裸261CAR-T细胞和装甲的261M CAR-T细胞的CAR阳性率分别为50.7％和23.0％。
8.10.2.IL-23和CCL-19表达
为了验证261M CAR的结构，将CAR-T细胞与密蛋白18.2阳性细胞系-NUGC4共培养过夜，并分析IL-23和CCL-19的分泌情况。简言之，CAR-T细胞和NUGC4细胞在6孔板中以E/T＝1:1共培养，并且过夜后收获上清液。根据制造商的方案，使用人IL-23试剂盒(CISBIO#62HIL23PEG)和CCL-19ELISA试剂盒(Abcam#ab100601)测定IL-23和CCL-19的量。如图20A和20B中显示，只有261M CAR-T细胞同时具有高水平的IL-23(3703.3pg/mL)和CCL-19(265.1pg/mL)分泌。
8.10.3.表达外源引入的p40和CCL-19的261M CAR-T细胞的体外重复攻击测定
按照上文实例2中所述建立CAR-T细胞重复攻击模型。使用CLDN18.2阳性细胞系NUGC4细胞作为靶细胞。对于第一轮(第1轮)再攻击，CAR-T细胞与肿瘤细胞以1:1E/T比率在6孔板中共培养。过夜后，轻轻收集孔中的CAR-T细胞，离心，并重悬于新鲜的CAR-T培养基(RPMI-1640+300IU/mL IL-2)。然后将CAR-T细胞添加到新板中再培养2天。然后，收集孔中的CAR-T细胞，再次重悬于新鲜培养基中并添加到接种有新鲜肿瘤细胞的新板中(第2轮)。CAR-T细胞总共被刺激了5轮。每轮对T细胞数量和活力进行计数。在再攻击测定中有三组处理：261CAR-T组(初始CAR-T细胞是262CAR-T细胞)、261M CAR-T组(初始CAR-T细胞是261MCAR-T细胞)和UnT(初始T细胞是未用CAR转导的T细胞)。为了确定在再攻击测定中具有IL12p40表达的CAR-T细胞的扩增功能的益处，在每一轮结束时记录T细胞的数量，并计算扩增倍数。如图21B中显示，与261CAR-T组(第5轮时为6.7倍)和UnT组(第5轮时为5.1倍)相比，用NUGC4细胞重复刺激导致261M CAR-T组细胞显著扩增(第5轮时为46.6倍)。261M CAR-T细胞的细胞活力(第5轮时为68.7％)高于裸261CAR-T细胞(第5轮时为41.7％)和UnT细胞(第5轮时为38.8％)(图21C)。与三组在传统培养条件(10％1640+300IU IL-2)下相似的T细胞扩增和活力相比，261M CAR-T细胞(第5轮时为46.6倍)在被NUGC4细胞多次攻击后显示出抗原依赖性扩增(图21A和21B)。
8.10.4.在胃癌模型中，过继转移后表达外源引入的p40和CCL-19的CAR-T细胞的抗肿瘤作用
在胃癌模型中，评估过继转移后表达外源引入的p40和CCL-19的261M CAR-T细胞的治疗功效。制备261M CAR-T细胞和裸261CAR-T细胞，并在NUGC4异种移植模型中进行评估。对于皮下异种移植模型，6-7周龄的NCG小鼠在右前腿皮下接种NUGC4细胞(3.0×106个细胞/小鼠)。当平均肿瘤体积接近100mm3时(异种移植接种后第14天)，将小鼠随机分成3组，并通过尾静脉注射分别用261CAR-T细胞(0.5M剂量)、261M CAR-T细胞(0.5M剂量)和UnT细胞(1.9M剂量)进行处理。每周两次用数字卡尺测量肿瘤大小。根据下式计算肿瘤体积：
如图22A和22B中显示，与UnT和261CAR-T细胞组相比，在第29天观察到过继转移261M CAR-T细胞的小鼠的肿瘤大小分别减小了59.0％和52.9％(609.0mm3对1484.8mm3、1291.8mm3)，这表明261M CAR-T细胞在较低剂量(0.5M/小鼠)下具有比裸261CAR-T细胞更好的治疗潜力。
用FACS检测小鼠外周血细胞中CAR-T细胞的扩增。在0.5M剂量下，261M CAR-T细胞在第5天后表现出显著的扩增，CD3阳性T细胞的比率在第21天达到最高(7.1％)，随后在第28天下降(5.3％)，而在整个处理期间用裸mus261 CAR-T细胞和UnT处理的小鼠中没有明显的扩增(图22C)。这些数据表明，表达外源引入的p40和CCL-19的261M CAR-T细胞在体内具有优异的扩增能力和更好的治疗潜力(图22A和22C)，这与GPC3小鼠模型中的结果一致。
在该实验期间，在所有三组中没有观察到小鼠体重减轻(图22D)，并且各处理组的小鼠都具有正常外观。
8.11.实例11-体内过继转移后，表达外源引入的p40和CCL-19的CAR-T细胞和表达外源引入的IL-7和CCL-19的CAR-T细胞的抗肿瘤作用
按照实例1中披露的方法，用抗密蛋白18.2VHH结构域(SEQ ID NO:40)和小鼠CAR主链多肽(SEQ ID NO:31)构建小鼠抗密蛋白18.2VHH CAR(即，mus261 CAR，SEQ ID NO:35)，该多肽从N末端到C末端包含：小鼠CD8α铰链结构域、小鼠CD8α跨膜结构域、小鼠CD137共刺激信号传导结构域、和小鼠CD3ζ胞内信号传导结构域。
基于mus261 CAR主链，mus261M CAR载体中的MCS允许插入包含编码小鼠IL12p40(SEQ ID NO:29)和小鼠CCL-19(SEQ ID NO:30)的核酸序列的核酸序列，该核酸序列通过与另一个2A自切割肽(例如，SEQ ID NO:13所示的P2A片段)的C末端融合的2A自切割肽(例如，SEQ ID NO:14所示的T2A肽)连接，在CD3ζ胞内信号传导结构域的C末端上游并可操作地连接到CD3ζ胞内信号传导结构域的C末端。化学合成编码P2A肽和小鼠IL12p40-T2A-小鼠CCL-19肽的核酸序列，并通过克隆EZ方法将其克隆到pMSCV-BBzBB CAR主链中。所得mus261MCAR包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列、以及SEQ ID NO:45的核酸序列。类似地，化学合成编码F2A肽和小鼠IL7-F2A-小鼠CCL19肽(SEQ ID NO:36)的核酸序列，并通过克隆EZ方法将其克隆到pMSCV-BBzBB CAR主链中以形成mus261-719 CAR。
在同基因胃癌模型中，评估了表达外源引入的IL12p40和CCL-19的mus261M CAR-T细胞和表达外源引入的IL-7和CCL-19的mus261-719 CAR-T细胞在过继转移后的治疗功效。制备Mus261M CAR-T细胞和mus261-719 CAR-T细胞，并在C57BL/6同基因异种移植模型中进行评估。对于皮下异种移植模型，6-7周龄的C57BL/6小鼠在右前腿皮下接种LL/2-hCLDN18.2细胞(过表达人密蛋白18.2的LL/2细胞)(1.0×106个细胞/小鼠)。当平均肿瘤体积接近100mm3时(异种移植接种后第9天)，将小鼠随机分成4组，并通过尾静脉注射分别用mus261 CAR-T细胞(10M剂量)、mus261M CAR-T细胞(10M剂量)、mus261-719 CAR-T细胞(10M剂量)和仅溶剂(媒介物)进行处理。从小鼠接受治疗的前一天开始，每周两次用数字卡尺测量肿瘤大小。根据下式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝((长度)×(宽度)2)/2。
如图23A中显示，与媒介物和mus261 CAR-T细胞组相比，过继转移mus261M CAR-T细胞的小鼠是无肿瘤的，并且直至第42天具有持久的功效。在第14天，观察到与媒介物组相比Mus261-719 CAR-T细胞处理组对肿瘤生长具有明显的抑制作用(191.9mm3对914.8mm3)，生长抑制率为79.0％，但随后肿瘤大小增加，并且由于肿瘤在第21天破裂和结痂而处死所有小鼠。这一结果表明，mus261M CAR-T细胞(分泌musIL12p40和musCCL-19)比mus261-719CAR-T细胞(分泌musIL7和musCCL-19)具有更好的治疗潜力。
在该实验期间，在CAR-T组中未观察到小鼠体重减轻(图23B)。
8.12.实例12-表达膜结合的IL12p40和CCL-19的CAR-T细胞的制备和表征
为了进一步改善IL12p40和CCL-19装甲的CAR-T细胞的功能，构建了示例性的膜结合形式的IL12p40(MB12)。基于H93 CAR主链，H93M-MB12 CAR载体中的MCS允许插入核酸序列，该核酸序列包含编码膜结合的IL12p40(即MB12，SEQ ID NO:37)和人CCL19(SEQ ID NO:6)的核酸序列。具体而言，人IL12p40通过编码CD8α铰链、CD8α跨膜结构域和胞内CD8α胞内结构域的核酸序列连接，从而使IL12p40可以锚定在细胞膜上。将MB12融合到2A自切割肽(例如，SEQ ID NO:14所示的T2A片段)的N末端，在人CCL-19下游并可操作地连接到人CCL-19。化学合成编码MB12和CCL19的核酸序列，并通过HpaI(5'-GTTAAC-3')(SEQ ID NO:17)和MluI(5'-ACGCGT-3')(SEQ ID NO:23)限制性位点将其克隆到pLSINK-BBzBB CAR主链中。所得H93M-MB12 CAR包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列、和SEQ ID NO:39的核酸序列。按照实例1中披露的程序制备H93M-MB12 CAR-T细胞。
8.12.1.IL12p40蛋白在CAR-T细胞膜上的表达
为了验证膜结合策略，通过FACS染色抗人IL12p40(Biolegend#501809)和CAR阳性率(Genscript#CP0001)检测膜上IL12p40蛋白的表达。如图24A中显示，裸H93 CAR-T细胞、H93M CAR-T细胞和H93M-MB12 CAR-T细胞的CAR阳性率分别为61.58％、50.74％和33.97％。如图24B中显示，H93M-MB12 CAR-T细胞的IL12p40蛋白在膜上的表达接近100％，这表明最初膜结合策略的可行性。
8.12.2.IL12p40、IL-23、CCL-19和IL-12蛋白的分泌
为了进一步验证膜结合策略的可行性，分析了IL12p40和IL-23的分泌。简言之，在6孔板中以1×106个细胞/mL培养与抗CD3/CD28共培养的细胞(RPMI-1640+300IU/mL IL-2+抗CD3/CD28)，并在过夜后收获上清液。根据制造商的方案，使用人IL12p40试剂盒(Invitrogen#4215608)、IL-23试剂盒(Cisbio#62HIL23PEG)和CCL-19试剂盒(Abcam#ab100601)测定IL12p40、IL-23和CCL-19的量。如图25A和图25B中显示，在与抗CD3/CD28共培养后，与H93CAR-T细胞相比，分泌IL12p40的H93M CAR-T细胞具有更高的IL12p40(17288.6pg/mL对41.1pg/mL)和IL23(1775.1pg/mL对0pg/mL)的分泌，而H93M-MB12CAR-T细胞中的IL12p40分泌(267.7pg/mL)显著减少，并且在与抗CD3/CD28共培养后没有明显的IL23分泌。此外，H93M CAR-T细胞和H93M-MB12 CAR-T细胞具有相同水平的CCL-19分泌(图25C)。数据表明MB12的膜结合的IL12p40结构是可行的。如图25D中显示，在与抗CD3/CD28共培养后，在所有测试细胞中没有明显的IL-12分泌，这表明尽管H93M CAR-T细胞分泌IL12p40，但它们只产生IL-23而不是IL-12。
8.12.3IL12p40膜结合CAR-T细胞的细胞迁移测定
为了评估H93M-MB12 CAR-T细胞和H93M CAR-T细胞中CCL-19的趋化功能，进行了细胞迁移测定。通过迁移通过96孔transwell小室(Corning)中5-μm孔径的聚碳酸酯过滤器来测量应答T细胞的趋化性。用GPC3阳性人HCC细胞系PLC/PRF/5细胞刺激CAR-T细胞和UnT细胞，24小时后收集共培养上清液。然后将125μL上清液置于下室中，并将75μL未经处理的T细胞(0.075M)在上室中孵育。2、4和6小时后，通过血液计数室对从上室迁移到下室的T细胞进行计数。在细胞迁移测定中有四组处理：H93 CAR-T组(下室中的上清液取自与PLC/PRF/5细胞共培养的H93 CAR-T细胞)、H93M CAR-T组(下室中的上清液取自与PLC/PRF/5细胞共培养的H93M CAR-T细胞)、H93M-MB12 CAR-T组(下室中的上清液取自与PLC/PRF/5细胞共培养的H93M-MB12 CAR-T细胞)和UnT组(下室中的上清液取自与PLC/PRF/5细胞共培养的UnT细胞)。
如图26A中显示，在4h和6h，同与PLC/PRF/5细胞共培养的H93CAR-T细胞和与PLC/PRF/5细胞共培养的UnT细胞的上清液相比，与PLC/PRF/5细胞共培养的H93M CAR-T细胞和H93M-MB12 CAR-T细胞的上清液吸引更多的T细胞。具体而言，H93M CAR-T和H93M-MB12CAR-T组可以在6小时(0.077M和0.075M)完全吸引上室的所有T细胞，而无CCL-19产生的H93CAR-T组和UnT组即使在6小时也仅迁移较少的T细胞，分别为0.051M和0.048M。此外，通过CCL-19ELISA(Abcam#ab100601)测量共培养上清液中CCL-19的浓度。来自与PLC/PRF/5细胞共培养的H93M-MB12 CAR-T细胞和H93M CAR-T细胞的上清液中CCL-19的浓度分别为1389.1pg/mL和1804.7pg/mL(p<0.005)(图26B)。这一结果表明H93M-MB12 CAR-T细胞在体外具有与H93M CAR-T细胞相同的趋化功能。
8.12.4.IL12p40膜结合CAR-T细胞的再攻击测定
按照上文实例2中所述建立重复攻击模型。使用GPC3阳性细胞系-Hep3B细胞作为靶细胞。对于第一轮(第1轮)再攻击，CAR-T细胞与肿瘤细胞以2:1E/T比率在6孔板中共培养。过夜后，轻轻收集孔中的CAR-T细胞，离心，并重悬于新鲜的CAR-T培养基(RPMI-1640+300IU/mL IL-2)。然后将CAR-T细胞添加到新板中再培养2天。然后，收集孔中的CAR-T细胞，再次重悬于新鲜培养基中并添加到接种有新鲜肿瘤细胞的新板中(第2轮)。CAR-T细胞总共被刺激了5轮。每轮对T细胞进行计数，并在每次刺激后过夜检测细胞因子。在再攻击测定中有四组处理：H93 CAR-T组(初始CAR-T细胞是H93 CAR-T细胞)、H93M CAR-T组(初始CAR-T细胞是H93M CAR-T细胞)、H93M-MB12 CAR-T组(初始CAR-T细胞是H93M-MB12 CAR-T细胞)和UnT组(初始T细胞是未用CAR转导的T细胞)。
8.12.4.1.T细胞的扩增
为了确定在再攻击测定中具有膜结合的IL12p40表达的CAR-T细胞的扩增功能的益处，在每一轮结束时记录T细胞的数量，并计算扩增倍数。如图27B中显示，与H93M CAR-T组(第5轮时为708.1倍)和H93 CAR-T组(第5轮时为115.1倍)相比，用Hep3B细胞重复刺激导致H93M-MB12 CAR-T组显著扩增(第5轮时为1155.7倍)，这表明IL12p40膜结合的CAR-T细胞仍然具有CAR-T细胞的扩增功能的益处。然而，在没有抗原刺激的传统培养条件下，IL12p40膜结合的CAR-T细胞没有表现出更好的扩增优势，这归因于IL23的抗原依赖性表达(图27A)。
在每轮之后计算H93M-MB12 CAR-T细胞和H93M CAR-T细胞的CAR阳性率。如图27C中显示，H93M-MB12 CAR-T细胞的CAR阳性率随着刺激轮数的增加比H93M CAR-T细胞更快(第4轮后89.0％对81.0％)，裸H93 CAR-T细胞的CAR阳性率增加得较慢(第4轮后为48.5％)。
8.12.4.2.细胞因子TNF-α和IFN-γ的分泌
为了进一步验证H93M-M12 CAR-T细胞与H93 CAR-T细胞相比在再攻击测定中针对GPC3阳性肿瘤细胞的持续细胞毒活性，在将CAR-T细胞与Hep3B细胞以2:1E/T比率共培养过夜后，通过ELISA分析TNF-α和IFN-γ的产生。结果表明，与H93 CAR-T组或甚至H93M CAR-T组相比，H93M-M12 CAR-T组在所有轮次中产生TNF-α和IFN-γ的能力显著更高。如图28A和28B中显示，在第3轮至第5轮后，H93M-MB12 CAR-T组的细胞分泌的TNF-α和IFN-γ的浓度高于其他组，在5939.4-13287.2pg/mL(TNF-α)和52842.5-56072.5pg/mL(IFN-γ)范围内。H93M CAR-T细胞也具有较高的产生水平，在3134.2-7343.9pg/mL(TNF-α)和46799.6-53462.7pg/mL(IFN-γ)的范围内，而H93 CAR-T组细胞分泌的TNF-α和IFN-γ浓度在第1轮至第5轮后逐渐降低，在5823.0-2065.3pg/mL(TNF-α)和51265.5-21996.2pg/mL(IFN-γ)范围内。
本文引用的所有专利、公开的申请和参考文献的传授内容均通过援引以其全文并入本文。虽然已经特别显示和描述了示例性实施例，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离所附权利要求所涵盖的实施例的范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。
从上文可以理解，尽管为了说明的目的在本文中描述了特定实施例，但是可以在不脱离本文所提供的精神和范围的情况下进行各种修改。上文提及的所有参考文献通过援引以其全文并入本文。
序列表
SEQ ID NO:1.人源化抗GPC3 scFv氨基酸
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:2.H93 CAR氨基酸
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:3.H93M CAR氨基酸
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS
SEQ ID NO:4.IL12p40-T2A-CCL-19
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS
SEQ ID NO:5.人IL12p40
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
SEQ ID NO:6.人CCL19
MALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS
SEQ ID NO:7.CD8α信号肽
MALPVTALLLPLALLLHAARP
SEQ ID NO:8.CD8α铰链
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
SEQ ID NO:9.CD8α跨膜结构域
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
SEQ ID NO:10. 4-1BB(CD137)胞内结构域
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
SEQ ID NO:11.CD3ζ(CD3z)胞内结构域
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:12.H93M CAR核酸
ATGGCCCTGCCTGTGACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCTGCCCGCCCTGACATTGTGATGACCCAGTCTCCCCTGTCCCTGCCAGTGACCCCTGGAGAGCCAGCCTCCATCTCTTGCAGGAGCTCCCAGACCATCGTGCACAGCAACGGCAATACATACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACAGGTTCAGCGGAGTGCCAGACCGCTTTAGCGGATCCGGATCTGGCACCGATTTCACACTGAAGATCTCTAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTATTGCTTCCAGGTGAGCCACGTGCCATATACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGGGCAGCACCTCCGGATCTGGCAAGCCAGGATCCGGAGAGGGATCTACAAAGGGACAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAGACTATGAGATGCACTGGGTGCGGCAGGCAACCGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGAGGAATCGACCCAGAGACAGGCAACACAGCCTACTCCCAGAAGTTTAAGGGCCGGGTGACCATGACAAGAAATACCAGCATCTCCACAGCCTATATGGAGCTGTCTAGCCTGAGATCTGAGGATACAGCCGTGTACTATTGTGCTCGCTACTATTCCTTTGCCTACTGGGGACAGGGGACACTGGTCACCGTCTCATCAACTAGTACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGTTAACGGCAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGTGCCATCAGCAGCTGGTCATTTCTTGGTTCTCTCTGGTGTTTCTGGCTAGTCCTCTGGTCGCTATTTGGGAACTGAAAAAAGATGTGTACGTGGTGGAGCTGGACTGGTATCCAGATGCACCAGGAGAGATGGTGGTGCTGACCTGCGACACACCCGAGGAGGATGGCATCACCTGGACACTGGACCAGAGCTCCGAGGTGCTGGGAAGCGGCAAGACCCTGACAATCCAGGTGAAGGAGTTCGGCGATGCCGGCCAGTACACATGTCACAAGGGCGGCGAGGTGCTGTCTCACAGCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAGGAGGACGGCATCTGGTCCACAGACATCCTGAAGGATCAGAAGGAGCCTAAGAACAAGACCTTCCTGCGGTGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGCCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGACCACAATCTCTACCGACCTGACCTTCAGCGTGAAGTCTAGCCGGGGCTCCTCTGATCCACAGGGAGTGACATGCGGAGCAGCCACCCTGAGCGCCGAGCGGGTGAGAGGCGACAACAAGGAGTACGAGTATAGCGTGGAGTGCCAGGAGGATTCCGCCTGTCCAGCAGCAGAGGAGTCCCTGCCTATCGAAGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAGCTGAAGTACGAGAATTATACAAGCTCCTTCTTTATCAGGGACATCATCAAGCCAGATCCCCCTAAGAACCTGCAGCTGAAGCCCCTGAAGAATTCCCGCCAGGTGGAGGTGTCTTGGGAGTACCCTGATACCTGGTCCACACCACACAGCTATTTCTCCCTGACCTTTTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGTCTAAGAGGGAGAAGAAGGACCGCGTGTTCACCGATAAGACAAGCGCCACCGTGATCTGTCGGAAGAACGCCTCCATCTCTGTGCGGGCTCAGGACCGATATTACTCATCATCATGGAGTGAATGGGCCTCAGTGCCTTGCTCAGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCTCTGCTGCTGGCACTGAGTCTGCTGGTCCTGTGGACATCACCTGCACCTACCCTGAGTGGAACTAATGACGCTGAAGATTGTTGCCTGAGCGTGACCCAGAAGCCAATCCCCGGCTACATCGTGAGGAACTTCCACTATCTGCTGATCAAGGACGGATGCAGGGTGCCTGCAGTGGTGTTTACCACACTGCGGGGCAGACAGCTGTGCGCACCACCTGATCAGCCCTGGGTCGAGAGAATTATTCAGAGACTGCAGCGCACCTCAGCTAAGATGAAACGCCGCTCAAGT
SEQ ID NO:13.P2A
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
SEQ ID NO:14.T2A
GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO:15.EcoRI限制性位点
GAATTC
SEQ ID NO:16.SpeI限制性位点
ACTAGT
SEQ ID NO:17.HpaI限制性位点
GTTAAC
SEQ ID NO:18.H93P CAR氨基酸
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMAQSLALSLLILVLAFGIPRTQGSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP
SEQ ID NO:19.H93P CAR核酸ATGGCCCTGCCTGTGACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCTGCCCGCCCTGACATTGTGATGACCCAGTCTCCCCTGTCCCTGCCAGTGACCCCTGGAGAGCCAGCCTCCATCTCTTGCAGGAGCTCCCAGACCATCGTGCACAGCAACGGCAATACATACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACAGGTTCAGCGGAGTGCCAGACCGCTTTAGCGGATCCGGATCTGGCACCGATTTCACACTGAAGATCTCTAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTATTGCTTCCAGGTGAGCCACGTGCCATATACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGGGCAGCACCTCCGGATCTGGCAAGCCAGGATCCGGAGAGGGATCTACAAAGGGACAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAGACTATGAGATGCACTGGGTGCGGCAGGCAACCGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGAGGAATCGACCCAGAGACAGGCAACACAGCCTACTCCCAGAAGTTTAAGGGCCGGGTGACCATGACAAGAAATACCAGCATCTCCACAGCCTATATGGAGCTGTCTAGCCTGAGATCTGAGGATACAGCCGTGTACTATTGTGCTCGCTACTATTCCTTTGCCTACTGGGGACAGGGGACACTGGTCACCGTCTCATCAACTAGTACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGTTAACGGCAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGTGCCATCAGCAGCTGGTCATTTCTTGGTTCTCTCTGGTGTTTCTGGCTAGTCCTCTGGTCGCTATTTGGGAACTGAAAAAAGATGTGTACGTGGTGGAGCTGGACTGGTATCCAGATGCACCAGGAGAGATGGTGGTGCTGACCTGCGACACACCCGAGGAGGATGGCATCACCTGGACACTGGACCAGAGCTCCGAGGTGCTGGGAAGCGGCAAGACCCTGACAATCCAGGTGAAGGAGTTCGGCGATGCCGGCCAGTACACATGTCACAAGGGCGGCGAGGTGCTGTCTCACAGCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAGGAGGACGGCATCTGGTCCACAGACATCCTGAAGGATCAGAAGGAGCCTAAGAACAAGACCTTCCTGCGGTGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGCCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGACCACAATCTCTACCGACCTGACCTTCAGCGTGAAGTCTAGCCGGGGCTCCTCTGATCCACAGGGAGTGACATGCGGAGCAGCCACCCTGAGCGCCGAGCGGGTGAGAGGCGACAACAAGGAGTACGAGTATAGCGTGGAGTGCCAGGAGGATTCCGCCTGTCCAGCAGCAGAGGAGTCCCTGCCTATCGAAGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAGCTGAAGTACGAGAATTATACAAGCTCCTTCTTTATCAGGGACATCATCAAGCCAGATCCCCCTAAGAACCTGCAGCTGAAGCCCCTGAAGAATTCCCGCCAGGTGGAGGTGTCTTGGGAGTACCCTGATACCTGGTCCACACCACACAGCTATTTCTCCCTGACCTTTTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGTCTAAGAGGGAGAAGAAGGACCGCGTGTTCACCGATAAGACAAGCGCCACCGTGATCTGTCGGAAGAACGCCTCCATCTCTGTGCGGGCTCAGGACCGATATTACTCATCATCATGGAGTGAATGGGCCTCAGTGCCTTGCTCAGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCCCAGAGCCTTGCTCTCTCTCTGCTCATTCTGGTGCTGGCATTCGGCATCCCACGTACCCAGGGCTCCGACGGCGGCGCGCAGGACTGTTGCCTGAAGTACTCCCAGCGCAAGATCCCCGCCAAGGTGGTCCGCAGCTACAGGAAGCAGGAGCCAAGTCTAGGGTGCTCTATCCCTGCCATCCTGTTTCTGCCCCGCAAGCGCAGCCAGGCCGAGCTGTGCGCCGACCCGAAGGAGCTTTGGGTGCAGCAGCTGATGCAACACTTGGATAAAACTCCGAGCCCTCAGAAGCCTGCTCAGGGGTGCCGAAAGGACCGCGGAGCTTCCAAGACCGGCAAAAAGGGTAAGGGCTCCAAAGGTTGTAAACGTACCGAACGGTCACAGACGCCCAAGGGACCC
SEQ ID NO:20.IL12p40-T2A-CCL21氨基酸
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMAQSLALSLLILVLAFGIPRTQGSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP
SEQ ID NO:21.IL12p40-T2A-CCL21核酸
ATGTGCCATCAGCAGCTGGTCATTTCTTGGTTCTCTCTGGTGTTTCTGGCTAGTCCTCTGGTCGCTATTTGGGAACTGAAAAAAGATGTGTACGTGGTGGAGCTGGACTGGTATCCAGATGCACCAGGAGAGATGGTGGTGCTGACCTGCGACACACCCGAGGAGGATGGCATCACCTGGACACTGGACCAGAGCTCCGAGGTGCTGGGAAGCGGCAAGACCCTGACAATCCAGGTGAAGGAGTTCGGCGATGCCGGCCAGTACACATGTCACAAGGGCGGCGAGGTGCTGTCTCACAGCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAGGAGGACGGCATCTGGTCCACAGACATCCTGAAGGATCAGAAGGAGCCTAAGAACAAGACCTTCCTGCGGTGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGCCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGACCACAATCTCTACCGACCTGACCTTCAGCGTGAAGTCTAGCCGGGGCTCCTCTGATCCACAGGGAGTGACATGCGGAGCAGCCACCCTGAGCGCCGAGCGGGTGAGAGGCGACAACAAGGAGTACGAGTATAGCGTGGAGTGCCAGGAGGATTCCGCCTGTCCAGCAGCAGAGGAGTCCCTGCCTATCGAAGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAGCTGAAGTACGAGAATTATACAAGCTCCTTCTTTATCAGGGACATCATCAAGCCAGATCCCCCTAAGAACCTGCAGCTGAAGCCCCTGAAGAATTCCCGCCAGGTGGAGGTGTCTTGGGAGTACCCTGATACCTGGTCCACACCACACAGCTATTTCTCCCTGACCTTTTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGTCTAAGAGGGAGAAGAAGGACCGCGTGTTCACCGATAAGACAAGCGCCACCGTGATCTGTCGGAAGAACGCCTCCATCTCTGTGCGGGCTCAGGACCGATATTACTCATCATCATGGAGTGAATGGGCCTCAGTGCCTTGCTCAGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCCCAGAGCCTTGCTCTCTCTCTGCTCATTCTGGTGCTGGCATTCGGCATCCCACGTACCCAGGGCTCCGACGGCGGCGCGCAGGACTGTTGCCTGAAGTACTCCCAGCGCAAGATCCCCGCCAAGGTGGTCCGCAGCTACAGGAAGCAGGAGCCAAGTCTAGGGTGCTCTATCCCTGCCATCCTGTTTCTGCCCCGCAAGCGCAGCCAGGCCGAGCTGTGCGCCGACCCGAAGGAGCTTTGGGTGCAGCAGCTGATGCAACACTTGGATAAAACTCCGAGCCCTCAGAAGCCTGCTCAGGGGTGCCGAAAGGACCGCGGAGCTTCCAAGACCGGCAAAAAGGGTAAGGGCTCCAAAGGTTGTAAACGTACCGAACGGTCACAGACGCCCAAGGGACCC
SEQ ID NO:22.人CCL21
MAQSLALSLLILVLAFGIPRTQGSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP
SEQ ID NO:23.MluI限制性位点
ACGCGT
SEQ ID NO:24.人IL-7
MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
SEQ ID NO:25.IL12p40-P2A-IL-7氨基酸
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
SEQ ID NO:26.IL12p40-P2A-IL7核酸
ATGTGCCACCAGCAGCTGGTGATCAGTTGGTTCTCTCTGGTGTTCCTGGCCTCGCCACTTGTTGCCATATGGGAACTCAAAAAGGACGTGTACGTGGTGGAGCTGGACTGGTACCCCGACGCTCCCGGGGAGATGGTGGTCCTGACCTGTGATACTCCGGAGGAAGATGGCATCACCTGGACATTGGATCAGAGCTCCGAGGTACTGGGCTCCGGCAAAACTCTGACCATCCAGGTGAAGGAGTTCGGTGATGCTGGACAATACACCTGCCATAAGGGCGGCGAGGTTCTTAGCCATTCTCTGCTGCTCCTCCACAAGAAGGAAGACGGTATTTGGTCGACCGACATCCTGAAGGACCAGAAGGAGCCCAAAAACAAGACTTTTTTGCGCTGCGAGGCCAAAAACTACTCCGGTCGCTTCACATGCTGGTGGCTAACGACCATCTCAACCGACCTGACCTTCTCTGTCAAGAGCTCTCGTGGCTCCAGCGATCCTCAGGGCGTCACCTGCGGGGCAGCCACCCTGAGCGCAGAGCGCGTGAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCGGTGGAGTGTCAGGAGGACTCGGCCTGCCCAGCGGCCGAGGAGAGCCTGCCCATTGAGGTGATGGTAGACGCCGTCCACAAGCTGAAGTACGAGAACTACACCTCCTCCTTCTTTATCCGGGACATCATCAAGCCCGACCCGCCCAAGAACCTGCAGCTCAAGCCTTTGAAGAATTCCCGCCAGGTTGAAGTCAGTTGGGAGTACCCTGACACCTGGTCTACTCCGCACAGCTATTTCTCGCTGACCTTCTGCGTGCAGGTCCAGGGAAAGTCCAAGCGCGAGAAGAAAGACAGGGTGTTCACCGACAAGACCTCCGCCACCGTGATTTGCCGAAAAAACGCCTCCATCTCCGTGCGTGCGCAGGACCGCTACTACAGTTCCTCTTGGTCCGAGTGGGCTTCCGTGCCTTGTTCAGGCAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGTTTCATGTCTCCTTCCGCTACATCTTCGGGCTCCCTCCCCTGATCCTCGTTCTGCTGCCAGTGGCATCTAGCGATTGTGACATTGAGGGCAAAGACGGCAAGCAATACGAGAGCGTGCTGATGGTGTCGATTGACCAGCTGTTGGATTCTATGAAAGAGATCGGCTCCAACTGCCTGAACAACGAGTTCAACTTCTTCAAGCGCCACATCTGTGACGCCAACAAGGAAGGTATGTTTCTGTTCCGGGCCGCGCGCAAGCTGAGGCAGTTCCTGAAAATGAATTCCACCGGTGATTTCGACTTGCACCTGCTTAAGGTGTCCGAGGGCACGACCATCCTTCTTAACTGCACTGGACAGGTCAAGGGCCGTAAGCCCGCCGCTCTAGGGGAGGCTCAGCCGACAAAGTCGCTGGAGGAGAACAAGTCACTCAAAGAACAGAAGAAGCTCAACGACCTGTGCTTTTTGAAGCGCCTGCTGCAGGAGATCAAGACCTGTTGGAATAAGATCCTGATGGGCACCAAGGAGCAC
SEQ ID NO:27.MusH93 CAR氨基酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQADIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR
SEQ ID NO:28.小鼠CAR主链(小鼠CD8α铰链-小鼠CD8α跨膜结构域-小鼠4-1BB(CD137)胞内结构域-小鼠CD3ζ胞内)
TTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR
SEQ ID NO:29.小鼠IL12p40
MCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRS
SEQ ID NO:30.小鼠CCL-19
MAPRVTPLLAFSLLVLWTFPAPTLGGANDAEDCCLSVTQRPIPGNIVKAFRYLLNEDGCRVPAVVFTTLRGYQLCAPPDQPWVDRIIRRLKKSSAKNKGNSTRRSPVS
SEQ ID NO:31.小鼠H93M CAR氨基酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQADIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMAPRVTPLLAFSLLVLWTFPAPTLGGANDAEDCCLSVTQRPIPGNIVKAFRYLLNEDGCRVPAVVFTTLRGYQLCAPPDQPWVDRIIRRLKKSSAKNKGNSTRRSPVS
SEQ ID NO:32.小鼠H93M CAR核酸
ATGGCAAGTCCTCTGACTCGGTTTCTGTCTCTGAATCTGCTCCTCCTCGGTGAATCCATTATCCTCGGTTCCGGTGAAGCTAAGCCTCAGGCCGACATCGTGATGACACAGAGCCCACTGTCCCTGCCAGTGACCCCAGGAGAGCCTGCTAGCATCTCCTGTAGGAGCTCCCAGACAATCGTGCACAGCAACGGCAACACCTACCTGGAGTGGTACCTGCAGAAGCCTGGACAGTCCCCACAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACAGGTTTAGCGGCGTGCCCGACAGATTCTCTGGCAGCGGATCCGGCACAGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGATGTGGGAGTGTACTACTGTTTTCAGGTGAGCCACGTGCCATACACATTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCTCTACAAGCGGATCCGGCAAGCCAGGATCCGGAGAGGGATCTACCAAGGGACAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCTAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACCGACTACGAGATGCACTGGGTGCGGCAGGCTACAGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGAGGCATCGATCCTGAGACAGGCAACACCGCCTACAGCCAGAAGTTCAAGGGAAGGGTGACAATGACCAGAAACACATCTATCAGCACCGCTTACATGGAGCTGTCTAGCCTGCGGTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTCGCTACTACTCTTTTGCCTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACCGTGTCCTCTACATCCACCACAACCAAGCCAGTGCTGAGGACCCCAAGCCCTGTGCACCCAACAGGCACCTCCCAGCCACAGAGGCCCGAGGATTGTAGGCCCAGAGGATCTGTGAAGGGCACAGGACTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCTCCTCTGGCTGGAATCTGCGTGGCTCTGCTGCTGTCTCTGATCATCACCCTGATCTGCAGCGTGCTGAAGTGGATCCGGAAGAAGTTCCCCCACATCTTTAAGCAGCCTTTCAAGAAGACAACCGGAGCTGCTCAGGAGGAGGACGCCTGCTCCTGTAGGTGCCCTCAGGAAGAAGAGGGAGGAGGAGGAGGATACGAGCTGAGGGCTAAGTTCTCCCGCTCTGCTGAGACAGCCGCTAACCTGCAGGATCCAAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGAGAAGAAGCGGGCTCGCGATCCTGAGATGGGAGGAAAGCAGCAGCGGCGCAGGAACCCACAGGAGGGCGTGTACAACGCTCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCTTACAGCGAGATCGGCACCAAGGGAGAGAGACGGCGCGGCAAGGGACACGATGGCCTGTACCAGGGACTCTCAACCGCTACTAAGGACACCTACGATGCTCTCCATATGCAGACCCTCGCACCCCGCGTTAACGGCAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGTGCCCTCAGAAACTGACTATATCATGGTTTGCCATTGTGCTGCTGGTAAGTCCTCTCATGGCCATGTGGGAATTGGAGAAAGATGTGTACGTGGTGGAGGTGGACTGGACCCCTGACGCACCAGGAGAAACAGTGAACCTGACGTGTGATACGCCAGAAGAGGATGACATTACTTGGACATCAGATCAAAGACACGGTGTCATAGGGTCAGGCAAAACTCTTACCATCACAGTCAAGGAGTTCCTAGATGCTGGCCAGTATACCTGCCATAAAGGAGGGGAAACCCTGTCCCACTCGCATCTGCTCCTCCACAAGAAGGAAAACGGCATCTGGAGCACAGAGATCCTGAAGAATTTTAAGAATAAGACCTTCTTGAAATGTGAGGCCCCCAACTACAGCGGGAGGTTCACCTGTTCCTGGCTGGTGCAACGGAACATGGACCTGAAGTTCAATATTAAATCTTCATCTTCCTCCCCGGACAGTCGCGCAGTTACTTGTGGCATGGCTTCTTTATCGGCAGAGAAAGTCACCCTTGACCAGCGCGACTATGAGAAGTATTCTGTTTCCTGCCAGGAGGACGTGACGTGCCCCACAGCTGAAGAGACTTTGCCTATTGAGTTAGCCCTGGAGGCCAGACAACAGAACAAATATGAAAATTATTCCACTTCATTCTTCATCCGTGATATCATCAAGCCCGATCCACCCAAGAATCTTCAGATGAAGCCTCTAAAGAACAGCCAGGTGGAGGTTAGCTGGGAGTACCCAGATAGCTGGTCTACCCCACATTCCTACTTTAGTTTAAAGTTTTTTGTAAGAATCCAGAGGAAAAAAGAAAAGATGAAAGAGACTGAAGAAGGTTGCAACCAGAAGGGAGCGTTTCTCGTTGAGAAGACAAGCACAGAAGTCCAGTGCAAAGGTGGAAATGTATGTGTGCAAGCTCAGGACAGGTACTACAACAGTAGCTGTTCTAAGTGGGCATGTGTCCCCTGCCGAGTGCGGAGTGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCTCCTAGAGTGACACCTTTGCTGGCCTTTTCTCTTCTAGTGTTGTGGACGTTTCCTGCACCCACCCTGGGTGGAGCGAATGATGCAGAGGACTGCTGCCTCAGTGTCACCCAAAGGCCCATACCAGGGAACATTGTGAAGGCCTTCCGCTATCTTCTCAATGAAGATGGATGTCGGGTTCCTGCTGTGGTCTTCACTACTTTACGCGGCTACCAGCTGTGTGCTCCTCCAGACCAGCCCTGGGTGGACCGTATCATCCGAAGGCTGAAGAAAAGCAGCGCCAAGAACAAAGGCAACTCAACAAGAAGATCCCCAGTTTCC
SEQ ID NO:33.小鼠H93IL12p40 CAR氨基酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQADIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRS
SEQ ID NO:34.小鼠H93CCL19 CAR氨基酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQADIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMAPRVTPLLAFSLLVLWTFPAPTLGGANDAEDCCLSVTQRPIPGNIVKAFRYLLNEDGCRVPAVVFTTLRGYQLCAPPDQPWVDRIIRRLKKSSAKNKGNSTRRSPVS
SEQ ID NO:35.mus261 CAR氨基酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQAQVQLEESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYRSSVCMGWFRQAPGKERERVAVIGRDGSTTYIDSVKGRFTISRDSAKNTLSLQMDNLKPEDTAMYSCAAGLGYWACEYNYWGQGTQVTVSSTSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR
SEQ ID NO:36.小鼠IL7-F2A-小鼠CCL19氨基酸
MFHVSFRYIFGIPPLILVLLPVTSSECHIKDKEGKAYESVLMISIDELDKMTGTDSNCPNNEPNFFRKHVCDDTKEAAFLNRAARKLKQFLKMNISEEFNVHLLTVSQGTQTLVNCTSKEEKNVKEQKKNDACFLKRLLREIKTCWNKILKGSIGSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPMAPRVTPLLAFSLLVLWTFPAPTLGGANDAEDCCLSVTQRPIPGNIVKAFRYLLNEDGCRVPAVVFTTLRGYQLCAPPDQPWVDRIIRRLKKSSAKNKGNSTRRSPVS
SEQ ID NO:37.MB12氨基酸(IL12p40-CD8α铰链-CD8α跨膜结构域-胞内CD8α胞内结构域)
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYCNHRNRRR
SEQ ID NO:38.H93M-MB12 CAR氨基酸
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMDWTWILFLVAAATRVHSIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYCNHRNRRRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS
SEQ ID NO:39.H93M-MB12 CAR核酸
ATGGCCCTGCCTGTGACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCTGCCCGCCCTGACATTGTGATGACCCAGTCTCCCCTGTCCCTGCCAGTGACCCCTGGAGAGCCAGCCTCCATCTCTTGCAGGAGCTCCCAGACCATCGTGCACAGCAACGGCAATACATACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACAGGTTCAGCGGAGTGCCAGACCGCTTTAGCGGATCCGGATCTGGCACCGATTTCACACTGAAGATCTCTAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTATTGCTTCCAGGTGAGCCACGTGCCATATACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGGGCAGCACCTCCGGATCTGGCAAGCCAGGATCCGGAGAGGGATCTACAAAGGGACAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAGACTATGAGATGCACTGGGTGCGGCAGGCAACCGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGAGGAATCGACCCAGAGACAGGCAACACAGCCTACTCCCAGAAGTTTAAGGGCCGGGTGACCATGACAAGAAATACCAGCATCTCCACAGCCTATATGGAGCTGTCTAGCCTGAGATCTGAGGATACAGCCGTGTACTATTGTGCTCGCTACTATTCCTTTGCCTACTGGGGACAGGGGACACTGGTCACCGTCTCATCAACTAGTACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGTTAACGGTTCCGGCGCCACCAACTTTTCACTGTTAAAGCAGGCCGGTGATGTGGAGGAGAATCCAGGCCCTATGGATTGGACCTGGATCCTCTTCCTGGTGGCTGCAGCCACCCGTGTCCACTCCATCTGGGAGCTGAAGAAGGACGTGTACGTGGTGGAGCTCGACTGGTACCCCGACGCTCCCGGGGAGATGGTGGTTCTGACCTGTGACACCCCAGAGGAAGACGGCATCACCTGGACCCTGGACCAGAGCTCCGAGGTGCTGGGCTCCGGCAAAACTTTGACTATCCAGGTCAAGGAGTTCGGTGATGCAGGCCAATACACATGCCATAAGGGCGGCGAGGTGCTGTCTCATTCTCTGCTGCTGCTGCACAAGAAGGAAGATGGCATTTGGTCGACTGACATCCTGAAGGACCAGAAGGAGCCCAAGAACAAGACCTTCCTAAGGTGTGAGGCCAAGAACTATTCCGGTCGCTTCACATGTTGGTGGCTAACCACAATTTCGACCGACCTGACCTTTAGCGTAAAATCCTCTCGTGGCTCGAGCGATCCTCAGGGAGTCACCTGCGGGGCCGCCACTCTGTCCGCCGAGCGCGTGCGCGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCCGTGGAGTGTCAGGAGGACAGCGCCTGCCCAGCAGCCGAGGAGAGCCTCCCCATCGAAGTGATGGTGGACGCGGTACACAAGCTGAAGTACGAGAACTACACCAGCTCCTTCTTCATCCGCGACATCATCAAGCCGGACCCGCCCAAAAACCTGCAGCTGAAACCTTTGAAAAACTCCCGCCAGGTCGAAGTCAGTTGGGAGTACCCGGACACCTGGTCGACTCCCCACAGCTATTTCAGTCTTACGTTCTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGTCCAAACGCGAGAAGAAAGACAGGGTGTTCACGGACAAGACTTCCGCTACCGTCATCTGCCGCAAGAACGCGAGCATCTCTGTCAGAGCTCAGGACCGCTACTACTCTTCCAGTTGGTCTGAGTGGGCGTCCGTCCCCTGTTCTACCACGACCCCGGCGCCGCGCCCCCCAACCCCTGCCCCTACCATTGCCTCACAGCCGTTGTCTCTGCGGCCCGAGGCGTGCCGACCTGCCGCGGGAGGCGCGGTGCACACGCGGGGTCTCGACTTTGCTTGTGATATTTACATATGGGCTCCCCTGGCCGGCACCTGCGGGGTTTTGCTCCTTTCCTTGGTGATCACTCTTTACTGCCTGTACTGCAATCACCGGAACCGCCGCCGTGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCTCTGCTGCTGGCACTGAGTCTGCTGGTCCTGTGGACATCACCTGCACCTACCCTGAGTGGAACTAATGACGCTGAAGATTGTTGCCTGAGCGTGACCCAGAAGCCAATCCCCGGCTACATCGTGAGGAACTTCCACTATCTGCTGATCAAGGACGGATGCAGGGTGCCTGCAGTGGTGTTTACCACACTGCGGGGCAGACAGCTGTGCGCACCACCTGATCAGCCCTGGGTCGAGAGAATTATTCAGAGACTGCAGCGCACCTCAGCTAAGATGAAACGCCGCTCAAGT
SEQ ID NO:40.抗密蛋白18.2 VHH结构域
QVQLEESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYRSSVCMGWFRQAPGKERERVAVIGRDGSTTYIDSVKGRFTISRDSAKNTLSLQMDNLKPEDTAMYSCAAGLGYWACEYNYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:41.261 CAR氨基酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQAQVQLEESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYRSSVCMGWFRQAPGKERERVAVIGRDGSTTYIDSVKGRFTISRDSAKNTLSLQMDNLKPEDTAMYSCAAGLGYWACEYNYWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:42.261M CAR氨基酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQAQVQLEESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYRSSVCMGWFRQAPGKERERVAVIGRDGSTTYIDSVKGRFTISRDSAKNTLSLQMDNLKPEDTAMYSCAAGLGYWACEYNYWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS
SEQ ID NO:43.261M CAR核酸
ATGGCCTCACCGTTGACCCGCTTTCTGTCGCTGAACCTGCTGCTGCTGGGTGAGTCGATTATCCTGGGGAGTGGAGAAGCTAAGCCACAGGCACAGGTGCAGCTGGAGGAGTCTGGAGGAGGAAGCGTGCAAGTGGGAGGCTCCCTGAGGCTGTCTTGCGCAGCAAGCGGATACAGATCCAGCGTGTGCATGGGATGGTTTAGACAGGCACCAGGAAAGGAGAGGGAGAGAGTGGCAGTGATCGGAAGGGACGGATCCACCACATATATCGATTCTGTGAAGGGCCGGTTTACCATCTCCAGAGACTCTGCCAAGAACACACTGTCTCTGCAGATGGACAATCTGAAGCCTGAAGACACAGCCATGTACAGCTGCGCCGCCGGCCTGGGATACTGGGCTTGCGAATACAACTACTGGGGGCAGGGCACTCAGGTGACCGTCTCTTCTACTAGTACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGTTAACGGCAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGTGCCACCAGCAGCTGGTGATCAGTTGGTTCTCTCTGGTGTTCCTGGCCTCGCCACTTGTTGCCATATGGGAACTCAAAAAGGACGTGTACGTGGTGGAGCTGGACTGGTACCCCGACGCTCCCGGGGAGATGGTGGTCCTGACCTGTGATACTCCGGAGGAAGATGGCATCACCTGGACATTGGATCAGAGCTCCGAGGTACTGGGCTCCGGCAAAACTCTGACCATCCAGGTGAAGGAGTTCGGTGATGCTGGACAATACACCTGCCATAAGGGCGGCGAGGTTCTTAGCCATTCTCTGCTGCTCCTCCACAAGAAGGAAGACGGTATTTGGTCGACCGACATCCTGAAGGACCAGAAGGAGCCCAAAAACAAGACTTTTTTGCGCTGCGAGGCCAAAAACTACTCCGGTCGCTTCACATGCTGGTGGCTAACGACCATCTCAACCGACCTGACCTTCTCTGTCAAGAGCTCTCGTGGCTCCAGCGATCCTCAGGGCGTCACCTGCGGGGCAGCCACCCTGAGCGCAGAGCGCGTGAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCGGTGGAGTGTCAGGAGGACTCGGCCTGCCCAGCGGCCGAGGAGAGCCTGCCCATTGAGGTGATGGTAGACGCCGTCCACAAGCTGAAGTACGAGAACTACACCTCCTCCTTCTTTATCCGGGACATCATCAAGCCCGACCCGCCCAAGAACCTGCAGCTCAAGCCTTTGAAGAATTCCCGCCAGGTTGAAGTCAGTTGGGAGTACCCTGACACCTGGTCTACTCCGCACAGCTATTTCTCGCTGACCTTCTGCGTGCAGGTCCAGGGAAAGTCCAAGCGCGAGAAGAAAGACAGGGTGTTCACCGACAAGACCTCCGCCACCGTGATTTGCCGAAAAAACGCCTCCATCTCCGTGCGTGCGCAGGACCGCTACTACAGTTCCTCTTGGTCCGAGTGGGCTTCCGTGCCTTGTTCAGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCTCTGCTGCTGGCACTGAGTCTGCTGGTCCTGTGGACATCACCTGCACCTACCCTGAGTGGAACTAATGACGCTGAAGATTGTTGCCTGAGCGTGACCCAGAAGCCAATCCCCGGCTACATCGTGAGGAACTTCCACTATCTGCTGATCAAGGACGGATGCAGGGTGCCTGCAGTGGTGTTTACCACACTGCGGGGCAGACAGCTGTGCGCACCACCTGATCAGCCCTGGGTCGAGAGAATTATTCAGAGACTGCAGCGCACCTCAGCTAAGATGAAACGCCGCTCAAGTTAA
SEQ ID NO:44.mus261M CAR氨基酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQAQVQLEESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYRSSVCMGWFRQAPGKERERVAVIGRDGSTTYIDSVKGRFTISRDSAKNTLSLQMDNLKPEDTAMYSCAAGLGYWACEYNYWGQGTQVTVSSTSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMAPRVTPLLAFSLLVLWTFPAPTLGGANDAEDCCLSVTQRPIPGNIVKAFRYLLNEDGCRVPAVVFTTLRGYQLCAPPDQPWVDRIIRRLKKSSAKNKGNSTRRSPVS
SEQ ID NO:45.mus261M CAR核酸
ATGGCCTCACCGTTGACCCGCTTTCTGTCGCTGAACCTGCTGCTGCTGGGTGAGTCGATTATCCTGGGGAGTGGAGAAGCTAAGCCACAGGCACAGGTGCAGCTGGAGGAGTCTGGAGGAGGAAGCGTGCAAGTGGGAGGCTCCCTGAGGCTGTCTTGCGCAGCAAGCGGATACAGATCCAGCGTGTGCATGGGATGGTTTAGACAGGCACCAGGAAAGGAGAGGGAGAGAGTGGCAGTGATCGGAAGGGACGGATCCACCACATATATCGATTCTGTGAAGGGCCGGTTTACCATCTCCAGAGACTCTGCCAAGAACACACTGTCTCTGCAGATGGACAATCTGAAGCCTGAAGACACAGCCATGTACAGCTGCGCCGCCGGCCTGGGATACTGGGCTTGCGAATACAACTACTGGGGGCAGGGCACTCAGGTGACCGTCTCTTCTACTAGTACTACTACCAAGCCAGTGCTGCGAACTCCCTCACCTGTGCACCCTACCGGGACATCTCAGCCCCAGAGACCAGAAGATTGTCGGCCCCGTGGCTCAGTGAAGGGGACCGGATTGGACTTCGCCTGTGATATTTACATCTGGGCACCCTTGGCCGGAATCTGCGTGGCCCTTCTGCTGTCCTTGATCATCACTCTCATCTGCTCTGTGCTCAAATGGATCAGGAAAAAATTCCCCCACATATTCAAGCAACCATTTAAGAAGACCACTGGAGCAGCTCAAGAGGAAGATGCTTGTAGCTGCCGATGTCCACAGGAAGAAGAAGGAGGAGGAGGAGGCTATGAGCTGAGAGCAAAATTCAGCAGGAGTGCAGAGACTGCTGCCAACCTGCAGGACCCCAACCAGCTCTACAATGAGCTCAATCTAGGGCGAAGAGAGGAATATGACGTCTTGGAGAAGAAGCGGGCTCGGGATCCAGAGATGGGAGGCAAACAGCAGAGGAGGAGGAACCCCCAGGAAGGCGTATACAATGCACTGCAGAAAGACAAGATGGCAGAAGCCTACAGTGAGATCGGCACAAAAGGCGAGAGGCGGAGAGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGCACTGCCACCAAGGACACCTATGATGCCCTGCATATGCAGACCCTGGCCCCTCGCGGCAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGTGTCCTCAGAAGCTAACCATCTCCTGGTTTGCCATCGTTTTGCTGGTGTCTCCACTCATGGCCATGTGGGAGCTGGAGAAAGACGTTTATGTTGTAGAGGTGGACTGGACTCCCGATGCCCCTGGAGAAACAGTGAACCTCACCTGTGACACGCCTGAAGAAGATGACATCACCTGGACCTCAGACCAGAGACATGGAGTCATAGGCTCTGGAAAGACCCTGACCATCACTGTCAAAGAGTTTCTAGATGCTGGCCAGTACACCTGCCACAAAGGAGGCGAGACTCTGAGCCACTCACATCTGCTGCTCCACAAGAAGGAAAATGGAATTTGGTCCACTGAAATTTTAAAAAATTTCAAAAACAAGACTTTCCTGAAGTGTGAAGCACCAAATTACTCCGGACGGTTCACGTGCTCATGGCTGGTGCAAAGAAACATGGACTTGAAGTTCAACATCAAGAGCAGTAGCAGTTCCCCTGACTCTCGGGCAGTGACATGTGGAATGGCGTCTCTGTCTGCAGAGAAGGTCACACTGGACCAAAGGGACTATGAGAAGTATTCAGTGTCCTGCCAGGAGGATGTCACCTGCCCAACTGCCGAGGAGACCCTGCCCATTGAACTGGCGTTGGAAGCACGGCAGCAGAATAAATATGAGAACTACAGCACCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCAGACCCGCCCAAGAACTTGCAGATGAAGCCTTTGAAGAACTCACAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACTCCTGGAGCACTCCCCATTCCTACTTCTCCCTCAAGTTCTTTGTTCGAATCCAGCGCAAGAAAGAAAAGATGAAGGAGACAGAGGAGGGGTGTAACCAGAAAGGTGCGTTCCTCGTAGAGAAGACATCTACCGAAGTCCAATGCAAAGGCGGGAATGTCTGCGTGCAAGCTCAGGATCGCTATTACAATTCCTCATGCAGCAAGTGGGCATGTGTTCCCTGCAGGGTCCGATCCGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCTCCTAGAGTGACACCTTTGCTGGCCTTTTCTCTTCTAGTGTTGTGGACGTTTCCTGCACCCACCCTGGGTGGAGCGAATGATGCAGAGGACTGCTGCCTCAGTGTCACCCAAAGGCCCATACCAGGGAACATTGTGAAGGCCTTCCGCTATCTTCTCAATGAAGATGGATGTCGGGTTCCTGCTGTGGTCTTCACTACTTTACGCGGCTACCAGCTGTGTGCTCCTCCAGACCAGCCCTGGGTGGACCGTATCATCCGAAGGCTGAAGAAAAGCAGCGCCAAGAACAAAGGCAACTCAACAAGAAGATCCCCAGTTTCCTAA
SEQ ID NO:46.甘氨酸-丝氨酸聚合物接头
(GSGGS)n[n是至少1的整数]
SEQ ID NO:47.甘氨酸-丝氨酸聚合物接头
(GGGS)n[n是至少1的整数]
SEQ ID NO:48.甘氨酸-丝氨酸聚合物接头
(GGGGS)n[n是至少1的整数]
序列表
<110> 南京传奇生物科技有限公司（NANJING LEGEND BIOTECH CO., LTD.）
<120> 表达外源引入的细胞因子的工程化免疫效应细胞
<130> 14651-039-228
<140>
<141>
<150> PCT/CN2021/078227
<151> 2021-02-26
<160> 48
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗GPC3 scFv氨基酸
<400> 1
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Val
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
145 150 155 160
Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu
165 170 175
Trp Met Gly Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asn Thr Ala Tyr Ser Gln
180 185 190
Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr
195 200 205
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 2
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H93 CAR氨基酸
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
35 40 45
Thr Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Phe Gln Val Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser
130 135 140
Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
145 150 155 160
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
165 170 175
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr
180 185 190
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asn
195 200 205
Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn
210 215 220
Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
225 230 235 240
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
275 280 285
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
290 295 300
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
305 310 315 320
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
325 330 335
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
340 345 350
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
355 360 365
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
370 375 380
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
385 390 395 400
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
405 410 415
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
420 425 430
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
435 440 445
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
450 455 460
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
465 470 475 480
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 3
<211> 962
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H93M CAR氨基酸
<400> 3
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
35 40 45
Thr Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Phe Gln Val Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser
130 135 140
Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
145 150 155 160
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
165 170 175
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr
180 185 190
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asn
195 200 205
Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn
210 215 220
Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
225 230 235 240
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
275 280 285
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
290 295 300
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
305 310 315 320
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
325 330 335
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
340 345 350
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
355 360 365
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
370 375 380
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
385 390 395 400
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
405 410 415
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
420 425 430
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
435 440 445
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
450 455 460
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
465 470 475 480
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Val Asn Gly Ser Gly
485 490 495
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
500 505 510
Pro Gly Pro Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu
515 520 525
Val Phe Leu Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp
530 535 540
Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met
545 550 555 560
Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr
565 570 575
Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile
580 585 590
Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly
595 600 605
Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp
610 615 620
Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn
625 630 635 640
Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr
645 650 655
Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys
660 665 670
Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala
675 680 685
Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr
690 695 700
Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser
705 710 715 720
Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu
725 730 735
Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro
740 745 750
Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu
755 760 765
Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe
770 775 780
Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys
785 790 795 800
Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg
805 810 815
Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser
820 825 830
Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Ser Gly Glu Gly
835 840 845
Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
850 855 860
Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro
865 870 875 880
Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser
885 890 895
Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr
900 905 910
Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr
915 920 925
Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu
930 935 940
Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg
945 950 955 960
Ser Ser
<210> 4
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL12p40-T2A-CCL-19
<400> 4
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser
325 330 335
Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu
340 345 350
Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro Ala Pro Thr
355 360 365
Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln
370 375 380
Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile
385 390 395 400
Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly
405 410 415
Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile
420 425 430
Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser
435 440 445
<210> 5
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IL12p40
<400> 5
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser
325
<210> 6
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CCL19
<400> 6
Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro
1 5 10 15
Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser
20 25 30
Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr
35 40 45
Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr
50 55 60
Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu
65 70 75 80
Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg
85 90 95
Ser Ser
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8α信号肽
<400> 7
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 8
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8α铰链
<400> 8
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 9
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8α跨膜结构域
<400> 9
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 10
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB（CD137）胞内结构域
<400> 10
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 11
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ζ（CD3z）胞内结构域
<400> 11
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 12
<211> 2886
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H93M CAR核酸
<400> 12
atggccctgc ctgtgaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgcccgc 60
cctgacattg tgatgaccca gtctcccctg tccctgccag tgacccctgg agagccagcc 120
tccatctctt gcaggagctc ccagaccatc gtgcacagca acggcaatac atacctggag 180
tggtatctgc agaagcccgg ccagtcccct cagctgctga tctacaaggt gtctaacagg 240
ttcagcggag tgccagaccg ctttagcgga tccggatctg gcaccgattt cacactgaag 300
atctctagag tggaggccga ggacgtgggc gtgtactatt gcttccaggt gagccacgtg 360
ccatatacct ttggcggcgg cacaaagctg gagatcaagg gcagcacctc cggatctggc 420
aagccaggat ccggagaggg atctacaaag ggacaggtgc agctggtgca gagcggagca 480
gaggtgaaga agcctggagc cagcgtgaag gtgtcctgta aggcctctgg ctacaccttc 540
acagactatg agatgcactg ggtgcggcag gcaaccggac agggcctgga gtggatggga 600
ggaatcgacc cagagacagg caacacagcc tactcccaga agtttaaggg ccgggtgacc 660
atgacaagaa ataccagcat ctccacagcc tatatggagc tgtctagcct gagatctgag 720
gatacagccg tgtactattg tgctcgctac tattcctttg cctactgggg acaggggaca 780
ctggtcaccg tctcatcaac tagtaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960
gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg caaacggggc 1020
agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1080
gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 1140
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 1200
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1260
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1320
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1380
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1440
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgcgttaacg gcagcggagc tacaaacttc 1500
agtcttctaa aacaggctgg tgacgtggag gagaatcccg gccctatgtg ccatcagcag 1560
ctggtcattt cttggttctc tctggtgttt ctggctagtc ctctggtcgc tatttgggaa 1620
ctgaaaaaag atgtgtacgt ggtggagctg gactggtatc cagatgcacc aggagagatg 1680
gtggtgctga cctgcgacac acccgaggag gatggcatca cctggacact ggaccagagc 1740
tccgaggtgc tgggaagcgg caagaccctg acaatccagg tgaaggagtt cggcgatgcc 1800
ggccagtaca catgtcacaa gggcggcgag gtgctgtctc acagcctgct gctgctgcac 1860
aagaaggagg acggcatctg gtccacagac atcctgaagg atcagaagga gcctaagaac 1920
aagaccttcc tgcggtgcga ggccaagaat tattctggcc ggttcacctg ttggtggctg 1980
accacaatct ctaccgacct gaccttcagc gtgaagtcta gccggggctc ctctgatcca 2040
cagggagtga catgcggagc agccaccctg agcgccgagc gggtgagagg cgacaacaag 2100
gagtacgagt atagcgtgga gtgccaggag gattccgcct gtccagcagc agaggagtcc 2160
ctgcctatcg aagtgatggt ggacgccgtg cacaagctga agtacgagaa ttatacaagc 2220
tccttcttta tcagggacat catcaagcca gatcccccta agaacctgca gctgaagccc 2280
ctgaagaatt cccgccaggt ggaggtgtct tgggagtacc ctgatacctg gtccacacca 2340
cacagctatt tctccctgac cttttgcgtg caggtgcagg gcaagtctaa gagggagaag 2400
aaggaccgcg tgttcaccga taagacaagc gccaccgtga tctgtcggaa gaacgcctcc 2460
atctctgtgc gggctcagga ccgatattac tcatcatcat ggagtgaatg ggcctcagtg 2520
ccttgctcag gcagtggaga gggcagagga agtctgctaa catgcggtga cgtcgaggag 2580
aatcctggcc caatggctct gctgctggca ctgagtctgc tggtcctgtg gacatcacct 2640
gcacctaccc tgagtggaac taatgacgct gaagattgtt gcctgagcgt gacccagaag 2700
ccaatccccg gctacatcgt gaggaacttc cactatctgc tgatcaagga cggatgcagg 2760
gtgcctgcag tggtgtttac cacactgcgg ggcagacagc tgtgcgcacc acctgatcag 2820
ccctgggtcg agagaattat tcagagactg cagcgcacct cagctaagat gaaacgccgc 2880
tcaagt 2886
<210> 13
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 13
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 14
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 14
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 15
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EcoRI限制性位点
<400> 15
gaattc 6
<210> 16
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SpeI限制性位点
<400> 16
actagt 6
<210> 17
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HpaI限制性位点
<400> 17
gttaac 6
<210> 18
<211> 998
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H93P CAR氨基酸
<400> 18
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
35 40 45
Thr Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Phe Gln Val Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser
130 135 140
Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
145 150 155 160
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
165 170 175
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr
180 185 190
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asn
195 200 205
Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn
210 215 220
Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
225 230 235 240
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
275 280 285
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
290 295 300
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
305 310 315 320
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
325 330 335
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
340 345 350
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
355 360 365
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
370 375 380
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
385 390 395 400
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
405 410 415
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
420 425 430
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
435 440 445
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
450 455 460
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
465 470 475 480
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Val Asn Gly Ser Gly
485 490 495
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
500 505 510
Pro Gly Pro Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu
515 520 525
Val Phe Leu Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp
530 535 540
Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met
545 550 555 560
Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr
565 570 575
Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile
580 585 590
Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly
595 600 605
Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp
610 615 620
Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn
625 630 635 640
Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr
645 650 655
Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys
660 665 670
Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala
675 680 685
Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr
690 695 700
Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser
705 710 715 720
Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu
725 730 735
Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro
740 745 750
Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu
755 760 765
Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe
770 775 780
Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys
785 790 795 800
Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg
805 810 815
Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser
820 825 830
Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Ser Gly Glu Gly
835 840 845
Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
850 855 860
Met Ala Gln Ser Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Ala Phe
865 870 875 880
Gly Ile Pro Arg Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys
885 890 895
Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr
900 905 910
Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe
915 920 925
Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu
930 935 940
Leu Trp Val Gln Gln Leu Met Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro
945 950 955 960
Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr
965 970 975
Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser
980 985 990
Gln Thr Pro Lys Gly Pro
995
<210> 19
<211> 2994
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H93P CAR核酸
<400> 19
atggccctgc ctgtgaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgcccgc 60
cctgacattg tgatgaccca gtctcccctg tccctgccag tgacccctgg agagccagcc 120
tccatctctt gcaggagctc ccagaccatc gtgcacagca acggcaatac atacctggag 180
tggtatctgc agaagcccgg ccagtcccct cagctgctga tctacaaggt gtctaacagg 240
ttcagcggag tgccagaccg ctttagcgga tccggatctg gcaccgattt cacactgaag 300
atctctagag tggaggccga ggacgtgggc gtgtactatt gcttccaggt gagccacgtg 360
ccatatacct ttggcggcgg cacaaagctg gagatcaagg gcagcacctc cggatctggc 420
aagccaggat ccggagaggg atctacaaag ggacaggtgc agctggtgca gagcggagca 480
gaggtgaaga agcctggagc cagcgtgaag gtgtcctgta aggcctctgg ctacaccttc 540
acagactatg agatgcactg ggtgcggcag gcaaccggac agggcctgga gtggatggga 600
ggaatcgacc cagagacagg caacacagcc tactcccaga agtttaaggg ccgggtgacc 660
atgacaagaa ataccagcat ctccacagcc tatatggagc tgtctagcct gagatctgag 720
gatacagccg tgtactattg tgctcgctac tattcctttg cctactgggg acaggggaca 780
ctggtcaccg tctcatcaac tagtaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960
gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg caaacggggc 1020
agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1080
gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 1140
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 1200
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1260
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1320
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1380
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1440
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgcgttaacg gcagcggagc tacaaacttc 1500
agtcttctaa aacaggctgg tgacgtggag gagaatcccg gccctatgtg ccatcagcag 1560
ctggtcattt cttggttctc tctggtgttt ctggctagtc ctctggtcgc tatttgggaa 1620
ctgaaaaaag atgtgtacgt ggtggagctg gactggtatc cagatgcacc aggagagatg 1680
gtggtgctga cctgcgacac acccgaggag gatggcatca cctggacact ggaccagagc 1740
tccgaggtgc tgggaagcgg caagaccctg acaatccagg tgaaggagtt cggcgatgcc 1800
ggccagtaca catgtcacaa gggcggcgag gtgctgtctc acagcctgct gctgctgcac 1860
aagaaggagg acggcatctg gtccacagac atcctgaagg atcagaagga gcctaagaac 1920
aagaccttcc tgcggtgcga ggccaagaat tattctggcc ggttcacctg ttggtggctg 1980
accacaatct ctaccgacct gaccttcagc gtgaagtcta gccggggctc ctctgatcca 2040
cagggagtga catgcggagc agccaccctg agcgccgagc gggtgagagg cgacaacaag 2100
gagtacgagt atagcgtgga gtgccaggag gattccgcct gtccagcagc agaggagtcc 2160
ctgcctatcg aagtgatggt ggacgccgtg cacaagctga agtacgagaa ttatacaagc 2220
tccttcttta tcagggacat catcaagcca gatcccccta agaacctgca gctgaagccc 2280
ctgaagaatt cccgccaggt ggaggtgtct tgggagtacc ctgatacctg gtccacacca 2340
cacagctatt tctccctgac cttttgcgtg caggtgcagg gcaagtctaa gagggagaag 2400
aaggaccgcg tgttcaccga taagacaagc gccaccgtga tctgtcggaa gaacgcctcc 2460
atctctgtgc gggctcagga ccgatattac tcatcatcat ggagtgaatg ggcctcagtg 2520
ccttgctcag gcagtggaga gggcagagga agtctgctaa catgcggtga cgtcgaggag 2580
aatcctggcc caatggccca gagccttgct ctctctctgc tcattctggt gctggcattc 2640
ggcatcccac gtacccaggg ctccgacggc ggcgcgcagg actgttgcct gaagtactcc 2700
cagcgcaaga tccccgccaa ggtggtccgc agctacagga agcaggagcc aagtctaggg 2760
tgctctatcc ctgccatcct gtttctgccc cgcaagcgca gccaggccga gctgtgcgcc 2820
gacccgaagg agctttgggt gcagcagctg atgcaacact tggataaaac tccgagccct 2880
cagaagcctg ctcaggggtg ccgaaaggac cgcggagctt ccaagaccgg caaaaagggt 2940
aagggctcca aaggttgtaa acgtaccgaa cggtcacaga cgcccaaggg accc 2994
<210> 20
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL12p40-T2A-CCL21氨基酸
<400> 20
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser
325 330 335
Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Gln
340 345 350
Ser Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Ala Phe Gly Ile Pro
355 360 365
Arg Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys Leu Lys Tyr
370 375 380
Ser Gln Arg Lys Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr Arg Lys Gln
385 390 395 400
Glu Pro Ser Leu Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe Leu Pro Arg
405 410 415
Lys Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu Leu Trp Val
420 425 430
Gln Gln Leu Met Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro Gln Lys Pro
435 440 445
Ala Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr Gly Lys Lys
450 455 460
Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser Gln Thr Pro
465 470 475 480
Lys Gly Pro
<210> 21
<211> 1449
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL12p40-T2A-CCL21核酸
<400> 21
atgtgccatc agcagctggt catttcttgg ttctctctgg tgtttctggc tagtcctctg 60
gtcgctattt gggaactgaa aaaagatgtg tacgtggtgg agctggactg gtatccagat 120
gcaccaggag agatggtggt gctgacctgc gacacacccg aggaggatgg catcacctgg 180
acactggacc agagctccga ggtgctggga agcggcaaga ccctgacaat ccaggtgaag 240
gagttcggcg atgccggcca gtacacatgt cacaagggcg gcgaggtgct gtctcacagc 300
ctgctgctgc tgcacaagaa ggaggacggc atctggtcca cagacatcct gaaggatcag 360
aaggagccta agaacaagac cttcctgcgg tgcgaggcca agaattattc tggccggttc 420
acctgttggt ggctgaccac aatctctacc gacctgacct tcagcgtgaa gtctagccgg 480
ggctcctctg atccacaggg agtgacatgc ggagcagcca ccctgagcgc cgagcgggtg 540
agaggcgaca acaaggagta cgagtatagc gtggagtgcc aggaggattc cgcctgtcca 600
gcagcagagg agtccctgcc tatcgaagtg atggtggacg ccgtgcacaa gctgaagtac 660
gagaattata caagctcctt ctttatcagg gacatcatca agccagatcc ccctaagaac 720
ctgcagctga agcccctgaa gaattcccgc caggtggagg tgtcttggga gtaccctgat 780
acctggtcca caccacacag ctatttctcc ctgacctttt gcgtgcaggt gcagggcaag 840
tctaagaggg agaagaagga ccgcgtgttc accgataaga caagcgccac cgtgatctgt 900
cggaagaacg cctccatctc tgtgcgggct caggaccgat attactcatc atcatggagt 960
gaatgggcct cagtgccttg ctcaggcagt ggagagggca gaggaagtct gctaacatgc 1020
ggtgacgtcg aggagaatcc tggcccaatg gcccagagcc ttgctctctc tctgctcatt 1080
ctggtgctgg cattcggcat cccacgtacc cagggctccg acggcggcgc gcaggactgt 1140
tgcctgaagt actcccagcg caagatcccc gccaaggtgg tccgcagcta caggaagcag 1200
gagccaagtc tagggtgctc tatccctgcc atcctgtttc tgccccgcaa gcgcagccag 1260
gccgagctgt gcgccgaccc gaaggagctt tgggtgcagc agctgatgca acacttggat 1320
aaaactccga gccctcagaa gcctgctcag gggtgccgaa aggaccgcgg agcttccaag 1380
accggcaaaa agggtaaggg ctccaaaggt tgtaaacgta ccgaacggtc acagacgccc 1440
aagggaccc 1449
<210> 22
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CCL21
<400> 22
Met Ala Gln Ser Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Ala Phe
1 5 10 15
Gly Ile Pro Arg Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys
20 25 30
Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr
35 40 45
Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe
50 55 60
Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu
65 70 75 80
Leu Trp Val Gln Gln Leu Met Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro
85 90 95
Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr
100 105 110
Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser
115 120 125
Gln Thr Pro Lys Gly Pro
130
<210> 23
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MluI限制性位点
<400> 23
acgcgt 6
<210> 24
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IL-7?
<400> 24
Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys
20 25 30
Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu
35 40 45
Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe
50 55 60
Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe
65 70 75 80
Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser
85 90 95
Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr
100 105 110
Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala
115 120 125
Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu
130 135 140
Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu
145 150 155 160
Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu
165 170 175
His
<210> 25
<211> 527
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL12p40-P2A-IL-7氨基酸
<400> 25
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser
325 330 335
Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Phe
340 345 350
His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile Leu Val
355 360 365
Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly
370 375 380
Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp
385 390 395 400
Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe
405 410 415
Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe
420 425 430
Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly
435 440 445
Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu
450 455 460
Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly
465 470 475 480
Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu
485 490 495
Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu
500 505 510
Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
515 520 525
<210> 26
<211> 1581
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL12p40-P2A-IL7核酸
<400> 26
atgtgccacc agcagctggt gatcagttgg ttctctctgg tgttcctggc ctcgccactt 60
gttgccatat gggaactcaa aaaggacgtg tacgtggtgg agctggactg gtaccccgac 120
gctcccgggg agatggtggt cctgacctgt gatactccgg aggaagatgg catcacctgg 180
acattggatc agagctccga ggtactgggc tccggcaaaa ctctgaccat ccaggtgaag 240
gagttcggtg atgctggaca atacacctgc cataagggcg gcgaggttct tagccattct 300
ctgctgctcc tccacaagaa ggaagacggt atttggtcga ccgacatcct gaaggaccag 360
aaggagccca aaaacaagac ttttttgcgc tgcgaggcca aaaactactc cggtcgcttc 420
acatgctggt ggctaacgac catctcaacc gacctgacct tctctgtcaa gagctctcgt 480
ggctccagcg atcctcaggg cgtcacctgc ggggcagcca ccctgagcgc agagcgcgtg 540
agaggggaca acaaggagta tgagtactcg gtggagtgtc aggaggactc ggcctgccca 600
gcggccgagg agagcctgcc cattgaggtg atggtagacg ccgtccacaa gctgaagtac 660
gagaactaca cctcctcctt ctttatccgg gacatcatca agcccgaccc gcccaagaac 720
ctgcagctca agcctttgaa gaattcccgc caggttgaag tcagttggga gtaccctgac 780
acctggtcta ctccgcacag ctatttctcg ctgaccttct gcgtgcaggt ccagggaaag 840
tccaagcgcg agaagaaaga cagggtgttc accgacaaga cctccgccac cgtgatttgc 900
cgaaaaaacg cctccatctc cgtgcgtgcg caggaccgct actacagttc ctcttggtcc 960
gagtgggctt ccgtgccttg ttcaggcagc ggagctacaa acttcagtct tctaaaacag 1020
gctggtgacg tggaggagaa tcccggccct atgtttcatg tctccttccg ctacatcttc 1080
gggctccctc ccctgatcct cgttctgctg ccagtggcat ctagcgattg tgacattgag 1140
ggcaaagacg gcaagcaata cgagagcgtg ctgatggtgt cgattgacca gctgttggat 1200
tctatgaaag agatcggctc caactgcctg aacaacgagt tcaacttctt caagcgccac 1260
atctgtgacg ccaacaagga aggtatgttt ctgttccggg ccgcgcgcaa gctgaggcag 1320
ttcctgaaaa tgaattccac cggtgatttc gacttgcacc tgcttaaggt gtccgagggc 1380
acgaccatcc ttcttaactg cactggacag gtcaagggcc gtaagcccgc cgctctaggg 1440
gaggctcagc cgacaaagtc gctggaggag aacaagtcac tcaaagaaca gaagaagctc 1500
aacgacctgt gctttttgaa gcgcctgctg caggagatca agacctgttg gaataagatc 1560
ctgatgggca ccaaggagca c 1581
<210> 27
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MusH93 CAR氨基酸
<400> 27
Met Ala Ser Pro Leu Thr Arg Phe Leu Ser Leu Asn Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Glu Ser Ile Ile Leu Gly Ser Gly Glu Ala Lys Pro Gln Ala Asp
20 25 30
Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu
35 40 45
Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser Asn
50 55 60
Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
65 70 75 80
Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp
85 90 95
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
100 105 110
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Val Ser
115 120 125
His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
130 135 140
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
145 150 155 160
Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
165 170 175
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp
180 185 190
Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp
195 200 205
Met Gly Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asn Thr Ala Tyr Ser Gln Lys
210 215 220
Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala
225 230 235 240
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
245 250 255
Cys Ala Arg Tyr Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
260 265 270
Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro
275 280 285
Val His Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg
290 295 300
Pro Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
305 310 315 320
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser
325 330 335
Leu Ile Ile Thr Leu Ile Cys Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys
340 345 350
Phe Pro His Ile Phe Lys Gln Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala
355 360 365
Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu
385 390 395 400
Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
405 410 415
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg
420 425 430
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro Gln Glu
435 440 445
Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
450 455 460
Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
465 470 475 480
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
485 490 495
His Met Gln Thr Leu Ala Pro Arg
500
<210> 28
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠CAR主链（小鼠CD8α铰链-小鼠CD8α
跨膜结构域-小鼠4-1BB（CD137）胞内结构域-小鼠
CD3ζ胞内）
<400> 28
Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro Val His Pro Thr
1 5 10 15
Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg Pro Arg Gly Ser
20 25 30
Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
35 40 45
Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu Ile Ile Thr
50 55 60
Leu Ile Cys Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile
65 70 75 80
Phe Lys Gln Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp
85 90 95
Ala Cys Ser Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Tyr Glu Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn
115 120 125
Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
130 135 140
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met
145 150 155 160
Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn
165 170 175
Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr
180 185 190
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
195 200 205
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Thr
210 215 220
Leu Ala Pro Arg
225
<210> 29
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠IL12p40
<400> 29
Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln
50 55 60
Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr
85 90 95
Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys
115 120 125
Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln
130 135 140
Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro
145 150 155 160
Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys
165 170 175
Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln
180 185 190
Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu
195 200 205
Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser
210 215 220
Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln
225 230 235 240
Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro
245 250 255
Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val
260 265 270
Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys
275 280 285
Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln
290 295 300
Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser
325 330 335
<210> 30
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠CCL-19
<400> 30
Met Ala Pro Arg Val Thr Pro Leu Leu Ala Phe Ser Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Trp Thr Phe Pro Ala Pro Thr Leu Gly Gly Ala Asn Asp Ala Glu Asp
20 25 30
Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Arg Pro Ile Pro Gly Asn Ile Val Lys
35 40 45
Ala Phe Arg Tyr Leu Leu Asn Glu Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val
50 55 60
Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Tyr Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln
65 70 75 80
Pro Trp Val Asp Arg Ile Ile Arg Arg Leu Lys Lys Ser Ser Ala Lys
85 90 95
Asn Lys Gly Asn Ser Thr Arg Arg Ser Pro Val Ser
100 105
<210> 31
<211> 994
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠H93M CAR氨基酸
<400> 31
Met Ala Ser Pro Leu Thr Arg Phe Leu Ser Leu Asn Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Glu Ser Ile Ile Leu Gly Ser Gly Glu Ala Lys Pro Gln Ala Asp
20 25 30
Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu
35 40 45
Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser Asn
50 55 60
Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
65 70 75 80
Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp
85 90 95
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
100 105 110
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Val Ser
115 120 125
His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
130 135 140
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
145 150 155 160
Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
165 170 175
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp
180 185 190
Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp
195 200 205
Met Gly Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asn Thr Ala Tyr Ser Gln Lys
210 215 220
Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala
225 230 235 240
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
245 250 255
Cys Ala Arg Tyr Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
260 265 270
Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro
275 280 285
Ser Pro Val His Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp
290 295 300
Cys Arg Pro Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys
305 310 315 320
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu
325 330 335
Leu Ser Leu Ile Ile Thr Leu Ile Cys Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg
340 345 350
Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly
355 360 365
Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu
370 375 380
Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser
385 390 395 400
Ala Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
405 410 415
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg
420 425 430
Ala Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro
435 440 445
Gln Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
450 455 460
Tyr Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
465 470 475 480
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
485 490 495
Ala Leu His Met Gln Thr Leu Ala Pro Arg Val Asn Gly Ser Gly Ala
500 505 510
Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
515 520 525
Gly Pro Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val
530 535 540
Leu Leu Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val
545 550 555 560
Tyr Val Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val
565 570 575
Asn Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser
580 585 590
Asp Gln Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr
595 600 605
Val Lys Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly
610 615 620
Glu Thr Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly
625 630 635 640
Ile Trp Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu
645 650 655
Lys Cys Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu
660 665 670
Val Gln Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser
675 680 685
Ser Pro Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala
690 695 700
Glu Lys Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser
705 710 715 720
Cys Gln Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile
725 730 735
Glu Leu Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser
740 745 750
Thr Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
755 760 765
Leu Gln Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu
770 775 780
Tyr Pro Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe
785 790 795 800
Phe Val Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu
805 810 815
Gly Cys Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu
820 825 830
Val Gln Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr
835 840 845
Tyr Asn Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg
850 855 860
Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val
865 870 875 880
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Pro Arg Val Thr Pro Leu Leu Ala
885 890 895
Phe Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Phe Pro Ala Pro Thr Leu Gly Gly
900 905 910
Ala Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Arg Pro Ile
915 920 925
Pro Gly Asn Ile Val Lys Ala Phe Arg Tyr Leu Leu Asn Glu Asp Gly
930 935 940
Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Tyr Gln Leu
945 950 955 960
Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Asp Arg Ile Ile Arg Arg Leu
965 970 975
Lys Lys Ser Ser Ala Lys Asn Lys Gly Asn Ser Thr Arg Arg Ser Pro
980 985 990
Val Ser
<210> 32
<211> 2982
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠H93M CAR核酸
<400> 32
atggcaagtc ctctgactcg gtttctgtct ctgaatctgc tcctcctcgg tgaatccatt 60
atcctcggtt ccggtgaagc taagcctcag gccgacatcg tgatgacaca gagcccactg 120
tccctgccag tgaccccagg agagcctgct agcatctcct gtaggagctc ccagacaatc 180
gtgcacagca acggcaacac ctacctggag tggtacctgc agaagcctgg acagtcccca 240
cagctgctga tctacaaggt gtctaacagg tttagcggcg tgcccgacag attctctggc 300
agcggatccg gcacagactt caccctgaag atcagcagag tggaggccga ggatgtggga 360
gtgtactact gttttcaggt gagccacgtg ccatacacat tcggcggagg caccaagctg 420
gagatcaagg gctctacaag cggatccggc aagccaggat ccggagaggg atctaccaag 480
ggacaggtgc agctggtgca gtccggagct gaggtgaaga agccaggagc tagcgtgaag 540
gtgtcctgca aggcctctgg ctacaccttc accgactacg agatgcactg ggtgcggcag 600
gctacaggac agggactgga gtggatggga ggcatcgatc ctgagacagg caacaccgcc 660
tacagccaga agttcaaggg aagggtgaca atgaccagaa acacatctat cagcaccgct 720
tacatggagc tgtctagcct gcggtccgag gacaccgccg tgtactactg cgctcgctac 780
tactcttttg cctactgggg ccagggaaca ctggtgaccg tgtcctctac atccaccaca 840
accaagccag tgctgaggac cccaagccct gtgcacccaa caggcacctc ccagccacag 900
aggcccgagg attgtaggcc cagaggatct gtgaagggca caggactgga cttcgcctgt 960
gatatctaca tctgggctcc tctggctgga atctgcgtgg ctctgctgct gtctctgatc 1020
atcaccctga tctgcagcgt gctgaagtgg atccggaaga agttccccca catctttaag 1080
cagcctttca agaagacaac cggagctgct caggaggagg acgcctgctc ctgtaggtgc 1140
cctcaggaag aagagggagg aggaggagga tacgagctga gggctaagtt ctcccgctct 1200
gctgagacag ccgctaacct gcaggatcca aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc 1260
aggagagagg agtacgacgt gctggagaag aagcgggctc gcgatcctga gatgggagga 1320
aagcagcagc ggcgcaggaa cccacaggag ggcgtgtaca acgctctgca gaaggacaag 1380
atggccgagg cttacagcga gatcggcacc aagggagaga gacggcgcgg caagggacac 1440
gatggcctgt accagggact ctcaaccgct actaaggaca cctacgatgc tctccatatg 1500
cagaccctcg caccccgcgt taacggcagc ggagctacaa acttcagtct tctaaaacag 1560
gctggtgacg tggaggagaa tcccggccct atgtgccctc agaaactgac tatatcatgg 1620
tttgccattg tgctgctggt aagtcctctc atggccatgt gggaattgga gaaagatgtg 1680
tacgtggtgg aggtggactg gacccctgac gcaccaggag aaacagtgaa cctgacgtgt 1740
gatacgccag aagaggatga cattacttgg acatcagatc aaagacacgg tgtcataggg 1800
tcaggcaaaa ctcttaccat cacagtcaag gagttcctag atgctggcca gtatacctgc 1860
cataaaggag gggaaaccct gtcccactcg catctgctcc tccacaagaa ggaaaacggc 1920
atctggagca cagagatcct gaagaatttt aagaataaga ccttcttgaa atgtgaggcc 1980
cccaactaca gcgggaggtt cacctgttcc tggctggtgc aacggaacat ggacctgaag 2040
ttcaatatta aatcttcatc ttcctccccg gacagtcgcg cagttacttg tggcatggct 2100
tctttatcgg cagagaaagt cacccttgac cagcgcgact atgagaagta ttctgtttcc 2160
tgccaggagg acgtgacgtg ccccacagct gaagagactt tgcctattga gttagccctg 2220
gaggccagac aacagaacaa atatgaaaat tattccactt cattcttcat ccgtgatatc 2280
atcaagcccg atccacccaa gaatcttcag atgaagcctc taaagaacag ccaggtggag 2340
gttagctggg agtacccaga tagctggtct accccacatt cctactttag tttaaagttt 2400
tttgtaagaa tccagaggaa aaaagaaaag atgaaagaga ctgaagaagg ttgcaaccag 2460
aagggagcgt ttctcgttga gaagacaagc acagaagtcc agtgcaaagg tggaaatgta 2520
tgtgtgcaag ctcaggacag gtactacaac agtagctgtt ctaagtgggc atgtgtcccc 2580
tgccgagtgc ggagtggcag tggagagggc agaggaagtc tgctaacatg cggtgacgtc 2640
gaggagaatc ctggcccaat ggctcctaga gtgacacctt tgctggcctt ttctcttcta 2700
gtgttgtgga cgtttcctgc acccaccctg ggtggagcga atgatgcaga ggactgctgc 2760
ctcagtgtca cccaaaggcc cataccaggg aacattgtga aggccttccg ctatcttctc 2820
aatgaagatg gatgtcgggt tcctgctgtg gtcttcacta ctttacgcgg ctaccagctg 2880
tgtgctcctc cagaccagcc ctgggtggac cgtatcatcc gaaggctgaa gaaaagcagc 2940
gccaagaaca aaggcaactc aacaagaaga tccccagttt cc 2982
<210> 33
<211> 865
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠H93IL12p40 CAR氨基酸
<400> 33
Met Ala Ser Pro Leu Thr Arg Phe Leu Ser Leu Asn Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Glu Ser Ile Ile Leu Gly Ser Gly Glu Ala Lys Pro Gln Ala Asp
20 25 30
Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu
35 40 45
Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser Asn
50 55 60
Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
65 70 75 80
Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp
85 90 95
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
100 105 110
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Val Ser
115 120 125
His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
130 135 140
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
145 150 155 160
Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
165 170 175
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp
180 185 190
Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp
195 200 205
Met Gly Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asn Thr Ala Tyr Ser Gln Lys
210 215 220
Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala
225 230 235 240
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
245 250 255
Cys Ala Arg Tyr Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
260 265 270
Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro
275 280 285
Ser Pro Val His Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp
290 295 300
Cys Arg Pro Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys
305 310 315 320
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu
325 330 335
Leu Ser Leu Ile Ile Thr Leu Ile Cys Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg
340 345 350
Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly
355 360 365
Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu
370 375 380
Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser
385 390 395 400
Ala Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
405 410 415
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg
420 425 430
Ala Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro
435 440 445
Gln Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
450 455 460
Tyr Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
465 470 475 480
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
485 490 495
Ala Leu His Met Gln Thr Leu Ala Pro Arg Val Asn Gly Ser Gly Ala
500 505 510
Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
515 520 525
Gly Pro Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val
530 535 540
Leu Leu Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val
545 550 555 560
Tyr Val Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val
565 570 575
Asn Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser
580 585 590
Asp Gln Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr
595 600 605
Val Lys Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly
610 615 620
Glu Thr Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly
625 630 635 640
Ile Trp Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu
645 650 655
Lys Cys Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu
660 665 670
Val Gln Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser
675 680 685
Ser Pro Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala
690 695 700
Glu Lys Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser
705 710 715 720
Cys Gln Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile
725 730 735
Glu Leu Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser
740 745 750
Thr Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
755 760 765
Leu Gln Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu
770 775 780
Tyr Pro Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe
785 790 795 800
Phe Val Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu
805 810 815
Gly Cys Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu
820 825 830
Val Gln Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr
835 840 845
Tyr Asn Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg
850 855 860
Ser
865
<210> 34
<211> 638
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠H93CCL19 CAR氨基酸
<400> 34
Met Ala Ser Pro Leu Thr Arg Phe Leu Ser Leu Asn Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Glu Ser Ile Ile Leu Gly Ser Gly Glu Ala Lys Pro Gln Ala Asp
20 25 30
Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu
35 40 45
Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser Asn
50 55 60
Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
65 70 75 80
Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp
85 90 95
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
100 105 110
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Val Ser
115 120 125
His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
130 135 140
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
145 150 155 160
Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
165 170 175
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp
180 185 190
Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp
195 200 205
Met Gly Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asn Thr Ala Tyr Ser Gln Lys
210 215 220
Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala
225 230 235 240
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
245 250 255
Cys Ala Arg Tyr Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
260 265 270
Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro
275 280 285
Ser Pro Val His Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp
290 295 300
Cys Arg Pro Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys
305 310 315 320
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu
325 330 335
Leu Ser Leu Ile Ile Thr Leu Ile Cys Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg
340 345 350
Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly
355 360 365
Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu
370 375 380
Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser
385 390 395 400
Ala Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
405 410 415
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg
420 425 430
Ala Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro
435 440 445
Gln Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
450 455 460
Tyr Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
465 470 475 480
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
485 490 495
Ala Leu His Met Gln Thr Leu Ala Pro Arg Val Asn Gly Ser Gly Ala
500 505 510
Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
515 520 525
Gly Pro Met Ala Pro Arg Val Thr Pro Leu Leu Ala Phe Ser Leu Leu
530 535 540
Val Leu Trp Thr Phe Pro Ala Pro Thr Leu Gly Gly Ala Asn Asp Ala
545 550 555 560
Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Arg Pro Ile Pro Gly Asn Ile
565 570 575
Val Lys Ala Phe Arg Tyr Leu Leu Asn Glu Asp Gly Cys Arg Val Pro
580 585 590
Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Tyr Gln Leu Cys Ala Pro Pro
595 600 605
Asp Gln Pro Trp Val Asp Arg Ile Ile Arg Arg Leu Lys Lys Ser Ser
610 615 620
Ala Lys Asn Lys Gly Asn Ser Thr Arg Arg Ser Pro Val Ser
625 630 635
<210> 35
<211> 379
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mus261 CAR氨基酸
<400> 35
Met Ala Ser Pro Leu Thr Arg Phe Leu Ser Leu Asn Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Glu Ser Ile Ile Leu Gly Ser Gly Glu Ala Lys Pro Gln Ala Gln
20 25 30
Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly Ser
35 40 45
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Arg Ser Ser Val Cys Met
50 55 60
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val Ala Val
65 70 75 80
Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ile Asp Ser Val Lys Gly Arg
85 90 95
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Leu Ser Leu Gln Met
100 105 110
Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Ser Cys Ala Ala Gly
115 120 125
Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
130 135 140
Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr
145 150 155 160
Pro Ser Pro Val His Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu
165 170 175
Asp Cys Arg Pro Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala
180 185 190
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu
195 200 205
Leu Leu Ser Leu Ile Ile Thr Leu Ile Cys Ser Val Leu Lys Trp Ile
210 215 220
Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln Pro Phe Lys Lys Thr Thr
225 230 235 240
Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser Cys Arg Cys Pro Gln Glu
245 250 255
Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg
260 265 270
Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu Tyr Asn
275 280 285
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys
290 295 300
Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg Arg Asn
305 310 315 320
Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
325 330 335
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
340 345 350
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
355 360 365
Asp Ala Leu His Met Gln Thr Leu Ala Pro Arg
370 375
<210> 36
<211> 287
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠IL7-F2A-小鼠CCL19氨基酸
<400> 36
Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Ile Pro Pro Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Pro Val Thr Ser Ser Glu Cys His Ile Lys Asp Lys
20 25 30
Glu Gly Lys Ala Tyr Glu Ser Val Leu Met Ile Ser Ile Asp Glu Leu
35 40 45
Asp Lys Met Thr Gly Thr Asp Ser Asn Cys Pro Asn Asn Glu Pro Asn
50 55 60
Phe Phe Arg Lys His Val Cys Asp Asp Thr Lys Glu Ala Ala Phe Leu
65 70 75 80
Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Lys Gln Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser
85 90 95
Glu Glu Phe Asn Val His Leu Leu Thr Val Ser Gln Gly Thr Gln Thr
100 105 110
Leu Val Asn Cys Thr Ser Lys Glu Glu Lys Asn Val Lys Glu Gln Lys
115 120 125
Lys Asn Asp Ala Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Arg Glu Ile Lys Thr
130 135 140
Cys Trp Asn Lys Ile Leu Lys Gly Ser Ile Gly Ser Gly Val Lys Gln
145 150 155 160
Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
165 170 175
Pro Gly Pro Met Ala Pro Arg Val Thr Pro Leu Leu Ala Phe Ser Leu
180 185 190
Leu Val Leu Trp Thr Phe Pro Ala Pro Thr Leu Gly Gly Ala Asn Asp
195 200 205
Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Arg Pro Ile Pro Gly Asn
210 215 220
Ile Val Lys Ala Phe Arg Tyr Leu Leu Asn Glu Asp Gly Cys Arg Val
225 230 235 240
Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Tyr Gln Leu Cys Ala Pro
245 250 255
Pro Asp Gln Pro Trp Val Asp Arg Ile Ile Arg Arg Leu Lys Lys Ser
260 265 270
Ser Ala Lys Asn Lys Gly Asn Ser Thr Arg Arg Ser Pro Val Ser
275 280 285
<210> 37
<211> 385
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MB12氨基酸（IL12p40-CD8α铰链-CD8α跨膜
结构域-胞内CD8α胞内结构域）
<400> 37
Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr
1 5 10 15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
35 40 45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly
50 55 60
Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu
65 70 75 80
Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys
85 90 95
Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys
100 105 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr
115 120 125
Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln
130 135 140
Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly
145 150 155 160
Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala
165 170 175
Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala
180 185 190
Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg
195 200 205
Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu
210 215 220
Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp
225 230 235 240
Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln
245 250 255
Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr
260 265 270
Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala
275 280 285
Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro
290 295 300
Cys Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
305 310 315 320
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
325 330 335
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
340 345 350
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
355 360 365
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg
370 375 380
Arg
385
<210> 38
<211> 1037
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H93M-MB12 CAR氨基酸
<400> 38
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
35 40 45
Thr Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Phe Gln Val Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser
130 135 140
Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
145 150 155 160
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
165 170 175
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr
180 185 190
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asn
195 200 205
Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn
210 215 220
Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
225 230 235 240
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
275 280 285
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
290 295 300
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
305 310 315 320
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
325 330 335
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
340 345 350
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
355 360 365
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
370 375 380
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
385 390 395 400
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
405 410 415
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
420 425 430
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
435 440 445
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
450 455 460
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465 470 475 480
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Val Asn Gly Ser Gly
485 490 495
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
500 505 510
Pro Gly Pro Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala
515 520 525
Thr Arg Val His Ser Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val
530 535 540
Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr
545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu
595 600 605
Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser
610 615 620
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625 630 635 640
Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu
645 650 655
Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly
660 665 670
Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala
675 680 685
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Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu
740 745 750
Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu
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Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe
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Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser
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Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
850 855 860
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
865 870 875 880
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
885 890 895
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Leu Tyr Cys Asn
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915 920 925
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945 950 955 960
Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro
965 970 975
Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp
980 985 990
Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln
995 1000 1005
Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln
1010 1015 1020
Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser
1025 1030 1035
<210> 39
<211> 3111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H93M-MB12 CAR核酸
<400> 39
atggccctgc ctgtgaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgcccgc 60
cctgacattg tgatgaccca gtctcccctg tccctgccag tgacccctgg agagccagcc 120
tccatctctt gcaggagctc ccagaccatc gtgcacagca acggcaatac atacctggag 180
tggtatctgc agaagcccgg ccagtcccct cagctgctga tctacaaggt gtctaacagg 240
ttcagcggag tgccagaccg ctttagcgga tccggatctg gcaccgattt cacactgaag 300
atctctagag tggaggccga ggacgtgggc gtgtactatt gcttccaggt gagccacgtg 360
ccatatacct ttggcggcgg cacaaagctg gagatcaagg gcagcacctc cggatctggc 420
aagccaggat ccggagaggg atctacaaag ggacaggtgc agctggtgca gagcggagca 480
gaggtgaaga agcctggagc cagcgtgaag gtgtcctgta aggcctctgg ctacaccttc 540
acagactatg agatgcactg ggtgcggcag gcaaccggac agggcctgga gtggatggga 600
ggaatcgacc cagagacagg caacacagcc tactcccaga agtttaaggg ccgggtgacc 660
atgacaagaa ataccagcat ctccacagcc tatatggagc tgtctagcct gagatctgag 720
gatacagccg tgtactattg tgctcgctac tattcctttg cctactgggg acaggggaca 780
ctggtcaccg tctcatcaac tagtaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960
gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg caaacggggc 1020
agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1080
gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 1140
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 1200
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1260
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1320
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aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1440
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgcgttaacg gttccggcgc caccaacttt 1500
tcactgttaa agcaggccgg tgatgtggag gagaatccag gccctatgga ttggacctgg 1560
atcctcttcc tggtggctgc agccacccgt gtccactcca tctgggagct gaagaaggac 1620
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tgtgacaccc cagaggaaga cggcatcacc tggaccctgg accagagctc cgaggtgctg 1740
ggctccggca aaactttgac tatccaggtc aaggagttcg gtgatgcagg ccaatacaca 1800
tgccataagg gcggcgaggt gctgtctcat tctctgctgc tgctgcacaa gaaggaagat 1860
ggcatttggt cgactgacat cctgaaggac cagaaggagc ccaagaacaa gaccttccta 1920
aggtgtgagg ccaagaacta ttccggtcgc ttcacatgtt ggtggctaac cacaatttcg 1980
accgacctga cctttagcgt aaaatcctct cgtggctcga gcgatcctca gggagtcacc 2040
tgcggggccg ccactctgtc cgccgagcgc gtgcgcgggg acaacaagga gtatgagtac 2100
tccgtggagt gtcaggagga cagcgcctgc ccagcagccg aggagagcct ccccatcgaa 2160
gtgatggtgg acgcggtaca caagctgaag tacgagaact acaccagctc cttcttcatc 2220
cgcgacatca tcaagccgga cccgcccaaa aacctgcagc tgaaaccttt gaaaaactcc 2280
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acgaccccgg cgccgcgccc cccaacccct gcccctacca ttgcctcaca gccgttgtct 2580
ctgcggcccg aggcgtgccg acctgccgcg ggaggcgcgg tgcacacgcg gggtctcgac 2640
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tccttggtga tcactcttta ctgcctgtac tgcaatcacc ggaaccgccg ccgtggcagt 2760
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attattcaga gactgcagcg cacctcagct aagatgaaac gccgctcaag t 3111
<210> 40
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗密蛋白18.2 VHH结构域
<400> 40
Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Arg Ser Ser Val Cys
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val Ala
35 40 45
Val Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ile Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Leu Ser Leu Gln
65 70 75 80
Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Ser Cys Ala Ala
85 90 95
Gly Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 41
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 261 CAR氨基酸
<400> 41
Met Ala Ser Pro Leu Thr Arg Phe Leu Ser Leu Asn Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Glu Ser Ile Ile Leu Gly Ser Gly Glu Ala Lys Pro Gln Ala Gln
20 25 30
Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly Ser
35 40 45
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Arg Ser Ser Val Cys Met
50 55 60
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val Ala Val
65 70 75 80
Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ile Asp Ser Val Lys Gly Arg
85 90 95
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Leu Ser Leu Gln Met
100 105 110
Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Ser Cys Ala Ala Gly
115 120 125
Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
130 135 140
Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
145 150 155 160
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
165 170 175
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
180 185 190
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
195 200 205
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
210 215 220
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
225 230 235 240
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
245 250 255
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
260 265 270
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
275 280 285
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
340 345 350
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
355 360 365
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
370
<210> 42
<211> 845
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 261M CAR氨基酸
<400> 42
Met Ala Ser Pro Leu Thr Arg Phe Leu Ser Leu Asn Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Glu Ser Ile Ile Leu Gly Ser Gly Glu Ala Lys Pro Gln Ala Gln
20 25 30
Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly Ser
35 40 45
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Arg Ser Ser Val Cys Met
50 55 60
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val Ala Val
65 70 75 80
Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ile Asp Ser Val Lys Gly Arg
85 90 95
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Leu Ser Leu Gln Met
100 105 110
Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Ser Cys Ala Ala Gly
115 120 125
Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
130 135 140
Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
145 150 155 160
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
165 170 175
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
180 185 190
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
195 200 205
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
210 215 220
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
225 230 235 240
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
245 250 255
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
260 265 270
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
275 280 285
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
290 295 300
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
305 310 315 320
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
325 330 335
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
340 345 350
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
355 360 365
Gln Ala Leu Pro Pro Arg Val Asn Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser
370 375 380
Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Cys
385 390 395 400
His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu Ala Ser
405 410 415
Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu
420 425 430
Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys
435 440 445
Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser
450 455 460
Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe
465 470 475 480
Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser
485 490 495
His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr
500 505 510
Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg
515 520 525
Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr
530 535 540
Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser
545 550 555 560
Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu
565 570 575
Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln
580 585 590
Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val
595 600 605
Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser
610 615 620
Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln
625 630 635 640
Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr
645 650 655
Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys
660 665 670
Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe
675 680 685
Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile
690 695 700
Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp
705 710 715 720
Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu
725 730 735
Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Leu Leu
740 745 750
Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro Ala Pro Thr Leu Ser
755 760 765
Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro
770 775 780
Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp
785 790 795 800
Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln
805 810 815
Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg
820 825 830
Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser
835 840 845
<210> 43
<211> 2538
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 261M CAR核酸
<400> 43
atggcctcac cgttgacccg ctttctgtcg ctgaacctgc tgctgctggg tgagtcgatt 60
atcctgggga gtggagaagc taagccacag gcacaggtgc agctggagga gtctggagga 120
ggaagcgtgc aagtgggagg ctccctgagg ctgtcttgcg cagcaagcgg atacagatcc 180
agcgtgtgca tgggatggtt tagacaggca ccaggaaagg agagggagag agtggcagtg 240
atcggaaggg acggatccac cacatatatc gattctgtga agggccggtt taccatctcc 300
agagactctg ccaagaacac actgtctctg cagatggaca atctgaagcc tgaagacaca 360
gccatgtaca gctgcgccgc cggcctggga tactgggctt gcgaatacaa ctactggggg 420
cagggcactc aggtgaccgt ctcttctact agtaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 480
acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 540
gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 600
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aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 720
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 780
gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 840
cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 900
cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 960
tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1020
gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1080
gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gcgttaacgg cagcggagct 1140
acaaacttca gtcttctaaa acaggctggt gacgtggagg agaatcccgg ccctatgtgc 1200
caccagcagc tggtgatcag ttggttctct ctggtgttcc tggcctcgcc acttgttgcc 1260
atatgggaac tcaaaaagga cgtgtacgtg gtggagctgg actggtaccc cgacgctccc 1320
ggggagatgg tggtcctgac ctgtgatact ccggaggaag atggcatcac ctggacattg 1380
gatcagagct ccgaggtact gggctccggc aaaactctga ccatccaggt gaaggagttc 1440
ggtgatgctg gacaatacac ctgccataag ggcggcgagg ttcttagcca ttctctgctg 1500
ctcctccaca agaaggaaga cggtatttgg tcgaccgaca tcctgaagga ccagaaggag 1560
cccaaaaaca agactttttt gcgctgcgag gccaaaaact actccggtcg cttcacatgc 1620
tggtggctaa cgaccatctc aaccgacctg accttctctg tcaagagctc tcgtggctcc 1680
agcgatcctc agggcgtcac ctgcggggca gccaccctga gcgcagagcg cgtgagaggg 1740
gacaacaagg agtatgagta ctcggtggag tgtcaggagg actcggcctg cccagcggcc 1800
gaggagagcc tgcccattga ggtgatggta gacgccgtcc acaagctgaa gtacgagaac 1860
tacacctcct ccttctttat ccgggacatc atcaagcccg acccgcccaa gaacctgcag 1920
ctcaagcctt tgaagaattc ccgccaggtt gaagtcagtt gggagtaccc tgacacctgg 1980
tctactccgc acagctattt ctcgctgacc ttctgcgtgc aggtccaggg aaagtccaag 2040
cgcgagaaga aagacagggt gttcaccgac aagacctccg ccaccgtgat ttgccgaaaa 2100
aacgcctcca tctccgtgcg tgcgcaggac cgctactaca gttcctcttg gtccgagtgg 2160
gcttccgtgc cttgttcagg cagtggagag ggcagaggaa gtctgctaac atgcggtgac 2220
gtcgaggaga atcctggccc aatggctctg ctgctggcac tgagtctgct ggtcctgtgg 2280
acatcacctg cacctaccct gagtggaact aatgacgctg aagattgttg cctgagcgtg 2340
acccagaagc caatccccgg ctacatcgtg aggaacttcc actatctgct gatcaaggac 2400
ggatgcaggg tgcctgcagt ggtgtttacc acactgcggg gcagacagct gtgcgcacca 2460
cctgatcagc cctgggtcga gagaattatt cagagactgc agcgcacctc agctaagatg 2520
aaacgccgct caagttaa 2538
<210> 44
<211> 865
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mus261M CAR氨基酸
<400> 44
Met Ala Ser Pro Leu Thr Arg Phe Leu Ser Leu Asn Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Glu Ser Ile Ile Leu Gly Ser Gly Glu Ala Lys Pro Gln Ala Gln
20 25 30
Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly Ser
35 40 45
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Arg Ser Ser Val Cys Met
50 55 60
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val Ala Val
65 70 75 80
Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ile Asp Ser Val Lys Gly Arg
85 90 95
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Leu Ser Leu Gln Met
100 105 110
Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Ser Cys Ala Ala Gly
115 120 125
Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
130 135 140
Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr
145 150 155 160
Pro Ser Pro Val His Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu
165 170 175
Asp Cys Arg Pro Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala
180 185 190
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu
195 200 205
Leu Leu Ser Leu Ile Ile Thr Leu Ile Cys Ser Val Leu Lys Trp Ile
210 215 220
Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln Pro Phe Lys Lys Thr Thr
225 230 235 240
Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser Cys Arg Cys Pro Gln Glu
245 250 255
Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg
260 265 270
Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu Tyr Asn
275 280 285
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys
290 295 300
Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg Arg Asn
305 310 315 320
Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
325 330 335
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
340 345 350
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
355 360 365
Asp Ala Leu His Met Gln Thr Leu Ala Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr
370 375 380
Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly
385 390 395 400
Pro Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu
405 410 415
Leu Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr
420 425 430
Val Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn
435 440 445
Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp
450 455 460
Gln Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val
465 470 475 480
Lys Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu
485 490 495
Thr Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile
500 505 510
Trp Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys
515 520 525
Cys Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val
530 535 540
Gln Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser
545 550 555 560
Pro Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu
565 570 575
Lys Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys
580 585 590
Gln Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu
595 600 605
Leu Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr
610 615 620
Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu
625 630 635 640
Gln Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr
645 650 655
Pro Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe
660 665 670
Val Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly
675 680 685
Cys Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val
690 695 700
Gln Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr
705 710 715 720
Asn Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser
725 730 735
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
740 745 750
Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Pro Arg Val Thr Pro Leu Leu Ala Phe
755 760 765
Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Phe Pro Ala Pro Thr Leu Gly Gly Ala
770 775 780
Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Arg Pro Ile Pro
785 790 795 800
Gly Asn Ile Val Lys Ala Phe Arg Tyr Leu Leu Asn Glu Asp Gly Cys
805 810 815
Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Tyr Gln Leu Cys
820 825 830
Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Asp Arg Ile Ile Arg Arg Leu Lys
835 840 845
Lys Ser Ser Ala Lys Asn Lys Gly Asn Ser Thr Arg Arg Ser Pro Val
850 855 860
Ser
865
<210> 45
<211> 2598
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mus261M CAR核酸
<400> 45
atggcctcac cgttgacccg ctttctgtcg ctgaacctgc tgctgctggg tgagtcgatt 60
atcctgggga gtggagaagc taagccacag gcacaggtgc agctggagga gtctggagga 120
ggaagcgtgc aagtgggagg ctccctgagg ctgtcttgcg cagcaagcgg atacagatcc 180
agcgtgtgca tgggatggtt tagacaggca ccaggaaagg agagggagag agtggcagtg 240
atcggaaggg acggatccac cacatatatc gattctgtga agggccggtt taccatctcc 300
agagactctg ccaagaacac actgtctctg cagatggaca atctgaagcc tgaagacaca 360
gccatgtaca gctgcgccgc cggcctggga tactgggctt gcgaatacaa ctactggggg 420
cagggcactc aggtgaccgt ctcttctact agtactacta ccaagccagt gctgcgaact 480
ccctcacctg tgcaccctac cgggacatct cagccccaga gaccagaaga ttgtcggccc 540
cgtggctcag tgaaggggac cggattggac ttcgcctgtg atatttacat ctgggcaccc 600
ttggccggaa tctgcgtggc ccttctgctg tccttgatca tcactctcat ctgctctgtg 660
ctcaaatgga tcaggaaaaa attcccccac atattcaagc aaccatttaa gaagaccact 720
ggagcagctc aagaggaaga tgcttgtagc tgccgatgtc cacaggaaga agaaggagga 780
ggaggaggct atgagctgag agcaaaattc agcaggagtg cagagactgc tgccaacctg 840
caggacccca accagctcta caatgagctc aatctagggc gaagagagga atatgacgtc 900
ttggagaaga agcgggctcg ggatccagag atgggaggca aacagcagag gaggaggaac 960
ccccaggaag gcgtatacaa tgcactgcag aaagacaaga tggcagaagc ctacagtgag 1020
atcggcacaa aaggcgagag gcggagaggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc 1080
agcactgcca ccaaggacac ctatgatgcc ctgcatatgc agaccctggc ccctcgcggc 1140
agcggagcta caaacttcag tcttctaaaa caggctggtg acgtggagga gaatcccggc 1200
cctatgtgtc ctcagaagct aaccatctcc tggtttgcca tcgttttgct ggtgtctcca 1260
ctcatggcca tgtgggagct ggagaaagac gtttatgttg tagaggtgga ctggactccc 1320
gatgcccctg gagaaacagt gaacctcacc tgtgacacgc ctgaagaaga tgacatcacc 1380
tggacctcag accagagaca tggagtcata ggctctggaa agaccctgac catcactgtc 1440
aaagagtttc tagatgctgg ccagtacacc tgccacaaag gaggcgagac tctgagccac 1500
tcacatctgc tgctccacaa gaaggaaaat ggaatttggt ccactgaaat tttaaaaaat 1560
ttcaaaaaca agactttcct gaagtgtgaa gcaccaaatt actccggacg gttcacgtgc 1620
tcatggctgg tgcaaagaaa catggacttg aagttcaaca tcaagagcag tagcagttcc 1680
cctgactctc gggcagtgac atgtggaatg gcgtctctgt ctgcagagaa ggtcacactg 1740
gaccaaaggg actatgagaa gtattcagtg tcctgccagg aggatgtcac ctgcccaact 1800
gccgaggaga ccctgcccat tgaactggcg ttggaagcac ggcagcagaa taaatatgag 1860
aactacagca ccagcttctt catcagggac atcatcaaac cagacccgcc caagaacttg 1920
cagatgaagc ctttgaagaa ctcacaggtg gaggtcagct gggagtaccc tgactcctgg 1980
agcactcccc attcctactt ctccctcaag ttctttgttc gaatccagcg caagaaagaa 2040
aagatgaagg agacagagga ggggtgtaac cagaaaggtg cgttcctcgt agagaagaca 2100
tctaccgaag tccaatgcaa aggcgggaat gtctgcgtgc aagctcagga tcgctattac 2160
aattcctcat gcagcaagtg ggcatgtgtt ccctgcaggg tccgatccgg cagtggagag 2220
ggcagaggaa gtctgctaac atgcggtgac gtcgaggaga atcctggccc aatggctcct 2280
agagtgacac ctttgctggc cttttctctt ctagtgttgt ggacgtttcc tgcacccacc 2340
ctgggtggag cgaatgatgc agaggactgc tgcctcagtg tcacccaaag gcccatacca 2400
gggaacattg tgaaggcctt ccgctatctt ctcaatgaag atggatgtcg ggttcctgct 2460
gtggtcttca ctactttacg cggctaccag ctgtgtgctc ctccagacca gccctgggtg 2520
gaccgtatca tccgaaggct gaagaaaagc agcgccaaga acaaaggcaa ctcaacaaga 2580
agatccccag tttcctaa 2598
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸-丝氨酸聚合物接头
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(5)
<223> GSGGS可以重复n次，其中n是至少1的整数
<400> 46
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 47
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸-丝氨酸聚合物接头
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(4)
<223> GGGS可以重复n次，其中n是至少1的整数
<400> 47
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸-丝氨酸聚合物接头
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(5)
<223> GGGGS可以重复n次，其中n是至少1的整数
<400> 48
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5

Claims (54)

1.一种免疫效应细胞，其表达：
(i)外源引入的IL-12的p40亚基；
(ii)外源引入的CCR7的配体；以及
(iii)功能性外源受体，所述功能性外源受体包含：
(a)胞外抗原结合结构域、
(b)跨膜结构域、和
(c)胞内信号传导结构域，
其中所述CCR7的配体是CCL-19，或其中所述CCR7的配体是CCL-21。
2.如权利要求1所述的免疫效应细胞，其中所述p40是人p40或其片段或变体。
3.如权利要求2所述的免疫效应细胞，其中所述p40包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
4.如权利要求2所述的免疫效应细胞，其中所述p40包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
5.如权利要求1至4中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述CCL-19是人CCL-19或其片段或变体；和/或其中CCL-21是人CCL-21或其片段或变体。
6.如权利要求5所述的免疫效应细胞，其中所述CCL-19包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或其中所述CCL-19包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
7.如权利要求5所述的免疫效应细胞，其中所述CCL-21包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，或其中所述CCL-21包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
8.如权利要求1至7中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述功能性外源受体是T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、嵌合TCR(cTCR)、或T细胞抗原偶联物(TAC)样嵌合受体。
9.如权利要求8所述的免疫效应细胞，其中所述功能性外源受体是CAR。
10.如权利要求1至9中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述跨膜结构域源自选自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。
11.如权利要求10所述的免疫效应细胞，其中所述跨膜结构域来自CD8α或CD28。
12.如权利要求1至11中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。
13.如权利要求12所述的免疫效应细胞，其中所述初级胞内信号传导结构域来自CD3ζ。
14.如权利要求1至13中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。
15.如权利要求14所述的免疫效应细胞，其中所述共刺激信号传导结构域源自共刺激分子，所述共刺激分子选自由CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组。
16.如权利要求15所述的免疫效应细胞，其中所述共刺激信号传导结构域包含CD28的胞内结构域和/或CD137的胞内结构域。
17.如权利要求1至16中任一项所述的免疫效应细胞，其进一步包含位于所述胞外抗原结合结构域的C末端和所述跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。
18.如权利要求17所述的免疫效应细胞，其中所述铰链结构域来自CD8α。
19.如权利要求1至18中任一项所述的免疫效应细胞，其进一步包含位于多肽的N末端的信号肽。
20.如权利要求19所述的免疫效应细胞，其中所述信号肽来自CD8α。
21.如权利要求1至20中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞是T细胞。
22.一种多肽，其包含：
(i)外源引入的IL-12的p40亚基；
(ii)外源引入的CCR7的配体；以及
(iii)功能性外源受体，所述功能性外源受体包含：
(a)胞外抗原结合结构域、
(b)跨膜结构域、和
(c)胞内信号传导结构域，
其中所述CCR7的配体是CCL-19，或其中所述CCR7的配体是CCL-21。
23.如权利要求22所述的多肽，其中所述p40是人p40或其片段或变体。
24.如权利要求22所述的多肽，其中所述p40包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
25.如权利要求22所述的多肽，其中所述p40包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
26.如权利要求22至25中任一项所述的多肽，其中所述CCL-19是人CCL-19或其片段或变体；和/或其中所述CCL-21是人CCL-21或其片段或变体。
27.如权利要求26所述的多肽，其中所述CCL-19包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或其中所述CCL-19包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
28.如权利要求26所述的多肽，其中所述CCL-21包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，或其中所述CCL-21包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
29.如权利要求22至28中任一项所述的多肽，其中所述功能性外源受体是T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、嵌合TCR(cTCR)、或T细胞抗原偶联物(TAC)样嵌合受体。
30.如权利要求29所述的多肽，其中所述功能性外源受体是CAR。
31.如权利要求22至30中任一项所述的多肽，其中所述跨膜结构域源自选自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。
32.如权利要求31所述的多肽，其中所述跨膜结构域来自CD8α或CD28。
33.如权利要求22至32中任一项所述的多肽，其中所述胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。
34.如权利要求33所述的多肽，其中所述初级胞内信号传导结构域来自CD3ζ。
35.如权利要求22至34中任一项所述的多肽，其中所述胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。
36.如权利要求35所述的多肽，其中所述共刺激信号传导结构域源自共刺激分子，所述共刺激分子选自由CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组。
37.如权利要求36所述的多肽，其中所述共刺激信号传导结构域包含CD28的胞内结构域和/或CD137的胞内结构域。
38.如权利要求22至37中任一项所述的多肽，其进一步包含位于所述胞外抗原结合结构域的C末端和所述跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。
39.如权利要求38所述的多肽，其中所述铰链结构域来自CD8α。
40.如权利要求1至39中任一项所述的多肽，其进一步包含位于所述多肽的N末端的信号肽。
41.如权利要求40所述的多肽，其中所述信号肽来自CD8α。
42.如权利要求22至41中任一项所述的多肽，其中所述p40、所述CCL-19和所述功能性外源受体通过肽接头彼此连接；或其中所述p40、所述CCL-21和所述功能性外源受体通过肽接头彼此连接。
43.如权利要求42所述的多肽，其中所述肽接头为2A自切割肽，所述2A自切割肽任选地选自由F2A、E2A、P2A、T2A及其变体组成的组。
44.如权利要求43所述的多肽，其中所述2A自切割肽是包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的P2A片段。
45.如权利要求43所述的多肽，其中所述2A自切割肽是包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的T2A片段。
46.如权利要求22至45中任一项所述的多肽，其中所述p40和所述CCL-19存在于包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的结构域中，或其中所述p40和所述CCL-19存在于结构域中，所述结构域包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
47.如权利要求22至45中任一项所述的多肽，其中所述p40和所述CCL-21存在于包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的结构域中，或其中所述p40和所述CCL-21存在于结构域中，所述结构域包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
48.一种分离的核酸，其包含编码如权利要求22至47中任一项所述的多肽的核酸序列。
49.一种分离的核酸，其包含：
(i)编码外源引入的IL-12的p40亚基的第一区；
(ii)编码外源引入的CCR7的配体的第二区；以及
(iii)编码功能性外源受体的第三区，所述功能性外源受体包含：
(a)胞外抗原结合结构域、
(b)跨膜结构域、和
(c)胞内信号传导结构域，
其中所述CCR7的配体是CCL-19，或其中所述CCR7的配体是CCL-21。
50.一种载体，其包含如权利要求49所述的分离的核酸。
51.一种制备免疫效应细胞的方法，所述方法包括向免疫细胞中引入：
(i)如权利要求48或权利要求49所述的核酸或如权利要求50所述的载体；或
(ii)包含两种或更多种核酸的组合物，所述两种或更多种核酸各自编码如下项中的一项或两项：IL-12的p40亚基、CCL-19；和功能性外源受体，或包含两种或更多种核酸的组合物，所述两种或更多种核酸各自编码如下项中的一项或两项：IL-12的p40亚基、CCL-21；和功能性外源受体。
52.一种根据如权利要求51所述的方法产生的免疫效应细胞。
53.一种药物组合物，其包含如权利要求1至21和52中任一项所述的免疫效应细胞、如权利要求22至47中任一项所述的多肽、如权利要求48和49中任一项所述的核酸、或如权利要求50所述的载体，以及药学上可接受的载剂。
54.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求53所述的药物组合物。
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