JP2024507958A - 外因的に導入されたサイトカインを発現する操作された免疫エフェクター細胞 - Google Patents
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Abstract
本出願は、免疫エフェクター細胞を提供し、該免疫エフェクター細胞は、外因的に導入された、IL-12のp40サブユニット;外因的に導入された、CCR7のリガンド(例えば、CCL-19とCCL-21);及び機能的外因性受容体(例えば、キメラ抗原受容体)であって、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、該機能的外因性受容体を発現する。
Description
1. 関連出願の相互参照
本出願は、2021年2月26日に提出された国際特許出願番号PCT/CN2021/078227の優先権を主張し、その内容は、全体として参照により本明細書に援用される。
本出願は、2021年2月26日に提出された国際特許出願番号PCT/CN2021/078227の優先権を主張し、その内容は、全体として参照により本明細書に援用される。
2. 配列表
本出願は、テキスト形式として本出願と共に提出された、「14651-039-228_SEQ_LISTING.txt」」という名称の、2022年2月18日に作成された145,395バイトのサイズの配列表を参照により援用する。
本出願は、テキスト形式として本出願と共に提出された、「14651-039-228_SEQ_LISTING.txt」」という名称の、2022年2月18日に作成された145,395バイトのサイズの配列表を参照により援用する。
3. 分野
本開示は、機能的外因性受容体(例えば、キメラ抗原受容体)を含むポリペプチド、操作された免疫エフェクター細胞、及びその使用方法に関する。本開示は、治療的使用のための細胞の活性化と増大にさらに関し、特にキメラ抗原受容体に基づくT細胞免疫療法に関する。
本開示は、機能的外因性受容体(例えば、キメラ抗原受容体)を含むポリペプチド、操作された免疫エフェクター細胞、及びその使用方法に関する。本開示は、治療的使用のための細胞の活性化と増大にさらに関し、特にキメラ抗原受容体に基づくT細胞免疫療法に関する。
4. 背景
操作された免疫エフェクター細胞の養子移入は、新しい革新的治療戦略を代表する。例えば、キメラ抗原受容体(CAR)で操作されたT細胞は、有効な臨床応答を生じるように誘導し、従来の治療と比較して良好な予後を有することが証明された。しかしながら、インビボでの生存効率が低く、内因性免疫細胞の活性化が不十分であり、免疫抑制微小環境、T細胞の枯渇、及び疾患組織への浸潤が困難であることは、CAR-T細胞がいくつかの疾患にとって難題であることの一般的な原因である。そのため、疾患又は障害を治療するために、改善されたコンストラクト又は操作された免疫エフェクター細胞、例えば、CAR-T細胞は、当分野において依然として必要とされている。
操作された免疫エフェクター細胞の養子移入は、新しい革新的治療戦略を代表する。例えば、キメラ抗原受容体(CAR)で操作されたT細胞は、有効な臨床応答を生じるように誘導し、従来の治療と比較して良好な予後を有することが証明された。しかしながら、インビボでの生存効率が低く、内因性免疫細胞の活性化が不十分であり、免疫抑制微小環境、T細胞の枯渇、及び疾患組織への浸潤が困難であることは、CAR-T細胞がいくつかの疾患にとって難題であることの一般的な原因である。そのため、疾患又は障害を治療するために、改善されたコンストラクト又は操作された免疫エフェクター細胞、例えば、CAR-T細胞は、当分野において依然として必要とされている。
5. 概要
一態様において、本明細書は、免疫エフェクター細胞を提供し、該免疫エフェクター細胞は、外因的に導入された、IL-12のp40サブユニット;外因的に導入された、CCR7のリガンド(例えば、CCL-19とCCL-21);及び機能的外因性受容体であって、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、該機能的外因性受容体を発現する。
一態様において、本明細書は、免疫エフェクター細胞を提供し、該免疫エフェクター細胞は、外因的に導入された、IL-12のp40サブユニット;外因的に導入された、CCR7のリガンド(例えば、CCL-19とCCL-21);及び機能的外因性受容体であって、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、該機能的外因性受容体を発現する。
いくつかの実施形態において、本明細書は、免疫エフェクター細胞を提供し、該免疫エフェクター細胞は、外因的に導入された、IL-12のp40サブユニット;外因的に導入されたCCL-19;及び機能的外因性受容体であって、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、該機能的外因性受容体を発現する。
いくつかの実施形態において、本明細書は、免疫エフェクター細胞を提供し、該免疫エフェクター細胞は、外因的に導入された、IL-12のp40サブユニット;外因的に導入されたCCL-21;及び機能的外因性受容体であって、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、該機能的外因性受容体を発現する。
いくつかの実施形態において、p40は、ヒトp40又はその断片もしくは変異体である。いくつかの実施形態において、p40は、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、p40は、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書によるp40ポリペプチドは、分泌されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、本明細書によるp40ポリペプチドは、膜結合性ポリペプチド(例えば、MB12)である。
いくつかの実施形態において、CCL-19は、ヒトCCL-19又はその断片もしくは変異体である。いくつかの実施形態において、CCL-19は、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、CCL-19は、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、CCL-21は、ヒトCCL-21又はその断片もしくは変異体である。いくつかの実施形態において、CCL-21は、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、CCL-21は、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、機能的外因性受容体は、T細胞受容体(TCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、キメラTCR(cTCR)、又はT細胞抗原結合体(TAC)様キメラ受容体である。いくつかの実施形態において、機能的外因性受容体はCARである。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152、及びPD1からなる群から選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、CD8α又はCD28からのものである。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、該一次細胞内シグナル伝達ドメインはCD3ζからのものである。
いくつかの実施形態において、該細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、該共刺激シグナル伝達ドメインは、CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83のリガンド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、該共刺激シグナル伝達ドメインは、CD28の細胞質ドメイン及び/又はCD137の細胞質ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、機能的外因性受容体は、細胞外抗原結合ドメインのC末端と膜貫通ドメインのN末端との間に位置するヒンジドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、該ヒンジドメインはCD8αからのものである。
いくつかの実施形態において、機能的外因性受容体は、ポリペプチドのN末端に位置するシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、該シグナルペプチドはCD8αからのものである。
いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、T細胞である。
別の態様において、本明細書は、ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、外因的に導入された、IL-12のp40サブユニット;外因的に導入された、CCR7のリガンド(例えば、CCL-19とCCL-21);及び機能的外因性受容体であって、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、該機能的外因性受容体を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書は、ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、外因的に導入された、IL-12のp40サブユニット;外因的に導入されたCCL-19;及び機能的外因性受容体であって、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、該機能的外因性受容体を含む。
他の実施形態において、本明細書は、ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、外因的に導入された、IL-12のp40サブユニット;外因的に導入されたCCL-21;及び機能的外因性受容体であって、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、該機能的外因性受容体を含む。
いくつかの実施形態において、p40は、ヒトp40又はその断片もしくは変異体である。いくつかの実施形態において、p40は、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、p40は、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書によるp40ポリペプチドは、分泌されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、本明細書によるp40ポリペプチドは、膜結合性ポリペプチド(例えば、MB12)である。
いくつかの実施形態において、CCL-19は、ヒトCCL-19又はその断片もしくは変異体である。いくつかの実施形態において、CCL-19は、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、CCL-19は、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、CCL-21は、ヒトCCL-21又はその断片もしくは変異体である。いくつかの実施形態において、CCL-21は、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、CCL-21は、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、機能的外因性受容体は、T細胞受容体(TCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、キメラTCR(cTCR)、又はT細胞抗原結合体(TAC)様キメラ受容体である。いくつかの実施形態において、機能的外因性受容体はCARである。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152、及びPD1からなる群から選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、CD8α又はCD28からのものである。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、該一次細胞内シグナル伝達ドメインはCD3ζからのものである。
いくつかの実施形態において、該細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、該共刺激シグナル伝達ドメインは、CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83のリガンド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、該共刺激シグナル伝達ドメインは、CD28の細胞質ドメイン及び/又はCD137の細胞質ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、機能的外因性受容体は、細胞外抗原結合ドメインのC末端と膜貫通ドメインのN末端との間に位置するヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態において、該ヒンジドメインはCD8αからのものである。
いくつかの実施形態において、機能的外因性受容体は、ポリペプチドのN末端に位置するシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、該シグナルペプチドはCD8αからのものである。
いくつかの実施形態において、p40、CCL-19、及び機能的外因性受容体は、ペプチドリンカーを介して互いに連結される。いくつかの実施形態において、p40、CCL-21、及び機能的外因性受容体は、ペプチドリンカーを介して互いに連結される。いくつかの実施形態において、該ペプチドリンカーは、F2A、E2A、P2A、T2A、及びそれらの変異体からなる群から任意に選択される2A自己切断ペプチドである。いくつかの特定の実施形態において、該2A自己切断ペプチドは、SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含むP2A断片である。いくつかの特定の実施形態において、該2A自己切断ペプチドは、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含むT2A断片である。
いくつかの実施形態において、p40とCCL-19は、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む1つのドメイン内に存在する。他の実施形態において、p40とCCL-19は、1つのドメイン内に存在し、該ドメインは、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、p40とCCL-21は、SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含む1つのドメイン内に存在する。他の実施形態において、p40とCCL-21は、1つのドメイン内に存在し、該ドメインは、SEQ ID NO:20のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
さらに別の態様において、本明細書は、単離された核酸を提供し、該単離された核酸は、本明細書によるポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
さらに別の態様において、本明細書は、単離された核酸を提供し、該単離された核酸は、外因的に導入された、IL-12のp40サブユニット、をコードする第1の領域;外因的に導入された、CCR7のリガンド(例えば、CCL-19とCCL-21)、をコードする第2の領域;及び機能的外因性受容体をコードする第3の領域であって、該機能的外因性受容体が、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、該第3の領域を含む。いくつかの実施形態において、CCR7のリガンドはCCL-19である。他の実施形態において、CCR7のリガンドはCCL-21である。
さらに別の態様において、本明細書は、本明細書による単離された核酸を含むベクターを提供する。
さらに別の態様において、本明細書は、免疫エフェクター細胞を作製する方法を提供し、該方法は、免疫細胞に、(i)本明細書による核酸もしくはベクター、又は(ii)IL-12のp40サブユニット、CCL-19、及び機能的外因性受容体のうちの一つもしくは二つをそれぞれがコードする二つもしくはそれ以上の核酸を含む組成物、もしくは、IL-12のp40サブユニット、CCL-21、及び機能的外因性受容体のうちの一つもしくは二つをそれぞれがコードする二つもしくはそれ以上の核酸を含む組成物を導入することを含む。
別の態様において、本明細書は、本明細書による方法によって産生された免疫エフェクター細胞を提供する。
さらに別の態様において、本明細書は、医薬組成物を提供し、該医薬組成物は、本明細書による免疫エフェクター細胞、ポリペプチド、核酸、又はベクターと、薬学的に許容されるキャリアとを含む。
さらに別の態様において、本明細書は、対象の疾患又は障害を治療する方法を提供し、該方法は、対象に有効量の本明細書による医薬組成物を投与することを含む。
6. 図面の簡単な説明
H93 CAR、H93M CAR及びH93P CARの構造を示す。SPはシグナルペプチドを指す。TMは膜貫通ドメインを指す。TAA結合タンパク質は、腫瘍関連抗原の抗原結合ドメイン又は結合タンパク質(即ち抗GPC3 scFv)を指す。
ヒト化抗GPC3 scFv CARを発現するH93 CAR-T細胞及びH93M CAR-T細胞の陽性率を示す。UnTは、CARで形質導入されていないT細胞を指す。
図3A~3Bは、正常な条件(RPMI-1640+300IU/mL IL-2)で培養したCAR-T細胞のIL-23(図3A)及びCCL-19(図3B)タンパク質の産生を示す。
図3Aの説明を参照のこと。
図4A~4Bは、再チャレンジアッセイにおけるCAR-T細胞の増大を示す。細胞を2日毎に1:1のE/T比のPLC/PRF/5細胞で一晩刺激した。各ラウンドの終了時、T細胞の増大倍率(図4A)及び生存率(図4B)を記録した。
図4Aの説明を参照のこと。
図5A~5Cは、再チャレンジアッセイにおける種々の刺激ラウンドによる処理後の1:1のE/T比でのGPC3陽性細胞株に対するCAR-T細胞のインビトロ細胞傷害性(図5A)、TNF-α放出レベル(図5B)及びIFN-γ放出レベル(図5C)を示す。
図5Aの説明を参照のこと。
図5Aの説明を参照のこと。
再チャレンジアッセイにおける種々の刺激ラウンドによる処理後のCAR-T細胞の陽性率を示す。
図7A~7Dは、再チャレンジアッセイにおける刺激ラウンドから24時間後のCAR-T細胞のPD-1(図7A及び図7B)及びLAG3(図7C及び図7D)の発現を示す。
図7Aの説明を参照のこと。
図7Aの説明を参照のこと。
図7Aの説明を参照のこと。
図8A~8Bは、96ウェルtranswellチャンバによって実施したCAR-T細胞の細胞遊走アッセイを示す。種々のCAR-T細胞をPLC/PRF/5細胞と1:1のE/F比で30時間共培養し、細胞培養上清を回収して下側チャンバに加えた。4、6、8時間後、上側チャンバから遊走した下側チャンバのT細胞数(図8A)及び共培養上清中のCCL-19の濃度(図8B)を定量化した。
図8Aの説明を参照のこと。
図9A~9Dは、NCGマウス異種移植モデルにおけるCAR-T細胞の抗腫瘍効果を示す。NCGマウスにHuh7細胞を皮下接種し、0.2 M投与量及び0.6 M投与量(i.v.)(各群n=4匹のマウス)のCAR-T細胞で処置した。腫瘍の体積(図9A及び図9B)及びNCGマウス末梢血のゲノムDNA中のCARコピー数(図9C及び図9D)を評価した。
図9Aの説明を参照のこと。
図9Aの説明を参照のこと。
図9Aの説明を参照のこと。
図10A~10Bは、NCGマウス異種移植モデルにおける0.2 M(図10A)及び0.6 M(図10B)投与量のCAR-T細胞で処置したマウス(各群n=4匹のマウス)の体重変化を示す。
図10Aの説明を参照のこと。
図11A~11Dは、0.2 M又は0.6 M投与量(各群n=3匹のマウス)のCAR-T細胞で処置した後のNCGマウス末梢血におけるIL-23タンパク質(図11A及び図11B)及びIFN-γタンパク質(図11C及び図11D)のレベルを示す。
図11Aの説明を参照のこと。
図11Aの説明を参照のこと。
図11Aの説明を参照のこと。
NCGマウス異種移植モデルにおける動物実験のエンドポイント(n=3)時の0.2 M UnT、H93 CAR-T細胞又はH93M CAR-T細胞で処置したマウスの腫瘍組織中のT細胞浸潤を示す。腫瘍組織をホルマリンで固定し、パラフィンに包埋して免疫組織化学(IHC)に使用することにより、3,3’-ジアミノベンジジン(DAB)で染色されるT細胞浸潤を検出した。画像は、3D HISTECH(DRNJIER)によって入手した。右欄は、黒色の矩形の拡大領域を示している。
NCGマウス異種移植モデルにおいて0.2 M UnT、H93 CAR-T細胞又はH93M CAR-T細胞で処置した後の腫瘍組織におけるマウスマクロファージ及びマウス樹状細胞の動員を示す。動物実験のエンドポイント時点で、腫瘍組織をホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、免疫組織化学(IHC)に使用した。CD68を有するマクロファージ(左欄)及びCD11cを有する樹状細胞(右欄)を3,3’-ジアミノベンジジン(DAB)によって染色した。画像は、3D HISTECH(DRNJIER)によって入手した。
ヒト化抗GPC3 scFv CARを発現するH93 CAR-T細胞、H93M CAR-T細胞及びH93P CAR-T細胞の陽性率を示す。
図15A~15Bは、再チャレンジアッセイの結果を示す。各ラウンドの終了時、CAR-T細胞の増大倍率(図15A)を記録した。図15Bは、再チャレンジアッセイにおける種々の刺激ラウンドによる処理後の全T細胞と標的細胞との比が1:2である場合でのGPC3陽性細胞株に対するCAR-T細胞のインビトロ細胞傷害性を示す。
図15Aの説明を参照のこと。
96ウェルtranswellチャンバによって実施したCAR-T細胞の細胞遊走アッセイを示す。種々のCAR-T細胞をPLC/PRF/5細胞と1:1のE/T比で30時間共培養し、細胞培養上清を回収して下側チャンバに加えた。2、4及び6時間後、上側チャンバから遊走した下側チャンバのT細胞数を定量化した。
図17A~17Bは、NCGマウス異種移植モデルにおけるCAR-T細胞の抗腫瘍効果を示す。NCGマウスにGPC3+ Hep3B細胞を皮下接種し、二つの投与量のCAR-T細胞を注入し、0.3 M CAR+ T細胞/マウス及び0.8M CAR+ T細胞/マウス(i.v.)(各群n=4匹のマウス)。
図17Aの説明を参照のこと。
図18A~18Cは、NCGマウス異種移植モデルにおけるCAR-T細胞の抗腫瘍効果を示す。NCGマウスにHep3B細胞を皮下接種し、0.3 M投与量のH93 CAR-T細胞、H93MのCAR-T細胞、H93IL12p40のCAR-T細胞又はH93CCL19のCAR-T細胞で処置した(i.v.)(各群n=4匹のマウス)。腫瘍の体積(図18A)、NCGマウス末梢血におけるCD3陽性細胞の比率(図18B)及び体重(図18C)を評価した。
図18Aの説明を参照のこと。
図18Aの説明を参照のこと。
図19A~19Dは、C57BL/6マウス異種移植モデルにおけるCAR-T細胞の抗腫瘍効果を示す。C57BL/6マウスにLL/2-hGPC3細胞を皮下接種し、それぞれ10M、6M、6M及び6M投与量のmusH93 CAR-T細胞、musH93M CAR-T細胞、musH93IL12p40 CAR-T細胞及びmusH93CCL19 CAR-T細胞で処置した(i.v.)(各群n=5匹のマウス)。腫瘍の体積(図19A)、C57BL/6マウス末梢血におけるCAR+CD3+の比率(図19B)及び体重(図19C)を評価し、生存率(%)(図19D)を計算した。
図19Aの説明を参照のこと。
図19Aの説明を参照のこと。
図19Aの説明を参照のこと。
図20A~20Bは、261 CAR-T細胞及び261M CAR-T細胞をCLDN18.2+NUGC4細胞と一晩共培養した後のIL-23(図20A)及びCCL-19(図20B)タンパク質の産生を示す。
図20Aの説明を参照のこと。
図21A~21Cは、261 CAR-T細胞及び261M CAR-T細胞の再チャレンジアッセイの結果を示す。従来の条件(10%1640+300 IU IL-2)(図21A)及び再チャレンジアッセイ(図21B)におけるCAR-T細胞の増大倍率の比較は、NUGC4細胞による複数回のチャレンジ後に261M CAR-T細胞が抗原依存性増大を示すことを示唆した。図21Cは、再チャレンジアッセイにおける複数の刺激ラウンドによる処理後のCAR-T細胞の細胞生存率を示す。
図21Aの説明を参照のこと。
図21Aの説明を参照のこと。
図22A~22Dは、NCGマウス異種移植モデルにおける261 CAR-T細胞及び261M CAR-T細胞の抗腫瘍効果を示す。NCGマウスにNUGC4細胞を皮下接種し、0.5 M投与量(i.v.)(各群n=4匹のマウス)のCAR-T細胞で処置した。腫瘍の体積(図22A及びB)、NCGマウス末梢血におけるCD3陽性細胞の比率(図22C)及び体重(図22D)を評価した。
図22Aの説明を参照のこと。
図22Aの説明を参照のこと。
図22Aの説明を参照のこと。
図23A~23Bは、C57BL/6マウス異種移植モデルにおけるmus261M CAR-T細胞及びmus261-719 CAR-T細胞の抗腫瘍効果を示す。C57BL/6マウスにLL/2-hCLDN18.2細胞を皮下接種し、10 M投与量(i.v.)(各群n=4匹のマウス)のマウスCAR-T細胞で処置した。腫瘍の体積(図23A)及び体重(図23B)を評価した。
図23Aの説明を参照のこと。
図24A~24Bは、H93 CAR-T細胞、H93M CAR-T細胞及びH93M-MB12 CAR-T細胞のCAR陽性率(図24A)及びIL12p40陽性率(図24B)を示す。
図24Aの説明を参照のこと。
図25A~25Bは、抗CD3/CD28ビーズにより一晩刺激した後のH93 CAR-T細胞、H93M CAR-T細胞及びH93M-MB12 CAR-T細胞のIL12p40(図25A)、IL-23(図25B)、CCL-19(図25C)、IL-12(図25D)タンパク質の産生を示す。
図25Aの説明を参照のこと。
図25Aの説明を参照のこと。
図25Aの説明を参照のこと。
図26A~26Bは、96ウェルtranswellチャンバによって実施したH93 CAR-T細胞、H93M CAR-T細胞及びH93M-MB12 CAR-T細胞の細胞遊走アッセイを示す。種々のCAR-T細胞をPLC/PRF/5細胞と1:1のE/F比で24時間共培養し、細胞培養上清を回収して下側チャンバに加えた。2、4、6時間後、上側チャンバから遊走した下側チャンバのT細胞数(図26A)、及び共培養上清中のCCL-19の濃度(図26B)を定量化した。
図26Aの説明を参照のこと。
図27A~27Cは、H93 CAR-T細胞、H93M CAR-T細胞及びH93M-MB12 CAR-T細胞の再チャレンジアッセイの結果を示す。図27A及び図27Bは、従来の条件(10% 1640+300 IU IL-2)及び再チャレンジアッセイにおけるCAR-T細胞の増大倍率を示す。図27Cは、再チャレンジアッセイにおける複数の刺激ラウンドによる処理後のCAR-T細胞のCAR陽性変化を示す。
図27Aの説明を参照のこと。
図27Aの説明を参照のこと。
図28A~28Bは、再チャレンジアッセイにおける種々の刺激ラウンドによる処理後のH93 CAR-T細胞、H93M CAR-T細胞及びH93M-MB12 CAR-T細胞のインビトロサイトカイン分泌、TNF-α放出レベル(図28A)及びIFN-γ放出レベル(図28B)を示す。
図28Aの説明を参照のこと。
7. 詳細な説明
本開示は部分的に、一つ又は複数の機能的外因性受容体(例えば、CAR)並びに外因的に導入されたp40及びCCR7リガンド(例えば、CCL-19及びCCL-21)を発現する操作された免疫細胞の機能と特性が改善されたという驚くべき発見に基づいている。
本開示は部分的に、一つ又は複数の機能的外因性受容体(例えば、CAR)並びに外因的に導入されたp40及びCCR7リガンド(例えば、CCL-19及びCCL-21)を発現する操作された免疫細胞の機能と特性が改善されたという驚くべき発見に基づいている。
7.1. 定義
本明細書に記載されるか又は参照される技術及び手順には、例えば、Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版 2001)、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubelらによる編集,2003)、Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic(Anによる編集 2009)、Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols(Albitarによる編集 2010)、及びAntibody Engineering 第1巻及び第2巻(Kontermann及びDubelによる編集,第2版 2010)に記載される広く利用されている方法など、概して当業者によって従来の方法を用いて良く理解されているもの及び/又は一般的に採用されているものが含まれる。本明細書において特に定義しない限り、本発明で使用される技術用語と科学用語は、当業者に一般的に理解されている意味を有する。本明細書の解釈上、以下の用語の説明が適用され、且つ任意の適切な場合に、単数形で使用される用語は複数形も含み、逆も同様である。記載される用語のいずれかの説明が、参照により本明細書に援用されるいずれかの文献と矛盾する場合、以下に記載される用語の説明が優先されるべきである。
本明細書に記載されるか又は参照される技術及び手順には、例えば、Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版 2001)、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubelらによる編集,2003)、Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic(Anによる編集 2009)、Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols(Albitarによる編集 2010)、及びAntibody Engineering 第1巻及び第2巻(Kontermann及びDubelによる編集,第2版 2010)に記載される広く利用されている方法など、概して当業者によって従来の方法を用いて良く理解されているもの及び/又は一般的に採用されているものが含まれる。本明細書において特に定義しない限り、本発明で使用される技術用語と科学用語は、当業者に一般的に理解されている意味を有する。本明細書の解釈上、以下の用語の説明が適用され、且つ任意の適切な場合に、単数形で使用される用語は複数形も含み、逆も同様である。記載される用語のいずれかの説明が、参照により本明細書に援用されるいずれかの文献と矛盾する場合、以下に記載される用語の説明が優先されるべきである。
用語「抗体」、「免疫グロブリン」又は「Ig」は、本明細書において同義的に使用されてもよく、最も広義に使用され、且つ具体的には、例えば、モノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、中和抗体、完全長の又はインタクトなモノクローナル抗体を含む)、マルチエピトープ又はモノエピトープ特異性を有する抗体組成物、ポリクローナル又は一価抗体、多価抗体、少なくとも二つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体(例えば、所望の生物学的活性を呈する限り、二重特異性抗体)、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体(例えば、VHH)及びその断片(例えば、ドメイン抗体)を包含する。抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体及び/又は親和性成熟抗体並びに他の種(例えば、マウス、ウサギ、ラマなど)からの抗体であり得る。用語「抗体」は、免疫グロブリン系ポリペプチドにおけるB細胞のポリペプチド生成物を含むことが意図され、それは、特定の分子抗原に結合する能力を有し、且つ二つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、ここで各対のポリペプチド鎖は、一本の重鎖(約50~70kDa)と一本の軽鎖(約25kDa)を有し、各本の鎖の各アミノ末端部分が約100~約130個又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含み、且つ各本の鎖の各カルボキシ末端部分が定常領域を含む。例えば、Antibody Engineering(Borrebaeckによる編集,第2版1995)、及びKuby,Immunology(第3版1997)を参照されたい。抗体は、合成抗体、組換えにより産生された抗体、ラクダ科(Camelidae)の種(例えば、ラマ又はアルパカ)由来を含む単一ドメイン抗体又はそれらのヒト化変異体、イントラボディ、抗イディオタイプ(抗Id)抗体及び上記のいずれかの機能性断片(例えば、抗原結合断片)をさらに含むが、それらに限らず、これらの機能性断片は、抗体重鎖又は軽鎖ポリペプチドの一部を指し、該断片の由来となった抗体の結合活性の一部又は全てを保持している。機能性断片(例えば、抗原結合断片)の非限定的な例としては、一本鎖Fv(scFv)(例えば、単一特異性、二重特異性などを含む)、Fab断片、F(ab’)断片、F(ab)2断片、F(ab’)2断片、ジスルフィド結合により連結されるFv(dsFv)、Fd断片、Fv断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及びミニボディが挙げられる。特に、本明細書による抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、抗原結合ドメイン又は抗原に結合する抗原結合部位を含有する分子(例えば、抗体の一つ又は複数のCDR)を含む。このような抗体断片は、例えば、Harlow及びLane,Antibodies:A Laboratory Manual(1989)、Mol.Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference(Myersによる編集,1995)、Hustonら,1993,Cell Biophysics 22:189-224、Pluckthun及びSkerra,1989,Meth.Enzymol.178:497-515、並びにDay,Advanced Immunochemistry(第2版,1990)を参照することができる。本明細書による抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD及びIgA)又は任意のサブクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)であり得る。抗体は、アゴニスト抗体又はアンタゴニスト抗体であり得る。抗体は、アゴニストでもアンタゴニストでもないものであり得る。
「抗原」は、抗体が選択的に結合することのできる構造である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン又は他の天然に存在する化合物もしくは合成化合物であり得る。いくつかの実施形態において、標的抗原はポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原は細胞と結び付いており、例えば、細胞上又は細胞内に存在する。
「インタクトな」抗体は、抗原結合部位並びにCL及び少なくとも重鎖定常領域CH1、CH2及びCH3を含む抗体である。定常領域は、ヒト定常領域又はそのアミノ酸配列変異体を含んでもよい。いくつかの実施形態において、インタクトな抗体は、一つ又は複数のエフェクター機能を有する。
「一本鎖Fv」(「sFv」又は「scFv」とも略される)は、単一のポリペプチド鎖に連結されるVH及びVL抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、sFvポリペプチドは、VHとVLドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含み、該ポリペプチドリンカーは、sFvが抗原結合のための望ましい構造を形成することを可能にする。sFvに関する概説は、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113巻、Rosenburg及びMooreによる編集,Springer-Verlag,New York,ページ269~315(1994)を参照されたい。
本明細書で使用されるように、「単一ドメイン抗体」又は「sdAb」は、単一のモノマー可変抗体ドメインを指し、且つ抗原に結合することができる。単一ドメイン抗体は、本明細書に記載のVHHドメインを含む。単一ドメイン抗体の例は、例えば、ラクダ科種(例えば、ラマ)からの抗体、従来の4鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体、及び抗体に由来するもの以外の単一ドメイン足場のような、軽鎖を天然に欠いている抗体を含むが、それに限らない。単一ドメイン抗体は、任意の種に由来してもよく、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ及びウシを含むが、それらに限らない。例えば、本明細書に記載されているように、単一ドメイン抗体は、ラクダ科種、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ及びグアナコから産生された抗体に由来してもよい。ラクダ科以外の他の種は、軽鎖を天然に欠いている重鎖抗体を産生することができ、このような他の種に由来するVHHは、本開示の範囲内にある。いくつかの実施形態において、本明細書による単一ドメイン抗体(例えば、VHH)は、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の構造を有する。単一ドメイン抗体は、本明細書に記載されているように、別の分子(例えば、剤)と遺伝子融合又は化学的にコンジュゲートされることができる。単一ドメイン抗体は、大きい結合分子(例えば、多重特異性抗体又はキメラ抗原受容体)の一部であり得る。
用語「結合(binds)」又は「結合すること(binding)」は、分子間の相互作用を指し、例えば、複合体を形成することを含む。相互作用は、例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用及び/又はファンデルワールス相互作用を含む非共有結合性相互作用であり得る。複合体は、共有結合性又は非共有結合性の結合、相互作用又は力によって一体に保持された二つ以上の分子の結合をさらに含んでもよい。抗体上の単一の抗原結合部位と標的分子(例えば、抗原)の単一のエピトープとの間の全体としての非共有結合性相互作用の強度は、該エピトープに対する抗体又は機能性断片の親和性である。結合分子(例えば、抗体)と一価抗原との解離速度(koff)と会合速度(kon)との比(koff/kon)は、解離定数KDであり、親和性に反比例する。KD値が低いほど、抗体の親和性は高くなる。KDの値は、抗体と抗原との複合体毎に異なり、且つkonとkoffに依存する。本明細書による抗体の解離定数KDは、本明細書による任意の方法又は当業者に周知の任意の他の方法を用いて決定することができる。一つの結合部位における親和性が、常に抗体と抗原との間の相互作用の真の強度を反映しているとは限らない。複数の反復する抗原決定基を含有する複合抗原(例えば、多価抗原)が、複数の結合部位を含有する抗体と接触する場合、一つの部位における抗体の抗原との相互作用により、二番目の部位における反応の可能性が増加することになる。多価抗体と抗原との間のこのような複数の相互作用の強度は、アビディティと呼ばれる。
本明細書に記載される結合分子に関連して、「~に結合する」、「~に特異的に結合すること」のような用語及び類似の用語も本明細書で同義的に使用され、抗原(例えば、ポリペプチド)に特異的に結合する抗原結合ドメインの結合分子を指す。抗原に結合するか又は特異的に結合する結合分子又は抗原結合ドメインは、例えば、イムノアッセイ、Octet(登録商標)、Biacore(登録商標)又は当業者に周知の他の技術によって同定することができる。いくつかの実施形態において、結合分子又は抗原結合ドメインは、いかなる交差反応性抗原よりも高い親和性で抗原に結合する場合、ラジオイムノアッセイ(RIA)及び酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)のような実験技術を用いて測定したように、抗原に結合するか又は特異的に結合する。典型的には、特異的又は選択的反応はバックグラウンドシグナル又はノイズの少なくとも2倍になることになり、バックグラウンドの10倍を超えることもあり得る。結合特異性に関する考察については、例えば、Fundamental Immunology 332-36(Paulによる編集,第2版1989)を参照されたい。いくつかの実施形態において、結合分子又は抗原結合ドメインが「非標的」タンパク質に結合する程度は、例えば、FACS分析又はRIAによって測定したように、結合分子又は抗原結合ドメインのその特定の標的抗原への結合の約10%未満である。抗原に結合する結合分子又は抗原結合ドメインは、例えば、結合分子が、例えば、抗原を標的とする際に治療剤及び/又は診断剤として有用であるように、十分な親和性で抗原に結合することができる結合分子又は抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗原に結合する結合分子又は抗原結合ドメインは、1μM、800nM、600nM、550nM、500nM、300nM、250nM、100nM、50nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、もしくは0.1nM未満、又は1μM、800nM、600nM、550nM、500nM、300nM、250nM、100nM、50nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、もしくは0.1nMの解離定数(KD)を有する。いくつかの実施形態において、結合分子又は抗原結合ドメインは、異なる種からの抗原で保存されている抗原エピトープに結合する。
いくつかの実施形態において、結合分子又は抗原結合ドメインは、「キメラ」配列を含んでもよく、ここで、重鎖及び/又は軽鎖の一部は、特定の種に由来するから又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同である一方、鎖の残りの部分は、別の種に由来するか又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体及びこのような抗体の断片における対応する配列と同一又は相同であり、それらが所望の生物学的活性を示すものであればよい(米国特許第4,816,567号及びMorrisonら,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-55を参照されたい)。キメラ配列は、ヒト化配列を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、結合分子又は抗原結合ドメインは、非ヒト(例えば、ラクダ科動物、ネズミ、非ヒト霊長類動物)抗体の「ヒト化」形態の部分を含んでもよく、これらの非ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン(例えば、受容体抗体)からの配列を含み、ここで、天然CDR残基は、所望の特異性、親和性及び能力を有するラクダ科動物、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類動物のような非ヒト種(例えば、ドナー抗体)の対応するCDRからの残基に置換されている。いくつかの場合に、ヒト免疫グロブリン配列の一つ又は複数のFR領域残基は、対応する非ヒト残基に置換されている。なお、ヒト化抗体は、受容体抗体又はドナー抗体で発見されていない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体性能をさらに改善するために行われる。ヒト化抗体重鎖又は軽鎖は、少なくとも一つ又は複数の可変領域の実質的に全てを含んでもよく、ここで、全て又は実質的に全てのCDRは、非ヒト免疫グロブリンのCDRに対応し、且つ全て又は実質的に全てのFRは、ヒト免疫グロブリン配列のFRである。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域(Fc)、通常、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含むことになる。さらなる詳細については、Jonesら,Nature 321:522-25(1986)、Riechmannら,Nature 332:323-29(1988)、Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-96(1992)、Carterら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285-89(1992)、米国特許第6,800,738号、同第6,719,971号、同第6,639,055号、同第6,407,213号、及び同第6,054,297号を参照されたい。
いくつかの実施形態において、結合分子又は抗原結合ドメインは、「完全ヒト抗体」又は「ヒト抗体」の一部を含んでもよく、ここで、これらの用語は、本明細書で同義的に使用され、且つヒト可変領域と、例えばヒト定常領域とを含む抗体を指す。結合分子は、単一ドメイン抗体配列を含んでもよい。具体的な実施形態において、該用語は、ヒト由来の可変領域と定常領域とを含む抗体を指す。いくつかの実施形態において、「完全ヒト」抗体は、ポリペプチドに結合し、且つ核酸配列によりコードされる抗体をさらに包含してもよく、これらの核酸配列は、ヒト生殖系列免疫グロブリン核酸配列の天然に存在する体細胞変異体である。用語「完全ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に対応する可変領域と定常領域を有する抗体を含み、例えば、Kabatら(Kabatら(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開番号91-3242を参照されたい)によって記載されているとおりである。「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し及び/又はヒト抗体を作製するための技術のいずれかを用いて産生された抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に排除する。ヒト抗体は、当分野の既知の様々な技術を用いて産生することができ、ファージディスプレイライブラリー(Hoogenboom及びWinter,J.Mol.Biol.227:381(1991)、Marksら,J.Mol.Biol.222:581(1991))と酵母ディスプレイライブラリー(Chaoら,Nature Protocols 1:755-68(2006))とを含む。なお、ヒトモノクローナル抗体の調製には、Coleら,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77(1985)、Boernerら,J.Immunol.147(1):86-95(1991)、及びvan Dijkとvan de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)に記載される方法も利用可能である。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してこのような抗体を産生するように改変されているが、その内因性遺伝子座が無効になったトランスジェニック動物(例えば、マウス)に抗原を投与することによって調製され得る(例えば、Jakobovits,Curr.Opin.Biotechnol.6(5):561-66(1995)、BruggemannとTaussing,Curr.Opin.Biotechnol.8(4):455-58(1997)、及びXENOMOUSETM技術に関する米国特許第6,075,181と同第6,150,584号を参照されたい)。ヒトB細胞ハイブリドーマ技術によって産生されるヒト抗体は、さらに、例えば、Liら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:3557-62(2006)を参照されたい。
いくつかの実施形態において、結合分子又は抗原結合ドメインは、「組換えヒト抗体」の一部を含んでもよく、ここで、該語句は、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現した抗体、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニック及び/又はトランスクロモソミックである動物(例えば、マウス又はウシ)から単離された抗体(例えば、Taylor,L.D.ら,Nucl.Acids Res.20:6287-6295(1992)を参照されたい)又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングに関わる任意の他の手段によって調製、発現、産生又は単離された抗体など、組換え手段によって調製、発現、産生又は単離されたヒト抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有し得る(Kabat,E.A.ら(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開番号91-3242を参照されたい)。しかしながら、いくつかの実施形態において、このような組換えヒト抗体に対してインビトロ変異誘発を行う(又は、ヒトIg配列のトランスジェニック動物を用いる場合、インビボ体細胞変異誘発を行う)ため、組換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VH及びVL配列に由来してその近縁であるが、インビボでのヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しないものであり得る配列である。
いくつかの実施形態において、結合分子又は抗原結合ドメインは、「モノクローナル抗体」の一部を含んでもよく、ここで、本明細書で使用される用語は、実質的に均一な抗体の集団から入手された抗体を指し、例えば、少量で存在し得る天然に存在する可能な突然変異又は周知の翻訳後修飾(例えば、アミノ酸異性体化又は脱アミド、メチオニン酸化又はアスパラギン若しくはグルタミン脱アミド)を除いて、該集団を構成する各抗体は同一であり、各モノクローナル抗体が、通常、抗原上の単一のエピトープを認識することになる。具体的な実施形態において、本明細書で使用される「モノクローナル抗体」は、単一のハイブリドーマ又は他の細胞により産生された抗体である。用語「モノクローナル」は、抗体を作製するための任意の特定の方法に限定されない。例えば、本開示において有用であるモノクローナル抗体は、Kohlerら,Nature 256:495(1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって調製されてもよいか、又は組換えDNA方法を用いて細菌又は真核生物の動物若しくは植物細胞において作製されてもよい(例えば、米国特許第4,816,567号を参照されたい)。「モノクローナル抗体」は、例えば、Clacksonら,Nature 352:624-28(1991)及びMarksら,J.Mol.Biol.222:581-97(1991)に記載される技術を用いてファージ抗体ライブラリーからも単離され得る。クローン細胞株及びクローン細胞株が発現するモノクローナル抗体の調製のための他の方法は、当分野において周知である。例えば、Short Protocols in Molecular Biology(Ausubelらによる編集,第5版,2002)を参照されたい。
典型的な4-鎖抗体単位は、二本の同一の軽(L)鎖と二本の同一の重(H)鎖で構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。IgGの場合に、4-鎖単位は、通常、約150,000ダルトンである。各本のL鎖は、一つの共有結合性ジスルフィド結合を介してH鎖に連結される一方、二本のH鎖は、H鎖のアイソタイプに依存して一つ又は複数のジスルフィド結合を介して互いに連結される。各本のH鎖とL鎖は、規則的に間隔を置いて配置された鎖内ジスルフィド架橋をさらに有する。各本のH鎖は、N末端に可変ドメイン(VH)を有し、α鎖とγ鎖のうちのそれぞれについて三つの定常ドメイン(CH)が続く一方、μアイソタイプ及びεアイソタイプについて四つのCHドメインが続く。各本のL鎖は、N末端に可変ドメイン(VL)を有し、その他端に定常ドメイン(CL)を有する。VLはVHと整列し、且つCLは重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)と整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の境界面を形成すると考えられる。VHとVLのペアリングは、一緒になって単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラス抗体の構造特性については、例えばBasic and Clinical Immunology 71(Stitesらによる編集,第8版,1994)及びImmunobiology(Janewayらによる編集,第5版,2001)を参照されたい。
用語「Fab」又は「Fab領域」は、抗原に結合する抗体領域を指す。従来のIgGは、通常、二つのFab領域を含み、各Fab領域は、Y字型IgG構造の二つのアームの一方に存在する。各Fab領域は、通常、重鎖と軽鎖のそれぞれの一つの可変領域及び一つの定常領域で構成される。より具体的には、Fab領域における重鎖の可変領域及び定常領域は、VH領域及びCH1領域であり、且つFab領域における軽鎖の可変領域及び定常領域は、VL領域及びCL領域である。Fab領域におけるVH、CH1、VL及びCLは、本開示に係る抗原結合能を付与するように様々な方法で配列され得る。例えば、従来のIgGのFab領域に似ているように、VH領域及びCH1領域は、一つのポリペプチド上にあり得、且つVL領域及びCL領域は、単独のポリペプチドにあり得る。代替的に、VH領域、CH1領域、VL領域及びCL領域は、以下の節でより詳細に記載されるように、全て同じポリペプチド上にあり、且つ異なる順序で配向されてもよい。
用語「可変領域」、「可変ドメイン」、「V領域」又は「Vドメイン」は、抗体の軽鎖又は重鎖の一部を指し、それは、通常、軽鎖又は重鎖のアミノ末端に位置し、且つ長さが重鎖で約120~130個のアミノ酸及び軽鎖で約100~110個のアミノ酸であり、且つ各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性に用いられる。重鎖の可変領域は、「VH」と呼ばれてもよい。軽鎖の可変領域は、「VL」と呼ばれてもよい。用語「可変」は、抗体における可変領域のいくつかのセグメントが配列に大きな違いを呈するという事実を指す。V領域は、抗原結合を媒介し、特定の抗体のその特定の抗原に対する特異性を定義する。しかしながら、可変性は、可変領域の110個のアミノ酸範囲内に均等に分布しているわけではない。代わりに、V領域は、約15~30個のアミノ酸の、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる、変化が小さい(例えば、相対的に変化しない)セグメントで構成され、これらのセグメントは、長さがそれぞれ約9~12個のアミノ酸である、「超可変領域」と呼ばれる、変化が大きい(例えば、極端的に変化する)短領域によって隔てられている。重鎖と軽鎖の可変領域はそれぞれ、主にβシート構造を用いる四つのFRを含み、それらは、三つの超可変領域を介して連結され、この三つの超可変領域は連結されてループを形成し、且ついくつかの場合にβシート構造の一部を形成する。各鎖の超可変領域は、FRによってごく接近して一体に保持されており、且つ他方の鎖の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(例えば、Kabatら,Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版,1991)を参照されたい)。定常領域は、抗体による抗原への結合に直接的には関わらないが、抗体依存性細胞傷害(ADCC)及び補体依存性細胞傷害(CDC)への抗体の関与など、様々なエフェクター機能を呈する。可変領域は、種々の抗体間で配列が広く異なる。具体的な実施形態において、可変領域はヒト可変領域である。
用語「Kabatによる可変領域残基の番号付け」又は「Kabatなどの場合のアミノ酸位置の番号付け」及びこれらの変化形は、Kabatら前掲における抗体編成の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域に使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用して、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのFR又はCDRの短縮又は挿入に対応するより少ない又は別のアミノ酸を含んでもよい。例えば、重鎖可変ドメインは、残基52の後の単一のアミノ酸挿入(Kabatによる残基52a)及び残基82の後の三つ挿入された残基(例えば、Kabatによる残基82a、82b及び82cなど)を含んでもよい。所与の抗体の残基のKabat番号付けは、抗体配列と「標準」Kabat番号付け配列との相同性領域におけるアラインメントによって決定されることができる。可変ドメインにおける残基(およそ軽鎖の残基1~107及び重鎖の残基1~113)に言及する場合、通常、kabat番号付けシステム(例えば、Kabatら前掲)を用いる。免疫グロブリン重鎖定常領域における残基に言及する場合、通常、「EU番号付けシステム」又は「EUインデックス」(例えば、Kabatら前掲に報告されるEUインデックス)を用いる。「KabatにおけるEUインデックス」は、ヒトIgG 1 EU抗体の残基番号付けを指す。他の番号付けシステムは、例えば、AbM、Chothia、Contact、IMGT及びAHonによって記載されている。
抗体に関連して使用される時、用語「重鎖」は、約50~70kDaのポリペプチド鎖を指し、ここで、アミノ末端部分は、約120~130又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分は定常領域を含む。重鎖定常領域に基づくアミノ酸配列は、定常領域が、アルファ(α)、デルタ(δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)及びミュー(μ)と称される五つの異なるタイプ(例えば、アイソタイプ)のうちの一つであり得る。別個の重鎖はサイズが異なる:α、δ及びγは約450個のアミノ酸を含有するが、μ及びεは約550個のアミノ酸を含有する。軽鎖と組み合わせになると、これらの異なるタイプの重鎖はそれぞれ、五つの周知のクラス(例えば、アイソタイプ)の抗体であるIgA、IgD、IgE、IgG及びIgMを産生し、IgGの四つのサブクラス、即ちIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4を含む。
抗体に関連して使用される時、用語「軽鎖」は、約25kDaのポリペプチド鎖を指し、ここで、アミノ末端部分は、約100~約110個又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分は定常領域を含む。軽鎖のおよその長さは211~217個のアミノ酸である。定常ドメインに基づくアミノ酸配列には、二つの異なるタイプが存在し、カッパ(κ)又はラムダ(λ)と称される。
本明細書で使用されるように、用語「超可変領域」、「HVR」、「相補性決定領域」及び「CDR」は、同義的に使用される。「CDR」は、免疫グロブリン(Ig又は抗体)VH β-シートフレームワークの非フレームワーク領域内の三つの超可変領域(H1、H2又はH3)の一つ、又は抗体VL β-シートフレームワークの非フレームワーク領域内の三つの超可変領域(L1、L2又はL3)の一つを指す。VHドメインにおけるCDR1、CDR2及びCDR3は、それぞれHCDR1、HCDR2及びHCDR3とも称される。VLドメインにおけるCDR1、CDR2及びCDR3は、それぞれLCDR1、LCDR2及びLCDR3とも称される。そのため、CDRは、フレームワーク領域配列の範囲内に散在する可変領域配列である。
CDR領域は当業者に周知であり、周知の番号付けシステムによって定義されている。例えば、Kabat相補性決定領域(CDR)は、配列可変性に基づくものであり、最も一般的に用いられている(例えば、Kabatら前掲、Nick Deschachtら,J Immunol 2010;184:5696-5704)を参照されたい)。Chothiaは、代わりに、構造ループの位置を指す(例えばChothia及びLesk,J.Mol.Biol.196:901-17(1987)を参照されたい)。Kabatの番号付け規則を用いて番号付けした時、Chothia CDR-H1ループの末端は、H32とH34との間で変化し、これはループの長さに依存する(これは、Kabatの番号付けレジメンが挿入をH35AとH35Bに置くためであり、35Aも35Bも存在しない場合、ループが32で終わり、35Aのみが存在する場合、ループが33で終わり、35A及び35Bの両方が存在する場合、ループが34で終わる)。AbM超可変領域は、Kabat CDRとChothia構造ループとの間の折衷案に相当し、Oxford MolecularのAbM抗体モデル化ソフトウェアに使用されている(例えばAntibody Engineering 第2巻(Kontermann及びDubelによる編集,第2版,2010)を参照されたい)。「コンタクト」超可変領域は、利用可能な複合体結晶構造に対する分析に基づく。開発され、広く採用されている別の汎用的な番号付けシステムは、ImMunoGeneTics(IMGT)Information System(登録商標)(Lafrancら,Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77(2003))である。IMGTは、ヒト及び他の脊椎動物の免疫グロブリン(IG)、T細胞受容体(TCR)及び主要組織適合性複合体(MHC)に特化した総合情報システムである。本明細書では、CDRは、軽鎖又は重鎖内のアミノ酸配列及び位置を指す。免疫グロブリン可変ドメインの構造内でのCDRの「位置」は種間で保存的であり、且つループと呼ばれる構造中に存在するため、構造的特徴に従い可変ドメイン配列をアラインメントする番号付けシステムを用いることにより、CDR及びフレームワーク残基が容易に認識される。該情報は、一つの種の免疫グロブリンからのCDR残基を、通常ヒト抗体からのアクセプターフレームワークに移植化及び置き換えるために用いることができる。Honegger及びPluckthun,J.Mol.Biol.309:657-70(2001)は、更なる番号付けシステム(AHon)を開発した。例えば、Kabat番号付けとIMGT独自の番号付けシステムとを含む番号付けシステム間の対応関係は、当業者に周知である(例えば、Kabat前掲、Chothia及びLesk前掲、Martin前掲、Lefrancら前掲を参照されたい)。これらの超可変領域又はCDRからの各残基は、以下の表1に例示されている。
所与のCDRの境界は、認識に用いられるレジメンに応じて異なり得る。そのため、特に指定されない限り、所与の抗体又はその領域(例えば、可変領域)の「CDR」及び「相補性決定領域」という用語並びに抗体又はその領域の各CDR(例えば、CDR-H1、CDR-H2)は、上記の任意の既知のレジメンによって定義される相補性決定領域を包含すると理解されるべきである。いくつかの場合に、一つ又は複数の特定のCDRを認識するためのレジメンを指定し、例えば、IMGT、Kabat、Chothia又はContact方法により定義されたCDRである。他の場合に、CDRの特定のアミノ酸配列が与えられる。注意すべきことは、CDR領域は、様々な番号付けシステムの組み合わせ、例えば、Kabat及びChothia番号付けシステムの組み合わせ、又はKabat及びIMGT番号付けシステムの組み合わせによって定義されてもよいことである。そのため、「特定のVH又はVHHに記載されているようなCDR」のような用語は、上記例示的なCDR番号付けシステムにより定義された任意のCDR1を含むが、それに限らない。可変領域(例えば、VHH、VH又はVL)が与えられると、当業者は、該領域内のCDRが種々の番号付けシステム又はその組み合わせによって定義され得ることを理解するであろう。
超可変領域は、以下のような「拡張された超可変領域」を含んでもよい:VLにおける24-36又は24-34(L1)、46-56又は50-56(L2)、及び89-97又は89-96(L3)、並びに、VHにおける26-35又は26-35A(H1)、50-65又は49-65(H2)、及び93-102、94-102又は95-102(H3)。
用語「定常領域」又は「定常ドメイン」は、軽鎖と重鎖のカルボキシ末端部分を指し、それは、抗体による抗原への結合に直接的には関わらないが、様々なエフェクター機能、例えば、Fc受容体との相互作用を呈する。該用語は、免疫グロブリン分子の一部を指し、該免疫グロブリン分子の一部は、免疫グロブリンの他の部分、即ち可変領域と比べて、より保存的なアミノ酸配列を有し、該アミノ酸配列は、抗原結合部位を含有する。定常領域は、重鎖のCH1、CH2及びCH3領域並びに軽鎖のCL領域を含有し得る。
用語「フレームワーク」又は「FR」は、CDRの両側に位置する可変領域残基を指す。FR残基は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ドメイン抗体(例えば、単一ドメイン抗体)、ダイアボディ、線形抗体及び二重特異性抗体に存在する。FR残基は、超可変領域残基又はCDR残基以外の可変ドメイン残基である。
本明細書における用語「Fc領域」は、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するためのものであり、例えば、天然配列Fc領域と、組換えFc領域と、変異体Fc領域とを含む。免疫グロブリン重鎖Fc領域の境界は異なる場合があるが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、Cys226又はPro230位置のアミノ酸残基からそのカルボキシ末端の方向に広がると定義される。例えば、抗体の生産又は精製期間又は抗体重鎖をコードする核酸に対して組換えて操作を行うことによって、Fc領域のC末端リジン(EU番号付けシステムの残基447に基づくものである)を除去することができる。そのため、インタクトな抗体の組成物は、全てのK447残基が除去された抗体集団、K447残基が除去されていない抗体集団及びK447残基を含む抗体と含まない抗体との混合物を有する抗体集団を含んでもよい。「機能的Fc領域」は、天然配列Fc領域の「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」としては、C1q結合、CDC、Fc受容体結合、ADCC、貪食作用、細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体)下方制御などが挙げられる。このようなエフェクター機能は、通常、Fc領域を結合領域又は結合ドメイン(例えば、抗体可変領域又はドメイン)と組み合わせる必要があり、且つ当業者に周知の様々なアッセイを用いて評価することができる。「変異体Fc領域」は、少なくとも一つのアミノ酸改変(例えば、置換、付加又は欠失)のために天然配列Fc領域と異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、変異体Fc領域は、天然配列Fc領域又は親ポリペプチドのFc領域と比べて少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、例えば、天然配列Fc領域又は親ポリペプチドのFc領域に約1~約10個のアミノ酸置換、又は約1~約5個のアミノ酸置換を有する。本明細書の変異体Fc領域は、天然配列Fc領域及び/又は親ポリペプチドのFc領域との少なくとも約80%の相同性を有するか、又はそれとの少なくとも約90%の相同性を有し、例えば、それとの少なくとも約95%の相同性を有する。
本明細書で使用されるように、「エピトープ」は、当分野における用語であり、且つ結合分子(例えば、一本鎖抗体配列を含む抗体)が特異的結合できる抗原の局所的領域を指す。エピトープは、線形エピトープ又は立体構造的、非線形的もしくは不連続的エピトープであってもよい。ポリペプチド抗原の場合に、例えば、エピトープは、ポリペプチドの連続したアミノ酸であってもよく(「線形」エピトープ)、又はエピトープは、ポリペプチドの二つ又はそれ以上の非連続領域からのアミノ酸を含んでもよい(「立体的」、「非線形的」又は「不連続的」エピトープ)。当業者によれば、一般に、線状エピトープは、二次、三次又は四次構造に依存することも又はしないこともあると理解されるであろう。例えば、いくつかの実施形態において、結合分子は、一群のアミノ酸に結合するが、それらが天然の三次元タンパク質構造に折り畳まれているかどうかは無関係である。他の実施形態において、結合分子は、エピトープを認識して結合するために、エピトープを構成するアミノ酸残基が特定の立体配座(例えば、屈曲、ねじれ、ターン、又は折り畳み)を呈する必要がある。
ペプチド、ポリペプチド又は抗体配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント(%)」及び「相同性」は、最大配列同一性パーセントを実現するために配列アラインメント及び必要な場合にギャップを導入し、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮されない時、候補配列における、特定のペプチド又はポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同じであるアミノ酸残基の割合として定義される。所属分野の技術の範囲内にある様々なやり方で、BLAST、BLAST-2、ALIGN又はMEGALIGN(商標)(DNASTAR)ソフトウェアのような公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて、アラインメントを実現してアミノ酸配列同一性パーセントを決定することができる。当業者は、比較下の配列の完全長にわたって最大限のアラインメントを実現するために必要な任意のアルゴリズムを含め、アラインメントの測定に適切なパラメータを決定することができる。
本明細書で使用されるように、用語「機能的外因性受容体」は、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)を導入した後に、その生物学的活性を保持する外因性受容体(例えば、組換え又は操作されたTCR、cTCR、TAC様キメラ受容体又はCARのようなTCR)を指す。生物学的活性は、外因性受容体による分子への特異的結合、下流シグナルの適切な形質導入、例えば、細胞増殖、サイトカイン産生及び/又は調節性又は細胞溶解性エフェクター機能の実行を誘導する能力を含むが、それらに限らない。
本明細書で使用されるように、「キメラ抗原受容体」又は「CAR」は、一つ又は複数の抗原をT細胞のような免疫エフェクター細胞に特異的に移植するために用いることができる遺伝子操作された受容体を指す。いくつかのCARは、「人工T細胞受容体」、「キメラT細胞受容体」又は「キメラ免疫受容体」とも呼ばれる。いくつかの実施形態において、CARは、一つ又は複数の抗原(例えば、腫瘍抗原)特異的な細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、T細胞及び/又は他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。「CAR-T細胞」又は「CAR-T」は、CARを発現するT細胞を指す。
本明細書で使用される用語「組換え又は操作されたTCR」は、本明細書による機能的外因性受容体として含まれ、且つ免疫細胞で発現されるペプチドを指す。組換え又は操作されたTCRの機能は、例えば、表面に特定のマーカーを有するがん細胞及び感染細胞のような所望のタイプの細胞に対する免疫細胞の免疫活性をリダイレクトすること含んでもよい。それらは、内因性TCRを置換するか又は内因性TCRと共発現することができる。いくつかの実施形態において、このような組換えTCRは、オープンリーディングフレームを含む一本鎖TCRであり、ここで、可変Vα及びVβドメインはタンパク質リンカーとペアリングする。これは、選択された抗原に特異的であることが知られているTCR遺伝子の分子クローニングに関する。そして、通常、レトロウイルスベクターによってこれらの鎖をT細胞に導入する。そのため、クローニングされたTCRα及びTCRβ遺伝子の発現は、形質導入されたT細胞に、これらの新たな遺伝子のペアリングにより決定された機能特異性を与える。組換え又は操作されたTCRの構成要素は、組換えTCRα及びTCRβのようなTCRの任意の機能的サブユニットであり、細胞に導入された外因性ポリヌクレオチド配列によりコードされる。
いくつかの実施形態において、本明細書による機能的外因性受容体は、キメラTCR(cTCR)であり、抗原結合機能とT細胞活性化機能を同時に有する。例えば、cTCRは、(a)腫瘍抗原(例えば、GPC3、クローディン18.2)の一つ又は複数のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片(例えば、sdAb、scFv)を含む細胞外リガンド結合ドメインと、(b)任意選択的なリンカーと、(c)第1のTCRサブユニット(例えば、CD3ε)の任意選択的な細胞外ドメイン又はその一部と、(d)第2のTCRサブユニット(例えば、CD3ε)の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、(e)第3のTCRサブユニット(例えば、CD3ε)の細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含んでもよく、ここで、第1、第2及び第3のTCRサブユニットは、いずれもTCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ、及びCD3δからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第1、第2及び第3のTCRサブユニットは同じである(例えば、いずれもCD3εである)。いくつかの実施形態において、第1、第2及び第3のTCRサブユニットは異なる。いくつかの実施形態において、cTCRは、細胞外リガンド結合ドメインのC末端と膜貫通ドメインのN末端との間に位置するヒンジドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、該ヒンジドメインはCD8αに由来する。いくつかの実施形態において、cTCRは、cTCRのN末端に位置するシグナルペプチド、例えば、CD8αに由来するシグナルペプチドをさらに含む。
いくつかの実施形態において、機能的外因性受容体は、T細胞抗原結合体(TAC)であり、例えば、(a)腫瘍抗原(例えば、GPC3、クローディン18.2)の一つ又は複数のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片(例えば、sdAb、scFv)を含む細胞外リガンド結合ドメインと、(b)任意選択的な第1のリンカーと、(c)TCRサブユニット(例えば、CD3ε)の細胞外ドメインを特異的に認識する細胞外TCR結合ドメインと、(d)任意選択的な第2のリンカーと、(e)第1のTCR共受容体(例えば、CD4)の任意選択的な細胞外ドメイン又はその一部と、(f)第2のTCR共受容体(例えば、CD4)の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、(g)第3のTCR共受容体(例えば、CD4)の細胞内シグナル伝達ドメインを含む任意選択的な細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。ここで、該TCRサブユニットは、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ、及びCD3δからなる群から選択され、且つここで、第1、第2及び第3のTCR共受容体は、いずれもCD4、CD8、及びCD28からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第1、第2及び第3のTCR共受容体は同じである。いくつかの実施形態において、第1、第2及び第3のTCR共受容体は異なる。いくつかの実施形態において、TACは、細胞外リガンド結合ドメインのC末端と膜貫通ドメインのN末端との間に位置するヒンジドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、該ヒンジドメインはCD8αに由来する。いくつかの実施形態において、TACは、TACのN末端に位置するシグナルペプチド、例えば、CD8αに由来するシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、細胞外TCR結合ドメインのN末端に位置する。いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、細胞外TCR結合ドメインのC末端に位置する。
いくつかの実施形態において、機能的外因性受容体は、TAC様キメラ受容体であり、例えば、(a)腫瘍抗原(例えば、GPC3、クローディン18.2)の一つ又は複数のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片(例えば、sdAb、scFv)を含む細胞外リガンド結合ドメインと、(b)任意選択的な第1のリンカーと、(c)第1のTCRサブユニット(例えば、TCRα)の細胞外ドメインを特異的に認識する細胞外TCR結合ドメインと、(d)任意選択的な第2のリンカーと、(e)第2のTCRサブユニット(例えば、CD3ε)の任意選択的な細胞外ドメイン又はその一部と、(f)第3のTCRサブユニット(例えば、CD3ε)の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、(g)第4のTCRサブユニット(例えば、CD3ε)の細胞内シグナル伝達ドメインを含む任意選択的な細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、ここで、第1、第2、第3及び第4のTCRサブユニットは、いずれもTCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ、及びCD3δからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第2、第3及び第4のTCRサブユニットは同じである。いくつかの実施形態において、第1、第2、第3及び第4のTCRサブユニットは同じである。いくつかの実施形態において、第1、第2、第3及び第4のTCRサブユニットは異なる。いくつかの実施形態において、第2、第3及び第4のTCRサブユニットは同じであるが、第1のTCRサブユニットとは異なる。いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、細胞外TCR結合ドメインのN末端に位置する。いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、細胞外TCR結合ドメインのC末端に位置する。いくつかの実施形態において、TAC様キメラ受容体は、細胞外リガンド結合ドメインのC末端と膜貫通ドメインのN末端との間に位置するヒンジドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、該ヒンジドメインはCD8αに由来する。いくつかの実施形態において、TAC様キメラ受容体は、TAC様キメラ受容体のN末端に位置するシグナルペプチド、例えば、CD8αに由来するシグナルペプチドをさらに含む。
用語「ポリペプチド」及び「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書で同義的に使用され、且つ任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖又は分岐鎖であってもよく、それは、改変されたアミノ酸を含んでもよく、且つ非アミノ酸によって分断され得る。これらの用語は、既に天然に改変されたか又は介入によって改変されたアミノ酸ポリマーをさらに包含する。例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作又は改変である。該定義は、例えば、一つ又は複数のアミノ酸類似体(非天然アミノ酸などを含むが、それに限らない)及び当分野の既知の他の改変を含むポリペプチドをさらに含む。理解すべきことは、本開示のポリペプチドが抗体又は免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーに基づいてもよいため、いくつかの実施形態において、「ポリペプチド」は、一本鎖又は二本以上の会合した鎖として存在し得ることである。
本明細書で同義的に使用されるように、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、且つDNAとRNAとを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変されたヌクレオチド又は塩基、及び/又はそれらの類似体、又はDNAもしくはRNAポリメラーゼ又は合成反応によってポリマーに取り込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド、例えば、メチル化されたヌクレオチド及びその類似体を含んでもよい。本明細書で使用されるように、「オリゴヌクレオチド」は、短く、通常一本鎖であり、合成されたポリヌクレオチドを指し、その長さが、通常(必ずしもそうとは限らない)約200ヌクレオチド未満である。用語「オリゴヌクレオチド」と「ポリヌクレオチド」とは、互いに排他的というわけではない。ポリヌクレオチドについての上記の説明は、オリゴヌクレオチドにも等しく全面的に適用可能である。本開示の結合分子を産生する細胞は、親ハイブリドーマ細胞、並びに抗体をコードする核酸が導入された細菌及び真核宿主細胞を含んでもよい。特に指定のない限り、本明細書に開示される任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は5’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は5’方向と称される。5’から3’への新生RNA転写物の付加方向は転写方向と称される。DNA鎖においてRNA転写物と同じ配列を有する、RNA転写物の5’末端より5’側にある配列領域は、「上流配列」と称され、DNA鎖においてRNA転写物と同じ配列を有する、RNA転写物の3’末端より3’側にある配列領域は、「下流配列」と称される。
「単離された核酸」は、天然では天然配列に付随する他のゲノムDNA配列並びにリボソーム及びポリメラーゼのようなタンパク質又は複合体と実質的に分離されている核酸(例えば、RNA、DNA又は核酸混合物)である。「単離された」核酸分子は、核酸分子の天然の供給源に存在する他の核酸分子と分離されている核酸分子である。なお、「単離された」核酸分子、例えば、cDNA分子は、組換え技術によって産生される場合、他の細胞物質又は培地を実質的に含まなくてもよいか、又は化学的に合成される場合、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。具体的な実施形態において、本明細書に記載の一本鎖抗体又は抗体をコードする一つ又は複数の核酸分子は、単離又は精製される。該用語は、その天然に存在する環境から除去された核酸配列を含み、且つ組換え又はクローニングされたDNA単離物及び化学的に合成された類似体又は異種系によって生物学的に合成された類似体を含む。実質的に純粋な分子は、該分子の単離された形態を含んでもよい。具体的には、本明細書に記載の、CARをコードする「単離された」核酸分子は、少なくとも一つの汚染物の核酸分子から同定され単離された核酸分子であり、該核酸分子は、通常、それが産生された環境において該少なくとも一つの汚染物の核酸分子と会合する。
用語「制御配列」は、特定の宿主生物において、作動可能に連結に連結されたコード配列を発現するために必要なDNA配列を指す。原核生物に適用される制御配列は、例えば、プロモーター、任意選択的なオペロン配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
本明細書で使用されるように、用語「作動可能に連結された」及び同様の語句(例えば、遺伝子融合された)は、核酸又はアミノ酸を指すために用いられる場合、それぞれ核酸配列又はアミノ酸配列の作動可能な連結を指し、それらは互いに機能的関係に置かれている。例えば、プロモーター、エンハンサーエレメント、オープンリーディングフレーム、5’及び3’UTR並びにターミネーター配列が作動可能に連結されると、核酸分子(例えば、RNA)の正確な産生が起こる。いくつかの実施形態において、作動可能に連結された核酸エレメントは、オープンリーディングフレームの転写を引き起こし、最終的にポリペプチドの産生(即ち、オープンリーディングフレームの発現)を引き起こす。別の例として、作動可能に連結されたペプチドは、その機能ドメインが互いに適切な距離に置かれており、各ドメインに所期の機能を付与するペプチドである。
用語「ベクター」は、核酸配列を宿主細胞に導入するように、核酸配列を担持するか又は含むための物質を指し、該核酸配列は、例えば、本明細書に記載の結合分子(例えば、抗体)をコードする核酸配列である。適用可能なベクターは、例えば、発現ベクター、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソーム及び人工染色体を含み、それは、選択配列、又は宿主細胞染色体に安定的に組込むことができるマーカーを含んでもよい。なお、ベクターは、一つ又は複数の選択的マーカー遺伝子と適切な発現制御配列とを含んでもよい。含まれる選択的マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質又は毒素に対する耐性を提供し、栄養欠乏を補充するか又は培地中にない重要栄養素を供給する。発現控制配列は、当分野に周知の構成型及び誘導型プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含んでもよい。二つ又はそれ以上の核酸分子を共発現させようとする時(例えば、抗体重鎖及び軽鎖又は抗体VH及びVL)、二つの核酸分子を、例えば、単一の発現ベクター又は単独の発現ベクターに挿入してもよい。単一のベクター発現について、コード核酸は、一つの共通の発現控制配列に作動可能地連結されるか又は異なる発現控制配列、例えば、一つの誘導型プロモーター及び一つの構成型プロモーターに連結されてもよい。宿主細胞への核酸分子の導入は、当分野に周知の方法を用いて確認することができる。このような方法は、例えば、mRNAのRNAブロット又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅のような核酸分析、遺伝子生成物の発現に用いられる免疫ブロット又は導入された核酸配列もしくはそれに対応する遺伝子生成物の発現を試験する他の適切な分析方法を含む。当業者は、核酸分子が所望の生成物を産生するのに十分な量で発現されていることを理解し、さらに、当分野に周知の方法で発現レベルを最適化して十分な発現を得ることができることを理解すべきである。
本明細書で使用されるように、用語「宿主」は、動物、例えば、哺乳動物(例えば、ヒト)を指す。
本明細書で使用されるように、用語「宿主細胞」は、核酸分子をトランスフェクトされ得る特定の対象細胞及びこのような細胞の子孫又は潜在的な子孫を指す。このような細胞の子孫は、次世代に起こり得る突然変異もしくは環境の影響又は宿主細胞ゲノムへの核酸分子の組込みが原因で、核酸分子をトランスフェクトされる親細胞と同じではないこともある。
本明細書で使用されるように、用語「自己由来」は、同じ個体に由来する任意の材料を指し、ここで、該材料が後に該個体に再導入される。
「同種異系」は、同じ種の異なる個体に由来する移植片を指す。
本明細書で使用される用語「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」は、外因性核酸を宿主細胞に転移又は導入するプロセスを指す。「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」細胞は、外因性核酸を用いて、トランスフェクト、形質転換、又は形質導入された細胞である。この細胞は、初代対象細胞及びその子孫を含む。
本明細書で使用されるように、用語「薬学的に許容される」は、連邦もしくは州政府の規制当局によって承認されていること、又は米国薬局方、欧州薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方において列挙されていること、又は動物に、より具体的にはヒトに使用することを意味する。
「賦形剤」は、液体又は固体の充填剤、希釈剤、溶媒又はカプセル化材料のような薬学的に許容される材料、組成物又はビヒクルを指す。賦形剤としては、例えば、カプセル化材料又は添加剤、例えば、吸収促進剤、酸化防止剤、結合剤、緩衝剤、キャリア、コーティング剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、増量剤、充填剤、香味剤、保湿剤、潤滑剤、香料、防腐剤、噴射剤、離型剤、滅菌剤、甘味剤、可溶化剤、湿潤剤及びそれらの混合物が挙げられる。用語「賦形剤」はさらに、希釈剤、アジュバント(例えば、フロイントアジュバント(完全もしくは不完全))又はビヒクルを指してもよい。
いくつかの実施形態において、賦形剤は、薬学的に許容される賦形剤である。薬学的に許容される賦形剤の例としては、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝剤、アスコルビン酸を含む酸化防止剤、低分子量(例えば、約10アミノ酸残基未満)のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンのようなタンパク質、ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリジンのようなアミノ酸、グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類及び他の炭水化物、EDTAのようなキレート剤、マンニトール又はソルビトールのような糖アルコール類、ナトリウムのような塩形成性対イオン、及び/又はTWEEN(商標)、ポリエチレングリコール(PEG)及びPLURONICS(商標)のような非イオン性界面活性剤が挙げられる。薬学的に許容される賦形剤の他の例は、Remington及びGennaro,Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版,1990)に記載されている。
一実施形態において、各成分は、医薬製剤の他の成分と適合性があるという意味で「薬学的に許容可能」であり、且つ合理的なリスク対効果比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性又は他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒト及び動物の組織又は臓器と接触するのに適している。例えば、Lippincott Williams & Wilkins:Philadelphia,PA,2005;Handbook of Pharmaceutical Excipients,第6版、Roweらによる編集;The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association:2009;Handbook of Pharmaceutical Additives,第3版、Ash及びAshによる編集;Gower Publishing Company:2007;Pharmaceutical Preformulation and Formulation,第2版、Gibsonによる編集;CRC Press LLC:Boca Raton,FL,2009を参照されたい。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される賦形剤は、用いられる投与量及び濃度で、それに曝露される細胞又は哺乳動物にとって非毒性である。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される賦形剤は、水性pH緩衝溶液である。
いくつかの実施形態において、賦形剤は、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油のような、石油、動物、植物又は合成供給源のものを含む油及び水のような無菌の液体である。組成物(例えば、医薬組成物)が静脈内投与される時、水は例示的賦形剤である。生理食塩水、デキストロース水溶液及びグリセリン溶液も液体賦形剤として、特に注射用溶液に用いることができる。賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、エチレングリコール、水、エタノールなどをさらに含んでもよい。該組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤又は乳化剤又はpH緩衝剤をさらに含んでもよい。組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル、散剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。経口組成物は、製剤を含み、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムのような標準的な賦形剤を含んでもよい。
医薬化合物を含む組成物は、例えば、単離又は精製された形態の結合分子(例えば、抗体)及び好適な量の賦形剤を含んでもよい。
本明細書で使用されるように、用語「有効量」又は「治療有効量」は、操作された免疫エフェクター細胞、又は作用物質と本明細書による操作された免疫エフェクター細胞とを含む治療用分子、又は医薬組成物、の所望の結果をもたらすのに十分な量を指す。
用語「対象」と「患者」は、同義的に使用され得る。本明細書で使用されるように、いくつかの実施形態において、対象は、非霊長類動物又は霊長類動物(例えば、ヒト)のような哺乳動物である。具体的な実施形態において、対象はヒトである。一実施形態において、対象は、疾患又は障害を発症していると診断される哺乳動物、例えば、ヒトである。別の実施形態において、対象は、疾患又は障害が進行するリスクがある哺乳動物、例えば、ヒトである。
「投与する(Administer)」又は「投与(administration)」は、例えば、粘膜、皮内、静脈内、筋肉内送達及び/又は本明細書に記載されるもしくは当分野に周知の任意の他の物理的送達方法により、体外に存在する物質を患者に注射するか又はそうでなければ物理的に送達する行為を指す。
本明細書で使用されるように、用語「治療する(treat)」、「治療(treatment)」及び「治療すること(treating)」は、一つ又は複数の療法の投与による疾患又は病態の進行、重症度及び/又は持続時間を低減又は改善することを指す。治療は、患者が潜在的状態を依然として有している可能性があるにもかかわらず、患者の改善が観察されるように、潜在的病態に関連する一つ又は複数の症状が低減されているか、寛解されているか否か及び/又は緩和されているか否かを評価することによって決定され得る。用語「治療」は、疾患の管理及び改善を含む。用語「管理する(manage)」、「管理すること(managing)」及び「管理(management)」は、対象が、必ずしも疾患の治癒をもたらすとは限らない療法から得る、有益な効果を指す。
用語「予防する(prevent)」、「予防すること(preventing)」及び「予防(prevention)」は、疾患、障害、病態又は関連する症状(例えば、がん)が発生(又は再発)する可能性を低減することを指す。
本明細書で使用されるように、がんの発症を「遅延」させるとは、疾患の発症を遅らせ、抑制し、減速させ、延ばし、安定させ、且つ/又は遅くすることを指す。この遅延は、疾患の病歴及び/又は治療される個体に応じて、異なる時間長を有してもよい。当業者には明らかなように、十分又は有意な遅延は、実際的には、該個体が該疾患を発症していないという点で予防を包含することができる。該方法を用いない場合に比べて、がんの発症を「遅延」させる方法は、所与の時間範囲内で疾患発症の確率を低減し、且つ/又は所与の時間範囲内で疾患の程度を低減する方法である。このような比較は、典型的には、統計学的に有意な数の個体を使用した臨床試験に基づく。がんの発症は、標準的な方法を用いて検出することができ、これらの標準的な方法は、コンピュータ体軸断層撮影(CATスキャン)、磁気共鳴画像法(MRI)、腹部超音波検査、凝固検査、動脈造影法又は生検を含むが、それらに限らない。発症は、最初に検出不能であり得るがんの進行を指してもよく、且つ発生、再発及び発作を含む。
用語「約」及び「およそ」は、所定値又は範囲から20%以内、15%以内、10%以内、9%以内、8%以内、7%以内、6%以内、5%以内、4%以内、3%以内、2%以内、1%以内、又はそれ未満を指す。
本開示及び特許請求の範囲で使用されるように、単数形の「一つの(a)」、「一つの(an)」、及び「その(the)」は、文脈上特に明確に指示されない限り、複数形を含む。
理解すべきことは、本明細書のいずれかの部分において用語「含む」で実施形態を説明し、「~からなる」及び/又は「実質的に~からなる」で説明された類似した実施形態も提供することである。さらに理解すべきことは、本明細書のいずれかの部分において語句「実質的に~からなる」で実施形態を説明し、「~からなる」で説明された類似した実施形態も提供することである。
語句「AとBとの間」又は「A~Bの間」で使用される用語「~の間」は、AとBを含む範囲を指す。
本明細書において「A及び/又はB」のような語句で使用される用語「及び/又は」は、AとB、A又はB、A(単独)、及びB(単独)を含むことが意図される。同様に、「A、B及び/又はC」のような語句で使用される用語「及び/又は」は、A、B及びC、A、B又はC、A又はC、A又はB、B又はC、A及びC、A及びB、B及びC、A(単独)、B(単独)、並びにC(単独)の実施形態のうちの各々を含むことが意図される。
7.2. 操作された免疫エフェクター細胞
以下のセクション8に示すように、IL-12のp40サブユニットとCCR7のリガンド(例えば、CCL-19及びCCL-21)の特定の組み合わせを、一つ又は複数の機能的外因性受容体を発現する免疫エフェクター細胞に導入することにより、免疫エフェクター細胞の特性/機能を著しく改善することができる。そのため、一態様において、本明細書は、宿主細胞(例えば、免疫エフェクター細胞)を提供し、該宿主細胞は、外因的に導入された、IL-12のp40サブユニットと;CCR7のリガンド(例えば、CCL-19及びCCL-21)とを含み、ここで、該宿主細胞は、一つ又は複数の機能的外因性受容体を発現する。
以下のセクション8に示すように、IL-12のp40サブユニットとCCR7のリガンド(例えば、CCL-19及びCCL-21)の特定の組み合わせを、一つ又は複数の機能的外因性受容体を発現する免疫エフェクター細胞に導入することにより、免疫エフェクター細胞の特性/機能を著しく改善することができる。そのため、一態様において、本明細書は、宿主細胞(例えば、免疫エフェクター細胞)を提供し、該宿主細胞は、外因的に導入された、IL-12のp40サブユニットと;CCR7のリガンド(例えば、CCL-19及びCCL-21)とを含み、ここで、該宿主細胞は、一つ又は複数の機能的外因性受容体を発現する。
CCR7(C-Cケモカイン受容体7型)は、ヒトにおいてCCR7遺伝子によりコードされるタンパク質である。CCR7は、BLR2、CC-CKR-7、CCR-7、CD197、CDw197、CMKBR7、EBI1及びC-Cモチーフケモカイン受容体7とも呼ばれる。いくつかの実施形態において、本明細書によるCCR7は、OMIM:600242、MGI:103011、HomoloGene:1387、及び/又はGeneCards:CCR7として同定される。該受容体に対して、CCL-19及びCCL-21の二つの天然リガンドが同定されている。本明細書によるCCR7のリガンドは、任意の種のCCR7の天然リガンドであってもよい。他の実施形態において、本明細書によるCCR7のリガンドは、任意の種のCCR7の人工又は合成リガンドであってもよい。
機能的外因性受容体は、例えば、キメラ抗原受容体(CAR)、操作されたT細胞受容体(TCR)、キメラTCR(cTCR)及びT細胞抗原結合体(TAC)様キメラ受容体であってもよい。いくつかの実施形態において、機能的外因性受容体はCARである。いくつかの実施形態において、機能的外因性受容体はTCRである。いくつかの実施形態において、機能的外因性受容体はcTCRである。他の実施形態において、機能的外因性受容体はTACである。免疫エフェクター機能を実行することができる任意の免疫エフェクター細胞を本発明に使用することができ、末梢血単核細胞(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、細胞傷害性T細胞、好中球及び好酸球を含むが、それらに限らない。
いくつかの実施形態において、本明細書は、本明細書に記載の(例えば、以下のセクションに提供されるような)ポリペプチド、ポリヌクレオチド又はベクターのうちのいずれか一つを含む宿主細胞(例えば、免疫エフェクター細胞)を提供する。
いくつかの特定の実施形態において、本明細書は、CAR-T細胞を提供し、該細胞は、外因的に導入されたp40及びCCL-19を発現する。いくつかの特定の実施形態において、本明細書は、TCR-T細胞を提供し、該細胞は、外因的に導入されたp40及びCCL-19を発現する。いくつかの特定の実施形態において、本明細書は、TAC-T細胞を提供し、該細胞は、外因的に導入されたp40及びCCL-19を発現する。
いくつかの特定の実施形態において、本明細書は、CAR-T細胞を提供し、該細胞は、外因的に導入されたp40及びCCL-21を発現する。いくつかの特定の実施形態において、本明細書は、TCR-T細胞を提供し、該細胞は、外因的に導入されたp40及びCCL-21を発現する。いくつかの特定の実施形態において、本明細書は、TAC-T細胞を提供し、該細胞は、外因的に導入されたp40及びCCL-21を発現する。
7.2.1. P40、CCL-19及びCCL-21
いくつかの実施形態において、本発明の操作された免疫エフェクター細胞は、外因的に導入された、IL-12のp40サブユニット又はその変異体と、CCL-19又はその変異体との特定の組み合わせを含む。他の実施形態において、本発明の操作された免疫エフェクター細胞は、外因的に導入された、IL-12のp40サブユニット又はその変異体と、CCL-21又はその変異体との特定の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、本発明の操作された免疫エフェクター細胞は、外因的に導入された、IL-12のp40サブユニット又はその変異体と、CCL-19又はその変異体との特定の組み合わせを含む。他の実施形態において、本発明の操作された免疫エフェクター細胞は、外因的に導入された、IL-12のp40サブユニット又はその変異体と、CCL-21又はその変異体との特定の組み合わせを含む。
本明細書で使用されるように、p40は、インターロイキン12のサブユニットβであり、IL-12B、ナチュラルキラー細胞刺激因子2、細胞傷害性リンパ球成熟因子p40又はインターロイキン-12サブユニットp40とも呼ばれ、且つヒトにおいてIL12B遺伝子によりコードされるタンパク質である。P40は、インターロイキン12及びインターロイキン23の一般的なサブユニットである。いくつかの実施形態において、p40は、OMIM:161561、MGI:96540、HomoloGene:1648、及び/又はGeneCards:IL12Bとして同定される。本明細書で使用されるp40は、任意の種からのp40を含む。本明細書で使用されるp40は、その少なくとも一つの生物学的活性(例えば、その生物学的活性のうちの少なくとも80%)を実質的に保持する任意のp40変異体をさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書によるp40は、ヒトp40又はその断片もしくは変異体である。具体的な実施形態において、本明細書によるp40は、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書によるp40は、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書によるp40は、SEQ ID NO:5との約80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含むp40の少なくとも80%の生物学的活性を保持した。いくつかの実施形態において、本明細書によるp40ポリペプチドは、分泌されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、本明細書によるp40ポリペプチドは、膜結合性ポリペプチド(例えば、MB12)である。
本明細書によるp40ポリペプチドは、当分野の既知の任意の技術で形成された膜結合性ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、p40ポリペプチドは、膜アンカードメインを介して膜に結合される。いくつかの実施形態において、p40ポリペプチドは、膜貫通ドメインを介して膜に結合される。例示的膜貫通ドメインは、以下の膜貫通ドメインを含むが、それらに限らない:T細胞受容体のα、βもしくはζ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、B7、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CDl la、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CD19、IL-2R β、IL-2R γ、CD8α、IL-7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D及び/又はNKG2C。いくつかの実施形態において、p40ポリペプチドは、膜結合性であり、第2のポリペプチド断片をさらに含む。いくつかの実施形態において、第2のポリペプチド断片は、CD28、CD8α、OX40、及びB7からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、p40断片及び第2のポリペプチド断片は、ペプチドリンカーを介して互いに連結される。いくつかの実施形態において、該リンカーペプチドは、フレキシブルリンカーである。例示的なフレキシブルリンカーは、グリシンポリマー(G)n、グリシン-セリンポリマー(例えば、(GSGGS)n(SEQ ID NO:46)、(GGGS)n(SEQ ID NO:47)、及び(GGGGS)n(SEQ ID NO:48)を含み、ここで、nは少なくとも1の整数である)、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー及び当分野の既知の他のフレキシブルリンカーを含むが、それらに限らない。いくつかの実施形態において、本明細書による膜結合性p40ポリペプチドは、N末端からC末端の方向に、シグナルペプチド、p40、CD8αに由来するヒンジ及び膜貫通ドメイン、並びにCD8αからの任意の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。具体的な実施形態において、本明細書による膜結合性p40ポリペプチドは、SEQ ID NO:37のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、膜結合性p40ポリペプチドは、第3のポリペプチド断片をさらに含む。いくつかの実施形態において、該第3のポリペプチド断片は、ドミナントネガティブ受容体(DNR)である。いくつかの実施形態において、該第3のポリペプチド断片は、TGFβRII DNRである。いくつかの実施形態において、本明細書による膜結合性p40ポリペプチドは、N末端からC末端の方向に、シグナルペプチド、p40、TGFβRII DNR、CD8αに由来するヒンジ及び膜貫通ドメイン、並びにCD8αからの任意の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド19(CCL-19)は、ヒトにおいてCCL19遺伝子によりコードされるタンパク質であり、CKb11、ELC、MIP-3b、MIP3B、SCYA19及びC-Cモチーフケモカインリガンド19とも呼ばれる。いくつかの実施形態において、CCL-19は、OMIM:602227、MGI:5434459、HomoloGene:4569、及び/又はGeneCards:CCL19として同定される。本明細書で使用されるCCL-19は、任意の種からのCCL-19を含む。本明細書で使用されるCCL-19は、その少なくとも一つの生物学的活性(例えば、その生物学的活性のうちの少なくとも80%)を実質的に保持する任意のCCL-19変異体をさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書によるCCL-19は、ヒトCCL-19又はその断片もしくは変異体である。具体的な実施形態において、本明細書によるCCL-19は、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書によるCCL-19は、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書によるCCL-19は、SEQ ID NO:6との約80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含むCCL-19の少なくとも80%の生物学的活性を保持した。
ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド21(CCL-21)は、CCケモカインファミリーに属するサイトカインである。CCL-21は、6Ckine、CKb9、ECL、SCYA21、SLC、TCA4及びC-Cモチーフケモカインリガンド21とも呼ばれる。いくつかの実施形態において、CCL-21は、OMIM:602737、MGI:1349183、HomoloGene:2247、及び/又はGeneCards:CCL21として同定される。本明細書で使用されるCCL-21は、任意の種からのCCL-21を含む。本明細書で使用されるCCL-21は、その少なくとも一つの生物学的活性(例えば、その生物学的活性のうちの少なくとも80%)を実質的に保持する任意のCCL-21変異体をさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書によるCCL-21は、ヒトCCL-21又はその断片もしくは変異体である。具体的な実施形態において、本明細書によるCCL-21は、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書によるCCL-21は、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書によるCCL-21は、SEQ ID NO:22との約80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つSEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含むCCL-21の少なくとも80%の生物学的活性を保持した。
いくつかの実施形態において、本明細書によるp40は、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ本明細書によるCCL-19は、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態において、本明細書によるp40は、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含み、且つ本明細書によるCCL-19は、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書によるp40は、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ本明細書によるCCL-21は、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態において、本明細書によるp40は、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含み、且つ本明細書によるCCL-21は、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含む。
二つの配列(例えば、アミノ酸配列又は核酸配列)の間の同一性パーセントは、数学的アルゴリズムを用いて決定することができる。二つの配列を比較するための数学的アルゴリズムの好ましい非限定的例は、Karlin及びAltschul,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264 2268(1990)のアルゴリズムであり、Karlin及びAltschul,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873 5877(1993)に修正された。このようなアルゴリズムは、Altschulら,J.Mol.Biol.215:403(1990)のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれている。本明細書に記載の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、例えば、スコア=100、ワード長さ=12であるNBLASTヌクレオチドプログラムパラメータセットを用いて、BLASTヌクレオチド検索を実施してもよい。本明細書に記載のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、例えば、スコア50、ワード長さ=3であるXBLASTプログラムパラメータセットを用いて、BLASTタンパク質検索を実施してもよい。比較目的のためのギャップありアライメントを得るために、Altschulら,Nucleic Acids Res.25:3389 3402(1997)に記載されたGapped BLASTを使用することができる。代替的に、PSI BLASTは、分子間の距離関係を検出する反復検索(Id.)に用いられてもよい。BLAST、Gapped BLAST及びPSI Blastプログラムを用いる場合、(例えば、XBLAST及びNBLASTの)対応するプログラムのデフォルトパラメータ(例えば、ワールドワイドウェブのアメリカ国立生物工学情報センター(NCBI)、ncbi.nlm.nih.govを参照されたい)を使用することができる。配列を比較するための数学的アルゴリズムの別の非限定的例は、Myers及びMiller,CABIOS 4:11-17(1998)のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれており、該プログラムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である。ALIGNプログラムを用いてアミノ酸配列のアラインメントを行う場合、PAM120重み残基テーブルを用いることができ、ギャップ長ペナルティは12であり、且つギャップペナルティは4である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のp40、CCL-19及びCCL-21の一つ又は複数のアミノ酸配列改変又は変化が企図される。変化は、元のポリペプチドに対するアミノ酸配列の変更をもたらす、ポリペプチドをコードする一つ又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってもよい。
アミノ酸置換は、セリンでロイシンを置換するように、似ている構造及び/又は化学的特性を有する別のアミノ酸でアミノ酸を置換した結果であってもよく、例えば、保存的アミノ酸置換であってもよい。当業者に周知の標準的技術は、本明細書による分子をコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入するために用いられてもよく、例えば、アミノ酸置換を引き起こす部位特異的変異誘発とPCR媒介性変異誘発とを含む。挿入又は欠失は、任意選択的に、約1~5個のアミノ酸の範囲内であってもよい。いくつかの実施形態において、置換、欠失又は挿入は、元の分子に対して25個未満のアミノ酸置換、20個未満のアミノ酸置換、15個未満のアミノ酸置換、10個未満のアミノ酸置換、5個未満のアミノ酸置換、4個未満のアミノ酸置換、3個未満のアミノ酸置換又は2個未満のアミノ酸置換を含む。具体的な実施形態において、置換は、一つ又は複数の予測された非必須アミノ酸残基において行われた保存的アミノ酸置換である。許容される変化は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に行い、且つ得られた変異体の親ポリペプチドが示す活性を試験することによって決定することができる。
本開示は、保存的アミノ酸置換により産生されたポリペプチドを含む。保存的アミノ酸置換において、アミノ酸残基は、似ている電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基に置換される。以上に記載したように、当分野では、似ている電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーが定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β-分岐側鎖を有するアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。代替的に、突然変異は、全て又は一部のコード配列に沿って、例えば、飽和変異誘発によって、ランダムに導入されてもよく、且つ得られた突然変異体の生物学的活性をスクリーニングして、活性を保持する突然変異体を同定することができる。変異誘発後、コードされたタンパク質を発現することができ、且つタンパク質の活性を測定することができる。特性を保持するか又は著しく変えないために、保存的(例えば、似ている特性及び/又は側鎖を有するアミノ酸群内で)置換を行ってもよい。
アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性に基づいてグループ分けすることができる(例えば、Lehninger,Biochemistry 73-75(第2版,1975)を参照されたい):(1)非極性:Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)、(2)非荷電極性:Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)、(3)酸性:Asp(D)、Glu(E)、及び(4)塩基性:Lys(K)、Arg(R)、His(H)。代替的に、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループ分けすることができる:(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile、(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、(3)酸性:Asp、Glu、(4)塩基性:His、Lys、Arg、(5)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro、及び(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。例えば、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を防止するために、ペプチドの正確な立体配座の維持に関与しない任意のシステイン残基は、例えば、アラニン又はセリンのような別のアミノ酸で置換されてもよい。非保存的置換は、これらのクラスにおける一つのメンバーを別のクラスに交換する必要がある。
アミノ酸配列の挿入は、長さが一つの残基から百個又はそれ以上の残基を含むポリペプチドの範囲内にあるアミノ末端及び/又はカルボキシ末端の融合と、単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入とを含む。変化は、オリゴヌクレオチド媒介性(部位特異的)変異誘発、アラニンスキャニング及びPCR変異誘発のような当分野の既知の方法を用いて行ってもよい。ポリペプチド変異体DNAを産生するために、クローニングされたDNAに対して、部位特異的変異誘発(例えば、Carter,Biochem J.237:1-7(1986)、及びZollerら,Nucl.Acids Res.10:6487-500(1982)を参照されたい)、カセット変異誘発(例えば、Wellsら,Gene 34:315-23(1985)を参照されたい)又は他の既知の技術を行ってもよい。
7.2.2. キメラ抗原受容体
本発明の操作された免疫エフェクター細胞は、一つ又は複数の機能的外因性受容体を発現する。いかなる機能的外因性受容体も本開示に含まれている。キメラ抗原受容体(CAR)は、以下で、本明細書による例示的機能的外因性受容体としてより詳しく説明されるが、本開示の範囲を限定するものではない。
本発明の操作された免疫エフェクター細胞は、一つ又は複数の機能的外因性受容体を発現する。いかなる機能的外因性受容体も本開示に含まれている。キメラ抗原受容体(CAR)は、以下で、本明細書による例示的機能的外因性受容体としてより詳しく説明されるが、本開示の範囲を限定するものではない。
いくつかの実施形態において、本発明の免疫エフェクター細胞におけるCARはポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、(a)細胞外抗原結合ドメインと、(b)膜貫通ドメインと、(c)細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、その各及び別の領域は、以下でより詳しく説明される。
細胞外抗原結合ドメイン
本明細書に記載のCARの細胞外抗原結合ドメインは、一つ又は複数の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書によるCARの細胞外抗原結合ドメインは単一特異性である。他の実施形態において、本明細書によるCARの細胞外抗原結合ドメインは多重特異性である。他の実施形態において、本明細書によるCARの細胞外抗原結合ドメインは一価である。他の実施形態において、本明細書によるCARの細胞外抗原結合ドメインは多価である。いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、二つ又はそれ以上の抗原結合ドメインを含み、これらの抗原結合ドメインは、直接ペプチド結合又はペプチドリンカーを介して互いと融合される。
本明細書に記載のCARの細胞外抗原結合ドメインは、一つ又は複数の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書によるCARの細胞外抗原結合ドメインは単一特異性である。他の実施形態において、本明細書によるCARの細胞外抗原結合ドメインは多重特異性である。他の実施形態において、本明細書によるCARの細胞外抗原結合ドメインは一価である。他の実施形態において、本明細書によるCARの細胞外抗原結合ドメインは多価である。いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、二つ又はそれ以上の抗原結合ドメインを含み、これらの抗原結合ドメインは、直接ペプチド結合又はペプチドリンカーを介して互いと融合される。
いくつかの実施形態において、該細胞外抗原結合ドメインは、抗体又はその断片を含む。例えば、該結合ドメインは、モノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、中和抗体、完全長の又はインタクトなモノクローナル抗体を含む)、マルチエピトープ又はモノエピトープ特異性を有する抗体、ポリクローナル又は一価抗体、多価抗体、少なくとも二つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体(例えば、所望の生物学的活性を呈する限り、二重特異性抗体)、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体及びその断片(例えば、ドメイン抗体)に由来してもよい。抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体及び/又は親和性成熟抗体並びに他の種(例えば、マウス、ウサギ、ラマなど)からの抗体であり得る。いくつかの実施形態において、抗体は、免疫グロブリン系ポリペプチドにおけるB細胞のポリペプチド生成物を含むことが意図され、それは、特定の分子抗原に結合する能力を有し、且つ二つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、ここで各対のポリペプチド鎖は、一本の重鎖(約50~70kDa)と一本の軽鎖(約25kDa)を有し、各本の鎖の各アミノ末端部分が約100~約130個又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含み、且つ各本の鎖の各カルボキシ末端部分が定常領域を含む。例えば、Antibody Engineering(Borrebaeckによる編集,第2版1995)、及びKuby,Immunology(第3版1997)を参照されたい。抗体は、合成抗体、組換えにより産生された抗体、ラクダ科種(例えば、ラマ又はアルパカ)由来を含む単一ドメイン抗体又はそれらのヒト化変異体、イントラボディ、抗イディオタイプ(抗Id)抗体及び上記のいずれかの機能性断片(例えば、抗原結合断片)をさらに含むが、それらに限らず、これらの機能性断片は、抗体重鎖又は軽鎖ポリペプチドの一部を指し、該断片の由来となった抗体の結合活性の一部又は全てを保持している。機能性断片(例えば、抗原結合断片)の非限定的な例としては、一本鎖Fv(scFv)(例えば、単一特異性、二重特異性などを含む)、Fab断片、F(ab’)断片、F(ab)2断片、F(ab’)2断片、ジスルフィド結合により連結されるFv(dsFv)、Fd断片、Fv断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及びミニボディが挙げられる。特に、本明細書による抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、抗原結合ドメイン又は抗原に結合する抗原結合部位を含有する分子(例えば、抗体の一つ又は複数のCDR)を含む。このような抗体断片は、例えば、Harlow及びLane,Antibodies:A Laboratory Manual(1989)、Mol.Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference(Myersによる編集,1995)、Hustonら,1993,Cell Biophysics 22:189-224、Pluckthun及びSkerra,1989,Meth.Enzymol.178:497-515、並びにDay,Advanced Immunochemistry(第2版,1990)を参照することができる。本明細書による抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD及びIgA)又は任意のサブクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)であり得る。抗体は、アゴニスト抗体又はアンタゴニスト抗体であり得る。抗体は、アゴニストでもアンタゴニストでもないものであり得る。
具体的な実施形態において、本発明CARの細胞外抗原結合ドメインは、一本鎖Fv(sFv又はscFv)を含む。scFvは、単一のポリペプチド鎖に連結されるVH及びVL抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、scFvポリペプチドは、VHとVLドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含み、該ポリペプチドリンカーは、sFvが抗原結合のための望ましい構造を形成することを可能にする。Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113巻,Rosenburg及びMooreによる編集,Springer-Verlag,New York,ページ269-315(1994)を参照されたい。
別の具体的な実施形態において、本発明CARの細胞外抗原結合ドメインは、一つ又は複数の単一ドメイン抗体(sdAb)を含む。sdAbは、同じ又は異なる供給源を有し、且つ同じ又は異なるサイズを有してもよい。例示的sdAbは、重鎖のみを有する抗体からの重鎖可変ドメイン(例えば、VHH又はVNAR)、軽鎖を天然に欠いている結合分子、従来の4鎖抗体に由来する単一ドメイン(例えば、VH又はVL)、重鎖のみを有するヒト化抗体、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウス又はラットから産生されたヒト単一ドメイン抗体、並びに操作されたドメイン及び抗体に由来するもの以外の単一ドメイン足場を含むが、それらに限らない。本開示において上記された単一ドメイン抗体を含めて、当分野の既知又は本開示により開発された任意のsdAbは、本明細書に記載のCARの構築に用いることができる。sdAbは、任意の種に由来してもよく、これらの種は、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ラマ、カワヤツメ、サカナ、サメ、ヤギ、ウサギ及びウシを含むが、それらに限らない。本明細書において企図される単一ドメイン抗体は、ラクダ科及びサメ以外の種からの天然に存在する単一ドメイン抗体分子をさらに含む。
いくつかの実施形態において、sdAbに由来する、天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子は、軽鎖を欠く重鎖抗体と呼ばれる(本明細書において「重鎖のみを有する抗体」とも呼ばれる)。例えば、このような単一ドメイン分子は、WO 94/04678及びHamers-Casterman,C.らNature 363:446-448(1993)に開示されている。明確にするために、軽鎖を天然に欠く重鎖分子に由来する可変ドメインは、四鎖免疫グロブリンの従来のVH領域と区別するために、本明細書においてVHHと呼ばれる。このようなVHH分子は、ラクダ科種、例えばラクダ、ラマ、ビクーニャ、ヒトコブラクダ、アルパカ及びグアナコから産生された抗体に由来してもよい。ラクダ科以外の他の種は、軽鎖を天然に欠く重鎖分子を産生することができ、且つこのようなVHHは本開示の範囲内にある。なお、VHHのヒト化型並びに他の改変及び変異体も企図され、本開示の範囲内にある。いくつかの実施形態において、sdAbは、軟骨魚に発見される免疫グロブリンの可変領域に由来する。例えば、sdAbは、サメ血清に発見される、新規抗原受容体(NAR)と呼ばれる免疫グロブリンアイソタイプに由来してもよい。NAR(「IgNAR」)の可変領域に由来する単一ドメイン分子を産生する方法は、WO 03/014161及びStreltsov,Protein Sci.14:2901-2909(2005)に記載されている。
いくつかの実施形態において、天然に存在する、特定の抗原又は標的に対するVHHドメインは、ラクダ科動物VHH配列の(ナイーブ又は免疫)ライブラリーから得ることができる。このような方法は、前記抗原もしくは標的、又はその少なくとも一部、断片、抗原決定基又はエピトープ、一つ又は複数の当分野の既知のスクリーニング技術を用いてこのようなライブラリーをスクリーニングすることに関しても又は関しなくてもよい。このようなライブラリー及び技術は、例えば、WO 99/37681、WO 01/90190、WO 03/025020及びWO 03/035694に記載されている。代替的に、(ナイーブ又は免疫)VHHライブラリーに由来する改善された合成又は半合成ライブラリー、例えば、ランダム変異誘発及び/又はCDRシャッフリングのようなWO 00/43507に記載されている技術によって(ナイーブ又は免疫)VHHライブラリーから得たVHHライブラリーを用いることができる。
いくつかの実施形態において、sdAbは、組換え、CDR移植、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化及び/又はインビトロで産生される(例えば、ファージディスプレイにより選択される)。いくつかの実施形態において、フレームワーク領域のアミノ酸配列は、フレームワーク領域における特定のアミノ酸残基の「ラクダ化」によって変化することができる。ラクダ化は、従来の4鎖抗体の(天然に存在する)VHドメインからのアミノ酸配列のうちの一つ又は複数のアミノ酸残基が、重鎖抗体のVHHドメインにおける一つ又は複数の対応する位置に存在する一つ又は複数のアミノ酸残基に置き換えられるか又は置換されることを指す。これは、当分野の既知のやり方で実施されてもよく、該やり方は当業者にとって明らかである。このような「ラクダ化」置換は、本明細書で定義されるように、VH-VL境界面を形成する及び/又は該VH-VL境界面に存在するアミノ酸位置、及び/又はいわゆるラクダ科標識的残基位置に挿入されることが好ましい(例えば、WO 94/04678、Davies及びRiechmann FEBS Letters 339:285-290(1994)、Davies及びRiechmann,Protein Engineering 9(6):531-537(1996)、Riechmann,J.Mol.Biol.259:957-969(1996)、並びにRiechmann及びMuyldermans,J.Immunol.Meth.231:25-38(1999)を参照されたい)。
いくつかの実施形態において、sdAbは、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウス又はラットにより産生されたヒト単一ドメイン抗体である。例えば、US 20090307787、米国特許第8,754,287号、US 20150289489、US 20100122358及びWO 2004049794を参照されたい。
いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、従来の四鎖抗体により産生される。例えば、EP 0 368 684、Wardら,Nature,341(6242):544-6(1989)、Holtら,Trends Biotechnol.,21(11):484-490(2003)、WO 06/030220、及びWO 06/003388を参照されたい。
いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、ヒト化抗体又はその断片を含む。ヒト化抗体は、ヒトフレームワーク領域とヒト定常領域配列とを含んでもよい。
ヒト化抗体は、当分野の既知の様々な技術を用いて産生することができ、CDR移植(欧州特許番号EP 239,400、国際公開番号WO 91/09967、及び米国特許第5,225,539号、同第5,530,101号及び同第5,585,089号)、ベニヤリング(veneering)又は再現化(resurfacing)(欧州特許番号EP 592,106及びEP 519,596、Padlan,1991,Molecular Immunology 28(4/5):489-498、Studnickaら,1994,Protein Engineering 7(6):805-814、及びRoguskaら,1994,PNAS 91:969-973)、鎖シャッフリング(米国特許第5,565,332号)、及び例えば、以下に開示される技術を含むが、それらに限らない:米国特許第6,407,213号、米国特許第5,766,886号、WO 93/17105、Tanら,J.Immunol.169:1119 25(2002)、Caldasら,Protein Eng.13(5):353-60(2000)、Moreaら,Methods 20(3):267 79(2000)、Bacaら,J.Biol.Chem.272(16):10678-84(1997)、Roguskaら,Protein Eng.9(10):895 904(1996)、Coutoら,Cancer Res.55(23増刊):5973s-5977s(1995)、Coutoら,Cancer Res.55(8):1717-22(1995)、Sandhu JS,Gene 150(2):409-10(1994)、及びPedersenら,J.Mol.Biol.235(3):959-73(1994)。さらに、米国特許第US 2005/0042664 A1号(2005年2月24日)を参照されたく、そのうちの各々は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法は、当分野の既知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒト由来から導入された一つ又は複数のアミノ酸残基を有してもよい。これらの非ヒトアミノ酸残基は、通常、「インポート」残基と呼ばれ、これらの残基は、典型的に、「インポート」可変ドメインから取られる。例えば、ヒト化は、以下の方法に従って、超可変領域配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって実施され得る:Jonesら,1986,Nature 321:522-25、Riechmannら,1988,Nature 332:323-27、及びVerhoeyenら,1988,Science 239:1534-36。
いくつかの場合に、ヒト化抗体は、CDR移植により構築され、ここで、親非ヒト抗体(例えば、齧歯動物)の六つのCDRのアミノ酸配列は、ヒト抗体フレームワークに移植される。例えば、Padlanらは、抗原に実際に接触するのがCDR中の残基の約三分の一のみであることを明らかにし、これらを「特異性決定残基」又はSDR(Padlanら,1995,FASEB J.9:133-39)と呼んだ。SDR移植技術において、SDR残基のみがヒト抗体フレームワークに移植される(例えば、Kashmiriら,2005,Methods 36:25-34を参照されたい)。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を作製するためのヒト(軽鎖及び重鎖)可変ドメインの選択が重要となり得る。例えば、いわゆる「最良適合」方法により、周知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対して非ヒト(例えば、齧歯動物)抗体の可変ドメインの配列をスクリーニングする。齧歯動物に最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワークとして選択してもよい(Simsら,1993,J.Immunol.151:2296-308、及びChothiaら,1987,J.Mol.Biol.196:901-17)。別の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを用いる。同じフレームワークは、いくつかの異なるヒト化抗体に用いることができる(Carterら,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-89、及びPrestaら,1993,J.Immunol.151:2623-32)。いくつかの場合に、フレームワークは、最も豊富なヒトサブクラスVL6サブグループI(VL6I)及びVHサブグループIII(VHIII)のコンセンサス配列に由来する。別の方法では、ヒト生殖系列遺伝子は、フレームワーク領域の供給源として用いられる。
CDRの比較に基づく代替的なパラダイムでは、超ヒト化と呼ばれ、FRの相同性は無関係である。該方法は、非ヒト配列と機能的ヒト生殖系列遺伝子レパートリーとの比較からなる。そして、マウス配列と同じ又は近縁のカノニカル構造をコードする遺伝子を選択する。続いて、非ヒト抗体とカノニカル構造を共有する遺伝子において、CDR内で最も高い相同性を有する遺伝子をFRドナーとして選択する。最後に、非ヒトCDRをこれらのFRに移植する(例えば、Tanら,2002,J.Immunol.169:1119-25を参照されたい)。
さらに、通常、抗原に対するその親和性及び他の有利に作用する生物学的特性を保持するために抗体をヒト化することが望ましい。該目標を実現するために、一つの方法によれば、親及びヒト化配列の三次元モデルを用いて親配列及び様々な概念的ヒト化生成物を分析する方法によってヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは、一般的に入手可能であり、且つ当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の三次元立体配座構造を説明し表示するコンピュータプログラムを得ることができる。これらは、例えば、WAM(Whitelegg及びRees,2000,Protein Eng.13:819-24)、Modeller(Sali及びBlundell,1993,J.Mol.Biol.234:779-815)及びSwiss PDB Viewer(Guex及びPeitsch,1997,Electrophoresis 18:2714-23)を含む。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な作用の分析、例えば、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析を可能にする。このように、受容体及びインポート配列からFR残基を選択し組み合わせることによって、一つ又は複数の標的抗原に対する親和性の増加のような、必要な抗体特徴を得ることができる。通常、抗原結合に影響を与える点では、超可変領域残基は直接且つ最も顕著に関与する。
別の抗体ヒト化方法は、ヒトストリングコンテント(Human String Content、HSC)と呼ばれる抗体ヒト化度の計量に基づく。該方法は、マウス配列をヒト生殖系列遺伝子レパートリーと比較し、その差異をHSCとしてスコア化する。そして、大域的な同一性尺度を用いるのではなく、そのHSCを最大にすることによって、標的配列をヒト化して、複数の異なるヒト化変異体を産生する(Lazarら,2007,Mol.Immunol.44:1986-98)。
上記方法に加えて、ヒト化抗体を産生し選択するために経験的方法も使用され得る。これらの方法は、ヒト化変異体の大規模ライブラリーの作成及びエンリッチメント技術又はハイスループットスクリーニング技術を用いた最適なクローンの選択に基づく方法を含む。抗体変異体は、ファージ、リボソーム及び酵母ディスプレイライブラリーから並びに細菌コロニースクリーニングにより単離され得る(例えば、Hoogenboom,2005,Nat.Biotechnol.23:1105-16、Dufnerら,2006,Trends Biotechnol.24:523-29、Feldhausら,2003,Nat.Biotechnol.21:163-70、及びSchlapschyら,2004,Protein Eng.Des.Sel.17:847-60を参照されたい)。
FRライブラリー方法において、FR内の特定の位置に一纏まりの残基変異体を導入し、そしてライブラリーのスクリーニングにより、移植されたCDRを最良に支持するFRを選択する。置換対象残基は、CDR構造に寄与する可能性があると同定される「バーニア」残基の一部又は全部(例えば、Foote及びWinter,1992,J.Mol.Biol.224:487-99)、又はBacaら(1997,J.Biol.Chem.272:10678-84)の同定からのより限定的な一組の標的残基を含んでもよい。
FRシャッフリングにおいて、FR全体は、選択された残基変異体のコンビナトリアルライブラリーを作成することなく、非ヒトCDRと組み合わせる(例えば、Dall’Acquaら,2005,Methods 36:43-60を参照されたい)。ライブラリーは、結合するために2段階のプロセス(まずはVLヒト化、次にVH)においてスクリーニングされ得る。代替的に、ワンステップFRシャッフリングプロセスを用いてもよい。このような方法は、得られた抗体が、増強した発現、増加した親和性及び熱安定性を含む、改善された生物化学的及び物理化学的特性を示すため、2段階のスクリーニングよりも有効であることが証明される、(例えば、Damschroderら,2007,Mol.Immunol.44:3049-60を参照されたい)。
「ヒューマニアリング(humaneering)」方法は、必須の最小特異性決定基(minimum specificity determinant、MSD)の実験的同定に基づき、ヒトFRライブラリーへの非ヒト断片の逐次置き換え及び結合の評価に基づく。それは、非ヒトVH及びVL鎖のCDR3領域から開始し、VH及びVLのCDR1及びCDR2を含む非ヒト抗体の他の領域を次第に置換してヒトFRに入る。該方法は、通常、エピトープが、異なるヒトVセグメントCDRを有する複数のサブクラスからの抗体を保持し同定することを引き起こす。ヒューマニアリングは、ヒト生殖系列遺伝子抗体との91%~96%の相同性を有する抗体の単離を可能にする(例えば、Alfreito,Cambridge Healthtech Instituteの第3回年度PEGS,The Protein Engineering Summit,2007を参照されたい)。
「ヒト操作(human engineering)」方法は、抗体のアミノ酸配列に対して特異的な変更を行って非ヒト抗体又は抗体断片(例えば、マウスもしくはキメラ抗体又は抗体断片)を変化させることによって、ヒトにおいて低下した免疫原性を有する改変された抗体を産生することに関し、該改変された抗体は、元の非ヒト抗体の必要な結合特性を依然として保持している。通常、該技術は、非ヒト(例えば、マウス)抗体のアミノ酸残基を「低リスク」、「中間リスク」又は「高リスク」残基に分類することに関する。分類は、全体的リスク/リターン計算を用いて行われ、該計算は、特定の置換(例えば、ヒトの免疫原性に対する)の予測利益、及び置換が得られた抗体の折り畳みに影響を及ぼすリスクを評価する。非ヒト抗体可変領域からのアミノ酸配列を、特定又はコンセンサスヒト抗体の配列の対応する領域とアラインメントすることにより、非ヒト(例えば、マウス)抗体配列の所与の位置(例えば、低リスク又は中間リスク)において置換されることになる特定のヒトアミノ酸残基を選択することができる。非ヒト配列における低リスク又は中間リスク位置のアミノ酸残基は、アラインメントによりヒト抗体配列における対応する残基を置換することができる。ヒト操作タンパク質を作製するための技術については、Studnickaら,1994,Protein Engineering 7:805-14、米国特許第5,766,886、同第5,770,196号、同第5,821,123号及び同第5,869,619号、並びにPCT公開WO 93/11794に更に詳細に記載されている。
複合ヒト抗体は、例えば、Composite Human Antibody(商標)技術(Antitope Ltd.,Cambridge,United Kingdom)を用いて産生され得る。複合ヒト抗体を産生するために、T細胞エピトープを回避するように複数のヒト抗体可変領域配列の断片から可変領域配列を設計することによって、得られた抗体の免疫原性を最小限する。このような抗体は、ヒト定常領域配列、例えば、ヒト軽鎖及び/又は重鎖定常領域を含んでもよい。
脱免疫化抗体は、その中のT細胞エピトープが除去された抗体である。脱免疫化抗体を作製するための方法が記載されている。例えば、Jonesら,Methods Mol Biol.2009;525:405-23,xiv及びDe Grootら,Cell.Immunol.244:148-153(2006)を参照されたい。脱免疫化抗体は、T細胞エピトープが欠失している可変領域及びヒト定常領域を含む。簡単に説明すると、抗体のVH及びVLをクローニングし、続いてT細胞増殖アッセイにおいて抗体VH及びVLに由来するオーバーラップペプチドを試験することによってT細胞エピトープを同定する。コンピュータ方法によってT細胞エピトープを同定してヒトMHC IIクラスに結合するペプチドを同定する。VH及びVLに突然変異を導入してヒトMHC IIクラスとの結合を除去する。そして、突然変異したVH及びVLを用いて脱免疫化抗体を産生する。
いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、複数の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、多重特異性抗体又はその断片を含み、例えば、細胞外抗原結合ドメインは、直列に接続された複数の結合ドメイン(例えば、複数のscFv)を含む。他の実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、多価抗体又はその断片を含む。用語「特異性」は、抗原結合タンパク質による抗原特定エピトープに対する選択的認識を指す。本明細書で使用されるように、用語「多重特異性」は、抗原結合タンパク質が二つ又はそれ以上の抗原結合部位を有することを示し、ここで、少なくとも二つが異なる抗原に結合する。本明細書で使用されるように、用語「価」は、抗原結合タンパク質に指定された数の結合部位が存在することを示す。全長抗体は、二つの結合部位であり、且つ二価である。このように、用語「三価」、「四価」、「五価」及び「六価」はそれぞれ、抗原結合タンパク質に二つの結合部位、三つの結合部位、四つの結合部位、五つの結合部位及び六つの結合部位が存在することを示す。
二重特異性抗体のような多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対して結合特異性を有する抗体である。二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖ペアを共発現するような、多重特異性抗体を作製するための方法は、当分野の既知のものであり、ここで、二つの重鎖は異なる特異性を有する(例えば、Milstein及びCuello,1983,Nature 305:537-40を参照されたい)。多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)の産生の更なる詳細については、例えば、二重特異性抗体(Kontermannによる編集,2011)を参照されたい。
抗体は、二つ又はそれ以上の抗原結合部位を有する多価抗体(例えば、四価抗体)であり、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により該抗体を容易に産生することができる。いくつかの実施形態において、多価抗体は、三個から約八個の抗原結合部位を含む(又は三個から約八個の抗原結合部位で構成される)。このような実施形態において、多価抗体は、四つの抗原結合部位を含む(又は四つの抗原結合部位で構成される)。多価抗体は、少なくとも一本のポリペプチド鎖(例えば、二本のポリペプチド鎖)を含み、ここで、一本又は複数本のポリペプチド鎖は、二つ又はそれ以上の可変ドメインを含む。例えば、一本又は複数本のポリペプチド鎖は、VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fcを含んでもよく、ここで、VD1は第1の可変ドメインであり、VD2は第2の可変ドメインであり、FcはFc領域の一本のポリペプチド鎖であり、X1及びX2はアミノ酸又はポリペプチドを示し、且つnは0又は1である。例えば、一本又は複数本のポリペプチド鎖は、VH-CH1-フレキシブルリンカー-VH-CH1-Fc領域鎖、又はVH-CH1-VH-CH1-Fc領域鎖を含んでもよい。本明細書における多価抗体は、少なくとも二つ(例えば、四つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含んでもよい。例えば、本明細書における多価抗体は、約二つから約八つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含んでもよい。本明細書で企図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、且つ任意選択的にCLドメインを含む。
本発明CARの細胞外抗原結合ドメインに複数の結合ドメインが存在する場合に、様々なドメインは、ペプチドリンカーを介して互いと融合されることができる。いくつかの実施形態において、ドメインは、いかなるペプチドリンカーもなしに、直接互いと融合される。ペプチドリンカーは、同じであってもよいか、又は異なってもよい。各ペプチドリンカーは、様々なドメインの構造及び/又は機能的特徴に応じて、同じ又は異なる長さ及び/又は配列を有してもよい。各ペプチドリンカーは、独立して選択され、最適化され得る。CARに使用される一つ又は複数のペプチドリンカーの長さ、柔軟度及び/又は他の特性は、特性に何らかの影響を与える可能性があり、一つ又は複数の特定抗原又はエピトープに対する親和性、特異性又はアビディティを含むが、それらに限らない。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、フレキシブル残基(例えば、グリシン及びセリン)を含み、それによって隣接するドメインは、互いに自由に移動する。例えば、グリシン-セリン二剤は、適切なペプチドリンカーであってもよい。
ペプチドリンカーは、天然に存在する配列又は非天然に存在する配列を有してもよい。例えば、重鎖のみを有する抗体に由来するヒンジ領域の配列は、リンカーとして用いられてもよい。例えばWO 1996/34103を参照されたい。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、フレキシブルリンカーである。例示的フレキシブルリンカーは、グリシンポリマー(G)n、グリシン-セリンポリマー(例えば、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:46)、(GGGS)n(SEQ ID NO:47)及び(GGGGS)n(SEQ ID NO:48)を含み、ここで、nは少なくとも1の整数である)、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー及び当分野の既知の他のフレキシブルリンカーを含むが、それらに限らない。例えば、以下に記載の当分野の既知の他のリンカーは、本明細書によるCARに含まれていてもよい:WO 2016014789、WO 2015158671、WO 2016102965、US 20150299317、WO 2018067992、US 7741465、Colcherら,J.Nat.Cancer Inst.82:1191-1197(1990)、及びBirdら,Science 242:423-426(1988)、ここで、各開示内容は、参照により本明細書に援用される。
いくつかの実施形態において、本発明のCARにおいて提供される細胞外抗原結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞における細胞表面マーカーとして作用する抗原を認識する。いくつかの実施形態において、抗原は腫瘍抗原である。腫瘍は、免疫応答(特にT細胞媒介性免疫応答)の標的抗原として作用できるタンパク質を発現する。CARが標的とする抗原は、単一の病変細胞における抗原、又はそれぞれ疾患に影響を与える異なる細胞で発現する抗原である。CARが標的とする抗原は、疾患に直接又は間接的に関与する可能性がある。
いくつかの実施形態において、標的細胞の抗原は、がん細胞表面における抗原である。いくつかの実施形態において、該抗原は、腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原又は新生抗原である。
いくつかの実施形態において、標的細胞はがん細胞であり、例えば、以下のがんの細胞である:副腎がん、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、妊娠性絨毛がん、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、腸がん、腎臓がん、白血病、肝臓がん、肺がん、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫(MM)、神経内分泌腫瘍、非ホジキンリンパ腫、口腔がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、副鼻腔がん、皮膚がん、軟部組織肉腫、脊椎がん、胃がん、精巣がん、咽頭がん、甲状腺がん、子宮がん、子宮内膜がん、膣がん又は外陰がん。いくつかの実施形態において、がんは、副腎がん、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、妊娠性絨毛がん、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、腸がん、腎臓がん、白血病、肝臓がん、肺がん、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫(MM)、神経内分泌腫瘍、非ホジキンリンパ腫、口腔がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、副鼻腔がん、皮膚がん、軟部組織肉腫、脊椎がん、胃がん、精巣がん、咽頭がん、甲状腺がん、子宮がん、子宮内膜がん、膣がん又は外陰がんである。いくつかの実施形態において、がんは、副腎がんである。いくつかの実施形態において、がんは、肛門がんである。いくつかの実施形態において、がんは、虫垂がんである。いくつかの実施形態において、がんは、胆管がんである。いくつかの実施形態において、がんは、膀胱がんである。いくつかの実施形態において、がんは、骨がんである。いくつかの実施形態において、がんは、脳がんである。いくつかの実施形態において、がんは、乳がんである。いくつかの実施形態において、がんは、子宮頸がんである。いくつかの実施形態において、がんは、結腸直腸がんである。いくつかの実施形態において、がんは、食道がんである。いくつかの実施形態において、がんは、胆嚢がんである。いくつかの実施形態において、がんは、妊娠性絨毛がんである。いくつかの実施形態において、がんは、頭頸部がんである。いくつかの実施形態において、がんは、ホジキンリンパ腫である。いくつかの実施形態において、がんは、腸がんである。いくつかの実施形態において、がんは、腎臓がんである。いくつかの実施形態において、がんは、白血病である。いくつかの実施形態において、がんは、肝臓がんである。いくつかの実施形態において、がんは、肺がんである。いくつかの実施形態において、がんは、黒色腫である。いくつかの実施形態において、がんは、中皮腫である。いくつかの実施形態において、がんは、多発性骨髄腫(MM)である。いくつかの実施形態において、がんは、神経内分泌腫瘍である。いくつかの実施形態において、がんは、非ホジキンリンパ腫である。いくつかの実施形態において、がんは、口腔がんである。いくつかの実施形態において、がんは、卵巣がんである。いくつかの実施形態において、がんは、膵臓がんである。いくつかの実施形態において、がんは、前立腺がんである。いくつかの実施形態において、がんは、副鼻腔がんである。いくつかの実施形態において、がんは、皮膚がんである。いくつかの実施形態において、がんは、軟部組織肉腫、脊椎がんである。いくつかの実施形態において、がんは、胃がんである。いくつかの実施形態において、がんは、精巣がんである。いくつかの実施形態において、がんは、咽頭がんである。いくつかの実施形態において、がんは、甲状腺がんである。いくつかの実施形態において、がんは、子宮がん、子宮内膜がんである。いくつかの実施形態において、がんは、膣がんである。いくつかの実施形態において、がんは、外陰がんである。
いくつかの実施形態において、副腎がんは、副腎皮質がん(ACC)、副腎皮質がん、褐色細胞腫又は神経芽細胞腫である。いくつかの実施形態において、肛門がんは、扁平上皮がん、総排泄腔がん、腺がん、基底細胞がん又は黒色腫である。いくつかの実施形態において、虫垂がんは、神経内分泌腫瘍(NET)、粘液腺がん、杯細胞カルチノイド、腸腺がん又は印環細胞型腺がんである。いくつかの実施形態において、胆管がんは、肝外胆管がん、腺がん、肝門部胆管がん、肝門領域胆管がん、遠位胆管がん又は肝内胆管がんである。いくつかの実施形態において、膀胱がんは、移行上皮がん(TCC)、乳頭状がん、扁平がん、扁平上皮がん、腺がん、小細胞がん又は肉腫である。いくつかの実施形態において、骨がんは、原発性骨がん、肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、肉腫、繊維肉腫、悪性繊維性組織球腫、骨巨細胞腫、脊索腫又は転移性骨がんである。いくつかの実施形態において、脳がんは、星細胞腫、脳幹神経膠腫、膠芽腫、髄膜腫、上衣細胞腫、乏突起神経膠腫、混合神経膠腫、下垂体腺がん、下垂体腺瘤、頭蓋咽頭腫、胚細胞腫瘍、松果体部腫瘍、髓芽細胞腫又は原発性CNSリンパ腫である。いくつかの実施形態において、乳がんは、乳腺がん、浸潤性乳がん、非浸潤性乳がん、乳房肉腫、化生性がん、腺様嚢胞がん、叶状腫瘍、血管肉腫、HER2陽性乳がん、トリプルネガティブ乳がん又は炎症性乳がんである。いくつかの実施形態において、子宮頸がんは、扁平上皮がん又は腺がんである。いくつかの実施形態において、結腸直腸がんは、結腸直腸腺がん、原発性結腸直腸リンパ腫、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫、カルチノイド腫瘍、粘液腺がん、印環細胞型腺がん、消化管カルチノイド腫瘍又は黒色腫である。いくつかの実施形態において、食道がんは、腺がん又は扁平上皮がんである。いくつかの実施形態において、胆嚢がんは、腺がん、乳頭状腺がん、腺扁平上皮がん、扁平上皮がん、小細胞がん又は肉腫である。いくつかの実施形態において、妊娠性絨毛疾患(GTD)は、胞状奇胎、妊娠性絨毛腫瘍(GTN)、絨毛がん、胎盤部トロホブラスト腫瘍(PSTT)又は類上皮性トロホブラスト腫瘍(ETT)である。いくつかの実施形態において、頭頸部がんは、喉頭がん、鼻咽頭がん、下咽頭がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、唾液腺がん、口腔がん、中咽頭がん又は扁桃がんである。いくつかの実施形態において、ホジキンリンパ腫は、古典的ホジキンリンパ腫、結節性硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型、リンパ球減少型又は結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫(NLPHL)である。いくつかの実施形態において、腸がんは、小腸がん(small intestine cancer)、小腸がん(small bowel cancer)、腺がん、肉腫、消化管間質腫瘍、カルチノイド腫瘍又はリンパ腫である。いくつかの実施形態において、腎臓がんは、腎細胞がん(RCC)、淡明細胞型RCC、乳頭状RCC、嫌色素性RCC、集合管RCC、未分類RCC、移行上皮がん、尿路上皮がん、腎盂がん又は腎肉腫である。いくつかの実施形態において、白血病は、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、有毛細胞白血病(HCL)又は骨髄異形成症候群(MDS)である。具体的な実施形態において、白血病はAMLである。いくつかの実施形態において、肝臓がんは、肝細胞がん(HCC)、繊維層板様HCC、胆管がん、血管肉腫又は肝転移である。いくつかの実施形態において、肺がんは、小細胞肺がん、小細胞がん、複合小細胞がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、扁平上皮肺がん、大細胞性未分化がん、肺結節、転移性肺がん、腺扁平上皮がん、大細胞神経内分泌がん、唾液腺型肺がん、肺カルチノイド、中皮腫、肺肉腫様がん又は悪性顆粒細胞肺腫瘍である。いくつかの実施形態において、黒色腫は、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、末端黒子型黒色腫、悪性黒子型、無色素性黒色腫、結合組織増殖性黒色腫、眼黒色腫又は転移性黒色腫である。いくつかの実施形態において、中皮腫は、胸膜中皮腫、腹膜中皮腫、心膜中皮腫又は精巣中皮腫である。いくつかの実施形態において、多発性骨髄腫は、症候性骨髄腫又はくすぶり型骨髄腫である。いくつかの実施形態において、神経内分泌腫瘍は、消化管神経内分泌腫瘍、膵臓神経内分泌腫瘍又は肺神経内分泌腫瘍である。いくつかの実施形態において、非ホジキンリンパ腫は、未分化大細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、末梢T細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、MALTリンパ腫、小細胞リンパ球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病(CLL)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、前駆体Tリンパ芽球性白血病/リンパ腫、急性リンパ球性白血病(ALL)、成人T細胞リンパ腫/白血病(ATLL)、有毛細胞白血病、B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL)、原発性縦隔B細胞性リンパ腫、中枢神経系原発(CNS)リンパ腫、マントル細胞リンパ腫(MCL)、辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織(MALT)リンパ腫、節内性辺縁帯B細胞リンパ腫、脾辺縁帯B細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、B細胞非ホジキンリンパ腫、T細胞非ホジキンリンパ腫、ナチュラルキラー細胞リンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、アリバート-バザン(Alibert-Bazin)症候群、セザリー症候群(Sezary syndrome)、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫、末梢T細胞リンパ腫、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫(AITL)、未分化大細胞リンパ腫(ALCL)、全身性ALCL、腸疾患関連T細胞リンパ腫(EATL)又は肝脾γ/δ T細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態において、口腔がんは、扁平上皮がん、疣状がん、小唾液腺がん、リンパ腫、良性口腔腫瘍、好酸球性肉芽腫症、繊維腫、顆粒細胞腫、角化棘細胞腫、平滑筋腫、骨軟骨瘤、脂肪腫、神経鞘腫、神経繊維腫、乳頭状瘤、尖圭コンジローマ、疣状黄色腫、化膿性肉芽腫、横紋筋腫、歯原性腫瘍、白斑、紅斑、扁平上皮口唇がん、基底細胞口唇がん、口がん、歯肉がん又は舌がんである。いくつかの実施形態において、卵巣がんは、上皮性卵巣がん、粘液性上皮卵巣がん、子宮内膜様上皮卵巣がん、上皮性卵巣淡明細胞がん、未分化上皮性卵巣がん、卵巣低悪性度腫瘍、原発性腹膜がん、卵管がん、胚細胞腫、奇形腫、未分化胚細胞腫、卵巣胚細胞がん、内胚葉洞腫瘍、性索-間質性腫瘍、性索-性腺間質性腫瘍、卵巣間質性腫瘍、顆粒細胞腫、顆粒-卵胞膜細胞腫、セルトリ-ライデッヒ細胞腫(Sertoli-Leydig tumor)、卵巣肉腫、卵巣がん肉腫、卵巣腺肉腫、卵巣平滑筋肉腫、卵巣繊維肉腫、クルーケンベルグ腫瘍(Krukenberg tumor)又は卵巣嚢胞である。いくつかの実施形態において、膵臓がんは、膵外分泌腺がん、膵内分泌腺がん又は膵臓腺がん、膵島細胞腫又は神経内分泌腫瘍である。いくつかの実施形態において、前立腺がんは、前立腺腺がん、前立腺肉腫、移行上皮がん、小細胞がん又は神経内分泌腫瘍である。いくつかの実施形態において、副鼻腔がんは、扁平上皮がん、粘膜細胞がん、腺様嚢胞がん 、腺房細胞がん、鼻副鼻腔未分化がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、上顎洞がん、篩骨洞がん又は鼻咽頭がんである。いくつかの実施形態において、皮膚がんは、基底細胞がん、扁平上皮がん、黒色腫、メルケル細胞がん(Merkel cell carcinoma)、カポジ肉腫(KS)、光線性角化症、皮膚リンパ腫又は角化棘皮瘤である。いくつかの実施形態において、軟部組織がんは、血管肉腫、皮膚繊維肉腫、上皮様肉腫、ユーイング肉腫(Ewing’s sarcoma)、繊維肉腫、消化管間質腫瘍(GIST)、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、脱分化型脂肪肉腫(DL)、粘液型/円形細胞脂肪肉腫(MRCL)、脂肪腫様脂肪肉腫(WDL)、悪性繊維性組織球腫、神経繊維肉腫、肉腫肉腫(RMS)又は滑膜肉腫である。いくつかの実施形態において、脊椎がんは、転移性脊椎腫瘍である。いくつかの実施形態において、胃がんは、胃腺がん、胃リンパ腫、消化管間質腫瘍、カルチノイド腫瘍、胃カルチノイド腫瘍、I型ECL細胞カルチノイド、II型ECL細胞カルチノイド又はIII型ECL細胞カルチノイドである。いくつかの実施形態において、精巣がんは、精上皮腫、非精上皮腫、胎児がん、卵黄嚢がん、絨毛がん、畸胎瘤、性腺間質性腫瘍、精巣ライデッヒ細胞腫又は精巣セルトリ細胞腫である。いくつかの実施形態において、咽頭がんは、扁平上皮がん、腺がん、肉腫、喉頭がん、咽頭がん、鼻咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん、喉頭がん、喉頭扁平上皮がん、喉頭腺がん、リンパ上皮腫、紡錘細胞がん、疣状がん、未分化がん又はリンパ節がんである。いくつかの実施形態において、甲状腺がんは、乳頭状がん、濾胞がん、ヒュルトレ細胞がん、甲状腺髄様がん又は未分化がんである。いくつかの実施形態において、子宮がんは、子宮内膜がん、子宮内膜腺がん、子宮内膜様がん、漿液性腺がん、腺扁平上皮がん、子宮がん肉腫、子宮肉腫、子宮平滑筋肉腫、子宮内膜間質肉腫又は未分化肉腫である。いくつかの実施形態において、膣がんは、扁平上皮がん、腺がん、黒色腫又は肉腫である。いくつかの実施形態において、外陰がんは、扁平上皮がん又は腺がんである。
腫瘍抗原は、免疫応答、特にT細胞媒介性免疫応答の腫瘍細胞により産生されたタンパク質である。例示的腫瘍抗原は、神経膠腫関連抗原、がん胎児性抗原(CEA)、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α-フェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、甲状腺グロブリン、RAGE-1、MN-CAIX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸管カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、前立腺酵素、前立腺特異抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、プロスタグランジン、PSMA、HER2/neu、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺がん腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、インスリン様成長因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受容体及びメソテリンを含むが、それらに限らない。
いくつかの実施形態において、がん抗原は、CEA、未熟ラミニン受容体、TAG-72、HPV E6、HPV E7、BING-4、カルシウム活性化クロライドチャネル2、サイクリン-B1、9D7、EpCAM、EphA3、Her2/neu、テロメラーゼ、メソテリン、SAP-1、サバイビン、BAGEファミリー抗原、CAGEファミリー抗原、GAGEファミリー抗原、MAGEファミリー抗原、SAGEファミリー抗原、XAGEファミリー抗原、NY-ESO-1/LAGE-1、PRAME、SSX-2、Melan-A、MART-1、Gp100、pmel17、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、P.ポリペプチド、MC1R、前立腺特異抗原、β-カテニン、BRCA1、BRCA2、CDK4、CML66、フィブロネクチン、MART-2、p53、Ras、TGF-βRII又はMUC1である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、CEAである。いくつかの実施形態において、がん抗原は、未熟ラミニン受容体である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、TAG-72である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、HPV E6である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、HPV E7である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、BING-4である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、カルシウム活性化クロライドチャネル2である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、サイクリン-B1である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、9D7である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、EpCAMである。いくつかの実施形態において、がん抗原は、EphA3である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、Her2/neuである。いくつかの実施形態において、がん抗原は、テロメラーゼである。いくつかの実施形態において、がん抗原は、メソテリンである。いくつかの実施形態において、がん抗原は、SAP-1である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、サバイビンである。いくつかの実施形態において、がん抗原は、BAGEファミリー抗原である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、CAGEファミリー抗原である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、GAGEファミリー抗原である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、MAGEファミリー抗原である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、SAGEファミリー抗原である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、XAGEファミリー抗原である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、NY-ESO-1/LAGE-1である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、PRAMEである。いくつかの実施形態において、がん抗原は、SSX-2である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、Melan-Aである。いくつかの実施形態において、がん抗原は、MART-1である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、Gp100である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、pmel17である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、チロシナーゼである。いくつかの実施形態において、がん抗原は、TRP-1である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、TRP-2である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、P.ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、がん抗原は、MC1Rである。いくつかの実施形態において、がん抗原は、前立腺特異抗原である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、β-カテニンである。いくつかの実施形態において、がん抗原は、BRCA1である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、BRCA2である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、CDK4である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、CML66である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、フィブロネクチンである。いくつかの実施形態において、がん抗原は、MART-2である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、p53である。いくつかの実施形態において、がん抗原は、Rasである。いくつかの実施形態において、がん抗原は、TGF-βRIIである。いくつかの実施形態において、がん抗原は、MUC1である。
いくつかの実施形態において、該腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する一つ又は複数の抗原がんエピトープである。悪性腫瘍は、免疫チャレンジとして用いられ得る標的抗原の多くのタンパク質を発現する。これらの分子は、組織特異性抗原、例えば、黒色腫におけるMART-1、チロシナーゼ及びgp100、並びに前立腺がんにおける前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)及び前立腺特異抗原(PSA)を含むが、それらに限らない。他の標的分子は、がん遺伝子HER2/Neu/ErbB-2のような形質転換に関連する分子群に属する。標的抗原のさらなる群は、がん胎児性抗原(CEA)のようながん胎児性抗原である。
いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、腫瘍特異性抗原(TSA)又は腫瘍関連抗原(TAA)である。TSAは、腫瘍細胞に特有のものであり、且つ体内の他の細胞には存在しない。TAA関連抗原は、腫瘍細胞に特有のものではなく、逆に抗原に対する免疫寛容状態を誘導できない条件下で正常な細胞で発現することもできる。腫瘍での抗原の発現は、免疫系による抗原に対する応答を可能にする条件下で発生し得る。TAAは、免疫系が未熟で応答不能な胚発生中に正常な細胞で発現する抗原であり得るか、又は正常細胞で通常極めて低いレベルで正常に存在するが、腫瘍細胞で遙かに高いレベルで発現する抗原であり得る。
TSA又はTAA抗原の非限定的例としては、MART-1/MelanA(MART-I)、gp 100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2のような分化抗原、及びMAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5のような腫瘍特異性多重系統抗原、CEAのような過剰発現の胎児性抗原、p53、Ras、HER2/neuのような過剰発現のがん遺伝子及び突然変異的した腫瘍抑制遺伝子、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RARのような染色体転座により産生された独特の腫瘍抗原、並びにエプスタイン-バールウイルス抗原EBVA及びヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6とE7のようなウイルス抗原が挙げられる。
タンパク質に基づく他の大型の抗原は、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2結合タンパク質\シクロフィリンC関連タンパク質、TAAL6、TAG72、TLP及びTPSを含む。
本明細書によるCARの他の非限定的例示的標的としては、GPC2、CD276、δ様タンパク質リガンド3(DLL3)、NY-ESO-1、黒色腫関連抗原4、サバイビン、滑膜肉腫Xブレークポイント2タンパク質、CD3、上皮成長因子受容体(EGFR)、erbb2チロシンキナーゼ受容体、HER2、CEA、CD66、CD66e、ROR1、ntrkr1チロシンキナーゼ受容体、GPC3、クローディン18.2、メソテリン、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼII、PMSA、PD-L1、葉酸受容体α、PSCA、ムチン1、HLA抗原(例えば、HLAクラスI抗原A-2 α、HLA クラスI抗体A-11α及びHLA クラスII抗原)、c-Met、肝細胞成長因子受容体、K-Ras GTP酵素(KRAS)、IL-15受容体、Kitチロシンキナーゼ、PDGF受容体β、RETチロシンキナーゼ受容体、Raf 1プロテインキナーゼ、Raf Bプロテインキナーゼ、チミジル酸合成酵素、トポイソメラーゼII、Brachyuryタンパク質、Flt3チロシンキナーゼ、VEGF、VEGF受容体(VEGF-1受容体、VEGF-2受容体及びVEGF-3受容体)、エストロゲン受容体、新生抗原、ヒトパピローマウイルスE6及び熱ショックタンパク質が挙げられる。
いくつかの特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、CD19である。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、CD20である。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、CD22である。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、BCMAである。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、VEGFR2である。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、FAPである。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、EpCamである。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、GPC3である。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、クローディン18.2である。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、CD133である。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、IL13Raである。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、EGFRIIIである。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、EphA2である。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、Muc1である。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、CD70である。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、CD123である。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、ROR1である。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、PSMAである。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、CD5である。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、GD2である。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、GAPである。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、CD33である。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、CEAである。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、PSCAである。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、Her2である。他の特定の実施形態において、本発明CARの少なくとも一つの標的抗原は、メソテリンである。
いくつかの実施形態において、本明細書によるCARは、B細胞抗原に結合する。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD2、CD5、CD6、CD9、CD11a、CD11b、CD11c、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD29、CD30、CD31、CD32a、CD32b、CD35、CD37、CD38、CD39、CD40、CD45、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RO、CD46、CD47、CD48、CD49b、CD49c、CD49d、CD50、CD52、CD53、CD54、CD55、CD58、CD60a、CD62L、CD63、CD68、CD69、CD70、CD72、CD73、CD74、CD75、CD75S、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85E、CD85I、CD85J、CD86、CD92、CD95、CD97、CD98、CD99、CD100、CD102、CD108、CD119、CD120a、CD120b、CD121b、CD122、CD124、CD125、CD126、CD130、CD132、CD137、CD138、CD139、CD147、CD148、CD150、CD152、CD162、CD164、CD166、CD167a、CD170、CD171、CD175、CD175s、CD180、CD184、CD185、CD192、CD196、CD197、CD200、CD205、CD201a、CDw210b、CD212、CD213a1、CD213a2、CD 215、CD217、CD218a、CD218b、CD220、CD221、CD222、CD224、CD225、CD226、CD227、CD229、CD230、CD232、CD252、CD252、CD254、CD255、CD256、CD257、CD258、CD259、CD260、CD261、CD262、CD263、CD264、CD267、CD268、CD269、CD270、CD272、CD274、CD275、CD277、CD279、CD283、CD289、CD290、CD295、CD298、CD300、CD300c、CD305、CD306、CD307a、CD307b、CD307c、CD307d、CD307e、CD314、CD215、CD316、CD317、CD319、CD321、CD327、CD328、CD329、CD338、CD351、CD352、CD353、CD354、CD355、CD356、CD357、CD358、CD360、CD361、CD362又はCD363抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD1a抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD1b抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD1c抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD1d抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD2抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD5抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD6抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD9抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD11a抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD11b抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD11c抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD17抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD18抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD19抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD20抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD21抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD22抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD23抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD24抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD25抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD26抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD27抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD29抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD30抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD31抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD32a抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD32b抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD35抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD37抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD38抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD39抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD40抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD45抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD45RA抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD45RB抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD45RC抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD45RO抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD46抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD47抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD48抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD49b抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD49c抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD49d抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD50抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD52抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD53抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD54抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD55抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD58抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD60a抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD62L抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD63抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD68抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD69抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD70抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD72抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD73抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD74抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD75抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD75S抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD77抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD79a抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD79b抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD80抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD81抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD82抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD83抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD84抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD85E抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD85I抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD85J抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD86抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD92抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD95抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD97抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD98抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD99抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD100抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD102抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD108抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD119抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD120a抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD120b抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD121b抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD122抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD124抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD125抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD126抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD130抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD132抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD137抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD138抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD139抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD147抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD148抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD150抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD152抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD162抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD164抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD166抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD167a抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD170抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD171抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD175抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD175s抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD180抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD184抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD185抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD192抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD196抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD197抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD200抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD205抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD201a抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CDw210b抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD212抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD213a1抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD213a2抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD 215抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD217抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD218a抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD218b抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD220抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD221抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD22
2抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD224抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD225抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD226抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD227抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD229抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD230抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD232抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD252抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD252抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD254抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD255抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD256抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD257、CD258抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD259抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD260抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD261抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD262抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD263抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD264抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD267抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD268抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD269抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD270抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD272抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD274抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD275抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD277抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD279抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD283抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD289抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD290抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD295抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD298抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD300抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD300c抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD305抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD306抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD307a抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD307b抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD307c抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD307d抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD307e抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD314抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD215抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD316抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD317抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD319抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD321抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD327抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD328抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD329抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD338抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD351抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD352抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD353抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD354抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD355抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD356抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD357抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD358抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD360抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD361抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD362抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD363抗原である。
2抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD224抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD225抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD226抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD227抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD229抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD230抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD232抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD252抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD252抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD254抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD255抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD256抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD257、CD258抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD259抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD260抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD261抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD262抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD263抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD264抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD267抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD268抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD269抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD270抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD272抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD274抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD275抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD277抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD279抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD283抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD289抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD290抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD295抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD298抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD300抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD300c抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD305抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD306抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD307a抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD307b抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD307c抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD307d抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD307e抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD314抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD215抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD316抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD317抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD319抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD321抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD327抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD328抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD329抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD338抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD351抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD352抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD353抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD354抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD355抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD356抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD357抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD358抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD360抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD361抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD362抗原である。いくつかの実施形態において、B細胞抗原は、CD363抗原である。
一実施形態において、本発明CARの標的は病原体である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、病原体を含む細胞である。
いくつかの実施形態において、病原体は、以下からなる群から選択される感染性疾患を引き起こす:急性弛緩性脊髄炎(AFM)、アナプラズマ病、アンスラックス、バベシア症(Babesiosis)、ボツリヌス中毒(Botulism)、ブルセラ症(Brucellosis)、カンピロバクター感染症(Campylobacteriosis)、カルバペネム耐性感染症、軟性下疳、チクングニアウイルス感染症(Chikungunya Virus Infection)、クラミジア疾患、魚からのボツリヌス、ディフィシル感染症(Difficile Infection)、ウエルシュ菌疾患(Perfringens)、コクシジオイデス真菌感染症、コロナウイルス感染症、Covid-19(SARS-CoV-2)、クロイツフェルト・ヤコブ病(Creutzfeldt-Jacob Disease)/伝達性海綿状脳症、クリプトスポリジウム症(Crypto)、サイクロスポーラ症、1、2、3又は4型デング熱、ジフテリア、志賀毒素産生性大腸菌(E. coli infection/Shiga toxin-producing、STEC)感染症、東部馬脳炎、出血熱(エボラ)、エーリキア症、脳炎、アルボウイルス又は副感染症、非エンテロウイルス、エンテロウイルスD68疾患(EV-D68)、ジアルジア症、鼻疽、淋菌感染症、鼠径部肉芽腫、ヘモフィルスインフルエンザ菌(Haemophilus Influenza)B型感染症(Hib又はH-インフルエンザ)、血球貪食症候群(HPS)、溶血性尿毒症症候群(HUS)、A型肝炎(Hep A)、B型肝炎(Hep B)、C型肝炎(Hep C)、D型肝炎(Hep D)、E型肝炎(Hep E)、疱疹、帯状疱疹(Herpes Zoster)(帯状ヘルペス(Shingles))、ヒストプラスマ症感染、ヒト免疫不全ウイルス/エイズ(HIV/AIDS)、ヒトパピローマウイルス(HPV)、インフルエンザ(Flu)、レジオネラ属菌感染症(レジオネラ症)、癩病(ハンセン病)、レプトスピラ症、リステリア症(リステリア)、ライム病、性病性リンパ肉芽腫(LGV)感染症、マラリア、麻疹、類鼻疽、髄膜炎(ウイルス性)、髄膜炎菌性髄膜炎(髄膜炎(細菌性))、中東呼吸器症候群コロナウイルス疾患(MERS-CoV)、耳下腺炎、ノーウォークウイルス疾患、シラミ寄生症、骨盤内炎症性疾患(PID)、百日咳(痙咳)、ペスト(腺ペスト、敗血症型ペスト、肺ペスト)、肺炎球菌感染症(肺炎)、急性灰白随炎(ポリオ(Polio))、ポーワッサン脳炎、オウム病、ケジラミ寄生症(Pthiriasis)、発疹性膿疱症(天然痘、サル痘、牛痘)、Q熱、狂犬病、リケッチア感染症(ロッキー山紅斑熱)、風疹(三日ばしか(German Measles))、サルモネラ胃腸炎(サルモネラ)、疥癬、スコンブロイド食中毒(Scombroid)、膿毒症、重症急性呼吸器症候群(SARS)、赤痢菌性胃腸炎(赤痢菌)、天然痘、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)感染症、ブドウ球菌性食中毒エンテロトキシンB中毒(ブドウ球菌性食中毒)、バンコマイシン中間耐性黄色ブドウ球菌感染症(VISA)、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌感染症(VRSA)、A群レンサ球菌感染症(侵襲性)(Strep A(侵襲性))、B群レンサ球菌感染症(Strep-B)、レンサ球菌中毒性ショック症候群STSS中毒性ショック、梅毒(原発性、二次性、早期潜伏性、後期潜伏性、先天性)、破傷風感染症、トリコモナス症、旋毛虫症(Trichonosis)感染、結核(TB)、潜在性結核感染症(LTBI)、野兎病、D群腸チフス、膣症、水痘(Varicella)(水疱瘡(Chickenpox))、コレラ菌感染症(Vibrio cholerae)(コレラ)、ビブリオ病(ビブリオ)、エボラ出血熱、ラッサウイルス出血熱、マールブルグ出血熱、ウエストナイルウイルス、黄熱病、エルシニア症及びジカウイルス感染症。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、急性弛緩性脊髄炎(AFM)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、アナプラズマ病である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、アンスラックスである。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、バベシア症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ボツリヌス中毒である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ブルセラ症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、カンピロバクター感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、カルバペネム耐性感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、軟性下疳である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、チクングニアウイルス感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、クラミジア疾患である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、魚からのボツリヌスである。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ディフィシル感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ウエルシュ菌疾患である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、コクシジオイデス真菌感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、コロナウイルス疾患である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、Covid-19(SARS-CoV-2)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、クロイツフェルト・ヤコブ病/伝達性海綿状脳症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、クリプトスポリジウム症(Crypto)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、サイクロスポーラ症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、1、2、3又は4型デング熱である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ジフテリアである。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、志賀毒素産生性大腸菌(STEC)感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、東部馬脳炎である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、出血熱(エボラ)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、エーリキア症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、脳炎である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、アルボウイルス又は副感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、非エンテロウイルスである。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、エンテロウイルスD68疾患(EV-D68)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ジアルジア症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、鼻疽である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、淋菌感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、鼠径部肉芽腫である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ヘモフィルスインフルエンザ菌B型感染症(Hib又はH-インフルエンザ)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、血球貪食症候群(HPS)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、溶血性尿毒症症候群(HUS)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、A型肝炎(Hep A)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、B型肝炎(Hep B)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、C型肝炎(Hep C)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、D型肝炎(Hep D)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、E型肝炎(Hep E)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、疱疹である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、帯状疱疹(帯状ヘルペス)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ヒストプラスマ症感染である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ヒト免疫不全ウイルス/エイズ(HIV/AIDS)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ヒトパピローマウイルス(HPV)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、インフルエンザ(Flu)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、レジオネラ属菌感染症(レジオネラ症)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、癩病(ハンセン病)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、レプトスピラ症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、リステリア症(リステリア)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ライム病である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、性病性リンパ肉芽腫(LGV)感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、マラリアである。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、麻疹である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、類鼻疽である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、髄膜炎(ウイルス性)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、髄膜炎菌性髄膜炎(髄膜炎(細菌性))である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、中東呼吸器症候群コロナウイルス疾患(MERS-CoV)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、耳下腺炎である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ノーウォークウイルス疾患である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、シラミ寄生症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、骨盤内炎症性疾患(PID)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、百日咳(痙咳)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ペスト(腺ペストであり、いくつかの実施形態において、感染性疾患は、敗血症型ペストであり、いくつかの実施形態において、感染性疾患は、肺炎性ペスト)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、肺炎球菌感染症(肺炎)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、急性灰白随炎(ポリオ)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ポーワッサン脳炎である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、オウム病である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ケジラミ寄生症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、発疹性膿疱症(天然痘であり、いくつかの実施形態において、感染性疾患は、サル痘であり、いくつかの実施形態において、感染性疾患は、牛痘)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、Q熱である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、狂犬病である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、リケッチア感染症(ロッキー山紅斑熱)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、風疹(三日ばしか)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、サルモネラ胃腸炎(サルモネラ)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、疥癬である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、スコンブロイド食中毒である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、膿毒症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、重症急性呼吸器症候群(SARS)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、赤痢菌性胃腸炎(赤痢菌)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、天然痘である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ブドウ球菌性食中毒エンテロトキシンB中毒(ブドウ球菌性食中毒)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、バンコマイシン中間耐性黄色ブドウ球菌感染症(VISA)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌感染症(VRSA)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、A群レンサ球菌感染症(侵襲性)(Strep A(侵襲性))である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、レンサ球菌病である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、B群疾患(Strep-B)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、レンサ球菌中毒性ショック症候群STSS中毒性ショックである。い
くつかの実施形態において、感染性疾患は、梅毒(原発性であり、いくつかの実施形態において、感染性疾患は、二次性であり、いくつかの実施形態において、感染性疾患は、早期潜伏性であり、いくつかの実施形態において、感染性疾患は、後期潜伏性であり、いくつかの実施形態において、感染性疾患は、先天性)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、破傷風感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、トリコモナス症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、旋毛虫症感染である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、結核(TB)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、潜在性結核感染症(LTBI)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、野兎病である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、D群腸チフスである。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、膣症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、水痘(水疱瘡))、コレラ菌感染症(コレラ)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ビブリオ病(ビブリオ)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、エボラ出血熱である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ラッサウイルス出血熱である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、マールブルグ出血熱である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ウエストナイルウイルスである。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、黄熱病である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、エルシニア症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ジカウイルス感染症である。
くつかの実施形態において、感染性疾患は、梅毒(原発性であり、いくつかの実施形態において、感染性疾患は、二次性であり、いくつかの実施形態において、感染性疾患は、早期潜伏性であり、いくつかの実施形態において、感染性疾患は、後期潜伏性であり、いくつかの実施形態において、感染性疾患は、先天性)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、破傷風感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、トリコモナス症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、旋毛虫症感染である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、結核(TB)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、潜在性結核感染症(LTBI)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、野兎病である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、D群腸チフスである。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、膣症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、水痘(水疱瘡))、コレラ菌感染症(コレラ)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ビブリオ病(ビブリオ)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、エボラ出血熱である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ラッサウイルス出血熱である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、マールブルグ出血熱である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ウエストナイルウイルスである。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、黄熱病である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、エルシニア症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ジカウイルス感染症である。
いくつかの実施形態において、病原体は細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、バシラス属(bacillus)、バルトネラ属(bartonella)、ボルデテラ属(bordetella)、ボレリア属(borrelia)、ブルセラ属(brucella)、カンピロバクター属(campylobacter)、クラミジア属(chlamydia)、類クラミジア属(chlamydophila)、クロストリジウム属(clostridium)、コリネバクテリウム属(corynebacterium)、エンテロコッカス属(enterococcus)、エスケリキア属(escherichia)、フランシセラ属(francisella)、ヘモフィルス属(haemophilus)、ヘリコバクター属(helicobacter)、レジオネラ属(legionella)、レプトスピラ属(leptospira)、リステリア属(listeria)、マイコバクテリウム属(mycobacterium)、マイコプラズマ属(mycoplasma)、ナイセリア属(neisseria)、シュードモナス属(pseudomonas)、リケッチア属(rickettsia)、サルモネラ属(salmonella)、赤痢菌属(shigella)、ブドウ球菌属(staphylococcus)、レンサ球菌属(streptococcus)、トレポネーマ属(treponema)、ウレアプラズマ属(ureaplasma)、ビブリオ属(vibrio)又はエルシニア属(yersinia)の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、バシラス属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、バルトネラ属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、ボルデテラ属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、ボレリア属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、ブルセラ属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、カンピロバクター属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、クラミジア属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、類クラミジア属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、クロストリジウム属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、コリネバクテリウム属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、エンテロコッカス属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、エスケリキア属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、フランシセラ属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、ヘモフィルス属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、ヘリコバクター属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、レジオネラ属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、レプトスピラ属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、リステリア属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、マイコバクテリウム属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、マイコプラズマ属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、ナイセリア属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、シュードモナス属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、リケッチア属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、サルモネラ属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、赤痢菌属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、ブドウ球菌属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、レンサ球菌属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、トレポネーマ属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、ウレアプラズマ属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、ビブリオ属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、エルシニア属の細菌である。
いくつかの実施形態において、病原体は寄生虫である。いくつかの実施形態において、寄生虫は、原生動物、蠕虫又は外部寄生虫である。いくつかの実施形態において、原生動物は、エントアメーバ属(entamoeba)、ジアルジア属(giardia)、リーシュマニア属(leishmania)、バランチジウム属(balantidium)、マラリア原虫属(plasmodium)又はクリプトスポリジウム属(cryptosporidium)である。いくつかの実施形態において、蠕虫は、吸虫、条虫、鉤頭虫又は回虫である。いくつかの実施形態において、外部寄生虫は、節足動物である。
いくつかの実施形態において、病原体はウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、アデノウイルス科(adenoviridae)、アレナウイルス科(arenaviridae)、アストロウイルス科(astroviridae)、ブニヤウイルス科(bunyaviridae)、カリシウイルス科(caliciviridae)、コロナウイルス科(coronaviridae)、フィロウイルス科(filoviridae)、フラビウイルス科(flaviviridae)、ヘパドナウイルス科(hepadnaviridae)、ヘペウイルス科(hepeviridae)、オルトミクソウイルス科(orthomyxoviridae)、パピローマウイルス科(papillomaviridae)、パラミクソウイルス科(paramyxoviridae)、パルボウイルス科(parvoviridae)、ピコルナウイルス科(picornaviridae)、ポリオーマウイルス科(polyomaviridae)、ポックスウイルス科(poxviridae)、レオウイルス科(reoviridae)、レトロウイルス科(retroviridae)、ラブドウイルス科(rhabdoviridae)又はトガウイルス科(togaviridae)のウイルスである。いくつかの実施形態において、科である。いくつかの実施形態において、ウイルスは、アデノウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、アレナウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、アストロウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ブニヤウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、カリシウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、コロナウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、フィロウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、フラビウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ヘパドナウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ヘペウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、オルトミクソウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、パピローマウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、パラミクソウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、パルボウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ピコルナウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ポリオーマウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ポックスウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、レオウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、レトロウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ラブドウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、トガウイルス科のウイルスである。
いくつかの実施形態において、ウイルスは、アデノウイルス、コロナウイルス、コクサッキーウイルス、エプスタイン・バーウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス2型、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス8型、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、風疹ウイルス又は水痘帯状疱疹ウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、アデノウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、コロナウイルスである。いくつかの実施形態において、コロナウイルスは、Covid-19(SARS-CoV-2)である。いくつかの実施形態において、ウイルスは、コクサッキーウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、エプスタイン・バーウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、A型肝炎ウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、B型肝炎ウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、C型肝炎ウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、単純ヘルペスウイルス2型である。いくつかの実施形態において、ウイルスは、サイトメガロウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ヒトヘルペスウイルス8型である。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、インフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、麻疹ウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、耳下腺炎ウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ヒトパピローマウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、パラインフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ポリオウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、狂犬病ウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、呼吸器多核体ウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、風疹ウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、水痘帯状疱疹ウイルスである。
膜貫通ドメイン
本開示のCARは、細胞外抗原結合ドメインと直接又は間接的に融合され得る膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然又は合成供給源に由来してもよい。本明細書で使用されるように、「膜貫通ドメイン」は、細胞膜(好ましくは、真核細胞膜)において熱力学的に安定な任意のタンパク質構造を指す。本明細書に記載のCARに適した膜貫通ドメインは、天然に存在するタンパク質から得ることができる。代替的に、それは、合成された、非天然タンパク質セグメント、例えば、細胞膜において熱力学的に安定なハイドロフォビンセグメントであってもよい。
本開示のCARは、細胞外抗原結合ドメインと直接又は間接的に融合され得る膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然又は合成供給源に由来してもよい。本明細書で使用されるように、「膜貫通ドメイン」は、細胞膜(好ましくは、真核細胞膜)において熱力学的に安定な任意のタンパク質構造を指す。本明細書に記載のCARに適した膜貫通ドメインは、天然に存在するタンパク質から得ることができる。代替的に、それは、合成された、非天然タンパク質セグメント、例えば、細胞膜において熱力学的に安定なハイドロフォビンセグメントであってもよい。
膜貫通ドメインの三次元構造に基づいて膜貫通ドメインを分類する。例えば、膜貫通ドメインには、α螺旋、二つ以上のα螺旋の複合体、β-バレル構造又は細胞リン脂質二重層に跨ることができる任意の他の安定構造が形成され得る。なお、膜貫通ドメインはさらに、同様に又は代わりに、膜貫通ドメインが膜を通過する回数及びタンパク質の配向を含む膜貫通ドメイントポロジー構造に基づいて分類され得る。例えば、一回膜タンパク質は細胞膜を一回通過するが、複数回膜タンパク質は細胞膜を少なくとも二回(例えば、2、3、4、5、6、7回又はそれ以上)通過する。膜タンパク質は、細胞内側及び外側に対するそれらの末端及び一つ又は複数の膜貫通セグメントのトポロジー構造に依存して、I型、II型又はIII型に定義され得る。I型膜タンパク質は、単一の膜貫通領域を有し、タンパク質のN末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に位置し、該タンパク質のC末端が細胞質側に存在するように配向される。II型膜タンパク質も単一の膜貫通領域を有するが、タンパク質のC末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、該タンパク質のN末端が細胞質側に存在するように配向される。III型膜タンパク質は、複数の膜貫通セグメントを有し、膜貫通セグメントの数並びにN末端及びC末端の位置に基づいてさらに分類され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARの膜貫通ドメインは、I型一回膜タンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、複数回膜タンパク質からの膜貫通ドメインは、本明細書に記載のCARに適応するために用いられてもよい。複数回膜タンパク質は、複合体(少なくとも2、3、4、5、6、7又はそれ以上)α螺旋又はβシート構造を含んでもよい。いくつかの実施形態において、複数回膜タンパク質のN末端とC末端は、脂質二重層の反対側に存在し、例えば、タンパク質のN末端は脂質二重層の細胞質側に存在するが、該タンパク質のC末端は細胞外側に存在する。
本明細書に記載のCARに用いられる膜貫通ドメインは、合成された、非天然タンパク質セグメントの少なくとも一部をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、合成された、非天然α螺旋又はβシートである。いくつかの実施形態において、タンパク質セグメントは、少なくとも約20個のアミノ酸、例えば、少なくとも18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個、又はそれ以上のアミノ酸である。合成された膜貫通ドメインの例は、当分野に既知のものであり、例えば、米国特許第7,052,906号及びPCT公開番号WO 2000/032776において、その関連開示内容は、参照により本明細書に援用される。
本明細書による膜貫通ドメインは、膜貫通領域と、膜貫通ドメインのC末端側に位置する細胞質領域とを含んでもよい。膜貫通ドメインの細胞質領域は、三つ又はそれ以上のアミノ酸を含んでもよく、且ついくつかの実施形態において、膜貫通ドメインの脂質二重層における配向に有利である。いくつかの実施形態において、一つ又は複数のシステイン残基は、膜貫通ドメインの膜貫通領域に存在する。いくつかの実施形態において、一つ又は複数のシステイン残基は、膜貫通ドメインの細胞質領域に存在する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインの細胞質領域は、正に荷電したアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインの細胞質領域は、アミノ酸アルギニンと、セリンと、リジンとを含む。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインの膜貫通領域は、疎水性アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、本明細書によるCARの膜貫通ドメインは、疎水性人工配列を含む。例えば、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットは、膜貫通ドメインのC末端位置に存在し得る。いくつかの実施形態において、膜貫通領域は、主に疎水性アミノ酸残基、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン又はバリンを含む。いくつかの実施形態において、膜貫通領域は疎水性である。いくつかの実施形態において、膜貫通領域は、ポリロイシン-アラニン配列を含む。タンパク質又はタンパク質セグメントの親水性又は疎水性又は親水性特徴は、当分野の既知の任意の方法、例えば、Kyte及びDoolittle親水性分析によって評価され得る。
いくつかの実施形態において、CARの膜貫通ドメインは、T細胞受容体のα、β又はζ鎖、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CDl la、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CD19、IL-2R β、IL-2R γ、IL-7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D及び/又はNKG2Cの膜貫通ドメインから選択された膜貫通ドメインを含む。
いくつかの特定の実施形態において、膜貫通ドメインはCD8αに由来する。他の特定の実施形態において、膜貫通ドメインはCD28αに由来する。
細胞内シグナル伝達ドメイン
本明細書によるCARにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、CARを発現する免疫エフェクター細胞の少なくとも一つの正常なエフェクター機能を活性化する役割を担う。用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊な機能を指す。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性又は補助活性(サイトカインの分泌を含む)であってもよい。そのため、用語「細胞質シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを形質導入し、特定の機能を実行するように細胞に指示するタンパク質部分を指す。通常、細胞質シグナル伝達ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合に鎖全体を使用する必要はない。細胞質シグナル伝達ドメインの短縮部分を使用することについては、エフェクター機能シグナルを形質導入する限り、インタクトな鎖の代わりにこのような短縮部分を使用してもよい。そのため、用語の細胞質シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを形質導入するのに十分な細胞質シグナル伝達ドメインを含む任意の短縮部分を指すことが意図される。
本明細書によるCARにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、CARを発現する免疫エフェクター細胞の少なくとも一つの正常なエフェクター機能を活性化する役割を担う。用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊な機能を指す。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性又は補助活性(サイトカインの分泌を含む)であってもよい。そのため、用語「細胞質シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを形質導入し、特定の機能を実行するように細胞に指示するタンパク質部分を指す。通常、細胞質シグナル伝達ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合に鎖全体を使用する必要はない。細胞質シグナル伝達ドメインの短縮部分を使用することについては、エフェクター機能シグナルを形質導入する限り、インタクトな鎖の代わりにこのような短縮部分を使用してもよい。そのため、用語の細胞質シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを形質導入するのに十分な細胞質シグナル伝達ドメインを含む任意の短縮部分を指すことが意図される。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、CARは、実質的に免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインからなる細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「一次細胞内シグナル伝達ドメイン」は、刺激的に作用して免疫エフェクターを機能するように誘導する細胞質シグナル伝達配列を指す。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ又はITAMと呼ばれるシグナル伝達モチーフを含有する。本明細書で使用されるように、「ITAM」は、保存的タンパク質モチーフであり、通常、免疫細胞で発現するシグナル伝達分子の尾部に存在する。モチーフは、6~8個のアミノ酸により隔てられたアミノ酸配列YxxL/Iの二つのリピートを含んでもよく、ここで、各xは、独立して、任意のアミノ酸であり、保存的モチーフYxxL/Ix(6~8)YxxL/Iを産生する。シグナル伝達分子におけるITAMは、細胞内シグナル形質導入にとって重要であり、該シグナル形質導入は、少なくとも一部がシグナル伝達分子活性化後のITAMにおけるチロシン残基のリン酸化により媒介される。ITAMは、シグナル伝達経路に関与する他のタンパク質のドッキング部位としても機能し得る。例示的なITAM含有一次細胞質シグナル伝達配列は、CD3z、FcR γ(FCER1G)、FcR β(Fc ε Rib)、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及びCD66dに由来するものを含む。
共刺激シグナル伝達ドメイン
いくつかの実施形態において、CARは、少なくとも一つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用されるように、用語「共刺激シグナル伝達ドメイン」は、細胞内シグナル形質導入を媒介して免疫応答(例えば、エフェクター機能)を誘導するタンパク質の少なくとも一部を指す。抗原特異性シグナルを刺激することに加えて、多くの免疫エフェクター細胞は、細胞の増殖、分化及び生存を促進し、細胞のエフェクター機能を活性化するために共刺激を必要とする。
いくつかの実施形態において、CARは、少なくとも一つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用されるように、用語「共刺激シグナル伝達ドメイン」は、細胞内シグナル形質導入を媒介して免疫応答(例えば、エフェクター機能)を誘導するタンパク質の少なくとも一部を指す。抗原特異性シグナルを刺激することに加えて、多くの免疫エフェクター細胞は、細胞の増殖、分化及び生存を促進し、細胞のエフェクター機能を活性化するために共刺激を必要とする。
本明細書に記載のキメラ受容体の共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激タンパク質からの細胞質シグナル伝達ドメインであってもよく、それは、シグナルを形質導入し、T細胞、NK細胞、マクロファージ、好中球又は好酸球のような免疫細胞により媒介される反応を調節する。「共刺激シグナル伝達ドメイン」は、共刺激分子の細胞質部分であってもよい。用語「共刺激分子」は、免疫細胞(例えば、T細胞)における相同結合パートナーを指し、それは、共刺激リガンドに特異的に結合することによって、免疫細胞の共刺激応答、例えば、限定されないが、増殖及び生存を媒介する。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、単一の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、二つ又はそれ以上(例えば、約2、3、4個又はそれ以上のうちのいずれか一つ)の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、二つ又はそれ以上の同じ共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、異なる共刺激タンパク質(例えば、本明細書に記載のいずれか二つ又はそれ以上の共刺激タンパク質)からの二つ又はそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、CD3zの細胞質シグナル伝達ドメイン)と、一つ又は複数の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。いくつかの実施形態において、一つ又は複数の共刺激シグナル伝達ドメイン及び一次細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、CD3zの細胞質シグナル伝達ドメイン)は、任意のペプチドリンカーを介して互いと融合される。一次細胞内シグナル伝達ドメイン及び一つ又は複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の適切な順序で並べられ得る。いくつかの実施形態において、一つ又は複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインと一次細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、CD3zの細胞質シグナル伝達ドメイン)との間に位置する。複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、相加的又は相乗的刺激効果を提供することができる。
宿主細胞(例えば、免疫細胞)における共刺激シグナル伝達ドメインの活性化は、サイトカインの産生及び分泌、貪食特性、増殖、分化、生存及び/又は細胞傷害性を増加又は減少させるように細胞を誘導することができる。任意の共刺激分子の共刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載のCARに適用可能である。共刺激シグナル伝達ドメインの一つ又は複数のタイプは、例えば、エフェクター分子がそれに発現することになる免疫エフェクター細胞のタイプ(例えば、T細胞、NK細胞、マクロファージ、好中球又は好酸球)及び所望の免疫エフェクター機能(例えば、ADCCエフェクター)などの要因に基づいて選択される。CARに用いられる共刺激シグナル伝達ドメインの例は、共刺激タンパク質の細胞質シグナル伝達ドメインであってもよく、B7/CD28ファミリーのメンバー(例えば、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD- 1、PD-L2/B7-DC及びPDCD6)と、TNFスーパーファミリーのメンバー(例えば、4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BBリガンド/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27リガンド/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30リガンド/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40リガンド/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITRリガンド/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、リンホトキシン-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40リガンド/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α及びTNF RII/TNFRSF1B)と、SLAMファミリーのメンバー(例えば、2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6及びSLAM/CD150)と、任意の他の共刺激分子、例えば、CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA クラスI、HLA-DR、Ikaros、インテグリンα4/CD49d、インテグリンα4β1、インテグリンα4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)及びNKG2Cとを含むが、それらに限らない。いくつかの実施形態において、一つ又は複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及びCD83に特異的に結合するリガンドからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載の任意の共刺激シグナル伝達ドメインの変異体であり、それにより共刺激シグナル伝達ドメインが免疫細胞の免疫応答を調節することができる。いくつかの実施形態において、野生型対照物に比べて、共刺激シグナル伝達ドメインは、10個まで(例えば、1個、2個、3個、4個、5個又は8個)のアミノ酸残基変種を含む。一つ又は複数のアミノ酸変種を含むこのような共刺激シグナル伝達ドメインは、変異体と呼ばれてもよい。突然変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比較して、共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の突然変異は、シグナル形質導入の増加及び免疫応答に対する刺激の増強をもたらすことができる。突然変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比較して、共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の突然変異は、シグナル形質導入の減少及び免疫応答に対する刺激の低下をもたらすことができる。
シグナルペプチド
いくつかの実施形態において、本明細書によるCARは、ポリペプチドのN末端位置のシグナルペプチド(シグナル配列とも呼ばれる)を含んでもよい。通常、シグナルペプチドは、ポリペプチドを細胞内の所望の部位にターゲティングするペプチド配列である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、エフェクター分子を細胞の分泌経路にターゲティングし、脂質二重層へのエフェクター分子の組込み及び繋ぎ留めを可能にする。本明細書に記載のCARに適用し、天然に存在するタンパク質のシグナル配列又は合成された非天然シグナル配列を含むシグナルペプチドは、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、CD8α、GM-CSF受容体α及びIgG1重鎖からなる群から選択される分子に由来する。
いくつかの実施形態において、本明細書によるCARは、ポリペプチドのN末端位置のシグナルペプチド(シグナル配列とも呼ばれる)を含んでもよい。通常、シグナルペプチドは、ポリペプチドを細胞内の所望の部位にターゲティングするペプチド配列である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、エフェクター分子を細胞の分泌経路にターゲティングし、脂質二重層へのエフェクター分子の組込み及び繋ぎ留めを可能にする。本明細書に記載のCARに適用し、天然に存在するタンパク質のシグナル配列又は合成された非天然シグナル配列を含むシグナルペプチドは、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、CD8α、GM-CSF受容体α及びIgG1重鎖からなる群から選択される分子に由来する。
ヒンジ領域
いくつかの実施形態において、本明細書によるCARは、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジドメインを含んでもよい。ヒンジドメインは、通常、タンパク質の二つのドメインの間で発現するアミノ酸セグメントであり、且つタンパク質の一つ又は二つの柔軟なドメインの互いに対する移動を可能にすることができる。エフェクター分子の膜貫通ドメインに対する細胞外抗原結合ドメインのこのような柔軟性及び移動を提供する任意のアミノ酸配列を使用することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書によるCARは、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジドメインを含んでもよい。ヒンジドメインは、通常、タンパク質の二つのドメインの間で発現するアミノ酸セグメントであり、且つタンパク質の一つ又は二つの柔軟なドメインの互いに対する移動を可能にすることができる。エフェクター分子の膜貫通ドメインに対する細胞外抗原結合ドメインのこのような柔軟性及び移動を提供する任意のアミノ酸配列を使用することができる。
抗体(例えば、IgG、IgA、IgM、IgE又はIgD抗体)のヒンジドメインは、本明細書に記載のpH依存性キメラ受容体系にも適用可能である。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、抗体の定常ドメインCH1とCH2を連結するヒンジドメインである。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインであり、且つ抗体及び該抗体の一つ又は複数の定常領域のヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、抗体及び該抗体のCH3定常領域のヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、抗体及び該抗体のCH2及びCH3定常領域のヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗体は、IgG、IgA、IgM、IgE、又はIgD抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、IgG抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4抗体である。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、IgG1抗体のヒンジ領域並びにCH2及びCH3定常領域を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、IgG1抗体のヒンジ領域及びCH3定常領域を含む。
非天然ペプチドは、本明細書に記載のキメラ受容体のヒンジドメインとして用いられてもよい。いくつかの実施形態において、Fc受容体の細胞外リガンド結合ドメインのC末端と膜貫通ドメインのN末端との間のヒンジドメインは、(GxS)nリンカーのようなペプチドリンカーであり、ここで、x及びnは、独立して、3~12の整数であってもよく、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又はそれ以上を含む。
ヒンジドメインは、約10~100個のアミノ酸、例えば、約15~75個のアミノ酸、20~50個のアミノ酸又は30~60個のアミノ酸のうちのいずれか一つを含んでもよい。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインの長さは、少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70又は75個のアミノ酸のうちのいずれか一つであってもよい。
いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインである。ヒンジドメインを含む当分野の既知の任意のタンパク質のヒンジドメインは、いずれも本明細書に記載のキメラ受容体に適用可能である。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインの少なくとも一部であり、且つキメラ受容体に柔軟性を与える。
いくつかの特定の実施形態において、ヒンジドメインはCD8αに由来する。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、CD8αのヒンジドメインの一部であり、例えば、CD8αのヒンジドメインの少なくとも15個(例えば20、25、30、35又は40個)の連続したアミノ酸の断片を含む。他の実施形態において、ヒンジドメインはCD28αに由来する。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、CD28αのヒンジドメインの一部であり、例えば、CD28αのヒンジドメインの少なくとも15個(例えば20、25、30、35又は40個)の連続したアミノ酸の断片を含む。
例示的CAR
本開示において、任意のCARを用いてもよく、Kymria(商標)(tisagenlecel)、Yescart(商標)(axicabtagene ciloleucel)、ALEXIS AIDT-2 EOC(Kiromic Biopharma Inc)、CIK-CAR.PSMA(Formula Pharmaceuticals Inc)、ADI-002(Adicet Bio Inc)、TSC-200(TScan Therapeutics Inc)、TSC-100(TScan Therapeutics Inc)、RB-H21(Refuge Biotechnologies Inc)、ADP-A2AFP(Adapimmune Therapeunics plc)、CT-0729(Carisma Therapeustics)、CT-1119(Carisma Therapeutics)、CCT-301-59(EXUMA Biotech Corp)、BOXR-889(Unum Therapeutics Inc)、meso-CAR-T+PD-78(MirImmune LLC)、MAGE-A10C796T(Adaptimune Therapeunics plc)、NKG2D-DARIC T細胞(Bluebird Bio Inc)、AGENt-NY-ESO-1 X(AgenTus Therapeutics Inc)、MB-105(City of Hope Medical Center)、P-MUC1C-101(Poseida Therapeustics Inc)、TT-16(Baylor College of Medicine)、ACTR-087(Unum Therapeutics Inc)、EGFR-806(Seattle Children’s Hospital)、TAC01-ROR1(Triumvira Immunologics Inc)、CCT-301-38(EXUMA Biotech Corp)、MB-103(Mustang Bio Inc)、TAB-28z(OncoTab Inc)、ET-1402(Eureka Therapeutics Inc)、ITI-1000(Duke University)、CIDeCAR(Bellicum Pharmaceuticals Inc)、MT-201(Myeloid Therapeunics Inc)、CT-0508(Carisma Therapeustics)、ADP-A2M4(Adapeimune Therapeutics plc)、AMG-119(Amgen Inc)、iCasp9M28z T細胞(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)、P-PSMA-101(Poseida Therapeutics Inc)、ACE-1702(Acepodia Inc)、AIC-100(Cornell University)、PRGN-3005(Precigen Inc)、UniCAR-T-PSMA(GEMoaB Monoclonals GmbH)、IMA-204(MD Anderson Cancer Center)、DSG3-CAART(University of Pennsylvania)、LXF-821(University of Pennsylvania)、MOv19-BBz CAR T細胞(University of Pennsylvania)、Tn MUC-1 CAR-T(University of Pennsylvania)、huMesoCART(University of Pennsylvania)、IMA-203(Immatics NV)、IMA-202(Immatics NV)、XYP-317(Xyphos Inc)、CYAD-101(Celyad Oncology)、huMNC2-CAR44 T細胞(Minerva Biotechnologies Corp)、HER2Bi-armed ATC(Roger Williams Medical Center)及びCYAD-200シリーズ(Celdara Medical LLC)、Lisocabtagene Maralequel(liso-cel)、FT596(Fate Therapeutics)、KTE-C19(Kite Pharma Inc)、KTE-X19(Kite Pharma Inc)、KITE-718(Kite Pharma Inc)、KITE-439(Kite Pharma Inc)、JCAR-024(Fred Hutchinson Cancer Research Center)、JCAR-023(Juno Therapeutics Inc)、BPX-201(Bellicum Pharmaceuticals Inc)、BPX-601(Bellicus Pharmacueticals Inc)、BPX-603(Bellicom Pharmaceeticals Inc)、MCY-M11(MaxCyte Inc)、KUR-503(Baylor College of Medicine)、ICS-200(University of Alabama at Birmingham)、ADP-A2M4CD8(Adapeimune Therapeutics plc)、GLYCAR(Baylor College of Medicine)を含むが、それらに限らない。
本開示において、任意のCARを用いてもよく、Kymria(商標)(tisagenlecel)、Yescart(商標)(axicabtagene ciloleucel)、ALEXIS AIDT-2 EOC(Kiromic Biopharma Inc)、CIK-CAR.PSMA(Formula Pharmaceuticals Inc)、ADI-002(Adicet Bio Inc)、TSC-200(TScan Therapeutics Inc)、TSC-100(TScan Therapeutics Inc)、RB-H21(Refuge Biotechnologies Inc)、ADP-A2AFP(Adapimmune Therapeunics plc)、CT-0729(Carisma Therapeustics)、CT-1119(Carisma Therapeutics)、CCT-301-59(EXUMA Biotech Corp)、BOXR-889(Unum Therapeutics Inc)、meso-CAR-T+PD-78(MirImmune LLC)、MAGE-A10C796T(Adaptimune Therapeunics plc)、NKG2D-DARIC T細胞(Bluebird Bio Inc)、AGENt-NY-ESO-1 X(AgenTus Therapeutics Inc)、MB-105(City of Hope Medical Center)、P-MUC1C-101(Poseida Therapeustics Inc)、TT-16(Baylor College of Medicine)、ACTR-087(Unum Therapeutics Inc)、EGFR-806(Seattle Children’s Hospital)、TAC01-ROR1(Triumvira Immunologics Inc)、CCT-301-38(EXUMA Biotech Corp)、MB-103(Mustang Bio Inc)、TAB-28z(OncoTab Inc)、ET-1402(Eureka Therapeutics Inc)、ITI-1000(Duke University)、CIDeCAR(Bellicum Pharmaceuticals Inc)、MT-201(Myeloid Therapeunics Inc)、CT-0508(Carisma Therapeustics)、ADP-A2M4(Adapeimune Therapeutics plc)、AMG-119(Amgen Inc)、iCasp9M28z T細胞(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)、P-PSMA-101(Poseida Therapeutics Inc)、ACE-1702(Acepodia Inc)、AIC-100(Cornell University)、PRGN-3005(Precigen Inc)、UniCAR-T-PSMA(GEMoaB Monoclonals GmbH)、IMA-204(MD Anderson Cancer Center)、DSG3-CAART(University of Pennsylvania)、LXF-821(University of Pennsylvania)、MOv19-BBz CAR T細胞(University of Pennsylvania)、Tn MUC-1 CAR-T(University of Pennsylvania)、huMesoCART(University of Pennsylvania)、IMA-203(Immatics NV)、IMA-202(Immatics NV)、XYP-317(Xyphos Inc)、CYAD-101(Celyad Oncology)、huMNC2-CAR44 T細胞(Minerva Biotechnologies Corp)、HER2Bi-armed ATC(Roger Williams Medical Center)及びCYAD-200シリーズ(Celdara Medical LLC)、Lisocabtagene Maralequel(liso-cel)、FT596(Fate Therapeutics)、KTE-C19(Kite Pharma Inc)、KTE-X19(Kite Pharma Inc)、KITE-718(Kite Pharma Inc)、KITE-439(Kite Pharma Inc)、JCAR-024(Fred Hutchinson Cancer Research Center)、JCAR-023(Juno Therapeutics Inc)、BPX-201(Bellicum Pharmaceuticals Inc)、BPX-601(Bellicus Pharmacueticals Inc)、BPX-603(Bellicom Pharmaceeticals Inc)、MCY-M11(MaxCyte Inc)、KUR-503(Baylor College of Medicine)、ICS-200(University of Alabama at Birmingham)、ADP-A2M4CD8(Adapeimune Therapeutics plc)、GLYCAR(Baylor College of Medicine)を含むが、それらに限らない。
いくつかの実施形態において、本明細書によるCARは、上記及び以下のセクション8における例示的CARのいずれか一つに対してある特定の同一性パーセントを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書はCARを提供し、該CARは、細胞外ドメインを含むか又は該細胞外ドメインで構成され、該細胞外ドメインは、上記及び以下のセクション8におけるCARのアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARの一つ又は複数のアミノ酸配列改変が企図される。例えば、細胞外ドメインの結合親和性及び/又は他の生物学的特性の最適化が必要とされる場合があり、特異性、熱安定性、発現レベル、エフェクター機能、グリコシル化、低下した免疫原性又は溶解性を含むが、それらに限らない。そのため、本明細書に記載の細胞外ドメインに加えて、本明細書に記載のドメインの変異体を調製することも企図される。例えば、適切なヌクレオチド変化をコードDNAに導入することによって及び/又は所望の抗体又はポリペプチドを合成することによってscFv変異体を調製することができる。アミノ酸の変更は抗体の翻訳後プロセスを変化させ得ることが当業者に理解される。
変化は、ポリペプチドをコードする一つ又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってもよく、元の抗体又はポリペプチドに対するアミノ酸配列の変更をもたらす。置換変異誘発の目的部位は、CDRとFRとを含む。
アミノ酸置換は、セリンでロイシンを置換するように、似ている構造及び/又は化学的特性を有する別のアミノ酸でアミノ酸を置換した結果であってもよく、例えば、保存的アミノ酸置換であってもよい。当業者に周知の標準的技術は、本明細書による分子をコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入するために用いられてもよく、例えば、アミノ酸置換を引き起こす部位特異的変異誘発とPCR媒介性変異誘発とを含む。挿入又は欠失は、任意選択的に、約1~5個のアミノ酸の範囲内であってもよい。いくつかの実施形態において、置換、欠失又は挿入は、元の分子に対して25個未満のアミノ酸置換、20個未満のアミノ酸置換、15個未満のアミノ酸置換、10個未満のアミノ酸置換、5個未満のアミノ酸置換、4個未満のアミノ酸置換、3個未満のアミノ酸置換又は2個未満のアミノ酸置換を含む。具体的な実施形態において、置換は、一つ又は複数の予測された非必須アミノ酸残基において行われた保存的アミノ酸置換である。許容される変化は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に行い、且つ得られた変異体の親ポリペプチドが示す活性を試験することによって決定することができる。
本開示は、保存的アミノ酸置換により産生されたポリペプチドを含む。特性を保持するか又は著しく変えないために、保存的(例えば、似ている特性及び/又は側鎖を有するアミノ酸群内で)置換を行ってもよい。
一つのタイプの置換変異体は、本発明CARの細胞外抗原結合ドメインにおいて親抗体(例えば、ヒト化又はヒト抗体)の一つ又は複数の超可変領域残基又はその断片を置換することに関する。通常、更なる研究のために選択された、得られた変異は、親抗体に対して、いくつかの生物学的特性(例えば、増加した親和性、低下した免疫原性)における改変(例えば、改善)を有し、かつ/又は親抗体のいくつかの生物学的特性を実質的に保持する。例示的な置換変異体は、親和性が成熟した抗体であり、例えば、本明細書に記載されたような、ファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、容易に産生することができる。簡単に説明すると、一つ又は複数のCDR残基は突然変異し、且つ変異体抗体は、ファージ上にディスプレイされ、特定の生物学的活性(例えば、結合親和性)に対してスクリーニングを行う。
CDRにおいて変更(例えば、置換)を行って、例えば、抗体親和性を向上させることができる。このような変更は、CDR「ホットポイント」、即ち、体細胞成熟過程期間に高頻度で突然変異したコドンによってコードされる残基(例えば、Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008)を参照されたい)、及び/又はSDR(a-CDR)において行われてもよく、ここで、得られた変異体抗体又はその断片の結合親和性を試験する。二次ライブラリーからの構築及び再選択による親和性成熟は、例えば、HoogenboomらMethods in Molecular Biology 178:1-37中(O’Brienらによる編集,Human Press,Totowa,NJ,(2001))に記述されている。親和性成熟のいくつかの実施形態において、様々な方法(例えば、エラープローンPCR、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発)のうちのいずれか一つによって、多様性を、成熟のために選択された可変遺伝子に導入する。そして、二次ライブラリーを作成する。そして、ライブラリーをスクリーニングし、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定する。多様性を導入する別の方法は、CDR配向方法に関し、ここで、若干のCDR残基(例えば、一度に4~6個の残基)をランダム化する。抗原結合に関与するCDR残基を特異的に同定することができ、例えば、アラニンスキャニング変異誘発又はモデル化を用いる。
いくつかの実施形態において、このような変更が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、置換、挿入又は欠失は、一つ又は複数のCDR内に発生してもよい。例えば、CDRにおいて、結合親和性を著しく低下させない保存的変更(例えば、本明細書による保存的置換)を行ってもよい。いくつかの実施形態において、各CDRは、変化していないものであるか、又は、一つ、二つ、もしくは三つ以下のアミノ酸の置換を含むものである。
Cunningham及びWells,Science,244:1081-1085(1989)に記載のように、変異誘発の標的とされることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。代替的には、又は付加的には、抗体と抗原との間の接触点を同定するための抗原-抗体複合体の結晶構造。このような接触残基及び隣接残基は、置換候補物としてターゲティングされるか又は除去され得る。変異体は、所望の特性を含むか否かを判定するためにスクリーニングされてもよい。
アミノ酸配列の挿入は、長さが一個の残基から百個又はそれ以上の残基を含むポリペプチドの範囲内にあるアミノ末端及び/又はカルボキシ末端の融合と、単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入とを含む。末端挿入の例としては、N末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体のN末端又はC末端を、抗原結合ドメイン抗体の血清半減期を増加させる酵素(例えば、ADEPTの場合)又はポリペプチドと融合させることを含む。
変化は、オリゴヌクレオチド媒介性(部位特異的)変異誘発、アラニンスキャニング及びPCR変異誘発のような当分野の既知の方法を用いて行ってもよい。抗体変異体DNAを産生するために、クローニングされたDNAに対して、部位特異的変異誘発(例えば、Carter,Biochem J.237:1-7(1986)、及びZollerら,Nucl.Acids Res.10:6487-500(1982)を参照されたい)、カセット変異誘発(例えば、Wellsら,Gene 34:315-23(1985)を参照されたい)又は他の既知の技術を行ってもよい。
本開示は、免疫エフェクター細胞をさらに含み、該免疫エフェクター細胞は、二つの異なる標的に結合する二重CARのような二つ又はそれ以上の機能的外因性受容体を含む。
7.2.3. 免疫エフェクター細胞
「免疫エフェクター細胞」は、免疫エフェクター機能を発揮し得る免疫細胞を指す。いくつかの実施形態において、該免疫エフェクター細胞は、少なくともFcγRIIIを発現し、且つADCCエフェクター機能を発揮する。ADCCを媒介する免疫エフェクター細胞の例としては、末梢血単核細胞(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単核細胞、細胞傷害性T細胞、好中球、及び好酸球が挙げられる。
「免疫エフェクター細胞」は、免疫エフェクター機能を発揮し得る免疫細胞を指す。いくつかの実施形態において、該免疫エフェクター細胞は、少なくともFcγRIIIを発現し、且つADCCエフェクター機能を発揮する。ADCCを媒介する免疫エフェクター細胞の例としては、末梢血単核細胞(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単核細胞、細胞傷害性T細胞、好中球、及び好酸球が挙げられる。
いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、T細胞である。いくつかの実施形態において、これらのT細胞は、CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+、CD4-/CD8-、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、T細胞は、CARを発現し標的細胞に結合した後にIL-2、TFN及び/又はTNFを産生する。いくつかの実施形態において、CD8+ T細胞は、CARを発現し標的細胞に結合した後に、抗原特異性標的細胞を溶解する。
いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞はNK細胞である。他の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、樹立された細胞株、例えば、NK-92細胞であってもよい。
いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、幹細胞(例えば、造血幹細胞、多能性幹細胞、iPS、又は胚性幹細胞)から分化したものである。
操作された免疫エフェクター細胞は、本明細書によるポリペプチドをT細胞のような免疫エフェクター細胞に導入することによって調製される。いくつかの実施形態において、いずれか一つの単離された核酸又はいずれか一つの上記ベクターをトランスフェクトすることによって、ポリペプチドを免疫エフェクター細胞に導入する。
ベクター又は単離された核酸を哺乳動物細胞に導入する方法は、当分野において既知である。記載されるベクターは、物理的、化学的、又は生物学的方法によって免疫エフェクター細胞に移入させることができる。
ベクターを免疫エフェクター細胞に導入する物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、パーティクルボンバードメント、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクター及び/又は外因性核酸を含む細胞の産生方法は、当分野において周知である。例えば、Sambrookら(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New Yorkを参照されたい。いくつかの実施形態において、エレクトロポレーションによってベクターを細胞に導入する。
ベクターを免疫エフェクター細胞に導入する生物学的方法は、DNAとRNAベクターを用いることを含む。ウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物、例えば、ヒトの細胞に挿入するための最も広く使用されている方法となっている。
ベクターを免疫エフェクター細胞に導入するための化学的方法は、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系と、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベースの系とを含む。インビトロ送達ビヒクルとしての例示的なコロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意のポリペプチドをコードするRNA分子は、従来の方法(例えば、インビトロ転写)によって調製され、そして、mRNAエレクトロポレーションのような既知の方法によって免疫エフェクター細胞に導入され得る。例えば、Rabinovichら,Human Gene Therapy 17:1027-1035(2006)を参照されたい。
いくつかの実施形態において、形質導入又はトランスフェクトされた免疫エフェクター細胞を、ベクター又は単離された核酸を導入した後にエキソビボで増殖させる。いくつかの実施形態において、形質導入又はトランスフェクトされた免疫エフェクター細胞を培養して、少なくとも約1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、10日間、12日間又は14日間のいずれかにわたって増殖させる。いくつかの実施形態において、形質導入又はトランスフェクトされた免疫エフェクター細胞は、操作された哺乳動物細胞を選択するために、さらに評価されるか又はスクリーニングされる。
レポーター遺伝子は、トランスフェクト可能な細胞の同定及び調節配列の機能の評価に用いられ得る。通常、レポーター遺伝子は、受容体生物又は組織に不存在しないか又は発現しない遺伝子であり、該レポーター遺伝子はポリペプチドをコードし、該ポリペプチドの発現は、いくつかの容易に検出可能な特性(例えば、酵素活性)によって表される。レポーター遺伝子の発現は、DNAが受容体細胞に導入された後の適切な時間に検出される。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子を含んでもよい(例えば、Ui-Teiら FEBS Letters 479:79-82(2000))。適切な発現系は、周知のものであり、且つ既知の技術を用いて調製されるか又は商業的に入手され得る。
操作された免疫エフェクター細胞にポリペプチドをコードする核酸が存在することを確認する他の方法は、例えば、DNAブロット法及びRNAブロット法、RT-PCR及びPCRのような当業者に周知の分子生物学的アッセイと、特定のペプチドの有無を例えば免疫学的方法(例えば、ELISA及びウエスタンブロット)によって検出する生物化学的アッセイとを含む。
7.2.4. T細胞の供給源
いくつかの実施形態において、T細胞の増大及び遺伝子改変の前に、対象からT細胞の供給源を得る。T細胞は、多くの供給源から得ることができ、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を含む。いくつかの実施形態において、当分野で利用可能な複数のT細胞株を用いることができる。いくつかの実施形態において、当業者に周知の複数の技術(例えば、Ficoll(商標)単離)を用いて、対象から採取した血液からT細胞を得ることができる。いくつかの実施形態において、個体の循環血液からの細胞はアフェレーシス(apheresis)によって入手される。アフェレーシス生成物は、典型的に、リンパ球を含み、T細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球及び血小板を含む。いくつかの実施形態において、アフェレーシスにより採取された細胞を洗浄して血漿部分を除去し、細胞を適切な緩衝液又は培地において後続の処理ステップに用いてもよい。いくつかの実施形態において、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄する。いくつかの実施形態において、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、且つマグネシウムを欠いている場合があるか、又は多くの(全てではないが)二価カチオンを欠いている場合がある。カルシウムが存在しない場合の初期活性化ステップは、活性化の拡大につながり得る。当業者であれば容易に理解できるように、洗浄ステップは、例えば、メーカーの指示に従って半自動化「フロースルー」遠心機(例えば、Cobe 2991細胞プロセッサ、Baxter CytoMate又はHaemonetics Cell Saver 5)を使用するような当分野の既知の方法によって完了され得る。洗浄後、例えば、Ca2+なし、Mg2+なしのPBS、PlasmaLyte A又は緩衝液を含むかもしくは含まない他の生理食塩水のような様々な生体適合性緩衝液に細胞を再懸濁してもよい。代替的に、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去し、細胞を培地に直接再懸濁してもよい。
いくつかの実施形態において、T細胞の増大及び遺伝子改変の前に、対象からT細胞の供給源を得る。T細胞は、多くの供給源から得ることができ、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を含む。いくつかの実施形態において、当分野で利用可能な複数のT細胞株を用いることができる。いくつかの実施形態において、当業者に周知の複数の技術(例えば、Ficoll(商標)単離)を用いて、対象から採取した血液からT細胞を得ることができる。いくつかの実施形態において、個体の循環血液からの細胞はアフェレーシス(apheresis)によって入手される。アフェレーシス生成物は、典型的に、リンパ球を含み、T細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球及び血小板を含む。いくつかの実施形態において、アフェレーシスにより採取された細胞を洗浄して血漿部分を除去し、細胞を適切な緩衝液又は培地において後続の処理ステップに用いてもよい。いくつかの実施形態において、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄する。いくつかの実施形態において、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、且つマグネシウムを欠いている場合があるか、又は多くの(全てではないが)二価カチオンを欠いている場合がある。カルシウムが存在しない場合の初期活性化ステップは、活性化の拡大につながり得る。当業者であれば容易に理解できるように、洗浄ステップは、例えば、メーカーの指示に従って半自動化「フロースルー」遠心機(例えば、Cobe 2991細胞プロセッサ、Baxter CytoMate又はHaemonetics Cell Saver 5)を使用するような当分野の既知の方法によって完了され得る。洗浄後、例えば、Ca2+なし、Mg2+なしのPBS、PlasmaLyte A又は緩衝液を含むかもしくは含まない他の生理食塩水のような様々な生体適合性緩衝液に細胞を再懸濁してもよい。代替的に、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去し、細胞を培地に直接再懸濁してもよい。
いくつかの実施形態において、例えば、PERCOLL(商標)勾配遠心分離又は向流遠心エルトリエーションによって赤血球を溶解させ、且つ単球を消費して、末梢血リンパ球からT細胞を単離する。ポジティブ又はネガティブ選択技術によって、CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+及びCD45RO+T細胞のような、T細胞の特定の亜集団をさらに単離することができる。例えば、いくつかの実施形態において、T細胞は、所望のT細胞のポジティブ選択のための十分な時間にわたって抗CD3/抗CD28(即ち、3×28)コンジュゲートビーズ(例えば、DYNABEADS(登録商標) M-450 CD3/CD28 T)とインキュベートすることによって単離される。いくつかの実施形態において、該期間は約30分間である。別の実施形態では、該期間は30分間~36時間又はそれ以上及びその間の全ての整数値である。別の実施形態において、該期間は、少なくとも1、2、3、4、5又は6時間である。いくつかの実施形態において、該期間は、10~24時間である。いくつかの実施形態において、該インキュベート期間は24時間である。白血病患者のT細胞の単離では、インキュベート時間(例えば、24時間)を長くとることにより、細胞の収量を増加させることができる。他の細胞タイプに比べて、腫瘍組織又は免疫無防備状態の個体から腫瘍浸潤リンパ球(TIL)をする場合のようなT細胞が少ない任意の場合に、長いインキュベート時間でT細胞を単離してもよい。なお、長いインキュベートを用いることにより、CD8+ T細胞の捕捉効率を向上させることができる。そのため、いくつかの実施形態において、T細胞とCD3/CD28ビーズとの結合を可能にする時間を単純に短縮又は延長するか、及び/又はビーズとT細胞との比を増加又は減少することによって、培養開始時又は培養中の他の時点にT細胞の亜集団を優先的に選択するか又は選択しないことができる。付加的に、ビーズ又は他の表面上の抗CD3及び/又は抗CD28抗体の比率を増加又は減少させることによって、培養開始時又は他の所望の時点にT細胞の亜集団を優先的に選択するか又は選択しないことができる。当業者であれば、複数の選択ラウンドも使用可能であることを認識するであろう。いくつかの実施形態において、選択手順を実施し、活性化及び増大プロセスに「選択されていない」細胞を使用することが望ましい場合もある。「選択されていない」細胞も更なるラウンドの選択に供することができる。
ネガティブ選択によるT細胞集団の濃縮は、ネガティブ選択された細胞に特有の表面マーカーに対する抗体との結合によって実現され得る。一つの方法は、ネガティブ磁気免疫付着又はフローサイトメトリーによって細胞選別及び/又は選択を行い、該方法は、ネガティブ選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体の混合物を用いる。例えば、ネガティブ選択によってCD4+細胞を濃縮させるために、モノクローナル抗体混合物は、通常、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及びCD8に対する抗体を含む。いくつかの実施形態において、通常CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+及びFoxP3+を発現する調節性T細胞を濃縮させるか又はポジティブ選択することが望ましい場合がある。代替的に、いくつかの実施形態において、抗C25コンジュゲートビーズ又は他の類似した選択方法によってT調節性細胞を消費する。
ポジティブ又はネガティブ選択によって所望の細胞集団を単離するために、細胞及び表面(例えば、粒子(例えば、ビーズ))の濃度を変えてもよい。いくつかの実施形態において、細胞とビーズとの接触が最大限となることを確保するために、ビーズ及び細胞が一緒に混合される体積を著しく減少させる(即ち、細胞の増加を増加させる)ことが望ましい場合もある。例えば、一実施形態において、20億個の細胞/mLの濃度を用いる。一実施形態において、10億個の細胞/mLの濃度を用いる。別の実施形態において、1億個の細胞/mL超を用いる。別の実施形態において、1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万又は5000万個の細胞/mLの細胞濃度を用いる。さらに別の実施形態では、7500万、8000万、8500万、9000万、9500万又は1億個の細胞/mLの細胞濃度を用いる。他の実施形態において、1.25又は1.50億個の細胞/mLの濃度を用いてもよい。高濃度の使用は、細胞収量、細胞活性化及び細胞増大の増加をもたらし得る。なお、高濃度の細胞の使用は、目的の標的抗原を弱発現する可能性のある細胞(例えば、CD28陰性T細胞)、又は多くの腫瘍細胞が存在する試料(即ち、白血病血液、腫瘍組織など)からの細胞のより有効な捕捉を可能にすることができる。このような細胞集団は、治療的価値を有する可能性があり、入手することが望ましい。いくつかの実施形態において、高濃度の細胞の使用は、通常弱いCD28発現を有するCD8+ T細胞のより有効な選択を可能にする。
いくつかの実施形態において、より低い濃度の細胞を使用することが望ましい場合がある。T細胞及び表面(例えば、ビーズのような粒子)の混合物を著しく希釈することによって、粒子と細胞との間の相互作用を最小限にする。これにより、粒子に結合するために所望の抗原を高量で発現する細胞が選択される。例えば、CD4+ T細胞は、より高いレベルのCD28を発現し、且つ希釈濃度のCD8+ T細胞よりも有効に捕捉される。いくつかの実施形態において、用いられる細胞の濃度は、5×106個/mLである。いくつかの実施形態において、用いられる濃度は、約1×105個/mL~1×106個/mL、及び両方の間にある任意の整数値であり得る。
いくつかの実施形態において、細胞は、回転器上にて、2℃~10℃又は室温で様々な速度で様々な長さの時間にわたってインキュベートされ得る。
刺激のためのT細胞は、洗浄ステップ後に凍結されてもよい。理論に束縛されるものではないが、凍結及び続く解凍ステップは、細胞集団における顆粒球を除去し単球をある程度で除去することによってより均一な生成物を提供することができる。血漿及び血小板を除去する洗浄ステップ後、細胞を凍結用溶液中に懸濁し得る。多くの凍結用溶液及びパラメータが当分野において既知であり、このような場合に有用であるが、一つの方法は、20% DMSO及び8%ヒト血清アルブミンを含有するPBS、又は10%デキストラン40及び5%デキストロース、20%ヒト血清アルブミン及び7.5% DMSO、又は31.25% plasmalyte-A、31.25%デキストロース5%、0.45% NaCl、10%デキストラン40及び5%デキストロース、20%ヒト血清アルブミン及び7.5% DMSOを含有する培地、又は例えば、Hespan及びPlasmaLyte Aを含有する他の適切な細胞凍結培地を使用し、そして細胞を1℃/分間の速度で-80℃に凍結し液体窒素貯蔵タンクの気相中に貯蔵することに関する。他の制御された凍結方法及び-20℃又は液体窒素中での制御されていない即時の凍結が用いられ得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるように、凍結保存された細胞を解凍し洗浄し、活性化前に室温に一時間静置する。
本開示において、本明細書に記載の増大した細胞が必要である可能性がある時よりも前の時点で対象から血液試料又はアフェレーシス生成物を採取することも企図される。そのため、任意の必要な時点で増大対象の細胞供給源を採取し、T細胞のような必要な細胞を単離し凍結し、それにより後にT細胞療法において、本明細書に記載されるような、T細胞療法から利益を得る複数の疾患又は病態に使用することができる。一実施形態において、血液試料又はアフェレーシス血液成分は、一般の健常な対象から取られる。いくつかの実施形態において、血液試料又はアフェレーシス血液成分は、疾患を発症するリスクがあるが、疾患を発症していない一般の健常な対象から取られ、且つ後の使用のために目的細胞を単離し凍結する。いくつかの実施形態において、T細胞は、増大し、凍結され、後に使用され得る。いくつかの実施形態において、試料は、本明細書に記載のような特定の疾患の診断の直後であるが、何らかの治療の前に患者から採取される。別の実施形態において、複数の関連する治療モダリティの前に対象の血液試料又はアフェレーシス血液成分から細胞を単離し、これらの関連する治療モダリティは、ナタリズマブ(natalizumab)、エファリズマブ(efalizumab)、抗ウイルス剤、化学療法、放射線照射、免疫阻害剤(例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸塩及びFK506)、抗体又は他の免疫除去剤(immunoablative agent)(例えば、CAMPATH、抗CD3抗体、シトキサン(cytoxan)、フルダラビン(fludarabine)、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228)及び放射線照射のような薬剤で治療することを含むが、それに限らない。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリン(シクロスポリン及びFK506)を抑制するか、又は成長因子誘導性シグナル伝達に重要なp70S6キナーゼ(ラパマイシン)を抑制する(Liuら,Cell 66:807-815(1991)、Hendersonら,Immun 73:316-321(1991)、Biererら,Curr.Opin.Immun.5:763-773(1993))。別の実施形態において、患者の細胞を単離し、後に骨髓又は幹細胞移植、化学治療剤(例えば、フルダラビン)を使用するT細胞除去療法、外照射放射線療法(XRT)、シトキサン又は抗体(例えば、OKT3又はCAMPATH)と併せて(例えば、その前、それと同時又はその後に)使用するためにそれを凍結する。別の実施形態において、B細胞除去療法(例えば、リツキシマブ(Rituxan)のような、CD20と反応する薬剤)の前に細胞を単離し、後の治療に使用するために凍結してもよい。
いくつかの実施形態において、T細胞は、治療中に得られるか又は患者から直接得られる。この点で、いくつかのがん治療後、特に免疫系に損傷を与える薬物による治療後、患者が通常であれば治療から回復しているはずの期間に治療直後、得られたT細胞の質が最適であり得ること、又は該T細胞のエクスビボ増大能力を改善し得ることが観察されている。同様に、本明細書に記載の方法でエクスビボ操作を行った後、これらの細胞は、生着及びインビボ増大を増強する好ましい状態にあり得る。そのため、本開示の文脈において、該回復期間に血液細胞を採取することが企図され、T細胞、樹状細胞、又は他の造血系細胞を含む。なお、いくつかの実施形態において、動員(例えば、GM-CSFによる動員)及びコンディショニングレジメンは、対象において、特に治療後に定義された時間ウィンドウの間、細胞型の再増殖、再循環、再生及び/又は増大に有利である状態を作り出すために、用いられることができる。説明的細胞型は、T細胞、B細胞、樹状細胞及び免疫系の他の細胞を含む。
7.2.5. T細胞の活性化及び増大
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARを有するT細胞の遺伝子改変の前又は後に、T細胞は、通常、例えば、米国特許第6,352,694号、同第6,534,055号、同第6,905,680号、同第6,692,964号、同第5,858,358号、同第6,887,466号、同第6,905,681号、同第7,144,575号、同第7,067,318号、同第7,172,869号、同第7,232,566号、同第7,175,843号、同第5,883,223号、同第6,905,874号、同第6,797,514号、同第6,867,041号、及び米国特許出願公開第20060121005号に記載の方法を用いて活性化され増大され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARを有するT細胞の遺伝子改変の前又は後に、T細胞は、通常、例えば、米国特許第6,352,694号、同第6,534,055号、同第6,905,680号、同第6,692,964号、同第5,858,358号、同第6,887,466号、同第6,905,681号、同第7,144,575号、同第7,067,318号、同第7,172,869号、同第7,232,566号、同第7,175,843号、同第5,883,223号、同第6,905,874号、同第6,797,514号、同第6,867,041号、及び米国特許出願公開第20060121005号に記載の方法を用いて活性化され増大され得る。
通常、T細胞は、CD3/TCR複合体関連シグナルを刺激する作用物質及びT細胞表面上の共刺激分子を刺激するリガンドが付着している表面と接触することによって増大することができる。特に、本明細書に記載されるように、表面上に固定される抗CD3抗体もしくはその抗原結合断片もしくは抗CD2抗体との接触、又はカルシウムイオンベクターに結合するプロテインキナーゼC活性化剤(例えば、ブリオスタチン)との接触によってT細胞集団を刺激することができる。T細胞表面のヘルパー分子を共刺激するために、ヘルパー分子に結合するリガンドを用いてもよい。例えば、T細胞の増大を刺激するのに適した条件下で、T細胞集団を抗CD3抗体及び抗CD28抗体と接触させてもよい。CD4+ T細胞又はCD8+ T細胞の増大を刺激するために、抗CD3抗体及び抗CD28抗体を使用してもよい。抗CD3抗体の例としては、UCHT1、OKT3、HIT3a(BioLegend,San Diego,US)が挙げられ、当分野に周知の他の方法のように使用されてもよい(Graves Jら,J.Immunol.146:2102(1991)、Li Bら,Immunology 116:487(2005)、Rivollier Aら,Blood 104:4029(2004))。当分野に周知の他の方法のように、抗CD28抗体の例としては、9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)が挙げられる(Bergら,Transplant Proc.30(8):3975-3977(1998)、Haanenら,J.Exp.Med.190(9):13191328(1999)、Garlandら,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63(1999))。
いくつかの実施形態において、T細胞の一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、種々のレジメンによって提供され得る。例えば、各シグナルを提供する作用物質は、溶液中に存在するか、又は表面にカップリングされ得る。表面にカップリングされる場合、作用物質は、同一の表面に(即ち、「シス」形式で)カップリングされるか又は単独の表面に(即ち、「トランス」形式で)カップリングされてもよい。代替的に、一つ作用物質は、溶液において表面及び別の作用物質にカップリングすることができる。一実施形態において、共刺激シグナルを提供する作用物質は細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する作用物質は溶液にあるか又は表面にカップリングされる。いくつかの実施形態において、両方の作用物質が溶液中に存在し得る。別の実施形態において、作用物質は、可溶性形態であり得、そしてFc受容体を発現する細胞又は抗体又は作用物質に結合することになる他の結合物質などの表面に架橋結合され得る。この点で、例えば、米国特許出願公開第20040101519号及び同第20060034810号の人工抗原提示細胞(aAPC)を参照されたく、それらは、本開示のいくつかの実施形態においてT細胞の活性化及び増大に用いられると企図される。
いくつかの実施形態において、T細胞を、作用物質をコーティングするビーズと組み合わせ、続いてビーズと細胞を分離し、そして細胞を培養する。別の実施形態において、培養前に、作用物質をコーティングするビーズと細胞とは分離されず、一緒に培養される。別の実施形態では、まず磁力のような力を印加することによりビーズ及び細胞を濃縮させて、細胞表面マーカーの連結を増加させることによって、細胞刺激を誘導する。
例えば、細胞表面タンパク質は、抗CD3及び抗CD28が付着している常磁性ビーズ(3×28ビーズ)とT細胞との接触を可能にすることによって連結され得る。一実施形態において、細胞(例えば、104~4×108個のT細胞)及びビーズ(例えば、推奨力価が1:100である抗CD3/CD28 MACSiBead粒子)を緩衝液中に組み合わせ、好ましくは、PBS(カルシウム及びマグネシウムのような二価カチオンを含まない)である。当業者は、任意の細胞濃度が用いられ得ることを容易に理解し得る。例えば、標的細胞は、試料中で非常に少量であり得、且つ試料の0.01%しか占めていないか、又は試料全体(即ち100%)が目的の標的細胞を含んでもよい。そのため、いかなる細胞数も本開示の範囲内である。いくつかの実施形態において、細胞と粒子との接触が最大限となることを確保するために、粒子及び細胞が一緒に混合される体積を著しく減少させる(即ち、細胞の増加を増加させる)ことが望ましい場合もある。例えば、一実施形態において、約20億個の細胞/mLの濃度を用いる。別の実施形態において、1億個の細胞/mL超を用いる。別の実施形態において、1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万又は5000万個の細胞/mLの細胞濃度を用いる。さらに別の実施形態では、7500万、8000万、8500万、9000万、9500万又は1億個の細胞/mLの細胞濃度を用いる。他の実施形態において、1.25又は1.50億個の細胞/mLの濃度を用いてもよい。高濃度の使用は、細胞収量、細胞活性化及び細胞増大の増加をもたらし得る。なお、高い細胞濃度の使用は、CD28陰性T細胞のような、目的標的抗原を弱発現する可能性のある細胞のより有効な捕捉を可能にすることができる。このような細胞集団は、治療的価値を有し得、且ついくつかの実施形態において入手することが望ましい。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常弱いCD28発現を有するCD8+ T細胞のより有効な選択を可能にする。
いくつかの実施形態において、混合物は、数時間(約3時間)から約14日又は両方の間の任意の時間整数値にわたって培養され得る。別の実施形態において、混合物は21日培養され得る。一実施形態において、ビーズとT細胞は、一緒に約八日培養される。別の実施形態において、ビーズとT細胞は、一緒に2~3日培養される。T細胞の培養時間が60日以上となり得るように、数回の刺激サイクルが必要であることもある。T細胞培養に適した条件は、適切な培地(例えば、最小必須培地又はRPMI培地1640又はX-vivo 15(Lonza))を含み、それは、増大及び生存に必須な因子を含んでもよく、血清(例えば、ウシ胎仔血清又はヒト血清)、インターロイキン-2(IL-2)、インスリン、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ及びTNF-α又は当業者に周知の、細胞成長のための任意の他の添加剤を含む。細胞成長のための他の添加剤は、界面活性剤、プラスマネート並びにN-アセチル-システイン及び2-メルカプトエタノールのような還元剤を含むが、それらに限らない。培地は、RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15及びX-Vivo 20、最適化物質(optimizer)であって、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム及びビタミンが加えられ、血清がないか又は適切な量の血清(又は血漿)もしくは既定の一組のホルモンが補充される、最適化剤、及び/又はT細胞を成長及び増大させるのに十分な量のサイトカインを含んでもよい。抗生物質(例えば、ペニシリン及びストレプトマイシン)は、実験培養物のみに含まれ、対象に注入されることになる細胞培養物に含まれていない。標的細胞を、成長を支持するのに必須な条件、例えば、適切な温度(例えば、37℃)及び雰囲気(例えば、空気+5%のCO2)に維持する。異なる刺激時間に曝露されたT細胞は、種々の特徴を呈し得る。例えば、典型的な血液又はアフェレーシス血液成分の末梢血単核球生成物は、細胞傷害性又は抑制性T細胞集団(TC、CD8)よりも多くのヘルパーT細胞集団(TH、CD4+)を有する。CD3及びCD28受容体の刺激によるT細胞エクスビボ増大はT細胞集団を産生し、該T細胞集団は、約8~9日目前に主にTH細胞で構成され、約8~9日目後に、T細胞集団はますます多くなるTC細胞集団を含む。そのため、治療目的により、主にTH細胞を含むT細胞集団を対象に注入することが有利であり得る。同様に、TC細胞の抗原特異性サブセットが単離された場合、該サブセットをより大きな程度に増大させることが有益であり得る。
なお、CD4及びCD8マーカーに加えて、他の表現型マーカーも有意に異なるが、細胞増大中にかなり再現可能である。そのため、このような再現性により、特定の目的のために活性化されたT細胞生成物をカスタマイズすることが可能となる。
7.3. 機能的外因性受容体と一つ又は複数の追加のドメインとを含むポリペプチド
別の態様において、本明細書はポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、少なくとも一つの機能的外因性受容体(例えば、CAR、TCR及びTAC)、IL-12のp40サブユニット及びCCR7のリガンド(例えば、CCL-19及びCCL-21)のうちの少なくとも一つを含む。
別の態様において、本明細書はポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、少なくとも一つの機能的外因性受容体(例えば、CAR、TCR及びTAC)、IL-12のp40サブユニット及びCCR7のリガンド(例えば、CCL-19及びCCL-21)のうちの少なくとも一つを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書はポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、少なくとも一つの機能的外因性受容体(例えば、CAR、TCR及びTAC)、IL-12のp40サブユニット及びCCL-19のうちの少なくとも一つを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書は、CARとp40とを含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書は、CARとCCL-19とを含むポリペプチドを提供する。他の実施形態において、本明細書は、CARと、p40と、CCL-19とを含むポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドにおけるCARは、上記セクション7.2に記載されているいずれか一つであってもよい。本発明のポリペプチドにおけるp40及びCCL-19は、上記セクション7.2に記載されているいずれか一つであってもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書は、TCRとp40とを含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書は、TCRとCCL-19とを含むポリペプチドを提供する。他の実施形態において、本明細書は、TCRと、p40と、CCL-19とを含むポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドにおけるp40及びCCL-19は、上記セクション7.2に記載されているいずれか一つであってもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書は、TACとp40とを含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書は、TACとCCL-19とを含むポリペプチドを提供する。他の実施形態において、本明細書は、TACと、p40と、CCL-19とを含むポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドにおけるp40及びCCL-19は、上記セクション7.2に記載されているいずれか一つであってもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書によるp40は、ヒトp40又はその断片もしくは変異体である。具体的な実施形態において、本明細書によるp40は、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書によるp40は、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書によるp40ポリペプチドは、分泌されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、本明細書によるp40ポリペプチドは、膜結合性ポリペプチド(例えば、MB12)である。
いくつかの実施形態において、本明細書によるCCL-19は、ヒトCCL-19又はその断片もしくは変異体である。具体的な実施形態において、本明細書によるCCL-19は、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書によるCCL-19は、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明のポリペプチドにおいて、CAR、p40及び/又はCCL-19は、任意の順序で並べられ得る。例えば、CAR、p40及びCCL-19がいずれもポリペプチドに存在する場合、いくつかの実施形態において、本明細書によるポリペプチドは、N末端からC末端の方向に、CARと、p40と、CCL-19とを含み、いくつかの実施形態において、本明細書によるポリペプチドは、N末端からC末端の方向に、CARと、CCL-19と、p40とを含み、いくつかの実施形態において、本明細書によるポリペプチドは、N末端からC末端の方向に、CCL-19と、p40と、CARとを含み、いくつかの実施形態において、本明細書によるポリペプチドは、N末端からC末端の方向に、p40と、CCL-19と、CARとを含み、いくつかの実施形態において、本明細書によるポリペプチドは、N末端からC末端の方向に、p40と、CARと、CCL-19とを含み、且ついくつかの実施形態において、本明細書によるポリペプチドは、N末端からC末端の方向に、CCL-19と、CARと、p40とを含む。
本明細書による様々なポリペプチドのいくつかの実施形態において、CAR、p40及び/又はCCL-19はペプチドリンカーを介して互いに連結される。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、2A自己切断ペプチドのような自己切断ペプチドであり、それによりCAR、p40及び/又はCCL-19が、細胞内で切断された後に単独のポリペプチドになる。
他の実施形態において、本明細書はポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、少なくとも一つの機能的外因性受容体(例えば、CAR、TCR及びTAC)、IL-12のp40サブユニット及びCCL-21のうちの少なくとも一つを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書は、CARとp40とを含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書は、CARとCCL-21とを含むポリペプチドを提供する。他の実施形態において、本明細書は、CARと、p40と、CCL-21とを含むポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドにおけるCARは、上記セクション7.2に記載されているいずれか一つであってもよい。本発明のポリペプチドにおけるp40及びCCL-21は、上記セクション7.2に記載されているいずれか一つであってもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書は、TCRとp40とを含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書は、TCRとCCL-21とを含むポリペプチドを提供する。他の実施形態において、本明細書は、TCRと、p40と、CCL-21とを含むポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドにおけるp40及びCCL-21は、上記セクション7.2に記載されているいずれか一つであってもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書は、TACとp40とを含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書は、TACとCCL-21とを含むポリペプチドを提供する。他の実施形態において、本明細書は、TACと、p40と、CCL-21とを含むポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドにおけるp40及びCCL-21は、上記セクション7.2に記載されているいずれか一つであってもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書によるp40は、ヒトp40又はその断片もしくは変異体である。具体的な実施形態において、本明細書によるp40は、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書によるp40は、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書によるp40ポリペプチドは、分泌されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、本明細書によるp40ポリペプチドは、膜結合性ポリペプチド(例えば、MB12)である。
いくつかの実施形態において、本明細書によるCCL-21は、ヒトCCL-21又はその断片もしくは変異体である。具体的な実施形態において、本明細書によるCCL-21は、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書によるCCL-21は、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明のポリペプチドにおいて、CAR、p40及び/又はCCL-21は、任意の順序で並べられ得る。例えば、CAR、p40及びCCL-21がいずれも本ポリペプチドに存在する場合、いくつかの実施形態において、本明細書によるポリペプチドは、N末端からC末端の方向に、CARと、p40と、CCL-21とを含み、いくつかの実施形態において、本明細書によるポリペプチドは、N末端からC末端の方向に、CARと、CCL-21と、p40とを含み、いくつかの実施形態において、本明細書によるポリペプチドは、N末端からC末端の方向に、CCL-21と、p40と、CARとを含み、いくつかの実施形態において、本明細書によるポリペプチドは、N末端からC末端の方向に、p40と、CCL-21と、CARとを含み、いくつかの実施形態において、本明細書によるポリペプチドは、N末端からC末端の方向に、p40と、CARと、CCL-21とを含み、且ついくつかの実施形態において、本明細書によるポリペプチドは、N末端からC末端の方向に、CCL-21と、CARと、p40とを含む。
本明細書による様々なポリペプチドのいくつかの実施形態において、CAR、p40及び/又はCCL-21はペプチドリンカーを介して互いに連結される。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、2A自己切断ペプチドのような自己切断ペプチドであり、それによりCAR、p40及び/又はCCL-21が、細胞内で切断された後に単独のポリペプチドになる。
2Aペプチドのメンバーは、それらを最初に記述したウイルスにちなんで命名されている。例えば、最初に記述された2AペプチドF2Aは口蹄疫ウイルスに由来する。長さが18~22個のアミノ酸である自己切断型2Aペプチドは、プロリンとグリシン残基との間の「リボソームスキッピング」を媒介し、下流翻訳に影響を及ぼすことなくペプチド結合形成を抑制する。これらのペプチドは、複数のタンパク質がポリタンパク質としてコードされることを可能にし、これらのポリタンパク質は翻訳時に解離して成分タンパク質となる。自己切断ペプチドは、ピコルナウイルス科ウイルスファミリーのメンバーに存在し、口蹄疫ウイルス(foot-and-mouth disease virus、FMDV)、ウマ鼻炎Aウイルス(ERAV)、ゾセアアジグナウイルス(TaV)及びブタテッショウウイルス-1(PTV-1)のようなアフトウイルス(aphthovirus)(Donnellyら,J.Gen.Virol.,82:1027-101(2001)、Ryanら,J.Gen.Virol.,72:2727-2732(2001)を参照されたい)と、タイロウイルス(例えば、タイラーマウス脳脊髄炎)及び脳心筋炎ウイルスのようなカルジオウイルスとを含む。FMDV、ERAV、PTV-1及びTaVに由来する2Aペプチドは、それぞれ「F2A」、「E2A」、「P2A」及び「T2A」と呼ばれることもあり、且つ、例えば、Donnellyら,J.Gen.Virol.,78:13-21(1997)、Ryan及びDrew,EMBO J.,13:928-933(1994)、Szymczakら,Nature Biotech.,5:589-594(2004)、Hasegawaら,Stem Cells,25(7):1707-12(2007)の文献に記載されるように、本開示の内容に含まれる。他の実施形態において、本明細書には、Shah及びMuir,Chem Sci.,5(1):446-461(2014)並びにTopilina及びMills,Mobile DNA,5(5)(2014)に記載されるように、インテイン媒介性タンパク質スプライシング系が使用される。当分野の既知の他の方法も本発明のコンストラクトに用いることができる。
いくつかの実施形態において、2A自己切断ペプチドは、F2A、E2A、P2A、T2A、又はそれらの変異体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、自己切断ペプチドは、SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む2A自己切断ペプチドP2A断片である。具体的な実施形態において、自己切断ペプチドは、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含むT2A断片である。
いくつかの特定の実施形態において、p40及びCCL-19は、第1の自己切断ペプチドを介して連結される。いくつかの実施形態において、第1の自己切断ペプチドは、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含む2A自己切断ペプチドT2A断片である。いくつかの実施形態において、本明細書による、IL-12のp40サブユニットとCCL-19とを含むドメインは、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書による、IL-12のp40サブユニットとCCL-19とを含むドメインは、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、機能的外因性受容体(例えば、CAR)は、第2の自己切断ペプチドを介してドメインに連結される。いくつかの実施形態において、第2の自己切断ペプチドは、SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む2A自己切断ペプチドP2A断片である。
他の特定の実施形態において、p40及びCCL-21は、第1の自己切断ペプチドを介して連結される。いくつかの実施形態において、第1の自己切断ペプチドは、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含む2A自己切断ペプチドT2A断片である。いくつかの実施形態において、本明細書による、IL-12のp40サブユニットとCCL-21とを含むドメインは、SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書による、IL-12のp40サブユニットとCCL-21とを含むドメインは、SEQ ID NO:20のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、機能的外因性受容体(例えば、CAR)は、第2の自己切断ペプチドを介してドメインに連結される。いくつかの実施形態において、第2の自己切断ペプチドは、SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む2A自己切断ペプチドP2A断片である。
別の態様において、本明細書は、上記ポリペプチドをコードする核酸を提供し、該ポリペプチドは、本明細書による機能的外因性受容体(例えば、CAR)、IL-12のp40サブユニット、及び/又はCCR7のリガンド(例えば、CCL-19及びCCL-21)を含み、それは、以下でより詳細に説明される。
7.4. ポリヌクレオチド
別の態様において、本開示は、本明細書によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、上記セクション7.2及びセクション7.3に記載されるものを含む。
別の態様において、本開示は、本明細書によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、上記セクション7.2及びセクション7.3に記載されるものを含む。
より具体的には、いくつかの実施形態において、本明細書は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、該ポリペプチドは、キメラ抗原受容体(CAR)と、p40と、CCL-19とを含み、ここで、該CAR、p40及びCCL-19は、ペプチドリンカー(例えば、2A自己切断ペプチドリンカー)を介して互いと融合される。
さらに別の態様において、本明細書はポリヌクレオチドを提供し、該ポリヌクレオチドは、CARをコードする領域、p40をコードする領域及び/又はCCL-19をコードする領域を含む。いくつかの実施形態において、二つ又はそれ以上の領域は、同一のプロモーターにより制御される。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書は、内部リボソームエントリー部位(IRES)を用いて、一つのプロモーターからの複数の遺伝子を発現する。他の実施形態において、これらの領域は、単独のプロモーターにより制御される。
さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、CARをコードする第1のポリヌクレオチドと、p40をコードする第2のポリヌクレオチドと、CCL-19をコードする第3のポリヌクレオチドとを含む。さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、CARをコードする第1のポリヌクレオチドと、p40をコードする領域及びCCL-19をコードする領域を含有する第2のポリヌクレオチドとを含む。さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、p40をコードする第1のポリヌクレオチドと、CARをコードする領域及びCCL-19をコードする領域を含有する第2のポリヌクレオチドとを含む。さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、CCL-19をコードする第1のポリヌクレオチド、CARをコードする領域及びp40をコードする領域を含有する第2のポリヌクレオチドを含む。
さらに別の態様において、本明細書は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、該ポリペプチドは、TCR(又はそのサブユニット)と、p40と、CCL-19とを含み、ここで、該TCR(又はそのサブユニット)、p40及びCCL-19は、ペプチドリンカー(例えば、2A自己切断ペプチドリンカー)を介して互いと融合される。
さらに別の態様において、本明細書はポリヌクレオチドを提供し、該ポリヌクレオチドは、TCR(又はそのサブユニット)をコードする領域、p40をコードする領域、及び/又はCCL-19をコードする領域を含む。いくつかの実施形態において、二つ又はそれ以上の領域は、同一のプロモーターにより制御される。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書は、内部リボソームエントリー部位(IRES)を用いて、一つのプロモーターからの複数の遺伝子を発現する。他の実施形態において、これらの領域は、単独のプロモーターにより制御される。
さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、TCR(又はそのサブユニット)をコードする第1のポリヌクレオチドと、p40をコードする第2のポリヌクレオチドと、CCL-19をコードする第3のポリヌクレオチドとを含む。さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、TCR(又はそのサブユニット)をコードする第1のポリヌクレオチドと、p40をコードする領域及びCCL-19をコードする領域を含有する第2のポリヌクレオチドとを含む。さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、p40をコードする第1のポリヌクレオチドと、TCR(又はそのサブユニット)をコードする領域及びCCL-19をコードする領域を含有する第2のポリヌクレオチドとを含む。さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、CCL-19をコードする第1のポリヌクレオチドと、TCR(又はそのサブユニット)をコードする領域及びp40をコードする領域を含有する第2のポリヌクレオチドとを含む。
さらに別の態様において、本明細書は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、該ポリペプチドは、TAC(又はそのドメイン)と、p40と、CCL-19とを含み、ここで、該TAC(又はそのドメイン)、p40及びCCL-19は、ペプチドリンカー(例えば、2A自己切断ペプチドリンカー)を介して互いと融合される。
さらに別の態様において、本明細書提供了ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドは、TAC(又はそのドメイン)をコードする領域、p40をコードする領域、及び/又はCCL-19をコードする領域を含む。いくつかの実施形態において、二つ又はそれ以上の領域は、同一のプロモーターにより制御される。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書は、内部リボソームエントリー部位(IRES)を用いて、一つのプロモーターからの複数の遺伝子を発現する。他の実施形態において、これらの領域は、単独のプロモーターにより制御される。
さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、TAC(又はそのドメイン)をコードする第1のポリヌクレオチドと、p40をコードする第2のポリヌクレオチドと、CCL-19をコードする第3のポリヌクレオチドとを含む。さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、TAC(又はそのドメイン)をコードする第1のポリヌクレオチドと、p40をコードする領域及びCCL-19をコードする領域を含有する第2のポリヌクレオチドとを含む。さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、p40をコードする第1のポリヌクレオチドと、TAC(又はそのドメイン)をコードする領域及びCCL-19をコードする領域を含有する第2のポリヌクレオチドとを含む。さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、CCL-19をコードする第1のポリヌクレオチドと、TAC(又はそのドメイン)をコードする領域及びp40をコードする領域を含有する第2のポリヌクレオチドとを含む。
他の実施形態において、本明細書は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、該ポリペプチドは、キメラ抗原受容体(CAR)と、p40と、CCL-21とを含み、ここで、該CAR、p40及びCCL-21は、ペプチドリンカー(例えば、2A自己切断ペプチドリンカー)を介して互いと融合される。
さらに別の態様において、本明細書はポリヌクレオチドを提供し、該ポリヌクレオチドは、CARをコードする領域、p40をコードする領域及び/又はCCL-21をコードする領域を含む。いくつかの実施形態において、二つ又はそれ以上の領域は、同一のプロモーターにより制御される。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書は、内部リボソームエントリー部位(IRES)を用いて、一つのプロモーターからの複数の遺伝子を発現する。他の実施形態において、これらの領域は、単独のプロモーターにより制御される。
さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、CARをコードする第1のポリヌクレオチドと、p40をコードする第2のポリヌクレオチドと、CCL-21をコードする第3のポリヌクレオチドとを含む。さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、CARをコードする第1のポリヌクレオチドと、p40をコードする領域及びCCL-21をコードする領域を含有する第2のポリヌクレオチドとを含む。さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、p40をコードする第1のポリヌクレオチドと、CARをコードする領域及びCCL-21をコードする領域を含有する第2のポリヌクレオチドとを含む。さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、CCL-21をコードする第1のポリヌクレオチド、CARをコードする領域及びp40をコードする領域を含有する第2のポリヌクレオチドを含む。
さらに別の態様において、本明細書は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、該ポリペプチドは、TCR(又はそのサブユニット)と、p40と、CCL-21とを含み、ここで、該TCR(又はそのサブユニット)、p40及びCCL-21は、ペプチドリンカー(例えば、2A自己切断ペプチドリンカー)を介して互いと融合される。
さらに別の態様において、本明細書はポリヌクレオチドを提供し、該ポリヌクレオチドは、TCR(又はそのサブユニット)をコードする領域、p40をコードする領域、及び/又はCCL-21をコードする領域を含む。いくつかの実施形態において、二つ又はそれ以上の領域は、同一のプロモーターにより制御される。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書は、内部リボソームエントリー部位(IRES)を用いて、一つのプロモーターからの複数の遺伝子を発現する。他の実施形態において、これらの領域は、単独のプロモーターにより制御される。
さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、TCR(又はそのサブユニット)をコードする第1のポリヌクレオチドと、p40をコードする第2のポリヌクレオチドと、CCL-21をコードする第3のポリヌクレオチドとを含む。さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、TCR(又はそのサブユニット)をコードする第1のポリヌクレオチドと、p40をコードする領域及びCCL-21をコードする領域を含有する第2のポリヌクレオチドとを含む。さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、p40をコードする第1のポリヌクレオチドと、TCR(又はそのサブユニット)をコードする領域及びCCL-21をコードする領域を含有する第2のポリヌクレオチドとを含む。さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、CCL-21をコードする第1のポリヌクレオチドと、TCR(又はそのサブユニット)をコードする領域及びp40をコードする領域を含有する第2のポリヌクレオチドとを含む。
さらに別の態様において、本明細書は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、該ポリペプチドは、TAC(又はそのドメイン)と、p40と、CCL-21とを含み、ここで、該TAC(又はそのドメイン)、p40及びCCL-21は、ペプチドリンカー(例えば、2A自己切断ペプチドリンカー)を介して互いと融合される。
さらに別の態様において、本明細書はポリヌクレオチドを提供し、該ポリヌクレオチドは、TAC(又はそのドメイン)をコードする領域、p40をコードする領域、及び/又はCCL-21をコードする領域を含む。いくつかの実施形態において、二つ又はそれ以上の領域は、同一のプロモーターにより制御される。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書は、内部リボソームエントリー部位(IRES)を用いて、一つのプロモーターからの複数の遺伝子を発現する。他の実施形態において、これらの領域は、単独のプロモーターにより制御される。
さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、TAC(又はそのドメイン)をコードする第1のポリヌクレオチドと、p40をコードする第2のポリヌクレオチドと、CCL-21をコードする第3のポリヌクレオチドとを含む。さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、TAC(又はそのドメイン)をコードする第1のポリヌクレオチドと、p40をコードする領域及びCCL-21をコードする領域を含有する第2のポリヌクレオチドとを含む。さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、p40をコードする第1のポリヌクレオチドと、TAC(又はそのドメイン)をコードする領域及びCCL-21をコードする領域を含有する第2のポリヌクレオチドとを含む。さらに別の態様において、本明細書は組成物を提供し、該組成物は、CCL-21をコードする第1のポリヌクレオチドと、TAC(又はそのドメイン)をコードする領域及びp40をコードする領域を含有する第2のポリヌクレオチドとを含む。
本開示のポリヌクレオチドは、RNA形態又はDNA形態であってもよい。DNAは、cDNAと、ゲノムDNAと、合成DNAとを含み、且つ二本鎖又は一本鎖であってもよく、且つ一本鎖であれば、コード鎖又は非コード(アンチセンス)鎖であってもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはcDNA形態である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは合成ポリヌクレオチドである。
本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドの変異体にさらに関し、ここで、該変異体は、例えば、本開示のポリペプチド的断片、類似体及び/又は誘導体をコードする。いくつかの実施形態において、本開示はポリヌクレオチドを提供し、該ポリヌクレオチドは、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも約75%同一である、少なくとも約80%同一である、少なくとも約85%同一である、少なくとも約90%同一である、少なくとも約95%同一である、且ついくつかの実施形態においては少なくとも約96%、97%、98%、又は99%同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用されるように、語句「参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば95%「同一である」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」は、該ポリヌクレオチド配列が、該参照ヌクレオチド配列の100ヌクレオチド当たり最大五つの点突然変異を含み得ることを除いて、該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一性を有することを意味することが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列における5%までのヌクレオチドを削除するかもしくは別のヌクレオチドで置換してもよいか、又は参照配列における全ヌクレオチドの5%までの複数のヌクレオチドを参照配列に挿入してもよい。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の5’又は3’末端位置又はそれらの末端位置の間にある、参照配列における単一のヌクレオチドの間に散在するか又は参照配列内にある一つ又は複数の連続した基における任意の場所で発生し得る。
ポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域又は両方に変化を含有し得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド変異体は、サイレント置換、付加、又は欠失を生じさせるが、コードされるポリペプチドの特性又は活性を変化させない変化を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド変異体は、サイレント置換を含み、それは、(遺伝子コードの縮重に起因して)ポリペプチドのアミノ酸配列の変化を生じさせない。ポリヌクレオチド変異体は、種々の理由、例えば、特定の宿主のコドン発現を最適化する(即ちヒトmRNAのコドンを大腸菌(E. coli)のような細菌宿主に好ましいものに変更する)ために産生され得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド変異体は、配列の非コード又はコード領域において少なくとも一つのサイレント突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド変異体は、コードされるポリペプチドの発現(又は発現レベル)を調節するか又は変化させるように産生された。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド変異体は、コードされるポリペプチドの発現を増加するように産生された。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド変異体は、ポリペプチドの発現を減少させるように産生された。いくつかの実施形態において、親ポリヌクレオチド配列に比べて、ポリヌクレオチド変異体は、コードされるポリペプチドの発現の増加を示す。いくつかの実施形態において、親ポリヌクレオチド配列に比べて、ポリヌクレオチド変異体はコードされるポリペプチドの発現の減少を示す。
7.5. ベクター
本明細書に記載のポリヌクレオチド又は核酸分子を含むベクターをさらに提供する。一実施形態において、核酸分子を組換え発現ベクターに組込んでもよい。
本明細書に記載のポリヌクレオチド又は核酸分子を含むベクターをさらに提供する。一実施形態において、核酸分子を組換え発現ベクターに組込んでもよい。
本開示は、本明細書に記載のポリペプチドのうちのいずれか一つをクローニングし発現するためのベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ベクターは、哺乳動物細胞のような真核細胞における複製及び組込みに適する。いくつかの実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、牛痘ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、及びその誘導体を含むが、それらに限らない。ウイルスベクター技術は、当分野に周知のものであり、且つ例えば、Sambrookら(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)並びに他のウイルス学及び分子生物学的マニュアルに記載されている。
哺乳動物細胞に遺伝子を移入するための多くのウイルスベースのシステムが開発されている。例えば、逆転写ウイルスは遺伝子送達システムのために便利なプラットフォームを提供する。当分野の既知の技術を用いて異種核酸をベクターに挿入し、逆転写ウイルス粒子にパッケージングすることができる。そして組換えウイルスを単離し、操作された哺乳動物細胞にそれをインビトロ又はエクスビボ送達することができる。多くの逆転写ウイルス系は、当分野に既知のものである。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターを用いる。多くのアデノウイルスベクターは当分野に既知のものである。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターを用いる。いくつかの実施形態において、自己不活性化型レンチウイルスベクターを用いる。例えば、免疫調節剤(例えば、免疫チェックポイント阻害剤)コード配列を担持する自己不活性化型レンチウイルスベクター及び/又はキメラ抗原受容体を担持する自己不活性化型レンチウイルスベクターは、当分野に既知のレジメンパッケージングでパッケージングされ得る。当分野の既知の方法を用いて、得られたレンチウイルスベクターを哺乳動物細胞(例えば、初代ヒトT細胞)の形質導入に用いられてもよい。レンチウイルスのような逆転写ウイルスに由来するベクターは、トランスジェニックの長期的かつ安定的な組込み及び子孫細胞での増殖を可能にするため、長期的な遺伝子転移を実現するのに適したツールである。レンチウイルスベクターは、低免疫原性をさらに有し、且つ非増殖性細胞を形質導入することができる。
いくつかの実施形態において、ベクターは、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸のうちのいずれか一つを含む。核酸は、例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位及び一つ又は複数の選択可能マーカーを用いることを含め、当分野における任意の周知の分子クローニング方法を用いてベクターにクローニングされ得る。いくつかの実施形態において、核酸は、プロモーターに作動可能に連結される。哺乳動物細胞における遺伝子発現のための様々なプロモーターが探索されており、本開示では、当分野に既知のプロモーターのいずれも使用し得る。プロモーターは、構成型プロモーター又は調節型プロモーター、例えば、誘導型プロモーターに大別され得る。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドをコードする核酸は、構成型プロモーターに作動可能に連結される。構成型プロモーターは、異種遺伝子(トランスジェニックとも呼ばれる)の宿主細胞での構成的発現を可能にする。本明細書で企図される例示的構成型プロモーターは、マウス幹細胞ウイルス(MSCV)プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ヒト伸長因子-1 α(hEF1α)、ユビキチンCプロモーター(UbiC)、ホスホグリセロキナーゼプロモーター(PGK)、シミアンウイルス40初期プロモーター(SV40)及びCMV初期エンハンサーにカップリングされるニワトリβ-アクチンプロモーター(CAGG)を含むが、それらに限らない。このような構成型プロモーターのトランスジェニック発現ドライブに対する効率は、多くの研究において広く比較されている。例えば、Michael C.Miloneらは、CMV、hEF1α、UbiC及びPGKが初代ヒトT細胞におけるキメラ抗原受容体発現をドライブする効率を比較し、hEF1αプロモーターが、最も高いレベルのトランスジェニック発現を誘導するだけでなく、且つCD4及びCD8ヒトT細胞において最適に維持されると結論付けた(Molecular Therapy,17(8):1453-1464(2009))。いくつかの実施形態において、CARをコードする核酸は、hEF1αプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、CARをコードする核酸は、MSCVプロモーターに作動可能に連結される。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドをコードする核酸は、誘導型プロモーターに作動可能に連結される。誘導型プロモーターは、調節型プロモーターのクラスに属する。誘導型プロモーターは、一つ又は複数の条件、例えば、物理的条件、操作された免疫エフェクター細胞の微小環境もしくは操作された免疫エフェクター細胞の生理学的状態、誘導物質(即ち、誘導剤)又はそれらの組み合わせにより誘導され得る。
いくつかの実施形態において、誘導条件は、操作された哺乳動物細胞及び/又は医薬組成物を受けた対象における内因性遺伝子の発現を誘導しない。いくつかの実施形態において、該誘導条件は、誘導物質、照射(例えば、電離放射線、光)、温度(例えば、熱)、酸化還元状態、腫瘍環境及び操作された哺乳動物細胞の活性化状態からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクターを介してトランスフェクトされた宿主細胞集団からポリペプチドを発現する細胞を選択するために、選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子を含む。宿主細胞における発現を可能にするために、選択マーカー及びレポーター遺伝子には、両方とも適切な調節配列が隣接され得る。例えば、ベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列並びに核酸配列発現の調節に有用であるプロモーターを含有する。
いくつかの特定の実施形態において、本明細書によるベクターは、MNDプロモーター(骨髓増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、陰性対照領域欠失、dl587revプライマー結合部位に置換される(MND)プロモーター)を含む。いくつかの特定の実施形態において、本明細書によるベクターはMSCVプロモーターを含む。他の特定の実施形態において、本明細書によるベクターはEF1αを含む。
7.6. 作製方法
さらに別の態様において、本明細書は、操作された免疫エフェクター細胞(例えば、CAR-T細胞又はTCR-T細胞又はTAC-T細胞)を作製するための方法を提供し、該方法は、本明細書による一つ又は複数のポリヌクレオチド又は一つ又は複数のベクター(例えば、上記セクション7.4及びセクション7.5に記載のとおりである)を免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)に導入することを含む。
さらに別の態様において、本明細書は、操作された免疫エフェクター細胞(例えば、CAR-T細胞又はTCR-T細胞又はTAC-T細胞)を作製するための方法を提供し、該方法は、本明細書による一つ又は複数のポリヌクレオチド又は一つ又は複数のベクター(例えば、上記セクション7.4及びセクション7.5に記載のとおりである)を免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)に導入することを含む。
より具体的には、いくつかの実施形態において、外因的に導入されたp40及びCCL-19を発現するCAR-T細胞は、セクション7.3に記載のポリペプチドをコードする一つ又は複数の核酸又はセクション7.4に記載の一つ又は複数の核酸を細胞に導入することによって産生され得る。
CAR、p40及びCCL-19は、それぞれ単独のポリペプチドとしてT細胞に単独に導入され得る。例えば、本明細書によるCARをコードする核酸、p40をコードする核酸、及びCCL-19をコードする核酸をそれぞれT細胞に導入する。代替的に、三者のうちのいずれか両者又は三者全ては、一つの核酸により単一ポリペプチドとしてT細胞に一緒に導入され得、該核酸は細胞内で翻訳されると切断される。例えば、本明細書によるCARと、自己切断ペプチドリンカーを介して連結されるp40とを含むポリペプチドをコードする核酸をT細胞に導入し、CCL-19をコードする核酸をT細胞に別々に導入する。同様に、本明細書によるCARと、自己切断ペプチドリンカーを介して連結されるCCL-19とを含むポリペプチドをコードする核酸をT細胞に導入し、p40をコードする核酸をT細胞に別々に導入する。いくつかの実施形態において、自己切断ペプチドリンカーを介して互いに連結されるCAR、p40及びCCL-19のうちの三者全てを含むポリペプチドをコードする核酸をT細胞に導入してもよい。以上では、自己切断ペプチドリンカーがより詳細に説明されている。いくつかの実施形態において、2A自己切断ペプチドは、F2A、E2A、P2A、T2A、又はそれらの変異体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、自己切断ペプチドは、SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む2A自己切断ペプチドP2A断片である。具体的な実施形態において、自己切断ペプチドは、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含むT2A断片である。
代替的に、本明細書によるCAR-T細胞は、複数の領域、例えば、CARをコードする領域、p40をコードする領域及び/又はCCL-19をコードする領域を含むポリヌクレオチドから産生され得る。異なる領域は、同じプロモーターにより制御され得る。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書は、内部リボソームエントリー部位(IRES)を用いて、一つのプロモーターからの複数の遺伝子を発現する。他の実施形態において、異なる領域は、単独のプロモーターにより制御される。
さらに別の態様において、本明細書は、本明細書による方法によって産生された、操作された免疫エフェクター細胞(例えば、CAR-T細胞)を提供する。他の特性に加えて、外因的に導入されたp40及びCCL-19を発現するCAR-T細胞は、外因的に導入されたp40及びCCL-19を有しないCAR-T細胞に比べてより高いレベルのIL-23を有する。いくつかの実施形態において、IL-23のレベルは少なくとも20%高い。いくつかの実施形態において、IL-23のレベルは少なくとも30%高い。いくつかの実施形態において、IL-23のレベルは少なくとも40%高い。いくつかの実施形態において、IL-23のレベルは少なくとも50%高い。いくつかの実施形態において、IL-23のレベルは少なくとも60%高い。いくつかの実施形態において、IL-23のレベルは少なくとも70%高い。いくつかの実施形態において、IL-23のレベルは少なくとも80%高い。いくつかの実施形態において、IL-23のレベルは少なくとも90%高い。いくつかの実施形態において、IL-23のレベルは少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍又はそれ以上である。
他の実施形態において、外因的に導入されたp40及びCCL-21を発現するCAR-T細胞は、セクション7.3に記載のポリペプチドをコードする一つ又は複数の核酸又はセクション7.4に記載の一つ又は複数の核酸を細胞に導入することによって産生され得る。
CAR、p40及びCCL-21は、それぞれ単独のポリペプチドとしてT細胞に単独に導入され得る。例えば、本明細書によるCARをコードする核酸、p40をコードする核酸及びCCL-21をコードする核酸をそれぞれT細胞に導入する。代替的に、三者のうちのいずれか両者又は三者全ては、一つの核酸により単一ポリペプチドとしてT細胞に一緒に導入され得、該核酸は細胞内で翻訳されると切断される。例えば、本明細書によるCARと、自己切断ペプチドリンカーを介して連結されるp40とを含むポリペプチドをコードする核酸をT細胞に導入し、CCL-21をコードする核酸をT細胞に別々に導入する。同様に、本明細書によるCARと、自己切断ペプチドリンカーを介して連結されるCCL-21とを含むポリペプチドをコードする核酸をT細胞に導入し、p40をコードする核酸をT細胞に別々に導入する。いくつかの実施形態において、自己切断ペプチドリンカーを介して互いに連結されるCAR、p40及びCCL-21のうちの三者全てを含むポリペプチドをコードする核酸をT細胞に導入してもよい。以上では、自己切断ペプチドリンカーがより詳細に説明されている。いくつかの実施形態において、2A自己切断ペプチドは、F2A、E2A、P2A、T2A、又はそれらの変異体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、自己切断ペプチドは、SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む2A自己切断ペプチドP2A断片である。具体的な実施形態において、自己切断ペプチドは、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含むT2A断片である。
代替的に、本明細書によるCAR-T細胞は、複数の領域、例えば、CARをコードする領域、p40をコードする領域及び/又はCCL-21をコードする領域を含むポリヌクレオチドから産生され得る。異なる領域は、同じプロモーターにより制御され得る。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書は、内部リボソームエントリー部位(IRES)を用いて、一つのプロモーターからの複数の遺伝子を発現する。他の実施形態において、異なる領域は、単独のプロモーターにより制御される。
さらに別の態様において、本明細書は、本明細書による方法によって産生された、操作された免疫エフェクター細胞(例えば、CAR-T細胞)を提供する。他の特性に加えて、外因的に導入されたp40及びCCL-21を発現するCAR-T細胞は、外因的に導入されたp40及びCCL-21を有しないCAR-T細胞に比べてより高いレベルのIL-23を有する。いくつかの実施形態において、IL-23のレベルは少なくとも20%高い。いくつかの実施形態において、IL-23のレベルは少なくとも30%高い。いくつかの実施形態において、IL-23のレベルは少なくとも40%高い。いくつかの実施形態において、IL-23のレベルは少なくとも50%高い。いくつかの実施形態において、IL-23のレベルは少なくとも60%高い。いくつかの実施形態において、IL-23のレベルは少なくとも70%高い。いくつかの実施形態において、IL-23のレベルは少なくとも80%高い。いくつかの実施形態において、IL-23のレベルは少なくとも90%高い。いくつかの実施形態において、IL-23のレベルは少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍又はそれ以上である。
CAR-T細胞との関連において記述される上記方法は、他の免疫エフェクター細胞(例えば、TCR-T細胞及びTAC-T細胞)の産生にも適用可能である。
7.7. 医薬組成物
一態様において、本開示は、本開示の操作された細胞を含む医薬組成物をさらに提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、治療有効量の本開示の操作されたT細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む。
一態様において、本開示は、本開示の操作された細胞を含む医薬組成物をさらに提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、治療有効量の本開示の操作されたT細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む。
具体的な実施形態において、用語「賦形剤」はさらに、希釈剤、アジュバント(例えば、フロイントアジュバント(完全もしくは不完全))、キャリア、又はビヒクルを指してもよい。医薬賦形剤は、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油のような、石油、動物、植物又は合成供給源のものを含む油及び水のような無菌の液体であってもよい。生理食塩水、デキストロース水溶液及びグリセリン溶液も液体賦形剤として用いることができる。適切な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、エチレングリコール、水、エタノールなどを含む。該組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤又は乳化剤又はpH緩衝剤をさらに含んでもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル、散剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。適切な医薬賦形剤の例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.,Easton,PAに記載されている。このような組成物は、患者への投与に適した形態を提供するために、予防又は治療有効量の、例えば、精製された形態で、本明細書に提供される活性成分、及び適切な量の賦形剤を含むことになる。該製剤は投与様式に適しているべきである。
いくつかの実施形態において、賦形剤の選択は、特定の細胞、及び/又は投与方法により部分的に決定される。そのため、複数の適切な製剤が存在する。
通常、許容可能なキャリア、賦形剤又は安定剤は、用いられる投与量及び濃度で受容体にとって非毒性であり、且つ、緩衝剤、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンE、メタ重亜硫酸ナトリウムを含む酸化防止剤;防腐剤、等張剤、安定剤、金属複合体(例えば、Zn-タンパク質複合体);EDTAのようなキレート剤及び/又は非イオン性界面活性剤を含む。
緩衝剤は、特に安定性がpH依存的である場合、治療効果を最適化する範囲内にpHを制御するために用いることができる。本開示に適した緩衝剤は、有機酸、無機酸及びそれらの塩を含む。例えば、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酢酸塩である。なお、緩衝液は、ヒスチジン及びトリメチルアミン塩、例えば、Trisを含んでもよい。
微生物の増殖を遅らせるため、保存剤を加えてもよい。本開示に適した防腐剤は、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、ベンザルコニウムハロゲン化物(例えば、塩素、臭素、ヨウ素)、塩化ベンゼトニウム、チメロサール、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、メチルパラベン又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン類、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノール及びm-クレゾールを含む。
等張化剤(「安定剤」と呼ばれることもある)は組成物における液体の張力を調節又は維持するために存在してもよい。タンパク質及び抗体のような大きな荷電生体分子と共に使用される場合、それらは、アミノ酸側鎖の荷電基と相互作用することによって分子間及び分子内相互作用の可能性を低下させることができるため、多くの場合に「安定剤」と呼ばれる。例示的等張化剤は、多価糖アルコール類、三価以上の糖アルコール類、例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールを含む。
別の例示的賦形剤は、(1)充填剤と、(2)溶解度促進剤と、(3)安定剤と、(4)変性又は容器壁への接着を防止する薬剤とを含む。このような賦形剤は、多価糖アルコール類(上記に列挙した)と、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、2-フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどのようなアミノ酸と、スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース(myoinisitose)、ミオイニシトール(myoinisitol)、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール類(例えば、イノシトール)、ポリエチレングリコールのような有機糖又は糖アルコール類と、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α-モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウムのような含硫還元剤と、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は他の免疫グロブリン低分子量タンパク質と、ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマーと、単糖類(例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース)と、二糖類(例えば、ラクトース、マルトース、スクロース)と、ラフィノースのような三糖類と、デキストリン又はデキストランのような多糖類とを含む。
治療剤の溶解を促進し、治療用タンパク質を撹拌誘発性凝集から保護するために、非イオン性界面活性剤又はデタージェント(「湿潤剤」とも呼ばれる)が存在し得、これは、活性治療用タンパク質又は抗体の変性を引き起こすことなく製剤が剪断表面応力に曝露されることも可能にする。適切な非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリソルベート類(20、40、60、65、80など)、ポロキサマー類(184、188など)、PLURONIC(登録商標)ポリオール類、TRITON(登録商標)、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル類(TWEEN(登録商標)-20、TWEEN(登録商標)-80など)、ラウロマクロゴール400、ステアリン酸ポリオキシル40、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油10、50及び60、モノステアリン酸グリセロール、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースが挙げられる。利用可能なアニオン性デタージェントとしては、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム及びジオクチルスルホン酸ナトリウムが挙げられる。カチオン性デタージェントとしては、塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウムが挙げられる。
投与経路は、単回又は複数回のボーラス注入又は適切なやり方、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内もしくは関節内経路による注射もしくは注入、局所投与、吸入、又は持続放出もしくは遅延放出手段による長時間注入のような、既知かつ許容可能な方法に従って行われる。
別の実施形態において、医薬組成物は、制御放出又は持続放出系として提供され得る。一実施形態において、制御放出又は持続放出を実現するために、ポンプを使用してもよい(例えば、Sefton,Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201-40(1987)、Buchwaldら,Surgery 88:507-16(1980)、及びSaudekら,N.Engl.J.Med.321:569-74(1989)を参照されたい)。別の実施形態において、ポリマー材料は、予防剤又は治療剤(例えば、本明細書に記載の融合タンパク質)又は本明細書による組成物の制御放出又は持続放出を実現するために用いられてもよい(例えば、Medical Applications of Controlled Release(Langer及びWiseによる編集,1974)、Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance(Smolen及びBallによる編集,1984)、Ranger及びPeppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61-126(1983)、Levyら,Science 228:190-92(1985)、Duringら,Ann.Neurol.25:351-56(1989)、Howardら,J.Neurosurg.71:105-12(1989)、米国特許第5,679,377号、同第5,916,597号、同第5,912,015号、同第5,989,463号、及び同第5,128,326号、PCT公開番号WO 99/15154及び同WO 99/20253を参照されたい)。持続放出製剤に用いられるポリマーの例は、ポリ(2-メタクリル酸ヒドロキシエチル)、ポリ(メタクリル酸メチル)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-コ-酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド類(PLG)、ポリ無水物、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド類(PLA)、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)類(PLGA)及びポリオルトエステル類を含むが、それらに限らない。一実施形態において、持続放出製剤に使用されるポリマーは、不活性であり、浸出性不純物を含まず、貯蔵時に安定性があり、無菌であり、且つ生分解性である。さらに別の実施形態において、制御放出又は持続放出系を特定の標的組織、例えば、鼻道又は肺付近に置いてもよいため、全身用量の一部のみが必要となる(例えば、Goodson,Medical Applications of Controlled Release 第2巻,115-38(1984)を参照されたい)。制御放出系は、例えば、Langer,Science 249:1527-33(1990)によって検討されている。当業者に周知の任意の技術は、本明細書に記載の一つ又は複数の作用物質を含む持続放出製剤を産生するために用いられてもよい(例えば、米国特許第4,526,938号、PCT公開番号WO 91/05548及び同WO 96/20698、Ningら,Radiotherapy & Oncology 39:179-89(1996)、Songら,PDA J.of Pharma.Sci.& Tech.50:372-97(1995)、Cleekら,Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-54(1997)、及びLamら,Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-60(1997)を参照されたい)。
本明細書に記載の医薬組成物は、治療する特定の適応症の必要に応じて二つ以上の活性化合物又は活性剤をさらに含んでもよい。代替的に又は付加的に、組成物は、細胞傷害性作用物質、化学療法剤、サイトカイン、免疫阻害剤又は増殖阻害剤を含んでもよい。このような分子は、所望の目的に有効な量で適宜組み合わせられて存在する。
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル、コロイド状薬物送達システム(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノパーティクル及びナノカプセル)又はマクロエマルションにも封入され得る。このような技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences第18版に開示されている。
様々な組成物及び送達システムは、周知であり、且つ本明細書による治療剤と共に使用することができ、該組成物及び送達システムは、リポソーム、マイクロパーティクル、マイクロカプセルに封入され、本明細書による単一ドメイン抗体又は治療用分子を発現することができる組換え細胞、レトロウイルスベクター又は他のベクターの一部として構築される核酸などを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書による医薬組成物は、治療有効量又は予防有効量などの、疾患又は障害を治療又は予防するのに有効な量の結合分子及び/又は細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療又は予防効果は、治療される対象を定期的に評価することによってモニタリングされる。数日以上の繰り返し投与については、病態に応じて、疾患症状の所望の抑制が起こるまで治療を繰り返して行う。しかしながら、他の投与量レジメンは、有用であり得、且つ決定され得る。
7.8. 方法と使用
別の態様において、本明細書は、本明細書による操作された細胞(例えば、CAR-T細胞)の使用方法及び使用を提供する。このような方法及び使用は、治療方法及び使用、例えば、疾患又は障害を有している対象に細胞又は細胞を含有する組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、疾患又は障害の治療を実現するために、細胞は有効量で投与される。使用は、細胞のこのような方法及び治療における使用、並びにこれらの治療方法を実施するための医薬の調製における使用を含む。いくつかの実施形態において、これらの方法は、疾患又は病態を有しているか又は有している疑いがある対象に、細胞又はこれらの細胞を含む組成物を投与することによって実施される。いくつかの実施形態において、これらの方法は、これにより対象の疾患又は障害を治療する。
別の態様において、本明細書は、本明細書による操作された細胞(例えば、CAR-T細胞)の使用方法及び使用を提供する。このような方法及び使用は、治療方法及び使用、例えば、疾患又は障害を有している対象に細胞又は細胞を含有する組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、疾患又は障害の治療を実現するために、細胞は有効量で投与される。使用は、細胞のこのような方法及び治療における使用、並びにこれらの治療方法を実施するための医薬の調製における使用を含む。いくつかの実施形態において、これらの方法は、疾患又は病態を有しているか又は有している疑いがある対象に、細胞又はこれらの細胞を含む組成物を投与することによって実施される。いくつかの実施形態において、これらの方法は、これにより対象の疾患又は障害を治療する。
いくつかの実施形態において、本明細書による治療は、疾患もしくは障害又はそれらに関連する症状、副効用もしくは結果もしくは表現型の完全又は部分的な改善又は減少をもたらす。治療の理想的効果は、疾患の発生又は再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善又は軽減、及び寛解又は予後の改善を含むが、それらに限らない。これらの用語は、疾患の完治、又は任意の症状又は全ての症状若しくはアウトカムに対する一つ又は複数の影響の完全除去を含むが、これを示唆するものではない。
本明細書で使用されるように、いくつかの実施形態において、本明細書による治療は、疾患又は障害の発症を遅延させ、例えば、疾患(例えば、がん)の発症を遅くし、妨げ、減速させ、阻止し、安定化し、抑制し及び/又は遅らせる。この遅延は、疾患の病歴及び/又は治療される個体に応じて、異なる時間長を有してもよい。当業者には明らかなように、個体が疾患又は障害を発症していないため、十分又は有意な遅延は、実際的には、予防を包含することができる。例えば、進行期がん(例えば、転移の発症)を遅延させる可能性がある。他の実施形態において、本明細書による方法又は使用は、疾患又は障害を予防する。
いくつかの実施形態において、本発明CAR-T細胞療法は、固形腫瘍がんを治療するためのものである。他の実施形態において、本発明CAR-T細胞は、血液がんを治療するためのものである。他の実施形態において、疾患又は障害は、自己免疫性及び炎症性疾患である。他の実施形態において、疾患又は障害は、感染性疾患である。
いくつかの実施形態において、疾患又は障害は、異常な細胞増殖及び/又はアポトーシス失調の疾患である。このような疾患の例は、がん、中皮腫、膀胱がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚又は眼内黒色腫、卵巣がん、乳がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、骨がん、結腸がん、直腸がん、肛門領域がん、胃がん、胃腸(胃、結腸直腸及び/又は十二指腸)がん、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、精巣がん、肝細胞(肝及び/又は胆管)がん、原発性又は二次性中枢神経系腫瘍、原発性又は二次性脳腫瘍、ホジキン病(Hodgkin’s disease)、慢性又は急性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、リンパ芽球性白血病、濾胞性リンパ腫、T細胞又はB細胞由来のリンパ球性悪性腫瘍、黒色腫、多発性骨髄腫、口腔がん、非小細胞肺がん、前立腺がん、小細胞肺がん、腎及び/又は尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、中枢神経系腫瘍、中枢神経系原発リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、脊柱腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺瘤、副腎皮質がん、胆嚢がん、脾臓がん、胆管がん、繊維肉腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫又はそれらの組み合わせを含むが、それらに限らない。
いくつかの実施形態において、疾患又は障害は、膀胱がん、脳がん、乳がん、骨髓がん、子宮頸がん、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、結腸直腸がん、食道がん、肝細胞がん、リンパ芽球性白血病、濾胞性リンパ腫、T細胞又はB細胞由来のリンパ球性悪性腫瘍、黒色腫、髓細胞性白血病、骨髄腫、口腔がん、卵巣がん、非小細胞肺がん、前立腺がん、小細胞肺がん及び脾臓がんからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、該疾患又は障害は、白血病、リンパ腫又は骨髄腫のような血液学的がんである。いくつかの実施形態において、がんは、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)、皮膚B細胞リンパ腫、活性化B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、濾胞性リンパ腫、形質転換リンパ腫、中分化型リンパ球性リンパ腫、中間リンパ球性リンパ腫(ILL)、びまん性低分化リンパ球性リンパ腫(PDL)、中心細胞リンパ腫、びまん性小開裂細胞リンパ腫(DSCCL)、末梢T細胞リンパ腫(PTCL)、皮膚T細胞リンパ腫、外套層状リンパ腫、低レベル濾胞性リンパ腫、多発性骨髄腫(MM)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL)、骨髄異形成症候群(MDS)、急性T細胞白血病、急性骨髄性白血病(AML)、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、急性巨核芽球性白血病、前駆体B急性リンパ芽球性白血病、前駆体T急性リンパ芽球性白血病、バーキット白血病(Burkitt’s leukemia)(バーキットリンパ腫)、急性二重表現型白血病、慢性骨髓性リンパ腫、慢性髓細胞性白血病(CML)及び慢性単球性白血病からなる群から選択される。具体的な実施形態において、該疾患又は障害は骨髄異形成症候群(MDS)である。別の具体的な実施形態において、該疾患又は障害は急性骨髄性白血病(AML)である。別の具体的な実施形態において、該疾患又は障害は慢性リンパ球性白血病(CLL)である。さらに別の具体的な実施形態において、該疾患又は障害じゃ多発性骨髄腫(MM)である。
他の実施形態において、該疾患又は障害は固形腫瘍がんである。いくつかの実施形態において、固形腫瘍がんは、がん、腺がん、副腎皮質がん、結腸腺がん、結腸直腸腺がん、結腸直腸がん、導管細胞がん、肺がん、甲状腺がん、鼻咽頭がん、黒色腫、非黒色腫皮膚がん、肝臓がん及び肺がんからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、がんは、副腎がんである。いくつかの実施形態において、がんは、肛門がんである。いくつかの実施形態において、がんは、虫垂がんである。いくつかの実施形態において、がんは、胆管がんである。いくつかの実施形態において、がんは、膀胱がんである。いくつかの実施形態において、がんは、骨がんである。いくつかの実施形態において、がんは、脳がんである。いくつかの実施形態において、がんは、乳がんである。いくつかの実施形態において、がんは、子宮頸がんである。いくつかの実施形態において、がんは、結腸直腸がんである。いくつかの実施形態において、がんは、食道がんである。いくつかの実施形態において、がんは、胆嚢がんである。いくつかの実施形態において、がんは、妊娠性絨毛がんである。いくつかの実施形態において、がんは、頭頸部がんである。いくつかの実施形態において、がんは、ホジキンリンパ腫である。いくつかの実施形態において、がんは、腸がんである。いくつかの実施形態において、がんは、腎臓がんである。いくつかの実施形態において、がんは、白血病である。いくつかの実施形態において、がんは、肝臓がんである。いくつかの実施形態において、がんは、肺がんである。いくつかの実施形態において、がんは、黒色腫である。いくつかの実施形態において、がんは、中皮腫である。いくつかの実施形態において、がんは、多発性骨髄腫(MM)である。いくつかの実施形態において、がんは、神経内分泌腫瘍である。いくつかの実施形態において、がんは、非ホジキンリンパ腫である。いくつかの実施形態において、がんは、口腔がんである。いくつかの実施形態において、がんは、卵巣がんである。いくつかの実施形態において、がんは、膵臓がんである。いくつかの実施形態において、がんは、前立腺がんである。いくつかの実施形態において、がんは、副鼻腔がんである。いくつかの実施形態において、がんは、皮膚がんである。いくつかの実施形態において、がんは、軟部組織肉腫、脊椎がんである。いくつかの実施形態において、がんは、胃がんである。いくつかの実施形態において、がんは、精巣がんである。いくつかの実施形態において、がんは、咽頭がんである。いくつかの実施形態において、がんは、甲状腺がんである。いくつかの実施形態において、がんは、子宮がん、子宮内膜がんである。いくつかの実施形態において、がんは、膣がんである。いくつかの実施形態において、がんは、外陰がんである。
いくつかの実施形態において、副腎がんは、副腎皮質がん(ACC)、副腎皮質がん、褐色細胞腫又は神経芽細胞腫である。いくつかの実施形態において、肛門がんは、扁平上皮がん、総排泄腔がん、腺がん、基底細胞がん又は黒色腫である。いくつかの実施形態において、虫垂がんは、神経内分泌腫瘍(NET)、粘液腺がん、杯細胞カルチノイド、腸腺がん又は印環細胞型腺がんである。いくつかの実施形態において、胆管がんは、肝外胆管がん、腺がん、肝門部胆管がん、肝門領域胆管がん、遠位胆管がん又は肝内胆管がんである。いくつかの実施形態において、膀胱がんは、移行上皮がん(TCC)、乳頭状がん、扁平がん、扁平上皮がん、腺がん、小細胞がん又は肉腫である。いくつかの実施形態において、骨がんは、原発性骨がん、肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、肉腫、繊維肉腫、悪性繊維性組織球腫、骨巨細胞腫、脊索腫又は転移性骨がんである。いくつかの実施形態において、脳がんは、星細胞腫、脳幹神経膠腫、膠芽腫、髄膜腫、上衣細胞腫、乏突起神経膠腫、混合神経膠腫、下垂体腺がん、下垂体腺瘤、頭蓋咽頭腫、胚細胞腫瘍、松果体部腫瘍、髓芽細胞腫又は原発性CNSリンパ腫である。いくつかの実施形態において、乳がんは、乳腺がん、浸潤性乳がん、非浸潤性乳がん、乳房肉腫、化生性がん、腺様嚢胞がん、叶状腫瘍、血管肉腫、HER2陽性乳がん、トリプルネガティブ乳がん又は炎症性乳がんである。いくつかの実施形態において、子宮頸がんは、扁平上皮がん又は腺がんである。いくつかの実施形態において、結腸直腸がんは、結腸直腸腺がん、原発性結腸直腸リンパ腫、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫、カルチノイド腫瘍、粘液腺がん、印環細胞型腺がん、消化管カルチノイド腫瘍又は黒色腫である。いくつかの実施形態において、食道がんは、腺がん又は扁平上皮がんである。いくつかの実施形態において、胆嚢がんは、腺がん、乳頭状腺がん、腺扁平上皮がん、扁平上皮がん、小細胞がん又は肉腫である。いくつかの実施形態において、妊娠性絨毛疾患(GTD)は、胞状奇胎、妊娠性絨毛腫瘍(GTN)、絨毛がん、胎盤部トロホブラスト腫瘍(PSTT)又は類上皮性トロホブラスト腫瘍(ETT)である。いくつかの実施形態において、頭頸部がんは、喉頭がん、鼻咽頭がん、下咽頭がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、唾液腺がん、口腔がん、中咽頭がん又は扁桃がんである。いくつかの実施形態において、ホジキンリンパ腫は、古典的ホジキンリンパ腫、結節性硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型、リンパ球減少型又は結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫(NLPHL)である。いくつかの実施形態において、腸がんは、小腸がん(small intestine cancer)、小腸がん(small bowel cancer)、腺がん、肉腫、消化管間質腫瘍、カルチノイド腫瘍又はリンパ腫である。いくつかの実施形態において、腎臓がんは、腎細胞がん(RCC)、淡明細胞型RCC、乳頭状RCC、嫌色素性RCC、集合管RCC、未分類RCC、移行上皮がん、尿路上皮がん、腎盂がん又は腎肉腫である。いくつかの実施形態において、白血病は、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、有毛細胞白血病(HCL)又は骨髄異形成症候群(MDS)である。具体的な実施形態において、白血病はAMLである。いくつかの実施形態において、肝臓がんは、肝細胞がん(HCC)、繊維層板様HCC、胆管がん、血管肉腫又は肝転移である。いくつかの実施形態において、肺がんは、小細胞肺がん、小細胞がん、複合小細胞がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、扁平上皮肺がん、大細胞性未分化がん、肺結節、転移性肺がん、腺扁平上皮がん、大細胞神経内分泌がん、唾液腺型肺がん、肺カルチノイド、中皮腫、肺肉腫様がん又は悪性顆粒細胞肺腫瘍である。いくつかの実施形態において、黒色腫は、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、末端黒子型黒色腫、悪性黒子型、無色素性黒色腫、結合組織増殖性黒色腫、眼黒色腫又は転移性黒色腫である。いくつかの実施形態において、中皮腫は、胸膜中皮腫、腹膜中皮腫、心膜中皮腫又は精巣中皮腫である。いくつかの実施形態において、多発性骨髄腫は、症候性骨髄腫又はくすぶり型骨髄腫である。いくつかの実施形態において、神経内分泌腫瘍は、消化管神経内分泌腫瘍、膵臓神経内分泌腫瘍又は肺神経内分泌腫瘍である。いくつかの実施形態において、非ホジキンリンパ腫は、未分化大細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、末梢T細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、MALTリンパ腫、小細胞リンパ球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病(CLL)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、前駆体Tリンパ芽球性白血病/リンパ腫、急性リンパ球性白血病(ALL)、成人T細胞リンパ腫/白血病(ATLL)、有毛細胞白血病、B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL)、原発性縦隔B細胞性リンパ腫、中枢神経系原発(CNS)リンパ腫、マントル細胞リンパ腫(MCL)、辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織(MALT)リンパ腫、節内性辺縁帯B細胞リンパ腫、脾辺縁帯B細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、B細胞非ホジキンリンパ腫、T細胞非ホジキンリンパ腫、ナチュラルキラー細胞リンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、アリバート-バザン症候群、セザリー症候群、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫、末梢T細胞リンパ腫、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫(AITL)、未分化大細胞リンパ腫(ALCL)、全身性ALCL、腸疾患関連T細胞リンパ腫(EATL)又は肝脾γ/δ T細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態において、口腔がんは、扁平上皮がん、疣状がん、小唾液腺がん、リンパ腫、良性口腔腫瘍、好酸球性肉芽腫症、繊維腫、顆粒細胞腫、角化棘細胞腫、平滑筋腫、骨軟骨瘤、脂肪腫、神経鞘腫、神経繊維腫、乳頭状瘤、尖圭コンジローマ、疣状黄色腫、化膿性肉芽腫、横紋筋腫、歯原性腫瘍、白斑、紅斑、扁平上皮口唇がん、基底細胞口唇がん、口がん、歯肉がん又は舌がんである。いくつかの実施形態において、卵巣がんは、上皮性卵巣がん、粘液性上皮卵巣がん、子宮内膜様上皮卵巣がん、上皮性卵巣淡明細胞がん、未分化上皮性卵巣がん、卵巣低悪性度腫瘍、原発性腹膜がん、卵管がん、胚細胞腫、奇形腫、未分化胚細胞腫、卵巣胚細胞がん、内胚葉洞腫瘍、性索-間質性腫瘍、性索-性腺間質性腫瘍、卵巣間質性腫瘍、顆粒細胞腫、顆粒-卵胞膜細胞腫、セルトリ-ライデッヒ細胞腫(Sertoli-Leydig tumor)、卵巣肉腫、卵巣がん肉腫、卵巣腺肉腫、卵巣平滑筋肉腫、卵巣繊維肉腫、クルーケンベルグ腫瘍(Krukenberg tumor)又は卵巣嚢胞である。いくつかの実施形態において、膵臓がんは、膵外分泌腺がん、膵内分泌腺がん又は膵臓腺がん、膵島細胞腫又は神経内分泌腫瘍である。いくつかの実施形態において、前立腺がんは、前立腺腺がん、前立腺肉腫、移行上皮がん、小細胞がん又は神経内分泌腫瘍である。いくつかの実施形態において、副鼻腔がんは、扁平上皮がん、粘膜細胞がん、腺様嚢胞がん 、腺房細胞がん、鼻副鼻腔未分化がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、上顎洞がん、篩骨洞がん又は鼻咽頭がんである。いくつかの実施形態において、皮膚がんは、基底細胞がん、扁平上皮がん、黒色腫、メルケル細胞がん、カポジ肉腫(KS)、光線性角化症、皮膚リンパ腫又は角化棘皮瘤である。いくつかの実施形態において、軟部組織がんは、血管肉腫、皮膚繊維肉腫、上皮様肉腫、ユーイング肉腫、繊維肉腫、消化管間質腫瘍(GIST)、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、脱分化型脂肪肉腫(DL)、粘液型/円形細胞脂肪肉腫(MRCL)、脂肪腫様脂肪肉腫(WDL)、悪性繊維性組織球腫、神経繊維肉腫、肉腫肉腫(RMS)又は滑膜肉腫である。いくつかの実施形態において、脊椎がんは、転移性脊椎腫瘍である。いくつかの実施形態において、胃がんは、胃腺がん、胃リンパ腫、消化管間質腫瘍、カルチノイド腫瘍、胃カルチノイド腫瘍、I型ECL細胞カルチノイド、II型ECL細胞カルチノイド又はIII型ECL細胞カルチノイドである。いくつかの実施形態において、精巣がんは、精上皮腫、非精上皮腫、胎児がん、卵黄嚢がん、絨毛がん、畸胎瘤、性腺間質性腫瘍、精巣ライデッヒ細胞腫又は精巣セルトリ細胞腫である。いくつかの実施形態において、咽頭がんは、扁平上皮がん、腺がん、肉腫、喉頭がん、咽頭がん、鼻咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん、喉頭がん、喉頭扁平上皮がん、喉頭腺がん、リンパ上皮腫、紡錘細胞がん、疣状がん、未分化がん又はリンパ節がんである。いくつかの実施形態において、甲状腺がんは、乳頭状がん、濾胞がん、ヒュルトレ細胞がん、甲状腺髄様がん又は未分化がんである。いくつかの実施形態において、子宮がんは、子宮内膜がん、子宮内膜腺がん、子宮内膜様がん、漿液性腺がん、腺扁平上皮がん、子宮がん肉腫、子宮肉腫、子宮平滑筋肉腫、子宮内膜間質肉腫又は未分化肉腫である。いくつかの実施形態において、膣がんは、扁平上皮がん、腺がん、黒色腫又は肉腫である。いくつかの実施形態において、外陰がんは、扁平上皮がん又は腺がんである。
いくつかの実施形態において、疾患又は障害は、病原体によるものである。いくつかの実施形態において、病原体は、以下からなる群から選択される感染性疾患を引き起こす:急性弛緩性脊髄炎(AFM)、アナプラズマ病、アンスラックス、バベシア症、ボツリヌス中毒、ブルセラ症、カンピロバクター感染症、カルバペネム耐性感染症、軟性下疳、チクングニアウイルス感染症、クラミジア疾患、魚からのボツリヌス、ディフィシル感染症、ウエルシュ菌疾患、コクシジオイデス真菌感染症、コロナウイルス感染症、Covid-19(SARS-CoV-2)、クロイツフェルト・ヤコブ病/伝達性海綿状脳症、クリプトスポリジウム症(Crypto)、サイクロスポーラ症、1、2、3又は4型デング熱、ジフテリア、志賀毒素産生性大腸菌(STEC)感染症、東部馬脳炎、出血熱(エボラ)、エーリキア症、脳炎、アルボウイルス又は副感染症、非エンテロウイルス、エンテロウイルスD68疾患(EV-D68)、ジアルジア症、鼻疽、淋菌感染症、鼠径部肉芽腫、ヘモフィルスインフルエンザ菌B型感染症(Hib又はH-インフルエンザ)、血球貪食症候群(HPS)、溶血性尿毒症症候群(HUS)、A型肝炎(Hep A)、B型肝炎(Hep B)、C型肝炎(Hep C)、D型肝炎(Hep D)、E型肝炎(Hep E)、疱疹、帯状疱疹(帯状ヘルペス)、ヒストプラスマ症感染、ヒト免疫不全ウイルス/エイズ(HIV/AIDS)、ヒトパピローマウイルス(HPV)、インフルエンザ(Flu)、レジオネラ属菌感染症(レジオネラ症)、癩病(ハンセン病)、レプトスピラ症、リステリア症(リステリア)、ライム病、性病性リンパ肉芽腫(LGV)感染症、マラリア、麻疹、類鼻疽、髄膜炎(ウイルス性)、髄膜炎菌性髄膜炎(髄膜炎(細菌性))、中東呼吸器症候群コロナウイルス疾患(MERS-CoV)、耳下腺炎、ノーウォークウイルス疾患、シラミ寄生症、骨盤内炎症性疾患(PID)、百日咳(痙咳)、ペスト(腺ペスト、敗血症型ペスト、肺ペスト)、肺炎球菌感染症(肺炎)、急性灰白随炎(ポリオ)、ポーワッサン脳炎、オウム病、ケジラミ寄生症、発疹性膿疱症(天然痘、サル痘、牛痘)、Q熱、狂犬病、リケッチア感染症(ロッキー山紅斑熱)、風疹(三日ばしか)、サルモネラ胃腸炎(サルモネラ)、疥癬、スコンブロイド食中毒、膿毒症、重症急性呼吸器症候群(SARS)、赤痢菌性胃腸炎(赤痢菌)、天然痘、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)感染症、ブドウ球菌性食中毒エンテロトキシンB中毒(ブドウ球菌性食中毒)、バンコマイシン中間耐性黄色ブドウ球菌感染症(VISA)、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌感染症(VRSA)、A群レンサ球菌感染症(侵襲性)(Strep A(侵襲性))、B群レンサ球菌感染症(Strep-B)、レンサ球菌中毒性ショック症候群STSS中毒性ショック、梅毒(原発性、二次性、早期潜伏性、後期潜伏性、先天性)、破傷風感染症、トリコモナス症、旋毛虫症感染、結核(TB)、潜在性結核感染症(LTBI)、野兎病、D群腸チフス、膣症、水痘(水疱瘡))、コレラ菌感染症(コレラ)、ビブリオ病(ビブリオ)、エボラ出血熱、ラッサウイルス出血熱、マールブルグ出血熱、ウエストナイルウイルス、黄熱病、エルシニア症及びジカウイルス感染症。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、急性弛緩性脊髄炎(AFM)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、アナプラズマ病である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、アンスラックスである。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、バベシア症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ボツリヌス中毒である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ブルセラ症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、カンピロバクター感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、カルバペネム耐性感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、軟性下疳である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、チクングニアウイルス感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、クラミジア疾患である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、魚からのボツリヌスである。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ディフィシル感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ウエルシュ菌疾患である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、コクシジオイデス真菌感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、コロナウイルス疾患である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、Covid-19(SARS-CoV-2)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、クロイツフェルト・ヤコブ病/伝達性海綿状脳症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、クリプトスポリジウム症(Crypto)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、サイクロスポーラ症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、1、2、3又は4型デング熱である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ジフテリアである。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、志賀毒素産生性大腸菌(STEC)感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、東部馬脳炎である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、出血熱(エボラ)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、エーリキア症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、脳炎である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、アルボウイルス又は副感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、非エンテロウイルスである。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、エンテロウイルスD68疾患(EV-D68)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ジアルジア症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、鼻疽である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、淋菌感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、鼠径部肉芽腫である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ヘモフィルスインフルエンザ菌 B型感染症(Hib又はH-インフルエンザ)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、血球貪食症候群(HPS)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、溶血性尿毒症症候群(HUS)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、A型肝炎(Hep A)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、B型肝炎(Hep B)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、C型肝炎(Hep C)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、D型肝炎(Hep D)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、E型肝炎(Hep E)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、疱疹である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、帯状疱疹(帯状ヘルペス)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ヒストプラスマ症感染である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ヒト免疫不全ウイルス/エイズ(HIV/AIDS)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ヒトパピローマウイルス(HPV)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、インフルエンザ(Flu)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、レジオネラ属菌感染症(レジオネラ症)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、癩病(ハンセン病)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、レプトスピラ症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、リステリア症(リステリア)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ライム病である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、性病性リンパ肉芽腫(LGV)感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、マラリアである。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、麻疹である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、類鼻疽である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、髄膜炎(ウイルス性)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、髄膜炎菌性髄膜炎(髄膜炎(細菌性))である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、中東呼吸器症候群コロナウイルス疾患(MERS-CoV)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、耳下腺炎である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ノーウォークウイルス疾患である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、シラミ寄生症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、骨盤内炎症性疾患(PID)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、百日咳(痙咳)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ペスト(腺ペストであり、いくつかの実施形態において、感染性疾患は、敗血症型ペストであり、いくつかの実施形態において、感染性疾患は、肺炎性ペスト)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、肺炎球菌感染症(肺炎)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、急性灰白随炎(ポリオ)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ポーワッサン脳炎である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、オウム病である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ケジラミ寄生症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、発疹性膿疱症(天然痘であり、いくつかの実施形態において、感染性疾患は、サル痘であり、いくつかの実施形態において、感染性疾患は、牛痘)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、Q熱である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、狂犬病である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、リケッチア感染症(ロッキー山紅斑熱)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、風疹(三日ばしか)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、サルモネラ胃腸炎(サルモネラ)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、疥癬である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、スコンブロイド食中毒である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、膿毒症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、重症急性呼吸器症候群(SARS)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、赤痢菌性胃腸炎(赤痢菌)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、天然痘である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ブドウ球菌性食中毒エンテロトキシンB中毒(ブドウ球菌性食中毒)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、バンコマイシン中間耐性黄色ブドウ球菌感染症(VISA)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌感染症(VRSA)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、A群レンサ球菌感染症(侵襲性)(Strep A(侵襲性))である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、レンサ球菌病である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、B群疾患(Strep-B)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、レンサ球菌中毒性ショック症候群STSS中毒性ショックである。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、梅毒(原発性であり、いくつかの実施形態において、感染性疾患は、二次性であり、いくつかの実施形態において、感染性疾患は、早期潜伏性であり、いくつかの実施形態において、感染性疾患は、後期潜伏性であり、いくつかの実施形態において、感染性疾患は、先天性)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、破傷風感染症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、トリコモナス症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、旋毛虫症感染である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、結核(TB)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、潜在性
結核感染症(LTBI)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、野兎病である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、D群腸チフスである。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、膣症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、水痘(水疱瘡))、コレラ菌感染症(コレラ)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ビブリオ病(ビブリオ)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、エボラ出血熱である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ラッサウイルス出血熱である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、マールブルグ出血熱である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ウエストナイルウイルスである。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、黄熱病である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、エルシニア症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ジカウイルス感染症である。
結核感染症(LTBI)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、野兎病である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、D群腸チフスである。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、膣症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、水痘(水疱瘡))、コレラ菌感染症(コレラ)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ビブリオ病(ビブリオ)である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、エボラ出血熱である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ラッサウイルス出血熱である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、マールブルグ出血熱である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ウエストナイルウイルスである。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、黄熱病である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、エルシニア症である。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ジカウイルス感染症である。
いくつかの実施形態において、病原体は細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、バシラス属、バルトネラ属、ボルデテラ属、ボレリア属、ブルセラ属、カンピロバクター属、クラミジア属、類クラミジア属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、エンテロコッカス属、エスケリキア属、フランシセラ属、ヘモフィルス属、ヘリコバクター属、レジオネラ属、レプトスピラ属、リステリア属、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、ナイセリア属、シュードモナス属、リケッチア属、サルモネラ属、赤痢菌属、ブドウ球菌属、レンサ球菌属、トレポネーマ属、ウレアプラズマ属、ビブリオ属又はエルシニア属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、バシラス属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、バルトネラ属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、ボルデテラ属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、ボレリア属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、ブルセラ属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、カンピロバクター属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、クラミジア属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、類クラミジア属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、クロストリジウム属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、コリネバクテリウム属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、エンテロコッカス属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、エスケリキア属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、フランシセラ属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、ヘモフィルス属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、ヘリコバクター属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、レジオネラ属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、レプトスピラ属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、リステリア属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、マイコバクテリウム属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、マイコプラズマ属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、ナイセリア属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、シュードモナス属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、リケッチア属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、サルモネラ属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、赤痢菌属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、ブドウ球菌属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、レンサ球菌属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、トレポネーマ属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、ウレアプラズマ属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、ビブリオ属の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、エルシニア属の細菌である。
いくつかの実施形態において、病原体は寄生虫である。いくつかの実施形態において、寄生虫は、原生動物、蠕虫又は外部寄生虫である。いくつかの実施形態において、原生動物は、エントアメーバ、ジアルジア、リーシュマニア、バランチジウム、マラリア原虫又はクリプトスポリジウムである。いくつかの実施形態において、蠕虫は、吸虫、条虫、鉤頭虫又は回虫である。いくつかの実施形態において、外部寄生虫は、節足動物である。
いくつかの実施形態において、病原体はウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アストロウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘペウイルス科、オルトミクソウイルス科、パピローマウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科又はトガウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、科である。いくつかの実施形態において、ウイルスは、アデノウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、アレナウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、アストロウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ブニヤウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、カリシウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、コロナウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、フィロウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、フラビウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ヘパドナウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ヘペウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、オルトミクソウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、パピローマウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、パラミクソウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、パルボウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ピコルナウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ポリオーマウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ポックスウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、レオウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、レトロウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ラブドウイルス科のウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、トガウイルス科のウイルスである。
いくつかの実施形態において、ウイルスは、アデノウイルス、コロナウイルス、コクサッキーウイルス、エプスタイン・バーウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス2型、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス8型、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、風疹ウイルス又は水痘帯状疱疹ウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、アデノウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、コロナウイルスである。いくつかの実施形態において、コロナウイルスは、Covid-19(SARS-CoV-2)である。いくつかの実施形態において、ウイルスは、コクサッキーウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、エプスタイン・バーウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、A型肝炎ウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、B型肝炎ウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、C型肝炎ウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、単純ヘルペスウイルス2型である。いくつかの実施形態において、ウイルスは、サイトメガロウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ヒトヘルペスウイルス8型である。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、インフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、麻疹ウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、耳下腺炎ウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ヒトパピローマウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、パラインフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ポリオウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、狂犬病ウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、呼吸器多核体ウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、風疹ウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、水痘帯状疱疹ウイルスである。
他の実施形態において、該疾患又は障害は、免疫性又は自己免疫性障害である。このような障害は、自己免疫性水疱症、無βリポタンパク質血症、後天性免疫不全に関連する疾患、器官移植に関連する急性免疫疾患、後天性肢端チアノーゼ、急性及び慢性寄生又は感染プロセス、急性膵炎、急性腎不全、急性リウマチ熱、急性横断性脊髄炎、腺がん、心房異所性収縮(aerial ectopic beat)、成人(急性)呼吸窮迫症候群、エイズ認知症複合体、アルコール性肝硬変、アルコール誘発性肝臓傷害、アルコール誘発性肝炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー及びぜんそく、同種移植片拒絶反応、α-l-抗トリプシン欠乏症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、貧血症、狭心症、強直性脊椎炎関連肺疾患、前角細胞変性、抗体媒介細胞毒性、抗リン脂質症候群、抗受容体過敏反応、大動脈瘤及び末梢動脈瘤、大動脈解離、動脈性高血圧症、動脈硬化症、動静脈瘻、関節症、無力症、ぜんそく、運動失調、アトピー性アレルギー、心房細動(持続性又は発作性)、心房粗動、房室ブロック、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、1型自己免疫性肝炎(古典的自己免疫性肝炎又はルポイド肝炎)、自己免疫媒介低血糖症、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、B細胞リンパ腫、骨移植片拒絶反応、骨髄移植(BMT)拒絶反応、閉塞性細気管支炎、脚ブロック、熱傷、悪液質、不整脈、心機能不全症候群、心臓腫瘍、心筋症、心肺バイパス炎症応答、軟骨移植拒絶反応、小脳皮質変性症、小脳障害、無秩序型又は多源性心房頻拍、化学療法関連障害、クラミジア、胆汁うっ滞(choleosatatis)、慢性アルコール依存症、慢性活動性肝炎、慢性疲労症候群、臓器移植に関連する慢性免疫性疾患、慢性好酸球性肺炎、慢性炎症性疾患、慢性粘膜皮膚カンジダ症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、慢性サリチル酸塩中毒、結腸直腸分類不能型免疫不全症(分類不能型低ガンマグロブリン血症)、結膜炎、結合組織病-関連間質性肺疾患、接触皮膚炎Coombs陽性溶血性貧血、肺性心、クロイツフェルト-ヤコブ病(Creutzfeldt-Jakob disease)、原因不明の自己免疫性肝炎、原因不明の繊維化性肺胞炎、培養陰性敗血症、嚢胞性繊維症、サイトカイン療法関連障害、クローン(Crohn’s disease)病、拳闘家認知症、脱髄疾患、デング出血熱、皮膚炎、皮膚炎強皮症、皮膚病、皮膚筋炎/多発性筋炎関連肺疾患、糖尿病(diabetes)、糖尿病性動脈硬化性疾患、糖尿病(diabetes mellitus)、びまん性レヴィー小体病、拡張型心筋症、拡張型うっ血性心筋症、円板状紅斑性狼瘡、基底核疾患、播種性血管内凝固、中年におけるダウン症候群、薬物誘発性間質性肺疾患、薬物誘発性肝炎CNSドーパミン受容体を遮断する薬物によって誘発される運動障害、薬物過敏、湿疹、脳脊髄炎、心内膜炎、内分泌障害、腸炎性滑膜炎、喉頭蓋炎、エプスタイン・バーウイルス感染症、先端紅痛症、錐体外路及び小脳障害、家族性血球貪食性リンパ組織球症、胎児胸腺移植組織拒絶反応、フリードライヒ運動失調症(Friedreich’s ataxia)、機能的末梢動脈障害、女性不妊症、繊維症、繊維性肺疾患、真菌性敗血症、ガス壊疽、胃潰瘍、巨細胞性動脈炎、糸球体腎炎、糸球体腎症(glomerulonephritides)、グッドパスチャー症候群、甲状腺腫性自己免疫性甲状腺機能低下症(橋本病)、痛風性関節炎、任意の臓器又は組織の移植片拒絶反応、移植片対宿主病、グラム陰性敗血症、グラム陽性敗血症、細胞内生物に起因する肉芽腫、B群連鎖球菌(GBS)感染症、グレーブス病、ヘモジデリン沈着症関連肺疾患、ヘアリー細胞白血病、ハレルフォルデン-スパッツ病、橋本甲状腺炎、花粉症、心臓移植拒絶反応、血色素症、造血器悪性腫瘍(白血病及びリンパ腫)、溶血性貧血、溶血性尿毒症症候群/血栓溶解性血小板減少性紫斑病、出血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病(Henoch-Schoenlein purpura)、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、HIV感染症/HIV神経障害、ホジキン病、副甲状腺機能低下症、ハンチントン舞踏病(Huntington’s chorea)、運動過多性運動障害、過敏反応、過敏性肺炎、甲状腺機能亢進症、運動低下性運動障害、視床下部-下垂体-副腎軸評価、特発性アジソン病(idiopathic Addison’s disease)、特発性白血球減少症、特発性肺繊維症、特発性血小板減少症、特異体質性肝疾患、乳児脊髄性筋萎縮症、感染性疾患、大動脈の炎症、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病、間質性肺炎、虹彩毛様体炎/ブドウ膜炎/視神経炎、虚血再かん流傷害、虚血性脳卒中、若年性悪性貧血、若年性関節リウマチ、若年性脊髄性筋萎縮症、カポジ肉腫(Kaposi’s sarcoma)、川崎病、腎臓移植拒絶反応、レジオネラ、リーシュマニア症、ハンセン病、皮質脊髄系の病変、リニアIgA病、脂肪性浮腫(lipidema)、肝臓移植拒絶反応、ライム病(Lyme disease)、リンパ水腫(lymphederma)、リンパ球浸潤性肺疾患、マラリア、男性不妊症特発性又はNOS、悪性組織球増殖症、悪性黒色腫、髄膜炎、髄膜炎菌血症、腎臓の顕微鏡的血管炎、片頭痛、ミトコンドリア多系統障害、混合結合組織病、混合結合組織病関連肺疾患、単クローン性免疫グロブリン血症、多発性骨髄腫、多系統変性症(Mencel型、Dejerine-Thomas型、Shy-Drager型及びMachado-Joseph型)、筋痛性脳炎/ロイヤルリー病(Royal Free Disease)、重症筋無力症、腎臓の顕微鏡的血管炎、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、骨髄異形成症候群、心筋梗塞、心筋虚血障害、鼻咽腔がん、新生児慢性肺疾患、腎炎、ネフローゼ、ネフローゼ症候群、神経変性疾患、神経原性I筋萎縮、好中球減少性発熱、非アルコール性脂肪性肝炎、腹部大動脈及びその分岐動脈の閉塞、閉塞性動脈障害、臓器移植拒絶反応、精巣炎/精巣上体炎(epidydimitis)、精巣炎/精管結紮術復元、臓器肥大症、変形性関節症、骨粗しょう症、卵巣不全、膵臓移植拒絶反応、寄生虫病、副甲状腺移植拒絶反応、パーキンソン病、骨盤内炎症性疾患、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、通年性鼻炎、心膜疾患、末梢アテローム硬化性疾患、末梢血管障害、腹膜炎、悪性貧血、水晶体起因性ブドウ膜炎、ニューモシスティス・カリニ肺炎、肺炎、POEMS症候群(多発ニューロパシー、臓器肥大症、内分泌障害、単クローン性免疫グロブリン血症及び皮膚変化症候群)、かん流後症候群、ポンプ後症候群(post-pump syndrome)、MI心臓切開術後症候群、感染後間質性肺疾患、早期卵巣不全、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性肝炎、原発性粘液水腫、原発性肺高血圧症、原発性硬化性胆管炎、原発性血管炎、進行性核上麻痺、乾癬、1型乾癬、2型乾癬、乾癬性関節症、結合組織病に続発する肺高血圧症、結節性多発性動脈炎の肺症状、炎症後間質性肺疾患、放射線繊維症、放射線療法、レイノー現象及び疾患(Raynaud’s phenomenon and disease)、レイノー病、レフサム病(Refsum’s disease)、規則的な狭いQRS頻拍、ライター病(Reiter’s disease)、腎疾患NOS、腎血管性高血圧症、再かん流傷害、拘束型心筋症、関節リウマチ関連間質性肺疾患、リウマチ様脊椎炎、サルコイドーシス、シュミット症候群(Schmidt’s syndrome)、強皮症、老年性舞踏病、レヴィー小体型認知症、敗血症候群、敗血症性ショック、血清反応陰性関節症、ショック、鎌状赤血球貧血、T細胞又はFAB ALL、高安病(Takayasu’s disease)/動脈炎、毛細血管拡張症、Th2型及びThl型媒介疾患、閉塞性血栓血管炎、血小板減少症、甲状腺炎、毒性、毒素性ショック症候群、移植、外傷/出血、2型自己免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、黒色表皮腫を伴うB型インスリン耐性、III型過敏反応、IV型過敏、潰瘍性大腸炎性関節症、潰瘍性大腸炎、不安定狭心症、尿毒症、尿路性敗血症、蕁麻疹、ブドウ膜炎、弁膜心疾患、静脈瘤、血管炎、血管炎性びまん性肺疾患、静脈疾患、静脈血栓症、心室細動、白斑急性肝疾患、ウイルス及び真菌感染症、ウイルス性脳炎/無菌性髄膜炎、ウイルス関連血球貪食症候群、ウェゲナー肉芽腫症(Wegener’s granulomatosis)、ウェルニッケコルサコフ症候群(Wernicke-Korsakoff syndrome)、ウィルソン病(Wilson’s disease)、任意の臓器又は組織の異種移植片拒絶反応、エルシニア属及びサルモネラ属関連関節症、後天性免疫不全疾患症候群(AIDS)、自己免疫性リンパ球増殖性症候群、溶血性貧血、炎症性疾患、血小板減少症、臓器移植に関連する急性及び慢性の免疫性疾患、アジソン病、アレルギー性疾患、脱毛症、円形脱毛症、アテローム性疾患/動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、関節炎(変形性関節症、若年性慢性関節炎、敗血症性関節炎、ライム病関節炎、乾癬性関節及び反応性関節炎を含む)、シェーグレン病関連肺疾患(Sjogren’s disease-associated lung disease)、シェーグレン症候群(Sjogren’s syndrome)、皮膚同種異体移植拒絶反応、皮膚異常症候群(skin changes syndrome)、小腸移植拒絶反応、自己免疫性精子形成障害、多発性硬化症(全てのサブタイプ)、脊髄性運動失調、脊髄小脳萎縮症、脊柱関節症、I型散発性多内分泌腺機能低下、II型散発性多内分泌腺機能低下、スチル病(Still’s disease)、連鎖球菌性筋炎、脳卒中、小脳の構造的病変、亜急性硬化性全脳炎、交感性眼炎、失神、心臓血管系の梅毒、アナフィラキシー、全身性炎症応答症候群、全身性発症若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス関連肺疾患、ループス腎炎、全身性強皮症、全身性強皮症関連間質性肺疾患。
いくつかの実施形態において、疾患又は障害は炎症性疾患である。炎症は、宿主防御及び免疫媒介性疾患の進行に重要な役割を果たしている。炎症反応は、損傷(例えば、創傷、虚血及び外因性粒子)及び感染(例えば、細菌又はウイルス感染)に対する反応であり、化学的媒体(例えば、サイトカイン及びプロスタグランジン)と炎症細胞(例えば、白血球細胞)とを含む複雑なカスケード事象によって開始される。炎症反応の特徴は、血流量の増加、毛細血管透過性の増加及び貪食細胞の大量流入である。これらの事象は、創傷又は感染した部位の腫れ、発赤、発熱(熱型の変化)及び膿形成をもたらす。
サイトカイン及びプロスタグランジンは、炎症反応を制御し、規則的且つ自己限定的なカスケードで、血液又は影響を受けた組織に放出される。サイトカイン及びプロスタグランジンのこのような放出は、創傷又は感染した領域への血流量を増加し、発赤及び発熱を引き起こし得る。ここで、いくつかの化学物質は、液体が組織に漏れることを引き起こし、腫れを引き起こす。この保護プロセスは、神経を刺激し、痛みを引き起こし得る。これらの変化は、関連する領域内で発生する時間が限られている場合に、身体に有益である。
炎症反応において、体液と細胞免疫エレメントとの間の微妙なバランスのとれた相互作用は、有害な薬剤を除去し、損傷組織の修復を開始することができる。このような微妙なバランスのとれた相互作用が破壊される場合、炎症反応は、正常な組織にかなりのダメージを与える可能性があり、且つ最初に反応を引き起こしたダメージよりも有害になり得る。これらの炎症反応が暴走した場合には、組織の損傷及び臓器の機能障害を防止するために臨床的介入が必要となる。乾癬、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節症、クローン病、ぜんそく、アレルギー又は炎症性腸疾患などの疾患は慢性炎症と特徴とする。関節症、関連する関節症病態(例えば、変形性関節症、関節リウマチ及び乾癬性関節症)、炎症性腸疾患(例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎)、膿毒症、乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎及び慢性閉塞性肺疾患、慢性炎症性肺疾患のような炎症性疾患も一般的であり、問題のある疾患である。
いくつかの実施形態において、これらの方法は、養子細胞療法を含み、これにより遺伝子操作された細胞を対象に投与する。疾患又は障害の細胞が破壊の標的にされるように、このような投与は細胞の活性化(例えば、T細胞活性化)を促進することができる。
いくつかの実施形態において、これらの方法は、これらの細胞又はこれらの細胞を含む組成物を、対象、組織、又は細胞、例えば、疾患又は障害を有している、疾患又は障害のリスクにあるか又は疾患又は障害を有している疑いがある、対象、組織、又は細胞に投与することを含む。いくつかの実施形態において、例えば、養子T細胞療法のような養子細胞療法によって、治療対象の特定の疾患又は障害を有している対象に細胞、集団、及び組成物を投与する。いくつかの実施形態において、細胞又は組成物を対象、例えば、疾患又は障害を有しているか又は疾患又は障害のリスクにある対象に投与する。いくつかの実施形態において、該方法は、これにより治療し、例えば、疾患又は障害の一つ又は複数の症状を改善する。
養子細胞療法に用いられる細胞投与方法は、周知のものであり、例えば、米国特許出願公開第2003/0170238号、米国特許第4,690,915号、Rosenberg,Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85(2011)、Themeliら,Nat Biotechnol.31(10):928-933(2013)、Tsukaharaら,Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9(2013)、及びDavilaら,PLoS ONE 8(4):e61338(2013)に記載されている。これらの方法は、本明細書による方法及び組成物と併用することができる。
いくつかの実施形態において、細胞療法(例えば、養子T細胞療法)は、自己伝達によって実施され、ここで、細胞は、細胞療法を受ける対象又はこのような対象に由来する試料から単離され且つ/又はそうでなければ調製される。そのため、いくつかの態様では、細胞は、治療を必要とする対象に由来し、且つ単離され処理された後、同一の対象に投与される。他の実施形態において、細胞療法(例えば、養子T細胞療法)は、同種異体伝達によって実施され、ここで、細胞は、細胞療法を受けるか又は最終的に受けた対象以外の対象(例えば、第1の対象)から単離され且つ/又はそうでなければ調製される。このような実施形態では、そして細胞を同じ種の異なる対象、例えば、第2の対象に投与する。いくつかの実施形態において、第1の対象と第2の対象は遺伝的に同一である。いくつかの実施形態において、第1の対象と第2の対象は、遺伝的に似ている。いくつかの実施形態において、第2の対象は、第1の対象と同じHLAタイプ又はスーパータイプを発現する。
いくつかの実施形態において、細胞、細胞集団、又は組成物が投与される対象は、ヒトのような霊長類動物である。対象は、男性又は女性であり得、且つ乳児、若年、青年、成人及び老年対象を含め、任意の適切な年齢であり得る。いくつかの例において、対象は、疾患、養子細胞療法のための、及び/又は毒性アウトカムを評価するための検証された動物モデルである。
本明細書による組成物は、任意の適切な手段、例えば、注射、例えば、静脈内又は皮下注射、眼内注射、眼窩周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、球後注射、球周囲注射又は後部強膜近傍送達によって投与され得る。いくつかの実施形態において、それらは、非経口、肺内及び鼻腔内投与され、且つ局所治療が必要とされる場合、病巣内投与される。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与を含む。
疾患又は病態を有効に予防及び/又は治療する、本明細書による予防剤又は治療剤の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。有効投与量は、インビトロ又は動物モデル試験システムから得られた投与量-反応曲線から推定され得る。疾患の予防又は治療について、結合分子又は細胞の適切な投与量は、治療する疾患又は障害のタイプ、結合分子のタイプ、疾患又は障害の重症度及び経過、治療剤が予防又は治療目的で投与されるか否か、過去の療法、患者の臨床病歴及び薬剤に対する反応、並びに主治医の判断に依存してもよい。いくつかの実施形態において、組成物、分子及び細胞は、一回又は一連の治療において患者に適切に投与される。複数の投与量を間欠的に投与することができる。初期のより高い負荷投与量を投与し、その後に一つ又は複数のより低い投与量を投与してもよい。
遺伝子操作された細胞の場合に、いくつかの実施形態において、対象に約一百万から約1千億個の細胞及び/又は体重1キログラム当たり該量の細胞を投与してもよい。いくつかの実施形態において、ここで、該医薬組成物は、本明細書に記載の操作された免疫細胞のうちのいずれか一つを含み、該医薬組成物は、個体の体重1kg当たり少なくとも約104、105、106、107、108、又は109個の細胞のうちのいずれか一つの投与量で投与される。投与量は、疾患又は障害及び/又は患者及び/又は他の治療の特定の属性に応じて変化することができる。
いくつかの実施形態において、医薬組成物を一回投与する。いくつかの実施形態において、医薬組成物を複数回(例えば、2、3、4、5、6回又はそれ以上のうちのいずれか一つ)投与する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、投与サイクル中に一回又は複数回投与される。投与サイクルは、例えば1、2、3、4、5週又はそれ以上、又は1、2、3、4、5ヶ月又はそれ以上であってもよい。特定の患者に対する最適な投与量及び治療レジメンは、患者の疾患徴候をモニタリングし、それに応じて治療を調整することによって、医学分野の当業者により決定され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書による組成物は、別の治療介入(例えば、別の抗体又は操作された細胞又は受容体又は作用物質、例えば、細胞傷害性作用物質又は治療剤)と同時に又は任意の順序で逐次的に投与されるように、組み合わせ治療の一部として投与される。
いくつかの実施形態において、本明細書による組成物は、一つ又は複数の別の治療剤と共に投与されるか、又は別の治療介入と併用投与され、同時にもしくは任意の順序で逐次的に投与される。いくつかの実施形態において、細胞と別の療法は、十分に近い時点で共に投与され、それにより細胞集団が一つ又は複数の別の治療剤の効果を増強するか、又は逆も同様である。いくつかの実施形態において、本明細書による組成物は、一つ又は複数の別の治療剤の前に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書による組成物は、一つ又は複数の別の治療剤の後に投与される。
いくつかの実施形態において、細胞を哺乳動物(例えば、ヒト)に投与した後、複数の既知の方法のうちのいずれか一つによって、操作された細胞集団の生物学的活性を測定する。評価のパラメータは、インビボ(例えば、イメージングによる)又はエクスビボ(例えば、ELISA又はフローサイトメトリーによる)操作又は天然T細胞もしくは他の免疫細胞と抗原との特異的結合を含む。いくつかの実施形態において、操作された細胞が標的細胞を破壊する能力は、例えば、Kochenderferら,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)及びHermanらJ.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)に記述されている細胞傷害性アッセイのような、当分野の既知の任意の適切な方法を用いて測定され得る。いくつかの実施形態において、細胞の生物学的活性はさらに、CD107a、IFNγ、IL-2及びTNFのようないくつかのサイトカインの発現及び/又は分泌のアッセイによって測定され得る。いくつかの態様では、生物学的活性は、腫瘍負荷又は負荷の減少のような臨床アウトカムを評価することによって測定される。
7.9. キット及び製品
本明細書に記載の操作された免疫エフェクター細胞のうちのいずれか一つを含むキット、単位投与量及び製品をさらに提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物のうちのいずれか一つを含有し、且つ好ましくは、その取扱説明書を提供する、キットを提供する。
本明細書に記載の操作された免疫エフェクター細胞のうちのいずれか一つを含むキット、単位投与量及び製品をさらに提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物のうちのいずれか一つを含有し、且つ好ましくは、その取扱説明書を提供する、キットを提供する。
本出願のキットは、適切な包装内にある。適切な包装は、バイアル、ボトル、ジャー、フレキシブル包装(例えば、密封されたポリエステルフィルム(Mylar)又はプラスチックバッグ)などを含むが、それらに限らない。キットは、緩衝液及び説明的情報のような他の構成部分を任意に提供することができる。そのため、本出願は製品をさらに提供し、それは、バイアル(例えば、密封されたバイアル)、ボトル、ジャー、フレキシブル包装などを含む。
製品は、容器、及び該容器にあるか又は該容器に関連するラベルもしくは包装インサートを含んでもよい。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどを含む。容器は、様々な材料(例えば、ガラス又はプラスチック)により形成され得る。通常、容器は、本明細書に記載の疾患又は障害(例えば、がん)を有効に治療する組成物を収容し、且つ無菌の入り口を有してもよい(例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、又は皮下注射針によって穿刺可能なストッパを有するバイアルであってもよい)。ラベル又は包装インサートは、組成物が個体の特定の病態の治療に使用されることを指示する。ラベル又は包装インサートは、組成物を個体に投与するための説明書をさらに含む。ラベルは、再構成及び/又は使用に関する指図を指示し得る。医薬組成物を収容する容器は、複数回使用のバイアルであってもよく、それは、再構築製剤の反復投与(例えば、2~6回の投与)を可能にする。包装インサートは、通常治療製品の商業用パッケージに含まれる説明書を指し、これらの説明書には、このような治療製品の使用の適応症、使用法、投与量、投与、禁忌及び/又は警告に関する情報が含まれる。付加的に、製品は、第2の容器をさらに含んでもよく、該容器は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を含む。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
キット又は製品は、複数の単位投与量の医薬組成物及び取扱説明書を含んでもよく、それは、薬局(例えば、院内薬局及び調剤薬局)での貯蔵及び使用に十分な量で包装される。
本開示は、概して、多くの実施形態を説明する際に肯定的文言を用いて本明細書に開示される。本開示は、具体的には、物質又は材料、方法ステップ及び条件、レジメン、手順、アッセイ又は分析など、特定の主題が完全に又は部分的に除外される実施形態をさらに含む。そのため、本開示が、概して、本開示に含まれていない内容に基づいて本明細書で表されていない場合であっても、本開示に明示的に含まれていない態様は、依然として本明細書で開示される。
本開示の複数の実施形態について説明した。しかしながら、理解すべきことは、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく様々な修正を行うことができることである。そのため、以下の例は、請求項に記載される開示範囲を限定するのではなく、例示することが意図される。
8. 実施例
本明細書に記載の実施例は、以下の実験がいずれも実施されるか又はこれらの実験しか実施されないことを示すように意図するものでもない。使用される数字(例えば、量、温度など)の正確性については正確性を確保するように努力してきたが、実験誤差及び偏差も考慮すべきである。別段の指示がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、且つ圧力は大気圧であるか又は大気圧に近い。
本明細書に記載の実施例は、以下の実験がいずれも実施されるか又はこれらの実験しか実施されないことを示すように意図するものでもない。使用される数字(例えば、量、温度など)の正確性については正確性を確保するように努力してきたが、実験誤差及び偏差も考慮すべきである。別段の指示がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、且つ圧力は大気圧であるか又は大気圧に近い。
8.1. 実施例1-外因的に導入されたp40及びCCL-19を発現するCAR-T細胞の調製
外因的に導入されたp40及びCCL-19を発現する例示的CAR-T細胞を構築し試験した。例えば、本実施例及び以下の実施例では、抗GPC3 CAR-T細胞を構築して本発明を例示して説明する。
外因的に導入されたp40及びCCL-19を発現する例示的CAR-T細胞を構築し試験した。例えば、本実施例及び以下の実施例では、抗GPC3 CAR-T細胞を構築して本発明を例示して説明する。
8.1.1. キメラ抗原受容体の構築
ヒト化抗GPC3 scFv CAR(即ち、H93 CAR)を構築するために、N末端からC末端の方向にCD8αヒンジドメイン(SEQ ID NO:8)、CD8α膜貫通ドメイン(SEQ ID NO:9)、CD137共刺激シグナル伝達ドメイン(SEQ ID NO:10)及びCD3ζ細胞質シグナル伝達ドメイン(SEQ ID NO:11)を含む、CAR主鎖ポリペプチドをコードするCAR主鎖配列を化学的に合成し、それを下流の予め改変されたレンチウイルスベクター(pLSINK-BBzBB)にクローニングし、構成型hEF1αプロモーターに作動可能に連結してインビトロ転写に用いた。ベクターにおけるマルチクローニングサイト(MCS)は、抗GPC3ヒト化scFv断片(即ち、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含むscFv)のN末端と融合されるCD8αシグナルペプチド(SEQ ID NO:7)をコードする核酸配列に作動可能に連結されるKozak配列を含む核酸配列を、CAR主鎖配列の上流においてCAR主鎖配列に作動可能に連結されるように、CAR主鎖ベクターに挿入することを可能にする。CD8αシグナルペプチド及び抗GPC3ヒト化scFv断片をコードする核酸配列を化学的に合成し、当分野の既知の分子クローニング技術によって、EcoRI(5’-GAATTC-3’)(SEQ ID NO:15)及びSpeI(5’-ACTAGT-3’)(SEQ ID NO:16)制限部位を介して、それをpLSINK-BBzBB CAR主鎖にクローニングした。得られたH93 CARは、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む。CARコード領域は、図1の上部に表示されている。
ヒト化抗GPC3 scFv CAR(即ち、H93 CAR)を構築するために、N末端からC末端の方向にCD8αヒンジドメイン(SEQ ID NO:8)、CD8α膜貫通ドメイン(SEQ ID NO:9)、CD137共刺激シグナル伝達ドメイン(SEQ ID NO:10)及びCD3ζ細胞質シグナル伝達ドメイン(SEQ ID NO:11)を含む、CAR主鎖ポリペプチドをコードするCAR主鎖配列を化学的に合成し、それを下流の予め改変されたレンチウイルスベクター(pLSINK-BBzBB)にクローニングし、構成型hEF1αプロモーターに作動可能に連結してインビトロ転写に用いた。ベクターにおけるマルチクローニングサイト(MCS)は、抗GPC3ヒト化scFv断片(即ち、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含むscFv)のN末端と融合されるCD8αシグナルペプチド(SEQ ID NO:7)をコードする核酸配列に作動可能に連結されるKozak配列を含む核酸配列を、CAR主鎖配列の上流においてCAR主鎖配列に作動可能に連結されるように、CAR主鎖ベクターに挿入することを可能にする。CD8αシグナルペプチド及び抗GPC3ヒト化scFv断片をコードする核酸配列を化学的に合成し、当分野の既知の分子クローニング技術によって、EcoRI(5’-GAATTC-3’)(SEQ ID NO:15)及びSpeI(5’-ACTAGT-3’)(SEQ ID NO:16)制限部位を介して、それをpLSINK-BBzBB CAR主鎖にクローニングした。得られたH93 CARは、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む。CARコード領域は、図1の上部に表示されている。
H93 CAR主鎖に基づき、H93M CARベクターにおけるMCSは、ヒトIL12p40(SEQ ID NO:5)及びヒトCCL-19(SEQ ID NO:6)をコードする核酸配列を含む核酸配列の挿入を可能にし、該核酸配列は、別の2A自己切断ペプチド(例えば、SEQ ID NO:13に示すP2A断片)のC末端と融合される2A自己切断ペプチド(例えば、SEQ ID NO:14に示すT2Aペプチド)に連結することによって、CD3ζ細胞質シグナル伝達ドメインのC末端上流において、CD3ζ細胞質シグナル伝達ドメインのC末端に作動可能に連結される。P2Aペプチド及びIL12p40-T2A-CCL-19ペプチドをコードする核酸配列を化学的に合成し、HpaI(5’-GTTAAC-3’)(SEQ ID NO:17)及びMluI(5’-ACGCGT-3’)(SEQ ID NO:23)制限部位を介して、それをpLSINK-BBzBB CAR主鎖にクローニングした。得られたH93M CARは、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列と、SEQ ID NO:12の核酸配列とを含む。H93MのCARコード領域は、図1の中部に表示されている。いかなる理論にも拘束されることなく、H93M CAR-T細胞において過剰発現するIL12p40は、内因性IL-23α p19サブユニットとIL-23を形成することができ、報告によると、該内因性IL-23α p19サブユニットは、TCR刺激後にT細胞により上方制御された。例えばMaら,Interleukin-23 engineering improves CAR T cell function in solid tumors.Nat Biotechnol.2020 Apr;38(4):448-459を参照されたい。
pMDLg.pRRE(Addgene#12251)、pRSV-REV(Addgene#12253)及びpMD2.G(Addgene#12259)を含有するレンチウイルスパッケージングプラスミド混合物と、CARコンストラクトを発現するベクターとを、予め最適化された比率でポリエーテルイミド(PEI)と予め混合し、そして25℃で5分間インキュベートした。HEK293細胞をトランスフェクト混合物内に加えた。そして、細胞を、5% CO2を含む細胞インキュベーターボックス中で、37℃で一晩インキュベートした。4℃及び3000g下で、15分間遠心分離してから上清を回収し、0.45μm PESフィルタによって濾過し、そして超速度で遠心分離してレンチウイルス濃縮を行った。上清を慎重に捨て、予冷されたDPBSでウイルス粒子を慎重に洗い流した。ウイルスを適宜液状にし、-80℃で貯蔵した。CHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞株を形質導入する滴定法によってウイルス力価を測定した。
8.1.2. CAR-T細胞調製
PBMCはTPCS(#A19Z284097)から購入された。Pan T細胞単離キット(Miltenyi #130-096-535)を用いて、以下に記載のメーカーのレジメンに従ってPBMCからヒトT細胞を精製した。細胞数を測定し、細胞懸濁液を300gで10分間遠心分離した。そして上清を完全に吸い出し、107個の総細胞ごとに、40μLの緩衝液に細胞粒子を再懸濁させた。Pan T細胞ビオチン-抗体混合物を107個の総細胞当たり10μL加え、十分に混合し、冷蔵庫(2℃~8℃)中で約5分間インキュベートした。そして107個の細胞当たり30μLの緩衝液を加えた。107個の細胞当たり20μLのPan T細胞マイクロビーズ混合物を加えた。細胞懸濁液混合物を十分に混合、冷蔵庫(2℃~8℃)中で10分間再インキュベートした。磁気分離には少なくとも500μLが必要である。磁気分離の場合、LSカラムを適切なMACS分離器の磁場に置いた。3mLの緩衝液で洗い流すことによってカラムを調製した。そして細胞懸濁液をカラムに適用し、標識されていない細胞を含む流出物を回収し、これは濃縮したT細胞部分を表す。3mLの緩衝液でカラムを洗浄し、通過した標識されていない細胞を回収することによって別のT細胞を回収した。これらの標識されていない細胞は、濃縮したT細胞を再び表し、前のステップ流出物と組み合わせた。そして回収された濃縮T細胞を遠心分離し、RPMI-1640+300IU/mL IL-2中に再懸濁させた。
PBMCはTPCS(#A19Z284097)から購入された。Pan T細胞単離キット(Miltenyi #130-096-535)を用いて、以下に記載のメーカーのレジメンに従ってPBMCからヒトT細胞を精製した。細胞数を測定し、細胞懸濁液を300gで10分間遠心分離した。そして上清を完全に吸い出し、107個の総細胞ごとに、40μLの緩衝液に細胞粒子を再懸濁させた。Pan T細胞ビオチン-抗体混合物を107個の総細胞当たり10μL加え、十分に混合し、冷蔵庫(2℃~8℃)中で約5分間インキュベートした。そして107個の細胞当たり30μLの緩衝液を加えた。107個の細胞当たり20μLのPan T細胞マイクロビーズ混合物を加えた。細胞懸濁液混合物を十分に混合、冷蔵庫(2℃~8℃)中で10分間再インキュベートした。磁気分離には少なくとも500μLが必要である。磁気分離の場合、LSカラムを適切なMACS分離器の磁場に置いた。3mLの緩衝液で洗い流すことによってカラムを調製した。そして細胞懸濁液をカラムに適用し、標識されていない細胞を含む流出物を回収し、これは濃縮したT細胞部分を表す。3mLの緩衝液でカラムを洗浄し、通過した標識されていない細胞を回収することによって別のT細胞を回収した。これらの標識されていない細胞は、濃縮したT細胞を再び表し、前のステップ流出物と組み合わせた。そして回収された濃縮T細胞を遠心分離し、RPMI-1640+300IU/mL IL-2中に再懸濁させた。
調製されたT細胞を、その後にヒトT細胞TransActキット(Miltenyi#170-076-156)を用いて、メーカーのレジメンに従って48時間予め活性化し、ここで、抗CD3/CD28 MACSiBead粒子は、40μL/百万個のビーズ対細胞比で加えられた。
CAR-T細胞調製では、予め活性化されたT細胞を24ウェルプレートに0.5×106個の細胞/ウェルの密度で播いた。そして、精製されたウイルスをウェルに加えた。一晩経った後、回収し、遠心分離し、新鮮なRPMI-1640+300IU/mL IL-2で再懸濁させた後、形質導入された細胞を24ウェルG-Rex(Wilson Wolf #80192M)中に置いた。形質導入されていないT細胞(UnT)を陰性対照として使用した。7日目に、ネイキッドのH93 CAR-T細胞及びH93M CAR-T細胞のCAR陽性率は、それぞれ39.3%及び32.5%であった(図2)。
8.1.3. IL-23及びCCL-19発現
H93M CARの構造を検証するために、CAR-T細胞を正常な条件(RPMI-1640+300IU/mL IL-2)で培養し、IL-23及びCCL-19の分泌状況を分析した。簡単に言うと、6ウェルプレートにおいて、細胞を1×106個の細胞/mLで培養し、それぞれ12、14及び17日目に上清を回収した。メーカーのレジメンに従って、ヒトIL-23キット(CISBIO#62HIL23PEG)及びCCL-19 ELISAキット(Abcam#ab100601)を用いてIL-23及びCCL-19の量を測定した。図3に示すように、H93 CAR-T細胞及びUnTに比べて、H93M CAR-T細胞のみは、IL-23(286.9pg/106個の細胞~570.3pg/106個の細胞)及びCCL-19(65.4pg/106個の細胞~237.2pg/106個の細胞)を分泌した(IL-23発現もCCL-19発現も検出されなかった)。
H93M CARの構造を検証するために、CAR-T細胞を正常な条件(RPMI-1640+300IU/mL IL-2)で培養し、IL-23及びCCL-19の分泌状況を分析した。簡単に言うと、6ウェルプレートにおいて、細胞を1×106個の細胞/mLで培養し、それぞれ12、14及び17日目に上清を回収した。メーカーのレジメンに従って、ヒトIL-23キット(CISBIO#62HIL23PEG)及びCCL-19 ELISAキット(Abcam#ab100601)を用いてIL-23及びCCL-19の量を測定した。図3に示すように、H93 CAR-T細胞及びUnTに比べて、H93M CAR-T細胞のみは、IL-23(286.9pg/106個の細胞~570.3pg/106個の細胞)及びCCL-19(65.4pg/106個の細胞~237.2pg/106個の細胞)を分泌した(IL-23発現もCCL-19発現も検出されなかった)。
8.2. 実施例2-外因的に導入されたp40及びCCL-19を発現するCAR-T細胞のインビトロ反復チャレンジアッセイ
CAR-T細胞のインビトロ持続性及び枯渇を評価するために、CAR-T細胞反復チャレンジモデルを確立した。GPC3陽性腫瘍細胞でCAR-T細胞を数ラウンドにわたって何度も刺激することによってCAR-T細胞の枯渇表現型を得た。再チャレンジアッセイには、H93 CAR-T群(初期CAR-T細胞はH93 CAR-T細胞であった)、H93M CAR-T群(初期CAR-T細胞はH93M CAR-T細胞であった)及びUnT(初期T細胞はCARで形質導入されていなかった)の三つの処理群があった。再チャレンジの初回ラウンド(ラウンド1)については、6ウェルプレートにおいて、CAR-T細胞と腫瘍細胞を1:1のE/T比で共培養した。一晩経った後、ウェル中のCAR-T細胞を穏やかに回収し、遠心分離し、新鮮なCAR-T培地(RPMI-1640+300 IU/mL IL-2)に再懸濁させた。そしてCAR-T細胞を新しいプレートに加えてさらに2日間培養した。そして、ウェル中のCAR-T細胞を回収し、新鮮な培地に再び再懸濁させ、新鮮な腫瘍細胞を播種した新しいプレートに加えた(ラウンド2)。前のラウンドの終了時のCAR-T細胞の陽性率によって、加えられた新鮮な腫瘍細胞の数を計算した。残りのCAR-T細胞の細胞数及び生存率に依存して、該プロセスを数ラウンド繰り返すことができる。各ラウンドの腫瘍細胞再チャレンジから24時間後に、CAR+ T細胞におけるCD4+ T細胞及びCD8+ T細胞の枯渇マーカーPD-1及びLAG3を分析した。各ラウンドの終了時にT細胞をカウントし、刺激から72時間後に、GPC3陽性HCC細胞株PLC/PRF/5に対して細胞傷害性アッセイを行った。
CAR-T細胞のインビトロ持続性及び枯渇を評価するために、CAR-T細胞反復チャレンジモデルを確立した。GPC3陽性腫瘍細胞でCAR-T細胞を数ラウンドにわたって何度も刺激することによってCAR-T細胞の枯渇表現型を得た。再チャレンジアッセイには、H93 CAR-T群(初期CAR-T細胞はH93 CAR-T細胞であった)、H93M CAR-T群(初期CAR-T細胞はH93M CAR-T細胞であった)及びUnT(初期T細胞はCARで形質導入されていなかった)の三つの処理群があった。再チャレンジの初回ラウンド(ラウンド1)については、6ウェルプレートにおいて、CAR-T細胞と腫瘍細胞を1:1のE/T比で共培養した。一晩経った後、ウェル中のCAR-T細胞を穏やかに回収し、遠心分離し、新鮮なCAR-T培地(RPMI-1640+300 IU/mL IL-2)に再懸濁させた。そしてCAR-T細胞を新しいプレートに加えてさらに2日間培養した。そして、ウェル中のCAR-T細胞を回収し、新鮮な培地に再び再懸濁させ、新鮮な腫瘍細胞を播種した新しいプレートに加えた(ラウンド2)。前のラウンドの終了時のCAR-T細胞の陽性率によって、加えられた新鮮な腫瘍細胞の数を計算した。残りのCAR-T細胞の細胞数及び生存率に依存して、該プロセスを数ラウンド繰り返すことができる。各ラウンドの腫瘍細胞再チャレンジから24時間後に、CAR+ T細胞におけるCD4+ T細胞及びCD8+ T細胞の枯渇マーカーPD-1及びLAG3を分析した。各ラウンドの終了時にT細胞をカウントし、刺激から72時間後に、GPC3陽性HCC細胞株PLC/PRF/5に対して細胞傷害性アッセイを行った。
8.2.1. T細胞の増大
H93M CAR-T細胞の増大機能の利点を決定するために、各ラウンドの再チャレンジの終了時に全T細胞の細胞数及び生存率を記録した。
H93M CAR-T細胞の増大機能の利点を決定するために、各ラウンドの再チャレンジの終了時に全T細胞の細胞数及び生存率を記録した。
図4Aに示すように、H93 CAR-T群(ラウンド6の時点で10.5倍)及びUnT群(ラウンド6の時点で0.2倍)に比べて、PLC/PRF/5細胞で繰り返して刺激すると、H93M CAR-T群細胞(ラウンド6の時点で138.4倍)は有意に増大した。それと共に、H93M CAR-T群の細胞生存率は依然として高く、比較として、H93 CAR-T群及びUnT群は、毎回の刺激後に徐々に減少した(図4B)。
8.2.2. 細胞傷害性アッセイ及びサイトカイン放出
さらに、CAR-T再チャレンジアッセイにおいて、2ラウンドが終わるごとにCAR-T細胞の細胞傷害性を評価し、全T細胞:標的細胞の比は1:1であった。標的細胞は、GPC3陽性PLC/PRF/5細胞であり、当分野の既知の技術によって操作されてホタルルシフェラーゼを発現する。2ラウンドが終わるごとに細胞を回収し、標的細胞(2×103個の細胞/ウェル)を混合し、384ウェルプレートにおいて24時間培養した。CAR-T細胞による腫瘍細胞への細胞傷害性をアッセイするために、メーカーのレジメンに従ってOne-glo発光ルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega#E6110)を調製し、ウェル内の残留ルシフェラーゼの活性を検出するために、共培養された細胞に加えた。ルシフェラーゼが腫瘍細胞のみで発現するため、ウェル内の残留ルシフェラーゼの活性は、ウェル内の生存標的細胞の数と直接相関する。エフェクター細胞の非存在下で標的細胞に培地を加えることによって、ルシフェラーゼ活性の最大値を得た。細胞傷害性アッセイを開始する時に最終濃度が1%であるTriton X-100を加えることによってルシフェラーゼ活性の最小値を測定した。以下の式によって特異的細胞傷害性を計算した:特異的細胞傷害性%=100%×(1-(RLU試料-RLUmin)/(RLUmax-RLUmin))。
さらに、CAR-T再チャレンジアッセイにおいて、2ラウンドが終わるごとにCAR-T細胞の細胞傷害性を評価し、全T細胞:標的細胞の比は1:1であった。標的細胞は、GPC3陽性PLC/PRF/5細胞であり、当分野の既知の技術によって操作されてホタルルシフェラーゼを発現する。2ラウンドが終わるごとに細胞を回収し、標的細胞(2×103個の細胞/ウェル)を混合し、384ウェルプレートにおいて24時間培養した。CAR-T細胞による腫瘍細胞への細胞傷害性をアッセイするために、メーカーのレジメンに従ってOne-glo発光ルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega#E6110)を調製し、ウェル内の残留ルシフェラーゼの活性を検出するために、共培養された細胞に加えた。ルシフェラーゼが腫瘍細胞のみで発現するため、ウェル内の残留ルシフェラーゼの活性は、ウェル内の生存標的細胞の数と直接相関する。エフェクター細胞の非存在下で標的細胞に培地を加えることによって、ルシフェラーゼ活性の最大値を得た。細胞傷害性アッセイを開始する時に最終濃度が1%であるTriton X-100を加えることによってルシフェラーゼ活性の最小値を測定した。以下の式によって特異的細胞傷害性を計算した:特異的細胞傷害性%=100%×(1-(RLU試料-RLUmin)/(RLUmax-RLUmin))。
図5Aに示すように、ラウンド1の後に同じ細胞傷害性(21.1%対22.4%)を示したことに加えて、ラウンド3の後に、H93M CAR-T群は、H93 CAR-T群よりも高い細胞傷害性を示した。具体的には、H93M CAR-T群は、ラウンド3の後に74.4%の平均細胞傷害性を示し、ラウンド5(80.7%)及びラウンド7(83.4%)の後にやや増加した。H93 CAR-T群において、低い細胞傷害性を観察し、平均細胞傷害性は、それぞれ52.7%(ラウンド3)、57.9%(ラウンド5)及び47.0%(ラウンド7)であった。H93M CAR-T群は、GPC3陽性HCC細胞株PLC/PRF/5.Luc細胞に対して、持続的な高レベルの細胞傷害性を有することが示唆された。
再チャレンジアッセイでのH93 CAR-T細胞との比較におけるH93M CAR-T細胞のGPC3陽性腫瘍細胞に対する持続的な細胞傷害活性をさらに検証するために、CAR-T細胞を1:1のE/T比(全T細胞:標的細胞)でPLC/PRF/5.Luc細胞と24時間共培養した後、ELISAによってTNF-α及びIFN-γの産生を分析した。結果として、H93M CAR-T群のTNF-α及びIFN-γ産生能力は、H93 CAR-T群に比べて有意高く、且つ全てのラウンドにおいて、いずれも細胞傷害性効力との関連性を示した。図5B及び5Cに示すように、H93M CAR-T群細胞が分泌したTNF-α及びIFN-γ濃度は、ラウンド3~ラウンド5の後に有意に高くなり、それぞれ451.2~1151.1pg/mL(TNF-α)及び18353.7~37072.7pg/mL(IFN-γ)の範囲内にあるが、H93 CAR-T群細胞が分泌したTNF-α及びIFN-γ濃度は、ラウンド3~ラウンド7の後に徐々に低下し、それぞれ197.1~129.2pg/mL(TNF-α)及び4993.1~1672.1pg/mL(IFN-γ)の範囲内にあった。
8.2.3. 陽性CAR-T細胞の比率の変化
H93 CAR-T細胞及びH93M CAR-T細胞の陽性率は、2ラウンドが終わるごとに計算され、刺激ラウンドに伴って30%~86%の範囲内でほぼ同じように増加した。最後に、ラウンド5の後にH93 CAR-T細胞及びH93M CAR-T細胞の陽性率は増加しなかった(図6)。ラウンド5の再チャレンジの後に、H93M CAR-T細胞は、高い細胞傷害性を示し、フラットなCAR+%(図6)に比べて細胞傷害性が増加した(図5A)。
H93 CAR-T細胞及びH93M CAR-T細胞の陽性率は、2ラウンドが終わるごとに計算され、刺激ラウンドに伴って30%~86%の範囲内でほぼ同じように増加した。最後に、ラウンド5の後にH93 CAR-T細胞及びH93M CAR-T細胞の陽性率は増加しなかった(図6)。ラウンド5の再チャレンジの後に、H93M CAR-T細胞は、高い細胞傷害性を示し、フラットなCAR+%(図6)に比べて細胞傷害性が増加した(図5A)。
8.2.4. T細胞の枯渇
再チャレンジアッセイにおいて、各ラウンドが終了してから24時間後にT細胞枯渇を評価した。二つの枯渇マーカーとしてのPD-1及びLAG-3を、それぞれ抗ヒトPD-1抗体(Biolegend#329908)及び抗LAG-3抗体(Invitrogen#17-2239-42)を用いて標識し、CD4+CAR+ T細胞及びCD8+CAR+ T細胞ダブルポジティブサブセットの発現レベルを分析した。図7に示すように、H93 CAR-T群に比べて、H93M CAR-T群は、全てのウンドにおいて、いずれも枯渇マーカーPD-1及びLAG3の発現の低下を示した。特にラウンド3~ラウンド5において、H93M CAR-T群におけるCD4+CAR+ダブルポジティブサブセットのPD-1発現は13%~18%である一方、H93 CAR-T群は30%を上回った(図7A)。全てのラウンド(R2-R7)では、CD4+CAR+ダブルポジティブサブセットにおいて、H93M CAR-T群は、H93 CAR-T群(30%~49%)よりも有意に低いLAG-3発現(12%~25%)を有した(図7C)。CD8+CAR+ダブルポジティブサブセットにおいて、H93M CAR-T群におけるPD-1の発現レベルは、依然としてH93 CAR-T群より低く(ラウンド3~ラウンド7で1.3%~4.1%対5.6%~9.4%)(図7B)、且つラウンド3~ラウンド5において、H93M CAR-T群のLAG3発現レベルは、56.6%~82.9%であり、H93 CAR-T群(82.7%~88.1%)より低く(図7D)、H93M CAR-T細胞が抗枯渇能力を有することを示唆した。
再チャレンジアッセイにおいて、各ラウンドが終了してから24時間後にT細胞枯渇を評価した。二つの枯渇マーカーとしてのPD-1及びLAG-3を、それぞれ抗ヒトPD-1抗体(Biolegend#329908)及び抗LAG-3抗体(Invitrogen#17-2239-42)を用いて標識し、CD4+CAR+ T細胞及びCD8+CAR+ T細胞ダブルポジティブサブセットの発現レベルを分析した。図7に示すように、H93 CAR-T群に比べて、H93M CAR-T群は、全てのウンドにおいて、いずれも枯渇マーカーPD-1及びLAG3の発現の低下を示した。特にラウンド3~ラウンド5において、H93M CAR-T群におけるCD4+CAR+ダブルポジティブサブセットのPD-1発現は13%~18%である一方、H93 CAR-T群は30%を上回った(図7A)。全てのラウンド(R2-R7)では、CD4+CAR+ダブルポジティブサブセットにおいて、H93M CAR-T群は、H93 CAR-T群(30%~49%)よりも有意に低いLAG-3発現(12%~25%)を有した(図7C)。CD8+CAR+ダブルポジティブサブセットにおいて、H93M CAR-T群におけるPD-1の発現レベルは、依然としてH93 CAR-T群より低く(ラウンド3~ラウンド7で1.3%~4.1%対5.6%~9.4%)(図7B)、且つラウンド3~ラウンド5において、H93M CAR-T群のLAG3発現レベルは、56.6%~82.9%であり、H93 CAR-T群(82.7%~88.1%)より低く(図7D)、H93M CAR-T細胞が抗枯渇能力を有することを示唆した。
8.3. 実施例3-外因的に導入されたp40及びCCL-19を発現するCAR-T細胞についての細胞遊走アッセイ
CCL-19の走化機能を評価するために、細胞遊走アッセイを行った。96ウェルtranswellチャンバ(Corning)における5-μm孔径のポリカーボネートフィルタを通した遊走によってレスポンダーT細胞の走化性を測定した。GPC3陽性ヒトHCC細胞株PLC/PRF/5細胞でCAR-T細胞及びUnT細胞を刺激し、30時間後に共培養上清を回収した。そして、125μLの上清を下側チャンバに入れ、75μLの処理されていないT細胞(0.075M)を上側チャンバでインキュベートした。4、6及び8時間後、上側チャンバから下側チャンバに遊走したT細胞を血球計数チャンバによってカウントした。細胞遊走アッセイには、H93 CAR-T群(下側チャンバにおける上清は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93 CAR-T細胞からのものであった)、H93M CAR-T群(下側チャンバにおける上清は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93M CAR-T細胞からのものであった)及びUnT群(下側チャンバにおける上清は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたUnT細胞からのものであった)の三つの処理群があった。
CCL-19の走化機能を評価するために、細胞遊走アッセイを行った。96ウェルtranswellチャンバ(Corning)における5-μm孔径のポリカーボネートフィルタを通した遊走によってレスポンダーT細胞の走化性を測定した。GPC3陽性ヒトHCC細胞株PLC/PRF/5細胞でCAR-T細胞及びUnT細胞を刺激し、30時間後に共培養上清を回収した。そして、125μLの上清を下側チャンバに入れ、75μLの処理されていないT細胞(0.075M)を上側チャンバでインキュベートした。4、6及び8時間後、上側チャンバから下側チャンバに遊走したT細胞を血球計数チャンバによってカウントした。細胞遊走アッセイには、H93 CAR-T群(下側チャンバにおける上清は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93 CAR-T細胞からのものであった)、H93M CAR-T群(下側チャンバにおける上清は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93M CAR-T細胞からのものであった)及びUnT群(下側チャンバにおける上清は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたUnT細胞からのものであった)の三つの処理群があった。
図8Aに示すように、異なる時点で、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93M CAR-T細胞(CCL-19の分泌を有する)の上清には、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93 CAR-T細胞及びPLC/PRF/5細胞と共培養されたUnT細胞の上清よりも多くのT細胞が引き込まれた(H93M CAR-T群対H93 CAR-T群:P<0.0001)。具体的には、H93M CAR-T群は、6時間で上側チャンバの全てのT細胞を完全に引き込むこができる(0.104 M)一方、CCL-19の産生のないH93 CAR-T群及びUnT群は、8時間を経っても少数のT細胞を遊走させ、それぞれ0.032 M及び0.026 Mであった。なお、CCL-19 ELISA(Abcam#ab100601)によって共培養上清におけるCCL-19の濃度を測定した。該結果は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93M CAR-T細胞からの上清がCCL-19を分泌したことを示唆し(4590.15±380.85pg/mL)、H93M CAR-T細胞の走化機能がさらに検証された(図8B)。
8.4. 実施例4-外因的に導入されたp40及びCCL-19を発現するCAR-T細胞の、インビボでの養子移入後の抗腫瘍効果
実施例1に開示される方法に従って、ヒトIL12p40及びヒトIL-7を発現するH93C CAR-T細胞をさらに調製した。H93 CAR主鎖に基づき、H93C CARベクターにおけるMCSは、ヒトIL12p40(SEQ ID NO:5)及びヒトIL-7(SEQ ID NO:24)をコードする核酸配列を含む核酸配列の挿入を可能にし、該核酸配列は、別の2A自己切断ペプチド(例えば、SEQ ID NO:13に示すP2A断片)のC末端と融合される2A自己切断ペプチド(例えば、SEQ ID NO:13に示すP2Aペプチド)に連結することによって、CD3ζ細胞質シグナル伝達ドメインのC末端上流において、CD3ζ細胞質シグナル伝達ドメインのC末端に作動可能に連結された。P2Aペプチド及びIL12p40-P2A-IL-7ペプチドをコードする核酸配列を化学的に合成し、HpaI(5’-GTTAAC-3’)(SEQ ID NO:17)及びMluI(5’-ACGCGT-3’)(SEQ ID NO:23)制限部位を介して、それをpLSINK-BBzBB CAR主鎖にクローニングした。IL12p40-P2A-IL-7ペプチドのアミノ酸配列及び核酸配列は、SEQ ID NO:25とSEQ ID NO:26に表示された。
実施例1に開示される方法に従って、ヒトIL12p40及びヒトIL-7を発現するH93C CAR-T細胞をさらに調製した。H93 CAR主鎖に基づき、H93C CARベクターにおけるMCSは、ヒトIL12p40(SEQ ID NO:5)及びヒトIL-7(SEQ ID NO:24)をコードする核酸配列を含む核酸配列の挿入を可能にし、該核酸配列は、別の2A自己切断ペプチド(例えば、SEQ ID NO:13に示すP2A断片)のC末端と融合される2A自己切断ペプチド(例えば、SEQ ID NO:13に示すP2Aペプチド)に連結することによって、CD3ζ細胞質シグナル伝達ドメインのC末端上流において、CD3ζ細胞質シグナル伝達ドメインのC末端に作動可能に連結された。P2Aペプチド及びIL12p40-P2A-IL-7ペプチドをコードする核酸配列を化学的に合成し、HpaI(5’-GTTAAC-3’)(SEQ ID NO:17)及びMluI(5’-ACGCGT-3’)(SEQ ID NO:23)制限部位を介して、それをpLSINK-BBzBB CAR主鎖にクローニングした。IL12p40-P2A-IL-7ペプチドのアミノ酸配列及び核酸配列は、SEQ ID NO:25とSEQ ID NO:26に表示された。
NCGマウス異種移植モデルにおいて、CAR-T細胞のインビボ抗腫瘍効果を評価した。皮下異種移植モデルについて、6~7週齢のNCGマウスの右前肢にHuh7細胞を皮下接種した(1.5×106個の細胞/マウス)。平均腫瘍体積が100mm3近くになった時(異種移植接種後11日目)に、マウスをいくつかの群にランダムに分け、それぞれH93 CAR-T細胞(0.2 M又は0.6 Mの投与量)、H93M CAR-T細胞(0.2 M又は0.6 Mの投与量)、H93C CAR-T細胞(0.2 Mの投与量)、UnT(2.3 Mの投与量、CAR-T群と同じ全T細胞の細胞数)、及び溶媒(ビヒクル)のみ、で尾静脈注射によって処置した。腫瘍サイズをデジタルノギスで週2回測定した。以下の式に基づいて腫瘍体積を計算した:腫瘍体積=((長さ)×(幅)2)/2。養子移入後0、7、14、21及び28日目に、それぞれデジタルPCRによってマウス血液におけるCAR-T細胞のコピー数も検出した。
ビヒクル、UnT及びH93 CAR-T細胞で処置したマウスを20日目に動物倫理的理由で屠殺し、且つこの三つの群の腫瘍体積は2000mm3超に達した。H93M CAR-T細胞で処置したマウスを、27日目(投与量:0.2 M)及び49日目(投与量:0.6 M)まで記録し続けた。図9Aに示すように、UnT及びH93 CAR-T細胞群に比べて、養子移入のH93M CAR-T細胞を投与したマウスの腫瘍サイズがそれぞれ76.8%及び74.6%減少した(584.3mm3対2514.7mm3、2297.3mm3)ことを20日目に観察し、且つ20日目以降も、腫瘍サイズは依然として徐々に減少し、H93M CAR-T細胞は、低い投与量(0.2 M/マウス)でH93 CAR-T細胞よりも良好な治療可能性を有することが示唆された。それとともに、H93C CAR-T細胞群は、わずかな抗腫瘍効果しか有しておらず、且つ20日目に32.7%の増殖抑制率(1546.8mm3対2297.3mm3)を有し、外因的に導入されIL12p40及びIL-7を発現するH93C CAR-T細胞に比べて、外因的に導入されIL12p40及びCCL-19を発現するH93M CAR-T細胞は、インビボでの養子移入後により良好な治療可能性を有することが示唆された。投与量が0.6 M/マウスに増加した場合、図9Bに示すように、H93M CAR-T細胞の投与は、腫瘍増殖に対して明らかな抑制効果を有し、20日目にUnTに比べて増殖抑制率は96.0%(101.6mm3対2514.7mm3)であるが、H93M CAR-T細胞処置群及びH93 CAR-T細胞処置群において類似している腫瘍退縮(101.6mm3対137.3mm3)が観察された。34日目に、H93M CAR-T細胞で処置されたマウスは、ほぼ無腫瘍であった。
デジタルPCRによってマウス末梢血細胞におけるCAR遺伝子コピー数を検出し、且つH93M CAR-T細胞は、0.2 Mの投与量で21日目に有意な増大を示し、続いて減少した一方、処置プロセス全体において、H93 CAR-T細胞及びUnTで処置されたマウスには有意な増大がなかった(図9C)。0.2 Mの投与量で、H93M CAR-T細胞の21日目のコピー数は、0日目の335.6倍(133.4175個のコピー対0.3975個のコピー)であり、28日目に184.7倍(73.4250個のコピー対0.3975個のコピー)まで低下した。H93C CAR-T細胞は、14日目後に制御不能な増大を示し、且つ28日目に4873.7倍(231.5350個のコピー対0.0475個のコピー)に達した(図9C)。0.6 Mの投与量で、H93M CAR-T細胞及びH93 CAR-T細胞は、7日目後にいずれも有意な増大を示し、且つH93M CAR-T細胞は、H93 CAR-T細胞よりも良好な増大能力を有した(21日目に272.2850個のコピー対83.6275個のコピー)(図9D)。
該実験中、0.2 Mの投与量であろうと0.6 Mの投与量であろうと、三つの群のいずれにおいてもマウスの体重減少が観察されなかった(図10A及び図10B)。しかし、H93 CAR-T細胞で処置されたマウスは、0.2 Mの投与量で20日目に立毛、後弯姿勢及びるい痩といった症状を示す一方、H93M CAR-T細胞で処置されたマウスは正常であった。0.6 Mの投与量で、両群のマウスとも正常な外見を有した。H93C CAR-T細胞(0.2 Mの投与量)を養子移入した4匹のマウスにおいて、2匹は、24日目に屠殺され、立毛、後弯姿勢、るい痩、息切れのような症状を示した。H93M CAR-T細胞及びH93C CAR-T細胞で処置されたマウスのデータ比較により、H93M CAR-T細胞は、H93C CAR-T細胞よりも良好な抗腫瘍可能性、制御可能な増大及びインビボ安全性を有することが示唆された。
H93M CAR-T細胞におけるIL-23の活性化依存的産生を検証するために、ヒトIL-23キット(CISBIO#62HIL23PEG)及びヒトIFN-γキット(CISBIO#62HIFNGPEG)を用いて、CAR-T細胞で処置した後のNCGマウス末梢血におけるIL-23及びIFN-γの分泌レベルを分析した。図11Aに示すように、H93 CAR-T細胞処置群に比べて、H93M CAR-T細胞処置群は、低い投与量(0.2 M、21日目)で3倍までのより高いIL-23分泌レベルを示した。高い投与量(0.6 M)でのH93M CAR-T細胞処置マウス及びH93 CAR-T細胞処置マウスにおいて、類似した低レベルのIL-23を観察した(図11B)。それとともに、マウス末梢血における活性化依存的産生のIFN-γの分泌行為は、IL-23に似ており(図11C及び11D)、H93M CAR-T細胞におけるIL-23の活性化依存的産生を示唆した。
H93M CAR-T細胞のインビボでの抗腫瘍効果を研究するために、免疫組織化学(IHC)を用いて、T細胞の浸潤状況、腫瘍部位マクロファージ及び樹状細胞(DC)の動員状況を研究した。簡単に言うと、組織パラフィン切片スライドグラスを60℃で60分間加熱し、そしてキシレンで3回、各10分間脱脂し、100%、100%、95%、90%、80%、70%のアルコール及び水で各5分間再水和した。スライドグラスを抗原回復(antigen retrieval)緩衝液中で20分間煮沸することにより抗原回復を行い、そしてスライドグラスを抗原回復緩衝液に浸漬して室温(RT)に冷却した後に、3%の過酸化水素のメタノールでスライドグラスを10分間処理して内因性ペルオキシダーゼの活性を破壊した。非特異的バックグラウンド染色を減少させるために、スライドグラスをブロッキング緩衝液(DPBSで希釈した5%ヤギ血清)と共に2℃~8℃で一晩インキュベートした。
一晩経った後、スライドグラスを室温で30分間インキュベートし、そして希釈された一次抗体と共に37℃で2時間インキュベートし、二次抗体HRPコンジュゲート抗マウスIgG抗体(Fuzhou Maixin Biotech.Co.,Ltd.# KIT-5002)と共に暗所下室温で15分間インキュベートした。メーカーの取扱説明書に従ってDAB基質を調製し、200~500μLのDAB基質をスライドグラスに加え、暗所で2分間インキュベートした。蒸留水で5分間洗浄することによって染色を停止させた。最後に、スライドグラスに中性バルサムを加え、ヘマトキシリンで再染色し、1%塩酸アルコールで分別し、アルコールで脱水した後にマウントした。
H93M CAR-T細胞が低い投与量(0.2 M)で抗腫瘍能力を増強する機序を解明するために、TCRα(H-1)(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY#sc-515719)を用いて、処置されたマウスの腫瘍組織においてIHCによってT細胞浸潤を研究した。図12に示すように、H93 CAR-T細胞及びUnT処置群に比べて、H93M CAR-T細胞処置群における全ての三匹のマウスの腫瘍部位のT細胞浸潤はいずれも改善された。H93M CAR-T細胞処置群において、より多くのT細胞は腫瘍巣中心部にまで浸潤した一方、三匹のH93 CAR-T細胞処置マウスにおいて、一匹のみのマウスの腫瘍境界領域に少ないT細胞浸潤があり、他のマウスの腫瘍部位にT細胞が非常に少なかった。UnT処置群において、三匹のマウスの腫瘍部位にT細胞浸潤は観察されなかった。
なお、腫瘍組織におけるマクロファージ及びDC動員を研究した。抗CD68抗体(Abcam#ab125212)及び抗CD11c抗体(Cell signaling technology#97585S)を用いて、腫瘍組織におけるマウスマクロファージ及びDCを検出した。図13に示すように、CD68+マクロファージ(左欄)及びCD11c+ DC(右欄)はDABに染色された。マクロファージ及びDCの腫瘍部位への動員は、H93M CAR-T細胞処置群において有意に高かった一方、UnT及びH93 CAR-T細胞処置群は、腫瘍組織境界のみにマクロファージ動員があった。これらのデータにより、H93 CAR-T細胞及びUnTに比べて、H93M CAR-T細胞は、腫瘍組織においてより多くのマクロファージ及びDC動員を誘導することができ、且つ腫瘍組織において自然免疫応答をより有効に引き出し得ることが示唆された。
8.5. 実施例5-外因的に導入されたp40及びCCL-21を発現するCAR-T細胞の調製
PBMCはTPCS(#A19K268037)から購入された。Pan T細胞単離キット(Miltenyi #130-096-535)を用いて、上記セクション8.1.2に記載のメーカーのレジメンに従ってPBMCからヒトT細胞を精製した。
PBMCはTPCS(#A19K268037)から購入された。Pan T細胞単離キット(Miltenyi #130-096-535)を用いて、上記セクション8.1.2に記載のメーカーのレジメンに従ってPBMCからヒトT細胞を精製した。
調製されたT細胞を、その後にヒトT細胞TransActキット(Miltenyi#170-076-156)を用いて、メーカーのレジメンに従って48時間予め活性化し、ここで、抗CD3/CD28 MACSiBead粒子は、40μL/百万個のビーズ対細胞比で加えられた。CAR-T細胞調製では、予め活性化されたT細胞を24ウェルプレート(BD)に0.5×106個の細胞/ウェルの密度で播いた。そして、精製されたウイルスをウェルに加えた。一晩経った後、回収し、遠心分離し、新鮮なRPMI-1640+300IU/mL IL-2で再懸濁させた後、形質導入された細胞を24ウェルG-Rex(Wilson Wolf #80192M)中に置いた。形質導入されていないT細胞(UnT)を陰性対照として使用した。H93 CAR-T細胞及びH93M CAR-T細胞、並びにH93P CARを有するH93P CAR-T細胞(そのコード領域は図1の底部に示されている)を以上に記載したように調製した。H93P CARは、SEQ ID NO:18のアミノ酸配列と、SEQ ID NO:19の核酸配列とを含む。6日目に、ネイキッドのH93 CAR-T細胞、武装化(armored)H93M CAR-T細胞(IL-23及びCCL-19を分泌する)及び武装化H93P CAR-T細胞(IL-23及びCCL-21を分泌する)のCAR陽性率は、それぞれ63.52%、48.59%及び25.24%であった(図14)。
8.6. 実施例6-外因的に導入されたp40及びCCL-21を発現するCAR-T細胞、並びに外因的に導入されたp40及びCCL-19を発現するCAR-T細胞についての、再チャレンジアッセイ
上記の実施例2に記載されるように、CAR-T細胞反復チャレンジモデルを確立した。GPC3陽性細胞株PLC/PRF/5細胞を標的細胞として使用した。再チャレンジの初回ラウンド(ラウンド1)については、6ウェルプレートにおいて、CAR-T細胞と腫瘍細胞を1:1のE/T比で共培養した。一晩経った後、ウェル中のCAR-T細胞を穏やかに回収し、遠心分離し、新鮮なCAR-T培地(RPMI-1640+300 IU/mL IL-2)に再懸濁させた。そしてCAR-T細胞を新しいプレートに加えてさらに2日間培養した。そして、ウェル中のCAR-T細胞を回収し、新鮮な培地に再び再懸濁させ、新鮮な腫瘍細胞を播種した新しいプレートに加えた(ラウンド2)。CAR-T細胞は、合計8ラウンド刺激された。各ラウンドにT細胞をカウントし、毎回の刺激から72時間後、GPC3陽性ヒト肝細胞がん(HCC)細胞株PLC/PRF/5.Lucを用いることによって細胞傷害性アッセイを行った。全T細胞と標的細胞との比を用いて細胞傷害性アッセイを行った。再チャレンジアッセイには、H93群(初期CAR-T細胞はH93 CAR-T細胞であった)、H93M群(初期CAR-T細胞はH93M CAR-T細胞であった)、H93P群(初期CAR-T細胞はH93P CAR-T細胞であった)及びUnT(初期T細胞はCARで形質導入されていないT細胞であった)の四つの処理群があった。
上記の実施例2に記載されるように、CAR-T細胞反復チャレンジモデルを確立した。GPC3陽性細胞株PLC/PRF/5細胞を標的細胞として使用した。再チャレンジの初回ラウンド(ラウンド1)については、6ウェルプレートにおいて、CAR-T細胞と腫瘍細胞を1:1のE/T比で共培養した。一晩経った後、ウェル中のCAR-T細胞を穏やかに回収し、遠心分離し、新鮮なCAR-T培地(RPMI-1640+300 IU/mL IL-2)に再懸濁させた。そしてCAR-T細胞を新しいプレートに加えてさらに2日間培養した。そして、ウェル中のCAR-T細胞を回収し、新鮮な培地に再び再懸濁させ、新鮮な腫瘍細胞を播種した新しいプレートに加えた(ラウンド2)。CAR-T細胞は、合計8ラウンド刺激された。各ラウンドにT細胞をカウントし、毎回の刺激から72時間後、GPC3陽性ヒト肝細胞がん(HCC)細胞株PLC/PRF/5.Lucを用いることによって細胞傷害性アッセイを行った。全T細胞と標的細胞との比を用いて細胞傷害性アッセイを行った。再チャレンジアッセイには、H93群(初期CAR-T細胞はH93 CAR-T細胞であった)、H93M群(初期CAR-T細胞はH93M CAR-T細胞であった)、H93P群(初期CAR-T細胞はH93P CAR-T細胞であった)及びUnT(初期T細胞はCARで形質導入されていないT細胞であった)の四つの処理群があった。
8.6.1. T細胞の増大
再チャレンジアッセイにおいてIL12p40発現を有するCAR-T細胞の増大機能の利点を決定するために、各ラウンドの終了時にT細胞の数を記録し、増大倍率を計算した。図15Aに示すように、H93 CAR-T群(ラウンド8の時点で109倍)及びUnT群(ラウンド8の時点で7倍)に比べて、PLC/PRF/5細胞で繰り返して刺激すると、H93M CAR-T群は有意に増大し(ラウンド8の時点で2759倍)、且つH93P CAR-T群は、H93M群に類似した強い増大能力を有した。
再チャレンジアッセイにおいてIL12p40発現を有するCAR-T細胞の増大機能の利点を決定するために、各ラウンドの終了時にT細胞の数を記録し、増大倍率を計算した。図15Aに示すように、H93 CAR-T群(ラウンド8の時点で109倍)及びUnT群(ラウンド8の時点で7倍)に比べて、PLC/PRF/5細胞で繰り返して刺激すると、H93M CAR-T群は有意に増大し(ラウンド8の時点で2759倍)、且つH93P CAR-T群は、H93M群に類似した強い増大能力を有した。
8.6.2. 細胞傷害性アッセイ
さらに、再チャレンジアッセイにおいて、CAR-T細胞の細胞傷害性を評価し、全T細胞:標的細胞の比は1:2であった。標的細胞は、GPC3陽性ヒト肝細胞がん(HCC)細胞株PLC/PRF/5.Lucであり、当分野の既知の技術によって操作されてホタルルシフェラーゼを発現した。2ラウンドが終わるごとに細胞を回収し、標的細胞(2×103個の細胞/ウェル)を混合し、384ウェルプレートにおいて24時間培養した。CAR-Tによる腫瘍細胞への細胞傷害性をアッセイするために、メーカーのレジメンに従ってOne-glo発光ルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega#E6110)を調製し、ウェル内の残留ルシフェラーゼの活性を検出するために、共培養された細胞に加えた。以下の式によって特異的細胞傷害性を計算した:特異的細胞傷害性%=100%×(1-(RLU試料-RLUmin)/(RLUmax-RLUmin))。図15Bに示すように、H93 CAR-T群、H93M CAR-T群及びH93P CAR-T群は、R0の場合(PLC/PRF/5刺激の前)に、似ている細胞傷害性を有した。PLC/PEF/5繰り返して刺激した後、H93M CAR-T群及びH93P CAR-T群は、似ている細胞傷害性(全てのラウンドにおいて47%~68%である)を有し、且つH93 CAR-T群(全てのラウンドにおいて24%~39%である)より有意に高く、H93M CAR-T群及びH93P CAR-T群は、GPC3陽性HCC細胞株PLC/PRF/5.Luc細胞に対していずれも持続的高レベルの細胞傷害性を有することが示唆された。
さらに、再チャレンジアッセイにおいて、CAR-T細胞の細胞傷害性を評価し、全T細胞:標的細胞の比は1:2であった。標的細胞は、GPC3陽性ヒト肝細胞がん(HCC)細胞株PLC/PRF/5.Lucであり、当分野の既知の技術によって操作されてホタルルシフェラーゼを発現した。2ラウンドが終わるごとに細胞を回収し、標的細胞(2×103個の細胞/ウェル)を混合し、384ウェルプレートにおいて24時間培養した。CAR-Tによる腫瘍細胞への細胞傷害性をアッセイするために、メーカーのレジメンに従ってOne-glo発光ルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega#E6110)を調製し、ウェル内の残留ルシフェラーゼの活性を検出するために、共培養された細胞に加えた。以下の式によって特異的細胞傷害性を計算した:特異的細胞傷害性%=100%×(1-(RLU試料-RLUmin)/(RLUmax-RLUmin))。図15Bに示すように、H93 CAR-T群、H93M CAR-T群及びH93P CAR-T群は、R0の場合(PLC/PRF/5刺激の前)に、似ている細胞傷害性を有した。PLC/PEF/5繰り返して刺激した後、H93M CAR-T群及びH93P CAR-T群は、似ている細胞傷害性(全てのラウンドにおいて47%~68%である)を有し、且つH93 CAR-T群(全てのラウンドにおいて24%~39%である)より有意に高く、H93M CAR-T群及びH93P CAR-T群は、GPC3陽性HCC細胞株PLC/PRF/5.Luc細胞に対していずれも持続的高レベルの細胞傷害性を有することが示唆された。
8.7. 実施例7-外因的に導入されたp40及びCCL-21を発現するCAR-T細胞、並びに外因的に導入されたp40及びCCL-19を発現するCAR-T細胞についての、細胞遊走アッセイ
CCL-19及びCCL-21の走化機能を評価するために、細胞遊走アッセイを行った。96ウェルtranswellチャンバ(Corning)における5-μm孔径のポリカーボネートフィルタを通した遊走によってレスポンダーT細胞の走化性を測定した。GPC3陽性ヒトHCC細胞株PLC/PRF/5細胞でCAR-T細胞及びUnT細胞を刺激し、30時間後に共培養上清を回収した。そして、125μLの上清を下側チャンバに入れ、75μLの処理されていないT細胞(0.075 M)を上側チャンバでインキュベートした。2、4及び6時間後、上側チャンバから下側チャンバに遊走したT細胞を血球計数チャンバによってカウントした。四つの処理群を有する:H93 CAR-T群(下側チャンバにおける上清は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93 CAR-T細胞からのものであった)、H93M CAR-T群(下側チャンバにおける上清は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93M CAR-T細胞からのものであった)、H93P CAR-T群(下側チャンバにおける上清は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93P CAR-T細胞からのものであった)及びUnT群(下側チャンバにおける上清は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたUnT細胞からのものであった)。
CCL-19及びCCL-21の走化機能を評価するために、細胞遊走アッセイを行った。96ウェルtranswellチャンバ(Corning)における5-μm孔径のポリカーボネートフィルタを通した遊走によってレスポンダーT細胞の走化性を測定した。GPC3陽性ヒトHCC細胞株PLC/PRF/5細胞でCAR-T細胞及びUnT細胞を刺激し、30時間後に共培養上清を回収した。そして、125μLの上清を下側チャンバに入れ、75μLの処理されていないT細胞(0.075 M)を上側チャンバでインキュベートした。2、4及び6時間後、上側チャンバから下側チャンバに遊走したT細胞を血球計数チャンバによってカウントした。四つの処理群を有する:H93 CAR-T群(下側チャンバにおける上清は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93 CAR-T細胞からのものであった)、H93M CAR-T群(下側チャンバにおける上清は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93M CAR-T細胞からのものであった)、H93P CAR-T群(下側チャンバにおける上清は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93P CAR-T細胞からのものであった)及びUnT群(下側チャンバにおける上清は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたUnT細胞からのものであった)。
図16に示すように、異なる時点で、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93 CAR-T細胞及びPLC/PRF/5細胞と共培養されたUnT細胞の上清に比べて、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93M CAR-T細胞(CCL-19を分泌する)及びH93P(CCL-21を分泌する)CAR-T細胞の上清には、より多くのT細胞が引き込まれた。しかしながら、H93M CAR-T群のインビトロでの遊走誘導能力は、H93P CAR-T群(H93M CAR-T群対H93P CAR-T群、6時間の時点でP<0.0001)より有意に優れている。具体的には、H93M CAR-T群は、6時間(0.095 M)で上側チャンバの全てのT細胞を完全に引き込むことができる一方、H93P CAR-T群は、大多数のT細胞(0.065 M)を引き込むことができる。CCL-19又はCCL-21の産生のないH93 CAR-T群及びUnT群は、6時間を経っても少数のT細胞を遊走させ、それぞれ0.028 M及び0.025 Mであった。なお、それぞれCCL-19 ELISA(Abcam#ab100601)及びCCL-21 ELISA(Thermo#EHCCL21)によって上清におけるCCL-19及びCCL-21の濃度を測定した。該結果は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93M及びH93P CAR-T細胞からの上清がそれぞれCCL-19(2292.10±85.48pg/mL)及びCCL-21(3481.08±193.11pg/mL)を分泌したことを示唆し、H93M及びH93P CAR-T細胞の走化機能がさらに検証された。
8.8. 実施例8-外因的に導入されたp40及びCCL-21を発現するCAR-T細胞、並びに外因的に導入されたp40及びCCL-19を発現するCAR-T細胞の、インビボでの養子移入後の抗腫瘍効果
NCGマウス異種移植モデルにおいて、CAR-T細胞のインビボ抗腫瘍効果を評価した。皮下異種移植モデルについて、6~7週齢のNCGマウスの右前肢にHep3B細胞を皮下接種した(4.0×106個の細胞/マウス)。平均腫瘍体積が150mm3近くになった時(異種移植接種後5日目)に、マウスを8群にランダムに分け、それぞれH93 CAR-T細胞(0.3 M及び0.8 Mの投与量)、H93M CAR-T細胞(0.3 M及び0.8 Mの投与量)、H93P CAR-T細胞(0.3 M及び0.8 Mの投与量)、UnT(0.2 Mの投与量)、及び溶媒(ビヒクル)のみ、で尾静脈注射によって処置した。腫瘍サイズをデジタルノギスで週2回測定した。以下の式に基づいて腫瘍体積を計算した:
。養子移入後7、14、21及び28日目に、FACS染色抗ヒトCD3(Biolegend#300316)によってマウス血液におけるT細胞の数も検出した。
NCGマウス異種移植モデルにおいて、CAR-T細胞のインビボ抗腫瘍効果を評価した。皮下異種移植モデルについて、6~7週齢のNCGマウスの右前肢にHep3B細胞を皮下接種した(4.0×106個の細胞/マウス)。平均腫瘍体積が150mm3近くになった時(異種移植接種後5日目)に、マウスを8群にランダムに分け、それぞれH93 CAR-T細胞(0.3 M及び0.8 Mの投与量)、H93M CAR-T細胞(0.3 M及び0.8 Mの投与量)、H93P CAR-T細胞(0.3 M及び0.8 Mの投与量)、UnT(0.2 Mの投与量)、及び溶媒(ビヒクル)のみ、で尾静脈注射によって処置した。腫瘍サイズをデジタルノギスで週2回測定した。以下の式に基づいて腫瘍体積を計算した:
。養子移入後7、14、21及び28日目に、FACS染色抗ヒトCD3(Biolegend#300316)によってマウス血液におけるT細胞の数も検出した。
図17Aに示すように、UnT及びH93 CAR-T細胞群に比べて、H93M CAR-T細胞を養子移入したマウスの腫瘍サイズは、32日目にそれぞれ98.2%及び97.1%減少した(52.0mm3対2942.0mm3、1766.5mm3)ことを観察した。これ結果により、低い投与量(0.3 M/マウス)で、H93M CAR-T細胞はH93 CAR-T細胞よりも良好な治療可能性を有することが示唆された。22日目前、H93P CAR-T細胞処置群とH93M CAR-T細胞処置群は、似ている抗腫瘍治療効果を有し、且つ22日目に、腫瘍サイズがそれぞれ77.3%及び65.7%減少したが(368.3mm3対1620.8mm3、1072.7mm3)、続いて腫瘍サイズが増加したことが観察された。投与量が0.8 M/マウスに増加した場合、図17Bに示すように、H93 CAR-T細胞及びH93M CAR-T細胞は、いずれも腫瘍増殖に対して明らかな抑制効果を有し、32日目に増殖抑制率は100%であったが、H93P CAR-T細胞の投与には明らかな腫瘍体積抑制作用が認められなかった。しかしながら、H93P CAR-T群の異種移植組織は海綿状であることが観察され、他の群と異なり、腫瘍サイズが2000mm3を超えるため、26日目にマウスを安楽死させた。
8.9. 実施例9-p40及びCCL-19により武装化されたCARと、両方のうちの一つにより別々に武装化されたCARとの比較
8.9.1. NCGマウス異種移植モデルにおける、p40及びCCL-19により武装化されたCARと、両方のうちの一つにより別々に武装化されたCARとの比較
H93 CAR主鎖に基づき、H93IL12p40 CARベクター又はH93CCL19 CARベクターにおけるMCSは、ヒトIL12p40(SEQ ID NO:5)又はヒトCCL-19(SEQ ID NO:6)をコードする核酸配列を含む核酸配列の挿入を可能にし、該核酸配列は、2A自己切断ペプチド(例えば、SEQ ID NO:13に示すP2A断片)のC末端と融合され、CD3ζ細胞質シグナル伝達ドメインのC末端上流において、CD3ζ細胞質シグナル伝達ドメインのC末端に作動可能に連結された。
8.9.1. NCGマウス異種移植モデルにおける、p40及びCCL-19により武装化されたCARと、両方のうちの一つにより別々に武装化されたCARとの比較
H93 CAR主鎖に基づき、H93IL12p40 CARベクター又はH93CCL19 CARベクターにおけるMCSは、ヒトIL12p40(SEQ ID NO:5)又はヒトCCL-19(SEQ ID NO:6)をコードする核酸配列を含む核酸配列の挿入を可能にし、該核酸配列は、2A自己切断ペプチド(例えば、SEQ ID NO:13に示すP2A断片)のC末端と融合され、CD3ζ細胞質シグナル伝達ドメインのC末端上流において、CD3ζ細胞質シグナル伝達ドメインのC末端に作動可能に連結された。
H93M CAR-T細胞中の相乗的効果を明らかにするために、H93M CAR-T細胞、H93IL12p40 CAR-T細胞(IL12p40を分泌する)、H93CCL19 CAR-T細胞(CCL-19を分泌する)を調製し、NCGマウス異種移植モデルにおいて評価した。実施例8に開示されるように、6~7週齢のNCGマウスの右前肢にHep3B細胞を皮下接種した(4.0×106個の細胞/マウス)。平均腫瘍体積が150mm3近くになった時(異種移植接種後5日目)に、マウスを6群にランダムに分け、H93 CAR-T細胞(0.3 Mの投与量)、H93M CAR-T細胞(0.3 Mの投与量)、H93IL12p40 CAR-T細胞(0.3 Mの投与量)、H93CCL19 CAR-T細胞(0.3 Mの投与量)、UnT(3.5 Mの投与量、CAR-T群と同じ全T細胞の細胞数)、及び溶媒(ビヒクル)のみ、で尾静脈注射によって処置した。腫瘍サイズをデジタルノギスで週2回測定した。以下の式に基づいて腫瘍体積を計算した:腫瘍体積=((長さ)×(幅)2)/2。養子移入後7、14、21及び28日目に、FACS染色抗ヒトCD3(Biolegend#300316)によってマウス血液におけるT細胞の数を検出した。
図18Aに示すように、UnT群に比べて、H93M CAR-T細胞を養子移入したマウスの腫瘍サイズが92.0%減少した(150.3mm3対1878.2mm3)ことを26日目に観察し、H93IL12p40 CAR-T細胞及びH93CCL19 CAR-T細胞を養子移入したマウスの腫瘍サイズがそれぞれ72.9%及び11.7%減少した(508.7mm3対1878.2mm3及び1658.7mm3対1878.2mm3)ことを26日目に観察した。これらの結果により、H93M CAR-T細胞は、H93IL12p40 CAR-T細胞及びH93CCL19 CAR-T細胞よりも良好な治療可能性を有することが示唆された。
CD3+%のFACSを用いてマウス末梢血細胞におけるCAR-T細胞の増大を検出した。H93M CAR-T細胞は、21日目前に有意な増大を示し、且つ続いて減少した。H93IL12p40 CAR-T細胞は、最適以下の増殖能力を有し、且つH93CCL19 CAR-T細胞は、H93 CAR-T細胞と似ており、有意な増大を示さなかった(図18B)。具体的には、H93M群の21日目のCD3比率は40.2%であり、その後28日目に腫瘍体積が減少したため、CD3比率は29.8%まで低下した。H93IL12p40 CAR-T細胞群におけるCD3の比率は、21日目に26.1%であり、且つ28日目に38.5%に上昇した。H93CCL19 CAR-T細胞群は、H93 CAR-T細胞及びUnT群と似ており、有意な増大を示さなかった。
該実験中、UnT群のマウス体重が20%超減少した(図18C)以外、CAR-T群ではマウス体重の減少が観察されず、且つCAR-T細胞処置群の全てのマウスは、いずれも正常な外見を示した。
8.9.2. C57BL/6同系遺伝子モデルにおける、p40及びCCL-19により武装化されたCARと、両方のうちの一つにより別々に武装化されたCARとの比較
実施例1に開示される方法に従って、抗GPC3 scFv(SEQ ID NO:1)及びマウスCAR主鎖ポリペプチド(SEQ ID NO:28)を用いて、マウス抗GPC3 scFv CAR(即ち、musH93 CAR、SEQ ID NO:27)を発現するベクターを構築し、該ポリペプチドは、N末端からC末端の方向に、マウスCD8αヒンジドメインと、マウスCD8α膜貫通ドメインと、マウスCD137共刺激シグナル伝達ドメインと、マウスCD3ζ細胞質シグナル伝達ドメインとを含む。
実施例1に開示される方法に従って、抗GPC3 scFv(SEQ ID NO:1)及びマウスCAR主鎖ポリペプチド(SEQ ID NO:28)を用いて、マウス抗GPC3 scFv CAR(即ち、musH93 CAR、SEQ ID NO:27)を発現するベクターを構築し、該ポリペプチドは、N末端からC末端の方向に、マウスCD8αヒンジドメインと、マウスCD8α膜貫通ドメインと、マウスCD137共刺激シグナル伝達ドメインと、マウスCD3ζ細胞質シグナル伝達ドメインとを含む。
musH93 CAR主鎖に基づき、musH93M CARベクターにおけるMCSは、マウスIL12p40(SEQ ID NO:29)及びマウスCCL-19(SEQ ID NO:30)をコードする核酸配列を含む核酸配列の挿入を可能にし、該核酸配列は、別の2A自己切断ペプチド(例えば、SEQ ID NO:13に示すP2A断片)のC末端と融合される2A自己切断ペプチド(例えば、SEQ ID NO:14に示すT2Aペプチド)に連結することによって、CD3ζ細胞質シグナル伝達ドメインのC末端上流において、CD3ζ細胞質シグナル伝達ドメインのC末端に作動可能に連結される。P2Aペプチド及びマウスIL12p40-T2A-CCL-19ペプチドをコードする核酸配列を化学的に合成し、CloneEZ方法によってそれをpMSCV BBzBB CAR主鎖にクローニングした。得られたmusH93M CARは、SEQ ID NO:31のアミノ酸配列と、SEQ ID NO:32の核酸配列とを含む。同様に、それぞれマウスIL12p40及びマウスCCL-19を含むmusH93IL12p40 CAR(SEQ ID NO:33)及びmusH93CCL19 CAR(SEQ ID NO:34)をさらに構築した。
musH93M CAR-T細胞中の相乗的効果をより明らかにするために、musH93M CAR-T細胞、musH93IL12p40 CAR-T細胞、musH93CCL19 CAR-T細胞及びmusH93 CAR-T細胞を調製し、C57BL/6同系遺伝子モデルにおいて評価した。皮下異種移植モデルについて、6~7週齢のC57BL/6マウスの右前肢にLL/2-hGPC3細胞(hGPC3を過剰発現するLL/2細胞)を皮下接種した(1.0×106個の細胞/マウス)。平均腫瘍体積が100mm3近くになった時(異種移植接種後9日目)に、マウスを5群にランダムに分け、それぞれmusH93 CAR-T細胞(10 Mの投与量)、musH93M CAR-T細胞(6 Mの投与量)、musH93IL12p40 CAR-T細胞(6 Mの投与量)、musH93CCL19 CAR-T細胞(6 Mの投与量)、UnT(24.1 Mの投与量、CAR-T群と同じ全T細胞の細胞数)で尾静脈注射によって処置した。腫瘍サイズをデジタルノギスで週2回測定した。以下の式に基づいて腫瘍体積を計算した:腫瘍体積=((長さ)×(幅)2)/2。それぞれ養子移入後1、7、14、21及び28日目に、FACS染色抗マウスCD3(Biolegend#100236)及びCAR陽性率(Genscript#CP0001)によって末梢血におけるCAR-T細胞の増大を検出した。
図19A及び19Dに示すように、腫瘍体積が大きい(>3000mm3)ため、ネイキッドのmusH93 CAR-T群及びUnT群の全てのマウスは19日目前に屠殺された。29日目に、musH93M CAR-T細胞を養子移入したマウスは、ほぼ無腫瘍であった(91.5mm3)。15日目に、musH93CCL19 CAR-T細胞を養子移入したマウスの腫瘍サイズが明らかに減少したが(437.2mm3)、続いて腫瘍が再発したことを観察した。注意すべきことは、musH93IL12p40 CAR-T細胞を養子移入したマウスは、実験全体を通じて有意な治療効果を示さなかったことである。これらの結果により、musH93M CAR-T細胞は、musH93IL12p40 CAR-T細胞及びmusH93CCL19 CAR-T細胞よりも良好な治療可能性を有することが示唆され、これは上記NCGマウス異種移植モデルにおける結果と一致した。
FACSを用いてマウス末梢血細胞におけるCAR-T細胞の増大を検出した。MusH93M CAR-T細胞は、28日目前に有意な増大を示した一方、musH93CCL19 CAR-T細胞は、明らかな増殖能力を示さず、且つmusH93IL12p40 CAR-T細胞は、増大が無視できるmusH93 CAR-T細胞と似ていた(図19B)。具体的には、musH93M CAR-T細胞群におけるCD3及びCAR陽性率は、21日目に17.0%であり、且つ28日目に21.9%まで増加した。MusH93CCL19 CAR-T細胞群は、21日目に6.9%であり、且つ28日目に8.7%まで上昇した。
該実験中、CAR-T群ではマウス体重の減少が観察されず(図19C)、且つCAR-T細胞処置群の全てのマウスは、いずれも正常な外見を示した。
8.10. 実施例10-胃がんモデルにおける、p40及びCCL-19により武装化されたCARの検証
8.10.1. 外因的に導入されたp40及びCCL-19を発現する261M CAR-T細胞の調製
実施例1に開示される方法に従って、PCT特許出願番号PCT/CN2020/139143に開示される抗クローディン18.2 VHH CAR(即ち、261 CAR、SEQ ID NO:41)を構築し、それは、抗クローディン18.2 VHHドメイン(SEQ ID NO:40)とCAR主鎖ポリペプチドとを含み、該主鎖ポリペプチドは、N末端からC末端の方向に、CD8αヒンジドメイン(SEQ ID NO:8)と、CD8α膜貫通ドメイン(SEQ ID NO:9)と、CD137共刺激シグナル伝達ドメイン(SEQ ID NO:10)と、CD3ζ細胞質シグナル伝達ドメイン(SEQ ID NO:11)とを含む。さらに、261M CAR(SEQ ID NO:42)の構造を構築し、それは、H93M CARと同じであり、IL12p40-T2A-CCL-19を含む。
8.10.1. 外因的に導入されたp40及びCCL-19を発現する261M CAR-T細胞の調製
実施例1に開示される方法に従って、PCT特許出願番号PCT/CN2020/139143に開示される抗クローディン18.2 VHH CAR(即ち、261 CAR、SEQ ID NO:41)を構築し、それは、抗クローディン18.2 VHHドメイン(SEQ ID NO:40)とCAR主鎖ポリペプチドとを含み、該主鎖ポリペプチドは、N末端からC末端の方向に、CD8αヒンジドメイン(SEQ ID NO:8)と、CD8α膜貫通ドメイン(SEQ ID NO:9)と、CD137共刺激シグナル伝達ドメイン(SEQ ID NO:10)と、CD3ζ細胞質シグナル伝達ドメイン(SEQ ID NO:11)とを含む。さらに、261M CAR(SEQ ID NO:42)の構造を構築し、それは、H93M CARと同じであり、IL12p40-T2A-CCL-19を含む。
実施例1に記述される方法を用いて、261 CAR-T細胞及び261M CAR-T細胞(IL12p40及びCCL-19を分泌する)を調製した。5日目に、形質導入した後、ネイキッドの261 CAR-T細胞及び武装化261M CAR-T細胞のCAR陽性率はそれぞれ50.7%及び23.0%であった。
8.10.2. IL-23及びCCL-19発現
261M CARの構造を検証するために、CAR-T細胞をクローディン18.2陽性細胞株-NUGC4と一晩共培養し、IL-23及びCCL-19の分泌状況を分析した。簡単に言うと、CAR-T細胞及びNUGC4細胞を6ウェルプレートにおいてE/T=1:1で共培養し、且つ一晩経った後に上清を得た。メーカーのレジメンに従って、ヒトIL-23キット(CISBIO#62HIL23PEG)及びCCL-19 ELISAキット(Abcam#ab100601)を用いてIL-23及びCCL-19の量を測定した。図20A及び20Bに示すように、261M CAR-T細胞のみは、高レベルのIL-23(3703.3pg/mL)及びCCL-19(265.1pg/mL)分泌を有する。
261M CARの構造を検証するために、CAR-T細胞をクローディン18.2陽性細胞株-NUGC4と一晩共培養し、IL-23及びCCL-19の分泌状況を分析した。簡単に言うと、CAR-T細胞及びNUGC4細胞を6ウェルプレートにおいてE/T=1:1で共培養し、且つ一晩経った後に上清を得た。メーカーのレジメンに従って、ヒトIL-23キット(CISBIO#62HIL23PEG)及びCCL-19 ELISAキット(Abcam#ab100601)を用いてIL-23及びCCL-19の量を測定した。図20A及び20Bに示すように、261M CAR-T細胞のみは、高レベルのIL-23(3703.3pg/mL)及びCCL-19(265.1pg/mL)分泌を有する。
8.10.3. 外因的に導入されたp40及びCCL-19を発現する261M CAR-T細胞のインビトロ反復チャレンジアッセイ
上記の実施例2に記載されるように、CAR-T細胞反復チャレンジモデルを確立した。CLDN18.2陽性細胞株NUGC4細胞を標的細胞として使用した。再チャレンジの初回ラウンド(ラウンド1)については、6ウェルプレートにおいて、CAR-T細胞と腫瘍細胞を1:1のE/T比で共培養した。一晩経った後、ウェル中のCAR-T細胞を穏やかに回収し、遠心分離し、新鮮なCAR-T培地(RPMI-1640+300 IU/mL IL-2)に再懸濁させた。そしてCAR-T細胞を新しいプレートに加えてさらに2日間培養した。そして、ウェル中のCAR-T細胞を回収し、新鮮な培地に再び再懸濁させ、新鮮な腫瘍細胞を播種した新しいプレートに加えた(ラウンド2)。CAR-T細胞は、合計5ラウンド刺激された。各ラウンドにおいて、T細胞の数及び生存率をカウントした。再チャレンジアッセイには、261 CAR-T群(初期CAR-T細胞は262 CAR-T細胞であった)、261M CAR-T群(初期CAR-T細胞は261M CAR-T細胞であった)及びUnT(初期T細胞はCARで形質導入されていないT細胞であった)の三つの処理群があった。再チャレンジアッセイにおいてIL12p40発現を有するCAR-T細胞の増大機能の利点を決定するために、各ラウンドの終了時にT細胞の数を記録し、増大倍率を計算した。図21Bに示すように、261 CAR-T群(ラウンド5の時点で6.7倍)及びUnT群(ラウンド5の時点で5.1倍)に比べて、NUGC4細胞で繰り返して刺激すると、261M CAR-T群細胞(ラウンド5の時点で46.6倍)は有意に増大した。261M CAR-T細胞の細胞生存率(ラウンド5の時点で68.7%)は、ネイキッドの261 CAR-T細胞(ラウンド5の時点で41.7%)及びUnT細胞(ラウンド5の時点で38.8%)より高かった(図21C)。従来の培養条件(10% 1640+300 IU IL-2)での三つの群の似ているT細胞増大及び生存率に比べて、261M CAR-T細胞(ラウンド5の時点で46.6倍)は、NUGC4細胞により複数回チャレンジされた後に、抗原依存的増大を示した(図21A及び21B)。
上記の実施例2に記載されるように、CAR-T細胞反復チャレンジモデルを確立した。CLDN18.2陽性細胞株NUGC4細胞を標的細胞として使用した。再チャレンジの初回ラウンド(ラウンド1)については、6ウェルプレートにおいて、CAR-T細胞と腫瘍細胞を1:1のE/T比で共培養した。一晩経った後、ウェル中のCAR-T細胞を穏やかに回収し、遠心分離し、新鮮なCAR-T培地(RPMI-1640+300 IU/mL IL-2)に再懸濁させた。そしてCAR-T細胞を新しいプレートに加えてさらに2日間培養した。そして、ウェル中のCAR-T細胞を回収し、新鮮な培地に再び再懸濁させ、新鮮な腫瘍細胞を播種した新しいプレートに加えた(ラウンド2)。CAR-T細胞は、合計5ラウンド刺激された。各ラウンドにおいて、T細胞の数及び生存率をカウントした。再チャレンジアッセイには、261 CAR-T群(初期CAR-T細胞は262 CAR-T細胞であった)、261M CAR-T群(初期CAR-T細胞は261M CAR-T細胞であった)及びUnT(初期T細胞はCARで形質導入されていないT細胞であった)の三つの処理群があった。再チャレンジアッセイにおいてIL12p40発現を有するCAR-T細胞の増大機能の利点を決定するために、各ラウンドの終了時にT細胞の数を記録し、増大倍率を計算した。図21Bに示すように、261 CAR-T群(ラウンド5の時点で6.7倍)及びUnT群(ラウンド5の時点で5.1倍)に比べて、NUGC4細胞で繰り返して刺激すると、261M CAR-T群細胞(ラウンド5の時点で46.6倍)は有意に増大した。261M CAR-T細胞の細胞生存率(ラウンド5の時点で68.7%)は、ネイキッドの261 CAR-T細胞(ラウンド5の時点で41.7%)及びUnT細胞(ラウンド5の時点で38.8%)より高かった(図21C)。従来の培養条件(10% 1640+300 IU IL-2)での三つの群の似ているT細胞増大及び生存率に比べて、261M CAR-T細胞(ラウンド5の時点で46.6倍)は、NUGC4細胞により複数回チャレンジされた後に、抗原依存的増大を示した(図21A及び21B)。
8.10.4. 胃がんモデルにおける、外因的に導入されたp40及びCCL-19を発現するCAR-T細胞の、養子移入後の抗腫瘍効果
胃がんモデルにおいて、外因的に導入されたp40及びCCL-19を発現する261M CAR-T細胞の、養子移入後の治療効果を評価した。261M CAR-T細胞及びネイキッドの261 CAR-T細胞を調製し、NUGC4異種移植モデルにおいて評価した。皮下異種移植モデルについて、6~7週齢のNCGマウスの右前肢にNUGC4細胞を皮下接種した(3.0×106個の細胞/マウス)。平均腫瘍体積が100mm3近くになった時(異種移植接種後14日目)に、マウスを3群にランダムに分け、それぞれ261 CAR-T細胞(0.5 Mの投与量)、261M CAR-T細胞(0.5 Mの投与量)及びUnT細胞(1.9 Mの投与量)で尾静脈注射によって処置した。腫瘍サイズをデジタルノギスで週2回測定した。以下の式に基づいて腫瘍体積を計算した:
。
胃がんモデルにおいて、外因的に導入されたp40及びCCL-19を発現する261M CAR-T細胞の、養子移入後の治療効果を評価した。261M CAR-T細胞及びネイキッドの261 CAR-T細胞を調製し、NUGC4異種移植モデルにおいて評価した。皮下異種移植モデルについて、6~7週齢のNCGマウスの右前肢にNUGC4細胞を皮下接種した(3.0×106個の細胞/マウス)。平均腫瘍体積が100mm3近くになった時(異種移植接種後14日目)に、マウスを3群にランダムに分け、それぞれ261 CAR-T細胞(0.5 Mの投与量)、261M CAR-T細胞(0.5 Mの投与量)及びUnT細胞(1.9 Mの投与量)で尾静脈注射によって処置した。腫瘍サイズをデジタルノギスで週2回測定した。以下の式に基づいて腫瘍体積を計算した:
。
図22A及び22Bに示すように、UnT及び261 CAR-T細胞群に比べて、261M CAR-T細胞を養子移入したマウスの腫瘍サイズがそれぞれ59.0%及び52.9%減少した(609.0mm3対1484.8mm3、1291.8mm3)ことを29日目に観察し、261M CAR-T細胞は、低い投与量(0.5 M/マウス)でネイキッドの261CAR-T細胞よりも良好な治療可能性を有することが示唆された。
FACSを用いてマウス末梢血細胞におけるCAR-T細胞の増大を検出した。0.5 Mの投与量で、261M CAR-T細胞は、5日目後に有意な増大を示し、CD3陽性T細胞の比率は、21日目に最高(7.1%)に達し、続いて28日目に低下した(5.3%)が、処置期間にわたって、ネイキッドのmus261 CAR-T細胞及びUnTで処置されたマウスは有意な増大を示さなかった(図22C)。これらのデータは、外因的に導入されたp40及びCCL-19を発現する261M CAR-T細胞が、インビボで優れた増大能力及びより良好な治療可能性を有することを示唆し(図22A及び22C)、これはGPC3マウスモデルにおける結果と一致した。
該実験中、全ての三つの群では、マウス体重の減少が観察されず(図22D)、且つ各処置群のマウスは、いずれも正常な外見を示した。
8.11. 実施例11-外因的に導入されたp40及びCCL-19を発現するCAR-T細胞、並びに外因的に導入されIL-7及びCCL-19を発現するCAR-T細胞の、インビボでの養子移入後の抗腫瘍効果
実施例1に開示される方法に従って、抗クローディン18.2 VHHドメイン(SEQ ID NO:40)及びマウスCAR主鎖ポリペプチド(SEQ ID NO:31)を用いて、マウス抗クローディン18.2 VHH CAR(即ち、mus261 CAR、SEQ ID NO:35)を構築し、該ポリペプチドは、N末端からC末端の方向に、マウスCD8αヒンジドメインと、マウスCD8α膜貫通ドメインと、マウスCD137共刺激シグナル伝達ドメインと、マウスCD3ζ細胞質シグナル伝達ドメインとを含む。
実施例1に開示される方法に従って、抗クローディン18.2 VHHドメイン(SEQ ID NO:40)及びマウスCAR主鎖ポリペプチド(SEQ ID NO:31)を用いて、マウス抗クローディン18.2 VHH CAR(即ち、mus261 CAR、SEQ ID NO:35)を構築し、該ポリペプチドは、N末端からC末端の方向に、マウスCD8αヒンジドメインと、マウスCD8α膜貫通ドメインと、マウスCD137共刺激シグナル伝達ドメインと、マウスCD3ζ細胞質シグナル伝達ドメインとを含む。
mus261 CAR主鎖に基づき、mus261M CARベクターにおけるMCSは、マウスIL12p40(SEQ ID NO:29)及びマウスCCL-19(SEQ ID NO:30)をコードする核酸配列を含む核酸配列の挿入を可能にし、該核酸配列は、別の2A自己切断ペプチド(例えば、SEQ ID NO:13に示すP2A断片)のC末端と融合される2A自己切断ペプチド(例えば、SEQ ID NO:14に示すT2Aペプチド)に連結することによって、CD3ζ細胞質シグナル伝達ドメインのC末端上流において、CD3ζ細胞質シグナル伝達ドメインのC末端に作動可能に連結された。P2Aペプチド及びマウスIL12p40-T2A-マウス CCL-19ペプチドをコードする核酸配列を化学的に合成し、クローニングEZ方法によってそれをpMSCV-BBzBB CAR主鎖にクローニングした。得られたmus261M CARは、SEQ ID NO:44のアミノ酸配列と、SEQ ID NO:45の核酸配列とを含む。同様に、F2Aペプチド及びマウスIL7-F2A-マウスCCL19ペプチド(SEQ ID NO:36)をコードする核酸配列を化学的に合成し、クローニングEZ方法によってそれをpMSCV-BBzBB CAR主鎖にクローニングしてmus261-719 CARを形成した。
同系遺伝子胃がんモデルにおいて、外因的に導入されIL12p40及びCCL-19を発現するmus261M CAR-T細胞、及び外因的に導入されIL-7及びCCL-19を発現するmus261-719 CAR-T細胞の、養子移入後の治療効果を評価した。Mus261M CAR-T細胞及びmus261-719 CAR-T細胞を調製し、C57BL/6同系遺伝子異種移植モデルにおいて評価した。皮下異種移植モデルについて、6~7週齢のC57BL/6マウスの右前肢にLL/2-hCLDN18.2細胞(ヒトクローディン18.2を過剰発現するLL/2細胞)を皮下接種した(1.0×106個の細胞/マウス)。平均腫瘍体積が100mm3近くになった時(異種移植接種後9日目)に、マウスを4群にランダムに分け、それぞれmus261 CAR-T細胞(10 Mの投与量)、mus261M CAR-T細胞(10 Mの投与量)、mus261-719 CAR-T細胞(10 Mの投与量)、及び溶媒(ビヒクル)のみ、で尾静脈注射によって処置した。マウスが治療を受ける前日から、腫瘍サイズをデジタルノギスで週2回測定した。以下の式に基づいて腫瘍体積を計算した:腫瘍体積=((長さ)×(幅)2)/2。
図23Aに示すように、ビヒクル及びmus261 CAR-T細胞群に比べて、mus261M CAR-T細胞を養子移入したマウスは無腫瘍であり、且つ42日目まで持続的な効果を有した。14日目に、ビヒクル群に比べてMus261-719 CAR-T細胞処置群が腫瘍増殖に対して明らかな抑制効果(191.9mm3対914.8mm3)を有することを観察し、増殖抑制率は79.0%であったが、続いて腫瘍サイズが増加し、且つ腫瘍が21日目に壊れ、痂皮ができたため全てのマウスを屠殺した。この結果により、mus261M CAR-T細胞(musIL12p40及びmusCCL-19を分泌する)は、mus261-719 CAR-T細胞(musIL7及びmusCCL-19を分泌する)よりも良好な治療可能性を有することが示唆された。
該実験中、CAR-T群では、マウス体重の減少が観察されなかった(図23B)。
8.12. 実施例12-膜結合性IL12p40及びCCL-19を発現するCAR-T細胞の調製及び特徴づけ
IL12p40及びCCL-19武装化CAR-T細胞の機能をさらに改善するために、例示的膜結合形態のIL12p40(MB12)を構築した。H93 CAR主鎖に基づき、H93M-MB12 CARベクターにおけるMCSは、核酸配列の挿入を可能にし、該核酸配列は、膜結合性IL12p40(即ちMB12、SEQ ID NO:37)及びヒトCCL19(SEQ ID NO:6)をコードする核酸配列を含む。具体的には、ヒトIL12p40は、CD8αヒンジ、CD8α膜貫通ドメイン及びCD8α細胞内細胞質ドメインをコードする核酸配列を介して連結され、それによってIL12p40を細胞膜に繋ぎ留めることができる。MB12を2A自己切断ペプチド(例えば、SEQ ID NO:14に示されるT2A断片)のN末端に融合され、ヒトCCL-19下流にあり、ヒトCCL-19に作動可能に連結された。MB12及びCCL19をコードする核酸配列を化学的に合成し、HpaI(5’-GTTAAC-3’)(SEQ ID NO:17)及びMluI(5’-ACGCGT-3’)(SEQ ID NO:23)制限部位を介して、それをpLSINK-BBzBB CAR主鎖にクローニングした。得られたH93M-MB12 CARは、SEQ ID NO:38のアミノ酸配列と、SEQ ID NO:39の核酸配列とを含む。実施例1に開示されるプログラムに従って、H93M-MB12 CAR-T細胞を調製した。
IL12p40及びCCL-19武装化CAR-T細胞の機能をさらに改善するために、例示的膜結合形態のIL12p40(MB12)を構築した。H93 CAR主鎖に基づき、H93M-MB12 CARベクターにおけるMCSは、核酸配列の挿入を可能にし、該核酸配列は、膜結合性IL12p40(即ちMB12、SEQ ID NO:37)及びヒトCCL19(SEQ ID NO:6)をコードする核酸配列を含む。具体的には、ヒトIL12p40は、CD8αヒンジ、CD8α膜貫通ドメイン及びCD8α細胞内細胞質ドメインをコードする核酸配列を介して連結され、それによってIL12p40を細胞膜に繋ぎ留めることができる。MB12を2A自己切断ペプチド(例えば、SEQ ID NO:14に示されるT2A断片)のN末端に融合され、ヒトCCL-19下流にあり、ヒトCCL-19に作動可能に連結された。MB12及びCCL19をコードする核酸配列を化学的に合成し、HpaI(5’-GTTAAC-3’)(SEQ ID NO:17)及びMluI(5’-ACGCGT-3’)(SEQ ID NO:23)制限部位を介して、それをpLSINK-BBzBB CAR主鎖にクローニングした。得られたH93M-MB12 CARは、SEQ ID NO:38のアミノ酸配列と、SEQ ID NO:39の核酸配列とを含む。実施例1に開示されるプログラムに従って、H93M-MB12 CAR-T細胞を調製した。
8.12.1. CAR-T細胞膜上でのIL12p40タンパク質の発現
膜結合戦略を検証するために、FACS染色抗ヒトIL12p40(Biolegend#501809)及びCAR陽性率(Genscript#CP0001)によって膜上でのIL12p40タンパク質の発現を検出した。図24Aに示すように、ネイキッドのH93 CAR-T細胞、H93M CAR-T細胞及びH93M-MB12 CAR-T細胞のCAR陽性率は、それぞれ61.58%、50.74%及び33.97%であった。図24Bに示すように、H93M-MB12 CAR-T細胞のIL12p40タンパク質の膜上での発現はほぼ100%であり、これは、最初の膜結合戦略の実現可能性を示した。
膜結合戦略を検証するために、FACS染色抗ヒトIL12p40(Biolegend#501809)及びCAR陽性率(Genscript#CP0001)によって膜上でのIL12p40タンパク質の発現を検出した。図24Aに示すように、ネイキッドのH93 CAR-T細胞、H93M CAR-T細胞及びH93M-MB12 CAR-T細胞のCAR陽性率は、それぞれ61.58%、50.74%及び33.97%であった。図24Bに示すように、H93M-MB12 CAR-T細胞のIL12p40タンパク質の膜上での発現はほぼ100%であり、これは、最初の膜結合戦略の実現可能性を示した。
8.12.2. IL12p40、IL-23、CCL-19及びIL-12タンパク質の分泌
膜結合戦略の実現可能性をさらに検証するために、IL12p40及びIL-23の分泌を分析した。簡単に言うと、抗CD3/CD28と共培養された細胞(RPMI-1640+300 IU/mL IL-2+抗CD3/CD28)を、6ウェルプレートにおいて、1×106個の細胞/mLで培養し、一晩経った後に上清を回収した。メーカーのレジメンに従って、ヒトIL12p40キット(Invitrogen#4215608)、IL-23キット(Cisbio#62HIL23PEG)及びCCL-19キット(Abcam#ab100601)を用いて、IL12p40、IL-23及びCCL-19の量を測定した。図25A及び図25Bに示すように、IL12p40を分泌するH93M CAR-T細胞は、抗CD3/CD28と共培養された後、H93 CAR-T細胞に比べて、IL12p40(17288.6pg/mL対41.1pg/mL)及びIL23(1775.1pg/mL対0pg/mL)分泌が高い一方、H93M-MB12 CAR-T細胞でのIL12p40分泌(267.7pg/mL)が有意に減少し、且つ抗CD3/CD28と共培養された後に明らかなIL23分泌がなかった。なお、H93M CAR-T細胞及びH93M-MB12 CAR-T細胞は、同じレベルのCCL-19分泌を有した(図25C)。データにより、MB12の膜結合性IL12p40構造は実現可能であることが示唆された。図25Dに示すように、抗CD3/CD28と共培養された後、全ての試験細胞には明らかなIL-12分泌がなく、これは、H93M CAR-T細胞がIL12p40を分泌するが、IL-12ではなくIL-23のみを産生することが示唆された。
膜結合戦略の実現可能性をさらに検証するために、IL12p40及びIL-23の分泌を分析した。簡単に言うと、抗CD3/CD28と共培養された細胞(RPMI-1640+300 IU/mL IL-2+抗CD3/CD28)を、6ウェルプレートにおいて、1×106個の細胞/mLで培養し、一晩経った後に上清を回収した。メーカーのレジメンに従って、ヒトIL12p40キット(Invitrogen#4215608)、IL-23キット(Cisbio#62HIL23PEG)及びCCL-19キット(Abcam#ab100601)を用いて、IL12p40、IL-23及びCCL-19の量を測定した。図25A及び図25Bに示すように、IL12p40を分泌するH93M CAR-T細胞は、抗CD3/CD28と共培養された後、H93 CAR-T細胞に比べて、IL12p40(17288.6pg/mL対41.1pg/mL)及びIL23(1775.1pg/mL対0pg/mL)分泌が高い一方、H93M-MB12 CAR-T細胞でのIL12p40分泌(267.7pg/mL)が有意に減少し、且つ抗CD3/CD28と共培養された後に明らかなIL23分泌がなかった。なお、H93M CAR-T細胞及びH93M-MB12 CAR-T細胞は、同じレベルのCCL-19分泌を有した(図25C)。データにより、MB12の膜結合性IL12p40構造は実現可能であることが示唆された。図25Dに示すように、抗CD3/CD28と共培養された後、全ての試験細胞には明らかなIL-12分泌がなく、これは、H93M CAR-T細胞がIL12p40を分泌するが、IL-12ではなくIL-23のみを産生することが示唆された。
8.12.3 IL12p40膜結合CAR-T細胞についての細胞遊走アッセイ
H93M-MB12 CAR-T細胞及びH93M CAR-T細胞におけるCCL-19の走化機能を評価するために、細胞遊走アッセイを行った。96ウェルtranswellチャンバ(Corning)における5-μm孔径のポリカーボネートフィルタを通した遊走によってレスポンダーT細胞の走化性を測定した。GPC3陽性ヒトHCC細胞株PLC/PRF/5細胞でCAR-T細胞及びUnT細胞を刺激し、24時間後に共培養上清を回収した。そして、125μLの上清を下側チャンバに入れ、75μLの処理されていないT細胞(0.075 M)を上側チャンバでインキュベートした。2、4及び6時間後、上側チャンバから下側チャンバに遊走したT細胞を血球計数チャンバによってカウントした。細胞遊走アッセイには、H93 CAR-T群(下側チャンバにおける上清は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93 CAR-T細胞からのものであった)、H93M CAR-T群(下側チャンバにおける上清は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93M CAR-T細胞からのものであった)、H93M-MB12 CAR-T群(下側チャンバにおける上清は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93M-MB12 CAR-T細胞からのものであった)及びUnT群(下側チャンバにおける上清は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたUnT細胞であった)の四つの処理群があった。
H93M-MB12 CAR-T細胞及びH93M CAR-T細胞におけるCCL-19の走化機能を評価するために、細胞遊走アッセイを行った。96ウェルtranswellチャンバ(Corning)における5-μm孔径のポリカーボネートフィルタを通した遊走によってレスポンダーT細胞の走化性を測定した。GPC3陽性ヒトHCC細胞株PLC/PRF/5細胞でCAR-T細胞及びUnT細胞を刺激し、24時間後に共培養上清を回収した。そして、125μLの上清を下側チャンバに入れ、75μLの処理されていないT細胞(0.075 M)を上側チャンバでインキュベートした。2、4及び6時間後、上側チャンバから下側チャンバに遊走したT細胞を血球計数チャンバによってカウントした。細胞遊走アッセイには、H93 CAR-T群(下側チャンバにおける上清は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93 CAR-T細胞からのものであった)、H93M CAR-T群(下側チャンバにおける上清は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93M CAR-T細胞からのものであった)、H93M-MB12 CAR-T群(下側チャンバにおける上清は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93M-MB12 CAR-T細胞からのものであった)及びUnT群(下側チャンバにおける上清は、PLC/PRF/5細胞と共培養されたUnT細胞であった)の四つの処理群があった。
図26Aに示すように、4h及び6hの時点で、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93 CAR-T細胞及びPLC/PRF/5細胞と共培養されたUnT細胞の上清に比べて、PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93M CAR-T細胞及びH93M-MB12 CAR-T細胞の上清には、より多くのT細胞が引き込まれた。具体的には、H93M CAR-T及びH93M-MB12 CAR-T群は、6時間(0.077 M及び0.075 M)の時点で上側チャンバの全てのT細胞を完全に引き込むことができる一方、CCL-19産生のないH93 CAR-T群及びUnT群は、6時間を経っても少数のT細胞を遊走させ、それぞれ0.051 M及び0.048 Mであった。なお、CCL-19 ELISA(Abcam#ab100601)によって共培養上清におけるCCL-19の濃度を測定した。PLC/PRF/5細胞と共培養されたH93M-MB12 CAR-T細胞及びH93M CAR-T細胞からの上清におけるCCL-19の濃度は、それぞれ1389.1pg/mL及び1804.7pg/mL(p<0.005)であった(図26B)。この結果により、H93M-MB12 CAR-T細胞は、インビトロでH93M CAR-T細胞と同じ走化機能を有することが示唆された。
8.12.4. IL12p40膜結合CAR-T細胞についての再チャレンジアッセイ
上記の実施例2に記載されるように、反復チャレンジモデルを確立した。GPC3陽性細胞株-Hep3B細胞を標的細胞として使用した。再チャレンジの初回ラウンド(ラウンド1)については、6ウェルプレートにおいて、CAR-T細胞と腫瘍細胞を2:1のE/T比で共培養した。一晩経った後、ウェル中のCAR-T細胞を穏やかに回収し、遠心分離し、新鮮なCAR-T培地(RPMI-1640+300 IU/mL IL-2)に再懸濁させた。そしてCAR-T細胞を新しいプレートに加えてさらに2日間培養した。そして、ウェル中のCAR-T細胞を回収し、新鮮な培地に再び再懸濁させ、新鮮な腫瘍細胞を播種した新しいプレートに加えた(ラウンド2)。CAR-T細胞は、合計5ラウンド刺激された。ラウンドにおいてT細胞をカウントし、各刺激後に一晩経ってサイトカインを検出した。再チャレンジアッセイには、H93 CAR-T群(初期CAR-T細胞はH93 CAR-T細胞であった)、H93M CAR-T群(初期CAR-T細胞はH93M CAR-T細胞であった)、H93M-MB12 CAR-T群(初期CAR-T細胞はH93M-MB12 CAR-T細胞であった)及びUnT群(初期T細胞はCARで形質導入されていないT細胞であった)の四つの処理群があった。
上記の実施例2に記載されるように、反復チャレンジモデルを確立した。GPC3陽性細胞株-Hep3B細胞を標的細胞として使用した。再チャレンジの初回ラウンド(ラウンド1)については、6ウェルプレートにおいて、CAR-T細胞と腫瘍細胞を2:1のE/T比で共培養した。一晩経った後、ウェル中のCAR-T細胞を穏やかに回収し、遠心分離し、新鮮なCAR-T培地(RPMI-1640+300 IU/mL IL-2)に再懸濁させた。そしてCAR-T細胞を新しいプレートに加えてさらに2日間培養した。そして、ウェル中のCAR-T細胞を回収し、新鮮な培地に再び再懸濁させ、新鮮な腫瘍細胞を播種した新しいプレートに加えた(ラウンド2)。CAR-T細胞は、合計5ラウンド刺激された。ラウンドにおいてT細胞をカウントし、各刺激後に一晩経ってサイトカインを検出した。再チャレンジアッセイには、H93 CAR-T群(初期CAR-T細胞はH93 CAR-T細胞であった)、H93M CAR-T群(初期CAR-T細胞はH93M CAR-T細胞であった)、H93M-MB12 CAR-T群(初期CAR-T細胞はH93M-MB12 CAR-T細胞であった)及びUnT群(初期T細胞はCARで形質導入されていないT細胞であった)の四つの処理群があった。
8.12.4.1. T細胞の増大
再チャレンジアッセイにおいて膜結合性IL12p40発現を有するCAR-T細胞の増大機能の利点を決定するために、各ラウンドの終了時にT細胞の数を記録し、増大倍率を計算した。図27Bに示すように、H93M CAR-T群(ラウンド5の時点で708.1倍)及びH93 CAR-T群(ラウンド5の時点で115.1倍)に比べて、Hep3B細胞で繰り返して刺激すると、H93M-MB12 CAR-T群は有意に増大し(ラウンド5の時点で1155.7倍)、これは、IL12p40膜結合性CAR-T細胞が、依然としてCAR-T細胞の増大機能の利点を有することを示唆した。しかしながら、抗原刺激のない従来の培養条件で、IL12p40膜結合性CAR-T細胞は、IL23の抗原依存性発現に起因して、より良好な増大優位性を示さなかった(図27A)。
再チャレンジアッセイにおいて膜結合性IL12p40発現を有するCAR-T細胞の増大機能の利点を決定するために、各ラウンドの終了時にT細胞の数を記録し、増大倍率を計算した。図27Bに示すように、H93M CAR-T群(ラウンド5の時点で708.1倍)及びH93 CAR-T群(ラウンド5の時点で115.1倍)に比べて、Hep3B細胞で繰り返して刺激すると、H93M-MB12 CAR-T群は有意に増大し(ラウンド5の時点で1155.7倍)、これは、IL12p40膜結合性CAR-T細胞が、依然としてCAR-T細胞の増大機能の利点を有することを示唆した。しかしながら、抗原刺激のない従来の培養条件で、IL12p40膜結合性CAR-T細胞は、IL23の抗原依存性発現に起因して、より良好な増大優位性を示さなかった(図27A)。
各ラウンドの後に、H93M-MB12 CAR-T細胞及びH93M CAR-T細胞のCAR陽性率を計算した。図27Cに示すように、H93M-MB12 CAR-T細胞のCAR陽性率は、刺激ラウンド数の増加に伴ってH93M CAR-T細胞よりも速く増加し(ラウンド4後に89.0%対81.0%)、ネイキッドのH93 CAR-T細胞のCAR陽性率は遅く増加した(ラウンド4後に48.5%であった)。
8.12.4.2. サイトカインTNF-α及びIFN-γの分泌
再チャレンジアッセイでのH93 CAR-T細胞との比較におけるH93M-M12 CAR-T細胞のGPC3陽性腫瘍細胞に対する持続的な細胞傷害活性をさらに検証するために、CAR-T細胞を2:1のE/T比でHep3B細胞と一晩経って共培養した後、ELISAによってTNF-α及びIFN-γの産生を分析した。結果により、H93 CAR-T群又はさらにH93M CAR-T群に比べて、H93M-M12 CAR-T群は、全てのラウンドにおいてTNF-α及びIFN-γを産生する能力が有意に向上したことが示唆された。図28A及び28Bに示すように、ラウンド3~ラウンド5の後に、H93M-MB12 CAR-T群の細胞が分泌したTNF-α及びIFN-γの濃度は、他の群より高く、5939.4~13287.2pg/mL(TNF-α)及び52842.5~56072.5pg/mL(IFN-γ)範囲内にあった。H93M CAR-T細胞も高い産生レベルを有し、3134.2~7343.9pg/mL(TNF-α)及び46799.6~53462.7pg/mL(IFN-γ)の範囲内にある一方、H93 CAR-T群細胞が分泌したTNF-α及びIFN-γの濃度は、ラウンド1~ラウンド5の後に徐々に低下し、5823.0~2065.3pg/mL(TNF-α)及び51265.5~21996.2pg/mL(IFN-γ)の範囲内にあった。
再チャレンジアッセイでのH93 CAR-T細胞との比較におけるH93M-M12 CAR-T細胞のGPC3陽性腫瘍細胞に対する持続的な細胞傷害活性をさらに検証するために、CAR-T細胞を2:1のE/T比でHep3B細胞と一晩経って共培養した後、ELISAによってTNF-α及びIFN-γの産生を分析した。結果により、H93 CAR-T群又はさらにH93M CAR-T群に比べて、H93M-M12 CAR-T群は、全てのラウンドにおいてTNF-α及びIFN-γを産生する能力が有意に向上したことが示唆された。図28A及び28Bに示すように、ラウンド3~ラウンド5の後に、H93M-MB12 CAR-T群の細胞が分泌したTNF-α及びIFN-γの濃度は、他の群より高く、5939.4~13287.2pg/mL(TNF-α)及び52842.5~56072.5pg/mL(IFN-γ)範囲内にあった。H93M CAR-T細胞も高い産生レベルを有し、3134.2~7343.9pg/mL(TNF-α)及び46799.6~53462.7pg/mL(IFN-γ)の範囲内にある一方、H93 CAR-T群細胞が分泌したTNF-α及びIFN-γの濃度は、ラウンド1~ラウンド5の後に徐々に低下し、5823.0~2065.3pg/mL(TNF-α)及び51265.5~21996.2pg/mL(IFN-γ)の範囲内にあった。
本明細書に援用された全ての特許、開示された出願及び参照文献の教示は、いずれも全体として参照により本明細書に組込まれる。例示的な実施形態が特に示され、説明されたが、当業者であれば理解できるように、添付の特許請求の範囲に包含される実施形態の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細において様々な変更がなされ得る。
以上から理解されるように、本明細書では、例示の目的で具体的な実施形態が説明されているが、本明細書により提供された精神及び範囲から逸脱することなく、様々な修正がなされてもよい。以上で言及された全ての参考文献は、全体として参照により本明細書に組込まれる。
配列一覧表
SEQ ID NO:1. ヒト化抗GPC3 scFvアミノ酸
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSG SGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:2. H93 CARアミノ酸
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ VSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGER RRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:3. H93M CARアミノ酸
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ VSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGER RRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEED GITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWS TDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKK DRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKD GCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS
SEQ ID NO:4. IL12p40-T2A-CCL-19
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEED GITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWS TDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKK DRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKD GCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS
SEQ ID NO:5. ヒトIL12p40
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
SEQ ID NO:6. ヒトCCL19
MALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS
SEQ ID NO:7. CD8αシグナルペプチド
MALPVTALLLPLALLLHAARP
SEQ ID NO:8. CD8αヒンジ
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
SEQ ID NO:9. CD8α膜貫通ドメイン
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
SEQ ID NO:10. 4-1BB(CD137)細胞質ドメイン
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
SEQ ID NO:11. CD3ζ(CD3z)細胞質ドメイン
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:12. H93M CAR核酸
ATGGCCCTGCCTGTGACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCTGCCCGCCCTGACATTGTGATGACCCAGTCTCCCCTGTCCCTGCCAGTGACCCCTGGAGAGCCAGCCTCCATCTCTTGCAGGAGCTCCCAGACCATCGTGCACAGCAACGGCAATACATACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACAGGTTCAGCGGAGTGCCAGACCGCTTTAGCGGATCCGGATCTGGCACCGATTTCACACTGAAGATCTCTAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTATTGCTTCCAGGTGAGCCACGTGCCATATACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGGGCAGCACCTCCGGATCTGGCAAGCCAGGATCCGGAGAGGGATCTACAAAGGGACAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAGACTATGAGATGCACTGGGTGCGGCAGGCAACCGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGAGGAATCGACCCAGAGACAGGCAACACAGCCTACTCCCAGAAGTTTAAGGGCCGGGTGACCATGACAAGAAATACCAGCATCTCCACAGCCTATATGGAGCTGTCTAGCCTGAGATCTGAGGATACAGCCGTGTACTATTGTGCTCGCTACTATTCCTTTGCCTACTGGGGACAGGGGACACTGGTCACCGTCTCATCAACTAGTACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCA CCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGTTAACGG CAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTGGAGGAGAA TCCCGGCCCTATGTGCCATCAGCAGCTGGTCATTTCTTGGTTCTCTCTGGTGTTTCTGGCTAGTCCTCTGGTCGCTATTTGGGAACTGAAAAAAGATGTGTACGTGGTGGAG CTGGACTGGTATCCAGATGCACCAGGAGAGATGGTGGTGCTGACCTGCGACACACCCGAGGAGGATGGCATCACCTGGACACTGGACCAGAGCTCCGAGGTGCTGGGAA GCGGCAAGACCCTGACAATCCAGGTGAAGGAGTTCGGCGATGCCGGCCAGTACA CATGTCACAAGGGCGGCGAGGTGCTGTCTCACAGCCTGCTGCTGCTGCACAAGA AGGAGGACGGCATCTGGTCCACAGACATCCTGAAGGATCAGAAGGAGCCTAAGA ACAAGACCTTCCTGCGGTGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGCCGGTTCACCTGTTG GTGGCTGACCACAATCTCTACCGACCTGACCTTCAGCGTGAAGTCTAGCCGGGGC TCCTCTGATCCACAGGGAGTGACATGCGGAGCAGCCACCCTGAGCGCCGAGCGG GTGAGAGGCGACAACAAGGAGTACGAGTATAGCGTGGAGTGCCAGGAGGATTCC GCCTGTCCAGCAGCAGAGGAGTCCCTGCCTATCGAAGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAGCTGAAGTACGAGAATTATACAAGCTCCTTCTTTATCAGGGACATCATCAAGCCAGATCCCCCTAAGAACCTGCAGCTGAAGCCCCTGAAGAATTCCCGCCAGGTGGAGGTGTCTTGGGAGTACCCTGATACCTGGTCCACACCACACAGCTATTTCTCCCTGACCTTTTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGTCTAAGAGGGAGAAGAAGGACCGCGTGTTCACCGATAAGACAAGCGCCACCGTGATCTGTCGGAAGAACGCCTCCATCTCTG TGCGGGCTCAGGACCGATATTACTCATCATCATGGAGTGAATGGGCCTCAGTGCCTTGCTCAGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCTCTGCTGCTGGCACTGAGTCTGCTGGTCCTGTGGA CATCACCTGCACCTACCCTGAGTGGAACTAATGACGCTGAAGATTGTTGCCTGAG CGTGACCCAGAAGCCAATCCCCGGCTACATCGTGAGGAACTTCCACTATCTGCTG ATCAAGGACGGATGCAGGGTGCCTGCAGTGGTGTTTACCACACTGCGGGGCAGACAGCTGTGCGCACCACCTGATCAGCCCTGGGTCGAGAGAATTATTCAGAGACTGCAGCGCACCTCAGCTAAGATGAAACGCCGCTCAAGT
SEQ ID NO:13. P2A
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
SEQ ID NO:14. T2A
GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO:15. EcoRI制限部位
GAATTC
SEQ ID NO:16. SpeI制限部位
ACTAGT
SEQ ID NO:17. HpaI制限部位
GTTAAC
SEQ ID NO:18. H93P CARアミノ酸
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ VSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSIS TAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQ PLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKK LLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLY NELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGM KGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRVNGSGATNFSLLKQAGDVE ENPGPMCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCD TPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKE DGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYEN YTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGK SKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGEGRGSL LTCGDVEENPGPMAQSLALSLLILVLAFGIPRTQGSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVV RSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQG CRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP
SEQ ID NO:19. H93P CAR核酸
ATGGCCCTGCCTGTGACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCTGCCCGCCCTGACATTGTGATGACCCAGTCTCCCCTGTCCCTGCCAGTGACCCCTGGA GAGCCAGCCTCCATCTCTTGCAGGAGCTCCCAGACCATCGTGCACAGCAACGGC AATACATACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTCAGCTGCTGA TCTACAAGGTGTCTAACAGGTTCAGCGGAGTGCCAGACCGCTTTAGCGGATCCG GATCTGGCACCGATTTCACACTGAAGATCTCTAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTATTGCTTCCAGGTGAGCCACGTGCCATATACCTTTGGCGGCGGCAC AAAGCTGGAGATCAAGGGCAGCACCTCCGGATCTGGCAAGCCAGGATCCGGAGA GGGATCTACAAAGGGACAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGAAGA AGCCTGGAGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAG ACTATGAGATGCACTGGGTGCGGCAGGCAACCGGACAGGGCCTGGAGTGGATGG GAGGAATCGACCCAGAGACAGGCAACACAGCCTACTCCCAGAAGTTTAAGGGCC GGGTGACCATGACAAGAAATACCAGCATCTCCACAGCCTATATGGAGCTGTCTA GCCTGAGATCTGAGGATACAGCCGTGTACTATTGTGCTCGCTACTATTCCTTTGC CTACTGGGGACAGGGGACACTGGTCACCGTCTCATCAACTAGTACCACGACGCC AGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCT GCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGC TGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGT CCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTC CTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAA GATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAG AGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTG AGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTAC CAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCC CTGCCCCCTCGCGTTAACGGCAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGTGCCATCAGCAGCTGGTCATTTCTTGGTTCTCTCTGGTGTTTCTGGCTAGTCCTCTGGTCGCTATTTGGGAACTGAAAAAAGATGTGTACGTGGTGGAGCTGGACTGGTATCCAGATGCACCAGGAGAGATGG TGGTGCTGACCTGCGACACACCCGAGGAGGATGGCATCACCTGGACACTGGACCAGAGCTCCGAGGTGCTGGGAAGCGGCAAGACCCTGACAATCCAGGTGAAGGAGTTCGGCGATGCCGGCCAGTACACATGTCACAAGGGCGGCGAGGTGCTGTCTCACAGCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAGGAGGACGGCATCTGGTCCACAGACATCCTGAAGGATCAGAAGGAGCCTAAGAACAAGACCTTCCTGCGGTGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGCCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGACCACAATCTCTACCGACCTGACCTT CAGCGTGAAGTCTAGCCGGGGCTCCTCTGATCCACAGGGAGTGACATGCGGAGCAGCCACCCTGAGCGCCGAGCGGGTGAGAGGCGACAACAAGGAGTACGAGTATA GCGTGGAGTGCCAGGAGGATTCCGCCTGTCCAGCAGCAGAGGAGTCCCTGCCTA TCGAAGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAGCTGAAGTACGAGAATTATACAAGCT CCTTCTTTATCAGGGACATCATCAAGCCAGATCCCCCTAAGAACCTGCAGCTGAAGCCCCTGAAGAATTCCCGCCAGGTGGAGGTGTCTTGGGAGTACCCTGATACCTGGTCCACACCACACAGCTATTTCTCCCTGACCTTTTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGTCTAAGAGGGAGAAGAAGGACCGCGTGTTCACCGATAAGACAAGCGCCACCGTG ATCTGTCGGAAGAACGCCTCCATCTCTGTGCGGGCTCAGGACCGATATTACTCAT CATCATGGAGTGAATGGGCCTCAGTGCCTTGCTCAGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCCCAGAGCCTTGCTCTCTCTCTGCTCATTCTGGTGCTGGCATTCGGCATCCCACGTACCCAGGGCTCCGACGGCGGCGCGCAGGACTGTTGCCTGAAGTACTCCCAGCGCAAGATCCCCGCCAAGGTGGTCCGCAGCTACAGGAAGCAGGAGCCAAGTCTAGGGTGCTCTATCCCTGCCATCCTGTTTCTGCCCCGCAAGCGCAGCCAGGCCGAGCTGTGCGCCGACCCGAAGGAGCTTTGGGTGCAGCAGCTGATGCAACACTTGGATAAAACTCCGAGCCCTCAGAAGCCTGCTCAGGGGTGCCGAAAGGACCGCGGAGCTTCCAAGACCGGCAAAAAGGGTAAGGGCTCCAAAGGTTGTAAACGTACCGAACGGTCACAGACGCCCAAGGGACCC
SEQ ID NO:20. IL12p40-T2A-CCL21アミノ酸
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSS FFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMAQSLALSLLILVLAFGIPRTQGSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP
SEQ ID NO:21. IL12p40-T2A-CCL21核酸
ATGTGCCATCAGCAGCTGGTCATTTCTTGGTTCTCTCTGGTGTTTCTGGCTAGTCCTCTGGTCGCTATTTGGGAACTGAAAAAAGATGTGTACGTGGTGGAGCTGGACTG GTATCCAGATGCACCAGGAGAGATGGTGGTGCTGACCTGCGACACACCCGAGGAGGATGGCATCACCTGGACACTGGACCAGAGCTCCGAGGTGCTGGGAAGCGGCAAGACCCTGACAATCCAGGTGAAGGAGTTCGGCGATGCCGGCCAGTACACATGTCA CAAGGGCGGCGAGGTGCTGTCTCACAGCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAGGAGGACGGCATCTGGTCCACAGACATCCTGAAGGATCAGAAGGAGCCTAAGAACAAGACCTTCCTGCGGTGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGCCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGACCACAATCTCTACCGACCTGACCTTCAGCGTGAAGTCTAGCCGGGGCTCCTCTGATCCACAGGGAGTGACATGCGGAGCAGCCACCCTGAGCGCCGAGCGGGTGAGA GGCGACAACAAGGAGTACGAGTATAGCGTGGAGTGCCAGGAGGATTCCGCCTGTCCAGCAGCAGAGGAGTCCCTGCCTATCGAAGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAGCTGAAGTACGAGAATTATACAAGCTCCTTCTTTATCAGGGACATCATCAAGCCAG ATCCCCCTAAGAACCTGCAGCTGAAGCCCCTGAAGAATTCCCGCCAGGTGGAGG TGTCTTGGGAGTACCCTGATACCTGGTCCACACCACACAGCTATTTCTCCCTGAC CTTTTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGTCTAAGAGGGAGAAGAAGGACCGCGTGTTCACCGATAAGACAAGCGCCACCGTGATCTGTCGGAAGAACGCCTCCATCTCTGT GCGGGCTCAGGACCGATATTACTCATCATCATGGAGTGAATGGGCCTCAGTGCCT TGCTCAGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCCCAGAGCCTTGCTCTCTCTCTGCTCATTCTGGTGC TGGCATTCGGCATCCCACGTACCCAGGGCTCCGACGGCGGCGCGCAGGACTGTT GCCTGAAGTACTCCCAGCGCAAGATCCCCGCCAAGGTGGTCCGCAGCTACAGGAAGCAGGAGCCAAGTCTAGGGTGCTCTATCCCTGCCATCCTGTTTCTGCCCCGCAAGCGCAGCCAGGCCGAGCTGTGCGCCGACCCGAAGGAGCTTTGGGTGCAGCAGCTGATGCAACACTTGGATAAAACTCCGAGCCCTCAGAAGCCTGCTCAGGGGTGCCGAAAGGACCGCGGAGCTTCCAAGACCGGCAAAAAGGGTAAGGGCTCCAAAGGTTGTAAACGTACCGAACGGTCACAGACGCCCAAGGGACCC
SEQ ID NO:22. ヒトCCL21
MAQSLALSLLILVLAFGIPRTQGSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP
SEQ ID NO:23. MluI制限部位
ACGCGT
SEQ ID NO:24. ヒトIL-7
MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
SEQ ID NO:25. IL12p40-P2A-IL-7アミノ酸
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSS FFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
SEQ ID NO:26. IL12p40-P2A-IL7核酸
ATGTGCCACCAGCAGCTGGTGATCAGTTGGTTCTCTCTGGTGTTCCTGGCCTCGC CACTTGTTGCCATATGGGAACTCAAAAAGGACGTGTACGTGGTGGAGCTGGACT GGTACCCCGACGCTCCCGGGGAGATGGTGGTCCTGACCTGTGATACTCCGGAGG AAGATGGCATCACCTGGACATTGGATCAGAGCTCCGAGGTACTGGGCTCCGGCA AAACTCTGACCATCCAGGTGAAGGAGTTCGGTGATGCTGGACAATACACCTGCC ATAAGGGCGGCGAGGTTCTTAGCCATTCTCTGCTGCTCCTCCACAAGAAGGAAG ACGGTATTTGGTCGACCGACATCCTGAAGGACCAGAAGGAGCCCAAAAACAAGACTTTTTTGCGCTGCGAGGCCAAAAACTACTCCGGTCGCTTCACATGCTGGTGGCTAACGACCATCTCAACCGACCTGACCTTCTCTGTCAAGAGCTCTCGTGGCTCCAGCGATCCTCAGGGCGTCACCTGCGGGGCAGCCACCCTGAGCGCAGAGCGCGTGAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCGGTGGAGTGTCAGGAGGACTCGGCCTGCCCAGCGGCCGAGGAGAGCCTGCCCATTGAGGTGATGGTAGACGCCGTCCACAAGCTGAAGTACGAGAACTACACCTCCTCCTTCTTTATCCGGGACATCATCAAGCCCG ACCCGCCCAAGAACCTGCAGCTCAAGCCTTTGAAGAATTCCCGCCAGGTTGAAGTCAGTTGGGAGTACCCTGACACCTGGTCTACTCCGCACAGCTATTTCTCGCTGAC CTTCTGCGTGCAGGTCCAGGGAAAGTCCAAGCGCGAGAAGAAAGACAGGGTGTTCACCGACAAGACCTCCGCCACCGTGATTTGCCGAAAAAACGCCTCCATCTCCGTGCGTGCGCAGGACCGCTACTACAGTTCCTCTTGGTCCGAGTGGGCTTCCGTGCCTTGTTCAGGCAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGTTTCATGTCTCCTTCCGCTACATCTTCGGGCTCCCTCCCCTGATCCTCGTTCTGCTGCCAGTGGCATCTAGCGATTGTGACATTGAGGGCA AAGACGGCAAGCAATACGAGAGCGTGCTGATGGTGTCGATTGACCAGCTGTTGG ATTCTATGAAAGAGATCGGCTCCAACTGCCTGAACAACGAGTTCAACTTCTTCAAGCGCCACATCTGTGACGCCAACAAGGAAGGTATGTTTCTGTTCCGGGCCGCGCGCAAGCTGAGGCAGTTCCTGAAAATGAATTCCACCGGTGATTTCGACTTGCACCTGCTTAAGGTGTCCGAGGGCACGACCATCCTTCTTAACTGCACTGGACAGGTCAAGG GCCGTAAGCCCGCCGCTCTAGGGGAGGCTCAGCCGACAAAGTCGCTGGAGGAGAACAAGTCACTCAAAGAACAGAAGAAGCTCAACGACCTGTGCTTTTTGAAGCGCCTGCTGCAGGAGATCAAGACCTGTTGGAATAAGATCCTGATGGGCACCAAGGAGC AC
SEQ ID NO:27. MusH93 CARアミノ酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQADIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGR VTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTTTKPVLRT PSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR
SEQ ID NO:28. マウスCAR主鎖(マウスCD8αヒンジ-マウスCD8α膜貫通ドメイン-マウス4-1BB(CD137)の細胞質ドメイン-マウスCD3ζ細胞質)
TTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR
SEQ ID NO:29. マウスIL12p40
MCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRS
SEQ ID NO:30. マウスCCL-19
MAPRVTPLLAFSLLVLWTFPAPTLGGANDAEDCCLSVTQRPIPGNIVKAFRYLLNEDGCRVPAVVFTTLRGYQLCAPPDQPWVDRIIRRLKKSSAKNKGNSTRRSPVS
SEQ ID NO:31. マウスH93M CARアミノ酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQADIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGR VTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTKPVL RTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDW TPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMAPRVTPLLAFSLLVLWTFPAPTLGGANDAEDCCLSVTQRPIPGNIVKAFRYLLNEDGCRVPAVVFTTLRGYQLCAPPDQPWVDRIIRRLKKSSAKNKGNSTRRSPVS
SEQ ID NO:32. マウスH93M CAR核酸
ATGGCAAGTCCTCTGACTCGGTTTCTGTCTCTGAATCTGCTCCTCCTCGGTGAATCCATTATCCTCGGTTCCGGTGAAGCTAAGCCTCAGGCCGACATCGTGATGACACAGAGCCCACTGTCCCTGCCAGTGACCCCAGGAGAGCCTGCTAGCATCTCCTGTAGGAGCTCCCAGACAATCGTGCACAGCAACGGCAACACCTACCTGGAGTGGTACCTGCAGAAGCCTGGACAGTCCCCACAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACAGGTTTA GCGGCGTGCCCGACAGATTCTCTGGCAGCGGATCCGGCACAGACTTCACCCTGA AGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGATGTGGGAGTGTACTACTGTTTTCAGGTGAGCCACGTGCCATACACATTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCTCTA CAAGCGGATCCGGCAAGCCAGGATCCGGAGAGGGATCTACCAAGGGACAGGTG CAGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCTAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACCGACTACGAGATGCACTGGGTGCGGCAGGCTACAGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGAGGCATCGATCCTGAGACAGGC AACACCGCCTACAGCCAGAAGTTCAAGGGAAGGGTGACAATGACCAGAAACAC ATCTATCAGCACCGCTTACATGGAGCTGTCTAGCCTGCGGTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTCGCTACTACTCTTTTGCCTACTGGGGCCAGGGAACACTGG TGACCGTGTCCTCTACATCCACCACAACCAAGCCAGTGCTGAGGACCCCAAGCCCTGTGCACCCAACAGGCACCTCCCAGCCACAGAGGCCCGAGGATTGTAGGCCCAGAGGATCTGTGAAGGGCACAGGACTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCTCCTCTGGCTGGAATCTGCGTGGCTCTGCTGCTGTCTCTGATCATCACCCTGATCTGCAGCGTGCTGAAGTGGATCCGGAAGAAGTTCCCCCACATCTTTAAGCAGCCTTTCAAGAAGACAACCGGAGCTGCTCAGGAGGAGGACGCCTGCTCCTGTAGGTGCCCTCAGGAAGAAGAGGGAGGAGGAGGAGGATACGAGCTGAGGGCTAAGTTCTCCCGCTCTGCTGAGACAGCCGCTAACCTGCAGGATCCAAACCAGCTGTACAACGAGCT GAACCTGGGCAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGAGAAGAAGCGGGCTCGCGATCCTGAGATGGGAGGAAAGCAGCAGCGGCGCAGGAACCCACAGGAGGGCGTG TACAACGCTCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCTTACAGCGAGATCGGCACCAAGGGAGAGAGACGGCGCGGCAAGGGACACGATGGCCTGTACCAGGGACTCTC AACCGCTACTAAGGACACCTACGATGCTCTCCATATGCAGACCCTCGCACCCCGCGTTAACGGCAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTG GAGGAGAATCCCGGCCCTATGTGCCCTCAGAAACTGACTATATCATGGTTTGCCA TTGTGCTGCTGGTAAGTCCTCTCATGGCCATGTGGGAATTGGAGAAAGATGTGTA CGTGGTGGAGGTGGACTGGACCCCTGACGCACCAGGAGAAACAGTGAACCTGACGTGTGATACGCCAGAAGAGGATGACATTACTTGGACATCAGATCAAAGACACGG TGTCATAGGGTCAGGCAAAACTCTTACCATCACAGTCAAGGAGTTCCTAGATGCTGGCCAGTATACCTGCCATAAAGGAGGGGAAACCCTGTCCCACTCGCATCTGCTCCTCCACAAGAAGGAAAACGGCATCTGGAGCACAGAGATCCTGAAGAATTTTAAGAATAAGACCTTCTTGAAATGTGAGGCCCCCAACTACAGCGGGAGGTTCACCTGTTCCTGGCTGGTGCAACGGAACATGGACCTGAAGTTCAATATTAAATCTTCATCTTCC TCCCCGGACAGTCGCGCAGTTACTTGTGGCATGGCTTCTTTATCGGCAGAGAAAGTCACCCTTGACCAGCGCGACTATGAGAAGTATTCTGTTTCCTGCCAGGAGGACGTGACGTGCCCCACAGCTGAAGAGACTTTGCCTATTGAGTTAGCCCTGGAGGCCAG ACAACAGAACAAATATGAAAATTATTCCACTTCATTCTTCATCCGTGATATCATC AAGCCCGATCCACCCAAGAATCTTCAGATGAAGCCTCTAAAGAACAGCCAGGTGGAGGTTAGCTGGGAGTACCCAGATAGCTGGTCTACCCCACATTCCTACTTTAGTT TAAAGTTTTTTGTAAGAATCCAGAGGAAAAAAGAAAAGATGAAAGAGACTGAAGAAGGTTGCAACCAGAAGGGAGCGTTTCTCGTTGAGAAGACAAGCACAGAAGTCCAGTGCAAAGGTGGAAATGTATGTGTGCAAGCTCAGGACAGGTACTACAACAGTAGCTGTTCTAAGTGGGCATGTGTCCCCTGCCGAGTGCGGAGTGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCTCCTAGAGTGACACCTTTGCTGGCCTTTTCTCTTCTAGTGTTGTGGACGTTTCCTGCACCCACCCTGGGTGGAGCGAATGATGCAGAGGACTGCTGCCTCAGTGTCACCCAAAGGCCCATACCAGGGAACATTGTGAAGGCCTTCCGCTATCTTCTCAATGAAGATGGATGTCGGGTTCCTGCTGTGGTCTTCACTACTTTACGCGGCTACCAGCTGTGTGCTCCTCCAGACCAGCCCTGGGTGGACCGTATCATCCGAAGGCTGAAGAAAAGCAGCGCCAAGAACAAAGGCAACTCAACAAGAAGATCCCCAGTTTCC
SEQ ID NO:33. マウスH93IL12p40 CARアミノ酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQADIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGR VTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTKPVL RTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDW TPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRS
SEQ ID NO:34. マウスH93CCL19 CARアミノ酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQADIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGR VTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTKPVL RTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMAPRVTPLLAFSLLVLWTFPAPTLGGANDAEDCCLSVTQRPIPGNIVKAFRYLLNEDGCRVPAVVFTTLRGYQLCAPPDQPWVDRIIRRLKKSSAKNKGNSTRRSPVS
SEQ ID NO:35. mus261 CARアミノ酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQAQVQLEESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYRSSVCMGWFRQAPGKERERVAVIGRDGSTTYIDSVKGRFTISRDSAKNTLSLQMDNLKPEDTAMYSCAAGLGYWACEYNYWGQGTQVTVSSTSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR
SEQ ID NO:36. マウスIL7-F2A-マウスCCL19アミノ酸
MFHVSFRYIFGIPPLILVLLPVTSSECHIKDKEGKAYESVLMISIDELDKMTGTDSNCPNNEPNFFRKHVCDDTKEAAFLNRAARKLKQFLKMNISEEFNVHLLTVSQGTQTLVNCTSKEEKNVKEQKKNDACFLKRLLREIKTCWNKILKGSIGSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPMAPRVTPLLAFSLLVLWTFPAPTLGGANDAEDCCLSVTQRPIPGNIVKAFRYLLNEDGCRVPAVVFTTLRGYQLCAPPDQPWVDRIIRRLKKSSAKNKGNSTRRSPVS
SEQ ID NO:37. MB12アミノ酸(IL12p40-CD8αヒンジ-CD8α膜貫通ドメイン-CD8α細胞内細胞質ドメイン)
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYCNHRNRRR
SEQ ID NO:38. H93M-MB12 CARアミノ酸
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSIS TAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQ PLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKK LLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMDWTWILFLVAAATRVHSIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPE EDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCL YCNHRNRRRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDA EDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS
SEQ ID NO:39. H93M-MB12 CAR核酸
ATGGCCCTGCCTGTGACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCTGCCCGCCCTGACATTGTGATGACCCAGTCTCCCCTGTCCCTGCCAGTGACCCCTGGAGAGCCAGCCTCCATCTCTTGCAGGAGCTCCCAGACCATCGTGCACAGCAACGGC AATACATACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACAGGTTCAGCGGAGTGCCAGACCGCTTTAGCGGATCCG GATCTGGCACCGATTTCACACTGAAGATCTCTAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGG GCGTGTACTATTGCTTCCAGGTGAGCCACGTGCCATATACCTTTGGCGGCGGCAC AAAGCTGGAGATCAAGGGCAGCACCTCCGGATCTGGCAAGCCAGGATCCGGAGAGGGATCTACAAAGGGACAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAG ACTATGAGATGCACTGGGTGCGGCAGGCAACCGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGAGGAATCGACCCAGAGACAGGCAACACAGCCTACTCCCAGAAGTTTAAGGGCCGGGTGACCATGACAAGAAATACCAGCATCTCCACAGCCTATATGGAGCTGTCTA GCCTGAGATCTGAGGATACAGCCGTGTACTATTGTGCTCGCTACTATTCCTTTGC CTACTGGGGACAGGGGACACTGGTCACCGTCTCATCAACTAGTACCACGACGCC AGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGT CCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAA GATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAG AGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTG AGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTAC CAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCC CTGCCCCCTCGCGTTAACGGTTCCGGCGCCACCAACTTTTCACTGTTAAAGCAGGCCGGTGATGTGGAGGAGAATCCAGGCCCTATGGATTGGACCTGGATCCTCTTCCTGGTGGCTGCAGCCACCCGTGTCCACTCCATCTGGGAGCTGAAGAAGGACGTGTACGTGGTGGAGCTCGACTGGTACCCCGACGCTCCCGGGGAGATGGTGGTTCTGAC CTGTGACACCCCAGAGGAAGACGGCATCACCTGGACCCTGGACCAGAGCTCCGAGGTGCTGGGCTCCGGCAAAACTTTGACTATCCAGGTCAAGGAGTTCGGTGATGC AGGCCAATACACATGCCATAAGGGCGGCGAGGTGCTGTCTCATTCTCTGCTGCTGCTGCACAAGAAGGAAGATGGCATTTGGTCGACTGACATCCTGAAGGACCAGAAGGAGCCCAAGAACAAGACCTTCCTAAGGTGTGAGGCCAAGAACTATTCCGGTCGCTTCACATGTTGGTGGCTAACCACAATTTCGACCGACCTGACCTTTAGCGTAAAAT CCTCTCGTGGCTCGAGCGATCCTCAGGGAGTCACCTGCGGGGCCGCCACTCTGTCCGCCGAGCGCGTGCGCGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCCGTGGAGTGTCAGGAGGACAGCGCCTGCCCAGCAGCCGAGGAGAGCCTCCCCATCGAAGTGATGGTGGACGCGGTACACAAGCTGAAGTACGAGAACTACACCAGCTCCTTCTTCATCCG CGACATCATCAAGCCGGACCCGCCCAAAAACCTGCAGCTGAAACCTTTGAAAAACTCCCGCCAGGTCGAAGTCAGTTGGGAGTACCCGGACACCTGGTCGACTCCCCACAGCTATTTCAGTCTTACGTTCTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGTCCAAACGCGAGAAGAAAGACAGGGTGTTCACGGACAAGACTTCCGCTACCGTCATCTGCCGCAAGAACGCGAGCATCTCTGTCAGAGCTCAGGACCGCTACTACTCTTCCAGTTGGTCTGAGTGGGCGTCCGTCCCCTGTTCTACCACGACCCCGGCGCCGCGCCCCCCAACCCCTGCCCCTACCATTGCCTCACAGCCGTTGTCTCTGCGGCCCGAGGCGTGCCGACCTGCCGCGGGAGGCGCGGTGCACACGCGGGGTCTCGACTTTGCTTGTGATATTTACAT ATGGGCTCCCCTGGCCGGCACCTGCGGGGTTTTGCTCCTTTCCTTGGTGATCACTCTTTACTGCCTGTACTGCAATCACCGGAACCGCCGCCGTGGCAGTGGAGAGGGCA GAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCTC TGCTGCTGGCACTGAGTCTGCTGGTCCTGTGGACATCACCTGCACCTACCCTGAGTGGAACTAATGACGCTGAAGATTGTTGCCTGAGCGTGACCCAGAAGCCAATCCC CGGCTACATCGTGAGGAACTTCCACTATCTGCTGATCAAGGACGGATGCAGGGT GCCTGCAGTGGTGTTTACCACACTGCGGGGCAGACAGCTGTGCGCACCACCTGATCAGCCCTGGGTCGAGAGAATTATTCAGAGACTGCAGCGCACCTCAGCTAAGATG AAACGCCGCTCAAGT
SEQ ID NO:40. 抗クローディン18.2 VHHドメイン
QVQLEESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYRSSVCMGWFRQAPGKERERVAVIGRDGSTTYIDSVKGRFTISRDSAKNTLSLQMDNLKPEDTAMYSCAAGLGYWACEYNYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:41. 261 CARアミノ酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQAQVQLEESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYRSSVCMGWFRQAPGKERERVAVIGRDGSTTYIDSVKGRFTISRDSAKNTLSLQMDNLKPEDTAMYSCAAGLGYWACEYNYWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:42. 261M CARアミノ酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQAQVQLEESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYRSSVCMGWFRQAPGKERERVAVIGRDGSTTYIDSVKGRFTISRDSAKNTLSLQMDNLKPEDTAMYSCAAGLGYWACEYNYWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS
SEQ ID NO:43. 261M CAR核酸
ATGGCCTCACCGTTGACCCGCTTTCTGTCGCTGAACCTGCTGCTGCTGGGTGAGTCGATTATCCTGGGGAGTGGAGAAGCTAAGCCACAGGCACAGGTGCAGCTGGAGGAGTCTGGAGGAGGAAGCGTGCAAGTGGGAGGCTCCCTGAGGCTGTCTTGCGCAGCAAGCGGATACAGATCCAGCGTGTGCATGGGATGGTTTAGACAGGCACCAGGAAAGGAGAGGGAGAGAGTGGCAGTGATCGGAAGGGACGGATCCACCACATATATC GATTCTGTGAAGGGCCGGTTTACCATCTCCAGAGACTCTGCCAAGAACACACTGTCTCTGCAGATGGACAATCTGAAGCCTGAAGACACAGCCATGTACAGCTGCGCCG CCGGCCTGGGATACTGGGCTTGCGAATACAACTACTGGGGGCAGGGCACTCAGG TGACCGTCTCTTCTACTAGTACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACAT CTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACC CTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTA TGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAG AAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGA CGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCC GGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGTTAACGGCAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGTGCCACCAGCAGCTGGTGATCAGTTGGTTCTCTCTGGTGTTCCTGGCCTCGCCACTTGTTGCCATATGGGAACTCAAAAAGGACGTGTACGTGGTGGAGCTGG ACTGGTACCCCGACGCTCCCGGGGAGATGGTGGTCCTGACCTGTGATACTCCGGAGGAAGATGGCATCACCTGGACATTGGATCAGAGCTCCGAGGTACTGGGCTCCGG CAAAACTCTGACCATCCAGGTGAAGGAGTTCGGTGATGCTGGACAATACACCTG CCATAAGGGCGGCGAGGTTCTTAGCCATTCTCTGCTGCTCCTCCACAAGAAGGAAGACGGTATTTGGTCGACCGACATCCTGAAGGACCAGAAGGAGCCCAAAAACAAGACTTTTTTGCGCTGCGAGGCCAAAAACTACTCCGGTCGCTTCACATGCTGGTGGCTAACGACCATCTCAACCGACCTGACCTTCTCTGTCAAGAGCTCTCGTGGCTCCAGCGATCCTCAGGGCGTCACCTGCGGGGCAGCCACCCTGAGCGCAGAGCGCGTGAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCGGTGGAGTGTCAGGAGGACTCGGCCTGCCCAGCGGCCGAGGAGAGCCTGCCCATTGAGGTGATGGTAGACGCCGTCCACAAGCTGAAGTACGAGAACTACACCTCCTCCTTCTTTATCCGGGACATCATCAAGCCC GACCCGCCCAAGAACCTGCAGCTCAAGCCTTTGAAGAATTCCCGCCAGGTTGAAGTCAGTTGGGAGTACCCTGACACCTGGTCTACTCCGCACAGCTATTTCTCGCTGA CCTTCTGCGTGCAGGTCCAGGGAAAGTCCAAGCGCGAGAAGAAAGACAGGGTGTTCACCGACAAGACCTCCGCCACCGTGATTTGCCGAAAAAACGCCTCCATCTCCGTGCGTGCGCAGGACCGCTACTACAGTTCCTCTTGGTCCGAGTGGGCTTCCGTGCCTTGTTCAGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCTCTGCTGCTGGCACTGAGTCTGCTGGTCCTGTGGACATCACCTGCACCTACCCTGAGTGGAACTAATGACGCTGAAGATTGTTGCCTGAGCGTGACCCAGAAGCCAATCCCCGGCTACATCGTGAGGAACTTCCACTATCTGCTGATCAAGGACGGATGCAGGGTGCCTGCAGTGGTGTTTACCACACTGCGGGGCAGACAGCTGTGCGCACCACCTGATCAGCCCTGGGTCGAGAGAATTATTCAGAGACTG CAGCGCACCTCAGCTAAGATGAAACGCCGCTCAAGTTAA
SEQ ID NO:44. mus261M CARアミノ酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQAQVQLEESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYRSSVCMGWFRQAPGKERERVAVIGRDGSTTYIDSVKGRFTISRDSAKNTLSLQMDNLKPEDTAMYSCAAGLGYWACEYNYWGQGTQVTVSSTSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMAPRVTPLLAFSLLVLWTFPAPTLGGANDAEDCCLSVTQRPIPGNIVKAFRYLLNEDGCRVPAVVFTTLRGYQLCAPPDQPWVDRIIRRLKKSSAKNKGNSTRRSPVS
SEQ ID NO:45. mus261M CAR核酸
ATGGCCTCACCGTTGACCCGCTTTCTGTCGCTGAACCTGCTGCTGCTGGGTGAGTCGATTATCCTGGGGAGTGGAGAAGCTAAGCCACAGGCACAGGTGCAGCTGGAGGAGTCTGGAGGAGGAAGCGTGCAAGTGGGAGGCTCCCTGAGGCTGTCTTGCGCAGCAAGCGGATACAGATCCAGCGTGTGCATGGGATGGTTTAGACAGGCACCAGGAAAGGAGAGGGAGAGAGTGGCAGTGATCGGAAGGGACGGATCCACCACATATATCGATTCTGTGAAGGGCCGGTTTACCATCTCCAGAGACTCTGCCAAGAACACACTGT CTCTGCAGATGGACAATCTGAAGCCTGAAGACACAGCCATGTACAGCTGCGCCG CCGGCCTGGGATACTGGGCTTGCGAATACAACTACTGGGGGCAGGGCACTCAGG TGACCGTCTCTTCTACTAGTACTACTACCAAGCCAGTGCTGCGAACTCCCTCACC TGTGCACCCTACCGGGACATCTCAGCCCCAGAGACCAGAAGATTGTCGGCCCCG TGGCTCAGTGAAGGGGACCGGATTGGACTTCGCCTGTGATATTTACATCTGGGCACCCTTGGCCGGAATCTGCGTGGCCCTTCTGCTGTCCTTGATCATCACTCTCATCTGCTCTGTGCTCAAATGGATCAGGAAAAAATTCCCCCACATATTCAAGCAACCATTT AAGAAGACCACTGGAGCAGCTCAAGAGGAAGATGCTTGTAGCTGCCGATGTCCACAGGAAGAAGAAGGAGGAGGAGGAGGCTATGAGCTGAGAGCAAAATTCAGCAGGAGTGCAGAGACTGCTGCCAACCTGCAGGACCCCAACCAGCTCTACAATGAGCTCAATCTAGGGCGAAGAGAGGAATATGACGTCTTGGAGAAGAAGCGGGCTCGGG ATCCAGAGATGGGAGGCAAACAGCAGAGGAGGAGGAACCCCCAGGAAGGCGTA TACAATGCACTGCAGAAAGACAAGATGGCAGAAGCCTACAGTGAGATCGGCACAAAAGGCGAGAGGCGGAGAGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAG CACTGCCACCAAGGACACCTATGATGCCCTGCATATGCAGACCCTGGCCCCTCGCGGCAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGTGTCCTCAGAAGCTAACCATCTCCTGGTTTGCCATCGTTTTGCTGGTGTCTCCACTCATGGCCATGTGGGAGCTGGAGAAAGACGTTTATGTTGTAGAGGTGGACTGGACTCCCGATGCCCCTGGAGAAACAGTGAACCTCACCTGTGACACGCCTGAAGAAGATGACATCACCTGGACCTCAGACCAGAGACATGGAGTCATAGGCTCTGGAAAGACCCTGACCATCACTGTCAAAGAGTTTCTAGATGCTGGCCAGTACACCTGCCACAAAGGAGGCGAGACTCTGAGCCACTCACATCTGCTGCTCCACAAGAAGGAAAATGGAATTTGGTCCACTGAAATTTTAAAAAATTTCAAAAACAAGA CTTTCCTGAAGTGTGAAGCACCAAATTACTCCGGACGGTTCACGTGCTCATGGCTGGTGCAAAGAAACATGGACTTGAAGTTCAACATCAAGAGCAGTAGCAGTTCCCCTGACTCTCGGGCAGTGACATGTGGAATGGCGTCTCTGTCTGCAGAGAAGGTCAC ACTGGACCAAAGGGACTATGAGAAGTATTCAGTGTCCTGCCAGGAGGATGTCAC CTGCCCAACTGCCGAGGAGACCCTGCCCATTGAACTGGCGTTGGAAGCACGGCAGCAGAATAAATATGAGAACTACAGCACCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAA ACCAGACCCGCCCAAGAACTTGCAGATGAAGCCTTTGAAGAACTCACAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACTCCTGGAGCACTCCCCATTCCTACTTCTCCCTC AAGTTCTTTGTTCGAATCCAGCGCAAGAAAGAAAAGATGAAGGAGACAGAGGA GGGGTGTAACCAGAAAGGTGCGTTCCTCGTAGAGAAGACATCTACCGAAGTCCA ATGCAAAGGCGGGAATGTCTGCGTGCAAGCTCAGGATCGCTATTACAATTCCTCA TGCAGCAAGTGGGCATGTGTTCCCTGCAGGGTCCGATCCGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCT CCTAGAGTGACACCTTTGCTGGCCTTTTCTCTTCTAGTGTTGTGGACGTTTCCTGCACCCACCCTGGGTGGAGCGAATGATGCAGAGGACTGCTGCCTCAGTGTCACCCAAAGGCCCATACCAGGGAACATTGTGAAGGCCTTCCGCTATCTTCTCAATGAAGATGGATGTCGGGTTCCTGCTGTGGTCTTCACTACTTTACGCGGCTACCAGCTGTGTG CTCCTCCAGACCAGCCCTGGGTGGACCGTATCATCCGAAGGCTGAAGAAAAGCAGCGCCAAGAACAAAGGCAACTCAACAAGAAGATCCCCAGTTTCCTAA
SEQ ID NO:46. グリシン-セリンポリマーリンカー
(GSGGS)n[nは少なくとも1の整数である]
SEQ ID NO:47. グリシン-セリンポリマーリンカー
(GGGS)n[nは少なくとも1の整数である]
SEQ ID NO:48. グリシン-セリンポリマーリンカー
(GGGGS)n[nは少なくとも1の整数である]
SEQ ID NO:1. ヒト化抗GPC3 scFvアミノ酸
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSG SGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:2. H93 CARアミノ酸
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ VSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGER RRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:3. H93M CARアミノ酸
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ VSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGER RRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEED GITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWS TDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKK DRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKD GCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS
SEQ ID NO:4. IL12p40-T2A-CCL-19
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEED GITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWS TDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKK DRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKD GCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS
SEQ ID NO:5. ヒトIL12p40
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
SEQ ID NO:6. ヒトCCL19
MALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS
SEQ ID NO:7. CD8αシグナルペプチド
MALPVTALLLPLALLLHAARP
SEQ ID NO:8. CD8αヒンジ
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
SEQ ID NO:9. CD8α膜貫通ドメイン
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
SEQ ID NO:10. 4-1BB(CD137)細胞質ドメイン
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
SEQ ID NO:11. CD3ζ(CD3z)細胞質ドメイン
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:12. H93M CAR核酸
ATGGCCCTGCCTGTGACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCTGCCCGCCCTGACATTGTGATGACCCAGTCTCCCCTGTCCCTGCCAGTGACCCCTGGAGAGCCAGCCTCCATCTCTTGCAGGAGCTCCCAGACCATCGTGCACAGCAACGGCAATACATACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACAGGTTCAGCGGAGTGCCAGACCGCTTTAGCGGATCCGGATCTGGCACCGATTTCACACTGAAGATCTCTAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTATTGCTTCCAGGTGAGCCACGTGCCATATACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGGGCAGCACCTCCGGATCTGGCAAGCCAGGATCCGGAGAGGGATCTACAAAGGGACAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAGACTATGAGATGCACTGGGTGCGGCAGGCAACCGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGAGGAATCGACCCAGAGACAGGCAACACAGCCTACTCCCAGAAGTTTAAGGGCCGGGTGACCATGACAAGAAATACCAGCATCTCCACAGCCTATATGGAGCTGTCTAGCCTGAGATCTGAGGATACAGCCGTGTACTATTGTGCTCGCTACTATTCCTTTGCCTACTGGGGACAGGGGACACTGGTCACCGTCTCATCAACTAGTACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCA CCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGTTAACGG CAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTGGAGGAGAA TCCCGGCCCTATGTGCCATCAGCAGCTGGTCATTTCTTGGTTCTCTCTGGTGTTTCTGGCTAGTCCTCTGGTCGCTATTTGGGAACTGAAAAAAGATGTGTACGTGGTGGAG CTGGACTGGTATCCAGATGCACCAGGAGAGATGGTGGTGCTGACCTGCGACACACCCGAGGAGGATGGCATCACCTGGACACTGGACCAGAGCTCCGAGGTGCTGGGAA GCGGCAAGACCCTGACAATCCAGGTGAAGGAGTTCGGCGATGCCGGCCAGTACA CATGTCACAAGGGCGGCGAGGTGCTGTCTCACAGCCTGCTGCTGCTGCACAAGA AGGAGGACGGCATCTGGTCCACAGACATCCTGAAGGATCAGAAGGAGCCTAAGA ACAAGACCTTCCTGCGGTGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGCCGGTTCACCTGTTG GTGGCTGACCACAATCTCTACCGACCTGACCTTCAGCGTGAAGTCTAGCCGGGGC TCCTCTGATCCACAGGGAGTGACATGCGGAGCAGCCACCCTGAGCGCCGAGCGG GTGAGAGGCGACAACAAGGAGTACGAGTATAGCGTGGAGTGCCAGGAGGATTCC GCCTGTCCAGCAGCAGAGGAGTCCCTGCCTATCGAAGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAGCTGAAGTACGAGAATTATACAAGCTCCTTCTTTATCAGGGACATCATCAAGCCAGATCCCCCTAAGAACCTGCAGCTGAAGCCCCTGAAGAATTCCCGCCAGGTGGAGGTGTCTTGGGAGTACCCTGATACCTGGTCCACACCACACAGCTATTTCTCCCTGACCTTTTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGTCTAAGAGGGAGAAGAAGGACCGCGTGTTCACCGATAAGACAAGCGCCACCGTGATCTGTCGGAAGAACGCCTCCATCTCTG TGCGGGCTCAGGACCGATATTACTCATCATCATGGAGTGAATGGGCCTCAGTGCCTTGCTCAGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCTCTGCTGCTGGCACTGAGTCTGCTGGTCCTGTGGA CATCACCTGCACCTACCCTGAGTGGAACTAATGACGCTGAAGATTGTTGCCTGAG CGTGACCCAGAAGCCAATCCCCGGCTACATCGTGAGGAACTTCCACTATCTGCTG ATCAAGGACGGATGCAGGGTGCCTGCAGTGGTGTTTACCACACTGCGGGGCAGACAGCTGTGCGCACCACCTGATCAGCCCTGGGTCGAGAGAATTATTCAGAGACTGCAGCGCACCTCAGCTAAGATGAAACGCCGCTCAAGT
SEQ ID NO:13. P2A
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
SEQ ID NO:14. T2A
GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO:15. EcoRI制限部位
GAATTC
SEQ ID NO:16. SpeI制限部位
ACTAGT
SEQ ID NO:17. HpaI制限部位
GTTAAC
SEQ ID NO:18. H93P CARアミノ酸
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ VSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSIS TAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQ PLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKK LLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLY NELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGM KGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRVNGSGATNFSLLKQAGDVE ENPGPMCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCD TPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKE DGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYEN YTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGK SKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGEGRGSL LTCGDVEENPGPMAQSLALSLLILVLAFGIPRTQGSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVV RSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQG CRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP
SEQ ID NO:19. H93P CAR核酸
ATGGCCCTGCCTGTGACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCTGCCCGCCCTGACATTGTGATGACCCAGTCTCCCCTGTCCCTGCCAGTGACCCCTGGA GAGCCAGCCTCCATCTCTTGCAGGAGCTCCCAGACCATCGTGCACAGCAACGGC AATACATACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTCAGCTGCTGA TCTACAAGGTGTCTAACAGGTTCAGCGGAGTGCCAGACCGCTTTAGCGGATCCG GATCTGGCACCGATTTCACACTGAAGATCTCTAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTATTGCTTCCAGGTGAGCCACGTGCCATATACCTTTGGCGGCGGCAC AAAGCTGGAGATCAAGGGCAGCACCTCCGGATCTGGCAAGCCAGGATCCGGAGA GGGATCTACAAAGGGACAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGAAGA AGCCTGGAGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAG ACTATGAGATGCACTGGGTGCGGCAGGCAACCGGACAGGGCCTGGAGTGGATGG GAGGAATCGACCCAGAGACAGGCAACACAGCCTACTCCCAGAAGTTTAAGGGCC GGGTGACCATGACAAGAAATACCAGCATCTCCACAGCCTATATGGAGCTGTCTA GCCTGAGATCTGAGGATACAGCCGTGTACTATTGTGCTCGCTACTATTCCTTTGC CTACTGGGGACAGGGGACACTGGTCACCGTCTCATCAACTAGTACCACGACGCC AGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCT GCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGC TGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGT CCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTC CTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAA GATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAG AGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTG AGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTAC CAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCC CTGCCCCCTCGCGTTAACGGCAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGTGCCATCAGCAGCTGGTCATTTCTTGGTTCTCTCTGGTGTTTCTGGCTAGTCCTCTGGTCGCTATTTGGGAACTGAAAAAAGATGTGTACGTGGTGGAGCTGGACTGGTATCCAGATGCACCAGGAGAGATGG TGGTGCTGACCTGCGACACACCCGAGGAGGATGGCATCACCTGGACACTGGACCAGAGCTCCGAGGTGCTGGGAAGCGGCAAGACCCTGACAATCCAGGTGAAGGAGTTCGGCGATGCCGGCCAGTACACATGTCACAAGGGCGGCGAGGTGCTGTCTCACAGCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAGGAGGACGGCATCTGGTCCACAGACATCCTGAAGGATCAGAAGGAGCCTAAGAACAAGACCTTCCTGCGGTGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGCCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGACCACAATCTCTACCGACCTGACCTT CAGCGTGAAGTCTAGCCGGGGCTCCTCTGATCCACAGGGAGTGACATGCGGAGCAGCCACCCTGAGCGCCGAGCGGGTGAGAGGCGACAACAAGGAGTACGAGTATA GCGTGGAGTGCCAGGAGGATTCCGCCTGTCCAGCAGCAGAGGAGTCCCTGCCTA TCGAAGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAGCTGAAGTACGAGAATTATACAAGCT CCTTCTTTATCAGGGACATCATCAAGCCAGATCCCCCTAAGAACCTGCAGCTGAAGCCCCTGAAGAATTCCCGCCAGGTGGAGGTGTCTTGGGAGTACCCTGATACCTGGTCCACACCACACAGCTATTTCTCCCTGACCTTTTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGTCTAAGAGGGAGAAGAAGGACCGCGTGTTCACCGATAAGACAAGCGCCACCGTG ATCTGTCGGAAGAACGCCTCCATCTCTGTGCGGGCTCAGGACCGATATTACTCAT CATCATGGAGTGAATGGGCCTCAGTGCCTTGCTCAGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCCCAGAGCCTTGCTCTCTCTCTGCTCATTCTGGTGCTGGCATTCGGCATCCCACGTACCCAGGGCTCCGACGGCGGCGCGCAGGACTGTTGCCTGAAGTACTCCCAGCGCAAGATCCCCGCCAAGGTGGTCCGCAGCTACAGGAAGCAGGAGCCAAGTCTAGGGTGCTCTATCCCTGCCATCCTGTTTCTGCCCCGCAAGCGCAGCCAGGCCGAGCTGTGCGCCGACCCGAAGGAGCTTTGGGTGCAGCAGCTGATGCAACACTTGGATAAAACTCCGAGCCCTCAGAAGCCTGCTCAGGGGTGCCGAAAGGACCGCGGAGCTTCCAAGACCGGCAAAAAGGGTAAGGGCTCCAAAGGTTGTAAACGTACCGAACGGTCACAGACGCCCAAGGGACCC
SEQ ID NO:20. IL12p40-T2A-CCL21アミノ酸
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSS FFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMAQSLALSLLILVLAFGIPRTQGSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP
SEQ ID NO:21. IL12p40-T2A-CCL21核酸
ATGTGCCATCAGCAGCTGGTCATTTCTTGGTTCTCTCTGGTGTTTCTGGCTAGTCCTCTGGTCGCTATTTGGGAACTGAAAAAAGATGTGTACGTGGTGGAGCTGGACTG GTATCCAGATGCACCAGGAGAGATGGTGGTGCTGACCTGCGACACACCCGAGGAGGATGGCATCACCTGGACACTGGACCAGAGCTCCGAGGTGCTGGGAAGCGGCAAGACCCTGACAATCCAGGTGAAGGAGTTCGGCGATGCCGGCCAGTACACATGTCA CAAGGGCGGCGAGGTGCTGTCTCACAGCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAGGAGGACGGCATCTGGTCCACAGACATCCTGAAGGATCAGAAGGAGCCTAAGAACAAGACCTTCCTGCGGTGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGCCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGACCACAATCTCTACCGACCTGACCTTCAGCGTGAAGTCTAGCCGGGGCTCCTCTGATCCACAGGGAGTGACATGCGGAGCAGCCACCCTGAGCGCCGAGCGGGTGAGA GGCGACAACAAGGAGTACGAGTATAGCGTGGAGTGCCAGGAGGATTCCGCCTGTCCAGCAGCAGAGGAGTCCCTGCCTATCGAAGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAGCTGAAGTACGAGAATTATACAAGCTCCTTCTTTATCAGGGACATCATCAAGCCAG ATCCCCCTAAGAACCTGCAGCTGAAGCCCCTGAAGAATTCCCGCCAGGTGGAGG TGTCTTGGGAGTACCCTGATACCTGGTCCACACCACACAGCTATTTCTCCCTGAC CTTTTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGTCTAAGAGGGAGAAGAAGGACCGCGTGTTCACCGATAAGACAAGCGCCACCGTGATCTGTCGGAAGAACGCCTCCATCTCTGT GCGGGCTCAGGACCGATATTACTCATCATCATGGAGTGAATGGGCCTCAGTGCCT TGCTCAGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCCCAGAGCCTTGCTCTCTCTCTGCTCATTCTGGTGC TGGCATTCGGCATCCCACGTACCCAGGGCTCCGACGGCGGCGCGCAGGACTGTT GCCTGAAGTACTCCCAGCGCAAGATCCCCGCCAAGGTGGTCCGCAGCTACAGGAAGCAGGAGCCAAGTCTAGGGTGCTCTATCCCTGCCATCCTGTTTCTGCCCCGCAAGCGCAGCCAGGCCGAGCTGTGCGCCGACCCGAAGGAGCTTTGGGTGCAGCAGCTGATGCAACACTTGGATAAAACTCCGAGCCCTCAGAAGCCTGCTCAGGGGTGCCGAAAGGACCGCGGAGCTTCCAAGACCGGCAAAAAGGGTAAGGGCTCCAAAGGTTGTAAACGTACCGAACGGTCACAGACGCCCAAGGGACCC
SEQ ID NO:22. ヒトCCL21
MAQSLALSLLILVLAFGIPRTQGSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP
SEQ ID NO:23. MluI制限部位
ACGCGT
SEQ ID NO:24. ヒトIL-7
MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
SEQ ID NO:25. IL12p40-P2A-IL-7アミノ酸
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSS FFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
SEQ ID NO:26. IL12p40-P2A-IL7核酸
ATGTGCCACCAGCAGCTGGTGATCAGTTGGTTCTCTCTGGTGTTCCTGGCCTCGC CACTTGTTGCCATATGGGAACTCAAAAAGGACGTGTACGTGGTGGAGCTGGACT GGTACCCCGACGCTCCCGGGGAGATGGTGGTCCTGACCTGTGATACTCCGGAGG AAGATGGCATCACCTGGACATTGGATCAGAGCTCCGAGGTACTGGGCTCCGGCA AAACTCTGACCATCCAGGTGAAGGAGTTCGGTGATGCTGGACAATACACCTGCC ATAAGGGCGGCGAGGTTCTTAGCCATTCTCTGCTGCTCCTCCACAAGAAGGAAG ACGGTATTTGGTCGACCGACATCCTGAAGGACCAGAAGGAGCCCAAAAACAAGACTTTTTTGCGCTGCGAGGCCAAAAACTACTCCGGTCGCTTCACATGCTGGTGGCTAACGACCATCTCAACCGACCTGACCTTCTCTGTCAAGAGCTCTCGTGGCTCCAGCGATCCTCAGGGCGTCACCTGCGGGGCAGCCACCCTGAGCGCAGAGCGCGTGAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCGGTGGAGTGTCAGGAGGACTCGGCCTGCCCAGCGGCCGAGGAGAGCCTGCCCATTGAGGTGATGGTAGACGCCGTCCACAAGCTGAAGTACGAGAACTACACCTCCTCCTTCTTTATCCGGGACATCATCAAGCCCG ACCCGCCCAAGAACCTGCAGCTCAAGCCTTTGAAGAATTCCCGCCAGGTTGAAGTCAGTTGGGAGTACCCTGACACCTGGTCTACTCCGCACAGCTATTTCTCGCTGAC CTTCTGCGTGCAGGTCCAGGGAAAGTCCAAGCGCGAGAAGAAAGACAGGGTGTTCACCGACAAGACCTCCGCCACCGTGATTTGCCGAAAAAACGCCTCCATCTCCGTGCGTGCGCAGGACCGCTACTACAGTTCCTCTTGGTCCGAGTGGGCTTCCGTGCCTTGTTCAGGCAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGTTTCATGTCTCCTTCCGCTACATCTTCGGGCTCCCTCCCCTGATCCTCGTTCTGCTGCCAGTGGCATCTAGCGATTGTGACATTGAGGGCA AAGACGGCAAGCAATACGAGAGCGTGCTGATGGTGTCGATTGACCAGCTGTTGG ATTCTATGAAAGAGATCGGCTCCAACTGCCTGAACAACGAGTTCAACTTCTTCAAGCGCCACATCTGTGACGCCAACAAGGAAGGTATGTTTCTGTTCCGGGCCGCGCGCAAGCTGAGGCAGTTCCTGAAAATGAATTCCACCGGTGATTTCGACTTGCACCTGCTTAAGGTGTCCGAGGGCACGACCATCCTTCTTAACTGCACTGGACAGGTCAAGG GCCGTAAGCCCGCCGCTCTAGGGGAGGCTCAGCCGACAAAGTCGCTGGAGGAGAACAAGTCACTCAAAGAACAGAAGAAGCTCAACGACCTGTGCTTTTTGAAGCGCCTGCTGCAGGAGATCAAGACCTGTTGGAATAAGATCCTGATGGGCACCAAGGAGC AC
SEQ ID NO:27. MusH93 CARアミノ酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQADIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGR VTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTTTKPVLRT PSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR
SEQ ID NO:28. マウスCAR主鎖(マウスCD8αヒンジ-マウスCD8α膜貫通ドメイン-マウス4-1BB(CD137)の細胞質ドメイン-マウスCD3ζ細胞質)
TTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR
SEQ ID NO:29. マウスIL12p40
MCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRS
SEQ ID NO:30. マウスCCL-19
MAPRVTPLLAFSLLVLWTFPAPTLGGANDAEDCCLSVTQRPIPGNIVKAFRYLLNEDGCRVPAVVFTTLRGYQLCAPPDQPWVDRIIRRLKKSSAKNKGNSTRRSPVS
SEQ ID NO:31. マウスH93M CARアミノ酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQADIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGR VTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTKPVL RTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDW TPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMAPRVTPLLAFSLLVLWTFPAPTLGGANDAEDCCLSVTQRPIPGNIVKAFRYLLNEDGCRVPAVVFTTLRGYQLCAPPDQPWVDRIIRRLKKSSAKNKGNSTRRSPVS
SEQ ID NO:32. マウスH93M CAR核酸
ATGGCAAGTCCTCTGACTCGGTTTCTGTCTCTGAATCTGCTCCTCCTCGGTGAATCCATTATCCTCGGTTCCGGTGAAGCTAAGCCTCAGGCCGACATCGTGATGACACAGAGCCCACTGTCCCTGCCAGTGACCCCAGGAGAGCCTGCTAGCATCTCCTGTAGGAGCTCCCAGACAATCGTGCACAGCAACGGCAACACCTACCTGGAGTGGTACCTGCAGAAGCCTGGACAGTCCCCACAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACAGGTTTA GCGGCGTGCCCGACAGATTCTCTGGCAGCGGATCCGGCACAGACTTCACCCTGA AGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGATGTGGGAGTGTACTACTGTTTTCAGGTGAGCCACGTGCCATACACATTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCTCTA CAAGCGGATCCGGCAAGCCAGGATCCGGAGAGGGATCTACCAAGGGACAGGTG CAGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCTAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACCGACTACGAGATGCACTGGGTGCGGCAGGCTACAGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGAGGCATCGATCCTGAGACAGGC AACACCGCCTACAGCCAGAAGTTCAAGGGAAGGGTGACAATGACCAGAAACAC ATCTATCAGCACCGCTTACATGGAGCTGTCTAGCCTGCGGTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTCGCTACTACTCTTTTGCCTACTGGGGCCAGGGAACACTGG TGACCGTGTCCTCTACATCCACCACAACCAAGCCAGTGCTGAGGACCCCAAGCCCTGTGCACCCAACAGGCACCTCCCAGCCACAGAGGCCCGAGGATTGTAGGCCCAGAGGATCTGTGAAGGGCACAGGACTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCTCCTCTGGCTGGAATCTGCGTGGCTCTGCTGCTGTCTCTGATCATCACCCTGATCTGCAGCGTGCTGAAGTGGATCCGGAAGAAGTTCCCCCACATCTTTAAGCAGCCTTTCAAGAAGACAACCGGAGCTGCTCAGGAGGAGGACGCCTGCTCCTGTAGGTGCCCTCAGGAAGAAGAGGGAGGAGGAGGAGGATACGAGCTGAGGGCTAAGTTCTCCCGCTCTGCTGAGACAGCCGCTAACCTGCAGGATCCAAACCAGCTGTACAACGAGCT GAACCTGGGCAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGAGAAGAAGCGGGCTCGCGATCCTGAGATGGGAGGAAAGCAGCAGCGGCGCAGGAACCCACAGGAGGGCGTG TACAACGCTCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCTTACAGCGAGATCGGCACCAAGGGAGAGAGACGGCGCGGCAAGGGACACGATGGCCTGTACCAGGGACTCTC AACCGCTACTAAGGACACCTACGATGCTCTCCATATGCAGACCCTCGCACCCCGCGTTAACGGCAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTG GAGGAGAATCCCGGCCCTATGTGCCCTCAGAAACTGACTATATCATGGTTTGCCA TTGTGCTGCTGGTAAGTCCTCTCATGGCCATGTGGGAATTGGAGAAAGATGTGTA CGTGGTGGAGGTGGACTGGACCCCTGACGCACCAGGAGAAACAGTGAACCTGACGTGTGATACGCCAGAAGAGGATGACATTACTTGGACATCAGATCAAAGACACGG TGTCATAGGGTCAGGCAAAACTCTTACCATCACAGTCAAGGAGTTCCTAGATGCTGGCCAGTATACCTGCCATAAAGGAGGGGAAACCCTGTCCCACTCGCATCTGCTCCTCCACAAGAAGGAAAACGGCATCTGGAGCACAGAGATCCTGAAGAATTTTAAGAATAAGACCTTCTTGAAATGTGAGGCCCCCAACTACAGCGGGAGGTTCACCTGTTCCTGGCTGGTGCAACGGAACATGGACCTGAAGTTCAATATTAAATCTTCATCTTCC TCCCCGGACAGTCGCGCAGTTACTTGTGGCATGGCTTCTTTATCGGCAGAGAAAGTCACCCTTGACCAGCGCGACTATGAGAAGTATTCTGTTTCCTGCCAGGAGGACGTGACGTGCCCCACAGCTGAAGAGACTTTGCCTATTGAGTTAGCCCTGGAGGCCAG ACAACAGAACAAATATGAAAATTATTCCACTTCATTCTTCATCCGTGATATCATC AAGCCCGATCCACCCAAGAATCTTCAGATGAAGCCTCTAAAGAACAGCCAGGTGGAGGTTAGCTGGGAGTACCCAGATAGCTGGTCTACCCCACATTCCTACTTTAGTT TAAAGTTTTTTGTAAGAATCCAGAGGAAAAAAGAAAAGATGAAAGAGACTGAAGAAGGTTGCAACCAGAAGGGAGCGTTTCTCGTTGAGAAGACAAGCACAGAAGTCCAGTGCAAAGGTGGAAATGTATGTGTGCAAGCTCAGGACAGGTACTACAACAGTAGCTGTTCTAAGTGGGCATGTGTCCCCTGCCGAGTGCGGAGTGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCTCCTAGAGTGACACCTTTGCTGGCCTTTTCTCTTCTAGTGTTGTGGACGTTTCCTGCACCCACCCTGGGTGGAGCGAATGATGCAGAGGACTGCTGCCTCAGTGTCACCCAAAGGCCCATACCAGGGAACATTGTGAAGGCCTTCCGCTATCTTCTCAATGAAGATGGATGTCGGGTTCCTGCTGTGGTCTTCACTACTTTACGCGGCTACCAGCTGTGTGCTCCTCCAGACCAGCCCTGGGTGGACCGTATCATCCGAAGGCTGAAGAAAAGCAGCGCCAAGAACAAAGGCAACTCAACAAGAAGATCCCCAGTTTCC
SEQ ID NO:33. マウスH93IL12p40 CARアミノ酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQADIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGR VTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTKPVL RTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDW TPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRS
SEQ ID NO:34. マウスH93CCL19 CARアミノ酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQADIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGR VTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTKPVL RTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMAPRVTPLLAFSLLVLWTFPAPTLGGANDAEDCCLSVTQRPIPGNIVKAFRYLLNEDGCRVPAVVFTTLRGYQLCAPPDQPWVDRIIRRLKKSSAKNKGNSTRRSPVS
SEQ ID NO:35. mus261 CARアミノ酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQAQVQLEESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYRSSVCMGWFRQAPGKERERVAVIGRDGSTTYIDSVKGRFTISRDSAKNTLSLQMDNLKPEDTAMYSCAAGLGYWACEYNYWGQGTQVTVSSTSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR
SEQ ID NO:36. マウスIL7-F2A-マウスCCL19アミノ酸
MFHVSFRYIFGIPPLILVLLPVTSSECHIKDKEGKAYESVLMISIDELDKMTGTDSNCPNNEPNFFRKHVCDDTKEAAFLNRAARKLKQFLKMNISEEFNVHLLTVSQGTQTLVNCTSKEEKNVKEQKKNDACFLKRLLREIKTCWNKILKGSIGSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPMAPRVTPLLAFSLLVLWTFPAPTLGGANDAEDCCLSVTQRPIPGNIVKAFRYLLNEDGCRVPAVVFTTLRGYQLCAPPDQPWVDRIIRRLKKSSAKNKGNSTRRSPVS
SEQ ID NO:37. MB12アミノ酸(IL12p40-CD8αヒンジ-CD8α膜貫通ドメイン-CD8α細胞内細胞質ドメイン)
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYCNHRNRRR
SEQ ID NO:38. H93M-MB12 CARアミノ酸
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSIS TAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQ PLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKK LLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMDWTWILFLVAAATRVHSIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPE EDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCL YCNHRNRRRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDA EDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS
SEQ ID NO:39. H93M-MB12 CAR核酸
ATGGCCCTGCCTGTGACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCTGCCCGCCCTGACATTGTGATGACCCAGTCTCCCCTGTCCCTGCCAGTGACCCCTGGAGAGCCAGCCTCCATCTCTTGCAGGAGCTCCCAGACCATCGTGCACAGCAACGGC AATACATACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACAGGTTCAGCGGAGTGCCAGACCGCTTTAGCGGATCCG GATCTGGCACCGATTTCACACTGAAGATCTCTAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGG GCGTGTACTATTGCTTCCAGGTGAGCCACGTGCCATATACCTTTGGCGGCGGCAC AAAGCTGGAGATCAAGGGCAGCACCTCCGGATCTGGCAAGCCAGGATCCGGAGAGGGATCTACAAAGGGACAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAG ACTATGAGATGCACTGGGTGCGGCAGGCAACCGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGAGGAATCGACCCAGAGACAGGCAACACAGCCTACTCCCAGAAGTTTAAGGGCCGGGTGACCATGACAAGAAATACCAGCATCTCCACAGCCTATATGGAGCTGTCTA GCCTGAGATCTGAGGATACAGCCGTGTACTATTGTGCTCGCTACTATTCCTTTGC CTACTGGGGACAGGGGACACTGGTCACCGTCTCATCAACTAGTACCACGACGCC AGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGT CCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAA GATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAG AGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTG AGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTAC CAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCC CTGCCCCCTCGCGTTAACGGTTCCGGCGCCACCAACTTTTCACTGTTAAAGCAGGCCGGTGATGTGGAGGAGAATCCAGGCCCTATGGATTGGACCTGGATCCTCTTCCTGGTGGCTGCAGCCACCCGTGTCCACTCCATCTGGGAGCTGAAGAAGGACGTGTACGTGGTGGAGCTCGACTGGTACCCCGACGCTCCCGGGGAGATGGTGGTTCTGAC CTGTGACACCCCAGAGGAAGACGGCATCACCTGGACCCTGGACCAGAGCTCCGAGGTGCTGGGCTCCGGCAAAACTTTGACTATCCAGGTCAAGGAGTTCGGTGATGC AGGCCAATACACATGCCATAAGGGCGGCGAGGTGCTGTCTCATTCTCTGCTGCTGCTGCACAAGAAGGAAGATGGCATTTGGTCGACTGACATCCTGAAGGACCAGAAGGAGCCCAAGAACAAGACCTTCCTAAGGTGTGAGGCCAAGAACTATTCCGGTCGCTTCACATGTTGGTGGCTAACCACAATTTCGACCGACCTGACCTTTAGCGTAAAAT CCTCTCGTGGCTCGAGCGATCCTCAGGGAGTCACCTGCGGGGCCGCCACTCTGTCCGCCGAGCGCGTGCGCGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCCGTGGAGTGTCAGGAGGACAGCGCCTGCCCAGCAGCCGAGGAGAGCCTCCCCATCGAAGTGATGGTGGACGCGGTACACAAGCTGAAGTACGAGAACTACACCAGCTCCTTCTTCATCCG CGACATCATCAAGCCGGACCCGCCCAAAAACCTGCAGCTGAAACCTTTGAAAAACTCCCGCCAGGTCGAAGTCAGTTGGGAGTACCCGGACACCTGGTCGACTCCCCACAGCTATTTCAGTCTTACGTTCTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGTCCAAACGCGAGAAGAAAGACAGGGTGTTCACGGACAAGACTTCCGCTACCGTCATCTGCCGCAAGAACGCGAGCATCTCTGTCAGAGCTCAGGACCGCTACTACTCTTCCAGTTGGTCTGAGTGGGCGTCCGTCCCCTGTTCTACCACGACCCCGGCGCCGCGCCCCCCAACCCCTGCCCCTACCATTGCCTCACAGCCGTTGTCTCTGCGGCCCGAGGCGTGCCGACCTGCCGCGGGAGGCGCGGTGCACACGCGGGGTCTCGACTTTGCTTGTGATATTTACAT ATGGGCTCCCCTGGCCGGCACCTGCGGGGTTTTGCTCCTTTCCTTGGTGATCACTCTTTACTGCCTGTACTGCAATCACCGGAACCGCCGCCGTGGCAGTGGAGAGGGCA GAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCTC TGCTGCTGGCACTGAGTCTGCTGGTCCTGTGGACATCACCTGCACCTACCCTGAGTGGAACTAATGACGCTGAAGATTGTTGCCTGAGCGTGACCCAGAAGCCAATCCC CGGCTACATCGTGAGGAACTTCCACTATCTGCTGATCAAGGACGGATGCAGGGT GCCTGCAGTGGTGTTTACCACACTGCGGGGCAGACAGCTGTGCGCACCACCTGATCAGCCCTGGGTCGAGAGAATTATTCAGAGACTGCAGCGCACCTCAGCTAAGATG AAACGCCGCTCAAGT
SEQ ID NO:40. 抗クローディン18.2 VHHドメイン
QVQLEESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYRSSVCMGWFRQAPGKERERVAVIGRDGSTTYIDSVKGRFTISRDSAKNTLSLQMDNLKPEDTAMYSCAAGLGYWACEYNYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:41. 261 CARアミノ酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQAQVQLEESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYRSSVCMGWFRQAPGKERERVAVIGRDGSTTYIDSVKGRFTISRDSAKNTLSLQMDNLKPEDTAMYSCAAGLGYWACEYNYWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:42. 261M CARアミノ酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQAQVQLEESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYRSSVCMGWFRQAPGKERERVAVIGRDGSTTYIDSVKGRFTISRDSAKNTLSLQMDNLKPEDTAMYSCAAGLGYWACEYNYWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS
SEQ ID NO:43. 261M CAR核酸
ATGGCCTCACCGTTGACCCGCTTTCTGTCGCTGAACCTGCTGCTGCTGGGTGAGTCGATTATCCTGGGGAGTGGAGAAGCTAAGCCACAGGCACAGGTGCAGCTGGAGGAGTCTGGAGGAGGAAGCGTGCAAGTGGGAGGCTCCCTGAGGCTGTCTTGCGCAGCAAGCGGATACAGATCCAGCGTGTGCATGGGATGGTTTAGACAGGCACCAGGAAAGGAGAGGGAGAGAGTGGCAGTGATCGGAAGGGACGGATCCACCACATATATC GATTCTGTGAAGGGCCGGTTTACCATCTCCAGAGACTCTGCCAAGAACACACTGTCTCTGCAGATGGACAATCTGAAGCCTGAAGACACAGCCATGTACAGCTGCGCCG CCGGCCTGGGATACTGGGCTTGCGAATACAACTACTGGGGGCAGGGCACTCAGG TGACCGTCTCTTCTACTAGTACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACAT CTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACC CTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTA TGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAG AAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGA CGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCC GGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGTTAACGGCAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGTGCCACCAGCAGCTGGTGATCAGTTGGTTCTCTCTGGTGTTCCTGGCCTCGCCACTTGTTGCCATATGGGAACTCAAAAAGGACGTGTACGTGGTGGAGCTGG ACTGGTACCCCGACGCTCCCGGGGAGATGGTGGTCCTGACCTGTGATACTCCGGAGGAAGATGGCATCACCTGGACATTGGATCAGAGCTCCGAGGTACTGGGCTCCGG CAAAACTCTGACCATCCAGGTGAAGGAGTTCGGTGATGCTGGACAATACACCTG CCATAAGGGCGGCGAGGTTCTTAGCCATTCTCTGCTGCTCCTCCACAAGAAGGAAGACGGTATTTGGTCGACCGACATCCTGAAGGACCAGAAGGAGCCCAAAAACAAGACTTTTTTGCGCTGCGAGGCCAAAAACTACTCCGGTCGCTTCACATGCTGGTGGCTAACGACCATCTCAACCGACCTGACCTTCTCTGTCAAGAGCTCTCGTGGCTCCAGCGATCCTCAGGGCGTCACCTGCGGGGCAGCCACCCTGAGCGCAGAGCGCGTGAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCGGTGGAGTGTCAGGAGGACTCGGCCTGCCCAGCGGCCGAGGAGAGCCTGCCCATTGAGGTGATGGTAGACGCCGTCCACAAGCTGAAGTACGAGAACTACACCTCCTCCTTCTTTATCCGGGACATCATCAAGCCC GACCCGCCCAAGAACCTGCAGCTCAAGCCTTTGAAGAATTCCCGCCAGGTTGAAGTCAGTTGGGAGTACCCTGACACCTGGTCTACTCCGCACAGCTATTTCTCGCTGA CCTTCTGCGTGCAGGTCCAGGGAAAGTCCAAGCGCGAGAAGAAAGACAGGGTGTTCACCGACAAGACCTCCGCCACCGTGATTTGCCGAAAAAACGCCTCCATCTCCGTGCGTGCGCAGGACCGCTACTACAGTTCCTCTTGGTCCGAGTGGGCTTCCGTGCCTTGTTCAGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCTCTGCTGCTGGCACTGAGTCTGCTGGTCCTGTGGACATCACCTGCACCTACCCTGAGTGGAACTAATGACGCTGAAGATTGTTGCCTGAGCGTGACCCAGAAGCCAATCCCCGGCTACATCGTGAGGAACTTCCACTATCTGCTGATCAAGGACGGATGCAGGGTGCCTGCAGTGGTGTTTACCACACTGCGGGGCAGACAGCTGTGCGCACCACCTGATCAGCCCTGGGTCGAGAGAATTATTCAGAGACTG CAGCGCACCTCAGCTAAGATGAAACGCCGCTCAAGTTAA
SEQ ID NO:44. mus261M CARアミノ酸
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQAQVQLEESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYRSSVCMGWFRQAPGKERERVAVIGRDGSTTYIDSVKGRFTISRDSAKNTLSLQMDNLKPEDTAMYSCAAGLGYWACEYNYWGQGTQVTVSSTSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMAPRVTPLLAFSLLVLWTFPAPTLGGANDAEDCCLSVTQRPIPGNIVKAFRYLLNEDGCRVPAVVFTTLRGYQLCAPPDQPWVDRIIRRLKKSSAKNKGNSTRRSPVS
SEQ ID NO:45. mus261M CAR核酸
ATGGCCTCACCGTTGACCCGCTTTCTGTCGCTGAACCTGCTGCTGCTGGGTGAGTCGATTATCCTGGGGAGTGGAGAAGCTAAGCCACAGGCACAGGTGCAGCTGGAGGAGTCTGGAGGAGGAAGCGTGCAAGTGGGAGGCTCCCTGAGGCTGTCTTGCGCAGCAAGCGGATACAGATCCAGCGTGTGCATGGGATGGTTTAGACAGGCACCAGGAAAGGAGAGGGAGAGAGTGGCAGTGATCGGAAGGGACGGATCCACCACATATATCGATTCTGTGAAGGGCCGGTTTACCATCTCCAGAGACTCTGCCAAGAACACACTGT CTCTGCAGATGGACAATCTGAAGCCTGAAGACACAGCCATGTACAGCTGCGCCG CCGGCCTGGGATACTGGGCTTGCGAATACAACTACTGGGGGCAGGGCACTCAGG TGACCGTCTCTTCTACTAGTACTACTACCAAGCCAGTGCTGCGAACTCCCTCACC TGTGCACCCTACCGGGACATCTCAGCCCCAGAGACCAGAAGATTGTCGGCCCCG TGGCTCAGTGAAGGGGACCGGATTGGACTTCGCCTGTGATATTTACATCTGGGCACCCTTGGCCGGAATCTGCGTGGCCCTTCTGCTGTCCTTGATCATCACTCTCATCTGCTCTGTGCTCAAATGGATCAGGAAAAAATTCCCCCACATATTCAAGCAACCATTT AAGAAGACCACTGGAGCAGCTCAAGAGGAAGATGCTTGTAGCTGCCGATGTCCACAGGAAGAAGAAGGAGGAGGAGGAGGCTATGAGCTGAGAGCAAAATTCAGCAGGAGTGCAGAGACTGCTGCCAACCTGCAGGACCCCAACCAGCTCTACAATGAGCTCAATCTAGGGCGAAGAGAGGAATATGACGTCTTGGAGAAGAAGCGGGCTCGGG ATCCAGAGATGGGAGGCAAACAGCAGAGGAGGAGGAACCCCCAGGAAGGCGTA TACAATGCACTGCAGAAAGACAAGATGGCAGAAGCCTACAGTGAGATCGGCACAAAAGGCGAGAGGCGGAGAGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAG CACTGCCACCAAGGACACCTATGATGCCCTGCATATGCAGACCCTGGCCCCTCGCGGCAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGTGTCCTCAGAAGCTAACCATCTCCTGGTTTGCCATCGTTTTGCTGGTGTCTCCACTCATGGCCATGTGGGAGCTGGAGAAAGACGTTTATGTTGTAGAGGTGGACTGGACTCCCGATGCCCCTGGAGAAACAGTGAACCTCACCTGTGACACGCCTGAAGAAGATGACATCACCTGGACCTCAGACCAGAGACATGGAGTCATAGGCTCTGGAAAGACCCTGACCATCACTGTCAAAGAGTTTCTAGATGCTGGCCAGTACACCTGCCACAAAGGAGGCGAGACTCTGAGCCACTCACATCTGCTGCTCCACAAGAAGGAAAATGGAATTTGGTCCACTGAAATTTTAAAAAATTTCAAAAACAAGA CTTTCCTGAAGTGTGAAGCACCAAATTACTCCGGACGGTTCACGTGCTCATGGCTGGTGCAAAGAAACATGGACTTGAAGTTCAACATCAAGAGCAGTAGCAGTTCCCCTGACTCTCGGGCAGTGACATGTGGAATGGCGTCTCTGTCTGCAGAGAAGGTCAC ACTGGACCAAAGGGACTATGAGAAGTATTCAGTGTCCTGCCAGGAGGATGTCAC CTGCCCAACTGCCGAGGAGACCCTGCCCATTGAACTGGCGTTGGAAGCACGGCAGCAGAATAAATATGAGAACTACAGCACCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAA ACCAGACCCGCCCAAGAACTTGCAGATGAAGCCTTTGAAGAACTCACAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACTCCTGGAGCACTCCCCATTCCTACTTCTCCCTC AAGTTCTTTGTTCGAATCCAGCGCAAGAAAGAAAAGATGAAGGAGACAGAGGA GGGGTGTAACCAGAAAGGTGCGTTCCTCGTAGAGAAGACATCTACCGAAGTCCA ATGCAAAGGCGGGAATGTCTGCGTGCAAGCTCAGGATCGCTATTACAATTCCTCA TGCAGCAAGTGGGCATGTGTTCCCTGCAGGGTCCGATCCGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCT CCTAGAGTGACACCTTTGCTGGCCTTTTCTCTTCTAGTGTTGTGGACGTTTCCTGCACCCACCCTGGGTGGAGCGAATGATGCAGAGGACTGCTGCCTCAGTGTCACCCAAAGGCCCATACCAGGGAACATTGTGAAGGCCTTCCGCTATCTTCTCAATGAAGATGGATGTCGGGTTCCTGCTGTGGTCTTCACTACTTTACGCGGCTACCAGCTGTGTG CTCCTCCAGACCAGCCCTGGGTGGACCGTATCATCCGAAGGCTGAAGAAAAGCAGCGCCAAGAACAAAGGCAACTCAACAAGAAGATCCCCAGTTTCCTAA
SEQ ID NO:46. グリシン-セリンポリマーリンカー
(GSGGS)n[nは少なくとも1の整数である]
SEQ ID NO:47. グリシン-セリンポリマーリンカー
(GGGS)n[nは少なくとも1の整数である]
SEQ ID NO:48. グリシン-セリンポリマーリンカー
(GGGGS)n[nは少なくとも1の整数である]
Claims (54)
- 免疫エフェクター細胞であって、
(i)外因的に導入された、IL-12のp40サブユニット、
(ii)外因的に導入された、CCR7のリガンド、及び
(iii)機能的外因性受容体であって、
(a)細胞外抗原結合ドメインと、
(b)膜貫通ドメインと、
(c)細胞内シグナル伝達ドメインと
を含む、前記機能的外因性受容体
を発現し、
ここで、前記CCR7のリガンドがCCL-19であるか、又は、前記CCR7のリガンドがCCL-21である、
前記免疫エフェクター細胞。 - 前記p40が、ヒトp40又はその断片もしくは変異体である、請求項1に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記p40が、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記p40が、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記CCL-19が、ヒトCCL-19又はその断片もしくは変異体であり、且つ/又は、CCL-21が、ヒトCCL-21又はその断片もしくは変異体である、請求項1~4のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記CCL-19がSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含むか、又は、前記CCL-19が、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記CCL-21がSEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含むか、又は、前記CCL-21が、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記機能的外因性受容体が、T細胞受容体(TCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、キメラTCR(cTCR)、又はT細胞抗原結合体(TAC)様キメラ受容体である、請求項1~7のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記機能的外因性受容体がCARである、請求項8に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記膜貫通ドメインが、CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152、及びPD1からなる群から選択される分子に由来する、請求項1~9のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記膜貫通ドメインが、CD8α又はCD28からのものである、請求項10に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記一次細胞内シグナル伝達ドメインがCD3ζからのものである、請求項12に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項1~13のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83のリガンド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子に由来する、請求項14に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、CD28の細胞質ドメイン及び/又はCD137の細胞質ドメインを含む、請求項15に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記細胞外抗原結合ドメインのC末端と前記膜貫通ドメインのN末端との間に位置するヒンジドメインをさらに含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記ヒンジドメインがCD8αからのものである、請求項17に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記ポリペプチドのN末端に位置するシグナルペプチドをさらに含む、請求項1~18のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記シグナルペプチドがCD8αからのものである、請求項19に記載の免疫エフェクター細胞。
- T細胞である、請求項1~20のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞。
- ポリペプチドであって、
(i)外因的に導入された、IL-12のp40サブユニット、
(ii)外因的に導入された、CCR7のリガンド、及び
(iii)機能的外因性受容体であって、
(a)細胞外抗原結合ドメインと、
(b)膜貫通ドメインと、
(c)細胞内シグナル伝達ドメインと
を含む、前記機能的外因性受容体
を含み、
ここで、前記CCR7のリガンドがCCL-19であるか、又は、前記CCR7のリガンドがCCL-21である、
前記ポリペプチド。 - 前記p40が、ヒトp40又はその断片もしくは変異体である、請求項22に記載のポリペプチド。
- 前記p40が、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む、請求項22に記載のポリペプチド。
- 前記p40が、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項22に記載のポリペプチド。
- 前記CCL-19が、ヒトCCL-19又はその断片もしくは変異体であり、且つ/又は、前記CCL-21が、ヒトCCL-21又はその断片もしくは変異体である、請求項22~25のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記CCL-19がSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含むか、又は、前記CCL-19が、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項26に記載のポリペプチド。
- 前記CCL-21がSEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含むか、又は、前記CCL-21が、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項26に記載のポリペプチド。
- 前記機能的外因性受容体が、T細胞受容体(TCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、キメラTCR(cTCR)、又はT細胞抗原結合体(TAC)様キメラ受容体である、請求項22~28のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記機能的外因性受容体がCARである、請求項29に記載のポリペプチド。
- 前記膜貫通ドメインが、CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152、及びPD1からなる群から選択される分子に由来する、請求項22~30のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記膜貫通ドメインが、CD8α又はCD28からのものである、請求項31に記載のポリペプチド。
- 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項22~32のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記一次細胞内シグナル伝達ドメインがCD3ζからのものである、請求項33に記載のポリペプチド。
- 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項22~34のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83のリガンド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子に由来する、請求項35に記載のポリペプチド。
- 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、CD28の細胞質ドメイン及び/又はCD137の細胞質ドメインを含む、請求項36に記載のポリペプチド。
- 前記細胞外抗原結合ドメインのC末端と前記膜貫通ドメインのN末端との間に位置するヒンジドメインをさらに含む、請求項22~37のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ヒンジドメインがCD8αからのものである、請求項38に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドのN末端に位置するシグナルペプチドをさらに含む、請求項1~39のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記シグナルペプチドがCD8αからのものである、請求項40に記載のポリペプチド。
- 前記p40、前記CCL-19、及び前記機能的外因性受容体が、ペプチドリンカーを介して互いに連結されているか、又は、前記p40、前記CCL-21、及び前記機能的外因性受容体が、ペプチドリンカーを介して互いに連結されている、請求項22~41のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ペプチドリンカーが、F2A、E2A、P2A、T2A、及びそれらの変異体からなる群から任意に選択される2A自己切断ペプチドである、請求項42に記載のポリペプチド。
- 前記2A自己切断ペプチドが、SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含むP2A断片である、請求項43に記載のポリペプチド。
- 前記2A自己切断ペプチドが、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含むT2A断片である、請求項43に記載のポリペプチド。
- 前記p40と前記CCL-19が、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む1つのドメイン内に存在するか、又は、
前記p40と前記CCL-19が、1つのドメイン内に存在し、前記ドメインが、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項22~45のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - 前記p40と前記CCL-21が、SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含む1つのドメイン内に存在するか、又は、
前記p40と前記CCL-21が、1つのドメイン内に存在し、前記ドメインが、SEQ ID NO:20のアミノ酸配列との少なくとも75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項22~45のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - 請求項22~47のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸。
- 単離された核酸であって、
(i)第1の領域であって、
外因的に導入された、IL-12のp40サブユニット
をコードする、前記第1の領域、
(ii)第2の領域であって、
外因的に導入された、CCR7のリガンド
をコードする、前記第2の領域、及び
(iii)機能的外因性受容体をコードする第3の領域であって、
前記機能的外因性受容体が、
(a)細胞外抗原結合ドメインと、
(b)膜貫通ドメインと、
(c)細胞内シグナル伝達ドメインと
を含む、前記第3の領域
を含み、
ここで、前記CCR7のリガンドがCCL-19であるか、又は、前記CCR7のリガンドがCCL-21である、
前記単離された核酸。 - 請求項49に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
- 免疫エフェクター細胞を作製する方法であって、
免疫細胞に、
(i)請求項48もしくは請求項49に記載の核酸、又は請求項50に記載のベクター、又は、
(ii)IL-12のp40サブユニット、CCL-19、及び機能的外因性受容体のうちの一つもしくは二つをそれぞれがコードする二つもしくはそれ以上の核酸を含む組成物、又はIL-12のp40サブユニット、CCL-21、及び機能的外因性受容体のうちの一つもしくは二つをそれぞれがコードする二つもしくはそれ以上の核酸を含む組成物
を導入することを含む、前記方法。 - 請求項51に記載の方法によって産生された免疫エフェクター細胞。
- 請求項1~21及び52のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞、請求項22~47のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項48もしくは49に記載の核酸、又は請求項50に記載のベクターと、薬学的に許容されるキャリアとを含む、医薬組成物。
- 対象の疾患又は障害を治療する方法であって、前記対象に有効量の請求項53に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
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