CN116507357A - 用于产生生物工程化的病毒特异性淋巴细胞的材料和方法 - Google Patents

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CN116507357A CN202180068030.4A CN202180068030A CN116507357A CN 116507357 A CN116507357 A CN 116507357A CN 202180068030 A CN202180068030 A CN 202180068030A CN 116507357 A CN116507357 A CN 116507357A
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R·甘尼桑
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Abstract

一种用于活化或富集Vβ17+CD8+T细胞的方法,包括使源自人甲型流感病毒的M1肽(M1 58‑66)与包含T细胞的细胞群接触。

Description

用于产生生物工程化的病毒特异性淋巴细胞的材料和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年8月10日提交的美国序列号63/063,749、2020年8月10日提交的美国序列号63/063,771、2020年8月10日提交的美国序列号63/063,784、2020年8月10日提交的美国序列号63/063,793、2020年8月10日提交的美国序列号63/063,801、2020年8月10日提交的美国序列号63/063,806、2020年8月10日提交的美国序列号63/063,811的权益,这些申请中的每一篇全文以引用方式并入本文。
以电子方式提交的参考序列表
本申请包含序列表,该序列表作为ASCII格式的序列表经由EFS-Web以电子方式递交,文件名为“14620-544-228_SEQ_LISTING.txt”,创建日期为2021年7月26日,并且大小为8,048字节。经由EFS-Web提交的该序列表是本说明书的一部分并且全文以引用方式并入本文。
1.技术领域
在一些实施方案中,本文提供了生物工程化的淋巴细胞,诸如生物工程化的T细胞和使用改良T细胞的过程。公开了用于产生此类T细胞(包括流感特异性Vβ17+CD8+T细胞)的方法及此类T细胞例如用于制备表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的用途。在某些实施方案中,本文还提供了包含CAR-T细胞的组合物及该组合物治疗疾病或障碍的用途。
2.背景技术
经遗传修饰以识别恶性肿瘤相关抗原的免疫细胞的过继转移显示出作为治疗癌症的新方法的希望(参见,例如,Brenner等人,Current Opinion in Immunology,22(2):251-257(2010);Rosenberg等人,Nature Reviews Cancer,8(4):299-308(2008))。例如,表达嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞已经作为最有效的癌症治疗之一出现。
常规地,为了生成临床级CAR-T细胞,通过白细胞除去法(leukapheresis)从患者体内(或外周血)收集T细胞,活化T细胞,使用病毒载体用CAR构建体转导T细胞,扩增T细胞,并且然后在淋巴细胞清除性化疗之后作为单次治疗再输注给同一患者(参见Ruella等人,BioDrugs,31(6):473-481(2017))。尽管CAR-T疗法的治疗结果是前所未有的,但受自身特征显著地限制。例如,不能从所有患者收获T细胞,并且T细胞的质量可能不满足制造标准。另外,常规的CAR-T疗法具有固有的制造问题,诸如制造失效、时间延迟、细胞扩增不充分或异质产物,这些问题可对受体患者有害。对于此类高度个性化的程序,高成本也是不可避免的。因此,需要改良的T细胞疗法。
3.发明内容
在一个方面,本文提供了一种用于活化或富集Vβ17+CD8+T细胞的方法,该方法包括使源自人甲型流感病毒的M1肽(M158–66)与包含T细胞的细胞群接触。
在一些实施方案中,该M1肽包含GILGFVFTL(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该方法还包括使IL-2与包含T细胞的细胞群接触。
在一些实施方案中,在包含M1肽和/或IL-2的培养基中离体培养该细胞群。
在一些实施方案中,该方法包括:(i).在包含M1肽和IL-2的培养基中离体培养该细胞群;(ii).在包含M1肽的培养基中离体培养该细胞群,并且然后在包含IL-2的培养基中离体培养该细胞群;或(iii).在包含M1肽的培养基中离体培养该细胞群,并且然后在包含M1肽和IL-2的培养基中离体培养该细胞群;并且然后在包含IL-2的培养基中离体培养该细胞群。
在一些实施方案中,该细胞群离体培养至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。
在一些实施方案中,该细胞群离体培养1-20天、2-18天、3-16天、4-14天、5-14天、6-14天、7-14天、8-14天、9-14天、10-14天、11-14天或12-14天。
在一些实施方案中,该细胞群是全外周血单核细胞(PBMC)群。在一些实施方案中,该全PBMC群来自健康供体。
在一些实施方案中,来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比是CD8+细胞的2%-10%。在一些实施方案中,来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比是CD8+细胞的3%-8%。在一些实施方案中,来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比是CD8+细胞的4%-6%。在一些实施方案中,来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比是CD8+细胞的4%-5%。在一些实施方案中,来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比是CD8+细胞的5%-6%。在一些实施方案中,来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比是CD8+细胞的5.5%。
在一些实施方案中,该方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、90%、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍或14倍;或者其中该方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加到CD8+细胞的至少6%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%。
在一些实施方案中,该方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的10%至20倍、20%至20倍、30%至20倍、40%至20倍、50%至20倍、60%至20倍、70%至20倍、80%至20倍、90%至20倍、2倍至20倍、3倍至20倍、4倍至20倍、5倍至20倍、6倍至20倍、7倍至20倍、8倍至20倍、9倍至20倍、10倍至20倍、11倍至20倍、12倍至20倍、13倍至20倍、14倍至20倍或15倍至20倍;或者其中该方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加到CD8+细胞的6%至99%、10%至99%、15%至99%、20%至99%、25%至99%、30%至99%、35%至99%、40%至99%、45%至99%、50%至99%、55%至99%、60%至99%、65%至99%、70%至99%、75%至99%、80%至99%、85%至99%或90%至99%。
在一些实施方案中,该方法还包括在使该细胞群与M1肽和/或IL-2接触之后从该细胞群中分离Vβ17+CD8+T细胞。
在另一方面,本文提供了根据本文提供的方法产生的分离的Vβ17+CD8+T细胞群。
在另一方面,该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比大于该分离的细胞群的6%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%。在一些实施方案中,该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是该分离的细胞群的6%至99%、10%至99%、15%至99%、20%至99%、25%至99%、30%至99%、35%至99%、40%至99%、45%至99%、50%至99%、55%至99%、60%至99%、65%至99%、70%至99%、75%至99%、80%至99%、85%至99%或90%至99%。在一些实施方案中,Vβ17+CD8+T细胞的至少一部分表达能够与M1肽结合的细胞表面受体。
在另一方面,本文提供了一种用于制备CAR-T细胞的方法,该方法包括:(i)获得本文提供的包含Vβ17+CD8+T细胞的分离的细胞群;并且(ii)将编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入Vβ17+CD8+T细胞中。在一些实施方案中,该CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。在一些实施方案中,该细胞外结构域与癌细胞上表达的抗原结合。在一些实施方案中,该癌细胞是血癌细胞。在一些实施方案中,该癌细胞是实体瘤癌细胞。在一些实施方案中,该抗原是CD123。在一些实施方案中,该抗原是PSMA。
在另一方面,本文提供了根据本文提供的方法产生的CAR-T细胞。
在另一方面,本文提供了一种用于治疗受试者的疾病或障碍的方法,该方法包括向受试者施用治疗有效量的本文提供的CAR-T细胞。在一些实施方案中,疾病或障碍为癌症。在一些实施方案中,癌症是血癌。在一些实施方案中,癌症是实体瘤癌症。在一些实施方案中,受试者是对其有需要的人类受试者。
在又一方面,本文提供了一种用于制备CAR-T细胞的过程,该过程包括:(i)执行获得本文提供的包含Vβ17+CD8+T细胞的分离的细胞群的功能的步骤;和(ii)执行在Vβ17+CD8+T细胞中表达CAR的功能的步骤。
在又一方面,本文提供了一种系统,该系统包含:能够结合癌细胞表面上的抗原的第一构件;和能够减少针对供体T细胞的同种异体反应性的第二构件。在一些实施方案中,能够结合癌细胞表面上的抗原的第一构件包含由本文提供的CAR-T细胞表达的CAR。在一些实施方案中,能够减少针对供体T细胞的同种异体反应性的第二构件包含Vβ17+CD8+T细胞。
在又一方面,本文提供了一种T细胞,该T细胞包含能够结合癌细胞表面上的抗原的第一构件和能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的M1肽的第二构件。在一些实施方案中,T细胞是Vβ17+CD8+T细胞。在一些实施方案中,能够结合癌细胞表面上的抗原的第一构件包含由本文提供的CAR-T细胞表达的CAR。在一些实施方案中,能够结合M1肽的第二构件包含能够结合M1肽的T细胞受体(TCR)。
4.附图说明
图1示出了在健康个体的全外周血单核细胞(PBMC)中Vβ17+CD8+T细胞的普遍率。所标示的荧光激活细胞分选(FACS)图中的数字是指CD8+T细胞中Vβ17+细胞的频率。点阵图标示了HLA-A2+和HLA-A2-健康个体的总CD8+T细胞中Vβ17+细胞的平均(±SEM)频率。每个点代表来自健康供体的数据。
图2A-图2D显示Vβ17+CD8+T细胞是甲型流感特异性的并且可以被活化和离体扩增。图2A说明Vβ17+CD8+T细胞从用M1肽和IL-2刺激的全PBMC中的选择性富集。Vβ17+T细胞从来自用M1肽和IL-2刺激12天的全PBMC的阴性富集CD8+T细胞中阳性分离。代表性点阵图中门上方的值是指Vβ17+细胞分离方案的未触及级分(左)、阳性级分(中)和阴性级分(右)中CD8+T细胞的频率。下排中的数字是指Vβ17+细胞分离方案的未触及级分(左)、阳性级分(中)和阴性级分(右)中富集的CD8+T细胞中的Vβ17-CD8+和Vβ17+CD8+T细胞。图2B说明柱状图叠加,其中数字是指在M1肽和IL-2或单独的IL-2的存在下培养的,活化标志物(CD25、CD71、CD69)和细胞内效应分子(颗粒酶B、穿孔素和CD107a)呈阳性的Vβ17+CD8+T细胞的频率。粗的和点状开放柱状图分别是指来自M1肽加上IL-2的培养条件对比单独的IL-2培养条件的Vβ17+CD8+T细胞。对于图2B此处示出了来自2个独立实验的代表性数据。封闭灰色柱状图反映荧光减一(FMO)对照。图2C说明代表性FACS图,该图示出在刺激第0天(左)和第14天(中),CD8+T细胞中Vβ17+细胞的频率。门下方的数字表示总CD8+T细胞中门控群的频率。图表(右)汇总了在M1肽刺激第0天和第14天来自健康个体的全PBMC的CD8+T细胞中Vβ17+细胞的频率。每个点代表来自健康供体的数据。图2C中示出了来自8个独立实验的9个供体的代表性数据。图2D(左)说明从用M1肽和IL-2刺激的PBMC培养物第12天富集的Vβ17+CD8+T细胞的丰度。图2D(右)说明在富集的Vβ17+CD8+T细胞中负载M1肽的四聚体-Vβ17+和负载M1肽的四聚体+Vβ17+细胞的频率。Tet代表四聚体。示出了来自2个独立实验的代表性数据。
图3显示Vβ17+CD8+T细胞可以用抗肿瘤相关抗原(TAA)嵌合抗原受体(CAR)信使RNA(mRNA)构建体有效转染。富集的Vβ17+CD8+T细胞用编码抗CD123/PSMA CAR构建体的mRNA转染,如以下实施例部分详细描述的那样。代表性FACS图中门上方的数字是指GFP(上方)和CAR表面表达(下方)为阴性或阳性细胞的频率。
图4A-图4D显示CAR介导的Vβ17+CD8+T细胞的重定向有效地消除液体瘤和实体瘤。图4A说明CD8+T细胞从用M1肽和IL-2刺激12天的全PBMC(来自HLA*0201供体)富集。富集的CD8+T细胞进一步富集Vβ17+细胞,并且然后用GFP、抗CD123 CAR mRNA构建体或抗PSMA CARmRNA构建体转染。将CAR转染的Vβ17+CD8+T细胞(效应物)与相应的羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的靶细胞以标示的效应物与靶标比率(ET比)在37℃处在湿润的CO2培养箱中共培养24小时(对于Kasumi-3而言)和72小时(对于22Rv1细胞而言)。通过7-氨基放线菌素D(7-AAD)染色和流式细胞术确定靶细胞裂解。代表性图表中的圆圈和正方形分别描绘了在所标示的ET比率下由抗CD123 CAR(左)或抗PSMA CAR(右)和GFP转染的Vβ17+CD8+T效应细胞介导的靶细胞裂解的频率。图4B说明了代表性柱状图叠加。门是指与相应的靶细胞(以1:1ET比率)共培养时,在共培养第5天对于CellTraceTM紫(CTV)稀释(增殖)呈阳性的效应细胞的频率。点状开口柱状图和封闭柱状图分别是指与相应的靶细胞共培养的GFP转染的效应细胞和非转染的效应细胞。图4C说明了来自图4A的细胞培养物上清液的细胞因子浓度(pg/mL)。黑色柱和灰色柱是指抗CD123/PSMA CAR和GFP转染的效应细胞分别在与靶细胞共培养时产生的细胞因子/效应分子的浓度。此处示出了分别来自一个和两个独立实验的一个供体(图4A和图4C)和两个供体(图4B)的代表性实验。图4D(左)说明了用负载M1肽的MHCI类四聚体和抗人Vβ17mAb染色的第12天富集的Vβ17+CD8+T细胞。图4D(右)说明了代表性点阵图,该点阵图示出在富集的Vβ17+CD8+T细胞中M1 Tet-Vβ17+和M1Tet+Vβ17+细胞的丰度。象限中的数字是指对于M1 Tet+Vβ17+细胞的相应分化标志物呈阳性的细胞的百分比(原初细胞:CD27+CD45RA+;中央记忆细胞(TCM):CD27+CD45RA-;效应记忆细胞(TEM):CD27-CD45RA-;再表达CD45RA的效应记忆细胞(EMRA)(TEMRA):CD45RA+CD27-)。对于图4D示出了来自两个独立实验的两个独立供体数据的代表性数据。
图5A-图5D显示CAR介导的Vβ17+CD8+T细胞的效应谱。Vβ17+CD8+T细胞从健康个体(印度裔)的全PBMC富集,并用抗CD123或PSMA CAR mRNA转染。将抗CD123或PSMA CAR转染的Vβ17+CD8+T细胞(效应物)与CFSE标记的靶细胞以标示的ET比在37℃处在湿润的CO2培养箱中共培养24小时(对于Kasumi-3而言)和72小时(对于22Rv1细胞而言)。通过7-AAD染色和流式细胞术确定靶细胞裂解。图5A说明了细胞裂解的测量结果。代表性图表中的圆圈和正方形分别描绘了在所标示的ET比率下由抗CD123(左)或抗PSMA(右)CAR和GFP转染的Vβ17+CD8+效应T细胞介导的靶细胞裂解的平均(±SEM)频率。图5B说明了代表性柱状图叠加。门上方的数字是指与相应的靶细胞共培养时在共培养第5天,对于CTV稀释(增殖)呈阳性的效应细胞的平均(±SEM)频率。点状开口柱状图和封闭柱状图分别是指与相应的靶细胞共培养的GFP转染的效应细胞和非转染的效应细胞。图5C说明了来自图5A的细胞培养物上清液的细胞因子/效应分子浓度(pg/mL)。黑色柱和灰色柱是指由抗CD123 CAR、抗PSMA CAR或GFP转染的效应细胞分别在与靶细胞共培养时产生的细胞因子/效应分子的浓度。此处所示的值是来自两个独立实验的两个独立供体的累积值。图5D(左)说明从新鲜PBMC富集的Vβ17+CD8+T细胞的频率。图5D(右)说明与靶细胞共培养时Vβ17+CD8+T细胞的分化状态。象限中的数字是指用CAR转染并且与靶细胞以1:1的ET比共培养的Vβ17+CD8+T细胞中对于相应分化标志物呈阳性的细胞(原初细胞:CCR7+CD45RA+;中央记忆细胞(TCM):CCR7+CD45RA-;效应记忆细胞(TEM):CCR7-CD45RA-;EMRA(TEMRA):CD45RA+CCR7-)。对于图5D示出了来自一个独立实验的两个独立供体数据的代表性数据。
5.具体实施方式
本公开部分地基于用于产生Vβ17+CD8+T细胞的新型方法或过程和它们的有利特性,以及它们制备用于治疗疾病或障碍的细胞疗法的用途。
5.1.定义
本文描述或引用的技术和程序包括本领域技术人员通常熟知的和/或使用常规方法通常采用的那些,诸如例如以下文献中描述的广泛利用的方法:Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3d ed.2001);Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人编辑,2003);Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic(An编辑,2009);Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols(Albitar编辑,2010);以及Antibody Engineering,第1卷和第2卷(Kontermann和Dübel编辑,第2版,2010)。除非本文另有定义,否则本说明书中使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。出于解释本说明书的目的,将应用以下术语描述,并且只要适当,以单数使用的术语也将包括复数,反之亦然。在所阐述的术语的任何描述与以引用方式并入本文的任何文档冲突的情况下,将以下面所阐述的术语的描述为准。
术语“抗体”、“免疫球蛋白”或“Ig”在本文中可互换使用,并且以最广泛的意义使用,并且具体地涵盖例如单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长或完整的单克隆抗体)、具有多表位或单表位特异性的抗体组合物、多克隆或单价抗体、多价抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如,双特异性抗体,只要它们表现出期望的生物活性即可),如下文所述。抗体可以是人的、人源化的、嵌合的和/或亲和力成熟的,以及来自其他物种例如小鼠、兔、美洲驼等的抗体。术语“抗体”旨在包括免疫球蛋白多肽类别内的B细胞的多肽产物,其能够与特定分子抗原结合并且由两对相同的多肽链组成,其中每对具有一条重链(约50kDa-70kDa)和一条轻链(约25kDa),每条链的每个氨基末端部分包括约100个至约130个或更多个氨基酸的可变区,并且每条链的每个羧基末端部分包括恒定区。参见例如,Antibody Engineering(Borrebaeck编辑,第2版,1995);和Kuby,Immunology(第3版,1997)。抗体还包括但不限于合成抗体、重组产生的抗体、包括来自骆驼科物种(例如美洲驼或羊驼)的单结构域抗体或其人源化变体、细胞内抗体、抗独特型(抗Id)抗体和上述任一种的功能性片段(例如,抗原结合片段),其是指保留了该片段所来源的抗体的一些或全部结合活性的抗体重链或轻链多肽的部分。功能性片段(例如,抗原结合片段)的非限制性示例包括单链Fv(scFv)(例如,包括单特异性、双特异性等)、Fab片段、F(ab')片段、F(ab)2片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和微抗体。具体地,本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分,例如,含有结合抗原的抗原结合位点的抗原结合结构域或分子(例如,抗体的一个或多个CDR)。此类抗体片段可见于例如Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratory Manual(1989);Mol.Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference(Myers编辑,1995);Huston等人,1993,Cell Biophysics22:189-224;Plückthun和Skerra,1989,Meth.Enzymol.178:497-515;和Day,Advanced Immunochemistry(第2版,1990)。本文提供的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。抗体可以是激动性抗体或拮抗性抗体。抗体可能既不是激动性的也不是拮抗性的。
“抗原”是抗体可选择性结合的结构。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在的或合成的化合物。在一些实施方案中,靶抗原是多肽。在某些实施方案中,抗原与细胞缔合,例如,存在于细胞上或细胞中。
“完整”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定区CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可包括人恒定区或其氨基酸序列变体。在某些实施方案中,完整抗体具有一种或多种效应子功能。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”,是包含连接成单一多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地,该sFv多肽还包含在VH结构域与VL结构域之间的多肽接头,该多肽接头使得该sFv能够形成抗原结合所需的结构。关于sFv的综述,参见Pluckthun,ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
术语“结合(binds)”或“结合(binding)”是指分子之间的相互作用,包括例如形成复合物。相互作用可以是例如非共价相互作用,包括氢键、离子键、疏水相互作用和/或范德华相互作用。复合物还可包括通过共价键或非共价键、相互作用或力保持在一起的两个或多个分子的结合。抗体上的单个抗原结合位点和靶分子诸如抗原的单个表位之间的总非共价相互作用的强度是抗体或功能性片段对该表位的亲和力。结合分子(例如抗体)与单价抗原的解离速率(koff)与缔合速率(kon)的比率(koff/kon)为解离常数KD,其与亲和力成反比。KD值越低,抗体的亲和力越高。KD值随着抗体和抗原的不同复合物而变化,并且取决于kon和koff两者。本文提供的抗体的解离常数KD可使用本文提供的任何方法或本领域技术人员众所周知的任何其他方法来确定。一个结合位点处的亲和力并不总是反映抗体与抗原之间的相互作用的真实强度。当含有多个重复抗原决定簇的复合抗原(诸如多价抗原)与含有多个结合位点的抗体接触时,抗体与抗原在一个位点处的相互作用将增加在第二个位点处反应的概率。多价抗体与抗原之间的这种多重相互作用的强度称为亲合力。
与本文所述的结合分子相关的术语,诸如“结合”、“特异性结合”和类似术语在本文中也可互换使用,并且是指特异性结合抗原诸如多肽的抗原结合结构域的结合分子。结合或特异性结合抗原的结合分子或抗原结合结构域可例如通过免疫测定、或本领域技术人员已知的其他技术来鉴定。在一些实施方案中,如使用实验技术诸如放射性免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)确定的,当结合分子或抗原结合结构域以比与任何交叉反应性抗原更高的亲和力结合抗原时,它结合或特异性结合抗原。典型地,特异性或选择性反应将为背景信号或噪声的至少两倍,并且可以是背景的10倍以上。参见例如Fundamental Immunology332-36(Paul编辑,第2版,1989年)有关结合特异性的讨论。在某些实施方案中,结合分子或抗原结合结构域与“非靶”蛋白的结合程度小于结合分子或抗原结合结构域与其特定靶抗原结合的约10%,例如,如通过FACS分析或RIA所确定的。与抗原结合的结合分子或抗原结合结构域包括能够以足够亲和力结合抗原的一种结合分子或抗原结合结构域,使得结合分子可用作例如靶向抗原的治疗剂和/或诊断剂。在某些实施方案中,与抗原结合的结合分子或抗原结合结构域具有小于或等于1μM、800nM、600nM、550nM、500nM、300nM、250nM、100nM、50nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM的解离常数(KD)。在某些实施方案中,结合分子或抗原结合结构域结合在来自不同物种的抗原中保守的抗原表位。
在某些实施方案中,结合分子或抗原结合结构域可包含“嵌合”序列,其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源,而链的剩余部分与来源于另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的对应序列相同或同源,只要它们表现出期望的生物活性即可(参见美国专利号4,816,567;和Morrison等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-55)。嵌合序列可包括人源化序列。
在某些实施方案中,结合分子或抗原结合结构域可包含非人(例如,骆驼、鼠类、非人灵长类)抗体的“人源化”形式的部分,这些抗体包括来自人免疫球蛋白(例如,受体抗体)的序列,其中天然CDR残基被来自非人物种诸如骆驼、小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(例如,供体抗体)的具有期望的特异性、亲和力和能力的对应CDR的残基替换。在一些情况下,人免疫球蛋白序列的一个或多个FR区残基被对应的非人残基替换。此外,人源化抗体可包含受体抗体或供体抗体中没有的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。人源化抗体重链或轻链可包含基本上所有的至少一个或多个可变区,其中所有或基本上所有的CDR对应于非人免疫球蛋白的那些,并且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的那些。在某些实施方案中,人源化抗体将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分,通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。对于更多细节,参见Jones等人,Nature 321:522-25(1986);Riechmann等人,Nature 332:323-29(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-96(1992);Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-89(1992);美国专利号6,800,738;6,719,971;6,639,055;6,407,213;和6,054,297。
在某些实施方案中,结合分子或抗原结合结构域可包含“完全人抗体”或“人抗体”的部分,其中这些术语在本文中可互换使用并且是指包含人可变区和例如人恒定区的抗体。结合分子可包含单结构域抗体序列。在具体实施方案中,这些术语是指包含人来源的可变区和恒定区的抗体。在某些实施方案中,“完全人”抗体还可涵盖结合多肽并由核酸序列编码的抗体,该核酸序列是人种系免疫球蛋白核酸序列的天然存在的体细胞变体。术语“完全人抗体”包括具有对应于如Kabat等人所述的人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体(参见Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.DeparTMent of Health and Human Services,NIH公开号91-3242)。“人抗体”是指具有与由人产生和/或已使用用于制备人抗体的任何技术制备的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这一定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可使用本领域已知的各种技术来产生人抗体,包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991);Marks等人,J.Mol.Biol.222:581(1991))和酵母展示文库(Chao等人,Nature Protocols 1:755-68(2006))。也可用于制备人单克隆抗体的方法描述于Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77(1985);Boerner等人,J.Immunol.147(1):86-95(1991);以及van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)。人抗体可通过将抗原施用到转基因动物来制备,该转基因动物已被修饰以响应于抗原攻击而产生此类抗体,但其内源性基因座已被禁用,例如小鼠(参见例如,Jakobovits,Curr.Opin.Biotechnol.6(5):561-66(1995);Brüggemann和Taussing,Curr.Opin.Biotechnol.8(4):455-58(1997);和关于XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584)。还参见例如Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:3557-62(2006)关于经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体。
在某些实施方案中,结合分子或抗原结合结构域可包含“重组人抗体”的部分,其中该短语包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的人抗体,诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组组合人抗体文库中分离的抗体、从人免疫球蛋白基因的转基因和/或转染色体的动物(例如,小鼠或牛)中分离的抗体(参见例如,Taylor,L.D.等人,Nucl.Acids Res.20:6287-6295(1992))或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体可具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(参见Kabat,E.A.等人(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest,第五版,U.S.DeparTMent of Health and HumanServices,NIH公开号91-3242)。然而,在某些实施方案中,对此类重组人抗体进行体外诱变(或者,当使用针对人Ig序列的转基因动物时,进行体内体细胞诱变),并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列,其虽然衍生自人种系VH和VL序列并与之相关,但可能不天然存在于体内人抗体种系组库内。
在某些实施方案中,结合分子或抗原结合结构域可包含“单克隆抗体”的一部分,其中如本文所用的术语是指从基本上均一的抗体群体中获得的抗体,例如,除了可能以少量存在的天然存在的突变或众所周知的翻译后修饰诸如氨基酸磷酸化或脱酰胺化、甲硫氨酸氧化或天冬酰胺或谷氨酰胺脱酰胺化之外,组成群体的单个抗体是相同的,每个单克隆抗体通常将识别抗原上的单个表位。在具体实施方案中,如本文所用,“单克隆抗体”是由单个杂交瘤或其他细胞产生的抗体。术语“单克隆”不限于用于制备抗体的任何特定方法。例如,可用于本公开的单克隆抗体可通过首先由Kohler等人,Nature 256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备,或者可在细菌或真核动物或植物细胞中使用重组DNA方法制备(参见例如,美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可使用例如Clackson等人,Nature352:624-28(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-97(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。用于制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其他方法在本领域中是众所周知的。参见例如Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑,第5版,2002)。
典型的4链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。在IgG的情况下,4链单元通常为约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接,而两条H链根据H链同种型通过一个或多个二硫键彼此连接。每条H和L链还具有规则间隔的链内二硫键。每条H链在N-末端具有可变结构域(VH),随后是α链和γ链中的每一条的三个恒定结构域(CH)以及μ和ε同种型的四个CH结构域。每条L链在N-末端具有可变结构域(VL),随后在其另一端具有恒定结构域(CL)。VL与VH对准,并且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对准。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别的抗体的结构和特性,参见例如Basicand Clinical Immunology 71(Stites等人编辑,第8版,1994);和Immunobiology(Janeway等人编辑,第5版,2001)。
术语“Fab”或“Fab区”是指结合抗原的抗体区。常规IgG通常包含两个Fab区,每个Fab区驻留在Y形IgG结构的两个臂中的一个臂上。每个Fab区通常由重链和轻链中的每一者的一个可变区和一个恒定区构成。更具体地,Fab区中重链的可变区和恒定区为VH和CH1区,并且Fab区中的轻链的可变区和恒定区为VL和CL区。Fab区中的VH、CH1、VL和CL可以各种方式布置以赋予根据本公开的抗原结合能力。例如,VH和CH1区可在一个多肽上,并且VL和CL区可在单独的多肽上,类似于常规IgG的Fab区。另选地,VH、CH1、VL和CL区可全部在同一多肽上并以不同的顺序取向,如下文部分更详细描述的。
术语“可变区”、“可变结构域”、“V区”或“V结构域”是指抗体的轻链或重链的一部分,其通常位于轻链或重链的氨基末端,并且在重链中具有约120至130个氨基酸的长度以及在轻链中具有约100至110个氨基酸的长度,并且用于每个特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。重链的可变区可被称为“VH”。轻链的可变区可被称为“VL”。术语“可变”是指可变区的某些片段在抗体之间在序列上广泛不同的事实。V区介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而,可变性在可变区的110个氨基酸跨度上不是均匀分布的。相反,V区由较少可变(例如,相对不变)的称为框架区(FR)的约15-30个氨基酸的延伸组成,其被称为“高变区”的较大可变性(例如,极端可变性)的较短区域分开,该较短区域各自长约9-12个氨基酸。重链和轻链可变区各自包含四个FR,主要采用β片构型,由三个高变区连接,它们形成连接β折叠结构的环并且在一些情况下形成其部分。每条链中的高变区通过FR并与来自另一条链的高变区紧密靠近地保持在一起,有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见例如,Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版,1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但表现出各种效应子功能,诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。不同抗体之间的可变区在序列上广泛不同。在具体实施方案中,可变区是人可变区。
术语“根据Kabat的可变区残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变型是指Kabat等人(出处同上)中用于抗体编译的重链可变区或轻链可变区的编号系统。使用该编号系统,实际线性氨基酸序列可含有对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入的更少或另外的氨基酸。例如,重链可变结构域可包括在残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和在残基82之后的三个插入残基(例如,根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。通过在抗体序列的同源区与“标准”Kabat编号序列比对,可确定给定抗体的Kabat残基编号。当提及可变结构域中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时,通常使用Kabat编号系统(例如,Kabat等人,出处同上)。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时,通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如,Kabat等人中报道的EU索引,出处同上)。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG 1EU抗体的残基编号。其他编号系统已由例如AbM、Chothia、Contact、IMGT和AHon描述。
当参考抗体使用时,术语“重链”是指约50-70kDa的多肽链,其中氨基末端部分包括约120至130个或更多个氨基酸的可变区,并且羧基末端部分包括恒定区。基于重链恒定区的氨基酸序列,恒定区可以是五种不同类型中的一种类型(例如同种型),称为α(α)、δ(δ)、ε(ε)、γ(γ)和μ(μ)。不同的重链大小不同:α、δ和γ含有大约450个氨基酸,而μ和ε含有大约550个氨基酸。当与轻链结合时,这些不同类型的重链分别产生五种众所周知的类别(例如,同种型)的抗体,即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,包括IgG的四个亚类,即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
当参考抗体使用时,术语“轻链”是指约25kDa的多肽链,其中氨基末端部分包括约100至约110个氨基酸的可变区,并且羧基末端部分包括恒定区。轻链的近似长度为211至217个氨基酸。基于恒定结构域的氨基酸序列,存在两种不同类型,称为κ(κ)或λ(λ)。
如本文所用,术语“高变区”、“HVR”、“互补决定区”和“CDR”可互换使用。“CDR”是指免疫球蛋白(Ig或抗体)VHβ-片框架的非框架区内的三个高变区(H1、H2或H3)中的一个高变区,或抗体VLβ-片框架的非框架区内的三个高变区(L1、L2或L3)中的一个高变区。因此,CDR是散布在框架区序列内的可变区序列。
CDR区是本领域技术人员众所周知的,并且已由众所周知的编号系统定义。例如,Kabat互补决定区(CDR)是基于序列变异性的,并且是最常用的(参见例如,Kabat等人,出处同上)。“Chothia”相反是指结构环的位置(参见例如,Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-17(1987))。当使用Kabat编号惯例编号时,Chothia CDR-H1环的末端在H32和H34之间变化,这取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案将插入置在H35A和H35B处;如果35A和35B都不存在,则环以32结束;如果仅35A存在,则环以33结束;如果35A和35B都存在,则环以34结束)。AbM高变区代表Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷,并被Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用(参见例如Antibody Engineering,第2卷(Kontermann和Dübel编辑,第2版,2010))。“contact”高变区是基于对可获得的复杂晶体结构的分析。已经开发出来并被广泛采用的另一通用编号系统为ImMunoGeneTics(IMGT)Information(Lafranc等人,Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77(2003))。IMGT是专门研究人和其他脊椎动物的免疫球蛋白(IG)、T细胞受体(TCR)和主要组织相容性复合物(MHC)的整合信息系统。在本文中,CDR根据氨基酸序列以及轻链或重链内的位置两者来引用。由于CDR在免疫球蛋白可变结构域结构内的“位置”在物种之间是保守的,并且存在于称为环的结构中,因此通过使用根据结构特征比对可变结构域序列的编号系统,CDR和构架残基容易鉴定。该信息可用于将来自一个物种的免疫球蛋白的CDR残基移植和替换到通常来自人抗体的受体框架中。Honegger和Plückthun开发了一个另外的编号系统(AHon),J.Mol.Biol.309:657-70(2001)。编号系统之间的对应关系,包括例如Kabat编号和IMGT唯一编号系统,为本领域技术人员所熟知(参见例如Kabat,出处同上;Chothia和Lesk,出处同上;Martin,出处同上;Lefranc等人,出处同上)。来自这些高变区或CDR中的每一者的残基在下表1中例示。
表1.根据各种编号系统的示例性CDR
给定CDR的边界可根据用于识别的方案而变化。因此,除非另有说明,否则给定抗体或其区域(诸如可变区)的术语“CDR”和“互补决定区”以及抗体或其区域的单独CDR(例如,CDR-H1、CDR-H2)应理解为涵盖如上文所述的任何已知方案所定义的互补决定区。在一些情况下,指定用于识别特定CDR或CDR的方案,诸如由IMGT、Kabat、Chothia或Contact方法定义的CDR。在其他情况下,给出了CDR的特定氨基酸序列。应当注意,CDR区还可以通过各种编号系统的组合,例如Kabat和Chothia编号系统的组合或Kabat和IMGT编号系统的组合来定义。因此,术语诸如“在特定VH中阐述的CDR”包括由上述示例性CDR编号系统定义的任何CDR1,但不限于此。一旦给出了可变区(例如,VH或VL),本领域技术人员就应理解,该区内的CDR可通过不同编号系统或其组合来定义。
高变区可包括如下“扩展高变区”:VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3),以及VH中的26-35或26-35A(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。
术语“恒定区”或“恒定结构域”是指轻链和重链的羧基末端部分,其不直接参与抗体与抗原的结合,但表现出各种效应子功能,诸如与Fc受体的相互作用。该术语是指免疫球蛋白分子的相对于免疫球蛋白的其他部分(包含抗原结合位点的可变区)具有更保守的氨基酸序列的部分。恒定区可包含重链的CH1、CH2和CH3区和轻链的CL区。
术语“框架”或“FR”是指侧接CDR的那些可变区残基。FR残基存在于例如嵌合的、人源化的、人的结构域抗体(例如,单结构域抗体)、双抗体、线性抗体和双特异性抗体中。FR残基是除高变区残基或CDR残基之外的那些可变结构域残基。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区域,包括例如天然序列Fc区、重组Fc区和变异Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能变化,但人IgG重链Fc区通常被定义为从位置Cys226的氨基酸残基或从Pro230延伸到其羧基末端。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447根据EU编号系统)可例如在抗体的生产或纯化期间或通过重组工程化编码抗体重链的核酸来去除。因此,完整抗体的组合物可包括去除了所有K447残基的抗体群、没有去除K447残基的抗体群体、以及具有含和不含K447残基的抗体混合物的抗体群体。“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括C1q结合;CDC;Fc受体结合;ADCC;吞噬作用;细胞表面受体(例如,B细胞受体)的下调等。此类效应子功能通常需要Fc区与结合区或结合结构域(例如,抗体可变区或结构域)组合,并且可使用本领域技术人员已知的各种测定来评估。“变体Fc区”包括由于至少一个氨基酸修饰(例如,取代、添加或缺失)而与天然序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。在某些实施方案中,变体Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸取代,例如,在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中约一至约十个氨基酸取代,或约一至约五个氨基酸取代。本文的变体Fc区可与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区具有至少约80%的同源性,或者与其具有至少约90%的同源性,例如与其具有至少约95%的同源性。
如本文所用,“表位”是本领域的术语,并且是指结合分子(例如,包含单结构域抗体序列的抗体)可特异性结合的抗原的局部区域。表位可以是线性表位或构象、非线性或不连续表位。在多肽抗原的情况下,例如,表位可以是多肽的连续氨基酸(“线性”表位),或者表位可包含来自多肽的两个或更多个非连续区域的氨基酸(“构象”、“非线性”或“不连续”表位)。本领域技术人员将理解,一般来讲,线性表位可取决于或不取决于二级、三级或四级结构。例如,在一些实施方案中,结合分子与一组氨基酸结合,而无论它们是否在天然三维蛋白质结构中折叠。在其他实施方案中,结合分子需要构成表位的氨基酸残基表现出特定的构象(例如弯曲、扭曲、翻转或折叠)以便识别和结合表位。
相对于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(%)”定义为候选序列中与特定的肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比,在比对序列并引入缺口(如果需要的话)以实现最大的序列同一性百分比之后,不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的进行的比对可以本领域技术范围内的多种方式实现,例如使用可公开获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数,包括在待比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
如本文所用的“嵌合抗原受体”或“CAR”是指遗传工程化的受体,其可用于将一种或多种抗原特异性移植到免疫效应细胞诸如T细胞上。一些CAR也被称为“人造T细胞受体”、“嵌合T细胞受体”或“嵌合免疫受体”。在一些实施方案中,CAR包含对一种或多种抗原(诸如肿瘤抗原)具有特异性的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和T细胞和/或其他受体的细胞内信号传导结构域。“CAR-T细胞”是指表达CAR的T细胞。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用,并且是指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的,其可包含经修饰的氨基酸,并且其可夹杂有非氨基酸。该术语还涵盖已被天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物;例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰。该定义还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括但不限于非天然氨基酸)以及本领域已知的其他修饰的多肽。应当理解,因为本公开的多肽可基于抗体或免疫球蛋白超家族的其他成员,所以在某些实施方案中,“多肽”可作为单链或两个或更多个相关链出现。
如在本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物,或是可通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸,诸如甲基化核苷酸及其类似物。如本文所用,“寡核苷酸”是指短的、通常单链的合成多核苷酸,其长度通常但不一定少于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不是相互排斥的。以上针对多核苷酸的描述同样并且完全适用于寡核苷酸。产生本公开的结合分子的细胞可包括亲本杂交瘤细胞,以及其中已引入编码抗体的核酸的细菌和真核宿主细胞。除非另有说明,否则本文所公开的任何单链多核苷酸序列的左侧末端是5'末端;双链多核苷酸序列的左侧方向被称为5'方向。新生RNA转录物的5'至3'添加方向被称为转录方向;DNA链上具有与RNA转录物相同序列的序列区域,其在RNA转录物的5'至5'端,被称为“上游序列”;DNA链上具有与RNA转录物相同序列的序列区域,其在RNA转录物的3'至3'端,被称为“下游序列”。
“分离的核酸”是基本上与天然序列自然伴随的其他基因组DNA序列以及蛋白质或复合物诸如核糖体和聚合酶分离的核酸,例如RNA、DNA或混合核酸。“分离的”核酸分子是与存在于该核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。此外,“分离的”核酸分子,诸如cDNA分子,当通过重组技术产生时可基本上不含其他细胞材料或培养基,或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。在一个具体实施方案中,分离或纯化编码单结构域抗体或如本文所述的抗体的一种或多种核酸分子。该术语涵盖已从其天然存在的环境中去除的核酸序列,并且包括重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。基本上纯的分子可包括该分子的分离形式。具体地,编码本文所述的CAR的“分离的”核酸分子是从至少一种污染物核酸分子鉴定并分离的核酸分子,该核酸分子通常在其产生的环境中与污染物核酸分子缔合。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如,适合原核生物的控制序列包括启动子、任选操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
如本文所用,当参考核酸或氨基酸使用时,术语“可操作地连接”和类似的短语(例如,基因融合)是指分别以彼此的功能关系放置的核酸序列或氨基酸序列的操作连接。例如,可操作地连接的启动子、增强子元件、开放阅读框、5'和3'UTR和终止子序列导致核酸分子(例如,RNA)的精确产生。在一些实施方案中,可操作地连接的核酸元件导致开放阅读框的转录并最终产生多肽(即,开放阅读框的表达)。作为另一示例,可操作地连接的肽是其中功能结构域彼此相距适当距离以赋予每个结构域的预期功能的一种肽。
术语“载体”是指用于携带或包含核酸序列的物质,该核酸序列包括例如编码如本文所述的结合分子(例如抗体)的核酸序列,以便将核酸序列引入宿主细胞。适用的载体包括例如表达载体、质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体,其可包括可操作用于稳定整合到宿主细胞染色体中的选择序列或标记。另外,载体可包括一个或多个选择性标记基因和适当的表达控制序列。可包括的选择性标记基因例如提供对抗生素或毒素的抗性,补充营养缺陷,或提供不在培养基中的关键营养物。表达控制序列可包括本领域众所周知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当两个或更多个核酸分子被共表达时(例如,抗体重链和轻链或抗体VH和VL两者),两种核酸分子都可被插入例如单个表达载体或单独的表达载体中。对于单个载体表达,编码核酸可操作地连接到一个共同表达控制序列或连接到不同的表达控制序列,诸如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。将核酸分子引入宿主细胞可使用本领域众所周知的方法来确认。此类方法包括例如核酸分析,诸如mRNA的Northern印迹或聚合酶链反应(PCR)扩增、用于基因产物表达的免疫印迹或其他合适的分析方法,以测试引入的核酸序列或其对应基因产物的表达。本领域技术人员应理解,核酸分子以足以产生期望产物的量表达,并且进一步理解,可使用本领域众所周知的方法优化表达水平以获得足够的表达。
如本文所用,术语“宿主”是指动物,诸如哺乳动物(例如,人)。
如本文所用,术语“宿主细胞”是指可用核酸分子转染的特定受试者细胞和此类细胞的后代或潜在后代。此类细胞的后代可与用核酸分子转染的亲本细胞不同,由于可在后代中发生的突变或环境影响或者由于核酸分子整合到宿主细胞基因组中。
如本文所用,术语“自体的”意指源自同一个体的任何材料,稍后将该材料重新引入该个体。
“同种异体的”是指源自相同物种的不同个体的移植物。
如本文所用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指外源核酸被转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代受试细胞及其后代。
如本文所用,术语“分离(isolation)”或“分离(isolating)”是指增加组合物中某种物质的百分比的过程。例如,从细胞群中分离一种类型的细胞是指产生其中这种类型的细胞的百分比与原始细胞群中这种类型的细胞的百分比相比增加的细胞群的过程。因此,当在一种类型的细胞的上下文中使用时,术语“分离的”并不意指分离的细胞群包含100%的这种类型的细胞,而是意指在分离过程之后在该细胞群中这种类型的细胞的百分比增加。
如本文所用,术语“药学上可接受的”意指在动物并且更具体地在人中使用的由联邦或州政府的监管机构批准的或在美国药典、欧洲药典或其他公认的药典中列出的。
“赋形剂”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物,诸如液体或固体填充剂、稀释剂、溶剂或包封材料。赋形剂包括例如包封材料或添加剂,诸如吸收促进剂、抗氧化剂、粘结剂、缓冲液、载体、包衣剂、着色剂、稀释剂、崩解剂、乳化剂、增量剂、填充剂、调味剂、保湿剂、润滑剂、香料、防腐剂、推进剂、释放剂、灭菌剂、甜味剂、增溶剂、润湿剂以及它们的混合物。术语“赋形剂”还可指稀释剂、佐剂(例如,弗氏佐剂(完全或不完全)或媒介物。
在一些实施方案中,赋形剂是药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂的示例包括缓冲液,诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸;低分子量(例如,少于约10个氨基酸残基)多肽;蛋白质,诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,诸如EDTA;糖醇,诸如甘露醇或山梨糖醇;成盐抗衡离子,诸如钠;和/或非离子表面活性剂,诸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。药学上可接受的赋形剂的其他示例描述于Remington和Gennaro,Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版,1990)中。
在一个实施方案中,每种组分在与药物制剂的其他成分相容的意义上是“药学上可接受的”,并且适用于与人和动物的组织或器官接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其他问题或并发症,与合理的益处/风险比相称。参见,例如LippincottWilliams&Wilkins:Philadelphia,PA,2005;Handbook of Pharmaceutical Excipients,第6版;Rowe等人编辑;The Pharmaceutical Press and the American PharmaceuticalAssociation:2009;Handbook of Pharmaceutical Additives,第3版;Ash和Ash编辑;Gower Publishing Company:2007;Pharmaceutical Preformulation and Formulation,第2版;Gibson编辑;CRC Press LLC:Boca Raton,FL,2009。在一些实施方案中,药学上可接受的赋形剂在所采用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或哺乳动物无毒。在一些实施方案中,药学上可接受的赋形剂是pH缓冲水溶液。
在一些实施方案中,赋形剂是无菌液体,诸如水和油,包括石油、动物、植物或合成来源诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等的那些。当静脉内施用组合物(例如,药物组合物)时,水是示例性赋形剂。盐水溶液和右旋糖水溶液以及甘油溶液也可用作液体赋形剂,尤其是用于注射溶液。赋形剂还可包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要,组合物还可含有少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。组合物可采用溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等形式。口服组合物,包括制剂,可包含标准赋形剂,诸如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
例如,包括药物化合物的组合物可含有结合分子(例如,抗体),例如以分离或纯化的形式与合适量的赋形剂一起。
如本文所用,术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以产生期望结果的本文提供的单结构域抗体或包含试剂和单结构域抗体的治疗性分子或药物组合物的量。
术语“受试者”和“患者”可互换使用。如本文所用,在某些实施方案中,受试者是哺乳动物,例如非灵长类动物或灵长类动物(例如,人)。在具体实施方案中,受试者是人。在一个实施方案中,受试者是被诊断患有疾病或障碍的哺乳动物,例如人。在另一个实施方案中,受试者是具有发展疾病或障碍的风险的哺乳动物,例如人。
“施用”(administer或administration)是指将存在于体外的物质注射或以其他方式物理递送至患者体内的动作,诸如通过粘膜、皮内、静脉内、肌内递送和/或本文所述或本领域已知的任何其他物理递送方法。
如本文所用,术语“治疗”(treat、treaTMent和treating)是指由施用一种或多种疗法引起的疾病或病症的进展、严重程度和/或持续时间的减少或改善。治疗可通过评估是否已存在与潜在障碍相关的一种或多种症状的减少、减轻和/或缓解来确定,使得尽管患者可能仍然受到潜在障碍的折磨,但观察到患者的改善。术语“治疗”包括管理和改善疾病。术语“管理”(manage、managing和management)是指受试者从不一定导致疾病治愈的疗法中获得的有益效果。
术语“预防”(prevention、preventing和prevention)是指降低疾病、障碍、病症或相关联症状(例如,糖尿病或癌症)发作(或复发)的可能性。
术语“约”和“大约”意指在给定值或范围的20%内、15%内、10%内、9%内、8%内、7%内、6%内、5%内、4%内、3%内、2%内、1%内或更小。
如本公开和权利要求书中所用,单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数形式,除非上下文清楚表明并非如此。
应当理解,在本文中用术语“包括”描述实施方案的任何地方,还提供了根据“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似实施方案。还应理解,在本文中用短语“基本上由...组成”描述实施方案的任何地方,还提供了根据“由……组成”描述的其他类似实施方案。
如在短语诸如“A与B之间”或“A-B之间”中使用的术语“之间”是指包括A和B两者的范围。
如在短语诸如“A和/或B”中使用的术语“和/或”在此旨在包括A和B两者;A或B;A(单独);和B(单独)。同样,如在短语诸如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每个实施方案:A、B和C;A、B或C;A或C;A或B;B或C;A和C;A和B;B和C;A(单独);B(单独);和C(单独)。
5.2.用于产生甲型流感病毒特异性Vβ17+CD8+T细胞的方法
在一个方面,本文提供了用于活化或富集对甲型流感病毒具有特异性的Vβ17+CD8+T细胞的方法。在一些实施方案中,本文提供的方法包括使包含T细胞的细胞群与源自人甲型流感病毒的肽接触。
5.2.1.获得包含T细胞的细胞群
示例性T细胞包括CD8+T细胞、CD4+T细胞、调节性T细胞、细胞毒性T细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞。T细胞可以从许多来源获得。在一些实施方案中,从体液、组织或器官(包括但不限于外周血、脐带血、骨髓、淋巴结、胸腺、脾或哺乳动物的其他组织或流体)收集、分离、纯化或诱导包含T细胞的细胞群。在其他实施方案中,包含T细胞的细胞群从培养的T细胞系获得。在具体的实施方案中,包含T细胞的细胞群是外周血淋巴细胞、T细胞的前体细胞(诸如造血干细胞、淋巴细胞前体细胞等)或含有它们的细胞群。在一个具体的实施方案中,包含T细胞的细胞群是PBMC。在一些实施方案中,PBMC来自健康供体。收集和制备PBMC的各种方法是本领域已知的。
在一些实施方案中,T细胞可以使用本领域技术人员已知的许多技术(诸如FicollTM分离),从收集自受试者的血液单位获得。在一些实施方案中,来自个体循环血液的细胞通过单采术获得。单采术产物通常含有淋巴细胞(包括T细胞)、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施方案中,可以对通过单采术收集的细胞进行洗涤,以除去血浆部分,并且将这些细胞置于适当的缓冲液或培养基中,用于随后的处理步骤。在一些实施方案中,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中,洗涤溶液不含钙且可以不含镁或者可以不含许多(如果不是全部的话)二价阳离子。如本领域普通技术人员将容易理解的,洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成,诸如通过使用半自动化“流通”离心机(例如,Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或HaemoneticsCell Saver 5)根据制造商的说明书完成。洗涤后,可将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中,例如无Ca2+、无Mg2+的PBS、PlasmaLyte A或其他含或不含缓冲液的盐水溶液。另选地,可以除去单采样品中不需要的组分,并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中,通过裂解红细胞并清除单核细胞,例如通过经PERCOLLTM梯度离心或对流离心洗脱,从外周血淋巴细胞分离T细胞。T细胞的特定亚群,诸如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞,可通过正向选择或负向选择技术进一步分离。
例如,在一些实施方案中,T细胞通过与抗CD3/抗CD28(即,3×28)缀合的珠粒,诸如M-450CD3/CD28 T一起孵育足以正向选择期望的T细胞的时间段来分离T细胞。在一些实施方案中,该时间段为至少0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。在一些实施方案中,该时间段范围为0.5小时至36小时或更长,以及介于之间的所有整数值。在一些实施方案中,该时间段为1小时至36小时。在一些实施方案中,该时间段为2小时至36小时。在一些实施方案中,该时间段为3小时至36小时。在一些实施方案中,该时间段为4小时至36小时。在一些实施方案中,该时间段为5小时至36小时。在一些实施方案中,该时间段为6小时至24小时。在一些实施方案中,该时间段为7小时至24小时。在一些实施方案中,该时间段为8小时至24小时。在一些实施方案中,该时间段为9小时至24小时。在一些实施方案中,该时间段为10小时至24小时。在一些实施方案中,孵育时间为0.5小时。在一些实施方案中,孵育时间为1小时。在一些实施方案中,孵育时间为2小时。在一些实施方案中,孵育时间为3小时。在一些实施方案中,孵育时间为4小时。在一些实施方案中,孵育时间为5小时。在一些实施方案中,孵育时间为6小时。在一些实施方案中,孵育时间为7小时。在一些实施方案中,孵育时间为8小时。在一些实施方案中,孵育时间为9小时。在一些实施方案中,孵育时间为10小时。在一些实施方案中,孵育时间为11小时。在一些实施方案中,孵育时间为12小时。在一些实施方案中,孵育时间为13小时。在一些实施方案中,孵育时间为14小时。在一些实施方案中,孵育时间为15小时。在一些实施方案中,孵育时间为16小时。在一些实施方案中,孵育时间为17小时。在一些实施方案中,孵育时间为18小时。在一些实施方案中,孵育时间为19小时。在一些实施方案中,孵育时间为20小时。在一些实施方案中,孵育时间为21小时。在一些实施方案中,孵育时间为22小时。在一些实施方案中,孵育时间为23小时。在一些实施方案中,孵育时间为24小时。
在与其他细胞类型相比T细胞很少的任何情况下,可以使用更长的孵育时间来分离T细胞。此外,使用更长的孵育时间可以增加CD8+T细胞的捕获效率。因此,在一些实施方案中,通过简单地缩短或延长允许T细胞结合CD3/CD28珠粒的时间和/或通过增加或减小珠粒与T细胞的比率,可以在培养开始时或在该过程的其他时间点优先选出或淘汰T细胞亚群。另外,通过增加或减小珠粒或其他表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比率,可以在培养开始时或在其他期望的时间点优先选出或淘汰T细胞亚群。本领域技术人员将认识到也可以使用多轮选择。在一些实施方案中,可能期望在本发明的方法或过程中执行选择程序并使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可经受更多轮的选择。
通过负向选择富集T细胞群可以用针对负向选择细胞特有的表面标志物的抗体组合来完成。一种方法是经由负磁性免疫粘附或流式细胞术的细胞分选和/或选择,其使用针对负向选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。为了通过正向选择或负向选择分离期望的细胞群,可以改变细胞的浓度和表面(例如,颗粒诸如珠粒)。在某些实施方案中,可能期望显著降低珠粒和细胞混合在一起的体积(即,增加细胞浓度),以确保细胞和珠粒的最大接触。在一些实施方案中,细胞的浓度范围为1千万个细胞/ml至50亿个细胞/ml。在一些实施方案中,细胞的浓度范围为1500万个细胞/ml至40亿个细胞/ml。在一些实施方案中,细胞的浓度范围为2000万个细胞/ml至30亿个细胞/ml。在一些实施方案中,细胞的浓度范围为2500万个细胞/ml至20亿个细胞/ml。在一些实施方案中,细胞的浓度范围为3000万个细胞/ml至20亿个细胞/ml。在一些实施方案中,细胞的浓度范围为3500万个细胞/ml至20亿个细胞/ml。在一些实施方案中,细胞的浓度范围为4000万个细胞/ml至20亿个细胞/ml。在一些实施方案中,细胞的浓度范围为4500万个细胞/ml至20亿个细胞/ml。在一些实施方案中,细胞的浓度范围为5000万个细胞/ml至20亿个细胞/ml。在一些实施方案中,使用1000万个细胞、1500万个细胞、2000万个细胞、2500万个细胞、3000万个细胞、3500万个细胞、4000万个细胞、4500万个细胞或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在一些实施方案中,使用5500万个细胞、6000万个细胞、6500万个细胞、7000万个细胞、7500万个细胞、8000万个细胞、8500万个细胞、9000万个细胞、9500万个细胞或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在一些实施方案中,使用大于1亿个细胞/ml。在一些实施方案中,可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。在一些实施方案中,使用10亿个细胞/ml的浓度。在一些实施方案中,使用20亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致增加的细胞产率、细胞活化和细胞扩增。此外,使用高细胞浓度可允许更有效地捕获可弱表达感兴趣的靶抗原的细胞。在一些实施方案中,使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施方案中,细胞可以在2℃-10℃或室温下在转子上以不同速度孵育不同长度的时间。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后,可将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数在本领域中是已知的并且在这种情况下将是有用的,但是一种方法涉及使用含有20%DMSO和8%人血清白蛋白的PBS,或含有10%右旋糖酐40和5%葡萄糖、20%人血清白蛋白和7.5%DMSO、或31.25%plasmalyte-A、31.25%右旋糖5%、0.45%NaCl、10%右旋糖酐40和5%葡萄糖、20%人血清白蛋白和7.5%DMSO的培养基,或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其他合适的细胞冷冻培养基。然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储存罐的气相中。可以使用其他受控冷冻方法以及立即处于-20℃或在液氮中的不受控冷冻。
在一些实施方案中,将冷冻保存的细胞如本文所述解冻并洗涤,并在活化前使其在室温下静置一小时。
在某些实施方案中,在本公开中提供了在可能需要如本文所述的扩增细胞之前的一段时间从受试者收集血液样品或单采产物。因而,可以在必要的任何时间点收集待扩增的细胞的来源,并且分离并冷冻期望的细胞(诸如T细胞)以供以后用于将受益于T细胞疗法的许多疾病或病症(诸如本文所述的那些疾病或病症)的T细胞疗法中。在一个实施方案中,血液样品或单采血液成分术取自一般健康受试者。在某些实施方案中,可将T细胞扩增、冷冻并稍后使用。
5.2.2.M1肽刺激
在一个方面,本文提供了一种方法,该方法包括通过使来自源自人甲型流感病毒的基质蛋白的肽与包含本文提供的T细胞的细胞群接触来活化或富集Vβ17+CD8+T细胞。
在一些实施方案中,来自源自人甲型流感病毒的基质蛋白的肽是源自人甲型流感病毒的M1肽(M158-66),该M1肽包含GILGFVFTL(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。
在其他实施方案中,来自源自人甲型流感病毒的基质蛋白的肽是肽57-68(KGILGFVFTLTV(SEQ ID NO:9))。在其他实施方案中,来自源自人甲型流感病毒的基质蛋白的肽是肽57-67(KGILGFVFTLT(SEQ ID NO:10))。在其他实施方案中,来自源自人甲型流感病毒的基质蛋白的肽是肽57-66(KGILGFVFTL(SEQ ID NO:11))。在其他实施方案中,来自源自人甲型流感病毒的基质蛋白的肽是肽58-68(GILGFVFTLTV(SEQ ID NO:12))。在其他实施方案中,来自源自人甲型流感病毒的基质蛋白的肽是肽58-67(GILGFVFTLT(SEQ ID NO:13))。
在一些实施方案中,本文提供的方法包括使源自人甲型流感病毒的M1肽(M158-66)与包含T细胞的细胞群以某一M1肽:细胞比率接触,例如,1μg/ml至10μg/ml的M1肽与103个至1011个细胞接触。在一个实施方案中,M1肽:细胞比率为1μg/ml的M1肽:约2.5×103个细胞。在一个实施方案中,M1肽:细胞比率为1μg/ml的M1肽:2.5×104个细胞。在一个实施方案中,M1肽:细胞比率为1μg/ml的M1肽:2.5×105个细胞。在一个实施方案中,M1肽:细胞比率为1μg/ml的M1肽:2.5×106个细胞。在一个实施方案中,M1肽:细胞比率为1μg/ml的M1肽:2.5×107个细胞。在一个实施方案中,M1肽:细胞比率为1μg/ml的M1肽:2.5×108个细胞。在一个实施方案中,M1肽:细胞比率为1μg/ml的M1肽:2.5×109个细胞。在一个实施方案中,M1肽:细胞比率为1μg/ml的M1肽:2.5×1010个细胞。
在一些实施方案中,本文提供的方法包括使源自人甲型流感病毒的M1肽(M158-66)与包含T细胞的细胞群接触一定量的时间。在一些实施方案中,M1肽接触细胞1天至20天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞2天至18天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞3天至16天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞4天至14天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞5天至14天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞6天至14天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞7天至14天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞8天至14天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞9天至14天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞10天至14天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞11天至14天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞12天至14天。在一个实施方案中,M1肽接触细胞1天。在一个实施方案中,M1肽接触细胞2天。在一个实施方案中,M1肽接触细胞3天。在一个实施方案中,M1肽接触细胞4天。在一个实施方案中,M1肽接触细胞5天。在一个实施方案中,M1肽接触细胞6天。在一个实施方案中,M1肽接触细胞7天。在一个实施方案中,M1肽接触细胞8天。在一个实施方案中,M1肽接触细胞9天。在一个实施方案中,M1肽接触细胞10天。在一个实施方案中,M1肽接触细胞11天。在一个实施方案中,M1肽接触细胞12天。在一个实施方案中,M1肽接触细胞13天。在一个实施方案中,M1肽接触细胞14天。
在一些实施方案中,本文提供的方法还包括使免疫刺激剂或免疫调节剂与已经与M1肽接触的包含T细胞的细胞群接触。在一些具体的实施方案中,免疫刺激剂或免疫调节剂能够刺激T细胞。在一个优选的实施方案中,免疫刺激剂或免疫调节剂是IL-2。
在一些实施方案中,本文提供的方法还包括使IL-2与包含T细胞的细胞群以某一IL-2:细胞比率接触,例如100至250IU的IL-2与103个至1011个细胞接触。在一个实施方案中,IL-2:细胞比率为210IU的IL-2:2.5×103个细胞。在一个实施方案中,IL-2:细胞比率为210IU的IL-2:2.5×104个细胞。在一个实施方案中,IL-2:细胞比率为210IU的IL-2:2.5×105个细胞。在一个实施方案中,IL-2:细胞比率为210IU的IL-2:2.5×106个细胞。在一个实施方案中,IL-2:细胞比率为210IU的IL-2:2.5×107个细胞。在一个实施方案中,IL-2:细胞比率为210IU的IL-2:2.5×108个细胞。在一个实施方案中,IL-2:细胞比率为210IU的IL-2:2.5×109个细胞。在一个实施方案中,IL-2:细胞比率为210IU的IL-2:2.5×1010个细胞。
在一些实施方案中,本文提供的方法还包括使IL-2与包含T细胞的细胞群接触一定量的时间。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触1天至20天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触2天至18天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触3天至16天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触4天至14天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触5天至14天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触6天至14天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触7天至14天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触8天至14天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触9天至14天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触10天至14天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触11天至14天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触12天至14天。在一个实施方案中,细胞与IL-2接触1天。在一个实施方案中,细胞与IL-2接触2天。在一个实施方案中,细胞与IL-2接触3天。在一个实施方案中,细胞与IL-2接触4天。在一个实施方案中,细胞与IL-2接触5天。在一个实施方案中,细胞与IL-2接触6天。在一个实施方案中,细胞与IL-2接触7天。在一个实施方案中,细胞与IL-2接触8天。在一个实施方案中,细胞与IL-2接触9天。在一个实施方案中,细胞与IL-2接触10天。在一个实施方案中,细胞与IL-2接触11天。在一个实施方案中,细胞与IL-2接触12天。在一个实施方案中,细胞与IL-2接触13天。在一个实施方案中,细胞与IL-2接触14天。
在某些实施方案中,使本文提供的包含T细胞的细胞群与M1肽和/或IL-2离体(例如在培养基中)接触。在一些实施方案中,该方法包括在包含M1肽和IL-2的培养基中离体培养该细胞群一段时间,例如5天至20天。
在其他实施方案中,该方法包括在包含M1肽的培养基中离体培养该细胞群一段时间,例如5天至10天,并且然后在包含IL-2的培养基中离体培养该细胞群一段时间,例如再培养5天至10天。
在还有其他实施方案中,该方法包括在包含M1肽的培养基中离体培养该细胞群,并且然后在包含M1肽和IL-2的培养基中离体培养该细胞群;并且然后在包含IL-2的培养基中离体培养该细胞群。例如,首先将该细胞群在包含M1肽的培养基中离体培养一段时间,并且然后将IL-2添加到培养基中,保持一段时间。并且然后洗涤细胞并再次在包含IL-2的培养基中培养。在一个具体的实施方案中,首先将该细胞群在包含M1肽的培养基中离体培养1天至3天,之后将IL-2添加到培养基中;并且然后将该细胞群在包含M1肽和IL-2两者的培养基中离体培养1天至7天;并且然后洗涤细胞并在包含IL-2的培养基中培养1天至10天。在另一个具体的实施方案中,使用如以下第7节中说明的方法培养包含T细胞的细胞群。
在一些实施方案中,通过本领域技术人员熟知的方法测量特定类型的细胞的量。在一些实施方案中,通过流式细胞术分析测量特定类型的细胞的量。
在一些实施方案中,来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比是CD8+细胞的2%-10%。在一些实施方案中,来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比是CD8+细胞的3%-8%。在一些实施方案中,来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比是CD8+细胞的4%-6%。在一些实施方案中,来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比是CD8+细胞的4%-5%。在一些实施方案中,来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比是CD8+细胞的5%-6%。在一些实施方案中,来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比是CD8+细胞的5.5%。
在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少10%。在其他实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少20%。在其他实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少30%。在其他实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少40%。在其他实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少50%。在其他实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少60%。在其他实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少70%。在其他实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少80%。在其他实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少90%。在其他实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少2倍。在其他实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少3倍。在其他实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少4倍。在其他实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少5倍。在其他实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少6倍。在其他实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少7倍。在其他实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少8倍。在其他实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少9倍。在其他实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少10倍。在其他实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少11倍。在其他实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少12倍。在其他实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少13倍。在其他实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少14倍。在其他实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少15倍。
在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的10%至20倍。在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的20%至20倍。在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的30%至20倍。在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的40%至20倍。在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的50%至20倍。在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的60%至20倍。在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的70%至20倍。在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的80%至20倍。在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的90%至20倍。在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的2倍至20倍。在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的3倍至20倍。在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的4倍至20倍。在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的5倍至20倍。在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的6倍至20倍。在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的7倍至20倍。在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的8倍至20倍。在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的9倍至20倍。在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的10倍至20倍。在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的11倍至20倍。在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的12倍至20倍。在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的13倍至20倍。在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的14倍至20倍。在一些实施方案中,本文提供的方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的15倍至20倍。
如图1所示,健康个体的全PBMC中的CD8+T细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的基线百分比为CD8+细胞的约5.5%。在一些实施方案中,在将包含T细胞的细胞群与源自人甲型流感病毒的M1肽(M158–66)和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加。
在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的至少6%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的至少10%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的至少15%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的至少20%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的至少25%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的至少30%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的至少35%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的至少40%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的至少45%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的至少50%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的至少55%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的至少60%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的至少65%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的至少70%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的至少75%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的至少80%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的至少85%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的至少90%。在一些实施方案中,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是在与M1肽接触之后的。在一些实施方案中,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是在与IL-2接触之后的。在一些实施方案中,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是在与M1肽和IL-2接触之后的。
在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的6%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的10%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的15%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的20%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的25%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的30%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的35%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的40%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的45%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的50%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的55%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的60%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的65%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的70%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的75%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的80%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的85%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的90%至99%。在一些实施方案中,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是在与M1肽接触之后的。在一些实施方案中,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是在与IL-2接触之后的。在一些实施方案中,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是在与M1肽和IL-2接触之后的。
5.2.3.CD8阳性细胞的富集
在一些实施方案中,本文提供的方法或过程包括在M1肽刺激后分离或富集Vβ17+CD8+T细胞。
在一个具体的实施方案中,该方法包括首先分离CD8+细胞,并且然后分离Vβ17阳性细胞。在一个具体的实施方案中,该方法包括首先分离Vβ17阳性细胞,并且然后分离CD8+细胞。在另一个具体的实施方案中,该方法包括同时分离CD8+细胞和Vβ17阳性细胞。
CD8是在细胞毒性T细胞表面上表达的跨膜糖蛋白。CD8形成由CD8α链和/或CD8β链组成的同型二聚体或异二聚体。CD8在抗原特异性活化期间与I类MHC受体相互作用,并参与T细胞受体介导的活化。
分离和富集CD8+细胞的方法是本领域技术人员已知的。在一些实施方案中,富集CD8+细胞的方法包括正向选择或负向选择。
在一些实施方案中,富集CD8+细胞的方法包括使用直接包被有抗CD8抗体的磁珠或使用抗CD8抗体包被细胞,并且然后使用具有第二试剂的珠粒结合抗体。在一些实施方案中,富集CD8+细胞的方法包括使用直接包被有抗CD8抗体的磁性微粒或使用抗CD8抗体包被细胞,并且然后使用具有第二试剂的磁性微粒结合抗体。在一些实施方案中,富集CD8+细胞的方法包括使用直接包被有抗CD8抗体的磁性纳米颗粒或使用抗CD8抗体包被细胞,并且然后使用具有第二试剂的磁性纳米颗粒结合抗体。在一些实施方案中,富集CD8+细胞的方法包括密度梯度离心,例如但不限于使用白蛋白、葡聚糖、Ficoll、甲泛葡胺(metrizamid)、Percoll等,以去除不期望的细胞。
在其他实施方案中,富集CD8+细胞的方法包括通过将细胞混合物与结合不期望的细胞的试剂一起孵育的负向选择。在一些实施方案中,富集CD8+细胞的方法包括通过选出有CD8表面表达的细胞的正向选择。在一些具体的实施方案中,富集CD8+细胞的方法包括CD8+细胞的FACS分选。在一些其他具体的实施方案中,富集CD8+细胞的方法包括使用靶向任何CD8链的抗CD8抗体。在一些具体的实施方案中,富集CD8+细胞的方法包括用针对CD8的结合剂固定亲和柱。在一些实施方案中,富集CD8+细胞的方法包括上述方法中的两种或更多种方法的组合。
在一些更具体的实施方案中,富集或分离CD8+细胞的方法如以下第7节中所述。
5.2.4.Vβ17阳性细胞的富集
在一些实施方案中,本文提供的富集Vβ17阳性细胞的方法包括选出有Vβ17表面表达的细胞。在一些其他具体的实施方案中,富集Vβ17阳性细胞的方法包括使用抗Vβ17抗体。在一些实施方案中,富集Vβ17阳性细胞的方法包括使用直接包被有抗Vβ17抗体的磁珠或使用抗Vβ17抗体包被细胞,并且然后使用具有第二试剂的珠粒结合抗体。在一些实施方案中,富集Vβ17阳性细胞的方法包括使用直接包被有抗Vβ17抗体的磁性微粒或使用抗Vβ17抗体包被细胞,并且然后使用具有第二试剂的磁性微粒结合抗体。在一些实施方案中,富集Vβ17阳性细胞的方法包括使用直接包被有抗Vβ17抗体的磁性纳米颗粒或使用抗Vβ17抗体包被细胞,并且然后使用具有第二试剂的磁性纳米颗粒结合抗体。在一些具体的实施方案中,富集Vβ17阳性细胞的方法包括Vβ17阳性细胞的FACS分选。在一些具体的实施方案中,富集Vβ17阳性细胞的方法包括用针对Vβ17的结合剂固定亲和柱。在一些实施方案中,富集Vβ17阳性细胞的方法包括上述方法中的两种或更多种方法的组合。
在一些更具体的实施方案中,富集或分离Vβ17阳性细胞的方法如以下第7节中所述。
5.2.5.富集的Vβ17+CD8+T细胞的活化
本文提供的方法还包括活化和/或扩增Vβ17+CD8+T细胞的步骤。
在一些实施方案中,活化和/或扩增Vβ17+CD8+T细胞的步骤包括向细胞中添加细胞因子,并且这些细胞因子包括但不限于凝集素、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、促乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、苗勒氏抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整联蛋白、血小板生成素(TPO)、神经生长因子(NGF)、血小板生长因子、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、红细胞生成素(EPO)、骨诱导因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-λ、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)、粒细胞-CSF(G-CSF)、白介素-1(IL-1)、IL-la、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、LIF、kit-配体、FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑素、肿瘤坏死因子和LT(淋巴毒素)。在一些实施方案中,活化和/或扩增Vβ17+CD8+T细胞的步骤包括将细胞与饲养细胞共培养。在一些实施方案中,活化和/或扩增Vβ17+CD8+T细胞的步骤包括添加抑制免疫抑制信号的试剂。在具体的实施方案中,活化和/或扩增Vβ17+CD8+T细胞的步骤包括免疫检查点抑制剂。在具体的实施方案中,活化和/或扩增Vβ17+CD8+T细胞的步骤包括抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在一个具体的实施方案中,活化和/或扩增Vβ17+CD8+T细胞的的步骤包括抗CD3/CD28珠粒。
5.3.Vβ17+CD8+T细胞
在另一方面,本文提供了T细胞,其中该T细胞是Vβ17+CD8+T细胞,并且其中该T细胞表达能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的M1肽的细胞表面受体。
在另一方面,本文提供了由本文提供的方法产生的分离的Vβ17+CD8+T细胞群。在一些实施方案中,Vβ17+CD8+T细胞包含能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的M1肽的细胞表面受体(例如,TCR)。
在又一方面,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比超过该分离的细胞群的6%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比超过该分离的细胞群的10%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比超过该分离的细胞群的15%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比超过该分离的细胞群的20%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比超过该分离的细胞群的25%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比超过该分离的细胞群的30%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比超过该分离的细胞群的35%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比超过该分离的细胞群的40%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比超过该分离的细胞群的45%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比超过该分离的细胞群的50%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比超过该分离的细胞群的55%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比超过该分离的细胞群的60%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比超过该分离的细胞群的65%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比超过该分离的细胞群的70%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比超过该分离的细胞群的75%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比超过该分离的细胞群的80%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比超过该分离的细胞群的85%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比超过该分离的细胞群的90%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比超过该分离的细胞群的95%。
在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是该分离的细胞群的6%至99%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是该分离的细胞群的10%至99%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是该分离的细胞群的15%至99%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是该分离的细胞群的20%至99%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是该分离的细胞群的25%至99%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是该分离的细胞群的30%至99%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是该分离的细胞群的35%至99%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是该分离的细胞群的40%至99%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是该分离的细胞群的45%至99%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是该分离的细胞群的50%至99%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是该分离的细胞群的55%至99%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是该分离的细胞群的60%至99%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是该分离的细胞群的65%至99%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是该分离的细胞群的70%至99%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是该分离的细胞群的75%至99%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是该分离的细胞群的80%至99%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是该分离的细胞群的85%至99%。在一些实施方案中,本文提供了分离的细胞群,其中该分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是该分离的细胞群的90%至99%。
在一些实施方案中,Vβ17+CD8+T细胞的至少一部分表达能够与M1肽结合的细胞表面受体(例如,TCR)。
在又一个方面,本文提供了使用本文提供的Vβ17+CD8+T细胞,例如用于同种异体CAR-T细胞疗法的方法,如以下在5.4节至5.8节中更详细描述的。
5.4.用于产生表达嵌合抗原受体的甲型流感病毒特异性Vβ17+CD8+ T细胞的方法
在另一方面,本文提供了用于制备CAR-T细胞的方法,该方法包括将编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入Vβ17+CD8+T细胞中。在一些实施方案中,Vβ17+CD8+T细胞是根据以上5.2节和5.3节中描述的方法或过程产生的。
更具体地,在用于制备CAR-T细胞的本发明方法的一些实施方案中,包括通过使来自源自人甲型流感病毒的基质蛋白的肽与本文提供的包含T细胞的细胞群接触来活化或富集Vβ17+CD8+T细胞。
T细胞群可从许多来源获得。在一些实施方案中,从体液、组织或器官(包括但不限于外周血、脐带血、骨髓、淋巴结、胸腺、脾或哺乳动物的其他组织或流体)收集、分离、纯化或诱导包含T细胞的细胞群。在其他实施方案中,包含T细胞的细胞群从培养的T细胞系获得。在具体的实施方案中,包含T细胞的细胞群是外周血淋巴细胞、T细胞的前体细胞(诸如造血干细胞、淋巴细胞前体细胞等)或含有它们的细胞群。在一个具体的实施方案中,包含T细胞的细胞群是PBMC。在一些实施方案中,PBMC来自健康供体。
在一些实施方案中,来自源自人甲型流感病毒的基质蛋白的肽是源自人甲型流感病毒的M1肽(M158-66),该M1肽包含GILGFVFTL(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。在其他实施方案中,来自源自人甲型流感病毒的基质蛋白的肽是肽57-68(KGILGFVFTLTV(SEQ ID NO:9))。在其他实施方案中,来自源自人甲型流感病毒的基质蛋白的肽是肽57-67(KGILGFVFTLT(SEQ ID NO:10))。在其他实施方案中,来自源自人甲型流感病毒的基质蛋白的肽是肽57-66(KGILGFVFTL(SEQ ID NO:11))。在其他实施方案中,来自源自人甲型流感病毒的基质蛋白的肽是肽58-68(GILGFVFTLTV(SEQ ID NO:12))。在其他实施方案中,来自源自人甲型流感病毒的基质蛋白的肽是肽58-67(GILGFVFTLT(SEQ ID NO:13))。
在一些实施方案中,本文提供的方法包括使源自人甲型流感病毒的M1肽(M158-66)与包含T细胞的细胞群以某一M1肽:细胞比率接触,例如,1μg/ml至10μg/ml的M1肽与103个至1011个细胞接触。在一些实施方案中,M1肽:细胞比率为1μg/ml的M1肽:约2.5×103个细胞、约2.5×104个细胞、约2.5×105个细胞、约2.5×106个细胞、约2.5×107个细胞、约2.5×108个细胞、约2.5×109个细胞或约2.5×1010个细胞。
在一些实施方案中,本文提供的方法包括使源自人甲型流感病毒的M1肽(M158-66)与包含T细胞的细胞群接触一定量的时间。在一些实施方案中,M1肽接触细胞1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或更长时间。在一些实施方案中,M1肽接触细胞1天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞2天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞2天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞3天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞4天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞5天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞6天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞7天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞8天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞9天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞10天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞11天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞12天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞13天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞14天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞1天至20天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞2天至18天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞3天至16天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞4天至14天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞5天至14天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞6天至14天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞7天至14天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞8天至14天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞9天至14天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞10天至14天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞11天至14天。在一些实施方案中,M1肽接触细胞12天至14天。在一些实施方案中,细胞与M1肽连续接触一段时间。在一些实施方案中,细胞与M1肽接触一段时间,并且然后将细胞在没有M1肽的情况下再培养一段时间,之后使细胞再次与M1肽接触。
在一些实施方案中,本文提供的方法还包括使免疫刺激剂或免疫调节剂与已经与M1肽接触的包含T细胞的细胞群接触。在一些具体的实施方案中,免疫刺激剂或免疫调节剂能够刺激T细胞。在一个优选的实施方案中,免疫刺激剂或免疫调节剂是IL-2。
在一些实施方案中,本文提供的方法还包括使IL-2与包含T细胞的细胞群以某一IL-2:细胞比率接触,例如100至250IU的IL-2与103个至1011个细胞接触。在一些实施方案中,IL-2:细胞比率为210IU的IL-2:约2.5×103个细胞、约2.5×104个细胞、约2.5×105个细胞、约2.5×106个细胞、约2.5×107个细胞、约2.5×108个细胞、约2.5×109个细胞或约2.5×1010个细胞。
在一些实施方案中,本文提供的方法还包括使IL-2与包含T细胞的细胞群接触一定量的时间。在一些实施方案中,IL-2接触细胞1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或更长时间。在一些实施方案中,IL-2接触细胞1天。在一些实施方案中,IL-2接触细胞2天。在一些实施方案中,IL-2接触细胞2天。在一些实施方案中,IL-2接触细胞3天。在一些实施方案中,IL-2接触细胞4天。在一些实施方案中,IL-2接触细胞5天。在一些实施方案中,IL-2接触细胞6天。在一些实施方案中,IL-2接触细胞7天。在一些实施方案中,IL-2接触细胞8天。在一些实施方案中,IL-2接触细胞9天。在一些实施方案中,IL-2接触细胞10天。在一些实施方案中,IL-2接触细胞11天。在一些实施方案中,IL-2接触细胞12天。在一些实施方案中,IL-2接触细胞13天。在一些实施方案中,IL-2接触细胞14天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触1天至20天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触2天至18天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触3天至16天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触4天至14天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触5天至14天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触6天至14天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触7天至14天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触8天至14天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触9天至14天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触10天至14天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触11天至14天。在一些实施方案中,细胞与IL-2接触12天至14天。
在某些实施方案中,使本文提供的包含T细胞的细胞群与M1肽和/或IL-2离体(例如在培养基中)接触。在一些实施方案中,该方法包括在包含M1肽和IL-2的培养基中离体培养该细胞群一段时间,例如5天至20天。
在其他实施方案中,该方法包括在包含M1肽的培养基中离体培养该细胞群一段时间,例如5天至10天,并且然后在包含IL-2的培养基中离体培养该细胞群一段时间,例如再培养5天至10天。
在还有其他实施方案中,该方法包括在包含M1肽的培养基中离体培养该细胞群,并且然后在包含M1肽和IL-2的培养基中离体培养该细胞群;并且然后在包含IL-2的培养基中离体培养该细胞群。例如,首先将该细胞群在包含M1肽的培养基中离体培养一段时间,并且然后将IL-2添加到培养基中,保持一段时间。并且然后洗涤细胞并再次在包含IL-2的培养基中培养。在一个具体的实施方案中,首先将该细胞群在包含M1肽的培养基中离体培养1天至3天,之后将IL-2添加到培养基中;并且然后将该细胞群在包含M1肽和IL-2两者的培养基中离体培养1天至7天;并且然后洗涤细胞并在包含IL-2的培养基中培养1天至10天。在另一个具体的实施方案中,使用如以下第7节中说明的方法培养包含T细胞的细胞群。
在一些实施方案中,通过本领域技术人员熟知的方法测量特定类型的细胞的量。在一些实施方案中,通过流式细胞术分析测量特定类型的细胞的量。
在一些实施方案中,来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比是CD8+细胞的2%-10%。在一些实施方案中,来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比是CD8+细胞的3%-8%。在一些实施方案中,来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比是CD8+细胞的4%-6%。在一些实施方案中,来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比是CD8+细胞的4%-5%。在一些实施方案中,来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比是CD8+细胞的5%-6%。在一些实施方案中,来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比是CD8+细胞的5.5%。
在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍或更多。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少10%。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少20%。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少30%。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少40%。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少50%。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少60%。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少70%。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少80%。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少90%。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少2倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少3倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少4倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少5倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少6倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少7倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少8倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少9倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少10倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少11倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少12倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少13倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少14倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少15倍。
在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的10%至20倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的20%至20倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的30%至20倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的40%至20倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的50%至20倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的60%至20倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的70%至20倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的80%至20倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的90%至20倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的2倍至20倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的3倍至20倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的4倍至20倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的5倍至20倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的6倍至20倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的7倍至20倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的8倍至20倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的9倍至20倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的10倍至20倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的11倍至20倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的12倍至20倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的13倍至20倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的14倍至20倍。在一些实施方案中,M1刺激使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的15倍至20倍。
在一些实施方案中,在将包含T细胞的细胞群与源自人甲型流感病毒的M1肽(M158–66)和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的至少6%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或更多。
在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的6%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的10%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的15%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的20%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的25%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的30%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的35%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的40%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的45%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的50%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的55%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的60%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的65%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的70%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的75%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的80%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的85%至99%。在一些实施方案中,在与M1肽和/或IL-2接触后,CD8+T细胞中Vβ17+CD8+T细胞的百分比为CD8+细胞的90%至99%。
在一些实施方案中,本文提供的方法或过程包括在M1肽刺激后分离或富集Vβ17+CD8+T细胞。在一个具体的实施方案中,该方法包括首先分离CD8+细胞,并且然后分离Vβ17阳性细胞。在一个具体的实施方案中,该方法包括首先分离Vβ17阳性细胞,并且然后分离CD8+细胞。在另一个具体的实施方案中,该方法包括同时分离CD8+细胞和Vβ17阳性细胞。
本文提供的方法还包括活化和/或扩增Vβ17+CD8+T细胞的步骤。在一些实施方案中,活化和/或扩增Vβ17+CD8+T细胞的步骤包括向细胞中添加细胞因子,并且这些细胞因子包括但不限于凝集素、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、促乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、苗勒氏抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整联蛋白、血小板生成素(TPO)、神经生长因子(NGF)、血小板生长因子、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、红细胞生成素(EPO)、骨诱导因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-λ、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)、粒细胞-CSF(G-CSF)、白介素-1(IL-1)、IL-la、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、LIF、kit-配体、FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑素、肿瘤坏死因子和LT(淋巴毒素)。在一些实施方案中,活化和/或扩增Vβ17+CD8+T细胞的步骤包括将细胞与饲养细胞共培养。在一些实施方案中,活化和/或扩增Vβ17+CD8+T细胞的步骤包括添加抑制免疫抑制信号的试剂。在具体的实施方案中,活化和/或扩增Vβ17+CD8+T细胞的步骤包括免疫检查点抑制剂。在具体的实施方案中,活化和/或扩增Vβ17+CD8+T细胞的步骤包括抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在一个具体的实施方案中,活化和/或扩增Vβ17+CD8+T细胞的的步骤包括抗CD3/CD28珠粒。
5.4.1.嵌合抗原受体
本文提供的用于生成CAR-T细胞的方法包括将编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入Vβ17+CD8+T细胞中。
在一些实施方案中,本文提供的CAR包含多肽,该多肽包含:(a)细胞外抗原结合结构域;(b)跨膜结构域;以及(c)细胞内信号传导结构域。
信号肽
在某些实施方案中,本文提供的CAR可在多肽的N端包含信号肽(也称为信号序列)。一般而言,信号肽是将多肽靶向细胞中期望的位点的肽序列。在一些实施方案中,信号肽将效应分子靶向细胞的分泌途径并且将允许效应分子整合并锚定到脂质双层中。对于在本文所述的CAR中使用相容的信号肽,包括天然存在的蛋白的信号序列或合成的、非天然存在的信号序列,对本领域技术人员来说将是显而易见的。在一些实施方案中,信号肽源自选自由CD8α、GM-CSF受体α和IgG1重链组成的组的分子。在一个具体的实施方案中,该信号肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
细胞外抗原结合结构域
本文描述的CAR的细胞外抗原结合结构域包含一个或多个抗原结合结构域。在一些实施方案中,本文提供的CAR的细胞外抗原结合结构域是单特异性的。在其他实施方案中,本文提供的CAR的细胞外抗原结合结构域是多特异性的。在一些实施方案中,该细胞外抗原结合结构域包含两个或更多个抗原结合结构域,这些抗原结合结构域直接经由肽键或经由肽接头彼此融合。
在一些实施方案中,该细胞外抗原结合结构域构成抗体或其片段。例如,结合结构域可源自单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长或完整的单克隆抗体)、具有多表位或单表位特异性的抗体、多克隆或单价抗体、多价抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如,双特异性抗体,只要它们表现出期望的生物活性即可)、单链抗体及它们的片段。抗体可以是人的、人源化的、嵌合的和/或亲和力成熟的,以及来自其他物种例如小鼠、兔、美洲驼等的抗体。在一些实施方案中,抗体包括免疫球蛋白多肽类别内的B细胞的多肽产物,其能够与特定分子抗原结合并且由两对相同的多肽链组成,其中每对具有一条重链(约50kDa-70kDa)和一条轻链(约25kDa),每条链的每个氨基末端部分包括约100个至约130个或更多个氨基酸的可变区,并且每条链的每个羧基末端部分包括恒定区。参见例如,Antibody Engineering(Borrebaeck编辑,第2版,1995);和Kuby,Immunology(第3版,1997)。抗体还包括但不限于合成抗体、重组产生的抗体、包括来自骆驼科物种(例如美洲驼或羊驼)的单结构域抗体或其人源化变体、细胞内抗体、抗独特型(抗Id)抗体和上述任一种的功能性片段(例如,抗原结合片段),其是指保留了该片段所来源的抗体的一些或全部结合活性的抗体重链或轻链多肽的部分。功能性片段(例如,抗原结合片段)的非限制性示例包括单链Fv(scFv)(例如,包括单特异性、双特异性等)、Fab片段、F(ab')片段、F(ab)2片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和微抗体。具体地,本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分,例如,含有结合抗原的抗原结合位点的抗原结合结构域或分子(例如,抗体的一个或多个CDR)。此类抗体片段可见于例如Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(1989);Mol.Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference(Myers编辑,1995);Huston等人,1993,Cell Biophysics 22:189-224;Plückthun和Skerra,1989,Meth.Enzymol.178:497-515;和Day,Advanced Immunochemistry(第2版,1990)。本文提供的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。抗体可以是激动性抗体或拮抗性抗体。抗体可能既不是激动性的也不是拮抗性的。
在一个具体的实施方案中,本发明CAR的细胞外抗原结合结构域包含单链Fv(sFv或scFv)。scFv是包含连接成单一多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地,该scFv多肽还包含在VH结构域与VL结构域之间的多肽接头,该多肽接头使得该sFv能够形成抗原结合所需的结构。参见Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
在另一个具体的实施方案中,本发明CAR的细胞外抗原结合结构域构成一种或多种单结构域抗体(sdAb)。sdAb可以是相同或不同来源的,并且可以是相同或不同大小的。示例性sdAb包括但不限于来自仅重链的抗体的重链可变结构域(例如,VHH或VNAR)、天然缺乏轻链的结合分子、源自常规4-链抗体的单结构域(诸如VH或VL)、仅重链的人源化抗体、由表达人重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人单结构域抗体以及除源自抗体的那些以外的工程化结构域和单结构域支架。本领域已知的或由本公开开发的任何sdAb,包括本公开上述的单结构域抗体,可用于构建本文所述的CAR。sdAb可以源自任何物种,包括但不限于小鼠、大鼠、人、骆驼、美洲驼、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。本文考虑的单结构域抗体还包括来自除骆驼科和鲨鱼以外的物种的天然存在的单结构域抗体分子。
在一些实施方案中,sdAb源自天然存在的单结构域抗原结合分子,其称为缺乏轻链的重链抗体(在本文中也称为“仅重链的抗体”)。此类单结构域分子例如公开于WO 94/04678和Hamers-Casterman,C.等人,Nature363:446-448(1993)中。为了清楚起见,源自天然缺乏轻链的重链分子的可变结构域在本文中称为VHH,以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区分开。此类VHH可以源自骆驼科物种中产生的抗体,骆驼科物种例如,骆驼、美洲驼、骆马、单峰驼、羊驼和原驼。除骆驼科以外的其他物种可产生天然缺乏轻链的重链分子,并且此类VHH在本公开的范围内。另外,VHH的人源化型式以及其他修饰和变体也被考虑并且在本公开的范围内。在一些实施方案中,sdAb源自在软骨鱼中发现的免疫球蛋白的可变区。例如,sdAb可源自在鲨鱼血清中发现的称为新型抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型。产生源自NAR可变区(“IgNAR”)的单结构域分子的方法描述于WO 03/014161和Streltsov,ProteinSci.14:2901-2909(2005)中。
在一些实施方案中,针对特定抗原或靶标的天然存在的VHH结构域可从骆驼科VHH序列的(原初或免疫)文库获得。此类方法可以涉及或可以不涉及使用所述抗原或靶,或其至少一部分、片段、抗原决定簇或表位,使用本领域已知的一种或多种筛选技术来筛选此类文库。此类文库和技术例如描述于WO 99/37681、WO 01/90190、WO 03/025020和WO 03/035694中。另选地,可以使用源自(原初或免疫)VHH文库的改良的合成或半合成文库,诸如通过诸如随机诱变和/或CDR改组的技术从(原初或免疫)VHH文库获得的VHH文库,如例如WO00/43507中所述。
在一些实施方案中,sdAb是重组的、CDR移植的、人源化的、骆驼化的、去免疫的和/或体外产生的(例如,通过噬菌体展示选择的)。在一些实施方案中,框架区的氨基酸序列可通过框架区中特定氨基酸残基的“骆驼化”而改变。骆驼化是指来自常规4链抗体的(天然存在的)VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基被重链抗体的VHH结构域中的对应位置出现的一个或多个氨基酸残基替换或取代。这可以以本领域已知的方式执行,该方式对于本领域技术人员来说是清楚的。此类“骆驼化”取代优选插入形成和/或存在于VH-VL界面的氨基酸位置处和/或所谓的骆驼科标志残基处,如本文所定义(参见例如WO 94/04678,Davies和Riechmann FEBS Letters 339:285-290(1994);Davies和Riechmann,Protein Engineering 9(6):531-537(1996);Riechmann,J.Mol.Biol.259:957-969(1996);及Riechmann和Muyldermans,J.Immunol.Meth.231:25-38(1999))。
在一些实施方案中,sdAb是由表达人重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人单结构域抗体。参见,例如,US20090307787、美国专利号8,754,287、US20150289489、US20100122358和WO2004049794。
在一些实施方案中,从常规四链抗体生成单结构域抗体。参见,例如EP 0 368684;Ward等人,Nature,341(6242):544-6(1989);Holt等人,Trends Biotechnol.,21(11):484-490(2003);WO 06/030220;和WO 06/003388。
在一些实施方案中,细胞外抗原结合结构域构成人源化抗体或其片段。人源化抗体可包含人框架区和人恒定区序列。
人源化抗体可以使用本领域已知的多种技术产生,这些技术包括但不限于CDR移植(欧洲专利号EP 239,400;国际公布号WO 91/09967;以及美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)、镶面或表面重修(欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596;Padlan,1991,Molecular Immunology28(4/5):489-498;Studnicka等人,1994,Protein Engineering 7(6):805-814;和Roguska等人,1994,PNAS 91:969-973)、链改组(美国专利号5,565,332),以及例如以下参考文献中公开的技术:美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、WO93/17105,Tan等人,J.Immunol.169:1119 25(2002),Caldas等人,Protein Eng.13(5):353-60(2000),Morea等人,Methods 20(3):267 79(2000),Baca等人,J.Biol.Chem.272(16):10678-84(1997),Roguska等人,Protein Eng.9(10):895 904(1996),Couto等人,Cancer Res.55(23增刊):5973s-5977s(1995),Couto等人,Cancer Res.55(8):1717-22(1995),Sandhu JS,Gene 150(2):409-10(1994),和Pedersen等人,J.Mol.Biol.235(3):959-73(1994)。还可参见美国专利公布US 2005/0042664A1(2005年2月24日),这些文献中的每一篇全文以引用的方式并入本文。
用于人源化非人抗体的各种方法是本领域已知的。例如,人源化抗体可具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基,其通常取自“输入”可变结构域。人源化可以例如按照Jones等人,1986,Nature 321:522-25;Riechmann等人,1988,Nature332:323-27;和Verhoeyen等人,1988,Science 239:1534-36)的方法,通过用高变区序列取代人抗体的对应序列来执行。
在一些情况下,人源化抗体通过CDR移植构建,其中亲本非人(例如,啮齿动物)抗体的六个CDR的氨基酸序列移植到人抗体框架上。例如,Padlan等人确定CDR中仅约三分之一的残基实际上接触抗原,并且将这些残基称为“特异性决定残基”或SDR(Padlan等人,1995,FASEB J.9:133-39)。在SDR接枝技术中,仅SDR残基被接枝到人抗体框架上(参见例如,Kashmiri等人,2005,Methods 36:25-34)。
用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链两者)的选择对于降低抗原性很重要。例如,根据所谓的“最佳拟合”方法,针对已知人可变结构域序列的整个文库筛选非人(例如,啮齿动物)抗体的可变结构域的序列。可选择最接近啮齿动物的人序列作为人源化抗体的人框架(Sims等人,1993,J.Immunol.151:2296-308;和Chothia等人,1987,J.Mol.Biol.196:901-17)。另一种方法使用来源于特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-89;和Presta等人,1993,J.Immunol.151:2623-32)。在一些情况下,框架源自最丰富的人亚类VL6亚组I(VL6I)和VH亚组III(VHIII)的共有序列。在另一种方法中,人类种系基因用作框架区的来源。
在基于CDR的比较的另选范例中,称为超人源化,FR同源性是不相关的。所述方法由非人序列与功能性人种系基因组库的比较组成。然后选择对鼠序列进行编码相同或紧密相关正则结构的那些基因。接着,在与非人抗体共享规范结构的基因中,选择在CDR内具有最高同源性的基因作为FR供体。最后,将非人CDR接枝到这些FR上(参见例如,Tan等人,2002,J.Immunol.169:1119-25)。
通常还期望抗体被人源化,同时保留其对抗原的亲和力和其他有利的生物特性。为了实现这个目标,根据一个方法,人源化抗体使用亲本和人源化序列的三维模型通过亲本序列和各种概念上的人源化产物的分析过程进行制备。三维免疫球蛋白模型通常是可用的并且是为本领域的技术人员所熟悉的。举例说明且显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可用的。这些包括例如WAM(Whitelegg和Rees,2000,ProteinEng.13:819-24)、Modeller(Sali和Blundell,1993,J.Mol.Biol.234:779-815)以及SwissPDB Viewer(Guex和Peitsch,1997,Electrophoresis 18:2714-23)。这些展示的检测使得能分析在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中残基的可能作用,例如分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以这种方式,可以从受体和输入序列中选择和组合FR残基,从而能实现所需抗体特征,诸如对靶抗原的增加的亲和力。通常,高变区残基直接且基本上大多数涉及影响抗原结合。
用于抗体人源化的另一种方法是基于称为人类链含量(HSC)的抗体人源性的度量。该方法将小鼠序列与人种系基因的组库进行比较,并且差异被评分为HSC。然后通过使其HSC最大化而不是使用全局同一性测量来人源化靶序列,以生成多种不同人源化变体(Lazar等人,2007,Mol.Immunol.44:1986-98)。
除了上述方法之外,经验方法还可以用于生成和选择人源化抗体。这些方法包括基于生成人源化变体的大基因库和使用富集技术或高通量筛选技术选择最佳克隆的方法。抗体变体可从噬菌体、核糖体和酵母展示文库中分离以及通过细菌菌落筛选分离(参见例如,Hoogenboom,2005,Nat.Biotechnol.23:1105-16;Dufner等人,2006,TrendsBiotechnol.24:523-29;Feldhaus等人,2003,Nat.Biotechnol.21:163-70;和Schlapschy等人,2004,Protein Eng.Des.Sel.17:847-60)。
在FR文库方法中,在FR中的特定位置处引入残基变体的集合,随后筛选文库以选择最佳支持移植CDR的FR。待取代的残基可包括一些或所有被鉴定为可能有助于CDR结构的“Vernier”残基(参见例如,Foote和Winter,1992,J.Mol.Biol.224:487-99),或通过Baca等人鉴定的更有限的靶残基组(1997,J.Biol.Chem.272:10678-84)。
在FR改组中,将完整FR与非人CDR组合,而不是产生所选残基变体的组合文库(参见例如,Dall’Acqua等人,2005,Methods 36:43-60)。可在两步法:第一步人源化VL,随后人源化VH中筛选用于结合的文库。另选地,可使用一步FR改组方法。已证实这种方法比两步筛选更有效,因为所得抗体表现出改进的生物化学和物理化学性质,包括增强的表达、增加的亲和力和热稳定性(参见例如,Damschroder等人,2007,Mol.Immunol.44:3049-60)。
“人源改造”方法基于实验鉴定必需的最小特异性决定簇(MSD),并且基于将非人片段顺序替换到人FR文库中并评估结合。其开始于非人VH和VL链的CDR3区,并且将非人抗体的其他区逐渐替换为人FR,包括VH和VL两者的CDR1和CDR2。该方法通常导致表位保留和鉴定具有不同人V-区段CDR的多个亚类的抗体。人源改造允许分离与人种系基因抗体91%-96%同源的抗体(参见例如,Alfenito,Cambridge Healthtech Institute's ThirdAnnual PEGS,The Protein Engineering Summit,2007)。
“人类工程化”方法涉及通过对抗体的氨基酸序列进行特异性改变来改变非人抗体或抗体片段诸如小鼠或嵌合抗体或抗体片段,以便产生在人类中具有降低的免疫原性的修饰抗体,该抗体仍然保留原始非人抗体的所需结合特性。通常,该技术涉及将非人(例如,小鼠)抗体的氨基酸残基分类为“低风险”、“中等风险”或“高风险”残基。使用整体风险/回报计算来执行分类,该整体风险/回报计算评估针对取代将影响所得抗体折叠的风险进行特定取代(例如针对人类中的免疫原性)的预测益处。可通过将来自非人抗体可变区的氨基酸序列与特定或共有人抗体序列的相应区域进行比对来选择在非人(例如,小鼠)抗体序列的给定位置(例如,低或中等风险)处待被取代的特定人氨基酸残基。非人序列中的低或中度风险位置处的氨基酸残基可以根据比对来取代人抗体序列中的对应残基。在Studnicka等人,1994,Protein Engineering 7:805-14;美国专利号5,766,886、5,770,196、5,821,123和5,869,619;及PCT公布WO 93/11794中更详细地描述了用于制备人类工程化蛋白的技术。
可以使用例如复合人抗体TM技术(Antitope Ltd.,Cambridge,United Kingdom)产生复合人抗体。为了产生复合人抗体,以避免T细胞表位的方式从多个人抗体可变区序列的片段设计可变区序列,从而使所得抗体的免疫原性最小化。此类抗体可包含人恒定区序列,例如人轻链和/或重链恒定区。
去免疫抗体是其中已经去除T细胞表位的抗体。已经描述了用于制备去免疫抗体的方法。参见,例如Jones等人,Methods Mol Biol.2009;525:405-23,xiv,及De Groot等人,Cell.Immunol.244:148-153(2006)。去免疫抗体包含T细胞表位耗竭的可变区和人恒定区。简而言之,克隆抗体的VH和VL,并且随后通过在T细胞增殖测定中测试来源于抗体的VH和VL的重叠肽来鉴定T细胞表位。经由电子方法鉴定T细胞表位以鉴定与人MHC II类结合的肽。将突变引入VH和VL中以消除与人MHC II类的结合。然后利用突变的VH和VL来生成去免疫抗体。
在一些实施方案中,细胞外抗原结合结构域包含多个结合结构域。在一些实施方案中,细胞外抗原结合结构域构成多特异性抗体或其片段。在其他实施方案中,细胞外抗原结合结构域构成多价抗体或其片段。术语“特异性”是指抗原结合蛋白对抗原的特定表位的选择性识别。如本文所用的术语“多特异性”表示抗原结合蛋白具有两个或更多个抗原结合位点,其中至少两个抗原结合位点结合不同的抗原。如本文所用的术语“价”表示在抗原结合蛋白中存在结合位点的指定数目。全长抗体具有两个结合位点并且是二价的。因此,术语“三价”、“四价”、“五价”和“六价”分别表示在抗原结合蛋白中存在两个结合位点、三个结合位点、四个结合位点、五个结合位点和六个结合位点。
多特异性抗体诸如双特异性抗体是对至少两个不同抗原具有结合特异性的抗体。用于制备多特异性抗体的方法是本领域已知的,诸如通过两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达,其中两条重链具有不同的特异性(参见例如,Milstein和Cuello,1983,Nature305:537-40)。有关生成多特异性抗体(例如,双特异性抗体)的详细信息,参见例如,Bispecific Antibodies(Kontermann编辑,2011)。
本公开的抗体可以是具有两个或更多个抗原结合位点的多价抗体(例如,四价抗体),其可通过重组表达编码抗体的多肽链的核酸容易地产生。在某些实施方案中,多价抗体包含三个至约八个抗原结合位点(或由其组成)。在一个此类实施方案中,多价抗体包含四个抗原结合位点(或由其组成)。多价抗体包含至少一条多肽链(例如,两条多肽链),其中多肽链包含两个或更多个可变结构域。例如,多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc,其中VD1是第一可变结构域,VD2是第二可变结构域,Fc是Fc区的一条多肽链,X1和X2表示氨基酸或多肽,并且n为0或1。例如,多肽链可包含:VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链;或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体还可包含至少两个(例如,四个)轻链可变结构域多肽。本文的多价抗体可例如包含约两个至约八个轻链可变结构域多肽。本文设想的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域,并且任选地还包含CL结构域。
在本发明CAR的细胞外抗原结合结构域中存在多个结合结构域的情况下。不同的结构域可以经由肽接头彼此融合。在一些实施方案中,结构域在没有任何肽接头的情况下彼此直接融合。肽接头可以相同或不同。每个肽接头可以具有相同或不同的长度和/或序列,这取决于不同结构域的结构特征和/或功能特征。可以独立地选择和优化每个肽接头。CAR中使用的肽接头的长度、柔性程度和/或其他特性可对包括但不限于对一种或多种特定抗原或表位的亲和力、特异性或亲合力的特性具有一定影响。在一些实施方案中,肽接头包含柔性残基(诸如甘氨酸和丝氨酸),使得相邻结构域相对于彼此自由移动。例如,甘氨酸-丝氨酸双联体可以是合适的肽接头。
肽接头可以具有天然存在的序列,或非天然存在的序列。例如,源自仅重链的抗体的铰链区的序列可用作接头。参见,例如WO1996/34103。在一些实施方案中,肽接头为柔性接头。示例性的柔性接头包括但不限于甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n和(GGGGS)n,其中n是至少为1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性接头。本领域已知的其他接头,例如,如WO2016014789、WO2015158671、WO2016102965、US20150299317、WO2018067992、US7741465、Colcher等人,J.Nat.Cancer Inst.82:1191-1197(1990)和Bird等人,Science 242:423-426(1988)也包括在本文提供的CAR中,上述参考文献中的每一篇的公开内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中,本发明CAR中提供的细胞外抗原结合结构域识别充当靶细胞上与特殊疾病状态相关的细胞表面标志物的抗原。在一些实施方案中,抗原是肿瘤抗原。肿瘤表达可作为免疫应答,特别是T细胞介导的免疫应答的靶抗原的许多蛋白。CAR靶向的抗原可以是单个患病细胞上的抗原或是在各自促成该疾病的不同细胞上表达的抗原。CAR靶向的抗原可直接或间接参与该疾病。
肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白,可以引发免疫应答,特别是T细胞介导的免疫应答。示例性的肿瘤抗原包括但不限于胶质瘤相关抗原、癌胚性抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、prostein、PSMA、HER2/neu、存活蛋白和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
在一些实施方案中,肿瘤抗原包含与恶性肿瘤相关的一个或多个抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达许多可作为免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原,诸如黑素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和gp100,以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其他靶分子属于转化相关分子的组,诸如癌基因HER2/Neu/ErbB-2。又一组靶抗原是癌胚胎抗原,诸如癌胚抗原(CEA)。
在一些实施方案中,肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA对于肿瘤细胞是独有的,并且不出现在体内的其他细胞上。TAA相关抗原不是肿瘤细胞独有的,而是在未能诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下也在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可以在能够使免疫系统对抗原应答的条件下发生。TAA可以是在胎儿发育期间(当免疫系统不成熟时)在正常细胞上表达并且不能应答的抗原,或者它们可以是通常以极低水平存在于正常细胞上但以高得多的水平在肿瘤细胞上表达的抗原。
TSA或TAA抗原的非限制性示例包括:分化抗原诸如MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5;过表达的胚抗原诸如CEA;过度表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因,诸如p53、Ras、HER2/neu;由染色体易位产生的独特肿瘤抗原;诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR;和病毒抗原,诸如爱泼斯坦巴尔病毒抗原EBVA及人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。
其他大的基于蛋白的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环素C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
在一些更具体的实施方案中,抗原是CD123。在一个具体的实施方案中,本文提供的CAR包含细胞外抗原结合结构域,该细胞外抗原结合结构域包含能够结合CD123并且包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的scFv。
在其他更具体的实施方案中,抗原是PSMA。在一个具体的实施方案中,本文提供的CAR包含细胞外抗原结合结构域,该细胞外抗原结合结构域包含能够结合PSMA并且包含SEQID NO:4的氨基酸序列的scFv。
铰链区
在一些实施方案中,本文提供的CAR包含位于细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的铰链结构域。铰链结构域是通常在蛋白质的两个结构域之间发现的氨基酸区段,并且可以允许蛋白质的柔性和一个或两个结构域相对于彼此移动。可以使用提供此类柔性和细胞外抗原结合结构域相对于效应分子的跨膜结构域的移动的任何氨基酸序列。
抗体(诸如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体)的铰链结构域对于在本文所述的pH依赖性嵌合受体系统中的使用是相容的。在一些实施方案中,铰链结构域是连接抗体的恒定结构域CH1和CH2的铰链结构域。在一些实施方案中,铰链结构域是抗体的铰链结构域并且包含抗体的铰链结构域和抗体的一个或多个恒定区。在一些实施方案中,铰链结构域包含抗体的铰链结构域和抗体的CH3恒定区。在一些实施方案中,铰链结构域包含抗体的铰链结构域和抗体的CH2恒定区和CH3恒定区。在一些实施方案中,抗体是IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体。在一些实施方案中,抗体是IgG抗体。在一些实施方案中,抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中,铰链区包含IgG1抗体的铰链区及CH2恒定区和CH3恒定区。在一些实施方案中,铰链区包含IgG1抗体的铰链区和CH3恒定区。
非天然存在的肽也可用作本文所述的嵌合受体的铰链结构域。在一些实施方案中,Fc受体的细胞外配体结合结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链结构域是肽接头,诸如(GxS)n接头,其中x和n可以独立地是3至12之间的整数,包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更大。
铰链结构域可含有约10个-100个氨基酸,例如约15个-75个氨基酸、20个-50个氨基酸或30个-60个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中,铰链结构域的长度可为至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75个氨基酸中的任一者。
在一些实施方案中,铰链结构域是天然存在的蛋白质的铰链结构域。本领域已知包含铰链结构域的任何蛋白质的铰链结构域对于在本文所述的嵌合受体中的使用是相容的。在一些实施方案中,铰链结构域是天然存在的蛋白质的铰链结构域的至少一部分并且赋予嵌合受体柔性。在一些实施方案中,铰链结构域源自CD8α。在一些实施方案中,铰链结构域是CD8α的铰链结构域的一部分,例如含有CD8α的铰链结构域的约15个-100个(例如,20个、25个、30个、35个或40个)连续氨基酸的片段。在一些实施方案中,CD8α的铰链结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
跨膜结构域
本公开的CAR包含可以直接或间接融合到细胞外抗原结合结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以来源于天然或合成来源。如本文所用,“跨膜结构域”是指在细胞膜,优选真核细胞膜中热力学稳定的任何蛋白质结构。可从天然存在的蛋白质获得对于在本文所述的CAR中的使用相容的跨膜结构域。另选地,它可以是合成的、非天然存在的蛋白质区段,例如在细胞膜中热力学稳定的疏水性蛋白质区段。
基于跨膜结构域的三维结构对跨膜结构域进行分类。例如,跨膜结构域可形成α螺旋、多于一个α螺旋的复合物、β桶或能够跨越细胞的磷脂双层的任何其他稳定结构。此外,跨膜结构域还可以或另选地基于跨膜结构域拓扑(包括跨膜结构域穿过膜的次数和蛋白质的定向)进行分类。例如,单次穿膜蛋白穿过细胞膜一次,而多次穿膜蛋白穿过细胞膜至少两次(例如,2、3、4、5、6、7次或更多次)。膜蛋白可定义为I型、II型或III型,这取决于它们的末端和穿膜区段相对于细胞内部和外部的拓扑结构。I型膜蛋白具有单个跨膜区并且定向成使得蛋白质的N端存在于细胞的脂质双层的细胞外侧,蛋白质的C端存在于细胞质侧。II型膜蛋白也具有单个跨膜区,但是定向成使得蛋白质的C端存在于细胞的脂质双层的细胞外侧,蛋白质的N端存在于细胞质侧。III型膜蛋白具有多个跨膜区段,并且可基于跨膜区段的数目及N端和C端的位置进一步细分。
在一些实施方案中,本文所述的CAR的跨膜结构域源自I型单次穿膜蛋白。在一些实施方案中,来自多次穿膜蛋白的跨膜结构域对于在本文所述的CAR中的使用也相容。多次穿膜蛋白可包含复合(至少2、3、4、5、6、7个或更多个)α螺旋或β折叠结构。在一些实施方案中,多次穿膜蛋白的N端和C端存在于脂质双层的相对侧上,例如蛋白质的N端存在于脂质双层的细胞质侧上,蛋白质的C端存在于细胞外侧上。
用于本文所述的CAR中的跨膜结构域还可包含合成的、非天然存在的蛋白质区段的至少一部分。在一些实施方案中,跨膜结构域是合成的、非天然存在的α螺旋或β折叠。在一些实施方案中,蛋白质区段为约15个-100个氨基酸。在一些实施方案中,蛋白质区段为至少大约20个氨基酸,例如至少18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸。合成的跨膜结构域的示例是本领域已知的,例如在美国专利号7,052,906和PCT公布号WO 2000/032776中,其相关公开内容以引用方式并入本文。
本文提供的跨膜结构域可包含跨膜区和位于跨膜结构域的C端侧的胞质区。跨膜结构域的胞质区可包含三个或更多个氨基酸,并且在一些实施方案中,帮助定向脂质双层中的跨膜结构域。在一些实施方案中,一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的跨膜区中。在一些实施方案中,一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的胞质区中。在一些实施方案中,跨膜结构域的胞质区包含带正电荷的氨基酸。在一些实施方案中,跨膜结构域的胞质区包含氨基酸即精氨酸、丝氨酸和赖氨酸。
在一些实施方案中,跨膜结构域的跨膜区包含疏水性氨基酸残基。在一些实施方案中,本文提供的CAR的跨膜结构域包含人工疏水序列。例如,苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸三联体可存在于跨膜结构域的C端。在一些实施方案中,跨膜区主要包含疏水性氨基酸残基,诸如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或缬氨酸。在一些实施方案中,跨膜区是疏水性的。在一些实施方案中,跨膜区包含聚亮氨酸-丙氨酸序列。蛋白质或蛋白质区段的亲水性或疏水或亲水特性可通过本领域已知的任何方法评估,例如Kyte和Doolittle亲水性分析。
在一些实施方案中,CAR的跨膜结构域包含选自以下项的跨膜结构域的跨膜结构域:T细胞受体的α、β或ζ链,CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CDlla、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CD19、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C。
在一些具体的实施方案中,跨膜结构域源自CD8α。在一些实施方案中,跨膜结构域是包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CD8α的跨膜结构域。
细胞内信号传导结构域
本文提供的CAR中的细胞内信号传导结构域负责激活表达CAR的免疫效应细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。T细胞的效应子功能例如可以是细胞溶解活性或辅助活性,包括细胞因子的分泌。因此,术语“细胞质信号传导结构域”是指蛋白质的一部分,该部分转导效应子功能信号并指导细胞执行特化功能。尽管通常可采用整个细胞质信号传导结构域,但是在许多情况下,不必使用整条链。在使用细胞质信号传导结构域的截短部分的方面来说,可使用此类截短部分代替完整链,只要它转导效应子功能信号即可。因此,术语细胞质信号传导结构域意在包括细胞质信号传导结构域的足以转导效应子功能信号的任何截短部分。
在一些实施方案中,细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中,CAR包含基本上由免疫效应细胞的初级细胞内信号传导结构域组成的细胞内信号传导结构域。“初级细胞内信号传导结构域”是指以刺激方式起作用以诱导免疫效应子功能的细胞质信号传导序列。在一些实施方案中,初级细胞内信号传导结构域含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。如本文所用,“ITAM”是保守蛋白基序,通常存在于许多免疫细胞中表达的信号传导分子的尾部。基序可以包含由6个-8个氨基酸分隔开的氨基酸序列YxxL/I的两个重复序列,其中每个x独立地是任何氨基酸,产生保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I。信号传导分子内的ITAM对于细胞内的信号转导很重要,该信号转导至少部分地由信号传导分子活化后ITAM中酪氨酸残基的磷酸化介导。ITAM还可以起到参与信号传导途径的其他蛋白质的停靠位点的作用。示例性的含ITAM的初级细胞质信号传导序列包括源自CD3z、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。
在一些实施方案中,初级细胞内信号传导结构域源自CD3z。在一些实施方案中,细胞内信号传导结构域由CD3z的细胞质信号传导结构域组成。在一些实施方案中,初级细胞内信号传导结构域是野生型CD3z的细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中,CD3zδ的初级细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。共刺激信号传导结构域
在一些实施方案中,CAR包含至少一个共刺激信号传导结构域。如本文所用,术语“共刺激信号传导结构域”是指介导细胞内的信号转导以诱导免疫应答(诸如效应子功能)的蛋白质的至少一部分。除了刺激抗原特异性信号之外,许多免疫效应细胞需要共刺激,以促进细胞增殖、分化和存活,以及激活细胞的效应子功能。
本文所述的嵌合受体的共刺激信号传导结构域可以是来自共刺激蛋白的细胞质信号传导结构域,该细胞质信号传导结构域转导信号并调节由免疫细胞(诸如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞)介导的应答。“共刺激信号传导结构域”可以是共刺激分子的细胞质部分。术语“共刺激分子”是指免疫细胞(诸如T细胞)上的同源结合配偶体,其与共刺激配体特异性地结合,从而介导免疫细胞的共刺激应答,诸如但不限于增殖和存活。
在一些实施方案中,细胞内信号传导结构域包括单个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中,细胞内信号传导结构域包含两个或更多个(诸如约2个、3个、4个或更多个中的任何一种)共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中,细胞内信号传导结构域包含两个或更多个相同的共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中,细胞内信号传导结构域包含来自不同共刺激蛋白,诸如本文所述的任何两种或更多种共刺激蛋白的两个或更多个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中,细胞内信号传导结构域包含初级细胞内信号传导结构域(诸如CD3z的细胞质信号传导结构域)和一个或多个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中,该一个或多个共刺激信号传导结构域和初级细胞内信号传导结构域(诸如CD3z的细胞质信号传导结构域)经由任选的肽接头彼此融合。初级细胞内信号传导结构域和该一个或多个共刺激信号传导结构域可以以任何合适的顺序排列。在一些实施方案中,该一个或多个共刺激信号传导结构域位于跨膜结构域和初级细胞内信号传导结构域(诸如CD3z的细胞质信号传导结构域)之间。多个共刺激信号传导结构域可提供相加或协同的刺激作用。
宿主细胞(例如,免疫细胞)中共刺激信号传导结构域的活化可诱导细胞增加或减少细胞因子的产生和分泌、吞噬特性、增殖、分化、存活和/或细胞毒性。任何共刺激分子的共刺激信号传导结构域对于在本文所述的CAR中的使用可以是相容的。共刺激信号传导结构域的类型基于诸如以下因素进行选择:效应分子将在其中表达的免疫效应细胞的类型(例如,T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞)和期望的免疫效应子功能(例如,ADCC效应)。在CAR中使用的共刺激信号传导结构域的示例可以是共刺激蛋白的细胞质信号传导结构域,包括但不限于B7/CD28家族的成员(例如,B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC和PDCD6);TNF超家族的成员(例如,4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α和TNF RII/TNFRSF1B);SLAM家族的成员(例如,2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6和SLAM/CD150);和任何其他共刺激分子,诸如CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I类、HLA-DR、Ikaros、整联蛋白α4/CD49d、整联蛋白α4β1、整联蛋白α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和NKG2C。在一些实施方案中,该一个或多个共刺激信号传导结构域选自由以下项组成的组:CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性结合CD83的配体。
在一些实施方案中,本公开的CAR中的细胞内信号传导结构域包括源自CD137的共刺激信号传导结构域(即,4-1BB)。在一些实施方案中,细胞内信号传导结构域包括CDz的细胞质信号传导结构域和CD137的共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中,细胞内信号传导结构域包括包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CD137的共刺激信号传导结构域。
在一些实施方案中,共刺激信号传导结构域是本文所述的任何共刺激信号传导结构域的变体,使得该共刺激信号传导结构域能够调节免疫细胞的免疫应答。在一些实施方案中,与野生型对应物相比,共刺激信号转导结构域包含多达10个氨基酸残基变异(例如,1个、2个、3个、4个、5个或8个)。包含一个或多个氨基酸变异的此类共刺激信号传导结构域可称为变体。相对于不包含突变的共刺激信号传导结构域,该共刺激信号传导结构域的氨基酸残基的突变可导致信号转导的增加和免疫应答的刺激增强。相对于不包含突变的共刺激信号传导结构域,该共刺激信号传导结构域的氨基酸残基的突变可导致信号转导的降低和免疫应答的刺激减少。
示例性CAR
如以下第7节中所示,生成示例性的多特异性CAR。
在一个具体的实施方案中,本文提供的CAR从N端至C端包含:包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的信号肽,包含结合CD123并包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的scFv的细胞外抗原结合结构域,包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CD8α铰链结构域,包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CD8α跨膜结构域,源自CD137的包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的共刺激信号传导结构域,及源自CD3z的包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的初级细胞内信号传导结构域。
在一个具体的实施方案中,本文提供的CAR从N端至C端包含:包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的信号肽,包含结合PSMA并包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的scFv的细胞外抗原结合结构域,包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CD8α铰链结构域,包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CD8α跨膜结构域,源自CD137的包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的共刺激信号传导结构域,及源自CD3z的包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的初级细胞内信号传导结构域。
在某些实施方案中,本文提供的CAR包含相对于以下第7节中例示的CAR中的任何一种具有一定百分比同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,本文提供了一种CAR,该CAR包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的细胞外结构域或该细胞外结构域组成。在一些实施方案中,本文提供了一种CAR,该CAR包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的细胞外结构域或该细胞外结构域组成。
两个序列(例如,氨基酸序列或核酸序列)之间的同一性百分比的测定可使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的优选非限制性示例为Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264 2268(1990)的算法,如Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873 5877(1993)中那样加以修改。此类算法并入Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。可用NBLAST核苷酸程序参数集进行BLAST核苷酸检索,例如,对于评分=100,字长=12,以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。可用XBLAST程序参数集进行BLAST蛋白质检索,例如,对于得分50,字长=3,以获得与本文所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对,可如Altschul等人,Nucleic Acids Res.25:3389 3402(1997)所述那样利用空位BLAST。另选地,可使用PSI BLAST执行检测分子之间的距离关系(Id.)的迭代检索。当利用BLAST、空位BLAST和PSI Blast程序时,可使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见例如,万维网上的国家生物技术信息中心(NCBI),ncbi.nlm.nih.gov)。用于比较序列的数学算法的另一非限制性示例为Myers和Miller,CABIOS 4:11-17(1998)的算法。此类算法并入ALIGN程序(版本2.0)中,其是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时,可使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12、空位罚分4。
在一些实施方案中,设想了本文所述的CAR的氨基酸序列修饰。例如,可能期望优化细胞外结构域的结合亲和力和/或其他生物特性,包括但不限于特异性、热稳定性、表达水平、效应子功能、糖基化、降低的免疫原性或溶解度。因此,除了本文所述的细胞外结构域之外,设想可制备本文所述的结构域的变体。例如,可通过将适当的核苷酸变化引入编码DNA和/或通过合成期望的抗体或多肽来制备scFv变体。理解氨基酸变化的本领域技术人员可改变抗体的翻译后过程。
变异可以是编码多肽的一个或多个密码子的取代、缺失或插入,这导致氨基酸序列与原始抗体或多肽相比发生变化。取代诱变的感兴趣位点包括CDR和FR。
氨基酸取代可以是用具有类似结构和/或化学特性的一个氨基酸替换另一个氨基酸的结果,诸如用丝氨酸替换亮氨酸,例如,保守氨基酸替换。本领域技术人员已知的标准技术可用于在编码本文提供的分子的核苷酸序列中引入突变,包括例如导致氨基酸取代的定点诱变和PCR介导的诱变。插入或缺失可任选地在约1至5个氨基酸的范围内。在某些实施方案中,取代、缺失或插入包括相对于原始分子少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。在具体实施方案中,取代是在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行的保守氨基酸取代。所允许的变体可通过系统地对序列中的氨基酸进行插入、缺失或取代并针对亲本抗体所表现出的活性测试所得变体来确定。
通过保守氨基酸取代生成的抗体包括在本公开中。在保守氨基酸取代中,氨基酸残基被具有带类似电荷的侧链的氨基酸残基替换。如上所述,本领域已经定义了具有带类似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如,赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如,天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如,甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。另选地,突变可沿编码序列的全部或部分诸如通过饱和诱变随机引入,并且可筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体。在诱变后,可表达所编码的蛋白质,并且可确定蛋白质的活性。(例如,在具有相似特性和/或侧链的氨基酸基团内)可进行保守取代,以便维持或不显著改变特性。
氨基酸可根据其侧链特性的相似性来分组(参见例如,Lehninger,Biochemistry73-75(第2版1975)):(1)非极性:Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M);(2)不带电荷极性:Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q);(3)酸性:Asp(D)、Glu(E);和(4)碱性:Lys(K)、Arg(R)、His(H)。另选地,天然存在的残基可基于常见的侧链特性分成几组:(1)疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile;(2)中性亲水:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;(3)酸性:Asp、Glu;(4)碱性:His、Lys、Arg;(5)影响链取向的残基:Gly、Pro;和(6)芳族:Trp、Tyr、Phe。例如,任何不参与维持抗体正确构象的半胱氨酸残基也可例如用另一氨基酸诸如丙氨酸或丝氨酸取代,以提高分子的氧化稳定性并防止异常交联。非保守取代将需要将这些类别中的一个类别的成员交换为另一类别。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如,人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常,选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体将在某些生物学特性方面具有改变(例如,改善)(例如,增加的亲和力、降低的免疫原性)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性的取代变体是亲和力成熟抗体,可以使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术,诸如本文所述的那些方便地生成。简言之,使一个或多个CDR残基突变并将变体抗体展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
可在CDR中产生改变(例如,取代),例如以改善抗体亲和力。此类改变可以在CDR“热点”,即在体细胞成熟过程中高频率经历突变的密码子所编码的残基(参见,例如,Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中产生,测试所得变体抗体或其片段的结合亲和力。例如Hoogenboom等人在Methods in Molecular Biology178:1-37中(O’Brien等人编辑,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中已经描述了通过构建二级文库并从二级文库中重新选择进行的亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中,通过多种方法中的任一种(例如,易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)将多样性引入选择进行成熟的可变基因中。然后产生二级文库。然后筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法包括CDR定向方法,其中几个CDR残基(例如,一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性地鉴定参与抗原结合的CDR残基。
在一些实施方案中,取代、插入或缺失可发生在一个或多个CDR内,只要此类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力。例如,可在CDR中产生基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如,如本文所提供的保守取代)。在一些实施方案中,每个CDR未改变,或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
鉴定可靶向诱变的抗体的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”,如Cunningham和Wells,Science,244:1081-1085(1989)所述。在该方法中,鉴定一个残基或一组靶残基(例如,带电荷的残基,诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu),并用中性或带负电荷的氨基酸(例如,丙氨酸或聚丙氨酸)替换,以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示出功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。
另选地或另外地,抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴定抗体和抗原之间的接触点。此类接触残基和相邻残基可作为取代的候选被靶向或消除。可筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合物,以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的示例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N-末端或C-末端与酶(例如,对于ADEPT来说)或多肽的融合物,这延长了抗体的血清半衰期。
可使用本领域已知的方法进行变化,诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变。定点诱变(参见,例如Carter,Biochem J.237:1-7(1986);和Zoller等人,Nucl.Acids Res.10:6487-500(1982))、盒式诱变(参见,例如Wells等人,Gene 34:315-23(1985))或其他已知技术可以对克隆的DNA执行以产生抗体变体DNA。
5.4.2.多核苷酸
在某些实施方案中,本公开提供了编码本文提供的CAR的多核苷酸。本公开的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA;并且可以是双链或单链的,并且如果是单链,可以是编码链或非编码(反义)链。在一些实施方案中,多核苷酸是cDNA的形式。在一些实施方案中,多核苷酸是合成的多核苷酸。在一些实施方案中,本文提供的多核苷酸编码本文提供的结合CD123的CAR。在一些实施方案中,本文提供的多核苷酸编码本文提供的结合PSMA的CAR。
本公开还涉及本文所述的多核苷酸的变体,其中该变体编码例如本公开的抗体或CAR的片段、类似物和/或衍生物。在某些实施方案中,本公开提供了一种多核苷酸,其包括具有与编码本公开的CAR的多核苷酸至少约75%相同、至少约80%相同、至少约85%相同、至少约90%相同、至少约95%相同并且在一些实施方案中至少约96%、97%、98%或99%相同的核苷酸序列的多核苷酸。如本文所用,短语“具有与参考核苷酸序列至少例如95%“相同”的核苷酸序列的多核苷酸”旨在意指该多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同,不同的是该多核苷酸序列可包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸至多五个点突变。换句话讲,为了获得具有与参考核苷酸序列至少95%相同的核苷酸序列的多核苷酸,参考序列中至多5%的核苷酸可缺失或被另一核苷酸取代,或者可将参考序列中总核苷酸的至多5%的核苷酸数目可插入参考序列中。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或那些末端位置之间的任何位置,或者单独散布在参考序列的核苷酸中,或者散布在参考序列内的一个或多个连续组中。
多核苷酸变体可在编码区、非编码区或两者中含有改变。在一些实施方案中,多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加或缺失但不改变所编码的多肽的特性或活性的改变。在一些实施方案中,多核苷酸变体包含沉默取代,其不导致多肽的氨基酸序列的改变(由于遗传密码的简并性)。多核苷酸变体可出于各种原因产生,例如,为了优化特定宿主的密码子表达(即,将人mRNA中的密码子改变为细菌宿主诸如大肠杆菌(E.coli)的优选密码子)。在一些实施方案中,多核苷酸变体在序列的非编码区或编码区中包含至少一个沉默突变。
在一些实施方案中,产生多核苷酸变体以调节或改变所编码的多肽的表达(或表达水平)。在一些实施方案中,产生多核苷酸变体以增加所编码的多肽的表达。在一些实施方案中,产生多核苷酸变体以降低所编码的多肽的表达。在一些实施方案中,多核苷酸变体与亲本多核苷酸序列相比具有增加的所编码的多肽的表达。在一些实施方案中,多核苷酸变体与亲本多核苷酸序列相比具有降低的所编码的多肽的表达。
5.4.3.载体
还提供包含本文所述的核酸分子的载体。在一个实施方案中,可以将核酸分子掺入到重组表达载体中。
本公开提供了用于克隆和表达本文所述的任一种CAR的载体。在一些实施方案中,该载体适于在真核细胞诸如哺乳动物细胞中复制和整合。在一些实施方案中,载体是病毒载体。病毒载体的示例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘载体、单纯疱疹病毒载体及它们的衍生物。病毒载体技术是本领域熟知的,并且例如在Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,New York),以及其他病毒学和分子生物学手册中有描述。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如,逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术将异源核酸插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并将其在体外或离体递送至工程化哺乳动物细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方案中,使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一些实施方案中,使用慢病毒载体。在一些实施方案中,使用自灭活慢病毒载体。例如,携带免疫调节剂(诸如免疫检查点抑制剂)编码序列的自灭活慢病毒载体和/或携带嵌合抗原受体的自灭活慢病毒载体可以用本领域已知的方案包装。所得慢病毒载体可用于使用本领域已知的方法转导哺乳动物细胞(诸如原代人T细胞)。源自逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具,因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子代细胞中的增殖。慢病毒载体还具有低免疫原性,并且可以转导非增殖细胞。
在一些实施方案中,载体包含编码本文所述CAR的核酸中的任一种。可以使用本领域任何已知的分子克隆方法将核酸克隆到载体中,包括例如使用限制性内切酶位点和一种或多种选择性标记。在一些实施方案中,核酸与启动子可操作地连接。已经探索了多种启动子用于在哺乳动物细胞中的基因表达,并且本领域已知的任何启动子都可以用于本公开。启动子可以大致分类为组成型启动子或调节型启动子,诸如诱导型启动子。
在一些实施方案中,编码CAR的核酸可操作地连接至组成型启动子。组成型启动子允许异源基因(也称为转基因)在宿主细胞中组成型表达。本文设想的示例性组成型启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、人延伸因子-1α(hEF1α)、泛素C启动子(UbiC)、磷酸甘油激酶启动子(PGK)、猿猴病毒40早期启动子(SV40)和与CMV早期增强子偶联的鸡β-肌动蛋白启动子(CAGG)。此类组成型启动子在驱动转基因表达方面的效率已经在大量研究中进行了广泛比较。例如,Michael C.Milone等人比较了CMV、hEF1α、UbiC和PGK驱动嵌合抗原受体在原代人T细胞中表达的效率,并且推断hEF1α启动子不仅诱导最高水平的转基因表达,而且还在CD4和CD8人T细胞中最佳地维持(Molecular Therapy,17(8):1453-1464(2009))。在一些实施方案中,编码CAR的核酸可操作地连接至hEF1α启动子。
在一些实施方案中,编码CAR的核酸可操作地连接至诱导型启动子。诱导型启动子属于调节型启动子的类别。诱导型启动子可由一种或多种条件诱导,诸如物理条件、工程化免疫效应细胞的微环境或工程化免疫效应细胞的生理状态、诱导因子(即,诱导剂)或它们的组合。
在一些实施方案中,诱导条件不诱导内源基因在工程化哺乳动物细胞中和/或在接受药物组合物的受试者中的表达。在一些实施方案中,诱导条件选自由以下项组成的组:诱导因子、辐射(诸如电离辐射、光)、温度(诸如热)、氧化还原状态、肿瘤环境和工程化哺乳动物细胞的活化状态。
在一些实施方案中,载体还含有选择性标记基因或报告基因,以从通过慢病毒载体转染的宿主细胞群中选择表达CAR的细胞。选择性标记和报告基因都可以侧接适当的调控序列以使得能够在宿主细胞中表达。例如,载体可含有用于调节核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
5.5.表达CAR的甲型流感病毒特异性Vβ17+CD8+T细胞
在又一方面,本文提供了根据本文提供的方法产生的CAR-T细胞,例如,如上文5.4节所述。
在又一方面,本文提供了表达CAR的CAR-T细胞,其中该CAR-T细胞是Vβ17+CD8+T细胞。在某些实施方案中,本文提供了表达CAR的CAR-T细胞,其中该CAR-T细胞是Vβ17+CD8+T细胞,并且其中该CAR-T细胞表达能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的M1肽的细胞表面受体。
在一些实施方案中,本发明的CAR-T细胞中的CAR包含细胞外抗原结合结构域;跨膜结构域;以及细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中,CAR还包含一个或多个附加区域/结构域,诸如信号肽、铰链区、共刺激信号传导结构域、接头等,它们中的每一个可以如上文5.4.1节中所述。
具体地,在某些实施方案中,本文提供的CAR可包含位于多肽的N端的信号肽。在一些实施方案中,信号肽将效应分子靶向细胞的分泌途径并且将允许效应分子整合并锚定到脂质双层中。对于在本文所述的CAR中使用相容的信号肽,包括天然存在的蛋白的信号序列或合成的、非天然存在的信号序列,对本领域技术人员来说将是显而易见的。在一些实施方案中,信号肽源自选自由CD8α、GM-CSF受体α和IgG1重链组成的组的分子。在一个具体的实施方案中,该信号肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
本文描述的CAR的细胞外抗原结合结构域包含一个或多个抗原结合结构域。在一些实施方案中,该细胞外抗原结合结构域构成抗体或其片段。在一个具体的实施方案中,本发明CAR的细胞外抗原结合结构域包含单链Fv(sFv或scFv)。在一些实施方案中,细胞外抗原结合结构域构成人源化抗体或其片段。
在一些实施方案中,细胞外抗原结合结构域包含多个结合结构域。在一些实施方案中,细胞外抗原结合结构域构成多特异性抗体或其片段。在其他实施方案中,细胞外抗原结合结构域构成多价抗体或其片段。在本发明CAR的细胞外抗原结合结构域中存在多个结合结构域的情况下。不同的结构域可以经由肽接头彼此融合。在一些实施方案中,结构域在没有任何肽接头的情况下彼此直接融合。肽接头可以相同或不同。每个肽接头可以具有相同或不同的长度和/或序列,这取决于不同结构域的结构特征和/或功能特征。可以独立地选择和优化每个肽接头。
在一些实施方案中,本发明CAR中提供的细胞外抗原结合结构域识别充当靶细胞上与特殊疾病状态相关的细胞表面标志物的抗原。在一些实施方案中,抗原是肿瘤抗原。肿瘤表达可作为免疫应答,特别是T细胞介导的免疫应答的靶抗原的许多蛋白。CAR靶向的抗原可以是单个患病细胞上的抗原或是在各自促成该疾病的不同细胞上表达的抗原。CAR靶向的抗原可直接或间接参与该疾病。
肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白,可以引发免疫应答,特别是T细胞介导的免疫应答。示例性的肿瘤抗原包括但不限于胶质瘤相关抗原、癌胚性抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、prostein、PSMA、HER2/neu、存活蛋白和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
在一些实施方案中,肿瘤抗原包含与恶性肿瘤相关的一个或多个抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达许多可作为免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原,诸如黑素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和gp100,以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其他靶分子属于转化相关分子的组,诸如癌基因HER2/Neu/ErbB-2。又一组靶抗原是癌胚胎抗原,诸如癌胚抗原(CEA)。
在一些实施方案中,肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA对于肿瘤细胞是独有的,并且不出现在体内的其他细胞上。TAA相关抗原不是肿瘤细胞独有的,而是在未能诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下也在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可以在能够使免疫系统对抗原应答的条件下发生。TAA可以是在胎儿发育期间(当免疫系统不成熟时)在正常细胞上表达并且不能应答的抗原,或者它们可以是通常以极低水平存在于正常细胞上但以高得多的水平在肿瘤细胞上表达的抗原。
TSA或TAA抗原的非限制性示例包括:分化抗原诸如MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5;过表达的胚抗原诸如CEA;过度表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因,诸如p53、Ras、HER2/neu;由染色体易位产生的独特肿瘤抗原;诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR;和病毒抗原,诸如爱泼斯坦巴尔病毒抗原EBVA及人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。
其他大的基于蛋白的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环素C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
在一些更具体的实施方案中,抗原是CD123。在一个具体的实施方案中,本文提供的CAR包含细胞外抗原结合结构域,该细胞外抗原结合结构域包含能够结合CD123并且包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的scFv。
在其他更具体的实施方案中,抗原是PSMA。在一个具体的实施方案中,本文提供的CAR包含细胞外抗原结合结构域,该细胞外抗原结合结构域包含能够结合PSMA并且包含SEQID NO:4的氨基酸序列的scFv。
在一些实施方案中,本文提供的CAR包含位于细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的铰链结构域。在一些实施方案中,铰链结构域是天然存在的蛋白质的铰链结构域。本领域已知包含铰链结构域的任何蛋白质的铰链结构域对于在本文所述的嵌合受体中的使用是相容的。在一些实施方案中,铰链结构域是天然存在的蛋白质的铰链结构域的至少一部分并且赋予嵌合受体柔性。在一些实施方案中,铰链结构域源自CD8α。在一些实施方案中,铰链结构域是CD8α的铰链结构域的一部分,例如含有CD8α的铰链结构域的约15个-100个(例如,20个、25个、30个、35个或40个)连续氨基酸的片段。在一些实施方案中,CD8α的铰链结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
本公开的CAR包含可以直接或间接融合到细胞外抗原结合结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以来源于天然或合成来源。可从天然存在的蛋白质获得对于在本文所述的CAR中的使用相容的跨膜结构域。另选地,它可以是合成的、非天然存在的蛋白质区段,例如在细胞膜中热力学稳定的疏水性蛋白质区段。在一些实施方案中,跨膜结构域源自I型、II型或III型膜蛋白。在一些实施方案中,本文所述的CAR的跨膜结构域源自I型单次穿膜蛋白。在一些实施方案中,来自多次穿膜蛋白的跨膜结构域对于在本文所述的CAR中的使用也相容。用于本文所述的CAR中的跨膜结构域还可包含合成的、非天然存在的蛋白质区段的至少一部分。。在一些实施方案中,蛋白质区段为约15个-100个氨基酸。在一些实施方案中,跨膜结构域是合成的、非天然存在的α螺旋或β折叠。在一些实施方案中,蛋白质区段为至少大约20个氨基酸,例如至少18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸。
本文提供的跨膜结构域可包含跨膜区和位于跨膜结构域的C端侧的胞质区。在一些实施方案中,跨膜结构域的跨膜区包含疏水性氨基酸残基。
在一些实施方案中,CAR的跨膜结构域包含选自以下项的跨膜结构域的跨膜结构域:T细胞受体的α、β或ζ链,CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CDlla、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CD19、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C。
在一些具体的实施方案中,跨膜结构域源自CD8α。在一些实施方案中,跨膜结构域是包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CD8α的跨膜结构域。
本文提供的CAR中的细胞内信号传导结构域负责激活表达CAR的免疫效应细胞的至少一种正常效应子功能。在一些实施方案中,细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中,CAR包含基本上由免疫效应细胞的初级细胞内信号传导结构域组成的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中,初级细胞内信号传导结构域含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。示例性的含ITAM的初级细胞质信号传导序列包括源自CD3z、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。
在一些实施方案中,初级细胞内信号传导结构域衍生自CD3z。在一些实施方案中,细胞内信号传导结构域由CD3z的细胞质信号传导结构域组成。在一些实施方案中,初级细胞内信号传导结构域是野生型CD3z的细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中,CD3zδ的初级细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一些实施方案中,CAR包含至少一个共刺激信号传导结构域。本文所述的嵌合受体的共刺激信号传导结构域可以是来自共刺激蛋白的细胞质信号传导结构域,该细胞质信号传导结构域转导信号并调节由免疫细胞介导的应答。在一些实施方案中,细胞内信号传导结构域包括单个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中,细胞内信号传导结构域包含两个或更多个(诸如约2个、3个、4个或更多个中的任何一种)共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中,细胞内信号传导结构域包含两个或更多个相同的共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中,细胞内信号传导结构域包含来自不同共刺激蛋白,诸如本文所述的任何两种或更多种共刺激蛋白的两个或更多个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中,细胞内信号传导结构域包含初级细胞内信号传导结构域(诸如CD3z的细胞质信号传导结构域)和一个或多个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中,该一个或多个共刺激信号传导结构域和初级细胞内信号传导结构域(诸如CD3z的细胞质信号传导结构域)经由任选的肽接头彼此融合。初级细胞内信号传导结构域和该一个或多个共刺激信号传导结构域可以以任何合适的顺序排列。在一些实施方案中,该一个或多个共刺激信号传导结构域位于跨膜结构域和初级细胞内信号传导结构域(诸如CD3z的细胞质信号传导结构域)之间。多个共刺激信号传导结构域可提供相加或协同的刺激作用。
任何共刺激分子的共刺激信号传导结构域对于在本文所述的CAR中的使用可以是相容的。在CAR中使用的共刺激信号传导结构域的示例可以是共刺激蛋白的细胞质信号传导结构域,包括但不限于B7/CD28家族的成员(例如,B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC和PDCD6);TNF超家族的成员(例如,4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α和TNF RII/TNFRSF1B);SLAM家族的成员(例如,2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6和SLAM/CD150);和任何其他共刺激分子,诸如CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I类、HLA-DR、Ikaros、整联蛋白α4/CD49d、整联蛋白α4β1、整联蛋白α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和NKG2C。在一些实施方案中,该一个或多个共刺激信号传导结构域选自由以下项组成的组:CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性结合CD83的配体。
在一些实施方案中,本公开的CAR中的细胞内信号传导结构域包括源自CD137的共刺激信号传导结构域(即,4-1BB)。在一些实施方案中,细胞内信号传导结构域包括CDz的细胞质信号传导结构域和CD137的共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中,细胞内信号传导结构域包括包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CD137的共刺激信号传导结构域。
在一个具体的实施方案中,本文提供的CAR从N端至C端包含:包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的信号肽,包含结合CD123并包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的scFv的细胞外抗原结合结构域,包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CD8α铰链结构域,包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CD8α跨膜结构域,源自CD137的包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的共刺激信号传导结构域,及源自CD3z的包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的初级细胞内信号传导结构域。
在一个具体的实施方案中,本文提供的CAR从N端至C端包含:包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的信号肽,包含结合PSMA并包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的scFv的细胞外抗原结合结构域,包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CD8α铰链结构域,包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CD8α跨膜结构域,源自CD137的包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的共刺激信号传导结构域,及源自CD3z的包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的初级细胞内信号传导结构域。
在某些实施方案中,本文提供的CAR包含相对于以下第7节中例示的CAR中的任何一种具有一定百分比同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,本文提供了一种CAR,该CAR包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的细胞外结构域或该细胞外结构域组成。在一些实施方案中,本文提供了一种CAR,该CAR包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的细胞外结构域或该细胞外结构域组成。
5.6.药物组合物
在一个方面,本公开还提供了包含本公开的工程化T细胞的药物组合物。在一些实施方案中,药物组合物包含治疗有效量的本公开的工程化T细胞和药学上可接受的赋形剂。
在一个具体的实施方案中,术语“赋形剂”还可指稀释剂、佐剂(例如,弗氏佐剂(完全或不完全))、载剂或媒介物。药物赋形剂可以是无菌的液体,诸如水和油,包括那些衍生自石油、动物、植物的油或合成的油,诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐水溶液和右旋糖水溶液以及甘油溶液也可用作液体赋形剂。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要,组合物还可含有少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采用溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等形式。合适的药物赋形剂的示例描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)MackPublishing Co.,Easton,PA。此类组合物将含有预防或治疗有效量的本文提供的活性成分,诸如纯化形式,以及合适量的赋形剂以便提供用于适当施用于患者的形式。制剂应与施用方式相适应。
在一些实施方案中,赋形剂的选择部分地由特定细胞和/或施用方法决定。因此,存在多种合适的制剂。
通常,可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的,并且包括缓冲液、抗氧化剂(包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、偏亚硫酸氢钠);防腐剂、等渗剂、稳定剂、金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物);螯合剂,诸如EDTA和/或非离子表面活性剂。
缓冲液可用于将pH控制在优化治疗有效性的范围内,尤其是如果稳定性是pH依赖性的。与本公开一起使用的合适的缓冲剂包括有机酸和无机酸及它们的盐。例如,柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、乙酸盐。另外,缓冲液可包含组氨酸和三甲胺盐诸如Tris。
可添加防腐剂以延缓微生物生长。与本公开一起使用的合适的防腐剂包括十八烷基二甲基苄基氯化铵;氯化六甲双铵;苯甲烃铵卤化物(例如,氯化物、溴化物、碘化物)、苄索氯铵;硫柳汞、苯酚、丁醇或苄醇;对羟基苯甲酸烷基酯,诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯;儿茶酚;间苯二酚;环己醇、3-戊醇和间甲酚。
可存在张度剂(有时称为“稳定剂”)以调节或维持组合物中液体的张度。当与大的带电荷的生物分子诸如蛋白质和抗体一起使用时,它们通常被称为“稳定剂”,因为它们可以与氨基酸侧链的带电荷的基团相互作用,从而减少分子间和分子内相互作用的可能性。示例性的张度剂包括多羟基糖醇、三羟基或更高级的糖醇,诸如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
另外的示例性赋形剂包括:(1)填充剂,(2)增溶剂,(3)稳定剂和(4)防止变性或粘附到容器壁上的试剂。此类赋形剂包括:多羟基糖醇(上面列举的);氨基酸,诸如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等;有机糖或糖醇,诸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌糖(myoinisitose)、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环多醇(例如,环己六醇)、聚乙二醇;含硫还原剂,诸如脲、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠;低分子量蛋白,诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其他免疫球蛋白;亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮;单糖(例如,木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖;二糖(例如,乳糖、麦芽糖、蔗糖);三糖诸如棉子糖;及多糖,诸如糊精或葡聚糖。
可以存在非离子表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白质免于搅动引起的聚集,这也容许制剂暴露于剪切表面应力而不引起活性治疗蛋白质或抗体的变性。合适的非离子表面活性剂包括例如聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(184、188等)、多元醇、聚氧乙烯山梨醇单醚(等)、聚桂醇400、硬脂酸聚氧酯40、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧基甲基纤维素。可以使用的阴离子洗涤剂包括月桂基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子洗涤剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
为了使药物组合物用于体内施用,它们优选是无菌的。可通过经无菌过滤膜过滤使药物组合物无菌。通常可将本文的药物组合物置于具有无菌入口的容器,例如具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的静脉溶液袋或小瓶中。
施用途径根据已知和接受的方法,诸如通过单次或多次推注或以合适的方式在长时间内输注,例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、病变内或关节内途径注射或输注,局部施用,吸入或通过持续释放或长期释放的手段。
在另一个实施方案中,药物组合物可作为受控释放或持续释放系统提供。在一个实施方案中,可使用泵来实现受控释放或持续释放(参见,例如Sefton,Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201-40(1987);Buchwald等人,Surgery88:507-16(1980);和Saudek等人,N.Engl.J.Med.321:569-74(1989))。在另一个实施方案中,可使用聚合材料来实现预防性或治疗性药剂(例如,如本文所述的融合蛋白)或本文提供的组合物的受控或持续释放(参见例如,Medical Applications of Controlled Release(Langer和Wise编辑,1974);Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance(Smolen和Ball编辑,1984);Ranger和Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61-126(1983);Levy等人,Science228:190-92(1985);During等人,Ann.Neurol.25:351-56(1989);Howard等人,J.Neurosurg.71:105-12(1989);美国专利号5,679,377;5,916,597;5,912,015;5,989,463;和5,128,326;PCT公布号WO 99/15154和WO 99/20253)。用于持续释放制剂的聚合物的示例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一个实施方案中,用于持续释放制剂中的聚合物为惰性的,不含可浸出的杂质,储存稳定,无菌,并且可生物降解。在另一个实施方案中,可将受控或持续释放系统置于特定靶组织(例如,鼻通道或肺)附近,因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如,Goodson,Medical Applications of Controlled Release,第2卷,115-38(1984))。受控释放系统例如通过Langer,Science 249:1527-33(1990)论述。本领域技术人员已知的任何技术可用于产生包含一种或多种如本文所述的试剂的持续释放制剂(参见例如,美国专利号4,526,938,PCT公布号WO 91/05548和WO 96/20698,Ning等人,Radiotherapy&Oncology39:179-89(1996);Song等人,PDA J.of Pharma.Sci.&Tech.50:372-97(1995);Cleek等人,Pro.Int’l.Symp.Control.相对Bioact.Mater.24:853-54(1997);以及Lam等人,Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-60(1997))。
本文所述的药物组合物还可以含有一种以上的活性化合物或活性剂,这对于所治疗的特定适应症是必需的。另选地或另外,该组合物可包含细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂或生长抑制剂。此类分子适合以对预期目的有效的量组合存在。
活性成分还可被包埋在微胶囊中,这些微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备,例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊,包埋在胶体药物递送系统(例如,脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或包埋在粗乳液中。此类技术公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences第18版中。
各种组合物和递送系统是已知的并且可与本文提供的治疗剂一起使用,包括但不限于包封在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达本文提供的单结构域抗体或治疗性分子的重组细胞中、作为逆转录病毒或其他载体的一部分的核酸的构建等。
在一些实施方案中,本文提供的药物组合物含有有效治疗或预防疾病或障碍的量(例如治疗有效量或预防有效量)的结合分子和/或细胞。在一些实施方案中,通过定期评估治疗的受试者来监测治疗或预防功效。对于数天或更长时间的重复施用,根据病症,重复治疗直至出现期望的疾病症状阻抑。然而,其他剂量方案也是有用的并且可以被确定。
5.7.方法和用途
在另一方面,本文提供了使用表达重组受体的工程化Vβ17+CD8+T细胞(诸如上文第5.5节中描述的那些,包括CAR-T细胞)的方法和这些细胞的用途,其中该CAR-T细胞是Vβ17+CD8+T细胞,并且其中该CAR-T细胞表达能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的M1肽的细胞表面受体。
在一些实施方案中,本文提供的工程化T细胞可用作同种异体CAR-T细胞疗法。在一些实施方案中,本发明的CAR-T细胞疗法具有传统自体CAR-T疗法所不具有的更多安全特征,例如没有或低细胞因子风暴、无调节性T细胞的刺激、减少的自体组织损伤、减少的自身免疫诱导、减少的移植物抗宿主病等。
此类方法和用途包括治疗方法和用途,例如涉及向患有疾病或障碍的受试者施用这些细胞或包含这些细胞的组合物。在一些实施方案中,以有效量施用细胞以实现疾病或障碍的治疗。用途包括细胞在此类方法和治疗中的用途,以及在制备药物以便执行此类治疗方法中的用途。在一些实施方案中,这些方法通过向患有或怀疑患有该疾病或病症的受试者施用这些细胞或包含这些细胞的组合物来执行。在一些实施方案中,这些方法由此治疗受试者的疾病或障碍。
在一些实施方案中,本文提供的治疗引起疾病或障碍,或症状、不良作用或结果,或与它们相关的表型的完全或部分改善或减轻。期望的治疗效果包括但不限于防止疾病的发生或复发、缓解症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。这些术语包括但不意味着完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结果的影响。
如本文所用,在一些实施方案中,本文提供的治疗延缓疾病或障碍的发展,例如推迟、阻碍、减缓、延迟、稳定、阻抑和/或推迟疾病(诸如癌症)的发展。这种延缓可以是不同时间长度的,这取决于疾病的病史和/或所治疗的个体。如对本领域技术人员显而易见的,充分或显著的延缓实际上可涵盖防止,因为个体不发展该疾病或障碍。例如,可以延缓晚期癌症,诸如转移的发展。在其他实施方案中,本文提供的方法或用途防止疾病或障碍。
在一些实施方案中,本发明的CAR-T细胞疗法用于治疗实体瘤癌症。在其他实施方案中,本发明的CAR-T细胞疗法用于治疗血癌。在其他实施方案中,疾病或障碍为自身免疫疾病和炎性疾病。在一些实施方案中,疾病或障碍为CD123相关疾病或障碍。在一些实施方案中,疾病或障碍为PSMA相关疾病或障碍。
在一些实施方案中,这些方法包括过继细胞疗法,由此将遗传工程化细胞施用于受试者。此类施用可促进细胞的活化(例如,T细胞活化),使得疾病或障碍的细胞被靶向破坏。
在一些实施方案中,这些方法包括将这些细胞或含有这些细胞的组合物施用于受试者、组织或细胞,诸如患有疾病或障碍,处于疾病或障碍风险中或怀疑患有疾病或障碍的受试者、组织或细胞。在一些实施方案中,将这些细胞、群体和组合物施用于患有待治疗(例如,经由过继细胞疗法,诸如过继T细胞疗法治疗)的特定疾病或障碍的受试者。在一些实施方案中,将这些细胞或组合物施用于受试者,诸如患有疾病或障碍或处于疾病或障碍风险中的受试者。在一些实施方案中,这些方法由此治疗,例如改善疾病或障碍的一种或多种症状。
用于过继细胞治疗的细胞施用方法是已知的,如例如美国专利申请公布号2003/0170238;美国专利号4,690,915;Rosenberg,Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85(2011);Themeli等人,Nat Biotechnol.31(10):928-933(2013);Tsukahara等人,Biochem BiophysRes Commun 438(1):84-9(2013);和Davila等人,PLoS ONE 8(4):e61338(2013)中所述。这些方法可连同本文提供的方法和组合物一起使用。
在一些实施方案中,细胞疗法(例如,过继T细胞疗法)通过自体转移进行,其中从要接受细胞疗法的受试者或从源自此类受试者的样品中分离和/或以其他方式制备细胞。因此,在一些方面,这些细胞源自需要治疗的受试者,并且这些细胞在分离和加工后施用于同一受试者。在其他实施方案中,细胞疗法(例如,过继T细胞疗法)通过同种异体转移进行,其中从除了要接受或最终会接受细胞疗法的受试者(例如,第一受试者)以外的受试者分离和/或以其他方式制备细胞。在此类实施方案中,然后将细胞施用于相同物种的不同受试者,例如第二受试者。在一些实施方案中,第一受试者和第二受试者基因相同。在一些实施方案中,第一受试者和第二受试者基因相似。在一些实施方案中,第二受试者表达与第一受试者相同的HLA类别或超型。
在一些实施方案中,施用细胞、细胞群或组合物的受试者是灵长类动物,诸如人。受试者可以是男性或女性,并且可以是任何合适的年龄,包括婴儿、少年、青年、成人和老年受试者。在一些示例中,受试者是用于疾病、过继细胞疗法和/或用于评估毒性结果的经验证的动物模型。
本文提供的组合物可通过任何合适的手段施用,例如通过注射,例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、筋膜囊下注射、眼球后注射、球周注射或后巩膜旁递送。在一些实施方案中,组合物通过肠胃外、肺内和鼻内施用,并且如果局部治疗需要,通过病变内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。
有效预防和/或治疗疾病或病症的预防性或治疗性药剂的量可通过标准临床技术确定。有效剂量可通过源自体外或动物模型测试体系的剂量响应曲线来推导。对于疾病预防或治疗而言,结合分子或细胞的适当剂量可取决于待治疗的疾病或障碍的类型、结合分子的类型、疾病或障碍的严重程度和过程、治疗剂是用于预防还是治疗目的施用、先前疗法、患者的临床病史和对药剂的反应以及主治医师的判断。在一些实施方案中,将组合物、分子和细胞一次性或经一系列治疗适当地施用于患者。多剂量可间歇施用。可以施用最初较高的初始负荷剂量,随后施用一个或多个较低剂量。
在遗传工程化细胞的情况下,在一些实施方案中,可以向受试者施用范围为约一百万至约1千亿个细胞和/或每千克体重的细胞量。在一些实施方案中,其中该药物组合物包含本文所述工程化免疫细胞中的任一种,该药物组合物以至少约104、105、106、107、108或109个细胞/kg个体体重中的任一种的剂量施用。剂量可根据疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗的特定属性而变化。
在一些实施方案中,药物组合物施用一次。在一些实施方案中,药物组合物施用多次(诸如2次、3次、4次、5次、6次或更多次中的任一种)。在一些实施方案中,药物组合物在给药周期期间施用一次或多次。给药周期可以是例如1周、2周、3周、4周、5周或或更多周,或1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或更多个月。对于特定患者的最佳剂量和治疗方案可以由医学领域的技术人员通过监测患者的疾病体征并相应地调整治疗来确定。
在一些实施方案中,本文提供的组合物作为组合治疗的一部分施用,诸如与另一种治疗性干预(诸如另一种抗体或工程化细胞或受体或药剂,诸如细胞毒性剂或治疗剂)同时或以任何顺序相继施用。
在一些实施方案中,将本文提供的组合物与一种或多种另外的治疗剂或结合另一种治疗干预同时或以任何顺序相继地共同施用。在一些实施方案中,细胞与另一种疗法在时间上足够接近地共同施用,使得细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的效果,或反之亦然。在一些实施方案中,本文提供的组合物在该一种或多种另外的治疗剂之前施用。在一些实施方案中,本文提供的组合物在该一种或多种另外的治疗剂之后施用。
在某些实施方案中,一旦将细胞施用于哺乳动物(例如,人),就通过许多已知方法中的任一种来测量工程化细胞群的生物活性。评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合,在体内例如,通过成像,或离体例如通过ELISA或流式细胞术。在某些实施方案中,工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用本领域已知的任何合适方法测量,诸如描述于例如Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)以及Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)中的细胞毒性测定。在某些实施方案中,还可以通过测定某些细胞因子(诸如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来测量细胞的生物活性。在一些方面,通过评估临床结果(诸如肿瘤负荷或载荷的减少)来测量生物活性。
5.8.试剂盒和制造的制品
还提供了包含本文所述的任何工程化免疫效应细胞的试剂盒、单位剂量和制造的制品。在一些实施方案中,提供了一种试剂盒,该试剂盒含有本文所述的任一种药物组合物并且优选提供其使用说明。
本申请的试剂盒处于合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、柔性包装(例如,密封的Mylar或塑料袋)等。试剂盒可任选地提供另外的组分,诸如缓冲液和解释信息。因此,本申请还提供了制造的制品,这些制造的制品包括小瓶(诸如密封小瓶)、瓶子、广口瓶、柔性包装等。
制造的制品可包括容器和在容器上或与容器相联的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可由多种材料,诸如玻璃或塑料形成。通常,容器容纳有效治疗本文所述的疾病或障碍(诸如癌症)的组合物,并且可以具有无菌入口(例如容器可以是静脉溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装说明书指示该组合物用于治疗个体的特定病症。标签或包装说明书将进一步包含将组合物施用于个体的说明书。标签可指示重构和/或使用的指导。容纳药物组合物的容器可以是多次使用的小瓶,多次使用的小瓶允许重复施用(例如,2-6次施用)重构制剂。包装说明书是指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书,其含有关于涉及此类治疗产品使用的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。另外,制造的制品还可包含第二容器,该第二容器包含药学上可接受的缓冲液,诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer’s solution)和葡萄糖溶液。制造的制品还可包括从商业和用户观点来看所期望的其他材料,包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
试剂盒或制造的制品可以包括药物组合物的多个单位剂量和使用说明,以足以在药房例如医院药房和混合药房中储存和使用的量包装。
为了简洁起见,本文使用某些缩写。一个示例是表示氨基酸残基的单字母缩写。氨基酸及其对应的三字母和单字母缩写如下:
本文使用肯定语言来描述多个实施方案而总体上公开本公开。本公开还具体地包括其中完全或部分排除特定主题诸如物质或材料、方法步骤和条件、方案、程序、测定或分析的实施方案。因此,即使本公开通常不是按照本公开不包括的内容来表达的,但本文仍然公开了未明确包括在本公开中的方面。
已描述了本公开的多个实施方案。然而,应当理解,在不脱离本公开的精神和范围的情况下,可进行各种修改。因此,以下实施例旨在说明而非限制权利要求书中描述的公开内容的范围。
6.实施方案
本发明提供了以下非限制性实施方案。
在一组实施方案(A组实施方案)中,提供了:
A1.一种用于活化或富集Vβ17+CD8+T细胞的方法,所述方法包括使源自人甲型流感病毒的M1肽(M158–66)与包含T细胞的细胞群接触。
A2.根据实施方案A1所述的方法,其中所述M1肽包含
GILGFVFTL(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。
A3.根据实施方案A1或实施方案A2所述的方法,所述方法还包括使IL-2与包含所述T细胞的所述细胞群接触。
A4.根据实施方案A1至A3中任一项所述的方法,其中所述细胞群在包含所述M1肽和/或IL-2的培养基中离体培养。
A5.根据实施方案A3所述的方法,其中所述方法包括:
(i)包含所述M1肽和IL-2的培养基中离体培养所述细胞群;
(ii)在包含所述M1肽的培养基中离体培养所述细胞群,并且然后在包含IL-2的培养基中离体培养所述细胞群;或
(iii)在包含所述M1肽的培养基中离体培养所述细胞群,然后在包含所述M1肽和IL-2的培养基中离体培养所述细胞群;并且然后在包含IL-2的培养基中离体培养所述细胞群。
A6.根据实施方案A4或实施方案A5所述的方法,其中所述细胞群离体培养至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。
A7.根据实施方案A4或实施方案A5所述的方法,其中所述细胞群离体培养1-20天、2-18天、3-16天、4-14天、5-14天、6-14天、7-14天、8-14天、9-14天、10-14天、11-14天或12-14天。
A8.根据实施方案A1至A7中任一项所述的方法,其中所述细胞群是全外周血单核细胞(PBMC)群。
A9.根据实施方案A8所述的方法,其中所述全PBMC群来自健康供体。
A10.根据实施方案A1至A9中任一项所述的方法,其中所述方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、90%、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍或14倍;或者其中所述方法使来自所述细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加到CD8+细胞的至少6%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%。
A11.根据实施方案A1至A9中任一项所述的方法,其中所述方法使来自所述细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的10%至20倍、20%至20倍、30%至20倍、40%至20倍、50%至20倍、60%至20倍、70%至20倍、80%至20倍、90%至20倍、2倍至20倍、3倍至20倍、4倍至20倍、5倍至20倍、6倍至20倍、7倍至20倍、8倍至20倍、9倍至20倍、10倍至20倍、11倍至20倍、12倍至20倍、13倍至20倍、14倍至20倍或15倍至20倍;或者其中所述方法使来自所述细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加到CD8+细胞的6%至99%、10%至99%、15%至99%、20%至99%、25%至99%、30%至99%、35%至99%、40%至99%、45%至99%、50%至99%、55%至99%、60%至99%、65%至99%、70%至99%、75%至99%、80%至99%、85%至99%或90%至99%。
A12.根据实施方案A1至A11中任一项所述的方法,其中所述方法还包括在使所述细胞群与所述M1肽和/或IL-2接触之后从所述细胞群中分离Vβ17+CD8+T细胞。
在另一组实施方案(B组实施方案)中,提供了:
B1.一种分离的Vβ17+CD8+T细胞群,所述细胞群通过包括使源自人甲型流感病毒的M1肽(M158–66)与包含T细胞的细胞群接触的方法而产生。
B2.根据实施方案B1所述的分离的Vβ17+CD8+T细胞群,其中所述M1肽包含GILGFVFTL(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。
B3.根据实施方案B1或实施方案B2所述的分离的Vβ17+CD8+T细胞群,其中所述方法还包括使IL-2与包含所述T细胞的所述细胞群接触。
B4.根据实施方案B1至B3中任一项所述的分离的Vβ17+CD8+T细胞群,其中所述细胞群在包含所述M1肽和/或IL-2的培养基中离体培养。
B5.根据实施方案B3所述的分离的Vβ17+CD8+T细胞群,其中所述方法包括:
(i)包含所述M1肽和IL-2的培养基中离体培养所述细胞群;
(ii)在包含所述M1肽的培养基中离体培养所述细胞群,并且然后在包含IL-2的培养基中离体培养所述细胞群;或
(iii)在包含所述M1肽的培养基中离体培养所述细胞群,然后在包含所述M1肽和IL-2的培养基中离体培养所述细胞群;并且然后在包含IL-2的培养基中离体培养所述细胞群。
B6.根据实施方案B4或实施方案B5所述的分离的Vβ17+CD8+T细胞群,其中所述细胞群离体培养至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。
B7.根据实施方案B4或实施方案B5所述的分离的Vβ17+CD8+T细胞群,其中所述细胞群离体培养1-20天、2-18天、3-16天、4-14天、5-14天、6-14天、7-14天、8-14天、9-14天、10-14天、11-14天或12-14天。
B8.根据实施方案B1至B7中任一项所述的分离的Vβ17+CD8+T细胞群,其中所述细胞群是全外周血单核细胞(PBMC)群。
B9.根据实施方案B8所述的分离的Vβ17+CD8+T细胞群,其中所述全PBMC群来自健康供体。
B10.根据实施方案B1至B9中任一项所述的分离的Vβ17+CD8+T细胞群,其中所述方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、90%、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍或14倍;或者其中所述方法使来自所述细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加到CD8+细胞的至少6%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%。
B11.根据实施方案B1至B9中任一项所述的分离的Vβ17+CD8+T细胞群,其中所述方法使来自所述细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的10%至20倍、20%至20倍、30%至20倍、40%至20倍、50%至20倍、60%至20倍、70%至20倍、80%至20倍、90%至20倍、2倍至20倍、3倍至20倍、4倍至20倍、5倍至20倍、6倍至20倍、7倍至20倍、8倍至20倍、9倍至20倍、10倍至20倍、11倍至20倍、12倍至20倍、13倍至20倍、14倍至20倍或15倍至20倍;或者其中所述方法使来自所述细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加到CD8+细胞的6%至99%、10%至99%、15%至99%、20%至99%、25%至99%、30%至99%、35%至99%、40%至99%、45%至99%、50%至99%、55%至99%、60%至99%、65%至99%、70%至99%、75%至99%、80%至99%、85%至99%或90%至99%。
B12.根据实施方案B1至B11中任一项所述的分离的Vβ17+CD8+T细胞群,其中所述方法还包括在使所述细胞群与所述M1肽和/或IL-2接触之后从所述细胞群中分离Vβ17+CD8+T细胞。
B13.一种分离的细胞群,其中所述分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比大于所述分离的细胞群的6%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%。
B14.一种分离的细胞群,其中所述分离的细胞群中Vβ17+CD8+T细胞的百分比是所述分离的细胞群的6%至99%、10%至99%、15%至99%、20%至99%、25%至99%、30%至99%、35%至99%、40%至99%、45%至99%、50%至99%、55%至99%、60%至99%、65%至99%、70%至99%、75%至99%、80%至99%、85%至99%或90%至99%。
B15.根据实施方案B13或实施方案B14所述的分离的细胞群,其中所述Vβ17+CD8+T细胞的至少一部分表达能够与所述M1肽结合的细胞表面受体。
在另一组实施方案(C组实施方案)中,提供了:
C1.一种制备CAR-T细胞的方法,所述方法包括:(i)获得包含Vβ17+CD8+T细胞的细胞群;并且(ii)将编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入Vβ17+CD8+T细胞中。
C2.根据实施方案C1所述的方法,其中所述方法中的步骤(i)包括通过使M1肽与包含T细胞的细胞群接触来活化或富集Vβ17+CD8+T细胞。
C3.根据实施方案C2所述的方法,其中所述M1肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
C4.根据实施方案C2或实施方案C3所述的方法,所述方法还包括使IL-2与包含所述T细胞的所述细胞群接触。
C5.根据实施方案C2至C4中任一项所述的方法,其中所述细胞群在包含所述M1肽和/或IL-2的培养基中离体培养。
C6.根据实施方案C4所述的方法,其中所述方法包括:
(i)包含所述M1肽和IL-2的培养基中离体培养所述细胞群;
(ii)在包含所述M1肽的培养基中离体培养所述细胞群,并且然后在包含IL-2的培养基中离体培养所述细胞群;或
(iii)在包含所述M1肽的培养基中离体培养所述细胞群,然后在包含所述M1肽和IL-2的培养基中离体培养所述细胞群;并且然后在包含IL-2的培养基中离体培养所述细胞群。
C7.根据实施方案C5或实施方案C6所述的方法,其中所述细胞群离体培养至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。
C8.根据实施方案C5或实施方案C6所述的方法,其中所述细胞群离体培养1-20天、2-18天、3-16天、4-14天、5-14天、6-14天、7-14天、8-14天、9-14天、10-14天、11-14天或12-14天。
C9.根据实施方案C2至C8中任一项所述的方法,其中所述细胞群是全PBMC群。
C10.根据实施方案C9所述的方法,其中所述全PBMC群来自健康供体。
C11.根据实施方案C2至C10中任一项所述的方法,其中所述方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍或14倍;或者其中所述方法使来自所述细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加到CD8+细胞的至少6%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%。
C12.根据实施方案C2至C10中任一项所述的方法,其中所述方法使来自所述细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的10%至20倍、20%至20倍、30%至20倍、40%至20倍、50%至20倍、60%至20倍、70%至20倍、80%至20倍、90%至20倍、2倍至20倍、3倍至20倍、4倍至20倍、5倍至20倍、6倍至20倍、7倍至20倍、8倍至20倍、9倍至20倍、10倍至20倍、11倍至20倍、12倍至20倍、13倍至20倍、14倍至20倍或15倍至20倍;或者其中所述方法使来自所述细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加到CD8+细胞的6%至99%、10%至99%、15%至99%、20%至99%、25%至99%、30%至99%、35%至99%、40%至99%、45%至99%、50%至99%、55%至99%、60%至99%、65%至99%、70%至99%、75%至99%、80%至99%、85%至99%或90%至99%。
C13.根据实施方案C2至C12中任一项所述的方法,其中所述方法还包括在使所述细胞群与所述M1肽和/或IL-2接触之后从所述细胞群中分离Vβ17+CD8+T细胞。
C14.根据实施方案C1至C13中任一项所述的方法,其中包含Vβ17+CD8+T细胞的所述细胞群包含所述分离的细胞群的超过6%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%的Vβ17+CD8+T细胞。
C15.根据实施方案C1至C13中任一项所述的方法,其中包含Vβ17+CD8+T细胞的所述细胞群包含所述分离的细胞群的6%至99%、10%至99%、15%至99%、20%至99%、25%至99%、30%至99%、35%至99%、40%至99%、45%至99%、50%至99%、55%至99%、60%至99%、65%至99%、70%至99%、75%至99%、80%至99%、85%至99%或90%至99%的Vβ17+CD8+T细胞。
C16.根据实施方案C1至C15中任一项所述的方法,其中所述CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。
C17.根据实施方案C16所述的方法,其中所述细胞外结构域与癌细胞上表达的抗原结合。
C18.根据实施方案C17所述的方法,其中所述癌细胞是血癌细胞或实体瘤癌细胞。
C19.根据实施方案C17所述的方法,其中抗原是CD123。
C20.根据实施方案C17所述的方法,其中抗原是PSMA。
在另一组实施方案(D组实施方案)中,提供了:
D1.一种CAR-T细胞,所述CAR-T细胞是通过包括以下的方法产生的:(i)获得包含Vβ17+CD8+T细胞的细胞群;并且(ii)将编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入Vβ17+CD8+T细胞中。
D2.根据实施方案D1所述的CAR-T细胞,其中所述方法中的步骤(i)包括通过使M1肽与包含T细胞的细胞群接触来活化或富集Vβ17+CD8+T细胞。
D3.根据实施方案D2所述的CAR-T细胞,其中所述M1肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
D4.根据实施方案D2或实施方案D3所述的CAR-T细胞,所述方法还包括使IL-2与包含所述T细胞的所述细胞群接触。
D5.根据实施方案D2至D4中任一项所述的CAR-T细胞,其中所述细胞群在包含所述M1肽和/或IL-2的培养基中离体培养。
D6.根据实施方案D4所述的CAR-T细胞,其中所述方法包括:
(i)包含所述M1肽和IL-2的培养基中离体培养所述细胞群;
(ii)在包含所述M1肽的培养基中离体培养所述细胞群,并且然后在包含IL-2的培养基中离体培养所述细胞群;或
(iii)在包含所述M1肽的培养基中离体培养所述细胞群,然后在包含所述M1肽和IL-2的培养基中离体培养所述细胞群;并且然后在包含IL-2的培养基中离体培养所述细胞群。
D7.根据实施方案D5或实施方案D6所述的CAR-T细胞,其中所述细胞群离体培养至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。
D8.根据实施方案D5或实施方案D6所述的CAR-T细胞,其中所述细胞群离体培养1-20天、2-18天、3-16天、4-14天、5-14天、6-14天、7-14天、8-14天、9-14天、10-14天、11-14天或12-14天。
D9.根据实施方案D2至D8中任一项所述的CAR-T细胞,其中所述细胞群是全PBMC群。
D10.根据实施方案D9所述的CAR-T细胞,其中所述全PBMC群来自健康供体。
D11.根据实施方案D2至D10中任一项所述的CAR-T细胞,其中所述方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍或14倍;或者其中所述方法使来自所述细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加到CD8+细胞的至少6%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%。
D12.根据实施方案D2至D10中任一项所述的CAR-T细胞,其中所述方法使来自所述细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的10%至20倍、20%至20倍、30%至20倍、40%至20倍、50%至20倍、60%至20倍、70%至20倍、80%至20倍、90%至20倍、2倍至20倍、3倍至20倍、4倍至20倍、5倍至20倍、6倍至20倍、7倍至20倍、8倍至20倍、9倍至20倍、10倍至20倍、11倍至20倍、12倍至20倍、13倍至20倍、14倍至20倍或15倍至20倍;或者其中所述方法使来自所述细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加到CD8+细胞的6%至99%、10%至99%、15%至99%、20%至99%、25%至99%、30%至99%、35%至99%、40%至99%、45%至99%、50%至99%、55%至99%、60%至99%、65%至99%、70%至99%、75%至99%、80%至99%、85%至99%或90%至99%。
D13.根据实施方案D2至D12中任一项所述的CAR-T细胞,其中所述方法还包括在使所述细胞群与所述M1肽和/或IL-2接触之后从所述细胞群中分离Vβ17+CD8+T细胞。
D14.根据实施方案D1至D13中任一项所述的CAR-T细胞,其中包含Vβ17+CD8+T细胞的所述细胞群包含超过6%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%的Vβ17+CD8+T细胞。
D15.根据实施方案D1至D13中任一项所述的CAR-T细胞,其中包含Vβ17+CD8+T细胞的所述细胞群包含6%至99%、10%至99%、15%至99%、20%至99%、25%至99%、30%至99%、35%至99%、40%至99%、45%至99%、50%至99%、55%至99%、60%至99%、65%至99%、70%至99%、75%至99%、80%至99%、85%至99%或90%至99%的Vβ17+CD8+T细胞。
D16.根据实施方案D1至D15中任一项所述的CAR-T细胞,其中所述CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。
D17.根据实施方案D16所述的CAR-T细胞,其中所述细胞外结构域与癌细胞上表达的抗原结合。
D18.根据实施方案D17所述的CAR-T细胞,其中所述癌细胞是血癌细胞或实体瘤癌细胞。
D19.根据实施方案D17所述的CAR-T细胞,其中所述抗原是CD123。
D20.根据实施方案D17所述的CAR-T细胞,其中所述抗原是PSMA。
D21.一种CAR-T细胞,包含含有细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域的CAR,其中所述CAR-T细胞是Vβ17+CD8+T细胞。
D22.根据实施方案D21所述的CAR-T细胞,其中所述CAR-T细胞表达能够与包含SEQID NO:1的氨基酸序列的M1肽结合的细胞表面受体。
D23.根据实施方案D21或实施方案D22所述的CAR-T细胞,其中所述细胞外结构域与癌细胞上表达的抗原结合。
D24.根据实施方案D23所述的CAR-T细胞,其中所述癌细胞是血癌细胞或实体瘤癌细胞。
D25.根据实施方案D23所述的CAR-T细胞,其中所述抗原是CD123或PSMA。
在又一组实施方案(E组实施方案)中,提供了:
E1.一种用于治疗受试者中的疾病或障碍的方法,所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的CAR-T细胞,其中所述CAR-T细胞通过包括以下的方法产生:(i)获得包含Vβ17+CD8+T细胞的细胞群;并且(ii)将编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入Vβ17+CD8+T细胞中。
E2.根据实施方案E1所述的方法,其中用于产生CAR-T细胞的所述方法中的步骤(i)包括通过使M1肽与包含T细胞的细胞群接触来活化或富集Vβ17+CD8+T细胞。
E3.根据实施方案E2所述的方法,其中所述M1肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
E4.根据实施方案E2或实施方案E3所述的方法,其中用于产生CAR-T细胞的所述方法还包括使IL-2与包含所述T细胞的所述细胞群接触。
E5.根据实施方案E2至E4中任一项所述的方法,其中所述细胞群在包含所述M1肽和/或IL-2的培养基中离体培养。
E6.根据实施方案E4所述的方法,其中用于产生CAR-T细胞的所述方法包括:
(i)包含所述M1肽和IL-2的培养基中离体培养所述细胞群;
(ii)在包含所述M1肽的培养基中离体培养所述细胞群,并且然后在包含IL-2的培养基中离体培养所述细胞群;或
(iii)在包含所述M1肽的培养基中离体培养所述细胞群,然后在包含所述M1肽和IL-2的培养基中离体培养所述细胞群;并且然后在包含IL-2的培养基中离体培养所述细胞群。
E7.根据实施方案E5或实施方案E6所述的方法,其中所述细胞群离体培养至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。
E8.根据实施方案E5或实施方案E6所述的方法,其中所述细胞群离体培养1-20天、2-18天、3-16天、4-14天、5-14天、6-14天、7-14天、8-14天、9-14天、10-14天、11-14天或12-14天。
E9.根据实施方案E2至E8中任一项所述的方法,其中所述细胞群是全PBMC群。
E10.根据实施方案E9所述的方法,其中所述全PBMC群来自健康供体。
E11.根据实施方案E2至E10中任一项所述的方法,其中用于产生CAR-T细胞的所述方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍或14倍;或者其中用于产生CAR-T细胞的所述方法使来自所述细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加到CD8+细胞的至少6%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%。
E12.根据实施方案E2至E10中任一项所述的方法,其中用于产生CAR-T细胞的所述方法使来自所述细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的10%至20倍、20%至20倍、30%至20倍、40%至20倍、50%至20倍、60%至20倍、70%至20倍、80%至20倍、90%至20倍、2倍至20倍、3倍至20倍、4倍至20倍、5倍至20倍、6倍至20倍、7倍至20倍、8倍至20倍、9倍至20倍、10倍至20倍、11倍至20倍、12倍至20倍、13倍至20倍、14倍至20倍或15倍至20倍;或者其中用于产生CAR-T细胞的所述方法使来自所述细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加到CD8+细胞的6%至99%、10%至99%、15%至99%、20%至99%、25%至99%、30%至99%、35%至99%、40%至99%、45%至99%、50%至99%、55%至99%、60%至99%、65%至99%、70%至99%、75%至99%、80%至99%、85%至99%或90%至99%。
E13.根据实施方案E2至E12中任一项所述的方法,其中用于产生CAR-T细胞的所述方法还包括在使所述细胞群与所述M1肽和/或IL-2接触之后从所述细胞群中分离Vβ17+CD8+T细胞。
E14.根据实施方案E1至E13中任一项所述的方法,其中包含Vβ17+CD8+T细胞的所述细胞群包含超过6%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%的Vβ17+CD8+T细胞。
E15.根据实施方案E1至E13中任一项所述的方法,其中包含Vβ17+CD8+T细胞的所述细胞群包含6%至99%、10%至99%、15%至99%、20%至99%、25%至99%、30%至99%、35%至99%、40%至99%、45%至99%、50%至99%、55%至99%、60%至99%、65%至99%、70%至99%、75%至99%、80%至99%、85%至99%或90%至99%的Vβ17+CD8+T细胞。
E16.根据实施方案E1至E15中任一项所述的方法,其中所述CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。
E17.根据实施方案E16所述的方法,其中所述细胞外结构域与癌细胞上表达的抗原结合。
E18.根据实施方案E17所述的方法,其中所述癌细胞是血癌细胞或实体瘤癌细胞。
E19.根据实施方案E17所述的方法,其中抗原是CD123。
E20.根据实施方案E17所述的方法,其中抗原是PSMA。
E21.一种用于治疗受试者中的疾病或障碍的方法,所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的CAR-T细胞,其中所述CAR-T细胞包含CAR,所述CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域,并且其中所述CAR-T细胞是Vβ17+CD8+T细胞。
E22.根据实施方案E21所述的方法,其中所述CAR-T细胞表达能够与包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列的M1肽结合的细胞表面受体。
E23.根据实施方案E21或实施方案E22所述的方法,其中所述细胞外结构域与癌细胞上表达的抗原结合。
E24.根据实施方案E23所述的方法,其中所述癌细胞是血癌细胞或实体瘤癌细胞。
E25.根据实施方案E23所述的方法,其中所述抗原是CD123或PSMA。
E26.根据实施方案E1至E25中任一项所述的方法,其中所述疾病或障碍为癌症。
E27.根据实施方案E26所述的方法,其中所述癌症是血癌。
E28.根据实施方案E26所述的方法,其中其中所述癌症是实体瘤癌症。
E29.根据实施方案E1至E28中任一项所述的方法,其中所述受试者是对其有需要的人类受试者。
在又一组实施方案(F组实施方案)中,提供了:
F1.一种用于制备CAR-T细胞的方法,所述方法包括:(i)执行获得Vβ17+CD8+T细胞的功能的步骤;和(ii)执行在Vβ17+CD8+T细胞中表达CAR的功能的步骤。
F2.根据实施方案F1所述的方法,其中所述方法中的步骤(i)包括在包含T细胞的细胞群中执行活化或富集Vβ17+CD8+T细胞的功能的步骤。
F3.根据实施方案F2所述的方法,其中在包含T细胞的细胞群中执行活化或富集Vβ17+CD8+T细胞的功能的步骤包括使M1肽与包含T细胞的细胞群接触,并且其中所述M1肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
F4.根据实施方案F3所述的方法,所述方法还包括使IL-2与包含所述T细胞的所述细胞群接触。
F5.根据实施方案F3或F4所述的方法,其中所述细胞群在包含所述M1肽和/或IL-2的培养基中离体培养。
F6.根据实施方案F4所述的方法,其中所述方法包括:
(i)包含所述M1肽和IL-2的培养基中离体培养所述细胞群;
(ii)在包含所述M1肽的培养基中离体培养所述细胞群,并且然后在包含IL-2的培养基中离体培养所述细胞群;或
(iii)在包含所述M1肽的培养基中离体培养所述细胞群,然后在包含所述M1肽和IL-2的培养基中离体培养所述细胞群;并且然后在包含IL-2的培养基中离体培养所述细胞群。
F7.根据实施方案F5或实施方案F6所述的方法,其中所述细胞群离体培养至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。
F8.根据实施方案F5或实施方案F6所述的方法,其中所述细胞群离体培养1-20天、2-18天、3-16天、4-14天、5-14天、6-14天、7-14天、8-14天、9-14天、10-14天、11-14天或12-14天。
F9.根据实施方案F2至F8中任一项所述的方法,其中所述细胞群是全PBMC群。
F10.根据实施方案F9所述的方法,其中所述全PBMC群来自健康供体。
F11.根据实施方案F2至F10中任一项所述的方法,其中所述方法使来自该细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍或14倍;或者其中所述方法使来自所述细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加到CD8+细胞的至少6%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%。
F12.根据实施方案F2至F10中任一项所述的方法,其中所述方法使来自所述细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加CD8+细胞中Vβ17+CD8+T细胞的初始百分比的10%至20倍、20%至20倍、30%至20倍、40%至20倍、50%至20倍、60%至20倍、70%至20倍、80%至20倍、90%至20倍、2倍至20倍、3倍至20倍、4倍至20倍、5倍至20倍、6倍至20倍、7倍至20倍、8倍至20倍、9倍至20倍、10倍至20倍、11倍至20倍、12倍至20倍、13倍至20倍、14倍至20倍或15倍至20倍;或者其中所述方法使来自所述细胞群的CD8+细胞中的Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加到CD8+细胞的6%至99%、10%至99%、15%至99%、20%至99%、25%至99%、30%至99%、35%至99%、40%至99%、45%至99%、50%至99%、55%至99%、60%至99%、65%至99%、70%至99%、75%至99%、80%至99%、85%至99%或90%至99%。
F13.根据实施方案F2至F12中任一项所述的方法,其中所述方法还包括在使所述细胞群与所述M1肽和/或IL-2接触之后从所述细胞群中分离Vβ17+CD8+T细胞。
F14.根据实施方案F1至F13中任一项所述的方法,其中执行在Vβ17+CD8+T细胞中表达CAR的功能的步骤包括将编码CAR的核酸引入Vβ17+CD8+T细胞中。
在又一组实施方案(G组实施方案)中,提供了:
G1.一种系统,所述系统包含:能够结合癌细胞表面上的抗原的第一构件;和能够减少针对供体T细胞的同种异体反应性的第二构件。
G2.根据实施方案G1所述的系统,其中能够结合癌细胞表面上的抗原的所述第一构件包含CAR,所述CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。
G3.根据实施方案G2所述的系统,其中所述细胞外结构域与癌细胞上表达的抗原结合。
G4.根据实施方案G3所述的系统,其中所述癌细胞是血癌细胞或实体瘤癌细胞。
G5.根据实施方案G3所述的系统,其中所述抗原是CD123。
G6.根据实施方案G3所述的系统,其中所述抗原是PSMA。
G7.根据实施方案G1至G6中任一项所述的系统,其中能够减少针对所述供体T细胞的同种异体反应性的所述第二构件包含Vβ17+CD8+T细胞。
G8.一种T细胞,所述T细胞包含能够结合癌细胞表面上的抗原的第一构件和能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的M1肽的第二构件。
G9.根据实施方案G8所述的T细胞,其中所述T细胞是Vβ17+CD8+T细胞。
G10.根据实施方案G8或G9所述的T细胞,其中能够结合癌细胞表面上的抗原的所述第一构件包含CAR,所述CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。
G11.根据实施方案G10所述的T细胞,其中所述细胞外结构域与癌细胞上表达的抗原结合。
G12.根据实施方案G11所述的T细胞,其中所述癌细胞是血癌细胞或实体瘤癌细胞。
G13.根据实施方案G12所述的T细胞,其中所述抗原是CD123。
G14.根据实施方案G12所述的T细胞,其中所述抗原是PSMA。
G15.根据实施方案G8至G14中任一项所述的T细胞,其中能够结合所述M1肽的所述第二构件包含能够结合所述M1肽的T细胞受体(TCR)。
7.实施例
以下是对在研究中使用的各种方法和材料的描述,并且被提出以便为本领域普通技术人员提供如何制造和使用本公开的完整公开和描述,并且不旨在限制发明人认为其公开的范围,也不旨在表示执行以下实验并且是可以执行的所有实验。应当理解,不一定要执行以现在时态书写的示例性描述,而是可以执行这些描述以生成与本公开的教导相关联的数据等。已努力确保关于所使用的数字(例如量、百分比等)的准确性,但应考虑一些实验误差和偏差。
7.1.实施例1-甲型流感病毒特异性Vβ17+CD8+CAR-T细胞的生成
7.1.1.自全血分离PBMC
PBMC购自HemaCare(HLA*0201供体)或内部来源(Clinigen/NH)。对于内部供体,从健康志愿者购得肝素化血液,并通过添加等体积的室温(RT)平衡的罗斯威尔平原公园纪念研究所培养基(RPMI培养基)(RPMI和1%Pen/Strep(Gibco,目录号15070-063,批号2108965))进行稀释。使用无菌移液管将30ml稀释的血液小心地分层到50ml离心(falcon)管中的15ml LymphoprepTM上。在将血液分层到LymphoprepTM上的同时,小心以防止梯度干扰。将50ml离心管在室温下以450×g无任何中断地离心(离心机的加速和减速保持为0)30分钟。离心后,小心地自离心机取出离心管,并且丢弃上血浆层,而不干扰血浆-血沉棕黄层-LymphoprepTM界面。将来自血浆-血沉棕黄层-LymphoprepTM界面的血沉棕黄层小心地转移到含有30ml室温平衡的完全RPMI培养基(RPMI、10%胎牛血清(FBS)(Gibco,目录号10099-141,批号2092575P)和1%Pen/Strep)的新的50ml离心管中,而不干扰红细胞/粒细胞沉淀。将50ml离心管在室温下以350x g离心10分钟,并且弃去上清液。通过在室温下将细胞沉淀重悬在1ml的ACK裂解溶液中5分钟至8分钟来进行红细胞(RBC)裂解。在培养期后,通过添加20ml完全RPMI培养基终止RBC裂解。将离心管在室温下再次以350×g离心10分钟。将细胞沉淀用35ml的1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次。将管在室温下以350×g离心10分钟。将细胞沉淀重悬在完全RPMI培养基中,并且在血球计上对细胞进行计数。PBMC直接用于下游应用或以25X106/的细胞密度在冷冻培养基(10%二甲亚砜(DMSO)(Sigma,目录号D2650,批号RNBG1808)和90%FBS)中冷冻。
测量健康个体的全PBMC中Vβ17+CD8+T细胞的普遍率。为了鉴定健康个体中TCR Vβ17+CD8+细胞的频率,用抗人TCR Vβ17、CD3和CD8mAb对全PBMC进行染色。流式细胞术分析显示在健康个体中总CD8+T细胞中平均(±SEM)频率4%-5%在其表面表达TCR Vβ17(图1)。
7.1.2.M1肽介导的来自全PBMC的Vβ17+CD8+T细胞的活化和扩增
在第0天,将一小瓶冷冻的PBMC快速解冻并添加到50ml离心管中的49ml温热的完全RPMI培养基(RPMI、10%FBS和1×Pen/Strep)中以稀释冷冻培养基。将PBMC以1500转/分钟(RPM)离心5分钟,并用完全RPMI培养基洗涤一次。将细胞沉淀重悬在完全RPMI培养基中。对细胞进行计数并在完全RPMI培养基中调节至2.5×106个细胞/1.25ml。
同时,制备FLU MP 58肽。FLU MP 58肽(GILGFVFTL)是在New England Peptide(目录号BP10-405和批号3677-33/42-2)购买的,纯度>95%。将FLU MP 58肽最初溶解在100%DMSO中至10mg/mL的浓度(1mg在100μL中),等分并在-20℃处冷冻。在实验当天,将FLU MP58肽从-20℃冰箱中解冻并以1mg/mL在DMSO中稀释。首先在完全RPMI培养基中以2×浓度(2μg/ml)制成FLU MP 58肽。然后将1.25ml的PBMC(2.5×106个细胞)和1.25ml稀释的肽(2×浓度)添加到6孔微量培养板的孔中。每孔的最终体积为2.5ml,最终肽浓度为1μg/mL,并且细胞浓度为2.5×106个细胞/孔。对于未刺激的对照,将1.25ml的PBMC(2.5×106个细胞)和1.25ml完全RPMI培养基添加到6孔微量培养板的孔中。每孔的最终体积为2.5ml,最终细胞计数为2.5×106个细胞/孔。
在第2天,添加重组人IL-2(R&D系统,目录号AE-6017031,批号AE-6017031)。IL-2的比活性为大约2.1×104IU/μg。在含有0.1%牛血清白蛋白的无菌100mM乙酸中以100μg/mL重构IL-2。对于工作浓度,将5μL的IL-2储备液(100μg/mL)在25ml完全RPMI培养基(20ng/mL)中稀释。向细胞中添加2.5ml稀释的IL-2。因此,孔的最终体积为5ml,含有10ng/mL(210IU)的IL-2。
在第5天,将PBMC收集在50ml离心管中,并以1500rpm离心5分钟。倾出用过的培养基,并且将刺激和未刺激的细胞重悬于含有完全RPMI培养基的IL-2中(最终浓度210IU)。将细胞悬浮液以5ml/孔添加到6孔板中。
在第8天和第10天,如在第5天进行的那样,重复IL-2补充。在第12天或第14天,通过将细胞用抗人CD8、CD3和TCRVβ17抗体染色对Vβ17+CD8+T细胞扩增进行计数,并在流式细胞仪(Novocyte)上获得。
7.1.3.CD8+T细胞富集
根据制造商的说明书,使用EasySepTM人CD8+T细胞富集试剂盒(负向选择),从用M1肽刺激或未刺激的完全PBMC中进行CD8+T细胞富集。简言之,从培养第12天或第14天收集FLU MP 58肽刺激的PBMC。对于未刺激的PBMC,通过快速解冻冷冻PBMC来收集新鲜PBMC,并添加到50ml离心管中的49ml温热的完全RPMI(RPMI、10%FBS和1×Pen/Strep)培养基中以稀释冷冻培养基。
将上述细胞在室温下以1500rpm离心5分钟并用FACS缓冲液(1×PBS和2%FBS)洗涤一次。将细胞以5×107个细胞/mL重悬于EasySepTM缓冲液中(Stemcell Technologies,目录号20144和批号18D89444)(体积为0.25ml-2ml)。将细胞转移到5ml聚苯乙烯圆底试管中。每1ml重悬细胞添加50微升的富集混合物(5×107个细胞)。将混合物与细胞混合并与细胞在室温下孵育10分钟。同时,将磁性颗粒涡旋30秒。将150μL涡旋的磁性颗粒添加到1ml来自上述步骤的重悬细胞中。在室温下混合后,孵育持续5分钟。在孵育期结束时,用2.5ml的EasySepTM缓冲液将管加满。在室温下将管放置在静止磁体上5分钟。在孵育期结束时,在一个连续运动中用磁体使试管倒转以收集富集的细胞悬浮液。将收集的细胞悬浮液在室温下以1500rpm离心5分钟。将细胞沉淀重悬在细胞培养基中,并在血球计上对细胞数进行计数。为了评估CD8+T细胞的纯度,将富集的细胞悬浮液用抗人CD8(BioLegend,目录号344724和批号B242233)和CD3 mAb染色。
7.1.4.Vβ17+细胞富集
使用EasySepTM释放人生物素正向选择试剂盒(Stem Cell Technologies,目录号17653A和批号1000014862),根据制造商的说明书并稍加修改,从M1肽活化和扩增的PBMC或未刺激的PMBC的负向富集的CD8+T细胞(如7.1.3节所述)中正向选择Vβ17+细胞。
简言之,收集富集的CD8+T细胞,并在室温下以1500rpm离心5分钟。在EasySepTM缓冲液(0.25ml-2ml)中将细胞浓度调节至1×108个细胞/mL。添加Fc受体阻断剂(100μL/mL)以阻断抗体经由Fc受体的非特异性结合。将Fc-受体阻断的细胞进一步与抗人Vβ17生物素mAb(Miltenyi Biotec,目录号130-115-246和批号5180806646)在室温下在黑暗中孵育15分钟。对于3000万个CD8+T细胞,使用30μL的Fc阻断剂和30μL的抗人Vβ17抗体。使用5ml聚丙烯管。
在孵育期结束时,用2ml的EasySepTM缓冲液将管加满。将细胞在室温下以1500rpm离心5分钟。将细胞沉淀重悬于EasySepTM缓冲液中,并将细胞悬浮液转移到新的5ml聚丙烯管中。向重悬细胞中添加EasySepTM释放生物素正向选择混合物(100μL/mL)。具体地,通过用移液管温和地重悬细胞,将正向选择混合物与细胞混合。将细胞悬浮液在室温下孵育3分钟。同时,通过涡旋30秒制备可释放的RapiSphearesTM。将可释放的RapidSphearesTM(100μl/mL)添加到重悬细胞中。将样品混合并在室温下孵育3分钟。在孵育期结束时,用2.5mlEasySepTM缓冲液将管加满,并将管置于静止磁体中以在室温下孵育10分钟。使用移液管小心地一次性收集全部上清液,不要倾倒出。用2.5ml的EasySepTM缓冲液通过使用移液管轻轻地将细胞上下移液来重复洗涤两次以上。将细胞重悬于0.25ml-2ml的EasySepTM缓冲液中。在重悬期间,从管的侧面收集细胞,并通过轻轻地上下移液2次至3次来混合。向重悬的细胞中添加1×释放缓冲液(100μL/mL),接着混合并在室温下孵育3分钟。用2.5ml的EasySepTM缓冲液将管加满,并通过轻轻上下移液2次-3次来混合细胞。将该管置于静止磁体中并在室温下孵育5分钟。将细胞富集群小心地移液到新管中,而不干扰附着于壁的RapidSphearesTM。将细胞在室温下以1500rpm离心5分钟。将细胞悬浮液重悬浮于细胞培养基中并在血球计上进行计数。为了评估Vβ17+T细胞的纯度,将富集的细胞悬浮液用抗人CD8和Vβ17mAb染色。作为生物素化Vβ17mAb的标记效率的对照,收集可释放RapidSphearesTM孵育后但释放缓冲液孵育前的阴性级分,并评估Vβ17+丰度。
在富集的CD8+T细胞中,Vβ17+细胞占大约30%-50%(图2A,左)。从富集的CD8+T细胞中,正向选择并富集Vβ17+细胞,如阳性级分中富集的Vβ17+细胞(图2A,中)和阴性级分中残留的Vβ17+细胞(图2A,右)所表明的。因此,与阴性级分相比,在阳性级分中Vβ17+细胞成功富集。
7.1.5.富集的Vβ17+CD8+T细胞的活化
使用人T-活化剂CD3/CD28 DynabeadsTM按照制造商说明书活化来自上述章节中分离的Vβ17+CD8+T细胞。通过将期望的珠粒体积重悬于5ml聚苯乙烯管中的过量体积DPBS(Gibco,目录号14190-136,批号1929973)(优选1ml)来洗涤DynabeadsTM。将DynabeadsTM涡旋5秒并停靠在磁力架上1分钟-2分钟。当管在磁力架上时,弃去上清液。通过将期望的珠粒体积重悬于5ml聚苯乙烯管中的过量体积的完全培养基(RPMI、10%FBS和1×Pen/Strep)(优选1ml)来洗涤DynabeadsTM。将DynabeadsTM涡旋5秒并停靠在磁力架上1分钟-2分钟。当管在磁力架上时,弃去上清液。将珠粒重悬于培养基(RPMI、10%FBS和1×Pen/Strep)中。
对于1×106个富集的Vβ17+CD8+T细胞,添加25μL经过洗涤的人T-活化剂CD3/CD28DynabeadsTM以得到1:1的细胞与珠率比。将30IU/mL重组人IL-2添加到培养物中。将上述溶液在湿润的CO2培养箱中在37℃处孵育4天。在孵育期结束时,从24孔板回收Vβ17+CD8+T细胞并用DPBS洗涤一次。
将DPBS中的细胞悬浮液转移到5ml圆底聚苯乙烯管中。通过将管在静止磁体上在室温下孵育5分钟,从细胞悬浮液中去除珠粒。当试管在磁体上时,用移液管小心收集上清液。将上清液离心。用完全培养基(RPMI、10%FBS和1×Pen/Strep)洗涤细胞沉淀一次。在血球计上对细胞进行计数。Vβ17+CD8+T细胞的活化状态通过测量它们的CD69(Alexa 647抗人CD69,BioLegend,目录号310918和批号B246313)、CD25和CD62L的表面表达来评估。
7.1.6.Vβ17+CD8+T细胞是甲型流感病毒特异性的并且可以离体活化和扩增
如下进行表面表型谱分析。收获新鲜的或培养的PBMC,并用FACS缓冲液(PBS和2%FBS)洗涤一次。使用血球计对细胞进行计数。将细胞以1500rpm离心5分钟。用200μL的FACS缓冲液(PBS和2%FBS)洗涤细胞沉淀一次。将细胞(1-2×106个细胞/mL)在96孔V型底板中于100μL含有活/死的可固定紫色死细胞染剂(0.1μL)(Thermofisher Scientific,目录号L34955和批号1910686)和人Trustain Fc阻断剂(5μL)(BioLegend,目录号422302和批号B247182)两者的PBS中在4℃处在黑暗中孵育30分钟。
孵育后,将细胞以1500rpm离心5分钟,并用200μL的FACS缓冲液(PBS和2%FBS)洗涤一次。通过在100μL含有抗体主混合物的FACS缓冲液中在4℃处孵育30分钟来对细胞进行染色。在孵育期后,将细胞以1500rpm离心5分钟,用200μL的FACS缓冲液洗涤两次,并重悬于100μL的FACS缓冲液中。在Novocyte流式细胞仪上获取细胞。
在表面表型谱分析后进行细胞内效应分子谱分析。通过将细胞沉淀重悬于100μL的BD Cytofix/Cytoperm缓冲液(BD biosciences,目录号554722和批号7156885)中来固定表面染色的细胞。将细胞悬浮液在4处在黑暗中孵育15分钟。在孵育期后,将细胞以1500rpm离心5分钟。弃去上清液,并且通过将细胞沉淀重悬于200μL的1×BD Perm/Wash(BDbiosciences,目录号554723和批号7180888)中来洗涤细胞。将细胞以1500rpm离心5分钟。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于100μL含有针对细胞内抗原的抗体诸如颗粒酶B(APC抗人颗粒酶B,BioLegend,目录号372204和批号B248651)和穿孔素(亮紫711抗人穿孔素,BioLegend,目录号308130和批号B242465)的1×Perm/Wash中。将细胞悬浮液在4处在黑暗中孵育30分钟。
孵育期后,将细胞以1500rpm离心5分钟。通过添加150μL的1×BD Perm/Wash洗涤细胞,然后通过将细胞沉淀重悬于200μL的1×BD Perm/Wash中再洗涤一次。将细胞以1500rpm离心5分钟。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于100μL的FACS缓冲液(PBS和2%FBS)中。在Novocyte流式细胞仪上获取细胞。
为了鉴定Vβ17+CD8+T细胞是否是甲型流感病毒特异性的,用甲型流感来源的M1(58-66)肽刺激来自HLA*0201健康个体的全PBMC,并评估Vβ17+细胞的活化和丰度。基于M1肽的刺激活化Vβ17+CD8+T细胞,如通过它们在培养第8天的活化状态(CD25、CD69和CD71的表面表达)和效应子谱型(细胞内颗粒酶B、穿孔素和CD107a)所表明的(图2B)。同样,与培养期第0天相比,总CD8+T细胞中Vβ17+细胞的丰度在第14天显著增加(图2C)。另一方面,单独的IL-2刺激既不导致Vβ17+CD8+T细胞的活化也不导致其扩增(图2B和图2C)。此外,几乎所有(约86%)扩增的Vβ17+CD8+T细胞中检测到负载甲型流感A来源的基质蛋白(M1)肽的MHC I类四聚体(MBL,目录号TS-0012-2C和批号004),再次证实这些细胞确实是甲型流感特异性的并且表达M1肽的细胞表面受体(图2D)。
7.1.7.将抗TAA CAR mRNA电穿孔到活化的Vβ17+CD8+T细胞中
如上所述,从M1肽刺激或未刺激的PBMC中分离Vβ17+CD8+T细胞。在未刺激的PBMC的情况下,如7.1.5节中所述那样活化富集的Vβ17+CD8+T细胞。
将细胞以1500rpm离心5分钟。用来自Neon转染试剂盒(Thermo FisherScientific,目录号MPK1096和批号2K11311)的缓冲液T(1×106个细胞/90μL缓冲液T)非常温和地重悬细胞沉淀。将10微升(10μg)GFP/抗肿瘤相关抗原CAR mRNA(mRNA浓度为约1μg/μL)添加到该细胞悬浮液中。通过将细胞悬浮液上下移液两次来轻轻地混合细胞悬浮液。Neon枪头(100μL枪头)通过用Neon移液管从Neon枪头盒中取出并轻轻地上下按压以去除截留在其中的任何空气来制备。将100μL细胞悬浮液(90μL细胞悬浮液含10μL的mRNA)缓慢取入Neon枪头中。小心确保没有气泡进入枪头。同时,将3.5ml电解质缓冲液(缓冲液E)添加到Neon管中。将装有细胞悬浮液的Neon枪头缓慢地置于含有电解质缓冲液的Neon管中。将Neon管(装有Neon枪头)置于Neon对接站中。
在1400V、20ms脉冲宽度和1个脉冲下进行电穿孔。电穿孔后立即将Neon枪头(装有细胞悬浮液和mRNA)从Neon管中取出。将细胞添加到装有2.5ml预先温热的RPMI培养基的6孔板中,该培养基含有10%FBS,不含抗生素。轻轻摇动该板以确保细胞在孔中均匀分布,并在37℃处在湿润的CO2培养箱中孵育。作为非电穿孔对照,将10μL的mRNA GFP或空CAR添加到90μL含有1×106个富集的Vβ17+CD8+δT细胞的缓冲液T中。作为替代对照,在没有任何mRNA的情况下,Vβ17+CD8+δT细胞电穿孔。将细胞添加到装有2.5ml预先温热的RPMI培养基的6孔板中,该培养基含有10%FBS,不含抗生素。轻轻摇动该板以确保细胞在孔中均匀分布,并在37处在湿润的CO2培养箱中孵育。
在静置过夜后通过取100μL-200μL含有细胞的培养基来确定细胞活力(通过测量活/死染色阴性的细胞)和转染效率(通过测量GFP+细胞的频率)。当评估α-CD123 CAR表达时,取GFP表达作为CAR表达的间接读数(FITC抗人CD123抗体,BioLegend,目录号306014,批号B201944)。为了评估α-PSMA CAR表面表达,使用兔抗骆驼科动物抗体(Biolegend,目录号342506和批号B224622)。一旦评估了活力和CAR表面表达,就从6孔板中回收细胞并在血球计上进行计数。
具体地,测试了两种CAR构建体,抗CD123或抗PSMA(参见下表2),并测量了CAR构建体对Vβ17+CD8+T细胞的转染率。由于没有可用的试剂来检测α-CD123 CAR表面表达,将GFP表达认为是用于估计对于α-CD123 CAR表面表达呈阳性或阴性的细胞的丰度的替代标志。因此,认为78%左右的细胞是阳性CAR表面表达的(图3顶行)。为了检测Vβ17+CD8+T细胞上的α-PSMA CAR表面表达,使用兔抗骆驼科动物抗体mAb。因此,68%左右的Vβ17+CD8+T细胞对于在其表面上的α-PSMA CAR呈阳性(图3底行)。
表2.嵌合抗原受体构建体的序列
7.2.实施例2-评估Vβ17+δCD8+δCAR-T细胞的细胞毒性
7.2.1.靶细胞、效应细胞和共培养物的制备
在RPMI、20%FBS和1×Pen/Strep的溶液中培养Kasumi-3细胞(ATCC,目录号CRL-2725,批号63990133)。细胞每3天传代一次。简言之,从烧瓶中收集Kasumi-3细胞并以1500rpm离心5分钟。弃去上清液并将细胞以0.3至0.5×106个细胞回种,并以1.0至2.0×106个细胞/mL的细胞密度维持在新鲜培养基中。
在含有10%FBS和1×Pen/Strep的RPMI培养基中培养22Rv1细胞。细胞每3天传代一次。简言之,用DPBS冲洗75%-80%融合的22Rv1单层细胞以去除任何痕量的血清。通过添加3ml-5ml胰蛋白酶-EDTA溶液(对于T-75烧瓶)使细胞从烧瓶分离,并在37℃处在湿润培养箱中孵育5分钟至10分钟。孵育期后,通过添加过量培养基(对于T-75烧瓶为20ml完全培养基)中和胰蛋白酶-EDTA溶液。收集细胞并以1500rpm离心5分钟。弃去上清液,并将细胞以0.1×106个细胞/mL的密度回种在新鲜的完全RPMI培养基中,总共15ml培养基中。
在靶细胞上检测到CD123和PSMA表达。将五万个Kasumi-3或22Rv1细胞在100μL的FACS缓冲液(DPBS和2%FBS)中染色。将细胞以1500rpm离心5分钟,并弃去上清液。抗人CD123或PSMA抗体与各自的同种型一起添加到在FACS缓冲液(1×PBS和2%FBS)中浓度为2μg/mL的细胞中。样品的等分试样保持未染色。将细胞在4℃处在黑暗中孵育30分钟。孵育后,将细胞以1500rpm离心5分钟,并用FACS缓冲液(DPBS和2%FBS)洗涤以去除任何未结合的抗体。再重复洗涤一次,因此进行两次洗涤。
通过将染色的细胞重悬于100μL的BD Cytofix缓冲液(BD,目录号554655,批号7271598)中在冰上固定染色的样品15分钟。在孵育期后,将细胞用FACS缓冲液洗涤一次并重悬于FACS缓冲液中。在流式细胞仪(Novocyte)上获取染色的细胞,接着通过Flow Jo(10.3版)进行分析。使用同种型和/或FMO对照建立门控。
用CFSE(Thermo fisher,目录号C34554,批号1878342)标记靶细胞(Kasumi-3/22Rv1)。收获Kasumi-3/22Rv1细胞,用普通RPMI培养基洗涤一次。对细胞进行计数并将密度调节至8×106个细胞/mL。将细胞重悬于1ml在1×PBS中的0.5μM CFSE中,并在室温下孵育8分钟并偶尔混合。添加1ml FBS以终止标记反应,稍后在完全RPMI培养基(RPMI、10%FBS和1×Pen/Strep)中洗涤两次。使用血球计对细胞计数,并根据ET比率调节100μL体积中的细胞密度。对于22Rv1和kasumi-3细胞而言分别在共培养的前一天或同一天接种CFSE标记的靶细胞。为了得到共培养设置的目标比率1,在96孔板的每个孔中分别接种35,000个和10,000个22Rv1和Kasumi-3细胞。
效应细胞(Vβ17+CD8+δCAR-T细胞)的制备如下进行。如7.1.3节所述,从新鲜PBMC或用M1肽刺激12天的PBMC中阴性富集CD8+T细胞。如7.1.4节所述,在分离的CD8+T细胞中阳性富集Vβ17+细胞。富集后通过用抗人CD8和抗人Vβ17单克隆抗体对其进行染色,通过流式细胞术评估Vβ17+CD8+δT细胞纯度。如7.1.7节所详细描述那样,用Neon电穿孔系统对富集的Vβ17+CD8+δT细胞进行嵌合抗原受体(CAR)mRNA电穿孔。电穿孔后,将Vβ17+CD8+δT细胞静置过夜。静置期后,评估转染的Vβ17+CD8+δT细胞(效应物)的CAR表达和活力并将细胞适当稀释以适应细胞毒性实验中各种效应物与靶标(ET)的比率。对于增殖实验,CAR转染的Vβ17+CD8+δT细胞通过将其重悬于1ml含有1μM CTV的DPBS中用CTV(Thermo Fischer,目录号C34557和批号1942260)进行标记,并在37℃处孵育20分钟并偶尔混合。在培养期结束时,通过添加1ml的FBS,接着添加8ml完全培养基来终止标记,因此总体积为10ml。将细胞以1500rpm离心5分钟并在血球计上进行计数。
在制备靶标和效应物后进行共培养。如上所述接种CFSE标记的靶细胞。在共培养当天,从接种孔的靶细胞(在22Rv1的情况下)中取出培养基并补充新鲜培养基(100μL)。向靶细胞中,在100μL体积的完全RPMI培养基中添加CAR阳性Vβ17+CD8+T细胞以得到期望的ET比率。为了归一化CAR转染效率的差异,将ET比率相对于CAR+细胞归一化。为此,取GFP表达作为α-CD123 CAR的替代读数,并测量表达α-PSMA CAR的效应细胞由兔抗骆驼科动物mAb介导的表面染色。在37℃和5%CO2下,将效应细胞和靶细胞以各种ET比率(在相对于CAR+细胞归一化后)共培养24小时(对于Kasumi-3靶细胞)和72小时(对于22Rv1靶细胞),以评估细胞毒性和细胞因子。为了评估增殖,将效应细胞和靶细胞以1:1ET比率共培养(在相对于CAR+细胞归一化后)5天。单独培养靶细胞(22Rv1/Kasumi-3)以限定自发细胞死亡。在共培养期结束时,将细胞在室温下以1500rpm离心5分钟,并且收集100μL上清液用于细胞因子分析。在贴壁靶细胞共培养的情况下,通过将细胞与50μL胰蛋白酶-EDTA
在37℃处在湿润培养箱中孵育2分钟-3分钟而使靶细胞(22Rv1)分离。在培养结束时,通过添加50μL完全相应培养基来中和胰蛋白酶。在悬浮靶细胞(kasumi-3)共培养的情况下,从腭回收效应物和靶。添加7-AAD(BioLegend,目录号420404,批号B235875)(1μL/孔),然后立即在Novocyte流式细胞仪上获取细胞。
基于流式细胞术的获取和分析如下进行。对于表面表型谱实验,最初在总细胞上FSC-H对比SSC-H上门控细胞。从总细胞中门控活细胞。通过门控FSC-A对比FSC-H参数从活细胞中消除双联体。由此处,通过对Vβ17+CD8+细胞进行门控来进行表面谱分析。对于细胞毒性和增殖测定,在具有NovoExpress软件的Novocyte流式细胞仪上获取染色的细胞。通过一般文件夹将数据转移到具有Flow Jo(版本10.3)的桌面上。对于细胞毒性实验,首先对CFSE阳性细胞进行门控以鉴定靶细胞。在CFSE阳性细胞内,死亡细胞被鉴定为7-AAD+FSClow细胞。基于CFSE未染色的细胞和7-AAD未染色的细胞来设置门。为了计算由CAR转染的Vβ17+CD8+T细胞特异性产生的细胞裂解,从获自含有用GFP、α-CD123 CAR或α-PSMA CAR mRNA电穿孔的Vβ17+CD8+T细胞的孔的细胞裂解值中减去自发靶细胞裂解值。对于增殖测定,在排除双联体后,对活的Vβ17+CD8+T细胞进行门控并且通过绘制CTV(以柱状图模式)来评估它们的增殖。从单独的效应物或与靶细胞共培养的效应物叠加柱状图以鉴定效应细胞的抗原增殖。
7.2.2.测量共培养的Vβ17+CD8+δCAR-T细胞的细胞毒性和细胞因子分泌
使用人磁性Luminex测定LXSAHM(R&D systems)试剂盒(R&Dsystems,目录号LXSAHM-15和批号L132268)根据制造商的说明书进行细胞培养物上清液中的细胞因子分析。简言之,在共培养期结束时(对于Kasumi-3在24小时后,对于22Rv1靶细胞在3天后)收集细胞培养物上清液。从共培养孔中取出200μL细胞培养物上清液,并在室温下以1500rpm离心4分钟。从离心下来的样品收集100μL上清液,这是为了使上清液中的细胞来源最小化。将收集的上清液储存在-20℃直至分析。在分析当天,将样品在冰上缓慢解冻,并将50微升细胞培养物上清液或每种的标准品添加到微量培养板中。如果分析物的浓度高,需要以1:1或1:2稀释上清液。然后,将50微升稀释的微粒混合物添加到微量培养板的每个孔中。将50微升的标准品和测试样品添加到各自的孔中。将板用铝箔密封材料牢固地覆盖,并在室温下在MixMate(Eppendorf)振荡器(300g)上孵育2小时。
在孵育期后,将板停靠在磁力架上,并静置2分钟。孔的内容物在单次运动中丢弃而不损失板中的微粒。然后,将具有磁力架的板压在纸巾上以除去任何过量的渗出液体。确保该板牢牢位于磁力架上。
通过添加100μL的洗涤缓冲液将微量培养板洗涤三次,其中如上所述进行丢弃步骤。向每个孔中添加50微升稀释的生物素抗体混合物。将板用铝箔密封材料覆盖,并在室温下在MixMate(Eppendorf)振荡器(300g)上孵育1小时。用如上所述的丢弃步骤丢弃微量培养板的孔的内容物。将板用100μL洗涤缓冲液洗涤三次。
将50微升稀释的链霉亲和素-PE添加到微量培养板的每个孔中。将板在室温下在MixMate(Eppendorf)振荡器(300g)上孵育30分钟。通过添加100μL的洗涤缓冲液将微量培养板洗涤三次,其中如上所述进行丢弃步骤。通过向微量培养板的每个孔中添加100μL洗涤缓冲液将微粒重悬。将板在室温下在MixMate(Eppendorf)振荡器(300g)上孵育2分钟。
在方案最后一步的90分钟内,在分析仪上对板进行读数。从测试值中减去空白(普通细胞培养基)值,同时绘制测试样品中分析物的浓度。
测量CAR介导的Vβ17+CD8+T细胞的细胞毒性。将CFSE标记的靶(Kasumi-3/22Rv1)细胞与CAR(抗CD123/PSMA)转染的Vβ17+CD8+T细胞(效应物)以不同的效应物与靶(ET)比率共培养24小时和72小时。作为对照,将CFSE标记的靶(Kasumi-3/22Rv1)细胞也与GFP转染的Vβ17+CD8+T细胞以各种ET比率培养。由于转染效率的差异,将ET比率相对于CAR+效应细胞归一化。引人注目地,Vβ17+CD8+T细胞在不同的ET比率下分别针对表达CD123和PSMA的Kasumi-3和22Rv1细胞显示出明显的CAR依赖性细胞毒性(图4A)。值得注意的是,Vβ17+CD8+T细胞在0.3:1左右的低ET比率下显示出大量细胞毒性,这是连续杀伤T细胞的特有标志性特征(图4A)。而用CleanCapTM EGFP mRNA(TriLink,目录号L-7201-100和批号WOTL29206)转染的Vβ17+CD8+T细胞并未介导针对Kasumi-3或22Rv1靶细胞的细胞毒作用(图4A)。
为了分析抗CD123/PSMA CAR介导的Vβ17+CD8+T细胞的细胞增殖,将CTV标记的CAR阳性Vβ17+CD8+T细胞与未标记的靶细胞(Kasumi-3/22Rv1细胞)共培养5天。CTV稀释度被认为是表达CAR的Vβ17+CD8+T细胞增殖的量度。有趣的是,CAR阳性Vβ17+CD8+T细胞的CTV稀释度暗示表达抗CD123/PSMA CAR的Vβ17+CD8+T细胞尚未经历任何增殖(图4B)。这与用这些细胞观察到的细胞毒性形成鲜明对比(图4A)。
为了评价从表达CAR的Vβ17+CD8+T细胞产生的细胞因子/效应分子的数量和类型,从共培养实验收集培养物上清液并对各种促炎和抗炎细胞因子和效应分子进行图谱分析。有趣的是,表达抗CD123/PSMA CAR的Vβ17+CD8+T细胞产生大量的效应特征细胞因子(IFNγ和TNFα)和效应分子(颗粒酶A和颗粒酶B)(图4C)。值得注意的是,Vβ17+CD8+T细胞在与靶细胞共培养期间不产生细胞因子如IL-6和IL-10,这是任何表达CAR的T细胞的最受欢迎的特征(图4C)。然而,GFP mRNA转染的Vβ17+CD8+T细胞确实产生相当大量的效应特征细胞因子和效应分子(图4C)。为了测试M1肽介导的活化和扩增细胞是否反映高度分化的细胞,将Vβ17+CD8+T细胞用抗CD27和CD45RA mAb(BioLegend,目录号304148和批号B228669)染色,并且发现它们的很大一部分(约80%)在它们培养的第12天表现出效应记忆表型(CD27-CD45RA-)图4D)。该观察结果部分解释了在共培养设置中CAR阳性Vβ17+CD8+T细胞增殖的缺乏。另外,所观察到的表达GFP的Vβ17+CD8+T细胞不依赖于CAR的效应细胞因子或效应分子分泌也可归因于这些细胞的分化状态。
虽然抗CD123/PSMA CAR阳性Vβ17+CD8+T细胞在建立针对液体肿瘤(kasumi-3)和实体瘤(22Rv1)的细胞毒性方面是有效的,但是在它们与靶细胞共培养期间没有观察到这些细胞的明显增殖。观察到的这种特征让人想起高度分化的CD8+T细胞(效应记忆/EMRA细胞),这些细胞表现出强的细胞毒性潜力,具有残留增殖或自我更新能力。为了规避活化诱导的终末分化和促进CAR介导的增殖,从全新鲜PBMC中分离Vβ17+CD8+T细胞,并用抗CD3/CD28珠粒瞬时活化,接着用抗CD123/PSMA CAR mRNA转染。将效应细胞(CAR阳性Vβ17+CD8+T细胞)与靶细胞(Kasumi-3/22Rv1细胞)以不同的ET比率共培养以评估细胞毒性(图5A)和以1:1共培养以增殖(图5B)。与M1肽活化的细胞一样,抗CD3/CD28珠粒活化的Vβ17+CD8+T细胞显示出显著的、同等的和CAR介导的针对Kasumi-3和22Rv1细胞的细胞毒性(图5A)。有趣的是,由抗CD3/CD28珠粒(效应物)瞬时活化的Vβ17+CD8+T细胞在与靶细胞系共培养时显示出显著的CAR依赖性增殖(图5B)。在共培养期结束时,效应细胞中存在大量低分化细胞(中央记忆表型:CCR7+CD45RA-)进一步巩固了这一观察结果(图5D)。所观察到的由M1肽介导的与抗CD3/CD28珠粒介导的活化诱导的Vβ17+CD8+T细胞分化的差异可能是由于a)活化模式(TCR对比CD3/CD28);b)活化的持续时间;c)TCR信号传导的强度,或a)、b)和c)的累积效应。此外,单独的CAR阳性Vβ17+CD8+T细胞(效应物)和与靶细胞共培养的GFP转染或非转染的Vβ17+CD8+T细胞均未导致这些细胞的增殖(图5B)。这显示观察到的Vβ17+CD8+T细胞增殖是CAR依赖性的和靶细胞依赖性的。另外,抗CD123/PSMA CAR阳性Vβ17+CD8+T细胞(效应物)的细胞因子图谱显示出效应细胞因子(IFNγ、TNFα)和效应分子(颗粒酶A和颗粒酶B)的特征以及残余量的IL-6、IL-10、IL-22和IL-4细胞因子(图5C)。
*****
根据前述内容,应当理解,尽管本文已出于说明的目的描述了具体实施方案,但可在不偏离本文提供的精神和范围的情况下进行各种修改。以上提及的所有参考文献均全文以引用方式并入本文。
本领域的技术人员应当理解,在不脱离本发明的广义的发明构思的情况下,可对上述实施方案作出修改。因此,应当理解,本发明不限于所公开的特定实施方案,而是旨在涵盖如本说明书所定义的本发明实质和范围内的修改。
背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利;这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。
<110> JANSSEN BIOTECH, INC.
<120> 用于产生生物工程化的病毒特异性淋巴细胞的材料和方法
<130> 14620-544-228/JBI6376WOPCT1
<140>
<141>
<150> US 63/063,811
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<150> US 63/063,806
<151> 2020-08-10
<150> US 63/063,801
<151> 2020-08-10
<150> US 63/063,793
<151> 2020-08-10
<150> US 63/063,784
<151> 2020-08-10
<150> US 63/063,771
<151> 2020-08-10
<150> US 63/063,749
<151> 2020-08-10
<160> 13
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<220>
<223> 源自人甲型流感病毒的M1肽
<400> 1
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
1 5
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号序列
<400> 2
Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1 5 10 15
Ile Gln Ala
<210> 3
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD123 CAR的scFv
<400> 3
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Thr Glu Gly Lys
100 105 110
Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Val Gln Leu Leu
115 120 125
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
130 135 140
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Trp Met His Trp Val
145 150 155 160
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Arg Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
180 185 190
Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
195 200 205
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Gly Val
210 215 220
Ile Glu Asp Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PSMA CAR的scFv
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (78)..(78)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Ile Leu Asn Ile His
20 25 30
Ala Val Asn Trp Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu
35 40 45
Trp Val Ala Gln Ile Ser Ser Gly Gly Ile Thr Thr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Xaa Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr
85 90 95
Cys Tyr Gln Asn Arg Ser Gly Trp Gly Thr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8a铰链结构域
<400> 5
Thr Ser Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8a跨膜结构域
<400> 6
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 7
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD137的共刺激信号传导结构域
<400> 7
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3z的细胞内信号传导结构域
<400> 8
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<220>
<223> 源自人甲型流感病毒的肽
<400> 9
Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu Thr Val
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<220>
<223> 源自人甲型流感病毒的肽
<400> 10
Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu Thr
1 5 10
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<220>
<223> 源自人甲型流感病毒的肽
<400> 11
Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<220>
<223> 源自人甲型流感病毒的肽
<400> 12
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu Thr Val
1 5 10
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<220>
<223> 源自人甲型流感病毒的肽
<400> 13
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu Thr
1 5 10

Claims (32)

1.一种用于活化或富集Vβ17+CD8+T细胞的方法,所述方法包括使源自人甲型流感病毒的M1肽(M158–66)与包含T细胞的细胞群接触。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述M1肽包含GILGFVFTL(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法,所述方法还包括使IL-2与包含所述T细胞的所述细胞群接触。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述细胞群在包含所述M1肽和/或IL-2的培养基中离体培养。
5.根据权利要求3所述的方法,其中所述方法包括:
(i).在包含所述M1肽和IL-2的培养基中离体培养所述细胞群;
(ii).在包含所述M1肽的培养基中离体培养所述细胞群,并且然后在包含IL-2的培养基中离体培养所述细胞群;或
(iii).在包含所述M1肽的培养基中离体培养所述细胞群,然后在包含所述M1肽和IL-2的培养基中离体培养所述细胞群;并且
然后在包含IL-2的培养基中离体培养所述细胞群。
6.根据权利要求4或5所述的方法,其中所述细胞群离体培养至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中所述细胞群是全外周血单核细胞(PBMC)群。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述全PBMC群来自健康供体。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法,其中所述方法使来自所述细胞群的CD8+细胞中的所述Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、90%、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍或14倍;或者其中所述方法使来自所述细胞群的CD8+细胞中的所述Vβ17+CD8+T细胞的百分比增加到至少6%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其中所述方法还包括在使所述细胞群与所述M1肽和/或IL-2接触之后从所述细胞群中分离Vβ17+CD8+T细胞。
11.一种分离的Vβ17+CD8+T细胞群,所述分离的Vβ17+CD8+T细胞群根据权利要求1至10中任一项所述的方法产生。
12.一种分离的细胞群,其中所述分离的细胞群中所述Vβ17+CD8+T细胞的百分比大于6%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%。
13.根据权利要求12所述的分离的细胞群,其中所述Vβ17+CD8+T细胞的至少一部分表达能够与所述M1肽结合的细胞表面受体。
14.一种用于制备CAR-T细胞的方法,所述方法包括:(i)获得根据权利要求11至13中任一项所述的包含Vβ17+CD8+T细胞的分离的细胞群;并且(ii)将编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入所述Vβ17+CD8+T细胞中。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述细胞外结构域与癌细胞上表达的抗原结合。
17.根据权利要求16所述的方法,其中所述癌细胞是血癌细胞或实体瘤癌细胞。
18.根据权利要求16所述的方法,其中所述抗原是CD123或PSMA。
19.一种CAR-T细胞,所述CAR-T细胞根据权利要求14至18中任一项所述的方法产生。
20.一种用于治疗受试者的疾病或障碍的方法,所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求19所述的CAR-T细胞。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述疾病或障碍是癌症。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述癌症是血癌或实体瘤癌症。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法,其中所述受试者是对其有需要的人类受试者。
24.一种用于制备CAR-T细胞的方法,所述方法包括:(i)执行获得根据权利要求11至13中任一项所述的包含Vβ17+CD8+T细胞的分离的细胞群的功能的步骤;和(ii)执行在所述Vβ17+CD8+T细胞中表达CAR的功能的步骤。
25.一种系统,所述系统包含:能够结合癌细胞表面上的抗原的第一构件;和能够减少针对供体T细胞的同种异体反应性的第二构件。
26.根据权利要求25所述的系统,其中能够结合癌细胞表面上的抗原的所述第一构件包含由根据权利要求19所述的CAR-T细胞表达的CAR。
27.根据权利要求25或26所述的系统,其中能够减少针对所述供体T细胞的同种异体反应性的所述第二构件包含Vβ17+CD8+T细胞。
28.一种T细胞,所述T细胞包含能够结合癌细胞表面上的抗原的第一构件和能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的M1肽的第二构件。
29.根据权利要求28所述的T细胞,其中所述T细胞是Vβ17+CD8+T细胞。
30.根据权利要求28或29所述的T细胞,其中能够结合癌细胞表面上的抗原的所述第一构件包含由根据权利要求19所述的CAR-T细胞表达的CAR。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的T细胞,其中能够结合所述M1肽的所述第二构件包含能够结合所述M1肽的T细胞受体(TCR)。
32.一种基本上如本文在说明书、序列表或附图中所述的分子、肽、组合物、制剂、方法、用途、过程或系统。
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