JP2022547837A - 遺伝子操作されたｔ細胞及びその産生方法 - Google Patents

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Abstract

機能的外因性受容体を含む修飾Ｔ細胞が提供される。機能的外因性受容体は、（ａ）細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）キメラシグナル伝達ドメイン（ＣＭＳＤ）を含む細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）とを含み、ＣＭＳＤは、１つ以上のリンカーによって接続されていてもよい複数の免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。ベクター、産生方法、薬学的組成物、キット、及びその治療方法が、さらに提供される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月２８日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／１０３０４１号及び２０１９年１２月１６日に出願されたＰＣＴ／ＣＮ２０１９／１２５６８１の優先権の利益を主張するものであり、これらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：コンピュータ読み取り可能形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：７６１４２２００２０４２ＩＴＡＭＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２０年８月２８日、サイズ：２２１ＫＢ）。
本出願は、キメラシグナル伝達ドメイン（ＣＭＳＤ）を含む機能的外因性受容体、及びかかる機能的外因性受容体を含有するＴ細胞に関する。
ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、Ｔ細胞を腫瘍部位に導くために、標的抗原（例えば、腫瘍抗原）を特異的に認識する操作された受容体を担持する遺伝子操作されたＴ細胞を利用する。これは血液癌及び多発性骨髄腫（ＭＭ）の治療において有望な結果を示している。ＣＡＲは、通常、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）を含む。細胞外リガンド結合ドメインは、所望の標的抗原（例えば、腫瘍抗原）を標的とする抗原結合断片（例えば、一本鎖可変断片、ｓｃＦｖ）を含み得る。標的抗原に結合すると、ＣＡＲは、標的抗原に特異的な主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の利用可能性によって制限されることなく、抗原依存的様態で、ＩＳＤ（例えば、ＴＣＲシグナル伝達を模倣する、ＣＤ３ζのＩＳＤを介した活性化シグナル）によって媒介された特異的な抗標的（例えば、腫瘍）応答を開始するように、Ｔ細胞を活性化することができる。
免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）は、それらが会合する多くの細胞表面受容体またはサブユニットの細胞質ドメインに存在し、シグナル伝達において重要な調節役割を果たす。例えば、ＴＣＲライゲーションの際、ＴＣＲ複合体のＩＴＡＭのリン酸化は、シグナル伝達カスケードを開始するのに不可欠な分子を動員するためのドッキング部位を作製し、Ｔ細胞の活性化及び分化をもたらす。ＩＴＡＭ機能はＴ細胞に限定されず、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ、ＣＤ７９ａ／Ｉｇα、及びＣＤ７９ｂ／Ｉｇβ）、選択されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞受容体（ＤＡＰ－１２）、及び特定のＦｃεＲの構成要素として機能し、これらはすべて、細胞内シグナルを伝播するためにＩＴＡＭを必要とする。今まで、ほとんどの臨床研究は、ＣＤ３ζをＣＡＲの主要ＩＳＤとして使用しているが、シグナル伝達ドメインとしてのその制限が報告されている。発現解析により、無傷なＣＤ３ζのＩＳＤを含む第２世代抗ＣＤ１９ ＣＡＲについて、炎症、サイトカイン、及びケモカイン活性に関連する遺伝子セットの有意な上方制御が同定され、強化されたエフェクター分化も観察された（Ｆｅｕｃｈｔ，Ｊ ｅｔ． ａｌ．，２０１９）。ＣＤ３ζのＩＳＤはまた、成熟Ｔ細胞アポトーシスを促進することも見出された（Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅ，Ｂ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。さらに、ＣＡＲ－Ｔ免疫療法関連サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）は、場合によっては、その臨床実施を制限し得る。
個体差により、自己ＣＡＲ－ＴまたはＴＣＲ－Ｔ療法（患者自身のＴ細胞を使用）は、製造及び標準化において重大な課題を提示し、製造及び治療には極めて高価な費用がかかる。さらに、がん患者は、通常、より低い免疫機能を有し、リンパ球は、数が低減し、より低い免疫活性を有し、インビトロでは拡大することが困難である。ユニバーサル同種異系ＣＡＲ－ＴまたはＴＣＲ－Ｔ療法は、健常なドナーに由来するＴ細胞を伴う理想的なモデルとして考えられている。しかしながら、重要な課題は、組織不適合に起因する治療中の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を効果的に排除する方法である。ＴＣＲは、抗原提示に応答してＴ細胞の活性化に関与する細胞表面受容体である。ヒトにおけるＴ細胞の９５％は、アルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖からなるＴＣＲを有する。ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖は、結合して、ヘテロ二量体を形成し、ＣＤ３サブユニットと会合して、細胞表面に存在するＴＣＲ複合体を形成する。ＧｖＨＤは、ドナーのＴ細胞がＴＣＲを介して非自己ＭＨＣ分子を認識し、宿主（移植レシピエント）組織を抗原的に外来物として認識し、それらを攻撃するときに起こる。ドナーＴ細胞から内因性ＴＣＲを排除し、それによってＧｖＨＤを防止するために、人々は、内因性ＴＣＲαまたはＴＣＲβ遺伝子ノックアウト（ＫＯ）のために、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びクラスター化された規則的な間隔の短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）などの遺伝子編集技術を使用し、次いで、同種異系ＣＡＲ－ＴまたはＴＣＲ－Ｔ産生のためにＴＣＲ陰性Ｔ細胞を濃縮してきた。しかしながら、ＴＣＲ欠失は、ＣＤ３下流シグナル伝達経路の障害をもたらし、Ｔ細胞の増殖に影響を及ぼし得る。
本明細書において参照されるすべての公開物、特許、特許出願、及び公開された特許出願の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
一態様では、本発明は、修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系Ｔ細胞）を提供し、当該修飾Ｔ細胞は、（ａ）細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）キメラシグナル伝達ドメイン（ＣＭＳＤ）を含む細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）とを含む、機能的外因性受容体を含み、ＣＭＳＤは、１つ以上のＩＴＡＭ（「ＣＭＳＤ ＩＴＡＭ」）を含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のリンカー（「ＣＭＳＤリンカー」）によって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、（ａ）複数（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭが互いに直接連結していることと、（ｂ）ＣＭＳＤが、ＩＴＡＭ含有親分子（例えばＧ／Ｓリンカー）に由来しない１つ以上のリンカーによって接続されている２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含むことと、（ｃ）ＣＭＳＤが、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの１つ以上が由来するＩＴＡＭ含有親分子とは異なる、ＩＴＡＭ含有親分子に由来する１つ以上のＣＭＳＤリンカーを含むことと、（ｄ）ＣＭＳＤが、２つ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の）同一のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含むことと、（ｅ）ＣＭＳＤ ＩＴＡＭの少なくとも１つが、ＣＤ３ζに由来しないことと、（ｆ）ＣＭＳＤ ＩＴＡＭの少なくとも１つが、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１またはＩＴＡＭ２ではないことと、（ｇ）複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、各々、異なるＩＴＡＭ含有親分子に由来することと、及び／または（ｈ）ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つが、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来すること、からなる群から選択される特徴のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、１つのＣＭＳＤ ＩＴＡＭから本質的になる（例えば、それからなる）。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、１つのＣＭＳＤ ＩＴＡＭ、ならびにＩＴＡＭ含有親分子（例えば、Ｇ／Ｓリンカー）に対して異種であるＣＭＳＤ Ｎ末端配列及び／またはＣＭＳＤ Ｃ末端配列から本質的になる（例えば、それらからなる）。いくつかの実施形態では、複数（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、互いに直接連結されている。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＩＴＡＭ含有親分子（例えば、Ｇ／Ｓリンカー）に由来しない１つ以上のリンカーによって接続されている２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの１つ以上が由来するＩＴＡＭ含有親分子とは異なる、ＩＴＡＭ含有親分子に由来する１つ以上のＣＭＳＤリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の同一のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζに由来しない。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１またはＩＴＡＭ２ではない。いくつかの実施形態では、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、各々、異なるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１及び／またはＩＴＡＭ２を含まない。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも２つは、同一のＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも２つは、互いに異なる。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤリンカーのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤリンカーのうちの少なくとも１つは、ＩＴＡＭ含有親分子に対して異種である。いくつかの実施形態では、異種ＣＭＳＤリンカーは、配列番号１７～３９及び１１６～１２０、例えば、配列番号１７～３１のうちのいずれかからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、異種ＣＭＳＤリンカーは、Ｇ／Ｓリンカーである。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、２つ以上の異種ＣＭＳＤリンカーを含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の異種ＣＭＳＤリンカー配列は、互いに同じである。いくつかの実施形態では、２つ以上の異種ＣＭＳＤリンカー配列は、互いに異なる。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤリンカー配列は、約１～約１５アミノ酸長である。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、最もＣ末端のＩＴＡＭのＣ末端においてＣＭＳＤ Ｃ末端配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ Ｃ末端配列は、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ Ｃ末端配列は、ＩＴＡＭ含有親分子に対して異種である。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ Ｃ末端配列は、配列番号１７～３９及び１１６～１２０、例えば、配列番号１７～３１のうちのいずれかからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ Ｃ末端配列は、約１～約１５アミノ酸長である。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、最もＮ末端のＩＴＡＭのＮ末端においてＣＭＳＤ Ｎ末端配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ Ｎ末端配列は、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ Ｎ末端配列は、ＩＴＡＭ含有親分子に対して異種である。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ Ｎ末端配列は、配列番号１７～３９及び１１６～１２０、例えば、配列番号１７～３１のうちのいずれかからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ Ｎ末端配列は、約１～約１５アミノ酸長である。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号４１または５４の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号４２または５５の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号４３の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号４４の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号４６または５６の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号４８の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＩｇαのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＩｇαのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＩｇαのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号４９の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＩｇβのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＩｇβのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＩｇβのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号５０の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＦｃεＲＩγのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＦｃεＲＩγのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＦｃεＲＩγのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号５２の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３γのＩＴＡＭ－任意の第３のＣＭＳＤリンカー－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号５７の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号４５の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３γのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３γのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３γのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号４７の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＦｃεＲＩβのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＦｃεＲＩβのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＦｃεＲＩβのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号５１の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１のＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１のＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１のＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号５３の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－任意の第３のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３γのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号６４の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３γのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意の第３のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号６５の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３γのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意の第３のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号６６の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号６９の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３γのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号７０の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号７１の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３γのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号７２の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号７３の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号７４の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号６７の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号６８の配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３γのＩＴＡＭ－任意の第３のＣＭＳＤリンカー－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号５８～６３のうちのいずれかの配列を含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、機能的外因性受容体は、ＩＴＡＭ修飾Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＩＴＡＭ修飾キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＩＴＡＭ修飾キメラＴＣＲ（ｃＴＣＲ）、またはＩＴＡＭ修飾Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）様キメラ受容体である。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、機能的外因性受容体は、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、ＩＳＤは、共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＭＳＤのＮ末端である。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＭＳＤのＣ末端である。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、機能的外因性受容体は、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲである。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲは、（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）任意の受容体ドメインリンカーと、（ｃ）第１のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の任意の細胞外ドメインまたはその一部分と、（ｄ）第２のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、（ｅ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含み、ＣＭＳＤが、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよく、第１及び第２のＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＣＤ３δからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＴＣＲサブユニットは、両方ともＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γのうちの１つ以上に由来する。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、機能的外因性受容体は、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体である。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体は、（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）任意の第１の受容体ドメインリンカーと、（ｃ）第１のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の細胞外ドメインを特異的に認識する細胞外ＴＣＲ結合ドメインと、（ｄ）任意の第２の受容体ドメインリンカーと、（ｅ）第２のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の任意の細胞外ドメインまたはその一部分と、（ｆ）第３のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、（ｇ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含み、ＣＭＳＤが、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよく、第１、第２、及び第３のＴＣＲサブユニットがすべて、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＣＤ３δからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２及び第３のＴＣＲサブユニットは、両方ともＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γのうちの１つ以上に由来する。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、１つ以上の標的（例えば、腫瘍）抗原のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する１つ以上の抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、ｓｄＡｂまたはｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、標的（例えば、腫瘍）抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、またはＣＤ２０である。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、機能的外因性受容体は、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、機能的外因性受容体は、ＣＤ８αに由来するシグナルペプチドなどの機能的外因性受容体のＮ末端に位置するシグナルペプチドをさらに含む。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤを含むＩＳＤを含む機能的外因性受容体のエフェクター機能は、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含むＩＳＤを含む機能的外因性受容体よりも最大で約８０％（例えば、最大で約７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちのいずれか）低い。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＣＭＳＤを含むＩＳＤを含む機能的外因性受容体のエフェクター機能は、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含むＩＳＤを含む機能的外因性受容体と比較して、少なくとも約２０％（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のうちのいずれか）活性である。
上記の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかによるいくつかの実施形態では、修飾Ｔ細胞は、外因性Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型、サブタイプ、変異、または非天然Ｎｅｆ）をさらに発現する。いくつかの実施形態では、外因性Ｎｅｆタンパク質は、修飾Ｔ細胞の内因性ＴＣＲ、ＣＤ３、及び／またはＭＨＣ Ｉを下方調節する（例えば、その細胞表面発現及び／またはエフェクター機能を下方調節する）、例えば、内因性ＴＣＲ、ＣＤ３、及び／またはＭＨＣ Ｉを少なくとも約４０％（例えば、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のうちのいずれか）下方調節する（例えば、その細胞表面発現及び／またはエフェクター機能を下方調節する）。いくつかの実施形態では、外因性Ｎｅｆタンパク質は、ＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体を最大で約８０％（例えば、最大で約７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちのいずれか）下方調節する（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、その細胞溶解活性に関連するシグナル伝達を下方調節する）。
別の態様における本発明は、機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）をコードする核酸を前駆体Ｔ細胞に導入することを含む、修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）を製造する方法を提供し、機能的外因性受容体は、（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含み、ＣＭＳＤが、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、核酸は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）などのベクター上にある。いくつかの実施形態では、本方法は、機能的外因性受容体陽性Ｔ細胞を修飾Ｔ細胞から単離及び／または濃縮することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、修飾Ｔ細胞を少なくとも１つの薬学的に許容される担体とともに製剤化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、複数（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、互いに直接連結されている。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＩＴＡＭ含有親分子（例えば、Ｇ／Ｓリンカー）に由来しない１つ以上のリンカーによって接続されている２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの１つ以上が由来するＩＴＡＭ含有親分子とは異なる、ＩＴＡＭ含有親分子に由来する１つ以上のＣＭＳＤリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の同一のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζに由来しない。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１またはＩＴＡＭ２ではない。いくつかの実施形態では、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、各々、異なるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、１つのＣＭＳＤ ＩＴＡＭから本質的になる（例えば、それからなる）。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、１つのＣＭＳＤ ＩＴＡＭ、ならびにＩＴＡＭ含有親分子（例えば、Ｇ／Ｓリンカー）に対して異種であるＣＭＳＤ Ｎ末端配列及び／またはＣＭＳＤ Ｃ末端配列から本質的になる（例えば、それらからなる）。いくつかの実施形態では、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。
別の態様では、上述の方法のうちのいずれかによって得られる修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）も提供される。
さらなる態様では、機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）をコードする核酸を含むウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）が提供され、機能的外因性受容体は、（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含み、ＣＭＳＤが、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。
本明細書に記載の修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系Ｔ細胞）のうちのいずれかを含む薬学的組成物、本明細書に記載の修飾Ｔ細胞のうちのいずれかまたはその薬学的組成物を使用して疾患（例えば、がん、感染性疾患、自己免疫疾患、または放射線疾患）を治療する方法もまた、提供される。いくつかの実施形態では、治療する個体（例えば、ヒト）は、修飾Ｔ細胞が由来する前駆体Ｔ細胞のドナーに対して組織不適合である。
本発明は、本明細書に記載の方法に有用であるキット及び製品をさらに提供する。
ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、ＣＡＲ媒介性特異的活性を有することを示す。それぞれ、標的細胞株ＲＰＭＩ８２２６及び非標的細胞株Ｋ５６２とともにインキュベートしたＪｕｒｋａｔ－ＩＳＤ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ細胞におけるＣＤ６９の活性化分子発現を示す。「Ｊｕｒａｋｔ」は、対照としての役割を果たした非形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を示す。 ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、ＣＡＲ媒介性特異的活性を有することを示す。それぞれ、標的細胞株ＲＰＭＩ８２２６及び非標的細胞株Ｋ５６２とともにインキュベートしたＪｕｒｋａｔ－ＩＳＤ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ細胞におけるＣＤ２５の活性化分子発現を示す。「Ｊｕｒａｋｔ」は、対照としての役割を果たした非形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を示す。 ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、ＣＡＲ媒介性特異的活性を有することを示す。それぞれ、標的細胞株ＲＰＭＩ８２２６及び非標的細胞株Ｋ５６２とともにインキュベートしたＪｕｒｋａｔ－ＩＳＤ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ細胞におけるＨＬＡ－ＤＲの活性化分子発現を示す。「Ｊｕｒａｋｔ」は、対照としての役割を果たした非形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を示す。 ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、ＣＡＲ媒介性特異的活性を有することを示す。「Ｊｕｒａｋｔ」は、対照としての役割を果たした非形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を示す。ＳＩＶ Ｎｅｆ及びＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６と様々な修飾細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）を含むＢＣＭＡ ＣＡＲとの相互作用を示す。対照として、Ｊｕｒｋａｔ－ＩＳＤ修飾ＣＡＲ－空のベクター細胞における高いＣＡＲ陽性率を示す。 ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、ＣＡＲ媒介性特異的活性を有することを示す。「Ｊｕｒａｋｔ」は、対照としての役割を果たした非形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を示す。ＳＩＶ Ｎｅｆ及びＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６と様々な修飾細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）を含むＢＣＭＡ ＣＡＲとの相互作用を示す。Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６６３－ＳＩＶ Ｎｅｆ細胞、Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６６５－ＳＩＶ Ｎｅｆ細胞、及びＪｕｒｋａｔ－Ｍ６６６－ＳＩＶ Ｎｅｆ細胞において低減されたＢＣＭＡ ＣＡＲ発現を示す。 ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、ＣＡＲ媒介性特異的活性を有することを示す。「Ｊｕｒａｋｔ」は、対照としての役割を果たした非形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を示す。ＳＩＶ Ｎｅｆ及びＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６と様々な修飾細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）を含むＢＣＭＡ ＣＡＲとの相互作用を示す。Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６６３－ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６細胞、Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６６５－ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６細胞、及びＪｕｒｋａｔ－Ｍ６６６－ＳＩＶ Ｍ１１６ Ｎｅｆ細胞において低減されたＢＣＭＡ ＣＡＲ発現を示す。 ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、ＣＡＲ媒介性特異的活性を有することを示す。「Ｊｕｒａｋｔ」は、対照としての役割を果たした非形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を示す。ＳＩＶ Ｎｅｆ及びＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６と様々な修飾細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）を含むＢＣＭＡ ＣＡＲとの相互作用を示す。対照として、Ｊｕｒｋａｔ－ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ－空のベクター細胞における高いＢＣＭＡ ＣＡＲ陽性率を示す。 ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、ＣＡＲ媒介性特異的活性を有することを示す。「Ｊｕｒａｋｔ」は、対照としての役割を果たした非形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を示す。ＳＩＶ Ｎｅｆ及びＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６と様々な修飾細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）を含むＢＣＭＡ ＣＡＲとの相互作用を示す。それぞれ、ＳＩＶ Ｎｅｆ及びＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６で形質導入されたＪｕｒｋａｔ－Ｍ６７８細胞、Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６８０細胞、Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６８４細胞、及びＪｕｒｋａｔ－Ｍ７９９細胞においてＢＣＭＡ ＣＡＲ発現の有意な減少がないことを示す。Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６６３－ＳＩＶ Ｎｅｆ細胞及びＪｕｒｋａｔ Ｍ６６３－ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６細胞におけるＢＣＭＡ ＣＡＲ発現の有意な減少を示す。 ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、ＣＡＲ媒介性特異的活性を有することを示す。「Ｊｕｒａｋｔ」は、対照としての役割を果たした非形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を示す。それぞれ、ＳＩＶ Ｎｅｆ及びＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６で形質導入されたＪｕｒｋａｔ－Ｍ６７８細胞、Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６８０細胞、Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６８４細胞、及びＪｕｒｋａｔ－Ｍ７９９細胞においてＢＣＭＡ ＣＡＲ発現の有意な減少がないことを示す。Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６６３－ＳＩＶ Ｎｅｆ細胞及びＪｕｒｋａｔ Ｍ６６３－ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６細胞におけるＢＣＭＡ ＣＡＲ発現の有意な減少を示す。 標的細胞における様々なＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞の特異的な細胞毒性を示す。４０：１のＥ：Ｔ比での、多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ上で、それぞれ、ＢＣＭＡ－ＢＢｚ、ＢＣＭＡ－ＢＢ００７、ＢＣＭＡ－ＢＢ００８、ＢＣＭＡ－ＢＢ００９、及びＢＣＭＡ－ＢＢ０１０を発現する修飾Ｔ細胞の死滅相対効率を示す。ＢＣＭＡ－ＢＢ（４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインのみを有し、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを有しない）を発現するＴ細胞は、陰性対照としての役割を果たした。 標的細胞における様々なＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞の特異的な細胞毒性を示す。２０：１のＥ：Ｔ比での、リンパ腫細胞株Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ上のＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ及びＣＤ２０－ＢＢ０１０を別々に発現する修飾Ｔ細胞の死滅相対効率を示す。「ＵｎＴ」は、対照としての役割を果たした非形質導入Ｔ細胞を示す。 ＣＡＲ－Ｔ細胞活性におけるＣＭＳＤリンカーの影響を示す。２．５：１のＥ：Ｔ比での、多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ上で、それぞれ、異なるＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現する修飾Ｔ細胞、例えば、従来のＣＤ３ζ（ＢＣＭＡ－ＢＢｚ）、互いに直接連結されたＣＭＳＤ ＩＴＡＭ（ＢＣＭＡ－ＢＢ０２４）、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されたＣＭＳＤ ＩＴＡＭ（ＢＣＭＡ－ＢＢ０１０、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２５、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２６、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２７、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２８、及びＢＣＭＡ－ＢＢ０２９）からなるＩＳＤ、の死滅相対効率を示す。「ＵｎＴ」は、対照としての役割を果たした非形質導入Ｔ細胞を示す。 ＣＡＲ－Ｔ細胞活性におけるＣＭＳＤ ＩＴＡＭの順序の影響を示す。図４は、２．５：１のＥ：Ｔ比での、多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ上で、それぞれ、ＢＣＭＡ－ＢＢｚ、ＢＣＭＡ－ＢＢ０１０、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３０、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３１、及びＢＣＭＡ－ＢＢ０３２を発現する修飾Ｔ細胞の死滅相対効率を示す。「ＵｎＴ」は、対照としての役割を果たした非形質導入Ｔ細胞を示す。 ＣＡＲ－Ｔ細胞活性におけるＣＭＳＤ ＩＴＡＭの量及び供給源の影響を示す。２．５：１のＥ：Ｔ比での、多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ上で、それぞれ、従来のＣＤ３ζのＣＡＲ（ＢＣＭＡ－ＢＢｚ）及び異なるＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲを別々に発現する修飾Ｔ細胞、例えば、１つのＣＭＳＤ ＩＴＡＭ（ＢＣＭＡ－ＢＢ０３３及びＢＣＡＭ－ＢＢ０３４）、２つのＣＭＳＤ ＩＴＡＭ（ＢＣＭＡ－ＢＢ０３５及びＢＣＭＡ－ＢＢ０３６）、３つのＣＭＳＤ ＩＴＡＭ（ＢＣＭＡ－ＢＢ０３７及びＢＣＭＡ－ＢＢ０３８）、ならびに４つのＣＭＳＤ ＩＴＡＭ（ＢＣＭＡ－ＢＢ０１０、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３０、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３１、及びＢＣＭＡ－ＢＢ０３２）を含むＩＳＤ、の死滅相対効率を示す。「ＵｎＴ」は、対照としての役割を果たした非形質導入Ｔ細胞を示す。 標的腫瘍細胞の再チャレンジ後のＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＴ細胞増殖を示す。「ＵｎＴ」は、非形質導入Ｔ細胞を示す。 標的腫瘍細胞の再チャレンジ後のＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型を示す。ＣＡＲ－Ｔ細胞内のＴ細胞枯渇マーカーのＰＤ－１及びＬＡＧ－３発現を示す。 標的腫瘍細胞の再チャレンジ後のＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型を示す。ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の中で、ＴＥＭＲＡ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７－）、ＴＥＭ細胞（ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７－）、ＴＣＭ細胞（ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７＋）、及びナイーブ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７＋）の細胞比を示す。 標的腫瘍細胞の再チャレンジ後のＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型を示す。、ＣＡＲ＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞の中で、ＴＥＭＲＡ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７－）、ＴＥＭ細胞（ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７－）、ＴＣＭ細胞（ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７＋）、及びナイーブ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７＋）の細胞比を示す。 標的腫瘍細胞の再チャレンジ後のＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型を示す。ＣＡＲ＋／ＣＤ４＋ Ｔ細胞の中で、ＴＥＭＲＡ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７－）、ＴＥＭ細胞（ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７－）、ＴＣＭ細胞（ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７＋）、及びナイーブ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７＋）の細胞比を示す。 ＩＴＡＭ含有親分子（例えば、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε）の細胞内シグナル伝達ドメイン構造及び例示的なＣＭＳＤ構造を示す。 ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ（ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６－ＩＲＥＳ－ＣＤ８α ＳＰ－ＣＤ２０ ｓｃＦｖ（Ｌｅｕ１６）－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＩＴＡＭ０１０）及びＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ（ＣＤ８α ＳＰ－ＣＤ２０ ｓｃＦｖ（Ｌｅｕ１６）－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ）配列を、それぞれ担持するレンチウイルスで初代Ｔ細胞を形質導入した後のＦＡＣＳ分析によるＣＤ２０ ＣＡＲ陽性率を示す。「ＣＡＲ ｐｏｓ」とは、ＣＡＲ陽性率を意味する。「ＵｎＴ」は、非形質導入Ｔ細胞を示す。 死滅アッセイの３日目の、それぞれ、２０：１、１０：１、及び５：１の異なるＥ：Ｔ比での、リンパ腫Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ細胞株（ＣＤ２０＋）上のＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞の細胞毒性を示す。非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）は、対照としての役割を果たした。 死滅アッセイの３日目に、２０：１、１０：１、及び５：１の異なるＥ：Ｔ比で、リンパ腫Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ細胞株を死滅させた際に、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞（従来のＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを有するＣＤ２０ ＣＡＲ）及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞（ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ／ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６共発現）によって放出された炎症誘発性因子のレベルを示す。非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）は、対照としての役割を果たした。 死滅アッセイの３日目に、２０：１、１０：１、及び５：１の異なるＥ：Ｔ比で、リンパ腫Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ細胞株を死滅させた際に、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞（従来のＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを有するＣＤ２０ ＣＡＲ）及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞（ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ／ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６共発現）によって放出されたケモカインのレベルを示す。非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）は、対照としての役割を果たした。 死滅アッセイの３日目に、２０：１、１０：１、及び５：１の異なるＥ：Ｔ比で、リンパ腫Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ細胞株を死滅させた際に、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞（従来のＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを有するＣＤ２０ ＣＡＲ）及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞（ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ／ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６共発現）によって放出されたサイトカインのレベルを示す。非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）は、対照としての役割を果たした。 ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＴＣＲαβ ＭＡＣＳで選別されたＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞のインビボ有効性を示す。免疫不全ＮＣＧマウスに、－４日目にヒトＲａｊｉ．Ｌｕｃ腫瘍細胞（ＣＤ２０＋）を移植し、その後、０日目にＨＢＳＳ、非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞、及びＴＣＲαβ ＭＡＣＳで選別されたＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞で処理した。マウスを週単位で評価して、生物発光イメージングによって腫瘍成長をモニタリングした。 ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＴＣＲαβ ＭＡＣＳで選別されたＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞のインビボ有効性を示す。免疫不全ＮＣＧマウスに、－４日目にヒトＲａｊｉ．Ｌｕｃ腫瘍細胞（ＣＤ２０＋）を移植し、その後、０日目にＨＢＳＳ、非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞、及びＴＣＲαβ ＭＡＣＳで選別されたＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞で処理した。マウスを週単位で評価して、生物発光イメージングによって腫瘍成長をモニタリングした。 ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＴＣＲαβ ＭＡＣＳで選別されたＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞のインビボ有効性を示す。免疫不全ＮＣＧマウスに、－４日目にヒトＲａｊｉ．Ｌｕｃ腫瘍細胞（ＣＤ２０＋）を移植し、その後、０日目にＨＢＳＳ、非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞、及びＴＣＲαβ ＭＡＣＳで選別されたＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞で処理した。マウスを週単位で評価して、体重によって腫瘍成長をモニタリングした。 ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＴＣＲαβ ＭＡＣＳで選別されたＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞のインビボ有効性を示す。免疫不全ＮＣＧマウスに、－４日目にヒトＲａｊｉ．Ｌｕｃ腫瘍細胞（ＣＤ２０＋）を移植し、その後、０日目にＨＢＳＳ、非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞、及びＴＣＲαβ ＭＡＣＳで選別されたＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞で処理した。マウスを週単位で評価して、生存率によって腫瘍成長をモニタリングした。 腫瘍再発モデルを模倣する、腫瘍再チャレンジ後のＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＴＣＲαβ ＭＡＣＳで選別されたＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞のインビボ有効性を示す。ＣＡＲ－Ｔ投与の４１日後、再発していないマウスに、３×１０４個のＲａｊｉ．Ｌｕｃ腫瘍細胞をさらに注入した（０日目として示される）。マウスを定期的に評価して、生物発光イメージングによって腫瘍成長をモニタリングした。 腫瘍再発モデルを模倣する、腫瘍再チャレンジ後のＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＴＣＲαβ ＭＡＣＳで選別されたＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞のインビボ有効性を示す。ＣＡＲ－Ｔ投与の４１日後、再発していないマウスに、３×１０４個のＲａｊｉ．Ｌｕｃ腫瘍細胞をさらに注入した（０日目として示される）。マウスを定期的に評価して、生物発光イメージングによって腫瘍成長をモニタリングした。 腫瘍再発モデルを模倣する、腫瘍再チャレンジ後のＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＴＣＲαβ ＭＡＣＳで選別されたＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞のインビボ有効性を示す。ＣＡＲ－Ｔ投与の４１日後、再発していないマウスに、３×１０４個のＲａｊｉ．Ｌｕｃ腫瘍細胞をさらに注入した（０日目として示される）。マウスを定期的に評価して、体重によって腫瘍成長をモニタリングした。 腫瘍再発モデルを模倣する、腫瘍再チャレンジ後のＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＴＣＲαβ ＭＡＣＳで選別されたＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞のインビボ有効性を示す。ＣＡＲ－Ｔ投与の４１日後、再発していないマウスに、３×１０４個のＲａｊｉ．Ｌｕｃ腫瘍細胞をさらに注入した（０日目として示される）。マウスを定期的に評価して、生存率によって腫瘍成長をモニタリングした。 ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（８６．５％ ＣＡＲ＋）及びＴＣＲαβ ＭＡＣＳで選別されたＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（８５．９％ ＣＡＲ＋）におけるＢＣＭＡ ＣＡＲ陽性率を示す。「ＵｎＴ」は、非形質導入Ｔリンパ球を表し、対照としての役割を果たした。「ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ」は、自己ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現し、ＢＣＭＡ＋ ＭＡＣＳが富化されたＴリンパ球を表す。「ＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ」は、ユニバーサルＢＣＭＡ ＣＡＲを発現し、ＴＣＲαβ－ＭＡＣＳが富化されたＴリンパ球を表す。 ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞株における２．５：１及び１．２５：１の異なるＥ：Ｔの細胞比での、ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＴＣＲαβ ＭＡＣＳで選別されたＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－）の特異的な腫瘍細胞毒性を示す。「ＵｎＴ」は、非形質導入Ｔリンパ球を表し、対照としての役割を果たした。「ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ」は、自己ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現し、ＢＣＭＡ＋ ＭＡＣＳが富化されたＴリンパ球を表す。「ＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ」は、ユニバーサルＢＣＭＡ ＣＡＲを発現し、ＴＣＲαβ－ＭＡＣＳが富化されたＴリンパ球を表す。 ２．５：１及び１．２５：１の異なるＥ：Ｔの比で、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞株を死滅させた際に、ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＴＣＲαβ ＭＡＣＳで選別されたＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－）によってインビトロで放出された炎症誘発性因子のレベルを示す。「ＵｎＴ」は、非形質導入Ｔリンパ球を表し、対照としての役割を果たした。「ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ」は、自己ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現し、ＢＣＭＡ＋ ＭＡＣＳが富化されたＴリンパ球を表す。「ＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ」は、ユニバーサルＢＣＭＡ ＣＡＲを発現し、ＴＣＲαβ－ ＭＡＣＳが富化されたＴリンパ球を表す。 ２．５：１及び１．２５：１の異なるＥ：Ｔの比で、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞株を死滅させた際に、ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＴＣＲαβ ＭＡＣＳで選別されたＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－）によってインビトロで放出されたケモカインのレベルを示す。「ＵｎＴ」は、非形質導入Ｔリンパ球を表し、対照としての役割を果たした。「ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ」は、自己ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現し、ＢＣＭＡ＋ ＭＡＣＳが富化されたＴリンパ球を表す。「ＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ」は、ユニバーサルＢＣＭＡ ＣＡＲを発現し、ＴＣＲαβ－ ＭＡＣＳが富化されたＴリンパ球を表す。 ２．５：１及び１．２５：１の異なるＥ：Ｔの比で、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞株を死滅させた際に、ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＴＣＲαβ ＭＡＣＳで選別されたＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－）によってインビトロで放出されたサイトカインのレベルを示す。「ＵｎＴ」は、非形質導入Ｔリンパ球を表し、対照としての役割を果たした。「ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ」は、自己ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現し、ＢＣＭＡ＋ ＭＡＣＳが富化されたＴリンパ球を表す。「ＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ」は、ユニバーサルＢＣＭＡ ＣＡＲを発現し、ＴＣＲαβ－ ＭＡＣＳが富化されたＴリンパ球を表す。 それぞれ、ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６＋ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ及びＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６＋ＣＤ３ζのＣＤ２０ ＣＡＲ（Ｍ１１８５）の一体型構築物で形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞のＴＣＲαβ発現を示す。「ＴＣＲαβ陽性」は、ＴＣＲαβ陽性率を示す。「Ｊｕｒｋａｔ」は、対照としての役割を果たした非形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を示す。 それぞれ、２０：１のＥ：Ｔ比での、リンパ腫細胞株Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ上で、ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６＋ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲの一体型構築物及びＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６＋ＣＤ３ζのＣＤ２０ ＣＡＲ（Ｍ１１８５）で形質導入されたＴ細胞の死滅相対効率を示す。「ＵｎＴ」は、対照としての役割を果たした非形質導入Ｔ細胞を示す。 それぞれ、ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６＋ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ及びＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６＋ＣＤ３ζのＢＣＭＡ ＣＡＲ（Ｍ１２１５）の一体型構築物で形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞のＴＣＲαβ発現を示す。「ＴＣＲαβ陽性」は、ＴＣＲαβ陽性率を示す。「Ｊｕｒｋａｔ」は、対照としての役割を果たした非形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を示す。 それぞれ、４：１のＥ：Ｔ比での、多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ上で、ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６＋ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ及びＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６＋ＣＤ３ζのＢＣＭＡ ＣＡＲ（Ｍ１２１５）の一体型構築物で形質導入されたＴ細胞の死滅相対効率を示す。「ＵｎＴ」は、対照としての役割を果たした非形質導入Ｔ細胞を示す。 Ｍ５９８－Ｔ細胞及びＭＡＣＳで選別されたＴＣＲαβ陰性Ｍ５９８－Ｔ細胞のＴＣＲαβ発現を示す。「ＴＣＲαβ陽性」は、ＴＣＲαβ陽性率を示す。「ＵｎＴ」は、非形質導入Ｔ細胞を示す。「ＴＣＲαβ－Ｍ５９８－Ｔ」は、ＭＡＣＳで選別されたＴＣＲαβ陰性Ｍ５９８－Ｔ細胞を示す。 Ｍ５９８－Ｔ細胞及びＭＡＣＳで選別されたＴＣＲαβ陰性Ｍ５９８－Ｔ細胞のＢＣＭＡ ＣＡＲ発現を示す。「ＣＡＲ陽性」は、ＣＡＲ陽性率を示す。「ＵｎＴ」は、非形質導入Ｔ細胞を示す。「ＴＣＲαβ－Ｍ５９８－Ｔ」は、ＭＡＣＳで選別されたＴＣＲαβ陰性Ｍ５９８－Ｔ細胞を示す。 それぞれ、２．５：１、１．２５：１、及び１：１．２５の異なるＥ：Ｔ比で、多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ上のＭＡＣＳで選別されたＴＣＲαβ陰性Ｍ５９８－Ｔ細胞の死滅相対効率を示す。「ＵｎＴ」は、非形質導入Ｔ細胞を示す。「ＴＣＲαβ－Ｍ５９８－Ｔ」は、ＭＡＣＳで選別されたＴＣＲαβ陰性Ｍ５９８－Ｔ細胞を示す。 ＣＡＲ－Ｔ細胞免疫療法におけるＴＣＲαβ及びＭＨＣ発現に関する二重調節を有するＳＩＶ Ｎｅｆサブタイプを示す。それぞれ、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ及びＭ１３９２を発現する修飾Ｔ細胞内のＣＤ２０ ＣＡＲ及びＴＣＲαβの発現率を示す。ＵｎＴは、対照としての役割を果たした非形質導入Ｔ細胞を示す。 ＣＡＲ－Ｔ細胞免疫療法におけるＴＣＲαβ及びＭＨＣ発現に関する二重調節を有するＳＩＶ Ｎｅｆサブタイプを示す。それぞれ、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ及びＭ１３９２を発現する修飾Ｔ細胞内のＴＣＲαβ及びＨＬＡ－Ｂ７の発現率を示す。ＵｎＴは、対照としての役割を果たした非形質導入Ｔ細胞を示す。 ＣＡＲ－Ｔ細胞免疫療法におけるＴＣＲαβ及びＭＨＣ発現に関する二重調節を有するＳＩＶ Ｎｅｆサブタイプを示す。１：１のＥ：Ｔ比での、エフェクター細胞とのインキュベーションから４８時間後の、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞、Ｂ２Ｍ ＫＯ ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞、及びＴＣＲαβ－Ｍ１３９２－Ｔ細胞の混合リンパ球反応に基づくＭＨＣクラスＩ交差反応性を示す。ＵｎＴは、対照としての役割を果たした非形質導入Ｔ細胞を示す。 ＣＡＲ－Ｔ細胞免疫療法におけるＴＣＲαβ及びＭＨＣ発現に関する二重調節を有するＳＩＶ Ｎｅｆサブタイプを示す。２０：１、１０：１、及び５：１の異なるＥ：Ｔ比での、リンパ腫細胞株Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ上のＴＣＲαβ－Ｍ１３９２－Ｔ細胞の死滅相対効率を示す。ＵｎＴは、対照としての役割を果たした非形質導入Ｔ細胞を示す。
本出願は、キメラシグナル伝達ドメイン（「ＣＭＳＤ」）を含む機能的外因性受容体を含む修飾Ｔ細胞を提供する。本明細書に記載のＣＭＳＤは、１つ以上の免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（「ＩＴＡＭ」）と、ＣＤ３ζなどの天然に存在するＩＴＡＭ含有親分子のうちのいずれかとは異なる構成で配置された任意のリンカーとを含む。驚くべきことに、天然に存在するＩＴＡＭベースのシグナル伝達ドメインを含有する従来の機能的外因性受容体と同様に、ＣＭＳＤを含有する受容体は、受容体の同族リガンドへの結合時にＴ細胞を活性化することができることが見出された。従来の機能的外因性受容体（ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）など）と比較して、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む受容体（例えば、ＣＭＳＤを含むＣＡＲ）は、サイトカイン、ケモカイン、及び炎症誘発性因子の放出における誘導が有意に低下しているが、腫瘍異種移植片マウスモデル及び腫瘍再発マウスモデルの両方において優れた腫瘍細胞毒性を示す。
さらに驚くべきことには、Ｔ細胞（本明細書で「ＴＣＲ欠損Ｔ細胞」または「ＧｖＨＤが最小限のＴ細胞」とも称される）内の内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を下方制御することができるＮｅｆタンパク質と共発現した場合に、ある特定のタイプのＣＭＳＤ（例えば、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１及びＩＴＡＭ２を含有しないＣＭＳＤ）を含有する受容体が、Ｎｅｆタンパク質による下方制御を示さなかったか、または下方制御が低減されたことが見出された。この特性により、ＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体は、特に、Ｎｅｆタンパク質との併用、例えば、同種異系Ｔ細胞療法に適している。
したがって、一態様では、本発明は、（ａ）細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）１つ以上のＩＴＡＭ（「ＣＭＳＤ ＩＴＡＭ」と称される）を含むＣＭＳＤを含む細胞内シグナル伝達ドメイン（「ＩＳＤ」）とを含む機能的外因性受容体を含む修飾Ｔ細胞を提供し、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のリンカー（「ＣＭＳＤリンカー」と称される）によって連結されていてもよい。機能的外因性受容体（本明細書では、「ＩＴＡＭ修飾機能的外因性受容体」または「ＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体」と称される）は、ＩＳＤがＣＭＳＤを含むことを除いて、キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）、操作されたＴ細胞受容体（「操作されたＴＣＲ」）、キメラＴ細胞受容体（「ｃＴＣＲ」）、及びＴ細胞抗原カプラー（「ＴＡＣ」）様キメラ受容体と同様である構造を有し得る。これらの機能的外因性受容体は、本明細書で、それぞれ、「ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ」、「ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ」、「ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ」、及び「ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体」と称される。本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体を含む修飾Ｔ細胞は、「ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ－Ｔ細胞」、「ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ－Ｔ細胞」、「ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様Ｔ細胞」、または「ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞」と称される。
修飾Ｔ細胞に含まれる機能的外因性受容体、そのような機能的外因性受容体をコードする核酸、及び修飾Ｔ細胞を作製する方法も、提供される。がんなどの様々な疾患を治療するための修飾Ｔ細胞を使用する方法が、さらに提供される。
Ｉ．定義
本明細書で使用される「機能的外因性受容体」という用語は、Ｔ細胞に導入された後にその生物活性を保持する外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体、またはＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ）を指す。生物学的活性としては、ある分子と特異的に結合する外因性受容体の能力、例えば、細胞増殖の誘導、サイトカイン産生、及び／または調節もしくは細胞溶解性エフェクター機能の実行などの下流シグナルを適切に形質導入する能力が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」、「特異的に認識する」、または「～に対して特異的な」という用語は、標的と抗原結合タンパク質（抗原結合ドメイン、リガンド受容体、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的細胞外受容体のうちのいずれか）との間の結合などの測定可能かつ再生可能な相互作用を指し、それは、生体分子を含む分子の不均一な集団の存在下で標的の存在を決定する。例えば、標的（エピトープであり得る）と特異的に結合する抗原結合タンパク質は、他の標的と結合するよりも、より大きい親和性、結合活性で、より容易に、及び／またはより長い持続時間で、この標的と結合する抗原結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、無関係な標的への抗原結合タンパク質の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定して、標的への抗原結合タンパク質の結合の約１０％未満である。いくつかの実施形態では、標的と特異的に結合する抗原結合タンパク質は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、異なる種からのタンパク質間で保存されるタンパク質上のエピトープと特異的に結合する。いくつかの実施形態では、特異的結合は、排他的結合を含み得るが、それを必要としない。
「特異性」という用語は、抗原の特定のエピトープに対する抗原結合タンパク質（例えば、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的細胞外受容体、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、またはリガンド受容体のうちのいずれか）の選択的認識を指す。例えば、自然抗体は、単一特異性である。「多重特異性」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合タンパク質（例えば、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的細胞外受容体、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、またはリガンド受容体のうちのいずれか）が、２つ以上の抗原結合部位を有し、これらの少なくとも２つは、異なる抗原またはエピトープと結合することを示す。「二重特異性」は、本明細書で使用される場合、抗原結合タンパク質（例えば、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的細胞外受容体、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、またはリガンド受容体のうちのいずれか）が、２つの異なる抗原結合特異性を有することを示す。本明細書で使用される「単一特異性」という用語は、各々が抗原の同じエピトープと結合する、１つ以上の結合部位を有する、抗原結合タンパク質（例えば、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的細胞外受容体、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、またはリガンド受容体のうちのいずれか）を示す。
「結合親和性」は、一般的に、分子（例えば、抗体、リガンド受容体、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的細胞外受容体のうちのいずれか）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原、リガンド）との間の非共有結合的相互作用の合計の強度を指す。別途示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原、または本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的細胞外受容体のうちのいずれか、及び抗原、例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する、固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）で表され得る。親和性は、本明細書に記載のものを含む当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定され得る。低親和性抗体は、一般に、抗原とゆっくり結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は、一般に、抗原とより早く結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当該技術分野で既知であり、これらのいずれも、本出願の目的のために使用することができる。結合親和性を測定するための具体的な例証的及び例示的な実施形態が、以下に記載される。
ペプチド、ポリペプチド、または抗体配列に関して、「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」及び「相同性」は、配列同一性最大パーセントを達成するために、配列のアラインメントを行い、必要に応じてギャップを導入した後の、配列同一性の一部としていずれの保存的置換も考慮しない、特定のペプチドもしくはポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当該技術分野の技術範囲内である種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
本明細書に記載の「単離された」（例えば、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的細胞外受容体のうちのいずれかをコードする）核酸分子は、それが産生される環境において通常会合している少なくとも１つの混入核酸分子から特定及び分離された核酸分子である。好ましくは、単離された核酸は、産生環境に付随するすべての成分との会合を含まない。本明細書のポリペプチド及び抗体をコードする単離された核酸分子は、それが天然に見られる形態または設定以外の形態である。したがって、単離された核酸分子は、細胞中に天然に存在する本明細書のポリペプチド及び抗体をコードする核酸とは区別される。
核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係性に置かれるとき、「操作可能に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡに操作可能に連結しており、または、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、その配列に操作可能に連結しており、または、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に操作可能に連結されている。一般に、「操作可能に連結」されるとは、連結しているＤＮＡ配列が連続的であること、及び分泌リーダーの場合、連続しており、リーディング相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続していなくてもよい。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。かかる部位が存在していない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣例に従って使用される。
特に指定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮退バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という表現は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がいくつかのバージョンでイントロン（複数可）を含有してもよい程度で、イントロンを含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが連結している別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入されている宿主細胞のゲノム内に組み込まれたベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが操作可能に連結している核酸の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。
本明細書で使用される「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクト」または「形質転換」または「形質導入」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換、または形質導入された細胞である。この細胞は、初代対象細胞及びその子孫を含む。
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療する」とは、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果としては、以下：疾患に起因する１つ以上の症状の緩和、疾患の程度の弱化、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化の予防または遅延）、疾患の蔓延（例えば、転移）の予防または遅延、疾患の再発の予防または遅延、疾患の進行の遅延または減速、病状の改善、疾患の寛解（部分的または全体的）の提供、疾患の治療に必要な１つ以上の他の薬剤の用量の低減、疾患の進行の遅延、生活の質の向上、及び／または生存期間の延長のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されないがんの病理学的帰結の軽減も「治療」に包含される。がんの病理学的帰結の軽減も「治療」に包含される。本出願の方法は、これらの治療態様のうちのいずれか１つ以上を企図する。
本明細書で使用される場合、「個体」または「対象」とは、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、齧歯類、または霊長類を含むが、これらに限定されない哺乳動物を指す。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。
本明細書で使用される「有効量」という用語は、特定の障害、状態、または疾患を治療するのに、例えば、その症状（例えば、がん、感染性疾患、自己免疫障害、または放射能障害）のうちの１つ以上を改善、緩和、軽減、及び／または遅延するのに十分な薬剤の量、例えば、本明細書に記載の修飾Ｔ細胞（例えば、ＩＴＡＭ修飾Ｔ細胞）、またはその薬学的組成物の量を指す。がんに関して、有効量は、腫瘍の縮小を引き起こし、及び／または腫瘍の成長速度を低下させる（例えば、腫瘍成長を抑圧する）か、または他の望ましくない細胞増殖を阻止または遅延させるのに十分な量を含む。いくつかの実施形態では、有効量は、発症を遅延させるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、再発を予防または遅延させるのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与で投与され得る。有効量の薬剤（例えば、修飾Ｔ細胞）または組成物は、（ｉ）がん細胞の数を減少させ得る、（ｉｉ）腫瘍サイズを減少させ得る、（ｉｉｉ）末梢器官へのがん細胞浸潤を阻止し、遅らせ、ある程度遅延させ、好ましくは停止させ得る、（ｉｖ）腫瘍転移を阻止し得る（すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは停止し得る）、（ｖ）腫瘍成長を阻止し得る、（ｖｉ）腫瘍の発生及び／または再発を予防または遅延し得る、及び／または（ｖｉｉ）がんに関連する症状のうちの１つ以上をある程度軽減し得る。ウイルス感染などの感染性疾患の場合、本明細書に記載の修飾Ｔ細胞またはその組成物の治療有効量は、病原体によって感染している細胞の数を減少させる、病原体由来抗原の産生または放出を減少させる、病原体の未感染細胞への拡散を阻止させる（すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは停止させる）、及び／または感染に関連する１つ以上の症状をある程度軽減させることができる。いくつかの実施形態では、治療有効量は、患者の生存を延ばす量である。
本明細書で使用される場合、「自己由来」という用語は、それが後に個体に再導入される同じ個体に由来する任意の材料を指すよう意図されている。
「同種異系」とは、同じ種の異なる個体に由来する移植片を指す。「同種異系Ｔ細胞」とは、レシピエントと一致する組織ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タイプを有するドナーからのＴ細胞を指す。典型的には、マッチングは、ＨＬＡ遺伝子の３つ以上の遺伝子座での変動性に基づいて実行され、これらの遺伝子座での完全なマッチングが好ましい。場合によっては、同種異系移植ドナーは、血縁関係がある場合（通常、ＨＬＡが厳密に一致する兄弟）、同系である場合（患者の一卵性の「そっくりの（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」双生児）または血縁関係がない場合（血縁関係がなく、ＨＬＡマッチングの程度が非常に近いことが判明したドナー）がある。ＨＬＡ遺伝子は、２つのカテゴリー（Ｉ型及びＩＩ型）に分類される。一般に、Ｉ型遺伝子のミスマッチ（すなわち、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ）は、移植片拒絶のリスクを高める。ＨＬＡ ＩＩ型遺伝子のミスマッチ（すなわち、ＨＬＡ－ＤＲ、またはＨＬＡ－ＤＱＢ１）は、ＧｖＨＤのリスクを高める。
本明細書で使用される「患者」は、疾患（例えば、がん、ウイルス感染症、ＧｖＨＤ）に罹患している任意のヒトを含む。「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書で同義に使用される。「ドナー対象」または「ドナー」という用語は、本明細書において、さらなるインビトロ操作のために細胞が得られる対象を指す。ドナー対象は、本明細書に記載の方法によって作製される細胞の集団で治療される患者（すなわち、自己ドナー）であり得るか、または本明細書に記載の方法によって作製される細胞の集団が作製された後、異なる個体または患者（すなわち、同種異系ドナー）を治療するために使用される血液試料（例えば、リンパ球試料）を供与する個体であり得る。本方法によって調製された細胞を受容する対象は、「レシピエント」または「レシピエント対象」と称され得る。
本明細書で使用される「刺激」という用語は、細胞表面部分のライゲーションによって誘導される一次応答を指す。例えば、受容体の文脈において、かかる刺激は、受容体のライゲーション及びその後のシグナル伝達事象を伴う。Ｔ細胞の刺激に関して、かかる刺激は、一実施形態では、その後、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と結合する、または本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体のうちのいずれかと結合するなどのシグナル伝達事象を誘導するＴ細胞表面部分のライゲーションを指す。さらに、刺激事象は、細胞を活性化し、ＴＧＦ－βの下方調節などの分子の発現または分泌を上方調節または下方調節し得る。したがって、細胞表面部分のライゲーションは、直接的なシグナル伝達事象が存在しない場合であっても、細胞骨格構造の再構築、または細胞表面部分の癒合をもたらし得、これらの各々が、それに続く細胞応答を増強するか、修正するか、または変化させるのに役立ち得る。
本明細書で使用される場合、「活性化」という用語は、注目に値する生化学的または形態的変化を誘導するのに十分な細胞表面部分のライゲーション後の細胞の状態を指す。Ｔ細胞の文脈において、かかる活性化は、細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されているＴ細胞の状態を指す。Ｔ細胞の活性化はまた、サイトカイン産生、及び制御性または細胞溶解性のエフェクター機能の遂行を誘導し得る。他の細胞の文脈内では、この用語は、特定の物理化学的プロセスの上方調節または下方調節のいずれかを暗示する。「活性化Ｔ細胞」という用語は、細胞分裂、サイトカイン産生、制御性または細胞溶解性のエフェクター機能の実行を経た、及び／または「活性化」のプロセスを近時に経たＴ細胞を示す。
Ｔ細胞における分子（例えば、内因性ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲα及び／またはＴＣＲβ）、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＭＨＣ Ｉ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的細胞外受容体）の「下方調節」という用語は、分子の細胞表面発現を下方調節すること、及び／またはそのシグナル伝達（例えば、ＣＭＳＤ含有機能的細胞外受容体、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２８媒介性シグナル伝達）、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞刺激、及び／またはＴ細胞増殖を妨げることを指す。例えば、細胞表面上の内部化、ストリッピング、キャッピング、または受容体再配列を変化させる他の形態を介した標的受容体の下方調節もまた、包含され得る。
本明細書に記載の本出願の実施形態が、実施形態「からなる」及び／または「から本質的になる」を含むことが理解される。
本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする変形を含む（及び説明する）。例えば、「約Ｘ」について言及する説明は、「Ｘ」の説明を含む。
本明細書で使用される場合、ある値またはパラメータ「ではない」への言及は、一般に、ある値またはパラメータ「以外」を意味し、説明する。例えば、タイプＸのがんを治療するためにその方法が使用されないとは、Ｘ以外のタイプのがんを治療するためにその方法が使用されることを意味する。
本明細書で使用される「約Ｘ～Ｙ」という用語は、「約Ｘ～約Ｙ」と同じ意味を有する。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ｏｒ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数指示対象を含む。
ＩＩ．ＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体を含むＴ細胞
本出願は、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）を含む修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＩＴＡＭ修飾Ｔ細胞は、外因性Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型Ｎｅｆまたは変異Ｎｅｆ）をさらに発現する。外因性Ｎｅｆタンパク質及びＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体を共発現する修飾Ｔ細胞は、「Ｎｅｆ含有ＩＴＡＭ修飾Ｔ細胞」または「ＧｖＨＤが最小限のＩＴＡＭ修飾Ｔ細胞」、例えば、「Ｎｅｆ含有ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ－Ｔ細胞」、「Ｎｅｆ含有ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ－Ｔ細胞」、「Ｎｅｆ含有ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様Ｔ細胞」、または「Ｎｅｆ含有ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞」と称される。
いくつかの実施形態では、（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）を含む、修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）が、提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）ｌをコードする核酸を含む修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）が提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、修飾Ｔ細胞は、修飾内因性ＴＣＲまたはＢ２Ｍ遺伝子座を含む。
いくつかの実施形態では、機能的外因性受容体は、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲである。したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲを含む修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）が提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、Ｎ’からＣ’まで、（ａ）１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）を含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）任意のヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｄ）任意の共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、４－１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する）及びＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含み、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＭＳＤのＮ末端である。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＭＳＤのＣ末端である。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲのＮ末端に位置するシグナルペプチド（例えば、ＣＤ８αに由来する）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、（ａ）ｉ）抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、またはｉｉ）ＢＣＭＡと特異的に結合する第１のｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）、任意のリンカー、及びＢＣＭＡと特異的に結合する第２のｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）を含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）任意のヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｄ）共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、４－１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する）及びＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＣＭＡ ＣＡＲであり、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよく、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＭＳＤのＮ末端である。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲは、Ｎ’からＣ’まで、（ａ）ＣＤ８αシグナルペプチドと、（ｂ）ｉ）抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖまたはｉｉ）ＢＣＭＡと特異的に結合する第１のｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）、任意のリンカー、及びＢＣＭＡと特異的に結合する第２のｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）を含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｃ）ＣＤ８αヒンジドメインと、（ｄ）ＣＤ８α膜貫通ドメインと、（ｅ）４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインと、（ｆ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）とを含み、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、（ａ）抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖを含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）ヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｄ）共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、４－１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する）及びＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲであり、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよく、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＭＳＤのＮ末端である。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲは、Ｎ’からＣ’まで、（ａ）ＣＤ８αシグナルペプチドと、（ｂ）抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖを含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｃ）ＣＤ８αヒンジドメインと、（ｄ）ＣＤ８α膜貫通ドメインと、（ｅ）４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインと、（ｆ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）とを含み、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＭＳＤリンカー、及び抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ間のリンカーは、独立して、配列番号１７～３９及び１１６～１２０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号７６～９６及び１０６～１１３のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖは、Ｌｅｕ１６に由来する。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲは、配列番号９８～１０４のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。したがって、いくつかの実施形態では、配列番号７６～９６及び１０６～１１３のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲを含む修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）が、提供される。いくつかの実施形態では、配列番号９８～１０４のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲを含む修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）が、提供される。
いくつかの実施形態では、（ａ）１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）または標的抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体（例えば、ＢＣＭＡ／ＭＨＣ複合体）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する野生型ＴＣＲに由来するＶα及びＶβ（Ｖα、Ｖβ、またはその両方は、野生型ＴＣＲと比較して１つ以上のＣＤＲ内の１つ以上の変異を含む）を一緒に含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）ＴＣＲαの膜貫通ドメイン及びＴＣＲβの膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、（ｃ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲを含む修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）が提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲは、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲのＮ末端に位置するシグナルペプチド（例えば、ＣＤ８αに由来する）をさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＭＳＤリンカーは、独立して、配列番号１７～３９及び１１６～１２０からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）任意の受容体ドメインリンカーと、（ｃ）第１のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の任意の細胞外ドメインまたはその一部分と、（ｄ）第２のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、（ｅ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲを含む修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）が提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよく、第１及び第２のＴＣＲサブユニットは、独立して、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＣＤ３δからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖまたは抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、ＢＣＭＡと特異的に結合する第１のｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）、任意のリンカー、及びＢＣＭＡと特異的に結合する第２のｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＴＣＲサブユニットは、同じである。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＴＣＲサブユニットは、異なる。いくつかの実施形態では、受容体ドメインリンカー及び／または２つの抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ間のリンカーは、配列番号１７～３９及び１１６～１２０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、１つのＣＤ３ε／δ／γのＩＴＡＭから本質的になる（例えば、それからなる）。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＴＣＲサブユニットは、両方ともＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの１つ以上は、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γのうちの１つ以上に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、もしくはＣＤ３γに由来するか、または配列番号１７～３９及び１１６～１２０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、少なくとも２つのＣＤ３εのＩＴＡＭ、少なくとも２つのＣＤ３δのＩＴＡＭ、または少なくとも２つのＣＤ３γのＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲは、細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメインをさらに含む（第１のＴＣＲサブユニットの任意の細胞外ドメインまたはその一部分が、存在しない場合）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲは、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲのＮ末端に位置するシグナルペプチド（例えば、ＣＤ８αに由来する）をさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体は、（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）任意の第１の受容体ドメインリンカーと、（ｃ）第１のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の細胞外ドメインを特異的に認識する細胞外ＴＣＲ結合ドメインと、（ｄ）任意の第２の受容体ドメインリンカーと、（ｅ）第２のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の任意の細胞外ドメインまたはその一部分と、（ｆ）第３のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、（ｇ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体を含む修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）が提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよく、第１、第２、及び第３のＴＣＲサブユニットは、独立して、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＣＤ３δからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖまたは抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、ＢＣＭＡと特異的に結合する第１のｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）、任意のリンカー、及びＢＣＭＡと特異的に結合する第２のｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）を含む。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３のＴＣＲサブユニットは、同じである。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３のＴＣＲサブユニットは、すべて異なる。いくつかの実施形態では、第２及び第３のＴＣＲサブユニットは、同じであるが、第１のＴＣＲサブユニットとは異なる。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体は、細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）をさらに含む（細胞外ＴＣＲ結合ドメインが、細胞外リガンド結合ドメインのＮ末端であり、かつ第２のＴＣＲサブユニットの任意の細胞外ドメインまたはその一部分が、存在しない場合）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体は、細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）をさらに含む（細胞外ＴＣＲ結合ドメインが、細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端であり、かつ第２のＴＣＲサブユニットの任意の細胞外ドメインまたはその一部分が、存在しない場合）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体は、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体のＮ末端に位置するシグナルペプチド（例えば、ＣＤ８αに由来する）をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の受容体ドメインリンカー、２つの抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ間のリンカー、ならびに１つ以上のＣＭＳＤリンカーは、配列番号１７～３９及び１１６～１２０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２及び第３のＴＣＲサブユニットは、両方ともＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γのうちの１つ以上に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、もしくはＣＤ３γに由来するか、または配列番号１７～３９及び１１６～１２０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、少なくとも２つのＣＤ３εのＩＴＡＭ、少なくとも２つのＣＤ３δのＩＴＡＭ、または少なくとも２つのＣＤ３γのＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体をコードする核酸は、プロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、サイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ ＩＥ）、伸長因子１αプロモーター（ＥＦ１－α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、ユビキチン－Ｃ（ＵＢＱ－Ｃ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＭＣ１）プロモーター、βアクチン（β－ＡＣＴ）プロモーター、「骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、欠失した陰性対照領域、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）」プロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、ＴＥＴＯＮ（登録商標）プロモーター、及びＮＦκＢプロモーターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＥＦ１－αまたはＰＧＫプロモーターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、エピソームベクター発現ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、及びそれらの誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＰｉｇｇｙＢａｃベクターまたはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙベクターである。
したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）をコードする核酸を含む第２のベクター（例えば、レンチウイルスなどのウイルスベクター）を含む修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）が提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）任意のヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｄ）任意の共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、４－１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する）とＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）とを含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲをコードする核酸を含むベクター（例えば、レンチウイルスなどのウイルスベクター）を含む修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）が、提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、（ａ）ｉ）抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖまたはｉｉ）ＢＣＭＡと特異的に結合する第１のｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）、任意のリンカー、及びＢＣＭＡと特異的に結合する第２のｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）を含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）ヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｄ）共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、４－１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する）、及びＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＣＭＡ ＣＡＲであり、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよく、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＭＳＤのＮ末端である。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、（ａ）抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖを含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）ヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｄ）共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、４－１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する）及びＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲであり、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよく、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＭＳＤのＮ末端である。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号７６～９６及び１０６～１１３のうちのいずれかの酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲは、配列番号９８～１０４のうちのいずれかの配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードする核酸を含むベクター（例えば、レンチウイルスなどのウイルスベクター）を含む修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）が提供され、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号７６～９６及び１０６～１１３のうちのいずれかの配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲをコードする核酸を含むベクター（例えば、レンチウイルスなどのウイルスベクター）を含む修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）が提供され、ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲは、配列番号９８～１０４のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）である。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＥＦ１－αまたはＰＧＫプロモーターである。
いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾機能的外因性受容体－Ｔ細胞（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ－Ｔ細胞、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ－Ｔ細胞、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体－Ｔ細胞）は、非修飾内因性ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲα及び／またはＴＣＲβ）遺伝子座及び／またはＢ２Ｍ遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾機能的外因性受容体－Ｔ細胞は、修飾内因性ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲα及び／またはＴＣＲβ）遺伝子座及び／または修飾内因性Ｂ２Ｍ遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、内因性ＴＣＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ｓｈＲＮＡ、及びＺＦＮから選択される遺伝子編集システムによって修飾される。いくつかの実施形態では、内因性ＴＣＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによって修飾される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムをコードする核酸（複数可）及びＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）をコードする核酸は、（例えば、同じプロモーター制御または別々のプロモーター制御下で）同じベクター上にある。いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムをコードする核酸（複数可）及びＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体をコードする核酸は、異なるベクター上にある。
本明細書に記載のベクター（例えば、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクター）のうちのいずれかを導入することによって得られる修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）が、さらに提供される。本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって得られた修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）が、さらに提供される。
エフェクター機能
本明細書で使用される「エフェクター機能」は、分子（例えば、ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲα及び／またはＴＣＲβ）、ＭＨＣ Ｉ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ２８、または本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的細胞外受容体）の生物学的活性を指す。例えば、ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲα及び／またはＴＣＲβ）、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ２８、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的細胞外受容体、ＩＴＡＭ含有分子、ＣＤ３ζのＩＳＤ含有分子（例えば、従来のＣＡＲ）、またはＣＭＳＤ含有分子（もしくはそれらを含む修飾Ｔ細胞）のエフェクター機能は、Ｔ細胞刺激、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生、Ｔ細胞の調節活性もしくは細胞溶解活性などに関連するシグナル伝達などのシグナル伝達であり得る。ＩＴＡＭ含有分子、ＣＭＳＤ含有分子、またはＣＭＳＤのエフェクター機能は、前述のシグナル伝達であり得る、及び／または他のシグナル伝達分子のドッキング部位として機能し得る。ＭＨＣ Ｉのエフェクター機能は、エピトープ提示などであり得る。
分子（例えば、ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲα及び／またはＴＣＲβ）、ＭＨＣ Ｉ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ２８、または本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的細胞外受容体）の下方調節は、分子の細胞表面発現の下方調節、及び／または分子もしくはそのような分子を含む細胞（例えば、修飾Ｔ細胞）のエフェクター機能の下方調節を包含する。外因性Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型または変異体Ｎｅｆ）の発現が、ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲα及び／またはＴＣＲβ）、ＭＨＣ Ｉ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ２８、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的細胞外受容体などを下方調節する（例えば、その細胞表面発現及び／またはエフェクター機能を下方調節する）かどうかを試験するために、あるいは外因性Ｎｅｆタンパク質が前述の分子と相互作用する（例えば、それに結合する）かどうかを試験するために、タンパク質の細胞表面発現の下方調節があるかどうか、またはシグナル伝達分子媒介シグナル伝達（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体媒介シグナル伝達）が影響を受ける（例えば、廃止または減衰させる）かどうかのいずれかを試験することができる。ＴＣＲ、ＣＭＳＤ含有機能的細胞外受容体、またはそれらを含む修飾Ｔ細胞などのエフェクター機能は、従来のＣＡＲ、従来のＣＡＲ－Ｔ、または細胞受容体のエフェクター機能を研究するために当該技術分野で既知の様々な方法によって（例えば、サイトカイン放出または受容体媒介性細胞毒性を測定することによって）測定することができる。例示的な試験方法については、実施例も参照のこと。
例えば、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）に対する受容体媒介性細胞毒性を、例えば、インビトロ試験のため、または腫瘍サイズのインビボ試験のために、ルシフェラーゼ標識（例えば、Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ）を有する標的細胞を使用することによって、ＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体を発現するＴ細胞に対して測定することができる。いくつかの実施形態では、炎症誘発性因子、ケモカイン、及び／またはサイトカインの細胞外受容体媒介放出を測定することができる。受容体媒介性細胞毒性及び／または炎症誘発性因子、ケモカイン、及び／またはサイトカインの放出が、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む同じ機能的外因性受容体（例えば、他のすべては同じであるが、ＣＤ３ζのＩＳＤを有する同じ従来のＣＡＲ）のものより少ない場合、ＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体がＣＤ３ζのＩＳＤを含む同じ機能的外因性受容体のものと比較してより少ないエフェクター機能を有することを示し、逆もまた同様である。あるいは、受容体媒介性細胞毒性及び／または炎症誘発性因子、ケモカイン、及び／またはサイトカインの放出が、修飾Ｔ細胞内で共刺激される外因性Ｎｅｆタンパク質の存在によって低減される場合、それは、外因性Ｎｅｆタンパク質と機能的外因性受容体との間の相互作用、または外因性Ｎｅｆタンパク質が機能的外因性受容体を下方調節する（例えば、その細胞表面発現及び／またはエフェクター機能を下方調節する）ことを反映する。
外因性Ｎｅｆタンパク質の発現が、シグナル伝達分子媒介シグナル伝達、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体媒介シグナル伝達を下方調節するかどうかを試験するために、外因性Ｎｅｆタンパク質をコードするベクターで形質導入／トランスフェクトされた細胞（例えば、Ｔ細胞）を、Ｔ細胞活性化のためのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で誘導することができる。ＰＨＡは、ＴＣＲを含むグリコシル化表面タンパク質上の糖に結合し、それによってそれらを架橋する。これは、活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）活性化の核因子につながるカルシウム依存性シグナル伝達経路を引き起こす。次いで、これらの細胞を、例えば、ＰＥ抗ヒトＣＤ６９抗体を使用してＦＡＣＳを使用してＣＤ６９＋割合について試験して、外因性Ｎｅｆタンパク質の影響下でのＰＨＡ媒介性Ｔ細胞活性化を検出することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の機能的外因性受容体のＣＭＳＤまたはＴＣＲなどのシグナル分子とのＮｅｆタンパク質の結合は、免疫沈降及び免疫蛍光などの通常の生化学的方法を使用して決定することもできる。例示的な試験方法については、実施例も参照のこと。
外因性Ｎｅｆタンパク質の発現が、ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲα及び／またはＴＣＲβ）の細胞表面発現を下方制御するかどうかを試験するために、外因性Ｎｅｆタンパク質をコードするベクターで形質導入／トランスフェクトされた細胞（例えば、Ｔ細胞）を、抗ＴＣＲα及び／または抗ＴＣＲβ抗体を使用してＦＡＣＳまたはＭＡＣＳ選別に供することができる（実施例も参照のこと）。例えば、形質導入／トランスフェクトされた細胞は、ＦＡＣＳのためにＰＥ／Ｃｙ５抗ヒトＴＣＲα抗体（例えば、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３０６７１０）とともにインキュベートして、ＴＣＲα陽性率を検出するか、またはビオチン標識のためにビオチン化ヒトＴＣＲα抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、２００－０７０－４０７）とともにインキュベートして、ＭＡＣＳキットプロトコルに従って磁気分離及び富化に供することができる。
外因性Ｎｅｆタンパク質の発現が、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的細胞外受容体の細胞表面発現を下方制御するかどうかを試験するために、ＦＡＣＳの機能的細胞外受容体、例えば、ＦＩＴＣ標識ヒトＢＣＭＡタンパク質（例えば、ＡＣＲＯＢＩＯＳＹＳＴＥＭ、ＢＣＡ－ＨＦ２５４－２００ＵＧ）によって認識される標識抗原を使用して、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現を検出することができる。例示的な試験方法については、実施例も参照のこと。
ＩＩＩ．ＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体
本明細書に記載のＴ細胞は、ＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体を含む。本出願は一態様において、かかるＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体及びかかるＣＭＳＤを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞などのエフェクター細胞）も提供する。
いくつかの実施形態では、機能的外因性受容体は、（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）ＣＭＳＤを含むＩＳＤとを含み、ＣＭＳＤは、１つ以上のＩＴＡＭ（「ＣＭＳＤ ＩＴＡＭ」）を含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のリンカー（ＣＭＳＤリンカー）によって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、複数（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、互いに直接連結されている。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＩＴＡＭ含有親分子（例えば、Ｇ／Ｓリンカー）に由来しない１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されている２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの１つ以上が由来するＩＴＡＭ含有親分子とは異なる、ＩＴＡＭ含有親分子に由来する１つ以上のＣＭＳＤリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の同一のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζに由来しない。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１またはＩＴＡＭ２ではない。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも２つは、互いに異なる。いくつかの実施形態では、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、各々、異なるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、１つのＣＭＳＤ ＩＴＡＭから本質的になる（例えば、それからなる）。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、１つのＣＭＳＤ ＩＴＡＭ（例えば、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、またはＣＤ３γに由来する）、ならびにＩＴＡＭ含有親分子（例えば、Ｇ／Ｓリンカー）に対して異種であるＣＭＳＤ Ｎ末端配列及び／またはＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む（例えば、それから本質的になるか、またはそれからなる）。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのまたは複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１２、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、及びＦｃεＲＩγのうちの１つ以上に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１及び／またはＣＤ３ζのＩＴＡＭ２を含まない。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３である。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＤ３ζからのいかなるＩＴＡＭも含まない。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも２つは、同じＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号４１～７４のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＳＤは、共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８または４－１ＢＢに由来する）をさらに含む。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＭＳＤのＮ末端である。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＭＳＤのＣ末端である。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１２６の配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号１２５の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体は、機能的外因性受容体のＮ末端に位置するシグナルペプチド（例えば、ＣＤ８αに由来する）をさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１２７の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体は、Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型ＳＩＶ Ｎｅｆなどの野生型Ｎｅｆ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）によって下方調節されない（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性に関与するシグナル伝達において下方調節されない）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体は、Ｎｅｆが存在しない場合と比較して、Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型ＳＩＶ Ｎｅｆなどの野生型Ｎｅｆ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）によって、最大で約８０％（例えば、最大で約７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちのいずれか）下方調節される（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性に関与するシグナル伝達において下方調節される）。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体は、Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型、サブタイプ、または変異体Ｎｅｆ）によって、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む同じ外因性受容体（例えば、すべて同じものを含むが、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む従来のＣＡＲ）と同じまたは同様に下方調節される（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性に関与するシグナル伝達において下方調節される）。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体は、Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型ＳＩＶ Ｎｅｆなどの野生型Ｎｅｆ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）によって、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む同じ外因性受容体（例えば、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む従来のＣＡＲ）よりも少なくとも約３％（例えば、少なくとも約４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のうちのいずれか）少なく下方調節される（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性に関与するシグナル伝達において下方調節される）。
ＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体の様々な構成要素、ならびに特異的機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、及びＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）は、以下により詳細に記載される。
ＣＭＳＤ
本明細書に記載のキメラシグナル伝達ドメイン（「ＣＭＳＤ」）は、天然に存在するＩＴＡＭ含有親分子のうちのいずれかとは異なる構成で配置された１つ以上のＩＴＡＭ（本明細書で「ＣＭＳＤ ＩＴＡＭ」とも称される）及び任意のリンカー（本明細書で「ＣＭＳＤリンカー」とも称される）を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、互いに直接連結された２つ以上のＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＩＴＡＭ含有親分子（例えば、Ｇ／Ｓリンカー）に由来しないか、またはＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの１つ以上が由来するＩＴＡＭ含有親分子とは異なるＩＴＡＭ含有親分子に由来するかのいずれかである、１つ以上の「異種リンカー」、すなわちリンカー配列によって接続されるＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の同一のＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも２つは、互いに異なる。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζに由来しない。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１またはＩＴＡＭ２ではない。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１及び／またはＣＤ３ζのＩＴＡＭ２を含まない。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３である。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＤ３ζからのいかなるＩＴＡＭも含まない。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも２つは、同じＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＩＴＡＭを含み、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも２つは、各々、異なるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、１つのＣＭＳＤ ＩＴＡＭから本質的になる（例えば、それからなる）。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、１つのＣＭＳＤ ＩＴＡＭ（例えば、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、またはＣＤ３γに由来する）、ならびにＩＴＡＭ含有親分子（例えば、Ｇ／Ｓリンカー）に対して「異種」であるＣＭＳＤ Ｎ末端配列及び／またはＣＭＳＤ Ｃ末端配列から本質的になる（例えば、それからなる）、すなわち、ＣＭＳＤ Ｎ末端配列及び／またはＣＭＳＤ Ｃ末端配列が、ＩＴＡＭ含有親分子（例えば、Ｇ／Ｓ含有配列）に由来しないか、またはＣＭＳＤ ＩＴＡＭ（例えば、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭ）が由来するＩＴＡＭ含有親分子とは異なるＩＴＡＭ含有親分子に由来するかのいずれかである。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１、ＩＴＡＭ２、及びＩＴＡＭ３を含むが、ａ）ＩＴＡＭのうちの２つまたは３つは、リンカーによって接続されていない、ｂ）３つのＩＴＡＭは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭと比較して、正しい順序で配置されていない、ｃ）ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζの対応するＩＴＡＭと比較して、異なる位置にある、ｄ）ＩＴＡＭのうちの少なくとも２つは、異種リンカーによって接続されている、及び／またはｅ）ＣＭＳＤは、さらなるＣＭＳＤ ＩＴＡＭをさらに含む。
したがって、例えば、いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のリンカー（「ＣＭＳＤリンカー」）によって接続されていてもよく、
（ａ）複数（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、互いに直接連結されている、
（ｂ）ＣＭＳＤは、ＩＴＡＭ含有親分子（例えばＧ／Ｓリンカー）に由来しない１つ以上のリンカーによって接続されている２つ以上（例えば２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む、
（ｃ）ＣＭＳＤは、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの１つ以上が由来するＩＴＡＭ含有親分子とは異なる、ＩＴＡＭ含有親分子に由来する１つ以上のＣＭＳＤリンカーを含む、
（ｄ）ＣＭＳＤは、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の同一のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む、
（ｅ）ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζに由来しない、
（ｆ）ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１またはＩＴＡＭ２ではない、
（ｇ）複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、各々、異なるＩＴＡＭ含有親分子に由来する、
（ｈ）ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来し、
（ｉ）ＣＭＳＤは、１つのＣＭＳＤ ＩＴＡＭからなる、及び／または
（ｊ）ＣＭＳＤは、１つのＣＭＳＤ ＩＴＡＭ、ならびにＩＴＡＭ含有親分子（例えば、Ｇ／Ｓリンカー）に対して異種であるＣＭＳＤ Ｎ末端配列及び／またはＣＭＳＤ Ｃ末端配列から本質的になる（例えば、それらからなる）。
いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、上に記載される特徴のうちの２つ以上を有する。例えば、いくつかの実施形態では、（ａ）複数（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、互いに直接連結され、（ｄ）ＣＭＳＤは、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の同一のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、（ｂ）ＣＭＳＤは、ＩＴＡＭ含有親分子（例えば、Ｇ／Ｓリンカー）に由来しない１つ以上のリンカーによって接続されている２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、（ｄ）ＣＭＳＤは、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の同一のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、（ｃ）ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭが由来する、ＩＴＡＭ含有親分子とは異なる、ＩＴＡＭ含有親分子に由来する１つ以上のＣＭＳＤリンカーを含み、（ｄ）ＣＭＳＤは、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の同一のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、（ｆ）ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１またはＩＴＡＭ２ではなく、（ｈ）ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、（ｂ）ＣＭＳＤは、ＩＴＡＭ含有親分子（例えば、Ｇ／Ｓリンカー）に由来しない１つ以上のリンカーによって接続されている２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、（ｆ）ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１またはＩＴＡＭ２ではない。いくつかの実施形態では、（ｂ）ＣＭＳＤは、ＩＴＡＭ含有親分子（例えば、Ｇ／Ｓリンカー）に由来しない１つ以上のリンカーによって接続されている２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、（ｈ）ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、（ｂ）ＣＭＳＤは、ＩＴＡＭ含有親分子（例えば、Ｇ／Ｓリンカー）に由来しない１つ以上のリンカーによって接続されている２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、（ｈ）ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、（ｃ）ＣＭＳＤは、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの１つ以上が由来するＩＴＡＭ含有親分子とは異なる、ＩＴＡＭ含有親分子に由来する１つ以上のＣＭＳＤリンカーを含み、（ｅ）ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζに由来しない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）のＩＳＤは、ＣＭＳＤから本質的になる（例えば、それからなる）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ）のＩＳＤは、共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、４－１ＢＢまたはＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン）をさらに含み、これは、ＣＭＳＤのＮ末端またはＣ末端のいずれかに配置することができ、ＣＭＳＤ内の任意の接続ペプチドを介してＣＭＳＤに接続されている（例えば、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列または任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を介して接続されている）。
本明細書に記載のＣＭＳＤは、刺激様態で作用して免疫エフェクター機能を誘導するＩＳＤにおける一次シグナル伝達ドメインとしての機能を果たす。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。本明細書で使用される「ＩＴＡＭ」とは、多くの免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）で発現するシグナル伝達分子の尾部分に見出され得る保存されたタンパク質モチーフを指す。ＩＴＡＭは、多くの細胞表面受容体（例えば、ＴＣＲ複合体）またはそれらが会合するサブユニットの細胞質ドメインに存在し、シグナル伝達において重要な調節役割を果たす。従来のＣＡＲは、通常、３つのＩＴＡＭであるＣＤ３ζのＩＴＡＭ１、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２、及びＣＤ３ζのＩＴＡＭ３を含有するＣＤ３ζの一次ＩＳＤを含む。しかしながら、ＣＡＲのＩＳＤとしてＣＤ３ζを使用することの制限が、報告されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＩＴＡＭは、天然に存在し、すなわち、天然に存在するＩＴＡＭ含有親分子に見出され得る。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭは、例えば、天然ＩＴＡＭに対して１つ、２つ、またはそれ以上のアミノ酸置換、欠失、付加、または再配置を行うことによって、さらに修飾される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＴＡＭ（以下、「非天然ＩＴＡＭ」とも称する）は、親ＩＴＡＭと比較して、同じまたは同様のＩＴＡＭ機能（例えば、シグナル伝達、またはドッキング部位として）を有する。
ＩＴＡＭは、６～８個のアミノ酸残基によって分離されたアミノ酸配列ＹｘｘＬ／Ｉの２つの繰り返しを含み、各ｘは独立して、保存されたモチーフＹｘｘＬ／Ｉ－ｘ６－８－ＹｘｘＬ／Ｉ（配列番号１１４）をもたらす任意のアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭは、第１のＩＴＡＭチロシン（Ｙ）に対して＋２位に負荷電アミノ酸（Ｄ／Ｅ）を含有し、Ｄ／Ｅ－ｘ０－２－ＹｘｘＬ／Ｉ－ｘ６－８－ＹｘｘＬ／Ｉ（配列番号１１５）のコンセンサス配列をもたらす。例示的なＩＴＡＭ含有シグナル伝達分子としては、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎが挙げられ、本明細書では、「ＩＴＡＭ含有親分子」とも称される。ＩＴＡＭ含有親分子に存在するＩＴＡＭは、リガンド連結における細胞内のシグナル伝達に関与することが知られており、これは、シグナル伝達分子の活性化後にＩＴＡＭ内のチロシン残基のリン酸化によって少なくとも部分的に媒介される。ＩＴＡＭは、シグナル伝達経路に関与する他のタンパク質のドッキング部位としての機能も果たし得る。
いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ含有親分子は、ＣＤ３ζである。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζのＩＳＤは、配列番号７の配列を有し、これは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１（配列番号４）、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２（配列番号５）、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３（配列番号６）と、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１のＮ末端、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３のＣ末端における非ＩＴＡＭ配列とを含み、３つのＩＴＡＭを接続する。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ含有親分子は、配列番号１～６及び８～１６からなる群から選択される配列を有するＩＴＡＭを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の）ＩＴＡＭを含み、それらのうちの少なくとも２つは、互いに直接接続されている。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、複数のＩＴＡＭを含み、ＩＴＡＭのうちの少なくとも２つは、異種リンカーによって接続されている。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、最もＮ末端のＣＭＳＤ ＩＴＡＭのＮ末端でのＮ末端配列（本明細書では、「ＣＭＳＤ Ｎ末端配列」とも称される）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、最もＣ末端のＣＭＳＤ ＩＴＡＭのＣ末端におけるＣ末端配列（本明細書では、「ＣＭＳＤ Ｃ末端配列」とも称される）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤリンカー（複数可）、ＣＭＳＤ Ｎ末端配列、及び／またはＣＭＳＤ Ｃ末端配列は、配列番号１７～３９及び１１６～１２０、例えば、１７～３１のうちのいずれかからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤリンカー（複数可）、ＣＭＳＤ Ｎ末端配列、及び／またはＣＭＳＤ Ｃ末端配列は、約１～約１５（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはその間の任意の範囲）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種リンカーは、Ｇ／Ｓリンカーである。いくつかの実施形態では、異種リンカー（複数可）は、配列番号１７～１９、２３、２５～２９からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ Ｃ末端配列は、配列番号１８、２０、２５、及び２７～２９からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ Ｎ末端配列は、配列番号１７、２１、２２、２４、３０、及び３１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、異種リンカーは、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの１つ以上が由来するＩＴＡＭ含有親分子とは異なる、ＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、いかなるＣＭＳＤリンカー、ＣＭＳＤ Ｎ末端配列、及び／またはＣＭＳＤ Ｃ末端配列も含まない。
いくつかの実施形態では、１つのＩＭＡＭを含有するＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＭＳＤ ＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号６７の配列（以下、「ＩＴＡＭ０３３」または「ＩＴＡＭ０３３構築物」とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号６８の配列（以下、「ＩＴＡＭ０３４」または「ＩＴＡＭ０３４構築物」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、２つのＩＴＡＭを含有するＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－第１のＣＭＳＤ ＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤリンカー－第２のＣＭＳＤ ＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３γのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤリンカー－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第１のリンカーまたはＣＤ３ζの第２のリンカーと同一である。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号６９の配列（以下、「ＩＴＡＭ０３５」または「ＩＴＡＭ０３５構築物」とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号７０の配列（以下、「ＩＴＡＭ０３６」または「ＩＴＡＭ０３６構築物」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、３つのＩＴＡＭを含有するＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－第１のＣＭＳＤ ＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－第２のＣＭＳＤ ＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－第３のＣＭＳＤ ＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。例示的な構造については、図８を参照のこと。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含み、第１のＣＭＳＤリンカー及び第２のＣＭＳＤリンカーのうちの少なくとも１つは、存在しないか、またはＣＤ３ζに対して異種である。いくつかの実施形態では、第１のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第２のリンカーと同一であり得、第２のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第１のリンカーと同一であり得る。いくつかの実施形態では、第１のＣＭＳＤリンカー及び第２のＣＭＳＤリンカーは、両方とも、ＣＤ３ζの第１のリンカーと同一であり得る。いくつかの実施形態では、第１のＣＭＳＤリンカー及び第２のＣＭＳＤリンカーは、両方とも、ＣＤ３ζの第２のリンカーと同一であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、配列番号４１の配列（以下、「Ｍ６６３ ＣＭＳＤ」とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、配列番号５４の配列（以下、「ＩＴＡＭ００７」または「ＩＴＡＭ００７構築物」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含み、任意の第１のＣＭＳＤリンカー及び／または第２のＣＭＳＤリンカーは、存在しないか、またはＣＭＳＤのエフェクター機能シグナル伝達に適している任意のリンカー配列のものであり得る（例えば、第１のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第１のリンカーと同一であり得、第２のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第２のリンカーと同一であり得る、図８を参照のこと）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、配列番号４２の配列（以下、「Ｍ６６５ ＣＭＳＤ」とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、配列番号５５の配列（以下、「ＩＴＡＭ００８」または「ＩＴＡＭ００８構築物」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含み、任意の第１のＣＭＳＤリンカー及び／または第２のＣＭＳＤリンカーは、存在しないか、またはＣＭＳＤのエフェクター機能シグナル伝達に適している任意のリンカー配列のものであり得る（例えば、第１のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第１のリンカーと同一であり得、第２のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第２のリンカーと同一であり得る）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、配列番号４３の配列（以下、「Ｍ６６６ ＣＭＳＤ」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含み、任意の第１のＣＭＳＤリンカー及び／または第２のＣＭＳＤリンカーは、存在しないか、またはＣＭＳＤのエフェクター機能シグナル伝達に適している任意のリンカー配列のものであり得る（例えば、第１のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第１のリンカーと同一であり得、第２のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第２のリンカーと同一であり得る）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、配列番号４４の配列（以下、「Ｍ６６７ ＣＭＳＤ」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＤ３ζのいかなるＩＴＡＭ（例えば、ＩＴＡＭ１、ＩＴＡＭ２、またはＩＴＡＭ３）も含まない。いくつかの実施形態では、３つのＩＴＡＭを含有するＣＭＳＤは、非ＣＤ３ζ ＩＴＡＭ含有親分子（例えば、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、またはＭｏｅｓｉｎ）に由来する１つ以上（例えば、１つ、２つ、または３つ）のＩＴＡＭを含み、それらを接続する任意のリンカー（複数可）は、存在しないか、またはＣＭＳＤのエフェクター機能シグナル伝達に適している任意のリンカー配列のものであり得る（例えば、第１のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第１のリンカーと同一であり得、第２のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第２のリンカーと同一であり得るか、またはＧ／Ｓリンカーであり得る）。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第１のリンカーまたはＣＤ３ζの第２のリンカーと同一である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、配列番号４６の配列（以下、「Ｍ６７９ ＣＭＳＤ」とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、配列番号５６の配列（以下、「ＩＴＡＭ００９」または「ＩＴＡＭ００９構築物」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第１のリンカーまたはＣＤ３ζの第２のリンカーと同一である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、配列番号４８の配列（以下、「Ｍ６８１ ＣＭＳＤ」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＩｇαのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＩｇαのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＩｇαのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第１のリンカーまたはＣＤ３ζの第２のリンカーと同一である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、配列番号４９の配列（以下、「Ｍ６８２ ＣＭＳＤ」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＩｇβのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＩｇβのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＩｇβのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第１のリンカーまたはＣＤ３ζの第２のリンカーと同一である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、配列番号５０の配列（以下、「Ｍ６８３ ＣＭＳＤ」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＦｃεＲＩγのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＦｃεＲＩγのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＦｃεＲＩγのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第１のリンカーまたはＣＤ３ζの第２のリンカーと同一である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、配列番号５２の配列（以下、「Ｍ６８５ ＣＭＳＤ」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第１のリンカーまたはＣＤ３ζの第２のリンカーと同一である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、配列番号４５の配列（以下、「Ｍ６７８ ＣＭＳＤ」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３γのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３γのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３γのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第１のリンカーまたはＣＤ３ζの第２のリンカーと同一である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、配列番号４７の配列（以下、「Ｍ６８０ ＣＭＳＤ」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＦｃεＲＩβのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＦｃεＲＩβのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＦｃεＲＩβのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第１のリンカーまたはＣＤ３ζの第２のリンカーと同一である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、配列番号５１の配列（以下、「Ｍ６８４ ＣＭＳＤ」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１のＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１のＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１のＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第１のリンカーまたはＣＤ３ζの第２のリンカーと同一である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、配列番号５３の配列（以下、「Ｍ７９９ ＣＭＳＤ」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第１のリンカーまたはＣＤ３ζの第２のリンカーと同一である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、配列番号７１の配列（以下、「ＩＴＡＭ０３７」または「ＩＴＡＭ０３７構築物」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３γのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第１のリンカーまたはＣＤ３ζの第２のリンカーと同一である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、配列番号７２の配列（以下、「ＩＴＡＭ０３８」または「ＩＴＡＭ０３８構築物」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第１のリンカーまたはＣＤ３ζの第２のリンカーと同一である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、配列番号７３の配列（以下、「ＩＴＡＭ０４５」または「ＩＴＡＭ０４５構築物」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＭＳＤリンカーは、ＣＤ３ζの第１のリンカーまたはＣＤ３ζの第２のリンカーと同一である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、配列番号７４の配列（以下、「ＩＴＡＭ０４６」または「ＩＴＡＭ０４６構築物」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、細胞質ＣＤ３ζ Ｎ末端配列－第１のＣＭＳＤ ＩＴＡＭ－ＣＤ３ζの第１のリンカー－第２のＣＭＳＤ ＩＴＡＭ－ＣＤ３ζの第２のリンカー－第３のＣＭＳＤ ＩＴＡＭ－ＣＤ３ζ Ｃ末端配列を含み、ＣＭＳＤ内のすべての非ＩＴＡＭ配列（細胞質ＣＤ３ζ Ｎ末端配列、ＣＤ３ζの第１のリンカー、ＣＤ３ζの第２のリンカー、及びＣＤ３ζ Ｃ末端配列）は、同一であり、それらが親ＣＤ３ζのＩＳＤに自然に存在するのと同じ位置にあり、かかるＣＭＳＤはまた、「非ＩＴＡＭＣＤ３ζのＩＳＤフレームワークを含むＣＭＳＤ」とも称される（図８を参照のこと）。非ＩＴＡＭＣＤ３ζのＩＳＤフレームワークを含むＣＭＳＤについて、第１／第２／第３のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、独立して、ＣＤ３δのＩＴＡＭ、ＣＤ３γのＩＴＡＭ、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３、ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１のＩＴＡＭ、ＩｇαのＩＴＡＭ、ＩｇβのＩＴＡＭ、及びＦｃεＲＩγのＩＴＡＭ（配列番号１、３～６、８～１１、及び１３；すべて２９アミノ酸長）からなる群から選択することができ、これらは、第１のＣＭＳＤ ＩＴＡＭがＣＤ３ζのＩＴＡＭ１であり、第２のＣＭＳＤ ＩＴＡＭがＣＤ３ζのＩＴＡＭ２であり、かつ第３のＣＭＳＤ ＩＴＡＭがＣＤ３ζのＩＴＡＭ３である組み合わせを除く。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、細胞質ＣＤ３ζ Ｎ末端配列－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－ＣＤ３ζの第１のリンカー－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－ＣＤ３ζの第２のリンカー－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－ＣＤ３ζ Ｃ末端配列を含む（例えば、それらからなる）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、細胞質ＣＤ３ζ Ｎ末端配列－ＣＤ３γのＩＴＡＭ－ＣＤ３ζの第１のリンカー－ＣＤ３γのＩＴＡＭ－ＣＤ３ζの第２のリンカー－ＣＤ３γのＩＴＡＭ－ＣＤ３ζ Ｃ末端配列を含む（例えば、それらからなる）。
いくつかの実施形態では、４つのＩＴＡＭを含有するＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－第１のＣＭＳＤ ＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－第２のＣＭＳＤ ＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－第３のＣＭＳＤ ＩＴＡＭ－任意の第３のＣＭＳＤリンカー－第４のＣＭＳＤ ＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。例えば、５つのＩＴＡＭを含有する、６つのＩＴＡＭを含有するなどのＣＭＳＤなど。４つ以上（例えば、４つ、５つ、またはそれ以上）のＩＴＡＭを含むＣＭＳＤについて、ＩＴＡＭ含有親分子は、通常、１つのＩＴＡＭ（例えば、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、またはＭｏｅｓｉｎなどの非ＣＤζ含有分子）、または３つのＩＴＡＭ（例えば、ＣＤ３ζ）を含むため、ＣＭＳＤ内の少なくとも１つのＩＴＡＭは、１つのＩＴＡＭを含有する親分子とは異なる分子に由来するか、またはＩＴＡＭがＩＴＡＭ含有親分子に天然に存在する位置とは異なる位置に存在するかのいずれかであり、したがって、４つ以上（例えば、４つ、５つ、またはそれ以上）のＩＴＡＭを含むＣＭＳＤは、本明細書に記載の任意のＩＴＡＭ含有親分子（例えば、ＣＤ３ζ）に由来するＩＴＡＭを含み得、任意のリンカーは、存在し得ないか、またはＩＴＡＭ含有親分子の細胞質の非ＩＴＡＭ配列に由来し得るか、またはＩＴＡＭ含有親分子（例えば、Ｇ／Ｓリンカーであり得る）とは異種配列のものであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３δのＩＴＡＭ（配列番号１）－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ（配列番号２）－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３γのＩＴＡＭ（配列番号３）－任意の第３のＣＭＳＤリンカー－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ（配列番号８）－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、任意のＣＭＳＤリンカー（複数可）、ＣＭＳＤ Ｎ末端配列、及びＣＭＳＤ Ｃ末端配列は、ＩＴＡＭ含有親分子の細胞質の非ＩＴＡＭ配列に由来する。いくつかの実施形態では、任意の第１、第２、及び第３のＣＭＳＤリンカー、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列、ならびに任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列は、異種であり、これらは、独立して、配列番号１７～３９及び１１６～１２０、例えば、配列番号１７～３１のうちのいずれかからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号５７の配列（以下、「ＩＴＡＭ０１０」または「ＩＴＡＭ０１０構築物」とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号５９の配列（以下、「ＩＴＡＭ０２５」または「ＩＴＡＭ０２５構築物」とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号６０の配列（以下、「ＩＴＡＭ０２６」または「ＩＴＡＭ０２６構築物」とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号６１の配列（以下、「ＩＴＡＭ０２７」または「ＩＴＡＭ０２７構築物」とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号６２の配列（以下、「ＩＴＡＭ０２８」または「ＩＴＡＭ０２８構築物」とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号６３の配列（以下、「ＩＴＡＭ０２９」または「ＩＴＡＭ０２９構築物」とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、ＣＤ３δのＩＴＡＭ－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－ＣＤ３γのＩＴＡＭ－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭからなる。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号５８の配列（以下、「ＩＴＡＭ０２４」または「ＩＴＡＭ０２４構築物」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－任意の第３のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３γのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、任意のＣＭＳＤリンカー（複数可）、ＣＭＳＤ Ｎ末端配列、及びＣＭＳＤ Ｃ末端配列は、ＩＴＡＭ含有親分子の細胞質の非ＩＴＡＭ配列に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号６４の配列（以下、「ＩＴＡＭ０３０」または「ＩＴＡＭ０３０構築物」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＣＤ３γのＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意の第３のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、任意のＣＭＳＤリンカー（複数可）、ＣＭＳＤ Ｎ末端配列、及びＣＭＳＤ Ｃ末端配列は、ＩＴＡＭ含有親分子の細胞質の非ＩＴＡＭ配列に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号６５の配列（以下、「ＩＴＡＭ０３１」または「ＩＴＡＭ０３１構築物」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列－ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ－任意の第１のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３γのＩＴＡＭ－任意の第２のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３εのＩＴＡＭ－任意の第３のＣＭＳＤリンカー－ＣＤ３δのＩＴＡＭ－任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、任意のＣＭＳＤリンカー（複数可）、ＣＭＳＤ Ｎ末端配列、及びＣＭＳＤ Ｃ末端配列は、ＩＴＡＭ含有親分子の細胞質の非ＩＴＡＭ配列に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号６６の配列（以下、「ＩＴＡＭ０３２」または「ＩＴＡＭ０３２構築物」とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、ＣＤ３ζのＩＳＤと比較して、本明細書に記載のＮｅｆタンパク質（例えば、野生型、サブタイプ、変異体、または非天然Ｎｅｆ）への結合を有しないか、または低減された結合（例えば、少なくとも約３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％低減された結合のうちのいずれか）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤは、ＣＤ３ζのＩＳＤと比較して、本明細書に記載のＮｅｆタンパク質への同じまたは同様の結合を有する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤの機能（例えば、シグナル伝達及び／またはドッキング部位として）は、ＣＤ３ζのＩＳＤと比較して、本明細書に記載のＮｅｆタンパク質によって、同じまたは同様に下方調節される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤの機能（例えば、シグナル伝達及び／またはドッキング部位として）は、ＣＤ３ζのＩＳＤと比較して、本明細書に記載のＮｅｆタンパク質によって、少なくとも約３％少なく（例えば、少なくとも約４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％少なく）下方調節される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤの機能（例えば、シグナル伝達及び／またはドッキング部位として）は、ＣＤ３ζのＩＳＤと比較して、本明細書に記載のＮｅｆタンパク質によって、最大で約８０％（例えば、最大で７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちのいずれか）多く下方調節される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、Ｎｅｆ（例えば、野生型ＳＩＶ Ｎｅｆなどの野生型Ｎｅｆ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）と結合しない。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１及びＣＤ３ζのＩＴＡＭ２を含まない。いくつかの実施形態では、複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３、ＤＡＰ１２、ＣＤ３ε、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、またはＦｃεＲＩγから選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ内のＩＴＡＭはすべて、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３である。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ内のＩＴＡＭはすべて、ＣＤ３εのＩＴＡＭである。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ、ＣＤ３εのＩＴＡＭ、及びＣＤ３ζのＩＴＡＭ３である３つのＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、Ｎｅｆ（例えば、野生型ＳＩＶ Ｎｅｆなどの野生型Ｎｅｆ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）とＣＭＳＤとの間の結合は、ＮｅｆとＩＴＡＭ含有親分子（例えば、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε）との間の結合よりも、少なくとも約３％少ない（例えば、少なくとも約４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％少ない）。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＤ３ζのＩＳＤの活性と比較して、同じまたは同様の活性（例えば、シグナル伝達及び／またはドッキング部位として）を有する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＤ３ζのＩＳＤの活性と比較して、最大で約８０％（例えば、最大で７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちのいずれか）少ない活性（例えば、シグナル伝達及び／またはドッキング部位として）を有する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＤ３ζのＩＳＤの活性と比較して、少なくとも約３％（例えば、少なくとも約４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％）強力な活性（例えば、シグナル伝達及び／またはドッキング部位として）を有する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤを含むＩＳＤを含む機能的外因性受容体のエフェクター機能は、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含むＩＳＤを含む機能的外因性受容体と比較して、少なくとも約２０％（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のうちのいずれか）活性である。
本明細書に記載のＣＭＳＤのうちのいずれかをコードする単離された核酸もまた、提供される。
ＣＭＳＤリンカー、ＣＭＳＤ Ｃ末端配列、ＣＭＳＤ Ｎ末端配列
上述のように、本明細書に記載のＣＭＳＤは、任意のＣＭＳＤリンカー（複数可）、任意のＣＭＳＤ Ｃ末端配列、及び／または任意のＣＭＳＤ Ｎ末端配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤリンカー（複数可）、ＣＭＳＤ Ｃ末端配列、及び／またはＣＭＳＤ Ｎ末端配列のうちの少なくとも１つは、ＩＴＡＭ含有親分子に由来し、例えば、ＩＴＡＭ含有親分子内のリンカー配列である。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤリンカー（複数可）、ＣＭＳＤ Ｃ末端配列、及び／またはＣＭＳＤ Ｎ末端配列は、異種であり、すなわち、それらは、ＩＴＡＭ含有親分子（例えば、Ｇ／Ｓリンカー）に由来しないか、またはＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの１つ以上が由来するＩＴＡＭ含有親分子とは異なるＩＴＡＭ含有親分子に由来するかのいずれかである。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤリンカー（複数可）、ＣＭＳＤ Ｃ末端配列、及び／またはＣＭＳＤ Ｎ末端配列のうちの少なくとも１つは、ＩＴＡＭ含有親分子に対して異種であり、例えば、ＩＴＡＭ含有親分子（例えば、Ｇ／Ｓリンカー）の任意の部分とは異なる配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、２つ以上の異種ＣＭＳＤリンカーを含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の異種ＣＭＳＤリンカーは、互いに同一である。いくつかの実施形態では、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の異種ＣＭＳＤリンカーのうちの少なくとも２つは、互いに同一である。いくつかの実施形態では、２つ以上の異種ＣＭＳＤリンカーはすべて、互いに異なる。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤリンカー、ＣＭＳＤ Ｃ末端配列、及び／またはＣＭＳＤ Ｎ末端配列のうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤリンカー（複数可）、ＣＭＳＤ Ｃ末端配列、及び／またはＣＭＳＤ Ｎ末端配列は、互いに同一である。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤリンカー（複数可）、ＣＭＳＤ Ｃ末端配列、及びＣＭＳＤ Ｎ末端配列のうちの少なくとも１つは、他のものとは異なる。
ＣＭＳＤ内のリンカー（複数可）、Ｃ末端配列、及び／またはＮ末端配列は、ＣＭＳＤの構造的及び／または機能的特徴に応じて同じまたは異なる長さ及び／または配列を有し得る。ＣＭＳＤリンカー、ＣＭＳＤ Ｃ末端配列、及びＣＭＳＤ Ｎ末端配列は、独立して、選択され、最適化され得る。いくつかの実施形態では、より長いＣＭＳＤリンカー（例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上のアミノ酸長のうちのいずれかであるリンカー）が、２つの隣接するドメインが互いに立体的に妨害しないことを確実にするために選択され得る。いくつかの実施形態では、より長いＣＭＳＤ Ｎ末端配列（例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上のアミノ酸長のうちのいずれかであるＣＭＳＤ Ｎ末端配列）は、シグナル伝達分子が最もＮ末端のＩＴＡＭに結合するのに十分な空間を提供するように選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤリンカー（複数可）、ＣＭＳＤ Ｃ末端配列、及び／またはＣＭＳＤ Ｎ末端配列は、約３０、２５、２０、１５、１０、５、または１以下のうちのいずれかのアミノ酸長である。ＣＭＳＤリンカー長はまた、ＩＴＡＭ含有親分子のＩＳＤ内でＩＴＡＭを接続している内因性リンカーの長さと同じであるように設計され得る。ＣＭＳＤ Ｎ末端配列長はまた、ＩＴＡＭ含有親分子の細胞質Ｎ末端配列の、最もＮ末端のＩＴＡＭと膜との間での長さと同じであるように設計され得る。ＣＭＳＤ Ｃ末端配列長はまた、最後のＩＴＡＭのＣ末端にあるＩＴＡＭ含有親分子の細胞質Ｃ末端配列の長さと同じであるように設計され得る。
いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤリンカーは、可撓性リンカー（例えば、Ｇｌｙ及びＳｅｒなどの可撓性アミノ酸残基、例えば、Ｇｌｙ－Ｓｅｒダブレットを含む）である。例示的な可撓性リンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ（配列番号１１６）、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ（配列番号１１７）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１１８）、及び（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１１９）（ｎは、少なくとも１の整数である）、（ＧｘＳ）ｎ（配列番号１２０、ｎ及びｘは、３～１２から独立して選択される整数である）を含む）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び当該技術分野で既知の他の可撓性リンカーが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤリンカーは、Ｇ／Ｓリンカーである。いくつかの実施形態では、可撓性リンカーは、アミノ酸配列ＧＥＮＬＹＦＱＳＧＧ（配列番号１７）、ＧＧＳＧ（配列番号１８）、ＧＳ（配列番号１９）、ＧＳＧＳＧＳ（配列番号２０）、ＰＰＰＹＱＰＬＧＧＧＧＳ（配列番号２１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２２）、Ｇ（配列番号２３）、ＧＧＧＧＳ（配列番号２９）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号３２）、（ＧＧＧＳ）３（配列番号３３）、（ＧＧＧＳ）４（配列番号３４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３６）、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３７）、（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号３８）、ＧＧＧＧＧＳＧＧＲＡＳＧＧＧＧＳ（配列番号３９）、またはＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号３０）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤリンカーは、配列番号１７～１９、２３、２５～２９からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＭＳＤリンカー、ＣＭＳＤ Ｎ末端配列、及び／またはＣＭＳＤ Ｃ末端配列は、可撓性（例えば、Ｇｌｙ及びＳｅｒなどの可撓性アミノ酸残基、例えば、Ｇｌｙ－Ｓｅｒダブレットを含む）である。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ Ｎ末端配列は、独立して、配列番号１７～３９及び１１６～１２０、例えば、配列番号１７～３１のうちのいずれかからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ Ｃ末端配列は、配列番号１８、２０、２５、及び２７～２９からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ Ｎ末端配列は、配列番号１７、２１、２２、２４、３０、及び３１からなる群から選択される。
任意のＣＭＳＤリンカー（複数可）、ＣＭＳＤ Ｎ末端配列、及び／またはＣＭＳＤ Ｃ末端配列は、任意の好適な長さのものであり得る。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤリンカー、ＣＭＳＤ Ｎ末端配列、及び／またはＣＭＳＤ Ｃ末端配列は、独立して、約３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１以下のうちのいずれかのアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤリンカー（複数可）、ＣＭＳＤ Ｎ末端配列、及び／またはＣＭＳＤ Ｃ末端配列の長さは、独立して、約１アミノ酸～約１０アミノ酸、約４アミノ酸～約６アミノ酸、約１アミノ酸～約２０アミノ酸、約１アミノ酸～約３０アミノ酸、約５アミノ酸～約１５アミノ酸、約１０アミノ酸～約１５アミノ酸、約１０アミノ酸～約２５アミノ酸長、約５アミノ酸～約３０アミノ酸、約１０アミノ酸～約３０アミノ酸、または約１アミノ酸～約１５アミノ酸のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤリンカー（複数可）、ＣＭＳＤ Ｎ末端配列、及び／またはＣＭＳＤ Ｃ末端配列の長さは、約１アミノ酸～約１５アミノ酸である。
細胞外リガンド結合ドメイン
本明細書に記載の機能的外因性受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のうちのいずれか１つ）の結合部分、例えば、１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合部分は、抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）である。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合部分は、４鎖抗体に由来する。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合部分は、ラクダ科抗体に由来する。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合部分は、ヒト抗体に由来する。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合部分は、ラクダＩｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ′断片、Ｆ（ａｂ）′２断片、Ｆ（ａｂ）′３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）、ビス－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、及び単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ナノボディ、ＶＨＨ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合部分は、ｓｄＡｂ（例えば、抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ）である。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合部分は、ｓｃＦｖ（例えば、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合部分は、非抗体結合タンパク質、例えば、ポリペプチドリガンド／受容体、または抗原に結合する操作されたタンパク質である。いくつかの実施形態では、１つ以上の非抗体結合部分は、リガンドに由来する少なくとも１つのドメイン、または細胞表面受容体の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、リガンドまたは受容体は、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫＧ２Ｄ、ＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＩＬ－３、ＩＬ－１３、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＤＮＡＭ－１、及びＮＫｐ８０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、リガンドは、ＢＣＭＡ受容体に結合し得る、ＡＰＲＩＬまたはＢＡＦＦである。いくつかの実施形態では、受容体は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）であり、リガンドは、Ｆｃ含有分子（例えば、全長モノクローナル抗体）である。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合部分は、ＦｃＲの細胞外ドメイン（またはその一部分）に由来する。一部の実施形態では、ＦｃＲは、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）である。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４Ａ）、ＦｃγＲＩＢ（ＣＤ６４Ｂ）、ＦｃγＲＩＣ（ＣＤ６４Ｃ）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）からなる群から選択される。２つ以上の結合部分（例えば、ｓｄＡｂ）は、ペプチド結合またはペプチドリンカーを介して互いに直接融合され得る（以下の受容体ドメインリンカーサブセクションを参照のこと）。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）
いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、１つ以上のｓｄＡｂ（例えば、抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ）を含む。ｓｄＡｂは、同じまたは異なる起源のものであり得、同じまたは異なるサイズのものであり得る。例示的なｓｄＡｂとしては、重鎖のみ抗体（例えば、ＶＨＨまたはＶＮＡＲ）からの重鎖可変ドメイン、軽鎖を天然に欠いている結合分子、従来の４鎖抗体に由来する単一ドメイン（ＶＨまたはＶＬなど）、ヒト化重鎖のみ抗体、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウスまたはラットによって産生されるヒトｓｄＡｂ、ならびに抗体に由来するもの以外の操作されたドメイン及び単一ドメインスキャフォールドが挙げられるが、これらに限定されない。当該技術分野で既知のまたはＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９６９３８及びＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０９４４０８（これらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載のｓｄＡｂを含む、出願者によって開発された任意のｓｄＡｂを使用して、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体を構築することができる。ＣＡＲ（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ）の例示的な構造が、ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９６９３８の図１５Ａ～１５Ｄに示されている。ｓｄＡｂは、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、及びウシを含むが、これらに限定されない任意の種に由来し得る。本明細書で企図されるＳｄＡｂは、ラクダ科及びサメ以外の種からの天然に存在するｓｄＡｂ分子も含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、軽鎖を欠いている重鎖抗体（本明細書で「重鎖のみ抗体」とも称される）として既知の天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子に由来する。かかる単一ドメイン分子は、例えば、ＷＯ９４／０４６７８及びＨａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－４４８において開示されている。明確化のために、軽鎖を天然に欠いている重鎖分子に由来する可変ドメインは既知であり、本明細書では、それを４鎖免疫グロブリンの従来のＶＨと区別するためにＶＨＨとする。かかるＶＨＨ分子は、ラクダ科種、例えば、ラクダ、ラマ、ビクーナ、ヒトコブラクダ、アルパカ、及びグアナコで産生される抗体に由来し得る。ラクダ科以外の他の種が、軽鎖を天然に欠いている重鎖分子を産生することができ、かかるＶＨＨは、本出願の範囲内である。
ラクダ科由来のＶＨＨ分子は、ＩｇＧ分子よりも約１０倍小さい。それらは、単一ポリペプチドであり、非常に安定しており、極度のｐＨ及び温度条件に耐性を示すことができる。さらに、それらは、プロテアーゼ作用に耐性を示すことができ、従来の４鎖抗体には当てはまらない。さらに、ＶＨＨのインビトロ発現は、高収率の適切に折り畳まれた機能的ＶＨＨをもたらす。加えて、ラクダ科で生成された抗体は、抗体ライブラリの使用により、またはラクダ科以外の哺乳動物の免疫化により、インビトロで生成された抗体によって認識されるエピトープ以外のエピトープを認識することができる（例えば、ＷＯ９７４９８０５を参照されたい）。したがって、１つ以上のＶＨＨドメインを含む本明細書に記載のＣＭＳＤを含む多重特異性または多価機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）は、従来の４鎖抗体に由来する抗原結合断片を含む多重特異性及び／または多価機能的外因性受容体よりも効率的に標的と相互作用することができる。ＶＨＨが空洞または溝などの「通常ではない」エピトープへ結合することで知られているため、かかるＶＨＨを含む機能的外因性受容体の親和性は、従来の多重特異性非ＶＨＨ含有キメラ受容体（例えば、非ＶＨＨ含有ＣＡＲ）よりも治療的処置により好適であり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、軟骨魚に見られる免疫グロブリンの可変領域に由来する。例えば、ｓｄＡｂは、サメ血清に見られる新規抗原受容体（ＮＡＲ）として既知の免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。ＮＡＲの可変領域（「ＩｇＮＡＲ」）に由来する単一ドメイン分子を製造する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１及びＳｔｒｅｌｔｓｏｖ（２００５） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１４：２９０１－２９０９において記載されている。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、組換え、ＣＤＲグラフト、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化、及び／またはインビトロ生成された（例えば、ファージディスプレイによって選択された）ものである。いくつかの実施形態では、フレームワーク領域のアミノ酸配列は、フレームワーク領域内の特定のアミノ酸残基の「ラクダ化」によって改変され得る。ラクダ化は、従来の４鎖抗体からの（天然に存在する）ＶＨドメインのアミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸残基の、重鎖抗体のＶＨＨドメイン内の対応する位置（複数可）で生じるアミノ酸残基のうちの１つ以上による置き換えまたは置換を指す。これは、当業者に明らかになる本来既知の様態で行われ得る。かかる「ラクダ化」置換は、好ましくは、ＶＨ－ＶＬ界面を形成し、及び／またはその界面に存在するアミノ酸位置に、及び／またはいわゆるラクダ科特徴残基に挿入される（例えば、ＷＯ９４／０４６７８、Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３３９：２８５－２９０，１９９４、Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９（６）：５３１－５３７，１９９６、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５９：９５７－９６９，１９９６、及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：２５－３８，１９９９を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ヒト重鎖セグメントを発現させるトランスジェニックマウスまたはラットによって産生されるヒトｓｄＡｂである。例えば、ＵＳ２００９０３０７７８７Ａ１、米国特許第８，７５４，２８７号、ＵＳ２０１５０２８９４８９Ａ１、ＵＳ２０１００１２２３５８Ａ１、及びＷＯ２００４０４９７９４を参照のこと。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、親和性成熟である。
いくつかの実施形態では、特定の抗原または標的に対する天然に存在するＶＨＨドメインは、ラクダ科ＶＨＨ配列の（天然または免疫）ライブラリから得られ得る。かかる方法は、本来既知の１つ以上のスクリーニング技術を使用した、当該抗原または標的、または少なくとも１つの部分、断片、抗原決定基、またはそのエピトープを使用するかかるライブラリのスクリーニングを伴っても伴わなくてもよい。かかるライブラリ及び技術は、例えば、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ０１／９０１９０、ＷＯ０３／０２５０２０、及びＷＯ０３／０３５６９４に記載されている。あるいは、例えば、ＷＯ００／４３５０７に記載のランダム変異誘発及び／またはＣＤＲシャッフリングなどの技術により（天然または免疫）ＶＨＨライブラリから得られるＶＨＨライブラリなどの（天然または免疫）ＶＨＨライブラリに由来する改善された合成または半合成ライブラリが使用され得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、従来の４鎖抗体から生成される。例えば、ＥＰ ０ ３６８ ６８４、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ １９８９ Ｏｃｔ．１２；３４１（６２４２）：５４４－６）、Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００３，２１（１１）：４８４－４９０）、ＷＯ０６／０３０２２０、及びＷＯ０６／００３３８８を参照のこと。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＢＣＭＡと特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）は、配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）は、配列番号１２８のアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂは、配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）と同じエピトープに結合する。
いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）は、配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂは、配列番号１２９のアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂは、配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）と同じエピトープに結合する。
いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態ではＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体は、ＢＣＭＡと特異的に結合する第１のｓｄＡｂ部分及びＢＣＭＡと特異的に結合する第２のｓｄＡｂ部分（以下、「抗ＢＣＭＡ ＶＨＨ」などの「抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ」と称される）を含む細胞外リガンド結合ドメインを含む。第１のｓｄＡｂ部分及び第２のｓｄＡｂ部分は、ＢＣＭＡの異なるエピトープに結合し得る。２つのｓｄＡｂは、タンデムに配置され得、所望により、リンカー配列によって連結されていてもよい。「ＣＭＳＤリンカー」及び「受容体ドメインリンカー」のセクションに記載されるリンカー配列のうちのいずれもが、本明細書で使用され得る。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体は、３つ以上のｓｄＡｂ（例えば、ＢＣＭＡを特異的に認識する）を含む細胞外リガンド結合ドメインを含む。
標的抗原及び標的分子
本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）の細胞外リガンド結合ドメインは、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）、または標的分子（例えば、モノクローナル抗体などのＦｃ含有分子）上の任意の抗原（または任意の抗原の任意のエピトープ）を特異的に認識することができる。いくつかの実施形態では、標的抗原は、細胞表面分子（例えば、受容体／リガンドの細胞外ドメイン）である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、特別の病状に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとしての役割を果たす。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、単一の標的（例えば、腫瘍）抗原を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、単一の標的（例えば、腫瘍）抗原のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、２つ以上の標的（例えば、腫瘍）抗原を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、Ｂ細胞リンパ腫または多発性骨髄腫（ＭＭ）などのＢ細胞悪性腫瘍に関連する。腫瘍は、免疫応答、具体的には、Ｔ細胞媒介免疫応答に対する標的抗原としての機能を果たすことができるいくつかのタンパク質を発現する。細胞外リガンド結合ドメインによって特異的に認識される標的抗原（例えば、腫瘍抗原、受容体／リガンドの細胞外ドメイン）は、単一の疾患細胞上の抗原または各々が疾患に寄与する異なる細胞上で発現する抗原であり得る。細胞外リガンド結合ドメインによって特異的に認識される抗原は、疾患に直接または間接的に関与し得る。
腫瘍抗原は、免疫応答、具体的には、Ｔ細胞媒介免疫応答を誘発することができる腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。本発明の標的とされる抗原の選択は、治療される特定の種類のがんに依存するであろう。例示的な腫瘍抗原としては、例えば、神経膠腫関連抗原、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、スルビビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ならびにメソテリンが挙げられる。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する１つ以上の抗原癌エピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃に対する標的抗原としての機能を果たすことができるいくつかのタンパク質を発現する。これらの分子としては、組織特異的抗原、例えば、黒色腫におけるＭＡＲＴ－１、チロシナーゼ、及びｇｐ１００、ならびに前立腺癌における前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）及び前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の標的分子は、がん遺伝子ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ－２などの形質転換関連分子の群に属する。標的抗原のさらに別の群は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）などのがん胎児抗原である。Ｂ細胞リンパ腫において、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に特有の真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。ＴＳＡは、腫瘍細胞に特有であり、体内の他の細胞に生じない。ＴＡＡは、腫瘍細胞に特有ではなく、代わりに、抗原に対する免疫学的寛容の状態を誘導することができない条件下で正常細胞でも発現する。腫瘍上での抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で生じ得る。ＴＡＡは、免疫系が未熟であり、応答することができない場合に胎児発育中に正常細胞で発現する抗原であり得るか、またはそれらは、通常非常に低レベルで正常細胞上に存在するが、はるかにより高いレベルで、腫瘍細胞で発現する抗原であり得る。ＴＳＡまたはＴＡＡ抗原の非限定的な例としては、以下、分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－Ｉ）、ｇｐ １００（Ｐｍｅｌ １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、及び腫瘍特異的多系列抗原、例えば、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐｌ５；過剰発現胚抗原、例えば、ＣＥＡ；過剰発現癌遺伝子及び変異腫瘍サプレッサー遺伝子、例えば、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ；染色体転座に起因する特有の腫瘍抗原、例えば、ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ、ならびにウイルス抗原、例えば、エプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡ及びヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７が挙げられる。他の大きいタンパク質に基づく抗原としては、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３ＨＩ、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ １９－９、ＣＡ ７２－４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ベータ－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１５、ｐ１６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ－フェトプロテイン、ベータ－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ １２５、ＣＡ １５－３＼ＣＡ ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ １９５、ＣＡ ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ １、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０＼Ｍａｃ－２結合タンパク質＼サイクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、及びＴＰＳが挙げられる。
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、メソテリン、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ Ａｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、インターロイキン－１１受容体ａ（ＩＬ－１１Ｒａ）、ＰＳＣＡ、ＰＲＤＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体α、ＥＲＢ２（Ｈｅｒｂ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＮＣＡＭ、プロストラーゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、スルビビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、子宮肉腫転座ブレークポイント（ｓａｒｃｏｍａ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ）、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸管カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、及びＩＧＬＬ１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３／ＩＬ３Ｒα、ｃ－Ｍｅｔ、ｇｐ１００、ＭＵＣ１、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＷＴ１、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ Ａ３、ＧＰＣ３、糖脂質Ｆ７７、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、Ｂ細胞上に発現する。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、またはＣＤ２０である。
いくつかの実施形態では、標的抗原は、病原体抗原、例えば、真菌、ウイルス、または細菌抗原である。いくつかの実施形態では、真菌抗原は、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたはＣａｎｄｉｄａからのものである。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、メタ肺炎ウイルス（ｈＭＰＶ）、ライノウイルス、パラインフルエンザ（ＰＩＶ）、エプスタイン－バールウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＪＣウイルス（Ｊｏｈｎ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス）、ＢＫウイルス、ＨＩＶ、ジカウイルス、ヒトコロナウイルス、ノロウイルス、脳炎ウイルス、またはエボラからのものである。
いくつかの実施形態では、標的抗原は、細胞表面分子である。いくつかの実施形態では、細胞表面分子は、リガンドまたは受容体である。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、リガンドに由来する少なくとも１つのドメイン、または受容体の細胞外ドメインを含む、１つ以上の結合部分を含む。いくつかの実施形態では、リガンドまたは受容体は、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫＧ２Ｄ、ＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＩＬ－３、ＩＬ－１３、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＤＮＡＭ－１、及びＮＫｐ８０からなる群から選択される分子に由来する。いくつかの実施形態では、リガンドは、ＢＣＭＡに結合し得る、ＡＰＲＩＬ及び／またはＢＡＦＦに由来する。いくつかの実施形態では、受容体は、ＦｃＲであり、リガンドは、Ｆｃ含有分子である。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）である。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４Ａ）、ＦｃγＲＩＢ（ＣＤ６４Ｂ）、ＦｃγＲＩＣ（ＣＤ６４Ｃ）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）からなる群から選択される。
ヒンジ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）は、細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、一般にタンパク質の２つのドメイン間に見られるアミノ酸セグメントであり、タンパク質の可撓性及びそれらのドメインの一方または両方の互いに対する移動を許容し得る。膜貫通ドメインに対する細胞外リガンド結合ドメインのかかる可撓性及び移動を提供する任意のアミノ酸配列が、使用され得る。
ヒンジドメインは、約１０～１００個のアミノ酸、例えば、約１５～７５個のアミノ酸、２０～５０個のアミノ酸、または３０～６０個のアミノ酸のうちのいずれか１つを含有し得る。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、または９５アミノ酸長のうちのいずれか１つである。
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインである。ヒンジドメインを含むための当該技術分野で既知の任意のタンパク質のヒンジドメインは、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体での使用に適合性がある。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインの少なくとも一部分であり、ＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体に可撓性を付与する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αのヒンジドメインの一部分、例えば、ＣＤ８αのヒンジドメインの少なくとも１５個（例えば、少なくとも約２０、２５、３０、３５、または４５個のうちのいずれか）の連続アミノ酸を含む断片である。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号１２５の配列を含む。
ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体などの抗体のヒンジドメインは、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）での使用にも適合性がある。いくつかの実施形態では、機能的外因性受容体のヒンジドメインは、抗体の定常ドメインＣＨ１及びＣＨ２を接続するヒンジドメインである。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体に由来し、かつ抗体のヒンジドメイン及び抗体の１つ以上の定常領域を含む抗体を含む。いくつかの実施形態では、機能的外因性受容体のヒンジドメインは、抗体のヒンジドメイン及び抗体のＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態では、機能的外因性受容体のヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインならびに抗体のＣＨ２及びＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、機能的外因性受容体のヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域ならびにＣＨ２及びＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態では、機能的外因性受容体のヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域及びＣＨ３定常領域を含む。
非天然ペプチドは、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体のヒンジドメインとしても使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメインは、可撓性リンカー（例えば、Ｇ／Ｓリンカー）、例えば、（ＧｘＳ）ｎリンカーであり、ｘ及びｎは、独立して、３～１２の整数（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２）であり得る（配列番号１２０）。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、上の「ＣＭＳＤリンカー」及び「受容体ドメインリンカー」のサブセクションに記載される可撓性リンカーであり得、例えば、配列番号１７～３９及び１１６～１２０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒンジは、少なくとも約１０アミノ酸長、例えば、ＧＥＮＬＹＦＱＳＧＧ（配列番号１７）、ＰＰＰＹＱＰＬＧＧＧＧＳ（配列番号２１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２２）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号３２）、（ＧＧＧＳ）３（配列番号３３）、（ＧＧＧＳ）４（配列番号３４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３６）、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３７）、（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号３８）、ＧＧＧＧＧＳＧＧＲＡＳＧＧＧＧＳ（配列番号３９）、またはＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号３０）である。
膜貫通ドメイン
本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）は、細胞外リガンド結合ドメインに直接または間接的に融合され得る膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来し得る。例えば、膜貫通ドメインは、合成の非天然タンパク質セグメント、例えば、細胞膜内で熱力学的に安定である疎水性タンパク質セグメントであり得る。本明細書で使用される場合、「膜貫通ドメイン」とは、細胞膜、好ましくは、真核生物細胞膜内で熱力学的に安定である任意のタンパク質構造を指す。
膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインの三次元構造に基づいて分類される。例えば、膜貫通ドメインは、アルファヘリックス、２つ以上のアルファヘリックスの複合体、ベータ－バレル、または細胞のリン脂質二重層にまたがることができる任意の他の安定した構造を形成し得る。さらに、膜貫通ドメインは、加えて、または代替的に、膜貫通ドメインが膜を通過する回数及びタンパク質の配向を含む膜貫通ドメイントポロジーに基づいて分類され得る。例えば、単回通過膜タンパク質は、細胞膜を１回横断し、複数回通過膜タンパク質は、細胞膜を少なくとも２回（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、またはそれ以上の回数）横断する。膜タンパク質は、細胞の内外に対するそれらの末端及び膜通過セグメント（複数可）のトポロジーに応じて、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型と定義され得る。Ｉ型膜タンパク質は、膜にまたがる単一の領域を有し、タンパク質のＮ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、タンパク質のＣ末端が細胞質側に存在するように配向される。ＩＩ型膜タンパク質も膜にまたがる単一の領域を有するが、タンパク質のＣ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、タンパク質のＮ末端が細胞質側に存在するように配向される。ＩＩＩ型膜タンパク質は、膜にまたがる複数のセグメントを有し、膜貫通セグメントの数ならびにＮ末端及びＣ末端の位置に基づいてさらに下位分類され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の機能的外因性受容体の膜貫通ドメインは、Ｉ型単回通過膜タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、複数回通過膜タンパク質からの膜貫通ドメインも、本明細書に記載の機能的外因性受容体での使用に適合性があり得る。複数回通過膜タンパク質は、複合（少なくとも２、３、４、５、６、７、またはそれ以上の）アルファヘリックスまたはベータシート構造を含み得る。好ましくは、複数回通過膜タンパク質のＮ末端及びＣ末端は、脂質二重層の反対側に存在し、例えば、タンパク質のＮ末端は、脂質二重層の細胞質側に存在し、タンパク質のＣ末端は、細胞外側に存在する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ２、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（例えば、ＣＤ８α）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＬＦＡ－１（ＣＤＩＩａ、ＣＤ１８）、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＣＤＩＩａ、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、ＰＳＧＬ１、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及び／またはＮＫＧ２Ｃの任意の膜貫通ドメイン（またはその一部分）から選択される膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ－１からなる群から選択される分子に由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８に由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１２６の配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ及び膜貫通ドメインは、同じ分子、例えば、ＣＤ８αに由来する。
本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体で使用するための膜貫通ドメインはまた、合成の非天然タンパク質セグメントの少なくとも一部分も含み得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、合成の非天然アルファヘリックスまたはベータシートである。いくつかの実施形態では、タンパク質セグメントは、少なくともおよそ１８個のアミノ酸、例えば、少なくとも約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個、またはそれ以上のうちのいずれかのアミノ酸である。合成膜貫通ドメインの例は、当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許第７，０５２，９０６ Ｂ１号及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０００／０３２７７６ Ａ２号にあり、これらの関連開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体の膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインのＣ末端側に位置する膜貫通領域及び細胞質領域を含み得る。膜貫通ドメインの細胞質領域は、３つ以上のアミノ酸を含み得、いくつかの実施形態では、脂質二重層内で膜貫通ドメインを配向させる助けとなる。いくつかの実施形態では、１つ以上のシステイン残基が、膜貫通ドメインの膜貫通領域に存在する。いくつかの実施形態では、１つ以上のシステイン残基が、膜貫通ドメインの細胞質領域に存在する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインの細胞質領域は、正荷電アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインの細胞質領域は、アミノ酸、アルギニン、セリン、及びリジンを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体の膜貫通ドメインの膜貫通領域は、疎水性アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体の膜貫通ドメインは、人工の疎水性配列を含む。例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットが、膜貫通ドメインのＣ末端に存在し得る。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、主に疎水性のアミノ酸残基、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはバリンを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、疎水性である。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、ポリ－ロイシン－アラニン配列を含む。タンパク質またはタンパク質セグメントのハイドロパシーまたは疎水性もしくは親水性特徴は、当該技術分野で既知の任意の方法、例えば、Ｋｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー分析によって評価され得る。
機能的外因性受容体ドメインリンカー（「受容体ドメインリンカー」）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）の様々なドメイン、例えば、細胞外リガンド結合ドメイン、細胞外リガンド結合ドメイン及び任意のヒンジドメイン、細胞外リガンド結合ドメイン及び膜貫通ドメイン、膜貫通ドメイン及びＩＳＤ内の２つ以上の結合部分（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗原結合断片、リガンド／受容体ドメイン）は、ペプチドリンカー（以下、ＣＭＳＤ内の上記の任意のＣＭＳＤリンカーと区別するために「受容体ドメインリンカー」とも称される）を介して互いに融合され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体の様々なドメイン、例えば、細胞外リガンド結合ドメイン内の２つ以上の結合部分（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗原結合断片、リガンド／受容体ドメイン）は、いかなるペプチドリンカーもなしで互いに直接融合される。本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体の様々なドメイン、例えば、細胞外リガンド結合ドメイン内の２つ以上の結合部分（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗原結合断片、リガンド／受容体ドメイン）の間、細胞外リガンド結合ドメインと任意のヒンジドメインとの間、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間、膜貫通ドメインとＩＳＤとの間を接続する受容体ドメインペプチドリンカーは、同じであっても異なってもよい。
本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）における各受容体ドメインペプチドリンカーは、機能的外因性受容体の様々なドメインの構造的及び／または機能的特徴に応じて同じまたは異なる長さ及び／または配列を有し得る。各受容体ドメインペプチドリンカーは、独立して、選択及び最適化され得る。本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体で使用される受容体ドメインペプチドリンカー（複数可）、例えば、細胞外リガンド結合ドメイン内の２つ以上の結合部分（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗原結合断片、リガンド／受容体ドメイン）を接続するペプチドリンカーの長さ、可撓度、及び／または他の特性は、１つ以上の特定の抗原またはエピトープに対する親和性、特異性、または結合力を含むが、これらに限定されない、特性に何らかの影響を及ぼし得る。例えば、より長いペプチドリンカーは、２つの隣接するドメイン（または結合部分）が互いに立体的に妨害しないことを確実にするために選択され得る。例えば、多量体抗原に対して指向されたｓｄＡｂを含む本明細書に記載の多価及び／または多重特異性ＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）において、受容体ドメインペプチドリンカーの長さ及び可撓性は、好ましくは、各ｓｄＡｂが多量体の各サブユニット上の抗原決定基に結合することを可能にするようなものである。いくつかの実施形態では、短いペプチドリンカーは、膜貫通ドメインとＩＳＤとの間に配置され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、隣接するドメイン（または結合部分）が互いに対して自由に移動することができるように、可撓性残基（グリシン及びセリンなど）を含む。例えば、グリシン－セリンダブレットは、好適なペプチドリンカーであり得る。
受容体ドメインペプチドリンカーは、任意の好適な長さのものであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上のうちのいずれかのアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、受容体ドメインペプチドリンカーは、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５以下、またはそれ以下のうちのいずれかのアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、受容体ドメインペプチドリンカーの長さは、約１アミノ酸～約１０アミノ酸、約１アミノ酸～約２０アミノ酸、約１アミノ酸～約３０アミノ酸、約５アミノ酸～約１５アミノ酸、約１０アミノ酸～約２５アミノ酸、約５アミノ酸～約３０アミノ酸、約１０アミノ酸～約３０アミノ酸長、約３０アミノ酸～約５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１００アミノ酸、または約１アミノ酸～約１００アミノ酸のうちのいずれかである。
受容体ドメインペプチドリンカーは、天然配列、または非天然配列を有し得る。例えば、重鎖のみ抗体のヒンジ領域に由来する配列が、受容体ドメインペプチドリンカーとして使用され得る。例えば、ＷＯ１９９６／３４１０３を参照のこと。いくつかの実施形態では、受容体ドメインペプチドリンカーは、可撓性リンカーである。例示的な可撓性リンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ（配列番号１１６）、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ（配列番号１１７）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１１８）、及び（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１１９）を含み、ｎは、少なくとも１の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び当該技術分野で既知の他の可撓性リンカーが挙げられる。いくつかの実施形態では、受容体ドメインペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎリンカーであり、ｘ及びｎは、独立して、３～１２の整数（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２）であり得る（配列番号１２０）。いくつかの実施形態では、受容体ドメインペプチドリンカーは、配列番号１７～３９及び１１６～１２０のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、受容体ドメインペプチドリンカーは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
シグナルペプチド
本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）は、機能的外因性受容体ポリペプチドのＮ末端にシグナルペプチド（別名、シグナル配列）を含み得る。一般に、シグナルペプチドは、ポリペプチドを細胞内の所望の部位に標的するペプチド配列である。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、機能的外因性受容体を細胞の分泌経路に標的し、機能的外因性受容体の脂質二重層への組み込み及び繋留を可能にする。本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体での使用に適合性のある天然に存在するタンパク質のシグナル配列または合成の非天然シグナル配列を含むシグナルペプチドは、当業者に明らかであろう。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８α、ＧＭ－ＣＳＦ受容体α、及びＩｇＧ１重鎖からなる群から選択される分子に由来する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１２７の配列を含む。
ＩＴＡＭ修飾キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体は、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、すなわち、本明細書に記載のＣＭＳＤを含むＩＳＤを含むＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、本明細書に記載のＣＭＳＤのうちのいずれかを含むＩＳＤを含む。いくつかの実施形態では、（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含み、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、複数（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、互いに直接連結されている。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＩＴＡＭ含有親分子（例えば、Ｇ／Ｓリンカー）に由来しない１つ以上のリンカーによって接続されている２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの１つ以上が由来するＩＴＡＭ含有親分子とは異なる、ＩＴＡＭ含有親分子に由来する１つ以上のＣＭＳＤリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の同一のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζに由来しない。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１またはＩＴＡＭ２ではない。いくつかの実施形態では、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、各々、異なるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１２、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、及びＦｃεＲＩγのうちの１つ以上に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１及び／またはＣＤ３ζのＩＴＡＭ２を含まない。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、いかなるＣＤ３ζのＩＴＡＭも含まない。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ－１からなる群から選択される分子に由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１２６の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＳＤは、共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２（ＬＦＡ－２）、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ－１）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１６２（ＳＥＬＰＬＧ）、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴＲ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７９（ＰＤ－１）、ＣＤ３１９（ＳＬＡＭＦ７）、ＬＦＡ－１（リンパ球機能関連抗原－１）、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤＳ、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＩＰＯ－３、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ８３、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ－４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７３（ＰＤ－Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）、ＤＡＰ１０、ＴＲＩＭ、ＺＡＰ７０、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）またはＣＤ２８に由来する。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１２４の配列を含む。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＭＳＤのＮ末端である。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＭＳＤのＣ末端である。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、１つ以上の標的抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＢＣＭＡなどの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、１つ以上のｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）を含む。細胞外リガンド結合ドメイン内に１つ以上の抗原結合断片を含むＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、以下、「ＩＴＡＭ修飾抗体ベースのＣＡＲ」と称される。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、ラクダＩｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、一本鎖Ｆｖ抗体、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、ｓｄＡｂまたはｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、メソテリン、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ Ａｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、インターロイキン－１１受容体ａ（ＩＬ－１１Ｒａ）、ＰＳＣＡ、ＰＲＤＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体α、ＥＲＢ２（Ｈｅｒｂ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＮＣＡＭ、プロストラーゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、スルビビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、子宮肉腫転座ブレークポイント（ｓａｒｃｏｍａ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ）、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸管カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、及びＩＧＬＬ１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＢＣＭＡである。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、１つ以上の非抗体結合部分、例えば、ポリペプチドリガンド、または抗原に結合する操作されたタンパク質を含む（例えば、それらに本質的になる）。いくつかの実施形態では、１つ以上の非抗体結合部分は、細胞表面リガンドに由来する少なくとも１つのドメイン、または細胞表面受容体の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、１つ以上のリガンドを特異的に認識する受容体の細胞外ドメインまたはその一部分（例えば、１つ以上の受容体の１つ以上の細胞外ドメインまたはその一部分）を含む。いくつかの実施形態では、リガンド及び／または受容体は、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫＧ２Ｄ、ＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＩＬ－３、ＩＬ－１３、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＤＮＡＭ－１、及びＮＫｐ８０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、受容体は、ＢＣＭＡである。細胞外リガンド結合ドメイン内に１つ以上の受容体の１つ以上の細胞外ドメイン（またはその一部分）を含むＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、以下、「ＩＴＡＭ修飾リガンド／受容体ベースのＣＡＲ」と称される。いくつかの実施形態では、受容体は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）であり、リガンドは、Ｆｃ含有分子である。細胞外リガンド結合ドメイン内に１つ以上のＦｃＲを含むＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、以下、「ＩＴＡＭ修飾抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）」と称される。ＩＴＡＭ修飾ＡＣＴＲを発現する修飾Ｔ細胞は、Ｆｃ含有分子、例えば、標的（例えば、腫瘍）抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体（例えば、抗ＢＣＭＡ、抗ＣＤ１９、または抗ＣＤ２０全長抗体）に結合することができ、これは、修飾Ｔ細胞を腫瘍細胞に導く架橋の機能を果たす。いくつかの実施形態では、受容体は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）である。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４Ａ）、ＦｃγＲＩＢ（ＣＤ６４Ｂ）、ＦｃγＲＩＣ（ＣＤ６４Ｃ）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有親分子は、全長抗体である。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、一価（または単一特異性）であり、すなわち、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、一価（または単一特異性）である。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、多価（例えば、二価）であり、単一特異性であり、すなわち、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、多価（例えば、二価）であり、単一特異性である。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、多価（例えば、二価）であり、多重特異性（例えば、二重特異性）であり、すなわち、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、多価（例えば、二価）であり、多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）のＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメ
インをさらに含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号１２５の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲのＮ末端（すなわち、細胞外リガンド結合ドメインのＮ末端）に位置するシグナルペプチド（ＳＰ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１２７の配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲの細胞表面に移出された後に除去される。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、配列番号７６～９６、９８～１０４、及び１０６～１１３のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、本明細書に記載のＮｅｆタンパク質（例えば、野生型ＳＩＶ Ｎｅｆなどの野生型Ｎｅｆ、Ｎｅｆサブタイプ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）によって下方調節されない（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性に関連するシグナル伝達において下方調節されない）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、Ｎｅｆが存在しない場合と比較して、Ｎｅｆタンパク質によって、最大で約８０％（例えば、最大で約７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちのいずれか）下方調節される（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性に関与するシグナル伝達において下方調節される）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む同じＣＡＲ（例えば、すべて同じものを含むが、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む従来のＣＡＲ）と同じまたは同様に、Ｎｅｆタンパク質によって下方調節される（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性に関与するシグナル伝達において下方調節される）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、Ｎｅｆタンパク質によって、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む従来のＣＡＲよりも少なくとも約３％（例えば、少なくとも約４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のうちのいずれか）少なく下方調節される（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性に関与するシグナル伝達において下方調節される）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、Ｎｅｆタンパク質によって、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む同じＣＡＲ（例えば、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む従来のＣＡＲ）よりも最大で約８０％（例えば、最大で約７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちのいずれか）下方調節される（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性に関与するシグナル伝達において下方調節される）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む同じＣＡＲ（例えば、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む従来のＣＡＲ）のエフェクター機能と比較して、同じまたは同様のエフェクター機能（例えば、細胞溶解活性に関与するシグナル伝達）を有する。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む同じＣＡＲ（例えば、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む従来のＣＡＲ）のエフェクター機能と比較して、少なくとも約３％（例えば、少なくとも約４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のうちのいずれか）強力なエフェクター機能（例えば、細胞溶解活性に関与するシグナル伝達）を有する。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む同じＣＡＲ（例えば、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む従来のＣＡＲ）のエフェクター機能と比較して、最大で約８０％（例えば、最大で約７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちのいずれか）少ないエフェクター機能（例えば、細胞溶解活性に関与するシグナル伝達）を有する。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む同じＣＡＲ（例えば、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む従来のＣＡＲ）のエフェクター機能と比較して、少なくとも約２０％（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のうちのいずれか）の活性を有する。
いくつかの実施形態では、Ｎ’からＣ’まで、（ａ）１つ以上の標的抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＢＣＭＡなどの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）を含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲが提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、Ｎ’からＣ’まで、（ａ）１つ以上の標的抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＢＣＭＡなどの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）を含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）ヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｄ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲが提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、Ｎ’からＣ’まで、（ａ）１つ以上の標的抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＢＣＭＡなどの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）を含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）任意のヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｄ）共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、４－１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する）及びＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲが提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよく、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＭＳＤのＮ末端である。いくつかの実施形態では、Ｎ’からＣ’まで、（ａ）１つ以上の標的抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＢＣＭＡなどの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）を含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）任意のヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｄ）共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、４－１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する）及びＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲが提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよく、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＭＳＤのＣ末端である。いくつかの実施形態では、Ｎ’からＣ’まで、（ａ）１つ以上の標的抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＢＣＭＡなどの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する１つ以上のｓｃＦｖまたはｓｄＡｂを含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）任意のヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、４－１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する）及びＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲが提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよく、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＭＳＤのＮ末端である。いくつかの実施形態では、Ｎ’からＣ’まで、（ａ）１つ以上の標的抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＢＣＭＡなどの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する１つ以上のｓｃＦｖまたはｓｄＡｂを含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）任意のヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｄ）共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、４－１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する）及びＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲが提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよく、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＭＳＤのＣ末端である。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０９４４０８及びＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９６９３８（これらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に開示される抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂのうちのいずれかなどのＢＣＭＡと特異的に結合する１つ以上のｓｄＡｂ（すなわち、抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）は、配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）は、配列番号１２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）は、配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）は、配列番号１２９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１２４の配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１２６の配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号１２５の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲのＮ末端（すなわち、細胞外リガンド結合ドメインのＮ末端）に位置するシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１２７の配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲの細胞表面に移出された後に除去される。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメイン（またはＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ）は、一価であり、すなわち、標的（例えば、腫瘍）抗原の１つのエピトープを特異的に認識する１つの抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメイン（またはＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ）は、多価（例えば、二価）であり、多重特異性（例えば、二重特異性）であり、すなわち、標的（例えば、腫瘍）抗原の２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）のエピトープを特異的に認識する２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）の抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）を含む。いくつかの実施形態では、２つ以上のエピトープは、同じ標的（例えば、腫瘍）抗原からのものである。いくつかの実施形態では、２つ以上のエピトープは、異なる標的（例えば、腫瘍）抗原からのものである。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメイン（またはＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ）は、標的（例えば、腫瘍）抗原の同じエピトープを特異的に認識する２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）の抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）を含む、多価（例えば、二価）であり、単一特異性である。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、１つ以上の標的抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＢＣＭＡなどの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する２つ以上の抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）を含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）は、同じであり、例えば、２つ以上の同一の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂまたは抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、２つ以上の抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）は、互いに異なり、例えば、同じＢＣＭＡエピトープを特異的に認識する２つ以上の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂもしくは抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、または異なるＢＣＭＡエピトープを特異的に認識する２つ以上の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂもしくは抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原結合断片は、４鎖抗体に由来する。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原結合断片は、ラクダ抗体に由来する。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原結合断片は、ヒト抗体に由来する。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原結合断片は、ラクダＩｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、及びｓｄＡｂからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、ｓｄＡｂ（例えば、抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ）またはｓｃＦｖ（例えば、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、直接連結されるか、またはペプチドリンカーを介してのいずれかで、一緒に連結される２つ以上のｓｄＡｂ（例えば、抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ）を含む。いくつかの実施形態では、配列番号７６～９６、９８～１０４、及び１０６～１１３のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むＩＴＡＭ修飾ＣＡＲが提供される。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲである。したがって、いくつかの実施形態では、Ｎ’からＣ’まで、（ａ）ＣＤ８αシグナルペプチドと、（ｂ）抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｃ）ＣＤ８αヒンジドメインと、（ｄ）ＣＤ８α膜貫通ドメインと、（ｅ）４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインと、（ｆ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）とを含む、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲが提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、配列番号７６～９６のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲが、提供される。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲである。したがって、いくつかの実施形態では、Ｎ’からＣ’まで、（ａ）ＣＤ８αシグナルペプチドと、（ｂ）抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖを含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｃ）ＣＤ８αヒンジドメインと、（ｄ）ＣＤ８α膜貫通ドメインと、（ｅ）４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインと、（ｆ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）とを含む、ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲが提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖは、リツキシマブ（例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標））またはＬｅｕ１６などの抗ＣＤ２０抗体に由来する。いくつかの実施形態では、配列番号９８～１０４のうちのいずれかのアミノ酸配列を含
むＩＴＡＭ修飾抗ＣＤ２０ ＣＡＲが、提供される。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、本明細書に記載のＮｅｆタンパク質（例えば、野生型ＳＩＶ Ｎｅｆなどの野生型Ｎｅｆ、Ｎｅｆサブタイプ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）によって下方調節されない（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性に関連するシグナル伝達において下方調節されない）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、Ｎｅｆが存在しない場合と比較して、Ｎｅｆタンパク質によって、最大で約８０％（例えば、最大で約７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちのいずれか）下方調節される（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性に関与するシグナル伝達において下方調節される）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む同じＣＡＲ（例えば、すべて同じものを含むが、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む従来のＣＡＲ）と同じまたは同様に、Ｎｅｆタンパク質によって下方調節される（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性に関与するシグナル伝達において下方調節される）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、Ｎｅｆタンパク質によって、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む従来のＣＡＲよりも少なくとも約３％（例えば、少なくとも約４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のうちのいずれか）少なく下方調節される（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性に関与するシグナル伝達において下方調節される）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、Ｎｅｆタンパク質によって、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む同じＣＡＲ（例えば、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む従来のＣＡＲ）よりも最大で約８０％（例えば、最大で約７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちのいずれか）下方調節される（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性に関与するシグナル伝達において下方調節される）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む同じＣＡＲ（例えば、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む従来のＣＡＲ）のエフェクター機能と比較して、同じまたは同様のエフェクター機能（例えば、細胞溶解活性に関与するシグナル伝達）を有する。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む同じＣＡＲ（例えば、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む従来のＣＡＲ）のエフェクター機能と比較して、少なくとも約３％（例えば、少なくとも約４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のうちのいずれか）強力なエフェクター機能（例えば、細胞溶解活性に関与するシグナル伝達）を有する。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む同じＣＡＲ（例えば、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む従来のＣＡＲ）のエフェクター機能と比較して、最大で約８０％（例えば、最大で約７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちのいずれか）少ないエフェクター機能（例えば、細胞溶解活性に関与するシグナル伝達）を有する。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む同じＣＡＲ（例えば、ＣＤ３ζのＩＳＤを含む従来のＣＡＲ）のエフェクター機能と比較して、少なくとも約２０％（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のうちのいずれか）の活性を有する。
いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、「ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ（リガンド／受容体ベースの）ＣＡＲ」である。したがって、いくつかの実施形態では、Ｎ’からＣ’まで、（ａ）ＣＤ８αシグナルペプチドと、（ｂ）ＡＰＲＩＬ及び／またはＢＡＦＦに由来する１つ以上のドメインを含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｃ）ＣＤ８αヒンジドメインと、（ｄ）ＣＤ８α膜貫通ドメインと、（ｅ）４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインと、（ｆ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）とを含む、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ（リガンド／受容体ベースの）ＣＡＲが提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、細胞外ＡＰＲＩＬドメイン（またはその機能部分）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、細胞外ＢＡＦＦドメイン（またはその機能部分）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、細胞外ＡＰＲＩＬドメイン及び細胞外ＢＡＦＦドメイン（またはその機能部分）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、ＡＰＲＩＬ及び／またはＢＡＦＦに由来する２つ以上の細胞外ドメインを含み、これらは、互いに同一である。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、ＡＰＲＩＬ及び／またはＢＡＦＦに由来する２つ以上のドメインを含み、これらは、互いに異なる。
いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、ＩＴＡＭ修飾ＡＣＴＲである。いくつかの実施形態では、Ｎ’からＣ’まで、（ａ）ＣＤ８αシグナルペプチドと、（ｂ）ＦｃＲ（例えば、ＦｃγＲ）を含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｃ）ＣＤ８αヒンジドメインと、（ｄ）ＣＤ８α膜貫通ドメインと、（ｅ）４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインと、（ｆ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）とを含む、ＩＴＡＭ修飾ＡＣＴＲが提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４Ａ）、ＦｃγＲＩＢ（ＣＤ６４Ｂ）、ＦｃγＲＩＣ（ＣＤ６４Ｃ）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、Ｆｃ含有分子（例えば、全長抗体）を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＡＣＴＲを含む修飾Ｔ細胞は、Ｆｃ含有分子（例えば、抗ＢＣＭＡ、抗ＣＤ１９、または抗ＣＤ２０全長抗体）をさらに発現する。いくつかの実施形態では、治療に使用されるとき、ＩＴＡＭ修飾ＡＣＴＲを含む修飾Ｔ細胞は、Ｆｃ含有分子（例えば、抗ＢＣＭＡ、抗ＣＤ１９、または抗ＣＤ２０全長抗体）と組み合わせて投与される。
ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９６９３８及びＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０９４４０８（これらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載のＣＡＲを含む、当該技術分野で既知のまたは出願者によって開発された任意のＣＡＲを使用して、本明細書に記載のＩＴＡＭ修飾ＣＡＲを構築することができる、すなわち、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲのＣＭＳＤを除いた任意の構造成分を含有することができる。ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲの例示的な構造を、ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９６９３８の図１５Ａ～１５Ｄに示す（ＩＳＤは、本明細書に記載のＣＭＳＤを含むＩＳＤに交換される）。
本明細書に記載のＩＴＡＭ修飾ＣＡＲのうちのいずれかをコードする単離された核酸もまた、提供される。
ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＶＨＨ－ＶＨＨ ＣＡＲ
いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲは、ａ）ＢＣＭＡに特異的に結合する第１のｓｄＡｂ部分及びＢＣＭＡに特異的に結合する第２のｓｄＡｂ部分を含む細胞外リガンド結合ドメインと、ｂ）細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）とを含む。膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する膜貫通ドメイン）が、細胞外リガンド結合ドメインとＩＳＤとの間に存在し得る。第１のｓｄＡｂ部分及び第２のｓｄＡｂ部分は、ＢＣＭＡの同じエピトープまたは異なるエピトープに結合し得る。２つのｓｄＡｂ部分は、タンデムに配置され得、所望により、ＧＧＧＧＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含むリンカーなどのリンカー配列によって連結されていてもよい。
ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間、またはＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲのＩＳＤと膜貫通ドメインとの間に、スペーサードメインが存在し得る。スペーサードメインは、ポリペプチド鎖内の膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインまたはＩＳＤに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドであり得る。スペーサードメインは、例えば、約１０～約１００個、約５～約３０個、または約２５～約５０個のアミノ酸を含む、最大で約３００個のアミノ酸を含み得る。
膜貫通ドメインは、ＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体に関して本明細書に記載されるのと同じ膜貫通ドメインであり得、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。例示的な膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４のα、β、δ、またはγ鎖に由来し得る（すなわち、それらの少なくとも膜貫通領域（複数可）を含む）。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、例えば、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、合成であり得、その場合、それは、主にロイシン及びバリンなどの疎水性残基を含み得る。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見出され得る。いくつかの実施形態では、長さが約２～約１０（約２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のうちのいずれかなど）のアミノ酸の長さを有する短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカーは、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲの膜貫通ドメインとＩＳＤとの間の連結を形成し得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン－セリンダブレットである。
いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲのＩＳＤ内の配列のうちの１つと自然に関連する膜貫通ドメインが、使用される（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲのＩＳＤが、４－１ＢＢの共刺激配列を含む場合、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲの膜貫通ドメインは、４－１ＢＢの膜貫通ドメインに由来する）。
ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲが置かれている免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化に関与する。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」または「ＩＳＤ」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化機能を行うように指示するタンパク質の一部分を指す。通常、全ＩＳＤが用いられ得るが、多くの場合、全鎖を使用する必要はない。ＩＳＤの切断部分が使用される程度まで、かかる切断部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用され得る。したがって、「細胞内シグナル伝達配列」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分なＩＳＤの任意の切断部分を含むことを意味する。
Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲを介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの（一次シグナル伝達配列）と、抗原非依存的な方法で作用して二次または共刺激シグナルを提供するもの（共刺激シグナル伝達配列）と、の２つの異なるクラスの細胞内シグナル伝達配列によって媒介され得る。本明細書に記載のＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲは、シグナル伝達配列の一方または両方を含み得る。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達配列は、配列番号４１～７４のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むＣＭＳＤなどの本明細書に記載のＣＭＳＤのうちのいずれかを含む。
本明細書に記載の共刺激シグナル伝達配列（共刺激シグナル伝達ドメインとも称される）は、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどを含む共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインの一部分であり得る。本明細書に記載のＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体における本明細書に記載の共刺激シグナル伝達ドメインのうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＭＳＤのＮ末端である。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＭＳＤのＣ末端である。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、例えば、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）に由来する。
いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＭＳＤ及び４－１ＢＢの細胞質シグナル伝達配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する膜貫通ドメイン）との間にヒンジ配列（例えば、ＣＤ８αに由来するヒンジ配列）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ａ）ＢＣＭＡに特異的に結合する１つ以上の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含む細胞外リガンド結合ドメイン（「抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ」、例えば、「抗ＢＣＭＡ ＶＨＨ」とも称される）と、ｂ）任意のヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αヒンジ）と、ｃ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８α ＴＭドメイン）と、ｄ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲが提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。
いくつかの実施形態では、Ｎ’からＣ’まで、第１の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）、任意のリンカー、及び第２のＢＣＭＡ ｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）を含む。
いくつかの実施形態では、第１（及び／または第２）の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）は、配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第１（及び／または第２）のｓｄＡｂ部分は、配列番号１２８のアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第１（及び／または第２）のｓｄＡｂ部分は、配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）と同じＢＣＭＡエピトープに結合する。
いくつかの実施形態では、第２（及び／または第１）の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）は、配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第２（及び／または第１）のｓｄＡｂ部分は、配列番号１２９のアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第２（及び／または第１）のｓｄＡｂ部分は、配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）と同じＢＣＭＡエピトープに結合する。
いくつかの実施形態では、Ｎ’からＣ’まで、ａ）第１の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）、任意のリンカー、及び第２の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）を含む細胞外抗原結合ドメインと、ｂ）任意のヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αヒンジ）と、ｃ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８α ＴＭドメイン）と、ｄ）ＣＭＳＤを含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲが提供され、ＣＭＳＤは、配列番号４１～７４のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、第１の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ部分は、配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、第２の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ部分は、配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ’からＣ’まで、ａ）第１の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）、任意のリンカー、及び第２の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ部分（例えば、ＶＨＨ）を含む細胞外抗原結合ドメインと、ｂ）任意のヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αヒンジ）と、ｃ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８α ＴＭドメイン）と、ｄ）ＣＭＳＤを含むＩＳＤとを含む、ＢＣＭＡ ＣＡＲが提供され、ＣＭＳＤは、配列番号４１～７４のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、第１の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ部分は、配列番号１２８のアミノ酸配列を含み、第２の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ部分は、配列番号１２９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＳＤは、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）またはＣＤ２８に由来する共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、任意のリンカーは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号１２７のアミノ酸配列を含む、Ｎ末端でシグナルペプチドをさらに含む。上記のヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、受容体ドメインリンカー、シグナルペプチド、及びＣＭＳＤのうちのいずれも、本明細書に記載のＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲで使用することができる。いくつかの実施形態では、配列番号１０６～１１２のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むＩＴＡＭ修飾抗ＢＣＭＡ ＣＡＲが、提供される。
いくつかの実施形態では、配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＩＴＡＭ修飾抗ＢＣＭＡ ＣＡＲが、提供される。
共刺激シグナル伝達ドメイン
多くの免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、細胞増殖、分化、及び生存を促進し、細胞のエフェクター機能を活性化するために、抗原特異的シグナルの刺激に加えて共刺激を必要とする。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。「共刺激分子」または「共刺激タンパク質」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、増殖及び生存などであるが、これらに限定されない免疫細胞による共刺激応答を媒介する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）上の同族結合パートナーを指す。本明細書で使用される「共刺激シグナル伝達ドメイン」という用語は、細胞内のシグナル伝達を媒介して、エフェクター機能などの免疫応答を誘導するタンパク質の少なくとも一部分を指す。本明細書に記載のＩＴＡＭ修飾ＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインは、シグナルを形質導入し、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球によって媒介される応答を調節する共刺激タンパク質からの細胞質シグナル伝達ドメインであり得る。
いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲのＩＳＤは、共刺激シグナル伝達ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲのＩＳＤは、単一の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲのＩＳＤは、２つ以上（約２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のうちのいずれかなど）の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲのＩＳＤは、同じ共刺激シグナル伝達ドメインのうちの２つ以上、例えば、ＣＤ２８またはＣＤ１３７（４－１ＢＢ）の共刺激シグナル伝達ドメインの２つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲのＩＳＤは、異なる共刺激タンパク質からの２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲのＩＳＤは、本明細書に記載のＣＭＳＤ及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、４－１ＢＢに由来する）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン及びＣＭＳＤは、任意のペプチドリンカーを介して互いに融合される。ＣＭＳＤ及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の好適な順序で配置され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインとＣＭＳＤとの間に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＭＳＤのＣ末端に位置する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインの間にある。複数の共刺激シグナル伝達ドメインが、相加的または相乗的刺激効果を提供し得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメイン、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン、及び／またはＣＭＳＤは、「ＣＭＳＤリンカー」及び「受容体ドメインリンカー」サブセクションに記載される、ペプチドリンカーのうちのいずれかなどの任意のペプチドリンカーを介して接続されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１７～３９及び１１６～１２０のうちのいずれか、例えば、配列番号１７～３１のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。
宿主細胞（例えば、Ｔ細胞などの免疫細胞）内の共刺激シグナル伝達ドメインの活性化は、細胞が、サイトカインの産生及び分泌、食作用特性、増殖、分化、生存、及び／または細胞毒性を増加または減少するように誘導し得る。共刺激シグナル伝達ドメインのタイプ（複数可）は、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲが発現される免疫エフェクター細胞のタイプ（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球）、及び所望の免疫エフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ効果）などの因子に基づいて本明細書に記載のＩＴＡＭ修飾ＣＡＲで使用するために選択される。ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲで使用するための共刺激シグナル伝達ドメインの例は、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバー（例えば、Ｂ７－１／ＣＤ８０、Ｂ７－２／ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＧＩ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７－Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２／Ｂ７－ＤＣ、及びＰＤＣＤ６）、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（例えば、４－１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４－１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ－α、及びＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、ＳＬＡＭファミリーのメンバー（例えば、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ－３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６、及びＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）、ならびに任意の他の共刺激分子、例えば、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ－１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ－ＤＲ、Ｉｋａｒｏｓ、インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンα４β１、インテグリンα４β７／ＬＰＡＭ－１、ＬＡＧ－３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、デクチン－１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ－１／ＫＩＭ－１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ－４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰＲ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、及びＮＫＧ２Ｃを含むが、これらに限定されない、任意の共刺激タンパク質の細胞質シグナル伝達ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２（ＬＦＡ－２）、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ－１）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１６２（ＳＥＬＰＬＧ）、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴＲ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７９（ＰＤ－１）、ＣＤ３１９（ＳＬＡＭＦ７）、ＬＦＡ－１（リンパ球機能関連抗原－１）、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤＳ、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＩＰＯ－３、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ８３、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ－４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７３（ＰＤ－Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）、ＤＡＰ１０、ＴＲＩＭ、ＺＡＰ７０、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲのＩＳＤは、４－１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン及び本明細書に記載のＣＭＳＤを含む（例えば、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲのＩＳＤは、ＣＤ２８に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン及び本明細書に記載のＣＭＳＤを含む（例えば、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲのＩＳＤは、４－１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、及び本明細書に記載のＣＭＳＤを含む（例えば、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲのＩＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、４－１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン及びＣＭＳＤを含む（例えば、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲのＩＳＤは、Ｎ’からＣ’まで、ＣＭＳＤ、及び４－１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含む（例えば、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる）。
共刺激シグナル伝達ドメインが免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の免疫応答を調節することができるように、本明細書に記載の共刺激シグナル伝達ドメインのうちのいずれかのバリアントも本開示の範囲内である。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、野生型対応物共刺激シグナル伝達ドメインと比較して、最大約１０個のアミノ酸残基変形（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）を含む。１つ以上のアミノ酸変形を含む、かかる共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインバリアントと称され得る。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の変異は、変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比較して、シグナル伝達の増加及び免疫応答の刺激の増強をもたらし得る。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の変異は、変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比較して、シグナル伝達の減少及び免疫応答の刺激の低減をもたらし得る。
ＩＴＡＭ修飾Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）様キメラ受容体
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体は、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体である。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体は、配列番号４１～７４のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むＣＭＳＤなどの本明細書に記載のＣＭＳＤのうちのいずれかを含むＩＳＤを含む。いくつかの実施形態では、（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）任意の第１の受容体ドメインリンカーと、（ｃ）第１のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の細胞外ドメインを特異的に認識する細胞外ＴＣＲ結合ドメインと、（ｄ）任意の第２の受容体ドメインリンカーと、（ｅ）第２のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の任意の細胞外ドメインまたはその一部分と、（ｆ）第３のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、（ｇ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体が、提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよく、第１、第２、及び第３のＴＣＲサブユニットは、独立して、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＣＤ３δからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体融合ポリペプチドは、例えば、ＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε、ＴＣＲα）の細胞外ドメインを特異的に認識することによって、他の内因性ＴＣＲサブユニットとともに機能的ＴＣＲ複合体に組み込まれ、ＴＣＲ複合体に抗原特異性を付与することができる。いくつかの実施形態では、第２及び第３のＴＣＲサブユニットは、同じであり、例えば、両方ともＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、第２及び第３のＴＣＲサブユニットは、異なる。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３のＴＣＲサブユニットは、同じであり、例えば、すべてがＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲサブユニットならびに第２及び第３のＴＣＲサブユニットは、異なり、例えば、第１のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲαであり、第２及び第３のＴＣＲサブユニットは、両方ともＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３のＴＣＲサブユニットはすべて、異なる。いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３εであり、及び／または第２のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３εであり、及び／または第３のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３γであり、及び／または第２のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３γであり、及び／または第３のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３γである。いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３δであり、及び／または第２のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３δであり、及び／または第３のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３δである。いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲαであり、及び／または第２のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲαであり、及び／または第３のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲαである。いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲβであり、及び／または第２のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲβであり、及び／または第３のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲβである。いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲγであり、及び／または第２のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲγであり、及び／または第３のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲγである。いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲδであり、及び／または第２のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲδであり、及び／または第３のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲδである。いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲサブユニット及び第３のＴＣＲサブユニットは、同じである。いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲサブユニット及び第３のＴＣＲサブユニットは、異なる。いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲサブユニット及び第２のＴＣＲサブユニットは、同じである。いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲサブユニット及び第２のＴＣＲサブユニットは、異なる。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体は、第２のＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインまたはその一部分を含まない。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体は、いかなるＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインも含まない。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、細胞外ＴＣＲ結合ドメインのＮ末端である。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、細胞外ＴＣＲ結合ドメインのＣ末端である。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体は、細胞外ＴＣＲ結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメインをさらに含む（例えば、ＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインまたはその一部分がなく、細胞外ＴＣＲ結合ドメインが、細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端である場合）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体は、細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメインをさらに含む（例えば、ＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインまたはその一部分がなく、細胞外ＴＣＲ結合ドメインが、細胞外リガンド結合ドメインのＮ末端である場合）。上記の「ヒンジ」、「ＣＭＳＤリンカー」、及び「受容体ドメインリンカー」サブセクションに記載のヒンジドメイン及びリンカーのうちのいずれかが、本明細書に記載のＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体で使用され得る。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の受容体ドメインリンカーは、配列番号１７～３９及び１１６～１２０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号１２５の配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、一価及び単一特異性であり、例えば、標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のエピトープを特異的に認識する単一の抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、多価及び単一特異性であり、例えば、標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のエピトープを特異的に認識する２つ以上の抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、多価及び単一特異性であり、例えば、同一の標的（例えば、腫瘍）抗原または異なる標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）の２つ以上のエピトープを特異的に認識する２つ以上の抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体は、細胞外ＴＣＲ結合ドメイン（例えば、ＣＤ３ε）によって認識されるＴＣＲサブユニット（例えば、ＴＣＲα）の異なる細胞外ドメインを特異的に認識する第２の細胞外ＴＣＲ結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）をさらに含み、第２の細胞外ＴＣＲ結合ドメインは、細胞外ＴＣＲ結合ドメインと細胞外リガンド結合ドメインとの間に位置する。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂのうちのいずれか、またはＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０９４４０８及びＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９６９３８（これらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に開示される抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂのうちのいずれかなどのＢＣＭＡと特異的に結合する１つ以上のｓｄＡｂ（すなわち、抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、１つ以上の抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体は、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体のＮ末端に位置するシグナルペプチドをさらに含み、例えば、細胞外リガンド結合ドメインが細胞外ＴＣＲ結合ドメインのＮ末端にある場合、シグナルペプチドは、細胞外リガンド結合ドメインのＮ末端にあるか、または細胞外リガンド結合ドメインが細胞外ＴＣＲ結合ドメインのＣ末端にある場合、シグナルペプチドは、細胞外ＴＣＲ結合ドメインのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１２７の配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体の細胞表面に移出された後に除去される。いくつかの実施形態では、複数（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、互いに直接連結されている。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＩＴＡＭ含有親分子（例えば、Ｇ／Ｓリンカー）に由来しない１つ以上のリンカーによって接続されている２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの１つ以上が由来するＩＴＡＭ含有親分子とは異なる、ＩＴＡＭ含有親分子に由来する１つ以上のＣＭＳＤリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の同一のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζに由来しない。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１またはＩＴＡＭ２ではない。いくつかの実施形態では、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、各々、異なるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１２、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、及びＦｃεＲＩγのうちの１つ以上に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１及び／またはＣＤ３ζのＩＴＡＭ２を含まない。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、いかなるＣＤ３ζのＩＴＡＭも含まない。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体は、Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型ＳＩＶ Ｎｅｆなどの野生型Ｎｅｆ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）によって下方調節されない（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性に関連するシグナル伝達において下方調節されない）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体は、Ｎｅｆが存在しない場合と比較して、Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型ＳＩＶ Ｎｅ
ｆなどの野生型Ｎｅｆ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）によって、最大で約８０％（例えば、最大で約７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちのいずれか）下方調節される（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能において下方調節される）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体は、Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型ＳＩＶ Ｎｅｆなどの野生型Ｎｅｆ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）によって、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、またはＣＤ３γのＩＳＤを含むＴＡＣ様キメラ受容体よりも少なくとも約３％（例えば、少なくとも約４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のうちのいずれか）少なく下方調節される（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性に関与するシグナル伝達において下方調節される）。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態では、第２及び第３のＴＣＲサブユニットは、両方ともＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γのうちの１つ以上に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ内のリンカーは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、もしくはＣＤ３γ（例えば、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、もしくはＣＤ３γのＩＳＤの非ＩＴＡＭ配列）に由来するか、または配列番号１７～３９及び１１６～１２０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、１つのＣＤ３εのＩＴＡＭから本質的になる（例えば、それからなる）。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、少なくとも２つのＣＤ３ε ＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号４６、５６、６７、または７１のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態では、（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）任意の第１の受容体ドメインリンカーと、（ｃ）第１のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の細胞外ドメインを特異的に認識する細胞外ＴＣＲ結合ドメインと、（ｄ）任意の第２の受容体ドメインリンカーと、（ｅ）第２のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の任意の細胞外ドメインまたはその一部分と、（ｆ）第３のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、（ｇ）ＣＭＳＤを含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体が提供され、ＣＭＳＤは、ＣＤ３ζに由来する１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよく、第１、第２、及び第３のＴＣＲサブユニットはすべて、独立して、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＣＤ３δからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号４１～４４、５４、及び５５からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）任意の第１の受容体ドメインリンカーと、（ｃ）第１のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の細胞外ドメインを特異的に認識する細胞外ＴＣＲ結合ドメインと、（ｄ）任意の第２の受容体ドメインリンカーと、（ｅ）第２のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の任意の細胞外ドメインまたはその一部分と、（ｆ）第３のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、（ｇ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体が提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよく、ＩＴＡＭは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γのうちの１つ以上に由来し、第１、第２、及び第３のＴＣＲサブユニットは、独立して、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＣＤ３δからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、１つ以上（例えば、２つ、３つ、またはそれ以上）のＣＤ３ε ＩＴＡＭを含み（例えば、本質的にそれからなるか、またはそれからなり）、第２のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３εであり、及び／または第３のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、１つ以上（例えば、２つ、３つ、またはそれ以上）のＣＤ３δ ＩＴＡＭを含み（例えば、本質的にそれからなるか、またはそれからなり）、第２のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３δであり、及び／または第３のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３δである。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、１つ以上（例えば、２つ、３つ、またはそれ以上）のＣＤ３γ ＩＴＡＭを含み（例えば、本質的にそれからなるか、またはそれからなり）、第２のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３γであり、及び／または第３のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３γである。いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲサブユニットは、第２のＴＣＲサブユニット及び／または第３のＴＣＲサブユニットと同じである。いくつかの実施形態では、第２のＴＣＲサブユニット及び第３のＴＣＲサブユニットは、同じであるが、第１のＴＣＲサブユニットとは異なる。
したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ１９などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）を含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）任意の第１の受容体ドメインリンカーと、（ｃ）ＴＣＲサブユニット（例えば、ＴＣＲα）の細胞外ドメインを特異的に認識する細胞外ＴＣＲ結合ドメインと、（ｄ）任意の第２の受容体ドメインリンカーと、（ｅ）ＣＤ３εの任意の細胞外ドメインまたはその一部分と、（ｆ）ＣＤ３εの任意の細胞外ドメインまたはその一部分と、（ｇ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体が提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよく、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＣＤ３δからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、（ａ）１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ１９などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）を含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）任意の第１の受容体ドメインリンカーと、（ｃ）ＴＣＲサブユニット（例えば、ＴＣＲα）の細胞外ドメインを特異的に認識する細胞外ＴＣＲ結合ドメインと、（ｄ）任意の第２の受容体ドメインリンカーと、（ｅ）ＣＤ３εの任意の細胞外ドメインまたはその一部分と、（ｆ）ＣＤ３εの膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、（ｇ）ＣＭＳＤを含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体が提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＤ３ε ＩＴＡＭを含み、複数のＣＤ３ε ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよく、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＣＤ３δからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号４６、５６、または６７からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体は、いかなるＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインも含まない。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体は、ヒンジドメインを含む。したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ１９などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）を含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）任意の第１の受容体ドメインリンカーと、（ｃ）第１のＴＣＲサブユニット（例えば、ＴＣＲα）の細胞外ドメインを特異的に認識する細胞外ＴＣＲ結合ドメインと、（ｄ）任意の第２の受容体ドメインリンカーと、（ｅ）任意のヒンジドメインと、（ｆ）第２のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、（ｇ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体が提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよく、第１及び第２のＴＣＲサブユニットは、両方とも、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＣＤ３δからなる群から選択される。
ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体は、「ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ」である。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲは、配列番号４１～７４のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むＣＭＳＤなどの本明細書に記載のＣＭＳＤのうちのいずれかを含むＩＳＤを含む。いくつかの実施形態では、（ａ）１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）または標的抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体（例えば、ＢＣＭＡ／ＭＨＣ複合体）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する野生型ＴＣＲに由来するＶα及びＶβ（Ｖα、Ｖβ、またはその両方は、野生型ＴＣＲと比較して１つ以上のＣＤＲ内の１つ以上の変異を含む）を一緒に含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）ＴＣＲαの膜貫通ドメイン及びＴＣＲβの膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、（ｃ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１から７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲが提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、変異は、保存的アミノ酸置換などのアミノ酸置換をもたらす。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲは、野生型ＴＣＲによって結合される同じ同種ペプチド－ＭＨＣに結合する。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲは、野生型ＴＣＲによって結合されるものと比較して、より高い親和性を有する同じ同種ペプチド－ＭＨＣに結合する。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲは、野生型ＴＣＲによって結合されるものと比較して、より低い親和性を有する同じ同種ペプチド－ＭＨＣに結合する。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲは、野生型ＴＣＲと結合しない非同種ペプチド－ＭＨＣに結合する。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲは、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）である。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲは、二量体ＴＣＲ（ｄＴＣＲ）である。いくつかの実施形態では、野生型ＴＣＲは、ＨＬＡ－Ａ２と結合する。いくつかの実施形態では、複数（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、互いに直接連結されている。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＩＴＡＭ含有親分子（例えば、Ｇ／Ｓリンカー）に由来しない１つ以上のリンカーによって接続されている２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの１つ以上が由来するＩＴＡＭ含有親分子とは異なる、ＩＴＡＭ含有親分子に由来する１つ以上のＣＭＳＤリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の同一のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζに由来しない。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１またはＩＴＡＭ２ではない。いくつかの実施形態では、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、各々、異なるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１２、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、及びＦｃεＲＩγのうちの１つ以上に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１及び／またはＣＤ３ζのＩＴＡＭ２を含まない。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、いかなるＣＤ３ζのＩＴＡＭも含まない。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメインをさらに含む。上記の「ヒンジ」サブセクションに記載のヒンジドメインのうちのいずれもが、本明細書に記載のＩＴＡＭ修飾ＴＣＲで使用され得る。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号１２５の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲは、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲのＮ末端（すなわち、細胞外リガンド結合ドメインのＮ末端）に位置するシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１２７の配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲの細胞表面に移出された後に除去される。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲは、Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型ＳＩＶ Ｎｅｆなどの野生型Ｎｅｆ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）によって下方調節されない（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性に関連するシグナル伝達において下方調節されない）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲは、Ｎｅｆが存在しない場合と比較して、Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型ＳＩＶ Ｎｅｆなどの野生型Ｎｅｆ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）によって、最大で約８０％（例えば、最大で約７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちのいずれか）下方調節される（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性に関与するシグナル伝達において下方調節される）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲは、Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型ＳＩＶ Ｎｅｆなどの野生型Ｎｅｆ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）によって、内因性ＣＤ３ζで複合化された同じＴＣＲよりも少なくとも約３％（例えば、少なくとも約４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のうちのいずれか）少なく下方調節される（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性に関与するシグナル伝達において下方調節される）。
ＩＴＡＭ修飾キメラＴＣＲ（ｃＴＣＲ）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体は、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲである。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲは、配列番号４１～７４のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むＣＭＳＤなどの本明細書に記載のＣＭＳＤのうちのいずれかを含むＩＳＤを含む。いくつかの実施形態では、（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）任意の受容体ドメインリンカーと、（ｃ）第１のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の任意の細胞外ドメインまたはその一部分と、（ｄ）第２のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、（ｅ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲが提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよく、第１及び第２のＴＣＲサブユニットは、独立して、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＣＤ３δからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ融合ポリペプチドは、他の内因性ＴＣＲサブユニットとともに機能的ＴＣＲ複合体に組み込むことができ、ＴＣＲ複合体に抗原特異性を付与する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＴＣＲサブユニットは、同じであり、例えば、両方ともＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＴＣＲサブユニットは、異なり、例えば、第１のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲαであり、第２のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３εであり、及び／または第２のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３γであり、及び／または第２のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３γである。いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３δであり、及び／または第２のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３δである。いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲαであり、及び／または第２のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲαである。いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲβであり、及び／または第２のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲβである。いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲγであり、及び／または第２のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲγである。いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲδであり、及び／または第２のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲδである。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲは、第１のＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインまたはその一部分を含まない。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲは、いかなるＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインも含まない。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲは、細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメインをさらに含む（例えば、ＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインまたはその一部分が、存在しない場合）。上記の「ヒンジ」及び「受容体ドメインリンカー」サブセクションに記載のヒンジドメイン及び受容体ドメインリンカーのうちのいずれもが、本明細書に記載のＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲで使用され得る。いくつかの実施形態では、受容体ドメインリンカーは、配列番号１７～３９及び１１６～１２０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号１２５の配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、一価及び単一特異性であり、例えば、標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のエピトープを特異的に認識する単一の抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、多価及び単一特異性であり、例えば、標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のエピトープを特異的に認識する２つ以上の抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、多価及び単一特異性であり、例えば、同一の標的抗原または異なる標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）の２つ以上のエピトープを特異的に認識する２つ以上の抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、本明細書に記載の任意の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ、またはＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０９４４０８及びＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９６９３８（これらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に開示される抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂのうちのいずれかなどのＢＣＭＡと特異的に結合する１つ以上のｓｄＡｂ（すなわち、抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、１つ以上の抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲは、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲのＮ末端に位置するシグナルペプチドをさらに含み、例えば、シングルペプチドは、細胞外リガンド結合ドメインのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１２７の配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲの細胞表面に移出された後に除去される。いくつかの実施形態では、複数（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、互いに直接連結されている。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＩＴＡＭ含有親分子（例えば、Ｇ／Ｓリンカー）に由来しない１つ以上のリンカーによって接続されている２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの１つ以上が由来するＩＴＡＭ含有親分子とは異なる、ＩＴＡＭ含有親分子に由来する１つ以上のＣＭＳＤリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の同一のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζに由来しない。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１またはＩＴＡＭ２ではない。いくつかの実施形態では、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、各々、異なるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する。いくつかの実施形態では、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１２、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、及びＦｃεＲＩγのうちの１つ以上に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１及び／またはＣＤ３ζのＩＴＡＭ２を含まない。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、いかなるＣＤ３ζのＩＴＡＭも含まない。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲは、Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型ＳＩＶ Ｎｅｆなどの野生型Ｎｅｆ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）によって下方調節されない（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性に関連するシグナル伝達において下方調節されない）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲは、Ｎｅｆが存在しない場合と比較して、Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型ＳＩＶ Ｎｅｆなどの野生型Ｎｅｆ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）によって、最大で約８０％（例えば、最大で約７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちのいずれか）下方調節される（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性に関与するシグナル伝達において下方調節される）。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲは、Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型ＳＩＶ Ｎｅｆなどの野生型Ｎｅｆ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）によって、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、またはＣＤ３γのＩＳＤを含む同じｃＴＣＲよりも少なくとも約３％（例えば、少なくとも約４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のうちのいずれか）少なく下方調節される（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能において下方調節される）。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＴＣＲサブユニットは、両方ともＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γのうちの１つ以上に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ内のリンカーは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、もしくはＣＤ３γ（例えば、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、もしくはＣＤ３γのＩＳＤの非ＩＴＡＭ配列）に由来するか、または配列番号１７～３９及び１１６～１２０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、１つのＣＤ３εのＩＴＡＭから本質的になる（例えば、それからなる）。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、少なくとも２つのＣＤ３ε ＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号４６、５６、６７、または７１のうちのいずれかの配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭは、ＣＤ３ζに由来する。したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）任意の受容体ドメインリンカーと、（ｃ）第１のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の任意の細胞外ドメインまたはその一部分と、（ｄ）第２のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、（ｅ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲが提供され、ＣＭＳＤは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されるＣＤ３ζに由来する複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含んでいてもよく、第１及び第２のＴＣＲサブユニットは、独立して、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＣＤ３δからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号４１～４４、５４、及び５５からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）任意の受容体ドメインリンカーと、（ｃ）第１のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の任意の細胞外ドメインまたはその一部分と、（ｄ）第２のＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、（ｅ）ＣＭＳＤを含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲが提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよく、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＣＤ３δのうちの１つ以上に由来し、第１及び第２のＴＣＲサブユニットは、独立して、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＣＤ３δからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、１つ以上（例えば、２つ、３つ、またはそれ以上）のＣＤ３ε ＩＴＡＭを含み（例えば、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり）、第１のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３εであり、及び／または第２のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、１つ以上（例えば、２つ、３つ、またはそれ以上）のＣＤ３δ ＩＴＡＭを含み（例えば、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり）、第１のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３δであり、及び／または第２のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３δである。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、１つ以上（例えば、２つ、３つ、またはそれ以上）のＣＤ３γ ＩＴＡＭを含み（例えば、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり）、第１のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３γであり、及び／または第２のＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３γである。いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲサブユニットは、第２のＴＣＲサブユニットと同じである。いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲサブユニットは、第２のＴＣＲサブユニットとは異なる。
したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ１９などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）を含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）任意の第１の受容体ドメインリンカーと、（ｃ）ＣＤ３εの任意の細胞外ドメインまたはその一部分と、（ｄ）ＣＤ３εの膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、（ｅ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲが提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、（ａ）１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ１９などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）を含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）任意の第１の受容体ドメインリンカーと、（ｃ）ＣＤ３εの任意の細胞外ドメインまたはその一部分と、（ｄ）ＣＤ３εの膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、（ｅ）ＣＭＳＤを含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲが提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＤ３ε ＩＴＡＭを含み、複数のＣＤ３ε ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤは、配列番号４６、５６、または６７の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲは、いかなるＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインも含まない。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲは、ヒンジドメインを含む。したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ１９などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）を含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）任意の受容体ドメインリンカーと、（ｃ）任意のヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｄ）ＴＣＲサブユニット（例えば、ＣＤ３ε）の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、（ｅ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体が提供され、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよく、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＣＤ３δからなる群から選択される。
ＩＶ．Ｎｅｆ（陰性調節因子）タンパク質
本明細書に記載のＮｅｆタンパク質は、野生型ＳＩＶ Ｎｅｆなどの野生型Ｎｅｆ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆであり得る。ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／０９７９６９及びＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０９７２３５（これらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるような、Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型Ｎｅｆ、Ｎｅｆサブタイプ、非天然変異体Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）、それらをコードする核酸、その核酸を含むベクター（例えば、ウイルスベクター）、外因性Ｎｅｆタンパク質を発現するかまたはそれらをコードする核酸（もしくはベクター）を含む修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系Ｔ細胞）のうちのいずれもすべて、本発明で使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体を含む修飾Ｔ細胞は、外因性Ｎｅｆタンパク質（「Ｎｅｆ含有ＩＴＡＭ修飾Ｔ細胞」または「ＧｖＨＤが最小限のＩＴＡＭ修飾Ｔ細胞」とも称される）をさらに発現し得る。
野生型Ｎｅｆは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２）ならびにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含む、霊長類レンチウイルスによってコードされる、２７～３５ｋＤａの小さなミリストイル化タンパク質である。Ｎｅｆは、主に細胞質に局在するが、原形質膜にも部分的に動員される。これは、宿主の細胞機構を操作して、病原体の感染、生存、または複製を可能にする、毒性因子として機能する。
Ｎｅｆは、すべての霊長類レンチウイルスにおいて高度に保存されている。ＨＩＶ－２及びＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質は、ＨＩＶ－１ Ｎｅｆよりも１０～６０アミノ酸長い。Ｎｅｆタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、以下のドメインを含む：ミリストイル化部位（ＣＤ４の下方調節、ＭＨＣ Ｉの下方調節、及びシグナル伝達分子との会合に関与し、Ｎｅｆ及びビリオン組み込みの内膜標的化に必要であり、それによって感染性に関与する）、Ｎ末端αヘリックス（ＭＨＣ Ｉの下方調節及びプロテインキナーゼ動員に関与する）、チロシンベースＡＰ動員（ＨＩＶ－２／ＳＩＶ Ｎｅｆ）、ＣＤ４結合部位（ＷＬ残基、ＣＤ４の下方調節に関与し、ＨＩＶ－１ Ｎｅｆについて特徴付けられる）、酸性クラスター（ＭＨＣ Ｉの下方調節、宿主ＰＡＣＳ １及びＰＡＣＳ２との相互作用に関与する）、プロリピリンベースリピート（ＭＨＣ Ｉの下方調節及びＳＨ３結合に関与する）、ＰＡＫ（ｐ２１活性化キナーゼ）結合ドメイン（シグナル伝達分子及びＣＤ４の下方調節との会合に関与する）、ＣＯＰ Ｉ動員ドメイン（ ＣＤ４の下方調節に関与する）、ジルシンベースＡＰ動員ドメイン（ＣＤ４の下方調節、ＨＩＶ－１ Ｎｅｆに関与する）、ならびにＶ－ＡＴＰａｓｅ及びＲａｆ－１結合ドメイン（ＣＤ４の下方調節及びシグナル伝達分子との会合に関与する）。
ＣＤ４は、５５ｋＤａのＩ型一体型細胞表面糖タンパク質である。ヘルパー／誘導性Ｔリンパ球などのＭＨＣクラスＩＩ制限細胞及びマクロファージ／単球系統の細胞上のＴＣＲの成分である。これはＨＩＶ及びＳＩＶの一次細胞受容体として機能する。ＣＤ４は、ＴＣＲの共受容体であり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と連通してＴＣＲを支援し、ＴＣＲ細胞内シグナル伝達を誘発する。
ＣＤ２８は、Ｔ細胞上で発現し、Ｔ細胞の活性化及び生存に必要な共刺激シグナルを提供する。ＴＣＲ及びＣＤ２８を介したＴ細胞刺激は、ＩＬ－６などのサイトカイン産生を引き起こすことができる。ＣＤ２８は、ＡＰＣで発現されるＣＤ８０（Ｂ７．１）及びＣＤ８６（Ｂ７．２）タンパク質の受容体である。
主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩは、赤血球を除くすべての細胞で発現される。これはキラーＴ細胞または細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）にエピトープを提示する。ＣＴＬのＴＣＲが、ＣＴＬのＣＤ８受容体を介してドッキングされるＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるエピトープを認識する場合、ＣＴＬは、細胞がアポトーシスによってプログラムされた細胞死を受けるように引き起こす。したがって、本明細書に記載の修飾Ｔ細胞上に発現するＭＨＣクラスＩ分子を下方調節（例えば、発現及び／または機能を下方調節）し、組織不適合性個体におけるＧｖＨＤ応答を低減／回避することが好ましい。
いくつかの実施形態では、Ｎｅｆタンパク質は、ＳＩＶ Ｎｅｆ、ＨＩＶ１ Ｎｅｆ、ＨＩＶ２ Ｎｅｆ、及びＮｅｆサブタイプからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｎｅｆタンパク質は、野生型Ｎｅｆである。いくつかの実施形態では、Ｎｅｆサブタイプは、ＨＩＶ Ｆ２－Ｎｅｆ、ＨＩＶ Ｃ２－Ｎｅｆ、またはＨＩＶ ＨＶ２ＮＺ－Ｎｅｆである。いくつかの実施形態では、Ｎｅｆサブタイプは、ＳＩＶ Ｎｅｆサブタイプである。
いくつかの実施形態では、Ｎｅｆタンパク質は、一次ＨＩＶ－１サブタイプＣインディアン単離物から得られるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、Ｎｅｆタンパク質は、全長タンパク質（ＨＩＶ Ｆ２－Ｎｅｆ）をコードするインディアン単離物のＦ２対立遺伝子から発現される。いくつかの実施形態では、Ｎｅｆタンパク質は、ＣＤ４結合部位、酸性クラスター、プロリンベースのリピート、及びＰＡＫ結合ドメイン（ＨＩＶ Ｃ２－Ｎｅｆ）のインフレーム欠失を伴う、インディアン単離物のＣ２対立遺伝子から発現される。いくつかの実施形態では、Ｎｅｆタンパク質は、ＣＤ４結合部位（ＨＩＶ Ｄ２－Ｎｅｆ）のインフレーム欠失を伴う、インディアン単離物のＤ２対立遺伝子から発現される。
いくつかの実施形態では、Ｎｅｆタンパク質は、変異体Ｎｅｆ、例えば、挿入、欠失、点変異体（複数可）、及び／または再配列のうちの１つ以上を含むＮｅｆタンパク質である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の変異体Ｎｅｆは、Ｔ細胞内で発現した場合に、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）を下方調節しない（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能を下方調節しない）非天然変異体Ｎｅｆなどの非天然変異体Ｎｅｆである。いくつかの実施形態では、変異体Ｎｅｆ（例えば、非天然変異体Ｎｅｆ）は、Ｔ細胞で発現した場合に、野生型Ｎｅｆと比較して、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体の下方調節を生じないか、またはそれのより少ない下方調節をもたらす。変異体Ｎｅｆは、ミリストイル化部位、Ｎ末端αヘリックス、チロシンベースのＡＰ動員、ＣＤ４結合部位、酸性クラスター、プロリンベースのリピート、ＰＡＫ結合ドメイン、ＣＯＰ Ｉ動員ドメイン、ジロイシンベースのＡＰ動員ドメイン、Ｖ－ＡＴＰａｓｅ、及びＲａｆ－１結合ドメイン、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のドメインまたはモチーフ内の１つ以上の変異（例えば、非天然変異）を含み得る。いくつかの実施形態では、変異体Ｎｅｆは、配列番号１２１または１２２の配列を含む変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体ＳＩＶ Ｎｅｆである。
Ｖ．ベクター
本出願は、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）のうちのいずれかをクローニングし、発現するためのベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳類細胞などの真核生物細胞における複製及び組み込みに好適である。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、及びそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ならびに他のウイルス学及び分子生物学手引き書に記載されている。
いくつかのウイルスベースの系が、哺乳類細胞への遺伝子導入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系に好都合なプラットフォームを提供する。異種核酸は、ベクターに挿入され、当該技術分野で既知の技術を使用してレトロウイルス粒子内にパッケージングされ得る。その後、組換えウイルスは、単離され、操作された哺乳類細胞にインビトロまたはエクスビボ送達され得る。いくつかのレトロウイルス系が当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。いくつかのアデノウイルスベクターが当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。いくつかの実施形態では、自己不活性化レンチウイルスベクターが使用される。例えば、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）をコードする自己不活性化レンチウイルスベクターが、当該技術分野で既知のプロトコルを有するレンチウイルスにパッケージングされ得る。結果として生じるレンチウイルスベクターは、当該技術分野で既知の方法を使用して哺乳類細胞（初代ヒトＴ細胞など）を形質導入するために使用され得る。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、それらが導入遺伝子の長期の安定した組み込み及び子孫細胞におけるその繁殖を可能にするため、長期遺伝子導入を達成するのに好適なツールである。レンチウイルスベクターは、低免疫原性も有し、非増殖細胞を形質導入することができる。
いくつかの実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、トランスポゾン、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系、またはＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系である。いくつかの実施形態では、ベクターは、例えば、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）及びポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、及びデンドリマーを含む、ポリマーに基づく非ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、陽イオン性脂質に基づく非ウイルスベクター、例えば、陽イオン性リポソーム、脂質ナノエマルション、及び固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）である。いくつかの実施形態では、ベクターは、ペプチドに基づく遺伝子非ウイルスベクター、例えば、ポリ－Ｌ－リジンである。ゲノム編集に好適な既知の非ウイルスベクターのうちのいずれも、ＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）をコードする核酸を免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、例えば、修飾Ｔ細胞、同種異系Ｔ細胞、またはＣＴＬ）に導入するために使用され得る。例えば、Ｙｉｎ Ｈ． ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１４） １５：５２１－５５５、Ａｒｏｎｏｖｉｃｈ ＥＬ ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｓｙｓｔｅｍ：ａ ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．（２０１１）Ｒ１：Ｒ１４－２０、及びＺｈａｏ Ｓ．ｅｔ ａｌ．“ＰｉｇｇｙＢａｃ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｔｈｅ ｔｏｏｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．”Ｔｒａｎｓｌ．Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１６）５（１）：１２０－１２５を参照されたく、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）をコードする核酸のうちのいずれかの１つ以上を、エレクトロポレーション、ソノポレーション、フォトポレーション、マグネトフェクション、ハイドロポレーションを含むが、これらに限定されない、物理的方法によって、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、例えば、修飾Ｔ細胞、同種異系Ｔ細胞、またはＣＴＬ）に導入する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）をコードする核酸のうちのいずれか１つを含むベクター（例えば、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクター）が、提供される。いくつかの実施形態では、機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）をコードする核酸を含むベクター（例えば、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクター）が提供され、機能的外因性受容体は、（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（例えば、１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含み、ＣＭＳＤは、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。核酸は、当該技術分野で既知の任意の分子クローニング法を使用して、例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位及び１つ以上の選択可能なマーカーを使用して、ベクターにクローニングされ得る。いくつかの実施形態では、核酸は、プロモーター（例えば、ｈＥＦ１αプロモーター）に操作可能に連結される。様々なプロモーターが哺乳類細胞での遺伝子発現について調査されており、当該技術分野で既知のプロモーターのうちのいずれかが本発明で使用され得る。プロモーターは、構成的プロモーターまたは制御プロモーター、例えば、誘導性プロモーターとして大まかに分類され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のベクター（例えば、ウイルスベクター）は、本明細書に記載の外因性Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型、サブタイプ、もしくは変異体Ｎｅｆ）をコードする第２の核酸、または内因性遺伝子座（例えば、ＴＣＲもしくはＢ２Ｍ）発現のノックダウン（例えば、ｓｉＲＮＡ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、もしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を介して）については第２の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の核酸及びＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体をコードする核酸は、各々、プロモーター（例えば、ｈＥＦ１αまたはＰＧＫプロモーター）に操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、第２の核酸及びＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体をコードする核酸は、プロモーター（例えば、ｈＥＦ１αプロモーター）に操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体をコードする第１の核酸及び第２の核酸は、１つ以上の連結配列、例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、ＢｍＣＰＶ ２Ａ、ＢｍＩＦＶ ２Ａ、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＧＳ）ｎのうちのいずれかをコードする核酸の連結配列、またはＩＲＥＳ、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、及びＣＡＧＧのうちのいずれかの核酸の連結配列、またはそれらの任意の組み合わせによって接続されており、ｎは、少なくとも１の整数である。いくつかの実施形態では、連結配列は、ＩＲＥＳ（例えば、配列番号１２３の核酸配列を含む）である。
プロモーター
いくつかの実施形態では、プロモーターは、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター（例えば、ＰＧＫ－１プロモーター）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期（ＩＥ）遺伝子プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ１－α）プロモーター、ユビキチン－Ｃ（ＵＢＱ－Ｃ）プロモーター、サイトメガロウイルスＣＭＶ）エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＭＣ１）プロモーター、βアクチン（β－ＡＣＴ）プロモーター、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、欠失した陰性対照領域、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、ＴＥＴＯＮ（登録商標）プロモーター、及びＮＦκＢプロモーターからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、もしくはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）、及び／または外因性Ｎｅｆタンパク質をコードする核酸は、構成的プロモーターに操作可能に連結される。構成的プロモーターは、異種遺伝子（導入遺伝子とも称される）を宿主細胞で構成的に発現させる。本明細書で企図される例示的な構成的プロモーターとしては、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ ＩＥ）、ヒト伸長因子－１α（ｈＥＦ１α）、ユビキチンＣプロモーター（ＵｂｉＣ）、ホスホグリセロキナーゼプロモーター（ＰＧＫ）、サルウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）、ニワトリβ－アクチン（ＲＳＶ）プロモーター、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＭＣ１）プロモーター、βアクチン（β－ＡＣＴ）プロモーター、「骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、欠失した陰性対照領域、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）」プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。導入遺伝子発現の駆動におけるかかる構成的プロモーターの効率は、多数の研究において広く比較されている。例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃ．Ｍｉｌｏｎｅらは、初代ヒトＴ細胞でのＣＡＲ発現を駆動するためのＣＭＶ、ｈＥＦ１α、ＵｂｉＣ、及びＰＧＫの効率を比較し、ｈＥＦ１αプロモーターが、最も高いレベルの導入遺伝子発現を誘導しただけでなく、ＣＤ４及びＣＤ８ヒトＴ細胞で最適に維持されたという結論を下した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（８）：１４５３－１４６４（２００９））。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、もしくはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）、及び／または外因性Ｎｅｆタンパク質をコードする核酸は、ｈＥＦ１αプロモーターまたはＰＧＫプロモーターに操作可能に連結される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、もしくはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）、及び／または外因性Ｎｅｆタンパク質をコードする核酸は、誘導性プロモーターに操作可能に連結される。誘導性プロモーターは、制御プロモーターのカテゴリーに属する。誘導性プロモーターは、物理的条件、操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の微環境、または操作された免疫エフェクター細胞、誘導因子（すなわち、誘導剤）、もしくはそれらの組み合わせの生理学的状態などの１つ以上の条件によって誘導され得る。いくつかの実施形態では、誘導条件は、操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）及び／または薬学的組成物を受ける対象における内在性遺伝子の発現を誘導しない。いくつかの実施形態では、誘導条件は、誘導因子、放射線照射（イオン化放射、光など）、温度（熱など）、レドックス状態、腫瘍環境、及び操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化状態からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、ＮＦＡＴプロモーター、ＴＥＴＯＮ（登録商標）プロモーター、またはＮＦκＢプロモーターであり得る。
いくつかの実施形態では、ベクターはまた、ベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を介してトランスフェクトされた宿主細胞の集団から本明細書に記載の、ＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、もしくはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）及び／または外因性Ｎｅｆタンパク質を発現する細胞を選択するために、選択可能なマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子も含有する。選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子はいずれも適切な制御配列と隣接して、宿主細胞での発現を可能にし得る。例えば、ベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、及び核酸配列の発現の制御に有用なプロモーターを含有し得る。
ＶＩ．修飾Ｔ細胞を製造する方法
本発明の一態様は、上記の修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）、例えば、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体を発現する修飾Ｔ細胞（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体、本明細書では「ＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体Ｔ細胞」または「ＩＴＡＭ修飾機能的外因性受容体Ｔ細胞」とも称される）のうちのいずれか１つを製造する方法を提供する。かかるＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体Ｔ細胞は、本明細書に記載の外因性Ｎｅｆタンパク質（本明細書では、「Ｎｅｆ含有ＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体Ｔ細胞」または「Ｎｅｆ含有ＩＴＡＭ修飾機能的外因性受容体Ｔ細胞」とも称される）を発現するように修飾され得る。外因性Ｎｅｆタンパク質をコードする核酸は、本明細書に記載のＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体のうちのいずれかをコードする核酸をＴ細胞に導入するのと同時に（例えば、別々のベクターを介して、または同じベクターを介して）、その前に、またはその後に、Ｔ細胞に導入され得る。いくつかの実施形態では、Ｎｅｆ含有ＩＴＡＭ修飾機能的外因性受容体Ｔ細胞は、修飾Ｔ細胞が由来する前駆体Ｔ細胞のドナーから単離された初代Ｔ細胞によって誘発されるか、またはＮｅｆ発現することなく同じドナー源からＩＴＡＭ修飾機能的外因性受容体Ｔ細胞によって誘発されるＧｖＨＤ応答と比較して、組織不適合性個体において、ＧｖＨＤ応答を誘発しないか、または低減させる（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のうちのいずれか低減させる）。以下の説明は、ＩＴＡＭ修飾機能的外因性受容体Ｔ細胞を製造する方法に焦点を合わせるが、かかる方法が、当該修飾Ｔ細胞内の外因性Ｎｅｆタンパク質をさらに発現するために使用及び／または修飾され得ることが考えられる。
本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体を発現する修飾Ｔ細胞を製造する方法は、概して、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体をコードする核酸を担持するベクター（例えば、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクター）を天然または操作されたＴ細胞（本明細書では「前駆Ｔ細胞」と称される）に導入することを含む。本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体を発現する修飾Ｔ細胞を製造する方法は、概して、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体をコードする核酸を前駆Ｔ細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、前駆体Ｔ細胞の集団が、本明細書に記載の修飾Ｔ細胞の産生のために使用される場合、本方法は、１つ以上の単離及び／または富化ステップ、例えば、ＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体を発現するように修飾されたＴ細胞からのＩＴＡＭ修飾機能的外因性受容体陽性Ｔ細胞（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ陽性、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ陽性、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ陽性、もしくはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体陽性）Ｔ細胞を１つ以上の単離及び／または濃縮するステップことも含む。そのような単離及び／または富化ステップは、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）などの当該技術分野における任意の既知の技術を使用して実行され得る。簡単に説明すれば、形質導入／トランスフェクトされた細胞懸濁液を、室温で遠心分離し、上清を廃棄した。細胞をＤＰＢＳで再懸濁し、次いでＭＡＣＳｅｌｅｃｔ ＬＮＧＦＲ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０－０９１－３３０）で補充し、磁気標識のために氷上で１５分間インキュベートした。インキュベート後、ＰＢＥ緩衝液（リン酸ナトリウム／ＥＤＴＡ）を添加して、体積を調整した。次いで、細胞懸濁液を、ＭＡＣＳキットプロトコルに従って磁気分離及び富化に供した。実施例も参照のこと。いくつかの実施形態では、修飾Ｔ細胞が、外因性Ｎｅｆタンパク質をさらに発現する場合、本方法は、外因性Ｎｅｆタンパク質を発現するように修飾されたＴ細胞からＮｅｆ陽性、ＣＤ３ε／γ／δ陰性、ＴＣＲα／β陰性、ＭＨＣ Ｉ陰性、ＣＤ４陽性、及び／またはＣＤ２８陽性Ｔ細胞を単離及び／または濃縮することをさらに含み得る。Ｔ細胞が、外因性Ｎｅｆタンパク質を発現するように修飾され、上述のマーカーのために単離及び／または富化され、次いでＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体をさらに発現するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、前駆体Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ、またはリンパ系器官に由来する。いくつかの実施形態では、前駆体Ｔ細胞は、先天性または適応性免疫の細胞などの免疫系の細胞である。いくつかの態様では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、前駆体Ｔ細胞は、細胞株、例えば、Ｔ細胞株に由来する。細胞は、いくつかの実施形態では、異種源、例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはブタから得られる。
いくつかの実施形態では、前駆体Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８－、ＣＤ４－／ＣＤ８＋、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋、ＣＤ４－／ＣＤ８－、またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。いくつかの実施形態では、前駆体Ｔ細胞は、修飾Ｔ細胞、例えば、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体を発現する修飾Ｔ細胞、外因性Ｎｅｆタンパク質を発現する修飾Ｔ細胞、または内因性ＴＣＲもしくはＢ２Ｍ遺伝子座（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ系を介して）を有するＴ細胞である。いくつかの実施形態では、前駆体Ｔ細胞は、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体の発現及び標的細胞（例えば、ＢＣＭＡ＋またはＣＤ２０＋腫瘍細胞）への結合時に、ＩＬ－２、ＴＦＮ、及び／またはＴＮＦを産生する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体の発現及び標的細胞への結合時に、抗原特異的な標的細胞（例えば、ＢＣＭＡ＋またはＣＤ２０＋腫瘍細胞）を溶解する。
いくつかの実施形態では、修飾されるＴ細胞は、造血幹細胞、多能性幹細胞、ｉＰＳ、または胚幹細胞などの幹細胞から分化される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）は、本明細書に記載の核酸のうちのいずれか１つまたはベクター（例えば、非ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクター）のうちのいずれか１つを形質導入／トランスフェクトすることによってＴ細胞に導入される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体は、タンパク質を細胞膜に挿入しながら、細胞をＣＥＬＬ ＳＱＵＥＥＺＥ（登録商標）などのマイクロ流体系に通過させることによってＴ細胞に導入される（例えば、米国特許出願公開第２０１４０２８７５０９号を参照のこと）。
ベクター（例えば、ウイルスベクター）または単離された核酸を哺乳類細胞に導入する方法が、当該技術分野で既知である。本明細書に記載のベクターは、物理的、化学的、または生物学的方法によってＴ細胞に移入され得る。
ベクター（例えば、ウイルスベクター）をＴ細胞に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝突、微量注入法、電気穿孔法などが挙げられる。ベクター及び／または外因性核酸を含む細胞を産生するための方法が、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。いくつかの実施形態では、ベクター（例えば、ウイルスベクター）は、電気穿孔法によって細胞に導入される。
ベクターをＴ細胞に導入するための生物学的方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクターは、遺伝子を哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞に挿入するための最も広く使用されている方法である。
ベクター（例えば、ウイルスベクター）をＴ細胞に導入するための化学的手段には、コロイド分散系、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質に基づく系が含まれる。インビトロで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）は、従来の方法（例えば、インビトロ転写）によって調製され、次いで、ｍＲＮＡエレクトロポレーションなどの既知の方法を介してＴ細胞に導入され得る。例えば、Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：１０２７－１０３５を参照のこと。
いくつかの実施形態では、形質導入／トランスフェクトされたＴ細胞は、ベクターまたは単離された核酸の導入後にエクスビボで繁殖する。いくつかの実施形態では、形質導入／トランスフェクトされたＴ細胞は、培養されて、少なくとも約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１０日間、１２日間、または１４日間のうちのいずれかにわたって繁殖する。いくつかの実施形態では、形質導入／トランスフェクトされたＴ細胞は、さらに評価またはスクリーニングされて、所望の操作された哺乳類細胞、例えば、本明細書に記載の修飾Ｔ細胞を選択する。
レポーター遺伝子が、トランスフェクト／形質導入された可能性のある細胞を特定し、制御配列の機能性を評価するために使用され得る。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物もしくは組織に存在せず、またはそれによって発現されず、発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により明らかになるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡ／ＲＮＡがレシピエント細胞に導入された後の好適な時点でアッセイされる。好適なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリ性ホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子をコードする遺伝子を含み得る（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２（２０００））。好適な発現系が周知であり、既知の技法を使用して調製されるか、または商業的に入手され得る。
修飾Ｔ細胞内の本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）のうちのいずれかをコードする核酸の存在を確認するための他の方法としては、例えば、サザンブロット法及びノーザンブロット法、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲなどの当業者に周知の分子生物学的アッセイ、例えば、免疫学的方法（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット法など）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、または磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）による特定のペプチドの存在または不在の検出などの生化学的アッセイが挙げられる（実施例のセクションも参照のこと）。
したがって、いくつかの実施形態では、機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）をコードする核酸を前駆体Ｔ細胞に導入することを含む、修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系Ｔ細胞、内因性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞、またはＧｖＨＤが最小限のＴ細胞、または自己Ｔ細胞）を製造する方法が、提供され、機能的外因性受容体は、（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含み、ＣＭＳＤが、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい。いくつかの実施形態では、配列番号７６～９６、９８～１０４、及び１０６～１１３のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むＩＴＡＭ修飾ＣＡＲなどの本明細書に記載のＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体のうちのいずれかをコードする核酸を前駆体Ｔ細胞に導入することを含む、修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）を製造する方法が、提供される。いくつかの実施形態では、修飾Ｔ細胞は、配列番号１２１、１２２、１３６、または１３９のアミノ酸配列を含む外因性Ｎｅｆタンパク質などの外因性Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型、サブタイプ、または変異体Ｎｅｆ）をさらに発現する。
いくつかの実施形態では、修飾Ｔ細胞は、非修飾内因性ＴＣＲ及び／またはＢ２Ｍ遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、修飾Ｔ細胞は、修飾ＴＣＲαまたはＴＣＲβ遺伝子座などの修飾内因性ＴＣＲ遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、修飾Ｔ細胞は、修飾内因性Ｂ２Ｍ遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、内因性ＴＣＲ（またはＢ２Ｍ）遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、及びＺＦＮから選択される遺伝子編集システムによって修飾される。
いくつかの実施形態では、本方法は、核酸を含むＴ細胞を単離及び／または濃縮することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体を発現する修飾Ｔ細胞からＩＴＡＭ修飾機能的外因性受容体陽性のＴ細胞を単離及び／または濃縮することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体を発現する修飾Ｔ細胞からＣＤ３ε／γ／δ陰性、ＴＣＲα／β陰性、ＭＨＣ Ｉ陰性、ＣＤ４陽性、及び／またはＣＤ２８陽性Ｔ細胞を単離及び／または濃縮することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、修飾Ｔ細胞（例えば、外因性Ｎｅｆ及びＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体を共発現する）は、修飾Ｔ細胞が由来する前駆体Ｔ細胞のドナーから単離された初代Ｔ細胞によって誘発されるＧｖＨＤ応答と比較して、組織不適合性個体において、ＧｖＨＤ応答を誘発しないか、または低減させる（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のうちのいずれか低減させる）。いくつかの実施形態では、本方法は、修飾Ｔ細胞（機能的外因性受容体及び／または外因性Ｎｅｆを発現する）を少なくとも１つの薬学的に許容される担体とともに製剤化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、個体（例えば、ヒト）に、有効量の本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、もしくはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）及び／または外因性Ｎｅｆタンパク質を発現する修飾Ｔ細胞、あるいは有効量のその薬学的製剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、個体（例えば、ヒト）に、有効量の本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、もしくはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）及び／または外因性Ｎｅｆタンパク質を発現する修飾Ｔ細胞、あるいは有効量のその薬学的製剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、個体は、がんを有する。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、個体は、修飾Ｔ細胞が由来する前駆体Ｔ細胞のドナーに対して組織不適合である。
Ｔ細胞源、細胞調製、及び培養
Ｔ細胞（例えば、前駆体Ｔ細胞）の増殖及び遺伝子修飾前に、Ｔ細胞源が、個体から得られる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含むいくつかの源から得られ得る。いくつかの実施形態では、当該技術分野で入手可能な任意の数のＴ細胞株が使用され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの当業者に既知の任意の数の技法を使用して対象から回収される血液単位から得られ得る。いくつかの実施形態では、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球細胞、赤血球細胞、及び血小板を含むリンパ球を含有する。いくつかの実施形態では、アフェレーシスによって回収された細胞は、洗浄されて血漿画分を除去し、細胞をその後の処理ステップに適切な緩衝液または培地中に置いてもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠き得、またはすべてではないが多くの二価陽イオンを欠き得る。いくつかの実施形態では、カルシウムの不在下での初期活性化ステップが、活性化の拡大をもたらす。当業者であれば容易に理解するであろうように、洗浄ステップは、当業者に既知の方法によって、例えば、製造業者の指示に従って半自動「貫流」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞処理装置、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を使用することによって達成され得る。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ２＋を含まないＰＢＳ、Ｍｇ２＋を含まないＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、または他の生理食塩水溶液（緩衝液の有無にかかわらず）などに再懸濁され得る。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分が除去され、細胞が培養培地に直接再懸濁され得る。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、臍帯血バンク、末梢血バンクから提供されるか、または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、多能性及び多能性幹細胞、またはヒト胚幹細胞に由来する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、細胞株に由来する。Ｔ細胞は、いくつかの実施形態では、異種遺伝子源、例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、及びブタから得られる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ヒト細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、初代細胞、例えば、対象から直接単離された、及び／または対象から単離され、凍結された細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞の１つ以上のサブセット、例えば、全Ｔ細胞集団、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及びその部分母集団、例えば、機能、活性化状態、成熟度、分化能、増殖、再循環、局在化、及び／または持続の能力、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の臓器もしくは区画における存在、マーカーもしくはサイトカイン分泌プロファイル、及び／または分化の程度によって規定されるＴ細胞の１つ以上のサブセットが含まれる。治療されるべき対象に関して、細胞は、同種異系及び／または自家移植であり得る。場合によっては、Ｔ細胞は、１つ以上の意図されたレシピエントに関して同種異系である。場合によっては、Ｔ細胞は、レシピエントにおいて、例えば、ＧｖＨＤを誘導することなく、移植に好適である。
Ｔ細胞及び／またはＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞のサブタイプ及び／または部分母集団の中には、ナイーブＴ（ＴＮ）細胞、エフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）、メモリーＴ細胞及びそのサブタイプ、例えば、幹細胞メモリーＴ（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ（ＴＥＭ）、または末端分化エフェクターメモリーＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、未熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、粘膜関連不変Ｔ（ＭＡＩＴ）細胞、天然に存在する及び適応調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ヘルパーＴ細胞、例えば、ＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、ＴＨ３細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＨ９細胞、ＴＨ２２細胞、濾過ヘルパーＴ細胞、α／β Ｔ細胞、及びδ／γ Ｔ細胞がある。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球細胞を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離または向流遠心分離水簸によって単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球から単離される。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などのＴ細胞の特定の下位集団は、陽性または陰性選択技法によってさらに単離され得る。例えば、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な時間にわたる、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）コンジュゲートビーズ、例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔとのインキュベーションによって単離される。いくつかの実施形態では、時間は、約３０分間である。さらなる一実施形態では、時間は、３０分間～３６時間以上の範囲及びそれらの間のすべての整数値である。さらなる一実施形態では、時間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。いくつかの実施形態では、時間は、１０～２４時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は、２４時間である。白血病を有する患者からのＴ細胞の単離の場合、２４時間などのより長いインキュベーション時間により、細胞収率が高まり得る。より長いインキュベーション時間を使用して、例えば、腫瘍組織または免疫が低下した個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する際に、他の細胞型と比較してわずかなＴ細胞しか存在しない任意の状況下でＴ細胞を単離することができる。さらに、より長いインキュベーション時間の使用により、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉効率が高まり得る。したがって、単にＴ細胞がＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合することができる時間を短縮もしくは延長することによって、及び／または（本明細書にさらに記載されるように）ビーズのＴ細胞に対する比率を増加もしくは減少させることによって、Ｔ細胞の下位集団は、培養開始時またはプロセス中の他の時点で賛否について優先的に選択され得る。加えて、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３及び／または抗ＣＤ２８抗体の比率を増加または減少させることによって、Ｔ細胞の下位集団は、培養開始時または他の所望の時点で賛否について優先的に選択され得る。当業者であれば、複数回の選択ラウンドを使用することもできることを認識するであろう。いくつかの実施形態では、選択手順を実行し、活性化及び増殖プロセスで「選択されていない」細胞を使用することが望ましい場合がある。「選択されていない」細胞は、さらなる選択ラウンドにも供され得る。
陰性選択によるＴ細胞集団の富化は、陰性選択された細胞に特有の表面マーカーに指向された抗体の組み合わせを用いて達成され得る。１つの方法は、陰性選択された細胞に存在する細胞表面マーカーに指向されたモノクローナル抗体のカクテルを使用する陰性磁気免疫付着またはフローサイトメトリーによる細胞選別及び／または選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体のカクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。ある特定の実施形態では、典型的にはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、及びＦｏｘＰ３＋を発現する制御Ｔ細胞を濃縮するか、またはそれを陽性選択することが望ましい場合がある。あるいは、ある特定の実施形態では、制御Ｔ細胞は、抗ＣＤ２５コンジュゲートビーズまたは他の同様の選択方法によって枯渇される。
陽性または陰性選択による所望の細胞集団を単離するために、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変化させることができる。ある特定の実施形態では、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、ビーズ及び細胞が一緒に混合される体積を著しく減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましい場合がある。例えば、一実施形態では、２０億個の細胞／ｍＬの濃度が使用される。一実施形態では、１０億個の細胞／ｍＬの濃度が使用される。さらなる一実施形態では、１億個超の細胞／ｍＬが使用される。さらなる一実施形態では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万個の細胞／ｍＬの細胞濃度が使用される。なお別の実施形態では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個の細胞／ｍＬの細胞濃度が使用される。さらなる実施形態では、１億２５００万または１億５０００万個の細胞／ｍＬの濃度が使用され得る。高濃度の使用により、細胞収率、細胞活性化、及び細胞増殖の増加がもたらされ得る。さらに、高細胞濃度の使用により、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的とする標的抗原を弱く発現し得る細胞、または多くの腫瘍細胞が存在する試料（すなわち、白血病血液、腫瘍組織など）からの細胞のより効率的な捕捉が可能になる。かかる細胞集団は、治療値を有し得、取得することが望ましいであろう。例えば、高濃度の細胞の使用により、通常より弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択が可能になる。
いくつかの実施形態では、より低い濃度の細胞を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズなどの粒子）との混合物を著しく希釈することにより、粒子と細胞との間の相互作用が最小限に抑えられる。これにより、粒子と結合する多量の所望の抗原を発現する細胞が選択される。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、より高いレベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度でＣＤ８＋Ｔ細胞よりも効率的に捕捉される。いくつかの実施形態では、使用される細胞濃度は、５×１０６／ｍＬである。いくつかの実施形態では、使用される濃度は、約１×１０５／ｍＬ～１×１０６／ｍＬ、及びそれらの間の任意の整数値であり得る。
いくつかの実施形態では、細胞は、回転子上で、２～１０℃または室温のいずれかで、様々な速度で様々な長さの時間にわたってインキュベートされ得る。
刺激用のＴ細胞は、洗浄ステップ後に凍結することもできる。理論に拘束されることを望まないが、凍結ステップ及びその後の解凍ステップにより、細胞集団における顆粒球を除去し、単球をある程度除去することによってより均一な生成物が提供される。血漿及び血小板を除去する洗浄ステップ後、細胞は、凍結溶液中に懸濁され得る。多くの凍結溶液及びパラメータが当該技術分野で既知であり、この状況において有用であるが、１つの方法は、２０％ＤＭＳＯ及び８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または１０％デキストラン４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン及び７．５％ＤＭＳＯ、または３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、及び７．５％ＤＭＳＯを含有する培養培地、または例えば、Ｈｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａを含有する他の好適な細胞凍結培地の使用を伴い、その後、細胞は、１℃／分の速度で－８０℃になるまで凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相中に貯蔵される。他の制御凍結方法、ならびに－２０℃でまたは液体窒素中での即時の非制御凍結方法が使用され得る。
いくつかの実施形態では、凍結保存細胞が解凍され、本明細書に記載されるように洗浄され、室温で１時間静置させた後、活性化する。
本明細書に記載の細胞の増殖が必要とされ得る前の時点での対象からの血液試料またはアフェレーシス産物の収集も本出願で企図される。したがって、増殖される細胞の源は、必要な任意の時点で回収され、Ｔ細胞などの所望の細胞が単離され、本明細書に記載の疾患または状態などのＴ細胞療法の利益を享受するであろう任意の数の疾患または状態のためのＴ細胞療法での後の使用のために凍結される。一実施形態では、血液試料またはアフェレーシスは、一般に健常な対象から採取される。ある特定の実施形態では、血液試料またはアフェレーシスは、疾患を発症する危険性があるが、疾患をまだ発症していない一般に健常な対象から採取され、目的とする細胞が単離され、後の使用のために凍結される。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞が増殖され、凍結され、後に使用され得る。ある特定の実施形態では、試料は、本明細書に記載の特定の疾患の診断直後であるが、任意の治療の前に患者から回収される。さらなる一実施形態では、細胞は、薬剤、例えば、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、及びＦＫ５０６、抗体、または他の免疫除去剤（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、及び放射線照射での治療を含むが、これらに限定されない、任意の数の関連治療法前に対象由来の血液試料またはアフェレーシスから単離される。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリン（シクロスポリン及びＦＫ５０６）または成長因子によって誘導されるシグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼ（ラパマイシン）のいずれかを阻害する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６６：８０７－８１５，１９９１、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎ ７３：３１６－３２１，１９９１、Ｂｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．５：７６３－７７３，１９９３）。さらなる一実施形態では、細胞は、患者のために単離され、骨髄もしくは幹細胞移植、フルダラビンなどのいずれかの化学療法薬を使用したＴ細胞除去療法、外部ビーム放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、または抗体、例えば、ＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨと併せて（例えば、その前に、同時に、またはその後に）後の使用のために凍結される。別の実施形態では、細胞は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンなどのＢ細胞除去療法前に単離され、Ｂ細胞除去療法前後の治療のために後の使用のために凍結され得る。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、治療後に患者から直接得られる。この点について、ある特定のがん治療後、具体的には、免疫系を損傷する薬物での治療後、治療直後、患者が通常治療から回復する期間中、得られたＴ細胞の質が最適であるか、またはエクスビボで増殖するそれらの能力について改善され得ることが観察されている。同様に、本明細書に記載の方法を使用したエクスビボ操作後、これらの細胞は、移植の増強及びインビボ増殖に好ましい状態にあり得る。したがって、この回復期中のＴ細胞、樹状細胞、または造血系列の他の細胞を含む血液細胞の収集が、本発明の文脈内で企図される。さらに、ある特定の実施形態では、動員（例えば、ＧＭ－ＣＳＦでの動員）及び前処置（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）レジメンを使用して、特に、療法後の定義された期間中に、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、及び／または増殖が好ましい状態を対象に作り出すことができる。例証的な細胞型としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及び免疫系の他の細胞が挙げられる。
Ｔ細胞の活性化及び増殖
いくつかの実施形態では、細胞は、遺伝子操作の前に、または遺伝子操作に関連してインキュベートされ、及び／または培養される。インキュベーションステップは、培養、発育、刺激、活性化、及び／または増殖を含むことができる。いくつかの実施形態では、本組成物または細胞は、刺激条件または刺激薬剤の存在下でインキュベートされる。かかる条件には、集団内の細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、活性化、及び／または生存を誘導するように、抗原曝露を模倣するように、及び／または遺伝子操作された抗原受容体の導入などの遺伝子操作のために細胞を初回刺激（ｐｒｉｍｅ）するように設計された条件が含まれる。条件は、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、薬剤、例えば、栄養分、アミノ酸、抗生物質、イオン、及び／または刺激因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、ならびに細胞を活性化するように設計された他の任意の薬剤のうちの１つ以上を含むことができる。
本明細書に記載の、外因性核酸を含むＴ細胞の遺伝子修飾の前または後にかかわらず、Ｔ細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、及び米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載の方法を一般に使用して活性化及び増殖され得る。
一般に、Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドと結合した表面との接触によって増殖され得る。具体的には、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載されるように、例えば、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片、または表面上に固定化された抗ＣＤ３抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアと併せたタンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触によって刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子と結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触し得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、当該技術分野で一般に既知の他の方法も同様に使用され得る（Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５－３９７７，１９９８、Ｈａａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９、Ｇａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．２２７（１－２）：５３－６３，１９９９）。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、（例えば、得られる細胞集団が、増殖させようとする初期集団内の各Ｔリンパ球に対して少なくとも約５個、１０個、２０個、または４０個もしくはそれ以上のＰＢＭＣフィーダー細胞を含有するように）培養開始組成物フィーダー細胞、例えば、非分裂末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に添加することと、培養物を（例えば、Ｔ細胞の数を増やすのに十分な時間にわたって）インキュベートすることとによって増殖される。いくつかの態様では、非分割フィーダー細胞は、γ線照射したＰＢＭＣフィーダー細胞を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、細胞分裂を阻止するために、約３０００～３６００ラドの範囲のγ線が照射される。いくつかの態様では、フィーダー細胞が培養培地に添加された後に、Ｔ細胞の集団が添加される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中に存在し得るか、または表面にカップリングし得る。表面にカップリングすると、薬剤は、同じ表面にカップリングし得る（すなわち、「シス」形成）か、または表面を分離し得る（すなわち、「トランス」形成）。あるいは、一方の薬剤が表面にカップリングし、他方の薬剤が溶液中に存在し得る。一実施形態では、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面と結合し、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中に存在するか、または表面と結合する。ある特定の実施形態では、両方の薬剤が溶液中に存在し得る。別の実施形態では、薬剤は、可溶性形態であり得、表面、例えば、Ｆｃ受容体もしくは抗体を発現する細胞、または薬剤と結合する他の結合剤に架橋し得る。この点について、例えば、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号及び同第２００６００３４８１０号（本発明におけるＴ細胞の活性化及び増殖での使用に企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ））を参照のこと。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、薬剤でコーティングされたビーズと合わせられ、その後、ビーズとＴ細胞が分離され、次いで、Ｔ細胞が培養される。代替の一実施形態では、培養前に、薬剤でコーティングされたビーズと細胞は分離されず、一緒に培養される。さらなる一実施形態では、ビーズ及び細胞は、磁力などの力を加えることによって最初に濃縮され、細胞表面マーカーのライゲーションの増加がもたらされ、それにより細胞刺激を誘導する。
一例として、細胞表面タンパク質は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８が結合する常磁性ビーズ（３×２８個のビーズ）をＴ細胞と接触させることによってライゲーションされ得る。一実施形態では、細胞（例えば、１０４～１０９個のＴ細胞）及びビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ常磁性ビーズ１：１の比率））が、緩衝液、好ましくは、ＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムなどの二価陽イオンなし）中で合わせられる。この場合もやはり、当業者であれば、任意の細胞濃度が使用され得ることを容易に理解することができる。例えば、標的細胞は、試料中では非常に稀であり、試料の０．０１％を構成し得るか、または全試料（すなわち、１００％）が目的とする標的細胞を含み得る。したがって、任意の細胞数は、本発明の文脈内である。ある特定の実施形態では、粒子及び細胞が一緒に混合される体積を著しく減少させて（すなわち、細胞濃度を増加させて）、細胞と粒子との最大接触を確実にすることが望ましい場合がある。例えば、一実施形態では、約２０億個の細胞／ｍＬの濃度が使用される。別の実施形態では、１億個超の細胞／ｍＬが使用される。さらなる一実施形態では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万個の細胞／ｍＬの細胞濃度が使用される。なお別の実施形態では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個の細胞／ｍＬの細胞濃度が使用される。さらなる実施形態では、１億２５００万または１億５０００万個の細胞／ｍＬの濃度が使用され得る。高濃度の使用により、細胞収率、細胞活性化、及び細胞増殖の増加がもたらされ得る。さらに、高細胞濃度の使用により、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的とする標的抗原を弱く発現し得る細胞のより効率的な捕捉が可能になる。ある特定の実施形態では、かかる細胞集団は、治療値を有し得、取得することが望ましいであろう。例えば、高濃度の細胞の使用により、通常より弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択が可能になる。
いくつかの実施形態では、混合物は、数時間（約３時間）～約１４日間またはそれらの間の任意の時間単位の整数値にわたって培養され得る。別の実施形態では、混合物は、２１日間にわたって培養され得る。本発明の一実施形態では、ビーズ及びＴ細胞は、約８日間にわたって一緒に培養される。別の実施形態では、ビーズ及びＴ細胞は、２～３日間にわたって一緒に培養される。Ｔ細胞の培養時間が６０日間以上になり得るように、いくつかの刺激サイクルも所望され得る。Ｔ細胞培養に適切な条件は、血清（例えば、ウシまたはヒト胎児血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ、及びＴＮＦ－α、または当業者に既知の細胞成長のための任意の他の添加物を含む増殖及び生存に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞成長のための他の添加物としては、界面活性剤、プラスマネート、ならびに還元剤、例えば、Ｎ－アセチル－システイン及び２－メルカプトエタノールが挙げられるが、これらに限定されない。培地は、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンが添加され、無血清であるか、または適切な量の血清（もしくは血漿）または定義された組のホルモン、及び／またはＴ細胞の成長及び増殖に十分な量のサイトカイン（複数可）を補充しているかのいずれかのＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５、及びＸ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含み得る。抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンは、実験培養物にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、成長を支援するのに必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）及び大気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）で維持される。様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を呈し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレーシス末梢血単核細胞産物は、細胞毒性またはサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８）より大きいヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３及びＣＤ２８受容体の刺激によるＴ細胞のエクスビボ増殖により、約８～９日目前に主にＴＨ細胞からなるＴ細胞集団が産生されるが、約８～９日目後、Ｔ細胞集団は、次第により多くのＴＣ細胞集団を含む。したがって、治療目的に応じて、対象に主にＴＨ細胞からなるＴ細胞集団を注入することが有利であり得る。同様に、抗原特異的ＴＣ細胞サブセットが単離された場合、このサブセットをより大きな程度に増殖することが有益であり得る。
さらに、ＣＤ４及びＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーが、細胞増殖プロセスの過程中に著しく変化するが、主に、再現可能に変化する。したがって、かかる再現性により、特定の目的のために活性化Ｔ細胞産物を調整する能力が有効になる。
いくつかの実施形態では、本方法は、操作された修飾細胞または細胞の表面上で１つ以上のマーカーの発現を評価することを含む。一実施形態では、本方法は、例えば、親和性に基づく検出方法、例えば、フローサイトメトリーによって、ＴＣＲ、ＭＨＣ Ｉ、ＣＤ４、ＣＤ２８、及び／またはＣＤ３（例えば、ＣＤ３ε）の表面発現を評価することを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞枯渇マーカーまたはメモリマーカーなどの細胞表面マーカーが、評価される。いくつかの態様では、本方法が抗原または他のマーカーの表面発現を明らかにする場合、例えば、本明細書に記載の方法を使用して、抗原または他のマーカーをコードする遺伝子は、破壊されるか、発現が別のやり方で抑制される。
修飾Ｔ細胞の単離及び富化
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、核酸を含むＴ細胞を単離または濃縮することをさらに含む。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体を発現する修飾Ｔ細胞を単離または濃縮することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、修飾Ｔ細胞（例えば、外因性Ｎｅｆタンパク質をさらに発現する）からＣＤ３ε／γ／δ陰性Ｔ細胞を単離または濃縮することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、修飾Ｔ細胞から内因性ＴＣＲα／β陰性Ｔ細胞を単離または濃縮することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、修飾Ｔ細胞からＣＤ４＋及び／またはＣＤ２８＋Ｔ細胞を単離または濃縮することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、修飾Ｔ細胞からＭＨＣ Ｉ陰性Ｔ細胞を単離または濃縮することをさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の単離または富化は、本明細書に記載の方法の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、単離方法は、１つ以上の特定の分子、例えば、表面マーカー、例えば、表面タンパク質、細胞内マーカー、または核酸の細胞内の不在または存在に基づく異なる細胞タイプの分離を含む。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、ＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ６９、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、及び／またはＭＨＣ Ｉである。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、ＰＤ－１またはＬＡＧ－３などのＴ細胞枯渇マーカーである。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、ＴＥＭＲＡ、ＴＥＭ、またはＴＣＭなどのＴ細胞メモリマーカーである。いくつかの実施形態では、かかるマーカーに基づく分離のための任意の既知の方法が、使用され得る。いくつかの実施形態では、分離は、親和性または免疫親和性に基づく分離である。例えば、いくつかの態様では、単離は、例えば、かかるマーカーに特異的に結合する抗体または結合パートナーとともにインキュベートし、続いて、一般に洗浄ステップを行い、抗体または結合パートナーと結合した細胞を抗体または結合パートナーと結合しなかった細胞から分離することによって、１つ以上のマーカー、典型的には細胞表面マーカーの細胞の発現または発現レベルに基づく細胞及び細胞集団の分離を含む。
かかる分離ステップは、試薬と結合した細胞をその後の使用のためにとっておく陽性選択及び／または抗体もしくは結合パートナーと結合しなかった細胞をとっておく陰性選択に基づくことができる。いくつかの例では、両方の画分は、その後の使用のためにとっておく。いくつかの態様では、陰性選択は、分離が所望の集団以外の細胞によって発現されたマーカーに基づいて最良に行われるように、異種集団における細胞型を特異的に同定する抗体が利用可能でない場合に特に有用であり得る。
分離は、特定の細胞集団または特定のマーカーを発現する細胞の１００％の富化または除去をもたらす必要はない。例えば、マーカーを発現する細胞などのある特定のタイプの細胞の陽性選択または富化は、そのような細胞の数またはパーセンテージを増加させることを指すが、マーカーを発現しない細胞が全く存在しない状態をもたらす必要はない。同様に、マーカーを発現する細胞などのある特定のタイプの細胞の陰性選択、除去、または枯渇は、そのような細胞の数またはパーセンテージを減少させることを指すが、すべてのそのような細胞の完全な除去をもたらす必要はない。
いくつかの例では、複数ラウンドの分離ステップが実施され、１つのステップで陽性選択または陰性選択された画分を別の分離ステップ（例えば後続の陽性選択または陰性選択）に供する。いくつかの例では、単一の分離ステップは、複数のマーカーを同時に発現する細胞を枯渇させることができ、例えば、細胞を複数の抗体または結合パートナーとともにインキュベートすることによって、各々が陰性選択のために標的となるマーカーに特異的である。同様に、複数の細胞型は、様々な細胞型上に発現される複数の抗体または結合パートナーをともに細胞をインキュベートすることによって、同時に陽性選択することができる。
例えば、いくつかの態様では、Ｔ細胞の特定の部分母集団、例えば、１つ以上の表面マーカーが陽性であるか、または高レベルに発現する細胞、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及び／またはＣＤ４５ＲＯ＋ Ｔ細胞が、陽性または陰性選択技法によって単離される。
例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋ Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８コンジュゲート磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標） Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｄｅｒ）を使用して陽性選択することができる。
いくつかの実施形態では、単離は、陽性選択による特定の細胞集団の富化、または陰性選択による特定の細胞集団の枯渇によって行われる。いくつかの実施形態では、陽性または陰性選択は、それぞれ、陽性または陰性選択された細胞上で発現している（マーカー＋）、または比較的高いレベルで発現している（マーカー高）、１つ以上の表面マーカーに特異的に結合する１つ以上の抗体または他の結合剤とともに、細胞をインキュベートすることによって達成される。
いくつかの態様では、分離される細胞の試料または組成物を、磁気応答性粒子または微粒子、例えば常磁性ビーズ（例えば、ＤｙｎａｂｅａｄｓまたはＭＡＣＳビーズ）などの小さな磁化可能なまたは磁気応答性材料とともにインキュベートする。磁気応答性材料、例えば、粒子は、一般に、分離することが所望される、例えば、陰性または陽性選択することが所望される細胞（複数可）または細胞集団上に存在する分子、例えば、表面マーカーに特異的に結合する結合パートナー、例えば、抗体に直接的または間接的に付着させられる。
いくつかの実施形態では、磁気粒子またはビーズは、抗体または他の結合パートナーなどの特定の結合メンバーと結合した磁気応答性材料を含む。磁気分離法において使用される多くの周知の磁気応答性材料がある。好適な磁気粒子としては、Ｍｏｌｄａｙの米国特許第４，４５２，７７３号及び欧州特許明細書ＥＰ４５２３４２Ｂに記載されるものが挙げられ、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。他の例には、コロイドサイズの粒子、例えば、Ｏｗｅｎの米国特許第４，７９５，６９８号及びＬｉｂｅｒｔｉらの米国特許第５，２００，０８４号に記載されるものがある。
インキュベーションは、一般に、抗体もしくは結合パートナー、またはかかる抗体もしくは結合パートナーに特異的に結合する分子、例えば、二次抗体もしくは他の試薬が、磁気粒子またはビーズに付着し、試料内の細胞上に存在する場合、細胞表面分子に特異的に結合するような条件下で行われる。
いくつかの実施形態では、試料を磁場に入れると、磁気応答性粒子または磁化可能粒子が付着している細胞は磁石に引きつけられ、非標識細胞から分離されるであろう。陽性選択の場合は、磁石に引きつけられた細胞をとっておき、陰性選択の場合は、磁石に引きつけられなかった細胞（非標識細胞）をとっておく。いくつかの態様では、陽性選択及び陰性選択の組み合わせが、同じ選択ステップの間に行われ、陽性画分及び陰性画分をとっておいて、さらに処理されるか、またはさらなる分離ステップに供する。
ある特定の実施形態では、磁気応答性粒子は、一次抗体または他の結合パートナー、二次抗体、レクチン、酵素、もしくはストレプトアビジンでコーティングされる。ある特定の実施形態では、磁気粒子は、１つ以上のマーカーに特異的な一次抗体のコーティングを介して細胞に付着させられる。ある特定の実施形態では、ビーズではなく細胞を一次抗体または結合パートナーで標識し、次いで細胞型特異的二次抗体または他の結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン）でコーティングされた磁気粒子を添加する。ある特定の実施形態では、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気粒子が、ビオチン化一次抗体または二次抗体と併せて使用される。
いくつかの実施形態では、磁気応答性粒子をその後インキュベートし、培養し、及び／または操作される細胞に付着したままにしておき、いくつかの態様では、粒子は、患者への投与のために細胞に付着したままにしておく。いくつかの実施形態では、磁化可能粒子または磁気応答性粒子を細胞から取り除く。磁化可能粒子を細胞から取り除くための方法は公知であり、例えば、競合する非標識抗体、磁化可能粒子、または切断可能なリンカーにコンジュゲートされた抗体などの使用を含む。いくつかの実施形態では、磁化可能粒子は、生分解性である。
いくつかの実施形態では、親和性に基づく選択は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆ．）を介した選択である。磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）システムは、磁気粒子が付着している細胞の高純度選択が可能である。ある特定の実施形態では、ＭＡＣＳは、外部磁場の印加後に、非標的種及び標的種が逐次的に溶出するモードで動作する。すなわち、磁化粒子に付着している細胞は、その場に保持されるが、一方、付着していない種は溶出する。次いで、この第１の溶出ステップが完了した後に、磁場に捕らわれて溶出が妨げられていた種が、溶出して回収され得るような何らかの方法で解放される。ある特定の実施形態では、非標的細胞を、標識して、不均一な細胞集団から枯渇される。
ある特定の実施形態では、単離または分離は、方法の単離、細胞調製、分離、処理、インキュベーション、培養、及び／または製剤化ステップのうちの１つ以上を行うシステム、デバイス、または装置を使用して実行される。いくつかの態様では、例えば、エラー、ユーザーによる取扱い、及び／または汚染を最小限に抑えるために、システムを使用して、閉鎖環境または無菌環境においてこれらのステップの各々を実行する。一例において、システムは、国際特許出願公開番号ＷＯ２００９／０７２００３またはＵＳ２０１１０００３３８０ Ａ１に記載されるシステムである。
いくつかの実施形態では、システムまたは装置が、単離、処理、操作、及び製剤化ステップのうちの１つ以上、例えばすべてを、統合型もしくは自己完結型システムにおいて、及び／または自動化されたもしくはプログラム可能な方法で実行する。いくつかの態様では、システムまたは装置は、システムまたは装置と連通するコンピュータ及び／またはコンピュータプログラムを含み、これは、ユーザーが、処理、単離、操作、及び製剤化ステップの様々な態様をプログラムし、制御し、その結果を評価し、及び／または調節することを可能にする。
いくつかの態様では、分離及び／または他のステップは、例えば、閉鎖及び無菌システムにおける臨床スケールレベルでの細胞の自動分離のために、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して実行される。構成部品には、統合型マイクロコンピュータ、磁気分離ユニット、蠕動ポンプ、及び様々なピンチバルブを含むことができる。統合型コンピュータは、いくつかの態様では、計器のすべての構成部品を制御し、標準化された順序で反復手順を行うようにシステムに指示する。磁気分離ユニットは、いくつかの態様では、可動性の永久磁石と、選択カラム用のホルダとを含む。蠕動ポンプは、チューブセット全体の流量を制御し、ピンチバルブとともに、システムを通る緩衝液の制御された流れと細胞の連続的な懸濁液とを保証する。
ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステムは、いくつかの態様では、無菌の非発熱性溶液中で供給される抗体カップリング磁化可能粒子を使用する。いくつかの実施形態では、磁気粒子による細胞の標識化後に、細胞を洗浄して、過剰な粒子を除去する。次いで、細胞調製バッグをチューブセットに接続し、次いで、チューブセットを、緩衝液を含有するバッグ及び細胞回収バッグに接続する。チューブセットは、プレカラム及び分離カラムを含む予め組み立てられた滅菌チューブからなり、使い捨て専用である。分離プログラムが開始した後に、システムは、自動で細胞試料を分離カラムに適用する。標識細胞はカラム内に保持されるが、一方、非標識細胞は一連の洗浄ステップによって除去される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で使用するための細胞集団は、非標識であり、カラム中に保持されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で使用するための細胞集団は、標識され、カラム中に保持される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で使用するための細胞集団は、磁場の除去後にカラムから溶出され、細胞回収バッグ内に回収される。
ある特定の実施形態では、分離及び／または他のステップは、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して実行される。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステムは、いくつかの態様では、遠心分離による細胞の自動洗浄及び分画を可能にする細胞処理ユニット（ｃｅｌｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｕｎｉｔｙ）を装備している。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステムはまた、ソース細胞産物（ｓｏｕｒｃｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｄｕｃｔ）の肉眼的層を識別することによって最適な細胞分画終点を決定する内蔵カメラ及び画像認識ソフトウェアも含むことができる。例えば、末梢血は、赤血球、白血球、及び血漿層へと自動的に分離される。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステムはまた、例えば、細胞の分化及び増殖、抗原負荷、ならびに長期細胞培養などの細胞培養プロトコルを達成する統合型細胞培養チャンバも含むことができる。入力ポートは、培地の滅菌除去及び補充を可能にすることができ、統合型顕微鏡を使用して、細胞を監視することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団は、フローサイトメトリーを介して回収及び富化（または枯渇）される。このフローサイトメトリーでは、複数の細胞表面マーカーのために染色された細胞が流体の流れに入って運ばれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団は、調製スケール（ＦＡＣＳ）選別を介して回収及び富化（または枯渇）される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の細胞集団は、ＦＡＣＳベースの検出システムと組み合わせて微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）チップを使用することによって回収及び富化（または枯渇）される（例えば、ＷＯ２０１０／０３３１４０、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １０，１５６７－１５７３及びＧｏｄｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００８） Ｊ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎ．１（５）：３５５－３７６を参照のこと）。どちらの場合も、細胞を複数のマーカーで標識して、高純度の明確なＴ細胞サブセットの単離を可能にすることができる。
いくつかの実施形態では、抗体または結合パートナーは、陽性及び／または陰性選択のための分離を容易にするために、１つ以上の検出可能なマーカーで標識される。例えば、分離は、蛍光標識抗体への結合に基づき得る。いくつかの例では、１つ以上の細胞表面マーカーに特異的な抗体または他の結合パートナーの結合に基づく細胞の分離は、流体流れの中で、例えば、分取スケール（ＦＡＣＳ）及び／または微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）チップを含む蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって行われる。かかる方法は、複数のマーカーに基づく陽性及び陰性選択を同時に可能にする。単離及び／または富化方法については、「実施例」セクションも参照のこと。
内因性遺伝子座の遺伝子編集
いくつかの実施形態では、内因性ＴＣＲ遺伝子座（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ）またはＢ２Ｍ（β２－マイクログロブリン；ＭＨＣクラスＩ分子発現の欠損及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇をもたらすことができる）遺伝子座などのＴ細胞の内因性遺伝子座は、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、もしくはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）を発現するようにＴ細胞を修飾する前に、または同時に、遺伝子編集方法によって修飾される。いくつかの実施形態では、内因性遺伝子座の修飾は、遺伝子の破壊、例えば、ノックアウト、挿入、ミスセンス変異もしくはフレームシフト変異、例えば、二対立遺伝子フレームシフト変異、遺伝子のすべてまたは一部分、例えば、１つ以上のエクソンまたはその一部分の欠失、及び／またはノックインを生じさせることによって行われる。いくつかの実施形態では、かかる遺伝子座修飾は、遺伝子に特異的に結合するか、または遺伝子にハイブリダイズする、ＤＮＡ標的分子、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質もしくはＤＮＡ結合核酸、またはそれを含有する複合体、化合物、もしくは組成物を使用して行われる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的分子は、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）もしくはＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメイン、クラスター化された規則的な間隔の短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）ＤＮＡ結合ドメイン、またはメガヌクレアーゼからのＤＮＡ結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、内因性遺伝子座（例えば、ＴＣＲまたはＢ２Ｍ）の修飾は、１つ以上のＤＮＡ結合核酸、例えば、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）による破壊、または別のＲＮＡ誘導エフェクター分子による他の形態の抑制を使用して実行される。例えば、いくつかの実施形態では、抑制は、クラスター化された規則的な間隔の短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を使用して実行される。Ｓａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｊｏｕｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２（４）：３４７－３５５を参照のこと。
一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、集合的に、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現またはその活性の指向に関与する転写物及び他の要素を指し、これには、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈での「直接反復」及びｔｒａｃｒＲＮＡによりプロセシングされる部分直接反復を包含する）、ガイド配列（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈での「スペーサー」とも称される）、及び／またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物が含まれる。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、ＤＮＡに配列特異的に結合する非コードＲＮＡ分子（ガイド）ＲＮＡ、及びヌクレアーゼ機能性（例えば、２つのヌクレアーゼドメイン）を有するＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムのうちの１つ以上の要素は、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに由来する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムのうちの１つ以上の要素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓなどの内因性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物に由来する。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ（標的配列及び固定ｔｒａｃｒＲＮＡに特異的なｃｒＲＮＡの融合を含む）を、細胞に導入する。一般に、ｇＲＮＡの５’末端での標的部位は、相補的な塩基対合を使用して、Ｃａｓヌクレアーゼを標的部位、例えば、遺伝子に対して標的する。いくつかの実施形態では、標的部位は、典型的にはＮＧＧまたはＮＡＧなどのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列のすぐ５’側でのその場所に基づいて選択される。この点で、ｇＲＮＡは、ガイドＲＮＡの最初の２０ヌクレオチドを修飾して、標的ＤＮＡ配列に対応させることによって所望の配列に対して標的化される。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的部位でのＤＳＢを誘導する。他の実施形態では、「ニッカーゼ」であると考えられるＣａｓ９バリアントが、一本鎖を標的部位においてニック切断するために使用される。いくつかの態様では、対になったニッカーゼが、例えば、特異性を改善するために使用され、この場合、ニックが同時に導入されたとき、５’オーバーハングが導入されるように、各々が、一対の異なるｇＲＮＡの標的化配列によって指向される。他の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９は、遺伝子発現に影響を与えるために、転写レプレッサーまたは活性化因子などの異種エフェクタードメインに融合される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の内因性遺伝子座（例えば、内因性ＴＣＲ）は、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）を発現するようにＴ細胞を修飾する前に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって修飾される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の内因性遺伝子座（例えば、内因性ＴＣＲ）は、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体を発現するようにＴ細胞を修飾するのと同時に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって修飾される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをコードする核酸（複数可）及び本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体をコードする核酸（複数可）は、同じベクター上にあり、所望により、同じプロモーターまたは異なるプロモーターによって制御されるかのいずれかであってもよい。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをコードする核酸（複数可）及び本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）をコードする核酸は、異なるベクター上にある。
ＶＩＩ．薬学的組成物
本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）を発現する修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系Ｔ細胞または自己Ｔ細胞）のうちのいずれか１つと、所望により薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物もまた、本出願によってさらに提供される。いくつかの実施形態では、修飾Ｔ細胞は、外因性Ｎｅｆタンパク質をさらに発現する。薬学的組成物は、本明細書に記載の修飾Ｔ細胞の集団を、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって水溶液の形態で調製され得る。いくつかの実施形態では、修飾Ｔ細胞の集団は、均一である。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）をコードする核酸を担持するベクターで形質導入／トランスフェクトされた修飾Ｔ細胞の集団の少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％のうちのいずれか）は、ＩＴＡＭ修飾機能的外因性受容体陽性である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体をコードする核酸で形質導入／トランスフェクトされた修飾Ｔ細胞の集団の少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％のうちのいずれか）は、ＴＣＲα／ＴＣＲβ陰性及びＩＴＡＭ修飾機能的外因性受容体陽性である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体をコードする核酸で形質導入／トランスフェクトされた修飾Ｔ細胞の集団の少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％のうちのいずれか）は、ＭＨＣ Ｉ陰性及びＩＴＡＭ修飾機能的外因性受容体陽性である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体をコードする核酸で形質導入／トランスフェクトされた修飾Ｔ細胞の集団の少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％のうちのいずれか）は、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３ε／γ／δ）陰性及びＩＴＡＭ修飾機能的外因性受容体陽性である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体をコードする核酸で形質導入／トランスフェクトされた修飾Ｔ細胞の集団の少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％のうちのいずれか）は、ＣＤ４及び／またはＣＤ２８陽性及びＩＴＡＭ修飾機能的外因性受容体陽性である。
許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投薬量及び濃度ではレシピエントに非毒性であり、緩衝液、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、メタ重亜硫酸ナトリウムを含む抗酸化物質、防腐剤、等張化剤、安定剤、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ及び／または非イオン性界面活性剤を含む。
緩衝液は、特に安定性がｐＨ依存性である場合、治療有効性を最適化する範囲内でｐＨを制御するために使用される。緩衝液は、好ましくは、約５０ｍＭ～約２５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。本発明での使用に好適な緩衝剤は、有機酸及び無機酸の両方、ならびにそれらの塩を含む。例えば、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酢酸塩。さらに、緩衝液は、ヒスチジン及びトリメチルアミン塩、例えば、トリスを含み得る。
防腐剤は、微生物成長を遅延させるために添加され、典型的には、０．２ｗ／ｖ％～１．０ｗ／ｖ％の範囲で存在する。本発明での使用に好適な防腐剤としては、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；ベンザルコニウムハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、塩化ベンゼトニウム；チメロサール、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾールが挙げられる。
時折「安定剤」としても既知の等張化剤が、組成物中の液体の等張性を調整または維持するために存在する。タンパク質及び抗体などの大きい荷電した生体分子とともに使用される場合、それらが、荷電したアミノ酸側鎖群と相互作用し、それにより分子間及び分子内相互作用の可能性を低減するため、それらは、多くの場合、「安定剤」と称される。等張化剤は、他の成分の相対量を考慮して、０．１％～２５重量％、好ましくは、１～５％の任意の量で存在し得る。いくつかの実施形態において、等張化剤としては、多価糖アルコール、好ましくは、三価以上の糖アルコール、例えば、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールが挙げられる。
さらなる賦形剤としては、以下、（１）増量剤、（２）溶解度向上剤、（３）安定剤、及び（４）変性または容器の壁への付着を阻止する薬剤のうちの１つ以上としての機能を果たし得る薬剤が挙げられる。かかる賦形剤としては、多価糖アルコール（上に列挙されるもの）；アミノ酸、例えば、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン等；有機糖または糖アルコール、例えば、スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール；硫黄含有還元剤、例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α－モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウム；低分子量タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、または他の免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；単糖（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；二糖（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）；三糖、例えば、ラフィノース；ならびに多糖、例えば、デキストリンまたはデキストランが挙げられる。
非イオン性界面活性剤または洗剤（別名、「湿潤剤」）は、治療薬の可溶化を助けるために、かつ撹拌によって誘導される凝集から治療用タンパク質を保護するために存在し、それにより、活性治療用タンパク質または抗体の変性を引き起こすことなく製剤が剪断表面応力に曝露されることも可能になる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約０．０７ｍｇ／ｍＬ～約０．２ｍｇ／ｍＬの範囲で存在する。
好適な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート（２０、４０、６０、６５、８０など）、ポリオキサマー（ｐｏｌｙｏｘａｍｅｒ）（１８４、１８８など）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０など）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０、及び６０、モノステアリン酸グリセロール、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースが挙げられる。使用され得る陰イオン性洗剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、及びジオクチルスルホン酸ナトリウムを含む。陽イオン性洗剤は、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムを含む。
薬学的組成物がインビボ投与に使用されるために、それらは、滅菌でなければならない。薬学的組成物は、滅菌濾過膜を通す濾過によって滅菌にされる。本明細書の薬学的組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈用溶液袋またはバイアルに入れられる。
投与経路は、好適な様態での、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内、もしくは関節内経路による注射もしくは注入、または持続放出もしくは徐放手段による長期にわたる単回もしくは複数回ボーラスまたは注入などの既知の認められている方法に従う。
徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の好適な例としては、アンタゴニストを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸とＬ－グルタミン酸エチルのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフェア）、ならびにポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
本明細書に記載の薬学的組成物は、治療される特定の適応症に必要な２つ以上の活性化合物または薬剤、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものも含有し得る。あるいは、または加えて、本組成物は、細胞毒性薬、化学療法剤、サイトカイン、免疫抑制剤、免疫チェックポイントモジュレータ、または成長阻害剤を含み得る。かかる分子は、意図される目的に有効な量で、組み合わせで好適に存在する。
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技法によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル及びポリ－（メチルメタシレート）マイクロカプセル内に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳濁液、ナノ粒子、及び名のカプセル）中、またはマクロ乳濁液中に取り込まれ得る。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎに開示されている。
ＶＩＩＩ．治療方法
本出願は、個体（例えば、ヒト）における疾患（がん、感染性疾患、ＧｖＨＤ、移植拒絶、自己免疫疾患、または放射線疾患など）を治療する方法をさらに提供し、個体に、有効量の本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、もしくはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）を発現する修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系Ｔ細胞、内因性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞、ＧｖＨＤが最小限のＴ細胞、もしくは自己Ｔ細胞）またはその薬学的組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、修飾Ｔ細胞は、配列番号１２１、１２２、１３６、または１３９のアミノ酸配列を含む外因性Ｎｅｆタンパク質などの外因性Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型、サブタイプ、または変異体Ｎｅｆ）をさらに発現する。本出願はまた、個体（例えば、ヒト）における疾患（がん、感染性疾患、自己免疫疾患、または放射線疾患など）を治療する方法も提供し、個体に、有効量の本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体を発現する修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系もしくは自己Ｔ細胞）またはその薬学的組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、修飾Ｔ細胞は、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ（例えば、配列番号９８～１０４のうちのいずれかの配列を含む）、またはＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ（例えば、配列番号７６～９６及び１０６～１１３のうちのいずれかの配列を含む）を発現する。
本明細書に記載の方法は、固形がん及び液体がんの両方を含む様々ながんを治療するのに適している。これらの方法は、早期、進行期、及び転移がんを含むすべての病期のがんに適用される。本明細書に記載の方法は、補助状況または新補助状況下で、第１の療法、第２の療法、第３の療法、または当該技術分野で既知の他の種類のがん療法、例えば、化学療法、手術、放射線、遺伝子療法、免疫療法、骨髄移植、幹細胞移植、標的療法、凍結療法、超音波療法、光線力学療法、高周波アブレーションなどとの併用療法として使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌、小腸の癌、食道の癌、黒色腫、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭または頸部の癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣癌、外陰部癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、環境的に誘発される癌、当該がんの組み合わせ、及び当該がんの転移性病変からなる群から選択される固体がんを治療するのに適している。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ細胞前リンパ性白血病、芽球性形質細胞樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞Ｂリンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ性増殖状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｉａ）及び骨髄異形成（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ）症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、黒色腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、または前白血病のうちの１つ以上から選択される血液癌を治療するのに適している。
いくつかの実施形態では、がんは、多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、がんは、Ｄｕｒｉｅ－Ｓａｌｍｏｎ病期分類システムに基づいた、ステージＩ、ステージＩＩ、もしくはステージＩＩＩ、及び／またはステージＡもしくはステージＢの多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、がんは、国際骨髄腫作業グループ（ＩＭＷＧ）によって刊行される国際病期分類システムに基づいた、ステージＩ、ステージＩＩ、またはステージＩＩＩの多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、がんは、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）である。いくつかの実施形態では、がんは、無症候性（くすぶり型／遅発性）骨髄腫である。いくつかの実施形態では、がんは、症候性または急性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、がんは、難治性多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、がんは、転移性多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、個体は、多発性骨髄腫に対するこれまでの治療に応答しなかった。いくつかの実施形態では、個体は、多発性骨髄腫のこれまでの治療後に進行性疾患を有する。いくつかの実施形態では、個体は、多発性骨髄腫に対する治療を少なくとも約２、３、４回、またはそれ以上のうちのいずれかの回数これまでに受けたことがある。いくつかの実施形態では、がんは、再発性多発性骨髄腫である。
いくつかの実施形態では、個体は、急性多発性骨髄腫を有する。いくつかの実施形態では、個体は、少なくとも１０％のクローン骨髄形質細胞を有する。いくつかの実施形態では、個体は、生検により確定診断された骨または髄外形質細胞腫を有する。いくつかの実施形態では、個体は、基礎にある形質細胞増殖疾患に起因し得る末端器官障害の証拠を有する。いくつかの実施形態では、個体は、例えば、血清カルシウムが正常上限より０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ超（１ｍｇ／ｄＬ超）高い、または２．７５ｍｍｏｌ／Ｌ超（１１ｍｇ／ｄＬ超）の高カルシウム血症を有する。いくつかの実施形態では、個体は、例えば、４０ｍＬ／分未満のクレアチニンクリアランスまたは１７７μｍｏｌ／Ｌ超（２ｍｇ／ｄＬ超）の血清クレアチニンである、腎不全を有する。いくつかの実施形態では、個体は、例えば、正常値最下限を２０ｇ／Ｌ超下回るヘモグロビン値、または１００ｇ／Ｌ未満のヘモグロビン値である、貧血を有する。いくつかの実施形態では、個体は、１つ以上の骨病変、例えば、骨格Ｘ線撮影、ＣＴ、またはＰＥＴ／ＣＴ上の１つ以上の骨破壊性病変を有する。いくつかの実施形態では、個体は、悪性腫瘍（ＭＤＥ）の以下のバイオマーカー：（１）骨髄検査における６０％以上のクローン形質細胞、（２）１００またはそれ以上の血清病変部／非病変部の遊離軽鎖比であるが、但し、病変部軽鎖の絶対レベルが少なくとも１００ｍｇ／Ｌであるものとする、（３）サイズが少なくとも５ｍｍ以上であるＭＲＩ上の１つを超える局所性病変、のうちの１つ以上を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、自己免疫疾患を治療するのに適している。自己免疫疾患または自己免疫は、生物がそれ自身の構成部分（サブ分子レベルまで）を「自己」として認識することができないことであり、それ自身の細胞及び組織に対する免疫応答をもたらす。そのような異常な免疫応答に起因するあらゆる疾患が、自己免疫疾患と称される。顕著な例としては、セリアック病、糖尿病１型（ＩＤＤＭ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、多発性硬化症（ＭＳ）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病、及び関節リウマチ（ＲＡ）が挙げられる。
炎症性疾患は、一般には、非常に毒性があり得るコルチコステロイド及び細胞毒性薬物で治療される。これらの薬物はまた、全免疫系を抑制し、重篤感染症もたらすこともあり、かつ骨髄、肝臓、及び腎臓に悪影響を及ぼし得る。これまでクラスＩＩＩ自己免疫疾患を治療するために使用されてきた他の治療薬は、Ｔ細胞及びマクロファージに向けられてきた。自己免疫疾患、特にクラスＩＩＩ自己免疫疾患を治療するより有効な方法が必要である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、自己免疫疾患を含む炎症性疾患を治療するのに適しており、Ｂ細胞障害に関連する疾患のクラスでもある。自己免疫疾患の例としては、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、真性糖尿病、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病、ポストストレプトコッカス腎炎（ｐｏｓｔ－ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡネフロパシー、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎（ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓｕｂｉｔｅｒａｎｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。シェーグレン症候群、原発性胆道肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡（ｐａｍｐｈｉｇｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ウェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発筋痛、悪性貧血（ｐｅｒｎｉｃｉｏｕｓａｎｅｍｉａ）、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、及び線維化性肺胞炎。
薬学的組成物の投与は、注入、輸液、インプランテーション、または移植によるものを含む任意の好都合な様態で行われ得る。本組成物は、患者に、経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内、または腹腔内投与され得る。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、全身投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、静脈内注入などの注入によって個体に投与される。免疫療法のための注入技法は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６（１９８８）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、個体に、皮内または皮下注射によって投与される。いくつかの実施形態では、本組成物は、静脈注射によって投与される。いくつかの実施形態では、本組成物は、腫瘍またはリンパ節に直接注射される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、腫瘍部位に、例えば、腫瘍細胞に直接、または腫瘍細胞を有する組織に局所投与される。
本発明の薬学的組成物の投薬量及び所望の薬物濃度は、想定される特定の使用に応じて異なり得る。適切な投薬量または投与経路の決定は、十分に当業者の技術の範囲内である。動物実験により、ヒト療法に有効な用量を決定するのに信頼できるガイダンスが提供される。有効な用量の種間スケーリングが、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．ａｎｄ Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．“Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｃａｌｉｎｇ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，” Ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｙａｃｏｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９，ｐｐ．４２－４６によって定められた原則に従って実施され得る。異なる製剤が異なる治療及び異なる障害に有効であり、特定の器官または組織を治療するよう意図された投与が別の器官または組織とは異なる様態での送達を必要とし得ることは、本出願の範囲内である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）を発現する修飾Ｔ細胞の集団を含む薬学的組成物については、薬学的組成物は、少なくとも約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、または１０９個の細胞／個体体重ｋｇのうちのいずれかの投薬量で投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約１０４～約１０５、約１０５～約１０６、約１０６～約１０７、約１０７～約１０８、約１０８～約１０９、約１０４～約１０９、約１０４～約１０６、約１０６～約１０８、または約１０５～約１０７個の細胞／個体体重ｋｇのうちのいずれかの投薬量で投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、少なくとも１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７個の細胞／ｋｇまたはそれ以上のうちのいずれかの用量で投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、少なくとも約３×１０５～約７×１０６個の細胞／ｋｇ、または約３×１０６個の細胞／ｋｇの用量で投与される。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、単回投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、複数回（２回、３回、４回、５回、６回、またはそれ以上の回数のうちのいずれか等）投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１か月に１回、２か月に１回、３か月に１回、４か月に１回、５か月に１回、６か月に１回、７か月に１回、８か月に１回、９か月に１回、または１年に１回投与される。いくつかの実施形態では、投与間の間隔は、約１週間～２週間、２週間～１か月、２週間～２か月、１か月～２か月、１か月～３か月、３か月～６か月、または６か月～１年のうちのいずれか１つである。特定の患者に最適な投薬量及び治療レジーム（ｒｅｇｉｍｅ）は、患者を疾患の兆候について監視し、適宜に治療を調整することによって、医学分野の技術者によって容易に決定され得る。
さらに、投薬量は、１回以上の別個の投与によって、または持続注入によって投与され得る。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約２回、３回、４回、５回、またはそれ以上の回数のうちのいずれかの１つの用量などの分割用量で投与される。いくつかの実施形態では、分割用量が、約１週間にわたって投与される。いくつかの実施形態では、分割用量は、等しく分割される。いくつかの実施形態では、分割用量は、総用量の約２０％、約３０％、約４０％、及び約５０％である。いくつかの実施形態では、連続した分割用量間の間隔は、約１日、２日、３日、またはそれ以上である。数日間以上にわたる反復投与の場合、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで治療が継続される。しかしながら、他の投薬量レジメンも有用であり得る。この療法の進行は、従来の技法及びアッセイによって容易に監視される。
いくつかの実施形態では、疾患（例えば、がん、感染性疾患、ＧｖＨＤ、移植拒絶、自己免疫障害、または放射線疾患）を有する個体（例えば、ヒト）を治療する方法が提供され、個体に、有効量の、（１）（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）を含む、修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系Ｔ細胞、内因性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞、ＧｖＨＤが最小限のＴ細胞）であって、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい、修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系Ｔ細胞、内因性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞、ＧｖＨＤが最小限のＴ細胞）と、（２）所望により、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、修飾Ｔ細胞は、配列番号１２１、１２２、１３６、または１３９のアミノ酸配列を含む外因性Ｎｅｆタンパク質などの外因性Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型、サブタイプ、または変異体Ｎｅｆ）をさらに発現する。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである。いくつかの実施形態では、個体は、修飾Ｔ細胞が由来する前駆体Ｔ細胞のドナーに対して組織不適合である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、静脈内投与される。いくつかの実施形態では、機能的外因性受容体は、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、例えば、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲまたはＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、配列番号７６～９６、９８～１０４、及び１０６～１１３のうちのいずれかの配列を含む。
いくつかの実施形態では、疾患（例えば、がん、感染性疾患、自己免疫障害、または放射線疾患）を有する個体（例えば、ヒト）を治療する方法が提供され、個体に、有効量の、（１）（ａ）細胞外リガンド結合ドメイン（１つ以上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０などの腫瘍抗原）のうちの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ）、受容体（例えば、ＦｃＲ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）の細胞外ドメイン（またはその一部分）など）と、（ｂ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８αに由来する）と、（ｃ）ＣＭＳＤ（例えば、配列番号４１～７４からなる群から選択される配列を含むＣＭＳＤ）を含むＩＳＤとを含む、機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）を発現する修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）であって、ＣＭＳＤは、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、所望により、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい、修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）と、（２）所望により、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである。いくつかの実施形態では、個体は、修飾Ｔ細胞が由来する前駆体Ｔ細胞のドナーに対して組織不適合である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、静脈内投与される。いくつかの実施形態では、機能的外因性受容体は、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載のＩＴＡＭ修飾ＣＡＲのうちのいずれか、例えば、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲまたはＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲは、配列番号７６～９６、９８～１０４、及び１０６～１１３のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、疾患は、がんである。いくつかの実施形態では、がんは、再発性または難治性多発性骨髄腫などの多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、治療効果は、個体における客観的臨床応答を引き起こすことを含む。いくつかの実施形態では、ストリンジェントな臨床奏効（ｓＣＲ）が個体において得られる。いくつかの実施形態では、治療効果は、個体における疾患寛解（部分的または完全）を引き起こすことを含む。いくつかにおいて、臨床的寛解は、個体が薬学的組成物を受けてから約６か月、５か月、４か月、３か月、２か月、１か月、またはそれ以下の後に得られる。いくつかの実施形態では、治療効果は、個体におけるがんの再発または疾患の進行を防ぐことを含む。いくつかの実施形態では、再発または疾患の進行を、少なくとも約６か月、１年、２年、３年、４年、５年、またはそれ以上の間防ぐ。いくつかの実施形態では、治療効果は、個体における生存（無病生存など）を延長することを含む。いくつかの実施形態では、治療効果は、個体における生活の質を改善することを含む。いくつかの実施形態では、治療効果は、固体腫瘍またはリンパ系腫瘍の成長を阻害するか、またはそのサイズを低減することを含む。
いくつかの実施形態では、固体腫瘍またはリンパ系腫瘍のサイズは、少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のうちのいずれかを含む）低減される。いくつかの実施形態では、個体における固体腫瘍またはリンパ系腫瘍の成長を阻害するか、またはそのサイズを低減する方法が、提供される。いくつかの実施形態では、治療効果は、個体における腫瘍転移を阻害することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のうちのいずれかを含む）の転移が阻害される。いくつかの実施形態では、リンパ節への転移を阻害する方法が提供される。いくつかの実施形態では、肺への転移を阻害する方法が提供される。いくつかの実施形態では、肝臓への転移を阻害する方法が提供される。転移は、当該技術分野における任意の既知の方法、例えば、血液試験、骨スキャン、Ｘ線スキャン、ＣＴスキャン、ＰＥＴスキャン、及び生検によって評価され得る。
本発明はまた、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）を発現する修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）、それらの単離集団、またはそれらを含む薬学的組成物を使用して、疾患及び障害を低減もしくは緩和、または予防もしくは治療する方法に関する。いくつかの実施形態では、修飾Ｔ細胞は、外因性Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型、サブタイプ、または変異体Ｎｅｆ）をさらに発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体を発現する修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）、それらの単離集団、またはそれらを含む薬学的組成物は、移植手術を受ける対象におけるがん、感染症、１つ以上の自己免疫疾患、放射線疾患を低減もしくは改善、または予防もしくは治療するために、または移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）もしくは移植拒絶反応を予防もしくは治療するために使用される。
本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）を発現する修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）、それらの単離集団、またはそれらを含む薬学的組成物は、これらのＴ細胞が成長中ＴＧＦ－βにおいて増殖し得、誘発性Ｔ制御性細胞になるように分化するため、自己免疫または移植拒絶反応を変化させるのに有用である。一実施形態では、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体は、これらの誘導性Ｔ制御性細胞に、疾患の組織部位でそれらの阻害機能を行うのに必要な機能的特異性を与えるために使用される。したがって、多数の抗原特異的制御性Ｔ細胞が、患者での使用のために増殖される。Ｔ制御性細胞の分化に不可欠なＦｏｘＰ３の発現は、フローサイトメトリーによって分析することができ、これらのＴ制御性細胞によるＴ細胞増殖の機能的阻害は、共培養時の抗ＣＤ３刺激後のＴ細胞増殖の減少を調べることによって分析することができる。いくつかの実施形態では、修飾Ｔ細胞は、外因性Ｎｅｆタンパク質をさらに発現する。
本発明の別の実施形態は、放射線疾患の予防または治療のために、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）を発現する修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）、それらの単離集団、またはそれらを含む薬学的組成物の使用に関する。放射線治療または曝露（例えば、汚染爆弾への曝露、放射線漏出）または骨髄細胞を除去する他の状態（ある特定の薬物療法）後の１つの課題は、造血系を再構築することである。骨髄移植を受けている患者では、移植後１５日目のリンパ球の絶対数は、転帰成功に相関する。リンパ球数の多い患者は、よく再構成されるため、良好なリンパ球再構成を有することが重要である。この影響の理由は明らかではないが、増殖因子の感染及び／または生成から、造血の再構築を好むリンパ球を保護することに起因し得る。いくつかの実施形態では、修飾Ｔ細胞は、外因性Ｎｅｆタンパク質をさらに発現する。
いくつかの実施形態では、本発明はまた、個体におけるドナーＴ細胞の持続性及び／または生着を増加させる方法も提供し、１）同種異系Ｔ細胞を提供することと、２）外来性Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型ＳＩＶ Ｎｅｆなどの野生型Ｎｅｆ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）などのＴＣＲ及び／またはＭＨＣ Ｉを下方調節する分子をコードする第１の核酸を同種異系Ｔ細胞に導入することとを含み、ＴＣＲ及び／またはＭＨＣ Ｉを下方調節する分子（例えば、外来性Ｎｅｆタンパク質）は、発現時に、同種異系Ｔ細胞の内在性ＴＣＲ、ＣＤ３、及び／またはＭＨＣ Ｉの下方調節（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、シグナル伝達の下方調節）をもたらす。いくつかの実施形態では、同種異系Ｔ細胞は、同種異系ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ－Ｔ細胞、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ－Ｔ細胞、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体をコードする第２の核酸を同種異系Ｔ細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の核酸は、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲをコードする。いくつかの実施形態では、第１の核酸及び第２の核酸は、別個のベクター上にある。いくつかの実施形態では、第１の核酸及び第２の核酸は、１つのプロモーターまたは異なるプロモーターのいずれかの制御下で、同じベクター上にある。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、個体（例えば、ヒト）におけるドナーＴ細胞の持続性及び／または生着を増加させる方法を提供し、１）同種異系Ｔ細胞を提供することと、２）ＴＣＲ及び／またはＭＨＣ Ｉを下方調節する分子（外来性Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型ＳＩＶ Ｎｅｆなどの野生型Ｎｅｆ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）など）をコードする第１の核酸及びＣＭＳＤ含有機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）をコードする第２の核酸を含むベクター（例えば、ウイルスベクター、レンチウイルスベクター）を同種異系Ｔ細胞に導入することとを含み、外来性Ｎｅｆタンパク質は、発現時に、同種異系Ｔ細胞の内在性ＴＣＲ、ＣＤ３、及び／またはＭＨＣ Ｉの下方調節（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、シグナル伝達の下方調節）をもたらす。いくつかの実施形態では、外因性Ｎｅｆタンパク質は、発現時に、内在性ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲα及び／またはＴＣＲβ）、ＣＤ３ε／δ／γ、及び／またはＭＨＣ Ｉを少なくとも約４０％（例えば、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のうちのいずれか）下方調節する（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能を下方調節する）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の外因性Ｎｅｆタンパク質を含む同種異系Ｔ細胞は、Ｎｅｆ発現することなく同じ同種異系Ｔ細胞によって誘発されるＧｖＨＤ応答と比較して、組織不適合性個体において、ＧｖＨＤ応答を誘発しないか、または低減させる（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のうちのいずれか低減させる）。いくつかの実施形態では、外因性Ｎｅｆは、配列番号１２１、１２２、１３６、または１３９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本発明はまた、ＧｖＨＤまたは移植拒絶反応を誘導することなく、同種異系Ｔ細胞移植を受ける個体における疾患（がん、感染性疾患、自己免疫疾患、または放射線疾患など）を治療する方法も提供し、ＴＣＲ及び／またはＭＨＣ Ｉを下方調節する分子（外来性Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型ＳＩＶ Ｎｅｆなどの野生型Ｎｅｆ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）など）をコードする第１の核酸を同種異系Ｔ細胞に導入することを含み、ＴＣＲ及び／またはＭＨＣ Ｉを下方調節する分子（外因性Ｎｅｆタンパク質など）は、発現時に、同種異系Ｔ細胞の内因性Ｔ細胞のＴＣＲ、ＣＤ３、及び／またはＭＨＣ Ｉの下方調節（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、シグナル伝達の下方制御）をもたらす。いくつかの実施形態では、同種異系Ｔ細胞は、同種異系ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ－Ｔ細胞、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ－Ｔ細胞、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体をコードする第２の核酸を同種異系Ｔ細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の核酸は、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、例えば、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲまたはＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲをコードする。いくつかの実施形態では、外因性Ｎｅｆタンパク質は、発現時に、内在性ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲα及び／またはＴＣＲβ）、ＣＤ３ε／δ／γ、及び／またはＭＨＣ Ｉを少なくとも約４０％（例えば、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のうちのいずれか）下方調節する（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能を下方調節する）。いくつかの実施形態では、外因性Ｎｅｆは、配列番号１２１、１２２、１３６、または１３９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本発明はまた、同種異系ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞のＧｖＨＤまたは移植拒絶反応を低減させる方法も提供し、ＴＣＲ及び／またはＭＨＣ Ｉを下方調節する分子（外来性Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型ＳＩＶ Ｎｅｆなどの野生型Ｎｅｆ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）など）をコードする核酸を同種異系ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞に導入することを含み、ＴＣＲ及び／またはＭＨＣ Ｉを下方調節する分子（外因性Ｎｅｆタンパク質など）は、発現時に、同種異系ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞の内因性ＴＣＲ、ＣＤ３、及び／またはＭＨＣ Ｉの下方調節（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能、例えば、シグナル伝達の下方制御）をもたらす。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ及び／またはＭＨＣ Ｉを下方調節する分子（外来性Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型ＳＩＶ Ｎｅｆなどの野生型Ｎｅｆ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）など）は、発現時に、内在性ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲα及び／またはＴＣＲβ）、ＣＤ３、及び／またはＭＨＣ Ｉを少なくとも約４０％（例えば、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のうちのいずれか）下方調節する（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能を下方調節する）。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ及び／またはＭＨＣ Ｉを下方調節する分子（外来性Ｎｅｆタンパク質（例えば、野生型ＳＩＶ Ｎｅｆなどの野生型Ｎｅｆ、または変異体ＳＩＶ Ｎｅｆなどの変異体Ｎｅｆ）など）は、発現時に、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲを下方調節しない（例えば、細胞表面発現及び／またはエフェクター機能を下方調節しない）か、またはＩＴＡＭ修飾ＣＡＲを最大で約８０％（例えば、最大で約７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちのいずれか）下方調節する。いくつかの実施形態では、外因性Ｎｅｆは、配列番号１２１、１２２、１３６、または１３９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の外因性Ｎｅｆタンパク質を含む同種異系ＩＴＡＭ修飾Ｔ細胞は、Ｎｅｆ発現することなく同じドナー源からの同種異系ＩＴＡＭ修飾Ｔ細胞によって誘発されるＧｖＨＤ応答と比較して、組織不適合性個体において、ＧｖＨＤ応答を誘発しないか、または低減させる（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のうちのいずれか低減させる）。
ＩＸ．キット及び製品
本明細書に記載のＣＭＳＤを含む機能的外因性受容体（例えば、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ、ＩＴＡＭ修飾ＴＣＲ、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲ、またはＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体）を発現する修飾Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己Ｔ細胞）のうちのいずれか１つを含むキット、単位投薬量、及び製品を、さらに提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物のうちのいずれか１つを含むキットが提供され、好ましくは、その使用に関する指示を提供する。
本出願のキットは、好適なパッケージング内に存在する。好適なパッケージングとしては、バイアル、ボトル、瓶、可撓性パッケージング（例えば、密封マイラーまたはプラスチック袋）等が挙げられるが、これらに限定されない。キットは、所望により、緩衝液及び解釈情報などの追加の成分を提供してもよい。したがって、本出願は、バイアル（密封バイアルなど）、ボトル、瓶、可撓性パッケージングなどを含む製品も提供する。
製品は、容器及び容器上のまたは容器に関連するラベルまたは添付文書を含み得る。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。一般に、容器は、本明細書に記載の疾患または障害（例えば、がん、自己免疫疾患、もしくは感染性疾患）を治療するか、あるいは疾患または障害を治療する場合にＧｖＨＤもしくは移植拒絶反応を低減／予防するのに有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈用溶液袋またはバイアルであり得る）。ラベルまたは添付文書は、組成物が個体における特定の状態の治療のために使用されることを示す。ラベルまたは添付文書は、個体への組成物の投与に関する指示をさらに含む。ラベルは、再構成及び／または使用に関する指示を示し得る。薬学的組成物を保持する容器は、再構成された製剤の繰り返し投与（例えば、２～６回の投与）を可能にする複数回使用バイアルであり得る。添付文書とは、かかる治療薬の適応症、使用、投薬量、投与、禁忌、及び／またはその使用に関する警告についての情報を含む、治療薬の商業用パッケージに通例含まれる指示を指す。さらに、製品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液を含む第２の容器をさらに含み得る。製品は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。キットまたは製品は、薬局、例えば、病院薬局及び配合薬局での保管及び使用に十分な量でパッケージングされる、薬学的組成物の複数の単位用量及び使用に関する指示を含み得る。
以下の実施例及び例示的な実施形態は、単に本発明の例示となるよう意図されており、それ故に、決して本発明を限定するものとみなされるべきではない。以下の実施例及び詳細な説明は、限定するものではなく、例証として提供されている。
実施例１．ＣＭＳＤ ＩＴＡＭ活性化活性の評価
１．ＩＳＤ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲの構築
様々な細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）を含むＣＡＲの活性化活性を試験するために、ＩＳＤ修飾ＣＡＲを構築した。「ＩＳＤ修飾ＣＡＲ」は、必ずしも本明細書に記載のＩＴＡＭ修飾ＣＡＲであるとは限らないが、ＩＳＤにおける任意の修飾を伴うＣＡＲを記載するために本明細書で使用される。例えば、表１の構築物はすべて「ＩＳＤ修飾ＣＡＲ」であるが、Ｍ６６３、Ｍ６６５、Ｍ６６６、Ｍ６６７、Ｍ６７８、Ｍ６７９、Ｍ６８０、Ｍ６８１、Ｍ６８２、Ｍ６８３、Ｍ６８４、Ｍ６８５、及びＭ７９９のみが本明細書に記載の「ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ」である。
ｐＬＶＸ－Ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，＃６３２１６４）は、多重クローニング部位（ＭＣＳ）のすぐ上流に位置する構成的に活性なヒトサイトメガロウイルス即時型初期プロモーター（ＰＣＭＶ ＩＥ）を含むＨＩＶ－１ベースのレンチウイルス発現ベクターである。自家レンチウイルスベクターが、ｐＬＶＸ－Ｐｕｒｏの元のＰＣＭＶＩＥプロモーターを、Ｃ末端にＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩ制限部位を担持するヒト伸長因子１α（ｈＥＦ１α）プロモーター配列（以下、「ｐＬＶＸ－ｈＥＦ１α－Ｐｕｒｏレンチウイルスベクター」と称される）と置き換えることによって産生された。簡言すれば、表１に示される様々なＩＳＤ構造を有するＣＤ８α ＳＰ－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－ＩＳＤをコードするポリヌクレオチド、ならびに対照構築物ＣＤ８α ＳＰ－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－ＣＤ３ζ（「Ｍ６６０」）及びＣＤ８α ＳＰ－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－リンカー２－４－１ＢＢ－リンカー２－４－１ＢＢ（「Ｍ６６１」）をコードするポリヌクレオチドを化学的に合成し（対応するＩＳＤ修飾ＣＡＲ構築物名は表１を参照のこと）、それぞれ、ＩＳＤ修飾ＣＡＲ組換えトランスファープラスミドの構築のために、ｐＬＶＸ－ｈＥＦ１α－Ｐｕｒｏレンチウイルスベクターにクローニングした。次いで、これらのトランスファープラスミドを、それぞれ、以下のレンチウイルスパッケージング手順に供した。
ｐｓＰＡＸ２を含有するレンチウイルスパッケージングプラスミド混合物（パッケージング；Ａｄｄｇｅｎｅ、＃１２２６０）及びｐＭＤ２．Ｇ（エンベロープ；Ａｄｄｇｅｎｅ、＃１２２５９）を、それぞれ、上記のＩＳＤ修飾ＣＡＲトランスファープラスミドと予め混合し、室温でインキュベートし、次いで、それぞれ、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に形質導入した。形質導入から６０時間後、レンチウイルスを含有する上清を、細胞形質導入混合物を４℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって回収した。上清を、０．４５μｍフィルターを使用して濾過し、５００ＫＤ中空繊維膜接線流濾過を使用してさらに濃縮して、濃縮レンチウイルスを得た。これらの濃縮されたレンチウイルス（以下、Ｍ６６０レンチウイルス（対照）、Ｍ６６１レンチウイルス、Ｍ６６２レンチウイルス、Ｍ６６３レンチウイルス、Ｍ６６５レンチウイルス、Ｍ６６６レンチウイルス、Ｍ６６７レンチウイルス、Ｍ６６８レンチウイルス、Ｍ６７９レンチウイルス、Ｍ６８０レンチウイルス、Ｍ６８１レンチウイルス、Ｍ６８２レンチウイルス、Ｍ６８３レンチウイルス、Ｍ６８４レンチウイルス、Ｍ６８５レンチウイルス、及びＭ７９９レンチウイルス、または集合的に、ＩＳＤ修飾ＣＡＲレンチウイルスと称される）を、－８０℃で保存した。
Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、＃ＴＩＢ１５２（商標））を、９０％ ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃２２４００－０８９）及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃１００９９－１４１）中で培養した。上記からのＩＳＤ修飾ＣＡＲレンチウイルスを、それぞれ、形質導入のためにＪｕｒｋａｔ細胞培養物（以下、Ｊｕｒｋａｔ－ＩＳＤ修飾ＣＡＲと称される）の上清に添加した。形質導入から７２時間後、１μｇ／ｍＬのピュロマイシンを２週間使用して、陽性細胞クローンを選択した。

Figure 2022547837000001
２．ＩＳＤ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲに特異的な活性化活性の評価
上記の１×１０６個のＪｕｒｋａｔ－ＩＳＤ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ細胞を、それぞれ、１：１のＥ：Ｔ比で、標的細胞株ＲＰＭＩ８２２６（ＣＦＳＥ標識あり）及び非標的細胞株Ｋ５６２（ＣＦＳＥ標識あり）と混合した。混合した細胞を２４ウェルプレートに添加し、１ｍＬ／ウェルの最終体積になるまでＲＰＭＩ １６４０培地（１０％ ＦＢＳを含有する）で補充して、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター内でインキュベートした。各共培養アッセイからの試料を回収し、それぞれ、２．５時間のインキュベーション後のＣＤ６９発現、２４時間のインキュベーション後のＣＤ２５発現、及びＣＦＳＥ陰性細胞における１４４時間のインキュベーション後のＨＬＡ－ＤＲ発現を評価した。非形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞（「Ｊｕｒｋａｔ」）は、対照としての役割を果たした。
図１Ａ～１Ｃに示すように、Ｊｕｒｋａｔ－ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ細胞における活性化分子ＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＨＬＡ－ＤＲの発現は、標的細胞株ＲＰＭＩ８２２６の刺激下で有意に増加した（Ｐ＜０．０５）。一方、非標的細胞株Ｋ５６２と共培養したＪｕｒｋａｔ－ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ細胞では、ＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＨＬＡ－ＤＲの発現は検出されなかった。これらのデータは、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＭＳＤ ＩＴＡＭの配置が、ＣＡＲ媒介性特異的活性を有することを示唆している。
３．ＳＩＶ ＮｅｆまたはＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６は、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１またはＣＤ３ζのＩＴＡＭ２を介してＣＡＲ発現に影響を及ぼす
野生型ＳＩＶ Ｎｅｆ配列、ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６配列、及び空のベクターを担持するレンチウイルスを、それぞれ、形質導入のためにＪｕｒｋａｔ－ＩＳＤ修飾ＣＡＲ細胞培養物の懸濁液に添加した。形質導入から３日、６日、７日、及び８日後、５×１０５個の細胞を回収し、室温で遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を１ｍＬのＤＰＢＳで再懸濁し、１μＬのＦＩＴＣ標識ヒトＢＣＭＡタンパク質（ＡＣＲＯＢＩＯＳＹＳＴＥＭ、＃ＢＣＡ－ＨＦ２５４－２００ＵＧ）を添加し、懸濁液を４℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、ＤＰＢＳステップでの遠心分離及び再懸濁を２回繰り返した。次いで、細胞を、ＦＡＣＳのためのＤＰＢＳで再懸濁して、ＢＣＭＡ ＩＳＤ修飾ＣＡＲ発現を検出した。各Ｊｕｒｋａｔ－ＩＳＤ修飾ＣＡＲ－ＳＩＶ Ｎｅｆ細胞及びＪｕｒｋａｔ－ＩＳＤ修飾ＣＡＲ－ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６細胞のＩＳＤ修飾ＣＡＲの相対発現率を、空のベクターを同時に形質導入した各対照で正規化し、以下の式を使用して計算する：ＩＳＤ修飾ＣＡＲ相対発現（％）＝［試料（％）］／［対照（％）］×１００％例えば、３日目における「Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６６１－ＳＩＶ Ｎｅｆ」のＩＳＤ修飾ＣＡＲの相対発現値は、以下のように計算する：ＩＳＤ修飾ＣＡＲ相対発現（％）＝［Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６６１－ＳＩＶ Ｎｅｆ（％）］／［Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６６１－空のベクター（％）］×１００％
図１Ｄ～１Ｆに示すように、各Ｊｕｒｋａｔ－ＩＳＤ修飾ＣＡＲ－ＳＩＶ Ｎｅｆ細胞（図１Ｅ）及びＪｕｒｋａｔ－ＩＳＤ修飾ＣＡＲ －ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６細胞（図１Ｆ）のＩＳＤ修飾ＣＡＲ陽性率は、同じ時点（ＳＩＶ Ｎｅｆ配列、ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６配列、または空のベクターを担持するレンチウイルスの形質導入の０日目、３日目、６日目、７日目、及び８日目など）で、Ｊｕｒｋａｔ－ＩＳＤ修飾ＣＡＲ－空のベクター細胞（図７Ｄ）の対照で正規化される。Ｎｅｆ／対照レンチウイルス形質導入から３日後、Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６６３－ＳＩＶ Ｎｅｆ細胞、Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６６５－ＳＩＶ Ｎｅｆ細胞、及びＪｕｒｋａｔ－Ｍ６６６－ＳＩＶ Ｎｅｆ細胞のＩＳＤ修飾ＣＡＲ陽性率は、３日目の対照と比較して、それぞれ、４６．７２％、８２．３１％、及び５７．０４％に低下した。Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６６３－ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６細胞、Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６６５－ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６細胞、及びＪｕｒｋａｔ－Ｍ６６６－ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６細胞のＩＳＤ修飾ＣＡＲ陽性率は、３日目の対照と比較して、それぞれ、５０．９２％、７０．３５％、及び５６．２２％に低下したが、一方で、Ｊｕｒｋａｔ－ＩＳＤ修飾ＣＡＲ －空のベクター細胞のＩＳＤ修飾ＣＡＲ陽性率は、対照として、すべて９５％超であった。Ｎｅｆ／対照レンチウイルス形質導入から６日、７日、及び８日後、ＩＳＤ修飾ＣＡＲ発現は、各群において安定しており、Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６６３－ＳＩＶ Ｎｅｆ細胞、Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６６５－ＳＩＶ Ｎｅｆ細胞、及びＪｕｒｋａｔ－Ｍ６６６－ＳＩＶ Ｎｅｆ細胞のＩＳＤ修飾ＣＡＲ陽性率は、４１．１９％から６９．８４％に低下し、Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６６３－ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６細胞、Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６６５－ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６細胞、及びＪｕｒｋａｔ－Ｍ６６６－ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６細胞のＩＳＤ修飾ＣＡＲ陽性率は、４４．６５％から６４．９４％に低下したが、一方で、Ｊｕｒｋａｔ－ＩＳＤ修飾ＣＡＲ－空のベクター細胞のＩＳＤ修飾ＣＡＲ陽性率は、対照として、依然として９５％超であった。
表１に示すように、Ｍ６６３（ＩＴＡＭ１／２／３）、Ｍ６６５（ＩＴＡＭ１／１／１）、Ｍ６６６（ＩＴＡＭ２／２／２）、及びＭ６６７（ＩＴＡＭ３／３／３）のＩＳＤは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭを含むが、一方、Ｍ６６２（０ ＩＴＡＭ）のＩＳＤは、ＣＤ３ζの非ＩＴＡＭ配列のみを含む。上記で見られたＭ６６２及びＭ６６７ではなく、Ｍ６６３、Ｍ６６５、及びＭ６６６のＳＩＶ ＮｅｆまたはＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６による下方調節は、ＳＩＶ Ｎｅｆ及びＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６が、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３または非ＩＴＡＭＣＤ３ζ配列ではないが、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１及びＣＤ３ζのＩＴＡＭ２と相互作用することによってＣＡＲ発現を調節することを示し、さらに、ＳＩＶ Ｎｅｆ及びＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６は、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１と比較して、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ２とのより強力な相互作用を有する（ＣＡＲ＋率Ｍ６６３＜Ｍ６６６＜Ｍ６６５を参照のこと）。他の試験されたＩＳＤは、いずれのＣＤ３ζ配列も含有せず、ＳＩＶ Ｎｅｆ及びＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６は、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ＣＤ３εのＩＴＡＭ、ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ、ＩｇαのＩＴＡＭ、ＩｇβのＩＴＡＭ、またはＦｃεＲＩγのＩＴＡＭと相互作用しないようである（図１Ｄ～１Ｆ）。
４．ＳＩＶ Ｎｅｆ及びＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６と、それぞれ、ＣＤ３δのＩＴＡＭ、ＣＤ３γのＩＴＡＭ、ＦｃεＲＩβのＩＴＡＭ、及びＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１のＩＴＡＭとの相互作用
野生型ＳＩＶ Ｎｅｆ配列、ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６配列、及び空のベクターを担持するレンチウイルスを、形質導入のためにＪｕｒｋａｔ－ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ（Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６６３、Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６７８、Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６８０、Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６８４、及びＪｕｒｋａｔ－Ｍ７９９）細胞培養物の懸濁液に別々に添加した。形質導入から３日、６日、７日、及び８日後、５×１０５個の細胞を回収し、室温で遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を１ｍＬのＤＰＢＳで再懸濁し、１μＬのＦＩＴＣ標識ヒトＢＣＭＡタンパク質（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３１０９０６）を添加し、懸濁液を４℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、ＤＰＢＳステップでの遠心分離及び再懸濁を２回繰り返した。次いで、細胞を、ＦＡＣＳのためにＤＰＢＳで再懸濁して、ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現を検出した。
図１Ｇ～１Ｉに示すように、各Ｊｕｒｋａｔ－ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ細胞のＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ陽性率は、９５％超であった。それぞれ、ＳＩＶ Ｎｅｆ、ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６、及び空のベクターで形質導入されたＪｕｒｋａｔ－Ｍ６７８細胞、Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６８０細胞、Ｊｕｒｋａｔ－Ｍ６８４細胞、及びＪｕｒｋａｔ－Ｍ７９９細胞において、ＣＡＲ陽性率の有意な下方調節は観察されなかった（Ｐ＞０．０５）。それぞれ、ＳＩＶ Ｎｅｆ及びＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６で形質導入されたＪｕｒｋａｔ－Ｍ６６３のＣＡＲ陽性率は、インキュベーション時間の増加に伴って有意に下方調節した（Ｐ＜０．０５）。これらのデータは、ＳＩＶ Ｎｅｆ及びＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６が、Ｍ６７８（ＣＤ３δのＩＴＡＭ）、Ｍ６８０（ＣＤ３γのＩＴＡＭ）、Ｍ６８４（ＦｃεＲＩβのＩＴＡＭ）、またはＭ７９９（ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１のＩＴＡＭ）と相互作用しないようであることを示唆している。
実施例２．ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ細胞毒性分析
１．ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ細胞毒性評価
ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲを構築するために、ＣＤ８α ＳＰ－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ（「ＢＣＭＡ－ＢＢ」；４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインのみを含有する）、ＣＤ８α ＳＰ－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ（「ＢＣＭＡ－ＢＢｚ」、配列番号７５）、ＣＤ８α ＳＰ－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＩＴＡＭ００７（「ＢＣＭＡ－ＢＢ００７」）、ＣＤ８α ＳＰ－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＩＴＡＭ００８（「ＢＣＭＡ－ＢＢ００８」）、ＣＤ８α ＳＰ－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＩＴＡＭ００９（「ＢＣＭＡ－ＢＢ００９」）、及びＣＤ８α ＳＰ－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＩＴＡＭ０１０（「ＢＣＭＡ－ＢＢ０１０」）をコードする融合遺伝子配列を化学的に合成して、それぞれ、以下、ｐＬＶＸ－ＢＣＭＡ－ＢＢトランスファープラスミド（陰性対照）、ｐＬＶＸ－ＢＣＭＡ－ＢＢｚトランスファープラスミド（陽性対照）、及びｐＬＶＸ－ＢＣＭＡ－（ＢＢ００７－ＢＢ０１０）トランスファープラスミドと称される組換えトランスファープラスミド（ＩＴＡＭ構築物構造については、表２を参照のこと）の構築のために、ｐＬＶＸ－ｈＥＦ１α－Ｐｕｒｏレンチウイルスベクター（実施例１を参照のこと）にクローニングした。すべてのレンチウイルストランスファープラスミドを精製し、実施例１に記載のように、レンチウイルス（以下、それぞれ、ＢＣＭＡ－ＢＢレンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢｚレンチウイルス、及びＢＣＭＡ－（ＢＢ００７～ＢＢ０１０）レンチウイルスと称される）にパッケージングした。

Figure 2022547837000002
５０ｍＬの末梢血を、ボランティアから抽出した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離によって単離した。汎Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０－０９６－５３５）を使用して、ＰＢＭＣを磁気標識し、Ｔリンパ球を単離及び精製した。ＣＤ３／ＣＤ２８にコンジュゲートした磁気ビーズを、精製されたＴリンパ球の活性化及び増殖のために使用した。活性化されたＴリンパ球を回収し、ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃２２４００－０８９）に再懸濁した。活性化から３日後、５×１０６個の活性化Ｔリンパ球を、それぞれ、レンチウイルスＢＣＭＡ－ＢＢ、ＢＣＭＡ－ＢＢｚ、ＢＣＭＡ－ＢＢ００７、ＢＣＭＡ－ＢＢ００８、ＢＣＭＡ－ＢＢ００９、及びＢＣＭＡ－ＢＢ０１０で形質導入した（以下、それぞれ、ＢＣＭＡ－ＢＢ Ｔ細胞、ＢＣＭＡ－ＢＢｚ Ｔ細胞、及びＢＣＭＡ－（ＢＢ００７～ＢＢ０１０）Ｔ細胞と称される）。Ｔ細胞懸濁液を６ウェルプレートに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター内で一晩インキュベートした。形質導入から３日後、修飾Ｔ細胞を、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ（ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）マーカーを有する、ＢＣＭＡ＋）との４０：１のエフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比でそれぞれ混合し、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３８４ウェル固体白色プレート中で１２時間インキュベートした。ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（ＰＲＯＭＥＧＡ、＃Ｂ６１１０）を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。２５μＬのＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）試薬を、３８４ウェルプレートの各ウェルに添加し、インキュベートし、次いで、標的細胞上の異なるＴリンパ球の細胞毒性を計算するために、蛍光測定のためにＳＰＡＲＫ（商標）１０Ｍマルチモードマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）上に配置した。
図２Ａに示すように、一次ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを有さない陰性対照ＢＣＭＡ－ＢＢは、腫瘍細胞死滅を媒介することができなかった。ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ（ＢＣＭＡ－ＢＢ００７、ＢＣＭＡ－ＢＢ００８、ＢＣＭＡ－ＢＢ００９、及びＢＣＭＡ－ＢＢ０１０）はすべて、ＵｎＴと比較して、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞株上の腫瘍細胞死滅を媒介することができた（Ｐ＜０．０５）。ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ（ＢＣＭＡ－（ＢＢ００７～ＢＢ０１０））及び従来のＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン（ＢＣＭＡ－ＢＢｚ）を有するＢＣＭＡ ＣＡＲの間では、細胞毒性に有意差は認められなかった（Ｐ＞０．０５）。これらのデータは、本明細書に記載のキメラシグナル伝達ドメイン（例えば、ＩＴＡＭ００７～ＩＴＡＭ０１０）が、腫瘍細胞死滅を保持するＩＴＡＭ修飾ＣＡＲを構築するための有望な戦略を提供し得ることを示唆している。
２．ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ細胞毒性評価
ＣＤ８α ＳＰ－ＣＤ２０ ｓｃＦｖ（Ｌｅｕ１６）－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ（「ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ」、配列番号９７）、及びＣＤ８α ＳＰ－ＣＤ２０ ｓｃＦｖ （Ｌｅｕ１６）－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＩＴＡＭ０１０（「ＣＤ２０－ＢＢ０１０」と称される、配列番号９８）をコードする融合遺伝子配列を化学的に合成し、それぞれ、ｐＬＶＸ－ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ及びｐＬＶＸ－ＣＤ２０－ＢＢ０１０組換えトランスファープラスミドの構築のために、ｐＬＶＸ－ｈＥＦ１α－Ｐｕｒｏレンチウイルスベクター（実施例１を参照のこと）にクローニングした。レンチウイルストランスファープラスミドを精製し、実施例１に記載のレンチウイルス（以下、それぞれ、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓレンチウイルス及びＣＤ２０－ＢＢ０１０レンチウイルスと称される）にパッケージングした。
ＰＢＭＣ及びＴリンパ球を、上記の方法に従って調製した。活性化から３日後、５×１０６個の活性化Ｔリンパ球を、それぞれ、レンチウイルスＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ（ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞と称される）及びＣＤ２０－ＢＢ０１０（ＣＤ２０－ＢＢ０１０ Ｔ細胞と称される）で形質導入した。Ｔ細胞懸濁液を６ウェルプレートに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター内で一晩インキュベートした。形質導入から３日後、修飾Ｔ細胞を、それぞれ、２０：１のＥ：Ｔ比でリンパ腫Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ（ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）マーカーを有する、ＣＤ２０＋）細胞株と混合し、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３８４ウェル固体白色プレート中で１２時間インキュベートした。ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（ＰＲＯＭＥＧＡ、＃Ｂ６１１０）を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。２５μＬのＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）試薬を、３８４ウェルプレートの各ウェルに添加し、インキュベートし、次いで、標的細胞上の異なるＴリンパ球の細胞毒性を計算するために、蛍光測定のためにＳＰＡＲＫ（商標）１０Ｍマルチモードマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）上に配置した。非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）は、対照としての役割を果たした。
図２Ｂに示すように、ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ（ＣＤ２０－ＢＢ０１０）及びＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓの両方が、ＵｎＴと比較して、はるかに強力な細胞毒性を示し（Ｐ＜０．０５）、ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ（ＣＤ２０－ＢＢ０１０）は、従来のＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを有するＣＤ２０ ＣＡＲ（ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ）と同様の細胞毒性を示す（Ｐ＞０．０５）。
要約すると、上記のデータは、本明細書に記載のキメラシグナル伝達ドメイン（例えば、ＩＴＡＭ００７～ＩＴＡＭ０１０）が、腫瘍細胞死滅を保持するＩＴＡＭ修飾ＣＡＲを構築するための有望な戦略を提供し得ることを示唆している。
実施例３．ＣＡＲ－Ｔ細胞活性におけるキメラシグナル伝達ドメインのＣＭＳＤリンカーの影響
１．ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲの構築
ＩＴＡＭ０１０細胞内シグナル伝達ドメインのＣＭＳＤリンカーを欠失または置き換えて、ＩＴＡＭ０２４構築物、ＩＴＡＭ０２５構築物、ＩＴＡＭ０２６構築物、ＩＴＡＭ０２７構築物、ＩＴＡＭ０２８構築物、及びＩＴＡＭ０２９構築物を形成した（対応するＩＴＡＭ構築物は表３を参照のこと）。ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲを構築するために、ＢＣＭＡ－ＢＢｚのＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ８α ＳＰ－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ）を、それぞれ、ｐＬＶＸ－ＢＣＭＡ－ＢＢ０２４、ｐＬＶＸ－ＢＣＭＡ－ＢＢ０２５、ｐＬＶＸ－ＢＣＭＡ－ＢＢ０２６、ｐＬＶＸ－ＢＣＭＡ－ＢＢ０２７、ｐＬＶＸ－ＢＣＭＡ－ＢＢ０２８、及びｐＬＶＸ－ＢＣＭＡ－ＢＢ０２９トランスファープラスミドの構築のために上記の構築物で置き換えた。次いで、これらのトランスファープラスミドを精製し、それぞれ、実施例１に記載のレンチウイルス（以下、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２４レンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２５レンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２６レンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２７レンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２８レンチウイルス、及びＢＣＭＡ－ＢＢ０２９レンチウイルスと称される）にパッケージングした。

Figure 2022547837000003
２．インビトロアッセイにおけるＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性
ＰＢＭＣ及びＴリンパ球を、実施例２に記載の方法に従って調製した。活性化から３日後、５×１０６個の活性化Ｔリンパ球を、それぞれ、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするレンチウイルス（実施例２からのＢＣＭＡ－ＢＢ０１０レンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２４レンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２５レンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２６レンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２７レンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２８レンチウイルス、及びＢＣＭＡ－ＢＢ０２９レンチウイルス）ならびに対照ＢＣＭＡ－ＢＢｚレンチウイルスで形質導入した。Ｔ細胞懸濁液を６ウェルプレートに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター内で一晩インキュベートした。形質導入から３日後、修飾Ｔ細胞を、それぞれ、２．５：１のＥ：Ｔ比で多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃと混合し、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３８４ウェル固体白色プレート中で１２時間インキュベートした。ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（ＴＡＫＡＲＡ、＃Ｂ６１２０）を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。２５μＬのＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）試薬を、３８４ウェルプレートの各ウェルに添加し、インキュベートし、次いで、標的細胞上の異なるＴリンパ球の細胞毒性を計算するために、蛍光測定のためにＳＰＡＲＫ（商標）１０Ｍマルチモードマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）上に配置した。非形質導入Ｔ細胞（「ＵｎＴ」）は、対照としての役割を果たした。
図３に示すように、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２４、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、互いに直接連結され、ＢＣＭＡ－ＢＢ０１０、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２５、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２６、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２７、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２８、及びＢＣＭＡ－ＢＢ０２９、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭは、異なるＣＭＳＤリンカーによって接続され、これらはすべて、ＵｎＴと比較して、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞株上で有意に特異的な腫瘍細胞死滅を媒介することが可能であった（Ｐ＜０．０５）。ＢＣＭＡ－ＢＢ０２５、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２８、及びＢＣＭＡ－ＢＢ０２９は、ＢＣＭＡ－ＢＢｚと比較して、有意にＣＡＲ特異的な細胞毒性を示した（Ｐ＜０．０５）。ＢＣＭＡ－ＢＢ０１０、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２４、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２６、ＢＣＭＡ－ＢＢ０２７、及び従来のＣＤ３ζのＩＳＤを有するＢＣＭＡ ＣＡＲ（ＢＣＭＡ－ＢＢｚ）の間で、細胞毒性の有意差は観察されなかった（Ｐ＞０．０５）。これらのデータは、キメラシグナル伝達ドメインのＣＭＳＤリンカーが、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ媒介性の特異的な細胞毒性を損なわないことを示唆している。
実施例４．ＣＡＲ－Ｔ細胞活性におけるＣＭＳＤ ＩＴＡＭの順序の影響
１．ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲの構築
ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲを構築するために、ＢＣＭＡ－ＢＢ０１０のＩＴＡＭ０１０細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ８α ＳＰ－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＩＴＡＭ０１０）を、それぞれ、ｐＬＶＸ－ＢＣＭＡ－ＢＢ０３０、ｐＬＶＸ－ＢＣＭＡ－ＢＢ０３１、及びｐＬＶＸ－ＢＣＭＡ－ＢＢ０３２トランスファープラスミドの構築のために、ＩＴＡＭ０３０、ＩＴＡＭ０３１、及びＩＴＡＭ０３２（対応するＩＴＡＭ構築物は表４を参照のこと）などのＩＴＡＭ０１０から異なる順序のＩＴＡＭを含むＩＴＡＭ構築物で置き換えた。次いで、これらのトランスファープラスミドを精製し、実施例１に記載のレンチウイルス（以下、それぞれ、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３０レンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３１レンチウイルス、及びＢＣＭＡ－ＢＢ０３２レンチウイルスと称される）にパッケージングした。

Figure 2022547837000004
２．インビトロアッセイにおけるＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性
ＰＢＭＣ及びＴリンパ球を、実施例２に記載の方法に従って調製した。活性化から３日後、５×１０６個の活性化Ｔリンパ球を、それぞれ、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするレンチウイルス（実施例２からのＢＣＭＡ－ＢＢ０１０レンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３０レンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３１レンチウイルス、及びＢＣＭＡ－ＢＢ０３２レンチウイルスを含む）ならびに対照ＢＣＭＡ－ＢＢｚレンチウイルスで形質導入した。Ｔ細胞懸濁液を６ウェルプレートに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター内で一晩インキュベートした。形質導入から３日後、修飾Ｔ細胞を、それぞれ、２．５：１のＥ：Ｔ比で多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃと混合し、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３８４ウェル固体白色プレート中で１２時間インキュベートした。ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（ＴＡＫＡＲＡ、＃Ｂ６１２０）を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。２５μＬのＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）試薬を、３８４ウェルプレートの各ウェルに添加し、インキュベートし、次いで、標的細胞上の異なるＴリンパ球の細胞毒性を計算するために、蛍光測定のためにＳＰＡＲＫ（商標）１０Ｍマルチモードマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）上に配置した。非形質導入Ｔ細胞（「ＵｎＴ」）は、対照としての役割を果たした。
図４に示すように、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＢＣＭＡ－ＢＢ０３０～ＢＣＭＡ－ＢＢ０３２）はすべて、ＵｎＴと比較して、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞株上で有意に特異的な腫瘍細胞死滅を媒介することが可能であった（Ｐ＜０．０５）。ＢＣＭＡ－ＢＢ０３１及びＢＣＭＡ－ＢＢ０３２は、ＢＣＭＡ－ＢＢｚと比較して、有意にＣＡＲ特異的な細胞毒性を示した（Ｐ＜０．０５）。ＢＣＭＡ－ＢＢ０１０及びＢＣＭＡ－ＢＢ０３０とＢＣＭＡ－ＢＢｚとの間で、細胞毒性の有意差は観察されなかった（Ｐ＞０．０５）。これらの結果は、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭの再配置が、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ媒介性の特異的な細胞毒性を損なわないことを示唆している。
実施例５．ＣＡＲ－Ｔ細胞活性におけるＣＭＳＤ ＩＴＡＭの量及び供給源の影響
１．ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲの構築
ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ、細胞内シグナル伝達ドメインは、それぞれ、１つ、２つ、３つ、または４つのＣＭＳＤ ＩＴＡＭからなるが、一方、異なる供給源を試験した。ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲを構築するために、ＢＣＭＡ－ＢＢｚのＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン（Ｄ８α ＳＰ－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ）を、それぞれ、ｐＬＶＸ－ＢＣＭＡ－ＢＢ０３３、ｐＬＶＸ－ＢＣＭＡ－ＢＢ０３４、ｐＬＶＸ－ＢＣＭＡ－ＢＢ０３５、ｐＬＶＸ－ＢＣＭＡ－ＢＢ０３６、ｐＬＶＸ－ＢＣＭＡ－ＢＢ０３７、またはｐＬＶＸ－ＢＣＭＡ－ＢＢ０３８トランスファープラスミドの構築のために、ＩＴＡＭ０３３構築物、ＩＴＡＭ０３４構築物、ＩＴＡＭ０３５構築物、ＩＴＡＭ０３６構築物、ＩＴＡＭ０３７構築物、またはＩＴＡＭ０３８構築物（対応するＩＴＡＭ構築物は表５を参照のこと）に置き換えた。次いで、これらのトランスファープラスミドを精製し、それぞれ、実施例１に記載のレンチウイルス（以下、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３３レンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３４レンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３５レンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３６レンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３７レンチウイルス、及びＢＣＭＡ－ＢＢ０３８レンチウイルスと称される）にパッケージングした。

Figure 2022547837000005
２．ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞活性におけるＣＭＳＤ ＩＴＡＭの量及び供給源の評価
ＰＢＭＣ及びＴリンパ球を、実施例２に記載の方法に従って調製した。活性化から３日後、５×１０６個の活性化Ｔリンパ球を、それぞれ、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするレンチウイルス（実施例２からのＢＣＭＡ－ＢＢ０３３レンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３４レンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３５レンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３６レンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３７レンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３８レンチウイルス、ＢＣＭＡ－ＢＢ０１０レンチウイルス、実施例４からのＢＣＭＡ－ＢＢ０３０レンチウイルス、実施例４からのＢＣＭＡ－ＢＢ０３１レンチウイルス、及び実施例４からのＢＣＭＡ－ＢＢ０３２レンチウイルスを含む）ならびに実施例２からの対照ＢＣＭＡ－ＢＢｚレンチウイルスで形質導入した。Ｔ細胞懸濁液を６ウェルプレートに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター内で一晩インキュベートした。形質導入から３日後、修飾Ｔ細胞を、それぞれ、２．５：１のＥ：Ｔ比で多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃと混合し、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３８４ウェル固体白色プレート中で１２時間インキュベートした。ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（ＴＡＫＡＲＡ、＃Ｂ６１２０）を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。２５μＬのＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）試薬を、３８４ウェルプレートの各ウェルに添加し、インキュベートし、次いで、標的細胞上の異なるＴリンパ球の細胞毒性を計算するために、蛍光測定のためにＳＰＡＲＫ（商標）１０Ｍマルチモードマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）上に配置した。非形質導入Ｔ細胞（「ＵｎＴ」）は、対照としての役割を果たした。
図５に示すように、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＢＣＭＡ－ＢＢ０３０～ＢＣＭＡ－ＢＢ０３８）、細胞内シグナル伝達ドメインは、１～４つの量及びその１～４つの供給源のＣＭＳＤ ＩＴＡＭからなり、これらはすべて、ＵｎＴと比較して、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞株上で有意に特異的な腫瘍細胞死滅を媒介することが可能であった（Ｐ＜０．０５）。ＢＣＭＡ－ＢＢ０３７、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３８、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３１、及びＢＣＭＡ－ＢＢ０３２は、ＢＣＭＡ－ＢＢｚと比較して、有意にＣＡＲ特異的な細胞毒性を示した（Ｐ＜０．０５）。ＢＣＭＡ－ＢＢ０１０、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３０、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３５、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３６、及び従来のＣＤ３ζのＩＳＤを有するＢＣＭＡ ＣＡＲ（ＢＣＭＡ－ＢＢｚ）の間で、細胞毒性の有意差は観察されなかった（Ｐ＞０．０５）。これらのデータは、１～４つの量及び１～４つの供給源のＣＭＳＤ ＩＴＡＭの再配置が、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ媒介性の特異的な細胞毒性と妥協しないことを示唆している。
実施例６．ＣＭＳＤ ＩＴＡＭ生物学的活性の評価
１．インビトロ再チャレンジモデルの確立
ＣＤ８α ＳＰ－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＩＴＡＭ０４５（「ＢＣＭＡ－ＢＢ０４５」、配列番号９５）、「リンカー６－ＤＡＰ１２ ＩＴＡＭ－リンカー１－ＣＤ３ε ＩＴＡＭ－リンカー７－ＣＤ３δ ＩＴＡＭ－リンカー２」（配列番号７３）を有するＩＴＡＭ０４５構築物；ＣＤ８α ＳＰ－ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＩＴＡＭ０４６（「ＢＣＭＡ－ＢＢ０４６」、配列番号９６）、「リンカー６－ＤＡＰ１２ ＩＴＡＭ－リンカー１－ＣＤ３δ ＩＴＡＭ－リンカー７－ＣＤ３ε ＩＴＡＭ－リンカー２」（配列番号７４）を有するＩＴＡＭ０４６構築物をコードする融合遺伝子を、化学的に合成し、次いで、それぞれ、ｐＬＶＸ－ＢＣＭＡ－ＢＢ０４５及びｐＬＶＸ－ＢＣＭＡ－ＢＢ０４６ランスファープラスミドの構築のためにｐＬＶＸ－ｈＥＦ１α－Ｐｕｒｏレンチウイルスベクター（実施例１を参照のこと）にクローニングした。次いで、これらのトランスファープラスミドを精製し、それぞれ、実施例１に記載のレンチウイルス（以下、ＢＣＭＡ－ＢＢ０４５レンチウイルス及びＢＣＭＡ－ＢＢ０４６レンチウイルスと称される）にパッケージングした。
ＰＢＭＣ及びＴリンパ球を、実施例２に記載の方法に従って調製した。活性化から３日後、５×１０６個の活性化Ｔリンパ球を、レンチウイルスＢＣＭＡ－ＢＢ、ＢＣＭＡ－ＢＢｚ、ＢＣＭＡ－ＢＢ０１０、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３０、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３２、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３５、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３６、ＢＣＭＡ－ＢＢ０４５、及びＢＣＭＡ－ＢＢ０４６で別々に形質導入した。Ｔ細胞懸濁液を６ウェルプレートに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター内で一晩インキュベートした。形質導入から３日後、５×１０５個の細胞を回収し、室温で遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を１ｍＬのＤＰＢＳで再懸濁し、１μＬのＦＩＴＣ標識ヒトＢＣＭＡタンパク質（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３１０９０６）を添加し、懸濁液を４℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、ＤＰＢＳステップでの遠心分離及び再懸濁を２回繰り返した。次いで、細胞を、ＦＡＣＳのためにＤＰＢＳで再懸濁して、ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現を検出した。非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）は、対照としての役割を果たした。次いで、各群におけるＣＡＲ陽性率は、一致するように調節した。修飾Ｔ細胞を、（０日目として示される）１：１のＥ：Ｔ比で多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株ＲＰＭＩ８２２６と別々に混合し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター内で一晩インキュベートした。３日目、５日目、及び７日目に、細胞計数後に、１：１のＥ：Ｔ比でＲＰＭＩ８２２６細胞株を補充した。
標的腫瘍細胞の再チャレンジ後に、上記のＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＢＣＭＡ－ＢＢｚ、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３０、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３２、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３５、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３６、ＢＭＣＡ－ＢＢ０４５、及びＢＣＭＡ－ＢＢ０４６）を、それぞれ、０日目、３日目、７日目、９日目、及び１１日目に計数し、Ｔ細胞の増殖曲線を作成した。非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）は、対照としての役割を果たした。
図６に示すように、ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＢＣＭＡ－ＢＢ０３０、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３２、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３５、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３６、ＢＣＭＡ－ＢＢ０４５、及びＢＣＭＡ－ＢＢ０４６）は、典型的には、標的腫瘍細胞の再チャレンジ後に、ＣＡＲ依存性細胞増殖を示した。ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ（ＢＣＭＡ－ＢＢ０３０、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３２、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３５、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３６、ＢＣＭＡ－ＢＢ０４５、及びＢＣＭＡ－ＢＢ０４６）及び従来のＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン（ＢＣＭＡ－ＢＢｚ）を有するＢＣＭＡ ＣＡＲの間では、細胞増殖に有意差は認められなかった（Ｐ＞０．０５）。これらのデータは、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭ含有修飾Ｔ細胞が、より高いインビトロ増殖活性を提供することを示唆している。
標的腫瘍細胞の再チャレンジ後に、５×１０５個の上記のＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＢＣＭＡ－ＢＢ、ＢＣＭＡ－ＢＢｚ、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３５、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３６、ＢＣＭＡ－ＢＢ０４５、ＢＣＭＡ－ＢＢ０４６、ＢＣＭＡ－ＢＢ０１０、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３０、及びＢＣＭＡ－ＢＢ０３２を含む）を、回収し、室温で遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を１ｍＬのＤＰＢＳで再懸濁し、１μＬのＦＩＴＣ標識ヒトＢＣＭＡタンパク質（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３１０９０６）、１μＬのＡＰＣ抗ヒトＣＤ２７９（ＰＤ－１）抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃６２１６１０）、及び１μＬのＡＰＣ抗ヒトＤ２２３（ＬＡＧ－３）抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３６９２１２）を添加し、懸濁液を４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＤＰＢＳステップでの遠心分離及び再懸濁を２回繰り返した。次いで、ＣＡＲ陽性／ＰＤ－１陽性（ＣＡＲ＋／ＰＤ－１＋）及びＣＡＲ陽性／ＬＡＧ－３陽性（ＣＡＲ＋／ＬＡＧ－３＋）細胞比をそれぞれ分析するために、細胞を、ＦＡＣＳ検出のためにＤＰＢＳで再懸濁した。
標的腫瘍細胞の再チャレンジ後に、５×１０５個の上記のＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＢＣＭＡ－ＢＢ、ＢＣＭＡ－ＢＢｚ、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３５、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３６、ＢＣＭＡ－ＢＢ０４５、ＢＣＭＡ－ＢＢ０４６、ＢＣＭＡ－ＢＢ０１０、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３０、及びＢＣＭＡ－ＢＢ０３２を含む）を、回収し、室温で遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を１ｍＬのＤＰＢＳで再懸濁し、１μＬのＦＩＴＣ標識ヒトＢＣＭＡタンパク質（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３１０９０６）、１μＬのＰＥ／Ｃｙ７抗ヒトＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３５７４０９）、１μＬのＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５抗ヒトＣＤ８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３４４７０９）、１μＬのＰＥ抗ヒトＣＤ１９７（ＣＣＲ７）抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３５３２０４）、及び１μＬのＡＰＣ抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３０４１５０）を添加し、懸濁液を４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＤＰＢＳステップでの遠心分離及び再懸濁を２回繰り返した。次いで、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞内の、ＴＥＭＲＡ細胞（最終分化したエフェクターＴ細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性／ＣＣＲ７陰性（ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７－））比、ＴＥＭ細胞（エフェクターメモリＴ細胞、ＣＤ４５ＲＡ陰性／ＣＣＲ７陰性（ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７－））比、ＴＣＭ細胞（中央メモリＴ細胞、ＣＤ４５ＲＡ陰性／ＣＣＲ７陽性（ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７＋））比、及びナイーブ細胞（ナイーブＴ細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性／ＣＣＲ７陽性（ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７＋））比を分析するために、細胞を、ＦＡＣＳ検出のために、ＤＰＢＳで再懸濁した。
図７Ａに示すように、ＣＡＲ陽性ＢＣＭＡ－ＢＢｚ Ｔ細胞、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３５ Ｔ細胞、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３６ Ｔ細胞、ＢＣＭＡ－ＢＢ０４５ Ｔ細胞、ＢＣＭＡ－ＢＢ０４６ Ｔ細胞、ＢＣＭＡ－ＢＢ０１０ Ｔ細胞、ＢＣＭＡ－ＢＢ０３０ Ｔ細胞、及びＢＣＭＡ－ＢＢ０３２ Ｔ細胞の中で、Ｔ細胞枯渇マーカーのＰＤ－１発現は、それぞれ、７．０７％、１０．５０％、５．２４％、５．８１％、５．８０％、７．８８％、６．２６％、及び１０．４２％であり、Ｔ細胞枯渇マーカーのＬＡＧ－３発現は、それぞれ、２２．６４％、１１．８１％、１７．２０％、１７．６６％、１６．２９％、２４．５４％、２１．６１％、及び１８．６８％であった。さらなる研究は、ＴＥＭＲＡ細胞、ＴＥＭ細胞、ＴＣＭ細胞、及びナイーブ細胞の発現プロファイルの差が、各ＣＡＲ＋ Ｔ細胞群（図７Ｂ）及びＣＡＲ＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞群（図７Ｃ）において観察され、ならびにＣＡＲ＋／ＣＤ４＋ Ｔ細胞群（図７Ｄ）において有意な差が観察されたこと（Ｐ＜０．０５）を（表６及び表７）に示した。これらの結果は、ＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、ＣＡＲ－Ｔ細胞表現型において有意な影響を有し、細胞／遺伝子療法において有望な戦略を提供することを示唆している。

Figure 2022547837000006
Figure 2022547837000007
実施例７．ＣＤ２０ ＣＡＲ－Ｔ及びＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ－Ｔ細胞毒性及びサイトカイン放出誘導のインビトロ分析
１．インビトロアッセイにおける細胞毒性
抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ（Ｌｅｕ１６）は、マウス抗体である。融合遺伝子配列ＣＤ８α ＳＰ－ＣＤ２０ ｓｃＦｖ（Ｌｅｕ１６）－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ（以下、「ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ」と称される、配列番号９７）、及びＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６－ＩＲＥＳ－ＣＤ８α ＳＰ－ＣＤ２０ ｓｃＦｖ（Ｌｅｕ１６）－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＩＴＡＭ０１０（以下、「ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ」と称される、配列番号９８）を化学的に合成し、次いで、それぞれ、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓレンチウイルストランスファープラスミドの構築のために、ｐＬＶＸ－ｈＥＦ１α－Ｐｕｒｏレンチウイルスベクター（実施例１を参照のこと）にクローニングした。レンチウイルストランスファープラスミドを精製し、次いで、ｐｓＰＡＸ２（パッケージング；Ａｄｄｇｅｎｅ、＃１２２６０）及びｐＭＤ２．Ｇ（エンベロープ；Ａｄｄｇｅｎｅ、＃１２２５９）を含有するレンチウイルスパッケージングプラスミド混合物と混合し、室温でインキュベートし、次いで、それぞれ、ＨＥＫ ２９３ Ｔ細胞に形質導入した。形質導入から６０時間後、レンチウイルスを含有する上清を、細胞形質導入混合物を４℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって回収した。上清を、０．４５μｍフィルターを使用して濾過し、５００ＫＤ中空繊維膜接線流濾過を使用してさらに濃縮して、濃縮レンチウイルスを得、これを－８０℃で保存した。
ＰＢＭＣ及びＴリンパ球を、実施例２に記載の方法に従って調製した。５×１０６個の活性化Ｔリンパ球を、それぞれ、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ（「ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞」と称される）及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ（「ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞」と称される）をコードするレンチウイルスで形質導入し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター内で一晩インキュベートした。形質導入から３日後、５×１０５個の細胞懸濁液を回収し、室温で遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を１ｍＬのＤＰＢＳで再懸濁し、１μＬのヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ’）２（ＦＩＴＣ）（Ａｂｃａｍ、＃ＡＢ９８６５８）を懸濁液に添加し、次いで、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＤＰＢＳステップによる遠心分離及び再懸濁を２回繰り返した。次いで、細胞をＤＰＢＳで再懸濁し、１μＬのストレプトアビジン（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ、＃Ｎ７０２１Ｓ）が補充され、次いで、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＤＰＢＳステップでの遠心分離及び再懸濁を２回繰り返した。次いで、細胞をＤＰＢＳで再懸濁し、ＣＤ２０ ＣＡＲ発現検出のためにＦＡＣＳに供した。
図９Ａに示すように、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓレンチウイルス及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓレンチウイルスで形質導入された初代Ｔリンパ球は、それぞれ、３５．６０％及び３６．４９％のＣＡＲ陽性率を示す。未処理のＴリンパ球は、陰性対照としての役割を果たした（０．５９％ ＣＡＲ陽性）。この結果は、ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６の共発現が、ＩＴＡＭ０１０キメラシグナル伝達ドメイン（ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ）を含むＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲの発現に影響を及ぼさないことを示し、ＣＡＲ発現レベルは、従来のＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン（ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ）を有するＣＤ２０ ＣＡＲの発現レベルに類似している。
ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞を、それぞれ、２０：１、１０：１、及び５：１の異なるエフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で、リンパ腫Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ細胞株（ＣＤ２０陽性、ルシフェラーゼマーカーを有する）と混合した。未処理のＴ細胞は、対照としての役割を果たした（「ＵｎＴ」）。混合細胞を、３８４ウェルプレート内で１２～２４時間インキュベートした。標的細胞上の異なるＴリンパ球の細胞毒性を、実施例２に記載の同様の方法に従って検出した。
図９Ｂに示すように、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓレンチウイルス及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓレンチウイルスで形質導入された初代Ｔリンパ球は両方とも、Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ細胞株上で強力な細胞毒性を示し、Ｅ：Ｔの濃度依存性である。ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞とＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞との間には、すべてのＥ：Ｔ比で有意な細胞毒性の差はないが、一方、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞は両方とも、細胞死滅アッセイの３日目に、非形質導入Ｔ細胞（「ＵｎＴ」）と比較して、はるかに強力な細胞毒性を示す（Ｐ＜０．０５）。この結果は、ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６の共発現が、ＩＴＡＭ０１０キメラシグナル伝達ドメイン（ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ）を含むＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲの細胞毒性に影響を及ぼさないことを示し、ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲは、従来のＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン（ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ）を有するＣＤ２０ ＣＡＲと同様の細胞毒性を示す。
２．インビトロアッセイにおけるサイトカイン放出
ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞を、それぞれ、上記の異なるＥ：Ｔ比でリンパ腫Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ細胞株とともにインキュベートした。共培養アッセイからの上清を回収して、炎症誘発性因子（図１０Ａ）、ケモカイン（図１０Ｂ）、及びサイトカイン（図１０Ｃ）を含む、１７種のサイトカイン分子のＣＡＲによって誘導されるサイトカイン放出を評価した。非形質導入Ｔ（「ＵｎＴ」）細胞は、対照としての役割を果たした。
図１０Ａに示すように、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞またはＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞を、異なるＥ：Ｔ比で２０～２４時間、ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ細胞と共培養した後、炎症誘発性因子（パーフォリン、グランザイムＡ、グランザイムＢ、ＩＦＮγ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、及びＩＬ－１３など）の分泌は、ＵｎＴ細胞と比較して有意に増加し（Ｐ＜０．０５）、分泌レベルは、Ｅ：Ｔ比に依存し、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞の両方が、強力なＲａｊｉ標的細胞毒性効果を開始し得ることを示唆した。これらの炎症誘発性因子のうち、グランザイムＡ、ＩＦＮγ、ＩＬ－６、及びＩＬ－１３は、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞において、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞においてよりも有意に高い分泌を示し（Ｐ＜０．０５）、ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ／ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６の共発現が、より少ない炎症誘発性因子の放出及びサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のリスクの低下を誘導し得ることを示唆した。
図１０Ｂに示すように、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞またはＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞を、異なるＥ：Ｔ比で２０～２４時間、ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ細胞と共培養した後、ケモカイン（ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ｓＦａｓ、及びｓＦａｓＬなど）の分泌は、ＵｎＴ細胞と比較して有意に増加し（Ｐ＜０．０５）、分泌レベルは、Ｅ：Ｔ比に依存し、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞の両方が、強力なＲａｊｉ標的細胞毒性効果を開始し得ることを示唆した。これらのケモカインのうち、ＭＩＰ－１α及びＭＩＰ－１β（及び場合によっては同様にｓＦａｓ）は、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞において、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞よりも有意に高い分泌を示し（Ｐ＜０．０５）、ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ／ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６の共発現が、より少ないケモカインの放出及びＣＲＳのリスクの低下を誘導し得ることを示唆した。
図１０Ｃに示すように、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞またはＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞を、異なるＥ：Ｔ比で２０～２４時間、ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ細胞と共培養した後、ケモカイン（ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、及びｓＣＤ１３７など）の分泌は、ＵｎＴ細胞と比較して有意に増加し（Ｐ＜０．０５）、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞の両方が、強力なＲａｊｉ標的細胞毒性効果を開始し得ることを示唆した。これらのケモカインのうち、ＴＮＦα分泌は、検出限界に達し、ＧＭ－ＣＳＦ及びｓＣＤ１３７の分泌は、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞において、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞よりも有意に高い分泌を示し（Ｐ＜０．０５）、ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ／ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６の共発現が、より少ないケモカインの放出及びＣＲＳのリスクの低下を誘導し得ることを示唆した。
要約すると、上記の結果は、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞とＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞との間の標的細胞上の細胞毒性に有意差はないことを示したが、一方で、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞によって誘導される炎症誘発性因子、ケモカイン、及びサイトカイン放出は、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞よりも有意に低く、ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ／ＳＩＶ ＮＥＦ Ｍ１１６共発現構築物が、より低いサイトカインの放出で有効かつより安全であることが示唆され、より広範な臨床応用の見込みが示されている。
実施例８．ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞のインビボ有効性評価
１．リンパ腫異種移植マウスモデルの確立及び生存指数のモニタリング
ＣＤ２０ ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍細胞へのインビボ細胞毒性を、重度の免疫不全マウスモデルを用いて調べた。実施例３のＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞を、ＴＣＲαβ－細胞についてＭＡＣ富化し、ＴＣＲαβ－ＭＡＣＳで選別された「ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞」をもたらした。ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞（実施例３からＭＡＣＳ富化されない）及びＴＣＲαβ－ＭＡＣＳで選別されたＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞を本実施例で使用した。免疫不全ＮＣＧマウスに、－４日目に尾静脈を介してＣＤ２０＋腫瘍細胞（３×１０４個のヒトＲａｊｉ．Ｌｕｃ細胞／マウス）を生着し、次いで、各マウスに、０日目に２×１０６個のＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞（群４マウス、８匹のマウス）またはＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞（群３マウス、８匹のマウス）の単回注射を行った。群１マウス（８匹のマウス）は、ＨＢＳＳ注射を受け、群２のマウス（８匹のマウス）は、非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）注射を受け、陰性対照としての役割を果たした。マウスを毎日モニタリングし、週単位で生物発光イメージングによって評価して、腫瘍成長及び体重をモニタリングした。図１１Ａを参照のこと。マウスの生存をモニタリングし、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存プロットによって記録した。
２．ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞のインビボ有効性
図１１Ａ～１１Ｄに示すように、Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ（ＣＤ２０＋）細胞生着後、ビヒクル（ＨＢＳＳ、Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ；群１）または非形質導入Ｔ細胞処理（群２）は、腫瘍細胞の成長を阻害しなかった。これら２群のマウスを、腫瘍負荷、喀痰、体重減少（図１１Ｃ）、体の悪寒及び他の症状のために、処置を受けた１５日目から安楽死させた。これらの対照マウスと比較して、処置から２０日以内にＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞またはＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞で処置したマウスにおいては、生物発光は観察されなかった。これらの結果は、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞が、インビボでＢ細胞リンパ腫の成長を効果的に阻害し得ることを示す。
ＣＡＲ－Ｔ細胞注射の２８日後、群３（ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－）及び群４（ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ）の一部のマウスは、腫瘍再発を示した（図１１Ａ～１１Ｂ）。群４の１匹／８匹のマウスを、再発腫瘍のため、３１日目に安楽死させた（図１１Ａ及び１１Ｄ）。４１日目の生物発光イメージングは、群３の１匹／８匹のマウス及び群４の４匹／７匹のマウス（３１日目に１匹を安楽死させた）が、多量の光子で、腫瘍再発を有したことを示した（図１１Ａ～１１Ｂ）。これらのマウスは、麻痺及び体重減少のため、安楽死させられた。生存曲線は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の全体的な活性を反映する。図１１Ｄに示すように、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞の両方は、腫瘍移植マウスの生存を著しく延長することができ、優れたインビボ抗腫瘍有効性を示し、体重減少への影響はほとんどまたはまったくない（図１１Ｃ）。さらに、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞（ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ／ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６共発現）は、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞（従来のＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを有するＣＡＲ）と比較して、より優れた治療有効性及び生存率を示すと思われる。
ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞の長期抗腫瘍活性をさらに試験するために、ＣＡＲ－Ｔ投与から４１日後に再発しなかったマウス（群３のＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓで処置した６匹のマウス、群４のＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓで処置した２匹のマウス）を、その後、３×１０４個のＲａｊｉ．Ｌｕｃ細胞（０日目として示される；図１２Ａ）で再チャレンジした。５匹の健常な免疫不全ＮＣＧマウスに、３×１０４個のＲａｊｉ．Ｌｕｃ細胞を生着し、０日目（群５）にＨＢＳＳを対照として注入した。腫瘍細胞移植マウスの状態をモニタリングし、毎週記録した（図１２Ａ～１２Ｃを参照のこと）。再チャレンジ後１４日目に、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞処置を受けたすべての群４のマウス（２／２）は、腫瘍再発を有し（図１２Ａ）、Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ光子の数が増加した（図１２Ｂ）。群４の１匹のマウス（１／２）を、２０日目に麻痺及び体重減少のため、安楽死させ（図１２Ａ、１２Ｂ、及び１２Ｄ）、すべてのマウスが２７日目に死亡した（図１２Ｄ）。再チャレンジ後１４日目に、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞処置を受けた群３マウスの３／６のみが、Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ光強度（図１２Ｂ）及び腫瘍負荷拡大（図１２Ａ）を増加させた。群３の腫瘍負荷は２１日目に増加したが（図１２Ａ～１２Ｂ）、麻痺または体重減少に起因する死亡は発生しなかった（図１２Ｃ～１２Ｄ）。２７日目においても、群３のマウスは、依然として６７％の生存率であった（図１２Ｄ）。対照群５のマウスがＨＢＳＳを受けた場合、腫瘍再チャレンジの１４日後、腫瘍負荷は、徐々に増加し始め（図１２Ａ～１２Ｂ）、５匹のマウスを、２１～２６日目に麻痺及び体重減少のため、安楽死させた（図１２Ａ～１２Ｄ）。
これらの結果は、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－細胞及びＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞の両方が、インビボでＢ細胞リンパ腫の成長を効果的に阻害し得ることを示唆している。さらに、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞は、腫瘍モデル及び腫瘍再発モデルの両方において、体重減少への影響がほとんどまたはまったくなくても、マウスの生存期間を延長することができ（図１１Ｃ及び１２Ｃ）、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞よりも強力なインビボ有効性及び持続性を示す。これらは、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－Ｔ細胞（ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ／ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６共発現）が、従来のＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを有するＣＡＲと比較して、より有望な処置レジメンを提供し得ることを示唆している。
実施例９．多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株におけるＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞の特異的細胞毒性
融合遺伝子配列ＣＤ８α ＳＰ－ＢＣＭＡ ＶＨＨ１－リンカー－ＢＣＭＡ ＶＨＨ２－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ（「ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ」、ＣＡＲ構築物については配列番号１０５）、及びＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６－ＩＲＥＳ－ＣＤ８α ＳＰ－ＢＣＭＡ ＶＨＨ１－リンカー－ＢＣＭＡ ＶＨＨ２－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＩＴＡＭ０１０（「ＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ」、ＣＡＲ構築物については配列番号１０６）を、化学的に合成し、組換えトランスファープラスミドの構築のために、それぞれ、ｐＬＶＸ－ｈＥＦ１α－Ｐｕｒｏレンチウイルスベクターにクローニングした。すべてのレンチウイルストランスファープラスミドを、精製し、レンチウイルスにパッケージングした。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＴＰＣＳ（登録商標）から購入した。汎Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０－０９６－５３５）を使用して、解凍ＰＢＭＣを磁気標識し、Ｔリンパ球を単離及び精製した。ＣＤ３／ＣＤ２８にコンジュゲートした磁気ビーズを、精製されたＴリンパ球の活性化及び増殖のために使用した。活性化されたＴリンパ球を、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター内で２４時間インキュベートした。次いで、それぞれ、ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ及びＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲをコードするレンチウイルスを用いて、Ｔリンパ球を形質導入した。形質導入から１２日後、細胞を回収し、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）に供した。ＢＣＭＡ＋ＭＡＣＳ富化後に、ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生し、ＴＣＲαβ－ＭＡＣＳ富化後に、ＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞を産生した。各５×１０５個のＭＡＣＳで選別された細胞懸濁液を回収し、室温で遠心分離し、上清を廃棄した。細胞をＤＰＢＳで再懸濁し、１μＬのＦＩＴＣ標識したヒトＢＣＭＡタンパク質（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３１０９０６）及び１μＬのＡＰＣ抗ヒトＴＣＲαβ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃Ｂ２５９８３９）を懸濁液に添加し、次いで、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、１ｍＬのＤＰＢＳステップでの遠心分離及び再懸濁を２回繰り返した。次いで、細胞をＤＰＢＳで再懸濁し、ＣＡＲ及びＴＣＲαβの陽性率検出のための蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に供した。
上記のステップから得られたＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＣＲαβ ＭＡＣＳで選別されたＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－）または未処理のＴ細胞（ＵｎＴ）を、それぞれ、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ（ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）マーカー、ＢＣＭＡ＋）と、２．５：１または１．２５：１のエフェクター対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）で混合し、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３８４ウェル固体白色プレート中で１８～２０時間インキュベートした。ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（ＴＡＫＡＲＡ、＃Ｂ６１２０）を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。２５μＬのＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）試薬を、３８４ウェルプレートの各ウェルに添加した。インキュベーション後、標的細胞上の異なるＴリンパ球の細胞毒性効果を計算するために、ＳＰＡＲＫ（商標）１０Ｍマルチモードマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）を使用して、蛍光を測定した。
図１３に示すように、ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－）のＢＣＭＡ ＣＡＲ陽性率は、それぞれ、８６．５％及び８５．９％であった。ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞株上のＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－）の特異的な死滅活性を、それぞれ、さらに評価した。図１４に示すように、ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－）は両方とも、ＲＰＭＩ ８２２６．Ｌｕｃ細胞株上で、死滅相対効率が１５％超のＣＡＲ特異的な腫瘍細胞死滅を効果的に媒介することができ、それらの間で有意な細胞毒性の差は観察されなかった。
実施例１０．ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞サイトカイン放出のインビトロ分析
ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－）を、それぞれ、異なるＥ：Ｔ比（２．５：１及び１．２５：１）で多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ ８２２６．Ｌｕｃと１８～２０時間インキュベートした。共培養アッセイからの上清を回収して、炎症誘発性因子（図１５Ａ）、ケモカイン（図１５Ｂ）、及びサイトカイン（図１５Ｃ）を含め、製造業者の指示に従って、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）ＭＡＰヒトＣＤ８＋Ｔ細胞磁気ビーズパネルを使用して、１７個のサイトカイン分子のＣＡＲによって誘導されるサイトカイン放出を評価した。未処理のＴ細胞（ＵｎＴ）は、対照としての役割を果たした。
図１５Ａに示すように、ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－）を、異なるＥ：Ｔ比でＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞株と共培養した後、炎症誘発性因子（パーフォリン、グランザイムＡ、グランザイムＢ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１０、及びＩＬ－１３など）の分泌は、ＵｎＴ群と比較して、有意に増加した（Ｐ＜０．０５）。ＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも高いＩＬ－２を分泌する。
図１５Ｂに示すように、ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－）を、異なるＥ：Ｔ比でＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞株と共培養した後、ケモカイン（ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ｓＦａｓ、及びｓＦａｓＬなど）の分泌は、ＵｎＴ群と比較して、有意に増加した（Ｐ＜０．０５）。一方、ＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも高いｓＦａｓＬを分泌する。
図１５Ｃに示すように、ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－）を、異なるＥ：Ｔ比でＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞株と共培養した後、サイトカイン（ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、及びｓＣＤ１３７など）の分泌は、ＵｎＴ群と比較して、有意に増加した（Ｐ＜０．０５）。一方、ＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも高いＴＮＦαを分泌する（ｓｅｃｒｅｔ）。
要約すると、上記の結果は、ＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－）が、自己ＬＩＣ９４８Ａ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞と同等の、細胞毒性及びサイトカイン放出などの効果を有することを示し、ＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞が、広範な臨床応用の見通しとともに有効かつ安全であることを示唆している。
実施例１１．ＣＤ２０ ＣＡＲ－Ｔ細胞免疫療法におけるＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６の使用
１．ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６＋ＣＡＲ一体型ベクターの構築
表８の融合遺伝子配列を、化学的に合成し、次いで、それぞれ、組換えトランスファープラスミドｐＬＶＸ－Ｍ１１８５、ｐＬＶＸ－Ｍ１２１８、ｐＬＶＸ－Ｍ１２１９、ｐＬＶＸ－Ｍ１１２４、ｐＬＶＸ－Ｍ１１２５、ｐＬＶＸ－Ｍ１１２６、及びｐＬＶＸ－Ｍ１１２７の構築のために、ｐＬＶＸ－ｈＥＦ１αベクター（実施例１を参照のこと）にクローニングした。次いで、これらのトランスファープラスミドを精製し、実施例１に記載のレンチウイルス（以下、それぞれ、Ｍ１１８５レンチウイルス、Ｍ１２１８レンチウイルス、Ｍ１２１９レンチウイルス、Ｍ１１２４レンチウイルス、Ｍ１１２５レンチウイルス、Ｍ１１２６レンチウイルス、及びＭ１１２７レンチウイルスと称される）にパッケージングした。

Figure 2022547837000008
２．ＴＣＲにおけるＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６調節の評価
実施例３からのレンチウイルスＭ１１８５、Ｍ１２１８、Ｍ１２１９、Ｍ１１２４、Ｍ１１２５、Ｍ１１２６、Ｍ１１２７、及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓを、それぞれ、形質導入のためにＪｕｒａｋｔ細胞培養の懸濁液に添加した。形質導入から３日後、５×１０５個の細胞懸濁液を回収し、室温で遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を１ｍＬのＤＰＢＳで再懸濁し、１μＬのＰＥ／Ｃｙ５抗ヒトＴＣＲα／β抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３０６７１０）を添加し、懸濁液を４℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、ＤＰＢＳステップでの遠心分離及び再懸濁を２回繰り返した。次いで、細胞をＦＡＣＳのためにＤＰＢＳで再懸濁して、ＴＣＲαβ発現を検出した。非形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞（「Ｊｕｒｋａｔ」）は、対照としての役割を果たした。
図１６Ａに示すように、ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６＋ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ一体型構築物で形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞は、非形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞と比較して、ＴＣＲαβ発現を有意に下方制御した（Ｐ＜０．０５）。
３．インビトロアッセイにおけるＣＤ２０ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性
ＰＢＭＣ及びＴリンパ球を、実施例２に記載の方法に従って調製した。活性化から３日後、５×１０６個の活性化Ｔリンパ球を、それぞれ、一体型構築物（Ｍ１１８５、Ｍ１２１８、Ｍ１２１９、Ｍ１１２４、Ｍ１１２５、Ｍ１１２６、Ｍ１１２７、及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓを含む）を担持するレンチウイルスで形質導入した。Ｔ細胞懸濁液を６ウェルプレートに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター内で一晩インキュベートした。形質導入から３日後、修飾Ｔ細胞を、それぞれ、２０：１のＥ：Ｔ比でリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ．Ｌｕｃと混合し、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３８４ウェル固体白色プレート中で１２時間インキュベートした。ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（ＴＡＫＡＲＡ、＃Ｂ６１２０）を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。２５μＬのＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）試薬を、３８４ウェルプレートの各ウェルに添加し、インキュベートし、次いで、標的細胞上の異なるＴリンパ球の細胞毒性を計算するために、蛍光測定のためにＳＰＡＲＫ（商標）１０Ｍマルチモードマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）上に配置した。非形質導入Ｔ細胞（「ＵｎＴ」）は、対照としての役割を果たした。
図１６Ｂに示すように、ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６＋ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ一体型構築物で形質導入したＴ細胞は、ＵｎＴと比較して、Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ細胞株上で有意なＣＡＲ媒介性の特異的な死滅活性を示した（Ｐ＜０．０５）。Ｍ１２１９、Ｍ１１２５～Ｍ１１２７、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ、及び従来のＣＤ３ζのＩＳＤを有するＣＤ２０ ＣＡＲ（Ｍ１１８５）の間では、細胞毒性に有意差は認められなかった（Ｐ＞０．０５）。
実施例１２．ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞免疫療法におけるＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６の使用
１．ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６＋ＣＡＲ一体型ベクターの構築
表９の融合遺伝子配列を、化学的に合成し、次いで、それぞれ、組換えトランスファープラスミドｐＬＶＸ－Ｍ１２１５、ｐＬＶＸ－Ｍ１２１６、ｐＬＶＸ－Ｍ１２１７、ｐＬＶＸ－Ｍ９８５、ｐＬＶＸ－Ｍ９８６、ｐＬＶＸ－Ｍ９８９、及びｐＬＶＸ－Ｍ９９０の構築のために、ｐＬＶＸ－ｈＥＦ１αベクター（実施例１を参照のこと）にクローニングした。次いで、これらのトランスファープラスミドを精製し、実施例１に記載のレンチウイルス（以下、それぞれ、Ｍ１２１５レンチウイルス、Ｍ１２１６レンチウイルス、Ｍ１２１７レンチウイルス、Ｍ９８５レンチウイルス、Ｍ９８６レンチウイルス、Ｍ９８９レンチウイルス、及びＭ９９０レンチウイルスと称される）にパッケージングした。

Figure 2022547837000009
２．ＴＣＲにおけるＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６調節の評価
レンチウイルスＭ１２１５、Ｍ１２１６、Ｍ１２１７、Ｍ９８５、Ｍ９８６、Ｍ９８９、Ｍ９９０、及びＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ（実施例７を参照のこと）を、それぞれ、形質導入のためにＪｕｒａｋｔ細胞培養の懸濁液に添加した。形質導入から３日後、５×１０５個の細胞懸濁液を回収し、室温で遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を１ｍＬのＤＰＢＳで再懸濁し、１μＬのＰＥ／Ｃｙ５抗ヒトＴＣＲα／β抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３０６７１０）を添加し、懸濁液を４℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、ＤＰＢＳステップでの遠心分離及び再懸濁を２回繰り返した。次いで、細胞をＦＡＣＳのためにＤＰＢＳで再懸濁して、ＴＣＲαβ発現を検出した。非形質導入Ｊｕｒａｋｔ細胞（「Ｊｕｒｋａｔ」）は、対照としての役割を果たした。
図１７Ａに示すように、ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６＋ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ一体型構築物で形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞は、非形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞と比較して、ＴＣＲαβ発現を有意に下方制御した（Ｐ＜０．０５）。
３．インビトロアッセイにおけるＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性
ＰＢＭＣ及びＴリンパ球を、実施例２に記載の方法に従って調製した。活性化から３日後、５×１０６個の活性化Ｔリンパ球を、それぞれ、一体型構築物（Ｍ１２１５、Ｍ１２１６、Ｍ１２１７、Ｍ９８５、Ｍ９８６、Ｍ９８９、Ｍ９９０、及びＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ（実施例９を参照のこと）を含む）を担持するレンチウイルスで形質導入した。Ｔ細胞懸濁液を６ウェルプレートに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター内で一晩インキュベートした。形質導入から３日後、修飾Ｔ細胞を、それぞれ、４：１のＥ：Ｔ比で多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃと混合し、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３８４ウェル固体白色プレート中で１２時間インキュベートした。ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（ＴＡＫＡＲＡ、＃Ｂ６１２０）を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。２５μＬのＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）試薬を、３８４ウェルプレートの各ウェルに添加し、インキュベートし、次いで、標的細胞上の異なるＴリンパ球の細胞毒性を計算するために、蛍光測定のためにＳＰＡＲＫ（商標）１０Ｍマルチモードマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）上に配置した。非形質導入Ｔ細胞（「ＵｎＴ」）は、対照としての役割を果たした。
図１７Ｂに示すように、ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１１６＋ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ一体型構築物で形質導入したＴ細胞は、ＵｎＴと比較して、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞株上で有意なＣＡＲ媒介性の特異的な死滅活性を示す（Ｐ＜０．０５）。Ｍ１２１７、Ｍ９８５、Ｍ９８６、及びＭ９８９は、ＢＣＭＡ－ＢＢｚと比較して、有意にＣＡＲ特異的な細胞毒性を示した（Ｐ＜０．０５）。Ｍ１２１６、ＬＵＣ９４８Ａ２２ ＵＣＡＲ、Ｍ９９０、及び従来のＣＤ３ζのＩＳＤを有するＢＣＭＡ ＣＡＲ（Ｍ１２１５）の間では、細胞毒性に有意差は認められなかった（Ｐ＞０．０５）。
実施例１３．ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞免疫療法におけるＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ７０８の使用
１．ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ７０８＋ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲ一体型ベクターの構築
融合遺伝子配列ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ７０８－ＩＲＥＳ－ＣＤ８α ＳＰ－ＢＣＭＡ ＶＨＨ１－リンカー－ＢＣＭＡ ＶＨＨ２－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＩＴＡＭ０１０（以下、Ｍ５９８と称される、ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ７０８は、配列番号１２２の配列を含む）を、化学的に合成し、次いで、組換えトランスファープラスミドｐＬＶＸ－Ｍ５９８の構築のために、ｐＬＶＸ－ｈＥＦ１αベクター（実施例１を参照のこと）にクローニングした。次いで、トランスファープラスミドを精製し、実施例１に記載のレンチウイルス（以下、Ｍ５９８レンチウイルスと称される）にパッケージングした。ＩＴＡＭ修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物「ＣＤ８α ＳＰ－ＢＣＭＡ ＶＨＨ１－リンカー－ＢＣＭＡ ＶＨＨ２－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＩＴＡＭ０１０」は、本明細書において、配列番号１１３の配列を含んで、「Ｍ５９８ ＩＴＡＭ０１０修飾ＢＣＭＡ ＣＡＲ」または「Ｍ５９８ ＢＣＭＡ ＣＡＲ」と称される。Ｍ５９８ ＢＣＭＡ ＣＡＲの抗ＢＣＭＡ ＶＨＨ１及びＶＨＨ２、ならびにそこに含まれるＣＤＲは、ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０９４４０８及びＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９６９３８（これらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。
２．ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ７０８＋ＣＡＲ一体型ベクターのインビトロＴＣＲαβ調節及び細胞毒性分析
ＰＢＭＣ及びＴリンパ球を、実施例２に記載の方法に従って調製した。活性化から３日後、５×１０６個の活性化Ｔリンパ球を、Ｍ５９８を担持するレンチウイルスで形質導入した。Ｔ細胞懸濁液を６ウェルプレートに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター内で一晩インキュベートして、Ｍ５９８－Ｔ細胞を得た。形質導入から３日後、ＴＣＲαβ発現及びＣＡＲ発現を、ＦＡＣＳを使用して検出した。形質導入から５日後、細胞懸濁液を、ＴＣＲα／β分離キットプロトコル（ＴＣＲα／β－ビオチン、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ、＃６１９０２２１００４；抗ビオチン試薬、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ、＃６１９０３１２０１０）に従って分離及び富化に供して、ＭＡＣＳで選別されたＴＣＲαβ陰性Ｍ５９８－Ｔ細胞を得た。ＭＡＣＳで選別されたＴＣＲαβ陰性Ｍ５９８－Ｔ細胞のＴＣＲαβ発現及びＣＡＲ発現を、ＦＡＣＳを使用して検出した。ＭＡＣＳで選別されたＴＣＲαβ陰性Ｍ５９８－Ｔ細胞を、それぞれ、２．５：１、１．２５：１、及び１：１．２５の異なるＥ：Ｔ比で多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃと混合し、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３８４ウェル固体白色プレート中で１８～２４時間インキュベートした。ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（ＴＡＫＡＲＡ、＃Ｂ６１２０）を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。２５μＬのＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）試薬を、３８４ウェルプレートの各ウェルに添加し、インキュベートし、次いで、標的細胞上の異なるＴリンパ球の細胞毒性を計算するために、蛍光測定のためにＳＰＡＲＫ（商標）１０Ｍマルチモードマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）上に配置した。非形質導入Ｔ細胞（「ＵｎＴ」）は、対照としての役割を果たした。
図１８Ａ～１８Ｂに示すように、Ｍ５９８－Ｔ細胞のＴＣＲαβ陽性率（５９．７％のＴＣＲαβ陽性率）は、ＵｎＴよりも有意に低かった（８８．６％のＴＣＲαβ陽性率）。Ｍ５９８－Ｔ細胞のＣＡＲ陽性率（３７．５％のＣＡＲ陽性率）は、ＵｎＴよりも有意に高かった（１．１１％のＣＡＲ陽性率）。ＭＡＣＳで選別されたＴＣＲαβ陽性Ｍ５９８－Ｔ細胞は、２．６ ４％のＴＣＲαβ陽性率及び８８．０％のＣＡＲ陽性率を示した。これらの結果は、Ｍ５９８が形質導入されたＴ細胞がＣＡＲを発現したが、一方、ＴＣＲαβの発現を効果的に阻害することを示唆している。
図１８Ｃに示すように、ＭＡＣＳで選別されたＴＣＲαβ陰性Ｍ５９８－Ｔ細胞は、異なるＥ：Ｔ比でＵｎＴと比較して、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞株に有意なＣＡＲ媒介性の特異的な死滅活性を示し（Ｐ＜０．０５）、５０．３２±２．５６％の死滅効率を有した。
要約すると、上記の結果は、切断型ＳＩＶ ＮｅｆのＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ７０８が、ＣＡＲ発現Ｔ細胞と組み合わせて、ＴＣＲαβ発現を効果的に阻害することができるが、一方、ＣＡＲ媒介性の特異的な細胞毒性活性に影響を及ぼさないことを示す。
実施例１４．ＣＡＲ－Ｔ細胞免疫療法におけるＴＣＲαβ及びＭＨＣ発現に関する二重調節を有するＳＩＶ Ｎｅｆサブタイプ
１．ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１２７５＋ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ一体型ベクターの構築
次いで、融合遺伝子ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１２７５－ＩＲＥＳ－ＣＤ８α ＳＰ－ＣＤ２０ ｓｃＦｖ（Ｌｅｕ１６）－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＩＴＡＭ０１０（以下、Ｍ１３９２と称される、ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１２７５は、配列番号１３６の配列を含む）を、組換えトランスファープラスミドｐＬＶＸ－Ｍ１３９２の構築のために、ｐＬＶＸ－ｈＥＦ１αベクター（実施例１を参照のこと）にクローニングした。次いで、トランスファープラスミドを精製し、実施例１に記載のレンチウイルス（以下、Ｍ１３９２レンチウイルスと称される）にパッケージングした。コード化ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ構築物「ＣＤ８α ＳＰ－ＣＤ２０ ｓｃＦｖ（Ｌｅｕ１６）－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＩＴＡＭ０１０」は、配列番号９８の配列を含み、「ＩＴＡＭ０１０修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ」とも称される。
２．ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１２７５＋ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ一体型構築物で形質導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞のＴＣＲαβ及びＭＨＣクラスＩ分子発現
ＰＢＭＣ及びＴリンパ球を、実施例２に記載の方法に従って調製した。活性化から３日後、５×１０６個の活性化Ｔリンパ球を、それぞれ、Ｍ１３９２レンチウイルス（以下、Ｍ１３９２－Ｔ細胞と称される）及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ（実施例３から、以下、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞と称される）で形質導入した。Ｔ細胞懸濁液を６ウェルプレートに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター内で一晩インキュベートした。形質導入から３日後、Ｍ１３９２－Ｔ及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔの５×１０５個の細胞懸濁液を別々に回収し、室温で遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を１ｍＬのＤＰＢＳで再懸濁し、１μＬのヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ’）２（ＦＩＴＣ）（Ａｂｃａｍ、＃ＡＢ９８６５８）を懸濁液に添加し、次いで、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＤＰＢＳステップによる遠心分離及び再懸濁を２回繰り返した。次いで、細胞を１ｍＬのＤＰＢＳで再懸濁し、次いで、１μＬのストレプトアビジン（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ、＃Ｎ７０２１Ｓ）及び１μＬのＡＰＣ抗ヒトＴＣＲα／β抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３０６７１８）を添加し、懸濁液を４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＤＰＢＳステップでの遠心分離及び再懸濁を２回繰り返した。次いで、細胞をＦＡＣＳのためにＤＰＢＳで再懸濁し、ＴＣＲαβ及びＣＤ２０ ＣＡＲの発現を検出した。形質導入から３日後、Ｍ１３９２－Ｔ及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔの５×１０５個の細胞懸濁液を別々に回収し、室温で遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を１ｍＬのＤＰＢＳで再懸濁し、次いで、１μＬのＡＰＣ抗ヒトＴＣＲα／β抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３０６７１８）及び１μＬのＰＥ抗ヒトＨＬＡ－Ｂ７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３７２４０４）を添加し、懸濁液を４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＤＰＢＳステップでの遠心分離及び再懸濁を２回繰り返した。次いで、細胞をＦＡＣＳのためにＤＰＢＳで再懸濁し、ＴＣＲαβ及びＨＬＡ－Ｂ７の発現を検出した。非形質導入Ｔ細胞（「ＵｎＴ」）は、対照としての役割を果たした。
図１９Ａに示すように、ＵｎＴ細胞、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞、及びＭ１３９２－Ｔ細胞のＣＡＲ陽性及びＴＣＲαβ陰性（ＣＡＲ＋／ＴＣＲαβ－）率は、それぞれ、０．７４５％、１３．７％、及び２１．３％であった。図１９Ｂに示すように、ＵｎＴ、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６ＳＴリンパ球、及びＭ１３９２－Ｔ細胞のＨＬＡ－Ｂ７陰性及びＴＣＲαβ陰性（ＨＬＡ－Ｂ７－／ＴＣＲαβ－）率は、それぞれ、０．６４１％、０．７２３％、及び２２．７％であった。これらの結果は、ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１２７５＋ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ構築物（Ｍ１３９２）が形質導入されたＴ細胞がＣＡＲを発現して、一方、ＴＣＲαβ及びＭＨＣクラスＩ分子の発現を効果的に下方調節することを示唆している。
３．ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１２７５＋ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ一体型構築物で形質導入したＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＭＨＣクラスＩの交差反応性の評価
ＰＢＭＣ及びＴリンパ球を、実施例２に記載の方法に従って調製した。活性化から３日後、５×１０６個の活性化Ｔリンパ球を、レンチウイルスＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ（実施例３から、以下、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞と称される）で形質導入した。
形質導入から３日後、５０％ ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術（配列番号１３８）及び分離に供し、Ｂ２Ｍノックアウト（Ｂ２Ｍ ＫＯ）細胞（以下、Ｂ２Ｍ ＫＯ ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞と称される）を構築した。次いで、上で得られたＭ１３９２－Ｔ細胞懸濁液を、ＴＣＲα／β分離キットプロトコル（ＴＣＲα／β－ビオチン、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ、＃６１９０２２１００４；抗ビオチン試薬、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ、＃６１９０３１２０１０）に従って分離及び富化に供して、ＭＡＣＳで選別されたＴＣＲαβ陰性Ｍ１３９２－Ｔ細胞（以下、ＴＣＲαβ－Ｍ１３９２－Ｔ細胞と称される）を得た。ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞、Ｂ２Ｍ ＫＯ ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞、及びＴＣＲαβ－Ｍ１３９２－Ｔ細胞のＭＨＣクラスＩの交差反応性の評価は、混合リンパ球反応に関して行われた（ＭＬＲ、Ｊｉａｎｇｔａｏ Ｒｅｎ，２０１７を参照のこと）。
図１９Ｃに示すように、１：１のＥ：Ｔ比で、エフェクター細胞とのインキュベーションから４８時間後の、ＴＣＲαβ－Ｍ１３９２－Ｔ細胞によって放出されたＩＦＮ－γのレベルは、ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓよりも有意に少なく（Ｐ＜０．０５）、Ｂ２Ｍ ＫＯ ＬＣＡＲ－Ｌ１８６Ｓ Ｔ細胞と同様であった（Ｐ＞０．０５）。これらの結果は、Ｍ１３９２（ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１２１５／ＩＴＡＭ０１０修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ共発現）が、エフェクター細胞のＭＨＣクラスＩの交差反応性を有意に低減させ得ることを示唆している。
４．ＳＩＶ Ｎｅｆ Ｍ１２７５＋ＩＴＡＭ修飾ＣＤ２０ ＣＡＲ一体型構築物で形質導入したＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ細胞毒性アッセイ
上で得られたＭＡＣＳで選別されたＴＣＲαβ－Ｍ１３９２－Ｔ細胞を、それぞれ、２０：１、１０：１、及び５：１の異なるＥ：Ｔ比でリンパ腫Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ細胞株と混合し、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３８４ウェル固体白色プレート中で１２時間インキュベートした。ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（ＴＡＫＡＲＡ、＃Ｂ６１２０）を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。２５μＬのＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）試薬を、３８４ウェルプレートの各ウェルに添加し、インキュベートし、次いで、標的細胞上の異なるＴリンパ球の細胞毒性を計算するために、蛍光測定のためにＳＰＡＲＫ（商標）１０Ｍマルチモードマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）上に配置した。非形質導入Ｔ細胞（「ＵｎＴ」）は、対照としての役割を果たした。
図１９Ｄに示すように、ＭＡＣＳで選別されたＴＣＲαβ－Ｍ１３９２－Ｔ細胞は、ＵｎＴと比較して、Ｒａｊｉ．Ｌｕｃ細胞株上で有意なＣＡＲ媒介性の特異的な死滅活性を示した（Ｐ＜０．０５）。

Claims (52)

  1. 修飾Ｔ細胞であって、
    （ａ）細胞外リガンド結合ドメイン、
    （ｂ）膜貫通ドメイン、および
    （ｃ）キメラシグナル伝達ドメイン（「ＣＭＳＤ」）を含む細胞内シグナル伝達ドメイン（「ＩＳＤ」）
    を含む機能的外因性受容体を含み、
    前記ＣＭＳＤが、１つ以上の免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（「ＣＭＳＤ ＩＴＡＭ」）を含み、所望により、前記複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、１つ以上のリンカー（「ＣＭＳＤリンカー」）によって接続されていてもよい、前記修飾Ｔ細胞。
  2. （ａ）前記複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、互いに直接連結されている、
    （ｂ）前記ＣＭＳＤが、ＩＴＡＭ含有親分子に由来しない１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続された２つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む、
    （ｃ）前記ＣＭＳＤが、前記ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの１つ以上が由来する前記ＩＴＡＭ含有親分子とは異なる、ＩＴＡＭ含有親分子に由来する１つ以上のＣＭＳＤリンカーを含む、
    （ｄ）前記ＣＭＳＤが、２つ以上の同一のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む、
    （ｅ）前記ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つが、ＣＤ３ζに由来しない、
    （ｆ）前記ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つが、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１またはＩＴＡＭ２ではない、
    （ｇ）前記複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、各々、異なるＩＴＡＭ含有親分子に由来する、及び／または
    （ｈ）前記ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つが、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する、請求項１に記載の修飾Ｔ細胞。
  3. 前記ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つが、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する、請求項１に記載の修飾Ｔ細胞。
  4. 前記ＣＭＳＤが、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１及び／またはＩＴＡＭ２を含まない、請求項１～３のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。
  5. 前記ＣＭＳＤが、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ３を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。
  6. 前記ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも２つが、同じＩＴＡＭ含有親分子に由来する、請求項１～５のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。
  7. 前記ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの前記少なくとも２つが、互いに同一である、請求項６に記載の修飾Ｔ細胞。
  8. 前記ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも２つが、互いに異なる、請求項１～６のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。
  9. 前記２つの異なるＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、各々、異なるＩＴＡＭ含有親分子に由来する、請求項８に記載の修飾Ｔ細胞。
  10. 前記ＣＭＳＤリンカーのうちの少なくとも１つが、ＣＤ３ζに由来する、請求項１～９のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。
  11. 前記ＣＭＳＤリンカーのうちの少なくとも１つが、前記ＩＴＡＭ含有親分子に対して異種である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。
  12. 前記ＣＭＳＤが、最もＣ末端のＣＭＳＤ ＩＴＡＭのＣ末端におけるＣ末端配列（「ＣＭＳＤ Ｃ末端配列」）をさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。
  13. 前記ＣＭＳＤが、最もＮ末端のＣＭＳＤ ＩＴＡＭのＮ末端におけるＮ末端配列（「ＣＭＳＤ Ｎ末端配列」）をさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。
  14. 前記１つ以上のＣＭＳＤリンカー、前記ＣＭＳＤ Ｃ末端配列、及び／または前記ＣＭＳＤ Ｎ末端配列が、独立して、配列番号１７～３９及び１１６～１２０からなる群から選択される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。
  15. 前記機能的外因性受容体が、ＩＴＡＭ修飾Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＩＴＡＭ修飾キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＩＴＡＭ修飾キメラＴＣＲ（ｃＴＣＲ）、またはＩＴＡＭ修飾Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）様キメラ受容体である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。
  16. 前記機能的外因性受容体が、ＩＴＡＭ修飾ＣＡＲである、請求項１５に記載の修飾Ｔ細胞。
  17. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８αに由来する、請求項１６に記載の修飾Ｔ細胞。
  18. 前記ＩＳＤが、共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項１６または１７に記載の修飾Ｔ細胞。
  19. 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）またはＣＤ２８に由来する、請求項１８に記載の修飾Ｔ細胞。
  20. 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む、請求項１８または１９に記載の修飾Ｔ細胞。
  21. 前記共刺激ドメインが、前記ＣＭＳＤのＮ末端である、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。
  22. 前記共刺激ドメインが、前記ＣＭＳＤのＣ末端である、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。
  23. 前記機能的外因性受容体が、ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲである、請求項１５に記載の修飾Ｔ細胞。
  24. 前記ＩＴＡＭ修飾ｃＴＣＲが、
    （ａ）細胞外リガンド結合ドメイン、
    （ｂ）任意の受容体ドメインリンカー、
    （ｃ）第１のＴＣＲサブユニットの任意の細胞外ドメインまたはその一部分、
    （ｄ）第２のＴＣＲサブユニットの膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、および
    （ｅ）前記ＣＭＳＤを含むＩＳＤ
    を含み、
    前記第１及び第２のＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＣＤ３δからなる群から選択される、請求項２３に記載の修飾Ｔ細胞。
  25. 前記第１及び第２のＴＣＲサブユニットが、いずれもＣＤ３εである、請求項２４に記載の修飾Ｔ細胞。
  26. 前記１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γのうちの１つ以上に由来する、請求項２４または２５に記載の修飾Ｔ細胞。
  27. 前記機能的外因性受容体が、ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体である、請求項１５に記載の修飾Ｔ細胞。
  28. 前記ＩＴＡＭ修飾ＴＡＣ様キメラ受容体が、
    （ａ）細胞外リガンド結合ドメイン、
    （ｂ）任意の第１の受容体ドメインリンカー、
    （ｃ）第１のＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインを特異的に認識する細胞外ＴＣＲ結合ドメイン、
    （ｄ）任意の第２の受容体ドメインリンカー、
    （ｅ）第２のＴＣＲサブユニットの任意の細胞外ドメインまたはその一部分、
    （ｆ）第３のＴＣＲサブユニットの膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、および
    （ｇ）前記ＣＭＳＤを含むＩＳＤとを含み、
    前記第１、第２、及び第３のＴＣＲサブユニットがすべて、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＣＤ３δからなる群から選択される、請求項２７に記載の修飾Ｔ細胞。
  29. 前記第２及び第３のＴＣＲサブユニットが、いずれもＣＤ３εである、請求項２８に記載の修飾Ｔ細胞。
  30. 前記１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γのうちの１つ以上に由来する、請求項２８または２９に記載の修飾Ｔ細胞。
  31. 前記細胞外リガンド結合ドメインが、１つ以上の標的抗原の１つ以上のエピトープを特異的に認識する１つ以上の抗原結合断片を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。
  32. 前記抗原結合断片が、ｓｄＡｂまたはｓｃＦｖである、請求項３１に記載の修飾Ｔ細胞。
  33. 前記標的抗原が、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、またはＣＤ２０である、請求項３１または３２に記載の修飾Ｔ細胞。
  34. 前記細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と前記膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメインをさらに含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。
  35. 前記ヒンジドメインが、ＣＤ８αに由来する、請求項３４に記載の修飾Ｔ細胞。
  36. 前記ＣＭＳＤを含むＩＳＤを含む前記機能的外因性受容体の前記エフェクター機能が、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含むＩＳＤを含む機能的外因性受容体よりも最大で約８０％低い、請求項１～３５のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。
  37. 修飾Ｔ細胞を製造する方法であって、機能的外因性受容体をコードする核酸を前駆体Ｔ細胞に導入することを含み、
    前記機能的外因性受容体が、
    （ａ）細胞外リガンド結合ドメイン、
    （ｂ）膜貫通ドメイン、および
    （ｃ）ＣＭＳＤを含むＩＳＤ
    を含み、
    前記ＣＭＳＤが、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、所望により、前記複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい、前記方法。
  38. 前記核酸が、ウイルスベクターである、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記修飾Ｔ細胞から機能的外因性受容体陽性Ｔ細胞を単離及び／または濃縮することをさらに含む、請求項３７または３８に記載の方法。
  40. 前記修飾Ｔ細胞を少なくとも１つの薬学的に許容される担体とともに製剤化することをさらに含む、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. （ａ）前記複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、互いに直接連結されている、
    （ｂ）前記ＣＭＳＤが、ＩＴＡＭ含有親分子に由来しない１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続された２つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む、
    （ｃ）前記ＣＭＳＤが、前記ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの１つ以上が由来する前記ＩＴＡＭ含有親分子とは異なる、ＩＴＡＭ含有親分子に由来する１つ以上のＣＭＳＤリンカーを含む、
    （ｄ）前記ＣＭＳＤが、２つ以上の同一のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含む、
    （ｅ）前記ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つが、ＣＤ３ζに由来しない、
    （ｆ）前記ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つが、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ１またはＩＴＡＭ２ではない、
    （ｇ）前記複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、各々、異なるＩＴＡＭ含有親分子に由来する、及び／または
    （ｈ）前記ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つが、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する、請求項３７～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つが、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する、請求項３７～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 請求項３７～４２のいずれか一項に記載の方法によって得られた、修飾Ｔ細胞。
  44. 請求項１～３６及び４３のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
  45. 個体における疾患を治療する方法であって、前記個体に、有効量の請求項１～３６及び４３のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞または請求項４４に記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
  46. 前記疾患が、がんである、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記個体が、前記修飾Ｔ細胞が由来する前記前駆体Ｔ細胞の前記ドナーに対して組織不適合である、請求項４５または４６に記載の方法。
  48. 前記個体が、ヒトである、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 機能的外因性受容体をコードする単離された核酸であって、
    前記機能的外因性受容体が、
    （ａ）細胞外リガンド結合ドメイン、
    （ｂ）膜貫通ドメイン、および
    （ｃ）ＣＭＳＤを含むＩＳＤ
    を含み、
    前記ＣＭＳＤが、１つ以上のＣＭＳＤ ＩＴＡＭを含み、所望により、前記複数のＣＭＳＤ ＩＴＡＭが、１つ以上のＣＭＳＤリンカーによって接続されていてもよい、前記核酸。
  50. ＣＭＳＤ ＩＴＡＭのうちの少なくとも１つが、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、Ｉｇβ（ＣＤ７９ｂ）、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、ＣＮＡＩＰ／ＮＦＡＭ１、ＳＴＡＭ－１、ＳＴＡＭ－２、及びＭｏｅｓｉｎからなる群から選択されるＩＴＡＭ含有親分子に由来する、請求項４９に記載の単離された核酸。
  51. 請求項４９または５０に記載の核酸を含む、ベクター。
  52. ウイルスベクターである、請求項５１に記載のベクター。
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