KR20230004898A - Nef-함유 t 세포 및 이의 생산 방법 - Google Patents

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윈청 자오
빙 왕
다웨이 위
신 황
핑옌 왕
추촨 좡
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Abstract

다음을 포함하는 변형된 T 세포로: i) 외인성 음성 조절 인자(Nef) 단백질; 및 ii) 다음을 포함하는 기능적 외인성 수용체: (a) 세포외 리간드 결합 도메인, (b) 막관통 도메인, 및 (c) 키메라 신호전달 도메인(CMSD)을 포함하는 세포내 신호전달 도메인(ISD), 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 면역-수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 또한 Nef 단백질(예를 들어, 비-자연 발생 Nef), 및 이러한 Nef 단백질을 포함하는 변형된 T 세포가 제공된다. 이를 제조하는 방법 및 용도가 제공된다.

Description

NEF-함유 T 세포 및 이의 생산 방법 {NEF-CONTAINING T CELLS AND METHODS OF PRODUCING THEREOF}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 8월 28일 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/CN2019/103041, 및 2019년 12월 16일 출원된 PCT/CN2019/125681의 우선권 이익을 주장하며, 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
ASCII 텍스트 파일에 대한 서열 목록 제출
ASCII 텍스트 파일에 대한 하기 제출 내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독가능 형태(CRF)(파일명: 761422002042SEQLIST.TXT, 기록 날짜: 2020년 8월 28일, 크기: 408 KB).
본 출원의 분야
본 출원은 음성 조절 인자(Nef) 단백질(예를 들어, 비-자연 발생 Nef 단백질), 키메라 신호전달 도메인(CMSD)을 포함하는 기능적 외인성 수용체, 및 이러한 Nef 단백질, 및/또는 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체를 함유하는 T 세포에 관한 것이다.
CAR-T 세포 요법은 T 세포를 종양 부위로 지시하기 위해 표적 항원(예를 들어, 종양 항원)을 특이적으로 인식하는 조작된 수용체를 보유하는 유전적으로 변형된 T 세포를 활용한다. 이는 혈액암 및 다발성 골수종(MM)을 치료하는 데 있어서 유망한 결과를 제시하였다. CAR은 일반적으로 세포외 리간드 결합 도메인, 막관통(TM) 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인(ISD)을 포함한다. 세포외 리간드 결합 도메인은 원하는 표적 항원을 표적화하는 항원-결합 단편(예를 들어, 단일-쇄 가변 단편, scFv)을 포함할 수 있다. 표적 항원(예를 들어, 종양 항원)에 결합 시, CAR은 T 세포를 활성화시켜 표적 항원에 특이적인 주요 조직적합성 복합체(MHC)의 이용가능성에 의해 제한되지 않고 항원-의존적 방식으로 ISD(예를 들어, CD3ζ ISD를 통한 활성화 신호, TCR 신호 전달 모방)에 의해 매개되는 특이적 항-종양 반응을 시작할 수 있다.
면역-수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)는 많은 세포 표면 수용체 또는 이들이 회합하는 하위단위의 세포질 도메인에 존재하고, 신호 전달에서 중요한 조절 역할을 한다. 예를 들어, TCR 결찰 시, TCR 복합체의 ITAM의 인산화는 신호전달 캐스케이드를 개시하는 데 필수적인 분자를 모집하기 위한 도킹 부위를 생성하여, T-세포 활성화 및 분화를 야기한다. ITAM 기능은 B-세포 수용체(BCR, CD79a/Igα 및 CD79b/Igβ), 선택된 자연 살해(NK) 세포 수용체(DAP-12), 및 특정 FcεR의 구성요소가 모두 세포내 신호를 전파하기 위해 ITAM을 필요로 함으로, T 세포로 제한되지 않는다. 현재까지, 대부분의 임상 연구는 CD3ζ를 CAR의 1차 ISD로 사용하지만, 신호전달 도메인으로서의 한계가 보고되었다. 발현 분석은 온전한 CD3ζ ISD를 포함하는 2세대 항-CD19 CAR에 대한 염증, 사이토카인, 및 케모카인 활성과 연관된 유전자 세트의 유의한 상향조절을 식별하였고, 향상된 효과기 분화가 또한 관찰되었다(Feucht, J 등, 2019). CD3ζ ISD는 또한 성숙 T 세포 세포자멸사를 촉진하는 것으로 밝혀졌다(Combadiere, B 등, 1996). 축로, CAR-T 면역요법 연관된 사이토카인 방출 증후군(CRS)은 일부 경우에 임상 실행을 제한할 수 있다.
개인별 차이로 인해, 자가 CAR-T 또는 TCR-T 요법(환자 자신의 T 세포 사용)은 제조 및 표준화에 있어서 상당한 도전과제를 제시하며, 제조 및 치료에 대한 비용이 매우 비싸다. 더욱이, 암 환자는 일반적으로 면역 기능이 저하되어, 림프구 수가 감소되고, 면역 활성이 저하되어, 시험관내에서 확장하기 어렵다. 보편적인 동종이계 CAR-T 또는 TCR-T 요법은 건강한 공여자에서 유래된 T 세포를 사용한 이상적인 모델로서 간주된다. 그러나, 핵심 도전과제는 조직부적합성으로 인해 치료 동안 이식편대숙주병(GvHD)을 효과적으로 제거하는 방법이다. TCR은 항원 제시에 반응하여 T 세포 활성화에 수반되는 세포 표면 수용체이다. 인간에서 T 세포의 95%는 알파(α) 쇄 및 베타(β) 쇄로 이루어진 TCR을 갖는다. TCRα 및 TCRβ 쇄는 조합하여 이종이량체를 형성하고 CD3 하위단위와 회합하여 세포 표면 상에 존재하는 TCR 복합체를 형성한다. GvHD는 공여자의 T 세포가 TCR을 통해 비-자기 MHC 분자를 인식하고 숙주(이식 수용자) 조직을 항원적으로 외래물질로 감지하고 공격할 때 발생한다. 공여자 T 세포로부터 내인성 TCR을 제거하여 GvHD를 예방하기 위해, 사람들은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 및 내인성 TCRα 또는 TCRβ 유전자 녹아웃(KO)에 대한 클러스터링된 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복부(CRISPR)-CRISPR　연관(Cas)(CRISPR/Cas)와 같은 유전자 편집 기술을 사용한 다음, 동종이계 CAR-T 또는 TCR-T 생산을 위해 TCR-음성 T 세포를 풍부화하였다. 그러나, TCR 결실은 손상된 CD3 하류 신호 전달 경로로 이어지고, T 세포 확장에 영향을 미칠 수 있다.
본원에 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 공개된 특허 출원의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 일 측면에서 다음을 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)를 제공하며: i) 외인성 Nef 단백질; 및 ii) 다음을 포함하는 기능적 외인성 수용체: (a) 세포외 리간드 결합 도메인, (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) 키메라 신호전달 도메인(CMSD)을 포함하는 세포내 신호전달 도메인(ISD), 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 ITAM("CMSD ITAM")를 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 링커("CMSD 링커")에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, CMSD는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 특성 중 하나 이상을 포함한다: (a) 복수(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM은 서로 직접 연결되고/되거나; (b) CMSD는 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 링커)에서 유래되지 않은 하나 이상의 링커에 의해 연결된 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM을 포함하고/하거나; (c) CMSD는 CMSD ITAM 중 하나 이상이 유래된 ITAM-함유 모 분자와 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된 하나 이상의 CMSD 링커를 포함하고/하거나; (d) CMSD는 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 동일한 CMSD ITAM을 포함하고/하거나; (e) CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ에서 유래되지 않고/않거나; (f) CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ의 ITAM1 또는 ITAM2가 아니고/아니거나; (g) 복수의 CMSD ITAM은 각각 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래되고/되거나; (h) CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신(Moesin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD는 하나의 CMSD ITAM으로 본질적으로 이루어진다(예를 들어, 이로 이루어진다). 일부 구현예에서, CMSD는 하나의 CMSD ITAM 및 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 링커)에 이종인 CMSD N-말단 서열 및/또는 CMSD C-말단 서열로 본질적으로 이루어진다(예를 들어, 이로 이루어진다). 일부 구현예에서, 복수(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM은 서로 직접 연결된다. 일부 구현예에서, CMSD는 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 링커)에서 유래되지 않은 하나 이상의 링커에 의해 연결된 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 CMSD ITAM 중 하나 이상이 유래된 ITAM-함유 모 분자와 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된 하나 이상의 CMSD 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 동일한 CMSD ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ에서 유래되지 않는다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ의 ITAM1 또는 ITAM2가 아니다. 일부 구현예에서, 복수의 CMSD ITAM은 각각 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 하나에 따른 일부 구현예에서, 복수의 CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD는 CD3ζ의 ITAM1 및/또는 ITAM2를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, CMSD는 CD3ζ의 ITAM3을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 2 개는 동일한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 2 개는 서로 상이하다. 일부 구현예에서, CMSD 링커 중 적어도 하나는 CD3ζ에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD 링커 중 적어도 하나는 ITAM-함유 모 분자에 대해 이종이다. 일부 구현예에서, 이종 CMSD 링커는 서열번호: 12-26, 103-107, 및 119-126으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 이종 CMSD 링커는 G/S 링커이다. 일부 구현예에서, CMSD는 2 개 이상의 이종 CMSD 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 2 개 이상의 이종 CMSD 링커 서열은 서로 동일하다. 일부 구현예에서, 2 개 이상의 이종 CMSD 링커 서열은 서로 상이하다. 일부 구현예에서, CMSD 링커 서열은 약 1 내지 약 15 개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 CMSD 링커는 서열번호: 12-14, 18, 및 120-124로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 가장 C-말단 ITAM의 C-말단에 CMSD C-말단 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD C-말단 서열은 CD3ζ에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD C-말단 서열은 ITAM-함유 모 분자에 대해 이종이다. 일부 구현예에서, CMSD C-말단 서열은 서열번호: 12-26, 103-107, 및 119-126으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CMSD C-말단 서열은 약 1 내지 약 15 개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, CMSD C-말단 서열은 서열번호: 13, 15, 120, 및 122-124로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 가장 N-말단 ITAM의 N-말단에 CMSD N-말단 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD N-말단 서열은 CD3ζ에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD N-말단 서열은 ITAM-함유 모 분자에 대해 이종이다. 일부 구현예에서, CMSD N-말단 서열은 서열번호: 12-26, 103-107, 및 119-126으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CMSD N-말단 서열은 약 1 내지 약 15 개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, CMSD N-말단 서열은 서열번호: 12, 16, 17, 119, 125, 및 126으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ζ ITAM1 - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM2 - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM3 - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 39 또는 48의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ζ ITAM1 - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM1 - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM1 - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 40 또는 49의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ζ ITAM2 - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM2 - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM2 - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 41의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ζ ITAM3 - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM3 - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM3 - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 42의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ε ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 43 또는 50의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - DAP12 ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - DAP12 ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - DAP12 ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 44의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - Igα ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - Igα ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - Igα ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 45의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - Igβ ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - Igβ ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - Igβ ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 46의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - FcεRIγ ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - FcεRIγ ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - FcεRIγ ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 47의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3δ ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3γ ITAM - 임의적인 제3 CMSD 링커 - DAP12 ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 51의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3δ ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3δ ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3δ ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 132의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3γ ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3γ ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3γ ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 133의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - FcεRIβ ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - FcεRIβ ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - FcεRIβ ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 134의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CNAIP/NFAM1 ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CNAIP/NFAM1 ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CNAIP/NFAM1 ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 135의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ε ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3δ ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - DAP12 ITAM - 임의적인 제3 CMSD 링커 - CD3γ ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 142의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3γ ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - DAP12 ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3δ ITAM - 임의적인 제3 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 143의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - DAP12 ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3γ ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 임의적인 제3 CMSD 링커 - CD3δ ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 144의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3δ ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 147의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3γ ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - DAP12 ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 148의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3δ ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 149의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3δ ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3γ ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 150의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - DAP12 ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3δ ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 151의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - DAP12 ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3δ ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 152의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ε ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 145의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3δ ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 146의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3δ ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3γ ITAM - 임의적인 제3 CMSD 링커 - DAP12 ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 136-141 중 임의의 것의 서열을 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, 기능적 외인성 수용체는 ITAM-변형된 T 세포 수용체(TCR), ITAM-변형된 키메라 항원 수용체(CAR), ITAM-변형된 키메라 TCR(cTCR), 또는 ITAM-변형된 T 세포 항원 커플러(TAC)-유사 키메라 수용체이다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, 기능적 외인성 수용체는 ITAM-변형된 CAR이다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD8α에서 유래된다. 일부 구현예에서, ISD는 공동-자극 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 4-1BB 또는 CD28에서 유래된다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동-자극 도메인은 CMSD에 대해 N-말단이다. 일부 구현예에서, 공동-자극 도메인은 CMSD에 대해 C-말단이다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, 기능적 외인성 수용체는 ITAM-변형된 cTCR이다. 일부 구현예에서 ITAM-변형된 cTCR은 다음을 포함하며: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 임의적인 수용체 도메인 링커, (c) 제1 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 임의적인 세포외 도메인 또는 이의 일부, (d) 제2 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 (e) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 제1 및 제2 TCR 하위단위는 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 TCR 하위단위는 둘 다 CD3ε이다. 일부 구현예에서, 여기서 하나 또는 복수의 CMSD ITAM은 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 중 하나 이상에서 유래된다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, 기능적 외인성 수용체는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체이다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함하며: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 임의적인 제1 수용체 도메인 링커, (c) 제1 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 세포외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포외 TCR 결합 도메인, (d) 임의적인 제2 수용체 도메인 링커, (e) 제2 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 임의적인 세포외 도메인 또는 이의 일부, (f) 제3 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 (g) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 하위단위는 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 및 제3 TCR 하위단위는 둘 다 CD3ε이다. 일부 구현예에서, 하나 또는 복수의 CMSD ITAM은 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 중 하나 이상에서 유래된다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 하나 이상의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 sdAb 또는 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 항원(예를 들어, 종양 항원)은 BCMA, CD19, 또는 CD20이다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, 기능적 외인성 수용체는 세포외 리간드 결합 도메인의 C-말단 및 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 CD8α에서 유래된다. 일부 구현예에서, 기능적 외인성 수용체는 기능적 외인성 수용체의 N-말단에 위치한 신호 펩티드, 예컨대 CD8α에서 유래된 신호 펩티드를 추가로 포함한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD를 포함하는 ISD를 포함한 기능적 외인성 수용체의 효과기 기능은 CD3ζ의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 ISD를 포함한 기능적 외인성 수용체보다 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것) 낮다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD를 포함하는 ISD를 포함한 기능적 외인성 수용체의 효과기 기능은 CD3ζ의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 ISD를 포함한 기능적 외인성 수용체에 비해 적어도 약 20%(예컨대 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 중 임의의 것) 활성이다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)은 변형된 T 세포의 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC I을 하향 조절하며(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), 예컨대 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 하향 조절하지 않는다(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체를 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5%중 임의의 것)까지 하향 조절한다(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 세포용해 활성과 관련된 신호 전달과 같은 효과기 기능을 하향 조절).
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 발현하는 변형된 T 세포는 변형된 T 세포가 유래된 전구체 T 세포의 공여자에서 단리된 1차 T 세포에 의해 도출된 이식편대숙주병(GvHD) 반응과 비교하여 조직부적합성 개체에서 GvHD 반응을 전혀 도출하지 않거나 또는 감소된(예를 들어, 적어도 약 30% 감소) GvHD 반응을 도출한다.
상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 SIV Nef, HIV1 Nef, HIV2 Nef, 및 이의 하위 유형으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 야생형 Nef, 예컨대 서열번호: 79, 80, 및 84 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 Nef이다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 Nef 하위유형, 예컨대 HIV F2-Nef, HIV C2-Nef, 또는 HIV HV2NZ-Nef이다. 일부 구현예에서, Nef 하위유형은 서열번호: 81-83 및 207-231 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 돌연변이체 Nef, 예컨대 돌연변이체 SIV Nef이다. 일부 구현예에서, 돌연변이체 Nef는 미리스토일화 부위, N-말단 α-나선, 티로신-기반 AP 모집, CD4 결합 부위, 산성 클러스터, 프롤린-기반 반복부, PAK 결합 도메인, COP I 모집 도메인, 디-류신 기반 AP 모집 도메인, V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인, 또는 이의 임의의 조합에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체 Nef는 서열번호: 85-89 및 198-204 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 79-89, 198-204, 및 207-231 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 핵산은 서열번호: 96 또는 234의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성을 갖는다.
본 발명은 또 다른 측면에서 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산 및 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 제2 핵산을 전구체 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하고: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 별개의 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 핵산은 제2 핵산의 상류에 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산은 제2 핵산의 하류에 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 연결 서열, 예컨대 P2A, T2A, E2A, F2A, BmCPV 2A, BmIFV 2A, (GS)n, (GGGS)n, 및 (GGGGS)n 중 임의의 것을 암호화하는 핵산 서열; 또는 IRES, SV40, CMV, UBC, EF1α, PGK, 및 CAGG 중 임의의 것의 핵산 서열; 또는 이의 임의의 조합을 통해 연결되며, 여기서 n은 적어도 1의 정수이다. 일부 구현예에서, 연결 서열은 IRES이다. 일부 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터)이다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 발현하는 변형된 T 세포는 전구체 T 세포의 공여자에서 단리된 1차 T 세포에 의해 도출된 GvHD 반응과 비교하여 조직부적합성 개체에서 GvHD 반응을 전혀 도출하지 않거나 또는 감소된 GvHD 반응을 도출한다. 일부 구현예에서, 방법은 변형된 T 세포에서 TCR-음성 및 기능적 외인성 수용체-양성 T 세포를 단리 및/또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 변형된 T 세포와 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 제형화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 복수(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM은 서로 직접 연결된다. 일부 구현예에서, CMSD는 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 링커)에서 유래되지 않은 하나 이상의 링커에 의해 연결된 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 CMSD ITAM 중 하나 이상이 유래된 ITAM-함유 모 분자와 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된 하나 이상의 CMSD 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 동일한 CMSD ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ에서 유래되지 않는다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ의 ITAM1 또는 ITAM2가 아니다. 일부 구현예에서, 복수의 CMSD ITAM은 각각 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, 복수의 CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다.
또 다른 측면에서, 상기 기재된 방법 중 임의의 것에 의해 수득되는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 또한 제공된다.
추가의 측면에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산 및 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터)가 제공되며, 여기서 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하고: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 핵산은 제2 핵산의 상류에 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산은 제2 핵산의 하류에 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 연결 서열, 예컨대 P2A, T2A, E2A, F2A, BmCPV 2A, BmIFV 2A, (GS)n, (GGGS)n, 및 (GGGGS)n 중 임의의 것을 암호화하는 핵산 서열; 또는 IRES, SV40, CMV, UBC, EF1α, PGK, 및 CAGG 중 임의의 것의 핵산 서열; 또는 이의 임의의 조합을 통해 연결되며, 여기서 n은 적어도 1의 정수이다. 일부 구현예에서, 연결 서열은 IRES이다. 일부 구현예에서, 복수(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM은 서로 직접 연결된다. 일부 구현예에서, CMSD는 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 링커)에서 유래되지 않은 하나 이상의 링커에 의해 연결된 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 CMSD ITAM 중 하나 이상이 유래된 ITAM-함유 모 분자와 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된 하나 이상의 CMSD 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 동일한 CMSD ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ에서 유래되지 않는다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ의 ITAM1 또는 ITAM2가 아니다. 일부 구현예에서, 복수의 CMSD ITAM은 각각 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD는 하나의 CMSD ITAM으로 본질적으로 이루어진다(예를 들어, 이로 이루어진다). 일부 구현예에서, CMSD는 하나의 CMSD ITAM 및 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 링커)에 대해 이종인 N-말단 서열 및/또는 C-말단 서열로 본질적으로 이루어진다(예를 들어, 이로 이루어진다). 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다.
추가의 측면에서, Nef 단백질(신규, 비-자연 발생 Nef 단백질 포함) 및 이러한 Nef 단백질을 발현하는 T 세포가 제공된다. T 세포는 임의적으로 기능적 외인성 수용체(예컨대 본원에 기재된 ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체, 또는 본원에 기재된 BCMA CAR 중 임의의 것)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, Nef 단백질(예컨대 비-자연 발생 Nef 단백질)은 서열번호: 79-89, 198-204, 및 207-231 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Nef 단백질(예컨대 비-자연 발생 Nef 단백질)은 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, Nef 단백질(예컨대 비-자연 발생 Nef 단백질)은 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, Nef 단백질은 발현 시 T 세포의 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC를 하향 조절하지 않는다(세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능을 하향 조절). 일부 구현예에서, Nef 단백질은 발현 시 T 세포의 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC를 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, Nef 단백질은 발현 시 T 세포의 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC를 야생형 Nef 단백질의 것보다 적어도 약 3%(예컨대 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것) 더 하향 조절한다. 일부 구현예에서, Nef 단백질은 발현 시 T 세포의 내인성 CD4 및/또는 CD28을 하향 조절하지 않는다. 일부 구현예에서, Nef 단백질은 발현 시 T 세포의 내인성 CD4 및/또는 CD28을 최대 약 50%(예컨대 최대 약 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, Nef 단백질은 발현 시 T 세포의 내인성 CD4 및/또는 CD28을 야생형 Nef 단백질 보다 약 3%(예컨대 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것) 낮게 하향 조절한다. 일부 구현예에서, Nef 단백질은 발현 시 T 세포의 기능적 외인성 수용체(예를 들어, CMSD-함유 기능적 외인성 수용체, 또는 BCMA CAR)를 하향 조절하지 않는다. 일부 구현예에서, Nef 단백질은 발현 시 T 세포의 기능적 외인성 수용체(예를 들어, CMSD-함유 기능적 외인성 수용체, 또는 BCMA CAR)를 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5%의 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, Nef 단백질은 발현 시 T 세포의 기능적 외인성 수용체를 야생형 Nef 단백질의 것보다 적어도 약 3%(예컨대 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것) 낮게 하향 조절한다. 일부 구현예에서, Nef 단백질은 발현 시 조직부적합성 개체에서 공여자 T 세포의 GvHD 반응을 제거하거나 또는 감소시킨다(예컨대 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것까지 감소됨).
본원에 기재된 외인성 Nef 단백질 및 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체 중 임의의 것을 암호화하는 단리된 핵산, 이러한 핵산을 함유하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터), 이러한 벡터를 함유하는 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포)가 또한 제공된다.
본원에 기재된 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포) 중 임의의 것을 포함하는 약제학적 조성물, 본원에 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것 또는 이의 약제학적 조성물을 사용하여 질환(예를 들어, 암, GvHD, 감염성 질환, 이식 거부, 자가면역 장애, 또는 방사선병)을 치료하는 방법이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 치료를 위한 개체(예를 들어, 인간)는 변형된 T 세포가 유래된 전구체 T 세포의 공여자와 조직부적합성이다.
본 발명은 본원에 기재된 방법에 유용한 키트 및 제조 물품을 추가로 제공한다.
도 1a는 Jurkat-BCMA-BBz(기존 BCMA CAR "BCMA-BBz" 서열을 보유하는 렌티바이러스로 형질도입된 Jurkat 세포) 세포 배양물(83.9% CAR+), 야생형 SIV Nef 서열을 보유하는 렌티바이러스로 추가로 형질도입된 Jurkat-BCMA-BBz 세포 배양물(Jurkat-BCMA-BBz-SIV Nef 세포, 42.3% CAR+), SIV Nef M116 서열을 보유하는 렌티바이러스로 추가로 형질도입된 Jurkat-BCMA-BBz 세포 배양물(Jurkat-BCMA-BBz-SIV Nef M116 세포, 39.1% CAR+)의 CAR 발현율을 나타낸다. 빈 벡터로 추가로 형질도입된 Jurkat-BCMA-BBz 세포 배양물(Jurkat-BCMA-BBz-빈 벡터 세포, 83.6% CAR+)은 대조군으로 제공되었다. 도 1b는 대조군 형질도입되지 않은 Jurkat 세포(96.8% TCRαβ pos), MACS 분류된 Jurkat-SIV Nef TCRαβ 음성(야생형 SIV Nef 서열을 보유하는 렌티바이러스로 형질도입된 Jurkat 세포) 세포 배양물(11.6% TCRαβ pos), BCMA-BBz를 암호화하는 렌티바이러스로 추가로 형질도입된 MACS 분류된 Jurkat-SIV Nef TCRαβ 음성 세포 배양물(Jurkat-SIV Nef-BCMA-BBz 세포, 61.5% TCRαβ pos), 및 ITAM-변형된 BCMA CAR "BCMA-BB010"을 암호화하는 렌티바이러스로 추가로 형질도입된 MACS 분류된 Jurkat-SIV Nef TCRαβ 음성 세포 배양물(Jurkat-SIV Nef-BCMA-BB010 세포, 7.98% TCRαβ pos)에서 TCRαβ 발현을 나타낸다. "TCRαβ pos"는 TCRαβ 양성율을 의미한다.
도 2는 사멸 검정의 3 일째에 20:1의 E:T 비에서 다발성 골수종 세포주 RPMI8226.Luc에서 BCMA-BBz(기존 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 BCMA CAR) 및 BCMA-BB010(ITAM010 키메라 신호전달 도메인을 포함하는 ITAM-변형된 BCMA CAR)을 발현하는 T 세포의 상대적 사멸 효율을 나타낸다. 형질도입되지 않은 T 세포(UnT)는 대조군으로 제공되었다.
도 3a는 LCAR-UL186S(SIV Nef M116-IRES-CD8α SP-CD20 scFv(Leu16)-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-ITAM010) 및 LCAR-L186S(CD8α SP-CD20 scFv(Leu16)-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-CD3ζ) 서열을 각각 보유하는 렌티바이러스로 1차 T 세포를 형질도입한 후 FACS 분석에 의한 CD20 CAR 양성율을 나타낸다. "CAR pos"는 CAR 양성율을 의미한다. "UnT"는 미처리된 T 세포를 나타낸다. 도 3b는 사멸 검정의 3 일째에 각각 20:1, 10:1 및 5:1의 상이한 E:T 비에서 림프종 Raji.Luc 세포주(CD20+)에서 LCAR-UL186S T 세포 및 LCAR-L186S T 세포의 세포독성을 나타낸다. 형질도입되지 않은 T 세포(UnT)는 대조군으로 제공되었다.
도 4a-4c는 사멸 검정의 3 일째에 20:1, 10:1 및 5:1의 상이한 E:T 비에서 림프종 Raji.Luc 세포주를 사멸시킬 때 LCAR-L186S T 세포(기존 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인이 있는 CD20 CAR) 및 LCAR-UL186S T 세포(ITAM-변형된 CD20 CAR/SIV Nef M116 공동-발현)에 의해 방출된 전염증 인자(도 4a), 케모카인(도 4b), 및 사이토카인(도 4c)의 수준을 입증한다. 미처리된 T 세포(UnT)는 대조군으로 제공되었다.
도 5a-5d는 LCAR-L186S T 세포 및 TCRαβ MACS 분류된 LCAR-UL186S CAR+/TCRαβ- T 세포의 생체내 효능을 나타낸다. 면역-결핍 NCG 마우스를 -4 일째에 인간 Raji.Luc 종양 세포(CD20+)로 이식하고, 이후에 0 일째에 HBSS, 형질도입되지 않은 T 세포(UnT), LCAR-L186S T 세포, 및 TCRαβ MACS 분류된 LCAR-UL186S CAR+/TCRαβ- T 세포로 처리하였다. 생물발광 영상화(도 5a-5b), 체중(도 5c), 및 생존(도 5d)에 의한 종양 성장을 모니터링하기 위해 마우스를 매주 평가하였다.
도 6a-6d는 종양 재발 모델을 모방하는 종양 재접종(re-challenge) 후 LCAR-L186S T 세포 및 TCRαβ MACS 분류된 LCAR-UL186S CAR+/TCRαβ- T 세포의 생체내 효능을 나타낸다. CAR-T 투여 후 41 일에, 비-재발 마우스에 3x104 Raji.Luc 종양 세포를 추가로 주사하였다(0 일로 표시됨). 생물발광 영상화(도 6a-6b), 체중(도 6c), 및 생존(도 6d)에 의한 종양 성장을 모니터링하기 위해 마우스를 정기적으로 평가하였다.
도 7a-7c는 SIV Nef 및 SIV Nef M116과 다양한 변형된 세포내 신호전달 도메인(ISD)을 포함하는 BCMA CAR 사이의 상호작용을 입증한다. 도 7a는 대조군으로서 Jurkat-ISD-변형된 CAR-빈 벡터 세포에서 높은 CAR 양성율을 나타낸다. 도 7b는 Jurkat-M663-SIV Nef 세포, Jurkat-M665-SIV Nef 세포, 및 Jurkat-M666-SIV Nef 세포에서 감소된 BCMA CAR 발현을 나타낸다. 도 7c는 Jurkat-M663-SIV Nef M116 세포, Jurkat-M665-SIV Nef M116 세포, 및 Jurkat-M666-SIV M116 Nef 세포에서 감소된 BCMA CAR 발현을 나타낸다.
도 8은 40:1의 E:T 비에서 다발성 골수종 세포주 RPMI8226.Luc(BCMA+, Luc+)에서 각각 BCMA-BBz, BCMA-BB007, BCMA-BB008, BCMA-BB009, 및 BCMA-BB010을 발현하는 변형된 T 세포의 상대적 사멸 효율을 나타낸다. BCMA-BB를 발현하는 T 세포(4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인만을 가지며, CD3ζ 세포내 신호전달 도메인이 없음)는 음성 대조군으로 제공되었다.
도 9는 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, CD3ζ, CD3ε) 세포내 신호전달 도메인 구조 및 예시적인 CMSD 구조를 도시한다.
도 10은 LIC948A22 CAR-T 세포(86.5% CAR+) 및 TCRαβ MACS 분류된 LUC948A22 UCAR-T 세포(85.9% CAR+)에 대한 BCMA CAR 양성율을 나타낸다. "UnT"는 형질도입되지 않은 T 림프구를 나타내고 대조군으로 제공되었다. "LIC948A22 CAR-T"는 자가 BCMA CAR을 발현하는 T 림프구를 나타내고 BCMA+ MACS에 의해 풍부화되었다. "LUC948A22 UCAR-T"는 보편적인 BCMA CAR을 발현하는 T 림프구를 나타내고 TCRαβ- MACS에 의해 풍부화되었다.
도 11은 2.5:1 및 1.25:1의 상이한 E:T 세포 비에서 RPMI8226.Luc 세포주에서 LIC948A22 CAR-T 세포 및 TCRαβ MACS 분류된 LUC948A22 UCAR-T 세포(CAR+/TCRαβ-)의 특이적 종양 세포독성을 나타낸다. "UnT"는 형질도입되지 않은 T 림프구를 나타내고 대조군으로 제공되었다. "LIC948A22 CAR-T"는 자가 BCMA CAR을 발현하는 T 림프구를 나타내고 BCMA+ MACS에 의해 풍부화되었다. "LUC948A22 UCAR-T"는 보편적인 BCMA CAR을 발현하는 T 림프구를 나타내고 TCRαβ- MACS에 의해 풍부화되었다.
도 12a-12c는 2.5:1 및 1.25:1의 상이한 E:T 비에서 RPMI8226.Luc 세포주를 사멸시킬 때 LIC948A22 CAR-T 세포 및 TCRαβ MACS 분류된 LUC948A22 UCAR-T 세포(CAR+/TCRαβ-)에 의해 시험관내에서 방출된 전염증 인자(도 12a), 케모카인(도 12b), 및 사이토카인(도 12c)의 수준을 입증한다. "UnT"는 형질도입되지 않은 T 림프구를 나타내고 대조군으로 제공되었다. "LIC948A22 CAR-T"는 자가 BCMA CAR을 발현하는 T 림프구를 나타내고 BCMA+ MACS에 의해 풍부화되었다. "LUC948A22 UCAR-T"는 보편적인 BCMA CAR을 발현하는 T 림프구를 나타내고 TCRαβ- MACS에 의해 풍부화되었다.
도 13a-13c는 SIV Nef 및 SIV Nef M116과 다양한 CMSD ITAM을 포함하는 BCMA CAR 사이의 상호작용을 입증한다. 도 13a는 대조군으로서 Jurkat-ITAM-변형된 BCMA CAR-빈 벡터 세포에서 높은 BCMA CAR 양성율을 나타낸다. 도 13b-13c는 SIV Nef 및 SIV Nef M116으로 형질도입된 Jurkat-M678 세포, Jurkat-M680 세포, Jurkat-M684 세포, 및 Jurkat-M799 세포에서 각각 BCMA CAR 발현의 유의한 감소가 없음을 나타낸다. 도13b-13c는 Jurkat-M663-SIV Nef 세포 및 Jurkat M663-SIV Nef M116 세포에서 BCMA CAR 발현의 유의한 감소를 나타낸다.
도 14a-14c는 CAR-T 세포의 CMSD ITAM이 CAR-매개 특이적 활성화 활성을 보유함을 입증한다. 도 14a-14c는 표적 세포주 RPMI8226 및 비-표적 세포주 K562와 각각 인큐베이션된 Jurkat-ISD-변형된 BCMA CAR 세포에서 CD69(도 14a), CD25(도 14b), 및 HLA-DR(도 14c)의 활성화 분자 발현을 나타낸다. "Jurakt"는 대조군으로서 형질도입되지 않은 Jurkat 세포를 나타낸다.
도 15는 CAR-T 세포 활성에 대한 CMSD 링커의 영향을 입증한다. 도 15는 서로 직접 연결된 CMSD ITAM(BCMA-BB024), 하나 이상의 CMSD 링커(BCMA-BB010, BCMA-BB025, BCMA-BB026, BCMA-BB027, BCMA-BB028, 및 BCMA-BB029)에 의해 연결된 CMSD ITAM을 각각 포함하는 ISD와 같이, 2.5:1의 E:T 비에서 다발성 골수종 세포주 RPMI8226.Luc에서 기존 CD3ζ CAR(BCMA-BBz) 및 상이한 ITAM-변형된 BCMA CAR을 별도로 발현하는 변형된 T 세포의 상대적 사멸 효율을 나타낸다. "UnT"는 대조군으로서 제공된 형질도입되지 않은 T 세포를 나타낸다.
도 16은 CAR-T 세포 활성에 대한 CMSD ITAM 순서의 영향을 입증한다. 도 16은 2.5:1의 E:T 비에서 다발성 골수종 세포주 RPMI8226.Luc에서 BCMA-BBz, BCMA-BB010, BCMA-BB030, BCMA-BB031, 및 BCMA-BB032를 각각 발현하는 변형된 T 세포의 상대적 사멸 효율을 나타낸다. "UnT"는 대조군으로 제공된 형질도입되지 않은 T 세포를 나타낸다.
도 17은 CAR-T 세포 활성에 대한 CMSD ITAM의 양 및 공급원의 영향을 입증한다. 도 17은 1 CMSD ITAM(BCMA-BB033 및 BCAM-BB034), 2 CMSD ITAM(BCMA-BB035 및 BCMA-BB036), 3 CMSD ITAM(BCMA-BB037 및 BCMA-BB038), 및 4 CMSD ITAM(BCMA-BB010, BCMA-BB030~BCMA-BB032))를 각각 포함하는 ISD와 같이, 2.5:1의 E:T 비에서 다발성 골수종 세포주 RPMI8226.Luc에서 기존 CD3ζ CAR(BCMA-BBz) 및 상이한 ITAM-변형된 BCMA CAR을 별도로 발현하는 변형된 T 세포의 상대적 사멸 효율을 나타낸다. "UnT"는 대조군으로 제공된 형질도입되지 않은 T 세포를 나타낸다.
도 18a-18b는 SIV Nef 및 SIV Nef M116과 다양한 CMSD ITAM을 포함하는 BCMA CAR 사이의 상호작용을 입증한다. 도 18a-18b는 상이한 ITAM-변형된 BCMA CAR 및 CD3ζ를 포함하는 BCMA CAR로 별도로 형질도입된 MACS 분류된 Jurkat-SIV Nef TCRαβ 음성 세포 및 MACS 분류된 Jurkat-SIV Nef M116 TCRαβ 음성 세포의 TCRαβ 발현을 나타낸다. "TCRαβ pos"는 TCRαβ 양성율을 나타낸다. "Jurkat"는 대조군으로 제공된 형질도입되지 않은 Jurkat 세포를 나타낸다.
도 19a는 SIV Nef M116+ITAM-변형된 CD20 CAR 및 SIV Nef M116+CD3ζ CD20 CAR(M1185) 올인원(all-in-one) 작제물로 각각 형질도입된 Jurkat 세포의 TCRαβ 발현을 나타낸다. 도 19b는 20:1의 E:T 비에서 림프종 세포주 Raji.Luc에서 SIV Nef M116+ITAM-변형된 CD20 CAR 및 SIV Nef M116+CD3ζ CD20 CAR(M1185) 올인원 작제물로 각각 형질도입된 T 세포의 상대적 사멸 효율을 나타낸다. "TCRαβ pos"는 TCRαβ 양성율을 나타낸다. "Jurkat"는 대조군으로 제공된 형질도입되지 않은 Jurkat 세포를 나타낸다. "UnT"는 대조군으로 제공된 형질도입되지 않은 T 세포를 나타낸다.
도 20a는 SIV Nef M116+ITAM-변형된 BCMA CAR 및 SIV Nef M116+CD3ζ BCMA CAR(M1215) 올인원 작제물로 각각 형질도입된 Jurkat 세포의 TCRαβ 발현을 나타낸다. 도 20b는 4:1의 E:T 비에서 다발성 골수종 세포주 RPMI8226.Luc에서 SIV Nef M116+ITAM-변형된 BCMA CAR 및 SIV Nef M116+CD3ζ BCMA CAR(M1215) 올인원 작제물로 각각 형질도입된 T 세포의 상대적 사멸 효율을 나타낸다. "TCRαβ pos"는 TCRαβ 양성율을 나타낸다. "Jurkat"는 대조군으로 제공된 형질도입되지 않은 Jurkat 세포를 나타낸다. "UnT"는 대조군으로 제공된 형질도입되지 않은 T 세포를 나타낸다.
도 21은 TCRαβ 발현에 대한 Jurkat-절두된 SIV Nef 세포 및 Jurkat-SIV Nef M116 세포 각각의 조절을 입증한다. "TCRαβ pos"는 TCRαβ 양성율을 나타낸다. "Jurkat"는 대조군으로 제공된 형질도입되지 않은 Jurkat 세포를 나타낸다.
도 22a는 M598-T 세포 및 MACS 분류된 TCRαβ 음성 M598-T 세포의 TCRαβ 발현을 나타낸다. 도 22b는 M598-T 세포 및 MACS 분류된 TCRαβ 음성 M598-T 세포의 BCMA CAR 발현을 나타낸다. 도 22c는 각각 2.5:1, 1.25:1, 및 1:1.25의 상이한 E:T 비에서 다발성 골수종 세포주 RPMI8226.Luc에서 MACS 분류된 TCRαβ 음성 M598-T 세포의 상대적 사멸 효율을 나타낸다. "TCRαβ pos"는 TCRαβ 양성율을 나타낸다. "CAR pos"는 CAR 양성율을 나타낸다. "UnT"는 형질도입되지 않은 T 세포를 나타낸다. "TCRαβ- M598-T"는 MACS 분류된 TCRαβ 음성 M598-T 세포를 나타낸다.
도 23a-23d는 CAR-T 세포 면역요법에서 TCRαβ 및 MHC 발현에 대한 이중 조절을 갖는 SIV Nef 하위유형을 나타낸다. 도 23a-23b는 LCAR-UL186S 및 M1392를 발현하는 변형된 T 세포에서 각각 CD20 CAR, TCRαβ, 및 HLA-B7의 발현율을 나타낸다. 도 23c는 1:1의 E:T 비에서 효과기 세포와 인큐베이션 48 시간 후, LCAR-L186S T 세포, B2M KO LCAR-L186S T 세포, 및 TCRαβ- M1392-T 세포의 혼합 림프구 반응에 기반한 MHC 클래스 I 교차-반응성을 나타낸다. 도 23d는 20:1, 10:1, 및 5:1의 상이한 E:T 비에서 림프종 세포주 Raji.Luc에서 TCRαβ- M1392-T 세포의 상대적 사멸 효율을 나타낸다. UnT는 대조군으로 제공된 형질도입되지 않은 T 세포를 나타낸다.
본 출원은 외인성 음성 조절 인자(Nef) 단백질 및 키메라 신호전달 도메인("CMSD")을 포함하는 기능적 외인성 수용체를 포함하는 변형된 T 세포를 제공한다. 본원에 기재된 CMSD는 하나 또는 복수의 면역-수용체 티로신-기반 활성화 모티프("ITAM"), 및 CD3ζ와 같은 자연 발생 ITAM-함유 모 분자 중 임의의 것과 상이한 구성으로 배열된 임의적인 링커를 포함한다. 놀랍게도, 자연 발생 ITAM-기반 신호전달 도메인을 함유하는 기존 기능적 외인성 수용체와 마찬가지로, CMSD를 함유하는 수용체는 수용체가 동족 리간드에 결합 시 T 세포를 활성화시킬 수 있음을 밝혀내었다. 기존 기능적 외인성 수용체(예컨대 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인(ISD)을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR))와 비교하여, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 수용체(예를 들어, CMSD를 포함하는 CAR)는 사이토카인, 케모카인, 및 전염증 인자의 방출 유도를 유의하게 감소시키면서, 종양 이종이식 마우스 모델 및 종양 재발 마우스 모델 둘 다에서 우수한 종양 세포독성을 입증한다.
추가로 놀랍게도 특정 유형의 CMSD(예를 들어 CD3ζ의 ITAM1 및 ITAM2를 함유하지 않는 CMSD)를 함유하는 수용체는, T 세포(또한 본원에서 "TCR-결핍 T 세포" 또는 "GvHD-최소화 T 세포"라고 지칭됨)에서 내인성 T 세포 수용체(TCR)를 하향 조절할 수 있는 Nef 단백질과 공동-발현될 때, Nef 단백질에 의해 하향 조절되지 않거나 또는 감소된 하향 조절을 나타냄을 밝혀내었다. 이 특성은 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체를 예를 들어 동종이계 T 세포 요법을 위해 Nef 단백질과 함께 사용하기에 특히 적합하게 만든다.
따라서, 본 발명은 일 측면에서 외인성 Nef 단백질 및 다음을 포함하는 기능적 외인성 수용체 포함하는 변형된 T 세포를 제공하며: (a) 세포외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 하나 또는 복수의 ITAM을 포함하는 CMSD("CMSD ITAM"으로 지칭됨)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인("ISD"), 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 링커("CMSD 링커"로 지칭됨)에 의해 임의적으로 연결된다. 기능적 외인성 수용체(본원에서 이하에 "ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체" 또는 "CMSD-함유 기능적 외인성 수용체"로 지칭됨)는, ISD가 CMSD를 포함하는 것을 제외하고, 키메라 항원 수용체("CAR"), 조작된 T 세포 수용체("조작된 TCR"), 키메라 T 세포 수용체("cTCR"), 및 T 세포 항원 커플러("TAC")-유사 키메라 수용체와 유사한 구조를 가질 수 있다. 이러한 기능적 외인성 수용체는 본원에서 각각 "ITAM-변형된 CAR," "ITAM-변형된 TCR," "ITAM-변형된 cTCR," 및 "ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체"로 지칭된다. 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 포함하는 변형된 T 세포는 "ITAM-변형된 TCR-T 세포", "ITAM-변형된 cTCR-T 세포", "ITAM-변형된 TAC-유사-T 세포", 또는 "ITAM-변형된 CAR-T 세포"로 지칭된다.
본 발명은 또한 Nef 단백질(예를 들어, 비-자연 발생 Nef 단백질) 및 Nef 단백질을 발현하는 변형된 T 세포를 제공한다. 본원에 기재된 특정 Nef 단백질은 CD3ζ ITAM1 및/또는 ITAM2와 상호작용하여, 본원에 기재된 ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체, 특히 CMSD가 CD3ζ ITAM1 및/또는 ITAM2를 함유하지 않는 기능적 외인성 수용체와 조합하여 사용하는 데 특히 적합하며, 즉, 이들 기능적 외인성 수용체는 T 세포에서 이러한 외인성 Nef 단백질의 공동-발현에 의해 훨씬 적게 영향을 받을 것이다. 그러나, Nef 단백질을 발현하는 T 세포는 임의의 기능적 외인성 수용체를 포함할 필요가 없거나, 또는 ITAM-변형되지 않은 기능적 외인성 수용체, 예를 들어, CD3ζ ISD를 포함하는 기존 CAR을 포함할 수 있음이 이해된다.
또한 변형된 T 세포에 포함될 기능성 외인성 수용체, 이러한 기능적 외인성 수용체를 암호화하는 핵산, 및 변형된 T 세포를 제조하는 방법이 제공된다. 암과 같은 다양한 질환을 치료하기 위해 변형된 T 세포를 사용하는 방법이 추가로 제공된다.
I. 정의
본원에 사용된 바와 같은 용어 "기능적 외인성 수용체"는 본원에 기재된 T 세포 또는 Nef-발현 T 세포 내로 도입된 후 생물학적 활성을 보유하는 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체, 또는 ITAM-변형된 CAR)를 지칭한다. 생물학적 활성은 세포 증식, 사이토카인 생산 및/또는 조절 또는 세포용해 효과기 기능의 수행을 유도하는 것과 같이 신호를 하류로 적절하게 전달하는, 분자에 특이적으로 결합하는 외인성 수용체의 능력을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합한다," "특이적으로 인식한다," 또는 "특이적"이다는 표적 및 항원 결합 단백질(예컨대 항원-결합 도메인, 리간드-수용체, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 임의의 기능적 외인성 수용체) 사이의 결합과 같은 측정가능하고 재현가능한 상호작용을 지칭하며, 이는 생물학적 분자를 포함한 분자의 이종 집단의 존재 하에 표적의 존재를 결정한다. 예를 들어, 표적(에피토프일 수 있음)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질은 다른 표적에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력, 더 용이하게, 및/또는 더 큰 지속기간으로 이 표적에 결합하는 항원 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 관련되지 않은 표적에 대한 항원 결합 단백질의 결합 정도는 예를 들어, 방사선면역검정(RIA)에 의해 측정된 바와 같이 표적에 대한 항원 결합 단백질의 결합의 약 10% 미만이다. 일부 구현예에서, 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질은
Figure pat00001
Figure pat00002
1 μM,
Figure pat00003
100 nM,
Figure pat00004
10 nM,
Figure pat00005
1 nM, 또는
Figure pat00006
0.1 nM의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 상이한 종의 단백질 중에서 보존된 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 특이적 결합은 배타적 결합을 포함할 수 있으나 이를 필요로 하지 않는다.
용어 "특이성"은 항원의 특정 에피토프에 대한 항원 결합 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 임의의 기능적 외인성 수용체, sdAb, scFv, 또는 리간드 수용체)의 선택적 인식을 지칭한다. 예를 들어, 천연 항체는 단일특이적이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "다중특이적"은 항원 결합 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 CMSD, sdAb, scFv, 또는 리간드-수용체를 포함하는 임의의 기능적 외인성 수용체)이 2 개 이상의 항원-결합 부위를 가지며 이 중 적어도 2 개가 상이한 항원 또는 에피토프에 결합함을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 "이중특이적"은 항원 결합 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 임의의 기능적 외인성 수용체, sdAb, scFv, 또는 리간드-수용체)이 2 개의 상이한 항원-결합 특이성을 가짐을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "단일특이적"은 하나 이상의 결합 부위를 가지며 각각이 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 임의의 기능적 외인성 수용체, sdAb, scFv, 또는 리간드-수용체)을 나타낸다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자(예를 들어, 항체, 리간드-수용체, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 임의의 기능적 외인성 수용체)의 단일 결합 부위 및 이의 결합 파트너(예를 들어, 항원, 리간드) 사이의 비-공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은 "결합 친화도"는 결합 쌍(예를 들어, 항체 및 항원, 또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 임의의 기능적 외인성 수용체 및 항원, 예컨대 ITAM-변형된 CAR 및 항원)의 구성원 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유한 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)로 표현될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것들을 포함하여, 당업계에 알려진 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 낮은-친화도 항체는 일반적으로 항원에 서서히 결합하고 용이하게 해리되는 경향이 있는 반면, 높은-친화도 항체는 일반적으로 항원에 더 빠르게 결합하고 더 오래 결합된 채 유지되는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법은 당업계에 알려져 있으며, 이 중 임의의 것이 본 출원의 목적을 위해 사용될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 구체적 예시 및 예시적 구현예는 하기에 기재되어 있다.
펩티드, 폴리펩티드 또는 항체 서열에 대해서 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성" 및 "상동성"은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 필요한 경우 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 특이적 펩티드 또는 폴리펩티드 서열에서 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로 정의되고, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않는다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGN™(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.
본원에 기재된 "단리된" 핵산 분자(예를 들어, 외인성 Nef 단백질 암호화, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 임의의 기능적 외인성 수용체 암호화)는 통상적으로 생산된 환경에서 연관된 적어도 하나의 오염 핵산 분자로부터 식별되고 분리된 핵산 분자이다. 바람직하게는, 단리된 핵산은 생산 환경과 연관된 모든 구성요소와 연관성이 없다. 본원의 폴리펩티드 및 항체를 암호화하는 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 설정 이외의 형태이다. 따라서 단리된 핵산 분자는 세포에 자연적으로 존재하는 본원의 폴리펩티드 및 항체를 암호화하는 핵산과 구별된다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여 있을 때 "작동가능하게 연결된다". 예를 들어, 전서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 위치하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우, 인접하고 판독 단계에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하지 않아야 한다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 관행에 따라 사용된다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴 버전이고 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이라는 어구는 또한 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 연결된 또 다른 핵산을 번식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 용어는 자기-복제 핵산 구조로서 벡터 뿐만 아니라 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포(예를 들어, T 세포) 내로 전달되거나 또는 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염되거나, 형질전환되거나 또는 형질도입된 세포이다. 세포는 1차 대상체 세포 및 이의 자손을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는"은 임상 결과를 포함한 유익하거나 또는 원하는 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 또는 원하는 임상 결과는 다음 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 질환으로 인한 하나 이상의 증상 완화, 질환 정도 감소, 질환 안정화(예를 들어, 질환의 악화 예방 또는 지연), 질환의 확산(예를 들어, 전이) 예방 또는 지연, 질환의 재발 예방 또는 지연, 질환의 진행 지연 또는 늦춤, 질환 상태 개선, 질환의 관해(부분 또는 전체) 제공, 질환을 치료하는 데 필요한 하나 이상의 다른 약제의 용량 감소, 질환의 진행 지연, 삶의 질 증가, 및/또는 생존 연장. 또한 "치료"에 의해 포함되는 것은 암의 병리학적 결과의 감소이다. 본 출원의 방법은 이러한 치료 측면 중 임의의 하나 이상을 고려한다.
본원에 사용된 바와 같이, "개체" 또는 "대상체"는 인간, 소, 말, 고양이, 개, 설치류, 또는 영장류를 포함하나 이에 제한되지 않는 포유동물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 명시된 장애, 병태 또는 질환(예를 들어, 암, 감염성 질환, GvHD, 이식 거부, 자가면역 장애, 또는 방사선병)의 증상 중 하나 이상을 개선, 완화, 경감, 및/또는 지연시키는 것과 같이 이를 치료하는 데 충분한 본원에 기재된 변형된 T 세포(예를 들어, Nef-함유 ITAM-변형된 T 세포)와 같은 제제, 또는 이의 약제학적 조성물의 양을 지칭한다. 암과 관련하여, 유효량은 종양을 수축시키고/시키거나 종양의 성장 속도를 감소시키거나(예컨대 종양 성장 억제) 또는 다른 원치않은 세포 증식을 방지 또는 지연시키기에 충분한 양을 포함한다. 일부 구현예에서, 유효량은 발달을 지연시키기에 충분한 양이다. 일부 구현예에서, 유효량은 재발을 방지하거나 또는 지연시키기에 충분한 양이다. 유효량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다. 제제(예를 들어, 변형된 T 세포) 또는 조성물의 유효량은 (i) 암 세포 수를 줄이고/줄이거나; (ii) 종양 크기를 줄이고/줄이거나; (iii) 말초 기관 내로 암 세포 침윤을 어느 정도 억제, 지연, 늦추고 바람직하게는 중지하고/하거나; (iv) 종양 전이를 억제하고/하거나(즉, 어느 정도 늦추고 바람직하게는 중지시킴); (v) 종양 성장을 억제하고/하거나; (vi) 종양의 발생 및/또는 재발을 방지 또는 지연시키고/시키거나; (vii) 암과 연관된 증상 중 하나 이상을 어느 정도로 완화시킬 수 있다. 감염성 질환, 예컨대 바이러스 감염의 경우, 본원에 기재된 변형된 T 세포 또는 이의 조성물의 치료적 유효량은 병원체에 의해 감염된 세포의 수를 줄이고/줄이거나; 병원체-유래 항원의 생산 또는 재발을 줄이고/줄이거나; 감염되지 않은 세포로 병원체의 확산을 억제하고/하거나(즉, 어느 정도 늦추고 바람직하게는 중지시킴); 감염과 연관된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 치료적 유효량은 환자의 생존을 연장하는 양이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "자가"는 나중에 개체에게 재도입될 동일한 개체에서 유래된 임의의 물질을 지칭하는 것을 의미한다.
"동종이계"는 동일한 종의 상이한 개체에서 유래된 이식편을 지칭한다. "동종이계 T 세포"는 수용자와 일치하는 조직 인간 백혈구 항원(HLA) 유형을 갖는 공여자로부터의 T 세포를 지칭한다. 전형적으로, 일치는 HLA 유전자의 3 개 이상의 유전자좌에서 가변성에 기초하여 수행되고, 이들 유전자좌에서 완벽한 일치가 바람직하다. 일부 경우에 동종이계 이식 공여자는 혈연(일반적으로 밀접하게 HLA 일치된 형제), 동계(환자의 일란성 "동일한" 쌍둥이) 또는 비혈연(혈연이 아니고 HLA 일치 정도가 매우 근접한 것으로 밝혀진 공여자)일 수 있다. HLA 유전자는 2 가지 범주(유형 I 및 유형 II)에 속한다. 일반적으로, 유형-I 유전자(즉, HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-C)의 불일치는 이식 거부의 위험을 증가시킨다. HLA 유형 II 유전자(즉, HLA-DR, 또는 HLA-DQB1)의 불일치는 GvHD의 위험을 증가시킨다.
본원에 사용된 바와 같은 "환자"는 질환(예를 들어, 암, 바이러스 감염, GvHD)으로 고통받는 임의의 인간을 포함한다. 용어 "대상체," "개체," 및 "환자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 용어 "공여자 대상체" 또는 "공여자"는 본원에서 세포가 추가로 시험관내 조작을 위해 수득되는 대상체를 지칭한다. 공여자 대상체는 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 세포 집단으로 치료될 환자(즉, 자가 공여자)일 수 있거나, 또는 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 세포 집단의 생성 시, 상이한 개체 또는 환자를 치료하는 데 사용될 혈액 샘플(예를 들어, 림프구 샘플)을 공여하는 개체(즉, 동종이계 공여자)일 수 있다. 본 방법에 의해 제조된 세포를 수용하는 이들 대상체는 "수용자" 또는 "수용자 대상체"로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "자극"은 세포 표면 모이어티의 결찰에 의해 유도된 1차 반응을 지칭한다. 예를 들어, 수용체의 맥락에서, 이러한 자극은 수용체의 결찰 및 후속 신호 전달 이벤트를 수반한다. T 세포의 자극과 관련하여, 이러한 자극은 일 구현예에서 TCR/CD3 복합체의 결합, 또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 임의의 기능적 외인성 수용체의 결합과 같은 신호 전달 이벤트를 후속적으로 유도하는 T 세포 표면 모이어티의 결찰을 지칭한다. 추가로, 자극 이벤트는 세포를 활성화하고 TGF-β의 하향 조절과 같은 분자의 발현 또는 분비를 상향 조절 또는 하향 조절할 수 있다. 따라서, 직접 신호 전달 이벤트의 부재 하에서도, 세포 표면 모이어티의 결찰은 세포골격 구조의 재조직, 또는 세포 표면 모이어티의 합체를 초래할 수 있으며, 각각은 후속 세포 반응의 향상, 변형, 또는 변경에 기여할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "활성화"는 뚜렷한 생화학적 또는 형태학적 변화를 유도하기에 충분한 세포 표면 모이어티 결찰 후 세포의 상태를 지칭한다. T 세포의 맥락 내에서, 이러한 활성화는 세포 증식을 유도하도록 충분히 자극된 T 세포의 상태를 지칭한다. T 세포의 활성화는 또한 사이토카인 생산 및 조절 또는 세포용해 효과기 기능의 수행을 유도할 수 있다. 다른 세포의 맥락 내에서, 이 용어는 특정 물리-화학 과정의 상향 또는 하향 조절을 암시한다. 용어 "활성화된 T 세포"는 현재 세포 분열, 사이토카인 생산, 조절 또는 세포용해 효과기 기능의 수행을 겪고 있고/있거나, 최근에 "활성화"의 과정을 겪은 T 세포를 나타낸다
T 세포에서 분자(예를 들어, 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD4, CD28, MHC I, CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 세포외 수용체, 또는 기능적 세포외 수용체 예컨대 본원에 기재된 BCMA CAR)의 "하향 조절"이라는 용어는 분자의 세포 표면 발현을 하향 조절하고/하거나, 이의 신호 전달(예를 들어, 기능적 세포외 수용체, TCR, CD3, CD4, CD28-매개 신호 전달), T 세포 자극, T 세포 활성화, 및/또는 T 세포 증식을 방해하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 세포 표면 상의 변화하는 수용체 재배열의 내재화, 스트립핑, 캡핑 또는 다른 형태를 통한 표적 수용체의 하향 조절이 또한 포함될 수 있다.
본원에 기재된 본 출원의 구현예는 구현예로 "이루어지는" 및/또는 "본질적으로 이루어지는" 것을 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 "약" 값 또는 매개변수에 대한 언급은 그 값 또는 매개변수 그 자체에 대한 변경을 포함한다(그리고 설명한다). 예를 들어, "약 X"를 언급하는 설명은 "X"의 설명을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 값 또는 매개변수 "아닌"에 대한 언급은 일반적으로 값 또는 매개변수 "이외"의 것을 의미하고 설명한다. 예를 들어, 방법이 유형 X의 암을 치료하는 데 사용되지 않는다는 것은 방법이 X 이외의 유형의 암을 치료하는 데 사용됨을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "약 X-Y"는 "약 X 내지 약 Y"와 동일한 의미를 갖는다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다.
II. CMSD-함유 기능적 외인성 수용체를 포함하는 Nef-함유 T 세포
본 출원은 다음을 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)를 제공한다: i) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef); 및 ii) 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체). 외인성 Nef 단백질 및 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체를 공동-발현하는 변형된 T 세포는 "Nef-함유 ITAM-변형된 T 세포" 또는 "GvHD-최소화 ITAM-변형된 T 세포", 예컨대 "Nef-함유 ITAM-변형된 TCR-T 세포", "Nef-함유 ITAM-변형된 cTCR-T 세포", "Nef-함유 ITAM-변형된 TAC-유사-T 세포", 또는 "Nef-함유 ITAM-변형된 CAR-T 세포"로 지칭된다.
일부 구현예에서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공되며: i) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef); 및 ii) 다음을 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체): (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공되며: i) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산; 및 ii) 다음을 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 제2 핵산: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, CMSD 링커는 서열번호: 12-26, 103-107, 및 119-126 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 HIV F2-Nef, HIV C2-Nef, 또는 HIV HV2NZ-Nef와 같은 Nef 하위유형이다. 일부 구현예에서, Nef 하위유형은 서열번호: 81-83 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Nef(예를 들어, SIV Nef) 하위유형은 서열번호: 207-231 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질은 일부 구현예에서 야생형 Nef, 예컨대 야생형 HIV1 Nef, 야생형 HIV2 Nef, 또는 야생형 SIV Nef이다. 일부 구현예에서, 야생형 Nef는 서열번호: 79, 80, 및 84 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질은 일부 구현예에서 돌연변이체 Nef, 예컨대 본원에 기재된 돌연변이체 Nef 단백질 중 임의의 것, 예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef 예컨대 SIV Nef M116이다. 일부 구현예에서, 돌연변이체 Nef는 미리스토일화 부위, N-말단 α-나선, 티로신-기반 AP 모집, CD4 결합 부위, 산성 클러스터, 프롤린-기반 반복부, PAK 결합 도메인, COP I 모집 도메인, 디-류신 기반 AP 모집 도메인, V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인, 또는 이의 임의의 조합에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 삽입, 결실,　점 돌연변이(들), 및/또는 재배열을 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체 Nef는 서열번호: 85-89 및 198-204 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)은 발현 시 변형된 T 세포의 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ)를 하향 조절한다(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, 하향 조절은 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 하향 조절하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질에 의한 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ)의 하향 조절(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능의 하향 조절)은 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)이다. 일부 구현예에서, 발현 시 외인성 Nef 단백질에 의한 내인성 MHC I, CD3ε, CD3γ, 및/또는 CD3δ의 하향 조절(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능의 하향 조절은 적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것의 하향 조절이다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 발현 시 내인성 CD3ζ를 하향 조절하지 않는다(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 발현 시 CD3ζ를 최대 약 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것까지 하향 조절한다(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)은 발현 시 CD4 및/또는 CD28을 하향 조절한다(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)은 발현 시 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD4, 및 CD28을 하향 조절한다(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)은 발현 시 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ)을 하향 조절하지만(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), CD4 및/또는 CD28을 하향 조절하지 않는다(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)은 발현 시 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ) 및 CD4를 하향 조절하지만(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), CD28을 하향 조절하지 않는다(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)은 발현 시 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ) 및 CD28을 하향 조절하지만(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), CD4를 하향 조절하지 않는다(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 발현 시: i) TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ)을 하향 조절하지만(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), MHC I을 하향 조절하지 않거나; ii) MHC I을 하향 조절하지만, TCR을 하향 조절하지 않거나; 또는 iii) TCR 및 MHC I을 둘 다 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)은 발현 시 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3(예를 들어, CD3ε/γ/δ), 및/또는 MHC I을 하향 조절하지만(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 하향 조절하지 않는다(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, Nef 하위유형 또는 돌연변이체 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 발현 시 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3(예를 들어, CD3ε/γ/δ), 및/또는 MHC I을 발현 시 야생형 Nef에 의한 것보다 적어도 약 3%(예컨대 적어도 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것) 더 하향 조절한다(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, Nef 하위유형 또는 돌연변이체 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 발현 시 CD4 및/또는 CD28을 하향 조절하지 않는다(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, Nef 하위유형 또는 돌연변이체 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef 예컨대 SIV Nef M116)는 발현 시 CD4 및/또는 CD28을 발현 시 야생형 Nef(예를 들어, 야생형 SIV Nef)에 의한 것보다 적어도 약 3% 낮게(예컨대 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 낮게 중 임의의 것) 하향 조절한다(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체는 발현 시 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)에 의해 하향 조절되지 않는다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체는 외인성 Nef 단백질이 부재할 때와 비교하여 발현 시 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)에 의해 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것) 하향 조절된다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)은 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3(예를 들어, CD3ε/γ/δ), 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절하지만(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절); 기능적 외인성 수용체를 하향 조절하지 않거나(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), 또는 기능적 외인성 수용체를 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR)는 CD3ζ ISD를 포함하는 동일한 외인성 수용체(예를 들어, CD3ζ ISD를 제외하고는 모든 것을 동일하게 포함하는 기존 CAR)보다 발현 시 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)에 의해 적어도 약 3% 낮게(예를 들어, 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 낮게 중 임의의 것) 하향 조절된다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, Nef 하위유형 또는 돌연변이체 Nef 단백질(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)은 발현 시 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3(예를 들어, CD3ε/γ/δ), 및/또는 MHC I을 하향 조절하지만(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 하향 조절하지 않는다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)는 변형된 T 세포가 유래된 전구체 T 세포의 공여자에서 단리된 1차 T 세포에 의해 도출된 GvHD 반응과 비교하여 조직부적합성 개체에서 GvHD 반응을 전혀 도출하지 않거나 또는 감소된(예컨대 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것까지 감소된) GvHD 반응을 도출한다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 변형된 내인성 TCR 유전자좌를 포함한다.
일부 구현예에서, 기능적 외인성 수용체는 ITAM-변형된 CAR이다. 따라서 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공되며: i) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef); 및 ii) 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CAR: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고; 여기서 외인성 Nef 단백질은 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3(예를 들어, CD3ε/γ/δ), 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절하고(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절); 임의적으로 여기서 외인성 Nef 단백질은 ITAM-변형된 CAR을 하향 조절하지 않거나(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), 또는 ITAM-변형된 CAR을 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 N'에서 C'으로 다음을 포함하며: (a) 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (b) 임의적인 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (d) 임의적인 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28에서 유래) 및 CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD에 대해 N-말단이다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD에 대해 C-말단이다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 ITAM-변형된 CAR의 N-말단에 위치한 신호 펩티드(예를 들어, CD8α에서 유래)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 다음을 포함하는 ITAM-변형된 BCMA CAR이며: (a) 다음을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인: i) 항-BCMA scFv, 또는 ii) BCMA에 특이적으로 결합하는 제1 sdAb 모이어티(예를 들어, VHH), 임의적인 링커, 및 BCMA에 특이적으로 결합하는 제2 sdAb 모이어티(예를 들어, VHH), (b) 임의적인 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (d) 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28에서 유래) 및 CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD에 대해 N-말단이다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 BCMA CAR은 N'에서 C'으로 다음을 포함하며: (a) CD8α 신호 펩티드, (b) 다음을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인: i) 항-BCMA scFv, 또는 ii) BCMA에 특이적으로 결합하는 제1 sdAb 모이어티(예를 들어, VHH), 임의적인 링커, 및 BCMA에 특이적으로 결합하는 제2 sdAb 모이어티(예를 들어, VHH), (c) CD8α 힌지 도메인, (d) CD8α 막관통 도메인, (e) 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인, 및 (f) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD), 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CD20 CAR이며: (a) 항-CD20 scFv를 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (b) 임의적인 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (d) 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28에서 유래) 및 CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD에 대해 N-말단이다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CD20 CAR은 N'에서 C'으로 다음을 포함하며: (a) CD8α 신호 펩티드, (b) 항-CD20 scFv를 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (c) CD8α 힌지 도메인, (d) CD8α 막관통 도메인, (e) 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인, 및 (f) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD), 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 항-BCMA sdAb 사이의 링커, 및/또는 CMSD 링커는 서열번호: 12-26, 103-107, 및 119-126 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열번호: 67의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열번호: 68의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호: 69의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 BCMA CAR은 서열번호: 71 및 153-169 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 BCMA CAR은 서열번호: 109, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD20 scFv는 Leu16에서 유래된다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CD20 CAR은 서열번호: 73 및 170-175 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 79-89, 198-204, 및 207-231 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 84, 85, 또는 230의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공된다: i) 서열번호: 79-89, 198-204, 207-231, 및 235-247 중 임의의 것의 서열을 포함하거나, 또는 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재하는 것인, 외인성 Nef 단백질; 및 ii) 서열번호: 71, 109, 153-169, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 서열을 포함하는 ITAM-변형된 BCMA CAR. 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공된다: i) 서열번호: 79-89, 198-204, 207-231, 및 235-247 중 임의의 것의 서열을 포함하거나, 또는 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재하는 것인, 외인성 Nef 단백질; 및 ii) 서열번호: 73 및 170-175 중 임의의 것의 서열을 포함하는 ITAM-변형된 CD20 CAR.
일부 구현예에서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공되며: i) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef); 및 ii) 다음을 포함하는 ITAM-변형된 TCR: (a) 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20) 또는 표적 항원 펩티드/MHC 복합체(예를 들어, BCMA/MHC 복합체)의 하나 이상의 에피토프를 함께 특이적으로 인식하는 야생형 TCR에서 유래된 Vα 및 Vβ를 포함하며, 여기서 Vα, Vβ, 또는 둘 다는 야생형 TCR에 비해 하나 이상의 CDR에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인, 세포외 리간드 결합 도메인, (b) TCRα의 막관통 도메인 및 TCRβ의 막과통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 (c) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고; 여기서 외인성 Nef 단백질은 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3(예를 들어, CD3ε/γ/δ), 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절하고(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절); 임의적으로 여기서 외인성 Nef 단백질은 ITAM-변형된 TCR을 하향 조절하지 않거나(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), 또는 ITAM-변형된 TCR을 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, CMSD 링커는 서열번호: 12-26, 103-107, 및 119-126 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TCR은 ITAM-변형된 TCR의 N-말단에 위치한 신호 펩티드(예를 들어, CD8α에서 유래)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열번호: 67의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 79-89, 198-204, 및 207-231 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 84, 85, 또는 230의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공되며: i) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef); 및 ii) 다음을 포함하는 ITAM-변형된 cTCR: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 임의적인 수용체 도메인 링커, (c) 제1 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 임의적인 세포외 도메인 또는 이의 일부, (d) 제2 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 (e) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 제1 및 제2 TCR 하위단위는 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 여기서 외인성 Nef 단백질은 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3(예를 들어, CD3ε/γ/δ), 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절하고(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절); 임의적으로 여기서 외인성 Nef 단백질은 ITAM-변형된 cTCR을 하향 조절하지 않거나(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), 또는 ITAM-변형된 cTCR을 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 항-BCMA scFv 또는 항-CD20 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 BCMA에 특이적으로 결합하는 제1 sdAb 모이어티(예를 들어, VHH), 임의적인 링커, 및 BCMA에 특이적으로 결합하는 제2 sdAb 모이어티(예를 들어, VHH)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 TCR 하위단위는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 TCR 하위단위는 상이하다. 일부 구현예에서, 수용체 도메인 링커 및/또는 2 개의 항-BCMA sdAb 사이의 링커는 서열번호: 12-26, 103-107, 및 119-126으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 TCR 하위단위는 둘 다 CD3ε이다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 하나 이상은 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 중 하나 이상에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD 링커는 CD3ε, CD3δ, 또는 CD3γ에서 유래되거나, 또는 서열번호: 12-26, 103-107, 및 119-126으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CMSD는 하나의 CD3ε/δ/γ ITAM으로 본질적으로 이루어진다(예를 들어, 이로 이루어진다). 일부 구현예에서, CMSD는 적어도 2 개의 CD3ε ITAM, 적어도 2 개의 CD3δ ITAM, 또는 적어도 2 개의 CD3γ ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 cTCR은 세포외 리간드 결합 도메인의 C-말단 및 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래)을 추가로 포함한다(제1 TCR 하위단위의 임의적인 세포외 도메인 또는 이의 일부가 부재하는 경우). 일부 구현예에서, ITAM-변형된 cTCR은 ITAM-변형된 cTCR의 N-말단에 위치한 신호 펩티드(예를 들어, CD8α에서 유래)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열번호: 67의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열번호: 68의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 79-89, 198-204, 및 207-231 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 84, 85, 또는 230의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공되며: i) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef); 및 ii) 다음을 포함하는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 임의적인 제1 수용체 도메인 링커, (c) 제1 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 세포외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포외 TCR 결합 도메인, (d) 임의적인 제2 수용체 도메인 링커, (e) 제2 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 임의적인 세포외 도메인 또는 이의 일부, (f) 제3 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 (g) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 하위단위는 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 여기서 외인성 Nef 단백질은 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3(예를 들어, CD3ε/γ/δ), 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절하고(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절); 임의적으로 여기서 외인성 Nef 단백질은 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체를 하향 조절하지 않거나(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체를 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 항-BCMA scFv 또는 항-CD20 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 BCMA에 특이적으로 결합하는 제1 sdAb 모이어티(예를 들어, VHH), 임의적인 링커, 및 BCMA에 특이적으로 결합하는 제2 sdAb 모이어티(예를 들어, VHH)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1, 제2 및 제3 TCR 하위단위는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1, 제2 및 제3 TCR 하위단위는 모두 상이하다. 일부 구현예에서, 제2 및 제3 TCR 하위단위는 동일하지만, 제1 TCR 하위단위와 상이하다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체는 세포외 리간드 결합 도메인의 C-말단 및 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래)을 추가로 포함한다(세포외 TCR 결합 도메인이 세포외 리간드 결합 도메인에 대해 N-말단이고, 제2 TCR 하위단위의 임의적인 세포외 도메인 또는 이의 일부가 부재하는 경우). 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체는 세포외 TCR 결합 도메인의 C-말단 및 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래)을 추가로 포함한다(세포외 TCR 결합 도메인이 세포외 리간드 결합 도메인에 대해 C-말단이고, 제2 TCR 하위단위의 임의적인 세포외 도메인 또는 이의 일부가 부재하는 경우). 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체의 N-말단에 위치한 신호 펩티드(예를 들어, CD8α에서 유래)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 2 개의 항-BCMA sdAb 사이의 링커, CMSD 링커, 제1 및/또는 제2 수용체 도메인 링커는 서열번호: 12-26, 103-107, 및 119-126으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 및 제3 TCR 하위단위는 둘 다 CD3ε이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 CMSD ITAM은 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 중 하나 이상에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD 링커는 CD3ε, CD3δ, 또는 CD3γ에서 유래되거나, 또는 서열번호: 12-26, 103-107, 및 119-126으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CMSD는 적어도 2 개의 CD3ε ITAM, 적어도 2 개의 CD3δ ITAM, 또는 적어도 2 개의 CD3γ ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열번호: 67의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열번호: 68의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 79-89, 198-204, 및 207-231 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 84, 85, 또는 230의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포) 내에서 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산 및 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 제2 핵산은 별개의 벡터, 즉, 각각 제1 벡터 및 제2 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산 및 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 암호화하는 제2 핵산은 동일한 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 급초기 유전자 프로모터(CMV IE), 신장 인자 1 알파 프로모터(EF1-α), 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 유비퀴틴-C(UBQ-C) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴(CAG) 프로모터, 폴리오마 인핸서/단순 포진 티미딘 키나제(MC1) 프로모터, 베타 액틴(β-ACT) 프로모터, "골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 대조군 영역 결실된, d1587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND)" 프로모터, NFAT 프로모터, TETON® 프로모터, 및 NFκB 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 EF1-α 또는 PGK이다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 암호화하는 제2 핵산의 상류에 있다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 암호화하는 제2 핵산의 하류에 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 연결 서열을 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 연결 서열은 P2A, T2A, E2A, F2A, BmCPV 2A, BmIFV 2A, (GS)n, (GGGS)n, 및 (GGGGS)n 중 임의의 것을 암호화하는 핵산 서열; 또는 IRES, SV40, CMV, UBC, EF1α, PGK, 및 CAGG 중 임의의 것의 핵산 서열; 또는 이의 임의의 조합을 포함하며, 여기서 n은 적어도 1의 정수이다. 일부 구현예에서, 연결 서열은 IRES이다. 일부 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 에피솜 벡터 발현 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터, 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 비-바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 피기백(Piggybac) 벡터 또는 잠자는 미녀(Sleeping Beauty) 벡터이다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 서열번호: 90-100 및 234 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 서열번호: 95, 96, 또는 234의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산은 서열번호: 75 또는 77의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산 및 ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 벡터는 서열번호: 78의 서열을 포함하는 연결 서열(예를 들어, IRES)을 통해 연결된다.
따라서 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공되며: i) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 제1 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터); 및 ii) 다음을 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 제2 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터): (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고; 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3(예를 들어, CD3ε/γ/δ), 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절하고(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절); 임의적으로 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 기능적 외인성 수용체를 하향 조절하지 않거나(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), 또는 기능적 외인성 수용체를 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공되며: i) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 제1 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터); 및 ii) 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 제2 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터): (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 임의적인 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (d) 임의적인 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28에서 유래) 및 CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고; 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3(예를 들어, CD3ε/γ/δ), 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절하고(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절); 임의적으로 여기서 외인성 Nef 단백질은 (발현시 하향 조절되지 않거나(ITAM-변형된 CAR을 하향 조절(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), 또는 ITAM-변형된 CAR을 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 다음을 포함하는 ITAM-변형된 BCMA CAR이며: (a) 다음을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인: i) 항-BCMA scFv, 또는 ii) BCMA에 특이적으로 결합하는 제1 sdAb 모이어티(예를 들어, VHH), 임의적인 링커, 및 BCMA에 특이적으로 결합하는 제2 sdAb 모이어티(예를 들어, VHH), (b) 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (d) 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28에서 유래) 및 CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD에 대해 N-말단이다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CD20 CAR이며: (a) 항-CD20 scFv를 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (b) 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (d) 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28에서 유래) 및 CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD에 대해 N-말단이다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열번호: 68의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호: 69의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 79-89, 198-204, 및 207-231 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 BCMA CAR은 서열번호: 71 및 153-169 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 BCMA CAR은 서열번호: 109, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CD20 CAR은 서열번호: 73 및 170-175 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 서열번호: 90-100 및 234 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 서열번호: 95, 96, 또는 234의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산은 서열번호: 75 또는 77의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공된다: i) 서열번호: 79-89, 198-204, 207-231, 및 235-247 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재하는 것인, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 제1 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터); 및 ii) 서열번호: 71, 109, 153-169, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM-변형된 BCMA CAR을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 제2 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터). 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공된다: i) 서열번호: 79-89, 198-204, 207-231, 및 235-247 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재하는 것인, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 제1 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터); 및 ii) 서열번호: 73 및 170-175 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM-변형된 CD20 CAR을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 제2 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터). 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 벡터는 바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터)이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 벡터 프로모터는 EF1-α 또는 PGK이다. 일부 구현예에서, 2 개의 벡터 프로모터는 동일하다. 일부 구현예에서, 2 개의 벡터 프로모터는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 벡터는 전구체 T 세포 내에 동시에 도입된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 벡터는 전구체 T 세포 내에 순차적으로 도입된다.
일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공되며: i) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산; iii) 제2 프로모터(예를 들어, PGK); 및 iv) 다음을 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 제2 핵산: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고; 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3(예를 들어, CD3ε/γ/δ), 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절하고(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절); 임의적으로 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 기능적 외인성 수용체를 하향 조절하지 않거나(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), 또는 기능적 외인성 수용체를 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공되며: i) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산; iii) 제2 프로모터(예를 들어, PGK); 및 iv) 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 한 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 임의적인 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (d) 임의적인 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28에서 유래) 및 CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고; 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3(예를 들어, CD3ε/γ/δ), 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절하고(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절); 임의적으로 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 ITAM-변형된 CAR을 하향 조절하지 않거나(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), 또는 ITAM-변형된 CAR을 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열번호: 68의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호: 69의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 79-89, 198-204, 및 207-231 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 BCMA CAR은 서열번호: 71 및 153-169 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 BCMA CAR은 서열번호: 109, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CD20 CAR은 서열번호: 73 및 170-175 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 서열번호: 90-100 및 234 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 서열번호: 95, 96, 또는 234의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산 서열번호: 75 또는 77의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공된다: i) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 서열번호: 79-89, 198-204, 207-231, 및 235-247 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재하는 것인, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산; iii) 제2 프로모터(예를 들어, PGK); 및 iv) 서열번호: 71, 109, 153-169, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM-변형된 BCMA CAR을 암호화하는 제2 핵산. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공된다: i) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 서열번호: 79-89, 198-204, 207-231, 및 235-247 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재하는 것인, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산; iii) 제2 프로모터(예를 들어, PGK); 및 iv) 서열번호: 73 및 170-175 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM-변형된 CD20 CAR을 암호화하는 제2 핵산. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 프로모터는 EF1-α 또는 PGK이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 프로모터는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 프로모터는 상이하다.
일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공되며: i) 제2 프로모터(예를 들어, PGK); ii) 다음을 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 제2 핵산: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되는 것; iii) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); 및 iv) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산; 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3(예를 들어, CD3ε/γ/δ), 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절하고(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절); 임의적으로 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 기능적 외인성 수용체를 하향 조절하지 않거나(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), 또는 기능적 외인성 수용체를 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공되며: i) 제2 프로모터(예를 들어, PGK); ii) 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 임의적인 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) 임의적인 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28에서 유래) 및 CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되는 것; iii) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); 및 iv) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산; 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3(예를 들어, CD3ε/γ/δ), 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절하고(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절); 임의적으로 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 ITAM-변형된 CAR을 하향 조절하지 않거나(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), 또는 ITAM-변형된 CAR을 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열번호: 68의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호: 69의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 79-89, 198-204, 및 207-231 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 BCMA CAR은 서열번호: 71 및 153-169 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 BCMA CAR은 서열번호: 109, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CD20 CAR은 서열번호: 73 및 170-175 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 서열번호: 90-100 및 234 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 서열번호: 95, 96, 또는 234의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산은 서열번호: 75 또는 77의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공된다: i) 제2 프로모터(예를 들어, PGK); ii) 서열번호: 71, 109, 153-169, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM-변형된 BCMA CAR을 암호화하는 제2 핵산; iii) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); 및 iv) 서열번호: 79-89, 198-204, 207-231, 및 235-247 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재하는 것인, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공된다: i) 제2 프로모터(예를 들어, PGK); ii) 서열번호: 73 및 170-175 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM-변형된 CD20 CAR을 암호화하는 제2 핵산; iii) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); 및 iv) 서열번호: 79-89, 198-204, 207-231, 및 235-247 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재하는 것인, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 프로모터는 EF1-α 또는 PGK이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 프로모터는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 프로모터는 상이하다.
일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공되며: i) 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산; iii) 제1 연결 서열(예를 들어, IRES, 또는 P2A 또는 T2A와 같은 자기-절단 2A 펩티드를 암호화하는 핵산); iv) 임의적인 제2 연결 서열(예를 들어, (GGGS)3과 같은 가요성 링커를 암호화하는 핵산); 및 v) 다음을 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 제2 핵산: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고; 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3(예를 들어, CD3ε/γ/δ), 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절하고(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절); 임의적으로 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 기능적 외인성 수용체를 하향 조절하지 않거나(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), 또는 기능적 외인성 수용체를 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공되며: i) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산; iii) 제1 연결 서열(예를 들어, IRES, 또는 P2A 또는 T2A와 같은 자기-절단 2A 펩티드를 암호화하는 핵산); iv) 임의적인 제2 연결 서열(예를 들어, (GGGS)3과 같은 가요성 링커를 암호화하는 핵산); 및 v) 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 임의적인 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (d) 임의적인 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28에서 유래) 및 CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고; 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3(예를 들어, CD3ε/γ/δ), 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절하고(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절); 임의적으로 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 ITAM-변형된 CAR을 하향 조절하지 않거나(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), 또는 ITAM-변형된 CAR을 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열번호: 68의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호: 69의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 79-89, 198-204, 및 207-231 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 BCMA CAR은 서열번호: 71 및 153-169 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 BCMA CAR은 서열번호: 109, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CD20 CAR은 서열번호: 73 및 170-175 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 서열번호: 90-100 및 234 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 서열번호: 95, 96, 또는 234의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산은 서열번호: 75 또는 77의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 연결 서열은 서열번호: 31-35 중 임의의 것, 예컨대 서열번호: 35로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공된다: i) 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 서열번호: 79-89, 198-204, 207-231, 및 235-247 중 임의의 것의 아미노산을 포함하거나, 또는 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재하는 것인, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, wt, 하위유형, 또는 돌연변이체 Nef)을 암호화하는 제1 핵산; iii) 서열번호: 31-35(예를 들어, 서열번호: 35)로 이루어진 군으로부터 선택된 연결 서열; 및 iv) 서열번호: 71, 73, 109, 153-175, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공되며: i) 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 서열번호: 79-89, 198-204, 207-231, 및 235-247 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재하는 것인, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, wt, 하위유형, 또는 돌연변이체 Nef)을 암호화하는 제1 핵산; iii) 제1 연결 서열(예를 들어, IRES, 또는 P2A 또는 T2A와 같은 자기-절단 2A 펩티드를 암호화하는 핵산, 예컨대 서열번호: 31-35 중 임의의 것); iv) 임의적인 제2 연결 서열(예를 들어, (GGGS)3과 같은 가요성 링커를 암호화하는 핵산); 및 v) 서열번호: 71, 73, 109, 153-175, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산; 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3(예를 들어, CD3ε/γ/δ), 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절하고(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절); 임의적으로 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 ITAM-변형된 CAR을 하향 조절하지 않거나(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), 또는 ITAM-변형된 CAR을 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 EF1-α 또는 PGK이다.
일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공되며: i) 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 다음을 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 제2 핵산: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)을 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되는 것; iii) 제1 연결 서열(예를 들어, IRES, 또는 P2A 또는 T2A와 같은 자기-절단 2A 펩티드를 암호화하는 핵산); iv) 임의적인 제2 연결 서열(예를 들어, (GGGS)3과 같은 가요성 링커를 암호화하는 핵산); 및 v) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산; 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3(예를 들어, CD3ε/γ/δ), 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절)하고; 임의적으로 여기서 외인성 Nef 단백질은 (발현 시 기능적 외인성 수용체를 하향 조절하지 않거나(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), 또는 기능적 외인성 수용체를 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공되며: i) 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 임의적인 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (d) 임의적인 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28에서 유래) 및 CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되는 것; iii) 제1 연결 서열(예를 들어, IRES, 또는 P2A 또는 T2A와 같은 자기-절단 2A 펩티드를 암호화하는 핵산); iv) 임의적인 제2 연결 서열(예를 들어, (GGGS)3과 같은 가요성 링크를 암호화하는 핵산); 및 v) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산; 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3(예를 들어, CD3ε/γ/δ), 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절하고(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절); 임의적으로 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 ITAM-변형된 CAR을 하향 조절하지 않거나(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), 또는 ITAM-변형된 CAR을 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열번호: 68의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호: 69의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 79-89, 198-204, 및 207-231 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 BCMA CAR은 서열번호: 71 및 153-169 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 BCMA CAR은 서열번호: 109, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CD20 CAR은 서열번호: 73 및 170-175 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 서열번호: 90-100 및 234 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 서열번호: 95, 96, 또는 234의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산은 서열번호: 75 또는 77의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 연결 서열은 서열번호: 31-35(예를 들어, 서열번호: 35)로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공된다: i) 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 서열번호: 71, 73, 109, 153-175, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산; iii) 서열번호: 31-35(예를 들어, 서열번호: 35)로 이루어진 군으로부터 선택된 연결 서열; 및 iv) 서열번호: 79-89, 198-204, 207-231, 및 235-247 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재하는 것인, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, wt, 하위유형, 또는 돌연변이체 Nef)을 암호화하는 제1 핵산. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 제공되며: i) 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 서열번호: 71, 73, 109, 153-175, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산; iii) 제1 연결 서열(예를 들어, IRES, 또는 P2A 또는 T2A와 같은 자기-절단 2A 펩티드를 암호화하는 핵산, 예컨대 서열번호: 31-35 중 임의의 것); iv) 임의적인 제2 연결 서열(예를 들어, (GGGS)3과 같은 가요성 링커를 암호화하는 핵산); 및 v) 서열번호: 79-89, 198-204, 207-231, 및 235-247 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재하는 것인, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 비-자연 발생 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산; 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3(예를 들어, CD3ε/γ/δ), 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절하고(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절); 임의적으로 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 ITAM-변형된 CAR을 하향 조절하지 않거나(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), 또는 ITAM-변형된 CAR을 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 EF1-α 또는 PGK이다.
일부 구현예에서, Nef-함유 ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체-T 세포(예를 들어, Nef-함유 ITAM-변형된 CAR-T 세포, Nef-함유 ITAM-변형된 TCR-T 세포, Nef-함유 ITAM-변형된 cTCR-T 세포, 또는 Nef-함유 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체-T 세포)는 비변형된 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ) 유전자좌 및/또는 비변형된 내인성 B2M을 포함한다. 일부 구현예에서, Nef-함유 ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체-T 세포는 변형된 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ) 및/또는 B2M 유전자좌를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 TCR 유전자좌는 CRISPR-Cas, TALEN, shRNA, 및 ZFN으로부터 선택된 유전자 편집 시스템에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 내인성 TCR 유전자좌(또는 B2M 유전자좌)는 서열번호: 108(또는 서열번호: 233)의 핵산 서열을 포함하는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas 시스템에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템을 암호화하는 핵산(들) 및 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 핵산은 동일한 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템을 암호화하는 핵산(들) 및 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 핵산은 동일한 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템을 암호화하는 핵산(들), 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산, 및 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 암호화하는 제2 핵산은 모두 동일한 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템을 암호화하는 핵산(들) 및 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 핵산은 상이한 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템을 암호화하는 핵산(들) 및 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 암호화하는 핵산은 상이한 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템을 암호화하는 핵산(들), 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산, 및 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 암호화하는 제2 핵산은 모두 상이한 벡터 상에 있다.
본원에 기재된 임의의 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 도입함으로써 수득된 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 추가로 제공된다. 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 수득된 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)가 추가로 제공된다.
외인성 Nef 단백질에 의한 하향 조절
분자(예를 들어, TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), MHC I, CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD28, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 세포외 수용체, 또는 본원에 기재된 BCMA CAR과 같은 기능적 세포외 수용체)의 하향 조절은 분자의 세포 표면 발현의 하향 조절, 및/또는 분자(예를 들어, 전술된 분자 중 임의의 것) 또는 이러한 분자를 포함하는 세포(예를 들어, 변형된 T 세포)의 효과기 기능의 하향 조절을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "효과기 기능"은 분자의 생물학적 활성을 지칭한다. 예를 들어, TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD28, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 세포외 수용체, 또는 기재된 BCMA CAR과 같은 기능적 세포외 수용체, ITAM-함유 분자, CD3ζ ISD-함유 분자(예를 들어, 기존 CAR), 또는 CMSD-함유 분자(또는 이를 포함하는 변형된 T 세포)의 효과기 기능은 신호 전달, 예컨대 T 세포 자극, T 세포 활성화, T 세포 증식, 사이토카인 생산, T 세포의 조절 또는 세포용해 활성 등과 관련된 신호 전달일 수 있다. ITAM-함유 분자, CMSD-함유 분자, 또는 CMSD의 효과기 기능은 전술된 신호 전달일 수 있고/있거나, 다른 신호전달 분자에 대한 도킹 부위로서 역할을 할 수 있다. MHC I의 효과기 기능은 에피토프 제시 등일 수 있다.
외인성 Nef 단백질(예를 들어, wt ot 돌연변이체 Nef)의 발현이 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), MHC I, CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD28, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 세포외 수용체, 또는 BCMA CAR 등을 하향 조절(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 기능을 하향 조절)하는지 테스트하거나, 또는 외인성 Nef 단백질이 전술된 분자와 상호작용(예를 들어, 이에 결합)하는지 테스트하기 위해, 단백질의 세포 표면 발현의 하향 조절이 있는지, 또는 신호전달 분자-매개 신호 전달(예를 들어, TCR/CD3 복합체-매개 신호 전달)이 영향을 받는지(예를 들어, 폐지되거나 또는 약화되는지) 테스트할 수 있다. 예를 들어, 외인성 Nef 단백질의 발현이 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 하향 조절하는지 테스트하기 위해, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 벡터로 형질도입/형질감염된 세포(예를 들어, T 세포)는 항-TCRα 및/또는 항-TCRβ 항체를 사용하여 FACS 또는 MACS 분류에 적용될 수 있다(또한 실시예 참조). 예를 들어, 형질도입/형질감염된 세포는 FACS를 위한 PE/Cy5 항-인간 TCRαβ 항체(예를 들어, Biolegend, #306710)와 인큐베이션되어 TCRαβ 양성율을 검출할 수 있거나, 또는 비오틴 표지화를 위한 비오티닐화 인간 TCRαβ 항체(Miltenyi, 200-070-407)와 인큐베이션된 다음 MACS 키트 프로토콜에 따라 자기 분리 및 풍부화에 적용될 수 있다. 외인성 Nef 단백질의 발현이 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 세포외 수용체의 세포 표면 발현을 하향 조절하는지 테스트하기 위해, FACS를 위한 기능적 세포외 수용체, 예를 들어, FITC-표지된 인간 BCMA 단백질(예를 들어, ACROBIOSYSTEM, BCA-HF254-200UG)에 의해 인식된 표지된 항체를 사용하여 ITAM-변형된 BCMA CAR 발현을 검출할 수 있다. 외인성 Nef 단백질의 발현이 신호전달 분자-매개 신호 전달, 예를 들어, TCR/CD3 복합체-매개 신호 전달을 하향 조절하는지 테스트하기 위해, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 벡터로 형질도입/형질감염된 세포(예를 들어, T 세포)가 T 세포 활성화를 위해 파이토헤마글루티닌(PHA)으로 유도될 수 있다. PHA는 TCR을 포함한 글리코실화된 표면 단백질 상의 당과 결합하여, 이들을 가교시킨다. 이는 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT) 활성화로 이어지는 칼슘-의존적 신호전달 경로를 촉발한다. 그런 다음 이들 세포는 외인성 Nef 단백질의 영향 하에 PHA-매개 T 세포 활성화를 검출하기 위해 예를 들어, PE 항-인간 CD69 항체를 사용하는 FACS를 사용하여 CD69+ 속도에 대해 테스트될 수 있다. 외인성 Nef 단백질의 발현이 세포외 수용체(예를 들어, CD3ζ ISD를 갖는 기존 CAR, 또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 세포외 수용체)를 하향 조절하는지 테스트하기 위해, 일부 구현예에서, 표적 세포(예를 들어, 종양 세포)에 대한 수용체-매개 세포독성은 종양 크기에 대한 시험관내 테스트, 또는 생체내 테스트를 위해 류시퍼라제 표지가 있는 세포(예를 들어, Raji.Luc)를 사용함으로써 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 전염증 인자, 케모카인 및/또는 사이토카인의 세포외 수용체-매개 방출이 측정될 수 있다. 전염증 인자, 케모카인 및/또는 사이토카인의 수용체-매개 세포독성 및/또는 방출이 외인성 Nef 단백질의 존재로 감소되는 경우, 이는 Nef 및 외인성 수용체 사이의 상호작용을 반영하거나, 또는 외인성 Nef 단백질은 외인성 수용체를 하향 조절한다(예를 들어, 발현 및/또는 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, Nef 단백질과 본원에 기재된 기능적 외인성 수용체 또는 TCR의 CMSD와 같은 신호전달 분자의 결합은 또한 면역침전 및 면역형광과 같은 정규 생화학적 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 또한 예시적 테스트 방법에 대해 실시예를 참조한다.
본원에 기재된 CMSD-함유 기능적 세포외 수용체, 또는 이를 포함하는 변형된 T 세포의 효과기 기능은 상기와 유사하게(예를 들어, 사이토카인 방출 또는 수용체-매개 세포독성을 측정함으로써) 측정될 수 있다. 또한 예시적 테스트 방법에 대해 실시예를 참조한다.
III. CMSD-함유 기능적 외인성 수용체
본원에 기재된 Nef-함유 T 세포는 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체를 포함한다. 본 출원은 일 측면에서 또한 이러한 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체 및 이를 발현하는 세포(예를 들어, 효과기 세포 예컨대 T 세포)를 제공한다.
일부 구현예에서, 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하며: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) CMSD를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 ITAM("CMSD ITAM")을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 링커("CMSD 링커")에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 복수(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM은 서로 직접 연결된다. 일부 구현예에서, CMSD는 ITAM-함유 모 분자에서 유래되지 않은 하나 이상의 CMSD 링커(예를 들어, G/S 링커)에 의해 연결된 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 CMSD ITAM 중 하나 이상이 유래된 ITAM-함유 모 분자와 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된 하나 이상의 CMSD 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 동일한 CMSD ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ에서 유래되지 않는다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ의 ITAM1 또는 ITAM2가 아니다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 2 개는 서로 상이하다. 일부 구현예에서, 복수의 CMSD ITAM은 각각 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, 복수의 CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD는 하나의 CMSD ITAM으로 본질적으로 이루어진다(예를 들어, 이로 이루어진다). 일부 구현예에서, CMSD는 하나의 CMSD ITAM(예를 들어, CD3ε, CD3δ, 또는 CD3γ에서 유래) 및 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 링커)에 이종인 CMSD N-말단 서열 및/또는 CMSD C-말단 서열을 포함한다(예를 들어, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다). 일부 구현예에서, 하나 또는 복수의 CMSD ITAM은 CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, DAP12, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), 및 FcεRIγ 중 하나 이상에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD는 CD3ζ ITAM1 및/또는 CD3ζ ITAM2를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ ITAM3이다. 일부 구현예에서, CMSD는 CD3ζ로부터의 임의의 ITAM을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 2 개는 동일한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 39-51 및 132-152 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)가 제공되며: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 임의적인 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래); (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (d) CMSD를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 서열번호: 39-51 및 132-152 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ISD는 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, CD28 또는 4-1BB에서 유래)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 공동-자극 도메인은 CMSD에 대해 N-말단이다. 일부 구현예에서, 공동-자극 도메인은 CMSD에 대해 C-말단이다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호: 69의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열번호: 68의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD-함유 기능적 외인성 수용체는 기능적 외인성 수용체의 N-말단에 위치한 신호 펩티드(예를 들어, CD8α에서 유래)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열번호: 67의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체는 Nef(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)에 의해 하향 조절되지 않는다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포용해 활성에 수반되는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체는 Nef가 부재할 때와 비교하여 Nef(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)에 의해 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것) 하향 조절된다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포용해 활성에 수반되는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체는 CD3ζ ISD를 포함하는 동일한 외인성 수용체(예를 들어, CD3ζ ISD를 제외하고는 모든 것을 동일하게 포함하는 기존 CAR)와 동일하거나 유사하게 Nef 단백질(예를 들어, wt, 하위유형, 또는 돌연변이체 Nef)에 의해 하향 조절된다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포용해 활성에 수반되는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체는 CD3ζ ISD를 포함하는 동일한 외인성 수용체(예를 들어, CD3ζ ISD를 제외하고는 모든 것을 동일하게 포함하는 기존 CAR)보다 Nef(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)에 의해 적어도 약 3% 낮게(예를 들어, 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 낮게 중 임의의 것) 하향 조절된다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포용해 활성에 수반되는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체는 CD3ζ ISD를 포함하는 동일한 외인성 수용체(예를 들어, 기존 CAR 또는 CD3ζ ISD가 있는 변형된 TCR)보다 Nef 단백질(예를 들어, wt, 하위유형, 돌연변이체, 또는 비-자연 발생 Nef)에 의해 최대 약 80%(예를 들어, 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것) 더 하향 조절된다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포용해 활성에 수반되는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체는 CD3ζ ISD를 포함하는 동일한 외인성 수용체(예를 들어, 기존 CAR 또는 CD3ζ ISD가 있는 변형된 TCR)의 것과 비교하여 동일하거나 또는 유사한 효과기 기능(예를 들어, 세포용해 활성에 수반되는 신호 전달)을 갖는다. 일부 구현예에서, CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체는 CD3ζ ISD를 포함하는 동일한 외인성 수용체(예를 들어, 기존 CAR 또는 CD3ζ ISD가 있는 변형된 TCR)의 것과 비교하여 적어도 약 3%(예를 들어, 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것) 더 강한 효과기 기능(예를 들어, 세포용해 활성에 수반되는 신호 전달)을 갖는다. 일부 구현예에서, CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체는 CD3ζ ISD를 포함하는 동일한 외인성 수용체(예를 들어, 기존 CAR 또는 CD3ζ ISD가 있는 변형된 TCR)의 것과 비교하여 최대 약 80%(예를 들어, 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것) 낮게 효과기 기능(예를 들어, 세포용해 활성에 수반되는 신호 전달)을 갖는다. 상기 기재된 변형된 T 세포 중 임의의 것에 따른 일부 구현예에서, CMSD를 포함하는 ISD를 포함한 기능적 외인성 수용체의 효과기 기능은 CD3ζ의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 ISD를 포함한 기능적 외인성 수용체에 비해 적어도 약 20%(예컨대 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 중 임의의 것) 활성이다.
CMSD-함유 기능적 외인성 수용체, 뿐만 아니라 특이적 기능적 외인성 수용체(예컨대 ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 및 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)의 다양한 구성요소는 하기에서 보다 상세하게 추가로 기재된다.
CMSD
본원에 기재된 키메라 신호전달 도메인("CMSD")은 임의의 자연 발생 ITAM-함유 모 분자와 상이한 구성으로 배열된 하나 이상의 ITAM(본원에서 "CMSD ITAM"으로도 지칭됨) 및 임의적인 링커(본원에서 "CMSD 링커"로도 지칭됨)를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, CMSD는 서로 직접 연결된 2 개 이상의 ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 하나 이상의 "이종 링커", 즉, ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 링커)에서 유래되지 않거나, 또는 CMSD ITAM 중 하나 이상이 유래된 ITAM-함유 모 분자와 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된 링커 서열에 의해 연결된 ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 2 개 이상(예컨대 2, 3, 4 개 또는 그 이상)의 동일한 ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 2 개는 서로 상이하다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ에서 유래되지 않는다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ의 ITAM1 또는 ITAM2가 아니다. 일부 구현예에서, CMSD는 CD3ζ ITAM1 및/또는 CD3ζ ITAM2를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ ITAM3이다. 일부 구현예에서, CMSD는 CD3ζ로부터의 임의의 ITAM을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 2 개는 동일한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD는 2 개 이상(예컨대 2, 3, 4 개 또는 그 이상)의 ITAM을 포함하며, 여기서 CMSD ITAM 중 적어도 2 개는 각각 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD는 하나의 CMSD ITAM으로 본질적으로 이루어진다(예를 들어, 이로 이루어진다). 일부 구현예에서, CMSD는 하나의 CMSD ITAM(예를 들어, CD3ε, CD3δ, 또는 CD3γ에서 유래) 및 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 링커)에 "이종"인 CMSD N-말단 서열 및/또는 CMSD C-말단 서열, 즉, ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 함유 서열)에서 유래되지 않거나, 또는 CMSD ITAM(예를 들어, 하나 이상의 CMSD ITAM)이 유래된 ITAM-함유 모 분자와 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래되는 CMSD N-말단 서열 및/또는 CMSD C-말단 서열로 본질적으로 이루어진다(예를 들어, 이로 이루어진다). 일부 구현예에서, CMSD는 CD3ζ의 ITAM1, ITAM2, 및 ITAM3을 포함하지만, a) 3 개의 ITAM 중 2 개는 링커에 의해 연결되지 않고/않거나; b) 3 개의 ITAM은 CD3ζ에서의 것과 비교하여 옳은 순서로 배열되지 않고/않거나; c) ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ에서 상응하는 ITAM과 비교하여 상이한 위치에 있고/있거나; d) ITAM 중 적어도 2 개는 이종 링커에 의해 연결되고/되거나; e) CMSD는 추가적인 CMSD ITAM을 추가로 포함한다.
따라서, 예를 들어, 일부 구현예에서, CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하며, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 링커("CMSD 링커")에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서:
(a) 복수(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM은 서로 직접 연결되고/되거나;
(b) CMSD는 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 링커)에서 유래되지 않은 하나 이상의 링커에 의해 연결된 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM을 포함하고/하거나;
(c) CMSD는 CMSD ITAM 중 하나 이상이 유래된 ITAM-함유 모 분자와 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된 하나 이상의 CMSD 링커를 포함하고/하거나;
(d) CMSD는 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 동일한 CMSD ITAM을 포함하고/하거나;
(e) CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ에서 유래되지 않고/않거나;
(f) CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ의 ITAM1 또는 ITAM2가 아니고/아니거나;
(g) 복수의 CMSD ITAM은 각각 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래되고/되거나;
(h) CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래되고/되거나;
(i) CMSD는 하나의 CMSD ITAM으로 이루어지고/지거나;
(j) CMSD는 하나의 CMSD ITAM 및 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 링커)에 이종인 CMSD N-말단 서열 및/또는 CMSD C-말단 서열로 본질적으로 이루어진다(예를 들어, 이로 이루어진다).
일부 구현예에서, CMSD는 상기 기재된 특징 중 2 개 이상을 보유한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, (a) 복수(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM은 서로 직접 연결되고, (d) CMSD는 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 동일한 CMSD ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, (b) CMSD는 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 링커)에서 유래되지 않은 하나 이상의 링커에 의해 연결된 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM을 포함하고, (d) CMSD는 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 동일한 CMSD ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, (c) CMSD는 CMSD ITAM 중 하나 이상이 유래된 ITAM-함유 모 분자와 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된 하나 이상의 CMSD 링커를 포함하고, (d) CMSD는 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 동일한 CMSD ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, (f) CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ의 ITAM1 또는 ITAM2가 아니고, (h) CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, (b) CMSD는 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 링커)에서 유래되지 않은 하나 이상의 링커에 의해 연결된 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM을 포함하고, (f) CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ의 ITAM1 또는 ITAM2가 아니다. 일부 구현예에서, (b) CMSD는 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 링커)에서 유래되지 않은 하나 이상의 링커에 의해 연결된 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM을 포함하고, (h) CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, (b) CMSD는 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 링커)에서 유래되지 않은 하나 이상의 링커에 의해 연결된 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM을 포함하고, (d) CMSD는 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 동일한 CMSD ITAM을 포함하고, (h) CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, (c) CMSD는 CMSD ITAM 중 하나 이상이 유래된 ITAM-함유 모 분자와 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된 하나 이상의 CMSD 링커를 포함하고, (e) CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ에서 유래되지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)의 ISD는 CMSD로 본질적으로 이루어진다(예를 들어, 이로 이루어진다). 일부 구현예에서, 본원에 기재된 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR)의 ISD는 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28 공동-자극 신호전달 도메인)을 추가로 포함하며, 이는 CMSD에 대해 N-말단 또는 C-말단에 위치할 수 있고, CMSD 내의 임의적인 연결 펩티드를 통해 CMSD에 연결된다(예를 들어 임의적인 CMSD N-말단 서열 또는 임의적인 CMSD C-말단 서열을 통해 연결된다).
본원에 기재된 CMSD는 면역 효과기 기능을 유도하는 자극 방식으로 작용하는 ISD에서 1차 신호전달 도메인으로서 기능한다. 예를 들어, T 세포의 효과기 기능은 세포용해 활성 또는 사이토카인의 분비를 포함하는 헬퍼 활성일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "ITAM"은 많은 면역 세포(예를 들어, T 세포)에서 발현된 신호전달 분자의 꼬리 부분에서 발견될 수 있는 보존된 단백질 모티프를 지칭한다. ITAM은 많은 세포 표면 수용체(예를 들어, TCR 복합체) 또는 이들이 회합하는 하위단위의 세포질 도메인에 존재하고, 신호 전달에서 중요한 조절 역할을 한다. 기존 CAR은 일반적으로 3 개의 ITAM, CD3ζ ITAM1, CD3ζ ITAM2, 및 CD3ζ ITAM3을 함유하는 CD3ζ의 1차 ISD를 포함한다. 그러나, CD3ζ를 CAR의 ISD로서 사용하는 것의 한계가 보고되었다. 본원에 기재된 ITAM은 일부 구현예에서 자연 발생이며, 즉, 자연 발생 ITAM-함유 모 분자에서 발견될 수 있다. 일부 구현예에서, ITAM은 예를 들어, 자연 발생 ITAM에 비해 1, 2 개, 또는 그 이상의 아미노산 치환, 결실, 부가, 또는 재배치에 의해 추가로 변형된다. 일부 구현예에서, 변형된 ITAM(이하에서 "비-자연 발생 ITAM"으로도 지칭됨)은 모 ITAM과 비교하여 동일하거나 또는 유사한 ITAM 기능(예를 들어, 신호 전달, 또는 도킹 부위로서)을 갖는다.
ITAM은 일반적으로 6-8 개의 아미노산 잔기에 의해 분리된 아미노산 서열 YxxL/I의 2 개의 반복부를 포함하며, 여기서 각각의 x는 독립적으로 임의의 아미노산 잔기이고, 보존된 모티프 YxxL/I-x6-8-YxxL/I(서열번호: 101)를 생성한다. 일부 구현예에서, ITAM은 제1 ITAM 티로신(Y)에 비해 +2 위치에서 음으로 하전된 아미노산(D/E)을 함유하여 D/E-x0-2-YxxL/I-x6-8-YxxL/I(서열번호: 102)의 공통 서열을 생성한다. 예시적인 ITAM-함유 신호전달 분자는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신을 포함하며, 본원에서 "ITAM-함유 모 분자"로도 지칭된다. ITAM-함유 모 분자에 존재하는 ITAM은 리간드 관여 시 세포 내의 신호전달에 수반되는 것으로 알려져 있으며, 이는 신호전달 분자의 활성화 후 ITAM에서 티로신 잔기의 인산화에 의해 적어도 부분적으로 매개된다. ITAM은 또한 신호전달 경로에 수반되는 다른 단백질에 대한 도킹 부위로서 기능할 수 있다.
일부 구현예에서, ITAM-함유 모 분자는 CD3ζ이다. 일부 구현예에서, CD3ζ ISD는 서열번호: 7의 서열을 가지며, 이는 CD3ζ ITAM1의 N-말단에서, CD3ζ ITAM3의 C-말단에서, 그리고 3 개의 ITAM를 연결하는 CD3ζ ITAM1(서열번호: 4), CD3ζ ITAM2(서열번호: 5), CD3ζ ITAM3(서열번호: 6), 및 비-ITAM 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-함유 모 분자는 서열번호: 1-6, 8-11, 및 127-131로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 ITAM을 포함한다.
일부 구현예에서, CMSD는 복수(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 ITAM을 포함하며, 여기서 이 중 적어도 2 개는 서로 직접 연결된다. 일부 구현예에서, CMSD는 복수의 ITAM을 포함하며, 여기서 ITAM 중 적어도 2 개는 이종 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, CMSD는 가장 N-말단 CMSD ITAM의 N-말단에 N-말단 서열(본원에서 "CMSD N-말단 서열"로도 지칭됨)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 가장 C-말단 CMSD ITAM의 C-말단에 C-말단 서열(본원에서 "CMSD C-말단 서열"로도 지칭됨)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD 링커(들), CMSD N-말단 서열, 및/또는 CMSD C-말단 서열은 서열번호: 12-26, 103-107, 및 119-126으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CMSD 링커(들), CMSD N-말단 서열, 및/또는 CMSD C-말단 서열은 약 1 내지 약 15 개(예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 개, 또는 이 사이의 임의의 범위 중 임의의 것) 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 이종 링커는 G/S 링커이다. 일부 구현예에서, 이종 링커(들)는 서열번호: 12-14, 18, 및 120-124로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CMSD C-말단 서열은 서열번호: 13, 15, 120, 및 122-124로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CMSD N-말단 서열은 서열번호: 12, 16, 17, 119, 125, 및 126으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 이종 링커는 CMSD ITAM 중 하나 이상이 유래된 ITAM-함유 모 분자와 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다.
일부 구현예에서, 1-ITAM 함유 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CMSD ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ε ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3δ ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 145의 서열(이하에서 "ITAM033" 또는 "ITAM033 작제물"로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 146의 서열(이하에서 "ITAM034" 또는 "ITAM034 작제물"로도 지칭됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 2-ITAM 함유 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - 제1 CMSD ITAM - 임의적인 CMSD 링커 - 제2 CMSD ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3δ ITAM - 임의적인 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3γ ITAM - 임의적인 CMSD 링커 - DAP12 ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커 또는 CD3ζ 제2 링커와 동일하다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 147의 서열(이하에서 "ITAM035" 또는 "ITAM035 작제물"로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 148의 서열(이하에서 "ITAM036" 또는 "ITAM036 작제물"로도 지칭됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 3-ITAM 함유 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - 제1 CMSD ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - 제2 CMSD ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - 제3 CMSD ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 예시적인 구조에 대해 도 9를 참조한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함하며: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ζ ITAM1 - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM2 - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM3 - 임의적인 CMSD C-말단 서열, 여기서 제1 CMSD 링커 및 제2 CMSD 링커 중 적어도 하나는 부재하거나 또는 CD3ζ에 대해 이종이다. 일부 구현예에서, 제1 CMSD 링커는 CD3ζ 제2 링커와 동일할 수 있고, 제2 CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커와 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 CMSD 링커 및 제2 CMSD 링커는 둘 다 CD3ζ 제1 링커와 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 CMSD 링커 및 제2 CMSD 링커는 둘 다 CD3ζ 제2 링커와 동일할 수 있다. 도 9를 참조한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 서열번호: 39의 서열(이하에서 "M663 CMSD"으로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 서열번호: 48의 서열(이하에서 "ITAM007" 또는 "ITAM007 작제물"로도 지칭됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함하며: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ζ ITAM1 - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM1 - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM1 - 임의적인 CMSD C-말단 서열, 여기서 임의적인 제1 CMSD 링커 및/또는 제2 CMSD 링커는 부재하거나 또는 CMSD의 효과기 기능 신호 전달에 적합한 임의의 링커 서열의 것일 수 있다(예를 들어, 제1 CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커와 동일할 수 있고, 제2 CMSD 링커는 CD3ζ 제2 링커와 동일할 수 있으며, 도 9를 참조한다). 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 서열번호: 40의 서열(이하에서 "M665 CMSD"으로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 서열번호: 49의 서열(이하에서 "ITAM008" 또는 "ITAM008 작제물"로도 지칭됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함하며: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ζ ITAM2 - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM2 - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM2 - 임의적인 CMSD C-말단 서열, 여기서 임의적인 제1 CMSD 링커 및/또는 제2 CMSD 링커는 부재하거나 또는 CMSD의 효과기 기능 신호 전달에 적합한 임의의 링커 서열의 것일 수 있다(예를 들어, 제1 CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커와 동일할 수 있고, 제2 CMSD 링커는 CD3ζ 제2 링커와 동일할 수 있다). 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 서열번호: 41의 서열(이하에서 "M666 CMSD"으로도 지칭됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함하며: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ζ ITAM3 - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM3 - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM3 - 임의적인 CMSD C-말단 서열, 여기서 임의적인 제1 CMSD 링커 및/또는 제2 CMSD 링커는 부재하거나 또는 CMSD의 효과기 기능 신호 전달에 적합한 임의의 링커 서열의 것일 수 있다(예를 들어, 제1 CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커와 동일할 수 있고, 제2 CMSD 링커는 CD3ζ 제2 링커와 동일할 수 있다). 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 서열번호: 42의 서열(이하에서 "M667 CMSD"로도 지칭됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ζ ITAM1 - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM2 - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM2 - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ζ ITAM1 - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM3 - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM3 - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ζ ITAM1 - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM3 - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM2 - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ζ ITAM2 - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM1 - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM1 - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ζ ITAM2 - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM1 - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM2 - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ζ ITAM2 - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM1 - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM3 - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ζ ITAM2 - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM3 - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM3 - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ζ ITAM3 - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM1 - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM1 - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ζ ITAM3 - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM1 - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM2 - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ζ ITAM3 - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM1 - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM3 - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ζ ITAM3 - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM2 - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM2 - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ζ ITAM3 - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM2 - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM3 - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, CMSD는 CD3ζ의 임의의 ITAM(예를 들어, ITAM1, ITAM2, 또는 ITAM3)을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 3-ITAM 함유 CMSD는 비-CD3ζ ITAM-함유 모 분자(예를 들어, CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 또는 모에신)에서 유래된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 또는 3 개)의 ITAM을 포함하고, 이들을 연결하는 임의적인 링커(들)는 부재하거나 또는 CMSD의 효과기 기능 신호 전달에 적합한 임의의 링커 서열의 것일 수 있다(예를 들어, 제1 CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커와 동일할 수 있고, 제2 CMSD 링커는 CD3ζ 제2 링커, 또는 G/S 링커와 동일할 수 있다).
따라서 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ε ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 하나 이상의 CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커 또는 CD3ζ 제2 링커와 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 서열번호: 43의 서열(이하에서 "M679 CMSD"으로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 서열번호: 50의 서열(이하에서 "ITAM009" 또는 "ITAM009 작제물"로도 지칭됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - DAP12 ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - DAP12 ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - DAP12 ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 하나 이상의 CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커 또는 CD3ζ 제2 링커와 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 서열번호: 44의 서열(이하에서 "M681 CMSD"으로도 지칭됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - Igα ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - Igα ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - Igα ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 하나 이상의 CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커 또는 CD3ζ 제2 링커와 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 서열번호: 45의 서열(이하에서 "M682 CMSD"로도 지칭됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - Igβ ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - Igβ ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - Igβ ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 하나 이상의 CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커 또는 CD3ζ 제2 링커와 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 서열번호: 46의 서열(이하에서 "M683 CMSD"로도 지칭됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - FcεRIγ ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - FcεRIγ ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - FcεRIγ ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 하나 이상의 CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커 또는 CD3ζ 제2 링커와 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 서열번호: 47의 서열(이하에서 "M685 CMSD"로도 지칭됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3δ ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3δ ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3δ ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 하나 이상의 CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커 또는 CD3ζ 제2 링커와 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 서열번호: 132의 서열(이하에서 "M678 CMSD"로도 지칭됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3γ ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3γ ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3γ ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 하나 이상의 CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커 또는 CD3ζ 제2 링커와 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 서열번호: 133의 서열(이하에서 "M680 CMSD"로도 지칭됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - FcεRIβ ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - FcεRIβ ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - FcεRIβ ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 하나 이상의 CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커 또는 CD3ζ 제2 링커와 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 서열번호: 134의 서열(이하에서 "M684 CMSD"로도 지칭됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CNAIP/NFAM1 ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CNAIP/NFAM1 ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CNAIP/NFAM1 ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 하나 이상의 CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커 또는 CD3ζ 제2 링커와 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 서열번호: 135의 서열(이하에서 "M799 CMSD"로도 지칭됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3δ ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 하나 이상의 CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커 또는 CD3ζ 제2 링커와 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 서열번호: 149의 서열(이하에서 "ITAM037" 또는 "ITAM037 작제물"로도 지칭됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3δ ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3γ ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 하나 이상의 CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커 또는 CD3ζ 제2 링커와 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 서열번호: 150의 서열(이하에서 "ITAM038" 또는 "ITAM038 작제물"로도 지칭됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - DAP12 ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3δ ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 하나 이상의 CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커 또는 CD3ζ 제2 링커와 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 서열번호: 151의 서열(이하에서 "ITAM045" 또는 "ITAM045 작제물"로도 지칭됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - DAP12 ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3δ ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 하나 이상의 CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커 또는 CD3ζ 제2 링커와 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 서열번호: 152의 서열(이하에서 "ITAM046" 또는 "ITAM046 작제물"로도 지칭됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함하며: 세포질 CD3ζ N-말단 서열 - 제1 CMSD ITAM - CD3ζ 제1 링커 - 제2 CMSD ITAM - CD3ζ 제2 링커 - 제3 CMSD ITAM - CD3ζ C-말단 서열, 여기서 CMSD 내의 모든 비-ITAM 서열(세포질 CD3ζ N-말단 서열, CD3ζ 제1 링커, CD3ζ 제2 링커, 및 CD3ζ C-말단 서열)은 동일하고 모 CD3ζ ISD에 자연적으로 존재하는 것과 동일한 위치에 있으며, 이러한 CMSD는 "비-ITAM CD3ζ ISD 프레임워크를 포함하는 CMSD"로 지칭된다(도 9 참조). 비-ITAM CD3ζ ISD 프레임워크를 포함하는 CMSD의 경우, 제1/제2/제3 CMSD ITAM은 제1 CMSD ITAM이 CD3ζ ITAM1이고, 제2 CMSD ITAM이 CD3ζ ITAM2이고, 제3 CMSD ITAM이 CD3ζ ITAM3인 조합을 제외하고, CD3δ ITAM, CD3γ ITAM, CD3ζ ITAM1, CD3ζ ITAM2, CD3ζ ITAM3, DAP12 ITAM, Igα ITAM, Igβ ITAM, FcεRIγ ITAM, 및 CNAIP/NFAM1 ITAM(서열번호: 1, 3-6, 8-11, 및 128; 모두 29 개의 아미노산 길이)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다(예를 들어, 이로 이루어진다): 세포질 CD3ζ N-말단 서열 - DAP12 ITAM - CD3ζ 제1 링커 - DAP12 ITAM - CD3ζ 제2 링커 - DAP12 ITAM - CD3ζ C-말단 서열. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다(예를 들어, 이로 이루어진다): 세포질 CD3ζ N-말단 서열 - CD3γ ITAM - CD3ζ 제1 링커 - CD3γ ITAM - CD3ζ 제2 링커 - CD3γ ITAM - CD3ζ C-말단 서열.
일부 구현예에서, 4-ITAM 함유 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - 제1 CMSD ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - 제2 CMSD ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - 제3 CMSD ITAM - 임의적인 제3 CMSD 링커 -제4 CMSD ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 5-ITAM 함유, 6-ITAM 함유 등의 CMSD가 이에 해당한다. 4 개 이상(예를 들어, 4, 5 개, 또는 그 이상)의 ITAM을 포함하는 CMSD의 경우, ITAM-함유 모 분자가 일반적으로 1 개의 ITAM(예를 들어, 비-CD3ζ ITAM-함유 분자, 예컨대 CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 또는 모에신) 또는 3 개의 ITAM(예를 들어, CD3ζ)을 포함하므로, CMSD 내의 적어도 하나의 ITAM은 하나의 ITAM-함유 모 분자와 상이할 것이며, ITAM-함유 모 분자와 상이하거나, 또는 ITAM이 ITAM-함유 모 분자에 자연적으로 존재하는 것과 상이한 위치에 존재하는 분자에서 유래되어, 4 개 이상(예를 들어, 4, 5 개, 또는 그 이상)의 ITAM을 포함하는 CMSD는 본원에 기재된 임의의 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, CD3ζ)에서 유래된 ITAM을 포함할 수 있고, 임의적인 링커가 부재하거나, ITAM-함유 모 분자의 세포질 비-ITAM 서열에서 유래되거나, 또는 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 링커일 수 있음)로부터의 이종 서열의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3δ ITAM(서열번호: 1) - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3ε ITAM(서열번호: 2) - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3γ ITAM(서열번호: 3) - 임의적인 제3 CMSD 링커 - DAP12 ITAM(서열번호: 8) - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 임의적인 CMSD 링커(들), CMSD N-말단 서열, 및 CMSD C-말단 서열은 ITAM-함유 모 분자의 세포질 비-ITAM 서열에서 유래된다. 일부 구현예에서, 임의적인 제1, 제2 및 제3 CMSD 링커, 임의적인 CMSD N-말단 서열, 및 임의적인 CMSD C-말단 서열은 이종이고, 서열번호: 12-26, 103-107, 및 119-126으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 51의 서열(이하에서 "ITAM010" 또는 "ITAM010 작제물"로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 137이 서열(이하에서 "ITAM025" 또는 "ITAM025 작제물"로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 138의 서열(이하에서 "ITAM026" 또는 "ITAM026 작제물"로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 139의 서열(이하에서 "ITAM027" 또는 "ITAM027 작제물"로도 지치됨)을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 140의 서열(이하에서 "ITAM028" 또는 "ITAM028 작제물"로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 141의 서열(이하에서 "ITAM029" 또는 "ITAM029 작제물"로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음으로 이루어진다: CD3δ ITAM - CD3ε ITAM - CD3γ ITAM - DAP12 ITAM. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 136의 서열(이하에서 "ITAM024" 또는 "ITAM024 작제물"로도 지칭됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3ε ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3δ ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - DAP12 ITAM - 임의적인 제3 CMSD 링커 - CD3γ ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 임의적인 CMSD 링커(들), CMSD N-말단 서열, 및 CMSD C-말단 서열은 ITAM-함유 모 분자의 세포질 비-ITAM 서열에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 142의 서열(이하에서 "ITAM030" 또는 "ITAM030 작제물"로도 지칭됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함하며: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - CD3γ ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - DAP12 ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3δ ITAM - 임의적인 제3 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 임의적인 CMSD 링커(들), CMSD N-말단 서열, 및 CMSD C-말단 서열은 ITAM-함유 모 분자의 세포질 비-ITAM 서열에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 143의 서열(이하에서 "ITAM031" 또는 "ITAM031 작제물"로도 지칭됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 N'에서 C'으로 다음을 포함한다: 임의적인 CMSD N-말단 서열 - DAP12 ITAM - 임의적인 제1 CMSD 링커 - CD3γ ITAM - 임의적인 제2 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 임의적인 제3 CMSD 링커 - CD3δ ITAM - 임의적인 CMSD C-말단 서열. 일부 구현예에서, 임의적인 CMSD 링커(들), CMSD N-말단 서열, 및 CMSD C-말단 서열은 ITAM-함유 모 분자의 세포질 비-ITAM 서열에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 144의 서열(이하에서 "ITAM032" 또는 "ITAM032 작제물"로도 지칭됨)을 포함한다.
본원에 기재된 CMSD는 일부 구현예에서 CD3ζ ISD와 비교하여, 본원에 기재된 Nef 단백질(예를 들어, wt, 하위유형, 돌연변이체, 또는 비-자연 발생 Nef)에 대해 결합이 없거나 또는 감소된 결합(예컨대 적어도 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 중 임의의 것의 감소된 결합)을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD는 CD3ζ ISD와 비교하여 본원에 기재된 Nef 단백질에 대해 동일하거나 또는 유사한 결합을 갖는다. 일부 구현예에서, CMSD의 기능(예를 들어, 신호 전달 및/또는 도킹 부위로서)은 CD3ζ ISD와 비교하여 동일하거나 또는 유사하게 본원에 기재된 Nef 단백질에 의해 하향 조절된다. 일부 구현예에서, CMSD의 기능(예를 들어, 신호 전달 및/또는 도킹 부위로서)은 CD3ζ ISD와 비교하여 본원에 기재된 Nef 단백질에 의해 적어도 약 3% 낮게(예를 들어, 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 낮게 중 임의의 것) 하향 조절된다. 일부 구현예에서, CMSD의 기능(예를 들어, 신호 전달 및/또는 도킹 부위로서)은 CD3ζ ISD와 비교하여 본원에 기재된 Nef 단백질에 의해 최대 약 80%(예를 들어, 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것) 더 하향 조절된다. 일부 구현예에서, CMSD는 Nef(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, CMSD는 CD3ζ ITAM1 및 CD3ζ ITAM2를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 복수(예를 들어, 2, 3, 4, 5 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM은 CD3ζ ITAM3, DAP12, CD3ε, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), CD3δ, CD3γ, CNAIP/NFAM1 ITAM, FcεRIβ, 또는 FcεRIγ로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CMSD 내의 ITAM은 모두 CD3ζ ITAM3이다. 일부 구현예에서, CMSD 내의 ITAM은 모두 CD3ε ITAM이다. 일부 구현예에서, CMSD는 DAP12 ITAM, CD3ε ITAM, 및 CD3ζ ITAM3인 3 개의 ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, Nef(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef) 및 CMSD 사이의 결합은 Nef 및 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, CD3ζ, CD3ε) 사이의 결합보다 적어도 약 3% 낮다(예를 들어, 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 낮게 중 임의의 것). 일부 구현예에서, CMSD는 CD3ζ ISD의 것과 비교하여 동일하거나 또는 유사한 활성(예를 들어, 신호 전달 및/또는 도킹 부위로서)을 갖는다. 일부 구현예에서, CMSD는 CD3ζ ISD의 것과 비교하여 최대 약 80%(예를 들어, 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것) 낮은 활성(예를 들어, 신호 전달 및/또는 도킹 부위로서)을 갖는다. 일부 구현예에서, CMSD는 CD3ζ ISD의 것과 비교하여 적어도 약 3%(예를 들어, 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것) 더 강한 활성(예를 들어, 신호 전달 및/또는 도킹 부위로서)을 갖는다. 일부 구현예에서, CMSD를 포함하는 ISD를 포함한 기능적 외인성 수용체의 효과기 기능은 CD3ζ의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 ISD를 포함한 기능적 외인성 수용체에 비해 적어도 약 20%(예컨대 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 중 임의의 것) 활성이다.
본원에 기재된 CMSD 중 임의의 것을 암호화하는 단리된 핵산, 예컨대 서열번호: 54-66 중 임의의 것의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산이 또한 제공된다.
CMSD 링커, CMSD C-말단 서열, CMSD N-말단 서열
상기 논의된 바와 같이, 본원에 기재된 CMSD는 임의적인 CMSD 링커(들), 임의적인 CMSD C-말단 서열, 및/또는 임의적인 CMSD N-말단 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CMSD 링커(들), CMSD C-말단 서열, 및/또는 CMSD N-말단 서열 중 적어도 하나는 ITAM-함유 모 분자에서 유래되며, 예를 들어 ITAM-함유 모 분자에서 링커 서열이다. 일부 구현예에서, CMSD 링커(들), CMSD C-말단 서열, 및/또는 CMSD N-말단 서열은 이종이며, 즉, 이들은 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 링커)에서 유래되지 않거나 또는 CMSD ITAM 중 하나 이상이 유래된 ITAM-함유 모 분자와 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD 링커(들), CMSD C-말단 서열, 및/또는 CMSD N-말단 서열 중 적어도 하나는 ITAM-함유 모 분자에 대해 이종이며, 예를 들어 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 링커)의 임의의 부분과 상이한 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CMSD는 2 개 이상의 이종 CMSD 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 2 개 이상의 이종 CMSD 링커는 서로 동일하다. 일부 구현예에서, 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 이종 CMSD 링커 중 적어도 2 개는 서로 동일하다. 일부 구현예에서, 2 개 이상의 이종 CMSD 링커는 모두 서로 상이하다. 일부 구현예에서, CMSD 링커, CMSD C-말단 서열, 및/또는 CMSD N-말단 서열 중 적어도 하나는 CD3ζ에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD 링커(들), CMSD C-말단 서열, 및/또는 CMSD N-말단 서열은 서로 동일하다. 일부 구현예에서, CMSD 링커(들), CMSD C-말단 서열, 및 CMSD N-말단 서열 중 적어도 하나는 서로 상이하다.
CMSD 내의 링커(들), C-말단 서열, 및 N-말단 서열은 CMSD의 구조적 및/또는 기능적 특징에 따라 동일하거나 또는 상이한 길이 및/또는 서열을 가질 수 있다. CMSD 링커, CMSD C-말단 서열, 및 CMSD N-말단 서열은 독립적으로 선택되고 최적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 더 긴 CMSD 링커(예를 들어, 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25 개 또는 그 이상의 아미노산 길이 중 임의의 것인 링커)는 2 개의 인접한 ITAM이 서로 입체적으로 방해하지 않도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 더 긴 CMSD N-말단 서열(예를 들어, 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25 개, 또는 그 이상의 아미노산 길이 중 임의의 것인 CMSD N-말단 서열)은 신호 전달 분자가 가장 N-말단 ITAM에 결합하기에 충분한 공간을 제공하도록 선택된다. 일부 구현예에서, CMSD 링커(들), C-말단 CMSD 서열, 및/또는 N-말단 CMSD 서열은 약 30, 25, 20, 15, 10, 5, 또는 1 개 아미노산 길이 중 임의의 것 이하이다. CMSD 링커 길이는 또한 ITAM-함유 모 분자의 ISD 내에서 ITAM을 연결하는 내인성 링커의 것과 동일하도록 설계될 수 있다. CMSD N-말단 서열 길이는 또한 가장 N-말단 ITAM 및 막 사이에서 ITAM-함유 모 분자의 세포질 N-말단 서열의 것과 동일하도록 설계될 수 있다. CMSD C-말단 서열 길이는 또한 마지막 ITAM의 C-말단에 있는 ITAM-함유 모 분자의 세포질 C-말단 서열의 것과 동일하도록 설계될 수 있다.
일부 구현예에서, CMSD 링커는 가요성 링커(예를 들어, Gly 및 Ser, 예를 들어, Gly-Ser 이중항과 같은 가요성 아미노산 잔기 포함)이다. 예시적인 가요성 링커는 글리신 중합체 (G)n(서열번호: 103), 글리신-세린 중합체(예를 들어, (GS)n(서열번호: 104), (GGGS)n(서열번호: 105), 및 (GGGGS)n(서열번호: 106), 여기서 n은 적어도 1의 정수임; (GxS)n(서열번호: 107, 여기서 n 및 x는 3-12로부터 독립적으로 선택된 정수임) 포함), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 당업계에 알려진 다른 가요성 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD 링커는 G/S 링커이다. 일부 구현예에서, 가요성 링커는 아미노산 서열 GENLYFQSGG(서열번호: 12), GGSG(서열번호: 13), GS(서열번호: 14), GSGSGS(서열번호: 15), PPPYQPLGGGGS(서열번호: 16), GGGGSGGGGS(서열번호: 17), G(서열번호: 18), GSTSGSGKPGSGEGSTKG(서열번호: 19), (GGGS)3(서열번호: 20), (GGGS)4(서열번호: 21), GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGS(서열번호: 22), GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호: 23), (GGGGS)3(서열번호: 24), (GGGGS)4(서열번호: 25), GGGGGSGGRASGGGGS(서열번호: 26), GGGGS(서열번호: 124), 또는 GSGSGSGSGS(서열번호: 125)를 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD 링커는 서열번호: 12-14, 18, 및 120-124로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CMSD N-말단 서열 및/또는 CMSD C-말단 서열은 가요성이다(예를 들어, Gly 및 Ser, 예를 들어, Gly-Ser 이중항과 같은 가요성 아미노산 잔기 포함). 일부 구현예에서, 하나 이상의 CMSD 링커, CMSD N-말단 서열, 및/또는 CMSD C-말단 서열은 서열번호: 12-26, 103-107, 및 119-126으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, CMSD C-말단 서열은 서열번호: 13, 15, 120, 및 122-124로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CMSD N-말단 서열은 서열번호: 12, 16, 17, 119, 125, 및 126으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
CMSD 링커(들), CMSD N-말단 서열, 및/또는 CMSD C-말단 서열은 임의의 적합한 길이의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, CMSD 링커, CMSD N-말단 서열, 및/또는 CMSD C-말단 서열은 독립적으로 약 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 개 아미노산 길이 중 임의의 것 이하이다. 일부 구현예에서, CMSD 링커(들), CMSD N-말단 서열, 및/또는 CMSD C-말단 서열의 길이는 독립적으로 약 1 개 아미노산 내지 약 10 개 아미노산, 약 4 개 아미노산 내지 약 6 개 아미노산, 약 1 개 아미노산 내지 약 20 개 아미노산, 약 1 개 아미노산 내지 약 30 개 아미노산, 약 5 개 아미노산 내지 약 15 개 아미노산, 약 10 개 아미노산 내지 약 15 개 아미노산, 약 10 개 아미노산 내지 약 25 개 아미노산, 약 5 개 아미노산 내지 약 30 개 아미노산, 약 10 개 아미노산 내지 약 30 개 아미노산 길이, 또는 약 1 개 아미노산 내지 약 15 개 아미노산 중 임의의 것이다. 일부 구현예에서, CMSD 링커(들), CMSD N-말단 서열, 및/또는 CMSD C-말단 서열의 길이는 약 1 개 아미노산 내지 약 15 개 아미노산이다.
세포외 리간드 결합 도메인
본원에 기재된 기능적 외인성 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 하나 이상(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6 개 또는 그 이상 중 임의의 하나)의 결합 모이어티, 예를 들어, 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 또는 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 결합 모이어티는 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 결합 모이어티는 4-쇄 항체에서 유래된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 결합 모이어티는 낙타과 항체에서 유래된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 결합 모이어티는 인간 항체에서 유래된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 결합 모이어티는 Camel Ig, Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단일 쇄 Fv 항체(scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디(minibody), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 디술피드 안정화된 Fv 단백질(dsFv), 및 단일-도메인 항체(예를 들어, sdAb, 나노바디(nanobody), VHH)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 결합 모이어티는 sdAb(예를 들어, 항-BCMA sdAb)이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 결합 모이어티는 scFv(예를 들어, 항-CD19 scFv, 항-CD20 scFv, 항-BCMA scFv)이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 결합 모이어티는 비-항체 결합 단백질, 예컨대 폴리펩티드 리간드/수용체 또는 항원에 결합하는 조작된 단백질이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 비-항체 결합 모이어티는 리간드에서 유래된 적어도 하나의 도메인 또는 세포 표면 수용체의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드 또는 수용체는 NKG2A, NKG2C, NKG2F, NKG2D, BCMA, APRIL, BAFF, IL-3, IL-13, LLT1, AICL, DNAM-1, 및 NKp80으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 리간드는 BCMA 수용체에 결합할 수 있는 APRIL 또는 BAFF이다. 일부 구현예에서, 수용체는 Fc 수용체(FcR)이고 리간드는 Fc-함유 분자(예를 들어, 전장 단클론 항체)이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 결합 모이어티는 FcR의 세포외 도메인(또는 이의 부분)에서 유래된다. 일부 구현예에서, FcR은 Fcγ 수용체(FcγR)이다. 일부 구현예에서, FcγR은 FcγRIA(CD64A), FcγRIB(CD64B), FcγRIC(CD64C), FcγRIIA(CD32A), FcγRIIB(CD32B), FcγRIIIA(CD16a), 및 FcγRIIIB(CD16b)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 2 개 이상의 결합 모이어티(예를 들어, sdAb)는 펩티드 결합을 통해, 또는 펩티드 링커를 통해 서로 직접 융합될 수 있다(하기 수용체 도메인 링커 하위섹션 참조). 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 서열번호: 124의 아미노산 서열을 포함한다.
단일-도메인 항체(sdAb)
일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 하나 이상의 sdAb(예를 들어, 항-BCMA sdAb)를 포함한다. sdAb는 동일하거나 또는 상이한 기원의 것, 및 동일하거나 또는 상이한 크기의 것일 수 있다. 예시적인 sdAb는 중쇄 단독 항체의 중쇄 가변 도메인(예를 들어, VHH 또는 VNAR), 경쇄가 자연적으로 없는 결합 분자, 기존 4-쇄 항체에서 유래된 단일 도메인(예컨대 VH 또는 VL), 인간화 중쇄 단독 항체, 인간 중쇄 분절을 발현하는 유전자이식 마우스 또는 래트에 의해 생산된 인간 sdAb, 및 항체에서 유래된 것 이외의 조작된 도메인 및 단일 도메인 스캐폴드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. PCT/CN2017/096938 및 PCT/CN2016/094408(각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 sdAb를 포함하는, 당업계에 알려져 있거나 또는 출원에 의해 개발된 임의의 sdAb는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 구축하는 데 사용될 수 있다. CAR(예를 들어, ITAM-변형된 CAR)의 예시적인 구조는 PCT/CN2017/096938의 도 15a-15d에 도시되어 있다. sdAb는 마우스, 래트, 인간, 낙타, 라마, 칠성장어, 어류, 상어, 염소, 토끼, 및 소를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 종에서 유래될 수 있다. 본원에서 고려되는 sdAb는 또한 낙타과(Camelidae) 및 상어 이외의 종으로부터의 자연 발생 sdAb 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, sdAb는 경쇄가 없는 중쇄 항체(본원에서 "중쇄 단독 항체"로도 지칭됨)로서 알려진 자연 발생 단일-도메인 항원 결합 분자에서 유래된다. 이러한 단일 도메인 분자는 예를 들어 WO 94/04678 및 Hamers-Casterman, C. 등 (1993) Nature 363:446-448에 개시되어 있다. 명료한 이유를 위해, 경쇄가 자연적으로 없는 중쇄 분자에서 유래된 가변 도메인은 4 쇄 면역글로불린의 기존 VH와 구별하기 위해 본원에서 VHH로 알려져 있다. 이러한 VHH 분자는 낙타과 종, 예를 들어, 낙타, 라마, 비쿠나, 단봉낙타, 알파카 및 구아나코에서 생성된 항체에서 유래될 수 있다. 낙타과 이외의 다른 종은 경쇄가 자연적으로 없는 중쇄 분자를 생성할 수 있고, 이러한 VHH는 본 출원의 범위 내에 있다.
낙타과의 VHH 분자는 IgG 분자보다 약 10 배 더 작다. 이들은 단일 폴리펩티드이고 극한의 pH 및 온도 조건에 저항하여 매우 안정될 수 있다. 더욱이, 이들은 기존 4-쇄 항체의 경우가 아닌 프로테아제의 작용에 저항할 수 있다. 더욱이, VHH의 시험관내 발현은 적절하게 접힌 기능적 VHH를 고수율로 생산한다. 게다가, 낙타과에서 생성된 항체는 항체 라이브러리의 사용을 통해 또는 낙타과 이외의 포유동물의 면역화를 통해 시험관내에서 생성된 항체에 의해 인식된 것들 이외의 에피토프를 인식할 수 있다(예를 들어, WO9749805 참조). 이와 같이, 하나 이상의 VHH 도메인을 포함하는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 다중특이적 및/또는 다가 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)는 기존 4-쇄 항체에서 유래된 항원-결합 단편을 포함하는 다중특이적 및/또는 다가 기능적 외인성 수용체보다 표적과 더 효율적으로 상호작용할 수 있다. VHH는 동공 또는 홈과 같은 "비정상적인" 에피토프 내에 결합하는 것으로 알려져 있으므로, 이러한 VHH를 포함하는 기능적 외인성 수용체의 친화도는 기존 다중특이적 비-VHH 함유 키메라 수용체(예를 들어, 비-VHH 함유 CAR)보다 치료적 치료에 더 적합할 수 있다.
일부 구현예에서, sdAb는 연골 어류에서 발견된 면역글로불린의 가변 영역에서 유래된다. 예를 들어, sdAb는 상어의 혈청에서 발견된 신규 항원 수용체(NAR)로 알려진 면역글로불린 이소형에서 유래될 수 있다. NAR의 가변 영역에서 유래된 단일 도메인 분자("IgNAR")를 생산하는 방법은 WO 03/014161 및 Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, sdAb는 재조합, CDR-이식, 인간화, 낙타화, 탈면역화 및/또는 시험관내 생성된다(예를 들어, 파지 디스플레이에 의해 선택). 일부 구현예에서, 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 프레임워크 영역에서 특이적 아미노산 잔기의 "낙타화"에 의해 변경될 수 있다. 낙타화는 중쇄 항체의 VHH 도메인의 상응하는 위치(들)에서 발생하는 아미노산 잔기 중 하나 이상에 의해 기존 4-쇄 항체로부터의 (자연 발생) VH 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 대체 또는 치환을 지칭한다. 이는 그 자체로 알려진 방식으로 수행될 수 있으며, 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 "낙타화" 치환은 바람직하게는 VH-VL 계면, 및/또는 소위 낙타과 특징 잔기에서 형성되고/되거나 존재하는 아미노산 위치에 삽입된다(예를 들어 WO 94/04678, Davies and Riechmann FEBS Letters 339: 285-290, 1994; Davies and Riechmann Protein Engineering 9(6): 531-537, 1996; Riechmann J. Mol. Biol. 259: 957-969, 1996; 및 Riechmann and Muyldermans J. Immunol. Meth. 231: 25-38, 1999 참조).
일부 구현예에서, sdAb는 인간 중쇄 분절을 발현하는 유전자이식 마우스 또는 래트에 의해 생산된 인간 sdAb이다. 예를 들어, US20090307787A1, 미국 특허 번호 제8,754,287호, US20150289489A1, US20100122358A1, 및 WO2004049794 참조. 일부 구현예에서, sdAb는 친화도 성숙된다.
일부 구현예에서, 특정 항원 또는 표적에 대한 자연 발생 VHH 도메인은 낙타과 VHH 서열의 (미처리(naive) 또는 면역) 라이브러리에서 수득될 수 있다. 이러한 방법은 알려진 하나 이상의 스크리닝 기술을 그 자체로 사용하여 상기 항원 또는 표적, 또는 적어도 하나의 부분, 단편, 항원 결정기 또는 이의 에피토프를 사용하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 것을 수반할 수 있거나 또는 수반할 수 없다. 이러한 라이브러리 및 기술은 예를 들어 WO 99/37681, WO 01/90190, WO 03/025020 및 WO 03/035694에 기재되어 있다. 대안적으로, 예를 들어 WO 00/43507에 기재된 바와 같이, 무작위 돌연변이생성 및/또는 CDR 셔플링과 같은 기술에 의해 (미처리 또는 면역) VHH 라이브러리에서 수득된 VHH 라이브러리와 같은 미처리 또는 면역) VHH 라이브러리에서 유래된 개선된 합성 또는 반-합성 라이브러리가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, sdAb는 기존 4-쇄 항체로부터 생성된다. 예를 들어, EP 0 368 684, Ward 등(Nature 1989 Oct. 12; 341(6242): 544-6), Holt 등 (Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490), WO 06/030220, 및 WO 06/003388 참조.
일부 구현예에서, sdAb는 BCMA에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항-BCMA sdAb(예를 들어, VHH)는 서열번호: 113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 115의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, sdAb(예를 들어, VHH)는 서열번호: 111의 아미노산 서열을 포함하는 sdAb의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, sdAb는 서열번호: 113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 115의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 sdAb(예를 들어, VHH)와 동일한 BCMA의 에피토프에 결합한다.
일부 구현예에서, 항-BCMA sdAb(예를 들어, VHH)는 서열번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 117의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, sdAb는 서열번호: 112의 아미노산 서열을 포함하는 sdAb의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, sdAb는 서열번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 117의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 sdAb 모이어티(예를 들어, VHH)와 동일한 BCMA의 에피토프에 결합한다.
일부 구현예에서, CMSD-함유 기능적 외인성 수용체는 BCMA에 특이적으로 결합하는 제1 sdAb 모이어티 및 BCMA에 특이적으로 결합하는 제2 sdAb 모이어티를 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인을 포함한다. 제1 sdAb 모이어티 및 제2 sdAb 모이어티는 BCMA의 상이한 에피토프 또는 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 2 개의 sdAb는 탠덤으로 배열되며, 링커 서열에 의해 임의적으로 연결될 수 있다. "CMSD 링커" 및 "수용체 도메인 링커" 섹션에 기재된 바와 같은 링커 서열 중 임의의 것이 본원에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, CMSD-함유 기능적 외인성 수용체는 3 개 이상의 sdAb를 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인(예를 들어, BCMA를 특이적으로 인식)을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1(및/또는 제2) 항-BCMA sdAb 모이어티(예를 들어, VHH)는 서열번호: 113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 115의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1(및/또는 제2) sdAb 모이어티는 서열번호: 111의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA sdAb의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1(및/또는 제2) sdAb 모이어티는 서열번호: 113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 115의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 sdAb 모이어티(예를 들어, VHH)와 동일한 BCMA 에피토프에 결합한다.
일부 구현예에서, 제2(및/또는 제1) 항-BCMA sdAb 모이어티(예를 들어, VHH)는 서열번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 117의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2(및/또는 제1) sdAb 모이어티는 서열번호: 112의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA sdAb의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2(및/또는 제1) sdAb 모이어티는 서열번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 117의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 sdAb 모이어티(예를 들어, VHH)와 동일한 BCMA 에피토프에 결합한다.
일부 구현예에서, 서열번호: 109, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM-변형된 항-BCMA CAR이 제공된다. 또한 하기 섹션 "IV. BCMA CAR 작제물"에 기재된 ITAM-변형된 BCMA CAR 작제물 참조.
표적 항원 및 표적 분자
본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)의 세포외 리간드 결합 도메인은 표적 세포(예를 들어, 종양 세포), 또는 표적 분자(예를 들어, Fc-함유 분자 예컨대 단클론 항체) 상의 임의의 항원(또는 임의의 항원의 임의의 에피토프)을 특이적으로 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 세포 표면 분자(예를 들어, 수용체/리간드의 세포외 도메인)이다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 특정 질환 상태와 연관된 표적 세포에 대한 세포 표면 마커로서 작용한다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 종양 항원이다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 단일 표적(예를 들어, 종양) 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 단일 표적(예를 들어, 종양) 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 2 개 이상의 표적(예를 들어, 종양) 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 B-세포 림프종 또는 다발성 골수종(MM)과 같은 B 세포 악성종양과 연관된다. 종양은 면역 반응, 특히 T 세포 매개 면역 반응에 대한 표적 항원으로 역할을 할 수 있는 다수의 단백질을 발현한다. 세포외 리간드 결합 도메인에 의해 특이적으로 인식되는 표적 항원(예를 들어, 종양 항원, 수용체/리간드의 세포외 도메인)은 단일 병적 세포 상의 항원 또는 각각이 질환에 기여하는 상이한 세포 상에서 발현되는 항원일 수 있다. 세포외 리간드 결합 도메인에 의해 특이적으로 인식되는 항원은 질환에 직접적으로 또는 간접적으로 수반될 수 있다.
종양 항원은 면역 반응, 특히 T 세포 매개 면역 반응을 도출할 수 있는 종양 세포에 의해 생산된 단백질이다. 본 발명의 표적화된 항원의 선택은 치료될 암의 특정 유형에 따라 달라질 것이다. 예시적인 종양 항원은 예를 들어, 신경교종-연관 항원, BCMA(B-세포 성숙 항원), 암배아 항원(CEA), β-인간 융모성 성선자극호르몬, 알파-태아단백질(AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CAIX, 인간 텔로머라제 역 전사효소, RU1, RU2(AS), 장내 카르복실 에스터라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제, 전립선-특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, 프로스테인, PSMA, HER2/neu, 서비빈 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체, 및 메소텔린을 포함한다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 악성 종양과 연관된 하나 이상의 항원성 암 에피토프를 포함한다. 악성 종양은 면역 공격에 대한 표적 항원으로서 역할을 할 수 있는 다수의 단백질을 발현한다. 이들 분자는 조직-특이적 항원 예컨대 흑색종에서 MART-1, 티로시나제 및 gp100 및 전립선암에서 전립선산 포스파타제(PAP) 및 전립선-특이적 항원(PSA)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 표적 분자는 종양유전자 HER2/Neu/ErbB-2와 같은 형질전환-관련 분자의 그룹에 속한다. 또한 표적 항원의 또 다른 그룹은 암배아 항원(CEA)과 같은 종양-태아 항원이다. B-세포 림프종에서 종양-특이적 유전자형 면역글로불린은 개별 종양에 고유한 진정한 종양-특이적 면역글로불린 항원을 구축한다. B-세포 분화 항원 예컨대 CD19, CD20 및 CD37은 B-세포 림프종에서 표적 항원에 대한 다른 후보이다.
일부 구현예에서, 종양 항원은 종양-특이적 항원(TSA) 또는 종양-연관 항원(TAA)이다. TSA는 종양 세포에 고유하고 신체의 다른 세포에서 발생하지 않는다. TAA는 종양 세포에 고유하지 않고, 대신에 항원에 대한 면역원성 내성 상태를 유도하지 못하는 조건 하에 정상 세포 상에서도 발현된다. 종양에 대한 항원의 발현은 면역계가 항원에 반응할 수 있는 조건 하에 발생할 수 있다. TAA는 면역계가 미성숙하고, 반응할 수 없을 때 태아 발달 동안 정상 세포 상에서 발현되는 항원일 수 있거나 또는 정상 세포 상에서 극도로 낮은 수준으로 정상적으로 존재하지만, 종양 세포 상에서 훨씬 더 높은 수준으로 발현되는 항원일 수 있다. TSA 또는 TAA 항원의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 분화 항원 예컨대 MART-1/멜란A(MART-I), gp 100(Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 종양-특이적 다중계통 항원 예컨대 MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5; 과발현된 배아 항원 예컨대 CEA; 과발현된 종양유전자 및 돌연변이된 종양-억제인자 유전자 예컨대 p53, Ras, HER2/neu; 염색체 전위로 인한 고유한 종양 항원; 예컨대 BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 및 바이러스 항원, 예컨대 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스 항원 EBVA 및 인간 유두종바이러스(HPV) 항원 E6 및 E7. 다른 대형, 단백질-기반 항원은 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, nm-23HI, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백질, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733＼EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO- 1, RCAS 1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린 C-연관 단백질, TAAL6, TAG72, TLP, 및 TPS를 포함한다.
일부 구현예에서, 종양 항원은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 메소텔린, TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 인터류킨-11 수용체 a(IL-11Ra), PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, 혈소판-유래 성장 인자 수용체-베타(PDGFR-베타), SSEA-4, CD20, 폴레이트 수용체 알파, ERBB2(Her2/neu), MUC1, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 폴레이트 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, CLDN18.2, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, 레구마인, HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 서비빈 및 텔로머라제, PCTA-1/갈렉틴 8, 멜란A/MART1, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전좌 파열점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역 전사효소, RU1, RU2, 장내 카르복실 에스터라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, 및 IGLL1. 일부 구현예에서, 종양 항원은 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, BCMA, CS1, CD138, CD123/IL3Rα, c-Met, gp100, MUC1, IGF-I 수용체, EpCAM, EGFR/EGFRvIII, HER2, IGF1R, 메소텔린, PSMA, WT1, ROR1, CEA, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, GPC3, 당지질 F77, PD-L1, PD-L2, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 B 세포 상에서 발현된다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 BCMA, CD19, 또는 CD20이다.
일부 구현예에서, 표적 항원은 병원체 항원, 예컨대 진균, 바이러스, 또는 박테리아 항원이다. 일부 구현예에서, 진균 항원은 아스페르길루스(Aspergillus) 또는 칸디다(Candida)에서 유래된다. 일부 구현예에서, 바이러스 항원은 단순 포진 바이러스(HSV), 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 메타뉴모바이러스(hMPV), 리노바이러스, 파라인플루엔자(PIV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 사이토메갈로바이러스(CMV), JC 바이러스(존 쿠닝햄 바이러스), BK 바이러스, HIV, 지카 바이러스, 인간 코로나바이러스, 노로바이러스, 뇌염 바이러스, 또는 에볼라에서 유래된다.
일부 구현예에서, 표적 항원은 세포 표면 분자이다. 일부 구현예에서, 세포 표면 항원은 리간드 또는 수용체이다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 리간드에서 유래된 적어도 하나의 도메인 또는 수용체의 세포외 도메인을 포함하는 하나 이상의 결합 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드 또는 수용체는 NKG2A, NKG2C, NKG2F, NKG2D, BCMA, APRIL, BAFF, IL-3, IL-13, LLT1, AICL, DNAM-1, 및 NKp80으로 이루어진 군으로부터 선택된 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, 리간드는 BCMA에 결합할 수 있는 APRIL 및/또는 BAFF에서 유래된다. 일부 구현예에서, 수용체는 FcR이고 리간드는 Fc-함유 분자이다. 일부 구현예에서, FcR은 Fcγ 수용체(FcγR)이다. 일부 구현예에서, FcγR은 FcγRIA(CD64A), FcγRIB(CD64B), FcγRIC(CD64C), FcγRIIA(CD32A), FcγRIIB(CD32B), FcγRIIIA(CD16a), 및 FcγRIIIB(CD16b)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
힌지
본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)는 일부 구현예에서 세포외 리간드 결합 도메인의 C-말단 및 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인을 포함한다. 힌지 도메인은 단백질의 2 개의 도메인 사이에서 일반적으로 발견되는 아미노산 분절이며 단백질의 가요성 및 서로에 대해 도메인 중 하나 또는 둘 다의 이동을 허용할 수 있다. 막관통 도메인에 대해 세포외 리간드 결합 도메인의 이러한 가요성 및 이동을 제공하는 임의의 아미노산 서열이 사용될 수 있다.
힌지 도메인은 약 10-100 개 아미노산, 예를 들어, 약 15-75 개 아미노산, 20-50 개 아미노산, 또는 30-60 개 아미노산 중 임의의 하나를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 95 개 아미노산 길이 중 임의의 하나이다.
일부 구현예에서, 힌지 도메인은 자연 발생 단백질의 힌지 도메인이다. 힌지 도메인을 포함하는 것으로 당업계에 알려져 있는 임의의 단백질의 힌지 도메인은 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체에서의 사용을 위해 호환가능하다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 자연 발생 단백질의 힌지 도메인의 적어도 일부이며 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체에 가요성을 부여한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 CD8α에서 유래된다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 CD8α의 힌지 도메인의 일부, 예를 들어, CD8α의 힌지 도메인의 적어도 약 15 개(예를 들어, 적어도 약 20, 25, 30, 35, 40, 또는 45 개 중 임의의 것)의 보존적 아미노산을 포함하는 단편이다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열번호: 68의 서열을 포함한다.
IgG, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD 항체와 같은 항체의 힌지 도메인은 또한 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)에서의 사용을 위해 호환가능하다. 일부 구현예에서, 기능적 외인성 수용체의 힌지 도메인은 항체의 불변 도메인 CH1 및 CH2를 연결하는 힌지 도메인이다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 항체에서 유래되고, 항체의 힌지 도메인 및 항체의 하나 이상의 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 기능적 외인성 수용체의 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인 및 항체의 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 기능적 외인성 수용체의 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인 및 항체의 CH2 및 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체이다. 일부 구현예에서, 기능적 외인성 수용체의 힌지 영역은 IgG1 항체의 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 기능적 외인성 수용체의 힌지 영역은 IgG1 항체의 힌지 영역 및 CH3 불변 영역을 포함한다.
비-자연 발생 펩티드는 또한 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체의 힌지 도메인으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인의 C-말단 및 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인은 가요성 링커(예를 들어, G/S 링커), 예컨대 a(GxS)n 링커이며, 여기서 x 및 n은 독립적으로 3 내지 12(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12)(서열번호: 107) 사이의 정수일 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열번호: 12-26, 103-107, 및 119-126으로 이루어진 군으로부터 선택된 것과 같이, "CMSD 링커" 및 "수용체 도메인 링커" 하위섹션에 기재된 가요성 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지는 적어도 약 10 개 아미노산 길이, 예를 들어, GENLYFQSGG(서열번호: 12), PPPYQPLGGGGS(서열번호: 16), GGGGSGGGGS(서열번호: 17), (GGGS)3(서열번호: 20), (GGGS)4(서열번호: 21), GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGS(서열번호: 22), GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호: 23), (GGGGS)3(서열번호: 24), (GGGGS)4(서열번호: 25), 또는 GSGSGSGSGS(서열번호: 125)이다.
막관통 도메인
본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)는 세포외 리간드 결합 도메인에 직접 또는 간접으로 융합될 수 있는 막관통 도메인을 포함한다. 막관통 도메인은 천연 공급원 또는 합성 공급원에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 막관통 도메인은 합성, 비-자연 발생 단백질 분절, 예를 들어, 세포 막에서 열역학적으로 안정된 소수성 단백질 분절일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "막관통 도메인"은 세포 막, 바람직하게는 진핵생물 세포 막에서 열역학적으로 안정된 임의의 단백질 구조를 지칭한다.
막관통 도메인은 막관통 도메인의 3차원 구조에 기반하여 분류된다. 예를 들어, 막관통 도메인은 알파 나선, 하나 초과의 알파 나선의 복합체, 베타-배럴, 또는 세포의 인지질 이중층에 걸칠 수 있는 임의의 다른 안정된 구조를 형성할 수 있다. 더욱이, 막관통 도메인은 또한 또는 대안적으로 막관통 도메인이 막을 가로질러 만드는 통과의 수 및 단백질의 배향을 포함하는, 막관통 도메인의 토폴로지에 기반하여 분류될 수 있다. 예를 들어, 단일-통과 막 단백질은 세포 막을 한번에 교차하고, 다중-통과 막 단백질은 세포 막을 적어도 2 회(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7 회 또는 그 이상) 교차한다. 막 단백질은 세포의 내부 또는 외부에 대해 말단 및 막-통과 분절(들)의 토폴로지에 따라 유형 I, 유형 II 또는 유형 III으로 정의될 수 있다. 유형 I 막 단백질은 단일 막에 걸쳐 있는 영역을 가지며 단백질의 N-말단이 세포의 지질 이중층의 세포외 측면 상에 존재하고 단백질의 C-말단이 세포질 측면 상에 존재하도록 배향된다. 유형 II 막 단백질은 또한 단일 막에 걸쳐 있는 영역을 갖지만 단백질의 C-말단이 세포의 지질 이중층의 세포외 측면 상에 존재하고 단백질의 N-말단이 세포질 측면 상에 존재하도록 배향된다. 유형 III 막 단백질은 다중 막에 걸쳐 있는 분절을 가지며 막관통 분절의 수 및 N- 및 C-말단의 위치에 기반하여 추가로 하위 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 기능적 외인성 수용체의 막관통 도메인은 유형 I 단일-통과 막 단백질에서 유래된다. 일부 구현예에서, 다중-통과 막 단백질로부터의 막관통 도메인은 또한 본원에 기재된 기능적 외인성 수용체에서 사용하기 위해 호환가능할 수 있다. 다중-통과 막 단백질은 복합(적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7 개 또는 그 이상) 알파 나선 또는 베타 시트 구조를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 다중-통과 막 단백질의 N-말단 및 C-말단은 지질 이중층의 반대 측면 상에 존재하며, 예를 들어, 단백질의 N-말단은 지질 이중층의 세포질 측면 상에 존재하고 단백질의 C-말단은 세포외 측면 상에 존재한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체는 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ζ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD2, CD45, CD4, CD5, CD8(예를 들어, CD8α), CD9, CD16, LFA-1(CDIIa, CD18), CD19, CD22, CD27, CD28, CD29, CD33, CD37, CD40, CD45, CD64, CD80, CD84, CD86, CD96(Tactile), CD100(SEMA4D), CD103, CD134, CD137(4-1BB), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), CD152, CD154, CD160(BY55), SELPLG(CD162), DNAM1(CD226), Ly9(CD229), SLAMF4(CD244, 2B4), ICOS(CD278), KIRDS2, OX40, PD-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), IL-2Rβ, IL-2Rγ, IL-7Ra, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, ITGAE, ITGAL, CDIIa, ITGAM, CD11b, CD11c, CD11d, ITGAX, ITGB1, ITGB2, ITGB7, TNFR2, CEACAM1, CRT AM, PSGL1, SLAMF6(NTB-A, Ly108), BLAME(SLAMF8), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 및/또는 NKG2C의 임의의 막관통 도메인(또는 이의 부분)으로부터 선택된 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137(4-1BB), CD152, CD154, 및 PD-1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD28에서 유래된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD8α에서 유래된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호: 69의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 및 막관통 도메인은 동일한 분자, 예를 들어, CD8α에서 유래된다.
본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체에서 사용하기 위한 막관통 도메인은 또한 합성, 비-자연 발생 단백질 분절의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 합성, 비-자연 발생 알파 나선 또는 베타 시트이다. 일부 구현예에서, 단백질 분절은 적어도 약 대략 18 개 아미노산, 예를 들어, 적어도 약 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 개, 또는 그 이상의 아미노산 중 임의의 것이다. 합성 막관통 도메인의 예는 당업계, 예를 들어 미국 특허 번호 제7,052,906 B1호 및 PCT 공개 번호 WO 2000/032776 A2에 알려져 있으며, 관련 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체의 막관통 도메인은 막관통 도메인의 막관통 영역 및 C-말단 측면에 위치한 세포질 영역을 포함할 수 있다. 막관통 도메인의 세포질 영역은 3 개 이상의 아미노산을 포함할 수 있고, 일부 구현예에서, 지질 이중층에서 막관통 도메인을 배향하는 것을 돕는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인 잔기는 막관통 도메인의 막관통 영역에 존재한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인 잔기는 막관통 도메인의 세포질 영역에 존재한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인의 세포질 영역은 양으로 하전된 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인의 세포질 영역은 아미노산 아르기닌, 세린, 및 리신을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체의 막관통 영역은 소수성 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체의 막관통 도메인은 인공 소수성 서열을 포함한다. 예를 들어, 페닐알라닌, 트립토판, 및 발린의 삼중항은 막관통 도메인의 C-말단에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 막관통 영역은 대부분 소수성 아미노산 잔기, 예컨대 알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 또는 발린을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 영역은 소수성이다. 일부 구현예에서, 막관통 영역은 폴리-류신-알라닌 서열을 포함한다. 단백질 또는 단백질 분절의 소수성, 또는 소수성 또는 친수성 특성은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들어 Kyte-Doolittle 소수성 분석에 의해 평가될 수 있다.
기능적 외인성 수용체 도메인 링커("수용체 도메인 링커")
일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인, 세포외 리간드 결합 도메인 및 임의적인 힌지 도메인, 세포외 리간드 결합 도메인 및 막관통 도메인, 막관통 도메인 및 ISD 내의 2 개 이상의 결합 모이어티(예를 들어, 항원-결합 단편 예컨대 scFv 또는 sdAb, 리간드/수용체 도메인)와 같은 본원에 기재된 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)의 다양한 도메인은 이하에서 "수용체 도메인 링커"로도 지칭되는 펩티드 링커를 통해 서로 융합되어, CMSD 내의 상기 기재된 임의적인 CMSD 링커와 구별될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체의 다양한 도메인, 예를 들어, 세포외 리간드 결합 도메인 내의 2 개 이상의 결합 모이어티(예를 들어, 항원-결합 단편 예컨대 scFv 또는 sdAb, 리간드/수용체 도메인)는 임의의 펩티드 링커 없이 서로 직접 융합된다. 예를 들어, 세포외 리간드 결합 도메인 내의 2 개 이상의 결합 모이어티(예를 들어, 항원-결합 단편 예컨대 scFv 또는 sdAb, 리간드/수용체 도메인) 사이, 세포외 리간드 결합 도메인 및 임의적인 힌지 도메인 사이, 세포외 리간드 결합 도메인 및 막관통 도메인 사이, 막관통 도메인 및 ISD 사이에서 본원에 기재된 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체의 다양한 도메인을 연결하는 수용체 도메인 펩티드 링커는 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
본원에 기재된 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)에서 각각의 수용체 도메인 펩티드 링커는 기능적 외인성 수용체의 다양한 도메인의 구조적 및/또는 기능적 특징에 따라 동일하거나 또는 상이한 길이 및/또는 서열을 가질 수 있다. 각각의 수용체 도메인 펩티드 링커는 독립적으로 선택되고 최적화될 수 있다. 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체에 사용되는 수용체 도메인 펩티드 링커(들), 예를 들어, 세포외 리간드 결합 도메인 내의 2 개 이상의 결합 모이어티(예를 들어, 항원-결합 단편 예컨대 scFv 또는 sdAb, 리간드/수용체 도메인)를 연결하는 펩티드 링커의 길이, 가요성 정도 및/또는 다른 특성은 하나 이상의 특정 항원 또는 에피토프에 대한 친화도, 특이성 또는 결합력을 포함하나 이에 제한되지 않는 특성에 대해 일부 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 2 개의 인접한 도메인(또는 결합 모이어티)가 서로 입체적으로 방해하지 않도록 더 긴 펩티드 링커가 선택될 수 있다. 예를 들어, 다량체성 항원에 대해 지시된 sdAb를 포함하는 본원에 기재된 다가 및/또는 다중특이적 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)에서, 수용체 도메인 펩티드 링커의 길이 및 가요성은 바람직하게는 세포외 리간드 결합 도메인 내의 각각의 sdAb가 다량체의 각각의 하위단위에 대한 항원 결정기에 결합하는 것을 허용하도록 한다. 일부 구현예에서, 짧은 펩티드 링커는 막관통 도메인 및 ISD 사이에 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 인접한 도메인(또는 결합 모이어티)가 서로에 대해 자유롭게 이동하도록 가요성 잔기(예컨대 글리신 및 세린)를 포함한다. 예를 들어, 글리신-세린 이중항은 적합한 펩티드 링커일 수 있다.
수용체 도메인 펩티드 링커는 임의의 적합한 길이의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 개 또는 그 이상의 아미노산 길이 중 임의의 것이다. 일부 구현예에서, 수용체 도메인 펩티드 링커는 약 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 개 또는 그 이하의 아미노산 길이 중 임의의 것 이하이다. 일부 구현예에서, 수용체 도메인 펩티드 링커의 길이는 약 1 개 아미노산 내지 약 10 개 아미노산, 약 1 개 아미노산 내지 약 20 개 아미노산, 약 1 개 아미노산 내지 약 30 개 아미노산, 약 5 개 아미노산 내지 약 15 개 아미노산, 약 10 개 아미노산 내지 약 25 개 아미노산, 약 5 개 아미노산 내지 약 30 개 아미노산, 약 10 개 아미노산 내지 약 30 개 아미노산 길이, 약 30 개 아미노산 내지 약 50 개 아미노산, 약 50 개 아미노산 내지 약 100 개 아미노산, 또는 약 1 개 아미노산 내지 약 100 개 아미노산 중 임의의 것이다.
수용체 도메인 펩티드 링커는 자연 발생 서열, 또는 비-자연 발생 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 중쇄 단독 항체의 힌지 영역에서 유래된 서열은 수용체 도메인 펩티드 링커로서 사용될 수 있다. 예를 들어, WO1996/34103 참조. 일부 구현예에서, 수용체 도메인 펩티드 링커는 가요성 링커이다. 예시적인 가요성 링커는 글리신 중합체(G)n(서열번호: 103), 글리신-세린 중합체(예를 들어, (GS)n(서열번호: 104), (GGGS)n(서열번호: 105), 및 (GGGGS)n(서열번호: 106) 포함, 여기서 n은 적어도 1의 정수임), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 당업계에 알려진 다른 가요성 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체 도메인 펩티드 링커는 (GxS)n 링커이며, 여기서 x 및 n은 독립적으로 3 내지 12의 정수(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12)(서열번호: 107)일 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체 도메인 링커는 아미노산 서열 GENLYFQSGG(서열번호: 12), GGSG(서열번호: 13), GS(서열번호: 14), GSGSGS(서열번호: 15), PPPYQPLGGGGS(서열번호: 16), GGGGSGGGGS(서열번호: 17), G(서열번호: 18), GSTSGSGKPGSGEGSTKG(서열번호: 19), GGGGS(서열번호: 124), (GGGS)3(서열번호: 20), (GGGS)4(서열번호: 21), GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGS(서열번호: 22), GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호: 23), (GGGGS)3(서열번호: 24), (GGGGS)4(서열번호: 25), 또는 GGGGGSGGRASGGGGS(서열번호: 26), GSGSGSGSGS(서열번호: 125)을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체 도메인 링커는 서열번호: 12-26, 103-107, 및 119-126 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체 도메인 링커는 서열번호: 124의 아미노산 서열을 포함한다.
신호 펩티드
본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)는 기능적 외인성 수용체 폴리펩티드의 N-말단에 신호 펩티드(신호 서열로도 알려짐)를 포함할 수 있다. 일반적으로, 신호 펩티드는 폴리펩티드를 세포에서 원하는 부위에 표적화하는 펩티드 서열이다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 기능적 외인성 수용체를 세포의 분비 경로에 표적화하고 기능적 외인성 수용체를 지질 이중층 내에 통합 및 고정하는 것을 허용할 것이다. 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체에서 사용하기 위해 호환가능한 자연 발생 단백질의 신호 서열 또는 합성, 비-자연 발생 신호 서열을 포함하는 신호 펩티드는 당업자에게 자명할 것이다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 CD8α, GM-CSF 수용체 α, 및 IgG1 중쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 CD8α에서 유래된다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열번호: 67의 서열을 포함한다.
ITAM-변형된 키메라 항원 수용체(CAR)
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체는 ITAM-변형된 CAR, 즉, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 ISD를 포함하는 CAR이다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 본원에 기재된 CMSD 중 임의의 것을 포함하는 ISD를 포함한다. 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CAR이 제공되며: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 복수(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM은 서로 직접 연결된다. 일부 구현예에서, CMSD는 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 링커)에서 유래되지 않은 하나 이상의 링커에 의해 연결된 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 CMSD ITAM 중 하나 이상이 유래된 ITAM-함유 모 분자와 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된 하나 이상의 CMSD 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 동일한 CMSD ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ에서 유래되지 않는다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ의 ITAM1 또는 ITAM2가 아니다. 일부 구현예에서, 복수의 CMSD ITAM은 각각 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, 복수의 CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, 복수의 CMSD ITAM은 CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, DAP12, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), 및 FcεRIγ 중 하나 이상에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD는 CD3ζ ITAM1 및/또는 CD3ζ ITAM2를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, CMSD는 CD3ζ ITAM3을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 임의의 CD3ζ ITAM을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137(4-1BB), CD152, CD154, 및 PD-1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD8α에서 유래된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호: 69의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ISD는 공동-자극 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 CARD11, CD2(LFA-2), CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM-1), CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD162(SELPLG), CD258(LIGHT), CD270(HVEM, LIGHTR), CD276(B7-H3), CD278(ICOS), CD279(PD-1), CD319(SLAMF7), LFA-1(림프구 기능-연관　항원-1), NKG2C, CDS, GITR, BAFFR, NKp80(KLRF1), CD160, CD19, CD4, IPO-3, BLAME(SLAMF8), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, CD83, CD150(SLAMF1), CD152(CTLA-4), CD223(LAG3), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1), DAP10, TRIM, ZAP70, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공동-자극 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 CD137(4-1BB) 또는 CD28에서 유래된다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 서열번호: 36의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동-자극 도메인은 CMSD에 대해 N-말단이다. 일부 구현예에서, 공동-자극 도메인은 CMSD에 대해 C-말단이다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 CD19, CD20, 또는 BCMA)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, 하나 이상의 scFv, sdAb)을 포함한다. 세포외 리간드 결합 도메인 내의 하나 이상의 항원-결합 단편을 포함하는 ITAM-변형된 CAR은 이하에서 "ITAM-변형된 항체-기반 CAR"로 지칭된다. 일부 구현예에서, 항원-결합 단편은 Camel Ig, Ig NAR, Fab 단편, 단일 쇄 Fv 항체, 및 단일-도메인 항체(sdAb, 나노바디)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항원-결합 단편은 sdAb 또는 scFv이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 메소텔린, TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 인터류킨-11 수용체 a(IL-11Ra), PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, 혈소판-유래 성장 인자 수용체-베타(PDGFR-베타), SSEA-4, CD20, 폴레이트 수용체 알파, ERBB2(Her2/neu), MUC1, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 폴레이트 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, CLDN18.2, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, 레구마인, HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 서비빈 및 텔로머라제, PCTA-1/갈렉틴 8, 멜란A/MART1, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전좌 파열점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역 전사효소, RU1, RU2, 장내 카르복실 에스터라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, 및 IGLL1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 CD19, CD20, 또는 BCMA이다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 항원에 결합하는 폴리펩티드 리간드 또는 조작된 단백질과 같은 하나 이상의 비-항체 결합 모이어티를 포함한다(예를 들어, 이로 본질적으로 이루어진다). 일부 구현예에서, 하나 이상의 비-항체 결합 모이어티는 세포 표면 리간드에서 유래된 적어도 하나의 도메인 또는 세포 표면 수용체의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 하나 이상의 리간드를 특이적으로 인식하는 수용체의 세포외 도메인 또는 이의 일부(예를 들어, 하나 이상의 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인, 또는 이의 일부)를 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드 및/또는 수용체는 NKG2A, NKG2C, NKG2F, NKG2D, BCMA, APRIL, BAFF, IL-3, IL-13, LLT1, AICL, DNAM-1, 및 NKp80으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 수용체는 BCMA이다. 세포외 리간드 결합 도메인 내의 하나 이상의 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인(또는 이의 부분)을 포함하는 ITAM-변형된 CAR은 이하에서 "ITAM-변형된 리간드/수용체-기반 CAR"로 지칭된다. 일부 구현예에서, 수용체는 Fc 수용체(FcR)이고 리간드는 Fc-함유 분자이다. 세포외 리간드 결합 도메인 내의 하나 이상의 FcR을 포함하는 ITAM-변형된 CAR은 이하에서 "ITAM-변형된 항체-커플링된 T 세포　수용체(ACTR)"로 지칭된다. ITAM-변형된 ACTR을 발현하는 변형된 T 세포는 변형된 T 세포를 종양 세포로 지시하는 가교로서 역할을 하는 종양 항원과 같은 표적 항원을 특이적으로 인식하는 단클론 항체(예를 들어, 항-BCMA, 항-CD19, 또는 항-CD20 전장 항체)와 같은 Fc-함유 분자에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체는 Fcγ 수용체(FcγR)이다. 일부 구현예에서, FcγR은 FcγRIA(CD64A), FcγRIB(CD64B), FcγRIC(CD64C), FcγRIIA(CD32A), FcγRIIB(CD32B), FcγRIIIA(CD16a), 및 FcγRIIIB(CD16b)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Fc-함유 분자는 전장 항체이다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 1가(또는 단일특이적)이며, 즉, ITAM-변형된 CAR은 1가(또는 단일특이적)이다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 다가(예를 들어, 2가) 및 단일특이적이며, 즉, ITAM-변형된 CAR은 다가(예를 들어, 2가) 및 단일특이적이다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 다가(예를 들어, 2가) 및 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이며, 즉, ITAM-변형된 CAR은 다가(예를 들어, 2가) 및 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 세포외 리간드 결합 도메인(예를 들어, scFv, sdAb)의 C-말단 및 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 CD8α에서 유래된다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열번호: 68의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 ITAM-변형된 CAR의 N-말단(즉, 세포외 리간드 결합 도메인의 N-말단)에 위치한 신호 펩티드(SP)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 CD8α에서 유래된다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열번호: 67의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 ITAM-변형된 CAR의 세포 표면으로의 유출 후 제거된다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 서열번호: 71, 73, 109, 153-175, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 본원에 기재된 Nef(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)에 의해 하향 조절되지 않는다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포 용해 활성에 관한 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 Nef가 부재할 때와 비교하여 Nef에 의해 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것) 하향 조절된다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포용해 활성에 수반되는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 CD3ζ ISD를 포함하는 동일한 CAR(예를 들어, CD3ζ ISD를 제외하고는 모든 것을 동일하게 포함하는 기존 CAR)과 동일하거나 또는 유사하게 Nef 단백질에 의해 하향 조절된다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포용해 활성에 수반되는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 CD3ζ ISD를 포함하는 동일한 CAR보다 Nef에 의해 적어도 약 3% 낮게(예를 들어, 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 낮게 중 임의의 것) 하향 조절(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포용해 활성에 수반되는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절)된다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 CD3ζ ISD를 포함하는 동일한 CAR(예를 들어, CD3ζ ISD를 갖는 기존 CAR)보다 Nef 단백질에 의해 최대 약 80%(예를 들어, 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것) 더 하향 조절된다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포용해 활성에 수반되는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 CD3ζ ISD를 포함하는 동일한 CAR(예를 들어, CD3ζ ISD를 갖는 기존 CAR)의 것과 비교하여 동일하거나 또는 유사한 효과기 기능(예를 들어, 세포용해 활성에 수반되는 신호 전달)을 갖는다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 CD3ζ ISD를 포함하는 동일한 CAR(예를 들어, CD3ζ ISD를 갖는 기존 CAR)의 것과 비교하여 적어도 약 3%(예를 들어, 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것) 더 강한 효과기 기능(예를 들어, 세포용해 활성에 수반되는 신호 전달)을 갖는다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 CD3ζ ISD를 포함하는 동일한 CAR(예를 들어, CD3ζ ISD를 갖는 기존 CAR)의 것과 비교하여 최대 약 80%(예를 들어, 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것) 낮은 효과기 기능(예를 들어, 세포용해 활성에 수반되는 신호 전달)을 갖는다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 CD3ζ ISD를 포함하는 동일한 CAR(예를 들어, CD3ζ ISD를 갖는 기존 CAR)의 것과 비교하여 적어도 약 20%(예컨대 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 중 임의의 것) 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, N'에서 C'으로 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CAR이 제공되며: (a) 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 CD19, CD20, 또는 BCMA)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, N'에서 C'으로 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CAR이 제공되며: (a) 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 CD19, CD20, 또는 BCMA)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (b) 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (d) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, N'에서 C'으로 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CAR이 제공되며: (a) 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 CD19, CD20, 또는 BCMA)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (b) 임의적인 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (d) 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28에서 유래) 및 CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD에 대해 N-말단이다. 일부 구현예에서, N'에서 C'으로 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CAR이 제공되며: (a) 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 CD19, CD20, 또는 BCMA)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (b) 임의적인 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (d) 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28에서 유래) 및 CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD에 대해 C-말단이다. 일부 구현예에서, N'에서 C'으로 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CAR이 제공되며: (a) 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 CD19, CD20, 또는 BCMA)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 하나 이상의 scFv를 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (b) 임의적인 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28에서 유래) 및 CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD에 대해 N-말단이다. 일부 구현예에서, N'에서 C'으로 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CAR이 제공되며: (a) 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 CD19, CD20, 또는 BCMA)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 하나 이상의 scFv를 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (b) 임의적인 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (d) 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28에서 유래) 및 CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD에 대해 C-말단이다. 일부 구현예에서, N'에서 C'으로 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CAR이 제공되며: (a) 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 CD19, CD20, 또는 BCMA)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 하나 이상의 sdAb를 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (b) 임의적인 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28에서 유래) 및 CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD에 대해 N-말단이다. 일부 구현예에서, N'에서 C'으로 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CAR이 제공되며: (a) 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 CD19, CD20, 또는 BCMA)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 하나 이상의 sdAb를 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (b) 임의적인 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (d) 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28에서 유래) 및 CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD에 대해 C-말단이다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 BCMA에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 sdAb(즉, 항-BCMA sdAb), 예컨대 PCT/CN2016/094408 및 PCT/CN2017/096938에 개시된 항-BCMA sdAb 중 임의의 것을 포함하며, 상기 문헌 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항-BCMA sdAb 모이어티(예를 들어, VHH)는 서열번호: 113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 115의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항-BCMA sdAb 모이어티(예를 들어, VHH)는 서열번호: 111의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항-BCMA sdAb 모이어티(예를 들어, VHH)는 서열번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 117의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항-BCMA sdAb 모이어티(예를 들어, VHH)는 서열번호: 112의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 51의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 서열번호: 36의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호: 69의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열번호: 68의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 ITAM-변형된 CAR의 N-말단(즉, 세포외 리간드 결합 도메인의 N-말단)에 위치한 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 CD8α에서 유래된다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열번호: 67의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 ITAM-변형된 CAR의 세포 표면으로의 유출 후 제거된다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인(또는 ITAM-변형된 CAR)은 1가이며, 즉, 표적(예를 들어, 종양) 항원의 하나의 에피토프를 특이적으로 인식하는 하나의 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인(또는 ITAM-변형된 CAR)은 다가(예를 들어, 2가) 및 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이며, 즉, 표적(예를 들어, 종양) 항원의 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5 개, 또는 그 이상)의 에피토프를 특이적으로 인식하는 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5 개, 또는 그 이상)의 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 구현예에서, 2 개 이상의 에피토프는 동일한 표적(예를 들어, 종양) 항원에서 유래된다. 일부 구현예에서, 2 개 이상의 에피토프는 상이한 표적(예를 들어, 종양) 항원에서 유래된다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인(또는 ITAM-변형된 CAR)은 다가(예를 들어, 2가) 및 단일특이적이며, 표적(예를 들어, 종양) 항원의 동일한 에피토프를 특이적으로 인식하는 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5 개, 또는 그 이상)의 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 CD19, CD20, 또는 BCMA)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 2 개 이상의 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 구현예에서, 2 개 이상의 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)은 동일하며, 예를 들어, 2 개 이상의 동일한 항-BCMA sdAb 또는 항-BCMA scFv이다. 일부 구현예에서, 2 개 이상의 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)은 서로 상이하며, 예를 들어, 동일한 BCMA 에피토프를 특이적으로 인식하는 2 개 이상의 항-BCMA sdAb 또는 항-BCMA scFv, 또는 상이한 BCMA 에피토프를 특이적으로 인식하는 2 개 이상의 항-BCMA sdAb 또는 항-BCMA scFv이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원-결합 단편은 4-쇄 항체에서 유래된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원-결합 단편은 낙타과 항체에서 유래된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원-결합 단편은 인간 항체에서 유래된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원-결합 단편은 Camel Ig, Ig NAR, Fab, scFv, 및 sdAb로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항원-결합 단편은 sdAb(예를 들어, 항-BCMA sdAb) 또는 scFv(예를 들어, 항-BCMA scFv, 항-CD20 scFv, 항-CD19 scFv)이다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 직접 연결되거나 또는 펩티드 링커를 통해 함께 연결된 2 개 이상의 sdAb(예를 들어, 항-BCMA sdAb)를 포함한다.
일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 ITAM-변형된 BCMA CAR이다. 따라서 일부 구현예에서, N'에서 C'으로 다음을 포함하는 ITAM-변형된 BCMA CAR이 제공되며: (a) CD8α 신호 펩티드, (b) 항-BCMA scFv를 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (c) CD8α 힌지 도메인, (d) CD8α 막관통 도메인, (e) 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인, 및 (f) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD), 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 서열번호: 71 및 153-169 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM-변형된 BCMA CAR이 제공된다. [[ITAM-변형된 BCMA scFv CAR]] 일부 구현예에서, N'에서 C'으로 다음을 포함하는 ITAM-변형된 BCMA CAR이 제공된다: (a) CD8α 신호 펩티드, (b) 항-BCMA scFv를 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (c) CD8α 힌지 도메인, (d) CD8α 막관통 도메인, (e) 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인, 및 (f) 서열번호: 51의 서열을 포함하는(예를 들어, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진) CMSD. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 BCMA CAR은 서열번호: 71의 서열을 포함하며, 이하에서 "BCMA-BB010"으로도 지칭된다.
일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 ITAM-변형된 CD20 CAR이다. 따라서 일부 구현예에서, N'에서 C'으로 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CD20 CAR이 제공되며: (a) CD8α 신호 펩티드, (b) 항-CD20 scFv를 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (c) CD8α 힌지 도메인, (d) CD8α 막관통 도메인, (e) 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인, 및 (f) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD), 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 서열번호: 73 및 170-175 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM-변형된 CD20 CAR이 제공된다. 일부 구현예에서, N'에서 C'으로 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CD20 CAR이 제공된다: (a) CD8α 신호 펩티드, (b) 항-CD20 scFv를 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (c) CD8α 힌지 도메인, (d) CD8α 막관통 도메인, (e) 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인, 및 (f) 서열번호: 51의 서열을 포함하는 CMSD. 일부 구현예에서, 항-CD20 scFv는 항-CD20 항체 예컨대 리툭시맙(rituximab)(예를 들어, Rituxan®, MabThera®) 또는 Leu16에서 유래된다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CD20 CAR은 서열번호: 73의 서열을 포함하며, 이하에서 "MM010-변형된 CD20 CAR"로도 지칭된다.
일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 "ITAM-변형된 BCMA(리간드/수용체-기반) CAR"이다. 따라서 일부 구현예에서, N'에서 C'으로 다음을 포함하는 ITAM-변형된 BCMA(리간드/수용체-기반) CAR이 제공되며: (a) CD8α 신호 펩티드, (b) APRIL 및/또는 BAFF에서 유래된 하나 이상의 도메인을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (c) CD8α 힌지 도메인, (d) CD8α 막관통 도메인, (e) 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인, 및 (f) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD), 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 세포외 APRIL 도메인(또는 이의 기능적 부분)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 세포외 BAFF 도메인(또는 이의 기능적 부분)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 세포외 APRIL 도메인 및 세포외 BAFF 도메인(또는 이의 기능적 부분)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 서로 동일한 APRIL 및/또는 BAFF에서 유래된 2 개 이상의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 서로 상이한 APRIL 및/또는 BAFF에서 유래된 2 개 이상의 세포외 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 ITAM-변형된 ACTR이다. 따라서 일부 구현예에서, N'에서 C'으로 다음을 포함하는 ITAM-변형된 ACTR이 제공되며: (a) CD8α 신호 펩티드, (b) FcR(예를 들어, FcγR)을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (c) CD8α 힌지 도메인, (d) CD8α 막관통 도메인, (e) 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인, 및 (f) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD), 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, FcγR은 FcγRIA(CD64A), FcγRIB(CD64B), FcγRIC(CD64C), FcγRIIA(CD32A), FcγRIIB(CD32B), FcγRIIIA(CD16a), 및 FcγRIIIB(CD16b)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, FcR은 Fc-함유 분자(예를 들어, 전장 항체)를 특이적으로 인식한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 ACTR을 포함하는 변형된 T 세포는 Fc-함유 분자(예를 들어, 항-BCMA, 항-CD19, 또는 항-CD20 전장 항체)를 추가로 발현한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 ACTR을 포함하는 변형된 T 세포는 치료를 위해 사용될 때 Fc-함유 분자(예를 들어, 항-BCMA, 항-CD19, 또는 항-CD20 전장 항체)와 조합하여 투여된다.
PCT/CN2017/096938 및 PCT/CN2016/094408(각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 CAR을 포함하는, 당업계에 알려져 있고 출원에 의해 개발된 임의의 CAR은 본원에 기재된 ITAM-변형된 CAR을 구축하는 데 사용될 수 있으며, 즉, ITAM-변형된 CAR의 CMSD를 제외한 임의의 구조적 구성요소를 함유할 수 있다. ITAM-변형된 CAR의 예시적인 구조는 PCT/CN2017/096938의 도 15a-15d에 제시되어 있다(ISD는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 ISD로 전환될 것이다).
서열번호: 75 또는 77의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산과 같은 본원에 기재된 ITAM-변형된 CAR 중 임의의 것을 암호화하는 단리된 핵산이 또한 제공된다.
공동-자극 신호전달 도메인
많은 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포)는 세포 증식, 분화 및 생존을 촉진시키고, 세포의 효과기 기능을 활성화하기 위해 항원-특이적 신호의 자극 이외에 공동-자극을 필요로 한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 적어도 하나의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 용어 "공동-자극 분자" 또는 "공동-자극 단백질"은 공동-자극 리간드와 특이적으로 결합하여, 증식 및 생존과 같으나 이에 제한되지 않는 면역 세포에 의한 공동-자극 반응을 매개하는 면역 세포(예를 들어, T 세포) 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "공동-자극 신호전달 도메인"은 효과기 기능과 같은 면역 반응을 유도하기 위해 세포 내의 신호 전달을 매개하는 공동-자극 분자의 적어도 일부를 지칭한다. 본원에 기재된 ITAM-변형된 CAR의 공동-자극 신호전달 도메인은 신호를 전달하고 T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구, 또는 호산구와 같은 면역 세포에 의해 매개된 반응을 조절하는 공동-자극 단백질로부터의 세포질 신호전달 도메인일 수 있다.
일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR의 ISD는 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR의 ISD는 단일 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR의 ISD는 2 개 이상(예컨대 약 2, 3, 4 개, 또는 그 이상 중 임의의 것)의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR의 ISD는 동일한 공동-자극 신호전달 도메인 중 2 개 이상, 예를 들어, CD28 또는 CD137(4-1BB)의 공동-자극 신호전달 도메인의 2 개 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR의 ISD는 상이한 공동-자극 단백질로부터의 2 개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR의 ISD는 본원에 기재된 CMSD, 및 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB에서 유래)을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인 및 CMSD는 임의적인 펩티드 링커를 통해 서로 융합된다. CMSD, 및 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인은 임의의 적합한 순서로 배열될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인은 막관통 도메인 및 CMSD 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD의 C-말단에 위치한다. 일부 구현예에서, CMSD는 2 개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인 사이에 있다. 다중 공동-자극 신호전달 도메인은 부가적 또는 상승적 자극 효과를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인, 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인, 및/또는 CMSD는 "CMSD 링커" 및 "수용체 도메인 링커" 하위섹션에 기재된 바와 같은 펩티드 링커 중 임의의 것과 같은 임의적인 펩티드 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 12-26, 103-107, 및 119-126 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다.
숙주 세포(예를 들어, T 세포와 같은 면역 세포)에서 공동-자극 신호전달 도메인의 활성화는 사이토카인의 생산 및 분비, 식세포 특성, 증식, 분화, 생존, 및/또는 세포독성을 증가 및 감소시키기 위해 세포를 유도할 수 있다. 공동-자극 신호전달 도메인의 유형(들)은 ITAM-변형된 CAR이 발현될 면역 효과기 세포의 유형(예를 들어, T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구, 또는 호산구) 및 원하는 면역 효과기 기능(예를 들어, ADCC 효과)와 같은 인자에 기반하여 본원에 기재된 ITAM-변형된 CAR에 사용하기 위해 선택된다. ITAM-변형된 CAR에서 사용하기 위한 공동-자극 신호전달 도메인의 예는 B7/CD28 패밀리의 구성원(예를 들어, B7-1/CD80, B7-2/CD86, B7-H1/PD-L1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7-H7, BTLA/CD272, CD28, CTLA-4, GI24/VISTA/B7-H5, ICOS/CD278, PD-1, PD-L2/B7-DC, 및 PDCD6); TNF 슈퍼패밀리의 구성원(예를 들어, 4- 1BB/TNFSF9/CD137, 4-1BB 리간드/TNFSF9, BAFF/BLyS/TNFSF13B, BAFF R/TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, CD27 리간드/TNFSF7, CD30/TNFRSF8, CD30 리간드/TNFSF8, CD40/TNFRSF5, CD40/TNFSF5, CD40 리간드/TNFSF5, DR3/TNFRSF25, GITR/TNFRSF18, GITR 리간드/TNFSF18, HVEM/TNFRSF14, LIGHT/TNFSF14, 림포톡신-알파/TNF-베타, OX40/TNFRSF4, OX40 리간드/TNFSF4, RELT/TNFRSF19L, TACI/TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNF-알파, 및 TNF RII/TNFRSF1B); SLAM 패밀리의 구성원(예를 들어, 2B4/CD244/SLAMF4, BLAME/SLAMF8, CD2, CD2F-10/SLAMF9, CD48/SLAMF2, CD58/LFA-3, CD84/SLAMF5, CD229/SLAMF3, CRACC/SLAMF7, NTB-A/SLAMF6, 및 SLAM/CD150); 및 임의의 다른 공동-자극 분자, 예컨대 CD2, CD7, CD53, CD82/Kai-1, CD90/Thy1, CD96, CD160, CD200, CD300a/LMIR1, HLA 클래스 I, HLA- DR, 이카로스, 인테그린 알파 4/CD49d, 인테그린 알파 4 베타 1, 인테그린 알파 4 베타 7/LPAM-1, LAG-3, TCL1A, TCL1B, CRTAM, DAP12, 덱틴-1/CLEC7A, DPPIV/CD26, EphB6, TIM-1/KIM-1/HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLPR, 림프구 기능 연관 항원-1(LFA-1), 및 NKG2C를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 공동-자극 단백질의 세포질 신호전달 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인은 CARD11, CD2(LFA-2), CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM-1), CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD162(SELPLG), CD258(LIGHT), CD270(HVEM, LIGHTR), CD276(B7-H3), CD278(ICOS), CD279(PD-1), CD319(SLAMF7), LFA-1(림프구 기능-연관　항원-1), NKG2C, CDS, GITR, BAFFR, NKp80(KLRF1), CD160, CD19, CD4, IPO-3, BLAME(SLAMF8), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, CD83, CD150(SLAMF1), CD152(CTLA-4), CD223(LAG3), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1), DAP10, TRIM, ZAP70, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공동-자극 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인은 4-1BB 또는 CD28에서 유래된다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR의 ISD는 4-1BB에서 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 본원에 기재된 CMSD를 포함한다(예를 들어, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다). 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR의 ISD는 CD28에서 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 본원에 기재된 CMSD를 포함한다(예를 들어, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다). 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR의 ISD는 4-1BB에서 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, CD28에서 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 본원에 기재된 CMSD를 포함한다(예를 들어, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다). 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR의 ISD는 N'에서 C'으로 4-1BB에서 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CMSD를 포함한다(예를 들어, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다). 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR의 ISD는 N'에서 C'으로 CMSD, 및 4-1BB에서 유래된 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다(예를 들어, 이로 본질적으로 이루어지거나 , 또는 이로 이루어진다).
또한 공동-자극 신호전달 도메인이 면역 세포(예를 들어, T 세포)의 면역 반응을 조절할 수 있도록 본원에 기재된 공동-자극 신호전달 도메인 중 임의의 것의 변이체가 본 개시내용의 범위 내에 있다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 야생형 대응 공동-자극 신호전달 도메인과 비교하여 약 10 개의 아미노산 잔기 변이(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개 중 임의의 것)로 구성된다. 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 이러한 공동-자극 신호전달 도메인은 공동-자극 신호전달 도메인 변이체로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이는 돌연변이를 포함하지 않는 공동-자극 신호전달 도메인에 비해 신호 전달의 증가 및 면역 반응의 향상된 자극을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이는 돌연변이를 포함하지 않는 공동-자극 신호전달 도메인에 비해 신호 전달의 감소 및 면역 반응의 감소된 자극을 초래할 수 있다.
ITAM-변형된 T 세포 항원 커플러(TAC)-유사 키메라 수용체
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체이다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체는 서열번호: 39-51 및 132-152 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 CMSD와 같은 본원에 기재된 CMSD 중 임의의 것을 포함하는 ISD를 포함한다 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체가 제공되며: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 임의적인 제1 수용체 도메인 링커, (c) 제1 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 세포외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포외 TCR 결합 도메인, (d) 임의적인 제2 수용체 도메인 링커, (e) 제2 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 임의적인 세포외 도메인 또는 이의 일부, (f) 제3 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 (g) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 하위단위는 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, 및 CD3δ으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체 융합 폴리펩티드는 예를 들어, TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε, TCRα)의 세포외 도메인을 특이적으로 인식함으로써 다른 내인성 TCR 하위단위와 함께 기능적 TCR 복합체 내로 혼입될 수 있고, TCR 복합체에 항원 특이성을 부여한다. 일부 구현예에서, 제2 및 제3 TCR 하위단위는 동일하며, 예를 들어, 둘 다 CD3ε이다. 일부 구현예에서, 제2 및 제3 TCR 하위단위는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1, 제2 및 제3 TCR 하위단위는 동일하며, 예를 들어, 모두 CD3ε이다. 일부 구현예에서, 제1 TCR 하위단위 및 제2 및 제3 TCR 하위단위는 상이하며, 예를 들어, 제1 TCR 하위단위는 TCRα이고 제2 및 제3 TCR 하위단위는 둘 다 CD3ε이다. 일부 구현예에서, 제1, 제2 및 제3 TCR 하위단위는 모두 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 TCR 하위단위는 CD3ε이고/이거나, 제2 TCR 하위단위는 CD3ε이고/이거나, 제3 TCR 하위단위는 CD3ε이다. 일부 구현예에서, 제1 TCR 하위단위는 CD3γ이고/이거나, 제2 TCR 하위단위는 CD3γ이고/이거나, 제3 TCR 하위단위는 CD3γ이다. 일부 구현예에서, 제1 TCR 하위단위는 CD3δ이고/이거나, 제2 TCR 하위단위는 CD3δ이고/이거나, 제3 TCR 하위단위는 CD3δ이다. 일부 구현예에서, 제1 TCR 하위단위는 TCRα이고/이거나, 제2 TCR 하위단위는 TCRα이고/이거나, 제3 TCR 하위단위는 TCRα이다. 일부 구현예에서, 제1 TCR 하위단위는 TCRβ이고/이거나, 제2 TCR 하위단위는 TCRβ이고/이거나, 제3 TCR 하위단위는 TCRβ이다. 일부 구현예에서, 제1 TCR 하위단위는 TCRγ이고/이거나, 제2 TCR 하위단위는 TCRγ이고/이거나, 제3 TCR 하위단위는 TCRγ이다. 일부 구현예에서, 제1 TCR 하위단위는 TCRδ이고/이거나, 제2 TCR 하위단위는 TCRδ이고/이거나, 제3 TCR 하위단위는 TCRδ이다. 일부 구현예에서, 제1 TCR 하위단위 및 제3 TCR 하위단위는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 TCR 하위단위 및 제3 TCR 하위단위는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 TCR 하위단위 및 제2 TCR 하위단위는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 TCR 하위단위 및 제2 TCR 하위단위는 상이하다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체는 제2 TCR 하위단위의 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체는 임의의 TCR 하위단위의 세포외 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 세포외 TCR 결합 도메인에 대해 N-말단이다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 세포외 TCR 결합 도메인에 대해 C-말단이다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체는 세포외 TCR 결합 도메인의 C-말단 및 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인을 추가로 포함한다(예를 들어, TCR 하위단위의 세포외 도메인 또는 이의 일부가 없고, 세포외 TCR 결합 도메인이 세포외 리간드 결합 도메인의 C-말단에 있는 경우). 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체는 세포외 리간드 결합 도메인의 C-말단 및 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인을 추가로 포함한다(예를 들어, TCR 하위단위의 세포외 도메인 또는 이의 일부가 없고, 세포외 TCR 결합 도메인이 세포외 리간드 결합 도메인의 N-말단에 있는 경우). 상기 "힌지," 및 "CMSD 링커," 및 "수용체 도메인 링커" 하위섹션에 기재된 힌지 도메인 및 링커 중 임의의 것은 본원에 기재된 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 수용체 도메인 링커는 서열번호: 12-26, 103-107, 및 119-126으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 CD8α에서 유래된다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열번호: 68의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 1가 및 단일특이적이며, 예를 들어, 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 에피토프를 특이적으로 인식하는 단일 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 다가 및 단일특이적이며, 예를 들어, 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 동일한 에피토프를 특이적으로 인식하는 2 개 이상의 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 다가 및 다중특이적이며, 예를 들어, 동일한 표적 항원 또는 상이한 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 2 개 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 2 개 이상의 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체는 세포외 TCR 결합 도메인(예를 들어, CD3ε)에 의해 인식된 TCR 하위단위(예를 들어, TCRα)의 상이한 세포외 도메인을 특이적으로 인식하는 제2 세포외 TCR 결합 도메인(예를 들어, scFv, sdAb)을 추가로 포함하며, 여기서 제2 세포외 TCR 결합 도메인은 세포외 TCR 결합 도메인 및 세포외 리간드 결합 도메인 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 본원에 기재된 항-BCMA sdAb 중 임의의 것, 또는 PCT/CN2016/094408 및 PCT/CN2017/096938에 개시된 항-BCMA sdAb 중 임의의 것과 같은 BCMA에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 sdAb(즉, 항-BCMA sdAb)를 포함하며, 상기 문헌 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 하나 이상의 항-BCMA scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체의 N-말단에 위치한 신호 펩티드를 추가로 포함하며, 예를 들어, 신호 펩티드는 세포외 리간드 결합 도메인이 세포외 TCR 결합 도메인에 대해 N-말단인 경우 세포외 리간드 결합 도메인의 N-말단에 있거나, 또는 신호 펩티드는 세포외 리간드 결합 도메인이 세포외 TCR 결합 도메인에 대해 C-말단인 경우 세포외 TCR 결합 도메인의 N-말단에 있다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 CD8α에서 유래된다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열번호: 67의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체의 세포 포면으로의 유출 후 제거된다. 일부 구현예에서, 복수(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM은 서로 직접 연결된다. 일부 구현예에서, CMSD는 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 링커)에서 유래되지 않은 하나 이상의 링커에 의해 연결된 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 CMSD ITAM 중 하나 이상이 유래된 ITAM-함유 모 분자와 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된 하나 이상의 CMSD 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 동일한 CMSD ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ에서 유래되지 않는다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ의 ITAM1 또는 ITAM2가 아니다. 일부 구현예에서, 복수의 CMSD ITAM은 각각 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, 복수의 CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, 복수의 CMSD ITAM은 CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, DAP12, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), 및 FcεRIγ 중 하나 이상에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD는 CD3ζ ITAM1 및/또는 CD3ζ ITAM2를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, CMSD는 CD3ζ ITAM3을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 임의의 CD3ζ ITAM을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체는 Nef(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)에 의해 하향 조절되지 않는다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포 용해 활성에 관한 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절되지 않는다). 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체는 Nef가 부재할 때와 비교하여 Nef(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)에 의해 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것) 하향 조절된다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포 용해 활성에 관한 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절된다). 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체는 CD3ε, CD3δ, 또는 CD3γ의 ISD를 포함하는 TAC-유사 키메라 수용체보다 Nef(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)에 의해 적어도 약 3% 낮게(예를 들어, 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 낮게 중 임의의 것) 하향 조절된다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포용해 활성에 수반되는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절된다). 일부 구현예에서, CMSD ITAM은 모두 CD3ζ에서 유래된다. 일부 구현예에서, 제2 및 제3 TCR 하위단위는 둘 다 CD3ε이다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM은 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 중 하나 이상에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD 내의 링커는 CD3ε, CD3δ, 또는 CD3γ(예를 들어, CD3ε, CD3δ, 또는 CD3γ의 ISD의 비-ITAM 서열)에서 유래되거나, 또는 서열번호: 12-26, 103-107, 및 119-126으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CMSD는 하나의 CD3ε ITAM으로 본질적으로 이루어진다(예를 들어, 이로 이루어진다). 일부 구현예에서, CMSD는 적어도 2 개의 CD3ε ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 43, 50, 145, 및 149 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CMSD ITAM은 CD3ζ에서 유래된다. 따라서 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체가 제공되며: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 임의적인 제1 수용체 도메인 링커, (c) 제1 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 세포외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포외 TCR 결합 도메인, (d) 임의적인 제2 수용체 도메인 링커, (e) 제2 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 임의적인 세포외 도메인 또는 이의 일부, (f) 제3 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 (g) CMSD를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 CD3ζ에서 유래된 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 하위단위는 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일 구현예에서, CMSD는 서열번호: 39-42, 48, 및 49로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 다음을 포함하는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체가 제공되며: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 임의적인 제1 수용체 도메인 링커, (c) 제1 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 세포외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포외 TCR 결합 도메인, (d) 임의적인 제2 수용체 도메인 링커, (e) 제2 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 임의적인 세포외 도메인 또는 이의 일부, (f) 제3 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 (g) CMSD를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 하나 이상의 ITAM은 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 중 하나 이상에서 유래되고, 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 하위단위는 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, CMSD는 하나 또는 복수(예를 들어, 2, 3 개, 또는 그 이상)의 CD3ε ITAM을 포함하고(예를 들어, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고), 제2 TCR 하위단위는 CD3ε이고/이거나 제3 TCR 하위단위는 CD3ε이다. 일부 구현예에서, CMSD는 하나 또는 복수(예를 들어, 2, 3 개, 또는 그 이상)의 CD3δ ITAM을 포함하고(예를 들어, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고), 제2 TCR 하위단위는 CD3δ이고/이거나 제3 TCR 하위단위는 CD3δ이다. 일부 구현예에서, CMSD는 하나 또는 복수(예를 들어, 2, 3 개, 또는 그 이상)의 CD3γ ITAM를 포함하고(예를 들어, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고), 제2 TCR 하위단위는 CD3γ이고/이거나 제3 TCR 하위단위는 CD3γ이다. 일부 구현예에서, 제1 TCR 하위단위는 제2 TCR 하위단위 및/또는 제3 TCR 하위단위와 동일하다. 일부 구현예에서, 제2 TCR 하위단위 및 제3 TCR 하위단위는 동일하지만, 제1 TCR 하위단위와 상이하다.
따라서 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체가 제공되며: (a) 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (b) 임의적인 제1 수용체 도메인 링커, (c) TCR 하위단위(예를 들어, TCRα)의 세포외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포외 TCR 결합 도메인, (d) 임의적인 제2 수용체 도메인 링커, (e) CD3ε의 임의적인 세포외 도메인 또는 이의 일부, (f) CD3ε의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 (g) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 TCR 하위단위는 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체가 제공되며: (a) 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (b) 임의적인 제1 수용체 도메인 링커, (c) TCR 하위단위(예를 들어, TCRα)의 세포외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포외 TCR 결합 도메인, (d) 임의적인 제2 수용체 도메인 링커, (e) CD3ε의 임의적인 세포외 도메인 또는 이의 일부, (f) CD3ε의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 (g) CMSD를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CD3ε ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CD3ε ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 TCR 하위단위는 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 43, 50, 145, 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체는 임의의 TCR 하위단위의 세포외 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체는 힌지 도메인을 포함한다. 따라서 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체가 제공되며: (a) 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (b) 임의적인 제1 수용체 도메인 링커, (c) 제1 TCR 하위단위(예를 들어, TCRα)의 세포외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포외 TCR 결합 도메인, (d) 임의적인 제2 수용체 도메인 링커, (e) 임의적인 힌지 도메인, (f) 제2 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 (g) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 제1 및 제2 TCR 하위단위는 둘 다 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다.
ITAM-변형된 TCR
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체는 "ITAM-변형된 TCR"이다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TCR은 서열번호: 39-51 및 132-152 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 CMSD와 같은 본원에 기재된 CMSD 중 임의의 것을 포함하는 ISD를 포함한다. 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 ITAM-변형된 TCR이 제공되며: (a) 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20) 또는 표적 항원 펩티드/MHC 복합체(예를 들어, BCMA/MHC 복합체)의 하나 이상의 에피토프를 함께 특이적으로 인식하는 야생형 TCR에서 유래된 Vα 및 Vβ를 포함하며, 여기서 Vα, 및 Vβ, 또는 둘 다는 야생형 TCR에 비해 하나 이상의 CDR에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인, 세포외 리간드 결합 도메인, (b) TCRα의 막관통 도메인 및 TCRβ의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 (c) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 야기한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TCR은 야생형 TCR에 의해 결합된 동일한 동족 펩티드-MHC에 결합한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TCR은 야생형 TCR에 의해 결합된 것과 비교하여 더 높은 친화도로 동일한 동족 펩티드-MHC에 결합한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TCR은 야생형 TCR에 의해 결합된 것과 비교하여 더 낮은 친화도로 동일한 동족 펩티드-MHC에 결합한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TCR은 야생형 TCR에 의해 결합되지 않은 비-동족 펩티드-MHC에 결합한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TCR은 단일 쇄 TCR(scTCR)이다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TCR은 이량체성 TCR(dTCR)이다. 일부 구현예에서, 야생형 TCR은 HLA-A2에 결합한다. 일부 구현예에서, 복수(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM은 서로 직접 연결된다. 일부 구현예에서, CMSD는 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 링커)에서 유래되지 않은 하나 이상의 링커에 의해 연결된 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 CMSD ITAM 중 하나 이상이 유래된 ITAM-함유 모 분자와 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된 하나 이상의 CMSD 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 동일한 CMSD ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ에서 유래되지 않는다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ의 ITAM1 또는 ITAM2가 아니다. 일부 구현예에서, 복수의 CMSD ITAM은 각각 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, 복수의 CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, 복수의 CMSD ITAM은 CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, DAP12, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), 및 FcεRIγ 중 하나 이상에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD는 CD3ζ ITAM1 및/또는 CD3ζ ITAM2를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, CMSD는 CD3ζ ITAM3을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 임의의 CD3ζ ITAM을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TCR은 세포외 리간드 결합 도메인의 C-말단 및 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 상기 "힌지" 하위섹션에 기재된 임의의 힌지 도메인은 본원에 기재된 ITAM-변형된 TCR에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 CD8α에서 유래된다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열번호: 68의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TCR은 ITAM-변형된 TCR의 N-말단(즉, 세포외 리간드 결합 도메인의 N-말단)에 위치한 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 CD8α에서 유래된다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열번호: 67의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 ITAM-변형된 TCR의 세포 표면으로의 유출 후 제거된다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TCR은 Nef(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)에 의해 하향 조절되지 않는다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포 용해 활성에 관한 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절되지 않는다). 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TCR은 Nef가 부재할 때와 비교하여 Nef(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)에 의해 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것) 하향 조절된다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포용해 활성에 수반되는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절된다). 일부 구현예에서, ITAM-변형된 TCR은 내인성 CD3ζ로 복합체화된 동일한 변형된 TCR보다 Nef(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)에 의해 적어도 약 3% 낮게(예를 들어, 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 낮게 중 임의의 것) 하향 조절된다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포용해 활성에 수반되는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절).
ITAM-변형된 키메라 TCR(cTCR)
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체는 ITAM-변형된 cTCR이다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 cTCR은 서열번호: 39-51 및 132-152 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 CMSD와 같은 본원에 기재된 CMSD 중 임의의 것을 포함하는 ISD를 포함한다. 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 ITAM-변형된 cTCR이 제공되며: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 임의적인 수용체 도메인 링커, (c) 제1 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 임의적인 세포외 도메인 또는 이의 일부, (d) 제2 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 (e) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 제1 및 제2 TCR 하위단위는 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 cTCR 융합 폴리펩티드는 다른 내인성 TCR 하위단위와 함께 기능적 TCR 복합체 내에 혼입될 수 있고 TCR 복합체에 항원 특이성을 부여한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 TCR 하위단위는 동일하며, 예를 들어, 둘 다 CD3ε이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 TCR 하위단위는 상이하며, 예를 들어, 제1 TCR 하위단위는 TCRα이고 제2 TCR 하위단위는 CD3ε이다. 일부 구현예에서, 제1 TCR 하위단위는 CD3ε이고/이거나 제2 TCR 하위단위는 CD3ε이다. 일부 구현예에서, 제1 TCR 하위단위는 CD3γ이고/이거나 제2 TCR 하위단위는 CD3γ이다. 일부 구현예에서, 제1 TCR 하위단위는 CD3δ이고/이거나 제2 TCR 하위단위는 CD3δ이다. 일부 구현예에서, 제1 TCR 하위단위는 TCRα이고/이고나 제2 TCR 하위단위는 TCRα이다. 일부 구현예에서, 제1 TCR 하위단위는 TCRβ이고/이거나 제2 TCR 하위단위는 TCRβ이다. 일부 구현예에서, 제1 TCR 하위단위는 TCRγ이고/이거나 제2 TCR 하위단위는 TCRγ이다. 일부 구현예에서, 제1 TCR 하위단위는 TCRδ이고/이거나 제2 TCR 하위단위는 TCRδ이다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 cTCR은 제1 TCR 하위단위의 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 cTCR은 임의의 TCR 하위단위의 세포외 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 cTCR은 세포외 리간드 결합 도메인의 C-말단 및 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인을 추가로 포함한다(예를 들어, TCR 하위단위의 세포외 도메인 또는 이의 일부가 없는 경우). 상기 "힌지" 및 "수용체 도메인 링커" 하위섹션에 기재된 힌지 도메인 및 수용체 도메인 링커 중 임의의 것은 본원에 기재된 ITAM-변형된 cTCR에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체 도메인 링커는 서열번호: 12-26, 103-107, 및 119-126으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 CD8α에서 유래된다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열번호: 68의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 1가 및 단일특이적이며, 예를 들어, 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 에피토프를 특이적으로 인식하는 단일 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 다가 및 단일특이적이며, 예를 들어, 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 동일한 에피토프를 특이적으로 인식하는 2 개 이상의 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 다가 및 다중특이적이며, 예를 들어, 동일한 표적 항원 또는 상이한 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 2 개 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 2 개 이상의 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 BCMA에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 sdAb(즉, 항-BCMA sdAb), 예컨대 본원에 기재된 항-BCMA sdAb 중 임의의 것, 또는 PCT/CN2016/094408 및 PCT/CN2017/096938에 개시된 항-BCMA sdAb 중 임의의 것을 포함하며, 상기 문헌 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 하나 이상의 항-BCMA scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 cTCR은 ITAM-변형된 cTCR의 N-말단에 위치한 신호 펩티드를 추가로 포함하며, 예를 들어, 신호 펩티드는 세포외 리간드 결합 도메인의 N-말단에 있다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 CD8α에서 유래된다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열번호: 67의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 ITAM-변형된 cTCR의 세포 표면으로의 유출 후 제거된다. 일부 구현예에서, 복수(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM은 서로 직접 연결된다. 일부 구현예에서, CMSD는 ITAM-함유 모 분자(예를 들어, G/S 링커)에서 유래되지 않은 하나 이상의 링커에 의해 연결된 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 CMSD ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 CMSD ITAM 중 하나 이상이 유래된 ITAM-함유 모 분자와 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된 하나 이상의 CMSD 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 2 개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 개, 또는 그 이상)의 동일한 CMSD ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ에서 유래되지 않는다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ의 ITAM1 또는 ITAM2가 아니다. 일부 구현예에서, 복수의 CMSD ITAM은 각각 상이한 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, 복수의 CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래된다. 일부 구현예에서, 복수의 CMSD ITAM은 CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, DAP12, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), 및 FcεRIγ 중 하나 이상에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD는 CD3ζ ITAM1 및/또는 CD3ζ ITAM2를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, CMSD는 CD3ζ ITAM3을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 임의의 CD3ζ ITAM을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 cTCR은 Nef(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)에 의해 하향 조절되지 않는다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포 용해 활성에 관한 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절되지 않는다). 일부 구현예에서, ITAM-변형된 cTCR은 Nef가 부재할 때와 비교하여 Nef(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)에 의해 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것) 하향 조절된다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포 용해 활성에 관한 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, ITAM-변형된 cTCR은 CD3ε, CD3δ, 또는 CD3γ의 ISD를 포함하는 동일한 cTCR보다 Nef(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)에 의해 적어도 약 3% 낮게(예를 들어, 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 낮게 중 임의의 것) 하향 조절된다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포 용해 활성에 관한 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, CMSD ITAM은 CD3ζ에서 유래된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 TCR 하위단위는 둘 다 CD3ε이다. 일부 구현예에서, CMSD ITAM은 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 중 하나 이상에서 유래된다. 일부 구현예에서, CMSD 내의 링커는 CD3ε, CD3δ, 또는 CD3γ(예를 들어, CD3ε, CD3δ, 또는 CD3γ의 ISD의 비-ITAM 서열)에서 유래되거나, 또는 서열번호: 12-26, 103-107, 및 119-126으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CMSD는 하나의 CD3ε ITAM으로 본질적으로 이루어진다(예를 들어, 이로 이루어진다). 일부 구현예에서, CMSD는 적어도 2 개의 CD3ε ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 43, 50, 145, 및 149 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, ITAM은 CD3ζ에서 유래된다. 따라서 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 ITAM-변형된 cTCR이 제공되며: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 임의적인 수용체 도메인 링커, (c) 제1 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 임의적인 세포외 도메인 또는 이의 일부, (d) 제2 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 (e) CMSD를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 CD3ζ에서 유래된 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 제1 및 제2 TCR 하위단위는 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 39-42, 48, 및 49로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 다음을 포함하는 ITAM-변형된 cTCR이 제공되며: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 임의적인 수용체 도메인 링커, (c) 제1 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 임의적인 세포외 도메인 또는 이의 일부, (d) 제2 TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 (e) CMSD를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 CMSD ITAM은 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 중 하나 이상에서 유래되고, 여기서 제1 및 제2 TCR 하위단위는 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, CMSD는 하나 또는 복수(예를 들어, 2, 3 개, 또는 그 이상)의 CD3ε ITAM를 포함하고(예를 들어, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고), 제1 TCR 하위단위는 CD3ε이고/이거나 제2 TCR 하위단위는 CD3ε이다. 일부 구현예에서, CMSD는 하나 또는 복수(예를 들어, 2, 3 개, 또는 그 이상)의 CD3δ ITAM을 포함하고(예를 들어, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고), 제1 TCR 하위단위는 CD3δ이고/이거나 제2 TCR 하위단위는 CD3δ이다. 일부 구현예에서, CMSD는 하나 또는 복수(예를 들어, 2, 3 개, 또는 그 이상)의 CD3γ ITAM을 포함하고(예를 들어, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고), 제1 TCR 하위단위는 CD3γ이고/이거나 제2 TCR 하위단위는 CD3γ이다. 일부 구현예에서, 제1 TCR 하위단위는 제2 TCR 하위단위와 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 TCR 하위단위는 제2 TCR 하위단위와 상이하다.
따라서 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 ITAM-변형된 cTCR이 제공되며: (a) 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (b) 임의적인 제1 수용체 도메인 링커, (c) CD3ε의 임의적인 세포외 도메인 또는 이의 일부, (d) CD3ε의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 (e) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 ITAM-변형된 cTCR이 제공되며: (a) 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (b) 임의적인 제1 수용체 도메인 링커, (c) CD3ε의 임의적인 세포외 도메인 또는 이의 일부, (d) CD3ε의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 (e) CMSD를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CD3ε ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CD3ε ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, CMSD는 서열번호: 43, 50, 145, 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, ITAM-변형된 cTCR은 임의의 TCR 하위단위의 세포외 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 cTCR은 힌지 도메인을 포함한다. 따라서 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 ITAM-변형된 cTCR이 제공되며: (a) 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (b) 임의적인 수용체 도메인 링커, (c) 임의적인 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (d) TCR 하위단위(예를 들어, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 (e) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 TCR 하위단위는 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다.
IV. BCMA CAR 작제물
본 출원은 일 측면에서 또한 신규 BCMA CAR 작제물(예를 들어, ITAM-변형된 BCMA CAR) 및 이를 발현하는 세포(예를 들어, T 세포, 예컨대 Nef-함유 T 세포)(본원에서 "BCMA CAR 효과기 세포", 예를 들어, "BCMA CAR-T 세포"로도 지칭됨)를 제공한다. 본원에 기재된 BCMA CAR 작제물 및 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질을 공동-발현하는 T 세포는 본원에서 "Nef-함유 BCMA CAR-T 세포"로도 지칭된다. 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 BCMA CAR 및 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질을 공동-발현하는 T 세포는 본원에서 "Nef-함유 ITAM-변형된 BCMA CAR-T 세포"로도 지칭된다.
BCMA CAR은 일부 구현예에서 다음을 포함한다: a) BCMA에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체(sdAb) 모이어티(본원에서 이후에 "항-BCMA sdAb," 예컨대 "항-BCMA VHH"로도 지칭됨)를 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, 및 b) 세포내 신호전달 도메인(ISD, 예를 들어, CD3ζ ISD 또는 본원에 기재된 CMSD를 포함). 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래)은 세포외 리간드 결합 도메인 및 ISD 사이에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 항-BCMA sdAb 모이어티(예를 들어, VHH)는 서열번호: 113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 115의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-BCMA sdAb 모이어티는 서열번호: 111의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA sdAb의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-BCMA sdAb 모이어티는 서열번호: 113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 115의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-BCMA sdAb 모이어티(예를 들어, VHH)와 동일한 에피토프에 결합한다(예를 들어, 경쟁적으로 결합한다).
일부 구현예에서, 항-BCMA sdAb 모이어티(예를 들어, VHH)는 서열번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 117의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-BCMA sdAb 모이어티는 서열번호: 112의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA sdAb의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-BCMA sdAb 모이어티는 서열번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 117의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-BCMA sdAb 모이어티(예를 들어, VHH)와 동일한 에피토프에 결합한다(예를 들어, 경쟁적으로 결합한다).
일부 구현예에서, BCMA CAR은 다음을 포함한다: a) BCMA에 특이적으로 결합하는 제1 sdAb 모이어티 및 BCMA에 특이적으로 결합하는 제2 sdAb 모이어티를 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, 및 b) 세포내 신호전달 도메인(ISD). 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래된 막관통 도메인)은 세포외 리간드 결합 도메인 및 ISD 사이에 존재할 수 있다. 제1 sdAb 모이어티 및 제2 sdAb 모이어티는 BCMA의 동일하거나 또는 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 2 개의 sdAb 모이어티는 탠덤으로 배열되며, GGGGS(서열번호: 124)의 아미노산 서열을 포함하는 링커와 같은 링커 서열에 의해 임의적으로 연결된다.
일부 구현예에서, 제1(및/또는 제2) 항-BCMA sdAb 모이어티(예를 들어, VHH)는 서열번호: 113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 115의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1(및/또는 제2) 항-BCMA sdAb 모이어티는 서열번호: 111의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA sdAb의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1(및/또는 제2) 항-BCMA sdAb 모이어티는 서열번호: 113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 115의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-BCMA sdAb 모이어티(예를 들어, VHH)와 동일한 에피토프에 결합한다.
일부 구현예에서, 제2(및/또는 제1) 항-BCMA sdAb 모이어티(예를 들어, VHH)는 서열번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 117의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2(및/또는 제1) 항-BCMA sdAb 모이어티는 서열번호: 112의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA sdAb의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2(및/또는 제1) 항-BCMA sdAb 모이어티는 서열번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 117의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-BCMA sdAb 모이어티(예를 들어, VHH)와 동일한 에피토프에 결합한다.
BCMA CAR의 세포외 리간드 결합 도메인 및 막관통 도메인 사이, 또는 BCMA CAR의 ISD 및 막관통 도메인 사이에, 스페이서 도메인이 있을 수 있다. 스페이서 도메인은 막관통 도메인을 세포외 리간드 결합 도메인 또는 폴리펩티드 쇄의 ISD에 연결하는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩티드일 수 있다. 스페이서 도메인은 예를 들어 약 10 내지 약 100 개, 약 5 내지 약 30 개의 아미노산, 또는 약 25 내지 약 50 개의 아미노산을 포함하는 최대 약 300 개의 아미노산을 포함할 수 있다.
막관통 도메인은 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체에 대해 본원에 기재된 동일한 막관통 도메인일 수 있고 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질에서 유래될 수 있다. 예시적인 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 α, β, δ, 또는 γ 쇄, CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, 또는 CD154에서 유래될 수 있다(즉, 적어도 이의 막관통 영역(들)을 포함한다). 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 것과 같이, CD8α에서 유래된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 합성일 수 있으며, 이 경우 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 주로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중항은 합성 막관통 도메인의 각각의 단부에서 발견될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 약 2 내지 약 10 개(예컨대 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개 중 임의의 것)의 아미노산 길이의 길이를 갖는 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커는 BCMA CAR의 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인 사이에 연결을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 글리신-세린 이중항이다.
일부 구현예에서, BCMA CAR의 세포내 신호전달 도메인 내의 서열 중 하나와 자연적으로 회합하는 막관통 도메인이 사용된다(예를 들어, BCMA CAR 세포내 신호전달 도메인이 4-1BB 공동-자극 서열을 포함하는 경우, BCMA CAR의 막관통 도메인은 4-1BB 막관통 도메인에서 유래된다).
BCMA CAR의 세포내 신호전달 도메인은 BCMA CAR이 배치된 면역 세포의 정상 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 예를 들어, T 세포의 효과기 기능은 세포용해 활성 또는 사이토카인의 분비를 포함한 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서 용어 "세포내 신호전달 도메인" 또는 "ISD"는 효과기 기능 신호를 형질도입하고 세포가 특수 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 일반적으로 전체 세포내 신호전달 도메인이 이용될 수 있지만, 많은 경우 전체 쇄가 사용될 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 절두된 부분이 사용되는 정도까지, 이러한 절두된 부분은 효과기 기능 신호가 형질도입되는 한 온전한 쇄 대신에 사용될 수 있다. 따라서 용어 "세포내 신호전달 서열"은 효과기 기능 신호를 형질도입하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절두된 부분을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 BCMA CAR에서 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 예는 T 세포 수용체(TCR) 및 항원 수용체 관여 후 신호 전달을 개시하기 위해 협력하여 작용하는 공동-수용체의 세포질 서열, 뿐만 아니라 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열을 포함한다.
T 세포 활성화는 세포내 신호전달 서열의 2 가지 별개의 부류에 의해 매개될 수 있다: TCR을 통해 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 것들(1차 신호전달 서열) 및 2차 또는 공동-자극 신호를 제공하기 위해 항원-독립적 방식으로 작용하는 것들(공동-자극 신호전달 서열). 본원에 기재된 BCMA CAR은 신호전달 서열 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다.
1차 신호전달 서열은 TCR 복합체의 1차 활성화를 자극 방식, 또는 억제 방식으로 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. BCMA CAR 작제물은 일부 구현예에서 하나 이상의 ITAM을 포함한다. 본 발명에서 특정 용도의 것인 1차 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3ζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5(슈도-ITAM 함유), CD22(SIGLEC-2), CD66d(CEACAM3), Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2, 및 모에신에서 유래된 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, BCMA CAR은 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 1차 세포내 신호전달 서열과 같은 CD3ζ에서 유래된 1차 세포내 신호전달 서열을 포함한다. 예를 들어, BCMA CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ 세포내 신호전달 서열 그 자체를 포함하거나 또는 본 발명의 BCMA CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 원하는 세포내 신호전달 서열(들)(예를 들어, 4-1BB 공동-자극 신호전달 서열)과 조합될 수 있다.
일부 구현예에서, 1차 신호전달 서열은 서열번호: 39-51 및 132-152 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 CMSD와 같은 본원에 기재된 임의의 CMSD를 포함한다. 이러한 구현예에서, BCMA CAR은 상기 섹션에 기재된 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체일 것이다.
본원에 기재된 공동-자극 신호전달 서열(공동-자극 신호전달 도메인으로도 지칭됨)은 예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함하는 공동-자극 분자의 세포내 신호전달 도메인의 일부일 수 있다. 본원에 기재된 BCMA CAR의 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체에 대한 본원에 기재된 공동-자극 신호전달 도메인 중 임의의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 공동-자극 도메인은 CMSD 또는 CD3ζ ISD에 대해 N-말단이다. 일부 구현예에서, 공동-자극 도메인은 CMSD 또는 CD3ζ ISD에 대해 C-말단이다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 것과 같이, CD137(4-1BB)에서 유래된다.
일부 구현예에서, BCMA CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ의 세포내 신호전달 서열 및 4-1BB의 세포내 신호전달 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, BCMA CAR의 막관통 도메인은 CD8α에서 유래된다. 일부 구현예에서 BCMA CAR은 세포외 리간드 결합 도메인 및 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래된 막관통 도메인) 사이에 힌지 서열(예를 들어, CD8α에서 유래된 힌지 서열)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열번호: 68의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, N'에서 C'으로 다음을 포함하는 BCMA CAR이 제공되며: a) 제1 항-BCMA sdAb 모이어티(예를 들어, VHH), 임의적인 링커, 및 제2 항-BCMA sdAb 모이어티(예를 들어, VHH)를 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인; b) 임의적인 힌지 도메인(예를 들어, CD8α 힌지); c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α TM 도메인); 및 d) 서열번호: 7, 37-51, 및 132-152 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 ISD; 여기서 제1 항-BCMA sdAb 모이어티는 서열번호: 113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 115의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고; 여기서 제2 항-BCMA sdAb 모이어티는 서열번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 117의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, N'에서 C'으로 다음을 포함하는 BCMA CAR이 제공되며: a) 제1 항-BCMA sdAb 모이어티(예를 들어, VHH), 임의적인 링커, 및 제2 항-BCMA sdAb 모이어티(예를 들어, VHH)를 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인; b) 임의적인 힌지 도메인(예를 들어, CD8α 힌지); c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α TM 도메인); 및 d) 서열번호: 7, 37-51, 및 132-152 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 ISD; 여기서 제1 항-BCMA sdAb 모이어티는 서열번호: 111의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 제2 항-BCMA sdAb 모이어티는 서열번호: 112의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ISD는 CD137(4-1BB) 또는 CD28에서 유래된 공동-자극 신호전달 도메인과 같은 공동-자극 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 서열번호: 124의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열번호: 68의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호: 69의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, BCMA CAR은 N-말단에 신호 펩티드를 추가로 포함하며, 서열번호: 67의 아미노산 서열을 포함한다. 섹션 III "CMSD-함유 기능적 외인성 수용체"에서 상기 기재된 바와 같은 힌지 도메인, 막관통 도메인, 수용체 도메인 링커, 신호 펩티드, 및 CMSD 중 임의의 것은 본원에 기재된 BCMA CAR에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 서열번호: 109, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA CAR이 제공된다. 일부 구현예에서, 서열번호: 110 또는 176의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA CAR이 제공된다.
또한 본원에 기재된 BCMA CAR을 발현하는 효과기 세포(예컨대 림프구, 예를 들어, T 세포 예컨대 CTL)가 본원에 제공된다. 또한 BCMA CAR을 발현하는 효과기 세포를 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 BCMA CAR을 암호화하는 핵산을 효과기 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 예를 들어, 형질도입, 형질감염, 또는 전기천공에 의해 BCMA CAR를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)를 효과기 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 예를 들어, 형질도입, 형질감염, 또는 전기천공에 의해 BCMA CAR을 암호화하는 mRNA를 효과기 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 벡터 또는 mRNA의 효과기 세포 내로의 형질도입, 형질감염, 또는 전기천공은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 이들 방법의 상세한 내용은 벡터에 관한 일반적인 섹션(예를 들어, 섹션 VI 및 VII) 및 변형된 T 세포를 생산하는 방법에 추가로 기재되어 있다. 또한 예시적인 방법에 대한 실시예를 참조한다. 하기의 많은 섹션이 기능적 외인성 수용체를 발현하는 변형된 세포의 제조 및 사용 방법에 초점을 맞추고 있지만, 방법은 또한 본원에 기재된 BCMA CAR을 발현하는 면역 세포에 적용가능함이 이해되어야 한다.
본원에 기재된 BCMA CAR을 포함하는 세포(예컨대 림프구, 예를 들어, T 세포 예컨대 CTL)는 외인성 Nef 단백질(예컨대 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질 중 임의의 것)을 추가로 발현할 수 있다. 따라서 다른 섹션(예를 들어, 섹션 V)에서 Nef에 관한 개시내용은 또한 본원에 기재된 BCMA CAR을 발현하는 세포에 적용가능할 것이다.
V. Nef(음성 조절 인자) 단백질
본원에 기재된 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)는 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef 또는 비-자연 발생 Nef 단백질)을 추가로 발현한다. 본 출원은 또 다른 측면에서 기능적 외인성 수용체(예컨대 기존 CAR)를 임의적으로 추가로 포함하는 Nef-발현 T 세포(예컨대 동종이계 T 세포)를 제공한다. 또한 본원에 기재된 바와 같은 신규 비-자연 발생 Nef 단백질이 제공된다.
PCT/CN2019/097969 및 PCT/CN2018/097235(각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef, 돌연변이체 Nef 예컨대 비-자연 발생 돌연변이체 Nef), 이를 암호화하는 핵산, 이의 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터), 외인성 Nef 단백질을 발현하거나 또는 이를 암호화하는 핵산(또는 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포) 중 임의의 것은 모두 본 발명에서 이용될 수 있다.
야생형 Nef는 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1 및 HIV-2) 및 시미안 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함하는 영장류 렌티바이러스에 의해 암호화된 작은 27-35 kDa 미리스토일화　단백질이다. Nef는 주로 세포질에 국소화하지만 또한 부분적으로 원형질 막으로 모집된다. 이는 숙주의 세포 기구를 조작하여 병원체의 감염, 생존 또는 복제를 허용할 수 있는 독성 인자로서 기능한다.
Nef는 모든 영장류 렌티바이러스에서 고도로 보존된다. HIV-2 및 SIV Nef 단백질은 HIV-1 Nef보다 10-60 개 아미노산이 더 길다. N-말단에서 C-말단으로, Nef 단백질은 다음 도메인을 포함한다: 미리스토일화 부위(CD4 하향 조절, MHC I 하향 조절, 및 신호전달 분자와의 회합에 수반, Nef 및 비리온 통합의 내부 원형질 막 표적화, 및 이에 의한 감염성에 필요), N-말단 α-나선(MHC I 하향 조절 및 단백질 키나제 모집에 수반), 티로신-기반 AP 모집(HIV-2 /SIV Nef), CD4 결합 부위(WL 잔기, CD4 하향 조절에 수반, HIV-1 Nef에 대해 특성화), 산성 클러스터(MHC I 하향 조절, 숙주 PACS1 및 PACS2와의 상호작용에 수반), 프롤린-기반 반복부(MHC I 하향 조절 및 SH3 결합에 수반), PAK(p21 활성화 키나제) 결합 도메인(신호전달 분자와의 회합 및 CD4 하향 조절에 수반), COP I 모집 도메인(CD4 하향 조절에 수반), 디-류신 기반 AP 모집 도메인(CD4 하향 조절, HIV-1 Nef에 수반), 및 V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인(CD4 하향 조절 및 신호전달 분자와의 회합에 수반).
CD4는 55 kDa 유형 I 통합 세포 표면 당단백질이다. 이는 헬퍼/유도자 T-림프구 및 대식세포/단핵구 계통의 세포와 같은 MHC 클래스 II-제한된 세포에 대한 TCR의 구성요소이다. 이는 HIV 및 SIV에 대한 주요 세포 수용체로서 역할을 한다. CD4는 TCR의 공동-수용체이고 항원-제시 세포(APC)와의 통신에 있어서 TCR을 보조하고, TCR 세포내 신호전달을 촉발한다.
CD28은 T 세포 상에서 발현되고 T 세포 활성화 및 생존에 필요한 공동-자극 신호를 제공한다. TCR 및 CD28을 통한 T 세포 자극은 IL-6과 같은 사이토카인 생산을 촉발할 수 있다. CD28은 APC 상에서 발현되는 CD80(B7.1) 및 CD86(B7.2) 단백질에 대한 수용체이다.
주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I은 적혈구를 제외한 모든 세포에서 발현된다. 이는 살해 T 세포 또는 세포독성 T 림프구(CTL)에 대한 에피토프를 제시한다. CTL의 TCR이 CTL의 CD8 수용체를 통해 도킹된 MHC 클래스 I 분자에 의해 제시된 에피토프를 인식하는 경우, CTL은 세포가 세포자멸사에 의해 프로그램된 세포 사멸을 겪도록 촉발할 것이다. 따라서 조직부적합성 개체에서 GvHD 반응을 감소/피하기 위해 본원에 기재된 변형된 T 세포 상에서 발현된 MHC 클래스 I 분자를 하향 조절(예를 들어, 발현 및/또는 기능을 하향 조절)하는 것이 바람직하다.
일부 구현예에서, Nef 단백질은 SIV Nef, HIV1 Nef, HIV2 Nef, 및 Nef 하위유형으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Nef 단백질은 야생형 Nef이다. 일부 구현예에서, Nef 단백질은 서열번호: 79, 80, 및 84 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Nef 하위유형은 HIV F2-Nef, HIV C2-Nef, 또는 HIV HV2NZ-Nef이다. 일부 구현예에서, Nef 하위유형은 서열번호: 81-83 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Nef 하위유형은 SIV Nef 하위유형이다. 일부 구현예에서, SIV Nef 하위유형은 서열번호: 207-231 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, Nef 단백질은 1차 HIV-1 하위유형 C 인디언 단리물로부터 수득되거나 또는 단리된다. 일부 구현예에서, Nef 단백질은 전장 단백질(HIV F2-Nef)을 암호화하는 인디언 단리물의 F2 대립유전자로부터 발현된다. 일부 구현예에서, Nef 단백질은 서열번호: 81의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Nef 단백질은 CD4 결합 부위, 산성 클러스터, 프롤린-기반 반복부, 및 PAK 결합 도메인(HIV C2-Nef)의 프레임내 결실이 있는 인디언 단리물의 C2 대립유전자자로부터 발현된다. 일부 구현예에서, Nef 단백질은 서열번호: 82의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Nef 단백질은 CD4 결합 부위(HIV D2-Nef)의 프레임내 결실이 있는 인디언 단리물의 D2 대립유전자로부터 발현된다.
일부 구현예에서, Nef 단백질은 삽입, 결실,　점 돌연변이(들), 및/또는 재배열 중 하나 이상을 포함하는 Nef 단백질과 같은 돌연변이체 Nef이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 돌연변이체 Nef는 T 세포에서 발현될 때 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 하향 조절하지 않는(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절) 비-자연 발생 돌연변이체 Nef와 같은 비-자연 발생 돌연변이체 Nef이다. 일부 구현예에서, 돌연변이체 Nef(예를 들어, 비-자연 발생 돌연변이체 Nef)는 T 세포에서 발현될 때 야생형 Nef와 비교하여 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체의 하향 조절을 전혀 초래하지 않거나 또는 낮은 하향 조절을 초래한다. 돌연변이체 Nef는 미리스토일화 부위, N-말단 α-나선, 티로신-기반 AP 모집, CD4 결합 부위, 산성 클러스터, 프롤린-기반 반복부, PAK 결합 도메인, COP I 모집 도메인, 디-류신 기반 AP 모집 도메인, V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 도메인 또는 모티프에 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 비-자연 발생 돌연변이)를 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 돌연변이체(예를 들어, 비-자연 발생 돌연변이체) Nef는 디-류신 기반 AP 모집 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체(예를 들어, 비-자연 발생 돌연변이체) Nef는 디-류신 기반 AP 모집 도메인 및 PAK 결합 도메인에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체(예를 들어, 비-자연 발생 돌연변이체) Nef는 디-류신 기반 AP 모집 도메인, PAK 결합 도메인, COP I 모집 도메인, 및 V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체(예를 들어, 비-자연 발생 돌연변이체) Nef는 디-류신 기반 AP 모집 도메인, COP I 모집 도메인, 및 V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체(예를 들어, 비-자연 발생 돌연변이체) Nef는 디-류신 기반 AP 모집 도메인 및 V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체(예를 들어, 비-자연 발생 돌연변이체) Nef는 부분적 또는 전체 도메인을 결실시키는 절두를 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체(예를 들어, 비-자연 발생 돌연변이체) Nef는 야생형 SIV Nef 단백질에 비해 다음 아미노산 잔기 중 하나 이상을 결실시키는 하나 이상의 절두를 포함한다: aa 50-91, aa 41-109, aa 41-91, aa 167-193, aa 193-223, aa 167-223, aa 2-19, aa 41-112, 및/또는 aa 164-223. 일부 구현예에서, 돌연변이체 Nef는 전술된 도메인/모티프 중 임의의 것에 없는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 비-자연 발생 돌연변이)를 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체(예를 들어, 비-자연 발생 돌연변이체) Nef 단백질은 서열번호: 85-89 및 198-204 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체 Nef(예를 들어, 비-자연 발생 돌연변이체 Nef)는 돌연변이체 SIV Nef이다.
일부 구현예에서, T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포)에서 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질의 발현은 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC I을 하향 조절하지 않는다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달 또는 에피토프 제시와 같은 효과기 기능을 하향 조절하지 않는다). 일부 구현예에서, T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포)에서 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질(야생형 또는 돌연변이체, 예를 들어, 비-자연 발생 돌연변이체)의 발현은 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포의 것과 비교하여 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절하는 것과 같이, T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포)의 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC I을 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 내인성 TCR 하향 조절은 내인성 TCR, CD3ε, CD3δ, 및/또는 CD3γ의 세포 표면 발현의 하향 조절, 및/또는 T 세포 활성화, T 세포 증식(예를 들어, Lck 및 LAT와 같은 필수 TCR 근위 기구의 원형질 막으로의 수송을 통제하는 소포 수송 경로를 조절함으로써, 및/또는 TCR 근위 신호전달 기구의 시공간적 배위에 필수적인 TCR-유도 액틴 리모델링 이벤트를 방해함으로써), 및/또는 세포용해 활성과 같은 T 세포 효과기 기능과 같은 TCR-매개 신호 전달 방해를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 발현하는 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포)에서 내인성 MHC I, TCR, CD3ε, CD3δ, 및/또는 CD3γ의 세포 표면 발현은 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포)의 것과 비교하여 적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것까지 하향 조절된다. 일부 구현예에서, 하위유형/돌연변이체 Nef 단백질(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)은 야생형 Nef(예를 들어, 야생형 SIV Nef)에 의해 하향 조절된 것과 상이하게 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3, 및/또는 MHC I의 세포 표면 발현을 약 3% 이하(예컨대 약 2% 또는 약 1% 이하)로 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 하위유형/돌연변이체 Nef 단백질(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef 예컨대 SIV Nef M116)은 야생형 Nef(예를 들어, 야생형 SIV Nef)에 의해 하향 조절된 것보다 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3, 및/또는 MHC I을 적어도 약 3%(예컨대 적어도 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것) 더 하향 조절한다(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달 또는 에피토프 제시와 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, 외인성 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 내인성 CD4 및/또는 CD28을 하향 조절하지 않는다(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 결합 또는 신호전달과 같은 공동-수용체 기능에 대해 하향 조절하지 않는다). 일부 구현예에서, 외인성 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 내인성 CD4 및/또는 CD28을 하향 조절하며, 예컨대 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포의 것과 비교하여 T 세포의 내인성 CD4 및/또는 CD28을 최대 약 50%(예컨대 최대 약 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 하위유형/돌연변이체 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 야생형 Nef(예를 들어, 야생형 SIV Nef)에 의해 하향 조절된 것보다 내인성 CD4 및/또는 CD28을 적어도 약 3%(예컨대 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것) 낮게 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 하위유형/돌연변이체 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 야생형 Nef에 의해 하향 조절된 것과 상이하게 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3, 및/또는 MHC I을 약 3% 이하(예컨대 약 2% 또는 약 1% 이하)로 하향 조절하는 반면, 1) CD4 및/또는 CD28을 하향 조절하지 않거나; 또는 2) 야생형 Nef(예를 들어, 야생형 SIV Nef)에 의해 하향 조절된 것보다 CD4 및/또는 CD28을 적어도 약 3%(예컨대 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것) 낮게 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 하위유형/돌연변이체 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 야생형 Nef(예를 들어, wt SIV Nef)에 의해 하향 조절된 것보다 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3, 및/또는 MHC I을 적어도 약 3%(예컨대 적어도 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것) 더 하향 조절하는 반면, 1) CD4 및/또는 CD28을 하향 조절하지 않거나; 또는 2) 야생형 Nef(예를 들어, 야생형 SIV Nef)에 의해 하향 조절된 것보다 CD4 및/또는 CD28을 적어도 약 3%(예컨대 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것) 낮게 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 하향 조절하지 않는다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포독성 활성에 수반되는 신호 전달과 같은 효과기 기능을 하향 조절한다). 일부 구현예에서, 외인성 Nef는 Nef 발현 없이 변형된 T 세포의 것과 비교하여 변형된 T 세포 내의 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 84-89, 198-204, 및 207-231 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 (적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것까지 하향 조절하는 것과 같이) 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3, 및/또는 MHC I을 하향 조절하지만(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달 또는 에피토프 제시와 같은 효과기 기능을 하향 조절), 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 하향 조절하지 않는다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포독성 활성에 수반되는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, 하위유형/돌연변이체 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 (적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것까지 하향 조절하는 것과 같이) 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3, 및/또는 MHC I을 하향 조절하고, 야생형 Nef(예를 들어, 야생형 SIV Nef)에 의해 하향 조절된 것과 상이하게 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 최대 약 3%(예컨대 최대 약 2% 또는 약 1%) 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 하위유형/돌연변이체 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 (적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것까지 하향 조절하는 것과 같이) 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3, 및/또는 MHC I을 하향 조절하고, 야생형 Nef(예를 들어, 야생형 SIV Nef)에 의해 하향 조절된 것보다 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 적어도 약 3%(예컨대 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것) 낮게 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 하위유형/돌연변이체 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 야생형 Nef(예를 들어, wt SIV Nef)에 의해 하향 조절된 것보다 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3, 및/또는 MHC I을 적어도 약 3%(예컨대 적어도 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것) 더 하향 조절하는 반면, 1) 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 하향 조절하지 않거나; 2) 야생형 Nef(예를 들어, 야생형 SIV Nef)에 의해 하향 조절된 것과 상이하게 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 최대 약 3%(예컨대 최대 약 2% 또는 약 1%) 하향 조절하거나; 또는 3) 야생형 Nef(예를 들어, 야생형 SIV Nef)에 의해 하향 조절된 것보다 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 적어도 약 3%(예컨대 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것) 낮게 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 79-89, 198-204, 및 207-231 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Nef 단백질은 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고 , 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, Nef 단백질은 CD3ζ ITAM1 및/또는 ITAM2에 결합한다. 일부 구현예에서, Nef 단백질을 암호화하는 핵산은 서열번호: 96 또는 234의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포)에서 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질(야생형, 또는 돌연변이체, 예를 들어, 비-자연 발생 돌연변이체)의 발현은 내인성 CD3ζ 발현 또는 CD3ζ-매개 신호 전달을 변경하지 않거나, 또는 내인성 CD3ζ 발현을 하향 조절하고/하거나 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포)의 것과 비교하여 CD3ζ-매개 신호 전달을 최대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 또는 그 이하 중 임의의 것까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 외인성 Nef의 발현은 (적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것까지 하향 조절하는 것과 같이) 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3, 및/또는 MHC I을 하향 조절(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달 또는 에피토프 제시와 같은 효과기 기능을 하향 조절)하기 위한 것으로 의도되는 반면, 동일한 세포 내로 도입된 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)의 신호 전달에 대한 효과를 거의 또는 전혀 도출하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 발현은 또한 동일한 세포 내로 도입된 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)의 발현에 대한 효과를 거의 또는 전혀 도출하지 않는 것이 바람직하다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 84-89, 198, 및 207-231 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포)에서 본원에 기재된 하위유형/돌연변이체(예를 들어, 비-자연 발생 돌연변이체) Nef 단백질(예를 들어, CD4 및/또는 CD28 하향 조절에 수반된 돌연변이된 도메인/모티프 함유)의 발현은 야생형 Nef 단백질이 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포)에서 발현될 때와 비교하여 내인성 CD4 및/또는 CD28에 대한 감소된 하향 조절 효과(예를 들어, 적어도 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 낮게 하향 조절 중 임의의 것)를 가지면서, (적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것까지 하향 조절하는 것과 같이) 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC I을 하향 조절한다(예를 들어, 발현 및/또는 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, 내인성 CD4 및/또는 CD28에 대한 하향 조절 효과는 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현의 하향 조절을 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포)에서 하위유형/돌연변이체 Nef(예를 들어, 비-자연 발생 돌연변이체 Nef)의 발현은 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포의 것과 비교하여 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 중 임의의 것까지 하향 조절하는 반면, 내인성 CD4 및/또는 CD28의 하향 조절은 야생형 Nef 단백질이 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포)에서 발현될 때와 비교하여 적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것까지 감소된다.
또한 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 또는 돌연변이체 Nef, 예컨대 비-자연 발생 Nef 단백질, 돌연변이체 SIV Nef) 중 임의의 것을 암호화하는 핵산(예를 들어, 단리된 핵산)이 제공된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 서열번호: 90-100 및 234 중 임의의 것의 서열을 포함하는 단리된 핵산이 제공된다. 본원에 기재된 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 또는 하위유형, 또는 돌연변이체 Nef, 예컨대 비-자연 발생 Nef 단백질, 돌연변이체 SIV Nef) 중 임의의 것을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터, 박테리아 발현 벡터)가 추가로 제공된다. 이들 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체 중 임의의 것을 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 T 세포와 같은 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 포함하는 변형된 T 세포 중 임의의 것 내로 형질도입될 수 있다. 본원에 기재된 Nef 단백질 중 임의의 것을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)는 또한 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포) 내로 형질도입되어 Nef-함유 T 세포를 수득한 다음, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체 중 임의의 것을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)로 추가로 형질도입되어 Nef-함유 ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체-T 세포(예를 들어, Nef-함유 ITAM-변형된 TCR-T 세포, Nef-함유 ITAM-변형된 CAR-T 세포, Nef-함유 ITAM-변형된 cTCR-T 세포, 또는 Nef-함유 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체-T 세포)를 생성할 수 있다. 본원에 기재된 Nef 단백질 중 임의의 것을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)는 또한 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포) 내로 형질도입되어 Nef-함유 T 세포를 수득할 수 있다. 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질을 포함하는 변형된 T 세포는 일부 구현예에서 변형된 T 세포가 유래된 전구체 T 세포의 공여자로부터 단리된 1차 T 세포에 의해 도출된 GvHD 반응과 비교하여 조직부적합성 개체에서 GvHD 반응을 전혀 도출하지 않거나 또는 감소된(예컨대 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것) GvHD 반응을 도출할 수 있거나, 또는 전구체 T 세포의 동일한 공여자에서 유래된 Nef 발현 없이 변형된 T 세포(예를 들어, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 포함하는 변형된 T 세포)에 의해 도출된 GvHD 반응과 비교하여 조직부적합성 개체에서 GvHD 반응을 전혀 도출하지 않거나 또는 감소된(예컨대 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것까지 감소된) GvHD 반응을 도출할 수 있다.
VI. 벡터
본 출원은 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef), BCMA CAR(예를 들어, ITAM-변형된 BCMA CAR), 및/또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체) 중 임의의 것을 클로닝하고 발현하기 위한 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 벡터는 포유류 세포와 같은 진핵생물 세포에서 복제 및 통합에 적합하다. 일부 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터, 및 이의 유도체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 예를 들어, Sambrook 등(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다.
하기 설명은 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질 및/또는 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체를 발현하기 위한 벡터에 초점을 맞추고 있지만, 본원에 기재된 벡터(예를 들어, 별개의 벡터, 또는 동일한 벡터에 대한) 및 방법은 또한 외인성 Nef 단백질 및/또는 다른 기능적 외인성 수용체(CD3ζ ISD를 포함하는 기능적 외인성 수용체, 예를 들어 기존 CAR)를 발현하도록 구축될 수 있음을 생각할 수 있을 것이다. 예를 들어, 본 발명은 또한 상류에서 하류로 다음을 포하하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터(예를 들어, EF1-α); 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산; 연결 서열(예를 들어, IRES); 및 기능적 외인성 수용체(예를 들어, 변형된 TCR, CD20 CAR 또는 BCMA CAR(예를 들어, 서열번호: 70, 72, 110, 및 176 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 것)과 같은 CAR, cTCR, 또는 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 제2 핵산. 또 다른 예를 들어, 본 발명은 또한 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: i) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산; iii) 제2 프로모터(예를 들어, PGK); 및 iv) 기능적 외인성 수용체(예를 들어, 변형된 TCR, CD20 CAR 또는 BCMA CAR(예를 들어, 서열번호: 70, 72, 110, 및 176 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 것)과 같은 CAR, cTCR, 또는 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 제2 핵산. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)가 제공된다: i) 프로모터(예를 들어, EF1-α); 및 ii) 서열번호: 183 또는 190을 포함하는 핵산 서열.
다수의 바이러스 기반 시스템이 포유류 세포 내로 유전자 전달을 위해 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템에 대한 편리한 플랫폼을 제공한다. 이종 핵산은 벡터 내로 삽입되고 당업계에 알려진 기술을 사용하여 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 그런 다음 재조합 바이러스는 단리되고 시험관내 또는 생체외에서 조작된 포유류 세포로 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템은 당업계에 알려져 있다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터는 당업계에 알려져 있다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 일부 구현예에서, 자기-불활성화 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 예를 들어, 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef) 코딩 서열을 암호화하는 자기-불활성화 렌티바이러스 벡터, 본원에 기재된 BCMA CAR(예를 들어, ITAM-변형된 BCMA CAR)을 암호화하는 자기-불활성화 렌티바이러스 벡터, 및/또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 자기-불활성화 렌티바이러스 벡터는 당업계에 알려진 프로토콜로 렌티바이러스 내로 패키징될 수 있다. 생성된 렌티바이러스는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 포유류 세포(예컨대 1차 인간 T 세포)를 형질도입하는 데 사용될 수 있다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스에서 유래된 벡터는 자손 세포에서 유전자이식의 장기간 안정된 통합 및 이의 번식을 허용하기 때문에 장기간 유전자 전달을 달성하는 데 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 또한 낮은 면역원성을 가지며, 비-증식 세포를 형질도입할 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 비-바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 잠자는 미녀 트랜스포존 시스템, 또는 피기백 트랜스포존 시스템과 같은 트랜스포존이다. 일부 구현예에서, 벡터는 예를 들어, 폴리(락트-코-글리콜산)(PLGA) 및 폴리 락트산(PLA), 폴리(에틸렌 이민)(PEI), 및 덴드리머를 포함하는 중합체-기반 비-바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 양이온성 리포솜, 지질 나노에멀젼, 및 고체 지질 나노입자(SLN)와 같은 양이온성-지질 기반 비-바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 폴리-L-리신과 같은 펩티드-기반 유전자 비-바이러스 벡터이다. 게놈 편집에 적합한 알려진 비-바이러스 벡터 중 임의의 것은 외인성 Nef-암호화 핵산, BCMA CAR(예를 들어, ITAM-변형된 BCMA CAR)-암호화 핵산, 및/또는 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)-암호화 핵산을 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포, 예컨대 변형된 T 세포, 동종이계 T 세포, 또는 CTL)로 도입하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, Yin H. 등 Nature Rev. Genetics (2014) 15:521-555; Aronovich EL 등 "The Sleeping Beauty transposon System: a non-viral vector for gene therapy." Hum. Mol. Genet. (2011) R1: R14-20; 및 Zhao S. 등 "PiggyBac transposon vectors: the tools of the human gene editing." Transl. Lung Cancer Res. (2016) 5(1): 120-125를 참조하며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질, BCMA CAR, 및/또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 핵산 중 임의의 하나 이상은 전기천공, 세포초음파처리, 광학형질감염, 자기형질감염, 유체천공을 포함하나 이에 제한되지 않는 물리적 방법에 의해 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포 예컨대 변형된 T 세포, 동종이계 T 세포, 또는 CTL) 내로 도입된다.
일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef, Nef 하위유형, 비-자연 발생 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef), BCMA CAR, 및/또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 핵산 중 임의의 하나를 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)가 제공된다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질, BCMA CAR, 및 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 암호화하는 핵산은 별개의 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef, 예컨대 서열번호: 79-89, 198-204, 207-231, 및 235-247 중 임의의 것)을 암호화하는 제1 핵산 및 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)가 제공되며, 여기서 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하며: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터(예를 들어, hEF1α)에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 핵산은 제2 핵산의 상류에 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산은 제2 핵산의 하류에 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 연결 서열을 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 연결 서열은 P2A, T2A, E2A, F2A, BmCPV 2A, BmIFV 2A, (GS)n, (GGGS)n, 및 (GGGGS)n 중 임의의 것을 암호화하는 핵산 서열; 또는 IRES, SV40, CMV, UBC, EF1α, PGK, 및 CAGG 중 임의의 것의 핵산 서열; 또는 이의 임의의 조합을 포함하며, 여기서 n은 적어도 1의 정수이다. 일부 구현예에서, 연결 서열은 IRES이다. 일부 구현예에서, 연결 서열은 서열번호: 31-35 중 임의의 것의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 서열번호: 78, 184-189, 191-197, 206, 및 232의 서열을 포함한다. 핵산은 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선택가능한 마커를 사용하는 것을 포함하여 당업계에서 임의의 알려진 분자 클로닝 방법을 사용하여 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 다양한 프로모터가 포유류 세포에서 유전자 발현을 위해 탐구되었으며, 당업계에 알려진 프로모터 중 임의의 것이 본 발명에 사용될 수 있다. 프로모터는 구성적 프로모터 또는 조절된 프로모터, 예컨대 유도성 프로모터로서 대략적으로 분류될 수 있다.
프로모터
일부 구현예에서, 프로모터는 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터(예를 들어, PGK-1 프로모터), 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 급초기(IE) 유전자 프로모터, 신장 인자 1 알파(EF1-α) 프로모터, 유비퀴틴-C(UBQ-C) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 CMV) 인핸서/닭 베타-액틴(CAG) 프로모터, 폴리오마 인핸서/단순 포진 티미딘 키나제(MC1) 프로모터, 베타 액틴(β-ACT) 프로모터, 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 대조군 영역 결실된, d1587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND) 프로모터, NFAT 프로모터, TETON® 프로모터, 및 NFκB 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef), BCMA CAR, 및/또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 핵산은 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 구성적 프로모터는 이종 유전자(이식유전자로도 지칭됨)가 숙주 세포에서 구성적으로 발현되도록 허용한다. 본원에서 고려되는 예시적인 프로모터는 사이토메갈로바이러스 급초기 프로모터(CMV IE), 인간 신장 인자-1알파(hEF1α), 유비퀴틴 C 프로모터(UbiC), 포스포글리세로키나제 프로모터(PGK), 시미안 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), CMV 초기 인핸서와 커플링된 닭 β-액틴 프로모터(CAGG), 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 폴리오마 인핸서/단순 포진 티미딘 키나제(MC1) 프로모터, 베타 액틴(β-ACT) 프로모터, "골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 대조군 영역 결실된, d1587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND)" 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이식유전자 발현을 구동하는 데 있어서 이러한 구성적 프로모터의 효율은 수많은 연구에서 광범위하게 비교되었다. 예를 들어, Michael C. Milone 등은 1차 인간 T 세포에서 CAR 발현을 구동하는 CMV, hEF1α, UbiC 및 PGK의 효율을 비교하였고, hEF1α 프로모터가 최고 수준의 이식유전자 발현을 유도할 뿐만 아니라, CD4 및 CD8 인간 T 세포에서 최적으로 유지되었다는 결론을 내렸다(Molecular Therapy, 17(8): 1453-1464(2009)). 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질, BCMA CAR, 및/또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 암호화하는 핵산은 hEF1α 프로모터 또는 PGK 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef), BCMA CAR, 및/또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 핵산은 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 유도성 프로모터는 조절된 프로모터의 범주에 속한다. 유도성 프로모터는 물리적 조건, 조작된 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포)의 미세환경, 또는 조작된 면역 효과기 세포의 생리학적 상태, 유도체(즉, 유도제), 또는 이의 조합과 같은 하나 이상의 조건에 의해 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 유도 조건은 조작된 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포), 및/또는 약제학적 조성물을 수용하는 대상체에서 내인성 유전자의 발현을 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 유도 조건은 유도체, 조사(예컨대 이온화 방사선, 빛), 온도(예컨대 열), 산화환원 상태, 종양 환경, 및 조작된 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포)의 활성화 상태로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 NFAT 프로모터, TETON® 프로모터, 또는 NFκB 프로모터일 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 또한 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터)를 통해 형질감염된 숙주 세포의 집단으로부터 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef), BCMA CAR, 및/또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 발현하는 세포를 선택하기 위한 선택가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자를 함유한다. 선택가능한 마커 및 리포터 유전자는 둘 다 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 적절한 조절 서열에 의해 플랭킹될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 핵산 서열의 발현을 조절하는 데 유용한 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열, 및 프로모터를 함유할 수 있다.
연결 서열
일부 구현예에서, 벡터는 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef, Nef 하위유형, 비-자연 발생 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef), BCMA CAR, 및/또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 하나 초과의 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)는 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산 및 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 암호화하는 제2 핵산을 포함하며, 여기서 제1 핵산은 연결 서열을 통해 제2 핵산에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 연결 서열은 P2A, T2A, E2A, F2A, BmCPV 2A, 또는 BmIFV 2A와 같은 자기-절단 2A 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다(예를 들어, 핵산 서열이다). 일부 구현예에서, 연결 서열은 서열번호: 31-34 중 임의의 것의 핵산 서열을 포함하거나(예를 들어, 이로 이루어지거나), 또는 서열번호: 27-30 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는(예를 들어, 이로 이루어진) 자기-절단 2A 펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 연결 서열은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)이다. IRES는 캡-독립적 방식으로 번역 개시를 허용하는 RNA 요소이다. 일부 구현예에서, 연결 서열은 서열번호: 35의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 연결 서열은 서열번호: 12-26, 103-107, 및 119-126 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 가요성 링커, 또는 펩티드 링커와 같이, 상기 "기능적 외인성 수용체 도메인 링커(수용체 도메인 링커)" 하위섹션에 기재된 바와 같은 펩티드 링커를 암호화하는 핵산 서열이다. 일부 구현예에서, 연결 서열은 (GS)n, (GGGS)n, 또는 (GGGGS)n 중 임의의 하나를 암호화하며, 여기서 n은 적어도 1의 정수이다. 일부 구현예에서, 연결 서열은 LNGFR과 같은 선택가능한 마커를 암호화한다. 일부 구현예에서, 연결 서열은 자기-절단 2A 펩티드(예를 들어, P2A, T2A) 이어서 Gly-Ser 가요성 링커(예를 들어, (GGGS)3), 또는 자기-절단 2A 펩티드(예를 들어, P2A, T2A) 이어서 선택가능한 마커(예를 들어, LNGFR)를 암호화하는 핵산과 같이, 본원에 기재된 연결 서열의 하나 이상의 유형을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 "기능적 외인성 수용체 도메인 링커('수용체 도메인 링커')" 하위섹션에 기재된 다양한 수용체 도메인 펩티드 링커 및 이의 특성은 또한 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef), BCMA CAR, 및/또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체) 사이에 이용되는 연결 서열에 의해 암호화된 펩티드에 적용된다. 예를 들어, 가요성 잔기(예컨대 글리신 및 세린)를 포함하는 펩티드 링커는 이들을 암호화하는 핵산이 동일함 벡터 상에 있을 때 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체 및 외인성 Nef 단백질 사이에 첨가되어, CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체 및 외인성 Nef 단백질 둘 다의 적절한 접힘을 위한 충분한 공간을 제공하고/하거나, (예를 들어, P2A, T2A) 사이의 연결 서열 절단을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, (GGGS)3 링커(서열번호: 20)는 ITAM-변형된 BCMA CAR-P2A-(GGGS)3-SIV Nef 작제물에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)가 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)가 제공된다.
일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)가 제공되며: i) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산; iii) 제2 프로모터(예를 들어, PGK); 및 iv) 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 제2 핵산, 여기서 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하며: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)가 제공되며: i) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산; iii) 제2 프로모터(예를 들어, PGK); 및 iv) 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 임의적인 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (d) 임의적인 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28에서 유래) 및 CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD에 대해 N-말단이다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD에 대해 C-말단이다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열번호: 68의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호: 69의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 79-89, 198-204, 및 207-231 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 서열번호: 71, 109, 153-169, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 서열을 포함하는 ITAM-변형된 BCMA CAR과 같은 ITAM-변형된 BCMA CAR이다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 서열번호: 73 및 170-175 중 임의의 것의 서열을 포함하는 ITAM-변형된 CD20 CAR과 같은 ITAM-변형된 CD20 CAR이다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 서열번호: 90-100 및 234 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산은 서열번호: 75 또는 77의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)가 제공된다: i) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 서열번호: 79-89, 198-204, 207-231, 및 235-247 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재하는 것인, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산; iii) 제2 프로모터(예를 들어, PGK); 및 iv) 서열번호: 71, 109, 153-169, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM-변형된 BCMA CAR을 암호화하는 제2 핵산. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)가 제공된다: i) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 서열번호: 79-89, 198-204, 207-231, 및 235-247 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재하는 것인, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산; iii) 제2 프로모터(예를 들어, PGK); 및 iv) 서열번호: 73 및 170-175 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM-변형된 CD20 CAR을 암호화하는 제2 핵산. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 프로모터는 EF1-α 또는 PGK이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 프로모터는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 프로모터는 상이하다.
일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)가 제공된다: i) 제2 프로모터(예를 들어, PGK); ii) 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 제2 핵산, 여기서 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하는 것: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되는 것; iii) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); 및 iv) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)가 제공된다: i) 제2 프로모터(예를 들어, PGK); ii) 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 임의적인 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (d) 임의적인 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28에서 유래) 및 CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되는 것; iii) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); 및 iv) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD에 대해 N-말단이다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD에 대해 C-말단이다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열번호: 68의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호: 69의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 79-89, 198-204, 및 207-231 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 서열번호: 71, 109, 153-169, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 서열을 포함하는 ITAM-변형된 BCMA CAR과 같은 ITAM-변형된 BCMA CAR이다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 서열번호: 73 및 170-175 중 임의의 것의 서열을 포함하는 ITAM-변형된 CD20 CAR과 같은 ITAM-변형된 CD20 CAR이다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 서열번호: 90-100 및 234 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산은 서열번호: 75 또는 77의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)가 제공된다: i) 제2 프로모터(예를 들어, PGK); ii) 서열번호: 71, 109, 153-169, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM-변형된 BCMA CAR을 암호화하는 제2 핵산; iii) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); 및 iv) 서열번호: 79-89, 198-204, 207-231, 및 235-247 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재하는 것인, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)가 제공된다: i) 제2 프로모터(예를 들어, PGK); ii) 서열번호: 73 및 170-175 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM-변형된 CD20 CAR을 암호화하는 제2 핵산; iii) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); 및 iv) 서열번호: 79-89, 198-204, 207-231, 및 235-247 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재하는 것인, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 프로모터는 EF1-α 또는 PGK이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 프로모터는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 프로모터는 상이하다.
일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)가 제공되며: i) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산; iii) 제1 연결 서열(예를 들어, IRES, 또는 P2A 또는 T2A와 같은 자기-절단 2A 펩티드를 암호화하는 핵산); iv) 임의적인 제2 연결 서열(예를 들어, (GGGS)3과 같은 가요성 링커를 암호화하는 핵산); 및 v) 다음을 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 제2 핵산: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)가 제공되며: i) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산; iii) 제1 연결 서열(예를 들어, IRES, 또는 P2A 또는 T2A와 같은 자기-절단 2A 펩티드를 암호화하는 핵산); iv) 임의적인 제2 연결 서열(예를 들어, (GGGS)3과 같은 가요성 링커를 암호화하는 핵산); 및 v) 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 임의적인 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (d) 임의적인 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28에서 유래) 및 CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD에 대해 N-말단이다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD에 대해 C-말단이다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열번호: 68의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호: 69의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 79-89, 198-204, 및 207-231 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 서열번호: 71, 109, 153-169, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 서열을 포함하는 ITAM-변형된 BCMA CAR과 같은 ITAM-변형된 BCMA CAR이다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 서열번호: 73 및 170-175 중 임의의 것의 서열을 포함하는 ITAM-변형된 CD20 CAR과 같은 ITAM-변형된 CD20 CAR이다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 서열번호: 90-100 및 234 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산은 서열번호: 75 또는 77의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 연결 서열은 서열번호: 31-35로부터 선택된 서열을 포함한다. 따라서 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)가 제공된다: i) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); 및 ii) 서열번호: 78, 184-189, 191-197, 206, 및 232로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)가 제공된다: i) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 서열번호: 79-89, 198-204, 207-231, 및 235-247 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재하는 것인, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, wt, 하위유형, 또는 돌연변이체 Nef)을 암호화하는 제1 핵산; iii) 서열번호: 31-35(예를 들어, 서열번호: 35)로 이루어진 군으로부터 선택된 연결 서열; 및 iv) 서열번호: 71, 73, 109, 153-175, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산. 일부 구현예에서, 프로모터는 EF1-α 또는 PGK이다.
일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)가 제공된다: i) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 다음을 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 제2 핵산: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되는 것; iii) 제1 연결 서열(예를 들어, IRES, 또는 P2A 또는 T2A와 같은 자기-절단 2A 펩티드를 암호화하는 핵산); iv) 임의적인 제2 연결 서열(예를 들어, (GGGS)3과 같은 가요성 링커를 암호화하는 핵산); 및 v) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)가 제공된다: i) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 다음을 포함하는 ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 임의적인 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (d) 임의적인 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28에서 유래) 및 CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되는 것; iii) 제1 연결 서열(예를 들어, IRES, 또는 P2A 또는 T2A와 같은 자기-절단 2A 펩티드를 암호화하는 핵산); iv) 임의적인 제2 연결 서열(예를 들어, (GGGS)3과 같은 가요성 링커를 암호화하는 핵산); 및 v) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD에 대해 N-말단이다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD에 대해 C-말단이다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열번호: 68의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호: 69의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 79-89, 198-204, 및 207-231 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 서열번호: 71, 109, 153-169, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 서열을 포함하는 ITAM-변형된 BCMA CAR과 같은 ITAM-변형된 BCMA CAR이다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 서열번호: 73 및 170-175 중 임의의 것의 서열을 포함하는 ITAM-변형된 CD20 CAR과 같은 ITAM-변형된 CD20 CAR이다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 서열번호: 90-100 및 234 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산은 서열번호: 75 또는 77의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 연결 서열은 서열번호: 31-35로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)가 제공된다: i) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 서열번호: 71, 73, 109, 153-175, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산; iii) 서열번호: 31-35(예를 들어, 서열번호: 35)로 이루어진 군으로부터 선택된 연결 서열; 및 iv) 서열번호: 79-89, 198-204, 207-231, 및 235-247 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재하는 것인, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, wt, 하위유형, 또는 돌연변이체 Nef)을 암호화하는 제1 핵산. 일부 구현예에서, 프로모터는 EF1-α 또는 PGK 프로모터이다.
VII. 변형된 T 세포의 생산 방법
본 발명의 다른 측면은 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체; 본원에서 "CMSD-함유 기능적 외인성 수용체-T 세포" 또는 "ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체-T 세포"로도 지칭됨), 본원에 기재된 BCMA CAR을 발현하는 변형된 T 세포(본원에서 "BCMA-CAR T 세포"로도 지칭됨), 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질을 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, wt, 또는 돌연변이체 Nef; 본원에서 "Nef-함유 T 세포" 또는 "Nef-함유 변형된 T 세포"로도 지칭됨), 또는 외인성 Nef 단백질 및 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포(본원에서 "Nef-함유 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체-T 세포" 또는 "Nef-함유 ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체-T 세포"로도 지칭됨)와 같이, 상기 기재된 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포) 중 임의의 하나를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질을 포함하는 변형된 T 세포는 변형된 T 세포가 유래된 전구체 T 세포의 공여자로부터 단리된 1차 T 세포에 의해 도출된 GvHD 반응과 비교하여 조직부적합성 개체에서 GvHD 반응을 전혀 도출하지 않거나 또는 감소된(적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것까지 감소된) GvHD 반응을 도출한다. 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포를 생산하는 방법은 일반적으로 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 암호화하는 핵산을 보유하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 미처리 또는 조작된 T 세포(본원에서 "전구체 T 세포"로 지칭됨) 내로 도입하는 단계를 수반한다. 본원에 기재된 외인성 Nef를 발현하는 변형된 T 세포를 생산하는 방법은 일반적으로 본원에 기재된 외인성 Nef를 암호화하는 핵산을 보유하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 미처리 또는 조작된 T 세포 내로 도입하는 단계를 수반한다. 외인성 Nef 단백질 및 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(또는 BCMA CAR)를 발현하는 변형된 T 세포를 생산하는 방법은 일반적으로 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산 및 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(또는 BCMA CAR)를 암호화하는 제2 핵산을 전구체 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포) 내로 도입하는 단계를 수반한다. 제1 및 제2 핵산은 별개의 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 통해, 또는 단일 벡터를 통해(예를 들어, 상이한 프로모터 또는 동일한 프로모터의 제어 하에) 도입될 수 있다. 전구체 T 세포는 제1 및 제2 핵산을 동시에 보유하는 별개의 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)로 형질도입/형질감염될 수 있다. 전구체 T 세포는 또한 먼저 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산을 보유하는 제1 벡터로 형질도입/형질감염되어 "Nef-함유 변형된 T 세포"를 수득한 다음, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 암호화하는 제2 핵산을 보유하는 제2 벡터로 추가로 형질도입/형질감염되어 "Nef-함유 ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체-T 세포"를 수득할 수 있다. 대안적으로, 전구체 T 세포는 먼저 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 암호화하는 제2 핵산을 보유하는 제2 벡터로 형질도입/형질감염되어 "ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체-T 세포"를 수득한 다음, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산을 보유하는 제1 벡터로 추가로 형질도입/형질감염되어 "Nef-함유 ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체-T 세포"를 수득할 수 있다. CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체 또는 BCMA CAR, 및/또는 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 단리된 핵산 또는 벡터 중 임의의 것은 본원에 기재된 변형된 T 세포를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 전구체 T 세포의 집단이 본원에 기재된 변형된 T 세포의 생산에 사용될 때, 방법은 또한 하나 이상의 단리 및/또는 풍부화 단계, 예를 들어, 외인성 Nef를 발현하도록 변형된 T 세포로부터 Nef-양성, CD3ε/γ/δ-음성, TCRα/β-음성, MHC I-음성, CD4-양성, 및/또는 CD28-양성 T 세포의 단리 및/또는 풍부화, CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 발현하도록 변형된 T 세포로부터 ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체-양성 T 세포(예를 들어, ITAM-변형된 CAR 양성, ITAM-변형된 TCR 양성, ITAM-변형된 cTCR 양성, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체 양성)의 단리 및/또는 풍부화, BCMA CAR을 발현하도록 변형된 T 세포로부터 BCMA CAR-양성 T 세포의 단리 및/또는 풍부화, BCMA CAR 및 외인성 Nef 단백질을 발현하도록 변형된 T 세포로부터 BCMA CAR-양성, 및 CD3ε/γ/δ-음성, TCRα/β-음성, MHC I-음성, CD4-양성, 및/또는 CD28-양성 T 세포의 단리 및/또는 풍부화, 또는 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체 및 외인성 Nef 단백질을 발현하도록 변형된 T 세포로부터 ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체-양성 T 세포(예를 들어, ITAM-변형된 CAR 양성, ITAM-변형된 TCR 양성, ITAM-변형된 cTCR 양성, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체 양성), 및 Nef-양성, CD3ε/γ/δ-음성, TCRαβ-음성, MHC I-음성, CD4-양성, 및/또는 CD28-양성의 단리 및/또는 풍부화를 포함한다. 이러한 단리 및/또는 풍부화 단계는 자기-활성화 세포 분류(MACS)와 같은 당업계에 알려진 임의의 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 간단히 말해서, 형질도입/형질감염된 세포 현탁액을 실온에서 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 세포를 DPBS로 재현탁한 다음 MACSelect MicroBead로 보충하고, 자기 표지화를 위해 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, PBE 완충액(나트륨 포스페이트/EDTA)을 첨가하여 부피를 조정하였다. 그런 다음 세포 현탁액을 MACS 키트 프로토콜에 따라 자기 분리 및 풍부화에 적용하였다. 또한 실시예 참조.
이 주제의 설명이 외인성 Nef 단백질 및/또는 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체를 포함하는 변형된 T 세포를 생성하는 방법에 초점을 맞추고 있지만, 본원에 기재된 방법은 또한 다른 기능적 외인성 수용체(예를 들어, CD3ζ ISD-함유 기능적 외인성 수용체 예컨대 기존 CAR)를 포함하는 변형된 T 세포 또는 다른 기능적 외인성 수용체 및 외인성 Nef 단백질을 포함하는 변형된 T 세포를 생성하는 데 사용될 수 있다는 것으로 생각할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, wt, 하위유형, 또는 돌연변이체 Nef)을 암호화하는 제1 핵산 및 70, 72, 110, 및 176 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 CAR과 같은 기능적 외인성 수용체(예를 들어, 변형된 TCR, CAR 예컨대 CD20 CAR 또는 BCMA CAR, cTCR, 또는 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 제2 핵산을 전구체 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, 또는 GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 전구체 T 세포는 혈액, 골수, 림프, 또는 림프 기관에서 유래된다. 일부 구현예에서, 전구체 T 세포는 선천성 또는 후천성 면역의 세포와 같은 면연계의 세포이다. 일부 측면에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 전구체 T 세포는 세포주, 예를 들어, T 세포주에서 유래된다. 세포는 일부 구현예에서 이종 공급원, 예를 들어, 마우스, 래트, 비-인간 영장류, 또는 돼지로부터 수득된다.
일부 구현예에서, 전구체 T 세포는 CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, CD4+/CD8+, CD4-/CD8-, 또는 이의 조합이다. 일부 구현예에서, T 세포는 자연 살해 T(NKT) 세포이다. 일부 구현예에서, 전구체 T 세포는 변형된 T 세포, 예컨대 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 발현하는 변형된 T 세포, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포, 본원에 기재된 BCMA CAR을 발현하는 변형된 T 세포, 또는 변형된 내인성 TCR 유전자좌가 있는 T 세포이다(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템을 통해). 일부 구현예에서, 전구체 T 세포는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(또는 BCMA CAR)의 발현 및 표적 세포(예를 들어, BCMA+ 또는 CD20+ 종양 세포)에 결합 시 IL-2, TFN, 및/또는 TNF를 생산한다. 일부 구현예에서, CD8+ T 세포는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(또는 BCMA CAR)의 발현 및 표적 세포에 결합 시 항원-특이적 표적 세포(예를 들어, BCMA+ 또는 CD20+ 종양 세포)를 용해시킨다.
일부 구현예에서, 변형될 T 세포는 조혈 줄기 세포, 만능 줄기 세포, iPS, 또는 배아 줄기 세포와 같은 줄기 세포로부터 분화된다.
일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef), BCMA CAR, 및/또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)는 핵산 중 임의의 하나 또는 본원에 기재된 벡터(예를 들어, 비-바이러스 벡터, 또는 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터) 중 임의의 하나를 형질도입/형질감염시킴으로서 T 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체 또는 본원에 기재된 BCMA CAR은 CELL SQUEEZE®(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제20140287509호 참조)와 같은 미세유체 시스템을 통해 세포를 통과하는 동안 단백질을 세포 막 내로 삽입함으로써 T 세포 내로 도입된다.
벡터(예를 들어, 바이러스 벡터) 또는 단리된 핵산을 포유류 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 본원에 기재된 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 방법에 의해 T 세포 내로 전달될 수 있다.
벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)를 T 세포 내로 도입하기 위한 물리적 방법은 칼슘 포스페이트 침전, 리포펙틴, 입자 충격, 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Sambrook 등 (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 참조. 일부 구현예에서, 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)는 전기천공에 의해 세포 내로 도입된다.
벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)를 T 세포 내로 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터는 유전자를 포유류, 예를 들어, 인간 세포 내로 삽입하기 위한 가장 널리 사용되는 방법이 되었다.
벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)를 T 세포 내로 도입하기 위한 화학적 수단은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드와 같은 콜로이드 분산 시스템, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀, 및 리포솜을 포함한 지질-기반 시스템을 포함한다. 시험관내에서 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포솜(예를 들어, 인공 막 소포)이다.
일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef), BCMA CAR, 및/또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체) 중 임의의 것을 암호화하는 RNA 분자는 통상적인 방법(예를 들어, 시험관내 전사)에 의해 제조된 다음 mRNA 전기천공과 같은 알려진 방법을 통해 T 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, Rabinovich 등, Human Gene Therapy 17:1027-1035 참조.
일부 구현예에서, 형질도입/형질감염된 T 세포는 벡터 또는 단리된 핵산의 도입 후 생체외에서 번식된다. 일부 구현예에서, 형질도입/형질감염된 T 세포는 적어도 약 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 10 일, 12 일, 또는 14 일 중 임의의 것 동안 번식되도록 배양된다. 일부 구현예에서, 형질도입/형질감염된 T 세포는 원하는 조작된 포유류 세포, 예를 들어, 본원에 기재된 변형된 T 세포를 선택하기 위해 추가로 평가 또는 스크리닝된다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염/형질도입된 세포를 식별하고 조절 서열의 기능성을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용자 유기체 또는 조직에 존재하거나 또는 이에 의해 발현되지 않고 발현이 일부 용이하게 검출가능한 특성, 예를 들어, 효소적 활성에 의해 나타나는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA/RNA가 수용자 세포 내로 도입된 후 적합한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제, 또는 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어, Ui-Tei 등 FEBS Letters 479: 79-82 (2000)). 적합한 발현 시스템은 잘 알려져 있으며 알려진 기술을 사용하여 제조되거나 또는 상업적으로 수득될 수 있다.
변형된 T 세포에서 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef), BCMA CAR, 및/또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체) 중 임의의 것을 암호화하는 핵산의 존재를 확인하는 다른 방법은 예를 들어, 서던(Southern) 및 노던(Northern) 블롯팅, RT-PCR 및 PCR과 같은 당업자에게 잘 알려진 분자 생물학적 검정; 예를 들어, 면역학적 방법(예컨대 ELISA 및 웨스턴(Western) 블롯), 형광-활성화 세포 분류(FACS), 또는 자기-활성화 세포 분류(MACS)에 의해 특정 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것과 같은 생화학적 검정을 포함한다(또한 실시예 섹션 참조).
따라서 일부 구현예에서, 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질(예를 들어, wt, 하위유형, 또는 돌연변이체 Nef) 중 임의의 것을 암호화하는 핵산을 전구체 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, 또는 GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 71, 73, 109, 153-175, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 ITAM-변형된 CAR과 같은 본원에 기재된 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체 중 임의의 것을 암호화하는 핵산을 전구체 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)를 생산하는 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산 및 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 제2 핵산을 전구체 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, 또는 GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법이 제공되며, 여기서 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하며: (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결된다.
일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산 및 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체(또는 BCMA CAR)를 암호화하는 제2 핵산은 전구체 T 세포 내로 순차적으로 도입된다. 따라서 일부 구현예에서, 다음 단계를 포함하는, 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법이 제공된다: i) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산을 전구체 T 세포 내로 도입하는 단계로, 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 변형된 T 세포에서 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC I의 하향 조절(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능의 하향 조절)을 초래하는 것인, 단계; 이어서 ii) 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체), 또는 본원에 기재된 BCMA CAR을 암호화하는 제2 핵산을 전구체 T 세포 내로 도입하는 단계. 일부 구현예에서, Nef-양성, CD3ε/γ/δ-음성, 및/또는 TCRα/β-음성, 변형된 T 세포는 단리 및/또는 풍부화된 다음, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(또는 BCMA CAR)를 암호화하는 제2 핵산은 단리/풍부화된 변형된 T 세포(Nef-함유 T 세포) 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 제2 핵산을 도입하기 전, 또는 제2 핵산을 도입한 후 MHC I-음성, CD4-양성, 및/또는 CD28-양성 변형된 T 세포에 대해 추가로 단리 및/또는 풍부화된다. 일부 구현예에서, 방법은 단리/풍부화된 Nef-함유 T 세포로부터 ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체-양성 변형된 T 세포를 단리/풍부화하기 위한 제2 단리 및/또는 풍부화 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 다음 단계를 포함하는, 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법이 제공된다: i) 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체) 또는 본원에 기재된 BCMA CAR을 암호화하는 제2 핵산을 전구체 T 세포 내로 도입하는 단계; 이어서 ii) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산을 전구체 T 세포 내로 도입하는 단계로, 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향 조절(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능의 하향 조절)을 초래하는 것인, 단계. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체 양성(또는 BCMA CAR-양성) 변형된 T 세포는 단리 및/또는 풍부화된 다음, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 단리/풍부화된 ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체 양성(또는 BCMA CAR-양성) 변형된 T 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 방법은 단리/풍부화된 ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체 양성(또는 BCMA CAR-양성) T 세포로부터 Nef-양성, CD3ε/γ/δ-음성, MHC I-음성, 및/또는 TCRα/β-음성, 변형된 T 세포를 단리/풍부화하기 위한 제2 단리 및/또는 풍부화 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 이전에 CD4-양성 및/또는 CD28-양성 변형된 T 세포에 대해 추가로 단리 및/또는 풍부화된다. 일부 구현예에서, 방법은 [Nef-양성, CD3ε/γ/δ-음성, MHC I-음성, 및/또는 TCRα/β-음성] 및 [ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체 양성(또는 BCMA CAR 양성)]인 변형된 T 세포를 단리/풍부화하기 위해, 두 핵산을 전구체 T 세포 내로 도입한 후 단일 단리 및/또는 풍부화 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 전구체 T 세포 내로 동시에 도입된다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 별개의 벡터 상에 있다. 따라서 일부 구현예에서, 다음 단계를 포함하는, 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법이 제공된다: i) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산을 보유하는 제1 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포 내로 도입하는 단계로, 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 변형된 T 세포에서 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC I의 하향 조절(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능의 하향 조절)을 초래하는 것인, 단계; 및 ii) 동시에 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체) 또는 본원에 기재된 BCMA CAR을 암호화하는 제2 핵산을 보유하는 제2 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포 내로 도입하는 단계. 일부 구현예에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체 또는 본원에 기재된 BCMA CAR을 암호화하는 제2 핵산의 상류에 있다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체 또는 본원에 기재된 BCMA CAR을 암호화하는 제2 핵산의 하류에 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 따라서 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법이 제공되고: i) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산; iii) 제2 프로모터(예를 들어, PGK); 및 iv) CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체) 또는 본원에 기재된 BCMA CAR을 암호화하는 제2 핵산; 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 변형된 T 세포에서 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC I의 하향 조절(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능의 하향 조절)을 초래한다. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법이 제공되고: i) 제2 프로모터(예를 들어, PGK); ii) CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체) 또는 본원에 기재된 BCMA CAR을 암호화하는 제2 핵산; iii) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); 및 iv) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산; 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 변형된 T 세포에서 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC I의 하향 조절(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능의 하향 조절)을 초래한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산 및 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체 또는 본원에 기재된 BCMA CAR을 암호화하는 제2 핵산은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 따라서 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법이 제공되고: i) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산; iii) 제1 연결 서열(예를 들어, IRES, 또는 P2A 또는 T2A와 같은 자기-절단 2A 펩티드를 암호화하는 핵산); iv) 임의적인 제2 연결 서열(예를 들어, (GGGS)3과 같은 가요성 링커를 암호화하는 핵산); 및 v) CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체) 또는 본원에 기재된 BCMA CAR을 암호화하는 제2 핵산; 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 변형된 T 세포에서 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC I의 하향 조절(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능의 하향 조절)을 초래한다. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법이 제공되고: i) 제1 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체) 또는 본원에 기재된 BCMA CAR을 암호화하는 제2 핵산; iii) 제1 연결 서열(예를 들어, IRES, 또는 P2A 또는 T2A와 같은 자기-절단 2A 펩티드를 암호화하는 핵산); iv) 임의적인 제2 연결 서열(예를 들어, (GGGS)3과 같은 가요성 링커를 암호화하는 핵산); 및 v) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산; 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 변형된 T 세포에서 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC I의 하향 조절(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능의 하향 조절)을 초래한다. 일부 구현예에서, 상류에서 하류로 다음을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법이 제공되고: i) 1 프로모터(예를 들어, EF1-α); ii) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산; iii) IRES 연결 서열; 및 iv) 디음을 포함하는 ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb)을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, (b) 힌지 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), (c) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (d) 공동-자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28에서 유래) 및 CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되고, 여기서 공동-자극 신호전달 도메인은 CMSD에 대해 N-말단이고; 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 변형된 T 세포에서 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC I의 하향 조절(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능의 하향 조절)을 초래한다. 일부 구현예에서, 제2 핵산은 70, 72, 110, 및 176 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 CAR(예를 들어, BCMA CAR 또는 CD20 CAR)을 암호화한다. 일부 구현예에서, 방법은 ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체 양성 변형된 T 세포 또는 BCMA CAR-양성 변형된 T 세포를 단리 및/또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 Nef-양성, 내인성 CD3ε/γ/δ-음성, 및/또는 내인성 TCRα/β-음성 변형된 T 세포를 단리 및/또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 MHC I-음성, CD4-양성, 및/또는 CD28-양성 변형된 T 세포를 단리 및/또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 [Nef-양성, 내인성 CD3ε/γ/δ-음성, 및/또는 내인성 TCRα/β-음성] 및 [ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체 양성(또는 BCMA CAR 양성)]인 변형된 T 세포를 단리/풍부화하기 위한 단일 단리 및/또는 풍부화 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 발현하는 변형된 T 세포는 전구체 T 세포의 공여자로부터 단리된 1차 T 세포에 의해 도출된 GvHD 반응과 비교하여 조직부적합성 개체에서 GvHD 반응을 전혀 도출하지 않거나 또는 감소된(예컨대 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것까지 감소된) GvHD 반응을 도출한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)은 발현 시 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3ε/γ/δ, 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절하고(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절); 임의적으로 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체 또는 BCMA CAR)를 하향 조절하지 않거나(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포용해 활성에 수반되는 신호 전달과 같은 효과기 기능을 하향 조절), 또는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체 또는 BCMA CAR)를 최대 약 80%(예컨대 최대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28을 하향 조절하지 않는다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)은 최대 약 50%(예컨대 최대 약 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)를 하향 조절하는 것과 같이 CD4 및/또는 CD28을 하향 조절한다(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능을 하향 조절한다). 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)은 TCR(예를 들어, TCRα 또는 TCRβ), CD3(예를 들어, CD3ε/γ/δ), MHC I, CD4, 및/또는 CD28을 하향 조절한다(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, Nef 하위유형 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)은 TCR(예를 들어, TCRα 또는 TCRβ) 및/또는 MHC I을 하향 조절하지만(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절), CD4 및/또는 CD28을 하향 조절하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, Nef 하위유형 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)은 TCR 및 CD4를 하향 조절하지만(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절), CD28을 하향 조절하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, Nef 하위유형 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)은 TCR 및 CD28을 하향 조절하지만(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능을 하향 조절), CD4를 하향 조절하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, Nef 하위유형 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)은 i) 내인성 TCR을 하향 조절하지만(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절), 내인성 MHC I을 하향 조절하지 않거나; ii) 내인성 MHC I을 하향 조절하지만, 내인성 TCR을 하향 조절하지 않거나; 또는 iii) 내인성 MHC I 및 TCR을 둘 다 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)은 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC I을 하향 조절하지만(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절), 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체 또는 본원에 기재된 BCMA CAR을 하향 조절하지 않는다(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 세포용해 활성에 수반되는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체 또는 본원에 기재된 BCMA CAR은 최대 약 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것까지 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)에 의해 하향 조절된다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 세포용해 활성에 수반되는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)은 발현 시 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것까지 내인성 TCR, MHC I, CD3ε, CD3γ, 및/또는 CD3δ를 하향 조절하는 것과 같이(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절) 변형된 T 세포에서 내인성 TCR, MHC I, CD3ε, CD3γ, 및/또는 CD3δ를 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 비변형된 내인성 TCR 유전좌를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 변형된 TCRα 또는 TCRβ 유전자좌와 같은 변형된 내인성 TCR 유전자좌를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 TCR 유전자좌는 CRISPR-Cas, TALEN, 및 ZFN으로부터 선택된 유전자 편집 시스템에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 내인성 TCR(또는 B2M) 유전자좌는 서열번호: 108(또는 서열번호: 233)의 핵산 서열을 포함하는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas 시스템에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR을 암호화하는 제2 핵산은 서열번호: 75 또는 77의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 서열번호: 90-100 및 234 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 79-89, 198-204, 및 207-231 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체는 서열번호: 71, 73, 109, 153-175, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 서열을 포함하는 ITAM-변형된 CAR이다. 일부 구현예에서, CAR은 서열번호: 72, 73 및 170-175 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 CD20 CAR이다. 일부 구현예에서, CAR은 서열번호: 70, 71, 109, 110, 153-169, 176-182, 및 205 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA CAR이다. 일부 구현예에서, 연결 서열은 P2A, T2A, E2A, F2A, BmCPV 2A, BmIFV 2A, (GS)n, (GGGS)n, 및 (GGGGS)n 중 임의의 것을 암호화하는 핵산 서열; 또는 IRES, SV40, CMV, UBC, EF1α, PGK, 및 CAGG 중 임의의 것의 핵산 서열; 또는 이의 임의의 조합을 포함하며, 여기서 n은 적어도 1의 정수이다. 일부 구현예에서, 제1 연결 서열은 서열번호: 31-35로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 연결 서열은 IRES이다. 일부 구현예에서, 벡터는 서열번호: 78, 184-189, 191-197, 206, 및 232 중 임의의 것의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 서열번호: 183 또는 190의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 EF1-α 또는 PGK이다.
일부 구현예에서, 방법은 제1 및/또는 제2 핵산을 포함하는 T 세포를 단리 및/또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포로부터 CD3γ, CD3δ, 및/또는 CD3ε-음성 T 세포를 단리 및/또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 외인성 Nef 단백질을 발현하는 변형된 T 세포로부터 내인성 TCRα-음성 및/또는 TCRβ-음성 T 세포를 단리 및/또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 외인성 Nef 단백질을 발현하는 변형된 T 세포로부터 내인성 MHC I-음성 T 세포를 단리 및/또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 외인성 Nef 단백질을 발현하는 변형된 T 세포로부터 내인성 CD4-양성 및/또는 CD28-양성 T 세포를 단리 및/또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포로부터 ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체-양성 T 세포를 단리 및/또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 기재된 BCMA CAR을 발현하는 변형된 T 세포로부터 BCMA CAR-양성 T 세포를 단리 및/또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 외인성 Nef 단백질 및 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(또는 BCMA CAR)를 발현하는 변형된 T 세포로부터 TCRα-음성 및/또는 TCRβ-음성 T 세포를 단리 및/또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 외인성 Nef 단백질 및 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(또는 BCMA CAR)를 발현하는 변형된 T 세포로부터 MHC I-음성 T 세포를 단리 및/또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 외인성 Nef 단백질 및 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(또는 BCMA CAR)를 발현하는 변형된 T 세포로부터 CD3γ, CD3δ, 및/또는 CD3ε-음성 T 세포를 단리 및/또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 외인성 Nef 단백질 및 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(또는 BCMA CAR)을 발현하는 변형된 T 세포로부터 CD4-양성 및/또는 CD28-양성 T 세포를 단리 및/또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 외인성 Nef 단백질 및 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(또는 BCMA CAR)를 발현하는 ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체-양성(또는 BCMA CAR-양성) 변형된 T 세포를 단리 및/또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 외인성 Nef(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)를 발현하는(그리고 일부 구현예에서 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체, 또는 본원에 기재된 BCMA CAR을 추가로 발현하는) 변형된 T 세포는 변형된 T 세포가 유래된 전구체 T 세포의 공여자로부터 단리된 1차 T 세포에 의해 도출된 GvHD 반응과 비교하여 조직부적합성 개체에서 GvHD 반응을 전혀 도출하지 않거나 또는 감소된(예컨대 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것까지 감소된) GvHD 반응을 도출한다. 일부 구현예에서, 방법은 변형된 T 세포(ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체, BCMA CAR, 및/또는 외인성 Nef를 발현)와 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 제형화하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 유효량의 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포, 또는 유효량의 이의 약제학적 제형을 개체(예를 들어, 인간)에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 유효량의 본원에 기재된 BCMA CAR을 발현하는 변형된 T 세포, 또는 유효량의 이의 약제학적 제형을 개체(예를 들어, 인간)에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 유효량의 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef) 및 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 발현하는 변형된 T 세포, 또는 유효량의 이의 약제학적 제형을 개체(예를 들어, 인간)에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 유효량의 외인성 Nef 단백질 및 본원에 기재된 BCMA CAR을 발현하는 변형된 T 세포, 또는 유효량의 이의 약제학적 제형을 개체(예를 들어, 인간)에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 개체는 암을 갖는다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다. 일부 구현예에서, 개체는 변형된 T 세포가 유래된 전구체 T 세포의 공여자와 조직부적합성이다.
T 세포의 공급원, 세포 준비 및 배양
T 세포(예를 들어, 전구체 T 세포)의 확장 및 유전적 변형 전에, T 세포의 공급원은 개체로부터 수득된다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직, 및 종양을 포함한 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 당업계에서 이용가능한 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는 FICOLL™ 분리와 같은 당업자에게 알려진 임의의 수의 기술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 분리반출법에 의해 수득된다. 분리반출법 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 포함한 림프구를 함유한다. 일부 구현예에서, 분리반출법에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획을 제거하고 세포를 후속 처리 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 배치할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 포스페이트 완충 염수(PBS)로 세척된다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 칼슘이 부족하고 마그네슘이 부족할 수 있거나 또는 2가 양이온이 전부는 아니지만 많이 부족할 수 있다. 일부 구현예에서, 칼슘의 부재 하에 초기 활성화 단계는 확대된 활성화를 야기한다. 당업자는 세척 단계가 제조업체의 지침에 따라 반자동화된 "관류(flow-through)" 원심분리(예를 들어, Cobe 2991 세포 처리기, Baxter CytoMate, 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 사용하는 것과 같이 당업자에게 알려진 방법에 의해 수행될 수 있음을 용이하게 이해할 것이다. 세척 후, 세포는 예를 들어, Ca2+-무함유, Mg2+-무함유 PBS, PlasmaLyte A, 또는 완충액이 있거나 없는 다른 염수 용액과 같은 다양한 생체적합성 완충액에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 분리반출법 샘플의 바람직하지 않은 구성요소는 제거될 수 있고 세포를 배양 배지에 직접 재현탁할 수 있다.
　일부 구현예에서, T 세포는 제대혈 은행, 말초 혈액 은행에서 제공되거나, 또는 유도된 만능 줄기 세포(iPSC), 다능 및 만능 줄기 세포, 또는 인간 배아 줄기 세포에서 유래된다. 일부 구현예에서, T 세포는 세포주에서 유래된다. T 세포는 일부 구현예에서 이종 공급원, 예를 들어, 마우스, 래트, 비-인간 영장류, 및 돼지로부터 수득된다. 일부 구현예에서, T 세포는 인간 세포이다. 일부 측면에서, T 세포는 대상체에서 직접 단리된 것 및/또는 대상체에서 단리되고 동결된 것과 같은 1차 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화 가능성, 확장, 재순환, 국소화, 및/또는 지속 능력, 항원- 특이성, 항원 수용체 유형, 특정 기관 또는 구획에서의 존재, 마커 또는 사이토카인 분비 프로파일, 및/또는 분화 정도에 의해 정의된 것들과 같은 전체 T 세포 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포, 및 이의 하위집단과 같은 T 세포의 하나 이상의 서브셋을 포함한다. 치료될 대상체와 관련하여, 세포는 동종이계 및/또는 자가일 수 있다. 일부 경우에, T 세포는 하나 이상의 의도된 수용자와 관련하여 동종이계이다. 일부 경우에, T 세포는 수용자에서 GvHD를 유도하지 않는 것과 같이 이식에 적합하다.
T 세포 및/또는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 하위유형 및 하위집단 중에는 미처리 T(TN) 세포, 효과기 T 세포(TEFF), 기억 T 세포 및 이의 하위 유형, 예컨대 줄기 세포 기억 T(TSCM), 중추 기억 T(TCM), 효과기 기억 T(TEM), 또는 말단 분화된 효과기 기억 T 세포, 종양-침윤 림프구(TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 점막-연관 불변 T(MAIT) 세포, 자연 발생 및 적응성 조절 T(Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예컨대 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 여포성 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포, 및 델타/감마 T 세포가 있다.
일부 구현예에서, T 세포는 예를 들어, PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리 또는 역류 원심분리 용출법에 의해 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+T 세포와 같은 T 세포의 특이적 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, T 세포는 원하는 T 세포의 양성 선택에 충분한 기간 동안 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와 같은 항-CD3/항-CD28(즉, 3x28)-접합된 비드와 함께 인큐베이션함으로써 단리된다. 일부 구현예에서, 기간은 약 30 분이다. 추가의 구현예에서, 기간은 30 분 내지 36 시간 또는 그 이상의 범위이며 그 사이의 모든 정수 값이다. 추가의 구현예에서, 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 시간이다. 일부 구현예에서, 기간은 10 내지 24 시간이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 기간은 24 시간이다. 백혈병 환자에서 T 세포를 단리하기 위해, 24 시간과 같은 더 긴 인큐베이션 시간의 사용은 세포 수율을 증가시킬 수 있다. 더 긴 인큐베이션 시간을 사용하여 종양 조직 또는 면역-손상된 개체로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 단리하는 것과 같이, 다른 세포 유형과 비교하여 T 세포가 거의 없는 임의의 상황에서 T 세포를 단리할 수 있다. 추가로, 더 긴 인큐베이션 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합하도록 허용된 시간을 단순히 단축하거나 또는 연장하고,하거나 T 세포에 대한 비드의 비율을 증가 또는 감소시킴으로써(본원에 추가로 기재된 바와 같음), T 세포의 하위집단은 배양 개시 시 또는 과정 동안 다른 시점에서 우선적으로 선택될 수 있다. 추가적으로, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비율을 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단은 배양 개시 시 또는 다른 원하는 시점에서 우선적으로 선택될 수 있다. 당업자는 다중 선택 라운드가 또한 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 일부 구현예에서, 선택 절차를 수행하고 활성화 및 확장 과정에서 "선택되지 않은" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "선택되지 않은" 세포는 또한 추가의 선택 라운드에 적용될 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 풍부화는 음성으로 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 대한 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 한 가지 방법은 음성으로 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 단클론 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유세포 분석법을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부화하기 위해, 단클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 특정 구현예에서, 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+, 및 FoxP3+를 발현하는 조절 T 세포를 풍부화하거나 또는 양성으로 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 특정 구현예에서, T 조절 세포는 항-CD25 접합된 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 고갈된다.
원하는 세포 집단을 양성 또는 음성 선택에 의해 단리하기 위해, 세포 및 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)의 농도가 달라질 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 및 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해, 비드 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 유의하게 감소시키는 것(즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 20억 개 세포/mL의 농도가 사용된다. 일 구현예에서, 10억 개 세포/mL의 농도가 사용된다. 추가의 구현예에서, 1억 개 초과의 세포/mL가 사용된다. 추가의 구현예에서, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 또는 5000만 개 세포/mL의 세포 농도가 사용된다. 또한 또 다른 구현예에서, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500만 개, 또는 1억 개 세포/mL의 세포 농도가 사용된다. 추가의 구현예에서, 1억 2500만 또는 1억 5000만 개 세포/mL의 농도가 사용될 수 있다. 높은 농도를 사용하는 것은 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 확장의 증가를 초래할 수 있다. 추가로, 높은 세포 농도의 사용은 CD28-음성 T 세포와 같은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 또는 많은 종양 세포가 존재하는 샘플(즉, 백혈병 혈액, 종양 조직 등)에서 보다 효율적인 포획을 허용한다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치가 있을 수 있으며 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 높은 농도의 세포를 사용하는 것은 정상적으로 더 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 보다 효율적인 선택을 허용한다.
일부 구현예에서, 더 낮은 농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포 및 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)의 혼합물을 유의하게 희석함으로써, 입자 및 세포 사이의 상호작용은 최소화된다. 이는 입자에 결합될 원하는 항원을 다량으로 발현하는 세포를 선택한다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 더 높은 수준의 CD28을 발현하고 희석 농도에서 CD8+ T 세포보다 더 효율적으로 포획된다. 일부 구현예에서, 사용되는 세포의 농도는 5x106/mL이다. 일부 구현예에서, 사용되는 농도는 약 1x105/mL 내지 1x106/mL, 및 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 2-10℃, 또는 실온에서 다양한 속도로 다양한 시간 길이 동안 회전기 상에서 인큐베이션될 수 있다.
자극을 위한 T 세포는 또한 세척 단계 후 동결될 수 있다. 이론에 의해 얽매이기를 바라지 않고, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도 단핵구를 제거함으로써 보다 균질한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포는 동결 용액에 현탁될 수 있다. 많은 동결 용액 및 매개변수가 당업자에게 알려져 있고 이 맥락에서 유용할 것이지만, 한 가지 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% Plasmalyte-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO를 함유하는 배양 배지 또는 예를 들어, Hespan 및 PlasmaLyte A를 함유하는 다른 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 것을 수반하며, 이어서 세포는 분 당 1°의 속도로 -80℃까지 동결되고 액체 질소 저장 탱크의 증기 상에서 저장된다. -20℃ 또는 액체 질소에서 즉시 동결을 제어할 뿐만 아니라 동결을 제어하지 않는 다른 방법이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 동결보존된 세포는 본원에 기재된 바와 같이 해동 및 세척되고 활성화 이전에 실온에서 1 시간 동안 휴지시킨다.
또한 본원에 기재된 바와 같은 확장된 세포가 필요할 수 있을 경우 이전의 기간에 대상체로부터 혈액 샘플 또는 분리반출법 생성물의 수집이 본 출원에서 고려된다. 이와 같이, 확장될 세포의 공급원은 언제든 필요한 시점에 수집될 수 있고, T 세포와 같은 원하는 세포는 본원에 기재된 것들과 같은 T 세포 요법으로부터 이익을 얻게 될 임의의 수의 질환 또는 병태에 대한 T 세포 요법에서 나중에 사용하기 위해 단리 및 동결된다. 일 구현예에서 혈액 샘플 또는 분리반출법은 일반적으로 건강한 대상체로부터 취해진다. 특정 구현예에서, 혈액 샘플 또는 분리반출법은 질환이 발생할 위험이 있지만, 아직 질환이 발생하지 않은 일반적으로 건강한 대상체로부터 취해지고, 관심 세포는 나중 사용을 위해 단리 및 동결된다. 특정 구현예에서, T 세포는 확장되고, 동결되고, 나중에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 샘플은 본원에 기재된 바와 같은 특정 질환의 진단 직후 그러나 임의의 치료 전에 환자로부터 수집된다. 추가의 구현예에서, 세포는 제제 예컨대 나탈리주맙(natalizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역제거제 예컨대 CAMPATH, 항-CD3 항체, 사이톡산, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 및 조사를 사용한 치료를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 수의 관련 치료 양식 전에 대상체로부터 혈액 샘플 또는 분리반출법으로 단리된다. 이들 약물은 칼슘 의존적 포스파타제 칼시뉴린(사이클로스포린 및 FK506)을 억제하거나 또는 성장 인자 유도된 신호전달에 중요한 p70S6 키나제(라파마이신)를 억제한다(Liu 등, Cell 66:807-815, 1991; Henderson 등, Immun 73:316-321, 1991; Bierer 등, Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). 추가의 구현예에서, 세포는 환자를 위해 단리되고 골수 또는 줄기 세포 이식, 화학요법제 예컨대, 플루다라빈, 외부-빔 방사선 요법(XRT), 사이클로포스파미드, 또는 항체 예컨대 OKT3 또는 CAMPATH를 사용한 T 세포 제거 요법과 함께(예를 들어, 전에, 동시에 또는 후에) 나중 사용을 위해 동결된다. 또 다른 구현예에서, 세포는 이전에 단리되고 CD20과 반응하는 제제, 예를 들어, 리툭산(Rituxan)과 같은 B-세포 제거 요법 후 치료에 나중 사용을 위해 동결될 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포는 치료 직후 환자로부터 수득된다. 이와 관련하여, 특정 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물로의 치료 후, 환자가 치료에서 정상적으로 회복될 기간 동안 치료 직후에, 수득된 T 세포의 품질은 최적일 수 있거나 또는 생체외에서 확장하는 능력이 개선될 수 있는 것으로 관찰되었다. 마찬가지로, 본원에 기재된 방법을 사용하여 생체외 조작 후, 이들 세포는 향상된 생착 및 생체내 확장을 위한 바람직한 상태에 있을 수 있다. 따라서, 이 회복 단계 동안, T 세포, 수지상 세포, 또는 조혈 계통의 다른 세포를 포함하는 혈액 세포를 수집하는 것이 본 발명의 맥락 내에서 고려된다. 추가로, 특정 구현예에서, 동원(예를 들어, GM-CSF를 사용한 동원) 및 조건화 레지멘을 사용하여 특정 세포 유형의 재증식, 재순환, 재생, 및/또는 확장이 특히 요법 후 정의된 시간 창 동안 선호되는 대상체에서 병태를 생성할 수 있다. 예시적 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 및 면역계의 다른 세포를 포함한다.
T 세포의 활성화 및 확장
일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작 전에 또는 이와 관련하여 인큐베이션 및/또는 배양된다. 인큐베이션 단계는 배양, 재배, 자극, 활성화, 및/또는 번식을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물 또는 세포는 자극 조건 또는 자극제의 존재 하에 인큐베이션된다. 이러한 조건은 집단에서 세포의 증식, 확장, 활성화, 및/또는 생존을 유도하고/하거나, 항원 노출을 모방하고/하거나, 유전자 조작된　항원 수용체의 도입을 위해서와 같은 유전자 조작을 위해 세포를 프라이밍하도록 설계된 것들이다. 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제, 예를 들어, 영양소, 아미노산, 항생체, 이온, 및/또는 자극인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체, 및 세포를 활성화시키도록 설계된 임의의 다른 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
외인성 Nef 단백질, BCMA CAR, 및/또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 사용한 T 세포의 유전자 조작 전이든 또는 후든, T 세포는 일반적으로 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 특허 출원 공개 번호 제20060121005호에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화 및 확장될 수 있다.
일반적으로, T 세포는 CD3/TCR 복합체 연관 신호를 자극하는 제제 및 T 세포의 표면 상의 공동-자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장될 수 있다. 특히, T 세포 집단은 표면 상에 고정화된 항-CD3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 운반체와 함께 단백질 키나제 C 활성화제(예를 들어, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해서와 같이 본원에 기재된 바와 같이 자극될 수 있다. T 세포 표면 상의 보조 분자의 공동-자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28(Diaclone, 프랑스 브장송 소재)을 포함하며 당업계에 통상적으로 알려진 다른 방법과 같이 사용될 수 있다(Berg 등, Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen 등, J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland 등, J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
일부 구현예에서, T 세포는 비-분할 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 같은 배양-개시 조성물 배양보조 세포에 첨가되고, (예를 들어, 세포의 생성된 집단이 확장될 개시 집단에서 각각의 T 림프구에 대해 적어도 약 5, 10, 20, 또는 40 개 또는 그 이상의 PBMC 배양보조 세포를 함유하도록); 배양물을 인큐베이션함으로써(예를 들어 T 세포의 수를 확장하기에 충분한 시간 동안) 확장된다. 일부 측면에서, 비-분할 배양보조 세포는 감마-조사된 PBMC 배양보조 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, PBMC는 세포 분열을 방지하기 위해 약 3000 내지 3600 라드(rad) 범위에서 감마선으로 조사된다. 일부 측면에서, 배양보조 세포는 T 세포 집단의 첨가 전에 배양 배지에 첨가된다.
일부 구현예에서, T 세포에 대한 1차 자극 신호 및 공동-자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각각의 신호를 제공하는 제제는 용액 내에 있거나 또는 표면에 커플링될 수 있다. 표면에 커플링된 경우, 제제는 동일한 표면에(즉, "시스" 형성으로) 또는 별도의 표면에(즉, "트랜스" 형성으로) 커플링될 수 있다. 대안적으로, 하나의 제제는 표면에 커플링되고 다른 제제는 용액 내에 있을 수 있다. 일 구현예에서, 공동-자극 신호를 제공하는 제제는 세포 표면에 결합되고 1차 활성화 신호를 제공하는 제제는 용액 내에 있거나 또는 표면에 커플링된다. 특정 구현예에서, 두 제제는 용액 내에 있을 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제제는 가요성 형태일 수 있고, 이어서 Fc 수용체를 발현하는 세포 또는 제제에 결합할 항체 또는 다른 결합제와 같이 표면에 교차 결합될 수 있다. 이와 관련하여, 예를 들어, 본 발명에서 T 세포를 활성화시키고 확장하는 데 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포(aAPC)에 대해 미국 특허 출원 공개 번호 제20040101519호 및 제20060034810호를 참조한다.
일부 구현예에서, T 세포는 제제-코팅된 비드와 조합되고, 비드 및 세포는 후속적으로 분리된 다음, 세포는 배양된다. 대안적인 구현예에서, 배양 전에, 제제-코팅된 비드 및 세포는 분리되지 않지만 함께 배양된다. 추가의 구현예에서, 비드 및 세포는 먼저 자력과 같은 힘의 적용에 의해 농축되어, 세포 표면 마커의 결찰을 증가시켜, 세포 자극을 유도한다.
예로서, 세포 표면 단백질은 항-CD3 및 항-CD28이 부착된(3x28 비드) 상자성 비드를 T 세포와 접촉시킴으로써 결찰될 수 있다. 일 구현예에서 세포(예를 들어, 104 내지 109 개 T 세포) 및 비드(예를 들어, 1:1 비율의 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드)는 완충액, 바람직하게는 PBS(칼슘 및 마그네슘과 같은 2가 양이온 없음)에서 조합된다. 다시, 당업자는 임의의 세포 농도가 사용될 수 있음을 용이하게 이해할 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 샘플에서 매우 드물고 샘플의 0.01%만을 포함할 수 있거나 또는 전체 샘플(즉, 100%)은 관심 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포 수는 본 발명의 맥락 내에 있다. 특정 구현예에서, 세포 및 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해, 입자 및 세포가 함께 혼합된 부피를 유의하게 감소시키는 것(즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 약 20억 개 세포/mL의 농도가 사용된다. 또 다른 구현예에서, 1억 개 초과의 세포/mL가 사용된다. 추가의 구현예에서, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 또는 5000만 개 세포/mL의 세포 농도가 사용된다. 또한 또 다른 구현예에서, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500만 개, 또는 1억 개 세포/mL의 세포 농도가 사용된다. 추가의 구현예에서, 1억 2500만 또는 1억 5000만 개 세포/mL의 농도가 사용될 수 있다. 높은 농도를 사용하는 것은 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 확장의 증가를 초래할 수 있다. 추가로, 높은 세포 농도의 사용은 CD28-음성 T 세포와 같은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포의 보다 효율적인 포획을 허용한다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치가 있을 수 있으며 특정 구현예에서 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 높은 농도의 세포를 사용하는 것은 정상적으로 더 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 보다 효율적인 선택을 허용한다.
일부 구현예에서, 혼합물은 수 시간(약 3 시간) 내지 약 14 일 동안 또는 그 사이의 임의의 시간당 정수 값 동안 배양될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 혼합물은 21 일 동안 배양될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서 비드 및 T 세포는 약 8 일 동안 함께 배양된다. 또 다른 구현예에서, 비드 및 T 세포는 2-3 일 동안 함께 배양된다. T 세포의 배양 시간이 60 일 이상일 수 있도록 여러 주기의 자극이 또한 바람직할 수 있다. T 세포 배양에 적절한 조건은 혈청(예를 들어, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, 및 TNF-α를 포함하는 증식 및 생존력에 필요한 인자 또는 당업자에게 알려진 세포의 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 함유할 수 있는 적절한 배지(예를 들어, 최소 필수 배지 또는 RPMI Media 1640 또는, X-vivo 15(Lonza))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는 계면활성제, 플라스마네이트, 및 환원제 예컨대 N-아세틸-시스테인 및 2-메르캅토에탄올을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 배지는 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, 및 X-Vivo 20, Optimizer를 포함할 수 있으며, 아미노산, 나트륨 피루베이트, 및 비타민이 첨가되거나, 무혈청이거나 또는 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 정의된 일련의 호르몬, 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토카인(들)이 보충된다. 항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험 배양물에만 포함되며, 대상체에게 주입될 세포 배양물에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지원하는 데 필요한 조건, 예를 들어, 적절한 온도(예를 들어, 37℃) 및 대기(예를 들어, 공기 + 5% CO2) 하에 유지된다. 다양한 자극 시간에 노출된 T 세포는 상이한 특성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 전형적인 혈액 및 분리반출법 말초 혈액 단핵 세포 생성물은 세포독성 또는 억제인자 T 세포 집단(TC, CD8)보다 더 큰 헬퍼 T 세포 집단(TH, CD4+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체를 자극함으로써 T 세포의 생체외 확장은 약 8-9 일 전에 주로 TH 세포로 이루어진 T 세포 집단을 생성하는 반면, 약 8-9 일 후에, T 세포 집단은 TC 세포의 점점 증가하는 더 큰 집단을 포함한다. 따라서, 치료 목적에 따라, 주로 TH 세포를 포함하는 T 세포 집단을 대상체에게 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게, TC 세포의 항원-특이적 서브셋이 단리된 경우 이 서브셋을 더 큰 정도로 확장하는 것이 유익할 수 있다.
추가로, CD4 및 CD8 마커 이외에, 다른 표현형 마커가 유의하게 다르지만, 대부분 세포 확장 과정 동안 재현가능하다. 따라서, 이러한 재현성은 활성화된 T 세포 생성물을 특이적 목적에 맞추는 능력을 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 방법은 변형된 세포 또는 조작될 세포의 표면 상에서 하나 이상의 마커의 발현을 평가하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 방법은 예를 들어, 유세포 분석법과 같은 친화도-기반 검출 방법에 의해 TCR, MHC I, 또는 CD3(예를 들어, CD3ε)의 표면 발현을 평가하는 것을 포함한다. 방법이 항원 또는 다른 마커의 표면 발현을 나타내 보이는 일부 측면에서, 항원 또는 다른 마커를 암호화하는 유전자는 예를 들어, 본원에 기재된 방법을 사용하여 파괴되거나 또는 달리 발현이 억제된다.
변형된 T 세포의 단리 및 풍부화
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 제1 및/또는 제2 핵산을 포함하는 T 세포를 단리 또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef, Nef 하위유형, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포로부터 CD3ε/γ/δ-음성 T 세포를 단리 또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 외인성 Nef 단백질을 발현하는 변형된 T 세포로부터 내인성 TCRα/β-음성 T 세포를 단리 또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 외인성 Nef 단백질을 발현하는 변형된 T 세포로부터 내인성 MHC I-음성 T 세포를 단리 또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 외인성 Nef 단백질을 발현하는 변형된 T 세포로부터 CD4+ 및/또는 CD28+ T 세포를 단리 또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체 또는 본원에 기재된 BCMA CAR을 발현하는 변형된 T 세포를 단리 또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포의 단리 또는 풍부화는 본원에 기재된 방법의 임의의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리 방법은 표면 마커, 예를 들어, 표면 단백질, 세포내 마커, 또는 핵산과 같은 하나 이상의 특이적 분자의 세포 내의 부재 또는 존재에 기반한 상이한 세포 유형의 분리를 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체), BCMA CAR, CD4, CD28, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, CD69, TCRα, TCRβ, 및/또는 MHC I이다. 일부 구현예에서, 이러한 마커에 기반한 분리를 위한 임의의 알려진 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 분리는 친화도- 또는 면역친화도-기반 분리이다. 예를 들어, 일부 측면에서 단리는 예를 들어, 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와 인큐베이션 후, 일반적으로 세척 단계 및 항체 또는 결합 파트너가 결합되지 않은 이러한 세포로부터 항체 또는 결합 파트너가 결합된 세포의 분리에 의해 하나 이상의 마커, 전형적으로 세포 표면 마커의 세포의 발현 수준 또는 발현에 기반한 세포 및 세포 집단의 분리를 포함한다.
이러한 분리 단계는 시약에 결합되는 세포가 추가 사용을 위해 유지되는 양성 선택, 및/또는 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 세포가 유지되는 음성 선택에 기반할 수 있다. 일부 예에서, 두 분획은 추가 사용을 위해 유지된다. 일부 측면에서, 음성 선택은 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 인식하는 항체가 이용가능하지 않는 경우 특히 유용할 수 있어, 분리가 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발현되는 마커에 기반하여 최상으로 수행될 수 있도록 한다.
분리는 특정 세포 집단 또는 특정 마커를 발현하는 세포의 100% 풍부화 또는 제거를 초래할 필요가 없다. 예를 들어, 마커를 발현하는 것들과 같은 특정 유형의 세포의 양성 선택 또는 이에 대한 풍부화는 이러한 세포의 수 또는 백분율을 증가시키지만, 마커를 발현하지 않는 세포의 완전한 부재를 초래할 필요는 없다는 것을 언급한다. 마찬가지로, 마커를 발현하는 것들과 같은 특정 유형의 세포의 음성 선택, 제거, 또는 고갈은 이러한 세포의 수 또는 백분율을 감소시키지만, 이러한 모든 세포의 완전한 제거를 초래할 필요는 없다는 것을 언급한다.
일부 예에서, 수 차례의 분리 단계가 수행되며, 여기서 하나의 단계로부터 양성으로 또는 음성으로 선택된 분획은 후속 양성 또는 음성 선택과 같은 또 다른 분리 단계에 적용된다. 일부 예에서, 단일 분리 단계는 각각이 음성 선택을 위해 표적화된 마커에 특이적인 복수의 항체 또는 결합 파트커와 세포를 인큐베이션하는 것과 같이 동시에 다중 마커를 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있다. 마찬가지로, 다중 세포 유형은 다양한 세포 유형에서 발현되는 복수의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 인큐베이션함으로써 동시에 양성으로 선택될 수 있다.
예를 들어, 일부 측면에서, 양성이거나 또는 하나 이상의 표면 마커를 높은 수준으로 발현하는 세포와 같은 T 세포의 특이적 하위집단, 예를 들어, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+　T 세포는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 단리된다.
예를 들어, CD3+, CD28+　T 세포는 CD3/CD28 접합된 자기 비드(예를 들어, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T 세포 확장기)를 사용하여 양성으로 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 단리는 양성 선택에 의한 특정 세포 집단에 대한 풍부화, 또는 음성 선택에 의한 특정 세포 집단의 고갈에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 양성 또는 음성 선택은 발현되거나 또는 각각 양성으로 또는 음성으로 선택된 세포 상에서 상대적으로 더 높은 수준(마커높음)에서 발현되는(마커+) 하나 이상의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 다른 결합제와 세포를 인큐베이션함으로써 달성된다.
일부 측면에서, 샘플 또는 분리될 세포의 조성물은 자기 반응성 입자와 같은 작은 자화성 또는 자기 반응성 물질 또는 상자성 비드(예를 들어, 예컨대 Dynabeads 또는 MACS 비드)와 같은 미세입자와 인큐베이션된다. 자기 반응성 물질, 예를 들어, 입자는 일반적으로 분리하기에 바람직한, 예를 들어, 음성으로 또는 양성으로 선택하기에 바람직한 세포, 세포들, 또는 세포 집단 상에 존재하는 분자, 예를 들어, 표면 마커에 특이적으로 결합하는 결합 파트너, 예를 들어, 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된다.
일부 구현예에서, 자기 입자 또는 비드는 항체 또는 다른 결합 파트너와 같은 특이적 결합 구성원에 결합된 자기 반응성 물질을 포함한다. 자기 분리 방법에 사용되는 많은 잘 알려진 자기 반응성 물질이 있다. 적합한 자기 입자는 Molday, 미국 특허 번호 제4,452,773호, 및 유럽 특허 명세서 EP 452342 B에 기재된 것들을 포함하며, 이들은 본원에 참조로 포함된다. Owen 미국 특허 번호 제4,795,698호, 및 Liberti 등, 미국 특허 번호 제5,200,084호에 기재된 것들과 같은 콜로이드 크기 입자는 다른 예이다.
인큐베이션은 일반적으로 항체 또는 결합 파트너, 또는 자기 입자 또는 비드에 부착된 이러한 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 분자, 예컨대 2차 항체 또는 다른 시약이 샘플 내의 세포 상에 존재하는 경우 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 조건 하에 수행된다.
일부 구현예에서, 샘플은 자기장에 배치되고, 이에 부착된 자기 반응성 또는 자화성 입자를 갖는 세포는 자석으로 유인되고 비표지된 세포로부터 분리될 것이다. 양성 선택의 경우, 자석으로 유인된 세포가 유지되고; 음성 선택의 경우, 유인되지 않은 세포(비표지된 세포)가 유지된다. 일부 측면에서, 양성 및 음성 선택의 조합은 동일한 선택 단계 동안 수행되며, 여기서 양성 및 음성 분획은 유지되고 추가로 처리되거나 또는 추가 분리 단계에 적용된다.
특정 구현예에서, 자기 반응성 입자는 1차 항체 또는 다른 결합 파트너, 2차 항체, 렉틴, 효소, 또는 스트렙타비딘으로 코팅된다. 특정 구현예에서, 자기 입자는 하나 이상의 마커에 특이적인 1차 항체의 코팅을 통해 세포에 부착된다. 특정 구현예에서, 비드보다는 세포가 1차 항체 또는 결합 파트너로 표지된 다음, 및 세포-유형 특이적 2차 항체- 또는 다른 결합 파트너(예를 들어, 스트렙타비딘)-코팅된 자기 입자가 첨가된다. 특정 구현예에서, 스트렙타비딘-코팅된 자기 입자는 비오티닐화 1차 또는 2차 항체와 함께 사용된다.
일부 구현예에서, 자기 반응성 입자는 후속적으로 인큐베이션, 배양 및/또는　조작될 세포에 부착된 채로 남아있으며; 일부 측면에서, 입자는 환자에게 투여하기 위한 세포에 부착된 채로 남아있다. 일부 구현예에서, 자화성 또는 자기 반응성 입자는 세포로부터 제거된다. 세포로부터 자화성 입자를 제거하기 위한 방법은 알려져 있으며 예를 들어, 경쟁 비-표지된 항체, 자화성 입자 또는 절단가능한 링커에 접합된 항체 등의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 자화성 입자는 생분해성이다.
일부 구현예에서, 친화도-기반 선택은 자기-활성화 세포 분류(MACS)(Miltenyi Biotec, 캘리포니아주 오번 소재)를 통한 것이다. 자기 활성화 세포 분류(MACS) 시스템은 자화 입자가 부착된 세포의 고순도 선택을 가능하게 한다. 특정 구현예에서, MACS는 비-표적 및 표적 종이 외부 자기장의 인가 후 순차적으로 용출되는 모드에서 작동한다. 즉, 자화 입자에 부착된 세포는 제자리에 유지되는 반면 부착되지 않은 종은 융출된다. 그런 다음, 이 첫번째 용출 단계가 완료되면, 자기장에 갇히고 용출되는 것이 방지된 종은 용출되고 회수될 수 있도록 일부 방식으로 유리된다. 특정 구현예에서, 비-표적 세포는 표지되고 세포의 이종 집단으로부터 고갈된다.
특정 구현예에서, 단리 또는 분리는 방법 중 단리, 세포 제조, 분리, 처리, 인큐베이션, 배양, 및/또는 제형화 단계 중 하나 이상을 수행하는 시스템, 장치, 또는 기계를 사용하여 수행된다. 일부 측면에서, 시스템은 예를 들어, 오류, 사용자 취급 및/또는 오염을 최소화하기 위해 폐쇄 또는 멸균 환경에서 이들 단계를 각각 수행하는 데 사용된다. 일 예에서, 시스템은 국제 특허 출원 공개 번호 WO2009/072003, 또는 US 20110003380 A1에 기재된 바와 같은 시스템이다.
일부 구현예에서, 시스템 또는 기계는 통합 또는 자급식 시스템에서, 및/또는 자동화 또는 프로그램화 방식으로 단리, 처리, 조작, 및 제형화 단계 중 하나 이상, 예를 들어 모두를 수행한다. 일부 측면에서, 시스템 또는 기계는 사용자가 처리, 단리, 조작, 및 제형화 단계의 결과를 프로그램밍, 제어, 평가하고/하거나, 이의 다양한 측면을 조정하도록 시스템 또는 기계와 통신하는 컴퓨터 및/또는 컴퓨터 프로그램을 포함한다.
일부 측면에서, 분리 및/또는 다른 단계는 예를 들어, 폐쇄 및 멸균 시스템에서 임상-규모 수준에서 세포의 자동화 분리를 위해 CliniMACS 시스템(Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행된다. 구성요소는 통합 마이크로컴퓨터, 자기 분리 장치, 연동 펌프, 및 다양한 핀치 밸브를 포함할 수 있다. 통합 컴퓨터는 일부 측면에서 기기의 모든 구성요소를 제어하고 시스템이 표준화된 순서로 반복된 절차를 수행하도록 지시한다. 자기 분리 장치는 일부 측면에서 이동가능한 영구 자석 및 선택 칼럼용 홀더를 포함한다. 연동 펌프는 튜빙 세트 전반에 걸쳐 유속을 제어하고, 핀치 밸브와 함께 시스템을 관통하는 완충액의 제어된 흐름 및 세포의 지속적인 현탁을 보장한다.
CliniMACS 시스템은 일부 측면에서 멸균된 비발연성 용액에 공급되는 항체-커플링된 자화성 입자를 사용한다. 일부 구현예에서, 세포를 자기 입자로 표지한 후 세포를 세척하여 과량의 입자를 제거한다. 그런 다음 세포 제조 백을 튜빙 세트에 연결하고, 차례로 완충액을 함유하는 백 및 세포 수집 백에 연결한다. 튜빙 세트는 사전-칼럼 및 분리 칼럼을 포함하는 사전-조립된 멸균 튜빙으로 이루어지고, 일회용이다. 분리 프로그램의 개시 후, 시스템은 자동적으로 세포 샘플을 분리 컬럼 위에 적용한다. 표지된 세포는 칼럼 내에 유지되는 반면, 비표지된 세포는 일련의 세척 단계에 의해 제거된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 비표지되고 칼럼에서 유지되지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 표지되고 칼럼에서 유지된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 자기장의 제거 후 칼럼으로부터 용출되고, 세포 수집 백 내에 수집된다.
특정 구현예에서, 분리 및/또는 다른 단계는 CliniMACS Prodigy 시스템(Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행된다. CliniMACS Prodigy 시스템은 일부 측면에서 원심분리에 의해 세포의 자동화 세척 및 분획화를 허용하는 세포 처리 장치가 장착되어 있다. CliniMACS Prodigy 시스템은 또한 공급원 세포 생성물의 거시적 층을 포착함으로써 최적의 세포 분획화 종점을 결정하는 온보드 카메라 및 이미지 인식 소프트웨어를 포함할 수 있다. 예를 들어, 말초 혈액은 자동적으로 적혈구, 백혈구 및 혈장 층으로 분리된다. CliniMACS Prodigy 시스템은 또한 예를 들어, 세포 분화 및 확장, 항원 로딩, 및 장기간 세포 배양과 같은 세포 배양 프로토콜을 수행하는 통합 세포 경작 챔버를 포함할 수 있다. 입력 포트는 배지의 멸군 제거 및 보충을 허용할 수 있고 세포는 통합 현미경을 사용하여 모니터링될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 세포 집단은 유세포 분석법을 통해 수집 및 풍부화(또는 고갈)되며, 여기서 다중 세포 표면 마커에 대해 염색된 세포는 유체 스트림으로 운반된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 세포 집단은 제조 규모 (FACS)-분류를 통해 수집 및 풍부화(또는 고갈)된다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 세포 집단은 FACS-기반 검출 시스템과 조합된 미세전자기계 시스템(MEMS) 칩의 사용에 의해 수집 및 풍부화(또는 고갈)된다(예를 들어, WO 2010/033140, Cho 등 (2010)　Lab Chip　10, 1567-1573; 및 Godin 등 (2008) J Biophoton. 1 (5):355-376 참조. 두 경우, 세포는 고순도로 잘 정의된 T 세포 서브셋의 단리를 허용하는 다중 마커로 표지될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 양성 및/또는 음성 선택을 위한 분리를 용이하게 하기 위해 하나 이상의 검출가능한 마커로 표지된다. 예를 들어, 분리는 형광으로 표지된 항체에 대한 결합에 기반할 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 세포 표면 마커에 특이적인 항체 또는 다른 결합 파트너의 결합에 기반한 세포의 분리는 예를 들어, 유세포 분석 검출 시스템과 조합하여 제조 규모 (FACS) 및/또는 미세전자기계 시스템(MEMS) 칩을 포함하는 형광-활성화 세포 분류(FACS)에 의한 것과 같은 유체 스트림에서 수행된다. 이러한 방법은 다중 마커에 기반한 양성 및 음성 선택을 동시에 허용한다.
또한 단리 및/또는 풍부화 방법에 대한 "실시예" 섹션을 참조한다.
내인성 유전자좌의 유전자-편집
일부 구현예에서, 내인성 TCR 유전자좌(예를 들어, TCRα, TCRβ) 또는 B2M(베타-2-마이크로글로불린; MHC　클래스 I 분자 발현의 결핍 및/또는 CD8+ T 세포의 고갈로 이어질 수 있음)과 같은 T 세포의 내인성 유전자좌는 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef, Nef 하위유형, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef), BCMA CAR, 및/또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 발현하도록 T 세포를 변형하기 전에 또는 동시에 유전자-편집 방법에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 내인성 유전자좌의 변형은 녹아웃(knock-out), 삽입, 미스센스 또는 프레임시프트 돌연변이, 예컨대 이중 대립유전자 프레임시프트 돌연변이, 유전자의 전부 또는 일부, 예를 들어, 하나 이상의 엑손 또는 이의 부분의 결실, 및/또는 녹인(knock-in)과 같은 유전자에서 파괴를 실행함으로써 수행된다. 일부 구현예에서, 이러한 유전자좌 변형은 유전자에 특이적으로 결합하거나 또는 혼성화하는 DNA-결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산과 같은 DNA-표적화 분자, 또는 이를 함유하는 복합체, 화합물, 또는 조성물을 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 분자는 DNA-결합 도메인, 예를 들어, 아연 핑거 단백질(ZFP) DNA-결합 도메인, 전사 활성인자-유사 단백질(TAL) 또는 TAL 효과기(TALE) DNA-결합 도메인, 클러스터링된 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복부(CRISPR) DNA-결합 도메인, 또는 메가뉴클레아제로부터의 DNA-결합 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 내인성 유전자좌(예를 들어, TCR 또는 B2M)의 변형은 RNA-가이드 엔도뉴클레아제(RGEN)를 통한 파괴, 또는 또 다른 RNA-가이드 효과기 분자에 의한 억제의 다른 형태와 같은 하나 이상의 DNA-결합 핵산을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 억제는 클러스터링된 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복부(CRISPR) 및 CRISPR-연관(Cas) 단백질을 사용하여 수행된다. Sander and Joung,　Nature Biotechnology,　32 (4): 347-355 참조.
일반적으로, "CRISPR 시스템"은 집합적으로 Cas 유전자를 암호화하는 서열, tracr(트랜스-활성화 CRISPR) 서열(예를 들어 tracrRNA 또는 활성 부분적 tracrRNA), tracr-짝 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "직접 반복" 및 tracrRNA-처리된 부분적 직접 반복 포함), 가이드 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"로도 지칭됨), 및/또는 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사체를 포함하는 CRISPR-연관("Cas") 유전자의 발현 또는 활성을 지시하는 데 수반되는 전사체 및 다른 요소를 지칭한다.
일부 구현예에서, CRISPR/Cas 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 뉴클레아제 기능성(예를 들어, 2 개의 뉴클레아제 도메인)이 있는 DNA, 및 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)에 서열-특이적으로 결합하는 비-코딩 RNA 분자(가이드) RNA를 포함한다.
일부 구현예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 유형 I, 유형 II, 또는 유형 III CRISPR 시스템에서 유래된다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)와 같은 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체에서 유래된다.
일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제 및 gRNA(표적 서열에 특이적인 crRNA 및 고정된 tracrRNA의 융합 포함)는 세포 내로 도입된다. 일반적으로, gRNA의 5' 단부에 있는 표적 부위는 상보성 염기 쌍형성을 사용하여 Cas 뉴클레아제를 표적 부위, 예를 들어 유전자에 표적화한다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 전형적으로 NGG, 또는 NAG와 같은 프로토 스페이서 인접 모티프(PAM) 서열의 바로 5' 위치에 기반하여 선택된다. 이와 관련하여, gRNA는 표적 DNA 서열에 상응하도록 가이드 RNA의 처음 20 개 뉴클레오티드를 변형시킴으로써 원하는 서열로 표적화된다. 일부 구현예에서, gRNA는 서열번호: 108 또는 233의 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CRISPR 시스템은 표적 부위에서 DSB를 유도한다. 다른 구현예에서, "닉카제"로 간주되는 Cas9 변이체는 표적 부위에서 단일 가닥을 닉(nick)하는 데 사용된다. 일부 측면에서, 쌍형성된 닉카제는 예를 들어 특이성을 개선하기 위해 사용되며, 각각은 닉의 도입 시 동시에, 5' 돌출부가 도입되도록 한 쌍의 상이한 gRNA 표적화 서열에 의해 지시된다. 다른 구현예에서, 촉매적으로 불활성인 Cas9는 유전자 발현에 영향을 미치기 위해 전사 억제인자 또는 활성인자와 같은 이종 효과기 도메인에 융합된다.
일부 구현예에서, T 세포의 내인성 유전자좌(예를 들어, 내인성 TCR 또는 B2M)는 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef), BCMA CAR, 및/또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 발현하도록 T 세포를 변형시키기 전에 CRISPR/Cas 시스템에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, T 세포의 내인성 유전자좌(예를 들어, 내인성 TCR 또는 B2M)는 외인성 Nef 단백질, BCMA CAR, 및/또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 발현하도록 T 세포를 변형시키는 것과 동시에 CRISPR/Cas 시스템에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 시스템을 암호화하는 핵산(들) 및 외인성 Nef 단백질, BCMA CAR, 및/또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 암호화하는 핵산(들)은 동일한 벡터 상에 있으며, 동일한 프로모터 또는 상이한 프로모터에 의해 임의적으로 제어된다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 시스템을 암호화하는 핵산(들) 및 외인성 Nef 단백질, BCMA CAR, 및/또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 암호화하는 핵산(들)은 상이한 벡터 상에 있다.
VIII. 약제학적 조성물
다음을 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포): i) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef), 및 ii) 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체), 및 임의적으로 약제학적으로 허용되는 담체 중 임의의 하나를 포함하는 약제학적 조성물이 본 출원에 의해 추가로 제공된다. 또한 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포), 및 임의적으로 약제학적으로 허용되는 담체 중 임의의 하나를 포함하는 약제학적 조성물이 본 출원에 의해 제공된다. 또한 본원에 기재된 BCMA CAR를 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포), 및 임의적으로 약제학적으로 허용되는 담체 중 임의의 하나를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 또한 다음을 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포): i) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 비-자연 발생 Nef 단백질, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef), 및 ii) 본원에 기재된 BCMA CAR, 및 임의적으로 약제학적으로 허용되는 담체 중 임의의 하나를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 비-자연 발생 Nef 단백질, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포), 및 임의적으로 약제학적으로 허용되는 담체 중 임의의 하나를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 본원에 기재된 변형된 T 세포 집단을 수용액 형태의 임의적인 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 제조될 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 일부 구현예에서, 변형된 T 세포의 집단은 균질하다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 핵산을 보유하는 벡터로 형질도입/형질감염된 변형된 T 세포 집단의 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)는 TCRα/TCRβ 음성, Nef-양성, MHC I-음성, 및/또는 CD3ε/γ/δ-음성이다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 비-자연 발생 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 핵산을 보유하는 벡터로 형질도입/형질감염된 변형된 T 세포 집단의 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)는 CD4-양성 및/또는 CD28-양성이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 핵산을 보유하는 벡터로 형질도입/형질감염된 변형된 T 세포 집단의 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)는 ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체-양성이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 BCMA CAR을 암호화하는 핵산을 보유하는 벡터로 형질도입/형질감염된 변형된 T 세포 집단의 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)는 BCMA CAR-양성이다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산 및 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 제2 핵산으로 형질도입/형질감염된 변형된 T 세포 집단의 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)는 [TCRα/TCRβ 음성, Nef-양성, MHC I-음성, 및/또는 CD3ε/γ/δ-음성] 및 [ITAM-변형된 기능적 외인성 수용체-양성]이다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 비-자연 발생 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산 및 본원에 기재된 BCMA CAR을 암호화하는 제2 핵산으로 형질도입/형질감염된 변형된 T 세포 집단의 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)는 [TCRα/TCRβ 음성, Nef-양성, MHC I-음성, 및/또는 CD3ε/γ/δ-음성] 및 [BCMA CAR-양성]이다. 제1 및 제2 핵산은 동일한 벡터, 또는 별개의 벡터 상에 있을 수 있다. 제1 및 제2 핵산은 동일한 프로모터, 또는 상이한 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 이용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 완충제, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E, 나트륨 메타비술파이트를 포함하는 산화방지제; 방부제, 등장화제, 안정화제, 금속 복합체(예를 들어 Zn-단백질 복합체); 킬레이트화제 예컨대 EDTA 및/또는 비-이온성 계면활성제를 포함한다.
완충제는 특히 안정성이 pH 의존적인 경우 치료 효과를 최적화하는 범위에서 pH를 제어하는 데 사용된다. 완충제는 바람직하게는 약 50 mM 내지 약 250 mM 범위의 농도로 존재한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 완충제는 유기 및 무기 산 및 이의 염을 모두 포함한다. 예를 들어, 시트레이트, 포스페이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 옥살레이트, 락테이트, 아세테이트. 추가적으로, 완충제는 히스티딘 및 트리메틸아민 염 예컨대 Tris를 포함할 수 있다.
방부제는 미생물 성장을 지연시키기 위해 첨가되고, 전형적으로 0.2%-1.0%(w/v) 범위로 존재한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 방부제는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 할라이드(예를 들어, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드), 벤즈에토늄 클로라이드; 티메로살, 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀, 3-펜타놀, 및 m-크레솔을 포함한다.
때때로 "안정화제"로 알려진 등장화제는 조성물에서 액체의 등장성을 조정하거나 또는 유지하기 위해 존재한다. 단백질 및 항체와 같은 큰 하전된 생체분자와 함께 사용될 때, 이들은 종종 아미노산 측쇄의 하전된 기와 상호작용할 수 있어, 분자간 및 분자내 상호작용에 대한 가능성을 줄일 수 있기 때문에 "안정화제"라고 불린다. 등장화제는 다른 성분의 상대적 양을 고려하여 0.1 중량% 내지 25 중량%, 바람직하게는 1 내지 5% 사이의 임의의 양으로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 등장화제는 다가 당 알코올, 바람직하게는 3가 이상의 당 알코올, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다.
추가적인 부형제는 다음 중 하나 이상으로 작용할 수 있는 제제를 포함한다: (1) 증량제, (2) 가용성 인핸서, (3) 안정화제 및 (4) 및 변성 또는 용기 벽에 부착을 방지하는 제제. 이러한 부형제는 다음을 포함한다: 다가 당 알코올(상기 열거됨); 아미노산 예컨대 알라닌, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 오르니틴, 류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등; 유기 당 또는 당 알코올 예컨대 수크로스, 락토스, 락티톨, 트레할로스, 스타키오스, 만노스, 소르보스, 크실로스, 리보스, 리비톨, 미오이니시토스, 미오이니시톨, 갈락토스, 갈락티톨, 글리세롤, 사이클리톨(예를 들어, 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜; 황 함유 환원제, 예컨대 우레아, 글루타티온, 티옥트산, 나트륨 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 나트륨 티오 술페이트; 저분자량 단백질 예컨대 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 다른 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 단당류(예를 들어, 크실로스, 만노스, 프룩토스, 글루코스; 이당류(예를 들어, 락토스, 말토스, 수크로스); 삼당류 예컨대 라피노스; 및 다당류 예컨대 덱스트린 또는 덱스트란.
비-이온성 계면활성제 또는 세제("습윤제"로도 알려짐)는 치료제를 가용화하는 것을 돕고 교반-유도된 응집으로부터 치료 단백질을 보호하기 위해 존재하며, 이는 또한 활성 치료 단백질 또는 항체의 변성을 야기하지 않고 제형을 전단 표면 응력에 노출시킨다. 비-이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 바람직하게는 약 0.07 mg/mL 내지 약 0.2 mg/mL의 범위로 존재한다.
적합한 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트(20, 40, 60, 65, 80 등), 폴리옥사머(184, 188 등), PLURONIC® 폴리올, TRITON®, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르(TWEEN®-20, TWEEN®-80 등), 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸레 수소화 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 수크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스를 포함한다. 사용될 수 있는 음이온성 세제는 나트륨 라우릴 술페이트, 디옥틸 나트륨 술포숙시네이트 및 디옥틸 나트륨 술포네이트를 포함한다. 양이온성 세제는 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤즈에토늄 클로라이드를 포함한다.
약제학적 조성물이 생체내 투여에 사용되기 위해서는 멸균되어야 한다. 약제학적 조성물은 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 멸균될 수 있다. 본원에서 약제학적 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어, 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알 내에 배치된다.
투여 경로는 적합한 방식, 예를 들어 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 병변내 또는 관절내 경로, 또는 지속 방출 또는 연장-방출 수단에 의한 주사 또는 주입으로 장기간에 걸쳐 단일 또는 다중 볼루스 또는 주입과 같은 알려지고 채택된 방법에 따른다.
지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 길항제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 매트릭스는 성형 물품 형태, 예를 들어 필름, 또는 마이크로캡슐이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(미국 특허 번호 제3,773,919호), L-글루탐산 및 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예컨대 LUPRON DEPOT™(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구체), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 화합물 또는 제제, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 조성물은 세포독성제, 화학치료제, 사이토카인, 면역억제제, 면역 체크포인트 조절인자, 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다.
활성 성분은 또한 예를 들어, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마이크로에멀젼에서 각각 하이드록실메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 18번째 개정판에 개시되어 있다.
IX. 치료 방법
본 출원은 유효량의 다음을 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포): i) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 비-자연 발생 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef); 및 ii) 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체), 또는 이의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체(예를 들어, 인간)에서 질환(예컨대 암, 감염성 질환, GvHD, 이식 거부, 자가면역 장애, 또는 방사선병)을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 또한 유효량의 다음을 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포): i) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 비-자연 발생 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef); 및 ii) 본원에 기재된 BCMA CAR, 또는 이의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체(예를 들어, 인간)에서 질환(예컨대 암, GvHD, 이식 거부)을 치료하는 방법이 제공된다. 본 출원은 또한 유효량의 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포), 또는 이의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체(예를 들어, 인간)에서 질환(예컨대 암, 감염성 질환, 자가면역 장애, 또는 방사선병)을 치료하는 방법을 제공한다. 본 출원은 또한 유효량의 본원에 기재된 BCMA CAR을 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포), 또는 이의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체(예를 들어, 인간)에서 질환(예컨대 BCMA-관련 암)을 치료하는 방법을 제공한다. 또한 유효량의 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체(예를 들어, 인간)에서 질환(예컨대 GvHD 또는 이식 거부)을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 ITAM-변형된 CAR, 예를 들어, ITAM-변형된 CD20 CAR(예를 들어, 서열번호: 73 및 170-175 중 임의의 것의 서열을 포함), 또는 ITAM-변형된 BCMA CAR(예를 들어, 서열번호: 71, 109, 153-169, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 서열을 포함)을 발현한다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 70, 71, 109, 110, 153-169, 176-182, 및 205 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 BCMA CAR과 같은 BCMA CAR(예를 들어, ITAM-변형된 BCMA CAR)을 발현한다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 i) 서열번호: 79-89, 198-204, 207-231, 및 235-247 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, ii) 서열번호: 235-247 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재하는 것이거나; 또는 iii) 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재하는 것인, 외인성 Nef 단백질과 같은 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 추가로 발현한다.
본원에 기재된 방법은 고형 암 또는 액상 암을 둘 다 포함하는 다양한 암을 치료하는 데 적합하다. 방법은 초기 단계, 진행 단계 및 전이성 암을 포함하는 모든 단계의 암에 적용가능하다. 본원에 기재된 방법은 제1 요법, 제2 요법, 제3 요법, 또는 보조 설정 또는 신보조 설정으로 화학요법, 수술, 방사선, 유전자 요법, 면역요법, 골수 이식, 줄기 세포 이식, 표적화 요법, 냉동요법, 초음파 요법, 광역학적 요법, 고주파 절제 등과 같은 당업계에 알려진 다른 유형의 암 요법과의 조합 요법으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 결장암, 직장암, 신세포 암종, 간암, 폐의 비-소세포 암종, 소장의 암, 식도의 암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부의 암, 피부 또는 안 내의 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부의 암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경관의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 내분비계의 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 부신의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 소아기의 고형 종양, 방광의 암, 신장 또는 요관의 암, 신우의 암종, 중추신경계(CNS)의 신생물, 1차 CNS 림프종, 종양 혈관형성, 척추 종양, 뇌간 교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 유표피암, 편평세포암, T-세포 림프종, 환경적으로 유도된 암, 상기 암의 조합, 및 상기 암의 전이성 병변으로 이루어진 군으로부터 선택된 고형 암을 치료하는 데 적합하다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 백혈병, 급성 림프성 백혈병(ALL), B-세포 급성 림프성 백혈병(B-ALL), T-세포 급성 림프성 백혈병(T-ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), B 세포 전림프구성 백혈병, 모구 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 모발 세포 백혈병, 소세포- 또는 거대 세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 형질모세포 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 또는 전백혈병 중 하나 이상으로부터 선택된 혈액암을 치료하는 데 적합하다.
일부 구현예에서, 암은 다발성 골수종이다. 일부 구현예에서, 암은 Durie-Salmon 병기 시스템에 기반한 I기, II기 또는 III기, 및/또는 A기 또는 B기 다발성 골수종이다. 일부 구현예에서, 암은 국제 골수종 작업 그룹(IMWG)에 의해 공개된 국제 병기 시스템에 기반한 I기, II기 또는 III기 다발성 골수종이다. 일부 구현예에서, 암은 의미불명 단클론 감마글로불린병증(MGUS)이다. 일부 구현예에서, 암은 무증후성(무증상/무통성) 골수종이다. 일부 구현예에서, 암은 증후성 또는 활성 골수종이다. 일부 구현예에서, 암은 난치성 다발성 골수종이다. 일부 구현예에서, 암은 전이성 다발성 골수종이다. 일부 구현예에서, 개체는 다발성 골수종에 대한 이전 치료에 반응하지 않았다. 일부 구현예에서, 개체는 다발성 골수종의 이전 치료 후에 진행성 질환을 갖는다. 일부 구현예에서, 개체는 이전에 다발성 골수종에 대한 적어도 약 2, 3, 4 회 또는 그 이상의 치료 중 임의의 하나를 받은 적이 있다. 일부 구현예에서, 암은 재발성 다발성 골수종이다.
일부 구현예에서, 개체는 활성 다발성 골수종을 갖는다. 일부 구현예에서, 개체는 적어도 10%의 클론성 골수 형질 세포를 갖는다. 일부 구현예에서, 개체는 생검-입증된 뼈 또는 절개외 형질세포종을 갖는다. 일부 구현예에서, 개체는 기저 형질 세포 증식 장애에 기인할 수 있는 말단 기관 손상의 증거를 갖는다. 일부 구현예에서, 개체는 고칼슘혈증, 예를 들어, 정상 한계치보다 >0.25 mmol/L(>1 mg/dL) 더 높거나 또는 >2.75 mmol/L(>11 mg/dL)의 혈청 칼슘을 갖는다. 일부 구현예에서, 개체는 신부전, 예를 들어, 분 당 <40 mL의 크레아티닌 청소율 또는 혈청 크레아티닌 >177 mol/L(>2 mg/dL)를 갖는다. 일부 구현예에서, 개체는 빈혈, 예를 들어, 정상의 하한치 미만인 >20g/L의 헤모글로빈 값, 또는 헤모글로빈 값 <100 g/L를 갖는다. 일부 구현예에서, 개체는 하나 이상의 골 병변, 예를 들어, 골격 방사선 촬영, CT, 또는 PET/CT에서 하나 이상의 골용해성 병변을 갖는다. 일부 구현예에서, 개체는 다음 악성종양 바이오마커(MDE) 중 하나 이상을 갖는다: (1) 골수 검사 시 60% 이상의 클론 형질 세포; (2) 수반된 경쇄의 절대 수준이 적어도 100 mg/L이면, 100 이상의 혈청 수반/비수반 유리 경쇄 비율; 및 (3) MRI 시 적어도 5 mm 이상의 크기인 하나 초과의 국소 병변.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 자가면역 질환을 치료하는 데 적합하다. 자가면역 질환, 또는 자가면역은 유기체가 자신의 구성 부분을 (하위 분자 수준까지) "자기"로 인식하지 못하여, 자신의 세포 및 조직에 대한 면역 반응을 초래한다. 이러한 비정상적인 면역 반응을 초래하는 임의의 질환을 자가면역 질환이라고 부른다. 두드러진 예는 복강 질환, 제1형 진성 백혈병(IDDM), 전신 홍반성 루푸스(SLE), 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증(MS), 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 특발성 혈소판감소성 자반증, 및 류마티스 관절염(RA)을 포함한다.
염증성 질환은 일반적으로 매우 독성일 수 있는 코르티코스테로이드 및 세포독성 약물로 치료될 수 있다. 이들 약물은 또한 전체 면역계를 억제하고, 심각한 감염을 초래할 수 있고, 골수, 간, 및 신장에 대한 부작용을 갖는다. 지금까지 클래스 III 자가면역 질환을 치료하는 데 사용된 다른 치료제는 T 세포 및 대식세포에 대해 지시되었다. 자가면역 질환, 특히 클래스 III 자가면역 질환을 치료하는 더 효과적인 방법이 필요하다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 자가면역 질환이 또한 B-세포 장애와 연관된 질환의 부류인 것을 포함하여 염증성 질환을 치료하는 데 적합하다. 자가면역 질환의 예는 급성 특발성 혈소판감소성 자반증, 만성 특발성 혈소판감소성 자반증, 피부근염, 시드남 무도병, 중증 근무력증, 전신 홍반성 루푸스, 루푸스신염, 류마티스성 열, 다선성 증후군, 수포성 유천포창, 진성 백혈병, 쇤라인-헤노흐 자반증, 연쇄구균감염 후 사구체신염, 결절성 홍반, 타카야수 동맥염, 애디슨병, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 유육종증, 궤양성 대장염, 다형삼출홍반, IgA 신장병, 결절성다발성 동맥염, 강직성 척추염, 굿파스쳐 증후군, 폐색성혈전맥관염. 쇼그렌 증후군, 원발성 담즙 간경변, 하시모토 갑상선염, 갑상선기능항진증, 피부경화증, 만성 활동 간염, 다발성근염/피부근염, 다발연골염, 심상성 천포창, 베게너 육아종증, 막성 신장병, 근위축성 측색 경화증, 척수 매독, 거인 세포 동맥염/다발성근육통, 악성 빈혈, 급속 진행성 사구체신염, 건선, 및 섬유성 폐렴을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
약제학적 조성물의 투여는 주사, 수혈, 피하주입 또는 이식에 의한 것들을 포함하여 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 조성물은 환자에게 경동맥으로, 피하로, 피내로, 종양내로, 절내로, 골수내로, 근육내로, 정맥내로, 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 전신으로 투여된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 정맥내 주입과 같은 주입에 의해 개체에게 투여된다. 면역요법을 위한 주입 기술은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, Rosenberg 등, New Eng. J. of Med. 319: 1676 (1988) 참조). 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 피내 또는 피하 주사에 의해 개체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물은 정맥내 주사에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물은 종양, 또는 림프절 내로 직접 주사된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 종양의 부위에 국소로, 예컨대 종양 세포 내로 직접, 또는 종양 세포를 갖는 조직에 투여된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 투여량 및 원하는 약물 농도는 구상되는 특정 용도에 따라 달라질 수 있다. 적절한 투여량 또는 투여 경로의 결정은 당업자의 기술 범위 내에 있다. 동물 실험은 인간 요법에 대한 유효량의 결정을 위한 신뢰할 수 있는 지침을 제공한다. 유효량의 종간 척도는 Mordenti, J. and Chappell, W. "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics," In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi 등, Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-46에 의해 정해진 원칙에 따라 수행될 수 있다. 상이한 제형이 상이한 치료 및 상이한 장애에 효과적일 것이고, 특정 기관 또는 조직을 치료하도록 의도된 투여가 또 다른 기관 또는 조직에 대한 것과 상이한 방식으로 전달을 필요로 할 수 있음이 본 출원의 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 다음을 발현하는 변형된 T 세포 집단을 포함하는 약제학적 조성물의 경우: i) 외인성 Nef(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 비-자연 발생 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef) 및 ii) 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체), 또는 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 발현하는 변형된 T 세포 집단을 포함하는 약제학적 조성물의 경우, 약제학적 조성물은 적어도 약 104, 105, 106, 107, 108, 또는 109 개 세포/개체의 체중 kg 중 임의의 것의 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 다음을 발현하는 변형된 T 세포 집단을 포함하는 약제학적 조성물의 경우: i) 외인성 Nef(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 비-자연 발생 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef) 및 ii) 본원에 기재된 BCMA CAR, 또는 본원에 기재된 BCMA CAR을 발현하는 변형된 T 세포 집단을 포함하는 약제학적 조성물의 경우, 약제학적 조성물은 적어도 약 104, 105, 106, 107, 108, 또는 109 개 세포/개체의 체중 kg 중 임의의 것의 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 외인성 Nef(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 비-자연 발생 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)를 발현하는 변형된 T 세포 집단을 포함하는 약제학적 조성물의 경우, 약제학적 조성물은 적어도 약 104, 105, 106, 107, 108, 또는 109 개 세포/개체의 체중 kg 중 임의의 것의 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 104 내지 약 105, 약 105 내지 약 106, 약 106 내지 약 107, 약 107 내지 약 108, 약 108 내지 약 109, 약 104 내지 약 109, 약 104 내지 약 106, 약 106 내지 약 108, 또는 약 105 내지 약 107 개 세포/개체의 체중 kg 중 임의의 것의 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 적어도 약 임의의 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107 개 세포/kg 또는 그 이상의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 3x105 내지 약 7x106 개 세포/kg, 또는 약 3x106 개 세포/kg의 용량으로 투여된다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 단일 회로 투여된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 다수 회(예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상 중 임의의 것)로 투여된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 1 주에 1 회, 2 주에 1 회, 3 주에 1 회, 4 주에 1 회, 1 개월에 1 회, 2 개월에 1 회, 3 개월에 1 회, 4 개월에 1 회, 5 개월에 1 회, 6 개월에 1 회, 7 개월에 1 회, 8 개월에 1 회, 9 개월에 1 회, 또는 1 년에 1 회 투여된다. 일부 구현예에서, 투여 사이의 간격은 약 1 주 내지 2 주, 2 주 내지 1 개월, 2 주 내지 2 개월, 1 개월 내지 2 개월, 1 개월 내지 3 개월, 3 개월 내지 6 개월, 또는 6 개월 내지 1 년 중 임의의 하나이다. 특정 환자에 대한 최적의 투여량 및 치료 레지멘은 질환의 징후에 대해 환자를 모니터링하고 이에 따라 치료를 조정함으로써 의학 분야의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
더욱이, 투여량은 하나 이상의 개별 투여, 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 2, 3, 4, 5 회, 또는 그 이상의 용량 중 임의의 하나와 같은 분할 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 분할 용량은 약 1 주에 걸쳐 투여된다. 일부 구현예에서, 용량은 동일하게 분할된다. 일부 구현예에서, 분할 용량은 총 용량의 약 20%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50%이다. 일부 구현예에서, 연속 분할 용량 사이의 간격은 약 1 일, 2 일, 3 일 또는 그 이상이다. 수 일 또는 그 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 병태에 따라, 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 치료가 지속된다. 그러나, 다른 투여량 레지멘이 유용할 수 있다. 이 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
일부 구현예에서, 유효량의 다음을 포함하는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환(예를 들어, 암, 감염성 질환, GvHD, 이식 거부, 자가면역 장애, 또는 방사선병)이 있는 개체(예를 들어, 인간)를 치료하는 방법이 제공된다: (1) 다음을 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포): i) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 비-자연 발생 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef), 및 ii) 다음을 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체): (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되는 것; 및 (2) 임의적으로 약제학적으로 허용되는 담체. 일부 구현예에서, 유효량의 다음을 포함하는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환(예를 들어, 암, 감염성 질환, GvHD, 이식 거부, 자가면역 장애, 또는 방사선병)이 있는 개체(예를 들어, 인간)를 치료하는 방법이 제공된다: (1) 다음을 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포): i) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 비-자연 발생 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef), 및 ii) 다음을 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, CAR 예컨대 BCMA CAR 또는 CD20 CAR, 변형된 TCR, cTCR, 또는 TAC-유사 키메라 수용체): (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) ISD(예를 들어, CD3ζ ISD 포함); 및 (2) 임의적으로 약제학적으로 허용되는 담체. 일부 구현예에서, 질환은 암이다. 일부 구현예에서, 개체는 변형된 T 세포가 유래된 전구체 T 세포의 공여자와 조직부적합성이다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 기능적 외인성 수용체는 본원에 기재된 ITAM-변형된 CAR 중 임의의 것과 같은 ITAM-변형된 CAR, 예를 들어, ITAM-변형된 BCMA CAR 또는 ITAM-변형된 CD20 CAR이다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 서열번호: 71, 73, 109, 153-175, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 BCMA CAR은 서열번호: 71, 109, 153-169, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, BCMA CAR은 서열번호: 70, 110, 및 176 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CD20 CAR은 서열번호: 73 및 170-175 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD20 CAR은 서열번호: 72의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 79-89, 198-204, 및 207-231 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 84, 85, 또는 230의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 유효량의 다음을 포함하는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환(예를 들어, 암, 감염성 질환, 자가면역 장애, 또는 방사선병)이 있는 개체(예를 들어, 인간)를 치료하는 방법이 제공된다: (1) 다음을 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포): (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb) , 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) CMSD(예를 들어, 서열번호: 39-51 및 132-152로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CMSD)를 포함하는 ISD, 여기서 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 여기서 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 임의적으로 연결되는 것; 및 (2) 임의적으로 약제학적으로 허용되는 담체. 일부 구현예에서, 유효량의 다음을 포함하는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환(예를 들어, 암, 감염성 질환, 자가면역 장애, 또는 방사선병)이 있는 개체(예를 들어, 인간)를 치료하는 방법이 제공된다: (1) 다음을 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, CAR 예컨대 BCMA CAR 또는 CD20 CAR, 변형된 TCR, cTCR, 또는 TAC-유사 키메라 수용체)를 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포): (a) 세포외 리간드 결합 도메인(예컨대 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 예컨대 BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, sdAb), 수용체(예를 들어, FcR)의 세포외 도메인(또는 이의 부분), 리간드(예를 들어, APRIL, BAFF)의 세포외 도메인(또는 이의 부분)), (b) 막관통 도메인(예를 들어, CD8α에서 유래), 및 (c) ISD(예를 들어, CD3ζ ISD 포함); 및 (2) 임의적으로 약제학적으로 허용되는 담체. 일부 구현예에서, 질환은 암이다. 일부 구현예에서, 개체는 변형된 T 세포가 유래된 전구체 T 세포의 공여자와 조직부적합성이다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 기능적 외인성 수용체는 본원에 기재된 ITAM-변형된 CAR 중 임의의 것과 같은 ITAM-변형된 CAR, 예를 들어, ITAM-변형된 BCMA CAR 또는 ITAM-변형된 CD20 CAR이다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CAR은 서열번호: 71, 73, 109, 153-175, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 BCMA CAR은 서열번호: 71, 109, 153-169, 177-182, 및 205 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, BCMA CAR은 서열번호: 70, 110, 및 176 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM-변형된 CD20 CAR은 서열번호: 73 및 170-175 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD20 CAR은 서열번호: 72의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 유효량의 다음을 포함하는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환(예를 들어, GvHD, 이식 거부)이 있는 개체(예를 들어, 인간)를 치료하는 방법이 제공된다: (1) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 비-자연 발생 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포); 및 (2) 임의적으로 약제학적으로 허용되는 담체. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 79-89, 198-204, 및 207-231 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 84, 85, 또는 230의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 질환은 암이다. 일부 구현예에서, 암은 재발성 또는 난치성 다발성 골수종과 같은 다발성 골수종이다. 일부 구현예에서, 치료 효과는 개체에서 객관적인 임상 반응을 유발하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 엄격한 임상 반응(sCR)이 개체에서 수득된다. 일부 구현예에서, 치료 효과는 개체에서 질환 관해(부분적 또는 완전)를 유발하는 것을 포함한다. 일부에서 임상 관해는 개체가 약제학적 조성물을 받은 후 약 6 개월, 5 개월, 4 개월, 3 개월, 2 개월, 1 개월 이하 중 임의의 것 후에 수득된다. 일부 구현예에서, 치료 효과는 개체에서 암의 재발 또는 질환 진행을 예방하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 재발 또는 질환 진행은 적어도 약 6 개월, 1 년, 2 년, 3 년, 4 년, 5 년 또는 그 이상 동안 예방된다. 일부 구현예에서, 치료 효과는 개체에서 생존(예컨대 무질환 생존)을 연장하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 효과는 개체에서 삶의 질을 개선하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 효과는 고형 또는 림프 종양의 성장을 억제하거나 또는 크기를 감소시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 고형 또는 림프 종양의 크기는 적어도 약 10%(예를 들어 적어도 약 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 중 임의의 것 포함) 감소된다. 일부 구현예에서, 개체에서 고형 또는 림프 종양의 성장을 억제하거나 또는 크기를 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 치료 효과는 개체에서 종양 전이를 억제하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 약 10%(예를 들어 적어도 약 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 중 임의의 것 포함) 전이가 억제된다. 일부 구현예에서, 림프절로의 전이를 억제하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 폐로의 전이를 억제하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 간으로의 전이를 억제하는 방법이 제공된다. 전이는 혈액 검사, 뼈 스캔, x-선 스캔, CT 스캔, PET 스캔, 및 생검과 같은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다.
본 발명은 또한 Nef 단백질 및 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포), 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포), 이의 단리된 집단, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 사용하여 질환 및 장애를 감소 또는 개선시키거나, 또는 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 외인성 Nef 단백질 및 BCMA CAR을 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포), 본원에 기재된 BCMA CAR을 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포), 이의 단리된 집단, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 사용하여 질환 및 장애를 감소 또는 개선시키거나, 또는 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질 및 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포), 외인성 Nef 단백질 및 본원에 기재된 BCMA CAR을 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포), 이의 단리된 집단, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물은 암, 감염, 하나 이상의 자가면역 장애, 방사선병을 감소 또는 개선하거나, 또는 예방 또는 치료하거나, 또는 이식 수술을 겪는 대상체에서 이식편대숙주병(GvHD) 또는 이식 거부를 예방 또는 치료하는 데 사용된다.
외인성 Nef 단백질 및 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포), 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포), 외인성 Nef 단백질 및 본원에 기재된 BCMA CAR을 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포), 본원에 기재된 BCMA CAR을 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포), 이의 단리된 집단, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물은 이러한 T 세포가 발생 동안 TGF-β에서 성장될 수 있고 유도된 T 조절 세포가 되도록 분화될 것이기 때문에 자가면역 또는 이식 거부를 변경하는 데 유용하다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체) 또는 본원에 기재된 BCMA CAR은 이러한 유도된 T 조절 세포가 질환의 조직 부위에서 억제 기능을 수행하는데 필요한 기능적 특이성을 제공하도록 사용된다. 따라서, 다수의 항원-특이적 조절 T 세포가 환자에서 사용하기 위해 성장된다. T 조절 세포 분화에 필수적인 FoxP3의 발현은 유세포 분석법에 의해 분석될 수 있고, 이러한 T 조절 세포에 의한 T 세포 증식의 기능적 억제는 공동-배양 시 항-CD3 자극 후 T 세포 증식에서 감소를 조사함으로써 분석될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예는 방사선병의 예방 또는 치료를 위한 외인성 Nef 단백질 및 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포), 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포), 외인성 Nef 단백질 및 본원에 기재된 BCMA CAR을 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포), 본원에 기재된 BCMA CAR을 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포), 이의 단리된 집단, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물의 사용에 관한 것이다. 방사선 치료 또는 노출(예를 들어 방사능이 많은 폭탄 노출, 방사선 누출) 또는 골수 세포를 제거하는 다른 조건(특정 약물 요법) 후 한 가지 도전과제는 조혈 시스템을 재구축하는 것이다. 골수 이식을 겪는 환자에서, 이식후 15 일째에 절대 림프구 계수는 성공적인 결과와 상관관계가 있다. 림프구 계수가 높은 환자는 재구축이 잘 되므로, 우수한 림프구 재구축을 갖는 것이 중요하다. 이 효과에 대한 이유는 명확하지 않지만, 감염으로부터 림프구 보호 및/또는 조혈 재구축을 선호하는 성장 인자의 생산 때문일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 또한 다음 단계를 포함하는, 개체에서 공여자 T 세포의 지속성 및/또는 생착을 증가시키는 방법을 제공하며: 1) 동종이계 T 세포를 제공하는 단계; 및 2) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 비-자연 발생 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산을 동종이계 T 세포 내로 도입하는 단계, 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 동종이계 T 세포의 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC I의 하향 조절을 초래한다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능의 하향 조절). 일부 구현예에서, 동종이계 T 세포는 동종이계 ITAM-변형된 CAR-T 세포, ITAM-변형된 TCR-T 세포, ITAM-변형된 cTCR-T 세포, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사-T 세포이다. 일부 구현예에서, 동종이계 T 세포는 동종이계 BCMA CAR-T 세포이다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 제2 핵산, 또는 본원에 기재된 BCMA CAR을 암호화하는 제2 핵산을 동종이계 T 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 핵산은 ITAM-변형된 CAR을 암호화한다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 별개의 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 하나의 프로모터 또는 상이한 프로모터의 제어 하에 동일한 벡터 상에 있다. 따라서 일부 구현예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 개체(예를 들어, 인간)에서 공여자 T 세포의 지속성 및/또는 생착을 증가시키는 방법을 제공하며: 1) 동종이계 T 세포를 제공하는 단계; 및 2) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 비-자연 발생 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산 및 본원에 기재된 CMSD-함유 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체) 또는 본원에 기재된 BCMA CAR을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터)를 동종이계 T 세포 내로 도입하는 단계; 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 동종이계 T 세포의 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC I의 하향 조절을 초래한다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능의 하향 조절). 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 발현 시 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3ε/δ/γ, 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질을 포함하는 동종이계 T 세포는 Nef 발현이 없는 동일한 동종이계 T 세포에 의해 도출된 GvHD 반응과 비교하여 조직부적합성 개체에서 GvHD 반응을 전혀 도출하지 않거나 또는 감소된(예컨대 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것까지 감소된) GvHD 반응을 도출한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 또한 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 비-자연 발생 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 제1 핵산을 동종이계 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, GvHD 또는 이식 거부를 유도하지 않고 동종이계 T 세포 이식을 받는 개체에서 질환(예컨대 암, 감염성 질환, 자가면역 장애, 또는 방사선병)을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 동종이계 T 세포의 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC I의 하향 조절을 초래한다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능의 하향 조절). 일부 구현예에서, 동종이계 T 세포는 동종이계 ITAM-변형된 CAR-T 세포, ITAM-변형된 TCR-T 세포, ITAM-변형된 cTCR-T 세포, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사-T 세포이다. 일부 구현예에서, 동종이계 T 세포는 BCMA CAR-T 세포이다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체)를 암호화하는 제2 핵산, 또는 본원에 기재된 BCMA CAR을 암호화하는 제2 핵산을 동종이계 T 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 핵산은 ITAM-변형된 CAR, 예를 들어, ITAM-변형된 BCMA CAR 또는 ITAM-변형된 CD20 CAR을 암호화한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 발현 시 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3ε/δ/γ, 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다(예를 들어, 이의 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절).
일부 구현예에서, 본 발명은 또한 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 비-자연 발생 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 핵산을 동종이계 ITAM-변형된 CAR-T 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 동종이계 ITAM-변형된 CAR-T 세포의 GvHD 또는 이식 거부를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 동종이계 ITAM-변형된 CAR-T 세포의 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC I의 하향 조절을 초래한다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능의 하향 조절). 일부 구현예에서, 본 발명은 또한 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 비-자연 발생 Nef, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 핵산을 동종이계 BCMA CAR-T 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 동종이계 BCMA CAR-T 세포의 GvHD 또는 이식 거부를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 외인성 Nef 단백질은 발현 시 동종이계 ITAM-변형된 CAR-T 세포의 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC I의 하향 조절을 초래한다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능의 하향 조절). 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 발현 시 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), CD3ε/δ/γ, 및/또는 MHC I을 적어도 약 40%(예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달과 같은 효과기 기능에 대해 하향 조절). 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 발현 시 ITAM-변형된 CAR(또는 BCMA CAR)을 하향 조절하지 않거나(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능에 대해 하향 조절), 또는 ITAM-변형된 CAR(또는 BCMA CAR)을 최대 약 60%(예컨대 최대 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것)까지 하향 조절한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef는 서열번호: 79-89, 198-204, 및 207-231 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 외인성 Nef 단백질은 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것) 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질을 포함하는 동종이계 ITAM-변형된 T 세포(또는 동종이계 BCMA CAR-T 세포)는 Nef 발현 없이 동종이계 ITAM-변형된 T 세포(또는 동종이계 BCMA CAR-T 세포)에 의해 도출된 GvHD 반응과 비교하여 조직부적합성 개체에서 GvHD 반응을 전혀 도출하지 않거나 또는 감소된(예컨대 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것까지 감소된) GvHD 반응을 도출한다.
X. 키트 및 제조 물품
다음을 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포) 중 임의의 하나를 포함하는 키트, 단위 투여량, 및 제조 물품이 추가로 제공된다: i) 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 예컨대 야생형 SIV Nef, Nef 하위유형, 또는 돌연변이체 Nef 예컨대 돌연변이체 SIV Nef) 및 ii) 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체), 또는 본원에 기재된 BCMA CAR. 또한 본원에 기재된 CMSD를 포함하는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, ITAM-변형된 CAR, ITAM-변형된 TCR, ITAM-변형된 cTCR, 또는 ITAM-변형된 TAC-유사 키메라 수용체) 또는 본원에 기재된 BCMA CAR을 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포) 중 임의의 하나를 포함하는 키트, 단위 투여량, 및 제조 물품이 제공된다. 본원에 기재된 외인성 Nef 단백질을 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포) 중 임의의 하나를 포함하는 키트, 단위 투여량, 및 제조 물품이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물 중 임의의 하나를 함유하고 바람직하게는 이의 사용 지침을 제공하는 키트가 제공된다.
본 출원의 키트는 적합한 패키징으로 있다. 적합한 패키징은 바이알, 병, 단지, 가요성 패키징(예를 들어, 밀봉된 Mylar 또는 플라스틱 백) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 키트는 임의적으로 완충제 및 설명 정보와 같은 추가적인 구성요소를 제공한다. 따라서 본 출원은 또한 바이알(예컨대 밀봉된 바이알), 병, 단지, 가요성 패키징 등을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
제조 물품은 용기 및 용기 상의 또는 연관된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 일반적으로, 용기는 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애(예컨대 암, 자가면역 질환, 또는 감염성 질환)을 치료하거나, 또는 질환 또는 장애를 치료할 때 GvHD 또는 이식 거부를 감소/예방하는 데 효과적인 조성물을 보유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알일 수 있다). 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 개체에서 특정 병태를 치료하는 데 사용됨을 나타낸다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 개체에게 조성물을 투여하기 위한 지침을 추가로 포함할 것이다. 라벨은 재구축 및/또는 사용을 위한 지시를 나타낼 수 있다. 약제학적 조성물을 보유하는 용기는 재구축된 제형의 반복 투여(예를 들어 2-6 회 투여)를 허용하는 다중 사용 바이알일 수 있다. 패키지 삽입물은 이러한 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는 치료 제품의 상업적인 패키지에 관습적으로 포함된 지침을 지칭한다. 추가적으로, 제조 물품은 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용가능한 완충액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충액, 희석제, 충전제, 바늘, 및 주사기를 포함하는 상업적이고 사용자의 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다. 키트 또는 제조 물품은 약국, 예를 들어, 병원 약국 및 조제 약국에서 저장 및 사용에 충분한 양으로 패키징된, 다중 단위 용량의 약제학적 조성물 및 사용 지침을 포함할 수 있다.
실시예
하기 실시예 및 예시적인 구현예는 전적으로 본 발명의 예시인 것으로 의도되며 따라서 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 하기 실시예 및 상세한 설명은 제한이 아니라 예시로 제공된다.
실시예 1. SIV Nef 단백질 및 기존 CAR 사이의 상호작용 테스트
1. 세포주 구축
pLVX-Puro(Clontech, #632164)는 다중 클로닝 부위(MCS)의 바로 상류에 위치한 구성적으로 활성인 인간 사이토메갈로바이러스 급초기 프로모터(PCMV IE)를 포함하는 HIV-1-기반 렌티바이러스 발현 벡터이다. pLVX-Puro의 원래 PCMV IE 프로모터를 C-말단에 EcoRI 및 ClaI 제한 부위를 보유하는 인간 신장 인자 1α(hEF1α) 프로모터로 대체하여 자체 제작한 렌티바이러스 벡터를 생산하였으며, 이하에서 "pLVX-hEF1α-Puro 렌티바이러스 벡터"로 지칭된다. "BCMA-BBz"(서열번호: 70)는 기존 세포내 신호전달 도메인을 갖는 BCMA CAR이다. BCMA-BBz는 N'에서 C'으로 다음의 구조를 갖는다: CD8α 신호 펩티드(SP)-BCMA scFv-CD8α 힌지-CD8α TM(막관통 도메인)-4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인-CD3ζ 세포내 신호전달 도메인("CD8α SP-BCMA scFv-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-CD3ζ"로도 지칭됨). 폴리뉴클레오티드 서열 CD8α SP-BCMA scFv-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-CD3ζ("BCMA-BBz", 서열번호: 74), 야생형 SIV Nef(서열번호: 95), 및 돌연변이체 SIV Nef M116(서열번호: 96)을 화학적으로 합성하고, EcoRI/ClaI을 통해 pLVX-hEF1α-Puro 벡터 내로 별도로 클로닝하여 각각 BCMA CAR(이하에서 "pLVX-BCMA-BBz-Puro"로 지칭됨), 야생형 SIV Nef(이하에서 "pLVX-SIV Nef-Puro"로 지칭됨), 및 SIV Nef M116(이하에서 "pLVX-SIV Nef M116-Puro"로 지칭됨)을 암호화하는 재조합 렌티바이러스 전달 플라스미드를 생산하였다. 그런 다음 이러한 재조합 렌티바이러스 전달 플라스미드를 각각 하기 렌티바이러스 패키징 절차에 적용하였다.
psPAX2(패키징; Addgene, #12260) 및 pMD2.G(외피; Addgene, #12259)를 함유하는 렌티바이러스 패키징 플라스미드 혼합물을 각각 pLVX-BCMA-BBz-Puro, pLVX-SIV Nef-Puro, 또는 pLVX-SIV Nef M116-Puro 전달 플라스미드와 사전 혼합하고, 실온에서 인큐베이션한 다음, 각각 HEK 293T 세포 내로 형질도입하였다. 형질도입 60 시간 후에, 세포 형질도입 혼합물을 4℃, 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하여 렌티바이러스를 함유하는 상청액을 수집하였다. 상청액을 0.45 μm 필터를 사용하여 여과하고, 500 KD 중공 섬유 막 접선 유동 여과를 사용하여 추가로 농축하여 농축된 렌티바이러스를 수득하였다. 이러한 농축된 렌티바이러스를 -80℃에서 저장하였다.
Jurkat 세포(ATCC®, #TIB152™)를 90% RPMI 1640 배지(Life Technologies, #22400-089) 및 10% 소 태아 혈청(FBS, Life Technologies, #10099-141)에서 배양하였다. BCMA-BBz를 암호화하는 렌티바이러스(이하에서 "BCMA-BBz 렌티바이러스"로 지칭됨) 및 야생형 SIV Nef를 암호화하는 렌티바이러스(이하에서 "야생형 SIV Nef 렌티바이러스"로 지칭됨)를 형질도입을 위해 Jurkat 세포 배양물의 상청액에 각각 첨가하였다. 형질도입 60 시간 후에, 1x107 개의 Jurkat 세포를 수집하고 자기-활성화 세포 분류(MACS; 하기 방법 참조)에 적용하였다. MACS 풍부화 후, BCMA-BBz 렌티바이러스로 형질도입된 Jurkat 세포(이하에서 "Jurkat-BCMA-BBz"로 지칭됨)는 85.2% CAR 양성 세포(BCMA MACS 풍부화)를 생산하였고, 야생형 SIV Nef 렌티바이러스로 형질도입된 Jurkat 세포(이하에서 "Jurkat-SIV Nef"로 지칭됨)는 88.4% TCRαβ 음성 세포(TCRαβ MACS 풍부화)를 생산하였다.
MACS(자기-활성화 세포 분류)
간단히 말해서, 세포 현탁액을 실온에서 1000 rpm/분으로 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 1x107 개의 세포를 DPBS에 재현탁한 다음 20 μL 비오티닐화 인간 BCMA/TNFRSF17 시약(ACROBIOSYSTEM, BCA-H522y) 또는 비오티닐화 인간 TCRαβ 시약(Miltenyi, 200-070-407)으로 보충하고, 4℃에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 10 mL DPBS로 세척하고, 원심분리하고 상청액을 버렸다. 세포를 400 μL 완충액에 재현탁한 다음 15 분 동안 추가 인큐베이션을 위해 20 μL 항-비오틴 마이크로비드를 첨가하였다. 인큐베이션 후, PBE 완충액(나트륨　포스페이트/EDTA)을 첨가하여 부피를 500 μL로 조정하였다. 그런 다음 세포 상청액을 MACS 키트 프로토콜에 따라 자기 분리 및 풍부화에 적용하였다.
2. SIV Nef 및 SIV Nef 돌연변이체는 기존 CAR 발현을 조절한다
야생형 SIV Nef 서열, SIV Nef M116 서열, 및 빈 벡터를 보유하는 렌티바이러스를 형질도입을 위해 MACS 분류된 Jurkat-BCMA-BBz CAR+ 세포 배양물의 현탁액에 각각 첨가하였다. 형질도입 5 일 후에, 5x105 개의 세포 현탁액을 수집하고 실온에서 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 세포를 1 mL DPBS로 재현탁하고, 1 μL FITC-표지된 인간 BCMA 단백질(ACROBIOSYSTEM, BCA-HF254-200UG)을 첨가하고 현탁액을 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, DPBS 단계를 이용한 원심분리 및 재현탁을 2 회 반복하였다. 그런 다음 세포를 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 위해 DPBS로 재현탁하여 BCMA CAR 발현을 검출하였다.
도 1a에 도시된 바와 같이, 야생형 SIV Nef 렌티바이러스로 추가로 형질도입된 MACS 분류된 Jurkat-BCMA-BBz CAR+ 세포 배양물("Jurkat-BCMA-BBz-SIV Nef" 세포 배양물), SIV Nef M116 렌티바이러스로 추가로 형질도입된 MACS 분류된 Jurkat-BCMA-BBz CAR+ 세포 배양물("Jurkat-BCMA-BBz-SIV Nef M116" 세포 배양물), 빈 벡터로 추가로 형질도입된 MACS 분류된 Jurkat-BCMA-BBz CAR+ 세포 배양물("Jurkat-BCMA-BBz-빈 벡터" 세포 배양물), 및 추가의 형질도입이 없는 MACS 분류된 Jurkat-BCMA-BBz CAR+ 세포 배양물의 BCMA CAR 양성율은 각각 42.3%, 39.1%, 83.6% 및 83.9%이다. 형질도입 5-9 일 후에, BCMA CAR의 발현은 각 그룹에서 안정되었다.
결과는 Jurkat-BCMA-BBz CAR+ 세포에서 SIV Nef 및 SIV Nef M116 과발현이 BCMA-BBz의 발현을 감소시킬 수 있음을 입증하며, 이는 SIV Nef 및 SIV Nef M116이 CAR 발현에 유의한 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
3. CAR은 TCR/CD3 복합체의 SIV Nef 조절에 영향을 미친다
BCMA-BBz 서열을 보유하는 렌티바이러스를 형질도입을 위해 MACS 분류된 Jurkat-SIV Nef TCRαβ 음성 세포 배양물의 현탁액에 첨가하였다. 형질도입 3 일 후에, 5x105 개의 세포 현탁액을 수집하고 실온에서 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 세포를 1 mL DPBS로 재현탁한 다음, 1 μL PE/Cy5 항-인간 TCRαβ 항체(Biolegend, #306710)를 첨가하고 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, DPBS 단계를 이용한 원심분리 및 재현탁을 2 회 반복하였다. 그런 다음 세포를 FACS를 위해 DPBS로 재현탁하여 TCRαβ 양성율을 검출하였다. 형질도입되지 않은 Jurkat 세포는 대조군으로 제공되었다.
도 1b에 도시된 바와 같이, 형질도입되지 않은 Jurkat 세포는 96.8% TCRαβ 양성율을 가지며, BCMA-BBz 렌티바이러스로 추가로 형질도입된 MACS 분류된 Jurkat-SIV Nef TCRαβ 음성 세포 배양물("Jurkat-SIV Nef-BCMA-BBz" 세포 배양물)은 61.5% TCRαβ 양성율을 나타내는 반면, MACS 분류된 Jurkat-SIV Nef TCRαβ 음성 세포 배양물은 11.6% TCRαβ 양성율을 나타낸다(상기 "세포주 구축" 하위섹션 참조, 88.4% 음성율에 상응함). 이 결과는 아마 일부 SIV Nef 단백질이 CAR 발현의 하향 조절에 참여하여, TCRαβ의 하향 조절이 희석되었기 때문에, BCMA-BBz 과발현이 SIV Nef에 의해 TCRαβ 발현의 하향 조절을 감소시킬 수 있음을 나타낸다. 이는 기존 CAR(및 아마 Nef 단백질에 의해 조절될 수 있는 다른 외인성 수용체)이 Nef 단백질에 의해 TCR/CD3 복합체의 하향 조절에 유의하게 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
요약하면, 상기 연구는 BCMA-BBz(BCMA CAR)가 야생형 SIV Nef 또는 SIV Nef M116과 상호작용할 수 있음을 입증한다. SIV Nef 단백질은 BCMA-BBz 발현을 하향 조절할 수 있는 반면, BCMA-BBz는 SIV Nef 단백질에 의해 TCR/CD3 복합체의 하향 조절에 영향을 미칠 수 있다.
실시예 2. ITAM-변형된 CAR 및 SIV Nef 사이의 상호작용 평가
1. ITAM-변형된 CAR은 낮은 SIV Nef 상호작용을 나타낸다
SIV Nef-매개 하향 조절이 낮은 ITAM-변형된 CAR을 구축하기 위해, BCMA-BBz의 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인(CD8α SP-BCMA scFv-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-CD3ζ)을 ITAM010 작제물(아미노산 서열 서열번호: 51, 핵산 서열 서열번호: 66; 구조에 대해 실시예 6의 표 2 참조)로 대체하여 CD8α SP-BCMA scFv-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-ITAM010 재조합 서열(이하에서 "BCMA-BB010"으로 지칭됨, 아미노산 서열 서열번호: 71, 핵산 서열 서열번호: 75)을 형성한 다음, BCMA-BB010 전달 플라스미드(이하에서 "pLVX-BCMA-BB010" 렌티바이러스 전달 플라스미드로 지칭됨)의 구축을 위해 pLVX-hEF1α-Puro 렌티바이러스 벡터(실시예 1 참조)로 클로닝하였다.
psPAX2(패키징; Addgene, #12260) 및 pMD2.G(외피; Addgene, #12259)를 함유하는 렌티바이러스 패키징 플라스미드 혼합물을 정제된 pLVX-BCMA-BB010-Puro 전달 플라스미드와 사전 혼합하고, 실온에서 인큐베이션한 다음, HEK 293T 세포 내로 형질도입하였다. 형질도입 60 시간 후에, 세포 형질도입 혼합물을 4℃, 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하여 렌티바이러스를 함유하는 상청액을 수집하였다. 상청액을 0.45 μm 필터를 사용하여 여과하고, 500 KD 중공 섬유 막 접선 유동 여과를 사용하여 추가로 농축하여 농축된 렌티바이러스를 수득한 다음, -80℃에서 저장하였다.
BCMA-BB010 서열을 보유하는 렌티바이러스를 형질도입을 위해 MACS 분류된 Jurkat-SIV Nef TCRαβ 음성 세포 배양물(실시예 1 참조)의 현탁액에 첨가하였고, 생성된 세포 배양물은 "Jurkat-SIV Nef-BCMA-BB010" 세포 배양물로 지칭한다. TCRαβ 발현을 실시예 1에 기재된 동일한 방법에 따라 조사하였다.
도 1b에 도시된 바와 같이, Jurkat-SIV Nef-BCMA-BB010 세포 배양물은 7.98%의 TCRαβ 양성율을 나타내며, 이는 MACS 분류된 Jurkat-SIV Nef TCRαβ 음성 세포 배양물의 것과 유사하고(11.6%), 기존 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인이 있는 BCMA CAR로 형질도입된 MACS 분류된 Jurkat-SIV Nef TCRαβ 음성 세포 배양물의 것(61.5%; 실시예 1 참조)보다 유의하게 더 낮았다. 이 결과는 SIV Nef에 의한 TCRαβ의 하향 조절이 희석되지 않도록, 아마 ITAM-변형된 CAR의 세포내 신호전달 도메인 내의 Nef-상호작용 ITAM의 부족으로 인해, ITAM-변형된 CAR(예를 들어, BCMA-BB010)이 야생형 SIV Nef에 의해 TCRαβ(또는 TCR/CD3 복합체) 하향 조절에 유의한 영향을 미치지 않음을 시사한다.
2. ITAM-변형된 CAR-T 세포의 세포독성 평가
50 mL 말초 혈액을 지원자로부터 추출하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 밀도 구배 원심분리를 통해 단리하였다. Pan T 세포 단리 키트(Miltenyi Biotec, #130-096-535)를 사용하여 PBMC를 자기적으로 표지하고 T 림프구를 단리 및 정제하였다. CD3/CD28 접합된 자기 비드를 정제된 T 림프구의 활성화 및 확장에 사용하였다. 활성화된 T 림프구를 수집하고 RPMI 1640 배지(Life Technologies, #22400-089)에 재현탁하였다. 활성화 3 일 후, 5x106 개의 활성화된 T 림프구를 각각 BCMA-BBz("BCMA-BBz T 세포") 및 BCMA-BB010("BCMA-BB010 T 세포")을 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입하였다. T 세포 현탁액을 6-웰 플레이트에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다. 형질도입 3 일 후에, BCMA-BBz T 세포 및 BCMA-BB010 T 세포를 20:1 효과기 대 표적 세포(E:T) 비 하에 각각 다발성 골수종(MM) 세포주 RPMI8226.Luc(루시퍼라제(Luc) 마커 함유, BCMA+)와 혼합하고, 12 시간 동안 Corning® 384-웰 고체 백색 플레이트에서 인큐베이션하였다. ONE-Glo™ 루시퍼라제 검정 시스템(PROMEGA, #B6110)을 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 25 μL ONE-Glo™ 시약을 384-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 인큐베이션한 다음, 표적 MM 세포 상의 상이한 T 림프구의 세포독성을 계산하기 위해, 형광 측정을 위해 Spark™ 10M 다중모드 마이크로플레이트 판독기(TECAN) 위에 배치하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, BCMA-BBz T 세포 및 BCMA-BB010 T 세포는 둘 다 사멸 검정의 3 일째에 RPMI8226.Luc 세포주(BCMA+)에서 강한 종양 세포 사멸을 매개하며, 이는 형질도입되지 않은 T 세포("UnT", P<0.05)보다 유의하게 더 높다. BCMA-BBz T 세포 및 BCMA-BB010 T 세포 사이에 유의한 세포독성 차이는 없다(P>0.05). 이러한 결과는 ITAM010 키메라 신호전달 도메인을 포함하는 ITAM-변형된 CAR(BCMA-BB010)이 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인이 있는 기존 CAR(BCMA-BBz)과 유사하게, 표적 세포 상에서 강한 세포독성을 나타낼 수 있음을 나타낸다.
실시예 3. CD20 CAR-T 및 ITAM-변형된 CD20 CAR-T 세포독성 및 사이토카인 방출 유도의 시험관내 분석
1. 세포독성 시험관내 검정
항-CD20 scFv(Leu16)는 마우스 항체이다. 융합 유전자 서열 CD8α SP-CD20 scFv(Leu16)-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-CD3ζ(이하에서 "LCAR-L186S"로 지칭됨, 서열번호: 76), 및 SIV Nef M116-IRES-CD8α SP-CD20 scFv(Leu16)-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-ITAM010(이하에서 "LCAR-UL186S"로 지칭됨, 서열번호: 78)을 화학적으로 합성한 다음, 각각 LCAR-L186S 및 LCAR-UL186S 렌티바이러스 전달 플라스미드의 구축을 위해 pLVX-hEF1α-Puro 렌티바이러스 벡터(실시예 1 참조) 내로 클로닝하였다. 렌티바이러스 전달 플라스미드를 정제한 다음, psPAX2(패키징; Addgene, #12260) 및 pMD2.G(외피; Addgene, #12259)를 함유하는 렌티바이러스 패키징 플라스미드 혼합물과 혼합하고, 실온에서 인큐베이션한 다음, 각각 HEK 293T 세포 내로 형질도입하였다. 형질도입 60 시간 후에, 세포 형질도입 혼합물을 4℃, 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하여 렌티바이러스를 함유하는 상청액을 수집하였다. 상청액을 0.45 μm 필터를 사용하여 여과하고, 500 KD 중공 섬유 막 접선 유동 여과를 사용하여 추가로 농축하여 농축된 렌티바이러스를 수득한 다음, -80℃에서 저장하였다.
PBMC 및 T 림프구를 실시예 2에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 5x106 개의 활성화된 T 림프구를 각각 LCAR-L186S("LCAR-L186S T 세포"로 지칭됨) 및 LCAR-UL186S("LCAR-UL186S T 세포"로 지칭됨)를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다. 형질도입 3 일 후에, 5x105 개의 세포 현탁액을 수집하고 실온에서 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 세포를 1 mL DPBS로 재현탁하고 1 μL 염소 F(ab')2 항-마우스 IgG(Fab')2(FITC)(Abcam, #AB98658)를 현탁액에 첨가한 다음, 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, DPBS 단계를 이용한 원심분리 및 재현탁을 2 회 반복하였다. 그런 다음 세포를 DPBS로 재현탁하고 1 μL 스트렙타비딘(NEW ENGLAND BIOLABS, #N7021S)으로 보충한 다음, 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, DPBS 단계를 이용한 원심분리 및 재현탁을 2 회 반복하였다. 그런 다음 세포를 DPBS로 재현탁하고 CD20 CAR 발현 검출을 위해 FACS에 적용하였다.
도 3a에 도시된 바와 같이, LCAR-L186S 렌티바이러스 및 LCAR-UL186S 렌티바이러스로 형질도입된 1차 T 림프구는 각각 35.60% 및 36.49% CAR 양성율을 나타낸다. 미처리된 T 림프구는 음성 대조군으로 제공되었다(0.59% CAR pos). 이 결과는 SIV Nef M116 공동-발현이 ITAM010 키메라 신호전달 도메인을 포함하는 ITAM-변형된 CD20 CAR(LCAR-UL186S)의 발현에 영향을 미치지 않으며; CAR 발현 수준이 기존 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인이 있는 CD20 CAR(LCAR-L186S)의 것과 유사함을 입증한다.
LCAR-L186S T 세포 및 LCAR-UL186S T 세포를 각각 20:1, 10:1 및 5:1의 상이한 효과기 대 표적 세포(E:T) 비에서 림프종 Raji.Luc 세포주(CD20 양성, 루시퍼라제 마커 함유)와 혼합하였다. 미처리된 T 세포는 대조군으로 제공되었다("UnT"). 혼합된 세포를 384-웰 플레이트에서 12-24 시간 동안 인큐베이션하였다. 표적 세포 상의 상이한 T 림프구의 세포독성을 실시예 2에 기재된 유사한 방법에 따라 검출하였다.
도 3b에 도시된 바와 같이, LCAR-L186S 렌티바이러스 및 LCAR-UL186S 렌티바이러스 둘 다로 형질도입된 1차 T 림프구는 Raji.Luc 세포주 상에서 강한 세포독성을 나타내고, E:T 농도 의존적이다. 모든 E:T 비에서 LCAR-L186S T 세포 및 LCAR-UL186S T 세포 사이에 유의한 세포독성 차이는 없지만, LCAR-L186S T 세포 및 LCAR-UL186S T 세포는 둘 다 형질도입되지 않은 T 세포("UnT", P<0.05)와 비교하여 세포 사멸 검정의 3 일째에 훨씬 더 강한 세포독성을 나타낸다. 이 결과는 SIV Nef M116 공동-발현이 ITAM010 키메라 신호전달 도메인을 포함하는 ITAM-변형된 CD20 CAR(LCAR-UL186S)의 세포독성에 영향을 미치지 않고; ITAM-변형된 CD20 CAR이 기존 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인이 있는 CD20 CAR(LCAR-L186S)과 유사한 세포독성을 나타냄을 입증한다.
2. 사이토카인 방출 시험관내 검정
LCAR-L186S T 세포 및 LCAR-UL186S T 세포를 각각 상기 기재된 상이한 E:T 비에서 림프종 Raji.Luc 세포주와 인큐베이션하였다. 공동-배양물 검정으로부터 상청액을 수집하여 전염증 인자(도 4a), 케모카인(도 4b), 및 사이토카인(도 4c)을 포함하는 17 개의 사이토카인 분자의 CAR-유도된 사이토카인 방출을 평가하였다. 형질도입되지 않은 T("UnT") 세포는 대조군으로 제공되었다.
도 4a에 도시된 바와 같이, LCAR-L186S T 세포 또는 LCAR-UL186S T 세포를 상이한 E:T 비에서 20-24 시간 동안 CD20 양성 Raji.Luc 세포와 공동-배양한 후, 전염증 인자(예컨대 퍼포린, 그랜자임 A, 그랜자임 B, IFNγ, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13)의 분비는 UnT 세포(P<0.05)와 비교하여 유의하게 증가하였고, 분비 수준은 E:T 비 의존적이었으며, 이는 LCAR-L186S T 세포 및 LCAR-UL186S T 세포가 둘 다 강한 Raji-표적화된 세포독성 효과를 개시할 수 있음을 시사한다. 이러한 전염증 인자 중에서, 그랜자임 A, IFNγ, IL-6, 및 IL-13은 LCAR-UL186S T 세포(P<0.05)에서 보다 LCAR-L186S T 세포에서 유의하게 더 높은 분비를 나타내었으며, 이는 ITAM-변형된 CD20 CAR/SIV Nef M116 공동-발현이 낮은 전염증 인자 방출 및 사이토카인 방출 증후군(CRS)의 더 낮은 위험을 유도할 수 있음을 시사한다.
도 4b에 도시된 바와 같이, LCAR-L186S T 세포 또는 LCAR-UL186S T 세포를 상이한 E:T 비에서 20-24 시간 동안 CD20 양성 Raji.Luc 세포과 공동-배양한 후, 케모카인(예컨대 MIP-1α, MIP-1β, sFas 및 sFasL)의 분비는 UnT 세포(P<0.05)과 비교하여 유의하게 증가되었고, 분비 수준은 E:T 비 의존적이었으며, 이는 LCAR-L186S T 세포 및 LCAR-UL186S T 세포가 둘 다 강한 Raji-표적화된 세포독성 효과를 개시할 수 있음을 시사한다. 이러한 케모카인 중에서, MIP-1α 및 MIP-1β(및 일부 경우에 또한 sFas)는 LCAR-UL186S T 세포(P<0.05)에서 보다 LCAR-L186S T 세포에서 유의하게 더 높은 분비를 나타내었으며, 이는 ITAM-변형된 CD20 CAR/SIV Nef M116 공동-발현이 낮은 케모카인 방출 및 CRS의 더 낮은 위험을 유도할 수 있음을 시사한다.
도 4c에 도시된 바와 같이, LCAR-L186S T 세포 또는 LCAR-UL186S T 세포를 상이한 E:T 비에서 20-24 시간 동안 CD20 양성 Raji.Luc 세포와 공동-배양한 후, 사이토카인(예컨대 TNFα, GM-CSF 및 sCD137)의 분비는 UnT 세포(P<0.05)와 비교하여 유의하게 증가하였으며, 이는 LCAR-L186S T 세포 및 LCAR-UL186S T 세포가 둘 다 강한 Raji-표적화된 세포독성 효과를 개시할 수 있음을 시사한다. 이러한 사이토카인 중에서, TNFα 분비는 검출 한계에 도달하였고; GM-CSF 및 sCD137 분비는 LCAR-UL186S T 세포(P<0.05)에서 보다 LCAR-L186S T 세포에서 유의하게 더 높았으며, 이는 ITAM-변형된 CD20 CAR/SIV Nef M116 공동-발현이 낮은 사이토카인 방출 및 CRS의 더 낮은 위험을 유도할 수 있음을 시사한다.
요약하면, 상기 결과는 LCAR-L186S T 세포 및 LCAR-UL186S T 세포 사이에 표적 세포에 대한 유의한 세포독성 차이는 없지만, LCAR-UL186S T 세포에 의해 유도된 전염증 인자, 케모카인 및 사이토카인 방출이 LCAR-L186S T 세포보다 유의하게 더 낮음을 나타내며, 이는 ITAM-변형된 CD20 CAR/SIV Nef M116 공동-발현 작제물이 더 낮은 사이토카인 방출로 효과적이고 더 안전함을 시사하며, 더 광범위한 임상 적용 가능성을 입증한다.
실시예 4. LCAR-L186S T 세포 및 LCAR-UL186S CAR+/TCRαβ- T 세포의 생체내 효능 평가
1. 림프종 이종이식 마우스 모델 확립 및 생존 지수 모니터링
종양 세포에 대한 CD20 CAR-T 세포 또는 ITAM-변형된 CD20 CAR-T 세포의 생체내 세포독성을 중증 면역-결핍 마우스 모델을 사용하여 조사하였다. 실시예 3의 LCAR-UL186S T 세포를 TCRαβ- 세포에 대해 MACS 풍부화하여, TCRαβ- MACS 분류된 "LCAR-UL186S CAR+/TCRαβ- T 세포"를 초래하였다. LCAR-L186S T 세포(MACS 풍부화되지 않음, 실시예 3에서 유래) 및 TCRαβ- MACS 분류된 LCAR-UL186S CAR+/TCRαβ- T 세포를 이 실시예에 사용하였다. 면역-결핍 NCG 마우스를 -4 일째에 꼬리 정맥을 통해 CD20+ 종양 세포를 이식한 다음(마우스 당 3x104 개의 인간 Raji.Luc 세포), 각 마우스에 0 일째에 2x106 개의 LCAR-L186S T 세포(그룹 4 마우스, 8 마리 마우스) 또는 LCAR-UL186S CAR+/TCRαβ- T 세포(그룹 3 마우스, 8 마리 마우스)를 단일 주사하였다. 그룹 1 마우스(8 마리 마우스)는 HBSS 주사를 받았고, 그룹 2 마우스(8 마리 마우스)는 형질도입되지 않은 T 세포(UnT) 주사를 받았으며, 음성 대조군으로 제공되었다. 마우스를 매일 모니터링하고, 매주 생물발광 영상화로 평가하여 종양 성장 및 체중을 모니터링하였다. 도 5a 참조. 마우스 생존을 모니터링하고 Kaplan-Meier 생존 플롯으로 기록하였다.
2. LCAR-L186S T 세포 및 LCAR-UL186S CAR+/TCRαβ- T 세포의 생체내 효능
도 5a-5d에 도시된 바와 같이, Raji.Luc(CD20+) 세포 이식 후, 비히클(HBSS, 행크의 균형잡힌 염 용액; 그룹 1) 또는 형질도입되지 않은 T 세포 처리(그룹 2)는 종양 세포 성장을 억제하지 않았다. 이러한 2 개 그룹의 마우스를 종양 부담, 가래, 체중 손실(도 5c), 오한 및 다른 증상으로 인해, 처리를 받은 지 15 일째부터 시작하여 안락사시켰다. 이러한 대조군 마우스와 비교하여, 처리 이후 20 일 이내에 LCAR-L186S T 세포 또는 LCAR-UL186S CAR+/TCRαβ- T 세포로 처리된 마우스에서 생물발광은 관찰되지 않았다. 이들 결과는 LCAR-L186S T 세포 및 LCAR-UL186S CAR+/TCRαβ- T 세포가 생체내에서 B 세포 림프종의 성장을 효과적으로 억제할 수 있음을 나타낸다.
CAR-T 세포 주사 28 일 후, 그룹 3(LCAR-UL186S CAR+/TCRαβ-) 및 그룹 4(LCAR-L186S)의 일부 마우스는 종양 재발을 나타내었다(도 5a-5b). 그룹 4의 8 마리 마우스 중 1 마리는 재발된 종양으로 인해 31 일째에 안락사시켰다(도 5a 및 5d). 41 일째의 생물발광 영상화는 그룹 3의 8 마리 마우스 중 1 마리 및 그룹 4의 7 마리 마우스 중 4 마리(1 마리는 31 일째에 안락사시킴)가 많은 광자 수와 함께 종양 재발됨을 나타내었다(도 5a-5b). 이들 마우스는 마비 및 체중 손실로 인해 안락사시켰다. 생존 곡선은 CAR-T 세포의 전반적인 활성을 반영한다. 도 5d에 도시된 바와 같이, LCAR-UL186S CAR+/TCRαβ- T 세포 및 LCAR-L186S T 세포는 둘 다 종양-이식된 마우스의 생존을 유의하게 연장시킬 수 있으며, 이는 체중 손실에 대한 효과가 거의 없거나 또는 전혀 없으면서 우수한 생체내 항-종양 효능을 입증한다(도 5c). 추가로, LCAR-UL186S CAR+/TCRαβ- T 세포(ITAM-변형된 CAR/SIV Nef M116 공동-발현)는 LCAR-L186S T 세포(기존 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인이 있는 CAR)와 비교하여 더 나은 치료 효능 및 생존율을 나타내는 것으로 보인다.
LCAR-L186S T 세포 및 LCAR-UL186S CAR+/TCRαβ- T 세포의 장기간 항-종양 활성을 추가로 연구하기 위해, CAR-T 투여 41 일 후에 재발하지 않았던 마우스(그룹 3 LCAR-UL186S-처리된 6 마리 마우스, 그룹 4 LCAR-L186S-처리된 2 마리 마우스)를 후속적으로 3x104 개의 Raji.Luc 세포로 재접종하였다(0 일로 표시됨; 도 6a). 5 마리의 건강한 면역-결핍 NCG 마우스를 3x104 개의 Raji.Luc 세포로 이식하고 대조군으로서 0 일째에 HBSS를 주사하였다(그룹 5). 종양 세포이식된 마우스의 상태를 모니터링하고 매주 기록하였다(도 6a-6c 참조). 재접종 14 일 후에, LCAR-L186S T 세포 처리를 받은 그룹 4 마우스(2마리 중 2 마리)는 모두 종양이 재발하고(도 6a) Raji.Luc 광자 수가 증가하였다(도 6b). 그룹 4의 1 마리 마우스(2 마리 중 1 마리)는 20 일째에 마비 및 체중 손실로 인해 안락사시켰으며(도 6a, 6b, 및 6d), 모든 마우스는 27 일째에 사망하였다(도 6d). 재접종 14 일 후에, LCAR-UL186S CAR+/TCRαβ- T 세포 처리를 받은 그룹 3 마우스의 6 마리 중 3 마리만이 Raji.Luc 광 감도(도 6b) 및 종양 부담 확장(도 6a)이 증가하였다. 그룹 3의 종양 부담은 21 일째에 증가하였지만(도 6a-6b), 마비 또는 체중 손실로 인한 사망을 발생하지 않았다(도 6c-6d). 27 일째에도, 그룹 3 마우스는 여전히 67% 생존율을 가졌다(도 6d). HBSS를 받은 대조군 그룹 5 마우스의 경우, 종양 재접종 14 일 후, 종양 부담이 점진적으로 증가하기 시작하였고(도 6a-6b), 5 마리 마우스는 21-26 일째에 마비 및 체중 손실로 인해 안락사시켰다(도 6a-6d).
이러한 결과는 LCAR-UL186S CAR+/TCRαβ- T 세포 및 LCAR-L186S T 세포가 둘 다 생체내에서 B 림프종 세포의 성장을 효과적으로 억제할 수 있음을 시사한다. 추가로, LCAR-UL186S CAR+/TCRαβ- T 세포는 체중 손실에 대한 효과가 거의 없거나 또는 전혀 없으면서, 종양 모델 및 종양 재발 모델 둘 다에서 마우스 생존을 연장할 수 있고(도 5c 및 6c), LCAR-L186S T 세포보다 더 강한 생체내 효능 및 지속성을 입증한다. 이는 LCAR-UL186S CAR+/TCRαβ- T 세포(ITAM-변형된 CAR/SIV Nef M116 공동-발현)가 기존 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인이 있는 CAR과 비교하여 더 유망한 치료 레지멘을 제공할 수 있음을 시사한다.
실시예 5. SIV Nef 및 세포내 신호전달 도메인(ISD) 사이의 상호작용
1. ISD-변형된 BCMA CAR-T 세포의 구축
Nef 및 다양한 세포내 신호전달 도메인(ISD) 사이의 상호작용을 테스트하기 위해, ISD-변형된 CAR을 구축하였다. "ISD-변형된 CAR"은 ISD 내에 임의의 변형이 있는 CAR을 기재하기 위해 본원에서 사용되며, 이는 반드시 본원에 기재된 ITAM-변형된 CAR일 필요는 없을 수 있다. 예를 들어, 표 1의 작제물은 모두 "ISD-변형된 CAR"이지만, M663, M665, M666, M667, M679, M681, M682, M683, 및 M685만이 본원에 기재된 "ITAM-변형된 CAR"이다.
간단히 말해서, 표 1에 제시된 바와 같은 다양한 ISD 구조를 갖는 CD8α SP-BCMA scFv-CD8α 힌지-CD8α TM-ISD를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 화학적으로 합성하고(상응하는 ISD-변형된 CAR 작제물 이름은 표 1을 참조함), ISD-변형된 CAR 재조합 전달 플라스미드의 구축을 위해 각각 pLVX-hEF1α-Puro 렌티바이러스 벡터(실시예 1 참조) 내로 클로닝하였다. 그런 다음 이들 전달 플라스미드를 정제하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 내로 패키징하였으며, 이하에서 각각 M661 렌티바이러스, M662 렌티바이러스, M663 렌티바이러스, M665 렌티바이러스, M666 렌티바이러스, M667 렌티바이러스, M679 렌티바이러스, M681 렌티바이러스, M682 렌티바이러스, M683 렌티바이러스, 및 M685 렌티바이러스; 또는 집합적으로 ISD-변형된 CAR 렌티바이러스로 지칭하였다.
표 1. ISD-변형된 CAR의 세포내 신호전달 도메인 구조
Figure pat00007
Jurkat 세포(ATCC®, #TIB152™)를 90% RPMI 1640 배지(Life Technologies,　#22400-089) 및 10% 소 태아 혈청(FBS, Life Technologies, #10099-141)에서 배양하였다. 상기로부터의 ISD-변형된 CAR 렌티바이러스를 형질도입을 위해 각각 Jurkat 세포 배양물의 상청액에 첨가하였다(이하에서 Jurkat-ISD-변형된 CAR로 지칭됨). 형질도입 72 시간 후에, 2 주 동안 1 μg/mL 퓨로마이신을 사용하여 양성 세포 클론을 선택하였다.
2. SIV Nef 또는 SIV Nef M116은 CD3ζ ITAM1 또는 CD3ζ ITAM2를 통해 CAR 발현에 영향을 미친다
야생형 SIV Nef 서열, SIV Nef M116 서열, 및 빈 벡터를 보유하는 렌티바이러스(실시예 1 참조)를 형질도입을 위해 각각 Jurkat-ISD-변형된 CAR 세포 배양물의 현탁액에 첨가하였다. 형질도입 3 일, 6 일, 7 일, 및 8 일 후에, 5x105 개의 세포를 수집하고 실온에서 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 세포를 1 mL DPBS로 재현탁하고, 1 μL FITC-표지된 인간 BCMA 단백질(ACROBIOSYSTEM, #BCA-HF254-200UG)을 첨가하고 현탁액을 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, DPBS 단계를 이용한 원심분리 및 재현탁을 2 회 반복하였다. 그런 다음 세포를 FACS를 위해 DPBS로 재현탁하여 BCMA ISD-변형된 CAR 발현을 검출하였다. 각각의 Jurkat-ISD-변형된 CAR-SIV Nef 세포 및 Jurkat-ISD-변형된 CAR-SIV Nef M116 세포의 상대적 ISD-변형된 CAR 발현율은 동일한 시점에 빈 벡터로 형질도입된 각각의 대조군으로 정규화되고, 다음 식을 사용하여 계산된다: 상대적 ISD-변형된 CAR 발현(%) = [샘플(%)] / [대조군(%)] x 100%. 예를 들면, 3 일째에 "Jurkat-M661-SIV Nef"의 상대적 ISD-변형된 CAR 발현 값은 다음과 같이 계산된다: 상대적 ISD-변형된 CAR 발현(%) = [Jurkat-M661-SIV Nef(%)] / [Jurkat-M661-빈 벡터(%)] x 100%.
도 7a-7c에 도시된 바와 같이, 각각의 Jurkat-ISD-변형된 CAR-SIV Nef 세포(도 7b) 및 Jurkat-ISD-변형된 CAR-SIV Nef M116 세포(도 7c)의 ISD-변형된 CAR 양성율은 동일한 시점(예컨대 SIV Nef 서열, SIV Nef M116 서열, 또는 빈 벡터를 보유하는 렌티바이러스 형질도입의 0 일, 3 일, 6 일, 7, 및 8 일째)에 Jurkat-ISD-변형된 CAR-빈 벡터 세포(도 7a)의 대조군으로 정규화된다. Nef/대조군 렌티바이러스 형질도입 3 일 후에, Jurkat-M663-SIV Nef 세포, Jurkat-M665-SIV Nef 세포, 및 Jurkat-M666-SIV Nef 세포의 ISD-변형된 CAR 양성율은 3 일째의 대조군과 비교하여 각각 46.72%, 82.31%, 및 57.04%로 떨어졌고; Jurkat-M663-SIV Nef M116 세포, Jurkat-M665-SIV Nef M116 세포, 및 Jurkat-M666-SIV Nef M116 세포의 ISD-변형된 CAR 양성율은 3 일째의 대조군과 비교하여 각각 50.92%, 70.35%, 및 56.22%로 떨어진 반면; Jurkat-ISD-변형된 CAR-빈 벡터 세포의 ISD-변형된 CAR 양성율은 대조군으로서 모두 95% 이상이었다. Nef/대조군 렌티바이러스 형질도입 6 일, 7 일, 및 8 일 후에, ISD-변형된 CAR 발현은 각 그룹에서 안정하게 되었고, Jurkat-M663-SIV Nef 세포, Jurkat-M665-SIV Nef 세포, 및 Jurkat-M666-SIV Nef 세포의 ISD-변형된 CAR 양성율은 41.19%-69.84%로 떨어졌고; Jurkat-M663-SIV Nef M116 세포, Jurkat-M665-SIV Nef M116 세포, 및 Jurkat-M666-SIV Nef M116 세포의 ISD-변형된 CAR 양성율은 44.65%-64.94%로 떨어진 반면; Jurkat-ISD-변형된 CAR-빈 벡터 세포의 ISD-변형된 CAR 양성율은 대조군으로서 여전히 95% 이상이었다.
표 1에 제시된 바와 같이, M663(ITAM1/2/3), M665(ITAM1/1/1), M666(ITAM2/2/2), 및 M667(ITAM3/3/3)의 ISD는 CD3ζ의 ITAM을 포함하는 반면, M662(0 ITAM)의 ISD는 CD3ζ의 비-ITAM 서열만을 포함한다. 상기 보여진 M662 및 M667을 제외하고 M663, M665, 및 M666의 SIV Nef 또는 SIV Nef M116에 의한 하향 조절은 SIV Nef 및 SIV Nef M116이 CD3ζ ITAM1 및 CD3ζ ITAM2와 상호작용하지만 CD3ζ ITAM3 또는 비-ITAM CD3ζ 서열과는 상호작용하지 않음으로써 CAR 발현을 조절하며; 추가로, SIV Nef 및 SIV Nef M116은 CD3ζ ITAM1과 비교하여 CD3ζ ITAM2와 더 강한 상호작용을 갖는 것으로 보임을 입증한다(CAR+ 비율 M663<M666<M665 참조). 다른 테스트된 ISD는 임의의 CD3ζ 서열을 함유하지 않고, SIV Nef 및 SIV Nef M116은 4-1BB 공동-자극 도메인, CD3ε ITAM, DAP12 ITAM, Igα ITAM, Igβ ITAM, 또는 FcεRIγ ITAM과 상호작용하는 것으로 보이지 않는다(도 7a-7c).
실시예 6. ITAM-변형된 BCMA CAR-T 세포의 시험관내 세포독성 분석
1. ITAM-변형된 BCMA CAR의 구축
ITAM-변형된 BCMA CAR을 구축하기 위해, 융합 유전자 서열 CD8α SP-BCMA scFv-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB("BCMA-BB"; 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인만을 함유함), CD8α SP-BCMA scFv-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-CD3ζ("BCMA-BBz", 서열번호: 74), CD8α SP-BCMA scFv-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-ITAM007("BCMA-BB007"), CD8α SP-BCMA scFv-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-ITAM008("BCMA-BB008"), CD8α SP-BCMA scFv-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-ITAM009("BCMA-BB009"), 및 CD8α SP-BCMA scFv-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-ITAM010("BCMA-BB010", 서열번호: 75)을 화학적으로 합성하고, 재조합 전달 플라스미드의 구축을 위해 각각 pLVX-hEF1α-Puro 렌티바이러스 벡터(실시예 1 참조) 내로 클로닝하였으며(ITAM 작제물 구조에 대해 표 2 참조), 이하에서 pLVX-BCMA-BB 전달 플라스미드(음성 대조군), pLVX-BCMA-BBz 전달 플라스미드(양성 대조군), 및 pLVX-BCMA-(BB007-BB010) 전달 플라스미드로 지칭하였다. 모든 렌티바이러스 전달 플라스미드를 정제하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 내로 패키징하였으며, 이하에서 각각 BCMA-BB 렌티바이러스, BCMA-BBz 렌티바이러스, 및 BCMA-(BB007-BB010) 렌티바이러스로 지칭하였다.
표 2. ITAM-변형된 BCMA CAR의 ITAM 작제물 구조
Figure pat00008
2. ITAM-변형된 BCMA CAR-T 세포의 시험관내 세포독성 평가
PBMC 및 T 림프구를 실시예 2에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 5x106 개의 활성화된 T 림프구를 각각 렌티바이러스 BCMA-BB, BCMA-BBz, BCMA-BB007, BCMA-BB008, BCMA-BB009, 및 BCMA-BB010으로 형질도입하였다(이하에서 각각 BCMA-BB T 세포, BCMA-BBz T 세포, 및 BCMA-(BB007-BB010) T 세포로 지칭됨). T 세포 현탁액을 6-웰 플레이트에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다. 형질도입 3 일 후에, 변형된 T 세포를 40:1 효과기 대 표적 세포(E:T) 비 하에 다발성 골수종(MM) 세포주 RPMI8226. Luc(BCMA+, 루시퍼라제(Luc) 마커 함유)와 각각 혼합하고, Corning® 384-웰 고체 백색 플레이트에서 12 시간 동안 인큐베이션하였다. ONE-Glo™ 루시퍼라제 검정 시스템(PROMEGA, #B6110)을 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 25 μL ONE-Glo™ 시약을 384-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 인큐베이션한 다음, 표적 세포 상의 상이한 T 림프구의 세포독성을 계산하기 위해 형광 측정을 위해 Spark™ 10M 다중모드 마이크로플레이트 판독기(TECAN) 위에 배치하였다.
도 8에 도시된 바와 같이, 1차 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인이 없는 음성 대조군 BCMA-BB는 종양 세포 사멸을 매개하지 못하였다. ITAM-변형된 BCMA CAR(BCMA-BB007, BCMA-BB008, BCMA-BB009, 및 BCMA-BB010)은 모두 RPMI8226. Luc(BCMA+, Luc+) 세포주에 대한 종양 세포 사멸을 매개할 수 있었다. ITAM-변형된 BCMA CAR(BCMA-(BB007-BB010)) 및 기존 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인이 있는 BCMA CAR(BCMA-BBz) 중에서 유의한 세포독성 차이(P>0.05)는 관찰되지 않았다. 이들 데이터는 본원에 기재된 키메라 신호전달 도메인(예를 들어, ITAM007-ITAM010)이 종양 세포 사멸을 유지하는 ITAM-변형된 CAR을 구축하기 위한 유망한 전략을 제공할 수 있음을 시사한다.
실시예 7. 다발성 골수종(MM) 세포주에 대한 LIC948A22 CAR-T 세포 및 LUC948A22 UCAR-T 세포의 특이적 세포독성
융합 유전자 서열 CD8α SP-BCMA VHH1-링커-BCMA VHH2-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-CD3ζ("LIC948A22 CAR", CAR 작제물에 대해 서열번호: 110 또는 176), 및 SIV Nef M116-IRES-CD8α SP-BCMA VHH1-링커-BCMA VHH2-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-ITAM010("LUC948A22 UCAR", CAR 작제물에 대해 서열번호: 109)을 화학적으로 합성하고, 재조합 전달 플라스미드의 구축을 위해 각각 pLVX-hEF1α-Puro 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝하였다. 모든 렌티바이러스 전달 플라스미드를 정제하고, 렌티바이러스 내로 패키징하였다.
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 TPCS®에서 구입하였다. Pan T 세포 단리 키트(Miltenyi Biotec, #130-096-535)를 사용하여 해동된 PBMC를 자기적으로 표지하고 T 림프구를 단리 및 정제하였다. CD3/CD28 접합된 자기 비드를 정제된 T 림프구의 활성화 및 확장에 사용하였다. 활성화된 T 림프구를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 각각 LIC948A22 CAR 및 LUC948A22 UCAR을 암호화하는 렌티바이러스로 T 림프구를 형질도입하였다. 형질도입 12 일 후에, 세포를 수집하고 자기-활성화 세포 분류(MACS)에 적용하였다. BCMA+ MACS 풍부화 후 LIC948A22 CAR-T 세포를 생산하였고, TCRαβ- MACS 풍부화 후 LUC948A22 UCAR-T 세포를 생산하였다. 각각의 5x105 개의 MACS 분류된 세포 현탁액을 수집하고 실온에서 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 세포를 DPBS로 재현탁하고 1 μL FITC-표지된 인간 BCMA 단백질(Biolegend, #310906) 및 1 μL APC 항-인간 TCRαβ 항체(Biolegend, #B259839)를 현탁액에 첨가한 다음, 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 1 mL DPBS 단계를 이용한 원심분리 및 재현탁을 2 회 반복하였다. 그런 다음 세포를 DPBS로 재현탁하고 CAR 및 TCRαβ의 양성율 검출을 위해 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 적용하였다.
상기 단계에서 수득된 LIC948A22 CAR-T 세포, TCRαβ MACS 분류된 LUC948A22 UCAR-T 세포(CAR+/TCRαβ-) 또는 미처리 T 세포(UnT)를 2.5:1 또는 1.25:1 효과기 대 표적 세포 비(E:T) 하에 각각 다발성 골수종(MM) 세포주 RPMI8226.Luc(루시퍼라제(Luc) 마커 함유, BCMA+)와 혼합하고, Corning® 384-웰 고체 백색 플레이트에서 18-20 시간 동안 인큐베이션하였다. ONE-Glo™ 루시퍼라제 검정 시스템(TAKARA, #B6120)을 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 25 μL ONE-Glo™ 시약을 384-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 인큐베이션 후, 표적 세포 상의 상이한 T 림프구의 세포용해 효과를 계산하기 위해 Spark™ 10M 다중모드 마이크로플레이트 판독기(TECAN)를 사용하여 형광을 측정하였다.
도 10에 도시된 바와 같이, LIC948A22 CAR-T 세포 및 LUC948A22 UCAR-T 세포(CAR+/TCRαβ-)의 BCMA CAR 양성율은 각각 86.5% 및 85.9%였다. RPMI8226.Luc 세포주에 대한 LIC948A22 CAR-T 세포 및 LUC948A22 UCAR-T 세포(CAR+/TCRαβ-)의 특이적 사멸 활성을 각각 추가로 평가하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, LIC948A22 CAR-T 세포 및 LUC948A22 UCAR-T 세포(CAR+/TCRαβ-)는 둘 다 15% 이상의 상대적 사멸 효율로 RPMI8226.Luc 세포주에 대한 CAR-특이적 종양 세포 사멸을 효과적으로 매개할 수 있고, 이들 사이에 유의한 세포독성 차이는 관찰되지 않았다.
실시예 8. LIC948A22 CAR-T 세포 및 LUC948A22 UCAR-T 세포 사이토카인 방출의 시험관내 분석
LIC948A22 CAR-T 세포 및 LUC948A22 UCAR-T 세포(CAR+/TCRαβ-)를 각각 상이한 E:T 비(2.5:1 및 1.25:1)에서 18-20 시간 동안 다발성 골수종 세포주 RPMI8226.Luc와 인큐베이션하였다. 공동-배양 검정으로부터 상청액을 수집하여 제조업체의 지침에 따라 MILLIPORE MILLIPLEX® MAP 인간 CD8+ T-세포 자기 비드 패널을 사용하여, 전염증 인자(도 12a), 케모카인(도 12b), 및 사이토카인(도 12c)을 포함하는 17 개 사이토카인 분자의 CAR-유도 사이토카인 방출을 평가하였다. 미처리 T 세포(UnT)는 대조군으로 제공되었다.
도 12a에 도시된 바와 같이, LIC948A22 CAR-T 세포 또는 LUC948A22 UCAR-T 세포(CAR+/TCRαβ-)를 상이한 E:T 비에서 RPMI8226.Luc 세포주와 공동-배양한 후, 전염증 인자(예컨대 퍼포린, 그랜자임 A, 그랜자임 B, IFNγ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, 및 IL-13)의 분비는 UnT 그룹과 비교하여 유의하게 증가하였다(P<0.05). LUC948A22 UCAR-T 세포는 LIC948A22 CAR-T 세포보다 더 많은 IL-2를 분비한다.
도 12b에 도시된 바와 같이, LIC948A22 CAR-T 세포 또는 LUC948A22 UCAR-T 세포(CAR+/TCRαβ-)를 상이한 E:T 비에서 RPMI8226.Luc 세포주와 공동-배양한 후, 케모카인(예컨대 MIP-1α, MIP-1β, sFas 및 sFasL)의 분비는 UnT 그룹와 비교하여 유의하게 증가하였다(P<0.05). 반면에, LUC948A22 UCAR-T 세포는 LIC948A22 CAR-T 세포보다 더 많은 sFasL을 분비한다.
도 12c에 도시된 바와 같이, LIC948A22 CAR-T 세포 및 LUC948A22 UCAR-T 세포(CAR+/TCRαβ-)를 상이한 E:T 비에서 RPMI8226.Luc 세포주와 공동-배양한 후, 사이토카인(예컨대 TNFα, GM-CSF 및 sCD137)의 분비는 UnT 그룹과 비교하여 유의하게 증가하였다(P<0.05). 반면에, LUC948A22 UCAR-T 세포는 LIC948A22 CAR-T 세포보다 더 많은 TNFα를 분비한다.
요약하면, 상기 결과는 LUC948A22 UCAR-T 세포(CAR+/TCRαβ-)가 세포독성 및 사이토카인 방출과 같이 자가 LIC948A22 CAR-T 세포와 비슷한 효과를 가짐을 나타내며, 이는 LUC948A22 UCAR-T 세포가 광범위한 임상 적용 가능성으로 효과적이고 안전할 것임을 시사한다.
실시예 9. SIV Nef 및 SIV Nef M116과 CMSD ITAM 사이의 상호작용
1. ITAM-변형된 BCMA CAR-T 세포의 구축
표 3에 제시된 바와 같은 다양한 ISD 구조를 갖는 CD8α SP-BCMA scFv-CD8α 힌지-CD8α TM-ISD를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 대조군 작제물 CD8α SP-BCMA scFv-CD8α 힌지-CD8α TM-CD3ζ("M660")를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 화학적으로 합성하고, ITAM-변형된 BCMA CAR 재조합 전달 플라스미드 pLVX-M678-Puro, pLVX-M680-Puro, pLVX-M684-Puro, 및 pLVX-M799-Puro, 및 대조군 BCMA-CD3ζ CAR 재조합 전달 플라스미드 pLVX-M660-Puro의 구축을 위해, pLVX-hEF1α-Puro 렌티바이러스 벡터(실시예 1 참조)로 별도로 클로닝하였다. pLVX-M663-Puro를 실시예 5에서와 같이 구축하였다. 그런 다음 이들 전달 플라스미드를 정제하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 내로 패키닝하였으며, 이하에서 각각 M678 렌티바이러스, M680 렌티바이러스, M684 렌티바이러스, M799 렌티바이러스, 및 대조군 M660 렌티바이러스; 또는 집합적으로 ISD-변형된 BCMA CAR 렌티바이러스로 지칭하였다.
표 3. ISD-변형된 CAR의 세포내 신호전달 도메인 구조
Figure pat00009
Jurkat 세포(ATCC®, #TIB152™)를 90% RPMI 1640 배지(Life Technologies,　#22400-089) 및 10% 소 태아 혈청(FBS, Life Technologies, #10099-141)에 배양하였다. 상기로부터의 ISD-변형된 BCMA CAR 렌티바이러스를 형질도입을 위해 각각 Jurkat 세포 배양물의 상청액에 첨가하였다(이하에서 Jurkat-ISD-변형된 BCMA CAR로 지칭됨). 형질도입 72 시간 후에, 2 주 동안 1 μg/mL 퓨로마이신을 사용하여 양성 클론을 선택하였다.
2. SIV Nef 및 SIV Nef M116과 각각 CD3δ ITAM, CD3γ ITAM, FcεRIβ ITAM, 및 CNAIP/NFAM1 ITAM 사이의 상호작용
야생형 SIV Nef 서열, SIV Nef M116 서열, 및 빈 벡터를 보유하는 렌티바이러스(실시예 1 참조)를 형질도입을 위해 Jurkat-ITAM-변형된 BCMA CAR(실시예 5의 Jurkat-M663, Jurkat-M678, Jurkat-M680, Jurkat-M684, 및 Jurkat-M799) 세포 배양물의 현탁액에 별도로 첨가하였다. 형질도입 3 일, 6 일, 7 일, 및 8 일 후에, 5x105 개의 세포를 수집하고 실온에서 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 세포를 1 mL DPBS로 재현탁하고, 1 μL FITC-표지된 인간 BCMA 단백질(Biolegend, #310906)을 첨가하고 현탁액을 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, DPBS 단계를 이용한 원심분리 및 재현탁을 2 회 반복하였다. 그런 다음 세포를 FACS를 위해 DPBS로 재현탁하여 BCMA CAR 발현을 검출하였다. 실시예 5와 같이 상대적 CAR 발현을 계산하였다.
도 13a-13c에 도시된 바와 같이, 각각의 Jurkat-ITAM-변형된 BCMA CAR 세포의 ITAM-변형된 BCMA CAR 양성율은 95% 이상이었고; 각각 SIV Nef, SIV Nef M116, 및 빈 벡터로 형질도입된 Jurkat-M678 세포, Jurkat-M680 세포, Jurkat-M684 세포, 및 Jurkat-M799 세포에서 CAR 양성율의 유의한 하향 조절은 관찰되지 않았다(P > 0.05). 각각 SIV Nef 및 SIV Nef M116으로 형질도입된 Jurkat-M663의 CAR 양성율은 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 유의하게 하향 조절되었다(P<0.05). 이들 데이터는 SIV Nef 및 SIV Nef M116이 M678(CD3δ ITAM), M680(CD3γ ITAM), M684(FcεRIβ ITAM), 또는 M799(CNAIP/NFAM1 ITAM)와 상호작용하는 것으로 보이지 않음을 시사한다.
실시예 10. CMSD ITAM 활성화 활성의 평가
상기 기재된 1x106 개의 Jurkat-ISD-변형된 BCMA CAR 세포(실시예 5의 Jurkat-M662 세포, Jurkat-M663 세포, Jurkat-M665 세포, Jurkat-M666 세포, Jurkat-M667 세포, Jurkat-M679 세포, Jurkat-M681세포, Jurkat-M682 세포, Jurkat-M683 세포, 및 Jurkat-M685 세포; 실시예 9의 Jurkat-M678 세포, Jurkat-M680 세포, Jurkat-M684 세포, Jurkat-M799 세포, 및 대조군 Jurkat-M660 세포 포함)를 1:1의 E:T 비에서 각각 표적 세포주 RPMI8226(CFSE 표지 함유) 및 비-표적 세포주 K562(CFSE 표지 함유)와 혼합하였다. 혼합된 세포를 24-웰 플레이트에 첨가하고, 최종 부피가 1 mL/웰이 되도록 RPMI 1640 배지(10% FBS 함유)로 보충하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 각각의 공동-배양된 검정으로부터 샘플을 수집하여 CFSE 음성 세포에서 각각 2.5 시간 인큐베이션 후 CD69 발현, 24 시간 인큐베이션 후 CD25 발현, 및 144 시간 인큐베이션 후 HLA-DR 발현을 평가하였다. 형질도입되지 않은 Jurkat 세포("Jurkat")는 대조군으로 제공되었다.
도 14a-14c에 도시된 바와 같이, Jurkat-ITAM-변형된 BCMA CAR 세포에서 활성화 분자 CD69, CD25, 및 HLA-DR의 발현은 표적 세포주 RPMI8226의 자극 하에 유의하게 증가하였다(P<0.05). 반면에, 비-표적 세포주 K562와 공동-배양된 Jurkat-ITAM-변형된 BCMA CAR 세포에서 CD69, CD25, 및 HLA-DR의 발현은 검출되지 않는다. 이들 데이터는 CAR-T 세포에서 CMSD ITAM의 배열이 CAR-매개 특이적 활성화 활성을 보유함을 시사한다.
실시예 11. CAR-T 세포 활성에 대한 키메라 신호전달 도메인의 CMSD 링커의 영향
1. ITAM-변형된 BCMA CAR의 구축
ITAM010 세포내 신호전달 도메인의 CMSD 링커를 결실 또는 대체하여 ITAM024 작제물, ITAM025 작제물, ITAM026 작제물, ITAM027 작제물, ITAM028 작제물, 및 ITAM029 작제물(상응하는 ITAM 작제물은 표 4 참조)을 형성하였다. ITAM-변형된 BCMA CAR을 구축하기 위해, BCMA-BBz의 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인(CD8α SP-BCMA scFv-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-CD3ζ)은 각각 pLVX-BCMA-BB024, pLVX-BCMA-BB025, pLVX-BCMA-BB026, pLVX-BCMA-BB027, pLVX-BCMA-BB028, 또는 pLVX-BCMA-BB029 전달 플라스미드의 구축을 위해 상기 작제물로 대체하였다. 그런 다음 이들 전달 플라스미드를 정제하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 내로 패키징하였으며, 이하에서 BCMA-BB024 렌티바이러스, BCMA-BB025 렌티바이러스, BCMA-BB026 렌티바이러스, BCMA-BB027 렌티바이러스, BCMA-BB028 렌티바이러스, 및 BCMA-BB029 렌티바이러스로 지칭하였다.
표 4. ITAM-변형된 BCMA CAR의 ITAM 작제물 구조
Figure pat00010
2. ITAM-변형된 BCMA CAR-T 세포 시험관내 검정의 세포독성
PBMC 및 T 림프구를 실시예 2에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 활성화 3 일 후에, 5x106 개의 활성화된 T 림프구를 각각 ITAM-변형된 BCMA CAR을 암호화하는 렌티바이러스(실시예 2의 BCMA-BB010 렌티바이러스 및 BCMA-BB024~BCMA-BB029 렌티바이러스 포함) 및 실시예 1의 대조군 BCMA-BBz 렌티바이러스로 형질도입하였다. T 세포 현탁액을 6-웰 플레이트에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다. 형질도입 3 일 후에, 변형된 T 세포를 2.5:1의 E:T 비에서 각각 다발성 골수종(MM) 세포주 RPMI8226.Luc와 혼합하고, Corning® 384-웰 고체 백색 플레이트에서 12 시간 동안 인큐베이션하였다. ONE-Glo™ 루시퍼라제 검정 시스템(TAKARA, #B6120)을 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 25 μL ONE-Glo™ 시약을 384-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 인큐베이션한 다음, 표적 세포 상의 상이한 T 림프구의 세포독성을 계산하기 위해 형광 측정을 위해 Spark™ 10M 다중모드 마이크로플레이트 판독기(TECAN) 위에 배치하였다. 형질도입되지 않은 T 세포("UnT")는 대조군으로 제공되었다.
도 15에 도시된 바와 같이, BCMA-BB024, CMSD ITAM은 서로 직접 연결되었으며; BCMA-BB010 및 BCMA-BB025~BCMA-BB029, CMSD ITAM은 상이한 CMSD 링커에 의해 연결되었고; 모두 UnT와 비교하여 RPMI8226.Luc 세포주에 대한 유의한 특이적 종양 세포 사멸을 매개할 수 있었다(P<0.05). BCMA-BB025, BCMA-BB028, 및 BCMA-BB029는 BCMA-BBz와 비교하여 유의하게 CAR-특이적 세포독성을 나타내었다(P<0.05). BCMA-BB010, BCMA-BB024, BCMA-BB026, BCMA-BB027, 및 기존 CD3ζ ISD가 있는 BCMA CAR(BCMA-BBz) 중에서 유의한 세포독성 차이(P>0.05)는 관찰되지 않았다. 이들 데이터는 키메라 신호전달 도메인의 CMSD 링커가 CAR-T 세포의 CAR-매개 특이적 세포독성과 절충하지 않음을 시사한다.
실시예 12. CAR-T 세포 활성에 대한 CMSD ITAM 순서의 영향
1. ITAM-변형된 BCMA CAR의 구축
ITAM-변형된 BCMA CAR을 구축하기 위해, BCMA-BB010의 ITAM010 세포내 신호전달 도메인(CD8α SP-BCMA scFv-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-ITAM010)을 각각 pLVX-BCMA-BB030, pLVX-BCMA-BB031, 및 pLVX-BCMA-BB032 전달 플라스미드의 구축을 위해 ITAM030, ITAM031, 및 ITAM032(상응하는 ITAM 작제물은 표 5 참조)와 같은 ITAM010과 상이한 순서의 ITAM을 포함하는 ITAM 작제물로 대체하였다. 그런 다음 이들 전달 플라스미드를 정제하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 내로 패키징하였으며, 이하에서 각각 BCMA-BB030 렌티바이러스, BCMA-BB031 렌티바이러스, 및 BCMA-BB032 렌티바이러스로 지칭하였다.
표 5. ITAM-변형된 BCMA CAR의 ITAM 작제물 구조
Figure pat00011
2. ITAM-변형된 BCMA CAR-T 세포 시험관내 검정의 세포독성
PBMC 및 T 림프구를 실시예 2에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 활성화 3 일 후에, 5x106 개의 활성화된 T 림프구를 각각 ITAM-변형된 BCMA CAR을 암호화하는 렌티바이러스(실시예 2의 BCMA-BB010 렌티바이러스 및 BCMA-BB030~BCMA-BB032 포함), 및 실시예 1의 대조군 BCMA-BBz 렌티바이러스로 형질도입하였다. T 세포 현탁액을 6-웰 플레이트에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다. 형질도입 3 일 후에, 변형된 T 세포를 2.5:1의 E:T 비에서 각각 다발성 골수종(MM) 세포주 RPMI8226.Luc와 혼합하고, Corning® 384-웰 고체 백색 플레이트에서 12 시간 동안 인큐베이션하였다. ONE-Glo™ 루시퍼라제 검정 시스템(TAKARA, #B6120)을 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 25 μL ONE-Glo™ 시약을 384-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 인큐베이션한 다음, 표적 세포 상의 상이한 T 림프구의 세포독성을 계산하기 위해 형광 측정을 위해 Spark™ 10M 다중모드 마이크로플레이트 판독기(TECAN) 위에 배치하였다. 형질도입되지 않은 T 세포("UnT")는 대조군으로 제공되었다.
도 16에 도시된 바와 같이, ITAM-변형된 BCMA CAR-T 세포(BCMA-(BB030-BB032))는 모두 UnT(P<0.05)와 비교하여 RPMI8226.Luc 세포주에서 유의한 특이적 종양 세포 사멸을 매개할 수 있었다. BCMA-BB031 및 BCMA-BB032는 BCMA-BBz와 비교하여 유의하게 CAR-특이적 세포독성을 나타내었다(P<0.05). BCMA-BB010 및 BCMA-BB030과 BCMA-BBz 사이에 유의한 세포독성 차이(P > 0.05)는 관찰되지 않았다. 이들 결과는 CMSD ITAM의 재배열이 CAR-T 세포의 CAR-매개 특이적 세포독성과 절충하지 않음을 시사한다.
실시예 13. CAR-T 세포 활성에 대한 CMSD ITAM의 양 및 공급원의 영향
1. ITAM-변형된 BCMA CAR의 구축
ITAM-변형된 BCMA CAR, 세포내 신호전달 도메인은 각각 1, 2, 3, 또는 4 개의 CMSD ITAM으로 이루어지며, 상이한 공급원을 테스트하였다. ITAM-변형된 BCMA CAR을 구축하기 위해, BCMA-BBz의 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인(CD8α SP-BCMA scFv-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-CD3ζ)을 각각 pLVX-BCMA-BB033, pLVX-BCMA-BB034, pLVX-BCMA-BB035, pLVX-BCMA-BB036, pLVX-BCMA-BB037, pLVX-BCMA-BB038, pLVX-BCMA-BB045, 또는 BCMA-BB046 전달 플라스미드의 구축을 위해 ITAM033 작제물, ITAM034 작제물, ITAM035 작제물, ITAM036 작제물, ITAM037 작제물, ITAM038 작제물, ITAM045 작제물, 또는 ITAM046 작제물(상응하는 ITAM 작제물은 표 6 참조)로 대체하였다. 그런 다음 이들 전달 플라스미드를 정제하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 내로 패키징하였으며, 이하에서 BCMA-BB033 렌티바이러스, BCMA-BB034 렌티바이러스, BCMA-BB035 렌티바이러스, BCMA-BB036 렌티바이러스, BCMA-BB037 렌티바이러스, BCMA-BB038 렌티바이러스, BCMA-BB045 렌티바이러스, 및 BCMA-BB046 렌티바이러스로 지칭하였다.
표 6. ITAM-변형된 BCMA CAR의 ITAM 작제물 구조
Figure pat00012
2. BCMA CAR-T 세포 활성에 대한 CMSD ITAM 영향의 양 및 공급원의 평가
PBMC 및 T 림프구를 실시예 2에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 활성화 3 일 후에, 5x106 개의 활성화된 T 림프구를 각각 ITAM-변형된 BCMA CAR을 암호화하는 렌티바이러스(BCMA-BB033~BCMA-BB038 렌티바이러스, 실시예 2의 BCMA-BB010 렌티바이러스, 및 실시예 12의 BCMA-BB030~BCMA-BB032 렌티바이러스 포함), 및 실시예 1의 대조군 BCMA-BBz 렌티바이러스로 형질도입하였다. T 세포 현탁액을 6-웰 플레이트에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다. 형질도입 3 일 후에, 변형된 T 세포를 2.5:1의 E:T 비에서 각각 다발성 골수종(MM) 세포주 RPMI8226.Luc와 혼합하고, Corning® 384-웰 고체 백색 플레이트에서 12 시간 동안 인큐베이션하였다. ONE-Glo™ 루시퍼라제 검정 시스템(TAKARA, #B6120)을 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 25 μL ONE-Glo™ 시약을 384-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 인큐베이션한 다음, 표적 세포 상의 상이한 T 림프구의 세포독성을 계산하기 위해 형광 측정을 위해 Spark™ 10M 다중모드 마이크로플레이트 판독기(TECAN) 위에 배치하였다. 형질도입되지 않은 T 세포("UnT")는 대조군으로 제공되었다.
도 17에 도시된 바와 같이, ITAM-변형된 BCMA CAR-T 세포(BCMA-BB010 및 BCMA-BB030~BCMA-BB038), 세포내 신호전달 도메인은 CMSD ITAM의 1 내지 4 개의 양 및 1 내지 4 개의 공급원으로 이루어지고, UnT와 비교하여 모두 RPMI8226.Luc 세포주에 대한 유의한 특이적 종양 세포 사멸을 매개할 수 있었다(P<0.05). BCMA-BB037, BCMA-BB038, BCMA-BB031, 및 BCMA-BB032는 BCMA-BBz와 비교하여 유의하게 CAR-특이적 세포독성을 나타내었다(P<0.05). BCMA-BB010, BCMA-BB030, BCMA-BB035, BCMA-BB036, 및 BCMA CAR과 기존 CD3ζ ISD(BCMA-BBz) 중에서 유의한 세포독성 차이(P > 0.05)는 관찰되지 않았다. 이들 데이터는 CMSD ITAM의 1 내지 4 개의 양 및 1 내지 4 개의 공급원의 재배열이 CAR-T 세포의 CAR-매개 특이적 세포독성과 절충하지 않음을 시사한다.
실시예 14. SIV Nef 및 SIV Nef M116과 CAR의 CMSD ITAM 사이의 상호작용
1. SIV Nef 및 SIV Nef M116을 별도로 발현하는 Jurkat 세포주의 구축
Jurkat 세포(ATCC®, #TIB152™)를 90% RPMI 1640 배지(Life Technologies,　#22400-089) 및 10% 소 태아 혈청(FBS, Life Technologies, #10099-141)에서 배양하였다. 야생형 SIV Nef 또는 SIV Nef M116 융합 유전자를 보유하는 렌티바이러스(실시예 1 참조)를 형질도입을 위해 Jurkat 세포 배양물의 상청액에 별도로 첨가하였다. 형질도입 60 시간 후에, 1x107 개의 세포를 수집하고 MACS에 적용하였다. MACS 풍부화 후, SIV Nef 렌티바이러스(이하에서 "MACS 분류된 Jurkat-SIV Nef"로 지칭됨) 및 SIV Nef M116 렌티바이러스(이하에서 "MACS 분류된 Jurkat-SIV Nef M116"으로 지칭됨)로 형질도입된 Jurkat 세포는 각각 8.41% 및 13.1% TCRαβ 양성 세포를 생산하였다.
2. SIV Nef 및 SIV Nef M116 조절 활성과 CMSD ITAM 사이의 상호작용 테스트
ITAM-변형된 BCMA CAR(예컨대 BCMA-BB035, BCMA-BB036, BCMA-BB045, BCMA-BB046, BCMA-BB010, BCMA-BB030, 및 BCMA-BB032) 및 대조군 BCMA-BBz를 보유하는 렌티바이러스를 형질도입을 위해 각각 MACS 분류된 Jurkat-SIV Nef TCRαβ 음성 세포 및 MACS 분류된 Jurkat-SIV Nef M116 TCRαβ 음성 세포에 첨가하였다(이하에서 Jurakt-SIV Nef-BBz, Jurakt-SIV Nef-BB035, Jurakt-SIV Nef-BB036, Jurakt-SIV Nef-BB045, Jurakt-SIV Nef-BB046, Jurakt-SIV Nef-BB010, Jurakt-SIV Nef-BB030, Jurakt-SIV Nef-BB032; Jurakt-SIV Nef M116-BBz, Jurakt-SIV Nef M116-BB035, Jurakt-SIV Nef M116-BB036, Jurakt-SIV Nef M116-BB045, Jurakt-SIV Nef M116-BB046, Jurakt-SIV Nef M116-BB010, Jurakt-SIV Nef M116-BB030, Jurakt-SIV Nef M116-BB032로 지칭됨). 형질도입 3 일 후에, 5x105 개의 세포 현탁액을 수집하고 실온에서 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 세포를 1 mL DPBS로 재현탁하고, 1 μL PE/Cy5 항-인간 TCRα/β 항체(Biolegend, #306710)를 첨가하고 현탁액을 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, DPBS 단계를 이용한 원심분리 및 재현탁을 2 회 반복하였다. 그런 다음 세포를 FACS를 위해 DPBS로 재현탁하여 TCRαβ 발현을 검출하였다. 형질도입되지 않은 Jurkat 세포("Jurkat")는 대조군으로 제공되었다.
도 18a에 도시된 바와 같이, 기존 CD3ζ ISD를 포함하는 BCMA CAR로 추가로 형질도입된 MACS 분류된 Jurkat-SIV Nef 세포 배양물(8.41% TCRαβ 양성율 가짐)은 49.0% TCRαβ 양성율을 나타낸다. BCMA-BB035, BCMA-BB036, BCMA-BB045, BCMA-BB046, BCMA-BB010, BCMA-BB030, 및 BCMA-BB032 렌티바이러스로 추가로 형질도입된 MACS 분류된 Jurkat-SIV Nef 세포 배양물(8.41% TCRαβ 양성율 가짐)은 각각 13.6%, 10.3%, 10.1%, 10.3%, 13.7%, 13.9%, 및 11.8% TCRαβ 양성율을 나타내고, MACS 분류된 Jurkat-SIV Nef TCRαβ 음성 세포와 비교하여 유의한 차이(P >0.05) 는 없었다. 도 18b에 도시된 바와 같이, 기존 CD3ζ ISD를 포함하는 BCMA CAR로 추가로 형질도입된 MACS 분류된 Jurkat-SIV Nef M116 세포 배양물(13.1% TCRαβ 양성율 가짐)은 47.4% TCRαβ 양성율을 나타낸다. BCMA-BB035, BCMA-BB036, BCMA-BB045, BCMA-BB046, BCMA-BB010, BCMA-BB030, 및 BCMA-BB032 렌티바이러스로 추가로 형질도입된 MACS 분류된 Jurkat-SIV Nef M116 세포 배양물(13.1% TCRαβ 양성율 가짐)은 각각 13.4%, 14.0%, 19.0%, 16.3%, 16.2%, 16.7%, 및 12.3% TCRαβ 양성율을 나타내고, MACS 분류된 Jurkat-SIV Nef M116 TCRαβ 음성 세포와 비교하여 유의한 차이(P > 0.05)는 없었다. 이들 결과는 TCR/CD3 복합체 상의 SIV Nef 및 SIV Nef M116의 조절이 BCMA-BB035, BCMA-BB036, BCMA-BB045, BCMA-BB046, BCMA-BB010, BCMA-BB030, 및 BCMA-BB032에 의해 영향을 받지 않음을 시사한다.
요약하면, 상기 결과는 BCMA-BB035, BCMA-BB036, BCMA-BB045, BCMA-BB046, BCMA-BB010, BCMA-BB030, 및 BCMA-BB032가 SIV Nef 또는 SIV Nef M116과 상호작용하지 않음을 나타낸다. TCR/CD3 복합체 상의 SIV Nef 및 SIV Nef M116의 조절은 CMSD ITAM-변형된 CAR과 조합될 때 영향을 미치지 않는다.
실시예 15. CD20 CAR-T 세포 면역요법에서 SIV Nef M116의 용도
1. SIV Nef M116+CAR 올인원 벡터의 구축
표 7의 융합 유전자 서열을 화학적으로 합성한 다음, 각각 재조합 전달 플라스미드 pLVX-M1185, pLVX-M1218, pLVX-M1219, pLVX-M1124, pLVX-M1125, pLVX-M1126, 및 pLVX-M1127의 구축을 위해 pLVX-hEF1α 벡터(실시예 1 참조) 내로 클로닝하였다. 그런 다음 이들 전달 플라스미드를 정제하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 렌티바이러스로 패키징하였으며, 이하에서 각각 M1185 렌티바이러스, M1218 렌티바이러스, M1219 렌티바이러스, M1124 렌티바이러스, M1125 렌티바이러스, M1126 렌티바이러스, 및 M1127 렌티바이러스로 지칭하였다.
표 7. 예시적인 SIV Nef M116+CAR 올인원 벡터
Figure pat00013
2. TCR에 대한 SIV Nef M116 조절 평가
실시예 3의 렌티바이러스 M1185, M1218, M1219, M1124, M1125, M1126, M1127, 및 LCAR-UL186S를 각각 형질도입을 위해 Jurakt 세포 배양물의 현탁액에 첨가하였다. 형질도입 3 일 후에, 5x105 개의 세포 현탁액을 수집하고 실온에서 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 세포를 1 mL DPBS로 재현탁하고, 1 μL PE/Cy5 항-인간 TCRα/β 항체(Biolegend, #306710)를 첨가하고 현탁액을 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, DPBS 단계를 이용한 원심분리 및 재현탁을 2 회 반복하였다. 그런 다음 세포를 FACS를 위해 DPBS로 재현탁하여 TCRαβ 발현을 검출하였다. 형질도입되지 않은 Jurkat 세포("Jurkat")는 대조군으로 제공되었다.
도 19a에 도시된 바와 같이, SIV Nef M116+ITAM-변형된 CD20 CAR 올인원 작제물 형질도입된 Jurkat 세포는 형질도입되지 않은 Jurkat 세포와 비교하여 TCRαβ 발현을 유의하게 하향 조절하였다(P<0.05).
3. 시험관내 검정에서 CD20 CAR-T 세포의 세포독성
PBMC 및 T 림프구를 실시예 2에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 활성화 3 일 후에, 5x106 개의 활성화된 T 림프구를 올인원 작제물을 보유하는 렌티바이러스(M1185, M1218, M1219, M1124, M1125, M1126, M1127, 및 LCAR-UL186S 포함)로 각각 형질도입하였다. T 세포 현탁액을 6-웰 플레이트에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다. 형질도입 3 일 후에, 변형된 T 세포를 20:1의 E:T 비에서 림프종 세포주 Raji.Luc와 각각 혼합하고, Corning® 384-웰 고체 백색 플레이트에서 12 시간 동안 인큐베이션하였다. ONE-Glo™ 루시퍼라제 검정 시스템(TAKARA, #B6120)을 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 25 μL ONE-Glo™ 시약을 384-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 인큐베이션한 다음, 표적 세포 상의 상이한 T 림프구의 세포독성을 계산하기 위해 형광 측정을 위해 Spark™ 10M 다중모드 마이크로플레이트 판독기(TECAN) 위에 배치하였다. 형질도입되지 않은 T 세포("UnT")는 대조군으로 제공되었다.
도 19b에 도시된 바와 같이, SIV Nef M116+ITAM-변형된 CD20 CAR 올인원 작제물 형질도입된 T 세포는 UnT와 비교하여 Raji.Luc 세포주에 대한 유의한 CAR-매개 특이적 사멸 활성을 나타내었다(P<0.05). M1219, M1125-M1127, LCAR-UL186S, 및 CD20 CAR과 기존 CD3ζ ISD(M1185) 중에서 유의한 세포독성 차이(P > 0.05)는 관찰되지 않았다.
실시예 16. BCMA CAR-T 세포 면역요법에서 SIV Nef M116의 용도
1. SIV Nef M116+CAR 올인원 벡터의 구축
표 8의 융합 유전자 서열을 화학적으로 합성한 다음, 각각 재조합 전달 플라스미드 pLVX-M1215, pLVX-M1216, pLVX-M1217, pLVX-M985, pLVX-M986, pLVX-M989, 및 pLVX-M990의 구축을 위해 pLVX-hEF1α 벡터(실시예 1 참조) 내로 클로닝하였다. 그런 다음 이들 전달 플라스미드를 정제하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 내로 패키징하였으며, 이하에서 각각 M1215 렌티바이러스, M1216 렌티바이러스, M1217 렌티바이러스, M985 렌티바이러스, M986 렌티바이러스, M989 렌티바이러스, 및 M990 렌티바이러스로 지칭하였다.
표 8. 예시적인 SIV Nef M116+CAR 올인원 벡터
Figure pat00014
2. TCR에 대한 SIV Nef M116 조절의 평가
렌티바이러스 M1215, M1216, M1217, M985, M986, M989, M990, 및 LUC948A22 UCAR(실시예 7 참조)을 각각 형질도입을 위해 Jurakt 세포 배양물의 현탁액에 첨가하였다. 형질도입 3 일 후에, 5x105 개의 세포 현탁액을 수집하고 실온에서 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 세포를 1 mL DPBS로 재현탁하고, 1 μL PE/Cy5 항-인간 TCRα/β 항체(Biolegend, #306710)를 첨가하고 현탁액을 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, DPBS 단계를 이용한 원심분리 및 재현탁을 2 회 반복하였다. 그런 다음 세포를 FACS를 위해 DPBS로 재현탁하여 TCRαβ 발현을 검출하였다. 형질도입되지 않은 Jurakt 세포("Jurkat")는 대조군으로 제공되었다.
도 20a에 도시된 바와 같이, SIV Nef M116+ITAM-변형된 BCMA CAR 올인원 작제물 형질도입된 Jurkat 세포는 형질도입되지 않은 Jurkat 세포와 비교하여 TCRαβ 발현을 유의하게 하향 조절하였다(P<0.05).
3. BCMA CAR-T 세포 시험관내 검정의 세포독성
PBMC 및 T 림프구를 실시예 2에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 활성화 3 일 후에, 5x106 개의 활성화된 T 림프구를 올인원 작제물을 보유하는 렌티바이러스(M1215, M1216, M1217, M985, M986, M989, M990, 및 LUC948A22 UCAR(실시예 7 참조) 포함)로 각각 형질도입하였다. T 세포 현탁액을 6-웰 플레이트에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다. 형질도입 3 일 후에, 변형된 T 세포를 4:1의 E:T 비에서 각각 다발성 골수종(MM) 세포주 RPMI8226.Luc와 혼합하고, Corning® 384-웰 고체 백색 플레이트에서 12 시간 동안 인큐베이션하였다. ONE-Glo™ 루시퍼라제 검정 시스템(TAKARA, #B6120)을 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 25 μL ONE-Glo™ 시약을 384-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 인큐베이션한 다음, 표적 세포 상의 상이한 T 림프구의 세포독성을 계산하기 위해 형광 측정을 위해 Spark™ 10M 다중모드 마이크로플레이트 판독기(TECAN) 위에 배치하였다. 형질도입되지 않은 T 세포("UnT")는 대조군으로 제공되었다.
도 20b에 도시된 바와 같이, SIV Nef M116+ITAM-변형된 BCMA CAR 올인원 작제물 형질도입된 T 세포는 UnT와 비교하여 RPMI8226.Luc 세포주에 대한 유의한 CAR-매개 특이적 사멸 활성을 나타낸다(P<0.05). M1217, M985, M986, 및 M989는 BCMA-BBz와 비교하여 유의하게 CAR-특이적 세포독성을 나타내었다(P<0.05). M1216, LUC948A22 UCAR, M990, 및 BCMA CAR과 기존 CD3ζ ISD(M1215) 중에서 유의한 세포독성 차이(P > 0.05)는 관찰되지 않았다.
실시예 17. TCRαβ 조절에 대한 절두된 SIV Nef의 평가
1. 절두된 SIV Nef 및 SIV Nef M116을 별도로 발현하는 Jurkat 세포주의 구축
절두된 SIV Nef의 폴리뉴클레오티드 서열(상응하는 서열은 표 9 참조)을 화학적으로 합성하고, 재조합 전달 플라스미드 pLVX-SIV Nef M708-Puro, pLVX-SIV Nef M709-Puro, pLVX-SIV Nef M710-Puro, pLVX-SIV Nef M711-Puro, pLVX-SIV Nef M712-Puro, pLVX-SIV Nef M714-Puro, 및 pLVX-SIV Nef M715-Puro의 구축을 위해 pLVX-hEF1α-Puro(실시예 1 참조) 벡터 내로 별도로 클로닝하였다. 그런 다음 이들 전달 플라스미드를 정제하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 내로 패키징하고, 렌티바이러스를 함유하는 여과된 상청액을 PEG6000을 사용하여 추가로 농축하여 농축된 렌티바이러스를 수득하였고, 이하에서 각각 SIV Nef M708 렌티바이러스, SIV Nef M709 렌티바이러스, SIV Nef M710 렌티바이러스, SIV Nef M711 렌티바이러스, SIV Nef M712 렌티바이러스, SIV Nef M714 렌티바이러스, 및 SIV Nef M715 렌티바이러스; 또는 집합적으로 절두된 SIV Nef 렌티바이러스로 지칭하였다. 이들 농축된 렌티바이러스를 -80℃에서 저장하였다.
표 9. TCRαβ 조절에 대한 예시적인 SIV Nef 돌연변이체
Figure pat00015
Jurkat 세포(ATCC®, #TIB152™)를 90% RPMI 1640 배지(Life Technologies,　#22400-089) 및 10% 소 태아 혈청(FBS, Life Technologies, #10099-141)에서 배양하였다. SIV Nef M116 렌티바이러스(실시예 1 참조) 및 상기로부터의 절두된 SIV Nef 렌티바이러스를 형질도입을 위해 Jurkat 세포 배양물의 상청액에 별도로 첨가하였다. (이하에서 각각 Jurkat-SIV Nef M116 및 Jurkat-절두된 SIV Nef로 지칭됨). 형질도입 72 시간 후에, 2 주 동안 1 μg/mL 퓨로마이신을 사용하여 양성 세포 클론을 선택하였다.
2. 절두된 SIV Nef는 TCRαβ 발현을 조절한다
Jurkat-SIV Nef M116 및 Jurkat-절두된 SIV Nef의 5x105 개의 세포 현탁액을 별도로 수집하고 실온에서 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 세포를 1 mL DPBS로 재현탁하고, 1 μL APC 항-인간 TCRα/β 항체(Biolegend, #306718)를 첨가하고 현탁액을 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, DPBS 단계를 이용한 원심분리 및 재현탁을 2 회 반복하였다. 그런 다음 세포를 FACS를 위해 DPBS로 재현탁하여 TCRαβ 발현을 검출하였다. 형질도입되지 않은 Jurakt 세포("Jurkat")는 대조군으로 제공되었다.
도 21에 도시된 바와 같이, Jurkat 세포, Jurkat-SIV Nef M116 세포, Jurkat-SIV Nef M708 세포, Jurkat-SIV Nef M709 세포, Jurkat-SIV Nef M710 세포, Jurkat-SIV Nef M711 세포, Jurkat-SIV Nef M712 세포, Jurkat-SIV Nef M714 세포, 및 Jurkat-SIV Nef M715 세포의 TCRαβ 양성율은 각각 92.8%, 1.93%, 33.5%, 88.5%, 83.2%, 87.3%, 89.8%, 86.2%, 및 81.4%였다. 이들 결과(표 9 참조)는 SIV Nef M708이 TCRαβ 발현을 유의하게 하향 조절할 수 있음을 시사한다(P<0.05).
실시예 18. BCMA CAR-T 세포 면역요법에서 SIV Nef M708의 용도
1. SIV Nef M708+ITAM-변형된 CAR 올인원 벡터의 구축
융합 유전자 서열 SIV Nef M708-IRES-CD8α SP-BCMA VHH1-링커-BCMA VHH2-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-ITAM010(이하에서 M598로 지칭됨, 서열번호: 206)을 화학적으로 합성한 다음, 재조합 전달 플라스미드 pLVX-M598의 구축을 위해 pLVX-hEF1α 벡터(실시예 1 참조) 내로 클로닝하였다. 그런 다음 전달 플라스미드를 정제하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 내로 패키징하였으며, 이하에서 M598 렌티바이러스로 지칭하였다. ITAM-변형된 BCMA CAR 작제물 "CD8α SP-BCMA VHH1-링커-BCMA VHH2-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-ITAM010"은 본원에서 "M598 ITAM010-변형된 BCMA CAR" 또는 "M598 BCMA CAR"로 지칭되며, 서열번호: 205의 서열을 포함한다. M598 BCMA CAR의 항-BCMA VHH1 및 VHH2, 뿐만 아니라 이에 함유된 CDR은 PCT/CN2016/094408 및 PCT/CN2017/096938에 개시되어 있으며, 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
2. SIV Nef M708+CAR 올인원 벡터의 시험관내 TCRαβ 조절 및 세포독성 분석
PBMC 및 T 림프구를 실시예 2에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 활성화 3 일 후에, 5x106 개의 활성화된 T 림프구를 M598을 보유하는 렌티바이러스로 형질도입하였다. T 세포 현탁액을 6-웰 플레이트에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하여, M598-T 세포를 초래하였다. 형질도입 3 일 후에, TCRαβ 발현 및 CAR 발현을 FACS를 사용하여 검출하였다. 그런 다음, 형질도입 5 일 후에, 세포 현탁액을 TCRα/β 분리 키트 프로토콜(TCRα/β-비오틴, CliniMACS, #6190221004; 항-비오틴 시약, CliniMACS, #6190312010)에 따라 분리 및 풍부화에 적용하여, MACS 분류된 TCRαβ 음성 M598-T 세포를 초래하였다. MACS 분류된 TCRαβ 음성 M598-T 세포의 TCRαβ 발현 및 CAR 발현을 FACS를 사용하여 검출하였다. MACS 분류된 TCRαβ 음성 M598-T 세포를 2.5:1, 1.25:1, 및 1:1.25의 상이한 E:T 비에서 각각 다발성 골수종(MM) 세포주 RPMI8226.Luc와 혼합하고, Corning® 384-웰 고체 백색 플레이트에서 18-24 시간 동안 인큐베이션하였다. ONE-Glo™ 루시퍼라제 검정 시스템(TAKARA, #B6120)을 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 25 μL ONE-Glo™ 시약을 384-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 인큐베이션한 다음, 표적 세포 상의 상이한 T 림프구의 세포독성을 계산하기 위해 형광 측정을 위해 Spark™ 10M 다중모드 마이크로플레이트 판독기(TECAN) 위에 배치하였다. 형질도입되지 않은 T 세포("UnT")는 대조군으로 제공되었다.
도 22a-22b에 도시된 바와 같이, M598-T 세포의 TCR 양성율(59.7%의 TCRαβ 양성율)은 UnT(88.6%의 TCRαβ 양성율)보다 유의하게 더 낮았고; M598-T 세포의 CAR 양성율(37.5%의 CAR 양성율)은 UnT(1.11%의 CAR 양성율)보다 유의하게 더 높았으며; MACS 분류된 TCRαβ 양성 M598-T 세포는 2.64% TCRαβ 양성율 및 88.0% CAR 양성율을 나타내었다. 이들 결과는 M598 형질도입된 T 세포가 CAR을 발현하는 반면, TCRαβ 발현을 효과적으로 억제함을 시사한다.
도 22c에 도시된 바와 같이, MACS 분류된 TCRαβ 음성 M598-T 세포는 50.32±2.56% 사멸 효율로, 상이한 E:T 비(P<0.05)에서 UnT와 비교하여 RPMI8226.Luc 세포주에 대한 유의한 CAR-매개 특이적 사멸 활성을 나타내었다.
요약하면, 상기 결과는 CAR 발현 T 세포와 조합된 절두된 SIV Nef의 SIV Nef M708이 TCRαβ 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 반면, CAR-매개 특이적 세포독성 활성에 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
실시예 19. CD3ζ ITAM1 및/또는 CD3ζ ITAM2와 Nef 하위유형 사이의 상호작용 분석
1. Nef 하위유형 함유 벡터의 구축
폴리뉴클레오티드 서열 Nef 하위유형(공급처: Uniprot/Unified Protein Database 및 ENA/European Nucleotide Archive, 표 10 참조)을 화학적으로 합성하고, 재조합 전달 플라스미드의 구축을 위해 pLVX-hEF1α-Puro(실시예 1 참조) 벡터 내로 별도로 클로닝하였다. 그런 다음 이들 전달 플라스미드를 정제하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 내로 패키징하였고, 렌티바이러스를 함유하는 여과된 상청액을 PEG6000을 사용하여 농축하여 농축된 렌티바이러스를 수득하였으며, 이하에서 집합적으로 Nef 하위유형 렌티바이러스로 지칭하였다. 이들 농축된 렌티바이러스를 -80℃에서 저장하였다.
2. CD3ζ ITAM1 및/또는 CD3ζ ITAM2와 Nef 하위유형 사이의 상호작용 분석
상기로부터의 Nef 하위유형 서열, 및 빈 벡터를 보유하는 렌티바이러스를 형질도입을 위해 Jurkat-M665(CAR 양성율은 95% 이상이었음, 실시예 5 참조) 및 Jurakt-M666(CAR 양성율은 95% 이상이었음, 실시예 5 참조) 세포 배양물의 현탁액에 별도로 첨가하였다. 형질도입 3 일 후에, 5x105 개의 세포 현탁액을 별도로 수집하고 실온에서 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 세포를 1 mL DPBS로 재현탁하고, 1 μL FITC-표지된 인간 BCMA 단백질(Biolegend, #310906)을 첨가하고 현탁액을 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, DPBS를 이용한 원심분리 및 재현탁을 2 회 반복하였다. 그런 다음 세포를 FACS를 위해 DPBS로 재현탁하여 BCMA CAR 발현을 검출하였다. 실시예 5와 같이 상대적 CAR 발현을 계산하였다. "+"는 Nef 하위유형 렌티바이러스로 형질도입된 Jurakt-M665 세포 또는 Jurkat-M666 세포의 CAR 양성율이 유의하게 감소됨을 나타내고, 상응하는 Nef 하위유형이 CD3ζ ITAM1 또는 CD3ζ ITAM2와 상호작용하는 것으로 간주된다. 반대로, "-"는 Nef 하위유형 렌티바이러스 형질도입 후 Jurkat-M665 세포 또는 Jurakt-M666 세포에서 CAR 발현의 유의한 감소가 관찰되지 않았음을 나타내고, 상응하는 Nef 하위유형이 CD3ζ ITAM1 또는 CD3ζ ITAM2와 상호작용하지 않는 것으로 간주된다.
아미노산을 다중 서열 정렬(MSA) ClustalW 방법에 의해 추가로 분석하였으며, 정렬된 공통 서열은 다음 원칙에 따라 기재하였다:
주어진 위치에서 가장 빈번한 문자의 상대적 빈도가 적어도 임계값만큼 크면, 이 가장 빈번한 문자는 그대로 이 위치에서 공통 서열에 사용된다.
열에서 가장 빈번한 문자의 상대적 빈도가 임계값보다 훨씬 더 작으면, 소문자 "x"는 이 위치에서 공통 서열에 사용된다. 소문자 "x"는 여기서 임의의 아미노산을 나타낸다.
공백 문자 굵은 대문자 "X"는 다중 정렬에서 공백 위치를 나타내는 데 사용된다. 공통 서열에서, X는 부재를 의미할 수 있다.
표 10에 제시된 바와 같이, 128 개의 Nef 하위유형 중에서, 이 중 27 개의 Nef 하위유형은 CD3ζ ITAM1 및 CD3ζ ITAM2와 상호작용하였고, 이 중 38 개의 Nef 하위유형은 CD3ζ ITAM2와 상호작용하였다.
표 10. CD3ζ ITAM1 및/또는 CD3ζ ITAM2와 예시적인 Nef 하위유형의 상호작용
Figure pat00016
Figure pat00017
Figure pat00018
CD3ζ ITAM1 및 CD3ζ ITAM2와 상호작용하는 상기 27 개의 Nef 하위유형의 아미노산(서열번호: 84, 85, 및 207-231)을 다중 서열 정렬(MSA)에 의해 추가로 분석하였다. 하기 임계값(90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 및 30%)을 사용하여 공통 서열을 계산하였다(표 11 참조).
표 11. 27 개의 Nef 하위유형의 공통 서열
Figure pat00019
CD3ζ ITAM2와 상호작용하는 상기 38 개의 Nef 하위유형의 아미노산을 다중 서열 정렬(MSA)에 의해 추가로 분석하였다. 하기 임계값(90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 및 30%)을 사용하여 공통 서열을 계산하였다(표 12 참조).
표 12. 38 개의 Nef 하위유형의 공통 서열
Figure pat00020
상기 기능-유래 공통 서열(서열번호: 235-247)을 UniProt 단백질 데이터베이스에서 추가로 블라스팅하여 계산 정확도를 조사하였다. 모든 공통 서열은 Nef의 하위유형인 SIV Nef를 완전히 표적화하는 반면, 단백질 상동성은 MSA 임계값이 감소함에 따라 점진적으로 증가하였으며, 아미노산 최소 동일성 영역은 53.70% 내지 89.60%에 이르렀다(표 13 참조). 관련 블라스팅 결과는 특이적 하위유형/클러스터 Nef를 구별하기 위한 높은 정확도, 및 유전자/세포 요법에서 더 넓은 범위의 정확한 생물학적 적용을 갖는 상기 기능-유래 공통 서열을 나타낸다.
표 13 공통 서열 UniProt 데이터베이스 블라스팅 결과
Figure pat00021
실시예 20. CAR-T 세포 면역요법에서 TCRαβ 및 MHC 발현에 대한 이중 조절을 갖는 SIV Nef 하위유형
1. SIV Nef M1275+ITAM-변형된 CD20 CAR 올인원 벡터의 구축
이어서 융합 유전자 SIV Nef M1275-IRES-CD8α SP-CD20 scFv(Leu16)-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-ITAM010(이하에서 M1392로 지칭됨, 서열번호: 232)을 재조합 전달 플라스미드 pLVX-M1392의 구축을 위해 pLVX-hEF1α 벡터(실시예 1 참조) 내로 클로닝하였다. 그런 다음 전달 플라스미드를 정제하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 내로 패키징하였으며, 이하에서 M1392 렌티바이러스로 지칭하였다. 암호화된 ITAM-변형된 CD20 CAR 작제물 "CD8α SP-CD20 scFv(Leu16)-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-ITAM010"은 서열번호: 73의 서열을 포함하며, "ITAM010-변형된 CD20 CAR"로도 지칭된다.
2. SIV Nef M1275+ITAM-변형된 CD20 CAR 올인원 작제물 형질도입된 CAR-T 세포의 TCRαβ 및 MHC 클래스 I 분자 발현
PBMC 및 T 림프구를 실시예 2에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 활성화 3 일 후에, 5x106 개의 활성화된 T 림프구를 각각 렌티바이러스 M1392(이하에서 M1392-T 세포로 지칭됨) 및 LCAR-UL186S(실시예 3의 것; 이하에서 LCAR-UL186S T 세포로 지칭됨)로 형질도입하였다. T 세포 현탁액을 6-웰 플레이트로 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다. 형질도입 3 일 후에, M1392-T 및 LCAR-UL186S T의 5x105 개의 세포 현탁액을 별도로 수집하고 실온에서 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 세포를 1 mL DPBS로 재현탁하고 1 μL 염소 F(ab')2 항-마우스 IgG(Fab')2(FITC)(Abcam, #AB98658)를 현탁액에 첨가한 다음, 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, DPBS 단계를 이용한 원심분리 및 재현탁을 2 회 반복하였다. 그런 다음 세포를 1 mL DPBS로 재현탁한 다음, 1 μL 스트렙타비딘(NEW ENGLAND BIOLABS, #N7021S) 및 1 μL APC 항-인간 TCRα/β 항체(Biolegend, #306718)를 첨가하고, 현탁액을 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, DPBS 단계를 이용한 원심분리 및 재현탁을 2 회 반복하였다. 그런 다음 세포를 FACS를 위해 DPBS로 재현탁하여 TCRαβ 및 CD20 CAR의 발현을 검출하였다. 형질도입 3 일 후에, M1392-T 및 LCAR-UL186S T의 5x105 개의 세포 현탁액을 별도로 수집하고 실온에서 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 세포를 1 mL DPBS로 재현탁한 다음, 1 μL APC 항-인간 TCRα/β 항체(Biolegend, #306718) 및 1 μL PE 항-인간 HLA-B7 항체(Biolegend, #372404)를 첨가하고, 현탁액을 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, DPBS 단계를 이용한 원심분리 및 재현탁을 2 회 반복하였다. 그런 다음 세포를 FACS를 위해 DPBS로 재현탁하여 TCRαβ 및 HLA-B7의 발현을 검출하였다. 형질도입되지 않은 T 세포("UnT")는 대조군으로 제공되었다.
도 23a에 도시된 바와 같이, UnT, LCAR-UL186S T 세포, 및 M1392-T 세포의 CAR 양성율 및 TCRαβ 음성율(CAR+/TCRαβ-)은 각각 0.745%, 13.7%, 및 21.3%였다. 도 23b에 도시된 바와 같이, UnT, LCAR-UL186S T 세포, 및 M1392-T 세포의 HLA-B7 음성율 및 TCRαβ 음성율(HLA-B7-/TCRαβ-)은 각각 0.641%, 0.723%, 및 22.7%였다. 이들 결과는 SIV Nef M1275+ITAM-변형된 CD20 CAR 작제물(M1392) 형질도입된 T 세포가 CAR을 발현하는 반면, TCRαβ 및 MHC 클래스 I 분자의 발현을 효과적으로 하향 조절함을 시사한다.
3. SIV Nef 1275+ITAM-변형된 CD20 CAR 올인원 작제물로 형질도입된 CAR-T 세포에서 MHC 클래스 I 교차-반응성의 평가
PBMC 및 T 림프구를 실시예 2에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 활성화 3 일 후에, 5x106 개의 활성화된 T 림프구를 렌티바이러스 LCAR-L186S(실시예 3의 것 이하에서 LCAR-L186S T 세포로 지칭됨)로 형질도입하였다.
형질도입 3 일 후에, 50% LCAR-L186S T 세포를 CRISPR/Cas9 기술(서열번호: 233) 및 분리에 적용하여 B2M 녹아웃(B2M KO) 세포(이하에서 B2M KO LCAR-L186S T 세포로 지칭됨)를 구축하였다. 그런 다음 상기에서 수득된 M1392-T 세포 현탁액을 TCRα/β 분리 키트 프로토콜(TCRα/β-비오틴, CliniMACS, #6190221004; 항-비오틴 시약, CliniMACS, #6190312010)에 따라 분리 및 풍부화에 적용하여, MACS 분류된 TCRαβ 음성 M1392-T 세포(이하에서 TCRαβ- M1392-T 세포로 지칭됨)를 초래하였다. LCAR-L186S T 세포, B2M KO LCAR-L186S T 세포, 및 TCRαβ- M1392-T 세포의 MHC 클래스 I 교차-반응성의 평가를 혼합 림프구 반응(MLR, Jiangtao Ren, 2017 참조)을 참조하여 수행하였다.
도 23c에 도시된 바와 같이, 1:1의 E:T 비에서 효과기 세포와 48 시간 인큐베이션 후, TCRαβ- M1392-T 세포에 의해 방출된 IFN-γ의 수준은 LCAR-L186S(P<0.05)보다 유의하게 낮았고, B2M KO LCAR-L186S T 세포(P>0.05)와 유사하였다. 이들 결과는 M1392(SIV Nef M1215/ITAM010-변형된 CD20 CAR 공동-발현)가 효과기 세포의 MHC 클래스 I 교차-반응성을 유의하게 감소시킬 수 있음을 시사한다.
4. SIV Nef M1275+ITAM-변형된 CD20 CAR 올인원 작제물로 형질도입된 CAR-T 세포의 시험관내 세포독성 검정
상기에서 수득된 MACS 분류된 TCRαβ- M1392-T 세포를 20:1, 10:1, 및 5:1의 상이한 E:T 비에서 각각 림프종 Raji.Luc 세포주와 혼합하고, Corning® 384-웰 고체 백색 플레이트에서 12 시간 동안 인큐베이션하였다. ONE-Glo™ 루시퍼라제 검정 시스템(TAKARA, #B6120)을 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 25 μL ONE-Glo™ 시약을 384-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 인큐베이션한 다음, 표적 세포 상의 상이한 T 림프구의 세포독성을 계산하기 위해 형광 측정을 위해 Spark™ 10M 다중모드 마이크로플레이트 판독기(TECAN) 위에 배치하였다. 형질도입되지 않은 T 세포("UnT")는 대조군으로 제공되었다.
도 23d에 도시된 바와 같이, MACS 분류된 TCRαβ- M1392-T 세포는 UnT와 비교하여 Raji.Luc 세포주에 대한 유의한 CAR-매개 특이적 사멸 활성을 나타내었다(P<0.05).
SEQUENCE LISTING <110> NANJING LEGEND BIOTECH CO., LTD. <120> NEF-CONTAINING T CELLS AND METHODS OF PRODUCING THEREOF <130> 76142-20020.42 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> PCT/CN2019/125681 <151> 2019-12-16 <150> PCT/CN2019/103041 <151> 2019-08-28 <160> 247 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg 1 5 10 15 Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr Ser His Leu Gly Gly Asn 20 25 <210> 2 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg 20 25 <210> 3 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr Gln Pro Leu Lys 1 5 10 15 Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly Asn 20 25 <210> 4 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 1 5 10 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Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 22 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 <210> 23 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Ser <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 25 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 27 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 28 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 29 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp 1 5 10 15 Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 30 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 25 <210> 31 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 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tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300 tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360 acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 420 aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480 gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 540 gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg ccaca 585 <210> 36 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 37 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 37 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Ser Gly Lys Arg 35 40 45 Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro 50 55 60 Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu 65 70 75 80 Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Ser Gly Lys Arg Gly Arg 85 90 95 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 100 105 110 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 115 120 125 Glu Gly Gly Cys Glu Leu 130 <210> 38 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 1 5 10 15 Gly Gly Lys Gly Ala Leu Pro Pro Arg Gly Gly Ser Gly Arg Val Lys 20 25 30 Phe Ser Arg Ser Ala Asp Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Gly Ala Leu Pro Pro Arg 50 <210> 39 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 39 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Tyr Gln Gln 1 5 10 15 Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 20 25 30 Tyr Asp Val Leu 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actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120 gaactgggtg gttctggtaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca 180 tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 240 gaagaagaag gaggatgtga actgggtggt tctggtaaac ggggcagaaa gaaactcctg 300 tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 360 agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tg 402 <210> 53 <211> 162 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 53 agagtgaagt tcagcaggag cgcagaccgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagggc 60 gccctgcccc ctcgcggtgg ttctggtaga gtgaagttca gcaggagcgc agaccgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagggcgcc ctgccccctc gc 162 <210> 54 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 54 ggcggcggag gctctggcgg cggaggaagc gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60 ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagaggt 120 gaaaatttgt attttcaatc tggtggtccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300 acctacgacg cccttcacat gcagggtggt tctggt 336 <210> 55 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 55 ggcggcggag gctctggcgg cggaggaagc gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60 ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagaggt 120 gaaaatttgt attttcaatc tggtggtgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 180 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagaggcgcc 240 cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 300 gagtacgatg ttttggacaa gagaggtggt tctggt 336 <210> 56 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 56 ggcggcggag gctctggcgg cggaggaagc ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 60 tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggt 120 gaaaatttgt attttcaatc tggtggtccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180 aatgaactgc agaaagataa 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gccggggatg aatatgaaga tgaaaacctt tatgaaggcc tgaacctgga cgactgctcc 300 atgtatgagg acatctcccg gggcggtggt tctggt 336 <210> 61 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 61 ggcggcggag gctctggcgg cggaggaagc gacagcaagg ctggcatgga ggaagatcac 60 acctacgagg gcctggacat tgaccagaca gccacctatg aggacatagt gacgctgggt 120 gaaaatttgt attttcaatc tggtggtgac agcaaggctg gcatggagga agatcacacc 180 tacgagggcc tggacattga ccagacagcc acctatgagg acatagtgac gctgggcgac 240 agcaaggctg gcatggagga agatcacacc tacgagggcc tggacattga ccagacagcc 300 acctatgagg acatagtgac gctgggtggt tctggt 336 <210> 62 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 62 ggcggcggag gctctggcgg cggaggaagc gctataacca gctatgagaa atcagatggt 60 gtttacacgg gcctgagcac caggaaccag gagacttacg agactctgaa gcatgagggt 120 gaaaatttgt attttcaatc tggtggtgct ataaccagct atgagaaatc agatggtgtt 180 tacacgggcc tgagcaccag gaaccaggag acttacgaga ctctgaagca tgagggcgct 240 ataaccagct atgagaaatc 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<212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 84 Met Gly Ser Ser Asn Ser Lys Arg Gln Gln Gln Gly Leu Leu Lys Leu 1 5 10 15 Trp Arg Gly Leu Arg Gly Lys Pro Gly Ala Asp Trp Val Leu Leu Ser 20 25 30 Asp Pro Leu Ile Gly Gln Ser Ser Thr Val Gln Glu Glu Cys Gly Lys 35 40 45 Ala Leu Lys Lys Ser Trp Gly Lys Gly Lys Met Thr Pro Asp Gly Arg 50 55 60 Arg Leu Gln Glu Gly Asp Thr Phe Asp Glu Trp Asp Asp Asp Glu Glu 65 70 75 80 Glu Val Gly Phe Pro Val Gln Pro Arg Val Pro Leu Arg Gln Met Thr 85 90 95 Tyr Lys Leu Ala Val Asp Phe Ser His Phe Leu Lys Ser Lys Gly Gly 100 105 110 Leu Asp Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg Glu Lys Ile Leu Asn Leu 115 120 125 Tyr Ala Leu Asn Glu Trp Gly Ile Ile Asp Asp Trp Gln Ala Tyr Ser 130 135 140 Pro Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Arg Val Phe Gly Phe Cys Phe Lys 145 150 155 160 Leu Val Pro Val Asp Leu His Glu Glu Ala Arg Asn Cys Glu Arg His 165 170 175 Cys Leu Met His Pro Ala Gln Met Gly Glu Asp Pro Asp Gly Ile Asp 180 185 190 His Gly Glu Val Leu Val Trp Lys Phe Asp Pro 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agccagcagc agatagggtg ggagcagcat ctcgagacct ggaaaaacat 120 ggagcaatca caagtagcaa tacagcagct accaatgctg cttgtgcctg gctagaagca 180 caagaggagg aggaggtggg ttttccagtc acacctcagg tacctttaag accaatgact 240 tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta 300 attcactccc aaagaagaca agatatcctt gatctgtgga tctaccacac acaaggctac 360 ttccctgatt ggcagaacta cacaccaggg ccaggggtca gatatccact gacctttgga 420 tggtgctaca agctagtacc agttgagcca gataagatag aagaggccaa taaaggagag 480 aacaccagct tgttacaccc tgtgagcctg catgggatgg atgacccgga gagagaagtg 540 ttagagtgga ggtttgacag ccgcctagca tttcatcacg tggcccgaga gctgcatccg 600 gagtacttca agaactgc 618 <210> 91 <211> 771 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 91 atgggtgcga gtggatccaa gaagctttcc aagcattcgc gaggactacg agagagactc 60 ttgcgggcgc gtggggatgg ttatgggaag cagcgcgacg catcgggagg ggaatactcg 120 cagttccaag aagaatcagg cagggagcag aactcgccct cctgtgaggg acagcagtat 180 cagcagggag agtacatgaa cagcccatgg agaaacccag caacagaaag acagaaagat 240 ttgtataggc agcaaaatat ggatgatgta gattctgatg atgatgacct aataggagtt 300 cctgttacac caagagtacc acggagagaa atgacctata aattggcaat agatatgtca 360 cattttataa aagaaaaagg gggactgcaa gggatgtttt acagtaggag gagacataga 420 atcctagaca tatacctaga aaaagaggaa gggataatac cagattggca gaattatact 480 catgggccag gagtaaggta cccaatgtac ttcgggtggc tgtggaagct agtatcagta 540 gaactctcac aagaggcaga ggaagatgag gccaactgct tagtacaccc agcacaaaca 600 agcagacatg atgatgagca tggggagaca ttagtgtggc agtttgactc catgctggcc 660 tataactaca aggccttcac tctgtaccca gaagagtttg ggcacaagtc aggattgcca 720 gagaaagaat ggaaggcaaa actgaaagca agagggatac catatagtga a 771 <210> 92 <211> 630 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 92 atgggtggca agtggtcaaa atgcagcata gttggatggc ctgatataag agagagaatg 60 agacgaactg agccagcagc agagccagca gcagaaggag taggagcagc gtctcaagac 120 ttagataaac atggagcact tacaagtagc aacacaaaca ccactaatgc tgattgtgct 180 tggccggaag cgcaagagga tgaaggagaa gtaggctttg cagtcagacc tcagagtcct 240 ttaagaccaa tgacttataa gggagcattt gatctcggct tctttttaaa agaaggggga 300 ctggaagggt taatttactc taagaaaagg caagagatcc ttgatttgtg ggtctatcat 360 acacaaggct acttccctga ttggcaaaac tacacaccgg gaccaggggt cagataccca 420 ctgacttttg ggtggtgctt caagctggta ccagttgacc caaaggcagt agaagaggcc 480 aacgaaggag aagacaactg tctgctacac ccagtgtgcc agcatggaat ggaggatgaa 540 cacagagaag tattaatgtg gaagtttgac agtcaactag cacgcagaca catggcccga 600 gagctacatc cggagttcta caaagactgc 630 <210> 93 <211> 387 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 93 atgggtggca agtggtcaaa atgcagcata ggtggatggc ctcagataag agagagaatg 60 agacgaactg agccagcagt agagccagca gcagagccag cagcagaagg agtaggagca 120 gcgtggctac ttcctgattg gcaaaactac acaccgggac caggagtcag atacccactg 180 acttttgggt ggtgcttcaa gctggtacca gtagacccag gggcagtaga agaggccaac 240 gaaggagaaa acaactgttt gctacacccg gtgtgccagc atggaatgga ggatgagcaa 300 agagaagtat tagtgtgcaa gtttgacagt ctactagcac gcagacacat ggcccgcgag 360 ctacatccgg agttctacaa agactgc 387 <210> 94 <211> 540 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 94 atgggtgcga gtggatccaa gaagcgttcc aagcccttgc aaggactaca agagagactc 60 ttgcaggcgc ggggagagac ttgtggaggg cgctgcaacg aatcgggagg gggatacttg 120 cagtcccacg aaggatcagg cagggagcag aactcgccct cctgtgaggg acagcgatat 180 cagcagggag attttgtaaa taccccatgg agaaccccag cagcagaaag ggagaaagaa 240 ttgtacaaac agcaaaatat ggatgatgta gatctagatg atgatgacca agtaggattc 300 cctgtcacac caagagtacc attaagacca atgacattca aattggcagt agatatgtct 360 cattttataa aagaaaaagg gggactggaa gggctgtttt atagtcagag aagacataga 420 atcttagact tatacttaga caaggctttt actctgtacc cagaggaatt tgggcataat 480 tcaggactgc cagagaaaga gtggaaggcg agactgaaag caaggggaat accatttagt 540 <210> 95 <211> 669 <212> DNA <213> Simian immunodeficiency virus <400> 95 atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60 cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120 acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180 ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240 gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300 gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360 agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420 caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480 ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tctgatgcat 540 ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600 tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660 gcaaagcgc 669 <210> 96 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 96 atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60 cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120 acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180 ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240 gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300 gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360 agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420 caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480 ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tgctgcacat 540 ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600 tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660 gcaaagcgc 669 <210> 97 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 97 atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60 cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120 acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180 ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240 gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300 gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360 gctgcagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420 caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480 ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tgctgcacat 540 ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600 tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660 gcaaagcgc 669 <210> 98 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 98 atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60 cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120 acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180 ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240 gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300 gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360 gctgcagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420 caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480 ctagtcccag tggacctgca tgaggagcat cacaactgtg agagacactg tgctgcacat 540 ccagcacaga tgggggcggc acctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600 tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660 gcaaagcgc 669 <210> 99 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 99 atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60 cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120 acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180 ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240 gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300 gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360 agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420 caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480 ctagtcccag tggacctgca tgaggagcat cacaactgtg agagacactg tgctgcacat 540 ccagcacaga tgggggcggc acctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600 tttgacccga agttggcggt 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<220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 14, 15 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <221> VARIANT <222> 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 <223> Xaa = Any Amino Acid, and up to two can be present or absent <220> <221> VARIANT <222> 4, 16 <223> Xaa = Leu or Ile <400> 101 Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 102 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Asp or Glu <220> <221> VARIANT <222> 2, 3 <223> Xaa = Any Amino Acid, and up to two can be present or absent <220> <221> VARIANT <222> 5, 6, 17, 18 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <221> VARIANT <222> 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 <223> Xaa = Any Amino Acid, and up to two can be present or absent <220> <221> VARIANT <222> 7, 19 <223> Xaa = Leu or Ile <400> 102 Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa <210> 103 <211> 1 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360 agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420 caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480 ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tgctgcacat 540 ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600 tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660 gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720 gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780 ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840 tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900 tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960 cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020 cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080 cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140 ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1200 taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 1260 acaggatccg ccgccaccat ggccctgcca gtgaccgcct tgctccttcc cctggctctt 1320 ctgctgcacg ctgctagacc tgaggtgcag ctgcagcaga gcggagctga gctggtgaag 1380 cctggcgcta gcgtgaagat gagctgcaag gccagcggct acaccttcac cagctataac 1440 atgcactggg tgaagcagac ccctggacag ggactggagt ggatcggagc tatctaccct 1500 ggaaacggag acacctcata caaccagaag ttcaagggaa aggctaccct gaccgctgac 1560 aagagcagca gcaccgctta catgcagctg agctcactga ccagcgagga ctccgccgac 1620 tactactgcg ccagaagcaa ctactacgga agcagctact ggttcttcga cgtgtgggga 1680 gctggaacca ccgtgaccgt gtcaagcggc ggcggaggct ccggaggcgg aggatctggc 1740 ggcggcggca gcgacatcgt gctgacccag agccctgcta tcctgtctgc cagccctgga 1800 gagaaggtga ccatgacctg cagagctagc agcagcgtga actacatgga ctggtatcag 1860 aaaaagcccg gcagctcacc taagccttgg atctacgcta ccagcaactt agccagcggc 1920 gtgcctgcta gattctccgg aagcggctct ggaaccagct actcccttac catcagcaga 1980 gtggaggctg aggacgctgc tacctactac 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ccggaggcgg aggatctggc 1740 ggcggcggca gcgacatcgt gctgacccag agccctgcta tcctgtctgc cagccctgga 1800 gagaaggtga ccatgacctg cagagctagc agcagcgtga actacatgga ctggtatcag 1860 aaaaagcccg gcagctcacc taagccttgg atctacgcta ccagcaactt agccagcggc 1920 gtgcctgcta gattctccgg aagcggctct ggaaccagct actcccttac catcagcaga 1980 gtggaggctg aggacgctgc tacctactac tgccagcagt ggagcttcaa ccctcctacc 2040 ttcggaggag gaaccaagct ggagatcaag actagtacca cgacgccagc gccgcgacca 2100 ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 2160 ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatctacatc 2220 tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac 2280 tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta 2340 caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga 2400 tgtgaactgg gtgaaaattt gtattttcaa tctggtggtg acacacaagc tctgttgagg 2460 aatgaccagg tctatcagcc cctccgagat cgagatgatg ctcagtacag ccaccttgga 2520 ggaaacggtg gttctggtga gaggccacca cctgttccca 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tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tgctgcacat 540 ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600 tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660 gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720 gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780 ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840 tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900 tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960 cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020 cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080 cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140 ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1200 taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 1260 acaggatccg ccgccaccat ggccctgcca gtgaccgcct tgctccttcc cctggctctt 1320 ctgctgcacg ctgctagacc tgaggtgcag 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<400> 213 Met Gly Ala Ala Gly Ser Lys Lys Arg Ser Arg Gln Gln Arg Gly Leu 1 5 10 15 Arg Glu Arg Leu Leu Gln Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Trp 20 25 30 Asp Gly Leu Glu Asp Gly Tyr Ser Gln Ser Arg Gly Glu Leu Gly Arg 35 40 45 Asp Trp Asn Leu His Ser Ser Glu Gly Gln Gly Tyr Ser Glu Gly Gln 50 55 60 Phe Met Asn Thr Pro Trp Arg Asn Pro Ala Arg Glu Arg Glu Lys Leu 65 70 75 80 Lys Tyr Arg Gln Gln Asn Met Asp Asp Val Asp Asp Asp Asp Asp Glu 85 90 95 Leu Ile Gly Val Ala Val His Pro Lys Val Pro Leu Arg Ala Met Ser 100 105 110 Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly Gly 115 120 125 Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg His Arg Ile Leu Asp Ile 130 135 140 Tyr Leu Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr 145 150 155 160 Ser Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Met Phe Phe Gly Trp Leu Trp Lys 165 170 175 Leu Val Pro Val Glu Val Ser Asp Glu Ala Gln Glu Asp Glu Thr His 180 185 190 Tyr Leu Val His Pro Ala Gln Ile Ser Gln Trp Asp Asp Pro Trp Gly 195 200 205 Glu Val Leu 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immunodeficiency virus <400> 223 Met Gly Gly Ala Ile Ser Met Arg Arg Ser Arg Pro Ser Gly Asp Leu 1 5 10 15 Arg Gln Arg Leu Leu Arg Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Gly Arg Leu Leu 20 25 30 Gly Glu Val Glu Asp Gly Tyr Ser Gln Ser Pro Gly Gly Leu Asp Lys 35 40 45 Gly Leu Ser Ser Leu Ser Cys Glu Gly Gln Lys Tyr Asn Gln Gly Gln 50 55 60 Tyr Met Asn Thr Pro Trp Arg Asn Pro Ala Glu Glu Arg Glu Lys Leu 65 70 75 80 Ala Tyr Arg Lys Gln Asn Met Asp Asp Ile Asp Glu Glu Asp Asp Asp 85 90 95 Leu Val Gly Val Ser Val Arg Pro Lys Val Pro Leu Arg Thr Met Ser 100 105 110 Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly Gly 115 120 125 Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Ser Ala Arg Arg His Arg Ile Leu Asp Ile 130 135 140 Tyr Leu Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asp Tyr Thr 145 150 155 160 Ser Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Lys Thr Phe Gly Trp Leu Trp Lys 165 170 175 Leu Val Pro Val Asn Val Ser Asp Glu Ala Gln Glu Asp Glu Glu His 180 185 190 Tyr Leu Met His Pro Ala Gln Thr Ser Gln Trp Asp Asp Pro Trp Gly 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Leu Asp Met 130 135 140 Tyr Met Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr 145 150 155 160 Ser Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Met Tyr Phe Gly Trp Leu Trp Lys 165 170 175 Leu Val Pro Val Asp Val Ser Asp Glu Ala Gln Glu Asp Glu Thr His 180 185 190 Cys Leu Val His Pro Ala Gln Thr His Gln Trp Asp Asp Pro Trp Gly 195 200 205 Glu Val Leu Ala Trp Lys Phe Asp Pro Glu Leu Ala Tyr Ser Tyr Lys 210 215 220 Ala Phe Ile Lys Tyr Pro Glu Glu Phe Gly Ser Lys Ser Gly Leu Ser 225 230 235 240 Glu Glu Glu Val Lys Arg Arg Leu Thr Ala Arg Gly Leu Ile Lys Met 245 250 255 Ala Asp Lys Lys Glu Thr Ser 260 <210> 225 <211> 263 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 225 Met Gly Gly Ala Ile Ser Arg Lys Gln Cys Arg Arg Gly Gly Asp Leu 1 5 10 15 Arg Glu Arg Leu Leu Gln Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Gly Arg Leu Trp 20 25 30 Glu Gly Leu Glu Glu Gly Tyr Ser Gln Ser Arg Gly Ala Ser Gly Lys 35 40 45 Gly Leu Ser Ser Leu Ser Cys Glu Pro Gln Lys Tyr Ser Glu Gly Gln 50 55 60 Tyr Met Asn Thr Pro Trp Arg Asn Pro Ala Thr Glu Arg Glu Lys Leu 65 70 75 80 Gly Tyr Arg Gln Gln Asn Arg Asp Asp Val Asp Asp Glu Asp Asp Asp 85 90 95 Leu Val Gly Val Ser Val His Pro Arg Val Pro Leu Arg Ala Met Thr 100 105 110 Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly Gly 115 120 125 Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg His Arg Ile Leu Asp Met 130 135 140 Tyr Met Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr 145 150 155 160 Ser Gly Pro Gly Thr Arg Tyr Pro Met Tyr Phe Gly Trp Leu Trp Lys 165 170 175 Leu Val Pro Val Asp Val Ser Asp Glu Ala Gln Glu Asp Glu Thr His 180 185 190 Cys Leu Val His Pro Ala Gln Thr His Gln Trp Asp Asp Pro Trp Gly 195 200 205 Glu Val Leu Ala Trp Lys Phe Asp Pro Glu Leu Ala Tyr Ser Tyr Lys 210 215 220 Ala Phe Ile Lys Tyr Pro Glu Glu Phe Gly Ser Lys Ser Gly Leu Ser 225 230 235 240 Glu Glu Glu Val Lys Arg Arg Leu Thr Ala Arg Gly Leu Ile Lys Met 245 250 255 Ala Asp Lys Lys Glu Thr Ser 260 <210> 226 <211> 263 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 226 Met Gly Gly Ala Ile Ser Arg Lys Gln Cys Arg Arg Gly Gly Asp Leu 1 5 10 15 Arg Glu Arg Leu Leu Gln Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Gly Arg Leu Trp 20 25 30 Glu Gly Leu Glu Glu Gly Tyr Ser Gln Ser Arg Gly Ala Ser Gly Lys 35 40 45 Gly Leu Ser Ser Leu Ser Cys Glu Pro Gln Lys Tyr Ser Glu Gly Gln 50 55 60 Tyr Met Asn Thr Pro Trp Arg Asn Pro Ala Thr Glu Arg Glu Lys Leu 65 70 75 80 Gly Tyr Arg Gln Gln Asp Met Asp Asp Val Asp Asp Glu Asp Asp Asp 85 90 95 Leu Val Gly Val Ser Val His Pro Arg Val Pro Leu Arg Ala Met Thr 100 105 110 Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly Gly 115 120 125 Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg His Arg Ile Leu Asp Met 130 135 140 Tyr Met Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr 145 150 155 160 Ser Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Met Tyr Tyr Gly Trp Leu Trp Lys 165 170 175 Leu Val Pro Val Asp Val Ser Asp Glu Ala Gln Glu Asp Glu Thr His 180 185 190 Cys Leu Val His Pro Ala Gln Thr His Gln Trp Asp Asp Pro Trp Gly 195 200 205 Glu Val Leu Ala Trp Lys Phe Asp 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Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr 145 150 155 160 Ser Gly Pro Gly Thr Arg Tyr Pro Met Tyr Tyr Gly Trp Leu Trp Lys 165 170 175 Leu Val Pro Val Asp Val Ser Asp Glu Ala Gln Glu Asp Glu Thr His 180 185 190 Cys Leu Met His Pro Ala Gln Thr His Gln Trp Asp Asp Pro Trp Gly 195 200 205 Glu Val Leu Ala Trp Lys Phe Asp Pro Glu Leu Ala Tyr Ser Tyr Lys 210 215 220 Ala Phe Ile Lys Tyr Pro Glu Glu Phe Gly Ser Lys Ser Gly Leu Ser 225 230 235 240 Glu Glu Glu Val Lys Arg Arg Leu Thr Ala Arg Gly Leu Ile Lys Met 245 250 255 Ala Asp Lys Lys Glu Thr Ser 260 <210> 228 <211> 263 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 228 Met Gly Gly Val Ile Ser Lys Lys Gln Cys Arg Arg Gly Gly Asn Leu 1 5 10 15 Arg Glu Arg Leu Leu Gln Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Gly Arg Leu Trp 20 25 30 Glu Gly Leu Glu Glu Gly Tyr Ser Gln Ser Arg Gly Ala Ser Gly Lys 35 40 45 Gly Leu Ser Ser Leu Ser Cys Glu Pro Gln Lys Tyr Ser Glu Gly Gln 50 55 60 Tyr Met Asn Thr Pro Trp Arg Asn Pro Ala Ala Glu Arg Ala Lys Leu 65 70 75 80 Gly Tyr Arg Gln Gln Asn Met Asp Asp Val Asp Asp Glu Asp Asp Asp 85 90 95 Leu Val Gly Val Ser Val His Pro Arg Val Pro Leu Arg Ala Met Thr 100 105 110 Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly Gly 115 120 125 Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Arg His Arg Ile Leu Asp Met 130 135 140 Tyr Met Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr 145 150 155 160 Ser Gly Pro Gly Thr Arg Tyr Pro Met Tyr Tyr Gly Trp Leu Trp Lys 165 170 175 Leu Val Pro Val Asp Val Ser Asp Glu Ala Gln Glu Asp Glu Thr His 180 185 190 Cys Leu Met His Pro Ala Gln Thr His Gln Trp Asp Asp Pro Trp Gly 195 200 205 Glu Val Leu Ala Trp Lys Phe Asp Pro Glu Leu Ala Tyr Ser Tyr Lys 210 215 220 Ala Phe Ile Lys Tyr Pro Glu Glu Phe Gly Ser Lys Ser Gly Leu Ser 225 230 235 240 Glu Glu Glu Val Lys Arg Arg Leu Thr Ala Arg Gly Leu Ile Lys Met 245 250 255 Ala Asp Lys Lys Glu Thr Ser 260 <210> 229 <211> 263 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 229 Met Gly Gly Val Ile Ser Lys Lys Gln Cys Arg Arg Gly Gly Asn Leu 1 5 10 15 Arg Glu Arg Leu Leu Gln Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Gly Arg Leu Trp 20 25 30 Glu Gly Leu Glu Glu Gly Tyr Ser Gln Ser Leu Gly Ala Ser Gly Lys 35 40 45 Gly Leu Ser Ser Leu Ser Cys Glu Pro Gln Lys Tyr Ser Glu Gly Gln 50 55 60 Tyr Met Asn Thr Pro Trp Arg Asn Pro Ala Ala Glu Arg Ala Lys Leu 65 70 75 80 Gly Tyr Arg Gln Gln Asn Met Asp Asp Val Asp Asp Lys Asp Asp Asp 85 90 95 Leu Val Gly Val Ser Val His Pro Arg Val Pro Leu Arg Ala Met Thr 100 105 110 Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly Gly 115 120 125 Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Arg His Arg Ile Leu Asp Met 130 135 140 Tyr Met Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr 145 150 155 160 Ser Gly Pro Gly Thr Arg Tyr Pro Met Tyr Tyr Gly Trp Leu Trp Lys 165 170 175 Leu Val Pro Val Asp Val Ser Asp Glu Ala Gln Glu Asp Glu Thr His 180 185 190 Cys Leu Met His Pro Ala Gln Thr His Gln Trp Asp Asp Pro Trp Gly 195 200 205 Glu Val Leu Ala Trp Lys Phe Asp Pro Glu Leu Ala Tyr Ser Tyr Lys 210 215 220 Ala Phe Ile Lys Tyr Pro Glu Glu Phe Gly Ser Lys Ser Gly Leu Ser 225 230 235 240 Glu Glu Glu Val Lys Arg Arg Leu Thr Ala Arg Gly Leu Ile Lys Met 245 250 255 Ala Asp Lys Lys Glu Thr Ser 260 <210> 230 <211> 240 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 230 Met Gly Ser Val Lys Ser Lys Leu Leu Gly Glu Thr Ala Ser Gln Arg 1 5 10 15 Leu Gln Gly Ser His Gly Gly Gly Arg Met Val Tyr Trp Arg Leu Arg 20 25 30 Asp Gly Gln Val Lys Arg Ser Gln Leu Ser Pro Gly Ala Arg Gly Lys 35 40 45 Asp Leu Asn Ile Ala Leu Leu Asp Glu Glu Trp Gln Ala Thr Gly Ala 50 55 60 Asp Tyr Met Gly Lys Ala Leu Thr Gln Gly Glu Val Trp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 Glu Gln Glu Glu Asn Asp Met Glu Leu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro 85 90 95 Lys Val Pro Leu Arg Thr Cys Thr Tyr Lys Leu Gly Ile Asp Phe Ser 100 105 110 Phe Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu Lys Gly Ile Phe Tyr Asn Lys 115 120 125 Arg Arg His Ala Ile Leu Asn Leu Tyr Ala His Asn Glu Trp Gly Ile 130 135 140 Leu Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr Glu Gly Pro Gly Thr Arg Tyr Pro 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Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu Lys Gly Ile Phe Tyr Asn Asn 115 120 125 Arg Arg His Ala Ile Leu Asn Leu Tyr Ala His Asn Glu Trp Gly Ile 130 135 140 Leu Pro Asp Trp Gln Ser Tyr Thr Glu Gly Pro Gly Thr Arg Tyr Pro 145 150 155 160 Leu Cys Phe Gly Ile Leu Trp Lys Leu Cys Pro Val Glu Ile His Glu 165 170 175 Asp Asp Thr Glu Asp Gly His Leu Leu Met His Pro Ala Tyr Asp Gly 180 185 190 Gln Gln Glu Asp Pro Trp Gly Glu Ala Leu Val Trp Val Phe Asp Glu 195 200 205 Lys Leu Ala Tyr Thr Pro Gly Ala Lys Met Ala Glu Tyr Asp Arg Leu 210 215 220 Glu Arg Lys Lys Lys Glu Leu Leu Ala Pro Pro Gln Thr Ala Ser Ser 225 230 235 240 <210> 232 <211> 2886 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 232 atgggttcag tgaaatccaa gctgcttggc gagacggcat cacagcgctt gcaaggttca 60 catggtggtg gacgaatggt gtattggcgg ctgcgcgatg ggcaggtgaa gcgatcgcag 120 ctatccccag gcgcacgagg caaggacttg aatattgctt tacttgatga agaatggcaa 180 gcaacaggag cggactacat gggcaaggca ttaacacaag gagaggtttg gtatgaaaaa 240 gaacaagaag aaaatgacat ggaactggtg ggcttccctg tgaggcctaa agttccgttg 300 agaacctgta cttataaact aggtatagac ttctcgttct ttttgaaaga aaagggagga 360 ctgaagggga tattttacaa caaacgtagg catgcaatct tgaatctgta tgcccacaat 420 gaatggggca tactgccaga ctggcagaac tacacagagg gaccaggaac aagataccca 480 ttgtgctttg gtatcctgtg gaaactctgc ccagtagaga tccatgagga tgacacggag 540 gacggacatc tcctcccgca tccagcatat gatgggcagg cagaagaccc atggggagaa 600 tccctggtct gggtctttga tgagaagctg gcctacaccc ccggagcgaa gatggccgag 660 tgggacaggt tggagagaga gaagcggatg ctgctagctc caccgcaaac cgcatcctct 720 tgaacgcgtg cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat 780 aaggccggtg tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg 840 tgagggcccg gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc 900 tcgccaaagg aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt 960 cttgaagaca aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg 1020 acaggtgcct ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac 1080 cccagtgcca cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg 1140 tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg 1200 ggcctcggtg cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc 1260 cgaaccacgg ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataatatggc cacaggatcc 1320 gccgccacca tggccctgcc agtgaccgcc ttgctccttc ccctggctct tctgctgcac 1380 gctgctagac ctgaggtgca gctgcagcag agcggagctg agctggtgaa gcctggcgct 1440 agcgtgaaga tgagctgcaa ggccagcggc tacaccttca ccagctataa catgcactgg 1500 gtgaagcaga cccctggaca gggactggag tggatcggag ctatctaccc tggaaacgga 1560 gacacctcat acaaccagaa gttcaaggga aaggctaccc tgaccgctga caagagcagc 1620 agcaccgctt acatgcagct gagctcactg accagcgagg actccgccga ctactactgc 1680 gccagaagca actactacgg aagcagctac tggttcttcg acgtgtgggg agctggaacc 1740 accgtgaccg tgtcaagcgg cggcggaggc tccggaggcg gaggatctgg cggcggcggc 1800 agcgacatcg tgctgaccca gagccctgct atcctgtctg ccagccctgg agagaaggtg 1860 accatgacct gcagagctag cagcagcgtg aactacatgg actggtatca gaaaaagccc 1920 ggcagctcac ctaagccttg gatctacgct accagcaact tagccagcgg cgtgcctgct 1980 agattctccg gaagcggctc tggaaccagc tactccctta ccatcagcag agtggaggct 2040 gaggacgctg ctacctacta ctgccagcag tggagcttca accctcctac cttcggagga 2100 ggaaccaagc tggagatcaa gactagtacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 2160 gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 2220 gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 2280 ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg 2340 ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 2400 caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 2460 ggtgaaaatt tgtattttca atctggtggt gacacacaag ctctgttgag gaatgaccag 2520 gtctatcagc ccctccgaga tcgagatgat gctcagtaca gccaccttgg aggaaacggt 2580 ggttctggtg agaggccacc acctgttccc aacccagact atgagcccat ccggaaaggc 2640 cagcgggacc tgtattctgg cctgaatcag agaggtggtt ctggtgacaa gcagactctg 2700 ttgcccaatg accagctcta ccagcccctc aaggatcgag aagatgacca gtacagccac 2760 cttcaaggaa acggtggttc tggtcggaaa cagcgtatca ctgagaccga gtcgccttat 2820 caggagctcc agggtcagag gtcggatgtc tacagcgacc tcaacacaca gggtggttct 2880 ggttaa 2886 <210> 233 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 233 actcacgctg gatagcctcc 20 <210> 234 <211> 723 <212> DNA <213> Simian immunodeficiency virus <400> 234 atgggttcag tgaaatccaa gctgcttggc gagacggcat cacagcgctt gcaaggttca 60 catggtggtg gacgaatggt gtattggcgg ctgcgcgatg ggcaggtgaa gcgatcgcag 120 ctatccccag gcgcacgagg caaggacttg aatattgctt tacttgatga agaatggcaa 180 gcaacaggag cggactacat gggcaaggca ttaacacaag gagaggtttg gtatgaaaaa 240 gaacaagaag aaaatgacat ggaactagtg ggcttccctg tgaggcctaa agttccgttg 300 agaacctgta cttataaact aggtatagac ttctcgttct ttttgaaaga aaagggagga 360 ctgaagggga tattttacaa caaacgtagg catgcaatct tgaatctgta tgcccacaat 420 gaatggggca tactgccaga ctggcagaac tacacagagg gaccaggaac aagataccca 480 ttgtgctttg gtatcctgtg gaaactctgc ccagtagaga tccatgagga tgacacggag 540 gacggacatc tcctcccgca tccagcatat gatgggcagg cagaagaccc atggggagaa 600 tccctggtct gggtctttga tgagaagctg gcctacaccc ccggagcgaa gatggccgag 660 tgggacaggt tggagagaga gaagcggatg ctgctagctc caccgcaaac cgcatcctct 720 tga 723 <210> 235 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 26, 27, 29, 30, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 41, 43, 45, 46, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 78, 81 <223> Xaa = Any Amino Acid or absent <220> <221> VARIANT <222> 82, 83, 84, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 94, 96, 97, 99, 101, 102, 104, 106, 111, 113, 120, 137, 141, 145, 147, 148, 149, 151, 166, 170, 171, 182, 186, 193, 195, 197, 202, 203, 205, 208, 209, 216, 221, 222, 226, 228, 230, 231, 232, 233 <223> Xaa = Any Amino Acid or absent <220> <221> VARIANT <222> 234, 238, 239, 243, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269 <223> Xaa = Any Amino Acid or absent <400> 235 Met Gly Xaa Xaa Xaa Ser Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Ala Arg Gly Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Leu Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Ser Xaa Gly Xaa Xaa Gly Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Arg Xaa Lys Leu 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Asp Asp Xaa Asp Xaa 85 90 95 Xaa Leu Xaa Gly Xaa Xaa Val Xaa Pro Xaa Val Pro Leu Arg Xaa Met 100 105 110 Xaa Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Xaa Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly 115 120 125 Gly Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Ser Xaa Arg Arg His Xaa Ile Leu Asp 130 135 140 Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn Tyr 145 150 155 160 Thr Ser Gly Pro Gly Xaa Arg Tyr Pro Xaa Xaa Phe Gly Trp Leu Trp 165 170 175 Lys Leu Val Pro Val Xaa Val Ser Asp Xaa Glu Ala Gln Glu Asp Glu 180 185 190 Xaa His Xaa Leu Xaa His Pro Ala Gln Xaa Xaa Gln Xaa Asp Asp Xaa 195 200 205 Xaa Pro Trp Gly Glu Val Leu Xaa Trp Lys Phe Asp Xaa Xaa Leu Ala 210 215 220 Tyr Xaa Tyr Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Glu Glu Xaa Xaa Ser 225 230 235 240 Lys Ser Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 245 250 255 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 260 265 <210> 236 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 3, 4, 5, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 22, 30, 32, 33, 37, 43, 45, 46, 49, 51, 52, 53, 55, 57, 59, 61, 62, 65, 75, 78, 81, 87, 89, 91, 94, 102, 104, 106, 113, 145, 147, 170, 171, 182, 186, 197, 202, 203, 208, 209, 221, 222, 226, 228, 230 <223> Xaa = Any Amino Acid or absent <220> <221> VARIANT <222> 231, 232, 233, 234, 250, 255, 259, 260, 268, 269 <223> Xaa = Any Amino Acid or absent <400> 236 Met Gly Xaa Xaa Xaa Ser Lys Xaa Gln Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 1 5 10 15 Arg Glu Arg Leu Leu Xaa Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Gly Xaa Leu Xaa 20 25 30 Xaa Gly Leu Glu Xaa Gly Tyr Ser Gln Ser Xaa Gly Xaa Xaa Gly Lys 35 40 45 Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Glu Xaa Gln Xaa Tyr Xaa Xaa Gly Gln 50 55 60 Xaa Met Asn Thr Pro Trp Arg Asn Pro Ala Xaa Glu Arg Xaa Lys Leu 65 70 75 80 Xaa Tyr Arg Gln Gln Asn Xaa Asp Xaa Asp Xaa Asp Asp Xaa Asp Asp 85 90 95 Glu Leu Val Gly Val Xaa Val Xaa Pro Xaa Val Pro Leu Arg Ala Met 100 105 110 Xaa Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly 115 120 125 Gly Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg His Arg Ile Leu Asp 130 135 140 Xaa Tyr Xaa Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn Tyr 145 150 155 160 Thr Ser Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Xaa Xaa Phe Gly Trp Leu Trp 165 170 175 Lys Leu Val Pro Val Xaa Val Ser Asp Xaa Glu Ala Gln Glu Asp Glu 180 185 190 Thr His Cys Leu Xaa His Pro Ala Gln Xaa Xaa Gln Trp Asp Asp Xaa 195 200 205 Xaa Pro Trp Gly Glu Val Leu Ala Trp Lys Phe Asp Xaa Xaa Leu Ala 210 215 220 Tyr Xaa Tyr Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Glu Glu Phe Gly Ser 225 230 235 240 Lys Ser Gly Leu Ser Glu Glu Glu Val Xaa Arg Arg Leu Thr Xaa Arg 245 250 255 Gly Leu Xaa Xaa Met Ala Asp Lys Lys Glu Thr Xaa Xaa 260 265 <210> 237 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 3, 5, 10, 12, 13, 14, 15, 30, 33, 37, 43, 46, 49, 51, 52, 53, 55, 57, 59, 65, 75, 78, 81, 89, 94, 106, 145, 147, 171, 182, 186, 197, 202, 203, 208, 209, 221, 222, 226, 228, 230, 233, 234, 255, 259, 269 <223> Xaa = Any Amino Acid or absent <400> 237 Met Gly Xaa Ala Xaa Ser Lys Lys Gln Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 1 5 10 15 Arg Glu Arg Leu Leu Gln Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Gly Xaa Leu Trp 20 25 30 Xaa Gly Leu Glu Xaa Gly Tyr Ser Gln Ser Xaa Gly Glu Xaa Gly Lys 35 40 45 Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Glu Xaa Gln Xaa Tyr Ser Glu Gly Gln 50 55 60 Xaa Met Asn Thr Pro Trp Arg Asn Pro Ala Xaa Glu Arg Xaa Lys Leu 65 70 75 80 Xaa Tyr Arg Gln Gln Asn Met Asp Xaa Asp Val Asp Asp Xaa Asp Asp 85 90 95 Glu Leu Val Gly Val Ser Val His Pro Xaa Val Pro Leu Arg Ala Met 100 105 110 Thr Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly 115 120 125 Gly Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg His Arg Ile Leu Asp 130 135 140 Xaa Tyr Xaa Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn Tyr 145 150 155 160 Thr Ser Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Met Xaa Phe Gly Trp Leu Trp 165 170 175 Lys Leu Val Pro Val Xaa Val Ser Asp Xaa Glu Ala Gln Glu Asp Glu 180 185 190 Thr His Cys Leu Xaa His Pro Ala Gln Xaa Xaa Gln Trp Asp Asp Xaa 195 200 205 Xaa Pro Trp Gly Glu Val Leu Ala Trp Lys Phe Asp Xaa Xaa Leu Ala 210 215 220 Tyr Xaa Tyr Xaa Ala Xaa Phe Ile Xaa Xaa Pro Glu Glu Phe Gly Ser 225 230 235 240 Lys Ser Gly Leu Ser Glu Glu Glu Val Lys Arg Arg Leu Thr Xaa Arg 245 250 255 Gly Leu Xaa Lys Met Ala Asp Lys Lys Glu Thr Ser Xaa 260 265 <210> 238 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 5, 10, 12, 13, 14, 15, 37, 43, 46, 49, 51, 52, 53, 55, 57, 59, 65, 75, 81, 89, 94, 145, 171, 182, 186, 197, 202, 203, 208, 209, 222, 226, 228, 230, 233, 234, 259, 269 <223> Xaa = Any Amino Acid or absent <400> 238 Met Gly Gly Ala Xaa Ser Lys Lys Gln Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 1 5 10 15 Arg Glu Arg Leu Leu Gln Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Gly Arg Leu Trp 20 25 30 Glu Gly Leu Glu Xaa Gly Tyr Ser Gln Ser Xaa Gly Glu Xaa Gly Lys 35 40 45 Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Glu Xaa Gln Xaa Tyr Ser Glu Gly Gln 50 55 60 Xaa Met Asn Thr Pro Trp Arg Asn Pro Ala Xaa Glu Arg Glu Lys Leu 65 70 75 80 Xaa Tyr Arg Gln Gln Asn Met Asp Xaa Asp Val Asp Asp Xaa Asp Asp 85 90 95 Glu Leu Val Gly Val Ser Val His Pro Arg Val Pro Leu Arg Ala Met 100 105 110 Thr Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly 115 120 125 Gly Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg His Arg Ile Leu Asp 130 135 140 Xaa Tyr Leu Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn Tyr 145 150 155 160 Thr Ser Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Met Xaa Phe Gly Trp Leu Trp 165 170 175 Lys Leu Val Pro Val Xaa Val Ser Asp Xaa Glu Ala Gln Glu Asp Glu 180 185 190 Thr His Cys Leu Xaa His Pro Ala Gln Xaa Xaa Gln Trp Asp Asp Xaa 195 200 205 Xaa Pro Trp Gly Glu Val Leu Ala Trp Lys Phe Asp Pro Xaa Leu Ala 210 215 220 Tyr Xaa Tyr Xaa Ala Xaa Phe Ile Xaa Xaa Pro Glu Glu Phe Gly Ser 225 230 235 240 Lys Ser Gly Leu Ser Glu Glu Glu Val Lys Arg Arg Leu Thr Ala Arg 245 250 255 Gly Leu Xaa Lys Met Ala Asp Lys Lys Glu Thr Ser Xaa 260 265 <210> 239 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 5, 13, 14, 15, 49, 52, 53, 55, 65, 75, 81, 89, 94, 171, 186, 208, 209, 222, 226, 230, 259, 269 <223> Xaa = Any Amino Acid or absent <400> 239 Met Gly Gly Ala Xaa Ser Lys Lys Gln Ser Arg Arg Xaa Xaa Xaa Leu 1 5 10 15 Arg Glu Arg Leu Leu Gln Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Gly Arg Leu Trp 20 25 30 Glu Gly Leu Glu Asp Gly Tyr Ser Gln Ser Arg Gly Glu Leu Gly Lys 35 40 45 Xaa Leu Asn Xaa Xaa Ser Xaa Glu Gly Gln Lys Tyr Ser Glu Gly Gln 50 55 60 Xaa Met Asn Thr Pro Trp Arg Asn Pro Ala Xaa Glu Arg Glu Lys Leu 65 70 75 80 Xaa Tyr Arg Gln Gln Asn Met Asp Xaa Asp Val Asp Asp Xaa Asp Asp 85 90 95 Glu Leu Val Gly Val Ser Val His Pro Arg Val Pro Leu Arg Ala Met 100 105 110 Thr Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly 115 120 125 Gly Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg His Arg Ile Leu Asp 130 135 140 Ile Tyr Leu Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn Tyr 145 150 155 160 Thr Ser Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Met Xaa Phe Gly Trp Leu Trp 165 170 175 Lys Leu Val Pro Val Asp Val Ser Asp Xaa Glu Ala Gln Glu Asp Glu 180 185 190 Thr His Cys Leu Val His Pro Ala Gln Thr Ser Gln Trp Asp Asp Xaa 195 200 205 Xaa Pro Trp Gly Glu Val Leu Ala Trp Lys Phe Asp Pro Xaa Leu Ala 210 215 220 Tyr Xaa Tyr Glu Ala Xaa Phe Ile Arg Tyr Pro Glu Glu Phe Gly Ser 225 230 235 240 Lys Ser Gly Leu Ser Glu Glu Glu Val Lys Arg Arg Leu Thr Ala Arg 245 250 255 Gly Leu Xaa Lys Met Ala Asp Lys Lys Glu Thr Ser Xaa 260 265 <210> 240 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 15, 65, 89, 186, 208, 209, 226, 230, 259, 269 <223> Xaa = Any Amino Acid or absent <400> 240 Met Gly Gly Ala Gly Ser Lys Lys Gln Ser Arg Arg Gln Gly Xaa Leu 1 5 10 15 Arg Glu Arg Leu Leu Gln Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Gly Arg Leu Trp 20 25 30 Glu Gly Leu Glu Asp Gly Tyr Ser Gln Ser Arg Gly Glu Leu Gly Lys 35 40 45 Asp Leu Asn Ser His Ser Cys Glu Gly Gln Lys Tyr Ser Glu Gly Gln 50 55 60 Xaa Met Asn Thr Pro Trp Arg Asn Pro Ala Arg Glu Arg Glu Lys Leu 65 70 75 80 Lys Tyr Arg Gln Gln Asn Met Asp Xaa Asp Val Asp Asp Asp Asp Asp 85 90 95 Glu Leu Val Gly Val Ser Val His Pro Arg Val Pro Leu Arg Ala Met 100 105 110 Thr Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly 115 120 125 Gly Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg His Arg Ile Leu Asp 130 135 140 Ile Tyr Leu Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn Tyr 145 150 155 160 Thr Ser Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Met Phe Phe Gly Trp Leu Trp 165 170 175 Lys Leu Val Pro Val Asp Val Ser Asp Xaa Glu Ala Gln Glu Asp Glu 180 185 190 Thr His Cys Leu Val His Pro Ala Gln Thr Ser Gln Trp Asp Asp Xaa 195 200 205 Xaa Pro Trp Gly Glu Val Leu Ala Trp Lys Phe Asp Pro Gln Leu Ala 210 215 220 Tyr Xaa Tyr Glu Ala Xaa Phe Ile Arg Tyr Pro Glu Glu Phe Gly Ser 225 230 235 240 Lys Ser Gly Leu Ser Glu Glu Glu Val Lys Arg Arg Leu Thr Ala Arg 245 250 255 Gly Leu Xaa Lys Met Ala Asp Lys Lys Glu Thr Ser Xaa 260 265 <210> 241 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 65, 89, 186, 208, 209, 230, 259, 269 <223> Xaa = Any Amino Acid or absent <400> 241 Met Gly Gly Ala Gly Ser Lys Lys Gln Ser Arg Arg Gln Gly Gly Leu 1 5 10 15 Arg Glu Arg Leu Leu Gln Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Gly Arg Leu Trp 20 25 30 Glu Gly Leu Glu Asp Gly Tyr Ser Gln Ser Arg Gly Glu Leu Gly Lys 35 40 45 Asp Leu Asn Ser His Ser Cys Glu Gly Gln Lys Tyr Ser Glu Gly Gln 50 55 60 Xaa Met Asn Thr Pro Trp Arg Asn Pro Ala Arg Glu Arg Glu Lys Leu 65 70 75 80 Lys Tyr Arg Gln Gln Asn Met Asp Xaa Asp Val Asp Asp Asp Asp Asp 85 90 95 Glu Leu Val Gly Val Ser Val His Pro Arg Val Pro Leu Arg Ala Met 100 105 110 Thr Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly 115 120 125 Gly Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg His Arg Ile Leu Asp 130 135 140 Ile Tyr Leu Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn Tyr 145 150 155 160 Thr Ser Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Met Phe Phe Gly Trp Leu Trp 165 170 175 Lys Leu Val Pro Val Asp Val Ser Asp Xaa Glu Ala Gln Glu Asp Glu 180 185 190 Thr His Cys Leu Val His Pro Ala Gln Thr Ser Gln Trp Asp Asp Xaa 195 200 205 Xaa Pro Trp Gly Glu Val Leu Ala Trp Lys Phe Asp Pro Gln Leu Ala 210 215 220 Tyr Arg Tyr Glu Ala Xaa Phe Ile Arg Tyr Pro Glu Glu Phe Gly Ser 225 230 235 240 Lys Ser Gly Leu Ser Glu Glu Glu Val Lys Arg Arg Leu Thr Ala Arg 245 250 255 Gly Leu Xaa Lys Met Ala Asp Lys Lys Glu Thr Ser Xaa 260 265 <210> 242 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 3, 4, 5, 10, 12, 13, 14, 15, 30, 33, 37, 43, 46, 49, 51, 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Val Pro Val Xaa Val Ser Asp Glu Ala Gln Glu Asp Glu Xaa Thr 180 185 190 His Cys Leu Xaa His Pro Ala Gln Xaa Xaa Gln Trp Asp Asp Xaa Xaa 195 200 205 Pro Trp Gly Glu Val Leu Ala Trp Lys Phe Asp Pro Xaa Leu Ala Tyr 210 215 220 Xaa Tyr Xaa Ala Phe Ile Xaa Xaa Pro Glu Glu Phe Gly Ser Lys Ser 225 230 235 240 Gly Leu Ser Glu Glu Glu Val Lys Arg Arg Leu Thr Xaa Arg Gly Leu 245 250 255 Xaa Lys Met Ala Asp Lys Lys Glu Thr Ser Xaa 260 265 <210> 243 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 3, 5, 10, 12, 13, 14, 15, 30, 37, 43, 46, 49, 51, 52, 53, 55, 57, 59, 65, 75, 81, 144, 170, 191, 196, 201, 202, 207, 208, 221, 225, 227, 231, 232, 253, 257, 267 <223> Xaa = Any Amino Acid or absent <400> 243 Met Gly Xaa Ala Xaa Ser Lys Lys Gln Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 1 5 10 15 Arg Glu Arg Leu Leu Gln Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Gly Xaa Leu Trp 20 25 30 Glu Gly Leu Glu Xaa Gly Tyr Ser Gln Ser Xaa Gly Glu Xaa Gly Lys 35 40 45 Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Glu Xaa Gln Xaa Tyr Ser Glu Gly Gln 50 55 60 Xaa Met Asn Thr Pro Trp Arg Asn Pro Ala Xaa Glu Arg Glu Lys Leu 65 70 75 80 Xaa Tyr Arg Gln Gln Asn Met Asp Asp Val Asp Asp Asp Asp Asp Glu 85 90 95 Leu Val Gly Val Ser Val His Pro Arg Val Pro Leu Arg Ala Met Thr 100 105 110 Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly Gly 115 120 125 Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg His Arg Ile Leu Asp Xaa 130 135 140 Tyr Leu Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr 145 150 155 160 Ser Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Met Xaa Phe Gly Trp Leu Trp Lys 165 170 175 Leu Val Pro Val Asp Val Ser Asp Glu Ala Gln Glu Asp Glu Xaa Thr 180 185 190 His Cys Leu Xaa His Pro Ala Gln Xaa Xaa Gln Trp Asp Asp Xaa Xaa 195 200 205 Pro Trp Gly Glu Val Leu Ala Trp Lys Phe Asp Pro Xaa Leu Ala Tyr 210 215 220 Xaa Tyr Xaa Ala Phe Ile Xaa Xaa Pro Glu Glu Phe Gly Ser Lys Ser 225 230 235 240 Gly Leu Ser Glu Glu Glu Val Lys Arg Arg Leu Thr Xaa Arg Gly Leu 245 250 255 Xaa Lys Met Ala Asp Lys Lys Glu Thr Ser Xaa 260 265 <210> 244 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 5, 13, 14, 15, 37, 46, 49, 52, 53, 55, 57, 59, 65, 75, 81, 170, 191, 201, 202, 207, 208, 221, 225, 227, 231, 257, 267 <223> Xaa = Any Amino Acid or absent <400> 244 Met Gly Gly Ala Xaa Ser Lys Lys Gln Ser Arg Arg Xaa Xaa Xaa Leu 1 5 10 15 Arg Glu Arg Leu Leu Gln Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Gly Arg Leu Trp 20 25 30 Glu Gly Leu Glu Xaa Gly Tyr Ser Gln Ser Gln Gly Glu Xaa Gly Lys 35 40 45 Xaa Leu Asn Xaa Xaa Ser Xaa Glu Xaa Gln Xaa Tyr Ser Glu Gly Gln 50 55 60 Xaa Met Asn Thr Pro Trp Arg Asn Pro Ala Xaa Glu Arg Glu Lys Leu 65 70 75 80 Xaa Tyr Arg Gln Gln Asn Met Asp Asp Val Asp Asp Asp Asp Asp Glu 85 90 95 Leu Val Gly Val Ser Val His Pro Arg Val Pro Leu Arg Ala Met Thr 100 105 110 Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly Gly 115 120 125 Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg His Arg Ile Leu Asp Leu 130 135 140 Tyr Leu Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr 145 150 155 160 Ser Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Met Xaa Phe Gly Trp Leu Trp Lys 165 170 175 Leu Val Pro Val Asp Val Ser Asp Glu Ala Gln Glu Asp Glu Xaa Thr 180 185 190 His Cys Leu Val His Pro Ala Gln Xaa Xaa Gln Trp Asp Asp Xaa Xaa 195 200 205 Pro Trp Gly Glu Val Leu Ala Trp Lys Phe Asp Pro Xaa Leu Ala Tyr 210 215 220 Xaa Tyr Xaa Ala Phe Ile Xaa Tyr Pro Glu Glu Phe Gly Ser Lys Ser 225 230 235 240 Gly Leu Ser Glu Glu Glu Val Lys Arg Arg Leu Thr Ala Arg Gly Leu 245 250 255 Xaa Lys Met Ala Asp Lys Lys Glu Thr Ser Xaa 260 265 <210> 245 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 5, 13, 15, 53, 55, 59, 65, 81, 170, 191, 207, 208, 225, 257, 267 <223> Xaa = Any Amino Acid or absent <400> 245 Met Gly Gly Ala Xaa Ser Lys Lys Gln Ser Arg Arg Xaa Gly Xaa Leu 1 5 10 15 Arg Glu Arg Leu Leu Gln Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Gly Arg Leu Trp 20 25 30 Glu Gly Leu Glu Asp Gly Tyr Ser Gln Ser Gln Gly Glu Leu Gly Lys 35 40 45 Gly Leu Asn Ser Xaa Ser Xaa Glu Gly Gln Xaa Tyr Ser Glu Gly Gln 50 55 60 Xaa Met Asn Thr Pro Trp Arg Asn Pro Ala Arg Glu Arg Glu Lys Leu 65 70 75 80 Xaa Tyr Arg Gln Gln Asn Met Asp Asp Val Asp Asp Asp Asp Asp Glu 85 90 95 Leu Val Gly Val Ser Val His Pro Arg Val Pro Leu Arg Ala Met Thr 100 105 110 Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly Gly 115 120 125 Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg His Arg Ile Leu Asp Leu 130 135 140 Tyr Leu Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr 145 150 155 160 Ser Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Met Xaa Phe Gly Trp Leu Trp Lys 165 170 175 Leu Val Pro Val Asp Val Ser Asp Glu Ala Gln Glu Asp Glu Xaa Thr 180 185 190 His Cys Leu Val His Pro Ala Gln Thr Ser Gln Trp Asp Asp Xaa Xaa 195 200 205 Pro Trp Gly Glu Val Leu Ala Trp Lys Phe Asp Pro Gln Leu Ala Tyr 210 215 220 Xaa Tyr Glu Ala Phe Ile Arg Tyr Pro Glu Glu Phe Gly Ser Lys Ser 225 230 235 240 Gly Leu Ser Glu Glu Glu Val Lys Arg Arg Leu Thr Ala Arg Gly Leu 245 250 255 Xaa Lys Met Ala Asp Lys Lys Glu Thr Ser Xaa 260 265 <210> 246 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 59, 191, 207, 208, 225, 257, 267 <223> Xaa = Any Amino Acid or absent <400> 246 Met Gly Gly Ala Gly Ser Lys Lys Gln Ser Arg Arg Gln Gly Gly Leu 1 5 10 15 Arg Glu Arg Leu Leu Gln Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Gly Arg Leu Trp 20 25 30 Glu Gly Leu Glu Asp Gly Tyr Ser Gln Ser Gln Gly Glu Leu Gly Lys 35 40 45 Gly Leu Asn Ser His Ser Cys Glu Gly Gln Xaa Tyr Ser Glu Gly Gln 50 55 60 Phe Met Asn Thr Pro Trp Arg Asn Pro Ala Arg Glu Arg Glu Lys Leu 65 70 75 80 Lys Tyr Arg Gln Gln Asn Met Asp Asp Val Asp Asp Asp Asp Asp Glu 85 90 95 Leu Val Gly Val Ser Val His Pro Arg Val Pro Leu Arg Ala Met Thr 100 105 110 Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly Gly 115 120 125 Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg His Arg Ile Leu Asp Leu 130 135 140 Tyr Leu Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr 145 150 155 160 Ser Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Met Phe Phe Gly Trp Leu Trp Lys 165 170 175 Leu Val Pro Val Asp Val Ser Asp Glu Ala Gln Glu Asp Glu Xaa Thr 180 185 190 His Cys Leu Val His Pro Ala Gln Thr Ser Gln Trp Asp Asp Xaa Xaa 195 200 205 Pro Trp Gly Glu Val Leu Ala Trp Lys Phe Asp Pro Gln Leu Ala Tyr 210 215 220 Xaa Tyr Glu Ala Phe Ile Arg Tyr Pro Glu Glu Phe Gly Ser Lys Ser 225 230 235 240 Gly Leu Ser Glu Glu Glu Val Lys Arg Arg Leu Thr Ala Arg Gly Leu 245 250 255 Xaa Lys Met Ala Asp Lys Lys Glu Thr Ser Xaa 260 265 <210> 247 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 59, 191, 207, 208, 257, 267 <223> Xaa = Any Amino Acid or absent <400> 247 Met Gly Gly Ala Gly Ser Lys Lys Gln Ser Arg Arg Gln Gly Gly Leu 1 5 10 15 Arg Glu Arg Leu Leu Gln Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Gly Arg Leu Trp 20 25 30 Glu Gly Leu Glu Asp Gly Tyr Ser Gln Ser Gln Gly Glu Leu Gly Lys 35 40 45 Gly Leu Asn Ser His Ser Cys Glu Gly Gln Xaa Tyr Ser Glu Gly Gln 50 55 60 Phe Met Asn Thr Pro Trp Arg Asn Pro Ala Arg Glu Arg Glu Lys Leu 65 70 75 80 Lys Tyr Arg Gln Gln Asn Met Asp Asp Val Asp Asp Asp Asp Asp Glu 85 90 95 Leu Val Gly Val Ser Val His Pro Arg Val Pro Leu Arg Ala Met Thr 100 105 110 Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly Gly 115 120 125 Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg His Arg Ile Leu Asp Leu 130 135 140 Tyr Leu Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr 145 150 155 160 Ser Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Met Phe Phe Gly Trp Leu Trp Lys 165 170 175 Leu Val Pro Val Asp Val Ser Asp Glu Ala Gln Glu Asp Glu Xaa Thr 180 185 190 His Cys Leu Val His Pro Ala Gln Thr Ser Gln Trp Asp Asp Xaa Xaa 195 200 205 Pro Trp Gly Glu Val Leu Ala Trp Lys Phe Asp Pro Gln Leu Ala Tyr 210 215 220 Arg Tyr Glu Ala Phe Ile Arg Tyr Pro Glu Glu Phe Gly Ser Lys Ser 225 230 235 240 Gly Leu Ser Glu Glu Glu Val Lys Arg Arg Leu Thr Ala Arg Gly Leu 245 250 255 Xaa Lys Met Ala Asp Lys Lys Glu Thr Ser Xaa 260 265

Claims (61)

  1. 변형된 T 세포로서,
    (a) 세포외 리간드 결합 도메인;
    (b) 막관통 도메인, 및
    (c) 키메라 신호전달 도메인("CMSD")을 포함하는 세포내 신호전달 도메인("ISD")를 포함하는, 기능적 외인성 수용체를 포함하되,
    상기 CMSD는 하나 또는 복수의 면역-수용체 티로신-기반 활성화 모티프("CMSD ITAM")을 포함하고, 상기 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 링커("CSMD 링커")에 의해 선택적으로 연결된 것인, 변형된 T 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 상기 복수의 CMSD ITAM이 서로 직접 연결되고/거나;
    (b) 상기 CMSD가 ITAM-함유 모 분자로부터 유래하지 않은 하나 이상의 링커에 의해 연결된 둘 이상의 CMSD ITAM을 포함하고/거나;
    (c) 상기 CMSD가 하나 이상의 CMSD ITAM이 유래된 ITAM-포함 모 분자와 다른 ITAM-함유 모 분자로부터 유래한 하나 이상의 CMSD를 포함하고/거나;
    (d) 상기 CMSD가 둘 이상의 동일한 CMSD ITAM을 포함하고/거나;
    (e) 상기 CMSD ITAM의 적어도 하나가 CD3ζ로부터 유래하지 않고/거나;
    (f) 상기 CMSD ITAM의 적어도 하나가 CD3ζ의 ITAM1 또는 ITAM2가 아니고/거나;
    (g) 상기 복수의 CMSD ITAM이 각각 다른 ITAM-함유 모 분자로부터 유래되고/거나;
    (h) 상기 CMSD ITAM 중 적어도 하나 이상이 CD3εCD3δγIgα (CD79a), Igβ(CD79b), FcεβFcεγ및 모에신으로 구성된 군으로부터 선택되는 ITAM-함유 모 분자로부터 유래한 것인, 변형된 T 세포.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 CMSD ITAM 중 적어도 하나 이상이 CD3εCD3δγζIgα(CD79a), IgβFcεβFcεγ및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래되는 것인, 변형된 T 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CMSD가 CD3ζ의 ITAM1 및/또는 ITAM2를 포함하지 않는 것인, 변형된 T 세포.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CMSD가 CD3ζ의 ITAM3을 포함하는 것인, 변형된 T 세포.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CMSD ITAM 중 적어도 2 개가 동일한 ITAM-함유 모 분자로부터 유래되는 것인, 변형된 T 세포.
  7. 제6항에 있어서, 상기 CMSD ITAM 중 적어도 2 개가 서로 동일한 것인, 변형된 T 세포.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CMSD ITAM 중 적어도 2 개가 서로 상이한 것인, 변형된 T 세포.
  9. 제8항에 있어서, 상기 2 개의 상이한 CMSD ITAM이 각각 상이한 ITAM-함유 모 분자로부터 유래되는 것인, 변형된 T 세포.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CMSD 링커 중 적어도 하나가 CD3ζ로부터 유래되는 것인, 변형된 T 세포.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CMSD 링커 중 적어도 하나가 ITAM-함유 모 분자에 대해 이종 기원인, 변형된 T 세포.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CMSD가 가장 C-말단 CMSD ITAM의 C-말단에 C-말단 서열("CMSD C-말단 서열")을 추가로 포함하는 것인, 변형된 T 세포.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CMSD가 가장 N-말단 CMSD ITAM의 N-말단에 N-말단 서열("CMSD N-말단 서열")을 추가로 포함하는 것인, 변형된 T 세포.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 CMSD 링커, 상기 CMSD의 C-말단 서열, 및/또는 상기 CMSD의 N-말단 서열이 서열번호: 12-26, 103-107, 및 119-126으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것인, 변형된 T 세포.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CMSD가 서열번호 39-51 및 132-152로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, 변형된 T 세포.
  16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능적 외인성 수용체가 ITAM-변형 T 세포 수용체(TCR), ITAM-변형 키메라 항원 수용체(CAR), ITAM-변형 키메라 TCR(cTCR), 또는 ITAM-변형 T 세포 항원 커플러(TAC)-유사 키메라 수용체인, 변형된 T 세포.
  17. 제16항에 있어서, 상기 기능적 외인성 수용체가 ITAM-변형 CAR인, 변형된 T 세포.
  18. 제17항에 있어서, 상기 막관통 도메인이 CD8α로부터 유래되는 것인, 변형된 T 세포.
  19. 제16항에 있어서, 상기 ISD가 공동-자극 신호전달 도메인을 추가로 포함하는 것인, 변형된 T 세포.
  20. 제19항에 있어서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인이 CD137(4-1BB) 또는 CD28로부터 유래되는 것인, 변형된 T 세포.
  21. 제19항에 있어서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인이 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 변형된 T 세포.
  22. 제19항에 있어서, 상기 공동-자극 도메인이 CMSD에 대해 N-말단인, 변형된 T 세포.
  23. 제17항에 있어서, 상기 ITAM-변형 CAR가 서열번호: 71, 73, 109, 153-169, 170-175, 177-182 및 205로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, 변형된 T 세포.
  24. 제16항에 있어서, 상기 기능적 외인성 수용체가 ITAM-변형 cTCR이고, 상기 ITAM-변형 cTCR은,
    (a) 세포외 리간드 결합 도메인,
    (b) 선택적인 수용체 도메인 링커,
    (c) 선택적인, 제1 TCR 서브유닛의 세포외 도메인 또는 그의 부분,
    (d) 제2 TCR 서브유닛의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및
    (e) CMSD를 포함하는 ISD를 포함하며,
    상기 제1 및 제2 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 변형된 T 세포.
  25. 제24항에 있어서, 상기 제1 및 제2 TCR 서브유닛이 둘 다 CD3ε인, 변형된 T 세포.
  26. 제24항에 있어서, 상기 하나 또는 복수의 CMSD ITAM이 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 중 하나 이상으로부터 유래되는 것인, 변형된 T 세포.
  27. 제16항에 있어서, 상기 기능적 외인성 수용체가 ITAM-변형 TAC-유사 키메라 수용체이고, 상기 ITAM-변형 TAC-유사 키메라 수용체는,
    (a) 세포외 리간드 결합 도메인,
    (b) 선택적인 제1 수용체 도메인 링커,
    (c) 제1 TCR 서브유닛의 세포외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포외 TCR 결합 도메인,
    (d) 선택적인 제2 수용체 도메인 링커,
    (e) 선택적인, 제2 TCR 서브유닛의 세포외 도메인 또는 그의 부분,
    (f) 제3 TCR 서브유닛의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및
    (g) 상기 CMSD를 포함하는 ISD를 포함하며,
    상기 제1, 제2, 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβTCRγδεγ및 CD3δ로 구성되는 군으로부터 선택되는, 변형된 T 세포.
  28. 제27항에 있어서, 상기 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 둘 다 CD3ε인, 변형된 T 세포.
  29. 제27항에 있어서, 상기 하나 또는 복수의 CMSD ITAM이 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 중 하나 이상으로부터 유래되는 것인, 변형된 T 세포.
  30. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 리간드 결합 도메인이 하나 이상의 표적 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 하나 이상의 항원-결합 단편을 포함하는 것인, 변형된 T 세포.
  31. 제31항에 있어서, 상기 항원-결합 단편이 sdAb 또는 scFv인, 변형된 T 세포.
  32. 제30항항에 있어서, 상기 표적 항원이 BCMA, CD19, 또는 CD20인, 변형된 T 세포.
  33. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 리간드 결합 도메인의 C-말단 및 상기 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인을 추가로 포함하는, 변형된 T 세포.
  34. 제33항에 있어서, 상기 힌지 도메인이 CD8α로부터 유래되는 것인, 변형된 T 세포.
  35. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CMSD를 포함하는 ISD를 포함하는 기능적 외인성 수용체의 효과기 기능이 CD3ζ의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 ISD를 포함하는 기능적 외인성 수용체보다 최대 약 80% 낮은 것인, 변형된 T 세포.
  36. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적으로 외인성 Nef 단백질을 포함하는, 변형된 T 세포.
  37. 제36에 있어서, 상기 외인성 Nef 단백질이 SIV Nef, HIV1 Nef, HIV2 Nef, 그의 아형(subtype), 및 그의 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 변형된 T 세포.
  38. 제36항에 있어서, 상기 외인성 Nef 단백질이 서열번호: 235-247 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재하는 것인, 변형된 T 세포.
  39. 제37항에 있어서, 상기 외인성 Nef 단백질이 서열번호: 85 또는 230의 서열에 대해 적어도 약 70% 서열 동일성의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 235-247 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 x 및 X는 독립적으로 임의의 아미노산이거나 또는 부재하는 것인, 변형된 T 세포.
  40. 제36항에 있어서, 상기 외인성 Nef 단백질이 서열번호: 79-89, 198-204, 및 207- 231 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 변형된 T 세포.
  41. 제36항에에 있어서, 상기 외인성 Nef 단백질이 변형된 T 세포의 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC I을 하향 조절하는 것인, 변형된 T 세포.
  42. 제41항에 있어서, 상기 하향 조절이 내인성 TCR, CD3, 및/또는 MHC I의 세포 표면 발현을 적어도 약 40%까지 하향 조절하는 것을 포함하는 것인, 변형된 T 세포.
  43. 제36항에 있어서, 상기 외인성 Nef 단백질이 상기 기능적 외인성 수용체를 하향 조절하지 않는 것인, 변형된 T 세포.
  44. 제36항에 있어서, 상기 외인성 Nef 단백질이 상기 기능적 외인성 수용체를 최대 약 80%까지 하향 조절하는 것인, 변형된 T 세포.
  45. 제36항에 있어서, 상기 외인성 Nef 단백질을 발현하는 변형된 T 세포가 상기 변형된 T 세포가 유래된 전구체 T 세포의 공여자로부터 단리된 1차 T 세포에 의해 도출된 이식편대숙주병(GvHD) 반응과 비교하여 조직부적합성(histoincompatible) 개체에서 GvHD 반응을 전혀 도출하지 않거나 또는 감소된 GvHD 반응을 도출하는 것인, 변형된 T 세포.
  46. 기능적 외인성 수용체를 암호화하는 핵산을 전구체 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포를 생산하는 시험관 내 방법으로서,
    상기 기능적 외인성 수용체는
    (a) 세포외 리간드 결합 도메인,
    (b) 막관통 도메인, 및
    (c) CMSD를 포함하는 ISD을 포함하며,
    상기 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 상기 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 선택적으로 연결되는 것인, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 변형된 T 세포가 상기 외인성 Nef 단백질을 추가적으로 발현하고 전구체 T 세포의 공여자로부터 단리된 1차 T 세포에 의해 도출된 GvHD 반응과 비교하여 조직부적합성 개체에서 GvHD 반응을 전혀 도출하지 않거나 또는 감소된 GvHD 반응을 도출하는, 방법.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 변형된 T 세포로부터 TCR-음성 및 기능적 외인성 수용체-양성 T 세포를 단리 및/또는 풍부화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  49. 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 변형된 T 세포를 적어도 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  50. 제46항 또는 제47항에 있어서,
    (a) 상기 복수의 CMSD ITAM이 서로 직접 연결되고/거나;
    (b) 상기 CMSD가 ITAM-포함 모 분자로부터 유래하지 않은 하나 이상의 링커에 의해 연결된 둘 이상의 CMSD ITAM을 포함하고/거나;
    (c) 상기 CMSD가 하나 이상의 CMSD ITAM이 유래된 ITAM-포함 모 분자와 다른 ITAM-함유 모 분자로부터 유래한 하나 이상의 CMSD를 포함하고/거나;
    (d) 상기 CMSD가 둘 이상의 동일한 CMSD ITAM을 포함하고/거나;
    (e) 상기 CMSD ITAM의 적어도 하나가 CD3ζ로부터 유래하지 않고/거나;
    (f) 상기 CMSD ITAM의 적어도 하나가 CD3ζ의 ITAM1 또는 ITAM2가 아니고/거나;
    (g) 상기 복수의 CMSD ITAM이 각각 다른 ITAM-함유 모 분자로부터 유래되고/거나;
    (h) 상기 CMSD ITAM 중 적어도 하나 이상이 CD3εCD3δγIgα (CD79a), Igβ(CD79b), FcεβFcεγ및 모에신으로 구성된 군으로부터 선택되는 ITAM-함유 모 분자로부터 유래한 것인, 방법.
  51. 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 CMSD ITAM 중 적어도 하나 이상이 CD3εCD3δγζIgα(CD79a), IgβFcεβFcεγ및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래되는 것인, 변형된 T 세포.
  52. 제46항 또는 제47항의 방법에 의해 수득된 변형된 T 세포.
  53. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 변형된 T 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  54. 유효량의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 변형된 T 세포를 인간을 제외한 포유동물 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 암을 치료하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 개체가 상기 변형 세포가 유래된 전구체 T 세포의 공여자와 조직부적합성인, 방법.
  56. 기능적 외인성 수용체를 암호화하는 단리된 핵산으로서,
    상기 기능적 외인성 수용체는,
    (a) 세포외 리간드 결합 도메인,
    (b) 막관통 도메인, 및
    (c) CMSD를 포함하는 ISD를 포함하며,
    상기 CMSD는 하나 또는 복수의 CMSD ITAM을 포함하고, 상기 복수의 CMSD ITAM은 하나 이상의 CMSD 링커에 의해 선택적으로 연결되는 것인, 단리된 핵산.
  57. 제56항에 있어서, 상기 CMSD ITAM 중 적어도 하나 이상이 CD3εCD3δγζIgα(CD79a), IgβFcεβFcεγ및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-함유 모 분자에서 유래되는 것인, 단리된 핵산.
  58. 제56항 또는 제57항의 핵산을 포함하는 벡터.
  59. 제58항에 있어서, 바이러스 벡터인 벡터.
  60. 제52항의 변형된T 세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  61. 치료적으로 유효한 양의 제52항의 변형된 T 세포를 인간을 제외한 포유동물 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 암을 치료하는 방법.
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