CN112175998A - 一种嵌合抗原受体t细胞及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种嵌合抗原受体T细胞及其应用，制备所述嵌合抗原受体T细胞的表达载体系统包括：含有嵌合抗原受体编码基因的第一表达载体，含有IL‑2信号肽编码基因和IL‑7编码基因的第二表达载体，含有NFAT调控型启动子和CCL19编码基因的第三表达载体；所述NFAT调控型启动子包括NFAT调控序列和启动子序列；所述NFAT调控序列包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列。本发明将IL‑7信号肽替换为T细胞分泌蛋白IL‑2的信号肽，采用NFAT调控型启动子调控T细胞对CCL19的表达，实现了CAR‑T细胞分泌性表达IL‑7和NFAT调控型表达CCL19。

Description

一种嵌合抗原受体T细胞及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种嵌合抗原受体T细胞及其应用。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)免疫治疗是通过在T细胞膜上表达特异性识别并结合肿瘤抗原的嵌合抗原受体分子，诱导T细胞活化，从而实现对肿瘤细胞特异性杀伤的一种技术，是最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。
目前，CAR-T免疫治疗方法在白血病治疗领域取得了巨大突破，但是在实体瘤的治疗上仍然存在诸多问题。科研人员通过对CAR-T疗法进行改进和优化，提高CAR-T对实体瘤的治疗效果。
CN109504660A公开了一种第四代CAR-T细胞及其构建方法和应用，所述CAR包括胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区、细胞因子信号区，其中，胞膜外抗原结合区以Nectin-4抗原的两个空间表位为靶点，细胞因子信号区为IL7和CCL19，但是存在外源IL-7蛋白无法分泌到T细胞外、CCL19的持续性分泌无法最大程度将外周血免疫细胞招募到肿瘤内部的问题。
因此，构建一种新型CAR-T细胞，不仅能分泌IL-7和CCL19，而且能将外源IL-7蛋白分泌到T细胞外，同时CCL19最大程度将外周血免疫细胞招募到肿瘤内部，在肿瘤的治疗领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种嵌合抗原受体T细胞及其应用，所述嵌合抗原受体T细胞能够将IL-7持续性分泌到胞外，在识别肿瘤抗原后表达分泌CCL19，显著提高了CAR-T细胞的抗肿瘤效果，同时规避了由于持续性分泌CCL19导致非肿瘤组织环境过多募集免疫细胞可能引起的炎症副反应。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种制备CAR-T细胞的表达载体系统，所述表达载体系统包括：
含有嵌合抗原受体编码基因的第一表达载体，含有IL-2信号肽编码基因和IL-7编码基因的第二表达载体，含有NFAT调控型启动子和CCL19编码基因的第三表达载体；
所述NFAT调控型启动子包括NFAT调控序列和启动子序列；
所述NFAT调控序列包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列；
SEQ ID NO:1：agcgctccaaat。
本发明中，将IL-7信号肽替换为T细胞分泌蛋白IL-2的信号肽，使得IL-7可以分泌到T细胞外，充分发挥IL-7对T细胞增殖的促进作用；采用NFAT调控型启动子调控T细胞对CCL19的表达，保证CAR-T细胞在肿瘤内部时才表达分泌CCL19，实现了外周血免疫细胞最大程度被招募到肿瘤内部的效果。
优选地，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域。
优选地，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原包括CD19、CD20、CD22、CD30、CEA、EGFR、BRAF、HER-2、Mesothelin、MUC1、PSCA、GPC3、TERT、PTEN、PD-1、PD-L1或VEGF中的任意一种，优选为CD19、MUC1、GPC3、Mesothelin、PSCA或HER2中的任意一种，进一步优选为MUC1。
优选地，所述跨膜结构域包括CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域，优选为CD28跨膜结构域。
优选地，所述信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR2、4-1BB、TLR1、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD28胞内结构域、CD3ζ和TLR2的组合。
优选地，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、MUC1抗原结合结构域、CD28跨膜结构域、CD28胞内结构域、CD3ζ和TLR2串联组成。
优选地，所述嵌合抗体受体编码基因包括SEQ ID NO:2所示的核酸序列；
SEQ ID NO:2：
atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctggatatcgttgtgactcaggaatctgcactcaccacatcacctggtgaaacagtcacactcacttgtcgctcaagtactggggctgttacaacaagtaactatgccaactgggtccaagaaaaaccagatcatttattcactggtctaataggtggtaccaacaaccgagcaccaggtgttcctgccagattctcaggctccctgattggagacaaggctgccctcaccatcacaggggcacagactgaggatgaggcaatatatttctgtgctctatggtacagcaaccattgggtgttcggtggaggaaccaaactgactgtcctaggatccgagggtggctcaggatcgggtggatcaggctctggtggctcaggatcggaggtccagctgcagcagtcaggaggaggcttggtgcaacctggaggatccatgaaactctcctgtgttgcctctggattcactttcagtaactactggatgaactgggtccgccagtctccagagaaggggcttgagtgggttgctgaaattagattgaaatctaataattatgcaacacattatgcggagtctgtgaaagggaggttcaccatctcaagagatgattccaaaagtagtgtctacctgcaaatgaacaacttaagagctgaagacactggcatttattactgtacctttggtaactcctttgcttactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgccaggccaaaaggaagcccaggaaagctcccagcaggaacatctgctatgatgcatttgtttcttacagtgagcgggatgcctactgggtggagaaccttatggtccaggagctggagaacttcaatccccccttcaagttgtgtcttcataagcgggacttcattcctggcaagtggatcattgacaatatcattgactccattgaaaagagccacaaaactgtctttgtgctttctgaaaactttgtgaagagtgagtggtgcaagtatgaactggacttctcccatttccgtctttttgatgagaacaatgatgctgccattctcattcttctggagcccattgagaaaaaagccattccccagcgcttctgcaagctgcggaagataatgaacaccaagacctacctggagtggcccatggacgaggctcagcgggaaggattttgggtaaatctgagagctgcgataaagtcc。
优选地，所述IL-2信号肽编码基因包括SEQ ID NO:3所示的核酸序列；
SEQ ID NO:3：
atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacaaacagt。
优选地，所述IL-7编码基因包括SEQ ID NO:4所示的核酸序列；
SEQ ID NO:4：
gattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatcgatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaataatgaatttaacttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgctcgcaagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctccacttattaaaagtttcagaaggcacaacaatactgttgaactgcactggccaggttaaaggaagaaaaccagctgccctgggtgaagcccaaccaacaaagagtttggaagaaaataaatctttaaaggaacagaaaaaactgaatgacttgtgtttcctaaagagactattacaagagataaaaacttgttggaataaaattttgatgggcactaaagaacac。
优选地，所述NFAT调控型启动子包括SEQ ID NO:5所示的核酸序列；
SEQ ID NO:5：
agcgctccaaatagcgctccaaatagcgctccaaatagcgctccaaatagatctagactctagagggtatataatggaagctcgaattccagcttggcattccggtactgttggtaaaaagcttggcaatccggtactgttggtaaagccacc。
本发明中，采用活化T细胞核因子(NFAT)特异性结合的序列构建NFAT调控型启动子4×NFAT-RE-minP，调控CCL19的表达，使得CAR-T细胞在识别肿瘤抗原并激活后启动对CCL19的转录和翻译，有利于最大程度将免疫细胞招募到肿瘤内部。
优选地，所述CCL19编码基因包括SEQ ID NO:6所示的核酸序列；
SEQ ID NO:6：
atggccctgctactggccctcagcctgctggttctctggacttccccagccccaactctgagtggcaccaatgatgctgaagactgctgcctgtctgtgacccagaaacccatccctgggtacatcgtgaggaacttccactaccttctcatcaaggatggctgcagggtgcctgctgtagtgttcaccacactgaggggccgccagctctgtgcacccccagaccagccctgggtagaacgcatcatccagagactgcagaggacctcagccaagatgaagcgccgcagcagt。
优选地，所述表达载体系统包括病毒载体系统。
优选地，所述病毒载体系统包括慢病毒载体系统、逆转录病毒载体系统或腺相关病毒载体系统中的任意一种，优选为慢病毒载体系统。
第二方面，本发明提供了一种重组慢病毒系统，所述重组慢病毒系统采用第一方面所述的表达载体系统与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。
优选地，所述重组慢病毒系统包括表达嵌合抗原受体的第一重组慢病毒，表达IL-2信号肽和IL-7的第二重组慢病毒，表达NFAT调控型CCL19的第三重组慢病毒。
优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合。
第三方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞表达特异性结合MUC1的嵌合抗原受体、分泌型IL-7和NFAT调控型CCL19。
优选地，所述嵌合抗原受体T细胞包括第一方面所述的表达载体系统和/或第二方面所述的重组慢病毒系统。
第四方面，本发明提供了一种第三方面所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，所述方法包括将第一方面所述的表达载体系统或第二方面所述的重组慢病毒系统导入T细胞的步骤。
第五方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第三方面所述的嵌合抗原受体T细胞。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第六方面，本发明提供了第一方面所述的表达载体系统、第二方面所述的重组慢病毒系统、第三方面所述的嵌合抗原受体T细胞或第五方面所述的药物组合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、乳腺癌、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、间皮质瘤、胰岛细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、子宫肌瘤、宫颈癌或甲状腺癌中的任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明将IL-7信号肽替换为T细胞分泌蛋白IL-2的信号肽，使得IL-7可以分泌到T细胞外，充分发挥IL-7对T细胞增殖的促进作用；
(2)本发明采用NFAT调控型启动子调控T细胞对CCL19的表达，当CAR-T细胞识别肿瘤抗原被激活后，4×NFAT-RE-minP启动对CCL19的转录和翻译，保证CAR-T细胞只有在肿瘤内部时才表达分泌CCL19，实现了外周血免疫细胞最大程度被招募到肿瘤内部的效果，并降低了炎症副反应；
(3)本发明构建的表达分泌型IL-7和调控型CCL19的CAR-T细胞具有显著增强的肿瘤抑制作用，在实体瘤治疗领域具有重要意义。
附图说明
图1为不同CAR-T细胞分泌IL-7和CCL19的结果；
图2为不同CAR-T细胞连续6天的增殖结果；
图3为不同CAR-T细胞对T细胞的招募能力。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1慢病毒载体的制备
全基因合成以下核酸分子：
①由GM-CSF信号肽、MUC1 scFv、CD28跨膜结构域、CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR2的核酸序列串联形成的CAR分子(SEQ ID NO:2)；
②由IL-7信号肽(SEQ ID NO:7)和IL-7(不含IL-7信号肽)(SEQ ID NO:4)的核酸序列串联形成的核酸分子；
③CCL19核酸分子(SEQ ID NO:6)；
④由IL-2信号肽(SEQ ID NO:3)和IL-7(不含IL-7信号肽)(SEQ ID NO:4)的核酸序列串联形成的分泌型IL-7分子；
⑤由4×NFAT-RE-minP启动子(SEQ ID NO:5)和CCL19(SEQ ID NO:6)串联形成的调控型CCL19分子；
SEQ ID NO:7：
atgttccatgtttcttttaggtatatctttggacttcctcccctgatccttgttctgttgccagtagcatcatct。
将合成的CAR分子克隆至慢病毒表达载体pwpxld-eGFP中；将合成的IL-7信号肽和IL-7(不含IL-7信号肽)的核酸序列串联形成的核酸分子克隆至pwpxld-tCD19中；将合成的CCL19核酸分子克隆至pwpxld-tCD19中；将合成的分泌型IL-7分子克隆至pwpxld-tCD19中；将合成的调控型CCL19分子克隆至pwpxld-tCD19中。
实施例2重组慢病毒的制备
(1)在10cm培养皿中培养293T细胞，培养基为DMEM高糖培养基+10％FBS(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)；
(2)待培养皿中的293T细胞密度达80％时，更换培养基为DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
(3)更换培养基培养2小时后，配制转染试剂，取500μL opti-DMEM至15mL离心管中，加入7.2μL浓度为10μg/μL的PEI(线性聚乙烯亚胺)，轻微混匀后，静置5min；
(4)取500μL opti-DMEM至1.5mL离心管中，取表1所示的质粒混合液加入到离心管中，混匀，加入到转染试剂中，颠倒混匀，静置20min；
表1
试剂 剂量
pWPXLd-表达质粒 9μg
pMD2.G 3μg
psPAX2 12μg
其中，pWPXLd-表达质粒为：表达CAR分子的慢病毒载体，表达完整IL-7的慢病毒载体，表达CCL19的慢病毒载体，表达分泌型IL-7的慢病毒载体，或表达调控型CCL19的慢病毒载体；
(5)将上述混合液全部加到293T细胞中，孵育6h后，更换7mL新鲜的培养基DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
(6)在更换培养基24h后收集上清，更换7mL新鲜的培养基DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
(7)24h后再次收集上清，更换7mL新鲜的培养基DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
(8)24h后收集上清，并且丢弃细胞；
(9)培养基上清收集完毕后，在2500g下离心0.5小时，将上清用0.45μm过滤器过滤，分别得到表达CAR的重组慢病毒、表达完整IL-7的重组慢病毒、表达CCL19的重组慢病毒、表达分泌型IL-7的重组慢病毒和表达调控型CCL19的重组慢病毒，4℃保存待用。
实施例3表达IL-7和CCL19的CAR-T细胞的制备
(1)从脐带血中分选出Pan T细胞后，对细胞进行计数，将浓度调整至1×106个/mL，随后向每毫升细胞悬液中加入10μL美天旎TransAct T细胞试剂，激活48小时后更换为新鲜培养基(IMDM培养基+5％FBS(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)+IL-2)；
(2)将3×107个激活的T细胞在300g下离心5min，用3mL培养基重悬(IMDM培养基+5％FBS(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液))；
(3)将3mL T细胞悬液接种在6孔板中，每孔1mL；
(4)分别加入以下重组慢病毒组合到6孔板中，每孔9mL；
①表达CAR的重组慢病毒上清；
②等量的表达CAR的重组慢病毒上清、表达完整IL-7的重组慢病毒上清和表达CCL19的重组慢病毒上清；
③等量的表达CAR的重组慢病毒上清、表达分泌型IL-7的重组慢病毒上清和表达调控型CCL19的重组慢病毒上清；
(5)取10μL polybrene加入到每孔中；
(6)培养8h后更换新鲜培养基(IMDM培养基+10％FBS(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液))1mL，重复步骤(4)和(5)；
(7)5h后撤去病毒，更换新鲜的培养基4mL(IMDM培养基+10％FBS(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液))；
(8)48小时后更换新鲜培养基，调整细胞密度继续培养10天，得到表达CAR的CAR-T细胞(MUC1 CAR-T)，表达CAR、IL-7和CCL19的CAR-T细胞(MUC1-7×19CAR-T)，和表达CAR、分泌型IL-7和调控型CCL19的CAR-T细胞(MUC1-secIL7×NFATpro-CCL19 CAR-T)，保存进行后续实验。
实施例4CAR-T细胞对IL-7和CCL19的分泌
取实施例3制备的三种CAR-T细胞各2×106个，用新鲜的T细胞培养基培养24小时，收集细胞上清；同时取2×106个MUC1-secIL7×NFATpro-CCL19CAR-T，与等量的MUC1阳性细胞K562-MUC1共培养24h，收集细胞上清；采用ELISA试剂盒(R&D system)检测每种细胞对IL-7和CCL19的分泌情况。
如图1所示，MUC1 CAR-T细胞的培养上清中无IL-7和CCL19，MUC1-7×19CAR-T细胞的培养上清中只有CCL19、没有IL-7，MUC1-secIL7×NFATpro-CCL19 CAR-T细胞的培养上清中只有IL-7、没有CCL19，与K562-MUC1共培养的MUC1-secIL7×NFATpro-CCL19 CAR-T细胞的培养上清中能同时检测到IL-7和CCL19。
由此表明改造的MUC1-secIL7×NFATpro-CCL19 CAR-T细胞可以顺利将IL-7分泌到胞外，同时CCL19的表达受到调控，只有当CAR-T细胞被肿瘤抗原激活后才表达分泌CCL19。
实施例5CAR-T细胞的体外增殖实验
取实施例3制备的三种CAR-T细胞各2×106个，用新鲜的T细胞培养基培养，每两天进行计数，连续培养6天，分析CAR-T细胞的增殖情况。
结果图2所示，MUC1-7×19CAR-T由于不分泌IL-7，对CAR-T细胞没有促进增殖的作用；经过改造的MUC1-secIL7×NFATpro-CCL19 CAR-T表达的IL-7可以顺利分泌到胞外，可以促进CAR-T细胞的增殖。
实施例6CAR-T细胞的体外迁移实验
取实施例3制备的三种CAR-T细胞各2×106个，于Transwell装置下层培养24h，同时取等量的MUC1-secIL7×NFATpro-CCL19 CAR-T和K562-MUC1于下层共培养24h，取CFSE标记的野生T细胞于上层培养5h，用流式细胞仪检测下层细胞中CFSE标记的T细胞的数量。
统计结果如图3所示，MUC1-7×19CAR-T相较于MUC1 CAR-T可以招募到更多的T细胞，MUC1-secIL7×NFATpro-CCL19 CAR-T被肿瘤抗原MUC1激活后招募到更多的T细胞，说明MUC1-secIL7×NFATpro-CCL19 CAR-T条件性表达CCL19，安全性更高。
综上所述，本发明的嵌合抗原受体T细胞能够将IL-7持续性分泌到胞外，在识别肿瘤抗原后表达分泌CCL19，显著提高了CAR-T细胞的抗肿瘤效果，同时规避了由于持续性分泌CCL19导致非肿瘤组织环境过多募集免疫细胞可能引起的炎症副反应。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东昭泰体内生物医药科技有限公司
<120> 一种嵌合抗原受体T细胞及其应用
<130> 202009
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agcgctccaa at 12
<210> 2
<211> 1926
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
gatatcgttg tgactcagga atctgcactc accacatcac ctggtgaaac agtcacactc 120
acttgtcgct caagtactgg ggctgttaca acaagtaact atgccaactg ggtccaagaa 180
aaaccagatc atttattcac tggtctaata ggtggtacca acaaccgagc accaggtgtt 240
cctgccagat tctcaggctc cctgattgga gacaaggctg ccctcaccat cacaggggca 300
cagactgagg atgaggcaat atatttctgt gctctatggt acagcaacca ttgggtgttc 360
ggtggaggaa ccaaactgac tgtcctagga tccgagggtg gctcaggatc gggtggatca 420
ggctctggtg gctcaggatc ggaggtccag ctgcagcagt caggaggagg cttggtgcaa 480
cctggaggat ccatgaaact ctcctgtgtt gcctctggat tcactttcag taactactgg 540
atgaactggg tccgccagtc tccagagaag gggcttgagt gggttgctga aattagattg 600
aaatctaata attatgcaac acattatgcg gagtctgtga aagggaggtt caccatctca 660
agagatgatt ccaaaagtag tgtctacctg caaatgaaca acttaagagc tgaagacact 720
ggcatttatt actgtacctt tggtaactcc tttgcttact ggggccaagg gaccacggtc 780
accgtctcct caattgaagt tatgtatcct cctccttacc tagacaatga gaagagcaat 840
ggaaccatta tccatgtgaa agggaaacac ctttgtccaa gtcccctatt tcccggacct 900
tctaagccct tttgggtgct ggtggtggtt gggggagtcc tggcttgcta tagcttgcta 960
gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt 1020
gactacatga acatgactcc ccgccgcccc gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat 1080
gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc tccagagtga agttcagcag gagcgcagac 1140
gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1200
gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1260
agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1320
gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1380
taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1440
ccccctcgcc aggccaaaag gaagcccagg aaagctccca gcaggaacat ctgctatgat 1500
gcatttgttt cttacagtga gcgggatgcc tactgggtgg agaaccttat ggtccaggag 1560
ctggagaact tcaatccccc cttcaagttg tgtcttcata agcgggactt cattcctggc 1620
aagtggatca ttgacaatat cattgactcc attgaaaaga gccacaaaac tgtctttgtg 1680
ctttctgaaa actttgtgaa gagtgagtgg tgcaagtatg aactggactt ctcccatttc 1740
cgtctttttg atgagaacaa tgatgctgcc attctcattc ttctggagcc cattgagaaa 1800
aaagccattc cccagcgctt ctgcaagctg cggaagataa tgaacaccaa gacctacctg 1860
gagtggccca tggacgaggc tcagcgggaa ggattttggg taaatctgag agctgcgata 1920
aagtcc 1926
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60
<210> 4
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gattgtgata ttgaaggtaa agatggcaaa caatatgaga gtgttctaat ggtcagcatc 60
gatcaattat tggacagcat gaaagaaatt ggtagcaatt gcctgaataa tgaatttaac 120
ttttttaaaa gacatatctg tgatgctaat aaggaaggta tgtttttatt ccgtgctgct 180
cgcaagttga ggcaatttct taaaatgaat agcactggtg attttgatct ccacttatta 240
aaagtttcag aaggcacaac aatactgttg aactgcactg gccaggttaa aggaagaaaa 300
ccagctgccc tgggtgaagc ccaaccaaca aagagtttgg aagaaaataa atctttaaag 360
gaacagaaaa aactgaatga cttgtgtttc ctaaagagac tattacaaga gataaaaact 420
tgttggaata aaattttgat gggcactaaa gaacac 456
<210> 5
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agcgctccaa atagcgctcc aaatagcgct ccaaatagcg ctccaaatag atctagactc 60
tagagggtat ataatggaag ctcgaattcc agcttggcat tccggtactg ttggtaaaaa 120
gcttggcaat ccggtactgt tggtaaagcc acc 153
<210> 6
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atggccctgc tactggccct cagcctgctg gttctctgga cttccccagc cccaactctg 60
agtggcacca atgatgctga agactgctgc ctgtctgtga cccagaaacc catccctggg 120
tacatcgtga ggaacttcca ctaccttctc atcaaggatg gctgcagggt gcctgctgta 180
gtgttcacca cactgagggg ccgccagctc tgtgcacccc cagaccagcc ctgggtagaa 240
cgcatcatcc agagactgca gaggacctca gccaagatga agcgccgcag cagt 294
<210> 7
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgttccatg tttcttttag gtatatcttt ggacttcctc ccctgatcct tgttctgttg 60
ccagtagcat catct 75

Claims (10)

1.一种制备CAR-T细胞的表达载体系统，其特征在于，所述表达载体系统包括：
含有嵌合抗原受体编码基因的第一表达载体，含有IL-2信号肽编码基因和IL-7编码基因的第二表达载体，含有NFAT调控型启动子和CCL19编码基因的第三表达载体；
所述NFAT调控型启动子包括NFAT调控序列和启动子序列；
所述NFAT调控序列包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的表达载体系统，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域；
优选地，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原包括CD19、CD20、CD22、CD30、CEA、EGFR、BRAF、HER-2、Mesothelin、MUC1、PSCA、GPC3、TERT、PTEN、PD-1、PD-L1或VEGF中的任意一种，优选为CD19、MUC1、GPC3、Mesothelin、PSCA或HER2中的任意一种，进一步优选为MUC1；
优选地，所述跨膜结构域包括CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域，优选为CD28跨膜结构域；
优选地，所述信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR2、4-1BB、TLR1、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD28胞内结构域、CD3ζ和TLR2的组合；
优选地，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、MUC1抗原结合结构域、CD28跨膜结构域、CD28胞内结构域、CD3ζ和TLR2串联组成；
优选地，所述嵌合抗体受体编码基因包括SEQ ID NO:2所示的核酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的表达载体系统，其特征在于，所述IL-2信号肽编码基因包括SEQ ID NO:3所示的核酸序列；
优选地，所述IL-7编码基因包括SEQ ID NO:4所示的核酸序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的表达载体系统，其特征在于，所述NFAT调控型启动子包括SEQ ID NO:5所示的核酸序列；
优选地，所述CCL19编码基因包括SEQ ID NO:6所示的核酸序列。
5.根据权利要求1-4任一项所述的表达载体系统，其特征在于，所述表达载体系统包括病毒载体系统；
优选地，所述病毒载体系统包括慢病毒载体系统、逆转录病毒载体系统或腺相关病毒载体系统中的任意一种，优选为慢病毒载体系统。
6.一种重组慢病毒系统，其特征在于，所述重组慢病毒系统采用权利要求1-5任一项所述的表达载体系统与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到；
优选地，所述重组慢病毒系统包括表达嵌合抗原受体的第一重组慢病毒，表达IL-2信号肽和IL-7的第二重组慢病毒，表达NFAT调控型CCL19的第三重组慢病毒；
优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合。
7.一种嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞表达特异性结合MUC1的嵌合抗原受体、分泌型IL-7和NFAT调控型CCL19；
优选地，所述嵌合抗原受体T细胞包括权利要求1-5任一项所述的表达载体系统和/或权利要求6所述的重组慢病毒系统。
8.一种权利要求7所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1-5任一项所述的表达载体系统或权利要求6所述的重组慢病毒系统导入T细胞的步骤。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求7所述的嵌合抗原受体T细胞；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
10.权利要求1-5任一项所述的表达载体系统、权利要求6所述的重组慢病毒系统、权利要求7所述的嵌合抗原受体T细胞或权利要求9所述的药物组合物在制备肿瘤治疗药物中的应用；
优选地，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、乳腺癌、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、间皮质瘤、胰岛细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、子宫肌瘤、宫颈癌或甲状腺癌中的任意一种或至少两种的组合。
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