CN110684739A

CN110684739A - 一种嵌合抗原受体t细胞及其应用

Info

Publication number: CN110684739A
Application number: CN201911095182.4A
Authority: CN
Inventors: 李鹏; 师靖轩; 秦乐; 姚瑶; 林思妙
Original assignee: Shenzhen In Vivo Biological Medicine Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen In Vivo Biological Medicine Technology Co Ltd
Priority date: 2019-11-11
Filing date: 2019-11-11
Publication date: 2020-01-14
Anticipated expiration: 2039-11-11
Also published as: CN110684739B

Abstract

本发明提供了一种嵌合抗原受体T细胞及其应用，所述嵌合抗原受体T细胞表达特异性结合抗原的嵌合抗原受体、IL‑7和CCL19；所述IL‑7的信号肽为T细胞分泌蛋白的信号肽；所述CCL19的启动子为NFAT调控启动子。本发明通过对IL‑7和CCL19进行优化，改变IL‑7的信号肽并将CCL19的持续性分泌改变为条件性分泌，构建的CAR‑T细胞能够将IL‑7持续性分泌到胞外，在识别肿瘤抗原后表达分泌CCL19、最大程度将免疫细胞招募到肿瘤内部，显著提高了CAR‑T细胞的抗肿瘤效果。

Description

一种嵌合抗原受体T细胞及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤的细胞免疫治疗领域，涉及一种嵌合抗原受体T细胞及其应用，尤其涉及一种高水平稳定表达细胞因子和去化因子的嵌合抗原受体T细胞及其在制备抗肿瘤治疗药物中的应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)免疫治疗是通过在T细胞膜上表达特异性识别并结合肿瘤抗原的嵌合抗原受体分子，诱导T细胞活化，从而实现对肿瘤细胞特异性杀伤的一种技术。

目前，CAR-T免疫治疗方法在白血病治疗领域取得了巨大突破，美国FDA已经批准了两种靶向CD19的CAR-T细胞产品上市，国内也有多家公司针对CD19的靶点开展了临床试验。

虽然CAR-T技术在血液瘤的治疗方面取得了一定突破，但是在实体瘤的治疗上仍然没有比较好的效果。近年来，科研人员对CAR-T疗法进行了深入研究和优化，例如：通过提高嵌合抗原受体的亲和力，使CAR-T细胞能够高效识别并结合肿瘤细胞，提高杀伤效果；研发识别两种抗原的CAR-T细胞，提高CAR-T细胞对表达多抗原的肿瘤细胞的杀伤能力；通过基因编辑技术敲除CAR-T细胞的PD-1，使CAR-T细胞在肿瘤微环境中不被抑制活性，促进CAR-T细胞发挥有效的杀伤能力。

Adachi等近期报道了新的研究成果(CN107109421A、CN109153989A)，将编码IL-7和CCL19的核酸序列由编码自切割肽的序列连接，构建的CAR-T细胞持续分泌IL-7和CCL19，一方面IL-7可以提高CAR-T细胞的体外扩增能力，另一方面当CAR-T细胞回输到小鼠体内后，浸润到肿瘤内的CAR-T细胞通过分泌的CCL19招募到更多的外周血循环T细胞和树突状细胞到肿瘤内，同时IL-7可以提高免疫细胞的存活能力，从而增强CAR-T细胞的抗肿瘤效果；但是，当CAR-T细胞留存在脾脏、淋巴结等免疫细胞较多的地方时，CCL19会将外周血循环T细胞和树突状细胞招募到特定部位，减少血液循环中的T细胞和树突状细胞的比例，从而降低了T细胞和树突状细胞被招募到肿瘤内的几率，因此这种使CAR-T细胞持续分泌CCL19的方法虽然可以招募更多的免疫细胞到肿瘤内发挥作用，但是同时也会将免疫细胞招募到其他部位，不能实现将外周血免疫细胞最大程度招募到肿瘤内部的效果。

此外，T细胞在自然情况下不分泌IL-7，因此T细胞对IL-7的表达调控在转录水平、蛋白质翻译水平和蛋白质分泌到胞外三个层面都是禁止的。虽然外源导入IL-7可以使T细胞转录和翻译IL-7蛋白，但是IL-7蛋白分泌到胞外仍然受到T细胞的严格控制，Adachi等报道的研究存在外源IL-7蛋白无法分泌到T细胞外的问题。

CN109504660A公开了一种第四代CAR-T细胞及其构建方法和应用，所述CAR包括胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区、细胞因子信号区，其中，胞膜外抗原结合区以Nectin-4抗原的两个空间表位为靶点，细胞因子信号区为IL7和CCL19，但是同样存在外源IL-7蛋白无法分泌到T细胞外、CCL19的持续性分泌无法最大程度将外周血免疫细胞招募到肿瘤内部的问题。

因此，构建一种新型CAR-T细胞，不仅能分泌IL-7和CCL19，而且能将外源IL-7蛋白分泌到T细胞外，同时CCL19最大程度将外周血免疫细胞招募到肿瘤内部，在肿瘤的治疗领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足及实际需求，本发明提供了一种嵌合抗原受体T细胞及其应用，通过对IL-7和CCL19进行优化，改变IL-7的信号肽并将CCL19的持续性分泌改变为条件性分泌，构建的CAR-T细胞能够将IL-7持续性分泌到胞外，在识别肿瘤抗原后表达分泌CCL19、最大程度将免疫细胞招募到肿瘤内部，显著提高了CAR-T细胞的抗肿瘤效果，同时规避了由于持续性分泌CCL19导致非肿瘤组织环境过多募集免疫细胞可能引起的炎症副反应。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞表达特异性结合抗原的嵌合抗原受体、IL-7和CCL19；

所述IL-7的信号肽为T细胞分泌蛋白的信号肽；

所述CCL19的启动子为NFAT调控启动子。

信号肽是影响蛋白质能否通过囊泡运输到细胞外的关键因素，本发明将IL-7信号肽替换为T细胞分泌蛋白的信号肽，解决了现有技术中IL-7不能被分泌到T细胞外的问题。

本发明将CCL19的持续性分泌改为条件性分泌，采用NFAT调控启动子调控T细胞对CCL19的表达，当CAR-T细胞处于静息状态时，CCL19不表达，当CAR-T细胞识别肿瘤抗原被激活后，NFAT调控启动子6×NFAT-RE-minP启动对CCL19的转录和翻译，CCL19开始表达，保证CAR-T细胞只有在肿瘤内部时才表达分泌CCL19，实现了外周血免疫细胞最大程度被招募到肿瘤内部的效果。

优选地，所述IL-7的信号肽包括IL-2信号肽、IL-3信号肽、IL-4信号肽、IL-5信号肽、IL-14信号肽或IL-17信号肽中的任意一种，优选为IL-2信号肽。

本发明中，采用常规人源信号肽作为IL-7的信号肽均可以实现将IL-7分泌到T细胞外的效果，IL-2是T细胞或T细胞系分泌的细胞生长因子，本发明优选采用IL-2信号肽替换IL-7信号肽，使得IL-7可以顺利被分泌到T细胞外，充分发挥IL-7对T细胞的体外增殖能力和体内存活能力的促进作用。

优选地，所述IL-2信号肽包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:1：

MYRMQLLSCIALSLALVTNS。

优选地，所述IL-7包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:2：

DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDA NKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRK PAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH。

优选地，所述CCL19包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:3：

MALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYL LIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS。

优选地，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内共刺激信号传导结构域。

优选地，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原包括CD19、CD20、CD22、CD30、CEA、EGFR、BRAF、HER-2、Mesothelin、MUC1、PSCA、GPC3、TERT、PTEN、PD-1、PD-L1或VEGF中的任意一种，优选为CD19、MUC1、GPC3、Mesothelin、PSCA或HER2中的任意一种，进一步优选为GPC3。

优选地，所述抗原结合结构域为靶向GPC3的单链抗体。

优选地，所述靶向GPC3的单链抗体包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:4：

DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSA。

优选地，所述跨膜结构域包括CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域，优选为CD28跨膜结构域。

优选地，所述CD28跨膜结构域包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:5：

IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGV LACYSLLVTVAFIIFWV。

优选地，所述胞内共刺激信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR2、4-1BB、TLR1、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD28胞内结构域、CD3ζ和TLR2的组合。

优选地，所述CD28胞内结构域包括如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:6：

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS。

优选地，所述CD3ζ包括如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:7：

RRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTA TKDTYDALHMQALPPRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDV LDKRRGRDPEMGGKP。

优选地，所述TLR2包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:8：

QAKRKPRKAPSRNICYDAFVSYSERDAYWVENLMVQELENFNPPFKLCLHKRDFIPGKWIIDNIIDSIEKSHKTVFVLSENFVKSEWCKYELDFSHFRLFDENNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVNLRAAIKS。

优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽，所述信号肽包括GM-CSF信号肽。

优选地，所述GM-CSF信号肽包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:9：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP。

作为优选技术方案，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、GPC3抗原结合结构域、CD28跨膜结构域、CD28胞内结构域、CD3ζ和TLR2串联组成。

优选地，所述嵌合抗原受体包括如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:10：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSL VHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQAKRKPRKAPSRNICYDAFVSYSERDAYWVENLMVQELENFNPPFKLCLHKRDFIPGKWIIDNIIDSIEKSHKTVFVLSENFVKSEWCKYELDFSHFRLFDENNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVNLRAAIKS。

第二方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体用于制备如第一方面所述的嵌合抗原受体T细胞。

优选地，所述表达载体包括(a)～(e)中的任意一种。

所述表达载体(a)包括编码嵌合抗原受体的核酸分子、编码2A肽的核酸分子、编码IL-2信号肽的核酸分子、编码IL-7的核酸分子、编码2A肽的核酸分子、NFAT调控启动子和编码CCL19的核酸分子；

所述表达载体(b)包括(b1)和(b2)：

(b1)包括编码嵌合抗原受体的核酸分子；

(b2)包括编码IL-2信号肽的核酸分子、编码IL-7的核酸分子、编码2A肽的核酸分子、NFAT调控启动子和编码CCL19的核酸分子；

所述表达载体(c)包括(c1)和(c2)：

(c1)包括编码嵌合抗原受体的核酸分子、编码2A肽的核酸分子、编码IL-2信号肽的核酸分子和编码IL-7的核酸分子；

(c2)包括NFAT调控启动子和编码CCL19的核酸分子；

所述表达载体(d)包括(d1)和(d2)：

(d1)包括编码嵌合抗原受体的核酸分子、编码2A肽的核酸分子、NFAT调控启动子和编码CCL19的核酸分子；

(d2)包括编码IL-2信号肽的核酸分子和编码IL-7的核酸分子；

所述表达载体(e)包括(e1)、(e2)和(e3)：

(e1)包括编码嵌合抗原受体的核酸分子；

(e2)包括编码IL-2信号肽的核酸分子和编码IL-7的核酸分子；

(e3)包括NFAT调控启动子和编码CCL19的核酸分子。

优选地，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、GPC3抗原结合结构域、CD28跨膜结构域、CD28胞内结构域、CD3ζ和TLR2串联组成。

优选地，所述GM-CSF信号肽包括如SEQ ID NO:11所示的核酸序列；

SEQ ID NO:11：

ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCC AGCATTCCTCCTGATCCCA。

优选地，所述靶向GPC3的单链抗体包括如SEQ ID NO:12所示的核酸序列；

SEQ ID NO:12：

GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGG AGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAATACACATGTTCCTCCTACGTTCGGATCGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGCAGGTTCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGCTACACATTTACTGACTATGAAATGCACTGGGTGAAGCAGACACCTGTGCATGGCCTAAAATGGATTGGAGCTCTTGATCCTAAAACTGGTGATACTGCCTACAGTCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTACAAGATTCTACTCCTATACTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA。

优选地，所述CD28跨膜结构域包括如SEQ ID NO:13所示的核酸序列；

SEQ ID NO:13：

ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG。

优选地，所述CD28胞内结构域包括如SEQ ID NO:14所示的核酸序列；

SEQ ID NO:14：

AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGA CTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCA CCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC。

优选地，所述CD3ζ包括如SEQ ID NO:15所示的核酸序列；

SEQ ID NO:15：

AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC。

优选地，所述TLR2包括如SEQ ID NO:16所示的核酸序列；

SEQ ID NO:16：

CAGGCCAAAAGGAAGCCCAGGAAAGCTCCCAGCAGGAACATCTGCTATGATGCATTTGTTTCTTACAGTGAGCGGGATGCCTACTGGGTGGAGAACCTTATGGTCCAGGAGCTGGAGAACTTCAATCCCCCCTTCAAGTTGTGTCTTCATAAGCGGGACTTCATTCCTGGCAAGTGGATCATTGACAATATCATTGACTCCATTGAAAAGAGCCACAAAACTGTCTTTGTGCTTTCTGAAAACTTTGTGAAGAGTGAGTGGTGCAAGTATGAACTGGACTTCTCCCATTTCCGTCTTTTTGATGAGAACAATGATGCTGCCATTCTCATTCTTCTGGAGCCCATTGAGAAAAAAGCCATTCCCCAGCGCTTCTGCAAGCTGCGGAAGATAATGAA CACCAAGACCTACCTGGAGTGGCCCATGGACGAGGCTCAGCGGGAAGGATTTTGGGTAAATCTGAGAGCTGCGATAAAGTCC。

优选地，所述IL-2信号肽包括如SEQ ID NO:17所示的核酸序列；

SEQ ID NO:17：

ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACT TGTCACAAACAGT。

优选地，所述IL-7包括如SEQ ID NO:18所示的核酸序列；

SEQ ID NO:18：

GATTGTGATATTGAAGGTAAAGATGGCAAACAATATGAGAGTGTTCTAATGGTCAGCATCGATCAATTATTGGACAGCATGAAAGAAATTGGTAGCAATTGCCTGAATAATGAATTTAACTTTTTTAAAAGACATATCTGTGATGCTAATAAGGAAGGTATGTTTTTATTCCGTGCTGCTCGCAAGTTGAGGCAATTTCTTAAAATGAATAGCACTGGTGATTTTGATCTCCACTTATTAAAAGTTTCAGAAGGCACAACAATACTGTTGAACTGCACTGGCCAGGTTAAAGGAAGAAAACCAGCTGCCCTGGGTGAAGCCCAACCAACAAAGAGTTTGGAAGAAAATAAATCTTTAAAGGAACAGAAAAAACTGAATGACTTGTGTTTCCTAAAGAGACTATTACAAGAGATAAAAACTTGTTGGAATAAAATTTTGATGGGCACTAAAGAACAC。

优选地，所述2A包括如SEQ ID NO:19所示的核酸序列；

SEQ ID NO:19：

AAAATTGTCGCTCCTGTCAAACAAACTCTTAACTTTGATTTACTCAA ACTGGCTGGGGATGTAGAAAGCAATCCAGGTCCA。

优选地，所述NFAT调控启动子包括如SEQ ID NO:20所示的核酸序列；

SEQ ID NO:20：

GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTAGATCTAGACTCTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGAATTCCAGCTTGGCATTCCGGTACTGTTGGTAAAAAGCTTGGCAATCCGGTACTGTTGGTAAAGCCACC。

本发明中，采用活化T细胞核因子(NFAT)调控的启动子6×NFAT-RE-minP来调控CCL19的表达，使得CAR-T细胞在识别肿瘤抗原并激活后启动对CCL19的转录和翻译，有利于最大程度将免疫细胞招募到肿瘤内部。

优选地，所述CCL19包括如SEQ ID NO:21所示的核酸序列；

SEQ ID NO:21：

ATGGCCCTGCTACTGGCCCTCAGCCTGCTGGTTCTCTGGACTTCCCCAGCCCCAACTCTGAGTGGCACCAATGATGCTGAAGACTGCTGCCTGTCTGTGACCCAGAAACCCATCCCTGGGTACATCGTGAGGAACTTCCACTACCTTCTCATCAAGGATGGCTGCAGGGTGCCTGCTGTAGTGTTCACCACACTGAGGGGCCGCCAGCTCTGTGCACCCCCAGACCAGCCCTGGGTAGAACGCATCATCCAGAGACTGCAGAGGACCTCAGCCAAGATGAAGCGCCGCAGCAGT。

优选地，所述表达载体包括病毒载体。

优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。

第三方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒采用如第二方面所述的表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。

优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合。

第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，所述方法包括将如第二方面所述的表达载体或如第三方面所述的重组慢病毒导入T细胞的步骤。

第五方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括如第一方面所述的嵌合抗原受体T细胞、如第二方面所述的表达载体或如第三方面所述的重组慢病毒中的任意一种或至少两种的组合。

第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述的嵌合抗原受体T细胞、如第二方面所述的表达载体、如第三方面所述的重组慢病毒或如第五方面所述的组合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。

优选地，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、乳腺癌、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、间皮质瘤、胰岛细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、子宫肌瘤、宫颈癌或甲状腺癌中的任意一种或至少两种的组合。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过对IL-7和CCL19进行优化，改变IL-7的信号肽并将CCL19的持续性分泌改变为条件性分泌，构建的CAR-T细胞能够将IL-7持续性分泌到胞外，分泌到胞外的IL-7对细胞具有显著的体外增殖能力和体内存活能力的促进作用；CAR-T在识别肿瘤抗原后表达分泌CCL19、最大程度将免疫细胞招募到肿瘤内部，显著提高了CAR-T细胞的抗肿瘤效果；

(2)本发明构建的优化型GPC3-IL2SG-IL7×NFATpro-CCL19 CAR-T较传统的CAR-T和GPC3-7×19CAR-T具有更强的肿瘤抑制作用，可以显著抑制肿瘤的增殖和体积；

(3)本发明规避了由于持续性分泌CCL19导致非肿瘤组织环境过多募集免疫细胞可能引起的炎症副反应

附图说明

图1为只表达CAR的CAR-T细胞(GPC3 CAR-T)，表达CAR、IL-7和CCL19的CAR-T细胞(GPC3-7×19CAR-T)和表达CAR分子、分泌性IL-7和条件性CCL19的CAR-T细胞(GPC3-IL2SG-IL7×NFATpro-CCL19 CAR-T)的流式结果图；

图2为ELISA检测GPC3 CAR-T、GPC3-7×19CAR-T和GPC3-IL2SG-IL7×NFATpro-CCL19 CAR-T对IL-7和CCL19的分泌情况；

图3为CAR-T细胞连续6天的增殖情况；

图4为CAR-T细胞对T细胞的招募能力；

图5为肝癌细胞系荷瘤小鼠经CAR-T注射后的肿瘤持续变化图；

图6为肝癌细胞系荷瘤小鼠经CAR-T注射后的肿瘤重量结果图；

图7为原代肿瘤荷瘤小鼠经CAR-T治疗后的肿瘤持续变化图；

图8为原代肿瘤荷瘤小鼠经CAR-T治疗后的肿瘤重量结果图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1表达分泌性IL-7及条件性CCL19的T细胞的制备

(1)细胞因子和趋化因子的优化策略

T细胞在自然情况下不分泌IL-7，外源导入的IL-7被转录和翻译后仍然无法分泌到T细胞外，为了使IL-7顺利被分泌到胞外，发明人将IL-7的信号肽替换为T细胞分泌蛋白的信号肽，例如IL-2的信号肽、IL-4的信号肽；为了最大程度将免疫细胞招募到肿瘤内部，提高CAR-T细胞的抗肿瘤效果，发明人将CCL19的持续性表达改为条件性表达，采用活化T细胞核因子(NFAT)调控的启动子6×NFAT-RE-minP调控CCL19的表达，使得CAR-T细胞在识别肿瘤抗原并被激活后才启动对CCL19的表达，从而特异地将免疫细胞招募到肿瘤内部。

(2)慢病毒载体的制备

通过全基因合成以下核酸分子：

①由GM-CSF信号肽、GPC3 scFv、CD28跨膜结构域、CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR2、2A肽和EGFP的核酸序列串联形成的CAR分子；

②由IL-7信号肽、IL-7(不含IL-7信号肽)、2A肽和CCL19的核酸序列串联形成的核酸分子；

③由IL-2信号肽和IL-7(不含IL-7信号肽)的核酸序列串联形成的分泌性IL-7分子；

④由6×NFAT-RE-minP启动子和CCL19串联形成的条件性CCL19分子；

其中，GM-CSF信号肽的核酸序列如SEQ ID NO:11所示，GPC3 scFv的核酸序列如SEQ ID NO:12所示，CD28跨膜结构域的核酸序列如SEQ ID NO:13所示，CD28胞内结构域的核酸序列如SEQ ID NO:14所示，CD3ζ的核酸序列如SEQ ID NO:15所示，TLR2的核酸序列如SEQ ID NO:16所示，IL-2信号肽的核酸序列如SEQ ID NO:17所示，IL-7(不含IL-7信号肽)的核酸序列如SEQ ID NO:18所示，2A肽的核酸序列如SEQ ID NO:19所示，6×NFAT-RE-minP启动子的核酸序列如SEQ ID NO:20所示，CCL19的核酸序列如SEQ ID NO:21所示，IL-7信号肽的核酸序列如SEQ ID NO:22所示；

SEQ ID NO:22：

ATGTTCCATGTTTCTTTTAGGTATATCTTTGGACTTCCTCCCCTGATCCTTGTTCTGTTGCCAGTAGCATCATCT。

将合成的CAR分子克隆至慢病毒表达载体pwpxld-eGFP中；将合成的IL-7信号肽、IL-7(不含IL-7信号肽)、2A肽和CCL19的核酸序列串联形成的核酸分子克隆至pwpxld-tCD19中；将合成的IL-2信号肽和IL-7(不含IL-7信号肽)的核酸序列串联形成的分泌性IL-7分子克隆至pwpxld-tCD19中，随后将合成的6×NFAT-RE-minP启动子和CCL19串联形成的条件性CCL19分子以相反的方向克隆至pwpxld-tCD19的末端。

(3)重组慢病毒的制备

为了将CAR分子、IL-7和CCL19导入T细胞，采用293T细胞制备重组慢病毒，当293T细胞铺100mm培养皿板底达80-90％时，进行慢病毒包装：

病毒包装前2h，更换培养基为含1％胎牛血清的DMEM，加入量为6mL/100mm培养皿；

配制如表1所示的质粒混合液：

表1

试剂	剂量
		pWPXLd-表达质粒	4.5μg
pMD2.G	1.5μg
		psPAX2	6μg

pWPXLd-表达质粒包括：表达CAR分子的慢病毒载体，表达完整IL-7和CCL19的慢病毒载体，以及表达分泌性IL-7和条件性CCL19的慢病毒载体，将各种pWPXLd-表达质粒分别加至500μL opti-MEM培养基内，混匀；

将36μg PEI加至另一500μL opti-MEM培养基内，混匀，室温静置5min；

将pWPXLd-表达质粒与PEI混合，吹打混匀，室温静置25～30min；

将上述混合液逐滴加至培养在100mm培养皿中的293T细胞上；

培养6h后，更换培养基为含1％胎牛血清的DMEM，加入量为7mL/100mm培养皿；

包装后24h、48h和72h，收取病毒上清，同时向293T细胞补加培养基，加入量为7mL/100mm培养皿；

1000g离心10min，0.45μm滤器过滤，分别得到表达CAR的重组慢病毒、表达完整IL-7和CCL19的重组慢病毒、以及表达分泌性IL-7和条件性CCL19的重组慢病毒，4℃保存待用；

(4)表达IL-7和CCL19的CAR-T细胞的制备

分离外周血单个核细胞：采用Ficoll密度梯度离心试剂盒(GE公司)从全血中分离外周血单个核细胞(PBMC)；

分离T细胞：采用Pan T细胞磁珠分选试剂盒(美天旎公司)从PBMC中分离T细胞；

T细胞激活：采用CD2/CD3/CD28 T细胞激活扩增试剂盒(美天旎公司)激活T细胞36h；

慢病毒感染T细胞：T细胞激活36h后，去磁珠，用含10％胎牛血清和1000IU/mL IL2的1640培养基重悬T细胞，分别加入上述制备的①表达CAR的重组慢病毒上清，②等量的表达CAR的重组慢病毒上清和表达完整IL-7和CCL19的重组慢病毒上清，③等量的表达CAR的重组慢病毒上清和表达分泌性IL-7和条件性CCL19的重组慢病毒上清，每10⁶个T细胞中加入1mL病毒上清和聚凝胺(8μg/mL)，在37℃、5％CO₂培养箱中感染两次，每次间隔8-12h；

CAR-T细胞的扩增：病毒感染T细胞后，采用含10％胎牛血清和1000IU/mL IL-2的1640培养基重悬T细胞，每10⁶个T细胞加入1mL，间隔48h加入新鲜培养基，调整细胞密度至(1～2)×10⁶/mL，培养10天后进行后续实验。

实施例2T细胞对CAR分子、IL-7和CCL19的表达

由于表达CAR分子的慢病毒载体上携带有EGFP基因，可以通过EGFP指示T细胞上CAR分子的表达，由于表达IL-7和CCL19的慢病毒载体上携带tCD19(只包含跨膜结构域和胞外结构域的人CD19)，可以通过CD19指示T细胞上IL-7和CCL19的表达；当T细胞被病毒感染结束48h后，通过流式细胞仪检测T细胞上的EGFP和CD19，得出表达CAR分子、IL-7和CCL19的T细胞；本实施例采用的流式细胞仪为ACEA Novocyte，检测CD19使用Biolegend公司克隆号为HIB19的流式抗体。

结果如图1所示为只表达CAR的CAR-T细胞(GPC3 CAR-T)，表达CAR、IL-7和CCL19的CAR-T细胞(GPC3-7×19CAR-T)和表达CAR分子、分泌性IL-7和条件性CCL19的CAR-T细胞(GPC3-IL2SG-IL7×NFATpro-CCL19 CAR-T)的流式结果图。

实施例3CAR-T细胞对IL-7和CCL19的分泌

取实施例2确认的三种CAR-T细胞各2×10⁶个，用新鲜的T细胞培养基培养24小时，收集细胞上清；同时取GPC3-IL2SG-IL7×NFATpro-CCL19 CAR-T2×10⁶个，与等量的表达GPC3肿瘤抗原的HepG2肿瘤细胞共培养24h，收集细胞上清；采用ELISA试剂盒(R&D system)检测每种细胞对IL-7和CCL19的分泌情况。

检测结果如图2所示，GPC3 CAR-T细胞的培养上清中无IL-7和CCL19，GPC3-7×19CAR-T细胞的培养上清中只有CCL19、没有IL-7，GPC3-IL2SG-IL7×NFATpro-CCL19 CAR-T细胞的培养上清中只有IL-7、没有CCL19，与HepG2肿瘤细胞共培养的GPC3-IL2SG-IL7×NFATpro-CCL19 CAR-T细胞的培养上清中能同时检测到IL-7和CCL19。

由此表明改造的GPC3-IL2SG-IL7×NFATpro-CCL19 CAR-T细胞可以顺利将IL-7分泌到胞外，同时CCL19的表达受到调控，只有当CAR-T细胞被肿瘤细胞激活后才表达分泌CCL19。

实施例4CAR-T细胞的体外增殖实验

取实施例2确认的三种CAR-T细胞各2×10⁶个，用新鲜的T细胞培养基培养，每两天进行计数，连续培养6天，分析CAR-T细胞的增殖情况。

统计结果图3所示，GPC3-7×19CAR-T由于不分泌IL-7，对CAR-T细胞没有促进增殖的作用，甚至由于合成的IL-7无法分泌到胞外，影响了T细胞的增殖速度，比传统的GPC3CAR-T的增殖速度更慢；经过改造的GPC3-IL2SG-IL7×NFATpro-CCL19 CAR-T表达的IL-7可以顺利分泌到胞外，可以促进CAR-T细胞的增殖。

采用IL-4的信号肽替换IL-7的信号肽，构建的GPC3-IL4SG-IL7×NFATpro-CCL19CAR-T细胞具有与GPC3-IL2SG-IL7×NFATpro-CCL19 CAR-T细胞基本相同的功能，可以顺利将IL-7分泌到胞外，促进CAR-T细胞的增殖，同时CCL19的表达受到调控，只有当CAR-T细胞被肿瘤细胞激活后才表达分泌CCL19。

实施例5T细胞迁移实验

本实施例采用Transwell细胞迁移实验，验证CCL19的招募能力，通过上层应答侧chamber里的T细胞穿过5μm聚碳酸酯、到达分泌CCL19的下层的数量，来指示CCL19对T细胞的招募情况。

取实施例2确认的三种CAR-T细胞各2×10⁶个于下层培养24h，同时取等量的GPC3-IL2SG-IL7×NFATpro-CCL19 CAR-T和HepG2肿瘤细胞于下层共培养24h，取CFSE标记的野生T细胞于上层chamber培养5h，用流式细胞仪检测下层细胞中CFSE标记的T细胞的数量，统计结果如图4所示，用学生t检验分析统计结果的显著性差异。

可以看出，与传统的GPC3 CAR-T相比，GPC3-7×19CAR-T可以招募到更多的T细胞，而GPC3-IL2SG-IL7×NFATpro-CCL19 CAR-T只有在被肿瘤细胞激活之后才会招募到更多的T细胞，说明条件性表达CCL19的GPC3-IL2SG-IL7×NFATpro-CCL19 CAR-T只有在识别肿瘤细胞后才会分泌CCL19，发挥招募作用，确保了本发明构建的GPC3-IL2SG-IL7×NFATpro-CCL19CAR-T在非肿瘤组织中的安全性。

实施例6免疫缺陷小鼠模型上验证CAR-T对肿瘤细胞系来源的实体肿瘤的治疗效果

将肝癌细胞系HepG2以2×10⁵个/只的数量皮下注射到NOD/SCID IL2rg-/-免疫缺陷小鼠体内，持续监测小鼠肿瘤的体积，待肿瘤长到50mm³以上后，将小鼠平均分为4组，每组5只；

将实施例2确认的三种CAR-T细胞以每只注射2×10⁶个细胞的剂量尾静脉注射到小鼠体内，同时设置不注射CAR-T的对照组(Blank)；

持续监测肿瘤体积(肿瘤长轴×(肿瘤短轴)²/2(mm³))，观察CAR-T的治疗效果。

如图5所示，经过GPC3 CAR-T治疗的小鼠，肿瘤体积(Tumor Volume)得到一定的抑制，GPC3-7×19CAR-T较GPC3 CAR-T具有较好的抗肿瘤效果，而本发明构建的GPC3-IL2SG-IL7×NFATpro-CCL19 CAR-T具有最优的抗肿瘤效果，肿瘤增长几乎被完全抑制。

如图6所示，经过GPC3 CAR-T治疗的小鼠，肿瘤重量(Tumor weight)有所降低，GPC3-7×19CAR-T较GPC3 CAR-T具有较好的抗肿瘤效果，而本发明构建的GPC3-IL2SG-IL7×NFATpro-CCL19 CAR-T较GPC3 CAR-T和GPC3-7×19CAR-T具有最优的肿瘤抑制作用，治疗后的小鼠体内的肿瘤得到非常有效的控制。

实施例7免疫缺陷小鼠模型上验证CAR-T对病人来源的的实体肿瘤的治疗效果

将病人来源的肝癌样本皮下注射到NOD/SCID IL2rg-/-免疫缺陷小鼠体内，待肿瘤体积长到50mm³以上后，将小鼠平均分为4组，每组5只；

如图7所示为携带原代病人肿瘤样本的小鼠经CAR-T治疗后肿瘤体积的持续变化，与空白组(Blank)相比，三个CAR-T组都具有良好的肿瘤增长抑制效果，GPC3-7×19CAR-T较GPC3 CAR-T抗肿瘤效果更优，而本发明构建的GPC3-IL2SG-IL7×NFATpro-CCL19 CAR-T具有最优的抗肿瘤效果，肿瘤增长得到完全抑制。

如图8所示为各组肿瘤重量结果，与GPC3 CAR-T和GPC3-7×19CAR-T相比，本发明构建的GPC3-IL2SG-IL7×NFATpro-CCL19 CAR-T对小鼠体内肿瘤有最强的抑制作用。

综上所述，本发明通过对IL-7和CCL19进行优化，改变IL-7的信号肽并将CCL19的持续性分泌改变为条件性分泌，构建的CAR-T细胞能够将IL-7持续性分泌到胞外，分泌到胞外的IL-7对细胞具有显著的体外增殖能力和体内存活能力的促进作用；CAR-T在识别肿瘤抗原后表达分泌CCL19、最大程度将免疫细胞招募到肿瘤内部，显著提高了CAR-T细胞的抗肿瘤效果；构建的优化型GPC3-IL2SG-IL7×NFATpro-CCL19 CAR-T较传统的CAR-T和GPC3-7×19CAR-T具有更强的肿瘤抑制作用，可以显著抑制肿瘤的增殖和体积。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市体内生物医药科技有限公司

<120> 一种嵌合抗原受体T细胞及其应用

<130> 20191108

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

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<212> PRT

<213> 人工合成

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<212> PRT

<213> 人工合成

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<212> PRT

<213> 人工合成

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Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro

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<212> PRT

<213> 人工合成

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<213> 人工合成

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<212> PRT

<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<213> 人工合成

<400> 19

aaaattgtcg ctcctgtcaa acaaactctt aactttgatt tactcaaact ggctggggat 60

gtagaaagca atccaggtcc a 81

<210> 20

<211> 285

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 60

ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 120

ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 180

agatctagac tctagagggt atataatgga agctcgaatt ccagcttggc attccggtac 240

tgttggtaaa aagcttggca atccggtact gttggtaaag ccacc 285

<210> 21

<211> 294

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

atggccctgc tactggccct cagcctgctg gttctctgga cttccccagc cccaactctg 60

agtggcacca atgatgctga agactgctgc ctgtctgtga cccagaaacc catccctggg 120

tacatcgtga ggaacttcca ctaccttctc atcaaggatg gctgcagggt gcctgctgta 180

gtgttcacca cactgagggg ccgccagctc tgtgcacccc cagaccagcc ctgggtagaa 240

cgcatcatcc agagactgca gaggacctca gccaagatga agcgccgcag cagt 294

<210> 22

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

atgttccatg tttcttttag gtatatcttt ggacttcctc ccctgatcct tgttctgttg 60

ccagtagcat catct 75

Claims

1.一种嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞表达特异性结合抗原的嵌合抗原受体、IL-7和CCL19；

所述IL-7的信号肽为T细胞分泌蛋白的信号肽；

所述CCL19的启动子为NFAT调控启动子。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述IL-7的信号肽包括IL-2信号肽、IL-3信号肽、IL-4信号肽、IL-5信号肽、IL-14信号肽或IL-17信号肽中的任意一种，优选为IL-2信号肽；

优选地，所述IL-2信号肽包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

优选地，所述IL-7包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

优选地，所述CCL19包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内共刺激信号传导结构域；

优选地，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原包括CD19、CD20、CD22、CD30、CEA、EGFR、BRAF、HER-2、Mesothelin、MUC1、PSCA、GPC3、TERT、PTEN、PD-1、PD-L1或VEGF中的任意一种，优选为CD19、MUC1、GPC3、Mesothelin、PSCA或HER2中的任意一种，进一步优选为GPC3；

优选地，所述抗原结合结构域为靶向GPC3的单链抗体；

优选地，所述跨膜结构域包括CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域，优选为CD28跨膜结构域；

优选地，所述胞内共刺激信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR2、4-1BB、TLR1、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD28胞内结构域、CD3ζ和TLR2的组合；

优选地，所述CD3ζ包括如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；

优选地，所述TLR2包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；

优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽，所述信号肽包括GM-CSF信号肽；

优选地，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、GPC3抗原结合结构域、CD28跨膜结构域、CD28胞内结构域、CD3ζ和TLR2串联组成；

优选地，所述嵌合抗原受体包括如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体用于制备如权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体T细胞；

优选地，所述表达载体包括(a)～(e)中的任意一种；

所述表达载体(b)包括(b1)和(b2)：

(b1)包括编码嵌合抗原受体的核酸分子；

所述表达载体(c)包括(c1)和(c2)：

(c2)包括NFAT调控启动子和编码CCL19的核酸分子；

所述表达载体(d)包括(d1)和(d2)：

(d2)包括编码IL-2信号肽的核酸分子和编码IL-7的核酸分子；

所述表达载体(e)包括(e1)、(e2)和(e3)：

(e1)包括编码嵌合抗原受体的核酸分子；

(e2)包括编码IL-2信号肽的核酸分子和编码IL-7的核酸分子；

(e3)包括NFAT调控启动子和编码CCL19的核酸分子。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、GPC3抗原结合结构域、CD28跨膜结构域、CD28胞内结构域、CD3ζ和TLR2串联组成；

优选地，所述GM-CSF信号肽包括如SEQ ID NO:11所示的核酸序列；

优选地，所述CD3ζ包括如SEQ ID NO:15所示的核酸序列；

优选地，所述TLR2包括如SEQ ID NO:16所示的核酸序列；

优选地，所述IL-2信号肽包括如SEQ ID NO:17所示的核酸序列；

优选地，所述IL-7包括如SEQ ID NO:18所示的核酸序列；

优选地，所述2A包括如SEQ ID NO:19所示的核酸序列；

优选地，所述CCL19包括如SEQ ID NO:21所示的核酸序列。

6.根据权利要求4或5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括病毒载体；

7.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒采用如权利要求4-6任一项所述的表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到；

8.一种如权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将如权利要求4-6任一项所述的表达载体或如权利要求7所述的重组慢病毒导入T细胞的步骤。

9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体T细胞、如权利要求4-6任一项所述的表达载体或如权利要求7所述的重组慢病毒中的任意一种或至少两种的组合。

10.一种如权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体T细胞、如权利要求4-6任一项所述的表达载体、如权利要求7所述的重组慢病毒或如权利要求9所述的组合物在制备肿瘤治疗药物中的应用；